RU2179034C2 - ЛЕЧЕНИЕ В СЛУЧАЕ ДЕФИЦИТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ А - Google Patents
ЛЕЧЕНИЕ В СЛУЧАЕ ДЕФИЦИТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ А Download PDFInfo
- Publication number
- RU2179034C2 RU2179034C2 RU99107287/14A RU99107287A RU2179034C2 RU 2179034 C2 RU2179034 C2 RU 2179034C2 RU 99107287/14 A RU99107287/14 A RU 99107287/14A RU 99107287 A RU99107287 A RU 99107287A RU 2179034 C2 RU2179034 C2 RU 2179034C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gal
- human
- cells
- signal peptide
- cell
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 title description 19
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 claims abstract description 214
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 claims abstract description 213
- 101000718525 Homo sapiens Alpha-galactosidase A Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000043404 human GLA Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 167
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 51
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 48
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 40
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 36
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 36
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 21
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- CWGBFIRHYJNILV-UHFFFAOYSA-N (1,4-diphenyl-1,2,4-triazol-4-ium-3-yl)-phenylazanide Chemical compound C=1C=CC=CC=1[N-]C1=NN(C=2C=CC=CC=2)C=[N+]1C1=CC=CC=C1 CWGBFIRHYJNILV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 37
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 17
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 64
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 50
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 45
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 45
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 45
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 37
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 34
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 14
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 14
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 9
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 9
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 8
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 8
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 6
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 5
- 102000019218 Mannose-6-phosphate receptors Human genes 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010031792 IGF Type 2 Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 3
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108050006616 Mannose-6-phosphate receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- -1 and the first intron Proteins 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 2
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUAGNSFMKLTCCT-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;carbonic acid Chemical compound OC(O)=O.NCC(O)=O JUAGNSFMKLTCCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUDPTGPSBJVHCN-CHUNWDLHSA-N 4-methylumbelliferyl alpha-D-galactoside Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YUDPTGPSBJVHCN-CHUNWDLHSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 101100519164 Arabidopsis thaliana PCR8 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010031540 CCGCGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 208000006069 Corneal Opacity Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102100040977 Follitropin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001028283 Homo sapiens FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 101150102264 IE gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000007177 Left Ventricular Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100029530 Thyrotropin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 206010047295 Ventricular hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 201000009431 angiokeratoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010068678 beta Subunit Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229940097706 buminate Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 231100000269 corneal opacity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000009093 first-line therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N herniarin Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N herniarin Natural products C1CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 102000043476 human FARP2 Human genes 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- ZLQJVGSVJRBUNL-UHFFFAOYSA-N methylumbelliferone Natural products C1=C(O)C=C2OC(=O)C(C)=CC2=C1 ZLQJVGSVJRBUNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 208000005907 mitral valve insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000002812 neutral glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 101150040365 tko gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к лечению заболеваний, связанных с дефицитом α-галактозидазы А (α-гал А). Сущность изобретения составляет способ лечения пациента, имеющего дефицит α-гал А, который включает введение пациенту человеческой клетки, генетически модифицированной для сверхэкспрессии и секреции человеческой α-гал А. Изобретение включает также молекулу ДНК, кодирующую полипептиз, содержащий α-гал А, способ очистки и терапевтическую композицию. Техническим результатом является расширение арсенала средств для лечения патологии, связанной с дефицитом α-гал А. 8 c. и 4 з.п. ф-лы, 13 ил., 8 табл.
Description
Предпосылки создания изобретения
Изобретение относится к α-галактозидазе А и лечению в случае дефицита α-галактозидазы А.
Изобретение относится к α-галактозидазе А и лечению в случае дефицита α-галактозидазы А.
Болезнь Фабри представляет болезнь, связанную с X-хромосомным унаследованным лизосомным накоплением, характеризующуюся такими симптомами, как тяжелая почечная недостаточность, ангиокератомы и сердечно-сосудистые нарушения, в том числе гипертрофия желудочков сердца и недостаточность митрального клапана. Болезнь также поражает периферическую нервную систему, вызывая мучительные приступы со жгучей болью в конечностях. Болезнь Фабри вызывается дефицитом фермента α-галактозидазы А ( α-гал А), который проявляется в блокировке катаболизма нейтральных гликосфинголипидов и накоплением ферментного субстрата церамид-тригексозида внутри клеток и в кровотоке.
Вследствие характера, связанного с Х- хромосомой унаследованного заболевания, по существу, все пациенты с болезнью Фабри являются мужчинами. Хотя наблюдали несколько случаев тяжелого поражения женских гетерозигот, женские гетерозиготы обычно или бессимптомны, или имеют относительно умеренные симптомы, ограниченные большей частью характерным помутнением роговицы. Нетипичный вариант болезни Фабри, при котором проявляется низкая остаточная активность α-гал А и весьма умеренные симптомы или явное отсутствие симптомов, характерных для болезни Фабри, коррелирует с гипертрофией левого желудочка и болезнью сердца (Nakano et al. New Engl. J. Med., 333:288-293, 1995). Сделано предположение, что редукция α-гал А может являться причиной таких нарушений в работе сердца.
Выделены и секвенированы кДНК и ген, кодирующий человеческую α-гал A (Bishop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4859, 1986; Kornreich et al., Nuc. Acids Res., 17:3301, 1988; Oeltjen et al. Mammalian Genome, 6:335-338, 1995). Человеческая α-гал А экспрессируется в виде полипептида из 429 аминокислот, из которых 31 N-концевая аминокислота составляет сигнальный пептид. Человеческий фермент экспрессирован в клетках яичника китайского хомячка (CHO) (Desnick, патент США N 5356804; Ioannou et al., J. Cell Biol., 119: 1137, 1992); в клетках насекомых (Calhoun et al., патент США N 5179023) и в COS-клетках (Tsuji et al., Eur. J. Biochem., 165:275, 1987). Сообщается о пробных испытаниях по применению белка, полученного из тканей человека, при α-гал А заместительной терапии (Mapes et al., Science, 169:987, 1970; Brady et al. , N. Engl. J. Med., 289:9, 1973; Desnick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5326, 1979), но на сегодняшний день эффективного способа лечения болезни Фабри не существует.
Краткое изложение сущности изобретения
Обнаружено, что при экспрессии ДНК, кодирующей человеческую α-гал А, в культивированных человеческих клетках продуцируется полипептид, который соответствующим образом гликозилирован, так что он не только ферментативно активен и способен действовать на гликосфинголипидный субстрат, накапливающийся при болезни Фабри, но он также эффективно поглощается клетками через рецепторы на поверхности клетки, которые его точно нацеливают туда, где они необходимы при этой болезни: в лизосомный компартмент пораженных клеток, в частности эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные сосуды пациента. Это открытие, подробнее обсуждаемое ниже, означает, что индивидуума с подозрением на дефицит α-гал А, как при болезни Фабри, можно лечить или (1) человеческими клетками, которые генетически модифицированы для сверхэкспресии и секреции человеческой α-гал А, или (2) очищенной человеческой α-гал А, полученной из культивированных, генетически модифицированных человеческих клеток.
Обнаружено, что при экспрессии ДНК, кодирующей человеческую α-гал А, в культивированных человеческих клетках продуцируется полипептид, который соответствующим образом гликозилирован, так что он не только ферментативно активен и способен действовать на гликосфинголипидный субстрат, накапливающийся при болезни Фабри, но он также эффективно поглощается клетками через рецепторы на поверхности клетки, которые его точно нацеливают туда, где они необходимы при этой болезни: в лизосомный компартмент пораженных клеток, в частности эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные сосуды пациента. Это открытие, подробнее обсуждаемое ниже, означает, что индивидуума с подозрением на дефицит α-гал А, как при болезни Фабри, можно лечить или (1) человеческими клетками, которые генетически модифицированы для сверхэкспресии и секреции человеческой α-гал А, или (2) очищенной человеческой α-гал А, полученной из культивированных, генетически модифицированных человеческих клеток.
Терапия по первому пути, т. е. с самими модифицированными клетками, включает генетическую манипуляцию с человеческими клетками (например, первичными клетками, вторичными клетками или иммортализованными клетками) in vitro или ex vivo, чтобы побудить клетки к экспресии и секреции большого количества человеческой α-гал А, с последующей имплантацией клеток пациенту, что в общих чертах описано в WO 93/09222, Selden et al. (включенной в настоящее описание в качестве ссылки).
Когда клетки должны быть генетически модифицированными для целей лечения болезни Фабри или посредством генной терапии, или посредством заместительной терапии ферментами, ДНК-молекула, содержащая кДНК α-гал А, или последовательность геномной ДНК может содержаться в экспрессирующей конструкции и может быть введена в первичные или вторичные человеческие клетки (например, в фибробласты, эпителиальные клетки, включая эпителиальные клетки молочной железы и кишечника, эндотелиальные клетки, форменные элементы крови, включая лимфоциты и клетки костного мозга, глиальные клетки, гепатоциты, кератиноцины, мышечные клетки, невральные клетки или в предшественников клеток таких типов) посредством стандартных способов трансфекции, в том числе, но не только перечисленными способами, липосомо-, полибрен- или DEAE-декстранопосредованной трансфекцией, электропорацией, осаждением фосфатом кальция, микроинъекцией или быстрыми частицами с управляемой скоростью ("биолистики" ["biolistics"] ). С другой стороны, можно использовать систему, которая доставляет ДНК с помощью вирусного вектора. Вирусами, известными как пригодные для переноса генов, являются аденовирусы, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус паротита, полиовирус, ретровирусы, вирус Синдбиса и вирус осповакцины, такой как вирус чумы канареек. Хотя для способов лечения данного изобретения предпочтительны культуры первичных или вторичных клеток, можно также использовать иммортализованные человеческие клетки. Примерами линий иммортализованных человеческих клеток, полезных в способах настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются перечисленным, клетки меланомы Bowes (АТСС, инвентарный N CRL 9607), клетки Дауди (АТСС, инвентарный N CCL 213), клетки HeLa и производные клеток HeLa (АТСС, инвентарные NN CCL 2, CCL 2.1 и CCL 2.2), клетки HL-60 (АТСС, инвентарный N CCL 240), клетки НТ1080 (АТСС, инвентарный N CCL 121), клетки Юрката (АТСС, инвентарный N TIB 152), клетки карциномы KB (АТСС, инвентарный N CCL 17), лейкозные клетки К-562 (АТСС, инвентарный N CCL 243), клетки рака молочной железы MCF-7 (АТСС, инвентарный N ВТН 22), клетки MOLT-4 (АТСС, инвентарный N 1562), клетки Намальвы (АТСС, 1 инвентарный N CRL 1432), Raji-клетки (АТСС, инвентарный N CCL 86), клетки RPMI 8226 (АТСС, инвентарный N CCL 155), клетки U-937 (АТСС, инвентарный N CRL 1593), клетки 2R4 сублинии WI-38VA13 (АТСС, инвентарный N CLL 75.1) и клетки карциномы яичника 2780AD (Van der Blick et al. Cancer Res. , 48:5927-5932, 1988), а также гетерогибридомные клетки, полученные путем слияния человеческих клеток и клеток другого вида. Штаммы вторичных фибробластов человека, такие как WI-38 (АТСС, инвентарный N CCL 75) и MRC-5 (АТСС, инвентарный N CCL 171), также можно использовать.
Методами генной инженерии из человеческих клеток с ДНК-молекулой, кодирующей α-гал А (или посредством другой подходящей генетической модификации, как описано ниже), для получения клетки, которая сверхэкспрессирует и секретирует α-гал А, можно генерировать клональный клеточный штамм, состоящий, по существу, из множества генетически идентичных культивированных первичных человеческих клеток, или, когда клетки иммортализованы, клональную клеточную линию, состоящую, в основном, из множества генетически идентичных иммортализованых человеческих клеток. Предпочтительно клетки клонального клеточного штамма или клональной клеточной линии являются фибробластами.
Затем можно получить генетически модифицированные клетки и ввести их пациенту подходящими способами, например так, как описано в WO 93/09222, Selden et al.
Генная терапия по изобретению обладает рядом преимуществ по сравнению с ферментно-заместительной терапией с применением фермента, полученного из тканей человека или животного. Например, способ по изобретению не зависит от возможно неустойчивой доступности источников соответствующих тканей и поэтому является коммерчески осуществимым способом лечения дефицита α-гал А. Он относительно безопасен по сравнению с ферментно-заместительной терапией с ферментом, полученным из человеческих тканей, которые могут быть инфицированы известными или неизвестными вирусами и другими инфицирующими агентами. Кроме того, генная терапия по изобретению обладает рядом преимуществ перед ферментно-заместительной терапией в целом. Например, способ изобретения (1) дает преимущества стратегии длительного лечения, исключающего необходимость ежедневных инъекций; (2) исключает экстремальные колебания в концентрациях в сыворотке и тканях терапевтического белка, которые типично сопровождают обычную фармокологическую доставку; и (3) является, вероятно, менее дорогостоящим, чем ферментно-заместительная терапия, поскольку нет необходимости в получении и очистки белка для частого введения.
Как описано выше, индивидуумов с дефицитом α-гал A можно также лечить очищенной α-гал А (т.е. ферментно-заместительной терапией). Первичные, вторичные и иммортализованные человеческие клетки, генетически модифицированные для сверхэкспресии человеческой α-гал А, также полезны в случае получения белка in vitro для получения белка, который можно очистить для ферментно-заместительной терапии. Вторичные или иммортализованные человеческие клетки можно выбрать среди клеток, описанных выше, и можно генетически модифицировать методами трансфекции или трансдукции, также описанными выше. После генетической модификации клетки культивируют в условиях, допускающих сверхэкспрессию и секрецию α-гал А. Белок выделяют из выращенных клеток, собирая среду, в которой выращивают клетки, и/или путем растворения клеток для высвобождения их содержимого и затем применяют стандартные методы очистки белков. Один из таких методов заключается в пропускании культуральной среды или любого образца, содержащего человеческую α-гал А, через гидрофобную, вступающую во взаимодействие смолу, такую как бутилсефароза®, или другую смолу с функциональной группой, содержащей бутильную группу. Пропускание образца через такую смолу может составлять первую стадию хроматографии. Если необходима дополнительная очистка, содержащий α-гал А материал, элюированный из гидрофобной активной смолы, можно загрузить в колонку, содержащую другую смолу, например иммобилизованную гепариновую смолу, такую как гепаринсефароза®, гидроксиапатит, анионообменную смолу, такую как Q-сефароза®, или смолу для гельхроматографии, такую как супердекс® 200. Предпочтительно, схема очистки включает применение каждой смолы из вышеуказанных типов смол. С другой стороны, можно применить одну или несколько из последних смол перед применением гидрофобной активной смолы или вместо нее.
Ранее описанные способы получения α-гал А относительно высокой чистоты зависят от применения аффинной хроматографии с использованием сочетания аффинной хроматографии на лецитине (конканавалин A-(Con А)-сефароза) и аффинной хроматографии, основанной на связывании α-гал А с аналогом субстрата N-6-аминогесаноил -α-D-галактозиламином, связанным с сефарозной матрицей (Bishop et al. , J. Biol. Chem., 256:1307-1316, 1981). Применение белковых лецитинаффинных смол и смол - аналогов субстрата типично связывается с непрерывным "сползанием" афинного агента с твердого носителя (ср. Marikar et al. , Anal. Biochem. , 201: 306-310, 1992), что приводит, в результате, к загрязнению очищенного продукта аффинным агентом или свободным в растворе или связанным с элюированным белком. Такие загрязнения делают продукт непригодным для применения в фармацевтических препаратах. Связанные аналоги субстрата и лецитины также могут весьма негативно влиять на ферментативные, функциональные и структурные свойства белков. Кроме того, такие аффинные смолы обычно дорогостоящи для получения, что делает применение таких смол менее подходящим для производства в коммерческом масштабе, чем более привычных смол для хроматографии. Таким образом, разработка схемы очистки с использованием традиционных смол для хроматографии, которые легко доступны для поставок и качественно подходящи для крупномасштабного коммерческого применения, является существенным преимуществом настоящего изобретения.
