PT1986612E - Composição estável de glucocerebrosidase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO ESTÁVEL DE GLUCOCEREBROSIDASE"

Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido U.S. N° de Série 60/771555, apresentado a 7 de Fevereiro de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a composições de proteínas com tióis livres, glucocerebrosidase e a métodos de preparação e métodos de utilização de tais composições. As composições têm estabilidades optimizadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Um produto farmacológico (e. g., que contém uma proteína) pode ser armazenado na forma líquida ou liofilizada, i. e., seca por congelação. Um produto farmacológico liofilizado é, muitas vezes, reconstituído por adição de um diluente de administração adequado mesmo antes de ser utilizado pelo doente. A proteína activa pode ser perdida como resultado de instabilidades físicas, incluindo desnaturação e agregação, bem como instabilidades químicas, incluindo, por exemplo, hidrólise, desamidação e oxidação. A estabilidade de um fármaco proteico numa forma particular, e. g., numa forma líquida ou liofilizada, 1 pode ser uma consideração importante na selecçao de uma forma de produto. 0 pedido de patente internacional WO 00/76480 descreve composições farmacêuticas compreendendo cristais de um componente de rede cristalina farmaceuticamente aceitável e um ingrediente farmacêutico activo incluído no interior do componente de rede cristalina. Um tal ingrediente Farmacêutico activo é a beta glucocerebrosidase. A publicação sugere que este componente activo possa ser formulado em conjunto com o manitol, citrato de sódio e polissorbato.

Wei Wang, 'Lyophilisation and Development of Solid Protein Pharmaceuticals', International Journal of Pharmaceutics, vol 203, páginas 1 a 60, proporciona uma revisão do processo de liofilização e suas aplicações na formulação de fármacos de proteína sólidos. A publicação sugere que os açúcares ou polióis, tais como a sacarose, trealose, manitol ou sorbitol, foram utilizados para estabilizar proteínas liofilizadas para armazenamento a longo prazo.

Lee et al 'The Stabilisation of Proteins by Sucrose', the Journal of Biological Chemistry, vol 256, número 14, 1981 descrevem o efeito da sacarose na integridade estructural de três proteínas, α-quimotripsina, quimotripsinogénio e ribonuclease.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína com um tiol livre e um hidrato de 2 carbono, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para manter a estabilidade da proteína e em que o pH da composição está entre cerca de 4,5 e cerca de 6,5, em que a proteína com um tiol livre é a glucocerebrosidase (GCB) e em que o hidrato de carbono é a sacarose. A invenção proporciona também um recipiente estanque a gases contendo tal composição farmacêutica, um componente proteico e uma câmara de expansão, em que a câmara de expansão é, pelo menos, 90% de um gás inerte. A invenção proporciona, também, um método de embalamento de tal composição farmacêutica, compreendendo colocar em contacto a GCB com um gás inerte para reduzir a quantidade de uma espécie reactiva e introduzindo o GCB e o gás inerte num recipiente estanque a gases. É também proporcionada a Composição Farmacêutica como descrito para utilização num método de tratamento.

Outros aspectos da invenção são descritos nas reivindicações em anexo.

As composições e métodos aqui descritos proporcionam uma estabilidade e tempo de armazenamento aumentados, aumentando a estabilidade de uma proteína nelas contidas.

As composições aqui descritas, e. g., composições líquidas contendo uma proteína, têm estabilidade prolongada. E. g., sob condições pré-seleccionadas, e. g., após armazenamento num recipiente estanque a gases, a uma temperatura de 2-8 °C durante um período de 3, 6, 9, 12 ou 24 meses (ou em algumas formas de realização, mais longos) uma proteína na composição irá reter, pelo menos, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% da estabilidade que tinha antes de ser armazenada. Estabilidade, 3 como aqui utilizado, inclui parâmetros, tais como estrutura proteica (e. g. , minimizando ou prevenindo alterações na estrutura proteica, e. g., agregação proteica ou degradação proteica (e. g., fragmentação)) e/ou uma actividade biológica da proteína, e. g., a capacidade para converter o substracto em produto. A estabilidade proteica pode ser determinada, e. g., determinando a agregação proteica, degradação proteica ou níveis de uma actividade biológica da proteína. A agregação proteica pode ser determinada, e. g., por cromatograf ia por exclusão de tamanhos, PAGE não desnaturante ou outros métodos para determinar o tamanho, etc. Por exemplo, a composição pode ter menos do que 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% de aumento na quantidade de agregação proteica (e. g., como determinado por cromatografia por exclusão de tamanhos), quando comparado com a quantidade de agregação proteica que estava na composição antes do armazenamento (e. g., armazenamento a uma temperatura de 2-8 °C durante um período até 3, 6, 9, 12 ou 24 meses (ou superior)). A degradação proteica pode ser determinada, e. g., por HPLC de fase reversa, PAGE não desnaturante, cromatografia de permuta iónica, mapeamento peptídico ou métodos semelhantes. Como um exemplo, a composição pode ter menos do que 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% de aumento na quantidade de degradação proteica (e. g., como determinado por HPLC de fase reversa) , quando comparado com a quantidade de degradação proteica que estava na composição antes do armazenamento (e. g., armazenamento a uma temperatura de 2-8 °C, durante um período até 3, 6, 9, 12 ou 24 meses (ou superior) ) . A actividade biológica de uma proteína pode ser determinada, e. g., através de ensaios in vitro ou in vivo, e. g., ELISA (e. g., para determinar a ligação ou actividade 4 enzimática) e outros ensaios enzimáticos (e. g., espectrofotométricos, fluorimétricos, calorimétricos, quimiluminescentes, radiométricos ou ensaios cromatográficos), ensaios com cinase e assim por diante. Como um exemplo, a composição pode ter menos do que 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% de diminuição numa actividade biológica da proteína (e. g., actividade enzimática, e. g. , como determinado por um ensaio in vitro) , em comparação com a quantidade da actividade biológica que existia na composição antes do armazenamento (e. g., armazenamento a uma temperatura de 2-8 °C durante um período de 3, 6, 9, 12 ou 24 meses (ou superior)).

Num aspecto, a proteína não modifica, e. g., decompõe quaisquer outros componentes da composição. Por exemplo, numa forma de realização preferida, numa composição contendo glucocerebrosidase (GCB), a composição não contém polissorbato como um tensioactivo porque o GCB pode reconhecer o polissorbato como um substracto e pode clivar o polissorbato para libertar ácidos gordos livres.

As formas de realização da invenção têm uma estabilidade comparável com a de uma composição liofilizada da mesma proteína. Uma composição líquida aqui descrita pode ter, pelo menos, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% do nível de estabilidade proteica (e. g., a actividade retida) de uma composição liofilizada após 3, 6, 12, 18 ou 24 meses de armazenamento (e. g., se uma composição liofilizada reteve 90% da sua actividade a 18 meses, a composição da invenção manteve, pelo menos, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% desse nível). 5

Num aspecto, a divulgação apresenta uma composição que inclui uma proteína com um tiol livre e um hidrato de carbono, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para manter a estabilidade da proteína, em que a proteína com um tiol livre é glucocerebrosidase (GCB) e em que o hidrato de carbono é sacarose. Em algumas formas de realização, a composição inclui também um antioxidante, em que o antioxidante e o hidrato de carbono estão presentes em quantidades suficientes para manter a estabilidade da proteína e, deste modo, da composição, e em que o pH da composição é inferior a 7,0. Por exemplo, o antioxidante é cisterna, cloridrato de cisterna (cisterna-HCl) ou metionina (e. g., presente entre cerca de 0,001 e cerca de 10% (p/vol)) e o hidrato de carbono é sacarose (e. g., presente entre cerca de 1 e cerca de 40% (p/vol)). O pH está na gama de 4,5 a 6,5, e. g., de um modo preferido entre 5,0 e 6,0, e. g., de um modo mais preferido, entre 5,5 e 5,8 (e. g., cerca de 5,7). Numa forma de realização preferida, a composição inclui um tensioactivo (e. g., poloxâmero 188).

Numa forma de realização preferida, o pH da composição está, e. g., entre 4,5 e 6,5, e. g., entre 5,0 e 6,0, e. g., entre 5,5 e 5,8 (e. g., cerca de 5,7).

