PT2070939E - Moduladores de agentes farmacológicos - Google Patents

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PT2070939E PT91562058T PT09156205T PT2070939E PT 2070939 E PT2070939 E PT 2070939E PT 91562058 T PT91562058 T PT 91562058T PT 09156205 T PT09156205 T PT 09156205T PT 2070939 E PT2070939 E PT 2070939E
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Description

1
DESCRIÇÃO "MODULADORES DE AGENTES FARMACOLÓGICOS"
Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. N°. 601293.231, depositado a 25 de maio de 2001, e do Pedido Provisório U.S. N° . 60/331.037, depositado a 7 de novembro de 2001.
ÁREA TÉCNICA A presente invenção refere-se, em geral, a um modulador oligonucleotidico gue inverte a atividade farmacológica de um aptâmero, fator de coagulação.
ANTECEDENTES O papel convencional atribuído aos ácidos nucleicos foi principalmente um papel informativo nos processos biológicos. Através de um método conhecido como Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (Evolução Sistemática de Ligandos por Enriquecimento Exponencial), denominado de SELEX, ficou claro que os ácidos nucleicos possuem uma diversidade estrutural tridimensional não diferente das proteínas. O SELEX é um método para a síntese in vitro e seleção de moléculas de ácido nucleico com um elevado nível de ligação específica às moléculas alvo. O processo SELEX foi descrito pela primeira vez por Gold e Tuerk no Pedido de Patente com o número de série US 07/536.428, depositado a 11 de Junho de 1990, convertido na Patente US 5.475.096 e, posteriormente, no Pedido de Patente com o número de série US 07/931.473, depositado a 17 de Agosto de 1992, intitulado "Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands" (Métodos para Identificação de Ligandos de Ácido Nucleico), convertido agora na Patente US 5.270.163 (ver também WO 91/19813) . Ver também Tuerk et al, 2
Science 249: 505-10 (1990).
Os ligandos de ácido nucleico ou aptâmeros são ácido nucleico de cadeia simples não codificante (ADN ou ARN) que têm a propriedade de se ligar especificamente a um composto ou molécula alvo desejado, e que têm a capacidade suficiente para formar uma variedade de estruturas bidimensionais e tridimensionais e a versatilidade química suficiente disponível no interior dos seus monómeros para atuar como ligandos (formando pares de ligação específicos) praticamente com qualquer composto químico, seja ele monomérico ou polimérico. As moléculas de qualquer dimensão ou composição podem ser utilizadas como alvos. O método SELEX envolve a seleção de uma mistura de oligonucleotídeos candidatos e iterações passo a passo de ligação, separação e amplificação, usando o mesmo esquema de seleção geral, para atingir praticamente qualquer critério desejado de afinidade e seletividade de ligação. A partir de uma mistura de ácidos nucleicos, preferencialmente incluindo segmentos de sequências aleatórias, o método SELEX inclui etapas de contacto da mistura com o alvo sob condições favoráveis para a ligação,separação de ácidos nucleicos não ligados dos ácidos nucleicos que se ligaram especificamente às moléculas alvo, dissociando os complexos ácido nucleico-alvo, amplificando os ácidos nucleicos dissociados dos complexos de ácido nucleico-alvo para produzir uma mistura rica em ligandos de ácidos nucleicos, repetindo de seguida as etapas de ligação, separação, dissociação e amplificação através do número de ciclos desejado de forma a produzir ligandos de ácido nucleico com elevada afinidade especifica para a molécula-alvo.
Os ligandos de ácidos nucleicos possuem uma série de características que os podem tornar úteis como agentes terapêuticos. Podem ser preparados em compostos sintéticos 3 relativamente pequenos (por exemplo, de 8 kDa a 15 kDa) e podem ser selecionados de forma a ter num elevado nível de afinidade e especificidade para moléculas-alvo (constantes de dissociação de equilíbrio que variam, por exemplo, entre 0,05 e 10 nM) . Os aptâmeros incorporam propriedades de afinidade de anticorpos monoclonais e, simultâneamente, anticorpos de cadeia única (scFv) e uma facilidade de produção semelhante à de um pequeno péptido. Os estudos iniciais demonstraram a utilização in vitro de aptâmeros para estudar a função da proteína, e estudos mais recentes confirmaram a utilidade destes compostos para o estudo da função da proteína in vivo (Floege et al, Am J Pathol 154: 169-179 (1999), Ostendorf et al, J Clin Invest 104: 913-923, (1999) ) . Além disso, os estudos em animais realizados até à data mostraram que os aptâmeros e os compostos com composições idênticas são bem tolerados, apresentam baixa ou nenhuma imunogenicidade, e são, portanto, adequados a administração repetida como compostos terapêuticos (Floege et al, Am J Pathol 154: 169-179 (1999), Ostendorf et al, J Clin Invest 104: 913-923 (1999), Griffin et al, Blood 81: 3271-3276 (1993), Hicke et al, J Clin Invest 106: 923-928 (2000) ) .
Como compostos sintéticos, as modificações específicas do local (inserções ou deleções) podem ser feitas aos aptâmeros de forma a se alterar racionalmente a sua biodisponibilidade e modo de depuração. Por exemplo, verificou-se que os aptâmeros de 2'-fluoro pirimidina modificados de dimensões entre 10 kDa e 12 kDa apresentam uma semi-vida circulante curta (~10 minutos) após a administração intravenosa em bólus, mas essa modificação química simples do aptâmero ou a conjugação do aptâmero com uma molécula transportadora de peso molecular elevado (por exemplo, PEG) aumenta substancialmente a semi-vida 4 circulante (6-12 horas) (Willis et al, Bioconjug Chem 9: 573-582 (1998) , Tucker et al, J Chromatogr Biomed Sei Appl 732: 203-212 (1999), Watson et al, Desenvolvimento Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:63-75 (2000)). Os ligandos de ácido nucleico de cadeia simples resistentes a nuclease e bioativos que consistem em L-nucleotideos foram descritos (Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 94: 11285 (1997); USP 5.780.221; Leva et al, Chem. Biol. 9: 351 (2002)). Estes "aptâmeros-L "são declaradamente estáveis em condições em que os aptâmeros que consistem em nucleotídeos de lateralidade natural (nucleotideos-D) (isto é, "aptâmeros-D ") estão sujeitos a degradação.
Um grande número de terceiros pediu e assegurou patentes que abrangem a identificação, produção e utilização de aptâmeros. Conforme acima referido, atribui-se, em termos gerais, a Gold Larry e a Craig Tuerk o desenvolvimento do primeiro método SELEX para o isolamento de aptâmeros. O seu método encontra-se descrito em diversas patentes nos Estados Unidos, incluindo as atrás referidas e a Patente US 5.670.637, 5.696.249, 5.843.653,6.110.900 e 5.270.163, bem como outras descritas na Descrição Detalhada da invenção. Thomas Bruice et al. relatou um processo para produzir aptâmeros na Patente US 5.686.242, o que difere do processo original SELEX relatado por Tuerk e Gold porque emprega oligonucleotides estritamente aleatórios durante a sequência de rastreio. Os oligonucleotideos selecionados no processo de patente '242 não dispõem dos iniciadores oligonucleotídicos que estão presentes em oligonucleotideos rastreados no processo SELEX.
Diversas patentes de Gold et al. referem-se aos próprios aptâmeros. Por exemplo, a Patente US 6.114.120 refere-se a um aptâmero que se liga a uma macromolécula da célula. A Patente US 5.670.637 refere-se aos aptâmeros que 5 se ligam às proteínas. A Patente US 5.696.249 refere-se a um aptâmero produzido pelo processo SELEX.
Outras patentes referem ser direcionadas aos aptâmeros contra alvos biológicos específicos e aos métodos de identificação destes aptâmeros. A Patente US 5.756.291 e 5.582.981 de 0'Toole, por exemplo, divulgam um método de deteção de trombina utilizando um aptâmero marcado que inclui uma sequência de seis nucleotídeos definida. A Patente US 5.527.894 e 5.637.461 de Gold et al. refere-se aos métodos de identificação de aptâmeros contra a proteína tat. Outras patentes que divulgam os aptâmeros direcionados aos alvos biológicos específicos incluem a Patente US 5.496.938 (transcriptase reversa de HIV), 5.476.766 (trombina), 5.459.015 (fator de crescimento fibroblástico), 5.472.841 (elastase de neutrófilos), 5.849.479 (fator de crescimento endotelial vascular), 5.726.017 (HIV GAG), 5.731.144 (TGF, Ββ), 5.827.456 (hormona gonadotrofina coriónica), 5.780.228 (lectinas), 5.766.853 (selectinas) , 5.674.685 (fator de crescimento derivado de plaquetas), 5.763.173 (ADN polimerase), 6.140.490 (proteínas do sistema complemento), e 5.869.641 (CD4).
Sullenger, Rusconi, Kontos e White em WO 0226932 A2 descrevem os aptâmeros de ARN que se ligam a fatores de coagulação, fatores de transcrição da família E2F, Angl,
Ang2 e seus fragmentos ou respetivos péptidos, fatores de transcrição, anticorpos auto-imunes e recetores celulares de superfície úteis na modulação da hemostase e outros eventos biológicos. (Ver também Rusconi et al, Thrombosis Haemost 83: 841-848 (2000), White et al, J. Clin Invest 106:929-34 (2000), Ishizaki et al, Nat Med 2: 1386-1389 (1996), and Lee et al, Nat Biotechnol 15: 41-45 (1997)).
Diversas patentes relataram também os usos específicos de aptâmeros. Por exemplo, Bruice et al. na Patente US 6 6.022.691 descreve o uso de aptâmeros identificados por um processo semelhante ao SELEX para detectar fármacos e outras moléculas em líquidos biológicos. Gold et al na Patente US 5.843.653 fornece um método de diagnóstico usando aptâmeros. A Patente US 6.110.900 divulga uma composição de diagnóstico que contém um aptâmero. A Patente US 5.789.163 divulga um ensaio tipo sanduíche que emprega aptâmeros como um ligando de captura e/ou de deteção. A Patente US 6.147.204 descreve o uso de aptâmeros/complexos lipofilicos para administrar aptâmeros terapêuticos e de diagnóstico a localizações intracelulares in vivo. As Patentes US 5.705.337, 5.962.219, 5.763.595 e 5.998.142 divulgam aptâmeros quimicamente modificados para se ligarem de modo covalente às proteínas-alvo. Vários métodos foram desenvolvidos para modificar o processo base de SELEX de forma a obter aptâmeros que satisfaçam os objectivos além de exibir um elevado nível de afinidade e seletividade de ligação com a molécula-alvo. Por exemplo, diversas patentes divulgam o uso de nucleotídeos modificados no processo SELEX para obter aptâmeros que exibem propriedades melhoradas. A Patente US 5.660.985, por exemplo, refere-se a utilização de nucleotídeos 2' modificados que exibem numa estabilidade aumentada in vivo. A Patente US 6.083.696 divulga um processo SELEX "misto", no qual os oligonucleotideos que se ligam covalentemente às unidades funcionais de ácido não nucleico são selecionados pela sua capacidade de ligação com a molécula-alvo. Outras patentes descrevem as modificações pós-SELEX aos aptâmeros para diminuir o seu tamanho, aumentar a sua estabilidade ou aumentar a afinidade e seletividade de ligação com o alvo. Ver, por exemplo, a Patente US 5.817.785 e 5.648.214.
Outras patentes descrevem ainda processos SELEX 7 únicos. Por exemplo, a Patente US 5.763.566 e 6.114.120 divulgam processos de geração de aptâmeros usando o processo SELEX com a totalidade do tecido biológico como o alvo, para identificar os aptâmeros que têm afinidade e seletividade de ligação com os tecidos biológicos e os seus componentes. A Patente US 5.580.737 divulga uma modificação no processo SELEX que produz aptâmeros que podem distinguir dois ou mais compostos. A Patente US 5.567.588 divulga o método "solução SELEX" no qual a mistura candidata de ácido nucleico é rastreada na solução a fim de, preferencialmente, amplificar o aptâmero com maior nível de afinidade.
Kauffman obteve patentes revelando a geração de grandes bibliotecas de proteínas de grandes pools de vectores de oligonucleotídeos geradas estocasticamente. Ver a Patente US 5.814.476 e 5.723.323.
Weis et al. divulga na Patente US 5.245.022 um oligonucleotídeo de cerca de 12-25 bases que é substituído por um terminal polialquilenoglicol. Estes oligonucleotídeos modificados parecem ser resistentes à atividade de exonuclease.
As Patentes US 5.670.633 e 6.005.087 de Cook et al descrevem oligonucleotídeos 2'-flúor termicamente estáveis que são complementares a uma sequência de bases de ARN ou ADN. As Patentes US 6.222.025 e 5.760.202 de Cook et al. descrevem a síntese de oligómeros e pirimidinas 2'-O substituídas contendo pirimidinas modificadas. A EP 0 593 901 BI divulga oligonucleotídeos e análogos de ribozima com o terminal 3 ', 3'-e 5', 5' de ligações de nucleósideos. A Patente US 6.011.020 de Gold et al divulga um aptâmero modificado por polietilenoglicol.
Diversas patentes norte americanas descrevem métodos de produção em larga escala que podem ser usados para produzir aptâmeros. Caruthers et al., por exemplo, descreve na Patente US 4.973.679, 4.668.777 e 4.415.732, uma classe de compostos fosforamidita que são úteis na produção de oligonucleotideos. Noutro conjunto de patentes, Caruthers et al. divulga um método de síntese de oligonucleotideos utilizando um suporte de polímero inorgânico. Ver, por exemplo, a Patente US 4.500.707,4.458.066 e 5.153.319. Noutro conjunto de patentes, Caruthers et al. divulga uma classe de fosforoditioatos de nucleosídeos que podem ser usados para fabricar oligonucleotideos. Ver, por exemplo, a Patente US 5.278.302, 5.453.496 e 5.602.244. Relatórios de aptâmeros concebidos para se ligarem a outros aptâmeros incluem: Aldaz-Carroll L, Tallet B, Dausse E, Yurchenko L, Toulme JJ.; "Apical loop-internal loop interactions: a new RNA-RNA recognition motif identified through in vitro selection against RNA hairpins of the hepatitis C virus RNA", Biochemistry. 7 de maio de 2002; 41 (18) : 5883-93; Darfeuille F, Cazenave C, Gryaznov S, Duconge F, Di Primo C, Toulme JJ.; "RNA and N3'—>P5' kissing aptamers targeted to the transact ivat ion responsive (TAR) RNA of the human immunodeficiency virus-1", Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. Abril-julho de 2001; 20 (4-7): 441-9; CollinD, vanHeijenoortC, BoiziauC, Toulme JJ, Guittet E., "NMR characterization of a kissing complex formed between the TAR RNA element of HIV-I and a DNA aptamer." Nucleic Acids Res. 1 de setembro de 2000; 28 (17): 3386-91; Duconge F, Di Primo C, Toulme JJ., "Is a closing "GA pair" a rule for stable looploop RNA complexes?" J Biol Chem. 14 de julho de 2000; 275 (28): 21287-94.; Duconge F, Toulme JJ. "In vitro selection identifies key determinants for loop-loop interactions: RNA aptamers selective for the TAR RNA element of HIV-1." RNA. Dezembro de 1999; 5 (12): 1605-14.; Boiziau C, Dausse E, Yurchenko L, Toulme JJ., "DNA aptamers 9 selected against the HIV-1 trans-activation-responsive RNA element form RNA-DNA kissing complexes." J Biol Chem. 30 de abril de 1999; 274 (18) : 12730-7; e Le Tinevez R, Mishra RK, Toulme JJ., "Selective inhibition of cell-free translation by oligonucleotides targeted to a RNA hairpin structure. Nucleic Acids Res. 15 de maio de 1998; 26 (10) : 2273-8 .
Hoje em dia, muitos fármacos desencadeiam complicações médicas tais como efeitos secundários e resultados indesejáveis ou não controláveis. Tratar complicações médicas que resultam de efeitos secundários comporta custos adicionais de saúde. A recente identificação desta gama de ligandos de ácidos nucleicos úteis na terapêutica médica abriu novas vias de investigação e desenvolvimento. Embora tenham sido feitos progressos nesta área, existe uma grande necessidade de encontrar métodos e combinações que melhorem a forma como estes ligandos são usados e aumentem a sua eficácia, para um melhor controlo do processo terapêutico e para encontrar terapêuticas com menos efeitos secundários comparativamente aos métodos terapêuticos tradicionais. Esta invenção fornece moduladores oligonucleotídicos para melhorar o processo de utilização de aptâmeros de fator de coagulação na terapêutica médica. A abordagem fornecida nesta invenção permite um maior controlo sobre o efeito terapêutico, a farmacocinética e a duração da atividade dos aptâmeros de fator de coagulação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Descobriu-se que os efeitos anticoagulantes e antitrombóticos dos aptâmeros de fator de coagulação que têm como alvo os componentes da via de coagulação do sangue podem ser especificamente e rapidamente invertidos in vivo para produzir um efeito biológico desejado. Esses aptâmeros são ácidos nucleicos de cadeia simples que se ligam a um 10 fator de coagulação. Isto pode ser conseguido através da administração de um modulador oligonucleotidico que hibridia, sob condições fisiológicas do referido aptâmero, gue troca a ligação do aptâmero de fator de coagulação pelo seu alvo ou que se degrada ou, de alguma forma, cliva, metaboliza ou decompõe o aptâmero de fator de coagulação, enquanto o aptâmero de fator de coagulação continua a exercer os seus efeitos. Os moduladores desta invenção podem ser administrados em tempo real, conforme for necessário com base em vários fatores, incluindo a evolução do paciente, bem como o critério do médico para obter a terapêutica ideal. Desta forma, esta invenção proporciona, pela primeira vez, um regime terapêutico regulável no decorrer da terapêutica de aptâmero de fator de coagulação. A invenção encontra-se definida pelas reivindicações em anexo.
As referências feitas a um "ligando de ácidos nucleicos "ou a um "ligando" significam um aptâmero de fator de coagulação, que é um ácido nucleico de cadeia simples que se liga a um fator de coagulação. As referências feitas a um "modulador" significam um "modulador oligonucleotídico" que híbrida sob condições fisiológicas a um aptâmero de fator de coagulação.
Este regime terapêutico regulável controla a ação do fármaco através da introdução de um modulador que é fácil de usar, pode não estar relacionado com o estado de saúde do paciente, possui um modo uniforme de ação e não necessita de uma infusão contínua de fármacos. Num exemplo, é fornecido um antídoto que é concebido de forma racional para rejeitar a atividade do aptâmero sempre que tal seja desejado pelo médico. O modulador é um oligonucleotídeo ou um produto ligado de qualquer um destes. Por exemplo, o modulador pode ser um 11 oligonucleotídeo que seja complementar a pelo menos uma parte do ligando de ácido nucleico. Noutra modalidade da invenção, o modulador pode ser uma ribozima ou DNAzima que tem como alvo o ligando de ácido nucleico. Numa modalidade adicional, o modulador pode ser um ácido nucleico peptídico (ANP), um ácido nucleico de morfolino (MNA), um ácido nucleico bloqueado (LNA) ou oligonucleobases pseudocíclicos (PCO), que inclui uma sequência que é complementar a ou que hibridia com pelo menos uma parte do ligando de ácido nucleico. Um ligando de ácido nucleico típico, isto é, o aptâmetro, possui uma determinada quantidade de uma estrutura secundária - a sua estrutura terciária ativa dependente da formação da estrutura apropriada secundária estável.
Consequentemente, embora o mecanismo de formação de um duplex entre um modulador oligonucleotídico complementar da invenção e um ligando de ácido nucleico seja igual ao existente entre os dois oligoribonucleotídeos lineares curtos, tanto as regras para a conceção de tais interações e a cinética de formação de tal produto são impactadas pela estrutura de aptâmero intramolecular. A taxa de nucleação é importante para a formação do duplex final estável, e a taxa dessa etapa é muito aumentada pela seleção do modulador oligonucleotídico a ciclos de cadeias simples e/ou caudas de 3' ou 5' cadeias simples presentes no ligando de ácido nucleico. Para que ocorra a formação do duplex intermolecular, a energia livre de formação do duplex intermolecular tem que ser favorável à formação dos dúplexes intramoleculares existentes dentro do ligando de ácido nucleico alvo.
Numa modalidade alternativa da invenção, o próprio modulador é um aptâmero. Nesta modalidade, um ligando de ácido nucleico é primeiramente gerado para se ligar ao alvo 12 terapêutico desejado. Numa segunda etapa, um segundo ligando de ácido nucleico que se liga ao primeiro ligando de ácido nucleico é gerado utilizando o processo SELEX aqui descrito ou outro processo e modula a interação entre o ligando de ácido nucleico terapêutico e o alvo. Numa modalidade, o segundo ligando de ácido nucleico desativa o efeito do primeiro ligando de ácido nucleico. "Modula" ou "regula" neste contexto significa "inverte especifica e rapidamente".
Noutras modalidades alternativas, o aptâmero que se liga ao alvo pode ser um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO e o modulador é um ligando de ácido nucleico. Alternativamente, o aptâmero que se liga ao alvo é um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO, e o modulador é um ANP. Em alternativa, o aptâmero que se liga ao alvo é um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO, e o modulador é um MNA. Em alternativa, o aptâmero que se liga ao alvo é um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO, e o modulador é um LNA. Em alternativa, o aptâmero que se liga ao alvo é um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO, e o modulador é um PCO. Qualquer um destes pode ser usado, conforme desejado, na estereoquimica de ocorrência natural ou estereoquímica de ocorrência não-natural ou numa sua mistura. Por exemplo, numa modalidade preferida, o ligando de ácido nucleico encontra-se na configuração D, e numa modalidade alternativa, o ligando de ácido nucleico encontra-se na configuração L. A presente especificação fornece também métodos para identificar os moduladores de ligandos de ácidos nucleicos. Os moduladores podem ser identificados, em geral, através de ensaios de ligação, modelagem molecular, ou ensaios in vivo ou in vitro que medem a modificação da função biológica. Num aspeto, a ligação de um modulador a um ácido nucleico é determinada pelo ensaio de troca em gel. Noutro 13 aspeto, a ligação de um modulador a um ligando de ácido nucleico é determinada pelo ensaio Biacore. Outros ensaios adequados encontram-se descritos na Descrição Detalhada da Invenção.
Noutro aspeto, a ligação ou interação do modulador com o ligando de ácido nucleico é medida através da avaliação do efeito do ligando de ácido nucleico com e sem o modulador em condições biológicas adequadas. Como exemplo, os moduladores da invenção podem ser identificados para regular os aptâmeros antitrombóticos e anticoagulantes. A eficácia do modulador pode ser avaliada in vitro ou in vivo através de um bioensaio de teste de coagulação tal como o teste de tempo de coagulação ativado, o teste de tromboplastina parcial ativado, o teste de duração da hemorragia, o teste do tempo de protrombina ou o teste do tempo de coagulação de trombina. Utilizando um regime de identificação, poderá ser administrado um ligando de ácido nucleico anticoagulante a um paciente e depois administrar-se-lhe o antídoto na altura correta para retomar a ação de coagulação normal. Este sistema é útil, por exemplo, durante uma cirurgia cardiovascular e cirurgia vascular, uma intervenção coronária percutânea (angioplastia), uma cirurgia ortopédica e tratamento do enfarte agudo do miocárdio. Um exemplo ilustrativo, apesar de não limitado a este, é o facto de os moduladores desta invenção se poderem ligar aos ligandos de ácido nucleico que têm como alvo o fator tecidual (TF)/fator Vila (FVIIa), fator Vila (FVIIIa)/fator IXa (FIXa), complexos de enzima de fator Va (FVa/fator Xa (Fxa) e recetores plaquetários tais como gp IlblIIa e gp IbIX e modular os efeitos do ligando de ácidos nucleicos. Esta invenção fornece também inibidores plaquetários controlados por antídoto, antitrombóticos e fibrinolíticos. 14
Numa modalidade, o modulador é um oligonucleotídeo que se liga a um aptâmero de fator IXa (por exemplo, Aptâmero 9,3 ou Aptâmero 9,3t) que tem como alvo o fator de coagulação IXa. 0 antídoto de oligonucleotídeo pode ser complementar a, pelo menos, uma parte do aptâmero do fator IXa.
Especificamente, o antídoto de oligonucleotídeo 2'-0-metilo pode ser constituído pela seguinte sequência, 5'AUGGGGAGGCAGCAUUA 3 ' , 5 'CAUGGGGAGGCAGCAUYA-3', 5'CAUGGGGAGGCAGCA3 ' , 5'CAUGGGGAGGCA-3', 5'GCAUUACGCGGUAUAGUCCCCUA3 ', 5'CGCGGUAUAGUCCCCUA3', 5 'CGC GGU AUA GUC CCC AU3' . As modificações ou seus derivados onde se mantém um grau desejado de hibridação.
Noutra modalidade, o modulador é um oligonucleotídeo que se liga a um aptâmero de fator Xa (por exemplo, Aptâmero llF7t) que tem como alvo o fator de coagulação Xa. 0 antídoto oligonucleotídeo pode ser complementar a pelo menos uma parte do aptâmero de fator Xa.