Индивидуума, у которого подозревают дефицит α-гал А, можно лечить путем введения фармацевтически приемлемой очищенной человеческой α-гал А стандартным способом, в том числе, но не только, внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекцией, или в виде твердого имплантата. Очищенный белок можно ввести в терапевтическую композицию, состоящую из водного раствора, содержащего физиологически приемлемый эксципиент, например носитель, такой как сывороточный альбумин человека, при pH 6,5 или ниже.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения больших количеств подходящим образом гликозилированной и поэтому терапевтически полезной, человеческой α-гал А. Это делает ферментно-заместительную терапию в случае дефицита α-гал А коммерчески жизнеспособной, а также относительно безопасной по сравнению с терапией ферментом, полученным из тканей человека или животного.
Специалистам в этой области техники будет понятно, что последовательность ДНК человеческой α-гал А (или кДНК, или геномной ДНК) или последовательности, которые отличаются от нее либо из-за изменений молчащих кодонов, либо изменений кодонов, которые дают консервативные замещения аминокислот, можно использовать для генетической модификации культивированных человеческих клеток, так что они будут сверхэкспрессировать и секретировать фермент. Также возможно, что некоторые мутации в последовательности α-гал А будут кодировать полипептиды, которые возвращают или обнаруживают повышенную ферментативную активность α-гал А (что можно будет выявить путем экспрессии молекулы мутантной ДНК в культивированных клетках, очистки кодированного полипептида и измерения каталитической активности, как описано здесь). Например, можно ожидать, что консервативные замещения аминокислот оказывают слабое действие или не оказывают действия на биологическую активность, особенно если они составляют менее 10% от общего числа остатков в белке. Консервативные замещения обычно включают замещения в пределах следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серии, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.
Продуцирование α-гал А клетками можно привести к максимуму путем некоторых генетических манипуляций. Например, молекула ДНК, которая кодирует α-гал А, может также кодировать гетерологичный сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид человеческого гормона роста (hGH), эритропоэтина, фактора VIII, фактора IX, глюкагона, рецептора для липопротеина низкой плотности (LDL), или лизосомного фермента, иного чем α-гал А. Предпочтительно, сигнальный пептид представляет сигнальный пептид hGH (ПОСЛЕД. N21) и находится в N-конце кодированного белка. ДНК-последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может содержать интрон, такой как первый интрон hGH-гена, результатом чего является такая ДНК-последовательность, как ПОСЛЕД. N 27 (см. также фиг. 10). Кроме того, молекула ДНК может также содержать 3'- нетранслируемую последовательность (UTS), которая составляет в длину по меньшей мере 6 нуклеотидов (в противоположность мРНК α-гал А, обнаруженной у людей, у которой нет 3' UTS, причем требуемый сайт полиаденилирования находится в пределах кодирующей последовательности). UTS располагается сразу же 3' к терминирующему кодону кодирующей последовательности и включает сайт полиаденилирования. Она составляет в длину, предпочтительно, по меньшей мере 6 нуклеотидов, предпочтительнее - по меньшей мере 12, а наиболее предпочтительно - по меньшей мере 30 нуклеотидов, и во всех случаях она содержит последовательность ААТААА или родственную последовательность, которая служит для промотирования полиаденилирования. Описанная молекула ДНК, т.е. кодирующая сигнальный пептид hGH, связанный с α-гал А, и содержащая 3' UTS, которая включает сайт полиаденилирования, и, предпочтительно, содержащая экспрессирующие регулярные последовательности, также входит в объем изобретения. Также в объем изобретения входит молекула ДНК, колирующая белок, которая содержит сигнальный пептид hGH, связанный с α-гал А или любым другим гетерологичным полипептидом (т. е., любым полипептидом, иным чем hGH, или аналогом hGH). Гетерологичный полипептид типично представляет белок млекопитающего, например любой, подходящий с медицинской точки зрения человеческий полипептид.
Другие особенности и преимущества данного изобретения станут очевидны из последующего подробного описания и из формулы изобретения.
Используемый здесь термин "генетически модифицированная" в отношении клеток охватывает клетки, которые экспрессируют определенный генный продукт после введения молекулы ДНК, кодирующей данный генный продукт и/или регуляторные элементы, которые регулируют экспрессию кодирующей последовательности. Введение молекулы ДНК можно осуществить с помощью направленной генной доставки (т.е. введения молекулы ДНК в определенный участок генома); кроме того, гомологичная рекомбинация допускает замену самого дефектного гена (дефектный ген α-гал А или его часть можно заменить при болезни Фабри собственными клетками пациента с целым геном или его частью).
Используемый здесь термин "α-гал А" относится к α-гал А без сигнального пептида, т. е, к ПОСЛЕД. N 26 (фиг. 9). Есть определенные признаки, что остатки 371-398 или 373-398 ПОСЛЕД. 26 (фиг. 9) в лизосоме можно удалить; однако считается, что удаление этого предполагаемого пропептида не влияет на активность фермента. Это приводит к мысли, что можно удалить любую часть предполагаемого пропептида без ухудшения активности. Таким образом, используемый здесь термин "α-гал А" также охватывает белок с последовательностью, соответствующей ПОСЛЕД. N 26, за исключением недостающих остатков (до 28) у C-конца этой последовательности.
"Дефицит α-гал А" означает любую недостаточность количества или активности этого фермента у пациента. Такой дефицит может вызвать тяжелые симптомы, которые обычно наблюдаются у мужчин, страдающих от болезни Фабри, или он может быть только частичным и вызывать относительно умеренные симптомы, что можно наблюдать у гетерозиготных женских носителей дефектного гена.
Используемый здесь термин "первичная клетка" включает клетки, присутствующие в суспензии клеток, выделенных из источника - ткани позвоночного (до того, как их высевают, т.е., связывают с подложкой для тканевой культуры, такой как чашка или колба), клетки, присутствующие в эксплантате, полученном из ткани, оба предыдущих типа клеток, высеянные в первый раз, и клеточные суспензии, полученные из этих высеянных клеток.
"Вторичными клетками" называются клетки на всех последующих стадиях культивирования. Иначе, высеянную первый раз первичную клетку удаляют с культурального субстрата и высевают снова (пересевают), и эта клетка, как и все клетки при последующих пересевах, называется вторичной клеткой.
"Клеточный штамм" состоит из вторичных клеток, которые пересевали один или несколько раз, которые показывают конечное число среднего удвоения популяций в культуре, показывают свойства угнетаемого контактом роста на "якорной подложке (за исключением клеток, разведенных в суспензионной культуре) и не являются иммортализованными.
"Иммортализованной клеткой" обозначают клетку из установленной клеточной линии, которая обнаруживает явно неограниченную продолжительность жизни в культуре.
"Сигнальный пептид" означает пептидную последовательность, которая направляет вновь синтезированный полипептид, с которым он связывается к эндоплазматическому ретикулуму для дальнейшего посттрансляционного процессирования и/или распределения.
Используемый здесь в контексте с α-гал А термин "гетерологичный сигнальный пептид" относится к сигнальному пептиду, который не является сигнальным пептидом человеческой α-гал А (т.е., который кодируется нуклеотидами 36-128 ПОСЛЕД. N 18). Типично, он представляет сигнальный пептид какого-то другого белка млекопитающего, но не α-гал А.
Термин "первая стадия хроматографии" относится к первому внесению образца в хроматографическую колонку (все стадии, связанные с получением образца, исключены).
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображен зонд в 210 п.о., который используют для выделения α-гал А из библиотеки кДНК фибробластов 13 человека (ПОСЛЕД. N 19). Последовательность состоит из экзона 7 гена α-гал А. Зонд выделяют из геномной ДНК человека посредством полимеразной цепной реакции (PCR). Участки, подчеркнутые на чертеже, соответствуют последовательностям затравок для амплификации.
На фиг. 1 изображен зонд в 210 п.о., который используют для выделения α-гал А из библиотеки кДНК фибробластов 13 человека (ПОСЛЕД. N 19). Последовательность состоит из экзона 7 гена α-гал А. Зонд выделяют из геномной ДНК человека посредством полимеразной цепной реакции (PCR). Участки, подчеркнутые на чертеже, соответствуют последовательностям затравок для амплификации.
На фиг. 2 представлена последовательность ДНК-фрагмента, который завершает 5'-конец клона кДНК α-гал А (ПОСЛЕД. N 20). Этот фрагмент амплифицируют посредством PCR из геномной ДНК человека. Подчеркнутые участки соответствуют последовательностям затравок для амплификации. Также показаны положения сайтов рестрикции эндонуклеазами Ncol и SacII, которые используют для субклонирования, как описано в примере 1А.
На фиг. 3 представлена последовательность кДНК α-гал А, включающая последовательность, кодирующую сигнальный пептид (ПОСЛЕД. N 18).
На фиг. 4 приводится схематическая карта pXAG-16 - конструкции, экспрессирующей α-гал А, которая включает промотор CMV (цитомегаловирус) и интрон, кодирующую последовательность сигнального пептида hGH и первый интрон, кДНК α-гал А (т.е., не имеющую последовательности сигнального пептида α- гал А) и 3' UTS hGH.
На фиг. 5 приводится схематическая карта pXAG-28 - конструкции, экспрессирующей α-гал А, которая включает коллагеновый промотор Iα2, интрон β-актина, кодирующую последовательность сигнального пептида hGH и первый интрон, кДНК α-гал А (т.е., не имеющую последовательности сигнального пептида α-гал А) и 3' UTS hGH.
На фиг. 6 приводится хроматограмма стадии очистки α-гал А с использованием смолы бутилсефарозы®. Показаны поглощение при 280 нм (ровная линия) и активность α-гал А (линия с точками) выделенных фракций.
Фиг. 7 представляет графическое отображение фибробластами Фабри человеческой α-гал А, полученной согласно изобретению. Внутриклеточную активность α-гал А и общую концентрацию белка измеряют после инкубации клеток с возрастающими концентрациями человеческой α-гал А, полученной по изобретению. Показаны влияние потенциальных ингибиторов интернализации маннозо-6-фосфата (М6Р; незаштрихованные ромбы)
и маннана (незаштрихованные кружки).
и маннана (незаштрихованные кружки).
Фиг. 8 представляет схему экспериментальной системы, созданной для исследования фибробластов Фабри после поглощения α-гал А. Активность α-гал А клеток Фабри измеряют после воздействия или обычных, или сверхэкспрессирующих α-гал А фибробластов человека, выращенных во вставках TranswelTM. "М6Р" = маннозо-6-фосфат; "нтрф. ФЧ" = нетрасфектированные фибробласты человека; "BRS11" = трансфектированный сверхэкспрессирующий α-гал А штамм фибробластов.
На фиг. 9 приводится аминокислотная последовательность человеческой α-гал А (ПОСЛЕД. N 26).
На фиг. 10 приводится ДНК-последовательность, кодирующая сигнальный пептид hGH и содержащая первый интрон hGH (подчеркнут) (ПОСЛЕД. N 27).
На фиг. 11 приводится ДНК-последовательность, кодирующая сигнальный пептид hGH, без интрона (ПОСЛЕД. N 22).
На фиг. 12 приводится аминокислотная последовательность сигнального пептида hGH (ПОСЛЕД. N 21).
На фиг. 13 приводится кДНК-последовательность, кодирующая человеческую α-гал А (без сигнального пептида) (ПОСЛЕД. N 25).
Подробное описание изобретения
Лизосомные ферменты, такие как α-гал А, направляются к лизосомному компартменту клетки через взаимодействие с маннозо-6- фосфатным (М6Р) рецептором, который связывает остатки М6Р, присутствующие в олигосахаридных частях ферментов, предназначенных для лизосомного компартмента (Kornfeld, S. and Mellman I., Ann. Rev. Cell Biol., 5:483-525, 1989). Первичное взаимодействие происходит в аппарате Гольджи, где ферменты, связанные с рецепторами для М6Р аппарата Гольджи, расщепляются для переноса к лизосомам. Полагают, что на поверхности клетки имеет место вторичный тип взаимодействия между внеклеточной α-гал А и М6Р-рецепторами. Внеклеточные вещества, поглощенные клетками, переносятся через цитоплазму в эндоцитических пузырьках, и сливаются с первичными лизосомами, и выливают их содержимое в лизосомы. В этом процессе М6Р-рецепторы поверхности клеток также включаются в эндоцитические пузырьки и переносятся к лизосомам.
Лизосомные ферменты, такие как α-гал А, направляются к лизосомному компартменту клетки через взаимодействие с маннозо-6- фосфатным (М6Р) рецептором, который связывает остатки М6Р, присутствующие в олигосахаридных частях ферментов, предназначенных для лизосомного компартмента (Kornfeld, S. and Mellman I., Ann. Rev. Cell Biol., 5:483-525, 1989). Первичное взаимодействие происходит в аппарате Гольджи, где ферменты, связанные с рецепторами для М6Р аппарата Гольджи, расщепляются для переноса к лизосомам. Полагают, что на поверхности клетки имеет место вторичный тип взаимодействия между внеклеточной α-гал А и М6Р-рецепторами. Внеклеточные вещества, поглощенные клетками, переносятся через цитоплазму в эндоцитических пузырьках, и сливаются с первичными лизосомами, и выливают их содержимое в лизосомы. В этом процессе М6Р-рецепторы поверхности клеток также включаются в эндоцитические пузырьки и переносятся к лизосомам.
Присутствующая во внеклеточной среде α-гал А, если она несет остатки М6Р, связываются с М6Р-рецепторами на поверхности клеток и за счет этого переносится в лизосомный компартмент вместе с рецепторами. Фермент в лизосомном компартменте в результате такого пути "утилизации" тотчас может осуществлять свою соответствующую функцию. Таким образом, даже если клетка генетически продуцирует недостаточно своей собственной α-гал А, существует механизм перемещения к ней экзогенно продуцированного фермента при условии, что (а) фермент подходящим образом гликозилирован и (б) дефектная клетка несет рецепторы для М6Р.
Показано, что при болезни Фабри васкулярные эндотелиальные клетки почки и сердца отображают серьезные гистопатологические отклонения от нормы и вносят вклад в клиническую патологию болезни; эти клетки, несущие рецепторы для М6Р, представляют собой особую мишень для представленного изобретения. Полученную по изобретению α-гал А можно доставлять к поврежденным клеткам или местно, или системно посредством генной терапии (т.е., с помощью генетически модифицированных клеток, которые экспрессируют и секретируют гликозилированный фермент в организме пациента), или с помощью традиционных фармакологических способов введения. Поэтому α-гал А, в которой в N-связанных олигосахаридах присутствует М6Р, имеет большое значение для лечения в соответствии с данным изобретением.
