CN101511858A - 用于蛋白质解聚的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于实现结合蛋白解聚的组合物和方法，所述结合蛋白包括但不限于蛋白质配体、可溶性受体、抗体、抗体片段、可变片段单链抗体(scFv)和小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)。适于解聚高度浓缩的结合蛋白溶液的所述组合物含有一种或多种离液剂，该组合物通常在酸性pH下配制，并且可以用于提供适用于制备药物组合物和在体内施用于患者的结合蛋白。

Description

用于蛋白质解聚的组合物和方法
技术领域
本发明涉及蛋白质化学和重组DNA技术领域。更具体地，本发明提供了用于实现结合蛋白的解聚的组合物和方法，所述蛋白质包括蛋白质配体、可溶性受体、抗体、抗体片段、可变片段单链抗体(scFv)和小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)。
发明背景
重组DNA方法允许大规模生产遗传工程化的蛋白质。此类产生重组蛋白质的方法是本领域公知的。通常，将编码具体蛋白质的DNA区段***宿主微生物并将经转化的微生物在诱导异源蛋白质表达的条件下生长。
然而，通常，在细菌、典型地大肠杆菌中表达的异源蛋白质不是生物活性的，因为它们不折叠成正确的三级结构，而是形成无活性蛋白质的大的聚集物，称作包含体。所述包含体也可以通过形成共价的分子间二硫键引起，所述二硫键将几个蛋白质分子连接在一起而形成不溶性复合体。必须采取步骤以变性和再折叠这些蛋白质以恢复生物活性。
除了在微生物中表达外，还存在在整合细胞中表达重组蛋白质的方法，所述细胞包括酵母、昆虫细胞和多种哺乳动物细胞。然而，不管用于基因表达的细胞，经合成的重组蛋白质必须折叠并装配成正确的三级结构以便具有生物活性。
公知需要被称作分子伴侣的蛋白质家族来介导折叠过程。不存在合适的分子陪伴时，新表达的重组蛋白质聚集，从而阻止结构蛋白质的形成。Goloubinoff等人，Nature 342：884-889(1989)和Welch，ScientificAmerican 56-64(1993年5月)。尽管存在分子伴侣，但是蛋白质的聚集在体内仍然发生并且可以实际上促进或者引起多种疾病状态，如唐氏综合征、阿尔茨海默氏病、糖尿病和白内障。De Young等人.，Accountsof Chemical Research 26：614-620-(199-3)；Wetzel，TIBTECH 12：193-198(1994)；和Haass和Selkoe，Cell 75：1039-1042(1993)。
多种重组蛋白质，包括酶和结合蛋白，如抗体、抗体片段、scFv、和SMIPTM产品在水溶液中，当在低温(即低于0℃)并且受到反复的冻融循环时，容易损失活性和/或形成可溶性或不溶性聚集物，如三聚体和更高的多聚体。因为重组蛋白质的体外生产重要性，蛋白质聚集是生物技术工业中非常重要的。溶液中的蛋白质，甚至高度纯化的蛋白质，在储存或者在生产过程期间可以形成聚集体。体外聚集限制了蛋白质的稳定性、溶解度和重组蛋白质的生产产率。De Young等人，Accounts ofChemical Research 26：614-620(1993)；Wetzel，TIBTECH 12：193-198(1994)；和Vandenbroeck等人，Eur.J.Biochem.215：481-486(1993)。
除了促进生物活性的损失外，蛋白质聚集在治疗应用中也是有害的。在一些情况下，当体内施用时，聚集物形成导致具有增加的免疫原性的复合体。从而，为了对患者施用重组蛋白质溶液，必须首先除去这些聚集物以避免患者的毒性反应。所以，重组蛋白质聚集物的形成对于药物组合物的制备是不可接受的。在本领域中已经描述了用于稳定蛋白质溶液从而防止和/或减小蛋白质聚集物形成的许多方法和添加剂。已经描述了常规的过滤方法；然而，聚集物-甚至在低至0.1-0.2％的浓度下-也快速阻塞此类过滤器，限制它们在生产方法中的有效性。凝胶过滤层析和大小排阻层析方法通常是有效的，但是非常昂贵并且因此是不实用的。
在EP-A0599344中描述了通过加入热休克蛋白如HSP25来稳定蛋白质。已经描述使用由聚氧丙烯和聚氧乙烯组成的嵌段聚合物用于稳定抗体溶液(EP-A0318081)。在EP-A0025275中描述了通过加入含氮碱性物质如精氨酸、鸟嘌呤或者咪唑的盐来稳定免疫球蛋白。也已经描述了其他用于稳定的添加剂，包括聚醚(EP-AOO 18609)；甘油、白蛋白和硫酸葡聚糖(美国专利号4,808,705)；去污剂，如Tween
Figure A200680026709D0005155238QIETU
20(DE2652636和GB 8514349)；分子伴侣，如GroEL(Mendoza，Biotechnol.Tech.10：535-540-(1991))和B23(美国专利号6,358,718)；柠檬酸盐缓冲液(WO 93/22335)；和螯合剂(WO 91/15509)。
现有的用于实现蛋白质解聚的方法通常使用在高浓度的强离液剂，如8M盐酸胍和/或尿素或者表面活性剂中增溶蛋白质的步骤，所述表面活性剂导致几乎完全的蛋白质解折叠。Mitraki等人，Eur.J.Biochem.163：29-34(1987)；Vandenbroeck等人，Eur.J.Biochem.215：481-486(1993)；DeLoskey等人，Arch.Biochem.Biophys.311：72-78(1994)；和Rudolph和Lilie，FASEB J.10：49-56(1996)。一旦可溶和解折叠，就将蛋白质在额外的离液剂中稀释并通过除去离液剂(如通过透析)再折叠。蛋白质的此类再折叠相当不可预测并且是依赖于条件的。Valax和Georgiou，Biotech.Prog.9：539-547(1993)。必须在蛋白质-蛋白质基础上根据经验优化氧化还原条件、pH、透析速率和蛋白质浓度。并且，与正确的再折叠相比，通常倾向于再聚集。结果，再折叠的蛋白质的可接受的产率通常需要在极低浓度下折叠蛋白质(例如，10-100μg/ml)。Rudolph，Modern Methods in Protein and Nucleic Acid Research 149-172(Tschesche ed.，1990)；Goldberg等人，Biochem.30：2790-2797(1991)；和Maachupalli-Reddy等人，Biotech.Prog.13：144-150(1997)。因此，一旦再折叠，蛋白质必须被浓缩100-1000倍以实现体内施用的合适浓度——通常导致天然蛋白质大量损失的过程。此外，蛋白质再折叠所需的大体积导致消耗大量昂贵试剂，如离液剂。
美国专利号5,077,392公开了活化原核细胞中产生的重组蛋白质的方法，其中将聚集的蛋白质溶解在4-8M盐酸胍或者6-10M尿素中。将得到的蛋白质溶液透析到1到4之间的pH，然后置于非变性和氧化环境以便允许蛋白质再折叠。