Especificamente, o antídoto de oligonucleotídeo pode ser constituído pelas seguintes sequências, 5'CUCGCUGGGGCUCUC3', 5'UAUUAUCUCGCUGGG3', 5'AAGAGCGGGGCCAAG3', 5'GGGCCAAGUAUUAU 3', 5'CAAGAGCGGGGCCAAG 3', 5'CGAGUAUUAUCUUG3' ou qualquer das suas modificações ou derivados, onde se mantiver um grau desejado de hibridação.
Noutra modalidade, os moduladores oligonucleotídicos incluem sequências de ácidos nucleicos que são substancialmente homólogos e que têm substancialmente a mesma capacidade de se ligar dos ligandos de ácidos nucleicos, como os moduladores oligonucleotídicos aqui identificados.
Noutra modalidade, os moduladores da invenção podem também ser utilizados para inverter a ligação de ligandos 15 de ácido nucleico em frações radioativas ou citotóxicas que tem como alvo o tecido (por exemplo, tecido neoplástico) e assim, por exemplo, facilitar a depuração de tais frações do sistema de um paciente. Da mesma forma, os moduladores da invenção podem ser usados para inverter a ligação dos ligandos de ácido nucleico marcados com frações detectáveis (usadas, por exemplo, na imagem ou isolamento ou classificação de células) para direcionar células ou tecidos (Hicke et al. J. Clin. Invest. 106: 923 (2000); Ringquist et al, Cytometry 33: 394 (1998)). Esta inversão pode ser usada para agilizar a depuração da fração detetável do sistema de um paciente.
Num aspeto da referência, os moduladores também podem ser usados em configurações in vitro para aumentar ou inibir o efeito de um ligando de ácido nucleico (por exemplo, um aptâmero) numa molécula-alvo. Por exemplo, os moduladores podem ser utilizados em estudos de validação-alvo. Usando moduladores da invenção, é possível confirmar que uma resposta observada após a inibição da molécula-alvo (com um ligando de ácidos nucleicos) se deve à inibição específica dessa molécula.
Os moduladores da invenção são utilizados na produção de um medicamento, por exemplo, podem ser formulados em composições farmacêuticas que podem incluir, para além do modulador, um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A natureza precisa da composição dependerá, pelo menos em parte, da natureza do modulador e da via de administração. Os regimes de dosagem ideais podem ser facilmente comprovados por um especialista, que poderão variar de acordo com o modulador, o paciente e o efeito pretendido.
Geralmente, o modulador pode ser administrado por IV, IM, IP, SC, ou topicamente, dependendo do caso. 16
Em alternativa, e tendo em conta a especificidade dos moduladores da invenção, o tratamento posterior pode envolver a administração adicional de ligandos de ácidos nucleicos idênticos ou diferentes ao ligando de ácido nucleico/par de oligonucleotideos antidoto administrados originalmente.
Finalmente, um aspeto opcional é a identificação e seleção dos moduladores e reguladores que exibem reatividade cruzada de espécies relevantes para aumentar a utilidade dos estudos pré-clínicos em animais.
Os objetivos e vantagens desta invenção tornar-se-ão evidentes com a seguinte descrição:
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o aptâmero FIXa 9,3t (SEQ ID N0:1). Todas as purinas são 2'-hidroxila e todas as pirimidinas são nucleotídeos 2'-flúor. A Figura 2 mostra a atividade anticoagulante do aptâmero 9,3t. 0 aumento do tempo de coagulação é normalizado no tempo de coagulação base na ausência de aptâmero. A Figura 3 mostra a mudança ACT de suínos após a injeção de aptâmero. Os dados são normalizados na linha de base de pré-injeção. A Figura 4 mostra a mudança no tempo de coagulação de suínos após a injeção de aptâmero.
As figuras 5A-5C mostram a atividade inibitória in vitro de aptâmero com colesterol modificado 9.3t-C. Figura 5A. A adição de colesterol tem um efeito modesto sobre a afinidade de aptâmero 9,3t-C para FIXa.
Um ensaio de ligação de competição é utilizado para medir a afinidade de 9,3t-C para FIXa. Fig. 5B. Atividade 17 anti-coagulante in vitro do aptâmero 9,3tC no plasma humano. Fig. 5C. Atividade anti-coagulante in vitro do aptâmero 9,3tC no plasma de suínos.
As figuras 6A-6C mostram a atividade anticoagulante in vivo do aptâmero 9,3t-C. Fig. 6A. Atividade anti-coagulante in vivo de aptâmero 9,3t-C em suínos após a injeção em bólus IV, ensaios ACT (linha pontilhada são dados ACT 9,3t, 0,5 mg / ml da figura. 3) . Fig. 6B. Atividade anti-coagulante in vivo de aptâmero 9,3t-C em suínos após a injeção em bólus IV, ensaios APTT e PT (0,5 mg/Kg 9,3t da figura. 4) . Fig. 6C. Concentração no plasma in vivo de 9,3t-C versus 9,3t durante um período após a injeção de bólus IV. As concentrações foram calculadas por interpolação a partir das curvas de resposta de dosagem in vitro de ensaios APTT para cada aptâmero. A Figura 7 mostra o alinhamento de aptâmeros FIXa mínimos (SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO:17). As sequências em letras minúsculas são derivadas da região fixa da biblioteca utilizada no processo de SELEX e sequências em letras maiúsculas são derivadas da região aleatória da biblioteca utilizada no processo de SELEX. S = haste, L = ciclo. A Figura 8 mostra a análise em gel nativa de ligação do oligonucleotídeo antídoto para o aptâmero 9,3t. A capacidade do oligonucleotídeo antídoto de se ligar e o aptâmero desnaturado 9,3t foi avaliada por electroforese em gel nativo. Resumidamente, 9.3t radio-marcado (125 nM) foi incubado a 37° C por 15 minutos, com (da esquerda para a direita) excesso molar de 8 vezes, 4 vezes, 2 vezes ou quantidades equimolares do antídoto (A. S.) ou oligonucleotídeo sem sentido (N. S.) 9,3t nativa migra mais rapidamente que o antídoto ligado a 9,3t neste sistema de gel (compare faixas 1 e 2). 18
As figuras 9A e 9B mostram a inversão do antídoto de oligonucleotídeo da atividade anticoagulante do aptâmero 9,3t no plasma humano. Fig. 9A. Mudança no tempo de coagulação versus a concentração de oligonucleotideo sem sentido ou antídoto. Um valor de 1,0 indica que não há alteração no tempo de coagulação em relação ao valor inicial. 9.3tM é uma versão mutante do aptâmero 9,3t que não tem atividade anticoagulante. Fig. 9B.
Fração da atividade anticoagulante do aptâmero 9,3t revertida contra o excesso molar de antidoto de oligonucleotideo.
As figuras 10A-10C mostram a especificidade dos antídotos de oligonucleotideos. Fig. 10A. Estrutura secundária mínima de aptâmero 9,20t (SEQ ID NO: 18) . Fig. 10B Atividade anticoagulante de 9,20t. Fig. 10C. Especificidade do oligonucleotideo antídoto Anti Dl. A Figura 11 mostra a estrutura secundária do aptâmero 9.3t-3NT com cauda (SEQ ID NO: 19) . Também são mostrados antídotos de oligonucleotideos (SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:22).
As figuras 12A e 12B mostram a atividade do aptâmero 9,3t-3NT. Fig. 12A. Dados de ligação competitiva. Fig. 12B. Dados anticoagulantes in vitro.
As figuras 13A e 13B mostram a inversão in vitro da atividade anticoagulante in vivo do aptâmero 9,3t-3NT. Fig. 13A. Inversão da atividade anticoagulante versus concentração do antídoto de oligonucleotideo. Fig. 13B. Inversão da atividade anticoagulante versus excesso molar do antido sobre o aptâmero.
As figuras 14A e 14B mostram o impacto da adição de cauda ao aptâmero 9,3t sobre a capacidade de inversão da atividade anticoagulante.
Figura 15. O antídoto de oligonucleotideo 5-2C, mas não uma versão codificada deste antídoto de 19 oligonucleotídeo, 5-2C scr, efetivamente reverte a atividade de aptâmeros 9,3t e Peg-9,3t no plasma humano.
Figura 16. Cinética de atividade antídoto no plasma humano, conforme descrito no Exemplo 6.
Figura 17. Duração de atividade antídoto in vitro, conforme descrito no Exemplo 6.
Figuras 18A e 18B. Fig. 18A. Estrutura secundária prevista de aptâmero llF7t (SEQ ID NO:23), que se liga ao fator de coagulação Xa humano com um KD de~1.5 nM. Fig. 18B. Estrutura secundária prevista de uma versão mutante de aptâmero llF7t, denominado HF7tM(SEQ ID NO:24).
Figuras 19A e 19B. 0 aptâmero llF7t é um potente anticoagulante do plasma humano. As concentrações variáveis do aptâmero llF7t foram adicionadas ao plasma humano in vitro e o tempo de coagulação foi medido pelo ensaio PT (Fig. 19A) ou APTT (Fig. 19B). Todos os dados são normalizados na linha de base para esse dia, de modo que um valor de 1 seja igual a nenhuma alteração no tempo de coagulação.
Figura 20. Sequências de llF7t às quais os antídotos de oligos são complementares.
Figuras 21A e 21B. Fig. 21A. Os antídotos de oligonucleotídeos invertem efetivamente a atividade do aptâmero llF7t no plasma humano. Fig. 21B. Caracterização da atividade 5-2 do antídoto ao longo de uma variação de maior concentração do antídoto 5-2, e comparação com a atividade do antídoto de uma versão de sequência baralhada do antídoto 5-2,5-2 scr.
Figura 22. Cinética da atividade do antídoto no plasma humano. O aptâmero llF7t foi adicionado ao plasma humano in vitro numa concentração final de 125 nM e permitiu ser incubado durante 5 minutos a 37° C. O antídoto de oligonucleotídeo 5-2 num excesso molar 1: 1 ou 5: 1 ou 20 nenhum antídoto foi adicionado e a atividade de coagulação do plasma determinada pela medição do tempo de coagulação num ensaio PT nos tempos indicados após a adição do antídoto. A percentagem da atividade anticoagulante residual foi calculada pela comparação da diferença ao longo da linha de base entre o tempo de coagulação na presença de antidoto e a diferença do valor inicial, na ausência de antídoto em cada período definido. Os dados colectados no excesso molar 5:1 de 5-2 antídoto para o aptâmero llF7t não são mostrados, uma vez que a inversão da atividade anticoagulante estava concluída no primeiro período (1 minuto).
Figura 23. Duração da atividade do antídoto in vitro. A duração da inativação da atividade anticoagulante do aptâmero llF7t por antídoto de oligonucleotídeo 5-2 foi medida in vitro no plasma humano. Resumidamente, llF7t foi adicionado ao plasma humano para uma concentração final de 125 nM e permitiu-se a sua incubação durante 5 minutos. Os oligonucleotídeos antídotos 5-2 foram então adicionados ao excesso molar por 4 vezes, ou num tampão de experiência paralelo isolado foi adicionado, em vez do antídoto de oligo, e o tempo de coagulação foi medido num ensaio PT em vários períodos após a adição do antídoto. Todos os dados são normalizados na linha de base para esse dia, de modo que um valor de 1 seja igual a nenhuma alteração no tempo de coagulação. Verificou-se que após 5 horas de incubação a 37° C, o PT do plasma tratado começou a aumentar, indicando a perda do coágulo que forma a atividade do plasma, e, portanto, a experiência foi interrompida em 5 horas. A05-2 (500 nM)-final em
Figura 24. Aptâmeros 9,3t e llF7t e suas respectivas funções de antídotos independentes umas das outras no plasma humano. Aptl = 9.3t (30 nM), Apt2 = llF7t (100 nM), ADI = AO 5-2c (300 nM) , AD2 = 21 concentrações plasmáticas em () . Foram adicionados aptâmetros ao plasma humano a 37 ° C, conforme indicado e permitiu-se a sua incubação durante 5 minutos. Os antídotos foram adicionados, conforme indicado, e a atividade de coagulação foi medida 10 minutos após a adição do antídoto em ensaios APTT. Em todos os ensaios, somente o tampão foi substituído por aptâmero ou antídoto nos casos em que apenas um aptâmero ou antídoto foi adicionado ao plasma. Todos os dados são normalizados na linha de base para esse dia, de modo que um valor de 1 seja igual a nenhuma alteração ao período de coagulação.
Figuras 25A-25F. A anticoagulação controlada pelo antídoto no plasma dos pacientes com trombocitopenia induzida pela heparina. Figuras 25A-25C. A atividade do aptâmero Peg-9.3t e antídoto 5-2 foram testados no plasma de pacientes dependentes de hemodiálise com diagnóstico de HIT. Fig. 25D-25F. A atividade do aptâmero Peg-9.3t e antídoto 5-2 foram testados no plasma de pacientes que sofrem de complicações tromboembólicas de HIT. As amostras de plasma foram tratadas conforme indicado: aptâmero, 125 nM Peg-9.3t; antídoto, 1,25 μΜΑΟ 5-2; aptâmero mutante, 125 9.3tM nM. As experiências foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2, Figura 9. Os dados são expressos em segundos e correspondem ± à média das medições em duplicado.
Figuras 26A e B. A anticoagulação controlada do antídoto no plasma dos pacientes com trombocitopenia induzida pela heparina. A atividade do aptâmero llF7t e do antídoto 5-2 foi testada no plasma de pacientes dependentes de hemodiálise com diagnóstico de HIT e de pacientes que sofrem de complicações tromboembólicas de HIT. Para o Paciente 3, as amostras de plasma foram tratadas conforme indicado: aptâmero, 250 nM llF7t; antídoto, 1,0 μΜ AO 5-2; 22 aptâmero mutante, 250 nM 9.3tM. As experiências foram realizadas conforme se descreve no Exemplo 2, Figura 9. Para o Paciente 6, as amostras de plasma foram tratadas conforme indicado: aptâmero, 125 nM llF7t; antidoto, 250 nM AO 5-2; aptâmero mutante, 125 rA 9.3tM. Os dados são expressos em segundos e correspondem ± à média de medições duplicadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se, em geral, ao uso de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero de fator de coagulação que tem como alvo os componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero, em que o aptâmero de fator de coagulação é um ácido nucleico de cadeia simples que se liga a um fator de coagulação, e em que o modulador oligonucleotidico hibridia em condições
fisiológicas ao aptâmero de fator de coagulação. A especificação diz ainda respeito aos métodos de melhoria ou inibição da eficácia de agentes farmacológicos através da administração de moduladores da invenção a um sujeito a necessitar deles (por exemplo, um humano). Além disso, a especificação diz respeito a métodos de utilização de modeladores da invenção para avaliar a atividade de ligandos de ácido nucleico, in vivo e in vitro.
Esta invenção refere-se a um método de uma inversão especifica e rápida da atividade de um ligando de ácido nucleico, por exemplo, alterando sua conformação e, consequentemente, a sua função. De acordo com a invenção, o modulador pode entrar em contacto com o ligando de ácido nucleico-alvo sob determinadas condições, ligando-se ao ligando de ácidos nucleicos e modificando a interação entre o ligando de ácido nucleico e a sua molécula-alvo. A 23 modificação dessa interação pode resultar na modificação da estrutura do ligando de ácidos nucleicos, em resultado da ligação pelo modulador. 0 modulador pode ligar o ligando de ácidos nucleicos e/ou o ligando de ácido nucleico ligados à sua molécula-alvo.
Os moduladores da invenção podem ser desenvolvidos de forma a ligarem qualquer ligando de ácido nucleico determinado com um elevado grau de especificidade e um grau desejado de afinidade. Os moduladores foram desenvolvidos de forma a que, ao se ligarem, modificarem a estrutura do ligando de ácido nucleico para uma forma menos ativa. Por exemplo, o modulador pode ser desenvolvido de modo que a ligação com o ligando de ácido nucleico alvo, a estrutura tridimensional dos ligandos de ácido nucleico seja alterada de tal forma que se ligam ao ligando de ácido nucleico não possa continuar a ligação à sua molécula-alvo ou se ligue à sua molécula alvo com menor afinidade. 0 modulador é um oligonucleotideo. 0 oligonucleotideo pode ser uma sequência que é complementar a, pelo menos, uma parte do ligando de ácido nucleico. Noutra modalidade, o modulador é uma ribozima ou DNAzima que tem como alvo o ligando de ácidos nucleicos. Numa modalidade adicional, o modulador pode ser, por exemplo, um ácido nucleico peptidico ou ácido nucleico morfolino que inclui uma sequência que é complementar ou se hibridia com pelo menos uma parte do ligando de ácidos nucleicos. Um modulador se hibridia especificamente com o ligando de ácido nucleico quando a ligação do modulador com o ligando de ácido nucleico interfere suficientemente no funcionamento normal do ligando de ácido nucleico para provocar a mudança na atividade biológica do ligando de ácido nucleico sob condições fisiológicas. Numa modalidade alternativa, existe um grau suficiente de ligação não-Watson Crick do modulador 24 para o ligando de ácido nucleico para afetar a atividade do ligando de ácido nucleico.
Em termos de referência também estão incluídos métodos para a identificação de moduladores de ligandos de ácidos nucleicos. Num aspeto, a ligação de um modulador a um ácido nucleico é determinada por um ensaio que mede a afinidade e seletividade de ligação, tal como um ensaio de troca de gel. Noutro aspeto, a ligação de um modulador a um ligando de ácido nucleico é determinada por um ensaio Biacore. Abaixo descrevem-se outros ensaios ilustrativos.
Noutro aspeto, a ligação ou a interação do modulador com o ligando de ácido nucleico é medida pela avaliação do efeito do ligando com e sem o regulador em condições biológicas adequadas. Por exemplo, os moduladores podem ser identificados por modificar a atividade antitrombótica e anticoagulante do ligando de ácido nucleico in vitro ou in vivo através de um bioensaio de teste de coagulação tal como um teste de tempo de coagulação ativado, um teste de tromboplastina parcial ativado, um teste de duração da hemorragia, um teste de tempo de protrombina ou um teste do tempo de coagulação de trombina.
Esta invenção inclui ainda o uso de tais moduladores numa variedade de indicações em que o controlo da atividade do ligando de ácidos nucleicos é desejado. Os moduladores podem agir para inibir a atividade do ligando de ácidos nucleicos como um antídoto para inverter as ações do ligando de ácidos nucleicos.
Além disso, a invenção fornece métodos de utilização de moduladores da invenção para avaliar a atividade de ligandos de ácidos nucleicos. Um aspeto de referência é direcionado aos métodos de inibição da eficácia de ligandos de ácido nucleico através da administração de moduladores dum aspeto de referência a mamíferos humanos ou não- 25 humanos .
Noutra modalidade, podem também ser utilizados moduladores da invenção para inverter a ligação dos ligandos de ácido nucleico com frações radioativas ou citotóxicas para o tecido-alvo e, assim, por exemplo, facilitar a depuração de tal fração do sistema de um paciente. Da mesma forma, os moduladores da invenção podem ser usados para inverter a ligação dos ligandos de ácido nucleico marcados com frações detectáveis (usadas, por exemplo, na imagem ou isolamento ou classificação de células) para direcionar células ou tecidos (Hicke et al. J. Clin. Invest. 106:923 (2000); Ringquist et al, Cytometry 33:394 (1998)). Esta inversão pode ser usada para agilizar a depuração da fração detetável num sistema de um paciente.
Num aspeto de referência, os moduladores podem também ser utilizados em configurações in vitro para aumentar ou inibir o efeito de um ligando de ácido nucleico (por exemplo, aptâmero) numa molécula-alvo. Por exemplo, os moduladores podem ser utilizados em estudos de validação alvo. Usando os moduladores, é possível confirmar que a resposta observada após a inibição da molécula alvo (com um ligando de ácidos nucleicos), se deve à inibição especifica da molécula.
Os moduladores da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas, que podem incluir, além do modulador, um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A natureza precisa da composição dependerá, pelo menos em parte, da natureza do modulador e da via de administração. Os regimes de dosagem ideais podem ser facilmente comprovados por um especialista e podem variar de acordo com o modulador, o paciente e o efeito pretendido. Geralmente, o modulador é administrado por IV, IM, IP, SC, oralmente ou topicamente, conforme se 26 considerar adequado.
Noutra modalidade, o ligando de ácidos nucleicos ou seu regulador pode ser covalentemente ligado a um composto lipofílico, como o colesterol, glicerol dialquil, glicerol diacil, ou um composto de elevado peso molecular não-imunogénico ou polímeros tais como polietilenoglicol (PEG).
Nestes casos, as propriedades farmacocinéticas do ligando de ácidos nucleicos ou modulador podem ser intensificadas. Ainda noutras modalidades, o ligando de ácidos nucleicos ou o modulador pode ser composto, por exemplo, por um ácido nucleico ou um ANP ou um MNA encapsulado em lipossoma, e a captação intracelular intensificada é vista através do oligonucleotideo ou mdulador não complexo. 0 composto lipofílico ou composto de elevado peso molecular não-imunogénico pode ser ligado covalentemente ou associado através de interações não-covalentes com ligando(s) ou modulador(es) . Noutras modalidades, onde o composto lipofílico é colesterol, glicerol dialquil, glicerol diacil ou um composto de elevado peso molecular não-imunogénico é o PEG, é preferível uma associação covalente com modulador oligonucleotidico. Em modalidades onde o composto lipofílico é um lipossoma catiónico ou quando os moduladores oligonucleotídicos são encapsulados dentro dos lipossomas, é preferível uma associação não-covalente com o modulador oligonucleotidico. Noutras modalidades, onde a ligação covalente é empregada, o composto lipofílico ou composto de elevado peso molecular não-imunogénico pode ser ligado covalentemente a uma variedade de posições sobre o modulador oligonucleotidico, tais como para um grupo amino exocíclico na base, um nucleotídeo de pirimidina na posição 5, nucleotídeo purina na posição 8, o grupo hidroxila do fosfato, ou um grupo hidroxila ou outro grupo no terminal 27 5' ou 3 do modulador oligonucleotídico. No entanto, é de preferência ligado ao grupo hidroxila 5' ou 3'. A fixação do modulador oligonucleotídico a outros componentes do complexo pode ser feita diretamente ou com a utilização dos ligandos ou espaçadores. 0 composto lipofílico ou composto de alto peso molecular não-imunogénico pode associar-se através de interações não-covalentes com o modulador oligonucleotídico. Por exemplo, numa modalidade da presente invenção, o modulador oligonucleotídico é encapsulado dentro do compartimento interno do composto lipofílico. Noutra modalidade da presente invenção, o modulador oligonucleotídico associa-se com o composto lipofílico através de interações eletroestáticas. Por exemplo, um lipossoma catiónico pode associar-se a um modulador oligonucleotídico aniónico. Outro exemplo de interação não-covalente iónica através de forças de atracção é aquele em que uma parte do modulador oligonucleotídico hibridia através de emparelhamento de bases Watson-Crick ou emparelhamento da base de hélice tripla a um oligonucleotídeo que é associado a um composto lipofílico ou composto de elevado peso molecular não-imunogénico. I. Definições É de conhecimento geral que os seguintes termos têm significados reconhecidos nesta área. No entanto, estabelecem-se as seguintes definições para facilitar a explicação da invenção.
Os termos "atividade de ligação" e "afinidade" referem-se à tendência de uma molécula de ligando se ligar ou não ligar a um alvo. A energia das referidas interações são significativas numa "atividade de ligação" e "afinidade e seletividade de ligação", pois estas definem as concentrações necessárias de interação com parceiros, as taxas a que estes parceiros são capazes de se associar e as 28 concentrações relativas de moléculas ligadas e livres numa solução. A energética é caracterizada, entre outras coisas, pela determinação de uma constante de dissociação, Kd. 0 Kd é preferencialmente estabelecido através de um ensaio de ligação de filtro de nitrocelulose de filtro duplo tal como foi divulgado por Wong e Lohman, 1993, Proc. Natl Acad. Sei. LISA 90, 5428-5432. Os "oligonucleotídeos de ligação especifica", "ligandos de ácido nucleico "ou "aptâmeros" numa modalidade da invenção são oligonucleotídeos com regiões de ligação especifica que são capazes de formar complexos com uma molécula-alvo pretendida. A especificidade da ligação é definida em termos das constantes de dissociação comparativas (Kd) de um modulador de um ligando de ácido nucleico em relação à constante de dissociação em relação a outros materiais no meio ambiente ou moléculas relacionadas em geral. O Kd para um modulador de um ligando de ácido nucleico pode ser de 2 vezes, de preferência 5 vezes, de preferência mais de 10 vezes inferior ao Kd com relação ao modulador e o material não relacionado ou material de apoio no ambiente. Ainda com maior preferência, o Kd será 50 vezes menor, mais preferentemente 100 vezes menor, mais preferentemente 200 vezes menor. O Kd pode ser determinado diretamente pelos métodos conhecidos, e pode ser calculado, mesmo para misturas complexas, através de métodos como os estabelecidos, por exemplo, em Caceei, M., et al. Byte (1984) 9:340-362. Observou-se, no entanto, que para alguns pequenos oligonucleotídeos, a determinação direta do valor de Kd é difícil, e pode levar, de forma errónea, a resultados elevados. Nessas circunstâncias, um ensaio competitivo de ligação para a molécula-alvo ou outra substância candidata pode ser conduzido relativamente substâncias conhecidas por 29 se ligar ao alvo ou aos candidatos. 0 valor da concentração em que ocorre 50% de inibição (Kx) é, em condições ideais, equivalente a Kd. No entanto, um Kd não poderá nunca ser inferior a Kd. Assim, a determinação de Klf em alternativa, estabelece um valor máximo para o valor de Kd. Nestas circunstâncias, em que as dificuldades técnicas se opõem a uma medida exacta do valor de Kd, a medição de Ki pode ser convenientemente substituída para fornecer um limite superior para Kd. Pode utilizar-se também um valor de K± para confirmar que um modulador se liga a um ligando de ácidos nucleicos.
