BR9914698B1 - Composto que se liga a um receptor mp1, e , composição farmacêutica. - Google Patents

Description

"COMPOSTO QUE SE LIGA A UM RECEPTOR MP1, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA".

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S.

Serial 60/105.348, depositado em 23 de outubro de 1998.

CAMPO DA INVENÇÃO

De uma forma geral, a invenção diz respeito ao campo dos compostos, especialmente peptídeos e polipeptídeos, que possuem atividade trombopoiética. Os compostos da invenção podem ser usados para aumento da produção de plaquetas ou precursores de plaquetas (por exemplo os megacariócitos) em um mamífero.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito a compostos, especialmente peptídeos, que têm a capacidade de estimular a produção in vitro e in vivo de plaquetas e suas células precursoras, tais como os megacariócitos. Antes de examinar a natureza dos compostos da invenção, o seguinte é fornecido como uma base relativamente a duas proteínas que têm atividade trombopoiética: a trombopoietina (TPO) e o fator de crescimento e de desenvolvimento megacariócito (MGDF). A clonagem da trombopoietina endógena (TPO) [Lok et ai, Nature 369: 568-571 (1994); Bartley et ai, Cell 77: 1117-1124 (1994); Kuter etal.,Proc. Natl. Acad, Sei. USA 91:11104-11108 (1994); de Sauvage et ai, Nature 369: 533-538 (1994); Kato et ai, Journal of Biochemistry 119: 229- 236 (1995); Chang et ai, Journal de Biological Chemistry 270: 511-514 (1995)] rapidamente aumentou nosso entendimento da megacariopoiese (produção de megacariócitos) e trombopoiese (produção de plaquetas). A TPO endógena humana, uma proteína glicosilada de 60 a 70 kDa principalmente produzida no fígado e nos rins, consiste de 332 aminoácidos [Bartley et al, Cell 77:1117-1124 (1994); Chang et al, Journal de Biological Chemistry 270: 511-514 (1995)]. A proteína é altamente conservada entre diferentes espécies, e tem 23% de homologia com a eritropoietina humana [Gumey et al, Blood 85: 981-988 (1995)] no terminal amino (aminoácidos de 1 a 172) [Bartley et al, Cell 77: 1117-1124 (1994)]. A TPO endógena foi observada possuir todas as características do regulador biológico chave da trombopoiese. Suas ações in vitro incluem a indução específica das colônias de megacariócitos, tanto das células primordiais hematopoiéticas murínicas purificadas [Zeigler et al, Blood 84: 4045-4052 (1994)] quanto das células CD34+ humanas [Lok et al, Nature 369: 568-571 (1994) ; Rasko et al, Stem Cells 15: 33-42 (1997)], a geração de megacariócitos com ploidia aumentada [Broudy et al, Blood 85: 402-413 (1995) ], e a indução de maturação terminal de megacariócitos e produção de plaquetas [Zeigler et al Blood 84: 4045-4052 (1994); Choi et al, Blood 85: 402-413 (1995)]. De modo inverso, os oligodeoxinucleotídeos anti-sentido sintético ap receptor da TPO (c-Mpl) inibem significativamente a capacidade de formação de colônias dos progenitores de megacariócitos (Methia et al, Blood 82: 1395-1401 (1993)]. Além disso, camundongos knock-out c-Mpl são severamente trombocitopênicos e deficientes em megacariócitos [Alexander et al, Blood 87:2162-2170 (1996)]. MGDF recombinante humano (rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) é outro polipeptídeo trombopoiético relacionado à TPO.

Ele é produzido usando-se E. coli transformado com um plasmídeo contendo cDNA que codifica uma proteína truncada englobando o domínio de ligação do receptor de terminal amino de TPO humana [Ulich et al, Blood 86: 971- 976 (1995)]. O polipeptídeo é extraído, reduplicado e purificado, e uma porção de poli[etileno glicol] é covalentemente ligada ao terminal amino. A molécula resultante é aqui referida como PEG-rHuMGDF ou, abreviando-se, MGDF. Vários estudos usando modelos de animais [Ulich, T R» et al., Blood 86: 971-976 (1995); Hokom, Μ. M. et al, Blood 86: 4486-4492 (1995)] têm demonstrado claramente as eficácias terapêuticas da TPO e da MGDF no transplante de medula óssea e no tratamento da trombocitopenia, uma condição que freqüentemente resulta da quimioterapia ou da terapia por radiação. Dados preliminares em seres humanos têm confirmado a utilidade da MGDF em elevar as contagens de plaquetas em vários parâmetros [Basser et al, Lancet 348: 1279-1281 (1996); Kato et al, Journal of Biochemistry 119:229-236 (1995); Ulich et al, Blood 86: 971-976 (1995)]. A MGDF pode ser usada para intensificar o processo de doação de plaquetas, uma vez que a administração de MGDF aumenta as contagens de plaquetas circulantes até cerca de três vezes o valor original nos doadores de plaquetas saudáveis. A TPO e a MGDF exercem sua ação através da ligação ao receptor c-Mpl, que é expresso principalmente na superfície de certas células hematopoiéticas, tais como os megacariócitos, as plaquetas, as células CD34+ e as células progenitoras primitivas [Debili, N. et al, Blood 85: 391-401 (1995); de Sauvage, F. J. et al, Nature 369: 533-538 (1994); Bartley, T. D. et al, Cell 77: 1117-1124 (1994); [Lok, S. et al, Nature 369: 565-568 (1994).

Como a maioria dos receptores para interleucinas e hormônios protéicos, c- Mpl pertence à classe 1 da superfamília do receptor da citocina [Vigon, I. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5640-5644 (1992)]. A ativação desta classe de receptores envolve a homodimerização do receptor induzida pela ligação a ligando, que por sua vez deflagra a cascata de eventos transdutores de sinal.

Em geral, a interação de um ligando protéico com seu receptor freqüentemente ocorre em uma interface relativamente grande. No entanto, como demonstrado no caso de hormônio de crescimento humano ligado a seu receptor, apenas uns poucos resíduos chave na interface realmente contribuem para a maioria da energia de ligação (Clackson, T. et al., Science 267: 383-386 (1995)]. Isto e o fato de que a massa do ligando protéico remanescente servem apenas para apresentar os epítopos de ligação na topologia correta, toma possível obter ligandos ativos de tamanho muito menor.

Em um esforço para isto, o sistema de apresentar a biblioteca de peptídeos de fato emergiu como uma técnica poderosa na identificação de miméticos de pequenos peptídeos de grandes ligandos protéicos [Scott, J. K. et al., Science 249 (1990); Devlin, J. J. et al, Science 249: 404 (1990)].

Mediante o uso desta técnica, moléculas de peptídeos pequenos que atuam como agonistas do receptor c-Mpl foram descobertas [Cwirla, S. E. et al., Science 276:1696-1699(1997)].

Em um tal estudo, seqüências aleatórias de peptídeos pequenos apresentadas como fusões às proteínas de cobertura de fago filamentoso foram eluídas por afinidade em relação ao domínio extracelular imobilizado por anticorpo, de c-Mpl, e os fagos retidos foram enriquecidos para uma segunda rodada de purificação por afinidade. Esta seleção de ligação e o processo de repropagação foi repetido muitas vezes para enriquecer o conjunto de aglutinantes mais equilibrados. Como resultado, duas famílias de peptídeos de ligação de c-Mpl, não relacionadas uma com a outra em suas seqüências, foram primeiro identificadas. As bibliotecas de mutagênese foram então criadas para ainda otimizar os melhores aglutinantes, que finalmente conduziram ao isolamento de um peptídeo muito ativo com um IC50 = 2 nM e um EC50 = 400 nM [Cwirla, S. E. et al, Science 276'. 1696- 1699 (1997)]. Este peptídeo de 14 resíduos, designados como um TMP (para Peptídeo Mimético de TPO), não tem nenhuma homologia seqüencial a TPO ouMGDF. A estrutura deste composto de TMP é como segue;

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Tip Leu Ala Ala Arg Ala SEQID NO: 1 ou IEGPTLRQWLAARA usando abreviauras de aminoácidos de letra única.

Anteriormente, em um estudo semelhante sobre os peptídeos miméticos de EPO, um peptídeo mimético de EPO (EMP) foi descoberto usando-se a mesma técnica [Wrighton, N. C. et al, Science 273: 458-463 (1996)], e foi observado que atua como um dímero na ligação ao receptor de EPO (EPOR). O complexo (ligando)2/(receptor)2 assim formado tinha uma simetria C2 de acordo com os dados cristalográfícos de raio-X [Livnah, O. et al, Science 273: 464-471 (1996)]. Com base nesta informação estrutural, um dímero de EMP covalentemente ligado, em que os terminais C de dois monômeros EMP foram reticulados com um espaçador flexível, foi designado e observado ter ligação grandemente intensificada, bem como bioatividade in vitro/in vivo [Wrighton, N. C. et al, Nature Biotechnology 15:1261-1265(1997)].

Uma estratégia de dimerização de terminal C semelhante foi aplicada ao peptídeo mimético de TPO (TMP) [Cwirla, S. E. et al, Science 276:1696-1699 (1997)]. Observou-se que um dímero ligado termmalmente C (ligação c-c) de TMP tinha uma afinidade de ligação melhorada de 0,5 nM e uma atividade in vitro notavelmente aumentada (EC50 = 0,1 nM) em ensaios de proliferação celular [Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997)]. A estrutura deste dímero C-C de TMP é apresentada abaixo: (SEQID NO:2) Em outro aspecto da presente invenção, os dímeros em série podem ser ainda ligados a uma ou mais porções que sejam derivadas de proteínas de imunoglobulina, referidas em geral como a região Fc de tais imunoglobulinas. Os compostos resultantes são referidos como fusões de Fc dos dímeros em série de TMP. O que segue é uma breve seção de fundamentos relacionando- se com as regiões Fc dos anticorpos que são úteis em conexão com alguns dos compostos presentes.

Os anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável conhecido como “Fab”, que liga o antígeno, e um domínio constante, conhecido como “Fc” que provê a ligação às funções efetoras, tais como a fixação do complemento ou a fagocitose. A porção Fc de uma imunoglobulina tem uma meia-vida plasmática longa, enquanto o Fab tem vida curta [Capon et al, Nature 337: 525-531 (1989)].

Produtos terapêuticos protéicos têm sido construídos usando- se o domínio Fc para tentar prover meia-vida mais longa ou para incorporar funções tais como a ligação do receptor de Fc, a ligação da proteína A, a fixação do complemento e a transferência placentária, que, todas, permanecem na região Fc das imunoglobulinas [Capon et al, Nature 337: 525-531 (1989)]. Por exemplo, a região Fc de um anticorpo IgGl foi fundida à CD30-L, uma molécula que liga os receptores CD30 expressos nas células tumorais da Doença de Hodgkin, nas células do linfoma anaplástico, nas células da leucemia de células T e outros tipos de células malignas. Ver a Patente U.S. 5.480.981. AIL-10, um agente anti-inflamatório e anti-rejeição, tem sido fundida a Fcy2a,de modo a aumentar a meia-vida curta de circulação da citocina [Zheng, X. et al, The Journal of Immunology, 154: 5590-5600 (1995) ]. Estudos têm também avaliado o uso do receptor do fator de necrose tumoral ligado com a proteína Fc de IgGl humano para tratar de pacientes com choque séptico [Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med. 334: 1697-1702 (1996) ; Van Zee, K. et al, The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996)]. Fc também tem sido fundido com o receptor CD4 para produzir uma proteína terapêutica para tratamento da AIDS. Ver Capon et al, Nature 337: 525-531 (1989). Além disso, a interleucina 2 tem sido fundida à porção Fc de IgGl ou IgG3, para superar a vida-média curta da interleucina 2 e sua toxicidade sistêmica. Ver Harvill et ai, Immunotechnology, 1: 95-105 (1995). A despeito da disponibilidade de TPO e MGDF, permanece uma necessidade de prover compostos adicionais que tenham uma atividade biológica de estimular a produção da plaquetas (atividade trombopoiética) e/ou células precursoras de plaquetas, especialmente megacariócitos (atividade megacariopoiética). A presente invenção provê novos compostos tendo tal(is) atividade(s), e aspectos relacionados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção provê um grupo de compostos que são capazes de se ligarem a, e de deflagrarem um, sinal de transmembrana completo, isto é, ativar, o receptor c-Mpl, que é o mesmo receptor que medeia a atividade da trombopeoietina endógena (TPO). Assim, os compostos da invenção têm atividade trombopoiética, isto é, a capacidade de estimular, in vivo e in vitro, a produção de plaquetas, e/ou a atividade megacariocitopoiética, isto é, a capacidade de estimular, in vivo e in vitro, a produção de precursores de plaquetas.

Em uma primeira modalidade preferida, os compostos da invenção compreendem a seguinte estrutura geral: TMPKLOn-TMPs em que TMP] e TMP2 são, cada um independentemente, selecionados do grupo de compostos que compreendem a estrutura núcleo: X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xl0, em que: X2 é selecionado do grupo consistindo de Glu, Asp, Lys e Vai; X3 é selecionado do grupo consistindo de Gly e Ala; X4 é Pro;

Xs é selecionado do grupo consistindo de Thr e Ser; X6 é selecionado do grupo consistindo de Leu, Ile, Vai, Ala e Phe; X7 é selecionado do grupo consistindo de Arg e Lys;

Xg é selecionado do grupo consistindo de Gin, Asn e Glu; X9 é selecionado do grupo consistindo de Trp, Tyr e Phe;

Xio é selecionado do grupo consistindo de Leu, Ile, Vai, Ala, Phe, Met e Lys;

Li é um ligador como aqui descrito; e n é 0 ou 1; e seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Em uma modalidade, Lj compreende (Gly)n, em que n é de 1 a 20, e quando n é maior do que 1, até metade dos resíduos de Gly pode ser substituída por outro aminoácido selecionado dos 19 aminoácidos naturais remanescentes ou um de seus estereoisômeros.

Além da estrutura de núcleo X2-Xio apresentada acima para TMPí e TMP2, outras estruturas relacionadas também são possíveis, em que uma ou mais das seguintes são adicionadas à estrutura núcleo TMPí e/ou TMP2: Xi é ligado ao terminal N e/ou Xn, Xi2, Xn e/ou XM são ligados ao terminal C, em que Xi, X[2, Xl3 e X14 são como segue: Xi é selecionado do grupo consistindo de Ile, Ala, Vai, Leu, Ser e Arg;

Xn é selecionado do grupo consistindo de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His e Glu;

Xt2 é selecionado do grupo consistindo de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Gly, Ser e Gin; X13 é selecionado do grupo consistindo de Arg, Lys, Thr, Vai, Asn, Gin e Gly; e Xl4 é selecionado do grupo consistindo de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu e Gly.

Em uma segunda modalidade preferida, os compostos da invenção têm a fórmula geral: (Fc)m-(L2VTMPr(L0„-TMP2-(L3)r-(Fc)p em que TMPí, TMP2 e n são, cada um, como descritos acima; Lt, L2e L3 são grupos ligadores que são, cada um, independentemente selecionados dos grupos ligadores aqui descritos; Fc é uma região Fc de uma imunoglobulma (como aqui definido abaixo); m, p, q e r são, cada um independentemente, selecionados do grupo consistindo de 0 e 1, em que pelo menos um dentre m ou p é 1, e ainda em que, se m for 0, então q é 0, e se p for 0, então ré 0; e seus sais fisiologicamente aceitáveis. Em uma modalidade, Lu F2 e L3 independentemente compreendem (Gly)n, em que n é de 1 a 20, e quando n for maior do que 1, até metade dos resíduos de Gly pode ser substituída por outro aminoácido selecionado dos 19 amínoácidos naturais remanescentes ou um seu estereoisômero.

Os derivados dos compostos acima (descritos abaixo) são também abrangidos por esta invenção.

Os compostos desta invenção são preferivelmente peptídeos, e eles podem ser preparados por processos sintéticos padrão ou por quaisquer outros processos de preparo de peptídeos. Os compostos desta invenção que abrangem as porções não peptídicas podem ser sintetizados por reações padrão da química orgânica, além das reações padrão da química de peptídeos, quando aplicável.

