DE69637012T2 - Waessrige Formulierung enthaltend TFPI und Lösungsvermittlers - Google Patents

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Kirk Emeryville Johnson
Bao-Lu Emeryville CHEN
Rajsharan K. Emeryville Rana
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Mark E. Emeryville Gustafson
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Gary V. Emeryville Johnson
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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft wässrige Formulierungen, die für die Rückfaltung, Solubilisierung, Formulierung und Reinigung von Proteinen geeignet sind. Diese Formulierungen sind insbesondere für Proteine geeignet, die durch genetische Rekombination erzeugt worden sind und in Bakterien-, Hefe- oder anderen Zellen in einer Form hergestellt worden sind, die eine nicht-native Tertiärstruktur aufweist.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Um den gesamten Vorgang der Genexpression vollständig zu verstehen, ist es ebenso wichtig, den Prozess für die Faltung der Peptidkette zu einem biologisch aktiven Protein zu verstehen, wie es wichtig ist, die Synthese der Primärsequenz zu verstehen. Die biologische Aktivität von Proteinen hängt nicht nur von ihren Aminosäuresequenzen, sondern auch von den einzelnen Konformationen der betreffenden Proteine ab, und geringfügige Störungen der konformativen Integrität eines Proteins können seine Aktivität zerstören. Tsou et al. (1988) Biochemistry 27: 1809–1812.
  • Unter den richtigen Bedingungen ist die in vitro-Rückfaltung gereinigter, denaturierter Proteine, um die native Sekundär- und Tertiärstruktur zu erhalten, ein spontaner Prozess. Um die Bildung stabiler, jedoch unerwünschter Strukturen zu vermeiden, ist es notwendig, die tertiären Wechselwirkungen (die beim Falten spät gebildet werden) mit ihrem hohen Maß an Selektivitätskraft einzusetzen, um diese frühen lokalen Strukturen, die auf dem Weg zu einer korrekten Faltung sind, auszuwählen und weiter zu stabilisieren. Somit könnte die begrenzte, jedoch sehr geringe Stabilität lokaler Strukturen der genetische "Korrekturlese"-Mechanismus der Proteinfaltung sein. Der aktivierte Faltungszustand mit der höchsten Energie ist eine verdrehte Form des nativen Proteins, und der langsamste, die Geschwindigkeit begrenzende Schritt der Entfaltung und Rückfaltung scheint hinsichtlich der geordneten Struktur nahe dem nativen Zustand zu sein. Darüber hinaus ist die Rückfaltung vieler Proteine in vitro nicht völlig reversibel und es werden häufig Reaktivierungsausbeuten von weniger als 100% beobachtet, was insbesondere für Versuche bei hoher Proteinkonzentration gilt, und die konkurrierende Aggregation ungefalteter oder teilweise rückgefalteter Proteinmoleküle kann die Hauptursache für eine herabgesetzte Reversibilität sein, wie in Fischer und Schmid, (1990) Biochemistry 29: 2205–2212 beschrieben ist.
  • Im Falle ausreichend großer Proteinmoleküle erwirbt die naszierende Polypeptidkette ihre native dreidimensionale Struktur durch die modulare Anordnung von Mikrodomänen. Variablen einschließlich Temperatur und Kosolvenzien wie Polyole, Harnstoff und Guanidiniumchlorid wurden getestet, um ihre Rolle bei der Stabilisierung und Destabilisierung von Proteinkonformationen zu bestimmen. Die Wirkung von Kosolvenzien kann das Ergebnis direkter Bindung oder die Änderungen durch die physikalischen Eigenschaften von Wasser sein, wie in Jaenicke et al. (1991) Biochemistry 30 (13): 3147–3161 beschrieben wird.
  • Experimentelle Beobachtungen, wie ungefaltete Proteine sich in ihre nativen dreidimensionalen Strukturen rückfalten, stehen im Gegensatz zu vielen populären Theorien der Mechanismen der Proteinfaltung. Unter Bedingungen, die das Rückfalten ermöglichen, äquilibrieren ungefaltete Proteinmoleküle rasch zwischen verschiedenen Konformationen, bevor sie sich vollständig rückfalten. Das rasche Gleichgewicht vor der Faltung begünstigt bestimmte kompakte Konformationen, die etwas niedrigere freie Energien aufweisen als die anderen ungefalteten Konformationen. Der die Geschwindigkeit limitierende Schritt findet im Reaktionsweg spät statt und umfasst eine hochenergetische, verdrehte Form der nativen Konformation. Es scheint einen einzigen Übergang zu geben, durch den sich im Wesentlichen sämtliche Moleküle falten, wie in Creighton et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 5082–5086 beschrieben ist.
  • Es wurden verschiedene Verfahren der Rückfaltung gereinigter, rekombinant hergestellter Proteine verwendet. Beispielsweise kann die Protease, die durch das Human Immunodeficiency-Virus Typ I (HIV-I) kodiert wird, in Escherichia coli hergestellt werden, wobei Einschlusskörper erhalten werden, welche die rekombinante HIV-I-Protease beherbergen, wie von Hui et al. (1993) J. Prot. Chem. 12: 323–327 beschrieben wurde. Die gereinigte HIV-I-Protease wurde in ein aktives Enzym rückgefaltet, indem eine Lösung des Proteins in 50%iger Essigsäure mit 25 Volumen eines Puffers bei pH 5,5 verdünnt wurde. Es wurde festgestellt, dass eine höhere spezifische Aktivität der Protease erhalten wurde, wenn das gereinigte Protein bei etwa 2 mg/ml in 50%iger Essigsäure aufgelöst wurde, gefolgt von einer Verdünnung mit 25 Volumen kaltem 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5, welches 5% Ethylenglycol und 10% Glycerin enthielt. Ein Ausschluss von Glycerin und Ethylenglycol führte zu einem allmählichen Verlust des Proteins aufgrund von Ausfällung. Es wurden bei diesem Verfahren etwa 85 mg korrekt gefaltete HIV-I-Protease pro Liter E. coli Zellkultur erhalten, und das Enzym wies eine hohe spezifische Aktivität auf.
  • Ein anderes Beispiel für die Rückfaltung eines rekombinanten Proteins ist die Isolierung und Rückfaltung von H-ras aus Einschlusskörpern von E. coli, wie sie von DeLoskey et al. (1994) Arch. Biochem. and Biophy. 311: 72–78 beschrieben wird. In dieser Untersuchung wurden die Proteinkonzentration, die Temperatur und die Gegenwart von 10% Glycerin während der Rückfaltung variiert. Die Ausbeute an korrekt gefaltetem H-ras war am höchsten, wenn das Protein bei Konzentrationen von weniger als oder gleich 0,1 mg/ml rückgefaltet wurde und war von der Gegenwart von 10% Glycerin unabhängig. Die Ausbeute war bei 4° geringfügig höher als bei 25°C.
  • Die Rückfaltung von Tissue Factor Pathway Inhibitor (u. a. auch bekannt als Lipoprotein-Associated Coagulation Inhibitor (LACI), Extrinsic Pathway Inhibitor (EPI) und Tissue Factor Inhibitor (EFI) und im Folgenden als "TFPI" bezeichnet), erzeugt in einem bakteriellen Expressionssystem, ist von Gustafson et al. (1994), Protein Expression and Purification 5: 233–241 beschrieben worden. In dieser Untersuchung führte eine hochgradige Expression von TFPI in rekombinanten E. coli zur Akkumulation von TFPI in Einschlusskörpern. Aktives Protein wurde durch Solubilisierung der Einschlusskörper in 8 M Harnstoff hergestellt, und die Reinigung des Moleküls in voller Länge wurde durch Kationenaustauschchromatographie und Renaturierung in 6 M Harnstoff erreicht. Das rückgefaltete Gemisch wurde dann fraktioniert, um ein gereinigtes, nicht glykosyliertes TFPI zu erhalten, das in vitro eine biologische Aktivität als Maß beim Prothrombingerinnungszeit-Test besitzt, die mit aus Säugerzellen gereinigtem TFPI vergleichbar ist.
  • Es wurde auch eine nicht-glykosylierte Form von FTPI aus Escherichia coli (E. coli)-Zellen hergestellt und isoliert, wie im US-Patent Nr. 5,212,091 , auf dessen Offenbarung hierin Bezug genommen wird, beschrieben ist. In der im US-Patent Nr. 5,212,091 beschriebenen Erfindung wurden die TFPI enthaltenden Einschlusskörper zur Bildung von TFPI-S-Sulfonat einer Sulfitolyse unterzogen, das TFPI-S-Sulfonat durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt, das TFPI-S-Sulfonat durch Disulfidaustausch unter Verwendung von Cystein rückgefaltet und aktives TFPI durch Kationenaustauschchromatographie gereinigt. Es wurde gezeigt, dass die im US-Patent Nr. 5,212,091 beschriebene Form von TFPI bei der Inhibierung von bovinem Faktor Xa und bei der Inhibierung von human tissue factor-induzierter Koagulation in Plasma aktiv ist. In einigen Tests wurde gezeigt, dass das mittels E. coli erzeugte TFPI aktiver ist als natives TFPI, das von SK-Hepatoma-Zellen stammt. In E. coli-Zellen erzeugtes TFPI ist jedoch auf eine Weise modifiziert, die die Heterogenität des Proteins erhöht.
  • Es besteht die Notwendigkeit auf dem Gebiet der Rückfaltung rekombinant erzeugter Proteine, die Menge an korrekt gefaltetem TFPI während des Rückfaltungsvorgangs zu erhöhen. Es besteht ebenfalls die Notwendigkeit, die Löslichkeit von TFPI zu erhöhen. Bislang waren die Ausbeuten von rekombinant erzeugtem TFPI niedriger als erwünscht und es besteht die Notwendigkeit, korrekt gefaltetes TFPI zu erzeugen. Siehe beispielsweise Gustafuson et al. (1994) Protein Expression und Purification 5: 233–241.
