PT2319928E

PT2319928E - Péptidos diméricos de trombopoietina que simulam a ligação ao receptor mpl e têm actividade trombopoiética

Info

Publication number: PT2319928E
Application number: PT100116896T
Authority: PT
Inventors: Ulrich Feige; Janet Cheetham; Chuan-Fa Liu
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2013-06-28
Also published as: WO2000024770A2; TWI257394B; HK1042114B; NO2012005I1; US20150024431A1; WO2000024770A3; EP1783222B1; NZ510529A; SI2319928T1; BG65663B1; EP1124961A2; NO2012005I2; JP2006230413A; ATE348163T1; BR9914698A; EP1783222A1; AR020934A1; SK4962001A3; BG110221A; US20120208760A1

Description

DESCRIÇÃO

PÉPTIDOS DIMÉRICOS DE TROMBOPOIETINA QUE SIMULAM A LIGAÇÃO AO RECEPTOR MPL E TÊM ACTIVIDADE TROMBOPOIÉTICA

ÂMBITO DA INVENÇÃO

De uma forma geral, a presente invenção tem por objecto o domínio de compostos, especialmente péptidos e polipéptidos, que têm actividade trombopoiética. Os compostos da presente invenção podem ser utilizados para aumentar a produção de plaquetas ou de percursores de plaquetas (por exemplo, megacariócitos) num mamífero.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto compostos, especialmente péptidos, que têm a capacidade de estimular in vitro e in vivo a produção de plaquetas e das suas células percursoras, tais como, megacariócitos. Antes de discutir a natureza dos compostos da presente invenção, dá-se a seguir uma visão do antecedente no que respeita a duas proteínas que têm actividade trombopoiética: trombopoietina (TPO) e factor de desenvolvimento e do crescimento de megacariócitos (FDCM), (MGDF na terminologia inglesa). A clonagem de trombopoietina (TPO) endógena (Lok et al., Nature 369: 568-571 (1994); Bartley et al., Cell 77:

1117-1124 (1994); Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91: 11.104-11.108 (1994); de Sauvage et al., Nature 369: 533-538 (1994); Kato et al., Journal of Biochemistry 119: 229-236 (1995); Chang et al., Journal of Biological 1

Chemistry 270: 511-514 (1995)) aumentou rapidamente a nossa compreensão sobre a megacariopoiese (produção de megacariócitos) e sobre a trombopoiese (produção de plaquetas) . A TPO humana endógena, uma proteína glicosilada de 60 a 70 kDa, basicamente produzida no fígado e nos rins, consiste em 332 aminoácidos (Bartley et al., Cell 77: 1117-1124 (1994); Chang et al., Journal of Biological Chemistry 270: 511-514 (1995)). A proteína está altamente conservada entre diferentes espécies e tem 23 % de homologia com a eritro-poietina humana (Gurney et al., Blood 85: 981-988 (1995)) na terminação amino (aminoácidos 1 a 172) (Bartley et al., Cell 77: 1117-1124 (1994)). A TPO endógena tem mostrado possuir todas as características do regulador biológico chave da trombopoiese. As suas acções in vitro incluem a indução específica de colónias de megacariócitos tanto provenientes de células hematopoiéticas indiferenciadas de murino purificadas (Zeigler et al., Blood 84:4045-4052 (1994)) como de células CD34+ humanas (Lok et al., Nature 369:568-571 (1994); Rasko et al., Stem Cells 15:33-42 (1997)), a geração de megacariócitos com aumento de ploidia (Broudy et al., Blood 85: 402-413 (1995) ) e a indução da maturação terminal de megacariócitos e da produção de plaquetas (Zeigler et al., Blood 84: 4045-4052 (1994); Choi et al., Blood 85: 402-413 (1995)). Inversamente, os oligodesoxinucleótidos sintéticos de sentido inverso em relação ao receptor de TPO (c-Mpl) inibem significativamente a capacidade de formação de colónias dos progenitores de megacariócitos (Methia et al., Blood 82: 1395-1401 (1993)). Além disso, os ratos atingidos com c-Mpl são severamente trombocitopénicos e deficitários em megacariócitos (Alexander et al., Blood 87: 2162-2170 (1996) ). 2 0 FDCM humano recombinante (FDCMHur, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) é outro polipéptido trombopoiético relacionado com a TPO. É produzido utilizando E. Coli transformada com um plasmido contendo ADNc que codifica uma proteína truncada que engloba o domínio de ligação do receptor com o terminal amino da TPO humana (Ulich et ai., Blood 86: 971-976 (1995)). 0 polipéptido é extraído, redobrado e purificado e liga-se covalentemente a uma parte de poli[etileno-glicol] (PEG) ao terminal amino. A molécula resultante é referida aqui como uma PEG-FDCMHur ou mais simplesmente FDCM. Vários estudos que utilizaram modelos de animais (Ulich, T.R. et al., Blood 86: 971-976 (1995); Hokom, M.M. et al., Blood 86: 4486-4492 (1995)) demonstraram claramente as eficácias terapêuticas da TPO e do FDCM na transplantação de medula óssea e no tratamento de trombocitopénia, um estado clínico que resulta muitas vezes de quimioterapia ou de terapia por radiação. Dados preliminares em seres humanos confirmaram a utilidade de FDCM no aumento das contagens de plaquetas em vários conjuntos. (Basser et al., Lancet 348: 1279-81 (1996); Kato et al. , Journal of Biochemistry 119: 229-236 (1995); Ulich et al., Blood 86: 971-976 (1995)). 0 FDCM pode ser utilizado para aumentar o processo de doação de plaquetas, dado que a administração de FDCM aumenta as contagens das plaquetas circulantes de cerca de três vezes em relação ao valor original em dadores saudáveis de plaquetas. A TPO e o FDCM exercem a sua acção através da ligação ao receptor de c-Mpl, que é expresso principalmente na superfície de certas células hematopoiéticas, tais como, megacariócitos, plaquetas, células CD34+ e células do progenitor primitivo (Debili, N. et al., Blood 85: 391-401 3 (1995); de Sauvage, F.J. et al., Nature 369: 533-538 (1994); Bartley, T.D., et al. , Cell 77: 1117-1124 (1994); Lok, S. et al., Nature 369: 565-8 (1994)). Tal como a maior parte dos receptores de interleucinas e hormonas de proteína, a c-Mpl pertence à super-família dos receptores de citocinas da classe I (Vigon, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89: 5640-5644 (1992)). A activação desta classe de receptores envolve a homodimerização do receptor, induzida pela ligação do ligando, que por sua vez, provoca a cascata de eventos de transdução do sinal.

Em geral, a interaeção de um ligando de proteína com o seu receptor muitas vezes tem lugar numa interface relativamente ampla. Contudo, tal como se demonstrou no caso da ligação da hormona de crescimento humano ao seu receptor, apenas alguns resíduos chave na interface contribuem realmente para a maior parte da energia de ligação (Clackson, T. et al., Science 267: 383-386 (1995)). Isto e o facto de a maior parte do ligando da proteína remanescente servir apenas para desencadear os epítopos de ligação na topologia correcta, torna possível encontrar ligandos activos de dimensão muito mais pequena.

Num esforço neste sentido, o sistema de exibição da biblioteca de péptidos de fago emergiu como uma técnica poderosa na identificação de alguns pequenos péptidos miméticos dos ligandos das proteínas grandes (Scott, J.K. et al., Science 249: 386 (1990); Devlin, J.J. et al., Science 249: 404 (1990)). Utilizando estas técnicas, descobriram-se pequenas moléculas de péptidos que actuam como agonistas do receptor de c-Mpl (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)).

Nesse estudo, sequências aleatórias de péptidos 4 pequenos foram exibidas como fusões com as proteínas de revestimento de fagos filamentosos, que foram eluídos por afinidade versus o domínio extracelular imobilizado do anticorpo de c-Mpl e os fagos retidos foram enriquecidos numa segunda passagem de purificação por afinidade. Esta selecção da ligação e o processo de re-propagação foram repetidos muitas vezes para enriquecer o conjunto dos ligantes mais poderosos. Como resultado, identificou-se, pela primeira vez, duas famílias de péptidos de ligação de c-Mpl, não relacionadas uma com a outra nas suas sequências. Criaram-se então bibliotecas de mutagénese para optimizar mais os melhores ligantes, o que finalmente levou ao isolamento de um péptido muito activo com uma CI50 = 2 nM e uma CE50 = 400 nM (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). Este péptido de 14 resíduos, designado como TMP (significando um péptido mimético de TPO), não tinha uma homologia de sequência aparente com TPO ou com FDCM. A estrutura deste composto de TMP é a seguinte:

Ile Glu Gli Pro Tre Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID N°. 1 ou

IEGPTLRQWLAARA utilizando uma única letra como abreviatura dos aminoácidos.

Previamente, num estudo semelhante em péptidos miméticos de EPO, descobriu-se um péptido mimético de EPO (EMP) utilizando a mesma técnica (Wrighton, N.C. et al., Science 273: 458-463 (1996)) e verificou-se que actuava como um dímero na ligação ao receptor de EPO (REPO, EPOR na terminologia inglesa). O complexo de (ligando)2/(receptor)2 assim formado tinha uma simetria de C2 de acordo com os 5 dados cristalográficos de raio X (Livnah, 0. et al., Science 273: 464-471 (1996)). Com base nesta informação estrutural, preparou-se um dimero de EMP ligado covalentemente e em que a terminação C dos dois monómeros de EMP estava reticulada com um espaçador flexível e verificou-se que tinham aumentado enormemente a ligação, assim como, a bioactividade in vitro/in vivo (Wrighton, N.C., et al., Nature Biotechnology 15: 1261-1265 (1997)).

Aplicou-se uma estratégia de dimerização do terminal C similar ao péptido mimético de TPO (TMP) (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). Verificou-se que o dimero ligado à terminação C (ligação C-C) de TMP tinha uma afinidade de ligação aumentada de 0,5 nM e uma actividade in vitro fortemente aumentada (CE50 = 0,1 nM) nos ensaios de proliferação das células (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). A estrutura deste dimero C-C de TMP está indicada a seguir:

O

h2n-iegptlrqwlaara-co-hn nh2

(SEQ ID NS. 2)

Num outro aspecto da presente invenção, os dímeros em tandem podem ainda ser ligados a uma ou mais partes que derivam de proteínas de imunoglobulina, referidas, de uma forma geral, como região Fc dessas imunoglobulinas. Os compostos resultantes são referidos como fusões de Fc dos dímeros em tandem de TMP. 6 A seguir dá-se uma breve descrição dos antecedentes relacionados com as regiões Fc de anticorpos que são úteis em ligação com alguns dos compostos presentes.

Os anticorpos compreendem duas partes independentes, sob o ponto de vista funcional, um dominio variável conhecido como "Fac", (Fab na terminologia inglesa) , que liga o antigénio e um dominio constante conhecido como "Fc", que providencia a ligação das funções efectoras, tais como, a fixação do complemento ou a fagocitose. A porção Fc de uma imunoglobulina tem um semi-periodo de vida no plasma longo, enquanto Fac tem um período de vida curto. (Capon, et al., Nature 337: 525-531 (1989)).

Os produtos terapêuticos de proteínas têm sido produzidos utilizando o domínio Fc para tentar dar um semi-periodo de vida mais longo ou para incorporar funções, tais como, a ligação do receptor de Fc, a ligação da proteína A, a fixação do complemento e a transferência placentária que residem todos na região Fc das imunoglobulinas (Capon, et al., Nature 337: 525-531 (1989)). Por exemplo, a região Fc de um anticorpo de IgGl tem sido fundida com CD30-L, uma molécula que liga os receptores de CD30 expressos em células de tumor da doença de Hodgkin, células anaplásicas de linfoma, células da leucemia das células T e outros tipos de células malignas. Ver, a patente de invenção norte-americana N°. 5.480.981. A IL-10, um agente anti-inflamatório e anti-rejeição, tem sido fundido com Fcy2a de murino, para aumentar o semi-periodo de vida da citocina, que é curto em circulação (Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 154: 5590-5600 (1995)). Alguns estudos têm também avaliado a utilização do receptor do factor de necrose do tumor ligado à proteína de Fc da IgGl humana para tratar pacientes com choque séptico (Fisher, C. et 7 al., N. Engl. J. Med., 334: 1697-1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221- 2230 (1996)). Fc também tem sido fundida com o receptor de CD4 para produzir uma proteína terapêutica para o tratamento da SIDA. Ver, Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989). Além disso, a interleucina 2 tem sido fundida com a porção Fc de IgGl ou de IgG3 para ultrapassar o curto semi-período de vida da interleucina 2 e a sua toxicidade sistémica. Ver, Harvill et al., Immunotechnology, 1: 95-105 (1995).

Apesar da disponibilidade de TPO e de FDCM, existe a necessidade de providenciar mais compostos que tenham uma actividade biológica de estimulação da produção de plaquetas (actividade trombopoiética) e/ou de células percursoras de plaquetas, especialmente, megacariócitos (actividade megacariopoiética). A presente invenção tem por objecto novos compostos que têm essas actividades e também os aspectos com eles relacionados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto um grupo de compostos que são capazes de se ligar a uma transmembrana e provocar um sinal da transmembrana através deles, isto é, são capazes de activar o receptor de c-Mpl, que é o mesmo receptor que medeia a actividade da trombopoietina (TPO) endógena. Assim, os compostos da presente invenção têm actividade trombopoiética, isto é, a capacidade de estimular, in vivo e in vitro, a produção de plaquetas e/ou a actividade megacariocitopoiética, isto é, a capacidade de estimular in vivo e in vitro, a produção de percursores de plaquetas.

Numa primeira modalidade preferida, os compostos da 8 presente invenção têm a estrutura geral que se segue: TMPi- (Li) n-TMP2 em que TMPj. e TMP2 se seleccionam, cada um, independentemente, a partir do grupo de compostos que compreendem a seguinte estrutura nuclear: X2-X3~X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0 r em que, X2 selecciona-se no grupo que consiste em Glu, Asp, Lis e Vai; X3 selecciona-se no grupo que consiste em Gli e Ala; X4 representa Pro; X5 selecciona-se no grupo que consiste em Tre e Ser; Χδ selecciona-se no grupo que consiste em Leu, Ile, Vai, Ala e Fen; X7 selecciona-se no grupo que consiste em Arg e Lis; X8 selecciona-se no grupo que consiste em Gin, Asn e Glu; X9 selecciona-se no grupo que consiste em Trp, Tir e Fen; X10 selecciona-se no grupo que consiste em Leu, Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis;

Li representa um ligante, tal como se aqui descrito; e n representa 0 ou 1; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico.

Num enquadramento, Li compreende (Gli)n, em que n representa de 1 a 20 e, quando n é maior do que 1, até metade dos resíduos de Gli podem ser substituídos por 9 outros aminoácidos seleccionados nos restantes 19 aminoácidos naturais ou nos seus estereoisómeros.

Para além da estrutura nuclear X2-X10 estabelecida antes para ΤΜΡχ e TMP2, são também possiveis outras estruturas relacionadas em que se adiciona à estrutura nuclear de TMPi e/ou de TMP2 um ou mais dos seguintes elementos: Χχ liga-se à terminação N e/ou Χχχ, Χχ2, Χχ3 e/ou Xi4 ligam-se à terminação C, em que os simbolos Χχ, X12, X13 e Χχ4 representam o seguinte:

Xl selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Ala, Vai , Leu, Ser e Arg; X11 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai , Leu, Fen, Ser, Tre, Lis, His e Glu; X12 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai , Leu, Fen, Gli, Ser e Gin; Xl3 selecciona-se no grupo que consiste em Arg, Lis, Tre , Vai, Asn, Gin e Gli; e Χχ4 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai , Leu, Fen, Tre, Arg, Glu e Gli.

Num segundo enquadramento preferido, os compostos da presente invenção têm a fórmula geral:

(Fc)m-(L2)g-ΤΜΡχ-(Lx)n-TMP2-(L3) r- (FC)P em que ΤΜΡχ, TMP2 e n têm os significados descritos antes; Lx, L2 e L3 são grupos ligantes, que se seleccionam, cada um, independentemente, nos grupos de ligantes descritos aqui; Fc representa uma região Fc de uma imunoglobulina (tal como se define a seguir) ; m, p, q e r seleccionam-se, cada um, independentemente, entre 0 a 1, em que pelo menos um de m ou p representa 1 e ainda em que, se 10 m representa 0 então q representa 0 e se p representa 0 então r representa 0; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico. Num enquadramento, Li, L2 e L3 compreendem, Independentemente, (Gli)n/ em que n representa de 1 a 20 e, quando n é maior do que 1, até metade dos residuos de Gli podem ser substituídos por outros aminoácidos seleccionados nos restantes 19 aminoácidos naturais ou nos seus estereoisómeros.

Os derivados dos compostos anteriores (descritos a seguir) também estão englobados na presente invenção.

Os compostos da presente invenção são preferencialmente péptidos e podem ser preparados por processos normalizados de síntese ou por quaisquer outros processos de preparação de péptidos. Os compostos da presente invenção que englobam porções não peptídicas podem ser sintetizados por reacções-padrão da química orgânica, para além das reacções-padrão da química de péptidos, quando for caso disso.

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados para fins terapêuticos ou profilácticos, por meio da sua incorporação com materiais veiculares apropriados e a administração de uma quantidade eficaz para um indivíduo, tal como um ser humano (ou outros mamíferos). Outros aspectos relacionados estão também incluídos na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Numerosos outros aspectos e vantagens da presente invenção serão por isso evidentes tendo em consideração a 11 descrição detalhada que se segue, sendo feito referência aos desenhos em que: A fig. 1 mostra exemplos de sequências de polinucleótidos e proteínas de Fc (a SEQ ID NO: 3 é a hélice de codificação que lê 5'-3', a SEQ ID NO: 4 é a hélice complementar que lê 3'-5'; e a SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos codificada) de IgGl humana que pode ser utilizada nos compostos de fusão de Fc da presente invenção. A fig. 2 mostra um esquema de síntese para a preparação do péptido 19 peguilado (SEQ ID NO:17). A fig. 3 mostra um esquema de síntese para a preparação do péptido 20 peguilado (SEQ ID NO:18). A fig. 4 mostra o número de plaquetas gerado in vivo em murganhos fêmeas normais BDFl tratados com 100 yg/kg de injecção em bólus de vários compostos, como se segue: PEG-MGDF significa PEG com um peso molecular médio de 20 kD ligado ao grupo amino do terminal N por aminação redutora dos aminoácidos 1-163 de TPO humana natural,

que é expressa em E. coli (ou seja não está glicosilado) (Ver WO 95/26746 intitulada "Composições e processos para estimula o crescimento e megacariócitos e a respectiva diferenciação"); TMP significa o composto com a sequência SEQ ID NO: 1; TMP-TMP significa o composto com a sequência SEQ ID NO: 21; PEG-TMP-TMP significa o composto com a sequência SEQ ID NO: 18, em que o grupo PEG é um PEG com um peso molecular médio de 5 kD ligado como se mostra na figura 3; TMP-TMP-Fc está definido aqui a seguir e Fc-TMP-TMP é igual a TMP-TMP-Fc excepto no facto de o grupo Fc estar ligado à extremidade do terminal N em vez da extremidade do terminal C do péptido TMP-TMP. 12 A fig. 5 mostra o número de plaquetas gerado in vivo em ratos normais BDF1 tratados com vários compostos libertados por via de bombas osmóticas implantadas durante um periodo de 7 dias. Os compostos são definidos da mesma maneira que foram definidos antes para a figura 4.

