PT1602667E - Formulação aquosa que compreende tfpi e agentes de solubilização - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "FORMULAÇÃO AQUOSA QUE COMPREENDE TFPI E AGENTES DE SOLUBILIZAÇÃO"
Campo Técnico da Invenção A invenção relaciona-se com formulações aquosas úteis para o enrolamento, solubilização, formulação e purificação de proteínas. Estas formulações são particularmente úteis para proteínas que foram modificadas geneticamente através de recombinação genética e produzidas em bactérias, leveduras ou outras células numa forma que não tem uma estrutura terciária nativa.
Antecedentes da Invenção
Compreender completamente todo o processo de expressão de genes, é tão importante como compreender o processo de enrolamento da cadeia de péptidos numa proteína biologicamente activa, tal como é importante compreender a síntese da sequência primária. As actividades biológicas das proteínas dependem não apenas das suas sequências de aminoácidos mas também das conformações discretas das proteínas envolvidas e ligeiras perturbações da integridade conformacional duma proteína, que podem destruir a sua actividade. Tsou et al. (1988) Biochemistry 27:1809-1812.
Sob condições apropriadas, o enrolamento in vitro de proteínas purificadas, desnaturadas para conseguir a estrutura secundária e terciária nativa é um processo espontâneo. Para evitar a formação de estruturas estáveis, mas indesejadas, é 1 necessário usar as interacções terciárias (que são formadas no enrolamento tardio) com o seu elevado grau de poder de selectividade para seleccionar e estabilizar ainda mais aquelas estruturas locais precoces que estão no caminho do correcto enrolamento. Assim, a finita, mas muito baixa, estabilidade das estruturas locais pode ser o mecanismo cinético de "reparação de defeitos" do enrolamento da proteína. 0 estado activado de enrolamento com a energia mais elevada é uma forma distorcida da proteína nativa, e a mais baixa, o passo de taxa limitada de desenrolamento e enrolamento parece ser próximo do estado nativo em termos da estrutura ordenada. Adicionalmente, o enrolamento de muitas proteínas não é completamente reversível in vitro, e rendimentos de reactivação inferiores a 100% são frequentemente observados, o que é verdade em particular para experiências em concentrações elevadas de proteínas, e agregação concorrente de moléculas de proteínas não enroladas ou parcialmente enroladas pode ser a razão principal para uma reversibilidade baixa, como descrito em Fischer and Schmid, (1990) Biochemistry 29:2205-2212.
No caso de moléculas de proteínas suficientemente grandes, a cadeia de polipéptido nascente adquire a sua estrutura tridimensional nativa por agregação modular de microdomínios. Variáveis que incluem temperatura, e co-solventes tais como polióis, ureia, e cloreto de guanidínio, têm sido testadas para determinar o seu papel na estabilização e desestabilização das conformações da proteína. A acção dos co-solventes pode ser o resultado de ligação directa ou das alterações das propriedades físicas da água, como descrito em Jaenicke et al. (1991) Biochemistry3 0 (13):3147-3161.
As observações experimentais de como as proteínas desenroladas enrolam nas suas estruturas tridimensionais 2 nativas contrastam com muitas teorias populares dos mecanismos de enrolamento das proteínas. Sob condições que permitem o enrolamento, as moléculas da proteína desenrolada rapidamente equilibram entre as conformações diferentes antes de completarem o enrolamento. 0 rápido equilíbrio antes do enrolamento favorece determinadas conformações compactas que têm de algum modo energias livres inferiores a outras conformações desenroladas. 0 passo limitante da taxa ocorre tarde na via e envolve uma elevada energia, forma distorcida da conformação nativa. Parece existir uma transição única através da qual essencialmente todas as moléculas enrolam, como descrito em Creighton et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85:5082-5086. Têm sido usados vários métodos de enrolamento de proteínas purificadas, produzidas recombinantemente. Por exemplo, a protease codificada pelo vírus imunodeficiência humana do tipo I (HIV-I) pode ser produzida em Escherichia coli, produzindo corpos de inclusão que incorporam a protease recombinante HIV- 1 como descrito por Hui et al. (1993) J. Prot. Chem. 12: 323-327. A protease de HIV-I purificada foi enrolada numa enzima activa por diluição duma solução da proteína em 50% de ácido acético com 25 volumes de tampão a pH 5.5. Descobriu-se que foi obtida uma actividade específica mais elevada da protease se da proteína purificada forem dissolvidos, aproximadamente, 2 mg/ml em ácido acético a 50% seguido por diluição com 25 volumes de acetato de sódio 0.1 M, pH 5.5, com 5% de etilenoglicol e 10% de glicerol. A exclusão de glicerol e de etilenoglicol conduz a uma perda gradual de proteína devido à precipitação. Cerca de 85 mg de protease de HIV-I correctamente enrolada por litro de cultura de células de E. coli foram obtidos por este método e a enzima tinha uma elevada actividade específica. 3
Outro exemplo de enrolamento duma proteína recombinante é o isolamento e enrolamento de H-ras a partir de corpos de inclusão de E. coli como descrito por De Loskey et al. (1994) Arch. Biochem. and Biophys. 311:72-78. Neste estudo, a concentração de proteína, a temperatura, e a presença de glicerol a 10% foram variadas durante o enrolamento. O rendimento de H-ras correctamente enrolada foi mais elevado quando a proteína foi enrolada em concentrações inferiores a ou iguais a 0.1 mg/ml e foi independente da presença de glicerol a 10%. O rendimento foi ligeiramente mais alto a 4 o do que a 25°C. O enrolamento do Inibidor da Via do Factor Tecidular (também conhecido diversamente como Inibidor da Coagulação Associada a Lipoproteína (LACI), Inibidor da Via Extrínseca (EPI) e Inibidor do Factor Tecidular (EFI) e daqui por diante referido como "TFPI") produzida num sistema de expressão bacteriana foi descrito por Gustafson et al. (1994) Protein Expression and Purification 5: 233-241. Neste estudo, o alto nível de expressão de TFPI em E. coli recombinante resultou na acumulação de TFPI nos corpos de inclusão. A proteína activa foi produzida por solubilização dos corpos de inclusão em ureia 8M, e a purificação da molécula de comprimento total foi conseguida por cromatografia de troca catiónica e renaturação em ureia 6M. A mistura enrolada foi então fraccionada para render um TFPI purificado não glicosilado que possui actividade biológica in vitro como medida no ensaio do tempo de coagulação da Protrombina comparável com TFPI purificado a partir de células de mamíferos.
Uma forma não glicosilada de TFPI também foi produzida e isolada a partir de células de Escherichia coli {E. coli) como revelado na Patente U.S. N°. 5,212,091, a revelação que é aqui incorporada por referência. A invenção descrita na Patente 4 U.S. N°. 5,212,091 sujeitou os corpos de inclusão com TFPI a lise por sulfito para formar TFPI-S-sulfonato, TFPI-S-sulfonato purificado por cromatografia de troca aniónica, TFPI-S-sulfonato enrolada por troca por dissulfureto que usa cisteína e TFPI activo purificado por cromatografia de troca catiónica. A forma de TFPI descrita na Patente U.S. No. 5,212,091 mostrou ser activa na inibição do factor bovino Xa e na inibição do factor do tecido humano que induz a coagulação no plasma. Em alguns ensaios, o TFPI produzido por E. coli tem apresentado ser mais activo do que o TFPI nativo derivado de células de hepatoma SK. No entanto, o TFPI produzido em células de E. coli está modificado de modo a aumentar a heterogeneidade da proteína.
Existe a necessidade na arte de enrolamento das proteínas produzidas recombinantemente para aumentar a quantidade de TFPI correctamente enrolado durante o processo de enrolamento. Também existe a necessidade para aumentar a solubilidade de TFPI. Presentemente, os rendimentos de TFPI produzido recombinantemente têm sido inferiores ao desejado, e existe uma necessidade na arte de se produzir TFPI correctamente enrolado. Consultar, por exemplo, Gustafuson et al. (1994) Protein Expression and Purification 5: 233-241. A TFPI inibe a cascata da coagulação de pelo menos duas maneiras: prevenindo a formação do factor Vlla/complexo do factor tecidular e por ligação ao local activo do factor Xa. A sequência primária de TFPI, deduzida a partir da sequência de cDNA, indica que a proteína contém três domínios inibidores da enzima do tipo Kunitz. O primeiro destes domínios é requerido para a inibição do factor Vlla/complexo do factor tecidular. O segundo domínio do tipo Kunitz é necessário para a inibição do factor Xa. A função do terceiro domínio do tipo Kunitz é desconhecida. O TFPI não tem actividade enzimática conhecida e 5 pensa-se que inibe a sua protease alvo dum modo estequiométrico; nomeadamente, ligando um domínio do tipo Kunitz de TFPI no local activo de uma molécula da protease. Acredita-se que a extremidade carboxil-terminal de TFPI tem um papel na localização na superfície da célula através da ligação da heparina e pela interacção com fosfolípidos. 0 TFPI também é conhecido como Inibidor da Coagulação com Lipoproteína Associada (LACI), Inibidor do Factor Tecidular (TFI) , e Inibidor da Via Extrínseca (EPI). 0 TFPI maduro tem um comprimento de 27 6 aminoácidos com uma extremidade amino-terminal negativamente carregada e uma extremidade carboxil-terminal positivamente carregada. O TFPI contém 18 resíduos de cisteína e forma 9 pontes de dissulfureto quando correctamente enrolado. A sequência primária também contém três locais consenso de glicosilação Asn-X-Ser/Thr N-ligados, os resíduos de asparagina localizados nas posições 145, 195 e 256. 0 componente carbohidrato do TFPI maduro é aproximadamente 30% da massa da proteína. No entanto, os dados a partir do mapeamento proteolítico e os dados do espectro de massa revelam que os radicais carbohidrato são heterogéneos. Também se descobriu que o TFPI está fosforilado no resíduo de serina na posição 2 da proteína em vários graus. A fosforilação não parece afectar a função do TFPI. O TFPI foi isolado a partir do plasma humano e a partir de células em cultura de tecido humano incluindo HepG2, fígado de Chang e células SK de hepatoma. O TFPI recombinante tem sido expresso em células C127 de ratinho, células de rim de cria de hamster, células de ovário de hamster Chinês e células SK de hepatoma humano. O TFPI recombinante a partir de células C127 de ratinho tem apresentado em modelos animais inibir o factor tecidular que induz a coagulação. 6
Uma forma não glicosilada do TFPI recombinante tem sido produzida e isolada a partir de células de Escherichia coli (E. coli) como revelado na Pat. U.S. No. 5,212,091. Esta forma de TFPI tem mostrado ser activa na inibição do factor Xa bovino e na inibição do factor tecidular humano que induz a coagulação no plasma. Têm sido revelados métodos para a purificação do TFPI a partir de meio de cultura de células de leveduras, tal como em Petersen et al., J. Biol. Chem. 18:13344-13351 (1993).
Recentemente, outra proteína com um grau mais elevado de identidade estrutural para TFPI foi identificada. Sprecher et al, Proc. Nat. Acad. Sei., USA 91:3353-3357 (1994). A estrutura secundária prevista desta proteína, chamada TFPI-2, é virtualmente idêntica à da TFPI com 3 domínios do tipo Kunitz, 9 ligações cisteína-cisteína, uma terminação amino acídica e uma cauda terminal carboxílica alcalina. Os três domínios do tipo Kunitz da TFPI-2 apresentam 43%, 35% e 53% de identidade da sequência primária com domínios do tipo Kunitz de TFPI 1, 2 e 3, respectivamente. O TFPI-2 recombinante inibe fortemente a actividade amidolítica do factor Vlla/factor tecidular. Em oposição, o TFPI-2 é um fraco inibidor da actividade amidolítica do factor Xa. O TFPI tem mostrado prevenir a mortalidade num modelo de babuínos com choque séptico letal com Escherichia coli (E. coli). Creasey et al, J. Clin. Invest. 91:2850-2860 (1993). A administração de 6 mg/kg de peso corporal de TFPI logo após a infusão duma dose letal de E. coli resultou numa sobrevivência de todos os cinco animais tratados com TFPI com uma significativa melhoria da qualidade de vida quando comparada com um tempo de sobrevivência médio para os cinco animais de controlo de 39.9 horas. A administração de TFPI também resultou numa atenuação significativa da resposta de 7 coagulação, nas várias medições de lesões celulares e redução significativa na patologia normalmente observada nos órgãos alvos de sepsia por E. coli, incluindo rins, glândulas supra-renais e pulmões.
Devido às suas propriedades de inibição da formação de coágulos, o TFPI também pode ser usado para prevenir a trombose durante a cirurgia microvascular. Por exemplo, a U.S. 5,276, 015 revela o uso do TFPI num método para reduzir a trombogenicidade de anastomoses microvasculares em que o TFPI é administrado no local da anastomose microvascular em simultâneo com a reconstrução microvascular. O TFPI é uma proteína hidrofóbica e como tal, tem uma solubilidade limitada em soluções aquosas. Esta solubilidade limitada tem tornado a preparação de formulações farmaceuticamente aceitáveis de TFPI difíceis de fabricar, especialmente para indicações clínicas que podem beneficiar com a administração de doses elevadas de TFPI. Assim, existe a necessidade na arte para composições farmaceuticamente aceitáveis com concentrações de TFPI que podem ser administradas a pacientes em quantidades aceitáveis.