  • TFPI inhibiert die Koagulationskaskade auf mindestens zwei Arten: Verhinderung der Bildung eines Faktor VIIa/Gewebefaktorkomplexes und durch Bindung der aktiven Stelle von Faktor Xa. Die Primarsequenz von TFPI, abgeleitet von der cDNA-Sequenz, weist darauf hin, dass das Protein drei Enzyminhibitordomänen vom Kunitz-Typ enthält. Die erste dieser drei Domänen wird für die Inhibierung des Faktor VIIa/Gewebefaktorkomplexes benötigt. Die zweite Kunitz-Typ-Domäne wird für die Inhibierung von Faktor Xa benötigt. Die Funktion der dritten Kunitz-Typ-Domäne ist unbekannt. TFPI weist keine bekannte enzymatische Aktivität auf, und es wird angenommen, dass es seine Proteasetargets auf stöchiometrische Weise inhibiert, nämlich durch Binden einer TFPI-Domäne vom Kunitz-Typ an die aktive Stelle eines Proteasemoleküls. Es wird angenommen, dass das carboxy-terminale Ende von TFPI bei der Zelloberflächenlokalisierung mittels Heparinbindung und durch Wechselwirkung mit Phospholipid eine Rolle spielt. TFPI ist auch bekannt als Lipoprotein Associated Coagulation Inhibitor (LACI), Tissue Factor Inhibitor (TFI), und Extrinsic Pathway Inhibitor (EPI).
  • Reifer TFPI weist eine Länge von 276 Aminosäuren mit einem negativ geladenen aminoterminalen Ende und einem positiv geladenen carboxyterminalen Ende auf. TFPI enthält 18 Cysteinreste und bildet neun Disulfidbrücken, wenn es korrekt gefaltet ist. Die Primärsequenz enthält auch drei Asn-X-Ser/Thr N-verknüpfte Glycosylierungsconsensussequenzen, wobei die Asparaginreste an den Positionen 145, 195 und 256 lokalisiert sind. Die Kohlenhydratkomponente von reifem TFPI beträgt etwa 30% der Masse des Proteins. Daten aus der proteolytischen Kartierung und Massenspektrumsdaten implizieren jedoch, dass die Kohlenhydratgruppen heterogen sind. Es wurde auch festgestellt, dass TFPI an dem Serinrest in Position 2 des Proteins in variierendem Maße phosphoryliert ist. Die Phosphorylierung scheint die TFPI-Funktion nicht zu beeinflussen.
  • TFPI wurde aus Humanplasma und aus humanen Gewebekulturzellen einschließlich HepG2, Chang liver und SK Hepatomazellen isoliert. Rekombinante TFPI wurde in C127-Zellen der Maus, Babyhamster-Nierenzellen, Eizellen des chinesischen Hamsters und humanen SK-Hepatomazellen exprimiert. Es wurde gezeigt, dass rekombinante TFPI aus den C127-Zellen der Maus in Tiermodellen die Gewebefaktor-induzierte Koagulation inhibiert.
  • Eine nicht-glycosylierte Form von rekombinantem TFPI wurde aus Escherichia coli (E. coli) Zellen erzeugt und isoliert, wie im US-Patent Nr. 5,212 091 beschrieben ist. Es wurde gezeigt, dass diese Form von TFPI bei der Inhibierung von bovinem Faktor Xa und bei der Inhibierung von Human Tissue Factor-induzierter Koagulation in Plasma aktiv ist. Auch Verfahren zur Reinigung von TFPI aus Hefezellkulturmedium wurden bereits beschrieben, beispielsweise in Petersen et al, J. Bio. Chem. 18: 13344–13351 (1993).
  • Vor kurzem wurde ein anderes Protein mit einem hohen Maß an struktureller Identität mit TFPI identifiziert. Sprecher et al, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91: 3353–3357 (1994). Die vorhergesagte Sekundärstruktur dieses Proteins, das TFPI-2 genannt wird, ist mit drei Domänen vom Kunitz-Typ, 9 Cystein-Cystein-Verknüpfungen, einem sauren Aminoterminus und einem basischen carboxyterminalen Ende im Wesentlichen mit TFPI identisch. Die drei Kunitz-Typ Domänen von TFPI-2 zeigen 43%, 35% bzw. 53% Primärsequenzidentität mit den TFPI Kunitz-Typ Domänen 1, 2 bzw. 3. Rekombinantes TFPI-2 inhibiert die amidolytische Aktivität von Faktor VIIa/Gewebefaktor stark. Im Gegensatz dazu ist TFPI-2 ein schwacher Inhibitor der amidolytischen Faktor Xa-Aktivität.
  • Es wurde gezeigt, dass TFPI die Mortalität in einem letalen septischen Escherichia coli (E. coli)-Schock beim Pavian Modell verhindert. Creasey et al, J. Clin. Invest. 91: 2850–2860 (1993). Die Verabreichung von TFPI bei 6 mg/kg Körpergewicht kurz nach Infusion einer letalen Dosis von E. coli führte bei allen fünf TFPI-behandelten Tieren zum Überleben mit einer beträchtlichen Verbesserung der Lebensqualität im Vergleich zu einer mittleren Überlebenszeit der fünf Kontrolltiere von 39,9 Stunden. Die Verabreichung von TFPI führte auch zu einer beträchtlichen Abschwächung der Koagulationsantwort bei verschiedenen Messungen von Zellverletzungen und einer signifikanten Abnahme der Pathologien, die in Zielorganen mit E. coli-Sepsis normalerweise beobachtet wird, einschließlich Nieren, Nebennieren und Lungen.
  • Aufgrund seiner gerinnungsinhibierenden Eigenschaften kann TFPI auch dazu verwendet werden, eine Thrombose während einer Mikrogefäßchirurgie zu verhindern. Beispielsweise wird in der US 5,276,015 die Verwendung von TFPI in einem Verfahren zur Verminderung der Thrombogenizität mikrovaskulärer Anastomosen beschrieben, wobei TFPI an der Stelle der mikrovaskulären Anastomosen gleichzeitig mit der mikrovaskulären Rekonstruktion verabreicht wird.
  • TFPI ist ein hydrophobes Protein und weist als solches eine sehr beschränkte Löslichkeit in wässrigen Lösungen auf. Diese beschränkte Löslichkeit hat die Herstellung einer Zubereitung pharmazeutisch verträglicher Formulierungen von TFPI erschwert, insbesondere für klinische Indikationen, für die eine Verabreichung hoher Dosen TFPI nützlich wäre. Daher sind pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen notwendig, die Konzentrationen an TFPI enthalten, die den Patienten in verträglichen Mengen verabreicht werden können.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine coomassiegefärbte SDS-PAGE-Analyse von TFPI-Peak-Fraktionen aus dem Phenyl-Sepharose-HIC-Rückfaltungsprozess.
  • 2 ist eine Darstellung der Rückgewinnung von nativem TFPI aus der HIC-Säule.
  • 3 ist eine Darstellung der Wiedergewinnung von nativem TFPI aus einer zweiten HIC-Säule.
  • 4 ist die Aminosäuresequenz von TFPI.
  • 5 zeigt die Löslichkeit von TFPI bei verschiedenen pH-Bedingungen. Etwa 10 mg/ml TFPI in 2 M Harnstoff wurden gegen 20 mM Acetat, Phosphat, Citrat, Glycin, L-Glutamat und Succinat in 150 mM NaCl dialysiert. Die Konzentration des verbleibenden löslichen TFPI nach Dialyse wurde nach Abfiltern des Präzipitats durch 0,22 mm Filtereinheiten mittels UV-Absorption gemessen.
  • 6 zeigt die Löslichkeit von TFPI als eine Funktion der Citratkonzentration in Gegenwart von 10 mM Na-Phosphat bei pH 7. Die TFPI-Löslichkeit nimmt mit steigender Citratkonzentration zu.
  • 7 zeigt die Löslichkeit von TFPI als eine Funktion der NaCl-Konzentration. Die TFPI-Löslichkeit nimmt mit steigender Salzkonzentration zu, was zeigt, dass Salz die Löslichkeit von TFPI fördert.
  • 8 zeigt den Effekt des pH auf die Stabilität von TFPI, das in 10 mM Na-Phosphat, 150 mM NaCl und 0,005% (Gew./Vol.) Polysorbat-80 hergestellt wurde. Stabilitätsproben, die 150 mg/ml TFPI enthielten, wurden 20 Tage lang bei 40°C inkubiert. Die kinetische Geschwindigkeitskonstante für das verbleibende lösliche TFPI wurde analysiert, indem die Abnahme des Hauptpeaks auf Kationen-Austausch-Chromatogrammen verfolgt wurde.
  • 9 zeigt den prozentualen Anteil des verbleibenden löslichen TFPI, gemessen mittels Kationenaustausch-HPLC (A) und des verbleibenden aktiven TFPI mittels Prothrombinzeit-Test (B) als Funktion der Phosphatkonzentration. Die Formulierung enthält 150 mg/ml TFPI, hergestellt in 150 mM NaCl und 0,005% (Gew./Vol.) Polysorbat-80 bei pH 7 bei variierenden Phosphatkonzentrationen.
  • 10 zeigt den Verlust an löslichem TFPI bei 40°C, gemessen sowohl durch Kationenaustausch-HPLC (Dreieck) und Prothrombinzeit-Test (Kreis) für 0,5 mg/ml TFPI, formuliert in 10 mM Na-Citrat, pH 6 und 150 mM NaCl.
  • 11 zeigt den Verlust an löslichem TFPI bei 40°C, gemessen sowohl mittels Kationenaustausch-HPLC (offenes Symbol) und Prothrombinzeit-Test (geschlossenes Symbol) für 0,5 mg/ml TFPI, formuliert in 10 mM Na-Phosphat, pH 6 und entweder 150 mM NaCl (Dreieck) oder 500 mM NaCl (Kreis).
  • 12 zeigt den Verlust an löslichem TFPI bei 40°C, gemessen sowohl durch Kationenaustausch-HPLC (offenes Symbol) und Prothrombinzeit-Test (geschlossenes Symbol) für 0,5 mg/ml TFPI, formuliert in 10 mM Na Acetat und pH 5,5, enthaltend 150 mM NaCl (Dreieck) oder 8% (Gew./Vol.) Saccharose (Quadrat) oder 4,5% Mannit (Kreis).