Em certas formas de realização, a estabilidade é, pelo menos, 5-80% superior (e. g., pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 45%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 55%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 65%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75% ou, pelo menos, cerca de 80% 6 superior), sob condições pré-seleccionadas, relativamente a uma composição que difere por falta do hidrato de carbono (e o antioxidante, se utilizado).

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono (e opcionalmente, um antioxidante) está presente numa quantidade suficiente para estabilizar o tiol livre da proteína (e. g., a proteína mostra menos formação de agregado, e. g., a proteína mostra cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% cerca de 95% ou cerca de 99% menos formação de agregado, sob condições pré-seleccionadas, do que uma composição proteica de outro modo idêntica, que não contém o hidrato de carbono (e antioxidante, se utilizado)).

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono (e opcionalmente, um antioxidante) está presente numa quantidade suficiente para aumentar a estabilidade da proteína (e. g., a proteína mostra menos formação de agregado, e. g., uma proteína mostra cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% cerca de 95% ou cerca de 99% menos de formação de agregado sob condições pré-seleccionadas, do que uma composição proteica de outro modo idêntica, que não contém o hidrato de carbono (e antioxidante, se útil)).

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono (e opcionalmente, um antioxidante) está presente numa quantidade 7 suficiente para inibir a reacção de um tiol livre numa primeira molécula da proteína, com um tiol livre numa segunda molécula da proteína, para formar um agregado.

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono (e, opcionalmente, um antioxidante) está presente numa quantidade suficiente para inibir a formação de um agregado formado pela reacção de um tiol livre numa primeira molécula, de uma proteína com um tiol livre numa segunda molécula, da proteína em, pelo menos, 5-80% (e. g. , pelo menos, cerca de 5% pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 45%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 55%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 65%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, ou pelo menos, cerca de 80% superior), sob condições pré-seleccionadas, em comparação com a mesma composição sem o hidrato de carbono (e o antioxidante, se presente).

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono (e, opcionalmente, um antioxidante) está presente numa quantidade suficiente de modo a que após armazenamento, num recipiente estanque a gases, a uma temperatura de 2-8 °C, durante um período de 6 meses, a composição irá reter, pelo menos, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% da estabilidade que a composição tinha antes do armazenamento. Numa forma de realização preferida, o armazenamento ocorre no escuro.

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono (e, opcionalmente, um antioxidante) está presente numa quantidade suficiente para ter uma estabilidade comparável a de uma composição liofilizada compreendendo cerca de 0,01% de polissorbato-20, pH 6,0, Citrato a 50 mM. Em certas formas de realização, a composição inclui, também, cerca de 1-40% (e. g., cerca de 5 até cerca de 30%, e. g., cerca de 8 até cerca de 24%, e. g., cerca de 16%, e. g., cerca de 3-5% em peso por volume (p/v) ) de um hidrato de carbono. O hidrato de carbono é a sacarose.

Numa forma de realização preferida, a composição é um liquido.

Em certas formas de realização, a composição contém menos do que cerca de 10% de O2 (e. g., menos do que cerca de 5% de O2, e. g., menos do que cerca de 2% de O2)· Numa forma de realização preferida, a quantidade de O2 dissolvido é inferior à quantidade de gases inertes dissolvidos na composição.

Em certas formas de realização, a composição é preparada por um método compreendendo a remoção fisica de O2 da composição (e. g. , desgaseificar a composição, purgar uma solução com um gás, outro que não O2, e. g., com um gás inerte (e. g., com N2 ou Ar), e. g., borbulhar o gás, outro que não 02 (e. g., N2 ou Ar) no interior da composição).

Em certas formas de realização, a proteína na composição que contém um tiol livre tem zero, dois, quatro, seis ou mais grupos tiol que formam pontes de sulfidrilo. Em certas formas de realização, a proteína contendo um tiol livre tem dois, três ou mais grupos tiol livres e tem zero, dois, quatro ou mais grupos tiol que formam pontes sulfidrilo, por unidade activa de proteína. 9

Num aspecto, a divulgação apresenta uma composição liquida de GCB que inclui GCB e sacarose, foi produzida por exposição da composição a um gás inerte (e. g., N2) e o gás inerte está presente numa concentração superior à da atmosfera ambiente, e. g., a composição contém, pelo menos, cerca de 85%, 90%, 95%, ou 99% ou, de um modo preferido, 100% de gás inerte. Em certas formas de realização, a composição inclui também um antioxidante. Por exemplo, o antioxidante é a cisteina, cisteina-HCl ou metionina (e. g., presente entre cerca de 0,001 e cerca de 10% (p/vol)) e o hidrato de carbono é a sacarose (e. g., presente entre cerca de 1 e cerca de 40% (p/vol)). O pH está na gama de 4,5 a 6,5, e. g., de um modo preferido, entre 5,0 e 6,0, e. g., de um modo preferido entre 5,5 e 5,8 (e. g., cerca de 5,7). Em certas formas de realização, a composição contém também um tensioactivo (e. g., poloxâmero 188).

Num aspecto, a divulgação apresenta uma composição que inclui glucocerebrosidase e sacarose e está a um pH abaixo do pKa de um tiol livre numa proteína, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para aumentar a estabilidade de uma proteína ao pH.

Em certas formas de realização, a estabilidade é, pelo menos, 5-80% superior (e. g., pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 45%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 55%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 65%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75% ou pelo menos, cerca de 80% superior), sob condições pré-seleccionadas, relativamente à 10 estabilidade de uma composição que não possui o hidrato de carbono e que tem um pH acima do pKa de um tiol livre, numa proteína.

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para estabilizar o tiol livre da proteína.

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para inibir a reacção de um tiol livre numa primeira molécula da proteína, com um tiol livre numa segunda molécula da proteína, para formar um agregado.

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para inibir a formação de um agregado formado pela reacção de um tiol livre numa primeira molécula da proteína, com um tiol livre numa segunda molécula da proteína em, pelo menos, 50, 55, 60, 55, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100%, sob condições pré-seleccionadas, quando comparado com a mesma composição sem o hidrato de carbono.

Numa forma de realização preferida, o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente que após armazenamento no escuro, num recipiente estanque a gases, a uma temperatura de 2-8 °C, durante um período de até 3, 6, 9, 12 ou 24 meses (ou superior), a composição irá reter, pelo menos, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% da estabilidade que tinha antes de armazenamento.

Em certas formas de realização, o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para a composição ter uma estabilidade comparável à de uma composição liofilizada. 11

Numa forma de realização preferida, a composição é um liquido.

Em certas formas de realização, a composição contém menos do que 10% de 02 (e. g., menos do que 5% de 02, e. g., menos do que 2% de 02) . Em certas formas de realização, a quantidade de 02 dissolvido é inferior à quantidade de gases inertes dissolvidos na composição.

Em certas formas de realização, a composição é preparada por um método compreendendo a remoção física de 02 da composição (e. g., desgaseificar a composição, purgar a solução com um gás, outro que não o 02, e. g. , com um gás inerte (e. g., com N2 ou Ar), e. g., borbulhar o gás, outro que não o 02 (e. g., N2 ou Ar) através da composição).

Em certas formas de realização, a proteína na composição que contém um tiol livre tem dois, três, quatro, cinco ou mais grupos tiol livres, por unidade activa de proteína.

Em certas formas de realização, a proteína na composição que contém um tiol livre tem dois, quatro, seis ou mais grupos tiol que formam pontes sulfidrilo por unidade activa (e. g. , dímero) de proteína. Em certas formas de realização, a proteína que contém um tiol livre tem dois, três ou mais grupos tiol livres e tem dois, quatro ou mais grupos tiol que formam pontes sulfidrilo por unidade activa de proteína.

Num aspecto, a divulgação apresenta uma composição líquida de GCB que inclui GCB e sacarose e o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para manter a integridade 12 biofísica/bioquímica (e. g., peso molecular, distribuição da carga) e características/propriedades de bioactividade da GCB ao pH. Por exemplo, a composição retém, pelo menos, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% da actividade biológica que tinha antes do armazenamento (e. g., armazenamento a uma temperatura de 2-8 °C, durante um período de até 3, 6, 9, 12 ou 24 meses (ou superior) ) . Como outro exemplo, pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% das proteínas na composição retém o peso molecular ou distribuição de carga média relativamente ao que a proteína tinha antes do armazenamento (e. g., armazenamento a uma temperatura de 2-8 °C durante um período de até 3, 6, 9, 12 ou 24 meses (ou superior)). O pH está na gama de 4,5 a 6,5, e. g., 5,0 a 6,0 (e. g., o pH é 5,5 a 5,8, e. g., cerca de 5,7). O hidrato de carbono é a sacarose (e. g., presente numa quantidade entre cerca de 1 e cerca de 40%, e. g., entre cerca de 3% e cerca de 5% (p/vol)).