Breve Descrição das Ilustrações A Figura 1 é uma análise SDS-PAGE de fracções do pico de TFPI coradas coomassie do procedimento de enrolamento a partir de Fenil Safarose HIC. A Figura 2 é um gráfico da recuperação do TFPI nativo a partir da coluna de HIC. A Figura 3 é um gráfico da recuperação do TFPI nativo a partir de uma segunda coluna de HIC. A Figura 4 é a sequência de aminoácidos do TFPI. A Figura 5 mostra a solubilidade do TFPI em condições de pH diferentes. Cerca de 10 mg/mL de TFPI em 2M de ureia foram 8 dialisados contra acetato 20 mM, fosfato, citrato, glicina, L- glutamato e succinato em NaCl 150 mM. A concentração da solução TPFI restante após a diálise foi calculada por absorvância UV após a filtração dos precipitados através de unidades de filtro de 0, ,22 mm. A Figura 6 mostra a solubilidade do TFPI como uma função da concentração do citrato na presença de fosfato de Na lOmM a pH 7. A solubilidade do TFPI aumenta com o aumento da concentração de citrato. A Figura 7 mostra a solubilidade do TFPI como uma função da concentração de NaCl. A solubilidade do TFPI aumenta com o aumento da concentração do sal, indicando que o sal promove a solubilidade do TFPI. A Figura 8 mostra o efeito do pH na estabilidade do TFPI preparado em fosfato de Na lOmM, NaCl 150mM e de polisorbato-80 (p/v) a 0,005%. Amostras de estabilidade contento 150mg/mL de TFPI foram incubadas a 40°C durante 20 dias. Foi analisada a taxa cinética constante para o restante TFPI solúvel seguindo o decréscimo do pico principal em cromatogramas de troca de catiões. A Figura 9 mostra a percentagem do TFPI restante solúvel medido por HPLC (A) de troca de catiões e do restante TFPI activo por ensaio do tempo da protrombina (B) como uma função da concentração de fosfato. A formulação contém 150mg/mL de TFPI preparado em NaCl 150mM e polisorbato-80 a 0,005% (p/v) a pH 7 com várias concentrações de fosfato. A Figura 10 mostra a perca do TFPI solúvel a 40°C medidos por ambos HPLC de troca de catiões (triângulo) e ensaio do tempo da protrombina (circulo) para 0,5mg/mL de TFPI formulado em citrato de NA lOmM, pH 6 e NaCl 150mM. A Figura 11 mostra a perca do TFPI solúvel a 40°C medidos por ambos HPLC de troca de catiões (símbolo aberto) e ensaio 9 do tempo da protrombina (símbolo fechado) para 0,5mg/mL de TFPI formulado em de fosfato lOmM, pH 6 e NaCl 150mM (triângulo) ou NaCl 500mM (círculo). A Figura 12 mostra a perca do TFPI solúvel a 4 0°C medidos por ambos HPLC de troca de catiões (símbolo aberto) e ensaio do tempo da protrombina (símbolo fechado) para 0,5mg/mL de TFPI formulado em acetato de Na lOmM e pH 5.5 contendo NaCl 150mM (triângulo) ou de sacarose a 8% (p/v) (quadrado) ou manitol a 4,5% (círculo). A Figura 13 mostra dois géis de SDS não redutores para a formulação de amostras de TFPI de pH 4 a 9 armazenados a 40°C por 0 e 20 dias. A Figura 14 mostra o percurso temporal de rhTFPI enrolado facilitado por polifosfato monitorizado utilizando SDS PAGE. A Figura 15 mostra a absorvância a 280nm durante o carregamento e eluição da coluna de S-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI a partir de um enrolado facilitado por polifosfato. A Figura 16 mostra uma análise SDS PAGE de fracções
recolhidas durante a eluição da coluna de S-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI a partir de um enrolado facilitado por polifosfato. A Figura 17 mostra a absorvância a 280nm durante o carregamento e eluição da coluna de Q-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI de uma mistura de S-Sepharose preparada a partir de um a partir de um enrolado facilitado por polifosfato. A Figura 18 mostra uma análise SDS PAGE de fracções
recolhidas durante a eluição da coluna de Q-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI de uma mistura de S-Sepharose preparada a partir de um enrolado facilitado por polifosfato. 10 A Figura 19 mostra o percurso temporal de um enrolado de rhTFPI facilitado por polietilenoimina monitorizada utilizando SDS PAGE. A Figura 20 mostra a absorvância a 280nm durante o carregamento e eluição da coluna de S-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI a partir de um enrolado facilitado por polietilenoimina. A Figura 21 mostra uma análise SDS PAGE de fracções recolhidas durante a eluição da coluna de S-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI a partir de um enrolado facilitado por polietilenoimina. A Figura 22 mostra a absorvância a 280nm durante o carregamento e eluição da coluna de Q-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI de uma mistura de S-Sepharose preparada a partir de um enrolado facilitado por polietilenoimina. A Figura 23 mostra uma análise SDS PAGE de fracções recolhidas durante a eluição da coluna de Q-Sepharose HP utilizada para purificar o rhTFPI de uma mistura de S-Sepharose preparada a partir de um enrolado facilitado por polietilenoimina. A Figura 24 mostra a análise do HPLC de troca de catiões num enrolado de rhTFPI facilitado por polifosfato a 0.4% na ausência de ureia. A Figura 25 mostra os resultados da análise do HPLC de troca de catiões de uma avaliação de diferentes níveis de cisteína num enrolado de rhTFPI em polifosfato a 0.4%, Tris 50mM na ausência de ureia. A Figura 26 mostra o efeito do comprimento da cadeia de polifosfato no percurso de corpos de inclusão de rhTFPI de um enrolado facilitado por polifosfato uma por HPLC de troca de catiões. 11 A Figura 27 mostra o efeito da concentração de polifosfato (vidro H) no enrolamento de rhTFPI a partir de corpos de inclusão como monitorizado por HPLC de troca de catiões. A Figura 28 mostra a análise do HPLC de troca de catiões do enrolamento facilitado por polietilenoimina e polifosfato de rhTFPI purificado e reduzido.
Sumário da Invenção É um objecto da invenção providenciar formulações aquosas de TFPI.
Foi agora descoberto que a solubilidade de TFPI é fortemente dependente do pH e, surpreendentemente, que polianiões tais como citrato, isocitrato, e sulfato têm efeitos solubilizantes profundos no TFPI. Esta descoberta é surpreendente à luz da natureza hidrofóbica do TFPI e do carácter hidrofilico destes contra-iões. Assim, citrato, isocitrato, sulfato bem como outros solubilizantes descritos mais adiante podem ser utilizados para produzir composições farmacêuticas aceitáveis tendo concentrações de TFPI suficientes para a administração a pacientes. Foi também mostrado que outras moléculas orgânicas podem agir como solubilizantes secundários. Estes solubilizantes secundários incluem PEG, sacarose, manitol, e sorbitol.
Numa modalidade, a invenção relaciona-se com composições farmacêuticas aceitáveis onde TFPI está presente numa concentração de mais do que 0,2 mg/mL de agentes solubilizantes. Os agentes solubilizantes podem ser ião acetato, cloreto de sódio, ião citrato, isocitrato, glicina, glutamato, ião succinato, histidina, imidazole e dodecil sulfato de sódio (SDS) bem como polímeros carregados. Em algumas composições, o TFPI pode estar presente em
concentrações de mais do que 1 mg/mL e mais do que 10 mg/mL. A 12 composição pode ter também um ou mais solubilizantes secundários. 0 solubilizante secundário ou solubilizantes podem ser polietilenoglicol (PEG), sacarose, manitol, ou sorbitol. Finalmente, a composição pode conter também fosfato de sódio numa concentração superior a 20mM.
Apesar da solubilidade do TFPI ser bastante baixa entre pH 5 e 10, foi descoberto que L-arginina pode aumentar a solubilidade por um factor de 100. A solubilidade está muito dependente da concentração de arginina, de tal forma que 300 mM são cerca de 30 vezes mais eficientes que 200 mM. A ureia é também bastante eficiente na solubilização de TFPI.
Descrição Detalhada da Invenção
Os polímeros poliónicos tais como polietilenoimina e polifosfato, podem modificar as interacções iónicas dentro das proteínas. O mascaramento de determinadas áreas de densidade de carga elevada dentro das proteínas usando poliões pode ter vários efeitos. As proteínas cuja solubilidade é reduzida através da neutralização intra- e/ou inter- molecular de áreas com cargas opostas podem ter a sua solubilidade aumentada por mascaramento de uma das regiões carregadas com policatiões ou polianiões. As barreiras à flexibilidade conformacional e forças especificas de atracção ou repulsão que interferem com o processo de enrolamento também podem ser moduladas. As proteínas que requerem desnaturantes fortes tais como ureia ou hidrocloreto de guanidina para solubilizar e manterem a solubilidade durante as operações de purificação podem ser solubilizadas e processadas eficazmente usando poliões.
Muitas proteínas que carecem duma clara região de localização de carga na sequência primária podem continuar a demonstrar áreas de localização de carga devido à sua estrutura secundária. Assim, muitas proteínas podem ter as 13 suas características de solubilidade, enrolamento e purificação modificadas através da interacção com modelos poliméricos carregados. A natureza da modificação irá depender da estrutura especifica da proteína, do comprimento da cadeia, carga e densidade da carga do polímero iónico.
Caracterizou-se o enrolamento do TFPI puro num tampão de enrolamento de base de ureia ou guanidina e os resultados indicam que as eficácias de enrolamento e cinéticas podem ser significativamente melhoradas pela adição de polímeros carregados o que inclui heparina, sulfato de dextrano, polietilenoimina (PEI) e polifosfatos. Estes polímeros aumentam a solubilidade do TFPI e melhoram o enrolamento através de interacção iónica com quer o N-terminal quer o C-terminal. Adicionalmente, aos aditivos de polímero, o enrolamento do TFPI puro requer um tampão redox de cisteína/cistina onde a reacção de enrolamento podem ser completada dentro de 48 horas. Os rendimentos de enrolamento são uma forte função de pH, concentração redox e aditivos de polímero; no entanto, eficácias do enrolamento tão elevadas quanto 60% podem ser conseguidas para o TFPI puro sob condições de enrolamento óptimas.
Foi descoberto pelos inventores desta invenção que a adição de glicosaminoglicanos ou polissacáridos sulfatados tais como, por exemplo, heparina e sulfato de dextrano, a uma solução com uma proteína desnaturada antes do enrolamento aumenta a quantidade do enrolado correctamente, proteína activa onde a proteína é capaz de se ligar ao glicosaminoglicano ou polissacárido sulfatado e está sujeita às condições de renaturação. 14
Dissolução A tecnologia de DNA recombinante tem permitido altos níveis de expressão de muitas proteínas que normalmente não podem ser isoladas a partir de fontes naturais em quaisquer quantidades apreciáveis. Em E. coli e vários outros sistemas de expressão, a proteína é frequentemente expressa num estado inactivo, desnaturado onde a sequência de aminoácidos primária é correcta, mas a estrutura secundária e terciária e nenhumas ligações dissulfureto de cisteína estão presentes. A proteína desnaturada presente num corpo de inclusão pode estar numa conformação tal que os resíduos carregados de diferentes partes da estrutura principal de aminoácidos que normalmente não estão em contacto, são capazes de interagir e formar ligações iónicas fortes entre resíduos de aminoácidos carregados positivamente e carregados negativamente. A formação destas ligações iónicas pode limitar a hidratação que deve ocorrer para se efectuar a dissolução do corpo de inclusão. A proteína num corpo de inclusão também pode ser complexada com outros componentes celulares tais como componentes da membrana e ácido nucleico que também pode limitar o acesso do solvente (água) aos resíduos normalmente hidratados e carregados. Também foi descoberto que no estado enrolado os resíduos hidrofóbicos que estão normalmente presentes ocultos no interior duma proteína estão mais expostos ao ambiente aquoso polar. Estas ocorrências podem trabalhar para prevenir a dissolução dos corpos de inclusão nos outros solventes sem ser os fortes agentes caotrópicos tais como ureia ou guanidina ou detergentes tais como SDS.
Os polímeros carregados, preferivelmente na solução aquosa, podem interferir com e provocar a disrupção das interacções iónicas indesejáveis que ocorrem dentro duma cadeia de polipéptido como encontrado num corpo de inclusão ou 15 outro ambiente. Os polímeros carregados podem ajudar na disrupção das interacções iónicas indesejadas e facilitar a solvatação dos resíduos iónicos e polares, promovendo a dissolução sem a necessidade de caotrópicos ou detergentes fortes. A carga, densidade da carga e peso molecular (comprimento da cadeia) do polímero carregado pode variar dependendo da proteína específica. Os polímeros adequados incluem: polissacáridos sulfatados, heparinas, sulfatos de dextrano, agaropectinas, polissacáridos de ácidos carboxílicos, ácidos algínicos, carboximetil celuloses, poli-inorgânicos, polifosfatos, poliaminoácidos, poliaspartatos, poliglutamatos, polihistidinas, poliorgânicos, polissacáridos, Dextranos DEAE, aminas poliorgânicas, polietilenoinimas, polietilenoinima celuloses, poliaminas, poliamino ácidos, polilisinas e poliargininas.
As proteínas com um pi superior a 7 podem beneficiar mais a partir de interacções com polímeros carregados negativamente, uma vez que estas proteínas terão uma carga positiva a pH 7. As proteínas com os pi abaixo de 7 podem interagir mais fortemente com polímeros carregados positivamente a pH neutro. A variação do pH da solução modificará a carga total e a distribuição de carga de qualquer proteína e é outra variável a ser avaliada.