  • 13 zeigt zwei nicht-reduzierende SDS-Gele für TFPI-Formulierungsproben bei pH 4 bis 9, die 0 und 20 Tage lang bei 40°C gelagert wurden.
  • 14 zeigt den Zeitverlauf einer polyphosphatunterstützten rhTFPI-Rückfaltung, überwacht mittels SDS-PAGE.
  • 15 zeigt die Absorption bei 280 nm während der Beladung und Elution der S-Sepharose HP-Säule, die zum Reinigen des rhTFPI aus einer polyphosphatunterstützten Rückfaltung verwendet wurde.
  • 16 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen, die während der Elution der S-Sepharose HP-Säule gesammelt wurden, welche zur Reinigung des rhTFPI aus einer polyphosphatunterstützten Rückfaltung verwendet wurde.
  • 17 zeigt die Absorption bei 280 nm während des Beladens und der Elution der Q-Sepharose HP-Säule, die zum Reinigen von rhTFPI aus einem S-Sepharose-Pool verwendet wurde, der aus einer polyphosphatunterstützten Rückfaltung hergestellt wurde.
  • 18 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen, die während der Elution der Q-Sepharose HP-Säule gesammelt wurden, die zum Reinigen von rhTFPI aus einem S-Sepharose-Pool, der aus einer polyphosphatunterstützten Rückfaltung hergestellt wurde, verwendet wurde.
  • 19 zeigt den Zeitverlauf einer Polyethylenimin-unterstützten rhTFPI-Rückfaltung, der mittels SDS-PAGE überwacht wurde.
  • 20 zeigt die Absorption bei 280 nm während der Beladung und Elution der S-Sepharose HP-Säule, die zur Reinigung von rhTFPI aus einer Polyethylenimin-unterstützten Rückfaltung verwendet wurde.
  • 21 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen, die während der Elution der S-Sepharose HP-Säule gesammelt wurden, die zum Reinigen von rhTFPI aus einer Polyethylenimin-unterstützten Rückfaltung verwendet wurde.
  • 22 zeigt die Absorption bei 280 nm während der Beladung und Elution der Q-Sepharose HP-Säule, die zum Reinigen von rhTFPI aus einem S-Sepharose-Pool verwendet wurde, der aus einer Polyethylenimin-unterstützten Rückfaltung hergestellt wurde.
  • 23 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen, die während der Elution der Q-Sepharose HP-Säule gesammelt wurden, die zum Reinigen von rhTFPI aus einem S-Sepharose-Pool verwendet wurde, der aus einer Polyethylenimin-unterstützten Rückfaltung hergestellt wurde.
  • 24 zeigt die Kationenaustausch-HPLC-Analyse einer 0,4% polyphosphat-unterstützten rhTFPI-Rückfaltung in Abwesenheit von Harnstoff.
  • 25 zeigt Ergebnisse der Kationenaustausch-HPLC-Analyse einer Evaluierung verschiedener Cystein-Konzentrationen auf eine rhTFPI-Rückfaltung in 0,4% Polyphosphat, 50 mM Tris in Abwesenheit von Harnstoff.
  • 26 zeigt die Auswirkung der Polyphosphat-Kettenlänge auf den Verlauf einer polyphosphat-unterstützten Rückfaltung von rhTFPI-Einschlusskörpern, überwacht durch Kationenaustausch HPLC.
  • 27 zeigt die Auswirkung der Konzentration von Polyphosphat (Glass H) auf die Rückfaltung von rhTFPI aus Einschlusskörpern, überwacht durch Kationenaustausch-HPLC.
  • 28 zeigt die Kationenaustausch-HPLC-Analyse von Polyethylenimin- und polyphosphat-unterstützter Rückfaltung von gereinigtem und reduziertem rhTFPI.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist ein Ziel der Erfindung, wässrige Formulierungen von TFPI bereitzustellen.
  • Es wurde nun festgestellt, dass die Löslichkeit von TFPI stark pH-abhängig ist und überraschenderweise, dass Polyanionen wie Citrat, Isocitrat und Sulfat auf TFPI tiefgreifende Solubilisierungseffekte aufweisen. Dieses Ergebnis ist überraschend angesichts der hydrophoben Natur des TFPI und des hydrophilen Charakters dieser Gegenionen. Somit können Citrat, Isocitrat, Sulfat sowie andere im folgenden beschriebene Solubilisierungsmittel verwendet werden, um pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen herzustellen, die TFPI-Konzentrationen aufweisen, die zur Verabreichung an Patienten ausreichend sind. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass andere organische Moleküle als sekundäre Solubilisierungsmittel wirken können. Diese sekundären Solubilisierungsmittel schließen PEG, Saccharose, Mannit und Sorbit mit ein.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen, wobei rückgefaltetes TPFI in einer Konzentration von mehr als 0.2 mg/ml Solubilisierungsmittel vorliegt. Die Solubilisierungsmittel können Acetat-Ion, Natriumchlorid, Citrat-Ion, Isocitrat-Ion, Glycin, Glutamat, Succinat-Ion, Histidin, Imidazol und Natriumdodecylsulfat (SDS) sowie geladene Polymere sein. In einigen Zusammensetzungen kann TFPI in Konzentrationen von mehr als 1 mg/ml und mehr als 10 mg/ml vorliegen. Die Zusammensetzung kann auch ein oder mehrere sekundäre Solubilisierungsmittel aufweisen. Das oder die sekundären Solubilisierungsmittel können Polyethylenglycol (PEG), Saccharose, Mannit oder Sorbit sein. Schließlich kann die Zusammensetzung auch Natriumphosphat bei einer Konzentration von größer als 20 mM enthalten.
  • Obwohl die Löslichkeit von TFPI zwischen pH 5 und 10 recht gering ist, wurde festgestellt, dass L-Arginin die Löslichkeit um einen Faktor von 100 erhöhen kann. Die Löslichkeit ist sehr abhängig von der Arginin-Konzentration, da 300 mM etwa 30 mal wirksamer sind als 200 mM. Harnstoff ist bei der Solubilisierung ebenfalls ziemlich wirksam.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Polyionische Polymere wie Polyethylenimin und Polyphosphat können die ionischen Interaktionen in Proteinen modifizieren. Die Maskierung bestimmter Bereiche hoher Ladungsdichte in Proteinen unter Verwendung von Polyionen kann zahlreiche Auswirkungen aufweisen. Proteine, deren Löslichkeit durch die intra- und/oder intermolekulare Neutralisation gegensätzlich geladener Bereiche vermindert ist, können ihre Löslichkeit durch Maskieren einer der geladenen Regionen mit Polykationen oder Polyanionen verbessern. Barrieren gegen die Konformationsflexibilität und spezifische anziehende oder abstoßende Kräfte, die den Rückfaltungsprozess stören, können ebenso moduliert werden. Proteine, für die starke Denaturierungsmittel wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid erforderlich sind, um sie zu lösen und die Löslichkeit während der Reinigungsverfahren aufrecht zu erhalten, können mittels Polyionen solubilisiert und erfolgreich prozessiert werden.
  • Viele Proteine, denen eine klare Region der Ladungslokalisierung in der Primärsequenz fehlt, können dennoch aufgrund ihrer Sekundärstruktur Bereiche einer Ladungslokalisierung zeigen. Auf diese Weise können die Löslichkeits-, Rückfaltungs- und Reinigungseigenschaften vieler Proteine durch Wechselwirkung mit geladenen polymeren Matrizen modifiziert werden. Die Natur der Modifikation hängt von der spezifischen Proteinstruktur, der Kettenlänge, der Ladung und der Ladungsdichte des ionischen Polymers ab.
  • Wir haben die Rückfaltung von reinem TFPI in einem Rückfaltungspuffer auf Guanidin- oder Harnstoffbasis charakterisiert, und die Ergebnisse zeigen, dass die Effizienz und Kinetik der Rückfaltung durch die Zugabe von geladenen Polymeren einschließlich Heparin, Dextransulfat, Polyethylenimin (PI) und Polyphosphaten beträchtlich verbessert werden kann. Diese Polymere erhöhen die Löslichkeit von TFPI und verbessern die Rückfaltung durch ionische Wechselwirkungen mit entweder dem N-Terminus oder dem C-Terminus. Zusätzlich zu den Polymeradditiven ist für die Rückfaltung von reinem TFPI ein Cystein/Cystin-Redoxpuffer erforderlich, in dem die Rückfaltungsreaktion innerhalb von 48 Stunden abgeschlossen werden kann. Die Ausbeuten der Rückfaltung sind eine starke Funktion von pH, Redoxkonzentration und Polymeradditiven; jedoch können unter optimalen Rückfaltungsbedingungen Rückfaltungseffizienzen in Höhe von 60% für reines TFPI erreicht werden.
  • Die Erfinder dieser Erfindung stellten fest, dass die Zugabe von Glucosaminoglycanen oder sulfatierten Polysacchariden, wie beispielsweise Heparin und Dextransulfat, und zwar vor der Faltung, zu einer Lösung, die denaturisiertes Protein enthält, die Menge an korrekt gefaltetem, aktivem Protein erhöht, wenn das Protein in der Lage ist, das Glucosaminoglycan oder sulfatierte Polysaccharid zu binden und Renaturisierungsbedingungen unterzogen wird.