Os compostos desta invenção podem ser usados para fíns terapêuticos ou profiláticos, incorporando-os com materiais portadores farmacêuticos apropriados, e administrando uma quantidade eficaz a um paciente, tal como um ser humano (ou outro mamífero). Outros aspectos relacionados também estão incluídos na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Numerosos outros aspectos e vantagens da presente invenção serão, portanto, evidentes após consideração da sua seguinte descrição detalhada, referência sendo feita aos desenhos, em que: A Figura 1 apresenta polinucleotídeos Fc exemplares e seqüências de proteínas (SEQ ID NO: 3 é a leitura 5'-3* de filamento codificador, a SEQ ID NO: 4 é a leitura 5’-3’ de filamento complementar; e a SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos codificada) de IgGl humano, que podem ser usadas nos compostos de fusão de Fc desta invenção. A Figura 2 mostra um esquema sintético para a preparação de 19 peptídeos pegilados (SEQ ID NO: 17). A Figura 3 mostra um esquema sintético para a preparação de 20 peptídeos pegilados (SEQ ID NO: 18). A Figura 4 mostra o número de plaquetas geradas in vivo em camundongos BDF1 fêmeas normais tratados com uma injeção de bolo de 100 pg/kg, como segue: PEG-MGDF significa PEG de peso molecular médio de 20 kD ligado ao grupo amino de terminal N por aminação redutiva dos aminoácidos de 1 a 163 de TPO humano nativo, que é expresso em E. coli (de modo que não seja glicosilado) (ver WO 95/26746 intitulada “Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation”); TMP significa o composto da SEQ ID NO: 1; TMP-TMP significa o composto da SEQ ID Nu: 21; PEG-TMP-TMP significa o composto da SEQ

ID NO: 18, em que o grupo PEG é um PEG de peso molecular médio de 5 kD ligado conforme mostrado na Figura 3; TMP-TMP-Fc é definido aqui abaixo e Fc-TMP-TMP é o mesmo que TMP-TMP-Fc, exceto que o grupo Fc é ligado na extremidade terminal N ao invés de o ser na extremidade terminal C do peptídeo TMP-TMP. A Figura 5 apresenta o número de plaquetas geradas in vivo em camundongos BDF1 normais tratados com vários compostos liberados através de bombas osmóticas implantadas durante o período de 7 dias. Os compostos são definidos da mesma maneira como apresentado acima quanto à Figura 4.

As Figuras 6A, 6B e 6C apresentam diagramas esquemáticos de compostos preferidos da presente invenção. A Figura 6A apresenta um composto de fusão Fc em que a porção Fc é fundida no terminal N do dímero TMP, e em que a porção Fc é uma forma monomérica (cadeia única). A

Figura 6B apresenta um composto de fusão Fc, em que a região Fc é fundida no terminal N do dímero TMP, e em que a porção Fc é dimérica, e um monômero Fc é ligado a um dímero TMP. A Figura 6C apresenta um composto de fusão Fc em que a porção Fc é fundida no terminal N do dímero TMP, e em que a porção Fc é dimérica, e cada monômero Fc é ligado a um dímero TMP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

Em um esforço para buscar estruturas pequenas como compostos condutores no desenvolvimento de agentes terapêuticos com mais propriedades desejáveis, um tipo diferente de dímero de TMP e estruturas relacionadas foram designadas, nas quais o terminal C de um peptídeo TMP foi ligado ao terminal N de um segundo peptídeo TMP, ou diretamente ou através de um ligador, e os efeitos desta estratégia de dimerização sobre a bioatividade das moléculas diméricas resultantes foram, então, pesquisados.

Em alguns casos, estes assim chamados dímeros em série (ligação C-N) foram designados como tendo ligadores entre os dois monômeros, os ligadores sendo preferivelmente compostos de aminoácidos naturais, portanto tomando sua síntese acessível às tecnologias recombinantes. A presente invenção se baseia na descoberta de um grupo de compostos que têm atividade trombopoiética e que se supõe exerçam sua atividade mediante ligação ao receptor TPO endógeno, c-Mpl.

COMPOSTOS E DERIVADOS

Em uma primeira modalidade preferida, os compostos da invenção compreendem a seguinte estrutura geral: TMPrCLjVTMPa em que TMPt e TMP2 são, cada um independentemente, selecionados do grupo de compostos que compreendem a estrutura núcleo: XrXj-Xí-Xs-XrXrXe-XsrXio, em que: X2 é selecionado do grupo consistindo de Glu, Asp, Lys e Vai;

Xj é selecionado do grupo consistindo de Gly e Ala; X4 é Pro; X5 é selecionado do grupo consistindo de Thr e Ser; X6 é selecionado do grupo consistindo de Leu, Ile, Vai, Ala e Phe; X7 é selecionado do grupo consistindo de Arg e Lys;

Xs é selecionado do grupo consistindo de Gin, Asn e Glu; X3 é selecionado do grupo consistindo de Trp, Tyr e Phe; X10 é selecionado do grupo consistindo de Leu, Ile, Vai, Ala, Phe, Met e Lys; L) é umligador como aqui descrito; e néOoul; e seus sais fisiologicamente aceitáveis, Em uma modalidade, L} compreende (Gly)n, em que n é de 1 a 20, e quando n é maior do que 1, até metade dos resíduos de Gly pode ser substituída por outro aminoácido selecionado dos 19 aminoácidos naturais remanescentes ou um de seus estereoisômeros.

Além da estrutura de núcleo X2-X10 apresentada acima para TMPj e TMP2, outras estruturas relacionadas também são possíveis, em que i uma ou mais das seguintes são adicionadas à estrutura núcleo TMPj e/ou TMP2: Xi é ligado ao terminal N e/ou Xn, X!2, X]3 e/ou X!4 são ligados ao terminal C, em que Xi, Χπ, X12, Xn e Xi4 são como segue: Xi é selecionado do grupo consistindo de Ile, Ala, Vai, Leu, Ser e Arg;

Xn é selecionado do grupo consistindo de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His e Glu; X12 é selecionado do grupo consistindo de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Gly, Ser e Gin;

Xi3 é selecionado do grupo consistindo de Arg, Lys, Thr, Vai, Asn, Gin e Gly; e X14 é selecionado do grupo consistindo de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Thr, Arg,Glu e Gly. O termo !TMP” é usado para significar uma porção composta de, isto é, compreendendo pelo menos 9 subunidades (X2-X10), em que X2- X10 compreende a estrutura núcleo. As subunidades X2-X14 são preferivelmente aminoácidos independentemente selecionados dentre os 20 aminoácidos de ocorrência natural, porém a invenção abrange compostos em que X2-X14 são independentemente selecionados do grupo de aminoácidos atípicos de ocorrência não natural bem conhecidos na técnica. Aminoácidos preferidos específicos são identificados quanto a cada posição. Por exemplo, X2 pode ser Glu, Asp, Lys ou Vai. Tanto as abreviações de três letras quanto as de uma única letra para os aminoácidos, são aqui usadas em cada caso; as abreviações são aquelas padrão para os 20 aminoácidos de ocorrência natural ou suas variações bem conhecidas. Estes aminoácidos têm ou estereoquímica L ou D (exceto quanto a Gly, que nem é L nem D), e as TMPs podem compreender uma combinação de estereoquímicas. No entanto, a estereoquímica L é a preferida para todos os aminoácidos na cadeia TMP. A invenção também provê moléculas reversas de TMP em que 0 terminal amino para a sequência terminal carbóxi dos aminoácidos é invertida. Por exemplo, 0 inverso de uma molécula tendo a sequência normal X1-X2-X3 deve ser X3- X2-X1. A invenção também provê moléculas retro-inversas de TMP, em que, como uma TMP reversa, o terminal amino para a sequência terminal carbóxi de aminoácidos é inversa e os resíduos que saonarmalmente enantrômeros “L” em TMP são alterados para a forma de estereoisômero “D”.

Adicionalmente, sais fisiologicamente aceitáveis dos TMPs são também abrangidos. “Sais fisiologicamente aceitáveis” significa qualquer sal que seja conhecido ou descoberto mais tarde como sem farmaceutícamente aceitável. Alguns exemplos específicos preferidos são: acetato, trifluoroacetato, cloridreto, bromidreto, sulfato, citrato, tartarato, glicolato, oxalato. É também considerado que “derivados” dos TMPs podem ser substituídos pelos TMPs acima descritos. Tais TMPs derivados incluem porções em que uma ou mais das seguintes modificações tenham sido feitas: uma ou mais cadeias (ligações) [-C(0)NR-] peptidílicas tenham sido substituídas por uma cadeia não peptidílica, tal como uma cadeia -CH2-carbamato [-CH2-0C(0)NR-]; uma cadeia fosfonato; uma cadeia -CH2- sulfonatnida [-CH2-S(0)2NR-]; uma cadeia uréia [-NHC(0)NH-]; uma cadeia amina secundária -CH2-; ou uma cadeia peptidílica alquilada [-C(0)NR6-, em que R6 é alquila inferior]; peptídeos em que o terminal N é derivado para um grupo - NRR1; para um grupo -NRC(0)R; para um grupo -NRC(0)0R; para um grupo -NRS(0)2R; para um grupo -NHC(0)NHR, em que R e R1 são hidrogênio ou alquila inferior, com a condição de que R e R1 não sejam ambos hidrogênio; a um grupo succinimida; a um grupo benziloxicarbonila- NH- (CBZ-NH-); ou a um grupo benziloxicarbonila-NH- tendo de 1 a 3 substituintes no anel fenila selecionados do grupo consistindo de alquila inferior, alcóxi inferior, cloro e bromo; e peptídeos em que o terminal C é derivado para -C(0)R2, em que R2 é selecionado do grupo consistindo de alcóxi inferior e -NR3R4 em que R3 e R4 são independentemente selecionados do grupo consistindo de hidrogênio e alquila inferior. Por “inferior” denota-se um grupo que tem de 1 a 6 átomos de carbono.

Adicionalmente, modificações dos aminoácidos individuais podem ser introduzidas na molécula de TMP pela reação dos resíduos de aminoácido do peptídeo alvos, comum agente de derivação orgânico que seja capaz de reagir com as cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos terminais. O seguinte são exemplos: Resíduos terminais lisinila e amino podem ser reagidos com anidridos de ácido succínico ou outro ácido carboxílico. A derivação com estes agentes tem o efeito de inverter a carga de resíduos de lisinila. Outros reagentes adequados para derivar resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres tais como o picolinímidato de metila; fosfato piridoxal; piridoxal; cloroboroidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisouréia; 2,4-pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

Resíduos de arginila podem ser modificados pela reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3- butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona e Ninhydrin. A derivação de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas, por causa do pKa elevado do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina, bem como o grupo guanidino de arginina. A modificação específica de resíduos de tirosila por si foi estudada extensivamente, com particular interesse na introdução de rótulos espectrais nos resíduos de tirosila, mediante reação com compostos de diazônio aromático ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano podem ser usados para formar espécies de tirosila O-acetila e derivados de 3-nitro, respectivamente.

Grupos laterais carboxila (aspartila ou glutamila) podem ser seletivamente modificados por reação com carbodiimídas (R’-N=C=N-R’)) tais como 1 -ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4- azônia-4,4-dimetilpentií) carbodiimida. Além disso, resíduos de aspertila e glutamila podem ser convertidos em resíduos de asparafinila e glutaminila, mediante reação com íons de amônio.

Resíduos de glutaminila e asparaginila são frequentemente desamidado nos resíduos correspondentes de glutamila e aspartila.

Altemativamente, estes resíduos podem ser desamidados sob condições brandamente acídicas. Qualquer forma destes resíduos situa-se dentro do escopo desta invenção. A derivação com agentes bifuncionais é útil para reticular os peptídeos ou seus derivados funcionais em uma matriz suporte insolúvel em água ou em outros portadores macromoleculares. Agentes de reticulação comumente usados incluem, por exemplo, l,l-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo os ésteres dissuccinimidílicos tais como 3,3’-ditíobia(succimmidilpropionato), e maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-l,8-octana. Agentes de derivação, tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato produz intermediários fotoativáveis, que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Altemativamente, matrizes reativas insolúveis em água, tais como carboidratos ativados por brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Patentes U.S. 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 e 4.330.440 podem ser empregados para imobilízação proteica.

Outras modificações possíveis incluem a hidroxilação de prolina e lisina, a fosforilação dos grupos hidroxila de resíduos de seril ou de treonila, oxidação do átomo de enxofre em Cys, metilação dos grupos alfa- amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilação da amina N-terminal, e, em alguns casos, amidação dos grupos carboxila C-terminais.

Tais porções derivadas preferivelmente melhoram uma ou mais características, incluindo a atividade trombopoiética, a solubilidade, a absorção, a meia-vida biológica, e outras, dos compostos da invenção.

Altemativamente, as porções derivadas resultam nos compostos que têm as mesmas, ou essencialmente as mesmas, características e/ou propriedades do composto que não é derivado. As porções podem altemativamente eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável dos compostos, etc.

Além da estrutura do núcleo apresentada acima, X2-Xio> outras estruturas que são especifícamente consideradas são aquelas em que um ou mais grupos X adicionais são ligados à estrutura núcleo. Assim, Xi e/ou Xn, Xt2, Xt3 e X14 podem ser ligados à estrutura núcleo. Algumas estruturas adicionais exemplares são as seguintes: XrXs-Xí-XrXrXrXrXrXKrXii, XrX3-X4-XrX6-XrXrXrXnrXirXi2>

XrX3-X4-Xs“X(rXrXrX9-Xi(rXirXirXi3, XrX3-X*-X5-X6-XrX«-Xí-Xio-XirXi2-Xi3-Xi4, Xi-XrX3-X4-X5-X6-XrXí-X9-Xia, XrX2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-XrXio-Xn, XrXa-Xs^-Xs-Xe-XrXrXs-Xie-Xu-Xib X,-XrX3-X4-Xs-X(fXrX8-X»-Xi(rXii-Xi2-Xi3, Χ,-ΧγΧ3-Χ4-Χ5-Χ6-ΧγΧ8-Χ9-Χιο-ΧιγΧι2-Χι3'Χι4, em que X( a X14 são conforme descrito acima. Cada um de TMP, e TMP2 podem ser os mesmos ou diferentes em sequência e/ou em comprimento. Em algumas modalidades preferidas, TMP] e TMP2 são os mesmos.

Um TMP particularmente preferido é 0 seguinte: Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQID NO: 1).

Como aqui usado, “compreendendo” significa, inier alia, que um composto pode incluir aminoácidos adicionais ou em qualquer um ou em ambos os términos C da dada sequência. No entanto, contanto que uma estrutura tal como X2 a Xio, Xi a X)4, ou uma das outras estruturas exemplares esteja presente, a estrutura química remanescente será relativamente menos importante. Naturalmente, qualquer estrutura fora da estrutura X2 a Xio do núcleo, ou a estrutura Xj a X14, não deve interferir significativamente com a atividade trombopoiética do composto. Por exemplo, um resíduo N-terminal Met é previsto como situando-se dentro desta invenção. Adicionalmente, embora muitos dos compostos preferidos da invenção sejam dímeros em série no fato de que eles possuem duas porções de TMP, outros compostos desta invenção são multímeros em série dos TMPs, isto é compostos das seguintes estruturas exemplares: TMPrL-TMP2-L-TMP3; TMPrL-TMP2-L-TMP3-L-TMP4; TMPrL-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5; em que TMPí, TMP2, TMP3, TMP4 e TMP5 podem ter as mesmas ou diferentes estruturas, e em que cada TMP e L são definidos como aqui apresentados, e os ligadores são, cada um, opcional. Preferivelmente, os compostos desta invenção terão de 2 a 5 porções de TMP, particularmente preferível de 2 a 3 e, o mais preferível, 2, Os compostos da primeira modalidade desta invenção preferivelmente terão menos do que cerca de 60 aminoácidos no total, mais preferivelmente menos do que 40 (isto é, eles serão peptídeos).