Como a especificidade é definida em termos de Kd, conforme estabelecido acima, nalgumas modalidades desta invenção, é preferível excluir das categorias de matérias independentes e de materiais que acompanham o alvo no ambiente alvo os materiais que são suficientemente relacionados com o alvo como apresentando uma reação cruzada imunológica com este. Por "reação cruzada imunológica" entende-se que os anticorpos aumentados relativamente ao alvo sofrem uma reação cruzada em condições normais de ensaio com o material candidato. Em geral, para que os anticorpos reajam de forma cruzada em testes normais, as afinidades e seletividades de ligação dos anticorpos com os materiais de reação cruzada comparados com os alvos devem variar entre 5-vezes a 100 vezes, geralmente cerca de 10 vezes.
No contexto desta invenção, "hibridação" significa ligações de hidrogénio, que podem ser ligações de hidrogénio Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen revertida, entre os nucleosídeos complementares ou bases de nucleotídeos. Por exemplo, a adenina e timina são nucleobases complementares que se emparelham através da formação de ligações de hidrogénio. "Complementares", como 30 utilizado neste texto, refere-se à capacidade de emparelhamento preciso entre dois nucleótideos. Por exemplo, se um nucleotideo numa determinada posição de um oligonucleotideo for capaz de realizar uma ligação de hidrogénio com um nucleotideo na mesma posição de uma molécula de ADN ou ARN, então o oligonucleotideo e o ADN ou ARN são considerados complementares entre si em tal posição. O oligonucleotideo e o ADN ou ARN são complementares entre si, quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula é ocupado por nucleotídeos que podem realizar uma ligação de hidrogénio entre si. Assim, "hibridação específica" e "complementar" são termos usados para indicar um grau suficiente de complementaridade ou de emparelhamento preciso de forma que a ligação específica ou estável ocorra entre o oligonucleotideo e o ADN ou ARN alvo. É do conhecimento geral nesta área que a sequência de compostos não precisa de ser 100% complementar à do seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizada. Um composto é especificamente hibridizado quando a ligação do composto à molécula de ácido nucleico alvo interfere no funcionamento normal do ácido nucleico alvo para gerar uma mudança na sua utilidade, e há um determinado grau de complementaridade para evitar a ligação não-específica do composto às sequências não-alvo em condições em que a ligação específica é desejada, isto é, sob condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico, e no caso de ensaios in vitro, nas condições em que os ensaios são realizados. "Oligómeros" ou "oligonucleotídeos" incluem sequências de ADN ou ARN ou suas misturas ou seus análogos, de mais de um nucleotideo em qualquer forma de cadeia simples ou dúplex e inclui especificamente sequências 31 curtas, tais como dímeros e trímeros, em qualquer forma de cadeia simples ou dúplex, que podem ser intermediários na produção dos oligonucleotides especificamente ligados. As formas "Modificadas" utilizadas em pools candidatas contêm pelo menos um resíduo não-nativo. 0 termo "análogo ao ARN" é utilizado para referir uma molécula polimérica que pode conter um ou mais nucleótidos que possuem um substituinte não-hidrogénio, com excepção de um grupo hidroxila na posição 2', e por exemplo, pode conter pelo menos um dos seguintes: 2'-desoxi, 2'-halo (incluindo 2'-fluor), 2'-amino (de preferência, insubstituído ou mono ou disubstituído), 2'-mono-, di-ou tri-halometil, 2'-0-alquila (incluindo 2'-0-metila ou etila), 2'-O-halo-alquila substituído, 2'-alquila, azido,fosforotioato, sulfidril, metilfosfonato, fluoresceína, rodamina, pireno, biotina, xantina, hipoxantina, 2-6-diamino purina, 2-hidroxi-6-mercaptopurina e bases pirimidinas substituídas na posição 6 com enxofre ou na posição 5 com halo ou grupos alquila C1-5 de alquil, ligandos básicos, 3'-desoxi-adenosina, bem como outros "terminadores de cadeias" disponíveis ou análogos "não-extensíveis" (na extremidade 3' do ARN), ou rótulos como 32P, 33P e similares. 0 acima referido pode ser incorporado num ARN utilizando as técnicas de síntese padrão aqui divulgadas.
Conforme aqui utilizado, um "alvo" ou "molécula-alvo" refere-se a uma biomolécula que é o foco de uma estratégia de fármacos terapêuticos ou um ensaio de diagnóstico, incluindo, entre outros, enzimas, inibidores de enzimas, hormonas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, ácidos nucleicos, proteínas de superfície celular, intracelular e extracelular, péptidos, carboidratos, incluindo glicosaminoglicanos, lípidos, incluindo glicolípidos e 32 oligonucleotídeos e, em geral, qualquer biomolécula capaz de ligar ou desligar uma via bioquímica ou de a modular, ou que esteja envolvida numa resposta biológica previsível. Os alvos podem estar livres em solução, como a trombina, ou associados com as células ou vírus, como nos recetores ou proteínas do envelope. Qualquer molécula que tenha uma dimensão suficiente para ser especificamente reconhecida por um ligando de ácidos nucleicos pode ser usada como alvo. Assim, as estruturas de membrana, recetores, organelas, e semelhantes podem ser usados como alvos de complexação.
Um "aptâmero ARN" é um aptâmero que inclui unidades de ribonucleósido. 0 "aptâmero ARN" também pretende abranger ARN análogos como acima definidos. 0 termo "aptâmero de fator de coagulação" é utilizado para referir um ácido nucleico de cadeia simples ou duplo que se liga um fator de coagulação e modula a sua função. 0 termo "fator de coagulação" é utilizado para referir um fator que actua numa ou em ambas as cascatas de coagulação intrínseca e extrínseca.
Conforme aqui utilizado, a "sequência consenso" refere-se a uma sequência ou região de nucleotídeos (que pode ou não ser composta por nucleotídeos contíguos) encontrada numa ou mais regiões de pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos. A sequência consenso pode ter apenas três nucleótidos. Também pode ser composta por uma ou mais sequências contíguas, com sequências de nucleotídeos ou polímeros de até cem bases intercaladas entre as sequências consenso. As sequências consenso podem ser identificadas pela sequência de comparações entre as diferentes espécies de ácidos nucleicos, cujas comparações podem ser auxiliadas por programas de computador e outras ferramentas para modelagem da estrutura secundária e 33 terciária da informação da sequência. Geralmente, a sequência consenso contém pelo menos aproximadamente 3 a 20 nucleotideos, em geral 6-10 nucleotideos.
Os termos "doença cardiovascular" e "doenças cardiovasculares" referem-se a qualquer doença cardiovascular conforme descrição de um especialista na área. Os exemplos não limitativos de doenças cardiovasculares específicos abrangidos incluem, entre outros, arteroesclerose, trombofilia, embolias, enfarte cardíaco (por exemplo, enfarte do miocárdio), trombose, angina, derrame, hipertensão, choque séptico, hiper-colesterolemia, reestenose e diabetes. 0 termo "aproximadamente", conforme aqui utilizado, em relação a um valor mensurável, como uma medida de peso, tempo, dose, etc, deve abranger as variações de ±20% ou ±10%, de preferência ±5%, e ainda de maior preferência, ±1%, e ainda de ainda maior preferência ±0.1% do valor especificado, visto que tais variações são apropriadas para executar o método divulgado.
Os compostos desta invenção com um centro quiral podem existir e ser isolados nas formas opticamente ativas e racémicas. Alguns compostos podem apresentar polimorfismo. Esta invenção engloba a forma racémica, oticamente-ativa, polimórfica, ou estereoisomérica, ou as suas misturas, de um composto da invenção, que possuem as propriedades úteis aqui descritas. As formas oticamente ativas podem ser preparadas, por exemplo, por resolução da forma racémica através de técnicas de recristalização, através de síntese de materiais de partida oticamente ativos, através de síntese quiral, ou através de separação cromatográfica utilizando uma fase estacionária quiral ou por resolução enzimática. Numa modalidade preferida, os compostos são usados em formas de ocorrência natural. No entanto, em 34 alternativa, os compostos podem ser usados na forma de ocorrência não-natural. II. Ligandos de ácido nucleico
Um "Ligando de ácido nucleico" conforme aqui utilizado é um aptâmero de fator de coagulação conforme acima definido. A ação desejável inclui, entre outros, ligação do alvo, mudança catalítica do alvo, reação com o alvo de forma que modifica o alvo ou a atividade funcional do alvo, ligação covalente ao alvo, como um inibidor suicida ou facilitando a reação entre o alvo e uma outra molécula. Na modalidade preferida, a ação é a afinidade e seletividade de ligação específica a uma molécula-alvo, sendo que tal molécula-alvo é uma estrutura química tridimensional, onde o ligando de ácido nucleico não é um ácido nucleico com função fisiológica conhecida por se ligar à molécula-alvo. Numa modalidade da invenção, os ligandos de ácidos nucleicos são identificados usando a metodologia SELEX. Os ligandos de ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos identificados a partir de uma mistura de ácidos nucleicos candidata, no qual o ligando de ácido nucleico, sendo um ligando de um alvo determinado pelo método compreendendo a) o contacto da mistura candidata com o alvo, na qual os ácidos nucleicos com uma afinidade maior para com o alvo relativo à mistura candidata podem ser separados do restante da mistura candidata; b) a clivagem do aumento de afinidade dos ácidos nucleicos do restante da mistura candidata e, c) a ampliação do aumento da afinidade dos ácidos nucleicos para produzir uma mistura enriquecida com ligandos de ácidos nucleicos. Conforme aqui utilizado, o ligando de ácido nucleico ou aptâmero denota as sequências no singular e plural dos ácidos nucleicos que são capazes 35 de se ligar a uma proteína ou a outra molécula, e interrompendo a função da proteína ou de outra molécula.
Os ligandos de ácidos nucleicos podem ser feitos com nucleotideos com estereoguimica D ou L, ou a sua mistura. Os nucleosídeos de ocorrência natural estão em configuração D. Os aptâmeros foram feitos a partir de nucleotideos L, e são denominados de L-aptâmeros. Os ligandos de ácido nucleico utilizados para fins terapêuticos são normalmente na configuração D, mas podem exibir qualquer configuração que proporcione o efeito desejado. Normalmente, quando os ligandos de ácido nucleico compreendem os L-nucleotídeos são alvo de um modulador oligonucleotídico, o modulador compreende também L-nucleotideos (ver, por exemplo, USP 5.780.221).
Os ligandos de ácido nucleico são formados, de preferência, por cerca de 10 a cerca de 100 nucleotideos, de preferência de cerca de 15 a cerca de 40 nucleotideos, mais preferivelmente cerca de 20 a cerca de 40 nucleotideos, em que os oligonucleotídeos de comprimento dentro destes limites são facilmente preparados pelas técnicas convencionais. Numa modalidade, os aptâmeros ou moduladores oligonucleotidicos podem incluir um mínimo de cerca de 6 nucleotideos, de preferência, 10, e de preferência 14 ou 15 nucleotideos, que são necessários para produzir a ligação especifica. As únicas limitações aparentes relativamente à especificidade da ligação do alvo/dupla de oligonucleotídeos da invenção referem-se à sequência suficiente para distinguir a ligação de oligonucleotídeo e a capacidade de ligação suficiente da substância-alvo para obter a interação necessária. Os aptâmeros de regiões de ligação contendo sequências inferiores a 10, por exemplo, 6-mers são adequados, se a interação adequada puder ser obtida no contexto do ambiente 36 em que o alvo é colocado. Assim, se houver pouca interferência de outros materiais, poderá ser necessária menor especificidade e menor força de ligação.
Os ligandos de ácidos nucleicos e os seus métodos de produção e utilização estão descritos, por exemplo, na seguinte Patente norte americana. Qualquer um dos ligandos de ácidos nucleicos descritos nas patentes abaixo referidas ou em outras patentes, ou quaisquer ligandos de ácidos nucleicos descritos nas publicações, bem como outros ácidos nucleicos desejados utilizados na terapêutica médica podem ser modulados ou regulados de acordo com a presente invenção. A Patente US 6.387.635 intitulada 2'-fluoropyrimidine anti-calf intestinal phosphatase nucleic acid ligands; a Patente US 6.387.620 intitulada "Transcription-free selex"; a Patente US 6.379.900 intitulada "Compositions and methods of use of 8-nitroguanine"; a Patente US 6.376.474 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX"; a Patente US 6.376.190 intitulada "Modified SELEX processes without purified protein"; a Patente US 6.355.787 intitulada "Purine nucleoside modifications by palladium catalyzed methods and compounds produced"; a Patente US 6.355.431 intitulada "Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays"; a Patente US 6.346.611 intitulada "High affinity TGFp, nucleic acid ligands and inhibitors "; a Patente US 6.344.321 intitulada "Nucleic acid ligands which bind to hepatocyte growth fator/scatter fator (HGF/SF) or its recetor c-met"; a Patente US 6.344.318 intitulada "Methods of producing nucleic acid ligands"; a Patente US 6.331.398 intitulada "Nucleic acid ligands"; a Patente US 6.331.394 intitulada "Nucleic acid ligands to integrins"; a Patente US 6.329.145 intitulada "Determining non-nucleic acid molecule binding 37 to target by competition with nucleic acid ligand"; a Patente US 6.306.598 intitulada "Nucleic acid-coupled colorimetric analyte detectors"; a Patente US 6.303.316 intitulada "Organic semiconductor recognition complex and System"; a Patente US 6.300.074 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Chemi-SELEX"; a Patente US 6.291.184 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex"; a Patente US 6.287.765 intitulada "Methods for detecting and identifying single molecules"; a Patente US 6.280.943 intitulada "2'-fluoropyrimidine anti-calf intestinal phosphatase nucleic acid ligands"; a Patente US 6.280.932 intitulada "High affinity nucleic acid ligands to lectins"; a Patente US 6.264.825 intitulada "Binding acceleration techniques for the detection of analytes"; a Patente US 6.261.783 intitulada "Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction"; a Patente US 6.261.774 intitulada "Truncation selex method"; a Patente US 6.242.246 intitulada "Nucleic acid ligand diagnostic Biochip"; a Patente US 6.232.071 intitulada "Tenascin-C nucleic acid ligands"; a Patente US 6.229.002 intitulada "Platelet derived growth fator (PDGF) nucleic acid ligand complexes"; a Patente US 6.225.063 intitulada "RNA channels in biological membranes"; a Patente US 6.207.816 intitulada "High affinity oligonucleotide ligands to growth factors"; a Patente US 6.207.388 intitulada "Compositions.methods.kits and apparatus for determining the presence or absence of target molecules"; a Patente US 6.184.364 intitulada "High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides"; a Patente US 6.183.967 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases"; a Patente US 6.180.348 intitulada "Method of 38 isolating target specific oligonucleotide ligands"; a Patente US 6.177.557 intitulada "High affinity ligands of basic fibroblast growth fator and thrombin"; a Patente US 6.177.555 intitulada "Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand- ligand beacon interaction"; a Patente US 6.171.795 intitulada "Nucleic acid ligands to CD40 ligand"; a Patente US 6.168.778 intitulada "Vascular endothelial growth fator (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes"; a Patente US 6.147.204 intitulada "Nucleic acid ligand complexes"; a Patente US 6.140.490 intitulada "High affinity nucleic acid ligands of complement System proteins"; a Patente US 6.127.119 intitulada "Nucleic acid ligands of tissue target"; a Patente US 6.124.449 intitulada "High affinity TGFL nucleic acid ligands and inhibitors"; a Patente US 6.114.120 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex"; a Patente US 6.110.900 intitulada "Nucleic acid ligands"; a Patente US 6.083.696 intitulada "Systematic evolution of ligands exponential enrichment: blended selex"; a Patente US 6.080.585 intitulada "Methods for discovering ligands"; a Patente US 6.051.698 intitulada "Vascular endothelial growth fator (VEGF) nucleic acid ligand complexes"; a Patente US6.048.698 intitulada "Parallel SELEX"; a Patente US 6.030.776 intitulada "Parallel SELEX"; a Patente US 6.028.186 intitulada "High affinity nucleic acid ligands of cytokines"; a Patente US 6.022.691 intitulada "Determination of oligonucleotides for therapeutics.diagnostics and research reagents"; a Patente US 6.020.483 intitulada "Nucleoside modifications by palladium catalyzed methods"; a Patente US 6.020.130 intitulada "Nucleic acid ligands that bind to and inhibit DNA polymerases"; a Patente US 6.013.443 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: 39 tissue SELEX"; a Patente US 6.011.020 intitulada "Nucleic acid ligand complexes"; a Patente US 6.001.988 intitulada "High affinity nucleic acid ligands to lectins"; a Patente US 6.001.577 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex"; a Patente US 6.001.570 intitulada "Compositions.methods.kits and apparatus for determining the presence or absence of target molecules"; a Patente US 5.998.142 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX"; a Patente US 5.989.823 intitulada "Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction"; a Patente US 5.972.599 intitulada "High affinity nucleic acid ligands of cytokines"; a Patente US 5.962.219 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-selex"; a Patente US 5.958.691 intitulada "High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides"; a Patente US 5.874.557 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases"; a Patente US 5.874.218 intitulada "Method for detecting a target compound in a substance using a nucleic acid ligand"; a Patente US 5.871.924 intitulada "Method for the production of ligands capable of facilitating aminoacyl- RNA synthesis"; a Patente US 5.869.641 intitulada "High
affinity nucleic acid ligands of CD4"; a Patente US 5.864.026 intitulada " Systematic evolution of ligands by exponential enrichment : tissue selex"; a Patente US 5.861.254 intitulada "Flow cell SELEX"; a Patente US
5.859.228 intitulada "Vascular endothelial growth fator (VEGF) nucleic acid ligand complexes"; a Patente US 5.858.660 intitulada "Parallel selex"; a Patente US 5.853.984 intitulada "Use of nucleic acid ligands in flow cytometry"; a Patente US 5.849.890 intitulada "High 40
affinity oligonucleotide ligands to chorionic gonadotropin hormone and related glycoprotein hormones"; a Patente US 5.849.479 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to vascular endothelial growth fator (VEGF)"; a Patente US 5.846.713 intitulada "High affinity HKGF nucleic acid ligands and inhibitors"; a Patente US 5.843.653 intitulada "Method for detecting a target molecule in a sample using a nucleic acid ligand"; a Patente US 5.837.834 intitulada "High affinity HKGF nucleic acid ligands and inhibitors"; a Patente US 5.837.456 intitulada "High affinity oligonucleotide ligands to chorionic gonadotropin hormone and related glycoprotein hormones"; a Patente US 5.834.199 intitulada "Methods of identifying transition metal complexes that selectively cleave regulatory elements of mRNA and uses thereof"; a Patente US 5.817.785 intitulada "Methods of producing nucleic acid ligands"; a Patente US 5.811.533 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to vascular endothelial growth fator (VEGF)"; 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a Patente US 5.763.173 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases"; a Patente US 5.756.287 intitulada "High affinity HIV integrase inhibitors"; a Patente US 5.750.342 intitulada "Nucleic acid ligands of tissue target"; a Patente US 5.734.034 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors of human neutrophil elastase"; a Patente US 5.731.424 intitulada "High affinity TGFL nucleic acid ligands and inhibitors "; a Patente US 5.731. 144 intitulada "High affinity TGFp nucleic acid ligands"; a Patente US 5.726.017 intitulada " High affinity HIV-1 gag nucleic acid ligands"; a Patente US 5.723.594 intitulada "High affinity PDGF nucleic acid ligands"; a Patente US 5.723.592 intitulada "Parallel selex"; a Patente US 5.723.289 intitulada "Parallel selex"; a Patente US 5.712.375 intitulada " Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex"; a Patente US 5.707.796 intitulada "Method for selecting nucleic acids on the basis of structure"; a Patente US 5.705.337 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi- SELEX"; a Patente US 5.696.249 intitulada "Nucleic acid ligands"; a Patente US 5.693.502 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases"; a Patente US 5.688.935 intitulada "Nucleic acid ligands of tissue target"; a Patente US 5.686.592 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to immunoglobulin E (IgE)"; a Patente US 5.686.242 intitulada "Determination ofoligonucleotides for therapeutics.diagnostics and research reagents"; a Patente US 5.683.867 intitulada 42 "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX"; a Patente US 5.674.685 intitulada "High affinity PDGF nucleic acid ligands"; a Patente US 5.670.637 intitulada "Nucleic acid ligands"; a Patente US 5.668.264 intitulada "High affinity PDGF nucleic acid ligands"; a Patente US 5.663.064 intitulada "Ribozymes with RNA protein binding site"; a Patente US 5.660.985 intitulada "High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides"; a Patente US 5.654.151 intitulada "High affinity MV Nucleocapsid nucleic acid ligands"; 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Patente US 5.567.588 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX"; a Patente US 5.543.293 intitulada "DNA ligands of thrombin"; a Patente US 5.527.894 intitulada "Ligands of HIV-1 tat protein"; a Patente US 5.475.096 intitulada "Nucleic acid ligands"; a Patente US 5.866.334 intitulada "Determination and identification of active compounds in a compound library"; a Patente US 5.864.026 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex"; a Patente US 5. 861.254 intitulada "Flow cell SELEX"; a Patente US 5 .859.228 intitulada "Vascular endothelial growth fator (VEGF) nucleic acid ligand complexes"; a Patente US 5.858.660 intitulada "Parallel selex"; a Patente US 5.853.984 intitulada "Use of nucleic acid ligands in flow cytometry"; a Patente US 5.849.890 intitulada "High affinity oligonucleotide ligands to chorionic gonadotropin hormone and related glycoprotein hormones"; a Patente US 5.849.479 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to vascular endothelial growth fator (VEGF)"; a Patente US 5.846.713 intitulada "High affinity HKGF nucleic acid ligands and inhibitors"; a Patente US 5.843.732 intitulada "Method and apparatus for determining consensus secondary structures for nucleic acid sequences"; a Patente US 5.843.653 intitulada "Method for detecting a target molecule in a sample using a nucleic acid ligand"; a Patente US 5.840.867 intitulada "Aptamer analogs specific for biomolecules"; a Patente US 5.840.580 intitulada "Phenotypic characterization of the hematopoietic stem cell"; a Patente US 5.837.838 intitulada "Bax inhibitor proteins"; a Patente US 5.837.834 intitulada "High affinity HKGF nucleic acid ligands and inhibitors"; a Patente US 5.837.456 intitulada "High affinity oligonucleotide ligands to chorionic gonadotropin hormone 44 and related glycoprotein hormones"; a Patente US 5.834.199 intitulada "Methods of identifying transition metal complexes that selectively cleave regulatory elements of NA and uses thereof"; a Patente US 5.834.184 intitulada "In vivo selection of RNA-binding peptides"; a Patente US 5.817.785 intitulada "Methods of producing nucleic acid ligands"; a Patente US 5.811.533 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to vascular endothelial growth fator (VEGF)"; a Patente US 5.804.390 intitulada "Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules"; a Patente US 5.795.721 intitulada "High affinity nucleic acid ligands of ICP4"; a Patente US 5.789.163 intitulada "Enzyme linked oligonucleotide assays (ELONAS)a Patente US 5.789.160 intitulada "Parallel selex"; a Patente US 5.789.157 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex"; a Patente US 5.786.462 intitulada "High affinity ssDNA ligands ofHIV-1 reverse transcriptase"; a Patente US 5.786.203 intitulada "Isolated nucleic acid encoding corticotropin-releasing fator. sub. 2 recetors"; a Patente US 5.786.145 intitulada "Oligonucleotide competitors for binding of HIV RRE to REV protein and assays for screening inhibitors of this binding"; a Patente US 5.783.566 intitulada "Method for increasing or decreasing transfection efficiency"; a Patente US 5.780.610 intitulada "Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes"; a Patente US 5.780.228 intitulada "High affinity nucleic acid ligands to lectins"; a Patente US 5.773.598 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex"; a Patente US 5.770.434 intitulada "Soluble peptides having constrained.secondary conformation in solution and method of making same"; a Patente US 5.766.853 intitulada "Method 45
for Identification of high affinity nucleic acid ligands to selectins"; a Patente US 5.763.595 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Chemi-SELEX"; a Patente US 5.763.566 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX"; a Patente US 5.763.177 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex"; a Patente US 5.763.173 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases"; a Patente US 5.756.296 intitulada "Nucleotide-directed assembly of bimolecular and multimolecular drugs and devices"; a Patente US 5.756.291 intitulada "Aptâmeros specific for biomolecules and methods of making"; a Patente US 5.756.287 intitulada "High affinity HIV integrase inhibitors"; a Patente US 5.750.342 intitulada "Nucleic acid ligands of tissue target"; a Patente US 5.739.305 intitulada "Nucleotide-directed assembly of bimolecular and multimolecular drugs and devices"; a Patente US 5.734.034 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors of human neutrophil elastase"; a Patente US 5.733.732 intitulada "Methods for detecting primary adhalinopathy"; a Patente US 5.731.424 intitulada "High affinity TGF, beta, nucleic acid ligands and inhibitors"; a Patente US 5.731.144 intitulada "High affinity TGF, Beta, nucleic acid ligands"; a Patente US 5.726.017 intitulada "High affinity HIV-1 gag nucleic acid ligands"; a Patente US 5.726.014 intitulada "Screening assay for the detection of DNA-binding molecules"; a Patente US 5.723.594 intitulada "High affinity PDGF nucleic acid ligands"; a Patente US 5.723.592 intitulada "Parallel selex"; a Patente US 5.723.289 intitulada "Parallel selex"; Patente US 5.712.375 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex"; a Patente US 46
5.707.796 intitulada "Method for selecting nucleic acids on the basis of structure"; a Patente US 5.705.337 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX"; a Patente US 5.698.442 intitulada "DNA encoding an 18 Kd CDK6 inhibiting protein"; a Patente US 5.698.426 intitulada "Surface expression libraries of heteromeric receptors"; a Patente US 5.698.401 intitulada "Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules"; a Patente US 5.693.502 intitulada "Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases"; a Patente US 5.688.935 intitulada "Nucleic acid ligands of tissue target"; a Patente US 5.688.670 intitulada "Self-modifying RNA molecules and methods of making"; a Patente US 5.686.592 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to immunoglobulin E (IgE)"; a Patente US 5.683.867 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX"; a Patente US 5.681.702 intitulada "Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes"; a Patente US 5.674.685 intitulada "High affinity PDGF nucleic acid ligands"; a Patente US 5.670.637 intitulada "Nucleic acid ligands"; a Patente US 5.668.265 intitulada "Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin"; Patente US 5.668.264 intitulada "High affinity PDGF nucleic acid ligands"; a Patente US 5.660.985 intitulada "High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides"; a Patente US 5.660.855 intitulada "Lipid constructs for targeting to vascular smooth muscle tissue"; a Patente US 5.658.738 intitulada "Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin"; a Patente US 5.656.739 intitulada "Nucleotide-directed assembly of bimolecular and multimolecular drugs and devices"; a Patente US 5.656.467 intitulada "Methods and materiais for producing gene libraries"; a Patente US 47 5.654.151 intitulada "High affinity Hl Nucleocapsid nucleic acid ligands"; a Patente US 5.650.275 intitulada "Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands"; a Patente US 5.648.214 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P"; a Patente US 5.641.629 intitulada "Spectroscopically detectable nucleic acid ligands"; a Patente US 5.639.868 intitulada "High-affinity RNA ligands for basic fibroblast growth fator"; a Patente US 5.639.428 intitulada "Method and apparatus for fully automated nucleic acid amplification.nucleic acid assay and immunoassay"; a Patente US 5.637.682 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P"; a Patente US 5.637.459 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex "; a Patente US 5.635 . 615 intitulada "High affinity HIV nucleocapsid nucleic acid ligands"; a Patente US 5.631 .156 intitulada "DNA encoding and 1. 8 KD CDK6 inhibiting protein"; a Patente US 5.631.146 intitulada ”DNA aptamers and catalysts that bind adenosine or adenosine-5'-phosphates and methods for isolation thereof"; a Patente US 5.629.407 intitulada "DNA encoding an 18 KD CDK6 inhibiting protein and antibodies thereto"; a Patente US 5.629.155 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to immunoglobulin E (IgE)"; a Patente US 5.622.828 intitulada "High-affinity oligonucleotide ligands to secretory phospholipase A2 (sPLA.sub.2)"; a Patente US 5.621.082 intitulada "DNA encoding an 18 Kd CDK6 inhibiting protein"; a Patente US 5.599.917 intitulada "Inhibition of interferon-gamma. with oligonucleotides"; a Patente US 5.597.696 intitulada "Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates"; a Patente US 5.587.468 intitulada "High affinity nucleic acid ligands to H1V integrase"; a Patente 48 US 5.585.269 intitulada "Isolated DNA encoding c-mer protooncogene"; Patente US 5.580.737 intitulada "High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine"; a Patente US 5.567.588 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX"; Patente US 5.565.327 intitulada "Methods of diagnosing parasitic infections and of testing drug susceptibility of parasites"; Patente US 5.527.894 intitulada "Ligands ofHIV-1 tat protein"; a Patente US 5.512.462 intitulada "Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences"; a Patente US 5.503.978 intitulada "Method for Identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase"; a Patente US 5.472.841 intitulada "Methods for identifying nucleic acid ligands of human neutrophil elastase"; e Patente US 5.459.015 intitulada "High-affinity RNA ligands of basic fibroblast growth fator". III. Tipos de moduladores
Os moduladores (isto é, os reguladores) da invenção são moduladores oligonucleotidicos farmaceuticamente aceitáveis que podem acoplar um ligando de ácidos nucleicos e modificar a interação entre o ligando e sua molécula-alvo (por exemplo, ao modificar a estrutura do aptâmero) da forma acima descrita, ou de forma a degradar, metabolizar, clivar ou alterar quimicamente de qualquer outra forma o ligando de ácido nucleico para modificar seu efeito biológico. Exemplos de moduladores incluem (A) oligonucleotídeos ou seus análogos complementares a pelo menos uma porção da sequência de aptâmero (incluindo ribozimas ou DNAzimas ou, por exemplo, os ácidos nucleicos peptidos (PNAS), ácidos nucleicos mofolino (MNAs), ou 49 Ácidos Nucleicos Fechados (LNAs)), e (E) quimeras, produtos de fusão ou outras combinações de qualquer um dos anteriores.