  • Auflösung
  • Die rekombinante DNA-Technologie hat die hochgradige Expression vieler Proteine ermöglicht, die nicht auf normale Weise aus natürlichen Quellen in vernünftigen Mengen isoliert werden konnten. In E. coli und verschiedenen anderen Expressionssystemen wird das Protein häufig in einem inaktiven denaturierten Zustand exprimiert, wobei die primäre Aminosäuresequenz korrekt ist, die Sekundär- und Tertiärstruktur und Cystein-Disulfidbindungen jedoch nicht vorliegen. Das in einem Einschlusskörper vorliegende denaturierte Protein kann in einer solchen Konformation vorliegen, dass geladene Reste verschiedener Teile der Aminosäurehauptkette, die normalerweise nicht in Kontakt sind, in der Lage sind, wechselzuwirken und zwischen positiv geladenen und negativ geladenen Aminosäureresten starke ionische Bindungen bilden können. Die Bildung dieser ionischen Bindungen kann die Hydratation, die stattfinden muss, um eine Auflösung des Einschlusskörpers zu bewirken, einschränken. Das Protein in einem Einschlusskörper kann auch mit anderen Zellkomponenten wie Membrankomponenten und Nukleinsäure komplexiert sein, die den Zutritt von Solvens (Wasser) zu geladenen und normalerweise hydratisierten Resten einschränken kann. Es wurde auch festgestellt, dass hydrophobe Reste, die normalerweise im Inneren eines Proteins versteckt gefunden werden, im ungefalteten Zustand der polaren wässrigen Umgebung stärker ausgesetzt sind. Solche Vorkommnisse können dazu beitragen, die Auflösung von Einschlusskörpern in anderen Lösungsmitteln als starken chaotropischen Mitteln wie Harnstoff oder Guanidin oder Detergentien wie SDS zu verhindern.
  • Geladene Polymere vorzugsweise in wässriger Lösung können die unerwünschten ionischen Wechselwirkungen, die in einer Polypeptidkette auftreten, wie sie in einem Einschlusskörper oder einer anderen Umgebung gefunden wird, beeinträchtigen oder aufbrechen. Die geladenen Polymere können helfen, die unerwünschten ionischen Wechselwirkungen aufzubrechen und die Solvatation ionischer und polarer Reste erleichtern, indem sie die Auflösung ohne die Notwendigkeit starker chaotroper Mittel oder Detergenzien begünstigen. Die Ladung, die Ladungsdichte und das Molekulargewicht (Kettenlänge) des geladenen Polymers können je nach dem spezifischen Protein variieren. Geeignete Polymere schließen mit ein: Sulfatierte Polysaccharide, Heparine, Dextransulfate, Agaropektine, Carbonsäurepolysaccharide, Alginsäuren, Carboxymethyl-cellulosen, polyanorganische Stoffe, Polyphosphate, Polyaminosäuren, Polyaspartate, Polyglutamate, Polyhistidine, Polyorganika, Polysaccharide, DEAE-Dextrane, organische Polyamine, Polyethylenimine, Polyethylenimincellulosen, Polyamine, Polyaminosäuren, Polylysine und Polyarginine.
  • Proteine mit einem pI von größer als 7 können aus Wechselwirkungen mit negativ geladenen Polymeren mehr Nutzen ziehen, da diese Proteine bei pH 7 eine positive Ladung aufweisen. Proteine mit pI unterhalb 7 können stärker mit positiv geladenen Polymeren bei neutralem pH wechselwirken. Eine Änderung des Lösungs-pH modifiziert die Gesamtladung und die Ladungsverteilung eines jeden Proteins und ist eine weitere zu bewertende Variable.
  • Rückfaltung
  • Die rekombinante DNA-Technologie hat die hochgradige Expression vieler Proteine ermöglicht, die nicht auf normale Weise aus natürlichen Quellen in vernünftigen Mengen isoliert werden konnten. In E. coli und verschiedenen anderen Expressionssystemen wird das Protein häufig in einem inaktiven, denaturierten Zustand exprimiert, wobei die primäre Aminosäuresequenz korrekt ist, die Sekundär- und Tertiärstruktur und jegliche Cysteindisulfidbindungen jedoch nicht vorliegen. Das denaturierte Protein muss in die richtige aktive Konformation rückgefaltet werden, wobei es häufig erforderlich ist, beträchtliche Energiebarrieren zu überwinden, die durch ionische Anziehung und Abstoßung, Einschränkungen der Bindungsrotation und anderer Arten von durch die Konformation induzierten Spannungen hervorgerufen werden. Spezifische ionische Anziehung zwischen entgegengesetzten Ladungen und/oder Abstoßung zwischen gleichen Ladungen können die Rückfaltungswege, die dem denaturierten Protein zur Verfügung stehen, auf schwerwiegende Weise beschränken und die Effizienz des Rückfaltungsprozesses vermindern.
  • Einige Proteine weisen spezifische Ladungsbereiche auf, deren Wechselwirkungen die Konformationsflexibilität einschränken oder die Aggregation fördern können. Viele Proteine, denen eine klare Region der Ladungslokalisierung in der Primärsequenz fehlt, können dennoch Bereiche der Ladungslokalisierung aufgrund ihrer in Rückfaltungszwischenstufen, Missfaltungen und unrichtig gefaltetem Protein gefundenen Sekundärstruktur zeigen. Proteine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, aber nicht darauf beschränkt, TFPI, TFPI-Muteine und TFPI-2, Gewebe-Plasminogenaktivator, BST, PST. Während man annimmt, dass diese Formulierungen für die generische Verwendung bei Proteinen geeignet sind, sind diejenigen, die unrichtig gefaltet, aggregiert, oligomerisiert oder inaktiv sind, am geeignetsten. Es handelt sich hierbei wahrscheinlich um Proteine, die mindestens einen, möglicherweise mehrere, Ladungsbereich(e) mit hoher Ladung aufweisen, die Wechselwirken können. Im Falle von TFPI sowie anderer Proteine Wechselwirken zwei gegengesetzt geladene Domänen miteinander, wobei eine richtige Faltung verhindert und Oligomerisation und Aggregation verursacht wird. Proteine, die viele Disulfidbindungen aufweisen, eignen sich ebenfalls mit größter Wahrscheinlichkeit für die vorliegenden Methoden. Bevorzugt weist das Protein mindestens 2 und stärker bevorzugt mindestens 4 oder 6 Disulfidbindungen auf.
  • Geladene Polymere können verwendet werden, um die Ladung, die Ladungsdichte zu modifizieren und ionisch vermittelte Einschränkungen der Konformation zu reduzieren oder zu eliminieren, die in ungefaltetem Zustand entstehen können. Die Nebeneinanderstellung geladener Gruppen, die normalerweise nicht nahe sind, kann zu Rückfaltungssackgassen führen, von denen sich der Rückfaltungsprozess nie mehr erholt.
  • Die Einführung von zusätzlichen positiven oder negativen Ladungen durch die Komplexierung mit geladenen Polymeren kann aus verschiedenen Gründen einen leichteren Ablauf der Rückfaltung ermöglichen: Zunächst können verschiedene Arten der Ladungsverteilung sich dem Rückfaltungsprozess besser anpassen; zweitens kann die Zugabe des geladenen Polymers die Löslichkeit des ungefalteten Proteins verbessern, was die Notwendigkeit für chaotrope Agenzien, welche einen negativen Effekt auf die Proteinkonformation aufweisen, reduziert oder eliminiert.
  • Aufgrund der häufig einzigartigen Struktur, die mit den meisten Proteinen verbunden ist, kann das geladene Polymer, das bevorzugte Eigenschaften aufweist, variieren. Die Evaluierung des isoelektrischen pH (pI) des Proteins kann als Ausgangspunkt dienen. Bei neutralem pH weist ein Protein mit einem pI von weniger als 7 eine negative Nettoladung auf, und wird daher eher an ein positiv geladenes Polymer binden. Das Protein mit einem pI von größer als 7 weist eine positive Nettoladung bei neutralem pH auf und hat daher eine stärkere Tendenz, an ein negativ geladenes Polymer zu binden. Es ist jedoch bekannt, dass Ladungen um ein Protein herum ungleichmäßig verteilt sind und eine signifikante Ladungslokalisierung eintreten kann. Die Möglichkeit lokaler Ladungskonzentrationen reduziert die Fähigkeit, vorherzusagen, welche Art von geladenem Polymer für eine Anwendung die wirksamste ist. Theoretisch existiert für jedes Protein mit einer spezifischen Verteilung wechselwirkender Ladungen und Konformationserfordernisse ein geeignetes Polymer mit geeigneter Zusammensetzung bezüglich Molekulargewicht, Ladung und Ladungsverteilung, welches die Rückfaltungseffizienz maximieren würde. Andere Variable, wie pH und Solvensionenstärke würden ebenfalls bewertet werden. Die erste Auswahl würde Polyethylenimin, DEAE-Dextran, Dextransulfat und Polyphosphat bei mehreren verschiedenen Konzentrationen und Molekulargewichten mit umfassen. Das Arbeiten mit rhTFPI hat den beträchtlichen Einfluss gezeigt, welche die Polyphosphatkettenlänge und Konzentration auf den Verlauf der Rückfaltungsreaktion von TFPI aufweisen kann. Eine relativ kurze Kettenlänge (n = 5) erzeugt hohe Aggregatkonzentrationen. Die optimale Polyphosphatkettenlänge für die Rückfaltung von rhTFPI betrug etwa 25 Wiederholungseinheiten. Längerkettige Polyphosphatketten (n = 75) erzeugten ebenfalls mehr Aggregat und weniger richtig gefaltetes Monomer.
  • Formulierung
  • Proteine bestehen aus Ketten von Aminosäuren, deren genaue Zusammensetzung und Sequenz eine der Primärstrukturdeterminanten des Proteins bilden. Die Sekundärdeterminante der Proteinstruktur ist das Ergebnis der Konformationsführung, welche die individuellen Aminosäurebindungen auf die Proteinkonformation ausüben. Drittens lenkt die spezifische Aminosäuresequenz die Bildung von Tertiärstrukturen wie β-Faltblätter und α-Helices. Die dreidimensionale Natur der Proteinkonformation bringt oftmals Aminosäurereste in Nachbarschaft, die einander normalerweise aufgrund der direkten Sequenz der Polypeptidkette nicht nahe sind. Die funktionale Form eines Proteins ist üblicherweise eine mäßig stabile Konformation, die durch eine Kombination aus Cysteindisulfidbindungen, ionischen Bindungen und hydrophoben und Van der Waals-Wechselwirkungen zusammen gehalten wird.