Enrolamento A tecnologia de DNA recombinante tem permitido altos níveis de expressão de muitas proteínas que normalmente não podem ser isoladas a partir de fontes naturais em quaisquer quantidades apreciáveis. Em E. coli e vários outros sistemas de expressão, a proteína é frequentemente expressa num estado inactivo, desnaturado onde a sequência de aminoácidos primária é correcta, mas a estrutura secundária e terciária e nenhumas 16 ligações dissulfureto de cisteína estão presentes. A proteína desnaturada deve ser enrolada na conformação activa adequada, a qual muitas vezes requer a ultrapassagem de barreiras energéticas significantes impostas pelas atracção e repulsão iónica, restrições na rotação da ligação e outros tipos de stress conformacionalmente induzidos. A atracção iónica específica entre cargas opostas e/ou repulsão entre cargas semelhantes pode limitar seriamente as vias de enrolamento disponíveis para a proteína desnaturada e reduzir a eficiência do processo enrolamento.
Algumas proteínas têm áreas específicas de carga cujas interacções podem limitar a flexibilidade conformacional ou promove agregação. Muitas proteínas que carecem duma clara região de localização de carga na sequência primária podem continuar a demonstrar áreas de localização de carga devido à sua estrutura secundária encontrada em intermediários de enrolamento, maus enrolamentos e proteínas enroladas inadequadamente. Proteínas que são particularmente adequadas de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, TFPI, muteínas de TFPI, TFPI-2, activador do plasminogénio tecidular, BST, PST. Embora se acredite que estas formulações serão adequadas para o uso com proteínas genericamente, as mais adequadas são aquelas que são enroladas inadequadamente, agregadas, oligomerizadas, ou inactivas. Estas serão proteínas que têm pelo menos um domínio altamente carregado e possivelmente mais, os quais podem interagir. No caso do TFPI, bem como outras proteínas, dois domínios opostamente carregados interagem com cada um para impedir o enrolamento adequado e para causar oligomerização e agregação. As proteínas que têm muitas ligações dissulfureto também serão mais adequadas para beneficiar dos presentes métodos. Preferivelmente, a proteína terá pelo menos 2 e mais 17 preferivelmente a proteína terá pelo menos 4 ou 6 ligações dissulfureto.
Os polímeros carregados podem ser usados para modificar a carga, densidade de carga e reduzir ou eliminar limitações ionicamente mediadas da conformação que podem aparecer no estado desenrolado. A sobreposição de grupos carregados que normalmente não estão próximos pode ter como resultado vias sem saída para o enrolamento a partir do qual o processo de enrolamento pode nunca recuperar. A introdução de cargas extra positivas ou negativas através da complexação com os polímeros carregados pode permitir que se faça o enrolamento mais facilmente por várias razões: primeiro, tipos diferentes de distribuições de carga podem acomodar melhor o processo de enrolamento; segundo, a adição do polímero carregado pode melhorar a solubilidade da proteína desenrolada, reduzindo ou eliminado a necessidade de caotrópicos que têm um efeito negativo na conformação da proteína.
Por causa da frequentemente estrutura única associada com a maioria das proteínas o polímero carregado que demonstra características preferidas pode variar. A avaliação do pH isoeléctrico (pi) da proteína pode servir como um ponto de partida. A pH neutro uma proteína com um pi inferior a 7 irá possuir uma carga efectiva negativa, e assim irá ter maior tendência para se ligar a um polímero positivamente carregado. A proteína com um pi superior a 7 possuirá uma carga efectiva positiva a pH neutro e terá uma forte tendência para se ligar a um polímero negativamente carregado. No entanto, está bem estabelecido que as cargas estão irregularmente distribuídas em torno duma proteína, e localização de cargas significativas podem ocorrer. A possibilidade de concentrações localizadas de cargas reduz a capacidade para predizer que tipo de polímero 18 carregado pode ser mais eficaz para qualquer aplicação. Teoricamente, para qualquer proteína com uma distribuição específica de requerimentos de interacção conformacional e de cargas, existe um polímero carregado de composição apropriada em termos de peso molecular, carga e distribuição de carga o que pode maximizar a eficiência do enrolamento. Outras variáveis, tais como pH e força iónica do solvente, também deverão ser avaliadas. A pesquisa inicial deverá envolver polietilenoimina, dextrano DEAE, sulfato de dextrano e polifosfato em várias concentrações diferentes e pesos moleculares. 0 trabalho com rhTFPI tem demonstrado o impacto significativo que o comprimento da cadeia e concentração de polifosfato pode ter no percurso da reacção de enrolamento do TFPI. 0 comprimento da cadeia relativamente curto (n=5) produz níveis elevados de agregado. 0 comprimento óptimo da cadeia de polifosfato para o enrolamento do rhTFPI foi de aproximadamente 25 unidades de repetição. Comprimentos de cadeia de polifosfatos maiores (n = 75) também produziram mais agregado e menos monómero adequadamente enrolado.
Formulação
As proteínas consistem em cadeias de aminoácidos, a composição e sequência exactas destas constituem um dos determinantes da estrutura primária da proteína. 0 determinante secundário da estrutura da proteína é o resultado da orientação conformacional que as ligações dos aminoácidos individuais têm na conformação da proteína. Em terceiro lugar, a sequência de aminoácidos específica dirige a formação das estruturas terciária tal como folhas β e hélices α. A natureza tridimensional da conformação da proteína geralmente traz para a proximidade resíduos de aminoácidos que normalmente não estão próximos uns dos outros, com base na sequência directa 19 da cadeia de polipéptido. A forma funcional duma proteína é geralmente uma conformação modestamente estável sustentada por uma combinação de ligações de dissulfureto de cisteína, ligações iónicas e interacções hidrofóbicas e de Van der Waals.
Geralmente, a solubilidade da proteína pode estar relacionada com o número de cargas e com menor grau de aminoácidos polares que constituem a proteína. Estes grupos carregados e polares ficam solvatados com moléculas de água na solução aquosa e esta interacção mantém a cadeia de polipéptido em solução. Os polipéptidos com números insuficientes de aminoácidos carregados positiva ou negativamente podem ter uma solubilidade aquosa limitada. Nalguns casos, os grupos carregados positiva e negativamente presentes numa proteína podem interagir entre si, deslocando a água da solvatação e conduzindo à solubilidade aquosa reduzida. Muitas proteínas que carecem duma clara região de localização de carga na sequência primária podem continuar a demonstrar áreas de localização de carga devido à sua estrutura secundária. Assim, muitas proteínas podem ter as suas características de solubilidade modificadas através da interacção com modelos poliméricos carregados. A natureza da modificação irá depender da estrutura específica da proteína, do comprimento da cadeia, carga e densidade da carga do polímero iónico. A complexação com polímeros carregados com densidade de carga relativamente elevada representa uma abordagem ao aumento da densidade de carga de qualquer proteína. Uma proteína com um número pequeno de resíduos carregados positivamente (lisina ou arginina) pode ser complexada com um polímero negativamente carregado tal como polifosfato. Alguns grupos negativamente carregados do polímero irão interagir com 20 os grupos positivamente carregados presentes na proteína. Os restantes grupos carregados no polímero estarão livres para interagir com o solvente, a água na maior parte dos casos, e aumentar efectivamente a densidade de carga e a solvatação da proteína. Alternativamente, um polímero positivamente carregado tal como polietilenoimina pode ser usado para complexar com os resíduos negativamente carregados da proteína. Em alguns casos os dois tipos de polímeros carregados podem trabalhar dum modo igualmente eficaz, noutros casos, um tipo de carga pode ser mais eficaz do que outros. A eficácia de qualquer polímero carregado em particular, irá depender da composição de aminoácidos da proteína, da distribuição de aminoácidos da proteína, da conformação da proteína, da densidade de carga do polímero carregado, do comprimento da cadeia do polímero carregado, do pH da solução e de outras variáveis. No entanto, é provável que para uma dada proteína, um polímero complementarmente carregado, que se irá ligar à proteína e essencialmente aumentar a densidade de carga da proteína, pode ser encontrado o que irá melhorar as características de solubilidade dessa proteína num meio aquoso.
Definições 0 termo "processamento", como aqui usado, refere-se aos passos envolvidos na purificação e preparação de quantidades farmaceuticamente aceitáveis de proteínas. 0 processamento pode incluir um ou mais passos tais como solubilização, enrolamento, separação cromatográfica, precipitação e formulação. 0 termo "polímero carregado" e "modelo polimérico carregado" refere-se a qualquer composto com uma estrutura principal com unidades de repetição ligadas dum modo linear ou 21 não linear, algumas destas unidades de repetição contêm grupos químicos carregados positiva ou negativamente. As unidades estruturais de repetição podem ser polissacáridos, hidrocarbonetos, orgânicas, ou inorgânicas presentes na natureza. As unidades de repetição podem variar desde n = 2 a n = vários milhões. 0 termo "polímero positivamente carregado" como aqui usado refere-se a polímeros que contêm grupos químicos que transportam, podem transportar, ou podem ser modificados para transportar uma carga positiva tal como amónio, alquil amónio, dialquil amónio, trialquil amónio e amónio quaternário. 0 termo "polímero negativamente carregado" como aqui usado refere-se a polímeros que contêm grupos químicos que transportam, podem transportar, ou podem ser modificados para transportar uma carga negativa tal como derivados de ácido fosfórico e outros ácidos que contêm fósforo, ácido sulfúrico e outros ácidos que contêm enxofre, nitrato e outros ácidos que contêm nitrogénio, ácido fórmico e outros ácidos carboxílicos. 0 termo "polietilenoimina" como aqui usado refere-se a polímeros que consistem em unidades de repetição de etilenoimina (H3N+-(CH2-CH2-NH2+) x-CH2-CH2-NH3+) . 0 peso molecular pode variar desde 5000 a mais de 50000. O termo "polifosfato" como aqui usado refere-se a polímeros que consistem em unidades de repetição de ortofosfato ligados num fosfoanidrido. O número de unidades de repetição pode variar desde 2 (pirofosfato) a vários milhares. O polifosfato é frequentemente referido como hexametafosfato de sódio (SHMP). Outros nomes comuns incluem sais de Grahams, Calgon, vidro fosfatado, tetrametafosfato de sódio, e Vidro H. O termo "enrolado" como aqui usado refere-se à renaturação da proteína. Tipicamente, o objectivo do enrolamento é 22 produzir uma proteína com um nível mais elevado de actividade do que a proteína teria se produzida sem um passo de enrolamento. Uma molécula de proteína enrolada é mais estável na conformação que tem a energia livre mais baixa. A maioria das proteínas solúveis em água renaturam de modo que a maior parte dos aminoácidos hidrofóbicos está na parte interior da molécula, longe da água. As ligações fracas que sustentam uma proteína no seu conjunto podem ser quebradas por vários tratamentos que causam um desenrolar do polipéptido, i.e. desnatura. Uma proteína enrolada é o produto de vários tipos de interacções entre os próprios aminoácidos e o seu ambiente, incluindo ligações iónicas, interacções de Van der Waals, pontes de hidrogénio, pontes de dissulfureto e ligações covalentes. 0 termo "desnaturar", como aqui usado, refere-se ao tratamento duma proteína ou polipéptido que resulta na disrupção das ligações iónicas e covalentes e as interacções de Van der Waals que existem na molécula no seu estado nativo ou renaturado. A desnaturação duma proteína pode ser acompanhada, por exemplo, pelo tratamento com ureia 8 M, agentes redutores tais como mercaptoetanol, calor, pH, temperatura e outros químicos. Os reagentes tais como ureia 8 M quebram as ligações de hidrogénio e hidrofóbicas, e se também for adicionado mercaptoetanol, as pontes dissulfureto (S-S) que são formadas entre cisteínas são reduzidas para dois grupos -S-H. 0 enrolamento das proteínas que têm ligações dissulfureto no seu estado nativo ou enrolado também pode envolver a oxidação dos grupos -S-H presentes nos resíduos de cisteína para a proteína refazer as ligações dissulfureto. 0 termo "glicosaminoglicano" como aqui usado refere-se a polissacáridos com resíduos alternados de ácido urónico e hexosamina e normalmente têm sulfato. A ligação duma proteína 23 numa reacção de renaturação como aqui descrita para um glicosaminoglicano é através de interacções iónicas. 0 termo "sulfato de dextrano" como aqui usado refere-se a um derivado polianiónico de dextrano, no intervalo de peso molecular entre 8000 e 500000 daltons. Os dextranos são polímeros de glucose em que os resíduos de glucose estão unidos por ligações α 1,6. O termo "heparina", como aqui usado, refere-se a 2-glucoaminoglicanos ou heparinóides que são baseados numa repetição de dissacárido (-4DGlcA(p)βΐ, 4GlcNAcal)n mas estão sujeitos a modificação extensiva após a reunião. A heparina é armazenada com histamina em grânulos de células de mastócitos e, assim, encontra-se na maior parte dos tecidos de conexão. De modo geral, as heparinas têm cadeias mais curtas do que a heparina. O termo "HIC" como aqui usado refere-se a cromatografia de interacção hidrofóbica que emprega uma interacção hidrofóbica entre a coluna e a molécula de interesse para separar os polissacáridos sulfatados e outros contaminantes do produto enrolado. A.
Os polímeros negativamente carregados incluem polissacáridos sulfatados, tais como heparinas, sulfatos de dextrano, e agaropectinas, bem como polissacáridos de ácidos carboxílicos tal como ácidos algínicos e carboximetil celuloses. Poli-inorgânicos tais como polifosfatos também estão incluídos. Os ácidos poliamino tais como poliaspartato, poliglutamato e polihistidina também podem ser usados.