Кроме того, большое значение имеет также степень, до которой посредством сиалилирования модифицированы N-связанные олигосахариды α-гал А. В отсутствии соответствующего сиалилирования α-гал А будет быстро выводиться из кровообращения из-за связывания асиалогликопротеиновыми рецепторами печени с последующим поглощением и расщеплением гепатоцитами (Ashwell and Harford, Ann. Rev. Biochem., 51:531-554, 1982.). Это снижает количество α-гал А, доступной при циркуляции для связывания с М6Р-рецепторами на клетках, которые участвуют в клинической патологии болезни Фабри, таких как васкулярные эндотелиальные клетки почки и сердца. К удивлению заявители обнаружили, что α-гал А, секретируемая устойчиво трансфектированными человеческими клетками, обладает характеристиками гликозилирования, которые подходят для лечения болезни Фабри либо генной терапией, либо посредством традиционного фармацевтического введения очищенного секретируемого белка. Это противоположно ситуации с наиболее хорошо исследованным лизосомным ферментом глюкоцереброзидазой, когда доставка к клинически соответствующим клеткам организма фермента, очищенного от человеческой плаценты или выделенного из трансфектированных CHO-клеток, требует сложной ферментной модификации фермента после очистки (ср. Beutler, New Engl. J. Med., 325;1354-1360, 1991).
Лечение по изобретению можно осуществить двумя основными путями: посредством введения пациенту терапевтически эффективного количества очищенной человеческой α-гал А, полученной из культивированных человеческих клеток, генетически модифицированных для сверхэкспресии и секреции фермента, или путем введения пациенту самой сверхэкспрессирующей клетки. Методы осуществления необходимых генетических модификаций описываются ниже, как и способы очистки, составления композиций и лечения.
Пример 1. Получение и применение конструкций, созданных для доставки и экспрессии α-гал А
Конструируют две экспрессирующие плазмиды - pXAG-16 и pXAG-28. Эти плазмиды содержат кДНК человеческой α-гал А, кодирующую 398 аминокислот фермента α-гал А (без сигнального пептида α-гал А); геномную ДНК- последовательность сигнального пептида человеческого гормона роста (hGH), которая прерывается первым интроном гена hGH; и 3'-нетранслируемую последовательность (UTS) гена hGH, которая содержит сигнал для полиаденилирования. Плазмида pXAG-16 содержит немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека (CMV IЕ) и первый интрон (фланкированный некодирующими экзонными последовательностями), в то время как pXAG-28 управляется коллагеновым промотором Iα2 и также содержит 5' UTS гена β-актина, которая содержит первый интрон гена β-актина.
Конструируют две экспрессирующие плазмиды - pXAG-16 и pXAG-28. Эти плазмиды содержат кДНК человеческой α-гал А, кодирующую 398 аминокислот фермента α-гал А (без сигнального пептида α-гал А); геномную ДНК- последовательность сигнального пептида человеческого гормона роста (hGH), которая прерывается первым интроном гена hGH; и 3'-нетранслируемую последовательность (UTS) гена hGH, которая содержит сигнал для полиаденилирования. Плазмида pXAG-16 содержит немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека (CMV IЕ) и первый интрон (фланкированный некодирующими экзонными последовательностями), в то время как pXAG-28 управляется коллагеновым промотором Iα2 и также содержит 5' UTS гена β-актина, которая содержит первый интрон гена β-актина.
А. Клонирование полной кДНК α-гал А и создание экспрессирующей α-гал А плазмиды pXAG-16
Человеческую α-гал А клонируют из кДНК-библиотеки фибробластов человека, которую создают следующим образом. Из полной РНК выделяют мРНК поли-А+ и осуществляют синтез кДНК с использованием реагентов для системы лямбда ZapII® по указаниям изготовителя (Stratagene Inc., Ла-Джолла, Калифорния). Коротко, "первоцепочечную" кДНК получают посредством обратной транскрипции в присутствии затравки олиго-dT, содержащей внутренний сайт для рестрикционной эндонуклеазы XhoI. После обработки РНКазой H кДНК "ник"-транслируют с ДНК-полимеразой I образования двухцепочечной кДНК. У этой кДНК тупят концы Т4-ДНК-полимеразой и лигируют с адапторами EcoRI. Продукты этого лигирования обрабатывают Т4-ДНК-киназой и расщепляют Xhol. Фракционируют кДНК хроматографией на сефакриле-400®. Фракции большого и среднего размера объединяют и лигируют кДНК с расщепленными EcoRI и XhoI плечами лямбда-ZapII. Продукты этого лигирования затем упаковывают и титруют. Первичная библиотека имеет титр 1,2•107 бое/мл и средний размер вставки 925 п.о.
Человеческую α-гал А клонируют из кДНК-библиотеки фибробластов человека, которую создают следующим образом. Из полной РНК выделяют мРНК поли-А+ и осуществляют синтез кДНК с использованием реагентов для системы лямбда ZapII® по указаниям изготовителя (Stratagene Inc., Ла-Джолла, Калифорния). Коротко, "первоцепочечную" кДНК получают посредством обратной транскрипции в присутствии затравки олиго-dT, содержащей внутренний сайт для рестрикционной эндонуклеазы XhoI. После обработки РНКазой H кДНК "ник"-транслируют с ДНК-полимеразой I образования двухцепочечной кДНК. У этой кДНК тупят концы Т4-ДНК-полимеразой и лигируют с адапторами EcoRI. Продукты этого лигирования обрабатывают Т4-ДНК-киназой и расщепляют Xhol. Фракционируют кДНК хроматографией на сефакриле-400®. Фракции большого и среднего размера объединяют и лигируют кДНК с расщепленными EcoRI и XhoI плечами лямбда-ZapII. Продукты этого лигирования затем упаковывают и титруют. Первичная библиотека имеет титр 1,2•107 бое/мл и средний размер вставки 925 п.о.
Для выделения кДНК используют зонд в 210 п.о. из экзона 7 гена человеческой α-гал А (фиг. 1, ПОСЛЕД. N 19). Сам зонд выделяют из геномной ДНК посредством полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием олигонуклеотидов 5'- CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (олиго-1; ПОСЛЕД. 1) и 5'-TCTAGC- TGAAGCAAAACAGTG-3" (олиго-2; ПОСЛЕД. N 2). PCR-продукт затем используют для скрининга библиотеки кДНК фибробластов, и выделяют положительные клоны, и характеризуют их далее. Один из положительных клонов фаг 3А "вырезают" по схеме с системой лямбда-ZapII® (Stratagene, Inc., Ла-Джолла, Калифорния) по указаниям изготовителя. Такая процедура дает плазмиду pBSAG3A, которая содержит кДНК-последовательность α-гал А в скелете плазмиды pBluescriptSK-TM. Секвенирование ДНК показывает, что эта плазмида не содержит полного 5'-конца кДНК-последовательности. Поэтому 5'-конец реконструируют с использованием PCR-фрагмента, амплифицированного из геномной ДНК человека. Чтобы это осуществить, фрагмент геномной ДНК в 268 п.о. (фиг. 2, ПОСЛЕД. N 20) амплифицируют с использованием олигонуклеотидов 5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (олиго-3; ПОСЛЕД. N 3) и 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3'(олиго-4; ПОСЛЕД. N 4). Этот фрагмент субклонируют в клонирующую плазмиду "ТА" (Invitrogen Corp., Сан-Диего, Калифорния), и генерируют плазмиду pTAAGEI. Плазмиду pBSAG3A, которая содержит большую часть кДНК-последовательности α-гал А, и плазмиду pTAAGEI, содержащую 5'-конец кДНК α-гал А, расщепляют каждую с SacII и NcoI. Положения соответствующих сайтов SacII и NcoI в амплифицированном ДНК-фрагменте показаны на фиг. 2. Выделяют из pTAAGEI Sacll-Ncol-фрагмент в 0,2 кб и лигируют с эквивалентно расщепленной pBSAG3A. Эта плазмида pAGAL содержит полную кДНК-последовательность α-гал А, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид α-гал А. Полностью секвинируют кДНК (показано на фиг. 3), включая сигнальный пептид α-гал А (ПОСЛЕД. N 18), и обнаруживают, что она идентична опубликованной последовательности кДНК α-гал А (геномная библиотека последовательностей HUMGALA).
Плазмиду pXAG-16 создают через несколько промежуточных этапов следующим образом. Во-первых, pAGAL расщепляют SacII и XhoI и тупят концы. Во-вторых, концы полной кДНК α-гал А лигируют 1 с линкерами XbaI, и субклонируют в гидролизованную с XbaI pEF-BOS (Mizushima et al., Nucl. Acids Res., 18:5322, 1990), и создают pXAG-1. Эта конструкция содержит 3' UTS человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) и промотор человеческого фактора элонгации 1α (EF-1α), фланкирующий кДНК, кодирующую α-гал А с добавлением сигнального пептида α-гал А, так что 5'-конец кДНК α-гал А сливается с промотором EF-1α. Чтобы создать конструкцию с промотором CMV IЕ и первым интроном, кДНК α-гал А и 3' UTS G-CSF удаляют из pXAG-1 в виде XbaI-BamHI-фрагмента в 2 кб. У фрагмента тупят концы, лигируют его с линкерами BamHI и вставляют в расщепленную BamHI pCMVfIpNeo (которую конструируют так, как описано ниже). Ориентация такова, что 5'-конец кДНК α-гал А сливается с промоторной областью CMV IE.
Создают pCMVfIpNeo следующим образом. Фрагмент промотора гена CMV IE амплифицируют PCR с использованием геномной ДНК CMV в качестве матрицы и олегонуклеотидов 5'- TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3' (ПОСЛЕД. N 23) И 5'- TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (ПОСЛЕД. N 24). Получающийся в результате продукт (фрагмент 1,6 кб) расщепляют BamHI и получают содержащий промотор CMV фрагмент с липкими гидролизованными BamHI концами. Из плазмиды pMCIneopA (Stratagene Inc. , Ла-Джолла, Калифорния) выделяют новую экспрессирующую единицу в виде Xhol-BamHI-фрагмента в 1,1 кб. Содержащий промотор CMV и новые фрагменты вставляют в BamHI-, Xhol-расщепленную плазмиду (pUC12). Заметим, что pCMVflpNeo содержит промоторную область CMV 1E, начинающуюся с нуклеотида 546 и оканчивающуюся на нуклеотиде 2105 (из геномной библиотеки последовательностей HS5MIEP), и ген устойчивости к неомицину, управляемый тимидинкиназным промотором вируса простого герпеса (HSV) (ген TKneo), сразу 5' к фрагменту промотора CMV IЕ. Направление транскрипции неогена такое же, как фрагмента промотора CMV. Промежуточную конструкцию называют pXAG- 4.
Чтобы добавить 3' UTS hGH, удаляют 3' UTS GCSF из pXAG-4 в виде Xbal-Smal-фрагмента и тупят концы pXAG-4. 3' UTS hGH удаляют из pXGH5 (Selden et al. , Mol. Cellular Biol., 6:3173- 3179, 1986) в виде Smal-EcoRI-фрагмента в 0,6 кб. После дефосфорилирования этого фрагмента его лигируют в pXAG-4 сразу после сайта с затупленными Xbal концами pXAG-4. Эту промежуточную конструкцию называют pXAG-7. Из этой плазмиды удаляют TKneo- фрагмент в виде Hindlll-Clal-фрагмента, и концы плазмиды дефосфорилируют посредством "замещения" фрагментом Кленова ДНК- полимеразы 1. Лигируют ген устойчивости к неомицину, управляемый ранним промотором SV40, в виде дефосфорилированного Clal-BsmBI-фрагмента из гидролизата pcDNeo (Chen et al., Mol. Cellular Biol. , 7: 2745-2752, 1987), помещая звено неотранскриптона в той же ориентации, что и транскриптон α-гал А. Эту промежуточную конструкцию называют pXAG-13.
Для завершения конструкции pXAG-16, содержащей кодирующую последовательность сигнального пептида hGH в 26 аминокислот и первый интрон гена hGH, сначала удаляют EcoRI-BamHI-фрагмент в 2,0 кб из pXAG-13. Этот фрагмент содержит кДНК α-гал А и 3' UTS hGH. Этот большой фрагмент заменяют 3 фрагментами. Первый фрагмент состоит из PCR-продукта pXGH5 в 0,3 кб, который содержит кодирующую последовательность сигнального пептида hGH и включает первую интронную последовательность bGH, от синтетического BamHI-сайта, расположенного сразу в обратном направлении от обобщающей последовательности Козака до конца кодирующей последовательности сигнального пептида hGH. Для амплификации этого фрагмента (фрагмента 1) используют олигонуклеотиды 5'-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3' (олиго-HGH101; ПОСЛЕД. N 5) и 5'-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (олиго-НGН102; ПОСЛЕД. N 6). Второй фрагмент состоит из PCR-продукта в 0,27 кб, содержащего последовательности, соответствующие началу кДНК, кодирующей фермент α-гал А в 398 аминокислот (т.е., не имеющей сигнального пептида α-гал А), до сайта NheI. Для амплификации этого фрагмента (фрагмента 2) используют олигонуклеотиды 5'-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (олиго-AG10; ПОСЛЕД. N 7) и 5'-TTTTGCTAGCTGGСGAATCC-3' (олиго-AG11; ПОСЛЕД. N 8). Третий фрагмент состоит из NheI-EcoRI-фрагмента pXAG-7, содержащего оставшуюся последовательность α-гал А, а также 3' UTS hGH (фрагмент 3).
Фрагмент 1 (расщепленный BamHI и NaeI), фрагмент 2 (расщепленный PvuII и NheI) и фрагмент 3 смешивают с BamHI-EcoRI-фрагментом в 6,5 кб pXAG-13, содержащим неоген и промотор CMV 1Е, и лигируют вместе с образованием плазмиды pXAG-16 (фиг. 4).
Б. Конструирование экспрессирующей α- гал А плазмиды pXAG-28
Промотор коллагена человека Iα2/ для применения в экспрессирующей α- гал A конструкции pXAG-28 выделяют следующим образом. С использованием олигонуклеотидов 5'- TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3' (олиго-72; ПОСЛЕД. N 9) и 5'- TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (олиго-73; ПОСЛЕД. N 10) выделяют PCR-фрагмент геномной ДНК человека в 408 п.о., содержащий часть промотора коллагена человека Iα2.
Этот фрагмент используют для скрининга библиотеки лейкоцитов человека в EMBL3 (Clontech Inc. , Пало-Альто, Калифорния). Выделяют один из положительных клонов (фаг 7H), содержащий EcoRI-фрагмент в 3,8 кб и клонируют в pBSIISK+ (Stratagene Inc. , Ла-Джолла, Калифорния) в сайте EcoRI (создавая pBS/7H. 2). В pBSIISK+ вводят сайт AvrII посредством расщепления с SpeI, который осуществляет расщепление в пределах полилинкера pBSIISK+, "вливания" фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и вставки олигонуклеотида 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (ПОСЛЕД. N 11). Этот вариант pBSIISK+ расщепляют с BamHI и AvrII и лигируют с BamHI-AvrII-фрагментом в 121 п.о. первоначального PCR-фрагмента промотора коллагена Iα2 в 408 п.о., описанным выше, и создают pBS/121COL.6.
Промотор коллагена человека Iα2/ для применения в экспрессирующей α- гал A конструкции pXAG-28 выделяют следующим образом. С использованием олигонуклеотидов 5'- TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3' (олиго-72; ПОСЛЕД. N 9) и 5'- TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (олиго-73; ПОСЛЕД. N 10) выделяют PCR-фрагмент геномной ДНК человека в 408 п.о., содержащий часть промотора коллагена человека Iα2.
