PT2593136T

PT2593136T - Parvovírus atenuados vivos

Info

Publication number: PT2593136T
Application number: PT117324806T
Authority: PT
Inventors: Spibey Norman
Original assignee: Intervet Int Bv
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2017-05-03
Also published as: BR122021023230B1; BR112012030659B1; CN107254451A; CA2802283A1; US20130195913A1; ES2623149T3; EP3199178B1; JP6298499B2; NL301108I2; JP6061850B2; JP2017029140A; BR112012030659A2; JP2013535188A; CN102985108A; BR112012030659B8; US9186398B2; EP2593136A1; BR122021023230B8; CN107254451B; DK3199178T3

Description

DESCRIÇÃO

PARVOVIRUS ATENUADOS VIVOS A invenção refere-se a parvovirus atenuados vivos, às suas utilizações, vacinas compreendendo tais parvovirus atenuados vivos, bem como métodos para a sua produção.

Os parvovirus pertencem à família dos vírus de ADN de cadeia simples. Os parvovirus podem causar doenças em vários animais tais como gatos, cães e porcos. Dado que os vírus requerem células em divisão ativa de modo a serem replicados, o tipo de tecido infetado varia com a idade do animal. 0 trato gastrointestinal e sistema linfático podem ser afetados em qualquer idade, levando a vómitos, diarreia e imunossupressão, mas somente é observada hipoplasia cerebelar em gatos que foram infetados no útero ou com menos de duas semanas de idade, e é observada doença do miocárdio em cachorros infetados entre as idades de três e oito semanas. 0 parvovirus canino (CPV) é uma doença particularmente mortal em cachorros, cerca de 80% fatal, causando dano do trato gastrointestinal e desidratação bem como uma síndrome cardíaca em cachorros muito jovens. É propagado através de contacto com fezes de cão infetadas. Os sintomas incluem letargia, diarreia grave, febre, vómitos, perda de apetite, e desidratação. 0 parvovirus suíno causa uma doença reprodutiva em suínos conhecida como SMEDI, que significa nascimento morto, mumificação, morte embrionária, e infertilidade. A panleucopenia felina, comummente conhecida como cinomose felina, é uma infeção virai afetando gatos, causada pelo parvovirus felino (FPV), um parente próximo do parvovirus canino. A panleucopenia felina é comum em gatinhos e causa febre, baixa contagem de glóbulos brancos, diarreia, e morte. A infeção de fetos felinos e gatinhos de menos de duas semanas de idade causa hipoplasia cerebelar. 0 vírus da enterite da marta tem efeito semelhante à panleucopenia felina, exceto que não causa hipoplasia cerebelar. Um parvovirus causa Doença de Aleúte em martas e outros mustelídeos, caracterizada por linfadenopatia, esplenomegalia, glomerulonefrite, anemia, e morte. 0 diagnostico mais preciso de parvovirus é através de ELISA. Os cães, gatos e porcos são comummente vacinados contra parvovirus.

Ao nível do ADN, os parvovirus caninos, felinos e suínos são conhecidos como tendo uma genoma altamente homólogo. 0 parvovirus canino CPV2 é um vírus que é responsável por uma enterite aguda e algumas vezes fatal em cães (Kelly, Aust. Vet. J. 54; 593, 1978; Appel et al., Vet. Rec. 105; 156-159, 1979). 0 vírus, que apareceu inicialmente por volta de 1977, originou provavelmente a partir de um vírus muito estreitamente relacionado em gatos, o vírus da panleucopenia (FPLV) através de um pequeno número de mutações na proteína de cápside única; um salto de espécies que pode ter envolvido passagem intermédia noutros carnívoros tais como martas ou guaxinins (Truyen et al., Virology 215, 186-189, 1996). Tão cedo quanto 1979 apareceram as primeiras variantes de CPV2, denominadas CPV2a, e estas foram rapidamente seguidas pela aparição de CPV2b em 1984. (Parrish et al., Science 230, 1046-1048, 1985, e J. Virol. 65; 6544-6552, 1991). 0 vírus de tipo 2 original desapareceu atualmente do campo tendo sido substituído pelos tipos 2a e 2b, embora as proporções relativas destes dois tipos variem de país a país (Truyen et al., supra; Chinchkar et al., Arch. Virol. 151, 1881-1887, 2 006; Pereira et al., Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007). As alterações de aminoácidos na proteína de cápside (VP2), que caracterizam a mudança de 2 a 2a e a 2b, são muito limitadas. Ocorreram substituições nas posições 87 (Met a Leu), 300 (Ala a Gly), 305 (Asp a Tyr) e 555 (Vai a lie) na evolução de 2 a 2a e 426 (Asn a Asp) e 555 (lie a Vai) na emergência de 2 b a partir de 2a (Parrish et al., supra; Truyen et al., J. Virol. 69, 4702-4710, 1995). Recentemente, foram relatadas estirpes de 2a carecendo da substituição de Vai a Ile na posição 555 (Wang et al., Virus Genes 31, 171-174, 2005; Martella et al., Virus Genes 33, 11-13, 2006). Foi verificado que uma única alteração de aminoácido pode diferenciar as sequências VP2 de CPV2a e CPV2b.

Mais recentemente emergiram estirpes em Itália nas quais o aminoácido na posição 42 6 (Asn em 2a e Asp em 2b) se tornou num resíduo de ácido glutâmico (Glu) (Buonavoglia et al., J. Gen. Virol. 82, 3021-3025, 2001; Martella et al., J. Clin. Microbiol. 42, 1333-1336, 2004). 0 facto de que estas variantes de Glu 426, denominadas vírus CPV2c, se encontrem em circulação e coexistindo com outros tipos de CPV em Itália e noutros países Europeus (Decaro et al., J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006) e foram também isolados em países tão geograficamente diversos como Vietname e Escócia (Nakamura et al., Arch Virol. 149, 2261-2269, 2004, Spibey et al., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008) sugere que têm vantagem em pelo menos uma proporção da população canina.

