BRPI0609615A2 - métodos de predição da eficácia de tratamento de agente de ligação especìfica a egfr em tratamento de cáncer relacionado com egfr num sujeito, de tratamento do mesmo e de determinação da eficácia de tratamento em paciente - Google Patents

Abstract

Métodos de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Ligação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado com EGFr num Sujeito, de Tratamento do Mesmo e de Determinação da Eficácia de Tratamento em Paciente. São proporcionados métodos de predição sobre se um tratamento de agente de ligação especifica a receptor do fator de crescimento anti-epidérmico ("EGFr") será eficaz no tratamento do câncer e métodos de tratamento de pacientes com agentes de ligação especifica a EGFr.

Description

"Métodos de Predição da Eficácia de Tratamento deAgente de Ligação Especifica a EGFr em Tratamento de CâncerRelacionado com EGFr num Sujeito, de Tratamento do Mesmo e deDeterminação da Eficácia de Tratamento em Paciente"

Relatório Descritivo

Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US60/667.827, depositado em 1 de abril de 2005. O pedido provisório US60/667.827 é incorporado aqui como referência em sua totalidade paraqualquer propósito.

Campo

O presente pedido refere-se a métodos para prever se umtratamento com um agente de ligação específica anti-receptor do fator decrescimento epitelial ("EGFr") será eficaz no tratamento de câncer e amétodos para o tratamento de pacientes com agentes de ligação específi-ca anti-EGFr. São providos métodos de determinação de eficácia dotratamento.

Antecedentes

Certas aplicações de anticorpos monoclonais em terapia docâncer são baseadas na capacidade do anticorpo de liberar especifica-mente para os tecidos cancerosos funções efetoras citotóxicas tais comoisotipos, toxinas ou drogas amplificadoras do sistema imunológico.Uma abordagem alternativa é utilizar-se anticorpos monoclonais paraafetar diretamente a sobrevivência das células tumorais as privando desinais de proliferação extracelulares essenciais, tais como os mediadospelos fatores de crescimento através de seus receptores. Um dos alvosatrativos nesta abordagem é o receptor do fator de crescimento epitelial(EGFr), que liga EGF e o fator de crescimento transformante a (TGFa)(ver, por exemplo, Ullrich e colaboradores, Cell 61:203-212, 1990;Baselga e colaboradores, Pharmacol. Ther. 64:127-154, 1994; Mendel-sohn e colaboradores, em Biologic Therapy of Câncer 607-623, Philadel-phia: J.B. Lippincott Co., 1995; Fan e colaboradores, Curr. Opin. Oncol.10:67-73, 1998). A ligação de EGF ou TGFa a EGFr, uma glicoproteínade superfície celular transmembrana de 170 kDa, aciona uma cascatade eventos celulares bioquímicos, incluindo autofosforilação e internali-zação de EGFr, que culmina na proliferação celular (ver, por exemplo,Ullrich e colaboradores, Cell 61:203-212, 1990).

Várias observações implicam o EGFr no suporte do desen-volvimento e progressão de tumores sólidos humanos. Demonstrou-seque o EGFr é super-expresso em muitos tipos de tumores sólidoshumanos (ver, por exemplo, Mendelsohn Câncer Cells 7:359 (1989),Mendelsohn Câncer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi e Dean IntíJ.Oncology 4:277-296 (1994)). Por exemplo, a super-expressão de EGFrfoi observada em certos carcinomas de pulmão, mama, cólon, gástricos,cerebrais, de bexiga, cabeça e pescoço e próstata (ver, por exemplo,Modjtahedi e Dean Int'1 J. Oncology 4:277- 296 (1994)). Certos gruposreportaram que um aumento dos níveis do receptor está associado auma prognose clínica pobre (ver, por exemplo, Baselga e colaboradoresPharmacol Ther. 64:127-154, 1994; Mendelsohn e colaboradores,Biologic Therapy of Câncer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. LippincottCo., 1995; Modjtahedi e colaboradores, Intl. J. of Oncology 4:277-296,1994; Gullick, Br. Medicai Bulletin, 47:87-98, 1991; Salomon e colabo-radores, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19:183-232, 1995). Outros estudos,entretanto, sugerem que a prognose não pode ser diretamente correla-cionada à super-expressão de EGFr (ver, por exemplo, Rusch e colabo-radores Clin. Câncer Res. 3:515-522, 1997; Pfeiffer e colaboradores, Br.J. Câncer 74:86-91 , 1996; Fontanini e colaboradores, Clin. Câncer Res.4:241-249, 1998; Greatens e colaboradores, Am. J. Respir. Crit. Core.Med. 157:1093-1097, 1998; D'Amico e colaboradores, J. Thorac. Cardio-vasc. Surg. 117:736- 743, 1999; Pastorino e colaboradores, J. Clin.Oncol. 15:2858-2865, 1997). Foi demonstrado que tanto o fator decrescimento epitelial (EGF) quanto o fator de crescimento transformantealfa (TGF-a) se ligam a EGFr e levam à proliferação celular e crescimentotumoral. Em muitos casos, a expressão superficial aumentada de EGFrfoi acompanhada pela produção de TGfa ou EGF pelas células tumorais,sugerindo o envolvimento de um controle de crescimento autócrino naprogressão destes tumores (ver, por exemplo, Baselga e colaboradoresPharmacol. Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn e colaboradores,Biologic Therapy of Câncer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. LippincottCo., 1995; Modjtahedi e colaboradores, Intl. J. of Oncology 4:277-296,1994; Salomon e colaboradores, Crít. Rev. Oncol. Hematol. 19: 183-232,1995).

Desta forma, certos grupos propuseram que anticorpos con-tra EGF, TGF-a e EGFr poderiam ser úteis na terapia de tumores queexpressam ou super-expressão EGF-r (ver, por exemplo, MendelsohnCâncer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Câncer Biology 1:339-344(1990), Modjtahedi e Dean Intí J. Oncology 4:277-296 (1994), Tosi ecolaboradores Int'1 J. Câncer 62:643-650 (1995)). De fato, foi demons-trado que anticorpos anti-EGFr que bloqueiam a ligação de EGF e TGF-aao receptor parecem inibir a proliferação de células tumorais. Aomesmo tempo, entretanto, anticorpos anti-EGFr aparentemente nãoinibem o crescimento celular independente de EGF e TGF-a (Modjtahedie Dean Int'1 J. Oncology 4:277-296 (1994)).

Anticorpos monoclonais específicos para o EGFr humano,capazes de neutralizar a ligação de EGF e TGFa a células tumorais e deinibir a proliferação celular mediada por ligante in vitro, foram gerados apartir de camundongos e ratos(ver, por exemplo, Baselga e colaborado-res, Pharmacol Ther. 64: 127-154, 1994; Mendelsohn e colaboradores,em Biologic Therapy of Câncer 607-623, Philadelphia: J.B. LippincottCo., 1995; Fan e colaboradores, Curr. Opin. Oncol. 10:67-73, 1998;Modjtahedi e colaboradores, Intl. J. Oncology 4: 277-296, 1994). Algunsdestes anticorpos, tais como os anticorpos monoclonais de camundongo108, 225 (ver, por exemplo, Aboud-Pirak e colaboradores, J. Natl. CâncerInst. 80:1605-1611, 1988) e 528 (ver, por exemplo, Baselga e colabora-dores, Pharmacol. Ther. 64:127-154, 1994; Mendelsohn e colaboradores,em Biologic Therapy of Câncer 607-623, Philadelphia: J.B. LippincottCo., 1995) ou os de rato ICR16, ICR62 e ICR64 (ver, por exemplo,Modjtajedi e colaboradores, Intl. J. Oncology 4:277-296, 1994; Modjta-hedi e colaboradores, Br. J. Câncer 67:247-253, 1993; Modjtahedi ecolaboradores, Br. J. Câncer 67:254-261, 1993), foram avaliadosextensivamente para sua habilidade em afetar o crescimento tumoral emmodelos de xenoenxerto em camundongos. A maioria dos anticorposmonoclonais anti-EGFr são eficazes na prevenção da formação de tumorem camundongos atímicos quando administrados com as célulastumorais humanas (Baselga e colaboradores Pharmacol. Ther. 64:127-154, 1994; Modjtahedi e colaboradores, Br. J. Câncer 67:254-261,1993). Quando injetados em camundongos portadores de xenoenxertosde tumor humano estabelecidos, os anticorpos monoclonais de camun-dongo 225 e 528 provocaram a regressão parcial do tumor e necessita-ram a co-administração de agentes quimioterápicos, tais como doxorru-bicina ou cisplatina, para a erradicação dos tumores (Baselga e colabo-radores Pharmacol. Ther. 64:127-154, 1994; Mendelsohn e colaborado-res, in Biologic Therapy of Câncer 607-623, Philadelphia: J.B. LippincottCo., 1995; Fan e colaboradores, Câncer Res. 53:4637-4642, 1993;Baselga e colaboradores, J. Natl. Câncer Inst. 85:1327-1333, 1993).Uma versão quimérica do anticorpo monoclonal 225 (C225), no qual asregiões variáveis do anticorpo de camundongo são ligadas a regiõesconstantes humanas, exibiu uma atividade anti-tumoral in vivo, noentanto apenas a altas doses (ver, por exemplo, Goldstein e colaborado-res, Clinicai Câncer Res. 1:1311-1318, 1995; Prewett e colaboradores, J.Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:419-427, 1996). Os anticor-pos de rato ICR16, ICR62 e ICR64 provocaram a regressão de tumoresestabelecidos, mas não sua erradicação completa (Modjtahedi e colabo-radores, Br. J. Câncer 67:254-261, 1993). Estes resultados estabelece-ram o EGFr como um alvo promissor para terapia de anticorpo contratumores sólidos que expressam EGFr e conduziram a ensaios clínicoshumanos com o anticorpo monoclonal C225 em cânceres sólidoshumanos múltiplos (ver, por exemplo, Baselga e colaboradores Pharma-col. Ther. 64:127-154, 1994; Mendelsohn e colaboradores, BiologicTherapy of Câncer pp. 607-623, Philadelphia: J.B. Lippincott Co., 1995;Modjtahedi e colaboradores, Intl. J. ofOncology 4:277-296, 1994).

Certos avanços nas técnicas biológicas tornaram possível aprodução de um anticorpo anti-EGFr humano completo. Utilizandocamundongos transgênicos para genes de imunoglobulina humana(tecnologia Xenomouse™, Abgenix, Inc.), anticorpos humanos específi-cos para EGFr humano foram desenvolvidos (ver, por exemplo, Mendez,Nature Genetics, 15:146-156, 1997; Jakobovits, Advanced Drug DeliveryReviews, 31(l-2):33-42, 1998; Jakobovits, Expert Opinion on Investigati-onal Drugs, 7(4):607-614, 1998; Yang e colaboradores, Crit. Rev. Oncol.Hematol 38(1): 17-23, 2001; WO 98/24893; WO 98/50433). Mostrou-seque um destes anticorpos, panitumumab, um anticorpo monoclonalIgG2 humano com uma afinidade de 5 x IO11 M para EGFr humano,bloqueia a ligação de EGF ao EGFr, para bloquear a sinalização doreceptor e inibe a ativação e proliferação de célula tumoral in vitro (ver,por exemplo, WO 98/50433; Patente US 6.235.883). Estudos emcamundongos atímicos demonstraram que o panitumumab apresentatambém atividade in vivo, não apenas prevenindo a formação de xenoen-xertos A431 de carcinoma epidermóide humano em camundongosatímicos, mas também erradicando xenoenxertos tumorais A431grandes já estabelecidos (ver, por exemplo, Yang e colaboradores, CritRev. Oncol. Hematol. 38(1): 17-23, 2001; Yang e colaboradores, CâncerRes. 59(6): 1236-43, 1999). O panitumumab foi considerado para otratamento de carcinoma renal, adenocarcinoma colo-retal, câncer depróstata e carcinoma de pulmão escamoso de célula não pequena, entreoutros cânceres (ver, por exemplo, publicação do pedido de patente USn° 2004/0033543) e ensaios clínicos estão em curso com este anticorpo.

Em certos tipos de célula, a ligação de fatores de crescimen-to, tais como EGFr, previne a apoptose por estímulo da fosfatidilinositol3-quinase ("PI3K") e B-Raf. A ativação da PI3K aciona uma cascatamolecular que conduz à sub-regulação das rotas centrais que controlama morte celular programada (Yao, R., Science 267:2003-2006, 1995).Membros da família Raf foram também identificados como reguladoresda morte celular programada em mamíferos (Hunter, Cell 80:225-236,1995). No bloqueio de Raf, camundongos carentes de B-Raf mostraramalterações na sobrevivência celular, enquanto camundongos carentes deRaf-1 ou A-Raf não mostraram tais alterações (ver, por exemplo, Prit-chard, Curr. Biol. 6:614-617, 1996; Wojnowski, Nat Genet. 16:293-297,1997), indicando que B-Raf pode apresentar funções específicas naregulação da morte celular. Tanto a PI3K quanto B-Raf são de interesseem distúrbios da proliferação celular, particularmente câncer.

Sumário

Em certas realizações, é provido um método para prever seum tratamento com agente de ligação específica para EGFr será eficazno tratamento de um câncer relacionado com EGFr em um indivíduo,compreendendo a determinação do número de cópias do gene de EGFrem uma amostra do indivíduo, onde a presença de um número decópias aumentado do gene de EGFr na amostra indica que um trata-mento com agente de ligação específica a EGFr será eficaz no tratamentode um câncer relacionado com EGFr no indivíduo.

Em certas modalidades, é provido um método para o trata-mento de um indivíduo apresentando um câncer relacionado com EGFr,que compreende: (a) a determinação do número de cópias do gene deEGFr em uma amostra do indivíduo; (b) determinação de se há umnúmero de cópias aumentado do gene de EGFr na amostra; e (c) sehouver um número de cópias aumentado do gene de EGFr, administrarao indivíduo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de um agentede ligação específica de EGFr.

Em certas modalidades, é provido um método para a deter-minação da eficácia de um tratamento em um paciente, que compreen-de: (a) determinação do número de cópias do gene de EGFr em umaprimeira amostra obtida de um paciente para se obter um primeiro níveldo número de cópias do gene de EGFr; (b) administração do tratamentoao paciente; (c) determinação do número de cópias do gene de EGFr emuma segunda amostra do paciente no momento seguinte à administra-ção do tratamento, gerando desta forma um segundo nível do número decópias do gene de EGFr; e (d) comparação dos primeiro e segundo níveisdo número de cópias do gene de EGFr, onde uma redução do número decópias do gene de EGFr no segundo nível do número de cópias do genede EGFr em relação ao nível do número de cópias do gene de EGFrindica que o tratamento é efetivo no paciente.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 1A-1D são imagens de análises como o ensaio deFISH dupla-cor conforme observadas por microscópio fluorescente, deacordo com o trabalho descrito no Exemplo 3. Em todas as quatrofiguras, os genes de EGFr aparecem em vermelho e as seqüências CEP7aparecem em verde. A Figura IA mostra o padrão de marcação decélulas da mucosa colo-retal normais. A Figura 1B mostra o padrão demarcação de células tumorais do paciente 7. A Figura 1C mostra opadrão de marcação de células tumorais do paciente 4. A Figura 1Dmostra o padrão de marcação de células tumorais do paciente 1.A Figura 2A é um Western blot mostrando o nível de ex-pressão de EGFr em diferentes linhagens celulares de carcinoma colo-retal, de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 4. A Figura 2B éuma imagem de uma análise por ensaio de FISH dupla-cor de células decarcinoma colo-retal DiFi conforme observada por microscópio fluores-cente, de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 4. Os genes EGFraparecem em vermelho e as seqüências CEP7 aparecem em verde.

Descrição Detalhada De Certas Modalidades Preferidas

Todas as referências citadas aqui, incluindo patentes, pedi-dos de patente, artigos, livros texto e outros, as referências aqui citadas,desde que já não o sejam, são desta forma incorporadas aqui comoreferência em sua totalidade. Os títulos das seções utilizados aqui têm opropósito apenas organizacional e não devem ser entendidos comolimitantes do assunto descrito.

Definições

A não ser que definidos de outra forma, os termos científicose técnicos utilizados em conexão com a presente invenção, têm osignificado comumente entendido pelos especialistas na técnica. Alémdisto, a não ser que requerido pelo contexto de forma diferente, ostermos no singular devem incluir as plurais e os termos no plural devemincluir os singulares.

Em geral, as nomenclaturas utilizadas em conexão com etécnicas de, cultura de célula e tecido, biologia molecular e química ehibridização de proteína e oligo ou polinucleotídeo descritas aqui, são asbem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Técnicas padrãosão utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo ecultura e transformação de tecido (por exemplo, eletroporação, Iipofec-ção). As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas deacordo com as especificações do fabricante ou conforme realizadascomumente na técnica ou conforme descritas aqui. As técnicas eprocedimentos precedentes são em geral realizados de acordo commétodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descritosem várias referências genéricas ou mais específicas que são citadas ediscutidas no presente relatório. Ver por exemplo, Sambrook e colabo-radores Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que éincorporada aqui como referência. As nomenclaturas utilizadas emconexão com e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, químicaanalítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêuticadescritos aqui são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados natécnica. As técnicas padrão são utilizadas para sínteses químicas,análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, administraçãoe tratamento de pacientes.

Neste pedido, a utilização de "ou" significa "e/ou" a não serque afirmado diferentemente. Além disto, a utilização do termo "inclu-indo", bem como outras formas, tais como "inclui" e "incluído", não élimitante. Da mesma forma, termos tais como "elemento" ou "compo-nente" englobam tanto elementos quanto componentes compreendendouma unidade e elementos e componentes que compreendem mais deuma sub-unidade, a não ser que especificamente afirmado diferente.

Conforme utilizados de acordo com o presente relatório, ostermos a seguir, a não ser que de outra forma indicado, devem serentendidos como tendo os seguintes significados:

Os termos "polinucleotídeo isolado" e "ácido nucléico isola-do" são utilizados de forma permutável e conforme utilizados aqui devemsignificar polinucleotídeo de origem genômica, cDNA, ou sintética oualguma combinação destes, que tendo em vista sua origem (1) não estáassociado com todo ou parte de um polinucleotídeo no qual o "polinu-cleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) está operativamenteligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza, ou (3)não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.

Os termos "proteína isolada" e "polipeptídeo isolado" são uti-lizados de forma permutável e conforme utilizados aqui significam umaproteína de cDNA, RNA recombinante, ou de origem sintética, ou algumacombinação destes, a qual tendo em vista sua origem, ou fonte dederivação, (1) não está associada com proteínas encontradas na nature-za, (2) é livre de outras proteínas provenientes da mesma fonte, porexemplo, livre de proteínas de murino, (3) é expressa por uma célula deuma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados de formapermutável e são utilizados aqui como um termo genérico para se fazerreferência à proteína nativa, fragmentos, peptídeos ou análogos de umaseqüência de polipeptídeo. Desta forma, proteína nativa, fragmentos eanálogos são espécies do gênero polipeptídeo.

O termo "polipeptídeo EGFr" engloba a proteína nativa, bemcomo fragmentos, análogos e mutantes de uma proteína nativa. Assim,a proteína EGFr nativa, bem como fragmentos, análogos e mutantes daproteína EGFr nativa são espécies do gênero polipeptídeo EGFr.

A terminologia "X#Y" no contexto de uma mutação em umaseqüência de polipeptídeo é conhecida na técnica, onde "#" indica o localda mutação em termos do número do aminoácido do polipeptídeo, "X"indica o aminoácido encontrado nesta posição na seqüência de aminoá-cidos do tipo selvagem e "Y" indica o aminoácido mutante nesta posição.

Por exemplo, a notação "G13D" com referência ao polipeptídeo Rãsindica que há uma glicina no aminoácido número 13 da seqüência deRas do tipo selvagem e que a glicina é substituída por uma ácidoaspártico na seqüência Ras mutante.

O termo "de ocorrência natural" conforme utilizado aqui a-plicado a um objeto refere-se ao fato do objeto poder ser encontrado nanatureza. Por exemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou polinucleotí-deo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode serisolada de uma fonte natural e que não foi intencionalmente modificadapelo homem no laboratório ou de outra forma qualquer, é de ocorrêncianatural.

O termo "operativamente ligado" conforme utilizado aqui re-fere-se ao posicionamento de componentes tais que estão em umarelação que os permite funcionar em sua maneira pretendida. Umaseqüência de controle "operativamente ligada" a uma seqüência decodificação é ligada de tal forma que a expressão da seqüência decodificação é obtida sob condições compatíveis com as seqüências decontrole.

O termo "seqüência de controle" conforme utilizado aqui re-fere-se a seqüências de polinucleotídeo que são necessárias parapossibilitar a expressão e processamento das seqüências de codificaçãoàs quais estão ligadas. A natureza de tais seqüências de controle diferedependendo do organismo hospedeiro; em procariotos, tais seqüênciasde controle em geral incluem promotor, sítio de ligação ribossômico eseqüências de terminação de transcrição; em eucariotos, em geral, taisseqüências de controle incluem promotores e seqüências de terminaçãode transcrição. O termo "seqüências de controle" pretende incluir, nomínimo, todos os componentes cuja presença seja essencial para aexpressão e processamento e pode incluir também componentes adicio-nais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líder e seqüên-cias de fusão.

O termo "polinucleotídeo" conforme utilizado aqui significauma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases emcomprimento, ou ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma formamodificada de ambos os tipos de nucleotídeo. O termo inclui formas deDNA de fita única e fita dupla.

O termo "oligonucleotídeo" utilizado aqui inclui nucleotídeosde ocorrência natural e modificados ligados entre si por ligações deocorrência natural e não natural de oligonucleotídeos. Oligonucleotí-deos são um sub-conjunto de polinucleotídeo em geral apresentando umcomprimento de 200 bases ou menos. Preferivelmente oligonucleotídeoscontêm de 10 a 60 bases de comprimento e com maior preferência 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases de comprimento. Osoligonucleotídeos são usualmente de fita única, por exemplo, parasondas, embora os oligonucleotídeos possam ser de fita dupla, porexemplo, para utilização na construção de um gene mutante. Osoligonucleotídeos da invenção podem ser oligonucleotídeos senso ouanti-senso.

O termo "nucleotídeos de ocorrência natural" utilizado aquiinclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeosmodificados" utilizado aqui inclui nucleotídeos com grupos sacarídeosmodificados ou substituídos e outros. O termo "ligações de oligonucleo-tídeo" utilizado aqui inclui ligações de oligonucleotídeo tais comofosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato,fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e outros. Ver, porexemplo, LaPlanche e colaboradores Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986);Stec e colaboradores J. Am. Chem. Soe. 106:6077 (1984); Stein e colabo-radores Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon e colaboradores Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon e colaboradores Oligonucleotidesand Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.,Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec e colaboradores,Patente US 5.151.510; Uhlmann e Peyman Chemical Reviews 90:543(1990), as descrições dos quais são incorporadas aqui como referência.Um oligonucleotídeo pode incluir um rótulo para detecção, se desejado.