美国专利号5,593,865公开了用于活化原核宿主细胞中表达的重组的含有二硫键的真核蛋白质的方法。将包含体溶解在含有还原剂的6M盐酸胍中。在再折叠步骤，将蛋白质导入氧化和非变性环境中。美国专利号4,659,568公开了溶解、纯化和表征来自不溶的蛋白质聚集物或者复合体的蛋白质的方法。不溶的蛋白质聚集物在尿素不连续梯度(3M到7M尿素)上分层。随着样品被离心，聚集物穿过该梯度直到溶解。
美国专利号5,728,804公开了一种方法，其中将变性或者聚集的蛋白质悬浮在含有5-7M盐酸胍的无去污剂的水性介质中并进行过夜温育。将悬浮的样品与环糊精接触以促进蛋白质再折叠。
美国专利号4,652,630公开了通过将聚集物或者包含体在离液剂(3M到5M尿素)中增溶来产生活性的促生长素。调节pH以实现完全溶解，接着改变条件以允许在非变性浓度的离液剂存在下的氧化。
美国专利号5,064,943公开了不使用离液剂进行增溶和复性促生长素的方法。通过该方法，调节pH到11.5到12.5之间并保持5到12小时，从而实现促生长素的增溶和复性。
美国专利号5,023,323公开了解聚促生长素聚集物的方法，其中将聚集物溶解在变性离液剂(1M到8M尿素)中。增溶后，将样品暴露于非变性的氧化环境中。美国专利号5,109,117公开了通过在有机醇和离液剂(1M到8M尿素)存在下溶解，接着在非变性的氧化环境中复性溶解的蛋白质来解聚促生长素聚集物的方法。
美国专利号5,714,371公开了通过在5M盐酸胍中增溶来再折叠丙型肝炎病毒蛋白酶聚集物的方法。向溶液中加入还原剂并调节pH至酸性pH。通过透析除去变性剂并升高pH。
美国专利号4,923,967公开了解聚人白介素-2(IL-2)的方法，其中将蛋白质聚集物溶解在具有亚硫酸盐分解剂的4-8M盐酸胍中。随后通过溶解交换除去亚硫酸盐分解剂并升高温度以沉淀出纯的IL-2。通过将沉淀物溶解在盐酸胍加还原剂中接着稀释以允许蛋白质再折叠来再折叠蛋白质。美国专利号5,410,026公开了将不溶的错折叠的***-1(IGF-I)再折叠成活性构象的方法。将分离的蛋白质与1-3M尿素或者1M盐酸胍温育直到聚集物溶解并再折叠。
可变片段单链抗体(scFv)是聚集倾向的蛋白质，其具有重要的诊断和治疗医学应用，包括肿瘤成像和定向药物递送。尽管已经开发了复杂的表达***来提供可溶的和功能型scFv，但是所得的产率和浓度通常小于所希望的。细菌表达将大量scFv漏入包含体中，阻止scFv折叠成活性形式。从包含体回收功能scFv的方法具有诸如聚集体形成的确定并且需要使用大量变性剂，如盐酸胍。
scFv与涉及聚集导致的人类疾病的蛋白质的结构相似性和对从细菌***非常有效、快速、廉价和无聚集体回收scFv的方法的需要为对进入这些蛋白质的聚集行为的研究提供了理由。当前的化学技术不能充分地阻止聚集已经使得聚集将注意力集中于物理处理，其已经在反向聚集方面显示出希望。以前的研究已经表明多聚蛋白质的聚集物在暴露于高压后断裂并且随后恢复活性。高压处理结合当前的化学方法可以提供一种解决scFv生产中聚集问题的方法。
小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)是高度模块化的基于抗体的化合物类别，与单克隆和重组抗体相比具有增强的药物性质。SMIPTM产品包含包括目标特异性结合结构域的单条多肽链，其例如基于抗体可变结构域与可变FC结构域的组合，所述可变FC结构域允许所需类别的效应细胞(如巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞)的特异募集和/或补体介导的杀伤的募集。取决于目标和铰链区的选择，SMIPTM产品可以通过细胞表面受体传递信号或者阻断信号。
像scFv一样，当在异源宿主细胞中体外表达时，SMIPTM产品对于蛋白质聚集物的形成是高度敏感的。对SMIPTM产品的解聚的初步研究表明在中性pH(即，磷酸缓冲盐水pH7.0)下高浓度的尿素(例如6M)有效解聚包含低浓度蛋白质(例如，小于1mg/ml)的溶液中的SMIPTM产品。然而，不幸的是，高蛋白质浓度导致极高分子量聚集物的积累和总蛋白质的损失。此外，发现使用6M尿素温育的时间长度局限于5小时或者更短；延长的温育时间导致形成极高分子量(HMW)聚集物。
在本领域中仍然非常需要适于制备药物组合物和在体内适用于患者的高浓度下实现解聚结合蛋白的组合物和方法。
发明概述
本发明通过提供用于从含有聚集物的混合物中回收生物活性的结合蛋白的组合物和方法而解决了这些和其他需要。本文给出的方法提供了在聚集的和解聚的(即天然的)蛋白质混合物中解聚存在的聚集物的方法。本文给出的组合物和方法有效地实现了结合蛋白的解聚，所述结合蛋白包括但不限于蛋白质配体、可溶性受体、抗体、抗体片段、可变片段单链抗体(scFv)和小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)。
本文公开的组合物和方法可以合适地用于约0.1mg/ml到约50mg/ml，更典型地约1mg/ml到约50mg/ml，还更典型约1mg/ml到约25mg/ml或者约1mg/ml到约10mg/ml范围内的结合蛋白的溶液。本文示例了用于在包含约1mg/ml、约2mg/ml、约5mg/ml、约8mg/ml、或约10mg/ml总结合蛋白中解聚结合蛋白的组合物和方法。
本文公开的组合物和方法通常包含与GMP生产方法相容的缓冲***。例如，合适的缓冲***包括一种或多种盐，包括但不限于，乙酸钠(NaOAc)和/或氯化钠(NaCl)。这些盐中的每一种的合适的浓度范围为约1mM到约100mM，更通常为约5mM到约50mM或者约10mM到约25mM。本文示例了包含25mM NaOAc到25mM NaCl的缓冲***。
本文给出的用于解聚结合蛋白的组合物和方法还包含一种或多种离液剂，包括但不限于一种或多种盐酸胍、精氨酸和尿素。将理解离液剂的精确浓度将取决于结合蛋白的性质和它对离液剂的敏感性，但是将局限于允许蛋白质在其天然状态保持其生物活性的浓度。通常，组合物中每种离液剂以约0.1M到约8M的浓度范围存在。更典型地，每种离液剂以约0.5M到约6M，甚至更典型地约1M到约5M或者约3M到约5M的浓度范围存在。本文示例了包含约3M、3.5M、4M、4.5M和5M浓度的一种或多种离液剂。
在相关方面，将明白可以有利地实现两种或多种离液剂的组合之间的协同作用。例如，本发明设想使用尿素与盐酸胍组合、尿素与精氨酸组合和盐酸胍与精氨酸组合的组合物和方法。不管所用的离液剂组合，组合物中每种离液剂以约0.1M到约8M的浓度范围存在。更典型地，每种离液剂以约0.5M到约6M、甚至更典型地约1M到约5M或约3M到约5M的浓度范围存在。
不管精确的浓度和离液剂身份和浓度，通常调节本文提供的组合物至微酸性pH，通常约pH4到约pH7的范围，更通常约pH5到约pH6。本文示例了缓冲到约pH5、约pH5.5和约pH6的组合物。将理解，作为通常的规则，包含较高浓度离液剂的组合物通常被缓冲到较高pH，而包含较低浓度离液剂的组合物通常被缓冲到较低pH。从而，例如，包含约3M离液剂的组合物通常被缓冲到约pH5，而包含约4M离液剂的组合物通常被缓冲到约pH6。其他合适的组合物包含约3.5M的离液剂，其被缓冲到约pH5.5。可以适当使用其他缓冲***。
