CN107254451B - 活的减毒的细小病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及活的减毒的细小病毒。还涉及它们的用途,包含这种活的减毒的细小病毒的疫苗以及它们的生产方法。
Description
本申请是申请日为2011年7月18日的中国专利申请201180034991.X “活的减毒的细小病毒”的分案申请。
技术领域
本发明涉及活的减毒的细小病毒,它们的用途,包含这种活的减毒的细小病毒的疫苗以及它们的生产方法。
背景技术
细小病毒属于单链DNA病毒科。在各种动物如猫、狗和猪中,细小病毒可引起疾病。因为病毒需要活跃***的细胞以便复制,感染的组织的类型随动物的年龄而变化。在任何年龄都可以影响胃肠道和淋巴***,导致呕吐、腹泻和免疫抑制,但是在子宫内或在小于两周龄时被感染的猫中仅看到小脑发育不全,在3周和8周龄之间被感染的小狗中看到心肌疾病。
犬细小病毒(CPV)是在小狗中尤其致命的疾病,约80%致死,在非常年幼的小狗中引起胃肠道损伤和脱水以及心脏综合症。它是通过与被感染的狗的粪便接触而传播的。症状包括嗜睡、严重腹泻、发烧、呕吐、食欲不振和脱水。猪细小病毒在猪中引起被称为SMEDI的生殖疾病,其代表为死胎、木乃伊化、胚胎死亡和***。猫泛白细胞减少症,通常被称为猫瘟热,是一种影响猫的病毒感染,由犬细小病毒的近亲猫细小病毒(FPV)引起。猫泛白细胞减少症在小猫中常见,并引起发烧、低白细胞数、腹泻和死亡。小于两周的猫胎儿和小猫的感染引起小脑发育不全。水貂肠炎病毒在对猫泛白细胞减少症的作用中是相似的,除了它不会引起小脑发育不全。不同的细小病毒在水貂和其它鼬科动物中引起阿留申病(Aleutian Disease),其特征在于***病、脾肿大、肾小球性肾炎、贫血和死亡。细小病毒的最准确的诊断方法是通过ELISA。通常对猫、狗和猪进行针对细小病毒的免疫。
在DNA水平上,已知犬、猫和猪细小病毒具有高度同源的基因组。犬细小病毒CPV2是一种在狗中引起急性、且有时是致命的肠炎的病毒(Kelly, Aust. Vet. J. 54;593,1978;Appel等, Vet. Rec. 105;156-159, 1979)。1977年左右首先出现的该病毒可能通过单个衣壳蛋白中少数突变而从在猫中非常密切相关的病毒(即猫泛白细胞减少症病毒(FPLV))产生的;物种跳跃可能涉及在其它食肉动物(如水貂或浣熊)的中间传递(Truyen等, Virology 215, 186-189, 1996)。
早在1979年,出现了CPV2的第一种变异体,被称为CPV2a,随后很快在1984年出现了CPV2b(Parrish等, Science 230, 1046-1048, 1985,和J. Virol. 65;6544-6552,1991)。
最初的2型病毒现在已经从野外(field)消失,被2a和2b型所替代,尽管这两种类型的相对比例在国与国间有变化(前面的Truyen等;Chinchkar等, Arch. Virol. 151,1881-1887, 2006;Pereira等, Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007)。在衣壳蛋白(VP2)中的氨基酸变化,其特征为从2至2a以及至2b的转变,是非常有限的。在87(Met至Leu)、300 (Ala至Gly)、305 (Asp至Tyr)和555 (Val至Ile)位的替换发生在2至2a的进化中,在426(Asn至Asp)和555(Ile至Val)的替换发生在从2a出现2b中(前面的Parrish等;Truyen等, J. Virol. 69, 4702-4710, 1995)。最近,报道了在555位缺乏Val至Ile替换的2a株(Wang等, Virus Genes 31, 171-174, 2005;Martella等, Virus Genes 33, 11-13,2006)。似乎单一的氨基酸改变可以区分CPV2a和CPV2b VP2序列。
