PT2085395E - Compostos de arilvinilazacicloalcano e métodos para a sua preparação e utilização - Google Patents

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Craig Harrison Miller
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Targacept Inc
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Description

ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Compostos de arilvinilazacicloalcano e métodos para a sua preparação e utilização"
Campo da invenção A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que incorporam compostos capazes de afectar receptores nicotinicos acetilcolinérgicos (nAChR), por exemplo, como moduladores de subtipos específicos de receptores nicotinicos. A presente invenção também se refere a métodos para tratar uma grande variedade de condições e distúrbios, em particular os associados com disfunção dos sistemas nervosos central e autónomo.
Antecedentes da invenção A nicotina foi proposta como tendo uma série de efeitos farmacológicos. Ver, por exemplo, Pullan et al., N. Engl. J. Med. 330:811-815 (1994). Alguns destes efeitos podem estar relacionados com efeitos na libertação de neurotransmissores. Foi descrita a libertação de acetilcolina, dopamina, norepinefrina, serotonina e glutamato por administração de nicotina (Rowell et al., J. Neurochem. 43:1593 (1984); Rapier et al., J. Neurochem. 50:1123 (1988); Sandor et al., Brain
Res. 567:313 (1991) e Vizi, Br. J. Pharmacol. 47:765 (1973); Hall et al., Biochem. Pharmacol. 21:1829 (1972); Hery et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 296:91 (1977); e Toth et al.,
Neurochem Res. 17:265 (1992)). Relatórios confirmatórios e estudos recentes adicionais incluíram a modulação, no sistema nervoso central (SNC), de glutamato, óxido nítrico, GABA, taquicininas, citoquinas e péptidos (revisto em Brioni et al., Adv. Pharmacol. 37:153 (1997)). Além disso, a nicotina alegadamente potência o comportamento farmacológico de algumas composições farmacêuticas utilizadas para o tratamento de determinados distúrbios. Ver, por exemplo Sanberg et al., Pharmacol. Biochem. & Behavior 46:303 (1993); Harsing et al., J. Neurochem. 59:48 (1993) e Hughes, Proceedings from Intl. Symp. Nic. S40 (1994) . Além disso, foram propostos efeitos neuroprotectores para a nicotina, ver, por exemplo, Sjak-shie et al., Brain Res. 624:295 (1993). Também foram propostos 2 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ vários outros efeitos farmacológicos benéficos. Ver, por exemplo, Decina et al., Biol. Psychiatry 28:502 (1990); Wagner et al., Pharmacopsychiatry 21:301 (1988); Pomerleau et al., Addictive Behaviors 9:265 (1984); Onaivi et al., Life Scl. 54(3):193 (1994); Tripathi et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 221:91 (1982) e Hamon, Trends ín Pharmacol. Res. 15:36 (1994). Vários compostos que têm por alvo os nAChR foram descritos como sendo úteis para o tratamento de uma grande variedade de condições e distúrbios. Ver, por exemplo, Williams et al., DN&P 7(4):205 (1994); Arneric et al., CNS Drug Rev. 1(1):1 (1995); Arneric et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 5(1):79 (1996); Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279:1413 (1996); Lippiello et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279:1422 (1996); Dama] et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:390 (1999); Chiari et al., Anesthesiology 91:1447 (1999); Lavand'homme e Eisenbach, Anesthesiology 91:1455 (1999); Holladay et al., J. Med. Chem. 40(28): 4169 (1997); Bannon et al., Science 279: 77 (1998); PCT WO 94/08992, PCT WO 96/31475, PCT WO 96/40682, e patentes U.S. 5583140 de Bencherif et al., 5597919 de Dull et al., 5604231 de Smith et al. e 5852041 de Cosford et al.. Os compostos nicotinicos estão descritos como sendo particularmente úteis para o tratamento de uma grande variedade de distúrbios do SNC. De facto, está descrito para uma grande variedade de compostos nicotinicos que estes têm propriedades terapêuticas. Ver, por exemplo, Bencherif e Schmitt, Current Drug Targets: CNS and Neurological Disorders 1(4): 349-357 (2002), Levin e Rezvani, Current Drug Targets: CNS and Neurological Disorders 1(4): 423-431 (2002), 0'Neill, et al., Current Drug Targets: CNS and Neurological Disorders 1(4): 399-411 (2002), patentes U.S. 51871166 de Kikuchi et al., 5672601 de Cignarella, PCT WO 99/21834 e PCT WO 97/40049, pedido de patente do Reino Unido GB 2295387 e pedido de patente europeia 297858. N.M. Silva et al., European Journal of Medicinal Chemistry, Editions Scientifique Elsevier, páginas 163-170 descrevem novos derivados de isoxazole concebidos como candidatos a ligandos do receptor nicotinico de acetilcolina. 3 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
Em WO 03/008559 descreve-se a preparação de uma gama de azaciclos que são tidos como análogos de colina, para utilização no tratamento de distúrbios neurodegenerativos.
Em WO 97/46554 e US-B-6437138 descrevem-se compostos de éter heterocíclico de 3-piridiloximetilo que se pensa que são compostos nicotinicos colinérgicos neuronais úteis para controlar a transmissão sináptica.
Em WO 01/32264 descrevem-se compostos arilolefinicos e acetilinicos azaciclicos e sua utilização como inibidores de receptores colinérgicos nicotinicos.
Em US-A-5585388 descreve-se um grupo de compostos de piridina e sua utilização como moduladores de receptores de acetilcolina.
Em WO 01/19817 descreve-se uma série de compostos de éter 3-pirrolidiniloxi-3'-piridilico (de preferência éteres 3-pirrolidinilmetoxi-3'-piridilicos (substituídos na posição 5' e/ou 6) e sua utilização no controlo da libertação de neurotransmissores em mamíferos.
Os distúrbios do SNC são um tipo de distúrbio neurológico. Os distúrbios do SNC podem ser induzidos por drogas; podem ser atribuídos a predisposição genética, infecção ou trauma; ou podem ser de etiologia desconhecida. Os distúrbios do SNC compreendem distúrbios neuropsiquiátricos, doenças neurológicas e doenças mentais e incluem doenças neurodegenerativas, distúrbios comportamentais, distúrbios cognitivos e distúrbios afectivos cognitivos. Existem vários distúrbios do SNC cujas manifestações clínicas foram atribuídas a disfunção do SNC (i.e., distúrbios resultantes de níveis inapropriados de libertação de neurotransmissores, propriedades inapropriadas de receptores de neurotransmissores e/ou interacção inapropriada entre neurotransmissores e receptores de neurotransmissores). vários distúrbios do SNC podem ser atribuídos a uma deficiência de acetilcolina, dopamina, norepinefrina e/ou serotonina.
Os distúrbios relativamente comuns do SNC incluem demência pré-senil (doença de Alzheimer com início precoce), 4 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ demência senil (demência do tipo de Alzheimer), demência por micro-enfarte, demência relacionada com a SIDA, demência vascular, doença de Creutzfeld-Jakob, doença de Pick, Parkinsonismo, incluindo doença de Parkinson, demência de corpos de Lewy, paralisia supranuclear progressiva, coreia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesia, epilepsia, mania, distúrbio do défice de atenção, ansiedade, dislexia, esquizofrenia, depressão, distúrbios obsessivo-compulsivos e sindrome de Tourette.
Existem subtipos de nAChR em ambos, o sistema nervoso central e periférico, mas a distribuição dos subtipos é heterogénea. Por exemplo, os subtipos que são predominantes no cérebro de vertebrados são α4β2, α7 e α3β2, enquanto que os que predominam nos gânglios autónomos são α3β4 e os da junção neuromuscular são αΐβίδγ e αΐβίδε (ver, por exemplo, Dwoskin et al., Exp. Opin. Ther. Patents 10: 1561 (2000) e Schmitt e
Bencherif, Annual Reports in Med. Chem. 35: 41 (2000)). Uma limitação de alguns compostos nicotinicos é o facto de desencadearem vários efeitos farmacológicos indesejáveis devido à sua interacção com nAChR em tecidos periféricos (por exemplo estimulando subtipos de nAChR musculares e ganglionares). Seria desejável ter compostos, composições e métodos para prevenir e/ou tratar várias condições ou distúrbios (e.g. distúrbios do SNC), incluindo aliviar os sintomas desses distúrbios, em que os compostos exibem farmacologia nicotinica com um efeito benéfico nos nAChR do SNC (e.g. no funcionamento do SNC), mas sem efeitos associados significativos nos nAChR periféricos (compostos específicos para os nAChR do SNC). Seria também altamente desejável proporcionar compostos, composições e métodos que afectem a função do SNC, sem afectar significativamente os subtipos de receptores que têm o potencial de induzir efeitos secundários indesejáveis (e.g. actividade apreciável nos sítios do músculo cardiovascular e esquelético). A presente invenção proporciona compostos, composições e métodos deste tipo.
Sumário da invenção A presente invenção refere-se aos compostos de vinilazacicloalcano (R)- e (S)-3-((E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridina. 5 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
Também estão incluídos misturas racémicas, enantiómeros, diastereómeros e tautómeros destes compostos, bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Os compostos da presente invenção e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para preparar composições farmacêuticas e/ou medicamentos destinados a prevenir distúrbios, ou tratar as doenças associadas com disfunção dos nAChR, em especial no seio do sistema nervoso central ou sistema gastrointestinal. O termo "tratar" pode abranger quer efeitos benéficos nos sintomas e/ou na evolução da condição em consideração.
Exemplos de tipos de distúrbios que podem ser tratados incluem distúrbios neurodegenerativos, incluindo distúrbios do sistema nervoso central, tais como doença de Alzheimer e outras demências, distúrbios motores, tais como a doença de Parkinson, viciação em drogas, distúrbios comportamentais e distúrbios inflamatórios no sistema gastrointestinal. Os compostos podem também ser utilizados como analgésicos, por exemplo no tratamento da dor aguda, crónica ou recorrente.
Descrição detalhada da invenção
Os compostos, composições e métodos aqui descritos serão mais bem compreendidos com referência às concretizações preferidas seguintes. As definições seguintes serão úteis para definir o âmbito da invenção:
Tal como aqui utilizado, "aromático" refere-se a anéis aromáticos e anéis heteroaromáticos de 3 a 10 membros, de preferência de 5 a 6 membros.
Tal como aqui utilizado, "espécie que contém um grupo aromático" refere-se a porções que são, ou incluem um grupo aromático. Deste modo, as porções fenilo e benzilo estão incluídas nesta definição, dado que ambas são, ou incluem um grupo aromático.
Tal como são aqui utilizados, os radicais alquilo-Ci_6 (radicais alquilo inferior) contêm de 1 a 6 átomos de carbono 6 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ numa cadeia linear ou ramificada e incluem também porções cicloalquilo-C3-6 e radicais alquilo que contêm porções cicloalquilo-C3-6.
