JP2017029140A - 生弱毒化パルボウイルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カプシドタンパク質のアミノ酸219位においてイソロイシン以外のアミノ酸を、及び/又はカプシドタンパク質のアミノ酸386位においてグルタミン以外のアミノ酸をコードするカプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルス。
【選択図】なし
Description
yafgrqhgqkttttget(グルタミン386=太字)
本発明における一方または両方のアミノ酸の置換のために出発物質として使用される株によっては、219位または386位におけるアミノ酸の単一置換は、例えば非常に若い動物において該ウイルスを安全にするのに十分でない可能性がある。更なる弱毒化が要求される場合、アミノ酸219位および386位の両方の置換が好ましい。
大腸菌(E.coli)株
大腸菌(E.coli)遺伝子ストックセンター(USA)から得られた大腸菌(E.coli)株JC811および株DL795(Kramel Biotech UK)を完全感染性クローンのプラスミド増殖のために選択した。
特製DNA合成がEurofins MWG GmbHにより行われた。合成されたDNA断片はpBluescrptクローニングプラスミド形態で供給された。
複製形態(RF)ウイルスDNAを、改変された「ヒルト(Hirt)」調製法(Parrishら 1988,Virology 166,293−307)を用いて、Nobivac Parvo C感染細胞に感染したA72細胞から得た。ウイルスDNAを幾つかの制限酵素で消化し、通常のクローニング法を用いて該ゲノムをpBluescript中で合体させた。該クローニング手順の概要を図1〜4に示す。まず、CPV 154attのRF DNAを、T4 DNAポリメラーゼを使用して「末端を埋める(エンドフィル)」。ついで該DNAをEcoRIおよびSpeIで消化した。これらの酵素はそれぞれ1099位および3459位で一度に切断した。この消化は、それらのサイズの順でA、BおよびCとして示される3つの断片を生成した。断片をゲル電気泳動で分離し、ついでEcoRI/SpeI断片(断片A)を、同じ酵素での消化により調製されたプラスミドpBluescript内にクローニングした(図1を参照されたい)。ついで該RF DNA消化物からのEcoRI末端断片(断片C)を、EcoRIおよびEcoRVで消化されたpBluescript内にクローニングして、pCPV Cを得た(図2を参照されたい。)イヌパルボウイルスAおよびC断片を一緒に同一プラスミド内にサブクローニングした。プラスミドpCPV AおよびPCPVCをSpeIおよびEcoRIで消化した。該CPVインサートをpCPVから精製し、該ベクター部分をpCPV Cから採取した。ついで連結は、断片AおよびCが「再結合」されたプラスミドを与えた(図3を参照されたい)。ついで該CPV RF DNA消化物からのSpeI末端断片(断片B)をpCPV AC内にクローニングした。プラスミドpCPV ACをSpeIおよび酵素HincII(これは切断により平滑末端を与える)で消化した。該断片を連結し、クローニングした(図4を参照されたい)。
Nobivac parvo C感染細胞およびそれとは別のCPV2c「Jes」感染細胞の両方からウイルスDNAを得た。ウイルスDNA調製物をそれぞれ、単一制限酵素で消化して、それぞれから2つのDNA断片を得た。Nobivacゲノムの左側の断片および「Jes」ゲノムの右側の断片が>200bpの重複配列を共有するように該酵素消化を行った。Nobivacの左側および「Jes」の右側断片を分離し、精製し、混合した(図7)。
感染性プラスミドクローンp154attからクローン630を作製し、DNAを2/2cハイブリッドD9から調製した。
630ウイルスは、イヌに注射された場合、幾つかの低レベルの臨床徴候を示した。
商業的に入手可能なNobivac Parvo C(Intervet Schering−Plough Animal Health)から株154attを得た。株Jessは2c型ウイルスの野外分離体であった。
組換えウイルスをクローン化断片から製造した。ウイルス株154attのゲノムを標準的なクローニングベクターpBluescript(Stratagene inc.)内にクローニングした。回文末端配列を完全なままに維持するために、幾つかの組換え系を欠損している細菌宿主DL795において該プラスミドを増殖させた。パルボウイルスゲノムのクローニングは文献に記載されており、必要な技術は当業者に公知である。154attの得られたクローン(p154att)を制限酵素PacIで消化した。この場合、該消化が完全には進行しないようにした。すなわち、該制限酵素消化は部分的に過ぎなかった。ついで該消化断片を制限酵素XmnIでの消化に付した。ついで該消化DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、以下の図に示されている断片を該ゲルから切り出し、Qiagen Qiaquickゲル抽出カラムを使用して精製した。該XmnIおよび右側Pac部位はパルボウイルスゲノム内でカプシド領域に隣接している。以下のとおりに、154attのカプシド遺伝子をCPVのビルレント株のカプシド遺伝子により置換した。図8に示されているXmnI部位および右側PacIは該カプシド遺伝子の境界の外部に位置する。PacI部位と該カプシド遺伝子の末端との間の約110bpの配列は154att株とビルレント分離体との間で有意に異なる。現在のところ、XmnI部位とカプシド遺伝子の開始部位との間の短い配列(〜55bp)において、記録された配列変化は存在しない。したがって、材料における置換を該カプシド配列のみに限定するために、該ビルレントCPVカプシド配列を化学合成し、PacI部位とカプシド終止シグナルとの間のワクチン特異的配列を維持した。