新近,在意大利出现了病毒株,其中426位的氨基酸(2a中为Asn,2b中为Asp)已经变为谷氨酸(Glu)残基(Buonavoglia等, J. Gen. Virol. 82, 3021-3025, 2001;Martella等, J. Clin. Microbiol. 42, 1333-1336, 2004)。这些被称为CPV2c病毒的Glu426变异体是在意大利和其他欧洲国家传播的(circulating)并与其它CPV类型共存(Decaro等, J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472,2006),并且也已经在地理上多样的国家如越南和苏格兰分离得到(Nakamura等, ArchVirol.149, 2261-2269, 2004, Spibey等, Vet.Microbiol 128, 48-55, 2008),这些事实表明它们在至少一定比例的狗群体中具有优势。
犬细小病毒的相对快速进化已经导致猫宿主范围的丢失以及然后重新获得(前面的Truyen等, 1996),这种重新获得的在猫中复制的能力可以很好地解释2a、2b和2c变异体对最初的2型病毒的替代。在二十世纪七十年代末期和二十世纪八十年代早期,由于刺激交叉保护的共享抗原,活的和灭活的FPL疫苗用于保护狗免于CPV疾病,然而它们提供的保护水平较差,免疫持续时间较短。这些疫苗被活的减毒CPV疫苗所替代,其提供了良好的保护和更长的免疫持续时间。目前活的减毒疫苗来自CPV2b分离物或最初的2型病毒。由于2型病毒已经在该野外中被2a、2b以及现在的2c病毒完全替代,已经考虑到对于减毒的2型疫苗提供的保护水平(Pratelli等, Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001;Truyen,Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999)。
然而,基于现有的单克隆抗体的研究,与以前的变异体相比,每种新的抗原变异体已经失去至少一个中和表位(Strassheim等, Virology 198, 175-184, 1994;前面的Pereira等)。以前已经表明,即使用针对各种抗原类型产生的血清在体外进行的交叉中和研究的确显示出显著差异(前面的Pratelli等),活的减毒的CPV2疫苗能够保护狗免于2a和2b野外攻击(Greenwood等, Vet. Record. 136, 63-67, 1995)。
最近显示,活的减毒的2型疫苗(Nobivac-Intervet)能够保护狗免于用最近的CPV变异体CPV2c的攻击(Spibey等, Vet.Microbiol 128, 48-55, 2008)。
尽管如此,在疫苗领域中存在着诱导动物、尤其是猫、狗和猪中足够水平的免疫以免于感染和具有高度减毒行为的细小病毒的疫苗相组合的需求。高水平的减毒与安全性是同义的,尤其在年幼和年老的动物中。
发明内容
本发明的一个目的是提供减毒的同时仍然免疫原性的新的活细小病毒。这种病毒提供了用于安全的疫苗的基础。
在这个方面,本发明的一个实施方案涉及活的减毒的细小病毒(PV),其包括在衣壳蛋白的219位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和/或在衣壳蛋白的386位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨基酸(条件是,PV不是犬细小病毒疫苗Nobivac Parvo C中存在的CPV。在这种CPV(犬细小病毒疫苗Nobivac Parvo C的CPV)中包含的序列如SEQ ID NO:1中所示。
令人惊讶地发现,在衣壳基因的219和386位氨基酸这两个位点,在病毒的减毒中起着重要作用。直到现在,假设衣壳区域之外的氨基酸主要参与病毒的毒力/减毒。
在犬和猫细小病毒中,无论血清型,衣壳蛋白的219位氨基酸处的异亮氨酸和衣壳蛋白的386位氨基酸处的谷氨酰胺的位置是相同的。这意味着,本发明可以至少普遍地适用于猫细小病毒和犬细小病毒。本发明也可以应用于例如猪细小病毒,所述猪细小病毒具有衣壳蛋白的219位氨基酸处的异亮氨酸和衣壳蛋白的386位氨基酸处的谷氨酰胺。