Numa modalidade alternativa da invenção, o modulador em si é um aptâmero. Nesta modalidade, gera-se primeiro um ligando de ácidos nucleicos que se liga ao alvo terapêutico desejado. Numa segunda etapa, o segundo aptâmero que se liga ao primeiro aptâmero é gerado através do processo SELEX aqui descrito ou através de outro processo, e modula a interação entre o aptâmero terapêutico e o alvo.
Noutras modalidades alternativas, o ligando de ácido nucleico que se liga ao alvo é um ANP, MNA, LNA ou PCO e o modulador é um aptâmero. Em alternativa, o ligando de ácido nucleico que se liga ao alvo é um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO, e o modulador é um MNA. Alternativamente, o ligando de ácido nucleico que se liga ao alvo é um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO, e o modulador é um LNA. Alternativamente, o ligando de ácido nucleico que se liga ao alvo é um ANP, um MNA, um LNA ou um PCO, e o modulador é um PCO.
Oligonucleotideos e seus análogos 1. Ácido polinucléico 0 modulador da invenção é um oligonucleotideo que compreende uma sequência complementar a pelo menos uma porção da sequência do ligando do ácido nucleico alvo. Por exemplo, o oligonucleotideo modulador pode incluir uma sequência complementar de 6 a 25 nucleotídeos do ligando do ácido nucleico alvo, geralmente, de 8 a 20 nucleotídeos, mais tipicamente, de 10 a 15 nucleotídeos. Vantajosamente, o oligonucleotideo modulador é complementar de 6 a 25 nucleótideos consecutivos do ligando de ácido nucleico, ou 50 de 8 a 20 ou de 10 a 15 nucleótidos consecutivos. O comprimento do oligonucleotideo modulador pode ser facilmente otimizado, considerando o ligando do ácido nucleico alvo e o efeito pretendido. Normalmente, o oligonucleotideo modulador apresenta de 5 a 80 nucleotideos de comprimento, mais tipicamente de 10 a 30 e mais tipicamente de 15 a 20 nucleotideos (por exemplo, de 15 a 17). O oligonucleotideo pode ser composto por nucleotideos contendo estereoquimica D ou L, ou uma mistura destes. Os nucleosideos que ocorrem naturalmente encontram-se na configuração D. A formação de cadeia dupla através da ligação de pares de oligonucleotideos complementares curtos é uma reação bastante rápida, com constantes de velocidade de segunda ordem de associação geralmente entre 1x10® e SL 3xl05 M1 s1. A fase inicial da reação de ligação envolve a formação de dois a três pares de bases dúplex, denominada de "nucleação". Após a nucleação, prossegue o emparelhamento através de todo o comprimento da sequência complementar a um ritmo muito rápido - cerca de 106 bases por segundo a 20 0 C. Assim, o efeito modulador num ligando de ácido nucleico por formação de um dúplex com um oligonucleotideo complementar é rápido. A estabilidade da cadeia dupla curta é altamente dependente do comprimento e da composição da base da dúplex. Os parâmetros termodinâmicos para a formação da cadeia dupla curta de ácido nucleico foram rigorosamente medidos, resultando na regra do vizinho mais próximo para todos os pares de bases possíveis, de maneira que tais previsões exatas de energia livre, Tm e, portanto, uma semi-vida de um dúplex de um dado oligoribonucleotídeo possa ser calculada (por exemplo, Xia et al. Biochem. 37:14719 (1998) (ver também Eguchi et al. Antigensis RNA, Annu. Rev. Biochem. 60:631 (1991)). 51
Os moduladores oligonucleotídicos da invenção são preferencialmente dirigidos às regiões de cadeia simples do ligando de ácidos nucleicos. Isso facilita a nucleação e, portanto, a taxa de modulação da atividade do ligando de ácidos nucleicos, levando também, duma maneira geral, à cadeia dupla intermolecular que contém mais pares de base do que o ligando ácido nucleico alvo.
Podem utilizar-se várias estratégias para determinar o local ideal para a ligação do oligonucleotideo a um ligando de ácido nucleico alvo. Pode utilizar-se uma estratégia empírica em que oligonucleotídeos complementares são movidos em torno do aptâmero. A experiência de movimento pode envolver duas experiências realizadas sequencialmente. Uma nova mistura candidata pode ser produzida de maneira que cada um dos membros da mistura candidata tenha uma região fixa do ácido nucleico que corresponde a um modulador oligonucleotídico de interesse. Cada membro da mistura candidata contém também uma região aleatória de sequências. Segundo este método, é possível identificar quais são os referidos como ligandos de ácidos nucleicos "alargados", que contêm as regiões que se podem ligar a mais de um domínio de ligação de um ligando de ácidos nucleicos. Em conformidade com esta abordagem, 2'-0-metil oligonucleotídeos (por exemplo, 2'-0-metil oligonucleotídeos) cerca de 15 nucleotídeos de comprimento podem ser usados de maneira que sejam escalonados por cerca de 5 nucleótideos no aptâmero (por exemplo, oligonucleotídeos complementares de nucleotídeos 1 -15,6-20,11-25, etc, de 9.3t aptâmero. Uma estratégia empírica pode ser particularmente eficaz porque o impacto da estrutura terciária do aptâmero sobre a eficácia da hibridação pode ser difícil de prever. Os ensaios descritos nos exemplos que se seguem podem ser utilizados para 52 avaliar a capacidade dos oligonucleotídeos diferentes para hibridizar com um ligando de ácido nucleico específico, com especial ênfase sobre o excesso molar do oligonucleotídeo necessário à realização completa de ligação do ligando de ácidos nucleicos. A capacidade dos moduladores de diferentes oligonucleotídeos para aumentar a taxa de dissociação do ligando de ácido nucleico da molécula-alvo, ou a associação do ligando de ácido nucleico com esta também pode ser determinada através da realização de estudos de padrão cinéticos, utilizando, por exemplo, ensaios BIACORE. Os moduladores oligonucleotídicos podem ser selecionados de forma gue o excesso molar de oligonucleotídeo deva ser de 5 a 50 vezes, ou menos, para modificar a interação entre o ligando de ácidos nucleicos e sua molécula-alvo na forma desejada.
Alternativamente, o ligando de ácido nucleico alvo pode ser modificado de modo a incluir uma cauda de cadeia simples (3' ou 5'), a fim de promover a associação com um modulador oligonucleotidico. Caudas adequadas podem compreender de 1 a 20 nucleotídeos, de preferência, de 1 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente, de 1 a 5 nucleotideos e, mais preferencialmente, de 3 a 5 nucleotídeos (por exemplo, os nucleotideos modificados, tais como sequências de 2-O-metil) . Os ligandos de ácidos nucleicos com cauda podem ser testados em ligação e bioensaios (por exemplo, como descrito nos exemplos a seguir) para verificar que além da cauda de cadeia simples, não prejudica a estrutura ativa do ligando de ácidos nucleicos. Uma série de oligonucleotídeos (por exemplo, 2'-O-metil oligonucleotídeos) que pode formar, por exemplo, 1,3 ou 5 pares de base com a sequência de cauda, podem ser projectados e testados tanto em relação à capacidade de se associar somente ao aptâmeroo com cauda, quanto em relação 53 à capacidade de aumentar a taxa de dissociação do ligando de ácido nucleico da molécula-alvo ou aumentar a taxa de associação dos aptâmeroos com a sua molécula-alvo. Podem ser utilizados controlos de sequências misturadas para verificar que os efeitos se devem à formação de dúplex e não a efeitos não-especificos. 0 ensaio de gel nativo descrito nos exemplos a seguir pode ser utilizado para medir a dissociação/associação da taxa de um modulador oligonucleotídico a partir de/com um aptâmero alvo.
Esta invenção fornece moduladores que invertem especifica e rapidamente os efeitos do anticoagulante e do antitrombótico de ligandos de ácido nucleico que direcionam os componentes da via de coagulação, em especial os antagonistas do ligando do ácido nucleico do fator tecidual (TF)/fator Vila (FVIIa) , fator VHIa (FVIIIa) / fator IXa (FIXa) , o fator Va (FVa / fator Xa (FXa) complexos de enzimas e recetores plaquetários tais como gpllbllla, gpIbIX, gpVI, os fatores envolvidos na promoção da ativação plaquetária como um Gas6, fatores envolvidos na promoção ou manutenção da formação de coagulação de fibrina tal como PAI-1 (inibidor ativador de plasminogénio 1) ou fatores coagulantes XlIIa (FxIIIa) e fatores adicionais envolvidos na promoção ou prevenção da formação de coagulação de fibrina tal como um ATUI (antitrombina III) , trombina ou fator coagulante Xla (FXIa). De acordo com esta modalidade, os moduladores (neste caso, os inibidores, preferencialmente, os inibidores de oligonucleotideos) são administrados de forma a inverter a atividade do ligando de ácidos nucleicos.
Em modalidades especificas, os moduladores da atividade do ligando de ácidos nucleicos, em conformidade com esta invenção, são ácidos nucleicos selecionados do grupo que consiste na seguinte sequência, embora não se 54 limitando a ela: iouowuig sequeuws; 5’AUGGGGAGGCAGCAUUA 3’ (SEQID NO:25), 5 'CAUGGGGAGGC AGC AUUA3 ’ (SEQ ID NO:26), 5 ’CAUGGGGAGGCAGCA3 ’ (SEQ DD NO:27), 5’CAUGGGGAGGCA3 ’ (SEQ ID NO:28), 5’GCAUUACGCGGUAUAGUCCCCUA3 ’ (SEQ Π) NO:29), 5’CGCGGUAUAGUCCCCUA3’ (SEQ ID NO:30), 5’CUCGCUGGGGCUCUC3’ (SEQ ID NO:31), 5TJAUU AUCUCGCUGGG3 ’ (SEQ ID NO:32), 5’AAGAGCGGGGCCAAG3 ’ (SEQ ID NO:33), 5’GGGCCAAGUAUUAU 3’ (SEQ DD NO:34), 5’ CAAGAGCGGGGCCAAG 3’ (SEQ ID NO:35), 5’CGAGUAUUAUCUUG3’ (SEQ ID NO:36), 5 ’CGCGGUAUAGUCCCCAU3 ’ (SEQ ID NO:41), ou qualquer sua modificação ou derivação em que se mantenha a hibridação ou seja opcionalmente, pelo menos 95% homóloga à sequência.
Por exemplo, o inibidor de um ligando do ácido nucleico para o fator IXa desta invenção pode ser um oligonucleotideo anti-sense. 0 oligonucleotídeo anti-sense híbrida com o ligando de ácidos nucleicos in vivo e bloqueia a ligação do ligando do ácido nucleico ao fator IXa.
Os moduladores oligonucleotídicos da invenção são formados por uma sequência complementar a, pelo menos, uma parte de um ligando de ácido nucleico. No entanto, a complementaridade absoluta não é necessária. A sequência "complementar para pelo menos uma porção de um ligando de ácidos nucleicos", aqui referida, significa uma sequência de complementaridade suficiente para ser capaz de hibridizar com o ligando de ácido nucleico. A capacidade de hibridizar pode depender tanto do grau de complementaridade como do comprimento do ácido nucleico anti-sense. Geralmente, quanto maior a hibridação do oligonucleotídeo, mais bases desemparelhadas com o ligando do ácido nucleico alvo poderá conter e ainda formar um dúplex estável (ou 55 triplo, de acordo com o caso) . Um especialista na área poderá determinar um grau tolerável de desemparelhamento utilizando os procedimentos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridado. Em aspetos específicos, o oligonucleotideo pode ser de pelo menos 5 ou pelo menos 10 nucleotideos, pelo menos 15 ou 17 nucleotideos, pelo menos 25 nucleotideos, ou pelo menos 50 nucleotideos. Os oligonucleot ideos da invenção podem ser de ADN, de ARN, de misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas destas, de cadeia simples.
Discutem-se técnicas anti-sense, por exemplo, em Okano, J., Neurochein. 56:560 (1991); "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Os métodos são baseados numa ligação de nucleótidos a um ADN ou a um ARN complementar.
Os oligonucleotideos da invenção podem ser modificados na porção de base, porção de açúcar, ou esqueleto de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, da hibridação, etc. O oligonucleotideo pode incluir outros grupos anexos. Para esse efeito, o oligonucleotideo pode ser conjugado com uma outra molécula, por exemplo, um péptido, agentes reticuladores disparados por hibridação, agente de transporte, agente de clivagem disparado por hibridação, etc. O oligonucleotideo pode incluir pelo menos uma molécula de base através da qual é selecionado do grupo, incluindo, mas não limitados a, 5-fluorouracilo, 5-Bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4 - acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetilo) uracilo, 5-Tiouridina carboximetilaminometilo, 5- carboximetilaminometiluracilo, Diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosine, 2,2- 56 dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-inetilcitosina, 5 metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5 - metilaminometiluracil, 5-methoxiaminometil-2a-Tiouracila, beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-methoxiuracil, 2-inetiltio-N & isopenteniladenina, ácido oxacético uracilo (v), vibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil Tiouracila, 2 - Tiouracila, 4-Tiouracila, 5-iodouracilo,-uracilo-5-metilico do ácido oxiacético, ácido uracilo oxiacético (v) , 5 Tiouracila-metilo, 3 - (3-amino-3-carboxipropilo N) e 2,6-diaminopurina.
Um modulador oligonucleotidico da invenção pode também incluir, pelo menos, uma porção de açúcar modificado selecionado do grupo, incluindo mas não limitados a, arabinose, 2-fluoroarabinose, xilose e hexose.
Ainda noutra modalidade, um modulador oligonucleotideo pode incluir pelo menos um esqueleto de fosfato selecionado do grupo, incluindo mas não limitado a um fosforotioato, um fosforoditioato, um fosforamidotioato, um fosforamidato, um fosforodiamidato, um metilfosfonato, um fosfotriéster alquila, e um formacetal ou seu análogo.
Os moduladores oligonucleotidicos podem ser preparados de forma a terem as caracteristicas desejadas, tais como a melhoria da estabilidade in vivo e/ou caracteristicas de libertação melhoradas. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas no açúcar e/ou a coluna vertebral e/ou postos de base. Os moduladores oligonucleotidicos podem conter derivados de nucleotídeos modificados nas posições 5 e 2' de pirimidinas, por exemplo, os nucleotídeos podem ser modificados com 2' amino, 2' flúor e/ou 2'-0-metilo. As modificações de modulação de oligonucleotídeos da invenção podem incluir as que fornecem os grupos químicos que incorporam carga 57 adicional, polarização, hidrofobicidade, ligações de hidrogénio e/ou interação eletrostática. Tais modificações incluem, mas não estão limitados a modificações de açúcar na posição 2', ácidos nucleicos bloqueados, modificações de pirimidina na posição 5, modificações de purinas na posição 8, modificação em aminas exociclicas, substituição de 4-Tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracilo, modificações no esqueleto, fosforotioato ou modificações de fosfato alquila, metilações, combinações de regras de emparelhamento não comuns, tais como isobases isocitidina e isoguanidina, etc. As modificações podem incluir também modificações em 3' e 5', tais como nivelamento. (Ver também Manoharan, Biochem. Biophys. Acta 1489:117 (1999); Herdewija, Antisense Nucleic Acid Drug Development 10:297 (2000); Maier et al, Organic Letters 2:1819 (2000)).
Os oligonucleotideos da invenção podem ser sintetizados por métodos padrão conhecidos na técnica, por exemplo, através da utilização de um sintetizador de ADN automatizado (tais como o que são comercializados pela Biosearch, pela Applied Biosystems, etc.).
Utilizando as instruções contidas neste documento, os especialistas podem facilmente fazer uso da invenção para regular qualquer ácido nucleico terapêutico através da administração oportuna de um ácido nucleico complementar, que põe termo a ou modifica de qualquer outra maneira a atividade do ligando terapêutico. Esta técnica pode ser usada, por exemplo, juntamente com qualquer dos ligandos de ácido nucleico, descritos ou referidos nos documentos de patentes acima referidos. 2. Ribozimas e DNAzimas
Da mesma forma, utilizando as instruções fornecidas 58 neste documento, os especialistas podem facilmente praticar a invenção para controlar qualquer liqando de ácido nucleico terapêutico através da administração oportuna de uma ribozima ou uma DNAzima. Ácidos nucleicos enzimáticos atuam por se ligarem primeiro a um ARN alvo (ou ADN, ver Cech Patente U.S. 5.180.818). Esta ligação ocorre através da porção de ligação alvo de um ácido nucleico enzimático que é realizada em proximidade imediata com uma porção enzimática da molécula que actua para aderir ao ARN-alvo. Assim, o ácido nucleico enzimático primeiro reconhece e depois liga-se a um ARN-alvo através de emparelhamento de base complementar, e uma vez ligado ao sitio correto, actua enzimaticamente para cortar o ARN alvo. A clivagem deste ARN alvo destruirá a sua capacidade de sintese direta de uma proteina codificada. Após um ácido nucleico enzimático se ter ligado e clivado ao seu ARN alvo, ele é libertado daquele ARN para procurar outro alvo e pode aderir e clivar repetidamente novos alvos, permitindo assim a inativação de aptâmeros de ARN. Existem pelo menos cinco classes de ribozimas, em que cada uma apresenta um tipo diferente de especificidade. Por exemplo, o Grupo I Intrãos são nucleotideos de dimensão de -300 a >1000 e requerem um U na sequência alvo imediatamente 5' do local de clivagem e liga de 4 a 6 nucleotideos na região 5'-lateral do local de clivagem. Existem mais de 75 membros conhecidos desta classe, que se encontram em rRNA Tetraimena termofila, mitocôndrias fúngicas, cloroplastos, fago T4, algas azuis-verdes, e outros.
Outra classe são os ARN RNaseP (Ml ARN), cuja dimensão é de -290 a 400 nucleotideos. Eles são a porção de ARN de uma enzima ribonucleoproteina e clivam os precursores de tRNA para formar tRNA maduro. Existem cerca de 10 membros 59 conhecidos deste grupo e todos são de origem bacteriana. Um terceiro exemplo são as ribozimas cabeça-de-martelo, cuja dimensão é de ~30 a 40 nucleotideos. Elas requerem imediatamente a sequência alvo 5' UH do local de clivagem e ligam um número variável de nucleotideos em ambos os lados do local de clivagem. Há pelo menos 14 membros conhecidos desta classe, que são encontrados em diversos patogénios de plantas (virusóides) que utilizam o ARN como agente infeccioso. A quarta classe são os grampos das ribozimas, cuja dimensão é de ~50 nucleotideos. Estas requerem a sequência alvo GUC de imediatamente 3' no local de clivagem e ligam 4 nucleotideos no lado 5' do local de clivagem e um número variável de nucleotideos no lado 3' do sitio de clivagem. Encontram-se num patogénio de plantas (ARN satélite do virus da mancha anelar do tabaco) que usa o ARN como agente infeccioso. O quinto grupo são as ribozimas do virus da hepatite delta (HDV), que possuem 60 nucleotideos de tamanho. A natureza enzimática de uma ribozima pode ser vantajosa em relação a outras tecnologias, como a tecnologia anti-sense, em determinadas aplicações, desde que a efetiva concentração da ribozima necessária para realizar um tratamento terapêutico seja menor do que a de um oligonucleotídeo anti-sense.
