JP2023548354A - イヌパルボウイルス - Google Patents
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Abstract
本発明は、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスに関し、生弱毒化パルボウイルスは、単回用量として動物に投与され、動物が２～１０週齢の間に投与される。本発明は更に、生弱毒化パルボウイルスを含むワクチン、並びにその製造方法に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスに関する。本発明は更に、生弱毒化パルボウイルスを含むワクチン、並びにその製造方法に関する。
パルボウイルスは、一本鎖ＤＮＡウイルスのファミリーに属する。パルボウイルスは、ネコ、イヌ及びブタ等の一部の動物において疾患を引き起こし得る。ウイルスは複製するために活発に***する細胞を必要とするため、感染した組織の種類は動物の年齢によって異なる。胃腸管及びリンパ系は、任意の年齢で罹患し得、嘔吐、下痢及び免疫抑制をもたらし得るが、小脳形成不全は、子宮内で感染したネコ又は２週齢未満でのみ見られ、心筋の疾患は、３～８週齢の間に感染した子犬に見られる。
イヌパルボウイルスは、幼若な仔イヌにおいて特に致命的な疾患であり、約８０％が致死的であり、胃腸管の損傷及び脱水、並びに非常に幼若な仔イヌにおける心臓症候群を引き起こす。これは、感染したイヌの糞便との接触によって広がる。症状としては、嗜眠、重度の下痢、発熱、嘔吐、食欲不振、及び脱水が挙げられる。ブタパルボウイルスは、死産、ミイラ化、胚死及び不妊症を表すＳＭＥＤＩとして知られる豚の生殖器疾患を引き起こす。ネコ汎白血球減少症は、ネコにおいて一般的であり、発熱、白血球数の減少、下痢、及び死を引き起こす。２週齢未満のネコ胎児及び仔ネコの感染は、小脳形成不全を引き起こす。ミンク腸炎ウイルスは、小脳形成不全を引き起こさないことを除いて、ネコ汎白血球減少症と影響が類似している。異なるパルボウイルスは、リンパ節症、脾腫、糸球体腎炎、貧血、及び死を特徴とするミンク及び他のイタチにアリューシアン病を引き起こす。イヌ、ネコ及びブタには、パルボウイルスに対するワクチン接種を行うことができる。
ＤＮＡレベルでは、イヌ及びネコパルボウイルスは、高度に相同なゲノムを有することが知られている。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ２）は、イヌの急性かつ時には致死的な腸炎の原因となるウイルスである。１９７７年頃に初めて出現したウイルスは、おそらく、ネコの非常に近縁のウイルスであるネコ汎血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）に由来し、単一キャプシドタンパク質における少数の変異を介して生じる（ミンク又はタヌキ等の他の肉食動物の中間通過に関与し得る種ジャンプ）。
ＣＰＶ２ａと呼ばれる最初のＣＰＶ ２型変異体は１９７９年という早期に出現し、その後１９８４年にＣＰＶ２ｂと呼ばれる第２の変異体が出現した。元の２型ウイルスは現在、２ａ及び２ｂ変異体によって置き換えられて野外から消失しているが、これらの２型の相対的割合は国によって異なる。２から２ａ及び２ｂへのシフトを特徴付けるキャプシドタンパク質（ＶＰ２）のアミノ酸変化は非常に限られている。位置８７（ＭｅｔからＬｅｕ）、３００（ＡｌａからＧｌｙ）、３０５（ＡｓｐからＴｙｒ）及び５５５（ＶａｌからＩｌｅ）での置換は、２から２ａへの進化において生じ、２ａから２ｂの出現において４２６（ＡｓｎからＡｓｐ）及び５５５（ＩｌｅからＶａｌ）で生じた。アミノ（ａｍｉｎｅ）酸位置４２６における単一のアミノ酸変化が、ＣＰＶ２ａ及びＣＰＶ２ｂのＶＰ２配列を区別することができるようであった。２０００年頃、同じアミノ酸位置に別の置換が起こり、Ａｓｐ４２６がＧｌｕに変化した。結果として生じた変異体はＣＰＶ－２ｃと呼ばれる。元のイヌパルボウイルス２型ウイルスの比較的急速な進化は、その後のＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃ変異体においてネコ宿主範囲の喪失及びその後の再獲得をもたらした。ネコにおいて複製するこの回復した能力は、２ａ、２ｂ及び２ｃ変異体による元の２型ウイルスの置き換えを十分に説明し得る。
１９７０年代後半及び１９８０年代初期に、生及び不活化ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）ワクチンの両方を使用して、交差防御を刺激した共有抗原のためにＣＰＶ疾患からイヌを防御したが、それらが提供した防御レベルは低く、免疫期間は短かった。これらのワクチンは、優れた防御及びより長い免疫持続時間を提供する生弱毒化ＣＰＶワクチンに置き換えられた。
現在、生弱毒化ワクチン株は、ＣＰＶ２ｂ分離株又は元の２型ウイルスのいずれかに由来する。２型ウイルスは、２ａ型、２ｂ型及び現在は２ｃ型のウイルスによって野外では完全に置き換えられているため、弱毒化２型ワクチンによってもたらされる防御のレベルが懸念されている。生弱毒化ＣＰＶ２ワクチンが２ａ及び２ｂの野外抗原刺激からイヌを防御することができること、及び生弱毒化２型ワクチン（Ｎｏｂｉｖａｃ－Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）が最新のＣＰＶ変異体であるＣＰＶ２ｃによる抗原刺激からイヌを防御することができることは以前に実証されている（Ｓｐｉｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８－５５，２００８）。
生弱毒化ＣＰＶ ２ｃワクチン株は、国際公開第２０１２／００７５８９号（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載され、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルスを開示している。
免疫のある母親から生まれた仔イヌは、その母親から周産期に獲得した母体由来抗体（ＭＤＡ）によって、その若齢期に受動的に防御される。仔イヌは初乳を介してそのＭＤＡの約９０％を受け取るが、経胎盤移行は全受動抗体のわずか１０％を占めると計算されている。生後すぐに、平均的な仔イヌは、その母親の血清抗体レベルの５０％に等しい血清抗体レベルを有するであろう。しかしながら、このＭＤＡは指数関数的に減少し、約１０日間の半減期を有する。特に同腹仔の大きさが平均より大きい場合、ＭＤＡレベルにおけるかなりの同腹仔内変動が時折起こり得る。
残留ＭＤＡとの干渉によって引き起こされるワクチン不全が頻繁に起こることが観察されている。高レベルのＭＤＡを有するそれらの仔イヌをカバーする試みにおいて、データシートは、後のワクチン接種を含むように変更され、現在、３～４回のワクチン接種を６～１６週齢にわたって与えるべきであることが推奨されている。ＷＳＡＶＡイヌワクチン接種ガイドラインは、６～８週齢でのワクチン接種と、それに続く１６週齢以上まで２～４週毎の更なるワクチン接種を推奨している。しかしながら、複数のワクチン接種スケジュールは費用がかかり、子犬の所有者は、年齢が進むまで新しいペットを閉じ込めるという問題に直面し、その結果、家庭訓練及び社会化が困難になる。ワクチン接種応答を予測及び／又は確認するための血清学的試験の代替法もまた、余分な来院及び費用を意味し、必ずしも実用的ではない。
さらに、仔イヌにおける母体免疫の低下及び残留ＭＤＡの存在下でのワクチン不全のリスクは、ＭＤＡレベルが毒性抗原刺激に対する防御をもはや提供しないレベルまで低下したが、残留ＭＤＡレベルにもかかわらずワクチン接種が無効である期間をもたらす。このため、幼若な子犬は感染しやすいが、依然としてワクチン接種に対して抵抗性である、数週間の期間が残る。この期間は、「免疫ギャップ」又は「感受性のウィンドウ」と呼ばれている。
これまで、ＭＤＡにもかかわらず、この免疫ギャップを閉じ、複数回のワクチン接種なしで積極的な防御を保証するのに十分に高い有効性が証明されたワクチンはない。したがって、仔イヌの一次ワクチン接種過程は通常１６週齢前に完了することができない。
したがって、当技術分野では、仔イヌにＭＤＡの存在下でワクチン接種する場合のワクチン不全の当技術分野における問題を克服し得るワクチンを提供する必要性が存在する。加えて、ワクチン不全の危険性を伴わずに、早期に仔イヌに与えることができるワクチンを提供することが望ましい。さらに、当分野では、単回ワクチン接種後でさえパルボウイルス感染に対する免疫を提供するワクチンが必要とされている。
Ｓｐｉｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８－５５，２００８
本発明では、驚くべきことに、本明細書で定義される生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）が先行技術の課題を克服することができることが見出された。特に、本発明は、単回ワクチン接種後でもパルボウイルス感染に対する免疫を提供する生弱毒化ＰＶを提供する。さらに、驚くべきことに、本明細書で定義される生弱毒化ＰＶによるワクチン接種は、動物のＭＤＡレベルとは無関係のＰＶ感染に対する免疫を提供し、すなわち、ＰＶ感染に対する免疫は、高いＭＤＡレベルの存在下であっても達成することができ、ワクチン接種応答を予測及び／又は確認するための血清学的試験を不要にすることが見出された。
したがって、ＰＶ感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化ＰＶであって、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶが提供され、ここで、生弱毒化ＰＶは、単回用量として動物に投与され、そして、この単回用量は、動物が２～１０週齢又は２～２０週齢の間に投与される。
ＰＶ感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化ＰＶであって、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶが更に提供され、ここで、投与は、生弱毒化ＰＶの投与時に測定される動物のワクチン接種前の母体由来抗体（ＭＤＡ）の赤血球凝集素阻害（ＨＡＩ）力価とは無関係に行われる。
ＰＶ感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化ＰＶであって、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶが更に提供され、ここで、生弱毒化ＰＶの投与時に測定される母体由来抗体（ＭＤＡ）の動物のワクチン接種前のＨＡＩ力価は、１２８より高く、又は２８８より高い。
ＰＶ感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化ＰＶであって、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶが更に提供され、ここで、生弱毒化ＰＶの投与後５日目又はそれより前、好ましくは４日目又はそれより前、最も好ましくは３日目又はそれより前に免疫の発現が達成される。
用語の定義
本発明を十分に理解するために、以下の定義を提供する。
本発明を十分に理解するために、以下の定義を提供する。
本発明によるウイルスは、「生弱毒化ウイルス」である。生弱毒化ウイルスは、野外から単離されたウイルスと比較して病原性のレベルが低下しているウイルスである。ウイルスを生存可能（生存）に保ちながらウイルスの病原性を低下させるプロセスは、弱毒化として知られている。生弱毒化ウイルスは、動物内で限られた程度まで複製することができるため、強力で長続きする免疫を誘導するが、疾患の典型的な臨床徴候を引き起こすことはない。
本発明によるウイルス及びワクチンは、ワクチン接種された標的動物における疾患を予防することによって「防御」を提供するか、又は「感染又は疾患から」「防御」している。例えば、標的動物におけるウイルス複製の数若しくは持続時間を減少させることによるか、又は感染の強度若しくは重症度を減少させることによる。また、又は結果として、ワクチン接種の方法は、そのような感染若しくは複製によって、又はその感染若しくは複製に対する標的動物の応答によって引き起こされ得る疾患の（臨床）徴候の減少又は改善がある場合に防御を提供する。本明細書で使用される場合、「防御する」又は「防御を提供する」という用語は、感染の兆候からの完全な防御を必要としない。例えば、「防御するのに使用するための」は、抗原刺激後に基礎となる感染の症状が少なくとも軽減されるように、及び／又は症状を引き起こす基礎となる細胞性、生理学的、若しくは生化学的原因若しくは機構の１つ以上が軽減及び／又は排除されるように、提供される防御が十分であることを意味し得る。この文脈で使用される場合、「減少した」とは、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子状態を含む感染の状態に対することを意味することが理解される。したがって、「防御」という用語は、ウイルスによる感染又は感染から生じる障害に対する予防的治療を包含する。
「防御レベル」は、ワクチン接種動物における抗原刺激ウイルスのウイルス複製率を測定することによって決定することができる。例えば、ウイルス複製速度は、ウイルス排出のレベルによって決定することができ、これは、宿主細胞感染中の成功した再生産後のウイルス子孫の排除及び放出を指す。したがって、例えば動物の糞便中に見出されるウイルスの量を決定することによって、防御レベルを当業者に公知の方法によって決定することができる。
本発明の生弱毒化パルボウイルスによるワクチン接種によって達成される防御レベルは、典型的には１０％より高く、好ましくは２０％より高く、又は３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％より高くてもよく、より好ましくは９０％以上である。例えば、これは、５０％の防御レベルが、例えば、感染しているがワクチン接種されていない動物と比較した場合、疾患の（臨床）症状の５０％の減少又は改善があることを意味する。これは、例えば、ウイルス複製が５０％少ないこと、及び／又は臨床徴候が５０％減少したことを意味する。臨床徴候は、出血性下痢、食欲不振、体重減少、腹痛、脱水のいずれかであり得る。５０％の減少は、非ワクチン接種動物と比較した場合、ワクチン接種動物は、例えば１日間だけ出血性下痢が５０％少ないのに対して、非ワクチン接種動物は２日間出血性下痢を有することを意味する。
最も好ましい実施形態では、本発明の生弱毒化パルボウイルスによるワクチン接種によって達成される防御レベルは１００％である。例えば、これは、感染後、動物においてウイルス複製を検出することができず、疾患の臨床徴候がないことを意味する。
さらに、本発明によるウイルス及びワクチンは、排出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）に対する殺菌免疫を提供することができる。殺菌免疫は、有毒な病原体への曝露後の宿主の効果的なウイルス感染を防ぐ免疫状態である。動物が臨床徴候を発症せず、感染後に有毒な病原体を排出しない場合、動物は殺菌免疫を有すると記載することができる。したがって、本発明によるウイルス及びワクチンは、疾患に対する完全な防御を提供することができ、感染後のウイルス排出を防止することができる。
本発明の生弱毒化パルボウイルスの好ましい形態及び／又はその実施形態は、そのパルボウイルスが、組み合わされた異なるパルボウイルス由来のゲノムセグメントを含有し得る組換えパルボウイルスである生弱毒化パルボウイルスに関する。例えば、本発明の生弱毒化パルボウイルス及び／又はその実施形態は、第１のパルボウイルス由来のキャプシド遺伝子及び第２のパルボウイルス由来の構造遺伝子を有し得る。非限定的な例では、本発明の生弱毒化パルボウイルス及び／又はその実施形態は、パルボウイルス２ｃ型由来のキャプシド遺伝子及びパルボウイルス２型由来の構造遺伝子を有し得る。また、本発明の生弱毒化パルボウイルス及び／又はその実施形態は、第１のパルボウイルス由来のキャプシド遺伝子の一部及び第２のパルボウイルス由来のゲノムの残りを有し得る。例えば、キャプシドの一部は２ｃ型であり、キャプシドの残りは２ｂ型であり、構造部分は２型である。
本発明の生弱毒化パルボウイルスパルボウイルスの好ましい形態及び／又はその実施形態は、生弱毒化パルボウイルスが弱毒化変異を保有する生弱毒化パルボウイルスパルボウイルスに関する。好適な形態では、当該パルボウイルスの非キャプシド領域の一部のＤＮＡ断片は、弱毒化変異を保有する第２のパルボウイルスに由来する非キャプシド領域の一部の相同ＤＮＡ断片で置き換えられる。第２のパルボウイルス由来の「相同ＤＮＡ」断片は、本発明によるパルボウイルスのＤＮＡ断片と同じ機能を有するが、ウイルスの弱毒化挙動をもたらす変異を保有するという点でそのＤＮＡ断片とは異なるＤＮＡ断片である。
ワクチンの「有効性」は、動物を疾患からどの程度防御するかの尺度である。これは、例えばワクチン接種後の能動免疫応答をモニタリングすることによって、又は野生型病原体による抗原刺激感染によって決定することができる。測定されるパラメータは、例えば、標的動物の疾患の徴候、臨床スコア、様々な血液パラメータ、又はウイルス病原体の再単離である。これらは、偽ワクチン接種又は非ワクチン接種標的動物で見られる応答と比較される。
本発明によるワクチン及びその任意の実施形態について、免疫学的活性成分の用量又は量は周知の方法で決定することができ、例えば、生弱毒化ウイルスを、例えば動物、受精卵、又は培養中の好適な宿主細胞で滴定することができる。次いで、結果を、例えばワクチン１ミリリットル当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）、ＴＣＩＤ５０又はＥＩＤ５０として表す。あるいは、抗原は、ＥＬＩＳＡ又はＡｌｐｈａＬｉｓａ（商標）等の血清学的又は生化学的試験によって定量化され、適切な参照標準と比較して相対単位で表され得る。これらは全て当技術分野で周知である。
本明細書で定義される、「能動免疫」という用語は、動物の免疫系による抗体の作製を介したパルボウイルス感染に対する防御を意味する。「免疫の発現」は、動物がパルボウイルス感染から防御される、ワクチン接種後の時点として本明細書で定義され、通常は日数で記載される。
本発明の文脈における治療の有効性と「非干渉」又は「干渉しない」とは、母体由来抗体（ＭＤＡ）の存在が、本発明の生弱毒化パルボウイルスによるワクチン接種に応答した抗体の能動的産生を阻害しないことを意味する。したがって、ワクチン接種後の有効な免疫応答は、ＭＤＡの存在下でさえ達成され得る。
本明細書で使用される場合、「免疫原有効量」という用語は、パルボウイルスによる感染から防御する程度に、動物において能動免疫応答を誘導するのに必要なウイルス又はワクチンの量に関する。
治療が「免疫学的に有効」であるかどうかの決定は、例えば、実験的抗原刺激感染をワクチン接種動物に投与し、次に標的動物の疾患の臨床徴候、血清学的パラメータを決定することによって、又は病原体の再単離を測定し、続いてこれらの所見を抗原刺激された非ワクチン接種動物又は野外感染非ワクチン接種動物で観察された所見と比較することによって達成することができる。
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物、例えばイヌに適用するのに適した組成物であり、１つ以上の抗原等の免疫学的に活性な成分と、水を含有する液体等の薬学的に許容され得る担体とを含み、動物への投与の際に、微生物による感染から生じる疾患からの防御を最小限に補助するのに十分強い免疫応答を誘導し、すなわち、疾患の予防を補助する、及び／又は疾患を予防、改善若しくは治癒するのに十分な強さである。担体は、液体又は（微粒子）固体であり得る。それぞれのワクチンにおける本発明の「免疫学的に活性な成分」は、生弱毒化形態のウイルスである。ワクチンは、標的動物の免疫系を刺激し、免疫学的応答を誘導する。応答は、標的動物の自然免疫系及び／又は獲得免疫系に由来し得、細胞型及び／又は体液型であり得る。
本明細書で使用される場合、「多価ワクチン」又は「混合ワクチン」は、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。この種の特定の実施形態では、多価ワクチンは、２つ以上の異なる病原体に対してレシピエントの免疫系を刺激する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る」という用語は、修飾された名詞が医薬品での使用に適切であることを意味するために形容詞的に使用される。例えば、「薬学的に許容され得る担体」等の薬学的ワクチン中の賦形剤を記載するためにそれが使用される場合、それは賦形剤が組成物の他の成分と適合性であり、意図されたレシピエント動物、例えばイヌに不利に有害でないことを特徴とする。
標的動物への本発明によるワクチンの「投与」は、任意の実行可能な方法及び経路を使用して実施することができる。典型的には、最適な投与方法は、適用されるワクチンの種類、並びに標的動物及びそれが防御することを意図しているウイルス性疾患の特徴によって決定される。例えば、生弱毒化ウイルスを含むワクチンは複製抗原を含むため、大量適用の方法を使用して、例えば飲料水又はスプレー適用を介して投与することができる。あるいは、生弱毒化形態のウイルスを含むワクチン及びウイルスを含むワクチンの両方について、非経口、粘膜、局所又は経腸投与のいくつかの経路が実現可能である。これらは全て当技術分野で周知であり、例えば、“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）を参照されたい。「非経口投与」としては、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射及び注入が挙げられる。