Os polímeros positivamente carregados incluem polissacáridos tais como DEAE dextrano, aminas poliorgânicas, tais como polietilenoiminas, polietilenoimino celuloses e poliaminas, bem como os ácidos poliamino, polilisina e poliarginina. Podem ser usadas combinações de polímeros, para 24 ambas polaridades carregadas. Adicionalmente, também podem ser usados co-polimeros anfotéricos.
Como aqui usado, "TFPI" refere-se ao Inibidor da Via do Factor Tecidular maduro. Como referido acima, o TFPI também é conhecida na arte como Inibidor da Coagulação com Lipoproteína Associada (LACI), Inibidor do Factor Tecidular (TFI) e
Inibidor da Via Extrínseca (EPI) . As muteínas de TFPI que retêm a actividade biológica de TFPI são incluídas nesta definição. Além disso, o TFPI que tem sido ligeiramente modificado para produção em células bacterianas também é incorporado na definição. Por exemplo, um análogo de TFPI que tem um resíduo de alanina na extremidade amino terminal do polipéptido TFPI tem sido produzido em Escherichia coli. Consultar U.S. 5,212,091.
Como aqui usado, "composição farmaceuticamente aceitável" refere-se a uma composição que não anula ou reduz a actividade biológica do TFPI formulado, e não tem qualquer efeito biológico adverso quando o TFPI formulado é administrado a um paciente.
Como aqui usado, "paciente" incorpora pacientes humanos e veterinários.
Como aqui usado, o termo "solubilizador" refere-se a sais, iões, carbohidratos, aminoácidos e outras moléculas orgânicas que, quando presentes em solução, aumentam a solubilidade da TFPI acima de 0.2 mg/mL. Os solubilizadores também podem alcançar concentrações de TFPI acima de 1 mg/mL e acima de 10 mg/mL. Deve ser notado que os solubilizadores podem actuar como agentes de estabilização. Os agentes de estabilização conservam a actividade da unidade de TFPI quando armazenados e podem actuar prevenindo a formação de agregados, ou prevenindo a degradação da molécula de TFPI (por exemplo, através de reacções catalisadas por ácido). 25
Como aqui usado, o termo "solubilizador secundário" refere-se a sais orgânicos, iões, carbohidratos, aminoácidos e outras moléculas orgânicas que, quando presentes em solução com um solubilizador, aumentam mais ainda a solubilidade da TFPI. Os solubilizadores secundários também podem ter outros efeitos. Por exemplo, os estabilizadores secundários podem ser úteis no ajustamento da tonicidade (por exemplo, para iso-tonicidade). A sequência de aminoácidos de TFPI está revelada na Patente U.S. No. 5,106,833 que está aqui incorporada por referência e a Figura 4. As muteinas de TFPI e TFPI-2 estão reveladas no No. de Série U.S. 08/286, 530 que é aqui incorporado por referência. Como descrito no No. de Série U.S. 08/286,530, podem ser preparadas muteinas de TFPI e TFPI-2, com mutações pontuais simples ou múltiplas, e moléculas quiméricas de TFPI e TFPI-2. Por exemplo, o resíduo de lisina no local PI do primeiro domínio do tipo Kunitz de TFPI pode ser substituído por arginina. As muteinas, que contêm de uma a cinco substituições de aminoácidos, podem ser preparadas por mutagénese apropriada da sequência do veículo de clonagem recombinante que codifica TFPI ou TFPI-2. As técnicas para a mutagénese incluem, sem limitação, mutagénese dirigida. A mutagénese dirigida pode ser realizada usando qualquer um de vários procedimentos conhecidos na arte. Estas técnicas são descritas por Smith (1985) Annual Review of Genetics, 19:423, e modificações de algumas das técnicas estão descritas em METHODS IN ENZYMOLOGY, 154, part E, (eds.) Wu and Grossman (1987), capítulos 17, 18, 19, e 20. Um procedimento preferido quando se usa mutagénese dirigida é uma modificação do método Gapped Duplex (introdução duma falha na cadeia dupla) de mutagénese dirigida. O procedimento geral é descrito por Kramer, et al., no capítulo 17 no Methods in Enzymology, 26 acima. Outra técnica para gerar mutações pontuais numa sequência de ácido nucleico é sobreposição por PCR. 0 procedimento para usar a sobrexposição por PCR para gerar mutações pontuais está descrito por Higuchi no Capitulo 22 de PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, (eds.) Innis, Gelfand, Sninsky and White (Academic Press, 1990).
Alternativamente, as proteínas híbridas contêm o primeiro domínio do tipo Kunitz de TFPI-2 e o segundo e terceiro domínios do tipo Kunitz de TFPI podem ser produzidas. Um especialista na arte da clonagem de DNA na posse do DNA que codifica TFPI e TFPI-2 será capaz de preparar moléculas de DNA adequadas para a produção duma tal proteína quimérica usando os procedimentos de clonagem conhecidos. Alternativamente, as moléculas de DNA sintético que codificam parte ou todo o domínio do tipo Kunitz e sequências de péptidos de ligação dos domínios do tipo Kunitz podem ser preparados. Como outra alternativa, a técnica de sobreposição por PCR também pode ser usada para preparar o DNA que codifica moléculas quiméricas que contêm sequências de TFPI e TFPI-2. O TFPI pode ser preparado em sistemas de expressão de leveduras como descrito no No. de Série U.S. 08/286,530 o qual está aqui incorporado por referência. Têm sido revelados métodos para a purificação da TFPI a partir de meio de cultura de células de leveduras, tal Petersen et al., J. Biol. Chem. 18:13344-13351 (1993). Nestes casos, o TFPI recombinante é excretado a partir da célula da levedura. O TFPI recuperado nestes protocolos também é, frequentemente, heterogéneo por causa da modificação N-terminal, degradação proteolítica e glicosilação variável. Assim, existe uma necessidade na arte para produzir TFPI maduro que é autêntico (i.e. com a sequência de aminoácidos N-terminal correcta), de comprimento total e homogéneo. 27 0 TFPI pode ser produzido em E. coli como descrito na Patente U.S. No. 5,212,091 que revela um método para produzir TFPI por expressão duma forma não glicosilada de TFPI numa E. coli hospedeira. Têm sido revelados métodos para a purificação do TFPI a partir de meio de cultura de células de leveduras, tal Petersen et al., J. Biol. Chem. 18:13344-13351 (1993). Nestes casos, o TFPI recombinante é excretado a partir da célula da levedura. O TFPI recuperado nestes protocolos também é, frequentemente, heterogéneo por causa da modificação N-terminal, degradação proteolitica e glicosilação variável. Assim, existe uma necessidade na arte para produzir TFPI maduro que é autêntico (i.e. com a sequência de aminoácidos N-terminal correcta), de comprimento total e homogéneo.
Num aspecto da invenção, as proteínas produzidas recombinantemente que têm a capacidade para ligar polímeros de polissacáridos sulfatados tais como, por exemplo, sulfato de heparina ou dextrano são enroladas. A invenção fornece um método que facilita a renaturação dum produto de proteína produzida recombinantemente desnaturada usando polímeros de polissacáridos sulfatados que actuam como modelos para o enrolamento da proteína. Sem estar limitados a qualquer teoria particular, os inventores acreditam que as interacções entre o enrolamento da proteína e o modelo polimérico podem minimizar a agregação dos intermediários da renaturação e fornecer um ambiente para que a proteína enrole na sua conformação nativa. O polímero que actua como um modelo pode se ligar a um domínio ou região da proteína para estabilizar o intermediário e permitir que mais enrolamento ocorra sem agregação. Os agregados da proteína, se formados, são geralmente menos activos do que proteína enrolada não agregada, e geralmente resulta num rendimento final reduzido da proteína enrolada activa. A concentração de NaCl nas condições de enrolamento é 28 considerada importante e é seleccionada para conseguir a eficiência máxima de renaturação através da maximização da interacção entre o polímero modelo e a renaturação da proteína. Por exemplo, os inventores descobriram que aproximadamente uma concentração de 0.2 M de NaCl ou inferior promove a ligação do C-terminal e/ou do terceiro domínio de Kunitz do TFPI para a heparina ou outro polímero de polissacárido sulfatado. Presume-se que a ligação do polímero ao intermediário facilite a solubilidade do intermediário e forneça um ambiente para o resto da proteína para enroladas através da redução da agregação dos intermediários do enrolamento. Métodos Geral O TFPI pode ser preparado por métodos recombinantes como revelado na U.S. 5,212,091, a revelação destes é aqui incorporada por referência. Resumidamente, o TFPI é expresso em células de Escherichia coli e os corpos de inclusão com o TFPI são isolados a partir do resto do material celular. Os corpos de inclusão são sujeitos a sulfitólise, purificados usando cromatografia de troca iónica, enrolados por reacção de intercâmbio de dissulfureto e o TFPI enrolado, activo purificado por cromatografia de troca catiónica. O TFPI também pode ser produzido em leveduras como revelado no pedido pendente U.S.S.N. 08/286,530. A actividade de TFPI pode ser testada pelo ensaio de tempo de protrombina (ensaio PTT). A bioactividade do TFPI foi medida pelo tempo de coagulação da protrombina usando um modelo RA4 Coag-A-Mate da Organon Teknika Corporation (Oklahoma City, OK) . As amostras de TFPI foram primeiramente diluídas de 9 a 24 yg/mL com um tampão de TBSA (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, 1 mg/mL de BSA, pH 7.5). Depois foram misturados 29 10 uL de Varify 1 (plasma normal misturado a partir de Organon Teknika Corp.) com 90 uL de amostras de TFPI diluídas num tabuleiro de amostras e aquecidas a 37°C no instrumento. Finalmente, foi adicionada Simplastin Excel (Tromboplastina a partir de Organon Teknika Corp.) para iniciar a coagulação. O atraso do tempo na coagulação devido à actividade anticoagulante do TFPI foi medido e convertido em concentração de TFPI nas amostras medidas por comparação com uma curva padrão de TFPI. A quantidade de TFPI solúvel também pode ser quantificada por medição da área do pico principal num cromatograma de troca catiónica. A análise por HPLC das amostras de TFPI foi realizada usando um sistema Waters 626 LC (Waters Corporation, Milford, MA) equipado com um amostrador automático Water 717 plus heater/cooler. A aquisição de dados foi processada por um sistema Turbochrom™ da Perkin-Elmer. O método de troca catiónica (IEX) usado numa coluna de vidro Pharmacia Mono S HR 5/5. A coluna foi equilibrada num tampão A a 80% (solução 20 mM de acetato trihidratadoracetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5.4) e tampão B a 20% (solução de acetato trihidratado 20 mM - cloreto de amónio 1.0 M:acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5.4). Após uma amostra ter sido injectada, foi aplicado um gradiente para eluir o TFPI a uma taxa de fluxo de 0.7 mL/min a partir de tampão B a 20% até tampão B a 85% em 21 minutos. As espécies de TFPI eluídas foram detectadas por absorvância a 214 nm. O pico principal (monómero de TFPI) foi encontrado no eluído a cerca de 18 minutos. A perda de TFPI solúvel foi quantificada por integração da área do pico restante do pico principal.
Todos os reagentes são grau U.S.P. ou A.C.S. Os fornecedores incluem J.T. Baker e Sigma Co. (St. Louis, MO). 30 A presente invenção será agora ilustrada por referência aos seguintes exemplos, gue apresentam determinadas modalidades. No entanto, deve ser notado gue estas modalidades são ilustrativas e não são construídas como restrições à invenção de gualguer forma.
EXEMPLOS - PARA REFERÊNCIA
Exemplo 1 - Enrolamento do TFPI Desnaturado 0 exemplo seguinte descreve a elaboração das soluções de base, a preparação da coluna de HIC, a recuperação inicial e purificação do TFPI antes do enrolamento, o enrolamento do TFPI e a recuperação do TFPL activo. A solução base de TFPI foi preparada a partir de corpos refractários gue resultam da expressão de TFPI recombinante em bactérias. Os corpos de refractários foram solubilizados a 10 mg/ml em ureia, Tris 50 mM pH 8.5 com DTT 10 mM, e esta solução foi clarificada por centrifugação a 10000 x g durante 10 minutos. A preparação da coluna para a purificação inicial do TFPI solubilizado foi preparada com esferas de S-Sepharose misturadas em ureia 7.5 M, Tris 10 mM e fosfato de sódio 10 mM (pH 6.5) com DTT 5 mM e EDTA 1 mM. O TFPI solubilizado numa concentração de 5 mg/ml foi então posto a correr numa coluna de S-Sepharose e eluído com um gradiente de cloreto de sódio de 0 a 1 Μ. O TFPI purificado tinha uma absorvância de 3.2 ao comprimento de onda de 280 nm (que é equivalente a 4.1 mg/ml usando um coeficiente de extinção de 0.78).
A solução base de dextrano consistiu em sulfato de dextrano de peso molecular 8000 daltons disponível na Sigma, item número D-4911, feito até 50 mg/ml (6.25 mM) em Tris 50 mM 31 (ρΗ 8.8) em cloreto de sódio 0.1 M, e armazenada a -20 graus centígrados entre usos. A solução base de heparina, se a heparina foi usada para conduzir o enrolamento, tinha o peso molecular de 6000 a 30000 daltons, (com um peso molecular médio de 18000 daltons) preparada como um sal de sódio disponível na Sigma Co. (St. Louis, MO), item número H-3393, feito até 60 mg/ml (3.33 mM) em Tris 50 mM (pH8.8) em cloreto do sódio 0.1, e armazenada a -20°C entre utilizações.