O termo "número de cópias" de um ácido nucléico refere-seao número de unidades discretas deste ácido nucléico em uma dadaamostra. Um "número de cópias do gene de EGFr" em uma amostrarefere-se ao número de cópias discretas de um gene de EGFr nestaamostra. Um "número de cópias aumentado do gene de EGFr" em umaamostra significa que o número de cópias discretas do gene de EGFr emuma amostra está aumentado em relação a uma referência. Em certasrealizações, a referência é uma outra amostra. Em algumas de taisrealizações, a referência é uma outra amostra retirada do mesmoindivíduo. Em algumas de tais realizações, a referência é uma outraamostra retirada de um indivíduo diferente. Em algumas de taisrealizações, a referência é o número de cópias do gene de EGFr caracte-rístico de uma população particular.

O termo "hibridiza-se seletivamente" utilizado aqui significaligação detectável e específica. Polinucleotídeos, oligonucleotídeos efragmentos destes se hibridizam seletivamente a fitas de ácido nucléicosob condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidadesapreciáveis de ligação detectável a ácidos nucléicos não específicos.Condições de alta severidade podem ser utilizadas para se obter condi-ções de hibridização seletivas como conhecido na técnica e discutidoaqui. Em geral, a homologia de seqüência de ácidos nucléicos entrepolinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos e uma seqüência deácidos nucléicos de interesse será de pelo menos 80% e mais tipicamen-te com homologias preferivelmente crescentes de pelo menos 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100%. Duas seqüências de aminoácidossão homólogas se existe uma identidade parcial ou completa entre suasseqüências. Por exemplo, uma homologia de 85% significa que 85% dosaminoácidos são idênticos quando as duas seqüências são alinhadaspara um pareamento máximo. Espaços (em uma das duas seqüênciassendo comparadas) são permitidos na maximização do pareamento; oscomprimentos dos espaços de 5 ou menos são preferidos com 2 oumenos sendo o de maior preferência. Alternativamente e preferivelmen-te, duas seqüências de proteína (ou seqüências de polipeptídeo deriva-das destas de pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólo-gas, conforme o termo é utilizado aqui, se apresentam um alinhamentode mais de 5 (em unidades de desvio padrão) utilizando-se o programaALIGN com a matriz de dados de mutação e uma perde em termos deespaço de 6 ou mais. Ver Dayhoff, M.O., em Atlas of Protein Sequenceand Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical ResearchFoundation (1972)) e Suplemento 2 deste volume, pp. 1-10. As duasseqüências ou partes destas são com maior preferência homólogas seseus aminoácidos são 50% ou mais idênticos, quando idealmentealinhados utilizando-se o programa ALIGN. O termo "corresponde a" éutilizado para significar que uma seqüência de polinucleotídeo é homó-loga (isto é, é idêntica, não relacionadas estritamente por evolução) atoda ou parte de uma seqüência de polinucleotídeo de referência, ou queuma seqüência de polinucleotídeo é idêntica a uma seqüência depolinucleotídeo de referência. Em contraste, o termo "complementar a"é utilizado aqui para significar que a seqüência complementar é homólo-ga a toda ou parte de uma seqüência de polinucleotídeo de referência.Para ilustração, a seqüência de nucleotídeos "TATAC" corresponde auma seqüência de nucleotídeos de referência "TATAC e é complementara uma seqüência de nucleotídeos de referência "GTATA".

Os termos a seguir são utilizados para descrever as relaçõesde seqüência entre duas ou mais seqüências de polinucleotídeo ouaminoácidos: "seqüência de referência", "janela de comparação", "identi-dade de seqüência", "percentagem de identidade de seqüência" e "identi-dade substancial". Uma "seqüência de referência" é uma seqüênciadefinida utilizada como base para uma comparação de seqüência; umaseqüência de referência pode ser um sub-conjunto de uma seqüênciamaior, por exemplo, um segmento de um cDNA ou seqüência genéticacom comprimento total fornecidos em uma listagem de seqüências, oupode compreender um cDNA ou seqüência genética completos. Emgeral, uma seqüência de referência tem um comprimento de pelo menos18 nucleotídeos ou 6 aminoácidos, freqüentemente pelo menos 24nucleotídeos ou 8 aminoácidos de comprimento e freqüentemente pelomenos 48 nucleotídeos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vezque duas seqüências de polinucleotídeo ou aminoácidos podem cadauma (1) compreender uma seqüência (isto é, uma parte da seqüênciacompleta de polinucleotídeo ou aminoácidos) que é similar entra as duasmoléculas e (2) pode compreender adicionalmente uma seqüência quediverge entre as duas seqüências de polinucleotídeo ou aminoácidos, ascomparações de seqüência entre duas moléculas (ou mais) são tipica-mente realizadas pela comparação das seqüências das duas moléculasem uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiõeslocais de similaridade de seqüência. Uma "janela de comparação",conforme utilizado aqui, refere-se a um segmento conceituai de pelomenos 18 posições de nucleotídeos ou 6 de aminoácidos contíguas emque uma seqüência de polinucleotídeo ou seqüência de aminoácidospodem ser comparadas a uma seqüência de referência de pelo menos 18nucleotídeos ou 6 aminoácidos contíguos e onde a parte da seqüência depolinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições,deleções, substituições e semelhantes (isto é, espaços) de 20 porcento oumenos quando em comparação com a seqüência de referência (que nãocompreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duasseqüências. É selecionado o alinhamento ideal de seqüências para umajanela de comparação pode ser realizado pelo algoritmo de homologialocal de Smith e Waterman Adv. Appl Math. 2:482 (1981), pelo algoritmode alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch J. Mol Biol.48:443 (1970), pela busca pelo método de similaridade de Pearson eLipman Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementa-ções em computador destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTAno Wisconsin Genetics Software Package versão 7.0, (Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, ou pacotes deprogramas MacVector), ou por inspeção e o melhor alinhamento (isto é,resultando na percentagem de homologia mais alta na janela de compa-ração) gerado pelos vários métodos.

O termo "identidade de seqüência" significa que duas se-qüências de polinucleotídeo ou aminoácidos são idênticas (isto é, emuma base nucleotídeo-a-nucleotídeo ou resíduo-a-resíduo) na janela decomparação. A "percentagem de identidade de seqüência" é calculadapor comparação de duas seqüências idealmente alinhadas na janela decomparação, determinação do número de posições em que ocorrembases de ácido nucléico (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ou resíduosidênticos em ambas as seqüências para produzir o número de posiçõesque combinam, divisão do número de posições que combinam pelonúmero total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho dajanela) e multiplicação do resultado por 100 para se obter a percenta-gem de identidade de seqüência. O termo "identidade substancial"conforme utilizado aqui denota uma característica de uma seqüência depolinucleotídeo ou aminoácidos, onde o polinucleotídeo ou aminoácidoscompreendem uma seqüência que apresenta pelo menos 85% deidentidade de seqüência, preferivelmente pelo menos de 90 a 95% deidentidade de seqüência, mais usualmente pelo menos 96, 97, 98 ou99% de identidade de seqüência quando em comparação com umaseqüência de referência em uma janela de comparação de pelo menos 18posições de nucleotídeos (6 aminoácidos), freqüentemente em umajanela de pelo menos 24-48 posições de nucleotídeos (8-16 aminoáci-dos), onde a percentagem da identidade de seqüência é calculada porcomparação da seqüência de referência com a seqüência que podeincluir deleções ou adições que totalizam 20% ou menos da seqüênciade referência na janela de comparação. A seqüência de referência podeser um sub-conjunto de uma seqüência maior.Conforme utilizados aqui, os vinte aminoácidos convencio-nais e suas abreviações seguem a utilização convencional. Ver Immuno-logy - A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., SinauerAssociates, Sunderland, Mass. (1991)), que é incorporado aqui comoreferência. O termo "aminoácido" ou "resíduo de aminoácido", conformeutilizados aqui, referem-se a L aminoácidos ou D aminoácidos deocorrência natural. As abreviações comumente utilizadas de uma outrês letras para aminoácidos são utilizadas aqui (Bruce Alberts e colabo-radores, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., NewYork (4a ed. 2002)). Os estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos)dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais taiscomo aminoácidos a,a-di-substituídos, N-alquil aminoácidos, ácidolático e outros aminoácidos não convencionais podem também sercomponentes adequados para polipeptídeos da presente invenção.

Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina,y-carboxiglutamato, s-N,N,N-trimetil-lisina, s-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, cr-N-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidossemelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação de peptídeoutilizada aqui, o direção da esquerda é o direção terminal amino e adireção da direita é a direção terminal carboxi, de acordo com o usopadrão e a convenção.

Similarmente, a não ser que especificado de forma diferente,a extremidade da esquerda das seqüências de polinucleotídeo de fitaúnica é a extremidade 5' e a direção da esquerda das seqüências depolinucleotídeo de fita dupla é referida como a direção 5'. A direção de5' para 3' de adição dos transcritos de RNA em formação é chamada dedireção de transcrição. As regiões da seqüência na fita de DNA apresen-tando a mesma seqüência que o RNA e que são da extremidade 5' para aextremidade 5' do transcrito de RNA são chamadas de "seqüências amontante". As regiões da seqüência da fita de DNA apresentando amesma seqüência que o RNA e que são da extremidade 3' para a extre-midade 3' do transcrito de RNA são chamadas de "seqüências a jusante".

Quando aplicado a polipeptídeos, o termo "identidade subs-tancial" significa que duas seqüências de peptídeos, quando idealmentealinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT utilizando ospesos dos espaços iniciais, compartilham pelo menos 80% de identidadede seqüência, preferivelmente pelo menos 90% de identidade de seqüên-cia, com maior preferência pelo menos 95, 96, 97 ou 98% de identidadede seqüência e com maior preferência pelo menos 99% de identidade deseqüência. Preferivelmente, as posições dos resíduos que não sãoidênticos diferem por substituições conservativas de aminoácido.Conforme discutido aqui, pequenas variações nas seqüências de amino-ácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são contempladascomo englobadas pela presente invenção, desde que as variações naseqüência de aminoácidos mantenha pelo menos 75%, com maiorpreferência pelo menos 80%, 90%, 95% e com maior preferência 99%.Substituições conservativas de aminoácidos são aquelas que ocorremdentro de uma família de aminoácidos relacionados por suas cadeiaslaterais. Aminoácidos codificados geneticamente são em geral divididosem famílias: (1) aminoácidos ácidos (por exemplo, aspartato e glutama-to); (2) aminoácidos básicos (por exemplo, lisina, arginina e histidina);(3) aminoácidos não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina,isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano); e (4) aminoáci-dos polares não carregados (por exemplo, glicina, asparagina, glutami-na, cisteína, serina, treonina e tirosina). Outras famílias de aminoáci-dos incluem, mas, sem limitações: serina e treonina são uma famíliahidroxi-alifática; asparagina e glutamina são uma família contendoamida; alanina, valina, leucina e isoleucina são uma família alifática;fenilalanina, triptofano e tirosina são uma família aromática e cisteína emetionina são uma família contendo enxofre na cadeia lateral. Porexemplo, é razoável se esperar que uma substituição isolada de umaleucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com uma glutami-na, uma treonina com uma serina, ou uma substituição semelhante deum aminoácido com um aminoácido estruturalmente próximo não iráapresentar um efeito importante na ligação ou propriedades da molécularesultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácidodentro de um sítio funcional. Grupos de substituição conservativa deaminoácido típicos incluem, mas, sem limitações: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácidoglutâmico-ácido aspártico, cisteína-metionina e asparagina-glutamina.

Substituições de aminoácido preferidas são aquelas que: (1)reduzem a susceptibilidade a proteólise, (2) reduzem a susceptibilidadea oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para a formulação decomplexos, (4) alteram as afinidades de ligação e (5) conferem oumodificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de taisanálogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma seqüênciaoutra que não a seqüência de peptídeos de ocorrência natural. Porexemplo, substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (preferi-velmente substituições conservativas de aminoácidos) podem ser obtidasem uma seqüência de ocorrência natural (preferivelmente na parte dopolipeptídeo fora do(s) domínio(s) que forma(m) contatos inter-moleculares). Uma substituição conservativa de aminoácidos não podealterar substancialmente as características estruturais da seqüênciaparental (por exemplo, uma substituição de aminoácido não deve tendera quebrar a hélice que ocorre na seqüência parental, ou romper outrostipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência parental).

Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeosreconhecidas na técnica são descritas em Proteins, Structures andMolecular Principies (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, NewYork (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze,eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton e colabo-radores Nature 354:105 (1991), que são incorporadas aqui comoreferência.

O termo "análogo" conforme utilizado aqui refere-se a poli-peptídeos que são compreendidos de um segmento de pelo menos 25aminoácidos que apresenta substancial identidade a um parte de umaseqüência de aminoácidos de um polipeptídeo de ocorrência natural eque apresenta pelo menos uma das atividades do polipeptídeo deocorrência natural. Tipicamente, os análogos de polipeptídeo compre-endem uma substituição conservativa de aminoácido (ou adição oudeleção) em relação à seqüência de ocorrência natural. Os análogostipicamente apresentam um comprimento de pelo menos 20 aminoáci-dos, preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos ou mais e podem serfreqüentemente tão longos quanto um polipeptídeo de ocorrêncianatural completo.

Os análogos de peptídeo são comumente utilizados na in-dústria farmacêutica como fármacos não peptídicos com propriedadesanálogas às do peptídeo molde. Estes tipos de composto não peptídicosão chamados de "miméticos de peptídeo" ou "peptideomiméticos".Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber e Freidinger TINS p.392(1985); e Evans e colaboradores J. Med. Chem. 30:1229 (1987), os quaissão incorporados aqui como referência. Tais compostos são freqüente-mente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular por compu-tador. Miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares apeptídeos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir umefeito terapêutico ou profilático equivalente. Em geral, peptideomiméti-cos são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradigma (isto é,um polipeptídeo que apresenta uma propriedade bioquímica ou ativida-de farmacológica), tal como um anticorpo humano, mas apresenta umaou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligaçãoselecionada do grupo consistindo em: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-,-CH=CH- (eis e trans), -COCH2-,

-CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica.Substituições sistemáticas de um ou mais aminoácidos de uma seqüên-cia consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) podem ser utilizadas para gerar peptídeosmais estáveis. Adicionalmente, peptídeos restritos compreendendo umaseqüência consenso ou uma variação da seqüência consenso substanci-almente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica(Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biockem. 61:387 (1992), que é incorporadaaqui como referência); por exemplo, por adição de resíduos de cisteínainternos capazes de formar pontes dissulfeto intra-moleculares queciclizam o peptídeo.

Terminais amino e carboxi preferidos de fragmentos de aná-logos ocorrem próximos aos limites dos domínios funcionais. Osdomínios estruturais e funcionais podem ser identificados por compara-ção dos dados de seqüência de nucleotídeos e/ou aminoácidos contidosem bancos de dados de seqüências públicos ou privados. Preferivelmen-te, métodos de comparação por computador são utilizados para identifi-car motivos de seqüência ou domínios de conformação de proteínaprevistos que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou funçãoconhecidas. Métodos para identificar seqüências de proteína que sedobram em uma estrutura tri-dimensional conhecida são conhecidos(ver Bowie e colaboradores Science 253:164 (1991)). Os especialistas natécnica podem reconhecer motivos de seqüência e conformações estru-turais que podem ser utilizados para definir domínios estruturais efuncionais de acordo com a invenção.

O termo "agente de ligação específica" refere-se a uma molecuia natural ou não natural que se liga especificamente a um alvo.Exemplos de agentes de ligação específica incluem, mas, sem limitações,proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos e compos-tos de molécula pequena. Em certas realizações, um agente de ligaçãoespecífica é um anticorpo. Em certas realizações, um agente de ligaçãoespecífica é uma região de ligação a um antígeno de um anticorpo.

O termo "agente de ligação específica a EGFr" refere-se a umagente de ligação específica que liga especificamente qualquer parte deum polipeptídeo EGFr. Em certas realizações, um agente de ligaçãoespecífica a EGF-r é um anticorpo que especificamente liga um polipep-tídeo EGFr. Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr é um anticorpo humano que especificamente liga um polipeptídeoEGFr. Em certas realizações, uma agente de ligação específica a EGFr éo panitumumab. Em certas realizações, um agente de ligação específicaa EGFr é uma região de ligação a antígeno de um anticorpo específicopara um polipeptídeo EGFr.

O termo "liga especificamente" refere-se à capacidade de umagente de ligação específica de se ligar a um alvo com maior afinidadeque se liga a um não alvo. Em certas realizações, ligação específicarefere-se à ligação para um alvo com uma afinidade de pelo menos 10,50, 100, 250, 500 ou 1000 vezes maior que a afinidade para um nãoalvo. Em certas realizações, a afinidade é determinada por um ensaio deafinidade ELISA. Em certas realizações, a afinidade é determinada porum ensaio BIAcore. Em certas modalidades, a afinidade é determinadapor um método cinético. Em certas realizações, a afinidade é determi-nada por um método equilíbrio/solução. Em certas modalidades, umanticorpo é considerado como ligando especificamente um antígenoquando a constante de dissociação entre o anticorpo e um ou mais deseus epitopos reconhecidos é < 1 pM, preferivelmente < 100 nM e commaior preferência < 10 nM."Anticorpos e imunoglobulinas nativas" são usualmente gli-coproteínas heterotetrâmicas de cerca de 150000 daltons, compostas deduas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas.Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfe-to covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre ascadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeiapesada e leve apresenta também pontes dissulfeto espaçadas inter-cadeia. Cada cadeia pesada apresenta em uma extremidade um domí-nio variável (VH) seguida de um número de domínios constantes. Cadacadeia leve apresenta um domínio variável em uma extremidade (VL) eum domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constanteda cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeiapesada e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domíniovariável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidoparticulares formem uma interface entre os domínios variáveis dascadeias leve e pesada (Chothia e colaboradores J. Mol. Biol. 186:651(1985); Novotny e Haber, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 82:4592 (1985);Chothia e colaboradores, Nature 342:877-883 (1989)).

O termo "anticorpo" refere-se tanto a um anticorpo intactoquanto a um fragmento deste que liga um antígeno que compete com oanticorpo intacto pela ligação específica. "Fragmento deste que liga umantígeno" refere-se a uma parte ou fragmento de uma molécula deanticorpo intacta, onde o fragmento retém a função de ligação a antíge-no. Os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de DNArecombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorposintactos, tal como clivagem com papaína. Fragmentos de ligaçãoincluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab")2, Fv, anticorpos de cadeiasimples ("scFv"), Fd' e Fd. Métodos para a produção dos vários fragmen-tos a partir de anticorpos monoclonais são bem conhecidos dos especia-listas na técnica (ver, por exemplo, Pluckthun, 1992, Immunol. Rev.130:151-188). Entende-se que um anticorpo outro que não um anticor-po "bi-específico" ou "bi-funcional" apresenta cada um de seus sítios deligação idênticos. Um anticorpo inibe substancialmente a adesão de umreceptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpo reduz aquantidade de receptor ligado ao contra-receptor em pelo menos cercade 20%, 40%, 60%, ou 80% e mais usualmente acima de cerca de 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% (conforme determinado em umensaio de ligação competitivo in vitró).

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separadoe/ou recuperado a partir de um componente de seu meio natural.Componentes contaminantes de seu meio natural são materiais queiriam interferir com diagnósticos ou usos terapêuticos para o anticorpo epodem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado(1) acima de 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelométodo de Lowry e seqüenciamento dos aminoácidos terminais ouinternos pela utilização de um seqüenciador tipo "spinning cup", ou (2)para uma homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ounão redutoras utilizando-se azul de Coomassie ou, preferivelmente,marcação com prata. Um anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ emcélulas recombinantes desde que pelo menos um componente do meionatural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, oanticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purifica-ção.

O termo "variável" refere-se ao fato de certas partes dos do-mínios variáveis diferirem extensivamente na seqüência entre anticorpose são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particularpara seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é distribu-ída uniformemente por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Éconcentrada em três segmentos chamados de regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis dos domíniosvariáveis tanto na cadeia leve quanto na cadeia pesada. As partes maisaltamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de quadro("framework") (FR). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e levesnativas cada uma compreendendo quatro regiões FR, largamenteadotando a configuração em folha (3, conectados por três CDRs, queformam uma alça conectando e em alguns casos fazendo parte da, aestrutura em folha (3. As CDRs em cada cadeia são mantidos unidospróximos pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuempara a formação do sítio de ligação a antígeno dos anticorpos (ver Kabate colaboradores (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidosdiretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibemvárias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na toxidezcelular dependente de anticorpo.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítiode reconhecimento e ligação a antígeno completo. Em uma espécie deFv de cadeia dupla, esta região consiste em um dímero de um domíniovariável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação estável nãocovalente. Numa espécie de Fv de cadeia simples, um domínio variávelde cadeia pesada e um de cadeia leve podem ser ligados covalentementepor um ligante peptídico flexível de tal forma que as cadeias leve epesada podem se associar em uma estrutura "dimérica" análoga à deuma espécie de Fv de cadeia dupla. É nesta configuração que as trêsCDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio deligação a antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, asseis CDRs conferem especificidade na ligação a antígeno ao anticorpo.Entretanto, mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fvcompreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno)apresenta a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora com umaafinidade mais baixa que o sítio de ligação completo.O termo "região hipervariáveF quando utilizado aqui refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveispela ligação a antígeno. A região hipervariável compreende resíduos deaminoácido de uma "região determinante de complementaridade'' ou"CDR" (por exemplo, os resíduos 24-34 (LI), 50-62 (L2) e 89-97 (L3) nodomínio variável de cadeia leve e 31-55 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3)no domínio variável de cadeia pesada; Kabat e colaboradores, Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos deuma "alça hipervariável" (por exemplo, os resíduos 26-32 (LI), 50-52(L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55(H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e LeskJ. Mol Biol. 196:901-917 (1987)). As "regiões de quadro" ou resíduos"FR" são aqueles resíduos de domínio variável outros que não os resí-duos de região hipervariável tal como definida aqui.

O termo "regiões determinantes de complementaridade" ou"CDRs", quando utilizado aqui, refere-se a partes de receptores imuno-lógicos que entram em contato com um ligante específico e determinasua especificidade. As CDRs de receptores imunológicos são a partemais variável da proteína receptora, conferindo aos receptores suadiversidade e estão contidas em seis alças na extremidade distai dosdomínios variáveis do receptor, três alças partindo de cada um dos doisdomínios variáveis do receptor.

"Citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo" e"ADCC" refere-se a uma reação mediada por célula na qual célulascitotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (porexemplo, células killer naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhe-cem anticorpo ligado em uma célula alvo e subseqüentemente causam alise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK,expressam apenas FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRl, FcyRIIe FcyRIII. A expressão de Fc em células hematopoiéticas está resumidana Tabela 3 à página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-92 (1991). De maneira a se acessar a atividade de ADCC de umamolécula de interesse, um ensaio ADCC in vitro, tal como o descrito naPatente US 5.500.362 ou na Patente US5.821.337, pode ser realizado.Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononuclearesde sangue periférico (PBMC) e células killer naturais (NK). Alternativa-mente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interessepode ser acessada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal comodescrito em Clynes e colaboradores PNAS (USA) 95:652-656 (1988).

O termo "epitopo" inclui qualquer proteína determinante ca-paz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina e/ou a umreceptor de célula T. Determinantes epitópicos usualmente consistemem agrupamentos quimicamente ativos de moléculas tais como aminoá-cidos ou cadeias laterais sacarídeas e usualmente apresentam caracte-rísticas estruturais em tr~es dimensões, bem como características decarga específica.

O termo "agente" é utilizado aqui para denotar um compostoquímico, uma mistura de compostos químicos, uma macromoléculabiológica, ou um extrato proveniente de materiais biológicos.

Conforme utilizados aqui, os termos "rótulo" ou "rotulado"referem-se à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, pelaincorporação de um aminoácido radio-rotulado ou ligação a um polipep-tídeo ou radicais biotinila que podem ser detectados por avidina marca-da (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ouatividade enzimática que possam ser detectados por métodos óticos oucolorimétricos). Em certas situações, o rótulo ou marcador podem sertambém terapêuticos. Vários métodos de rotulagem de polipeptídeos eglicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados.

Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas, sem limitações,os seguintes: radioisótopos ou radionucleotídeos (por exemplo, 3H, 14C,15N, 35S1 90Y, "Tc, niIn, 125I, i3ii)f rótulos fluorescentes (por exemplo,FITC, rodamina, fósforo lantanídeo) rótulos enzimáticos (peroxidase derábano, (3-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimio-luminescentes, grupos biotinila e epitopos de polipeptídeo predetermi-nados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, seqüên-cias pares de zipper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secun-dários, domínios de ligação de metal, tags epitopo). Em algumasrealizações, os rótulos são fixados por braços espaçadores de várioscomprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

O termo "agente farmacêutico ou fármaco" conforme utiliza-do aqui refere-se a um composto químico ou composição química capazde introduzir um efeito terapêutico desejado quando apropriadamenteadministrado a um paciente. Outros termos químicos são utilizadosaqui de acordo com o uso convencional da técnica, como exemplificadopelo The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed.,McGraw-Hill, San Francisco (1985)), incorporado aqui como referência.

O termo "agente anti-câncer" é utilizado aqui para se fazerreferência a agentes que apresentam a propriedade funcional de inibir odesenvolvimento ou progressão de um neoplasma em um ser humano,particularmente uma lesão maligna (cancerosa), tal como um carcino-ma, sarcoma, linfoma, ou leucemia. Inibição de metástase é freqüente-mente uma propriedade de agentes anti-câncer.

Conforme utilizado aqui, o termo "substancialmente puro"significa uma espécie e a espécie predominante presente (isto é, em umabase molar é mais abundante que qualquer outra espécie individual nacomposição) e preferivelmente uma fração substancialmente purificada éuma composição em que a espécie compreende pelo menos cerca de50% (em uma base molar) de todas as espécies macromolecularespresentes. Em geral, uma composição substancialmente pura irácompreender mais de cerca de 80% de todas as espécies macromolecu-lares presentes na composição, com maior preferência mais de que cercade 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. Com maior preferência, aespécie é purificada à homogeneidade essencial (espécies contaminantesnão podem ser detectadas na composição por métodos de detecçãoconvencionais) onde a composição consiste essencialmente de umaúnica espécie macromolecular.

Os termos "paciente" e "indivíduo" incluem indivíduos hu-manos e animais.

Os termos "mamífero" e "animal" para os propósitos de tra-tamento referem-se a qualquer animal classificado como mamífero,incluindo humanos, animais domésticos e de criação e animais dezoológico, esportes ou de companhia, tais como cães, cavalos, gatos,vacas etc. Preferivelmente, o mamífero é humano.

O termo "estado doentio" refere-se a um estado fisiológico deuma célula ou de um mamífero total no qual ocorreu uma interrupção,parada ou distúrbio das funções, sistemas celulares ou corporais, ouórgãos.

Os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto a tra-tamento terapêutico quanto profilático ou medidas preventivas, onde oobjetivo é prevenir ou desacelerar (reduzir) uma alteração fisiológica oudistúrbio indesejados, tal como o desenvolvimento ou disseminação decâncer. Para os propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficosou desejados incluem, mas, sem limitações, alívio de sintomas, reduçãoda extensão da doença, estabilização (isto é, não agravamento) do estadoda doença, retardo ou redução da progressão da doença, melhora oupaliação do estado doentio e remissão (parcial ou total), detectável ounão detectável. "Tratamento" pode também significar o prolongamentoda sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada semtratamento. Os necessitados de tratamento incluem aqueles já com acondição ou distúrbio, bem como aqueles com tendência a apresentarema condição ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou distúrbio deveser prevenido.

Uma afirmação de que o tratamento é "eficaz" significa que otratamento é útil para o tratamento da doença ou condição para a qualo tratamento é administrado.

Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria deum ou mais tratamentos. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicos ouagudos incluindo aquelas condições patológicas que predispõem omamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitantes de distúr-bios a serem tratados aqui incluem tumores benignos e malignos,leucemias e malignidades linfóides, em particular câncer de mama,retal, de ovário, de estômago, endometrial, da glândula salivar, dopulmão, rim, cólon, tiróide, pancreático, da próstata e bexiga. Umdistúrbio preferido a ser tratado de acordo com a presente invenção éum tumor maligno, tal como câncer colo-retal, câncer cervical (porexemplo, escamoso intraepitelial cervical e neoplasia glandular), câncerde pulmão, carcinoma de célula renal (RCC), tumores esofágicos,tumores epiteliais malignos e linhagens celulares derivadas de carcino-ma.

Uma "doença ou condição relacionada com um polipeptídeoEGFr" inclui pelo menos uma doença ou condição selecionada de: umadoença ou condição causada por um polipeptídeo EGFr; uma doença oucondição exacerbada por um polipeptídeo EGFr; uma doença ou condi-ção para a qual um polipeptídeo EGFr contribui; e uma doença oucondição que está associada com a presença de um polipeptídeo EGFr.Em certas realizações, a doença ou condição relacionada com umpolipeptídeo EGFr pode existir na ausência do polipeptídeo EGFr. Emcertas realizações, um aumento ou redução da quantidade de polipeptí-deo EGFr causa uma doença ou condição relacionada com um polipep-tídeo EGFr. Em certas realizações, uma doença ou condição relacionadaa um polipeptídeo EGFr pode ser exacerbada por um aumento ouredução da quantidade de polipeptídeo EGFr. Em certas realizações,uma doença ou condição relacionada com um polipeptídeo EGFr é umcâncer. Um "câncer relacionado com EGFr" inclui pelo menos umcâncer selecionado de: um câncer que é provocado por um polipeptídeoEGFr, um câncer que é exacerbado por um polipeptídeo EGFr, umcâncer para o qual um polipeptídeo EGFr contribui e um câncer que éassociado com um polipeptídeo EGFr. Cânceres relacionados com EGFrtípicos incluem, mas, sem limitações, câncer de pulmão (incluindo, mas,sem limitações, carcinoma pulmonar de célula pequena), câncer demama, câncer renal, câncer do cólon, câncer gástrico, câncer no cére-bro, câncer de bexiga, cânceres de cabeça e pescoço, câncer de ovário ecâncer da próstata.

Em "terapia combinada" ou "terapia por combinação", ospacientes são tratados com um agente de ligação específica de EGFr emcombinação com um agente quimioterápico ou anti-câncer e/ou terapiapor radiação. Em certas realizações, um câncer relacionado com EGFr étratado sob protocolo pela adição de um agente de ligação específica aum polipeptídeo EGFr à linha primária e secundária terapêutica padrão.

Em certas realizações, os esquemas de protocolo irão objetivar a efetivi-dade tal como acessada pela redução da massa tumoral bem como acapacidade em reduzir as doses usuais da quimioterapia padrão. Emcertas realizações, estas reduções de dosagem irão permitir uma terapiaadicional e/ou prolongada pela redução da toxidez relacionada com adose do agente quimioterapêutico.

"Monoterapia" refere-se ao tratamento de um distúrbio pelaadministração de um agente de ligação específica a EGFr a pacientessem um acompanhamento quimioterapêutico ou agente anti-câncer outerapia com radiação.Algumas Modalidades TípicasAlguns Métodos Típicos de Determinaçãodo Número de Cópias do Gene de EGFr

Em várias realizações, o número de cópias do gene de EGFrde uma amostra pode ser determinado por uma variedade de formasconhecidas na técnica. Métodos típicos incluem, mas, sem limitações,ensaios baseados em hibridização, ensaios baseados em amplificação epor detecção da transcrição genética e expressão de proteína.

Em certas modalidades, um ensaio baseado em hibridizaçãoé utilizado para se determinar o número de cópias do gene de EGFr emuma amostra. Em certas realizações, o ensaio baseado em hibridizaçãoé a hibridização fluorescente in situ ("FISH") (ver, por exemplo, Angerer,Meth. Enzymol. 152:649 (1987); Pinkel e colaboradores, Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A. 85:9138-42 (1988)). Em algumas destas modalidades, aamostra é fixada. Em algumas destas realizações, a amostra é tratadapara aumentar a acessibilidade de um ou mais ácidos nucléicos alvo.Em algumas destas realizações, a amostra é exposta a uma ou maissondas que se ligam especificamente ao gene de EGFr. Em certasrealizações, uma ou mais sondas que se ligam especificamente ao genede EGFr são rotuladas. Em certas modalidades, a amostra é tambémexposta a um ou mais sondas que se ligam especificamente a pelomenos uma seqüência de nucleotídeos de referência. Em certas modali-dades, uma ou mais sondas que se ligam especificamente a pelo menosuma seqüência de nucleotídeos de referência, são rotuladas. Em certasrealizações, uma ou mais sondas que se ligam especificamente ao genede EGFr são rotuladas com um rótulo diferente do rótulo das uma oumais sondas que se ligam especificamente a pelo menos uma seqüênciade nucleotídeos de referência. Em certas modalidades, pelo menos umaseqüência de nucleotídeos de referência está localizada no cromossomo7. Em certas modalidades, duas cópias de pelo menos uma seqüênciade nucleotídeos de referência estão presentes em cada célula na amos-tra. Em certas realizações, pelo menos uma seqüência de nucleotídeosde referência é uma seqüência centromérica. Em certas modalidades, assondas rotuladas são detectadas por microscopia fluorescente. Emcertas realizações, o número de cópias do gene de EGFr é comparadocom o número de cópias de pelo menos uma seqüência de nucleotídeosde referência. Em certas modalidades, um aumento do número decópias do gene de EGFr na amostra de teste em relação ao número decópias da pelo menos uma seqüência de nucleotídeos de referênciaprediz que um tratamento com agente de ligação específica a EGFr seráeficaz no tratamento de um câncer relacionado com EGFr no indivíduo.

Em certas modalidades, é determinado o número de núcleospresentes em uma amostra. Em certas realizações, o número denúcleos presentes em uma amostra é determinado por microscopiafluorescente. Em certas modalidades, o número de cópias do gene deEGFr é comparado com o número de núcleos presentes na amostra. Emcertas realizações, a razão do número de cópias do gene de EGFr para onúmero de núcleos espera-se que seja 2 em uma amostra normal. Emcertas modalidades, uma razão do número de cópias do gene de EGFrpara o número de núcleos maior que dois prediz que um tratamentocom uma gente de ligação específica a EGFr será eficaz no tratamento deum câncer relacionado com EGFr em um indivíduo.

Em certas realizações, um ensaio baseado em hibridização éum Southern blot (ver, por exemplo, Sambrook e Russell, "SouthernHybridization" em "Molecular Cloning: A Laboratory ManuaT, 3a ed., ColdSpring Harbor Lab. Press: Cold Spring Harbor (2001)). Em certasrealizações, os ácidos nucléicos da amostra são separados por eletrofo-rese. Em certas modalidades, os ácidos nucléicos separados sãotransferidos para um suporte sólido. Suportes sólidos típicos incluem,mas, sem limitações, nylon; vidro; quartzo; membranas diazotadas,incluindo mas, sem limitações, papel ou nylon; silicones; poliformaldeí-do, celulose; acetato de celulose; plásticos incluindo, mas, sem limita-ções, polietileno, polipropileno e poliestireno; papel; cerâmicas; metais;metalóides; materiais semicondutores; e substâncias que formam géis,incluindo, mas, sem limitações, gelatinas, lipopolissacarídeos, silicatos,agarose e poliacrilamidas. Em algumas destas modalidades, os ácidosnucléicos separados sobre o suporte sólido são expostos a uma ou maissondas que se ligam especificamente ao gene de EGFr. Em certasrealizações, uma ou mais sondas que se ligam especificamente ao genede EGFr são rotuladas. Em certas modalidades, os ácidos nucléicosseparados sobre o suporte sólido são também expostos a uma ou maissondas que se ligam especificamente a pelo menos uma seqüência denucleotídeos de referência. Em certas realizações, uma ou mais sondasque se ligam especificamente a pelo menos uma seqüência de nucleotí-deos de referência são rotuladas. Em certas modalidades, uma ou maissondas que se ligam especificamente ao gene de EGFr são rotuladas comum rótulo diferente do rótulo das uma ou mais sondas que se ligamespecificamente a pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dereferência. Em certas realizações, pelo menos uma seqüência denucleotídeos de referência está localizada no cromossomo 7. Em certasmodalidades, duas cópias da pelo menos uma seqüência de nucleotídeosde referência estão presentes em cada célula na amostra. Em certasrealizações, pelo menos uma seqüência de nucleotídeos de referência éuma seqüência centromérica. Em certas modalidades, as sondasrotuladas são detectadas. Em certas realizações, o número de cópias dogene de EGFr é comparado com o número de cópias de pelo menos umaseqüência de nucleotídeos de referência. Em certas realizações, umaumento no número de cópias do gene de EGFr na amostra de teste emrelação ao número de cópias da pelo menos uma seqüência de nucleotí-deos de referência prediz que um tratamento com um agente de ligaçãoespecífica a EGFr será eficaz no tratamento de um câncer relacionadocom EGFr no indivíduo.

Em certas modalidades, o ensaio baseado em hibridização éum ensaio sandwich (ver, por exemplo, Hames e Higgins, "Nucleic AcidHybridization, A Practical Approach', IRL Press (1985); Gall e colabora-dores, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 63: 378-383 (1969); e John e colabo-radores, Nature 223:582-587 (1969)). Em certas modalidades, um ácidonucléico que se liga especificamente ao gene de EGFr é imobilizado emum suporte sólido. Suportes sólidos típicos incluem, mas, sem limita-ções, nylon; vidro; quartzo; membranas diazotadas, incluindo mas, semlimitações, papel ou nylon; silicones; poliformaldeído, celulose; acetatode celulose; plásticos incluindo, mas, sem limitações, polietileno,polipropileno e poliestireno; papel; cerâmicas; metais; metalóides;materiais semicondutores; e substâncias que formam géis, incluindo,mas, sem limitações, gelatinas, lipopolissacarídeos, silicatos, agarose epoliacrilamidas. Tipos exemplares de imobilização incluem, mas, semlimitações, ligação covalente via um ou mais grupos funcionais, incluin-do, mas, sem limitações, ácidos carboxílicos, aldeídos, grupos amino,grupos ciano, grupos etilênicos, grupos hidroxila e grupos mercapto.

Em certas modalidades, um ácido nucléico imobilizado quese liga especificamente ao gene de EGFr é exposto a ácidos nucléicos deuma amostra. Em certas realizações, um ou mais genes de EGFr sehibridizam ao ácido nucléico imobilizado que se liga especificamente aogene de EGFr. Em certas modalidades, uma etapa de lavagem removeácidos nucléicos na amostra não hibridizados e/ou mal hibridizados doácido nucléico imobilizado. Em certas realizações, o complexo gene deEGFr:ácido nucléico imobilizado é exposto a uma sonda específica parao gene de EGFr. Em certas modalidades, a sonda é rotulada. Em certasrealizações, o rótulo é detectavel quantitativamente. Em certas modali-dades, o número de cópias do gene de EGFr em uma amostra é compa-rado com número de cópias de pelo menos uma seqüência de referêncianesta amostra. Em certas realizações, o número de cópias do gene deEGFr em uma amostra tumorigênica é comparado com o número decópias do gene de EGFr de uma amostra normal. Em certas modalida-des, o número de cópias do gene de EGFr em uma amostra de tumormaligno é comparado com o número de cópias do gene de EGFr de umaamostra normal.

Em certas modalidades, o número de cópias do gene de EG-Fr de uma amostra é determinado por um ensaio baseado em amplifica-ção. Ensaios baseados em amplificação típicos incluem, mas, semlimitações, PCR quantitativa (ver, por exemplo, Poropat e colaboradores,Clinicai Chem. 44:724-730, 1998), reação em cadeia de ligase (ver, porexemplo, Wu e colaboradores, Genomics 4:560 (1989); Landegren ecolaboradores, Science 241:1077 (1988); e Barringer e colaboradores,Gene 89:117 (1990)), amplificação por transcrição (ver, por exemplo,Kwoh e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:1173 (1989)); PCRcompetitiva (ver, por exemplo, Honda e colaboradores, J. Exp. Botany53:1515-20 (2002)); e replicação de seqüência auto-sustentada (ver, porexemplo, Guatelli e colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 87:1874(1990)).

Em certas realizações, o número de cópias do gene de EGFrde uma amostra é determinado pela quantificação de transcritos do genede EGFr na amostra, utilizando-se qualquer um dos métodos descritosacima.

Em certas modalidades, o número de cópias do gene de EG-Fr de uma amostra é determinado pela quantificação da expressão dopolipeptídeo EGFr, utilizando-se métodos conhecidos na técnica.Métodos de quantificação de polipeptídeo típicos incluem, mas, semlimitações, análise de absorção de luz, incluindo, mas, sem limitações,determinação da absorbância a 280 nm; incubação de extratos daamostra com anticorpos anti-EGFr seguida da quantificação dos anti-corpos anti-EGFr especificamente ligados; e cromatografia, incluindo,mas, sem limitações, eletroforese seguida de densiometria ou análiseWestern e cromatografia em coluna acoplada a um dispositivo dedetecção.

Em certas realizações, um sistema baseado em conjunto éutilizado para a determinação do número de cópias do gene de EGFr daamostra. Sistemas baseados em conjunto incluem, mas, sem limita-ções, sistemas baseados em conjunto envolvendo ensaios baseados emhibridização, ensaios baseados em amplificação, quantificação datranscrição do gene e quantificação da expressão da proteína. Algumasmetodologias de conjunto típicas são descritas abaixo.

Alguns Conjuntos Típicos

Em certas modalidades, o número de cópias do gene de EG-Fr em uma amostra de um ou mais indivíduos é determinado utilizando-se tecnologia de micro-conjunto, como conhecido na técnica (ver, porexemplo, Pollack e colaboradores, Nature Genetics 23: 41-46 (1999);Pastinen, Genome Res. 7:606-614 (1997); Jackson, Nature Biotechnology14:1685 (1996); Chee, Science 274: 610 (1995); e Pinkel e colaborado-res, Nature Genetics 20:207-211 (1998)). Em certas realizações, onúmero de cópias do gene de EGFr em duas ou mais amostras de um oumais indivíduos é determinado utilizando-se tecnologia de micro-conjunto. Em algumas destas modalidades, duas ou mais amostras sãocoletadas de um único indivíduo. Em algumas destas realizações, umade duas ou mais amostras é de um tumor relacionado com EGFr e umaoutra de duas ou mais amostras é de um tecido normal não tumorigêni-co.

Em certas modalidades, uma amostra não é tratada antesda determinação do número de cópias do gene de EGFr. Em certasrealizações, uma amostra é tratada antes da determinação do númerode cópias do gene de EGFr. Em certas realizações, o número de cópiasdo gene de EGFr em uma amostra é determinado tanto antes quantodepois do tratamento da amostra.

Em certas modalidades, são providos micro-conjuntos com-preendendo uma ou mais moléculas que se ligam especificamente a umgene de EGFr. Em certas realizações, são providos micro-conjuntoscompreendendo uma ou mais ácidos nucléicos complementares a umgene de EGFr. Em certas modalidades, os ácidos nucléicos são extraí-dos de uma ou mais amostras de um ou mais indivíduos e os ácidosnucléicos extraídos são expostos a um ou mais ácidos nucléicos com-plementares a um gene de EGFr no micro-conjunto para formar umcomplexo de hibridização do gene de EGFr. Em algumas destas modali-dades, a quantidade do complexo de hibridização do gene de EGFr emum micro-conjunto é determinada. Em algumas destas realizações, aquantificação é por ligação de uma molécula rotulada a um complexo dehibridização do gene de EGFr e detecção quantitativa do rótulo. Emalgumas destas modalidades, o gene de EGFr é rotulado e quantitativa-mente detectado após a formação do complexo de hibridização do genede EGFr.

Em certas modalidades, um tratamento candidato para umcâncer relacionado com EGFr é selecionado utilizando-se tecnologia demicro-conjunto. Em algumas destas realizações, o número de cópias dogene de EGFr é determinado em uma primeira amostra obtida de umpaciente antes da administração do tratamento ao paciente e o númerode cópias do gene de EGFr é determinado em uma segunda amostraobtida do paciente no momento após a administração do tratamento.Em algumas destas modalidades, o número de cópias do gene de EGFrda primeira amostra e o da segunda amostra são comparados, ondeuma redução do número de cópias do gene de EGFr na segunda amos-tra em relação ao número de cópias do gene de EGFr da primeiraamostra indica que o tratamento é efetivo para o paciente.

Em certas modalidades, a presença ou ausência de um oumais polipeptídeos EGFr em uma ou mais amostras é acessada utilizan-do-se tecnologia de micro-conjunto. Em algumas destas realizações, omRNA é primeiro extraído de uma amostra de célula ou tecido e ésubseqüentemente convertido a cDNA, que é hibridizado ao micro-conjunto. Em algumas destas modalidades, a presença ou ausência decDNA que é especificamente ligado ao micro-conjunto é indicativa dapresença ou ausência do polipeptídeo EGFr. Em algumas destasmodalidades, o nível de expressão de um ou mais polipeptídeos EGFr éacessado pela quantificação do cDNA que está especificamente ligado aomicro-conjunto. Em algumas destas realizações, a célula ou tecido sãotratados antes do acesso e a capacidade do tratamento em afetar aexpressão dos um ou mais polipeptídeos EGFr é também acessada.

