PT1611112E - Compostos de isoxazole como inibidores de proteínas de choque térmico - Google Patents

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PT1611112E
PT1611112E PT04709273T PT04709273T PT1611112E PT 1611112 E PT1611112 E PT 1611112E PT 04709273 T PT04709273 T PT 04709273T PT 04709273 T PT04709273 T PT 04709273T PT 1611112 E PT1611112 E PT 1611112E
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dihydroxy
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Martin James Drysdale
Brian William Dymock
Harry Finch
Paul Webb
Edward Mcdonald
Karen E James
Kwai M Cheung
Thomas P Mathews
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Cancer Rec Tech Ltd
Cancer Res Inst
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Description

ΡΕ1611112 1
DESCRIÇÃO
"COMPOSTOS DE ISOXAZOLE COMO INIBIDORES DE PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO"
Esta invenção diz respeito a isoxazoles substituídos possuindo actividade inibitória de HSP90, à utilização de tais compostos em medicina, em relação a doenças que respondem à inibição da actividade de HSP90 tais como cancros, e a composições farmacêuticas que contêm tais compostos.
Antecedentes da invenção
As chaperonas moleculares mantêm o enrolamento e conformação apropriados das proteínas e são cruciais na regulação do equilíbrio entre a síntese e a degradação da proteína. Eles têm sido mostrados como sendo importantes na regulação de muitas funções celulares importantes, tais como a proliferação e a apoptose celulares (Jolly e Morimoto, 2000; Smith et al., 1998; Smith, 2001).
Proteínas de Choque térmico (HSPs) A exposição de células numerosos stresses ambientais, incluindo choque térmico, álcoois, metais pesados e stresse oxidativo, resulta na acumulação celular de numerosas chaperonas, vulgarmente conhecidas como proteínas de 2 ΡΕ1611112 choque térmico (HSPs). A indução de HSPs protege a célula contra o insulto de stresse inicial, aumenta a recuperação e conduz à manutenção de um estado tolerante do stresse. Também se tornou evidente, no entanto, que certas HSPs podem também desempenhar um papel de chaperona molecular principal em condições normais, sem stresse, pela regulação do correcto enrolamento, degradação, localização e função de uma lista cada vez maior de importantes proteínas celulares.
Existem numerosas famílias multigénicas de HSPs, com produtos de genes individuais, variando em expressão, função e localização celulares. Elas são classificadas de acordo com a massa molecular, por exemplo, HSP70, HSP90 e HSP27. Várias doenças em seres humanos podem ser adquiridas como resultado de enrolamento errado da proteína (revisto em Tytell et al., 2001; Smith et al., 1998) . Por isso o desenvolvimento de terapias que perturbam os mecanismos do chaperona molecular pode revelar-se benéfico. Em algumas condições (por exemplo, doença de Alzheimer, doenças provocadas por priões e doença de Huntington), as proteínas mal enroladas podem causar a agregação da proteína resultando em perturbações neurodegenerativas. Além disso, as proteínas mal enroladas podem resultar em perda da função da proteína de tipo selvagem, que conduz a funções moleculares e fisiológicas desregulados na célula. 3 ΡΕ1611112
As HSPs também foram implicadas no cancro. Por exemplo, há provas da expressão diferencial de HSPs, o que podem estar relacionado com a fase de progressão do tumor (Martin et al., 2000; Conroy et al., 1996; Kawanishi et al., 1999; Jameel et al., 1992; Hoang et al., 2000; Lebeau et al., 1991) . Como resultado do envolvimento de HSP90 em vários caminhos oncogénicos criticos e a descoberta de que certos produtos naturais com actividade anticancro estão a rotular esta chaperona molecular, o fascinante novo conceito tem sido desenvolvido: inibindo HSP pode ser útil no tratamento do cancro. O primeiro inibidor de chaperona molecular está actualmente em fase de ensaios clínicos. HSP90 A HSP90 constitui cerca de 1-2% da proteína celular total, e está usualmente presente na célula na forma de um dímero em associação com uma de numerosas outras proteínas (ver, por exemplo, Pratt, 1997) . É essencial para a viabilidade celular e exibe funções de chaperona dual (Young et al., 2001) . Ela desempenha um papel chave na resposta ao stresse celular ao interagir com muitas proteínas após a sua conformação nativa ter sido alterada por vários stresses ambientais, tais como o choque térmico, garantindo o enrolamento adequado da proteína e prevenindo a agregação não específica (Smith et al., 1998). Além disso, resultados recentes sugerem que a HSP90 pode também desempenhar um papel no tamponamento contra os efeitos da mutação, presumivelmente corrigindo o enrolamento inapropriado de proteínas mutantes (Rutherford 4 ΡΕ1611112 e Lindquist, 1998). Contudo, a HSP90 também tem um papel regulador importante. Sob condições fisiológicas normais, juntamente com o seu homólogo do reticulo endoplasmático GRP94, a HSP90 desempenha um papel de limpeza na célula, mantendo a estabilidade conformacional e a maturação de várias proteínas clientes chave. Estas podem ser subdivididas em três grupos: (a) receptores da hormona esteroide, (b) Ser/Thr ou tirosina-cinases (por exemplo, ERBB2, RAF-1, CDK4, e LCK), e (c) recolha de proteínas aparentemente não relacionadas, por exemplo, p53 mutante e a subunidade catalítica de telomerase hTERT. Todas estas proteínas desempenham papéis chave na regulação de muitos processos fisiológicos e bioquímicos na célula. Novas proteínas clientes HSP90 estão continuamente a ser identificadas. A família HSP90 altamente conservada em humanos consiste de quatro genes, nomeadamente as isoformas HSP90oí e ΗΞΡ90β citosólicas (Hickey et al., 1989), GRP94 no retículo endoplasmático (Argon et al., 1999) e HSP75/TRAP1 na matriz mitocondrial (Felts et al., 2000). Pensa-se que todos os membros da família têm um modo de acção similar, mas ligam-se a diferentes proteínas clientes dependendo da sua localização no interior da célula. Por exemplo, ERBB2 é conhecida por ser uma proteína cliente específica de GRP94 (Argon et al., 1999) e o receptor do factor de necrose tumoral do tipo 1 (TNFR1) e RB têm ambos sido mostrados como sendo clientes de TRAP1 (Song et al., 1995; Chen et al., 1996). 5 ΡΕ1611112 HSP90 participa numa série de interacções complexas com uma variedade de proteínas clientes e reguladoras (Smith, 2001). Embora os detalhes moleculares precisos continuem por elucidar, estudos bioquímicos e de cristalografia de raios X (Prodromou et al., 1997; Stebbins et al., 1997) realizados ao longo dos últimos anos têm fornecido entendimentos cada vez mais pormenorizados sobre a função chaperona da HSP90.
Seguindo controvérsia anterior sobre este assunto, é agora claro que a HSP90 é uma chaperona molecular ATP-dependente (Prodromou et al., 1997), com a dimerização dos domínios de ligação de nucleótidos que são essenciais para a hidrólise de ATP, o que por sua vez é essencial para a função de chaperona (Prodromou et al., 2000a). A ligação da ATP resulta na formação de uma estrutura de dímero toroidal em que os domínios N-terminal são postos em contacto mais estreito uns com os outros, resultando num interruptor conformacional conhecido como "mecanismo de fixação" (Prodromou e Pearl, 2000b).
Inibidores de HSP90 Conhecidos A primeira classe de inibidores de HSP90 a ser descoberta foi a classe de ansamicina com benzoquinona (ou benzoquinona-ansamicina) , que inclui os compostos herbi-micina A e geldanamicina. Eles foram mostrados a reverter o fenótipo maligno de fibroblastos transformados pelo oncogénio v-Src (Uehara et al., 1985) e, subsequentemente, 6 ΡΕ1611112 a apresentar uma potente atividade antitumoral em modelos animais não só in vitro (Schulte et al., 1998) mas também in vivo (Supko et al., 1995) .
Estudos de imunoprecipitação e de afinidade de matriz têm mostrado que o principal mecanismo de acção da geldanamicina envolve a ligação de HSP90 (Whitesell et al., 1994; Schulte e Neckers, 1998) . Além disso, os estudos de cristalografia de raios X mostraram que a geldanamicina compete no sitio de ligação da ATP e inibe a atividade de ATPase intrínseca de HSP90 (Prodromou et al., 1997; Panaretou et al., 1998). Isto por sua vez evita a formação de complexos de HSP90 multiméricas maduras capazes de chaperonização de proteínas clientes. Como resultado, as proteínas de cliente são alvo para a degradação via ubiquitina-proteassoma. 17-Alilamino, 17-desmetoxigeldana-micina (17AAG) retém a propriedade de inibição da HSP90 resultando na depleção da proteína cliente e atividade antitumoral em cultura de células e modelos de xenoenxerto (Schulte et al., 1998; Kelland et al., 1999), mas tem hepatotoxicidade significativamente menor do que a geldanamicina (Page et al., 1997). 17AAG está sendo atualmente avaliada em ensaios clínicos da Fase I.
Radicicol é um antibiótico macrocíclico mostrado a inverter o fenótipo maligno de fibroblastos transformados por v-Src e v-Ha-Ras (Kwon et al., 1992; Zhao et al., 1995). Foi mostrado a degradar numerosas proteínas de sinalização, como uma consequência da inibição da HSP90 7 ΡΕ1611112 (Schulte et al., 1998). Dados de cristalografia de raios X confirmaram que o radicicol também se liga ao dominio de N-terminal da HSP90 e inibir a atividade de ATPase intrínseca (Roe et al., 1998). 0 radicicol não tem atividade antitumoral in vivo devido à natureza química instável do composto.
Os antibióticos de cumarina são conhecidos por se ligarem a DNA-girase bacteriana num local de ligação de ATP homólogo ao da HSP90. A cumarina, novobiocina, mostrou ligar-se ao terminal carboxi de HSP90, isto é, num sítio diferente do ocupado pelas benzoquinonas-ansamicinas e radicicol que se ligam no terminal N (Marcu et al., 2000b). No entanto, isso ainda resultou na inibição da função de HSP90 e degradação de numerosas proteínas de sinalização chaperonadas por HSP90 (Marcu et al., 2000a). A geldanamicina não pode ligar-se a HSP90 subsequente à novobiocina; isto sugere que uma certa interacção entre os domínios N- e C-terminal têm de existir e é consistente com a ideia de que ambos os sítios são importantes para as propriedades de chaperona da HSP90. O inibidor de HSP90 à base de purina, PU3, tem sido mostrado a resultar na degradação de moléculas de sinalização, incluindo ERBB2, e a causar a paragem do ciclo celular e a diferenciação em células do cancro da mama (Chiosis et al., 2001). 8 ΡΕ1611112 HSP90 como Alvo Terapêutico
Devido ao seu envolvimento na regulação de numerosos caminhos de sinalização que são de importância crucial na condução do fenótipo de um tumor, e a descoberta de que certos produtos naturais bioativos exercem os seus efeitos através da atividade da HSP90, a chaperona molecular HSP90 está actualmente a ser avaliada como um novo alvo para o desenvolvimento de fármacos anticancro (Neckers et ai., 1999). 0 mecanismo de acção predominante da geldana-micina, 17AAG, e radicicol envolve a ligação a HSP90 no sítio de ligação da ATP localizado no domínio N-terminal da proteína, conduzindo à inibição da atividade de ATPase intrínseca da HSP90 (ver, por exemplo, Prodromou et ai., 1997; Stebbins et ai., 1997;. Panaretou et ai., 1998). A inibição da atividade da ATPase da HSP90 impede o recrutamento de co-chaperonas e encoraja a formação de um tipo de heterocomplexo de HSP90 a partir do que estas proteínas clientes são alvo para a degradação pela via da ubiquitina-proteassoma (ver, por exemplo, Neckers et ai., 1999; Kelland et ai., 1999). 0 tratamento com inibidores de HSP90 leva à degradação selectiva de proteínas importantes envolvidas na proliferação celular, regulação do ciclo celular e 9 ΡΕ1611112 apoptose, processos que são de importância fundamental no cancro. A inibição da função de HSP90 tem sido demonstrada a causar a degradação selectiva de proteinas de sinalização importantes envolvidos na proliferação celular, regulação do ciclo celular e apoptose, processos que são de importância fundamental e que são comummente desregulados no cancro (ver, por exemplo, Hostein et al., 2001) . Uma lógica atrativa para o desenvolvimento de fármacos contra este alvo para utilização na prática clinica é que, pela depleção simultânea de proteinas associadas com o fenótipo transformado, se pode obter um efeito antitumoral forte e conseguir uma vantagem terapêutica contra o cancro contra as células normais. Estes eventos a jusante da inibição de HSP90 são acreditados como sendo responsáveis pela atividade antitumoral de inibidores de HSP90 em cultura celular e em modelos animais (ver, por exemplo, Schulte et al., 1998; Kelland et al., 1999).
Breve Descrição da Invenção A presente invenção diz respeito à utilização de uma classe de compostos de isoxazole substituídos como inibidores de HSP90, por exemplo para a inibição da proliferação de células cancerosas. A invenção também inclui compostos de isoxazole novos de per si e composições farmacêuticas que os contêm. 10 ΡΕ1611112
Descrição Detalhada da Invenção
De acordo com a presente invenção é proporcionado um composto de fórmula (A) ou (B) ou um seu sal, N-óxido, hidrato ou solvato:
3 (A) (B) em que
Ri é um grupo de fórmula (IB)
(IB) em que, em qualquer combinação compatível R representa um ou mais substituintes facultativos,
Alk1 e Alk2 são grupos alquileno Ci-Ce ou alce-nileno C2-C6 divalentes facultativamente substituídos, p, r e s são independentemente 0 ou 1, Z é -O-, -S-, - (C=0)-, -C(=S)-, -SO2-, -C(=0)0-, -C(=0)NRa-, -C(=S)NRa-, -so2nra-, -NRaC(=0)-, -nraso2- ou NRa- em que RA é hidrogénio ou alquilo C1-C6, e Q é hidrogénio ou um grupo carbocíclico ou heterocíclico facultativamente substituído; R2 é 11 ΡΕ1611112 (i) um grupo de fórmula (IA): -Ar1- (Alk1) p- (Z) r- (Alk2) S-Q (IA) em que, em qualquer combinação compatível Ar1 é um grupo arilo ou heteroarilo facultativamente substituído ou heteroarilo, e
Alk1, Alk2, p, r, s, Z, RA e Q são conforme definidos em relação a FR; (ii) um grupo carboxamida; ou (iii) um anel carbocíclico ou heterocíclico aromático em que um carbono do anel é facultativamente substituído, e/ou um azoto do anel é facultativamente substituído por um grupo de fórmula
- (Alk1) p- (Z) r- (Alk2) S-Q em que Q, Alk1, Alk2, Z, p, r e s são conforme acima definidos em relação ao grupo (IA); e R3 é um grupo carboxilo, carboxamida ou éster de carboxilo o termo "facultativamente substituído" significando substituído com até quatro substituintes compatíveis, cada um dos quais sendo independentemente seleccionado a partir de alquilo C1-C6, alcoxi (Ci-Cô) , hidroxi, hidroxi-alquilo (C1-C5) , mercapto, mercapto-alquilo (Οχ-Οε) , (alquil Οχ-Οε) _ -tio, halo (incluindo fluoro, bromo e cloro), trifluoro-metilo, trifluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN), oxo, fenilo, -COOH, -COORA, -CORa, -S02Ra, -CONH2, -SO2NH2, -CONHRA, -S02NHRa, -CONRaRb, -S02NRaRb, -NH2, -NHRa, -NRaRb, -OCONH2, 12 ΡΕ1611112 -oconhra, -oconrarb, -nhcora, -nhcoora, -nrbcoora, -nhso2ora, nrbso2oh, -nrbso2ora, -NHCONH2, -nraconh2, -nhconhrb, nraconhrb, -nhconrarb ou -NRaC0NRaRb em que RA e RB são, independentemente, um grupo alquilo Ci-Cô, e o termo "carboxamida" significa um grupo de fórmula -CONH2 ou um grupo metilaminocarbonilo, etilaminocarbonilo ou isopropilaminocarbonilo, ou um grupo de fórmula -CONRB (Alk) nRA em que
Alk é um grupo alquileno, alcenileno ou alcinileno divalente facultativamente substituído, n é 0 ou 1,
Rb é hidrogénio ou um grupo alquilo C1-C6 ou alcenilo C2-C6,
Ra é hidroxi ou carbociclilo ou heterociclilo facultativamente substituído, ou Ra e Rb tomados em conjunto com o azoto ao qual eles estão ligados formam um anel N-heterocíclico que pode facultativamente conter um ou mais heteroátomos adicionais seleccionados de entre 0, S e N, e que pode ser facultativamente substituído num ou mais átomos C ou N do anel.
Conforme aqui usado: o termo "grupo carboxilo" refere-se a um grupo de fórmula -C00H; e o termo "grupo éster de carboxi" refere-se a um grupo de fórmula -C00R, em que R é um radical verdadeiramente ou nocionalmente derivado do composto de hidroxilo ROH. 13 ΡΕ1611112
Conforme aqui usado, o termo "alquilo Ca-Cb" em que a e b são números inteiros refere-se a um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada tendo desde a até b átomos de carbono. Assim, quando a é 1 e b é 6, por exemplo, o termo inclui metilo, etilo, η-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo e n-hexilo.
Conforme aqui usado, o termo "grupo alquileno Ca-Cb divalente" em que a e b são números inteiros refere--se a uma cadeia de hidrocarboneto saturado tendo desde a até b átomos de carbono e duas valências não satisfeitas.
Conforme aqui usado, o termo "alcenilo Ca-Cb" em que a e b são números inteiros refere-se a um grupo alcenilo de cadeia linear ou ramificada tendo desde a até b átomos de carbono e contendo pelo menos uma ligação dupla de configuração E ou Z, incluindo, por exemplo, etenilo e alilo.
Conforme aqui usado, o termo "grupo alcenileno Ca-Cb" em que a e b são números inteiros refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto tendo desde a até b átomos de carbono, pelo menos uma ligação dupla e duas valências não satisfeitas.
Conforme aqui usado, o termo "alcinilo Ca-Cb" em que a e b são números inteiros refere-se a um grupo 14 ΡΕ1611112 alcinilo de cadeia linear ou ramificada tendo desde a até b átomos de carbono e contendo pelo menos uma ligação tripla, incluindo, por exemplo, etinilo e prop-2-inilo.
Conforme aqui usado, o termo "grupo alcinileno Ca-Cb divalente" em que a e b são números inteiros refere--se a um grupo alcinilo de cadeia linear ou ramificada tendo desde a até b átomos de carbono e contendo pelo menos uma ligação tripla e duas valências não satisfeitas.
Conforme aqui usado, o termo "cicloalquilo" refere-se a um grupo carbociclico saturado possuindo desde 3 até 8 átomos de carbono e inclui, por exemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e ciclo-octilo.
Conforme aqui usado, o termo "cicloalcenilo" refere-se a um grupo carbociclico possuindo desde 3 até 8 átomos de carbono contendo pelo menos uma ligação dupla, e inclui, por exemplo, ciclopentenilo, ciclo-hexenilo, ciclo--heptenilo e ciclo-octenilo.
Conforme aqui usado, o termo "arilo" refere-se a um grupo aromático carbociclico mono-, bi- ou tri-ciclico. Ilustrativos de tais grupos são o fenilo, bifenilo e naftilo.
Conforme aqui usado, o termo "carbociclico" refere-se a um grupo cíclico cujos átomos do anel são todos 15 ΡΕ1611112 de carbono, e inclui grupos arilo monociclico, cicloalquilo e cicloalcenilo.
Conforme aqui usado, o termo "heteroarilo" refe-re-se a um grupo aromático mono-, bi- ou tri-ciclico contendo um ou mais heteroátomos seleccionados de entre S, N e 0. Ilustrativos de tais grupos são tienilo, benzo-tienilo, furilo, benzofurilo, pirrolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, isotiazolilo, benzisotiazolilo, pirazolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, benzisoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, benzotriazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, indo-lilo e indazolilo.
Conforme aqui usado, o termo não qualificado "heterociclilo" ou "heterocíclico" inclui "heteroarilo" conforme acima definido, e em particular significa um grupo não aromático mono-, bi- ou tri-ciclico contendo um ou mais heteroátomos seleccionados de entre S, N e 0, e a grupos constituídos por um grupo não aromático monociclico contendo um ou mais tais heteroátomos que está covalentemente ligado a um outro tal radical ou a um grupo carbocíclico monociclico. Ilustrativos de tais radicais são os grupos pirrolilo, furanilo, tienilo, piperidinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolilo, morfolinilo, benzofuranilo, pira-nilo, isoxazolilo, benzimidazolilo, metilenodioxifenilo, etilenodioxifenilo, maleimido e succinimido. 16 ΡΕ1611112 A menos que especificado em contrário no contexto no qual ele ocorre, o termo "substituído" conforme aplicado a qualquer porção aqui presente significa substituído com até quatro substituintes compatíveis, cada um dos quais independentemente pode ser, por exemplo, alquilo Ci~Ce, alcoxi Ci-C6, hidroxi, hidroxi-alquilo Ci-C6, mercapto, mercapto-alquilo Ci-Ce, (alquil Ci-C6)tio, halo (incluindo fluoro, bromo e cloro), trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN), oxo, fenilo, -COOH, -COORA, -CORA, -so2ra, -conh2, -so2nh2, -CONHRa, -S02NHRa, -CONRaRb, -so2nrarb, -nh2, -nhra, -nrarb, -oconh2, -oconhra, -oconrarb, -nhcora, -nhcoora, -NRbCOORa, -nhso2ora, -nrbso2oh, -nrbso2ora, -nhconh2, -NRaCONH2, -nhconhrb, -nraconhrb, -nhconrarb ou -NRaCONRaRb em que RA e Rb são, independente- mente, um grupo alquilo C1-C6. Um "substituinte facultativo" pode ser um dos grupos substituintes precedentes. Dos substituintes acima, alquilo C1-C6, halo, trifluorometilo, trifluorometoxi, trifluorometilsulfonilo e fenilo são os mais comummente considerados como lipofílicos. Outros substituintes listados que contêm grupos alquilo podem ser lipofílicos dependendo dos grupos alquilo particulares presentes.
Conforme aqui usado, o termo "sal" inclui sais de adição de base, adição de ácido e quaternários. Compostos da invenção que são acídicos podem formar sais, incluindo sais farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis, com bases tais como hidróxidos de metal alcalino, por exemplo 17 ΡΕ1611112 hidróxidos de sódio e potássio; hidróxidos de metal alcalino-terroso por exemplo hidróxidos de cálcio, bário e magnésio; com bases orgânicas por exemplo N-metil-D-gluca-mina, colina tris (hidroximetil)aminometano, L-arginina, L-lisina, N-etilpiperidina, dibenzilamina e semelhantes. Aqueles compostos (I) que são básicos podem formar sais, incluindo sais farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis com ácidos inorgânicos, por exemplo com ácidos halidricos tais como ácidos clorídrico ou bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico ou ácido fosfórico e semelhantes, e com ácidos orgânicos por exemplo com os ácidos acético, tartárico, succínico, fumárico, maleico, málico, salicí-lico, cítrico, metanossulfónico, p-toluenessulfónico, ben-zóico, benzenossulfónico, glutâmico, lático e mandélico e semelhantes. 0 termo "lipofílico" conforme aqui usado em relação a um substituinte significa que ele tem uma constante de hidrofobicidade de substituinte positiva (π). (Um valor positivo para π indica que o substituinte é mais lipofílico do que o hidrogénio, ao passo que um valor negativo indica que ele é menos lipofílico, isto é mais hidrofílico, do que o hidrogénio).
Alguns compostos da invenção contêm um ou mais centros quirais atuais ou potenciais devido à presença de átomos de carbono assimétricos. A presença de vários átomos de carbono assimétricos origina numerosos diastereoisómeros com estereoquímica R ou S em cada centro quiral. A invenção inclui todos estes diastereoisómeros e suas misturas. 18 ΡΕ1611112
Um aspeto da invenção inclui compostos de fórmula (A) ou (B) acima e seus sais, N-óxidos, hidratos ou sol-vatos e seus pró-fármacos, exceto os seguintes três compostos (X), (Y) e (Z) que estão comercialmente disponíveis:
(X) (V) (Z)
Sujeita àquelas exclusões, a invenção inclui particularmente aqueles em que os substituintes Ri, R2 e R3 são conforme discutido e especificado nas seguintes secções intituladas "0 grupo Ri", "0 grupo R2" e "0 grupo R3". Um outro aspeto inclui a utilização de tais compostos para o tratamento de doenças responsivas à inibição da atividade de HSP90. 0 Grupo Ri 0 grupo Ri tem a fórmula (IB)
(IB) em que Alk1, Alk2, p, r, s, Z e Q são conforme acima 19 ΡΕ1611112 definido em relação a Ri, e R representa um ou mais substituintes facultativos. Em tais estruturas, é ainda preferido que o átomo de carbono do anel adjacente ao grupo hidroxilo não esteja substituído. Noutra discussão de Ri que se segue, esta preferência aplica-se em adição a quaisquer outras possibilidades mencionadas.
Nas estruturas mais simples com relativamente às quais a invenção diz respeito, cada um dos p, r e s pode ser 0, e Q pode ser hidrogénio, de maneira que Ri é arilo ou heteroarilo facultativamente substituído. Em tais casos, Ri pode ser, por exemplo, facultativamente substituído fenilo, preferivelmente 2-hidroxifenilo o qual pode ser ainda substituído, por exemplo por um ou mais hidroxi, metilo, etilo, metoxi, etoxi, cloro ou bromo. São correntemente preferidos os compostos em que Ri é 2,4-di--hidroxifenilo, substituído na posição 5 por um pequeno substituinte lipofílico" por exemplo tendo um volume molecular igual ou inferior ao de terc-butilo, tal como metilo, etilo, isopropilo, isobutilo, terc-butilo, cloro ou bromo, especialmente etilo, isopropilo ou cloro. Naqueles compostos da invenção 5-substituído-2,4-di-hidroxifenilo, os grupos hidroxilo podem ser protegidos por grupos que são clivados no corpo para libertar os grupos hidroxilos. Grupos deste género do tipo pró-fármaco conhecidos que são clivados a hidroxilos incluem grupos alquilcarboniloxi tais como metilcarboniloxi, e grupos alquilaminocarboniloxi tais como dialquilamino- ou isopropilaminocarboniloxi. 20 ΡΕ1611112
Noutras estruturas simples que dizem respeito à invenção, p, r e s podem outra vez cada um ser 0, e Q pode ser um anel carbociclico ou heterociclico facultativamente substituído, por exemplo um anel fenilo ou piridilo. Em tais casos, Q é um substituinte direto no anel Ar1 facultativamente substituído
Em estruturas mais complexas com as quais a invenção está relacionada, um ou mais de p, r e s pode ser 1, e Q pode ser hidrogénio ou um anel carbociclico ou heterociclico facultativamente substituído. Por exemplo, p e/ou s podem ser ler pode ser 0, de maneira que Q está ligado a Ar1 por um radical alquileno ou alcenileno, por exemplo um radical alquileno C1-C3, o qual é facultativamente substituído. Noutros casos cada um dos p, r, e s pode ser 1, casos em que Q está ligado a Ar1 por um radical alquileno ou alcenileno o qual é interrompido pelo radical Z contendo o heteroátomo. Ainda noutros casos, p e s podem ser 0 e r pode ser 1, caso no qual Q está ligado a Ar1 via o radical Z contendo o heteroátomo.