Esta vantagem reflete a capacidade da ribozima agir enzimaticamente. Assim, uma única molécula de ribozima é capaz de decompor muitas moléculas de aptâmeros de ARN alvo. Além disso, a ribozima é um inibidor altamente especifico, com a especificidade de inibição em função não só do mecanismo da base de emparelhamento de ligação, mas também sobre o mecanismo pelo qual a molécula inibe a expressão do ARN a qual se liga. Ou seja, a inibição é causada pela clivagem do ARN alvo e assim a especificidade 60 é definida como a razão entre a taxa de clivagem do ARN alvo sobre a taxa de clivagem de ARN não-alvo. Este mecanismo de clivagem depende de fatores além dos envolvidos na base de emparelhamento. Assim, a especificidade da ação de uma ribozima, em determinadas circunstâncias, pode ser maior do que o do oligonucleotideo anti-sense a ligar-se à mesma localização do ARN.
Outra classe de moléculas catalíticas é denominada de "DNAzimas". As DNAzimas são de cadeia simples, e unem-se tanto ao ARN como ao ADN. Foi proposto um modelo geral para a DNAzima, que é conhecido como modelo "10-23". As DNAzimas que seguem o modelo "10-23", também conhecidas simplesmente como "10-23 DNAzimas", possuem um dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótideos, ladeados por dois domínios de reconhecimento do substrato de sete a nove desoxirribonucleótideos cada. As análises in vitro mostram que este tipo de DNAzimas podem efetivamente unir o seu ARN substrato em purinas: uniões de pirimidina sob condições fisiológicas. Conforme aqui utilizado, "DNAzima" significa uma molécula de ADN que especificamente reconhece e cliva uma sequência de ácido nucleico alvo diferente, que pode ser ou um ADN ou um ARN.
As ribozimas e as DNAzimas incluem tanto os domínios de ligação de substrato como os domínios catalíticos. As regras para a conceção ideal das ribozimas reguladoras podem encontrar-se em "Methods in Molecular Biology" Volume 74 "Ribozyme Protocolos" editado por Philip C. Turner (Humana Press, Totowa, NJ, 1997) . Este volume também descreve estratégias para identificação de sítios reativos para ribozimas dentro de um ácido nucleico alvo. Utilizando estas regras, as ribozimas cabeça-de-martelo, grampos das ribozimas, as ribozimas do vírus da hepatite delta e as ribozimas derivadas de intrões do grupo I podem ser 61 especificamente projectadas para se ligar e se unir a um ligando ácido nucleico alvo. A capacidade dos ribozimas ou das DNAzimas de decompor o ligando de ácidos nucleicos-alvo pode ser determinada em diversos ensaios. Por exemplo, após a incubação de uma ribozima ou DNAzima ou com ligando de ácido nucleico alvo não marcado ou marcado (por exemplo, 32p) sob condições que favoreçam a reação, o ligando do ácido nucleico pode ser analisado por desnaturação de eletroforese gel para determinar se a ribozima ou a DNAzima clivou o esqueleto do ligando do ácido nucleico alvo. Alternativamente, a transferência de energia de fluorescência de ressonância ou a mudança na intensidade da fluorescência pode ser usada para medir a clivagem de um ligando de ácido nucleico marcado apropriado. 3. Análogos de ácido polinucléico (ácidos nucleicos de péptido (PNAS), ácidos nucleicos mofolinos (mnas), ácidos nucleicos bloqueados (LNAs)), e Oligonucleotideos pseudo-cíclicos (PCO)
As nucleobases dos moduladores oligonucleotidicos da invenção podem ser ligadas através de ligações internucleobase, por exemplo, ligações de peptidil (como no caso de ácidos nucleicos de péptidos (PNAS), Nielsen et al. (1991) Science 254,1497 e U. S. Pat. N.° 5.539.082) e ligações de morfolino (Qin et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10,11 (2000); Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7,187 (1997); Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 63 (1997), Taylor et al. J Biol Chem. 271,17445 (1996); Partridge et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6.169 (1996)), ou por qualquer outra ligação natural ou modificada. Os oligonucleobases podem também ser ácidos nucleicos bloqueados (LNAs). Nielsen et al., J Biomol Struct Dyn 17.175 (1999); Petersen et al. J Mol 62
Recognit 13,44 (2000), Nielsen et al. Bioconjug Chem 11, 228 (2000).
Os PNAS são compostos análogos aos oligonucleotídeos, mas diferem na sua composição. Nos PNAS, o esqueleto da desoxirribose do oligonucleotídeo é substituída por um esqueleto peptídico. Cada subunidade do esqueleto do péptido está ligada a um nucleobase de ocorrência natural ou de ocorrência não-natural. A ANP tem muitas vezes um esqueleto de poliamida aquiral constituído por N-(2 aminoetil-) unidades de glicina. As bases purinas ou pirimidinas são ligadas a cada unidade através de um ligando carbonílico de metileno (1-3) que tem como alvo os ácidos nucleicos complementares. O ANP liga-se ao ARN ou ao ADN complementar numa orientação paralela ou antiparalela seguindo as regras de emparelhamento de Watson-Crick. A natureza neutra dos oligómeros de ANP aumenta a estabilidade do ANP híbrido/ADN (ARN) de cadeia dupla em comparação com os homodúplexes naturais. O carácter não-natural do ANP torna os oligómeros de ANP altamente resistentes aos ataques de protease e de nuclease. Essas propriedades dos oligómeros de ANP permitem que estes sirvam como eficientes anti-sense ou moduladores da atividade do ligando de ácidos nucleicos. Na verdade, os ácidos nucleicos de péptidos foram aplicados para bloquear a expressão da proteína em nível transcricional e translacional e os oligómeros ANP microinjetados demonstram um forte efeito anti-sense em células intactas. Ver www .bioScience.org/1999/v4/d/soomets/fulltext.htm; e "Frontiers in Bioscience", 4 d782-786 (1 de novembro de 1999) para obter detalhes sobre as realizações recentes sobre a aplicação anti-sense de ANP, especialmente as relacionadas com a célula inteira ou libertação de tecido do ANP. Ver também Nielsen, P. E., BJR. M., Berg, R. H. & 63
Buchardt, 0. (1993) Ácidos nucleicos Péptidos (ANP).
Análogos de ADN com um esqueleto de poliamida. Em "Antisense Research and Application" Crook, S. & '26;
Lebleu, B. (eds.) Imprensa CRC, Boca Raton, pp 363-373.
Os PNAs ligam tanto com o ADN como com o ARN e formam ANP/ADN ou ANP/ARN dúplexes. 0 ANP/ANP resultante ou os duplos de ANP/ARN são mais comprimidos que o ADN/ADN ou duplos de ADN/ARN correspondentes como é evidenciado pelas suas elevadas temperaturas de fusão (Tm) . Esta elevada estabilidade térmica do ANP/ADN (ARN) dúplex tem sido atribuída à neutralidade do esqueleto ANP, o que resulta na eliminação de carga de repulsão que se encontra presente nos duplos de ADN/ADN ou ARN/ARN x. Outra vantagem do ANP/ADN (ARN) dúplex é que a Tm é praticamente independente da concentração de sal. Os duplos de ADN/ADN, por outro lado, são altamente dependentes da força iónica.
Uma vez que as PNAS são um análogo do ADN, cujo esqueleto é um pseudopéptido ao invés de um açúcar, elas imitam o comportamento do ADN e ligam cadeias de ácido nucleico complementar. Nucleobases não-naturais, tais como pseudo isocitosina, metilcitosina-5 e diaminopurina-2,6, entre muitos outros, também podem ser incorporadas em ANP sintons. As PNAS são mais comumente sintetizadas a partir de monómeros (ANP sintões) protegidos de acordo com a estratégia de protecção t-Boc/benzil, em que o esqueleto do grupo amino do polímero em crescimento é protegido com o grupo t-butiloxicarbonil (t-BOC) e os grupos de amino exociclica das nucleobases, quando presentes, são protegidos com o grupo benziloxicarbonil (benzil). As ANP sintons protegidas com a utilização da estratégia a t-Boc/benzil estão actualmente disponíveis comercialmente. A ANP é tanto biologicamente quanto quimicamente estável e facilmente acessível por sínteses automáticas 64 ((xarope B., Egholm, M., Rolland, M., Nielsen, P.E., Berg, R. H. & Buchardt, 0. (1993) "Modification of the binding affinity of peptide nucleic acids (PNA). PNA with extended backbones consisting of 2-Aminoethyl—Alanine or 3-Amino-propylglycine units". J. Chem. Soc. Chem. Commun. 518-519); Demidov, V., Frank-KAMENETSKII, MD, Egholm, M., Buchardt, 0. & Nielsen, P. E. (1993). "Sequence selective double strand DNA cleavage by PNA targeting using nuclease Sl". "Nucleic Acids Res." 21, 2103-2107). Estas propriedades tornaram a ANP um bom condutor para fármacos terapêuticos de gene anti-sense, e estudos in vitro fundamentaram ainda mais o potencial anti-sense (Nielsen, P. E. "Peptide Nucleic Acid (ANP) A model structure for the primordial genetic material." Origins of life 1993,23,323-327; Egholm, M., Behrens, C., Christensen, L., Berg, R. H., Nielsen, P. E. & Buchardt, 0. "Peptide nucleic acids containing adenine or guanine recognize thymine and cytosine in complementary DNA sequences" J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993,800-801; Kim, S. K., Nielsen, P. E., Egholm, M., Buchardt, O., Berg, R. H. & Norden, B. "Right-handed triplex formed between peptide nucleic acid PNA-T8 and poly(dA) showned by linear and circular dichroism spectroscopy" J. Amer. Chem. Soc. 1993,115,6477-6481; Egholm, M., Buchardt, O., Christensen, L., Behrens, C., Freier, S. M., Driver, D. A., Berg, R. H., Kim, S. K., Norden, B. & Nielsen, P. E. "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen bonding rules" Nature 1993,365,556-568; Buchardt, 0., Egholm, M., Berg, R. & Nielsen, P. E. "Peptide nucleic acids (PNA) and their potential applications in medicine and biotechnology" Trends Biotechnology, 1993, 11, 384- 386) .
As PNAs parecem ser muito úteis para diversas utilizações especiais. Quando dirigidas contra as 65 sequências de todas as purinas raras, as PNAS podem bloquear a tradução em qualquer parte da mRNA, formando uma estrutura de fixação dupla. Com estas sequências de ARN raras liga-se um segmento do ANP à sequência alvo através de ligação Watson e Crick e o outro segmento da ANP liga-se aos sítios principais de ranhura da ANP/ARN dúplex resultante. Provavelmente por causa da sua estrutura dorsal muito flexível, as PNAS também formam prontamente estruturas de hélice tripla, com sequências raras de ADN dúplex compreendendo principalmente purinas num filamento e principalmente pirimidinas no outro filamento. Finalmente, sob condições de baixo teor de sal em sistemas livres de células, as PNAs mostraram realizar a invasão da sequência específica do ADN dúplex, resultando na inibição da transcrição do dúplex invadido.
Estudos recentes realizados por diversos grupos mostraram que o acoplamento da ANP a diferentes transportadores pode melhorar a sua absorção nas células. Entre estes, "péptidos de absorção celular", ácidos gordos ou ADN, especialmente diversas sequências peptídicas mostraram ser capazes de transportar ANP oligómeros através das membranas celulares. Conjugados do péptido de vetor-ANP foram descritos como sendo capazes de atravessar a membrana do neurónio e reprimir o mRNA alvo (Aldrian-Herrada, G. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:4920). O ANP biotinilado ligado a um conjugado de esteptavidina e o anticorpo monoclonal murino 0x26 ligado ao recetor de transferrina do rato têm sido descritos como sendo capazes de atravessar a barreira sangue-cérebro de ratos in vivo (Pardridge, W. et al. 1995 PNAS 92: 5592-5596) . Chinnery, P. F. et al. anexado o péptido pre-sequência da oxidase de citocromo C humano codificado nuclear (COX Vm) subunidade para ANP biotinilado que foi importado com sucesso em mitocôndrias 66 isoladas in vitro (Chinnery, PF et al. 1999 Gene Ther. 6:1919-28). A libertação do péptido biotina-ANP para mitocôndrias nas células intactas foi confirmada por microscópio confocal. Além disso, um pequeno péptido hidrofóbico com a sequência biotinil FLFL acoplado a um ANP trimero foi exibida para se interiorizar nos eritrócitos e células humanas NAMALWA (Scarfi, S., A. Gasparini, G. Damonte & '26; U. Benatti: Synthesis, uptake, and intracelular metabolismo of a hydrophobic tetrapeptide-peptide nucleic acid (PNA)-biotin molecule. Biochem Biophys Res Commun 1997.236, 323 - 326). Basu e Wickstrõm (Sysnthesis and characterization of a peptide nucleic acid conjugated to a D-peptide analog of insulin-like growth factor 1 for increased cellular uptake. Bioconjugate Chem 1997,8,481-488) mostrou que a ANP conjugada a um aminoácido todo D fator do tipo insulina 1(IGF1) que imita o péptido foi concretamente captada pelas células expressando o recetor de IGF1, embora nenhuma atividade anti-sense tenha sido descrita.
Para alguns exemplos de outros trabalhos, ver exemplos Nielsen, P.E., M. Egholm, R. H. Berg & 0. Buchardt: "Sequence selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide." Science 254,1497-1500 (1991); Egholm, M., O. Buchart, P. E. Nielsen & R. H. Berg: "Peptide Nucleic Acids (PNA)". "Oligonucleotide analogues with na achiral peptide backbone". JAm Chem Soc 114,1895-1897 (1992); Nielsen, P. E., M. Egholm & 0. Buchardt: "Peptide Nucleic Acids (PNA). A DNA mimic with a peptide backbone. Bioconjugate Chemistry" 5, 3-7 (1994); Egholm, Μ., P. E. Nielsen, 0. Buchardt & R. H. Berg: "Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosine and thymine containing peptide nucleic acid". JAm Chem Soc 114, 9677-9678 (1992); Egholm, M., 0. 67
Buchardt, L. Christensen, C. Behrens, S. M. Freier, D. A. Driver, R. H. Berg, S. K. Kim, B. Norden & P. E. Nielsen: "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules [see comments]. Nature 365,566-568 (1993); Wittung, P., P. E. Nielsen, 0. Buchardt, M. Egholm & B. Norden: "DNA-like double hélix formed by peptide nucleic acid." Nature 368,561-563 (1994); Brown, S. C., S. A. Thomson, J. M. Veal & D. G. Davis: "NMR solution structure of a peptide nucleic acid complexed with RNA". Science 265, 777-780 (1994); Demidov, V. V., V. N. Potaman, M. D. Frank-Kamenetskii, M. Egholm, 0. Buchard, S. H. Sõnnichsen & P. E. Nielsen: "Stability of peptide nucleic acids in human sérum and celular extracts. Biochemical Pharmacology". Biochemical Pharmacology 48, 1310-1313 (1994); Peffer, N. J., J. C. Hanvey, J. E. Bisi, S. A. Thomson, C. F. Hassman, S. A. Noble & L. E. Babiss: "Strand-invasion of duplex DNA by peptide nucleic acid oligomers". Proc NatAcad Sei USA 90, 10648-10652 (1993) . A Patente US 6.046.307 de Shay et al. divulga PNAs que inibem a atividade da telomerase em células de mamíferos. Patente US 5.789.573 de Baker et al. divulga composições e métodos para a inibição da tradução de mRNA alvo tampado usando PNAs. PATENTE US 6, 165.720 divulga a marcação do complexo ANP.
Pode-se facilmente preparar uma ANP ou MNA que seja complementar pelo menos em parte a um ligando de ácido nucleico utilizando as mesmas regras da complementaridade e regras de emparelhamento de bases Watson-Crick como as utilizadas na preparação de moléculas anti-sense de oligonucleotídeos convencionais.
Os ácidos nucleicos morfolinos são assim denominados porque são montados a partir de subunidades morfolinas, cada uma das quais contém uma das quatro bases genéticas 68 (adenina, citosina, guanina e timina) ligadas a um anel morfolino de 6 membros. Dezoito a vinte e cinco subunidades destes quatro tipos de subunidades estão unidas numa ordem especifica por ligações inter-subunidades fosforodiamidato não-iónico para resultar num oligo morfolino. Estes oligos morfolinos, com as suas frações de esqueleto de morfolina de 6 membros unidas por ligações não-iónicas, resultam em propriedades anti-sense substancialmente melhores que ARN, ADN e seus análogos contendo frações de esqueletos de desoxirribose ou de ribose de 5 membros unidas por ligações iónicas (ver www.gene-tools.com/Morpholinos/body_morpholinos. HTML).
Os morfolinos, idealizados por Summerton em 1985, constituem uma nova conceção radical dos ácidos nucleicos naturais, com as vantagens potenciais de matérias-primas de baixo custo e montagem barata. Assim como os PNAS, os morfolinos são completamente resistentes a nucleases e parecem estar livres da maioria ou de todos os efeitos não anti-sense que são vistos com os S-DNAs. Em contraste com os PNAS, a maioria dos morfolinos apresenta uma excelente solubilidade aquosa. Os morfolinos têm também afinidades e seletividades de ligação com ARN muito maiores do que os S-DNAs, embora não tão elevadas quanto as dos PNAS. Provavelmente, em resultado das suas afinidades e seletividades de ligação significativas com ARN, os morfolinos longos (25-mers) proporcionam um direcionamento previsível e uma eficácia muito elevada. Mais notoriamente, os morfolinos fornecem uma boa especificidade de sequência. Os mesmos fatores que sustentam a sua especificidade sequencial excecional também os tornam impróprios para mutações do ponto de vista do direcionamento. A Patente dos EUA de No. 6.153.737 para Manoharan et al. é direcionada para oligonucleotídeos derivatizados, 69 caracterizada pelo facto dos nucleosídeos ligados serem funcionais com péptidos, proteínas, vitaminas hidrossolúveis ou vitaminas lipossolúveis. Esta divulgação foi dirigida para terapêuticas anti-sense por modificação de oligonucleotídeos com uma sequência de péptido ou proteína que ajuda na entrada selectiva do complexo no envelope nuclear. Da mesma forma, podem utilizar-se vitaminas hidrosolúveis e liposslúveis podem ser utilizadas para auxiliar na transferência da terapêutica antisenso ou do agente de diagnóstico através das membranas celulares. A ligação ao ARN ou ADN sequencial específica e eficiente combinada com a estabilidade biológica muito elevada torna os PNAs e MMAs extremamente atraentes para o desenvolvimento dos moduladores desta invenção. Os ácidos nucleicos de péptidos, que podem ser conjugados com os transportadores, são destacados na Patente dos EUA No. 5.864.010 intitulada "Peptide Nucleic Acid Combinatorial Libraries and Improved Methods of Synthesis", desenvolvida pela Isis Pharmaceuticals, que é aqui incorporada como referência. Além disso, os ácidos nucleicos de péptido que podem ser conjugados com os portadores da presente invenção são destacados na Patente dos EUA No. 5.986.053 intitulada "Peptide nucleic acids complexes of two peptide nucleic acid strands and one nucleic acid strand". O LNA é uma nova classe de análogos de ADN que possui algumas características que o torna um forte candidato a moduladores da invenção. Os monómeros LNA são compostos bi-cíclicos estruturalmente semelhantes aos ARN-monómeros. O LNA partilha a maioria das propriedades químicas do ADN e do ARN, é solúvel em água, pode ser separado por eletroforese em gel, é precipitável por etanol, etc. (Tetraedro, 54,3607-3630 (1998)). Contudo, a introdução de monómeros LNA em oligos ADN ou ARN resulta na alta 70 estabilidade térmica do dúplex com ADN ou ARN complementar, enquanto, ao mesmo tempo, obedece às regras de emparelhamento de Watson-Crick. Esta elevada estabilidade térmica do duplo formado com oligómeros LNA, juntamente com a constatação de que os iniciadores contendo LNA(s) de localização 3' são substratos para as extensões enzimáticas, por exemplo, a reação de PCR é utilizada na presente invenção para aumentar significativamente a especificidade de deteção de ácidos nucleicos variantes nos ensaios in vitro descritos no pedido. Os processos de amplificação de alelos individuais são altamente distintos (as reações cruzadas não são visíveis) e podem dar-se várias reações no mesmo tubo. Veja, por exemplo, a Patente dos EUA No. 6.316, 198.
As Oligonucleobases pseudo-cíclicas (PCOs) podem também ser usadas como moduladores na presente invenção (ver patente dos EUA No 6.383.752) . Os PCOs contêm dois segmentos de oligonucleotídeo ligados através das suas terminações 3'-3'ou 5'-5'. Um dos segmentos (o "segmento funcional"), do PCO tem algumas funcionalidades (por exemplo, um oligonucleotídeo antisenso complementar a um mRNA alvo). Outro segmento (o "segmento protetor") é complementar à terminação 3'- ou 5' do segmento funcional (dependendo da terminação através da qual ele está ligado ao segmento funcional). Em resultado da complementaridade entre os segmentos funcionais e protetores, os PCOs formam estruturas intra-moleculares pseudo-cíclicas na ausência dos ácidos nucleicos alvo (por exemplo, o ARN). Os PCOs são mais estáveis do que os oligonucleotídeos antisenso convencionais devido à presença de ligações 3'-3' ou 5'-5' e da formação de pseudo estruturas intra-moleculares pseudo-cíclicas. A farmacocinética, a distribuição de tecidos e estudos de estabilidade em ratos sugerem que os 71 PCOs têm maior estabilidade in vivo, e que os perfis farmacocinéticos e de distribuição de tecidos são semelhantes àqueles dos PS-oligonucleotídeos em geral, mas com uma rápida eliminação dos tecidos selecionados. Quando um fluoróforo e moléculas se resfriam bruscamente estão devidamente ligados aos PCOs desta invenção, a molécula será fluorescente quando se encontrar na configuração linear, mas a fluorescência é extinta na conformação cíclica. E. Quimeras, Produtos de Fusão e Outros Materiais Relacionados
Os oligonucleotídeos ou análogos destes (incluindo ribozimas ou DNAses ou péptidos de ácidos nucleicos (PNAs) ou ácidos nucleicos de morfolinos (MNAs) podem ser combinados covalentemente ou não covalentemente para proporcionar um regulador de combinação, como o desejado. Num exemplo, um oligonucleot ídeo, ANP ou MNA pode ser ligado a um péptido ou proteína para fornecer as propriedades desejadas ou efeito terapêutico. Alternativamente, um oligonucleotídeo ou um seu análogo pode ser ligado a uma pequena molécula para intensificar as suas propriedades. Estes materiais podem ser diretamente ligados ou ligados através de um grupo de informações, como é do conhecimento geral dos especialistas. Numa modalidade da invenção, a pequena molécula inclui um radioligando ou outro agente detetável que pode ser monitorizado através da utilização de técnicas padrão. Desta forma, o progresso e a localização do regulador podem ser monotorizados. Em alternativa, a molécula pequena é uma terapêutica que é trazida para o local do tratamento pelo regulador e, em seguida, opcionalmente clivada para fornecer o seu efeito terapêutico no local apropriado. Numa terceira modalidade, a molécula pequena é um selante que une dois materiais 72 biológicos em conjunto para produzir um efeito combinado.
