BR112012030659B1

BR112012030659B1 - Parvovírus vivo atenuado, vacinas que o compreendem e método para a fabricação das referidas vacinas

Info

Publication number: BR112012030659B1
Application number: BR112012030659-6A
Authority: BR
Inventors: Norman Spibey
Original assignee: Intervet International B.V.
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2021-12-21
Also published as: BR122021023230B1; CN107254451A; CA2802283A1; US20130195913A1; ES2623149T3; EP3199178B1; JP6298499B2; NL301108I2; JP6061850B2; JP2017029140A; BR112012030659A2; JP2013535188A; CN102985108A; BR112012030659B8; US9186398B2; EP2593136A1; BR122021023230B8; CN107254451B; DK3199178T3; EP2593136B1

Abstract

PARVOVÍRUS VIVO ATENUADO, VACINA, E, MÉTODOS PARA A FABRICAÇÃO DE UMA VACINA, E PARA A PREPARAÇÃO DE UM PARVOVÍRUS MUTANTE A invenção se refere aos parvovírus vivos atenuados, seus usos, vacinas compreendedno tais parvovírus vivos atenuados, bem como métodos para sua produção.

Description

[001] A invenção se refere aos parvovírus vivos atenuados, seus usos, vacinas compreendendo tais parvovírus vivos atenuados, bem como métodos para sua produção.

[002] O parvovírus pertence à família de vírus de DNA de fita simples. Os parvovírus podem causar doença em vários animais tais como gatos, cachorros e porcos. Em decorrência dos vírus exigirem células que se dividem ativamente, a fim de se replicar, o tipo de tecido infectado varia com a idade do animal. O trato gastrointestinal e sistema linfático podem ser afetados em qualquer idade, levando ao vômito, diarreia e imunossupressão, mas a hipoplasia cerebelar é observada apenas em gatos que foram infectados no útero ou com menos de duas semanas de idade, e a doença do miocárdio é observada em filhotes de cachorro infectados entre as idades de três e oito semanas.

[003] O parvovírus canino (CPV) é uma doença particularmente fatal em filhotes de cachorro, cerca de 80 % fatal, causando dano ao trato gastrointestinal e desidratação, bem como uma síndrome cardíaca em cachorros muito jovens. É disperso por contato com fezes infectadas de cachorro. Os sintomas incluem letargia, diarreia grave, febre, vômito, perda de apetite e desidratação. O parvovírus de porco causa uma doença reprodutiva em suínos conhecida como SMEDI, que corresponde a natimorto, mumificação, morte embrionária e infertilidade. A panleucopenia felina, comumente conhecida como cinomose felina, é uma infecção viral que afeta gatos, causada por parvovírus felino (FPV) que é muito próximo do parvovírus canino. A panleucopenia felina é comum em gatos jovens e causa febre, baixa contagem de células brancas do sangue, diarreia e morte. A infecção do feto de gato e gatos jovens com menos de duas semanas causa hipoplasia cerebelar. O vírus da enterite dos visons é similar em efeito à panleucopenia felina, com a exceção de que não causa hipoplasia cerebelar. Um parvovírus diferente causa doença aleutiana em visons e outros mustelídeos, caracterizada por linfadenopatia, esplenomegalia, glomerulonefrite, anemia e morte. O diagnóstico mais exato de parvovírus é por ELISA. Cachorros, gatos e suínos são comumente vacinados contra os parvovírus.

[004] No nível do DNA, os parvovírus canino, felino e porcino são conhecidos por apresentar um genoma muito homólogo. O parvovírus canino CPV2 é um vírus que é responsável por uma enterite aguda e algumas vezes fatal em cachorros (Kelly, Aust. Vet. J. 54; 593, 1978; Appel et al, Vet. Rec. 105; 156-159, 1979). O vírus, que apareceu primeiro em torno de 1977, provavelmente originou-se de um vírus muito semelhante em gatos, o vírus da panleucopenia felina (FPLV), por meio de um pequeno número de mutações na proteína simples do capsídeo; um salto entre espécies que pode ter envolvido a passagem intermediária em outros carnívoros, tal como visom ou guaxinins (Truyen et al, VirolIny 215, 186-189, 1996).

[005] Em 1979 os primeiros variantes de CPV2 apareceram, denominados CPV2a, e foram seguidos rapidamente pelo aparecimento de CPV2b em 1984. (Parrish et al, Science 230, 1046-1048, 1985, e J. Virol. 65; 6544-6552, 1991).