  • Im Allgemeinen kann die Proteinlöslichkeit auf die Anzahl geladener und in geringerem Umfang polarer Aminosäuren, die das Protein bilden, bezogen sein. Diese geladenen und polaren Gruppen werden in der wässrigen Lösung mit Wassermolekülen solvatisiert und diese Wechselwirkungen halten die Polypeptidkette in Lösung. Polypeptide mit einer ungenügenden Anzahl von positiv oder negativ geladenen Aminosäuren können eine beschränkte wässrige Löslichkeit aufweisen. In manchen Fällen können die positiv und negativ geladenen Gruppen, die in einem Protein vorliegen, miteinander Wechselwirken, das Solvatationswasser verdrängen und zu einer verminderten Wasserlöslichkeit führen. Viele Proteine, denen ein klarer Bereich der Ladungslokalisierung in der Primärsequenz fehlt, können dennoch aufgrund ihrer Sekundärstruktur Bereiche einer Ladungslokalisierung aufweisen. Auf diese Weise können viele Proteine ihre Löslichkeit durch Wechselwirkung mit geladenen polymeren Matrizen modifizieren. Die Natur der Modifikation hängt von der spezifischen Proteinstruktur, der Kettenlänge, der Ladung und der Ladungsdichte des ionischen Polymers ab.
  • Die Komplexierung mit geladenen Polymeren mit relativ hoher Ladungsdichte stellt einen Ansatz dar, um die Ladungsdichte eines beliebigen Proteins zu erhöhen. Ein Protein mit einer geringen Anzahl positiv geladener Reste (Lysin oder Arginin) kann mit einem negativ geladenen Polymer wie beispielsweise Polyphosphat komplexiert werden. Einige der negativ geladenen Gruppen des Polymers werden mit den positiv geladenen Gruppen, die in dem Protein vorliegen, Wechselwirken. Die verbleibenden geladenen Gruppen auf dem Polymer sind frei, um mit dem Solvens, in den meisten Fällen Wasser, wechselzuwirken, und die Ladungsdichte und die Solvatation des Proteins wirksam zu erhöhen. Alternativ kann ein positiv geladenes Polymer wie Polyethylenimin verwendet werden, um mit den negativ geladenen Resten des Proteins einen Komplex zu bilden. In einigen Fällen funktionieren beide Typen geladener Polymere gleichermaßen effektiv, in anderen Fällen kann ein Ladungstyp effektiver sein als andere. Die Wirksamkeit eines besonderen geladenen Polymers hängt ab von der Aminosäurezusammensetzung des Proteins, der Aminosäurenverteilung des Proteins, der Proteinkonformation, der Ladungsdichte des geladenen Polymers, der Kettenlänge des geladenen Polymers, des Lösungs-pH und anderen Variablen. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass für ein beliebiges gegebenes Protein ein komplementäres geladenes Polymer, das an das Protein bindet und die Ladungsdichte des Proteins wesentlich erhöht, gefunden werden kann, welches die Lösungseigenschaften des Proteins in einem wässrigen Medium verbessert.
  • Definitionen
  • Der hier verwendete Begriff "prozessieren" bezieht sich auf die Schritte, die bei der Reinigung und Herstellung pharmazeutisch verträglicher Mengen an Proteinen beteiligt sind. Prozessieren kann einen oder mehrere Schritte umfassen, wie Solubilisierung, Rückfaltung, chromatographische Abtrennung, Ausfällung und Formulierung.
  • Der Begriff "geladenes Polymer" und "geladene polymere Matrize" betrifft jede Verbindung, die aus einem Rückgrat aus sich wiederholenden Struktureinheiten zusammengesetzt ist, die in linearer oder nichtlinearer Weise verknüpft sind, wobei einige der Wiederholungseinheiten positiv oder negativ geladene chemische Gruppen enthalten. Die sich wiederholenden Struktureinheiten können Polysaccharid, Kohlenwasserstoff, organischer oder anorganischer Natur sein. Die Wiederholungseinheiten können im Bereich von n = 2 bis n = mehrere Millionen liegen.
  • Der hier verwendete Begriff "positiv geladenes Polymer" betrifft Polymere, die chemische Gruppen enthalten, die eine positive Ladung tragen, tragen können oder modifiziert werden können, um eine positive Ladung zu tragen, wie Ammonium, Alkylammonium, Dialkylammonium, Trialkylammonium und quarternäres Ammonium.
  • Der hier verwendete Begriff "negativ geladenes Polymer" betrifft Polymere, die chemische Gruppen enthalten, die eine negative Ladung tragen, tragen können oder modifiziert werden können, um eine negative Ladung zu tragen, wie Derivate von Phosphorsäure und anderen phosphorhaltigen Säuren, Schwefelsäure und anderen schwefelhaltigen Säuren, Nitrat und anderen stickstoffhaltigen Säuren, Ameisensäure und andere Carbonsäuren.
  • Der hier verwendete Begriff "Polyethylenimin" betrifft Polymere, die aus Wiederholungseinheiten von Ethylenimin (H3N+-(CH2-CH2-NH2+)x-CH2-CH2- NH3+) bestehen. Das Molekulargewicht kann von 5.000 bis mehr als 50.000 variieren.
  • Der hier verwendete Begriff "Polyphosphat" betrifft Polymere, die aus Wiederholungseinheiten von Orthophosphat, die in einer Phosphoanhydridverknüpfung verknüpft sind, bestehen. Die Anzahl der Wiederholungseinheiten kann im Bereich von 2 (Pyrophosphat) bis mehreren Tausend liegen. Polyphosphat wird häufig auf Natriumhexametaphosphat (SHMP, sodium hexametaphosphate) bezogen. Andere übliche Bezeichnungen umfassen Grahamsalz, Calgon, Phosphatglas, Natriumtetrametaphosphat und Glass H.
  • Der hier verwendete Begriff "rückfalten" betrifft die Renaturierung von Protein. Ziel der Rückfaltung ist es normalerweise, ein Protein zu erzeugen, das ein größeres Maß an Aktivität aufweist als das Protein hätte, wenn es ohne Rückfaltungsschritt hergestellt worden wäre. Ein gefaltetes Proteinmolekül ist in der Konformation am stabilsten, die die geringste freie Energie aufweist. Die meisten wasserlöslichen Proteine falten sich so, dass sich die meisten der hydrophoben Aminosäuren im inneren Teil des Moleküls befinden, dem Wasser abgewandt. Die schwachen Bindungen, die ein Protein zusammenhalten, können durch eine Reihe von Behandlungen aufgebrochen werden, die eine Entfaltung eines Polypeptids verursachen, d. h. eine Denaturierung. Ein gefaltetes Protein ist das Produkt mehrerer Arten von Wechselwirkungen zwischen den Aminosäuren selbst und ihrer Umgebung, einschließlich ionischer Bindungen, Van der Waals-Wechselwirkungen, Wasserstoffbindungen, Disulfidbindungen und kovalente Bindungen.
  • Der hier verwendete Begriff "denaturieren" betrifft die Behandlung eines Proteins oder Polypeptids, welche zu einem Aufbrechen der ionischen und kovalenten Bindungen und der Van der Waals-Wechselwirkungen, die in dem Molekül in seinem nativen oder renaturierten Zustand vorliegen, führen. Die Denaturierung eines Proteins kann beispielsweise durch Behandeln mit 8 M Harnstoff, Reduktionsmitteln wie Mercaptoethanol, Hitze, pH, Temperatur oder anderen Chemikalien erreicht werden. Reagenzien wie 8 M Harnstoff brechen sowohl die Wasserstoff- als auch hydrophoben Bindungen auf, und wenn auch Mercaptoethanol zugegeben wird, werden die Disulfidbrücken (S-S), die zwischen Cysteinen gebildet werden, zu zwei S-H-Gruppen reduziert. Die Rückfaltung von Proteinen, die Disulfidverknüpfungen in ihrem nativen oder rückgefalteten Zustand enthalten, kann auch die Oxidation der -S-H-Gruppen umfassen, die auf Cysteinresten vorliegen, damit das Protein die Disulfidbindungen wieder bilden kann.
  • Die hier verwendete Bezeichnung "Glycosaminoglycan" betrifft Polysaccharide, die alternierende Reste von Uronsäure und Hexosamin enthalten und üblicherweise Sulfat enthalten. Das Binden eines Proteins in einer Rückfaltungsreaktion, wie es hier beschrieben wird, zu einem Glycosaminoglycan erfolgt durch ionische Wechselwirkungen.
  • Der hier verwendete Begriff "Dextransulfat" betrifft ein polyanionisches Derivat von Dextran, dessen Molekulargewicht im Bereich von 8.000 bis 500.000 Dalton liegt. Dextrane sind Polymere von Glukose, bei denen Glukosereste durch alpha-1,6-Verknüpfungen verbunden sind.
  • Der hier verwendete Begriff "Heparin" betrifft zwei Glucoaminoglycane oder Heparinoide, die auf einem wiederholten Disaccharid (-4DGlcA(p)β1, 4GlcNAcαl-)n beruhen, nach dem Aufbau jedoch einer umfangreichen Modifizierung unterliegen. Heparin wird mit Histamin in Mastzellgranula gelagert und wird daher in den meisten Bindegeweben gefunden. Im allgemeinen weisen Heparine kürzere Ketten als Heparin auf.
  • Der hier verwendete Begriff "HIC" betrifft hydrophobe Interaktionschromatographie, bei der eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen der Säule und dem interessierenden Molekül eingesetzt wird, um die sulfatisierten Polysaccharide und andere Verunreinigungen von dem rückgefalteten Produkt A abzutrennen.
  • Negativ geladene Polymere umfassen sulfatisierte Polysaccharide wie Heparine, Dextransulfate und Agaropektine, sowie Carbonsäurepolysaccharide wie Asalginsäuren und Carboxymethylcellulosen. Polyanorganische Stoffe wie Polyphosphate sind ebenfalls mit umfasst. Polyaminosäuren wie Polyasparatat, Polyglutamat und Polyhistidin können ebenfalls verwendet werden.