As quimeras, produtos de fusão ou de outro regulador multicomponente, podem ser identificadas e avaliadas quanto à eficácia terapêutica, conforme descrito detalhadamente abaixo. III. Identificação e Seleção do Modulador
Podem ser utilizados ensaios de ligação padrão para identificar e selecionar moduladores da invenção. Exemplos não limitativos são ensaios de gel shift e ensaios da BIACORE. Isto é, os moduladores de teste podem estar em contacto com ligandos de ácidos nucleicos para serem orientados sob condições de teste ou condições fisiológicas típicas e determinar se o modulador de teste, de facto, liga o ligando de ácido nucleico. Os moduladores de teste que são encontrados para vincular o ligando de ácido nucleico podem ser analisados num bio-ensaio adequado (o que irá variar dependendo do aptâmero e da sua molécula-alvo, por exemplo, em testes de coagulação) para determinar se o modulador teste pode afectar o efeito biológico causado pelo ligando de ácidos nucleicos na sua molécula-alvo . 0 ensaio em Gel-Shift é uma técnica utilizada para avaliar a capacidade de ligação. Por exemplo, um fragmento de ADN contendo a sequência de teste é primeiramente incubado com a proteína de teste ou com uma mistura contendo as supostas proteínas, e então separado num gel de eletroforese. Se o fragmento de ADN for ligado por proteínas, será maior em tamanho e sua migração, será portanto retardada em relação à do fragmento livre. Por exemplo, um método para um ensaio de mobilidade de eletroforese em gel shift pode ser: (a) em contacto com uma 73 mistura de um ligando de ácido nucleico com uma proteína não radioativa ou radioativa marcada com a molécula de ácido nucleico, constituída por uma sonda molecular em condições adequadas para promover interações específicas de ligação entre a proteína e a sonda na formação de um complexo, em que a dita sonda é selecionada do grupo consistindo de dsDNA, ssDNA, e ARN; (b) submetendo a mistura a eletroforese; (c) transferindo o complexo, com a utilização de transferência blot de pressão positiva ou transferência capilar, para uma membrana de nylon carregada positivamente, e (d) deteção do complexo ligado à membrana através da deteção de marcadores radioativos ou não radioativos no complexo. A tecnologia Biacore mede os eventos de ligação na superfície do chip sensor, de modo a que o interagente ligado à superfície determine a especificidade da análise. Testar a especificidade de uma interação envolve simplesmente analisar se moléculas diferentes se podem ligar ao interagente imobilizado. A ligação provoca uma mudança imediata no sinal de ressonância plasmon de superfície (SPR), de modo que se torna diretamente evidente se uma interação ocorre ou não. Os biosensores de base SPR monitorizam interações através da medição da concentração em massa de biomoléculas perto de uma superfície. A superfície torna-se especifica anexando-se a um dos parceiros da interação. A amostra contendo outro(s) parceiro (s) flui sobre a superfície: quando as moléculas da amostra se ligam ao interagente anexado à superfície, a concentração local muda e uma resposta SPR é medida. A resposta é diretamente proporcional à massa das moléculas que se ligam à superfície. 0 SPR surge quando a luz é reflectida em determinadas condições de um filme no interface entre dois meios de 74 índice de refração diferentes. Na tecnologia Biacore, os meios são a amostra e o vidro do chip sensor, e o filme condutor é uma fina camada de ouro na superfície do chip. 0 SPR provoca uma redução na intensidade da luz reflectida num ângulo específico de reflexão. Este ângulo varia com o índice de refração próximo da superfície do lado oposto da luz reflectida. Quando as moléculas na amostra se ligam à superfície do sensor, detecta-se a concentração e, consequentemente, o índice de refração, com as mudanças de superfície e uma resposta SPR. Registar a resposta relativamente ao tempo durante o curso de uma interação fornece uma medida quantitativa da evolução da interação. A tecnologia Biacore mede o ângulo do valor mínimo de intensidade da luz reflectida. A luz não é absorvida pela amostra: em vez disso, a energia da luz é dissipada através da SPR no filme de ouro. Valores de resposta SPR são expressos em unidades de ressonância magnética (RIJ). Uma EF representa uma mudança de 0,0001° para o ângulo de intensidade mínima. Para a maioria das proteínas, isto é aproximadamente equivalente a uma mudança na concentração de cerca de 1 pg/mm2 na superfície do sensor. O fator de conversão exacta entre RU e a concentração de superfície depende das características da superfície do sensor e da natureza da molécula responsável pela mudança de concentração.
Existe uma série de outros ensaios que pode determinar se um oligonucleotídeo ou um seu análogo se poderá ligar ao ligando de ácido nucleico de forma a que a interação com o alvo seja modificada. Por exemplo, ensaios de mobilidade em electroforese shift (AESM), calorimetria de titulação, ensaios proximidade de cintilação, ensaios de sedimentação de equilíbrio utilizando ultra-centrifugação analítica (ver, por exemplo, www.cores.utah.edu/interaction), ensaios 75 de polarização de fluorescência, ensaios de anisotropia de fluorescência, ensaios de intensidade da fluorescência, ensaios de fluorescência de transferência de energia de ressonância (FRET), ensaios de filtro de nitrocelulose de ligação, ensaios de ELISA, ELONAs (ver, por exemplo, USP 5.789.163), RIAs, ou ensaios de diálise de equilíbrio, podem ser usados para avaliar a capacidade de um agente se vincular a um ligando de ácido nucleico. Ensaios diretos em que a interação entre o agente e o ligando de ácidos nucleicos é diretamente determinada podem ser realizados, ou ensaios de competição ou de deslocamento, em que a capacidade do agente para deslocar o ligando de ácido nucleico do seu destino podem ser realizados (por exemplo, ver Green, Bell e Janjic, Biotechniques 30 (5), 2001, p 1094 e USP 6.306.598) . Uma vez que um agente modulante candidato é identificado, a sua capacidade de modular a atividade de um ligando de ácido nucleico para o seu destino pode ser confirmada num bio-ensaio. Alternativamente, se for identificado um agente que possa modular a interação de um ligando de ácidos nucleicos com o seu alvo, tais ensaios de ligação podem ser utilizados para verificar se o agente está interagindo diretamente com o ligando de ácido nucleico e podem medir a afinidade da referida interação.
Noutra modalidade, a espetrometria de massa pode ser usada para a identificação de um regulador que se liga a um ligando de ácido nucleico, o(s) local(is) de interação entre o regulador e o ligando de ácido nucleico, e a afinidade e seletividade de ligação relativa de agentes com o ligando de ácido nucleico (ver, por exemplo a Patente dos EUA No. 6.329.146, Crooke et al) . Esses métodos de espetrometria de massa também podem ser usados para a seleção de misturas químicas ou bibliotecas, especialmente 76 bibliotecas combinatórias, para componentes individuais que se ligam a um alvo selecionado de ligando de ácido nucleico que pode ser usado como modulador do ligando de ácidos nucleicos. Além disso, as técnicas de espetrometria de massa podem ser usadas para selecionar vários ligandos de ácido nucleico alvos simultaneamente contra, por exemplo, uma biblioteca combinatória de compostos. Além disso, as técnicas de espetrometria de massa podem ser usadas para identificar a interação entre uma pluralidade de espécies moleculares, especialmente as moléculas "pequenas" em local de interação molecular num alvo ligando de ácidos nucleicos.
Os ensaios in vivo ou in vitro que avaliam a eficácia de um regulador para modificar a interação entre um ligando de ácido nucleico e um alvo são específicos para a doença a ser tratada. Existem inúmeros testes padrão para as propriedades biológicas que são amplamente conhecidos e podem ser usados. Exemplos de ensaios biológicos são fornecidos nas patentes citadas neste texto explicativo que descrevem certos ligandos de ácido nucleico para aplicações específicas.
Como exemplo não limitativo, os testes de coagulação podem ser realizados como bio-ensaios em laboratório clínico. Estes testes são geralmente ensaios de "ponto final" funcionais, em que uma amostra de pacientes (plasma ou sangue total) é incubada com reagentes exógenos que ativam a cascata da coagulação, e o tempo até a formação do coágulo é medido. 0 tempo de coagulação da amostra do paciente é então comparado com o tempo de coagulação do plasma normal, ou de sangue total para fornecer um padrão de medição do estado hemostático do paciente. Como abaixo descrito, os ensaios de coagulação são normalmente utilizados como testes de rastreio que avaliam o 77 funcionamento dos sistemas de coagulação intrínseca e extrínseca do paciente. 0 Teste de Tempo de Coagulação Ativada (ACT) é um teste de rastreio que se assemelha ao teste de tempo da tromboplastina parcial ativada (APTT), mas é realizado utilizando amostras inteiras de sangue fresco. 0 ACT pode ser usado para monitorizar o estado de coagulação de um paciente no âmbito dos procedimentos clínicos, como aqueles que envolvem a administração de altas doses de heparina (por exemplo, CPB e PTCA). 0 Teste de Tempo da Tromboplastina Parcial Ativada (APTT) é um teste de laboratório central comum, o APTT é usado para avaliar a via intrínseca da coagulação, que inclui fatores I, II, V, VIH, M e XII. 0 teste é realizado com uma amostra de plasma, em que a via intrínseca é ativada pela adição de fosfolipídeos, um ativador (ácido elágico, caulim, ou sílica micronizada), e Ca2+. A formação do Xase e complexos protrombinase sobre a superfície do fosfolipideo permite à protrombina ser convertida em trombina, com posterior formação de coágulo. 0 resultado do teste APTT é a medição do tempo (em segundos) necessário para esta reação. 0 APTT pode ser usado para avaliar a competência global do sistema de coagulação do paciente, como um teste de rastreio pré-operatório de tendências de sangramento, e como um teste de rotina para a monotorização da terapêutica com heparina. Outro exemplo do APTT é realizado da seguinte forma. Primeiro, recolhe-se o plasma sanguíneo após o sangue ser submetido à separação centrífuga e, em seguida, é adicionado o agente. 0 cloreto de cálcio é também adicionado. 0 período de tempo é medido até a coagulação ser formada. Em termos detalhados, o plasma do sangue é armazenado no frigorífico depois de ter sido obtido através 78 da separação centrífuga do sangue. Ativando o agente de 0,1 ml, aguecido em água a uma temperatura de 37°C por um minuto, este é vertido num tubo de ensaio contendo 0,1 ml de plasma. A mistura deve permanecer em água a 37 °C por dois minutos. Em seguida, a esta mistura, 0,1 ml de CaCL2 de 0,02 M, que tinha sido colocada em água à temperatura de 37°C, são adicionados sob pressão. Neste momento, liga-se um cronómetro. O tubo de ensaio é aquecido na água a 37 °C por 25 segundos. O tubo é retirado, e se a coagulação for observada, o cronómetro é desligado. Esta é uma forma de medir o tempo de coagulação do sangue. O teste de duração da hemorragia pode ser utilizado para o diagnóstico da disfunção hemostática, doença de von Willebrand, e de desordens vasculares. Também pode ser usado para rastreio de anormalias nas plaquetas antes da cirurgia. O teste é realizado através de uma pequena incisão no antebraço e drenagem do sangue do local da ferida. O tempo que leva a hemorragia a estancar é registado e, em indivíduos do grupo de controlo é de aproximadamente 3,5 minutos. O prolongamento de duração da hemorragia é indicativo de defeitos qualitativos ou quantitativos nas plaquetas. O Teste do Tempo de Protrombina (PT), que foi inicialmente descrito por Quick em 1935, mede o tempo de coagulação do tecido do sangue ou plasma induzido pelo fator. É utilizado como teste de rastreio para avaliar a integridade da via extrínseca da coagulação, e é sensível aos fatores de coagulação I, II, V, VII e X. O teste pode ser realizado com a adicção de tromboplastina e Ca2+ para uma amostra do paciente e medição do tempo para a formação de coágulos. Um tempo de coagulação prolongado sugere a presença de um inibidor, ou uma deficiência num ou mais dos fatores de coagulação da via extrínseca. Mas o tempo de 79 coagulação PT também pode ser prolongado para pacientes em terapêutica com varfarina, ou para aqueles com deficiência de vitamina K ou disfunção hepática. 0 teste PT pode fornecer uma avaliação da via extrínseca da coagulação, e é amplamente usado para monitorizar a terapêutica anticoagulante oral. 0 Teste de Tempo de Coagulação da Trombina (TCT) mede a taxa de formação de um coágulo do paciente, comparada com a de um plasma controlo normal. 0 teste pode ser realizado pela adicção de um montante fixo de trombina ao plasma de um paciente que foi "despojado" de plaquetas, e medido o tempo necessário para um coágulo se formar. Este teste tem sido utilizado como um coadjuvante no diagnóstico de coagulação intravascular disseminada (DIC) e em doenças hepáticas. Há também uma série de testes que podem ser utilizados no diagnóstico do estado de coagulação do paciente. Estes dividem-se em duas categorias: testes complexos, alguns dos quais são baseados em testes de rastreio acima descritos, e imunoensaios. Testes complexos incluem ensaios de fator específico com base em testes laboratoriais, como o APTT, PT, e os testes TCT. Um ensaio mede o nível de ativação do fator péptido IXa ou o fator IX do complexo antitrombina III. Essas medições são utilizadas para determinar os niveis do fator IX ou fator do tecido complexo mediado VII. Ensaios de resistência à proteína C ativada, antitrombina, deficiência de proteína C e deficiência de proteína S também fazem parte deste grupo. Os indivíduos assintomáticos que têm deficiências heterogéneas de proteínas C e S, e resistência à proteína C ativada, têm os niveis da protrombina de fragmento F1.2 significantemente elevados quando comparados com os controlos. 80 V. Método de Regulação da Terapêutica de Ligando de Ácido Nucleico
Fornece-se um método de modulação da atividade biológica incluindo (i) a administração a um paciente necessitado do ligando de ácido nucleico que se liga a um alvo para produzir um efeito terapêutico e então, ajustar ao tempo selecionado ou desejado, (ii) a administração ao paciente de um modulador que modifica o efeito terapêutico. Num dos casos, o modulador desliga o efeito terapêutico. Noutra modealidade da invenção, o modulador reduz ou minimiza, mas não conclui o efeito terapêutico. A base do efeito terapêutico é determinada pelo destino do ligando de ácido nucleico. A modificação do efeito terapêutico é determinada pelo modulador. Qualquer ligando de ácido nucleico conhecido ou desenvolvido pode ser regulado de acordo com esta invenção.
Numa modalidade, o método compreende: (a) administrar a um paciente, incluindo os vertebrados de sangue quente que dela necessitem, uma quantidade eficaz de ligando de ácidos nucleicos ou de um aptâmero de ADN que se liga selectivamente a um fator de via de coagulação, o aptâmero de ARN de constante dissociação para o fator de via de coagulação de cerca de 20 nM ou menos, (b) modulação da atividade biológica do fator de coagulação de vertebrados de sangue quente, através da administração do aptâmero de ARN, na etapa (a) e (c) criação de um antídoto para inverter os efeitos do aptâmero através da administração de um modulador. Por exemplo, os moduladores da presente invenção podem vincular-se a ligandos de ácidos nucleicos de fator tecidual (TF) / fator Vila (FVIIa), fator de Villa (FVIIIa) / fator IXa (fixa) , o fator Va (FVa / fator Xa (FXa) complexos de enzimas e recetores plaquetários como 81
DblIIa gp e I6IX gp e modular os efeitos dos ácidos nucleicos ligandos. Essa invenção também fornece controlo antídoto de inibidores plaquetários, antitrombóticos e trombolíticos.
Existem pelo menos três cenários clínicos em que é desejável a capacidade de inverter rapidamente a atividade de um ligando de ácido nucleico anti-trombótico e anti-coagulante. 0 primeiro caso dá-se quando o tratamento com anticoagulantes ou antitrombóticos leva a hemorragia, incluindo hemorragia intracraniana ou gastrointestinal. Embora a identificação de proteínas-alvo mais seguras possa reduzir este risco, o potencial de morbidade e mortalidade por este tipo de situação de sangramento é tal que o risco não pode ser negligenciado. 0 segundo caso dá-se quando a cirurgia de emergência é necessária para pacientes que receberam tratamento antitrombótico. Esta situação clinica surge numa baixa percentagem de doentes que necessitam de revascularização de emergência do miocárdio quando submetidos à intervenção coronária percutânea sob a cobertura dos inibidores GPIIb/ta. A prática corrente nesta situação é permitir o apuramento do composto (para pequenas moléculas antagonistas como eptifibatide), que pode demorar 2-4 horas, ou realizar a infusão de plaquetas (por tratamento Abciximab). 0 terceiro caso dá-se quando um ligando de ácido nucleico anticoagulante é usado durante um processo de circulação extra-corpórea. Pacientes com bypasses estão predispostos à hemorragia pós-operatória. Em caso de inversão aguda dos efeitos anticoagulantes de um composto através de um antídoto (por exemplo, um modulador oligonucleotídico da invenção direcionados para um ligando de ácido nucleico anticoagulante ou anti-trombótico) permite um melhor, e provavelmente mais seguro controlo médico de anticoagulantes ou antitrombóticos compostos. 82
Um dos métodos de tratamento de doenças cardiovasculares consiste em administrar uma quantidade eficaz de um aptâmero de ARN que select ivamente liga um fator de via de coagulação, o aptâmero de ARN tendo uma dissociação constante para o fator de via de coagulação de cerca de 20 nM ou menos, para um vertebrado sofrendo de doença cardiovascular, segundo o qual a doença cardiovascular nos vertebrados é tratada, em seguida fornecendo um antídoto para inverter os efeitos do aptâmero pela administração de um modulador. O paciente tratado na presente invenção nas suas muitas modalidades é preferivelmente um paciente humano, ainda que se deva entender que os princípios da invenção indicam que a invenção é eficaz no que diz respeito a todas as espécies de vertebrados, incluindo os vertebrados de sangue quente (por exemplo, aves e mamíferos), que se destinem a ser incluídos no termo "paciente". Neste contexto, subentende-se o termo mamífero, de modo a incluir todas as espécies de mamíferos em que o tratamento de doenças cardiovasculares seja desejável, sobretudo em espécies de mamíferos agrícolas e domésticas. O que está contemplado é o tratamento de mamíferos como os seres humanos, bem como os mamíferos importantes pelo facto de estarem ameaçados de extinção (como os tigres da Sibéria), economicamente relevantes (como os animais criados em quintas para consumo por seres humanos) e/ou de importância social para os seres humanos (animais mantidos como animais de estimação ou em jardins zoológicos), tal como outros carnívoros diferentes dos seres humanos, gatos e cães, suínos (porcos, leitões e javalis), os ruminantes (como bovinos, bois, carneiros, girafas, caprinos, veados, bisontes e camelos), e os cavalos. Também se contempla o tratamento das aves, incluindo o tratamento das espécies de 83 aves ameaçadas de extinção, mantidas em jardins zoológicos, de aves, particularmente de aves domésticas, como galinhas e outras aves caseiras, perus, patos, gansos, e similares, visto que também são de economicamente relevantes para os seres humanos.
Este método de tratamento de doenças cardiovasculares em tecido contempla o contacto entre um tecido em se verifique uma doença cardiovascular, ou esteja em risco de se verificar, e uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero de ARN capaz de se ligar a um fator de coagulação, bem como proporcionar um antídoto para inverter os efeitos do aptâmero pela administração de um modulador. Assim, o método consiste em administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição fisiologicamente tolerável contendo o aptâmero de ARN, bem como um método para fornecer um antídoto para inverter os efeitos do aptâmero através da administração de um modulador.
As variações da dosagem para a administração do modulador dependem da forma do modulador e da sua potência, conforme aqui descrito, e têm de ser quantidades suficientes para produzir o efeito desejado. Para as situações em que a coagulação é modulada, o que pode efetivamente melhorar as doenças cardiovasculares e os seus sintomas, a dose não deve ser demasiado grande, uma vez que causa efeitos secundários adversos, tais como síndromes de hiperviscosidade, edema pulmonar, insuficiência cardíaca congestiva, e situações análogas. Geralmente, a dose varia com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente e pode ser determinada por um especialista na área. 0 médico responsável do caso, pode perante qualquer complicação ajustar a dosagem. A quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade 84 de modulador suficiente para produzir uma modulação dos efeitos mensuráveis do ligando de ácidos nucleicos, incluindo, mas não limitado a um montante de coagulação-modulação. A modulação da coagulação pode ser medida in situ por imuno-histoquímica através de métodos divulgados nos exemplos, ou por outros métodos conhecidos pelos epecialistas.
Um modulador preferido tem a capacidade de substancialmente se ligar a um ligando de ácidos nucleicos em solução, em concentrações moduladoras de menos de um (1) micromolar (μΜ) , de preferência menos de 0,1 μΜ, e mais preferivelmente inferior a 0,01 μΜ. Por "substancialmente" entende-se que pelo menos uma redução de 50 por cento no alvo da atividade biológica é observada pela modulação na presença de um alvo, e a redução de 50% é aqui referida como um valor lC5o.
Os modos preferidos de administração dos materiais da presente invenção a uma série de mamíferos são parenteral, intravenoso, intradérmico, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, intra-arterial, intracardíaco, intramuscular, subcutâneo, intra-orbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal, tópico adesivo transdérmico, via supositório retal, vaginal ou uretral, spray peritonial percutâneo, ou nasal, implantes cirúrgicos, pintura interna cirúrgica, bomba de infusão ou via cateter. Numa modalidade, o agente e o transportador são administrados numa formulação de libertação lenta, como um implante, bólus, micropartícuias, microesferas, nanoparticulas ou nanosferas. Para obter informações gerais sobre formulações farmacêuticas, consulte Ansel, et al. Formas de Dosagem Farmacêutica e Sistemas de Administração de Medicamento, Sexta Edição, Williams & Wilkins (1995).
Os moduladores da presente invenção podem ser 85 administrados preferencialmente parenteralmente por injeção ou por infusão gradual ao longo do tempo. Embora o tecido a ser tratado normalmente possa ser acedido no corpo através da administração sistémica e, por isso mais frequentemente tratado pela administração intravenosa de composições terapêuticas, outros tecidos e técnicas de entrega são fornecidos onde exista uma probabilidade do tecido atingido conter a molécula-alvo. Apesar dos moduladores da presente invenção serem geralmente administrados por via oral, tópica num tecido vascular, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intra-cavidade, transdérmica, podem ser aplicados por meio de técnicas peristálticas. Como mencionado acima, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas ao indivíduo por diversas vias, como sejam aoral, tópica num tecido vascular, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intra-cavidade, transdérmica, e podem ser entregues por meio de técnicas peristálticas. Abordagens não limitativas representrantes de administração tópica num tecido vascular incluem (1) um revestimento ou impregnação do tecido dos vasos sanguíneos com um gel que contem um ligando de ácidos nucleicos, para entrega in vivo, por exemplo, pela implantação da veia impregnada ou revestida no lugar de um segmento de tecido danificado ou doente que foi removido ou contornado; (2) entrega através de um cateter para uma veia no qual a administração é desejada; (3) bombeamento de uma composição de ligando de ácido nucleico numa veia que está para ser implantada num paciente. Alternativamente, o ligando de ácido nucleico pode ser introduzido nas células por micro-injeção, ou por encapsulamento de lipossomas. Vantajosamente, o ligando de ácido nucleico da presente invenção pode ser administrado numa dose única diária, ou a dose diária total pode ser administrada em várias doses 86 divididas. Posteriormente, o modulador é fornecido por qualquer meio adequado para alterar o efeito do ligando de ácido nucleico pela administração do modulador.
As composições são administradas de forma compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do assunto a ser tratado, da capacidade do sistema do sujeito em utilizar o ingrediente ativo, e do grau de efeito terapêutico desejado. Quantidades precisas de ingrediente ativo necessárias na administração dependem do julgamento do médico e são peculiares a cada indivíduo. No entanto, as variações de dosagem adequadas para aplicação sistémica são divulgadas aqui e dependem da via de administração. Regimes adequados de administração também são variáveis, mas são caracterizados por uma administração inicial seguida de doses repetidas num ou mais intervalos de uma hora por cada injeção subsequente ou outra administração. Alternativamente, a infusão intravenosa continua suficiente para manter a concentração no sangue em variações especificadas para terapêuticas in vivo é contemplada.
Conforme utilizados aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável", "fisiologicamente tolerável", e suas variações gramaticais, uma vez que referem-se às composições, transportadores, diluentes e reagentes, são utilizados alternadamente e significam que os materiais são capazes de serem administrados sem efeitos secundários tóxicos substanciais ou debilitantes.
Composições farmaceuticamente úteis compreendendo um modulador da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos, como a mistura de um transportador farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais transportadores e de métodos de formulação podem ser 87 encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar uma composição farmaceuticamente aceitável adequada para a administração eficaz, tais composições deverão conter uma quantidade eficaz do aptâmero. Essas composições podem conter misturas de mais de um modulador. 0 montante efetivo pode variar de acordo com uma variedade de fatores, como condições do indivíduo, peso, sexo, idade e quantidade de ligando de ácido nucleico administrada. Outros fatores incluem a forma de administração. Geralmente, as composições serão administradas em doses ajustadas ao peso corporal; por exemplo, dosagens variando de cerca de 1 pg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal; de preferência, 1 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal.
Moduladores de ligandos de ácido nucleico podem ser particularmente úteis para o tratamento de doenças em que é benéfico inibir a coagulação ou impedir que tal atividade ocorra. As composições farmacêuticas são administradas em quantidades terapeuticamente eficazes, ou seja, em quantidades suficientes para gerar a coagulação, resposta modular, ou em quantidades profilaticamente eficazes, ou seja, em quantidades suficientes para evitar que um fator de coagulação actue gerando uma cascata de coagulações. A quantidade terapeuticamente eficaz e a quantidade profilaticamente eficaz podem variar de acordo com o tipo de modulador. A composição farmacêutica pode ser administrada em doses únicas ou múltiplas.
Geralmente, os moduladores oligonucleotídicos da invenção podem ser administrados por meio de protocolos estabelecidos utilizados em terapêuticas antisenso. Os dados apresentados no Exemplo 6 indicam que a atividade de um ligando de ácido nucleico terapêutico pode ser modulada pela infusão intravenosa de oligonucleotídeos antídotos em humanos ou outros animais. Além disso, devido à atividade do modulador ser durável, uma vez que o nível desejado de modulação do ligando de ácido nucleico é atingido pelo modulador, a infusão do modulador pode ser terminada, permitindo que o modulador residual limpe o humano ou animal. Isto permite um posterior re-tratamento com o ligando de ácido nucleico, conforme necessário. Em alternativa, e tendo em vista a especificidade dos moduladores da invenção, o tratamento subsequente pode envolver o uso de um segundo par de ligandos de ácido nucleico/modulador diferente (por exemplo, oligonucleotídeo).