[006] O vírus tipo 2 original desaparecido do campo tem sido substituído atualmente pelos tipos 2a e 2b, embora as proporções relativas destes dois tipos possam variar de pais para pais (Truyen et al, supra; Chinchkar et al, Arch. Virol. 151, 1881-1887, 2006; Pereira et al, Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007). As mudanças no aminoácido na proteína do capsídeo (VP2), que caracterizam o deslocamento de 2 para 2a e para 2b, são muito limitadas. As substituições nas posições 87 (Met para Leu), 300 (Ala para Gly), 305 (Asp para Tyr) e 555 (Val para lie) ocorreram na evolução de 2 para 2^, e 426 (Asn para Asp), e 555 (lie para Val) na emergência de 2b a partir de 2a (Parrish et al, supra; Truyen et al, J. Virol. 69, 4702-4710, 1995). Recentemente, as cepas 2a que não apresentam a substituição de Val para lie na posição 555 foram relatadas (Wang et al, Virus Genes 31, 171-174, 2005; Martella et al, Virus Genes 33, 11-13, 2006). Parece que uma mudança simples no aminoácido pode diferenciar as sequências CPV2a e CPV2b VP2.

[007] Mais recentemente, as cepas emergiram na Itália, nas quais o aminoácido na posição 426 (Asn em 2a e Asp em 2b) se tornar um resíduo de ácido glutâmico (Glu) (Buonavoglia et al, J. Gen. Virol. 82, 3021-3025, 2001; Martella et al, J. Clin. Microbiol. 42, 1333-1336, 2004). O fato de que estas variantes de Glu 426, denominados vírus CPV2c, são circulantes e coexistem com outros tipos de CPV na Itália e outros países da europa (Decaro et al, J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006), e que também foram isolados em países tão geograficamente diversos quanto Vietnã e Escócia (Nakamura et al, Arch Virol.149, 2261-2269, 2004, Spibey et al, Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008), sugere que apresentam uma vantagem em pelo menos uma proporção da população de cachorros.

[008] A evolução relativamente rápida do parvovírus canino resultou na perda e a seguir na recuperação da faixa de hospedeiros felinos (Truyen et al, 1996 supra), e esta capacidade de replicação recuperada em gatos pode explicar bem a substituição do vírus tipo 2 original pelos variantes 2a, 2b e 2c. No final dos anos 70 e início de 80, tanto vacinas de FLP vivo quanto inativado foram usadas para proteger cachorros contra a doença CPV, em virtude dos antígenos semelhantes que estimularam a proteção cruzada, entretanto, o nível de proteção fornecido era pobre e a duração da imunidade era curta. Estas vacinas foram substituídas por vacinas de CVP vivo atenuado, que forneceu boa proteção e duração mais longa de imunidade. Atualmente, as vacinas de vírus vivo atenuado são derivadas tanto de CPV2b isolados quanto do vírus tipo 2 original. Uma vez que o vírus tipo 2 foi totalmente substituído no campo pelo vírus 2a, 2b e agora 2c, existe a preocupação com o nível de proteção fornecido pelas vacinas com vírus tipo 2 atenuado (Pratelli et al., Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001; Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999).

[009] Entretanto, com base nos estudos com anticorpos monoclonais disponíveis, cada novo variante antigênico perde pelo menos um epítopo de neutralização, comparado com a variante molde (Strassheim et al, Virology 198, 175-184, 1994; Pereira et al, supra). Demonstrou-se previamente que a vacina com CPV2 vivo atenuado é capaz de proteger cachorros contra os desafios de campo com 2a e 2b (Greenwood et al, Vet. Record. 136, 63-67, 1995), apesar de estudos de neutralização cruzada conduzidos in vitro usando soros elevados contra os vários tipos antigênicos mostrarem diferenças acentuadas (Pratelli et al, supra).

[0010] Recentemente mostrou-se que a vacina com vírus tipo 2 vivo atenuado (Nobivac-Intervet) foi capaz de proteger cachorros de desafio com a variante de CPV mais recente, CPV2c (Spibey et al, Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008).

[0011] Apesar disso, existe uma necessidade no campo de vacinas que combinam a indução de um nível suficiente de imunidade em animais, em particular gatos, cachorros e porcos, contra infecção com parvovírus com um comportamento muito atenuado. Um nível elevado de atenuação é sinônimo de segurança, especialmente em animais jovens e velhos.

[0012] É um objetivo da presente invenção fornecer novos parvovírus vivos que são atenuados, embora ainda imunogênicos. Tais vírus fornecem uma base para vacinas seguras.

[0013] Com relação a isto, uma modalidade da presente invenção se refere aos parvovírus vivos atenuados (PV) que compreendem um aminoácido sem ser isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína do capsídeo, e/ou um aminoácido sem ser uma glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína do capsídeo (com a condição de que o PV não é o CPV que está presente na vacina de parvovírus canino Nobivac Parvo C). Uma sequência compreendida neste CPV (o CPV da vacina de parvovírus canino Nobivac Parvo C) é fornecida em SEQ ID NO: 1.

[0014] Observa-se surpreendentemente que estes dois sítios na posição de aminoácido 219 e 386 do gene de capsídeo desempenham um papel importante na atenuação do vírus. Até o momento, aceita-se principalmente que os aminoácidos fora da região do capsídeo estão envolvidos na virulência/atenuação dos vírus.