Tal como são aqui utilizados, os radicais alcoxilo-Ci_6 contêm de 1 a 6 átomos de carbono numa cadeia linear ou ramificada e também incluem radicais cicloalquilo-C3_6 e alcoxilo que contêm porções cicloalquilo-C3-6 ·
Tal como são aqui utilizados, os radicais arilo são seleccionados de entre fenilo, naftilo e indenilo.
Tal como são aqui utilizados, os radicais heteroarilo contêm de 3 a 10 membros, de preferência 5 ou 6 membros, incluindo um ou mais heteroátomos seleccionados de entre oxigénio, enxofre e azoto. Exemplos de porções heteroarilo de anel de 5 membros adequadas incluem furilo, tiofenilo, pirrolilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, tienilo, tetrazolilo, e pirazolilo. Exemplos de porções heteroarilo de anéis de 6 membros adequadas incluem piridinilo, pirimidinilo e pirazinilo, dos quais são preferidos o piridinilo e pirimidinilo.
Tal como aqui utilizado, halogéneo é cloro, iodo, flúor ou bromo.
Tal como são aqui utilizados, os radicais policicloalquilo são estruturas de anel cíclico fundidas. Radicais policicloalquilo representativos incluem, mas não se limitam a, adamantilo, bornanilo, norbornanilo, bornenilo e norbornenilo. Radicais policicloalquilo também podem incluir um ou mais heteroátomos, tais como N, O ou S.
Tal como são aqui utilizados, os radicais heterociclilo contêm de 3 a 10 membros, incluindo um ou mais heteroátomos seleccionados de entre oxigénio, enxofre e azoto. Exemplos de porções heterociclilo adequadas incluem, mas não se limitam a, piperidinilo, morfolinilo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, isotiazolidinilo, tiazolidinilo, isoxazolidinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, tetra-hidropiranilo e tetra-hidrofuranilo. 7 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
Tal como são aqui utilizados, os radicais cicloalquilo contêm de 3 a 8 átomos de carbono. Exemplos de radicais cicloalquilo adequados incluem, mas não se limitam a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e ciclo-octilo.
Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem sais de adição de ácidos inorgânicos, tais como cloreto, brometo, sulfato, fosfato e nitrato; sais de adição de ácidos orgânicos tais como acetato, galactarato, propionato, succinato, lactato, glicolato, malato, tartarato, citrato, maleato, fumarato, metanossulfonato, p-toluenossulfonato e ascorbato; sais com aminoácidos ácidos, tais como aspartato e glutamato; sais de metais alcalinos tais como sal de sódio e sal de potássio; sais de metais alcalino-terrosos, tais como sal de magnésio e sal de cálcio; sal de amónio; sais de bases orgânicas, tais como sal de trimetilamina, sal de trietilamina, sal de piridina, sal de picolina, sal de diciclo-hexilamina e sal de N,N'-dibenziletilenodiamina; e sais com aminoácidos básicos, tais como sal de lisina e sal de arginina. Os sais podem nalguns casos ser hidratos ou solvatos de etanol. Sais representativos são providenciados tal como descrito nas Patentes U.S. 5597919 de Dull et al., 5616716 de Dull et al. e 5663356 de Ruecroft et al. .
Tal como é aqui utilizado, um "agonista" é uma substância que estimula o seu parceiro de ligação, tipicamente um receptor. A estimulação é definida no contexto do ensaio particular, ou pode ser evidente na literatura, a partir de uma discussão nesta descrição que faz uma comparação com um factor ou substância que é aceite como um "agonista" ou como um "antagonista" do parceiro de ligação particular, sob circunstâncias substancialmente similares, conforme apreciado pelos peritos na especialidade. A estimulação pode ser definida em relação a um aumento num efeito ou função particular que é induzido pela interacção do agonista, ou agonista parcial com um parceiro de ligação e pode incluir efeitos alostéricos.
Tal como é aqui utilizado, um "antagonista" é uma substância que inibe o seu parceiro de ligação, tipicamente um 8 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ receptor. A inibição é definida no contexto do ensaio particular, ou pode ser evidente na literatura a partir de uma discussão nesta descrição que faz uma comparação com um factor ou substância que é aceite como um "agonista" ou como um "antagonista" do parceiro de ligação particular, sob circunstâncias substancialmente similares, conforme apreciado pelos peritos na especialidade. A inibição pode ser definida em relação a uma diminuição num efeito ou função particular que é induzido pela interacção do antagonista com um parceiro de ligação e pode incluir efeitos alostéricos.
Tal como é aqui utilizado, um "agonista parcial" é uma substância que proporciona um nivel de estimulação ao seu parceiro de ligação que é intermédio entre o de um antagonista total ou completo e um agonista definido por qualquer padrão aceite para actividade agonista. Deve reconhecer-se que a estimulação, e portanto a inibição, é definida intrinsecamente para qualquer substância ou categoria de substâncias a serem definidas como agonistas, antagonistas, ou agonistas parciais. Tal como é aqui utilizado, "actividade intrínseca", ou "eficácia," refere-se a alguma medida de eficácia biológica do complexo de parceiros de ligação. No que se refere à farmacologia do receptor, o contexto em que a actividade intrínseca ou eficácia devem ser definidas dependerá do contexto do complexo do parceiro de ligação (e.g., receptor/ligando) e da consideração de uma actividade relevante para um resultado biológico particular. Por exemplo, em certas circunstâncias a actividade intrínseca pode variar, dependendo do sistema de segundo mensageiro particular, envolvido. Ver Hoyer, D. e Boddeke, H., Trends Pharmacol Sei. 14(7):270-5 (1993). As situações em que essas avaliações contextualmente específicas são relevantes e o modo como podem ser relevantes no contexto da presente invenção, serão evidentes para os peritos na especialidade.
Tal como são aqui utilizados, os neurotransmissores cuja libertação é mediada pelos compostos aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, acetilcolina, dopamina, norepinefrina, serotonina e glutamato, e os compostos aqui descritos funcionam como agonistas ou agonistas parciais num ou mais dos nAChR do SNC. 9 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ I. Compostos
Os compostos da presente invenção, (R)- e (S)—3—((E)—2— pirrolidin-3-ilvinil)-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridina, têm um ou mais carbonos assimétricos e podem, portanto, existir na forma de isómeros, misturas racémicas, enantiómeros e diastereómeros. Estes compostos individuais e suas misturas são considerados como estando dentro do âmbito da presente invenção.
Os compostos da presente invenção, e suas misturas, incluem misturas racémicas, os seus enantiómeros, diastereómeros e tautómeros, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. II. Preparação de compostos
Apesar de outras estratégias de síntese serem evidentes para os peritos na especialidade, os compostos da presente invenção em que R3 representa um hidrogénio podem ser obtidos a partir de um composto de fórmula geral (II), de acordo com o esquema geral de síntese seguinte:
O esquema geral de síntese é como se segue: a) um aldeído de fórmula geral (II) é feito reagir com o ileto de fosforano (III); 10 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ b) ο vinilazacicloalcano de fórmula geral (IV) é feito reagir com um halogeneto de heteroarilo de fórmula geral (V, em que Y = halogéneo); c) o grupo terc-butoxicarbonilo é eliminado do composto de fórmula geral (VI); e o produto é isolado e opcionalmente convertido num sal farmaceuticamente aceitável. A reacção (a) entre um aldeído de fórmula geral (II) e o ileto de fosforano (III) ocorre, com vantagem, sob uma atmosfera inerte (por exemplo, sob azoto ou árgon) num solvente inerte, tal como tetra-hidrofurano, a uma temperatura entre -10°C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional, de preferência a uma temperatura entre cerca de -5°C e cerca de 22°C. A reacção (b) entre um vinilazacicloalcano de fórmula geral (IV) e um halogeneto de heteroarilo de fórmula (V) adequado ocorre, com vantagem, sob uma atmosfera inerte na presença de um catalisador, tal como acetato de paládio, uma base, tal como diisopropiletilamina e um sal inorgânico, tal como cloreto de lítio, num solvente inerte, tal como dimetilformamida, a uma temperatura entre 20°C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional. Idealmente, a temperatura da reacção é na região de cerca de 110°C.
Noutra concretização, a reacção (b) entre um vinilazacicloalcano de fórmula geral (IV) e um halogeneto de heteroarilo de fórmula geral (V) adequado pode ser realizada de preferência sob uma atmosfera inerte (por exemplo sob azoto ou sob árgon) na presença de um catalisador, tal como acetato de paládio e uma fosfina, tal como trifenilfosfina em meio básico, por exemplo na presença de uma base, tal como trietilamina, a uma temperatura entre 20°C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional, de preferência a uma temperatura na região de 110°C. A reacção (c) ocorre geralmente de acordo com os métodos usuais que não afectam de forma adversa o resto da molécula, em particular por aplicações dos métodos descritos por T.W. Greene e P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2a ed.), A. Wiley-Interscience Publication (1991). Por 11 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ exemplo, a reacção (c) de eliminação do grupo terc- butoxicarbonilo do composto de fórmula geral (VI) ocorre de preferência sob uma atmosfera inerte (por exemplo sob azoto ou sob árgon) na presença de um ácido, tal como ácido trifluoroacético num solvente inerte, tal como diclorometano, a uma temperatura entre -10°C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional, de preferência a uma temperatura entre -5°C e uma temperatura na região de 22°C.
Alternativamente, a reacção (c) de eliminação do grupo terc-butoxicarbonilo do composto de fórmula geral (VI) pode ser realizada de preferência sob uma atmosfera inerte (por exemplo sob azoto, ou sob árgon) por acção de iodeto de trimetilsililo num solvente inerte, tal como diclorometano, a uma temperatura entre -10°C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional, de preferência a uma temperatura na região de 22°C.
Os compostos de fórmula geral (II) que não estão comercialmente disponíveis, podem ser obtidos aplicando ou adaptando métodos descritos por Peschke B. et ai., Eur. J. Med. Chem. 34:363-380 (1999), cujo conteúdo é aqui incorporado como referência.
Os compostos de fórmula geral (V) que não estão disponíveis comercialmente podem ser obtidos aplicando ou adaptando métodos descritos em pct wo 00/75110, cujo conteúdo é aqui incorporado como referência.