Como observado acima, os compostos da primeira modalidade desta invenção são preferivelmente dímeros de TMP, que são ou ligados diretamente ou são ligados por um grupo ligador. As porções de TMP monoméricas são apresentadas na orientação convencional do terminal N a C, lendo-se da esquerda para a direita. Consequentemente, pode-se observar que os compostos da invenção são todos orientados de modo que o terminal C de ΤΜΡι fique ligado, ou diretamente, ou através de um ligador ao terminal N de TMP2. Esta orientação é referida como uma orientação em série, e os compostos da invenção podem ser em geral referidos como “dímeros em série”. Estes compostos são referidos como dímeros, mesmo se TMP[ e TMP2 forem estruturalmente distintos. Isto é, tanto os homodímeros quanto os heterodímeros são previstos. O grupo “ligador” (“Li”) é opcional. Quando estiver presente, não é decisiva o que sua estrutura química é, uma vez que ele serve principalmente como um espaçador. O ligador deve ser escolhido de modo a não interferir com a atividade biológica do composto final e, também, de modo a que a imunogenicidade do composto final não seja significativamente aumentada. O ligador é preferivelmente composto de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Assim, nas modalidades preferidas, o ligador compreende Y„, em que Y é um aminoácido de ocorrência natural ou um seu estereoisômero, e “n” é qualquer um dentre 1 a 20. O ligador é, portanto, composto de 1 a 20 aminoácidos ligados por ligações peptídicas, em que os aminoácidos são selecionados dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em uma modalidade mais preferida, os aminoácidos de 1 a 20 são selecionados de Gly, Ala, Pro, Asn, Gin, Cys, Lys. Ainda mais preferível, o ligador é composto de uma maioria de aminoácidos que são estericamente não impedidos, tais como Gly, Gly-Gly [(Gly)2], Gly-Gly-Gly [(Gly)3]... (Gly)2o, Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, etc. Outros exemplos específicos de Hgadores são: (Gly)3Lys(Gly)4(SEQIDNO;6); (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQID NO: 7) (esta estrutura provê um sítio para glicosilação, quando ela é produzida por recombinação em um sistema celular de mamíferos que seja capaz de glicosilar tais sítios); (Gly)3Cys(Gly)4(SEQIDNO: 8); e GlyProAsnGly (SEQID NO: 9).

Para explicar a nomenclatura acima, por exemplo (Gly)3Lys(Gly)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. As combinações de Gly com Ala são também preferidas.

Ligadores não peptídicos são também possíveis. Por exemplo, ligadores dealquilall tais como -HN-(CH2)s-CO-, em que s = 2 a 20, podem ser usados. Estes ligadores de alquila podem ainda ser substituídos por qualquer grupo não esteticamente impedido, tal como alquila inferior (por exemplo, Ci-C6), acila inferior, halógeno (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenila etc.

Outro tipo de ligador não peptídeo é um grupo de polietileno glicol, tal como; -HN-CH2-CH2-(0-CH2-CH2)n-0-CH2-C0- em que n é tal que o peso molecular total do ligador varie aproximadamente de 101 a 5000, preferivelmente de 101 a 500.

De um modo geral, foi descoberto que um ligador de um comprimento de cerca de 0 a 14 subunidades (por exemplo de aminoácidos) é preferido para os compostos trombopoiéticos da primeira modalidade desta invenção.

Os ligadores de peptídeo podem ser alterados para formar derivados da mesma maneira como descrito acima para os TMPs.

Os compostos deste primeiro grupo podem ainda ser lineares ou cíclicos. Por “cíclico”, denota-se que pelo menos duas porções separadas, isto é, não contíguas, da molécula são ligadas entre si. Por exemplo, o terminal amino e o carbóxi das extremidades da molécula podem ser covalentemente ligados para formar uma molécula cíclica. Altemativamente, a molécula pode conter dois ou mais resíduos Cys (por exemplo, no ligador), que podem ciclizar através da formação de ligação dissulfeto. É, ainda, considerado que mais do que um dímero peptídico em série podem se ligar para formar um dímero de dímeros. Assim, por exemplo, um dímero em série contendo um resíduo Cys pode formar uma ligação dissulfeto intermolecular com um Cys de outro tal dímero. Ver, por exemplo, o composto da SEQID NO: 20, abaixo.

Os compostos da invenção também podem ser covalente ou não covalentemente associados com uma molécula portadora, tal como um polímero linear (por exemplo, polietileno glicol, polilisina, dextrano etc.), um polímero de cadeia ramificada (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.289.872 para Denkenwalter et ai, emitida em 15 de setembro de 1981; 5.229.490 para Tam, emitida em 20 de julho de 1993; WO 93/21259 por Frechet et aU publicada em 28 de outubro de 1993); um lipídeo; um grupo de colesterol (tal como um esteróide); ou um carboidrato ou oligossacarídeo. Outros portadores possíveis incluem uma ou mais ligações de polímero solúvel em água, tal como polioxietileno glicol, ou polipropileno glicol como descrito nas Patentes U.S. 4.640.835, 4.496.689, 4.30U44, 4.670.417, 4.791.192 e 4.179.337. Outros polímeros ainda conhecidos na técnica incluem monometóxi-polietíleno glicol, dextrano, celulose ou outros polímeros com base em carboidrato, poli(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímero de oxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo glicerol) e álcool polivinílico, bem como misturas destes polímeros.

Um tal portador preferido é o polietileno glicol (PEG). O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser de cadeia reta ou ramificado. O peso molecular médio do PEG variará preferivelmente de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, mais preferivelmente de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, o mais preferível de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa.

Os grupos PEG geralmente serão ligados aos compostos da invenção através de acilação, alquilação redutiva, adição de Michael, alquilação de tiol ou outros processos de conjugação/ligação quimiosseletiva através de um grupo reativo na porção de PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, α-haloacetila, maleimido ou hidrazino) a um grupo reativo no composto alvo (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, α-haloacetila, maleimido ou hidrazino).

Grupos de carboidrato (oligossacarídeo) convenientemente podem ser ligado a sítios que sejam conhecidos como sendo sítios de glícosilaçao em proteínas. Geralmente, oligossacarídeos ligados em O são ligados a resíduos de serina (Ser) ou de treonina (Thr), enquanto os oligossacarídeos ligados em N são ligados a resíduos de asparagina (Asn) quando eles fazem parte da seqüência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos de ocorrência natural, não contando a prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O dos resíduos de açúcar encontradas em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é comumente encontrado em ambas é o ácido acetilneuramínico (referido como ácido siálico). O ácido siálico é comumente o resíduo terminal tanto do oligossacarídeo ligado em N quanto ao ligado em O e, em virtude de sua carga negativa, pode conferir propriedades acídicas ao composto glicosilado.

Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ligador dos compostos desta invenção e são preferivelmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos de polipeptídeos (por exemplo, em células de mamíferos, tais como CHO, BHK, COS). No entanto, tais sítios podem ainda ser glicosilados por procedimentos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na técnica.

Alguns peptídeos exemplares desta invenção são apresentados abaixo. São usadas abreviações dos aminoácidos de letras isoladas, e o ligados é apresentado separado por hífens, para clareza. Abreviações adicionais: BrAc significa bromoacetil [BrCH2C(0)] e PEG é polietileno glicol. IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQID KO: 10) IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) |________________________| (SEQ ID NO: 11) IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ ID NO: 12) IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO: 13) IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 14) IEGPTLRQCLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 15) IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 16) IEGPTLRQWLAARA-GGGK(peg)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 17) IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 18) IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 19) IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 20) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 21) Em cada um dos compostos acima, um terminal N Met (ou resíduo M, usando o código de uma letra) é considerado também. Multímeros (por exemplo covalentemente ligados e não covalentemente ligados em série e não em série) dos compostos acima também são considerados.

Em uma segunda modalidade desta invenção, os compostos descritos acima podem ainda ser fundidos a um ou mais grupos Fc, ou diretamente ou através de grupos ligadores. Em geral, a fórmula deste segundo grupo de compostos é: (FcVíLzVTMPríL.VTMPHLjHFcJp em que TMPb TMP2 e n são, cada um, como descrito acima; Li, L2 e L3 são grupos ligadores que são, cada um independentemente, selecionados dos grupos ligadores descritos acima; Fc é uma região Fc de uma imunoglobulina; m, p, q e r são, cada um independentemente, selecionados do grupo consistindo de 0 e 1, em que pelo menos um de m ou p é 1, e ainda em que, se M é 0, então q é 0, e se p é 0, então r é 0; e seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Consequentemente, os compostos deste segundo grupo têm estruturas conforme definidas para 0 primeiro grupo de compostos, como descrito acima, mas estes compostos são ainda fundidos a pelo menos um grupo Fc, ou diretamente ou através de um ou mais grupos ligadores. A sequência Fc dos compostos acima pode ser selecionada da cadeia pesada de IgG-1 de imunoglobulina humana, ver Ellison, J. W. et ai, Nucleic Acids Res. 10\ 4071-4079 (1982), ou qualquer outra sequência Fc conhecida na técnica (por exemplo outras classes de IgG, incluindo, mas a estas não se limitando, IgG-2, IgG-3 e IgG-4, ou outras imunoglobulinas). É bem conhecido 0 fato de que as regiões Fc de anticorpos são compostas de segmentos de polipeptídeos monoméricos, que podem ser ligados nas formas diméricas ou multiméricas por ligações dissulfeto ou por associação não covalente. O número de ligações dissulfeto intermoleculares entre as subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas varia de 1 a 4, dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2) do anticorpo envolvido. O termo “Fc”, como aqui usado, é genérico para as formas monoméricas, diméricas e multiméricas das moléculas Fc. Deve ser observado que os monômeros Fc dimerizarão espontaneamente quando os resíduos de Cys estiverem presentes, a menos que condições particulares estejam presentes, que impeçam a dimerização através da formação de ligação dissulfeto. Mesmo que os resíduos de Cys, que normalmente formam ligações dissulfeto no dímero Fc, sejam removidos ou substituídos por outros resíduos, as cadeias monoméricas geralmente dimerizarão através de interações não covalentes. O termo “Fc” aqui é usado para denotar qualquer destas formas: o monômero nativo, o dímero nativo (ligado por ligação dissulfeto), dímeros modificados (ligado por dissulfeto e/ou não covalentemente), e monômeros modificados (isto é, derivados).

Variantes, análogos ou derivados da porção Fc podem ser construídos, por exemplo, fazendo-se várias substituições de resíduos ou sequências.

Polipeptídeos variantes (ou análogos) incluem as variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácidos suplementam uma seqüência de aminoácidos Fc. As inserções podem ser localizadas em qualquer um ou em ambos os términos da proteína, ou podem ser posicionados dentro das regiões internas da seqüência de aminoácidos Fc. As variantes de inserção com resíduos adicionais em qualquer um ou em ambos os términos podem incluir, por exemplo, as proteínas de fusão e as proteínas que incluem etiquetas ou rótulos de aminoácidos. Por exemplo, a molécula Fc pode opcionalmente conter um terminal N Met, especialmente quando a molécula é expressa por recombinação em uma célula bacteriana, tal como E. coli.

Nas variantes de deleção Fc, um ou mais resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo Fc são removidos. As deleções podem ser efetuadas em um ou em ambos os términos do polipeptídeo Fc, ou com a remoção de um ou mais resíduos dentro da seqüência de aminoácidos Fc. As variantes de deleção, portanto, incluem todos os fragmentos de uma seqüência de polipeptídeo Fc, Nas variantes de substituição Fc, um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipeptídeos Fc são removidos e substituídos por resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições são conservativas por natureza, porém a invenção abrange substituições que são também não conservativas.

Por exemplo, os resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para impedir a formação de algumas ou de todas as reticulações dissulfeto das sequências Fc. Em particular, os aminoácidos nas posições 7 e 10 da SEQ ID NO: 5 são resíduos de cisteína.

Pode-se remover cada um destes resíduos de cisteína ou substituir um ou mais de tais resíduos de cisteína por outros aminoácidos, tais como Ala ou Ser. Como outro exemplo, as modificações também podem ser feitas para introduzir substituições de aminoácidos para (1) remover o sítio de ligação do receptor de Fc; (2) remover o sítio de ligação do complemento (Clq); e/ou para (3) remover o sítio da citoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), Tais sítios são conhecidos na técnica, e quaisquer substituições conhecidas se acham dentro do escopo de Fc conforme aqui usado. Por exemplo, ver Molecular Immunology, Vol. 29, n° 5, 633-639 (1992) com respeito a sítios da ADCC em IgGl.

Da mesma forma, um ou mais resíduos de tirosina podem ser substituídos por resíduos de fenilalanina também. Além disso, outras inserções de aminoácido variante, deleções (por exemplo de 1 a 25 aminoácidos) e/ou substituições são também consideradas e se situam dentro do escopo da presente invenção. Substituições de aminoácidos conservativas geralmente serão preferidas. Além disso, as alterações podem estar na forma de aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos.

As seqüências de Fc do composto TMP podem também ser derivadas, isto é, conduzindo modificações outras que não a inserção, a deleção ou a substituição de resíduos de aminoácidos. Preferivelmente, as modificações são covalentes por natureza, e incluem, por exemplo, ligação química com polímeros, lipídeos, outras porções orgânicas e inorgânicas. Os derivados da invenção podem ser preparados para aumentas a meia-vida de circulação, ou podem ser projetados para melhorar a capacidade de direcionamento quanto ao polipeptídeo às células, tecidos ou órgãos desejados. É também possível usar o domínio selvagem de ligação do receptor da molécula Fc intacta como a parte Fc dos compostos da invenção, tal como descrito na WO 96/32478, intitulada “Altered Polypeptides with Increased Half-Life". Membros adicionais da classe de moléculas designadas como Fc aqui, são aqueles que são descritos na WO 97/34631, intitulada “Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lifes”. Ambos os pedidos PCR publicados, citados neste parágrafo, são aqui incorporados por referência.

As fusões de Fc podem ser no terminal N ou C de TMPí ou TMP2 ou em ambos os términos N e C dos TMPs. Foi surpreendentemente descoberto que os peptídeos em que uma porção de Fc está ligada ao terminal N do grupo TMP, são mais bioativos do que as outras possibilidades, de modo que a fusão tendo um domínio de Fc no terminal N do TMPí (isto é, r e p são ambos 0, e m e q são ambos 1, na fórmula geral) é preferida. Quando a cadeia Fc é fundida no terminal N do TMP ou ligador, tal fusão ocorrerá em geral no terminal C da cadeia Fc, e vice-versa. São também preferidos os compostos que são dímeros (por exemplo, em série e não em série) dos compostos apresentados na fórmula geral, como exposto acima. Em tais casos, cada cadeia de Fc será ligada a um dímero em série de peptídeos de TMP. Um exemplo esquemático de um tal composto é apresentado na Figura 6C. Um exemplo preferido deste tipo de composto se baseia na Figura 6C, em que Fc é um dímero do composto da SEQID NO: 5, cada L2 é (Gly)5, TMP! e TMP2 são, cada um, o composto da SEQ ID NO: 1, e cada Li é (Gly)s. Este composto também é aqui referido como “Fc-TMPi-L-TMP2”. Ele também é representado como um dímero (através da porção Fc) da SEQ ID NO: 34. O composto análogo, em que o grupo Fc é ligado através de um ligador ao terminal C dos grupos TMP2 na Figura 6C, também é considerado e é aqui referido como TMPí-L-TMP2-Fc.

Alguns exemplos específicos dos compostos do segundo grupo são fornecidos como segue: Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 22) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 23) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 24) Fc-GG-IEGPTLRQ WLAARA-GPNG-IEGPTLRQ WLAARA (SEQ ID NO: 25) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 26) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) |_______________________| (SEQ ID NO: 27) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ ID NO: 28) F c-IEGPTLRQ AL AARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO: 29) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 30) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 31) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 32) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-BEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 33) Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 34) Em cada um dos compostos acima, um terminal N adicional Met (ou resíduo M, usando o código de uma letra) é considerado também. O resíduo Met pode ser ligado no terminal N do grupo Fc naqueles casos em que exista um grupo Fc ligado ao terminal N do TMP. Naqueles casos em que o grupo Fc seja ligado ao terminal C do TMP, os resíduos Met podem ser ligados ao terminal N do grupo TMP.