[0015] O local da isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína do capsídeo, e de uma glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína do capsídeo, é idêntico tanto no parvovírus canino quanto felino, independente do sorotipo. Isto significa que a invenção pode ser pelo menos universalmente aplicada ao parvovírus felino e ao parvovírus canino. A invenção também pode ser aplicada, por exemplo, ao parvovírus porcino que apresenta uma isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína do capsídeo, e/ou uma glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína do capsídeo.

[0016] É especificamente renunciado a partir da presente invenção o CPV que está presente na vacina de parvovírus canino Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health), que compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO: 1.

[0017] Assim, uma primeira modalidade da presente invenção se refere a um parvovírus vivo atenuado (PV) que compreende um gene que codifica um capsídeo, um aminoácido sem ser isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína do capsídeo, e/ou um aminoácido sem ser glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína do capsídeo, com a condição de que PV não compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1.

[0018] Apenas para indicar o local da isoleucina na posição de aminoácido 219 e a glutamina na posição de aminoácido 386, os dois aminoácidos são mostrados a seguir (em negrito) em um exemplo do contexto sequencial encontrado na maioria das cepas CPV e FPV.yfqwdrtlipshtgtsg (isoleucina 219 = negrito) yafgrqhgqkttttget (glutamina 386 = negrito)

[0019] Dependendo da cepa que é usada como o material de partida para a substituição de um ou ambos os aminoácidos de acordo com a invenção, pode ser que uma substituição simples do aminoácido na posição 219 ou 386 não seja suficiente, por exemplo, para introduzir o vírus em segurança em animais muito jovens. Se uma atenuação adicional for exigida, a substituição tanto do aminoácido na posição 219 quanto 386 é preferida.

[0020] Portanto, uma forma preferida desta modalidade se refere a um parvovírus vivo atenuado (PV) de acordo com a invenção, que compreende um gene que codifica um capsídeo para um aminoácido sem ser isoleucina na posição de aminoácido 219 da proteína do capsídeo, e um aminoácido sem ser glutamina na posição de aminoácido 386 da proteína do capsídeo.

[0021] Uma forma mais preferida desta modalidade se refere a um parvovírus vivo atenuado (PV), que compreende um gene que codifica um capsídeo para uma valina na posição de aminoácido 219 da proteína do capsídeo, e/ou uma lisina na posição de aminoácido 386 da proteína do capsídeo.

[0022] Uma forma ainda mais preferida desta modalidade se refere a um parvovírus vivo atenuado (PV), que compreende um gene que codifica um capsídeo para uma valina na posição de aminoácido 219 da proteína do capsídeo, e uma lisina na posição de aminoácido 386 da proteína do capsídeo.

[0023] Se uma atenuação mais adicional for preferida, pode ser atraente usar um parvovírus que já apresenta uma outra mutação de atenuação como o material de partida para a introdução de uma substituição de aminoácido de acordo com a invenção.

[0024] Preferivelmente, uma mutação de atenuação como esta está localizada fora da região do capsídeo. Isto pode permitir a substituição de um fragmento de DNA de uma parte da região não capsídeo de um vírus de acordo com a invenção, com uma região de não capsídeo homóloga de uma cepa de parvovírus que carrega uma atenuação naquela região. O parvovírus que carrega uma atenuação em uma parte da região de não capsídeo, por exemplo, é o parvovírus canino da vacina disponível comercialmente Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health).

[0025] A vantagem de uma abordagem como esta é que tal vírus pode apresentar um nível de atenuação ainda maior. Assim, uma forma ainda mais preferida desta modalidade se refere a um parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção, em que este parvovírus é um parvovírus recombinante no qual um fragmento de DNA de uma parte da região de não capsídeo do dito parvovírus é substituído por um fragmento homólogo de DNA de uma parte da região de não capsídeo derivada de um segundo parvovírus, em que o fragmento homólogo de DNA do dito segundo parvovírus carrega uma mutação de atenuação.

[0026] Um fragmento homólogo de DNA de um segundo parvovírus é um fragmento de DNA que apresenta a mesma função do fragmento de DNA do parvovírus de acordo com a invenção, mas difere daquele fragmento de DNA no qual carrega uma mutação que leva o comportamento atenuado do vírus. Apenas como um exemplo, se um fragmento de DNA compreender uma mutação de atenuação em um fragmento de DNA entre os dois sítios de restrição específicos, e estes dois sítios de restrição também estiverem presentes no mesmo local em um vírus que não apresenta esta mutação, o fragmento de restrição que carrega a mutação pode ser considerado homólogo ao mesmo fragmento do vírus que não apresenta esta mutação.

[0027] Uma forma muito preferida desta modalidade se refere a um parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção, em que o fragmento homólogo de DNA do dito segundo parvovírus carrega uma mutação de atenuação na região não estrutural, na região da posição 2061 a 2070.