As figs. 6A, 6B e 6C mostram diagramas esquemáticos dos compostos preferidos da presente invenção. A fig. 6A mostra um composto de fusão de parte Fc no terminal N do dimero de TMP e em que a porção de Fc é uma forma monomérica (cadeia simples). A fig. 6B mostra um composto de fusão de Fc em que a região de Fc está fundida, no terminal N -do dimero de TMP e em que a porção de Fc é dimérica e um monómero de Fc está ligado a um dimero de TMP. A fig. 6C mostra um composto de fusão de Fc em que a parte de Fc está fundida com o terminal N do dimero de TMP e em que a porção de Fc é dimérica e cada monómero de Fc está ligado a um dimero de TMP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS ENQUADRAMENTOS PREFERIDOS

Num esforço para procurar estruturas pequenas como os compostos principais para o desenvolvimento de agentes terapêuticos com mais propriedades desejáveis, concebeu-se um tipo diferente de dimero de TMP e estruturas relacionadas em que o terminal C de um péptido de TMP foi ligado ao terminal N de um segundo péptido de TMP, quer directamente ou por via de um ligante e investigaram-se então os efeitos desta estratégia de dimerização na bioactividade das moléculas diméricas resultantes. Nalguns casos, estes chamados dimeros (ligação C-N) foram concebidos para ter ligantes entre os dois monómeros, sendo os ligantes preferencialmente compostos por aminoácidos 13 naturais, tornando assim a sua sintese acessível a tecnologias recombinantes. A presente invenção baseia-se na descoberta de um grupo de compostos que têm actividade trombopoiética e que se pensa que exercem a sua actividade por meio da ligação ao receptor endógeno de TPO, c-Mpl.

Compostos e derivados

Num primeiro enquadramento preferido, os compostos da presente invenção compreendem a seguinte estrutura geral: TMPi- (L!)n-TMP2 em que TMPi e TMP2 se seleccionam, cada um, independentemente, a partir do grupo de compostos que compreendem a seguinte estrutura nuclear: X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0 , em que, X2 selecciona-se no grupo que consiste em Glu, Asp, Lis e Vai; X3 selecciona-se no grupo que consiste em Gli e Ala; X4 representa Pro; X5 selecciona-se no grupo que consiste em Tre e Ser; Χδ selecciona-se no grupo que consiste em Leu, Ile, Vai, Ala e Fen; X7 selecciona-se no grupo que consiste em Arg e Lis; X$ selecciona-se no grupo que consiste em Gin, Asn e Glu; X9 selecciona-se no grupo que consiste em Trp, Tir e 14

Fen; Χίο selecciona-se no grupo que consiste em Leu, Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; L2 representa um ligante, tal como se descreve aqui; e n representa 0 ou 1; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico.

Num enquadramento, Li compreende (Gli)n, em que n representa de 1 a 20 e, quando n é maior do que 1, até metade dos residuos de Gli podem ser substituídos por outros aminoácidos seleccionados nos restantes 19 aminoácidos naturais ou nos seus estereoisómeros.

Para além da estrutura nuclear Χ2-Χιο, estabelecida antes para TMP2 e TMP2, são também possíveis outras estruturas relacionadas em que se adiciona à estrutura nuclear de TMPi e/ou de TMP2 um ou mais dos seguintes elementos: Xi liga-se à terminação N e/ou Xn, Χι2, X13 e/ou X14 ligam-se à terminação C, em que os símbolos Xi, Xi2, Xi3 e X14 representam o seguinte:

Xi selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Ala, Vai, Leu, Ser e Arg; X11 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai, Leu, Fen, Ser, Tre, Lis, His e Glu; Xi2 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai, Leu, Fen, Gli, Ser e Gin; X13 selecciona-se no grupo que consiste em Arg, Lis, Tre, Vai, Asn, Gin e Gli; e X14 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai, Leu, Fen, Tre, Arg, Glu e Gli. O termo "TMP" é utilizado para significar uma parte 15 constituída por, isto é, que compreende pelo menos até 9 subunidades (X2-Xio) , em que X2-Xio compreende a estrutura nuclear. As subunidades de X2-Xi4 são preferencialmente aminoácidos seleccionados, independentemente, entre os 20 aminoácidos de ocorrência natural, contudo, a presente invenção engloba os compostos em que X2-Xi4 se seleccionam, independentemente, no grupo de aminoácidos de ocorrência não natural, atípicos, bem conhecidos na técnica. Os aminoácidos específicos preferidos são identificados para cada posição. Por exemplo, o símbolo X2 pode representar Glu, Asp, Lis ou Vai. Utiliza-se aqui tanto as abreviaturas de três letras como as de única letra, para os aminoácidos; em cada caso, as abreviaturas são as que estão normalizadas e são utilizadas para os 20 aminoácidos de ocorrência natural ou as suas variações bem conhecidas. Estes aminoácidos podem ter uma estereoquímica L ou D (excepto para Gli, que nunca é nem L nem D) e as TMP podem compreender uma combinação das várias estereoquímicas. Contudo, a estereoquímica L é preferida para todos os aminoácidos na cadeia de TMP. A presente invenção também tem por objecto moléculas de TMP reversas, em que a sequência do terminal amino para o terminal carboxi dos aminoácidos é inversa. Por exemplo, o inverso de uma molécula que tem uma sequência normal Xi-X2-X3 seria X3-X2-Xi. A presente invenção também tem por objecto as moléculas de TMP retro-inversas em que, tal como a TMP inversa, a sequência do terminal amino para o terminal carboxi dos aminoácidos é inversa e os resíduos que são normalmente enantiómeros "L" em TMP, estão alterados para a forma de estereoisómeros "D".

Adicionalmente estão também englobados os sais das TMP, aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico. "Sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico" significa 16 quaisquer sais que são conhecidos ou que se descubra mais tarde que sejam aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Alguns exemplos preferidos específicos são: acetato, trifluoroacetato, cloridrato, bromidrato, sulfato, citrato, tartrato, glicolato, oxalato.

Também se considera que "derivados" de TMP podem ser substituídos pelas TMP descritas antes. Esses derivados de TMP incluem partes em que se fizeram uma ou mais das seguintes modificações: uma ou mais das ligações peptidilo [-C(0)NR-] foi substituída por uma ligação não peptidílica, tal como, uma ligação de -CH2-carbamato [-CH2-OC (O)NR-] ; uma ligação fosfonato; uma ligação -CH2-sulfonamida [-CH2-S(0)2NR-]; uma ligação ureia [-NHC(0)NH-]; uma ligação de -CH2-amina secundária; ou uma ligação de peptidilo alquilado [-C(0)NR6-] em que o símbolo R6 representa alquilo inferior; péptidos em que a terminação N está derivada originando -NRR1; um grupo -NRC(0)R; um grupo -NRC(0)0R; um grupo -NRS(0)2R; um grupo -NHC(0)NHR, em que R e R1 representam hidrogénio ou alquilo inferior, com a condição de que R e R1 não representem ambos hidrogénio; um grupo succinimida; um grupo benziloxi-carbonil-NH- (CBZ-NH-); ou um grupo benziloxicarbonil-NH-, comportando de 1 a 3 substituintes no anel de fenilo, seleccionados no grupo que consiste em alquilo inferior, alcoxi inferior, cloro ou bromo; e péptidos em que o terminal C livre deriva para -C(0)R2, em que R2 se selecciona no grupo que consiste em alcoxi inferior e -NR3R4, em que R3 e R4 se seleccionam, independentemente, no grupo que consiste em hidrogénio e alquilo inferior. Por "inferior", 17 entende-se um grupo comportando de 1 a 6 átomos de carbono.

Adicionalmente podem ser introduzidas modificações de aminoácidos individuais na molécula de TMP, por meio de uma reacção dirigida aos residuos de aminoácidos do péptido com um agente de derivação orgânico, que é capaz de reagir com as cadeias laterais seleccionadas ou com os residuos terminais. A seguir dão-se alguns exemplos: pode-se fazer reagir residuos de lisinilo e residuos do terminal amino com anidridos de ácido succinico ou de outros ácidos carboxilicos. A derivação com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos residuos de lisinilo. Outros reagentes apropriados para derivar residuos contendo alfa-amino incluem imido-ésteres, tais como, picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; hidreto de cloro e boro; ácido trinitrobenzeno-sulfónico; O-metil-iso-ureia; 2,4-pentanodiona; e uma reacção com glioxilato catalisada com transaminase.

Os residuos de arginilo podem ser modificados por uma reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e ninidrina. A derivação dos residuos de arginina requer que a reacção seja realizada em condições alcalinas, por causa do pKa elevado do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina, assim como, com o grupo guanidino de arginina.

Esta modificação especifica dos residuos de tirosilo per se, têm sido estudadas intensivamente, com particular interesse na introdução de marcadores espectrais nos 18 resíduos de tirosilo, por meio da reacção com compostos aromáticos de diazónio ou com tetranitrometano. Mais vulgarmente pode-se utilizar N-acetilimidizol e tetranitrometano para formar espécies de O-acetil-tirosilo e derivados de 3-nitro, respectivamente.

Os grupos laterais de carboxilo (aspartilo ou glutamilo) podem ser modificados selectivamente pela reacção com carbodi-imidas (R'-N=C=N-R'), tais como 1-ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodi-imida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodi-imida. Além disso, os resíduos de aspartilo e de glutamilo podem ser convertidos em resíduos de asparaginilo e glutaminilo por reacção com iões de amónio.

Os resíduos de glutaminilo e de asparaginilo são frequentemente desamidados para os correspondentes resíduos de glutamilo e aspartilo. Alternativamente, estes resíduos podem ser desamidados em condições ácidas moderadas. Qualquer uma das formas destes resíduos cai dentro do âmbito da presente invenção. A derivação com agentes bifuncionais é útil para a reticulação dos péptidos ou dos seus derivados funcionais com uma matriz de suporte insolúvel em água ou com outros veículos macromoleculares. Os agentes de reticulação que se utilizam normalmente incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazo-acetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxi-succinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azido-salicílico, imido-ésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de disuccinimidilo, tais como, 3,3'-ditiobis-(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Os agentes de derivação, tais como, metil-3-[(p-azidofenil)ditio]-propioimidato 19 originam produtos intermédios foto-activáveis, que são capazes de formar reticulações na presença da luz. Alternativamente, as matrizes reactivas insolúveis em água, tais como hidratos de carbono activados por brometo de cianogénio e os substratos reactivos descritos nas patentes de invenção norte-americanas N°s. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440,podem ser utilizados para a imobilização da proteina.

Outras modificações possiveis incluem a hidroxilação de prolina e lisina, a fosforilação de grupos hidroxilo de residuos de serilo ou de trionilo, a oxidação do átomo de enxofre em Cis, a metilação das cadeias laterais dos grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co. , San Francisco, p. 79-86 (1983)), a acetilação da amina de terminal N e, nalguns casos, a amidação dos grupos carboxilo do terminal C.

Essas partes derivadas melhoram preferencialmente uma ou mais características incluindo a actividade trombopoiética, a solubilidade, a absorção, o semi-periodo de vida biológico e similares dos compostos da presente invenção. Alternativamente, as partes derivadas resultam em compostos que têm as mesmas ou praticamente as mesmas caracteristicas e/ou propriedades do composto que não é derivado. As partes podem, alternativamente, eliminar ou atenuar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis dos compostos e similares.

Para além da estrutura nuclear indicada antes, X2-X10, outras estruturas que são especificamente contempladas, são aquelas em que um ou mais dos grupos adicionais X estão ligados à estrutura nuclear. Assim, Xi e/ou Xn, X12, X13 e 20

Xi4 podem estar ligado à estrutura nuclear. Alguns exemplos adicionais de estruturas são os seguintes: X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11; X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12; X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13; X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14; X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio; X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11; X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12;

Xl_X2_X3-X4-X5-X6_X7_X8_X9_Xl0-Xll_Xl2_Xl3 /

Xl_X2_X3-X4-X5-X6_X7_X8_X9_Xl0-Xll_Xl2_Xl3-Xl4 i' em que Xi a X14 têm os significados definidos antes. Cada um dos ΤΜΡχ e de TMP2 podem ser iguais ou diferentes na sua sequência e/ou no seu comprimento. Nalguns dos enquadramentos preferidos, TMPi e TMP2 são iguais.

Um TMP particularmente preferido é o seguinte:

Ile-Glu-Gli-Pro-Tre-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID N°. 1).

Tal como se utiliza aqui, "compreende" significa, inter alia, que um composto pode incluir aminoácidos adicionais em cada um ou em ambos os terminais C de uma dada sequência. Contudo, desde que esteja presente uma estrutura, tal como X2 a X10, Xi a X14 ou uma das outras estruturas presentes, de que se deu exemplo, a estrutura quimica remanescente é relativamente menos importante. Obviamente, qualquer estrutura fora da estrutura nuclear X2 a X10 ou da estrutura Xi a X14, não deve interferir significativamente com a actividade trombopoiética do composto. Por exemplo, um resíduo de Met de um terminal N é 21 encarado como caindo dentro do âmbito da presente invenção. Adicionalmente, embora muitos dos compostos preferidos da presente invenção sejam dimeros em tandem e por isso possuem duas partes de TMP, outros compostos da presente invenção são multimeros em tandem dos TMP, isto é, compostos com as estruturas seguintes que se exemplificam: TMPi-L-TMP2-L-TMP3; TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4; TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5; em que TMPi, TMP2, TMP3, TMP4 e TMP5 podem ter estruturas iguais ou diferentes e em que cada TMP e L têm os significados definidos antes e em que os ligantes são opcionais. Preferencialmente, os compostos da presente invenção terão de 2-5 partes de TMP, particularmente, preferencialmente, 2-3 e, mais preferencialmente, 2. Os compostos do primeiro enquadramento da presente invenção terão, preferencialmente, menos do que cerca de 60, mais preferencialmente, menos do que cerca de 40 aminoácidos no total (isto é, serão péptidos).

Tal como se fez notar antes, os compostos do primeiro enquadramento da presente invenção são preferencialmente dimeros de TMP, que ou estão directamente ligados ou são ligados por um grupo ligante. As partes de TMP monoméricas estão indicadas na orientação convencional a partir da leitura da terminação de N para C, da esquerda para a direita. De acordo com isto, pode-se ver que os compostos da presente invenção estão todos orientados de tal modo que a terminação C de TMPi está ligada quer directamente ou através de um ligante à terminação N de TMP2. Esta orientação é referida como uma orientação em tandem e os compostos da presente invenção podem ser, de uma forma 22 genérica, referidos como "dímeros em tandem". Estes compostos são referidos como dimeros mesmo se TMPi e TMP2 forem estruturalmente distintos. Isto é, consideram-se tanto os homodimeros como os heterodimeros. 0 grupo "ligante" ("Li") é opcional. Quando está presente, não é critico que a sua estrutura química esteja, dado que serve basicamente como espaçador. 0 ligante deve ser escolhido de modo a não interferir com a actividade biológica do composto final e também de tal modo que a imunogenicidade do composto final não esteja significativamente aumentada. 0 ligante é preferencialmente constituído por aminoácidos ligados em conjunto por ligações peptídicas. Assim, em enquadramentos preferidos, o ligante compreende Yn, em que o símbolo Y representa um aminoácido de ocorrência natural ou um seu estereoisómero e "n" representa qualquer número de 1 a 20. 0 ligante é por isso constituído por 1 a 20 aminoácidos ligados por ligações peptídicas, em que os aminoácidos se seleccionam entre os 20 aminoácidos de ocorrência natural. Num enquadramento mais preferido, os 1 a 20 aminoácidos seleccionam-se entre Gli, Ala, Pro, Asn, Gin, Cis, Lis. Ainda mais preferencialmente, o ligante é constituído por uma maioria de aminoácidos que estão estericamente não ligados, tais como, Gli, Gli-Gli [(Gli)2], Gli-Gli-Gli [(Gli)3 ] ... (Gli)20r Ala, Gli-Ala, Ala-Gli, Ala-Ala, etc.

Outros exemplos específicos de ligantes são: (Gli)3Lis(Gli)4 (SEQ ID N°. 6); (Gli) 3AsnGliSer(Gli)2 (SEQ ID N°. 7) (esta estrutura providencia um sítio para a glicosilação, quando é produzida recombinantemente num sistema de células de mamíferos, que é capaz de glicosilar esses sítios); 23 (Gli)3Cis(Gli)4 (SEQ ID N°. 8); e

GliProAsnGli (SEQ ID N° . 9).

Para explicar a nomenclatura anterior, por exemplo, (Gli)3Lis(Gli) 4, significa Gli-Gli-Gli-Lis-Gli-Gli-Gli-Gli. As combinações de Gli e Ala são também preferidas. São possíveis ligantes não peptídicos. Por exemplo, ligantes de alquilo, tal como, -HN- (CH2) S-C0-, em que o símbolo s = 2-20. Estes ligantes alquílicos podem ainda ser substituídos por qualquer grupo de ligação não estérica, tais como, alquilo inferior (por exemplo, Οχ-Οε) , acilo inferior, halogéneo (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc.

Outro tipo de ligante não peptídico é um grupo de polietileno-glicol, tal como: -HN-CH2-CH2- (O-CH2-CH2) n-0-CH2-CO-em que n tem um valor tal que o peso molecular global do ligante varia entre, aproximadamente, 101 e 5.000, preferencialmente, 101 e 500.

Em geral, verificou-se que um ligante com um comprimento de cerca de 0-14 subunidades (por exemplo, aminoácidos) é preferido para os compostos trombopoiéticos do primeiro enquadramento da presente invenção.

Os ligantes de péptidos podem ser alterados para formar derivados da mesma forma que se descreveu antes para os TMP.

Os compostos deste primeiro grupo podem ainda ser 24 lineares ou cíclicos. Por "cíclico", entende-se que pelo menos duas porções separadas, isto é, não contíguas da molécula estão ligadas uma à outra. Por exemplo, as terminações amino e carboxi das extremidades da molécula podem estar ligadas covalentemente para formar uma molécula cíclica. Alternativamente, a molécula pode conter dois ou mais resíduos de Cis (por exemplo, no ligante) , que podem ciclizar por via da formação de uma ligação de di-sulfureto. Considera-se ainda que mais do que um dímero de péptido em tandem pode ligar-se para formar um dímero de dímeros. Assim, por exemplo, um dímero em tandem contendo um resíduo de Cis pode formar uma ligação inter-molecular de di-sulfureto com um Cis de outro desses dímeros. Ver, por exemplo, o composto da SEQ ID N°: 20 a seguir.

Os compostos da presente invenção podem também estar associados covalentemente ou de uma forma não covalente com uma molécula veicular, tal como um polímero linear (por exemplo, polietileno-glicol, polilisina, dextrano, etc.), um polímero de cadeia ramificada (ver, por exemplo, a patente de invenção norte-americana N°. 4.289.872 para Denkenwalter et al., publicada em 15 de Setembro de 1981; patente de invenção norte-americana N°. 5.229.490 para Tam, publicada em 20 de Julho de 1993; a patente WO 93/21259 para Frechet et al., publicada em 28 de Outubro de 1993); um lípido; um grupo colesterol (tal como um esteróide); ou um hidrato de carbono ou um oligossacárido. Outros veículos possíveis incluem um ou mais polímeros solúveis em água, tais como, polioxietileno-glicol ou polipropileno-glicol, conforme descrito nas patentes de invenção norte-americanas N°s. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 e 4.179.337. Ainda outros polímeros úteis, conhecidos na técnica, incluem monometoxi-polietileno-glicol, dextrano, celulose ou outros polímeros à base de hidratos de carbono, 25 poli-(N-vinil-pirrolidona)-polietileno-glicol, homo-polímeros de propileno-glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool de polivinilo, assim como misturas destes polimeros.

Um desses veiculos preferidos é o polietileno-glicol (PEG). 0 grupo PEG pode ter qualquer peso molecular conveniente e pode ser de cadeia linear ou ramificada. 0 peso molecular médio do PEG variará, preferencialmente, entre cerca de 2 kDa até cerca de 100 kDa, mais preferencialmente, entre cerca de 5 kDa até cerca de 50 kDa e, ainda mais preferencialmente, entre cerca de 5 kDa até cerca de 10 kDa.

Os grupos de PEG estão geralmente ligados aos compostos da presente invenção por via de acilação, alquilação redutora, adição de Michael, alquilação de tiol ou outros processos de conjugação/ligação quimio-selectivos através de um grupo reactivo na parte de PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, a-halogeno-acetilo, maleimido ou hidrazino) com um grupo reactivo no composto alvo (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, a-halogeno-acetilo, maleimido ou hidrazino).