Exemplos específicos de grupos Ri dos tipos acima estão presentes nos compostos dos Exemplos presentes. O Radical R2
Quando R2 é do tipo (i) , isto é um grupo de fórmula (IA), os exemplos incluem fenilo, 2-, 3- ou 4-piridilo, 2- ou 3-furanilo, 2- ou 3-tienilo, e tiazolilo 21 ΡΕ1611112 em que os substituintes facultativos incluem quaisquer dos listados acima na definição de "substituído", por exemplo metoxi, etoxi, metilenodioxi, etilenodioxi, fluoro, cloro, bromo e trif luorometilo. Por exemplo R2 pode ser fenilo substituído na posição 4 por alcoxi Ci-C6 tal como metoxi ou etoxi, ou por fluoro, cloro, bromo, piperazinilo, N-metilpiperazinilo ou piperidinilo.
Os substituintes R2 presentemente preferidos incluem aqueles que têm a estrutura parcial:
em que o qrupo amino substituído -NR10R11 é um grupo de solubilização. Muitos de tais grupos de solubilização são conhecidos em química médica. Os exemplos incluem morfo-linilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilami-no, isopropilamino, dietilamino, ciclo-hexilamino, ciclo-pentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpi-perazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, tiomorfoli-nildióxido, 4-hidroxietilpiperidinilo e 4-hidroxipiperidi-nilo. 0 nosso pedido de patente internacional copen-dente n° PCT/GB2003/005275 revela compostos de pirazole que inibem HSP90 análogos aos isoxazoles em relação aos quais esta invenção diz respeito, e dos quais se acredita ligarem-se ao alvo HSP90 duma maneira análoga. Aqueles 22 ΡΕ1611112 compostos de pirazole têm um grupo carboxamida na posição correspondente a R2 dos isoxazoles presentes. Por isso, quando R2 nos isoxazoles presentes é um radical carboxamida do tipo (ii) acima, os exemplos incluem aqueles presentes nos compostos de pirazole de PCT/GB2003/005275, por exemplo carboxamidas de fórmula -CONRB (Alk) nRA em que
Alk é um grupo divalente alquileno, alcenileno ou alcinileno, por exemplo um grupo -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH=CH- ou -CH2CCCH2-, e o grupo Alk pode ser facultativamente substituído, n é 0 ou 1,
Rb é hidrogénio ou um grupo alquilo C1-C6 ou alcenilo C2 C6, por exemplo metilo, etilo, n- ou isopropilo, ou alilo,
Ra é hidroxi ou carbocíclico facultativamente substituído, por exemplo hidroxi e/ou fenilo substituído por cloro e 3,4-metilenodioxifenilo; ou heterociclilo, por exemplo piridilo, furilo, tienilo, N-piperazinilo ou N-morfolinilo, qualquer dos quais anéis heterocíclicos pode ser substituído, ou Ra e Rb tomados em conjunto com o azoto ao qual eles estão ligados formam um anel N-heterocíclico o qual pode facultativamente conter um ou mais heteroátomos adicionais selecionados de entre 0, S e N, e que podem facultativamente ser substituídos num ou mais átomos C ou N do anel, os exemplos de tais anéis N-heterocíclicos incluindo morfolino, piperidinilo, piperazinilo e N-fenil-piperazinilo. 23 ΡΕ1611112 O Radical R3 R3 é grupo carboxilo, carboxamida ou éster de carboxilo.
Um subconjunto particular dos compostos com os quais esta invenção diz respeito consiste naqueles de fórmula (ID) , e os seus regioisómeros de fórmula B, e seus sais, solvatos e hidratos, e seus pró-fármacos:
(ID) em que cada R representa independentemente um substi-tuinte facultativo e R3 representa um grupo carboxamida.
Um subconj unto preferido dos compostos com os quais esta invenção diz respeito consiste daqueles de fórmula (IE) , e os seus regioisómeros de fórmula (B) , e seus sais, solvatos e hidratos, e seus pró-fármacos: (IE) 24 ΡΕ1611112 em que R3 representa um grupo carboxamida (tal como etilaminocarbonilo CH3CH2NHC(=0)ou isopropilaminocarbo-nilo (CH3) 2CHNHC (=0)-) ; Rg representa -CtRNR^R11 ou -NR10R1:l em que o grupo amino substituído -NR10R11 é um grupo de solubilização, (tal como morfolinilo, piperidinilo, pipe-razinilo, pirrolidinilo, etilamino, isopropilamino, dietil-amino, ciclo-hexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, N-metilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, tiomorfolinil-dióxido, 4-hidroxietilpiperidinilo e 4-hidroxipiperidinilo) ; e Rs representa um substituinte facultativo, especialmente um pequeno grupo lipofílico (tal como etilo, isopropilo, bromo ou cloro) .
Os compostos específicos relativamente aos quais a invenção diz respeito incluem os dos Exemplos, particularmente os seguintes, e seus sais, N-óxidos, hidratos e solvatos, e seus pró-fármacos:
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazole-3--carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-piperidin-l-ilmetil-fenil)-isoxazole-3--carboxílico
Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5--(2,4-di-hidroxi-5-isopropil-fenil)-isoxazole-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil- 25 ΡΕ1611112 -fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]--isoxazole-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-etilaminometil-fenil)-isoxazole-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-[4-(isopropilamino-metil)-fenil]-isoxazole-3--carboxilico
Etilamida do ácido 4-(4-ciclo-hexilaminometil-fenil)--5- (2, 4-di-hidroxi-5-isopropilfenil) -isoxazole-3-carboxilico
Etilamida do ácido 4-[4-(terc-butilamino-metil)--fenil]-5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropilfenil)-isoxazole-3--carboxilico
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)— 4 — {4 —[ (2-metoxi-etilamino)-metil]-fenilo}--isoxazole-3-carboxilico
Isopropilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazole-3--carboxílico
Isopropilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]--isoxazole-3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]--isoxazole-3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-piperidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxilico 26 ΡΕ1611112
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isobutil--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isobutil--fenil)-4-(4-piperidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico
Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico
Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-dietilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Etilamida do ácido 3-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-5-carboxilico
Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5--(4, 6-di-hidroxi-2'-metil-bifenil-3-il)-isoxazol-3--carboxílico
Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(4'--fluoro-4,6-di-hidroxi-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxilico
Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5--(4,6-di-hidroxi-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(2'-fluoro-4,6-di-hidroxi--bifenil-3-il)-4-(4-pirrolidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol--3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(4,6-di-hidroxi-bifenil-3-il)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-fenetil-fenil)--4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico 27 ΡΕ1611112
Isopropilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-piperidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico
Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(5--etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--[4-(4-metil-piperazin-l-il-metil)-fenil]-isoxazole-3--carboxílico
Etilamida do ácido 5-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--(4-dietilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]-isoxazol-3--carboxílico
Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Os compostos com os quais a invenção está relacionada podem ser preparados por métodos descritos da literatura, tais como os dos Exemplos preparativos aqui descritos e métodos análogos.
Por exemplo, alguns compostos de fórmula (IA) podem ser preparados pela reacção de hidroxilamina e um composto de fórmula (III) (III) «2 (III) «2 28 ΡΕ1611112 Ο
Ra em que o anel A corresponde ao grupo Ri de compostos (IA) e R2e R3 são conforme definidos em relação à fórmula (I). Os compostos preparados deste modo podem então ser quimicamente modificado para introduzir substituintes desejados, para produzir outros compostos de fórmula (A). Por exemplo, onde Ri é um anel fenilo, facultativamente carregando já substituintes, a introdução de um substituinte bromo permitirá muitas vezes a introdução de outros substituintes no sitio do bromo por acoplamento sp2.
Noutro caminho para alguns compostos de fórmula (A), o anel isoxazole é formado pela reacção de um composto (IV) com hidroxilamina
(IV)
O OH em que R'i e R'3 são membros das classes de substituintes Rie R3 definidas acima, para produzir o isoxazole (V)
(V) seguido pela introdução do substituinte adicional R2 (por 29 ΡΕ1611112 exemplo, por bromação ou iodação do carbono do anel em (V) e acoplamento sp2, e/ou modificação dos substituintes R\, rS e R2 resultantes do isoxazole.
Além disso, alguns regioisómeros de isoxazole (B) podem ser preparados a partir dos isoxazoles (A) por reacção com trifluoreto de trimetiloxónio boro e, novamente, os compostos preparados deste modo podem em seguida ser quimicamente modificados para introduzir substituintes desejados, para produzir outros compostos de fórmula (IA).
Será entendido que, durante as sínteses acima referidas, pode ser desejável proteger quaisquer grupos reativos, tais como hidroxilos, e desproteger mais tarde. Outros detalhes sintéticos são descritos nos exemplos presentes.
Os compostos da invenção são inibidores de HSP90 e são por conseguinte úteis no tratamento de doenças que respondem à inibição da atividade de HSP90, tais como cancros; doenças virais, tais como a hepatite C (VHC) (Waxman, 2002); imunossupressão, tal como no transplante (Bijlmakers, 2000 e Yorgin, 2000); anti-doenças inflamatórias (Bucci, 2000), tais como artrite reumatoide, asma, esclerose múltipla, diabetes do tipo I, lúpus, psoríase e doença inflamatória intestinal; fibrose cística (Fuller, 2000); doenças relacionadas com angiogénese (Hur, 2002 e Kurebayashi, 2001): retinopatia diabética, hemangiomas, psoríase, endometriose e angiogénese tumoral. Também um 30 ΡΕ1611112 inibidor de HSP90 da presente invenção pode proteger as células normais contra a toxicidade induzida por quimioterapia e ser útil em doenças em que a falha para submeter a apoptose é um factor subjacente. Um tal inibidor de HSP90 também pode ser útil em doenças em que a indução de um stresse celular ou a resposta a proteina de choque térmico pode ser benéfica, por exemplo, a protecção contra a hipoxia-lesão isquémica devido à elevação de Hsp70 no coração (Hutter, 1996 e Trost, 1998) e no cérebro (Plumier, 1997 e Rajder, 2000) . Um inibidor de HSP90 poderia também ser útil em doenças em que o enrolamento errado da proteina ou a agregação é um importante factor causal, por exemplo, paraplexia enzoótica dos ovinos (ou «scrapie»)/DJC, Huntin-gdon e Alzheimer (Sittler, 2001; Trazelt, 1995 e Winklhofer, 2001).
De acordo com isto, a invenção também proporciona : (i) um método de tratamento de doenças ou condições que respondem à inibição da atividade de HSP90 em mamíferos, particularmente seres humanos, método esse que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade de um composto de fórmula (A) ou (B) conforme acima definido, ou um seu sal, hidrato ou solvato, eficaz para inibir a referida atividade de HSP90; (ii) um composto de fórmula (A) ou (B) conforme acima definido, ou um seu sal hidrato ou solvato, para utilização em medicina humana ou veterinária, particularmente no 31 ΡΕ1611112 tratamento de doenças ou condições que respondem à inibição da atividade de HSP90; e (iii) uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (A) ou (B) conforme acima definido e especificado, em conjunto com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Em particular, a invenção inclui uma solução ou suspensão de tal composto num agente de suporte ou veiculo estéril, fisiologicamente aceitável, por exemplo, solução salina aquosa.
Deve entender-se que o nível de dose específico para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de factores incluindo a atividade do composto específico utilizado, a idade, massa corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos e o mecanismo causal e severidade da doença particular submetida a terapia. Em geral, uma dose adequada para as formulações administráveis por via oral situar-se-á geralmente no intervalo de 0,1 a 3000 mg, uma vez, duas vezes ou três vezes por dia, ou a quantidade diária equivalente administrada por infusão ou outras vias. Contudo, os níveis de dose e a frequência de dosagem ótimos serão determinados por ensaios clínicos, como é convencional na técnica.
Os compostos com os quais a invenção está relacionada podem ser preparados para administração por qualquer via consistente com as suas propriedades farmaco-cinéticas. As composições administráveis por via oral podem 32 ΡΕ1611112 estar na forma de comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pastilhas, preparações liquidas ou em gel, tais como soluções ou suspensões orais, tópicas ou parentéricas estéreis. Os comprimidos e cápsulas para administração oral podem estar na forma de apresentação de unidade de dosagem, e podem conter excipientes convencionais tais como agentes ligantes, por exemplo xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto ou polivinilpirrolidona; agentes de enchimento, por exemplo lactose, açúcar, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina; lubrificante para fazer comprimidos, por exemplo estearato de magnésio, talco, polietilenoglicol ou silica; desintegrantes por exemplo amido de batata, ou agentes molhantes aceitáveis tais como sulfato de laurilo e sódio. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na prática farmacêutica normal. As preparações líquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas na forma de um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Tais preparações líquidas podem conter aditivos convencionais tais como agentes de suspensão, por exemplo sorbitol, xarope, metilcelulose, xarope de glucose, gelatina, gorduras comestíveis hidrogenadas, agentes emulsio-nantes, por exemplo lecitina, mono-oleato de sorbitano ou acácia; veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis) , por exemplo óleo de amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres oleosos tais como glicerina, propileno-glicol ou álcool etílico; conservantes, por exemplo p- 33 ΡΕ1611112 hidroxibenzoato de metilo ou propilo ou ácido sórbico, e se desejado agentes aromatizantes ou corantes convencionais.
Para aplicação tópica na pele, o fármaco pode ser feito num creme, loção ou pomada. As formulações de creme ou pomada que podem ser utilizadas para o fármaco são formulações convencionais bem conhecidas na técnica, por exemplo conforme descrito em livros de texto padrão de produtos farmacêuticos tais como a British Pharmacopoeia. 0 ingrediente ativo também pode ser administrado parentericamente num meio estéril. Dependendo do veiculo e da concentração usada, o fármaco pode ser ou suspenso ou dissolvido no veiculo. Vantajosamente, adjuvantes, tais como um anestésico local, conservantes e agentes tampo-nantes, podem ser dissolvidos no veiculo.
Os compostos da invenção também são úteis em ensaios in vitro dependentes da inibição da atividade de HSP90, por exemplo no rastreio para as classes alternativas de inibidores de HSP90 em que o composto de teste compete com ou desloca um composto desta invenção. De acordo com isto, num ainda outro aspecto, a invenção inclui um método de inibição da atividade de HSP90, compreendendo colocar em contacto, in vitro, uma enzima de HSP90 e um composto de fórmula (A) ou (B) conforme definido e especificado acima.
Os exemplos seguintes ilustram a preparação e as atividades de compostos específicos da invenção. 34 ΡΕ1611112
Exemplos 1-4 Esquema. 1
Preparação do intermediário bromo e subsequente arilação í
Exemplo 1 4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzeno-1,3— diol
Passo 1 1-(2,4-Di-hidroxi-fenil)-2-(4-metoxi-fenil)--etanona i
35 ΡΕ1611112
Resorcinol (4,4 g, 40 mmol) e ácido 4-metoxi-fenilacético (6,6 g, 40 mmol) em eterato de trifluoreto de boro (25 mL, 0,2 mol) foram aquecidos, sob uma atmosfera de azoto, a 90 °C durante 90 min para dar uma solução vermelha clara. A solução foi deixada arrefecer e vertida em acetato de sódio aquoso (200 mL, 10%) e a mistura foi agitada para dar um precipitado amarelo pálido. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com água (200 mL) . Os sólidos foram retomados em acetato de etilo (250 mL) e lavados com água (200 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada, até um semissólido amarelo. A trituração com éter dietilico (100 mL) deu a 1-(2,4-di-hidroxi-fenil)-2-(4-metoxi-fenil)-etanona na forma dum sólido laranja claro, seco sob vácuo, (2,2 g) . LC: tempo de retenção 2,39 minutos; [M+H]+ 259,2 (tempo de jato 3,75 min); RMN (DMSO-d6) 7,95 (d, J 8,9 Hz, ArH) , 7,2 (d, J 8,7 Hz, 2ArH) , 6,9 (d, J 8,7 Hz, 2ArH) , 6,4 (d, J 9,9 ArH) , 6,25 (s, ArH) , 4,2 (s, 2CH2) , 3,75 (s, 30CH3) .
Passo 2 7-Hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-cromen-4-ona
I
Anidrido acético (3 mL, 30 mmol) foi adicionado a uma suspensão de carbonato de potássio (4,0 g, 29 mmol) e 1-(2,4-di-hidroxi-fenil)-2-(4-metoxifenil)-etanona (1,95 g, 7,5 mmol) em DMF (10 mL) , e a suspensão resultante foi 36 ΡΕ1611112 aquecida a 115 °C durante ~90 min. A mistura foi deixada arrefecer e foi vertida em água (200 mL) , para dar um precipitado esbranquiçado. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com água (100 mL) e éter dietilico (2x40 mL), para dar 7-hidroxi-3-(4-metoxi-fenil) -2-metil--cromen-4-ona na forma dum pó esbranquiçado, seco sob vácuo, (1,65 g) . LC: tempo de retenção de 2,2 6 minutos; [M+H]+ 283,2 (tempo de jato 3,75 min); RMN (DMSO-d6) 7,8 (d, J 8,7 Hz, Ar H) 7,2 (d, J 8,8 Hz, 2Ar£f) 7,0 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) 6,9 (d, J 8,7 ArH) 6, 8 (s, ArH) 3, 8 (s, 30CH3) 2,2 (s, 3CH3) .
Passo 3 4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]- -benzeno-1,3-diol \
Hidrocloreto de hidroxilamina (0,35 g, 5 mmol) foi adicionado a uma suspensão de 7-hidroxi-3-(4-metoxi--fenil)-2-metil-cromen-4-ona (0,14 g, 0,5 mmol) em piridina (3 mL) e a mistura foi aquecida sob refluxo durante ~4 h. A solução foi deixada arrefecer e vertida em água (50 mL) e extraída com éter dietilico (50 mL) . Os extractos foram lavados com água (3 x 50 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (30 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para dar uma goma castanha pálida. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica, eluindo com acetato de etilo/hexano 37 ΡΕ1611112 (1:2), para dar uma goma incolor. A trituração com hexano deu origem a 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]--benzeno-1,3-diol na forma de um pó branco, seco sob vácuo, (0,087 g) . LC: tempo de retenção de 2,20 minutos; [M+H] + 298,2 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (DMSO-de) 7,1 (d, J 8,8
Hz, 2ArH) 6,85 (d, J 8,6 Hz, ArH) 6,8 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) 6,25 (s, ArH) 6,15 (d, J 8,6 Hz, ArH) 3,65 (s, 30CH3) 2,15 (s, 3CH3) .
Exemplo 2 4-Bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]- -benzeno-1,3-diol
O-N
Tribrometo de benziltrimetilamónio (3,95 g, 10 mmol) foi adicionado em porções a uma suspensão arrefecida em gelo de 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metilisoxa-zol-5-il]-benzeno-1,3-diol (Exemplo 1) (2,95 g, 10 mmol) em diclorometano (50 mL) e a mistura foi agitada durante ~60 min, à temperatura ambiente. Acetato de etilo (300 mL) foi adicionado e a mistura foi lavada com água (3x200 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para dar um sólido castanho pálido. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna, sobre silica, eluindo com acetato de etilo/hexano (1:2), para dar 38 ΡΕ1611112 4-bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]--benzeno-1,3-diol na forma dum sólido branco, seco sob vácuo, (3,42 g) . LC: tempo de retenção de 2,38 minutos; [M+H]+ 378,2 (tempo de jato 3,75 min); RMN (acetona-dô) 7,35 (s, ArH) , 7,2 (d, J 8,8 Hz, 2AtH) , 6,9 (d, J 8,8 Hz, 2AtH) , 6,65 (s, ArH) , 3,8 (s, 30CH3) , 2,2 5 (s, 3CH3) .
Exemplo 3 5-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-bifenil-2,4— diol
Passo 1 5-(2,4-Bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi- -fenil)-3-metilisoxazol
Brometo de benzilo (0,36 mL, 3 mmol) foi adicionado a uma suspensão de 4-bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzeno-1,3-diol (Exemplo 2) (0,55 g, 1,5 mmol) e carbonato de césio (0,85 g, 2,6 mmol) em DMF (5 mL) e a mistura foi agitada durante ~18 h, à temperatura ambiente. Água (100 mL) foi adicionada e a mistura foi extraída com éter dietílico (2x30 mL) . Os extractos 39 ΡΕ1611112 combinados foram lavados com água (4x75 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para se obter uma goma castanha pálida. A trituração com hexano deu 5- (2,4-bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil) -3-metil-isoxazole na forma dum sólido esbranquiçado, seco em vácuo, (0,5 g) . LC: tempo de retenção de 3,08 minutos; [M+H]+ 558,4 (tempo de jato 3,75 min); RMN (clorofórmio-d), 7,55 (s, ArJí) 7,35-7,25 (m, 5ArJí) , 7,2 (m, 3ArH) , 6,95 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) 6, 85 (m, 2ArH) , 6,7 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) , 6, 35 (s, ArH) , 4, 95 (s, 2CH2) , 4,6 (s, 2CH2) , 3,75 (s, 30CH3) , 2, 25 (s, 3CH3)
Passo 2 5-(4,6-Bis-benziloxi-bifenil-3-il)-4-(4-metoxi- -fenil)-3-metilisoxazol
Fosfato de potássio (0,1 g, 0,5 mmol) foi adicionado a uma solução de 5-(2,4-bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazole (0,14 g, 0,25 mmol) e ácido fenil-borónico (0,095 g, 0,75 mmol) em 1,4-dioxano (4 mL) sob atmosfera de azoto. Tetraquis(trifenilfosfi-na)paládio (0) (cat.) foi adicionado e a suspensão foi aquecida a 80 °C durante ~18 h. A suspensão foi deixada arrefecer e acetato de etilo (25 mL) foi adicionado. A mistura foi lavada com água (3x25 mL) e solução aquosa 40 ΡΕ1611112 saturada de cloreto de sódio (25 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para dar uma goma castanha pálida. A trituração com hexano deu 5-(4,6-bis-benziloxibifenil-3-il)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazole na forma dum sólido esbranquiçado, seco em vácuo. LC: tempo de retenção de 3,08 minutos; [M+H]+ 554,4 (tempo de jato 3,75 min); RMN (clorofórmio-d), 7,4 (m, 2ArH), 7,35 (s, ArH) , 7,3-7,1 (m, llArJI) , 6,95 (d, J8,8 Hz, 2Arfl) , 6,9 (m, 2ArJΪ) , 6,7 (d, J8,8 Hz, 2ArJÍ) , 6,45 (s, Arfl) , 4,9 (s, 2CH2) , 4,7 (s, 2CH2) , 3,75 (s, 30CH3) , 2,25 (s, 3CH3) .
Passo 3 7-Hidroxi-3-(4-metoxi-fenil)-2-metil-6-fenil--cromen-4-ona
I
o
Formato de amónio (3,2 g, 50 mmol) foi adicionado a uma solução de 5-(4,6-bis-benziloxi-bifenil-3-il)-4-(4--metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol (1,4 g, 2,5 mmol) em metanol (20 mL)/acetato de etilo (10 mL) sob atmosfera de azoto. Paládio sobre carbono (10%) (cat.) foi adicionado e a suspensão foi aquecida a 60 °C durante ~18 h. A suspensão foi deixada arrefecer e acetato de etilo (150 mL) foi adicionado, e a suspensão foi filtrada. O filtrado foi lavado com água (3x100 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para dar uma goma castanha pálida. A trituração com metanol deu 7-hidroxi-3-(4-metoxi- 41 ΡΕ1611112 fenil)-2-metil-6-fenil-cromen-4-one na forma dum sólido esbranquiçado, seco em vácuo. LC: tempo de retenção de 2,58 minutos; [M+H]+ 359,2 (tempo de jato 3,75 min); RMN (DMSO- d6) 7, 9 (s, ArH) , 7,5-7,3 (m, 5Arlí) , 7,2 5 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) , 7,1 (s, ArH) , 7,05 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) , 3,8 5 (s, 30CH3) , 2,2 (s, 3CH3) .
Passo 4 5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]- -bifenil-2,4-diol
O-n
Hidrocloreto de hidroxilamina (75 mg, 1,08 mmol) foi adicionado a uma suspensão de 7-hidroxi-3-(4-metoxi--fenil)-2-metil-6-fenil-cromen-4-ona (105 mg, 0,29 mmol) em piridina (2 mL) e a mistura foi aquecida sob refluxo durante ~6 h, para dar uma solução amarela pálida. A solução foi deixada arrefecer e água (20 mL) foi adicionada. A mistura foi extraída com éter dietilico (2x10 mL). Os extractos combinados foram lavados com água (2x20 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (10 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada. Os produtos crus foram purificados por cromatografia em coluna de silica, eluindo com acetato de etilo/hexano (1:1), para dar o composto mencionado em titulo na forma dum pó esbranquiçado (80 mg). LC: tempo de retenção de 2,56 minutos; [M+H]+ 374,3 (tempo de jato 42 ΡΕ1611112
3,75 min) ; RMN (acetona-d6) 7,5-7,3 (m, 5ArH) , 7,2 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) , 7,0 (d, J 8,8 Hz, 2ArJÍ) , 6,9 (d, J 8,6 Hz, ArH) , 6,35 (s, Arfl) , 6,1 (d, J 8,7 Hz, ArH) , 3,85 (s, 30Cff3), 2,25 (s, 3CH3) .
Exemplo 4 4-Cloro-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]- -benzeno-1,3-diol
OH 0-N
Hidrocloreto de hidroxilamina (0,7 g, 10 mmol) foi adicionado a uma suspensão de 6-cloro-7-hidroxi-3- (4--metoxi-fenil)-2-metil-cromen-4-ona [preparado de modo análogo ao do Exemplo 1, Passo 2] (0,32 g, 1,0 mmol) em
piridina (4 mL) e a mistura foi aguecida sob refluxo durante ~6 h, para dar uma solução amarela pálida. A solução foi deixada arrefecer e água (20 mL) foi adicionada. A mistura foi extraida com éter dietilico (2x10 mL). Os extractos combinados foram lavados com água (2x20 mL) e solução aguosa saturada de cloreto de sódio (10 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada. Os produtos crus foram purificados por cromatografia em coluna de silica, eluindo-se com acetato de etilo/hexano (1:1), para dar 4-cloro-6-[4-(4-metoxi-fenil) -3-metil-isoxazol-5-il]-benzeno-1,3-diol na forma de um pó esbranquiçado (0.103 g) . LC: tempo de retenção de 43 ΡΕ1611112 2,37 minutos; [M+H]+ 332,2 (tempo de jato 3,75 min); RMN (acetona-d6) 7,2 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) , 7,15 (s, ArH) , 6,9 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) , 6,6 (s, ArH) , 3,85 (s, 30CH3) , 2,25 (s, 3CH3) .
Os compostos dos Exemplos 1-4 tinham uma CI5o de HSP90 no intervalo A quando testados no ensaio de malaquite verde de ATPase descrito abaixo Nos quadros seguintes, a coluna final dá o resultado na mesma base para o composto em questão, excepto no caso do Exemplo 12b, em que a atividade citado é conforme medida no ensaio de polarização de fluorescência descrito abaixo.
Os Exemplos 5-16 foram preparados usando a reacção descrita para os Exemplos 1-4. Outros detalhes da preparação dos Exemplos 6 e 7 são análogos aos dos Exemplos 86 e 87.
