FR3011250A1 - Acides nucleiques se liant specifiquement au facteur ix/ixa humain, et utilisations - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain.

Description

TITRE DE L'INVENTION Acides nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain, et leurs utilisations DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de l'identification de ligands spécifiques du Facteur IX/IXa humain, ces ligands étant destinés notamment à la purification et à la détection de cette protéine, ainsi qu'à leur utilisation dans le domaine médical.

ART ANTERIEUR Le facteur IX (FIX), également appelé facteur anti-hémophilique B, est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FIXa), participe au processus de coagulation en interagissant avec le thromboplastinogène (facteur VIII de la coagulation) pour former la thromboplastine, une enzyme indispensable à la coagulation du sang. Le FIX est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 415 résidus d'acides aminés, dont la masse moléculaire est d'environ 57 à 68 kDa. Le FIXa joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FIX est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie présentant un déficit en facteur IX (hémophilie de type B ou maladie de Christmas). En effet, l'hémophilie B est un déficit héréditaire en facteur IX de coagulation, lié au sexe, et qui se caractérise par des hémorragies au niveau des articulations, des muscles, des organes internes, ces hémorragies pouvant être spontanées, accidentelles ou liées à une intervention chirurgicale. Le traitement de substitution permet d'augmenter les taux plasmatiques de facteur IX, palliant temporairement le déficit et corrigeant les tendances hémorragiques. Il est donc nécessaire de disposer de concentrés de FIXa injectables. La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FIXa a consisté en la purification du FIXa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement. Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FIXa, obtenue après adsorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FIX et le FIXa et d'autres protéines telles les facteurs VII (FVII), X (FX) et II (FII), notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX). L'inconvénient de ce procédé est que le FIX obtenu contient encore quelques traces d'autres facteurs de coagulation.

La demande de brevet WO 2002/077161 décrit la production de FIXa dans un animal transgénique. Une telle méthode de production permet d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De plus, une telle méthode permet d'obtenir des protéines dont la séquence primaire, c'est-à-dire un enchaînement identique entre les différents acides aminés, est identique à la séquence primaire humaine. Toutefois, quelle que soit la source initiale de Facteur IX/IXa, les procédés mis en oeuvre génèrent des compositions enrichies en Facteur IX/IXa humain comprenant des substances contaminantes. Pour les procédés de purification du Facteur IX/IXa à partir de plasma humain, il serait très avantageux de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt d'activité thrombogénique résiduelle. Pour les procédés d'obtention de Facteur IX/IXa humain recombinant purifié, il est essentiel de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt, de protéines cellulaires indésirables. En particulier, pour les compositions de Facteur IX/IXa humain purifié à partir de fluides biologiques provenant de mammifères transgéniques, il est important de disposer d'un produit final exempt, ou quasi- exempt, de Facteur IX/IXa produit par ailleurs naturellement par ces mammifères transgéniques, susceptible d'être immunogène chez l'homme. Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de disposer d'outils efficaces et spécifiques permettant la purification du Facteur IX/IXa humain à partir d'un échantillon comprenant ledit Facteur IX/IXa, et pouvant être produits facilement et de manière reproductible. RESUME DE L'INVENTION Il est fourni selon l'invention des acides nucléiques monobrin se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain. La présente invention concerne aussi divers composés se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, qui comprennent dans leur structure au moins un acide nucléique défini ci-dessus. Elle est également relative à des complexes entre (i) un acide nucléique ou un composé tels que définis ci-dessus et (ii) un facteur IX/IXa humain. Cette invention a également trait à un support pour l'immobilisation du Facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques ou de composés tels que définis ci-dessus.

L'invention a aussi pour objet un procédé pour l'immobilisation du facteur IX/IXa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un support tel que défini ci-dessus. L'invention est aussi relative à un procédé pour la purification du Facteur IX/IXa humain comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un acide nucléique ou avec un support tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa humain, et b) libérer le Facteur IX/IXa humain à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer le Facteur IX/IXa humain purifié. L'invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur IX/IXa humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un acide nucléique ou un support tel que défini ci-dessus avec ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa. La présente invention a également trait à des utilisations médicales préventives ou curatives des acides nucléiques tels que définis ci-dessus.

DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre les séquences consensus des divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain identifiés par les inventeurs. Les séquences représentées sur la figure 1 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 8, relatives, respectivement, aux familles d'aptamères désignés par « Nonapta 1 » à « Nonapta 8 ». La Figure 2 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain et résultant de la mise en oeuvre de deux séries distinctes de sélection in vitro de type SELEX, désignées SELEX 5 et SELEX 6. Les séquences représentées sur la figure 2 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 9 à SEQ ID N° 20, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 1 ». ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 20 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 9 par la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction).

La Figure 3 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin de la mise en oeuvre du procédé de type SELEX, désigné SELEX 6. Les séquences représentées sur la figure 3 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 21 et SEQ ID N° 23, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 2 ». ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 23 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 21 par la technique de PCR. La Figure 4 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin de la mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX (désigné SELEX 5). Les séquences représentées sur la figure 4 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 24 à SEQ ID N° 44, relatives à la famille d' aptamères désignée « Nonapta 3 ». La Figure 5 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 6). Les séquences représentées sur la figure 5 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 45 à SEQ ID N° 67, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 3 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 67 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 45 par la technique de PCR. La Figure 6 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 5). Les séquences représentées sur la figure 6 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 68 à SEQ ID N° 104, relatives à la famille d' aptamères désignée « Nonapta 4 ». La Figure 7 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 6). Les séquences représentées sur la figure 7 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 105 à SEQ ID N° 131, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 4 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 131 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 105 par la technique de PCR.