本明細書で使用される場合、同一性、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列同一性パーセントを、配列同一性を決定するための既知のアルゴリズム、Ｃ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ、ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムをアラインメントデフォルトパラメータ及び同一性のデフォルトパラメータと共に使用して決定することができる。これらの市販のプログラムを使用して、同じ又は類似のデフォルトパラメータを使用して配列類似性及び同一性を決定することもできる。あるいは、例えば、デフォルトパラメータを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージのプログラムマニュアル、バージョン７、ウィスコンシン州マディソン）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルタ条件下でのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を使用することができる。同一性パーセントを決定するため、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｓｅｐ １；２５（１７）：３３８９－４０２）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ，Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８８ Ａｐｒ；８５（８）：２４４４－８）のような他の広く使用されているフリープログラムを使用することができる。
－生弱毒化パルボウイルス
本発明の生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２／００７５８９号に記載される生弱毒化ＰＶであり得る。
本発明の生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２／００７５８９号に記載される生弱毒化ＰＶであり得る。
この点において、本発明の一実施形態及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸を含む生弱毒化ＰＶに関する。
驚くべきことに、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９及び３８６におけるこれらの２つの部位が、ウイルスの弱毒化において重要な役割を果たすことが見出された。これまでは、主にキャプシド領域外のアミノ酸がウイルスの病原性／弱毒化に関与すると想定されていた。
ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミンの位置は、生物型にかかわらず、イヌ及びネコのパルボウイルスの両方において同一である。これは、本発明がネコパルボウイルス及びイヌパルボウイルスに少なくとも普遍的に適用できることを意味する。本発明はまた、例えば、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミンを有するブタパルボウイルスにも適用され得る。
パルボウイルスでは、ウイルスＤＮＡは２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。ＯＲＦ１は非構造タンパク質（ＮＳ）をコードし、ＯＲＦ２はウイルスキャプシドを組み立てる２つ又は３つのウイルス粒子（ＶＰ）タンパク質をコードする。ＶＰ１は、構造遺伝子の完全な翻訳であり、ＶＰ２は、Ｎ末端において約１４０個のアミノ酸を欠き、図１、並びに配列番号１０（ＶＰ１）及び配列番号１２（ＶＰ２）を参照されたい。したがって、ＶＰ１はＶＰ２の完全長を含む。アミノ酸変化２１９及び３８６のナンバリングは、ＶＰ２（配列番号１２）のアミノ酸ナンバリングに基づく。ＶＰ１は、そのＮ末端に１３８個の追加のアミノ酸を有するため、ＶＰ１における位置は、１３８個より多いアミノ酸である。例えば、ＶＰ２におけるアミノ酸２１９は、ＶＰ１におけるアミノ酸３５７である。
したがって、本発明の第１の実施形態及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶに関する。
アミノ酸位置２１９のイソロイシン及びアミノ酸位置３８６のグルタミンの位置を示すためだけに、これら２つのアミノ酸を、ほとんどのＣＰＶ株及びＦＰＶ株において見出される連続的な状況の例において以下に（太字で）示す。
ＹＦＱＷＤＲＴＬＩＰＳＨＴＧＴＳＧ（Ｉ；イソロイシン２１９＝太字）（配列番号３）
ＹＡＦＧＲＱＨＧＱＫＴＴＴＴＧＥＴ（Ｑ；グルタミン３８６＝太字）（配列番号４）
本発明による一方又は両方のアミノ酸の置換のための出発材料として使用される株に応じて、位置２１９又は３８６のアミノ酸の単一の置換は、例えば非常に若い動物においてウイルスを安全にするのに十分ではない可能性がある。更なる弱毒化が必要な場合、位置２１９及び３８６の両方のアミノ酸の置換が好ましい。
したがって、本発明のこの実施形態又は任意の他の実施形態の好ましい形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶに関する。
本発明のこの実施形態のより好ましい形態又は任意の他の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶに関する。
本発明のこの実施形態のより一層好ましい形態又は任意の他の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶに関する。アミノ酸位置２１９のバリン及びアミノ酸位置３８６のリジンの位置を示すためだけに、これら２つのアミノ酸を、ほとんどのＣＰＶ株及びＦＰＶ株において見出される連続的な状況の例において以下に（太字で）示す。
ＹＦＱＷＤＲＴＬＶＰＳＨＴＧＴＳＧ（配列番号５）
ＹＡＦＧＲＱＨＧＫＫＴＴＴＴＧＥＴ（配列番号６）
ＹＡＦＧＲＱＨＧＫＫＴＴＴＴＧＥＴ（配列番号６）
更に更なる弱毒化が好ましい場合、本発明によるアミノ酸置換の導入のための出発材料として、既に別の弱毒化変異を有するＰＶを使用することが魅力的であり得る。
好ましくは、そのような弱毒化変異はキャプシド領域の外側に位置する。これにより、本発明によるウイルスの非キャプシド領域の一部のＤＮＡ断片を、その領域に弱毒化を保有するパルボウイルス株の相同な非キャプシド領域で置き換えることが可能になる。非キャプシド領域の一部に弱毒化を保有するパルボウイルスは、例えば、Ｎｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）等のワクチン中に存在する市販のイヌパルボウイルスワクチン株１５４である。
そのようなアプローチの利点は、そのようなウイルスが更に高い弱毒化レベルを有することである。
したがって、この実施形態の更により好ましい形態は、本発明による生弱毒化ＰＶに関し、ここで、そのＰＶは、非キャプシド領域に弱毒化変異を保有する組換えＰＶである。
結果として、本発明のＰＶは、ウイルスの弱毒化挙動をもたらす非キャプシド領域の変異を保有することが好ましい。
本発明の好ましい形態及びその実施形態は、生弱毒化ＰＶに関し、ここで、パルボウイルスは、位置２０６２～２０７０の領域の非キャプシド領域に弱毒化変異を保有する。本発明の好ましい実施形態及びその実施形態では、弱毒化変異を保有するＤＮＡ配列は、位置２０６２～２０７０のＡＣＧ ＴＡＣ ＧＴＡの配列番号１の配列に対応する配列を有する。野生型パルボウイルスにおける位置２０６２～２０７０の領域のＤＮＡ配列は、ＴＡＡ ＣＴＣ ＣＴＣの配列番号２のものである。
弱毒化変異は、当業者に周知の方法によって、例えば野生型ウイルスのＤＮＡ断片を、弱毒化変異を保有する相同ＤＮＡ断片と交換することによって導入することができる。例えば、本発明のパルボウイルスの非キャプシド領域の一部のＤＮＡ断片は、第２のパルボウイルスに由来する非キャプシド領域の一部の相同ＤＮＡ断片で置き換えることができ、当該第２のパルボウイルスの相同ＤＮＡ断片は弱毒化変異を保有する。ＤＮＡの交換は、部位特異的変異誘発、制限断片の交換等の当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して行うことができる。そのようなヌクレオチド変化は、例えば、化学合成又はＰＣＲによって導入され、その後、新たに合成された断片とウイルスＤＮＡとの組換えが行われ得る。
本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態は、例えば弱毒化非キャプシド領域等の任意の更なる弱毒化の追加的な存在にかかわらず、キャプシドタンパク質中の本発明によるイソロイシン／Ｘ１及び／又はグルタミン／Ｘ２転移が作製され得る全てのパルボウイルスから、したがって少なくともＣＰＶ及びＦＰＶの現在配列決定されている全てのメンバーから得ることができることが理解されよう。Ｘ１及びＸ２は、それぞれイソロイシン及びグルタミン以外のアミノ酸である。
ＦＰＶ－キャプシド及びＣＰＶ－非キャプシド骨格を含むハイブリッドウイルス、並びにＣＰＶ－キャプシド及びＦＰＶ－非キャプシド骨格を含むハイブリッドウイルスが、本発明及びその任意の実施形態に含まれることも理解されよう。
例えば、配列番号７に示される配列を有するか、又は配列番号８に示される非キャプシドタンパク質をコードする非キャプシド遺伝子を含む、本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態である。
配列番号７：非キャプシド遺伝子
配列番号８非構造タンパク質
特に、ワクチンがそれぞれＣＰＶ及びＦＰＶに対するイヌ及びネコの防御を特に目的とする場合、本発明によるウイルスのキャプシド遺伝子は、好ましくはＣＰＶ生物型２ａ、２ｂ、２ｃのキャプシドタンパク質又はその遺伝子変異体、好ましくはＣＰＶ生物型２ａ、２ｂ又は２ｃのキャプシドタンパク質、その遺伝子変異体、又はネコパルボウイルスのキャプシドタンパク質をコードする。更に好ましくは、本発明によるウイルスのキャプシド遺伝子は、ＣＰＶ生物型２ｃのキャプシドタンパク質又はその遺伝子変異体をコードする。遺伝子変異体は、ＣＰＶ生物型２ａ、２ｂ若しくは２ｃの１つ、又は当技術分野で公知の任意の他のＣＰＶ生物型に起因するが、キャプシドタンパク質をコードするＤＮＡに１つ以上の変異を保有し、アミノ酸配列に１つ以上の変化をもたらす任意の変異体であり得る。
上記のキャプシド遺伝子のアミノ酸位置２１９及び３８６に加えて、キャプシド遺伝子のＣＰＶ生物型２ｃバックグラウンドを有する本発明の弱毒化ＰＶ及びその実施形態は、驚くべきことに、本発明において観察されるように、５日目、４日目、又は３日目に既に達成することができる免疫の早期発現を提供することが示される。したがって、更なる好ましい実施形態では、本発明の弱毒化ＰＶ及びその実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸を含み、そして、ウイルスのキャプシド遺伝子は、ＣＰＶ生物型２ｃのキャプシドタンパク質又はその遺伝子変異体をコードする。
上記のように、パルボウイルスの非キャプシド部分は、ＣＰＶ又はＦＰＶ起源のいずれかであり得る。
したがって、この実施形態のなお更に好ましい形態は、パルボウイルスが、ＣＰＶ生物型２ａ、２ｂ、２ｃ、又はその遺伝子変異体、好ましくはＣＰＶ生物型２ａ、２ｂ又は２ｃ、最も好ましくはＣＰＶ生物型２ｃのキャプシドタンパク質、又はネコパルボウイルスのキャプシドタンパク質をコードする、本発明による生弱毒化ＣＰＶ及び／又はその任意の実施形態に関する。
好ましくは、本発明による生弱毒化パルボウイルス及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質の位置８７におけるロイシン、位置３００におけるグリシン、位置３０５におけるチロシン、位置４２６におけるアスパラギン酸又はグルタミン酸、及び位置５５５におけるイソロイシン又はバリンのアミノ酸のうちの少なくとも１つをコードするキャプシド遺伝子を含む。好ましくは、本発明による生弱毒化パルボウイルス及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質の位置８７におけるロイシン、位置３００におけるグリシン、位置３０５におけるチロシン、位置４２６におけるアスパラギン酸又はグルタミン酸、及び位置５５５におけるイソロイシン又はバリンのアミノ酸のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つをコードするキャプシド遺伝子を含む。
好ましくは、本発明による生弱毒化パルボウイルス及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質の位置８７におけるロイシン、位置３００におけるグリシン、位置３０５におけるチロシン、位置４２６におけるグルタミン酸、及び位置５５５におけるバリンのアミノ酸のうちの少なくとも１つをコードするキャプシド遺伝子を含む。好ましくは、本発明による生弱毒化パルボウイルス及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質の位置８７におけるロイシン、位置３００におけるグリシン、位置３０５におけるチロシン、位置４２６におけるグルタミン酸、及び位置５５５におけるバリンのアミノ酸のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つをコードするキャプシド遺伝子を含む。
本発明のパルボウイルス及び／又はその任意の実施形態の好ましい形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、位置２０６２～２０７０の領域の非キャプシド領域に弱毒化変異を含む、本発明による生弱毒化パルボウイルスに関する。
本発明のパルボウイルスの好ましい形態及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードするキャプシド遺伝子を含み、弱毒化変異が、位置２０６２～２０７０の非キャプシド領域においてＡＣＧ ＴＡＣ ＧＴＡの配列番号１に対応する配列を有する、本発明による生弱毒化パルボウイルスに関する。
本発明のパルボウイルス及び／又はその任意の実施形態の好ましい形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、位置２０６２～２０７０の領域の非キャプシド領域に弱毒化変異を含み、パルボウイルスがＣＰＶ生物型２ｃのキャプシドタンパク質をコードする、本発明による生弱毒化パルボウイルスに関する。
本発明のパルボウイルスの好ましい形態及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードするキャプシド遺伝子を含み、弱毒化変異が、位置２０６２～２０７０の非キャプシド領域においてＡＣＧ ＴＡＣ ＧＴＡの配列番号１に対応する配列を有し、パルボウイルスがＣＰＶ生物型２ｃのキャプシドタンパク質をコードする、本発明による生弱毒化パルボウイルスに関する。
本発明のパルボウイルスの好ましい形態及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードし、ＶＰ２キャプシドタンパク質の位置８７におけるロイシン、位置３００におけるグリシン、位置３０５におけるチロシン、位置４２６におけるグルタミン酸及び位置５５５におけるバリンのうちの少なくとも２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸、並びに位置２０６２～２０７０の非キャプシド領域における弱毒化変異をコードするキャプシド遺伝子を含む、本発明による生弱毒化パルボウイルスに関する。
本発明のパルボウイルスの好ましい形態及び／又はその任意の実施形態は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードし、ＶＰ２キャプシドタンパク質の位置８７におけるロイシン、位置３００におけるグリシン、位置３０５におけるチロシン、位置４２６におけるグルタミン酸及び位置５５５におけるバリンのうちの少なくとも２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、弱毒化変異が、位置２０６２～２０７０の非キャプシド領域においてＡＣＧ ＴＡＣ ＧＴＡの配列番号１に対応する配列を有する、本発明による生弱毒化パルボウイルスに関する。
例えば、配列番号９に示される配列を有するか、又は配列番号１０（ＶＰ１／２）及び配列番号１２（ＶＰ２）に示されるキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含む、本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態である
。
。
配列番号９：キャプシド遺伝子
配列番号１０：キャプシドＶＰ１／２タンパク質
配列番号１２キャプシドＶＰ２
本発明によるパルボウイルスの好適な形態及び／又はその任意の実施形態は、配列番号９のヌクレオチド配列と９０％、９２％、９４％、９６％、又は９８％の配列同一性を含む配列を有するキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶを含む。
本発明によるパルボウイルスの好適な形態及び／又はその任意の実施形態は、配列番号１０（ＶＰ１）又は配列番号１２（ＶＰ２）のアミノ酸配列と９０％、９２％、９４％、９６％、又は９８％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶを含む。
本発明によるパルボウイルスの好適な形態及び／又はその任意の実施形態は、配列番号９のヌクレオチド配列と９５％、９７％、又は９９％の配列同一性を含む配列を有するキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶを含む。
本発明によるパルボウイルスの好適な形態及び／又はその任意の実施形態は、配列番号１０（ＶＰ１）又は配列番号１２（ＶＰ２）のアミノ酸配列と９５％、９７％、又は９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化ＰＶを含む。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号９のヌクレオチド配列と９０％、９２％、９４％、９６％又は９８％の配列同一性を含む配列を有するキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードする。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号１０（ＶＰ１）又は配列番号１２（ＶＰ２）のアミノ酸配列と９０％、９２％、９４％、９６％又は９８％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９のイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６のグルタミン以外のアミノ酸をコードする。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号９のヌクレオチド配列と９５％、９７％又は９９％の配列同一性を含む配列を有するキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードする。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号１０（ＶＰ１）又は配列番号１２（ＶＰ２）のアミノ酸配列と９５％、９７％又は９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９のイソロイシン以外のアミノ酸及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６のグルタミン以外のアミノ酸をコードする。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号９のヌクレオチド配列と９０％、９２％、９４％、９６％、又は９８％の配列同一性を含む配列を有するキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードする。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号１０（ＶＰ１）又は配列番号１２（ＶＰ２）のアミノ酸配列と９０％、９２％、９４％、９６％、又は９８％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９のバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６のリジンをコードする。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号９のヌクレオチド配列と９５％、９７％又は９９％の配列同一性を含む配列を有するキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードする。