Podem ser adicionadas ao TFPI purificado por S-Sepharose tanto a solução bases de sulfato de dextrano como a de heparina. O dextrano ou a heparina foram adicionados ao TFPI sob condições de desnaturação em ureia de 6 a 8 M. Com os reagentes a 4°C, a solução de desnaturação com TFPI foi diluída para ureia 3 M, Tris 50 mM (pH 8.8), cloreto de sódio 0.2 M e 0.5 mg/ml de TFPI, e para uma concentração final de sulfato de dextrano de 0.6 mg/ml (75 μΜ) ou uma concentração final de heparina de 1.5 mg/ml (83 μΜ) , dependendo no que foi usada para facilitar o enrolamento. Foi adicionada cistina à solução de enrolamento para uma concentração final igual à concentração final de DTT. A solução de enrolamento foi incubada a 4°C com agitação suave durante 4 a 6 dias, preferivelmente 5 dias.
Como uma ilustração deste procedimento o que se segue é um detalhe dum protocolo para enrolamento duma solução de 5 ml de TFPI em sulfato de dextrano ou heparina.
Foi adicionado a 610 μΐ da solução base de TFPI quer 60 μΐ de sulfato de dextrano com 65 μΐ de Tris 50 mM (pH 8.8) em NaCl 0.1 M, quer 125 μΐ de solução base de heparina com Tris 50 mM (pH 8.8) ou NaCl 0.1 Μ. A solução de enrolamento foi misturada e deixada a incubar 10 minutos em gelo. Depois, foram adicionados 4.2 ml do tampão de enrolamento com ureia 32 2.5 M, Tris 50 mM (pH 8.8) e cloreto de sódio 165 mM à solução de enrolamento e misturados. Finalmente, foram adicionados 61 μΐ de cistina 50 mM preparados em hidróxido de sódio 120 mM e a solução total foi incubada a 4°C com agitação suave durante 4 dias. O conteúdo em sulfidril livre foi verificado com reagente de Ellman (também chamado DTNB). Foi adicionada idoacetamida, a 20 mM, preparada até 1 M em etanol 100% para guardar a - 20°C. A coluna de interacção hidrofóbica (HIC) foi preparada a partir da resina de Tosohaas Toyopearl Butyl-650M com tamanho de partícula 40-90, parte # 014702. A resina de butilo foi lavagem em ureia 3 M, sulfato de amóniol M, Tris 50 mM, fosfato de sódio 10 mM, pH 6.5 e ressuspendida numa pasta a 50%.
As amostras de enrolamento, guardadas a -20°C permaneceram no tampão de enrolamento padrão com ureia 3 M, Tris 50 mM, pH 8.8, redox 1-4 mM, 0.5 mg/ml de TFPI, e NaCl 0.2-0.6 M dependendo das condições. As amostras enroladas com dextrano ou heparina tinham sal a 0.2 M e as amostras sem dextrano ou heparina tinham NaCl 0.6 M.
Os seguintes passos foram realizados à temperatura ambiente para efectuar uma maior purificação do TFPI enrolado. Foram adicionados a 300 μΐ da amostra enrolada, um volume igual de sulfato de amónio 2 M, ureia 3 M, Tris 50 mM e fosfato de sódio 10 mM (pH 6.5). Depois, foram adicionadas 100 μΐ de esferas Butyl-650M lavadas à amostra enrolada diluída. A solução com as esferas foi incubada com agitação ou mistura suave durante 30 minutos à temperatura ambiente. A mistura foi então posta num ependorf e centrifugada durante 5 segundos, e posta num suporte para permitir que assente durante um minuto para as esferas sedimentem no fundo do tubo. O sobrenadante 33 foi aspirado cuidadosamente, de modo a não perturbar as esferas.
Para lavar as esferas com o TFPI ligado, foi adicionado 1 ml de tampão de lavagem composto por sulfato de amónio 1 M, ureia 3 M, Tris 50 mM, fosfato de sódio 10 mM (pH 6.5) às esferas para remover o sulfato de dextrano ou heparina remanescente. A mistura lavada foi recentrifugada num ependorf durante 5 segundos, e deixada a assentar durante um minuto para as esferas sedimentarem como anteriormente. O sobrenadante foi removido, e as esferas foram então lavadas com o tampão de lavagem uma última vez, e centrifugadas para permitir assentar como antes. Após a lavagem e sedimentação final, o sobrenadante foi removido com uma pipeta de Pasteur estirada à chama com muito cuidado.
Para eluir o TFPI enrolado, foram adicionados 300 μΐ de tampão de eluição composto por ureia 3 M, sulfato de amónio 0.1 M, Tris 50 mM e fosfato de sódio 10 mM (pH 6.5) à pasta de esferas e agitados durante mais 10 minutos. As esferas foram sedimentadas por rotação numa centrífuga de ependorf, e o sobrenadante com o TFPI enrolado foi recuperado. Para evitar a contaminação das esferas com o produto, algum do sobrenadante foi deixado ficar.
Exemplo 2 - HIC de Enrolamento com Sulfato de Dextrano A amostra de TFPI foi renaturada numa concentração de 0.5 mg/ml de TFPI, 0.6 mg/ml de sulfato de dextrano, ureia 3.0 M, NaCl 200 mM e Tris 50 mM (pH 5.5) . A coluna de HIC foi preparada a partir de esferas de TosoHaas Butyl para HIC, 4.6 mmD/lOOmmL, numa pasta de 1.66 ml. A taxa de fluxo foi de 1.0 ml/min. Antes de carregar a coluna de HIC, a amostra foi diluída de 2:3 com ureia 3.0 Me NH4S04 3.0 M num pH final de 5.68; foram carregados 2 ml da amostra. O gradiente de partida 34 foi MES 33 mM/HEPES 33 mM/ acetato de sódio 33 mM, NH4S04 1.0 M, e ureia 3.0 M, pH 6.0; o gradiente final foi MES 33 mM/HEPES 33 mM/ acetato de sódio 33 mM, ureia 3.0 Μ, pH 6.0. O volume de gradiente foi 5.0 CV. A partir desta coluna, a recuperação de TFPI nativo foi de 68%. Os resultados desta corrida estão apresentados na Figura 2.
Uma segunda coluna de HIC também foi posta a correr. A amostra do TFPI desnaturado foi diluída de 2:3 com ureia 3.0 M, NH4S04 1.5 M e foram carregados 2 ml. O gradiente de partida foi MES 33 mM/HEPES 33 mM/ acetato de sódio 33 mM, NH4S04 0.5 M, e ureia 3.0 M, pH 6.0; o gradiente final foi MES 33 mM/HEPES 33 mM/ acetato de sódio 33 mM, ureia 3.0 M, pH 6.0. O volume de gradiente foi 5.0 CV. A recuperação do TFPI nativo a partir desta segunda coluna foi 74%. Os resultados desta corrida estão apresentados na Figura 3.
As amostras foram analisadas por SDS-PAGE não redutor como ilustrado na Figura 1. Correctamente enroladas, as espécies de TFPI activo (banda principal) são visualizadas no gel.
Exemplo 3
Foram dialisados cerca de 10 mg/mL de TFPI em ureia 2M contra um dos seguintes: acetato 20 mM, fosfato 20 mM, citrato 20 mM, glicina 20 mM, L-glutamato 20 mM ou succinato 20 mM em NaCl 150 mM como descrito acima. 6-10 mg/mL de solução base de TFPI foram carregados em tubagem de diálise Spec/Por 7 (corte de MM 3500). A diálise foi realizada quer a 4°C quer à temperatura ambiente. Três variações do tampão numa razão de solução de proteína para tampão: 1 para 50-100, foram feitas durante o curso da diálise por mais de um período de 12 a 24h. Após a diálise, a solução de TFPI foi filtrada por unidades de microfiltro 0.22 Costar para separar o TFPI precipitado a partir do TFPI solúvel. A solubilidade de TFPI foi então 35 medida por absorvância UV/Vis assumindo uma absortividade de 0.68 (mg/mL)"1 cm"1 a 278 nm. As soluções foram preparadas a vários niveis de pH por titulação com HC1 ou NaOH.
Após a finalização da diálise, os precipitados foram filtrados através de unidades de filtro de 0.22 pm. A concentração do TFPI solúvel remanescente após a diálise foi medida por absorvância UV. A Figura 1 apresenta os resultados destas experiências. A solubilidade do TFPI aumenta bastante em soluções com acetato 20 mM, fosfato 20 mM, L-glutamato 20 mM e succinato 20 mM a niveis de pH abaixo de 7 e, particularmente, a ou abaixo de pH 4.5. A solubilidade do TFPI também foi substancialmente aumentada em soluções com glicina 20 mM acima de pH 10. A Figura 2 apresenta a solubilidade do TFPI como uma função da concentração do ião citrato na presença de fosfato Na 10 mM a pH 7. A solubilidade do TFPI aumenta com o aumento da concentração de citrato. A Figura 3 apresenta a solubilidade do TFPI como uma função da concentração de NaCl a pH 7.0. A solubilidade do TFPI aumenta com o aumento da concentração de sal, indicando que o sal promove a solubilidade de TFPI. A solubilidade do TFPI foi estudada usando vários solubilizadores diferentes e solubilizadores secundários. A Tabela 1 apresenta a solubilidade do TFPI em variadas soluções tampão medidas por absorvância UV após diálise de 6 a 10 mg/mL de TFPI nestas soluções tampão. 36
Tabela 1
Efeito do sal Solubilidade Conteúdo pH c (mg/ml) uv NaP04 lOmM 7 0.21 NaP04 lOmM, NaCl 150mM 7 0.72 NaP04 20mM, NaCl 150mM 7 0.85 NaP04 20mM, NaCl 0.5 mM 7 6.71 NaP04 20mM, NaCl 1 M 7 8.24 efeito do pH Conteúdo pH c (mg/ml) uv NaOAc 20mM, NaCl 150mM 3 10.27 NaOAc 20mM, NaCl 150mM 3.5 10.25 NaOAc 20mM, NaCl 150mM 4 7.54 NaOAc 20mM, NaCl 150mM 4.5 1.75 NaOAc 20mM, NaCl 150mM 5 1.15 NaOAc 20mM, NaCl 150mM 5.5 0.85 NaP04 20mM, NaCl 150mM 5.5 0.89 NaP04 20mM, NaCl 150mM 6 0.78 NaP04 20mM, NaCl 150mM 6.5 0.79 NaP04 20mM, NaCl 150mM 7 0.95 NaP04 20mM, NaCl 150mM 7.5 0.82 NaP04 20mM, NaCl 150mM 8 0.86 NaCitrato 20 mM, NaCl 150 mM 4 2.17 NaCitrato 20 mM, NaCl 150 mM 4.5 1.19 NaCitrato 20 mM, NaCl 150 mM 5 1.1 NaCitrato 20 mM, NaCl 150 mM 5.5 1.84 NaCitrato 20 mM, NaCl 150 mM 6 2.09 NaCitrato 20mM NaCl 150mM 6.5 2.12 NaCitrato 20 mM, NaCl 150 mM 7 1.92 Glicina 20 mM, NaCl 150 mM 9 0.32 Glicina 20 mM, NaCl 150 mM 10 0.9 Glicina 20 mM, NaCl 150 mM 11 13.94 37
Continuação
Efeito do Sal Solubilidade L-Glutamato 20mM, NaCl 150mM 4 9.07 L-Glutamato 20mM, NaCl 150mM 5 1.21 Succinato 20mM, NaCl 150mM 4 8.62 Succinato 20 mM, NaCl 150 mM 5 1.21 Succinato 20 mM, NaCl 150 mM 6 1.07 Citrato Conteúdo pH c (mg/ml) uv NaP04 lOmM, NaCitrato 20mM 7 1.16 NaP04 lOmM, NaCitrato 50mM 7 5.81 NaP04 lOmM, NaCitrato lOOmM 7 12.7 NaP04 lOmM, NaCitrato 200mM 7 15.9 NaP04 lOmM, NaCitrato 300mM 7 8.36 Mg2+, Ca2+ e polifosfato Conteúdo pH c (mg/ml) uv NaP04 lOmM, NaCl 150mM, MgCl2 lmM 7 0.66 NaP04 lOmM, NaCl 150mM, MgCl2 10mM 7 1.02 NaP04 lOmM, NaCl 150mM, CaCl2 O.lmM 7 0.67 NaP04 lOmM, NaCl 150mM, CaCl2 lmM 7 0.71 NaP04 lOmM, NaCl 150mM, trifosfato lOmM 7 3.64 NaP04 lOmM, PEG-400 a 5% 7 0.07 NaP04 lOmM, EDTA lOmM 7 0.36 NaP04 lOmM, Na2S04 lOOmM 7 5.08 NaP04 lOmM, ácido L-aspártico lOOmM 7 0.4 NaP04 lOmM, ácido succinico lOOmM 7 2.33 NaP04 lOmM, ácido tartárico lOOmM 7 2.56 NaP04 20mM, ácido maleico lOOmM 7 0.11 NaP04 20mM, ácido málico lOOmM 7 1.87 NaP04 lOmM, ácido L-glutâmico lOOmM 7 0 NaP04 lOmM, NaCl 150mM 7 0.25 NaP04 lOmM, isocitrato lOOmM 7 10.83 38