Os grupos de hidrato de carbono (oligossacárido) podem estar ligados aos sítios de uma forma conveniente, sítios esses que são conhecidos por serem sítios de glicosilação em proteínas. Geralmente, os oligossacáridos ligados a O, estão ligados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Tre), enquanto os oligossacáridos ligados a N, estão ligados aos resíduos de asparagina (Asn) quando fazem parte da sequência Asn-X-Ser/Tre, em que o símbolo X pode representar qualquer aminoácido excepto prolina. O símbolo 26 X representa, preferencialmente, um dos 19 aminoácidos de ocorrência natural não contando com a prolina. As estruturas de oligossacáridos ligadas a N e ligadas a 0 e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que normalmente se encontra em ambos é o ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico). 0 ácido siálico é normalmente o resíduo terminal tanto dos oligossacáridos ligados a N como os ligados a 0 e, em virtude da sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas ao composto glicosilado. Esses sitios podem estar incorporados no ligante dos compostos da presente invenção e são, preferencialmente, glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos de polipéptidos (por exemplo, em células de mamíferos, tais como, OHC, BHK, COS). Contudo, esses sítios podem ainda ser glicosilados por processos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na técnica. A seguir mostram-se alguns exemplos de péptidos da presente invenção. Utilizam-se abreviaturas dos aminoácidos por uma única letra e o ligante é mostrado separadamente por traços de união para maior clareza. Abreviaturas adicionais: BrAc significa bromoacetilo (BrCH2C (0) ) e PEG significa polietileno-glicol. IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 10) IEGPTLRQCLAARA—GGGGGGGG—IEGPTLRQCLAARA (ciclico) I I (SEQ ID Ne . 11) 1_1 IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ ID N° . 12) IEG PT LRQALAARA- GGGGGGGG -1EG PT LRQALAARA (SEQ ID N° . 13) IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 14) IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 15) IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 16) IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 17) IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 18) IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 19) 27

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

I (SEQ ID N2. 20)

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA IEGPTLROWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N°. 21)

Em cada um dos compostos anteriores, um Met de terminal N (ou resíduo M, utilizando o código de uma letra), está também contemplado. Os multímeros (por exemplo, ligados covalentemente ou não covalentemente em tandem ou sem ser em tandem) dos compostos anteriores estão também contemplados.

Num segundo enquadramento da presente invenção, os compostos descritos antes podem ainda estar fundidos com um ou mais grupos Fc, quer directamente ou através de grupos ligantes. Em geral, a fórmula deste segundo grupo de compostos é a seguinte: (Fc)m- (L2)q-TMPi- (L!)n-TMP2- (L3)r- (FC) p em que TMPi, TMP2 e n têm os significados descritos antes; Li, L2 e L3 são grupos ligantes, que se seleccionam, cada um, independentemente, no grupo de ligantes descrito antes; Fc representa uma região Fc de uma imunoglobulina; os símbolos m, p, q e r seleccionam-se, cada um, independentemente, entre 0 a 1, em que pelo menos um de m ou p representa 1 e ainda em que se m representa 0 então q representa 0 e se p representa 0 então r representa 0; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico.

De acordo com isto, os compostos deste segundo grupo têm estruturas conforme definido para o primeiro grupo de compostos que foram descritos antes, mas estes compostos estão ainda fundidos com pelo menos um grupo Fc quer directamente ou através de um ou mais grupos de ligantes. 28 A sequência de Fc dos compostos anteriores pode ser seleccionada na cadeia pesada da imunoglobulina humana IgGl, ver Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982) ou em qualquer outra sequência de Fc conhecida na técnica (por exemplo, outras classes de IgG incluindo, mas não se limitando a IgG-2, IgG-3 e IgG-4 ou outras imunoglobulinas). É bem sabido que as regiões Fc de anticorpos são constituídas por segmentos de polipéptidos monoméricos, que podem estar ligados em formas diméricas ou multiméricas por ligações de di-sulfureto ou por uma associação não covalente. O número de ligações intermoleculares de di-sulfureto entre as subunidades monoméricas das moléculas originais de Fc varia de 1 a 4, consoante a classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasses (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2) do anticorpo envolvido. O termo "Fc", tal como utilizado aqui, é genérico para as formas monoméricas, diméricas e multiméricas das moléculas de Fc. Deve notar-se que os monómeros de Fc vão dimerizar espontaneamente quando os residuos apropriados de Cis estão presentes, a menos que existam também condições particulares que evitem a dimerização através da formação de ligações de di-sulfureto. Mesmo se se eliminarem os residuos de Cis que normalmente formam as ligações de di-sulfureto no dimero de Fc ou se as substituirmos por outros residuos, as cadeias monoméricas vão geralmente dimerizar através de interacções não covalentes. O termo "Fc" utilizado aqui significa qualquer uma das seguintes formas: monómero original, dimero original (ligado por uma ligação di-sulfureto), dimeros modificados (ligados por di-sulfuretos e/ou ligados de uma forma não covalente) e monómeros modificados (isto é, derivados). 29

Podem produzir-se variantes, análogos ou derivados da porção de Fc, por exemplo, fazendo várias substituições de residuos ou de sequências.

As variáveis de polipéptidos (ou análogos) incluem variantes de inserção, em que um ou mais residuos de aminoácidos complementam uma sequência de aminoácido de Fc. As inserções podem estar localizadas em qualquer um ou em ambos os terminais da proteina ou podem estar posicionadas dentro de regiões internas da sequência de aminoácidos de Fc. As variantes insercionais com residuos adicionais em qualquer um ou em ambos os terminais podem incluir, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas que incluem marcadores de aminoácidos. Por exemplo, a molécula de Fc pode eventualmente conter um Met do terminal N, especialmente quando a molécula é expressa de forma recombinante numa célula bacteriana, tal como de E. Coli.

Nas variantes de eliminação de Fc, elimina-se um ou mais resíduos de aminoácidos num polipéptido de Fc. As eliminações podem ser efectuadas numa extremidade ou em ambas do polipéptido de Fc ou com a eliminação de um ou mais resíduos dentro da sequência de aminoácidos de Fc. As variantes de eliminação, por isso, incluem todos os fragmentos de uma sequência de polipéptidos de Fc.

Nas variações de substituição de Fc, elimina-se um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipéptido de Fc e substitui-se por resíduos alternativos. Num aspecto, as substituições são conservadoras na natureza, contudo, a presente invenção engloba substituições que não são conservadoras.

Por exemplo, os resíduos de cisterna podem ser 30 eliminados ou substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de algumas ou de todas as reticulações de di-sulfureto das sequências de Fc. Em particular, os aminoácidos nas posições 7 e 10 da SEQ ID N°: 5 são resíduos de cisteína. Pode-se eliminar cada um destes resíduos de cisteína ou substituir um ou mais destes resíduos de cisteína com outros aminoácidos, tal como Ala ou Ser. Como outro exemplo, podem também fazer-se modificações para introduzir substituições de aminoácidos com (1) eliminação do sítio de ligação do receptor de Fc; (2) eliminação do sítio da ligação do complemento (Clq); e/ou (3) eliminação do sítio da toxicidade mediada pela célula dependente do anticorpo (CCDA). Esses sítios são conhecidos na técnica e quaisquer substituições conhecidas estão dentro do âmbito da Fc, tal como se utiliza aqui. Por exemplo, ver Molecular Immunology, Vol. 29, N°. 5, 633-639 (1992), no que respeita aos sítios de CCDA na IgGl.

Do mesmo modo, pode substituir-se um ou mais resíduos de tirosina por resíduos de fenilalanina. Além disso, outras variantes de inserções, eliminações (por exemplo, 1-25 aminoácidos) e/ou substituições de aminoácidos, estão também contempladas e estão dentro do âmbito da presente invenção. As substituições conservadoras de aminoácidos serão geralmente as preferidas. Além disso, as alterações podem ser sob a forma de aminoácidos alterados, tal como, ácidos peptidomiméticos ou de aminoácidos D.

As sequências de Fc do composto TMP podem também ser derivadas, isto é, podem comportar modificações diferentes da inserção, eliminação ou substituição de resíduos de aminoácidos. Preferencialmente, as modificações são covalentes na sua natureza e incluem, por exemplo, ligação química com polímeros, lípidos e outras partes orgânicas e 31 inorgânicas. Os derivados da presente invenção podem ser preparados para aumentar o semi-periodo de vida em circulação ou podem ser preparados para aumentar a capacidade do polipéptido atingir as células, tecidos ou órgãos desejados. É também possível utilizar o domínio de ligação do receptor recuperável da molécula de Fc intacta como a parte de Fc dos compostos da presente invenção, tal como descrito na patente WO 96/32478, intitulada "Altered Polypeptides with Increased Half-Life". Outros membros da classe das moléculas designadas aqui como Fc são aqueles que estão descritos na patente WO 97/34631, intitulada "Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives". Ambos os pedidos de patentes de invenção PCT publicados e citados neste parágrafo são aqui incorporados como referência.

As fusões de Fc podem ser na terminação N ou C de ΤΜΡχ ou de TMP2 ou em ambas as terminações N e C dos TMP. Verificou-se, surpreendentemente, que os péptidos em que a parte de Fc está ligada à terminação N do grupo TMP é mais bioactiva do que outras possibilidades, por isso, a fusão que tem um domínio de Fc na terminação N de TMPi (isto é, r e p representam ambos 0 e m e q representam ambos uma fórmula geral), são as preferidas. Quando a cadeia de Fc está fundida na terminação N do TMP ou do ligante, essa fusão normalmente vai ocorrer na terminação C da cadeia de Fc e vice-versa.

Também são preferidos os compostos que são dímeros (por exemplo, em tandem e sem ser em tandem) dos compostos estabelecidos na fórmula geral indicada antes. Nesses casos, cada cadeia de Fc estará ligada a um dímero em 32 tandem dos péptidos TMP. Um exemplo esquemático de um desses compostos está indicado na figura 6C. Um exemplo preferido deste tipo de composto baseia-se na figura 6C, em que Fc representa um dimero do composto da SEQ ID N° : 5, cada L2 representa (Gli)5, TMPi e TMP2 são cada um deles compostos da SEQ ID N°: 1 e cada L2 representa (Gli)8. Este composto é também referido aqui como "Fc-TMPi-L-TMP2". Está também representado como um dimero (através da porção de Fc) da SEQ ID N°: 34. 0 composto análogo em que o grupo Fc está ligado através de um ligante à terminação C dos grupos TMP2 na figura 6C, está também contemplado e é aqui referido como TMPi-L-TMP2-Fc . A seguir dão-se alguns exemplos específicos de compostos do segundo grupo:

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 22) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID N° . 23) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID N° . 24) Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 25) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 26) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) (SEQ ID N° . 27)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (1inear) (SEQ ID N° . 28) Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID N° . 29) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 30) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 31) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 32) Fc—IEGPTLRQWLAARA—GGGCGGGG—IEGPTLRQWLAARA I 1 Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N2. 33) Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 34)

Em cada um dos compostos anteriores, considera-se também mais um Met de terminal N (ou um resíduo M, 33 utilizando o código de uma letra) . 0 residuo de Met pode ligar-se na terminação N do grupo Fc, nos casos em que há um grupo Fc ligado à terminação N do TMP. Nesses casos, quando o grupo Fc está ligado à terminação C do TMP, os resíduos de Met podem estar ligados à terminação N do grupo TMP.

Em cada um dos casos anteriores, Fc é preferencialmente a região Fc da cadeia pesada da imunoglobulina humana IgGl ou de um seu fragmento, derivado ou dímero, activos sob o ponto de vista biológico, ver Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982) . A sequência de Fc mostrada na SEQ ID N°: 5 é a Fc mais preferida para os compostos anteriores. Também são preferidos os compostos anteriores nos quais a Fc é uma forma dimérica da sequência da SEQ ID N°: 5 e cada cadeia de Fc está ligada a um dímero em tandem de TMP.

Adicionalmente, embora muitos dos compostos preferidos do segundo enquadramento incluam um ou mais dímeros em tandem, em que possuem duas partes de TMP ligadas, outros compostos da presente invenção incluem multímeros em tandem dos TMP, isto é, compostos com, por exemplo, as seguintes estruturas:

Fc-TMP!-L-TMP2-L-TMP3;

Fc-TMPi-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4 ; Fc-TMPi-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5 ; TMPi-L-TMP2-L-TMP3-L-Fc; TMPi-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-Fc; TMPi-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5-L-Fc; em que ΤΜΡ4, ΤΜΡ2, ΤΜΡ3, TMP4 e TMP5 podem ter estruturas iguais ou diferentes e em que Fc e cada TMP e L têm os 34 significados definidos antes e cada um dos ligantes é opcional. No caso anterior, o grupo Fc pode ser monomérico ou dimérico e nos casos em que Fc é dimérica, um ou mais multimeros de TMP podem estar ligados a cada uma das cadeias de Fc. Também se consideram outros exemplos em que os dimeros ou os multimeros de TMP estão ligados tanto às terminações N como C de uma ou de ambas as cadeias de Fc, incluindo o caso em que os dimeros ou os multimeros de TMP estão ligados aos quatro terminais das duas cadeias de Fc.

Preferencialmente, os compostos deste segundo enquadramento da presente invenção terão cerca de 200 a 400 aminoácidos no total (isto é, serão polipéptidos).

Processos de produção

Os compostos da presente invenção podem ser produzidos de uma variedade de maneiras. Dado que muitos dos compostos serão péptidos ou irão incluir um péptido, terão aqui particular relevância os processos para a sintese de péptidos. Por exemplo, podem utilizar-se técnicas de sintese em fase sólida. As técnicas apropriadas são bem conhecidas da técnica e incluem as descritas em Merrifield, em Chem. Polypeptides, p. 335-61 (Katsoyannis e Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl. 10:394-414 (1985); Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); patente de invenção norte-americana N°. 3.941.763; Finn et al., The Proteins, 3a. ed., vol. 2, p. 105-253 (1976); e Erickson et al., The Proteins, 3a. ed., vol. 2, p. 257-527 (1976). A sintese em fase sólida é a técnica preferida para a produção de péptidos individuais, dado que é o processo com a melhor relação custo/eficácia para a produção de péptidos pequenos. 35

Os péptidos também podem ser produzidos em células hospedeiras transformadas, utilizando técnicas de ADN recombinante. Para se realizar isto, prepara-se uma molécula de ADN recombinante que codifique para o péptido. Os processos de preparação dessas moléculas de ADN e/ou de ARN, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as sequências que codificam para os péptidos podem ser excisadas do ADN utilizando enzimas de restrição apropriadas. As sequências relevantes podem ser criadas utilizando a reacção em cadeia de polimerase (RCP) com a inclusão de sitios de restrição úteis para a subsequente clonagem. Alternativamente, a molécula de ADN/ARN pode ser sintetizada utilizando técnicas de sintese quimica, tal como o processo de fosforamidite. Também se pode utilizar uma combinação destas técnicas. A presente invenção também inclui um vector que codifica os péptidos num hospedeiro apropriado. 0 vector compreende a molécula de ADN que codifica os péptidos operacionalmente ligados às sequências de controlo de expressão apropriadas. Os processos para efectuar esta ligação operacional, quer antes ou depois da molécula de ADN que codifica o péptido ter sido inserida no vector, são bem conhecidos. As sequências de controlo de expressão incluem promotores, activadores, melhoradores, operadores, sitios de ligação do ribossoma, sinais de partida, sinais de paragem, sinais de cobertura, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos no controlo da transcrição ou da tradução. 0 vector resultante que compreende a molécula de ADN que codifica o péptido é utilizado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada utilizando processos bem conhecidos na técnica. 36

Pode-se utilizar, na prática da presente invenção, qualquer uma de um grande número de células hospedeiras disponiveis e bem conhecidas. A selecção de um hospedeiro particular depende de um certo número de factores reconhecidos pela técnica. Estes factores incluem, por exemplo, a compatibilidade com o vector de expressão escolhido, a toxicidade em relação à célula hospedeira dos péptidos codificados pela molécula de ADN, a taxa de transformação, a facilidade de recuperação dos péptidos, as caracteristicas de expressão, a bio-segurança e os custos. Deve-se fazer um balanço entre estes factores com a certeza de que nem todos os hospedeiros podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma sequência particular de ADN.

Dentro destas linhas gerais de orientação, os hospedeiros microbianos úteis incluem bactérias (tal como, E. coli), leveduras (tais como, Saccharomyces sp. e Pichia pastoris) e outros fungos, células de insectos, de plantas, de mamiferos (incluindo de seres humanos) em cultura ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.

Em seguida, o hospedeiro transformado é posto em cultura em condições convencionais de fermentação para que os péptidos desejados sejam expressos. Essas condições de fermentação são bem conhecidas na técnica.

Finalmente, os péptidos são purificados a partir da cultura de fermentação ou a partir das células hospedeiras em que estão expressos. Estes processos de purificação são bem conhecidos da técnica.

Os compostos que contêm péptidos derivados ou que contêm grupos não peptídicos podem ser sintetizados por 37 técnicas da química orgânica bem conhecidas.

Utilizações dos compostos

Os compostos da presente invenção têm a capacidade de se ligar e de activar o receptor de c-Mpl e/ou têm a capacidade de estimular a produção (tanto in vivo como in vitro) de plaquetas ("actividade trombopoiética") e percursores de plaquetas ("actividade megacariocito-poiética") . Para medir as actividades destes compostos, podem utilizar-se ensaios padrão, tais como os descritos na patente WO 95/26746 intitulada "Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation". Na secção de exemplos da presente descrição descrevem-se melhor os ensaios in vivo.

Os estados clínicos a serem tratados pelos processos e pelas composições da presente invenção são geralmente aqueles que envolvem a existência de uma deficiência de megacariócitos/plaquetas ou em que se espera ou antecipa uma deficiência dos megacariócitos/plaquetas no futuro (por exemplo, por causa de uma cirurgia planeada ou de uma doação de plaquetas). Essas condições podem ser o resultado de uma deficiência (temporária ou permanente) do ligando activo de Mpl in vivo. 0 termo genérico para a deficiência de plaquetas é trombocitopénia e por isso os processos e as composições da presente invenção estão geralmente disponíveis para o tratamento profilático ou terapêutico de trombocitopénia em pacientes que deles necessitam. A Organização Mundial de Saúde tem classificado o grau de trombocitopénia como o número de plaquetas em circulação no indivíduo (Miller, et al., Câncer 47: 210- 211 (1981)). Por exemplo, um indivíduo que não apresenta sinais de 38 trombocitopénia (grau 0) terá, geralmente, pelo menos 100.000 plaquetas/mm3. Uma trombocitopénia ligeira (grau 1) indica um nível de plaquetas em circulação entre 79.000 e 99.000/mm3. Uma trombocitopénia moderada (grau 2) mostra entre 50 000 e 74 000 plaquetas/mm3 e uma trombocitopénia severa é caracterizada por entre 25 000 e 49 000 plaquetas/mm3. A trombocitopénia debilitante ou que ameaça a vida é caracterizada por uma concentração de plaquetas em circulação inferior a 25 000/mm3. A trombocitopénia (deficiência de plaquetas) pode estar presente por várias razões, incluindo quimioterapia e outras terapias com uma variedade de fármacos, terapia de radiação, cirurgia, perda sanguínea acidental e outras condições específicas de doença. Exemplos específicos de condições de doença que envolvem trombocitopénia e podem ser tratadas de acordo com a presente invenção são: anemia aplásica; trombocitopénia idiopática ou imune (TPI), incluindo a púrpura trombocitopénica idiopática associada com o cancro da mama; TPI associado com VIH e púrpura trombocitopénica trombótica relacionada com VIH; tumores metastásicos que resultam em trombocitopénia; lúpus eritematoso sistémico; incluindo esplenomegalia da síndrome do lúpus neo-natal; síndrome de Fanconi; deficiência em vitamina B12; deficiência em ácido fólico; anomalia de May-Hegglin; síndrome de Wiskott-Aldrich; doença crónica do fígado; síndrome mielodisplásica associada com trombocitopénia; hemoglobinúria nocturna paroxismal; trombocitopénia profunda aguda no seguimento de terapia com C7E3 Fab (Abciximab); trombo-citopénia alo-imune, incluindo trombocitopénia alo-imune materna; trombocitopénia associada com anticorpos anti-fosfolípidos e trombose; trombocitopénia auto-imune; trombocitopénia imune induzida por fármacos, incluindo trombocitopénia induzida por 39 carboplatina, trombocitopénia induzida por heparina; trombocitopénia fetal; trombocitopénia gestacional; sindrome de Hughes; trombocitopénia lupóide; perda de sangue acidental e/ou massiva; distúrbios mielo-proliferativos; trombocitopénia em pacientes com doenças malignas; púrpura trombocitopénica trombótica, incluindo microangiopatia trombótica que se manifesta como púrpura trombocitopénica trombótica/síndrome urémica hemolitica em doentes com cancro; anemia hemolitica auto-imune; perfuração do diverticulo jejunal oculto; aplasia pura dos glóbulos vermelhos do sangue; trombocitopénia auto-imune; nefropatia epidémica; insuficiência renal aguda associada à rifampicina; trombocitopénia de Paris-Trousseau; trombo-citopénia alo-imune neo-natal; hemoglobinúria nocturna paroxismal; alterações hematológicas em cancro do estômago; síndromes urémicas hemoliticas na infância; manifestações hematológicas relacionadas com uma infecção virai incluindo hepatite do vírus A e trombocitopénia associada ao CMV. Do mesmo modo, alguns tratamentos para a SIDA resultam em trombocitopénia (por exemplo, AZT) . Certos distúrbios de cura de feridas podem também beneficiar de um aumento no número de plaquetas.