パルボウイルスの好適な形態は、配列番号１０（ＶＰ１）又は配列番号１２（ＶＰ２）のアミノ酸配列と９５％、９７％、又は９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含む本発明による生弱毒化ＰＶ及び／又はその任意の実施形態を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９のバリン及びＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６のリジンをコードする。
本発明の好適な実施形態及び／又はその任意の実施形態では、生弱毒化ＰＶは、キャプシドタンパク質をコードするキャプシド遺伝子を含み、ここで、キャプシド遺伝子は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置９３におけるリジン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるリジン以外のアミノ酸、及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３７７におけるリジン以外のアミノ酸、及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３００におけるセリン以外のアミノ酸、及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３０１におけるアラニン以外のアミノ酸をコードする。
本発明の別の実施形態は、本発明による弱毒化パルボウイルスの調製方法及びその任意の実施形態に関し、ここで、そのような方法は、アミノ酸位置２１９にイソロイシンをコードするコドンを有し、及び／又はアミノ酸位置３８６にグルタミンをコードするコドンを有するパルボウイルスキャプシドタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ断片を、アミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンを有し、及び／又はアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするコドンを有するパルボウイルスキャプシドタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ断片と交換することを含む。
そのようなＤＮＡの交換は、部位特異的変異誘発、制限断片の交換等の当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して行うことができる。２１９－イソロイシンをＸ１置換又は３８６－グルタミンにＸ２置換するいくつかの方法がある。そのような変化を、化学合成又はＰＣＲ、続いて新たに合成された断片とウイルスＤＮＡとの組換えによって導入することができる。
本発明のパルボウイルス及び／又はその実施形態を産生するための好適な方法は、本発明のパルボウイルス及び／又はその実施形態のゲノム配列をコードするプラスミド等、本明細書で定義される生弱毒化パルボウイルスから遺伝物質を調製することである。好適な方法は、例えば、国際公開第２０１２／００７５８９号及び国際公開第２０１１／１０７５３４号に記載されている。次いで、プラスミドＤＮＡを、培養中のＡ７２細胞又はＣｒＦＫ細胞等の感受性イヌ又はネコ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の周知のトランスフェクション技術を使用して行う。トランスフェクション後、細胞を継代する。モニタリングは、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによって達成され得る。トランスフェクション後、細胞を１～２０回継代することができる。好ましくは、細胞を５～１５回、好ましくは２～１６回、好ましくは１～１０回、好ましくは１０～２０回、より好ましくは２～１０回、より好ましくは２～５回継代する。好適には、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回継代される。その後、ウイルスを当技術分野における任意の公知の方法によって精製することができる。
－ワクチン接種対象
動物、より具体的には、パルボウイルス感染に対するペットの防御のためにワクチンが開発される場合、そのようなワクチンに使用するための好ましいパルボウイルスは、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）又はネコパルボウイルス（ＦＰＶ）であり得る。したがって、この実施形態の更により好ましい形態は、パルボウイルスがＣＰＶ又はＦＰＶである、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスに関する。したがって、生弱毒化パルボウイルスは、本発明では、好ましくはペット、更に好ましくはネコ又はイヌ、より好ましくはイヌである動物に投与される。本発明では、動物が２～１０週齢又は２～２０週齢の間に単回ワクチン接種が実施されるため、イヌは本明細書では仔イヌ又は子犬とも呼ばれる。
動物、より具体的には、パルボウイルス感染に対するペットの防御のためにワクチンが開発される場合、そのようなワクチンに使用するための好ましいパルボウイルスは、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）又はネコパルボウイルス（ＦＰＶ）であり得る。したがって、この実施形態の更により好ましい形態は、パルボウイルスがＣＰＶ又はＦＰＶである、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスに関する。したがって、生弱毒化パルボウイルスは、本発明では、好ましくはペット、更に好ましくはネコ又はイヌ、より好ましくはイヌである動物に投与される。本発明では、動物が２～１０週齢又は２～２０週齢の間に単回ワクチン接種が実施されるため、イヌは本明細書では仔イヌ又は子犬とも呼ばれる。
別の実施形態では、動物は、単一のワクチン接種動物として収容される。動物は、単一の動物として、又はワクチン接種されていない動物の群の中に収容される。動物の群は、１匹の動物のみに本発明のパルボウイルスをワクチン接種する同腹仔であり得る。同腹仔等の動物群は、典型的には母動物も含む。同腹仔のサイズは、イヌ品種等の動物に依存し、典型的には２～１０匹の動物であるが、３、４、５、６、７、８又は９匹の動物の群であってもよい。典型的には、仔イヌは６～８週齢まで同腹仔を離れず、同腹仔を離れる前に４～８週齢の間にワクチン接種される。したがって、更なる実施形態では、本発明は、動物の群、好ましくは同腹仔の中に収容され、この動物の群を離れる前にワクチン接種される、仔イヌ等の動物に投与される本明細書で定義されるパルボウイルスに関する。この実施形態では、ワクチン接種は、典型的には、動物が４～８週の間に１回実施される。野外における典型的な状況は、動物が６～１２週齢でワクチン接種され、動物が同腹仔を残すか又は離乳していることである。別の典型的な状況は、動物が２～１０週齢又は２～２０週齢でワクチン接種され、少なくとも１週間又は更には２～４週間同腹仔に留まることである。
別の実施形態では、動物は、２匹のイヌ等の２匹の動物の群に収容され、そのうち１匹の動物のみが本発明のパルボウイルスでワクチン接種される（本明細書では「ペアハウジング（ｐａｉｒ－ｈｏｕｓｅｄ）」動物とも呼ばれる）。
－パルボウイルス感染に対する防御
本明細書に記載の生弱毒化ＰＶは、ＰＶ感染から動物を防御するのに使用され、ＰＶは、動物に単回用量として投与され、２～２０週又は２～１２週の間、特に動物の２～１０週齢の間に単回用量として投与される。驚くべきことに、本発明では、本明細書に記載の生弱毒化ＰＶを用いて、２～２０週又は２～１２週の間、例えば２～１０週齢の間に投与される単回ワクチン接種が、パルボウイルス感染に対する免疫を提供するための有効な免疫応答を提供し得ることが見出された。加えて、驚くべきことに、本発明において、本明細書中に記載されるような生弱毒化ＰＶはＭＤＡを干渉しないことが見出された。そのため、２～２０週齢、２～１２週齢、例えば２～１０週齢の間に投与される単回ワクチン接種は、動物のＭＤＡレベルにかかわらず、パルボウイルス感染に対する免疫を提供するための効果的な免疫応答を提供することができる。したがって、高レベルのＭＤＡの存在下であっても効果的な免疫応答を達成することができるため、複数回のワクチン接種の必要性が排除される。加えて、驚くべきことに、２～２０週齢又は２～１２週齢の動物に投与される、好ましくは２～１０週齢で投与される、好ましくは４～８週齢で投与される、又は６～８週齢の動物に投与される単回ワクチン接種は、生弱毒化ＰＶの投与後、５日又は４日、更には３日で既に殺菌免疫を提供することができ、典型的にはＰＶ感染に対する効果的かつ長期の防御を達成することが見出された。
本明細書に記載の生弱毒化ＰＶは、ＰＶ感染から動物を防御するのに使用され、ＰＶは、動物に単回用量として投与され、２～２０週又は２～１２週の間、特に動物の２～１０週齢の間に単回用量として投与される。驚くべきことに、本発明では、本明細書に記載の生弱毒化ＰＶを用いて、２～２０週又は２～１２週の間、例えば２～１０週齢の間に投与される単回ワクチン接種が、パルボウイルス感染に対する免疫を提供するための有効な免疫応答を提供し得ることが見出された。加えて、驚くべきことに、本発明において、本明細書中に記載されるような生弱毒化ＰＶはＭＤＡを干渉しないことが見出された。そのため、２～２０週齢、２～１２週齢、例えば２～１０週齢の間に投与される単回ワクチン接種は、動物のＭＤＡレベルにかかわらず、パルボウイルス感染に対する免疫を提供するための効果的な免疫応答を提供することができる。したがって、高レベルのＭＤＡの存在下であっても効果的な免疫応答を達成することができるため、複数回のワクチン接種の必要性が排除される。加えて、驚くべきことに、２～２０週齢又は２～１２週齢の動物に投与される、好ましくは２～１０週齢で投与される、好ましくは４～８週齢で投与される、又は６～８週齢の動物に投与される単回ワクチン接種は、生弱毒化ＰＶの投与後、５日又は４日、更には３日で既に殺菌免疫を提供することができ、典型的にはＰＶ感染に対する効果的かつ長期の防御を達成することが見出された。
したがって、第１の態様では、本発明は、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための、好ましくはＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ若しくは２ｃ、又はその遺伝子変異体、更に好ましくはＣＰＶ生物型２ｃ、又はその遺伝子変異体であり、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子、を含む生弱毒化パルボウイルスを提供し、ここで、生弱毒化パルボウイルスは、単回用量として動物に投与され、動物が２～１２週齢の間、好ましくは２～１０週齢の間に投与される。適切には、本発明の生弱毒化パルボウイルス及び／又はその実施形態は、単回用量として動物に投与され、２～１２週の間に投与され、より好適には２～１０週の間に投与され、より好適には２～８週の間に投与され、より好適には２～６週の間に投与され、より好適には２～４週の間に投与され、より好適には４～１０週の間に投与され、より好適には４～８週の間に投与され、より好適には４～６週の間に投与され、より好適には３～１１週の間に投与され、より好適には３～９週の間に投与され、より好適には３～７週の間に投与され、より好適には３～５週の間に投与され、より好適には２～１１週の間に投与され、より好適には２～９週の間に投与され、より好適には２～７週の間に投与され、より好適には２～５週の間に投与される。
また、本発明は、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための、好ましくは、ＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ若しくは２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子、更に好ましくはＣＰＶ生物型２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子であって、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子、を含む生弱毒化パルボウイルスを提供し、ここで、生弱毒化パルボウイルスは、動物が２～２０週齢の間、好ましくは２～１５週齢の間に単回用量として動物に投与される。
「単回用量」は、生弱毒化パルボウイルス又は生弱毒化パルボウイルスを含むワクチンが１回、すなわち単回ワクチン接種として与えられることを意味する。単回用量は、例えば、動物が２～２０週齢又は２～１０週齢の間に投与され得る。単回用量は、ワクチン接種剤として、本発明の生弱毒化パルボウイルスのみを含み得る。別の実施形態では、単回用量は、ワクチン接種剤として、１つ以上のワクチン接種剤と組み合わせた本発明の生弱毒化パルボウイルスを含む、すなわち、本発明の生弱毒化パルボウイルスは、例えばイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）等のジステンパーウイルス、又は任意の他のウイルス若しくは病原体と組み合わせた混合ワクチンに含まれる。
特定の場合には、ワクチン不全を防ぐために、動物が１１～２０週齢、例えば１３～２０週齢の間に、又は免疫応答の増強及び免疫持続時間の延長を達成するためのブースターワクチン接種として、１回又は２回以上の追加のワクチン接種を行うことができる。
しかしながら、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスは、典型的には、動物が２、～２０週齢又は２～１２週齢、例えば２～１０週齢の間に投与される単回ワクチン接種後、少なくとも３ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、より好ましくは少なくとも１２ヶ月間、更により好ましくは少なくとも３年間、最も好ましくは生涯にわたって、パルボウイルス感染に対する有効かつ長期の防御を達成するため、追加のワクチン接種は典型的には必要ではない。したがって、好ましい実施形態では、生弱毒化パルボウイルスを、動物が２～２０週齢の間に１回、すなわち単回用量として動物に投与する。更に好ましい実施形態では、生弱毒化パルボウイルスを、動物が４～８週齢の間、特に好ましくは動物が５～６週齢、最も好ましくは動物が６週齢のとき単回用量として動物に投与する。したがって、単回用量の投与時間は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週齢であり得、例えば、イヌ品種等の動物に応じて、又は動物の収容状況に応じて選択され得る。
驚くべきことに、本発明では、生弱毒化パルボウイルスによる単回ワクチン接種が、パルボウイルス感染に対する能動免疫を効果的に刺激し、したがって、パルボウイルス感染に対する防御を提供する抗体の産生を達成し得ることが見出された。
典型的には、免疫の発現は、本明細書に記載の弱毒化ＰＶワクチンの投与後、５日目又はそれより前、好ましくは４日目又はそれより前、好ましくは３日目又はそれより前に達成される。したがって、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスによる動物の単回ワクチン接種でさえ、ワクチン接種後の初期段階で既にパルボウイルス感染に対する防御を効果的に提供する。
先行技術では、パルボウイルスに対するワクチン接種は、通常、少なくとも２回又は更には３回の用量を必要とした。例えば、弱毒化２ｃ型イヌパルボウイルスを開示している国際公開第２０１４／０９５９５６号を参照されたい。弱毒化２ｃ型パルボウイルスを含むワクチンを、３週間の間隔で２回用量で、６～８週齢の２０匹の子犬に投与する。
本明細書に記載される生弱毒化パルボウイルスの更なる利点は、動物における母体由来抗体（ＭＤＡ）の存在が典型的には処置の有効性を干渉しないことである。したがって、パルボウイルス感染に対する動物の信頼できる免疫応答及び防御は、動物のＭＤＡレベルから独立して達成することができる。したがって、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスによるワクチン接種は、残留ＭＤＡの存在下でのワクチン不全のリスクを最小限に抑える。さらに、パルボウイルス感染に対する防御は、動物のＭＤＡレベルに関係なく達成することができるため、典型的には、ワクチン接種前に、例えば動物のＭＤＡのヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）力価を決定することによって、動物のＭＤＡレベルを決定する必要はない。したがって、本発明では、生弱毒化パルボウイルスの投与は、ワクチン接種時に測定された動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価とは無関係に行うことができる。
特に、驚くべきことに、本発明では、ワクチン接種時に測定された動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、実験のセクションに記載の方法によって決定される場合、１２８又は２８８より高く、好ましくは５７６より高く、更により好ましくは１１５２より高く、最も好ましくは１６６４より高い場合であっても、動物におけるパルボウイルス感染に対する防御を提供する免疫応答が達成され得ることが観察された。好ましくは、ワクチン接種時に測定される母体由来抗体のワクチン接種前のＨＡＩ力価は、０～２０００の間、好ましくは１００～１８００の間、好ましくは２００～１６００の間、好ましくは３００～１４００の間、好ましくは４００～１２００の間、好ましくは５００～１０００の間、好ましくは６００～９００の間、好ましくは７００～８００の間である。したがって、驚くべきことに、パルボウイルス感染に対する防御が、先行技術のワクチンでは不可能であった高レベルのＭＤＡの存在下でさえ達成され得ることが本発明において示され得る。
ＭＤＡのレベル又は力価は、血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイによって測定することができる。ＨＡＩは、ＣＰＶによるブタ赤血球の凝集を阻害する試料内の血清ＣＰＶ抗体の能力を測定する。ＣＰＶに対する抗体を、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ １９８０；４１（５）：７８－７９１；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ａ．Ｅ．，Ｊ Ｂｉｏ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １９８２；１０（１）：１－８に従ってＨＡＩアッセイによって決定することができる。
５日目又はそれより前、例えば３日目における免疫の発現は、典型的には、ＭＤＡの非存在下で達成され、これは、ワクチン接種時に決定される８未満、好ましくは１６未満、更に好ましくは６４未満のＨＡＩ力価を下回るＭＤＡレベルと見なすことができる。
さらに、ワクチン接種時に測定された動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が１２８より高い、又は２８８より高い、又は更には５７６より高い場合であっても、一方の動物のみにワクチン接種されている（すなわち、動物間でのウイルスの排出及び拡散を伴わない）ペアハウジング動物におけるパルボウイルス感染に対する防御を提供する免疫応答が達成され得ることが観察され得る。
さらに、ワクチン接種時に測定された動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が１１５２より高くても、又は１６６４より高い場合であっても、２匹以上の動物にワクチン接種されている（すなわち、動物間でのワクチンウイルスの排出及び拡散を可能にする２匹以上の動物）２匹以上の群収容動物におけるパルボウイルス感染に対する防御を提供する免疫応答が達成され得ることが観察され得る。
したがって、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスによる動物のワクチン接種は、単回ワクチン接種後の初期段階で既にパルボウイルス感染に対する防御を効果的に提供し、ＭＤＡの存在下でパルボウイルス感染に対する防御を達成することさえできる。
結果として、第２の態様では、本発明は、パルボウイルス感染に対する動物の防御に使用するための、好ましくはＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ若しくは２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子、更に好ましくはＣＰＶ生物型２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子であって、そして、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子、を含む、弱毒化パルボウイルスを提供し、ここで、投与が、ワクチン接種時に測定される動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価とは無関係に行われる。