  • Positiv geladene Polymere umfassen Polysaccharide wie DEAE-Dextran, organische Polyamine wie Polyethylenimine, Polyethylenimin-Cellulosen und Polyamine, sowie die Polyaminosäuren, Polylysin und Polyarginin. Kombinationen von Polymeren können von jeder Ladungspolarität verwendet werden. Darüber hinaus können auch amphotere Copolymere verwendet werden.
  • "TFPI" bedeutet hierin reifer Tissue Factor Pathway Inhibitor. Wie zuvor bereits angemerkt, ist TFPI in der Technik auch bekannt als Lipoprotein Associated Coagulation Inhibitor (LACI), Extrinsic Pathway Inhibitor (EPI) und Tissue Factor Inhibitor (TFI). Muteine von TFPI, die die biologische Aktivität von TFPI behalten, werden von dieser Definition mit umfasst. Darüber hinaus ist auch TFPI, der für die Herstellung in bakteriellen Zellen geringfügig modifiziert worden ist, von der Definition ebenfalls mit umfasst. Beispielsweise ist ein TFPI-Analog, das einen Alaninrest am aminoterminalen Ende des TFPI-Polypeptids aufweist, in Escherichia coli hergestellt worden, siehe US 5,212,091 .
  • "Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung", wie sie hier verwendet wird, betrifft eine Zusammensetzung, die die biologische Aktivität von formuliertem TFPI nicht negiert oder vermindert und die keine nachteiligen biologischen Wirkungen aufweist, wenn formuliertes TFPI einem Patienten verabreicht wird.
  • Der hier verwendete Begriff "Patient" umfasst menschliche und tierische Patienten.
  • Der hier verwendete Begriff "Solubilisierer" betrifft Salze, Ionen, Kohlenhydrate, Aminosäuren und andere organische Moleküle, die, wenn sie in Lösung vorliegen, die Löslichkeit von TFPI auf über 0,2 mg/ml erhöhen. Solubilisierer können auch die Konzentrationen von TFPI auf über 1 mg/ml und über 10 mg/ml erhöhen. Es ist zu beachten, dass Solubilisierer als Stabilisierungsmittel wirken können. Stabilisierungsmittel bewahren die Einheitsaktivität von TFPI bei der Lagerung und können durch Verhindern von Aggregatbildung, oder Verhindern des Abbaus des TFPI-Moleküls (z. B. durch säurekatalysierte Reaktionen) wirken.
  • Der hier verwendete Begriff "sekundäre Solubilisierer" betrifft organische Salze, Ionen, Kohlenhydrate, Aminosäuren und andere organische Moleküle, die, wenn sie in Lösung mit einem Solubilisierer vorliegen, die Löslichkeit von TFPI weiter erhöhen. Sekundäre Solubilisierer können auch andere Wirkungen aufweisen. Beispielsweise können sekundäre Stabilisatoren beim Einstellen der Tonizität (z. B. Isotonizität) brauchbar sein.
  • Die Aminosäuresequenz von TFPI ist im US Patent Nr. 5,106,833 , auf das hierin Bezug genommen wird, und 4 beschrieben. Muteine von TFPI und TFPI-2 sind in der US Anmeldung Serien-No. 08/286,530, auf die hierin Bezug genommen wird, beschrieben. Wie in der US Serien-No. 08/286,530 beschrieben ist, können Muteine von TFPI und TFPI-2 durch einfachen oder mehrfachen Punktmutationen und chimäre Moleküle von TFPI und TFPI-2 hergestellt werden. Beispielsweise kann der Lysinrest an der P1-Stelle der ersten Kunitz-Typ-Domäne von TFPI durch Arginin ersetzt werden. Muteine, die 1 bis 5 Aminosäuresubstitutionen enthalten, können hergestellt werden durch geeignete Mutagenese der Sequenz des rekombinanten Klonierungsvehikels, das TFPI oder TFPI-2 kodiert. Techniken für die Mutagenese umfassen, ohne Einschränkung, gerichtete Mutagenese. Gerichtete Mutagenese kann unter Verwendung einer Reihe in der Technik bekannter Verfahren durchgeführt werden. Diese Techniken sind von Smith (1985) Annual Review of Genetics, 19:423 beschrieben, und Modifikationen einiger der Techniken sind in METHODS IN ENZYMOLOGY, 154, Teil E, (Hrsg.) Wu und Grossman (1987), Kapitel 17, 18, 19 und 20 beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren bei der Verwendung gerichteter Mutagenese ist eine Modifikation der zielgerichteten Gapped Duplex-Mutagenese. Das allgemeine Verfahren ist von Kramer, et al., in Kapitel 17 der zuvor zitierten Methods in Enzymology beschrieben. Eine andere Technik zum Erzeugen von Punktmutationen in einer Nukleinsäuresequenz ist überlappende PCR. Das Verfahren, bei dem überlappende PCR zum Erzeugen von Punktmutationen verwendet wird, ist von Higuchi in Kapitel 22 der PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, (Hrsg.) Innis, Gelfand, Sninsky und White (Academic Press, 1990) beschrieben.
  • Alternativ konnten Hybridproteine, die die erste Kunitz-Typ-Domäne von TFPI-2 und die zweiten und dritten Kunitz-Typ-Domänen von TFPI enthalten, hergestellt werden. Ein Fachmann für DNA-Klonierung, der im Besitz von DNA kodierendem TFPI und TFPI-2 ist, wird in der Lage sein, geeignete DNA-Moleküle zur Herstellung solcher chimärer Proteine unter Verwendung bekannter Klonierungsverfahren herzustellen. Alternativ können synthetische DNA-Moleküle, die einen Teil oder alles einer jeden Kunitz-Typ-Domäne kodieren, und Peptidsequenzen, die Kunitz-Typ-Domänen verknüpfen, hergestellt werden. Als eine weitere Alternative kann auch die überlappende PCR-Technik zur Herstellung von DNA kodierenden chimären Molekülen, die TFPI- und TFPI-2-Sequenzen enthalten, verwendet werden.
  • TFPI kann in Hefeexpressionssystemen hergestellt werden, wie sie in der US Serien-No. 08/286,530 beschrieben sind, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Es sind auch Verfahren zur Reinigung von TFPI aus Hefezellkulturmedien beschrieben worden, beispielsweise in Petersen et al, J. Biol. Chem. 18: 13344–13351 (1993). In diesen Fällen wird rekombinantes TFPI von den Hefezellen sezerniert. Durch solche Vorgehensweisen gewonnenes TFPI ist auch häufig aufgrund N-terminaler Modifikation, proteolytischem Abbau und variabler Glykosylierung heterogen. Es besteht daher die Notwendigkeit, reifen TFPI zu erzeugen, der authentisch ist (d. h. die korrekte N-terminale Aminosäuresequenz aufweist), volle Länge aufweist und homogen ist.
  • TFPI kann in E. coli hergestellt werden, wie im US Patent Nr. 5,212,091 beschrieben ist, welches ein Verfahren zur Herstellung von TFPI durch Expression einer nicht glycosylierten Form von TFPI in einem E. coli-Wirt beschreibt.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden rekombinant hergestellte Proteine, die in der Lage sind, Polymere sulfatisierter Polysaccharide, wie beispielsweise Heparin oder Dextransulfat, zu binden, rückgefaltet. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Rückfaltung eines denaturierten, rekombinant hergestellten Proteinprodukts erleichtert unter Verwendung von Polymeren sulfatisierter Polysaccharide, die als Matrizen für das Rückfaltungsprotein agieren. Ohne auf eine spezielle Theorie eingeschränkt zu sein, gehen die Erfinder davon aus, dass die Wechselwirkungen zwischen dem rückgefalteten Protein und der polymeren Matrize die Aggregation der Rückfaltungszwischenstufen minimieren kann und für das Protein eine Umgebung bereitstellen kann, in der es sich in seine native Konformation zurückfalten kann. Das als Matrize agierende Polymer kann eine Proteindomäne oder -region binden, um die Zwischenstufe zu stabilisieren und ein weiteres Falten zu ermöglichen, ohne dass eine Aggregation eintritt. Die Proteinaggregate, falls sie gebildet werden, sind im Allgemeinen weniger aktiv als nicht-aggregiertes rückgefaltetes Protein und führen im Allgemeinen zu einer reduzierten Gesamtausbeute an aktivem rückgefaltetem Protein. Die NaCl-Konzentration der Rückfaltungsbedingungen wird als bedeutend angesehen und wird so ausgewählt, dass eine maximale Effizienz der Rückfaltung durch Maximieren der Wechselwirkung zwischen dem Matrizenpolymer und dem Rückfaltungsprotein erreicht wird. Beispielsweise haben die Erfinder herausgefunden, dass eine NaCl-Konzentration von etwa 0,2 M oder kleiner das Binden der C-terminalen und/oder der dritten Kunitz-Domäne von TFPI an Heparin oder andere sulfatisierte Polysaccharidpolymere begünstigt. Es wird angenommen, dass das Binden des Polymers an die Zwischenstufe die Solubilität der Zwischenstufe erleichtert und für den Rest des Proteins eine Umgebung zum Rückfalten bereitstellt, indem eine Aggregation der Rückfaltungszwischenstufe reduziert wird.
  • Allgemeine Verfahren
  • TFPI kann durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, wie in der US 5,212,091 beschrieben ist, deren Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Kurz gesagt wird TFPI in Escherichia coli-Zellen exprimiert und die TFPI enthaltenden Einschlusskörper werden von dem Rest des zellulären Materials isoliert. Die Einschlusskörper werden einer Sulfitolyse unterzogen, unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie gereinigt, mittels Disulfidaustauschreaktion rückgefaltet und das rückgefaltete aktive TFPI mittels Kationenaustauschchromatographie gereinigt. TFPI kann auch in Hefe erzeugt werden, wie in der ebenfalls anhängigen US S. N. 08/286,530 beschrieben ist.