No que respeita a deficiências de plaquetas antecipadas, por exemplo, devidas a uma cirurgia futura, pode-se administrar um composto da presente invenção alguns dias ou algumas horas antes da necessidade das plaquetas. No que respeita a situações agudas, por exemplo, perda de sangue acidental ou massiva, pode-se adicionar um composto da presente invenção em conjunto com sangue ou plaquetas purificadas.

Os compostos da presente invenção podem também ser úteis na estimulação de certos tipos de células diferentes 40 dos megacariócitos se se verificar que essas células expressam o receptor de Mpl. Os estados clinicos associados a essas células que expressam o receptor de Mpl, que são responsáveis pela estimulação pelo ligando de Mpl, estão também dentro do âmbito da presente invenção.

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados em qualquer situação em que a produção de plaquetas ou de células percursoras de plaquetas é desejável ou em que se deseja a estimulação do receptor de c-Mpl. Assim, por exemplo, os compostos da presente invenção, podem ser utilizados para tratar qualquer estado clinico num mamifero, em que há uma necessidade de plaquetas, megacariócitos e similares. Esses estados clinicos estão descritos com detalhe nas fontes seguintes, que se dão como exemplo: patentes WO 95/26746; WO 95/21919; WO 95/18858; WO 95/21920 e que se incorporam aqui.

Os compostos da presente invenção podem também ser úteis na manutenção da viabilidade ou no tempo de armazenagem de plaquetas e/ou megacariócitos e células relacionadas. De acordo com isto, poderá ser útil incluir uma quantidade efectiva de um ou mais desses compostos numa composição que contenha essas células.

Por "mamifero", entende-se qualquer mamifero, incluindo seres humanos, animais domésticos, incluindo cães e gatos; animais exóticos e/ou de jardim zoológico, incluindo macacos; animais de laboratório, incluindo ratos, murganhos e cobaias; animais de quinta, incluindo cavalos, gado, ovelhas, cabras e porcos; e similares. O mamifero preferido é o ser humano. 41

Composições farmacêuticas A presente invenção também tem por objecto processos de utilização de composições farmacêuticas dos compostos da presente invenção. Essas composições farmacêuticas podem ser para administração por injecção ou para administração oral, nasal, transdérmica ou por outras formas de administração, incluindo, por exemplo, por via de injecção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitonial, intratecal, intraocular, retrobulbar, intrapulmonar (por exemplo, fármacos em forma de aerossol) ou subcutânea (incluindo a administração de depósitos para a libertação a longo prazo); por via sublingual, anal, vaginal ou por implantação cirúrgica, por exemplo, embebida numa cápsula esplénica, no cérebro ou na córnea. 0 tratamento pode consistir numa dose única ou em várias doses ao longo de um certo período de tempo. Em geral, estão compreendidas na presente invenção as composições farmacêuticas que compreendem quantidades efectivas de um composto da presente invenção, em conjunto com diluentes, conservantes, solubilizantes emulsionantes, adjuvantes e/ou veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Essas composições incluem diluentes com vários teores de tampão (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e força iónica; aditivos, tais como, detergentes e agentes de solubilização (por exemplo, Tween 80, polisorbato 80), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabi-sulfureto de sódio), conservantes (por exemplo, timersol, álcool benzílico) e substâncias para aumentar o volume (por exemplo, lactose, manitol); incorporação do material em preparações em partículas de compostos poliméricos, tais como, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. ou em lipossomas. Pode-se utilizar o ácido hialurónico e este pode ter o efeito de promover uma duração sustentada em 42 circulação. As composições farmacêuticas eventualmente podem incluir ainda outros liquidos, semi-sólidos ou diluentes sólidos, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, que servem como veiculos, excipientes ou meios farmacêuticos incluindo, mas não se limitando a monolaurato de polioxietileno e sorbitano, estearato de magnésio, hidroxibenzoato de propilo e hidroxibenzoato de metilo, amidos, sacarose, dextrose, goma de acácia, fosfato de cálcio, óleo mineral, manteiga de cacau e óleo de teobroma. Essas composições podem influenciar o estado fisico, a estabilidade, a taxa de libertação in vivo e a taxa de purificação in vivo das proteínas e dos derivados presentes. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712. As composições podem ser preparadas sob a forma líquida ou podem estar sob a forma de pós anidros, tais como, sob a forma liofilizada. Também se consideram formulações de implantes de libertação sustentada, assim como formulações transdérmicas.

Contemplam-se ainda aqui, para utilização, as formas farmacêuticas orais sólidas, que estão descritas, de uma forma geral, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) no capítulo 89. As formas de dosagem sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas ou pastilhas expectorantes, granulados. Também se pode utilizar a encapsulação lipossomal ou proteinóide para formular as composições da presente invenção (como, por exemplo, microesferas proteinóides relatadas na patente norte-americana N°. 4.925.673). A encapsulação lipossomal pode ser utilizada e os lipossomas podem ser derivados com vários polímeros (por exemplo, patente norte-americana N°. 5.013.556). Uma descrição das possíveis formas farmacêuticas sólidas para fins 43 terapêuticos é dada por Marshall, K., Modem Pharmaceutics, editada por G.S. Banker e C.T. Rhodes capitulo 10, 1979. Em geral, a formulação incluirá o composto da presente invenção e ingredientes inertes que permitem a protecção contra o ambiente do estômago e libertam o material activo, sob o ponto de vista biológico, no intestino.

Também estão especificamente contempladas as formas farmacêuticas orais dos compostos da presente invenção. Se necessário os compostos podem ser modificados quimicamente de modo que a libertação oral seja eficaz. Geralmente, a modificação química contemplada é a ligação de pelo menos uma parte à própria molécula do composto, em que a referida parte permite (a) a inibição da proteólise; e (b) a entrada na corrente sanguínea a partir do estômago ou do intestino. Também é desejável aumentar a estabilidade global do composto e aumentar o tempo de circulação no corpo. Exemplos dessas partes incluem: polietileno-glicol, copolímeros de etileno-glicol e propileno-glicol, carboxi-metil-celulose, dextrano, álcool de polivinilo, polivinil-pirrolidona e poliprolina (Abuchowski e Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg e Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), p 367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982)). Outros polímeros que podem ser utilizados são o poli-1,3-dioxolano e o poli-1,3,6-tioxocano. As preferidas para serem utilizadas em farmácia, tal como se indicou antes, são as partes de polietileno-glicol.

Para as formas farmacêuticas de libertação oral, é também possível utilizar um sal de um aminoácido alifático modificado, tal como, caprilato de N-(8-2-hidroxibenzoil-amino) e sódio (SNAC), como um veículo para aumentar a absorção dos compostos terapêuticos da presente invenção. A 44 eficácia clinica de uma formulação de heparina utilizando SNAC tem sido demonstrada nos ensaios da fase II conduzida por Emisphere Technologies. Ver, a patente norte-americana N°. 5.792.451, "Oral drug delivery composition and methods". A terapêutica pode ser incluida na formulação sob a forma de multipartícuias finas, sob a forma de grânulos ou massas de partículas com uma dimensão de cerca de 1 mm. A formulação do material para a administração de cápsulas, também pode ser feita sob a forma de pós, pós ligeiramente comprimidos ou mesmo em comprimidos. A terapêutica pode ser preparada por compressão.

Podem incluir-se agentes corantes e aromatizantes. Por exemplo, a proteína (ou um derivado) podem ser formulados (tal como por encapsulação de lipossomas ou microesferas) e ainda podem estar contidos dentro de um produto comestível, tal como, uma bebida refrigerada contendo corantes e agentes aromatizantes.

Pode-se diluir ou aumentar o volume do agente terapêutico com um material inerte. Estes diluentes podem incluir hidratos de carbono, especialmente, manitol, a-lactose, lactose anidra, celulose, sacarose, dextranos modificados e amido. Alguns sais inorgânicos podem também ser utilizados como cargas incluindo trifosfato de cálcio, carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes disponíveis comercialmente são o Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell.

Podem incluir-se desintegrantes na formulação do agente terapêutico numa forma farmacêutica sólida. Os materiais utilizados como desintegrantes incluem, mas não 45 se limitam, a amido incluindo o desintegrante comercial à base de amido, Explotab. Também se pode utilizar glicolato de amido e sódio, Amberlite, carboximetil-celulose de sódio, ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca de laranja, ácido de carboximetil-celulose, esponja natural e bentonite. Outra forma para os desintegrantes são as resinas permutadoras catiónicas insolúveis. Podem utilizar-se gomas em pó como desintegrantes e como ligantes e podem incluir-se gomas em pó, tais como, agar, caraia ou tragacanto. 0 ácido alginico e o seu sal de sódio são também desintegrantes úteis.

Os ligantes podem ser utilizados para manter o agente terapêutico em conjunto para formar um comprimido rígido e incluem materiais de produtos naturais, tais como, acácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem metil-celulose (MC) , etil-celulose (EC) e carboximetil-celulose (CMC) . Também se pode utilizar tanto polivinil-pirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetil-celulose (HPMC), no seio de soluções alcoólicas para granular o agente terapêutico.

Pode-se incluir um agente anti-atrito na formulação do agente terapêutico, para evitar que ele se pegue durante o processo de formulação. Podem utilizar-se lubrificantes como uma camada entre o agente terapêutico e a parede e pode incluir-se, sem carácter limitativo, ácido esteárico incluindo os seus sais de magnésio e de cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, óleos e ceras vegetais. Também se podem utilizar lubrificantes solúveis, tais como, sulfato de laurilo e sódio, sulfato de laurilo e magnésio, polietileno-glicol de vários pesos moleculares, Carbowax 4000 e 6000.

Podem-se adicionar agentes de deslizamento que podem 46 melhorar as propriedades de fluidez do fármaco durante a formulação e ajudam ao rearranjo durante a compressão. Os agentes de deslizamento podem incluir amido, talco, silica pirogénica e silico-aluminato hidratado.

Para ajudar a dissolução do agente terapêutico num ambiente aquoso, pode-se adicionar um tensioactivo como agente de molhagem. Os tensioactivos podem incluir detergentes aniónicos, tais como, sulfato de laurilo e sódio, sulfo-succinato de dioctilo e sódio e sulfonato de dioctilo e sódio. Os detergentes catiónicos podem ser utilizados e podem incluir cloreto de benzalcónio ou cloreto de benzetónio. A lista de detergentes não iónicos potenciais, que podem ser incluídos na formulação como tensioactivos, são lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, óleo de rícino e polioxietileno hidrogenado 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido gordo e sacarose, metil-celulose e carboximetil-celulose. Estes tensioactivos podem estar presentes na formulação da proteína ou do seu derivado, quer isoladamente ou como uma mistura em proporções diferentes.

Os aditivos que potencialmente melhoram a ingestão dos compostos são, por exemplo, o ácido oleico dos ácidos gordos, ácido linoleico e ácido linolénico.

Pode ser desejável uma formulação de libertação controlada. O fármaco pode ser incorporado numa matriz inerte que permite a libertação quer por difusão ou por um mecanismo de lixiviamento, por exemplo, gomas. As matrizes de degeneração lenta podem também ser incorporadas na formulação, por exemplo, alginatos e polissacáridos. Outra forma de libertação controlada deste agente terapêutico é 47 por um processo à base do sistema terapêutico Oros (Alza Corp.), isto é, um fármaco está incluido numa membrana semipermeável que permite que a água entre e que empurre o fármaco para fora, através de uma pequena abertura, devido a efeitos osmóticos. Alguns revestimentos entéricos têm um efeito de libertação retardada.

Outros revestimentos podem ser utilizados para a formulação. Incluem uma variedade de açúcares que podem ser aplicados numa panela de revestimento. 0 agente terapêutico pode também ser dado num comprimido revestido com uma película e os materiais utilizados neste caso são divididos em 2 grupos. 0 primeiro são os materiais não entéricos e inclui metil-celulose, etil-celulose, hidroxietil-celulose, metil-hidroxi-etil-celulose, hidroxipropil-celulose, hidroxi-propil-metil-celulose, carboximetil-celulose sódica, providona e polietileno-glicóis. 0 segundo grupo consiste em materiais entéricos que são normalmente ésteres do ácido ftálico.

Uma mistura de materiais pode ser utilizada para providenciar o revestimento com a película óptima. 0 revestimento com uma película pode ser realizado num reactor de revestimento ou num leito fluidizado ou por compressão do revestimento.

Também se contemplam aqui a libertação pulmonar da proteína presente (ou dos seus derivados). A proteína (ou o derivado) é libertada para os pulmões de um mamífero quando ele a inala e atravessa através da membrana epitelial do pulmão para a corrente sanguínea. (Outros relatórios sobre isto incluem Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990) (acetato de leuprólido); 48

Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (supl. 5): s. 143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard et al., Annals of Internai Medicine 3: 206-212 (1989) (al-anti-tripsina); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (al-proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, Março, 1990 (hormona de crescimento humana recombinante); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (interferão-γ e factor oí da necrose do tumor) e Platz et al., patente de invenção norte-americana U.S. N°. 5.284.656 (factor de estimulação da colónia de granulócitos) .

Na prática da presente invenção está contemplada a utilização de uma vasta gama de dispositivos mecânicos concebidos para a libertação pulmonar de produtos terapêuticos, incluindo, mas não se limitando a nebulizadores, inaladores com medidores de dose e inaladores de pós, todos eles familiares para os especialistas na matéria.

Alguns exemplos específicos de dispositivos comercialmente disponíveis, apropriados para a prática da presente invenção, são o nebulizador Ultravent, fabricado pela Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; o nebulizador Acorn II, fabricado pela Marquest Medicai Products, Englewood, Colorado; o inalador com medidor de dose Ventolin, fabricado pela Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; e o inalador de pós Spinhaler, fabricado pela Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Todos estes dispositivos requerem a utilização de formulações apropriadas para dispensar o composto da presente invenção. Normalmente, cada formulação é 49 específica para o tipo de dispositivo utilizado e pode envolver a utilização de um material propelente apropriado, para além dos diluentes, adjuvantes e/ou veículos úteis na terapêutica. 0 composto da presente invenção deve ser preparado, com a maior vantagem, sob a forma de partículas com uma dimensão média de partícula inferior a 10 ym (ou mícrones), mais preferencialmente, 0,5 a 5 ym, para a libertação mais eficaz até ao pulmão distai.

Os veículos incluem hidratos de carbono, tais como, tre-halose, manitol, xilitol, sacarose, lactose e sorbitol. Outros ingredientes para serem utilizados nas formulações podem incluir DPPC, DOPE, DSPC e DOPC. Podem utilizar-se tensioactivos naturais ou sintéticos. Pode-se utilizar o polietileno-glicol (mesmo independentemente da sua utilização na derivação da proteína ou do seu análogo). Podem utilizar-se dextranos, tal como ciclodextrano. Podem utilizar-se sais biliares e outros melhoradores com eles relacionados. Pode utilizar-se celulose e derivados de celulose. Podem utilizar-se aminoácidos, tal como utilizar uma formulação tampão.

Também se contempla a utilização de lipossomas, micro-cápsulas ou microesferas, complexos de inclusão ou outros tipos de veículos.

As formulações apropriadas para serem utilizadas com um nebulizador, quer de jacto ou ultrassónico, compreenderão, normalmente, o composto da presente invenção dissolvido em água, numa concentração de cerca de 0,1 a 25 mg de proteína activa sob o ponto de vista biológico, por mL de solução. A formulação também pode incluir um tampão e 50 um açúcar simples (por exemplo , para a estabilização da proteína e para a regulação da pressão osmótica). A formulação de nebulizador pode também conter um tensioactivo para reduzir ou evitar a agregação induzida da superfície da proteína, causada pela atomização na solução na formação do aerossol.

As formulações para serem utilizadas num dispositivo de inalador com medidor de dose, compreenderão geralmente um pó finamente dividido contendo o composto da presente invenção suspenso num propelente, com a ajuda de um tensioactivo. 0 propelente pode ser qualquer material convencional utilizado para este fim, tal como, clorofluorocarbono, hidroclorofluorocarbono, hidrofluoro-carbono ou um hidrocarboneto, incluindo tricloro-fluoro-metano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1, 1, 1,2-tetrafluoroetano ou as suas combinações. Os tensioactivos apropriados incluem trioleato de sorbitano e lecitina de soja. 0 ácido oleico pode ser útil como um tensioactivo.

As formulações para serem libertadas a partir de um dispositivo inalador de pós compreenderão um pó anidro finamente dividido, contendo composto da presente invenção e podem também incluir um agente de aumento de volume, tal como, lactose, sorbitol, sacarose, manitol, tre-halose ou xilitol, em quantidades que facilitam a dispersão do pó do dispositivo, por exemplo, 50 a 90 % em peso da formulação. A administração nasal do composto da presente invenção está também contemplada. A libertação nasal permite a passagem da proteína para a corrente sanguínea directamente após a administração do produto terapêutico ao nariz, sem a necessidade de deposição do produto no pulmão. As 51 formulações para libertação nasal incluem as que têm dextrano ou ciclodextrano. A libertação por via do transporte através de outras membranas mucosas está também contemplada.

Dosagens 0 regime de dosagem envolvido num processo para o tratamento das condições descritas antes, será determinado pelo médico assistente, considerando vários factores que modificam a acção dos fármacos, por exemplo, a idade, o estado clinico, o peso do corpo, o género e a dieta do doente, a severidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros factores clinicos. Geralmente, a dose deve estar no intervalo de 0,1 yg a 100 mg do composto da presente invenção, por quilograma de peso do corpo por dia, preferencialmente, de 0,1 a 1.000 yg/kg e, mais preferencialmente, de 0,1 a 150 yg/kg, dados em doses diárias ou em doses equivalentes a intervalos mais curtos ou mais longos, por exemplo, de dois em dois dias, duas vezes por semana, semanalmente ou duas ou três vezes por dia. O composto da presente invenção pode ser administrado por uma injecção inicial seguida de uma infusão continua para manter os níveis terapêuticos de circulação do produto do fármaco. Como outro exemplo, o composto da presente invenção pode ser administrado numa dose de uma só vez. Os especialistas na matéria estarão prontos para optimizar as doses eficazes e os regimes de administração, conforme pode ser determinado pela boa prática médica e as condições clínicas do doente individualmente. A frequência de dosagem dependerá de parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração. A formulação farmacêutica óptima será 52 determinada por um especialista na matéria, consoante a via de administração e a dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, cuja descrição é aqui incorporada como referência. Essas formulações podem influenciar o estado fisico, a estabilidade, a taxa de libertação in vivo e a taxa de purificação in vivo dos agentes administrados. Consoante a via de administração, pode-se calcular uma dose apropriada, de acordo com o peso do corpo, a área da superfície do corpo ou a dimensão do órgão. Um refinamento de cálculos posterior necessário para determinar a dosagem apropriada para o tratamento envolvendo cada uma das formulações mencionadas antes, é feito por rotina pelos especialistas na matéria, sem experimentação desnecessária, especialmente à luz da informação sobre dosagem e dos ensaios aqui descritos, assim como, dos dados farmacocinéticos observados nos ensaios clínicos em seres humanos discutidos antes. As dosagens apropriadas podem ser acertadas através da utilização de ensaios estabelecidos, para determinar os níveis de dosagem no sangue em conjunto com dados apropriados de resposta à dose. O regime final de dosagem será determinado pelo médico assistente, considerando vários factores que modificam a acção dos fármacos, por exemplo, a actividade específica do fármaco, a severidade dos danos e a capacidade de resposta do doente, a idade, o estado clínico, o peso do corpo, o género e a dieta do doente, a severidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros factores clínicos. À medida que vão sendo realizados estudos, emergem mais informações respeitantes aos níveis de dosagem apropriados e à duração do tratamento para várias doenças e estados clínicos.