Alternativamente, os compostos de fórmula geral (V) em que X é C-R2; R2 é -OR6; e R6 é alquilo-Ci-6, arilalquilo-Ci_6, heteroarilalquilo-Ci_6, heterociclilo, heterociclilalquilo, cicloalquilo ou policicloalquilos, estando estes radicais opcionalmente substituídos com 1 ou mais substituintes seleccionados entre halogéneo, alquilo-Ci_6, alcoxi-Ci_6, -CN, -NO2, -NH2, -OH, -COOH, -COO-alquilo-Ci-6, -CONH2, formilo, trif luorometilo ou trifluorometoxi, 12 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ podem ser be obtidos a partir de um halogeneto de heteroarilo de fórmula geral (VII), onde Y é um halogéneo e R1 é como anteriormente definido, e um álcool de fómrula geral (VIII), onde R6 é como previamente definido, de acordo com o esquema geral de sintese que se segue:
(VUJ (V) A reacção (d) entre álcool heteroarilico de fórmula geral (vil) e um álcool apropriado de fórmula geral (VIII) tem lugar preferivelmente sob uma atmosfera inerte na presença de um diazeno tal como azodicarboxilato de dietilo e uma fosfina tal como trifenilfosfina num solvente inerte tal como tolueno, a uma temperatura entre 0°C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional, preferivelmente a uma temperatura entre uma temperatura na região de 22°C e a temperatura de ebulição do solvente.
Os compostos da presente invenção podem ser isolados e purificados utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, incluindo, por exemplo, cristalização, cromatografia e/ou extracção.
Nos esquemas acima mencionados, quando qualquer um ou mais dos grupos R são, ou contêm grupos reactivos que são potencialmente reactivos nas condições reaccionais, por exemplo, -OH, -SH, -NH2 ou -C02H, será evidente para o perito na especialidade que estes grupos funcionais podem requerer a utilização de "grupos protectores" adequados durante as reacções, para "bloquear" a reactividade do grupo R. Estes grupos "protectores" podem ser seleccionados, introduzidos e clivados de acordo com T.W. Greene e P.G.M. Wuts (Protective Groups in Organic Synthesis (2a ed.), A. Wiley-Interscience Publication (1991)).
Os compostos da presente invenção e os compostos de fórmula geral (IV) podem ser obtidos na forma opticamente pura separando os seus racematos de acordo com os métodos usuais 13 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ (í.e. resolução de enantiómeros), ou utilizando materiais de partida opticamente puros.
Os compostos da presente invenção podem ser opcionalmente convertidos em sais de adição com um ácido mineral ou orgânico, por acção desse ácido num solvente adequado, por exemplo, um solvente orgânico, tal com um álcool, uma cetona, um éter ou um solvente clorado. Estes sais formam igualmente parte da invenção.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis representativos incluem, mas não se limitam a, benzenossulfonato, brometo, cloreto, citrato, etanossulfonato, fumarato, gluconato, iodato, maleato, isetionato, metanossulfonato, metilenobis(β-oxinaftoato), nitrato, oxalato, palmoato, fosfato, salicilato, succinato, sulfato, tartarato, teofilinoacetato, p-toluenossulfonato, hemigalactarato e sais de galactarato. III. Composições farmacêuticas
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção incluem um composto da presente invenção ou um seu sal, no estado puro ou na forma de uma composição em que é combinado com qualquer outro produto farmaceuticamente compatível, que pode ser inerte ou fisiologicamente activo. Estas composições podem ser administradas, por exemplo, oral, parentérica, rectal ou topicamente.
Exemplos de composições sólidas para administração oral incluem, mas não se limitam a, comprimidos, pílulas, pós (cápsulas de gelatina, hóstias) e grânulos. Nestas composições, o composto activo é misturado com um ou mais diluentes inertes, tais como amido, celulose, sacarose, lactose ou sílica, idealmente sob uma corrente de um gás inerte, tal como árgon.
As composições também podem incluir outras substâncias além dos diluentes, por exemplo, um ou mais lubrificantes, tais como estearato de magnésio ou talco, um corante, um revestimento (comprimidos revestidos), ou um verniz. 14 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
Exemplos de composições líquidas para administração oral incluem, mas não se limitam a, soluções, suspensões, emulsões, xaropes e elixires que são farmaceuticamente aceitáveis e contêm tipicamente diluentes inertes, tais como água, etanol, glicerol, óleos vegetais, ou parafina líquida. Estas composições podem compreender outras substâncias para além dos diluentes, por exemplo, agentes molhantes, edulcorantes, espessantes, aromatizantes e estabilizantes.
As composições estéreis para administração parentérica podem incluir, por exemplo, soluções, suspensões e emulsões aquosas e não aquosas. Exemplos de solventes e veículos adequados incluem, mas não se limitam a soluções aquosas, preferencialmente soluções aquosas tamponadas, propilenoglicol, um polietilenoglicol, óleos vegetais, em especial azeite, ésteres orgânicos injectáveis, por exemplo oleato de etilo e outros solventes orgânicos adequados. Estas composições podem também incluir adjuvantes, em especial agentes molhantes, agentes de isotonicidade, emulsionantes, dispersantes e estabilizantes. Estas composições estéreis podem ser esterilizadas de vários modos, por exemplo, por filtração asséptica, por incorporação de agentes esterilizantes na composição, por irradiação e por aquecimento. Elas também podem ser preparadas na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas na altura de utilização em água estéril, ou qualquer outro meio injectável, estéril.
Exemplos de composições para administração rectal incluem, mas não se limitam a, supositórios e cápsulas rectais que, adicionalmente ao produto activo podem incluir excipientes, tais como manteiga de cacau, glicéridos semi-sintéticos e polietilenoglicóis.
As composições para administração tópica podem ser, por exemplo, cremes, loções, colírios, colutórios, gotas nasais ou aerossóis.
As composições farmacêuticas também podem incluir vários outros componentes, tais como aditivos ou adjuvantes. Exemplos de componentes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis que são utilizados em circunstâncias relevantes incluem 15 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ antioxidantes, agentes de captação de radicais livres, péptidos, factores de crescimento, antibióticos, agentes bacteriostáticos, imunossupressores, anticoagulantes, agentes tampão, agentes anti-inflamatórios, antipiréticos, ligantes de libertação controlada, anestésicos, esteróides e corticosteróides. Estes componentes podem proporcionar um beneficio terapêutico adicional, actuar de modo a afectar a acção terapêutica da composição farmacêutica ou actuar no sentido de prevenir quaisquer efeitos secundários potenciais que possam resultar da administração da composição farmacêutica. Nalgumas circunstâncias, um composto da presente invenção pode ser utilizado como parte de uma composição farmacêutica com outros compostos destinados à prevenção ou tratamento de um distúrbio particular. IV. Métodos de tratamento
Os compostos aqui descritos são úteis para tratar os tipos de condições e distúrbios para os quais outros tipos de compostos nicotinicos foram propostos como agentes terapêuticos. Ver, por exemplo, Williams et al., DN&P 7(4):205-227 (1994); Arneric et al., CNS Drug Rev. 1(1):1-26 (1995) ; Arneric et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 5(1):79-100 (1996) ; Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279:1413 (1996); Lippiello et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279:1422 (1996); Dama] et al., Neuroscience (1997); Holladay et al., J. Med. Chem. 40(28): 4169-4194 (1997); Bannon et al., Science 279: 77-80 (1998); PCT WO 94/08992, PCT WO 96/31475, e patentes U.S. 5583140 de Bencherif et al., 5597919 de Dull et al., e 5604231 de Smith et al..
Os compostos também podem ser utilizados como terapia adjuvante em combinação com terapias existentes, no tratamento dos tipos de doenças e distúrbios acima mencionados. Nestas situações, é preferido administrar os ingredientes activos de um modo que minimize os efeitos nos subtipos de nAChR, tais como os que estão associados com os músculos e gânglios. isto pode ser conseguido por meio de um fornecimento de drogas direccionado para um alvo e/ou ajustando a dosagem de um modo tal que o efeito desejado é obtido sem se alcançar a dosagem limiar necessária para se obterem efeitos secundários significativos. As composições farmacêuticas podem ser 16 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ utilizadas para melhorar qualquer um dos sintomas associados com essas condições, doenças e distúrbios.
Exemplos de condições e distúrbios que podem ser tratados incluem distúrbios neurológicos, distúrbios neurodegenerativos, em particular distúrbios do SNC e distúrbios inflamatórios. Os distúrbios do SNC podem ser induzidos por drogas; podem ser atribuídos a predisposição genética, infecção ou trauma; ou podem ser de etiologia desconhecida. Os distúrbios do SNC compreendem distúrbios neuropsiquiátricos, doenças neurológicas e doenças mentais e incluem doenças neurodegenerativas, distúrbios comportamentais, distúrbios cognitivos e distúrbios afectivos cognitivos. Existem vários distúrbios do SNC cujas manifestações clínicas têm sido atribuídas a disfunção do SNC (i.e., distúrbios que resultam de níveis inapropriados de libertação de neurotransmissores, propriedades inapropriados de receptores de neurotransmissores e/ou interacção inapropriada entre neurotransmissores e receptores de neurotransmissores). Vários distúrbios do SNC podem ser atribuídos a uma deficiência de colina, dopamina, norepinefrina e/ou serotonina.