第３の態様では、本発明は、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための、好ましくはＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ若しくは２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子、更に好ましくはＣＰＶ生物型２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子であって、そして、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子、を含む生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）を提供し、ここで、ワクチン接種時に測定された動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価は、１２８より高く、又は２８８より高く、好ましくは５７６より高い。
本発明の特に好ましい実施形態及び／又はその実施形態では、生弱毒化パルボウイルスは、ワクチン接種時に測定された動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が１２８より高く又は２８８より高く、更には５７６より高く、更には１１５２より高くても、動物が２～７週齢の間、好ましくは動物が４～６週齢、特に好ましくは動物が５～６週齢のとき、最も好ましくは６週齢で動物に投与される。
本発明における更なる驚くべき所見は、動物、好ましくはイヌが単一のワクチン接種動物として収容されている場合であっても、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスの投与後にパルボウイルス感染に対する防御が達成され得ることである。
ワクチン接種のために動物に投与される生弱毒化パルボウイルスは、典型的には、ワクチン接種後最大８日間、動物の糞便中に***される。時折、このウイルスは、疾患の臨床徴候を引き起こすことなく、糞便－経口経路を介して他の動物に広がることができる。通常、パルボウイルス感染に対するワクチンが当技術分野で試験される場合、子犬等の動物は、１つの部屋に３匹以上の動物、例えば５～１０匹の動物の群に収容される。この状況では、動物群のうちの１匹の動物のみに生弱毒化パルボウイルスをワクチン接種しても、ワクチンウイルスは、ワクチン接種個体から糞便を介して他の共同収容動物に排出される。イヌは生来探究的な性質を有するため、ウイルスは容易に摂取され、室内の他のイヌに代理でワクチン接種される。室内の２匹以上の動物にワクチン接種した場合、既にワクチン接種した動物は、他のワクチン接種個体の糞便からウイルスを摂取することによってブースターワクチン接種を受ける。ウイルスは非常に安定しており、イヌは同室のイヌから糞便中に***されたワクチンウイルスに継続的に曝露されているため、免疫系は複数日間にわたって持続的なブーストを受ける。ＭＤＡのレベルは、初期ワクチン接種が機能しなかったイヌにおいて経時的に低下するため、十分に低いレベルに達すると、環境から選択されたワクチン株は、任意の残留ＭＤＡを人工的に突破し、能動免疫を誘導することができる。しかしながら、動物群におけるワクチン有効性を試験するこの方法は、典型的には、子犬等の新しいペットが通常、ペットの所有者によって単一の動物として収容され、したがって他の最近ワクチン接種された動物からワクチンウイルスが拡散する可能性がない現場の状況を表していない。
例えば、国際公開第２０１４／０９５９５６号は、弱毒化２ｃ型イヌパルボウイルスを開示している。弱毒化２ｃ型パルボウイルスを含むワクチンを、３週間の間隔で２回用量で、６～８週齢の２０匹の子犬に投与する。この群では、２０匹全ての子犬がワクチン接種を受けた。ワクチンの生パルボ株は糞便中に排出され、ワクチン群の子犬によって摂取される。
本発明では、生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも２週間の期間中に、生弱毒化パルボウイルスを、イヌ等の単一のワクチン接種動物として収容された動物に投与することによって、パルボウイルス感染に対する防御を達成する免疫応答が達成され得ることが見出された。したがって、パルボウイルス感染に対する防御は、糞便を介して動物にウイルスを排出し得る他の動物、例えば他のワクチン接種動物が存在しない場合でも達成することができる。したがって、本発明では、他の動物の糞便との接触を介して達成されるブースターワクチン接種等のブースターワクチン接種は必要ではない。この収容方法は、ほとんどの仔イヌが同腹仔から定住地に移動した後に遭遇する生物学的に隔離された環境をより正確に反映する。
動物は、典型的には、生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも２週間の期間中、単独のワクチン接種済のイヌとして、好ましくは単独のイヌとして収容される。さらに、好ましくは、動物は、生弱毒化パルボウイルスの投与後、少なくとも３週間、更に好ましくは少なくとも４週間の期間、単独のワクチン接種済のイヌ、好ましくは単独のイヌとして収容される。
代替の実施形態では、動物は、１匹、２匹、３匹又はそれ以上の他のワクチン接種動物の群内にワクチン接種動物として収容される。他のワクチン接種動物の存在は、ウイルスが動物に、例えばそれらの糞便を介して排出及び拡散することを可能にし、免疫のより速い増加及びＰＶ感染に対する防御の増強をもたらすブースターワクチン接種をもたらす。したがって、この実施形態では、１１～２０週の間、例えば１３～２０週の間の１回又は２回以上の追加のワクチン接種等のブースターワクチン接種は、典型的にはＰＶ感染に対する防御を達成するために必要ではない。結果として、動物が１匹、２匹、３匹又はそれ以上の他のワクチン接種動物の群内にワクチン接種動物として収容され、動物が２～２０週齢の間に１回、すなわち単回用量として生弱毒化ＰＶが動物に投与されることが更に好ましい実施形態である。
さらに、本発明の生弱毒化パルボウイルス及びその実施形態は、少なくとも１つの他のワクチン接種動物とグループ化された動物において防御を提供し、すなわち、ワクチンウイルスの排出及び拡散を可能にし、ＭＤＡレベルは、５７６より高い、更には１１５２より高い、又は更には１６６４より高いＨＡＩ力価等、特に高いことが見出された。
したがって、第４の態様では、本発明は、パルボウイルス感染に対する動物の防御に使用するための、好ましくはＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ若しくは２ｃ又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子、更に好ましくはＣＰＶ生物型２ｃ又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子であって、そして、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードする、キャプシド遺伝子、を含む生弱毒化パルボウイルスを提供し、動物、好ましくはイヌは、生弱毒化ＰＶの投与後少なくとも２週間の期間の間、単一のワクチン接種動物として収容される。
更に驚くべきことに、本発明の生弱毒化パルボウイルスによるワクチン接種は、ＭＤＡの存在下であっても迅速な免疫応答を達成し、ワクチン接種後、５日目、好ましくは４日目、より好ましくは３日目に既にパルボウイルス感染に対する防御を達成することができることが観察された。ワクチン接種後に感染に対する免疫が達成される時間を、本明細書では「免疫の発現」とも呼ぶ。
したがって、第５の態様では、本発明は、パルボウイルス感染に対する動物を防御するのに使用するための、好ましくはＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ若しくは２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子、更に好ましくはＣＰＶ生物型２ｃ、又はその遺伝子変異体であるキャプシド遺伝子であって、そして、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子、を含む生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）を提供し、ここで、動物の免疫の発現が、生弱毒化ＰＶの投与後５日目、好ましくは４日目に達成され、好ましくは３日目に達成される。
さらに、本発明のＰＶワクチンによるワクチン接種後の免疫の発現は、ワクチン接種動物のＭＤＡレベルに依存し得ることが観察され得る。典型的には、ＭＤＡレベルが２８８ ＨＡＩ単位未満、好ましくは５７６ ＨＡＩ単位未満である場合、３日の免疫の発現を達成することができる。ＭＤＡレベルが８３２ ＨＡＩ単位未満、好ましくは１１５２ ＨＡＩ単位未満、又は更には１６６４ ＨＡＩ単位未満である場合、５日の免疫発現を達成することができる。
本発明は更に、本発明の第１、第２、第３、第４及び／又は第５の態様の任意の組み合わせを包含する。したがって、本発明の実施形態では、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスが提供され、以下の（１）～（５）のうちの１つ以上が適用される：
（１）生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として動物に投与され、動物が２週～１２週の間、好ましくは動物が２週～１０週の間、より好ましくは動物が４週～８週の間、最も好ましくは動物が５週～６週の間投与される、及び／又は
（２）投与が、生弱毒化ＰＶの投与時に測定される母体由来抗体（ＭＤＡ）の動物のワクチン接種前のＨＡＩ力価とは無関係に行われる、及び／又は
（３）生弱毒化ＰＶの投与時に測定された動物のワクチン接種前の母体由来抗体（ＭＤＡ）のＨＡＩ力価が１２８より高く、又は２８８より高く、好ましくは５７６超、更に好ましくは１１５２より高い、及び／又は
（４）動物が、単一のワクチン接種動物として、又はワクチン接種されていない２匹以上の動物の群に単一のワクチン接種動物として収容される、及び／又は
（５）動物の免疫の発現が、生弱毒化ＰＶの投与後５日目、好ましくは４日目に達成され、更に好ましくは３日目に達成される。
（１）生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として動物に投与され、動物が２週～１２週の間、好ましくは動物が２週～１０週の間、より好ましくは動物が４週～８週の間、最も好ましくは動物が５週～６週の間投与される、及び／又は
（２）投与が、生弱毒化ＰＶの投与時に測定される母体由来抗体（ＭＤＡ）の動物のワクチン接種前のＨＡＩ力価とは無関係に行われる、及び／又は
（３）生弱毒化ＰＶの投与時に測定された動物のワクチン接種前の母体由来抗体（ＭＤＡ）のＨＡＩ力価が１２８より高く、又は２８８より高く、好ましくは５７６超、更に好ましくは１１５２より高い、及び／又は
（４）動物が、単一のワクチン接種動物として、又はワクチン接種されていない２匹以上の動物の群に単一のワクチン接種動物として収容される、及び／又は
（５）動物の免疫の発現が、生弱毒化ＰＶの投与後５日目、好ましくは４日目に達成され、更に好ましくは３日目に達成される。
－パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するためのワクチン
本発明は更に、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスを含み、薬学的に許容され得る担体を更に含むワクチンを提供する。
本発明は更に、パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスを含み、薬学的に許容され得る担体を更に含むワクチンを提供する。
本発明によるワクチンに使用するためのパルボウイルスの好適な量は、ウイルスの弱毒化のレベル及び複製特性に応じて、多くの場合、１０３～１０９ ＴＣＩＤ５０の範囲内である。１０３ ＴＣＩＤ５０未満のウイルスの感染用量は、多くの場合、免疫系を誘因し、母体由来抗体を克服するのに十分に高いレベルまでウイルスが複製するには時間がかかりすぎるため、低すぎると考えられる。１０９ ＴＣＩＤ５０を超える量は、商業上の理由だけであれば魅力的ではないであろう。非常に好適な用量は、１０５～１０８ ＴＣＩＤ５０の範囲、更に良好には１０５～１０７又は１０６～１０８ ＴＣＩＤ５０である。生弱毒化パルボウイルスの好ましい用量は、１０５．１～１０６．７ ＴＣＩＤ５０又は１０４．７～１０６．７ ＴＣＩＤ５０の用量で動物に投与される。
薬学的に許容され得る担体は当技術分野で周知である。単なる例として、そのような担体は、滅菌水又はＰＢＳ等の緩衝液と同じくらい単純であり得る。ワクチンは、２つ以上の担体の組み合わせの単一の担体を含み得る。
本発明によるワクチンを、いくつかの方法で投与することができる。ワクチンは生弱毒化ウイルスを含むため、経口、鼻腔内、筋肉内及び皮下投与等の多くの投与方法が実行可能である。好ましい投与経路は、皮下投与及び経口投与である。
パルボウイルス感染に感受性の動物、例えば、つまり、ネコ及びイヌは、いくつかの他の疾患に対して同時にワクチン接種されることが多い。したがって、本発明によるワクチンを、イヌ及びネコに対して病原性のウイルス又は微生物の追加の抗原又は当該抗原をコードする遺伝情報と組み合わせることが実用的であろう。
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明によるワクチンと、動物に対して病原性のウイルス若しくは微生物の追加の抗原、又は当該ウイルス若しくは微生物の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝情報とを含む混合ワクチンに関する。
ウイルス又は微生物の追加の抗原は、防御免疫応答を誘導することができる、ウイルス若しくは微生物全体（生弱毒化形態又は不活化形態）若しくは免疫原性ポリペプチド、又はそのウイルス若しくは微生物の別の免疫原性部分、例えば（リポ）多糖であり得る。
好ましくは、動物に対して病原性のウイルス又は微生物は、イヌエーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）、ヴォーゲリ（ｖｏｇｅｌｉ）、ロッシ（ｒｏｓｓｉ）、リーシュマニア－ドノバニ複合体（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ－ｃｏｍｐｌｅｘ）、イヌアデノウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）１型、イヌアデノウイルス２型、イヌコロナウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、イヌジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型イクテロヘモリジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、イヌ肝炎ウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、イヌパラインフルエンザウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、イヌヘパトゾーン（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコヘルペスウイルス（ｆｅｌｉｎｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ネコカリシウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ネコ汎白血球減少症（ｆｅｌｉｎｅ ｐａｎｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ）、ネコ白血病（ｆｅｌｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、クラミドフィラフェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｃｏｖｉｄ－１９）等のコロナウイルスの群から選択される。
好ましい実施形態では、動物に対して病原性の当該ウイルス又は微生物は、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、例えばイヌジステンパーウイルス株Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔである。
好適な量の生弱毒化イヌジステンパーウイルスを、生弱毒化イヌパルボウイルスについて上記で記載されるような用量で動物に投与し、好ましくは１０５．１～１０６．５ ＴＣＩＤ５０の用量で動物に投与する。
生弱毒化ウイルスを含むワクチンは、通常、低温で保存されるか、又は凍結乾燥形態である。凍結乾燥ワクチンは、中程度の冷却条件下又は室温であっても維持することができる。多くの場合、ワクチン抗原は、例えば、分解しやすいタンパク質が分解されるのを防ぐため、ワクチンの貯蔵寿命を向上させるため、凍結乾燥効率を改善するため、又は生成物の外観を改善するために、安定剤と混合される。有用な安定剤は、すなわち、ＳＰＧＡ、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、タンパク質、例えばゼラチン、アルブミン若しくはカゼイン、又はそれらの分解産物、及び緩衝液、例えばアルカリ金属リン酸塩である。
別の態様では、本発明は、本発明の生弱毒化パルボウイルスと、薬学的に許容され得る担体とを含む液体ワクチン組成物に関し、担体は、約０．８未満の水分活性を有する天然深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）である。ＮＡＤＥＳ担体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１２２３２９号に記載されている。
したがって、好ましくは、本発明による（混合）ワクチンは凍結乾燥形態であり、すなわち凍結乾燥物として提供される。
さらに、ワクチンは、アジュバントを含む又は含まない生理学的に許容され得る希釈剤に懸濁され得る。そのような緩衝液は、例えば、滅菌水、緩衝液等であり得る。
言うまでもなく、ウイルスを乳化又は安定化するための希釈剤及び化合物も本発明において具体化される。
本発明によるワクチン中の賦形剤の特に好ましい組み合わせは、加水分解ゼラチン、カゼイン、ソルビトール及びリン酸二ナトリウム二水和物である。
本発明によるワクチンは、上記の凍結乾燥ワクチン及び溶媒を含むキットの形態で提供され得る。溶媒は特に限定されず、注射用水又はＰＢＳ等のワクチンの投与に典型的に使用される任意の溶媒であり得、塩及び／又は緩衝液等の１つ以上の賦形剤を含み得る。好ましくは、溶媒は、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素カリウム及び注射用水を含む。更に好ましくは、キットは、凍結乾燥物と溶媒とを含み、凍結乾燥物は、投与前に溶媒で再構成される。
－本発明のワクチンの製造方法及び使用
本発明の更に別の実施形態は、本発明による（混合）ワクチンの製造方法に関し、これらの方法は、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスと、薬学的に許容され得る担体との混合を含む。
本発明の更に別の実施形態は、本発明による（混合）ワクチンの製造方法に関し、これらの方法は、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスと、薬学的に許容され得る担体との混合を含む。
本発明の更に別の実施形態は、医薬として使用するための本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスに関する。より具体的には、本発明は、パルボウイルス感染の治療に使用するための生弱毒化パルボウイルスに関する。本発明の更に別の実施形態は、パルボウイルス感染を治療するための、本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスの使用に関する。
上記のワクチンの製造方法は、
（１）本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスからの遺伝物質による細胞のトランスフェクション、及び、生弱毒化パルボウイルスの産生を可能にする条件下で細胞を培養する工程であって、ここで、該方法は、トランスフェクション後の別の細胞培養物へのウイルスの多くとも２回の継代を含み、
（２）細胞培養物からの生弱毒化パルボウイルスの単離工程、および
（３）生弱毒化パルボウイルスを薬学的に許容され得る担体と混合する工程、を含み得る。