Em casa um dos casos acima, Fc é preferivelmente a região Fc da cadeia pesada de IgGl de imunoglobulina humana ou um seu fragmento, derivado ou dímero biologicamente ativos, ver Ellison, J. W. et ai., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079 (1982). A seqüência de Fc mostrada na SEQ ID NO: 5 é a Fc mais preferida para os compostos acima. Também preferidos são os compostos acima, em que a Fc é uma forma dimérica da seqüência de SEQ ID NO: 5, e cada cadeia de Fc é ligada a um dímero em série de TMP.

Adicionalmente, embora muitos dos compostos preferidos da segunda modalidade incluam um ou mais dímeros em série em que eles possuam duas porções de TMP ligado, outros compostos desta invenção incluem multímeros em série dos TMPs, isto é, compostos das seguintes estruturas exemplares: Fc-TMPrL-TMP2-L-TMP3;

Fc-TMPi-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4;

Fc-TMP, -L-TMP2-L-TMP3 -L-TMP4-L-TMP5; TMP i -L-TMP2-L-TMP3 -L-Fc; TMPí -L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-Fc; TMPrL-TMPrL-TMP3-L-TMP4-L-TMP5-L-Fc; em que TMP], TMP2, TMP3, TMP4 e TMP5 podem ter as mesmas ou diferentes estruturas, e em que Fc e cada TMP e L são definidos como apresentados acima, e os ligadores são, cada um, opcionais. Em cada caso acima, o grupo Fc pode ser monomérico ou dímérico, e nos casos onde o Fc seja dímérico, um ou mais multímeros de TMP podem ser ligados a cada cadeia de Fc. Também considerados são outros exemplos em que os dímeros ou multímeros de TMP são ligados a todos os quatro términos das duas cadeias de Fc.

Preferivelmente, os compostos desta segunda modalidade da invenção terão de cerca de 200 a 400 aminoácidos no total (isto é, eles serão polipeptídeos).

PROCESSOS DE PRODUÇÃO

Os compostos desta invenção podem ser produzidos por uma variedade de meios. Tendo em vista que muitos dos compostos serão peptídeos, ou incluirão peptídeos, os processos para sintetizar peptídeos são aqui de particular relevância. Por exemplo, as técnicas de síntese de fase sólida podem ser usadas. Técnicas adequadas são bem conhecidas na prática e incluem aquelas descritas em Merrifield, em Chem. Polypeptides, pp. 335- 361 (Katsoyannis e Panayotis, eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Davis et al.y Biochem. Intl. 10: 394-414 (1985); Stewart e Young, Sólid Phase Peptide Synthesis (1969); Patente U.S. 3.941.763; Finn et al., The Proteins, 3r edição, volume 2, páginas 105-253 (1976); e Erickson et al., The Proteins, 3~ edição, volume 2, páginas 257-527 (1976). A síntese de fase sólida é a técnica preferida de produzir peptídeos individuais, uma vez que ela é o processo mais interessante quanto ao custo de se produzir peptídeos pequenos.

Os peptídeos também podem ser produzidos em células hospedeiras transformadas usando-se técnicas de DNA recombinante. Para fazê-lo, uma molécula de DNA recombinante codificando o peptídeo é preparada. Os processos de preparo de tais moléculas de DNA e/ou de RNA são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as sequências que codificam os peptídeos podem ser excisadas do DNA usando-se enzimas de restrição adequadas. As seqüências relevantes podem ser criadas usando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR) com a inclusão de sítios de restrição úteis, para a clonagem subsequente. Altemativamente, a molécula de DNA/RNA pode ser sintetizada usando-se técnicas de síntese química, tais como o processo de fosforamidita. Igualmente, uma combinação destas técnicas pode ser usada. A invenção também inclui um vetor que codifica os peptídeos em um hospedeiro apropriado. O vetor compreende a molécula de DNA que codifica os peptídeos operativamente ligados às seqüências de controle de expressão apropriadas. Os processos de efetuar esta ligação operativa, ou antes ou após a molécula de DNA que codifica o peptídeo ter sido inserida no vetor, são bem conhecidos. As seqüências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, intensificadores, operadores, sítios de ligação ribossômica, sinais de partida, sinais de parada, sinais de cobertura, sinais de poliadenilação, e outros sinais envolvidos com o controle da transcrição ou da translação. O vetor resultante que compreende a molécula de DNA que codifica o peptídeo é usado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada usando-se processos bem conhecidos na técnica.

Qualquer uma de um grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas pode ser usada na prática desta invenção. A seleção de um hospedeiro particular é dependente de vários fatores reconhecidos pela técnica. Estes fatores incluem, por exemplo, a compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, a toxicidade, para com as células hospedeiras, dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, o índice de transformação, a facilidade de recuperação dos peptídeos, as características de expressão, a bio-segurança e os custos. Um equilíbrio destes fatores deve ser acordado com o entendimento de que nem todos os hospedeiros podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma seqüência de DNA particular.

Dentro destas diretrizes gerais, hospedeiros microbianos úteis incluem as bactérias (tais como E. coli), as leveduras (tais como a Saccharomyces sp e a Pichia pastoris) e outros fungos, células de insetos, de plantas, de mamíferos (incluindo o ser humano) em cultura, ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.

Em seguida, o hospedeiro transformado é cultivado sob condições convencionais de fermentação, de modo que os peptídeos desejados sejam expressos. Tais condições de fermentação são bem conhecidas na técnica.

Finalmente, os peptídeos são purificados da cultura de fermentação ou das células hospedeiras em que eles são expressos. Estes processos de purificação também são bem conhecidos na técnica.

Os compostos que contêm peptídeos derivados ou que contêm grupos não peptídicos, podem ser sintetizados por técnicas da química orgânica bem conhecidas.

USOS DOS COMPOSTOS

Os compostos desta invenção têm a capacidade de ligarem-se ao receptor c-Mpl e de ativá-los, e/ou têm a capacidade para estimular a produção (tanto in vivo quanto in vitró) de plaquetas (“atividade trombopoiética”) e dos precursores de plaqueta (“atividade megacariocitopoiética”). Para medir a(s) atividade(s) destes compostos pode- se utilizar ensaios padrão, tais como aqueles descritos na WO 95/26746 intitulado “Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation”. Os ensaios in vivo são ainda descritos na seção de Exemplos neste.

As condições a serem tratadas pelos métodos e composições da presente invenção são, no geral, aquelas que envolvem uma deficiência existente de megacariócito/plaqueta ou uma deficiência esperada ou prognosticada de megacariócito/plaqueta no futuro (por exemplo, por causa de cirurgia planejada ou doação de plaqueta). Tais condições podem ser o resultado de uma deficiência (temporária ou permanente) do ligando ativo Mpl in vivo, O termo genérico para a deficiência de plaqueta é trombocitopenia e por este motivo os métodos e composições da presente invenção são, no geral, disponíveis para tratar profilática ou terapeuticamente a trombocitopenia em pacientes em necessidade deste. A Organização Mundial de Saúde classificou o grau de trombocitopenia com base no número de plaquetas em circulação no indivíduo (Miller et ai, Câncer 47: 210 e 211 (1981)). Por exemplo, um indivíduo que não apresente nenhum sinal de trombocitopenia (Grau 0) terá, no geral, pelo menos 100.000 plaquetas/mm3. A trombocitopenia branda (Grau 1) indica um nível de circulação de plaquetas entre 79.000 e 99.000/ mm3. A trombocitopenia moderada (Grau 2) apresenta entre 50.000 e 74.000 Λ plaquetas/mm e a trombocitopenia grave é caracterizada entre 25.000 e 49.000 plaquetas/mm3. A trombocitopenia que ameaça a vida ou que debilita é caracterizada por uma concentração circulante de plaquetas de menos do que 25.000/mm3. A trombocitopenia (deficiências de plaqueta) pode estar presente por várias razões, incluindo a quimioterapia e outras terapias com uma variedade de medicamentos, terapia de radiação, cirurgia, perda acidental de sangue e outras condições específicas de doença. As condições específicas de doença exemplares que envolvem a trombocitopenia e podem ser tratadas de acordo com esta invenção são: a anemia aplásica; trombocitopenia idiopática ou imune (ITP), que inclui a púrpura trombocitopênica idiopática associada com o câncer de mama, a ITP associada ao HIV e a púrpura trombocitopênica trombótica relacionada ao HIV; tumores metastáticos que resultam na trombocitopenia; lúpus sistêmico eritematoso que inclui a síndrome do lúpus neonatal esplenomegalia; a síndrome de Fanconi; a deficiência de vitamina BI2; a deficiência de ácido fólico; a anomalia de May-Hegglin; a síndrome de Wiskott-Aldrich; a doença crônica do fígado; a síndrome mielodisplástica associada com a trombocitopenia; a hemoglobinúria paroxísmica noturna; a trombocitopenia aguda profunda que segue a terapia C7E3 Fab (Abciximab); a trombocitopenia aloimune, que inclui a trombocitopenia aloimune maternal; a trombocitopenia associada com anticorpos antifosfolipídeos e trombose; a trombocitopenia autoimune; a trombocitopenia imune induzida por medicamento, que inclui a trombocitopenia induzida por carboplatina, a trombocitopenia induzida por heparina; a trombocitopenia fetal; a trombocitopenia gestacional; a síndrome de Hughes; a trombocitopenia lupóide; a perda de sangue acidental e/ou maciça; distúrbios mieloproliferativos; trombocitopenia em pacientes com malignidades; púrpura trombocitopênica trombótica, que inclui a microangiopatia trombótica que se manifesta como a púrpura trombocitopênica trombótica/síndrome urêmica hemolítica em pacientes com câncer; anemia hemolítica autoimune; perfuração do divertículo jejunal oculto; aplasia de célula vermelha pura; trombocitopenia autoimune; nefropatia epidêmica; insuficiência renal aguda associada à rifanpicina; trombocitopenia de Paris- Trousseau; trombocitopenia aloimune neonatal; hemoglobinúria noturna paroxísmica; mudanças hematológicas em câncer estomacal; síndromes urênicas hemolíticas na infância; manifestações hematológicas relacionadas a infecção viral incluindo o vírus da hepatite A e a trombocitopenia associada a CMV. Também, certos tratamentos para a AIDS resultam na trombocitopenia (por exemplo, AZT). Certos distúrbios de cicatrização de certos ferimentos também podería se beneficiar de um aumento nos números de plaqueta.

Com respeito às deficiências de plaqueta prognosticadas, por exemplo, devido a uma cirurgia futura, um composto da presente invenção podería ser administrado vários dias até várias horas antes da necessidade para plaquetas. Com respeito a situações agudas, por exemplo, perda de sangue acidental ou maciça, um composto desta invenção podería ser administrado junto com o sangue ou com as plaquetas purificadas.

Os compostos desta invenção também podem ser utilizáveis na estimulação de certos tipos de células outras que não as megacariócitas se tais células são descobertas expressaram o receptor Mpl, As condições associadas com tais células que expressam o receptor Mpl, que são responsivas à estimulação pelo ligando Mpl também estão dentro do escopo desta invenção.

Os compostos desta invenção podem ser usados em qualquer situação em que a produção de plaquetas ou as células precursoras de plaqueta são desejadas ou em que o estímulo do receptor c-Mpl é desejado.

Assim por exemplo, os compostos desta invenção podem ser usados para tratar qualquer condição em um mamífero em que exista uma necessidade de plaquetas, megacariócitos e outros. Tais condições estão descritas em detalhes nas seguintes fontes exemplares: WO 95/26746; WO 95/21919; WO 95/18858; WO 95/21920 e são aqui incorporadas.

Os compostos desta invenção também podem ser utilizáveis na manutenção da viabilidade ou da vida de armazenagem de plaquetas e/ou megacariócitos e células relacionadas. Consequentemente, poria ser utilizável incluir uma quantidade eficaz de um ou mais de tais compostos em uma composição contendo tais células.

Por “mamífero” é entendido qualquer mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos incluindo cães e gatos, animais exóticos e/ou de zoológico incluindo macacos; animais de laboratório incluindo camundongos, ratos e porquinhos da índia; animais de fazenda incluindo cavalos, gado, ovelhas, cabras e porcos; e outros. O mamífero preferido e o ser humano.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS A presente invenção também fornece métodos de usar composições farmacêuticas dos compostos da invenção. Tais composições farmacêuticas podem ser para a administração por injeção ou para a oral, nasal, transdérmica ou outras formas de administração, que inclui, por exemplo, pela injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, intraocular, retrobulbar, intrapulmonar (por exemplo, medicamentos aerossolizados) ou subcutânea (incluindo a administração por depósito para liberação de longa duração); pela administração sublingual, anal, vaginal ou pela implantação cirúrgica, por exemplo, embutida sob a cápsula esplênica, no cérebro ou na córnea. O tratamento pode consistir de uma dose única ou de uma pluralidade de doses durante um período de tempo. No geral, estão compreendidas pela invenção composições farmacêuticas que compreendam quantidades eficazes de um composto de invenção junto com diluentes, preservativos, solubilizadores, emulsificadores, adjuvantes e/ou carregadores farmaceuticamente aceitáveis.

Tais composições incluem diluentes de vários conteúdos de tampão (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e concentração iônica; aditivos tais como detergentes e agentes de solubilização (por exemplo, Tween 80, polissorbato 80), anti-oxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfíto de sódio), preservativos (por exemplo, Thimersol, álcool benzílico) e substâncias de carga (por exemplo, lactose, manitol); a incorporação do material em preparações particuladas de compostos poliméricos tais como o ácido polilático, o ácido poliglicólico, etc. ou em lipossomas. O ácido hialurônico também pode ser usado e este pode ter o efeito de promover a duração sustentada na circulação. As composições farmacêuticas opcionalmente podem incluir ainda outros diluentes líquidos, semi-sólidos ou sólidos farmaceuticamente aceitáveis que servem como veículos, excipientes ou meios farmacêuticos, incluindo mas não estando limitado a monolaurato de polioxietileno sorbitano, estearato de magnésio, hidroxibenzoato de metila e de propila, amidos, sacarose, dextrose, goma acácia, fosfato de cálcio, óleo mineral, manteiga de cacau e óleo de teobroma.

Tais composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de transferência in vivo e a taxa de liberação in vivo das proteínas e derivados presentes. Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18â Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435 a 1712, que são incorporadas aqui por referência. As composições podem ser preparadas na forma líquida ou podem estar em pó seco, tal como a forma liofilizada. As formulações de liberação sustentada implantáveis também são consideradas, como o são as formulações transdérmicas.

Consideradas para o uso nesta são as formas de dosagem oral sólidas, que estão descritas, no Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. 1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) no capítulo 89, que é aqui incorporada por referência. As formas de dosagem sólida incluem tabletes, cápsulas, pílulas, pastilhas ou losangos, selos ou grãos. Da mesma maneira, a encapsulação lipossômica ou proteinóidica podem ser usadas para formular as presentes composições (como, por exemplo, as microesferas proteinóidicas relatadas na Patente U.S. 4.925.673). A encapsulação lipossômica pode ser usada e os lipossomas podem ser derivados com vários polímeros (por exemplo, Patente U.S. 5.013.556). Uma descrição de formas de dosagem sólida possíveis para os produtos terapêuticos é dada por Marshall, K., Modem Pharmaceutics, editado por G. S. Banker e C. T.

Rhodes, Capítulo 10, 1979, aqui incorporada por referência. No geral, a formulação incluirá o composto da invenção e ingredientes inertes que permitem a proteção contra o ambiente do estômago e a liberação do material biologicamente ativo no intestino.

Também são especificamente consideradas as formas de dosagem oral dos compostos da invenção acima. Se necessário, os compostos podem ser quimicamente modificados de modo que a transferência local seja eficaz. No geral, a modificação química considerada é a ligação de pelo menos uma porção da própria molécula do composto, onde a dita porção permite (a) a inibição da proteólise; e (b) a absorção na corrente sanguínea do estômago ou do intestino. Também desejado é o aumento na estabilidade global do composto e o aumento no tempo de circulação no corpo. Os exemplos de tais porções incluem: polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol e de propileno glicol, celulose carboximetílica, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e poliprolina [Abuchowski e Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg e Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp 367 a 383; Newmark et ai, J.