A evolução relativamente rápida do parvovirus canino resultou na perda e posterior recuperação da gama de hospedeiros felinos (Truyen et al., 1996 supra), e esta capacidade de replicação recuperada em gatos pode ser responsável pela substituição do vírus de tipo 2 original com as variantes 2a, 2b e 2c. No final dos anos 70 e início dos anos 80 foram utilizadas vacinas de FPL tanto vivas como inativadas para proteger cães contra a doença de CPV devido aos antigénios partilhados que estimulavam a proteção cruzada, contudo o nível de proteção que proporcionavam era pobre e a duração da imunidade era curta. Estas vacinas foram substituídas por vacinas de CPV atenuado vivo, que proporcionou boa proteção e duração mais longa da imunidade. Atualmente as vacinas vivas atenuadas são derivadas a partir ou de isolados de CPV2 ou do vírus de tipo 2 original. Dado que o vírus de tipo 2 foi totalmente substituído no campo pelos vírus 2a, 2b e agora 2c tem existido preocupação sobre o nível de proteção proporcionada pelas vacinas de tipo 2 atenuado (Pratelli et al. , Clin. Drag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001; Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999) .

No entanto, com base em estudos com anticorpos monoclonais disponíveis cada nova variante antigénica perdeu pelo menos um epítopo de neutralização em comparação com a variante anterior (Strassheim et al. , Virology 198, 175-184, 1994; Pereira et al., acima) . Anteriormente foi demonstrado que a vacina de CPV2 atenuado vivo é capaz de proteger os cães contra desafios de campo com 2a e 2b (Greenwood et al., Vet. Record. 136, 63-67, 1995) muito embora os estudos de neutralização cruzada levados a cabo in vitro utilizando soros criados contra os vários tipos antigénicos mostrem diferenças marcadas (Pratelli et al., acima).

Recentemente, foi mostrado que a vacina de tipo 2 viva atenuada (Nobivac-Intervet) foi capaz de proteger os cães contra o desafio com a variante d CPV mais recente, CPV2c (Spibey et al., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008) .

Contudo existe uma necessidade no campo de vacinas que combinem a indução de um nível suficiente de imunidade em animais, em particular gatos, cães e porcos contra infeção com parvovirus com um comportamento altamente atenuado. Um nível elevado de atenuação é sinónimo de segurança, especialmente em animais jovens e idosos. É um objetivo da presente invenção proporcionar novos parvovirus vivos que estejam atenuados enquanto sendo ainda imunogénicos. Tais vírus proporcionam uma base para vacinas seguras. A invenção no seu sentido mais amplo é conforme definido nas reivindicações independentes. A este respeito, uma forma de realização da presente invenção refere-se a parvovirus CPV2 atenuados vivos, caracterizada por o dito CPV2 compreender um gene de cãpside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c codificando para um aminoácido para além de Isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e/ou um aminoácido para além de Glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside, e caracterizada por um fragmento de ADN de uma parte da região não de cápside do dito CPV2 ser substituída por um fragmento de ADN homólogo de uma parte da região de não cápside derivada a partir de um segundo parvovirus, em que o dito fragmento de ADN homólogo do dito segundo parvovirus porta uma mutação de atenuação. 0 parvovirus CPV2 atenuado vivo da invenção não é o CPV que está presente na vacina de parvovirus canino Nobivac Parvo C. É proporcionada uma sequência compreendida no CPV da vacina de parvovirus canino Nobivac Parvo C na SEQ ID NO: 1.

Foi surpreendentemente constatado, que estes dois sítios, na posição de aminoácido 219 e 386 do gene de cãpside, desempenham um papel importante na atenuação do vírus. Até agora foi assumido que principalmente os aminoácidos fora da região de cápside estão envolvidos na virulência/atenuação do vírus. A localização da Isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e uma Glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside é idêntica em parvovirus tanto caninos como felinos, independentemente do serotipo, A técnica anterior descreve o CPV que está presente na vacina de parvovirus canino Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health) que compreende a sequência conforme proporcionado na SEQ ID NO: 1.

Meramente para indicar a localização da Isoleucina na posição de aminoácido 219 e a Glutamina na posição de aminoácido 386, os dois aminoácidos são mostrados abaixo (em caracteres em negrito) num exemplo do contexto sequencial encontrado na maioria das estirpes de CPV e FPV, yfqwdrtlipshtgtsg (Isoleucina 219 = negrito) yafgrqhgqkttttget (Glutamina 386 = negrito)

Dependendo da estirpe que for utilizada como o material de partida para a substituição de um ou ambos aminoácidos de acordo com a invenção, pode ocorrer que uma única substituição do aminoácido na posição 219 ou 386 não seja suficiente para por exemplo tornar o vírus seguro em animais muito jovens. Se for requerida atenuação adicional, é preferida a substituição do aminoácido na posição tanto 219 como 386.

Como tal, uma forma preferida desta forma de realização refere-se a um CPV2 atenuado vivo de acordo com a invenção que compreende um gene de cápside codificando para um aminoácido para além de Isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e um aminoácido para além de Glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside.

Uma forma mais preferida desta forma de realização refere-se a um CPV atenuado vivo de acordo com a invenção, que compreende um gene de cápside codificando para uma Valina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e/ou uma Lisina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside.

Uma forma ainda mais preferida desta forma de realização refere-se a um CPV atenuado vivo de acordo com a invenção, que compreende um gene de cápside codificando para uma Valina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e uma Lisina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside.

Pode ser utilizado um parvovirus que já tem uma mutação de atenuação localizada fora da região de cãpside como o material de partida para a introdução de uma substituição de aminoácido de modo a preparar um CPV2 atenuado vivo de acordo com a invenção. Uma alternativa pode ser a substituição de um fragmento de ADN de uma parte da região não de cápside de um vírus compreendendo um gene de cãpside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c codificando para um aminoácido para além de Isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e/ou um aminoácido para além de Glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside, com uma região não de cápside homóloga de uma estirpe de parvovirus que porta uma atenuação nessa região. Parvovirus portando uma atenuação numa parte da região não de cápside são por exemplo a vacina de parvovirus canino comercialmente disponível Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health). A vantagem de uma tal abordagem é, que tais vírus tenham um nível de atenuação ainda mais elevado do que um parvovirus CPV2 compreendendo a dita mutação de atenuação na região não de cápside mas um gene de cápside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c codificando para Isoleucina na posição de aminoácido 219 e Glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside.