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 5* HO O-v Ç) tí-o> HO /=( O. N 326 B 6 OH O-N 330 B 44 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 7 ^ W°A o ck HO r\ O, N 296 B 8 HO ,cl 0— O Õ-°' Ho r=( o. /> N 349 B 9 HO F Yx HO f=\ ο. N 286 A 10 Q-/J-S O X 303 A 11 HO ^ O— HO /=^ 0. ^ N 342 A 12 OH 0-f(j 375 B 12a Br 367 A ΡΕ1611112 45 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 12b** o °^0-8 V 323 k k k 12c§ <1 H°XjOC 1 O-N 351 A 12d§ OH ^ N X F\ 0-N F 343 A * também disponível comercialmente em Interbioscreen § disponível comercialmente em Enamina ** preparado a partir do intermediário bromo-resorcinol protegido com cianeto de cobre (I) em dimetilformamida a 150 °C *** Ensaio de Polarização de Fluorescência: Ά' = <10 μΜ; ' B ' = >10 μΜ
Exemplo 14 4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-6-fenetil- -benzeno-1,3-diol
46 ΡΕ1611112
Foi preparado a partir de ácido estirilborónico acoplamento do composto de bromo isoxazole do Exemplo 2 Passo 1, conforme descrito acima, seguido por redução e tratamento com hidroxilamina, analogamente ao Exemplo 3. LC: tempo de retenção de 2,56 minutos; [M+H]+ 402 (tempo de jato 3,75 min) .
Exemplo 15 4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-6-fenetil- -benzeno-1,3-diol
Esquema 2: Reação de Mannich ho
oh o~h
N-metilpiperazina (0,125 mL, 1,1 mmol) foi adicionada a uma suspensão de 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil--isoxazol-5-il]-benzeno-1,3-diol (0,15 g, 0,5 mmol) e para-formaldeido (0,040 g) em 1,4-dioxano (4 mL) e a mistura foi aquecida sob refluxo durante ~18 h, para dar uma solução amarela castanha. A solução foi deixada arrefecer e acetato 47 ΡΕ1611112 de etilo (25 mL) foi adicionado. A mistura foi lavada com água (3x25 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (25 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada até uma goma castanha pálida. A trituração com hexano, deu 4-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-2,6-bis-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-benzeno-1,3-diol (0,121 g) na forma dum pó castanho pálido. LC: tempo de retenção de 1,61 minutos; [M+H]+ 522,6 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (acetona-dg) 7,2 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) , 6,95 (s, ArH) , 6,8 (d, J 8,8 Hz, 2ArJÍ) , 3,85 (s, 30CH3), 3,75 (s, 2CH2) , 3,65 (s, 2CH2) , 2,9-2,0 (br s
Exemplo 16 Éster de metilo do ácido 2,4-di-hidroxi-5-[4-(4-metoxi--fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzóico / o
o. ^ N
Esquema 3: Formação de éster / / 8n0
O
8nO 48 ΡΕ1611112
Passo 1 n-Butil-litio (100 yL) foi adicionado a uma solução de 5-(2,4-bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi--fenil)-3-metil-isoxazole (154 mg, 0,28 mmol) em tetra--hidrofurano (2,5 mL) sob uma atmosfera de azoto a -78 °C. Solução agitada a -70 °C durante 30 minutos para dar uma solução cor de laranja. O ião foi extinto com cloroformato de metilo (100 yL, 3 eq) e deixado aquecer até à temperatura ambiente, durante 30 minutos. A solução foi arrefecida bruscamente com cloreto de amónio aquoso saturado (5 mL) . A mistura foi extraída com acetato de etilo (3x5 mL) . Os extractos combinados foram lavados com água (2x5 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (5 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada. Os produtos crus foram purificados por cromatografia em coluna de silica, eluindo com acetato de etilo em hexano (gradiente de 20% a 60% de acetato de etilo) para dar éster de metilo do ácido 2,4-bis-benziloxi--5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzóico (72 mg) . LC: tempo de retenção de 4,95 minutos; [M+H] + 53 6, 4 (tempo de jato 7,5 min) ; RMN (DMSO-de) 7,8 (s, ArH) , 7,55 (d, J 7, 1 Hz, 2ArH) , 7,4 (t, J 6,2 Hz, 2ArH) , 7,35 (d, J 6,1 Hz, ArH) , 7,3 (m, 3ArH) , 7,1 (m, 4ArH) , 7,0 (s, ArH) , 6,9 (d, 8,8 Hz, 2ArH) , 5,3 (s, 2CH2) , 5,1 (s, 2CH2) , 3,78 (s, OCH3) , 3,76 (s, OCH3) r 2,28 (s, CH3) .
Passo 2
Formato de amónio (172 mg, 20 eq) foi adicionado a uma solução de éster de metilo do ácido 2,4-bis-benzilo- 49 ΡΕ1611112 xi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzóico (72 mg, 0,13 mmol) em metanol (2 mL)/acetato de etilo (1 mL) sob uma atmosfera de azoto. Paládio a 10% sobre carbono (cat.) foi adicionado e a suspensão foi aquecida a 60 °C durante a noite. A solução foi deixada arrefecer.
Acetato de etilo (5 mL) foi adicionado, a solução foi lavada com água (2x5 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (5 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada. Os produtos crus foram purificados por cromatografia em coluna de silica, eluindo com acetato de etilo em hexano (gradiente de 25% a 45% de acetato de etilo) para dar éster de metilo do ácido 2,4-di--hidroxi-5-[4-(4-metoxifenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-benzóico (7,0 mg) . LC: tempo de retenção de 2,49 minutos; [M+H]+ 356, 3 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (DMSO3) δ = 10,85 (s, ArO-ff) , 7,52 (s, ArOfl) , 7,12 (d, J 8 Hz, 2ArJÍ) , 6,98 (s, ArH) r 6,91 (d, J 8 Hz, 2ArH) , 6,45 (s, ArH) , 3,78 (s, 30CH3), 3,71 (s, 30CH3) , 2,21 (s, 3CH3) .
Os compostos dos Exemplos 14-16 tinham uma CI50 de HSP90 nos intervalos Ά', 'B' e 'B', respetivamente, quando testados no ensaio de ATPase de malaquite verde descrito abaixo.
De modo semelhante, os Exemplos 17-20 foram preparados extinguindo com N-formil-piperidina, tioisocia-nato de fenilo, isocianato de 2-metoxi-fenilo e benzaldei-do, respetivamente. A reacção de desproteção final foi realizada com tricloreto de boro, conforme descrito para o Exemplo 23 (última reacção em Esquema 5). O Exemplo 21 foi 50 ΡΕ1611112 um subproduto do Passo 1, Exemplo 16. As actividades indicados são as descrito abaixo. obtidas no Ensaio de Malaquite Verde
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 Cl50 17 o" HO OH °-N 326 B 18 Q f HO~yY OH 433 B 19 Y? r ΗΝγ° ΗΟΥη 1 OH °~N 447 A 20 | <3Me ΗΟ'ΤΐΙ lT OH °~N 418 A 21 OMe OH °~N 354 A ΡΕ1611112 51
Exemplo 22 4-Benzil-6-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]- -benzeno-1,3-diol
OH O-k
Esquema 4: Síntese de Benzil-resorcinol
Éster de 2-benzoil-5-etoxicarboniloxi-fenilo éster de etilo do ácido carbónico o Λ
J
O X o o
Trietilamina (10 mL, 72,2 iranol) foi adicionada a uma solução de 2,4-di-hidroxibenzofenona (1) (5,4 g, 23,3 mmol) em THF (50 mL) e a solução foi arrefecida a 0 °C. Cloroformato de etilo (6,9 mL, 72,2mmol) foi adicionado lentamente à suspensão e esta foi agitada durante ~30 minutos a 0 °C, e durante ~3 horas à temperatura ambiente. Água (150 mL) foi adicionada e a mistura foi extraida com éter dietilico (150 mL). Os extratos foram lavados com água (2x150 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio 52 ΡΕ1611112 (100 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para dar 4-benzil-benzeno-l,3-diol, na forma duma goma verde-clara, que solidificou quando em repouso, (8,2 g) . LC: tempo de retenção de 2,73 minutos; [M+H] + 359,2 (tempo de jato 3,75 min) δ (clorofórmio-d) 7,7 (m, 2ArH) , 7,5 (m, 2ArH) , 7,35 (m, 2ArB) , 7,15 (m 2ArJí) , 4,25 (q, J 7, 1 Hz, 2CH2) , 4,05 (q# J 7,1 Hz, 2CH2) 1,35 (t, J 7,1 Hz, 3CH3) , 1,15 (t, J7,l Hz, 3CH3) . 4-Benzil-benzeno-l,3-diol
Uma solução de tetra-hidretoborato de sódio (1,85 g, 49 mmol) em água (30 mL) foi adicionada a uma solução arrefecida em gelo de éster de 2-benzoil-5--etoxicarboniloxi-fenilo éster de etilo do ácido carbónico (3, 6 g, 10 mmol) em THF (30 mL) . A mistura foi agitada durante ~60 min a 0 °C e durante ~60 h à temperatura ambiente, para dar uma suspensão vermelha pálida. Água (150 mL) foi adicionada e a mistura foi extraída com éter dietílico (150 mL) . Os extratos foram lavados com água (2x100 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para dar uma goma amarela pálida. A goma foi recebida em hidróxido de sódio aquoso (20 mL, 10%) e a solução foi aquecida sob refluxo, durante ~60 min. A solução foi deixada a arrefecer e acidificada com ácido clorídrico (5 mL, 37%) . A mistura foi extraída com éter 53 ΡΕ1611112 dietílico (50 mL). Os extratos foram lavados com água (3x40 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (30 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada para dar 4-benzilbenzeno-l, 3-diol, na forma duma goma vermelha escura, (2,1 g) . LC: tempo de retenção de 2,28 minutos; [M+H]+ nenhum ião (tempo de jato 3,75 min) δ (clorofórmio-d) , 7,2 (m, 3ArH) , 7,1 (m, 2ArH) , 6,85 (d, J 8,1 Hz, ArH) , 6,3 (d, J 8,1 Hz, ArH) , 6,2 (s,
ArH) , 3,85 (s, 2CH2) . O 4-benzil-benzeno-1,3-diol foi utilizado como material de partida numa sintese do Esquema 1 para proporcionar o Exemplo 23.
Exemplo 23 Ácido 3-{2,4-di-hidroxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil--isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico
Esquema. 5: Reação de Heck e Desproteção de Tricloreto de Boro
54 ΡΕ1611112
Passo 1 Éster de terc-butilo do ácido 3-{2,4-bis-ben-ziloxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5--il]-fenil}-acrílico
Di-isopropiletilamina (1 mL, 5,7 mmol) foi adicionada a uma suspensão de 5-(2,4-bis-benziloxi-5-bromo--fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazole (0,56 g, 1,0 mmol) em acrilato de terc-butilo (1 mL, 6,8 mmol) e 1-butanol (8 mL) sob uma atmosfera de azoto. Dicloro-bis-(tri-o-tolilfosfina)paládio (II) (cat.) foi adicionado e a suspensão foi aquecida a 140 °C durante ~18 h, para dar uma solução amarela/verde. A solução foi deixada arrefecer e foi concentrada até uma goma amarela/verde. 0 produto cru foi purificado por cromatografia em coluna de silica, eluindo com acetato de etilo/hexano (1:9), para dar éster de terc-butilo do ácido 3-{2,4-bis-benziloxi-5-[4-(4- -metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico na forma duma goma amarela/verde (315 mg). 0 material de partida (170 mg) foi recuperado. LC: tempo de retenção de 3,23 minutos; [M+H]+ 604,6 (tempo de jato 3,75 min); RMN (clorofórmio-d) , 7,85 (d, J 16,1 Hz, CH) , 7,6 (s, ArH) 7,4-7,25 (m, 8ArH) 7,05 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) 6,9 (m, 2ArH) 6,8 (d, J 8,8 Hz, 2ArH) 6,5 (s, ArH) 6,35 (d, J 16,1 Hz, CH) 55 ΡΕ1611112 5.05 (s, 2C H2) 4,75 (s, 2C H2) 3,75 (s, 30C H3) 2,25 (s, 3CH3) 1.5 (s, 9CCH3) .
Passo 2 Ácido 3-(2,4-di-hidroxi-5-[4-(4-metoxi-fenil)-3--metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico
Solução de tricloreto de boro (2 mL, 1,0 M em diclorometano) foi adicionada lentamente a uma solução de éster de terc-butilo do ácido 3-{2,4-bis-benziloxi-5-[4-(4--metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrilico (50 mg, 0,09 mmol) em diclorometano (1 mL), a -78 °C (gelo seco/acetona) sob uma atmosfera de azoto. A solução resultante foi agitada durante ~1 h a -78 °C, e durante ~90 min à temperatura ambiente. A solução foi arrefecida até -78 °C e foi adicionada água (2 mL) e a mistura foi agitada durante ~30 min à temperatura ambiente. Acetato de etilo (30 mL) foi adicionado e a solução foi lavada com água (2x5 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (10 mL). A solução foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e concentrada até uma goma amarela pálida. A trituração com hexano deu um sólido amarelo, os sólidos foram removidos por filtração e lavados com hexano, secos em vácuo, para dar o ácido 3-{2,4-di-hidroxi-5-[4-(4--metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-fenil}-acrílico 56 ΡΕ1611112 (10 mg) na forma dum pó amarelo. LC: tempo de retenção de 2,08 minutos; [M+H]+ 368,3 (tempo de jato 3,75 min); RMN (acetona-d6) 7,85 (d, J 16,1 Hz, CH) , 7,5 (s, ArH) , 7,25 (d, J 8,8Hz, 2 Ar tf) , 6,95 (d, J 8,8 Hz, 2Arff) , 6,6 (s, Arff), 6,35 (d, J 16,1 Hz, CH) , 3,8 (s, 30Cff3) , 2,25 (s, 3CJT3) .
Exemplo 24 4-[4-(4-Metoxi-fenil)-3-metil-isoxazol-5-il]-6-estirilbenzeno-1,3-diol
De modo semelhante, foi preparado este composto por desproteção de tricloreto de boro de 5-(2,4-bis-benzi-loxi-5-estiril-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazole (composto preparado a partir de ácido estiril-borónico acoplando o intermediário bromo-isoxazole, Exemplo 3)).
LC: tempo de retenção de 2,08 minutos; [M+H] 368,3 (tempo de jato 3,75 min).
Os compostos dos Exemplos 22-24 tinham uma CI50 de HSP90 no intervalo ' A', 'B' e 'C', respetivamente, quando testados no ensaio de ATPase de verde de malaquite descrito abaixo. ΡΕ1611112 57
Esquema 6: Síntese de 5-Carboxamido-isoxazoles 80.
ACOM OH o NO SFjOsíj
Sa8j-
KjCOj QH O CHjCN
a BnO
«xalato _ _ tiestiip Ha/EiOH 08η O
oet 0&> O OH
HjNOH.HCÍ βηΟ &0h
S(NH* Bt1°
BiOHimOH Ύ 'γ^Χ tf AcOH ÕBf* O-jJ oet Οβη o-n NHSt
&tt 8nO
OSn 0-8 MHE<
NaHC-Oj
MeOCaH4S(OH),
Exemplo 25
Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxifenil)-4-(4--metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Passo 1 1-(5-Cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-etanona ci
oh o Ácido acético (17,5 mL) foi adicionado gota a gota a uma suspensão de 4-clororresorcinol (42,5 g, 0,293 mmol) em eterato de trifluoreto de boro (200 mL) sob 58 ΡΕ1611112 uma atmosfera de azoto. A mistura de reacção foi aquecida a 90 °C durante 3,5 horas e em seguida deixada arrefecer até a temperatura ambiente. Um sólido formou-se após cerca de 1 hora de arrefecimento. A mistura foi vertida em 700 mL de uma solução aquosa a 10% m/v de acetato de sódio. Esta mistura foi agitada vigorosamente durante 2,5 h. O sólido castanho claro que se formou foi filtrado, lavado com água e seco ao ar durante a noite para se produzir 1-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-etanona (31,6 g, 58%). LCMS: [MH] + 185,
Passo 2 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-etanona ci .
OBn O
Brometo de benzilo (30 mL) foi adicionado a uma mistura de 1-(5-cloro-2,4-di-hidroxifenil)-etanona (20 g, 0,107 mol) e carbonato de potássio (37 g, 2,5 eq) em acetonitrilo (350 mL) . A mistura foi aquecida em refluxo durante 6 horas e depois deixou-se arrefecer e agitou-se durante a noite. A mistura foi filtrada e os sólidos foram lavados com diclorometano (3x100 mL). Os extratos orgânicos combinados foram evaporados em vácuo para deixar um sólido amarelo pálido que foi triturado com uma mistura de hexano (350 mL)/acetato de etilo (15 mL) e filtrado para dar um sólido esbranquiçado, l-(2,4-bis- benziloxi-5-cloro-fenil)--etanona (35,4 g, 90%). 1H-RMN (400 MHz) consistente com a estrutura. 59 ΡΕ1611112
Passo 3 Éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5--clorofenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enóico
Metal sódio (1,35 g, 0,058 mol) foi adicionado em pequenas porções ao longo de um período de 20 minutos a etanol anidro agitado sob uma atmosfera de azoto. A mistura de reacção foi em seguida agitada durante mais 10 minutos até todo o sódio ter reagido para dar uma solução homogénea. 1- (2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-etanona (10,0 g, 0,027 mol) foi adicionada em porções ao longo de 2-3 minutos, e a suspensão resultante foi agitada durante 5 minutos antes da adição de oxalato de dietilo (6 mL, 0,043 mol), o que originou um espesso precipitado amarelo. A mistura reacional foi aquecida até ao refluxo (dando uma solução castanha homogénea) durante 4 horas, em seguida deixada arrefecer até à temperatura ambiente e ácido acético (6 mL) foi adicionado. O sólido resultante que se formou foi triturado, filtrado, lavado com etanol e seco para dar um sólido amarelo (12,0 g, 95%). 1H-RMN (400 MHz, CDC13) δ 1,2 (t, 3H) , 4,19 (q, 2H) , 5,05 (s, 2H) , 5,10 (s, 2H), 6,50 (s, 1H), 7,22-7,41 (m, 10H), 7,97 (s, 1H).
Passo 4 Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--clorofenil)-isoxazol-3-carboxílico 60 ΡΕ1611112
Hidrocloreto de hidroxilamina (0,89 g; 12,8 mmol) foi adicionado a uma suspensão de éster de etilo do ácido 4- (2,4-bis-benziloxi-5-clorofenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2--enóico (5,00 g; 10,7 mmol) em etanol absoluto (100 mL). A mistura reacional foi aquecida em refluxo durante quatro horas e em seguida deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente (durante este tempo a mistura continua a ser heterogénea, mas torna-se de cor amarela mais clara). A mistura foi filtrada e o sólido filtrado foi lavado com água (2x20 mL) , etanol (2x20 mL) e seca em vácuo a 45 °C. Isto produz o éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi--5-cloro-fenil-sulfónico)-isoxazol-3-carboxílico, na forma dum sólido amarelo fofo, 4,49 g (91%). LCMS: [M+H]+ 466, 37C1 ; 35Ci: 1. 1H-RMN (400 MHz, CDC13) δ 1, 42 (t, 3H) , (q, 2H) , 5,13 (s, 2H) , 5, 14 (s, 2H) , 6, 62 (s, 1H) , (s, 1H), 7 ,35-7,43 (m, 10H), 8 O O (s, 1H) .
Passo 5 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--clorofenil)-isoxazol-3-carboxílico :i
Qu 61 ΡΕ1611112
Uma solução de etilamina em metanol (2,0 M, 40 mL, 80 mmol) foi adicionada a uma suspensão agitada de éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-clorofenil)--isoxazol-3-carboxílico (4,40 g; 9,51 mmol) em etanol absoluto (50 mL) . A mistura reacional foi aquecida a 80 °C (temperatura do banho de óleo) durante cinco horas. A mistura reacional foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e deixada em repouso durante a noite. Formou-se um produto sólido incolor e a mistura de reacção foi novamente arrefecida num banho de gelo-água, filtrada e lavada com etanol frio (2x20 mL). 0 produto incolor foi seco em vácuo para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-clorofenil)-isoxazol-3-carboxilico 3,42 g (78%). LCMS : [M+H]+ 465, 463 (37C1; 35C1) ; 1H-RMN (400 MHz, CDC13) δ 1,25 (t, 3H) , 3,48 (m, 2H) , 5,10 (s, 2H) , 5,2 (s, 2H) , 6,59 (s, 1H), 6,83 (t largo, 1H), 7,08 (s, 1H), 7,30-7,41 (m, 10H), 7,97 (s, 1H) .
Passo 6 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--clorofenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxilico
Uma solução de bromo em ácido acético (0,6 M; 7,2 mL; 4,32 mmol) foi adicionada a uma suspensão agitada de etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-clorofenil)-4- 62 ΡΕ1611112 -bromoisoxazole-3-carboxílico (2,00 g; 4,32 mmol) e acetato de sódio (0,708 g, 8,64 mmol) em ácido acético (30 mL) à temperatura ambiente. A mistura foi aquecida a 80 °C e torna-se homogénea dentro de 5-10 minutos, para produzir uma solução vermelha escura. Depois de se aquecer durante 2,5 horas, a solução ficou de cor amarela. A análise por TLC mostrou material de partida e produto presentes. Um adicional de 2,0 mL (1,2 mmol) da solução de bromo em ácido acético foi adicionado ao longo das duas horas seguintes. A mistura reacional foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e o ácido acético foi removido em vácuo para se obter um residuo sólido, o qual foi repartido entre éter (200 mL) e água (200 mL). As fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (3x100 mL), solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2x100 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (1x200 mL) . A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e os solventes filtrados foram removidos em vácuo para produzirem um óleo amarelo que foi purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica, eluindo com 1-20% de acetato de etilo em hexano. Isto proporciona o produto na forma dum sólido incolor, 1,2 g (52%). LCMS: [M+H]+ 543, 541 (81Br; 79Br) ; 1H-RMN (400 MHz, CDC13) δ 1,26 (t, 1H) , 3,50 (m, 2H) , 5,01 (s, 2H) , 5,12 (s, 2H) , 6,62 (s, 1H) , 6,74 (t largo, 1H) , 2,28-7,41 (m, 10H), 7,53 (s, 1H).
Passo 7 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazole-3-carboxílico 63 ΡΕ1611112
A uma mistura de ácido 4-metoxifenilborónico (0,178 g, 1,17 mmol) e etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benzi-loxi-5-clorofenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico (0,507 g, 0,94 mmol) foi adicionado hidrogenocarbonato de sódio (237 mg, 2,82 mmol) seguido de DMF (5 mL) e água (1,0 mL). A mistura foi desgaseifiçada por evacuação e lavagem com azoto (três vezes), seguido de borbulhamento de azoto gasoso através da mistura durante cinco minutos. Dicloro--bis(trifenilfosfina)paládio (II) (66 mg, 0,094 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi aquecida sob uma atmosfera de azoto a 90 °C durante duas horas (mistura de reacção torna-se de cor castanha escura) . Outros 10 mg de dicloro-bis(trifenilfosfina)paládio (II) foram adicionados e a mistura de reacção foi aquecida a 90 °C durante 15 horas e em seguida deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A maioria dos solventes foram removidos em vácuo e o resíduo foi repartido entre acetato de etilo (50 mL) e água (50 mL). Esta mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite para remover resíduos de paládio e, em seguida, as fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (2x30 mL), solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL) e em seguida seca sobre sulfato de sódio. A mistura foi filtrada e os solventes do filtrado foram removidos em vácuo para se obter um óleo amarelo 64 ΡΕ1611112 (598 mg) . 0 produto de reacção cru foi purificado por adsorção em gel de silica seguido por cromatografia "flash" sobre gel de silica (20 g IST), eluindo com um gradiente de solvente de 1 a 20% de acetato de etilo em hexano. Isto produz etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-clorofe-nil)-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma dum sólido incolor (0,223 g, 40%). LCMS: [M+H]+ 571, 569 (37C1; 35C1) . 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 1,21 (t, 3H) , 3,44 (m, 2H) , 3.79 (s, 3H) , 4,73 (s, 2H) , 6,45 (s, 1H) , 6,65 (t, 1H) , 6.80 (d, 2H) , 7,14-7,44 (m, 8H) , 6,95 (m, 2H) .
Passo 8 Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxife-nil)-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico OMe
A uma solução arrefecida em banho de gelo de etilamida do ácido 5- (2,4-bis-benziloxi-5-clorofenil)-4-(4--metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (0,213 mg, 0,374 mmol) em diclorometano (5 mL) sob uma atmosfera de azoto foi adicionada uma solução 1,0 M de tricloreto de boro em diclorometano (1,12 mL; 1,12 mmol). A mistura de reacção foi agitada a 0 °C durante 15 minutos e depois à temperatura ambiente durante 35 minutos. A mistura reacional foi rearrefecida a 0 °C e extinta por adição de uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio (5 mL) . Depois de se agitar durante 5 minutos, o diclorometano foi removido em vácuo e o resíduo foi repartido 65 ΡΕ1611112 entre acetato de etilo (30 mL) e água (30 mL) . As fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (30 mL), solução saturada aquosa de cloreto de sódio (30 mL) e em seguida seca sobre sulfato de sódio. A mistura foi filtrada e os solventes do filtrado foram removidos em vácuo para darem um sólido incolor semelhante a espuma o qual foi purificado por adsorção em gel de silica seguido por cromatografia "flash" sobre gel de silica (10 g IST) , eluindo com acetato de etilo 50% em hexano. Isto proporciona etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxifenil)-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma dum sólido incolor (0,097 g, 67%). LCMS: [M+H]+ 391, 389 (37C1"; 35C1) ; 1H-RMN (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,08 (t, 3H) , 3,22 (m, 2H) , 3,73 (s, 3H) , 6,59 (s, 1H) , 6,87 (d, 1H) , 7,13-7,17 (m, 3H) , 8,88 (br t, 1H) , 10,09 (s, 1H) , 10,62 (s, 1H) . O Exemplo 25 tinha atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo.
Do mesmo modo, o Exemplo 26 foi preparado por acoplamento do éster boronato de piperazinofenilo protegido por 4-Boc, como acima. Este éster boronato foi feito a partir de 1-(4-bromofenil)-piperazina por proteção com boc seguida pela formação do éster de boronato por acoplamento catalisado por Pd com cloreto de bis(tetrametilpinacolato) de diboro. O Exemplo 27 foi feito de forma semelhante. O Exemplo 27a foi feito por desproteção da etilamida do ácido 5- (2,4-bis-benziloxi-5-clorofenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico: 66 ΡΕ1611112
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 26 O 443 A 27 F OyL JL /\ i t x O O-N 377 A 27a Cl ho^L d OH O-N H 362 A * Ensaio de Polarização de Fluorescência
Esquema 7: Preparação do Intermediário 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-
-FENIL) -4-IODO-3-METIL-ISOXAZOL 8*0
açstato ÍÍÔ ôtíÍG £ StHÍtO
ÍO
OBr* O
AcQH água
67 ΡΕ1611112
Exemplo 28 4-Cloro-6-[3-metil-4-(3-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-5-il]-benzeno-1,3-diol
Passo 1 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-3-hidroxi- -but-2-en-l-ona A uma solução de cetona (15 g) em EtOAc (200 mL) foi adicionado sódio metálico (3,0 g) em pequenos pedaços. A suspensão foi agitada à temperatura ambiente durante 15 min, em seguida, aquecida em refluxo durante a noite. A reacção foi extinta com ácido acético, e o precipitado amarelo filtrado. Este foi triturado em hexanos para dar cristais amarelos brilhantes. RMN indicou que isto era o produto desejado - a maioria em forma enol - pequeno traço da forma ceto.