La Figure 8 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX (i.e. SELEX 6). Les séquences représentées sur la figure 8 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 132 à SEQ ID N° 134, relatives à la famille d'aptamères désignée « Nonapta 5 ». Les séquences représentées en lettres minuscules SEQ ID N° 132 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») utilisées pour l'amplification de l'aptamère de SEQ ID N° 133 par la technique de PCR. La Figure 9 illustre un alignement de divers aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en oeuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 9 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N° 135 à 138 relatives à la famille d'aptamères « Nonapta 6 », les séquences SEQ ID N° 139 à 141 relatives à la famille d'aptamères « Nonapta 7 »et les séquences SEQ ID N° 142 et 143 relatives à la famille d'aptamères « Nonapta 8 ». Les séquences représentées en lettres minuscules en SEQ ID N° 135, 136, 137, 139 et 142 correspondent aux séquences complémentaires des « amorces » (ou « primers ») utilisées pour l'amplification des aptamères, respectivement, de SEQ ID N° 138 en tout ou partie, 140 et 143 par la technique de PCR. La Figure 10 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 1 (i.e. SEQ ID N° 20 en figure 2), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1: Nonapta 1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 25 nM ; courbe 2: Nonapta 1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM. La Figure 11 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 2 (i.e. SEQ ID N° 23 en figure 3), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, 30 exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1: Nonapta 2 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2: Nonapta 2 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM. La Figure 12 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 3 (i.e. SEQ ID N° 67 en figure 5) 0, au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1: Nonapta 3.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2: Nonapta 3.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM. La Figure 13 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 5 (i.e. SEQ ID N° 132 en figure 8), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1: Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2: Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3: Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 15 nM ; courbe: 4 Nonapta 5 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. La Figure 14 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, dérivé de l'aptamère Nonapta 5 (i.e. Nonapta 5.1, SEQ ID N° 133 en figure 8), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de 20 résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 5.1 avec FIX humain plasmatique purifié à la 25 concentration de 100 nM. La Figure 15 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique dérivé de l'aptamère Nonapta 5 (i.e. Nonapta 5.7, SEQ ID N° 134, figure 8), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de 30 résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 5.7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. La Figure 16 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 6 (i.e. SEQ ID N° 135 en figure 9), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 6 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 6 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 6 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 200 nM ; courbe 4 Nonapta 6 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. La Figure 17 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique dérivé de l'aptamère Nonapta 6 (i.e. Nonapta 6.3, SEQ ID N° 136, figure 9), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1000 nM ; courbe 2 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 6.3 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. La Figure 18 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique dérivé de l'aptamère Nonapta 6 (i.e. Nonapta 6.4, SEQ ID N° 137, figure 9), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 6.4 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 6.4 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 6.4 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 6.4 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. La Figure 19 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 7 (i.e. SEQ ID N° 139, figure 9), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 1 000 nM ; courbe 2 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 3 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 4 Nonapta 7 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 100 nM. La Figure 20 illustre les courbes de liaison d'un acide nucléique, appartenant à la famille Nonapta 8 (i.e. SEQ ID N° 142, figure 9), au Facteur IX humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 Nonapta 8 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2 Nonapta 8 avec FIX humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM. La Figure 21 représente un profil de purification par chromatographie d'affinité d'une composition de Facteur IX humain (produit Betafact® commercialisé par la société LFB, France). En abscisse : le temps, exprimé en minutes. En ordonnées: les valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm, exprimées en Unités Arbitraires (mAU). Sur la courbe, l'injection du Facteur IX humain est réalisé au temps 0. Sur la courbe, « 1 » correspond à la fraction non retenue, « 2 » correspond à la fraction liée de manière non-spécifique et éliminée au cours de l'étape de lavage, « 3 » correspond au pic de la fraction d'élution. La Figure 22 représente le cliché d'un gel d'électrophorèse SDS PAGE dans lequel les pistes n°1 et 1' correspondent au produit de départ de Facteur IX Betafact®, les pistes n°2 et 2' correspondent à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne et les pistes n°3 et 3' correspondent à la fraction d'élution.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Il est fourni selon l'invention de nouveaux outils aptes à se lier de manière spécifique au Facteur IX/IXa humain, de taille réduite, faciles et peu onéreux à synthétiser, et qui peuvent être employés dans tous les domaines d'application dans lesquels de tels outils sont utiles, y compris pour la purification du Facteur IX/IXa humain, pour la détection du Facteur IX/IXa humain et pour l'utilisation en tant que principe actif de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des troubles de la coagulation.

Plus précisément, la demanderesse a obtenu une collection d'acides nucléiques monobrins aptes à se lier de manière spécifique au Facteur IX/IXa humain, lesquels acides nucléiques sont décrits plus loin dans la présente description. Comme cela sera détaillé plus loin, la famille d'acides nucléiques de l'invention, qui sont aptes à se lier de manière spécifique au Facteur IX/IXa humain, consistent en des acides nucléiques simple brin, préférentiellement de type ADN, que le demandeur pense être capables d'adopter des conformations dans l'espace qui contribuent à leur conférer leurs propriétés de liaison au Facteur IX/IXa précitées. De manière générique, les acides nucléiques de l'invention peuvent aussi être appelés « aptamères » nucléotidiques, en référence à un terme couramment utilisé par l'homme du métier pour désigner ce type de molécules. On connaît déjà dans l'état de la technique des aptamères nucléiques capables de se lier à diverses protéines impliquées dans la voie de la coagulation sanguine, y compris des aptamères liant le Facteur de Willebrand (Demande PCT n° WO 2008/150495), des aptamères liant l'alpha-thrombine (demande de brevet euopéen n° EP 1 972 693) ou la thrombine (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19) : 7586-7593), des aptamères liant le Facteur IX/IXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95 : 767-771; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vasc Biol, Vol. 27 : 722-727; Demande PCT n° WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n° US 7,312,325), des aptamères liant le Facteur X/Xa (Demande PCT n° WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n° US 7,312,325), des aptamères nucléiques se liant au facteur VII/VIIa humain (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5) : 841-848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17 : 1-11). La présente invention a pour objet un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain. Dans la présente description, un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain peut aussi être désigné « aptamère nucléique », « aptamère », « aptamère se liant au Facteur IX/IXa humain » ou encore « aptamère antiFIX/FIXa humain ». Par Facteur IX/IXa humain, on englobe un Facteur IX/IXa humain naturel (i.e. d'origine plasmatique) et un Facteur IX/IXa humain recombinant. Au sens de la présente description, un Facteur IX/IXa humain est considéré en référence à sa séquence en acides aminés, c'est-à-dire indépendamment du fait que la protéine soit glycosylée ou non glycosylée, et, si la protéine est glycosylée, quel que soit le type de glycosylation. La demanderesse a isolé des familles d'aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain dont elle a pu montrer l'existence de relations entre (i) les caractéristiques structurelles communes et (ii) la ou les caractéristiques fonctionnelles communes. D'un point de vue structurel, un acide nucléique, ou aptamère nucléique selon l'invention, se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain a la formule (I) suivante : [5'-TER] m - [SEQ ID N° X] - [3'-TER] n (I), dans laquelle : - « [5'-TER]ll, » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 50 nucléotides, de préférence entre 1 et 32 nucléotides , - « [3'-TER]ii » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 50 nucléotides, de préférence entre 1 et 40 nucléotides acides nucléiques, - m est un entier égal à 0 ou 1, - n est un entier égal à 0 ou 1, et - « [SEQ ID N° X] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides 15 nucléiques de séquences SEQ ID N° 5 (= Nonapta 5), SEQ ID N° 6 (= Nonapta 6), SEQ ID N° 1 (= Nonapta 1), SEQ ID N° 2 (= Nonapta 2), SEQ ID N° 3 (= Nonapta 3), SEQ ID N° 4 (= Nonapta 4), SEQ ID N° 7 (= Nonapta 7) et SEQ ID N° 8 (= Nonapta 8), dans lesquelles : - « a et A » représentent un nucléotide adénine, 20 - « t et T » représentent un nucléotide thymine, - « c et C » représentent un nucléotide cytosine, - « g et G» représentent un nucléotide guanine, et - « N » représente un nucléotide choisi parmi adénine, thymine, cytosine ou guanine. 25 Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X a une longueur de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 nucléotides. Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X 30 a une longueur de 39 ou 40 nucléotides de longueur. Dans certains modes de réalisation, les entiers « m » et « n » sont tous les deux égaux à 0, et l'acide nucléique de formule (I) est un acide nucléique de formule (IA) suivante : [SEQ ID N° X] (IA), dans laquelle [SEQ ID N° X] a la même signification que pour l'acide nucléique de formule (I). Dans certains modes de réalisation, l'entier m est égal à 1 et l'entier n est égal à 0, et l'acide nucléique de formule (I) est un acide nucléique de formule (I13) suivante : [5'-TER]ff, - [SEQ ID N° X] (IB), dans laquelle [5'-TER] et [SEQ ID N° X] ont la même signification que pour l'acide nucléique de formule (I). Dans certains modes de réalisation, l'entier m est égal à 0 et l'entier n est égal à 1, et l'acide nucléique de formule (I) est un acide nucléique de formule (IC) suivante : [SEQ ID N° X] - [3'-TER]' (IB), dans laquelle [3'-TER] et [SEQ ID N° X] ont la même signification que pour l'acide nucléique de formule (I). Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique « 5'-TER », lorsqu'il est présent, a une longueur de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucléotides, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées. Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique « 3'-TER », lorsqu'il est présent, a une longueur de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucléotides, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées. Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 ou 140 nucléotides de longueur, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées. La collection d'aptamères nucléiques anti-FIX/FIXa selon l'invention comprend une pluralité de familles d'aptamères nucléiques, chaque famille d'aptamères nucléiques étant caractérisée par des caractéristiques structurelles communes, en particulier par une séquence d'acide nucléique commune. En d'autres termes, deux aptamères nucléiques appartenant à une famille donnée d'aptamères nucléiques anti-FIX/FIXa selon l'invention possèdent entre eux une séquence consensus commune, et en particulier une séquence commune qui est désignée « SEQ ID N° X» dans la présente description. La collection d'aptamères nucléiques antiFIX/FIXa selon l'invention englobe en particulier huit familles d'aptamères nucléiques, désignées respectivement « Nonapta 1 », « Nonapta 2 », « Nonapta 3 », Nonapta 4 », « Nonapta 5 », « Nonapta 6 », « Nonapta 7 » et « Nonapta 8 », chaque famille d'aptamères nucléiques comprenant une séquence nucléique consensus, et en particulier une séquence nucléique consensus désignée « SEQ ID N° X », qui est commune à tous les aptamères de ladite famille.