Num aspecto, a divulgação apresenta uma composição líquida de GCB que inclui GCB, um antioxidante, sacarose, a um pH entre 4,5-6,5 e a composição foi produzida por exposição da composição a um gás inerte (e. g., N2 ou Ar) . Em certas formas de realização, o pH está na gama de 4,5 a 6,5, e. g. , 5,0 a 6,0 (e. g., o pH é cerca de 5,5 a cerca de 5,8, e. g., cerca de 5, 7) .

Em certas formas de realização, a composição líquida inclui cerca de 0,1-40 mg/mL de GCB (e. g. , de um modo mais preferido, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/mL, e. g., cerca de 2 a cerca de 8 mg/mL ou cerca de 5 mg/mL) (e. g. , cerca de 2 mg/mL), cerca de 13 0,001-10% de cisteína (e. g., cerca de 0,075%), cerca de 1-40% de sacarose (e. g., cerca de 16%), a um pH de 5,5-6,0 (e. g., cerca de 5,7) e o nível de O2 dissolvido é inferior a cerca de 10% (e. g., inferior a cerca de 5%, e. g., inferior a cerca de 2%).

Numa forma de realização preferida, a composição inclui também um tensioactivo (e. g., poloxâmero 188).

Num aspecto, a divulgação apresenta um recipiente estanque a gases que contém um componente proteico e uma câmara de expansão, em que o componente proteico é glucocerebrosidase e a câmara de expansão é, pelo menos, 90%, 95% ou 99% (vol/vol) de um gás inerte.

Em certas formas de realização, o recipiente estanque a gases é uma seringa pré-cheia, um frasco ou uma ampola. Numa forma de realização mais preferida, a seringa pré-cheia é uma seringa sem agulha.

Uma proteína contendo um tiol livre é a glucocerebrosidase (GCB).

Num aspecto, a divulgação apresenta um método para preparar uma composição que inclui colocar em contacto um tiol livre contendo a proteína glucocerebrosidase, com um gás inerte (e. g., N2 ou Ar) para reduzir a quantidade de uma espécie reactiva (e. g., 02) e introduzir a proteína e o gás inerte num recipiente estanque a gases. O termo "espécies reactivas" inclui moléculas ou iões formados pela redução de um electrão incompleta do oxigénio. Estas espécies reactivas incluem 02; superóxidos; peróxidos; radical hidróxilo; e ácido hipocloroso. 14

Numa forma de realizaçao preferida, o gás inerte é N2 ou Ar e a espécie reactiva é 02. A proteína contendo o tiol livre é a glucocerebrosidase (GCB) .

Num aspecto, a divulgação apresenta um método de tratamento de um doente (e. g., um doente com necessidade de tratamento com uma proteína contendo tiol livre, e. g., um doente com uma deficiência em proteína com tiol livre) que inclui administrar a um doente uma composição aqui descrita, e. g., uma composição contendo uma proteína com tiol livre, glucocerebrosidase. Por exemplo, uma composição farmacêutica que é administrada a um doente pode incluir uma composição aqui descrita, e. g., numa quantidade terapeuticamente eficaz.

Numa forma de realização preferida, a administração é por infusão IV ou subcutânea.

Numa forma de realização, uma composição aqui descrita que contém uma proteína com tiol livre, glucocerebrosidase, é utilizada em terapia.

Numa forma de realização, uma composição aqui descrita que contém uma proteína com tiol livre, glucocerebrosidase, é utilizada para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma patologia na qual existe uma necessidade de uma proteína contendo tiol livre, glucocerebrosidase. Por exemplo, um medicamento para administração a um doente pode incluir uma composição aqui descrita, e. g., numa quantidade terapeuticamente eficaz. 15

Num aspecto, a divulgação apresenta um método para o tratamento de um doente com deficiência em glucocerebrosidase que inclui administrar uma composição de GCB aqui descrita.

Em certas formas de realização, a deficiência em glucocerebrosidase é a doença de Gaucher. A não ser que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os materiais e métodos adequados são aqui descritos abaixo. Em caso de conflito, a presente descrição, incluindo definições, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não têm como intenção ser limitantes.

Outras características, objectivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Visão global

As composições de proteínas contendo tiol livre, as GCB, são relativamente instáveis como composições líquidas. Os três grupos tiol livres expostos em GCB podem sofrer reacções que conduzem à redução na estabilidade, e. g., por agregação de moléculas de GCB. Por exemplo, em tampão a um pH de 6, 16 tipicamente, 1-2% da proteína agregou após um mês de armazenamento e cerca de 15% agregou após 6 meses de armazenamento. Embora não desejando estar estritamente limitado pela teoria ou mecanismo, acredita-se gue vários factores contribuem para a instabilidade proteica, e. g., a reacção de agregação: Por exemplo, 02 livre em solução pode acelerar a reticulação dos grupos tiol, conduzindo à agregação. Se a reacção dos grupos tiol livres for reduzida e/ou se uma proteína pode ser preparada mais compacta, por exemplo, escondendo resíduos de cisteína em domínios hidrofóbicos, a agregação proteica pode ser reduzida. Além disso, a degradação proteica (e. g., fragmentação) pode ser reduzida.

As formas de realização aqui descritas incluem uma ou mais determinações para resolver um ou mais destes problemas. Como exemplos, foram direccionados vários factores para o aumento da estabilidade de composições (e. g., composições líquidas) de proteínas contendo tiol livre, por exemplo: a presença de espécies reativas (e. g., 02 livre) em solução, a disponibilidade dos grupos sulfidrilo livres (e. g. , tióis livres) numa proteína, a conformação de proteína e pH. Um, dois, três, quatro, ou todos estes factores podem ser alterados ou controlados para aumentar a estabilidade de uma proteína de interesse.

Proteínas Contendo Tiol Livre

As proteínas que ligam tiol livre são proteínas que, na forma activa, têm uma ou mais porções -S-H. Em formas de realização preferidas, a porção -S-H está acessível a um reagente e pode reagir com esse reagente, e. g., um agente 17 reductor tal como a cisteína, sob condições que são óptimas para a estabilidade. Alternativamente, a porção -S-H pode reagir com um reagente sob condições fisiológicas quando entram em contacto com um ou mais fluidos biológicos, quando administrado a um doente, e. g., a porção está acessível para reacção no sangue. A proteína contendo o tiol livre é a glucocerebrosidase (GCB) . A estrutura de GCB em solução, proporciona porções -S-H livres relativamente acessíveis (como oposto aos escondidos ou impedidos), que promovem reacções com a porção -S-H.

Remoção de Espécies Reactivas

As espécies reactivas, e. g., O2 ou peróxidos, dissolvidos em solução, podem diminuir a estabilidade de uma proteína na composição, e. g., promovendo a agregação proteica. No entanto, mesmo na ausência de O2, as porções -S-H podem reticular.

Para aumentar a estabilidade proteica, as espécies reactivas, e. g., O2, numa solução, podem ser removidas, e. g., quimicamente, pela utilização de captadores de O2, e. g., sulfitos. Os captadores químicos são muitas vezes, menos desejáveis, porque podem provocar degradação proteica. 0 O2 pode também ser removido fisicamente de uma solução, e. g., por desgaseificação da solução, e. g., por aplicação de um vácuo à solução para remover o 02 da solução e substitui-lo por um gás inerte, e. g., azoto ou árgon. A redução dos níveis de O2 pode também ser efectuada fisicamente purgando uma solução com um gás, outro que não ο O2, e. g., um gás inerte, e. g., azoto ou árgon. A purga pode ser efectuada por borbulhamento de gás numa solução a ser purgada com O2. 18

Com composições de proteína GCB, o borbulhamento ou outras manipulações que resultam em interfaces entre um gás e uma solução contendo proteínas, são, muitas vezes evitados no tratamento de proteínas porque podem desnaturar as proteínas, no entanto, verificou-se que estas manipulações eram bem toleradas nos métodos de GCB aqui divulgados. A remoção do O2 pode ser combinada com a minimização do contacto de uma solução com O2, e. g., por manipulação e armazenamento sob condições que minimizam a presença de O2, e. g., enchimento dos recipientes sob um gás, outro que não ο O2, e. g., um gás inerte, e. g. , azoto ou árgon, ou o selamento dos recipientes com um tal gás. No geral, é desejável minimizar o contacto da solução com O2 antes da administração ao doente. Os níveis de O2 no espaço de expansão deverão ser reduzidos para menos de cerca de 10%, de um modo preferido, menos do que cerca de 5% e, de um modo mais preferido, menos de cerca de 2%. A remoção das espécies reactivas podem resultar, também, no aumento da estabilidade proteica, e. g., minimizando também a oxidação das outras porções, e. g., Tyr, Trp e/ou resíduos Met. Em particular, é desejável minimizar a oxidação destas porções em GCB.