Этот фрагмент используют для скрининга библиотеки лейкоцитов человека в EMBL3 (Clontech Inc. , Пало-Альто, Калифорния). Выделяют один из положительных клонов (фаг 7H), содержащий EcoRI-фрагмент в 3,8 кб и клонируют в pBSIISK+ (Stratagene Inc. , Ла-Джолла, Калифорния) в сайте EcoRI (создавая pBS/7H. 2). В pBSIISK+ вводят сайт AvrII посредством расщепления с SpeI, который осуществляет расщепление в пределах полилинкера pBSIISK+, "вливания" фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и вставки олигонуклеотида 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (ПОСЛЕД. N 11). Этот вариант pBSIISK+ расщепляют с BamHI и AvrII и лигируют с BamHI-AvrII-фрагментом в 121 п.о. первоначального PCR-фрагмента промотора коллагена Iα2 в 408 п.о., описанным выше, и создают pBS/121COL.6.
Плазмиду pBS/121COL. 6 расщепляют XbaI, расщепляющим в пределах полилинкерной последовательности pBSIISK+, "вливают" фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 и расщепляют AvrII. Выделяют BamHI-AvrII-фрагмент pBS/7H.2 и дефосфорилируют сайт BamHI посредством обработки ферментом Кленова. Затем фрагмент расщепляют AvrII и лигируют с расщепленным AvrII вектором, и создают, таким образом, плазмиду с коллагеновым промотором pBS/121bpCOL7H.18.
Затем коллагеновый промотор сливают с 5' UTS гена человеческого β-актина, содержащей первый интрон гена человеческого β-актина. Чтобы выделить эту последовательность, из геномной ДНК человека выделяют PCR-фрагмент в 2 кб с использованием олигонуклеотидов 5'-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3'(олиго-BA1; ПОСЛЕД. N 12) и 5'-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (олиго-ВА2; ПОСЛЕД. N 13).
Этот фрагмент расщепляют BamHI и BsiHKAl и высвобождают фрагмент в 0,8 кб, содержащий 5' UTS β-актина и интрон. Затем из плазмиды с коллагеновым промотором pBS/121bpCOL7H.18 выделяют SalI-SrfI-фрагмент с 3,6 кб следующим образом. Частично расщепляют pBS/121bpCOL7H.18 с BamHI (сайт BamHI лежит в 5'-конце фрагмента коллагенового промотора Iα2), дефосфорилируют посредством обработки фрагментом Кленова и лидируют с линкером SalI (5'-GGTCGACC-3'), посредством чего размещают сайт SalI ниже коллагенового промотора Iα2. Затем эту плазмиду расщепляют SalI и SrfI (сайт SrfI лежит на 110 п.о. ниже САР-сайта коллагенового промотора Iα2) и выделяют фрагмент в 3,6 кб. Фрагменты в 0,8 кб и 3,6 кб объединяют с SalI- и BamHI-расщепленной pBSIlSK- (Stratagene Inc. , Ла-Джолла, Калифорния) и составляют фрагмент из указанных далее четырех олигонуклеотидов, отожженных вместе (с образованием фрагмента с дефосфорилированным концом и концом BsiHKAI): 5'- GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCCGT АТ-3'(олиго-COL-1; ПОСЛЕД. N 14); 5'- AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3' (олиго-COL-2; ПОСЛЕД. N 15);
5'- TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGC CTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3' (олиго-COL-3; ПОСЛЕД. N 16); и 5'- CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3' (олиго-COL-4; ПОСЛЕД. N 17). Эти четыре олигонуклеотида, будучи отожженными, соответствуют области, начинающейся с сайта SrfI коллагенового промотора и проходящей через сайт BsiHKAI β-актинового промотора. Получающуюся в результате плазмиду обозначают pCOL/β-актин.
5'- TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGC CTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3' (олиго-COL-3; ПОСЛЕД. N 16); и 5'- CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3' (олиго-COL-4; ПОСЛЕД. N 17). Эти четыре олигонуклеотида, будучи отожженными, соответствуют области, начинающейся с сайта SrfI коллагенового промотора и проходящей через сайт BsiHKAI β-актинового промотора. Получающуюся в результате плазмиду обозначают pCOL/β-актин.
Чтобы закончить построение pXAG-28, выделяют SalI-BamHI- фрагмент pCOL/β- актина, содержащий коллагеновый промотор Iα2 и 5' UTS β-актина. Этот фрагмент лигируют с двумя фрагментами из pXAG-16 (см. пример 1А и фиг. 4): (1) BamHI- фрагментом в 6,0 кб (содержащим неоген, плазмидный скелет, кДНК, кодирующую фермент α- гал А в 398 аминокислот, и 3' UTS hGH); и (2) BamHI-XhoI-фрагментом в 0,3 кб (содержащим последовательность поли-А SV40 из pcDneo). pXAG-28 содержит промотор человеческого коллагена Iα2, слитый с 5' UTS человеческого β-актина, сигнальный пептид hGH (который прерывается первым интроном hGH), кДНК, кодирующую фермент α-гал А, и 3' UTS hGH. Карта завершенной экспрессирующей конструкции pXAG-28 показана на фиг. 5.
В. Трансфекция и селекция фибробластов при электропорации с экспрессирующими α-гал А плазмидами
Чтобы экспрессировать α-гал А в фибробластах, культивируют вторичные фибробласты и трансфектируют методами, описанными в литературе (Selden et al., WO 93/09222).
Чтобы экспрессировать α-гал А в фибробластах, культивируют вторичные фибробласты и трансфектируют методами, описанными в литературе (Selden et al., WO 93/09222).
Плазмиды pXAG-13, pXAG-16 и pXAG-28 трансфектируют посредством электропорации в фибробласты крайней плоти человека, чтобы генерировать устойчиво трансфектированные клональные клеточные штаммы, и получающиеся в результате уровни экспрессии α-гал А контролируют так, как описано в примере IГ. Секреция α- гал А нормальными фибробластами крайней плоти находится в интервале 2-10 единиц на 106 клеток за 24 часа. В противоположность этому, трансфектированные фибробласты показывают средние уровни экспрессии, приведенные в табл. 1.
Эти данные показывают, что все три экспрессирующие конструкции способны превысить экспрессию α-гал А нетрасфектированными фибробластами во много раз. Экспрессия фибробластами, устойчиво трасфектированными pXAG-13, кодирующей α-гал А, связанную с сигнальным пептидом α-гал А, существенно ниже экспрессии фибробластами, трасфектированными pXAG-16, которая отличается только тем, что сигнальный пептид представляет сигнальный пептид hGH, кодирующая последовательность которого прерывается первым интроном гена hGH.
Каждый раз трасфектированные клетки пересевают, определяют активность секретированной α-гал А, подсчитывают клетки и вычисляют плотность клеток. На основании числа харвестированных клеток и времени, разрешенном для секреции α-гал А, определяют удельную скорость экспрессии α-гал А и указывают ее в таблицах 2 и 3 в виде секретируемых единиц (α-гал А) на 106 клеток за период 24 часа. Клеточные штаммы, нужные для генной терапии или для применения при получении материала для выделения чистой α-гал А, должны показывать стабильный рост и экспрессию при нескольких пересевах. Данные, полученные для клеточных штаммов, приведенных в таблицах 2 и 3, которые устойчиво трасфектированы экспрессирующей α-гал А конструкцией pXAG-16, поясняют факт, что экспрессия α-гал А устойчиво сохраняется при проведении серийных пересевов.
Г. Количественная оценка экспрессии α-гал А
Активность α-гал А измеряют с использованием водорастворимого субстрата 4-метилумбеллиферил-α-D-галактопиранозида (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) по видоизмененной схеме, описанной loannou et al., J. Cell Biol., 119: 1137-1150, 1992. Субстрат растворяют в буфере для субстрата (0,1 М цитратфосфата, pH 4,6) до концентрации 1,69 мг/мл (5 мМ). Обычно к 75 мкл раствора субстрата добавляют 10 мкл культурального супернатанта. Пробирки закрывают и инкубируют на водяной бане при 37oC в течение 60 минут. По окончании инкубационного периода для остановки реакции используют 2 мл глицинкарбонатного буфера (130 мМ глицина, 83 мМ карбоната натрия, pH 10,6). Относительную флуоресценцию каждого образца измеряют с использованием флуорометра модели ТК0100 (Hoefer Scientific Instruments) с фиксированной длиной волны возбуждения 365 нм и обнаруживают фиксированную длину волны испускания 460 нм. Показатели образцов сравнивают с показателями стандартов, полученных из 1-мкМ исходного раствора метилумбеллиферона (Sigma Chemical Co.), и вычисляют количество гидролизованного субстрата. Активность α-гал А выражают в единицах; одна единица активности α-гал А эквивалентна одному наномолю субстрата, гидролизованного за час при 37oC. Данные по экспрессии в клетках обычно выражают в виде единиц активности α-гал А, выделенной 106 клетками за 24 часа. Этот анализ также используют для измерения количества активной α-гал А в клеточных лизатах и в образцах с различных стадий очистки α-гал А, описанных ниже.
Активность α-гал А измеряют с использованием водорастворимого субстрата 4-метилумбеллиферил-α-D-галактопиранозида (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) по видоизмененной схеме, описанной loannou et al., J. Cell Biol., 119: 1137-1150, 1992. Субстрат растворяют в буфере для субстрата (0,1 М цитратфосфата, pH 4,6) до концентрации 1,69 мг/мл (5 мМ). Обычно к 75 мкл раствора субстрата добавляют 10 мкл культурального супернатанта. Пробирки закрывают и инкубируют на водяной бане при 37oC в течение 60 минут. По окончании инкубационного периода для остановки реакции используют 2 мл глицинкарбонатного буфера (130 мМ глицина, 83 мМ карбоната натрия, pH 10,6). Относительную флуоресценцию каждого образца измеряют с использованием флуорометра модели ТК0100 (Hoefer Scientific Instruments) с фиксированной длиной волны возбуждения 365 нм и обнаруживают фиксированную длину волны испускания 460 нм. Показатели образцов сравнивают с показателями стандартов, полученных из 1-мкМ исходного раствора метилумбеллиферона (Sigma Chemical Co.), и вычисляют количество гидролизованного субстрата. Активность α-гал А выражают в единицах; одна единица активности α-гал А эквивалентна одному наномолю субстрата, гидролизованного за час при 37oC. Данные по экспрессии в клетках обычно выражают в виде единиц активности α-гал А, выделенной 106 клетками за 24 часа. Этот анализ также используют для измерения количества активной α-гал А в клеточных лизатах и в образцах с различных стадий очистки α-гал А, описанных ниже.
Пример II. Очистка α-гал А от кондиционированной среды штаммов устойчиво трансфектированных человеческих клеток
В примерах IIA-IIД показывается, что α-гал А из кондиционированной среды культивированных штаммов человеческих клеток, устойчиво трансфектированных для продуцирования фермента, можно очистить почти до однородного состояния.
В примерах IIA-IIД показывается, что α-гал А из кондиционированной среды культивированных штаммов человеческих клеток, устойчиво трансфектированных для продуцирования фермента, можно очистить почти до однородного состояния.
А. Применение хроматографии на бутилсефарозе® как первой стадии очистки α-гал А
Холодную кондиционированную среду (1,34 л) делают прозрачной посредством центрифугирования и фильтруют через 0,45- мкм ацетатцеллюлозный фильтр с использованием предфильтров из стекловолокна. После перемешивания доводят pH холодной отфильтрованной среды до 5,6, добавляя по каплям 1N HCl, и добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 0,66 М путем добавления по каплям исходного 3,9 М раствора (комнатной температуры) сверхчистого сульфата аммония. Среду перемешивают еще в течение 5 минут при 4oC, фильтруют так же, как раньше, и вносят в колонку Fast Flow с бутилсефарозой® (объем колонки 81 мл, 2,5 х 16,5 см; Pharmacia, Упсала, Швеция), которую уравновешивают 10 мМ MES-трис, pH 5,6, содержащим 0,66 М сульфата аммония (буфер А). Хроматографию осуществляют при 4oC на системе Gradi-FracTM (Pharmacia, Упсала, Швеция), снабженной подключенными регистраторами УФ и проводимости для оценки общего содержания белка и концентрации солей соответственно. После внесения образца при скорости потока 10 мл/мин колонку промывают буфером А в объеме, составляющем 10 объемов колонки. Из колонки с бутилсефарозой® α-гал А элюируют с градиентом от буфера А (содержащего сульфат аммония) до 10 мМ MES-трис, pH 5,6 (без сульфата аммония) при общем объеме, равном 14 объемам колонки. Фракции анализируют на активность α-гал А посредством анализа с 4-MUF-gal и объединяют фракции, содержащие существенное количество активного фермента. Как видно на фиг. 6 и по итогам очистки (табл. 4), на этой стадии удаляется приблизительно 99% загрязняющего белка (общее количество белка в образце до загрузки в колонку 8,14 г; после выхода из колонки общее количество белка 0,0638 г).
Холодную кондиционированную среду (1,34 л) делают прозрачной посредством центрифугирования и фильтруют через 0,45- мкм ацетатцеллюлозный фильтр с использованием предфильтров из стекловолокна. После перемешивания доводят pH холодной отфильтрованной среды до 5,6, добавляя по каплям 1N HCl, и добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 0,66 М путем добавления по каплям исходного 3,9 М раствора (комнатной температуры) сверхчистого сульфата аммония. Среду перемешивают еще в течение 5 минут при 4oC, фильтруют так же, как раньше, и вносят в колонку Fast Flow с бутилсефарозой® (объем колонки 81 мл, 2,5 х 16,5 см; Pharmacia, Упсала, Швеция), которую уравновешивают 10 мМ MES-трис, pH 5,6, содержащим 0,66 М сульфата аммония (буфер А). Хроматографию осуществляют при 4oC на системе Gradi-FracTM (Pharmacia, Упсала, Швеция), снабженной подключенными регистраторами УФ и проводимости для оценки общего содержания белка и концентрации солей соответственно. После внесения образца при скорости потока 10 мл/мин колонку промывают буфером А в объеме, составляющем 10 объемов колонки. Из колонки с бутилсефарозой® α-гал А элюируют с градиентом от буфера А (содержащего сульфат аммония) до 10 мМ MES-трис, pH 5,6 (без сульфата аммония) при общем объеме, равном 14 объемам колонки. Фракции анализируют на активность α-гал А посредством анализа с 4-MUF-gal и объединяют фракции, содержащие существенное количество активного фермента. Как видно на фиг. 6 и по итогам очистки (табл. 4), на этой стадии удаляется приблизительно 99% загрязняющего белка (общее количество белка в образце до загрузки в колонку 8,14 г; после выхода из колонки общее количество белка 0,0638 г).
Б. Применение хроматографии на гепаринсефарозе® как стадия очистки α-гал А
Максимальные фракции из колонки с бутилсефарозой® диализуют при 4oC против (4 л) 10 мМ MES-трис, pH 5,6 (с одной заменой). Проводимость диализата доводят до 1,0 ммо (мСм) при 4oC путем добавления H2O или NaCl, что требуется. После этого образец вносят в колонку Fast Flow с гепаринсефарозой® (Pharmacia, Упсала, Швеция; объем колонки 29 мл, 2,5 х 6 см), которая уравновешена 10 мМ MES-трис, pH 5,6, содержащим 9 мМ NaCI (буфер Б). Это делают при 4oC и скорости потока 10 мл/мин. Общее содержание белка и концентрацию солей измеряют подключенными регистраторами УФ (280 нм) и проводимости. После внесения образца колонку промывают буфером Б в объеме, равном 10 объемам колонки (10 "колоночными" объемами). А затем 3 "колоночными" объемами с градиентом до 8% буфера В в 92% буфера Б (где буфер В представляет 10 мМ MES-трис, pH 5,6, содержащий 250 мМ NaCl) и 10 "колоночными" объемами промывной жидкости с 8% буфера В. За этим следует элюирование α-гал А 1,5 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 29% буфера В и последующее - 10 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 35% буфера В. Фракции анализируют на активность α-гал А и объединяют фракции, содержащие заметную активность.