Continuação
Efeito do Sal Solubilidade NaOAc, NaP04 e NaCl Conteúdo pH c (mg/ml) uv NaOAc lOmM, NaCl 150mM 4.5 1.76 NaOAc lOmM 4.5 4.89 NaOAc lOmM 5.5 4.95 NaOAc lOmM 6.5 5.1 NaOAc lOmM 7 5.87 NaP04 lOmM, NaCl 150mM 4.5 0.14 NaP04 lOmM 4.5 4.97 NaP04 lOmM 5.5 0.79 NaP04 lOmM 6.5 0.091 NaP04 lOmM 7 0.94 NaOAc 50mM 5 5.24 NaOAc 5mM 5.5 4.59 NaOAc lOmM 5.5 5.05 NaOAc 20mM 5.5 5.04 NaOAc 50mM 5.5 5.71 NaOAc lOOmM 5.5 1.4 NaOAc 200mM 5.5 1.32 NaOAc 5mM, NaCl 5mM 5.5 4.85 NaOAc 5mM, NaCl lOmM 5.5 5.04 NaOAc 5mM, NaCl 50mM 5.5 0.56 NaOAc 5mM, NaCl lOOmM 5.5 0.43 NaOAc 5mM, NaCl 200mM 5.5 0.8 NaOAc 5mM 4.5 7.27 NaOAc lOmM 4.5 6.5 NaOAc 20mM 4.5 8.32 NaOAc 50mM 4.5 9.17 NaOAc 5mM 5.5 8.98 NaOAc lOmM 5.5 8.08 39
Continuação
Efeito do Sal Solubilidade NaOAc 20mM 5.5 8.99 NaOAc 50mM 5.5 2.92 NaOAc 5mM, NaCl 150mM 4.5 2.6 NaOAc lOmM, NaCl 150mM 4.5 2.59 NaOAc 20mM, NaCl 150mM 4.5 2.55 NaOAc 50mM, NaCl 150mM 4.5 2.1 NaOAc 5mM, NaCl 150mM 5.5 0.65 NaOAc lOmM, NaCl 150mM 5.5 0.69 NaOAc 20mM, NaCl 150mM 5.5 0.71 NaOAc 50mM, NaCl 150mM 5.5 0.91 Comprimento da cadeia hidrofóbica Conteúdo pH c (mg/ml) uv NaP04 lOmM, Ácido Fórmico 50mM 7 0.12 NaP04 lOmM, ácido acético 50mM 7 0.16 NaP04 10mM, ácido propanóico 50mM 7 0.16 NaP04 lOmM, Ácido butanóico 50mM 7 0.13 NaP04 lOmM, Ácido pentanóico 50mM 7 0.14 NaP04 lOmM, Ácido hexanóico 50mM 7 0.11 Outros Conteúdo PH c (mg/ml) uv NaOAc 20mM, Manitol 3%, Sacarose 2%, PEG-400 5% 4 19.9 Na Citrato 20mM, Manitol 3%, Sacarose 2%, PEG-400 5% 6.5 0.72 Na Citrato 20mM, NaCl 150mM, PEG-400 5% 6.5 2.18 NaOAc 20mM, NaCl 150mM, PEG-400 5% 4 19.8 Na Citrato 20mM, NaCl 130mM, Glicina 1%, Tween-80 0.25%, PEG-400 5% 6.5 1.48 Na Citrato 20mM, NaCl 130mM, Glicina 1%, Tween-80 0.25% 6.5 1.32 Solubilidade Conteúdo pH c (mg/ml) uv 40
Continuação
Efeito do Sal Solubilidade NaAcetato 5mM 5.5 8.9 NaAcetato 5mM, Sacarose 8% 5.5 11 NaAcetato 5mM, Polisorbato-80 0.01% 5.5 7 NaAcetato 5mM, Sacarose 8%, Polisorbato-80 0.01% 5.5 1 2 NaAcetato lOmM 5.5 7.6 NaAcetato lOmM, Sacarose 8% 5.5 10 NaAcetato lOmM, Sacarose 8%, Polisorbato-80 0.01% 5.5 12.1 NaAcetato 5mM, Sorbitol 5% 5.5 7.8 NaAcetato 5mM, Manitol 4.5% 5.5 9.2 Histidina 5mM 6 5.5 Histidina 5mM 6.5 1 NaCitrato 5mM 5.5 0.1 NaCitrato 5mM 6 0.1 NaCitrato 5mM 6.5 0.1 NaSuccinato 5mM 5.5 0.6 NaSuccinato 5mM 6 0.3 NaSuccinato 5mM 6.5 0.2 Imidazole lOmM 6.5 2.5. 10.8 Imidazole lOmM 7 0.8 Imidazole lOmM, Sacarose 8% 6.5 12.2 NaAcetato 5mM 6 8.2 Imidazole lOmM, NaAcetato 5mM 6.5 12.8 NaCitrato lOmM 6 0.2 NaCitrato lOOmM 6 8.1 NaCitrato lOOmM 7 9.3 Nafosfato lOmM, Na2S04 260mM 6 9.1 Nafosfato 10mM, NaCitrato lOOmM 8 8.8 NaCitrato 10mM, ácido L-glutâmico 1% 6 4.6 NaCitrato lOmM, L-lisina 2% 6 1.1 NaCitrato lOmM, ácido L-aspártico 0,5% 6 0.4 NaCitrato lOmM, Vidro fosfatado 0.1% 7 5.9 Tris lOmM, NaCitrato lOOmM 8 8.5 NaCitrato lOmM, Glicina 1M 6 0.3 41
Continuação
Efeito do Sal Solubilidade NaCitrato 10mM, Glicina 300mM 6 0.3 NaCitrato 10mM, Glicerol 280mM 6 0.3 NaCitrato lOmM, (NH4)2S04 0.5M 6 8.3 NaCitrato lOmM, (NH4)2S04 120mM 6 8.8 NaCitrato lOmM, Na2S04 260mM 6 9.4 NaP04 lOmM, Vidro fosfatado 0.1% 7 15.8 NaCitrato lOmM, SDS 0.1% 6 11.2 NaCitrato lOmM, SDS 0.02% 6 7.8 NaAcetato lOmM, PEG-400 8% 5.5 13.7 NaOAcetato lOmM, NaCl 150mM, PEG-400 8% 5.5 0.6 NaAcetato lOmM, PEG-400 8% 6 16.2 NaCitrato lOmM, PEG-400 8% 6 0.2
Exemplo 4 A estabilidade do TFPI armazenado a várias condições de pH foi testada. 0 TFPI foi preparado por diálise como acima em fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM e polisorbato-80 0.005% (m/v). As amostras estabilizadas com 150 mg/mL de TFPI foram incubadas a 40°C durante 20 dias. A constante da taxa cinética para o TFPI solúvel remanescente foi analisada pelo seguimento da diminuição do pico principal nos cromatogramas de troca catiónica. Como pode ser visto na Figura 5, a constante da taxa de decaimento aumenta a pH acima de 6.0, o que indica maior agregação a condições de pH superiores. O TFPI também foi formulado numa concentração de 150 mg/mL em NaCl 150 mM e polisorbato-80 0.005 % (m/v) a pH 7 com concentrações variantes de fosfato. A Figura 5A apresenta a percentagem do TFPI solúvel remanescente medido por HPLC de troca catiónica. O aumento das concentrações do ião fosfato em solução resulta em niveis mais elevados do TFPI solúvel que permanece após a incubação a 40°C. Os niveis mais elevados do 42 ião fosfato também resulta em níveis mais elevados do TFPI activo como ensaiado pelo ensaio do tempo de protrombina. Os resultados estão apresentados na Figura 5B. A estabilidade do TFPI numa concentração de 0.5 mg/mL e formulado em Na citrato 10 mM, pH 6 e NaCl 150 mM também foi testado a 40°C durante um período superior a 40 dias. Como pode ser visto na Figura 6, o HPLC de troca catiónica (triângulo) apresenta a presença de TFPI solúvel com níveis mais elevados do que 60% iniciais, mesmo após o dia 40 de incubação. Do mesmo modo, o ensaio do tempo da protrombina (circulo) apresenta a presença do TFPI activo com níveis mais elevados do que 60% iniciais, mesmo após o dia 40 de incubação. A Figura 7 apresenta perda do TFPI solúvel a 40°C medido tanto por HPLC de troca catiónica (símbolo aberto) como pelo ensaio do tempo da protrombina (símbolo fechado) para 0.5 mg/mL de TFPI formulado em Na fosfato 10 mM, pH 6 e tanto com NaCl 150 mM (triângulo) como com NaCl 500 mM (circulo). A Figura 8 apresenta perda do TFPI solúvel a 40°C medido tanto por HPLC de troca catiónica (símbolo aberto) como pelo ensaio do tempo da protrombina (símbolo fechado) para 0.5 mg/mL de TFPI formulado em Na acetato 10 mM, pH 5.5 com NaCl 150 mM (triângulo) ou sacarose a 8% (m/v) (quadrado) ou manitol a 4.5% (m/v) (circulo). A Figura 9 apresenta dois géis SDS não redutores para formulação de amostras de TFPI em NaPCú 10 mM, NaCl 150 mM e polisorbato-80 0.005 %, de pH 4 a pH 9 armazenado a 40°C durante 0 dias (inferior) e 20 dias (superior). Não se verifica perda no TFPI no dia 0. No entanto, no dia 20 pode ser vista a clivagem de fragmentos de TFPI na gama inferior de pH (i.e. pH 4 e pH 5). Sem estar ligado a uma teoria em 43 particular, acredita-se que estes fragmentos podem resultar a partir duma reacção catalizada por ácido.
Finalmente, a Tabela 2 apresenta a meia-vida do TFPI solúvel remanescente a 40°C para várias formulações. Foi formulado 0.5 mg/mL de TFPI nestas condições de formulação e incubado a 40°C. As amostras foram retiradas a intervalos de tempo predeterminados e a perda de TFPI activo e solúvel foi examinada por IEX-HPLC e pelo ensaio PT. A meia-vida do TFPI solúvel remanescente foi então calculado por execução dum ajustamento exponencial único para os resultados de IEX-HPLC e ensaio PT.
Exemplo 5 A eluição de TFPI no modo de deslocamento a partir de resinas de cromatografia usando compostos poliónicos. O TFPI é ligado em primeiro lugar a uma resina num tampão com baixo teor em sal. A seguir, um tampão, com o composto poliónico usado para eluir o TFPI num modo de deslocamento, é bombeado através da coluna. Este composto liga-se mais fortemente à resina do que o TFPI e desloca o TFPI. Para uma resina positivamente carregada (permutador aniónico) é usado um composto negativamente carregado e para uma resina negativamente carregada (permutador catiónico) é usado um composto positivamente carregado. O TFPI parcialmente purificado foi usado como material de partida. O TFPI, em ureia 6 M, Tris 20 mM, pH 8.0 foi carregado numa coluna empacotada com uma resina de troca aniónica, Q Sepharose HP, para uma resina 20 mg/mL. Após o carregamento, a coluna foi lavada com ureia 6 M, Tris 20 mM, pH 9.0. O TFPI foi eluido e 10 mg/ml de Vidro H (polifosfato) em ureia 6 M, Tris 10 mM, pH 9.0. 44
Exemplo 6
Eluição do TFPI a partir da resina de cromatografia num tampão aquoso usando compostos poliónicos.
Tabela 2 tl/2 (dia) a 40°C 0.5 mg/ml de TFPI formulado em: IEX-HPLC ensaio PT Na Acetato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5.5 10.8 17.2 Na Citrato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5.5 12.2 24.4 Na Acetato 10 mM, Sacarose a 8% (m/v), pH 5.5 43.2 42.2 Na Acetato 10 mM, Manitol a 4.5%, pH 5.5 47.7 46.6 Na Succinato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6.0 7.8 11.0 Na Citrato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6.0 13.0 18.8 Na Fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6.0 7.8 11.2 Na Fosfato 10 mM, NaCl 500 mM, pH 6.0 52.2 68.9 Na Citrato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6.5 10.0 14.8
Para uma resina positivamente carregada é usado um composto positivamente carregado e para uma resina negativamente carregada é usado um composto negativamente carregado. 0 TFPI, em ureia 3.5 Μ, 1 mg/ml de polifosfato, Tris 50 mM, pH 5.9 foi carregado numa resina de troca catiónica, SP Sepharose HP. Após o carregamento a coluna foi lavada com um tampão sem ureia, 10 mg/ml de polifosfato, fosfato de sódio 10 mM, pH 5.0. O TFPI foi eluído no mesmo tampão a pH 7.5, sem ureia. 45
Exemplo 7
Eluição selectiva de TFPI a partir de resinas de troca iónica usando compostos poliónicos.
Os compostos poliónicos opostamente carregados podem-se ligar às extremidades carregadas de TFPI. Quando o composto poliónico tem uma força de ligação maior ao TFPI do que à resina, o TFPI pode ser selectivamente eluido a partir da resina de cromatografia. 0 TFPI, em ureia 3.5 Μ, 1 mg/ml de polifosfato, Tris 50 mM, pH 5.9 foi carregado numa resina de troca catiónica, SP Sepharose HP. Após o carregamento, a coluna foi lavada com um ureia 6M, lmg/ml de polifosfato, fosfato de sódio 10 mM, pH 5.9. O TFPI foi eluido num gradiente de volume de coluna 25 até 20 mg/ml de polifosfato. O TFPI começa a eluir a cerca de 2-3 mg/ml de polifosfato.