Em certas realizações, são providos micro-conjuntos com-preendendo um ou mais polipeptídeos EGFr (ver, por exemplo, McBeathe colaboradores, Science, 289:1760-1763, 2000). Em certas realizações,agentes de ligação específica a um ou mais polipeptídeos EGFr candida-tos são selecionados utilizando-se um micro-conjunto de polipeptídeoEGFr. Em certas modalidades, são providos micro-conjuntos compre-endendo um ou mais agentes de ligação específica a um polipeptídeoEGFr. Em certas realizações, a quantidade de um polipeptídeo EGFr emuma ou mais amostras é acessada.

Alguns Agentes de Ligação Específica e Anticorpos

Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr é provido. Em algumas destas realizações, o agente de ligaçãoespecífica a EGFr é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígenodeste.

Em certas modalidades, anticorpos monoclonais podem serobtidos utilizando-se o método de hibridoma primeiro descrito porKohler e colaboradores, Nature 256:495 (1975). Em certas realizações,anticorpos monoclonais podem ser obtidos por métodos de DNA recom-binante (Patente US4.816.567).

Em certas modalidades do método de hibridoma, um ca-mundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, incluindo, mas, semlimitações, um hamster ou macaco, é imunizado para induzir linfócitosque produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão se ligarespecificamente à proteína utilizada para a imunização. Em certasrealizações, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Em certasrealizações, os linfócitos ou linfócitos enriquecidos para células B sãofundidos com células de mieloma por um processo de fusão de eletro-célula ou pela utilização de um agente de fusão adequado, tal comopolietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Mono-clonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103, Academic Press,(1996)).

Em certas modalidades, as células de hibridoma são semea-das e crescidas num meio de cultura adequado que preferivelmentecontém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevi-vência das células de mielona parentais não fundidas. Em certasrealizações, se as células de mielona parentais não contêm a enzimahipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meiode cultura para os hibridomas tipicamente irão incluir hipoxantina,aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias estas que inibem ocrescimento de células deficientes em HGPRT.

Em certas modalidades, são selecionadas células de mielo-ma que se fundem eficientemente, suportam produção em nível altoestável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadase são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Linhagens de célulasde mieloma típicas incluem, mas, sem limitações, linhagens de mielomade murino, tais como as derivadas de tumores de camundongo MOP-21e MC-11 disponibilizadas pelo Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego, Califórnia EUA e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponibiliza-das pela American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA.Em certas modalidades, são utilizadas linhagens de célula de mielomahumano e/ou heteromieloma camundongo-humano para a produção deanticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984);Brodeur e colaboradores, Monoclonál Antibody Production Techniqu.esand Applications, pp. 51-63, Mareei Dekker, Inc., New York, (1987)).

Em certas realizações, o meio de cultura no qual as célulasde hibridoma são crescidas é ensaiado para a produção de anticorposmonoclonais direcionados contra o antígeno. Em certas modalidades, aespecificidade da ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelascélulas de hibridoma é determinada por imuno-precipitação ou por umensaio de ligação in vitro. Ensaios de ligação típicos incluem, mas, semlimitações, um radioimunoensaio (RIA), um ensaio imunosorvente ligadoa enzima (ELISA) e uma análise de Scatchard de Munson e colaborado-res, Anal Biochem. 107:220 (1980).

Em certas modalidades, após terem sido identificadas as cé-lulas de hibridoma produtoras de anticorpos com a especificidade,afinidade e/ou atividade desejadas, as células podem ser sub-clonadaspor procedimentos de limitação por diluição e crescidas por métodospadrão (Goding, Monoclonál Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1996). Meios de cultura típicos para este propósi-to incluem, mas, sem limitações, os meios DMEM e RPMI-1640. Emcertas realizações, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivocomo tumores ascites em um animal.

Em certas realizações, os anticorpos monoclonais secretadospelos sub-clones são adequadamente separados do meio de cultura,fluido ascite, ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobu-lina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-sefarose, croma-tografia em hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise, ou cromatografiapor afinidade.

Em certas realizações, um ácido nucléico que codifica os an-ticorpos monoclonais é isolado e seqüenciado utilizando-se procedimen-tos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas de oligonucle-otídeo capazes de se ligarem especificamente a genes que codificam ascadeias leve e pesada dos anticorpos monoclonais). Em certas modali-dades, as células de hibridoma servem como uma fonte preferida de talácido nucléico. Em certas realizações, o polinucleotídeo isolado pode sercolocado em vetores de expressão. Em algumas destas modalidades, osvetores de expressão são transfectados em células hospedeiras para seobter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeirasrecombinantes. Células hospedeiras típicas incluem, mas, sem limita-ções, células de E. coli, células CÓS de símio, células de ovário dehamster chinês (CHO), ou células de mieloma que de outra forma nãoproduzem imunoglobulina. Em certas realizações, o ácido nucléico podeser modificado, por exemplo, por união covalente à seqüência de codifi-cação da imunoglobulina toda ou parte da seqüência de codificação deum polipeptídeo não imunoglobulina, criando um anticorpo "quimérico"ou "híbrido".

Em certas realizações, os polipeptídeos não imunoglobulinasão substituídos para os domínios constantes de um anticorpo. Emcertas realizações, os polipeptídeos não imunoglobulina são substituídospara os domínios variáveis de sítios de combinação de antígeno de umanticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendoum sítio de combinação a antígeno apresentando especificidade para umantígeno alvo e um outro sítio de combinação a antígeno apresentandoespecificidade para um antígeno diferente.

Em certas, os anticorpos quiméricos ou híbridos podem serpreparados in vitro utilizando-se métodos conhecidos na química deproteína sintética, incluindo mas, sem limitações, as envolvendo agentesde reticulação. Em certas realizações, podem ser construídas imunoto-xinas utilizando-se uma reação de troca de dissulfeto ou pela formaçãode uma ligação tioéter. Reagentes típicos para este propósito incluem,mas, sem limitações, iminotiolato e metil-4-mercaptobutiri-midato.

Em certas modalidades, são providos anticorpos humanospara um antígeno alvo. Em certas realizações, a tecnologia de hibrido-ma é estendida para criar anticorpos humanos utilizando-se heteromie-lomas (mielomas híbridos camundongo x humano) como pares de fusão(ver, por exemplo, Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur ecolaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applica-tions, pp. 51-63, Mareei Dekker, Inc., New York, 1987). Em certasrealizações, células que secretam anticorpo humano podem ser imortali-zadas por infecção com um vírus de Epstein-Barr (EBV) (James e Bell, J.Immunol. Methods 100:5-40 (1987)). Em certas modalidades, a imorta-lidade de células B humanas pode obtida pela introdução de umacombinação definida de genes transformantes (Hahn e colaboradores,Nature 400: 464-468 (1999)).

Em certas modalidades, animais transgênicos que são capa-zes, por imunização, de produzir um repertório de anticorpos humanosna ausência da produção de imunoglobulina endógena são utilizadospara produzir anticorpos humanos (ver, por exemplo, Jakobovits ecolaboradores, Nature 362:255-258 (1993); Lonberg e Huszar, Int. Rev.Immunol. 13:65-93 (1995); Fishwild e colaboradores, Nat. Biotechnol.14:845-851 [1996]; Mendez et al, Nat. Genet. 15:146-156 [1997]; Green,J. Immunol. Methods 231:11-23 (1999); Tomizuka e colaboradores, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727 (2000); revisto em Little e colaborado-res, Immunol Today 21:364-370 (2000)). Foi descrito que a deleçãohomozigótica do gene da região de união da cadeia pesada do anticorpo(Jh) em linhagens quiméricas ou germinais de camundongos mutantesresulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno(Jakobovits e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2551-2555(1993)). A transferência do conjunto genético da imunoglobulina delinhagem germinal humana em tal linhagem germinal de camundongosmutantes resulta na produção de anticorpos humanos por desafio comantígeno (Jakobovits e colaboradores, Nature 362:255-258 (1993)).

Mendez e colaboradores [Nature Genetics 15:146-156 (1997))geraram uma linhagem de camundongos transgênicos designados por"Xenomouse®ir que, quando desafiados com um antígeno, geramanticorpos humanos totais de alta afinidade. Isto foi obtido pela inte-gração de linhagem germinal de locais de cadeia pesada e cadeia levehumana megabase em camundongos com deleção no segmento Jhendógeno. O XenoMouse® II ancora 1020 kb de local de cadeia pesadahumana contendo aproximadamente 66 genes Vh, regiões Dh e Jhcompletas e três diferentes regiões constantes (u, 6ey) e ancora também800 kb do local k humano contendo 32 genes VK, segmentos JK e genesCK. Em certas realizações, os anticorpos produzidos nestes camundon-gos se assemelham muito àqueles observados em humanos em todos osaspectos, incluindo rearranjo genético, montagem e repertório genéticos.

Em certas realizações, os anticorpos humanos são preferivelmenteexpressos em anticorpos endógenos devido à deleção no segmento Jhendógeno que evita o rearranjo genético no local murino.

Em certas realizações, um animal transgênico compreendegenes de imunoglobulina humana (por exemplo, o Xenomouse® II(Abgenix, Inc.)) pode ser imunizado com um antígeno de interesseparticular, tal como um polipeptídeo EGFr. Em certas realizações, sorosdestes animais imunizados são varridos para a reatividade do anticorpocontra o antígeno inicial. Em certas modalidades, são isolados linfócitosdos nódulos linfáticos ou células de baço e podem ser enriquecidosadicionalmente para células B por seleção para células CD 136 negativase CD 19+. Em certas realizações, estas culturas de célula B (BCCs) sãofundidas a células de mieloma para gerar hibridomas conforme detalha-do acima. Em certas modalidades, estas culturas de célula B sãovarridas adicionalmente para reatividade contra o antígeno inicial. Talvarredura inclui, mas não se limita a, ELISA, um ensaio de competiçãocom anticorpos conhecidos que ligam o antígeno de interesse e ligação invitro a células CHO transfectadas de forma transiente que expressam oantígeno. Em certas realizações, células B únicas que secretam anticor-pos de interesse são identificadas por um ensaio de placa hemolíticaespecífico. Em algumas destas modalidades, as células alvo para lisesão células de sangue vermelho de ovelha (SRBCs) revestidas com oantígeno. Em algumas destas realizações, a formação de um placaindica lise mediada por antígeno específico das células alvo, e, destaforma, a presença de uma cultura de célula B secretando a imunoglobu-lina de interesse e complemento. Em algumas destas modalidades, acélula plasmática específica para antígeno único no centro da placapode ser isolada e utilizado para isolamento de mRNA.

Em certas realizações, o ácido nucléico que codifica a regiãovariável do anticorpo secretado pode ser clonado utilizando-se PCR detranscriptase reversa. Em certas modalidades, o ácido nucléico clonadoé posteriormente inserido em um vetor de expressão adequado, tal comoum cassete vetor tal como um vetor pcDNA ou vetor pcDNA contendo osdomínios constantes das cadeias pesada e leve da imunoglobulina. Emcertas modalidades, o vetor gerado é transfectado em células hospedei-ras (isto é, células CHO) e cultivado em meio nutriente convencionalmodificado conforme apropriado para induzir promotores, transforman-tes de seleção, ou amplificação de genes que codificam as seqüênciasdesejadas.

Em certas realizações, tecnologia de apresentação de fago éutilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpoin vitro, a partir de repertórios de gene do domínio variável (V) deimunoglobulina a partir de doadores não imunizados (ver, por exemplo,McCafferty e colaboradores, Nature 348:552-553 (1990); revisto emKipriyanov e Little, Mol Biotechnol. 12:173-201 (1999); Hoogenboom eChames, Immunol. Today 21:371-378 (2000)). Em algumas destasrealizações, os genes do domínio V do anticorpo são clonados "in-frame"ou em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de umbacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd e apresentados comofragmentos funcionais na superfície da partícula do fago. Em certasrealizações, a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fitasimples do genoma do fago e seleções baseadas nas propriedadesfuncionais do anticorpo resultam também na seleção do gene quecodifica o anticorpo que exibe estas propriedades. A apresentação defago pode ser realizada em uma variedade de formatos, incluindo, mas,sem limitações, aqueles identificados nos seguintes documentos:Johnson e Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993); Winter e colaboradores, Annu. Rev. Immunol 12:433-455 (1994);Dall'Acqua e Carter, Curr. Opin. Struct. Biol. 8:443-450 (1998); eHoogenboom e Chames, Immunol Today 21:371-378 (2000). Fontes desegmentos do gene V para a apresentação de fago incluem, mas, semlimitações, uma biblioteca combinatória randômica pequena de genes Vderivados de baços de camundongos imunizados (Clackson e colabora-dores, Nature 352:624-628 (1991)) e um repertório de genes V dedoadores humanos não imunizados (Marks e colaboradores, J. Mol Biol2 22:581-597 (1991), ou Griffiths e colaboradores, EMBO J. 12:725-734(1993)).

Em certas modalidades, em uma resposta imunológica na-tural, os genes de anticorpo acumulam mutações em um alto grau(hipermutação somática). Em certas realizações, algumas das altera-ções introduzidas conferem maior afinidade. Em certas modalidades, ascélulas B mostrando imunoglobulina de superfície de alta afinidade sãopreferivelmente replicadas e diferenciadas durante o desafio por antíge-no subseqüente. Em certas modalidades, este processo natural pode sermimetizado pelo emprego da técnica conhecida como "mistura decadeia" ("chain shuffling") (Marks e colaboradores, Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). Em algumas destas realizações, a afinidade dos anticorposhumanos "primários" obtidos por apresentação de fago pode ser aumen-tada pela substituição seqüencial dos genes da região V das cadeias levee pesada com repertórios de variantes de ocorrência natural (repertórios)de genes do domínio V obtidos de doadores não imunizados, permitindoa produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo com afinidades nafaixa de nM. Em certas realizações, um repertório de anticorpo de fagomuito amplo é construído (também conhecido como "a mãe de todas asbibliotecas"), conforme descrito por Waterhouse e colaboradores, Nucl.

Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Em certas realizações, um anticorpohumano de alta afinidade é diretamente isolado de uma biblioteca defago ampla (ver, por exemplo, Griffiths e colaboradores, EMBO J.13:3245-3260 (1994)). Em certas realizações, a mistura ("shuffling") degenes pode ser utilizada para derivar anticorpos humanos a partir deanticorpos de roedores, onde o anticorpo humano apresenta afinidades eespecificidades similares ao anticorpo de roedor de partida. Em algu-mas destas realizações, o gene do domínio V de cadeia pesada ou decadeia leve de anticorpos de roedor obtido pela técnica de apresentaçãode fago com um repertório de genes do domínio V humano, criandoquimeras roedor-humano (também chamada de "estampagem deepitopo"). Em certas modalidades, a seleção de regiões variáveis pelosresultados de antígeno no isolamento de regiões variáveis humanascapazes de restaurar um sítio de ligação a antígeno funcional, isto é, oepitopo governa a escolha do par. Em certas realizações, quando oprocesso é repetido de maneira a substituir o domínio V de roedorremanescente, um anticorpo humano é obtido o qual não contémnenhum quadro ou resíduo CDR originária de roedor (ver, por exemplo,pedido de patente PCT WO 93/06213).

Alguns Tratamentos Típicos

Em certas modalidades, agente de ligação específica anti-EGFr podem apresentar uso terapêutico pela inclusão em um tratamen-to com agente de ligação específica a EGFr. Neste Relatório, quando dadiscussão da utilização de agentes de ligação específica a EGFr paratratar doenças ou condições, tal utilização pode incluir agentes deligação específica a EGFr em si; composições compreendendo agentes deligação específica a EGFr; e/ou terapias por combinação compreenden-do agentes de ligação específica a EGFr e um ou mais ingredientesativos. Quando agentes de ligação específica a EGFr são utilizados para"tratar" uma doença ou condição, tal tratamento pode ou não incluir aprevenção da doença ou condição. Em certas modalidades, os agentesde ligação específica a EGFr podem bloquear a interação do receptor deEGF com seu ligante, EGF. Em certas realizações, os agentes de ligaçãoespecífica a EGFr podem ativar o receptor de EGF. Em certas realiza-ções, os agentes de ligação específica a EGFr podem ativar constitutiva-mente o receptor de EGF. Em certas modalidades, os agentes de ligaçãoespecífica a EGFr podem bloquear a ativação do receptor de EGF. Emcertas realizações, os agentes de ligação específica a EGFr podembloquear constitutivamente a ativação do receptor de EGF.

Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr é administrado sozinho. Em certas modalidades, o agente deligação específica a EGFr é administrado antes da administração de pelomenos um outro agente terapêutico. Em certas realizações, um agentede ligação específica a EGFr é administrado concorrente à administraçãode pelo menos um outro agente terapêutico. Em certas modalidades,um agente de ligação específica a EGFr é administrado subseqüente àadministração de pelo menos um outro agente terapêutico. Agentesterapêuticos típicos incluem, mas, sem limitações, pelo menos um outroagente para terapia de câncer. Agentes de terapia de câncer típicosincluem, mas, sem limitações, terapia por radiação e quimioterapia.

Em certas realizações, as composições farmacêuticas de a-gente de ligação específica a EGFr podem ser administradas em terapiapor combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Em certasmodalidades, a terapia por combinação compreende um agente deligação específica a EGFr em combinação com pelo menos um agenteanti-angiogênico. Agentes típicos incluem, mas, sem limitações, compo-sições químicas preparadas sinteticamente, anticorpos, regiões deligação a antígeno, radionuclídeos e combinações e conjugados destes.Em certas modalidades, um agente pode agir como agonista, antagonis-ta, modulador alostérico, ou toxina. Em certas realizações, um agentepode agir no sentido a inibir ou estimular seu alvo (por exemplo, recep-tor ou enzima de ativação ou inibição), e, desta forma, promover a mortecelular ou interrupção do crescimento celular.

Tratamentos quimioterápicos típicos incluem, mas, sem li-mitações, agentes anti-câncer incluindo, mas, sem limitações, agentesalquilantes incluindo, mas, sem limitações, mecloretamina, ciclofosfa-mida, ifosfamida, melfalan e clorambucil; nitrosuréias, incluindo, mas,sem limitações, carmustina BCNU, lomustina, CCNU e semustina,metil-CCNU; Temodal™, temozolamida; etileniminas/metil-melamina,incluindo, mas, sem limitações, trietilenomelamina (TEM), metileno,tiofosforamida, tiotepa, hexametilmelamina (HMM) e altretamina;sulfonatos de alguila, incluindo, mas, sem limitações, busulfan; triazi-nas, incluindo, mas, sem limitações, dacarbazina (DTIC); antimetabóli-tos, incluindo, mas, sem limitações, análogos de ácido fólico tais comometotrexato e trimetrexato; análogos de pirimidina, incluindo, mas, semlimitações, 5-fluoruracil (5FU), fluordesoxiuridina, gemcitabina, citosinaarabinosídeo (AraC, citarabina), 5-azacitidina e 2,2'-difluordesoxicitidi-na;análogos de purina, incluindo, mas, sem limitações, 6-mercapto-purina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina),eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina, cladribina e 2-clorodesoxiadenosina (2- CdA); produtos naturais incluindo, mas, semlimitações, fármacos antibióticos tais como paclitaxel; alcalóides vinca,incluindo, mas, sem limitações, vinblastina (VLB), vincristina e vinorel-bina; taxotere; estramustina e fosfato de estramustina; pipodofilotoxi-nas, incluindo, mas, sem limitações, etoposídeo e teniposídeo; antibióti-cos, incluindo, mas, sem limitações, actinomicina D, daunomicina,rubidomicina, doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas,plicamicina, mitramicina, mitomicina C e actinomicina; enzimas,incluindo, mas, sem limitações, L-asparaginase; modificadores deresposta biológica, incluindo, mas, sem limitações, interferon-alfa, IL-2,G-CSF e GM-CSF; doxiciclina; hidrocloreto de irinotecan; agentesdiversos, incluindo, mas, sem limitações, complexos de coordenaçãocom platina tais como cisplatina e carboplatina; antracenodionasincluindo, mas, sem limitações, mitoxantrona; uréia substituída,incluindo, mas, sem limitações, hidroxiuréia; derivados de metilhidrazi-na, incluindo, mas, sem limitações, N-metilhidrazina (MIH) e procarba-zina; supressores adrenocorticais, incluindo, mas, sem limitações,mitotano (o,p'-DDD) e aminoglutetimida; hormônios e antagonistas,incluindo, mas, sem limitações, antagonistas adrenocorticosteróides taiscomo prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida;Gemzar™, gemcitabina; progestina, incluindo, mas, sem limitações,caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona eacetato de megestrol; estrogênio, incluindo, mas, sem limitações,dietilestilbestrol e equivalentes a etinil estradiol; antiestrogênio, incluin-do, mas, sem limitações, tamoxifeno; androgênios, incluindo, mas, semlimitações, propionato de testosterona e fluoximesterona/equivalentes;antiandrogênios, incluindo, mas, sem limitações, flutamida, análogos dohormônio de liberação de gonadotropina e leuprolida; oxaliplatina,Eloxatin®, capecitabina, Xeloda®, pemetrexed, Alimta®, letrozol, Fema-ra®, anastrozol, Arimidex® e antiandrogênios não esteroidais, incluindo,mas, sem limitações, flutamida.

Terapias de câncer típicas, que podem ser administradascom um agente de ligação específica a EGFr, incluem, mas, sem limita-ções, terapias orientadas. Exemplos de terapias orientadas incluemmas, sem limitações, a utilização de anticorpos terapêuticos. Anticorposterapêuticos típicos incluem, mas, sem limitações, anticorpos de ca-mundongo, quiméricos camundongo-humano, enxertados com CDR,humanizados e humanos e anticorpos sintéticos, incluindo, mas, semlimitações, os selecionados por varredura de bibliotecas de anticorpo.Anticorpos típicos incluem, mas, sem limitações, aqueles que se ligam aproteínas de superfície celular Her2, CDC20, CDC33 e glicoproteínasemelhante a mucina e opcionalmente induzem um efeito citostáticoe/ou cito tóxico nas células tumorais que contêm estas proteínas.Anticorpos típicos incluem, mas, sem limitações, HERCEPTIN™, trastu-zumab, que podem ser utilizados para tratar câncer de mama e outrasformas de câncer; RITUXAN™, rituximab, ZEVALIN™, ibritumomab,tiuxetano e LYMPHOCIDE™, epratuzumab, que podem ser utilizadospara tratar linfona não de Hodgkin e outras formas de câncer; GLEE-VEC™, mesilato de imatinib, que podem ser utilizados para tratarleucemia mielóide crônica e tumores estromais; e BEXXAR™, tositumo-mab iodo 131, que podem ser utilizados para o tratamento de linfomanão de Hodgkin. Alguns anticorpos típicos incluem também ERBI-TUX™; IMC-C225; Iressa™; gefitinib; TARCEVATM, ertinolib; inibidoresdo KDR (receptor do domínio de quinase); anticorpos anti VEGF eantagonistas (por exemplo, Avastin™ e VEGAF-TRAP); anticorpos doreceptor anti VEGF e regiões de ligação a antígeno; anticorpos anti-Ang-1 e Ang-2 e regiões de ligação a antígeno; anticorpos para Tie-2 e outrosreceptores Ang-1 e Ang-2; ligantes de Tie-2; anticorpos contra inibidoresde Tie-2 quinase; e Campath®, alemtuzumab. Em certas realizações, osagentes de terapia de câncer são outros polipeptídeos que induzemseletivamente a apoptose em células tumorais, incluindo, mas, semlimitações, polipeptídeos relacionados com TNF tais como TRAIL.