Um fragmento de ADN homólogo de uma parte da região não de cápside a partir de um segundo parvovirus é um fragmento de ADN que tem a mesma função que o fragmento de ADN do parvovirus CPV2 compreendendo um gene de cápside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c de acordo com a invenção, mas difere desse fragmento de ADN por portar uma mutação que leva a comportamento atenuado do vírus. Meramente como um exemplo, se um fragmento de ADN compreender uma mutação de atenuação num fragmento de ADN entre dois sítios de restrição específicos, e estes dois sítios de restrição estiverem também presentes na mesma localização num vírus não tendo essa mutação, o fragmento de restrição portando a mutação seria considerado homólogo com o mesmo fragmento a partir do vírus não tendo essa mutação.

Uma forma altamente preferida desta forma de realização refere-se a um parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com a invenção em que o fragmento de ADN homólogo do dito segundo parvovirus porta uma mutação de atenuação na região não estrutural, 11a região a partir da posição 2061 até 2070 da SeqldNo.1. 0 gene de cápside do vírus de acordo com a invenção codifica uma proteína de cápside de CPV serotipo 2a, 2b ou 2c compreendendo um aminoácido para além de Isoleucina na posição de aminoácido 219 e/ou um aminoácido para além de Glutamina na posição de aminoácido 386.

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a vacinas para a proteção de animais contra infeção com o parvovirus CPV2, em que tais vacinas compreendem um parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com a invenção e um portador farmaceuticamente aceitável.

Uma quantidade adequada de parvovirus de acordo com a invenção, para utilização numa vacina estaria em muitos casos no intervalo de 103 - 109 TCID50, dependendo do nível de atenuação e das características de replicação do vírus. Uma dose infeciosa de vírus que seja inferior a 103 TCIDS0 seria em muitos casos considerada como sendo demasiado baixa, dado que demoraria muito tempo para que o vírus fosse replicado até um nível suficientemente elevado para disparar o sistema imune. Quantidades que excedam 109 TCID50 não seriam atrativas, mesmo que apenas por motivos comerciais.

Uma dose muito adequada estaria no intervalo de 10a -108 TCID50, melhor ainda entre 106 - 108 TCID50.

Os portadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Meramente como um exemplo; um tal portador pode ser tão simples como água estéril ou uma solução de tampão tal como PBS.

Podem ser administradas vacinas de acordo com a invenção de diferentes formas. Dado que a vacina compreende um vírus atenuado vivo, são viáveis várias formas de administração, tais como administração oral, intranasal, I.M. e subcutânea. Uma via de administração preferida é a administração subcutânea.

Os animais suscetíveis a infeção por parvovirus tais como entre outros gatos e cães são frequentemente vacinados contra várias outras doenças ao mesmo tempo. Como tal seria prático combinar uma vacina de acordo com a invenção com um antigénio adicional de um vírus ou microrganismo patogénico para cães e gatos ou informação genética codificando o dito antigénio.

Consequentemente, outra forma de realização refere-se a uma vacina de combinação compreendendo uma vacina de acordo com a invenção e um antigénio adicional de um vírus ou microrganismo patogénico para animais ou informação genética codificando um polipéptido imunogénico do dito vírus ou microrganismo. 0 antigénio adicional de um vírus ou microrganismo pode ser o vírus ou microrganismo inteiro (numa forma atenuada viva ou numa forma inativada) ou um polipéptido imunogénico ou outra parte imunogénica desse vírus ou microrganismo tal como por exemplo um (lipo)polissacarídeo, capaz de induzir uma resposta imune protetora.

Preferentemente, o vírus ou microrganismo patogénico para animais é selecionado a partir do grupo de Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, vogeli, rossi, complexo Leishmania donovani, adenovirus canino, coronavírus canino, vírus da cinomose canina, Leptospira interrogans serovar canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa, bratislava, vírus da hepatite canina, vírus da parainfluenza canina, vírus da raiva, Hepatozoon canis, Borrei ia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, herpesvirus felino, calicivirus felino, panleucopenia felina e Chiamydophila felis.

As vacinas compreendendo vírus atenuados vivos devem ser armazenadas a baixa temperatura, ou devem estar numa forma seca por congelamento. As vacinas secas por congelamento podem ser mantidas sob condições de arrefecimento moderado ou inclusive à temperatura ambiente. Frequentemente, a vacina é misturada com estabilizantes, por exemplo para proteger proteínas propensas à degradação de serem degradadas, para potenciar a vida útil da vacina, ou para melhorar a eficácia da secagem por congelamento. Estabilizantes úteis são entre outros SPGA, hidratos de carbono por exemplo sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glucose, proteínas tais como albumina ou caseína ou produtos de degradação das mesmas, e tampões, tais como fosfatos metálicos alcalinos.

Como tal, preferentemente, a vacina (de combinação) de acordo com a invenção encontra-se numa forma seca por congelamento. Adicionalmente, a vacina pode ser suspensa num diluente fisiologicamente aceitável. Tais tampões podem por exemplo ser água estéril, um tampão e semelhantes. É evidente, QUE são também incorporados diluentes e compostos para emulsificar ou estabilizar vírus na presente invenção.

Novamente outra forma de realização da invenção refere-se a métodos para o fabrico de uma vacina (de combinação) de acordo com a invenção em que estes métodos compreendem a mistura de um parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com a invenção e um portador farmaceuticamente aceitável.

Ainda outra forma de realização da invenção refere-se a parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com a invenção para utilização como um medicamento. Mais especificamente, esta forma de realização refere-se a parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com a invenção para utilização no tratamento de infeção por parvovirus.

Finalmente, outra forma de realização de acordo com a presente invenção refere-se a métodos para a preparação de um parvovirus CPV2 mutante de acordo com a invenção, em que tais métodos compreendem permutar numa codificação génica uma proteína de cápside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c de um parvovirus canino que jã está atenuado numa parte para além da parte codificando a cápside um fragmento de ADN codificando pelo menos parte doa proteína de cápside do parvovirus tendo na posição de aminoácido 219 um codão codificando Isoleucina e/ou tendo na posição de aminoácido 386 um codão codificando Glutamina, por um fragmento de ADN codificando pelo menos parte da proteína de cápside do parvovirus tendo na posição de aminoácido 219 um codão codificando um aminoácido para além de Isoleucina e/ou tendo na posição de aminoácido 386 um codão codificando um aminoácido para além de Glutamina.