使用如上述的缓冲***，在约3M到约4M的尿素浓度下一种或多种离液剂在约5小时到约24小时的时间内实现高水平解聚。如本文进一步详述的，结合蛋白的活性对于蛋白质浓度不敏感并且高分子(HMW)聚集物的积累被实质性地减小。在本发明的某些方面，组合物和方法可以额外地包含一种或多种还原剂，如三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)。本领域技术人员将理解还原剂的加入对于用于结合蛋白尤其有利，其中不需要分子内和/或分子间二硫键来提供蛋白质三级和/或四级结构的稳定化。DTT通常以约1mM到约50mM存在于组合物中。GSH通常以约1μM到约100μM，更通常约5μM到约20μM存在于组合物中。在其他方面，组合物和方法可以额外地或者备选地包含一种或多种螯合剂，如DTPA(二亚乙基三胺五乙酸；二亚乙基三胺-N，N，N′，N′，N”-五乙酸；三胺五乙酸；N，N-二(2-(二-(羧甲基)氨基)乙基)-甘氨酸；二亚乙基三胺五乙酸；[[(羧甲基)亚氨基]二(亚乙基次氮基)]四乙酸)；EDTA(依地酸；乙二胺四乙酸；EDTA，游离碱；EDTA游离酸；乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸；Hampene；依地酸；N，N′-1，2-乙二基二-(N-(羧甲基)甘氨酸)；乙二胺四乙酸)；NTA(N，N-二(羧甲基)甘氨酸；氮川乙酸；Trilone A；α，α’，α”-三甲胺三羧酸；三(羧甲基)胺；氨基三乙酸；Hampshire nta酸；氮川-2，2′，2＂-三乙酸；Titriplexi；次氮基三乙酸)。可以适当使用其他螯合剂。
使用本文的组合物和方法可以令人满意地得到多种结合蛋白的解聚。示例了对CD20、VEGF、Her2、EGFR或CD37具有特异结合亲和性的结合蛋白。例如，通过解聚对CD20具有特异性的结合亲和性的SMIPTM产品的组合物和方法示例了本发明。
通过本发明的组合物和方法解聚的结合蛋白显示出如通过结合和功能测定法证明的实质水平的体外活性以及实质水平的体内活性。例如，本文给出的CD20特异性SMIPTM产品显示出对WIL-2S细胞系的表面上表达的CD20抗原的实质水平的结合，以及在补体结合测定法中实质水平的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。当参考下面的详细描述时，本发明的这些和其他方面将变得显而易见。将本文公开的所有参考文献完整引入作为参考，就好像每个单独被引入一样。
附图简述
图1是层析迹线，显示了蛋白质聚集物的依赖时间的洗脱和示例性CD20特异性SMIPTM产品从用一步pH5的蛋白A洗脱的蛋白A层析柱POI。图1A中给出的数据是采用应用于柱子中包含25mM NaCl，25mMNaOAc(pH5)的对照缓冲液的结合蛋白得到的，而图1B中给出的数据是采用应用于柱子的相同结合蛋白在用包含25mM NaCl、25mMNaOAc、3M尿素(pH5)的溶液处理20小时后得到的。在图1A中得到的“目的蛋白质”百分数或者％POI为46.8％，而在图1B中得到的％POI为80.1％。
图2是条形图，图解了使用本发明的组合物和方法(即，25mMNaOAc、25mM NaCl、3M尿素、pH5和25mM NaOAc、25mM NaCl、4M尿素、pH5)的示例性CD20特异性SMIPTM产品(5mg/ml和10mg/ml)与磷酸缓冲盐水(PBS)，pH7结合3M尿素或者4M尿素中相同结合蛋白的％POI相比提高的产率(表达为％POI)。图3是曲线图，描绘了在包含2M、3M或4M尿素(每种在pH4、pH5和pH6)的所示组合物中，示例性CD20特异性SMIPTM产品的POI的依赖时间的浓度(表示为“曲线下面积”或者AUC)。
图4是条形图，图解了使用本发明的示例性组合物和方法(即，25-mM NaOAc、25mM NaCl、3M尿素、pH5和25mM NaOAc、25mMNaCl、4M尿素、pH6)，示例性CD20特异性SMIPTM产品的提高的产率(％POI，图4A和POI-AUC，图4B)。
发明详述
如上面指出的，本发明涉及用于解聚结合蛋白的组合物和方法，所述结合蛋白包括但不限于蛋白质配体、可溶性受体、抗体、抗体片段、可变片段单链抗体(scFv)和小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)。本文公开的组合物和方法可有效实现结合蛋白的解聚而保持高水平的功能活性。
如该说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“这个”包括复数引用，除非内容明确指出相反。
除非特别指出相反，本发明的实践将使用免疫学、微生物学、分子生物学和蛋白质化学的常规方法和本领域技术内的重组DNA技术，它们的许多在下面描述用于说明的目的。此类技术在文献中充分解释。见例如，Sambrook，等人.，＂Molecular Cloning：A Laboratory Manual＂(第二版，1989)；Maniatis等人，＂Molecular Cloning：A Laboratory Manual＂(1982)；＂DNA Cloning：A Practical Approach，vol.I & II＂(D.Glover，ed)；＂Oligonucleotide Synthesis＂(N.Gait，ed.，1984)；＂Nucleic AcidHybridization＂(B.Hames & S.Higgins，eds.，1985)；＂Transcription andTranslation＂(B.Hames & S.Higgins，eds.，1984)；＂Animal Cell Culture＂(R.Freshney，ed，1986)；Perbal，＂A Practical Guide to Molecular Cloning＂(1984)；Ausubel等人，＂Current protocols in Molecular Biology＂(NewYork，John Wiley and Sons，1987)；Bonifacino等人，＂Current Protocolsin Cell Biology＂(New York，John Wiley & Sons，1999)；Coligan等人，＂Current Protocols in Immunology＂(New York，John Wiley & Sons，1999)；和Harlow and Lane Anti bodies：a Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory(1988)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请无论在上文或下文，都完整引入本文作为参考。通过具体实施方案的详细描述将更好地理解本发明，每个实施方案在下文详细描述。