具体而言,从本发明排除要求保护的是,犬细小病毒疫苗Nobivac Parvo C(Intervet Schering-Plough Animal Health)中存在的CPV,其包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
因此,本发明的第一个实施方案涉及活的减毒的细小病毒(PV),其包括编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和/或在衣壳蛋白的386位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣壳基因,条件是,PV不包含SEQ ID NO:1所示的序列。
仅仅是为了表示219位氨基酸处的异亮氨酸和386位氨基酸处的谷氨酰胺的位置,下面显示了在大多数CPV和FPV毒株中发现的序列背景的例子中这两个氨基酸(以粗体字符表示)。
根据被用作根据本发明的一个或两个氨基酸的取代的起始材料的毒株,可能在219位或386位的单一氨基酸取代不足以,例如使病毒在非常年幼的动物中是安全的。如果需要进一步的减毒,优选在219和386位的两个氨基酸的取代。
因此,本实施方案的优选形式涉及本发明的活的减毒的细小病毒(PV),其包括编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和在衣壳蛋白的386位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣壳基因。
本实施方案的更优选形式涉及活的减毒的细小病毒(PV),其包括编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处的缬氨酸和/或在衣壳蛋白的386位氨基酸处的赖氨酸的衣壳基因。
本实施方案的甚至更优选形式涉及活的减毒的细小病毒(PV),其包括编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处的缬氨酸和在衣壳蛋白的386位氨基酸处的赖氨酸的衣壳基因。
如果优选仍进一步减毒,使用已经具有另一个减毒突变的细小病毒作为用于引入本发明的氨基酸取代的起始材料可能是有吸引力的。
优选地,这种减毒突变位于衣壳区域之外。这允许用在细小病毒毒株的同源非衣壳区域(所述细小病毒毒株在该区域携带减毒)替代本发明的病毒的非衣壳区域的一部分的DNA片段。在非衣壳区域的一部分中携带减毒的细小病毒是,商业上可获得的犬细小病毒疫苗Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health)。
这样一种方法的优势是,这种病毒可以具有更高的减毒水平。因此,本实施方案的仍然甚至更优选的形式涉及本发明的活的减毒的细小病毒,其中所述细小病毒是重组细小病毒,其中所述细小病毒的非衣壳区域的一部分的DNA片段被源自第二细小病毒的非衣壳区域的一部分的同源DNA片段所替代,其中所述第二细小病毒的同源DNA片段携带减毒的突变。
来自第二细小病毒的同源DNA片段是具有与本发明的细小病毒的DNA片段相同功能的DNA片段,但是不同于该DNA片段,因为其携带导致病毒的减毒行为的突变。仅仅作为一个例子,如果DNA片段在两个特定的限制性位点之间的DNA片段中包括减毒突变并且这两个限制性位点也存在于不具有该突变的病毒中的相同位置,那么携带该突变的限制性片段被认为与来自不具有该突变的病毒的相同片段是同源的。
本实施方案的高度优选形式涉及本发明的活的减毒的细小病毒,其中所述第二细小病毒的同源的DNA片段在非结构区中从2061位至2070位的区域中携带减毒突变。
可以理解的是,本发明的活的减毒的细小病毒,无论是否额外存在任何进一步的减毒,如,例如,减毒的非衣壳区域,可以从所有细小病毒(在所述细小病毒中,可以在衣壳蛋白中进行本发明的异亮氨酸/X1和/或谷氨酰胺/X2转换)获得,因此至少可以从CPV和FPV的所有目前测序的成员获得。(X1和X2分别是除了异亮氨酸和谷氨酰胺以外的氨基酸)。