Tal permuta de ADN pode ser realizada utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na técnica, tais como mutagénese sítio-dirigida, permuta de fragmentos de restrição e semelhantes. Existem várias formas de tornar a Isoleucina 219 numa substituição XI ou a Glutamina 386 numa substituição X2. Tais alterações podem ser introduzidas através de síntese química ou PCR seguido por recombinação do fragmento recém-sintetizado com ADN virai. Exemplos

Exemplo 1; Produção de Clone 630att de Parvovirus Canino Materiais de partida Uí vil

es ·

Estirpes de E. coli

Foram selecionadas as estirpes de E. coli JC811 obtida a partir do E. coli Genetic Stock Center (EUA) e a estirpe DL795 (Kramel Biotech UK) para propagação de plasmídeos de clones infeciosos completos.

Síntese de ADN

Foi realizada síntese de ADN personalizada através de Eurofins MWG GmbH. 0 fragmento de ADN sintetizado foi proporcionado no plasmídeo de clonagem pBluescrpt. A construção do clone de parvovirus canino 630att foi um processo multi etapa e é descrito aqui nas suas etapas separadas. 1) . Construção de um clone molecular infecioso de Nobivac Parvo C (pl54att)

Foi obtido ADN virai de forma replicativa (RF) a partir de células A72 infetadas com células infetadas com Nobivac Parvo C utilizando um método de preparação "Hirt" modificado (Parrish et al 1988, Virology 166, 293-307) . 0 ADN virai foi digerido com uma série de enzimas de restrição e o genoma foi montado em pBluescript utilizando metodologia de clonagem padrão. 0 esquema de clonagem é delineado na Figura 1-4. 0 ADN RF de CPV 154att foi primeiro submetido a "preenchimento terminal" utilizando ADN polimerase T4. 0 ADN foi então digerido com EcoRI e Spel. Estas enzimas cortam uma vez nas posições 1099 e 3459 respetivamente. Esta digestão resulta em três fragmentos etiquetados A, B e C por ordem de tamanho. Os fragmentos foram separados através de eletroforese por gel e o fragmento EcoRI/Spel (fragmento A) foi então clonado no plasmídeo pBluescript que foi preparado através de digestão com as mesmas enzimas (veja-se a Figura 1). 0 fragmento terminal EcoRI (fragmento C) a partir da digestão de ADN RF foi então clonado em pBluescript digerido com EcoRI e EcoRV para produzir pCPV C (veja-se a Figura 2).

Os fragmentos A e C de parvovirus canino foram subclonados em conjunto no mesmo plasmideo. Os plasmideos pCPV A e PCPV C foram digeridos com Spel e EcoRI. A inserção de CPV foi purificada a partir de pCPV A e a porção do vetor foi tomada a partir de pCPV C. A ligação resultou então num plasmideo no qual os fragmentos A e C foram "novamente unidos" (veja-se a Figura 3) . 0 fragmento terminal Spel (fragmento B) a partir da digestão de ADN CPV RF foi então clonado em pCPV AC. 0 plasmideo pCPV AC foi digerido com Spe I e uma enzima Hindi que corta deixando terminais rombos. Os fragmentos foram ligados e clonados. (veja-se a Figura 4). 0 plasmideo resultante foi denominado pl54att. A confirmação de que foi montado um clone completo foi alcançada através de transfeção do ADN do plasmideo em células A72 resultando na produção do virus infecioso.

Foi realizada análise de sequência do clone do plasmideo; esta sequência foi mostrada como sendo idêntica à determinada a partir de ADN virai extraído a partir de células infetadas, conforme mostrado mais abaixo. 2). Construção de Híbrido D9 2/2c

Foi obtido ADN vital a partir tanto de células infetadas com Nobivac parvo C como separadamente a partir de células infetadas com CPV2c "Jes". As preparações de ADN virai foram cada uma digeridas com uma única enzima de restrição para produzir 2 fragmentos de ADN a partir de cada uma. As digestões enzimáticas foram realizadas de tal forma que o fragmento esquerdo do genoma de Nobivac e o fragmento direito do genoma "Jes" partilhavam >200pb de sobreposição de sequências. Os fragmentos terminal esquerdo de Nobivac e terminal direito de "Jes" foram separados, purificados e misturados (Figura 7). A transfeção de células A72 e CrFK com estes fragmentos sobrepostos permitiu que fossem produzidos vírus infeciosos através de recombinação natural. 0 vírus resultante foi clonado através de diluição limitante e denominado híbrido D9 2/2c. 3) . Construção do Clone 630. 0 clone 630 foi desenvolvido a partir do clone de plasmídeo infecioso pl54att e ADN preparado a partir do híbrido D9 2/2c. A enzima de restrição Pad corta o genoma de CPV em dois sítios à volta das posições 561 e 4651; os terminais mais à esquerda e à direita do genoma. Como tal o plasmídeo pl54att foi digerido com Pad e o fragmento de Pad de ~ 4kpb contendo mais de 80% do genoma foi separado a partir do vetor e das sequências terminais e substituído por aquele obtido a partir de ADN do híbrido D9 2/2c. O plasmídeo resultante foi denominado p630. Isto é ilustrado na Figura 5.

Conforme previsto, a transfeção de células A72 ou CrFK com p630 resulta na geração de vírus infeciosos, este vírus é denominado 630. 0 vírus 630 como o híbrido D9 2/2c reteve um nível baixo de patogenicidade. 4) . Construção do Clone 630att 0 vírus 630 mostrou alguns sinais clínicos de baixo nível quando injetado em cães.

Foi sintetizada quimicamente uma porção do gene de cápside incorporando alterações de aminoácidos observadas em Nobivac parvo C mas não constatadas como ocorrendo em estirpes de campo. Este fragmento foi então substituído pela mesma região no plasmídeo p630 para criar o plasmídeo p630att; isto é ilustrado na Figura 6.

Foi sintetizada a sequência de ADN correspondente àquela entre as posições 3356 e 4029 no genoma de CPV. A sequência de ADN exata, proporcionada aqui como SEQ ID NO: 2, é mostrada abaixo 1 agatctqaqa cattgggttt ttatccatgg aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attagtacca tctcatactg 101 gaactagtgg cacaccaaea aatatatacc atggtacaga tccagatgat gttcaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac 201 aggtgatgaa tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa acaaatagag cattgggctt accaccattt 301 ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga aatacaaact 401 atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat 501 tgcagcagga cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt. ggtagacaac atggtaaaaa aactaccaca 601 acaggagaaa cacctgagag atttacatat atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt gg

Os sítios de enzima de restrição Bgl II e Xcml são mostrados em negrito e sublinhados. A sequência foi libertada a partir do plasmídeo no qual foi proporcionada através de digestão com Bgl II e Xcml. Os fragmentos de ADN foram separados através de eletroforese com gel de agarose e o fragmento de 672 pb foi isolado e purificado. A transfeção de células A72 ou CrF com p630att resultou na geração de vírus infeciosos (630att) que quando administrados a cachorros não produziram sinais clínicos.