定义
如本文使用的术语“结合蛋白”指所有类别的蛋白质配体、可溶性受体、抗体、抗体片段、可变片段单链抗体(scFv)和小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)。本文示例了对目标蛋白具有特异结合亲和性的结合蛋白和其他分子，包括与疾病如癌症和炎性疾病有关的细胞表面受体。在一些实施方案中，结合蛋白对目标蛋白CD20、VEGF、Her2、EGFR和CD37具有特异性的结合亲和性。更具体地，本文给出了特异性地结合目标蛋白CD20、VEGF、Her2、EGFR和CD37的SMIPTM产品。
如本文使用的术语“抗体”包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和完全人抗体以及生物学或者抗原结合片段和/或其部分。本文对“抗体”的参考包括对其部分、片段、前体形式、衍生物、变体和遗传工程化的或者天然的突变形式的参考，并且包括氨基酸替代和用化学品和/或放射性同位素等等标记，只要所得的衍生物和/或变体保持至少实质量的目标结合特异性和/或亲和性。术语“抗体”广义地包括抗体重链和轻链以及抗体的所有同种型，包括IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2，并且还包括其抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab′)2、Fc和scFv。
如本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质性抗体群体得到的抗体，即该群体包含的各抗体除了不实质性地影响抗体结合特异性、亲和性和/或活性的天然存在的突变之外是相同的。
如本文使用的术语“嵌合抗体”指包含重链和轻链的抗体，其中非人抗体可变结构域有效地融合到人恒定结构域。嵌合抗体与亲本的完全非人抗体相比通常显示出降低的免疫原性。如本文使用的术语“人源化抗体”指这样的抗体，其包含一个或多个非人互补决定区(CDR)、人可变结构域构架区(FR)和人重链恒定结构域，如IgG2重链恒定结构域和人轻链恒定结构域，如Igκ轻链恒定结构域。如本文使用的术语“人源化抗体”意在包括人抗体(受体抗体)，其中来自该受体的互补决定区(CDR)的残基被非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所希望的特异性、亲和性和能力的CDR的残基替代。在一些情况下，人抗体的可变结构域构架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体可以还包含在受体抗体和输出的CDR或者构架序列中都没有发现的残基。人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体在非人来源的抗体中引入一个或多个氨基酸残基。在与合适的人抗体恒定结构域融合前，可以通过将CDR移植到人的支持FR中可以实现人源化。见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323.-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)。
如本文使用的术语“可变片段单链抗体”或者“scFv”指共价连接的VH::VL异源二聚体，其从包括通过编码肽的接头连接的VH-和VL编码基因的基因融合物表达。Huston等人，Proc.Nat.Acad.Sci USA 85(161：5879-5883(1988)。已经描述了多种方法来辨别用于将天然聚集的-但是化学上分离的-轻和重多肽链转变成scFv分子的化学结构，所述scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本上相似的三维结构。参见例如，美国专利号5,091,513、5,132,405和4,946,778。
如本文所用的，被称作“小模块免疫药物产品”或者“SMIPTM产品”的工程化融合蛋白如在共同所有的美国专利公布号2003/133939、2003/0118592和2005/0136049以及共同所有的国际专利公布号WO02/056910、WO2005/037989和WO2005/017148中描述，将它们都引入本文作为参考。
如果目标特异性地结合蛋白，如抗体或者其抗原结合片段与所述目标在可检测水平(例如在ELISA测定法内)上反应，并且在相似条件下不与不相关多肽可检测地反应，那么说所述目标特异性地结合蛋白是“特异性地结合”、“免疫结合”和/或“免疫反应的”。
如该上下文中使用的“免疫结合”一般指该类型的非共价反应，其在抗体和该抗体的特异性抗原之间发生。抗体-目标结合反应的强度或者亲和性可以按照相互作用的解离常数(Kd)表达，其中较低的Kd表示较大的亲和性。可以使用本领域公知的方法定量目标特异性抗体的免疫结合性质。一种此类方法需要测量目标-特异性抗体/抗体复合体形成和解离的速率，其中那些速率依赖于复合体配偶体的浓度、相互作用的亲和性以及同等地影响两个方向的速率的几何参数。从而，“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)可以通过计算结合和解离的浓度和实际速率来确定。Koff/Kon比率使得可以取消所有与亲和性不相关的参数，并且从而等于解离常数Kd。一般见Davies等人，Annual Rev.Biochem.59：439--473(1990)。本文的“特异性结合”指结合蛋白以至少10-6-10-9M、更通常至少10-7到10-9M的解离常数结合到目标多肽、蛋白质和/或其他分子。
目标特异性抗体的“抗原结合位点”或者“结合部分”指抗体分子的参与目标结合的部分。通过重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成抗原结合位点。重链和轻链的V区内三个高度趋异的一段序列被称作“高变区”或者“互补决定区(CDR)”，其***被称作“构架区”或者“FR”的更保守的侧翼序列之间。
如本文所用的术语“蛋白质聚集物”指两个或多个蛋白质之间的非特异性和非天然的结合。蛋白质聚集物可以包括结合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体和更高级的多聚体。药物组合物、特别是经配制用于肠胃外递送的药物组合物内蛋白质聚集物的存在与不利的体内反应(包括过敏性休克)有关。见例如，Moore和Leppart，J.Clin.Enodcrin.and Metab.51：691-697(1980)；Rattier等人，Diabetes 39：728-733(1990)；和Thornton和Ballow，Arch.Neurology 50：135-136(1993)。