Exemplos de distúrbios do SNC que podem ser tratados utilizando os compostos da presente invenção e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e composições farmacêuticas incluindo estes compostos incluem demência pré-senil (doença de Alzheimer com início precoce) demência senil (demência do tipo Alzheimer), demência de corpos de Lewy, demência por micro-enfarte, demência relacionada com a SIDA, demência por VIH, enfartes cerebrais múltiplos, Parkinsonismo, incluindo doença de Parkinson, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, coreia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesia, epilepsia, mania, distúrbio do défice de atenção, ansiedade, depressão, dislexia, depressão da esquizofrenia, distúrbios obsessivo-compulsivos, síndrome de Tourette, deficiência cognitiva suave (MCI), deficiência de memória associada à idade (AAMI), distúrbios amnésicos e cognitivos prematuros que estão relacionadas com a idade ou são uma consequência do alcoolismo, ou de síndrome de imunodeficiência, ou que estão associados com distúrbios vasculares, com alterações genéticas (tais como, por exemplo, 17 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ trissomia 21) ou com deficiências de atenção ou deficiências de aprendizagem, condições neurodegenerativas agudas ou crónicas, tais como esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, neurotrofias periféricas e traumas cerebrais ou espinais. Adicionalmente, os compostos podem ser utilizados para tratar a viciação em nicotina e/ou outros distúrbios comportamentais relacionados com substâncias que conduzam a dependência (e.g. álcool, ***a, heroina e opiáceos, psicoestimulantes, benzodiazepinas e barbituratos). Os compostos também podem ser utilizados para tratar patologias que exibem um carácter inflamatório no sistema gastrointestinal, tal com a doença de Crohn, sindrome do intestino irritável e colite ulcerosa e nas diarreias. O modo como os compostos são administrados pode variar. Os compostos podem ser administrados por inalação (e.g. na forma de um aerossol, quer por via nasal, quer utilizando dispositivos de entrega do tipo estabelecido na patente U.S. 4922901 de Brooks et al.); topicamente (e.g. na forma de loção); oralmente (e.g. na forma liquida, num solvente tal como um liquido aquoso ou não aquoso, ou num transportador sólido); intravenosamente (e.g. numa solução de dextrose ou salina); como uma infusão ou injecção (e.g., como uma suspensão ou como uma emulsão num liquido ou mistura de líquidos farmaceuticamente aceitável); intratecalmente; intracerebroventricularmente; ou transdermicamente (e.g., utilizando um pacho transdérmico). Apesar de ser possível administrar os compostos na forma de um produto químico activo a granel, é preferido apresentar cada composto na forma de uma composição ou formulação farmacêutica para uma administração eficiente e eficaz. Os exemplos de métodos para administração desses compostos serão evidentes para o técnico perito. Por exemplo, os compostos podem ser administrados na forma de um comprimido, uma cápsula de gelatina dura, ou como uma cápsula de libertação controlada. Como outro exemplo, os compostos podem ser fornecidos transdermicamente utilizando os tipos de tecnologia de pachos disponíveis da Novartis and Alza Corporation. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de modo intermitente, ou a uma velocidade gradual, contínua, constante ou controlada, a um animal de sangue quente (e.g., um mamífero, tal como um ratinho, rato, gato, coelho, cão, porco, vaca ou macaco), mas, 18 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ com vantagem, são preferencialmente administradas a um ser humano. Adicionalmente, a altura do dia e o número de vezes por dia que a formulação farmacêutica é administrada podem variar. Preferencialmente, a administração é de um modo tal que os ingredientes activos da formulação farmacêutica interagem com sitios receptores no seio do organismo do indivíduo que afectam o funcionamento do SNC ou do tracto gastrointestinal (GI). Mais especificamente, no tratamento de um distúrbio do SNC, a administração é preferencialmente de modo a optimizar o efeito nos subtipos de receptor relevantes que têm um efeito sobre o funcionamento do SNC, minimizando ao mesmo tempo os efeitos nos subtipos de receptores do tipo muscular. Outros métodos adequados para administração dos compostos da presente invenção são descritos na Patente U.S. 5604231 de Smith et al., cuja revelação é aqui incorporada como referência, na sua totalidade. A dose apropriada do composto é a quantidade eficaz para prevenir a ocorrência dos sintomas do distúrbio, ou para tratar alguns sintomas do distúrbio de que o paciente sofre. Por "quantidade eficaz", "quantidade terapêutica", ou "dose eficaz" entende-se a quantidade suficiente para desencadear os efeitos farmacológicos ou terapêuticos desejados, resultando assim numa prevenção ou tratamento eficazes do distúrbio. Deste modo, no tratamento de um distúrbio do SNC, uma quantidade eficaz de composto é uma quantidade suficiente para atravessar a barreira hematoencefálica do indivíduo, para se ligar a sítios receptores relevantes no cérebro do indivíduo e para activar subtipos de receptores nicotínicos relevantes (e.g., proporcionar a secreção de neurotransmissores, resultando assim numa prevenção ou tratamento eficaz do distúrbio). A prevenção do distúrbio manifesta-se por um retardamento do aparecimento dos sintomas do distúrbio. O tratamento do distúrbio manifesta-se por uma diminuição dos sintomas associados com o distúrbio, ou por uma melhoria da recorrência dos sintomas do distúrbio. A dose eficaz pode variar, dependendo de factores tais como a condição do paciente, a gravidade dos sintomas do distúrbio e o modo segundo o qual a composição farmacêutica é administrada. Para pacientes humanos, a dose eficaz de compostos típicos requer geralmente a administração do 19 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ composto numa quantidade suficiente para activar receptores relevantes para realizar a libertação de neurotransmissores (e.g., dopamina), mas a quantidade deverá ser insuficiente para induzir efeitos sobre os músculos esqueléticos e gânglios em qualquer grau significativo. A dose eficaz dos compostos diferirá evidentemente de paciente para paciente, mas em geral inclui quantidades que partem do ponto em que ocorrem efeitos sobre o SNC ou outros efeitos terapêuticos desejados, mas são inferiores à quantidade em que se observam efeitos musculares.
As doses dependem do efeito desejado, da duração do tratamento e da via de administração utilizada; são geralmente de entre 0,05 mg e 100 mg de substância activa por dia, oralmente, para um adulto.
Em termos gerais, o médico irá determinar a dosagem adequada como uma função da idade, peso e todos os outros factores específicos do paciente.
Os compostos têm preferencialmente a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica do paciente. Deste modo, estes compostos têm a capacidade de entrar no sistema nervoso central do paciente. Os valores de log P de compostos típicos que são úteis para realizar a presente invenção são geralmente superiores a 0, muitas vezes são superiores a cerca de 0,5 e frequentemente são superiores a cerca de 1. Os valores de log P destes compostos típicos são geralmente inferiores a cerca de 3,5, muitas vezes são inferiores a cerca de 3 e por vezes são inferiores a cerca de 2,5. Os valores de log P proporcionam uma medida da capacidade de um composto atravessar uma barreira de difusão, tal como uma membrana biológica. Ver, Hansch, et al.r J. Med. Chem. 11:1 (1968).
Os compostos têm a capacidade de se ligar a, e na maioria dos casos causar a activação de nAChR do cérebro do paciente (e.g., tais como os receptores que modulam a libertação de dopamina). Assim, estes compostos têm a capacidade de expressar farmacologia nicotínica e, em particular, de actuar como agonistas ou agonistas parciais nicotínicos. As constantes de ligação ao receptor de compostos típicos úteis na realização da presente invenção geralmente excedem cerca de 0,1 nM, muitas vezes excedem cerca de 1 nM e frequentemente 20 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ excedem cerca de 10 nM. As constantes de ligação ao receptor destes compostos típicos são geralmente inferiores a cerca de 1 μΜ, muitas vezes são inferiores a cerca de 100 nM e frequentemente são inferiores a cerca de 50 nM. As constantes de ligação ao receptor proporcionam uma medida da capacidade do composto se ligar a metade dos sítios receptores relevantes de determinadas células cerebrais do paciente. Ver Cheng, et al., Biochem. Pharmacol. 22:3099 (1973).
Os compostos úteis de acordo com o método da presente invenção têm a capacidade de demonstrar uma função nicotínica, desencadeando eficazmente um fluxo iónico através de, e/ou a secreção de neurotransmissores a partir de preparações de terminações nervosas (e.g. sinaptossomas do tálamo ou estriado). Assim, estes compostos têm a capacidade de fazer com que os neurónios relevantes fiquem activados e libertem ou segreguem acetilcolina, dopamina ou outros neurotransmissores. Em geral, os compostos típicos úteis para realizar a presente invenção proporcionam eficazmente uma activação do receptor relevante em quantidades de pelo menos cerca de 30 porcento, muitas vezes de pelo menos cerca de 50 porcento e frequentemente pelo menos cerca de 75 porcento da quantidade máxima proporcionada pela (S)-(-)-nicotina. Em geral, os compostos típicos úteis para realizar a presente invenção são mais potentes do que a (S)-(-)-nicotina em desencadear uma activação do receptor relevante. Em geral, os compostos típicos úteis para realizar a presente invenção proporcionam eficazmente a secreção de dopamina em quantidades de pelo menos 50 porcento, muitas vezes pelo menos cerca de 75 porcento e frequentemente pelo menos cerca de 100 porcento, da quantidade máxima proporcionada pela (S)-(-)-nicotina. Alguns compostos da presente invenção podem proporcionar a secreção de dopamina numa quantidade que pode exceder a quantidade máxima proporcionada pela (S)-(-)-nicotina. Em geral, os compostos típicos úteis para realizar a presente invenção são menos potentes que a (S)-(-)-nicotina em desencadear a secreção de neurotransmissores, tal como a secreção de dopamina.
Os compostos da presente invenção, quando utilizados em quantidades eficazes de acordo com o método da presente invenção, não têm a capacidade de desencadear a activação de 21 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ nAChR de músculo humano em nenhum grau significativo. A este respeito, os compostos da presente invenção demonstram uma capacidade fraca para causar um fluxo do ião rubídio isotópico através de nAChR em preparações de células que expressam receptores nicotínicos de acetilcolina do tipo muscular. Assim, estes compostos exibem constantes de activação do receptor ou valores de EC50 (i.e. que proporcionam uma medida da concentração de composto necessária para activar metade dos sítios receptores relevantes do músculo esquelético de um paciente) que são extremamente elevados (i.e. superiores a cerca de 100 μΜ) . Em geral, os compostos preferidos típicos, úteis para realizar a presente invenção activam o fluxo do ião rubídio isotópico em menos de 10 porcento, muitas vezes em menos de 5 porcento, do máximo proporcionado pela (S)-(-)-nicotina.
Os compostos da presente invenção, quando utilizados em quantidades eficazes de acordo com o método da presente invenção, não têm a capacidade de desencadear a activação de nAChR de gânglios humanos, em nenhum grau significativo. Esta selectividade dos compostos da presente invenção contra os nAChR responsáveis por efeitos secundários cardiovasculares é demonstrada por uma ausência da capacidade desses compostos activarem a função nicotínica do tecido cromafim supra-renal. Como tal, estes compostos têm uma fraca capacidade de provocar o fluxo do ião rubídio isotópico através de nAChR em preparações de células derivadas da glândula supra-renal. Em geral, os compostos preferidos típicos, úteis para realizar a presente invenção activam, de forma máxima, o fluxo de ião rubídio isotópico em menos de 10 porcento, muitas vezes menos de 5 porcento do máximo proporcionado pela S(-)nicotina.
Os compostos são eficazes no sentido de proporcionar um certo grau de prevenção da progressão de distúrbios do SNC, melhorar os sintomas dos distúrbios do SNC e melhorar em certo grau a recorrência de distúrbios do SNC. No entanto, estas quantidades eficazes destes compostos não são suficientes para desencadear quaisquer efeitos nicotínicos indesejáveis, apreciáveis, como é demonstrado por efeitos menores em preparações que se pensa que reflectem os efeitos no sistema cardiovascular, ou efeitos no músculo-esquelético. Deste modo, a administração de compostos da presente invenção proporciona 22 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ uma janela terapêutica em que é proporcionado o tratamento de determinados distúrbios do SNC e são evitados efeitos nicotínicos periféricos/efeitos secundários indesejados. Isto é, uma dose eficaz de um composto da presente invenção é suficiente para proporcionar os efeitos desejados no SNC, mas é insuficiente (i.e., não está a um nível suficientemente elevado) para proporcionar efeitos secundários indesejáveis. Preferencialmente, a administração eficaz de um composto da presente invenção que resulta no tratamento de distúrbios do SNC ocorre por administração de menos de 1/3, frequentemente menos de 1/5 e muitas vezes menos de 1/10 da quantidade suficiente para provocar quaisquer efeitos secundários, num grau significativo.