（１）本明細書に記載の生弱毒化パルボウイルスからの遺伝物質による細胞のトランスフェクション、及び、生弱毒化パルボウイルスの産生を可能にする条件下で細胞を培養する工程であって、ここで、該方法は、トランスフェクション後の別の細胞培養物へのウイルスの多くとも２回の継代を含み、
（２）細胞培養物からの生弱毒化パルボウイルスの単離工程、および
（３）生弱毒化パルボウイルスを薬学的に許容され得る担体と混合する工程、を含み得る。
本発明は更に、上記製造方法により得られるワクチンに関する。
別の実施形態は、動物をパルボウイルス感染から防御する方法であって、該方法は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルスを単回用量として動物に投与することと、この単回用量を動物の２週齢～１２週齢の間、好ましくは２週齢～１０週齢の間に投与することとを含む。
別の実施形態は、動物をパルボウイルス感染から防御する方法であって、該方法は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルスを動物に投与することを含み、ここで、この投与が、ワクチン接種時に測定される動物のワクチン接種前の母体由来抗体（ＭＤＡ）のＨＡＩ力価とは無関係に行われる。
別の実施形態は、動物をパルボウイルス感染から防御する方法であって、該方法は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルスを動物に投与することを含み、ここで、ワクチン接種時に測定される母体由来抗体（ＭＤＡ）の動物のワクチン接種前のＨＡＩ力価が、１２８より高いか又は２８８より高く、好ましくは５７６より高く、更に好ましくは１１５２より高い。
別の実施形態は、動物をパルボウイルス感染から防御する方法であって、該方法は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルスを、動物に投与することを含む方法であり、ここで、動物は、単一のワクチン接種動物として、又は他の動物がワクチン接種されない２匹以上の動物の群における単一のワクチン接種動物として収容される。
別の実施形態は、動物をパルボウイルス感染から防御する方法であって、該方法は、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルスを動物に投与することを含み、ここで、動物の免疫発現がワクチン接種後５日目、好ましくは４日目に達成され、更に好ましくは３日目に達成される。
［実施例］
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明され得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明され得る。
ワクチン
以下の実施例の実験で使用される生弱毒化パルボウイルスは、国際公開第２０１２／００７５８９号の実施例１に記載されているパルボウイルスクローン６３０ａｔｔである。パルボウイルスクローン６３０ａｔｔ（以下、「ＣＰＶ ６３０ａ」と略す）を含むワクチンを、Ａ７２細胞のトランスフェクションによって調製し、Ａ７２細胞を更に２回継代してウイルスを生成させ、これを仔イヌに投与した。図１は、ＣＰＶ ６３０ａ（配列番号１１）のヌクレオチド配列を示す。非キャプシド遺伝子（非構造遺伝子）（配列番号７）の塩基配列及び非キャプシドタンパク質（配列番号８）のアミノ酸配列、並びにキャプシド遺伝子（キャプシドＶＰ１／２）（配列番号９）の塩基配列及びキャプシドタンパク質（配列番号１０）のアミノ酸配列も示される。ヌクレオチド２０６２～２０７０の非構造遺伝子の弱毒化配列も示される（「ホットスポット」）（配列番号１も参照）。キャプシドには、アミノ酸８７、１１０、２９７、３００、３０５、３７５、４２６、並びにアミノ酸２１９のイソロイシンのバリンへの変異、及びアミノ酸３８６グルタミンのリジンへの変異が示される。
以下の実施例の実験で使用される生弱毒化パルボウイルスは、国際公開第２０１２／００７５８９号の実施例１に記載されているパルボウイルスクローン６３０ａｔｔである。パルボウイルスクローン６３０ａｔｔ（以下、「ＣＰＶ ６３０ａ」と略す）を含むワクチンを、Ａ７２細胞のトランスフェクションによって調製し、Ａ７２細胞を更に２回継代してウイルスを生成させ、これを仔イヌに投与した。図１は、ＣＰＶ ６３０ａ（配列番号１１）のヌクレオチド配列を示す。非キャプシド遺伝子（非構造遺伝子）（配列番号７）の塩基配列及び非キャプシドタンパク質（配列番号８）のアミノ酸配列、並びにキャプシド遺伝子（キャプシドＶＰ１／２）（配列番号９）の塩基配列及びキャプシドタンパク質（配列番号１０）のアミノ酸配列も示される。ヌクレオチド２０６２～２０７０の非構造遺伝子の弱毒化配列も示される（「ホットスポット」）（配列番号１も参照）。キャプシドには、アミノ酸８７、１１０、２９７、３００、３０５、３７５、４２６、並びにアミノ酸２１９のイソロイシンのバリンへの変異、及びアミノ酸３８６グルタミンのリジンへの変異が示される。
抗原刺激材料
イヌパルボウイルス抗原刺激ウイルス（ＭＳＤ Ａｎｉｍａ１ Ｈｅａｌｔｈ、オランダ国）
ウイルス：イヌパルボウイルス２ｃ型イタリアフィールド株
イヌパルボウイルス抗原刺激ウイルス（ＭＳＤ Ａｎｉｍａ１ Ｈｅａｌｔｈ、オランダ国）
ウイルス：イヌパルボウイルス２ｃ型イタリアフィールド株
方法及び手順：
別段の指示がない場合、以下の方法及び手順を使用した。
別段の指示がない場合、以下の方法及び手順を使用した。
投与
ワクチン接種は、正中線の中央の首筋に皮下接種することによって行った。皮下注射は、イヌにおけるワクチン接種の標準的な経路である。
ワクチン接種は、正中線の中央の首筋に皮下接種することによって行った。皮下注射は、イヌにおけるワクチン接種の標準的な経路である。
各仔イヌにＣＰＶ－２ｃイタリアフィールドウイルスを経口で抗原刺激した。経口抗原刺激は、イヌパルボウイルスの自然伝播を模倣し、欧州薬局方のモノグラフ０９６４で推奨されている経路に従う。
血清学的分析：
血液試料を分離し、血清を試験前に水浴中で５６℃で３０～６０分間熱不活性化した。
血液試料を分離し、血清を試験前に水浴中で５６℃で３０～６０分間熱不活性化した。
イヌパルボウイルス血球凝集阻害（ＨＡＩ）：
血球凝集阻害（ＨＡＩ）は、ＣＰＶによるブタ赤血球の凝集を阻害する試料内の血清ＣＰＶ抗体の能力を測定する。ＣＰＶに対する抗体を、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ １９８０；４１（５）：７８－７９１；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ａ．Ｅ．，Ｊ Ｂｉｏ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １９８２；１０（１）：１－８に従ってＨＡＩアッセイによって決定した。簡潔には、血清の希釈液を、９６ウェルプレート上で８ ＨＡ単位のＣＰＶと共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを２～８℃で１５～２０分間インキュベートし、次いで１％のブタ赤血球を添加し、２～８℃で約２時間インキュベートした。血球凝集の阻害を、ブタ血球の滴下（ｔｅａｒ－ｄｒｏｐｐｉｎｇ）によって特徴付けた。試料のＨＡＩ力価は、凝集の阻害が生じた最後の希釈（５０％凝集）の逆数であった。
血球凝集阻害（ＨＡＩ）は、ＣＰＶによるブタ赤血球の凝集を阻害する試料内の血清ＣＰＶ抗体の能力を測定する。ＣＰＶに対する抗体を、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ １９８０；４１（５）：７８－７９１；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ａ．Ｅ．，Ｊ Ｂｉｏ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １９８２；１０（１）：１－８に従ってＨＡＩアッセイによって決定した。簡潔には、血清の希釈液を、９６ウェルプレート上で８ ＨＡ単位のＣＰＶと共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを２～８℃で１５～２０分間インキュベートし、次いで１％のブタ赤血球を添加し、２～８℃で約２時間インキュベートした。血球凝集の阻害を、ブタ血球の滴下（ｔｅａｒ－ｄｒｏｐｐｉｎｇ）によって特徴付けた。試料のＨＡＩ力価は、凝集の阻害が生じた最後の希釈（５０％凝集）の逆数であった。
各血清試料をＣＰＶ ２ａ、ＣＰＶ ２ｂ及びＣＰＶ ２ｃの生物型に対して試験し、４ ＨＡＩ単位の抗原に対して発現させた。
イヌパルボウイルス血清中和（ＳＮ）：
選択した時点について、ＣＰＶに対する抗体を、２ａ、２ｂ及び２ｃの生物型に対する血清中和（ＳＮ）によっても決定した。
選択した時点について、ＣＰＶに対する抗体を、２ａ、２ｂ及び２ｃの生物型に対する血清中和（ＳＮ）によっても決定した。
ＳＮアッセイは、血清試料内の抗体がウイルスを中和し、培養中の細胞の感染を防ぐ能力を測定する。簡潔には、血清の希釈液を、９６ウェルプレート上の１００～３００ ＴＣＩＤ５０／ｍｌウイルスと共に３７℃で１時間インキュベートした。Ａ７２細胞を添加し、３日間インキュベートした。ＣＰＶを、ＣＰＶ特異的ＭＡｂ及び抗マウスＩｇＧ－ＦＩＴＣを用いた免疫蛍光法によって検出した。ウイルス中和抗体力価（ＳＮ５０）を、ウイルスの中和を示す血清の最大希釈の逆数として計算した。
ウイルスの単離：
直腸スワブ中に存在するウイルスの量の半定量的推定値を得るために、スワブ輸送液の連続希釈で単離を繰り返した。ワクチン接種済のイヌにおけるワクチンウイルスの排出と抗原刺激ウイルスとを区別するために、Ｄａｙ＋８日の直腸スワブをＰＣＲによって検査した。スワブ試料を濾過し、一般的なＣＰＶプライマーとワクチン又は同等のフィールドウイルス配列に特異的なＰＣＲプライマーの両方で分析した。
直腸スワブ中に存在するウイルスの量の半定量的推定値を得るために、スワブ輸送液の連続希釈で単離を繰り返した。ワクチン接種済のイヌにおけるワクチンウイルスの排出と抗原刺激ウイルスとを区別するために、Ｄａｙ＋８日の直腸スワブをＰＣＲによって検査した。スワブ試料を濾過し、一般的なＣＰＶプライマーとワクチン又は同等のフィールドウイルス配列に特異的なＰＣＲプライマーの両方で分析した。
直腸スワブからのウイルス単離：
組織培養における増殖によるウイルス単離を、全ての直腸スワブ試料について行った。スワブ上清を、５倍希釈を使用して２連でプレーティングし、ＣＰＶ特異的ＭＡｂ及び抗マウスＩｇＧ－ＦＩＴＣを用いてＡ７２細胞に対する免疫蛍光によってアッセイした。
組織培養における増殖によるウイルス単離を、全ての直腸スワブ試料について行った。スワブ上清を、５倍希釈を使用して２連でプレーティングし、ＣＰＶ特異的ＭＡｂ及び抗マウスＩｇＧ－ＦＩＴＣを用いてＡ７２細胞に対する免疫蛍光によってアッセイした。
差次的プライマーセットを用いた直腸スワブ材料のＰＣＲ分析：
スワブ材料を除去し、濾過した。２００μｌの濾過した上清を、標準的な手順を用い、製造業者の指示に従って、Ｒｏｃｈｅ製のＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ自動核酸抽出ロボットで使用した。
スワブ材料を除去し、濾過した。２００μｌの濾過した上清を、標準的な手順を用い、製造業者の指示に従って、Ｒｏｃｈｅ製のＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ自動核酸抽出ロボットで使用した。
ＰＣＲ後、ＤＮＡマーカーと一緒にアガロース／臭化エチジウムゲル上に反応物を流した。電気泳動後、ゲルをｇｅｌ ｄｏｃイメージング機器で可視化した。試料が正しいサイズの可視バンドサイズを与えた場合、試料を陽性と見なした。関連する陽性対照も正しいサイズの可視バンドを与え、陰性対照による増幅の証拠がなかった場合、ＰＣＲ試験を有効であると見なした。
臨床モニタリング：
全てのイヌを、直腸温及び体重を含む臨床徴候について毎日観察した。臨床徴候を毎日記録し、スコアを各臨床状態に割り当てた。
全てのイヌを、直腸温及び体重を含む臨床徴候について毎日観察した。臨床徴候を毎日記録し、スコアを各臨床状態に割り当てた。
［実施例１］
この試験の目的は、ＣＰＶ ６３０ａワクチン接種済の仔イヌにおける免疫の早期発現を調査することであった。
この試験の目的は、ＣＰＶ ６３０ａワクチン接種済の仔イヌにおける免疫の早期発現を調査することであった。
試験設計
およそ１０週齢であり、母体由来抗体を欠く２１匹のＳＰＦビーグル犬を、３匹の犬からなる７つの群に分けた。群１、２、３、４、５及び６の各イヌに、皮下接種によって適切な試験物質をワクチン接種した。
およそ１０週齢であり、母体由来抗体を欠く２１匹のＳＰＦビーグル犬を、３匹の犬からなる７つの群に分けた。群１、２、３、４、５及び６の各イヌに、皮下接種によって適切な試験物質をワクチン接種した。
群１：１０５．０ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群２：１０５．５ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群３：１０６．０ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群４：１０５．０ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群５：１０５．５ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群６：１０６．０ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群７：非ワクチン接種対照
群２：１０５．５ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群３：１０６．０ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群４：１０５．０ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群５：１０５．５ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群６：１０６．０ ＴＣＩＤ５０の用量のパルボウイルス６３０ａ
群７：非ワクチン接種対照
全てのイヌにＣＰＶ－２ｃイタリアンフィールドウイルス（Ｉｔａｌｉａｎ ｆｉｅｌｄ ｖｉｒｕｓ．）を抗原刺激した。群１、２及び３のワクチン接種の３日後、並びに群４、５及び６のワクチン接種の５日後に抗原刺激が降下するように、ワクチン接種をずらした。
動物を臨床徴候について観察し、毎日体重を測定した。直腸スワブを採取してウイルス***をモニタリングし、直腸温度を毎日検温した。ワクチン接種及び／又は抗原刺激に対する血清学的応答をモニターするために血液試料を採取した。
０、５、７、１１／１２及び２８日目に、全てのイヌから血清学的検査のために採血した。群１、２、３及び７を２日目に更に採血した。局所及び全身の有害反応について動物をモニタリングした。
材料：
ワクチン：生弱毒化イヌパルボウイルス６３０ａ
抗原刺激ウイルス：ＣＰＶ－２ｃ（イタリア分離株）
試験系
ＳＰＦビーグル犬、約１０週齢（雄性及び雌性の両方）
ワクチン：生弱毒化イヌパルボウイルス６３０ａ
抗原刺激ウイルス：ＣＰＶ－２ｃ（イタリア分離株）
試験系
ＳＰＦビーグル犬、約１０週齢（雄性及び雌性の両方）
ワクチン接種方法
群７のイヌを除く全てのイヌに、皮下接種によって適切な試験材料をワクチン接種した。
群７のイヌを除く全てのイヌに、皮下接種によって適切な試験材料をワクチン接種した。
ＣＰＶ抗原刺激
ＣＰＶ－２ｃイタリアンフィールドウイルスを１０５．５ ＴＣＩＤ５０の用量で経口投与した。
ＣＰＶ－２ｃイタリアンフィールドウイルスを１０５．５ ＴＣＩＤ５０の用量で経口投与した。
結果
血液凝集阻害（ＨＡＩ）応答値を以下の表１に示す。血清中和（ＳＮ）値を以下の表２に示す。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
血液凝集阻害（ＨＡＩ）応答値を以下の表１に示す。血清中和（ＳＮ）値を以下の表２に示す。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
臨床観察
ワクチン接種動物のいずれにもパルボウイルス感染の臨床徴候はなかった。したがって、１０５．０ ＴＣＩＤ５０の力価でのＣＰＶ ６３０ａワクチンによるワクチン接種は、臨床徴候に対して３日の免疫発現を提供することができた。全てのワクチン接種していない対照イヌを、出血性パルボウイルス感染の急性症状で抗原刺激の６日後に安楽死させた。
ワクチン接種動物のいずれにもパルボウイルス感染の臨床徴候はなかった。したがって、１０５．０ ＴＣＩＤ５０の力価でのＣＰＶ ６３０ａワクチンによるワクチン接種は、臨床徴候に対して３日の免疫発現を提供することができた。全てのワクチン接種していない対照イヌを、出血性パルボウイルス感染の急性症状で抗原刺激の６日後に安楽死させた。
ウイルス排出
全てのワクチン接種動物は、１～４日間にわたって感染性ワクチンウイルスを排出する。
＋８日目の３匹のワクチン接種済の仔イヌにおける残留排出は、対照イヌにおけるフィールドウイルスの排出の開始と重複していることが認められた。これは、診断ＰＣＲによってワクチンウイルスであることが示された。したがって、１０５ ＴＣＩＤ５０の力価でのＣＰＶ ６３０ａワクチンによるワクチン接種は、抗原刺激ウイルス排出を防止し、滅菌免疫を誘導することができた。
全てのワクチン接種動物は、１～４日間にわたって感染性ワクチンウイルスを排出する。
＋８日目の３匹のワクチン接種済の仔イヌにおける残留排出は、対照イヌにおけるフィールドウイルスの排出の開始と重複していることが認められた。これは、診断ＰＣＲによってワクチンウイルスであることが示された。したがって、１０５ ＴＣＩＤ５０の力価でのＣＰＶ ６３０ａワクチンによるワクチン接種は、抗原刺激ウイルス排出を防止し、滅菌免疫を誘導することができた。
Ａｌ１対照仔イヌは＋８日目（抗原刺激の３日後）にフィールドウイルスを排出し始めた。力価は＋１０日目に最大となり、試験終了まで高いままであった。
血清学的応答
表１及び表２に示す血清学的データは、免疫の臨床滴発現と相関するワクチン接種に対する一時的な用量依存的応答を示す。
表１及び表２に示す血清学的データは、免疫の臨床滴発現と相関するワクチン接種に対する一時的な用量依存的応答を示す。
３日間のＯＯＩ
＋５日目；抗原刺激の日、群１及び群２の２／３のイヌ、並びに群３の３／３のイヌは、用量依存的に抗体陽転を開始した。抗原刺激の２日後の＋７日目までに、全ての仔イヌは、強い抗体陽転を示した。急速な抗体陽転は、仔イヌを臨床疾患から防御した。
＋５日目；抗原刺激の日、群１及び群２の２／３のイヌ、並びに群３の３／３のイヌは、用量依存的に抗体陽転を開始した。抗原刺激の２日後の＋７日目までに、全ての仔イヌは、強い抗体陽転を示した。急速な抗体陽転は、仔イヌを臨床疾患から防御した。
５日間のＯＯＩ
群４、５及び６の仔イヌは全て、抗原刺激の日である＋５日目までに抗体陽転した。抗体力価は＋１２日目までに最大になり、試験終了まで高いままであった。
群４、５及び６の仔イヌは全て、抗原刺激の日である＋５日目までに抗体陽転した。抗体力価は＋１２日目までに最大になり、試験終了まで高いままであった。
対照
試験開始時、全ての仔イヌはＣＰＶ抗体に対して血清陰性であり、＋１１日目（抗原刺激の６日後）までに抗体陽転した。
試験開始時、全ての仔イヌはＣＰＶ抗体に対して血清陰性であり、＋１１日目（抗原刺激の６日後）までに抗体陽転した。
結論
この試験の結果は、驚くべきことに、１０５．０ ＴＣＩＤ５０の力価でのパルボウイルス６３０ａによるワクチン接種が、１０週のＳＰＦ仔イヌにおいて臨床徴候及び抗原刺激ウイルス排出に対して、３日の免疫発現を提供することができることを示している。更に驚くべきことに、防御されたイヌは、抗原刺激の日に十分な抗体応答を有していなかったとしても、殺菌免疫を有していたことが見出された。これは、歴史的に８０ ＨＡＩ単位の力価が防御レベルとして普遍的に受け入れられていたため、非常に驚くべきことであった。
この試験の結果は、驚くべきことに、１０５．０ ＴＣＩＤ５０の力価でのパルボウイルス６３０ａによるワクチン接種が、１０週のＳＰＦ仔イヌにおいて臨床徴候及び抗原刺激ウイルス排出に対して、３日の免疫発現を提供することができることを示している。更に驚くべきことに、防御されたイヌは、抗原刺激の日に十分な抗体応答を有していなかったとしても、殺菌免疫を有していたことが見出された。これは、歴史的に８０ ＨＡＩ単位の力価が防御レベルとして普遍的に受け入れられていたため、非常に驚くべきことであった。
［実施例２］
試験の目的は、４週齢の仔イヌにおける生弱毒化ＣＰＶ ６３０ａワクチンの有効性を調査することであった。更なる目的は、４週齢で投与した場合のＣＰＶ ６３０ａワクチン接種済の仔イヌの３日の免疫発現を実証することであった。
試験の目的は、４週齢の仔イヌにおける生弱毒化ＣＰＶ ６３０ａワクチンの有効性を調査することであった。更なる目的は、４週齢で投与した場合のＣＰＶ ６３０ａワクチン接種済の仔イヌの３日の免疫発現を実証することであった。
試験設計
イヌパルボウイルスに対する抗体がないＳＰＦビーグルの子犬の２匹の同腹仔を２つの群に分け、以下に詳述するように処置した。