Passo 2 5-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-3-metil— isoxazol A dicetona (4,0 g) foi suspensa em EtOH aq° 80%. Hidrocloreto de hidroxilamina (3,4 g) e acetato de sódio (4,0 g) foram adicionados e o pH foi ajustado a 8/9 com NaOH 2 Μ. A solução foi refluxada durante 24 h (difícil de monitorizar por TLC devido a valores de Rf muito 68 ΡΕ1611112 semelhantes). Após este tempo, a solução foi acidificada até pH 5 com HC1 1 M e vertida em água. 0 precipitado branco foi filtrado, lavado com água e triturado com hexano para dar um sólido branco.
Notas: 0 composto também pode ser lavado com éter, se necessário, para remover impurezas vestigiais, mas normalmente não é necessário. A RMN indicou ser este o produto pretendido.
Passo 3 5-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-iodo-3- -metil-isoxazol
Isoxazole (2 g) foi colocado numa mistura de ácido acético (24 mL) e água (30 mL) . Monocloreto de iodo (excesso de 2 g) foi adicionado e a solução foi aquecida a 80 °C durante 2-3 h. Após arrefecimento à temperatura ambiente, Na2SC>3 (sulfito de sódio) 10% em água foi adicionado (50 mL). Um sólido/óleo laranja viscoso foi separado a partir da mistura e lavado com água. Em seguida, foi dissolvido em acetona e filtrado. A remoção da acetona sob vácuo deu um óleo pegajoso cor de laranja que solidificou num sólido laranja durante a noite. RMN e LCMS indicaram que este era o produto desejado.
Passo 4 3-[5-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-3-metil- -isoxazol-4-il]-benzaldeido
OBn O-N 69 ΡΕ1611112 5-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-iodo-3-me-til-isoxazole (200 mg, 0,38 mmol) e ácido 3-formilbenzeno--borónico (85 mg, 1,5 eq) foram dissolvidos em DMF (12 mL) antes de solução 1 M de hidrogenocarbonato de sódio (1,1 mL, 3,0 eq) e Pd(Ph3P)2Cl2 (21 mg, 0,08 eq.) serem adicionados, com agitação. A mistura de reacção foi transferida para três tubos de micro-ondas que foram selados e as misturas dentro desgaseifiçado antes de ser irradiada com uma potência inicial de 200 W a uma temperatura de 150 °C durante 15 minutos num aparelho de micro-ondas CEM. Depois de se arrefecer, as misturas de reacção foram combinadas e repartidas entre acetato de etilo (10 mL) e água (10 mL) . A camada aquosa foi separada e extraida de novo com acetato de etilo (10 mL) . As fases orgânicas foram em seguida combinadas, lavadas com água (2x20 mL) , água salgada (20 mL) , secas sobre Na2S04 antes de serem condensadas em vácuo e purificadas por cromato-grafia "flash" sobre gel de silica, eluindo com acetato de etilo 25% em hexano. LCMS tR= 9,06; MS m/z 510,4; [M+H]+.
Passo 5 4-{3-[5-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-3- metil-isoxazol-4-il]-benzil}-morfolina
3- [5- (2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-3-metil- 70 ΡΕ1611112 -isoxazol-4-il]-benzaldeído (25 mg, 0,05 mmol) e morfolina (0,3 mL) foram misturados com DCE (0,5 mL) num tubo de micro-ondas. Triacetoxi-hidretoborato de sódio (15 mg; 1,4 eq) foi adicionado, o tubo selado e a atmosfera de azoto introduzida. Após 1 h, mais triacetoxi-hidretoborato de sódio (15 mg) foi adicionado e a reacção foi deixada em agitação durante a noite. A análise por TLC mostrou que a reacção não estava completa, por isso uma gota de ácido acético foi adicionada e a reacção foi novamente deixada em agitação durante a noite, após o que a reacção foi extinta com solução 1 M de NaHCCb (7 mL) e extraida com EtOAc (5 mL). Esta foi seca sobre MgS04 e o solvente foi removido em vácuo para proporcionar 13 mg do produto cru na forma dum pó esbranquiçado, que foi levado para o passo de desproteção.
Passo 6 4-Cloro-6-[3-metil-4-(3-morfolin-4-il-metil--fenil)-isoxazol-5-il]-benzeno-1,3-diol
4-{3 - [5 - (2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-3-me-til-isoxazol-4-il]-benzil}-morfolina foi desprotegida conforme anteriormente mostrado e o produto cru purificado por TLC preparativa eluindo com etanol 10% em diclorometano para proporcionar 0,6 mg (7% de rendimento) do produto na forma dum pó branco. LCMS tR= 5,46; MS m/z 399,3 [M-H]'. 71 ΡΕ1611112 0 Exemplo 28 tinha uma atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo.
Exemplo 29
Amida do ácido 1-{3-[5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-3--metil-isoxazol-4-il]-benzil}-piperidina-4-carboxilico
BnO
Preparado usando um procedimento semelhante para 4-cloro-6-[3-metil-4-(3-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxa-zol-5-il]-benzeno-1,3-diol, excepto que isonipecotamida substituiu a morfolina e o triacetoxi-hidretoborato de sódio (3 eq) e ácido acético (1 gota) foram adicionados inicialmente. A reacção estava completa após 18 horas e o produto cru obtido após manipulação foi levado para o passo de desproteção.
Amida do ácido 1-{3-[5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-3-metil-isoxazol-4-il]-benzil}-piperidina-4-carboxilico
OH O-N conh2 72 ΡΕ1611112
Amida do ácido 1-{3-[5-(2,4-bis-benziloxi-5-clo-ro-fenil)-3-metil-isoxazol-4-il]-benzil}-piperidina-4-car-boxílico foi desprotegida conforme anteriormente mostrado e o produto cru foi purificado por TLC preparativa eluindo com etanol 10% em diclorometano para fornecer 0,7 mg (3% de rendimento) do produto na forma dum pó branco. LCMS tR= 5,36; MS m/z 442,3 [M+H]+. O Exemplo 29 tinha uma atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo.
De um modo semelhante, foi preparado o Exemplo 30 :
08«
Exemplo 31 Esquema. 8:
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 30 o. P o, N 359 A* * Ensaio de Polarização de Fluorescência
Passo 1: Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxilico 73 ΡΕ1611112
Etilamida do ácido (2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fe-nil)-isoxazol-3-carboxílico (0,90 g, 1,94 mmol), N-iodo--succinimida (0,44 g, 1 eq) e nitrato de amónio e cério (IV) (0,53 g, 0,5 eq) foram suspensos em acetonitrilo (55 mL) , antes de aquecimento em refluxo (banho de óleo 100 °C) e então a mistura torna-se homogénea. Após 18 horas, a solução foi arrefecida e o solvente removido em vácuo para dar um óleo espesso laranja. Este foi repartido entre DCM (25 mL) e água (10 mL) , a camada orgânica foi mantida e lavada com água salgada (2x25 mL) antes de secagem sobre Na2S04. O DCM foi removido em vácuo para proporcionar 0,88 g (77% de rendimento) do produto na forma dum pó cor de cor laranj a/castanho. LCMS tR= 8,75, MS m/z 589, 1 [M+H] +.
Passo 2: 1-(3-Bromo-fenil)-4-metil-piperazina
1,3-Dibromobenzeno (0,90 mL, 7,49 mmol), N-metil-piperazina (0,28 mL, 2,50 mmol) e tolueno anidro (7 mL) foram adicionados por meio de seringa a um frasco seco 74 ΡΕ1611112 cheio de árgon. A solução foi bem misturada antes de BINAP (47 mg) e Pd2dba3 (23 mg) serem entregues e o frasco foi novamente cheio com árgon e DBU (0,93 g, 2,5 eq) adicionados via seringa. A mistura reacional foi aquecida a 60 °C antes de terc-butóxido de sódio moido recentemente ter sido adicionado numa porção para iniciar a reacção. A reacção foi deixada em agitação a 60 °C durante a noite e a análise por TLC pareceu mostrar que alguma piperazina ainda estava presente, de modo que a reacção foi aquecida a 100 °C e agitada durante outras 24 h depois do que foi repartida entre EtOAc (20 mL) e água (20 mL) . A camada aquosa foi novamente extraída com EtOAc e os extratos orgânicos combinados foram lavados com solução de HC1 1,6 M (2x10 mL). A solução ácida contendo o produto foi em seguida basificada primeiro com um volume semelhante de solução de NaOH 1 M e, em seguida, bicarbonato de sódio sólido foi cuidadosamente adicionado para tornar o pH=8,5 antes da extração com EtOAc (2x15 mL) , o qual foi lavado com água salgada, seco sobre MgS04 e evaporado até à secura para proporcionar 0,50 g (78% de rendimento) do produto puro na forma dum óleo amarelo. LCMS tR= 4,55, MS m/z 255,4/257,3 [M+H]\
Passo 3: l-Metil-4-[3-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxa-borolan-2-il)-fenil]-piperazina
75 ΡΕ1611112 A uma solução de PdCl2 (dppf) · DCM (10 mg, 0,012 mmol) em tolueno anidro (4 mL) num tubo de micro-ondas vedado cheio de árgon foi adicionado 1-(3-bromo-fenil)-4-metil-piperazina (100 mg, 0,39 mmol), Et3N (0,11 mL, 2 eq) , e 4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolano (0,09 mL, 1,5 eq). O tubo de micro-ondas foi evacuado e reenchido com árgon antes de ser irradiado num reator de micro-ondas CEM a 100 °C durante 1 h usando uma potência inicial de 200 W. A mistura de reacção foi repartida entre mais tolueno (6 mL) e água (10 mL) , a camada orgânica foi separada, lavada com água (1x10 mL), seca sobre MgSCg e em seguida evaporada em vácuo para deixar um resíduo púrpura/castanho o qual foi utilizado para o acoplamento de Suzuki sem purificação adicional. LCMS tR= 0,97, MS m/z 303,5 [M+H]+.
Passo 4 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-[3-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]--isoxazole-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico (38 mg, 0,07 mmol) e l-metil-4-[3-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenil]-piperazina (31 mg, 2 eq) foram acoplados em conjunto utilizando o método de Suzuki anteriormente descrito para 76 ΡΕ1611112 proporcionar 37 mg (83% de rendimento) do cru na forma dum óleo castanho, o qual foi levado ao passo de desproteção.
Passo 5 Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-[3-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]--isoxazole-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-[3-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-isoxazole-3--carboxílico foi desprotegido conforme anteriormente mostrado. 0 precipitado formado durante a reacção foi separado, repartido entre EtOAc e água. A camada aquosa foi mantida, basificada usando hidrogenocarbonato de sódio sólido e o produto foi extraído usando EtOAc (2x10 mL). Os produtos orgânicos combinados foram lavados com água salgada (10 mL) , secos sobre MgS04 e evaporados em vácuo para fornecer 5,2 mg (20% de rendimento) de produto na forma dum pó de cor bronzeada. LCMS tR= 5,58, MS m/z 457,3 [M+H] +. δΗ (d4-MeOH) , 7,17 (1H, m, Ar-ff) , 7,09 (1H, s, Ar-ff; 6,94 (1H, m, Ar-ff), 6,80 (1H, m, Ar-.ff) , 6,49 (1H, s, Ar-ff; 3,13 (4H, t, NCff2CH2N-CH3) , 2,69 (2H, q, CONHCff2CH3) , 2,61 (4H, t, NCH2Cff2N-CH3) , 2,37 (3H, s, NCH2CH2NCií3) , 1,19 (3H, t, CONHCff2CH3) . 77 ΡΕ1611112 0 Exemplo 31 tinha uma atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo.
Os Exemplos 32-38 no Quadro a seguir foram preparados de forma semelhante, mas com as seguintes variações: 1. Para o Exemplo 36, o intermediário dioxaborolano foi preparado como se segue:
Esquema. :
Passo 1: 1-(4-Bromo-fenil)-4-metil-piperazina
Br
O N-—' 1-(4-Bromo-fenil)-piperazina (1 g, 4,1 mmol) e carbonato de potássio (1,8 g, 3 eq) em DMF (15 mL) foram tratados com iodeto de metilo (250 pL, 1,1 eq), e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reacção foi extinta com água desionizada (10 mL) e extraída com acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com 78 ΡΕ1611112 hidrogenocarbonato de sódio para remover qualquer impureza dimetilada, seca e o solvente foi removido para dar 1- (4--bromo-fenil)-4-metil-piperazina com um rendimento de 73%. LC: tempo de retenção de 2,21 minutos; [M+H]+ 256 (tempo de j ato 3,75 min) .
Passo 2: l-Metil-4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxa-borolan-2-il)-fenil]-piperazina /
1-(4-Bromo-fenil)-4-metil-piperazina (750 mg, 3 mmol) em DMSO (15 mL) com bis(pinacolato)diborano (1,1 g, 1,5 equivalentes) e acetato de potássio (900 mg, 3 equivalentes) . A suspensão foi desgaseifiçada antes do tratamento com PdCl2(dppf) (cat.), agitada a 80 °C. Mais bis(pinacolato) diborano (1 eq) foi adicionado após 3 horas, agitou-se durante 2 horas adicionais. A suspensão foi repartida entre acetato de etilo e água. A purificação por cromatografia em coluna com gradiente de metanol 0-8% em diclorometano para dar l-metil-4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenil]-piperazina com um rendimento de 62%. LC: tempo de retenção de 1,83 minutos; [M+H]+ 303 (tempo de jato 3,75 min). 2. Para os Exemplos 37 e 38, um ácido borónico 79 ΡΕ1611112 intermediário foi utilizado em vez de um dioxaborolano, o primeiro preparado como se segue: Ácido 4-[(2-metilsulfonil)-etilaminometil]-fenil--borónico (Intermediário para o Exemplo 37)
Hidrocloreto do ácido 4-aminometil-fenil-borónico (560 mg, 3 mmol) em etanol (5 mL) foi tratado com metil--vinil-sulfona (260 pL, 1 equivalente) e trietilamina (1,2 mL, 3 equivalentes). A solução foi agitada a 100 °C durante 2 h. O etanol foi removido sob vácuo, repartido entre água e butanol para dar ácido 4-[(2-metilsulfonil)--etilaminometil]-fenil-borónico com 94% de rendimento. LC: tempo de retenção de 0,39 minutos; [M+H]+ 258 (tempo de j ato 3,75 min) . Ácido 4-[N-metil-S,S-dioxo-tiomorfolin]-fenil-borónico (Intermediário para o Exemplo 38)
HO OH 80 ΡΕ1611112
Hidrocloreto do ácido 4-aminometil-fenil-borónico (456 mg, 2,4 mmol) em etanol (8 mL) foi tratado com vinil--sulfona (244 pL, 1 equivalente) e trietilamina (2 equivalentes) , e agitou-se a solução a 100 °C durante 3 h. O etanol foi removido sob vácuo, repartido entre água e butanol para dar o produto com rendimento de 88%. LC: tempo de retenção de 1,65 minutos; [M+H]+ 270 (tempo de jato 8 min).
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 32 ci ho / Η°ζΗ° N ηΛ 409 411 A 33 HO _P1 _ 0. N O 410 412 A 34 νς o— 0 1 360 362 A 35 X o o? 409 411 A 81 ΡΕ1611112
Exemplo 39 Esquema 9:
(continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 36 õ-fyz o X 457 459 A 37 Γ'έ9- α Γη 0 ho . í-Α HO ΓΗ N ΒΛ 494 496 A 38 rNw^ o HOwf Ác HO oW3 N SA 506 508 A * Ensaio de Polarização de Fluorescência
Passo 1
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-(3-cloro-fenil)-isoxazol-3-carboxilico 82 ΡΕ1611112
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxílico (60 mg, 0,11 mmol) e ácido 3-clorobenzeno-borónico (23mg, 1,3 eq) foram acopla dos em conjunto usando o método de Suzuki anteriormente descrito para proporcionar 35 mg (55% de rendimento) do produto cru na forma dum pó castanho o qual foi levado para o passo seguinte.
Passo 2 [5-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(3-cloro- -fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-etil-amina
A uma solução de etilamida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(3-cloro-fenil)-isoxazol-3-car-boxílico (36 mg, 0,06 mmol) em THF anidro sob árgon foi adicionado complexo de borano 1 M-THF (1 mL) e a solução foi submetida a refluxo durante a noite. Após arrefecimento a solução foi vertida sobre uma coluna Isolute®SPE "flash" SCX-2 5g a qual foi rapidamente eluida com metanol (2x20 mL). O produto desejado foi em seguida recuperado por eluição com uma mistura de amoniaco a 10% em metanol 83 ΡΕ1611112 (2x10 mL) que foi evaporada em vácuo para proporcionar 23 mg (65% de rendimento) de um pó amarelo claro. LCMS (LCT) tR= 8,18; MS m/z 558,8 [M+H]+. O Exemplo 39 tinha uma atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo. O Exemplo 40 foi preparado de forma semelhante:
Exemplo 41 Esquema 10:
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 40 hoP o- HO ÁY ,n-^ o. —/ N 375 377 A * Ensaio de Polarização de Fluorescência
Passo 1 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico 84 ΡΕ1611112
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico (preparado como no Exemplo 31) (2 g, 3,4 mmol), ácido 4-formilborónico (0,612 g, 4,08 mmol), NaHCCb (10,2 mL, solução aqa 1 , 10,2 mmol), PdCl2(PPh3)2 (119 mg, 0,17 mmol) e DMF (50 mL) foram combinados. A mistura foi em seguida desgaseifiçada fazendo borbulhar N2 através dela durante 5 minutos antes de ser aquecida a 80 °C durante 1 hora. A mistura foi então evaporada em vácuo e dividida entre EtOAc (3x50 mL) e água (50 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) e evaporados em vácuo para darem um óleo cru. Este foi dissolvido em EtOAc e passado através de um tampão de SÍO2, lavando profundamente com EtOAc. O filtrado foi evaporado em vácuo e o óleo resultante foi triturado com Et20 para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1,577 g, 82%) na forma dum sólido de cor pálida. LC/MS: tR=2, 908 min; 567,3 (MH+) .
Passo 2 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol--3-carboxí1ico 85 ΡΕ1611112
Ácido acético (0,37 mL, 6,44 mmol) foi adicionado gota a gota a uma mistura de etilamida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico (730 mg, 1,29 mmol), morfolina (0,225 mL, 2,58 mmol), peneiros moleculares em pó 3A (730 mg) e MeOH (21 mL) . Isto foi deixado a agitar durante a noite sob N2. A mistura foi em seguida evaporada em vácuo e o produto cru resultante foi repartido entre CH2CI2 (3x40 mL) e solução sata de NaHC03 (40 mL). Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) e evaporados em vácuo para darem etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4--(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (810 mg) na forma dum sólido amarelo. LC/MS: TR=2,365 min; 638,4 (MH+) .
Passo 3 Etilamida do ácido 5-(5-Cloro-2,4-di-hidroxi- -fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol--3-carboxílico
BC13 (sol. 1 M em CH2C12, 3,87 mL, 3,87 mmol) foi 86 ΡΕ1611112 adicionado gota a gota a uma solução de etilamida do ácido 5- (2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilme-til-fenil)-isoxazol-3-carboxílico cru (810 mg, -1,29 mmol) em CH2CI2 (30 mL) a 0 °C. A reacção foi em seguida deixada atingir a temperatura ambiente. NaHCC>3 saturado aquoso (40 mL) foi em seguida adicionado lentamente e a mistura resultante foi concentrada em vácuo. Isto foi em seguida repartido entre EtOAc (3x50 mL) e água (50 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) e evaporados em vácuo. A cromatografia "flash", eluindo com CH2C12 - MeOH 10%/NH3 1%/CH2C12 proporcionou etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (380 mg, 64% em 2 passos) na forma duma espuma amarela. LC/MS: TR=1,751 min; 458,2 (MH+) . O Exemplo 41 tinha uma atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo.
No Quadro que se segue, os Exemplos 42-64 foram preparados por métodos análogos ao do Exemplo 41, utilizando o aldeido ou cetona apropriados.
87 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 43 r^o rH^J Λ ci JL HO /Tv 458 460 A 44 O Cl ^ ;N HO 472 474 A 45 O Cl / HO^/ 458 A 46 0 r\A rNw/ x Cl H°vy r^N Ho ^V-<0 N r\ 499 501 A 47 <pN- Cl ho^j H° X>~^ N ηΛ 471 473 A 88 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 48 ó ci ^ ? h°>j ry N Ba 471 A 49 HO _P 'n w o 444 446 A 50 HO P >^"0-^ ¢3 OH HO Γ=\ N—/ Ο. N » O 486 488 A 51 hov_p y^oH H0Í=( N—/ Ο, N » O 500 502 A 52 hof y HO /A N—/ O, J~~~S N W O 456 458 A 53 HO^P ^^^NvZ)_0H HO l=\ N—/ O. N % 0 472 474 A 89 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 54 ho F /"O HO F=\ N^/ O. N V O 442 A 55 X o s^Q-λ ^tCs ^ ° o 452 ^k k 56 ( \ <V*E rÓ~l o X 450 k k 57 N" rNJ HOIU OH O-N N"\ H 465 J^k k 58 Η "H HOT=( N—/ °.N^ 0 479 481 A 59 HO c, ^Nv HO V\ N^/ N ft O 416 418 A 90 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 60 HO ,CI QP OH O. N « O 446 448 A 61 V H HO J=\ 3^/ O, N U O 471 473 A 62 O /—N h<\F HO r=\ o 499 501 A 63 V /—N HO^' /<nJ HO V\ o- r-y N % O 517 519 A 64 HO F / O V__-/ r----P4-* HO y=( o. yy N W o 476 478 A • * Ensaio de Polarização de Fluorescência • ** preparado a partir do material de partida etil--resorcinol ΡΕ1611112 91
Os compostos por métodos análogos ao adicionais 41a-s do Exemplo 41: foram preparados
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 41a Ηθ/=\ N—/ N H O 468 A 41b ti o o X 438 p^-k * 41c ncDp' y Ho r=( o. <y—~S N w o 442 A 4 le X O Í^Cr0 O^zi" 395 A 41F p rO ΗΟ-γΛ^ q TtV^n^ OH O-N H 474 A 92 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* lg o rN-U ? η HOyk ΤΪΓνΛ OH O-N H 476 A 4 lh .ο , y Ho rK nh, °7nI^ o 428 A 41 i rO Cl J h° r\ 470 A 41 j r^o Cl ho.J μ y η^Η„ 472 A 41k ô ci _ y HOv=C Γ\ ^ V# y^NH H0 o^t N Κ“Λ 502 A ΡΕ1611112 93 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 4 lm Cl__. HOy< D Γό ÇVyvNj HO N ΗΛ 458 A 4 ln OH ci JL ho , HO οΗ° N N—v H \ 389 k k k 4 lp HO Cl /—. tt çf° N if T o 1 471 A 4 lq y—N HO^f1 N— HO V=\ fL N « ' 0 475 2^k k k k 4 lr Ho c, H° r=\ rp7 N ^ \ 0 507 2^k k k k k 41s HO? Q uaO' H0 H^ 472 A • * Ensaio de Polarização de Fluorescência • ** preparado a partir de material de partida de etil--resorcinol • *** preparados por redução do aldeído intermediário • **** preparado por alquilação do fenol intermediário . ***** preparado a partir de naftil-aldeído ΡΕ1611112 94
Exemplo 65 Esquema de Reação:
oh o
ΟΒπ O
OBo O
8o8f KjCOs MeCN
Passo 1: 1-(2,4-Bis-benziloxi-fenil)-etanona
BnO
OBn O 95 ΡΕ1611112 35 g de 2,4-di-hidroxiacetofenona (0,230 mol, 1 eq) foram dissolvidos em 500 mL de acetonitrilo. 79,5 g de carbonato de potássio (0,575 mol, 2,5 eq) e 86,6 g de brometo de benzilo (0,506 mol, 2,2 eq) foram adicionados. A mistura foi refluxada durante 64 horas, arrefecida e o acetonitrilo removido sob pressão reduzida. O resíduo foi separado entre água e acetato de etilo. 0 resíduo era principalmente resorcinol monobenzilado. O produto cru (43 g) foi em seguida dissolvido em 250 mL de DMF. Carbonato de potássio (29 g, 0,210 mol, 1,2 eq) e 25 mL de brometo de benzilo (0,210 mol, 1,2 eq) foram adicionados e a mistura foi agitada durante a noite. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi separado entre acetato de etilo e água. Após a remoção do solvente, o resíduo foi triturado com hexano para remover o brometo de benzilo em excesso. LC-MS [M+H]+ = 333; Rendimento: 51,2g (67%).
Passo 2 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-etanona
Br
OBn O 51,2 g de 1-(2,4-bis-benziloxi-fenil)-etanona (0,154 mol, 1 eq) foram dissolvidos em 250 mL de DMF. 27,42 g de N-bromossuccinimida (0,154 mol, 1 eq) em 100 mL de DMF foram adicionados gota a gota. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura reacional foi vertida sobre 700 mL de água e o precipitado separado 96 ΡΕ1611112 por filtração. 0 bolo do filtro foi enxaguado com água e o sólido incolor foi recristalizado a partir de 370 mL de acetonitrilo. LC-MS; [M+H]+=411 e 413. Rendimento: 58,15 g (92%) .
Passo 3 Éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5--bromo-fenil)-2,4-dioxo-butirico Br
OBn O O 9,75 g de sódio (0,424 mol, 3 eq) foram dissolvidos em 500 mL de etanol absoluto (1,5 horas) . 58 g de 1- (2,4-bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-etanona (0,141 mol, 1 eq) e 30,98 g de oxalato de dietilo (0,212 mol, 1,5 eq) foram adicionados e a mistura foi refluxada durante 2 h. Depois de arrefecer, a mistura foi vertida em 220 mL de HC1 2 N aquoso e o produto foi extraído com 700 mL de diclorometano. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo amarelo foi triturado com 150 mL de éter dietílico. Rendimento: 69,24 g (96%); 1H-RMN (400 MHz, CDC13) δ 1,27 (t, 3H) , 4,27 (q, 2H) , 5,13 (d, 2H) , 6,54 (s, 1H), 7,37 (m, 10H), 8,17 (s, 1H).
Passo 4 Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--bromo-fenil)-isoxazol-3-carboxílico
BnO
OBn O- 97 ΡΕ1611112
69,3 g de éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis--benziloxi-5-bromo-fenil)-2,4-dioxo-butírico (0,135 mol, 1 eq) foram dissolvidos em 750 mL de etanol. 14,11 g de hidrocloreto de hidroxilamina (0,203 mol, 1,5 eq) foram adicionados. A mistura foi refluxada durante 2,5 horas e arrefecida. Foi em seguida vertida em 1000 mL de água, o precipitado foi separado por filtração. O bolo do filtro foi lavado com 500 mL de água seguido de 75 mL de éter dietilico e secou-se. Rendimento: 67,62 g (99%). 1H-NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,39 (t, 3H) , 4,41 (q, CM 5, 11 (d 2H) , 5,15 (d, 2H) , 6,58 (s, 1H) , 6, 99 (s, 1H) , 7,35 (m 10H), 8,16 (s, 1H).