也可以理解的是,本发明包括包含FPV-衣壳和CPV-非衣壳骨架的杂合病毒以及包含CPV-衣壳和FPV-非衣壳骨架的杂合病毒。
当开发疫苗用于保护动物,更具体地保护宠物免于细小病毒感染时,用于这种疫苗中的优选的细小病毒是犬细小病毒或猫细小病毒。
因此,本实施方案的甚至更优选的形式涉及本发明的活的减毒的细小病毒,其中所述细小病毒是犬细小病毒或猫细小病毒。
特别地,当疫苗分别特别针对保护狗和猫免于CPV和FPV时,本发明的病毒的衣壳基因优选编码CPV血清型2a,2b或2c的衣壳蛋白或猫细小病毒的衣壳蛋白。
如上所述,细小病毒的非衣壳部分可以是CPV或FPV来源的。
因此,本实施方案的甚至进一步优选的形式涉及,本发明的活的减毒的CPV,其中所述细小病毒编码CPV血清型2a,2b或2c的衣壳蛋白或猫细小病毒的衣壳蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及用于保护动物免于细小病毒感染的疫苗,其中这种疫苗包括本发明的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载体。
在许多情况下,取决于减毒的水平和病毒的复制特征,用于疫苗中的本发明的合适量的细小病毒在103–109 TCID50的范围内。在许多情况下,低于103 TCID50的感染剂量的病毒被认为太低,因为对于病毒复制到足以触发免疫***的高水平需要太多时间。如果仅仅出于商业的原因,超过109 TCID50的量是没有吸引力的。
非常合适的剂量是105–108 TCID50的范围内,甚至更好地106–108 TCID50的范围内。
药学上可接受的载体是本领域中公知的。仅仅作为例子,这种载体可以和无菌水或缓冲溶液如PBS一样简单。
可以以若干方式施用本发明的疫苗。由于疫苗包括活的减毒的病毒,许多施用方式,如口服的,鼻内的,I.M.和皮下施用是可行的。优选的施用途径是皮下施用。
易受细小病毒感染的动物,如猫和狗经常同时接种疫苗以免受若干其它疾病。因此,组合本发明的疫苗和对狗和猫致病的病毒或微生物的额外的抗原或编码所述抗原的遗传信息是可行的。
因此,本发明的另一个实施方案涉及包含本发明的疫苗和对动物致病的病毒或微生物的额外的抗原或编码所述病毒或微生物的免疫原性多肽的遗传信息组合疫苗。
病毒或微生物的额外抗原可以是整个病毒或微生物(以活的减毒的形式或灭活的形式)或该病毒或微生物的能够诱导保护性免疫应答的免疫原性的多肽或另一种免疫原性部分,如,例如,(脂质-)多糖。
优选地,对动物致病的病毒或微生物选自犬埃立克体(Ehrlichiacanis),吉氏巴贝斯虫(Babesiagibsoni),vogeli, rossi,杜氏利什曼原虫-复合体(Leishmania donovani-complex),犬腺病毒,犬冠状病毒,犬distempervirus,犬钩端螺旋体血清型肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans serovar canicola),黄疸出血钩端螺旋体(icterohaemorrhagiae),pomona,流感伤寒型钩端螺旋体(grippotyphosa),bratislava,犬肝炎病毒,犬副流感病毒,狂犬病毒,犬肝簇虫(Hepatozoon canis),伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi),波氏支气管败血(Bordetella bronchiseptica),猫疱疹病毒,猫杯状病毒,猫白细胞减少症(feline panleucopenia)和猫衣原体(Chlamydophila felis)。
包含活的减毒的病毒的疫苗必须在低温下贮存,或者它们必须是冷冻干燥的形式。冷冻干燥的疫苗可以保持在适度的冷却条件下,或者甚至在室温下。经常,将疫苗与稳定剂混合,例如以保护易于降解的蛋白免于被降解,以增强的疫苗的寿命,或以提高冷冻干燥效率。有用的稳定剂是,尤其SPGA,碳水化合物,例如山梨醇,甘露醇,海藻糖,淀粉,蔗糖,葡聚糖,葡萄糖,蛋白如白蛋白或酪蛋白或其降解产物,和缓冲液如碱金属磷酸盐。