イヌパルボウイルスに対する抗体がないＳＰＦビーグルの子犬の２匹の同腹仔を２つの群に分け、以下に詳述するように処置した。
７匹の仔イヌに、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）溶媒（ワクチン接種動物：群１）に再懸濁した単回用量の凍結乾燥イヌジステンパーウイルス／イヌパルボウイルス混合試験ワクチン（パルボウイルス６３０ａ）を皮下ワクチン接種した。５匹の仔イヌを非ワクチン接種対照として残した（群２）。群１のワクチン接種の３日後、両群の仔イヌに、経口投与により毒性のイタリアＣＰＶ－２ｃフィールド株を同時に抗原刺激した。
試験０日目（ワクチン接種日）、＋３（抗原刺激日）、＋６（抗原刺激後３日）、＋１０（抗原刺激後７日）及び＋１７（終了日）に、ＣＰＶ血清学的分析のために血液試料を採取した。試験の終了前に福祉の理由で安楽死させた任意のイヌから追加の血液試料も採取した。
ワクチンウイルス及び／又は抗原刺激ウイルス排出を監視するために、試験全体を通して毎日の直腸スワブを全てのイヌから採取した。試験＋６日目の直腸スワブの差次的ＰＣＲ分析を実施して、ワクチンとフィールドウイルス排出を識別した。
全ての仔イヌを、試験を通して臨床徴候について毎日観察した。臨床所見には、毎日の体重及び直腸温が含まれた。
ワクチン
ＣＰＶ６３０ａ／ＣＤＶ混合ワクチン
力価ＣＰＶ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量；１回／バイアル、凍結乾燥
力価ＣＤＶ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量；１回／バイアル、凍結乾燥
溶媒（希釈剤）：Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）溶媒（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａ１ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール）
ＣＰＶ６３０ａ／ＣＤＶ混合ワクチン
力価ＣＰＶ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量；１回／バイアル、凍結乾燥
力価ＣＤＶ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量；１回／バイアル、凍結乾燥
溶媒（希釈剤）：Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）溶媒（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａ１ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール）
試験系
ＳＰＦビーグル犬、４週齢（雄性及び雌性の両方）
ワクチン接種
ワクチン接種動物：群１
ＳＰＦビーグル犬、４週齢（雄性及び雌性の両方）
ワクチン接種
ワクチン接種動物：群１
７匹全ての仔イヌに、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）溶媒に再懸濁した単回０．５ｍｌ用量の凍結乾燥イヌジステンパーウイルス／イヌパルボウイルス混合試験ワクチンを皮下ワクチン接種した。
群２の仔イヌにはワクチン接種しなかった。
抗原刺激
ＣＰＶ－２ｃイタリアンフィールドウイルスを１０５．４ ＴＣＩＤ５０の用量で経口投与した。
ＣＰＶ－２ｃイタリアンフィールドウイルスを１０５．４ ＴＣＩＤ５０の用量で経口投与した。
結果
仔イヌの血清学的応答を以下の表３及び表４に詳述する。赤血球凝集素阻害アッセイ（ＨＡＩ）によるイヌパルボウイルスに対する仔イヌの血清学的応答を表３に示す。血清中和アッセイ（ＳＮ）によるイヌパルボウイルスに対する仔イヌの血清学的応答を表４に示す。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
仔イヌの血清学的応答を以下の表３及び表４に詳述する。赤血球凝集素阻害アッセイ（ＨＡＩ）によるイヌパルボウイルスに対する仔イヌの血清学的応答を表３に示す。血清中和アッセイ（ＳＮ）によるイヌパルボウイルスに対する仔イヌの血清学的応答を表４に示す。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
８未満のＨＡＩ単位の抗体力価は、血清干渉が観察されない限り、血清陰性であると見なされる。
－試験せず
－試験せず
ａＨＡＩプレートの最初の１つ又は２つのウェルに血清干渉が見られた。この低レベルの血清干渉は、幼若な仔イヌからの血清の低い事前希釈を使用し、イヌがイヌパルボウイルス抗体に対して陰性であると考えられた場合には珍しいものではない。
１４以下のＳＮ５０の抗体力価は、血清陰性であると考えられ、より高い値は、ウイルス中和のレベルが明らかであったことを示す。
－試験せず
－試験せず
結論
この試験では、４週齢の仔イヌにおけるＣＰＶ ６３０ａワクチンの低力価の単回接種の有効性を、ワクチン接種３日後の実験的イヌパルボウイルス抗原刺激によって評価した。
この試験では、４週齢の仔イヌにおけるＣＰＶ ６３０ａワクチンの低力価の単回接種の有効性を、ワクチン接種３日後の実験的イヌパルボウイルス抗原刺激によって評価した。
抗原刺激後の疾患の臨床パラメータ
全てのワクチン接種動物は、抗原刺激段階を通して優れた健康状態を維持した。対照的に、各対照イヌは急性イヌパルボウイルス疾患の古典的徴候に屈し、感染の５日後又は６日後に人道的な理由で安楽死させた。
全てのワクチン接種動物は、抗原刺激段階を通して優れた健康状態を維持した。対照的に、各対照イヌは急性イヌパルボウイルス疾患の古典的徴候に屈し、感染の５日後又は６日後に人道的な理由で安楽死させた。
ワクチン接種動物
ワクチン接種済の仔イヌは、イヌパルボウイルス疾患又は関連する発熱の臨床徴候を何ら発症しなかった。全てのイヌは、試験全体を通して体重のほぼ連続的な増加を維持し、その年齢の仔イヌについて予測されるように体重を増やした。
ワクチン接種済の仔イヌは、イヌパルボウイルス疾患又は関連する発熱の臨床徴候を何ら発症しなかった。全てのイヌは、試験全体を通して体重のほぼ連続的な増加を維持し、その年齢の仔イヌについて予測されるように体重を増やした。
対照
各対照仔イヌは、イヌパルボウイルス疾患の典型的な臨床徴候を示した。経口補水療法にもかかわらず、仔イヌの状態は急速に低下し、感染の５日後又は６日後（試験８又は９日目）に人道的な理由で安楽死させた。一過性発熱は、５匹の仔イヌのうち３匹において疾患の初期段階と一致することが認められた。
各対照仔イヌは、イヌパルボウイルス疾患の典型的な臨床徴候を示した。経口補水療法にもかかわらず、仔イヌの状態は急速に低下し、感染の５日後又は６日後（試験８又は９日目）に人道的な理由で安楽死させた。一過性発熱は、５匹の仔イヌのうち３匹において疾患の初期段階と一致することが認められた。
抗原刺激後のウイルス排出
全てのイヌは、試験開始前にイヌパルボウイルス直腸スワブ単離について陰性であった。予想通り、ワクチン接種後２～６日の１～５日間にわたってワクチン接種動物の直腸スワブ材料からウイルスを単離した。
全てのイヌは、試験開始前にイヌパルボウイルス直腸スワブ単離について陰性であった。予想通り、ワクチン接種後２～６日の１～５日間にわたってワクチン接種動物の直腸スワブ材料からウイルスを単離した。
抗原刺激後３～６日の３～４日間にわたって、対照の直腸スワブ材料からウイルスを単離した。全ての対照は、安楽死の日である９日目に高レベルのフィールドウイルスを排出した。
抗原刺激後のワクチン接種動物では、２回目の排出波は観察されなかったが、ワクチンウイルス排出段階の終了は、対照における抗原刺激ウイルス排出の開始と重複した。差次的ＰＣＲは、重複する６日目（抗原刺激後３日目）にワクチン接種動物によって排出されたウイルスはワクチンウイルスであり、抗原刺激ウイルスではないことを実証した。これは、感染３日前のワクチン接種が殺菌免疫を高め、フィールドウイルスの排出を防ぐことを示す。
ワクチン接種及び抗原刺激に対する血清学的応答
ワクチン接種前に、全ての仔イヌはイヌパルボウイルスに対して血清陰性であった。
ワクチン接種前に、全ての仔イヌはイヌパルボウイルスに対して血清陰性であった。
試験３日目、抗原刺激の日に、ワクチン接種動物は、イヌパルボウイルスに対して中程度の抗体応答を示し、２ｃ生物型による群平均で２３８ ＨＡＩ単位であった。血清学的応答は、試験の６から１０日目までに最大レベルに達し、試験終了まで高いままであった。
対照仔イヌは、試験の６日目に血清陰性のままであり、抗原刺激の３日後に、抗原刺激の５日後又は６日後の最終出血において明らかに検出可能であった迅速な血清学的応答を開始した。
概要
結論として、この試験は、４週齢からの最小力価用量のＣＰＶ ６３０ａワクチンによる単回ワクチン接種の投与が、イヌがワクチン接種の３日後にフィールドウイルスに感染した場合に、イヌパルボウイルス疾患及びフィールドウイルス排出の典型的な徴候から防御することを実証している。
結論として、この試験は、４週齢からの最小力価用量のＣＰＶ ６３０ａワクチンによる単回ワクチン接種の投与が、イヌがワクチン接種の３日後にフィールドウイルスに感染した場合に、イヌパルボウイルス疾患及びフィールドウイルス排出の典型的な徴候から防御することを実証している。
［実施例３］
試験の目的は、幼若な仔イヌにおける母体由来抗体（ＭＤＡ）の存在下でのＣＰＶ株６３０ａワクチンの有効性を調査し、ＣＰＶ株６３０ａワクチンの有効性を市販のＣＰＶワクチンと比較することであった。
試験の目的は、幼若な仔イヌにおける母体由来抗体（ＭＤＡ）の存在下でのＣＰＶ株６３０ａワクチンの有効性を調査し、ＣＰＶ株６３０ａワクチンの有効性を市販のＣＰＶワクチンと比較することであった。
ワクチン接種済の母親に生まれた子犬は、初乳からイヌパルボウイルスに対する母体抗体を受動的に獲得することが十分に確立されている。現場でのイヌパルボウイルスに対するイヌの日常的なワクチン接種は現在一般的であるため、有効なワクチンの顕著な特徴は、残留母体抗体を克服し、能動免疫応答を上昇させるその能力に関連している。この試験は、ＣＰＶ ６３０ａ株が母体由来抗体を克服する能力を調べるために行われた。
ワクチンウイルスの排出及び拡散による追加のブースター効果を回避するために、各ワクチン接種済の仔イヌは、抗体陽転がワクチン接種の有効性のみに起因し得るように、１匹のみの他のワクチン接種されていないセンチネル仔イヌとのペアとして飼育された。この収容方法は、ほとんどの仔イヌが同腹仔群から分離され、定住地に移動した後に遭遇する生物学的に隔離された収容を反映している。
試験設計
５～６週齢の仔イヌを仔イヌのペアに分け、各群は、１匹のワクチン接種済の仔イヌ及び１匹のワクチン接種されていないセンチネル仔イヌを含んでいた。仔イヌの各ペアを別々の生物収容室に収容した。
５～６週齢の仔イヌを仔イヌのペアに分け、各群は、１匹のワクチン接種済の仔イヌ及び１匹のワクチン接種されていないセンチネル仔イヌを含んでいた。仔イヌの各ペアを別々の生物収容室に収容した。
仔イヌをＨＡＩによるワクチン接種の前にスクリーニングし、ワクチン接種動物を、野外の同じ年齢の仔イヌに見られる同等レベルを表す一連の低、中及び高母体抗体力価を有するように選択した。ワクチン接種されていないセンチネルは、それらのペアワクチン接種物と同等又はそれより低いレベルの抗体を有するように選択された。
全てのワクチン接種済の仔イヌに、ＣＰＶ ６３０ａワクチン又は競合ワクチンの単回用量による単回ワクチン接種を行った。センチネルの仔イヌにはクチン接種しなかった。
ワクチン接種前及びワクチン接種後の血清学的状態を決定するために、全ての仔イヌから、イヌパルボウイルス血清学についての定期的な時点で採血した。抗体力価と疾患からの防御との間に強い相関があるため、ＭＤＡを克服して抗体陽転を引き起こすＣＰＶ ６３０ａワクチン株の能力を有効性のマーカーとして使用した。毎日の直腸スワブも採取し、排出及び拡散を監視した。
全ての仔イヌを、日常的な毎日の管理の一部として毎日観察された。
ワクチン：
ＣＰＶ／ＣＤＶ混合ワクチン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール）；１用量／バイアル、
ＣＰＶ／ＣＤＶ混合ワクチン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール）；１用量／バイアル、
凍結乾燥
力価ＣＰＶ株６３０ ａ：１０５．８ ＴＣＩＤ５０／用量
力価ＣＤＶ：１０６．４ ＴＣＩＤ５０／用量
Ｎｏｂｉｖａｃ溶媒（希釈剤）；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｂｖ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール。
－Ｖｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ（Ｚｏｅｔｉｓ、ＣＰＶ－２ｂ株ＢＩＯ １２／Ｂ）；１．０ｍｌ／用量、凍結乾燥
力価ＣＰＶ株６３０ ａ：１０５．８ ＴＣＩＤ５０／用量
力価ＣＤＶ：１０６．４ ＴＣＩＤ５０／用量
Ｎｏｂｉｖａｃ溶媒（希釈剤）；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｂｖ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール。
－Ｖｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ（Ｚｏｅｔｉｓ、ＣＰＶ－２ｂ株ＢＩＯ １２／Ｂ）；１．０ｍｌ／用量、凍結乾燥
力価：用量あたり１０４．３～１０６．６ ＴＣＩＤ５０
－Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＣＰＶ－２株１１５－７８０９１６－Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖ．）
力価：用量あたり≧１０５．５ ＴＣＩＤ５０
－Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５（Ｚｏｅｔｉｓ）；１．０ｍｌ／用量、凍結乾燥、供給された溶媒に再懸濁）
力価ＣＤＶ：用量あたり≧１０３．０ ＴＣＩＤ５０
力価ＣＡＶ－２：用量あたり≧１０３．２ ＴＣＩＤ５０
力価ＣＰｉ：用量あたり≧１０６．０ ＴＣＩＤ５０
ＣＰＶ－２ ｃ：用量あたり＞１０７．０ ＴＣＩＤ５０
－Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＣＰＶ－２株１１５－７８０９１６－Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖ．）
力価：用量あたり≧１０５．５ ＴＣＩＤ５０
－Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５（Ｚｏｅｔｉｓ）；１．０ｍｌ／用量、凍結乾燥、供給された溶媒に再懸濁）
力価ＣＤＶ：用量あたり≧１０３．０ ＴＣＩＤ５０
力価ＣＡＶ－２：用量あたり≧１０３．２ ＴＣＩＤ５０
力価ＣＰｉ：用量あたり≧１０６．０ ＴＣＩＤ５０
ＣＰＶ－２ ｃ：用量あたり＞１０７．０ ＴＣＩＤ５０
試験系
ＳＰＦビーグル犬、４～６週齢（雄性及び雌性の両方）
ＳＰＦビーグル犬、４～６週齢（雄性及び雌性の両方）
治療
ワクチン接種直前に、供給された希釈剤１ｍｌにＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐを再懸濁した。Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐを１ｍｌのすぐに使用できる液体として供給した。Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５を、供給された１ｍｌの希釈剤（Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５（溶媒））に再懸濁した。
ワクチン接種直前に、供給された希釈剤１ｍｌにＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐを再懸濁した。Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐを１ｍｌのすぐに使用できる液体として供給した。Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５を、供給された１ｍｌの希釈剤（Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５（溶媒））に再懸濁した。
結果
ＨＡＩ及びＳＮアッセイによる仔イヌの血清学的応答を以下の表６及び７に詳述する。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
ＨＡＩ及びＳＮアッセイによる仔イヌの血清学的応答を以下の表６及び７に詳述する。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
結論
ＣＰＶ ６３０ａワクチン：
イヌパルボウイルスに対する防御免疫は、ワクチン接種に応答して開始された中和抗体応答によって測定することができる。罹患率及び死亡率が幼若な仔イヌにおいて最も高いことを考えると、母体由来抗体の存在下で防御免疫応答を開始する能力は、有効なワクチンにとって特に重要である。
ＣＰＶ ６３０ａワクチン：
イヌパルボウイルスに対する防御免疫は、ワクチン接種に応答して開始された中和抗体応答によって測定することができる。罹患率及び死亡率が幼若な仔イヌにおいて最も高いことを考えると、母体由来抗体の存在下で防御免疫応答を開始する能力は、有効なワクチンにとって特に重要である。
表６及び表７の血清学的データは、本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンが、低レベルから高レベルの母体由来抗体を有する５～６週齢の仔イヌにおいてイヌパルボウイルスに対する防御免疫を誘導することができることを示す。各ワクチン接種済の仔イヌを、他の１匹のワクチン接種されていないセンチネル仔イヌとのペアとして収容したため、抗体陽転は、ワクチン接種の有効性のみに起因し得る。この収容方法は、ほとんどの仔イヌが同腹仔群から分離され、定住地に移動した後に遭遇する生物学的に隔離された収容を反映している。大部分の場合、新しく引き取られた仔イヌは、単頭飼育又は多頭飼育に入り、そこでは、任意の既存の（１又は複数の）イヌがしばらく前に一次ワクチン接種を完了している。
ワクチン接種動物：
全てのワクチン接種済の仔イヌがワクチン接種後に抗体陽転した。表６の血清学的ＨＡＩデータは、各イヌの経時的応答がワクチン接種日に存在する母体抗体のレベルに依存することを示している。７２及び１４４ ＨＡＩ単位の母体抗体力価を有する２匹の仔イヌは、７日目までに血清学的応答を示した。その後、４１６及び５７６ ＨＡＩ単位の抗体力価を有する更に２匹の仔イヌが９日目までに抗体陽転した。５７６ ＨＡＩ単位の抗体力価を有する５番目の仔イヌは、１１日目までに強く抗体陽転した。抗体陽転後、試験の残りの期間を通して、全ての抗体力価が高いままであった。異なるＣＰＶ ２ａ、２ｂ又は２ｃ生物型のそれぞれに対して得られた抗体力価に観察可能な差はなかった。
全てのワクチン接種済の仔イヌがワクチン接種後に抗体陽転した。表６の血清学的ＨＡＩデータは、各イヌの経時的応答がワクチン接種日に存在する母体抗体のレベルに依存することを示している。７２及び１４４ ＨＡＩ単位の母体抗体力価を有する２匹の仔イヌは、７日目までに血清学的応答を示した。その後、４１６及び５７６ ＨＡＩ単位の抗体力価を有する更に２匹の仔イヌが９日目までに抗体陽転した。５７６ ＨＡＩ単位の抗体力価を有する５番目の仔イヌは、１１日目までに強く抗体陽転した。抗体陽転後、試験の残りの期間を通して、全ての抗体力価が高いままであった。異なるＣＰＶ ２ａ、２ｂ又は２ｃ生物型のそれぞれに対して得られた抗体力価に観察可能な差はなかった。
血清中和（表７）の結果は、ＨＡＩの結果を広く反映し、ＭＤＡの低下及び抗体陽転のパターンは同一であった。
ワクチンウイルスは、２～４日間にわたって各ワクチン接種済の仔イヌから排出され、排出の開始は抗体陽転の直前に起こった（表６及び７）。
センチネル：
ワクチン接種されていない年齢適合のセンチネル仔イヌを各ワクチン接種動物と共に個別に収容すると、ワクチンウイルスの排出及び拡散が強調された。各センチネルは、そのペアワクチン接種動物と同等又はわずかに低いレベルの母体抗体を有するように選択されたため、排出及び拡散の動態は最悪のシナリオを表す。
ワクチン接種されていない年齢適合のセンチネル仔イヌを各ワクチン接種動物と共に個別に収容すると、ワクチンウイルスの排出及び拡散が強調された。各センチネルは、そのペアワクチン接種動物と同等又はわずかに低いレベルの母体抗体を有するように選択されたため、排出及び拡散の動態は最悪のシナリオを表す。
ペアワクチン接種動物の糞便中のウイルス排出後、センチネル仔イヌのうち４匹が抗体陽転した。イヌが生来探究的な性質を有することを考慮して、排出されたワクチンウイルスを部屋の床の糞便物質から採取し、口腔鼻腔経路を介してイヌにワクチン接種した。