Passo 5 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-bromo--fenil)-isoxazol-3-carboxílico
Br
Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--bromo-fenil)-isoxazol-3-carboxílico foi suspenso em etanol e etilamina (2 M em metanol, 3 eq) , a suspensão amarela resultante foi aquecida ao refluxo (80 °C) sob azoto, altura em que os reagentes entraram em solução. Esta foi aquecida durante 14 horas, depois deixada a arrefecer até à temperatura ambiente. Formou-se um precipitado branco, o qual foi separado por filtração e lavado com mais etanol 98 ΡΕ1611112 antes de ser seco em vácuo. LC-MS: tempo de retenção de 2,868 minutos; [M+H]+=507 e 509 (tempo de jato 3,75 minutos).
Passo 6 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--estirilfenil)-isoxazol-3-carboxilico
A uma mistura de ácido trans-2-fenilvinilborónico (0,472 g, 3,2 mmol) e etilamida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-bromofenil)-isoxazole-3-carboxílico (1,079 g, 2,13 mmol) foi adicionado hidrogenocarbonato de sódio (536 mg, 6,39 mmol) seguido por DMF (25 mL) e água (5 mL). A mistura foi desgaseifiçada por evacuação e lavagem com azoto (três vezes), seguido de borbulhamento de azoto gasoso através da mistura durante cinco minutos. Dicloro--bis(trifenilfosfina)paládio (II) (149 mg, 0,21 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi aquecida sob uma atmosfera de azoto a 80 °C durante sete horas (mistura de reacção torna-se castanha escura ao fim de 10 minutos). A mistura reacional foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e a maioria dos solventes foram removidos em vácuo. O resíduo resultante foi repartido entre acetato de etilo (100 mL) e água (100 mL) e esta mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite para remover resíduos de 99 ΡΕ1611112
paládio. As fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (2x50 mL) , solução aquosa saturada de cloreto de sódio (100 mL) e em seguida seca sobre sulfato de sódio. A mistura foi filtrada e os solventes do filtrado foram removidos em vácuo para darem um sólido castanho (800 mg). O bolo do filtro de Celite foi lavado com diclorometano e em seguida seco sobre sulfato de sódio. A mistura foi filtrada e os solventes do filtrado foram removidos em vácuo para produzirem um sólido castanho (541 mg). Os lotes de produtos combinados foram purificados por trituração com uma mistura de acetato de etilo-hexano. Isto produz etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-estirilfenil)-isoxazol-3-carboxilico na forma dum sólido castanho claro (808 mg, 71%). LCMS: [M+H]+ 531; 1H-RMN (400 MHz, CDC1 .3) δ 1, 12 (t, 3H) , 3,37 (m, 2H), 4, 95 (s, 2H) , 5, 07 (s, 2H) , 6,46 (s, 1H) , 6,7 0 (br t, 1H), 7, 11 (s, 1H) , 7, 17 (d, 1H) , 7,23 (d, 1H), 7,32-7,44 (m, 15H) , 8,09 (s, 1H).
Passo 7 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-fenetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico
Catalisador de paládio em carvão vegetal (10%; 50 mg) foi adicionado a uma solução desgaseifiçada de 100 ΡΕ1611112 etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-estirilfenil)--isoxazol-3-carboxílico (690 mg, 1,30 mmol) em 1,4-dioxano (50 mL) sob uma atmosfera de azoto. A mistura de reacção foi hidrogenada durante um total de 4,75 h, com mais catalisador de Pd sobre carvão vegetal (50 mg) adicionado às 0,75 e 2,5 h. A mistura de reacção foi filtrada através de uma almofada de Celite, a qual foi lavada com 1,4-dioxano (20 mL) e diclorometano (20 mL) . Os solventes do filtrado combinados foram removidos em vácuo para produzirem um sólido de cor creme, o qual foi purificado por cromatografia "flash" sobre gel de silica (20 g, IST), eluindo com 10-50% de acetato de etilo em hexano. Isto produz etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-fenetil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma dum sólido amarelo pálido i (609 mg , 88%) . LCMS: [M+H] + 533; ΧΗ -NMR (400 MHz, CDC13) δ 1,26 (t, 3H), 2,86 -2, 96 (m, 4H) , 3,49 (m, 2H) , 5,03 (s, 2H) , 5,18 (s, 2H) , 6, 56 (s,, 1H), 6, 81 (t, 1H) , 7,07 (s, 1H) , 7,15-7,20 (m, 3H) , 7 ,23-7,28 (m, 2H) , 7,31- 7,42 (m, 10H) , 7,73 (s, 1H) .
Passo 8 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5- -fenetilfenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxilico
Br 101 ΡΕ1611112 N-Bromossuccinimida (207 mg, 1,16 mmol) foi adicionada a uma suspensão de etilamida do ácido 5-(2,4--bis-benziloxi-5-fenetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico (564 mg, 1,06 mmol) em acetonitrilo (20 mL). Nitrato de amónio cérico (290 mg, 0,53 mmol) foi adicionado e a mistura de reacção foi aquecida ao refluxo (produzindo uma solução cor de laranja homogénea) e agitou-se durante 30 minutos. A mistura reacional foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e o acetonitrilo foi removido sob vácuo. O residuo foi repartido entre acetato de etilo (50 mL) e água (50 mL) e as fases foram separadas. A fase orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL) e seca sobre sulfato de sódio. A mistura foi filtrada e os solventes do filtrado foram removidos em vácuo para se produzir um óleo amarelo que foi purificado por cromatografia "flash" sobre gel de silica (20 g, IST), eluindo com 10-30% de acetato de etilo em hexano. Isto proporciona etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--fenetilfenil)-4-bromoisoxazole-3-carboxílico na forma dum óleo amarelo (326 mg, 53%). LCMS: [M+H]+ 613, 611.
Passo 9 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5- -fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil) -isoxazol-3-carboxílico
102 ΡΕ1611112 A uma mistura de 4-morfolin-4-il-metil-fenil--pinacol-borano (0,215 g, 0,71 mmol) e etilamida do ácido 5- (2,4-bis-benziloxi-5-fenetilfenil)-4-bromo-isoxazol-3--carboxílico (0,347 g, 0,57 mmol) foi adicionado hidrogeno-carbonato de sódio (142 mg, 1,69 mmol) seguido por DMF (10 mL) e água (2,0 mL) . A mistura foi desgaseifiçada por evacuação e lavagem com azoto (três vezes), seguido de borbulhamento de azoto gasoso através da mistura durante cinco minutos. Dicloro-bis(trifenilfosfina)paládio (II) (40 mg, 0,057 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi aquecida sob uma atmosfera de azoto a 80 °C durante 5 horas (mistura de reacção torna-se de cor castanha escura). Outros 20 mg (0,029 mmol) de dicloro-bis(trifenilfosfina)-paládio (II) foram adicionados e a mistura de reacção foi aquecida a 80 °C durante 15 horas, em seguida deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A maioria dos solventes foi removida sob vácuo e o residuo foi repartido entre acetato de etilo (50 mL) e água (50 mL). Esta mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite para remover resíduos de paládio e, em seguida, as fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (2x50 mL) , solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL) e em seguida seca sobre sulfato de sódio. A mistura foi filtrada e os solventes do filtrado foram removidos em vácuo para se produzir um óleo castanho. O produto da reacção cru foi purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica (20 g, IST) , eluindo com um gradiente de solvente de 30 a 70% de acetato de etilo em hexano. Isto produz etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin- 103 ΡΕ1611112 4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma dum óleo amarelo (0,110 g, 27%). LCMS: [M+H]+ 708.
Passo 10 Hidrocloreto da etilamida do ácido 5-(2,4-di--hidroxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4--ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxilico
A uma solução arrefecida em banho de gelo de etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-fenetil-fenil)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico (0,109 g, 0,15 mmol) em diclorometano (4 mL) sob uma atmosfera de azoto foi adicionada uma solução 1,0 M de tricloreto de boro em diclorometano (0,45 mL; 0,45 mmol). A mistura de reacção foi agitada a 0 °C durante 20 minutos e em seguida à temperatura ambiente durante 3,5 h. A mistura de reacção foi rearrefecida a 0 °C e extinta por adição de uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio (5 mL) . Depois de se agitar durante 5 minutos, o diclorometano foi removido sob vácuo e o residuo foi repartido entre acetato de etilo (20 mL) e água (20 mL). As fases foram separadas e a fase orgânica foi lavada com água (20 mL), solução aquosa saturada de cloreto de sódio (20 mL) e em seguida seca sobre sulfato de sódio. A mistura foi filtrada e os solventes do filtrado foram removidos em vácuo para dar um óleo castanho-claro que foi purificado 104 ΡΕ1611112 por adsorção em gel de sílica, em seguida cromatografia "flash" em gel de sílica (10 g IST) , eluindo com metanol 0-5% em acetato de etilo. Isto dá origem a um óleo incolor o qual foi triturado com HC1 1,0 M em solução de éter dietílico (5 mL) para produzir hidrocloreto da etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-fenetil-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenilo)-isoxazol-3-carboxílico (0,019 g, 24%). LCMS: [M+H]+ 528; 1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,08 (t, 3H) , 2, 60 (m, 4H) , O CD CM -3, 30 (m, 6H) , 3, 67 (m, 2H) , 3,87 (m, CM 4,30 (s, 2H) , 6, 46 (s, 1H) , 6, 84 (s, 1H), 7,05-7,49 (m, 5H) , 7,40- -7, 68 (m, 4H) , 8, 90 (brs, 1H) , 9,67 (s, 1H), 9,89 (s, 1H), 10,75 (brs, 1H). O Exemplo 65 tinha uma atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo.
Os exemplos no Quadro seguinte foram preparados por métodos análogos aos do Exemplo 64, e tinham as atividades mostrados no ensaio de polarização de fluorescência, conforme descrito abaixo.
105 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 67 X 0~0"° o X 419 A 68 HO^^-L N"^\ OH O-N h 459 A 69 F Φ rO HO^y Cl OH O-N {)} \ 544 A 70 F rN^L/° ho^^L OH O-N H^\ 546 A 71 HO-JC Í^j Lij^o OH Ο-Γ N-\ 437 A 106 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 Cl50* 72 I o O Jtp OH O-N N \ 516 A 73 F ,~-n 1 V o [f] Γη'^ Im c,~ h° OH O-N N" \ 518 A 74 0 OH O-N N-"\ 500 A 75 1 O °x r" O rZI f~\ Àz X 546 A
Os exemplos adicionais 75a-v no quadro seguinte foram também preparados por métodos análogos aos do Exemplo 65. 107 ΡΕ1611112
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 75a S K° OH O-N NH 2 540 A 75b 0 rV »γ[ kyik^/~p OH O-H MH 0 498 A 75c CT r0 X rN^ HO lÔ OH 0~n ^jh 542 A 7 5d Γ5 fH0 p-V (ίη cf ho^ OH O-N 516 A 7 5e *7' rO KO_l (J O v-Xj Λ°* OH °~N 544 A 7 5f /~Nvv° ho^JL (/j cf lAX o OH 0'fj fj· y H 518 A 108 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 7 5g U A /—N N— kíFXw OH H 531 A 7 5h \ Ί] o VyU Am °H °~N 532 A 7 5i 0 o ho^lX jí ^°h °H O-f/ \iH 526 A 7 5k rJD rrO ΗΟγΧ Wq OH O-N 502 A 7 5m Q, r~ H\ ^ HOvQL-A// OH O-N 512 A 7 5n k X ^ HO.J>. \X kJkpX ,P OH Ο-n ^IH 545 A 109 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 7 5p ^ Γ HOvl K o OH 486 A 7 5q F r-N — OH O-N h 531 A 7 5r F Cj /“KZ Cl' OH O-N 504 A 7 5s ^ A-N h0v1 OH O-N h 527 A 75t r- m~ «olU cf OH O-N Π 500 A 7 5u ^ ^o Cl r HO^J^ 0 OH Ο-n ^ih 501 B 110 ΡΕ1611112
Exemplo 76 Esquema de Reação:
(continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 7 5v O N-O HO^XT O o OH 0-N n—^ 517 A
Passo 1 3-(2,4-Bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi- -fenil)-5-metilisoxazol
Trifluoreto de trimetiloxónio-boro (Aldrich; 70 mg, 0,47 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de 5- (2,4-bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-3-metil-isoxazole (Exemplo 3, Passo 1) (120 mg, 0,22 mmol) em 111 ΡΕ1611112 diclorometano (3 mL) e a agitação foi continuada durante 3 h. A mistura resultante foi concentrada em vácuo para deixar um semissólido branco, o qual foi misturado com hidrocloreto de hidroxilamina (70 mg, 1,0 mmol), carbonato de potássio (120 mg, 0,87 mmol) e metanol (2 mL), e aque-ceu-se ema refluxo durante 18 h. A mistura de reacção foi repartida entre água (20 mL) e acetato de etilo (2x10 mL) e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e evaporadas em vácuo para deixar um óleo incolor. 0 produto cru foi purificado por cromatografia em coluna, silica (10 g), eluindo com hexano, seguido por éter dietilico/hexano (1:1), para dar 3-(2,4-bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-5-metil-isoxazole na forma dum sólido branco (44 mg, 37%). LC: tempo de retenção de 5,55 minutos; [M+H]+ 556,0 e 558,0 (tempo de jato 8,00 min) ; RMN (clorofórmio-d) , 7,64 (s, ArH) , 7,35 6, 76 (m, 14ArH), 6,34 (s, ArJÍ) , 4,90 (s, 2CH2) , 4,60 (s, 2CH2) , 3,79 (s, 3CH3) , 2,46 (s, 3CH3) .
Passo 2 4-Bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-5-metil-isoxazol-3--il]-benzeno-l,3-diol
Solução de tricloreto de boro (1 M em diclorometano, 1 mL, 1 mmol) foi adicionada a uma solução de 3-(2,4-bis-benziloxi-5-bromo-fenil)-4-(4-metoxi-fenil)-5- 112 ΡΕ1611112 -metil-isoxazole (38 mg, 0,068 mmol) em diclorometano (1 mL) , e a agitação foi continuada durante 1 h. A mistura de reacção foi repartida entre água (20 mL) e diclorometano (2x20 mL) e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e concentradas em vácuo para deixarem um óleo castanho. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna de silica (10 g) , eluindo com hexano seguido de hexano/éter dietilico (3:1, em seguida 1:1), para se obter 4-bromo-6-[4-(4-metoxi-fenil)-5-metil--isoxazol-3-il]-benzeno-1,3-diol na forma dum óleo incolor (11 mg, 43%). LC: tempo de retenção de 2,52 minutos; [M+H]+ 376, 1 e 378,1 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (DMSO-de) 10,40 (s, OH) , 9,69 (s, OH) , 7,22 (ArH) , 7,10-6,89 (m, 4 Ar tf) , 6,5 (s, ArH) , 3,7 (s, OCtf3) , 2,46 (s, CH3) .
Este composto tem atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência HSP90.
Exemplo 76A O composto que se segue encontra-se comercialmente disponivel (Interbioscreen) e teve uma atividade "B) no teste de polarização de fluorescência:
113 ΡΕ1611112
Os seguintes compostos foram feitos de acordo com o Exemplo 76:
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50* 7 6B HO P 0— H0 R / N, O \\ O 389 A 76C HOP Ό ft o 458 A
Exemplo 77
Preparação de Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di--hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3— carboxílico
Esquema de Reação: 114 ΡΕ1611112
Passo 1 1-(5-terc-Butil-2,4-di-hidroxi-fenil)-etanona
Ácido sulfúrico (4 mL, 75 mmol) foi adicionado a uma suspensão de 2,4-dihidrroxiacetofenona (22,8 g, 150 mmol) numa mistura de 2-metil-2-propanol (35 g, 470 mmol) e ácido trifluoroacético (80 mL) , sob uma atmosfera de azoto. A suspensão resultante foi aquecida, a temperatura do banho de óleo de 75 °C, durante ~3 h para dar uma solução vermelha clara. A solução resultante foi deixada arrefecer e vertida sobre gelo/água (350 mL) , para dar um precipitado cor de rosa pálido. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com água (600 mL) e hexano (200 mL) para dar um pó de cor de rosa pálido. Secou-se em vácuo (40 °C) para dar 1-(5-terc-butil-2,4-di--hidroxi-fenil)-etanona na forma de um pó cor de laranja 115 ΡΕ1611112 pálido (28,8 g, 92%). LC: tempo de retenção de 2,74 minutos; [M+H] + 209,1 (tempo de jato 3,75 min); RMN (clorofórmio-d), 7,35 (s, ArH) , 6, 05 (s, ArH) , 7,35 (m, 2ΑτΗ) , 2,35 (s, 3CH3) , 1,15 (s, 9CΗ3) .
Passo 2 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-etanona
Brometo de benzilo (10 mL, 84 mmol) foi adicionado a uma solução da acetofenona (13,5 g, 65 mmol) em DMF (50 mL), carbonato de potássio (20 g, 145 mmol) foi adicionado e a suspensão foi agitada, à temperatura ambiente, durante ~4 h. A suspensão resultante foi vertida em água (200 mL) para dar um precipitado cor de laranja pálido. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com água. Os sólidos foram recebidos em diclorometano (150 mL) e a solução foi lavada com água (2x100 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (100 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada a um óleo vermelho pálido. O óleo foi recebido em 2-metil-2-propanol (100 mL) e terc-butóxido de potássio (7,5 g, 67 mmol) foi adicionado para dar um precipitado amarelo pálido, o brometo de benzilo (8 mL, 67 mmol) foi adicionado e a mistura foi aquecida sob refluxo durante ~1 h. A suspensão resultante foi deixada a arrefecer e vertida em água 116 ΡΕ1611112 (250 mL), para dar um precipitado cor de laranja pálido. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com água. Os sólidos foram recebidos em acetato de etilo (150 mL) e lavados com água (2x200 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (100 mL). A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada até um semissólido de cor laranja; a trituração com metanol deu um sólido de cor de rosa pálido. Os sólidos foram removidos por filtração e seco em vácuo (40 °C) , para dar 1-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-etanona na forma dum pó cor de rosa pálido (9,1 g, 36%). LC: tempo de retenção de 3,03 minutos; [M+H]+ 389,3 (tempo de jato 3,75 min); RMN (clorofórmio-d), 7,65 (s, ArH) , 7,25-7,15 (m, lOAríí) , 6,35 (s, ArH) , 4,95
Passo 3 Éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5--terc-butil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enóico n /-mj
Etóxido de sódio (2,8 g, 41 mmol) foi adicionado a uma suspensão de 1-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil--fenil)-etanona (7,8 g, 20 mmol) em etanol (40 mL). Oxalato de dietilo (4 mL, 29,5 mmol) foi adicionado e a suspensão resultante foi aquecida sob refluxo durante ~2 h para dar uma solução vermelha pálida. A solução foi deixada arrefecer e foi vertida em água (200 mL) , a mistura foi 117 ΡΕ1611112 acidificada com ácido clorídrico (50 mL, 1 M) e extraida com diclorometano (150 mL) . Os extratos foram lavados com água (2x200 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (100 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada para dar uma goma amarela. A trituração com hexano deu um sólido amarelo. Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com hexano e secos em vácuo (40 °C) , para dar o éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enóico na forma dum pó amarelo (9,1 g, 93%) . RMN (clorofórmio-d) , 8,0 (s, ArH) , 7,5-7,35 (m, llArH) , 6,6 (s, AtH) , 5,2 (s, 2CH2) , 5,15 (s, 2CH2) , 4,3 (q, J 7,1 Hz, 2CH2) , 1,4 (s, 9CH3) , 1,25 (t, J7,l Hz, 3CH3) .
Passo 4 Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico
Hidrocloreto de hidroxilamina (3,6 g, 52 mmol) foi adicionado a uma solução de éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo--but-2-enóico (9,0 g, 18,5 mmol) em etanol (75 mL) e a suspensão foi aquecida sob refluxo durante ~4 h. A solução resultante foi deixada a arrefecer e vertida em água (200 mL) para dar um precipitado esbranquiçado. Os sólidos 118 ΡΕ1611112 foram removidos por filtração e recebidos em diclorometano (150 mL) . A solução foi lavada com água (150 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL). A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada até um sólido esbranquiçado. Os sólidos foram lavados com hexano e secos em vácuo (40 °C), para dar éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carbo-xílico na forma dum pó castanho pálido (8,0 g, 89%) . LC: tempo de retenção de 3,13 minutos; [M+H]+ 486,5 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (clorofórmio-d) , 7,85 (s, ArH) , 7,4-7,2 5 (m, lOAríí) , 6,9 (s, ArH) , 6,5 (s, ArH) , 5,1 (s, 2CH2) , 5,0 (s, 2CHz) , 4,35 (q, J7,l Hz, 2Cfl2) , 1,4 (s, 9Ctf3) , 1,35 (t, J 7, 1 Hz, 3CH3) ·
Passo 5 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc- -butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico
Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (10,0 g, 20,6 mmol) foi adicionado a uma solução de etilamina em metanol (60 mL, 2,0 M) e a suspensão foi aquecida a temperatura de banho de óleo de 75 °C durante ~2 h. A solução resultante foi deixada arrefecer e foi concentrada até um óleo castanho pálido, diclorometano (150 mL) foi adicionado e a 119 ΡΕ1611112 solução foi lavada com água (100 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (75 mL) . A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada até um óleo castanho, que solidificou em repouso (9,9 g, ~quant). LC: tempo de retenção de 3,02 minutos; [M+H]+ 485,3 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (clorofórmio-d) , 7,8 (s, ArJí) , 7,4-7,2 (m, lOArH) , 7,0 (s, ArH) , 6,75 (t largo, J 5,4 Hz, NH) , 6,5 (s, ArH) , 5,1 (s, 2CH2) , 5,0 (s, 2CH2) , 3,4 (dq, J 5,4 Hz, 7,1 Hz, 2CH2) , 1,35 (s, 9CH3) , 1,15 (t, J 7,1 Hz, 3CH3) .
Passo 6 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc--butil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxilico
N-Iodo-succinimida (9,0 g, 40 mmol) foi adicionado a uma suspensão de etilamida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-terc-butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (9,9 g, 20,4 mmol) em acetonitrilo (60 mL). Nitrato de cério e amónio (0,25 g, 0,46 mmol) foi adicionado e a suspensão foi agitada durante ~18 h. A suspensão resultante foi concentrada e o residuo foi recebido em diclorometano (125 mL). A solução resultante foi lavada solução aquosa de metabissulfito de sódio (2x100 mL, 5%) , água (100 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (100 mL). A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e 120 ΡΕ1611112 concentrada até uma goma vermelha pálida. A trituração com etanol (25 mL) deu um sólido esbranquiçado, os sólidos foram removidos por filtração e lavados com etanol. Secou-se em vácuo (40 °C) , para dar a etilamida do ácido 5-(2,4--bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carbo-xílico na forma dum pó esbranquiçado (7,75 g, 62%). LC: tempo de retenção de 3,07 minutos; [M+H]+ 611,2 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (clorofórmio-d) , 7,45-7,25 (m, HAríí) , 6,8 (br t, J 5,4 Hz, NH) , 6,6 (s, ArH) r 5,05 (s, 4CJϊ2) , 3,5 (dq, J 5,4 Hz, 7,1 Hz, 2CH2) , 1,35 (s, 9CH3) , 1,2 (t, J7,l Hz, 3CH3) .
Passo 7 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc--butil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3— carboxílico
Solução aquosa de fosfato de potássio (25 mL, 1,2 M) foi adicionada a uma solução de etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3--carboxílico (6,1 g, 10 mmol) e ácido 4-formilfenil-boróni-co (2,35 g, 15,7 mmol) em 1,4-dioxano (75 mL), sob uma atmosfera de azoto. Dicloro-bis(tri-o-tolilfosfina)paládio (II) (cat.) foi adicionado e a mistura foi aquecida, 121 ΡΕ1611112 temperatura do banho de óleo de 100 °C durante ~1 h. A mistura foi deixada a arrefecer, e a camada aquosa foi separada e extraída com acetato de etilo (100 mL). As fases orgânicas combinadas foram concentradas para dar uma goma castanha pálida. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna de silica (600 mL) , eluindo com acetato de etilo/hexano (1:3), para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol--3-carboxílico na forma duma espuma amarela pálida (5,18 g, 88%). LC: tempo de retenção de 3,01 minutos; [M+H]+ 589,4 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (clorofórmio-d) , 9,75 (s, CHO) , 7,5 (d, J 6,9 Hz, 2ArH) , 7,2 (d, J 6,9 Hz, 2ArJÍ) , 7,15-7,0 (m, 8ArH) , 6,8 (m, 2ArH) , 6,65 (br t, J 5,4 Hz, NH) , 6,2 (s, ArH) , 4,8 (s, 2CH2) , 4,5 (s, 2CHz) , 3,2 (dq, J 5,4 Hz, 7,1 Hz, 2CHz) , 1,1 (s, 9CH3) , 1,05 (t, J 7,Hz, 3CH3) .
Passo 8 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc--butil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)--isoxazol-3-carboxílico
BnO
OBn 0-N nh
Tetra-hidretocianoborato de sódio (65 mg, 1,03 mmol) foi adicionado a uma solução de etilamida do ácido 5- 122 ΡΕ1611112 (2,4-bis-benziloxi-5-te.rc-butil-fenil) -4- (4-formil-fenil) -isoxazol-3-carboxílico (125 mg, 0,21 mmol), morfolina (50 pL, 0,57 mmol) e ácido acético (cat.) em metanol (4 mL) e a solução foi agitada durante ~12 h. Diclorometano (50 mL) foi adicionado e a solução foi lavada com água (2x50 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (50 mL). A solução foi seca sobre sulfato de sódio anidro e concentrada até uma goma incolor. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna de silica (20 g) , eluindo com acetato de etilo/hexano (1:1), para se obter etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxi-lico na forma dum óleo incolor (35 mg, 25%) . LC: tempo de retenção de 2,56 minutos; [M+H]+660,8 (tempo de jato 3,75 min) ; RMN (clorofórmio-d) , 7,35-7,05 (m, 15Ar.Hj , 6,7
(br t, J 5,4 Hz, NH) , 6,4 (s, ArH) , 4,9 (s, 2CH2) , 4,75 (s, 2CH2) , 3,6 (t, J 4,5 Hz, 4 CH2) , 3, (s, 2CH2) , 3,35 (dq, J 5,4 Hz, 7,1 Hz, 2CHz) , 2,35 (br s 4CH2) , 1,15 (t, J 7,1 Hz, 3CJ?3), 1,1 (s, 9CH3) .
Passo 9 Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di- -hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)--isoxazol-3-carboxílico
123 ΡΕ1611112
Uma solução de tricloreto de boro (1 mL, 1,0 M em diclorometano) foi adicionada a uma solução de etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-terc-butil-fenil)-4-(4-morfo-lin-4-il-metil-fenilo)-isoxazol-3-carboxílico (35 mg, 0,05 mmol) em diclorometano (1 mL) a -20 °C (gelo/metanol) , sob uma atmosfera de azoto. A solução resultante foi agitada a 0 °C (gelo/água) durante ~90 min. Metanol (2 mL) foi adicionado e a solução foi concentrada até uma goma castanha. O produto cru foi purificado por HPLC preparativa, para dar etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma dum pó branco (sal formato) (21 mg, 75%). LC: tempo de retenção de 1,97 minutos; [M+H]+ 480,5 (tempo de jato 3,75 min); RMN (DMSO-dô) 8,8 (t, J 5,6 Hz, NH) , 7,25 (d, J 7,2 Hz, 2ArH) , 7,15 (d, J 7,2 Hz, 2ArH) , 6,7 (s, Ar H) , 6,45 (s, Ar#), 3,45 (br s, 4C H2) , 3,2 (dq, J 5,6 Hz, 7,2 Hz, 2CH2) , 2,3 (br s, 4C#2) , 1,1 (s, 9CH3) , 1,05 (t, J 7,2 Hz, 3CH3) .