Claims (15)
- カプシドタンパク質のアミノ酸219位においてイソロイシン以外のアミノ酸を、および/またはカプシドタンパク質のアミノ酸386位においてグルタミン以外のアミノ酸をコードするカプシド遺伝子を含み、配列番号1に記載の配列を含まない生弱毒化パルボウイルス(PV)。
- カプシドタンパク質のアミノ酸219位においてイソロイシン以外のアミノ酸を、および/またはカプシドタンパク質のアミノ酸386位においてグルタミン以外のアミノ酸をコードするカプシド遺伝子を含む、請求項1記載の生弱毒化パルボウイルス。
- カプシドタンパク質のアミノ酸219位においてバリンを、およびカプシドタンパク質のアミノ酸386位においてリシンをコードするカプシド遺伝子を含む、請求項1または2記載の生弱毒化パルボウイルス(PV)。
- 該パルボウイルスが組換えパルボウイルスであり、ここで、該パルボウイルスの非カプシド領域の一部のDNA断片が、第2パルボウイルスに由来する非カプシド領域の一部の相同DNA断片により置換されており、ここで、該第2パルボウイルスの相同DNA断片が弱毒化突然変異を含有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の生弱毒化パルボウイルス。
- 該第2パルボウイルスの相同DNA断片が2061〜2070位の領域の非構造領域内に弱毒化突然変異を含有する、請求項4記載の生弱毒化パルボウイルス。
- 該パルボウイルスがイヌパルボウイルスまたはネコパルボウイルスである、請求項1〜5のいずれか1項記載の生弱毒化パルボウイルス。
- 該パルボウイルスがCPV血清型2a、2bもしくは2cのカプシドタンパク質またはネコパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードする、請求項1〜6のいずれか1項記載の生弱毒化パルボウイルス。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の生弱毒化パルボウイルスと医薬上許容される担体とを含む、パルボウイルスの感染に対して動物を防御するためのワクチン。
- 請求項8記載のワクチンと、動物に対して病原性であるウイルスもしくは微生物の追加的抗原または該ウイルスもしくは微生物の免疫原性タンパク質をコードする遺伝的情報とを含む、病原体に対して動物を防御するための混合ワクチン。
- 動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物が、エールリチア・カニス(Ehrlichia canis)、バベシア・ギブソニ(Babesia gibsoni)、ボゲリ(vogeli)、ロッシイ(rossi)、リーシュマニア・ドノバニ(Leishmania donovani)複合体、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、レプトスイラ・インタロガンス・セロバル・カニコラ(Leptospira interrogans serovar canicola)、イクテロヘモラジエ(icterohaemorrhagiae)、ポモナ(pomona)、グリッポチホサ(grippotyphosa)、ブラチスラバ(bratislava)、イヌ肝炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘパトゾーン・カニス(Hepatozoon canis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、ネコヘルペスウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ汎白血球減少症およびクラミドフィラ・フェリス(Chlamydophila felis)からなる群から選択される、請求項9記載の混合ワクチン。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載の生弱毒化パルボウイルスと医薬上許容される担体とを混合することを含む、請求項8記載のワクチンまたは請求項9もしくは10記載の混合ワクチンの製造方法。
- 医薬として使用するための、請求項1〜7のいずれか1項記載の生弱毒化パルボウイルス。
- パルボウイルス感染の治療において使用するための、請求項1〜7のいずれか1項記載の生弱毒化パルボウイルス。
- イソロイシンをコードするアミノ酸219位におけるコドンおよび/またはグルタミンをコードするアミノ酸386位におけるコドンを、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするアミノ酸219位におけるコドンおよび/またはグルタミン以外のアミノ酸をコードするアミノ酸386位におけるコドンへと、組換えDNA技術により改変する工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のパルボウイルス突然変異体の製造方法。
- イソロイシンをコードするコドンをアミノ酸219位に有する及び/又はグルタミンをコードするコドンをアミノ酸386位に有するパルボウイルスカプシドタンパク質の少なくとも一部分をコードするDNA断片を、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンをアミノ酸219位に有する及び/又はグルタミン以外のアミノ酸をコードするコドンをアミノ酸386位に有するパルボウイルスカプシドタンパク質の同じ部分をコードするDNA断片により置換する工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のパルボウイルス突然変異体の製造方法。
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