Dans la collection d'aptamères nucléiques de l'invention, l'ensemble des séquences SEQ ID N°X consiste en un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N° 1 (= Nonapta 1), SEQ ID N° 2 (= Nonapta 2), SEQ ID N° 3 (= Nonapta 3), SEQ ID N° 4 (= Nonapta 4), SEQ ID N° 5 (= Nonapta 5), SEQ ID N° 6 (= Nonapta 6), SEQ ID N° 7 (= Nonapta 7) et SEQ ID N° 8 (= Nonapta 8). De manière générale, un acide nucléique SEQ ID N°X ayant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec une séquence nucléique de référence possède au moins 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec ladite séquence nucléique de référence. Selon une première variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 5 (= Nonapta 5). Selon cette première variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 133 (= Nonapta 5.1) ou SEQ ID N° 134 (=Nonapta 5.7), de préférence un acide nucléique de séquence SEQ ID N° 134. Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 133 ou SEQ ID N° 134.

Selon une seconde variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 6 (= Nonapta 6). Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 6. Selon une troisième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un 10 acide nucléique de SEQ ID N° 7 (= Nonapta 7). Selon cette troisième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 139, SEQ ID N° 140 ou SEQ ID N° 141. Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de 15 l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 139, SEQ ID N° 140 ou SEQ ID N° 141. Selon une quatrième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence 20 SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 2 (= Nonapta 2). Selon cette quatrième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22 ou SEQ ID N° 23. 25 Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22 ou SEQ ID N° 23. 30 Selon une cinquième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 3 (= Nonapta 3). Selon cette cinquième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 24 à SEQ ID N° 67.

Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 24 à SEQ ID N° 67. Selon une sixième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 1 (= Nonapta 1). Selon cette sixième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut 10 alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 9 à SEQ ID N° 20. Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 1 ou 15 SEQ ID N° 9 à SEQ ID N° 20. Selon une septième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 4 (= Nonapta 4). Selon cette septième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut 20 alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 68 à SEQ ID N° 131. Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 4 ou 25 SEQ ID N° 68 à SEQ ID N° 131. Selon une huitième variante de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° X peut être figuré par un acide nucléique ayant au moins 80 % d'identité avec un acide nucléique de SEQ ID N° 8 (= Nonapta 8). Selon cette huitième variante de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) peut 30 alors être figuré par un acide nucléique de SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 142 ou SEQ ID N° 143. Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de formule (I) de l'invention, la séquence dudit acide nucléique possède au moins 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 142 ou SEQ ID N° 143. Dans certains modes de réalisation, la séquence SEQ ID N° X d'un acide nucléique selon l'invention peut être choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides, mieux au moins 90 % d'identité en nucléotides, avec au moins l'une des séquences SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6, de préférence la SEQ ID N° 1. Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique selon l'invention peut présenter au moins 80% d'identité en nucléotides, mieux au moins 90 % d'identité en nucléotides, avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°1 à 143. Dans certains modes de réalisation, un acide nucléique selon l'invention peut présenter au moins 80% d'identité en nucléotides, mieux au moins 90 % d'identité en nucléotides, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N°133 (i.e. Nonapta 5.1) ou SEQ ID N° 134 (i.e. Nonapta 5.7), de préférence la séquence SEQ ID N° 134. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.

De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4) OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) = « default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9) TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES = « default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ». Sur la base d'un acide nucléique selon l'invention, tel que représenté en figures 1 à 9, l'homme du métier peut aisément déterminer les séquences spécifiques possibles pour la séquence SEQ ID N° X, au sein de l'ensemble du nombre fini des enchaînements de nucléotides possibles.

L'homme du métier peut vérifier ses propriétés de liaison au Facteur IX/IXa humain, par exemple selon l'une des méthodes spécifiées dans la présente description, en particulier dans les exemples. Selon l'invention, un acide nucléique se liant au Facteur IX/IXa humain consiste en un acide nucléique monobrin capable de former un complexe avec le Facteur IX/IXa humain, lorsqu'il est mis en contact avec ce dernier. Les acides nucléiques se liant au Facteur IX/IXa humain englobent donc ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec le Facteur IX/IXa humain après une étape préalable de mise en contact desdits partenaires respectivement nucléique et protéique. La détection de complexes formés entre un acide nucléique se liant au Facteur IX/IXa humain peut être aisément réalisée par l'homme du métier, par exemple en mettant en oeuvre une technique de détection par résonance plasmonique de surface, y compris la technique Biacore®, comme cela est illustré dans les exemples. L'homme du métier peut aussi aisément détecter la formation de complexes entre un acide nucléique d'intérêt et le Facteur IX/IXa humain par des techniques classiques du type ELISA, ou par toute autre technique de laboratoire capable de mettre en évidence une interaction entre un acide nucléique et une protéine. Comme cela est illustré dans les exemples, un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité de liaison à tout type de Facteur IX/IXa humain. Qui plus est, la liaison d'un acide nucléique de formule (I) au Facteur IX/IXa humain naturel est spécifique.