Este composto tem atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência de HSP90.
De uma maneira semelhante à preparação do composto do Exemplo 77, foram preparados os Exemplos 77a-f. 124 ΡΕ1611112
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 77a X °Ti O o +Q"S o X 480 A 77b HO^ 1 c r /—N fl o )H O-N 466 A 77c H° 1 0 rO fS ^ \-sv p H °'N ^IH 478 A 77d lyy ° o X NpN" rH^J Ó Jvi o 1 O-f/ Vih 493 A 77e HO^ \ F I rS O OH °"N ^IH 399 A 77 f HO^ (Γ \ O Jr rS P OH O-n ^JH 411 A 125 ΡΕ1611112
Exemplo 78
Preparação de Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5--isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazole-3— carboxílico
Esquema, de Reação:
8a8r, 8«Sr, KjCO, MbCN BnQ Kjftao
08«
©OH
O OH
M*OH
NSCWBH^AeOM moffólitia, MeOH
SnO a«o
M CONHÊí
COHHEi
O ao, V-—t OCM
Passo 1 1-(2,4-Bis-benziloxi-fenil)-etanona o
OBn 126 ΡΕ1611112
Carbonato de potássio (2,5 eq) foi adicionado a uma solução de 2',4'-di-hidroxiacetofenona (1 eq) em acetonitrilo (400 mL), e a suspensão foi aqitada à temperatura ambiente. Brometo de benzilo (2,5 eq) foi adicionado qota a gota ao longo de 10 minutos e a mistura aquecida em refluxo durante 18 h. A mistura foi arrefecida e evaporada em vácuo para dar uma pasta. A pasta foi repartida entre água e acetato de etilo e as fases foram separadas. A camada aquosa foi ainda extraida com diclorometano e os extratos orgânicos foram combinados, secos (MgS04) e evaporados em vácuo. O produto foi triturado com hexano, filtrado e lavado com hexano frio e seco em vácuo a 45 °C para dar 1-(2,4-bis-benziloxi-fenil)-etanona na forma de um pó branco. LC: tempo de retenção 2,704 min; [M+H]+ 333,3,
Passo 2 2,4-Bis-benziloxi-l-isopropenil-benzeno
OBn
BnO.
Brometo de metiltrifenilfosfónio (1,1 eq) foi suspenso em THF anidro e arrefecido a 0 °C sob atmosfera de azoto. n-Butil-litio 1,6 M em hexanos (1,1 eq) foi adicionado gota a gota e agitou-se durante 30 minutos. 1-(2,4-Bis-benziloxi-fenil)-etanona (1 eq) foi dissolvida em THF anidro e adicionada gota a gota à suspensão. Quando 127 ΡΕ1611112 a adição estava completa, o banho de gelo foi removido e a mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante a noite. Foi adicionado metanol à mistura de reacção e a solução resultante foi evaporada em vácuo. Foi adicionado hexano ao óleo resultante e aqueceu-se em refluxo durante 30 minutos, em seguida a mistura foi filtrada através de Celite. O licor foi evaporado em vácuo para dar um óleo que foi purificado por cromatograf ia em coluna, eluindo com EtOAc a 30% em hexano, para dar 2,4-bis-benzi-loxi-l-isopropenil-benzeno. Rf tempo de retenção de 0,722, hexano:EtOAc 3:1.
Passo 3 4-Isopropil-benzeno-l,3-diol
OH 2,4-Bis-benziloxi-l-isopropenil-benzeno foi recebido em solução em etanol e adicionado a paládio a 10% sobre carbono, o qual tinha sido pré-humedecido com água. O hidrogénio foi introduzido no frasco e a mistura foi deixada a agitar durante 16 h. O catalisador foi filtrado da mistura de reacção, por um método adequado, e o liquido foi concentrado em vácuo para dar 4-isopropil-benzeno-l,3--diol na forma dum sólido cristalino branco. LC: tempo de retenção 2,088 min; [M+H]+ 153,1. 128 ΡΕ1611112
Passo 4 1-(2,4-Di-hidroxi-5-isopropil-fenil)-etanona
O OH 4-Isopropil-benzeno-l,3-diol (1 eq) foi dissolvido em BF3*OEt2 (6 eq) e foi adicionado ácido acético (2 eq) . A solução foi aquecida durante 16 horas a 90 °C e em seguida deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A solução foi adicionada gota a gota a NaOAc 10% (aq) e deixada em repouso durante 4 horas, antes de ser extraida para EtOAc. As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com NaHCCt (aq.) e em seguida secas sobre MgSCd, filtradas e concentradas em vácuo. O óleo residual foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com diclorometano, para dar 1-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil-fenil)-etanona na forma dum sólido branco. LC: tempo de retenção 2,633 min; [M+H]+ 195,1.
Passo 5 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-etanona
O OBn 1-(2,4-Di-hidroxi-5-isopropil-fenil)-etanona (1 eq) foi dissolvido em DMF e carbonato de potássio (2,2 eq) seguido de brometo de benzilo (2,2 eq) foram 129 ΡΕ1611112 adicionados. A suspensão foi aquecida com agitação a 150 °C, sob azoto, durante 16 h. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente e a mistura foi vertida em HC1 (aq) 1 M e, em seguida, extraida para acetato de etilo. As fases orgânicas foram combinadas e lavadas de novo com HC1 (aq) 1 M e, em seguida, cinco vezes com solução de água salgada. A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e concentrada em vácuo, para dar um sólido, o qual foi purificado por trituração em éter dietilico:hexano (1:1) para dar 1-(2,4-bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-etanona. LC: tempo de retenção de 3,575 min; [M+H]+ 375,2.
Passo 6 Éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5--isopropil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enóico
Sódio (2,8 eq) foi adicionado a etanol sob azoto à temperatura ambiente e agitada durante 25 minutos para gerar o etóxido de sódio. 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-isopropil--fenil)-etanona (1 eq) foi dissolvido em mais etanol e adicionado à solução de etóxido de sódio. Oxalato de dietilo (1,64 eq) foi adicionado e a mistura reacional foi aquecida em refluxo durante 4 h. A mistura foi deixada a arrefecer até à temperatura ambiente e foi adicionado suficiente HC1 (aq) 1 M para acidificar a mistura de 130 ΡΕ1611112 reacção, a qual foi em seguida concentrada em vácuo. A goma resultante foi repartida entre diclorometano e água salgada e a fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e evaporada em vácuo para dar o éster de etilo do ácido 4- (2,4-bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo--but-2-enóico na forma de uma goma amarela. LC: tempo de retenção 3,057min; [M+H]+ 475.
Passo 7 Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico
CQ2Et Éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5--isopropil-fenil)-2-hidroxi-4-oxo-but-2-enóico (1 eq) foi dissolvido em etanol com agitação. Hidrocloreto de hidro-xilamina (1,2 eq) foi adicionado e a solução foi aquecida em refluxo durante 4 horas sob uma atmosfera de azoto. A mistura de reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada em vácuo. 0 residuo foi repartido entre água salgada e diclorometano. A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e concentrada em vácuo para dar éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazole-3-carboxílico na forma dum sólido. LC: tempo de retenção 3,059 min; [M+H]+ 472. 131 ΡΕ1611112
Passo 8 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--isopropil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico foi dissolvido em excesso de etilamina 2 M em metanol e aquecido no forno de micro-ondas Smith Synthesiser a 120 °C durante 600 segundos. A solução foi concentrada em vácuo para dar um sólido que foi purificado por trituração em hexano, para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopropil--fenil)-isoxazol-3-carboxílico. LC: tempo de retenção de 2,979 min; [M+H]+ 471,3.
Passo 9 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5- -isopropil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico
NHEt
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopro-pil-fenil)-isoxazole-3-carboxílico (1 eq) foi dissolvido em acetonitrilo anidro e N-iodossuccinimida (2,0 eq), seguido 132 ΡΕ1611112 por nitrato de amónio cérico (0,05 eq) foram adicionados e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reacção foi concentrada em vácuo e a goma resultante foi repartida entre acetato de etilo e água salgada. A fase orgânica foi seca sobre MgS04, filtrada e concentrada em vácuo. O residuo foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com hexano:acetato de etilo 9:1, para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-isopropil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico na forma dum óleo. LC: tempo de retenção 2,975 min; [M+H]+ 597,2.
Passo 10 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5- -isopropil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) foi dissolvido em DMF anidra. Na2C03 (aq) 1 M foi adicionado, seguido por ácido 4-formilfenilborónico (2 eq) e, em seguida, PdCl2(PPhs) 2· Borbulhou-se azoto através da solução durante dez minutos à temperatura ambiente, após o que a temperatura foi elevada até 80 °C sob uma atmosfera de azoto, durante 15 minutos. A mistura reacional foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e a mistura de reacção 133 ΡΕ1611112 foi diluída com acetato de etilo. Esta solução foi lavada com água salgada, em seguida seca sobre MgSCg, filtrada e concentrada em vácuo para dar um óleo. Purificou-se por cromatografia em coluna, eluindo com EtOAc 10% em hexano, para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico na forma dum sólido branco. LC: tempo de retenção de 2,981 min; [M+H] + 575,3.
Passo 11 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopro-pil-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)--isoxazol-3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopro-pil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) foi dissolvido em metanol e peneiros em pó 3A foram adicionados. Morfolina (2 eq) foi adicionada, seguido por tetra-hidreto-cianoborato de sódio (2 eq). Ácido acético (5 eq) foi adicionado gota a gota e a suspensão foi agitada sob azoto à temperatura ambiente durante 16 h. A mistura de reacção foi diluída com DCM e lavada com NaHCCg (aq°) sat°. A fase orgânica foi seca sobre MgSCg, filtrada e concentrada em vácuo. A goma resultante foi purificada por cromatografia "flash", eluindo com MeOH 1% em DCM para dar a etilamida do 134 ΡΕ1611112 ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfo-lin-4-il-metil-fenil)-isoxazole-3-carboxílico na forma dum óleo incolor. LC: tempo de retenção 4,42 min; [M+H]+ 646,2; método B.
Passo 12 Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol- -3-carboxilico
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isopro-pil-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-car-boxílico (1 eq) foi dissolvido em DCM anidro e sob uma atmosfera de azoto, foi arrefecida até 0 °C. BCI3 1 M em DCM foi adicionado gota a gota e a solução foi agitada sob estas condições durante 30 minutos. Metanol (2 mL) foi adicionado e a mistura de reacção foi concentrada sob vácuo. A purificação da amostra por LC preparativa/MS deu a etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico na forma dum sólido branco. LC: tempo de retenção de 1,991 min; [M+H]+ 466,3.
Este composto teve atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência de HSP90. 135 ΡΕ1611112
De uma maneira semelhante à preparação do composto do Exemplo 78, foram preparados os Exemplos 78a-u.
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 78a HO V" HO ^ Ο, -íA. / N Π O 464 A 78b HO Γ\ H O. N Π O 452 A 78c HO r Vl— O 479 A 7 8d Lr > X X 424 A 7 8e , y- HO\_/ /~H HO>=( < O. .N. / N Y ^ O 439 A 136 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 7 8f r\ 0 "«γ" «n=r h 0 680 A 7 8g \ 0 /—H ^0 H \_/ B—i X_' ' η ο. Α^,ν^ N Tj o 636 Pró-fármaco ver Exemplo 7 8 v 7 8h o A>> y—h/ \> V° H η o. A .N- / Ο N Π O 550 Pró-fármaco ver Exemplo 7 8 v 7 8i (X ^ IZ • X X 478 A 78 j , P HO K /—N v / ^_y h h°h; h o* A^N. / N Π O 464 A 7 8k , P HO A /—N v_/ H H°>=( H 0. AyN^/ N Jí O 480 A 137 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 781 i y HO /—N \_/ _y H HO V=\ LI o. NI γ O 452 A 7 8m \ H O HO JC O OH O-n 454 A 7 8n 1 n; ^ γ- 0 1 495 A 7 8p Γ^ΝΗ H°^Ò OH 0~n 465 A 7 8q X o ^cT X 479 A 138 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 7 8r Γ'ο 'VyÇ γ 0 0^0 O-N NH 608 Pró-fármaco ver Exemplo 7 8 v 7 8s h°yó OH O-hj NH 480 A 7 81 I O x~0“( ^~z \ 493 A 7 8u r r'Nv-- H°^Ó OH O-μ NH -Λ 466 A 7 8w V £> HO . /—N H° V=\ o Ο. Μ T . 492 A 139 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura ΜΗ+ HSP90 CI50 7 8y v 0 .Ο. ηοΑ\Γ Ο ο. Ν ΗΝ^ 478 Α 7 8 z v V ΗΟ λ ΗΟ / \ Ο ο. ΗΝ~^ 466 Α 7 8aa •Ο" ολ}' ΟΟ Η^ηΖ° Ν Τ ΗΝ-^/ 514 Α 7 8ab Ο ϊΡΜ “Π 478 Α 7 8ac ο X 500 Α 140 ΡΕ1611112 (continuação)
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 7 8ad o J N \ v. rK h x ,° OH °'N NH 495 A 7 8ae X O 521 A 7 8af r-<çyN H°T 0H °'N NH 479 A 7 8ag X o \ 481 A 7 8 ah o γΛ r* ΚΆ _f H M H° I C^v OH °'N NH K 481 A 141 ΡΕ1611112 (continuação)
Éster de 4-cloro-5-(dietoxi-fosforiloxi)-2-[3-etil-carbamoil-4-(4-metoxi-fenil)-isoxazol-5-il]-fenilo éster dietilico do ácido fosfórico \
O
A uma mistura sólida de etilamida do ácido 5 — (5 — -cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4-metoxifenil)-isoxazol-3--carboxílico (11 mg, 2,lxl0“2 mmol) e MgO (25 mg) num frasco pequeno, foram adicionadas 10 gotas de clorofosfato dietilico. A mistura resultante foi aquecida e agitada a 70 °C durante uma hora, o progresso da reacção foi monitorizado por TLC. Quando arrefecida, foram adicionados MeOH (1 mL) e DCM (1 mL) . Após filtração, os solventes foram evaporados e foi obtido um óleo amarelo. O éster difosforilico foi separado por TLC preparativa, obtendo-se 142 ΡΕ1611112 4 mg. Rf= 0,35; ^-RMN δ = 7,95 (1H, s, largo); 1,1 A (1H, s); 7,55 (1H, s) ; 7,32 (2H, d, J= 9,0 Hz); 6,90 (2H, d, J = 9,0 Hz); 4,30 (8H, q) ; 3,80 (3H, s) ; 3,40 (2H, q) ; 1,35 (12H, t) e 1,25 (3H, t) . LCMS: (M+l)+=661,l (TR=7,60 min) .
Exemplo 79
Preparação de Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5--isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3- carboxílico o
Esquema de Reação:
143 ΡΕ1611112
Passo 1 1-(2,4-Di-hidroxi-fenil)-2-metil-propan-l-ona
HO
OH
Resorcinol (1 eq) foi dissolvido em BF3*OEt2 (6 eq) e foi adicionado ácido isobutirico (1 eq). A solução foi aquecida durante 1,5 horas a 90 °C e depois deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A solução foi adicionada gota a gota a NaOAc (aq) 10% e deixada em repouso durante 4 horas, antes de ser extraída para EtOAc. As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com NaHCCb (aq), em seguida secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas em vácuo para darem a 1-(2,4-di-hidroxi-fenil)-2-metil-propan-l-ona na forma dum óleo vermelho que foi usado sem purificação adicional. LC: tempo de retenção de 2,279 min; [M+H]+ 181,1.
Passo 2 4-Isobutil-benzeno-l,3-diol
OH adicionado 1-(2,4-di-
Cloroformato de etilo (3 eq) foi lentamente a uma solução arrefecida (0 °C) de -hidroxi-fenil)-2-metil-propan-l-ona (1 eq) e trietilamina 144 ΡΕ1611112 (3 eq) em THF. A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e aqitada durante três horas antes de ser filtrada e os sólidos foram lavados com THF frio. Os filtrados combinados foram arrefecidos até 0 °C e tetra-hidretoborato de sódio (4 eq) em um volume de áqua iqual ao dos filtrados de THF foi lentamente adicionado. A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente, aqitada durante três horas e diluida com áqua. A mistura foi extraida duas vezes com éter dietilico, os extratos combinados foram concentrados até à secura e ressuspensos em solução aquosa a 10% de hidróxido de sódio (4 eq) . Depois de refluxo durante 90 minutos, a mistura foi arrefecida, acidificada com HC1 aq° 5 M e extraida duas vezes com éter dietilico. Os extratos orgânicos foram secos sobre sulfato de magnésio, filtrados e concentrados até à secura para se obter 4-isobutil-benzeno-1,3-diol na forma dum óleo turvo, o qual foi utilizado sem purificação adicional. RMN consistente com a estrutura.
Passo 3 1-(2,4-di-Hidroxi-5-isobutil-fenil)-etanona
4-Isobutil-benzeno-l,3-diol (1 eq) foi dissolvido em BF3 · OEt2 (6 eq) e foi adicionado ácido acético (2 eq) . A solução foi aquecida durante 16 horas a 90 °C e em seguida deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A solução foi 145 ΡΕ1611112 adicionada gota a gota a NaOAc 10% (aq°) e deixada em repouso durante 4 horas, antes de ser extraida duas vezes com éter dietílico. As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com NaHCC>3 (aq°), em seguida secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas em vácuo para darem 1-(2,4-di-hidroxi-5-isobutil-fenil)-etanona, que foi usada sem purificação adicional. RMN consistente com a estrutura.
Passo 4 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-isobutil-fenil)-etanona
1-(2,4-Di-hidroxi-5-isobutil-fenil)-etanona (1 eq) foi dissolvida em DMF e carbonato de potássio (4,4 eq) e em seguida foi adicionado brometo de benzilo (4,4 eq) . A suspensão foi aquecida com agitação a 150 °C, sob azoto, durante 16 h. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente, filtrada e concentrada à secura. Este sólido foi purificado cromatografia em coluna (silica, hexanos:acetato de etilo 4:1) e em seguida recristalizado em acetato de etilo:hexanos, para dar 1-(2,4-bisbenziloxi--5-isobutil-fenil)-etanona na forma de cristais incolores. LC: tempo de retenção de 3,030 min; [M+H]+389,3.
Passo 5 Éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5- -isobutil-fenil)-2,4-dioxo-butirico 146 ΡΕ1611112
Sódio (3 eq) foi adicionado a etanol sob azoto à temperatura ambiente e agitou-se até ocorrer dissolução completa. 1-(2,4-Bis-benziloxi-5-isobutil)-etanona (1 eq) foi adicionada, seguido de oxalato dietilico (1,5 eq) e a mistura reacional foi aquecida em refluxo durante 4 h. A mistura foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e acidificada com HC1 (aq°) 2 M para dar um precipitado amarelo de éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5--isobutil-fenil)-2,4-dioxo-butírico, o qual foi obtido por filtração. LC: tempo de retenção de 3,254 min; [M+H]+ 89,3.
Passo 6 Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico
Éster de etilo do ácido 4-(2,4-bis-benziloxi-5--isobutil-fenil)-2,4-dioxo-butírico (1 eq) foi dissolvido em etanol com agitação. Hidrocloreto de hidroxilamina (1,2 eq) foi adicionado e a solução foi aquecida em refluxo durante 2 h. A mistura de reacção foi arrefecida até à 147 ΡΕ1611112 temperatura ambiente, para dar um precipitado. Este precipitado foi obtido por filtração para dar éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isobutil)-isoxazol-3--carboxilico na forma dum sólido branco. LC: tempo de retenção de 3,261 min; [M+H]+ 486,3.
Passo 7 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-iso- butil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico
Éster de etilo do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico foi dissolvido em etilamina 2 M em metanol (10 eq) e aquecido no forno de micro-ondas Smith Synthesiser a 120 °C durante 600 segundos. A solução foi concentrada em vácuo para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isobutil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma dum sólido branco que foi utilizado sem purificação adicional. LC: tempo de retenção de 3,112 min; [M+H]+ 485,3.
Passo 8 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-iso-butil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico
BnO
148 ΡΕ1611112
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isobu-til-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) e N-iodo-succini-mida (2,0 eq) foram dissolvidos em acetonitrilo, nitrato de amónio cérico (0,1 eq) foi adicionado e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reacção foi concentrada em vácuo e a goma resultante foi repartida entre acetato de etilo e água salgada. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com hexano:acetato de etilo 4:1, para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benzilo-xi-5-isobutil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico na forma dum óleo. LC: tempo de retenção de 3,089 min; [M+H]+ 611,2.
Passo 9 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5--isobutil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol- -3-carboxílico
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isobutil-fenil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) foi dissolvida em DMF e Na2CC>3 (aq°) 1 M (3 eq) foi adicionado, seguido de ácido 4-formilfenilborónico (2 eq) e PdCl2(PPh3)2 catalítica. Borbulhou-se azoto através da solução durante 149 ΡΕ1611112 dez minutos à temperatura ambiente, depois do que a temperatura foi elevada a 80 °C sob uma atmosfera de azoto, durante 2 h. A mistura reacional foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo. Esta solução foi lavada com água salgada, em seguida seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada em vácuo para dar um óleo que foi purificado por cromatografia em coluna, eluindo com EtOAc 10% em hexano, para dar etilamida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazole--3-carboxílico na forma dum sólido branco. LC: tempo de retenção 5,57 min; [M+H]+ 589,1 método B.
Passo 10 Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-iso-butil-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetilfenil)--isoxazole-3-carboxílico
BnC
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isobu-til-fenil)-4-(4-formil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (1 eq) foi dissolvida em metanol e foram adicionados peneiros 3À em pó. Morfolina (2 eq) foi adicionada, seguida de ácido acético (5 eq) . Após agitação durante 30 minutos, tetra--hidretocianoborato de sódio (2 eq) foi adicionado em 150 ΡΕ1611112 porções e a suspensão foi agitada sob azoto à temperatura ambiente durante 16 h. A mistura de reacção foi filtrada através de Celite e concentrada até à secura. A cromato-grafia em coluna, eluindo com MeOH 5% em DCM deu etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfo-lin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma de um óleo incolor. LC: tempo de retenção 4,53 min; [M+H]+ 660,2 método B.
Passo 11 Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isobutil--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol- -3-carboxilico H(
Etilamida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-isobu-til-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-car-boxílico (1 eq) foi dissolvida em DCM anidro e sob uma atmosfera de azoto foi arrefecida até 0 °C. BC13 1 M em DCM (9 eq) foi adicionado gota a gota e a solução foi agitada durante 30 minutos. Metanol (2 mL) foi adicionado e a mistura de reacção foi concentrada em vácuo. A purificação da amostra por LC preparativa/MS deu a etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isobutil-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico na forma dum branco sólido. LC: tempo de retenção de 1,902 min; [M+H]+ 480,3. 151 ΡΕ1611112
Este composto tinha atividade "A" no ensaio de polarização de fluorescência de HSP90.
De uma maneira semelhante à preparação do composto do Exemplo 79, foi preparado o Exemplo 80. A purificação da amostra por LC preparativa/MS deu o composto na forma dum sólido branco.
Exemplo Estrutura MH+ HSP90 CI50 80 , jO H° ly 480 A OH O-jg m
Exemplo 81 N-[5-(5-Cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)--isoxazol-3-ilmetil]-metano-sulfonamida
Exemplo 82 N-[5-(5-Cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)--isoxazol-3-ilmetil]-acetamida 152 ΡΕ1611112
Amida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-carboxilico
Amida do ácido 5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro-fe-nil)-4-iodo-isoxazol-3-carboxílico (0,45 g, 0,80 iranol) foi sujeito a acoplamento cruzado com ácido 4-fluorofenil-borónico (0,17 g, 1,5 eq), usando as condições padrão descritas acima. O produto cru, um sólido cor de laranja (0,40 g) , foi levado para o passo seguinte sem purificação adicional. LCMS (LCQ) tR=8,70; MS m/z 529,1 [M+H]+. C-[5-(2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-il]-metilamina
A uma solução de amida do ácido 5-(2,4-bis--benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3--carboxílico (0,40 g, 0,76 mmol) em THF anidro (20 mL), sob árgon, foi adicionado complexo borano 1 M-THF (1 mL) e a solução foi refluxada durante a noite. Após arrefecimento, a reacção foi extinta com metanol (10 mL) e o produto foi 153 ΡΕ1611112 purificado usando uma coluna Isolute®SPE "flash" SCX-2 5g para dar 0,30 g (77% de rendimento) na forma dum pó. LCMS (LCQ) tR=7,54; MS m/z 515,2 [M+H]+. N-[5-(5-Cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-metano-sulfonamida
C-[5- (2,4-Bis-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-fluo-ro-fenil)-isoxazole-3-il-metilamina (100 mg, 0,19 mmol) foi dissolvida em DCM (3 mL) antes da adição de cloreto de metanossulfonilo (17 pL, 1,1 eq) e trietilamina (30 pL, 1,1 eq). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite antes de ser evaporada até à secura sob vácuo o produto cru protegido por benzilo na forma dum resíduo de cor azul (90 mg). Este foi desprotegido usando o procedimento padrão com tricloreto de boro descrito acima e purificado por TLC preparativa (etanol 10% em DCM) e extração em Soxhlet da sílica por éter deu o composto puro na forma dum sólido quase incolor (8 mg, rendimento de 10%) . LCMS (LCQ) tR = 6,65; MS m/z 411,2 [M-H]'; δΗ (d4- MeOH), 7,19 (2H, m, Ar-Jí) , 7,04 (1H, s, Ar-Jí), 7,03 (2H, m, Ar-H) , 6, 34 (1H, s, Ar-Jí) , 4,27 (2H, s, CH2NJÍ) , 2, 81 (3H, s, SO2CJÍ3) · N-[5-(5-Cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazol-3-ilmetil]-acetamida 154 ΡΕ1611112
A uma solução de C-[5-(2,4-bis-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-(4 — fluoro-fenil)-isoxazol-3-il]-metilamina (100 mg, 0,19 mmol) em DCM foi adicionado anidrido acético (130 yL, 7,0 eq) e trietilamina (81 yL, 3,0 eq) . A solução foi agitada à temperatura ambiente até a amina estar consumido. O solvente foi removido em vácuo, para deixar o produto protegido por benzilo cru oleoso tingido de amarelo. Este foi desprotegido usando o procedimento padrão com tricloreto de boro descrito acima e purificado por TLC preparativa e extração em Soxhlet da sílica por éter deu o composto puro na forma dum sólido incolor (10 mg, rendimento 14%). LCMS (LCQ) tR=6,57, MS m/z 377,1 [M+H]+ ; δΗ (d4-MeOH) , 7,17 (2H, m, Ar-H) , 7,01 (1H, s, Ar-H) , 6,98 (2H, m, Ar-H) , 6,32 (1H, s, Ar-H) , 4,37 (2H, s, CH2Nií) , 1,77 (3H, s, COCH3) .