  • Die TFPI-Aktivität kann durch den Prothrombinzeit-Test (PTT-Assays) getestet werden. Die biologische Aktivität von TFPI wurde durch die Prothrombingerinnungszeit gemessen, wobei ein Coag-A-Mate Modell RA4 von Organon Teknika Corporation (Oklahoma City, OK) verwendet wurde. Die TFPI-Proben wurden zuerst auf 9 bis 24 μg/mL mit einem TBSA-Puffer (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mg/mL BSA, pH 7,5) verdünnt. Dann wurden 10 μL Varify 1 (normales Poolplasma von Organon Teknika Corp.) mit 90 μL verdünnten TFPI-Proben in einem Probentablett gemischt und in dem Instrument auf 37°C erwärmt. Schließlich wurde Simplastin Excel (Thromboplastin von Organon Teknika Corp.) zugegeben, um die Gerinnung zu starten. Die Zeitverzögerung bei der Gerinnung aufgrund der antikoagulierenden Aktivität von TFPI wurde gemessen und in die TFPI-Konzentration in den gemessenen Proben durch Vergleich mit einer TFPI-Standardkurve umgerechnet.
  • Die Menge an löslichem TFPI kann auch durch Messen der Fläche des Hauptpeaks auf einem Kationenaustauschchromatogramm quantifiziert werden. Eine HPLC-Analyse von TFPI-Proben wurde unter Verwendung eines Waters 626 LC Systems (Waters Corporation, Milford, MA) durchgeführt, welches mit einem Water 717 plus-Heizer/Kühler-Autosampler ausgestattet war. Die Datenerfassung wurde mittels eines TurbochromTM-Systems von Perkin-Elmer verarbeitet.
  • Für das Kationenaustauschverfahren (IEX) wurde eine Pharmacia Mono S HR 5/5-Glassäule verwendet. Die Säule wurde in einem 80%igen Puffer A (20 mM Natriumacetattrihydrat:Acetonitril-Lösung (70:30 v/v) bei pH 5,4) und 20% Puffer B (20 mM Natriumacetattrihydrat – 1,0 M Ammoniumchlorid:Acetonitril-Lösung (70:30 v/v) bei pH 5,4) äquilibriert. Nach dem Injizieren eine Probe wurde ein Gradient angelegt, um den TFPI bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 mL/Min von 20% Puffer B zu 85% Puffer B in 21 Minuten zu eluieren. Eluierte TFPI-Arten werden durch Absorption bei 214 nm nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass der Hauptpeak (monomeres TFPI) bei etwa 18 Minuten eluiert. Der Verlust an löslichem TFPI wurde quantifiziert, indem die verbleibende Peakfläche des Hauptpeaks integriert wurde.
  • Sämtliche Reagenzien entsprechen der Güte U.S.P. oder A.C.S. Anbieter umfassen J. T. Baker und Sigma Co. (St. Louis, MO).
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben, in denen bestimmte Ausführungsformen dargelegt sind. Diese Ausführungsformen dienen jedoch lediglich der Veranschaulichung und sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • REFERENZBEISPIELE
  • Beispiel 1 – Rückfaltung von denaturiertem TFPI
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung von Vorratslösungen, die HIC-Säulenherstellung, die anfängliche Gewinnung und Reinigung von TFPI vor der Rückfaltung, die Rückfaltung von TFPI und die Gewinnung von aktiven TFPI.
  • Das TFPI-Material wurde aus refraktilen Körpern hergestellt, die aus der Expression von rekombinantem TFPI in Bakterien resultierten. Die refraktilen Körper wurden bei 10 mg/ml in 8 M Harnstoff, 50 mM Tris pH 8,5, das 10 mM DTT enthielt, solubilisiert und diese Lösung wurde durch 10minütiges Zentrifugieren bei 10.000 × g geklärt.
  • Die Säulenherstellung für die Anfangsreinigung des solubilisierten TFPI wurde mit S-Sepharose Beads hergestellt, die in 7,5 M Harnstoff, 10 mM Tris und 10 mM Natriumphosphat (pH 6,5), welches 5 mM DTT und 1 mM EDTA enthielt, gemischt. Der solubilisierte TFPI wurde dann bei einer Konzentration von 5 mg/ml über die S-Sepharosesäule laufen gelassen und mit einem Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M eluiert. Der gereinigte TFPI wies bei einer Wellenlänge von 280 nm ein Absorptionsvermögen von 3,2 auf (was 4,1 mg/ml äquivalent ist, wenn ein Extinktionskoeffizient von 0,78 verwendet wird).
  • Das Dextransulfatmaterial bestand aus Dextransulfat mit einem Molekulargewicht von 8.000 Dalton, erhältlich von Sigma, Artikel Nummer D-4911, hergestellt bei 50 mg/ml (6,25 mM) in 50 mM Tris (pH 8,8) in 0,1 M Natriumchlorid, und wurde zwischen den Verwendungen bei –20°C gelagert.
  • Das Heparinmaterial, falls Heparin zur Durchführung der Rückfaltung verwendet wurde, wies ein Molekulargewicht von 6.000 bis 30.000 Dalton auf (mit einer mittleren Moimasse von 18.000 Dalton), hergestellt als ein Natriumsalz, das von Sigma Co. (St. Louis, MO) erhältlich ist, Artikel Nummer H-3393, hergestellt mit 60 mg/ml (3,33 mM) in 50 mM Tris (pH 8,8) in 0,1 Natriumchlorid und zwischen den Anwendungen bei –20°C gelagert.
  • Zu dem S-Sepharose-gereinigtem TFPI kann Dextransulfat-Ausgangslösung oder Heparin-Ausgangslösung zugegeben werden. Dextran oder Heparin wurden zu TFPI unter Denaturierungsbedingungen in 6 bis 8 M Harnstoff zugegeben. Mit 4°C-Reagenzien wurde die denaturierende Lösung, die TFPI enthielt, verdünnt auf 3 M Harnstoff, 50 mM Tris (pH 8,8), 0,2 M Natriumchlorid und 0,5 mg/ml TFPI, und zu einer Dextransulfatendkonzentration von 0,6 mg/ml (75 μM) oder Heparinendkonzentration von 1,5 mg/ml (83 μM), je nachdem was zum Erleichtern der Rückfaltung verwendet wurde. Cystin wurde zu der Rückfaltungslösung zu einer Endkonzentration zugegeben, die gleich der DTT-Endkonzentration war. Die Rückfaltungslösung wurde bei 4°C mit leichter Bewegung 4 bis 6 Tage lang, vorzugsweise 5 Tage inkubiert.
  • Zur Veranschaulichung dieses Verfahrens folgt ein Teil eines Protokolls zur Rückfaltung von 5 ml Lösung von TFPI in Dextransulfat oder Heparin.
  • Zu 610 μl TFPI Ausgangsmaterial wurden entweder 60 μl Dextransulfat mit 65 μl 50 mM Tris (pH 8,8) in 0,1 M NaCl, oder 125 μl Heparin-Ausgangslösung mit 50 mM Tris (pH 8,8) oder 0,1 M NaCl zugegeben. Die Rückfaltungslösung wurde gemischt und 10 Minuten auf Eis inkubieren gelassen. Als nächstes wurden zu der Rückfaltungslösung 4,2 ml Rückfaltungspuffer zugegeben, der 2,5 M Harnstoff, 50 mM Tris (pH 8,8) und 165 mM Natriumchlorid enthielt, und gemischt. Schließlich wurden 61 μl von 50 mM Cystin hergestellt in 120 mM Natriumhydroxid zugegeben und die gesamte Lösung wurde bei 4°C bei leichter Bewegung 4 Tage lang inkubiert. Der freie Sulfhydrylgehalt wurde mit Ellman's Reagens (auch als DTNB bezeichnet) geprüft. Idoacetamid wurde zugegeben, bis 20 mM, hergestellt als 1 M in 100% Ethanol zur Lagerung bei –20°C.
  • Die hydrophobe Interaktionssäule (HIC) wurde hergestellt aus Butyl-650M Tosohaas Toyopearlharz Partikelgröße 40–90, Part # 014702. Das Butylharz wurde in 3 M Harnstoff, 1 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris, 10 mM Natriumphosphat, pH 6,5 gewaschen und zu einer 50%igen Aufschlämmung resuspendiert.
  • Die Rückfaltungsproben, gelagert bei –20°C, blieben in dem Standardrückfaltungspuffer, der 3 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 8,8, 1–4 mM Redox, 0,5 mg/ml TFPI und 0,2–0,6 M NaCl, je nach Bedingung, enthielt. Proben, die mit Dextran oder Heparin rückgefaltet wurden, wiesen 0,2 M Salz, und Proben ohne Dextran oder Heparin wiesen 0,6 M NaCl auf.
  • Die folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, um die weitere Reinigung des rückgefalteten TFPI zu bewirken. Zu 300 μl rückgefalteter Probe wurde ein gleiches Volumen von 2 M Ammoniumsulfat, 3 M Harnstoff, 50 mM Tris und 10 mM Natriumphosphat (pH 6,5) zugegeben. Als nächstes wurden 100 μl gewaschener Butyl-650M-Beads zu der verdünnten rückgefalteten Probe zugegeben. Die Lösung mit den Beads wurde unter leichtem Schütteln oder Mischen bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Das Gemisch wurde dann in einer Eppendorfzentrifuge 5 Sekunden lang zentrifugiert, auf eine Ablage gestellt und 1 Minute stehen gelassen, damit sich die Beads in dem Röhrchen flach absetzen konnten. Der Überstand wurde vorsichtig abgesaugt, um die Beads nicht durcheinander zu bringen.
  • Um die TFPI-gebundenen Beads zu waschen, wurde zu den Beads 1 ml Waschpuffer, gebildet aus 1 M Ammoniumsulfat, 3 M Harnstoff, 50 mM Tris, 10 mM Natriumphosphat (pH 6,5) zugegeben, um das verbleibende Dextransulfat oder Heparin zu entfernen. Das gewaschene Gemisch wurde in einer Eppendorfzentrifuge 5 Sekunden lang zentrifugiert, und wie zuvor eine Minute lang stehen gelassen, damit sich die Beads absetzen konnten. Der Überstand wurde entfernt und die Beads dann mit dem Waschpuffer ein letztes Mal gewaschen und wie zuvor zentrifugiert und absitzen gelassen. Nach dem letzten Waschen und Absetzen wurde der Überstand mit einer Pasteur-Pipette mit feuergezogener Spitze (flame-pulled-tip Pasteur pipette) sehr sorgfältig entfernt.