Num estudo comparativo, foram comparadas uma vacina compreendendo o clone 630 e uma vacina compreendendo o clone 630att. Foram vacinados cinco cães negativos para MDA por via subcutânea com ΙΟ80 -108 ·3 TCID50 de Clone 63 0 em 1 ml. Isto levou a sinais leves a moderados em todos os cães. A alteração da massa durante um período de 5 dias foi de -6% de média nos 5 cães, conforme segue no quadro abaixo.

Foram vacinados cinco cães negativos para MDA por via subcutânea com 108°-108·3 TCID50 de Clone 630att em 1 ml.

Neste grupo, não foram observados sinais clínicos, aumento de temperatura, leucopenia, diarreia ou vómitos. Além disso, houve um amento de peso substancial neste grupo, conforme segue a partir do quadro abaixo.

Foi como tal concluído que as vacinas à base do clone 630att têm de facto comportamento atenuado quando comparadas ao clone 630, e têm um excelente perfil de segurança.

Exemplo 2: geração de um vírus recombinante tendo uma mutação atenuante fora do gene de cápside A estirpe 154 att foi obtida a partir de uma Nobivac Parvo C comercialmente disponível (Intervet Schering-Plough Animal Health) e a estirpe Jess foi um isolado de campo de um vírus de tipo 2c.

Os vírus foram cultivados em células renais caninas e ou felinas aderentes (por exemplo A72 e CrFK) utilizando meio M6B8 contendo soro fetal bovino a 5%. Foi preparado ADN de forma replicativa (RF) a partir de culturas celulares infetadas utilizando uma modificação do método "Hirt" padrão (McMaster et al 1981). ADN RF preparado a partir da estirpe 154 att foi digerido com a enzima de restrição PstI e os fragmentos separados através de eletroforese com gel de agarose. A banda do par de bases (pb) 3055 (correspondendo ao terminal esquerdo de CPV) foi excisada a partir do gel e purificada utilizando colunas de extração de gel Qiagen Qiaquick. Foi digerido ADN RF isolado a partir de células infetadas com CPV Jess com a enzima de restrição Xmnl. Novamente os fragmentos de ADN foram separados através de eletroforese com gel de agarose seguido por purificação de uma banda de aproximadamente 2750 pb (correspondendo ao terminal direito de CPV incluindo a sequência de cápside) utilizando colunas de extração de gel Qiagen Qiaquick.

Os fragmentos de 3055 pb e 2750pb a partir de 154att e Jess foram combinados e transfetados para células A72 ou CrFK em cultura. As transfeções foram realizadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) com aproximadamente 3pg de cada fragmento, seguindo as instruções do fabricante.

Após a transfeção, as células foram passadas e monitorizadas através de ensaio de hemaglutinação (HA) . O vírus foi detetado através de HA na passagem 4. Foi

realizada determinação de sequência de ADN de vírus híbridos utilizando protocolos de sequenciação de ADN padrão utilizando ou ADN RF ou moldes de fragmentos de PCR. O vírus foi purificado limitando a diluição a células caninas ou felinas suscetíveis aderentes.

Exemplo 3: Vírus Recombinantes Construídos a partir de ADN Virai Clonado

Foram gerados vírus recombinantes a partir de fragmentos clonados. O genoma da estirpe virai 154att foi clonado no vetor de clonagem padrão pBluescript (Stratagene inc.) . De modo a manter as sequências palindrómicas terminais intactas o plasmídeo foi propagado no hospedeiro bacteriano DL795 que carece de uma série de sistemas de recombinação. A clonagem de genomas de parvovirus foi descrita na literatura e as técnicas requeridas são conhecidas para o perito na especialidade. 0 clone obtido de 154att (pl54att) foi digerido com a enzima de restrição Pac I de tal modo que não fosse possível completar a digestão, isto é, a digestão da enzima de restrição foi somente parcial. Os fragmentos digeridos foram então submetidos a digestão com a enzima de restrição Xmn I. Os fragmentos de ADN digerido foram então separados através de eletroforese com gel de agarose e o fragmento indicado no diagrama abaixo foi excisado a partir do gel e purificado utilizando colunas de extração de gel Qiagen Qiaquick. Os sítios Man I e Pac do lado direito flanqueiam a região de cápside no genoma do parvovirus, o gene de cápside de 154 att foi substituído pelo gene de cápside de uma estirpe virulenta de CPV conforme segue. 0 sítio Xmn I e Pac I do lado direito indicados na Figura 8 encontram-se fora dos limites do gene de cápside. A sequência de aproximadamente HOpb entre o sítio Pac I e o final do gene de cápside difere significativamente entre a estirpe 154all e isolados virulentos. Não existem ainda alterações de sequência registadas na sequência curta (-55 pb) entre o sítio Man I e o início do gene de cápside. Como tal de modo a limitar a permuta de material somente com a sequência de cápside; a sequência de cápside de CPV virulento foi sintetizada quimicamente e a sequência específica de vacina entre o sítio Pad e o sinal de terminação de cápside foi retida.

Abaixo, é mostrada a sequência sintetizada quimicamente contendo o gene de cápside de CPV. A sequência conforme mostrada abaixo é proporcionada no presente documento como SEQ ID NO: 3.