如本文使用的术语“生物活性”指结合蛋白的目标特异性结合能力以及介导它的天然生物功能性的能力。
如本文使用的术语“离液剂”指化合物，其包括但不限于盐酸胍(aka，盐酸胍，GdmHCl)、硫氰酸钠、尿素、精氨酸和/或去污剂。离液剂通常能够破坏蛋白质单体或二聚体之间的非共价分子间结合，其中单体或者二聚体代表结合蛋白的天然状态。
如本文使用的术语“缓冲剂”或者“缓冲试剂”指加入组合物中以实现所希望的pH值或pH范围的化合物或化合物的组合。通常将缓冲剂分类为无机缓冲剂(例如盐酸盐和碳酸盐缓冲剂)和有机缓冲剂(例如，柠檬酸盐、Tris、MOPS、MES和HEPES缓冲剂)。其他缓冲剂和缓冲试剂也可以用于本文给出的组合物和方法中。
如本文使用的术语“宿主细胞”指原核或真核细胞，如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物、或者植物细胞，其被转化或转染从而它表达异源目的结合蛋白。示例性宿主细胞包括但不限于，大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9、COS和CHO细胞。
用于解聚结合蛋白的组合物
如上面指出的，本发明提高了适于实现结合蛋白的解聚的组合物。本文公开的组合物可以适宜地用于解聚包含高浓度结合蛋白的溶液，所述结合蛋白的浓度通常在约0.1mg/ml到约50mg/ml，更通常约0.5到约20mg/ml或者约1mg/ml到约10mg/ml的范围内。本文示例了约1mg/ml、约2mg/ml、约5mg/ml、约8mg/ml和约10mg/ml的结合蛋白溶液。
本发明的组合物通常包含与GMP生产方法相容的缓冲***。例如，合适的缓冲***可以包含一种或多种盐，包括但不限于乙酸钠和/或氯化钠。可以有利地使用其他盐。这些盐中的每一种的合适的浓度范围为约1mM到约100mM，更通常为约5mM到约50mM或者约10mM到约25mM。本文示例了包含25mM乙酸钠和25mM氯化钠的缓冲***。
本文给出的用于解聚结合蛋白的组合物额外地包含一种或多种离液剂，包括但不限于，盐酸胍、精氨酸和尿素中的一种或多种。将理解离液剂的精确浓度将依赖于结合蛋白的性质和它对离液剂的敏感性，并且将限于所述蛋白质在其天然状态下的生物活性。通常，每种离液剂以约0.1M到约8M的浓度范围存在于组合物中。更典型地，每种离液剂以约0.5M到约6M，甚至更通常约1M到约5M或者约3M到约5M的浓度范围存在。本文示例了包含浓度约3M、3.5M、4M、4.5M和5M的一种或多种离液剂。
在相关方面，将理解可以有利地实现两种或多种离液剂的组合之间的协同作用。例如，本发明设想使用尿素与盐酸胍组合、尿素与精氨酸组合以及盐酸胍与精氨酸组合的组合物和方法。不管所用的离液剂组合，每种离液剂以约0.1M到约8M的浓度范围存在于组合物中。更通常地，每种离液剂以约0.5M到约6M，甚至更通常约1M到约5M或者约3M到约5M的浓度范围存在。
不管精确的盐含量和浓度，通常调节本文提供的组合物至微酸性pH，通常约pH4到约pH7的范围，更通常约pH5到约pH6的范围。本文示例了缓冲到约pH5、约pH5.5，和约pH6的组合物。将理解，作为通常的规则，包含较高浓度离液剂的组合物通常被缓冲到较高pH，而包含较低浓度离液剂的组合物通常被缓冲到较低pH。从而，例如，包含约3M离液剂的组合物通常被缓冲到约pH5，而包含约4M离液剂的组合物通常被缓冲到约pH6。其他合适的组合物包含约3.5M的离液剂，其被缓冲到约pH5.5。可以适当使用其他缓冲***。
使用如上述的缓冲***，用约3M到约4M尿素浓度的一种或多种离液剂在约24小时的时间内实现高水平解聚。如本文进一步详述的，结合蛋白的活性对于蛋白质浓度不敏感并且不发生高分子(HMW)聚集物的积累。
在本发明的某些方面，组合物可以额外地包含一种或多种氧化剂和/或一种或多种还原剂，如三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)。本领域技术人员将理解还原剂的加入对于用于结合蛋白尤其有利，其中不需要分子内和/或分子间二硫键来提供蛋白质三级和/或四级结构的稳定化。DTT通常以约1mM到约50mM存在于组合物中。GSH通常以约1μM到约100μM，更通常约5μM到约20μM存在于组合物中。
在其他方面，组合物可以额外地或者备选地包含一种或多种螯合剂，如DTPA(二亚乙基三胺五乙酸；二亚乙基三胺-N，N，N′，N′，N”-五乙酸；三胺五乙酸；N，N-二(2-(二-(羧甲基)氨基)乙基)-甘氨酸；二亚乙基三胺五乙酸；[[(羧甲基)亚氨基]二(亚乙基次氮基)]四乙酸)；EDTA(依地酸；乙二胺四乙酸；EDTA，游离碱；EDTA游离酸；乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸；Hampene；依地酸；N，N′-1，2-乙二基二-(N-(羧甲基)甘氨酸)；乙二胺四乙酸)；NTA(N，N-二(羧甲基)甘氨酸；氮川乙酸；Trilone A；α，α’，α”-三甲胺三羧酸；三(羧甲基)胺；氨基三乙酸；Hampshire nta酸；氮川-2，2′，2＂-三乙酸；Titriplex i；次氮基三乙酸)。可以适当使用其他螯合剂。
本发明的组合物可以在具体组合物的冰点到结合蛋白显示出实质程度的热变性的温度之间的宽范围内被适当使用。从而，例如，可以在约-10℃到约50℃之间使用组合物和方法。然而，更典型地，在约-10℃到约37℃；更典型约0℃到约30℃或者约10℃到约25℃使用组合物和方法。然而，将理解给定组合物和方法的最佳温度将在实质部分取决于所用的具体结合蛋白的生物物理性质。
用本文给出的组合物和方法可以令人满意地得到多种不同结合蛋白的解聚。本文示例了对CD20、VEGF、Her2、EGFR和CD37具有特异结合亲和性的结合蛋白。例如，通过用于解聚对CD20具有特异结合亲和性的SMIPTM产品的组合物和方法示例了本发明。
通过本发明的组合物解聚的结合蛋白显示出如通过结合和功能测定法证明的实质水平的体外活性以及实质水平的体内活性。例如，本文的CD20特异性SMIPTM产品与未处理的SMIPTM产品相比显示出对WIL-2S细胞系表面上表达的CD20抗原的实质水平的特异结合以及在体外补体结合测定法中实质水平的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
解聚结合蛋白的方法
如上面指出的，本发明还提供了解聚多种结合蛋白的方法，所述蛋白包括但不限于蛋白质配体、可溶性受体、抗体、可变片段单链抗体(scFv)和小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)。
本文公开的发明方法可以合适地用于通常约0.1mg/ml到约50mg/ml范围内的高浓度的结合蛋白(如上文指出)。本文示例了用于实现解聚5mg/ml、8mg/ml和10mg/ml浓度的结合蛋白。然而，将理解，本发明方法可以用于多种浓缩的结合蛋白溶液。