Максимальные фракции из колонки с бутилсефарозой® диализуют при 4oC против (4 л) 10 мМ MES-трис, pH 5,6 (с одной заменой). Проводимость диализата доводят до 1,0 ммо (мСм) при 4oC путем добавления H2O или NaCl, что требуется. После этого образец вносят в колонку Fast Flow с гепаринсефарозой® (Pharmacia, Упсала, Швеция; объем колонки 29 мл, 2,5 х 6 см), которая уравновешена 10 мМ MES-трис, pH 5,6, содержащим 9 мМ NaCI (буфер Б). Это делают при 4oC и скорости потока 10 мл/мин. Общее содержание белка и концентрацию солей измеряют подключенными регистраторами УФ (280 нм) и проводимости. После внесения образца колонку промывают буфером Б в объеме, равном 10 объемам колонки (10 "колоночными" объемами). А затем 3 "колоночными" объемами с градиентом до 8% буфера В в 92% буфера Б (где буфер В представляет 10 мМ MES-трис, pH 5,6, содержащий 250 мМ NaCl) и 10 "колоночными" объемами промывной жидкости с 8% буфера В. За этим следует элюирование α-гал А 1,5 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 29% буфера В и последующее - 10 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 35% буфера В. Фракции анализируют на активность α-гал А и объединяют фракции, содержащие заметную активность.
В. Применение хроматографии на гидроксиапатите как стадия очистки α-гал А
Гепариновый пул фильтруют и вносят в колонку с керамическим гидроксиапатитом НС (40 мкм; American International Chemical, Нейтик, Миннесота; объем колонки 12 мл, 1,5 х 6,8 см), уравновешенную 1 мМ фосфата натрия, pH 6,0 (буфер Г). Хроматографию осуществляют при комнатной температуре на комбинированной системе Gradi-FracTM/FPLC® (Pharmacia, Упсала, Швеция), снабженной подключенными регистраторами УФ (280 нм) и проводимости. После внесения образца (5 мл/мин) колонку промывают 10 "колоночными" объемами буфера Г. Элюируют α-гал А 7 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 42% буфера Д с 58% буфера Г (где буфер Д представляет буфер с 250 мМ фосфата натрия, pH 6,0), а затем 10 "колоночными" объемами с градиентом до 52% буфера Д. Фракции анализируют на активность α-гал А и объединяют фракции с заметной активностью.
Гепариновый пул фильтруют и вносят в колонку с керамическим гидроксиапатитом НС (40 мкм; American International Chemical, Нейтик, Миннесота; объем колонки 12 мл, 1,5 х 6,8 см), уравновешенную 1 мМ фосфата натрия, pH 6,0 (буфер Г). Хроматографию осуществляют при комнатной температуре на комбинированной системе Gradi-FracTM/FPLC® (Pharmacia, Упсала, Швеция), снабженной подключенными регистраторами УФ (280 нм) и проводимости. После внесения образца (5 мл/мин) колонку промывают 10 "колоночными" объемами буфера Г. Элюируют α-гал А 7 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 42% буфера Д с 58% буфера Г (где буфер Д представляет буфер с 250 мМ фосфата натрия, pH 6,0), а затем 10 "колоночными" объемами с градиентом до 52% буфера Д. Фракции анализируют на активность α-гал А и объединяют фракции с заметной активностью.
Г. Применение анионообменной хроматографии на Q-сефарозе® как стадии очистки α-гал А
Гидроксиапатитный пул разбавляют H2O приблизительно в 1,5 раза до конечной проводимости 3,4-3,6 ммо при комнатной температуре. После фильтрации образец вносят в колонку c Q-сефарозой® HP (Pharmacia, Упсала, Швеция; объем колонки 5,1 мл, 1,5 х 2,9 см), уравновешенную 10% буфера Ж с 90% буфера E, где буфер E содержит 25 М фосфата натрия, pH 6,0, а буфер Ж содержит 25 М фосфата натрия, pH 6,0, и 250 мМ NaCl. Хроматографию осуществляют при комнатной температуре на комбинированной системе Gradi-FracTM/FPLC® (Pharmacia, Упсала, Швеция), и общее количество белка и концентрацию солей контролируют с помощью подключенных регистраторов. Образец вносят при скорости потока 5 мл/мин, затем выполняют следующие стадии: (1) промывка 5 "колоночными" объемами буфера Ж, (2) промывка 7 "колоночными" объемами с 12% буфера Ж, (3) промывка 3 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 50% буфера Ж, (4) промывка 10 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 53% буфера Ж, (5) промывка 3 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 100% буфера Ж и (6) промывка 10 "колоночными" объемами 100% буфера Ж. Элюируют α-гал А преимущественно при осуществлении стадий 3 и 4. Фракции, содержащие заметную активность, объединяют ("Q-пул").
Гидроксиапатитный пул разбавляют H2O приблизительно в 1,5 раза до конечной проводимости 3,4-3,6 ммо при комнатной температуре. После фильтрации образец вносят в колонку c Q-сефарозой® HP (Pharmacia, Упсала, Швеция; объем колонки 5,1 мл, 1,5 х 2,9 см), уравновешенную 10% буфера Ж с 90% буфера E, где буфер E содержит 25 М фосфата натрия, pH 6,0, а буфер Ж содержит 25 М фосфата натрия, pH 6,0, и 250 мМ NaCl. Хроматографию осуществляют при комнатной температуре на комбинированной системе Gradi-FracTM/FPLC® (Pharmacia, Упсала, Швеция), и общее количество белка и концентрацию солей контролируют с помощью подключенных регистраторов. Образец вносят при скорости потока 5 мл/мин, затем выполняют следующие стадии: (1) промывка 5 "колоночными" объемами буфера Ж, (2) промывка 7 "колоночными" объемами с 12% буфера Ж, (3) промывка 3 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 50% буфера Ж, (4) промывка 10 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 53% буфера Ж, (5) промывка 3 "колоночными" объемами с линейным градиентом до 100% буфера Ж и (6) промывка 10 "колоночными" объемами 100% буфера Ж. Элюируют α-гал А преимущественно при осуществлении стадий 3 и 4. Фракции, содержащие заметную активность, объединяют ("Q-пул").
Д. Применение гель-хроматографии на супердексе®-200 как стадия очистки α-гал А
Концентрируют Q-пул приблизительно в 5 раз с использованием центробежных концентраторов Centriprep®-10 (Amicon, Беверли, Миннесота) и вносят в колонку с супердексом® 200 (Pharmacia, Упсала, Швеция; объем колонки 189 мл, 1,6 х 94 см). Колонку уравновешивают и элюируют буфером с 25 мМ фосфата натрия, pH 6,0, содержащим 150 мМ NaCl. Хроматографию осуществляют на системе FPLC® (Pharmacia, Упсала, Швеция) при комнатной температуре с использованием подключенного регистратора УФ (280 нм) для отслеживания элюирования белка. Объем образца, вносимого в колонку, составляет ≤ 2 мл, скорость потока составляет 0,5 мл/мин, и объем фракции составляет 2 мл. Осуществляют много прогонов через колонку; фракции анализируют на активность α-гал А и объединяют фракции с заметной активностью.
Концентрируют Q-пул приблизительно в 5 раз с использованием центробежных концентраторов Centriprep®-10 (Amicon, Беверли, Миннесота) и вносят в колонку с супердексом® 200 (Pharmacia, Упсала, Швеция; объем колонки 189 мл, 1,6 х 94 см). Колонку уравновешивают и элюируют буфером с 25 мМ фосфата натрия, pH 6,0, содержащим 150 мМ NaCl. Хроматографию осуществляют на системе FPLC® (Pharmacia, Упсала, Швеция) при комнатной температуре с использованием подключенного регистратора УФ (280 нм) для отслеживания элюирования белка. Объем образца, вносимого в колонку, составляет ≤ 2 мл, скорость потока составляет 0,5 мл/мин, и объем фракции составляет 2 мл. Осуществляют много прогонов через колонку; фракции анализируют на активность α-гал А и объединяют фракции с заметной активностью.
Объединенные фракции из колонки с супердексом® 200 = концентрируют с использованием установок Centriprep-10, делят на аликвоты, быстро замораживают и хранят при -80oC непродолжительное время. Результаты этого примера очистки α-гал А приводятся в табл. 4. Конечный выход α-гал А составляет 59% от активности исходного материала, а удельная активность очищенного продукта составляет 2,92 х 106 единиц на мг белка. Получающийся в результате продукт показывает высокую степень чистоты после электрофореза в условиях восстановления в 4-15% ДСН-полиакриламидном геле, который по существу не окрашивается серебряным красителем.
Пример III. Составление композиций и хранение очищенной α-гал А
Высокочистая α-гал А неустойчива при длительном хранении в виде разбавленных растворов очищенного белка (≤ 1 мг белка на мл). Поэтому разрабатывают композицию, улучшающую устойчивость при длительном хранении, т.е. хранении, длящемся от нескольких недель до, по меньшей мере, нескольких месяцев. Очищенный фермент концентрируют по меньшей мере до уровня 1 мг/мл с использованием центробежного концентратора (в буфере для фермента, состоящем из 25 мМ фосфата натрия (pH 6,0) и 150 мМ NaCI). Добавляют сывороточный альбумин человека (HSA; Buminate®, Baxter-Hyland) до конечной концентрации 2,5 мг/мл. Затем раствор белка стерилизуют фильтрацией с использованием 0,2-мкм ацетатцеллюлозного фильтра (Schleicher and Schuell), установленного в шприце. Раствор α-гал А помещают в стерильные апирогенные стеклянные флаконы, плотно закрывают тефлоновыми пробками, быстро замораживают и хранят при -20oC.
Высокочистая α-гал А неустойчива при длительном хранении в виде разбавленных растворов очищенного белка (≤ 1 мг белка на мл). Поэтому разрабатывают композицию, улучшающую устойчивость при длительном хранении, т.е. хранении, длящемся от нескольких недель до, по меньшей мере, нескольких месяцев. Очищенный фермент концентрируют по меньшей мере до уровня 1 мг/мл с использованием центробежного концентратора (в буфере для фермента, состоящем из 25 мМ фосфата натрия (pH 6,0) и 150 мМ NaCI). Добавляют сывороточный альбумин человека (HSA; Buminate®, Baxter-Hyland) до конечной концентрации 2,5 мг/мл. Затем раствор белка стерилизуют фильтрацией с использованием 0,2-мкм ацетатцеллюлозного фильтра (Schleicher and Schuell), установленного в шприце. Раствор α-гал А помещают в стерильные апирогенные стеклянные флаконы, плотно закрывают тефлоновыми пробками, быстро замораживают и хранят при -20oC.
Устойчивость активного состояния α-гал А оценивают на протяжении 3 месяцев с применением анализа с 4-MUF-gal. Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что за время испытаний не происходит потери активности фермента. Кислотный pH композиции (< 6,5) является критическим показателем для устойчивости фермента высокой степени чистоты.
Пример IV. Продуцированная штаммами человеческих клеток α-гал А, пригодная для лечения дефицита α-гал А
Исследуют структурные и функциональные свойства очищенной человеческой α-гал А, полученной по изобретению, чтобы показать, что описанные здесь молекулы ДНК и соответствующие экспрессированные гликопротеины, продуцированные штаммами трансфектированных человеческих клеток, можно использовать при генной или ферментно-заместительной терапии соответственно.
Исследуют структурные и функциональные свойства очищенной человеческой α-гал А, полученной по изобретению, чтобы показать, что описанные здесь молекулы ДНК и соответствующие экспрессированные гликопротеины, продуцированные штаммами трансфектированных человеческих клеток, можно использовать при генной или ферментно-заместительной терапии соответственно.
А. Размер молекулы α-гал А, продуцированной устойчиво трансфектированными человеческими клетками в культуре
Молекулярную массу α-гал А оценивают с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF. Полученные результаты показывают, что молекулярная масса димера составляет 102353 Д, в то время как молекулярная масса мономера составляет 51002Д. Ожидаемая на основании аминокислотного состава молекулярная масса мономера составляет 45400 Д.
Молекулярную массу α-гал А оценивают с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF. Полученные результаты показывают, что молекулярная масса димера составляет 102353 Д, в то время как молекулярная масса мономера составляет 51002Д. Ожидаемая на основании аминокислотного состава молекулярная масса мономера составляет 45400 Д.
Следовательно, можно заключить, что углеводные компоненты фермента увеличивают его молекулярную массу на 5600 Д.
Результаты стандартного анализа аминокислот, выполненного с очищенным белком, согласуются с выводом, что белок, продуцированный человеческими клетками, по аминокислотному составу идентичен белку, выделенному в чистом виде из тканей человека.
Б. N-Терминальный процессинг α-гал А, продуцированной устойчиво трансфектированными человеческими клетками
Нуклеотидная последовательность кДНК человеческой α-гал А кодирует 429 аминокислот. 31 N-концевая аминокислота составляет сигнальную пептидную последовательность, которая отщепляется, когда образующийся белок проходит мембрану эндоплазматического ретикулума (LeDonne et al. Arch. Biochem. Biophys. , 224: 186, 1983; Lemansky et al., J. Biol. Chem., 262:2062, 1987). Чтобы подтвердить, что α-гал А процессируется должным образом, когда связана с гетерологичной сигнальной пептидной последовательностью (например, сигнальной последовательностью гормона роста человека), и экспрессируется в трансфектированных фибробластах человека, микросеквенируют 10 N-концевых аминокислот секретируемого белка. Образцы подвергают электрофорезу методом SDS-PAGE и переносят на ProBlott® (ABI, Фостер-Сити, Калифорния) с использованием буферной системы с 10 мМ CAPS (pH 11,0) и 10% метанола. Белок на ProBlott® визуализируют посредством окрашивания кумасси и вырезают полосы с соответствующим размером молекул (50 кД). N-Концевую последовательность получают с использованием импульсного жидкостного анализатора аминокислот Applied Biosystems, который осуществляет автоматическое расщепление по Эдману. Полученная N-концевая последовательность LDNGLARTRT (ПОСЛЕД. N 28) соответствует точному отщеплению сигнального пептида и точно соответствует N-концевой последовательности, предсказанной для секретируемого белка.
Нуклеотидная последовательность кДНК человеческой α-гал А кодирует 429 аминокислот. 31 N-концевая аминокислота составляет сигнальную пептидную последовательность, которая отщепляется, когда образующийся белок проходит мембрану эндоплазматического ретикулума (LeDonne et al. Arch. Biochem. Biophys. , 224: 186, 1983; Lemansky et al., J. Biol. Chem., 262:2062, 1987). Чтобы подтвердить, что α-гал А процессируется должным образом, когда связана с гетерологичной сигнальной пептидной последовательностью (например, сигнальной последовательностью гормона роста человека), и экспрессируется в трансфектированных фибробластах человека, микросеквенируют 10 N-концевых аминокислот секретируемого белка. Образцы подвергают электрофорезу методом SDS-PAGE и переносят на ProBlott® (ABI, Фостер-Сити, Калифорния) с использованием буферной системы с 10 мМ CAPS (pH 11,0) и 10% метанола. Белок на ProBlott® визуализируют посредством окрашивания кумасси и вырезают полосы с соответствующим размером молекул (50 кД). N-Концевую последовательность получают с использованием импульсного жидкостного анализатора аминокислот Applied Biosystems, который осуществляет автоматическое расщепление по Эдману. Полученная N-концевая последовательность LDNGLARTRT (ПОСЛЕД. N 28) соответствует точному отщеплению сигнального пептида и точно соответствует N-концевой последовательности, предсказанной для секретируемого белка.