Exemplos de síntese
Os exemplos de síntese que se seguem são proporcionados para ilustrar a presente invenção e não devem ser entendidos como limitativos do seu âmbito. Nestes exemplos, todas as partes e percentagens são em peso, salvo indicação em contrário. Os rendimentos de reacção são apresentados em percentagens molares.
Exemplo 1: Hemigalactarato de 3-((E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridina racémico:
Adicionou-se, gota a gota, ácido trifluoroacético (0,91 cm3, 11,7 mmol) a uma solução de 0,44 g (1,17 mmol) de éster terc-butílico do ácido 3-{(E)-2-[5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridin-3-il]vinil}pirrolidino-l-carboxílico racémico em 4,5 cm3 de diclorometano, que estava sob árgon e arrefeceu-se a 0°C. A mistura reaccional foi agitada a esta temperatura durante 0,5 h e em seguida a uma temperatura na região de 22°C, durante 20 h e foi concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa). O resíduo oleoso foi retomado em 5 cm3 de água e a solução resultante foi tornada básica (pH=8) por adição de solução de amoníaco aquoso a 28% e em seguida extraída com 3 vezes 25 cm3 de diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com 25 cm de agua, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas até à secura sob pressão (2,7 kPa), para se obter 0,225 g de um óleo de cor laranja, que foi purificado por cromatografia em sílica 23 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ gel [eluente: diclorometano/metanol (9/1, em seguida 8/2 em volume)]. A concentração das fracções sob pressão reduzida (2,7 kPa) originou 0,1 g (0,36 mmol) de um óleo de cor laranja. Adicionou-se ácido galactárico (0,038 g, 0,18 mmol) a uma solução deste óleo, em 2 cm3 de metanol a que se tinha adicionado 0,5 cm3 de água. A mistura foi levada ao refluxo e arrefecida até uma temperatura na região de 22°C e o material insolúvel foi removido por filtração. O filtrado foi concentrado até à secura, sob pressão reduzida (2,7 kPa) e o resíduo oleoso foi retomado em 2 cm3 de etanol. O sólido precipitado foi removido por filtração, lavado com 2 cm3 de acetato de isopropilo e 2 cm3 de éter diisopropílico e em seguida seco a 40°C sob vácuo (2,7 kPa), para se obterem 0,088 g de hemigalactarato de 3-( (E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridina racémico na forma de um sólido bege. Espectro de massa (EI): m/z 274 (M+), m/z 232.
Espectro de ΧΗ RMN (300 MHz, (CD3)2SO d6 com algumas gotas de CD3COOD d4, δ em ppm) : 1,61 (m: 2H) ; 1,82 (m: 1H) ; 1,98 (m: 2H) ; 2,17 (m: 1H) ; 2,96 (dd, J=10,5 e 8,5 Hz: 1H) ; 3,07 (m: 1H); de 3,10 a 3,40 (m: 2H); 3,41 (dd, J=10,5 e 7,5 Hz: 1H) ; 3,50 (ddd, J=12-9,5 e 3 Hz: 2H); 3,79 (s: 1H); 3,87 (dt, J=12 e 4,5 Hz: 2H) ; 4,24 (s: 1H); 4,69 (m: 1H); 6,43 (dd, J=16 e 7 Hz: 1H); 6,56 (d, J=16 Hz: 1H); 7,49 (m: 1H); 8,20 (m: 2H). O éster terc-butilico do ácido 3-{(E)-2-[5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridin-3-il]vinil}pirrolidino-l-carboxílico racémico pode ser preparado como se segue:
Adicionou-se, sucessivamente, acetato de paládio (0,117 g, 0,52 mmol), 0,678 g (16 mmol) de cloreto de litio e 7,25 cm3 (42 mmol) de etildiisopropilamina a uma solução, sob árgon, de 1,33 g (5,17 mmol) de 3-bromo-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridina e 1,2 g (5,17 mmol) de éster terc-butilico do ácido 3-vinilpirrolidino-l-carboxílico racémico em 15 cm3 de dimetilformamida. Após 3 horas de aquecimento a 110°C, com agitação, a mistura reaccional foi agitada durante 2 horas a uma temperatura na região de 22°C e em seguida concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa). O resíduo oleoso foi retomado em 50 cm3 de acetato de etilo e a solução resultante foi lavada sucessivamente com 2 vezes 25 cm de agua, 25 cm de solução saturada de bicarbonato, 2 vezes 25 cm3 de água e 25 cm3 de solução saturada de cloreto de sódio e em seguida 24 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ foi seco sobre sulfato de magnésio, filtrado e concentrado até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) para se obterem 1,4 g de um óleo castanho. Este resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel [eluente: ciclo-hexano/acetato de etilo (8/2 em volume)]. A concentração das fracções sob pressão reduzida (2,7 kPa) originou 0,44 g de um óleo amarelo que foi utilizado sem posterior purificação no restante da síntese. A 3-bromo-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridina pode ser preparada como se segue:
Adicionou-se, gota a gota, azodicarboxilato de dietilo (7,1 cm3, 45 mmol) a uma solução sob árgon de 5,22 g (30 mmol) de 5-bromopiridin-3-ol, 4,69 g (45 mmol) de tetra-hidropiran-4-ol (45 mmol) e 11,8 g (45 mmol) de trifenilfosf ina em 150 cm3 de tolueno. Após 20 horas de aquecimento sob refluxo, com agitação, a mistura reaccional foi levada a uma temperatura na região de 22°C e em seguida foi lavada sucessivamente com 2 vezes 75 cm3 de água, 2 vezes 75 cm3 de solução saturada de bicarbonato, 2 vezes 75 cm3 de água e 75 cm3 de solução saturada de cloreto de sódio e em seguida a solução orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) para se obter um óleo de cor laranja. Este resíduo foi misturado com 100 cm3 de éter diisopropí lico e o sólido formado foi removido por filtração e lavado com 2 vezes 25 cm3 de éter diisopropílico. O filtrado foi concentrado até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) para se obterem 10 g de um óleo de cor laranja. Este resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel [eluente: ciclo-hexano/acetato de etilo (8/2 em volume)]. A concentração das fracções sob pressão reduzida (2,7 kPa) originou 7,3 g de 3-bromo-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)piridina na forma de um óleo amarelo. Espectro de 3H RMN (300 MHz, (CD3)2SO d6, δ em ppm) : 1,59 (m: 2H) ; 1,99 (m: 2H) ; 3,49 (ddd, J=12,5-9,5 e 3 Hz: 2H); 3,87 (dt, J=12,5 e 4,5 Hz: 2H); 4,75 (m: 1H); 7,82 (dd, J=2,5 e 2 Hz: 1H) ; 8,28 (d, J=2 Hz: 1H); 8,33 (d, J=2,5 Hz: 1H). O éster terc-butílico de ácido 3-vinilpirrolidino-l-carboxílico racémico pode ser preparado como se segue: 25 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
Adicionou-se, gota a gota, n-butillítio em hexano (44 cm3 de uma solução 1,6 N) a uma suspensão de 25,5 g (71 mmol) de brometo de trifenilmetilfosfónio em 300 cm3 de tetra-hidrofurano, que estava sob árgon e arrefeceu-se a 0°C. A mistura reaccional foi agitada a 0°C durante 0,5 h e em seguida misturada com uma solução de 7,1 g (35,6 mmol) de éster terc-butilico de ácido 3-formilpirrolidino-l-carboxilico racémico em 100 cm3 de tetra-hidrofurano. Após 2,5 horas de reacção a uma temperatura na região de 22°C, a mistura foi vazada em 600 cm3 de solução saturada de cloreto de amónio aquoso. Após a adição de acetato de etilo, a fase orgânica foi removida por decantação, lavada duas vezes com água e com solução saturada de cloreto de sódio e em seguida seca sobre sulfato de magnésio e concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa). O óleo resultante foi purificado por cromatografia em sílica gel [eluente: ciclo-hexano/acetato de etilo (95/5 em seguida 9/1 em volume)]. A concentração das fracções sob pressão reduzida (2,7 kPa) originou 6,3 g de éster terc-butilico de ácido 3-vinilpirrolidino-l-carboxílico racémico, na forma de um óleo incolor. Espectro de massa (ES): m/z 198 (MH+), m/z=142.
Exemplo 2 de Referência: Hemigalactarato de 5-((E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)-pirimidina racémico:
Adicionou-se, gota a gota, ácido trifluoroacético (1,2 cm3, 15,6 mmol) a uma solução de 0,43 g (1,56 mmol) de éster terc-butilico de ácido 3-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxílico racémico em 6 cm3 de diclorometano, que estava sob árgon e arrefeceu-se a 0°C. A mistura reaccional foi agitada a esta temperatura durante 0,5 h, em seguida a uma temperatura na região de 22°C, durante 20 horas e foi concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa). O resíduo oleoso foi retomado em 5 cm3 de água e a solução resultante foi tornada básica (pH=8) por adição de uma solução de amoníaco aquosa a 28% e em seguida extraída com 3 vezes 25 cm3 de diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram lavadas com 25 cm3 de água, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) para se obterem 0,126 g de um óleo de cor laranja que foi purificado por cromatografia em sílica gel [eluente: diclorometano/metanol (9/1 em seguida 8/2 em 26 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ volume)]. A concentração das fracções sob pressão reduzida (2,7 kPa) originou 0,1 g (0,57 mmol) de um óleo de cor laranja. Adicionou-se ácido galactárico (0,06 g, 0,28 mmol) a uma solução deste óleo em 2 cm3 de metanol, a que se tinham adicionado 0,5 cm3 de água. A mistura foi levada ao refluxo e arrefecida até uma temperatura na região de 22°C e o material insolúvel foi removido por filtração. O filtrado foi concentrado até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) e o resíduo oleoso foi retomado em 2 cm3 de etanol. O sólido precipitado foi removido por filtração, lavado com 2 cm3 de acetato de isopropilo e 2 cm3 de éter diisopropílico e em seguida seco a 40°C sob vácuo (2,7 kPa) para se obterem 0,1 g de hemigalactarato de 5-( (E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)pirimidina racémico na forma de um sólido ocre. Espectro de massa (DCI): m/z 176 (MH+) . Espectro de 3H RMN (300 MHz, (CD3)2SO d6 com algumas gotas de CD3COOD d4, δ em ppm) : 1,82 (m: 1H); 2,18 (m: 1H); 2,98 (dd, J=ll e 8,5 Hz: 1H); 3,10 (m: 1H); 3,20 (m: 1H); 3,33 (m: 1H); 3,42 (dd, J=ll e 7,5 Hz: 1H); 3,79 (s: 1H) ; 4,24 (s: 1H); 6,55 (AB limite: 2H); 8,87 (s: 2H); 9,04 (s: 1H). O éster terc-butílico de ácido 3-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxílico racémico pode ser preparado como se segue:
Adicionou-se, sucessivamente, acetato de paládio (0,117 g, 0,52 mmol), 0,678 g (16 mmol) de cloreto de lítio e 7,25 cm3 (42 mmol) de etildiisopropilamina a uma solução sob árgon de 0,822 g (5,17 mmol) de 5-bromopirimidina e 1,2 g (5,17 mmol) de éster terc-butílico de ácido 3-vinilpirrolidino-l-carboxílico racémico em 15 cm3 de dimetilformamida. Após 3 horas de aquecimento a 110°C, com agitação, a mistura reaccional foi agitada durante 2 horas, a uma temperatura na região de 22°C e em seguida concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa). O resíduo oleoso foi retomado em 50 cm3 de acetato de etilo e a solução resultante foi lavada sucessivamente com 2 vezes 25 cm3 de água, 25 cm3 de solução saturada de bicarbonato, 2 vezes 25 cm3 de água e 25 cm3 de solução saturada de cloreto de sódio e foi em seguida seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) para se obterem 1,1 g de um óleo castanho. Este resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel [eluente: ciclo-hexano/acetato de 27 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ etilo (8/2 em volume)]. A concentração das fracções sob pressão reduzida (2,7 kPa) originou 0,43 g de éster terc-butílico de ácido 3-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxilico racémico na forma de um óleo. Espectro de *Η rmn (300 MHz, (CD3)2SO d6, δ em ppm) : 1,42 (s: 9H) ; 1,78 (m: 1H) ; 2,05 (m: 1H); de 2,90 a 3,15 (m: 2H); de 3,15 a 3,60 (m: 3H); 6,51 (d, J=16,5 Hz: 1H) ; 6,64 (dd, J=16,5 e 7 Hz: 1H) ; 8,89 (s: 2H); 9,04 (s: 1H).