简言之，选择合适的细胞或细胞系用于表达目的结合蛋白并用携带待表达的质粒载体或者其他合适的表达***转化或转染。从细胞或者培养上清液分离包含经聚集和解聚的结合蛋白的混合物的悬浮液，如需要，进行浓缩，并进行一步或多步蛋白质分离和病毒失活。将浓缩的结合蛋白交换到合适的缓冲***中，在本文中通过包含25mM NaOAc和25mM NaCl的缓冲***示例。然而，将理解考虑到目的结合蛋白的生物物理性质，可以修饰准确的盐和浓度。
通常，以约2M到约5M的浓度向经缓冲的结合蛋白中加入一种或多种离液剂，如盐酸胍、精氨酸和/或尿素。更典型地，以约3M、约3.2M、约3.4M、约3.6M、约3.8M、或约4M的浓度向经缓冲的结合蛋白中加入一种或多种离液剂。
取决于使用的确切的结合蛋白、离液剂和/或缓冲***，并且考虑离液剂的浓度，通常将溶液调节到约pH4到约pH7的pH。更典型地，结合蛋白、离液剂、缓冲***溶液的pH为约pH5到约pH6之间的pH。如上文讨论的，已经确定对于本文公开的示例性结合蛋白，对于包含3M的一种或多种离液剂的溶液，约pH5的pH适于实现蛋白质解聚。备选地，对于包含4M的一种或多种离液剂的溶液，约pH6的pH也是合适的。离液剂和pH的精确组合可以部分地取决于需要解聚的结合蛋白的生物物理性质，所述组合可以由技术人员考虑本文提供的教导通过常规实验实现。
还将理解本发明方法还可以使用加入一种或多种还原剂，如三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)和/或一种或多种螯合剂，如DTPA、EDTA和/或NTA。
本发明方法适于解聚多种结合蛋白，如在本文中通过对CD20、VEGF、Her2、EGFR和CD37具有特异结合亲和性的结合蛋白所示例的。例如，通过用于解聚对CD20具有特异结合亲和性的SMIPTM产品来示例本发明。
为了实现结合蛋白的高度解聚，有利的是将结合蛋白、离液剂、缓冲***溶液在约0℃到约100℃的温度下保持约5小时到约24小时的期间。例如，为了实现本文给出的结合蛋白的解聚，将溶液保持在约25℃(即室温)的温度下约5小时到约20小时的期间。
在保持期后，通常将解聚的蛋白质交换到缓冲***，如25mMNaOAc，25mM NaCl缓冲***(pH5)。在这些条件下，解聚的蛋白质是稳定的并且不经历实质性再聚集。随后的蛋白质纯化和病毒过滤步骤可以任选地进行，以便实现包含解聚的目的结合蛋白的高度纯化的溶液。
用于评估解聚的结合蛋白的生物活性的测定***
通过本领域可用的多种合适的方法，可以测试使用本文公开的组合物和方法解聚的结合蛋白的生物活性，所述方法一般包括用于评估特异结合活性和亲和性的测定***以及用于评估其他功能活性的测定***。如本文使用的术语“功能活性的”和“功能活性”是指天然的非聚集的结合蛋白的目标特异性的生物和/或免疫活性。
例如，通过本文给出的示例方法解聚的CD20特异性SMIPTM产品与未处理的SMIP产品相比显示出对WIL-2S细胞系的表面上表达的CD20抗原的实质水平的特异结合以及在体外补体结合测定中实质水平的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
用于评估通过使用本文给出的组合物和方法分离的解聚结合蛋白的功能性的下面的测定***通过实例提供，并且不用于限定。
用于测量坏死性细胞死亡的测定***
坏死是一种被动过程，其中内部稳态的瓦解导致细胞溶解，涉及质膜完整性的损失和随后的膨胀，接着是细胞的裂解。Schwartz等人，1993。坏死细胞死亡的特征是丧失细胞膜完整性和对染料如碘化丙啶(PI)的通透性，本领域技术人员已知碘化丙啶与经历初次和再次坏死的细胞的DNA结合。Vitale等人.，Histochemistry 100：223-229(1993)和Swat等人，J.Immunol.Methods B7：79-&7(1991)。坏死可以与细胞凋亡相区分，因为在凋亡的早期阶段细胞膜保持完整。由于染料排阻的结果，如下述使用PI的测定法可以与凋亡测定法平行使用，以便区分细胞凋亡和坏死性细胞死亡。使用PI的基于流式细胞术测定法的荧光激活细胞分选仪(FACS)允许快速评估和定量坏死细胞百分数。
用于测量凋亡性细胞死亡的测定***
如本领域技术人员将明白的，可以完成程序化细胞死亡或者细胞凋亡的检测。在刺激细胞凋亡后，施用或不施用通过施用本文公开的组合物和方法解聚的结合蛋白，可以在不同时间测量经历细胞凋亡的细胞百分比。经历凋亡性细胞死亡的细胞的形态通常的特征是细胞胞质和细胞核的收缩和染色质的凝聚和断裂。Wyllie等人，J.Pathol.142：67-77(1984)。
用于测量目标特异性的结合亲和性和特异性的测定***
还可以对使用本文所述的组合物和方法解聚的结合蛋白测试目标特异性的结合亲和性和特异性并与天然蛋白质的结合亲和性和活性比较。
通过本领域当前可用的任一种方法可以测试结合蛋白的例如抗原结合亲和性和/或特异性。例如，可以用常规的细胞淘选、蛋白质印迹和ELISA方法来完成筛选具有特定特异性的结合蛋白的步骤。可以使用多种合适的免疫测定技术，如参考美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653所看到的，将它们每一篇都引入本文作为参考。
在一种类型的测定法中，将未标记的抗结合蛋白抗体固定在固相支持体上并将待测试的解聚的结合蛋白与所述固定化的抗体接触。在足够允许形成第一种复合体的合适的时间后，加入用能够产生可检测信号的报道分子标记的目标分子并温育允许足够形成固定化的抗体/结合蛋白/目标分子的第二种复合体的时间。洗除未复合的物质，并通过观察受体分子产生的信号来确定目标分子的存在。结果可以是定性的(通过视觉信号观察)，或者可以通过与含有已知量的天然结合蛋白的对照样品相比较来定量。
在第二种类型的测定法中，与结合蛋白特异性地结合的目标分子被结合到固相支持体。结合方法是本领域公知的并且通常由教练、共价结合或者物理吸附目标分子到固相支持体上组成。然后将含有待测试的解聚的结合蛋白的样品加入固相复合体并在合适条件(例如，从约室温到约38℃，如25℃)下温育足够的时间(例如，2-40分钟或者如果更方便，过夜)以允许结合蛋白结合到目标分子。在温育期后，洗涤固相支持体并干燥以及与报道分子可以附着的结合蛋白-特异性抗体一起温育，从而允许检测所述结合蛋白-特异性抗体与复合到固定化的目标分子的解聚的结合蛋白的结合。
如本文使用的术语“固相支持体”指例如，微量滴定板、膜和小珠等等。例如，此类固相支持体可以由玻璃、塑料(例如，聚苯乙烯)、多糖、尼龙、硝酸纤维素或者特氟隆等等制造。此类支持体的表面可以是固体或者多孔的和任何方便的形状。合适的固相支持体包括玻璃或者聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯。固相支持体可以是管、小珠、微量滴定板的孔或者适于进行免疫测定法的任何其他表面的形式。