En effet, un acide nucléique de formule (I) possède une très faible capacité de liaison au Facteur VII/VIIa, voire même une capacité nulle. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les résultats présentés dans les exemples montrent qu'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention possède une forte capacité à se lier à des facteurs IX/IXa humains ayant des types distincts de glycosylation. En d'autres termes, le demandeur pense qu'un acide nucléique de formule (I) est capable de se lier efficacement, non seulement au Facteur IX/IXa provenant de sources naturelles, y compris le plasma humain, mais également à un Facteur IX/IXa humain recombinant produit en culture cellulaire in vitro, ou dans un animal transgénique, préférentiellement un mammifère transgénique, de différentes espèces, y compris le lapin, dont les types de glycosylation peuvent différer, même légèrement du type de glycosylation du Facteur IX/IXa humain produit naturellement dans le plasma sanguin. Selon l'invention, un acide nucléique se liant « spécifiquement » au Facteur IX/IXa humain consiste en un acide nucléique possédant une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain supérieure à sa capacité à se lier à toute autre protéine, et en particulier aux Facteurs VII/VIIa. Au sens de la présente description, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque, en utilisant l'une quelconque des techniques de détection de liaison ci-dessus, et dans les mêmes conditions d'essai, une valeur de signal de liaison supérieure statistiquement significative est obtenue avec le premier acide nucléique, par rapport à celle obtenue avec les seconds acides nucléiques. De manière illustrative, lorsque la technique de détection de liaison utilisée est la technique Biacore , comme dans les exemples, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque la valeur de signal de résonance pour le premier acide nucléique, quelle que soit l'unité de mesure de résonance exprimée, est statistiquement supérieure à la valeur de signal de résonance mesurée pour le second acide nucléique. Deux valeurs de mesure « statistiquement » distinctes englobent deux valeurs qui ont entre elles un écart supérieur à l'erreur de mesure de la technique de détection de liaison utilisée.

Comme cela est illustré dans les exemples, on a testé la capacité des acides nucléiques de l'invention à se lier spécifiquement au Facteur IX/IXa humain. Qui plus est, les acides nucléiques de formule (I) selon l'invention sont en outre avantageux en ce qu'ils ont une capacité à se lier au Facteur IX/IXa humain qui est significativement supérieure à leur capacité de liaison à n'importe quel autre Facteur. En particulier, alors qu'un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité à se lier à tout type de Facteur IX/IXa humain, y compris naturel ou recombinant, il a une capacité faible, et même nulle, à se lier à un Facteur VII/VIIa codé par le génome d'un mammifère non humain. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, ces caractéristiques de spécificité de la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au Facteur IX/IXa humain illustrent que les acides nucléiques aptamères de l'invention peuvent être avantageusement utilisés pour discriminer entre un Facteur IX/IXa humain et un Facteur VII/VIIa humain voire, en outre, discriminer entre un Facteur IX/IXa humain et un Facteur IX/IXa non humain. En particulier, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans un moyen de purification d'un Facteur IX/IXa humain, y compris à partir d'un milieu de départ complexe susceptible de contenir un Facteur IX/IXa en association avec d'autres types de facteurs de la coagulation, tel que par exemple le Facteur VII/VIIa. Notamment, un acide nucléique de formule (I) peut être utilisé dans un moyen de purification du Facteur IX/IXa recombinant dans un fluide biologique d'un animal transgénique pour le Facteur IX/IXa humain, ledit fluide biologique étant susceptible de contenir d'autres facteurs de la coagulation, et tout particulièrement étant susceptible de contenir un Facteur IX/IXa produit naturellement par l'animal transgénique. Comme cela est illustré dans les exemples, une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) est son aptitude, dans un complexe avec le Facteur IX/IXa humain, à libérer le Facteur IX/IXa humain par incubation dudit complexe avec un agent chélateur de cations métalliques tels que l'EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) ou l'EGTA (acide éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther)-N,N,N',N'-tétraacétique). On a notamment montré que les molécules de Facteur IX/IXa complexées avec un acide nucléique de formule (I) sont libérées desdits complexes par mise en contact avec un agent chélateur de cations métalliques tel que l'EDTA. Ainsi, selon encore un autre aspect, la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au facteur IX/IXa humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques, y compris par mise en contact avec de l'EDTA ou de 1' EGTA.

Cette caractéristique additionnelle d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est particulièrement avantageuse pour l'utilisation dudit acide nucléique dans un moyen de purification du Facteur IX/IXa humain. En effet, dans un telle application pour la purification, le Facteur IX/IXa humain, immobilisé dans un complexe avec un acide nucléique de formule (I), peut ensuite être récupéré sous forme purifiée par simple mise en contact ou incubation avec un agent chélateur des cations métalliques, donc sans nécessiter l'emploi de substances connues pour dénaturer, au moins partiellement, le Facteur IX/IXa humain, comme les conditions acides ou l'urée. Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur IX/IXa humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement immobilisé sur un support solide. Ledit support solide englobe des particules solides, des supports de chromatographie, etc. Les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques d'intérêt sur des types très variés de supports solides sont bien connues par l'homme du métier. Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester ou encore une bille magnétique ou paramagnétique. Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur IX/IXa humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement inclus dans une structure chimique comprenant également un moyen espaceur et, le cas échéant, un moyen d'immobilisation sur un support solide. Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (II) suivante : [SPAC]- [NUCL] (II), dans laquelle : - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I). Le composé ci-dessus constitue un mode de réalisation particulier d'un moyen de purification du Facteur IX/IXa humain. La « chaîne espaceur » désignée [SPAC] dans le composé de formule (II) peut être de tout type connu. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé peut être immobilisé et de permettre une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCL], par rapport à la surface du support solide sur lequel il peut être immobilisé. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec l'acide nucléique de formule (I), gênent les évènements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules de Facteur IX/IXa humain susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci. Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL]. Avantageusement la chaîne espaceur est liée à la fois à une extrémité de l'aptamère et au support solide. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence, la chaîne espaceur est un oligonucléotide non spécifique ou du Polyéthylène Glycol (PEG). Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur. Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (II) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur englobe un polyéthylène glycol de type PEG(C18). Pour immobiliser l'aptamère directement sur le support solide, ou sur la chaîne espaceur, l'acide nucléique [NUCL] peut être modifié chimiquement avec différents groupements chimiques tels que des groupements permettant d'immobiliser ledit acide nucléique de façon covalente, tels que des thiols, des amines ou tout autre groupement capable de réagir avec des groupements chimiques présents sur le support solide. Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur est-elle-même apte à être immobilisée sur le support solide, le cas échéant après modification de ladite chaîne espaceur avec un ou plusieurs groupements chimiques appropriés. Dans encore d'autres modes de réalisation, la chaîne espaceur est liée à un composé permettant l'immobilisation du composé d'intérêt comprenant l'aptamère nucléique sur le support mobile. Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante : [FIX]-[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle : - [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I). Le composé de formule (III) ci-dessus constitue un mode de réalisation d'un 25 moyen de purification du Facteur IX/IXa humain. Ledit moyen de purification du Facteur IX/IXa humain de formule (II) ou de formule (III) se présente préférentiellement sous une forme liée à un support solide. Dans le composé de formule (III) le composé [FIX] consiste en un composé choisi parmi (i) un composé capable de former une ou plusieurs liaisons covalente avec le matériau 30 de surface d'un support solide et (ii) un composé capable de se lier spécifiquement sur le support solide par l'intermédiaire de liaison faibles non covalentes, y compris des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques ou des forces de Van der Waals. Le premier type de composé [FIX] englobe les agents de couplage bifonctionnels, comme le glutaraldéhyde, le SIAB ou encore le SMCC.