Em certas modalidades, os agentes de terapia de câncer sãoagentes anti-angiogênicos que reduzem a angiogênese. Alguns destesagentes incluem, mas, sem limitações, ERBITUX™, IMC-C225; agentesinibidores de KDR (receptor do domínio de quinase) (por exemplo,anticorpos e regiões de ligação a antígeno que se ligam especificamenteao receptor do domínio de quinase); agentes anti-VEGF (por exemplo,anticorpos ou regiões de ligação a antígeno que se ligam especificamentea VEGF, ou receptores solúveis de VEGF ou uma região de ligação aligante destes) tais como AVASTIN™ ou VEGF-TRAP™; agentes doreceptor anti-VEGF (por exemplo, anticorpos ou regiões de ligação aantígeno que se ligam especificamente a estes); agentes inibidores deEGFR tais como IRESSA™, gefitinib, TARCEVA™, erlotinib, agentesanti-Angl e anti-Ang2 (por exemplo, anticorpos ou regiões de ligação aantígeno que se ligam especificamente a estes ou a seus receptores, porexemplo, Tie2/Tek); e agentes inibidores anti-Tie-2 quinase (por exem-plo, anticorpos ou regiões de ligação a antígeno que se ligam especifica-mente a estes). Em certas modalidades, as composições farmacêuticaspodem incluir também um ou mais agentes (por exemplo, anticorpos,regiões de ligação a antígeno, ou receptores solúveis) que especificamen-te ligam e inibem a atividade de fatores de crescimento, tais comoantagonistas do fator de crescimento hepatócito (HGF, também conheci-do como Fator de Scatter) e anticorpos ou regiões de ligação a antígenoque ligam especificamente seu receptor "c-met".

Os agentes anti-angiogênicos típicos incluem, mas, sem li-mitações, Campath, IL-8, B-FGF, antagonistas de Tek (Ceretti e colabo-radores, publicação do pedido de patente US n° 2003/0162712; PatenteUS6.413.932); agentes anti-TWEAK (por exemplo, anticorpos de ligaçãoespecíficas ou regiões de ligação a antígeno, ou antagonistas do receptorde TWEAK solúvel; ver, por exemplo, Wiley, Patente US6.727.225);domínio da desintegrina ADAM para antagonizar a ligação de integrina aseus ligantes (Fanslow e colaboradores, publicação do pedido de patenteUS 2002/0042368); anticorpos que ligam especificamente o receptoranti-eph e/ou anti-ephrin ou regiões de ligação a antígeno (Patentes US5.981.245, 5.728.813, 5.969.110, 6.596.852, 6.232.447, 6.057.124 emembros da família destas); antagonistas anti-PDGF-BB (por exemplo,anticorpos de ligação específica ou regiões de ligação a antígeno) bemcomo anticorpos ou regiões de ligação a antígeno que se ligam especifi-camente a ligantes de PDGF-BB e agentes inibidores de PDGFR quinase(por exemplo, anticorpos ou regiões de ligação a antígeno que se ligamespecificamente a estes).

Os agentes anti-angiogênicos/anti-tumorais incluem, mas,sem limitações, SF-7784 (Pfizer, EUA); cilengitide (Merck KgaA, Alema-nha, EPO 770622); pegaptanib octasódico (Gilead Sciences, EUA);Alphastatin (BioActa, UK); M-PGA (Celgene, EUA, Patente US5.712.291); ilomastat (Arriva, EUA, Patente US 5.892.112); emaxanib(Pfizer, EUA, Patente US 5.792.783); vatalanib (Novartis, Suíça); 2-metoxiestradiol (EntreMed, EUA); TLC ELL-12 (Elan, Irlanda); acetato deanecortave (Alcon, EUA); alfa-D148 Mab (Amgen, EUA); CEP-7055(Cephalon, EUA); anti-Vn Mab (Crucell, Holanda); DAC:antiangiogênico(ConjuChem, Canadá); Angiocidina (InKine Pharmaceutical, EUA); KM-2550 (Kyowa Hakko, Japão); SU-0879 (Pfizer, EUA); CGP-79787 (Novar-tis, Suíça, EP 970070); tecnologia ARGENT (Ariad, EUA); YIGSR-Strealth(Johnson & Johnson, EUA); fragmento do fibrinogênio E (BioActa, UK);inibidor de angiogênese (Trigen, UK); TBC-1635 (Encysive Pharmaceuti-cais, EUA); SC-236 (Pfizer, EUA); ABT-567 (Abbott, EUA); Metastatina(EntreMed, EUA); inibidor de angiogênese (Tripep, Suécia); maspin(Sosei, Japão); 2-metoxiestradiol (Oncology Sciences Corporation, EUA);ER-68203-00 (IVAX, EUA); Benefin (Lane Labs, EUA); Tz-93 (Tsumura,Japão); TAN-1120 (Takeda, Japão); FR-111142 (Fujisawa, Japão, JP02233610); fator 4 de plaqueta (RepliGen, EUA, EP 407122); antagonis-ta do fator de crescimento endotelial vascular (Borean, Dinamarca);temsirolimus (CCI-779) (University of South Carolina, EUA); bevacizu-mab (pINN) (Genentech, EUA); inibidores de angiogênese (SUGEN, EUA);XL 784 (Exelixis, EUA); XL 647 (Exelixis, EUA); Mab, integrina al-fa5beta3, Vitaxin e Vitaxin de segunda geração (Applied MolecularEvolution, EUA e Medlmmune EUA); terapia do gene Retinostat® (OxfordBioMedica, UK); hidrocloreto de enzastaurin (USAN) (Lilly, EUA); CEP7055 (Cephalon, EUA e Sanofi-Synthelabo, França); BC 1 (GenoaInstitute of Câncer Research, Itália); inibidor de angiogênese (Alchemia,Austrália); antagonista de VEGF (Regeneron, EUA); rBPI 21 e derivadoantiangiogênico de BPI (XOMA, EUA); PI 88 (Progen, Austrália); cilengití-deo (pINN) (Merck KgaA, Alemanha; Munich Technical University,Alemanha; Scripps Clinic e Research Foundation, EUA); cetuximab (INN)(Aventis, França); AVE 8062 (Ajinomoto, Japão); AS 1404 (CâncerResearch Laboratory, Nova Zelândia); SG 292 (Telios, EUA); Endostatina(Boston Children's Hospital, EUA); 2-metoxiestradiol (Boston ChildrensHospital, EUA); ZD 6474 (AstraZeneca, UK); ZD 6126 (AngiogenePharmaceuticals, UK); PPI 2458 (Praecis, EUA); AZD 9935 (AstraZeneca,UK); AZD 2171 (AstraZeneca, UK); vatalanib (pINN) (Novartis, Suíça eSchering AG, Alemanha); inibidores da rota do fator de tecido (Entra-Med, EUA); pegaptanib (Pinn) (Gilead Sciences, EUA); xanthorrhizol(Yonsei University, Coréia do Sul); vacina, com base genética, de VEGF-2(Scripps Clinic e Research Foundation, EUA); SPV5.2 (Supratek, Cana-dá); SDX 103 (University of Califórnia em San Diego, EUA); PX 478(ProlX, EUA); Metastatina (EntreMed, EUA); troponina I (HarvardUniversity, EUA); SU 6668 (SUGEN, EUA); OXI 4503 (OXiGENE, EUA);o-guanidinas (Dimensional Pharmaceuticals, EUA); motuporamina C(British Columbia University, Canadá); CDP 791 (Celltech Group, UK);atiprimod (pINN) (GlaxoSmithKline, UK); E 7820 (Eisai, Japão); CYC 381(Harvard University, EUA); AE 941 (Aeterna, Canadá); vacina contracâncer de FGF2 (EntreMed, EUA); inibidor do ativador de plasminogêniouroquinase (Dendreon, EUA); oglufanide (pINN) (Melmotte, EUA);inibidores de HIF-lalfa (Xenova, UK); CEP 5214 (Cephalon, EUA); BAYRES 2622 (Bayer, Alemanha); Angiocidina (InKine, EUA); A6 (Angstrom,EUA); KR 31372 (Korean Research Institute of Chemical Technology,Coréia do Sul); GW 2286 (GlaxoSmithKline, UK); EHT 0101 (ExonHit,França); CP 868596 (Pfizer, EUA); CP 564959 (OSI, EUA); CP 547632(Pfizer, EUA); 786034 (GlaxoSmithKline, UK); KRN 633 (Kirin Brewery,Japão); sistema de liberação de fármaco, intraocular, 2-metoxiestradiol(EntreMed, EUA); anginex (Maastricht University, Holanda e MinnesotaUniversity, EUA); ABT 510 (Abbott, EUA); AAL 993 (Novartis, Suíça);VEGI (ProteomTech, EUA); inibidores do fator de necrose alfa (NationalInstitute on Aging, EUA); SU 11248 (Pfizer, EUA e SUGEN EUA); ABT518 (Abbott, EUA); YH16 (Yantai Rongchang, China); S-3APG (BostonChildrens Hospital, EUA e EntreMed, EUA); Mab, KDR (ImCIone Sys-tems, EUA); Mab, alfa5betal (Protein Design, EUA); inibidor de KDRquinase (Celltech Group, UK e Johnson & Johnson, EUA); GFB 116(South Florida University, EUA e Yale University, EUA); CS 706 (Sankyo,Japão); pró-fármaco de combretastatina A4 (Arizona State University,EUA); chondroitinase AC (IBEX, Canadá); BAY RES 2690 (Bayer,Alemanha); AGM 1470 (Harvard University, EUA, Takeda, Japão e TAP,EUA); AG 13925 (Agouron, EUA); tetratiomolibdato (University ofMichigan, EUA); GCS 100 (Wayne State University, EUA); CV 247 (IvyMedicai, UK); CKD 732 (Chong Kun Dang, Coréia do Sul); Mab, fator decrescimento endotelial vascular (Xenova, UK); irsogladina (INN) (NipponShinyaku, Japão); RG 13577 (Aventis, França); WX 360 (Wilex, Alema-nha); esqualamina (pINN) (Genaera, EUA); RPI 4610 (Sirna, EUA);sulfato de galactofucana (Marinova, Austrália); inibidores de heparanase(InSight, Israel); KL 3106 (Kolon, Coréia do Sul); Honokiol (EmoryUniversity, EUA); ZK CDK (Shering AG, Alemanha); ZK Angio (ScheringAG, Alemanha); ZK 229561 (Novartis, Suíça e Schering AG, Alemanha);XMP 300 (XOMA, EUA); VGA 1102 (Taisho, Japão); moduladores doreceptor de VEGF (Pharmacopeia, EUA); antagonistas de VE-cadherin-2(ImClone Systems, EUA); Vasostatin (National Institutes of Health, EUA);vacina, Flk-1 (ImClone Systems, EUA); TZ 93 (Tsumura, Japão); TumS-tatin (Beth Israel Hospital, EUA); FLT 1 solúvel truncado (receptor 1 dofator de crescimento endotelial vascular) (Merck & Co, EUA); ligantes deTie-2 (Regeneron, EUA); e inibidor de trombospondina 1 (AlleghenyHealth, Education and Research Foundation, EUA).

Alguns agentes de terapia do câncer incluem, mas, sem li-mitações: talidomida e análogos de talidomida (N-(2,6-dioxo-3-piperidil)ftalimida); tecogalan sódico (sulfated polissacarídeo peptidogli-cano sulfatado); TAN 1120 (8-acetil-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,l 1-trihidroxi-l-metoxi-10-[[octahidro-5-hidroxi-2-(2-hidroxipropil)-4,10-dimetil-pirano[3,4-d]-l,3,6-dioxazocin-8-il]oxi]-5,12-naftaceno-diona);suradista (ácido 7,7'-[carbonilbis[imino(l-metil-lH-pirrol-4,2-diil)carbonilimino( 1 -metil- lH-pirrol-4,2-diil)-carbonilimino]]bis-1,3-naftalenodisulfônico sal tetra-sódico); SU 302; SU 301; SU 1498 ((E)-2-ciano-3-[4-hidroxi-3,5-bis(l-metiletil)fenil]-N-(3-fenilpropil)-2-propenamida); SU 1433 (4-(6,7-dimetil-2-quinoxalinil)-l,2-benzenediol);ST 1514; SR 25989; Tie-2 solúvel; derivados de SERM; Pharmos;semaxanib (pINN) (3-[(3,5-dimetil-1 H-pirrol-2-il)metileno]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona); S 836; RG 8803; RESTIN; R 440 (3-(l-metil-lH-indol-3-il)-4-(l-metil-6-nitro-lH-indol-3-il)-lH-pirrol-2,5-diona); R 123942 (1-[6-(l,2,4-tiadiazol-5-il)-3-piridazinil]-N-[3-(tri^

namina); inibidor de prolil hidroxilase; genes de progressão elavada;prinomastat (INN) (ácido (S)-2,2-dimetil-4-[[p-(4-piridiloxi)fenil]sulfonil]-3-tiomorfolinocarbohidroxâmico); NV 1030; NM 3 (ácido 8-hidroxi-6-metoxi-alfa-metil-l-oxo-lH-2-benzopiran-S-acético); NF 681; NF 050;MIG; METH 2; METH 1; manassantina B (alfa-[l-[4-[5-[4-[2-(3,4-dimetoxifenil)-2-hidroxi-l-metiletoxi]-3-metoxifenil]tetrahidro-3,4-dime-til-2-furanil]-2-metoxifenoxi]etil]-1,3-benzodioxol-5-metanol); anticorpomonoclonal de KDR; anticorpo monoclonal de integrina alfa5beta3; LY290293 (2-amino-4-(3-piridinil)-4H-nafto[l,2-b]piran-3-carbonitrila); KP0201448; KM 2550; peptídeos específicos de integrina; INGN 401; GYKI66475; GYKI 66462; greenstatina (101-354-plasminogênio (humano));terapia gênica para artrite reumatóide, câncer de próstata, câncer deovário, glioma, endostatina, câncer colo-retal, ATF BTPI, genes daantiangiogênese, inibidor de angiogênese, ou angiogênese; inibidor degelatinase, FR 111142 (éster 5-metoxi-4-[2-metil-3-(3-metil-2-butenil)-oxiranil]-l-oxaspiro[2.5]oct-6-il de ácido 4,5-dihidroxi-2-hexenóico);forfenimex (pINN) ácido (S)-alfa-amino-3-hidroxi-4-(hidroximetil) benze-noacético); antagonista de fibronectina (1-acetil-L-prolil-L-histidil-L-seril-L-cisteinil-L-aspartamida); inibidor do receptor do fator de cresci-mento de fibroblasto; antagonista do fator de crescimento de fibroblasto;FCE 27164 (ácido 7,7'-[carbonilbis[imino(l-metil-lH-pirrol-4,2-diil) car-bonil-imino( 1 -metil-1 H-pirrol-4,2-diil)carbonil-imino]]-bis-1,3,5-naftale-notrisulfônico sal hexassódico); FCE 26752 (ácido 8,8'-[carbonil-bis[imino( 1 -metil-1 H-pirrol-4,2-diil)-carbonilimino( 1 -metil-1 H-pirrol-4,2-diil)carbonilimino]]-bis-l,3,6-naftalenotrisulfônico); polipeptídeo II deativação de monócito endotelial; oligonucleotídeo anti-senso VEGFR;fatores anti-angiogênicos e tróficos; agente angiostático ANCHOR;endostatina; proteína angiogênica Del-1; CT 3577; contortrostatina; CM101; condroitinase AC; CDP 845; CanStatin; BST 2002; BST 2001; BLS0597; BIBF 1000; ARRESTIN; apomigren (colagênio XV do tipo 1304-1388 (gene humano precurssor de cadeia COL15A1 alfal)); angioinhibi-na; aaATIII; A 36; acetato de 9-alfa-fluormedroxiprogesterona ((6-alfa)-17-(acetiloxi)-9-fluor-6-metil-pregn-4-eno-3,20-diona); ácido 2-metil-2-ftalimidino-glutárico (ácido 2-(l,3-dihidro-l-oxo-2H-isoindol-2-il)-2-metilpentanodióico); anticorpo monoclonal BC-1 rotulado com ítrio 90;Semaxanib (3-(4,5-dimetilpirrol-2-ilmetileno)indolin-2-ona) (C15 H14 N2O); PI 88 (sulfato de fosfomanopentose); Alvocidib (4H-l-benzopiran-4-ona, 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-(3-hidroxi-l-metil-4-piperidinil)-cis-(-)-) (C21 H20 Cl N 05); E 7820; SU 11248 (ácido 5-[3-fluor-2-oxo-l,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico(2-di-etilaminoetil)amida) (C22 H27 F N4 02); esqualamina (colestano-7,24-diol, 3-[[3-[(4-aminobutil)aminopropil]-amino]-, 24-(sulfato de hidrogê-nio), (3.beta.,5.alfa.,7.alfa.)-) (C34 H65 N3 05 S); Eriochrome Black T;AGM 1470 (ácido carbâmico, (cloroacetil)-, 5-metoxi-4-[2-metil-3-(3-metil-2-butenil)oxiranil]- l-oxaspiro[2,5]oct-6-il éster, [3R-[3alfa,4alfa(2R,3R), 5beta, õbeta]]) (C19 H28 Cl N 06); AZD 9935; BIBF 1000; AZD2171; ABT 828; KS-interleucina-2; Uteroglobina; A6; NSC 639366(fumarato de l-[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil-amino]-4-(oxiran-2-ilme-tilamino)antraquinona) (C24 H29 N3 04 . C4 H4 04); ISV 616; proteínasde fusão anti-ED-B; HUI 77; Troponina I; anticorpo monoclonal BC-1;SPV 5.2; ER 68203; CKD 731 (éster (3R,4S,5S,6R)-4-[2(R)-metil-3(R)-3(R)-(3-metil-2-butenil)oxiran-2-il]-5-metoxi-l-oxaspiro[2.5]oct-6-il doácido 3-(3,4,5-trimetoxifenil)-2(E)-propenóico) (C28 H38 08); IMC-1 Cll;aaATIII; SC 7; CM 101; Angiocol; Kringle 5; CKD 732 (ácido 3-[4-[2-(dimetilamino)etoxi]fenil]-2(E)-propenóico)(C29 H41 N 06); U 995;Canstatina; SQ 885; CT 2584 (1-[1 l-(dodecilamino)-10-hidroxiundecil]-3,7-dimetilxantina) (C30 H55 N5 03); Salmosina; EMAP II; TX 1920 (1-(4-metilpiperazino)-2-(2-nitro-lH-l-imidazoil)-l-etanona) (CIO H15 N503); inibidor de Alfa-v Beta-x; CHIR 11509 (N-(l-propinil)glicil-[N-(2-naftil)]glicil-[N-(carbajrioilmetil)]glicina-bis(4-metoxi-fenil)metilamida) (C36 H37 N5 06); BST 2002; BST 2001; B 0829; FR 111142; éster(3R,4S,5S,6R)-4-[ 1 (R),2(R)-epoxi-1,5-dimetil-4-hexenil]-5-metoxi-1 -oxas-piro[2.5]octan-6-il de ácido 4,5-dihidroxi-2(E)-hexenóico (C22 H34 07); einibidores de quinase incluindo, mas, sem limitações, N-(4-clorofenil)-4-(4-piridinilmetil)-1-ftalazinamina; 4-[4-[[[[4-cloro-3-(trifluormetil) fenil]amino]carbonil]amino]-fenoxi]-N-metil-2-piridinocarboxamida; N-[2-(di-etilamino)-etil]-5-[(5-fluor-l,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilideno)-metil]-2,4-dimetil- lH-pirrol-3-carboxamida; 3-[(4-bromo-2,6-difluorfenil) meto-xi]-5-[[[[4-(l-pirrolidinil)butil]-amino]carbonil]amino]-4-isotiazolcarboxa-mida; N-(4-bromo-2-fluorfenil)-6-metoxi-7-[(l-metil-4-piperidinil)metoxi]-4-quinazolinamine; 3-[5,6,7,13-tetrahidro-9-[(l-metiletoxi)-metil]-5-oxo-12H-indeno[2,1 -a]pirrol[3,4-c]carbazol-12-il]propil éster N,N-dimetil-glicina; N-[5-[[[5-(l,l-dimetiletil)-2-oxazolil]metil]tio]-2-tiazolil]-4-piperi-dinocarboxamida; i\T-[3-cloro-4-[(3-fluorfenil)metoxi]-fenil]-6-[5-[[[2-(metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-quinazolinamina; 4-[(4-metil-l-pi-perazinil)-metil]-N-[4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-fenil]benzamida; i\T-(3-cloro-4-íluorfenil)-7-metoxi-6-[3-(4-morfolinil)propoxi]-4-quinazolinamina; iV-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazoli-namina; N-(3-((((2R)-l-metil-2-pirrolidinil)metil)oxi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((3-(l,3-oxazol-5-il)fenil)amino)-3-piridinocarboxamida; 2-(((4-fluorfe-nil)metil)amino)-N-(3-((((2R)-l-metil-2-pirrolidinil)metil)oxi)-5-(trifluor-metil)fenil)-3-piridino-carboxamida; N-[3-(Azetidin-3-ilmetoxi)-5-trifluor-metil-fenil]-2-(4-fluor-benzilamino)-nicotinamida; 6-fluor-N-(4-(l-metil-etil)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridino-carboxamida; 2-((4-piridi-nilmetil)amino)-N-(3-(((2S)-2-pirrolidinilmetil)oxi)-5-(trifluormetil)fenil)-3-piridino-carboxamida; N-(3-(l,l-dimetiletil)-lH-pirazol-5-il)-2-((4-piridi-nilmetil)amino)-3-piridinocarboxamida; N-(3,3-dimetil-2,3-dihidro-l-benzofuran-6-il)-2-((4-piridinil-metil)amino)-3-piridinocarboxamida; N-(3-((((2S)-l-metil-2-pirrolidinil)metil)oxi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((4-piridi-nilmetil)amino)-3-piridinocarboxamida; 2-((4-piridinilmetil)amino)-N-(3-((2-(l-pirrolidinil)etil)oxi)-4-(triíluormetil)fenil)-3-piridinocarboxamida; N-(3,3-dimetil-2,3-dihidro-lH-indol-6-il)-2-((4-piridinilmetü)amino)-3-piri^carboxamida; N-(4-(pentafluoretil)-3-(((2S)-2-pirrolidinilmetil)oxi)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinocarboxamida; N-(3-((3-azetidinil-metil)oxi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinocarboxa-mi-da; N-(3-(4-piperidiniloxi)-5-(trifluor-metil)fenil)-2-((2-(3-piridinil) etil)amino)-3-piridino-carboxamida; N-(4,4-dimetil-l,2,3,4-tetrahidro-isoqui-nolin-7-il)-2-(lH-indazol-6-ilamino)-nicotinamida; 2-(lH-indazol-6-ilami-no)-N-[3-(l-metilpirrolidin-2-ilmetoxi)-5-trifluor-metil-fenil]-nicotinanida;N-[l-(2-dimetilaminoacetil)-3,3-dimindazol-6-ilamino)-nicotinamida; 2-( 1 H-indazol-6-ilamino)-N-[3-(pirroli-din-2-ilmetoxi)-5-trifluormetil-fenil]-nicotinamida; N-(l-acetil-3,3-di-me-til-2,3-dihidro-lH-indol-6-il)-2-(lH-indazol-6-ilamino)-nicotinamida; N-(4,4-dimetil-l-oxo-l,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-7-il)-2-(lH-indazol-6-il-amino) -nicotinamida; N- [4 - (tert- butil) -3 - (3- piperidilpropil) fenil] [2 - (1H-indazol-6-ilamino) (3-piridil)]carboxamida; N-[5-(tert-butil)isoxazol-3-il] [2-(lH-indazol-6-ilamino)(3-piridil)]carboxamida; e N-[4-(tert-butil)fenil][2-(lH-indazol-6-ilamino)(3-piridil)]-carboxamida e os inibidores de quinasedescritos nas patentes US 6.258.812, 6.235.764, 6.630.500, 6.515.004,6.713.485, 5.521.184, 5.770.599, 5.747.498, 5.990.141, publicação dopedido de patente US n° US2003/0105091; e publicações PCT nos WO01/37820; WO 01/32651; WO 02/68406; WO 02/66470; WO02/55501; WO 04/05279; WO 04/07481; WO 04/07458; WO04/09784; WO 02/59110; WO 99/45009; WO 98/35958; WO00/59509; WO 99/61422; WO 00/12089; e WO 00/02871, publicaçõesdos quais são incorporados aqui como referência para qualquer propósito.

Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr pode ser utilizado sozinho ou com pelo menos um agente terapêu-tico adicional para o tratamento de um câncer relacionado a EGFr. Emcertas realizações, um agente de ligação específica a EGFr é utilizado emconjunto com uma quantidade terapeuticamente efetiva de um agenteterapêutico adicional. Os agentes terapêuticos típicos que podem seradministrados com um agente de ligação específica a EGFr incluem,mas, sem limitações, um membro da família da geldanamicina doaantibióticos anisamicina; Pro-HGF; NK2; um inibidor do peptídeo c-Met;um antagonista de Grb2 Src de homologia 2; um modulador de Gabl;Src negativo dominante; um inibidor de von-Hippel-Landau, incluindo,mas, sem limitações, wortmanina; inibidores de PI3 quinase, outrasterapias anti-receptor, um inibidor de COX-2, Celebrex™, celecoxib,Vioxx™, rofecoxib; um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),um modulador de VEGF, um fator de crescimento de fibroblasto (FGF),um modulador de FGF, um fator de crescimento epitelial (EGF); ummodulador de EGF; um fator de crescimento de queratinócito (KGF),uma molécula relacionada a KGF, um modulador de KGF; e um modu-lador de matriz de metaloproteinase (MMP).

Em certas modalidades, um agente de ligação específica aEGFr é utilizado com agentes terapêuticos particulares para tratarvários cânceres. Em certas realizações, tendo em vista da condição e donível de tratamento desejados, dois, três ou mais agentes podem seradministrados. Onde os compostos são utilizados com um ou maisoutros componentes, o composto e o um ou mais componentes podemser administrados em conjunto, separadamente, ou seqüencialmente(por exemplo, em uma formulação farmacêutica). Em certas realizações,tais agentes podem ser providos juntos por inclusão na mesma formula-ção. Em certas modalidades, tais agentes e um agente de ligaçãoespecífica a EGFr podem ser providos juntos por inclusão na mesmaformulação. Em certas realizações, esses agentes podem ser formuladosseparadamente e providos juntos por inclusão em um kit de tratamento.Em certas realizações, tais agentes e um agente de ligação específica aEGFr podem ser formulados separadamente e providos juntos porinclusão em um kit de tratamento. Em certas realizações, tais agentespodem ser providos separadamente.

Em certas modalidades, quando administrados por terapiagênica, os genes que codificam agentes protéicos e/ou um agente deligação específica a EGFr podem ser incluídos no mesmo vetor. Emcertas realizações, os genes que codificam agentes protéicos e/ou umagente de ligação específica a EGFr podem estar sob o controle damesma região promotora. Em certas modalidades, os genes que codifi-cam agentes protéicos e/ou um agente de ligação específica a EGFrpodem estar em vetores separados.

Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr pode ser utilizado para tratar animais não humanos, tais comoanimais de companhia (cães, gatos, pássaros, primatas etc.) e animaisde fazenda domésticos (cavalos, gado, ovelhas, porcos, pássaros etc).Em alguns destes casos, uma dose apropriada pode ser determinada deacordo com o peso corporal do animal. Por exemplo, em certas modali-dades, uma dose de 0,2-1 mg/kg pode ser utilizada. Em certas realiza-ções, a dose pode ser determinada de acordo com a área superficial doanimal, uma dose típica variando de 0,1 a 20 mg/in2, ou de 5 a 12mg/m2. Para animais pequenos, tais como cães ou gatos, em certasrealizações, uma dose adequada é de 0,4 mg/kg. Em certas modalida-des, os agentes de ligação específica a EGFr são administrados porinjeção ou outra rota adequada, uma ou mais vezes por semana até quea condição do animal melhore, ou podem ser administrados indefinida-mente.

Entende-se que a resposta por pacientes individuais às me-dicações ou terapias por combinação mencionadas acima pode variar euma combinação eficaz apropriada de fármacos para cada paciente podeser determinada por seu médico.

O macaco cynomolgus prove um modelo útil para certas do-enças. Doenças típicas incluem, mas, sem limitações, síndrome darejeição a transplante e doenças semelhantes à doença inflamatória dosintestinos. Quando se testa a eficácia de um anticorpo monoclonalhumano em um modelo da doença humana em macaco cynomolgus, emcertas realizações, é útil se determinar se o agente de ligação específicaa EGFr se liga a EGFr em humanos e macacos cynomolgus em um nívelcomparável.

Em certas modalidades, um agente de ligação específica aEGFr pode ser parte de uma molécula conjugada compreendendo todoou parte do agente de ligação específica a EGFr e um agente citotóxico.O termo "agente citotóxico" refere-se a uma substância que inibe ouprevine a função de células e/ou causa a morte ou destruição decélulas. O termo inclui, mas não se limita a, isótopos radioativos (porexemplo, I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos e toxinas taiscomo toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica,vegetal ou animal, ou fragmentos destas. Os agentes citotóxicos típicosincluem, mas, sem limitações, Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluoruracil, Citosina arabinosídeo ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa,Taxotere (docetaxel), Busulfan, Citoxin, Taxol, Metotrexato, Cisplatina,Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposídeo, Ifosfamida, MitomicinaC, Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposídeo,Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomici-nas, Esperamicinas, Melfalan e outros nitrogênio mustardas relacionados.

Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr pode ser parte de uma molécula conjugada compreendendo todoou parte do agente de ligação específica a EGFr e um pró-fármaco. Emcertas modalidades, o termo "pró-fármaco" refere-se a um precursor ouforma derivada de uma substância farmaceuticamente ativa. Em certasmodalidades, um pró-fármaco é menos citotóxico às células quando emcomparação com o fármaco parental e é capaz de ser enzimaticamenteativado ou convertido à forma parental citotóxica mais ativa. Pró-fármacos típicos incluem, mas, sem limitações, pró-fármacos contendofosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendosulfato, pró-fármacos contendo peptídeo, pró-fármacos modificados comD-aminoácido, pró-fármacos glicosiladas, pró-fármacos contendo beta-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substi-tuída e pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituí-da, pró-fármacos de 5-fluorcitosina e outras pró-fármacos de 5-fluoruridina que podem ser convertidas em um fármaco livre citotóxicomais ativo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatiza-dos em uma forma de pró-fármaco incluem, mas, sem limitações,aqueles agentes citotóxicos descritos acima. Ver, por exemplo, PatenteUS 6.702.705.

Em certas realizações, conjugados de anticorpo funcionamtendo a parte do anticorpo da molécula alvo a parte citotóxica ou partedo pró-fármaco da molécula a uma população específica de células nopaciente. No caso de agentes de ligação específica a EGFr, tais molécu-las conjugadas podem ser utilizadas, por exemplo, em certas realizações,para eliminar células em proliferação anormal, tais como célulascancerígenas.

Em certas modalidades, são providos métodos de tratamen-to de um paciente compreendendo a administração de uma quantidadeterapeuticamente efetiva de um agente de ligação específica a EGFr. Emcertas realizações, são providos métodos de tratamento de um pacientecompreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamenteefetiva de um conjugado de anticorpo. Em certas modalidades, é utiliza-do um anticorpo em conjunto com uma quantidade terapeuticamenteefetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, conformediscutido acima.

Conforme discutido acima, em certas realizações, agentes deligação específica a EGFr podem ser administrados concorrentementecom um ou mais fármacos que são administrados ao mesmo paciente,cada fármaco sendo administrado de acordo com um regime adequadopara este medicamento. Esse tratamento engloba pré-tratamento,tratamento simultâneo, tratamento seqüencial e regimes alternativos.

Exemplos adicionais de tais fármacos, incluem, mas, sem limitações,antivirais, antibióticos, analgésicos, corticosteróides, antagonistas decitocinas inflamatórias, DMARDs, antiinflamatórios não esteroidais,quimioterápicos e estimulantes de angiogênese.

Em certas modalidades, vários distúrbios médicos são tra-tados com agentes de ligação específica a EGFr em combinação com umestimulante de apoptose. Por exemplo, em certas realizações, agentesde ligação específica a EGFr podem ser administrados em uma composi-ção que contém também um composto que estimula apoptose de umaou mais células. Em certas modalidades, o agente de ligação específicaa EGFr e estimulantes de apoptose podem ser administrados comocomposições separadas e estes podem ser administrados pela mesmarota ou rota diferente.

Em certas modalidades, são providas composições farma-cêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva deum agente de ligação específica a EGFr e um diluente, veículo, solubili-zante, emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamenteaceitável.

Em certas realizações, são providas composições farmacêu-ticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de umagente de ligação específica a EGFr e uma quantidade terapeuticamenteefetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional e um diluente,veículo, solubilizante, emulsificante, conservante e/ou adjuvantefarmaceuticamente aceitável.

Em certas modalidades, os materiais de formulação aceitá-veis são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentraçõesempregadas.

Em certas realizações, a composição farmacêutica pode con-ter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, porexemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, cor, claridade, isotonicidade,odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsor-ção ou penetração da composição. Em certas modalidades, os materiaisde formulação adequados incluem, mas, sem limitações, aminoácidos(tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicro-bianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ouhidrogenossulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato,Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes deenchimento (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais comoácido etilenodiamino-tetracético (EDTA)); agentes complexantes (taiscomo cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos, dissacarídeos; eoutros carboidratos (tais como glicose, manose ou dextrinas); proteínas(tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas); agentescorantes, flavorizantes ou diluentes; agentes emulsificantes; polímeroshidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo pesomolecular; contra-íons formadores de sal (tais como sódio); conservantes(tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico,timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorohexidi-na, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais comoglicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois sacarídeos (taiscomo manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; surfactantes ouagentes de umectante (tais como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitana,polissorbatos tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trome-tamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes melhoradores de estabili-dade (tais como sacarose ou sorbital); agentes melhoradores de tonici-dade (tais como haletos de metal alcalino, preferivelmente cloreto desódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de liberação; diluentes,excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. {Remington's Pharmaceuti-cal Sciences, 18a Edição, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company(1990)).

Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr e/ou uma molécula terapêutica adicional são ligados a um veículode extensão de meia vida conhecido na técnica. Esses veículos incluem,mas, sem limitações, o domínio Fc, polietilenoglicol e dextrana. Taisveículos são descritos, por exemplo, na Patente US 6.660.843 e pedidoPCTn°WO 99/25044.

Em certas modalidades, a composição farmacêutica ideal se-rá determinada por um especialista na técnica dependendo, por exem-plo, da rota de administração pretendida, do formato de liberação edosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's PharmaceuticalSciences, supra. Em certas realizações, tais composições podem influ-enciar o estado físico, a estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa dedisponibilidade in vivo dos agentes de ligação específica a EGFr.

Em certas modalidades, o veículo primário em uma compo-sição farmacêutica pode ser de natureza ou aquosa ou não aquosa. Porexemplo, em certas realizações, um veículo adequado pode ser águapara injeção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial,possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composi-ções para administração parenteral. Em certas modalidades, soluçãosalina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina desoro são veículos típicos adicionais. Em certas modalidades, as compo-sições farmacêuticas compreendem tampão Tris com pH de cerca de7,0-8,5, ou tampão acetato de pH de cerca de 4,0-5,5, que pode incluiradicional sorbitol ou um substituto adequado deste. Em certas realiza-ções, uma composição farmacêutica é uma formulação aquosa oulíquida compreendendo um tampão acetato de pH de cerca de 4,0-5,5,um poliol (poliálcool) e opcionalmente, um surfactante, onde a composi-ção não compreende um sal, por exemplo, cloreto de sódio e onde acomposição é isotônica para o paciente. Polióis típicos incluem, mas,sem limitações, sacarose, glicose, sorbitol e manitol. Um surfactantetípico inclui, mas não se limita a, polissorbato. Em certas realizações,uma composição farmacêutica é uma formulação aquosa ou líquidacompreendendo um tampão acetato de pH de cerca de 5,0, sorbitol e umpolissorbato, onde a composição não compreende um sal, por exemplo,cloreto de sódio e onde a composição é isotônica para o paciente. Certascomposições típicas são encontradas, por exemplo, na Patente US6.171.586. Veículos farmacêuticos adicionais incluem, mas, semlimitações, óleos, incluindo petróleo, óleo animal, óleo vegetal, óleo deamendoim, óleo mineral, óleo de gergelim e outros. Em certas modali-dades, soluções de dextrose aquosa e glicerol podem ser tambémempregadas como veículo líquido, particularmente para soluçõesinjetáveis. Em certas realizações, uma composição compreendendo umanticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional,pode ser preparada para armazenamento por mistura da composiçãofarmacêutica apresentando o grau desejado de pureza com agentes deformulação idéias (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na formade uma torta liofilizada ou uma solução aquosa. Além disto, em certasmodalidades, uma composição compreendendo um anticorpo, com ousem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formuladacomo uma liofilizado utilizando-se soluções excipientes apropriadas (porexemplo, sacarose) como diluentes.Em certas realizações, é administrado um agente de ligaçãoespecífica a EGFr na forma de uma composição fisiologicamente aceitá-vel compreendendo uma proteína recombinante purificada em conjuntocom veículos fisiologicamente aceitáveis. Em certas modalidades, taisveículos são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentraçõesempregadas. Em certas realizações, a preparação de tais composiçõespode envolver a combinação do agente de ligação específica a EGFr comtampões, antioxidantes tais como ácido ascórbico, polipeptídeos debaixo peso molecular (tais como os que contêm menos de 10 aminoáci-dos), proteínas, aminoácidos, carboidratos tais como glicose, sacaroseou dextrinas, agentes quelantes tais como EDTA, glutationa e/ou outrosestabilizantes e excipientes. Em certas modalidades, as dosagensapropriadas são determinadas em ensaios de dosagem padrão e podemvariar de acordo com a rota de administração escolhida. Em certasrealizações, de acordo com padrões industriais apropriados, podem seradicionados conservantes, os quais incluem, mas, sem limitações, álcoolbenzílico. Em certas modalidades, a quantidade e freqüência de admi-nistração podem ser determinadas com base em fatores tais como anatureza e severidade da doença sendo tratada, a reposta desejada, aidade e condição do paciente e assim em diante.

Em certas realizações, as composições farmacêuticas podemser selecionadas para administração parenteral. A preparação de taiscomposições farmaceuticamente aceitáveis é do conhecimento doespecialista na técnica.

Em certas modalidades, os componentes da formulação es-tão presentes em concentrações que são aceitáveis no local de adminis-tração. Em certas realizações, são utilizados tampões para manter acomposição no pH fisiológico ou a um pH ligeiramente mais baixo,tipicamente em um pH na faixa de cerca de 5 a cerca de 8.

Em certas realizações, quando é contemplada a administra-ção parenteral, uma composição terapêutica pode estar na forma deuma solução aquosa livre de pirogênio parenteralmente aceitável,compreendendo o anticorpo desejado, com ou sem agentes terapêuticosadicionais, em um veículo farmacêutica. Em certas modalidades, umveículo para injeção parenteral é água destilada estéril na qual o anti-corpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, éformulado como uma solução estéril isotônica, apropriadamente preser-vada. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulaçãoda molécula desejada com um agente, tal como micro-esferas injetáveis,partículas biodegradáveis, compostos poliméricos (tais como ácidopoliacético ou ácido poliglicólico), pérolas, ou lipossomas, que podemconferir liberação sustentada do produto que pode então ser adminis-trado por meio de uma injeção depot. Em certas realizações, ácidohialurônico pode ser também utilizado e pode apresentar o efeito depromover duração sustentada na circulação. Em certas modalidades,dispositivos de liberação de fármaco implantáveis podem ser utilizadospara introduzir a molécula desejada.

Em certas realizações, uma composição farmacêutica po-de ser formulada para inalação. Em certas modalidades, um agente deligação específica a EGFr, com ou sem pelo menos um agente terapêuti-co adicional, pode ser formulado como um pó seco para inalação. Emcertas modalidades, uma solução de inalação compreendendo umagente de ligação específica a EGFr, com ou sem pelo menos um agenteterapêutico adicional, pode ser formulada com um propelente paraadministração por aerossol. Em certas realizações, podem ser soluçõesnebulizadas. A administração pulmonar é adicionalmente descrita napublicação PCT n° WO 94/20069, que descreve a administração pulmo-nar de proteínas quimicamente modificadas.

Em certas modalidades, é contemplado que formulações po-dem ser administradas oralmente. Em certas realizações, um agente deligação específica a EGFr, com ou sem pelo menos um agente terapêuti-co adicional, que é administrado desta forma pode ser formulado com ousem os veículos utilizados comumente na composições de formas dedosagem sólidas tais como tabletes e cápsulas. Em certas modalidades,uma cápsula pode ser projetada para liberar a parte ativa da formulaçãono ponto do trato gastrintestinal quando a biodisponibilidade é maximi-zada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Em certas realizações,pelo menos um agente adicional pode ser incluído para facilitar aabsorção do agente de ligação específica a EGFr e/ou quaisquer agentesterapêuticos adicionais. Em certas modalidades, diluentes, flavorizan-tes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentesde suspensão, agentes de desintegração de tablete, e/ou ligantes podemser também empregados.

Em certas realizações, uma composição farmacêutica podeenvolver uma quantidade efetiva de um agente de ligação específica aEGFr, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, em umamistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a fabrica-ção de tabletes. Em certas modalidades, podem ser preparadas solu-ções na forma de dosagem única pela dissolução de tabletes em águaestéril ou outro veículo apropriado. Excipientes adequados incluem,mas, sem limitações, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio,carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose, ou fosfato de cálcio; eagentes ligantes, tais como amido, gelatina e acácia; e agentes lubrifi-cantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico e talco.

Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes aosespecialistas na técnica, incluindo formulações envolvendo um agentede ligação específica a EGFr, com ou sem pelo menos um agente tera-pêutico adicional, em formulações de liberação sustentada ou controla-da. Certas formulações de liberação sustentada ou controlada típicasincluem, mas, sem limitações, veículos lipossômicos, micro-partículasbiodegradáveis, pérolas porosas e injeções depot. Algumas técnicastípicas para a preparação de algumas formulações são conhecidas dosespecialistas na técnica. Ver, por exemplo, publicação PCT n° WO93/15722, que descreve a liberação controlada de micro-partículaspoliméricas porosas para a administração de composições farmacêuti-cas. Em certas modalidades, as preparações de liberação sustentadapodem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigosmoldados, por exemplo, filmes, ou micro-cápsulas. Matrizes de libera-ção sustentada incluem, mas, sem limitações, poliésteres, hidrogéis,polilactídeos (Patentes US 3.773.919 e EP 058.481), copolímeros deácido L-glutâmico gama etil-L-glutamato (Sidman e colaboradores,Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli-(2-hidroxietil-metacrilato) (Langere colaboradores, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) e Langer,Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de etilenovinila (Langer ecolaboradores, supra) e ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).Em certas modalidades, as composições de liberação sustentada podemincluir também lipossomas, os quais podem ser preparados, em certasrealizações, por qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica.Ver, por exemplo, Eppstein e colaboradores, Proa Natl. Acad. Sei. USA,82:3688-3692 (1985); EP 036.676; EP 088.046 e EP 143.949.

Em certas realizações, a composição farmacêutica a ser uti-lizada para administração in vivo é estéril. Em certas modalidades, acomposição farmacêutica a ser utilizada para administração in vivo éesterilizada por filtração através de membranas de filtração estéril. Emcertas modalidades, onde a composição é liofilizada, a esterilizaçãoutilizando membranas de filtração estéril pode ser conduzida ou antesou após a liofilização e reconstituição. Em certas realizações, a compo-sição para administração parenteral pode ser armazenada na formaliofilizada ou em uma solução. Em certas modalidades, as composiçõesparenterais em geral são colocadas em um recipiente contendo umaporta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de soluçãointravenosa contendo um tampão perfurável por uma agulha de injeçãohipodérmica.

Em certas modalidades, após a composição farmacêutica tersido formulada, esta pode ser armazenada em frascos estéreis comouma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidra-tado ou liofilizado. Em certas realizações, tais formulações podem serarmazenadas ou uma forma pronta para utilização ou em uma forma(por exemplo, uma forma liofilizada) que é reconstituída antes daadministração.

Em certas modalidades, são providos kits para a produçãode uma unidade de administração de dose única. Em certas realizações,os kits podem apresentar cada um tanto um primeiro recipiente conten-do uma proteína seca quanto um segundo recipiente contendo umaformulação aquosa. Em certas modalidades, são incluídos kits conten-do seringas de câmera única e/ou múltipla cheias previamente (porexemplo, seringas para líquido e "lyosyringes").