Exemplos 83, 84 e 85
Etilamida do ácido 5-(5-etil-4-hidroxi-2-metoxi-fenil)-4--(4-morfolin-4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxílico (83),
Etilamida do ácido 5-(5-etil-2-hidroxi-4-metoxi-fenil)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico (84),
Etilamida do ácido 5-(5-etil-2,4-dimetoxifenil)-4-(4--morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (85) 155 ΡΕ1611112
A um frasco carregado com árgon contendo etilamida do ácido 5-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4--morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico (25 mg, 0,055 mmol) e N,N-(di-isopropil)aminometilpolistireno [PS-DIEA] (35 mg, 3,83 mmol/g, 2,4 eq) foi adicionado DCM anidro (2,3 mL) e metanol anidro (0,25 mL). Durante a agitação suave, (trimetilsilil)diazometano 2 M em hexanos (28 pL, 1,0 eq) foi adicionado e a solução foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Árgon foi borbulhado através da solução durante 10 min, a resina foi separada por filtração, e os voláteis removidos em vácuo. O residuo cru foi purificado por HPLC semipreparativa para se produzir a etilamida do ácido 5-(5-etil-4-hidroxi-2--metoxifenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico (83) (5,52 mg, 21%), etilamida do ácido 5-(5- -etil-2-hidroxi-4-metoxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil--fenil)-isoxazol-3-carboxilico (84) (1,14 mg, 4%), etilami da do ácido 5-(5-etil-2,4-dimetoxi-fenil)-4-(4-morfolin-4--ilmetilfenil)-hisoxazole-3-carboxilico (1,46 mg, 5%) e o material de partida não metilado. (83) : LCMS (LCT) tR= 4,95, MS m/z 466, 4 [M+H] + (84) : LCMS (LCT) tR= 5,14, MS m/z 466, 4 [M+H] + (85) : LCMS (LCT) tR= 5,45, MS m/z 480,4 [M+H] + Os dados de RMN confirmaram as atribuições ΡΕ1611112 156
Exemplo 86 N-Etil-5-(5-cloro-2-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-il--metil-fenil)-isoxazol-3-carboxamida
Passo 1 2-Benzoiloxi-5-cloro-benzoato de metilo
CO,Me
Uma mistura de 5-cloro-2-hidroxi-benzoato de metilo (2,5 g, 13,4 mmol) , K2C03 (3,7 g, 26,8 mmol) e brometo de benzilo (2,98 g, 17,4 mmol) em acetona (30 mL) foi refluxada durante 12 horas. Após arrefecimento, a acetona foi evaporada. EtOAc (100 mL) foi adicionado e filtrou-se. A camada orgânica foi em seguida lavada com HC1 1 M (1x80 mL) , água salgada (2x80 mL) e seca com Na2SC>4. Após filtração e evaporação do solvente, foram obtidos semissólidos amarelos (3,2 g) . 1H-RMN (dô-acetona) δ = 7,73 (1H, d), 7, 60-7,30 (1H + 5H, m) , 7,28 (1H, d), 5,30 (2H, s) e 3, 90 (3H, s) . ΡΕ1611112 157
Passo 2 1-(2-Benziloxi-5-cloro-fenil)-2- (trifenil-X5-fosfanilideno)-etanona ca
oez o <*)j A uma suspensão agitada de brometo de trifenil-fosfónio (2,14 g, 6,0 mmol) em THF seco (30 mL) à temperatura ambiente foi adicionado n-BuLi 1,6 M em hexano (5,25 mL, 8,39 mmol). A suspensão laranja foi agitada durante 3 horas. Em seguida, uma solução de 2-benzoiloxi-5-cloro-benzoato de metilo (0,83 g, 3,0 mmol) em THF (8 mL) foi adicionada lentamente. A mistura resultante foi agitada a 60 °C durante 2 horas e filtrada depois de arrefecida. DCM (100 mL) foi adicionado ao filtrado e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água salgada (2x80 mL) . Após filtração e evaporação do solvente, foi obtido um óleo amarelo (2,0 g). Ele foi em seguida purificado por cromatografia, eluido com EtOAc:hexano 1:1, e originou 0,97 g de sólidos. Rf= 0,43; 1H-RMN (d6-acetona) δ = 7, 80-7,52 (20H, m) , 7,40-7,20 (1H+1H+1H, m) , 5,25 (2H, s) , 4,72 (1H, s, trans-H) e 4,62 (1H, s, cis-H) ; LCMS: (M+l)+=521,2 (TR = 5,94 min).
Passo 3 4-(2-Benziloxi-5-cloro-fenil)-2,4- dioxo-3-(trifenil-X5-fosfanilideno)-butirato de etilo 158 ΡΕ1611112
A uma solução de 1-(2-benziloxi-5-cloro-fenil)-2-- (trifenil-X5-fosfanilideno) -etanona (0,49 g, 0,94 mmol), NEt3 (96 mg, 0,94 mmol) e DMAP (12 mg, 0,09 mmol) em tolueno seco (20 mL) à temperatura ambiente, foi adicionado clorooxoacetato de etilo (0,38 g, 2,78 mmol) em tolueno (5 mL). A mistura foi agitada durante 2 horas e vertida em água (50 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aqa foi extraída com EtOAc (2x40 mL). As camadas orgânicas combinadas foram em seguida lavadas com solução sata de NaHCCb (2x40 mL) , ácido citrico sat° (1x40 mL) , água salgada (1x40 mL) e secas. O óleo cru (0,36 g) foi purificado por cromatografia, eluído com EtOAc. Rf= 0,88; 1H-RMN (dg-acetona) δ = 7,75-7,40 (15H, m) , 7,30 (1H, dd) , 7,15 (1H, d), 7,05 (1H, d), 5,10 (2H, s) , 3,60 (2H, q) e 1,10 (3H, s). LCMS: (M+l)+=621,2 (TR = 6,49 min).
Passo 4 3-(2-Benzoiloxi-5-cloro-benzoil)-3- bromo-3H-azirina-2-carboxilato de etilo α
A uma solução de 4-(2-benziloxi-5-cloro-fenil)- 159 ΡΕ1611112 -2,4-dioxo-3-(trifenil-X5-fosfanilideno)-butirato de metilo (0,143 g, 0,23 mmol) em DCM (8 mL) à temperatura ambiente, uma mistura de TMSN3 (40 mg, 0,35 mmol) e NBS (62 mg, 0,35 mmol) em DCM (6 mL) foi adicionado. A solução resultante foi agitada durante 2 horas. Depois da evaporação do solvente, o produto cru foi purificado por TLC preparativa. Foram obtidos sólidos amarelos (38 mg) .
Rf= 0,7 3 (EtOAc:hexano 1:2). 1H-RMN (d6~acetona) δ = 7,80 (1H, d), 7,60 (1H, dd) , 7,40 (5H, m) , 7,30 (1H, d) , 5,20 (2H, s), 4,10 (2H, q) e 1,00 (3H, t) ; LCMS: (M+l)+= = 438,0 (Rt=7,32 min) .
Passo 5 5-(2-Benzoiloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo- isoxazole-3-carboxilato de etilo
Cl
3- (2-Benzoiloxi-5-cloro-benzoil)-3-bromo-3H--azirina-2-carboxilato de etilo (55 mg, 0,12 mmol) foi aquecido a refluxo em tolueno seco durante 2 h. Após evaporação do solvente, os sólidos crus (34 mg) foram obtidos e purificados por TLC preparativa (EtOAc:hexano 1:2) , Rf= 0,73 (fluorescente) . 1H-RMN (d6-acetona) δ = 7, 60 (1H, d) , 7,50 (1H, dd), 7,40 (1H, d) , 7,30 (5H, nf ), 5,25 (2H, s) , 4,42 (2H, q) e 1,40 (3H, t ); LCMS: (M+l) +=438,0 (TR = 7,09 min) . ΡΕ1611112 160
Passo 6 Etil-5-(2-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazol-3-carboxamida
Q
A uma solução de 5-(2-benzoiloxi-5-cloro-fenil)--4-bromo-isoxazol-3-carboxilato de etilo (30 mg, 6,8xl0“2 mmol) em EtOH (1 mL) , foi adicionada etilamina (70% em água, 1 mL). A solução foi aquecida a 100 °C num reator de micro-ondas CEM® (200 W) durante uma hora. Depois disso, o solvente foi evaporado e o composto foi purificado por TLC preparativa para dar sólidos (20 mg) , Rf: 0,39 (EtOAc:hexano 1:4). 1H-RMN (d6-acetona) δ = 8,10 (1H, s, largo), 7,50 (1H, d), 7,45- -7,35 (1H+1H, m) , 7,25 (5H, m) , 5,20 (2H, s) , • 3,40 (2H, q) e 1,20 (3H, t) ; LCMS: (M+l)+= 437,1 (TR = 6, .57 min).
Passo 7 Etil-5-(2-benziloxi-5-cloro-fenil)-4-(4-morfolin--4-ilmetilfenil)-isoxazol-3-carboxamida
Uma mistura de etil-5-(2-enziloxi-5-cloro-fenil)- 161 ΡΕ1611112 -4-bromo-isoxazol-3-carboxamida (30 mg, 5, 6xl0“2 mmol), Pd(Ph3P)4 (4 mg, 3,5xl0”2 mmol), 4-[4-(4,4,5,5-tetrametil--[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-benzil]-morfolina (63 mg, 0,2 mmol) e solução 1 M de NaHCCb (0,2 mL) em DME (1 mL) foi agitada a 80 °C sob gás árgon, durante 16 h. Após arrefecimento, a solução foi diluida com água (8 mL) e extraída com EtOAc (2x20 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água salgada (1x20 mL) e secas. Após filtração e evaporação dos solventes, o produto cru foi purificado por TLC preparativa, produziu 30 mg de sólidos, Rf= 0,44 (EtOAc). 1H-RMN (d6-acetona) δ = 8,25 (1H, s, largo), 7,60 (1H, d), 7,55 (1H, dd) , 7,45 (1H, d), 7,30-6, 90 (9H, m) , 5,00 (2H, s), 3,55 (4H, m) , 3,45 (2H+2H, s+q) ; 2,30 (4H, m) e 1,20 (3H, t); LCMS: (M+l)+= 532,2 (TR = 4,39 min).
Passo 8 Etil-5-(5-cloro-2-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazole-3-carboxamida
A uma solução de etil-5-(2-benziloxi-5-cloro--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxa-mida (25 mg, 4,7xl0”2 mmol) em DCM (5 mL) a 0 °C, BCI3 1 M em DCM (0,15 mL) foi adicionado. A solução amarela turva resultante foi então agitada a 0 °C durante 15 minutos e à 162 ΡΕ1611112 temperatura ambiente 3 a 4 horas até que se tornou clara. Depois disso, a solução foi extinta por MeOH (1 mL). NaHCCb sat° (1 mL) foi em seguida adicionado e extraiu-se com EtOAc (2x2 mL) e secou-se. Depois do solvente ser filtrado e evaporado, o óleo cru foi purificado por TLC preparativa (EtOAc:MeOH 50:1), produzindo 12 mg de sólidos. 1H-RMN (d4-MeOD) δ = 7,60 (2H, d), 7,50-7,30 (1H+1H+1H, m), 7,00 (2H, d), 3,70 (4H, m) , 3,60 (2H, s) , 3,50 (2H, q) , 2,60 (4H, m) e 1,25 (3H, t); LCMS: (M+l)+= 442,2 (TR = 3,54 min). O isómero 4-hidroxi foi preparado de um modo semelhante à sua contraparte 2-hidroxi como se segue:
Exemplo 87
Etil-5-(3-cloro-4-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil- -fenil)-isoxazol-3-carboxamida
Passo 1 4-Benzoiloxi-3-cloro-benzoato de metilo α
Dissolveu-se 3-cloro-4-hidroxi-benzoato de metilo 163 ΡΕ1611112 (1,0 g, 5,36 mmol) deu um sólido cru (1,57 g) . 1H-RMN (dg-acetona) δ = 8,00 (1H, d), 7,95 (1H, dd) , 7, 60-7,40 (5H, m) , 7,35 (1H, d), 5,40 (2H, s) e 3,90 (3H, s) .
Passo 2 1-(4-Benziloxi-3-cloro-fenil)-2-(trifenil-λ5- -fosfanilideno)-etanona
Cl
4-Benzoiloxi-3-cloro-benzoato de metilo (1,5 g, 5,40 mmol) deu um sólido cru (2,5 g) . Rf= 0,31 (EtOAc: hexano 1:1). 1H-NMR (dg-acetona) δ = 8,05 (1H, d), 7,90 (1H, dd) , 7,85-7,35 (20H, m) , 7,20 (1H, d), 5,30 (2H, s), 4,60 (1H, s, trans-H) e 4,50 (1H, s, cis-H) ; LCMS: (M+l)+= 521,2 (TR = 5,29 min) .
Passo 3 4-(4-Benziloxi-3-cloro-fenil)-2,4-dioxo-3- (trifenil-X5-fosfanilideno) -butirato de etilo
1-(4-Benziloxi-3-cloro-fenil)-2- (trifenil-X5-fos-fanilideno)-etanona (1,84 g, 3,53 mmol) deu origem a um sólido cru (1,43 g) . 1H-RMN (dg-acetona) δ = 8,00-7,35 (22H, m) , 7,20 (1H, d), 5,35 (2H, s), 3,55 (2H, q) e 1,14 (3H, s); LCMS: (M+l)+= 621,2 (TR = 7,29 min). 164 ΡΕ1611112
Passo 4 Etil-3-(4-benzoiloxi-3-cloro-benzoil)-3-bromo-3H--azirina-2-carboxilato de etilo
4- (4-Benziloxi-3-cloro-fenil)-2,4-dioxo-3-(trife-nil-X5-fosfanilideno)-butirato de etilo (0,74 g, 1,19 mmol) deu um sólido (0,168 g) após a purificação em por TLC em coluna e preparativa, Rf= 0,24 (EtOAc:hexano 1:6). 1H-RMN (d6~acetona) δ = 8, 00 (1H, d), 7,90 (1H, dd), 7,50 (1H, d) , 7,40 (5H, m) , 5, 40 (2H, s), 4,05 (2H, q) e 0, 95 (3H, t) ; LCMS: (M+l)+= 438 ,1 (TR = 7,27 min).
Passo 5 5-(4-Benzoiloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazole- -3-carboxilato de etilo
3-(4-Benziloxi-3-cloro-benzoil)-3-bromo-3H-aziri-na-2-carboxilato de etilo (68 mg, 0,16 mmol) deu origem a um sólido (20 mg) depois de TLC preparativa e cristalização (EtOH). Rf= 0,26 (fluorescente) (EtOAc:hexano 1:4). 1H-RMN (d6-acetona) δ = 8,00 (1H, d), 7,90 (1H, dd) , 7,50 (1H, d), 7,40 (5H, m) , 5,35 (2H, s) , 4,45 (2H, q) e 1,40 (3H, t) . LCMS: (M+l)+= 438,0 (TR = 7,39 min). 165 ΡΕ1611112
Passo 6 Etil-5-(4-benziloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo--isoxazole-3-carboxamida α
5-(4-Benziloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo-isoxazole--3-carboxilato de etilo (10 mg, 2,3xl0“2 mmol) deu um sólido cru (8 mg); Rf= 0,53 (EtOAc:hexano 1:2). 1H-RMN (d6~ acetona) δ = 8,15 (1H, s, largo), 8,00 (1H, d), 7,90 (1H, dd) , 7,50 (1H, d), 7,40 (5H, m) , 5,32 (2H, s) , 3,42 (2H, q) e 1,20 (3H, t) .
Passo 7 Etil-5-(4-benziloxi-3-cloro-fenil)-4-(4-morfolin--4-ilmetilfenil)-isoxazole-3-carboxamida
Etil-5- (4-benziloxi-3-cloro-fenil)-4-bromo-isoxa-zole-3-carboxamida (10 mg, 2,3xl0“2 mmol) deu origem a um sólido cru (10 mg) , que foi em seguida usado no passo seguinte sem qualquer purificação adicional. 166 ΡΕ1611112
Passo 8 Etil-5-(3-cloro-4-hidroxi-fenil)-4-(4-morfolin-4--il-metil-fenil)-isoxazole-3-carboxamida
Etil-5- (4-benziloxi-3-cloro-fenil)-4-(4-morfolin--4-il-metil-fenil)-isoxazole-3-carboxamida (8 mg, l,5xl0“2 mmol) deu origem a um sólido em bruto (2 mg) depois de purificada duas vezes por TLC preparativa (EtOAc:MeOH 50:1). 1H-RMN (d4-MeOD) δ = 7,70 (2H, d), 7,60 (1H, d), 7,45 (1H+1H, m), 7,00 (2H, d), 3,80 (4H, m) , 3,75 (2H, s) , 3,50 (2H, q) , 2,82 (4H, m) e 1,25 (3H, t) ; LCMS: (M+l)+= 442,2 (TR = 4, 47 min) .
Exemplo 88 3-[4-(4-Bromo-fenil)-isoxazol-5-il]-5-cloro-2,6-di-hidroxi--benzaldeído
Passo 1 3-(4-Bromo-fenil)-6-cloro-7-hidroxi-4-oxo-4H- -cromeno-8-carbaldeido
167 ΡΕ1611112 3-(4-Bromo-fenil)-6-cloro-7-hidroxi-cromen-4-ona (0,35 g, 1 iranol) e hexametileno-tetramina (0,14 g, 1 mmol) foram dissolvidos em ácido acético glacial (20 mL) e aquecidos durante a noite a 100 °C. HC1 6 M (10 mL) quente foi adicionado e a mistura foi aquecida durante mais uma hora antes de ser vertida em água. O precipitado formado foi filtrado, lavado e seco para dar o produto desejado puro na forma dum sólido castanho pálido. LCMS (LCQ) tR= 8,27; MS m/z 377,3/379,2 [M-H]".
Passo 2 3-[4-(4-Bromo-fenil)-isoxazol-5-il]-5-cloro-2,6- -di-hidroxibenzaldeido
A uma solução de 3-(4-bromo-fenil)-6-cloro-7--hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-8-carbaldeído, 53,5 mg, 0,14 mmol) em EtOH (6 mL) , foi adicionado hidrocloreto de hidroxil-amina (100 mg, 1,4 mmol). A mistura resultante foi aquecida em refluxo durante 16 h. EtOH foi evaporado e EtOAc (20 mL) foi adicionado. A camada orgânica foi lavada com NaHC03 sat° e seca . Foram obtidos sólidos (33 mg) quando o óleo resultante foi triturado com éter. 1H-RMN (de-DMSO) δ = 9, 83 (1H, s ), 8,70 (1H, s), 8,21 (1H, s), 7,78 (2H, d) e 7, 68 (2H, s) . LCMS: (M+l)+= 394,1 (TR = 8,60 min) . 168 ΡΕ1611112
Exemplo 89
Hidroxiamida do ácido 5-(5-etil-2-hidroxi-4-metoxi-fenil)--4-(4-fluoro-fenil)-isoxazole-3-carboxílico
Passo 1 1-(5-Etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-2-(4-fluoro- -fenil)-etanona
Etil-resorcinol (5,37 g, 39 mmol) e ácido 4-fluo-rofenilacético (6,00 g, 39 mmol) foram dissolvidos em ete-rato de BF3 (40 mL). A solução foi aquecida a 80 °C durante 4 horas. Quando arrefecida, foi cuidadosamente adicionada água (100 mL) e a solução foi extraida com EtOAc (2x80 mL). As camadas orgânicas foram em seguida lavadas com NaHC03 sata (cuidado) (2x100 mL) e água salgada (2x100 mL) e seca com Na2S04. Depois da purificação com carvão vegetal desco-rante, um xarope verde escuro (10,5 g) foi obtido. Rf=0,4 (EtOAc:n-hexano 1:3). O composto foi utilizado no passo seguinte sem purificação adicional. 1H-RMN (dô-acetona) δ = 169 ΡΕ1611112 7, 80 (1H, s) , 7,35 (2H, m) , 7,00 (1H, m) , 4, 35 (2H, s) , 2,55 (2H, q) e 1,10 (3H, t). 6,35 (1Η, s) ,
Passo 2 Éster de etilo do ácido 4-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-3-(4-fluoro-fenil)-2,4-dioxo-butirico
A uma solução de 1-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)--2-(4-fluoro-fenil)-etanona (10,3 g, 37,6 mmol) em piridina seca (100 mL) a 0 °C, cloro-oxoacetato de etilo (15,4 g, 112,8 mmol) foi adicionado. A solução foi agitada a 0 °C durante 4 horas e à temperatura ambiente durante 16 horas. A camada aqa foi neutralizada com HC1 1 M e extraída com DCM (2x100 mL) . As camadas de DCM combinadas foram então lavadas com HC1 2 M (2x80 mL), NaHCCb sat° (1x100 mL), água salgada (1x100 mL) e secas com Na2SC>4. Após filtração e evaporação do solvente, o óleo castanho escuro foi obtido (11,4 g). Rf= 0,22 (EtOAc:n-hexano 1:2). LCMS mostra que é uma mistura do produto desejado, [ (M-l) ”=373, 1, TR = 7,27) e o cromeno carboxilato ciclizado [(M-l)”= 355,4, TR = 7,83), numa proporção de ca. 6:1. Uma pequena quantidade de amostra foi purificada por TLC prep. para análise espectroscópica. 1H-RMN (d6-acetona) δ = 7,75 (1H, s), 7,30 (2H, m) , 7,00 (1H, m) , 6,45 (1H, s) , 4,65 (1H, s) , 4,25 (2H, q) , 2,55 (2H, q) e 1,10 (6H, t) . 170 ΡΕ1611112
Passo 3 Éster de etilo do ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fenil)-7-hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxilico
Éster de etilo do ácido 4-(5-etil-2,4-di-hidroxi- -fenil)-3-(4-fluoro-fenil)-2,4-dioxo-butírico (3,22 g, 8,6 mmol) foi refluxado numa mistura de HC1 0,8 M e MeOH (20 mL/20 mL) durante 3 horas a 100 °C. Depois disso, o MeOH foi evaporado e a camada aqa foi extraida com EtOAc (2x60 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com NaHC03 sat° (1x80 mL) , água salgada (2x80 mL) , (1x80 mL) e secas com Na2S04. Depois da purificação com carvão vegetal descorante e evaporação do solvente, foram obtidos sólidos castanhos pegajosas. Eles foram em seguida extraídos com éter quente e foram obtidos sólidos amarelos escuros (0,26 g) . Rf= 0,43 (EtOAc:n-hexano 1:2). LCMS: (M+l) += 357,3 (TR = 7,83). 1H-RMN (d6-Acetona) δ = 9,75 (1H, s), 7,80 (1H, s), 7,25 (2H, m) , 7,10 (1H, m) , 6,90 (1H, s) , 4,05 (2H, q) , 2,70 (2H, q) , 1,20 (3H, t) e 0,95 (3H, t) .
Passo 4 Éster de etilo do ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fe-nil)-7-metoxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxilico
MeO 171 ΡΕ1611112
Iodometano (0,10 mL, 12 eq) foi adicionado a uma solução de éster de etilo do ácido 6-etil-3-(4-fluoro--fenil)-7-hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico (50 mg, 0,14 mmol) e carbonato de potássio (58 mg, 3,0 eq) em acetona e a mistura foi refluxada durante a noite. Os voláteis foram em seguida evaporados sob vácuo e o residuo foi repartido entre água (15 mL) e EtOAc (15 mL) . A camada orgânica foi lavada com água salgada, seca sobre MgS04 e evaporada até à secura em vácuo para dar um produto cristalino branco (45 mg, rendimento de 87%). õH(CDCl3), 7,96 (1H, s, Ar-H) , 7,27 (2H, m, Ar-H) , 7,12 (2H, m, Ar-B) , 6,92 (1H, s, Ar-H) , kO \—1 V q aí cu C02CJ?2CH3), 3,95 ( OCH3) , 2,71 (3H, q, CH2CR3 ), 1,24 (3H, t, C02CH2C H3) (3H, t, CH2C.H3) ·
Passo 5 Hidroxiamida do ácido 5-(5-etil-2-hidroxi-4-metoxi--fenil)-4-(4-fluoro-fenil)-isoxazole-3-carbo-xilico
A éster de etilo do ácido 6-etil-3-(4-fluoro-fenil)-7--metoxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico (25 mg, 0,068 mmol) em etanol (2,5 mL) foi adicionada hidroxilamina (50% em água, 1 mL) e a solução foi agitada durante 48 h. Os voláteis foram evaporados sob vácuo e o residuo foi purificado por TLC preparativa (10% de MeOH em DCM) para 172 ΡΕ1611112 dar o produto desejado na forma dum sólido castanho claro (3 mg, rendimento de 12%) . LCMS (LCT) tR= 6,54, MS m/z 373, 17; [M+H]+; δΗ (dô-acetona), 10,73 (1H, s largo), 8,59 (1H, s largo), 7,39 (2H, m, Ar-H) , 7,07 (2H, m, Ar-H) , 7,00 (1H, s, Ar-H), 6,55 (1H, s, Ar-H), 3,82 (3H, s, OCH3) , 2,48 (2H, q, CH2CH3), 1,30 (1H, s largo), 1,01 (3H, t, CH2CH3) .
Exemplo 90
Hidroxiamida do ácido 5-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-4-(4--fluoro-fenil)-isoxazole-3-carboxílico
A éster de etilo do ácido 6-etil-3-(4-fluoro--fenil)-7-hidroxi-4-oxo-4H-cromeno-2-carboxílico (25 mg, 0,070 mmol) em etanol (2,5 mL) foi adicionada hidroxilamina (50% em água, 1 mL) e a solução foi agitada durante 48 h. Os voláteis foram evaporados sob vácuo e o resíduo foi purificado por TLC preparativa (MeOH 15% em DCM) para dar o produto desejado na forma dum sólido castanho (2 mg, 8% de rendimento). LCMS (LCT) tR= 5,63, MS m/z 359,13; [M+H]+; δΗ (dõ-acetona), 10,72 (1H, s largo, CONH) , 8,69 (1H, s largo, Ar-OH) , 8,5 9 (1H, s largo, Ar-OH) , 7,39 (2H, m, Ar-H) , 7,06 (2H, m, Ar-H) , 6,99 (1H, s , Ar-H) , 6, 52 (1H, s, Ar-H) , 2,49 (2H, g, CH2CH3), 1,31 (1H, s largo), 1,08 (3H, t, CH2CH3) . 173 ΡΕ1611112
Resultados Biológicos A atividade de ATPase intrínseca de HSP90 pode ser medida utilizando HSP90 de levedura como um sistema modelo. 0 ensaio, baseado na utilização de verde de mala-quite para a medição de fosfato inorgânico, foi utilizado para testar a atividade inibitória da HSP90 de alguns dos compostos dos Exemplos aqui apresentados.