Le composé SIAB, décrit par Hermanson G.T. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Academic Press, pp 239-242), est le composé de formule (I) suivante : o (I) Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl. Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1) : 37-46), est le composé de formule (II) suivante : (11) Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl. Le second type de composé [FIX] englobe la biotine, qui est capable de se lier de manière spécifique non covalente à des molécules d'avidine ou de streptavidine présentes sur le support solide. Dans certains modes de réalisation, une fois immobilisé sur le support solide via la chaîne espaceur, l'aptamère est avantageusement modifié à son extrémité libre (extrémité non liée à l'espaceur) grâce à, et sans s'y limiter, un nucléotide chimiquement modifié (tel que 2'- 0-methyl ou 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), un nucléotide inversé ou un groupement chimique (PEG, polycations, cholestérol). Ces modifications permettent de protéger certains aptamères des dégradations enzymatiques. Dans encore certains autres modes de réalisation, l'immobilisation d'un acide nucléique anti-FIX/IXa selon l'invention sur un support peut être réalisé selon le procédé décrit 25 dans la demande PCT publiée au nom de LFB Biotechnologies sous le n° WO 2012/090183 en date du 5 juillet 2012. Ce procédé d'immobilisation est réalisé par greffage d'acides nucléiques comprenant une amine primaire sur un support solide présentant des groupes acides carboxyliques activés, ledit procédé comprenant une étape de couplage covalent desdits acides nucléiques sur ledit support solide à un pH inférieur à 6.

Un support d'affinité sur lequel sont immobilisées des molécules d'un acide nucléique anti-FIX/FIXa selon l'invention, et préparé selon l'enseignement de la demande PCT n° WO 2012/090183 précitée, peut être représenté par la formule suivante (IV) : O (SPAC)n-NUCL N (IV) H dans laquelle : - [SUP] représente le support solide du support d'affinité - [SPAC]n et [NUCL] répondent aux définitions précédemment indiquées. En d'autres termes, -NH-(SPAC).-NUCL représente un aptamère nucléique dans lequel : ^ n est indice valant 0 ou 1, ^ SPAC représente une chaîne espaceur, et ^ NUCL représente un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I). Dans certains modes de réalisation, un « aptamère nucléique » utilisé pour le greffage au support solide pré-activé, selon le procédé ou la méthode décrite dans la demande PCT n° WO 2012/090183, peut comprendre, par définition, une partie non nucléotidique ou nucléotidique, par exemple une chaîne espaceur non nucléotidique, qui relie l'une des extrémités 5' ou 3' de la partie nucléique dudit aptamère et la fonction amine réactive utilisée pour le greffage chimique dudit support pré-activé. Dans ces modes de réalisation, un aptamère nucléique peut être de formule (V) suivante : NH2-[SPAC].- [NUCL] (V), dans laquelle : - n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l'aptamère ne comprend pas une chaîne espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur. - NH2 signifie la fonction amine réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I). Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester, une bille magnétique ou paramagnétique. La présente invention est également relative à un complexe entre : (i) une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) et un composé de formule (III), et (ii) un Facteur IX/IXa humain. La présente invention a aussi pour objet un support pour l'immobilisation du Facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffées une pluralité de molécules consistant chacune en, ou comprenant chacune, un aptamère nucléique, lesdites molécules étant choisies parmi (a) un acide nucléique de formule (I), (b) un composé de formule (II) et (c) un composé de formule (III). Le support ci-dessus peut être utilisé pratiquement dans toutes les applications pour lesquelles on cherche à immobiliser le Facteur IX/IXa humain, ce qui englobe les applications à des fins de purification du Facteur IX/IXa et les applications à des fins de détection du Facteur IX/IXa humain. La réalisation de supports sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques de l'invention se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain est illustrée dans les exemples, dans lesquels les aptamères de l'invention sont utilisés notamment comme agents de capture du Facteur IX/IXa humain, utilisables pour la purification ou pour la détection du Facteur IX/IXa humain dans des échantillons. La présente invention concerne donc aussi un procédé pour l'immobilisation du facteur IX/IXa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un support solide sur lequel a été préalablement immobilisée une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) et un composé de formule (III). Ledit procédé peut comprendre, selon les objectifs techniques poursuivis, une étape additionnelle de récupération des molécules de Facteur IX/IXa humain immobilisées, complexées avec les molécules d'acides nucléiques de formule (I). L'étape additionnelle de récupération du Facteur IX/IXa consiste préférentiellement en une étape de mise en contact des complexes de Facteur IX/IXa avec les acides nucléiques de formule (I) avec un agent chélateur des cations métalliques, tels que l'EDTA ou l'EGTA. La présente invention a encore pour objet un procédé pour la purification du Facteur IX/IXa humain comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II), un composé de formule (III) ou avec un support solide tel que défini dans la présente description, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa humain, et b) libérer le Facteur IX/IXa humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur IX/IXa humain purifié. Pour la réalisation de procédés de purification de protéine par chromatographie d'affinité en utilisant des supports solides sur lesquels sont immobilisés les aptamères d'intérêt, l'homme du métier peut se référer aux travaux décrits par Romig et al. (1999, J Chomatogr B Biomed Sci Apl, Vol. 731(2) : 275-284). Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage.

Avantageusement, le procédé comprend une étape a') de lavage du support d'affinité au cours de laquelle on augmente la force ionique, c'est à dire qu'on utilise un tampon de lavage dont la force ionique est augmentée par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage utilisé à l'étape a') est supérieure de 2 à 500 fois par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a).

Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage est supérieure de 100 à 500 fois, de préférence de 200 à 500 fois, par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Un tampon de lavage ayant une force ionique élevée, en particulier un tampon ayant une concentration élevée en NaC1, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du Facteur IX au support d'affinité. A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaC1 d'au moins 0,5 M.

Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaC1 d'au moins 0,5 M englobe les tampons de lavage ayant une concentration finale en NaC1 d'au moins 1 M, 1,5 M, 2 M, 2,5 Mou au moins 3 M. De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaC1 d'au plus 3,5 M. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaC1 comprise entre 0,5 et 3,5, de préférence entre 1,5 et 3,5, y compris de préférence entre 2 et 3,5, par exemple de préférence entre 2,5 et 3,5. Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à l'étape a') contient à la fois du NaC1 et du propylène glycol. De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA ou l'EGTA. A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale 15 d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 300 mM. L'expression « au moins 1 mM » englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM. L'expression « au plus 300 mM » englobe au plus 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120 ou 110 mM. De plus, la fabrication d'un support d'affinité comprenant un aptamère nucléique 20 de l'invention et la réalisation d'un procédé de purification du Facteur IX humain avec ledit support d'affinité est illustrée dans les exemples. De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les aptamères de l'invention englobent tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, de support de silicium pour des puces, des 25 membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un 30 polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, et des combinaisons de ceux-ci. Le support solide peut être revêtu avec un matériau facilitant l'attachement, la fixation, la formation de complexes, l'immobilisation ou l'interaction avec les aptamères.