AGAG G CAGAC C T GAGAG C CAT CTTTACTTCT GAACAAT T G GAAGAAGATTTTC GAGA

Xmn I

C GAC T T G GAT TAAG GTAC GAT G G CAC C T C C G G CAAAGAGAG C CAG GAGAG GTAAG G GT GT GTTAGTAAAGTGGGGGGAGAGGAAAGATTTAATAACTTAACTAAGTATGTGTTTTTTTAT AGGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGA ACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCT TCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCA AACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAA GGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAA ACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATTAATCTTGCAAAAAAAAAAAA AGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCA ACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCAACAGGATCTGGGAACGGGTC TGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAA TCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAG ACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTT GGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTAAC ACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCA ACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAA TGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAA TGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCC AGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCC ATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGG CACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGA AAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTT TTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTT ACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGG AGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACTATATTACTGA AGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGC GTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGA TGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAA

AACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGG AAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGAAGA TAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATAT ATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGG TCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACC ATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTTAAC AAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTT TTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCC AATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGG AGGTATGAAAATTGTATATGAAAAATCTCAGCTAGCACCTAGAAAATTATATTAA.CATAC T T AC TAT GT T T T TAT GT T TAT TAG AT AT C AAC TAÃ.CAC CT AGAAAAT TAT AT T AAT AT AC T TAC TAT G T T T T TAT GT T TAT TACATAT TAT T T TAAGATTAATTAAGGC G C GC C

PacI

Os sítios Man I e Pac I são indicados e sublinhados. 0 codão de terminação (TAA) da região de codificação de cápside A sequência de codificação de cãpside (Vpl/Vp2) está em negrito. 0 fragmento sintetizado foi libertado a partir do plasmídeo no qual foi proporcionado utilizando as enzimas Xmn I e Pac I, foi então ligado ao fragmento mostrado na Figura 9. Foram transformadas E. coli competentes (estirpe DL795) com a mistura de ligação utilizando protocolos e as bactérias albergando os plasmídeos recombinantes isoladas e identificadas. 0 plasmídeo resultante p 1542c ilustrado abaixo (Figura 10) foi então preparado a partir das E. coli clonadas.

Foi preparado um vírus híbrido conforme segue. 0 ADN do plasmídeo p 15 42c foi transfetado em células A72 ou CrFK em cultura. As transfeções foram realizadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) com aproximadamente 3 microgramas de ADN, seguindo as instruções do fabricante. Após a transfeção, as células foram passadas e

monitorizadas através de ensaio de hemaglutinação (HA) . 0 vírus foi detetado através de HA na passagem 4. Foi realizada determinação de sequência de ADN de vírus híbridos utilizando protocolos de sequenciação de ADN padrão utilizando ou ADN RF ou moldes de fragmentos de PCR. 0 vírus foi purificado limitando a diluição a células caninas ou felinas suscetíveis aderentes.

Legenda das figuras.

Figura 1: Construção de pCPV A Figura 2: Construção de pCPV C Figura 3: Construção de pCPV AC Figura 4 : Construção de pCPV 154att Figura 5: Construção de p630 Figura 6: Construção de p630att

Figura 7: representação esquemática do método de recombinação natural (não MG) de obtenção de um isolado de vírus híbrido 2/2c. Os fragmentos sobrepostos a partir da vacina de tipo 2 e vírus de campo de tipo 2c foram transfetados em células e os vírus isolados após recombinação homóloga.

Figura 8: representação esquemática do clone de plasmídeo infecioso da estirpe CPV 154att mostrando os sítios das enzimas de restrição Pac I e Xmn I. As caixas sombreadas ilustram as sequências palindrómicas terminais Figura 9: esquemática mostrando o produto selecionado da digestão parcial de Pac I / Xmn I que foi selecionado para posterior manipulação