Os processos terapêuticos, as composições e os 53 compostos da presente invenção também podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outras citocinas, receptores solúveis de Mpl, factores hematopoiéticos, interleucinas, factores de crescimento ou anticorpos, no tratamento de estados de doença caracterizados por outros sintomas, tais como, insuficiência de plaquetas. Considera-se que o composto da presente invenção provará ser útil no tratamento de algumas formas de trombocitopénia, em combinação com estimuladores gerais de hematopoiese, tais como, IL-3 ou GM-CSF. Outros factores estimuladores megacariociticos, isto é, meg-CSF, factores de células estaminais (FCE), factores inibidores de leucemia (FIL), oncostatina M (OSM) ou outras moléculas com actividade que estimulam os megacariócitos podem também ser utilizados com o ligando de Mpl. Exemplos adicionais de citocinas ou de factores hematopoiéticos para essa co-administração, incluem IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor 1 de estimulação de colónias (FEC-1), M-FEC, FCE, GM-FEC, factor de estimulação de colónias de granulócitos (FEC-G), EPO, interferão-alfa (IFN-alfa), interferão de consenso, IFN-beta, IFN-gama, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, trombopoietina (TPO), angiopoietinas, por exemplo, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, o polipéptido semelhante a angiopoietina humana, factor do crescimento endotelial vascular (FCEV), angiogenina, proteína 1 morfogénica do osso, proteína 2 morfogénica do osso, proteína 3 morfogénica do osso, proteína 4 morfogénica do osso, proteína 5 morfogénica do osso, proteína 6 morfogénica do osso, proteína 7 morfogénica do osso, proteína 8 morfogénica do osso, proteína 9 morfogénica do osso, proteína 10 morfogénica do osso, proteína 11 morfogénica do osso, proteína 12 morfogénica do osso, proteína 13 morfogénica do osso, proteína 14 morfogénica do osso, 54 proteína 15 morfogénica do osso, receptor IA da proteína morfogénica do osso, receptor IB da proteína morfogénica do osso, factor neurotrófico derivado do cérebro, factor neurotrófico ciliar, receptor α do factor neurotrófico ciliar, factor 1 quimiotáctico neutrofílico induzido por citocina, neutrófilo induzido por citocina, factor 2a quimiotáctico, factor 2β quimiotáctico de neutrófilo induzido por citocina, factor do crescimentos das células endoteliais β, endotelina 1, factor do crescimento da epiderme, agente atractor do neutrófilo derivado do epitélio, factor 4 do crescimento do fibroblasto, factor 5 do crescimento do fibroblasto, factor 6 do crescimento do fibroblasto, factor 7 do crescimento do fibroblasto, factor 8 do crescimento do fibroblasto, factor 8b do crescimento do fibroblasto, factor 8c do crescimento do fibroblasto, factor 9 do crescimento do fibroblasto, factor 10 do crescimento do fibroblasto, factor ácido do crescimento do fibroblasto, factor básico do crescimento do fibroblasto, receptor al do factor neutrófico derivado da linha de células glial, receptor a2 do factor neutrófico derivado da linha de células glial, proteína relacionada com o crescimento, proteína α relacionada com o crescimento, proteína β relacionada com o crescimento, proteína γ relacionada com o crescimento, factor do crescimento epidérmico de ligação à heparina, factor do crescimento dos hepatócitos, receptor do factor do crescimento dos hepatócitos, factor I do crescimento semelhante a insulina, receptor do factor do crescimento semelhante a insulina, factor II do crescimento semelhante a insulina, proteína de ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina, factor do crescimento dos caratinócitos, factor inibidor da leucemia, receptor α do factor inibidor da leucemia, factor do crescimento do nervo, receptor do factor do crescimento do nervo, neutrofina-3, neurotrofina-4, factor do 55 crescimento da placenta, factor 2 do crescimento da placenta, factor do crescimento das células endoteliais derivadas de plaquetas, factor do crescimento derivadas de plaquetas, cadeia A do factor do crescimento derivado de plaquetas, factor AA do crescimento derivado de plaquetas, factor AB do crescimento derivado de plaquetas, cadeia B do factor do crescimento derivado de plaquetas, factor BB do crescimento derivado de plaquetas, receptor α do factor do crescimento derivado de plaquetas, receptor β do factor de crescimento derivado de plaquetas, factor de estimulação do crescimento das células pré-B, receptor do factor das células indiferenciadas, FNT, incluindo FNTO, FNT1, FNT2, factor a do crescimento da transformação, factor β do crescimento da transformação, factor βΐ do crescimento da transformação, factor β1,2 do crescimento da transformação, factor β2 do crescimento da transformação, factor β3 do crescimento da transformação, factor β5 do crescimento da transformação, factor βΐ do crescimento da transformação latente, proteína I da ligação do factor β do crescimento da transformação, proteína II da ligação do factor β do crescimento da transformação, proteína III da ligação do factor β do crescimento da transformação, receptor do tipo I do factor de necrose do tumor, receptor do tipo II do factor de necrose do tumor, receptor activador do plasminogénio do tipo urocinase, factor de crescimento endotelial vascular e proteínas quiméricas e os seus fragmentos activos sob o ponto de vista biológico ou imunológico. Pode ainda ser útil administrar quer simultaneamente, quer sequencialmente, uma quantidade efectiva de um receptor solúvel de Mpl de mamífero, que parece ter um efeito de fazer com que os megacariócitos se fragmentem em plaquetas quando os megacariócitos atingem a forma madura. Assim, a administração de um composto da presente invenção (para aumentar o número de megacariócitos 56 maduros) seguida da administração do receptor solúvel de Mpl (para inactivar o ligando e permitir que os megacariócitos maduros produzam plaquetas) , é espectável que seja um meio particularmente efectivo de estimular a produção de plaquetas. A dosagem citada antes seria ajustada para compensar essas componentes adicionais na composição terapêutica. 0 progresso do doente a ser tratado pode ser monitorizado por processos convencionais.

Nos casos em que os compostos da presente invenção são adicionados às composições de plaquetas e/ou de megacariócitos e a células com eles relacionados, a quantidade a ser incluida será normalmente acertada experimentalmente por técnicas e ensaios conhecidos na técnica. Um exemplo de um intervalo de quantidades é de 0,1 ym - 1 mg do composto da presente invenção por 106 células.

Deve entender-se que a aplicação dos ensinamentos da presente invenção a um problema ou situação específicos, estará dentro das capacidades de um especialista na matéria à luz dos ensinamentos aqui contidos. Exemplos dos produtos da presente invenção e dos processos representativos para o seu isolamento, a sua utilização e o seu fabrico, aparecem a seguir.

EXEMPLOS I. A seguir dão-se exemplos de processos para produzir alguns dos compostos do primeiro grupo aqui descrito. A._Materiais e Processos

Todos os derivados de aminoácidos (todos das configurações L) e as resinas utilizadas na sintese de 57 péptidos, foram comprados na Novabiochem. Os reagentes da síntese dos péptidos (DCC, HOBt, etc.) foram comprados sob a forma de soluções na Applied Biosystems, Inc. Os dois derivados de PEG foram da Shearwater Polymers, Inc. Todos os dissolventes (diclorometano, N-metilpirrolidinona, metanol, acetonitrilo) vieram da EM Sciences. A CLAR analítica foi realizada num sistema de Beckman com uma coluna Vydac (0,46 cm X 25 cm, C18 de fase inversa, 5 mm), a um débito de 1 mL/minuto e com uma detecção por UV dupla a 220 e 280 nm. Utilizaram-se gradientes lineares para todas as operações de CLAR com duas fases móveis: tampão A - H2O (ATF a 0,1 %) e tampão B - acetonitrilo (ATF a 0,1 %). Os péptidos numerados aqui referidos, por exemplo, 17b, 18, 19 e 20, são numerados em referência ao quadro 1 e alguns deles estão ainda ilustrados nas figuras 2 e 3. Sínteses dos péptidos. Todos os péptidos foram preparados por um processo de síntese em fase sólida, em várias etapas, bem estabelecido. A síntese em fase sólida com a química de Fmoc foi realizada utilizando um sintetizador de péptidos da ABI. Normalmente, a síntese dos péptidos começou com uma pré-carga de resina Wang numa escala de 0,1 mmole. Realizou-se a desprotecção de Fmoc com um protocolo padrão de piperidina. O acoplamento foi efectuado utilizando DCC/HOBt. Os grupos de protecção da cadeia lateral foram: Glu (O-t-Bu), Tre (t-Bu), Arg (Pbf), Gin (Trt), Trp (t-Boc) e Cis (Trt). Para o primeiro percursor de péptidos para o tratamento com polietileno-glicol, utilizou-se Dde para a protecção da cadeia lateral de Lis no ligante e utilizou-se Boc-Ile-OH para o último acoplamento. Dde foi eliminado utilizando hidrazina anidra (a 2 % no seio de NMP, 3x2 minutos), seguido do acoplamento com anidrido bromoacético realizado por acção de DCC. Para o péptido 18, a cadeia lateral de cisteína no ligante foi 58 protegida por meio de um grupo tritilo. A desprotecção final e a clivagem de todas as resinas de peptidilo foi efectuada à TA, durante 4 horas, utilizando ácido trifluoroacético (ATF), contendo H20 a 2,5 %, fenol a 5 %, tri-isopropilsilano a 2,5 % e tioanisol a 2,5 %. Depois da eliminação do ATF, o péptido clivado precipitou no seio de éter anidro frio. A formação de di-sulfureto do péptido ciclico foi realizada directamente no material impuro utilizando DMSO a 15 %, em H20 (pH 7,5). Todos os péptidos impuros foram purificados por CLAR preparativa de fase inversa e essas estruturas foram confirmadas por IEP (ionização por elctropulverização) - EM (espectrometria de massa) e por análise dos aminoácidos.

Alternativamente, todos os péptidos descritos antes podiam também ser preparados utilizando a quimica de t-Boc. Neste caso, as resinas iniciais seriam as clássicas resinas de Merrifield ou Pam e os grupos de protecção da cadeia lateral seriam: Glu (OBzI), Tre (Bzl), Arg (Tos), Trp (OHC) , Cis (p-MeBzI) . 0 fluoreto de hidrogénio (HF) seria utilizado para a clivagem final das resinas de peptidilo.

Todos os péptidos diméricos em tandem descritos neste estudo, que têm ligantes compostos por aminoácidos naturais, podem também ser preparados pela tecnologia do ADN recombinante.

Tratamento com PEG. Desenvolveu-se uma estratégia nova, convergente para o tratamento de péptidos sintéticos com polietileno-glicol, que consiste na combinação, através da formação de uma ligação conjugada em solução, de um péptido e uma parte de PEG, cada uma delas comportando uma funcionalidade especial que é mutuamente reactiva em relação à outra. Os péptidos percursores podem ser 59 facilmente preparados pela síntese convencional em fase sólida, tal como se descreveu antes. Tal como se descreve a seguir, estes péptidos são "pré-activados" com um grupo funcional apropriado, num sitio especifico. Os percursores são purificados e completamente caracterizados antes de reagirem com a parte de PEG. A ligação do péptido a PEG normalmente tem lugar em fase aquosa e pode ser facilmente monitorizada por CLAR analítica de fase inversa. Os péptidos tratados com polietileno-glicol podem ser facilmente purificados por CLAR preparativa e caracterizados por CLAR analítica, análise de aminoácidos e espectrometria de massa de desabsorção a laser.

Preparação do péptido 19. Dissolveu-se o péptido 17b (12 mg) e MeO-PEG-SH 5000 (30 mg, 2 equiv.) em 1 mL de tampão aquoso (pH 8) . Fez-se a incubação da mistura à TA, durante cerca de 30 min. e controlou-se a reacção por CLAR analítica que mostrou que a reacção estava > 80 % completa. O material tratado com polietileno-glicol foi isolado por CLAR preparativa.

Preparação do péptido 20. Dissolveu-se o péptido 18 (14 mg) e MeO-PEG-maleimida (25 mg) em cerca de 1,5 mL de tampão aquoso (pH 8) . Fez-se a incubação da mistura à TA, durante cerca de 30 min., momento em que ~70 % da transformação estava completa, conforme monitorizado com CLAR analítica, por meio da aplicação de uma aliquota de amostra à coluna de CLAR. O material tratado com polietileno-glicol foi purificado por CLAR preparativa.

Ensaio de bioactividade. A TPO num ensaio in vitro é um ensaio mitogénico que utiliza um clone dependente de IL-3 das células 32D de murino, que tinham sido transfectadas com receptor humano de Mpl. Este ensaio está descrito com 60 mais detalhe na patente WO 95/26746. Mantiveram-se as células em meio MEM contendo clone II fetal a 10 % e 1 ng/mL de ILm-3. Antes da adição da amostra, prepararam-se as células lavando duas vezes com meio de crescimento sem ILm-3. Preparou-se uma curva padrão de TPO alargada a doze pontos, variando de 3 333 até 39 pg/mL. Prepararam-se quatro diluições, que se estimou que cairiam dentro da pressão linear da curva padrão (1000 a 125 pg/mL), para cada amostra e realizou-se em triplicado. Adicionou-se um volume de 100 yL de cada diluição da amostra ou do padrão aos microtubos apropriados de uma placa microtituladora com 96 microtubos, contendo 10 000 células/microtubo. Depois de quarenta e quatro horas, a 37 °C e em atmosfera de CO2 a 10 %, adicionou-se, a cada tubo, MTS (um composto de tetrazólio, que é bio-reduzido pelas células para um forma-zano). Aproximadamente seis horas mais tarde lê-se a densidade óptica no leitor de placa a 490 nm. Gera-se uma curva de resposta à dose (concentração log de TPO versus D.O.-base) e a análise de regressão linear dos pontos irá cair na porção linear da curva padrão que se desenha. As concentrações das amostras de ensaio desconhecidas são determinadas utilizando a equação linear resultante e uma correcção para o factor de diluição.

Abreviaturas♦ CLAR: cromatografia liquida de alta resolução; EM-IEP-EM: espectrometria de massa de ionização por pulverização; EM-IDLAM: espectrometria de massa de ionização de desabsorção a laser assistida por uma matriz; PEG: poli(etileno-glicol). Todos os aminoácidos são representados com as três letras padrão ou com códigos de uma única letra. t-Boc: terc-butoxicarbonilo; tBu: terc-butilo; Bzl: benzilo; DCC: diciclo-hexilcarbodi-imida; HOBt: 1-Hidroxibenzotriazol; NMP: N-metil-2-pirrolidinona; Pbf: 2,2,4,6,7-pendametildi-hidro-benzofuran-5-sulfonilo; 61

Trt: tritilo; Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciclo- hexilideno)-etilo. B. Resultados

Dlmeros de TMP em tandem com ligandos de poliglicinas. A concepção de dímeros de TMP ligados sequencialmente foi baseado na assunção de que a forma dimérica de TMP era necessária para a sua interacção efectiva com c-Mpl (o receptor de TPO) e que dependia da forma como se ligavam umas com as outras no contexto do receptor, podendo as duas moléculas de TMP ser mantidas em conjunto na configuração das terminações C para N, de tal modo que não perturbassem a conformação dimérica global. Claramente, a actividade dos dimeros ligados em tandem pode também depender da própria selecção do comprimento e da composição do ligante que junta as terminações C e N dos dois monómeros de TMP alinhados sequencialmente. Dado que não há informação estrutural disponível da ligação de TMP a c-Mpl, sintetizou-se uma série de péptidos diméricos com ligantes compostos por 0 até 10 e 14 residuos de glicina (quadro 1). Escolheu-se a glicina por causa da sua simplicidade e flexibilidade. Pensou-se que uma cadeia de péptido de poliglicina flexivel podia permitir a dobragem livre de duas repetições de TMP tétradas, na conformação necessária, enquanto mais sequências de aminoácidos articuladas de forma estérica podiam adoptar estruturas secundárias indesejáveis, cuja rigidez pode quebrar o empilhamento correcto do péptido dimérico no contexto do receptor.

Os péptidos resultantes estão facilmente acessíveis por processos de sintese de péptidos convencionais em fase sólida (Merrifiled, R.B., Journal of the American Chemical Society 85: 2149 (1963)), quer pela quimica de Fmoc ou de 62 t-Boc. Ao contrário da síntese do dímero paralelo ligado terminalmente a C (SEQ ID N°: 2) que requer a utilização de um resíduo de lisina protegido ortogonalmente como no ponto inicial do ramo para construir as duas cadeias de péptidos numa via pseudo-simétrica (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)), a síntese dos dímeros em tandem da presente invenção é feita directamente, juntando, em etapas, as cadeias contínuas dos péptidos das terminações C para N. Dado que a dimerização de TMP tem um efeito mais dramático na actividade proliferativa do que a afinidade de ligação, tal como se mostra para o dímero de terminal C (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)), analisaram-se os péptidos sintéticos directamente quanto à actividade biológica num ensaio de proliferação de células dependentes de TPO, utilizando um clone dependente de IL-3 de células 32D de murino transfectadas com c-Mpl de comprimento completo (Palacios, R. et al., Cell 41: 727 (1985)) . Tal como mostram os resultados do ensaio (ver o quadro 1 a seguir), todos os dímeros em tandem ligados por poliglicina demonstraram > 1000 vezes o aumento de potência quando comparados com o monómero e mostraram ainda ser mais potentes do que o dímero do terminal C neste ensaio de proliferação de células. A actividade absoluta do dímero do terminal C no ensaio dos requerentes, foi inferior à da proteína TPO original, que é diferentes das verificações já relatadas previamente, em que o dímero de terminal C mostrou ser tão activo como o ligando natural (Cwirla, S.E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)). Isto pode ser devido a diferenças nas condições utilizadas nos dois ensaios. Apesar disso, a diferença na actividade entre dímeros em tandem de (terminal C do primeiro monómero ligado ao terminal N do segundo monómero) e os dímeros paralelos de (terminal C do primeiro monómero ligados ao terminal C do segundo monómero), no mesmo ensaio, 63 demonstraram claramente a superioridade do produto dimerizado em tandem comparado com os produtos de dimero em paralelo. É interessante notar que uma vasta gama de comprimento é tolerada pelo ligante. 0 ligante óptimo com os monómeros de TMP seleccionados (SEQ ID N°: 1) aparentemente é composto por 8 glicinas.