备选测定***涉及固定化解聚的结合蛋白并将该固定化的结合蛋白暴露于目标分子，所述目标分子可以用或不用报道分子标记。如本文使用的术语“报道分子”是指这样的分子，其通过它的化学、生物化学和/或物理性质提供了分析上可鉴定的信号，该信号允许筛选与目标分子或者第二种抗体复合的结合蛋白。检测可以是定性或者定量的。用于本文公开的该类型的测定法中的最常用的报道分子是酶、荧光团、放射性同位素和/或化学发光分子。
对于酶免疫测定(EIA)的情况，通常通过戊二醛或者高碘酸盐将酶缀合到检测抗体或者目标分子。然而，如将容易认识到的，存在多种不同的缀合技术，它们是技术人员容易得到的。通常使用的酶包括辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。通常，将酶标记的抗体加到目标分子和结合蛋白之间的潜在复合体之间，允许结合，然后洗涤以除去过量的试剂。然后将含有合适底物的溶液加入目标抗原/解聚的结合蛋白/经标记抗体的复合体。底物与连接到标记的抗体的酶反应，产生定性的视觉信号，其可以通常通过分光光度法进一步定量，以指出样品中存在的解聚的结合蛋白的活性。
备选地，可以将荧光化合物，如荧光素和罗丹明，或者荧光蛋白如藻红蛋白化学偶联到抗体而不改变它们的结合能力。当通过特定波长的光照射活化时，荧光标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发态，接着发出特征性颜色的光，其可以用光学显微镜或者其他光学仪器通过视觉检测。如在EIA中，允许荧光标记的抗体结合到抗原-抗体复合体。除去未结合的试剂后，将剩余的三元复合体暴露于合适波长的光。所观察到的荧光表明存在结合的目的结合蛋白。
免疫荧光和EIA技术都是本领域中良好建立的。将理解其他报道分子，如放射性同位素和化学发光和/或生物发光分子也可以合适地用于本文公开的筛选方法中。
下面的实施例用于更完整地描述使用上述发明的方式，以及给出预期实施本发明的多个方面的最佳方式。这些实施例绝不用于限制本发明的真实范围，而是为了阐明目的而给出。
实施例
实施例1
用于分离蛋白质聚集物和非聚集的蛋白质的大小排阻高效液相层析(SEC-HPLC)***
该实施例阐明用于从示例性CD20-特异性SMIPTM阐明的非聚集的目的蛋白质(POI)分离多聚蛋白质聚集物的大小排阻高效层析(SEC-HPLC)***。
通过大小排阻高效液相层析(SEC-HPLC；Progel-TSK G3000 SWXLHPLC柱；Tosoh Bioscience LLC，Montgomeryville，PA)分析CD20特异性SMIPTM产品的样品并对峰面积积分。SEC-HPLC运行参数见表1。
表1
SEC-HPLC运行参数
 
柱子尺寸 7.8mm(ID) x 30.0cm(L)
孔径 5μm
最大柱压 70kg/cm2
运行温度 环境温度
样品温度 环境温度
检测/参考波长 280nm/n/a，使用Shimadzu设备
带宽(nm) 2nm
移动相 dPBS+0.05％叠氮化钠
流速 1ml/分钟
运行长度 15分钟
注射的蛋白质样品量 250μg
积分方法 垂降法
使用TSK G3000SWXL柱，测定CD20特异性SMIPTM的批产物的线性范围为10μg到500μg(r2≥0.99)，在50μg到500μg范围内相对纯度具有可接受的重复性(sd≤0.1％)。观察到产物和柱基质之间的相互作用，导致低估了CD20特异性SMIPTM产物POI的分子量(81kDa)，相比，二聚体CD20特异性的SMIPTM产物的理论分子量为107kDa和目的蛋白质的轻微峰拖尾。
对线性图的视觉检查表明峰面积应答在至多500μg的负荷下是线性的(数据未显示)。通过回归分析产生的结果概述被显示在表2中。对于9μg到491μg负荷的POI峰面积数据进行的回归分析得到相关系数的平方(r2)为0.99-7，截距值为41.65峰面积单位。在9μg到491μg负荷范围的应答给出了可接受的线性(r2≥0.99)。
表2
9μg到491μg负荷的回归分析和CD20特异性SMIPTM产品130L批产物“目的蛋白”的峰面积
 
参数 值
截距(mAU*s) 41.6476
斜率(mAU*s/μg) 95.3907
r2 0.9974
图1A和1B给出了层析迹线，其显示了从用单步pH5的蛋白A洗脱的蛋白A层析柱得到的CD20特异性SMIPTM产品的蛋白质聚集物和POI的依赖时间的洗脱。用应用于柱子中的包含25mM NaCl，25mMNaOAc的对照缓冲液(pH5)的结合蛋白得到了图1A中给出的数据。用应用于柱子的相同结合蛋白，在用包含5mM NaCl、25mM NaOAc、3M尿素的溶液(pH5)处理20小时后得到的图1中给出的数据。图1A中得到的％POI为46.8％(见表3)，而在图1B中得到的％POI为80.1％(见表4)。
表3
在25mM NaCl/25mM NaOAc，pH5中用SEC-HPLC从非聚集的CD20特异性SMIPTM产品中分离CD20特异性SMIPTM产品聚集物
 
峰号 保留时间 峰面积 总的峰面积百分数     峰高度
1 5.732 1187786 9.284 50362
2 6.372 1295781 10.128 44255
3 6.808 1603612 12.534 50174
4 7.512 2718219 21.247 70023
5(POI) 8.804 5988243 46.806 165024
总计 12793641 100.000 379838
表4
在25mM NaCl/25mM NaOAc，3M尿素中用SEC-HPLC从非聚集的CD20特异性SMIPTM产品中分离CD20特异性SMIPTM产品聚集物
 
峰号 保留时间 峰面积 总的峰面积百分数     峰高度
1 5.772 130273 1.252 5174
2 6.808 416329 4.002 10699
3 7.460 1465905 14.092 35220
4(POI) 8.864 8337188 80.149 231667
5 12.004 52432 0.504 675
总计 10402127 100.000 283435
实施例2
CD20特异性SMIPTM产品的解聚的依赖于组合物的增加
该实施例阐明在包含NaOAc和NaCl的酸性缓冲液中包含多种浓度的离液剂的组合物可以有效地增加示例性CD20特异性SMIPTM产品的活性的、解聚的目的蛋白质(POI)的产率。
在第一个实验中，将CD20特异性SMIP产品的16.3mg/ml蛋白A洗脱液的10ml样品对1升磷酸缓冲盐水(PBS)，pH7.0过夜透析。平行地，将示例性CD20特异性SMIPTM产品的16.3mg/ml蛋白A洗脱液的第二个10ml样品对1升25mM NaOAc/25mM NaCl，pH5.0过夜透析。
对于总共12种样品，从透析中除去每种样品，用各自的透析缓冲液稀释到5或者10mg/ml，并调节到0M、3M或者4M的最终尿素浓度。将这些样品在室温下温育22小时。
通过大小排阻高效液相层析(如实施例1描述)分析10μl的12种样品的每一种并积分峰面积。在～8.8分钟保留时间时0M尿素对照目的峰(POI)的相对峰面积被设置为100％，并且对于每种样品将实验组POI面积的相对增加作图。见图2.