Appl. Biochem. 4: 185 a 189 (1982)]. Outros polímeros que podem ser usados são poli-l,3-dioxolano e poli-l,3,6-tioxocano. Preferidas para o uso farmacêutico, como indicado acima, são as porções de polietileno glicol.

Para as formas de dosagem de transferência oral, também é possível usar um sal de um aminoácido alifático modificado, tal como o N-(8- [2-hidroxibenzoil]amino)caprilato de sódio (SNAC), como um carregador para acentuar a absorção dos compostos terapêuticos desta invenção. A eficácia clínica de uma formulação de heparina usando-se SNAC foi demonstrada em um teste de Fase II conduzido pela Emisphere Technologies.

Ver a Patente US 5.792.451, “Oral drug delivery composition and methods”. O produto terapêutico pode ser incluído na formulação como multiparticulados finos na forma de grânulos ou de grãos de tamanho de partícula de cerca de 1 mm, A formulação do material para a administração em cápsula também pode ser como um pó, tarugos levemente comprimidos ou ainda como tabletes. O produto terapêutico pode ser preparado por compressão.

Os agentes corantes e flavorizantos também podem estar incluídos. Por exemplo, a proteína (ou derivado) pode ser formulada (tal como por encapsulação de lipossoma ou microesfera) e depois contida ainda dentro de um produto comestível, tal como uma bebida refrigerada contendo agentes corantes e flavorizantes.

Pode-se diluir ou aumentar o volume do produto terapêutico com um material inerte. Estes diluentes podem incluir carboidratos, especialmente manitol, α-lactose, lactose anidra, celulose, sacarose, dextranas e amido modificados. Certos sais inorgânicos também podem ser usados como enchedores incluindo trifosfato de cálcio, carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmente disponíveis são Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress e Avicell.

Os desintegrantes podem ser incluídos na formulação do produto terapêutico em uma forma de dosagem sólida. Os materiais usados como desintegrantes incluem mais não estão limitados a amido, incluindo o desintegrante comercial com base em amido, Explotab. O glicolato de amido sódico, Amberlita, carboximetilcelulose sódica, ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca de laranja, celulose carboximetílica ácida, esponja natural e bentonita podem ser todos usados. Uma outra forma dos desintegrantes são as resinas trocadoras catiônicas insolúveis. Gomas em pó podem ser usadas como desintegrantes e como aglutinantes e podem incluir gomas em pó tais como agar, Karaya ou tragacanto. O ácido algínico e o seu sal sódico também são utilizáveis como desintegrantes.

Os aglutinantes podem ser usados para manter o agente terapêutico junto para formar um tablete duro e incluem materiais de produtos naturais tais como acácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem celulose metílica (MC), celulose etílica (EC) e celulose carboximetílica (CMC). A polivinil pirrolidona (PVP) e a celulose hidroxipropilmetílica (HPMC) podem ser ambas usadas em soluções alcóolicas para granular o produto terapêutico.

Um agente anti-friccional pode ser incluído na formulação do produto terapêutico para impedir a aderência durante o processo de formulação. Lubrificantes podem ser usados como uma camada entre o produto terapêutico e a parede morta e estes podem incluir, porém não são limitados ao ácido esteárico incluindo os seus sais de magnésio e de cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, óleos vegetais e ceras.

Lubrificantes solúveis também podem ser utilizados tais como lauril sulfato de sódio, lauril sulfato de magnésio, polietileno glicol de vários pesos moleculares, Carbowax 4.000 e 6.000.

Os glidantes que podem melhorar as propriedades de fluxo do medicamento durante a formulação e auxiliar o rearranjo durante a compressão podem ser adicionados. Os glidantes podem incluir amido, talco, sílica pirogênica e silicoaluminato hidratado.

Para auxiliar a dissolução do produto terapêutico no ambiente aquoso, um tensoativo pode ser adicionado com um agente umectante. Os tensoativos podem incluir detergentes aniônicos ais como o lauril sulfato de sódio, o dioctil sulfossuccinato de sódio e o dioctil sulfonato de sódio. Os detergentes catiônicos podem ser usados e podem incluir cloreto de benzalcônio ou o cloreto de benzetônio. A lista de detergentes não iônicos potenciais que podem ser incluídos na formulação como tensoativos são lauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, polioxietileno de óleo de mamona hidrogenado 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido graxo de sacarose, celulose metílica e celulose carboximetílica. Estes tensoativos podem estar presentes na formulação da proteína ou derivado seja sozinho ou com uma mistura em proporções diferentes.

Os aditivos que acentuam potencialmente a absorção dos compostos são por exemplo, o ácido oléico, ácido linoléico e ácido linolênico de ácidos graxos.

A formulação de liberação controlada pode ser desejada. O medicamento pode ser incorporado em uma matriz inerte que permita a liberação pelos mecanismos de difusão ou lixiviação, por exemplo, gomas.

As matrizes que se degeneram lentamente também podem ser incorporadas na formulação, por exemplo, alginatos, polissacarídeos. Uma outra forma de uma liberação controlada deste produto terapêutico é por um método com base no sistema terapêutico de Oros (Alza Corp.), isto é, o medicamento é incluído em uma membrana semipermeável que permite que a água entre e empurre o medicamento para fora através de uma abertura pequena única devido aos efeitos osmóticos. Alguns revestimentos entéricos também têm um efeito de liberação retardada.

Outros revestimentos podem ser usados para a formulação.

Estes incluem uma variedade de açúcares que podem ser aplicados em um taxo de revestimento. O agente terapêutico também pode ser dado em um tablete revestido por película e os materiais usados neste exemplo são divididos em 2 grupos. No primeiro estão os materiais não entéricos e incluem celulose metílica, celulose etílica, celulose hidroxietílica, celulose metilidroxietílica, celulose hidroxipropílica, celulose hidroxipropilmetílica, celulose carboximetílica sódica, provídona e os polietileno glicóis. O segundo grupo consiste dos materiais entéricos que são comumente ésteres do ácido ftálico.

Uma mistura de materiais pode ser usada para fornecer o revestimento de película ótimo. O revestimento de película pode ser realizado em revestidor de tacho ou em um leito fluidizado ou por revestimento por compressão. É também aqui considerado a liberação pulmonar da presente proteína (ou seus derivados). A proteína (ou derivados) é liberada aos pulmões de um mamífero por inalação e atravessa o revestimento epitelial pulmonar para a corrente sanguínea. (Outros relatos disto incluem Adjei et al, Pharmaceutical Research 7: 565 a 569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135 a 144 (1990) (acetato de leuprolida);

Braquet et ai, Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): s. 143 a 146 (1989) (endotelina-1); Hubbard et al., Annals of Internai Medicine 3: 206 a 212 (1989) (α-1-antitripsina); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145 a 1146 (1989) (αΐ-proteinase); Oswein et al “Aerosolization of Proteinas”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, Março, 1990 (hormônio do crescimento humano recombinante);

Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482 a 3488 (1988) (Interferon- y e fator a de necrose tumoral) e Platz et al., Patente US 5.284.656 (fator de estímulo de colônia de granulócito). São considerados para o uso na prática desta invenção uma ampla faixa de dispositivos mecânicos projetados para a transferência pulmonar de produtos terapêuticos, que incluem mas não são limitados a nebulizadores, inaladores de dose medida e inaladores de pó, todos os quais são familiares a aqueles habilitados na técnica.

Alguns exemplos específicos de dispositivos comercialmente disponíveis adequados para a prática desta invenção são o nebulizador Ultravent, fabricado pela Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missuri; o nebulizador Acom II, fabricado pela Marquest Medicai Products, Englewood, Colorado; o inalador de dose medida Ventolin, fabricado pela Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; e o inalador de pó Spinhaler, fabricado pela Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Todos de tais dispositivos requerem o uso de formulações adequadas para a dispensa do composto da invenção. Tipicamente, cada formulação é específica para o tipo de dispositivo utilizado e pode envolver o uso de um material propelente, além de diluentes, adjuvantes e/ou carregadores utilizáveis em terapia. O composto da invenção deve ser mais vantajosamente preparada na forma de particulado com um tamanho médio de partícula menor do que 10 pm (ou mícrons), mais preferivelmente de 0,5 a 5 pm, para a transferência mais eficaz ao pulmão distai.

Os portadores incluem carboidratos tais como trealose, manitol, xilitol, sacarose, lactose e sorbitol. Outros ingredientes para o uso em formulações podem incluir DPPC, DOPE, DSPC e DOPC. Os tensoativos naturais ou sintéticos podem ser usados. Polietileno glicol pode ser usado (mesmo separadamente do seu uso na derivatização da proteína ou análogo).

Dextranas, tais como ciclodextrana, podem ser usadas. Sais de bile e outros acentuadores relacionados podem ser relacionados. A celulose e os derivados de celulose podem ser usados. Aminoácidos podem ser usados, tal como o uso em uma formulação tampão.

Da mesma maneira, o uso de lipossomas, microcápsulas ou microesferas, complexos de inclusão ou outros tipos de carregadores é considerado.

As formulações adequadas para o uso com um nebulizador, de jato ou ultrassônico, tipicamente compreenderá o composto da invenção dissolvido em água em uma concentração de cerca de 0,1 a 25 mg da proteína biologicamente ativa por ml de solução. A formulação também pode incluir um tampão ou um açúcar simples (por exemplo, para a estabilização da proteína e regulagem da pressão osmótica). A formulação nebulizadora também pode conter um tensoativo, para reduzir ou impedir a agregação induzida pela superfície da proteína causada pela atomização da solução na formação do aerossol.

As formulações para o uso com um dispositivo inalador de dose medida compreenderá, no geral, um pó fínamente dividido contendo o composto da invenção em suspensão em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional utilizado para este propósito, tal como um clorofluorocarboneto, um hidroclorofluorocarboneto, um hidrofluorocarboneto ou um hidrocarboneto incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano ou combinações destes. Os tensoativos adequados incluem trioletano de sorbitano e lecitina de soja. O ácido oléico também pode ser utilizável como um tensoativo.

As formulações para a dispensa a partir de um dispositivo inalador de pó compreenderão um pó seco fmamente dividido contendo o composto da invenção e também podem incluir um agente de carga tal como lactose, sorbitol, sacarose, manitol, trealose ou xilitol em quantidades que facilitem a dispersão do pó do dispositivo, por exemplo, de 50 a 90% em peso da formulação. A liberação nasal do composto da invenção também é considerada. A liberação nasal permite a passagem da proteína para a corrente sanguínea diretamente após a administração do produto terapêutico no nariz, se a necessidade para a deposição do produto nos pulmões. As formulações para a liberação nasal incluem aquelas com dextrana ou ciclodextrana. A liberação pelo transporte através de outras membranas mucósicas também é considerada.

DOSAGENS O regime de dosagem envolvido em um método para tratar as condições acima descritas será determinado pelo médico atendente, considerando-se vários fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo, a idade, condição, peso corpóreo, sexo e dieta do paciente, a gravidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros fatores clínicos. No geral, a dose deve estar na faixa de 0,1 pg a 100 mg do composto da invenção por quilograma de peso corporal por dia, preferivelmente de 0,1 a 1000 pg/kg; e mais preferivelmente de 0,1 a 150 pg/kg, dada em doses diárias ou em doses equivalentes em intervalos mais longos ou mais curtos, por exemplo, dia sim dia não, duas vezes na semana, semanalmente ou duas ou três vezes ao dia. O composto da invenção pode ser administrado por um bolo inicial seguido por uma infusão contínua para manter os níveis circulantes terapêuticos do produto medicamentoso. Como um outro exemplo, o composto da invenção pode ser administrado como uma dose única. Aqueles de habilidade comum na técnica facilmente otimizarão as dosagens eficazes e os regimes de administração como determinado pela boa prática medica e pelas condições clínicas do paciente individual. A ffeqüência da dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e de via de administração. A formulação farmacêutica ótima será determinada por uma pessoa habilitada na técnica dependendo da via de administração e da dosagem desejada, Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18- Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435 a 1712, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência. Tais formulações podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de transferência in vivo e a taxa de liberação in vivo dos agentes administrados.

Dependendo da via de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com o peso corporal, a área de superfície do corpo ou o tamanho do órgão. O refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento que envolve cada uma das formulações mencionadas acima é rotineiramente feito por aqueles de habilidade ordinária na técnica sem a experimentação indevida, especialmente levando-se em consideração as informações de dosagem e os ensaios aqui divulgados, bem como os dados farmacocinéticos observados nos testes clínicos humanos debatidos acima. As dosagens apropriadas podem ser averiguadas através do uso de ensaios estabelecidos para se determinar as dosagens de níveis sangüíneos em conjunção com dados de dose-resposta apropriados. O regime de dosagem final será determinado pelo médico atendente, considerando-se vários fatores que modificam a ação dos medicamentos, por exemplo a atividade específica do medicamento, a severidade do dano e a responsividade do paciente, a idade, as condições, o peso corporal, o sexo e a dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros fatores clínicos. À medida em que os estudos são conduzidos, outras informações emergirão com respeito a níveis de dosagem apropriados e à duração do tratamento para as várias doenças e condições.

Os processos terapêuticos, as composições e os compostos da presente invenção podem também ser empregados, sozinhos ou em combinação com outras citocinas, receptor Mpl solúvel, fatores hematopoiéticos, interleucinas, fatores do crescimento ou anticorpos no tratamento de estados de doença caracterizados por outros sintomas, bem como as deficiências de plaquetas. Antecipa-se que o composto da invenção provará ser útil em tratar algumas formas de trombocitopenia em combinação com estimuladores gerais de hematopoiese, tal como IL-3 ou GM-CSF.