Pode-se testar um método candidato para remoção de O2 proporcionando uma composição contendo 2 mg/mL de GCB, 0,075% de cisteína (como um antioxidante), sacarose a 16% (para diminuir a disponibilidade de -S-H), ajustando o pH para 5,7 e aplicando o método candidato. A estabilidade da composição de GCB produzida pelo método candidato, determinada, e. g., como uma percentagem de agregação ou degradação, a um tempo pré-determinado, é 19 comparada com um ou mais padrões. Por exemplo, um padrão adequado seria uma composição semelhante às condições de teste, excepto no facto de o método de remoção de 02 não ser aplicado. A estabilidade das composições tratadas (em que o método de remoção de 02 candidato é aplicado) e não tratadas (em que um método de remoção de 02 não é aplicado), é comparada. A adequabilidade pode ser mostrada pela estabilidade aumentada no tratamento de teste, em comparação com este padrão. Outro padrão pode ser uma composição semelhante à composição de teste, excepto que em vez do método candidato de remoção, o 02 é removido por um método aqui descrito, por exemplo, por purga ou desgaseificação com um gás inerte. A adequabilidade pode ser apresentada pelo método candidate com efeitos comparáveis ou melhores em estabilidade relativamente ao método aqui descrito.

A estabilidade proteica pode ser determinada, e. g., por determinação da agregação proteica ou degradação proteica. A agregação proteica pode ser determinada, e. g., por

cromatografia por exclusão de tamanhos, PAGE não desnaturante ou outros métodos para a determinação de tamanhos, etc. A degradação proteica pode ser determinada, e. g., por HPLC de fase reversa, PAGE não desnaturante, cromatografia de permuta iónica, mapeamento peptídico ou métodos semelhantes.

Antioxidantes A estabilidade de uma proteína numa composição pode ser aumentada (e. g., a reticulação mediada por porções -S-H livres pode ser reduzida) por adição de um antioxidante e, em particular, um anti-oxidante que inclui uma porção que reage com -S-H livre (e. g., um -S-H), e. g., cisteína, cisteína-HCl ou 20 metionina. Para uma proteína (e. g., GCB) que contém ambos os grupos tiol livres e também ligações dissulfureto internas dentro de uma molécula de proteína, o nível de antioxidante (e. g., cisteína) utilizado deverá ser elevado o suficiente para minimizar a reticulação das ligações do tiol livre (e. g., agregação), mas baixo o suficiente de modo a não provocar fragmentação e/ou proteólise e/ou degradação (e. g., detectável com HPLC de fase reversa) . Por exemplo, com cisteína, particularmente para GCB, inclusão de cerca de 0,001% a cerca de 10%, e. g., cerca de 0,01 a cerca de 0,15%, e. g., cerca de 0,05% a cerca de 0,1%, é adequado. Níveis superiores a 10% podem não ser óptimos.

Por exemplo, pode-se testar um candidato a antioxidante (que pode ser qualquer agente que pode remover ou reduzir ο O2 dissolvido em solução), proporcionando uma composição contendo 2 mg/mL de GCB, sacarose a 16% (para diminuir a disponibilidade de -S-H), ajustando o pH para 5, 7, adicionado o antioxidante candidato (e. g., numa quantidade aqui descrita, e. g., 0, 075%) e purgando a composição de 02. A estabilidade da composição de GCB contendo o antioxidante candidato, determinada, e. g., como uma percentagem de agregação ou desagregação, num tempo predeterminado, é comparada com um ou mais padrões. Por exemplo, um padrão adequado será uma composição semelhante às condições de teste excepto que o antioxidante não é adicionado à composição. São comparadas as estabilidades das composições tratadas (contendo o antioxidante) e não tratadas (sem o antioxidante). A adequabilidade pode ser demonstrada pela estabilidade aumentada no tratamento de teste quando comparado com este padrão. Outro padrão pode ser uma composição semelhante à composição de teste, excepto que em vez do antioxidante candidato, é adicionado um antioxidante aqui descrito, por 21 exemplo, a cisteína (e. g., numa quantidade aqui descrita, e. g., 0,075%), à composição. A adequabilidade pode ser demonstrada pelo antioxidante candidato com efeitos comparáveis ou melhores em estabilidade do que um antioxidante aqui descrito. Se o antioxidante candidato é determinado para ser adequado (e. g., aumenta a estabilidade da composição quando comparado com um dos padrões), a concentração do antioxidante candidato pode ser refinada. Por exemplo, a concentração pode ser aumentada ou diminuída numa gama de valores e comparada com o padrão e com as outras concentrações a ser testadas, para determinar que concentração provoca o maior aumento na estabilidade. A estabilidade proteica pode ser determinada, e. g., determinando a agregação proteica ou degradação proteica. A agregação proteica pode ser determinada, e. g., por cromatografia por exclusão de tamanhos, PAGE não desnaturante, ou outros métodos para determinar o tamanho, etc. A degradação proteica pode ser determinada, e. g., por HPLC de fase reversa, PAGE não desnaturante, cromatografia de permuta iónica, mapeamento peptídico ou métodos semelhantes.

Um antioxidante preferido é a cisteína. Outros antioxidantes adequados para utilização incluem: cisteína-HCl, glutationo reduzido, tioetanolamina, tiodiglicol, ácido tioacético, monotioglicerol, N-acetilcisteína, ditiotreitol, ácido DL—tióctico, mercaptoetanol, dimercaptopropanol, bissulfito, di-hidroacorbato, metabissulfito, sulfito, sulfoxilato de formaldeído, tiossulfato e bissulfito de acetona. Em algumas formas de realização, uma combinação de dois ou mais destes antioxidantes é utilizada na composição aqui descrita. A 22 adequabilidade da combinação pode ser testada como descrito acima para um antioxidante candidato. A adição de anti-oxidantes pode resultar numa estabilidade proteica aumentada, e. g., minimizando também a oxidação de outras porções, e. g., resíduos Tyr, Trp e/ou Met. Em particular, é desejável minimizar a oxidação destas porções em GCB.

Hidratos de Carbono

Um hidrato de carbono, sacarose, é incluído na composição. E. g., um hidrato de carbono pode fazer com que uma proteína seja mais compacta e, por exemplo, esconda ou, de outro modo, impeça o acesso a uma porção, e. g., um resíduo cisteína (e. g., uma porção -S-H livre num resíduo cisteína), e. g. , um resíduo cisteína num domínio hidrofóbico. Isto pode (e. g., com GCB) aumentar a estabilidade proteica, e. g., reduzindo a agregação proteica. 0 nível de açúcar na composição pode ser crítico. Um conteúdo em açúcar de cerca de 1 a cerca de 40%, e. g., cerca de 5 a cerca de 30%, e. g., cerca de 8 a cerca de 24%, e. g., cerca de 16%, em peso por volume (p/v) é adequado, e. g., para utilização com GCB. Um conteúdo em açúcar de cerca de 3 a cerca de 5% é também adequado.