Em certas realizações, a quantidade efetiva de uma compo-sição farmacêutica compreendendo um agente de ligação específica aEGFr, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, a serempregada terapeuticamente irá depender, por exemplo, do contexto edos objetivos terapêuticos. Um especialista na técnica observará que osníveis de dosagem apropriados para o tratamento, de acordo com certasrealizações, irão variar desta forma dependendo, em parte, da moléculautilizada, da indicação para a qual o agente de ligação específica a EGFr,com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, está sendoutilizado, da rota de administração e do tamanho (peso corporal,superfície corporal ou tamanho do órgão) e/ou condição (idade e saúdegeral) do paciente. Em certas realizações, o clínico pode titular adosagem e modificar a rota de administração para obter o efeito terapêu-tico ótimo. Em certas modalidades, uma dosagem típica pode variar decerca de 0,1 ug/kg a até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dosfatores mencionados acima. Em certas realizações, a dosagem podevariar de 0,1 ug/kg a até cerca de 100 mg/kg; ou 1 ug/kg até cerca de100 mg/kg; ou 5 ug/kg a até cerca de 100 mg/kg.

Em certas realizações, a freqüência de dosagem irá conside-rar os parâmetros farmacocinéticos do agente de ligação específica aEGFr e/ou quaisquer agentes terapêuticos adicionais na formulaçãoutilizada. Em certas realizações, um clínico irá administrar a composi-ção até que seja atingida uma dosagem que obtenha o efeito desejado.Em certas modalidades, a composição pode, por esta razão, ser adminis-trada como uma dose única, ou como duas ou mais doses (que podemou não conter a mesma quantidade da molécula desejada), ou comouma infusão contínua por meio de um dispositivo de implante oucateter. Alguns métodos de refino adicional da dosagem apropriada sãode conhecimento do especialista na técnica. Em certas realizações, asdosagens apropriadas podem ser determinadas através da utilização dedados dose-resposta apropriados.

Em certas realizações, a rota de administração da composi-ção farmacêutica é de acordo com métodos conhecidos, por exemplo,oralmente, por meio de injeção intravenosa, intraperitoneal, intracere-bral (intraparenquimal), intra cerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou rotas intralesionais; por sistemas deliberação sustentada ou por dispositivos de implante. Em certasmodalidades, as composições podem ser administradas por injeção debolus ou continuamente por infusão, ou por um dispositivo implantado.

Conforme discutido acima, em várias realizações, qualquerrota eficaz de administração pode ser utilizada para administrar umagente de ligação específica a EGFr. Se injetado, em certas realizações,um agente de ligação específica a EGFr pode ser administrado, porexemplo, via rota intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesio-nal, intracraniana, intranasal, inalação ou subcutânea por injeção debolus ou por infusão contínua. Métodos típicos de administraçãoincluem, mas, sem limitações, a liberação sustentada a partir deimplantes, a inalação por aerossol, colírios, preparações orais, incluindopílulas, xaropes, comprimidos e gomas de mascar e as preparaçõestópicas tais como loções, géis, sprays, ungüentos e outras técnicasadequadas.

Em certas realizações, a administração por inalação é bené-fica quando do tratamento de doenças associadas com distúrbiospulmonares. Em certas modalidades, um agente de ligação específica aEGFr pode ser administrado por implante de células cultivadas queexpressam um agente de ligação específica a EGFr. Em certas realiza-ções, as próprias células do paciente são induzidas a produzir portransfecção in vivo ou ex vivo com um ou mais vetores que codificam umagente de ligação específica a EGFr. Em certas modalidades, este vetorpode ser introduzido nas células do paciente, por exemplo, por injeçãode DNA nu ou DNA que codifica um agente de ligação específica a EGFrencapsulado em lipossoma, ou por outros métodos de transfecção.Quando um agente de ligação específica a EGFr é administrado emcombinação com um ou mais outros compostos biologicamente ativos,em certas realizações, estes podem ser administrados pela mesma rotaou rota diferente e podem ser administrados em conjunto, separada-mente, ou seqüencialmente.

Em certas modalidades, a composição pode ser administra-da localmente por meio de implante de uma membrana, chumaço dealgodão ou um outro material apropriado no qual a molécula desejadafoi absorvida ou encapsulada. Em certas realizações, onde é utilizadoum dispositivo de implante, o dispositivo pode ser implantado emqualquer tecido ou órgão adequado e a administração da moléculadesejada pode ser por meio de difusão, bolus de liberação controlada notempo, ou administração contínua.

Em certas modalidades, pode ser desejável se utilizar umacomposição farmacêutica compreendendo um agente de ligação específi-ca a EGFr, como ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, deuma forma ex vivo. Nessas realizações, células, tecidos e/ou órgãos queforam removidos do paciente são expostos a uma composição farmacêu-tica compreendendo um anticorpo, com ou sem pelo menos agenteterapêutico adicional, após o que as células, tecidos e/ou órgãos sãosubseqüentemente implantados de volta no paciente.

Em certas realizações, um agente de ligação específica aEGFr e quaisquer agentes terapêuticos adicionais podem ser adminis-trados por implante de certas células que foram geneticamente enge-nheiradas, utilizando-se métodos tais como os descritos aqui, paraexpressar e secretar os polipeptídeos. Em certas modalidades, taiscélulas podem ser células animais ou humanas e podem ser autólogas,heterólogas, ou xenogênicas. Em certas realizações, as células podemser imortalizadas. Em certas modalidades, de maneira a reduzir achance de uma reposta imunológica, as células podem ser encapsuladaspara se evitar infiltração nos tecidos circunvizinhos. Em certas realiza-ções, os materiais de encapsulamento são tipicamente compartimentosou membranas poliméricos biocompatíveis semipermeáveis que permi-tam a liberação da(s) proteína(s), mas evitam a destruição das célulaspelo sistema imunológico do paciente ou por outros fatores negativosdos tecidos circunvizinhos.

Alguns Métodos Típicos

Em certas realizações, é provido um método para prever seum tratamento com agente de ligação específica a EGFr será eficaz notratamento de um câncer relacionado com EGFr em um indivíduo. Emcertas modalidades, o método compreende a determinação do númerode cópias do gene de EGFr em uma amostra do indivíduo. Em certasrealizações, a presença de um número de cópias do gene de EGFraumentado na amostra prediz que um tratamento com agente de ligaçãoespecífica a EGFr será eficaz no tratamento de um câncer relacionadocom EGFr no indivíduo. Em certas modalidades, o tratamento comagente de ligação específica a EGFr compreende um anticorpo anti-EGFr. Em certas realizações, o anticorpo anti-EGFr é um anticorpoanti-EGFr humano. Em certas modalidades, o anticorpo anti-EGFr é opanitumumab. Em certas modalidades, o tratamento com agente deligação específica a EGFr compreende um agente de ligação específica aEGFr e pelo menos um agente quimioterapêutico. Em certas modalida-des, o câncer relacionado com EGFr é um tumor sólido. Em certasrealizações, o tumor sólido compreende pelo menos um câncer selecio-nado de câncer colo-retal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncerde ovário, câncer de próstata, câncer renal e câncer de pescoço e cabeça.

Em certas modalidades, a determinação do número de có-pias do gene de EGFr na amostra compreende a comparação do númerode cópias do gene de EGFr na amostra com o número de cópias do genede EGFr em uma amostra de referência normal. Em certas modalida-des, a amostra de referência normal é do mesmo indivíduo da amostra.Em certas realizações, a amostra de referência normal não é do mesmoindivíduo da amostra. Em certas modalidades, a amostra de referêncianormal é do mesmo tecido da amostra. Em algumas destas modalida-des, a amostra de referência normal é de tecido não tumoral e a amostraé do tecido tumoral. Em algumas destas realizações, a amostra dereferência normal é de tecido não maligno e a amostra é de tecidomaligno. Em certas modalidades, a determinação do número de cópiasdo gene de EGFr compreende análise de hibridização in situ fluorescen-te. Em certas realizações, a determinação do número de cópias do genede EGFr compreende PCR quantitativa. Em certas modalidades, adeterminação do número de cópias do gene de EGFr compreende análiseSouthern blot. Em certas realizações, a determinação do número decópias do gene de EGFr compreende uma outra metodologia de determi-nação do número de cópias de gene descrita aqui. Em certas modalida-des, o tratamento com agente de ligação específica a EGFr compreendeum anticorpo anti-EGFr. Em certas realizações, o anticorpo anti-EGFr éum anticorpo anti-EGFr humano. Em certas modalidades, o anticorpoanti-EGFr é o panitumumab. Em certas realizações, o tratamento comagente de ligação específica a EGFr compreende um agente de ligaçãoespecífica a EGFr e pelo menos um agente quimioterapêutico. Emcertas realizações, o câncer relacionado com EGFr é um tumor sólido.Em certas modalidades, o tumor sólido compreende pelo menos umcâncer selecionado de câncer colo-retal, câncer de pulmão, câncer demama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer renal e câncer depescoço e cabeça.

Em certas modalidades, a determinação do número de có-pias do gene de EGFr em uma amostra compreende a determinação donúmero de cópias do gene de EGFr em uma amostra de teste de umtumor no indivíduo, determinação do número de cópias de pelo menosuma seqüência de nucleotídeos de referência na amostra de teste ecomparação do número de cópias do gene de EGFr na amostra de testecom o número de cópias da pelo menos uma seqüência de nucleotídeosde referência. Em certas realizações, um número aumentado de cópiasdo gene de EGFr na amostra de teste em relação ao número de cópiasda pelo menos uma seqüência de nucleotídeos de referência prediz queum tratamento com agente de ligação específica a EGFr será eficaz notratamento de um câncer relacionado com EGFr no indivíduo. Emcertas modalidades, a pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dereferência está localizada no mesmo cromossomo que o gene de EGFr.Em certas realizações, a pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dereferência está localizada em um outro cromossomo que não o cromos-somo em que o EGFr está localizado. Em certas modalidades, o númerode cópias da pelo menos uma seqüência de nucleotídeos de referência éde duas cópias por célula. Em certas realizações, a pelo menos umaseqüência de nucleotídeos de referência é uma seqüência centromérica.Em certas modalidades, a proporção de número de cópias do gene deEGFr para o número de cópias da pelo menos uma seqüência de nucleo-tídeos de referência em uma amostra normal é de 1. Em certas modali-dades, a determinação do número de cópias do gene de EGFr e donúmero de cópias da pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dereferência compreende análise de hibridização in situ fluorescente. Emcertas modalidades, a determinação do número de cópias do gene deEGFr e do número de cópias da pelo menos uma seqüência de nucleotí-deos de referência compreende PCR quantitativa. Em certas realizações,a determinação do número de cópias do gene de EGFr e do número decópias da pelo menos uma seqüência de nucleotídeos de referênciacompreende análise Southern blot. Em certas modalidades, a determi-nação do número de cópias do gene de EGFr e do número de cópias dapelo menos uma seqüência de nucleotídeos de referência compreendeuma outra metodologia de determinação do número de cópias de gene.Em certas modalidades, o câncer relacionado com EGFr é um tumorsólido. Em certas realizações, o tumor sólido compreende pelo menosum câncer selecionado de câncer colo-retal, câncer de pulmão, câncerde mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer renal e câncer depescoço e cabeça. Em certas realizações, o tratamento com agente deligação específica a EGFr compreende um anticorpo anti-EGFr. Emcertas modalidades, o anticorpo anti-EGFr é um anticorpo anti-EGFrhumano. Em certas realizações, o anticorpo anti-EGFr é o panitumu-mab. Em certas modalidades, o tratamento com agente de ligaçãoespecífica a EGFr compreende um agente de ligação específica a EGFr epelo menos um agente quimioterapêutico.

Em certas realizações, a determinação do número de cópiasdo gene de EGFr compreende: a determinação do número de cópias dogene de EGFr em uma amostra de teste do indivíduo; determinação donúmero de núcleos na amostra de teste; e comparação do número decópias do gene de EGFr com o número de núcleos. Em certas modali-dades, uma proporção entre o número de cópias do gene de EGFr e onúmero de núcleos acima de dois prediz que um tratamento com agentede ligação específica a EGFr será eficaz no tratamento de um câncerrelacionado com EGFr no indivíduo. Em certas modalidades, a propor-ção do número de cópias do gene de EGFr para o número de núcleos emuma amostra normal é de 2. Em certas modalidades, um número decópias do gene de EGFr aumentado em uma amostra é indicado pelaproporção do número de cópias do gene de EGFr para o número denúcleos acima de 2. Em certas modalidades, o tratamento com agentede ligação específica a EGFr compreende um anticorpo anti-EGFr. Emcertas realizações, o anticorpo anti-EGFr é um anticorpo anti-EGFrhumano. Em certas realizações, o anticorpo anti-EGFr é o panitumu-mab. Em certas modalidades, o tratamento com agente de ligaçãoespecífica a EGFr compreende um agente de ligação específica a EGFr epelo menos um agente quimioterapêutico. Em certas realizações, ocâncer relacionado com EGFr é um tumor sólido. Em certas modalida-des, o tumor sólido compreende pelo menos um câncer selecionado decâncer colo-retal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário,câncer de próstata, câncer renal e câncer de pescoço e cabeça.

Em certas realizações, a determinação do número de cópiasdo gene de EGFr e do número de núcleos compreende análise dehibridização in situ fluorescente. Em certas modalidades, a determina-ção do número de cópias do gene de EGFr e do número de núcleoscompreende PCR quantitativa. Em certas realizações, a determinaçãodo número de cópias do gene de EGFr e do número de núcleos compre-ende análise Southern blot. Em certas modalidades, a determinação donúmero de cópias do gene de EGFr e do número de núcleos compreendeuma outra metodologia de determinação do número de cópias de genedescrita aqui. Em certas modalidades, o câncer relacionado com EGFr éum tumor sólido. Em certas realizações, o tumor sólido compreendepelo menos um câncer selecionado de câncer colo-retal, câncer depulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncerrenal e câncer de pescoço e cabeça. Em certas modalidades, o trata-mento com agente de ligação específica a EGFr compreende um anticor-po anti-EGFr. Em certas realizações, o tratamento com anticorpo anti-EGFr compreende um anticorpo anti-EGFr humano. Em certas modali-dades, o anticorpo anti-EGFr é o panitumumab. Em certas realizações,o tratamento com agente de ligação específica a EGFr compreende umagente de ligação específica a EGFr e pelo menos um agente quimiotera-pêutico.

Em certas modalidades, é provido um método para o trata-mento de um indivíduo apresentando um câncer relacionado com EGFr,compreendendo: a determinação do número de cópias do gene de EGFrem uma amostra do indivíduo, determinação de se há um aumento donúmero de cópias do gene de EGFr na amostra; e se houver um aumen-to do número de cópias do gene de EGFr na amostra, administração aoindivíduo de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de um agentede ligação específica a EGFr. Em certas realizações, o agente de ligaçãoespecífica a EGFr é um anticorpo anti-EGFr. Em certas modalidades, oanticorpo anti-EGFr é um anticorpo humano. Em certas realizações, oanticorpo anti-EGFr é o panitumumab. Em certas modalidades, otratamento com agente de ligação específica a EGFr compreende umagente de ligação específica a EGFr e pelo menos um agente quimiotera-pêutico. Em certas realizações, a determinação do número de cópias dogene de EGFr compreende análise de hibridização in situ fluorescente.Em certas modalidades, a determinação do número de cópias do gene deEGFr compreende PCR quantitativa. Em certas realizações, a determi-nação do número de cópias do gene de EGFr compreende análiseSouthern blot. Em certas modalidades, a determinação do número decópias do gene de EGFr compreende uma outra metodologia de determi-nação do número de cópias de gene descrita aqui. Em certas modalida-des, o câncer relacionado com EGFr é um tumor sólido. Em certasrealizações, o tumor sólido compreende pelo menos um câncer selecio-nado de câncer colo-retal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncerde ovário, câncer de próstata, câncer renal e câncer de pescoço e cabeça.

Em certas modalidades, é provido um método para a deter-minação da eficácia de um tratamento em um paciente, que compreen-de: (a) determinação do número de cópias do gene de EGFr em umaprimeira amostra obtida de um paciente de maneira a se obter umprimeiro nível de número de cópias do gene de EGFr; (b) determinaçãodo número de cópias do gene de EGFr em uma segunda amostra dopaciente no momento seguinte à administração do tratamento, gerando,desta forma, um segundo nível de número de cópias do gene de EGFr; e(c) comparação dos níveis de número de cópias do gene de EGFr daprimeira e da segunda amostras, onde uma redução do número decópias do gene de EGFr do segundo nível do número de cópias do genede EGFr em relação ao primeiro nível de número de cópias do gene deEGFr indica que o tratamento é efetivo no paciente. Em certas modali-dades, a determinação do número de cópias do gene de EGFr compre-ende análise de hibridização in situ fluorescente. Em certas realizações,a determinação do número de cópias do gene de EGFr compreende PCRquantitativa. Em certas modalidades, a determinação do número decópias do gene de EGFr compreende análise Southern blot. Em certasrealizações, a determinação do número de cópias do gene de EGFrcompreende uma outra metodologia de determinação do número decópias de gene descrita aqui. Em certas modalidades, o tratamentocompreende um agente de ligação específica a EGFr. Em certas realiza-ções, o agente de ligação específica a EGFr é um anticorpo anti-EGFr.Em certas realizações, o anticorpo anti-EGFr é um anticorpo humano.Em certas modalidades, o anticorpo anti-EGFr é o panitumumab. Emcertas realizações, o tratamento compreende um agente de ligaçãoespecífica a EGFr e pelo menos um agente quimioterapêutico. Emcertas modalidades, o tratamento é para um câncer relacionado comEGFr. Em certas realizações, o câncer relacionado com EGFr é umtumor sólido. Em certas modalidades, o tumor sólido compreende pelomenos um câncer selecionado de câncer colo-retal, câncer de pulmão,câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer renal ecâncer de pescoço e cabeça.

Os exemplos a seguir, incluindo os experimentos conduzidose resultados obtidos são providos com propósito ilustrativo apenas e nãodevem ser entendidos como limitantes da presente invenção.

Exemplo 1

Isolamento de Amostras de Tumor CRC e Correlação

Com o Tratamento com PANITUMUMAB

Dez pacientes foram selecionados entre pacientes cadastra-dos no Ospedale Niguarda Ca' Granda para um experimento clínico companitumumab (anticorpo monoclonal IgG2 humano para EGFr; AmgenInc.) para o tratamento de câncer colo-retal expressando EGFr ("CRC").Os protocolos de tratamento foram aprovados pelo Comitê de ÉticaInstitucional. Os pacientes forneceram consentimento por escrito parareceberem panitumumab, bem como para a análise de EGFr expressopor tumor e moléculas envolvidas na ativação de EGFr. Todos os dezpacientes foram resistentes a regimes quimioterápicos anteriores. Estesregimes quimioterápicos anteriores são mostrados na Tabela 1 abaixo.As amostras do tumor do paciente foram analisadas para a expressão deEGFr utilizando-se o kit EGFRPharmDX (DAKO Corp.) de acordo com asinstruções do fabricante. Todos os pacientes selecionados para o estudoapresentavam CRC metastático expressando EGFr, confirmado pelapresença de marcação de EGFr em pelo menos 1% das células malignas.Os pacientes foram tratados por via intravenosa com panitumumab comuma dose de 6 mg/kg a cada duas semanas até que a progressão dadoença foi observada.

A resposta do tumor ao tratamento com panitumumab foiavaliada por Imagem de Tomografia Computadorizada ("CT scan")empregando os critérios dos "Critérios de Avaliação de Resposta emTumores Sólidos" (RECIST) por radiologistas institucionais bem comoindependentes de acordo com os protocolos clínicos. O RECIST provediretrizes para a identificação da melhora, estabilidade ou progressão dedoença com base no tamanho do tumor (ver Therasse e colaboradores,February 2000, "New Guidelines to Evaluate the Response to Treatmentin Solid Tumors," J. Natl. Câncer Inst. 92(3):205-216). Os resultados daanálise RECIST dos pacientes tratados com o panitumumab são mos-trados na Tabela 1.Tabela 1

<table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table>

Desta forma, seis dos dez pacientes responderam positiva-mente ao tratamento com panitumumab, mostrando ou doença estávelou uma resposta parcial.

Exemplo 2

Análise Mutacional de EGFR, PI3K,

RAS E RAF em Amostras de Tumor CRC

Antes do início do tratamento com panitumumab discutidono Exemplo 1, amostras de tumor CRC de cada paciente foram fixadasem parafina. Uma seção de 10 microns foi preparada a partir de cadaamostra de paciente. As regiões da seção contendo tecido tumoralforam marcadas e o tecido foi extraído com 0,2 M NaOH/1 mM EDTA.As amostras foram neutralizadas subseqüentemente com Tris-TElOOmM. Após a extração e neutralização, o DNA de cada amostra foipurificado utilizando-se um kit de purificação PCR (Qiagen) seguindo-seas instruções do fabricante.

Iniciadores de PCR específicos para exon e iniciadores deseqüenciamento foram desenhados utilizando-se o programa Primer3(Rozen S., Skaletsky H. (2000) Primer3 on the WWW for general usersand for biologist programmers. In: Krawetz, S., Misener, S. (eds.) Bioin-formatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Huma-na Press, Totowa, NJ, pp 365-386). Os iniciadores foram sintetizadospela Invitrogen™ (Carlsbad, CA). O iniciador de PCR direto para exon18 de EGFr foi GCTGAGGTGACCCTTGTCTC (SEQ ID No.: 1), o iniciadorreverso de PCR para o exon 18 de EGFr foi ACAGCTTGCAAGGACTCTGG(SEQ ID No.: 2) e o iniciador de seqüenciamento para o exon 18 de EGFrfoi TGGAGCCTCTTACACCCAGT (SEQ ID No.: 3). O iniciador direto dePCR para o exon 19 de EGFr foi CCCAGTGTCCCTCACCTTC (SEQ IDNO: 4), iniciador reverso de PCR para o exon 19 de EGFr foi CCACA-CAGCAAAGCAGAAAC (SEQ ID No.: 5) e o iniciador de seqüenciamentopara o exon 19 de EGFr foi GCTGGTAACATCCACCCAGA (SEQ ID No.:6). O iniciador direto de PCR para o exon 21 de EGFr foiTGATCTGTCCCTCACAGCAG (SEQ ID No.: 7), iniciador reverso de PCRpara o exon 21 de EGFr foi TCAGGAAAATGCTGGCTGAC (SEQ ID No.: 8)e o iniciador de seqüenciamento para o exon 21 de EGFr foi TTCAGGG-CATGAACTACTTGG (SEQ ID No.: 9). O iniciador direto de PCR para oexon 9 de PI3K foi GGGAAAAATATGACAAAGAAAGC (SEQ ID No.: 10), oiniciador reverso de PCR para o exon 9 de PI3K foi CTGAGATCAGCCAA-ATTCAGTT (SEQ ID No.: 11) e o iniciador de seqüenciamento para oexon 9 de PI3K foi TAGCTAGAGACAATGAATTAAGGGAAA (SEQ ID No.:12). O iniciador direto de PCR para o exon 20 de PI3K foi CTCAAT-GATGCTTGGCTCTG (SEQ ID No.: 13), o iniciador reverso de PCR para oexon 20 de PI3K foi TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC (SEQ ID No.: 14) e oiniciador de seqüenciamento para o exon 20 de PI3K foi TTGATGA-CATTGCATACATTCG (SEQ ID No: 15). O iniciador direto de PCR para oexon 2 de Ras foi GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAAC (SEQ ID No.: 16),o iniciador reverso de PCR para o exon 2 de Ras foi AGAATGGTCCTG-CACCAGTAA (SEQ ID No.: 17) e o iniciador de seqüenciamento para oexon 2 de Ras foi TCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTG (SEQ ID No.: 18).