因此,优选地,本发明的(组合)疫苗是冷冻干燥的形式。
此外,疫苗可以悬浮在生理上可接受的稀释剂中。这种缓冲液可以例如是无菌水,缓冲液等。
不用说,用于乳化或稳定病毒的稀释剂和化合物也体现在本发明中。
再次,本发明的另一个实施方案涉及用于制备本发明的(组合)疫苗的方法,其中这些方法包括混合本发明的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载体。
本发明的仍另一个实施方案涉及本发明的活的减毒的细小病毒,其用作药物。
更具体地,本实施方案涉及本发明的活的减毒的细小病毒,其用于治疗细小病毒感染。
再次,本发明的另一个实施方案涉及本发明的活的减毒的细小病毒的用途,其用于治疗细小病毒感染。
最后,本发明的另一个实施方案涉及用于制备本发明的细小病毒突变体的方法,其中这种方法包括用编码至少部分细小病毒衣壳蛋白的DNA片段(其在219位氨基酸处具有编码除了异亮氨酸以外的氨基酸的密码子和/或在386位氨基酸处具有编码除了谷氨酰胺以外的氨基酸的密码子)替代编码至少部分细小病毒衣壳蛋白的DNA片段(其在219位氨基酸处具有编码异亮氨酸的密码子和/或在386位氨基酸处具有编码谷氨酰胺的密码子)。
可以使用本领域公知的重组DNA技术,如位点定向诱变,限制性片段的交换等进行这种DNA的替代。有若干制备219异亮氨酸和X1或386谷氨酰胺和X2取代的方法。可以通过化学合成或PCR以及随后的新合成的片段和病毒DNA的重组而引入这种变化。
附图说明
图1: pCPV A的构建
图2: pCPV C的构建
图3: pCPV AC的构建
图4: pCPV 154att的构建
图5: p630的构建
图6: p630att的构建
图7: 获得杂合的2/2c病毒分离物的天然重组(非GM)方法的示意图。将源自2型疫苗和2c型场地病毒的两个重叠片段转染进细胞,以及在同源重组后分离的病毒。
图8: 显示限制性酶位点Pac I和Xmn I的CPV毒株154att的感染性质粒克隆的示意图。阴影方框表示末端回文序列。
图9: 显示选择用于进一步操作的部分Pac I/Xmn I消化的选择的产物的示意图。
图10: 包含其中衣壳基因被强毒的CPV2c衣壳序列替代的154att疫苗病毒DNA的质粒。
具体实施方式
实施例1:犬细小病毒克隆630att的产生
起始材料
病毒
大肠杆菌菌株
选择从大肠杆菌遗传储存中心(美国)获得的大肠杆菌菌株JC811和菌株DL795(Kramel Biotech UK)用于完整的感染性克隆的质粒繁殖。
DNA合成
由Eurofins MWG GmbH进行定制的DNA合成。合成的DNA片段在pBluescrpt克隆质粒中提供。
犬细小病毒克隆630att的构建是多步骤过程,在这里以其分开的步骤进行描述。
1) Nobivac Parvo C的感染性分子克隆(p154att)的构建(p154att)
用“Hirt”制备法的修改方法从被Nobivac Parvo C感染的细胞感染的A72细胞获得复制形式(RF)病毒DNA(Parrish等1988, Virology 166, 293-307)。用多种限制性酶消化病毒DNA,并使用常规的克隆方法将基因组装配进pBluescript。图1-4中概述了克隆方案。
首先用T4 DNA聚合酶“末端填充(end filled)”CPV 154att的RF DNA。然后用EcoRⅠ和SpeⅠ消化DNA。这些酶分别在1099和3459位切割一次。这种消化产生三个片段,以它们的大小顺序标记为A、B & C。通过凝胶电泳分开片段,然后将EcoRⅠ/SpeⅠ片段(片段A)克隆进已经通过相同的酶消化而制备的质粒pBluescript中(见图1)。
然后将来自RF DNA消化的EcoRI末端片段(片段C)克隆进用EcoRI和EcoRV消化的pBluescript,以产生pCPV C(见图2)。