Exemplo 8
Neutralização dos compostos poliónicos antes da separação cromatográfica de TFPI. O TFPI pode interagir com polímeros carregados. Esta interacção pode impedir a ligação e purificação das resinas cromatográficas. Através da neutralização do polímero carregado com um polímero de carga oposta, o TFPI pode se ligar à resina.
Num tampão com polifosfato (Vidro Η), o TFPI não se liga ao Express Ion S (Whatman) e não é conseguida purificação. Através da mistura de PEI na carga da coluna, o TFPI liga-se agora à resina e o TFPI pode ser purificado.
Exemplo 9
Enrolamento e purificação do TFPI recombinante humano (rhTFPI) usando um Processo de Enrolamento Facilitado com Polifosfato (Vidro H). 46
Os corpos de inclusão com cerca de 40 g de rhTFPl foram descongelados por remoção dos contentores dum congelador a -20°C e incubação dos mesmos num ambiente arrefecido a 4-10°C durante aproximadamente 196 horas. Os corpos de inclusão descongelados foram então dispersos com uma misturadora de elevada força de corte para reduzir os aglomerados que ocorrem durante o descongelamento. Os corpos de inclusão descongelados foram adicionados a 80 L de ureia 3 M, Tris-Cl 50 mM, tampão a pH 10.5 com 2 g/L Vidro H contidos num tanque de polietileno de 100 L equipado com um agitador suspenso. Os conteúdos foram misturados durante aproximadamente 15 minutos, e depois foi medida a absorvância da solução a 280 nm. Se a absorvância é superior a da mistura, esta foi diluida com tampão de dissolução suficiente para obter uma absorvância de 1.0-1.1 a 280 nm. A solução foi incubada com agitação suave durante 15-30 minutos, e depois foi adicionada cisteina suficiente para dar uma concentração de cisteina de 0.1 mM. A L-cisteina sólida foi dissolvida em aproximadamente 50 ml de água purificada e adicionada à mistura enrolada. O pH foi verificado e ajustado para pH 10.2 se necessário. A mistura enrolada foi incubada com agitação durante 96-120 horas.
Após aproximadamente 96 h, o processo de enrolamento foi terminado por ajustamento do pH da mistura enrolada para pH 5.9 usando ácido acético glacial. A agitação foi continuada durante 90 minutos e o pH verificado. Foi adicionado mais ácido, se necessário, para ajustar o pH para 5.9 +/- 0.1. Foi usado um processo de filtração em dois passos para remover o particulado que se formou durante os passos anteriores e preparar a mistura enrolada acidificada para SP-cromatografia em Sepharose HP. Primeiramente, a mistura enrolada acidificada é passada através de um filtro de profundidade A Cuno 60LP (caixa de filtro modelo 8ZP1P) usando uma bomba peristáltica 47 (com tubo de silicone de 1/4 - 3/8 polegadas de diâmetro interno). O sistema de filtro foi lavado com 8-10 L de ureia 6 M desionizada antes do uso. O filtrado foi recolhido num tanque de polietileno de 100 L. A pressão de retorno foi mantida a uma constante de 20 PSI. A taxa de fluxo inicial para um novo filtro foi aproximadamente de 5-6 L por minuto. Os filtros foram substituídos quando a taxa de fluxo caiu abaixo de 1 L por minuto de modo a manter a pressão de retorno a 20 PSI. O segundo estágio da filtração usou um cartuxo de 0.45 micra (Sartorius Sartobran pH ou equivalente) com um sistema de bombeamento peristáltico. Após a filtração, o pH foi verificado e ajustado para pH 5,9 se necessário. O enrolado filtrado, acidificado foi carregado numa coluna de SP Sepharose HP equilibrada numa taxa de fluxo de aproximadamente 80.0 ml/min. A taxa de fluxo foi ajustada para acomodar o carregamento durante a noite da mistura enrolada filtrada acidificada. A coluna foi equilibrada em ureia 6 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM a pH 5.9 antes do carregamento. Após o carregamento, a coluna foi lavada com 2 CF de ureia 6 M, NaCl 0.3 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 5.9 antes do passo de eluição com gradiente. A taxa de fluxo da coluna foi aumentada para 190-200 ml/min para o passo de lavagem e para todos os passos subsequentes (velocidade linear =- 47 cm/h). O produto foi eluído a partir da coluna usando um gradiente de sal linear a partir de NaCl 0.3 a 0.5 M em ureia 6 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 5.9. O gradiente foi formado por distribuição de ureia 6 M, NaCl 0.5 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM para dentro de ureia 6 M, NaCl 0.3 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM. O tampão limite foi bombeado com uma bomba Masterflex (modelo 7553-20) com uma cabeça Masterflex (modelo 7015.21) com uma taxa de fluxo de 48 aproximadamente 100 ml/min. com agitação vigorosa usando uma misturadora Paratrol A a partir da Parametrics (modelo 250210). O volume total do gradiente foi 71.0 litros ou 13.0 CV. O pH dos tampões do gradiente foi de 5.92 (+/- .02). As fracções são avaliadas gualitativamente usando SDS PAGE e misturadas com base no conteúdo do SC-59735 enrolado correctamente relativamente a outros mal enrolados e impurezas. Após a mistura a corrente do processo é referida como mistura S. O pH da mistura S foi logo a seguir ajustado para pH 8.0 com NaOH 2.5 N. A mistura S foi concentrada 2-3 vezes para aproximadamente 2 L usando uma unidade de ultrafiltraçâo Amicon DC-10L com um cartucho espiral Amicon YM10 (membrana de corte de 10000 M.M.). Após a concentração, a mistura S concentrada foi diafiltrada contra 7 volumes de ureia 6 M, tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8.0. A diafiltração foi considerada completa quando a condutividade do retido foi abaixo de 2 mS. O concentrado diafiltrado foi drenado a partir da unidade de ultrafiltraçâo e a unidade foi lavada com aproximadamente 1 L de tampão de diafiltração. Este é combinado com o concentrado para formar o Q-load.
Uma coluna Amicon (7.0 cm de diâmetro) foi empacotada com aproximadamente 700 ml de meio de alta resolução Q-Sepharose (Pharmacia Q-Sepharose HP). A coluna foi empacotada com etanol a 20% a 20 psi. A altura do leito após o empacotamento foi aproximadamente de 18 cm. A coluna foi equilibrada com 5 CF de ureia 6 M, tampão Tris/HCl 0.02 M, pH 8. A estimativa para o carregamento da proteína é 8-10 mg proteína/ml de resina de Q Sepharose. O Q-load foi aplicado à coluna com uma taxa de fluxo de 30-35 ml/min (50 cm/h). Após o carregamento, a coluna foi lavada com aproximadamente 5 CV de ureia 6 M, tampão Tris/HCl 20 mM, pH 8.0, ou até a absorvância a 280 nm retornar 49 à linha de base. 0 produto foi eluído usando um gradiente de cloreto de sódio a partir de NaCl 0-0.15 M em ureia 6 M, tampão Tris/HCl 20 mM, pH 8.0 em mais de 25 volumes de coluna. Os primeiros sete volumes de coluna foram recolhidos como uma única fracção, seguido de 30 fracções de 0.25 volumes de coluna cada.
As fracções são analisadas rotineiramente por SDS-PAGE de redução e não redução e cromatografia de exclusão molecular. As fracções são misturadas com base no conteúdo de agregado (<5% por SEC HPLC Método MSL 13929) e avaliação qualitativa por SDS PAGE para avaliar a pureza. As fracções são armazenadas congeladas a -20°C até serem misturadas.
As fracções de Q Sepharose aceitáveis foram misturadas, e o pH da mistura foi ajustado para 7.2 usando HC1 2 Μ. A mistura foi depois concentrada aproximadamente 5 vezes num sistema de ultrafiltraçâo Amicon DC-1 com um cartucho SlYl Amicon YM-10 (membrana do cartucho espiral de 10000 MWCO). A Mistura Q concentrada foi depois diafiltrada contra sete volumes de coluna com ureia 2 M, NaCl 0.15 M, tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7.2. Seguindo-se à ultrafiltraçâo, a solução foi drenada a partir do sistema de ultrafiltraçâo. Foi posto em circulação aproximadamente 100 ml de ureia 2 M, NaCl 0.15 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7.2 através do sistema de ultrafiltraçâo durante aproximadamente 5 min. A solução de lavagem foi combinada com o concentrado original e a solução foi filtrada através duma unidade de filtro de vácuo de 0.45 micron (Nalgene) .
Exemplo 10
Enrolamento e Purificação de rhTFPI usando Processo de Enrolamento Facilitado por Polietilenoimina (PEI). 50
Os corpos de inclusão com cerca de 40 g de rhTFPl foram descongelados por remoção dos contentores dum congelador a -20°C e incubação dos mesmos num ambiente arrefecido a 4-10°C durante aproximadamente 96 horas. Os corpos de inclusão descongelados foram então dispersos com uma misturadora de elevada força de corte para reduzir os aglomerados que ocorrem durante o descongelamento. A pasta dos corpos de inclusão foi vigorosamente fundida durante aproximadamente 1 minuto usando um homogeneizador polytron (Brinkman modelo PT45/80) ou até os corpos de inclusão estarem adicionados a 40 L de ureia 6 M, tampão Tris/HCl 100 mM a pH 9.8 com NaCl 300 mM e 0.4 g/L de PEI contidos num tanque de 100 L de polietileno equipado com um agitador suspenso. A mistura foi vigorosamente agitada durante 20-30 min. O pH foi monitorizado e ajustado para pH 9.8 conforme necessário. A absorvância da mistura dos corpos de inclusão dissolvidos foi medida a 280 nm, e se a absorvância fosse maior do que 2.1, a amostra era diluida com 10 litros do tampão de dissolução descrito acima para obter um valor de A2so de 2.0-2.1. Continuou-se com agitação suave durante mais 15-30 minutos. Em seguida, a solução dos corpos de inclusão dissolvidos foi diluida com um volume igual de ureia de solução de 1.0 M, NaCl 300 mM. Finalmente, foi adicionada L-cisteina para dar uma concentração final de 0.25 mM. A L-cisteina sólida foi dissolvida em 50 ml de WFI e adicionada como uma solução ao enrolado diluído. O pH foi verificado e ajustado, se necessário. O enrolado continuou com agitação suave durante 96-120 horas com verificações periódicas do pH, e ajustamento para pH 9.8, se necessário. O progresso do enrolado foi monitorizado através de ensaios do tempo da protrombina e troca catiónica Mon-S.
Após aproximadamente 96 h, o processo de enrolamento foi terminado por ajustamento do pH do enrolado para pH 5.9 usando 51 ácido acético glacial. A agitação foi continuada durante 90 minutos e o pH verificado. Foi adicionado mais ácido, se necessário, para ajustar o pH para 5.9 +/- 0.1.
Foi usado um processo de filtração em dois passos para remover o particulado que se formou durante os passos anteriores e preparar o enrolado acidificado para SP-cromatografia em Sepharose HP. Primeiramente, o enrolado acidificado é passada através de um filtro de profundidade A Cuno 60LP (caixa de filtro modelo 8ZPIP) usando uma bomba peristáltica (com tubo de silicone de 1/4 -1/3 polegadas de diâmetro interno). O sistema de filtro foi lavado com 8-10 L de ureia 6 M desionizada antes do uso. O filtrado foi recolhido num tanque de polietileno de 100 L. A pressão de retorno foi mantida a uma constante de 20 PSI. A taxa de fluxo inicial para um novo filtro foi aproximadamente de 5-6 L por minuto. Os filtros foram substituídos quando a taxa de fluxo caiu abaixo de 1 L por minuto de modo a manter a pressão de retorno a 20 PSI. O segundo estágio da filtração usou um cartuxo de 0.45 micron (Sartorius Sartobran pH ou equivalente) com um sistema de bombeamento peristáltico. Após a filtração, o pH foi verificado e ajustado para pH 5.9, se necessário. O enrolado filtrado, acidificado foi carregado numa coluna de SP Sepharose HP equilibrada numa taxa de fluxo de aproximadamente 80.0 ml/min. A taxa de fluxo foi ajustada para acomodar o carregamento durante a noite do enrolado filtrado acidificado. A coluna foi depois lavada com 5.5 volumes de coluna de ureia 2 M, NaCl 0.15 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 5.9. A taxa de fluxo da coluna foi aumentada para 190-200 ml/min para o passo de lavagem e para todos os passos subsequentes (velocidade linear =- 47 cm/h). O produto foi eluido a partir da coluna usando um gradiente de sal linear a 52 partir de NaCl 0.3 a 0.5 M em ureia 6 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 5.9. O gradiente foi formado por distribuição de ureia 6 M, NaCl 0.5 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM para dentro de ureia 6 M, NaCl 0.3 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM. O tampão limite foi bombeado com uma bomba Masterflex (modelo 7553-20) com uma cabeça Masterflex (modelo 7015.21) com uma taxa de fluxo de aproximadamente 100 ml/min. com agitação vigorosa usando uma misturadora Paratrol A a partir da Parametrics (modelo 250210) . O volume total do gradiente foi 71.0 litros ou 13.0 CV. O pH dos tampões do gradiente foi de 5.92 (+/- .02). A recolha da fracção foi começada quando a condutividade à entrada da coluna alcançou 28.0 - 28.5 mS/cm, conforme medido pelo radiómetro em linha medidor de condutividade. Foram recolhidas 40 fracções de 500 ml (0.1 CV) . Um colector de fracções da Pharmacia Frac-300 foi usado com garrafas de polipropileno numeradas de 500 ml. Quando a recolha de fracções foi parada, o gradiente restante foi recolhido como uma mistura.