在第二个实验中，用3M和4M尿素在pH4.0、pH5.0和pH6.0测定示例性CD20特异性SMIPTM产品的解聚的时间过程。将16.3mg/ml的CD20特异性SMIPTM产品蛋白A洗脱液8ml对pH4.0、5.0或6.0的500ml 25mM NaOAc/25mM NaCl过夜透析。用各自的透析缓冲液和尿素稀释三种样品至8mg/ml CD20特异性SMIPTM产品和0M、2M、3M或4M尿素的终浓度。通过SEC HPLC分析0M尿素样品并将POI峰面积设置为t＝0时间点。注射pH4.0、5.0和6.0的12μl 2M、3M和4M尿素浓度并随后通过SEC HPLC分析，在～24小时内重复整个顺序。将POI的总的峰面积对注射时间作图以产生在这9种条件下解聚的时间过程。该实验的结果在图3中总结。
在第三个实验中，在pH5，3M尿素和pH6，4M尿素下测量示例性CD20特异性SMIPTM产品的依赖于尿素的解聚。将16.3mg/ml的2个2ml示例性CD20特异性SMIPTM产品蛋白A洗脱液分别对300ml的pH5.0或pH6.0的25mM NaOAc/25mM NaCl过夜透析。将pH5.0样品调节到8mg/ml CD20特异性SMIPTM产品和在含有25mM NaOAc/25mM NaCl(pH5.0)的缓冲液中的3M尿素。将pH6.0样品调节到8mg/mlCD20特异性SMIPTM产品和含有25mM NaOAc/25mM NaCl(pH6.0)的缓冲液中4M尿素。将这些样品在室温温育～20小时。通过5小时透析将两种样品都交换到PBS中。通过SEC HPLC分析两种样品并通过条形图对总的POI面积和总的％POI作图。见图4。
实施例3
解聚的CD20特异性SMIPTM产品的体外表征
该实施例阐明通过本发明的组合物和方法解聚的CD20特异性SMIPTM产品的体外活性。
基于AlamarBlueTM染料的细胞代谢还原测量示例性CD20特异性SMIPTM产品与补体组合的细胞毒性作用。将人B类淋巴母细胞细胞系WIL2-S与示例性CD20特异性SMIPTM产品和兔补体组合用于96孔形式中。加入合适的对照和产品样品浓度并允许在37℃，5％CO2下温育。然后加入AlamarBlueTM染料溶液。通过细胞代谢将染料还原成能在固定的时间点被荧光读数的形式。相对荧光单位(RFU)与每个样品中活细胞的数目成正比。
基于以剂量依赖性方式结合CD20特异性SMIPTM产品的缀合异硫氰酸荧光素(FITC)的染料的相对荧光，测量表达CD20的细胞系上示例性CD20特异性SMIPTM产品的目标亲和性。将人B类淋巴母细胞细胞系WIL2-S与CD20特异性SMIPTM产品的多种稀释液温育，让其结合细胞靶标。洗涤细胞以除去任何未结合的CD20特异性SMIPTM产品并染色用于检测结合的蛋白质。洗涤细胞以除去任何未结合的染料并通过流式细胞术(FACS)分析FITC几何平均荧光强度(GMFI)。将数据对四参数曲线拟合并计算ED50值。结果以相对功效％(样品对参考标准)报告。
实施例4 体外表征解聚的CD20特异性SMIPTM产品
该实施例公开了Ramos肿瘤细胞动物模型***，其用于评估通过本发明的组合物和方法解聚的CD20特异性SMIPTM产品的体内活性。将Ramos细胞培养到合适的汇合度和>90％存活性，收获并用无菌PBS洗涤两次。将收获的细胞重悬浮至合适的细胞数用于注射(即，100μl/小时；用于5×106个细胞/小鼠，将细胞重悬浮至5 x 107个细胞/ml)并在冰上保持直到注射。在针头中使用27G 1/2，在小鼠的右侧腹皮下注射100μl细胞悬浮液，其通常产生可见的水泡。每天观察肿瘤生长。典型地当它们达到～150-300mm3时建立肿瘤。
在第0天，根据肿瘤大小将动物分选和分组(使用LabCat软件；Innovative Programming Associates，Inc.，Princeton，NJ)并记录体重。每周测量肿瘤2-3次并每周监视体重。保持动物直到肿瘤不大于1500mm3。如果发生肿瘤溃疡形成，如果存在体重的过度减轻，如果肿瘤超过1500mm3，和/或如果肿瘤抑制动物的活动，那么处死动物。通常在第90天后结束研究。

Claims (20)

1.用于解聚结合蛋白的组合物，所述组合物包含浓度为约1mM到约100mM的盐和浓度为约0.1M到约8M的离液剂，其中所述组合物具有约pH4到约pH7的pH。
2.权利要求1的组合物，其中所述盐的浓度为约10mM到约25mM。
3.权利要求1的组合物，其中所述盐选自NaCl和NaOAc。
4.权利要求1的组合物，其中所述离液剂的浓度为约3M到约5M。
5.权利要求1的组合物，其中所述离液剂选自胍、精氨酸和尿素。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物具有约pH5到约pH6的pH。
7.权利要求1的组合物，其还包含选自三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)。
8.权利要求1的组合物，其还包含选自DTPA、EDTA和NTA的螯合剂。
9.用于解聚结合蛋白的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a)将包含非聚集的结合蛋白和聚集的结合蛋白的混合物用包含约1mM到约100mM浓度的盐和约0.1M到约8M浓度的离液剂的组合物悬浮到约0.1mg/ml到约50mg/ml的浓度；
(b)调节所述结合蛋白悬浮液的pH至约pH4到约pH7之间的pH；和
(c)保持所述结合蛋白悬浮液在约-10℃到约50℃的温度约5小时到约24小时，从而增加非聚集的结合蛋白的百分数和降低聚集的结合蛋白的百分数。
10.权利要求9的方法，其还包括将所述结合蛋白悬浮液交换到包含盐的缓冲***中，其中所述缓冲***的pH为约pH5。
11.权利要求10的方法，其还包括从所述聚集的结合蛋白中分离所述非聚集的结合蛋白的步骤。
12.权利要求9的方法，其中所述结合蛋白选自蛋白质配体、可溶性受体、抗体、抗体片段、可变片段单链抗体(scFv)和小模块免疫药物产品。
13.权利要求12的方法，其中将所述结合蛋白悬浮到约1mg/ml到约50mg/ml的浓度。
14.权利要求12的方法，其中所述盐浓度为约10mM到约25mM。
15.权利要求12的方法，其中所述盐选自NaOAc和NaCl。
16.权利要求12的方法，其中所述离液剂的浓度为约3M到约5M。
17.权利要求12的方法，其中所述离液剂选自胍、精氨酸和尿素。
18.权利要求12的方法，其中调节所述结合蛋白悬浮液至约pH5到约pH6的pH。
19.权利要求12的方法，其中所述结合蛋白对选自CD20、VEGF、Her2、EGFR和CD37的目标蛋白具有特异性的结合亲和性。
20.权利要求19的方法，其中所述结合蛋白是小模块免疫药物产品，其中所述小模块免疫药物产品以至少10-6到10-9M范围内的解离常数结合到所述目标蛋白。
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