В. C-Концевая аминокислота α-гал А, продуцированной устойчиво трансфектированными человеческими клетками
Остаток C-концевой аминокислоты секретируемой α--гал А, полученной по изобретению, идентифицируют с использованием автоматизированного анализатора C- окончаний Hewlett Packard. Результаты показывают в C-конце остаток лейцина, что соответствует C-концевой аминокислоте, предсказанной ДНК-последовательностью.
Остаток C-концевой аминокислоты секретируемой α--гал А, полученной по изобретению, идентифицируют с использованием автоматизированного анализатора C- окончаний Hewlett Packard. Результаты показывают в C-конце остаток лейцина, что соответствует C-концевой аминокислоте, предсказанной ДНК-последовательностью.
Г. Вызванная углеводами модификация α-гал А, продуцированной устойчиво трансфектированными человеческими клетками
Оценивают также картину гликозилирования α-гал А, полученной
по изобретению. Правильное гликозилирование является важным для оптимальной активности α-гал A in vivo; α-гал А, экспрессированная в негликозилирующих системах, неактивна или неустойчива (Hantzopolous et al. Gene, 57: 159, 1987). Гликозилирование также важно для поглощения α-гал А в нужных клетках-мишенях и влияет на время полужизни фермента в кровотоке in vivo. В каждом звене α-гал А имеется 4 участка, доступных для присоединения аспарогинсвязанных углеводных цепей, из которых занимаются только три (Desnick et al. , в "The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease", pp. 2741-2780, McGraw Hill, New York, 1995).
Оценивают также картину гликозилирования α-гал А, полученной
по изобретению. Правильное гликозилирование является важным для оптимальной активности α-гал A in vivo; α-гал А, экспрессированная в негликозилирующих системах, неактивна или неустойчива (Hantzopolous et al. Gene, 57: 159, 1987). Гликозилирование также важно для поглощения α-гал А в нужных клетках-мишенях и влияет на время полужизни фермента в кровотоке in vivo. В каждом звене α-гал А имеется 4 участка, доступных для присоединения аспарогинсвязанных углеводных цепей, из которых занимаются только три (Desnick et al. , в "The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease", pp. 2741-2780, McGraw Hill, New York, 1995).
Образец α-гал А, продуцированной устойчиво трансфектированными клетками, для удаления сиаловой кислоты обрабатывают нейраминидазой, которую выделяют из A. urafaciens (Boehringer-Mannheim, Индианаполис, Индиана). Эту реакцию осуществляют посредством обработки в течение ночи при комнатной температуре 5 мкг α-гал А нейраминидазы в 10 мкл (общий объем) забуференного ацетатом физиологического раствора (ЗАР, 20 мМ ацетата натрия, pH 5,2, 150 мМ NaCI).
Очищенную α-гал А, продуцированную устойчиво трансфектированными клетками, также дефосфорилируют с использованием щелочной фосфатазы (щелочная фосфатаза из кишечника теленка, Boehringer-Mannheim, Индианаполис, Индиана) посредством обработки в течение ночи при комнатной температуре 5 мкг α-гал А 15 E щелочной фосфатазы в ЗАР (рН поднимают до 7,5 с помощью 1 М трис).
Образцы анализируют посредством Вестерн-блоттинга со специфическим антителом против α-гал А. Используемое антитело представляет кроличье поликлональное антипептидное антитело, полученное с использованием в качестве иммуногена пептида, представляющего аминокислоты 68-81 α-гал А. После переноса белка на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF, Millipore, Бедфорд, Миннесота) мембрану зондируют разведенной 1:2000 антисывороткой в 2,5% блотто (обезжиренное сухое молоко в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,05% твина-20). После этого следует детекция с козьим антикроличьим lgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (Organon Teknika/Cappel, Дарем, Северная Каролина; разведение 1: 5000) и реагентами из набора для хемилюминесценции ECL (Amersham, Арлингтонские Высоты, Индиана).
Обработка α-гал А нейраминидазой приводит к небольшому сдвигу молекулярной массы (приблизительно 1500-2000 Д или 4-6 сиаловых кислот на мономер), что позволяет сделать предположение о существовании удлиненной сиаловой кислотой модификации α-гал А. Для справки, α-гал А плазмы содержит 5-6 остатков сиаловой кислоты на мономер, а плацентарная форма содержит 0,5-1,0 остаток сиаловой кислоты на мономер (Bishop et al., J. Biol. Chem., 256:1307, 1981).
Другим способом, применяемым для исследования модификаций α-гал А с сиаловой кислотой и маннозо-6-фосфатом, является изоэлектрофокусирование (IEF), когда образцы разделяют, основываясь на их изоэлектрической точке (pI) или суммарном заряде. Таким образом, можно ожидать, что удаление из α-гал А заряженных остатков, таких как сиаловая кислота или фосфат, изменит мобильность белка в системе IEF.
Чтобы осуществить эксперименты по IEF, образцы α-гал А, полученной по изобретению, обрабатывают нейраминидазой и щелочной фосфатазой, смешанными в соотношении 1: 1 с 2X буфером Novex для образцов (с 8 М мочевины, pH 3,0-7,0), и загружают в гель для IEF с 6М мочевины (5,5% полиакриламида), полученным с использованием фармалита® (Pharmacia, Упсала, Швеция; pH 3,0-6,5; ( фармалит® 4-6,5 и 2,5-5,5, 0,25 мл каждого на гель). Включают также стандарты изоэлектрических точек (Bio-Rad). После электрофореза гель переносят на PVDF и осуществляют Вестерн-блоттинг, как описано выше.
Продуцированная устойчиво трансфектированными фибробластами человека α-гал А состоит из трех основных изоформ с интервалом pI приблизительно 4,4-4,65. Эти величины подобны значениям pI форм α-гал А в плазме и селезенке (Bishop et al., J. Biol. Chem., 256:1307, 1981). Обработка фермента нейраминидазой увеличивает pI всех трех изоформ, что указывает, что все они до некоторой степени модифицированы сиаловой кислотой. Эти данные наводят на мысль, что α-гал А, продуцированная устойчиво трансфектированными фибробластами человека, должна иметь желаемое время полужизни в плазме, что показывает, что этот материал будет подходить для фармакологического применения. Кроме того, обработка щелочной фосфатазой α-гал А, обработанной нейраминидазой, еще увеличивает pI части белка приблизительно до 5,0-5,1, что указывает, что фермент содержит один или несколько маннозо-6-фосфатных остатков. Такая модификация важна тем, что она требуется для эффективного поглощения α-гал А клетками-мишенями.
Д. Удельная активность α-гал А, выделенной в чистом виде из устойчиво трансфектированных фибробластов
Потенциальную возможность или удельную активность очищенной α-гал А вычисляют с помощью измерений как каталитической активности фермента (анализ с 4-MUF-gal), так и концентрации белка. Концентрацию белка можно определить любым стандартным способом, таким как способ с системой ВСА (Pierce), или посредством измерения поглощения при 280 нм и использования коэффициента экстинкции, мг/мл, 2,3 (определенного из анализа аминокислот) для вычисления этой величины. При использовании таких методов удельная активность α-гал А, очищенной от кондиционированной среды трансфектированных фибробластов человека, составляет 2,2-2,9 х 106 единиц на мг белка, что сравнимо с удельной активностью α-гал А, которую очищают от тканей человека (Bishop et al., J. Biol. Chem., 256:1301, 1981).
Потенциальную возможность или удельную активность очищенной α-гал А вычисляют с помощью измерений как каталитической активности фермента (анализ с 4-MUF-gal), так и концентрации белка. Концентрацию белка можно определить любым стандартным способом, таким как способ с системой ВСА (Pierce), или посредством измерения поглощения при 280 нм и использования коэффициента экстинкции, мг/мл, 2,3 (определенного из анализа аминокислот) для вычисления этой величины. При использовании таких методов удельная активность α-гал А, очищенной от кондиционированной среды трансфектированных фибробластов человека, составляет 2,2-2,9 х 106 единиц на мг белка, что сравнимо с удельной активностью α-гал А, которую очищают от тканей человека (Bishop et al., J. Biol. Chem., 256:1301, 1981).
E. Поглощение α-гал А, опосредованное маннозой и маннозо-6-фосфатом
Чтобы α-гал А, продуцированная устойчиво трансфектированными фибробластами человека, стала эффективным лечебным средством в случае дефицита α-гал А, фермент должен поглощаться пораженными клетками. При физиологических значениях pH α-гал А неактивна и нет возможности для нее быть эффективной в крови или межклеточных жидкостях. Она оптимально метаболизирует аккумулированные липидные субстраты только тогда, когда интернализована в кислой окружающей среде лизосомы. Такое поглощение опосредуется путем связывания α-гал А с маннозо-6-фосфатными рецепторами, экспрессированными на поверхности клетки, и доставки фермента к лизосоме эндоцитическим путем. Рецептор для М6Р экспрессируется повсеместно; до некоторой степени его экспрессируют большинство соматических клеток. Маннозный рецептор, специфический для доступных маннозных остатков на гликопротеинах, является менее распространенным. Последние рецепторы, как правило, обнаруживаются только на макрофагах и подобных макрофагам клетках и предоставляют дополнительные средства для вхождения α-гал А в клетки такого типа.
Чтобы α-гал А, продуцированная устойчиво трансфектированными фибробластами человека, стала эффективным лечебным средством в случае дефицита α-гал А, фермент должен поглощаться пораженными клетками. При физиологических значениях pH α-гал А неактивна и нет возможности для нее быть эффективной в крови или межклеточных жидкостях. Она оптимально метаболизирует аккумулированные липидные субстраты только тогда, когда интернализована в кислой окружающей среде лизосомы. Такое поглощение опосредуется путем связывания α-гал А с маннозо-6-фосфатными рецепторами, экспрессированными на поверхности клетки, и доставки фермента к лизосоме эндоцитическим путем. Рецептор для М6Р экспрессируется повсеместно; до некоторой степени его экспрессируют большинство соматических клеток. Маннозный рецептор, специфический для доступных маннозных остатков на гликопротеинах, является менее распространенным. Последние рецепторы, как правило, обнаруживаются только на макрофагах и подобных макрофагам клетках и предоставляют дополнительные средства для вхождения α-гал А в клетки такого типа.
Чтобы показать опосредованное М6Р поглощение α-гал А, фибробласты кожи пациента с болезнью Фабри (NIGMS, хранилище генетически мутантных клеток) культивируют в течение ночи в присутствии возрастающих концентраций очищенной α-гал А по изобретению. Некоторые из образцов содержат 5 мМ растворимого М6Р, который конкурентно ингибирует связывание и, в результате, поглощение, с помощью маннозо-6-фосфатного рецептора. Другие образцы содержат 30 мкг/мл маннана, который ингибирует связывание и, в результате, поглощение, с помощью маннозного рецептора. После инкубации клетки промывают и харвестируют путем соскоба в буфер для лизиса (10 мМ трис, pH 7,2, 100 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТК, 2 мМ пефаблокаTM (Boehringer-Mannheim, Индианаполис, Индиана) и 1% NP-40). Лизированные образцы затем анализируют на содержание белка и активность α-гал А. Результаты выражают в единицах активности α-гал А на мг клеточного белка. Клетки Фабри поглощают α-гал А в зависимости от дозы (фиг. 7). Такое поглощение может ингибироваться маннозо-6-фосфатом, но не ингибируется маннаном. Следовательно, поглощение α-гал А в фибробластах Фабри опосредуется маннозо-6-фосфатным рецептором, но не маннозным рецептором.
Также α-гал А поглощается in vitro эндотелиальными клетками - важными клетками-мишенями при лечении болезни Фабри. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) культивируют в течение ночи с 7500 единицами α-гал А; некоторые из лунок содержат М6Р. По завершении периода инкубации клетки харвестируют и анализируют на α-гал А, как описано выше. Клетки, инкубированные только с α-гал А, содержат фермента почти в 10 раз больше, чем контрольные клетки (без инкубации с α-гал А). М6Р ингибирует внутриклеточное накопление α-гал А, что наводит на мысль, что поглощение α-гал A HUVEC опосредуется М6Р-рецептором. Таким образом, человеческая α-гал А по изобретению поглощается клинически важными клетками.
Известно, что немногие культивированные линии человеческих клеток экспрессируют маннозный рецептор. Однако линия подобных макрофагам мышиных клеток (J774.E), которая несет маннозные рецепторы, но немного, если (есть) сколько-нибудь маннозно-6-фосфатных рецепторов, может быть использована для определения того, поглощается ли очищенная α-гал А по изобретению с помощью маннозного рецептора (Diment et al., J. Leukocyte Biol., 42:485-490, 1987). Клетки J774.E культивируют в течение ночи в присутствии 10000 единиц α-гал А на мл. Отобранные образцы также содержат 2 мМ М6Р, а другие содержат 100 мкг/мл маннана. Клетки промывают и харвестируют, как описано выше, и определяют общее содержание белка и активность α-гал А каждого образца. Результаты приводятся в табл. 6. М6Р не ингибирует поглощение α-гал А этими клетками, в то время как маннан снижает уровень накопленной α-гал A на 75%. Таким образом, α-гал А по изобретению может поглощаться при помощи маннозного рецептора в клеточных типах, экспрессирующих этот особый рецептор клеточной поверхности.
Эти эксперименты показывают, что α-гал А, продуцированная устойчиво трансфектированными человеческими клетками, может поглощаться клетками при помощи маннозного или маннозо-6-фосфатного рецептора.
Ж. Коррекция фибробластов Фабри с помощью фибробластов человека, экспрессирующих α-/ гал А
В случае генной терапии имплантат аутологичных клеток, продуцирующих α-гaл А, должен продуцировать фермент в форме, соответствующим образом модифицированной для "исправления" дефицита α-гал А в клетках-мишенях. Чтобы оценить действие продуцирования трансфектированными фибробластами человека α-гал А на клетки Фабри, собранные от пациентов с болезнью Фабри фибробласты (NIGMS, хранилище генетически мутантных человеческих клеток) сокультивируют с продуцирующим α-гал А клеточным штаммом (BRS-11) на Transwells® (Costar, Кемридж, Минессота). Схема эксперимента приводится на фиг. 8. Клетки Фабри культивируют в 12-луночных планшетах для культивирования тканей, некоторые из которых содержат вставки (Transwels® размер пор 0,4 мкм) с поверхностью, на которой могут расти клетки. Матрица вставки для роста пористая и позволяет макромолекулам проникать с верхней части в нижележащую среду. Одна группа вставок содержит фибробласты крайней плоти здорового человека (HF), которые секретируют α-гал А на минимальном уровне, в то время как другая группа содержит штамм устойчиво трансфектированных фибробластов человека BRS-11, который секретирует большое количество α-гал А. В лунках с сокультивируемыми продуцирующими α-гал А клетками α-гал А может поступать в среду, омывающую клетки Фабри, и, возможно, поглощаться клетками Фабри.