Exemplo 3 de Referência: Galactarato de (+)-5-((E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)-pirimidina
Adicionou-se iodeto de trimetilsililo (0,2 cm3, 1,4 mmol) a uma temperatura na região de 22°C a uma solução sob árgon de 0,26 g (0,944 mmol) de éster terc-butílico de ácido (+)-3-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxilico em 10 cm3 de diclorometano. Após 2 horas de agitação a esta temperatura, a mistura reaccional foi misturada com 15 cm3 de solução aquosa de amoniaco a 5% e agitada durante 1 hora a uma temperatura na região de 22°C e deixada assentar. A fase aquosa foi separada e extraida com diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio e foram em seguida secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa), para se obterem 0,06 g de óleo de cor laranja. Adicionou-se ácido galactárico (0, 035 g, 0,16 mmol) a uma solução deste óleo em 6 cm3 de metanol a que se tinham adicionado 0,6 cm3 de água. A mistura foi levada ao refluxo, arrefecida até uma temperatura na região de 22°C e concentrada até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa). O residuo oleoso foi triturado na presença de 5 cm3 de éter diisopropilico e o sólido formado foi removido por filtração e em seguida seco a 45°C sob vácuo (2,7 kPa), para se obterem 0,072 g de galactarato de (+)-5-((E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)pirimidina na forma de um sólido amarelo. Espectro de massa (DCI) : m/z=176 (MH+) . Espectro de 1ft RMN (300 MHz, (CD3)2SO d6 com algumas gotas de CD3COOD d4, δ em ppm): 1,81 (m: 1H) ; 2,19 (m: 1H) ; 2,98 (dd, J=ll e 9 Hz: 1H) ; 3,10 (m: 1H); 3,21 (m: 1H); 3,33 (m: 1H); 3,43 (dd, J=ll e 8 Hz: 1H); 3,79 (s: 2H); 4,25 (s: 2H) ; 6,56 (AB limite: 2H) ; 8,88 (s: 2H); 9,05 (s: 1H). 28 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ Ο éster terc-butílico do ácido (+)-3-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxílico pode ser preparado como se segue:
Injectou-se uma mistura racémica de éster terc-butilico de ácido 3-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-1-
carboxílico (0,5 g) em duas partes, numa coluna de 8 cm de diâmetro contendo 1,2 kg de fase estacionária quiral Chiralpak AS(TM) 20 pm [caudal: 130 ml/min, eluente: heptano/metanol/ etanol (98/1/1 em volume)]. A concentração das fracções sob pressão reduzida (2,7 kPa) originou 0,24 g de éster terc-butilico de ácido (+) - ( (E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-1-carboxílico e 0,27 g de éster terc-butilico de ácido (-)-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxilico. O éster terc-butilico de ácido ( + )- ( (E)-2-pirimidin-5- ilvinil)pirrolidino-l-carboxílico foi eluido na primeira posição com um tempo de retenção de 14,2 min, numa coluna Chiralpak AS (TM) 20 pm de 4,6 mm de diâmetro e 250 mm de comprimento [caudal: 1 ml/min, eluente: heptano/metanol/etanol (98/1/1 em volume)]. Espectro de XH RMN (300 MHz, (CD3)2SO d6, δ em ppm): 1,43 (s: 9H); 1,79 (m: 1H); 2,06 (m: 1H); de 2,95 a 3.15 (m: 2H) ; de 3,20 a 3,35 (m: 1H); 3,44 (ddd, J=ll-8,5 e 3
Hz: 1H); 3,53 (dd largo, J=10 e 7,5 Hz: 1H); 6,52 (d, J=16,5 Hz: 1H); 6,63 (dd, J=16,5 e 7 Hz: 1H); 8,89 (s: 2H); 9,04 (s: 1H). 0 éster terc-butilico de ácido (-)-((E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxilico foi eluido na segunda posição com um tempo de retenção de 17 min numa coluna Chiralpak AS TM 20 pm de 4,6 mm de diâmetro e 250 mm de comprimento [caudal: 1 ml/min, eluente: heptano/metanol/etanol (98/1/1 em volume)]. Espectro de XH RMN (300 MHz, (CD3)2SO d6, δ em ppm): 1,43 (s: 9H); 1,79 (m: 1H); 2,06 (m: 1H); de 2,95 a 3.15 (m: 2H) ; de 3,20 a 3,35 (m: 1H) ; 3,44 (ddd, J=ll-8,5 e 3 Hz: 1H) ; 3,53 (dd largo, J=10 e 7,5 Hz: 1H) ; 6,52 (d, J=16,5 Hz: 1H); 6,63 (dd, J=16,5 e 7 Hz: 1H) ; 8,89 (s: 2H) ; 9,04 (s: 1H).
Exemplo 4 de Referência: Galactarato de (-)-5-((E)-2-Pirrolidin-3-ilvinil)-pirimidina
Adicionou-se iodeto de trimetilsililo (0,2 cm3, 1,4 mmol) a uma temperatura na região de 22°C a uma solução sob árgon de 0,29 g (1,053 mmol) de éster terc-butilico de ácido (-)-3- 29 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ ((Ε)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxílico em 10 cm3 de diclorometano. Após 2 horas de agitação a esta temperatura, a mistura reaccional foi misturada com 15 cm3 de solução aquosa de amoníaco a 5%, agitada durante lha uma temperatura na região de 22 °C e deixada assentar. A fase aquosa foi separada e extraída com diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com água e com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e em seguida foram secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas até à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) para se obter 0,1 g de um óleo de cor laranja. Adicionou-se ácido galactárico (0,06 g, 0,28 mmol) a uma solução deste óleo em 10 cm3 de metanol a que se tinha adicionado 1 cm3 de água. A mistura foi levada ao refluxo, arrefecida a uma temperatura na região de 22°C e concentrada ate à secura sob pressão reduzida (2,7 kPa) . O resíduo oleoso foi triturado na presença de 5 cm3 de éter diisopropílico e o sólido formado foi filtrado e em seguida seco a 45°C sob vácuo (2,7 kPa), para se obterem 0,094 g de galactarato de (-)-5-((E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)-pirimidina na forma de um sólido amarelo. Espectro de massa (DCI) : m/z=176 (MH+) . Espectro de XH RMN (300 MHz, (CD3)2SO d6 com algumas gotas de CD3COOD d4, δ em ppm): 1,82 (m: 1H); 2,19 (m: 1H) ; 2,98 (dd, J=ll e 9 Hz: 1H) ; 3,10 (m: 1H) ; 3,21 (m: 1H); 3,32 (m: 1H); 3,43 (dd, J=ll e 7,5 Hz: 1H); 3,79 (s: 2H); 4,24 (s: 2H) ; 6,57 (AB limite: 2H) ; 8,88 (s: 2H) ; 9,05 (s: 1H) . O éster terc-butílico de ácido (-) -3-( (E)-2-pirimidin-5-ilvinil)pirrolidino-l-carboxílico pode ser preparado como descrito no Exemplo 3.
Exemplo 5: Determinação do valor de Log P
Os valores de Log P, que foram utilizados para determinar as capacidades relativas dos compostos atravessarem a barreira hematoencefálica (Hansch, et al., J. Med. Chem. ii:1 (1968)), foram calculados utilizando o pacote de programa Cerius2 versão 3.5 pela Molecular Simulations, Inc.
Exemplo 6: Avaliação das várias propriedades dos compostos representativos
Os ensaios seguintes foram utilizados para determinar a afinidade de ligação e outras propriedades farmacológicas de 30 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ determinados compostos aqui descritos e podem ser utilizados, em geral, para avaliar outros compostos, como aqui descrito.
Ligação de radioligandos em receptores de n-acetilcolina do sistema nervoso central (nAChR SNC)
Subtipo α4β2
Mantiveram-se ratos (fêmeas, Sprague-Dawley), com pesos de 150-250 g, num ciclo de luz/escuridão de 12 h e com livre acesso a água e alimento fornecido pela PMI Nutrition
International, Inc. Os animais foram anestesiados com CO2 a 70% e em seguida decapitados. Os cérebros foram removidos e colocados numa plataforma arrefecida em gelo. O córtex cerebral foi removido e colocado em 20 volumes (peso:volume) de tampão preparativo arrefecido em gelo (NaCl 137 mM, KC1 10,7 mM, KH2P04 5, 8 mM, Na2HP04 8 mM, HEPES 20 mM (ácido livre), iodoacetamida 5 mM, edta 1,6 mM, pH 7,4); adicionou-se PMSF, dissolvido em metanol, até uma concentração final de 100 μΜ, e a suspensão foi homogeneizada por Polytron. O homogenato foi centrifugado a 18000 x g durante 20 min a 4°C e o sedimento resultante foi ressuspenso em 20 volumes de água arrefecida em gelo. Após 60 min de incubação em gelo, recolheu-se um novo sedimento por centrifugação a 18000 x g durante 20 min, a 4°C. O sedimento final foi ressuspenso em 10 volumes de tampão e armazenado a -20°C. No dia do ensaio, o tecido foi descongelado, centrifugado a 18000 x g durante 20 min e em seguida ressuspenso em PBS arrefecido em gelo (Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, NaCl 138 mM, KC1 2,67 mM, KH2P04 1,47 mM, Na2HP04 8, 1 mM, CaCl2 0,9 mM, MgCl2 0,5 mM, Invitrogen/Gibco, pH 7,4) até uma concentração final de aproximadamente 4 mg proteína/ml. A proteína foi determinada pelo método de Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265 (1951), utilizando albumina de soro de bovino como padrão. A ligação de [3H]nicotina foi medida utilizando uma modificação dos métodos de Romano et al., Science 210: 647 (1980) e Marks et al., Mol. Pharmacol. 30: 427 (1986). A [3H]nicotina (Actividade Especifica = 81,5 Ci/mmol) foi obtida da NEN Research Products. A ligação de [3H]nicotina foi medida utilizando uma incubação de 3 h a 4°C. As incubações foram realizadas em placas de microtitulo de 48 poços e continham 31 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ cerca de 400 μg de proteína por poço, num volume final de incubação de 300 μΐ. O tampão de incubação era PBS e a concentração final de [3H] nicotina era 5 nM. A reacção de ligação foi terminada por filtração da proteína contendo ligando ligado sobre filtros de fibra de vidro (GF/B, Brandel), utilizando um colector de tecido Brandel, a 4°C. Os filtros foram ensopados em água desionizada contendo polietilenoimina a 0,33%, para reduzir a ligação não específica. Cada filtro foi lavado 3 vezes com 1 ml de tampão arrefecido em gelo. A ligação não específica foi determinada por inclusão de L-nicotina não radioactiva 10 μΜ (Acros
Organics) em poços seleccionados. A inibição da ligação de [3H]nicotina pelos compostos de teste foi determinada por inclusão de sete concentrações diferentes do composto de teste em poços seleccionados. Cada concentração foi repetida em triplicado. Os valores de IC50 foram estimados como a concentração do composto que inibiu 50 por cento da ligação específica de [3H]nicotina. As constantes de inibição (valores de Ki), apresentadas em nM, foram calculadas a partir dos valores de IC50 utilizando o método de Cheng et al., Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108 (1973) .
Subtipo <x7
Mantiveram-se ratos (fêmeas, Sprague-Dawley), com pesos de 150-250 g, num ciclo de luz/escuridão de 12 h e com livre acesso a água e alimento fornecido pela PMI Nutrition
International, Inc. Os animais foram anestesiados com CO2 a 70% e em seguida decapitados. Os cérebros foram removidos e colocados numa plataforma arrefecida em gelo. O hipocampo foi removido e colocado em 10 volumes (peso:volume) de tampão preparativo arrefecido em gelo (NaCl 137 mM, KC1 10,7 mM, KH2PO4 5,8 mM, Na2HP04 8 mM, HEPES 20 mM (ácido livre), iodoacetamida 5 mM, edta 1,6 mM, pH 7,4); adicionou-se PMSF, dissolvido em metanol, até uma concentração final de 100 μΜ, e a suspensão de tecido foi homogeneizada por Polytron. O homogenato foi centrifugado a 18000 x g durante 20 min a 4°C e o sedimento resultante foi ressuspenso em 10 volumes de água arrefecida em gelo. Após 60 min de incubação sobre gelo, recolheu-se um novo sedimento por centrifugação a 18000 x g, durante 20 min a 4°C. O sedimento final foi ressuspenso em 32 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ 10 volumes de tampão e armazenado a -20°C. No dia do ensaio, o tecido foi descongelado, centrifugado a 18000 x g durante 20 min, e em seguida ressuspenso em PBS arrefecido em gelo (Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, NaCl 138 mM, KC1 2,6 7 mM, KH2P04 1, 47 mM, Na2HP04 8, 1 mM, CaCl2 0,9 mM, MgCl2 0,5 mM, Invitrogen/Gibco, pH 7,4) até uma concentração final de aproximadamente 2 mg de proteina/ml. A proteina foi determinada pelo método de Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265 (1951), utilizando albumina de soro de bovino como padrão. A ligação de [3H]MLA foi medida utilizando uma modificação dos métodos de Davies et al., Neuropharmacol. 38: 679 (1999). O [3H]MLA (Actividade Específica = 25-35 Ci/mmol) foi obtido da Tocris. A ligação de [3H]MLA foi determinada utilizando uma incubação de 2 h a 21°C. As incubações foram realizadas em placas de microtítulo de 48 poços e continham g de proteína por poço num volume final de incubação de 300 cerca de 200 μΐ. O tampão de incubação era PBS e a concentração final de [3H]MLA era 5 nM. A reacção de ligação foi terminada por filtração da proteína contendo ligando ligado sobre filtros de fibra de vidro (GF/B, Brandel) utilizando um colector de tecido Brandel, à temperatura ambiente. Os filtros foram ensopados em água desionizada contendo polietilenoimina a 0,33%, para reduzir a ligação não especifica. Cada filtro foi lavado 3 vezes com 1 ml de PBS à temperatura ambiente. A ligação não específica foi determinada por inclusão de MLA não radioactivo 50 μΜ em poços seleccionados. A inibição da ligação de [3H]MLA pelos compostos de teste foi determinada por inclusão de sete concentrações diferentes do composto de teste em poços seleccionados. Cada concentração foi repetida em triplicado. Os valores de IC50 foram estimados como a concentração do composto que inibiu 50 por cento da ligação especifica de [3H]MLA. As constantes de inibição (valores de Ki), apresentadas em nM, foram calculadas a partir dos valores de IC50 utilizando o método de Cheng et al., Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108 (1973). 33 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
Determinação da Libertação de Dopamina A libertação de dopamina foi medida utilizando sinaptossomas do estriado, obtidos de cérebro de rato, de acordo com os procedimentos estabelecidos por Rapier et al.r J. Neurochem. 54: 937 (1990). Mantiveram-se ratos (fêmeas,
Sprague-Dawley), com pesos de 150-250 g, num ciclo de luz/escuridão de 12 h e com livre acesso a água e alimento fornecido por PMI Nutrition International, Inc. Os animais foram anestesiados com C02 a 70%, e em seguida decapitados. Os cérebros foram removidos rapidamente e o estriado dissecado. O tecido do estriado de 2 ratos foi reunido e homogeneizado em 5 ml de sacarose 0,32 M arrefecida em gelo contendo HEPES 5 mM, pH 7,4, utilizando um homogeneizador vidro/vidro. O tecido foi então centrifugado a 1000 x g durante 10 min. O sedimento foi rejeitado e o sobrenadante foi centrifugado a 12000 x g durante 20 min. O sedimento resultante foi ressuspenso em tampão de perfusão contendo inibidores de monoamina-oxidase (NaCl 128 mM, KH2P04 1,2 mM, KC1 2,4 mM, CaCl2 3,2 mM, MgS04 1,2 mM, HEPES 25 mM, ácido ascórbico 1 mM, pargilina HC1 0,02 mM e glucose 10 mM, pH 7,4) e centrifugado durante 15 min a 25000 x g. O sedimento final foi ressuspenso em 1,4 ml de tampão de perfusão para utilização imediata.
A suspensão de sinaptossomas foi incubada durante 10 min a 37°C para restaurar a actividade metabólica. Adicionou-se [3H]Dopamina ([3H]DA, actividade especifica = 28,0 Ci/mmol, NEN Research Products) a uma concentração final de 0,1 μΜ e a suspensão foi incubada a 37°C durante mais 10 min. Carregaram-se aliquotas de 50 μΐ de tecido + 100 μΐ de tampão de perfusão nas câmaras de suprafusão de um Sistema de Suprafusão Brandel (série 2500, Gaithersburg, MD). O tampão de perfusão (temperatura ambiente) foi bombeado para as câmaras a uma velocidade de 3 ml/min durante um período de lavagem de 8 minutos. Aplicou-se então o composto de teste (10 μΜ) ou nicotina (10 μΜ) na corrente de perfusão, durante 40 segundos. Recolheram-se continuamente fracções (12 segundos cada) de cada câmara ao longo da experiência para capturar a libertação basal e a libertação de pico induzida por agonista e para restabelecer a linha de base após a aplicação do agonista. O perfusato foi recolhido directamente para frascos de cintilação, aos quais se adicionou fluido de cintilação. A 34 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ [3Η]DA libertada foi quantificada por contagem de cintilação. Para cada câmara, a área integrada do pico foi normalizada para a sua linha de base. A libertação foi expressa como uma percentagem da libertação obtida com uma concentração igual de L-nicotina. Em cada ensaio, fizeram-se réplicas de cada composto de teste utilizando 2-3 câmaras; foi feita a média das réplicas. Quando apropriado, determinaram-se as curvas de dose-resposta do composto de teste. A activação máxima para compostos individuais (Emax) foi determinada como uma percentagem da activação máxima induzida pela L-nicotina. A concentração do composto que resulta em metade da activação máxima (EC50) do fluxo iónico especifico foi também definida.
Selectividade versus nAChR Periféricos Interacção no subtipo muscular humano A activação de nAChR do tipo muscular foi estabelecida na linha clonal humana TE671/RD, que é derivada de um rabdomiossarcoma embrionário (Stratton et al., Carcinogen 10: 899-905 (1989)). Estas células expressam receptores que têm perfis farmacológicos (Lukas et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 251: 175-182 (1989)), electrofisiológicos (Oswald et al.,
Neuroscl. Lett. 96: 207-212 (1989)), e de biologia molecular (Luther et al., J. Neuroscl. 9: 1082-1096 (1989)) similares aos de nAChR do tipo muscular.