Figura 10: plasmídeo contendo o ADN de vírus de vacina 154att no qual o gene de cápside é substituído por uma sequência de cápside CPV2c virulenta.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Intervet International B.V. <120> Parvovirus atenuados vivos <130> 2010.016 <160>5 <17G> Patentln versão 3,5 <210> 1 <211> 5003 < 212 > ADN <213> parvovirus <400> 1 atcaatgttt agaaccaact gaccaagttc acgtacgtat gacgtgatga cgcgcgctge SO gcgcgctgcc tacggcagtc acacgtcata cgtacgctcc ttggtcagtt ggttctaaag 120 aatgataggc ggtttgtgtg tttaaacttg ggcgggaaaa ggtggcgggc taattgtggg 180 cgtggttaaa ggtataaaag acaaaccata gaccgttact gacattcgct tcttgtcttt 240 gacagagtga acetctctta ctttgactaa ccatgtctgg caaccagtat actgaggaag 300 ttatggaggg agtaaattgg ttaaagaaac atgcagaaaa tgaagcattt tcgtttgttt 360 ttaaatgtga caacgtccaa ctaaatggaa aggatgttcg ctggaacaac tataccaaac 420 caattcaaaa tgaagagcta acatctttaa ttagaggagc acaaacagca atggatcaaa 480 ccgaagaaga agaaatggac tgggaatcgg aagttgatag tctcgccaaa aagcaagtac 540 aaacttttga tgcattaatt aaaaaatgtc tttttgaagt ctttgtttct aaaaatatag SOO aaccaaatga atgtgtttgg tttattcaac atgaatgggg aaaagatcaa ggctggcatt 660 gtcatgtttt acttcatagt aagaacttac aacaagcaac tggtaaatgg etacgcagac 720 aaatgaatat gtattggagt agatggttgg tgactctttg ttcggtaaac ttaacaccaa 780 ctgaaaagat taagctcaga gaaattgcag aagatagtga atgggtgact atattaacat 840 acagacataa gcaaacaaaa aaagactatg ttaaaatggt tcattttgga aatatgatag 900 catattacfct. tttaacaaag aaaaaaattg tccacatgac aaaagaaagt ggctattttt 960 taagtactga ttctggttgg aaatttaact ttatgaagta tcaagacaga caaattgtca 1020 gcacacttta cactgaacaa atgaaaccag aaaccgttga aaccacagtg acgacagcac 1080 aggaaacaaa gcgcgggaga attcaaacta aaaaggaagt gtcaatcaaa tgtactttgc 1140 gggacttggt tagtaaaaga gtaacatcac ctgaagactg gatgatgtta caaccagata 1200 gttatattga aatgatggca caaccaggag gtgaaaatct tttaaaaaat acacttgaaa 1260 tttgtacttt gactttagca agaaeaaaaa cagcatttga attaatactt gaaaaagcag 1320 ataatactaa actaactaac tttgatcttg caaattctag aacatgtcaa atttttagaa 1380 tgcacggatg gaattggatt aaagtttgtc acgctatagc atgtgtttta aatagacaag 1440 gtggtaaaag aaatacagtt ctttttcatg gaccagcaag tacaggaaaa tctatcattg 1500 ctcaagccat agcacaagct gtgggtaatg ttggttgtta taatgcagca aatgtaaatt 1560 ttccatttaa tgactgtacc aataaaaatt taatttggat tgaagaagct ggtaactttg 1620 gtcaacaagt taatcaattt aaagcaattt gttctggaca aacaattaga attgatcaaa 1680 aaggtaaagg aagtaagcaa attgaaccaa ctccagtaat tatgacaact aatgaaaata 1740 taacaattgt gaggattgga tgtgaagaaa gacctgaaca tacacaacca ataagagaca 1800 gaatgtcgaa cattaagtta gtatgtaagc ttccaggaga ctctggtttg gttgataaag I860 aagaatggcc tttaatatgt gcatggfctag ttaaacatgg ttatgaatca accatggcta 1920 actatacaca tcattgggga aaagtaccag aatgggatga aaactgggcg gagcctaaaa 1980 tacaagaagg tataaattca ccaggttgca aagacttaga gacacaagcg gcaagcaatc 2040 ctcagagtca agaccaagtt cacgtacgta tgactccgga cgtagtggac cttgcactgg 2100 aaccgtggag tactccagat acgcctattg cagaaactgc aaatcaacaa tcaaaccaac 2150 ttggcgttac tcacaaagac gtgcaagcga gtccgacgtg gtccgaaata gaggcagacc 2220 tgagagccat etttacttct gaacaattgg aagaagattt tcgagacgac ttggattaag 2280 gtacgatggc acctccggca aagagagcea ggagaggtaa gggtctgtta gtaaagtggg 2340 gggagaggaa agatttaata acttaactaa 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<210> 3 <211> 2451 <212> ADN <213> parvovirus <400> 3 agaggcagao ctgagagcca tctttacttc tgaacaattg gaagaagatt ttcgagacga 60 cttggattaa ggtacgatgg cacctccggc aaagagagcc aggagaggta agggtgtgtt 120 agtaaagtgg ggggagagga aagatttaat aacttaacta agtatgtgtt tttttatagg 180 acttgtgcct ccaggttata aatatcttgg gcctgggaac agtcttgacc aaggagaacc 240 aactaaccct tctgacgccg ctgcaaaaga acacgacgaa gcttacgctg cttatcttcg 300 ctctggtaaa aacccatact tatatttctc gccagcagat caacgcttta tagatcaaac 360 taaggacgct aaagattggg gggggaaaat aggacattat ttttttagag ctaaaaaggc 420 aattgctcca gtattaactg atacaccaga tcatccatca acatcaagac caacaaaacc 480 aactaaaaga agtaaaccac cacctcatat tttcattaat cttgcaaaaa aaaaaaaagc 540 cggtgcagga caagtaaaaa gagacaatct tgcaccaatg agtgatggag cagttcaacc 600 agacggtggt caacctgctg tcagaaatga aagagcaaca ggatctggga acgggtctgg 660 aggcgggggt. ggtggtggtt ctgggggtgt ggggatttct acgggtactt tcaataatca 720 gacggaattt aaatttttgg aaaacggatg ggtggaaatc acagcaaact caagcagact 780 tgtacattta aatatgccag aaagtgaaaa ttatagaaga gtggttgtaa ataatttgga 840 taaaactgca gttaacggaa acatggcttt agatgatact catgcacaaa ttgtaacacc 900 ttggtcattg gttgatgcaa atgcttgggg agtttggttt aatccaggag attggcaact 960 aattgttaat actatgagtg agttgcattt agttagtttt gaacaagaaa tttttaatgt 1020 tgtttfcaaag actgtttcag aatctgctac tcagccacca actaaagttt ataataatga 1080 tttaactgca tcattgatgg ttgcattaga tagtaataat actatgccat ttactccagc 1140 agctatgaga tctgagacat tgggttttta tccatggaaa ccaaccatac caactccatg 1200 gagatattat tttcaatggg atagaacatt aataccatct catactggaa ctagtggcac 1260 accaacaaat atataccatg gtacagatcc agatgatgtt caattttata ctattgaaaa 1320 ttctgtgcca gtacacttac taagaacagg tgatgaattt gctacaggaa catttttttt 1380 tgattgtaaa ccatgtagac taacacatac atggcaaaca aatagagcat tgggcttaoc 1440 accatttcta aattctttgc ctcaagctga aggaggtact aactttggtt atataggagt 1500 tcaacaagat aaaagacgtg gtgtaactca aatgggaaat acaaactata ttactgaagc 1560 tactattatg agaccagctg aggttggtta tagtgcacca tattattctt ttgaggcgtc 1620 tacacaaggg ccatttaaaa cacctattgc agcaggacgg gggggagcgc aaacagatga 1680 aaatcaagca gcagatggtg atccaagata tgcatttggt agacaacatg gtcaaaaaac 1740 taccacaaca ggagaaacac ctgagagatt tacatatata gcacatcaag atacaggaag 1800 atatccagaa ggagattgga ttcaaaatat taactttaac cttcctgtaa cagaagataa 1860 tgtattgcta ccaacagatc caattggagg taaaacagga attaactata ctaatatatt 1920 taatacttat ggtcctttaa ctgcattaaa taatgtacca ccagtttatc caaatggtca 1980 aatttgggat aaagaatttg atactgactt aaaaccaaga cttcatgtaa atgcaccatt 2040 tgtttgtcaa aataattgtc ctggtcaatt atttgtaaaa gttgcgccta atttaacaaa 2100 tgaatatgat cctgatgcat ctgctaatat gtcaagaatt gtaacttact cagatttttg 2160 gtggaaaggt aaattagtat ttaaagctaa actaagagcc tctcatactt ggaatccaat 2220 tcaacaaatg agtattaatg tagataacca atttaactat gtaccaagta atattggagg 2280 tatgaaaatt gtatatgaaa aatctcagct agcacctaga aaattatatt aacatactta 2340 ctatgttttt atgtttatta catatcaact aacacctaga aaattatatt aatatactta 2400 ctatgttttt atgtttatta catattattt taagattaat taaggcgcgc c 2451 <210> 4 <211> 17

<212> PRT <213> parvovirus <400> 4

Tyr Phe Gin Trp Asp Arg Thr Leu Val Pro Ser His Thr Gly Thr Ser 15 10 15

Gly < 210 > 5 <211> 17 <212> PRT <213> parvovirus <400>5

Tyr Ala Phe Gly Arg Gin His Gly Lys Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu 15 10 15

Thr

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. Não constitui uma parte integrante do documento de patente europeu. Embora a compilação das referências tenha sido feita com grande cuidado, não são de excluir erros ou omissões e o EPO não aceita qualquer responsabilidade a esse respeito.