Os moduladores sintetizados ou identificados de acordo com os métodos aqui divulgados podem ser usados isoladamente, em doses adequadas definidas por testes de rotina, a fim de obter melhor modulação da atividade do ligando de ácido nucleico na coagulação, minimizando qualquer toxicidade potencial. Além disso, a co-administração ou a administração sequencial de outros agentes pode ser desejável. Para tratamento combinado com mais de um agente ativo, onde os agentes ativos estão em formulações de dosagem separada, estes podem ser administrados concomitantemente, ou cada um pode ser administrado em tempos escalonados separados. 0 regime de dosagem utilizando os moduladores da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores, incluindo o tipo, espécie, idade, peso, sexo e condição clínica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; a via de administração; as funções renal e hepática do paciente; e o modulador utilizado no caso em particular. Qualquer médico pode facilmente determinar e fixar a quantidade efetiva do aptâmero necessária para 89 prevenir, combater ou deter o progresso da doença. A precisão ideal para alcançar as concentrações de modulador dentro da variação que produz a eficácia sem toxicidade requer um regime baseado na cinética de disponibilidade do modulador em locais alvos. Isto envolve uma análise da distribuição, do equilíbrio, e da eliminação do modulador.
No uso da presente invenção, os moduladores aqui descritos detalhadamente podem formar o ingrediente ativo, e são normalmente administrados em mistura com diluentes farmacêuticos adequados, excipientes ou transportadores (colectivamente referidos aqui como materiais "transportadores") devidamente selecionados em relação à forma de administração pretendida, ou seja, comprimidos orais, cápsulas, elixir, xarope, supositórios, géis e similares, e de acordo com as práticas farmacêuticas convencionais.
Por exemplo, para a administração oral na forma de um comprimido ou cápsula, o componente ativo do fármaco pode ser combinado com um transportador inerte, farmaceuticamente aceitável não-tóxico oral, como o etanol, glicerol, água e afins. Além disso, quando desejado ou necessário, os ligandos adequados, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes de coloração também podem ser incorporados na mistura. Aglomerantes adequados incluem, sem limitação, amido, gelatina, açúcares naturais como a glicose ou beta-lactose, edulcorantes de milho, gomas naturais e sintéticas como acácia, adragante ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietileno glicol, ceras e similares. Lubrificantes utilizados nessas formas de dosagem incluem, sem limitação, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e outros. Desintegradores incluem, sem limitação, amido, metil-celulose, ágar, 90 bentonita, goma xantana e similares.
Para formas liquidas, o componente ativo do fármaco pode ser combinado numa suspensão ou dispersão de agentes devidamente "adaptada ao sabor", tal como as gomas sintéticas e naturais, por exemplo, adragante, acácia, metil-celulose e similares. Outros agentes dispersantes que podem ser empregados incluem glicerina e similares. Para a administração parenteral, suspensões estéreis e soluções são desejadas. Preparações isotónicas que geralmente contêm conservantes adequados são empregadas quando a administração intravenosa é desejada.
As preparações tópicas contendo o componente ativo do fármaco podem ser misturadas com uma variedade de materiais transportadores bem conhecidos, como por exemplo, álcool, gel de aloe vera, alantoína, glicerina, vitamina E e óleos, óleo mineral, PPG2 propionato miristílico, e semelhantes, para formar, por exemplo, soluções alcoólicas, produtos de limpeza tópica, cremes de limpeza, géis de pele, loções para a pele, e champoos de formulação em creme ou gel.
Os compostos da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de libertação de lipossomas, tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipideos, como o colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas.
Os compostos da presente invenção podem também ser conjugados com polímeros solúveis, como transportadores de fármacos segmentáveis. Tais polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de piran, poli hidroxi propil metacril-aminofenol, polihidroxi-etilaspartamidepbenol, ou polietilenoxido-polilisina substituídos por resíduos de palmitoil. Além disso, os 91 compostos da presente invenção podem ser acoplados (de preferência através de uma ligação covalente) a uma classe de polimeros biodegradáveis úteis para obter a libertação controlada de um fármaco, por exemplo, polietileno glicol (PEG), o ácido polilático, poli-epsilon caprolactona, ácido polihidroxibutirico, poliortoésteres, poliacetais, polidihidro-piranos, policianoacrilatos e copolímeros em bloco amfipático de hidrogéis. Colesterol e moléculas semelhantes podem ser ligados aos aptâmeros para aumentar e prolongar a biodisponibilidade.
Os moduladores oligonucleotidicos podem ser administrados diretamente (por exemplo, sozinhos ou numa formulação lipossomal ou complexa num transportador (por exemplo, PEG)) (ver, por exemplo, USP 6.147.204, USP 6.011.020) . O ligando de ácido nucleico ou modulador pode ser composto por um modulador oligonucleotideo ligado a um composto não-imunogénico de alto peso molecular como o polietileno glicol (PEG). Nesta modalidade, as propriedades farmacocinéticas do complexo são melhoradas somente em relação ao ligando de ácido nucleico. Como referido acima, a associação poderia ser através de ligações covalentes ou interações não-covalentes. Numa modalidade, o modulador é associado com a molécula PEG através de ligações covalentes. Além disso, como explicado acima, onde a ligação covalente é empregada, o PEG pode ser ligado covalentemente numa variedade de posições, ao modulador oligonucleotidico. Na modalidade preferida, um modulador oligonucleotídico é ligado ao 5'tiol por uma funcionalidade vinilsulfona ou maleimida. Numa modalidade, uma pluralidade de moduladores pode estar associada a uma única molécula PEG. O modulador pode ser para o mesmo ou para diferentes alvos. Em modalidades onde há vários moduladores para o 92 mesmo ligando de ácido nucleico, há um aumento da avidez devido a múltiplas interações de ligação com o ligando. Ainda noutra modalidade, uma pluralidade de moléculas PEG podem ser anexadas umas às outras. Nesta modalidade, um ou mais moduladores para o mesmo alvo ou alvos diferentes podem ser associados a cada molécula de PEG. Isto também resulta num aumento da avidez de cada modulador ao seu destino. Em modalidades onde vários moduladores específicos para o mesmo destino estão ligados a PEG, existe a possibilidade de trazer os mesmos objectivos em estreita proximidade uns com os outros, a fim de gerar interações específicas entre os mesmos objectivos. Onde vários moduladores específicos para alvos diferentes são anexados à PEG, existe a possibilidade de trazer alvos distintos em estreita proximidade uns com os outros, a fim de gerar interações especificas entre os alvos. Além disso, em modalidades onde existem moduladores para o mesmo alvo ou alvos diferentes associados com a PEG, um fármaco também pode ser associado com a PEG. Assim, o complexo proporcionaria a administração no alvo, do fármaco, com a PEG servindo como um Ligante.
Um problema encontrado no uso diagnóstico in vivo e terapêutico de ácidos nucleicos é que oligonucleotídeos na sua forma fosfodiéster podem ser rapidamente degradados nos fluidos do organismo por enzimas intracelulares e extracelulares, tais como endonucleases e exonucleases antes do efeito desejado ser manifestado. Algumas modificações químicas do ácido nucleico podem ser feitas para aumentar a estabilidade in vivo do ácido nucleico, para intensificar ou para mediar a entrega do ácido nucleico. Modificações dos ligandos de ácido nucleico, contempladas nesta invenção incluem, entre outras, as que permitem outros grupos químicos incorporarem custos 93 adicionais, polarizabilidade, hidrofobicidade, ligações de hidrogénio, interações eletrostáticas, e fluxionalidade às bases de ácidos nucleicos ou aos ácidos nucleicos como um todo. Tais modificações incluem, entre outras, modificações de posição 2' do açúcar, modificações da pirimidina de posição 5, modificações da purina de posição 8, modificações em aminas exociclicas, substituição da 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo - uracil; modificações do esqueleto, modificações de alquil fosfato ou de fosforotioato, metilações, base-pairing combinações de pares de base incomuns, como a isobases isocitidina e isoguanidina e similares. Modificações podem incluir também modificações 3' e 5' tais como o nivelamento.
Compostos lipofilicos e compostos não-imunogénicos de alto peso molecular com os quais os moduladores da invenção podem ser formulados para uso na presente invenção e podem ser preparados por uma das várias técnicas actualmente conhecidas ou posteriormente desenvolvidas. Normalmente, eles são preparados a partir de um fosfolipídeo, por exemplo, fosfatidilcolina distearoil, e podem incluir outros materiais, como lipídios neutros, por exemplo, o colesterol, e também modificadores de superfície como compostos de carga positiva (por exemplo, esterilamina ou aminomanose ou derivados de aminomanitol do colesterol) ou de carga negativa (por exemplo, o diacetil fosfato, fosfatidil glicerol) . Os lipossomas multilamelares podem ser formados pela técnica convencional, ou seja, depositando-se um lipídio selecionado na parede interna de um recipiente apropriado ou vasilhame, dissolvendo-se o lipídeo num solvente apropriado, e em seguida, evaporando-se o solvente para deixar uma fina película no interior do vasilhame, ou por spray. Uma fase aquosa é então adicionada ao vasilhame, com movimento espiral ou em vórtice o que 94 resulta na formação de MLVs. Os UVs podem, então, ser formados pela homogenização, sonicação ou extrusão (através de filtros) de MLVs. Além disso, UVs podem ser formados por técnicas de remoção de detergente.
Em algumas modalidades desta invenção, o complexo consiste num lipossoma com um ligando(s) de ácido nucleico direcionado associado com a superfície do lipossoma e um agente de diagnóstico ou terapêutico encapsulado. Os lipossomas pré-formados podem ser modificados para se associarem aos ligandos de ácido nucleico. Por exemplo, um lipossoma catiónico associa-se através de interações electrostáticas com os ácidos nucleicos. Alternativamente, um ácido nucleico anexado a um composto lipofílico, como o colesterol, pode ser adicionado a lipossomas pré-formados nos quais o colesterol se associa à membrana de lipossomas. Alternativamente, o ácido nucleico pode ser associado com o lipossoma durante a formulação do lipossoma. Preferencialmente, o ácido nucleico está associado ao lipossoma por estar carregado de lipossomas pré-formados.
Alternativamente, os moduladores oligonucleotidicos da invenção podem ser produzidos in vivo após a administração de uma construção composta por uma sequência de codificação do oligonucleotideo. Técnicas disponíveis para efectuar a entrega intracelular de moduladores de ARN da expressão genética podem ser usadas (ver geralmente Sullenger et al, Mol. Cell Biol. 10:6512 (1990)).
Certos aspetos da invenção podem ser descritos em maior detalhe nos exemplos não limitativos que se seguem. EXEMPLO 1
Aptâmero ao Fator IXa
Aptâmeros modificados por 2'-fluoro pirimidina resistentes a nuclease para o Fator IXa de coagulação humana foram gerados como descrito em WO 0226932 A2. Foram 95 executados oito ciclos interativos de seleção, compreendendo uma família de 16 aptâmeros com afinidade elevada por FIXa; os KD' s variando de -0.6-15 nM em sal fisiológico e pH a 37°C. A análise da sequência comparativa tornou possível prever e sintetizar a versão minimizada do aptâmero de afinidade mais alta, denominado ARN 9.3t ("t" para truncado), mostrada na Fig. 1. Este aptâmero de 34 nucleotídeos tem um peso molecular de 11.5 kDa e liga-se a FIXa com essencialmente a mesma afinidade que a sequência de comprimento inteiro (KD 0.6 nM) Como um controlo, uma versão mutante de ARN 9.3t denominada 9.3tM foi sintetizada na qual os A's absolutamente conservados na volta interna sofreram mutação para G's (Fig. 1). Este aptâmero liga-se a FIXa com um KD > 5 μΜ como determinado por ensaios de ligação por competição. Em todos os ensaios de atividade, ARN 9.3tM é usado como um controlo para medir qualquer efeito não específico causado por um aptâmero desta composição. O aptâmero 9.3t bloqueia a ativação de FX por FVIIla/FIXa/lipídeos, e também bloqueia parcialmente a hidrólise de substrato sintético por FIXa.
Para examinar a especificidade do aptâmero para FIXa versus fatores de coagulação estruturalmente semelhantes, a afinidade de 9.3t para FIX, FVIIa, FXa, FXIa e APC foi medida em ensaios de ligação direta como descrito anteriormente (Rusconi et al, Trombose e Hemostase 83:841-848 (2000)) . O aptâmero liga-se a FIX somente -5-50 vezes menos firmemente do que FIXa. Ele não exibe ligação significativa a concentrações de proteína de até 5μΜ (fração ARN ligada < 10%) a qualquer uma das outras proteínas testadas. Então, a especificidade do aptâmero 9.3t para FIXa versus FVIIa, FXa, FXIa ou APC é > 5000 vezes.
Para determinar a potência anticoagulante do ARN 9.3t, 96 a capacidade do 9.3t para prolongar o tempo de coagulação de plasma humano foi avaliada em tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) e em ensaios de coagulação de tempo de protrombina (PT). 0 aptâmero 9.3t, mas não o aptâmero de controlo 9.3tM, foi capaz de prolongar o tempo de coagulação do plasma humano de uma maneira a depender da dose (Fig. 2) . Nenhum aptâmero teve um efeito no PT, demonstrando a especificidade funcional do aptâmero 9.3t para FIXa e demonstrando que este tipo de oligonucleotídeo, a concentrações até ΙμΜ, não aumenta especificamente o tempo de coagulação do plasma humano. Assim, ARN 9.3 é um anticoagulante potente, com um efeito máximo no APTT semelhante àquele observado em plasma deficiente de FIX. Foram executadas experiências semelhantes em plasma suíno e foram observadas potência e especificidade semelhante.
Para determinar se esta molécula é capaz de inibir a atividade de FIX/FIXa in vivo, a capacidade deste aptâmero para anticoagular sistematicamente porcos pequenos (1.5-4 kg), seguida de injeção intravenosa de bólus, foi testada. Para estas experiências, um cateter intravenoso foi colocado na veia femoral para injeção da amostra e um cateter arterial foi colocado numa artéria femoral do animal para recolha consecutiva de amostras de sangue. Uma amostra de sangue antes da injeção foi recolhida e o tempo de ACT medido no local para estabelecer um tempo de coagulação de sangue total da linha base para o animal. 0 aptâmero 9.3t a doses de 0.5 mg/kg (n=4) e 1.0 mg/kg (n=4), o aptâmero 9.3tM a 1.0 mg/kg (n=3) ou veículo (n=3) foi então libertado, através de injeção de bólus intravenosa. Foram retiradas amostras de sangue a vários tempos após a injeção e o ACT imediatamente determinado. Sangue adicional foi recolhido para determinação dos APTT's em tempos diferentes após injeção. Como mostrado na Fig. 3, o 97 aptâmero 9.3t, mas não o aptâmero de controlo 9.3tM ou o veículo, foi capaz de inibir a atividade de FIXa in vivo como comprovado por um aumento significativo da dose no ACT do animal após a injeção. Como mostrado na Fig. 4, o aptâmero 9.3 especificamente prolongou o APTT, mas não o PT dos animais de uma maneira dependente da dose. Usando as curvas de resposta à dose in vitro das experiências de APTT, a mudança na concentração no plasma de 9.3t com o passar do tempo a seguir à injeção pode ser estimada.
Como uma tentativa para aumentar a biodisponibilidade do 9.3t, foi sintetizada uma versão deste aptâmero com uma fração 5'colesterol, denominada 9.3t-C. 0 aptâmero modificado com colesterol reteve ligação de alta afinidade a FIXa (Fig. 5A) e atividade anticoagulante potente (Figs. 5B e 5C). Os efeitos in vivo desta modificação na semi-vida na circulação de 9.3t-C contra 9.3t (n=2 animais para cada aptâmero) foram testados usando o modelo de anticoagulação sistémica do porco. Em seguida a injeção de 0.5 mg/kg de 9.3t-C, o ACT do animal aumentou ~1.4 vezes e foi mantido a este nível por 1 hora após a injeção (Fig. 6A) . A Fig. 6B mostra a análise do APTT e do PT dos animais desta experiência. Embora a potência anticoagulante dos dois aptâmeros seja semelhante, a duração do efeito anticoagulante de 9. 3t-C é significativamente mais longa (Fig. 6C). EXEMPLO 2
Oligonucleotídeo gue inverte a interação do Aptâmero FIXa com FIXa de Coagulação. 0 modelo da estrutura secundária do 9.3t é mostrado na Fig. 1, e foi desenvolvido a partir da análise comparativa da sequência do aptâmero FIXa exibido na Fig. 7. Estes dados sustentam fortemente a formação da estrutura em laço em haste ilustrada na Fig. 1. Além disso, a análise de 98 mutação do aptâmero 9.3t demonstrou que o rompimento da haste 1 ou da haste 2 resultou numa perda de afinidade para FIXa maior do que 1000 vezes. Desse modo, um resíduo 17 todo 2'0metil oligonucleotideo foi projectado (sequência 5'auggggaggcagcauua 3') (Anti-Dl) complementar às 2 metades do aptâmero 9.3t com início na extremidade 5' da volta 2 (L2 na Fig. 7) e estendendo-se até a extremidade 3' do aptâmero. Este projeto permite a nucleação de um dúplex intermolecular entre o oligonucleotideo e a volta 2 do aptâmero. Também, a formação do dúplex intermolecular é termodinamicamente favorecida devido tanto ao comprimento quanto à composição base do oligonucleotideo complementar. Uma dúplex de ribonucleotídeo desta sequência tem energia livre calculada de -26.03 kcal/mol e uma Tm prevista de 75.4 °C. a semi-vida de tal dúplex a 37°C grandemente excederia 24 horas.
Para determinar se este oligonucleotideo pode desnaturar o aptâmero 9.3t, o aptâmero 9.3t (125nM) radiomarcado foi incubado com concentrações crescentes do oligonucleotideo "antídoto" (de equimolar até um excesso molar de 8 vezes) a 37°C durante 15 minutos (-calor Fig. 8), e a quantidade de dúplex intermolecular formada foi visualizada por electroforese de gel nativa (12% de acrilamida, NaCl 150 mM, CaCl2 2mM, ocorrido em tampão lXtris-borato + CaCl2 2 mM) seguido por imagem de fósforo (Fig. 8) . Para gerar um complexo oligonucleotídeo-aptâmero como um controlo de mobilidade em gel, o oligonucleotideo foi temperado com o aptâmero 9.3t aquecendo o aptâmero e um excesso molar de 8 vezes do oligonucleotideo a 95°C durante 5 minutos antes da incubação a 37°C (+calor Fig. 8) . O mesmo conjunto de experiências foi executado com um oligonucleotideo "sem sentido" da mesma composição básica que o oligonucleotideo de antídoto (N. S. na Fig. 8) . Tal 99 como pode ser visto na Fig. 8, o oligonucleotídeo de antídoto desnatura o aptâmero 9.3t prontamente como comprovado pela formação quase completa do complexo oligonucleotídeo-aptâmero quando o oligonucleotídeo estava presente a um excesso molar de 8 vezes com o aptâmero. Além disso, esta interação é muito específica, porque não é observado nenhum complexo, com ou sem aquecimento, entre o aptâmero e o oligonucleotídeo de controlo "sem sentido".
Para determinar se este oligonucleotídeo de antídoto pode inverter a atividade anticoagulante do aptâmero 9.3t, o APTT de plasma humano foi medido na presença de 9.3t 50 nM e concentrações crescentes do oligonucleotídeo de antídoto (Fig. 9A e 9B). Nesta experiência, o aptâmero 9.3t foi pré-incubado 5 minutos em plasma antes da adicção do oligonucleotídeo de antídoto para gerar complexos aptâmero-FIX, o oligonucleotídeo de antídoto ou "sem sentido" foi, então, adicionado e a incubação continuada por 10 minutos adicionais antes de adicionar CaCl2 para iniciar a formação do coágulo. Conforme mostrado nas Figs. 9A e 9B, o oligonucleotídeo de antídoto pode inverter efetivamente aproximadamente 80% da atividade anticoagulante do aptâmero 9.3t. Porém, o excesso molar de oligonucleotídeo de antídoto exigido para obter este efeito é substancialmente maior do que a quantidade exigida para desnaturar o aptâmero efetivamente na ausência de proteína. EXEMPLO 3
Especificidade de Antídotos de Oligonucleotídeo
Para avaliar a especificidade de um antídoto de oligonucleotídeo, o aptâmero 9.20t foi preparado (ver Fig. 10A) . A haste 1 de 9.20t é idêntica à haste 1 do aptâmero 9.3t, como é a metade 3' da haste 2. As principais diferenças entre 9.20t e 9.3t encontram-se na volta 2 e 100 volta 3 (comparar a Fig. 1 com a Fig. 10A). O aptâmero 9.20t liga o FIXa com um KD comparável àquele do 9.3t. Foram usados ensaios de APTT para medir o tempo de coagulação de plasma humano em função da concentração de aptâmero 9.20t. A sua potência anticoagulante in vitro em plasma humano foi comparável àquela do 9.3t (Fig. 10B) . O aptâmero 9.20t foi acrescentado ao plasma humano numa concentração de 50nM e permitiu ligar-se ao FIX do plasma durante 5 minutos. Concentrações variadas de oligonucleotideo do antídoto Anti Dl foram então adicionadas, e o APTT foi medido 10 minutos após adicção de antídoto ao plasma. A mudança relativa no tempo de coagulação causada pela adicção de 9.20t ao plasma não foi afectada pela adicção deste oligonucleotideo de antídoto complementar ao aptâmero 9.3t (Fig. 10C). EXEMPLO 4
Aptâmero com Cauda 9.3t A fim de determinar se uma "cauda" de cadeia simples adicionada à extremidade de um aptâmero promove a associação de um oligonucleotideo de "antídoto" ao aptâmero, uma cauda 3' foi adicionada ao aptâmero 9.3t, o aptâmero com cauda sendo este designado por 9.3t-3NT (Fig. 11) . A cauda 3' do 9.3t-3NT é uma cauda de ARN modificada com 3 nucleotídeos 2'0metil. Esta sequência de cauda foi escolhida para reduzir a probabilidade de impacto na atividade do aptâmero e reduzir estruturas secundárias potenciais dentro do oligonucleotideo de antídoto complementar.
Foi comparada a afinidade do aptâmero 9.3t-3NT ao 9.3t em ensaios de ligação por competição (Fig. 12A). A afinidade do aptâmero 9.3t-3NT para FIXa foi comparável àquela do 9.3t (KD 1.5nM ou menos). Foram usados ensaios de APTT para medir o tempo de coagulação do plasma humano em 101 função da concentração dos aptâmeros 9.3t-3NT e 9.3t (Fig. 12B) . As atividades anticoagulantes dos aptâmeros eram semelhantes e ambos os aptâmeros puderam inibir a atividade de FIX completamente no plasma humano. O aptâmero 9.3t-3NT foi adicionado ao plasma humano numa concentração de 50 nM (~3 vezes de aumento no APTT) e permitiu a ligação ao FIX do plasma durante 5 minutos. Concentrações variadas de oligonucleotideos de antídoto (ver Fig. 11) foram, então, adicionadas 10 minutos após a adição de antídoto ao plasma (Fig. 13A). A fração da atividade anticoagulante invertida pelo oligonucleotídeo de antídoto é a diferença entre o APTT somente na presença do aptâmero e o APTT na presença do aptâmero + o antídoto dividida pela mudança no APTT sobre a linha de base na presença do aptâmero somente (0 = nenhum efeito, 1 = inversão completa). Cada um dos oligonucleotideos de antídoto complementares testados pôde inverter mais de 90% da atividade anticoagulante do aptâmero 9.3t-3NT dentro de 10 minutos após adicção no plasma humano, com AS3NT-3 demonstrando a atividade de inversão mais potente (Fig. 13B). Esta atividade de inversão é comparável à capacidade da protamina inverter o aumento no APTT em após adicção de heparina ao plasma humano. A inversão da atividade anticoagulante do 9. 3t-3NT pelo oligonucleotídeo de antídoto AS3NT-3 foi comparada à inversão da atividade anticoagulante do 9.3t pelo oligonucleotídeo antídoto Anti Dl. A adicção da cauda ao aptâmero aumenta a eficiência de inversão por um oligonucleotídeo antídoto com sequências complementares à cauda 3' do aptâmero (Figs. 14A e 14B).
Além do anterior, foram produzidos os moduladores de oligonucleotídeo seguintes cujo alvo é o aptâmero 9.3t e são eficazes para inverter a sua atividade anticoagulante 102 em plasma humano in vitro (todos são oligonucleotídeos 2'Ometil) : Ant i D TI: 5' cau ggg gag gca gca uua 3' AS 9. 3t-2 : 5' cau ggg gag gca gca 3' AS 9. 3t-3: 5' cau ggg gag gca 3'
Os moduladores de oligonucleotídeo seguintes objetivam os aptâmeros 9.3t e 9.3t-3NT e são eficazes para inverter a atividade anticoagulante destes em plasma humano in vitro (todos são oligonucleotideos 2'Ometil): AS 5-1: 5' gca uua cgc ggu aua guc ccc ua 3' AS 5-2: 5' cgc ggu aua guc ccc ua 3'.