将犬细小病毒A和C片段一起亚克隆进相同的质粒。用SpeI和EcoRI消化质粒pCPVA和PCPV C。从pCPV A纯化CPV***物,从pCPV C 获取载体部分。然后连接产生其中片段A和C“重新联合”的质粒(见图3)。
然后将来自CPV RF DNA消化的SpeI末端片段(片段B)克隆进pCPV AC。用Spe I和切割导致平末端的酶HincII消化质粒pCPV AC。连接并克隆片段。(见图4)。
产生的质粒被称为p154att。
通过将质粒DNA转染进A72细胞导致产生感染性病毒而实现验证已经组装完整的克隆。
进行质粒克隆的DNA序列分析;如下面进一步显示,显示该序列与从感染的细胞提取的病毒DNA测定的序列是相同的。
2). 2/2c杂合D9的构建
从Nobivac parvo C感染的细胞和CPV2c“Jes”感染的细胞或者单独从CPV2c“Jes”感染的细胞获得病毒DNA。各自用单一限制性酶消化病毒DNA制备物,以便从每种制备物产生2个DNA片段。酶消化进行的方式使得Nobivac基因组的左手片段和“Jes”基因组的右手片段共享>200bp的重叠序列。分开、纯化并混合Nobivac左末端和“Jes”右末端片段(图7)。
用这些重叠的片段转染A72和CrFK细胞允许通过自然重组产生感染性病毒。通过有限稀释克隆产生的病毒,并命名为2/2c杂合D9。
3). 克隆630的构建。
从感染性质粒克隆p154att和从2/2c杂合D9制备的DNA开发克隆630。
限制性酶PacI在561和4651位左右的两个位置(基因组的远左末端和右末端)切割CPV基因组。因此,用PacI消化质粒p154att,从载体和末端序列分开包含超过80%的基因组的~ 4kbp PacI片段,并用从2/2c杂合D9 DNA获得的片段替代。产生的质粒被称为p630。这如图5中所示。
据预测,用p630转染A72或CrFK细胞导致感染性病毒的产生,该病毒被称为630。
病毒630如2/2c杂合D9保留了低水平的致病性。
4). 克隆630att的构建。
当注射进狗时,630病毒显示出一些低水平的临床迹象。
化学合成衣壳基因的一部分,引入在Nobivac parvo C中观察到但是在场地毒株中没有发现的氨基酸变化。然后用该片段替代质粒p630中的相同区域以产生质粒p630att;这如图6中所示。
合成对应于CPV基因组上的3356和4029位之间的DNA序列。确切的DNA序列,这里提供为SEQ ID NO:2,如下所示
限制性酶位点BglⅡ和XcmI以粗体和下划线显示。
从质粒释放该序列,这通过用BglⅡ和XcmI消化而提供。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,分离并纯化672 bp片段。
用p630att转染A72或CrFK细胞导致感染性病毒(630att)的产生,当该病毒施用于小狗时没有任何临床症状。
在比较研究中,比较包含克隆630的疫苗和包含克隆630att的疫苗。
以1 ml中108.0-108.3 TCID50的克隆630对五只MDA阴性狗皮下接种疫苗。
这导致所有的狗中轻度至中度的迹象。在5只狗中超过5天期间的重量变化平均为-6%,从下表如下所示。
以1 ml中108.0-108.3 TCID50的克隆630att对五只MDA阴性狗皮下接种疫苗。
在这组中,可见无临床症状,无温度升高,无白血球减少症,无腹泻或呕吐。此外,该组中出现显著的体重增加,从下表如下所示。
因此得出结论,基于克隆630att的疫苗与克隆630相比的确表现出减毒,并具有优异的安全性特征。
实施例2:产生具有在衣壳基因之外的减毒突变的重组病毒
从商售的Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health)获得154 att株,Jess株是2c型病毒的野外分离物。
使用包含5%胎牛血清的M6B8培养基使病毒生长在贴壁的犬或猫肾细胞(如A72 &CrFK)上。用标准“Hirt”法的修改方法从被感染的细胞培养物制备复制形式(RF)DNA(McMaster等 1981)。