As fracções da coluna foram ensaiadas por A280, HPLC de exclusão molecular e, em adição, com fins informativos, SDS PAGE, HPLC de fase reversa e ensaios de PT. As fracções foram misturadas se obedeciam ao critério de mistura de conterem 20% do menos agregado como determinado pelo processo HPLC SEC. As fracções SP Sepharose misturadas são referidas como mistura S. O pH da mistura-S foi logo a seguir ajustado para pH 8.0 com NaOH 2.5 N. A mistura S foi concentrada 2-3 vezes para aproximadamente 2 L usando uma unidade de ultrafiltração Amicon DC-10L com um cartucho espiral Amicon YM10 (membrana de corte de 10000 M.M.). Após a concentração, a S pool concentrada foi diafiltrada contra 7 volumes de ureia 6 M, tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8.0. A diafiltração foi considerada 53 completa quando a condutividade do retido foi abaixo de 2 mS. 0 concentrado diafiltrado foi drenado a partir da unidade de ultrafiltração e a unidade foi lavada com aproximadamente 1 L de tampão de diafiltração. Este é combinado com o concentrado para formar o Q-load.
Uma coluna Amicon (7.00 cm de diâmetro) foi empacotada com aproximadamente 700 ml de meio de alta resolução Q-Sepharose (Pharmacia Q-Sepharose HP). A coluna foi empacotada em etanol a 20% a 20 psi. A altura do leito após o empacotamento foi aproximadamente de 18 cm. A coluna foi equilibrada com 5 CV de ureia 6 M, tampão Tris/HCl 0.02 M, pH 8. A estimativa para o carregamento da proteína é 8-10 mg proteína/ml de resina de Q Sepharose. O Q load foi aplicado à coluna com uma taxa de fluxo de 30-35 ml/min (50 cm/h) . Após o carregamento, a coluna foi lavada com aproximadamente 5 CV de ureia 6 M, tampão Tris/HCl 20 mM, pH 8.0, ou até a absorvância a 280 nm retornar à linha de base. O produto foi eluído usando um gradiente de cloreto de sódio a partir de NaCl 0-0.15 M em ureia 6 M, tampão Tris/HCl 20 mM, pH 8.0 em mais de 25 volumes de coluna. Os primeiros sete volumes de coluna foram recolhidos como uma única fracção, seguido de 30 fracções de 0.25 volumes de coluna cada.
As fracções são analisadas rotineiramente por SDS-PAGE de redução e não redução e cromatografia de exclusão molecular. As fracções são misturadas com base no conteúdo de agregado (5% por SEC HPLC) e avaliação qualitativa por SDS PAGE para avaliar a pureza. As fracções são armazenadas congeladas a -20°C até serem misturadas.
As fracções de Q-Sepharose a serem misturadas foram descongeladas por incubação a 2-8°C, misturadas, e o pH da mistura foi ajustado para 7.2 usando HC1 2 Μ. A mistura foi depois concentrada aproximadamente 5 vezes num sistema de 54 ultrafiltração Amicon DC-1 com um cartucho SlYl Amicon YM-10 (membrana do cartucho espiral de 10000 MWCO). A mistura Q concentrada foi depois diafiltrada contra sete volumes de coluna com ureia 2 M, NaCl 0.15 M, tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7.2. Seguindo-se à ultrafiltração, a solução foi drenada a partir do sistema de ultrafiltração. Foi posto em circulação aproximadamente 100 ml de ureia 2 M, NaCl 0.15 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7.2 através do sistema de ultrafiltração durante aproximadamente 5 min. A solução de lavagem foi combinada com o concentrado original e filtrada através duma unidade de filtro de vácuo de 0.45 micron (Nalgene) .
Exemplo 11
Solubilização, enrolamento e purificação de rhTFPI a partir de corpos de inclusão usando polifosfato na ausência de caotrópicos tais como ureia (GDS 5327089,92)
Cerca de 2 g de rhTFPI (4 3 ml de pasta de corpos de inclusão com 46 mg/ml de rhTFPI) foram dissolvidos com mistura em 4 L de tampão Tris 50 mM, pH 10.5 com 4 g/1 de polifosfato (Vidro H, FMC Corporation) 2-8°C. Foram adicionadas cisteina e cistina suficientes para fazer as soluções 0.1 mM e 0.05 mM, respectivamente. O pH foi mantido a pH 10.5 com NaOH 1 N. A solução enrolada foi incubada a 2-8°C com mistura suave durante 72-96 h. O enrolado foi logo depois ajustado para pH 6 usando ácido acético glacial e depois filtrado através de um filtro de 0.2 micron. Uma alíquota do enrolado filtrado foi aplicada a uma coluna de 200 ml de SP-Sepharose HP (Pharmacia) previamente equilibrada em Vidro H a 0.4 %, tampão de fosfato de sódio 20 mM a pH 6 após carregamento, a coluna foi lavada com 4 volumes de coluna de Vidro H de 0.4%, tampão de sódio fosfato 20 mM a 55 pH6. A coluna foi eluída usando um gradiente de pH linear a partir de Vidro H a 0.4 %, tampão de fosfato de sódio 20 mM a pH 6 até Vidro H a 0.4 %, tampão Tris 50 mM Tris a pH 8. As fracções foram recolhidas e analisadas por SDS PAGE. O rhTFPI relativamente puro pode ser enrolado e purificado deste modo.
Exemplo 12
Solubilidade melhorada de rhTFPI em água pela formação dum complexo entre TFPI e polifosfato (GDS 5327046-47)
Foram descongelados cerca de 10 g de rhTFPI purificado em cerca de 1 litro de ureia 2 M, cloreto de sódio 125 mM, tampão de fosfato de sódio 20 mM a pH 7.4 por incubação a 2-8°C durante 18-36 h. Foi adicionada ureia seca suficiente para fazer a solução 6 M em ureia. A solução foi então filtrada através de um filtro de 0.2 micron. Foram dissolvidos 5 g de polifosfato de vidro (Vidro H, FMC) em 50 ml de ureia 6 M, com o pH 7 ajustado com NaOH 1 N, e adicionado à solução da proteína. A solução foi então concentrada por ultrafiltração usando 1 pé quadrado de membrana (Amicon S1Y3) a cerca de 400 ml (-25 mg/ml) e diafiltrada contra 10 volumes (cerca de 4
litros) de água purificada para remover a ureia residual. Após a diafiltração, a solução foi concentrada a cerca de 250 ml e removida a partir da unidade de ultrafiltração. A unidade de ultrafiltração foi lavada com cerca de 150 ml de água purificada e foi adicionada ao concentrado de proteína. O
concentrado de proteína final continha quase 10 g de proteína em 400 ml de água (cerca de 24 mg/ml de proteína). A solubilidade normal de rhTFPI em água é inferior a 0.5 mg/ml. 56
Exemplo 13
Uso de polímeros catiónicos para a remoção de contaminantes de E. coli a partir de lisados de células TFPI e corpos refractários. 0 uso de polímeros catiónicos para precipitar e remover os contaminantes de E coli a partir de intermediários de TFPI em bruto (lisados, corpos refractários) pode melhorar significativamente as operações de processo subsequentes (enrolamento, cromatografia etc.). Uma pesquisa aleatória de polímeros catiónicos identificou candidatos que precipitam selectivamente os contaminantes bacterianos enquanto o TFPI permanece em solução. Especificamente, o polímero Betz 624 precipitou quantidades substanciais de contaminantes bacterianos, enquanto deixa o TFPI em solução num ambiente aquoso.
Os corpos refractários de TFPI solubilizados (em 3.5 M hidrocloreto de guanidina, cloreto de sódio 2 M, TRIS 50 mM, ditiotreitol 50 mM, pH 7.1) foram o material de partida usado para uma experiência de pesquisa de polímeros. Este material foi diluído 10 vezes numa solução a 0.5% de vários polímeros. Os precipitados a partir desta experiência foram analisados por SDS-PAGE para a presença de TFPI. O polímero Betz 624 precipitou quantidades substanciais de contaminantes, não TFPI, e resultou numa solução aquosa límpida.
Exemplo 14
Uso de extracção de duas fases aquosas com um sistema polietileno glicol (PEG), polifosfato, ureia oferece vantagens no processamento para a TFPI purificação. Os sistemas típicos de duas fases aquosas consistem em sistemas de dois polímeros (por exemplo, PEG e dextrano) ou um polímero e sal (por exemplo, PEG e sulfato) . O sistema aqui descrito tem vantagens 57 porque o comprimento da cadeia de polifosfato pode ser optimizado para a separação, é barato e é especifico na remoção de contaminantes problemáticos a partir de corpos refractários de TFPI conhecidos por interferirem com o enrolamento e cromatografia (polifosfato nativo e metais bivalentes associados).
Os corpos refractários de TFPI foram solubilizados em ureia 7 M, CAPS 10 mM, monotioglicerol a 1% a pH 10. Foram adicionados polifosfato e PEG de comprimentos de cadeia diferentes para formar duas fases. Depois da separação das fases, o TFPI particionado na fase superior rica em PEG, deixando o polifosfato e contaminantes associados na fase inferior. A separação é eficaz por ambos os comprimentos das cadeias de PEG e polifosfato e pode ser optimizado através da variação dos dois.
Exemplo 15
Enrolamento facilitado por polímero carregado do activador do plasminogénio tecidular recombinante (t-PA) a partir de corpos de inclusão de E. coli
Foram adicionados 5 gramas (peso húmido) de corpos de inclusão com cerca de 2 gramas do activador do plasminogénio tecidular recombinante a cerca de 1 litro de Vidro H a 0.5 %, tampão Tris 50 mM a pH 10.8 com glutationa 1 mM reduzida (GSH) e bissulfito de glutationa 0.2 mM (GSSG). A mistura é completamente fundida usando um homogeneizador polytron (Brinkman) durante 2-3 minutos para dispersar completamente os corpos de inclusão. A mistura é incubada com agitação usando um agitador suspenso durante 15 minutos enquanto o pH é mantido a 10.5-10.9 usando NaOH 1 N. A mistura é então misturada suavemente durante 48-72 horas a 2-8 °C. 58
Exemplo 16
Enrolamento facilitado por polímero carregado de somatotropina bovina a partir de corpos de inclusão de E. coli.
Foram adicionados 10 gramas (peso húmido) de corpos de inclusão com 5 gramas de somatotropina bovina a cerca de 1 litro de Vidro H a 1 %, tampão Tris 50 mM a pH 10.5. A mistura é completamente fundida usando um homogeneizador polytron (Brinkman) durante 2-3 minutos para dispersar completamente os corpos de inclusão. A mistura é incubada com agitação usando um agitador suspenso durante 15 minutos enquanto o pH é mantido a 10,4-10,6 usando NaOH 1 N. A cisteína sólida (121 mg) é adicionada para fazer a reacção de cisteína 1 mM, e a reacção de enrolamento é misturada durante 48-72 horas.
Lisboa, 3 de Julho 2007 59
Claims (18)
- REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação aquosa com um pH entre 5 e 10 e que compreende (a) um inibidor da via do factor tecidular e (b) L-arginina, caracterizada por a concentração de arginina estar entre 200mM e 300mM.
- 2. A formulação, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizada por a concentração de arginina ser 300mM.
- 3. Uma formulação aquosa, de acordo com a reivindicação N°.l ou reivindicação N°.2, caracterizada por compreender ainda um agente de solubilização seleccionado a partir do grupo que consiste em: um ião acetato; um ião sulfato; cloreto de sódio; um ião citrato; um ião isocitrato; glicina; glutamato; um ião succinato; histidina; imidazole; dodecil sulfato de sódio (SDS); ou um polimero carregado.
- 4. A formulação, de acordo com a reivindicação N°.3, caracterizada por o agente de solubilização ser seleccionado a partir do grupo que consiste em: um ião citrato; um ião isocitrato; ou um ião sulfato.
- 5. A formulação, de acordo com a reivindicação N°.4, caracterizada por o agente de solubilização ser citrato, e caracterizada por a concentração de citrato estar entre lOmM e 20mM.
- 6. A formulação, de acordo com a reivindicação N°.5, caracterizada por a concentração de citrato ser 200mM.
- 7. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.3 a N°.6, caracterizada por o pH da composição estar abaixo de pH 7.0 e o agente de solubilização não ser glicina.
- 8. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a concentração 1 do inibidor da via do factor tecidular ser superior a 0.2 mg/mL.
- 9. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a formulação incluir um tampão.
- 10. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o inibidor da via do factor tecidular ser (i) TFPI, (ii) uma muteina de TFPI que inclui mutações únicas ou de múltiplos pontos, ou (iii) uma molécula quimérica de TFPI.
- 11. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o inibidor da via do factor tecidular ter um residuo de alanina na extremidade amino-terminal.
- 12. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o inibidor da via do factor tecidular conter 18 residuos de cisteina e 9 pontes dissulfureto.
- 13. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o inibidor da via do factor tecidular conter 3 locais consenso de glicosilação Asn-X-Ser/Thr N-ligados.
- 14. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o inibidor da via do factor tecidular ter uma extremidade carboxi-terminal positivamente carregada.
- 15. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o inibidor da via do factor tecidular não estar glicosilado.
- 16. A formulação, de acordo com a reivindicação N°.15, caracterizada por o inibidor da via do factor tecidular ser purificado a partir de um hospedeiro de Escherichia coli. 2
- 17. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a formulação ser hipertónica.
- 18. A formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.16, caracterizada por a formulação ser isotónica. Lisboa, 3 de Julho de 2007 3
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