Pode-se testar uma substância candidata, e. g., um candidato a hidrato de carbono, para diminuir a disponibilidade de -S-H, proporcionando uma composição contendo 2 mg/mL de GCB, 0,075% de cisteína (como um antioxidante), ajustando o pH para 5,7, 23 adicionando a substância candidata (e. g., numa quantidade aqui descrita, e. g., 16%) e purgando a composição de O2. A estabilidade da composição de GCB contendo a substância candidata, determinada e. g., como uma percentagem de agregação ou degradação, a um tempo predeterminado, é comparada com um ou mais padrões. Por exemplo, um padrão adequado seria uma composição semelhante às condições de teste excepto que uma substância não é adicionada à composição. São comparadas as estabilidades das composições tratadas (contendo a substância) e não tratada (sem uma substância) . A adequabilidade pode ser apresentada pela estabilidade aumentada do tratamento de teste quando comparado com este padrão. Outro padrão pode ser uma composição semelhante à composição de teste excepto que em vez da substância candidata, uma substância aqui descrita, por exemplo, sacarose (e. g., numa quantidade aqui descrita, e. g., 16%), é adicionada à composição. A adequabilidade pode ser demonstrada pela substância candidata com efeitos comparáveis ou melhores em estabilidade do que uma substância aqui descrita. Se a substância candidata é determinada como sendo adequada (e. g., aumenta a estabilidade da composição quando comparada com um dos padrões), a concentração da substância candidata pode ser refinada. Por exemplo, a concentração pode ser aumentada ou diminuída numa gama de valores e comparada com o padrão e com as outras concentrações a serem testadas para determinar que concentração provoca o maior aumento na estabilidade. A estabilidade proteica pode ser determinada, e. g., determinando a agregação proteica ou degradação proteica. A agregação proteica pode ser determinada, e. g., por cromatografia por exclusão de tamanhos, PAGE não desnaturante ou outros métodos para determinar o tamanho, etc. A degradação proteica pode ser determinada, e. g., por HPLC de fase reversa, iónica, PAGE não desnaturante, cromatografia de permuta mapeamento peptídico ou métodos semelhantes.

pH 0 pH pode ser crítico quando se pretende alcançar uma composição proteica optimizada, e. g., uma composição proteica líquida com estabilidade aumentada. 0 pH pode funcionar afectando a conformação e/ou agregação e/ou degradação e/ou reactividade de uma proteína. Por exemplo, a um pH superior, ο O2 pode ser mais reactivo. 0 pH está numa gama de 4,5 a 6,5, de um modo mais preferido, 5,0 a 6,0 e, de um modo mais preferido, 5,5 a 5,8, de um modo mais preferido, cerca de 5,7. Com algumas proteínas, e. g., GCB, a agregação pode atingir níveis desejados a um pH acima de 7,0 e a degradação (e. g., fragmentação) pode atingir níveis indesejáveis a um pH abaixo de 4,5 ou 5,0, ou a um pH acima de 6,5 ou 7,0.

Pode-se testar um pH candidato proporcionando uma composição contendo 2 mg/mL de GCB, 0,075% de cisteína (como um antioxidante), sacarose a 16% (para diminuir a disponibilidade do -S-H) ajustando a composição para um pH candidato e purgando a composição de 02. A estabilidade da composição de GCB no pH candidato, determinada, e. g., como uma percentagem de agregação ou degradação, a um tempo predeterminado, é comparada com um ou mais padrões. Por exemplo, um padrão adequado seria uma composição semelhante às condições de teste excepto que o pH da composição não é ajustado. São comparadas as estabilidades das composições tratadas (a composição ajustada ao pH candidato) e não tratadas (o pH não é ajustado) . A adequabilidade pode ser apresentada pela estabilidade aumentada do tratamento de teste 25 quando comparado com este padrão. Outro padrão pode ser uma composição semelhante à composição de teste, excepto que em vez do pH candidato, a composição tem um pH aqui descrito, por exemplo, pH 5,7. A adequabilidade pode ser apresentada pela composição no pH candidato com efeitos comparáveis, ou melhores, na estabilidade, relativamente à composição a pH 5,7. A estabilidade proteica pode ser determinada, e. g., determinando a agregação proteica ou degradação proteica. A agregação proteica pode ser determinada, e. g., por cromatografia por exclusão de tamanhos, PAGE não desnaturante ou outros métodos para determinar o tamanho, etc. A degradação proteica pode ser determinada, e. g. , por HPLC de fase reversa, PAGE não desnaturante, cromatografia de permuta iónica, mapeamento peptídico ou métodos semelhantes.

Os tampões que podem ser utilizados para ajustar o pH de uma composição proteica incluem: histidina, citrato, fosfato, glicina, succinato, acetato, glutamato, Tris, tartarato, aspartato, maleato e lactato. Um tampão preferido é o citrato.

Concentração Proteica

Uma concentração proteica de GCB preferida pode ser entre cerca de 0,1 a cerca de 40 mg/mL, de um modo mais preferido, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/mL, e. g., cerca de 2 a cerca de 8 mg/mL ou cerca de 5 mg/mL.

Pode-se testar uma concentração proteica adequada proporcionado uma composição contendo 0,075% de cisterna (como um antioxidante), sacarose a 16% (para diminuir a 26 disponibilidade do -S-H), ajustando o pH para 5,7, ajustando a proteína (e. g., GCB) para uma concentração candidata e purgando a composição de 02. A estabilidade da composição proteica (e. g., GCB) na concentração candidata, determinada, e. g., como uma percentagem de agregação ou degradação, a um tempo predeterminado, é comparada com um ou mais padrões. Por exemplo, um padrão adequado seria uma composição semelhante às condições de teste excepto que a concentração proteica (e. g., GCB), é uma concentração aqui descrita, e. g., 2 mg/mL. São comparadas as estabilidades de uma proteína (e. g., GCB) a cada concentração. A adequabilidade pode ser apresentada pela concentração candidata com efeitos comparáveis ou melhores na estabilidade, relativamente a uma concentração aqui descrita. A estabilidade proteica pode ser determinada, e. g., determinando a agregação proteica ou degradação proteica. A agregação proteica pode ser determinada, e. g., por cromatografia por exclusão de tamanhos, PAGE não desnaturante ou outros métodos para determinar o tamanho, etc. A degradação proteica pode ser determinada, e. g., por HPLC de fase reversa, PAGE não desnaturante, cromatografia de permuta iónica, mapeamento peptídico ou métodos semelhantes.

Tensioactivos

Um tensioactivo pode ser adicionado à composição de proteína líquida (e. g., GCB). Numa forma de realização preferida, isto pode aumentar a estabilidade proteica, e. g., degradação proteica reduzida, e. g., devido à interface ar/líquido após agitação/transferência. É selecionado um tensioactivo que aumenta a estabilidade proteica, e. g., não provoca a degradação 27 proteica, na composição liquida. Um tensioactivo adequado para utilização é o e. g., poloxâmero 188, e. g. , PLURONIC® F68. 0 tensioactivo pode estar presente numa quantidade entre cerca de 0,005% e cerca de 5%, e. g., entre cerca de 0,01% e cerca de 1%, e. g., cerca de 0,025% e cerca de 0.5%, e. g., cerca de 0,03% e cerca de 0,25%, e. g. , cerca de 0,04 a cerca de 0,1%, e. g., cerca de 0,05% a cerca de 0,075%, e. g., 0,05%.

Idealmente, um tensioactivo seleccionado para utilização numa composição proteica aqui descrito é um que não é modificado, e. g., clivado pela proteína.

Por exemplo, pode-se testar um tensioactivo candidato proporcionando uma composição contendo 2 mg/mL de GCB, 0,075% de cisteina (como um antioxidante), sacarose a 16% (para diminuir a disponibilidade de -S-H), ajustando o pH para 5,7, adicionando o tensioactivo candidato (e. g., numa quantidade aqui descrita, e. g. , 0,05%) e purgando a composição de 02. A estabilidade da composição de GCB contendo o tensioactivo candidato, determinado, e. g., como uma percentagem de agregação ou degradação, a um tempo predeterminado, é comparada com um ou mais padrões. Por exemplo, um padrão adequado seria uma composição semelhante às condições de teste, excepto que não é adicionado um tensioactivo à composição. São comparadas as estabilidades das composições tratadas (contendo o tensioactivo) e não tratadas (sem o tensioactivo), em condições simulando cenários de "mundo real", e. g., situações de transporte. A adequabilidade pode ser demonstrada pela estabilidade aumentada do tratamento de teste, como comparado com este padrão. Outro padrão pode ser uma composição semelhante à composição de teste, excepto que em vez do tensioactivo candidato, é adicionado um tensioactivo aqui descrito, por exemplo, poloxâmero 188 (e. g., 28 numa quantidade aqui descrita, e. g., 0,05%), à composição. A adequabilidade pode ser apresentada pelo tensioactivo candidato com efeitos comparáveis ou melhores em estabilidade, relativamente a um tensioactivo aqui descrito. Se o tensioactivo candidato é determinado como sendo adequado (e. g., aumenta a estabilidade da composição quando comparado com um ou mais padrões), a concentração do tensioactivo candidato pode ser refinada. Por exemplo, a concentração pode ser aumentada ou diminuída numa gama de valores e comparada com o padrão e com outras concentrações a serem testadas para determinar que concentração provoca o maior aumento na estabilidade.