用限制性酶PstI消化从154 att株制备的RF DNA,通过琼脂糖凝胶电泳分开片段。从凝胶切出3055碱基对(bp)条带(对应于CPV的左手末端)并用Qiagen Qiaquick凝胶提取柱纯化。用限制性酶XmnI消化从CPV Jess感染的细胞分离的RF DNA。再次通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,随后用Qiagen Qiaquick凝胶提取柱纯化约2750 bp条带(对应于包括衣壳序列的CPV的右手末端)。
将来自154att和Jess的纯化的3055 bp和2750bp片段合并并转染进培养中的A72或CrFK细胞。根据厂商说明书,用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将约3µg的每种片段进行转染。
转染后,传代细胞并用血凝(HA)分析法监测。在第4代时用HA检测病毒。使用标准DNA测序方案,用RF DNA或PCR片段模板进行杂合病毒的DNA序列测定。通过有限稀释法纯化在贴壁的易感犬或猫细胞上的病毒。
实施例3:从克隆的病毒DNA构建的重组病毒
从克隆的片段产生重组病毒。将病毒株154att的基因组克隆进标准的克隆载体pBluescript(Stratagene inc.)。为了保持回文末端序列完整,将质粒在许多重组***缺陷的细菌宿主DL795中繁殖。细小病毒基因组的克隆已经在文献中描述,所需的技术对于本领域技术人员而言是已知的。
用限制性酶Pac I消化获得的154att的克隆(p154att)而不允许消化完整进行,即限制性酶消化仅仅是部分的。然后使消化的片段经受限制性酶Xmn I的消化。然后通过琼脂糖凝胶电泳分开消化的DNA片段,从凝胶切出下图中所示的片段,并用Qiagen Qiaquick凝胶提取柱纯化。Xmn I和右手的Pac位点位于细小病毒基因组中的衣壳区域的两侧。
如下用CPV的强毒株的衣壳基因替代154 att的衣壳基因。图8中所示的Xmn I位点和右手的Pac I位于衣壳基因的边界之外。Pac I位点和衣壳基因的末端之间约110bp序列在154att株和强毒的分离物之间差异显著。在Xmn I位点和衣壳基因的起始处之间的短序列(~55 bp)中还没有记录到序列改变。因此,为了将物质的交换仅仅限制在衣壳序列;化学合成了强毒的CPV衣壳序列,保留了PacI位点和衣壳终止信号之间的疫苗特异性序列。
下面,显示了包含CPV衣壳基因的化学合成的序列。下面所示的序列在本文作为SEQ ID NO:3提供。
标注并用下划线表示了Xmn I和Pac I位点。衣壳编码区的终止密码子(TAA)用下划线表示。衣壳(Vp1/Vp2)编码序列用粗体表示。
用酶Xmn I和Pac I将合成的片段从提供其的质粒中切出释放,然后将其连接至图9所示的片段。用标准方法以连接混合物转化感受态E.coli(菌株DL795),分离并鉴定包含重组质粒的细菌。然后从克隆的E.coli制备下面所示的获得的质粒p1542c(图10)。
如下制备杂合病毒。将质粒p1542c DNA转染进培养中的A72或CrFK细胞。根据厂商说明书,用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)将约3微克DNA进行转染。转染后,传代细胞并用血凝(HA)分析法监测。在第4代时用HA检测病毒。使用标准DNA测序方法,用RF DNA或PCR片段模板进行杂合病毒的DNA序列测定。通过有限稀释法纯化在贴壁的易感犬或猫细胞上的病毒。
Claims (14)
1.活的减毒的CPV2细小病毒,其编码血清型2c的衣壳蛋白,其特征在于所述CPV2细小病毒包含编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和在衣壳蛋白的386位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣壳基因,条件是,所述活的减毒的细小病毒不是存在于犬细小病毒疫苗Nobivac Parvo C中的CPV。