O iniciador direto de PCR para o exon 15 de B-Raf foi TGCTTGCTCTGA-TAGGAAAATG (SEQ ID No.: 19), o oniciador reverso de PCR para o exonq5 de B-Raf foi AGCATCTCAGGGCCAAAAAT (SEQ ID No.: 20) e oiniciador de seqüenciamento para o exon 15 de B-Raf foi TGTTTTCCTT-TACTTACTACACCTCA (SEQ ID No.: 21).

Os exons 18, 19 e 21 de EGFr, exons 9 e 20 de PI3K, exon 2de Ras e exon 15 de B-Raf foram amplificados por PCR a partir do DNAgenômico do tumor purificado utilizando-se os iniciadores de PCRdescritos acima. O PCR foi realizado em um volume total de 20 ulutilizando-se um programa PCR "touchdown". O programa de amplifi-cação foi como se segue: 94°C por 2 minutos; três ciclos de 94°C por 30segundos, 64°C por 30 segundos, 70°C por 30 segundos; três ciclos de94°C por 30 segundos, 58°C por 30 segundos, 70°C por 30 segundos;35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 57°C por 30 segundos e 70°C por 30segundos; e um ciclo de 70°C por 5 minutos. Após a reação estarcompleta, os amplificados foram purificados utilizando-se o sistema depurificação AMPure PCR (Agencourt Bioscience Corp.). Os amplificadospurificados foram seqüenciados utilizando-se o kit BigDye® Terminatorv.3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) de acordo com as instru-ções do fabricante e analisados com um sistema de eletroforese capilar3730 ABI. Cada seqüência de exon do DNA tumoral de um pacienteparticular foi comparada com a seqüência do exon selvagem do DNAnormal do mesmo paciente para identificar a presença de quaisquermutações. Os resultados da análise são mostrados na Tabela 2.Tabela 2

<table>table see original document page 90</column></row><table>

Os resultados nas Tabelas 1 e 2 mostram que as mutaçõesno domínio catalítico de EGFr (exons 18, 19 e 21) e as mutações no exon1 de Ras, exons 9 e 20 de PI3K e mutações no exon 15 de B-Raf, nãoestavam correlacionadas com a eficácia do tratamento com panitumu-mab nos dez pacientes com CRC testados.

Exemplo 3

Análise do Número de Cópias de EGFRe Localização nas Amostras de Tumor CRC

O número de cópias de um gene de EGFr em amostras detumor do paciente foi determinado de duas maneiras: por hibridizaçãofluorescente in situ ("FISH") e por PCR quantitativa. A análise FISH foirealizada utilizando-se o kit de detecção Herl FISH (Dakocytomation,Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O kit permitiu arotulagem fluorescente diferencial de cada gene de EGFr, a seqüênciaalfa-centromérica de cada cromossomo 7 ("CEP7") e cada núcleopresente na amostra. As amostras dos pacientes foram colocadas emuma solução de pré-tratamento (provida no kit) por 30 minutos a 96°C esubseqüentemente digeridas com uma solução de pepsina (provida nokit) por 30 minutos a temperatura ambiente. Foram realizados ensaiosde FISH de dupla-cor duplo-alvo utilizando-se a sonda LSI EGFRSpectrum Orange (Vysis, Downers Grove, IL) e a sonda CEP7 SpectrumGreen (Vysis, Downers Grove, IL). As seções de tecido foram cobertascom 10 ul de solução de sonda (provida no kit) e incubadas a 75°C por 5minutos para co-desnaturar as sondas de EGFr e de CEP7. As seçõesforam deixadas hibridizar durante a noite com as sondas desnaturadasa 37°C. As etapas de co-desnaturação e hibridização foram realizadasseqüencialmente em um sistema controlada por microscópio (Hybridizer,Dakocytomation, Dinamarca). Após a hibridização, as seções foramlavadas duas vezes a 65°C por 10 minutos por lavagem utilizando-se otampão de lavagem provido no kit e secadas a temperatura ambiente por15 minutos. As seções de tecido foram cobertas com 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI II, Vysis) para contra-marcação com cromatina eexaminadas por microscopia fluorescente.

Um microscópio fluorescente (Zeiss Axioskop, Alemanha)equipado com a estação de trabalho Chromowin (Amplimedical, Itália)foi utilizado para a visualização FISH. O gene de EGFr foi observadocomo um sinal vermelho com um filtro de isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC). A seqüência de CEP7 foi observada como um sinalverde com um filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC). O núcleocelular foi observado como um sinal azul com um filtro DAPI. Asimagens representativas de cada espécie foram obtidas com uma câmeraHamamatsu C5895 chilled CCD (Upstate Technical Equipment Co., NewYork) em camadas monocromáticas que foram subseqüentementemisturadas pelo programa Casti Imaging FISH Multicolor (Amplimedi-cal). As células do epitélio pigmentoso da retina e células da mucosacolo-retal normais adjacentes às células tumorais em cada amostra depaciente foram utilizadas como controles de célula normal. Células decarcinoma epidermóide humano foram utilizadas como controles para onúmero aumentado de cópias do gene de EGFr. A espécie do paciente 5foi disponível apenas como uma seção de 10 mícron e, apesar detentativas múltiplas, a análise FISH não foi conclusiva devido ao excessode espessura do tecido.

Dois observadores independentes contaram pelo menos 200núcleos na interfase não sobrepostos de cada amostra utilizandodiretrizes de contagem predefinidas. Aos observadores não foi dadoconhecer nem as características clínicas dos pacientes nem as conta-gens e observações do outro observador. No interior de cada núcleo, osnúmeros de cópias do gene de EGFr e da seqüência CEP7 foram obtidosindependentemente. A proporção do número de cópias do gene de EGFrpara o número de núcleos (EGFr:núcleo) e a proporção do número decópias do gene de EGFr para o número de seqüências CEP7 (EG-Fr:CEP7) foram registradas. Os resultados são mostrados na Tabela 3.Tabela 3

<table>table see original document page 93</column></row><table>

Um gene de EGFr está normalmente localizado no cromos-somo 7 e, desta forma, a proporção esperada do número de genes deEGFnnúmero de seqüências CEP7 era de 1. A proporção esperada donúmero de genes de EGFr:número de núcleos era de 2, tendo em vistaque duas cópias do cromossomo 7 deveriam estar presentes no núcleo.Um número aumentado de cópias do gene de EGFr pode resultar tantona polissomia do cromossomo 7 quanto da amplificação do gene deEGFr. A dissomia normal é, desta forma, indicada por uma proporçãogene de EGFr:CEP7 de 1 e uma proporção gene de EGFr:núcleos de 2.

Uma polissomia equilibrada é indicada por uma proporção gene deEGFr:CEP7 de 1 e uma proporção gene de EGFnnúcleos acima de 2. Adissomia normal com amplificação de um gene de EGFr é indicada poruma proporção gene de EGFr:CEP7 acima de 1 e uma proporção gene deEGFnnúcleos acima de 2. O número aumentado de cópias do gene deEGFr foi arbitrariamente definido como um valor > 3 na proporção denúmero de genes de EGFrrnúcleos.

A Figura 1 mostra algumas imagens do ensaio de FISH dedupla-cor, nas quais os genes de EGFr aparecem em vermelho e asseqüências CEP7 aparecem em verde. A Figura IA mostra o padrão demarcação de células de mucosa colo-retal normais, nas quais foiobservada uma dissomia equilibrada. A Figura 1B mostra o padrão demarcação de células tumorais do paciente 7, também mostrandodissomia equilibrada. A Figura 1C mostra o padrão de marcação decélulas tumorais do paciente 4, apresentando polissomia equilibrada. AFigura 1D mostra o padrão de marcação de células tumorais do paciente1, apresentando dissomia com amplificação do gene de EGFr.

O número de cópias do gene de EGFr é também determina-do para cada paciente utilizando-se PCR quantitativa. PCR em temporeal é realizada utilizando-se um aparelho ABI PRISM® 7900HT e osistema de detecção SYBR® Green (Molecular Probes, Inc.) (AppliedBiosystems), seguindo-se as instruções do fabricante. O iniciador diretoGAATTCGGATGCAGAGCTTC (SEQ ID No.: 22) e o iniciador reversoGACATGCTGCGGTGTTTTC (SEQ ID No.: 23) são utilizados para amplifi-car uma região pequena (100-200 bp) não repetitiva de um gene deEGFr. Linhagem 1, um elemento repetitivo para o qual os números decópias por genoma diplóide são semelhantes em todos as célulashumanas, é também amplificada a partir da amostra de cada pacientepara permitir a normalização dos resultados do gene de EGFr. Osiniciadores direto e reverso para o elemento repetitivo da Linhagem 1são AAAGCCGCTCAACTACATGG (SEQ ID No.: 24) e TGCTTTGA-ATGCGTCCCAGAG (SEQ ID No.: 25), respectivamente. As condições deamplificação são como se segue: um ciclo de 10 minutos a 95°C, seguidode 45 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. O número deciclos limite são obtidos utilizando-se o programa ABI PRISM® 7900HTSequence Detection System. As reações de amplificação são realizadas emtriplicata e o número de ciclos limite são a média. As alterações donúmero de cópias são calculadas utilizando-se a fórmula s(Dt-DlinhageiI1)-(N1;-Niinhagem), Nesta fórmula, Dt é a média do número de ciclos limite obser-vado para a seqüência do gene de EGFr em uma amostra do paciente,Dlinhagem é a média do número de ciclos limite observado para aseqüência da Linhagem 1 em uma amostra do paciente, Nt é o númerode ciclos limite observado para a seqüência do gene de EGRr em DNA decélulas do epitélio pigmentoso da retina ("RPE") e Nlinhagem é o númerode ciclos limite observado para a seqüência da Linhagem 1 em DNA decélulas RPE.

Exemplo 4

Ensaio de Inibição da Proliferação Celular

Foi estudado o efeito do panitumumab sobre linhagens celu-lares com um número normal de cópias go gene de EGFr ou com umnúmero aumentado de cópias do gene de EGFr. Primeiramente, foideterminado o número de cópias de EGRr em linhagens de células CRCexperimentais. Foram estudadas oito linhagens de células CRC: DiFi(Jose Baselga, Vali d'Hebron University, Barcelona, Espanha), DLD-1 ,HCT-116, HT- 29, LoVo, SW48, SW480 e SW620 (todas do ATCC). Foideterminado o número de cópias de EGFr de cada linhagem de célulasCRC utilizando-se a metodologia FISH conforme descrito no Exemplo 3acima. Cada linhagem de célula (com exceção das células DiFi) foramcrescidas em DMEM suplementado com soro fetal bovino 10%, penicili-na e estreptomicina. As células DiFi foram crescidas em meio F-12suplementado com FCS 10% e antibióticos. Uma imagem de marcaçãofluorescente FISH típica para células DiFi é mostrada na Figura 2B. Osvalores obtidos das análises FISH são mostrados na Tabela 4.Tabela 4

Número de Cópias do Gene EGFrem Linhagens de Células CRC

<table>table see original document page 96</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 4, as células DiFi apresentam umnúmero de cópias do gene de EGFr muito alto.

A expressão do gene de EGFr foi examinada em cada umadas linhagens de células por análise Western blot da proteína EGFrcelular (ver Figura 2A). Os extratos de proteína foram submetidos aeletroforese via SDS-PAGE e transferidos para membranas de difluoretode polivinilideno por marcação a úmido de alta intensidade. Os filtrosforam sondados com os anticorpos indicados e a ligação específica foidetectada utilizando-se um sistema de quimioluminescência amplificado(Amersham). Conforme esperado a partir dos dados de FISH, acima, ascélulas DiFi apresentaram alto nível da proteína EGFr. Com exceção daSW620, as outras linhagens de células mostraram níveis variáveis deproteína EGFr. As células SW260 não continham proteína EGFr, apesardo alto número de cópias do gene de EGFr.

O efeito do panitumumab sobre a proliferação de cada umadas linhagens de células de tumor CRC é determinado utilizando-se umensaio de incorporação de bromodesoxiuridina ("BrdU"). As células sãocrescidas em DMEM suplementado com FBS 2% em placas escuras de96 poços (Culture Plate™ 96F (Packard Bioscience)). As células plaque-adas são incubadas por 5 dias com concentrações variáveis entre 0,01-100 nM de panitumumab (Amgen Inc.). A proliferação celular é deter-minada por um método ELISA quimioluminescente para ensaio deincorporação de BrdU (Roche). A densidade de semeadura de célula porpoço para cada linhagem de célula é como se segue: DiFi: 4000; LoVo:4000; DLD: 500; HCT116: 1000; HT29: 1000; SW480: 1000; SW387:4000; SW48: 500; e SW620: 500. O ensaio BrdU é realizado em trêsexperimentos com triplicatas separadas de acordo com as instruções dofabricante e é finalizado 20 horas após a adição da solução de rotula-gem. A porcentagem de proliferação celular a cada concentração depanitumumab é calculada utilizando-se a seguinte fórmula: [(amostrateste - amostra branco) / (amostra controle - amostra branco) x 100],onde a amostra de controle são células crescidas em meio sem panitu-mumab e a amostra em branco consiste em células crescidas em TritonX 0,02% em DMEM (isto é, sem crescimento).Listagem de Seqüência

< 110> Amgen Inc.Siena, SalvatoreMoroni, MauroBardelli, Alberto

<120> Número de Cópia de Gene do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico

<130> 6843.106-304

<150> 60/667,827<151> 2005-04-01

<160> 25

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 1

gctgaggtga cccttgtctc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 2

acagcttgca aggactctgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 3

tggagcctct tacacccagt 20

<210> 4<211> 19<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 4

cccagtgtcc ctcaccttc

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 5

ccacacagca aagcagaaac

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 6

gctggtaaca tccacccaga

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 7

tgatctgtcc ctcacagcag

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 8

tcaggaaaat gctggctgac

<210> 9<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 9

ttcagggcat gaactacttg g

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 10

gggaaaaata tgacaaagaa age

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 11

ctgagatcag ccaaattcag tt

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 12

tagetagaga caatgaatta agggaaa

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 13

ctcaatgatg cttggctctg

<210> 14<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio

<400> 14tggaatccag agtgagcttt c

<210> 15<211> 22<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 15

ttgatgacat tgcatacatt cg

<210> 16<211> 26<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de oligonucleotídio<400> 16

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Claims (37)

"Métodos de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente deLigação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionadocom EGFr num Sujeito, de Tratamento do Mesmo e de Determinaçãoda Eficácia de Tratamento em Paciente"

1. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, caracterizado por que compreende determinar onúmero de cópia de gene de EGFr numa amostra a partir do sujeito, emque a presença de um número de cópia de gene de EGFr aumentado naamostra prediz que um tratamento de agente de ligação específica a EGFrserá eficaz para tratar um câncer relacionado com EGFr no sujeito.

2. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 1 , caracterizado porque o tratamento de agente de ligação específica a EGFr compreende umanticorpo anti-EGFr.

3. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 2 , caracterizado porque o anticorpo anti-EGFr é um anticorpo anti-EGFr humano.

4. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 3 , caracterizado porque o anticorpo anti-EGFr humano é o panitumumabe.

5. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 1 , caracterizado porque o tratamento de agente de ligação específica a EGFr compreende umagente de ligação específica a EGFr e pelo menos um agente quimioterá-pico.

6. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 1 , caracterizado porque o câncer relacionado com EGFr é um tumor sólido.

7. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 6 , caracterizado porque o tumor sólido é pelo menos um câncer selecionado a partir de cân-cer coloretal, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer do ovário, cân-cer da próstata, câncer do rim e câncer de cabeça e pescoço.

8.- Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 1 , caracterizado porque determinar o número de cópia de gene de EGFr na amostra compre-ende comparar o número de cópia de gene de EGFr na amostra com onúmero de cópia de gene de EGFr numa amostra de referência normal.

9. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Liga-ção Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 8 , caracterizado porque determinar o número de cópia de gene de EGFr compreende a análi-se fluorescente de hibridação in situ.

10. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 8 , caracterizado porque determinar o número de cópia de gene de EGFr compreende a análi-se quantitativa de PCR.

11. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 8 , caracterizado porque determinar o número de cópia de gene de EGFr compreende a análi-se de borrão de Southern.

12. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 1 , caracterizado porque determinar o número de cópia de gene de EGFr compreende:(a) determinar o número de cópia de gene de EGFr numa a-mostra de teste a partir de um tumor no sujeito;(b) determinar o número de cópia de pelo menos uma se-qüência de nucleotídios de referência na amostra de teste; e(c) comparar o número de cópia de gene de EGFr com pelomenos um número de cópia de seqüência de nucleotídios de referência,em que um número de cópia aumentado do gene de EGFr na amostra deteste em relação ao número de cópia de pelo menos uma seqüência denucleotídios de referência prediz que um tratamento de agente de ligaçãoespecífica a EGFr será eficaz no tratamento de câncer relacionado comEGFr no sujeito.

13. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que pelo menos um número de cópia de seqüência de nucleotídios dereferência é de duas cópias por célula.

14. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que pelo menos uma seqüência de nucleotídios de referência é umaseqüência centromérica.

15. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que determinar o número de cópia de gene de EGFr e pelo menos umnúmero de cópia de seqüência de nucleotídios de referência compreendea análise fluorescente de hibridação in situ.

16. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que determinar o número de cópia de gene de EGFr e pelo menos umnúmero de cópia de seqüência de nucleotídios de referência compreendea análise quantitativa de PCR.

17. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que determinar o número de cópia de gene de EGFr e pelo menos umnúmero de cópia de seqüência de nucleotídios de referência compreendea análise de borrão de Southern.

18. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que o câncer relacionado com EGFr é um tumor sólido.

19. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizadopor que o tumor sólido é pelo menos um câncer selecionado a partir decâncer coloretal, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer do ovário,câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer do rim e câncer de cabeça epescoço.

20. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que o tratamento de agente de ligação específica a EGFr compreendeum anticorpo anti-EGFr.

21. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 20 , caracterizadopor que o anticorpo anti-EGFr é um anticorpo anti-EGFr humano.

22. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizadopor que o anticorpo anti-EGFr humano é o panitumumabe.

23. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizadopor que o tratamento de agente de ligação específica a EGFr compreendeum agente de ligação específica a EGFr e pelo menos um agente quimio-terápico.

24. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado comEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 1 , caracterizado porque determinar o número de cópia de gene de EGFr compreende:(a) determinar o número de cópia de gene de EGFr numa a-mostra de teste a partir do sujeito;(b) determinar o número de núcleos na amostra de teste; e(c) comparar o número de cópia de gene de EGFr com o nú-mero de núcleos, em que uma relação maior do que dois prediz que umtratamento de agente de ligação específica a EGFr será eficaz no trata-mento de um câncer relacionado com EGFr no sujeito.

25. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado aEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizadopor que determinar o número de cópia de gene de EGFr e o número denúcleos compreende a análise fluorescente de hibridação in situ.

26. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado aEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizadopor que o câncer relacionado com EGFr é um tumor sólido.

27. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado aEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 26 , caracterizadopor que o tumor sólido é pelo menos um câncer selecionado a partir decâncer coloretal, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer do ovário,câncer da bexiga, câncer da próstata, câncer do rim e câncer de cabeça epescoço.

28. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado aEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 24 , caracterizadopor que o tratamento de agente de ligação específica a EGFr compreendeum anticorpo anti-EGFr.

29. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado aEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizadopor que o anticorpo anti-EGFr é um anticorpo anti-EGFr humano.

30. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado aEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 29, caracterizadopor que o anticorpo anti-EGFr humano é o panitumumabe.

31. - Método de Predição da Eficácia de Tratamento de Agente de Li-gação Específica a EGFr em Tratamento de Câncer Relacionado aEGFr num Sujeito, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizadopor que o tratamento de agente de ligação específica a EGFr compreendeum agente de ligação específica a EGFr e pelo menos um agente quimio-terápico.

32. - Método de Tratamento de Sujeito com Câncer Relacionado comEGFr, caracterizado por que compreende:(a) determinar o número de cópia de gene de EGFr numa a-mostra a partir do sujeito;(b) determinar se existe um número de cópia de gene de EGFraumentado na amostra; e(c) se existir um número de cópia de gene de EGFr aumenta-do na amostra, administrar ao sujeito uma quantidade farmaceuticamen-te efetiva de um agente de ligação específica a EGFr.

33. - Método de Tratamento de Sujeito com Câncer Relacionado comEGFr, de acordo com a Reivindicação 32, caracterizado por que o agentede ligação específica a EGFr é um anticorpo anti-EGFr.

34. - Método de Tratamento de Sujeito com Câncer Relacionado comEGFr, de acordo com a Reivindicação 33, caracterizado por que o anti-corpo anti-EGFr é um anticorpo anti-EGFr humano.

35. - Método de Tratamento de Sujeito com Câncer Relacionado comEGFr, de acordo com a Reivindicação 34, caracterizado por que o anti-corpo anti-EGFr humano é o panitumumabe.

36. - Método de Tratamento de Sujeito com Câncer Relacionado comEGFr, de acordo com a Reivindicação 32, caracterizado por que o agentede ligação específica a EGFr é administrado com pelo menos um agentequimioterápico.

37. - Método de Determinação da Eficácia de Tratamento em Pacien-te, caracterizado por que compreende:(a) determinar o número de cópia de gene de EGFr numaprimeira amostra obtida a partir de um paciente para obter um primeironível de número de cópia de gene de EGFr;(b) administrar o tratamento ao paciente;(c) determinar o número de cópia de gene de EGFr numa se-gunda amostra a partir do paciente num momento a seguir à administra-ção do tratamento, gerando, assim, um segundo nível de número de có-pia de gene de EGFr copia; e(d) comparar o primeiro e o segundo níveis de número de ge-ne de cópia de EGFr, em que uma diminuição no número de cópia de ge-ne de EGFr no segundo nível de número de cópia de gene de EGFr para oprimeiro nível de número de cópia de gene de EGFr indica que o trata-mento é efetivo no paciente.