Dans certains modes de réalisation, le support solide est une lame de verre dont la surface est revêtue d'une couche d'or, d'une couche ayant subi un traitement par carboxyméthylation, d'une couche de dextran, de collagène, d'avidine, de streptavidine, etc. De cette manière, les aptamères selon l'invention peuvent être immobilisés sur le support solide par l'intermédiaire d'un revêtement d'attachement, comme par exemple décrit ci-dessus, soit par réaction chimique avec création de liaisons covalentes, soit par association par des liaisons non covalentes telles que des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques, des forces de Van der Waals, etc. Selon l'invention, par « support d'affinité », on entend de manière générale un support formé d'un matériau solide sur lequel on a immobilisé des aptamères nucléiques tels que définis dans la présente description. Les exemples ci-après décrivent un mode de réalisation de support solide sur lequel sont immobilisés, par des liaisons non covalentes, les aptamères de l'invention. Dans les exemples, on décrit notamment un support solide consistant en une lame de verre revêtue d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine. Dans certains modes de réalisation, les aptamères de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide adapté pour la chromatographie d'affinité, l'électrochromatographie et l' électrophorèse capillaire, comme décrit par exemple par Ravelet et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 117(1) : 1-10), Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 111(2) : 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol. 25 (21-22) : 3730-3739) ou encore Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80(10) : 3915-3920). Un aptamère de formule (I) selon l'invention et se liant spécifiquement au Facteur 25 IX/IXa humain, un composé de formule (II), ou un composé de formule (III), peuvent être aussi avantageusement utilisés comme agent de capture du FIX/IXa humain, dans des procédés et dispositifs de détection ou de diagnostic. Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur IX/IXa humain dans un échantillon comprenant les étapes 30 suivantes : a) mettre en contact (i) un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) ou un composé de formule (III) ou un support solide sur lequel sont immobilisés une pluralité de molécules dudit acide nucléique ou dudit composé, avec (ii) ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique de formule (I), ledit composé de formule (II) ou ledit composé de formule (III) ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa. Les exemples de la présente demande de brevet fournissent divers modes de réalisation de procédés de détection du FIX/IXa humain avec des aptamères de l'invention préalablement immobilisés sur un support solide. Pour la réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, le support solide utilisé peut être un support solide choisi parmi les supports solides décrits précédemment en relation avec le procédé de purification du Facteur IX/IXa humain.

Pour la réalisation d'un procédé ou d'un dispositif de détection du Facteur IX/IXa humain, l'homme du métier peut se référer notamment aux techniques décrites dans la demande de brevet européen n° EP 1 972 693, la demande PCT n° WO 2008/038696, la demande PCT n° WO 2008/025830, ou encore la demande PCT n° WO 2007/0322359. Dans certains modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur IX/IXa humain peut être réalisé par mesure du signal de résonance plasmonique de surface, comme cela est décrit dans les exemples. Dans certains autres modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur IX/IXa humain peut être réalisée par la mise en contact desdits complexes éventuellement formés avec un ligand du Facteur IX/IXa humain, ledit ligand étant détectable. Comme ligand détectable du Facteur IX/IXa humain, on peut mentionner des anticorps monoclonaux ou polyclonaux antiIX/IXa humain, marqués avec une enzyme, en l'occurrence la peroxydase de raifort, comme cela est conventionnellement utilisé dans les tests de type ELISA.

Avantageusement, l'échantillon comprenant, ou susceptible de comprendre, du Facteur IX/IXa humain consiste en un échantillon liquide qui contient le Facteur IX/IXa humain, y compris un échantillon liquide comprenant le Facteur IX/IXa humain et qui est susceptible de contenir aussi des molécules de Facteur IX/IXa d'un mammifère non humain. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci- dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique, tels qu'un fluide corporel, une cellule, un broyat cellulaire, un tissu, un broyat tissulaire, un organe ou un organisme entier. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique liquide provenant d'un animal tel que du sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère. Ledit échantillon peut consister en du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés. Dans des modes de réalisation particulièrement préférés du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon provient d'un animal transgénique pour le Facteur IX/IXa humain. Avantageusement, la solution est du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère transgénique pour le Facteur IX/IXa humain. Au sens de l'invention, les animaux transgéniques englobent (i) les mammifères non humains tels que les vaches, les chèvres, les lapins, les porcs, les singes, les rats ou les souris, (ii) les oiseaux ou encore (iii) les insectes tels que les moustiques, les mouches ou les vers à soie. Dans certains modes de réalisation préférés, l'animal transgénique pour le Facteur IX/IXa humain est un mammifère transgénique non humain, de manière tout à fait préférée une lapine transgénique pour le Facteur IX/IXa humain. Avantageusement, le mammifère transgénique produit le Facteur IX/IXa recombinant dans ses glandes mammaires, du fait de l'insertion dans son génome d'une cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant le Facteur IX/IXa humain qui est placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression de la protéine transgénique dans le lait dudit mammifère transgénique. Une méthode de production du Facteur IX/IXa humain dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant le Facteur IX/IXa humain, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta- caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le Facteur IX/IXa humain. Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern Blot à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations de la protéine transgénique dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.

D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter, les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170 (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique). Selon d'autres aspects de la présente invention, un acide nucléique selon l'invention et se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain peut être utilisé in vivo, dans des situations physiologiques nécessitant de provoquer une inhibition de l'activation du Facteur X par le Facteur IXa, par exemple en inhibant la formation d'un complexe fonctionnel Facteur IXa/Facteur VIIIa). En d'autres termes, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut aussi être utilisé, à titre préventif ou curatif, en tant que principe actif anticoagulant d'un médicament. En particulier, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut être utilisé comme principe actif préventif ou curatif anticoagulant, notamment pour le traitement de troubles de la coagulation incluant les thromboses veineuses, les thromboses artérielles, les thromboses post-chirurgicales, les troubles associés aux pontages coronariens (CABG), les accidents vasculaires cérébraux, les angioplasties coronariennes percutanées transdermiques (PTCA), les métastases tumorales, les réactions inflammatoires non-sévères ou sévères, les chocs septiques, l'hypotension, le syndrome de détresse respiratoire aigu (ARDS), les embolismes pulmonaires, la coagulation intravasculaire disséminée (DIC), les resténoses vasculaires, le dépôt de plaquettes, l'infarctus du myocarde, l'angiogénèse, et tout traitement prohylactique d'hommes ou de femmes ayant un risque de développer une thrombose. La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain tel que défini 30 dans la présente description, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. La quantité d'acide nucléique aptamère anti-FIX/FIXa humain selon l'invention, dans une composition pharmaceutique, est adaptée pour permettre l'administration d'une quantité efficace de ce principe actif aux patients.