Outros fatores estimuladores megacariócitos, isto é, meg-CSF, o fator de células primordiais (SCF), o fator inibidor da leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), ou outras moléculas com atividade estimuladora de megacariócitos, podem também ser empregados com o ligando Mpl. Citocinas adicionais de exemplo ou fatores hematopoiéticos para tal co-administração incluem IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, o fator-1 estimulador de colônias (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), EPO, interferon-alfa (IFN-alfa), interferon de consenso, IFN-beta, IFN-gama, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, trombopoietina (TPO), angiopoietinas, por exemplo Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, o polipeptídeo semelhante à angiopoietina humana, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), a angiogenina, a proteína-1 morfogênica dos ossos, proteína-2 morfogênica dos ossos, a proteína-3 morfogênica dos ossos, a proteína-4 morfogênica dos ossos, proteína-5 morfogênica dos ossos, a proteína-6 morfogênica dos ossos, a proteína-7 morfogênica dos ossos, a proteína-8 morfogênica dos ossos, a proteína-9 morfogênica dos ossos, a proteína-10 morfogênica dos ossos, a proteína-11 morfogênica dos ossos, a proteína-12 morfogênica dos ossos, a proteína-13 morfogênica dos ossos, a proteína-14 morfogênica dos ossos, a proteína-15 morfogênica dos ossos, o receptor IA da proteína morfogênica dos ossos, o receptor IB da proteína morfogênica dos ossos, o fator neurotrófíco derivado do cérebro, o fator neutrófico ciliar, receptor α do fator neutrófico ciliar, o fator 1 quimiotáctico neutrófilo induzido pela citocina, o neutrófilo induzido por citocina, o fator 2a quimiotático, o fator 2β quimiotático neutrófilo induzido por citocina, o fator de crescimento de células endoteliais β, a endotelina 1, o fator do crescimento epidérmico, o atraente neutrófilo de derivação epitelial, o fator de crescimento de fibroblastos 4, o fator de crescimento de fibroblastos 5, o fator de crescimento de fibroblastos 6, o fator de crescimento de fibroblastos 7, o fator de crescimento de fibroblastos 8, o fator de crescimento de fibroblastos 8b, o fator de crescimento de fibroblastos 8c, o fator de crescimento de fibroblastos 9, o fator de crescimento de fibroblastos 10, o fator de crescimento de fibroblastos acídico, o fator de crescimento de fibroblastos básico, o receptor α 1 do fator neutrófico derivado da linhagem de células gliais, o receptor α 2 do fator neutrófico derivado da linhagem de células gliais, a proteína relacionada ao crescimento, a proteína α relacionada ao crescimento, a proteína β relacionada ao crescimento, a proteína γ relacionada ao crescimento, o fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina, o fator de crescimento de hepatócitos, o receptor do fator de crescimento de hepatícitos, o fator I de crescimento semelhante à insulina, o receptor do fator de crescimento semelhante à insulina, o fator I de crescimento semelhante à insulina, a proteína de ligação do fator de crescimento semelhante à insulina, o fator de crescimento de ceratinócitos, o fator inibidor da leucemia, o receptor oc do fator inibidor da leucemia, o fator de crescimento dos nervos, o receptor do fator de crescimento dos nervos, neurotrofma-3, neurotrofina-4, fator de crescimento da placenta, fator 2 de crescimento da placenta, fator de crescimento de células endoteliais derivadas de plaqueta, fator de crescimento derivado de plaqueta, cadeia do fator A de crescimento derivado de plaqueta, fator AA de crescimento derivado de plaqueta, fator AB de crescimento derivado de plaqueta, cadeia do fator B de crescimento derivado de plaqueta, fator BB de crescimento derivado de plaqueta, receptor α do fator de crescimento derivado de plaqueta, receptor β do fator de crescimento derivado de plaqueta, fator estimulador do crescimento de pré-células B, receptor do fator de células primordiais, TNF, incluindo TNFO, TNF1, TNF2, fator α de crescimento transformador, fator β de crescimento transformador, fator βΐ de crescimento transformador, fator β 1,2 de crescimento transformador, fator β2 de crescimento transformador, fator β3 de crescimento transformador, fator β5β de crescimento transformador, fator βΐ de crescimento transformador latente, proteína I de ligação do fator β de crescimento transformador, proteína II de ligação do fator β de crescimento transformador, proteína III de ligação do fator β de crescimento transformador, tipo I do receptor do fator de necrose tumoral, tipo II do receptor do fator de necrose tumoral, receptor ativador do plasminogênio tipo urocinase, fator de crescimento endotelial vascular, e proteínas quiméricas e seus fragmentos biológica ou imunologicamente ativos. Pode ainda ser útil administrar, ou simultânea ou seqüencialmente, uma quantidade eficaz de um receptor Mpl de mamífero, solúvel, que parece ter o efeito de fazer com que os megacariócitos se fragmentem em plaquetas uma vez os megacariócitos tenham atingido a forma matura. Assim, espera-se que a administração de um composto da invenção (para intensificar o número de megacariócitos maduros), seguida pela administração do receptor Mpl solúvel (para inativar o ligando e permitir que os megacariócitos maduros produzam plaquetas) seja um meio particularmente eficaz de estímulo da produção de plaquetas. A dosagem apresentada acima deve ser ajustada para compensar quanto a tais componentes adicionais na composição terapêutica. O progresso do paciente tratado pode ser monitorado por processos convencionais.

Nos casos em que os compostos da invenção sejam acrescentados às composições de plaquetas e/ou megacariócitos e células relacionadas, a quantidade a ser incluída será em geral averiguada experimentalmente por técnicas e ensaios conhecidos na técnica. Um exemplo de faixa de quantidades é a de 0,1 pg a 1 mg do composto da invenção por 106 células. * * * Fica entendido que a aplicação dos preceitos da presente invenção a um problema ou situação específicos situar-se-ão dentro da capacidade de uma pessoa que tenha experiência normal na técnica, à luz dos preceitos aqui contidos. Os exemplos dos produtos da presente invenção e os processos representativos para seu isolamento, uso e fabricação, aparecem abaixo.

EXEMPLOS I. Os seguintes apresentam processos exemplares para produzir alguns dos compostos do primeiro grupo aqui apresentado.

A. MATERIAIS E PROCESSOS

Todos os derivados de aminoácidos (todos de configurações L) e resmas usadas na síntese do peptídeo foram adquiridos de Novabiochem.

Os reagentes (DCC, HOBt, etc) da síntese do peptídeo foram adquiridos na forma de solução de Applied Biosystems, Inc. Os dois derivados de PEG foram de Shearwater Polymers, Inc. Todos os solventes (diclorometano, N- metilpirrolidinona, metanol, acetonitrila) foram de EM Sciences. HPLC analítica foi executada sobre um sistema Bechman com uma coluna Vydac (0,46 cm X 25 cm, fase reversa C18, 5 mm), em um taxa de fluxo de 1 ml/minuto e com detecção UV dual em 220 e 280 nm. Gradientes lineares foram usados para todas as operações HPLC com duas fases móveis: Tampão A - H20 (0,1% de TFA) e Tampão B - acetonitrila (0,1% de TFA). Os peptídeos numerados referidos até aqui, por exemplo, 17b, 18,19 e 20, foram numerados com referência a tabela 1, e alguns deles são ainda ilustrados nas figuras 2 e 3. SÍNTESE DO PEPTÍDEO. Todos os peptídeos foram preparados pelo processo de síntese de fase sólida gradualmente bem estabelecido. A síntese de fase sólida com química Fmoc foi executada usando um Sintetizador de Peptídeo ABI. Tipicamente, a síntese do peptídeo começou com uma resina Wang pré-carregada em escala de 0,1 mmol. A

desproteção Fmoc foi executada com o protocolo de piperidina padrão. O acoplamento foi efetuado usando DCC/HOBt. Canais laterais que protegem os grupos são: Glu(O-t-Blu), Thr(t-Bu), Arg(Pbf), Gln(Trt), Trp(t-Boc) e Cys(Trt). Para o primeiro precursor de peptídeo para peguilação, o Dde foi usado para proteção da cadeia lateral do Lys no ligador e Boc-Ile-OH foi usado para o último acoplamento. O Dde foi removido usando hidrazina de anidro (2% em NMP, 3x2 minutos), seguido por acoplamento com anidreto bromoacético pela ação de DCC. Para o peptídeo 18, a cadeia lateral da cisteína no ligador foi protegido por um grupo de tritila. A desproteção final e divagem de todas as resinas peptídicas foram efetuadas em Rt por 4 horas, usando ácido trifluoroacético (TFA) contendo 2,5% de H20, 5% de fenol, 2,5% de triisopropilsilano e 2,5% de tioanisola. Após remoção do TFA, o peptídeo clivado foi precipitado com éter anidro frio. A formação de dissulfeto do peptídeo cíclico foi realizada diretamente sobre o material bruto usando 15% de DMSO em H20 (pH 7,5). Todos os peptídeos brutos foram purificados por HPLC de fase reversa preparativa e as estruturas foram confirmadas por ESI-MS e análise de aminoácido.

Altemativamente, todos os peptídeos descritos acima puderam também ser preparados usando a química t-Boc. Neste caso, as resinas de partida deveríam ser a Merrifield clássica ou a resina Pam, e a cadeia lateral que protege os grupos deveria ser: Glu(OBzl), Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp(CHO), Cys(p-MeBzl). O fluoreto de hidrogênio (HF) podería ser usado para a divagem final das resinas peptídicas.

Todos os peptídeos diméricos em série descritos neste estudo que têm ligadores compostos de aminoácido natural também podem ser preparados por tecnologia de DNA recombinante. PEGUILACÃO. Uma nova estratégia convergente para a peguilação de peptídeos sintéticos foi desenvolvida consistindo de combinação, através da formação de uma ligação conjugada na solução, um peptídeo e uma metade de PEG, cada um ligando uma funcionalidade especial que é mutuamente reativa em relação à outra. Os peptídeos precursores podem ser facilmente preparados com a síntese de fase sólida convencional como descrito acima. Como descrito abaixo, esses peptídeos são “pré-ativados” com um grupo funcional apropriado em um sítio específico. Os precursores são purificados e completamente anteriores a reação com a metade PEG. A ligação do peptídeo com PEG comumente ocorre na fase aquosa e pode ser facilmente monitorada por HPLC analítica de fase reversa. Os peptídeos peguilados podem ser facilmente purificados por HPLC preparativa e caracterizados por HPLC analítica, análise de aminoácido e espectometria de massa de dessorção a laser. PREPARAÇÃO DO PEPTÍDEO 19. O peptídeo 17b (12 mg) e MeO-PEG-SH 5000 (30 mg, 2 equivalentes) foram dissolvidos em 1 tampão aquoso de 1 ml (pH 8). A mistura foi incubada em RT por cerca de 30 minutos e a reação foi controlada por HPLC analítica que mostrou uma conclusão maior que 80% da reação. O material peguilado foi isolado por HPLC preparativa. PREPARAÇÃO DO PEPTÍDEO 20. O peptídeo 18 (14 mg) e Me-O-PEG-maleimida (25 mg) foram dissolvidos em um tampão aquoso de cerca de 1,5 (pH 8). A mistura foi incubada em RT por cerca de 30 minutos, em cujo tempo -70% da transformação estava completa como monitorada com HPLC analítica aplicando uma alíquota da amostra à coluna de HPLC. O material peguilado foi purificado por HPLC preparativa. ENSAIO DE BIOATIVIDADE, O bioensaio in vitro TPO é um ensaio mitogênico utilizando um clone dependente IL-3 de células 32D murínicas que foram transfectadas com receptor mpl humano. Este ensaio é descrito em maior detalhe na WO 95/26746. As células foram mantidas em meios MEM contendo 10% de Fetal Clone II e 1 ng/ml de mIL-3. Anterior à adição da amostra, as células são preparadas enxaguando-as duas vezes com meios de crescimento desprovido de mIL-3. Uma curva padrão TPO de ponto doze estendida é preparada, alcançando de 3333 até 3339 pg/ml. Quatro diluições, estimadas para cair dentro da parte linear da curva padrão, (1000 a 1125 pg/ml), foram preparadas para cada amostra e desenvolvidas em triplicata. Um volume de 100 μΐ de cada diluição da amostra ou padrão foi adicionado aos reservatórios apropriados de placa microtituladora de 96 reservatórios contendo 10.000 células/reservatório. Após quarenta e quatro horas em 37°C e 10% de C02, MTS (um composto tetrazólio que é bioreduzido por células para um formazan) foi adicionado em cada reservatório. Aproximadamente seis horas mais tarde, a densidade ótica foi lida em um leitor de placa em 490 nm, Uma curva de resposta de dose (log de concentração de TPO versus fundo OD.) foi gerada e a análise de regressão linear de pontos que caem na parte linear da curva padrão foi realizada. As concentrações de amostras de testes desconhecidas foram determinadas usando a equação linear resultante e uma correção para o fator de diluição. ABREVIAÇÕES. HPLC: cromatografia líquida de alto desempenho; ESI-MS: espectometria de massa de ionização de pulverizador de elétron; MALDI-MS: espectometria de massa de ionizaçao de dessorção a laser assistida por matriz; PEG: Poli (etileno glicol). Todos os aminoácidos são representados nos códigos padrão três letras ou letra única. t-Boc: terc- Butoxicarbonila; t-Btu: terc-Butila; Bzl: Benzila; DCC: dicilcohexilcarbodiimida; HOBt: 1-Hidroxibenzotriazola; NMP: N-metil-2- pirrolidinona; Pbf: 2,2,4,67-pendametildiidro-benzoíurano-5-sulfonil; Trt: tritil; Dde: l-(4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciclo-hexilidene)etila.

B. RESULTADOS

DÍMEROS EM SÉRIES TMP COM LIGADORES DE PQLIGLICINA. O desenho dos dímeros TMP seqüencialmente ligados foi feito com base na suposição de que uma forma dimérica de TMP foi solicitada para sua interação eficaz com c-Mpl (o receptor TPO) e que dependendo de como eles foram feridos em relação um ao outro no contexto de receptor, as duas moléculas de TMP deveríam ser cativas juntas na configuração C- a N-terminal em um modo que não deveria perturbar a conformação dimérica global. Evidentemente, a atividade dos dímeros ligados em série também podem depender da própria seleção do tamanho e composição do ligador que une o terminal C- e - dos dois manômeros TMP alinhados seqüencialmente. Uma vez que nenhuma informação estrutural do TMP ligado a c-Mpl estava disponível, uma série de peptídeos diméricos com ligadores compostos de 0 a 10 e 14 resíduos de glicinas (tabela 1) foram sintetizados. A glicina foi escolhida por causa de suas simplicidade e flexibilidade. Foi considerado que uma forte cadeia de peptídeo de poliglicina leva em conta a duplicação livre das duas TMP cativas repete na conformação requerida, enquanto mais seqüências de aminoácidos esteticamente impedidas podem adotar estruturas secundárias indesejadas cuja rigidez pode interromper o correto acondicionamento do peptídeo dimérico no contexto de receptor.

Os peptídeos resultantes são facilmente acessíveis por processos de síntese de peptídeo de fase sólida convencional [Merrifiled, R. B., Journal of the American Chemical Society 85: 2149 (1963)] com química ou Fmoc ou t-Boc. Diferente da síntese do dímero paralelo ligado C- terminalmente (SEQ ID NO:2) que requer o uso de um resíduo de lisina ortogonalmente protegido como ponto de ramificação inicial para construir as duas cadeias de peptídeos em um modo pseudossimétrico [Cwirla, S.E. et ai, Science 276: 1696-1699 (1997)], a síntese de nossos dímeros em séries foi uma montagem direta, gradual das cadeias de peptídeos contínuos do terminal C- até N-. Uma vez que a dimerização de TMP teve um efeito mais dramático na atividade proliferativa do que ligando afinidade como mostrado para o dímero terminal C [Cwirla, S. E., et ai, Science 276: 1696-1699 (1997)], os peptídeos sintéticos foram testados diretamente quanto a atividade biologica em um ensaio de proliferação celular de TPO dependente usando um clone dependente IL-3 de células 32D murínicas transfectadas com o c- Mpl de tamanho completo [Palacios, R. et al, Cell 41: 727 (1985)]. Como os resultados dos testes mostraram (ser tabela 1 abaixo), todos dos dímeros em série ligados a poliglicina demonstraram aumento de mais de 1000 vezes em potência em comparação com o manômero, e estavam até mais potentes do que o dímero terminal C neste ensaio de proliferação celular. A atividade absoluta do dímero terminal C em nosso ensaio foi inferior do que aquela da proteína nativa TPO, que é diferente das descobertas anteriormente relatadas em que o dímero terminal C foi observado sendo tão ativo quanto o ligando natural (Cwirla, S.E., èt d., Science 276:1696-1699)]. Isto pode ser devido a diferenças nas condições usadas nos dois ensaios. Apesar disso, a diferença na atividade entre terminal C de dímeros em série do primeiro manômero ligado a terminal N do segundo manômero (e terminal C de dímeros paralelos do primeiro monômero ligado a terminal C do segundo monômero) no mesmo ensaio claramente demonstrou a superioridade do produto dimerizado em série comparado aos produtos de dímero paralelo. É interessante notar que uma larga faixa de tamanho é tolerada pelo ligador. O melhor ligador com os manômeros TMP selecionados (SEQID NO:l) aparentemente é composto de 8 glicinas. OUTROS DÍMEROS EM SÉRIE. Subseqüente a esta primeira série de dímeros em série TMP, várias outras moléculas foram designadas ou com diferentes ligadores ou contendo modificações dentro de seu próprio monômero. A primeira destas moléculas, peptídeo 13, tem um ligador composto de GPNG, uma seqüência conhecida por ter uma alta propensão para formar uma estrutura secundária do tipo fi-turn. Embora ainda cerca de 100 vezes mais potente do que o manômero, este peptídeo foi observado como sendo mais de 10 vezes menos ativo do que o análogo ligado GGGG.

Assim, a introdução de um β-íwm relativamente rígido na região ligadora pareceu causar uma leve distorção da melhor conformação agonista neste breve forma ligadora. A Trp9 na seqüência TMP é um resíduo altamente conservado entre os peptídeos ativos isolados das bibliotecas aleatórias de peptídeos.