В случае генной терапии имплантат аутологичных клеток, продуцирующих α-гaл А, должен продуцировать фермент в форме, соответствующим образом модифицированной для "исправления" дефицита α-гал А в клетках-мишенях. Чтобы оценить действие продуцирования трансфектированными фибробластами человека α-гал А на клетки Фабри, собранные от пациентов с болезнью Фабри фибробласты (NIGMS, хранилище генетически мутантных человеческих клеток) сокультивируют с продуцирующим α-гал А клеточным штаммом (BRS-11) на Transwells® (Costar, Кемридж, Минессота). Схема эксперимента приводится на фиг. 8. Клетки Фабри культивируют в 12-луночных планшетах для культивирования тканей, некоторые из которых содержат вставки (Transwels® размер пор 0,4 мкм) с поверхностью, на которой могут расти клетки. Матрица вставки для роста пористая и позволяет макромолекулам проникать с верхней части в нижележащую среду. Одна группа вставок содержит фибробласты крайней плоти здорового человека (HF), которые секретируют α-гал А на минимальном уровне, в то время как другая группа содержит штамм устойчиво трансфектированных фибробластов человека BRS-11, который секретирует большое количество α-гал А. В лунках с сокультивируемыми продуцирующими α-гал А клетками α-гал А может поступать в среду, омывающую клетки Фабри, и, возможно, поглощаться клетками Фабри.
Данные, приведенные в табл. 7, показывают, что клетки Фабри поглощают секретируемую α-гал А. Внутриклеточное содержание α-гал А контролируют в течение трех суток. Клетки, выращенные одни (без вставки) или в присутствии нетрансфектированных фибробластов крайней плоти (вставка HF), имеют очень низкие внутриклеточные уровни активности α-гал А. Клетки Фабри, культивированные с продуцирующими α-гал А клетками (вставка BRS-11), однако, к концу 2 суток показывают содержание фермента, подобное его количеству в здоровых клетках (нормальные фибробласты содержат 25-80 единиц α-гал А на мг белка). То что эту коррекцию можно приписать α-гал А, поглощенной при посредничестве М6Р-рецептора, демонстрируется ее ингибированием маннозо-6-фосфатом (вставка BRS-11 + М6Р).
3. Полезность других типов клеток
В описанном здесь способе можно применять другие типы клеток. Клетки можно получить из многих тканей, и к ним могут относиться все типы клеток, которые можно поддерживать в культуре. Например, к первичным и вторичным клеткам, которые можно трансфектировать по способу настоящего изобретения, относятся фибробласты человека, кератиноциты, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки молочной железы или кишечника), эндотелиальные клетки, глиальные клетки, невральные клетки, форменные элементы крови (например, лимфоциты и клетки костного мозга), мышечные клетки и предшественники этих типов соматических клеток. Особый интерес представляют фибробласты. Первичные клетки получают, предпочтительно, от индивидуума, которому должны быть введены трансфектированные первичные и вторичные клетки, так что они не будут отторгаться иммунной системой пациента. Однако, если уделить должное внимание предотвращению или подавлению отторжения иммунной системой (как описано ниже), можно также использовать клетки другого донора, а не только пациента. В таком случае будет позволительно использовать клетки из стандартизированной, установленной, устойчиво трансфектированной клеточной линии для всех пациентов.
В описанном здесь способе можно применять другие типы клеток. Клетки можно получить из многих тканей, и к ним могут относиться все типы клеток, которые можно поддерживать в культуре. Например, к первичным и вторичным клеткам, которые можно трансфектировать по способу настоящего изобретения, относятся фибробласты человека, кератиноциты, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки молочной железы или кишечника), эндотелиальные клетки, глиальные клетки, невральные клетки, форменные элементы крови (например, лимфоциты и клетки костного мозга), мышечные клетки и предшественники этих типов соматических клеток. Особый интерес представляют фибробласты. Первичные клетки получают, предпочтительно, от индивидуума, которому должны быть введены трансфектированные первичные и вторичные клетки, так что они не будут отторгаться иммунной системой пациента. Однако, если уделить должное внимание предотвращению или подавлению отторжения иммунной системой (как описано ниже), можно также использовать клетки другого донора, а не только пациента. В таком случае будет позволительно использовать клетки из стандартизированной, установленной, устойчиво трансфектированной клеточной линии для всех пациентов.
И. Введение клеток, экспрессирующих α-гал А
Описанные выше клетки можно вводить индивидууму посредством различных стандартных способов введения, так что они будут находиться, например, в ренальной субкапсуле, подкожном пространстве, центральной нервной системе, подоболочечном пространстве, печени, брюшной полости или внутри мышцы. Клетки также можно инъецировать внутривенно или интраартериально с тем, чтобы циркулировали в кровотоке индивидуума. Однажды имплантированные индивидууму трансфектированные клетки будут продуцировать и секретировать лечебный продукт гликозилированную человеческую α-гал.
Описанные выше клетки можно вводить индивидууму посредством различных стандартных способов введения, так что они будут находиться, например, в ренальной субкапсуле, подкожном пространстве, центральной нервной системе, подоболочечном пространстве, печени, брюшной полости или внутри мышцы. Клетки также можно инъецировать внутривенно или интраартериально с тем, чтобы циркулировали в кровотоке индивидуума. Однажды имплантированные индивидууму трансфектированные клетки будут продуцировать и секретировать лечебный продукт гликозилированную человеческую α-гал.
Число генетически модифицированных клеток, которые будут вводится индивидууму, будет изменяться, но его могут определить специалисты в этой области техники. Возраст, масса, пол и общее физическое состояние каждого пациента, а также объем распределения, время полужизни и биологическая доступность фермента и продуктивность генетически модифицированных клеток in vivo будут рассматриваться в первую очередь при определении дозы и способа введения. Как правило, будут применяться от одного миллиона до одного биллиона клеток при уровне экспресии в интервале 100-100000 единиц на 106 клеток в сутки. При необходимости, процедуру можно повторять или изменять до получения нужного результата, например до достижения освобождения от симптомов болезни Фабри.
Как описано выше, используемые клетки обычно будут специфичными для пациента, т. е, полученными от индивидуума, которому должны вводиться трансфектированные первичные или вторичные клетки, так что они будут отторгаться иммунной системой пациента. Однако, если такой сценарий невозможен или нежелателен, клетки, генетически модифицированные так, как описано здесь, можно получить от другого индивидуума и имплантировать пациенту, страдающему от дефицита α-гал А.
Применение клеток от другого индивидуума, не являющегося реципиентом, может потребовать введения иммунодепрессанта, изменения антигенов гистосовместимости или применения барьерного устройства для предотвращения отторжения имплантированных клеток. Барьерное устройство следует изготовлять из материала (например, мембраны, такой как ХМ-50 от Amicon, Беверли, Миннесота), который позволяет секретируемому
продукту проходить в кровоток или ткани пациента, но предотвращает контакт между имплантированными клетками и иммунной системой пациента, и таким образом предотвращает иммунную реакцию (и возможное отторжение) пациента на клетки. Для дополнительного руководства относительно генной терапии см. Selden et al. (WO 93/09222).
продукту проходить в кровоток или ткани пациента, но предотвращает контакт между имплантированными клетками и иммунной системой пациента, и таким образом предотвращает иммунную реакцию (и возможное отторжение) пациента на клетки. Для дополнительного руководства относительно генной терапии см. Selden et al. (WO 93/09222).
С другой стороны, клетки можно внедрить в матрицу или гель, такие как описаны в патентной заявке США, per. N 08/548/002, совладельцами которой являются заявители, где описывается применение гибридноматричных имплантатов, или в заявке на патент Jain et al. (заявка PCT WO 95/19430), в которой описывается макроинкапсулирование секреторных клеток в гидрофильный гель (работы, включенные в настоящее в качестве ссылок).
К. Фармацевтическая композиция для обычного введения белка α-гал А
Белок α-гал А, который экспрессируется и секретируется устойчиво трансфектированными (или генетически модифицированными иным способом) человеческими клетками и очищается так, как здесь описано, можно вводить индивидуумам, у которых белок α- гал А продуцируется недостаточно или с нарушениями. Белок можно вводить в фармацевтически приемлемом носителе при pH ниже 6,5, например, в композиции, какая описана в примере III. Примерами эксципиентов, которые можно включать в композицию, являются буферные системы, такие как цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер, аминокислоты, мочевина, спирты, аскорбиновая кислота, фосфолипиды, белки, такие как сывороточный альбумин и желатин, ЭДТК, хлорид натрия, липосомы, поливинилпирролидон, маннит, сорбит, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль (например, ПЭГ-4000, ПЭГ-6000). Способ введения может представлять, например, внутривенное, интраартериальное, подкожное, интраперитонеальное, интрацеребральное, внутримышечное, внутрилегочное введение или введение через слизистую оболочку. Способ введения и количество отпускаемого белка будет определяться факторами, которые в состоянии определить специалист. Кроме того, специалистам известно, что способ введения и дозировка лечебного белка могут изменяться для данного пациента, пока не получится лечебный уровень дозировки. Как правило, следует вводить дозы α-гал А в 0,01-100 мг на кг массы тела. Ожидается, что в продолжение жизни пациента будут необходимы регулярно повторяемые дозы.
Белок α-гал А, который экспрессируется и секретируется устойчиво трансфектированными (или генетически модифицированными иным способом) человеческими клетками и очищается так, как здесь описано, можно вводить индивидуумам, у которых белок α- гал А продуцируется недостаточно или с нарушениями. Белок можно вводить в фармацевтически приемлемом носителе при pH ниже 6,5, например, в композиции, какая описана в примере III. Примерами эксципиентов, которые можно включать в композицию, являются буферные системы, такие как цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер, аминокислоты, мочевина, спирты, аскорбиновая кислота, фосфолипиды, белки, такие как сывороточный альбумин и желатин, ЭДТК, хлорид натрия, липосомы, поливинилпирролидон, маннит, сорбит, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль (например, ПЭГ-4000, ПЭГ-6000). Способ введения может представлять, например, внутривенное, интраартериальное, подкожное, интраперитонеальное, интрацеребральное, внутримышечное, внутрилегочное введение или введение через слизистую оболочку. Способ введения и количество отпускаемого белка будет определяться факторами, которые в состоянии определить специалист. Кроме того, специалистам известно, что способ введения и дозировка лечебного белка могут изменяться для данного пациента, пока не получится лечебный уровень дозировки. Как правило, следует вводить дозы α-гал А в 0,01-100 мг на кг массы тела. Ожидается, что в продолжение жизни пациента будут необходимы регулярно повторяемые дозы.
Л. Лечение других состояний, вызванных дефицитом ферментов
Вероятно, что другие состояния, вызванные дефицитом иных, чем α-гал А, ферментов, накапливаемых в лизосомах, могут поддаваться лечению методами, сопоставимыми с описанными здесь. В таких случаях ДНК, которая кодирует функциональную форму недостающего фермента, следует заменить на ДНК, кодирующую α- гал А в описанных здесь экспрессирующих конструкциях. Примеры синдромов нехватки ферментов, которые идентифицированы и которые могут поддаваться лечению, описанному здесь, даны в табл. 8. Сведения, приведенные в этой таблице, взяты из работы Е. Neufeld (Ann. Rev. Biochem., 60:257-280, 1991), включенной в настоящее в качестве ссылки.
Вероятно, что другие состояния, вызванные дефицитом иных, чем α-гал А, ферментов, накапливаемых в лизосомах, могут поддаваться лечению методами, сопоставимыми с описанными здесь. В таких случаях ДНК, которая кодирует функциональную форму недостающего фермента, следует заменить на ДНК, кодирующую α- гал А в описанных здесь экспрессирующих конструкциях. Примеры синдромов нехватки ферментов, которые идентифицированы и которые могут поддаваться лечению, описанному здесь, даны в табл. 8. Сведения, приведенные в этой таблице, взяты из работы Е. Neufeld (Ann. Rev. Biochem., 60:257-280, 1991), включенной в настоящее в качестве ссылки.
V. Другие варианты воплощения изобретения
Описанное здесь изобретение пояснено примерами в части способов лечения, при которых используются клетки, экспрессирующие определенный генный продукт после трансфекции, т.е., после введения конструкции, кодирующей генный продукт и содержащей регуляторные элементы, которые регулируют экспрессию этой кодирующей последовательности. Эти способы также можно осуществить с использованием клеток, которые генетически модифицированы посредством иных процедур, в том числе направленным переносом генов и активацией генов (см. Treco et al., WO 95/31560, включена в настоящее в качестве ссылки; см, также Selden et al., WO 93/09222).
Описанное здесь изобретение пояснено примерами в части способов лечения, при которых используются клетки, экспрессирующие определенный генный продукт после трансфекции, т.е., после введения конструкции, кодирующей генный продукт и содержащей регуляторные элементы, которые регулируют экспрессию этой кодирующей последовательности. Эти способы также можно осуществить с использованием клеток, которые генетически модифицированы посредством иных процедур, в том числе направленным переносом генов и активацией генов (см. Treco et al., WO 95/31560, включена в настоящее в качестве ссылки; см, также Selden et al., WO 93/09222).
Сигнальный пептид hGH можно использовать с иными, чем α- гал А, гетерологичными белками для повышения уровня экспрессии и секреции гетерологичного белка. Примерами таких белков являются α- 1-антитрипсин, антитромбин Ш, аполипопротеин E, аполипопротеин А-1, факторы свертывания крови V, VII, VIII, IX, X и XIII, фактор роста кости 2, фактор роста кости 7, кальцитонин, каталитические антитела, ДНКаза, эритропоэтин, FSH-β, глобины, глюкагон, глюкоцереброзидаза, G-КСФ, GM-КСФ, гормоны роста, иммуномодуляторы, иммуноглобулины, инсулин, инсулинотропин, инсулиноподобные факторы роста, интерферон-β, интерферон-β- нервные факторы роста, интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-6, интерлейкин-11, интерлейкин-12, IL-2-рецептор, антагонисты. IL-1-рецептора, рецептор для липопротеина низкой плотности, М-КСФ, паратиреоидный гормон, протеинкиназа С, растворимый CD4, супероксиддисмутаза, тканевый активатор плазминогена, TGF-β, фактор некроза опухоли, TSH-β, тирозингидроксилаза и урокиназа.
Другие варианты воплощения изобретения также входят в объем приведенной далее формулы изобретения.
Список последовательностей приведен в конце текста.
Claims (12)
1. Способ лечения пациента, имеющего дефицит α-галактозидазы А (α-гал А), путем введения ему человеческой клетки, генетически модифицированной для сверхэкспрессии и секреции человеческой α-гал А.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетку трансфектируют in vitro молекулой ДНК с последовательностью, кодирующей полипептид, содержащий человеческую α-гал А (ПОСЛЕД. 26).
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что полипептид дополнительно содержит гетерологичный сигнальный пептид.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что гетерологичный сигнальный пептид представляет сигнальный пептид человеческого гормона роста (hGH) (ПОСЛЕД. 21).
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что молекула ДHК содержит интрон в последовательности, кодирующей сигнальный пептид.
6. Молекула ДHК, содержащая первую последовательность, кодирующую сигнальный пептид hGH (ПОСЛЕД. 21), причем указанная первая последовательность содержит нитрон; и присоединенную к 3'-концу первой последовательности вторую последовательность, кодирующую полипептид, содержащий человеческую α-гал А.