Os moduladores de oligonucleotideo seguintes ojetivam ou o aptâmero 9.3t ou o aptâmero 9.3t-3NT e são oligonucleotideos mutantes projectados para testar aspetos específicos do projeto para modular oligonucleotídeos para estes aptâmeros (todos são oligonucleotídeos 2'0metil): AS 9.3t-M: 5' cau ggg gaa gca 3' (SEQ ID NO:37) AS 9.3t-3NOH: 5' aug ggg agg ca 3' (SEQ ID NO:38). AS 3NT-3M: 5' gac aug ggg aag ca 3' (SEQ ID NO:39) AS 3NT-3MT: 5' aca aug ggg agg ca 3' (SEQ ID NO:40) EXEMPLO 5
Oligonucleotideo de Antídoto para Aptâmero 9.3t O oligonucleotideo de antídoto 5-2C (5'CGC GGU AUA GUC CCC AU) , mas não uma versão misturada deste oligonucleotideo antídoto, 5-2C scr, mostrou-se capaz de inverter efetivamente a atividade dos aptâmeros 9.3t e Peg-9.3t in vitro em plasma humano. Peg-9.3t é 9.3t com um polietileno glicol de 40 KDa afixado à sua extremidade 5' através de um ligante.
Nestas experiências, o aptâmero foi adicionado ao plasma (9.3t 50nM, Peg-9.3t 125 nM) e foi permitido incubar durante 5 minutos. Foram então adicionados 103 oligonucleotídeos antídoto e iniciados os ensaios de APTT 10 minutos após a adição de antídoto. Os resultados estão ilustrados na Figura 15. EXEMPLO 6
Rapidez e Durabilidade do Controlo de Aptâmero 9.3t por Oligonucleotídeo Antídoto
Os aptâmeros 9.3t ou Peg-9.3t foram adicionados ao plasma humano in vitro a uma concentração final de 50 nM para 9.3t ou 125 nM para Peg-9.3t, e permitidos incubar durante 5 minutos a 37°C. O oligonucleotídeo antídoto 5-2C no excesso de molar indicado para o aptâmero foi então adicionado e a atividade de aptâmero residual foi determinada medindo-se o tempo de coagulação em ensaios de APTT nos tempos indicados seguidos à adição do antídoto. A percentagem (%) de atividade anticoagulante residual é igual a 1 - o racio de (TAptâmero sozinho - TAptâmero + antídoto) para (TAptâmero sozinho - Tlinha de base) X 100, onde T= tempo de coagulação do APTT. A duração da inativação da atividade anticoagulante do Peg-9.3t através do oligonucleotídeo antídoto 5-2C foi medida in vitro em plasma humano. Por breves instantes, o Peg-9.3t foi adicionado ao plasma humano a uma concentração final de 125 nM e permitiu incubar por 5 minutos. O oligonucleotídeo antídoto 5-2C foi, em seguida, acrescentado a um excesso molar de 10 vezes ou, numa experiência paralela, o tampão puro foi adicionado em vez do oligonucleotídeo antídoto, e o tempo de coagulação foi medido em ensaios APTT em vários períodos de tempo após a adicção do antídoto. A percentagem (%) de atividade anticoagulante residual foi determinada como descrito acima. 0 ATTP do plasma humano sem tratamento também foi medido em paralelo para estabelecer um prazo inicial de coagulação em cada momento. Verificou-se que após 5 horas 104 de incubação a 37 °C, o APTT do plasma sem tratamento começou a aumentar, indicando a perda da atividade de formação do coágulo do plasma, e, a experiência foi portanto interrompida após 5 horas.
Os dados apresentados nas Figuras 16 e 17 demonstram a capacidade de rapidamente e de forma duradoura se controlar a atividade anticoagulante do aptâmero 9.3t antagonista FIXa e de seus derivados, utilizando os oligonucleotideos antídoto. Juntos, esses dados demonstram que o início da ação do antídoto é rápido, que o tempo necessário para o antídoto atuar pelo menos em parte, está dependente da concentração de antídoto, e que uma vez que o antídoto tem o aptâmero inativado, esse efeito é duradouro. EXEMPLO 7
Oligonucleotídeo de Antídoto para Aptâmero Contra o Fator de Coagulação Xa.
Na Figura 18A encontra-se representado um aptâmero (designado llF7t) contra o fator de coagulação Xa que é um potente anticoagulante in vitro no plasma humano. Na Figura 18B encontra-se representada uma versão mutante do aptâmero 1lF7t, designado HF7tM. Alterações da identidade das posições indicadas na figura 18B levam a uma perda >1300 vezes da afinidade do aptâmero mutante para a coagulação Fxa. Concentrações variáveis de aptâmeros llF7t e HF7tM foram adicionadas ao plasma humano in vitro, e o tempo de coagulação foi medido em seguida num PT (Fig. 19A) ou teste APTT (Fig. 19B). Na Figura 19, as linhas pontilhadas indicam mudança relativa no tempo de coagulação de plasmas contendo 10% ou menos de 1% do nível de plasma normal de FX, o que demonstra o potente efeito anticoagulante do aptâmero llF7t. Todos os dados são normalizados para a linha de base para aquele dia, de modo a que um valor de 1 = inalteração no tempo de coagulação. O aptâmero llF7t 105 também é um poderoso anticoagulante do plasma humano, testado em ensaios de coagulação do PT, como seria de esperar de um inibidor FXa. O aptâmero mutante, HF7tM não mostrou nenhuma atividade anticoagulante nem no ensaio PT nem no ensaio ΆΡΤΤ.
Os oligonucleotideos antídoto seguintes foram selecionados pela capacidade de inverter a atividade anticoagulante da aptâmero llF7t in vitro no plasma humano: AO 5-1: 5' CUC GCU GGG GCU CUC 3' AO 5-2: 5' UAU UAU CUC GCU GGG 3' AO 3-1: 5' AAG AGC GGG GCC AAG 3' AO 3-3: 5' GGG CCA AGUAUU AU 3' A Figura 20 mostra as sequências de llF7t às quais estes oligonucleotideos antídoto são complementares. Tal como mostra a Figura 21A, os oligonucleotideos antídoto invertem de maneira eficaz a atividade do aptâmero llF7t no plasma humano. Nestas experiências, o aptâmero foi adicionado ao plasma (numa concentração final de 125 nM) e permitiu incubar durante 5 minutos. Os oligonucleotideos antídoto foram então adicionados, e os testes APTT foram iniciados 10 minutos após a adição do antídoto. Em adição aos oligonucleotideos antídoto acima descritos, as seguintes sequências foram também reconhecidas como tendo atividade de antídoto contra o aptâmero llF7t: AO 3-2: 5' CAA GAC CGG GGC CAA 3' AO 5-3: 5' CGA GUA UUA UCU UG 3' A Figura 21B mostra a caracterização da atividade do antídoto 5-2 sobre uma maior amplitude de concentração do antídoto 5-2, e a comparação com a atividade de antídoto de uma versão de uma sequência mista do antídoto 5-2, 5-2scr. Os dados demonstram uma potente inversão da atividade do antídoto, e especificidade da atividade do oligonucleotídeo de antídoto conforme demonstrado pela falta de atividade 106 reversa do AO 5-2scr.
As Figuras 22 e 23 referem-se à capacidade para rápida e duradouramente controlar a atividade anticoagulante do antagonista FXa do aptâmero llF7t, e seus derivados, utilizando oligonucleotideos antídoto. Juntos, estes dados demonstram que o início da ação do antídoto é rápida (Fig. 22), que o tempo necessário para o antídoto para atuar, depende pelo menos em parte da concentração de antídoto (Fig. 22), e quando o antídoto tiver inativado o aptâmero, esse efeito é duradouro (Fig. 23) . Juntos, estes dados indicam que os oligonucleotideos antídoto podem ser administrados por via intravenosa num humano ou outro animal, sendo um potencial método para o uso de oligonucleotideos antídoto para modular a atividade de um aptâmero terapêutico. Além disso, devido à atividade do antídoto ser durável, uma vez que o nível desejado de modulação do aptâmero pelo antídoto é atingido, a infusão do antídoto pode ser terminada, permitindo ao antídoto residual limpar o humano ou animal. Isto permite posterior re-tratamento do ser humano ou animal com o aptâmero conforme necessário. EXEMPLO 8
Funcionamento Independente dos Pares de Aptâmero Antídoto
Para demonstrar que os pares de aptâmero-antídoto (aptâmero 9.3t e seu antídoto A05-2c e aptâmero llF7t e seu antídoto A05-2) funcionam de forma independente um do outro, foram adicionados aptâmeros ao plasma humano a 37°C, conforme indicado na Figura 24, e permitidos incubar durante 5 minutos. Os antídotos foram adicionados em seguida e a atividade de coagulação foi medida 10 minutos após a adicção antídoto nos testes APTT. Em todos os ensaios, o tampão puro foi substituído pelo aptâmero ou 107 antídoto nos casos em que apenas um aptâmero ou antídoto foi adicionado ao plasma. Todos os dados foram normalizados para a linha de base para esse dia, de modo que um valor de 1 = inalteração no tempo de coagulação.
Comparando a amostra Apt 1&2+AD1 ao Apt 1 puro e a amostra Apt 1&2+AD2 ao Apt2 puro (ver fig. 24), é evidente que a atividade de inversão do antídoto é especifica para o aptâmero alvo (por exemplo, não houve perda de atividade do Apt 2 na presença de AD 1 e vice-versa) , e a atividade do antídoto foi efetivamente inalterada pela presença do segundo aptâmero.
Estes resultados têm duas implicações importantes. Primeiro, eles demonstram a capacidade de um paciente com uma dose de ligando de ácido nucleico 1 (por exemplo, 9.3t), inverter esse ligando de ácido nucleico com o seu antídoto correspondente, e depois voltar a tratar o doente com um segundo ligando de ácido nucleico. Em segundo lugar, os resultados demonstram a utilidade dos pares de antídoto do ligando de ácidos nucleicos para a validação de destino, bem como o estudo das vias bioquímicas. O antídoto permite determinar que a resposta observada após a inibição da proteína alvo com um ligando de ácidos nucleicos é devida especificamente à inibição da proteína. Além disso, o antídoto possibilita determinar se a ligação do ligando de ácido nucleico à proteína alvo leva ao retorno da proteína. Por exemplo, se além da adicção de antídoto, a atividade da proteína completa é restaurada, diz-se que não houve mudança liquida na concentração de proteína como resultado da ligação do ligando de ácido nucleico. EXEMPLO 9
Função do Aptâmero PEG-9.3t e do Antídoto 5-2C no Plasma de Pacientes com Trombocitopenia Induzida por Heparina (HIT) 108 A capacidade de controlar a atividade anticoagulante da heparina com protamina permite um tratamento mais seguro de pacientes submetidos a procedimentos que exigem um elevado nivel de anticoagulação, nos quais o risco pós-processo de hemorragia é elevado. No entanto, ~ 3-5% dos pacientes que recebem heparina desenvolvem uma resposta imunológica induzida por um fármaco denominado trombocitopenia induzido pela heparina (HIT), que contra-indica outros tratamentos destes pacientes com heparina (Warkentin et al, Thromb Haemost 79: 1-7. (1998)) . Esta doença é caracterizada por uma diminuição na contagem de plaquetas e pelo aumento do risco uma vida nova ou recorrente e latente tromboembolismo (Warkentin et al,
Thromb Haemost 79: 1- -7. (1998)) . Várias alternativas anticoagulantes estão disponíveis, mas nenhum desses anticoagulantes pode ser controlado por um agente de inversão. Isso limita significativamente as opções de tratamento para pacientes com HIT, e complicações hemorrágicas e são comuns as situações de tromboembolismo recorrente durante o tratamento (Greinacher et al, Circulation 99: 73 - 80. (1999), Lewis et al, Circulation 103: 1838-1843. (2001)). Portanto, a capacidade do aptâmero Peg-9.3t e do antídoto 5-2C para servirem como um par anticoagulante-antídoto em amostras de plasma de seis pacientes com HIT foi investigado, três em estágio final de doença renal, necessitando de hemodiálise e, portanto, anticoagulações repetidas, e três com complicações tromboembólicas que necessitam de terapêutica anticoagulante. O critério serológico incluiu um ensaio positivo de agregação de plaquetas induzido por heparina (Ortel et al, Thromb Haemost 67: 292-296. (1992)) e/ou níveis elevados de anticorpos do fator plaquetário 4/heparina detetados por ELISA (GTI, Inc., Brookfield, WI). 109
Cinco pacientes preencheram os critérios clínicos e serológicos; um paciente cumpriu os critérios clínicos, mas teve estudos serológicos negativos. O aptâmero PEG-9.3t prolongou os tempos de coagulação APTT do plasma de todos os seis pacientes, e o antídoto 5-2 foi capaz de efetivamente inverter essa atividade anticoagulante à base dum pré-tratamento a cada paciente (Fig. 25). É importante referir que, dois pacientes estavam a receber terapêutica anticoagulante momento em que as amostras foram tomadas (paciente 3 com sódio danaproid e paciente 6 com varfarina), e a adicção de PEG-9.3t ao plasma desses pacientes aumentou o tempo de coagulação sobre a base do tratamento, e antídoto 5-2C inverteu essa resposta de volta ao início do tratamento, demonstrando que no plasma paciente este par fármaco-antídoto pode funcionar independentemente de um anticoagulante "de bordo". Além disso, o tratamento dessas amostras de plasma desses pacientes com o aptâmero 9.3tM de controlo e com o antídoto 5-2C resultou nenhum aumento no tempo de coagulação, indicando também que os oligonucleotídeos da composição do aptâmero ou do antídoto não possuem inerentemente atividade anticoagulante significativa. A capacidade do aptâmero llF7t e do antídoto correspondente 5-2 serviram como um par anticoagulante-antídoto em amostras de plasma de 2 pacientes com HIT, em estágio final de doença renal, necessitando de hemodiálise e, portanto de anticoagulações repetidas e uma com complicações tromboembólicas que exijam terapêutica anticoagulante. O aptâmero llF7t prolongou os tempos de coagulação APTT do plasma de ambos os pacientes, e o antídoto 5-2 foi capaz de efetivamente inverter essa atividade anticoagulante à base de um pré-tratamento de cada paciente (Fig. 26) . Importa realçar que estes dois 110 pacientes estavam a receber terapêutica anticoagulante no momento em que as amostras foram tomadas (paciente 3 com sódio danaproid e paciente 6 com varfarina), e a adicção de llF7t ao plasma desses pacientes aumentou o tempo de coagulação sobre a base do tratamento e o antídoto 5-2 inverteu esta resposta para o início do tratamento, demonstrando que no plasma do paciente este par fármaco-antídoto pode funcionar independentemente de um anticoagulante "de bordo". Além disso, o tratamento dessas amostras de plasma de pacientes com o aptâmero de controlo 9.3tM e com o antídoto 5-2 não apresentou nenhuma alteração no aumento do tempo de coagulação, indicando também que os oligonucleotideos da composição do aptâmero ou do antídoto não possuem inerente atividade anticoagulante significativa. 111 LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> SULLENGER, BRUCE À RUSCONI, CHRISTOPHER <12 0> MODULADORES DE AGENTES FARMACOLÓGICOS <130> 1579-684 <14 0> 10/155,233 <141> 2002-05-28 <150> 60/293,231 <151> 2001-05-25 <150> 60/331,037 <151> 2001-11-07 <160> 41 <17 0> Patentin Ver. 2.1 <12 0> 1 <211> 35 <212> ANP <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâme <22 0> <221> misc_ARN <222> (35) <22 3> N=idT <400> auggggacua uaccgcguaa ugcugccucc ccaun 35
<210> 2 <211> 40 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 2 112 gggaugggga cuuaccgcg uaaugcugcc uccccauucc 40
<210> 3 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 3
ggggacuaua ccggcaaucg ugcaucccc 29 <210> 4 <211> 30 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 4
ugggaccaua acgacuacuc gugaauccca 30 <210> 5 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 5 ugggcacuau acgcaucuua cugccug 27
<210> 6 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 6 113 ugggcgauau acacauuggu gauccca 27
<210> 7 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0>
Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 7 gggaccauac gcacauugcu gaauccc 27
<210> 8 <211< 29 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> : Aptâmero 29 <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 8
ugggacuaua uucggaaucu ggacuccca <210> 9 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0>
Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 9 gggaugggcu auauacacgc uggugauccc aucuc 35
<210> 10 <211> 33 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0>
Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 10 114 ggaugggcga uaaccaacau ggugauccca uuc 33
<210> 11 <211> 27 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 11
Ugggccauac guggacgacu gcacccg 27 <210> 12 <211> 27 <212> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 12 ugggccauaa ccacuuuuggu gaaccca 27
<210> 13 <211> 30 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 13
gggcgccaua cgcacauugc ugcaucgccu 30 <210> 14 <211> 28 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 14 28 gggaccauaa cucuaacggg ugaauccc 115
<210> 15 <211> 29 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> ial: Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artific <400> 15 ggggacuaua cgugaacgac ugcauccac 2 9
<210> 16 <211> 26 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> ial: Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artific <400> 16 uggguaauaa cuguauggug aaccca 26
<210> 17 <211> 25 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> ial: Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artific <400< 17
gggugauaac cacucuggug aaccc 25 <210> 18 <211> 33 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> ial: Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artific <400> 18 auggggacua uaccggcaau cgugcauccc cau <210> 19 33 116 116 <211> 35 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <22 3> Descrição da Sequência <22 0> <221> misc_ARN <222> (27) <22 3> N=mGmUmCidT <400> 19
Aptâmero auggggacua uaccgcguaa ugcugccucc ccaun 35
<210> 20 <211> 20 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0>
Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 20 gacaugggga ggcagcauua 20
<210> 21 <211> 17 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0>
Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 21 gacaugggga ggcagca 17
<210> 22 <211> 14 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> 117 117 Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 22 gacaugggga ggca 14
<210> 23 <211> 37 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0>
Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial: <22 0> <221> misc_ARN <222> (37) <223> N=idT <400> 23 gagagcccca gcgagauaau acuuggcccc gcucuun 37
<210> 23 <211> 37 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0>
Aptâmero <223> Descrição da Sequência Artificial: <22 0> <221> misc_ARN <222> (37) <223> N=idT <400> 24 gagacccca gcgagauaau acuuguaccc gcucuun 37
<210> 25 <211> 17 <212> ARN <213> Sequência Artificial 118 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 25 auggggaggc agcauua 17
<210> 26 <211> 18 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 26 cauggggagg cagcauua 18
<210> 27 <211> 15 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 27 cauggggagg cagca 15
<210> 28 <211> 12 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 28 cauggggagg ca 12
<210> 29 <211> 23 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> 119 <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 29 gcauuacgcg guauaguccc cua 23
<210> 30 <211> 17 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 30 cgcggaauag uccccua 17
<210> 31 <211> 15 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 31 cucgcugggg cucuc 15
<210> 32 <211> 15 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 32 uauuaucucg cuggg 15
<210> 33 <211> 15 <212> ARN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero 120 <400> 33 agagcgggg ccaag 15 <210> 34 <211> 14 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <22 3> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 34 gggccaagua uuau 14 <210> 35 <211> 16 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 35 caagagcggg gccaag 16 <210> 36 <211> 16 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <22 3> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 36 cgaguauuau cuug 14 <210> 37 <211> 12 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <22 3> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 37 121 caugggaaag ca 12 <210> 38 <211> 11 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 38 auggggaggc 11 <210> 39 <211> 14 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <22 3> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 39 gacaugggga agca 14 <210> 40 <211> 14 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <22 3> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 40 acaaugggga ggca 15 <210> 41 <211> 17 <212> ARN <213> <22 0> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: Aptâmero <400> 41 cgcgguauag uccccau 17 122 123
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.
Documentos de Patente citados na descrição us 601293231 A [0001] us 33103701 . P [0001] us 5364289C i A [0003] us 5475096 A [0003][0065] us 93147392 : a [0003] us 5270163 A [0003][0007] wo 9119813 A [0003] us P5780221 . A [0006][0063] us 5670637 A [0007] [0008] [0065] us 5696249 A [0007] [0008] [0065] us 5843653 A [0007] [0011] [0065] us 6110900 A [0007][0011][0065] us 5686242 A [0007][0065] us 6114120 A [0008][0013][0065] us 5756291 [0009] [0065] us 5582981 A, 0'Toole [0009] us 5527894 A [0009][0065] us 5637461 A, Gold [0009][0065] us 5496938 A [0009] us 5476766 A [0009] us 5459015 A [0009] [0065] us 5472841 [0009] [0065] 124 • US 5849479 A [0009] [0065] • US 5726017 A [0009][0065] • US 5731144 A [0009] [0065] • US 5780228 A [0009] [0065] • US 5766853 A [0009] [0065] • US 5674685 A [0009][0065] • US 6140490 A [0009] [0065] • US 5869641 A [0009] [0065]
White • WO 0226932 A2. Sullenger, Rusconi, Kontos [0010] [0155] US 6022691 A, Bruice [0011] [0065] US 5789163 A [0011] [0065] US 6147204 A [0011] [0065] [0149] US 5705337 A [0011] [0065] US 5962219 A [0011] [0065] US 5763595 A [0011] [0065] US 5998142 A [0011] [0065] US 5660985 A [0012][0065] US 6083696 A [0012] [0065] US 5817785 A [0012][0065] US 5648214 A [0012] [0065] US 5763566 A [0013][0065] US 5580737 A [0013][0065] US 5567588 A [0013][0065] US 5814476 A [0014] US 5723323 A [0014] US 5245022 A, Weiss [0015] US 5670633 A [0016] US 6005087 A, Cook [0016] US 6222025 A [0016] US 5760202 B, Cook [0016] EP 0593901 BI [0016] US 6411020 B, Gold [0016] 125 us 4973679 A [0017] us 4668777 A [0017] us 4415732 A [0017] us 4500707 A [0017] us 4458066 A [0017] us 5153319 A [0017] us 5278302 A [0017] us 5453496 A [0017] us 5602244 A [0017] us 6387635 B [0065] us 6387620 B [0065] us 6379900 B [0065] us 6376474 B [0065] us 6376190 B [0065] us 6355787 B [0065] us 6355431 B [0065] us 6346611 B [0065] us 6344321 B [0065] us 6344318 B [0065] us 6331398 B [0065] us 6331394 B [0065] us 6329145 B [0065] us 6306598 B [0065] us 6303316 B [0065] us 6300074 B [0065] us 6291184 B [0065] us 6287765 B [0065] us 6280943 B [0065] us 6280932 B [0065] us 6264825 B [0065] us 6261783 B [0065] us 6251774 B [0065] us 6242246 B [0065] 126
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Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes de uma via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero, em que o aptâmero do fator de coagulação é um ácido nucleico de cadeia simples que se liga ao fator de coagulação, e em que o modulador oligonucleotidico híbrida em condições fisiológicas com o aptâmero do fator de coagulação.
2. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com a reivindicação 1, em que o dito modulador oligonucleotidico é combinado com um veículo farmacêutico.
3. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o modulador oligonucleotidico é complementar ao aptâmero do fator de coagulação.
4. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente 2 inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com a reivindicação 3, em que o modulador oligonucleotídico compreende uma sequência complementar a 6-25 nucleotídeos do aptâmero de fator de coagulação.
5. Utilização de um modulador oligonucleotídico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com a reivindicação 3, em que o modulador oligonucleotídico compreende 5-80 nucleotídeos.
6. Utilização de um modulador oligonucleotídico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com a reivindicação 3, em que o modulador oligonucleotídico compreende 10-30 nucleotídeos.
7. Utilização de um modulador oligonucleotídico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o modulador é complementar a uma região de cadeia simples do aptâmero de fator de coagulação. 3
8. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o modulador é complementar a uma região de cadeia simples do aptâmero de fator de coagulação e uma região da cadeia dupla do aptâmero de fator de coagulação.
9. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, em que o componente da via de coagulação do sangue é um recetor plaquetário gpllbllla; um recetor plaquetário gpIbIX; um recetor plaquetário gpVI; um complexo enzimático fator tecidual / fator de coagulação Vila (TF/fator Vila); um complexo enzimático fator de coagulação VlIIa / fator de coagulação IXa (FVIIIa/FIXa) ; um complexo enzimático fator de coagulação Va / fator de coagulação Xa (FVa/FXa); inibidor 1 de ativador de plasminogénio (PAI-1); fator de coagulação XlIIa (FXIIIa) ; anti-trombina III (ATUI) ; fator de coagulação FIXa (FIXa); e fator de coagulação Xla (FXIa).
10. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe 4 o aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o modulador oligonucleotidico contém uma substituição química.
11. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com a reivindicação 10, em que o modulador compreende uma pirimidina substituída numa posição 5' ou um açúcar substituído numa posição 2'.
12. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero utilizado, de acordo com a reivindicação 11, em que o modulador compreende uma substituição 2'-amino, 2'-flúor ou 2'-0-metilo.
13. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o aptâmero de fator de coagulação possui um marcador detetável, um marcador citotóxico ou um marcador radioativo.
14. Utilização de um modulador oligonucleotidico na 5 produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o modulador oligonucleotidico compreende um ácido nucleico bloqueado (LNA).
15. Utilização de um modulador oligonucleotidico na produção de um medicamento para especifica e rapidamente inverter os efeitos de anticoagulação e antitrombóticos de um aptâmero do fator de coagulação que tem como alvo componentes da via de coagulação num hospedeiro que recebe o aptâmero de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o componente da via de coagulação do sangue é um fator IXa, fator Xa, ou trombina.
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