Existe também um Trp altamente conservado nas seqüências de consenso de peptídeos miméticos de EPO e este resíduo Trp foi observado como sendo envolto na formação de um centro hidrofóbico entre os dois Peptídeos Miméticos EPO (EMPs) e contribuiu par interações hidrofóbicas com o receptor EPO [Livnah, O et al, Science 273:464 a 471 (1996)]. Por analogia, pensou-se que o resíduo Trp9 em TMP podia ter uma função semelhante na dimerização do ligando do peptídeo, e em um esforço para modular e estimar os efeitos de forças hidrofóbicas não covalentes exercidas pelos dois anéis indóis, vários análogos foram construídos resultantes de mutações na Trp.

Assim no peptídeo 14, o resíduo Trp em cada um dos dois monômeros foi substituído com um Cys, e uma ligação de dissulfeto intramolecular foi formada entre as duas cisteínas por oxidação a qual foi prevista para imitar as interações hidrofóbicas entre as dois resíduos Trp na dimerização do peptídeo. O peptídeo 15 é a forma reduzida do peptídeo 14. No peptídeo 16, os dois resíduos Trp foi substituídos por Ala. Como o ensaio mostra os dados, todos os três análogos estavam inativos. Esses dados ainda demonstraram que Trp é importante para a atividade do peptídeo mimético TPO, não apenas para a formação de dímero.

Os próximos dois peptídeos (peptídeo 17a, e 18) cada um contém na sua ligação ligação de 8 aminoácidos um resíduo Lys ou Cys.

Estes dois compostos são precursores dos dois peptídeos peguilados (peptídeo 19 e 20) em que a cadeia lateral de Lys ou Cys é modificada por uma metade de polietileno glicol (PEG). Decidiu-se introduzir uma metade de PEG no meio de uma ligador relativamente longo, de modo que o componente PEG grande (5 kDa) fica distante o bastante dos sítios de ligações importantes na molécula do peptídeo. PEG é um polímero biocompatível conhecido que é mais e mais usado com um modificador covalente para melhorar os perfis farmacocinéticos de terapêuticos com base em peptídeo e proteína.

Um processo com base em solução modular foi planejado para peguilação conveniente de peptídeos sintéticos ou recombinantes. O processo é baseado na agora bem estabelecida estratégia de ligação quiomosseletiva.

Assim, para o peptídeo 19 peguilado, a cadeia lateral de lisina foi pré-ativada com um grupo bromoacetil para dar o peptídeo 17b para acomodar a reação com um PEG derivado de tiol. Para fazer isto, um grupo de proteção ortogonal, Dde, foi empregado para a proteção de lisina ε-amina. Uma vez que a cadeia de peptídeo total foi montada, a amina terminal N foi reprotegida com t-Boc. Dde foi então removido para permitir a bromoacetilação. Esta estratégia deu um peptídeo bruto de alta qualidade que foi facilmente purificado usando HPLC de fase reversa convencional. A ligação do peptídeo com o PEG modificado por tiol ocorreu em tampão aquoso em pH 8 e a reação completou dentro de 30 minutos A análise MALDI-MS do material peguilado purificado revelou um espectro conformado em sino característico com um incremento de 44 Da entre os picos adjacentes. Para o peptídeo 20 PEG, um resíduo de cisteína foi colocado na região do ligador e seu grupo tiol de cadeia lateral pode servir como um sítio de ligação para uma maleimida contendo PEG. Semelhantes condições foram usadas para a peguilação deste peptídeo. Como os dados do ensaio revelaram, estes dois peptídeos peguilados tiveram ainda a mais alta bioatividade in vitro em comparação com as contra-partes não peguiladas. O peptídeo 21 tem em seu ligador de aminoácido 8 um motivo de glicosilação potencial NGS. Uma vez que os dímeros em série exemplares são produzidos de aminoácidos naturais ligados por ligações peptídeas, expressão de uma tal molécula em um sistema celular eucariótico apropriado deve produzir um glicopeptídeo com a metade de carboidrato adicionado na carboximida de cadeia lateral de Asn. A glicosilação é um processo de modificação pós-transacional comum que pode ter muitos impactos positivos na atividade biológica de uma dada proteína aumentando sua solubilidade aquosa e estabilidade in vivo. Como mostra os dados do ensaio, a incorporação deste motivo de glicosilação na alta bioatividade mantida pelo ligador. O precursor sintético do glicopeptídeo potencial tem em efeito uma atividade comparável àquela do análogo ligado -(Gly)g-. Uma vez glicosilado, espera-se que este peptídeo tenha a mesma ordem de atividade como os peptídeos peguilados, por causa das propriedades quimofísicas semelhantes exibidas por um PEG e uma metade de carboidrato. O último peptídeo é um dímero de um dímero. Ele foi preparado através da oxidação do peptídeo 18, que formou uma ligação de dissulfeto intermolecular entre os dois resíduos de cisteína localizados no ligador. Este peptídeo foi desenhado para direcionar a possibilidade que TMP ativou como um tetrâmero. Os ciados do ensaio mostraram que este peptídeo nào estava mais ativo do que um dímero em série medio em uma base molar ajustada, que indiretamente suporta a idéia de que a forma ativa de TMP é realmente um dímero, se não a dimerização de um dímero em série pode ter um impacto adicional na bioatividade. A seguinte tabela I resume as atividades relativas dos compostos acima descritos em termos de EC50 com base em ensaios in vitro como descrito acima.

TABELA I

Nota: Na tabela I, os numerais indicam aproximadamente 1 log de atividade, de modo que a diferença na atividade entre “1” e “4” é de aproximadamente 1000 vezes. Um incremento de 0,5 é um ponto intermediário, de modo que a diferença na atividade entre “1” e “3,5” é de aproximadamente 500 vezes. “ND” significa não determinado. II. O seguinte apresenta processos exemplares para produção de alguns dos compostos do segundo grupo aqui apresentado.

A. PREPARAÇÃO DE UM COMPOSTO DE FUSÃO Fc DO TIPO MOSTRADO NA FIGURA 6C.

Um codificação de seqüência de DNA para a região Fc do IhGl humano fundido na estrutura a um dímero do peptídeo mimético TPO (SEQID NO:34) foi colocado sob o controle do promotor luxPR no vetor de expressão de plasmídeo pAMG21 como segue.

O gene de fusão foi construído usando tecnologia de PCR padrão. Os modelos para reações de PCR foram o vetor de fusão contendo a seqüência Fc e um gene sintético codificando o restante do composto da SE ID NO:34. O gene sintético foi construído a partir de 4 nucleotídeos de transição mostrado abaixo: 1830- 1852 AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG

ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT (SEQ ID NO: 35) 1830- 1853 ACCTCCACCACCAGCACGAGCAGCCAG

CCA CTG ACG CAG AGT CGG ACC (SEQ ID NO: 36) 1830 - 1854 GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC

CCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA CGC GCA (SEQ ID NO: 37) 1830- 1855 AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG

CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC

CTCCGC CGCC (SEQID NO: 38) Os 4 nucleotídeos foram enrijecidos para formar o duplex mostrado abaixo: SEQ IDNO: 39 [olinucleotídeos co-lineares 1830 - 1852 e 1830 - 1854] SEQ ID NO: 40 [olinucleotídeos co-lineares 1830 - 1853 e 1830 - 1855] e SEQ ID NO: 41 [a sequência de aminoácido codificada] Este duplex foi amplificado em uma reação de PCR usando 1830 - 1852 e 1830 - 1855 como os iniciadores de senso e antisenso. A parte Fc da molécula foi gerada em uma reação PCR com DNA de Fc usando os iniciadores. 1216- 1252 AAC ATA AGT ACC TGT AGG ATC G (SEQ ID NO: 42) 1830- 1851 TTCGATACCACCACCTCCACCTTTACCCGGAGACAGG GAGAGGCTCTTCTGC (SEQ ID NO: 43) Os nucleotídeos 1830 - 1851 e 1830 - 1852 contêm uma transição de 24 nucleotídeos, que permitem que os dois genes sejam fundidos juntos na estrutura de leitura correta combinando os produtos de PCR acima em uma terceira reação usando os iniciadores externos, 1216 - 1252 e 1830 - 1855. O produto fmal do gene de PCR (o gene de fusão de tamanho completo) foi digerido com endonucleases de restrição Xbal e BamVil, e então ligados no vetor pAMG21 (ver abaixo), também digerido com Xbal e BamRl. 0 DNA ligado foi transformado em células hospedeiras competentes da cepa E. coli 2596 (GM221, descrito abaixo). Os clones foram classificados quanto a habilidade para produzir o produto de proteína recombinante e controlar a fusão do gene tendo a seqüência de nucleotídeo correta. Os níveis de expressão de proteína foram determinados a partir de estudos em frasco sacudidor de 50 ml. Os lísados das células totais foram analisados quanto a expressão da fusão através de géis PAGE manchados Coomassie. A seqüência de aminoácido da proteína de fusão mostra abaixo a seqüência de nucleotídeo correspondente: SEQID NO: 44 [leitura do filamento único 5’ -> 3’ acima], SEQ ID NO: 45 [leitura do filamento único 3’ -> 5’ acima] e SEQ ID NO: 46 [a seqüência de aminoácido codificada] pAMG21 O plasmídeo de expressão pAMG21 está disponível a partir do ATCC sob número de acesso 98113, que foi depositado em 24 de julho de 1996. GM221ÍCEPA HOSPEDEIRA AMGEN #2596) A cepa hospedeira Amgen #2596 é uma cepa E. coli K-12 que foi modificada para conter tanto a temperatura do repressor lambda sensível cI857s7 na região ebg prematura quanto o repressor lacíQ na região ebg tardia (68 minutos). A presença desses dois genes repressores permitem o uso deste hospedeiro com uma variedade de sistemas de expressão, entretanto ambos desses repressores são irrelevantes à expressão de IuxPr. O hospedeiro não transformado não tem resistência antibiótica. O sítio de ligação do ribossomo do gene cI857s7 foi modificado para incluir um RBS melhorado. Ele foi inserido no óperon ebg entre a posição de nucleotídeo 1170 e 1411 como numerado no número de acesso de Genbank M6441Gb_Ba com deleção da seqüência de ebg intervindo. A construção foi liberada ao cromossoma usando um fago recombinante chamado RBS #4 intensificado MMebg-cI857s7 no F’tet/393 Após a recombinação e resolução apenas o inserto cromossômico descrito acima restou na célula. Ele foi renomeado F’tet/GM101.

Ftet/GMIOl foi então modificado através da liberação de uma construção lqcIQ no óperon ebg entre a posição de nucleotídeo 2493 e 2937 como numerado no número de acesso Genbank M64441Gb_Ba com a deleção da seqüência ebg intervindo. A construção foi liberada ao cromossomo usando um fago recombinante chamado AGebg-LacIQ#5 no F’tet/GM101. Após a recombinação e resolução apenas o inserto cromossômico descrito acima restou na célula. Ela foi renomeada F’tet/GM221. O epissoma F’tet foi curado da cepa usando laranja de acridina em uma concentração de 25 pg/ml em LB. A cepa curada foi identificada como tetraciclina sensível e foi armazenada como GM221. A construção da fusão Fc contida no plasmídeo pAMG21 (aqui referida como pAMG21-Fc-TMP-TMP), que sucessivamente está contida na cepa hospedeira GM221 foi depositada na ATCC sob número de acesso 98957, com uma data de depósito de 22 de outubro de 1998. EXPRESSÃO, As culturas de pAMG2l-Fc-TMP-TMP em GM221 de E. coli em meio Luria Broth contendo 50 pg/ml de canamicina foram incubadas em 37°C antes da indução. A indução da expressão do produto do gene Fc-TMP-TMP do promotor luxPR foi alcançada seguindo a adição do auto-indutor lactona de N-(3-oxoexanoil)-DL-homoserina ao meio de cultura a uma concentração final de 20 ng/ml e as culturas foram incubadas em 37°C por um adicional de 3 horas. Após 3 horas, as culturas bacterianas foram examinadas por microscopia quanto a presença de corpos de inclusão e foram então colhidas por centrifugação. Corpos de inclusão refrátil foram observados nas culturas induzidas indicando que o Fc-TMP- TMP foi muito provavelmente produzido na fração insolúvel em E. coli.

Pelotas celulares foram lisadas diretamente pela ressuspensão em tampão de amostra de Laemmli contendo 10% de β-mercaptoetanol e foram analisadas por SDS-PAGE. Uma intensa banda manchada de Coomassie de aproximadamente 30 kDa foi observada sobre um gel de SDS-PAGE. O produto de gene esperado deve ser de 269 aminoácidos em tamanho e tem um peso molecular esperado de cerca de 29,5 kDa. A fermentação também foi executada sob condições de batelada padrão na escala 10 L, resultando em níveis de expressão semelhantes da Fc-TMP-TMP para aqueles obtidos na escala de referência.

PURIFICAÇÃO DE Fc-TMP-TMP

As células foram quebradas em água (1/10) por homogeneização de alta pressão (2 passagens em 14.000 PSI) e os corpos de inclusão foram colhidos por centrifugação (4200 RPM em J-6B por 1 hora).

Os corpos de inclusão foram soíubilizados em guanidina a 6 M, Tris a 50 mM, DTT a 8 mM, pH 8,7 por 1 hora em uma relação 1/10. A mistura solubilizada foi diluída 20 vezes em uréia a 2 M, Tris a 50 mM, arginina a 160 mM, cisteína a 3 mM, pH 8,5. A mistura foi agitada durante a noite no frio. Neste ponto no procedimento as sub-unidades manoméricas de Fc-TNP- TMP dimerizam-se para formar o composto dissuifeto ligado tendo a estrutura mostrada na figura 6C e então concentradas em cerca de 10 vezes por ultrafiltração. Ela foi então diluída 3 vezes com Tris a 10 mM, uréia a 1,5 M, pH 9.0 pH da mistura foi então ajustado para pH 5 com ácido acético. O precipitado foi removido por centrifugação e o sobrenadante foi carregado em uma coluna SP-Sepharose HP em NaAc a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 5 (10 mg/ml de carga de proteína, temperatura ambiente). A proteína foi removida por eluíção usando um gradiente de volume de coluna 20 no mesmo tampão variando NaCl a 150 mM até NaCl a 400 mM. O pico foi fundido e filtrado.

III. O SEGUINTE É UM RESUMO DE DADOS IN VIVO EM

CAMUNDONGOS COM VÁRIOS COMPOSTOS DESTA INVENÇÃO CAMUNDONGO. BDF1 fêmea normal aproximadamente 10 a 12 semanas de idade. ESQUEMA DE SANGRAMENTO. Dez camundongos por grupo foram tratados no dia 0, dois grupos começaram 4 dias à parte para um total de 20 camundongos por grupo. Cinco camundongos sangraram em cada ponto de tempo, os camundongos foram sangrados em um mínimo de 3 vezes em uma semana. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e um volume total de 140 a 160 μΐ de sangue foi obtido através de perfuração do seio orbital. O sangue foi contado em um software de execução de análise de sangue Technicon H1E para sangue murínico. Os parâmetros medidos foram glóbulos bancos, glóbulos vermelhos, hematócrito, hemoglobina, plaquetas, neutrófilos. TRATAMENTOS. Os camundongos foram ou injetados subcutaneamente por um tratamento de bolo ou implantados com bombas micro osmóticas de 7 dias para liberação contínua. As injeções subcutâneas foram liberadas em um volume de 0,2 ml. As bombas osmóticas foram inseridas em uma incisão subcutânea feita na pele entre o omoplata do camundongo anestesiado. Os compostos foram diluídos em PBD com 0,1% de BSA. Todos os experimentos incluiram um grupo de controle, rotulado “portador” que foram tratados apenas com este diluente. A concentração dos artigos de teste nas bombas foi ajustada de modo que a taxa de fluxo calibrada das bombas deu os níveis de tratamento indicados no gráfico. COMPOSTOS. Uma titulação da dose do composto foi liberada para camundongo em bombas micro osmóticas de 7 dias. Os camundongos foram tratados com vários compostos em uma dose única de 100 ug/kg em bombas osmóticas de 7 dias. Alguns dos mesmos compostos foram então dados aos camundongos com uma injeção de bolo única. RESULTADOS DOS TESTES DE ATIVIDADE. Os resultados das experiências de atividade são mostrados nas figuras 4 e 5. Nos ensaios de resposta de dose usando bombas micro osmóticas de 7 dias (dados não mostrados) o efeito máximo observado com o composto da SEQID NO: 18 foi em 100 pg/kg/dia; a dose de 10 pg/kg/dia foi cerca de 50% a mais ativa e 1 pg/kg/dia foi a dose mais baixa em que a atividade pôde ser observada neste sistema de ensaio. O composto em dose de 10 pg/kg/dia foi quase igualmente ativo como 100 pg/kg/dia de fHu-MGDF não peguilado na mesma experiência.