２匹のセンチネル仔イヌでは、ペアワクチン接種動物における排出期間と一致する１日に、一過性の低レベルのワクチンウイルスが単離された。これは、感染した糞便がイヌを介して確率的に移動すると考えられ、腸から複製ウイルスが能動的に排出されることを表すものではない。この物質の摂取から４日後、活発な複製及び排出が観察された。
群５のセンチネル仔イヌは、そのペアワクチン接種動物において同様の排出プロファイルにもかかわらず、試験の経過中に抗体陽転しなかった。この仔イヌは高レベルの母体抗体を有していたため、仔イヌが接触したワクチンウイルスの量は、存在する母体抗体を克服するのに十分ではなかった可能性が高い。これは、動物間の排出及び拡散動態の変動する性質を反映しており、野外状況を反映している可能性が高い。
市販のワクチン：
血球凝集阻害（表６）：
市販のワクチンであるＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ、Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ及びＶａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５は、低いＭＤＡレベルから中程度のＭＤＡレベルを有する仔イヌにおいてイヌパルボウイルスへの活発な抗体陽転を誘導することができた。本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンとは対照的に、市販のワクチンは、４１６／４４８～５７６ ＨＡＩ単位のＭＤＡレベルを突破することができなかった。Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５は、２０８ ＨＡＩの中程度のＭＤＡレベルを一貫して突破することができなかった。市販のワクチンでは、ワクチン接種後に４匹のワクチン接種済の仔イヌのうち２匹が抗体陽転し、共同収容されたセンチネルのいずれも抗体陽転しなかった。
血球凝集阻害（表６）：
市販のワクチンであるＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ、Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ及びＶａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５は、低いＭＤＡレベルから中程度のＭＤＡレベルを有する仔イヌにおいてイヌパルボウイルスへの活発な抗体陽転を誘導することができた。本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンとは対照的に、市販のワクチンは、４１６／４４８～５７６ ＨＡＩ単位のＭＤＡレベルを突破することができなかった。Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５は、２０８ ＨＡＩの中程度のＭＤＡレベルを一貫して突破することができなかった。市販のワクチンでは、ワクチン接種後に４匹のワクチン接種済の仔イヌのうち２匹が抗体陽転し、共同収容されたセンチネルのいずれも抗体陽転しなかった。
この試験のデータは、各イヌの（経時的な）応答がワクチン接種日に存在するＭＤＡのレベルに依存することを示している。１４４ ＨＡＩ単位のＭＤＡ力価を有する２匹の仔イヌについては、９日目及び１１日目に抗体陽転が検出された（それぞれＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ及びＥｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ）。その後、２８８ ＨＡＩ単位の抗体力価を有する２匹の仔イヌは、１１及び１４日目に検出された血清学的応答を開始した（それぞれＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ及びＥｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ）。Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５ワクチン接種済の仔イヌは７日目までに抗体陽転し、活発な抗体陽転が試験の残りの期間を通して明らかであったが、力価は予測されるよりも低かった。
抗体陽転後、試験の残りの期間を通して、全ての抗体力価が安定なままであった。しかしながら、市販のワクチンでは、ＭＤＡがより低く、抗体陽転がより早い仔イヌは、後に抗体陽転したＭＤＡがより高い仔イヌよりも高い抗体力価を示した。さらに、Ｖｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐをワクチン接種した仔イヌは、Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐをワクチン接種した仔イヌよりも高い抗体力価を示した。２１日目に、群６（２８８）及び群９（１４４）のＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ仔イヌは、それぞれ１４，３３６及び３６，８６４ ＨＡＩ単位のピーク抗体力価を上昇させたが、群１２（２８８）及び群１３（１４４）のＥｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ仔イヌは、それぞれ３３２８及び９２１６ ＨＡＩ単位のピーク抗体力価を上昇させた。群１２（２８８）の仔イヌで測定されたピーク抗体力価は他の仔イヌのものよりも著しく低く、試験の終了までに１１５２ ＨＡＩ単位／２２６３ ＳＮ単位で横ばいになった。
血清中和（表７）：
血清中和の結果は、ＨＡＩの結果を広く反映し、ＭＤＡの低下及び抗体陽転のパターンは同一であった。
血清中和の結果は、ＨＡＩの結果を広く反映し、ＭＤＡの低下及び抗体陽転のパターンは同一であった。
直腸スワブからのウイルス単離：
本発明のＣＰＶ株６３０ａで実証されているように、ワクチンウイルスは２～４日間にわたって各ワクチン接種済の仔イヌから排出され、排出の開始は抗体陽転の直前に起こった。続いて、５匹のセンチネル仔イヌのうち４匹が、ペアワクチン接種動物の糞便中のウイルス排出後に抗体陽転した。
本発明のＣＰＶ株６３０ａで実証されているように、ワクチンウイルスは２～４日間にわたって各ワクチン接種済の仔イヌから排出され、排出の開始は抗体陽転の直前に起こった。続いて、５匹のセンチネル仔イヌのうち４匹が、ペアワクチン接種動物の糞便中のウイルス排出後に抗体陽転した。
Ｖｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ及びＥｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐワクチンウイルスは、ＣＰＶ株６３０ａよりも少量しか排出されないようであり、排出されたウイルスはセンチネルに拡散しなかった。ワクチンウイルスを、４匹の抗体陽転ワクチン接種済の仔イヌのうち３匹（１４４ ＨＡＩ単位の最低開始ＭＤＡ力価を有する２匹のＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ仔イヌ及びＥｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ仔イヌ）の直腸スワブから単離した。排出が２～４日間にわたって検出され、排出の開始が抗体陽転の直前に起こった。これにもかかわらず、ウイルス排出量は、センチネル仔イヌに存在するＭＤＡを克服し、抗体陽転又はウイルス排出を誘導するのに十分ではなかった。ウイルスは、２８８ ＨＡＩ単位のより高い開始ＭＤＡ力価を有する第２の抗体陽転ワクチン接種済のＥｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐの仔イヌから単離することができなかった。この仔イヌは、遅発性の抗体陽転（１４日目）を示し、３３２８ ＨＡＩ単位／４０３２ ＳＮ単位のピークＨＡＩ力価しか発現せず、おそらくｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス複製の制限を示している。したがって、２８８ ＨＡＩ単位のＭＤＡ力価がこのワクチン株に対する有効性の閾値を表すことが考えられる。Ｖａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５ワクチンウイルスは、ＣＰＶ株６３０ａよりも排出（ｓｈｅｄ）しないか、又は程度が低いようであり、排出されたウイルスはセンチネルに拡散しなかった。ワクチンウイルスは、抗体陽転した仔イヌを含むワクチン接種済の仔イヌのいずれの直腸スワブからも単離されなかった。
概要
日常的な生産で見られるバッチを代表する力価を有する本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンの単回用量の投与は、５～６週齢の仔イヌにおいて低レベルから高レベルの母体抗体を突破することができる。ワクチン接種されていないセンチネルを各ワクチン接種されたイヌと共に個別に収容することは、ワクチン接種後の排出及び拡散の動態に光を当て、群収容動物におけるワクチン接種に対する血清学的応答を試験する潜在的な問題を強調する。
日常的な生産で見られるバッチを代表する力価を有する本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンの単回用量の投与は、５～６週齢の仔イヌにおいて低レベルから高レベルの母体抗体を突破することができる。ワクチン接種されていないセンチネルを各ワクチン接種されたイヌと共に個別に収容することは、ワクチン接種後の排出及び拡散の動態に光を当て、群収容動物におけるワクチン接種に対する血清学的応答を試験する潜在的な問題を強調する。
本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンについて観察された結果とは対照的に、市販のワクチンＶｅｒｓｉｃａｎ Ｐｌｕｓ Ｐ（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｅｕｒｉｃａｎ Ｐｒｉｍｏ Ｐ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｂ．Ｉ．））又はＶａｎｇｕａｒｄ Ｐｌｕｓ ５のバッチの単回用量の投与は、より高いＭＤＡレベルを突破することができない。さらに、ワクチンウイルスは、ワクチン接種されていない共同収容されたセンチネル仔イヌには排出及び拡散されなかった。
［実施例４］
目的
この試験は、ＣＰＶ ６３０ａ株を含むワクチンが４週齢からイヌパルボウイルスに対する母体由来抗体を克服する能力を調べるために実施された。ワクチン接種済の母親に生まれた子犬は、初乳からイヌパルボウイルスに対する母体抗体を受動的に獲得することが十分に確立されている。現場でのイヌパルボウイルスに対するイヌの日常的なワクチン接種は現在一般的であるため、有効なワクチンの顕著な特徴は、残留母体抗体を克服し、能動免疫応答を上昇させるその能力に関連している。
目的
この試験は、ＣＰＶ ６３０ａ株を含むワクチンが４週齢からイヌパルボウイルスに対する母体由来抗体を克服する能力を調べるために実施された。ワクチン接種済の母親に生まれた子犬は、初乳からイヌパルボウイルスに対する母体抗体を受動的に獲得することが十分に確立されている。現場でのイヌパルボウイルスに対するイヌの日常的なワクチン接種は現在一般的であるため、有効なワクチンの顕著な特徴は、残留母体抗体を克服し、能動免疫応答を上昇させるその能力に関連している。
試験設計
４週齢の１６匹の仔イヌを２つの群に分けた；１１匹のワクチン接種動物の１つの群（群１）及び５匹の対照の第２の群（群２）。
４週齢の１６匹の仔イヌを２つの群に分けた；１１匹のワクチン接種動物の１つの群（群１）及び５匹の対照の第２の群（群２）。
全ての仔イヌは、従来のワクチン接種された母親に生まれ、したがって、野外状況を代表する様々なレベルのイヌパルボウイルスに対する母体抗体を有していた。全ての仔イヌを血清学について事前スクリーニングし、母体抗体の相対レベルを２つの群にわたって等しく広げた。
群１の全ての仔イヌは、４週齢でＣＰＶ ６３０ａワクチンの単回用量による単回ワクチン接種を受けた。群２の仔イヌにはワクチン接種しなかった。２つの群を別々の生物収容室に収容した。
ワクチン接種前及びワクチン接種後の血清学的状態（群１）又は経時的な母体由来抗体の自然減少（群２）を決定するために、全ての仔イヌからイヌパルボウイルス血清学について週２回採血した。抗体力価と疾患からの防御との間に強い相関があるため、この時間枠内でＭＤＡを克服して抗体陽転を引き起こすＣＰＶ ６３０ａワクチン株の能力を有効性のマーカーとして使用した。
全ての仔イヌを、日常的な毎日の管理の一部として毎日観察された。試験終了時に、全ての仔イヌを安楽死させた。
ワクチン：
ＣＰＶ／ＣＤＶ混合ワクチン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール）；１用量／バイアル、凍結乾燥
力価ＣＰＶ株６３０ ａ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量
力価ＣＤＶ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量
Ｎｏｂｉｖａｃ溶媒（希釈剤）；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｂｖ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール。
ＣＰＶ／ＣＤＶ混合ワクチン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール）；１用量／バイアル、凍結乾燥
力価ＣＰＶ株６３０ ａ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量
力価ＣＤＶ：１０５．１ ＴＣＩＤ５０／用量
Ｎｏｂｉｖａｃ溶媒（希釈剤）；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｂｖ／ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、ボクスメール。
試験系
ＳＰＦビーグル犬、４週齢、（雄性及び雌性）
ＳＰＦビーグル犬、４週齢、（雄性及び雌性）
結果：
仔イヌの血清学的応答を以下の表８及び表９に詳述する。血液凝集阻害（ＨＡＩ）応答値を以下の表８に示す。血清中和（ＳＮ）値を以下の表９に示す。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
仔イヌの血清学的応答を以下の表８及び表９に詳述する。血液凝集阻害（ＨＡＩ）応答値を以下の表８に示す。血清中和（ＳＮ）値を以下の表９に示す。示される結果は、ＣＰＶ－２ｃ抗原に対して測定されたものである。
結論
血清学的データは、パルボウイルス株６３０ａを含む本発明のワクチンが、中等度～高レベルの母体由来抗体を有する４週齢の仔イヌにおいてイヌパルボウイルスに対する防御免疫を誘導することができることを示す。
血清学的データは、パルボウイルス株６３０ａを含む本発明のワクチンが、中等度～高レベルの母体由来抗体を有する４週齢の仔イヌにおいてイヌパルボウイルスに対する防御免疫を誘導することができることを示す。
ワクチン接種動物：
群１の各仔イヌに、最小効力に製剤化した単回用量の試験ワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種の日に、ワクチン接種動物において測定された母体抗体レベルの範囲は、２８８ ＨＡＩ単位と１６６４ ＨＡＩ単位との間及び８０６ ＳＮ５０単位と４５２５ ＳＮ５０単位との間であった（ＣＰＶ－２ｃに対する）。全てのワクチン接種済の仔イヌは、対照における母体由来抗体の減衰前に抗体陽転した。抗体陽転後、試験の残りの期間を通して、全ての抗体力価が高いままであった。
群１の各仔イヌに、最小効力に製剤化した単回用量の試験ワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種の日に、ワクチン接種動物において測定された母体抗体レベルの範囲は、２８８ ＨＡＩ単位と１６６４ ＨＡＩ単位との間及び８０６ ＳＮ５０単位と４５２５ ＳＮ５０単位との間であった（ＣＰＶ－２ｃに対する）。全てのワクチン接種済の仔イヌは、対照における母体由来抗体の減衰前に抗体陽転した。抗体陽転後、試験の残りの期間を通して、全ての抗体力価が高いままであった。
対照：
対照仔イヌにはワクチン接種しなかった。ワクチン接種の日に、対照仔イヌに存在する母体由来抗体レベルは、ワクチン接種済の仔イヌに存在するものと同様の範囲内であった（２８８及び８３２ ＨＡＩ単位、並びに６４０及び４０３２ ＳＮ５０単位（ＣＰＶ－２ｃに対して））。各仔イヌ内の母体抗体レベルは経時的に予測可能に低下し、半減期は約１１～１４日であった。
対照仔イヌにはワクチン接種しなかった。ワクチン接種の日に、対照仔イヌに存在する母体由来抗体レベルは、ワクチン接種済の仔イヌに存在するものと同様の範囲内であった（２８８及び８３２ ＨＡＩ単位、並びに６４０及び４０３２ ＳＮ５０単位（ＣＰＶ－２ｃに対して））。各仔イヌ内の母体抗体レベルは経時的に予測可能に低下し、半減期は約１１～１４日であった。
概要
結論として、本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンの単回用量の投与は、４週齢の仔イヌに存在する母体由来抗体のレベルの全てを突破することができた。データは、母体由来抗体が４週齢からの仔イヌのワクチン接種を干渉しないことを実証している。
結論として、本発明のＣＰＶ ６３０ａワクチンの単回用量の投与は、４週齢の仔イヌに存在する母体由来抗体のレベルの全てを突破することができた。データは、母体由来抗体が４週齢からの仔イヌのワクチン接種を干渉しないことを実証している。
本発明は、以下の実施形態に関する。
１．パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスであって、
前記生弱毒化パルボウイルスが、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として前記動物に投与され、そして、前記２～２０週目の間に投与される、生弱毒化パルボウイルス。
１．パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスであって、
前記生弱毒化パルボウイルスが、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として前記動物に投与され、そして、前記２～２０週目の間に投与される、生弱毒化パルボウイルス。
２．前記生弱毒化パルボウイルスが、前記動物に投与され、前記動物が２～１２週齢の間、好ましくは２～１０週齢の間に単回用量として投与される、実施形態１に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
３．前記生弱毒化パルボウイルスが、追加の用量で前記動物に投与され、そして、前記動物が１１～２０週齢の間に投与される、実施形態１で使用するための生弱毒化パルボウイルス。
４．前記投与がパルボウイルス感染に対する能動免疫を刺激する、実施形態１～３のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
５．前記免疫の発現が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後、５又はそれより前、好ましくは３日又はそれより前に達成される、実施形態１～４のいずれか一項に記載使用のための生弱毒化パルボウイルス。
６．前記動物における母体由来抗体の前記存在が前記治療の有効性を干渉しない、実施形態１～５のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
７．投与が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される母体由来抗体（ＭＤＡ）の動物のワクチン接種前のヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）力価とは無関係に行われる、実施形態１～６のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
８．ワクチン接種時に測定された前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が１２８より高い、又は２８８より高い、好ましくは５７６より高い、実施形態１～６のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
９．前記生弱毒化パルボウイルスがイヌパルボウイルスである、実施形態１～８のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
１０．前記動物がイヌである、実施形態１～９のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
１１．前記イヌが、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも２週間の期間中、単独のワクチン接種済のイヌとして収容される、実施形態１０に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