Documentos de não patente citados na descrição • KELLY. Aust. Vet. J., 1978, vol. 54, 593 [0004] • APPEL et al. Vet. Rec., 1979, vol . 105, 156-159 [0004] • TRUYEN et al. Virology, 1996, vol. 215, 186-189 [0004] • PARRISH et al. Science, 1985, vol. 230, 1046-1048 [0005] • J. Virol., 1991, vol. 65, 6544-6552 [0005] • CHINCHKAR et al. Arch. Virol., 2006, vol. 151, 1881-1887 [0006] • PEREIRA et al. Infect. Genet. Evol., 2007, vol. 3, 399- 409 [0006] • TRUYEN et al. J. Virol. , 1995, vol. 69, 4702-4710 [0006] • WANG et al. Virus Genes, 2005, vol. 31, 171-174 [0006] • MARTELLA et al. Virus Genes, 2006, vol. 33, 11-13 [0006] • BUONAVOGLIA et al. J. Gen. Virol. , 2001, vol. 82, 3021- 3025 [0007] • MARTELLA et al. J. Cl in. Microbiol., 2004, vol. 42, 1333-1336 [0007] • DECARO et al. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health, 2006, vol. 53, 468-472 [0007] • NAKAMURA et al. Arch Virol. , 2004, vol. 149, 2261-2269 [0007] • SPIBEY et al. Vet. Microbiol, 2008, vol. 128, 48-55 [0007] [0010] • PRATELLI et al. Cl in. Diag. Lab. Immunol., 2001, vol. 8, 612-615 [0008] • TRUYEN. Vet. Microbiol., 1999, vol. 69, 47-50 [0008] • STRASSHEIM et al. Virology, 19 94, vol. 198, 175-184 [0009] • GREENWOOD et al. Vet. Record. , 1995, vol. 136, 63-67 [0009] • PARRISH et al. Virology, 1988, vol. 166, 293-307 [0049]

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Parvovirus CPV2 atenuado vivo, caracterizado por o dito CPV2 compreender um gene de cãpside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c codificando para um aminoácido para além de Isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína de cãpside e/ou um aminoácido para além de Glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside, e caracterizado por um fragmento de ADN de uma parte da região não de cápside do dito CPV2 ser substituída por um fragmento de ADN homólogo de uma parte da região de não cápside derivada a partir de um segundo parvovirus, em que o dito fragmento de ADN homólogo do dito segundo parvovirus porta uma mutação de atenuação.
2. CPV2 atenuado vivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito CPV2 compreender um gene de cãpside codificando para um aminoácido para além de Isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e um aminoácido para além de Glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside.
3. CPV2 atenuado vivo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o dito CPV2 compreender um gene de cápside codificando para uma Valina na posição de aminoácido 219 da proteína de cápside e/ou uma Lisina na posição de aminoácido 386 da proteína de cápside.
4. Parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, caracterizado por o dito fragmento de ADN homólogo do dito segundo parvovirus porta uma mutação de atenuação na região não estrutural, na região a partir da posição 2061 até 2070 da SEQ ID NO 1.
5. Vacina para a proteção de animais contra infeção com o parvovirus CPV2, caracterizada por a dita vacina compreender um parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4 e um portador farmaceuticamente aceitável.
6. Vacina de combinação para a proteção de animais contra agentes patogénicos, caracterizada por a dita vacina de combinação compreender uma vacina de acordo com a reivindicação 5 e um antigénio adicional de um vírus ou microrganismo patogénico para animais ou informação genética codificando uma proteína imunogénica do dito vírus ou microrganismo.
7. Vacina de combinação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o dito vírus ou microrganismo patogénico para animais é selecionado a partir do grupo consistindo em Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, vogeli, rossi, complexo Leishmania donovani, adenovirus canino, coronavírus canino, vírus da cinomose canina, Leptospira interrogans serovar canicola, icterohaefraorrhagiae, pomona, grippotyphosa, Bratislava, vírus da hepatite canina, vírus da parainfluenza canina, vírus da raiva, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, herpesvirus felino, calicivirus felino, panleucopenia felina e Ch1amydophila felis.
8. Método para o fabrico de uma vacina de acordo com a reivindicação 5 ou uma vacina de combinação de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizada por o dito método compreender a mistura de um parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4 e um portador farmaceuticamente aceitável.
9. Parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4 para utilização com um medicamento.
10. Parvovirus CPV2 atenuado vivo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4 para utilização no tratamento de infeção por parvovirus.
11. Método para a preparação de um parvovirus CPV2 mutante de acordo com qualquer das reivindicações 1-4. caracterizado por o método compreender a etapa de alterar numa codificação génica uma proteína de cápside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c de um parvovirus canino que já está atenuado numa parte para além da parte codificando a cápside através de técnicas de ADN recombinante um codão na posição de aminoãcido 219 codificando Isoleucina e/ou um codão na posição de aminoácido 386 codificando Glutamina, num codão na posição de aminoãcido 219 codificando um aminoácido para além de Isoleucina e/ou um codão codificando um aminoácido para além de Glutamina na posição de aminoácido 386.
12. Método para a preparação de um parvovirus CPV2 mutante de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado por o método compreender permutar numa codificação génica uma proteína de cápside de CPV2 serotipo 2a, 2b ou 2c de um parvovirus canino que já está atenuado numa parte para além da parte codificando a cápside um fragmento de ADN codificando pelo menos parte doa proteína de cápside do parvovirus tendo na posição de aminoácido 219 um codão codificando Isoleucina e/ou tendo na posição de aminoácido 386 um codão codificando Glutamina, por um fragmento de ADN codificando a mesma parte da proteína de cápside do parvovirus tendo agora na posição de aminoãcido 219 um codão codificando um aminoãcido para além de Isoleucina e/ou tendo na posição de aminoácido 386 um codão codificando um aminoácido para além de Glutamina.