Les gammes de doses de l'aptamère anti-FIX/FIXa humain de l'invention peut être aisément déterminée par le médecin ou le pharmacien. En général, la quantité de principe actif à administrer varie avec l'âge, la condition médicale, et le sexe du patient, ainsi qu'avec le degré d'extension de la maladie ou du degré du risque de développer la maladie, et peut être aisément déterminée par l'homme du métier. En général, une composition pharmaceutique comprend une quantité d'un aptamère anti-FIX/FIXa humain allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes par dose unitaire, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes par dose unitaire. En général, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 0,01% à 99,9% en poids d'un aptamère anti-FIX/FIXa, ou d'une combinaison de plusieurs aptamères anti-FIX/FIXa, et de 99,9% à 0,01% en poids d'un excipient, ou d'une combinaison d'excipients, par rapport au poids total de ladite composition. Dans certains modes de réalisation, ladite composition pharmaceutique comprend 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aptamères anti-FIX/FIXa distincts.

Pour réaliser une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'ouvrage de Remington. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée de manière prophylactique et/ou thérapeutique. L'administration d'une composition pharmaceutique selon l'invention peut être réalisée de plusieurs façons, y compris, mais sans s'y limiter, par voie locale et cutanéo-muqueuse, par voie entérale ou par voie parentérale. Par « voie locale et cutanéo-muqueuse », on entend notamment désigner la voie topique, intra-auriculaire, intravaginal, intrautérin, en inhalation, transdermique, oculaire, ou intravésicale. Par « voie entérale », on entend notamment désigner la voie, intrarectal, sublingual, buccal, nasal, intrastomacal ou intrajéjunal. Par « voie parentérale », on entend notamment désigner la voie intradermique, sous-cutané, intramusculaire, intracardiaque, intravasculaire, intraveineuse, intra-oculaire, intra-artériel, épidural, intrarachidien, extracorporel, intrathécal, intrapéritionéal, intrapleural, intraluminal, intravitréal, intracaverneux, intraventriculaire, intraosseux, palatin, intra- articlaire, intracellulaire, pulmonaire ou intrafoetal. De préférence, l'administration d'une composition pharmaceutique selon l'invention peut être faite par voie intra-veineuse. Ainsi, un aptamère anti-FIX/FIXa humain selon la présente invention est préparé sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques d'aptamères anti-FIX/FIXa humain selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux. De nombreux excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés ainsi que des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate de sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la composition pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien connues de l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer également à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la 5è édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à la 6è édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007. Pour la fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant un aptamère comme principe actif, l'homme du métier peut également se référer au contenu de la demande PCT n° WO 2007/058801, de la demande PCT n° WO 2005/084412 et la demande PCT n° WO 2004/047742 ou encore dans la demande PCT n° WO 2008/150495.

Dans certains modes de réalisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, le ou les principes actifs aptamères anti-FIX/FIXa humain peut (peuvent) être utilisé(s) seul(s) ou en combinaison avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives, y compris avec un ou plusieurs autres principes actifs anticoagulants.

L'invention est également relative à un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, tel que défini dans la présente description, pour son utilisation en tant que médicament. L'invention a aussi trait à l'utilisation d'un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, tel que défini dans la présente description, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation, notamment incluant ceux mentionnés ci-dessus, de préférence l'hémophilie de type B. L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, tel que défini dans la présente description, pour le traitement des troubles de la coagulation, notamment incluant ceux mentionnés ci-dessus, de préférence l'hémophilie de type B. L'invention a aussi pour objet une méthode de prévention ou de traitement d'un trouble de la coagulation, comprenant une étape au cours de laquelle on administre, à un patient nécessitant un traitement préventif ou curatif d'un trouble de la coagulation, une composition pharmaceutique aptamère anti-FIX/FIXa humain telle que définie dans la présente description. En général, on administre une dose quotidienne d'un aptamère anti-FIX/FIXa humain tel que défini dans la présente description allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes, pour un patient de 80 kgs. La présente invention est également illustrée ci-après, sans y être limitée, aux exemples suivants.

EXEMPLES Exemple 1 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur IX humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au NaC1) Matériel et Méthodes On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules d'aptamères nucléiques selon l'invention. Préalablement à leur fixation sur le support solide, l'extrémité 5' des aptamères considérés a été chimiquement couplée à une molécule de biotine. On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Serie S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessous afin d'immobiliser les acides nucléiques, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères. Les aptamères considérés sont ceux figurés par les séquences SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 132, SEQ ID N° 133, SEQ ID N° 134, SEQ ID N° 135, SEQ ID N° 136, SEQ ID N° 137, SEQ ID N° 139 et SEQ ID N° 142.

L'aptamère Nonapta 1 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 1 830 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2). Les aptamères Nonapta 2 et Nonapta 3 sont ainsi immobilisés avec un taux d'immobilisation d'environ 1 950 RU.

L'aptamère Nonapta 3.1 (à savoir un aptamère de séquence SEQ ID N° 67 pour lequel l'extrémité 3' a été chimiquement couplée à une molécule de biotine) est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 2 050 RU. Les aptamères Nonapta 5, 5.1 et 5.7 sont ainsi immobilisés avec un taux d'immobilisation, respectivement, d'environ 2 190 RU, 3 080 RU et 1 760 RU. Les aptamères Nonapta 6, 6.3 et 6.4 sont ainsi immobilisés avec un taux d'immobilisation, respectivement, d'environ 2 270 RU, 1 720 RU et 2 150 RU. L'aptamère Nonapta 7 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 2 220 RU.

L'aptamère Nonapta 8 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation d'environ 2 260 RU. Du FIX humain purifié a été dilué dans du tampon de course (Tris-HC1 50 mM, NaC1 150 mM, CaC12 2 mM, MgC12 1 mM, pH 7,4) de manière à obtenir des échantillons de concentration 100 et 250 nM en FIX, voire pour certains des aptamères ci-dessus de concentration 500 et 1 000 nM en FIX. A noter toutefois que, pour Nonapta 6, le même FIX humain purifié a été dilué dans du tampon de course (Tris-HC1 50 mM, NaC1 150 mM, CaC12 2 mM, MgC12 1 mM, pH 7,4) de manière à obtenir des échantillons de concentration 100, 200, 500 et 1 000 nM en FIX.

Plusieurs supports ont été fabriqués, chacun comprenant un unique aptamère spécifique parmi ceux indiqués ci-dessus. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 301.11/min pendant 60 sec après l'injection.

Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore® T-200 (GE), sous contrôle du logiciel Biacore® T-200 Control Software (Version 1.0). Les courbes de liaison des aptamères immobilisés et décrits ci-dessus au FIX humain ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore® T-200 Evaluation Software (Version 1.0).

Ces résultats ont permis de déterminer que: - les aptamères mis en oeuvre, une fois immobilisés, se lient effectivement au FIX. Ces résultats sont illustrés en figures 10 à 20. - la liaison au facteur IX est particulièrement significative pour les aptamères Nonapta 5, 5.1, 5.7, 6, 6.3 et 6.4, et plus particulièrement l'aptamère Nonapta 5.7. Ces résultats sont illustrés en figures 13 à 18.

Exemple 2 : préparation d'un support d'affinité Le support d'affinité a été réalisé à partir d'un matériau de support solide consistant en une matrice sur laquelle on a greffé de la streptavidine (streptavidin-agarose - Novagen ). On a introduit un volume de 1 ml de gel dans un conteneur consistant en une colonne (i.d. 11mm). On a lavé le gel avec de l'eau purifiée, pour éliminer le solvant de stockage. Les caractéristiques du gel sont : - Capacité d'adsorption de biotine > 85 nanomole / ml de gel - Test fonctionnel : Capture >99% de thrombine biotinylée en 30 minutes à TA - Autres tests : Protease-free , endo/exonucléase-free, RNase-free. - Conservateur : 100 mM sodium phosphate pH7,5 + NaN3 0,02 La sortie de la colonne conditionnée (« packée ») (Hauteur de lit de gel = 1cm) est connectée à un détecteur d'absorbance équipé d'un filtre UV à 254 nm et d'un enregistreur. Les aptamères nucléiques anti-FIX humain biotinylés selon l'invention, et notamment ceux considérés en exemples 1 et 2 ci-dessus, sont solubilisés dans de l'eau purifiée à la concentration finale de 0,5 mg/0,187 ml, soit une concentration molaire finale de 0,1 mM. La solution d'aptamères nucléiques a été activée à 95°C selon le cycle standard, pour l'immobilisation des aptamères sur le matériau support solide. La solution d'aptamères nucléiques a été préalablement diluée par 4,8 ml d'eau purifiée puis 1,5 ml de tampon Me++ (5 x concentré). Le détecteur d'absorbance est ajusté à 1 AUFS (Absorbance Unit Full Scale) et on enregistre la DO à 254 nm de cette solution à 0,575 UA254. La solution d'aptamères nucléiques biotinylés est injectée sur le gel streptavidinagarose pré-conditionnée (« prépackée ») et mise en recirculation avec une pompe péristaltique à un débit de 2,5 ml/minute, soit un temps de contact sur le gel de 24 secondes (entrée/sortie E/S). Dans ces conditions, la DO à 254 nm se stabilise rapidement à 0,05 UA254, soit une valeur de 91% de couplage théorique, c'est-à-dire 0,455 mg d'aptamères nucléiques par millilitre de gel. Un lavage avec un tampon 10 mM CaC12 + 4 mM MgC12 puis en NaC1 2M est réalisé, afin d'éliminer les aptamères nucléiques qui ne sont pas fixées spécifiquement aux molécules de streptavidine greffées sur le matériau de support solide. Exemple 3 : Procédé de purification du Facteur IX humain A. Matériel et Méthodes A.1. Le support de chromatographie d'affinité Matière Gel d'affinité sur lequel on a immobilisé l'aptamère Nonapat 5.1 de séquence SEQ ID No.1, couplé directement à la biotine, sans chaîne espaceur entre l'aptamère et la biotine. L'aptamère est immobilisé sur un gel streptavidine (Fournisseur Novagen) grâce à une biotine en 5' terminal avec une densité de ligand théorique 0,4 mg/ml : volume 1 ml packé dans une colonne )(K16 (GE).

Le produit de départ de Facteur IX est du Betafact 94 Ul/mL - 1 mL. A.2. Le protocole de purification Equilibration gel : Tris-HC1 50 mM, NaC1 150 mM, CaC12 2 mM, MgC12 1 mM, pH 7,4, Lavage : Tampon TSP contenant 0,5 M de NaC1- 2,5 mL, Elution : EDTA 200 mM, pH 8 - 2,5 mL, 1 mL de Betafact est injecté avec un débit de 0,4 mL/min en tampon d'équilibration.

Après détection du pic de non retenu 2 volumes de colonne de tampon d'élution est injecté. On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d' absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres. B. Résultats Les résultats sont illustrés sur les figures 21 et 22. La Figure 21 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps. Sur la Figure 21, le pic n°1 correspond à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne. Le pic n°2 correspond à la fraction d'élution.

Le produit de départ ainsi que le produit élue a été analysé en SDS PAGE avec coloration au nitrate d'argent. La Figure 22 représente ce gel : - les pistes n°1 et l' correspondent au produit de départ de Facteur IX Betafact. - les pistes n°2 et 2' correspondent à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne. - les pistes n°3 et 3' correspondent à la fraction d' élution. - les pistes n°1 à 3 sont obtenues dans des conditions non réductrices. - les pistes n°1' à 3' sont obtenues dans des conditions réductrices Les résultats des figures 21 et 22 montrent que l'aptamère de séquence SEQ ID N° 133 (i.e. Nonapta 5.1) est capable de lier le FIX humain et de l'éluer spécifiquement en présence d'EDTA.

En effet, la bande correspondante au pistes 2 et 2' est particulièrement claire, voire inexistante, ce qui traduit la capacité dudit aptamère à se lier efficacement au FIX humain.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) suivante : - [SEQ ID N°X] - [3' -TER]n (I), dans laquelle : - « [5'-TER]m » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 32 nucléotides, - « [3'-TER]' » représente un acide nucléique comprenant entre 1 et 40 10 nucléotides, - m est un entier égal à 0 ou 1, - n est un entier égal à 0 ou 1, et - « [SEQ ID N° X] » consiste en un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides 15 nucléiques de séquences SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 7 et SEQ ID N° 8.
2. 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence SEQ ID N° X est un acide nucléique possédant au moins 80 % d'identité en nucléotides avec 20 acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6.
3. 3. Acide nucléique selon l'une des revendications. 1 et 2, caractérisé en ce qu'il possède au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°1 à 143, de préférence un acide 25 nucléique de séquence SEQ ID N° 134.
4. 4. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisé en ce que sa liaison au facteur IX/IXa humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques. ` 30
5. 5. Composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (II) suivante : [SPAC]- [NUCL] (H), dans laquelle :- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4.
6. 6. Composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante : [FIX]-[SPAC1- [NU CL] (III), dans laquelle : - [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4.
7. 7. Composé se liant spécifiquement au facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (V) suivante : NH2-[SPAC],,- [NUCL] (V), dans laquelle : - n étant indice valant 1 ou 0, 0 signifiant que l'aptamère ne comprend pas une chaîne espaceur libre et 1 signifiant que l'aptamère comprend une chaîne espaceur. - NH2 signifie la fonction amine réactive utilisée pour le greffage sur le support solide pré-activé par des groupes NHS, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur IX/IXa humain de formule (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4.
8. 8. Complexe entre (i) un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un composé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 et (ii) un facteur IX/IXa humain,
9. 9. Support pour l'immobilisation du Facteur IX/IXa humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou de composés selon l'une quelconque des revendications 5 à 7.
10. 10. Procédé pour l'immobilisation du facteur IX/IXa humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un support selon la revendication 9.
11. 11. Procédé pour la purification du Facteur IX/lXa humain comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur IX/IXa humain avec un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou avec un composé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, ou avec un support selon la revendication 9, afin de 10 former un complexe entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur LX/IXa humain, et b) libérer le Facteur IX/lXa humain à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer le Facteur IX/IXa humain purifié. 15
12. 12. Procédé pour détecter la présence de Facteur IX/IXa humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou avec un composé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 ou avec un support selon la revendication 9 avec ledit échantillon; et 20 b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur IX/IXa.
13. 13. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, en combinaison avec un ou plusieurs excipients 25 pharmaceutiquement acceptables.
14. 14. Acide nueléiqUe selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour son utilisation COrntne.Médicament. 30
15. 15. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation, de préférence l'hémophilie de type B.