１２．前記ウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸、及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ又は２ｃのキャプシド遺伝子を含み、
そしてここで、前記非キャプシド領域が、弱毒化変異を保有する、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
そしてここで、前記非キャプシド領域が、弱毒化変異を保有する、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
１３．前記ウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸、及び前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む、実施形態１２に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
１４．前記ウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードするキャプシド遺伝子を含む、実施形態１２又は１３に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
１５．前記ウイルスの前記相同ＤＮＡ断片が、位置２０６２～２０７０の非キャプシド遺伝子に弱毒化変異を保有する、実施形態１２～１４に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
１６．パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスであって、
前記生弱毒化パルボウイルスは、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、投与が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価とは無関係に行われる、生弱毒化パルボウイルス。
前記生弱毒化パルボウイルスは、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、投与が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価とは無関係に行われる、生弱毒化パルボウイルス。
１７．パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスであって、
前記生弱毒化パルボウイルスは、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、２８８より高い、生弱毒化パルボウイルス。
前記生弱毒化パルボウイルスは、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、２８８より高い、生弱毒化パルボウイルス。
１８．パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスであって、
前記生弱毒化パルボウイルスは、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記動物が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも１週間の期間中、単一のワクチン接種動物として収容される、生弱毒化パルボウイルス。
前記生弱毒化パルボウイルスは、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記動物が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも１週間の期間中、単一のワクチン接種動物として収容される、生弱毒化パルボウイルス。
１９．パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するためのワクチンであって、該ワクチンは、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の生弱毒化パルボウイルスを含み、そして、薬学的に許容され得る担体を更に含み、ここで、前記使用が実施形態１～１８のいずれか一項に記載の使用である、ワクチン。
２０．生弱毒化パルボウイルスが、１０５．０ ＴＣＩＤ５０及び１０６．７ ＴＣＩＤ５０の用量で動物に投与される、実施形態１９に記載の使用のためのワクチン。
２１．動物に対して病原性のウイルス若しくは微生物の抗原、又はパルボウイルス以外の前記ウイルス若しくは微生物の免疫原性タンパク質をコードする遺伝情報を更に含む、実施形態１９又は２０に記載の使用のためのワクチン。
２２．動物に対して病原性である前記ウイルス又は微生物が、イヌエーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）、ヴォーゲリ（ｖｏｇｅｌｉ）、ロッシ（ｒｏｓｓｉ）、リーシュマニア－ドノバニ複合体（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ－ｃｏｍｐｌｅｘ）、イヌアデノウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、イヌコロナウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、イヌジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型イクテロヘモリジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、イヌ肝炎ウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）、イヌパラインフルエンザウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、イヌヘパトゾーン（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコヘルペスウイルス（ｆｅｌｉｎｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ネコカリシウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ネコ汎白血球減少症（ｆｅｌｉｎｅ ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａ）、クラミドフィラフェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、及びコロナウイルスからなる群から選択され、前記コロナウイルスが好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｃｏｖｉｄ－１９）．である、実施形態２１に記載の使用のためのワクチン。
２３．動物に対して病原性である前記ウイルス又は微生物が、生弱毒化イヌジステンパーウイルスである、実施形態２２に記載の使用のためのワクチン。
２４．前記イヌジステンパーウイルスがウイルス株Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔである、実施形態２３に記載の使用のためのワクチン。
２５．前記生弱毒化イヌジステンパーウイルスが１０５．０ ＴＣＩＤ５０及び１０６．５ ＴＣＩＤ５０の用量で動物に投与される、実施形態２３又は２４に記載の使用のためのワクチン。
２６．凍結乾燥物の形態で提供される、実施形態１９～２５のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
２７．薬学的に許容され得る担体が、加水分解ゼラチン、カゼイン、ソルビトール及びリン酸二ナトリウム二水和物の組み合わせを含む、実施形態１９～２６のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
２８．投与が皮下投与又は経口投与によって行われる、実施形態１９～２７のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
２９．動物におけるパルボウイルス感染の治療に使用するためのキットであって、該キットは、実施形態１９～２８のいずれか一項に記載の凍結乾燥ワクチンと、溶媒とを含み、ここで、該使用が実施形態１～２８のいずれか一項の使用である、キット。
３０．前記溶媒が、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素カリウム、及び注射用水を含む、実施形態２９に記載の使用のためのキット。
３１．前記凍結乾燥物が投与前に前記溶媒で再構成される、実施形態２９又は３０に記載の使用のためのキット。
３２．実施形態１９～２８のいずれか一項に記載のワクチンの製造方法であって、該方法は、
（１）本明細書に規定される生弱毒化パルボウイルスからの遺伝物質による細胞のトランスフェクション、及び、実施形態１～１８のいずれか一項に規定される生弱毒化パルボウイルスの産生を可能にする条件下で前記細胞を培養することであって、ここで、前記方法が、トランスフェクション後に多くとも２回の前記ウイルスの継代を含み、
（２）細胞培養物からの前記生弱毒化パルボウイルスの単離、および
（３）前記生弱毒化パルボウイルスを薬学的に許容され得る担体と混合する、
ことを含む、方法。
（１）本明細書に規定される生弱毒化パルボウイルスからの遺伝物質による細胞のトランスフェクション、及び、実施形態１～１８のいずれか一項に規定される生弱毒化パルボウイルスの産生を可能にする条件下で前記細胞を培養することであって、ここで、前記方法が、トランスフェクション後に多くとも２回の前記ウイルスの継代を含み、
（２）細胞培養物からの前記生弱毒化パルボウイルスの単離、および
（３）前記生弱毒化パルボウイルスを薬学的に許容され得る担体と混合する、
ことを含む、方法。
３３．実施形態３２に記載の方法によって得ることができる、ワクチン。
３４．パルボウイルス感染のリスクにある動物の治療方法であって、前記方法が、生弱毒化パルボウイルスの投与を含み、前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として前記動物に投与され、前記動物が、２～１２週齢、好ましくは２～１０週齢の間に投与される、方法。
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として前記動物に投与され、前記動物が、２～１２週齢、好ましくは２～１０週齢の間に投与される、方法。
３５．パルボウイルス感染のリスクにある動物の治療方法であって、前記方法が、生弱毒化パルボウイルスの投与を含み、前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、投与時に測定された前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、２８８より高い、方法。
ここで、投与時に測定された前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、２８８より高い、方法。
３６．パルボウイルス感染のリスクにある動物の治療方法であって、前記方法が、生弱毒化パルボウイルスの投与を含み、前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記動物が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも１週間の期間中、単一のワクチン接種動物として収容される、方法。
ここで、前記動物が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも１週間の期間中、単一のワクチン接種動物として収容される、方法。
３７．動物においてパルボウイルス感染の治療のための医薬の製造のための生弱毒化パルボウイルスの使用であって、
前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として前記動物に投与され、前記動物が、２～１２週齢、好ましくは２～１０週齢の間に投与される、使用。
前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として前記動物に投与され、前記動物が、２～１２週齢、好ましくは２～１０週齢の間に投与される、使用。
３８．動物においてパルボウイルス感染の治療のための医薬の製造のための生弱毒化パルボウイルスの使用であって、
前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、２８８より高い、使用。
前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、２８８より高い、使用。
３９．動物においてパルボウイルス感染の治療のための医薬の製造のための生弱毒化パルボウイルスの使用であって、
前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記動物が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも１週間の期間中、単一のワクチン接種動物として収容される、使用。
前記生弱毒化パルボウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記動物が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも１週間の期間中、単一のワクチン接種動物として収容される、使用。
Claims (15)
- パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するための生弱毒化パルボウイルスであって、
前記生弱毒化パルボウイルスが、ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９にイソロイシン以外のアミノ酸及び／又はＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６にグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含み、
ここで、前記生弱毒化パルボウイルスが、単回用量として前記動物に投与され、そして、前記動物が２～２０週齢の間に投与される、生弱毒化パルボウイルス。 - 前記生弱毒化パルボウイルスが、前記動物に投与され、前記動物が２～１２週齢の間に単回用量として投与される、請求項１に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 免疫の発現が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後４日目又はそれより前に達成される、請求項１又は２に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 投与が、前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される母体由来抗体（ＭＤＡ）の動物のワクチン接種前のヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）力価とは無関係に行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 前記生弱毒化パルボウイルスの投与時に測定される前記動物のワクチン接種前のＭＤＡのＨＡＩ力価が、２８８より高い、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 前記生弱毒化パルボウイルスがイヌパルボウイルスであり、及び／又は、前記動物がイヌである、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 前記イヌが、前記生弱毒化パルボウイルスの投与後少なくとも１週間、好ましくは２週間の期間中、単独のワクチン接種済のイヌとして収容される、請求項６に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 前記ウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸、及び／又は、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするＣＰＶ２生物型２ａ、２ｂ又は２ｃのキャプシド遺伝子を含み、
ここで、非キャプシド領域が、弱毒化変異を保有する、
請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。 - 前記ウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるイソロイシン以外のアミノ酸、及び前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードするキャプシド遺伝子を含む、請求項８に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 前記ウイルスが、前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置２１９におけるバリン及び／又は前記ＶＰ２キャプシドタンパク質のアミノ酸位置３８６におけるリジンをコードするキャプシド遺伝子を含む、請求項８又は９に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- 前記ウイルスが、ＣＰＶ２生物型２ｃのキャプシド遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための生弱毒化パルボウイルス。
- パルボウイルス感染から動物を防御するのに使用するためのワクチンであって、該ワクチンは、請求項１～１１のいずれか一項に記載の前記生弱毒化パルボウイルスを含み、そして、薬学的に許容され得る担体を更に含む、ワクチン。
- 動物に対して病原性であるウイルス若しくは微生物の抗原、又は前記ウイルス若しくは微生物の免疫原性タンパク質をコードする遺伝情報を更に含み、前記ウイルス又は微生物が、イヌエーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）、ヴォーゲリ（ｖｏｇｅｌｉ）、ロッシ（ｒｏｓｓｉ）、リーシュマニア－ドノバニ複合体（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ－ｃｏｍｐｌｅｘ）、イヌアデノウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、イヌコロナウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、イヌジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型イクテロヘモリジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型グリポティフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・インテロガンス血清型ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、イヌ肝炎ウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）、イヌパラインフルエンザウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、イヌヘパトゾーン（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコヘルペスウイルス（ｆｅｌｉｎｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ネコカリシウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ネコ汎白血球減少症（ｆｅｌｉｎｅ ｐａｎｌｅｕｃｏｐｅｎｉａ）、クラミドフィラフェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、及びコロナウイルスからなる群から選択される、請求項１２に記載の使用のためのワクチン。
- 請求項１２又は１３に記載のワクチンの製造方法であって、該方法は、
（１）請求項１～１１のいずれか一項に規定される前記生弱毒化パルボウイルスからの遺伝物質による細胞のトランスフェクション、及び、請求項１～１１のいずれか一項に規定される生弱毒化パルボウイルスの産生を可能にする条件下で前記細胞を培養することであって、ここで、前記方法が、トランスフェクション後に多くとも２回の前記ウイルスの継代を含み、
（２）細胞培養物からの前記生弱毒化パルボウイルスの単離、および、
（３）前記生弱毒化パルボウイルスを薬学的に許容され得る担体と混合する、
ことを含む、方法。 - 請求項１４に記載の方法によって得ることができる、ワクチン。
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