Em algumas formas de realização, uma combinação de dois ou mais tensioactivos é utilizada nas composições aqui descritas. A adequabilidade da combinação pode ser testada como descrito acima para um tensioactivo candidato. A estabilidade proteica pode ser determinada, e. g., determinando a agregação proteica ou degradação proteica. A agregação proteica pode ser determinada, e. g., por cromatografia por exclusão de tamanhos, PAGE não desnaturante ou outros métodos para determinar o tamanho, etc. A degradação proteica pode ser determinada, e. g. , por HPLC de fase reversa, PAGE não desnaturante, cromatografia de permuta iónica, mapeamento peptídico ou métodos semelhantes.

GCB

A doença de Gaucher é um distúrbio de armazenamento lisossomal autossómico recessivo, caracterizado por uma deficiência na enzima lisossomal, glucocerebrosidase (GCB). A 29 GCB hidrolisa o glucocerebrósido glicolipídico que é formado após a degradação dos glicoesfingolípidos nas membranas dos glóbulos brancos e glóbulos vermelhos. A deficiência nesta enzima faz com que o glucocerebrósido se acumule em grandes quantidades nos lisossomas das células fagociticas localizadas no fígado, baço e medula óssea, de doentes com Gaucher. A acumulação destas moléculas provoca uma gama de manifestações clínicas incluindo esplenomegalia, hepatomegalia, distúrbio esquelético, trombocitopenia e anemia. (Beutler et ai., Gaucher disease; In: The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (McGraw-Hill, Inc, Nova Iorque, 1995) p. 2625-2639).

Os tratamentos para doentes que sofrem desta doença incluem a administração de analgésicos para o alívio da dor nos ossos, transfusões de sangue e plaquetas e, em alguns casos, esplenectomia. A substituição de articulações é, muitas vezes necessária para doentes com erosão óssea. A terapia de substituição enzimática com GCB tem sido utilizada como um tratamento para a doença de Gaucher. A estrutura de GCB em solução proporciona porções -S-H livres relativamente acessíveis (como oposto às escondidas ou impedidas), que promovem reacções com a porção -S-H. A GCB pode ser obtida por métodos que são conhecidos na técnica. Por exemplo, os documentos WO 02/15927 WO 2005/089047, WO 03/056897, WO 01/77307, WO 01/07078 e WO 90/07573; O Pedido Europeu Publicado N° EP 1392826; Pedidos Publicados U.S. N° 2005-0026249, 2005-0019861, 2002-0168750, 2005-0265988, 2004-0043457, 2003-0215435 e 2003-0133924; e Pedido de Patente U.S. N° 10/968,870; Patentes U.S. N° 7138262, 6451600, 6074864, 5879680, 5549892, 5236838 e 3910822 descrevem métodos ou 30 preparação da proteína GCB. Qualquer uma das preparações da proteína GCB descritas nestas patentes e pedidos podem ser formuladas numa composição aqui descrita. A actividade enzimática de GCB pode ser determinada nos exemplos aqui proporcionados, ou como descrito na técnica, e. g., na Pat. U.S. N° 7138262.

Embalamento e Distribuição

As composições proteicas, e. g., composições de GCB, e. g. , as composições aqui descritas e no documento WO02/1592 nos Pedidos U.S. Publicados N° 2005-0026249, 2005-0019861 e 2002-0168750 e Pedido de Patente U.S. N° 09/641471 e 10/968870 podem ser embaladas numa seringa de duas câmaras. Por exemplo, a composição na forma liofilizada pode ser colocada numa primeira câmara da seringa e pode estar presente um líquido numa segunda câmara da seringa (ver e. g., Pedido U.S. Publicado N° 2004-0249339) .

As composições proteicas, e. g., composições de GCB, e. g., as composições aqui descritas e no documento WO 02/15927, Pedidos U.S. Publicados N° 2005-0026249, 2005-0019861 e 2002-0168750 e Pedidos de Patente U.S. N° 09/641471 e 10/968870, podem ser embaladas numa seringa sem agulha (ver e. g., Patentes U.S. N° 6406455 e 6939324). Resumidamente, como um exemplo, o dispositivo de injecção inclui: uma câmara de gás contendo um gás ou uma fonte de gás; uma porta que pode permitir a libertação do gás a partir da câmara de gás; um êmbolo, que após libertação do gás a partir da câmara de gás, pode provocar o movimento de, pelo menos, um primeiro pistão; um primeiro 31 uma pistão; um segundo pistão; uma primeira câmara, e. g., câmara útil para o armazenamento do fármaco e mistura; uma caixa para o pistão, no qual está o primeiro pistão, o segundo pistão e a primeira câmara; um membro de deslocamento que pode, independente da força motriz do gás da câmara de gás, provocar o movimento de um ou ambos, do primeiro e segundo pistão (o membro de deslocamento pode ser um êmbolo ou um membro separado) ; um orifício adequado para a injecção sem agulha na comunicação com a primeira câmara; em que o primeiro e segundo pistão, estão dispostos de modo deslizante no interior da caixa do êmbolo e o membro de deslocamento, a fonte do gás e o êmbolo estão dispostos de modo a que: numa primeira posição do pistão, uma segunda câmara, e. g. , um reservatório de fluído, é definido no interior da caixa do pistão pelo primeiro pistão, a caixa do pistão e o segundo pistão, o membro de deslocamento pode mover um ou ambos os pistões para uma segunda posição, em que o primeiro pistão está numa posição tal, que a segunda câmara, que pode ser um reservatório de fluído, está em comunicação com a primeira câmara, que pode ser um armazenamento de fármaco e a câmara de mistura e o segundo pistão são deslocados na direcção do primeiro pistão, diminuindo, assim, o volume da segunda câmara e permitindo a transferência do fluído da segunda câmara para a primeira câmara, o êmbolo, após libertação do gás da câmara de gás, faz com que o primeiro pistão se mova de modo a diminuir o volume da primeira câmara permitindo que a substância seja expelida através do orifício da câmara e, e. g., para um indivíduo. A seringa sem agulha pode incluir módulos separados para um primeiro componente, e. g., um componente seco ou líquido e um segundo componente, e. g., um componente líquido. Os módulos podem ser proporcionados como dois componentes separados e 32 montados, e. g., pelo indivíduo que irá administrar o componente a ele próprio, ou por outra pessoa, e. g. , por um indivíduo que proporciona ou presta cuidados de saúde. Em conjunto, os módulos podem formar o todo ou parte de uma caixa de pistão dos dispositivos aqui descritos. Os dispositivos podem ser utilizados para proporcionar qualquer um de, primeiro ou segundo componente, em que é desejável armazenar ou proporcionar os componentes em separado e combina-los antes da administração a um indivíduo.

As composições proteicas (e. g. , GCB) aqui descritas podem ser incorporadas em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo, e. g., um humano. Uma composição de GCB pode incluir uma dosagem suficiente de GCB para tratar um indivíduo com a doença de Gaucher. As composições farmacêuticas podem incluir um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Como aqui utilizado, a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável" pretende incluir qualquer um e todos os solventes, excipientes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da adsorção e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica. A formulação farmacêutica está bem estabelecida na técnica e é ainda descrita, e. g., em Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); e Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X). Excepto na medida em que como qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o composto activo, tal meio pode ser utilizado nas composições da invenção. Os 33 compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

Uma composição farmacêutica pode incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma composição aqui descrita. Tais quantidades eficazes podem ser determinadas com base no efeito da composição administrada. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode também variar de acordo com factores tais com estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e da capacidade da composição para induzir uma resposta desejada no indivíduo, e. g., melhoria de, pelo menos um sintoma de uma patologia ou distúrbio, e. g., a deficiência em glucocerebrosidase, e. g., doença de Gaucher. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial da composição é compensado pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a via de administração pretendida. Por exemplo, a composição pode ser administrada através do modo parentérico (e. g. , injecção intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular). As frases "administração parentérica" e "parentericamente administrado", como aqui utilizado, significa modos de administração, outros que não a administração entérica e tópica, normalmente por injecção e incluem, sem limitação, injecção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinal, epidural e intra-esternal e infusão. De um modo preferido, a via de administração é a intravenosa. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica podem incluir os seguintes 34 componentes: um diluente estéril, tal como a água para injecção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzilico ou parabenos de metilo; antioxidantes tais como o ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes guelantes, tais como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste de tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser colocada no interior de ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla, feitos de vidro ou plástico.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis, e. g., preparações liofilizadas, para a preparação extemporânea de soluções injectáveis intravenosas ou dispersão. Para administração intravenosa, os transportadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, CREMOPHOR EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada (PBS) . Em todos os casos, a composição deverá ser estéril e deverá ser fluida de modo a que exista capacidade para empurrar o êmbolo da seringa. Deverá ser estável sob condições de preparação e armazenamento e deverá ser preservada contra a acção de contaminação de microrganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como a lecitina, pela 35 manutenção do tamanho de partícula pretendido no caso de dispersão, e pela utilização de tensioactivos. A prevenção da acção dos microorganismos pode ser alcançada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferido incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como, manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A estabilidade prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio, albumina de soro humano e gelatina.