7. Экспрессирующая конструкция, содержащая молекулу ДНК по п. 6 и пригодная для экспрессии в человеческой клетке.
8. Белок, содержащий сигнальный пептид hGH (ПОСЛЕД. 21), соединенный пептидной связью с человеческой α-гал А.
9. Способ получения гликозилированной человеческой α-гал А, включающий культивирование человеческой клетки, содержащей молекулу ДНК, которая кодирует полипептид, содержащий человеческую α-гал А связанную с гетерологичным сигнальным пептидом и допускает экспрессию полипептида в клетке, причем клетка культивирована в условиях, допускающих экспрессию человеческой α-гал А указанной молекулой ДНК и выделение гликозилированной человеческой α-гал А в культуральную среду клетки.
10. Способ очистки образца человеческой α-гал А, включающий первую стадию хроматографии, когда образец пропускают через гидрофобную, вступающую во взаимодействие смолу, причем смола необязательно содержит бутильную группу в качестве функциональной группы.
11. Способ лечения, включающий введение очищенной гликозилированной человеческой α-гал А пациенту с на дефицит α-гал А.
12. Терапевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемую очищенную человеческую α-гал А с N-присоединенным маннозо-6-фосфатом в фармацевтически приемлемом носителе.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71261496A | 1996-09-13 | 1996-09-13 | |
US08/712,614 | 1996-09-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU99107287A RU99107287A (ru) | 2001-06-27 |
RU2179034C2 true RU2179034C2 (ru) | 2002-02-10 |
Family
ID=24862863
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99107287/14A RU2179034C2 (ru) | 1996-09-13 | 1997-09-12 | ЛЕЧЕНИЕ В СЛУЧАЕ ДЕФИЦИТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ А |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
EP (4) | EP0935651B1 (ru) |
JP (7) | JP4001925B2 (ru) |
KR (2) | KR100547402B1 (ru) |
CN (1) | CN1268741C (ru) |
AT (1) | ATE286120T1 (ru) |
AU (1) | AU4424497A (ru) |
CA (1) | CA2265464C (ru) |
DE (1) | DE69732129T2 (ru) |
DK (2) | DK1538202T3 (ru) |
ES (3) | ES2458292T3 (ru) |
HK (3) | HK1022173A1 (ru) |
HU (2) | HU230275B1 (ru) |
IL (2) | IL128960A (ru) |
MX (1) | MX340738B (ru) |
NO (4) | NO328443B1 (ru) |
NZ (2) | NZ334721A (ru) |
PL (1) | PL190041B1 (ru) |
PT (1) | PT1538202E (ru) |
RU (1) | RU2179034C2 (ru) |
TW (1) | TW585919B (ru) |
WO (1) | WO1998011206A2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2529830C2 (ru) * | 2006-01-20 | 2014-09-27 | Джензим Корпорейшн | Внутрижелудочковая доставка ферментов при лизосомных болезнях накопления |
US11253485B2 (en) | 2006-02-09 | 2022-02-22 | Genzyme Corporation | Slow intraventricular delivery |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6458574B1 (en) * | 1996-09-12 | 2002-10-01 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Treatment of a α-galactosidase a deficiency |
US6083725A (en) | 1996-09-13 | 2000-07-04 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein |
EP1027069B1 (en) * | 1997-10-29 | 2006-07-26 | Genzyme Corporation | Gene therapy for gaucher disease |
EP1658857A1 (en) * | 1997-10-29 | 2006-05-24 | Genzyme Corporation | Compositions and methods for treating lysosomal storage disease |
US6274597B1 (en) | 1998-06-01 | 2001-08-14 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Method of enhancing lysosomal α-Galactosidase A |
AU2012241170B2 (en) * | 1999-03-11 | 2016-07-28 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency |
AU2016250357B2 (en) * | 1999-03-11 | 2018-11-01 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency |
AU2004242550B2 (en) * | 1999-03-11 | 2008-04-03 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Treatment of alpha-Galactosidase A deficiency |
EP2275559A3 (en) * | 1999-09-28 | 2011-03-23 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Optimized messenger RNA |
WO2002064799A2 (en) | 1999-09-28 | 2002-08-22 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Optimized messenger rna |
WO2001042442A2 (en) | 1999-12-10 | 2001-06-14 | Cytos Biotechnology Ag | Activation of endogenous genes by genomic introduction of a replicon |
ES2328446T5 (es) | 2000-02-04 | 2014-02-27 | Children's Hospital Research Foundation | Uso de lipasa ácida lisosomal para tratar la aterosclerosis y enfermedades asociadas |
US20020095135A1 (en) | 2000-06-19 | 2002-07-18 | David Meeker | Combination enzyme replacement, gene therapy and small molecule therapy for lysosomal storage diseases |
US7138262B1 (en) * | 2000-08-18 | 2006-11-21 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | High mannose proteins and methods of making high mannose proteins |
IL140110A0 (en) * | 2000-12-05 | 2002-02-10 | Applied Research Systems | Improvement of homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems |
WO2003090695A2 (en) | 2002-04-25 | 2003-11-06 | Transkaryotic Therapies, Inc. | TREATMENT OF α-GALACTOSIDASE A DEFICIENCY |
EP1587923B1 (en) | 2003-01-22 | 2011-08-24 | Duke University | Improved constructs for expressing lysosomal polypeptides |
BRPI0618583A2 (pt) | 2005-11-18 | 2011-09-06 | Tokyo Metropolitan Org Med Res | enzima altamente funcional tendo especifidade ao substrato modificada |
JP5364382B2 (ja) | 2006-02-07 | 2013-12-11 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | 遊離チオール部分を有するタンパク質の安定化された組成物 |
JP5507242B2 (ja) * | 2007-05-18 | 2014-05-28 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | 酵素補充療法用医薬組成物 |
EP4212541A1 (en) | 2008-12-16 | 2023-07-19 | Genzyme Corporation | Oligosaccharide-protein conjugates and their intermediates |
EP2459212B1 (en) | 2009-07-28 | 2018-03-14 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Compositions and methods for treating gaucher disease |
US20130209436A1 (en) | 2010-04-23 | 2013-08-15 | Synageva Biopharma Corp. | Lysosomal storage disease enzymes |
WO2012012461A2 (en) | 2010-07-19 | 2012-01-26 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mannose receptor c type 1 (mrc1) codon optimized cell line and uses thereof |
SI2613798T2 (en) | 2010-09-09 | 2018-05-31 | Synageva Biopharma Corp. | Use of lysosomal acid lipase to treat lysosomal acid lipase deficiency in patients |
EP2675472A4 (en) | 2011-02-15 | 2014-09-17 | Synageva Biopharma Corp | METHOD FOR THE TREATMENT OF LACK OF LYSOSOMAL SAURER LIPASE |
CN104023804B (zh) * | 2011-11-02 | 2017-05-24 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 超载和洗脱层析 |
CN104519905A (zh) | 2012-03-02 | 2015-04-15 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 用于治疗iii型戈谢病的组合物和方法 |
US9744247B2 (en) * | 2012-06-29 | 2017-08-29 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Functionalized liposomes useful for the delivery of bioactive compounds |
JP6226435B2 (ja) * | 2012-07-26 | 2017-11-08 | Jcrファーマ株式会社 | 組換えヒトα−ガラクトシダーゼAの製造方法 |
WO2014016873A1 (en) * | 2012-07-26 | 2014-01-30 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a |
CN104884147A (zh) | 2012-10-24 | 2015-09-02 | 建新公司 | 使用mes和mops作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子 |
TWI642782B (zh) * | 2013-10-23 | 2018-12-01 | 健臻公司 | 重組醣蛋白及其用途 |
HUE062016T2 (hu) * | 2014-12-22 | 2023-09-28 | Codexis Inc | Humán alfa-galaktozidáz variánsok |
WO2016116966A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins |
GB201508025D0 (en) | 2015-05-11 | 2015-06-24 | Ucl Business Plc | Fabry disease gene therapy |
JP6903295B2 (ja) | 2017-06-30 | 2021-07-14 | 富士フイルム株式会社 | ライソゾーム病処置剤 |
ES2716305B2 (es) | 2017-12-11 | 2019-11-27 | Fund Biomedica Galicia Sur | Uso de chaperonas farmacologicas para el tratamiento de enfermedades de deposito lisosomal |
EA202191735A1 (ru) | 2018-12-20 | 2021-11-24 | Кодексис, Инк. | Варианты альфа-галактозидазы человека |
CN111308095A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-06-19 | 北京师范大学 | 用于诊断***癌的尿液蛋白标记物 |
WO2024044697A2 (en) * | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Walking Fish Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treatment of fabry disease |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2619719B1 (fr) * | 1987-09-01 | 1991-05-10 | Sanofi Sa | Procede d'obtention d'interleukine-2 a partir de cellules eucaryotes, vecteurs necessaires a sa mise en oeuvre et lignees cellulaires hautement productrices |
AU2334088A (en) * | 1987-10-02 | 1989-05-18 | Zymogenetics Inc. | Bar1 secretion signal |
WO1990011353A1 (en) * | 1989-03-24 | 1990-10-04 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant alpha-galactosidase, a therapy for fabry disease |
US5179023A (en) | 1989-03-24 | 1993-01-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant α-galactosidase a therapy for Fabry disease |
NZ234453A (en) * | 1989-07-13 | 1993-01-27 | Sanofi Sa | Recombinant dna encoding urate oxidase, and vector, host, protein and pharmaceutical compositions associated therewith |
IL95330A0 (en) * | 1989-08-11 | 1991-06-30 | Lilly Co Eli | Expression of a functional insect specific toxin gene in mammalian cells |
CA2092823A1 (en) * | 1990-09-28 | 1992-03-29 | Barry D. Greenberg | Transgenic animals with alzheimer's amyloid precursor gene |
US5356804A (en) | 1990-10-24 | 1994-10-18 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York | Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A |
US5401650A (en) * | 1990-10-24 | 1995-03-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A |
WO1993008292A1 (en) * | 1991-10-16 | 1993-04-29 | Agracetus, Inc. | Particle-mediated transformation of animal somatic cells |
PT101031B (pt) | 1991-11-05 | 2002-07-31 | Transkaryotic Therapies Inc | Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica |
US5641670A (en) | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
SE9300105D0 (sv) * | 1993-01-15 | 1993-01-15 | Kabi Pharmacia Ab | Stable protein solution |
EP0726944B1 (en) * | 1993-07-02 | 2002-12-18 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Glycosylated and non-glycosylated bactericidal/permeability increasing proteins, and methods for producing same |
RU2177503C2 (ru) | 1994-01-13 | 2001-12-27 | Рогозин Институт | Макрогранула с секреторными клетками, способ ее получения и способ лечения заболеваний, вызванных нарушением функционирования секреторных клеток |
JP2984552B2 (ja) * | 1994-09-02 | 1999-11-29 | 大和化成株式会社 | ラッカーゼおよびその生産方法 |
US5541087A (en) * | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
JPH08196293A (ja) * | 1995-01-25 | 1996-08-06 | Mitsui Toatsu Chem Inc | タンパク質の製造方法 |
CA2209298C (en) * | 1995-02-15 | 2001-12-18 | Amgen Inc. | Mpl ligand analogs |
-
1997
- 1997-09-12 RU RU99107287/14A patent/RU2179034C2/ru active
- 1997-09-12 EP EP97942567A patent/EP0935651B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 EP EP04030107.9A patent/EP1538202B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 ES ES04030107.9T patent/ES2458292T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 PL PL97332188A patent/PL190041B1/pl unknown
- 1997-09-12 AU AU44244/97A patent/AU4424497A/en not_active Abandoned
- 1997-09-12 EP EP10181991A patent/EP2327775A3/en not_active Withdrawn
- 1997-09-12 WO PCT/US1997/016603 patent/WO1998011206A2/en active Application Filing
- 1997-09-12 HU HU1000445A patent/HU230275B1/hu unknown
- 1997-09-12 IL IL128960A patent/IL128960A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-09-12 JP JP51400498A patent/JP4001925B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 ES ES97942567T patent/ES2234032T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 NZ NZ334721A patent/NZ334721A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-09-12 CN CNB97197909XA patent/CN1268741C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 DK DK04030107.9T patent/DK1538202T3/en active
- 1997-09-12 NZ NZ506214A patent/NZ506214A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-09-12 DK DK10181859.9T patent/DK2374876T3/en active
- 1997-09-12 KR KR1019997002088A patent/KR100547402B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-09-12 AT AT97942567T patent/ATE286120T1/de active
- 1997-09-12 ES ES10181859.9T patent/ES2581828T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 DE DE69732129T patent/DE69732129T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 KR KR1020057011793A patent/KR20050084473A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-09-12 HU HU9904666A patent/HU227189B1/hu unknown
- 1997-09-12 MX MX2014010892A patent/MX340738B/es unknown
- 1997-09-12 EP EP10181859.9A patent/EP2374876B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 CA CA002265464A patent/CA2265464C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-12 PT PT40301079T patent/PT1538202E/pt unknown
- 1997-09-13 TW TW086113342A patent/TW585919B/zh not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-12 NO NO19991225A patent/NO328443B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-02-23 HK HK00101063A patent/HK1022173A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-09-05 HK HK12102808.4A patent/HK1162580A1/zh not_active IP Right Cessation
- 2005-09-05 HK HK05107760.8A patent/HK1074058A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-07-18 JP JP2006195854A patent/JP4313381B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-06-13 JP JP2007155943A patent/JP4313405B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-07-16 IL IL184637A patent/IL184637A/en not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-11-26 JP JP2008300426A patent/JP2009060918A/ja not_active Withdrawn
- 2008-11-26 JP JP2008300335A patent/JP5590788B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-02-06 NO NO20090583A patent/NO330687B1/no not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-03-31 NO NO20110496A patent/NO340408B1/no not_active IP Right Cessation
- 2011-09-06 JP JP2011193635A patent/JP2012019793A/ja not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-09-29 NO NO20141168A patent/NO20141168L/no not_active Application Discontinuation
- 2014-10-15 JP JP2014210566A patent/JP2015044830A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
DE 3715485 os, 17.11.1988. * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2529830C2 (ru) * | 2006-01-20 | 2014-09-27 | Джензим Корпорейшн | Внутрижелудочковая доставка ферментов при лизосомных болезнях накопления |
RU2665381C2 (ru) * | 2006-01-20 | 2018-08-29 | Джензим Корпорейшн | Внутрижелудочковая доставка ферментов при лизосомных болезнях накопления |
US10080783B2 (en) | 2006-01-20 | 2018-09-25 | Genzyme Corporation | Intraventricular enzyme delivery for lysosomal storage diseases |
US11253485B2 (en) | 2006-02-09 | 2022-02-22 | Genzyme Corporation | Slow intraventricular delivery |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2179034C2 (ru) | ЛЕЧЕНИЕ В СЛУЧАЕ ДЕФИЦИТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ А | |
US7122354B2 (en) | Nucleic acid encoding a chimeric polypeptide | |
WO1998011206A9 (en) | THERAPY FOR α-GALACTOSIDASE A DEFICIENCY | |
AU2012227349B2 (en) | Therapy for alpha-galactosidase A deficiency | |
AU2003220717B2 (en) | Therapy for alpha-galactosidase a deficiency | |
AU2008200265B2 (en) | Therapy for alpha-galactosidase A deficiency | |
MXPA99002458A (en) | THERAPY FOR&agr;-GALACTOSIDASE A DEFICIENCY |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |