PT2412828E - Mutações k-ras e b-raf e terapia com anticorpos anti-egfr - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "MUTAÇÕES K-RAS E B—RAF E TERAPIA COM ANTICORPOS ANTI-EGFR" 0 presente pedido refere-se a mutações K-ras, a polinucleótidos que codificam polipéptidos mutantes K-ras e a métodos de identificação de mutações K-ras. 0 presente pedido também se refere a mutações B-raf, a polinucleótidos que codificam polipéptidos mutantes B-raf, a vectores contendo esses polinucleótidos e a métodos de identificação de mutações B-raf. 0 presente pedido também se refere a métodos de diagnóstico de cancro; e métodos e kits para prever a utilidade de agentes de ligação específica anti-EGFr no tratamento de tumores.
ANTECEDENTES
Determinadas aplicações de anticorpos monoclonais na terapia do cancro baseiam-se na capacidade do anticorpo para distribuir especificamente aos tecidos cancerosos funções efectoras citotóxicas, tais como isotipos intensificadores imunes, toxinas ou fármacos. Uma abordagem alternativa é utilizar anticorpos monoclonais para afectar directamente a sobrevivência de células tumorais ao privá-las de sinais essenciais de proliferação extracelular, tais como aqueles mediados por factores de crescimento através dos seus receptores celulares. Um dos alvos atractivos nesta abordagem é o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFr) que se liga a EGF e o factor α de crescimento transformante (TGFa) (ver, e. g., Ullrich et al., Cell 61:203-212, 1990; Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1 1994; Mendelsohn et al., em Biological Therapy of Câncer 607-623, Filadélfia: J.B. Lippincott Co., 1995; Fan et al.,
Curr. Opin. Oncol. 10: 67-73, 1998). A ligação de EGF ou TGFa a EGFr, uma glicoproteina de superfície celular transmembranar de 170 kDa, despoleta uma cascata de eventos bioquímicos celulares, incluindo autofosforilação e internalização de EGFr, os quais culminam em proliferação celular (ver, e. g., Ullrich et al., Cell 61:203-2 12, 1990).
Diversas observações implicam EGFr no apoio ao desenvolvimento e progressão de tumores sólidos humanos. Foi demonstrado que o EGFr é sobreexpresso em muitos tipos de tumores sólidos humanos (ver, e. g., Mendelsohn Câncer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Câncer Biology 1:339-344 (1990),
Modjtahedi e Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994)). Por exemplo, foi observada sobreexpressão de EGF-r em determinados carcinomas do pulmão, mama, cólon, gástrico, cérebro, bexiga, cabeça e pescoço, ovário e próstata (ver, e. g., Modjtahedi e Dean Int'1 J. Oncology 4:277-296 (1994)). O aumento dos níveis de receptores foi reportado como estar associado a fraca prognose clínica (ver, e. g., Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., Biological Therapy of Câncer pp. 607-623, Filadélfia: J.B. Lippincott Co. , 1995;
Modjtahedi et al., Int'1 J. Oncology 4:277-296, 1994; Gullick, Br Medicai Bulletin, 47:87-98, 1991; Salomon et al., Crit. Rev.
Oncol. Hematol. 19: 183-232, 1995). Foi demonstrado que ambos o factor de crescimento epidérmico (EGF) e o factor alfa de crescimento transformante (TGF-α) se ligam a EGF-r e conduzem a proliferação e crescimento celular do tumor. Em muitos casos, a expressão aumentada de EGFr à superfície, foi acompanhada por produção de TGFa ou EGF por células tumorais, sugerindo o envolvimento um controlo de crescimento autócrino na progressão 2 desses tumores (ver, e. g., Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., Biological Therapy of Câncer pp. 607-623, Filadélfia: J.B. Lippincott Co., 1995; Modjtahedi et al., Int'1 J. Oncology 4:277-296, 1994; Salomon et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19: 183-232, 1995).
Assim, determinados grupos propuseram que os anticorpos contra EGF, TGF-α e EGF-r podem ser úteis na terapia de tumores que expressam ou sobreexpressam EGF-r (ver, e. g., Câncer Cells Mendelsohn 7:359 (1989), Câncer Biology Mendelsohn 1:339-344 (1990), Modjtahedi e Dean Int'1 J. Oncology 4:277-296 (1994),
Tosi et al. Int'1 J. Câncer 62:643-650 (1995)). De facto, foi demonstrado que anticorpos anti-EGF-r que bloqueiam a ligação de EGF e TGF-α ao receptor parecem inibir a proliferação celular tumoral. Ao mesmo tempo, contudo, os anticorpos anti-EGF-r não pareceram inibir o crescimento celular independente de EGF e TGF-α (Modjtahedi e Dean Int'1 J. Oncology 4:277-296 (1994)).
Foram produzidos em murganhos e ratos anticorpos monoclonais específicos para o EGFr humano, capazes de neutralizar a ligação de EGF e TGFa a células tumorais e de inibirem a proliferação celular de mediada por ligando in vitro (ver, e. g., Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., em
Biological Therapy of Câncer pp. 607-623, Filadélfia: J.B.
Lippincott Co., 1995; Fan et al. , Curr. Opin. Oncol. 10: 67-73, 1998; Modjtahedi et al., Int'1 J. Oncology 4: 277-296, 1994). Alguns desses anticorpos, tais como os anticorpos monoclonais de murganho 108, 225 (ver, e. g., Aboud-Pirak et al., J. Natl. Câncer Inst. 80: 1605-1611, 1988) e 528 (ver, e. g., Baselga et al., Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., em Biological Therapy of Câncer pp. 607-623, Filadélfia: J.B.
Lippincott Co., 1995) ou os de rato ICR16, ICR62 e ICR64 (ver, 3 e. g., Modjtajedi et al., Int'l J. Oncology 4: 277-296, 1994;
Modjtahedi et al., Br J. Câncer 67:247-253, 1993; Modjtahedi et al., Br J. Câncer 67: 254-261, 1993) foram avaliados extensivamente para a sua capacidade de afectar o crescimento tumoral em modelos de xenoenxerto de murganho. A maioria dos anticorpos monoclonais anti-EGFr foram eficazes na prevenção da formação de tumor em murganhos atimicos quando administrados conjuntamente com células tumorais humanas (Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Modjtahedi et al., Br J. Câncer 67: 254-261, 1993). Quando injectados em murganhos que têm xenoenxertos tumorais humanos estabelecidos, os anticorpos monoclonais 225 e 528 de murganho provocaram regressão tumoral parcial e requereram a co-administração de agentes quimioterapêuticos, tais como doxorrubicina ou cisplatina, para erradicação dos tumores (Baselga et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., em Biologlcal Therapy of Câncer pp. 607-623, Filadélfia: J.B. Lippincott Co., 1995; Fan et al., Câncer Res. 53: 4637-4642, 1993; Baselga et al., J.
Natl. Câncer Inst. 85: 1327-1333, 1993). Uma versão quimérica do anticorpo monoclonal 225 (C225) , em que as regiões variáveis do anticorpo de murganho estão ligadas a regiões constantes humanas, apresentou uma actividade antitumoral in vivo melhorada mas apenas em doses elevadas (ver, e. g., Goldstein et al., Clinicai Câncer Res. 1: 1311-1318, 1995; Prewett et al. , J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19: 419-427, 1996) . Os anticorpos ICR16, ICR62 e ICR64 de ratos provocaram regressão de tumores estabelecidos, mas não a sua completa erradicação (Modjtahedi et al., Br J. Câncer 67: 254-261, 1993). Estes resultados estabeleceram EGFr como um alvo promissor para terapia de anticorpo contra tumores sólidos que expressam EGFr e conduziram a ensaios clínicos humanos com o anticorpo monoclonal C225 em múltiplos cancros sólidos humanos (ver, e. g., Baselga 4 et al. Pharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn et al., Biological Therapy of Câncer pp. 607-623, Filadélfia: J.B. Lippincott Co., 1995; Modjtahedi et al., Int'l J. Oncology 4:277-296, 1994).
Determinados avanços nas técnicas biológicas tornaram possivel produzir um anticorpo anti-EGFr totalmente humano. Utilizando murganhos transgénicos para genes de imunoglobulina humana (tecnologia Xenomouse™, Abgenix, Inc.), foram desenvolvidos anticorpos humanos específicos para EGFr humano (ver, e. g. , Mendez, Nature Genetics, 15: 146-156, 1997; Jakobovits, Adv. Drug Deliv. Rev., 31(1-2): 33-42, 1998; Jakobovits, Expert Opin. Invest. Drugs, 7(4): 607-614, 1998; Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38(1):17-23, 2001; documentos W098/24893; WO98/50433). Um tal anticorpo, panitumumab, um anticorpo monoclonal IgG2 humano com uma afinidade de 5xl0-11 M para o EGFr humano, foi demonstrado bloquear a ligação de EGF ao EGFr, bloquear a sinalização de receptor e inibir a activação e proliferação celular tumoral in vitro (ver, e. g., documento WO98/50433; Patente U.S. N° 6235883). Estudos em murganhos atímicos demonstraram que o panitumumab tem também actividade in vivo, não apenas previne a formação de xenoenxertos A431 de carcinoma epidermóide humano em murganhos atímicos, mas também erradicar grandes xenoenxertos de tumor A431 já estabelecidos (ver, e. g., Yang et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38(1):17-23, 2001; Yang et al., Câncer Res. 59(6):1236-43, 1999). O panitumumab tem sido considerado para o tratamento de carcinoma renal, adenocarcinoma colorrectal, cancro da próstata e carcinoma escamoso de células não pequenas do pulmão, entre outros cancros (ver, e. g., publicação de Patente U.S. N° 2004/0033543) e estão em curso ensaios clínicos com esse anticorpo. O panitumumab foi aprovado pela Food & Drug 5
Administration para tratar doentes com cancro colorrectal metastático. A activação de EGFr despoleta, pelo menos, duas vias de sinalização. Em determinados tipos de células, a activação de EGFr previne a apoptose por estimulação da fosfatidilinositol 3-cinase ("PI3K"). A activação de PI3K despoleta uma cascata molecular que conduz a regulação negativa das vias centrais que controlam a morte celular programada (Yao, R., Science 267:2003-2006, 1995). Em determinados tipos de células, a activação de EGFr inicia a cascata de MAPK através de Ras/Raf. Lièvre et al. Câncer Res. 66:3992-5 (2006) divulga que as mutações no codão 12 e 13 de K-ras são vaticinadoras da resistência de CRC ao tratamento com cetuximab.
SUMÁRIO A invenção proporciona métodos como definidos nas reivindicações anexas.
Em determinadas formas de realização, é divulgado um método para prever se um doente será não responsivo ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, tal método compreende determinar a presença ou ausência da mutação K-ras num tumor do doente, em que a mutação K-ras é no codão 12 ou codão 13. Em determinadas formas de realização, se estiver presente uma mutação K-ras, é previsto que o doente não seja responsivo ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr. 6
Em determinadas formas de realização, é divulgado um método para prever se um tumor será não responsivo ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, tal método compreende determinar a presença ou ausência da mutação K-ras de uma amostra do referido tumor, em que a mutação K-ras é no codão 12 ou codão 13. Em determinadas formas de realização, a presença da mutação K-ras indica que o tumor será não responsivo ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr.
Em determinadas formas de realização, é divulgado um método para prever se um doente será não responsivo ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, tal método compreende determinar a presença ou ausência da mutação B-raf num tumor do doente, em que a mutação B-raf é no codão 600 . Em determinada forma de realização, se estiver presente uma mutação B-raf, é previsto que o doente não seja responsivo ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr.
Em determinadas formas de realização, é divulgado um método para prever se um tumor será não responsivo ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, tal método compreende determinar a presença ou ausência da mutação B-raf numa amostra do referido tumor, em que a mutação B-raf é no codão 600 . Em determinadas formas de realização, a presença da mutação B-raf indica que o tumor será não responsivo a um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr.
Em determinadas formas de realização, é divulgado um método para prever se um doente será não responsivo ao tratamento com 7 um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, tal método compreende determinar a presença ou ausência da mutação K-ras num tumor do doente, em que a mutação K-ras é no codão 12 ou codão 13; e determinar a presença ou ausência de uma mutação B-raf num tumor do doente, em que a mutação B-raf é no codão 600. Em determinadas formas de realização, se estiver presente, pelo menos, uma mutação K-ras e uma mutação B-raf, é previsto que o doente não seja responsivo ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr.
Em determinadas formas de realização, é divulgado um método para prever se um tumor será não responsivo ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, tal método compreende determinar a presença ou ausência da mutação K-ras numa amostra do referido tumor, em que a mutação K-ras é no codão 12 ou codão 13; e determinar a presença ou ausência de uma mutação B-raf, em que a mutação B-raf é no codão 600. Em determinadas formas de realização, a presença de, pelo menos, uma mutação K-ras e uma mutação B-raf indicam que o tumor será não responsivo ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a resposta de doentes com cancro colorrectal metastático (mCRC) tratado com o anticorpo panitumamab. "Mut+" indica que um doente possui uma mutação K-ras ou B-raf. "Mut-" indica que um doente não possui uma mutação K-ras ou B-raf. SD significa doença estável. PD significa doença progressiva. O PR significa resposta parcial.
Figuras 2A a 2H mostram as sequências de ADNc e de aminoácidos para K-ras tipo selvagem (SEQ ID N° : 1 e 2), K-ras mutante G12S (SEQ ID N°: 3 e 4), K-ras mutante G12V (SEQ ID N° : 5 e 6), K-ras mutante G12D (SEQ ID N°: 7 e 8), K-ras mutante G12A (SEQ ID N°: 9 e 10), K-ras mutante G12C (SEQ ID N°: 11 e 12), K-ras mutante G13A (SEQ ID N°: 13 e 14), e K-ras mutante G13D (SEQ ID N°: 15 e 16).
As Figuras 3Ά a 3D mostram sequências de ADNc e de aminoácidos para B-raf tipo selvagem (SEQ ID N°: 17 e 18) e B-raf mutante V600E (SEQ ID N°: 19 e 20).
DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS FORMAS DE REALIZAÇÃO
Definições
Salvo definição em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados em relação à presente invenção têm os significados que são habitualmente entendidos pelos especialistas com conhecimentos gerais na matéria. Além disso, salvo se requerido em contrário pelo contexto, os termos no singular incluem o plural e os termos no plural incluem o singular.
Em termos gerais, as nomenclaturas utilizadas em relação à cultura de tecidos e células, biologia molecular e química de proteínas e de oligo ou polinucleótidos, e respectivas técnicas, aqui descritas são aqueles bem conhecidos e utilizados geralmente na técnica. São utilizadas técnicas convencionais para ADN recombinante, síntese de oligonucleótidos e cultura de tecidos e transformação (e. g., electroporação, lipofecção) . As 9 reacções enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como habitualmente realizadas na técnica ou como aqui descritas. As técnicas e processos anteriores ser geralmente realizadas de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritas várias referências gerais e mais especificas que são citadas e discutidas ao longo da presente descrição. Ver, e. g., Sambrook et ai. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1989)), a qual é aqui incorporada por referência. As nomenclaturas utilizadas em relação à química analítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêutica, e respectivos processos e técnicas laboratoriais, aqui descritas são aquelas bem conhecidas e utilizadas geralmente na técnica. São utilizados técnicas convencionais para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento de doentes.
Neste pedido, a utilização de "ou" significa "e/ou", salvo indicação em contrário. No contexto de uma reivindicação dependente múltipla, a utilização de "ou" refere-se a mais do que uma reivindicação independente ou dependente anterior em alternativa. Além disso, a utilização do termo "incluindo", assim como outras formas, como "inclui" e "incluiu", não é limitativa. Também, os termos tais como "elemento" ou "componente" abrangem elementos e componentes compreendendo uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais do que uma subunidade, salvo referência específica em contrário.
Como utilizado de acordo com a presente divulgação, as seguintes expressões, salvo indicação em contrário, deverão ser entendidas como tendo os seguintes significados: 10 "ácido nucleico
As expressões "polinucleótido isolado" e isolado" são utilizadas indiscriminadamente e como aqui utilizadas significam um polinucleótido de origem genómica, ADNc ou sintética ou qualquer sua combinação, a qual devido à sua origem (1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleótido em que o "polinucleótido isolado" é encontrado na natureza, (2) está operativamente ligado a um polinucleótido que não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.
As expressões "proteína isolada" e "polipéptido isolado" são utilizadas indiscriminadamente e como aqui referidas significam uma proteína de origem em ADNc, ARN recombinante ou sintética, ou qualquer sua combinação, a qual em virtude da sua origem ou fonte de derivação, (1) não está associada com proteínas encontradas na natureza, (2) está livre de outras proteínas da mesma fonte, e. g., livre de proteínas murinas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza.
Os termos "polipéptido" e "proteína" são utilizados indiscriminadamente e são aqui utilizados como um termo genérico para se referir a proteína, fragmentos, péptidos ou análogos nativos de uma sequência polipeptídica. Assim, proteínas, fragmentos e análogos nativos são espécies do género do polipéptido. A terminologia "X#Y" no contexto de uma mutação numa sequência polipeptídica é reconhecida na técnica, em que "#" indica a posição da mutação em termos do número do aminoácido do polipéptido, "X" indica o aminoácido encontrado nessa posição na sequência de aminoácidos de tipo selvagem, e "Y" indica o mutante aminoácido nessa posição. Por exemplo, a notação "G12S" 11 com referência ao polipéptido K-ras indica que existe uma glicina no aminoácido número 12 da sequência de tipo selvagem de K-ras e que a glicina é substituída com uma serina na sequência mutante de K-ras.
As expressões "polipéptido K-ras mutante" e "proteína K-ras mutante" são utilizadas indiscriminadamente e referem-se a um polipéptido K-ras compreendendo, pelo menos, uma mutação K-ras seleccionada de G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A e G13D. Determinados polipéptidos K-ras mutantes exemplificativos incluem, mas não são limitados a, variantes alélicas, variantes de splice, variantes de derivados, variantes de substituição, variantes de deleção e/ou variantes de inserção, polipéptidos de fusão, ortólogos e homólogos inter-espécies. Em determinadas formas de realização, um polipéptido K-ras mutante inclui resíduos adicionais no C ou N terminal, tais como, mas não limitados a, resíduos de sequência líder, resíduos alvos, resíduos de metionina amino terminais, resíduos de lisina, resíduos Marcadores e/ou resíduos de proteína de fusão.
As expressões "polipéptido B-raf mutante" e "proteína B-raf mutante" são utilizadas indiscriminadamente e referem-se a um polipéptido B-raf compreendendo a mutação V600E. Determinados polipéptidos B-raf mutantes exemplificativos incluem, mas não são limitados a, variantes alélicas, variantes de splice, variantes de derivados, variantes de substituição, variantes de deleção e/ou variantes de inserção, polipéptidos de fusão, ortólogos e homólogos inter-espécies. Em determinadas formas de realização, um polipéptido B-raf mutante inclui resíduos adicionais no C ou N terminal, tais como, mas não limitados a, resíduos de sequência líder, resíduos alvos, resíduos de metionina amino terminais, resíduos de lisina, resíduos Marcadores e/ou resíduos de proteína de fusão. 12 A expressão "ocorrência natural" como aqui utilizada, aplicada a um objecto refere-se ao facto de um objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotidica que esteja presente num organismo (incluindo virus) que possa ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é, caso contrário, de ocorrência natural. A expressão "ligado operativamente", como aqui utilizada, refere-se ao posicionamento de componentes de modo que estejam numa relação que lhes permite funcionar do seu modo pretendido. Uma sequência de controlo "ligada operativamente" a uma sequência codificante é ligada de tal modo que a expressão da sequência codificante seja realizada sob condições compatíveis com as sequências de controlo. A expressão "sequência de controlo", como aqui utilizada, refere-se a sequências polinucleotídicas que são necessárias para efectuar a expressão e processamento de sequências codificantes a que estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controlo incluem geralmente promotor, local de ligação ribossomal e sequências de terminação de transcrição; em eucariotas, geralmente, tais sequências de controlo incluem promotores e sequências de terminação de transcrição. A expressão "sequências de controlo" pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiro de fusão. 13 0 termo "polinucleótido",, como aqui referido, significa uma forma polimérica de nucleótidos de, pelo menos, 10 bases de comprimento, ribonucleótidos ou desoxinucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. O termo inclui formas de cadeia simples e dupla de ADN. O termo "oligonucleótido", aqui referido, inclui nucleótidos modificados e de ocorrência natural ligados em conjunto através de ligações oligonucleotidicas de ocorrência natural e de ocorrência não natural. Os oligonucleótidos são um subconjunto de polinucleótidos geralmente compreendendo um comprimento de 200 bases ou menos. De um modo preferido, os oligonucleótidos têm 10 a 60 bases de comprimento e, de um modo muito preferido, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos são geralmente de cadeia simples, e. g., para sondas, embora os oligonucleótidos possam ser de cadeia dupla, e. g., para utilização na construção de um mutante génico. Os oligonucleótidos da invenção podem ser oligonucleótidos com sentido ou anti-sentido.
As expressões "polinucleótido K-ras mutante", "oligonucleótido K-ras mutante" e "ácido nucleico K-ras mutante" são utilizadas indiscriminadamente e referem-se a um polinucleótido que codifica um polipéptido K-ras compreendendo, pelo menos, uma mutação K-ras seleccionada de G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A e G13D.
As expressões "polinucleótido B-raf mutante", "oligonucleótido B-raf mutante" e "ácido nucleico B-raf mutante" são utilizadas indiscriminadamente e referem-se a um polinucleótido que codifica um polipéptido B-raf compreendendo uma mutação V600E. 14 A expressão "nucleótidos de ocorrência natural", aqui referida, inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. A expressão "nucleótidos modificados", aqui referida inclui nucleótidos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e semelhantes. A expressão "ligação oligonucleotídica", aqui referida, inclui ligações oligonucleotídicas, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Ver, e. g., LaPlanche et ai. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec et al. Patente U.S. N° 5151510; Uhlmann e Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. Um oligonucleótido pode incluir um marcador para detecção, se desejado. A expressão "hibridar selectivamente", aqui referida significa ligar detectavelmente e especificamente. Polinucleótidos, oligonucleótidos e os seus fragmentos hibridam selectivamente a cadeias de ácidos nucleicos sob condições de hibridação e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não específicos. Podem ser utilizadas condições de elevada restringência para conseguir condições de hibridação selectiva como conhecidas na técnica e aqui discutidas. Geralmente, a homologia de sequência de ácidos nucleicos entre polinucleótidos, oligonucleótidos e fragmentos e uma sequência de ácidos nucleicos de interesse será, pelo menos, 80% e, mais tipicamente, com homologias, de um modo preferido, crescentes de, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100%. Duas sequências de aminoácidos são homólogas se existir 15 uma identidade parcial ou completa entre as suas sequências. Por exemplo, 85% de homologia significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências forem alinhadas para um emparelhamento máximo. São permitidas lacunas (em qualquer uma das duas sequências a emparelhar) na maximização do emparelhamento; comprimentos de lacunas de 5 ou menos são preferidos, sendo mais preferidos 2 ou menos. Alternativamente e de um modo preferido, duas sequências proteicas (ou sequências polipeptidicas derivadas delas de, pelo menos, 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, como este termo é aqui utilizado, se tiverem uma pontuação de alinhamento superior a 5 (em unidades convencionais de desvio) utilizando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade de lacuna de 6 ou mais. Ver, Dayhoff, M.O., em Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e o Suplemento 2 desse volume, pp. 1-10. As duas sequências ou suas partes são, de um modo mais preferido, homólogas se os seus aminoácidos tiverem 50% de identidade ou mais quando optimamente alinhadas utilizando o programa ALIGN. A expressão "corresponde a" é aqui utilizada para indicar que uma sequência polinucleotidica é homóloga (i. e., é idêntica, não estritamente relacionada evolutivamente) à totalidade ou a uma porção de uma sequência polinucleotidica de referência, ou que uma sequência polipeptídica é idêntica a uma sequência polipeptidica de referência. Pelo contrário, a expressão "complementar a" é aqui utilizada para significar que a sequência complementar é homóloga à totalidade ou a uma porção de uma sequência polinucleotidica de referência. Para ilustração, a sequência nucleotidica "TATAC" corresponde a uma sequência "TATAC" de referência e é complementar a uma sequência "GTATA" de referência. 16
As seguintes expressões são utilizadas para descrever as relações de sequência entre duas ou mais sequências polinucleotidicas ou de aminoácidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como uma base para uma comparação de sequência; uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de um ADNc ou uma sequência génica de tamanho total apresentada numa listagem de sequências ou pode compreender um ADNc ou sequência génica completa. Geralmente, uma sequência de referência tem, pelo menos, 18 nucleótidos ou 6 aminoácidos de comprimento ou, pelo menos, 24 nucleótidos ou 8 aminoácidos de comprimento ou, pelo menos, 48 nucleótidos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que duas sequências polinucleotidicas ou de aminoácidos podem cada (1) compreender uma sequência (i. e., uma porção da sequência polinucleotidica ou de aminoácidos completa) que é semelhante entre as duas moléculas e (2) compreender ainda uma sequência que é divergente entre as duas sequências polinucleotídicas ou de aminoácidos, as comparações de sequência entre duas (ou mais) moléculas são realizadas tipicamente por comparação de sequências das duas moléculas ao longo de uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de semelhança de sequência. Uma "janela de comparação", como aqui utilizada, refere-se a um segmento conceptual de, pelo menos, 18 posições nucleotídicas ou 6 aminoacidicas contíguas, em que uma sequência polinucleotidica ou uma sequência de aminoácidos pode ser comparada a uma sequência de referência de, pelo menos, 18 nucleótidos contíguos ou sequências de 6 aminoácidos e em que a porção da sequência polinucleotidica na janela de comparação podem compreender adições, deleções, substituições e semelhantes (i. e., lacunas) de 20 porcento ou menos, em comparação à 17 sequência de referência (que não compreende as adições ou deleções) para alinhamento óptimo das duas sequências. O alinhamento óptimo de sequências para alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido através do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela método de pesquisa de semelhança de Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package versão 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), software Geneworks ou MacVector), ou por inspecção, e é seleccionado o melhor alinhamento (i. e., que resulta na maior percentagem de homologia ao longo da janela de comparação) produzido pelos vários métodos. A expressão "identidade de sequência" significa que duas sequências polinucleotidicas ou de aminoácidos são idênticas (i. e., numa base de nucleótido-para-nucleótido ou resíduo-para-residuo) ao longo da janela de comparação. A expressão "percentagem de identidade de sequência" é calculada por comparação de duas sequências optimamente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições nas quais ocorre a base de ácido nucleico (e. g., A, T, C, G, U ou I) ou resíduo idêntico em ambas as sequências, para produzir o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (i. e., o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência. A expressão "identidade substancial" como aqui utilizada denota uma caracteristica de uma sequência polinucleotidica ou de aminoácidos, em que a sequência polinucleotidica ou de aminoácidos compreende uma sequência que 18 tem, pelo menos, 85 porcento de identidade de sequência, de um modo preferido, pelo menos, 90 a 95 porcento de identidade de sequência, mais habitualmente, pelo menos, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência ao longo de uma janela de comparação de, pelo menos, 18 posições nucleotidicas (6 aminoácidos) , frequentemente ao longo de uma janela de, pelo menos, 24-48 posições nucleotidicas (8-16 aminoácidos), em que a percentagem de identidade de sequência é calculada por comparaçao da sequência de referência com a sequência que pode incluir deleções ou adições que perfazem 20 porcento ou menos da sequência de referência ao longo da janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior.
Como aqui utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver, Immunology - A Synthesis (2a edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Massa. (1991)), a qual é aqui incorporada por referência. A expressão "aminoácido" ou "Resíduo de aminoácido" como aqui utilizada, refere-se a L-aminoácidos ou D-aminoácidos de ocorrência natural. As abreviaturas de uma e três letras habitualmente utilizadas para aminoácidos, são aqui utilizadas (Bruce Alberts et al., Molecular Blology of the Cell, Garland Publishing, Inc., Nova Iorque (4a ed. 2002)). Estereoisómeros (e. g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos a,a-dissubstituídos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para polipéptidos da presente invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, 0-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, 19 σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (e. g., 4-hidroxiprolina) . Na notação polipeptídica, aqui utilizada, o sentido esquerdo é o sentido amino terminal e o sentido direito é o sentido carboxi terminal, de acordo com utilização e convenção padrão.
De modo semelhante, salvo indicação em contrário, a extremidade esquerda de sequências polinucleotidicas de cadeia simples é a extremidade 5'; o sentido esquerdo de sequências polinucleotidicas de cadeia dupla é referido como o sentido 5'. 0 sentido de adição de 5' para 3' de transcritos de ARN nascente é referido como o sentido de transcrição. As regiões de sequência na cadeia de ADN as quais têm a mesma sequência que o ARN e as quais estão 5' para a extremidade 5' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a montante". As regiões de sequência na cadeia de ADN as quais têm a mesma sequência que o ARN e que estão 3' para a extremidade 3' do transcrito de ARN são referidas como "sequência a jusante".
Como aplicada a polipéptidos, a expressão "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando optimamente alinhadas, como através dos programas GAP ou BESTFIT utilizando pesos de lacuna por defeito, partilham, pelo menos, 80 por cento de identidade de sequência, de um modo preferido, pelo menos, 90 porcento de identidade de sequência, de um modo mais preferido, pelo menos, 95, 96, 97 ou 98 porcento de identidade de sequência e, de um modo muito preferido, pelo menos, 99 porcento de identidade de sequência. De um modo preferido, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservadoras de aminoácidos. Como aqui discutido, estão contempladas pequenas variações nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina como estando abrangidas pela presente invenção, desde que as 20 variações na sequência de aminoácidos mantenham, pelo menos, 75%, de um modo mais preferido, pelo menos, 80%, 90%, 95% e, de um modo muito preferido, 99%. As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Os aminoácidos geneticamente codificados estão habitualmente divididos em famílias: (1) acídicos: aspartato, glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) não polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Famílias mais preferidas são: serina e treonina são da família alifática-hidroxi; asparagina e glutamina são uma família contendo amida; alanina, valina, leucina e isoleucina são uma família alifática; fenilalanina, triptofano e tirosina são uma família aromática e cisteína e metionina como uma família de cadeia lateral contendo enxofre. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina ou uma substituição semelhante de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um grande efeito na ligação ou nas propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um local estrutural. Os grupos preferidos de substituição conservadora de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutâmico-ácido aspártico, cisteína-metionina e asparagina-glutamina.
As substituições de aminoácidos preferidas são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram afinidades de 21 ligação e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Os análogos podem incluir vários muteínas de uma sequência à excepção da sequência peptídica de ocorrência natural. Por exemplo, podem ser feitas substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (de um modo preferido, substituições conservadoras de aminoácidos) na sequência de ocorrência natural (de um modo preferido, na porção do polipéptido fora do(s) domínio(s) que formam contactos intermoleculares. Uma substituição conservadora de aminoácidos não deve mudar substancialmente as características estruturais da sequência parental (e. g., uma substituição de aminoácido não deve ter tendência para quebrar uma hélice que ocorra na sequência parental, ou perturbar outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência parental). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias polipeptídicas reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.I. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991), as quais são aqui incorporados por referência. O termo "análogo", como aqui utilizado, refere-se a polipéptidos que são compreendidos de um segmento de, pelo menos, 25 aminoácidos que tem identidade substancial com uma porção de uma sequência de aminoácidos de um polipéptido de ocorrência natural e que tem, pelo menos, uma das actividades do polipéptido de ocorrência natural. Tipicamente, os análogos polipeptidicos compreendem uma substituição (ou adição ou deleção) conservadora de aminoácido relativamente à sequência de ocorrência natural. Os análogos têm tipicamente, pelo menos, 20 aminoácidos de comprimento, de um modo preferido, pelo menos, 50 aminoácidos de comprimento ou mais e podem ser frequentemente 22 tao compridos quanto um polipéptido de ocorrência natural de tamanho total.
Os análogos peptídicos são utilizados habitualmente na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicos com propriedades análogas àquelas do péptido modelo. Esses tipos de compostos não peptídicos são denominados "miméticos peptídicos" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber e Freidinger TINS p.392 de (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), os quais são aqui incorporados por referência. Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com a ajuda de modelação molecular computorizada. Os miméticos peptídicos que são estruturalmente semelhantes a péptidos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equivalente. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipéptido paradigma (i. e., um polipéptido que tem uma propriedade bioquímica ou uma actividade farmacológica) , tal como um anticorpo humano, mas tem uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas com uma ligação seleccionada do grupo consistindo em: —CH2NH—, —CH2S—, —CH2- CH2 —, —CH=CH—(cis e trans), -COCH2—, —CH(OH)CH2— e —CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (e. g., D-lisina no lugar do L-lisina) pode ser utilizada para gerar péptidos mais estáveis. Além disso, péptidos constrangidos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação da sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser produzidos por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), aqui incorporado por referência); por exemplo, por adição de resíduos internos de cisteína capazes de formar pontes bissulfureto intramoleculares que ciclizam o péptido. 23
Os terminais amino e carboxilo preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem perto dos limites de domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação de dados de sequências de nucleótidos e/ou aminoácidos em bases de dados de sequências públicas ou privadas. De um modo preferido, são utilizados métodos computorizados de comparação para identificar motivos sequenciais de sequência ou domínios previstos de conformação proteica que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. São conhecidos os métodos para identificar as sequências proteicas que se enrolam numa estrutura tridimensional conhecida (ver Bowie et al. Science 253:164 (1991)). Os especialistas na técnica podem reconhecer motivos de sequência e conformações estruturais que podem ser utilizadas para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com a invenção. A expressão "agente de ligação específica" refere-se a uma molécula de ocorrência natural ou não natural que se liga especificamente a um alvo. Os exemplos de agentes de ligação específica incluem, mas não estão limitados a, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos e compostos moleculares pequenos. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação específica é um anticorpo. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação específica é uma região de ligação ao antigénio. A expressão "agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr" refere-se a um agente de ligação específica que se liga especificamente a qualquer porção de um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr é um anticorpo a para um 24 polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr é uma região de ligação ao antigénio. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr é um anticorpo para EGFr. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr é panitumumab. A expressão "agente de ligação especifica a um polipéptido K-ras mutante" refere-se a um agente de ligação especifica que se liga especificamente a qualquer porção de um polipéptido K-ras mutante. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação especifica a um polipéptido K-ras mutante é um anticorpo para um polipéptido K-ras mutante. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação especifica a um polipéptido K-ras mutante é uma região de ligação ao antigénio. A expressão "agente de ligação específica a um polipéptido B-raf mutante" refere-se a um agente de ligação específica que se liga especificamente a qualquer porção de um polipéptido B-raf mutante. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação especifica a um polipéptido B-raf mutante é um anticorpo para um polipéptido B-raf mutante. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação especifica a um polipéptido B-raf mutante é uma região de ligação ao antigénio. A expressão "liga-se especificamente" refere-se à capacidade de um agente de ligação especifica de ligação a um alvo com maior afinidade com que se liga a um não alvo. Em determinadas formas de realização, a ligação especifica refere-se à ligação a um alvo com uma afinidade que é, pelo menos, 10, 50, 100, 250, 500 ou 1000 vezes superior do que a afinidade para um não alvo. Em determinadas formas de realização, a afinidade é determinada 25 através de um ensaio ELISA de afinidade. Em determinadas formas de realização, a afinidade é determinada através de um ensaio BIAcore. Em determinadas formas de realização, a afinidade é determinada através de um método cinético. Em determinadas formas de realização, a afinidade é determinada através de um método de equilibrio/solução. Em determinadas formas de realização, um anticorpo é referido que se liga especificamente a um antigénio quando a constante dissociação entre o anticorpo e um ou mais dos seus epitopos reconhecidos é El μΜ, de um modo preferido, ^100 nM e, de um modo muito preferido, ElO nM.
Os "anticorpos e imunoglobulinas nativas", em determinados casos, são glicoproteinas habitualmente heterotetraméricas de cerca de 150000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação bissulfureto covalente, enquanto o número de ligações bissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes bissulfureto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (VH) , seguido por uma variedade de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Crê-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada (Chothia et al. J. Mol. Biol. 186:651 (1985; Novotny e Haber, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82:4592 (1985); Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)). 26 0 termo "anticorpo" refere-se a um anticorpo intacto e a um seu fragmento de ligação ao antigénio que compete com o anticorpo intacto para ligação especifica. "Seu fragmento de ligação ao antigénio" refere-se a uma porção ou fragmento de uma molécula intacta de anticorpo, em que o fragmento retém a função de ligação ao antigénio. Os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de ADN recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos, tal como por clivagem com papaína. Os fragmentos de ligação incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de cadeia simples ("scFv"), Fd' e Fd. Os métodos para produzir os vários fragmentos a partir de anticorpos monoclonais são bem conhecidos dos especialistas na técnica (ver, e. g., Pluckthun, 1992, Immunol. Rev. 130:151-188). Um anticorpo à excepção de um anticorpo "bispecífico" ou "bifuncional" é entendido como tendo cada um dos seus locais de ligação idêntico. Um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um receptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra-receptor em, pelo menos, cerca de 20%, 40%, 60% ou 80% e, mais habitualmente, maior do que cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (como medido num ensaio de ligação competitiva in vitro).
Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% em peso do anticorpo, como determinado pelo método de Lowry e sequenciação interna ou terminal de aminoácidos por utilização de um sequenciador de copo rotativo ou (2) até 27 homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de um modo preferido, coloração de prata. Um anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que, pelo menos, um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Habitualmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de, pelo menos, um passo de purificação. 0 termo "variável" refere-se ao facto de determinadas porções dos domínios variáveis diferirem extensivamente em sequência entre anticorpos e serem utilizados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. Contudo, a variabilidade não está distribuída uniformemente ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou regiões hipervariáveis nos domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas estruturais (FR). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem, cada, quatro regiões FR, adoptando amplamente uma configuração de folha β, ligadas por três CDR, as quais formam loops que ligam, e nalguns casos que formam parte, da estrutura de folha β. As CDR em cada cadeia são mantidas, em conjunto, em íntima proximidade através das regiões FR e, com as CDR da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio de anticorpos (ver Kabat et al. (1991). Os domínios constantes não estão envolvidos directamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas apresentam várias funções efectoras, tal como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo. 28
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento e ligação de antigénio. Numa espécie Fv de duas cadeias, esta região compreende um dímero de um domínio variável de uma cadeia leve e de uma cadeia pesada em associação firme, não covalente. Numa espécie Fv de cadeia simples, um domínio variável de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve podem estar ligados covalentemente através de um ligante peptídico flexível, de modo que as cadeias leve e pesadas possam se associar numa estrutura "dimérica" análoga àquela numa espécie Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antigénio na superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis CDR conferem especificidade de ligação ao antigénio no anticorpo. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou a metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade para reconhecer e ligar-se ao antigénio, embora a uma afinidade inferior do que a totalidade do local de ligação. A expressão "região hipervariável" quando aqui utilizada refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende habitualmente resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (e. g., resíduos 24-34 (Ll), 50-62 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-55 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "loop hipervariável" (e. g., resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol 196 : 901- 29 -917 (1987)). Os resíduos da "região estrutural" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável à excepção dos resíduos da região hipervariável como aqui definidos.
As expressões "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDR", quando aqui utilizadas referem-se a partes dos receptores imunológicos que contactam com um ligando específico e determinam a sua especificidade. As CDR de receptores imunológicos são a parte mais variável da proteína do receptor, conferindo aos receptores a sua diversidade e estão em seis loops na extremidade distai dos domínios variáveis do receptor, três loops que vêm de cada dos dois domínios variáveis do receptor. A "citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma reacção mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcR) (e. g., células assassinas naturais (NK) , neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado numa célula alvo e, subsequentemente, provocam lise da célula alvo. As células primárias para mediarem a ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de Fc em células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) . Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro, tais como aqueles descritos nas patentes U.S. N° 5500362 ou 5821337. As células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, e. g., num modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1988). 30 0 termo "epitopo" inclui qualquer determinante proteico capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina e/ou receptor de célula T. Os determinantes epitópicos consistem habitualmente de grupos superficiais quimicamente activos de moléculas tais como cadeias laterais de aminoácidos ou açúcares e têm habitualmente caracteristicas estruturais tridimensionais especificas, assim como caracteristicas especificas de carga. 0 termo "agente" é aqui utilizado para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto feito de materiais biológicos.
Como aqui utilizados, os termos "marcador" ou "marcado" refere-se à incorporação de um marcador detectável, e. g., por incorporação de um aminoácido marcado radioactivamente ou ligação a um polipéptido de unidades biotinilo que podem ser detectadas por avidina marcada (e. g., estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que possa ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Em determinadas situações, o marcador pode também ser terapêutico. Vários métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados. Os exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não estão limitados, aos seguintes: radioisótopos ou radionuclidos (e. g., H, C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, ιηΙη, 125i, 131I), marcadores fluorescentes (e. g., FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), marcadores enzimáticos (e. g., peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos biotinilo e epitopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (e. g., sequências pares de fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, marcadores 31 epitópicos). Em algumas formas de realização, os marcadores são ligados através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico. A expressão "fármaco ou agente farmacêutico", como aqui utilizada, refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado correctamente a um doente. Outros termos de química são aqui utilizados de acordo com a utilização convencional na técnica, como exemplificado pelo The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, São Francisco (1985)), aqui incorporado por referência). A expressão "agente antineoplásico" é aqui utilizada para se referir a agentes que têm a propriedade funcional de inibir o desenvolvimento ou progressão de um neoplasma num humano, particularmente uma lesão maligna (cancerígena) , tais como um carcinoma, sarcoma, linfoma ou leucemia. A inibição de metástases é frequentemente uma propriedade de agentes antineoplásicos. Em determinadas formas de realização, um agente antineoplásico é panitumumab.
Como aqui utilizado, "substancialmente pura" significa que uma espécie objecto é a espécie presente predominante (i. e., numa base molar é mais abundante do que quaisquer outras espécies individuais na composição) e, de um modo preferido, uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objecto compreende, pelo menos, cerca de 50 porcento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura irá compreender mais do que cerca de 80 porcento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, de um modo mais preferido, mais do que cerca de 85%, 90%, 95%, 96, 97, 98 32 ou 99%. De um modo muito preferido, a espécie objecto é purificada até essencialmente à homogeneidade (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos convencionais de detecção) em que a composição consiste essencialmente numa única espécie macromolecular. 0 termo doente inclui indivíduos humanos e animais.
Os termos "mamífero" e "animal" para objectivos de tratamento referem-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de criação, e animais de jardim zoológico, desportivos ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De um modo preferido, o mamífero é humano. A expressão "estado de doença" refere-se a um estado fisiológico de uma célula ou de um mamífero inteiro em que ocorreu uma interrupção, cessação ou distúrbio das funções, sistemas ou órgãos celulares ou corporais.
Os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se a tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que o objectivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração ou distúrbio fisiológico indesejado, tal como o desenvolvimento ou propagação de cancro. Para objectivos desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (i. e., não agravamento) da doença, atraso ou retardamento da progressão da doença, melhoria ou atenuação do estado de doença e remissão (parcial ou total), detectável ou não detectável. "Tratamento" pode também significar prolongamento da sobrevivência comparativamente à sobrevivência prevista se não receber tratamento. Aqueles com 33 necessidade do tratamento incluem aqueles já com o estado ou distúrbio, assim como aqueles susceptíveis para ter o estado ou o distúrbio ou aqueles em que o estado ou o distúrbio é para ser prevenido. 0 termo "responsivo", como aqui utilizado, significa que um doente ou um tumor mostra uma resposta completa ou uma resposta parcial após administração de um agente, de acordo com RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos). 0 termo "não responsivo", como aqui utilizado, significa que um doente ou tumor mostra doença estável ou doença progressiva após administração de um agente, de acordo com RECIST. Os RECIST são descritos, e. g., em Therasse et al., Fevereiro de 2000, "New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors", J. Natl. Câncer Inst. 92 (3) : 205-216, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Os agentes exemplificativos incluem agentes de ligação especifica para um polipéptido de EGFr, incluindo mas não limitado a, anticorpos para EGFr.
Um "distúrbio" é qualquer estado que beneficie de um ou mais tratamentos. Isto inclui doenças ou distúrbios crónicos e agudos incluindo aqueles estados patológicos que predispõem o mamífero para o distúrbio em questão. Exemplos não limitantes de distúrbios para serem aqui tratadas incluem tumores benignos e malignos, leucemias e malignidades linfóides, em particular cancro da mama, rectal, do ovário, estômago, endométrio, das glândulas salivares, rim, cólon, tiróide, pancreático, próstata ou bexiga. Um distúrbio preferido a ser tratado de acordo com o presente invenção é um tumor maligno, tais como carcinomas cervicais e neoplasia glandular e escamosa intraepitelial cervical, carcinoma da célula renal (RCC), tumores esofágicos e linhas celulares derivadas de carcinoma. 34
Uma "doença ou estado relacionado com um polipéptido de EGFr" inclui um ou mais dos seguintes: uma doença ou estado provocado por um polipéptido de EGFr; uma doença ou estado contribuido por um polipéptido de EGFr; e uma doença ou estado que esteja associado com a presença de um polipéptido de EGFr. Em determinadas formas de realização, uma doença ou estado relacionado com um polipéptido de EGFr é um cancro. Os cancros exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, carcinoma das células não pequenas do pulmão, carcinomas da mama, cólon, gástrico, cérebro, bexiga, cabeça e pescoço, ovário e próstata.
Uma "doença ou estado relacionado com um polipéptido K-ras mutante" inclui um ou mais dos seguintes: uma doença ou estado provocado por um polipéptido K-ras mutante; uma doença ou estado contribuido por um polipéptido K-ras mutante; uma doença ou estado que provoque um polipéptido K-ras mutante; e uma doença ou estado que esteja associado com a presença de um polipéptido K-ras mutante. Em determinadas formas de realização, a doença ou estado relacionado com um polipéptido K-ras mutante pode existir na ausência do polipéptido K-ras mutante. Em determinadas formas de realização, a doença ou estado relacionado com um polipéptido K-ras mutante pode ser exacerbado pela presença de um polipéptido K-ras mutante. Em determinadas formas de realização, uma doença ou estado relacionado com um polipéptido K-ras mutante é um cancro. Os cancros exemplificativos incluem, mas não são limitados a, carcinoma das células não pequenas do pulmão, carcinomas da mama, cólon, gástrico, cérebro, bexiga, cabeça e pescoço, ovário e próstata.
Uma "doença ou estado relacionado com um polipéptido B-raf mutante" inclui um ou mais dos seguintes: uma doença ou estado provocado por um polipéptido B-raf mutante; uma doença ou estado 35 contribuído por um polipéptido B-raf mutante; uma doença ou estado que provoque um polipéptido B-raf mutante; e uma doença ou estado que esteja associado com a presença de um polipéptido B-raf mutante. Em determinadas formas de realização, a doença ou estado relacionado com um polipéptido B-raf mutante pode existir na ausência de mutação. Em determinadas formas de realização, a doença ou estado relacionado com um polipéptido B-raf mutante pode ser exacerbado pela presença de um polipéptido B-raf mutante. Em determinadas formas de realização, uma doença ou estado relacionado com um polipéptido B-raf mutante é um cancro. Os cancros exemplificativos incluem, mas não são limitados a, carcinoma das células não pequenas do pulmão, carcinomas da mama, cólon, gástrico, cérebro, bexiga, cabeça e pescoço, ovário e próstata.
Em "terapia combinada", os doentes são tratados com um agente de ligação específica para um antigénio alvo em combinação com um agente quimioterapêutico ou antineoplásico e/ou uma radioterapia. Em determinadas formas de realização, o agente de ligação específica é panitumumab. Os desenhos de protocolo abordarão a eficácia como avaliada pela redução na massa tumoral, assim como pela capacidade para reduzir doses habituais de quimioterapia convencional. Estas reduções da dosagem permitirão terapia adicional e/ou prolongada por redução da toxicidade relacionada com a dose do agente quimioterapêutico. A "monoterapia" refere-se ao tratamento de um distúrbio por administração de imunoterapia a doentes sem agente quimioterapêutico ou antineoplásico acompanhante. Em determinadas formas de realização, a monoterapia compreende a administração de panitumumab na ausência de um agente quimioterapêutico ou antineoplásico e/ou uma radioterapia. 36
Determinadas formas de realização
Em determinadas formas de realização, é proporcionado um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo. Em determinadas formas de realização, é divulgado um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo.
Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido K-ras mutante numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de transcrição ou tradução de um polinucleótido K-ras mutante numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polinucleótido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro.
Em determinadas formas de realização da divulgação, o método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) 37 determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido compreendendo, pelo menos, uma sequência de aminoácidos seleccionada da SEQ ID N° : 4, SEQ ID N° : 6, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°:14 e SEQ ID N° : 16; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de transcrição ou tradução de um polinucleótido que codifica, pelo menos, uma sequência de aminoácidos seleccionada da SEQ ID N°: 4, SEQ ID N° : 6, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14 e SEQ ID N° : 16 numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polinucleótido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo. Em determinadas formas de realização, um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido B-raf mutante numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo 38 compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de transcrição ou tradução de um polinucleótido B-raf mutante numa amostra do individuo; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polinucleótido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro.
Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num individuo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 20 numa amostra do individuo; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização, um método de diagnóstico de uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num individuo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de transcrição ou tradução de um polinucleótido que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 20 numa amostra do individuo; e (b) diagnosticar uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polinucleótido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num individuo. Em determinadas formas de realização, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a 39 uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido K-ras mutante numa amostra do indivíduo; e (b) diaqnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de transcrição ou tradução de um polinucleótido K-ras mutante numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K- -ras com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polinucleótido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro.
Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido compreendendo, pelo menos, uma sequência de aminoácidos seleccionada da SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°:14 e SEQ ID N°: 16 numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de 40 transcrição ou tradução de um polinucleótido que codifica, pelo menos, uma sequência de aminoácidos seleccionada da SEQ ID N° : 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N° : 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14 e SEQ ID N°: 16 numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações K-ras com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido B-raf mutante numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de transcrição ou tradução de um polinucleótido B-raf mutante numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polinucleótido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro. 41
Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de expressão de um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 20 numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de expressão do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método de diagnóstico de uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf num indivíduo compreende: (a) determinar a presença ou a quantidade de transcrição ou tradução de um polinucleótido que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 20 numa amostra do indivíduo; e (b) diagnosticar uma susceptibilidade a uma doença ou estado que está relacionado com uma ou mais mutações B-raf com base na presença ou na quantidade de transcrição ou tradução do polipéptido. Em determinadas formas de realização da divulgação, a doença ou estado é o cancro.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para determinar a presença ou ausência de um polinucleótido que codifica um polipéptido K-ras mutante. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método para determinar a presença ou ausência de um polinucleótido que codifica um polipéptido K-ras mutante numa amostra compreende (a) expor uma amostra a uma sonda que híbrida com um polinucleótido que codifica uma região de um polipéptido K-ras mutante, em que a região compreende, pelo menos, uma mutação K-ras seleccionada de G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A e G13D e (b) determinar a presença ou ausência de um polinucleótido que 42 codifica um polipéptido K-ras mutante na amostra. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método para determinar a presença ou ausência de um polipéptido K-ras mutante numa amostra compreende (a) expor uma amostra a uma sonda que híbrida com um polinucleótido que codifica uma região de um polipéptido K-ras mutante, em que a região compreende, pelo menos, uma mutação K-ras seleccionada de G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A e G13D e (b) determinar a presença ou ausência de um polipéptido K-ras mutante na amostra.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para determinar a presença ou ausência de um polinucleótido que codifica um polipéptido B-raf mutante. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método para determinar a presença ou ausência de um polinucleótido que codifica um polipéptido B-raf mutante numa amostra compreende (a) expor uma amostra a uma sonda que hibrida com um polinucleótido que codifica uma região de um polipéptido B-raf mutante, em que a região compreende uma mutação de V600E e (b) determinar a presença ou ausência de um polinucleótido que codifica um polipéptido B-raf mutante na amostra. Em determinadas formas de realização da divulgação, um método para determinar a presença ou ausência de um polipéptido B-raf mutante numa amostra compreende (a) expor uma amostra a uma sonda que hibrida com um polinucleótido que codifica uma região de um polipéptido B-raf mutante, em que a região compreende uma mutação de V600E e (b) determinar a presença ou ausência de um polipéptido B-raf mutante na amostra.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para estabelecer um perfil de população K-ras mutante numa população específica de indivíduos compreendendo: (a) determinar a presença de, pelo menos, uma 43 mutação K-ras num perfil genético dos indivíduos numa população; e (b) estabelecer uma relação entre perfis genéticos K-ras mutante e os indivíduos. Em determinadas tais formas de realização da divulgação, as características específicas dos indivíduos incluem uma susceptibilidade para desenvolver uma doença ou estado que está relacionado com uma mutação K-ras. Nessas determinadas formas de realização, as características específicas dos indivíduos incluem apresentar uma doença ou estado que está relacionado com uma mutação K-ras.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação G12S de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação G12V de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação G12D de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab. 44
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação G12A de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação G12C de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação G13A de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação G13D de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab. 45
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência de uma mutação K-ras em 12 aminoácidos de K-ras e/ou 13 aminoácidos de K-ras no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um kit para detectar um polinucleótido que codifica um polipéptido K-ras mutante num indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o kit compreende uma sonda que híbrida com um polinucleót ido que codifica uma região de um polipéptido K-ras mutante, em que a região compreende, pelo menos, uma mutação K-ras seleccionada de G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A e G13D. Em determinadas formas de realização da divulgação, o kit compreende ainda dois ou mais iniciadores de amplificação. Em determinadas formas de realização da divulgação, o kit compreende ainda um componente de detecção. Em determinadas formas de realização da divulgação, o kit compreende ainda um componente de amostragem de ácido nucleico.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para estabelecer um perfil de população B-raf mutante numa população específica de indivíduos compreendendo: (a) determinar a presença de, pelo menos, uma mutação B-raf num perfil genético de indivíduos numa população; e (b) estabelecer uma relação entre perfis genéticos B-raf mutante e os indivíduos. Nessa determinada forma de realização da divulgação, as características específicas dos indivíduos incluem uma susceptibilidade para desenvolver uma doença ou estado que está relacionado com uma mutação B-raf. Nessas 46 determinadas formas de realização da divulgação, as caracteristicas especificas dos indivíduos incluem apresentar uma doença ou estado que está relacionado com uma mutação B-raf.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para prever a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência da mutação V600E de B-raf no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um método para determinar a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação específica a um polipéptido de EGFr num indivíduo que sofre de cancro, compreendendo determinar a presença ou ausência de uma mutação B-raf no aminoácido 600 de B-raf no indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o anticorpo é panitumumab.
Em determinadas formas de realização da divulgação, é proporcionado um kit para detectar um polinucleótido que codifica um polipéptido B-raf mutante num indivíduo. Nessas determinadas formas de realização, o kit compreende uma sonda que híbrida com um polinucleótido que codifica uma região de um polipéptido B-raf mutante, em que a região compreende uma mutação de V600E. Em determinadas formas de realização da divulgação, o kit compreende ainda dois ou mais iniciadores de amplificação. Em determinadas formas de realização da divulgação, o kit compreende ainda um componente de detecção. Em determinadas formas de realização da divulgação, o kit compreende ainda um componente de amostragem de ácido nucleico.
Em determinadas formas de realização da divulgação, a não responsividade ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr é determinada utilizando RECIST (Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos). A resposta completa e a resposta parcial de acordo com RECIST são ambos considerados como sendo responsivos ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr. A doença estável e a doença progressiva são ambas consideradas como sendo não responsivas ao tratamento com um agente de ligação especifica a um polipéptido de EGFr. Os RECIST são conhecidos na técnica e descritos, e. g., em Therasse et ai., Fevereiro de 2000, "New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors", J. Natl. Câncer Inst. 92(3): 205-216,
Em determinadas formas de realização, é detectada uma mutação K-ras e/ou uma mutação B-raf. Em determinadas formas de realização, uma mutação K-ras e/ou uma mutação B-raf é detectada por detecção do polinucleótido K-ras mutante e/ou do polinucleótido B-raf mutante. Em determinadas formas de realização, uma mutação K-ras e/ou uma mutação B-raf é detectada por detecção do polipéptido K-ras mutante e/ou do polipéptido B-raf mutante.
Determinados métodos de detecção de uma mutação num polinucleótido são conhecidos na técnica. Esses Determinados métodos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, seguenciação, reacção de extensão de iniciador, electroforese, ensaios picogreen, ensaios ligação de oligonucleótidos, ensaios de hibridização, ensaios de TaqMan, ensaios SNPlex e ensaios descritos, e. g., nas Patentes U.S. N° 5470705, 5514543, 5580732, 5624800, 5807682, 6759202, 6756204, 6734296, 6395486 e publicação de Patente U.S. N° US 2003-0190646 AI. 48
Em determinadas formas de realização, detectar uma mutação num polinucleótido compreende primeiro a amplificação de um polinucleótido que possa compreender a mutação. Determinados métodos para amplificar um polinucleótido são conhecidos na técnica. Tais produtos de amplificação podem ser utilizados em algum dos métodos aqui descritos ou conhecidos na técnica, para detectar um polinucleótido numa mutação.
Determinados métodos para detectar uma mutação num polipéptido são conhecidos na técnica. Esses determinados métodos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, detectar utilizando um agente de ligação especifica, especifico para o polipéptido mutante. Outros métodos de detecção de um polipéptido mutante incluem, mas não estão limitados a, electroforese e sequenciação peptídica.
Determinados métodos exemplificativos de detecção de uma mutação num polinucleótido e/ou polipéptido são descritos, e. g.f em Schimanski et al. (1999) Câncer Res.r 59: 5169-5175; Nagasaka et al. (2004) J. Clin. Oncol., 22: 4584-4596; Publicação PCT N° WO 2007/001868 Al; Publicação de Patente U.S. N° 2005/0272083 Al; e Lievre et al. Câncer Res. (2006). 66:3992-3994.
Em determinadas formas de realização, são proporcionados microarrays compreendendo um ou mais polinucleótidos que codificam um ou mais polipéptidos K-ras mutantes. Em determinadas formas de realização, são proporcionados microarrays compreendendo um ou mais polinucleótidos complementares a uma ou mais polinucleótidos que codificam um ou mais polipéptidos K-ras mutantes. Em determinadas formas de realização, são proporcionados microarrays compreendendo um ou mais polinucleótidos que codificam um ou mais polipéptidos B-raf 49 mutantes. Em determinadas formas de realização, são proporcionados microarrays compreendendo um ou mais polinucleótidos complementares a um ou mais polinucleótidos que codificam um ou mais polipéptidos B-raf mutantes.
Em determinadas formas de realização, a presença ou ausência de um ou mais polinucleótidos K-ras mutantes em duas ou mais amostras de células ou tecidos é avaliada utilizando tecnologia de microarray. Em determinadas formas de realização, a quantidade de um ou mais polinucleótidos K-ras mutantes em duas ou mais amostras de células ou tecidos é avaliada utilizando tecnologia de microarray.
Em determinadas formas de realização, a presença ou ausência de um ou mais polinucleótidos B-raf mutantes em duas ou mais amostras de células ou tecidos é avaliada utilizando tecnologia de microarray. Em determinadas formas de realização, a quantidade de um ou mais polinucleótidos B-raf mutantes em duas ou mais amostras de células ou tecidos é avaliada utilizando tecnologia de microarray.
Em determinadas formas de realização, a presença ou ausência de um ou mais polipéptidos K-ras mutantes em duas ou mais amostras de células ou tecidos é avaliada utilizando tecnologia de microarray. Nessas determinadas formas de realização, o ARNm é primeiro extraído de uma amostra de células ou tecidos e é convertido subsequentemente em ADNc que é hibridado ao microarray. Nessas determinadas formas de realização, a presença ou ausência de ADNc especificamente ligado ao microarray é indicativo da presença ou ausência do polipéptido K-ras mutante. Nessas determinadas formas de realização, o nível de expressão do um ou mais polipéptidos K-ras mutantes é avaliado por 50 quantificação da quantidade ADNc que é especificamente ligada ao microarray.
Em determinadas formas de realização, a presença ou ausência de um ou mais polipéptidos B-raf mutantes em duas ou mais amostras de células ou tecidos é avaliada utilizando tecnologia de microarray. Em determinadas tais formas de realização, o ARNm é primeiro extraído de uma amostra de células ou tecidos e é convertido subsequentemente em ADNc que é hibridado ao microarray. Nessas determinadas formas de realização, a presença ou ausência de ADNc especificamente ligado ao microarray é indicativo da presença ou ausência do polipéptido B-raf mutante. Nessas determinadas formas de realização, o nível de expressão do um ou mais polipéptidos B-raf mutantes é avaliado por quantificação da quantidade ADNc que é especificamente ligada ao microarray.
Em determinadas formas de realização, são proporcionados microarrays compreendendo um ou mais agentes de ligação específica com um ou mais polipéptidos K-ras mutantes. Nessas determinadas formas de realização, é avaliada a presença ou ausência de um ou mais polipéptidos K-ras mutantes numa célula ou tecido. Nessas determinadas formas de realização, é avaliada a quantidade de um ou mais polipéptidos K-ras mutantes numa célula ou tecido.
Em determinadas formas de realização, são proporcionados microarrays compreendendo um ou mais agentes de ligação específica a um ou mais polipéptidos B-raf mutantes. Nessas determinadas formas de realização, é avaliada a presença ou ausência de um ou mais polipéptidos B-raf mutantes numa célula ou tecido. Nessas determinadas formas de realização, é avaliada 51 a quantidade de um ou mais polipéptidos B-raf mutantes numa célula ou tecido.
Os seguintes exemplos, incluindo as experiências conduzidas e os resultados obtidos, são proporcionados apenas para fins ilustrativos e não são para serem interpretados como limitando as reivindicações. EXEMPLOS EXEMPLO 1
RESPOSTA DO CANCRO METASTÁTICO COLORRECTAL AO TRATAMENTO COM PΑΝITUMUMAB
Tumores de 25 doentes com cancro colorrectal metastático foram registados em ensaios clínicos de panitumumab (Amgen, Thousand Oaks, CA) . Todos os doentes tinham cancro colorrectal metastático que expressa EGFr e 1% ou mais de células malignas que coraram para EGFr por análise imuno-histoquímica com o kit DAKO EGFRPharmDX (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca).
Os doentes receberam 6 mg/kg de panitumumab intravenosamente cada 2 semanas até progressão como um tratamento de terceira-linha ou quarta-linha para os doentes resistentes aos regimes de oxaliplatina e irinotecano. A resposta tumoral foi avaliada utilizando CT ou MRI e analisada estatisticamente utilizando RECIST (Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos), que proporciona directrizes para identificar a resposta completa, resposta parcial, doença estável ou doença progressiva baseada no tamanho do tumor (ver, e. g., Therasse et al., 52
Fevereiro de 2000, "New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors", J. Natl. Câncer Inst. 92(3): 205-216) .
Dos 25 doentes, 4 mostraram uma resposta parcial ao tratamento, 8 mostraram doença estável e 13 mostraram doença progressiva, como mostrado na Tabela 1.
Tabela 1: Características clínicas dos doentes com cancro colorrectal metastático tratado com panitumumab.
ID do Doente Idade Sexo Linha de tratamento para doença metastática Resposta tumoral Melhor resposta Duração (semanas) 1 59 M 4“ PR 31 2 62 F 3a PR 23 3 57 M 3a SD 15 4 78 F 4“ PR 24 5 63 M 3a PR 15 6 71 M 3a SD 32 7 60 M 4“ SD 24 8 58 M 4“ PD NA 9 68 M 4“ SD 23 10 56 M T PD NA 11 67 F 3a PD NA 12 54 M 3a PD NA 13 65 F 4“ PD NA 14 57 M 4“ PD NA 15 62 F 4“ PD NA 53 (continuação) ID do Doente Idade Sexo Linha de tratamento para doença metastática Resposta tumoral Melhor resposta Duração (semanas) 16 46 F 3a PD NA 17 53 F 4a PD NA 18 67 M 3a PD NA 19 61 M 4a PD NA 20 70 F 4a PD NA 21 63 F 3a SD 15 22 44 M 4a SD 16 23 47 F 3a PD NA 24 52 F 4a SD 16 25 53 F 4a SD 31 PR = resposta parcial; SD = doença estável; PD = doença progressiva EXEMPLO 2
ANÁLISE MUTACIONAL DE K-RAS, B—RAF E EGFR EM DOENTES COM CANCRO METASTÁTICO COLORRECTAL
Para determinar se as mutações K-ras, B-raf e/ou EGFr se correlacionavam com a resposta do cancro colorrectal metastático ao panitumumab, exão 2 de K-ras, exões 15 e 21 de B-raf e exões 9 e 20 de EGFr foram sequenciados a partir de cada doente.
Para cada doente, foram preparadas amostras embebidas em parafina de 10 micrones. Secções de dois micrones foram 54 desparafinadas, coradas com hematoxilineosina e analisadas para morfologia detalhada. As regiões que apresentam tecido tumoral foram marcadas e o ADN extraído do tecido como descrito em Moroni et ai. Lancet Oncol. 6: 279-286 (2005).
Iniciadores específicos de exão e iniciadores de sequenciação foram concebidos utilizando o software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) e sintetizados pela Invitrogen. O exão 2 de K-ras, os exões 15 e 21 de B-raf e os exões 9 e 20 de EGFr foram amplificados por PCR utilizando iniciadores específicos para cada exão. Um especialista técnica pode conceber iniciadores apropriados utilizando as sequências génicas de K-ras e B-raf. A sequência polipeptídica de tipo selvagem de K-ras é mostrada na Figura 2A (SEQ ID N°: 2; N° de Acesso Genbank NP_004976) . A sequência de tipo selvagem do ADNc de K-ras é mostrada também na Figura 2A (SEQ ID N°: 1; N° de Acesso Genbank NM_004985). A sequência nucleotídica genómica de tipo selvagem de K-ras é encontrada no N° de Acesso Genbank NM_004985. A sequência polipeptídica de tipo selvagem de B-raf é mostrada na Figura 3B (SEQ ID N°: 18; N 0 de Acesso Genbank NP_0 0 4324) . A sequência de tipo selvagem do ADNc de B-raf é mostrada na Figura 3A (SEQ ID \—1 o 0 de Acesso Genbank NM_004333) . A sequência nucleotídica genómica de tipo selvagem de B-raf é encontrada, e. g., no N° de Acesso Genbank NT_0 0 7914.14. A sequência polipeptídica de tipo selvagem de EGFr é mostrada, e. g., na publicação PCT N° WO 2006/091899 AI na Figura 6C (N° de Acesso Genbank AAS83109). A sequência de tipo selvagem do ADNc de EGFr é mostrada, e. g., na publicação PCT N° 55 WO 2006/091899 AI nas Figuras 6A e 6B (N° de Acesso Genbank AC006977). A sequência nucleotídica genómica de tipo selvagem de EGFr é encontrada o N° de Acesso Genbank AC073324. A PCR foi realizada num volume de 20 pL utilizando um programa de PCR touchdown sob condições previamente descritas para amplificar regiões especificas de exão a partir de ADN genómico tumoral. Ver, e. g., Bardelli et ai., Science 300: 949 (2003). Os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando o kit de sequenciação cíclica BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems) e analisados num sistema de electroforese capilar 3730 ABI. O tecido tumoral do doente 13 era limitado em quantidade e a análise mutacional não foi tecnicamente possível para todos os exões.
Os resultados dessa análise são mostrados na Tabela 2. 56 de
Tabela 2: Análise mutacional de K-ras, B-raf e EGFr cancros colorrectais metastáticos
ID do Análise de sequenciação Melhor Doente K-ras B-raf EGFr resposta 1 WT WT WT PR 2 G13D WT WT PR 3 G12D WT WT SD 4 WT WT WT PR 5 WT WT WT PR 6 G12V WT WT SD 7 WT V600E WT SD 8 WT WT WT PD 9 WT V600E WT SD 10 WT WT WT PD 11 G13D WT WT PD 12 WT WT WT PD 13 WT V600E WT PD 14 G12V WT WT PD 15 WT WT WT PD 16 G12V WT WT PD 17 G12D WT WT PD 18 WT V600E WT PD 19 WT WT WT PD 20 G13A WT WT PD 21 G12V WT WT SD 22 WT V600E WT SD 23 WT V600E WT PD 24 G13D WT WT SD 25 WT WT WT SD 57
As mutações K-ras foram detectadas em 10 dos 25 tumores ou seja 40%. Seis dessas mutações foram no codão 12 e 4 foram no codão 13.
As mutações B-raf foram detectadas em 6 dos 25 tumores ou seja 24%. Todas as mutações B-raf foram no codão 600 (a mutação V599E previamente descrita). Não foram encontradas mutações de EGFr nos 25 cancros testados.
Analisados globalmente, um total de 64% dos tumores tinha uma mutação em K-ras ou B-raf (mas nenhum dos tumores analisados tinham mutações em ambos) . Apenas um dos 16 tumores com uma mutação K-ras ou B-raf, ou seja 6%, mostrou uma resposta à terapia de panitumumab. Os 15 tumores restantes com mutações K-ras ou B-raf, ou seja 94%, mostraram doença progressiva ou doença estável após terapia de panitumumab. Pelo contrário, 3 dos 9 tumores que não tinham uma mutação K-ras ou B-raf, ou seja 33%, mostraram uma resposta à terapia de panitumumab.
Esses dados estão resumidos na Figura 1. Nesta análise, uma mutação no codão 12 ou 13 de K-ras ou no codão 600 de B-raf foi correlacionada com não responsividade à terapia de panitumumab.
Outras formas de realização serão evidentes aos especialistas na técnica por consideração da descrição e prática da invenção aqui divulgada. É pretendido que a descrição e os exemplos sejam considerados como apenas exemplificativos. 58
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Amgen Inc.
<120> MUTAÇÕES K-RAS E B-RAF E TERAPIA DE ANTICORPOS ANTI-EGFR <13 0> EP6 7 06 7IHVSEpau <140> ainda não atribuído <141> aqui <150> 08742064.2 <151> 2008-03-11 <150> PCT/US2 0 08/003327 <151> 2008-03-11 <150> 60/906976 <151> 2007-03-13 <160> 20 <1 7 0> Patentln versão 3 <210> 1 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 59 60 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc caagaggagt acagtgcaat gagggaccag gtatttgcca taaataatac taaatcattt aaaagagtta aggactctga agatgtacct ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg gaatatgatc caacaataga ggattcctac tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gaagatattc accattatag agaacaaatt atggtcctag taggaaataa atgtgatttg caggacttag caagaagtta tggaattcct ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 120 180 240 300 360 420 480 540 567
<210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gin Leu Ile Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60 ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu cys 65 70 75 80 val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys ser Phe Glu Asp ile HIS His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gin Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp val Pro Met val 100 105 110 Leu val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr val Asp Thr Lys 115 120 125 Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arq Ser Tyr Gly ile Pro Phe ile Glu Thr 130 135 140 60
Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Vai Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Vai 145 150 155 160
Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175
Lys Lys Lys Lys ser Lys Thr Lys cys vai ile Met 180 185
<210> 3 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgccttgacg 60 atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120 aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180 caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240 gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300 aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360 ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420 tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480 cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567
<210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Vai Vai Vai Gly Ala ser Gly vai Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gin Leu Ile Gin Asn His Phe Vai Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr ile Glu Asp ser Tyr Arg Lys Gin vai vai Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60 61
Ser 65 Ala Met Arg ASp Gin 70 Tyr Met Arg Thr Gly 75 Glu Gly Phe Leu cys 80 Vai Phe Al a lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp ile His Hi s QC Tyr 85 90 Arg Glu Gin lie 100 Lys Arg vai Lys Asp 105 ser Glu Asp vai Pro 110 Met Vai Leu Vai Gly Asn Lys cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Vai Asp Thr Lys 115 120 125 Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Vai Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu vai 145 150 155 160 Arg Glu lie Arg Lys His Lys Gl u Lys Met ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys ser Lys Thr Lys cys vai Ile Met 180 185
<210> 5 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 5 60 120 180 240 300 360 420 480 540 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgttggcg taggcaagag tgccttgacg atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 62 567 <210> 6 <211> 188
<212> PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 6
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Vai Vai Vai Gly Ala Vai Gly Vai Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gin Leu Ile Gin Asn His Phe Vai Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Vai vai Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu GlU Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu cys 65 70 75 80 Vai Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gin Ile Lys Arg Vai Lys Asp Ser Glu Asp Vai Pro Met vai 100 105 110 Leu Vai Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro ser Arg Thr Vai Asp Thr Lys 115 120 125 Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg ser Tyr Gly ile Pro Phe ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Vai Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Vai 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys vai Ile Met 180 185 <210> 7 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 63 60 atgactgaat ataaacttgt atacagctaa ttcagaatca aggaagcaag tagtaattga caagaggagt acagtgcaat gtatttgcca taaataatac aaaagagtta aggactctga ccttctagaa cagtagacac tttattgaaa catcagcaaa cgagaaattc gaaaacataa tcaaagacaa agtgtgtaat ggtagttgga gctgatggcg ttttgtggac gaatatgatc tggagaaacc tgtctcttgg gagggaccag tacatgagga taaatcattt gaagatattc agatgtacct atggtcctag aaaacaggct caggacttag gacaagacag ggtgttgatg agaaaagatg agcaaagatg tatgtaa taggcaagag tgccttgacg caacaataga ggattcctac atattctcga cacagcaggt ctggggaggg ctttctttgt accattatag agaacaaatt taggaaataa atgtgatttg caagaagtta tggaattcct atgccttcta tacattagtt gtaaaaagaa gaaaaagaag 120 180 240 300 360 420 480 540 567
<210> 8 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Vai Vai Vai Gly Ala Asp Gly Vai Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gl n Leu Ile Gin Asn His Phe Vai Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin vai Vai Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60 ser Ala Met Arg Asp Gl n Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu cys 65 70 75 80 Vai Phe Ala lie Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gin Ile Lys Arg Vai Lys Asp Ser Glu Asp Vai Pro Met Vai 100 105 110 Leu Vai Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr vai Asp Thr Lys 115 120 125 Gin Ala Gl n Asp Leu Al a Arg Ser Tyr Gly ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 64
Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly vai Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu vai 145 150 155 j.60
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lvs 165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Vai ile Met 180 185
<210> 9 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 60 120 180 240 300 360 420 480 540 567 atgactgaat ataaacttgt atacagctaa ttcagaatca aggaagcaag tagtaattga caagaggagt acagtgcaat gtatttgcca taaataatac aaaagagtta aggactctga ccttctagaa cagtagacac tttattgaaa catcagcaaa cgagaaattc gaaaacataa tcaaagacaa agtgtgtaat ggtagttgga gctgctggcg ttttgtggac gaatatgatc tggagaaacc tgtctcttgg gagggaccag tacatgagga taaatcattt gaagatattc agatgtacct atggtcctag aaaacaggct caggacttag gacaagacag ggtgttgatg agaaaagatg agcaaagatg tatgtaa taggcaagag tgccttgacg caacaataga ggattcctac atattctcga cacagcaggt ctggggaggg ctttctttgt accattatag agaacaaatt taggaaataa atgtgatttg caagaagtta tggaattcct atgccttcta tacattagtt gtaaaaagaa gaaaaagaag
<210> 10 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Met Thr Gl u Tyr Lys Leu vai Vai Vai Gly Ala Ala Gly val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gin Leu Ile Gin Asn His Phe vai Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Vai Vai Ile Asp Gly 35 40 45 65
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 vai Phe Ala ile Asn Asn Thr Lys ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95
Arg Glu Gin Ile Lys Arg Vai Lys Asp Ser Glu Asp vai Pro Met vai 100 105 HO
Leu vai Gly Asn Lys cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr vai Asp Thr Lys 115 120 125
Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg ser Tyr Gly ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly vai Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Vai 145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Vai Ile Met 180 185
<210> 11 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 11 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gcttgtggcg taggcaagag tgccttgacg 60 atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120 aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180 caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240 gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300 aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360 ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420 tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480 cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567 66
<210> 12 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gin Leu ile Gin Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr lie Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val lie Asp Gly 35 40 45 Glu Thr cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60 ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu cys 65 70 75 80 val Phe Al a Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gin lie Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Al a Lys Thr Arg Gin Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu val 145 150 155 160 Arg Glu lie Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys cys Val ile Met 180 185 <210> 13 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 67 atgactgaat ataaacttgt atacagctaa ttcagaatca aggaagcaag tagtaattga caagaggagt acagtgcaat gtatttgcca taaataatac aaaagagtta aggactctga ccttctagaa cagtagacac tttattgaaa catcagcaaa cgagaaattc gaaaacataa tcaaagacaa agtgtgtaat ggtagttgga gctggtgccg ttttgtggac gaatatgatc tggagaaacc tgtctcttgg gagggaccag tacatgagga taaatcattt gaagatattc agatgtacct atggtcctag aaaacaggct caggacttag gacaagacag ggtgttgatg agaaaagatg agcaaagatg tatgtaa taggcaagag tgccttgacg caacaataga ggattcctac atattctcga cacagcaggt ctggggaggg ctttctttgt accattatag agaacaaatt taggaaataa atgtgatttg caagaagtta tggaattcct atgccttcta tacattagtt gtaaaaagaa gaaaaagaag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 567
<210> 14 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 14
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Vai Vai Vai Gly Ala Gly Ala Val Gly Lys 1 5 10 15 ser Al a Leu Thr Ile Gin Leu Ile Gin Asn His Phe vai Asp Glu Tyr 20 25 30 O. 10 < Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Vai Vai Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu Glu Tyr 50 55 60 ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 vai Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gin ile Lys Arg vai Lys Asp ser Glu Asp vai Pro Met val 100 105 110 Leu vai Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Gl u Thr 130 135 140 ser Al a Lys Thr Arg Gin Gly vai Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu val 145 150 155 160 68
Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175
Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Vai lie Met 180 185
<210> 15 <211> 567 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtgacg taggcaagag tgccttgacg 60 atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120 aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180 caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg etttctttgt 240 gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300 aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360 ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420 tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480 cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567 <210> 16
<211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 16
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Vai Val Val Gly Ala Gly Asp Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gin Leu ile Gin Asn His Phe val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gin Val Val Ile ASP Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gin Glu GlU Tyr 50 55 60 ser Ala Met Arg Asp Gin Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu cys 65 70 75 80 69
vai Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys 85 Arg Glu Gin Ile Lys Arg vai Lys 100 Leu vai Gly Asn Lys Cys Asp Leu 115 120 Gin Ala Gin Asp Leu Ala Arg Ser 130 135 Ser Ala Lys Thr Arg Gin Gly Vai 145 150 Arg Glu Ile Arg Lys 165 His Lys Glu Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys 180 <21 0> 17 <21 1> 230 1 <21 2> ADN ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 90 95 Asp Ser Glu Asp vai Pro Met vai 105 110 Pro Ser Arg Thr Vai Asp Thr Lys 125 Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 140 ASp Asp Ala phe Tyr Thr Leu val 155 160 Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 170 175 Cys Vai Ile Met 185 <213> Homo sapiens <40 0> 17 atggcggcgc tgagcggtgg cggtggtggc ggggacatgg agcccgaggc cggcgccggc cctgccattc cggaggaggt gtggaatatc atagaggccc tattggacaa atttggtggg gcctatgaag aatacaccag caagctagat gaatctctgg ggaacggaac tgatttttct acatcttctt cctcttctag cctttcagtg cccacagatg tggcacggag caaccccaag ctgcccaaca aacagaggac agtggtacct ctaaagaaag cactgatgat gagaggtcta caggatggag agaagaaacc aattggttgg gaattgcatg tggaagtgtt ggagaatgtt acgtttttca ccttagcatt ttgtgacttt tgtcaaacat gtggttataa atttcaccag gttaattatg accaacttga tttgctgttt ggcgcggagc cgggccaggc tctgttcaac gccggcgccg cggcctcttc ggctgcggac aaacaaatga ttaagttgac acaggaacat gagcataatc caccatcaat atatctggag gcactccaac aaagagaaca acagttattg gtttctagct ctgcatcaat ggataccgtt ctaccttcat ctctttcagt ttttcaaaat tcaccacaaa aacctatcgt tagagtcttc gcaaggtgtg gagttacagt ccgagacagt atcccagagt gctgtgctgt ttacagaatt gacactgata tttcctggct tactggagaa ccacttacaa cacacaactt tgtacgaaaa tgtcgaaagc tgcttttcca gggtttccgc cgttgtagta cagaagttcc actgatgtgt gtctccaagt tctttgaaca ccacccaata 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 70 900 ccacaggaag aggcgtcctt agcagagact cccgcctcgg actctattgg gccccaaatt ccaattccac agcccttccg accagcagat gaccgatcct catcagctcc caatgtgcat gacttgatta gagaccaagg atttcgtggt accccccctg cctcattacc tggctcacta ggacctcagc gagaaaggaa gtcatcttca cttggtagac gggactcgag tgatgattgg caaagaattg gatctggatc atttggaaca gcagtgaaaa tgttgaatgt gacagcacct gaagtaggag tactcaggaa aacacgacat acaaagccac aactggctat tgttacccag ctccatatca ttgagaccaa atttgagatg gcacagggca tggattactt acacgccaag aatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gcaccagaag tcatcagaat gcaagataaa gcatttggaa ttgttctgta tgaattgatg aacagggacc agataatttt tatggtggga gtacggagta actgtccaaa agccatgaag agagatgaga gaccactctt tccccaaatt ttgccaaaaa ttcaccgcag tgcatcagaa gaggatttta gtctatatgc ttgtgcttct ggtgcgtttc ctgtccactg a
<210> 18 <211> 766 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18
Met Ala Ala Leu ser Gly Gly Gly 1 5
Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu 20