Outros dimeros em tandem. Na sequência desta primeira série de dimeros de TMP em tandem, prepararam-se várias outras moléculas quer com ligantes diferentes ou contendo modificações dentro do próprio monómero. A primeira destas moléculas, o péptido 13, tem um ligante composto por GPNG, uma sequência conhecida por ter uma elevada propensão para formar uma estrutura secundária do tipo β circular. Embora ainda cerca de 100 vezes mais potente do que o monómero, verificou-se que este péptido era mais do que 10 vezes menos activo do que o análogo ligado a GGGG. Assim, a introdução de uma estrutura circular β relativamente rigida na região do ligante, parece causar uma ligeira distorção da conformação óptima do agonista nesta forma de ligante curto. O Trp9 na sequência de TMP é um residuo altamente conservado entre os péptidos activos isolados a partir de bibliotecas de péptidos aleatórias. Há também um Trp altamente conservado nas sequências de consenso dos péptidos miméticos de EPO e verificou-se que este residuo de Trp estava envolvido na formação do núcleo hidrofóbico entre os dois péptidos miméticos de EPO (PME) e contribuia para as interacções hidrofóbicas com o receptor de EPO (Livnah, O. et al., Science 273: 464-471 (1996)). Por analogia, pensa-se que o residuo Trp9 em TMP pode ter uma função semelhante na dimerização do ligando do péptido e numa tentativa para modular e estimar os efeitos das forças 64 hidrofóbicas não covalentes exercidas pelos dois anéis de indol, construíram-se vários análogos resultando das mutações em Trp. Assim, no péptido 14, o resíduo de Trp em cada um dos dois monómeros de TMP foi substituído por Cis e formou-se uma ligação intramolecular de di-sulfureto entre as duas cisteínas por oxidação, o que pareceu imitar as interacções hidrofóbicas entre os dois resíduos de Trp na dimerização do péptido. 0 péptido 15 é a forma reduzida do péptido 14. No péptido 16, os dois resíduos de Trp foram substituídos por Ala. Como mostram os dados do ensaio, os três análogos estavam inactivos. Estes dados ainda demonstram que Trp é importante para a actividade do péptido mimético de TPO e não só para a formação do dímero.

Os dois péptidos seguintes (péptido 17a e 18) contêm, cada um, no seu ligante do aminoácido 8, um resíduo de Lis ou de Cis. Estes dois compostos são percursores dos dois péptidos tratados com polietileno-glicol (péptido 19 e 20) em que a cadeia lateral da Lis ou da Cis está modificada por uma parte de polietileno-glicol (PEG). Decidiu-se introduzir uma parte de PEG num ligante médio ou relativamente longo, de modo que o componente grande de PEG (5 kDa) estivesse suficientemente longe dos sítios de ligação importantes na molécula de péptido. O PEG é um polímero biocompatível conhecido que é cada vez mais utilizado como um modificador covalente para melhorar os perfis farmacocinéticos de agentes terapêuticos à base de péptidos e de proteínas.

Desenhou-se um processo modular, à base de uma solução, para o tratamento conveniente com polietileno-glicol dos péptidos sintéticos ou recombinantes. O processo baseia-se na estratégia de ligação quimio-selectiva que está hoje bem estabelecida, que utiliza a reacção 65 específica entre um par de funcionalidades que reagem mutuamente. Assim, para o péptido 19 tratado com polietileno-glicol, a cadeia lateral de lisina foi pré-activada com um grupo bromoacetilo para fazer com que o péptido 17b acomode a reacção com um PEG derivado de tiol. Para fazer isto, utilizou-se um grupo de protecção ortogonal, Dde, para a protecção da ε-amina de lisina. Uma vez ligada toda a cadeia do péptido, a amina do terminal N foi novamente protegida com t-Boc. Eliminou-se Dde para permitir a bromoacetilação. Esta estratégia originou um péptido impuro de elevada qualidade, que foi facilmente purificado utilizando CLAR convencional de fase inversa. A ligação do péptido com um PEG modificado por tiol, teve lugar no seio de um tampão aquoso a pH 8 e a reacção estava completa em trinta minutos. A análise de EM-IDLAM para o material tratado com polietileno-glicol, purificado, revelou uma característica, um espectro em forma de sino com um incremento de 44 Da entre os picos adjacentes. Para o péptido 20 de PEG, colocou-se um resíduo de cisteína na região ligante e o seu grupo tiol da cadeia lateral serviu como um sítio de ligação para um PEG contendo maleimida. Utilizaram-se condições semelhantes para o tratamento deste péptido com polietileno-glicol. Como os dados do ensaio revelaram, estes dois péptidos tratados com polietileno-glicol tinham uma bioactividade in vitro ainda mais elevada quando comparada com as suas contrapartes não tratadas com polietileno-glicol. O péptido 21 tinha no seu ligante de 8 aminoácidos um elemento de glicosilação potencial; NGS. Dado que os exemplos de dímeros em tandem constituídos a partir de aminoácidos naturais se ligam por ligações peptídicas, a expressão de uma dessas moléculas num sistema apropriado de células eucarióticas, deve produzir um glicopéptido com a 66 parte de hidrato de carbono adicionada na cadeia lateral de carboxiamida de Asn. A glicosilação é um processo de modificação pós-translaccional comum, que pode ter muitos impactos positivos na actividade biológica de uma dada proteína, porque aumenta a sua solubilidade aquosa e a sua estabilidade in vivo. Como mostram os dados do ensaio, a incorporação deste elemento de glicosilação no ligante manteve uma elevada bioactividade. 0 percursor sintético do glicopéptido potencial, teve um efeito na actividade comparável ao do análogo ligado a -(GliJs-· Uma vez glicosilado, é espectável que este péptido tenha a mesma ordem de actividade que os péptidos tratados com polietileno-glicol, por causa das propriedades químico-físicas semelhantes exibidas por um PEG e uma parte de hidrato de carbono. 0 último péptido é um dímero de um dímero. Preparou-se por oxidação do péptido 18, que formou uma ligação de di-sulfureto, intermolecular, entre os dois resíduos de cisteína localizados no ligante. Este péptido foi concebido de modo a dar a possibilidade de que TMP fosse activo como um tetrâmero. Os dados do ensaio mostraram que este péptido não era mais activo do que a média de um dímero em tandem numa base molar ajustada, o que suporta indirectamente a ideia de que a forma activa de TMP é na verdade um dímero, de qualquer forma, a dimerização de um dímero em tandem teria um impacto na bioactividade. 0 quadro 1 a seguir resume as actividades relativas dos compostos descritos antes em termos das potências relativas com base nos ensaios in vitro, tal como se descreveu antes. 67 QUADRO 1

Composto Potência Relativa (CE5q ) TPO 4,0 TMP monómero (SEQ ID N°: 1) 1,0 TMP C-C dímero (SEQ ID N°: 2 ) 3,5 TMP- - (Gli)n-TMP: 1 n=0 4,5 2 n=l 4,0 3 n=2 4,0 4 n=3 4,0 5 n=4 4,0 6 n=5 4,0 7 n=6 4,0 8 n=7 4,0 9 n=8 4,5 10 n=9 4,0 11 n=l 0 4,0 12 n=14 4,0 13 TMP-GPNG-TMP (SEQ ID N ° : 10) 3, 0 14 IEGP TLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA(SEQ I”_1 “ ID N2. 11) 0,5 15 IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (SEQ ID N°. 12) 0, 5 16 IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID N°. 13) 0,5 17a TMP-GGGKGGGG-TMP (SEQ ID N°. 14) 4,0 17b TMP-GGGK(BrAc)GGGG-TMP (SEQ ID N°, . 15) ND 18 TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ID N°. 16) 4,0 19 TMP-GGGK(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID N°. 17) 5, 0 20 TMP-GGGC(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID N°. 18) 5, 0 21 TMP-GGGNGSGG-TMP (SEQ ID N°. 19) 4,0 22 TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ 0 CM 01 fc Ω H 4,0

I

TMP-GGGCGGGG-TMP NOTA: no quadro 1, os numerais indicam, aproximadamente, 1 log de actividade, de tal maneira que a diferença na actividade entre "1" e "4" é de, aproximadamente, 1.000 vezes. Um incremento de 0,5 é um ponto intermédio, de tal modo que a diferença na actividade entre "1" e "3,5", é determinado. de, aproximadamente, 500 vezes, "ND' significa não 68 II. Os conjuntos que se seguem são processos exemplares para preparar alguns dos compostos do segundo grupo aqui descrito. A. Preparação de um composto de fusão de Fc do tipo indicado na figura 6C.

Colocou-se uma sequência de ADN que codifica para a região Fc da IgGl humana fundida em secções com um dimero do péptido mimético de TPO (SEQ ID N°: 34), sob o controlo do promotor luxPR no vector de expressão do plasmido pAMG21, como se segue. 0 gene de fusão foi preparado utilizando uma tecnologia padrão de RCP. As matrizes para as reacções de RCP foram o vector de fusão contendo a sequência de Fc e um gene sintético codificando a parte restante do composto da SEQ ID N°: 34. 0 gene sintético foi construído a partir de 4 oligonucleótidos sobrepostos mostrados a seguir: 1830-52 AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT (SEQ ID Na . 35) 1830-53 ACC TCC ACC ACC AGC ACG AGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGT CGG ACC (SEQ ID N2. 36) 1830-54 GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC CCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA CGC GCA (SEQ ID N2. 37) 1830-55 AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC CTC CGC CGC C (SEQ ID N2 . 38) 69

Os 4 oligonucleótidos foram anelados para formar a estrutura dupla que se mostra a seguir:

AAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCT 1--------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

CCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGA KGGGGGI EGPTLRQWLAARA

GGTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCA ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

CCACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGT

GGGGGGGGIEGPTLRQWLAA

CGCGCA ---------------------------148

GCGCGTATTAGAGCTCCTAGGAAAAAAA RA * SEQ ID NO: 39 [oligonucleótidos co-lineares 1830-52 e 1830-54] SEQ ID N: 40 [oligonucleótidos co-lineares 1830-53 e 1830-55] e SEQ ID N° 41 [a sequência de aminoácidos codificada]

Esta estrutura dupla foi amplificada numa reacção de RCP, utilizando 1830-52 e 1830-55 como os iniciadores num sentido e no sentido inverso. A porção de Fc da molécula foi gerada numa reacção de RCP com ADN de Fc utilizando os iniciadores 1216-52 AAC ATA AGT ACC TGT AGG ATC G (SEQ ID NO: 42) 1830-51 TTCGATACCACCACCTCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCT GC (SEQ ID NO: 43)

Os oligonucleótidos 1830-51 e 1830-52 contêm uma sobreposição de 24 nucleótidos, permitindo que os dois genes se fundam em conjunto numa secção de leitura correcta, combinando os produtos de RCP anteriores numa terceira reacção, utilizando os iniciadores externos, 1216- 70 52 e 1830-55. O produto final da RCP do gene (o gene de fusão de comprimento completo) foi digerido com as endonucleases de restrição Xbal e Bamtí.1 e depois ligado ao pAMG21 do vector (ver a seguir), também digerido com Xbal e BamHI. O ADN ligado foi transformado nas células hospedeiras concorrentes da estirpe 2596 de E. coli (GM221, descrita a seguir). Os clones foram rastreados guanto à sua capacidade para produzir o produto recombinante de proteina e para possuir a fusão do gene com a sequência correcta de nucleótidos. Os niveis de expressão da proteina foram determinados em estudos em frascos de 50 mL com agitadores. Analisaram-se todos os lisados das células quanto à expressão da fusão por via de geles de EGPA (electroforese em gel de poliacrilamida) corados com Coomassie. A sequência de aminoácidos da proteina de fusão está indicada a seguir à correspondente sequência de nucleótidos: 71

Xbal

I

T C T AGAT T T GT ΤΤ TAAC Τ ΑΑΤ Τ AAAGGAGGAAT AAC AT AT GGAC AAAAC Τ CAC AC AT GT C 1----------1-----------1----------Η-----------1-----------1-----------Η 60

AGAT C TAAACAAAATT GAT ΤΑΑΤ TTCCTCCT ΤAT Τ GTATAC C Τ GT Τ Τ Τ GAGT GT GTACAG

MDKTHTCP

CACCTTGTCCAGCTCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC 61--------—l·-----------l·-----------1-----------1-----------1-----------I- 12 0

GTGGAACAGGTCGAGGCCTTGAGGACCCCCCTGGCAGTCAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTG

PCPAPELLGGPSVFLFPPKP

CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 18 0

GGTTCCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGACTCCAGTGTACGCACCACCACCTGCACT KDTLMI SRTPEVTCVVVDVS

GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

CGGTGCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTAC

HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA

CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

GGTTCTGTTTCGGCGCCCTCCTCGTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGT

KTKPREEQYNSTYRVVSVLT

C C GT C C T GCAC CAGGAC TGGC T GAAT GGC AAGGAGTACAAGT GCAAGGT C T C CAAC AAAG 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

GGCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTC

VLHQDWLNGKEYKCKVSNKA 72

C C C T C C C AGC C C C C AT C GAGAAAAC C AT C T C C AAAG C C AAAGGGC AGC C C C GAGAAC C AC 361 ————————-----------1-----------+-----------j------------f- 420

GGGAGGGTCGGGGGTAGCTCTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTG

LPAPIEKTISKAKGQPREPQ

AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT 421----------1-----------1-----------1-------*---1-----------1-----------t- 480

TCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGA

VYTLPPSRDELTKNQVSLTC

GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

CGGACCAGTTTCCGAAGATAGGGTCGCTGTAGCGGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCG LVKGFYPS DIAVEWESNGQP

CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT 541----------1-----------1 ——— —----1---------—+——--------1-----------} 600

GCCTCTTGTTGATGTTCTGGTGCGGAGGGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGA

ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG 601---— — —----h----------1------————+---------+----------1-----------h 660

TGTCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGC

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA 661----------t-----------1-----------!---------—I-----------1-----------720

ACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCAT

MHEALHNHYTQKSLSLSPGK

AAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTG 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780

TTCCACCTCCACCACCATAGCTTCCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGAC

GGGGGIEGPTLRQWLAARAG

GTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCAC 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840

CACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGTG GGGGGGGI EGPTLRQWLAAR

BaiClHI

I

GCGCATAATCTCGAGGATCCG 841 ---------+---------+- 861

CGCGTATTAGAGCTCCTAGGC

A SEQ ID N°. 44 [leitura da estirpe simples 5'V3' anterior], SEQ ID N°. 45 [leitura da estirpe simples 3'V5' anterior] e SEQ ID N°. 46 [a sequência de aminoácidos codificada] pAMG21 O plasmido de expressão pAMG21 está disponivel na ATCC com o número de acesso 98113, que foi depositado em 24 de Julho de 1996. 73 GM221 (Estirpe hospedeira da Amgen #2596) A estirpe hospedeira da Amgen #2596 é uma estirpe K-12 de E. coli, que foi modificada para conter tanto o repressor lambda sensivel à temperatura cI857s7 na região precoce ebg como o repressor lacIQ na região tardia ebg (68 minutos). A presença destes dois genes repressores permite a utilização deste hospedeiro com uma variedade de sistemas de expressão, contudo, ambos estes repressores são irrelevantes para a expressão de IuxPr. 0 hospedeiro não transformado não tem resistência a antibióticos. 0 sitio de ligação do ribossoma do gene cI857s7 tem sido modificado para incluir um RBS melhorado. Tem sido inserido no operão de ebg entre a posição 1.170 e 1.411 dos nucleótidos, tal como está numerado no Genbank com o número de acesso M6444lGb_Ba com a eliminação de uma sequência de intervenção ebg. A estrutura foi libertada para o cromossoma utilizando um fago recombinante designado por RBS #4 melhorado por MMebg-cI857s7 em F'tet/393. Depois da recombinação e da resolução apenas a inserção cromossómica descrita antes permaneceu na célula. Foi renomeada para F'tet/GM101. F'tet/GM101 foi então modificada pela libertação de uma estrutura de lacIQ no operão de ebg entre as posições 2.493 e 2.937 dos nucleótidos, numerada no Genbank com o número de acesso M64441Gb_Ba, com a eliminação da sequência de intervenção de ebg. A estrutura foi libertada para o cromossoma utilizando um fago recombinante designado por AGebg-LacIQ#5 em F'tet/GM101. Depois da recombinação e da resolução apenas a 74 inserção cromossómica descrita antes permaneceu na célula. Foi renomeada para F'tet/GM221. 0 episoma de F'tet foi curado a partir da estirpe utilizando laranja de acridina a uma concentração de 25 pg/mL em CL (caldo de luria) . A estirpe curada foi identificada como sensivel a tetraciclina e foi armazenada como GM221. A estrutura de fusão de Fc contida no plasmido pAMG221 (aqui referida como pAMG21-Fc-TMP-TMP) , que por sua vez estava contida na estirpe hospedeira GM221, tinha sido depositada na ATCC com o número de acesso 98957, com a data de depósito de 22 de Outubro de 1998.

Expressão. As culturas de pAMG21-Fc-TMP-TMP em GM221 de E. coli, em meio de caldo de Luria contendo 50 pg/mL de canamicina, foram incubadas a 37 °C, antes da indução. A indução da expressão do produto do gene de Fc-TMP-TMP, a partir do promotor luxPR, foi conseguida no seguimento da adição do auto-indutor sintético N-(3-oxo-hexanoil)-DL-homoserina-lactona ao meio de cultura, até a uma concentração final de 20 ng/mL e incubaram-se as culturas, a 37 °C, durante mais 3 horas. Passadas 3 horas, examinaram-se as culturas bacterianas num microscópio quanto à presença de corpos de inclusão, que depois se recolheram por centrifugação. Os corpos de inclusão refrácteis foram observados nas culturas induzidas indicando que a Fc-TMP-TMP tinha sido muito provavelmente produzido na fracção insolúvel de E. coli. Fez-se a lise dos aglomerados de células directamente por re-suspensão em tampão de amostra de Laemmli contendo β-mercaptoetanol a 10 % e analisou-se por EGPA-SDS. Observou-se uma banda corada de Coomassie intensa, aproximadamente de 30 kDa, no gel de EGPA-SDS. O produto de gene esperado teria 2 69 aminoácidos de comprimento e tinha um peso molecular 75 espectável de cerca de 29,5 kDa. Realizou-se também a fermentação em condições de lote padrão, a uma escala de 10 L, resultando em níveis de expressão semelhantes de Fc-TMP-TMP aos obtidos a uma escala de mistura.

Purificação de Fc-TMP-TMP.

Romperam-se as células em água (1/10) por homogeneização a alta pressão (2 passagens a 14.000 PSI) e colheram-se os corpos de inclusão por centrifugação (4.200 RPM em J-6B, durante 1 hora). Solubilizaram-se os corpos de inclusão em guanidina 6 M, Tris 50 mM, DTT 8 mM, a pH 8,7, durante 1 hora, a uma taxa de 1/10. A mistura solubilizada foi diluída 20 vezes em ureia 2 M, Tris 50 mM, arginina 160 mM, cisteína 3 mM, a pH 8,5. Agitou-se a mistura durante a noite em frio. Nesse momento do processo, as subunidades dos monómeros de Fc-TMP-TMP dimerizam para formar o composto ligado por di-sulfureto com a estrutura mostrada na figura 6C e depois concentrou-se cerca de 10 vezes por ultrafiltração. Diluiu-se então 3 vezes com Tris 10 mM, ureia 1,5 M, a pH 9. Ajustou-se então o pH da mistura para pH 5 com ácido acético. Eliminou-se o precipitado por centrifugação e carregou-se o sobrenadante numa coluna de SP-sefarose de fluxo rápido, equilibrada com NaAc 20 mM, NaCl 100 mM, a pH 5 (carga de proteína de 10 mg/mL, à temperatura ambiente). Eluiu-se a proteína utilizando um gradiente de volume da coluna de 20 no mesmo tampão variando de NaCl 100 mM até NaCl 500 mM. Diluiu-se todo o conjunto da coluna, 3 vezes, e carregou-se numa coluna SP-sefarose HP em NaAc 20 mM, NaCl 150 mM, a pH 5 (carga de proteína de 10 mg/mL, à temperatura ambiente) . Eluiu-se a proteína utilizando um gradiente de volume da coluna de 20, no mesmo tampão, variando de NaCl 150 mM até NaCl 400 mM. Juntaram-se os picos e filtraram-se. 76 III. A seguir dá-se um sumário dos dados in vivo de ratos com vários compostos da presente invenção.

Ratos. Ratos fêmeas BDFI, normais, aproximadamente com 10-12 semanas de idade.