Ensaio de ATPase de Verde de Malaquite Materiais
Os produtos químicos são da mais elevada pureza comercialmente disponível e todas as soluções aquosas são preparadas em água AR. Por causa da necessidade de minimizar a contaminação com fosfato inorgânico, devem ser tomadas precauções com soluções e aparelhos utilizados nos ensaios. Os materiais de vidro e os medidores de pH são lavados com água duplamente destilada ou desionizada antes da utilização e, sempre que possível, deverá ser usado material de plástico. As luvas são usadas por todos os procedimentos. (1) Placas de multicavidades de polistireno de fundo plano Greiner de 384 cavidades (Greiner 781101) ou Costar de 384 cavidades (VWR). (2) Tampão de ensaio de (a) Tris 100 mM-HCl, pH 7,4, (b) KC1 150 mM, (c) MgCl2 6 mM. Armazenado à temperatura ambiente. (3) Verde de malaquite 0,0812% (m/v) (M 9636, Sigma 174 ΡΕ1611112
Aldrich Ltd., Poole, UK). Armazenado à temperatura ambiente. (4) Álcool polivinilico 2,32% (m/v) USP (P 1097, Sigma Aldrich Ltd, Poole, UK) em água fervente (ver Comentários 1), deixado a arrefecer, e armazenado à temperatura ambiente. (5) Molibdato de amónio 5,72% (m/v) em ácido clorídrico 6 M. Armazenado à temperatura ambiente. (6) Citrato de sódio 34% (m/v). Armazenado a temperatura ambiente. (7) ATP 100 mM, sal dissódico, qualidade especial (47699, Sigma Aldrich). Armazenados a 20 °C. (8) Proteina de HSP90 de levedura expressa em E. coli, purificada >95% (ver, por exemplo, Panaretou et al.r 1998) e armazenada em alíquotas de 50 pL a -80 °C. Método 1. Diluir os compostos de teste até 500 μΜ em água AR (a concentração de DMSO será de 2,5%). Transferir 2,5 pL destes compostos directamente a partir da placa filha para a placa de ensaio, originando uma concentração de ensaio final de 100 pM. Para obter valores de CI5o de 12 pontos, realizar diluições em série 1:2 para produzir uma gama de concentrações de ensaio desde 100 pM até 97,6 nM (DMSO 2,5%) e transferir 2,5 pL de cada concentração para a placa de ensaio. A coluna 1 da placa de ensaio não contém composto, como um 175 ΡΕ1611112 controlo negativo. Uma linha adicional sem composto é também usada como fundo. 2. Preparar ATP diluindo estoque de 100 mM até 925 μΜ com tampão de ensaio, e fazer aliquotas de 5 pL de ATP diluido para cada cavidade, incluindo os controlos (concentração de ensaio final de 370 μΜ). 3. Adicionar 5 pL de tampão à linha de fundo. 4. Diluir a preparação enzimática até 1,05 pM com tampão de ensaio, e fazer aliquotas de 5 pL para cada cavidade de composto bem como para a coluna de controlo negativo. 5. Recolher os reagentes para o fundo da cavidade, cobrir a placa com vedante de placa e incubar durante a noite a 37 °C. 6. Primeira coisa de manhã é preparar o reagente verde de malaquite. Adicionar 2 partes de Solução de Verde de Malaquite, 1 parte de solução de álcool polivinilico, 1 parte de solução de molibdato de amónio e 2 partes de água AR. 7. Inverter para misturar, e deixar durante aproximada-mente 1 hora até que a cor mude de castanho para amarelo dourado. 8. Adicionar 40 pL de reagente verde de malaquite a cada poço, deixar 5 minutos para permitir que a cor se desenvolva. 9. Adicionar 5 pL de reagente de citrato de sódio a cada cavidade (ver Comentário 2). 176 ΡΕ1611112 10. Recobrir com vedante de placa e agitar em agitador de placas durante pelo menos 15 minutos. 11. Medir a absorvância em 620 nm utilizando um leitor de placas apropriado (por exemplo, Victor, Perkin Elmer Life Sciences, Milton Keynes, RU). Sob estas condições, a absorvância de controlo é de 0,9 a 1,4, e o fundo é 0,2-0,35 dando uma razão de sinal para ruido de ~12. O fator Z' calculado a partir de dados obtidos usando estas condições está entre 0,6 e 0,9.
Comentários (1) 0 álcool polivinilico dissolve-se em água a ferver com dificuldade e é necessária agitação durante 2-3 h. (2) O intervalo de tempo entre a adição do reagente de verde de malaquite e o citrato de sódio deve ser mantido tão curto quanto possível, a fim de reduzir a hidrólise não enzimática de ATP. Uma vez que o citrato de sódio adicionado, a cor é estável durante 4 h à temperatura ambiente. (3) Os compostos podem ser adicionados às placas de ensaio, utilizando um Biomek FX Robot (Beckman Coulter). Um dispensador Multidrop 384 (Thermo Labsystems, Basingstoke, UK) pode ser convenientemente utilizado para adicionar os reagentes à placa. (4) As condições do ensaio foram optimizadas com respeito ao tempo, proteína e concentração do substrato, a fim 177 ΡΕ1611112 de alcançar a concentração de proteína minima, enquanto se mantém um diferencial sinal para ruido. (5) Sinal para ruido (S/N) é calculada usando a seguinte equação: (S-B) / V(DP de S)2 + DP de B)2 (6) Para determinar a atividade especifica da HSP90, uma gama de concentrações de fosfato inorgânico (0-10 μΜ) é preparada e a absorvância em 620 nm medida conforme descrito. A atividade especifica é calculada a partir da curva de calibração resultante.
Os compostos testados no ensaio anterior foram atribuídos a um dos dois intervalos de atividade, nomeadamente, A = <50 μΜ, B = >50 μΜ, e as atribuições são relatados acima.
Um ensaio de inibição de crescimento foi também empregue para a avaliação de candidatos a inibidores de HSP90:
Avaliação da Citotoxicidade por Ensaio da Sulforrodamina B (SRB): Cálculo da Concentração Inibitória de 50% (CI50)
Dia 1 1) Determinar o número de células por hemocitómetro. 2) Usando um multipipetador de 8 canais, adicionar 160 μύ da suspensão de células (3600 células/cavidade ou 2xl04 células/mL) a cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. 178 ΡΕ1611112 3) Incubar durante a noite a 37 °C num incubador de CO2. Dia 2 4) Soluções de fármacos de stock são preparadas, e diluições em série de cada fármaco são realizados em meio para dar as concentrações finais nas cavidades. 5) Utilizando um multipipetador, 40 pL de fármaco (concentração final de 5x) são adicionados a cavidades em quadruplicado. 6) As cavidades de controlo estão em ambos os lados das placas de 96 cavidades, onde são adicionados 40 pL de meio. 7) Incubar as placas em incubadora de CO2 durante 4 dias (48 horas).
Dia 6 8) Despejar o meio para a pia e mergulhar a placa lentamente em ácido tricloroacético (TCA) a 10% gelado. Deixar cerca de 30 minutos sobre gelo. 9) Lavar as placas três vezes em água da torneira por imersão das placas nos banhos de água da torneira e despej ando-a. 10) Secar no incubador. 11) Adicionar 100 pL de SRB a 0,4% em ácido acético 1% a cada cavidade (excepto a última linha (lado direito) da placa de 96 cavidades, isto é o controlo de 0%, quer dizer, nenhuma droga, nenhum corante. A primeira linha será o controlo a 100% sem fármaco, mas com 179 ΡΕ1611112 corante). Deixar durante 15 minutos. 12) Deitar fora o corante de SRB não ligada com quatro lavagens de ácido acético a 1%. 13) Secar as placas no incubador. 14) Solubilizar a SRB usando 100 yL de base Tris 10 mM e colocar as placas no agitador de placas durante 5 minutos. 15) Determinar a absorvância em 540 nm utilizando um leitor de placas. Calcula a absorvância média para cavidades em quadruplicado e expressar como uma percentagem do valor para cavidades de controlo, não tratadas. 16) Fazer um gráfico de valores em % da absorvância contra log concentração de fármaco e determinar a CI5o· A título de ilustração, o composto do Exemplo 2 deu uma CI5o no intervalo 'A' (<50 μΜ) para o ensaio SRB de paragem do crescimento. O ensaio de Polarização de Fluorescência foi também empregue para a avaliação de alguns dos compostos dos Exemplos:
Ensaio de Polarização de Fluorescência A Polarização de Fluorescência {também conhecido como anisotropia de fluorescência} mede a rotação de uma espécie fluorescente em solução, onde quanto maior a molécula mais polarizada a emissão de fluorescência. 180 ΡΕ1611112
Quando o fluoróforo é excitado com luz polarizada, a luz emitida é também polarizada. O tamanho molecular é proporcional à polarização da emissão de fluorescência. A sonda marcada com fluoresceina - RBT0045864-FAM -
liga-se a HSP90 {HSP90 humana de comprimento completo, de levedura de comprimento completo ou do domínio N-terminal} e a anisotropia {rotação do complexo sonda:proteína} é medida. O composto de teste é adicionado à placa de ensaio, deixado a equilibrar e a anisotropia é medida de novo. Qualquer mudança na anisotropia é devida à ligação competitiva do composto a HSP90, libertando assim a sonda.
Materiais
Os produtos químicos são da mais elevada pureza comercialmente disponível e todas as soluções aquosas são preparadas em água AR. 1) Placa de ensaio preta de 96 cavidades Costar #3915 181 ΡΕ1611112
2) Tampão de ensaio de (a) Tris 100 mM pH 7,4, (b) KCI 20 mM, (c) MgCl2 6 mM. Armazenado à temperatura ambiente. 3) BSA (albumina de soro de bovino), 10 mg/mL (New England Biolabs #B9001S). 4) Sonda 20 mM em concentração de stock de DMSO 100%. Armazenado no escuro à temperatura ambiente. A concentração de trabalho é de 200 nM diluído em água AR e armazenada a 4 °C. Concentração final no ensaio de 80 nM. 5) Proteína de HSP90 de comprimento completo humana expressa em E. coli, purificado >95% (ver, por exemplo, Panaretou et al., 1998) e armazenada em alíquotas de 50 pL a -80 °C.
Protocolo 1) Adicionar 100 pL de tampão lx a cavidades 11A e 12A (= FP BLNK). 2) preparar a mistura de ensaio - todos os reagentes são mantidos em gelo com uma tampa sobre o recipiente quando a sonda é sensível à luz.
i. Cone. finaln 10 mL lx 5.0 pL 5 pg/mL 4.0 pL 80 nM 6,25 pL
200 nM • Tampão FP de HSP90 lx • BSA 10 mg/mL (NEB) • Sonda 200 μΜ • HSP90 comprimento completo humana 182 ΡΕ1611112 3) Alíquota de 100 pL de mistura de ensaio a todos as outras cavidades. 4) Vedar a placa e deixar no escuro à temperatura ambiente por 20 minutos para equilibrar.
Placa de Diluição do Composto -1x3 séries de diluição 1) Numa placa de fundo em V de 96 cavidades clara - {# VWR 007/008/257} adicionar 10 pL de DMSO 100% às cavidades BI a Hll. 2) Às cavidades AI a All adicionar 17,5 pL de DMSO 100%.
3) Adicionar 2,5 pL cpg a AI. Isto dá stock {50x} 2,5 mM cpg - assumindo cpds 20 mM. 4) Repetir para cavidades A2 a A10. Controlo nas colunas 11 e 12. 5) Transferir 5 pL da linha A para a linha B - não a coluna 12. Misturar bem. 6) Transferir 5 pL da linha B para a linha C. Misturar bem. 7) Repita para a linha G. 8) Não adicionar qualquer composto à linha H - esta é a linha 0. 9) Isto produz uma série de diluições 1x3 desde 50 pM a 0,07 pM. 10) Na cavidade B12 preparar 20 pL de composto padrão 100 pM. 11)
Após a primeira incubação da placa de ensaio é lida 183 ΡΕ1611112 num leitor de placas Fusion™ a-FP (Packard BioScience, Pangboume, Berkshire, UK). 12) Após a primeira leitura, 2 pL de composto diluido são adicionados a cada cavidade para as colunas 1 a 10. Na coluna 11 {fornece a curva padrão} adicionar apenas composto Bll-Hll. Adicionar 2 pL de cpd padrão 100 mM às cavidades B12-H12 {é o controlo positivo}. 13) O factor Z' é calculado a partir dos controlos zero e cavidades positivas. Tipicamente dá um valor de 0,7-0, 9.
Os compostos testados no ensaio acima foram atribuídos a um de dois intervalos de atividade, nomeadamente A = <10 pM, B = >10 pM, e as atribuições são relatadas acima. A titulo de ilustração, o composto do Exemplo 2 deu uma CI50 no intervalo Ά' .
REFERÊNCIAS
Numerosas publicações são citadas acima a fim de descrever e revelar mais completamente a invenção e o estado da técnica à qual a invenção pertence. As citações completas para estas referências são fornecidas abaixo. Y. Argon Y e BB. Simen, "Grp94, an ER chaperone with protein and peptide binding properties" in Semin. Cell Dev. Biol., 10 (1999) 495-505. M-JJE Bijlmakers, M. Marsh, "Hsp90 is essential for the synthesis and subsequent membrane association, but not 184 ΡΕ1611112 the maintenance, of the Src-kinase p561ck" in Molecular Biology of the Cell, 11 (2000) 51585-1595 M. Bucci, F. Roviezzo, C. Cicala, W. C. Sessa, G. Cirino, "Geldanamycin, an inhibitor of heat shock protein 90 (Hsp90) mediated signal transduction has anti-inflammatory effects and interacts with glucocorticoid receptor in vivo" in Brit. J. Pharmacol., 131 (2000) 113-16. C. F. Chen, Y. Chen, K. D. Dai, P. L. Chen, D. J. Riley e W.-H. Lee, "A new member of the hsp90 family of molecular chaperones interacts with the retinoblastoma protein during mitosis and after heat shock" in Mol. Cell. Biol., 16 (1996) 4691-4699. G. Chiosis, Μ. N. Timaul, B. Lucas, P. N. Munster, F. F. Zheng, L. Sepp-Lozenzino e N. Rosen, "A small molecule designed to bind to the adenine nucleotide pocket of HSP90 causes Her2 degradation and the growth arrest and differentiation of breast câncer cells" in Chem. Biol., 8 (2001) 289-299. S. E. Conroy e D. S. Latchman, "Do heat shock proteins have a role in breast câncer?" in Brit. J. Câncer, 74 (1996) 717-721. S. J. Felts, BAL Owen, P. Nguyen, J. Trepei, D. B. Donner e D. O. Toft, "The HSP90-related protein TRAP1 is a mitochondrial protein with distinct functional properties" in J. Biol. Chem., 5 (2000) 3305-3312. W. Fuller, A. W. Cuthbert, "Post-translational disruption of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-molecular Chaperone complex 185 ΡΕ1611112 with geldanamycin stabilizes delta F508 CFTR in the rabbit reticulocyte lysate" in J. Biol. Chem., 275(48) (2000) 37462-37468. E. Hickey, S. E. Brandon, G. Smale, D. Lloyd w L. A. Weber, "Sequence and regulation of a gene encoding a human 89-kilodalton heat shock protein" in Mol. Cell. Biol., 9 (1999) 2615-2626. A. T. Hoang, J. Huang, N. Rudra-Gonguly, J. Zheng, W. C. Powell, S. K. Rabindron, C. Wu e P. Roy-Burman, "A novel association between the human heat shock transcription factor I (HSF1) and prostate adenocarcinoma" in Am. J. Pathol., 156 (2000) 857-864. I. Hostein, D. Robertson, F. Di Stefano, P. Workman e P. A. Clarke, "Inhibition of signal transduction by the HSP90 inhibitor 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin results in cytostasis and apoptosis" in Câncer Res., 61 (2001) 4003-4009. E. Hur, H.-H. Kim, S. M. Choi, J. H. Kim, S. Yim, H. J. Kwon, Y. Choi, D. K. Kim, M. 0. Lee, H. Park, "Reduction of hypoxia-induced transcription through the repression of hypoxia-inducible factor-la/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator DNA binding by the 90-kDa heat-shock protein inhibitor radicicol" in Mol. Pharmacol., 62 (2002) 5975-982.
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Lisboa, 24 de outubro de 2012

Claims (28)

  1. ΡΕ1611112 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de fórmula (A) ou (B) ou um seu sal, N-óxido, hidrato ou solvato:
    (A) (B) em que Ri é um grupo de fórmula (IB)
    em que, em qualquer combinação compatível R representa um ou mais substituintes facultativos, Alk1 e Alk2 são grupos alquileno Ci-C6 ou alce-nileno C2-C6 divalentes facultativamente substituídos, p, r e s são independentemente 0 ou 1, Z é -0-, -S-, -(C=0)-, -C (=S) -, -SO2-, -C(=0)0-, -C(=0)NRa-, -C(=S)NRa-, -S02NRa-, -NRaC(=0)-, -nraso2- ou NRa- em que RA é hidrogénio ou alquilo Ci-Cõ, e Q é hidrogénio ou um grupo carbocíclico ou heterocíclico facultativamente substituído; 2 ΡΕ1611112 R2 é (i) um grupo de fórmula (IA): -Ar1- (Alk1) p- (Z) r- (Alk2) S-Q (IA) em que, em qualquer combinação compatível Ar1 é um grupo arilo ou heteroarilo facultativamente substituído ou heteroarilo, e Alk1, Alk2, p, r, s, Z, RA e Q são conforme definidos em relação a Ri; (ii) um grupo carboxamida; ou (iii) um anel carbocíclico ou heterocíclico aromático em que um carbono do anel é facultativamente substituído, e/ou um azoto do anel é facultativamente substituído por um grupo de fórmula - (Alk1) p- (Z) r- (Alk2) S-Q em que Q, Alk1, Alk2, Z, p, r e s são conforme acima definidos em relação ao grupo (IA); e R3 é um grupo carboxilo, carboxamida ou éster de carboxilo o termo "facultativamente substituído" significando substituído com até quatro substituintes compatíveis, cada um dos quais sendo independentemente seleccionado a partir de alquilo Ci-Cõ, alcoxi (Ci-Cô) , hidroxi, hidroxi-alquilo (Ci-C6) , mercapto, mercapto-alquilo (Ci-C6) , (alquil Ci-Cô) --tio, halo (incluindo fluoro, bromo e cloro), trifluoro-metilo, trifluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN), oxo, fenilo, 3 ΡΕ1611112 -COOH, -coora, -cora, -so2ra, -conh2, -so2nh2, -conhra, -so2nhra, -conrarb, -so2nrarb, -nh2, -nhra, -nrarb, -oconh2, -oconhra, -oconrarb, -nhcora, -nhcoora, -nrbcoora, -nhso2ora, -nrbso2oh, -nrbso2ora, -nhconh2, -nraconh2, -nhconhrb, -NRaCONHRb, -NHCONRaRb ou -NRaCONRaRb em que Ra e RB são, independentemente, um grupo alquilo C1-C6, e o termo "carboxamida" significa um grupo de fórmula -CONH2 ou um grupo metilaminocarbonilo, etilaminocarbonilo ou isopropilaminocarbonilo, ou um grupo de fórmula -CONRB (Alk) nRA em que Alk é um grupo alquileno, alcenileno ou alci-nileno divalente facultativamente substituído, n é 0 ou 1, Rb é hidrogénio ou um grupo alquilo Ci-Cõ ou alcenilo C2-C6, Ra é hidroxi ou carbociclilo ou heterociclilo facultativamente substituído, ou Ra e Rb tomados em conjunto com o azoto ao qual eles estão ligados formam um anel N-heterociclico que pode facultativamente conter um ou mais hete-roátomos adicionais seleccionados de entre 0, S e N, e que pode ser facultativamente substituído num ou mais átomos C ou N do anel.
  2. 2. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 1 em que R3 é um grupo carboxamida.
  3. 3. Um composto conforme reivindicado nas rei- 4 ΡΕ1611112 vindicação 1 ou reivindicação 2, em que o composto é um de fórmula (A).
  4. 4. Um composto conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes em que o átomo de carbono do anel adjacente ao grupo hidroxilo no radical (IB) não é substituído.
  5. 5. Um composto conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes em que, no Ri, cada um dep, reséO, eQé hidrogénio.
  6. 6. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 2 ou qualquer uma das reivindicações 3 a 5 quando dependentes da reivindicação 2, em que Ri é fenilo facultativamente substituído, em que o termo "facultativamente substituído" tem o significado definido na reivindicação 1.
  7. 7. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 5, em que Ri é 2-hidroxifenilo, ainda facultativamente substituído por um ou mais de hidroxilo, metilo, etilo, metoxi, etoxi, cloro ou bromo.
  8. 8. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 5, em que Ri é 2,4-di-hidroxifenilo, substituídos na posição 5 por metilo, etilo, isopropilo, isobutilo, terc-butilo, cloro ou bromo. 5 ΡΕ1611112
  9. 9. Um composto conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que, no Ri, p, r e s são cada um 0, e Q é um anel carbocíclico ou heterocíclico facultativamente substituído, em que o termo "facultativamente substituído" tem o significado definido na reivindicação 1.
  10. 10. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 9, em que Q é um anel fenilo ou piridilo facultativamente substituído, em que o termo "facultativamente substituído" tem o significado definido na reivindicação 1.
  11. 11. Um composto conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que, no Ri, p e/ou s são cada um 1, e r é 0.
  12. 12. Um composto conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que, no Ri, cada um de p, r, e s é 1.
  13. 13. Um composto conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que, no Ri, p e s são cada um 0 e r é 1.
  14. 14. Um composto conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes em que R2 é 2-, 3-ou 4-piridilo, 2- ou 3-furanilo, 2- ou 3-tienilo, ou tiazolilo, facultativamente substituído, em que o termo "facultativamente substituído" tem o significado definido na reivindicação 1. 6 ΡΕ1611112
  15. 15. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 14, em que os substituintes facultativos presentes em R2 são seleccionados a partir de metoxi, etoxi, metile-nodioxi, etilenodioxi, flúor, cloro, bromo e trifluoro- metilo.
  16. 16. Um composto conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 14, em que R2 é fenilo substituído na posição 4 por metoxi, etoxi, fluoro, cloro, bromo, piperazinilo, N-metilpiperazinilo ou piperidinilo.
  17. 17. Um composto conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 13, em que R2 tem a estrutura parcial:
    N R" em que o grupo amino substituído-NR10R11 é seleccionado a partir de morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirroli-dinilo, etilamino, isopropilamino, dietilamino, ciclo-hexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfoli-nilo, tiomorfolinildióxido, 4-hidroxietilpiperidinilo e 4-hidroxipiperidinilo.
  18. 18. Um composto conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 2 a 17, em que R3 é etilamino-carbonilo ou isopropilaminocarbonilo.
  19. 19.ΡΕ1611112 7 dicação fórmula 1, queB, Um composto conforme reivindicado na reivin-tem a fórmula (ID), ou o seu regioisómero de
    (ID) em que cada R representa independentemente um substituinte facultativo seleccionado entre os substituintes facultativos conforme definidos na reivindicação 1 e R3 representa um grupo carboxamida conforme definido na reivindicação 1.
  20. 20. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 1, que tem a fórmula (IE), ou o seu regioisómero de fórmula B,
    (IE) em que R3 representa um grupo carboxamida conforme definido na reivindicação 1; Rg representa -CH2NR10R11 ou -NR10Rn em que 0 grupo amino substituído -NR10R11 é um grupo de solubilização seleccionado de entre morfolinilo, piperidi- ΡΕ1611112 nilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilamino, isopropila-mino, dietilamino, ciclo-hexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, N-metilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, tiomorfolinildióxido, 4-hidroxietilpiperidinilo ou 4-hidro-xipiperidinilo; e Rs representa um substituinte facultativo seleccionado de entre os substituintes facultativos como definidos na reivindicação 1.
  21. 21. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 20, em que R3 é etilaminocarbonilo CH3CH2NHC (=0) -, ou isopropilaminocarbonilo (CH3) 2CHNHC(=0)-; o grupo amino substituído -NR10R11 em R9 é morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, etilamino, isopropilamino, dietilamino, ciclo-hexilamino, ciclopentilamino, metoxietilamino, piperidin-4-ilo, N-acetilpiperazinilo, N-metilpiperazinilo, metilsulfonilamino, tiomorfolinilo, tiomorfo-linildióxido, 4-hidroxietilpiperidinilo ou 4-hidroxipi-peridinilo; e Rs é etilo, isopropilo, bromo ou cloro.
  22. 22. Um composto conforme reivindicado na reivindicação 1, seleccionado a partir de: Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazole-3--carboxílico Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-piperidin-l-ilmetil-fenil)-isoxazole-3--carboxílico 9 ΡΕ1611112 Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5--(2,4-di-hidroxi-5-isopropil-fenil)-isoxazole-3-carboxílico Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]--isoxazole-3-carboxílico Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-etilaminometil-fenil)-isoxazole-3-carboxilico Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-[4-(isopropilamino-metil)-fenil]-isoxazole-3--carboxílico Etilamida do ácido 4-(4-ciclo-hexilaminometil-fenil)--5- (2, 4-di-hidroxi-5-isopropilfenil) -isoxazole-3-carboxilico Etilamida do ácido 4-[4-(terc-butilamino-metil)--fenil]-5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropilfenil)-isoxazole-3--carboxilico Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)— 4 — {4 —[ (2-metoxi-etilamino)-metil]-fenilo}--isoxazole-3-carboxílico Isopropilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-(4-morfolin-4-ilmetil-fenil)-isoxazole-3--carboxilico Isopropilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isopropil--fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]--isoxazole-3-carboxílico Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]--isoxazole-3-carboxilico 10 ΡΕ1611112 Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-piperidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-isobutil--fenil)-4-(4-piperidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil) -isoxazol-3--carboxilico Etilamida do ácido 5-(5-terc-butil-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-dietilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico Etilamida do ácido 3-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-5-carboxilico Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5--(4,6-di-hidroxi-2'-metil-bifenil-3-il)-isoxazol-3--carboxilico Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(4'--fluoro-4,6-di-hidroxi-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxilico Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5--(4,6-di-hidroxi-bifenil-3-il)-isoxazol-3-carboxilico Etilamida do ácido 5-(2'-fluoro-4,6-di-hidroxi--bifenil-3-il)-4-(4-pirrolidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol--3-carboxilico Etilamida do ácido 5-(4,6-di-hidroxi-bifenil-3-il)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico 11 ΡΕ1611112 Etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5-fenetil-fenil) -4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico Isopropilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi--fenil)-4-(4-piperidin-l-il-metil-fenil)-isoxazol-3--carboxílico Etilamida do ácido 4-(4-dietilaminometil-fenil)-5-(5--etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-isoxazol-3-carboxilico Etilamida do ácido 5-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--[4-(4-metil-piperazin-l-il-metil)-fenil]-isoxazole-3--carboxilico Etilamida do ácido 5-(5-etil-2,4-di-hidroxi-fenil)-4--(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxilico Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4 -(4-dietilaminometil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4 -[4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-fenil]-isoxazol-3--carboxílico Etilamida do ácido 5-(5-cloro-2,4-di-hidroxi-fenil)-4 -(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico e seus sais, hidratos e solvatos.
  23. 23. Um composto conforme reivindicado na reivin dicação 1, que é etilamida do ácido 5-(2,4-di-hidroxi-5 isopropil-fenil)-4-(4-morfolin-4-il-metil-fenil)-isoxazol-3-carboxílico, ou um seu sal, hidrato ou solvato. 12 ΡΕ1611112
  24. 24. Um composto reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, para uso em medicina humana ou veterinária.
  25. 25. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 23, em conjunto com um agente de suporte farmaceuticamente aceitável.
  26. 26. Uma composição farmacêutica conforme reivindicada na reivindicação 25, sob a forma de uma solução ou suspensão do composto num agente de suporte estéril, fisiologicamente aceitável, por exemplo, solução salina aquosa.
  27. 27. Uma composição farmacêutica conforme reivindicada na reivindicação 26, sob a forma de uma solução ou suspensão do composto em solução salina aquosa estéril.
  28. 28. 0 composto conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 21 para uso no tratamento do cancro. Lisboa, 24 de outubro de 2012 1 ΡΕ1611112 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição WD G2S776S A ♦ SB2003OOS27SW Literatura que não é de patentes citada na Descrição ARSOS Y; SfKES BB- GfpS4„ an ER dssperofíe «ito psofeto and psp-tÍEÍe btodtog pswpsíiiés Ssasto, OsS Dsk. EM., 1998« voL 1«, 48S-SQ5 BIJLMAKERS1IWJE ; MARSH H.HspSO is essen-tis! 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