As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação das composições de GCB aqui descritas na quantidade necessária, num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, quando necessário, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a composição de soluções estéreis injectáveis, os métodos preferidos da composição são a secagem a vácuo e secagem por congelamento, e. g., liofilização, que proporciona um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado, de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

Os compostos activos (e. g., composições de GCB aqui descritos) podem ser preparados com transportadores que irão proteger o composto contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, tais 36 como acetato de etilenovinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Métodos para preparação de tais formulações irão ser evidentes para os especialistas na técnica. Os materiais podem também ser obtidos comercialmente da Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossomais (incluindo lipossomas direccionados para as células infectadas com anticorpos monoclonais para antigénios virais), podem também ser utilizados como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N° 4522811.

As composições proteicas, e. g., composições de GCB, aqui descritas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma composição proteica (e. g. , GCB) aqui descrita pode ser administrada com um dispositivo de injecção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos revelados nas Patentes U.S. N° 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 ou 4596556. Exemplos de implantes bem conhecidos e módulos úteis na invenção incluem: Patente U.S. N° 4487603, que revela uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar a medicação a uma taxa controlada; Patente U.S. N° 4486194, que revela um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente U.S. N° 4447233, que divulga uma bomba de infusão de medicamento para distribuir medicação a uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. N° 4447224, que divulga um dispositivo de infusão implantável de fluxo variável para distribuição contínua de fármaco; Patente U.S. N° 4439196, que divulga um sistema de distribuição de fármaco osmótico com compartimentos multi-câmara; e Patente U.S. N° 4475196, que revela um sistema 37 de distribuição de fármaco osmótico. Com certeza, são conhecidos muitos outros implantes, sistemas de distribuição e módulos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Materiais e Equipamento

Foram utilizados os seguintes reagentes na geração dos resultados apresentados nos Exemplos 2-6: GCB: A glucocerebrosidase foi preparada utilizando, mas não limitado a, os métodos descritos no Pedido Internacional N° PCT/US01/25882. Podem ser utilizados outros métodos conhecidos para um especialista na técnica, utilizando tecnologia de ADN recombinante, por exemplo, os métodos descritos nos Pedidos Internacionais N° PCT/US88/04314, PCT/US89/05801 e PCT/US92/00431 e Patentes US N° 5236838B1, 5641670B1, 5549892B1 e 6270989B1.

Sacarose: P/N S-124-01 or S-124-02, Pfanstiehl (Waukegen, IL) Cisteina HC1: P/N 2071-05, JTBaker (Phillipsburg, NJ)

Poloxâmero 188: P/N P1169, Spectrum (New Brunswick, NJ)

Citrato de Sódio: P/N 3649-01, JTBaker (Phillipsburg, NJ)

Frascos de 20 mL: P/N 6800-0321, West Pharmaceuticais Services (Lionville, PA) Frascos de 2 mL: P/N 6800-0314, West Pharmaceuticals Services (Lionville, PA) Tampas de 2 0 mm: P/N 1950-0414, West Pharmaceuticals Services (Lionville, PA) Tampas de 13 mm: P/N 1950-0412, West Pharmaceuticals Services (Lionville, PA) 38 N2 gasoso: Ρ/Ν UN 1066, Airgas (Salem, NH)

Liofilizador: Genesis 35EL, SP Industries (Warminster, PA)

Exemplo 2: Estabilidade de GCB A GCB foi formulada a 2,5 mg/mL em sacarose a 16%, cloridrato de cisteína a 0,03%, poloxâmero 188 a 0,05%, citrato de sódio a 50 mM, pH 6,0. Os frascos de vidro de vinte mL foram cheios com 4,5 mL cada, com as soluções formuladas. Os frascos cheios foram colocados numa prateleira do liofilizador e desgaseifiçados a vácuo com uma temperatura de prateleira de 20 °C durante 3 minutos, seguido por recarga com N2 a 950 mBar e imediatamente selados com tampas cinzentas de 20 mm. As amostras foram colocadas em câmaras de estabilidade a 2-8 °C. A 0, 6, 12, 18 e 24 meses após armazenamento, as amostras foram retiradas e testadas para a actividade enzimática, agregação por SE-HPLC e alterações por degradação por RP-HPLC. A actividade enzimática foi avaliada por um ensaio colorimétrico utilizando β-D-glucopiranosido de p-nitrofenilo como um substrato (a actividade pode também ser avaliada, e. g, utilizando o ensaio descrito na Pat. US N° 7138262).

Os resultados estão resumidos na Tabela 1. A GCB desta composição tinha menos do que 5% de alterações relativamente à linha de base após 24 meses a 2-8 °C. 39

Tabela 1: Resumo da Estabilidade para o Exemplo 2, após 24 Meses de Armazenamento a 2-8 SC

Ponto de Tempo (meses) Actividade* SE-HPLC* RP-HPLC* 0 100% 100% 100% 6 N/A 100% 100% 12 100% 100% 99% 18 96% 99% 97% 24 95% 99% 96% * Percentagem retida a partir da linha de base.

Exemplo 3: Efeito dos níveis de O2 A GCB foi formulada a 2,5 mg/mL de GCB em sacarose a 16%, cloridrato de cisteína a 0,03%, poloxâmero 188 a 0,05%, citrato de sódio a 50 mM, pH 6,0. Os frascos de vidro de dois mililitros foram cheios com 1 mL cada, com as soluções formuladas. A câmara de expansão dos frascos foi tratada utilizando um dos liofilizados para ter níveis de O2 de 3%, 6% ou 14%. As amostras foram colocadas numa câmara de estabilidade a 2-8 °C. No ponto de tempo dos 6 meses, as amostras foram retiradas e testadas para alteração na agregação por SE-HPLC e alteração na degradação por RP-HPLC. Os resultados foram resumidos na Tabela 2. A GCB destas composições é sensível ao nível de oxigénio na câmara de expansão do frasco. Com um valor de O2 inferior a 3%, não foram observadas essencialmente alterações após 6 meses a 2-8 °C. 40

Tabela 2: Resumo da Estabilidade para o Exemplo 3, após 6 Meses de Armazenamento a 2-8 2C Nível de O2 na câmara de expansao SE-HPLC* RP-HPLC* 3% 100% 99% 6% 93% 89% 14% 64% 72% * Percentagem retida a partir da linha de base.

Exemplo 4: Efeito dos Níveis de Sacarose A GCB foi formulada a 2,5 mg/mL GCB em Cloridrato de Cisteína a 0,05%, Poloxâmero 188 a 0,05%, citrato de sódio a 50 mM, pH 6,0, contendo níveis de sacarose de 0%, 5%, 8% ou 16%. Os frascos de dois mililitros foram cheios com 1 mL de cada uma das soluções formuladas. Os frascos foram desgaseifiçados a vácuo por um liofilizador e revestidos com N2 a 950 mBar, seguido por encerramento com tampas de 13 mm. As amostras foram colocadas em câmaras de estabilidade a 2-8 °C. No ponto de tempo de 6 meses, as amostras foram retiradas para testar a alteração na agregação por SE-HPLC e alteração na degradação por RP-HPLC. Os resultados estão resumidos na Tabela 3. 41

Tabela 3: Resumo da Estabilidade para o Exemplo 4, após 6 Meses de Armazenamento a 2-8 SC Nível de Sacarose SE-HPLC* RP-HPLC* 0% 99, 1% 98,9% 5% 99,5% 98,9% 8% 99,6% 98,9% 16% 99, 8% 98,6% *Percentagem retida a partir da linha de base.