Esquema de hemorragia. Dez ratos por grupo tratados no dia 0, dois ratos iniciados 4 dias à parte de um total de 20 ratos por grupo. Cinco ratos sangrados em cada intervalo de tempo, os ratos foram sangrados no minimo três vezes por semana. Os ratos foram anestesiados com isoflurano e obteve-se um volume total de sangue de 140-160 pL por punção do sinus orbital. Fez-se a contagem do sangue num analisador de sangue H1E da Technicon com um programa informático para sangue de murino. Os parâmetros medidos foram as células dos glóbulos brancos do sangue, as células dos glóbulos vermelhos do sangue, o hematócrito, a hemoglobina, as plaquetas e os neutrófilos.

Tratamentos. Os ratos foram injectados subcutaneamente quer com um tratamento de injecção ou com um implante, com bombas micro-osmóticas de 7 dias, para libertação continua. As injecções subcutâneas foram dadas num volume de 0,2 mL. As bombas osmóticas foram inseridas numa incisão subcutânea feita na pele entre a escápula dos ratos anestesiados. Diluiram-se os compostos com SBF com ASB a 0,1 %. Todas as experiências incluíram um grupo de controlo, designado por "veículo", que foi tratado apenas com este diluente. A concentração dos artigos ensaiados nas bombas foi ajustada, de tal maneira que a velocidade do fluxo calibrado das bombas deu os níveis de tratamento indicados nos gráficos.

Compostos. Libertou-se uma titulação da dose do composto para o rato em bombas micro-osmóticas de 7 dias. 77

Os ratos foram tratados com vários compostos numa única dose de 100 pg/kg, em bombas osmóticas de 7 dias. Alguns dos mesmos compostos foram dados aos ratos como uma única inj ecção.

Resultados dos ensaios de actividade. Os resultados das experiências de actividade estão indicados nas figuras 4 e 5. Nos ensaios de resposta à dose, utilizando bombas micro-osmóticas, durante 7 dias (dados não mostrados), o efeito máximo foi verificado com o composto da SEQ ID N°. 18 a 100 pg/kg/dia; a dose de 10 pg/kg/dia foi maximamente activa a cerca de 50 % e 1 pg/kg/dia foi a dose mais baixa à qual a actividade podia ser vista neste sistema de ensaio. O composto, a uma dose de 10 pg/kg/dia, foi igualamente activo como 100 pg/kg/dia de rHu-FDCM sem tratamento com polietileno-glicol, na mesma experiência. IV. Discussão É bem aceite que FDCM actua de uma forma semelhante à hormona do crescimento humano (HCh), isto é, uma molécula do ligando da proteína liga duas moléculas do receptor para a sua activação (Wells, J.A. et al., Ann. Rev. Biochem. 65: 609-634 (1996) ) . Esta interacção é escamoteada pela acção do péptido de TMP, que é muito mais pequeno. Contudo, os actuais estudos sugerem que este mimetismo requer a acção concertada de duas moléculas de TMP, como dimerização covalente de TMP quer de uma forma paralela C-C ou de uma forma sequencial C-N, o que aumenta a potência biológica in vitro do monómero original de um factor maior do que 103. A biopotência relativamente baixa do monómero, é provavelmente devida à formação ineficiente do dímero não covalente. Um dímero covalente formado tem a capacidade de eliminar a barreira da entropia para a formação de um 78 dímero não covalente, que é exclusivamente produzido por interacções fracas, não covalentes, entre as duas moléculas do péptido pequeno de 14 residuos. É interessante notar que a maior parte dos dimeros em tandem são mais potentes que os dimeros paralelos, de terminal C. A dimerização, em tandem, parece dar à molécula uma melhor conformação do que a dimerização em paralelo de C-C. A caracteristica aparentemente assimétrica de um dimero em tandem pode fazer com que ele esteja mais próximo do ligando natural o qual, como uma molécula assimétrica, utiliza dois sitios diferentes para ligar duas moléculas receptoras idênticas. A introdução da parte de PEG foi pensada para melhorar a actividade in vivo do péptido modificado conferindo-lhe protecção contra a degradação proteolitica e retardando a sua purificação através da filtração renal. Não é expectável que o tratamento com polietileno-glicol possa aumentar mais a bioactividade in vitro de um péptido de TMP dimerizado em tandem no ensaio de proliferação à base das células. V. Dá-se a seguir um resumo dos dados, in vivo, em macacos com vários compostos da presente invenção.

Para avaliar os parâmetros hematológicos em macacos rhesus fêmeas associados com a administração de TMP, por uma via de administração subcutânea, realizou-se o protocolo que se segue. Juntaram-se cinco grupos de três macacos cada. 0 grupo 1 serviu como controlo e recebeu tampão de acetato (acetato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,25 M, a pH 5) não contendo TMP tratado com polietileno-glicol, nem FDCM humano recombinante (PEG-FDCMHur). O grupo 79 2 recebeu uma ou mais doses de TMP nos intervalos indicados a seguir; o grupo 3 recebeu 1.000 yg/kg de TMP nos intervalos indicados a seguir; o grupo 4 recebeu 5.000 yg/kg de TMP nos intervalos indicados a seguir; e o grupo 5 recebeu 100 yg/kg de PEG-FDCMHur nos intervalos indicados a seguir. O dia em que a primeira dose única foi administrada foi designado como dia 0 do ciclo 1. No ciclo 2, administraram-se doses nos dias 21, 23, 25, 28, 30 e 32. Durante o ciclo 3, administrou-se uma única dose no dia 84 e no ciclo 4, administrou-se uma única dose no dia 123. Observaram-se os animais quanto aos seus sinais clínicos, uma vez por dia, durante o período de aclimatação, três vezes por dia (antes da dosagem, 30 minutos imediatamente após a dosagem e 2 a 3 horas depois da dosagem) , nos dias da dosagem e uma vez por dia nos dias em que não receberam nenhuma dose. Calculou-se o consumo diário de alimentos com base no número de peças de alimentos dadas e no número deixado para cada animal durante os 7 dias antes do início do período de dosagem até ao fim do período de recuperação. Mediu-se o peso do corpo de cada animal, duas vezes, antes dos regimes de dosagem e duas vezes durante a dosagem e os períodos de recuperação. As amostras de sangue para a hematologia, foram preparadas uma vez antes da iniciação da dosagem e uma vez nos dias 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20 22, 24, 26, 29, 31 , 69, , 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 99, 101, 103, 105, 111 , 122, 124, 126, 128, . 130 , 132, 134 136, 138, 140, 142, 144, 150. Para a análise fármaco-cinética, recolheram-se amostras de soro de 0,5 mL, uma vez antes da dosagem e uma vez às 1, 4 e 24 horas após a dosagem. Recolheram-se amostras nos dias 0, 21, 32, 84 e 123 e armazenaram-se a, aproximadamente, -70 °C até à análise. Para a análise do anticorpo, recolheram-se 80 amostras de sangue de 2 mL, uma semana antes da dose única e uma semana nos dias 0 (antes da dosagem), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 111, 118, 129, 136, 143 e 150. Armazenaram-se as amostras a -70 °C até à análise.

Os resultados indicaram que os valores das plaquetas aumentaram em todos os grupos tratados, tendo-se visto o aumento maior nos grupos de PEG-FDCMHur e nos grupos de dose elevada de TMP. No ciclo 1, o pico dos valores das plaquetas aumentou, aproximadamente 3,3 vezes e 3,1 vezes no grupo de PEG-FDCMHur (dia 9) e no grupo de 5.000 pg/kg de TMP (dia 9), respectivamente, comparados com a contagem média de plaquetas no grupo de controlo. Os valores de plaquetas para a dose baixa de TMP, aumentaram aproximadamente 1,5 vezes mais do que os do grupo de controlo nos mesmos dias especificados do estudo. Obtiveram-se respostas similares em todos os outros ciclos.

Contudo, no ciclo 4, o grupo de PEG-FDCMHur não demonstrou um aumento tão grande na contagem de plaquetas como nos ciclos anteriores. O grupo de PEG-FDCMHur aumentou as contagens das plaquetas de, aproximadamente, 2 vezes em relação ao grupo de controlo, 9 dias depois da dose deste ciclo. Para comparação, a contagem média de plaquetas para o grupo da dose mais elevada de TMP no ciclo 4, foi 3,3 vezes mais alto do que o grupo de controlo. Adicionalmente, os animais de PEG-FDCMHur tinham uma contagem média de plaquetas de 53 %, inferior à contagem média de plaquetas do grupo de controlo no inicio do ciclo 4 (por dose) e à contagem média de plaquetas para o grupo no fim do ciclo 4* (27 dias após a dose), foi 79 % inferior ao do grupo de controlo. Para todos os animais de TMP, as contagens médias de plaquetas no inicio e no fim do ciclo 4, foram + 15 % 81 das contagens de plaquetas no grupo de controlo.

Nos ciclos 1 e 2, notou-se uma tendência para um decréscimo nas contagens das células dos glóbulos vermelhos do sangue (CGV) em todos os grupos tratados, quando comparados com o controlo. 0 decréscimo foi mais evidente nos dias 41 a 43 e o maior decréscimo nas CGV foi notado no grupo de PEG-FDCMHur. As contagens começaram a voltar aos niveis normais (quando comparadas com as do controlo), próximo do dia 47. Os niveis de células dos glóbulos brancos (CGB) durante os ciclos 1 e 2 aumentaram drasticamente (2,6 vezes), quando comparados com os do controlo no dia 35. Notou-se um ligeiro aumento no grupo tratado com 5.000 pg/kg de TMP no dia 33. Os valores passaram para niveis normais (controlo) a começar no dia 37. Observou-se uma resposta semelhante no ciclo 3 sem alteração aparente nas CGB no ciclo 4 em qualquer um dos grupos tratados.

Durante o ciclo 3, as contagens de CGV decresceram ligeiramente no dia 3 (no seguimento da dose única do ciclo 3) em todos os grupos tratados, excepto o grupo de 500 pg/kg de TMP. Os valores de CGV começaram a voltar aos niveis normais (quando comparados com o controlo) no dia 17 .

No ciclo 4, as contagens de CGV decresceram em todos os grupos tratados, quando comparadas com o grupo de controlo, excepto no grupo de 500 pg/kg de TMP. Ao contrário dos outros ciclos, houve mais do que um ponto mais baixo presente neste ciclo. Estes decréscimos apareceram nos dias 1-9 após a dose e começaram a recuperar próximo do dia 11. 82

Os resultados indicaram que um aumento na contagem das plaquetas, acima do dos animais de controlo, podia ser detectado 7 a 9 dias após a dosagem, em todos os animais tratados, em todos os ciclos ensaiados. Pareceu que a fase de dose repetida causou uma resposta mais elevada na produção de plaquetas, quando comparada com as fases de doses únicas. No ciclo 4, a resposta das plaquetas provocada pelo grupo PEG-FDCMHur foi inferior, comparada com os ciclos anteriores e comparada com a resposta à dose elevada de TMP. Os decréscimos nas contagens das CGV, foram assinalados nos ciclos 1, 2, 3 e 4 na maior parte dos grupos tratados, nalguns pontos, durante cada ciclo do estudo, contudo, todos os parâmetros hematológicos voltaram aos níveis normais (quando comparados com o controlo) após cessar a dosagem.

Em resumo, estes resultados indicam que o tratamento com TMP foi bem tolerado nos macacos rhesus e que o TMP resultou num aumento das contagens das plaquetas após vários ciclos de tratamento. Não parece, com base nos resultados da contagem de plaquetas, que haja uma resposta significativa sob o ponto de vista biológico mediada pelo sistema imunitário ao TMP. Pelo contrário, o tratamento nos vários ciclos com PEG-FDCMHur mostrou uma inibição na resposta das plaquetas no ciclo 4, sugerindo que os anticorpos a PEG-FDCMHur tinham sido gerados e que estes anticorpos anti-FDCM podiam reagir de uma forma cruzada com a TPO endógena dos macacos rhesus. 83

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Amgen Inc. <120> Compostos trombopoiéticos <130> EP68 97 41IHV21Opau <140> ainda não atribuído <141> em conjunto <150> EP 06 022 333.6 <151> 1999-10-22 <150> EP 99 970 998.3 <151> 1999-10-22 <150> 60/105.348 <151> 1998-10-23 < 16 0 > 4 6 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: péptido <4 0 0> 1

Ala

Ile Glu Gli Pro Tre Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg 15 10 84 <210> 2

<211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: péptido <22 0> <223> 0 péptido é uma subunidade de um homodimero: subunidades no dimero estão ligadas covalentemente em cada terminação carboxi através de uma ligação de péptido com NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(C0NH2)-NH-C0-CH2- CH2-NH2 <400> 2

Ile Glu Gli Pro Tre Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 15 10

<210> 3 <211> 684 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 3 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgt ccagctccgg aactcctggg gggaccgbca 60 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 85 aaagggcagc aagaaccagg gagtgggaga tccgacggct gggaacgtct agcctctccc cccgagaacc tcagcctgac gcaatgggca ccttcttcct tctcatgctc tgtctccggg acaggtgtac ctgcctggtc gccggagaac ctacagcaag cgtgatgcat taaa accctgcccc aaaggcttct aactacaaga ctcaccgtgg gaggctctgc catcccggga atcccagcga ccacgcctcc acaagagcag acaaccacta tgagctgacc 420 catcgccgtg 480 cgtgctggac 540 gtggcagcag 600 cacgcagaag 660 684

<210> 4 <211> 684 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 4 tacctgtttt gagtgtgtac aggtggaaca cagaaggaga aggggggttt tgggttcctg tgtacgcacc accacctgca ctcggtgctt ctgccgcacc tccacgtatt acggttctgt atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac ttcacgttcc agaggttgtt tcgggagggt tttcccgtcg gggctcttgg tgtccacatg ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg aggctgccga ggaagaagga gatgtcgttc cccttgcaga agagtacgag gcactacgta tcggagaggg acagaggccc attt ggtcgaggcc ttgaggaccc ccctggcagt 60 tgggagtact agagggcctg gggactccag 120 ctgggactcc agtt caagtt gaccatgcac 180 ttcggcgccc tcctcgtcat gttgtcgtgc 240 gtggtcctga ccgacttacc gttcctcatg 300 cgggggtagc tcttttggta gaggtttcgg 360 tgggacgggg gtagggccct actcgactgg 420 tttccgaaga tagggtcgct gtagcggcac 480 ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg 540 gagtggcacc tgttctcgtc caccgtcgtc 600 ctccgagacg tgttggtgat gtgcgtcttc 660 684

<210> 5 <211> 228 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> artificial: péptido <223> Descrição da sequência <400> 5

Met Asp Lis Tre His Tre Cis Pro Pro Cis Pro Ala Pro Glu Leu Leu 15 10 15 86

Gli Gli Pro Ser Vai Fen Leu Fen Pro Pro Lis Pro Lis Asp Tre Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Tre Pro Glu Vai Tre Cis Vai Vai Vai Asp Vai Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Vai Lis Fen Asn Trp Tir Vai Asp Gli Vai Glu 50 55 60 Vai His Asn Ala Lis Tre Lis Pro Arg Glu Glu Gin Tir Asn Ser Tre 65 70 75 80 Tir Arg Vai Vai Ser Vai Leu Tre Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gli Lis Glu Tir Lis Cis Lis Vai Ser Asn Lis Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lis Tre Ile Ser Lis Ala Lis Gli Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120 125 Vai Tir Tre Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Tre Lis Asn Gin Vai 130 135 140 Ser Leu Tre Cis Leu Vai Lis Gli Fen Tir Pro Ser Asp Ile Ala Vai 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gli Gin Pro Glu Asn Asn Tir Lis Tre Tre Pro 165 170 175 Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gli Ser Fen Fen Leu Tir Ser Lis Leu Tre 180 185 190 Vai Asp Lis Ser Arg Trp Gin Gin Gli Asn Vai Fen Ser Cis Ser Vai 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tir Tre Gin Lis Ser Leu Ser Leu 210 215 220

Ser Pro Gli Lis 225

<210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 6

Gli Gli Gli Lis Gli Gli Gli Gli 1 5

<210> 7 <211> 8 <212> PRT 87 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 7

Gli Gli Gli Asn Gli Ser Gli Gli 1 5

<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 8

Gli Gli Gli Cis Gli Gli Gli Gli 1 5

<210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: pétido <400> 9

Gli Pro Asn Gli 1 <210> 10 88

<211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: péptido <400> 10

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Pro Asn Gli Ile Glu 20 Gli Pro Tre Leu Arg 25 Gin Trp Leu Ala Ala 30 Arg Ala

<210> 11 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <22 0> <223> Péptido ciclico: a estrutura secundária é mantida por ligações di-sulfureto entre os resíduos intramo-leculares de Cis nas posições 9 e 31 <4 0 0> 11

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Cis Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli Gli Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Cis Leu

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 12 <211> 36 89

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: péptido <400> 12

Ile Glu Gli Pro Tre Leu Arg Gin Cis Leu Ala Ala Arg Ala Gli Gli 1 5 10 15 Gli Gli Gli Gli Gli Gli Ile Glu Gli Pro Tre Arg Leu Gin Cis Leu 20 35 30 Ala Ala Arg Ala 35

<210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <4 0 0> 13

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Ala Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli Gli Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Ala Leu

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 90 <223> Descrição da sequência artificial: péptido <4 0 0> 14

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Gli Lis Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Ala Ala Arg 35 Ala

Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli 35 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu

<210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 18 está bromoacetilado artificial: péptido derivado <223> Lis residuo na posição <22 0> <223> Descrição da sequência <4 0 0> 15

Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli 35 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu

<210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> artificial: péptido <223> Descrição da sequência <4 0 0> 16 91

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli 611 Cis Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Lis na posição 18 está ligada a polietileno-glicol <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido derivado <4 0 0> 17

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli Lis Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Cis na poí sição 18 está ligada a polietileno -glicol <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido derivado <4 0 0> 18 92

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli Cis Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <4 0 0> 19

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli Asn Gli Ser 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 20 <211> 36

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Subunidade monomérica de um dimero; Subunidades do homodimero estão ligadas por uma ligação di-sulfureto entre os residuos Cis nas posições 18 de cada subunidade <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 20 93

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 21 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 21

Ile 1 Glu Gli Pro Tre 5 Leu Arg Gin Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gli 15 Gli Gli Gli Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> 0 péptido é derivado na terminação amino com uma região Fc da imunoglobulina ligada covalentemente <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 22

Ile Glu Gli Pro Tre Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gli Pro 94 1 5 10 15

Asn 611 Ile Glu Gll Pro Tre Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 20 25 30

<210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação carboxi e amino numa região Fc de imunoglobulina <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 23

Ile 1 Glu Gll Pro Tre 5 Leu Arg Gin Trp Leu 10 Ala Ala Arg Ala Gll 15 Pro Asn Gll Ile Glu 20 Gll Pro Tre Leu Arg 25 Gin Trp Leu Ala Ala 30 Arg Ala

<210> 24 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação carboxi numa região Fc de imunoglobulina <220> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 24

Ile Glu Gll Pro Tre Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gll Gll 95 1 5 10 15 Gli Gli Gli Gli 20 Gli Gli Ile Glu Gli 25 Pro Tre Leu Arg Gin 30 Trp Leu Ala Ala Arg 35 Ala

<210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Ο péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 25

Gli 1 Gli Ile Glu Gli 5 Pro Tre Leu Arg Gin 10 Trp Leu Ala Ala Arg 15 Ala Gli Pro Asn Gli 20 Ile Glu Gli Pro Tre 25 Leu Arg Gin Trp Leu 30 Ala Ala

Arg Ala

<210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 26 96

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 27 <211> 36

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <22 0> <223> Péptido ciclico; a estrutura secundária mantém-se por uma ligação de di-sulfureto entre os resíduos Cis intramoleculares nas posições 9 e 31 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 27

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 28 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 97 <223> Ο péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 28

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <22 0> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <400> 29

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 30 <211> 36 <212> PRT 98 <213> Sequência artificial <220> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <220> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 30

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 31 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 31

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 32 99

<211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <22 0> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <400> 32

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 33 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <220> <223> 0 péptido é uma subunidade de um homodimero; as subunidades no homodimero estão ligadas covalentemente através de uma ligação de di-sulfureto entre os resíduos Cis nas posições 18 de cada subunidade <22 0> 100 <223> Ο péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <400> 33

Ala Ala Arg Ala 35

<210> 34 <211> 41 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <22 0> <223> 0 péptido está ligado covalentemente à terminação amino numa região Fc de imunoglobulina <400> 34

Gli 1 Gli Gli Gli Gli 5 Ile Glu Gli Pro Tre 10 Leu Arg Gin Trp Leu 15 Ala Ala Arg Ala Gli 20 Gli Gli Gli Gli Gli 25 Gli Gli Ile Glu Gli 30 Pro Tre Leu Arg Gin 35 Trp Leu Ala Ala Arg 40 Ala

<210> 35 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 101 <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 35 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60

<210> 36 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 36 acctccacca ccagcacgag cagccagcca ctgacgcaga gtcggacc 48 <210> 37 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequênc <4 0 0> 37 ggtggtggac cgcgca [ gtggcggcgg aggtattgag <210> 38 <211> 76 <212> ADN <213> <22 0> Sequência artificial artificial: oligonucleótido ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 60 66 102 <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 38 aaaaaaagga tcctcgagat tatgcgcgtg ctgcaagcca ttggcgaagg gttgggccct 60 caatacctcc gccgcc 76 <210> 39 <211> 126 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 39 agtggctggc tgctcgtgct 60 ttcgccaatg gcttgcagca 120 126 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc cgcgca

<210> 40 <211> 124 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 40 ccaggctgag acgcagtcac cgaccgacga gcacgaccac cacctccacc gccgcctcca 60 taactcccgg gttgggaagc ggttaccgaa cgtcgtgcgc gtattagagc tcctaggaaa 120 aaaa 124

<210> 41 <211> 42 <212> PRT 103 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: péptido <400> 41

Lis 1 Gli Gli Gli Gli 5 Gli Ile Glu Ala Ala Arg Ala 20 Gli Gli Gli Gli Tre Leu Arg 35 Gin Trp Leu Ala Ala 40

Gli Pro 10 Tre Leu Arg Gin Trp 15 Leu Gli 25 Gli Gli Gli Ile Glu 30 Gli Pro Arg Ala <210> 42 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <400> 42 aacataagta cctgtaggat cg 22 <210> 43 <211> 52 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <400> 43 ttcgatacca ccacctccac ctttacccgg artificial: oligonucleótido artificial: oligonucleótido agacagggag aggctcttct gc 52 104

<210> 44 <211> 861 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 44 tctagatttg ttttaactaa ttaaaggagg aataacatat ggacaaaact cacacatgtc 60 caccttgtcc agctccggaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 120 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 180 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 240 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 300 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 360 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 420 aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 480 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 540 cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 600 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 660 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 720 aaggtggagg tggtggtatc gaaggtccga ctctgcgtca gtggctggct gctcgtgctg 780 gtggtggagg tggcggcgga ggtattgagg gcccaaccct tcgccaatgg cttgcagcac 840 gcgcataatc tcgaggatcc g 861

<210> 45 <211> 861 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido <400> 45 agatctaaac aaaattgatt aatttcctcc ttattgtata cctgttttga gtgtgtacag 60 gtggaacagg tcgaggcctt gaggaccccc ctggcagtca gaaggagaag gggggttttg 120 ggttcctgtg ggagtactag agggcctggg gactccagtg tacgcaccac cacctgcact 180 cggtgcttct gggactccag ttcaagttga ccatgcacct gccgcacctc cacgtattac 240 ggttctgttt cggcgccctc ctcgtcatgt tgtcgtgcat ggcacaccag tcgcaggagt 300 ggcaggacgt ggtcctgacc gacttaccgt tcctcatgtt cacgttccag aggttgtttc 360 105 gggagggtcg ggggtagctc ttttggtaga tccacatgtg ggacgggggt agggccctac cggaccagtt tccgaagata gggtcgctgt gcctcttgtt gatgttctgg tgcggagggc tgtcgttcga gtggcacctg ttctcgtcca actacgtact ccgagacgtg ttggtgatgt ttccacctcc accaccatag cttccaggct caccacctcc accgccgcct ccataactcc cgcgtattag agctcctagg c ggtttcggtt tcccgtcggg gctcttggtg 420 tcgactggtt cttggtccag tcggactgga 480 agcggcacct caccctctcg ttacccgtcg 540 acgacctgag gctgccgagg aagaaggaga 600 ccgtcgtccc cttgcagaag agtacgaggc 660 gcgtcttctc ggagagggac agaggcccat 720 gagacgcagt caccgaccga cgagcacgac 780 cgggttggga agcggttacc gaacgt cgtg 840 861

<210> 46 <211> 269 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> artificial: péptido <223> Descrição da sequência <400> 46

Met Asp Lis Tre His Tre Cis Pro 1 5 Gli Gli Pro Ser Vai Fen Leu Fen 20 Met Ile Ser Arg Tre Pro Glu Vai 35 40 His Glu Asp Pro Glu Vai Lis Fen 50 55 Vai His Asn Ala Lis Tre Lis Pro 65 70 Tir Arg Vai Vai Ser Vai Leu Tre 85 Gli Lis Glu Tir Lis Cis Lis Vai 100 Ile Glu Lis Tre Ile Ser Lis Ala 115 120 Vai Tir Tre Leu Pro Pro Ser Arg 130 135 Ser Leu Tre Cis Leu Vai Lis Gli 145 150 Glu Trp Glu Ser Asn Gli Gin Pro 165 Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gli Ser 180 Vai Asp Lis Ser Arg Trp Gin Gin 195 200 Met His Glu Ala Leu His Asn His 210 215 Ser Pro Gli Lis Gli Gli Gli Gli

Pro Cis 10 Pro Ala Pro Glu Leu 15 Leu Pro 25 Pro Lis Pro Lis Asp 30 Tre Leu Tre Cis Vai Vai Vai 45 Asp Vai Ser Asn Trp Tir Vai 60 Asp Gli Vai Glu Arg Glu Glu 75 Gin Tir Asn Ser Tre 80 Vai Leu 90 His Gin Asp Trp Leu 95 Asn Ser 105 Asn Lis Ala Leu Pro 110 Ala Pro Lis Gli Gin Pro Arg 125 Glu Pro Gin Asp Glu Leu Tre 140 Lis Asn Gin Vai Fen Tir Pro 155 Ser Asp Ile Ala Vai 160 Glu Asn 170 Asn Tir Lis Tre Tre 175 Pro Fen 185 Fen Leu Tir Ser Lis 190 Leu Tre Gli Asn Vai Fen Ser 205 Cis Ser Vai Tir Tre Gin Lis 220 Ser Leu Ser Leu Gli Ile Glu Gli Pro Tre Leu Arg 106 225 230 235 240

Gin Trp Leu Ala Ala 245 Arg Ala Gli Gli Gli 250 Gli Gli Gli Gli Gli Ile 255 Glu Gli Pro Tre 260 Leu Arg Gin Trp Leu 265 Ala Ala Arg Ala

Lisboa, 24 de Junho de 2013. 107

Claims

REINVINDICAÇÕES 1. Composto que se liga a um receptor mpl, caracterizado pelo facto de compreender a estrutura TMPi- (Li) n-TMP2 em que o terminal C do péptido TMPi se liga ao terminal C do péptido TMP2, por via de Li e em que TMPi e TMP2 se seleccionam, cada um, independentemente, no grupo de compostos nucleares que compreendem a estrutura seleccionada no grupo que consiste em: (a) X2-X3_X4-X5_X6-X7' em que, -X8_X9-Xl0í X2 selecciona-se no Lis e Vai; grupo que consiste em Glu X3 selecciona-se no Ala; 0 X4 representa Pro; grupo que consiste em Gli X5 selecciona-se no Ser ; grupo que consiste em Tre Χδ selecciona-se no Ile, Vai, Ala e Fen; grupo que consiste em Leu X7 selecciona-se no Lis; grupo que consiste em Arg X8 selecciona-se no Asn e Glu; grupo que consiste em Gin X9 selecciona-se no Tir, Cis, Ala e Fen; grupo que consiste em Trp X10 selecciona-se no grupo que Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; (b) X2 — X3 — X4 — X5 — Xe~X7 — Χδ— X9 — XlO r consiste em Leu 1 em que, X2 selecciona-se no grupo que Asp, Lis e Vai; X3 representa Ala r X4 representa Pro r X5 selecciona-se no grupo que Ser; X6 selecciona-se no grupo que Ile, Vai, Ala e Fen; X7 selecciona-se no grupo que Lis; X8 selecciona-se no grupo que Asn e Glu; X9 selecciona-se no grupo que Tir, Cis, Ala e Fen; X10 selecciona-se nc 1 grupo que Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; (c) X2 X3-X4-X5~X6-X7-X8-X9-Xl0 r consiste em Glu, consiste em Tre e consiste em Leu, consiste em Arg e consiste em Gin, consiste em Trp, consiste em Leu, em que, X2 selecciona-se no grupo que consiste em Glu, Asp, Lis e Vai; X3 selecciona-se no grupo que consiste em Gli e Ala; X4 representa Pro; X5 representa Ser; Xe selecciona-se no grupo que consiste em Leu, Ile, Vai, Ala e Fen; X7 selecciona-se no grupo que consiste em Arg e Lis; Xs selecciona-se no grupo que consiste em Gin, Asn e Glu; Xg selecciona-se no grupo que consiste em Trp, Tir, Cis, Ala e Fen; X10 selecciona-se no grupo que consiste em Leu, 2 Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; (d) X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10, em que, X2 selecciona-se no grupo que Asp, Lis e Vai; X3 selecciona-se no grupo que Ala; X4 representa Pro r X5 selecciona-se no grupo que Ser ; Χδ selecciona-se no grupo que Vai, Ala e Fen; X7 selecciona-se no grupo que Lis; Xs selecciona-se no grupo que Asn e Glu; Xg selecciona-se no grupo que Tir, Cis, Ala e Fen; X10 selecciona-se nc ' grupo que Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; (e) X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10, consiste em Glu, consiste em Gli e consiste em Tre e consiste em Ile, consiste em Arg e consiste em Gin, consiste em Trp, consiste em Leu, em que, X2 selecciona-se no Asp, Lis e Vai; X3 selecciona-se no Ala; X4 representa Pro; X5 selecciona-se no Ser ; Χβ selecciona-se no Ile, Vai, Ala e Fen; X7 representa Lis; Xs selecciona-se no Asn e Glu; grupo que consiste em Glu, grupo que consiste em Gli e grupo que consiste em Tre e grupo que consiste em Leu, grupo que consiste em Gin, 3 X9 selecciona-se no grupo que consiste em Trp, Tir, Cis, Ala e Fen; Xio selecciona-se no grupo que consiste em Leu, Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; (f) r em que, X2 selecciona-se no grupo que Asp, Lis e Vai; X3 selecciona-se no grupo que Ala; X4 representa Pro , X5 selecciona-se no grupo que Ser; X6 selecciona-se no grupo que Ile, Vai, Ala e Fen; X7 selecciona-se no grupo que Lis; X8 selecciona-se no grupo que Asn; X9 selecciona-se no grupo que Tir, Cis, Ala e Fen; X10 selecciona-se nc 1 grupo que Ile, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; (g) X2 X3 X4~X5~X6-X7 —^8-XlO/ consiste em Glu, consiste em Gli e consiste em Tre e consiste em Leu, consiste em Arg e consiste em Gin e consiste em Trp, consiste em Leu, em que, X2 selecciona-se no grupo que consiste em Glu, Asp, Lis e Vai; X3 selecciona-se no grupo que consiste em Gli e Ala; X4 representa Pro; X5 selecciona-se no grupo que consiste em Tre e Ser; Xe selecciona-se no grupo que consiste em Leu, Ile, Vai, Ala e Fen; 4 X7 selecciona-se no Lis; grupo que consiste em Arg e Xs selecciona-se no Asn e Glu; grupo que consiste em Gin, X9 selecciona-se no Cis, Ala e Fen; grupo que consiste em Tir, Xio selecciona-se no lie, Vai, Ala, Fen, e (h) X2-X3_X4_X5_X6-X7~ em que, grupo que Met e Lis; Xg-Xg-Xio, consiste em Leu, X2 selecciona-se no Asp, Lis e Vai; grupo que consiste em Glu, X3 selecciona-se no Ala; X4 representa Pro; grupo que consiste em Gli e X5 selecciona-se no Ser; grupo que consiste em Tre e X6 selecciona-se no lie, Vai, Ala e Fen; grupo que consiste em Leu, X7 selecciona-se no Lis ; grupo que consiste em Arg e Xs selecciona-se no Asn e Glu; grupo que consiste em Gin, Xg selecciona-se no Cis, Ala e Fen; grupo que consiste em Tir, X10 selecciona-se no ' grupo que consiste em Leu, Vai, Ala, Fen, Met e Lis; e em que Li representa um ligante; e n representa 0 ou 1; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico. 5
2. Composto, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo facto de os referidos TMPi e se selecionarem, independentemente no grupo consiste em: X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0-Xll'· X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0-Xll-Xl2; X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0-Xll-Xl2-Xl3; X2-X3-X4~X5-X6-X7-X8-X9-Xl0-Xll-Xl2-Xl3-Xl4; Xl-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0; Xl-X2“X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0_Xll'· Xl-X2_X3-X4_X5_X6_X7_X8_X9-Xl0_Xll_Xl2; Xl-X2-X3-X4_X5_X6_X7_X8_X9-Xl0_Xll_Xl2-Xl3; Θ Xl-X2-X3-X4_X5_X6_X7_X8_X9-Xl0_Xll_Xl2_Xl3-Xl4; em que X2 a X10 têm os significados definidos e Xi a X14 seleccionam-se no grupo que consiste em: (a) Xi selecciona-se no grupo que consist Ile, Ala, Vai, Leu, Ser e Arg; Xu selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Vai, Leu, Fen, Ser, Tre, Lis, His e Glu; X12 selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Vai, Leu, Fen, Gli, Ser e Gin; X13 selecciona-se no grupo que consiste em Lis, Tre, Vai, Asn, Gin e Gli; e X14 selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Vai, Leu, Fen, Tre, Arg, Glu e Gli; (b) Xi selecciona-se no grupo que consist Ile, Ala, Vai, Leu, Ser e Arg; Xu selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Vai, Leu, Fen, Tre, Lis, His e Glu; X12 selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Vai, Leu, Fen, Gli, Ser e Gin; 1, TMP2 que e Xu e em Ala, Ala, Arg, AI a, e em AI a, AI a, 6 Xi3 selecciona-se no grupo que consiste em Arg, Lis, Tre, Vai, Asn , Gin e Gli; e Xi4 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai, Leu, Fen , Tre, Arg, Glu e Gli; vt (c) Χχ selecciona-se no grupo que consiste em Ile, Ala, Vai, Leu , Ser e Arg; Xxx selecciona-se no grupo que consiste em AI a, Ile, Vai, Leu, Fen , Ser, Tre, Lis, His e Glu; Χχ2 selecciona-se no grupo que consiste em AI a, Ile, Vai, Leu, Gli , Ser e Gin; Χχ3 selecciona-se no grupo que consiste em Arg, Lis, Tre, Vai, Asn , Gin e Gli; e Χχ4 selecciona-se no grupo que consiste em Ala, Ile, Vai, Leu, Fen , Tre, Arg, Glu e Gli.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, nesse composto, os referidos ΤΜΡχ e/ou TMP2 derivarem de uma ou mais das situações que se seguem: uma ou mais das ligações de peptidilo [-C(0)NR-] foram substituídas por uma ligação não peptidílica, tal como, uma ligação de -CH2-carbamato [-CH2-0C(0)NR-]; uma ligação fosfonato; uma ligação de -CH2-sulfonamida [-CH2-S (0) 2NR-] ; uma ligação de ureia [-NHC(0)NH-]; uma ligação de -CH2-amina secundária; ou uma ligação de peptidilo alquilado [-C(0)NR6-] em que R6 representa alquilo inferior; a terminação N é um grupo -NRR1; um grupo -NRC(0)R; um grupo -NRC(0)0R; um grupo -NRS(0)2R; um grupo -NHC(0)NHR, em que R e R1 representam hidrogénio ou alquilo inferior, com a condição de que R e R1 não representem ambos hidrogénio; um grupo succinimida; 7 um grupo benziloxi-carbonil-NH-(CBZ-NH-); ou um grupo benziloxicarbonil-NH-, comportando de 1 a 3 substituintes no anel de fenilo, seleccionados no grupo que consiste em alquilo inferior, alcoxi inferior, cloro ou bromo; e o terminal C é -C(0)R2, em que R2 se selecciona no grupo que consiste em alcoxi inferior e -NR3R4, em que R3 e R4 se seleccionam, independentemente, no grupo que consiste em hidrogénio e alquilo inferior.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser ciclico.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de Li, no composto, conter um péptido.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de Li conter Yn, em que Y representa um aminoácido de ocorrência natural ou um seu estereoisómero e n representa 1 a 20.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de Li conter (Gli)n em que n representa 1 a 20 e, quando n é maior do que 1, até metade dos resíduos de Gli podem ser substituídos por um outro aminoácido selecionado nos 19 aminoácidos naturais remanescentes ou num seu estereoisómero.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de Li se selecionar no grupo que consiste em (Gli)3Lis(Gli)4 (SEQ ID N°. 6); (Gli) sAsnGliSer(Gli)2 (SEQ ID N°. 7) (Gli)3Cis(Gli)4 (SEQ ID N°. 8); e 8 GliProAsnGli (SEQ ID N°. 9).
9. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de, nesse composto, Li conter um resíduo Cis.
10. Dímero do composto de acordo com a reivindicação 9.
11. Dímero, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser representado por ™PrGly3-Cys-Gly4-TMP2 TMPrGly3*Cys-Gly4-TMP2.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, nesse composto, Li conter (CH2) n em que n representa 1 a 20.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se selecionar no grupo que consiste em: IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 10) ; IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) (SEQ ID N2 . ii); IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ ID N° . 12) ; IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID N° . 13) ; IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 14) ; IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 15) ; IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 16) ; IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 17) ; IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 18) ; IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N° . 19) ; IEGP TLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA I 1 IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID Ne . 20) 9 e IEGPTLROWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID N°. 21)
14. Composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo facto de se utilizar no (a) aumento do número de megacariócitos ou de plaquetas num doente que disso necessite; (b) tratamento de trombocitopénia num doente que disso necessite; (c) tratamento de trombocitopénia idiopática ou imunitária (TPI) num doente que disso necessite; ou (d) tratamento de um sindrome mielodisplásico num doente que disso necessite.
15. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 13 caracterizada pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento para (a) o aumento do número de megacariócitos ou das plaquetas num doente que disso necessite; (b) o tratamento de trombocitopénia num doente que disso necessite; (c) o tratamento de trombocitopénia idiopática ou imunitária (TPI) num doente que disso necessite; ou (d) o tratamento do sindrome mielodisplásico num doente que disso necessite.
16. Composto de acordo com a reivindicação 14 ou a sua utilização, de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo facto de a referida quantidade ser de 1 yg/kg a 100 mg/kg.
17. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um composto de acordo com uma qualquer das 10 reivindicações 1 a 13, misturado com um seu veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
18. Polinucleótido caracterizado pelo facto de codificar um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 13.
19. Polinucleótido, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de codificar um composto com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 34 ou na SEQ ID NO: 46.
20. Polinucleótido, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o composto com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 34 ou na SEQ ID NO: 46 ser um dimero.
21. Vector caracterizado pelo facto de compreender um polinucleótido de acordo com a reivindicação 18 ou 19.
22. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de compreender um vector de acordo com a reivindicação 21.
23. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo facto de a referida célula hospedeira ser uma célula de E. coli.
24. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo facto de a referida E. coli ser a GM221 de E. coli depositada na ATCC com o número de acesso 98957.
25. Processo para a produção do composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo 11 facto de compreender o crescimento da célula hospedeira, de acordo com uma qualquer das reivindicações 22 a 24, num meio nutriente adequado e o isolamento do referido composto a partir das referidas células ou do referido meio nutriente. Lisboa, 24 de Junho de 2013. 12