[0028] Será entendido que o parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção, independente da presença adicional de qualquer atenuação adicional tal como, por exemplo, uma região de não capsídeo atenuada, pode ser obtido de todos os parvovírus em que a transição isoleucina/Xl e/ou glutamina/X2 de acordo com a invenção na proteína do capsídeo pode ser realizada e, assim, pelo menos de todos os elementos atualmente sequenciados de CPV e FPV. (XI e X2 são aminoácidos sem ser isoleucina e glutamina, respectivamente).

[0029] Também será entendido que o vírus híbrido compreendendo um capsídeo de FPV e uma parte principal de não capsídeo de CPV, bem como o vírus híbrido compreendendo um capsídeo de CPV e uma parte principal de não capsídeo de FPV são incluídos na invenção.

[0030] Quando uma vacina for desenvolvida para a proteção de animais, mais especificamente animais de estimação contra infecção por parvovírus, o parvovírus preferido para uso em uma vacina como esta pode ser um parvovírus canino ou um parvovírus felino.

[0031] Assim, uma forma ainda mais preferida desta modalidade se refere ao parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção, em que o parvovírus é um o parvovírus canino ou um parvovírus felino.

[0032] Especificamente, quando uma vacina auxilia especificamente na proteção de cachorros e gatos contra CPV e FPV, respectivamente, o gene de capsídeo do vírus de acordo com a invenção pode codificar preferivelmente uma proteína de capsídeo do sorotipo CPV 2a, 2b ou 2c ou uma proteína de capsídeo de parvovírus felino. Da maneira mencionada anteriormente, a parte de não capsídeo do parvovírus pode ser tanto de origem de CPV quanto de FPV. Portanto, uma forma ainda mais preferida desta modalidade se refere ao CPV vivo atenuado de acordo com a invenção, em que o parvovírus codifica uma proteína de capsídeo do sorotipo CPV 2a, 2b ou 2c ou uma proteína de capsídeo de parvovírus felino.

[0033] Uma outra modalidade da presente invenção se refere a vacinas para a proteção de animais contra infecção com parvovírus, em que tais vacinas compreendem um parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0034] Uma quantidade adequada de parvovírus de acordo com a invenção, para uso em uma vacina, pode estar em muitos casos na faixa de 103 - 109 TCID50, dependendo do nível de atenuação e das características de replicação do vírus. Uma dose infecciosa de vírus que é abaixo de 103 TCID50 pode ser considerada em muitos casos como muito baixa, uma vez que pode levar muito tempo para que o vírus se replique em um nível suficientemente alto para ativar o sistema imune. As quantidades que excedem 109 TCID50 podem ser não atraentes, se for apenas para razões comerciais.

[0035] Uma dose muito adequada pode estar na faixa de 105 - 108 TCID50, ainda melhor entre 106 - 108 TCID50.

[0036] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Apenas como um exemplo, um carreador como este pode ser tão simples quanto água estéril ou uma solução tampão, tal como PBS.

[0037] As vacinas de acordo com a invenção podem ser administradas de várias maneiras. Uma vez que a vacina compreende um vírus vivo atenuado, muitas maneiras de administração tais como administração oral, intranasal, I.M. e subcutânea são possíveis. Uma via de administração preferida é a administração subcutânea.

[0038] Os animais susceptíveis à infecção por parvovírus tais como, i.a., gatos e cachorros são frequentemente vacinados contra várias outras doenças ao mesmo tempo. Portanto, pode ser prático combinar uma vacina de acordo com a invenção com um antígeno adicional de um vírus ou microrganismo patogênico para cachorros e gatos, ou a informação genética que codifica o dito antígeno.

[0039] Assim, uma outra modalidade da invenção se refere a uma vacina de combinação, compreendendo uma vacina de acordo com a invenção e um antígeno adicional de um vírus ou microrganismo patogênico para animais, ou a informação genética que codifica um polipeptídeo imunogênico do dito vírus ou microrganismo.

[0040] O antígeno adicional de um vírus ou um microrganismo pode ser o vírus completo ou microrganismo (em uma forma viva atenuada ou em uma forma inativada), ou um polipeptídeo imunogênico, ou uma outra parte imunogênica deste vírus ou microrganismo tal como, por exemplo, um (lipo- )polissacarídeo capaz de induzir uma resposta imune protetora.

[0041] Preferivelmente, o vírus ou microrganismo patogênico para animais é selecionado do grupo de Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, vogeli, rossi, complexo Leishmania donovam, adenovírus canino, coronavírus canino, vírus da cinomose canina, Leptospira interrogans serovar canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa, bratislava, vírus da hepatite canina, vírus da parainfluenza canina, vírus da raiva, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, vírus da herpes felina, calicivírus felino, panleucopenia felina e Chlamydophila felis.

[0042] As vacinas compreendendo os vírus vivos atenuados têm que ser armazenadas em baixa temperatura, ou têm que ficar em uma forma seca por congelamento. As vacinas secas por congelamento podem ser mantidas em condições moderadas de resfriamento ou mesmo em temperatura ambiente. Frequentemente, a vacina é misturada com estabilizantes, por exemplo, para proteger as proteínas propensas à degradação de serem degradadas, para melhorar a vida em prateleira da vacina, ou para melhorar a eficiência da secagem por congelamento. Os estabilizantes usados são, i.a., SPGA, carboidratos, por exemplo, sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas, tal como albumina ou caseína, ou produtos de degradação destes, e tampões, tais como fosfatos de metal alcalino. Portanto, preferivelmente, a (combinação) vacina de acordo com a invenção está em uma forma seca por congelamento. Além disso, a vacina pode ser suspensa em um diluente fisiologicamente aceitável. Tais tampões, por exemplo, podem ser água estéril, um tampão e similares. É evidente que os diluentes e compostos para emulsificar ou estabilizar vírus também são incorporados na presente invenção.

[0043] Novamente, uma outra modalidade da invenção se refere a métodos para a fabricação de uma (combinação) vacina de acordo com a invenção, em que estes métodos compreendem a mistura de um parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0044] Ainda em uma outra modalidade, a invenção se refere ao parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção para uso como um medicamento. Mais especificamente, esta modalidade se refere ao parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção para uso no tratamento de infecção por parvovírus.

[0045] Novamente, uma outra modalidade da presente invenção se refere ao uso de um parvovírus vivo atenuado de acordo com a invenção para o tratamento de infecção por parvovírus.

[0046] Finalmente, uma outra modalidade da presente invenção se refere aos métodos para a preparação de um parvovírus mutante de acordo com a invenção, em que tais métodos compreendem trocar um fragmento de DNA que codifica pelo menos parte da proteína de capsídeo de parvovírus com um códon na posição de aminoácido 219 que codifica isoleucina, e/ou com um códon na posição de aminoácido 386 que codifica glutamina, por um fragmento de DNA que codifica pelo menos parte da proteína de capsídeo de parvovírus com um códon na posição de aminoácido 219 que codifica um aminoácido sem ser isoleucina, e/ou com um códon na posição de aminoácido 386 que codifica um aminoácido sem ser glutamina.

[0047] Tal alteração de DNA pode ser realizada usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na tecnologia, tais como mutagênese sítio direcionada, troca de fragmentos de restrição e similares. Existem várias maneiras de realizar a substituição de 219 isoleucina em XI ou 386 glutamina em X2. Tais mudanças podem ser introduzidas por síntese química ou PCR, seguido por recombinação do fragmento recentemente sintetizado com DNA viral. Exemplos Exemplo 1: Produção do parvovirus canino clone 630att Materiais de partida Vírus:

Cepas de E. coli

[0048] As cepas de E. Coli JC811 obtidas do centro genético de linhagem de E. coli (USA) e a cepa DL795 (Kramel Biotech UK) foram selecionadas para propagação de plasmídeo de clones infecciosos completos.

Síntese de DNA

[0049] A síntese de DNA personalizada foi realizada por Eurofins MWG GmbH. O fragmento de DNA sintetizado foi fornecido pelo plasmídeo de clonagem pBluescript.

[0050] A construção do clone 630att de parvovírus canino foi um processo multietapas e é descrita aqui em suas etapas separadas.

1) Construção de um clone molecular infeccioso de Nobivac Parvo C (pl54att)

[0051] A forma replicativa (RF) do DNA viral foi obtida das células A72 infectadas com células infectadas de Nobivac Parvo C, usando um método de preparação modificado “Hirt” (Parrish et al 1988, Virology 166, 293-307). O DNA viral foi digerido com inúmeras enzimas de restrição e o genoma foi montado em pBluescript usando metodologia de clonagem de rotina. O esquema de clonagem é representado nas figuras 1-4. O DNA RF de CPV 154att foi primeiro “preenchido na extremidade” usando T4 DNA polimerase. O DNA foi então digerido com EcoRI e Spel. Estas enzimas cortaram uma vez nas posições 1099 e 3459, respectivamente. Esta digestão resulta em três fragmentos marcados A, B e C, em ordem de tamanho. Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel e o fragmento EcoRI/Spel (fragmento A) foi então clonado no plasmídeo pBluescript, que foi preparado por digestão com as mesmas enzimas (ver figura 1). O fragmento final EcoRI (fragmento C) do DNA RF digerido foi então clonado no pBluescript digerido com EcoRI e EcoRV para produzir pCPV C (ver figura 2). Os fragmentos de parvovírus canino A e C foram subclonados junto no mesmo plasmídeo. Os plasmídeos pCPV A e PCPV C foram digeridos com Spel e EcoRI. O inserto CPV foi purificado a partir de pCPV A, e a porção do vetor foi obtida de pCPV C. A ligação então resultou em um plasmídeo em que os fragmentos A e C foram “reunidos” (ver figura 3). O fragmento final Spel (fragmento B) do DNA RF de CPV digerido foi então clonado em pCPV AC. O plasmídeo pCPV AC foi digerido com SpeI e uma enzima Hindi, que cortam deixando as extremidades cegas. Os fragmentos foram ligados e clonados (ver figura 4).

[0052] O plasmídeo resultante foi denominado p154att.

[0053] A confirmação de que um clone completo foi montado foi atingida por transfecção do DNA plasmidial nas células A72, resultando na produção de vírus infecciosos.

[0054] A análise de sequência de DNA do clone plasmidial foi realizada; esta sequência mostrou ser idêntica àquela determinada a partir do DNA viral extraído de células infectadas, da maneira mostrada adicionalmente a seguir.

2) Construção de híbrido 2/2c D9

[0055] O DNA viral foi obtido tanto de células infectadas com Nobivac parvo C quanto separadamente de células infectadas com CPV2c “Jes”. As preparações do DNA viral foram cada uma digeridas com uma enzima de restrição simples para produzir 2 fragmentos de DNA de cada. As digestões enzimáticas foram realizadas de uma maneira tal que o fragmento do lado esquerdo do genoma de Nobivac e o genoma do lado direito do genoma “Jes” compartilhem >200 bp de sequência de sobreposição. Os fragmentos da extremidade esquerda de Nobivac e da extremidade direita de “Jes” foram separados, purificados e misturados (Figura 7).

[0056] A transfecção de células A72 e CrFK com estes fragmentos de sobreposição permitiu que vírus infecciosos fossem produzidos por recombinação natural. Os vírus resultantes foram clonados limitando a diluição e denominados hídrido 2/2c D9.

3) Construção de Clone 630.

[0057] O clone 630 foi desenvolvido a partir do clone de plasmídeo infeccioso pl54att e o DNA foi preparado a partir do híbrido 2/2c D9.

[0058] A enzima de restrição Pad corta o genoma de CPV em dois lugares em torno das posições 561 e 4651; as extremidades mais à esquerda e à direita do genoma. Portanto, o plasmídeo p154att foi digerido com Pad e o fragmento Pad de ~ 4kbp contendo mais de 80 % do genoma foi separado do vetor e das sequências finais, e substituído por aquele obtido do DNA 2/2c D9 híbrido. O plasmídeo resultante foi denominado p630. Isto é ilustrado na figura 5.

[0059] Da maneira prevista, a transfecção de células A72 ou CrFK com p630 resulta na geração de vírus infeccioso, este vírus é denominado 630.

[0060] O vírus 630, assim como o híbrido 2/2c D9, manteve um baixo nível de patogenicidade.

4) Construção de Clone 630att

[0061] 630 vírus mostraram os mesmos níveis baixos de sinais clínicos quando injetados em cachorros

[0062] Uma porção do gene de capsídeo foi sintetizada quimicamente incorporando mudanças de aminoácido observadas em Nobivac parvo C, mas não se observou que ocorrem em cepas de campo. Este fragmento foi então substituído pela mesma região no plasmídeo p630 para criar o plasmídeo p630att; isto é ilustrado na figura 6.

[0063] A sequência de DNA que corresponde àquela entre as posições 3356 e 4029 no genoma de CPV foi sintetizada. A sequência exata de DNA, fornecida aqui como SEQ ID NO: 2, é mostrada a seguir: 1 agatctgaga cattgggttt ttatccatgg aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attagtacca tctcatactg 101 gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat Igttcaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac 201 aggtgatgaa tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa acaaatagag cattgggctt accaccattt 301 ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga aatacaaact 401 atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat 501 tgcagcagga cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt ggtagacaac atggtaaaaa aactaccaca 601 acaggagaaa cacctgagag atttacatat atagcacatc aagatacagg a a g a t a tcca gaaggagatt gg

[0064] Os sítios de enzimas de restrição Bgl II e Xcml são mostrados em negrito e sublinhados.

[0065] A sequência foi liberada do plasmídeo no qual foi fornecida por digestão com Bgl II e Xcml. Os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose, e o fragmento de 672 bp foi isolado e purificado.

[0066] A transfecção de células A72 ou CrFK com p630att resultou na geração de vírus infecciosos (630att), os quais quando administrados aos filhotes não forneceram nenhum sinal clínico.

[0067] Em um estudo comparativo, uma vacina compreendendo o clone 630 e uma vacina compreendendo o clone 630att foram comparadas.

[0068] Cinco cachorros negativos para MDA foram vacinados subcutaneamente com 108 - 108 TCID50 de clone 630 em 1 mL. Isto levou aos sinais leves a moderados em todos os cachorros. A mudança de peso por um período de 5 dias foi -6 % em média, em 5 cachorros, da maneira apresentada na tabela a seguir.

[0069] Cinco cachorros negativos para MDA foram vacinados subcutaneamente com 108 - 108 TCID50 de clone 630att em 1 mL.

[0070] Neste grupo, nenhum sinal clínico, nenhum aumento de temperatura, nenhuma leucopenia, nenhuma diarreia ou vômito foi observado. Além do mais, houve um ganho de peso substancial neste grupo, da maneira apresentada na tabela a seguir.

[0071] Portanto, conclui-se que as vacinas na base do clone 630att se comportam de fato como atenuadas quando comparadas ao clone 630, e apresentam um excelente perfil de segurança.

Exemplo 2: Geração de um vírus recombinante com uma mutação de atenuação fora do gene de capsídeo

[0072] A cepa 154 art foi obtida a partir de um Nobivac Parvo C disponível comercialmente (Intervet Schering-Plough Animal Health) e a cepa Jess foi um isolado de campo de um vírus tipo 2c.

[0073] Os vírus foram crescidos em células renais aderentes caninas ou felinas (por exemplo, A72 & CrFK) usando meio M6B8 que contém 5 % de soro fetal bovino. A forma replicativa (RF) do DNA foi preparada a partir de culturas de células infectadas usando uma modificação do método padrão “Hirt” (McMaster et al 1981).

[0074] O DNA RF preparado a partir da cepa 154 att foi digerido com a enzima de restrição Pstl, e os fragmentos foram separados por eletroforese em gel de agarose. A banda de 3.055 pares de base (bp) (que corresponde à extremidade esquerda de CPV) foi excisada do gel e purificada usando colunas de extração em gel Qiagen Qiaquick. O DNA RF isolado de células infectadas com CPV Jess foi digerido com a enzima de restrição Xmnl. Novamente, os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose, seguido por purificação de uma banda de aproximadamente 2.750 bp (que corresponde à extremidade direita de CPV, incluindo a sequência de capsídeo) usando as colunas de extração em gel Qiagen Qiaquick.

[0075] Os fragmentos purificados de 3.055 bp e 2.750bp de 154att e Jess foram combinados e transfectados em culturas de células A72 ou CrFK. As transfecções foram realizadas usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) com aproximadamente 3μg de cada fragmento, seguindo as instruções do fabricante.

[0076] Após a transfecção, as células foram passadas e monitoradas por ensaio de hemaglutinação (UA). O vírus foi detectado por HA na passagem 4. A determinação da sequência de DNA do vírus híbrido foi realizada usando protocolos padrões de sequenciamento de DNA usando tanto os moldes de DNA RF quanto de fragmentos de PCR. O vírus foi purificado limitando a diluição em células aderentes susceptíveis caninas ou felinas.

Exemplo 3: Vírus recombinante construído a partir do DNA viral clonado

[0077] O vírus recombinante foi gerado a partir dos fragmentos clonados. O genoma da cepa 154att de vírus foi clonado no vetor de clonagem padrão pBluescript (Stratagene inc.). A fim de manter as sequências terminais palindrômicas intactas, o plasmídeo foi propagado no hospedeiro bacteriano DL795, que é deficiente em inúmeros sistemas de recombinação. A clonagem de genomas de parvovírus foi descrita na literatura e as técnicas exigidas são conhecidas pelos versados na técnica. O clone de 154att (pl54att) obtido foi digerido com a enzima de restrição Pac I, de maneira tal que não se permitiu que a digestão fosse finalizada, isto é, a digestão com a enzima de restrição foi apenas parcial. Os fragmentos digeridos foram então submetidos à digestão com a enzima de restrição Xmn I. Os fragmentos de DNA digeridos foram então separados por eletroforese em gel de agarose, e o fragmento indicado no diagrama a seguir foi excisado do gel e purificado usando colunas de extração em gel Qiagen Qiaquick. Os sítios Xmn I e Pac à direita flanqueiam a região de capsídeo no genoma de parvovírus.

[0078] O gene de capsídeo de 154 att foi substituído pelo gene de capsídeo de uma cepa de CPV virulenta da maneira a seguir. O sítio Xmn I site e o Pac I à direita indicados na figura 8 estão fora das extremidades do gene de capsídeo. A sequência de aproximadamente 110 bp entre o sítio Pac I e a extremidade do gene de capsídeo difere significativamente entre a cepa 154att e os isolados virulentos. Ainda não existe nenhuma mudança de sequência recuperada na sequência pequena (-55 bp) entre o sítio Xmn I e o início do gene de capsídeo. Portanto, a fim de limitar a mudança de material apenas da sequência de capsídeo; a sequência de capsídeo CPV virulento foi sintetizada quimicamente, e a sequência específica da vacina entre o sítio Pad e o sinal de parada do capsídeo foram mantidos.

[0079] A seguir, a sequência sintetizada quimicamente é mostrada contendo o gene do capsídeo de CPV. A sequência mostrada a seguir é fornecida aqui como SEQ ID NO: 3. AGAGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGAACAATTGGAAGAAGATTTTCGAGA Xmn I CGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGT GTTAGTAAAGTGGGGGGAGAGGAAAGATTTAATAACTTAACTAAGTATGTGTTTTTTTAT AGGACTTGTGCCTCCAGGTTATAAATATCTTGGGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGA ACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCT TCGCTCTGGTAAAAACCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCA AACTAAGGACGCTAAAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAA GGCAATTGCTCCAGTATTAACTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAA ACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCACCTCATATTTTCATTAATCTTGCAAAAAAAAAAAA AGCCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATGGAGCAGTTCA ACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCAACAGGATCTGGGAACGGGTC TGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAA TCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAG ACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTT GGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACTCATGCACAAATTGTAAC ACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCA ACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAA TGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAA TGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCC AGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCC ATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGG CACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGA AAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTT TTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTT ACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGG AGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACTATATTACTGA AGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGC GTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGA TGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAA AACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGG AAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAGAAGA TAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATAT ATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGG TCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACC ATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTTAAC AAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTT TTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCC AATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGG AGGTATGAAAATTGTATATGAAAAATCTCAGCTAGCACCTAGAAAATTATATTAACATAC T TAG TAT GT T T T TAT GT T TATTAGATAT CAACTAACACCTAGAAAATTATATTAATATAC TTACTATGTTTTTATGTTTATTACATATTATTTTAAGATTAATTAAGGCGCGCC Pad

[0080] Os sítios Xmn I & Pac I são indicados e sublinhados. O códon de parada (TAA) da sequência que codifica a região que codifica o capsídeo (Vpl/Vp2) está em negrito.

[0081] O fragmento sintetizado foi liberado do plasmídeo no qual ele foi fornecido usando as enzimas Xmn I e Pac I, foi então ligado ao fragmento mostrado na figura 9. A E. coli competente (cepa DL795) foi transformada com a mistura de ligação usando protocolos padrões e bactérias que carregam os plasmídeos recombinantes isolados e identificados. O plasmídeo resultante p1542c ilustrado a seguir (figura 10) foi então preparado a partir de E. coli clonada. O vírus híbrido foi preparado da maneira a seguir. O DNA do plasmídeo p1542c foi transfectado em cultura de células A72 ou CrFK. As transfecções foram realizadas usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) com aproximadamente 3 microgramas de DNA, seguindo as instruções do fabricante. Após a transfecção, as células foram passadas e monitoradas por ensaio de hemaglutinação (HA). O vírus foi detectado por HA na passagem 4. A determinação da sequência de DNA do vírus híbrido foi realizada usando protocolos de sequenciamento de DNA padrão, usando tanto DNA RF quanto moldes de fragmento de PCR. O vírus foi purificado por diluição limitante nas células caninas ou felinas susceptíveis aderentes.

Legenda das figuras.

[0082] Figura 1 : Construção de pCPV A

[0083] Figura 2: Construção de pCPV C

[0084] Figura 3: Construção de pCPV AC

[0085] Figura 4: Construção de pCPV 154;

[0086] Figura 5: Construção de p630

[0087] Figura 6: Construção de p630att

[0088] Figura 7: representação esquemática do método de recombinação natural (não GM) de obter um isolado de vírus híbrido 2/2c. Dois fragmentos de sobreposição do vírus da vacina tipo 2 e do vírus de campo tipo 2c foram transfectados em células e vírus isolados após a recombinação homóloga.

[0089] Figura 8: representação esquemática do clone de plasmídeo infeccioso da cepa CPV 154att que exibe os sítios de enzima de restrição Pac I e Xmn I. As caixas sombreadas ilustram as sequências palíndromes terminais.

[0090] Figura 9: esquema que exibe o produto selecionado da digestão parcial Pac I / Xmn I, que foi selecionado por manipulação adicional.

[0091] Figura 10: plasmídeo contendo o DNA do vírus da vacina 154att, em que o gene de capsídeo é substituído por uma sequência de capsídeo de CPV2c virulento.

Claims

1. Parvovírus vivo atenuado (PV), caracterizado pelo fato de que compreende a sequência definida na SEQ ID NO: 1, em que o fragmento de DNA entre as posições 3356 e 4029 é substituído por um fragmento de DNA de uma parte da região de capsídeo definido na SEQ ID NO: 2.

2. Vacina para a proteção de animais contra infecção com parvovírus, caracterizada pelo fato de que a dita vacina compreende um parvovírus vivo atenuado definido na reivindicação 1, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

3. Vacina de combinação para a proteção de animais contra patógenos, caracterizada pelo fato de que a dita vacina de combinação compreende uma vacina definida na reivindicação 2, e um antígeno adicional de um vírus ou microrganismo patogênico para animais, ou informação genética que codifica uma proteína imunogênica do dito vírus ou microrganismo, em que o dito vírus ou microrganismo patogênico para animais é selecionado a partir do grupo que consiste em Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, vogeli, rossi, complexo Leishmania donovam, adenovírus canino, coronavírus canino, vírus da cinomose canina, Leptospira interrogans serovar canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa, bratislava, vírus da hepatite canina, vírus da parainfluenza canina, vírus da raiva, Hepatozoon canis, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, vírus da herpes felina, calicivírus felino, panleucopenia felina e Chlamydophila felis.

4. Método para a fabricação de uma vacina definida na reivindicação 2, ou de uma vacina de combinação definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a mistura de um parvovírus vivo atenuado definido na reivindicação 1, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

5. Parvovírus vivo atenuado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso para fabricar um medicamento para tratar infecção por parvovírus.