Ala Ala Ala ser Ser Ala Ala Asp 35 40 gccctaacat ctggatcatc cccttccgca ctcaccagtc cgtctccttc aaaatccatt gaagatcatc gaaatcaatt tgggcaacga ataaacacaa tagaacctgt caatattgat gatggaggat caaccacagg tttgtctgct actaacgtga aagccttaca gaaatctcca tcctcagaag acaggaatcg aatgaaaaca gagattcctg atgggcagat tacagtggga gtctacaagg gaaagtggca tggtgatgtg acacctcagc agttacaagc cttcaaaaat gtgaatatcc tactcttcat gggctattcc tggtgtgagg gctccagctt gtatcaccat atcaaactta tagatattgc acgacagact tcaatcatcc acagagacct caagagtaat aaaataggtg attttggtct agctacagtg gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg aatccataca gctttcagtc agatgtatat actggacagt taccttattc aaacatcaac cgaggatacc tgtctccaga tctcagtaag agattaatgg cagagtgcct caaaaagaaa ctcgcctcta ttgagctgct ggcccgctca ccctccttga atcgggctgg tttccaaaca ccaaaaacac ccatccaggc agggggatat
Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gin 10 15
Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly 25 30
Pro Ala Ile Pro Glu Glu Vai Trp 45 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2301 71
As η Ile Lys Gin Met Ile Lys Leu Thr Gl n Gl u His Ile Glu Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn pro pro m p* Ser ile Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gin Gin Arg Glu 85 90 95 Gin Gin Leu Leu Glu ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Vai Leu Pro Ser ser Leu Ser Val Phe Gin Asn Pro Thr Asp Val 130 135 140 Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser pro Gin Lys Pro ile val Arg val Phe 145 150 155 160 Leu Pro Asn Lys Gin Arg Thr val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175 Vai Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro 180 185 190 Glu cys Cys Ala Vai Tyr Arg Ile Gin Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile 195 200 205 Gly Trp Asp Thr Asp Ile ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 210 215 220 Glu Vai Leu Glu Asn vai Pro Leu Thr Thr His Asn Phe val Arg Lys 225 2 30 235 240 Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe 245 250 255 Gin Gly Phe Arg Cys Gin Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gin Arg cys 260 265 270 Ser Thr Glu Vai Pro Leu Met cys val Asn Tyr Asp Gin Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Phe vai Ser Lys Phe Phe Glu HÍS His Pro ile Pro Gin Glu Glu 290 295 300 Ala Ser Leu Ala Glu Thr Al a Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala 305 310 315 320 Pro Ala ser Asp ser ile Gly Pro Gin ile Leu Thr ser Pro Ser Pro 325 330 335 72
Ser Lys ser Ile Pro Ile Pro Gin Pro Phe Arg pro Ala Asp Glu Asp 340 345 350 His Arg Asn Gin Phe Gly Gin Arg Asp Arg Ser ser ser Ala Pro Asn 355 360 365 Vai His ile Asn Thr ile Glu Pro vai Asn Ile Asp ASp Leu ile Arg 370 375 380 Asp Gl n Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu ser Ala 385 390 395 400 Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Vai Lys Ala Leu 405 410 415 Gin Lys ser Pro Gly Pro Gin Arg Glu Arg Lys Ser Ser ser Ser Ser 420 425 430 Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp ser Ser Asp 435 440 445 Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gin Ile Thr vai Gly Gin Arg Ile Gly 450 455 460 Ser Gly Ser Phe Gly Thr Vai Tyr Lys Gly Lys Trp His dy Asp Vai 465 470 475 480 Ala Vai Lys Met Leu Asn Vai Thr a1 a pro Thr Pro Gin Gin Leu Gin 485 490 495 Ala Phe Lys Asn Glu Vai Gly Vai Leu Arg Lys Thr Arg His vai Asn 500 505 510 lie Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gin Leu Ala Ile val 515 520 525 Thr Gin Trp cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr His His Leu His Ile Ile 530 535 540 Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gin Thr 545 550 555 560 Ala Gin Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys ser Ile Ile His Arg Asp 565 570 575 Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Vai Lys Ile 580 585 590 Gly ASp Phe Gly Leu Ala Thr Vai Lys Ser Arg Trp ser Gly ser His 595 600 605 Gin Phe Gl u Gin Leu ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala pro Glu val 610 615 620 73 lie Arg Met Gin Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gin Ser Asp val Tyr 625 630 635 640 Ala Phe Gly Ile Vai Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gin Leu Pro Tyr 645 650 655 Ser Asn lie Asn Asn Arg Asp Gin Ile Ile Phe Met val Gly Arg Gly 660 665 670 Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala 675 680 685 Met Lys Arg Leu Met Ala Glu cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg 690 695 700 ΡΓΟ Leu Phe Pro Gin Ile Leu Ala ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720 Leu Pro Lys ile His Arg ser Ala ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735 Gly Phe Gin Thr Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys 740 745 750 Thr Pro lie Gin Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro val His 755 760 765
<210> 19 <211> 2301 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 19 atggcggcgc tgagcggtgg cggtggtggc ggcgcggagc cgggccaggc tctgttcaac 60 ggggacatgg agcccgaggc cggcgccggc gccggcgccg cggcctcttc ggctgcggac 120 cctgccattc cggaggaggt gtggaatatc aaacaaatga ttaagttgac acaggaacat 180 atagaggccc tattggacaa atttggtggg gagcataatc caccatcaat atatctggag 240 gcctatgaag aatacaccag caagctagat gcactccaac aaagagaaca acagttattg 300 gaatctctgg ggaacggaac tgatttttct gtttctagct ctgcatcaat ggataccgtt 360 acatcttctt cctcttctag cctttcagtg ctaccttcat ctctttcagt ttttcaaaat 420 cccacagatg tggcacggag caaccccaag tcaccacaaa aacctatcgt tagagtcttc 480 ctgcccaaca aacagaggac agtggtacct gcaaggtgtg gagttacagt ccgagacagt 540 ctaaagaaag cactgatgat gagaggtcta atcccagagt gctgtgctgt ttacagaart 600 caggatggag agaagaaacc aattggttgg gacactgata tttcctggct tactggagaa 660 74 acgtttttca ccttagcatt ttgtgacttt tgtcgaaagc tgcttttcca gggtttccgc 780 tgtcaaacat gtggttataa atttcaccag cgttgtagta cagaagttcc actgatgtgt 840 gttaattatg accaacttga tttgctgttt gtctccaagt tctttgaaca ccacccaata 900 ccacaggaag aggcgtcctt agcagagact gccctaacat crggatcatc cccttccgca 960 cccgcctcgg actctattgg gccccaaatt ctcaccagtc cgtctccttc aaaatccatt 1020 ccaattccac agcccttccg accagcagat gaagatcatc gaaatcaatt tgggcaacga 1080 gaccgatcct catcagctcc caatgtgcat ataaacacaa tagaacctgt caatattgat 1140 gacttgatta gagaccaagg atttcgtggt gatggaggat caaccacagg tttgtctgct 1200 accccccctg cctcattacc tggctcacta actaacgtga aagccttaca gaaatctcca 1260 ggacctcagc gagaaaggaa gtcatcttca tcctcagaag acaggaatcg aatgaaaaca 1320 cttggtagac gggactcgag tgatgattgg gagattcctg atgggcagat tacagtggga 1380 caaagaattg gatctggatc atttggaaca gtctacaagg gaaagtggca tggtgatgtg 1440 gcagtgaaaa tgttgaatgt gacagcacct acacctcagc agttacaagc cttcaaaaat 1500 gaagtaggag tactcaggaa aacacgacat gtgaatatcc tactcttcat gggctattcc 1560 acaaagccac aactggctat tgttacccag tggtgtgagg gctccagctt gtatcaccat 1620 ctccatatca ttgagaccaa atttgagatg atcaaactta tagatattgc acgacagact 1680 gcacagggca tggattactt acacgccaag tcaatcatcc acagagacct caagagtaat 1740 aatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaaataggtg attttggtct agctacagag 1800 aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg 1860 gcaccagaag tcatcagaat gcaagataaa aatccataca gctttcagtc agatgtatat 1920 gcatttggaa ttgttctgta tgaattgatg actggacagt taccttattc aaacatcaac 1980 aacagggacc agataatttt tatggtggga cgaggatacc tgtctccaga tctcagtaag 2040 gtacggagta actgtccaaa agccatgaag agattaatgg cagagtgcct caaaaagaaa 2100 agagatgaga gaccactctt tccccaaatt ctcgcctcta ttgagctgct ggcccgctca 2160 ttgccaaaaa ttcaccgcag tgcatcagaa ccctccttga atcgggctgg tttccaaaca 2220 gaggatttta gtctatatgc ttgtgcttct ccaaaaacac ccatccaggc agggggatat 2280 ggtgcgtttc ctgtccactg a 2301 <210> 20 <211> 766 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 75
Met Ala 1 Ala Leu Ala Ala Asn ile 50 Leu Asp 65 Ala Tyr Gin Gin ser ser Ser Vai 130 Ala Arg 145
Leu Pro val Arg
Glu cys
Gly Trp 210
Glu Val 225 Thr Phe Gin Gly ser Thr __--—-=—-=j—rnV,7iwGlyAla Glu Pro Gly Gin
Ala Leu ser Gly Gly Gly Gly Gly Giy 15' .. * nr,^. /-In Ala Gly Ala Gly Ala Gly
Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ai* r r 20 25 - .i ai, om Ala ile Pro g1 u g1 u Val Trp
Ala Ser Ser Ala Ala Asp pro Aia j.· k 35 40
Lys Gin Met He Lys Leu Thr Gin Glu His Ile Glu Ala Leu
Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu 70 /·> ou
Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gin Gin Arg Glu 85 90 95
Leu Leu Glu ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe ser val ser 100 105 110
Ala ser Met Asp Thr val Thr ser ser Ser ser Ser ser Leu 115 120 125
Leu Pro Ser ser Leu Ser Val Phe Gin Asn Pro Thr Asp val 135 140
Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gin Lys Pro ile val Arg val Phe 150 155 160
Asn Lys Gin Arg Thr val Val Pro Ala Arg cys Gly Val Thr 165 170 175
Asp ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro 180 185 190 cys Ala val Tyr Arg ile Gin Asp Gly Glu Lys Lys Pro ile 195 200 205
Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 215 220
Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe val Arg Lys 230 235 240
Phe Thr Leu Ala Phe cys Asp Phe cys Arg Lys Leu Leu Phe 245 250 255
Phe Arg Cys Gin Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gin Arg Cys 260 265 270
Glu Val Pro Leu Met cys val Asn Tyr Asp Gin Leu Asp Leu 275 280 285 76
Leu Phe vai Ser Lys Phe Phe Glu 290 295 Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu 305 310 Pr o Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro 325 Ser Lys ser Ile Pro ile Pro Gin 340 His Arg Asn Gin Phe Gly Gin Arg 355 360 Vai His Ile Asn Thr Ile Glu Pro 370 375 Asp Gin Gly Phe Arg Gly Asp Gly 385 390 Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly 405 Gin Lys Ser Pro Gly Pro Gin Arg 420 Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr 435 440 Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gin 450 455 Ser Gly Ser Phe Gly Thr Vai Tyr 465 470 Ala Vai Lys Met Leu Asn Vai Thr 485 Ala Phe Lys Asn Glu Vai Gly vai 500 lie Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser 515 520 Thr Gin Trp Cys Glu Gly Ser Ser 530 535 Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys 545 550 Ala Gl n Gly Met Asp Tyr Leu His 565
His His Pro Ile 300 pro Gin Glu Glu Thr Ser Gly 315 Ser Ser Pro Ser Ala 320 Gin Ile 330 Leu Thr ser Pro ser 335 Pro Pro 345 Phe Arg Pro Ala Asp 350 Glu Asp Asp Arg Ser Ser Ser 365 Ala Pro Asn Val Asn Ile Asp 380 ASP Leu Ile Arg Gly ser Thr 395 Thr Gly Leu Ser Ala 400 Ser Leu 410 Thr Asn Val Lys Ala 415 Leu Glu 425 Arg Lys Ser Ser Ser 430 Ser Ser Leu Gly Arg Arg Asp 445 Ser ser Asp Ile Thr Val Gly 460 Gin Arg Ile Gly Lys Gly Lys 475 Trp His Gly Asp val 480 Ala Pro 490 Thr Pro Gin Gin Leu 495 Gin Leu 505 Arg Lys Thr Arg His 510 val Asn Thr Lys Pro Gin Leu 525 Ala Ile val Leu Tyr His His 540 Leu His Ile Ile Leu ile ASp 555 Ile Ala Arg Gin Thr 560 Ala Lys 570 Ser Ile ile His Arg 575 Asp 77
Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Vai Lys He 580 585 590 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Glu Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His 595 600 605 Gin Phe Glu Gin Leu Ser Gly ser ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Vai 610 615 620 lie Arg Met Gin Asp Lys Asn Pro Tyr ser Phe Gin ser Asp Vai Tyr 625 650 635 640 Ala Phe Gly Ile vai Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gin Leu Pro Tyr 645 650 655 Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gin Ile Ile Phe Met Vai Gly Arg Gly 660 665 670 Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Vai Arg Ser Asn cys pro Lys Ala 675 680 685 Met Lys Arg Leu Met Ala Glu cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg 690 695 700 Pro Leu Phe Pro Gin Ile Leu Ala Ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720 Leu Pro Lys Ile His Arg ser Ala ser Glu Pro ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735 Gly phe Gin Thr Glu Asp Phe ser Leu Tyr Ala cys Ala ser Pro Lys 740 745 750 Thr Pro Ile Gin Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Vai His 755 760 765
Lisboa, 26 de Julho de 2013 78

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para prever se um tumor será não responsivo ao tratamento com um anticorpo para EGFr, compreendendo determinar a presença ou ausência de uma mutação V600E de B-raf numa amostra do referido tumor; em que a presença da mutação B-raf indica que o tumor será não responsivo ao tratamento com o anticorpo para EGFr.
  2. 2. Método da reivindicação 1, compreendendo ainda determinar a presença ou ausência de uma mutação K-ras numa amostra do referido tumor, em que a mutação K-ras é seleccionada de G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A e G13D; em que a presença da mutação K-ras indica que o tumor será não responsivo ao tratamento com o anticorpo para EGFr.
  3. 3. Método para prever se um doente será não responsivo ao tratamento com um anticorpo para EGFr, compreendendo determinar a presença ou ausência de uma mutação V600E de B-raf numa amostra de tumor do referido doente; em que a presença da mutação B-raf indica que o doente será não responsivo ao tratamento com o anticorpo para EGFr.
  4. 4. Método da reivindicação 3, compreendendo ainda determinar a presença ou ausência de uma mutação K-ras numa amostra de tumor do referido doente, em que a mutação K-ras é seleccionada de G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A e G13D; em que a presença da mutação K-ras indica que o doente será não responsivo ao tratamento com o anticorpo para EGFr. 1
  5. 5. Método da reivindicação 1, 2, 3 ou 4, em que o anticorpo para EGFr é panitumumab.
  6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o tumor é um tumor do cólon ou rectal.
  7. 7. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o tumor é obtido de um doente que sofre de cancro metastático do cólon.
  8. 8. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que determinar a presença ou ausência da mutação B-raf e/ou K-ras num tumor ou numa amostra do referido tumor compreende a amplificação de um ácido nucleico de B-raf e/ou K-ras do tumor ou da amostra do referido tumor e sequenciação do ácido nucleico amplificado.
  9. 9. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que determinar a presença ou ausência da mutação B-raf e/ou K-ras num tumor ou numa amostra do referido tumor compreende detectar um polipéptido B-raf e/ou K-ras mutante numa amostra do tumor utilizando um agente de ligação especifica para um polipéptido B-raf e/ou K-ras mutante. Lisboa, 26 de Julho de 2013 2
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