Exemplo 5: Efeito nos Níveis de Cisteína A GCB foi formulada a 2,5 mg/mL de GCB em sacarose a 16%, poloxâmero 188 a 0,05%, citrato de sódio a 50 mM, pH 6,0, contendo cloridrato de cisteína de 0% ou 0,05%. Os frascos de vidro de dois mililitros foram cheios com 1 mL de cada uma das soluções formuladas. Os frascos foram desgaseifiçados a vácuo por um liofilizador e revestidos com N2 a 950 mBar na câmara de expansão, seguido por encerramento com tampas de 13 mm. Estas amostras foram colocadas numa câmara de estabilidade a 2-8 °C.

No ponto de tempo de 6 meses, as amostras foram retiradas para testar a alteração na agregação por SE-HPLC e alteração na degradação por RP-HPLC. Os resultados estão resumidos na Tabela 4. A adição de cloridrato de cisteína reduziu o nível de agregação mas aumentou o nível de degradação, como detectado por RP-HPLC. 42

Tabela 4: Resumo da Estabilidade para o Exemplo 5, após 6 Meses de Armazenamento a 2-8 2C Nível de Cloridrato de Cisteína SE-HPLC* RP-HPLC* 0% 99, 4% 99,2% 0, 05% 99,8% 98,6% * Percentagem retida a partir da linha de base.

Exemplo 6: Efeito dos níveis de pH A GCB foi formulada a 2,5 mg/mL de GCB em sacarose a 16%, cloridrato de cisteína a 0,05%, poloxâmero 188 a 0,05%, citrato de sódio a 50 mM com pH de 6,0, 5,8 ou 5,5. Os frascos de vidro de dois mililitros foram cheios com 1 mL de cada uma das soluções formuladas. Os frascos foram desgaseifiçados a vácuo por um liofilizador e revestidos com N2 a 950 mBar na câmara de expansão, seguido por encerramento com tampas de 13 mm. Estas amostras foram colocadas numa câmara de estabilidade a 13-17 °C. No ponto de tempo de 3 meses, as amostras foram retiradas para testar a alteração na agregação por SE-HPLC e alteração na degradação por RP-HPLC. Os resultados estão resumidos na Tabela 5. A diminuição do pH pode reduzir tanto o nível de agregação como o nível de degradação. 43

Tabela 5: Resumo da Estabilidade para o Exemplo 6, após

3 Meses de Armazenamento a 13-17 2C pH SE-HPLC* RP-HPLC* 6, 0 99,8% 96, 9% 5, 8 100% 97, 9% 5, 5 100% 98,5% *Percentagem retida a partir da linha de base.

Lisboa, 19 de Outubro de 2012 44

Claims (38)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo uma proteína com um tiol livre e um hidrato de carbono, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para manter a estabilidade da proteína e em que o pH da composição está entre 4,5 e 6,5, em que a proteína com um tiol livre é a glucocerebrosidase (GCB) e em que o hidrato de carbono é a sacarose.
2. 2. Composição farmacêutica da reivindicação 1, compreendendo também um antioxidante, em que o antioxidante e o hidrato de carbono estão presentes em quantidades suficientes para manter a estabilidade da proteína.
3. 3. Composição farmacêutica da reivindicação 1, compreendendo também um tensioactivo.
4. 4. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a estabilidade é, pelo menos, 5-80% superior, sob condições pré-seleccionadas, relativamente à estabilidade de uma composição que difere pela ausência do hidrato de carbono.
5. 5. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para aumentar a estabilidade da proteína.
6. 6. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para inibir a reacção de um tiol livre numa primeira molécula da proteína, com um tiol livre numa segunda molécula da proteína, para formar um agregado. 1
7. 7. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para inibir a formação de um agregado formado pela reacção de um tiol livre numa primeira molécula da proteína, com um tiol livre numa segunda molécula da proteína, em pelo menos, 5-80%, sob condições pré-seleccionadas, quando comparado com a mesma composição sem o hidrato de carbono.
8. 8. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente que após armazenamento, num recipiente estanque a gases, a uma temperatura 2-8 °C, durante um período de tempo de 6 meses, a composição irá reter, pelo menos, 85% da estabilidade que a composição tinha antes do armazenamento.
9. 9. Composição farmacêutica da reivindicação 8, em que o armazenamento ocorre no escuro.
10. 10. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para ter estabilidade comparativamente à de uma composição liofilizada compreendendo sacarose, polissorbato 20 a 0,01%, pH 6,0, citrato 50 mM.
11. 11. Composição farmacêutica da reivindicação 1, compreendendo cerca de 1-40% de hidrato de carbono.
12. 12. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a composição é um líquido.
13. 13. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a composição contém menos de cerca de 10% de O2. 2
14. 14. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a composição é preparada através de um método compreendendo remoção física de 02 da composição.
15. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a composição é uma composição líquida de GCB, em que a composição foi produzida por exposição da composição a um gás inerte e em que o gás inerte está presente numa concentração superior à atmosfera ambiente.
16. 16. Composição farmacêutica da reivindicação 15, compreendendo também um antioxidante.
17. 17. Composição farmacêutica da reivindicação 16, em que o antioxidante é a cisteína, cisteína-HCl ou metionina.
18. 18. Composição farmacêutica da reivindicação 17, em que o antioxidante é a cisteína, cisteína-HCl ou metionina, e está presente entre 0,001 e 10% (p/vol) e o hidrato de carbono está presente entre 1 e 40% (p/vol).
19. 19. Composição farmacêutica da reivindicação 15, compreendendo também um tensioactivo.
20. 20. Composição farmacêutica da reivindicação 19, em que o tensioactivo é o poloxâmero 188.
21. 21. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a composição é uma composição líquida de GCB, em que o pH da composição está entre 4,5 e 6,5, e em que o hidrato de carbono está presente numa quantidade suficiente para manter a integridade bioquímica e características de bioactividade de GCB ao pH. 3
22. 22. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o pH está na gama de 5,0 a 6,0.
23. 23. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o hidrato de carbono está presente entre 1 e 40% (p/vol).
24. 24. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a composição é uma composição liquida de GCB compreendendo GCB, um antioxidante, um hidrato de carbono e em que a composição foi produzida por exposição da composição a um gás inerte.
25. 25. Composição farmacêutica da reivindicação 24, compreendendo cerca de 0,1-40 mg/mL de GCB, cerca de 0,001-10% de cisteina, 1-40% de sacarose, a um pH de 5,5-6,0 e em que o nível de O2 dissolvido é inferior a cerca de 10%.
26. 26. Composição farmacêutica da reivindicação 24, compreendendo também um tensioactivo.
27. 27. Composição farmacêutica da reivindicação 26, em que o tensioactivo é o polaxamero 188.
28. 28. Recipiente estanque a gases, compreendendo a composição farmacêutica da reivindicação 1, um componente proteico, uma câmara, em que a câmara é, pelo menos, 90% (vol/vol) de um gás inerte.
29. 29. Recipiente estanque a gases da reivindicação 28, em que o recipiente é uma seringa pré-cheia, um frasco ou ampola.
30. 30. Recipiente estanque a gases da reivindicação 28, em que a seringa pré-cheia é uma seringa sem agulha. 4
31. 31. Método de embalamento da composição farmacêutica da reivindicação 1, o método compreendendo colocar o GCB em contacto com um gás inerte para reduzir a quantidade de uma espécie reactiva e introduzindo o GCB e o gás inerte num recipiente estanque a gases.
32. 32. Método da reivindicação 31, em que o gás inerte é ο N2 ou Ar e a espécie reactiva é ο O2.
33. 33. Composição farmacêutica da reivindicação 1, para utilização num método de tratamento de um doente, o método compreendendo administrar a composição ao doente.
34. 34. Composição farmacêutica da reivindicação 33, em que a administração é por infusão IV ou administração subcutânea.
35. 35. Composição farmacêutica da reivindicação 15, para utilização num método de tratamento de um doente com uma deficiência em glucocerebrosidase.
36. 36. Composição da reivindicação 35, em que a deficiência em glucocerebrosidase é a doença de Gaucher.
37. 37. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que a composição farmacêutica não contém polissorbato.
38. 38. Recipiente estanque a gases, da reivindicação 28, em que a componente proteica está em solução. Lisboa, 19 de Outubro de 2012 5