IV. DISCUSSÃO É bem aceito que MGDF atua em um modo semelhante ao hormônio de crescimento humano (hGH), isto é, uma molécula do ligando de proteína liga duas moléculas do receptor para sua ativação [Wells, J. A. et al., Ann. Ver. Biochem. 65: 609-634 (1996)]. Esta interação é imitada pela ação do peptídeo TMP muito menor. Entretanto, os presentes estudos sugerem que este mimetismo requer a ação harmonizada de duas moléculas de TMP, como a dimerização covalente de TMP em ou uma forma paralela C-C ou seqüencial C-N aumentou a potência biológica in vitro do monômero original por um fator maior do que 103. A biopotência relativamente baixa do monômero é provavelmente devida a formação ineficiente do dímero não covalente. Um dímero covalente pré-formado tem a habilidade para eliminar a barreira da entropia para a formação de um dímero não covalente que é exclusivamente induzido por interações fracas, não covalentes entre as duas moléculas do peptídeo menor, de 14 resíduos. É interessante notar que a maioria dos dímeros em série são mais potentes do que os dímeros paralelos de terminal C. A dimerização em série parece dar à molécula uma conformação mais adequada do que a dimerização paralela C-C. A característica aparentemente não simétrica de dímero em série pode tê-lo levado mais próximo ao ligando natural que, como uma molécula não simétrica, usa dois sítios diferentes para ligar duas moléculas receptoras idênticas. A introdução da metade PEG foi considerada para melhorar para melhorar a atividade in vivo do peptídeo modifica provendo-o com uma proteção contra degradação proteolítica e reduzindo sua liberação através de filtração renal. Foi inesperado que a peguilação pudesse ainda aumentar a bioatividade in vitro de um peptídeo TMP dimerizado em série no ensaio de proliferação com base celular.

V. O SEGUINTE É UM SUMÁRIO DE DADOS IN VIVO EM MACACOS COM VÁRIOS COMPOSTOS DESTA INVENÇÃO. A fim de avaliar os parâmetros hematológicos em macacos Rhesus fêmeas associados com a administração de AMP2 através de administração subcutânea, o seguinte protocolo foi projetado e executado.

Cinco grupos de três macacos cada foram montados. O grupo 1 serviu como controle e recebeu tampão de acetato (acetato de sódio a 20 mM, cloreto de sódio a 0,25 M, pH 5) contendo nem AMP2 nem MGDF humano recombinante peguilado (PEG-rHuMGDF). O grupo 2 recebeu uma ou mais dosagem de AMP2 em intervalos indicados abaixo; o grupo 3 recebeu 1000 pg/kg de ΑΜΡ2 em intervalos indicados abaixo; o grupo 4 recebeu 5000 pg/kg de AMP2 em intervalos indicados abaixo; e o grupo 5 recebeu 100 pg/kg de PEG-rHuMGDF em intervalos indicados abaixo. O dia em que a primeira dose única foi administrada foi designado como Dia 0 do Ciclo 1. No Ciclo 2, as doses foram administradas nos Dias 21, 23, 25, 28, 30 e 32. Durante o Ciclo 3, uma dose única foi administrada no Dia 84, e no Ciclo 4, uma dose única foi administrada no Dia 123. Os animais foram observados quanto a sinais clínicos uma vez diariamente durante o período de aclimatação, três vezes diariamente (antes da dosagem, imediatamente a 30 minutos em seguida à dosagem, e 2 a 3 horas em seguida à dosagem) nos dias de dosagem, e uma vez diariamente nos dias sem dosagem. O consumo de alimento foi calculado diariamente com base no número de pedaços de alimentos dados e o número de resto para cada animal a partir de 7 dias antes à iniciação do período de dosagem até o fim do período de recuperação. O peso corporal para cada animal foi medido duas vezes antes do regime de dosagem e duas vezes durante os períodos de dosagem e recuperação. Amostras sangüíneas quanto a hematologia foram preparadas uma vez antes à iniciação da dosagem e uma vez nos Dias 1,3, 5, 7, 9,11,13,15, 20, 22, 24, 26, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99,101, 103, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150. Para a análise farmacocinética 0,5 ml de amostras de soro foram colhidas uma vez antes da dosagem e uma vez em 1, 4 e 24 horas após a dosagem. As amostras foram colhidas nos Dias 0, 21, 32, 84 e 123 e armazenadas em aproximadamente - 70°C até a análise. Para a análise de anticorpo, 2 ml de amostras de sangue foram colhidos uma semana antes à dose única e uma vez nos Dias 0 (antes da dosagem), 6,13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104,111, 118, 129, 136, 143 e 150. As amostras foram armazenadas em -70°C até a análise.

Os resultados indicaram que os valores das plaquetas aumentaram em todos os grupos tratados com os maiores aumentos observados nos grupos AMP2 de alta dose e PEG-rHuMGDF. No Ciclo 1, os valores das plaquetas de picos aumentaram aproximadamente 3,3 vezes e 3,1 vezes no grupo PEG-rHuMGDF (Dia 9) e 5000 μg/kg do grupo AMP2 (Dia 9), respectivamente, em comparação com a contagem da plaqueta principal no grupo de controle. Os valores da plaqueta de AMP2 de dose baixa aumentaram aproximadamente 1,5 vezes mais do que o controle nos mesmos dias de estudo específicos. Respostas semelhantes foram notadas em todos os outros ciclos.

Entretanto, no Ciclo 4, o grupo PEG-rHuMGDF não demonstrou uma contagem de plaqueta aumentada tão grande quanto nos ciclos anteriores. O grupo PEG-rHuMGDF teve contagem de plaquetas aumentadas de aproximadamente 2 vezes aquela no grupo de controle 9 dias após a dose deste ciclo. Para comparação, a contagem de plaqueta média no grupo AMP2 de dose elevada no Ciclo 4 foi 3,3 vezes maior do que o grupo de controle. Adicionalmente, os animais PEG-rHuMGDF tiveram uma contagem de plaqueta média 53% menor do que a contagem de plaqueta média do grupo de controle no início do Ciclo 4 (por dose) e a contagem de plaqueta média para o grupo no fim do Ciclo 4 *(27 dias após a dose) foi 79% menor do que aquela do grupo de controle. Para todos os animais AMP2, as contagens de plaquetas médias no início do Ciclo 4 foram ± 15% da contagem de plaqueta no grupo de controle.

Nos ciclos 1 e 2, uma tendência em direção a uma diminuição na contagem das células de glóbulos vermelhos (RBC) foi notada em todos os grupos tratados em comparação ao controle. A diminuição foi mais evidente nos Dias 43 até 43 e a maior diminuição em RBC foi notada no grupo PEG-rHuMGDF. As contagens iniciaram retomando aos níveis normais (em comparação ao controle) tão breve quanto o Dia 47. Os níveis celulares de glóbulos brancos (WBC) durante os Ciclos 1 e 2 foram dramaticamente aumentados (2,6 vezes) em comparação ao controle no Dia 35. Um leve aumento foi notado nos 5000 pg/kg do grupo AMP2 no Dia 33.

Valores entitulados com relação a níveis normais iniciando no Dia 37. Uma resposta semelhante foi observada no Ciclo 3 sem mudança aparente em WBC no Ciclo 4 em qualquer dos grupos tratados.

Durante o Ciclo3, as contagens de RBC foram levemente diminuídas durante o Dia 13 (seguindo a dose única do Ciclo 3) em todos os grupos tratados exceto para os 500 pg/kg do grupo AMP2. Os valores de RBC começaram retomando aos níveis normais em comparação com o controle) durante o Dia 17.

No Ciclo 4, as contagens de RBC diminuíram em todos os grupos tratados em comparação com o controle exceto nos 500 pg/kg do grupo AMP2. Diferente dos outros ciclos, houve mais do que um nadir presente neste ciclo. Estas diminuições apareceram dos Dias 1 a 9 após a dose e começaram a recuperar tão breve quanto o Dia 11.

Os resultados indicaram que um aumento nas contagens das plaquetas, acima daquela dos animais de controle pode ser detectada 7 a 9 dias em seguida a dosagem em todos os animais tratados em todos os ciclos testados. Pareceu que a fase de dose repetida causou uma resposta elevada na produção de plaquetas em comparação com as fases de dose única. Durante o Ciclo 4 a resposta de plaqueta extraída pelo grupo PEG-rHuMGDF foi menor em comparação aos ciclos anteriores e em comparação àqueles de resposta de AMP2 de dose alta. As diminuições em contagens RBC foram notadas nos Ciclos 1, 2, 3 e 4 na maioria dos grupos tratados em alguns pontos durante cada ciclo do estudo, entretanto, todos os parâmetros hematológicos retomaram aos níveis normais (em comparação com o controle) após cessação da dosagem.

Além de tudo, estes resultados indicaram que o tratamento com AMP2 foi bem tolerado nos macacos Rhesus e que AMP2 resultou em contagens de plaquetas aumentadas após vários ciclos de tratamento. Não pareceu, com base nos resultados de contagem de plaquetas que houve uma resposta imune mediada biologicamente significativa a AMP2. Em contraste o tratamento nos vários ciclos com PEG-rHuMGDF mostrou uma inibição na resposta da plaqueta durante o ciclo 4, sugerindo que anticorpos a PEG- rHuMGDF foram gerados e estes anticorpos anti-MGDF pode ter reação cruzada com o TPO Rhesus endógeno. A invenção sendo agora completamente descrita, estará aparente para aquele de conhecimento normal na técnica que muitas mudanças e modificações podem a esta ser feitas, sem o afastamento do espirito e escopo da invenção como aqui apresentada.

Claims (15)

1. Composto que se liga a um receptor mpl, caracterizado pelo fato de compreender a estrutura: (Fc)m-(L2)q-TMPi-(L1)n-TMP2-(L3)r-(Fc)p em que TMP3 e TMP2 são, cada um, independentemente selecionados do grupo de compostos de núcleo que compreendem a estrutura: X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio, em que: X2 é selecionado do grupo consistindo de Glu, Asp, Lys e Vai; X3 é selecionado do grupo consistindo de Gly e Ala; X4 é Pro; X5 é selecionado do grupo consistindo de Thr e Ser; X6 é selecionado do grupo consistindo de Leu, Ile, Vai, Ala e Phe; X7 é selecionado do grupo consistindo de Arg e Lys; Xg é selecionado do grupo consistindo de Gin, Asn e Glu; X9 é selecionado do grupo consistindo de Trp, Tyr, Cys, Ala e Phe; X10 é selecionado do grupo consistindo de Leu, Ile, Vai, Ala, Phe, Met e Lys; em que Lj, L2 e L3 são grupos ligantes que são, cada um, independentemente selecionados dos grupos ligantes que consistem de: Yn, em que Y é um aminoácido de ocorrência natural ou um esteroisômero do mesmo e n é de 1 até 20; (Gly)n, em que n é de 1 até 20, e quando n é maior do que 1, até metade dos resíduos de Gly podem ser substituídos por outros aminoácidos selecionados de 19 aminoácidos naturais remanescentes ou um estereoisômero dos mesmos; (Gly)3Lys(Gly)4(SEQIDNO: 6); (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQID NO: 7); (Gly)3Cys(Gly)4 (SEQID NO: 8); GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 9); um resíduo Cys; e (CH2)n, em que n é de 1 até 20 Fc é uma região Fc de uma imunoglobulina; n é 0 ou 1; m, p, q e r são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste de 0 e 1, em que pelo um dentre m ou p é 1, e adicionalmente em que se m é 0 então q é 0, e se p é 0, então r é 0; e sais fisiologicamente aceitáveis dos mesmos.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos TMPí e TMP2 são independentemente selecionados do grupo que consistem de: XrXs-Xí-XrXe-XrXg-XírXirXii; X2OC3fXrXrX6-X7-Xg-X9-X10-X11-X12; X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-XirXi2-Xi3; XrX3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-XirXi2-Xi3-Xi4; XrXrXrXrXrXe-XrXrXrX.o; XrX2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xli; XJ-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12; XrX2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xi.-Xi2-Xi3;e x1“X2-X3-X4-X5-X6“X7-X8-X9-Xio_X1i-X12“Xi3-XI4» em que X2-Xio são como definidos; X] é selecionado do grupo que consiste de Ile, Ala, Vai, Leu, Ser e Arg; Xn é selecionado do grupo que consiste de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His e Glu; X,2 é selecionado do grupo que consiste de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Gly, Ser e Gin; X]3 é selecionado do grupo que consiste de Arg, Lys, Thr, Vai, Asn, Gin e Gly; e Χμ é selecionado do grupo que consiste de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu, e Gly.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito TMP, e/ou TMP2 são derivatizados conforme estabelecido em um ou mais dos seguintes: uma ou mais ligações [-C(0)NR-] peptidílicas tenham sido substituídas por uma ligação não peptidílica, tais como uma ligação -CH2- carbamato [-CH2-0C(0)NR-]; uma ligação fosfonato; uma ligação 'CH2- sulfonamida [-CH2-S(0)2NR-]; uma ligação uréia [-NHC(0)NH-]; uma ligação amina secundária -CH2-; ou uma ligação peptidílica alquilada [- C(0)NR6-, em que R6 é alquila inferior]; 0 N-termínal é um grupo -NRR1; para um grupo -NRC(0)R; para um grupo -NRC(0)0R; para um grupo -NRS(0)2R; para um grupo - NHC(0)NHR, em que Re R1 são hidrogênio e alquila inferior, com a condição de que R e R1 não sejam ambos hidrogênio; para um grupo succinimida; para um grupo benziloxicarbonila-NH- (CBZ-NH-); ou para um grupo benziloxicarbonila-NH- tendo de 1 a 3 substituintes no anel fenila selecionados do grupo consistindo de alquila inferior, alcóxi inferior, cloro e bromo; 2 2 0 C-terminal é -C(0)R, em que R é selecionado do grupo consistindo de alcóxi inferior e -NR3R4 em que R3 e R4 são independentemente selecionados do grupo consistindo de hidrogênio e alquila inferior.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é cíclico.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que TMP] e TMP2 são, cada um: Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQIDNO: 1).

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que Li, L2 e L3 são, cada um, independentemente selecionados do grupo que consiste de Yn, em que Y é selecionado de um aminoácido de ocorrência natural ou um estereoisômero do mesmo e n é de 1 a 20.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que Li, L2 e L3 compreendem (Gly)n, em que n é de 1 a 20, e quando n for maior do que 1, até a metade dos resíduos Gly, pode ser substituída por outro aminoácido selecionado dos 19 aminoácidos naturais remanescentes ou um estereoisômero dos mesmos.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1-7, caracterizado pelo fato de que Lj é (Gly)5 e L2 é (Gly)s.

9. Composto de acordo com as reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQID NO: 46.

10. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que Lj, L2 ou L3 são independentemente selecionados dos grupos que consistem de: (GIy)3Lys(Gly)4 (SEQIDNO: 6); (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 7); e (Gly)3Cys(Gly)4(SEQIDNO: 8).

11. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que Lj, L2 ou L3 compreendem um resíduo Cys.

12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que Li, L2 ou L3 compreendem (CH2)n, em que n é de 1 a 20.

13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo de: Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQID NO: 22) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 23) IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ ID NO: 24) Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 25) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 26). Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ IDNO: 28) Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO: 29) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 30) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 31) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 32) Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA * Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ IDNO: 33) Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ IDNO: 34).

14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que é um dímero.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 em mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável do mesmo. FIGURA 1 FIGURA 2