2.权利要求1的活的减毒的CPV2,其中所述衣壳蛋白的219位氨基酸和所述衣壳蛋白的386位氨基酸是所述CPV2细小病毒的第一减毒突变。
3.权利要求1的活的减毒的CPV2,其特征在于所述CPV2包含编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处的缬氨酸和/或在衣壳蛋白的386位氨基酸处的赖氨酸的衣壳基因。
4.权利要求1-3中任一项的活的减毒的CPV2,其特征在于所述细小病毒的非衣壳区域的一部分的DNA片段被源自第二细小病毒的非衣壳区域的一部分的同源DNA片段所替代,其中所述第二细小病毒的所述同源DNA片段携带减毒突变。
5.权利要求1-3中任一项的活的减毒的细小病毒,其特征在于所述第二细小病毒的所述同源DNA片段在非结构区中从2061位至2070位的区域中携带减毒突变。
6.权利要求1-3中任一项的活的减毒的细小病毒,其特征在于所述细小病毒是犬细小病毒或猫细小病毒。
7.用于保护动物免于细小病毒感染的疫苗,其特征在于所述疫苗包含权利要求1-6中任一项的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载体。
8.用于保护动物免于病原体的组合疫苗,其特征在于所述组合疫苗包含权利要求7的疫苗和对动物致病的病毒或微生物的额外的抗原或编码所述病毒或微生物的免疫原性蛋白的遗传信息。
9.权利要求8的组合疫苗,其特征在于所述对动物致病的病毒或微生物选自犬埃立克体(Ehrlichia canis)、吉氏巴贝斯虫(Babesia gibsoni)、vogeli、rossi、杜氏利什曼原虫-复合体(Leishmania donovani-complex)、犬腺病毒、犬冠状病毒、犬distempervirus、犬钩端螺旋体血清型肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans serovar canicola)、黄疸出血钩端螺旋体(icterohaemorrhagiae)、pomona、流感伤寒型钩端螺旋体(grippotyphosa)、bratislava、犬肝炎病毒、犬副流感病毒、狂犬病毒、犬肝簇虫(Hepatozoon canis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、波氏支气管败血(Bordetella bronchiseptica)、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫白细胞减少症(felinepanleucopenia)和猫衣原体(Chlamydophila felis)。
10.用于制备权利要求7的疫苗或权利要求8或9的组合疫苗的方法,其特征在于所述方法包括混合权利要求1-6中任一项的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载体。
11.权利要求1-6中任一项的活的减毒的细小病毒在制备药物中的用途。
12.权利要求1-6中任一项的活的减毒的细小病毒在制备用于治疗细小病毒感染的药物中的用途。
13.用于制备权利要求1-6中任一项的细小病毒突变体的方法,其特征在于所述方法包括通过重组DNA技术将在219位氨基酸处编码异亮氨酸的密码子和/或在386位氨基酸处编码谷氨酰胺的密码子改变为在219位氨基酸处编码除了异亮氨酸以外的氨基酸的密码子和/或在386位氨基酸处编码除了谷氨酰胺以外的氨基酸的密码子的步骤。
14.用于制备权利要求1-6中任一项的细小病毒突变体的方法,其特征在于所述方法包括编码至少部分细小病毒衣壳蛋白的DNA片段,所述DNA片段在219位氨基酸处具有编码异亮氨酸的密码子和/或在386位氨基酸处具有编码谷氨酰胺的密码子,被编码细小病毒衣壳蛋白的相同部分的DNA片段所替代,所述DNA片段现在在219位氨基酸处具有编码除了异亮氨酸以外的氨基酸的密码子和/或在386位氨基酸处具有编码除了谷氨酰胺以外的氨基酸的密码子。
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