Mantiveram-se células TE671/RD em fase de crescimento proliferativo de acordo com protocolos de rotina (Bencherif et al., Mol. Cell. Neuroscl. 2: 52-65 (1991) e Bencherif et al., J Pharmacol. Exp. Ther. 257: 946-953 (1991)). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco/BRL) com soro de cavalo a 10% (Gibco/BRL), soro fetal de bovino a 5% (HyClone, Logan Utah), piruvato de sódio 1 mM, L-Glutamina 4 mM, 50 000 unidades de penicilina-estreptomicina (Irvine Scientific). Quando as células atingiram 80% de confluência, foram plaqueadas para placas de poliestireno de 6 poços (Costar). As experiências foram realizadas quando as células alcançaram 100% de confluência. 35 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ A função do receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) foi analisada utilizando efluxo de 86Rb+, de acordo com um método descrito por Lukas et al.r Anal. Biochem. 175: 212-218 (1988) . No dia da experiência, o meio de crescimento foi cuidadosamente removido do poço e adicionou-se a cada poço meio de crescimento que continha cloreto de 86rubídio (106 μΟί/ιηΙ) . As células foram incubadas a 37°C, durante um minimo de 3 h. Após o periodo de carga, o excesso de 86Rb foi removido e as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, livre de marcador (NaCl 138 mM, KC1 2,67 mM, KH2P04 1, 47 mM, Na2HP04 8,1 mM, CaCl2 0,9 mM, MgCl2 0,5 mM, Invitrogen/Gibco, pH 7,4), tendo o cuidado de não perturbar as células. Em seguida as células foram expostas a 100 μΜ de composto de teste, 100 μΜ de L-nicotina (Acros Organics), ou a tampão apenas, durante 4 min. Após o período de exposição o sobrenadante que contém o 86Rb libertado foi removido e transferido para frascos de cintilação. Adicionou-se fluido de cintilação e a radioactividade libertada foi medida por contagem de cintilação liquida.
Em cada ensaio, cada ponto teve 2 réplicas, das quais foi feita a média. A quantidade de libertação de 86Rb foi comparada com um controlo positivo (L-nicotina 100 μΜ) e com um controlo negativo (tampão apenas), para determinar a percentagem de libertação relativamente à de L-nicotina.
Quando apropriado, determinaram-se as curvas de dose-resposta dos compostos de teste. A activação máxima para compostos individuais (Emax) foi determinada como uma percentagem da activação máxima induzida pela L-nicotina. A concentração de composto que resulta em metade da activação máxima (EC50) do fluxo iónico específico também foi definida.
Interacção no Subtipo Gangliónico de Rato A activação dos nAChR de gânglios de ratos foi estabelecida na linha clonal de feocromocitoma PC12, que é uma linha celular clonal contínua originária da cristã neural, derivada de um tumor da medula supra-renal de rato. Estas células expressam nAChR neuronais do tipo ganglionar (ver Whiting et al., Nature 327: 515-518 (1987); Lukas et al., J. 36 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ
Pharmacol. Εχρ. Ther. 251: 175-182 (1989); Whiting et al., Mol. Brain Res. 10: 61-70 (1990)).
As células PC12 de rato foram mantidas em fase de crescimento proliferativo de acordo com protocolos de rotina (Bencherif et al., Mol. Cell. Neuroscí. 2: 52-65 (1991) e Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 257: 946-953 (1991)). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco/BRL) com soro de cavalo a 10% (Gibco/BRL), soro fetal de bovino a 5% (HyClone, Logan Utah), piruvato de sódio 1 mM, L-Glutamina 4 mM, e 50.000 unidades de penicilina-estreptomicina (Irvine Scientific). Quando as células atingiram 80% de confluência foram plaqueadas para placas Nunc de 6 poços (Nunclon) e revestidas com poli-L-lisina a 0,03% (Sigma, dissolvida em ácido bórico 100 mM). As experiências foram realizadas quando as células atingiram 80% de confluência. A função do receptor nicotinico de acetilcolina (nAChR) foi analisada utilizando efluxo de 86Rb+ de acordo com o método descrito por Lukas et al., Anal. Biochem. 175: 212-218 (1988). No dia da experiência, o meio de crescimento foi cuidadosamente removido do poço e adicionou-se a cada poço meio de crescimento que continha cloreto de 86rubídio (106 μΟί/ηιΙ) . As células foram incubadas a 37°C durante um mínimo de 3 h. Após o período de carga, o excesso de 86Rb foi removido e as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, livre de marcador (NaCl 138 mM, KC1 2,67 mM, KH2P04 1, 47 mM, Na2HP04 8,1 mM, CaCl2 0,9 mM, MgCl2 0,5 mM, Invitrogen/Gibco, pH 7,4), tendo o cuidado de não perturbar as células. Em seguida as células foram expostas a 100 μΜ de composto de teste, ou 100 μΜ de L-nicotina, ou a tampão apenas, durante 4 min. Após o período de exposição o sobrenadante que contém o 86Rb+ libertado foi removido e transferido para frascos de cintilação. Adicionou-se fluido de cintilação e a radioactividade libertada foi medida por contagem de cintilação líquida.
Em cada ensaio, cada ponto tinha 2 réplicas, das quais foi feita a média. A quantidade de 86Rb libertado foi comparada com um controlo positivo (L-nicotina 100 μΜ) e com 37 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ um controlo negativo (tampão apenas), para determinar a percentagem de libertação relativamente à de L-nicotina.
Quando apropriado, determinaram-se as curvas de dose-resposta do composto de teste. A activação máxima para compostos individuais (Emax) foi determinada como uma percentagem da activação máxima induzida pela L-nicotina. A concentração de composto que resulta em metade da activação máxima (EC50) do fluxo iónico especifico foi também definida.
Interacção no Subtipo Gangliónico Humano A linha celular SH-SY5Y é uma linha continua derivada por subclonagem sequencial da linha celular progenitora, SK-N-SH, que foi obtida originalmente a partir de um neuroblastoma periférico humano. As células SH-SY5Y expressam um nAChR do tipo ganglionar (Lukas et al., Mol. Cell. Neurosci. 4: 1-12 (1993)) .
As células SH-SY5Y humanas foram mantidas em fase de crescimento proliferativo de acordo com protocolos de rotina (Bencherif et al., Mol. Cell. Neurosci. 2: 52-65 (1991) e
Bencherif et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 257: 946-953 (1991)). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco/BRL) com soro de cavalo a 10% (Gibco/BRL), soro fetal de bovino a 5% (HyClone, Logan Utah), piruvato de sódio 1 mM, L-Glutamina 4 mM, e 50.000 unidades de penicilina-estreptomicina (Irvine Scientific). Quando as células atingiram 80% de confluência foram plaqueadas para placas de poliestireno de 6 poços (Costar). As experiências foram realizadas quando as células atingiram 100% de confluência. A função do receptor nicotinico de acetilcolina (nAChR) foi analisada utilizando efluxo de 86Rb+ de acordo com um método descrito por Lukas et al., Anal. Biochem. 175: 212-218 (1988) . No dia da experiência, o meio de crescimento foi cuidadosamente removido do poço e adicionou-se meio de crescimento contendo cloreto de 86rubidio (10β μοί/ιηΐ) a cada poço. As células foram incubadas a 37°C durante um mínimo de 3 h. Após o período de carga, o excesso de 86Rb+ foi removido e as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, livre de marcador (NaCl 38 ΕΡ 2 085 395/ΡΤ 138 mM, KC1 2,67 mM, KH2P04 1,47 mM, Na2HP04 8, 1 mM, CaCl2 0,9 mM, MgCl2 0,5 mM, Invitrogen/Gibco, pH 7,4), tendo o cuidado de não perturbar as células. Em seguida as células foram expostas a 100 μΜ de composto de teste, ou 100 μΜ de nicotina, ou a tampão apenas, durante 4 min. Após o periodo de exposição o sobrenadante que continha o 86Rb libertado foi removido e transferido para frascos de cintilação. Adicionou-se fluido de cintilação e a radioactividade libertada foi medida por contagem de cintilação líquida.
Em cada ensaio, cada ponto tinha 2 réplicas, das quais foi feita a média. A quantidade de 86Rb+ libertado foi comparada com um controlo positivo (nicotina 100 μΜ) e com um controlo negativo (tampão apenas) para determinar a percentagem de libertação relativamente à de L-nicotina.
Quando apropriado, foram determinadas curvas de dose-resposta do composto de teste. A activação máxima para compostos individuais (Emax) foi determinada como uma
percentagem da activação máxima induzida pela L-nicotina. A concentração de composto que resulta em metade da activação máxima (EC50) do fluxo iónico especifico foi também definida.
Os compostos representativos foram avaliados utilizando os ensaios aqui descritos. Os resultados indicam que os compostos da presente invenção se ligam selectivamente a nAChR α4β2 e consequentemente desencadeiam a libertação de dopamina. Tipicamente, os valores de Ki para a ligação em α4β2 são na gama de 1-100 nM e os valores de Emax para a libertação de dopamina atingem 100% do que é produzido pela nicotina. Em contraste, os compostos da presente invenção não se ligam bem aos subtipos de nAChR que são característicos do sistema nervoso periférico e sistema muscular. Assim, os compostos da presente invenção possuem potencial terapêutico para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central, sem produzirem efeitos secundários associados com interacção com o sistema nervoso periférico.
Lisboa, 2011-04-14

Claims (7)

  1. ΕΡ 2 085 395/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composto, que é seleccionado entre (R)- e (S)—3—((E) — 2-pirrolidin-3-ilvinil)-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)pirimidina, suas misturas racémicas, seus enantiómeros e tautómeros, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, que é hemigalactarato de 3-( (E)-2-pirrolidin-3-ilvinil)-5-(tetra-hidropiran-4-iloxi)pirimidina racémico.
  3. 3. Composição farmacêutica compreendendo um composto da reivindicação 1 ou 2 e um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis.
  4. 4. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou composição da reivindicação 3, no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de distúrbios neurodegenerativos.
  5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou composição da reivindicação 3, para utilização no tratamento ou prevenção de um distúrbio neurodegenerativo.
  6. 6. Utilização da reivindicação 4, ou composto ou composição da reivindicação 5, em que o distúrbio é demência pré-senil, doença de Alzheimer com início precoce, demência senil, demência do tipo de Alzheimer, demência de corpos de Lewy, demência por micro-enfarte, demência relacionada com a SIDA, demência pelo VIH, deficiência cognitiva suave, deficiência de memória associada à idade, distúrbio amnésico prematuro, distúrbios cognitivos relacionados com a idade, distúrbios cognitivos relacionados com substâncias, distúrbios cognitivos relacionados com a síndrome da imunodeficiência, distúrbios cognitivos associados a distúrbios vasculares, esquizofrenia, distúrbio do défice de atenção, deficiências de atenção, ou deficiências de aprendizagem.
  7. 7. Utilização da reivindicação 4 ou composto ou composição da reivindicação 5, em que o distúrbio é doença de Alzheimer, demência do tipo de Alzheimer suave a moderada, distúrbio do défice de atenção, distúrbio de hiperactividade ΕΡ 2 085 395/ΡΤ 2/2 cognitiva suave, esquizofrenia, ou com défice de atenção, deficiência deficiência de memória associada à idade, disfunção cognitiva na esquizofrenia. Lisboa, 2011-04-14
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