  • Um das rückgefaltete TFPI zu eluieren wurden zu der Beads-Aufschlämmung 300 μl Elutionspuffer, gebildet aus 3 M Harnstoff, 0,1 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris und 10 mM Natriumphosphat (pH 6,5) zugegeben und mehr als 10 Minuten lang geschüttelt. Die Beads wurden durch Zentrifugieren in einer Eppendorfzentrifuge pelletiert und der Überstand, der rückgefaltetes TFPI enthielt, wurde gewonnen. Um eine Kontamination der Beads mit dem Produkt zu vermeiden, wurde etwas Überstand zurückgelassen.
  • Beispiel 2 – HIC der Dextransulfatrückfaltung
  • Die TFPI-Probe wurde bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml TFPI, 0,6 mg/ml Dextransulfat, 3,0 M Harnstoff, 200 mM NaCl und 50 mM Tris (pH 5,5) renaturiert. Die HIC-Säule wurde hergestellt aus TosoHaas-Butylbeads für HIC, 4,6 mmD/100 mmL, in einer 1,66 ml Aufschlämmung. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 1,0 ml/Minute eingestellt. Vor dem Beladen der HIC-Säule wurde die Probe 2:3 verdünnt mit 3,0 M Harnstoff und 3,0 M NH4SO4 bei einem End-pH von 5,68; 2 ml der Probe wurden beladen. Der Gradient begann mit 33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM Natriumacetat, 1,0 M NH4SO4, und 3,0 M Harnstoff, pH 6,0; der Gradient endete mit 33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM Natriumacetat, 3,0 M Harnstoff bei pH 6,0. Das Gradientenvolumen betrug 5,0 CV. Bei dieser Säule betrug die Rückgewinnung an nativem TFPI 68%. Die Ergebnisse dieses Versuchslaufs sind in 2 gezeigt.
  • Es wurde auch eine zweite HIC-Säule laufen gelassen. Die Proben von denaturiertem TFPI wurden 2:3 verdünnt mit 3,0 M Harnstoff, 1,5 M NH4SO4 und 2 ml wurden geladen. Der Gradient begann mit 33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM Natriumacetat, 0,5 M NH4SO4 und 3,0 M Harnstoff, pH 6,0; das Gradientenende mit 33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM Natriumacetat, 3,0 M Harnstoff bei pH 6,0. Das Gradientenvolumen betrug 5,0 CV. Die Gewinnung von nativem TFPI aus dieser zweiten Säule betrug 74%. Die Ergebnisse dieses Versuchslaufs sind in 3 angegeben.
  • Die Proben wurden durch nichtreduzierende SDS-PAGE analysiert, wie in 1 dargestellt ist. Auf dem Gel sind korrekt rückgefaltete, aktive TFPI-Spezies (Hauptbande) zu sehen.
  • Beispiel 3
  • Es wurden etwa 10 mg/ml TFPI in 2 M Harnstoff gegen eines der Folgenden dialysiert: 20 mM Acetat, 20 mM Phosphat, 20 mM Citrat, 20 mM Glycin, 20 mM L-Glutamat oder 20 mM Succinat in 150 mM NaCl wie zuvor beschrieben. 6–10 mg/ml TFPI-Ausgangsmaterial (bulk stock) wurde in Spec/Por 7-Dialyseröhrchen (MW cutoff 3.500) geladen. Die Dialyse wurde entweder bei 4°C oder Umgebungstemperatur durchgeführt. Drei Pufferänderungen bei einem Verhältnis von Proteinlösung zu Puffer: 1 zu 50 bis 100 wurden während des Verlaufs der Dialyse über einen Zeitraum von 12 bis 24 Stunden durchgeführt. Nach der Dialyse wurde die TFPI-Lösung mittels 0,22-Micron-Costar-Filtereinheiten abfiltriert, um ausgefallenes TFPI von löslichem TFPI abzutrennen. Die Löslichkeit von TFPI wurde dann mittels UV/Vis-Absorption gemessen, wobei ein Absorptionsvermögen von 0,68 (mg/ml)–1 cm–1 bei 278 nm angenommen wurde. Die Lösungen wurden bei verschiedenen pH-Höhen mittels Titration mit HCl oder NaOH hergestellt.
  • Nach Beendigung der Dialyse wurden die Präzipitate durch 0,22 μm Filtereinheiten abfiltriert. Die Konzentration des verbleibenden löslichen TFPI nach der Dialyse wurde mittels UV-Absorption gemessen. 1 zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. Die Löslichkeit von TFPI nahm in Lösungen, die 20 mM Acetat, 20 mM Phosphat, 20 mM L-Glutamat und 20 mM Succinat bei pH-Werten unter 7 und insbesondere bei oder unterhalb pH 4, 5 enthielten, stark zu. Die Löslichkeit von TFPI wurde auch in Lösungen, die 20 mM Glycin oberhalb eines pH von 10 enthielten, im Wesentlichen erhöht. 2 zeigt die Löslichkeit von TFPI als eine Funktion der Konzentration des Citrations in Gegenwart von 10 mM Na-Phosphat bei pH 7. Die TFPI-Löslichkeit nimmt mit zunehmender Konzentration des Citrats zu. 3 zeigt die Löslichkeit von TFPI als eine Funktion der Konzentration von NaCl bei pH 7,0. Die TFPI-Löslichkeit nimmt mit zunehmender Salzkonzentration zu, was darauf hinweist, dass Salz die Löslichkeit von TFPI fördert.
  • Die Löslichkeit von TFPI wurde untersucht, wobei eine Reihe verschiedener Solubilisierer und sekundärer Solubilisierer verwendet wurden. Tabelle 1 zeigt die Löslichkeit von TFPI in variierenden Pufferlösungen, gemessen mittels UV-Absorption, nach Dialyse von 6–10 mg/ml TFPI in diesen Pufferlösungen. Tabelle 1
    Salzeffekt Löslichkeit
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    10 mM NaPO4, 7 0,21
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl 7 0,72
    20 mM NaPO4, 150 mM NaCl 7 0,85
    20 mM NaPO4, 0,5 M NaCl 7 6,71
    20 mM NaPO4, 1 M NaCl 7 8,24
    pH-Effekt
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 3 10,27
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 3,5 10,25
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 4 7,54
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 4,5 1,75
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 5 1,15
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 5,5 0,85
    20 mM NaPO4, 150 mM NaCl 5,5 0,89
    20 mM NaPO4, 150 mM NaCl 6 0,78
    20 mM NaPO4, 150 mM NaCl 6,5 0,79
    20 mM NaPO4, 150 mM NaCl 7 0,95
    20 mM NaPO4, 150 mM NaCl 7,5 0,82
    20 mM NaPO4, 150 mM NaCl 8 0,86
    20 mM NaCitrat, 150 mM NaCl 4 2,17
    20 mM NaCitrat, 150 mM NaCl 4,5 1,19
    20 mM NaCitrat, 150 mM NaCl 5 1,1
    20 mM NaCitrat, 150 mM NaCl 5,5 1,84
    20 mM NaCitrat, 150 mM NaCl 6 2,09
    20 mM NaCitrat, 150 mM NaCl 6,5 2,12
    20 mM NaCitrat, 150 mM NaCl 7 1,92
    20 mM Glycin, 150 mM NaCl 9 0,32
    20 mM Glycin, 150 mM NaCl 10 0,9
    20 mM Glycin, 150 mM NaCl 11 13,94
    Forts. Tabelle 1
    20 mM L-Glutamat, 150 mM NaCl 4 9,07
    20 mM L-Glutamat, 150 mM NaCl 5 1,21
    20 mM Succinat, 150 mM NaCl 4 8,62
    20 mM Succinat, 150 mM NaCl 5 1,21
    20 mM Succinat, 150 mM NaCl 6 1,07
    Citrat
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    10 mM NaPO4, 10 mM NaCitrat 7 1,16
    10 mM NaPO4, 50 mM NaCitrat 7 5,81
    10 mM NaPO4, 100 mM NaCitrat 7 12,7
    10 mM NaPO4, 200 mM NaCitrat 7 15,9
    10 mM NaPO4, 300 mM NaCitrat 7 8,36
    Mg2+, Ca2+ und Polyphosphat
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 7 0,66
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 7 1,02
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 0,1 mM CaCl2 7 0,67
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2 7 0,71
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 10 mM Triphosphat 7 3,64
    10 mM NaPO4, 5% PEG-400 7 0,07
    10 mM NaPO4, 10 mM EDTA 7 0,36
    10 mM NaPO4, 100 mM Na2SO4 7 5,08
    10 mM NaPO4, 100 mM L-Asparaginsäure 7 0,4
    10 mM NaPO4, 100 mM Bernsteinsäure 7 2,33
    10 mM NaPO4, 100 mM Weinsäure 7 2,56
    20 mM NaPO4, 100 mM Maleinsäure 7 0,11
    20 mM NaPO4, 100 mM Äpfelsäure 7 1,87
    10 mM NaPO4, 100 mM L-Glutaminsäure 7 0
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl 7 0,25
    10 mM NaPO4, 100 mM Isocitrat 7 10,83
    NaOAc, NaPO4 und NaCl
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    10 mM NaOAc, 150 mM NaCl 4,5 1,76
    10 mM NaOAc 4,5 4,89
    10 mM NaOAc 5,5 4,95
    10 mM NaOAc 6,5 5,1
    10 mM NaOAc 7 5,87
    10 mM NaPO4, 150 mM NaCl 4,5 0,14
    10 mM NaPO4 4,5 4,97
    10 mM NaPO4 5,5 0,79
    10 mM NaPO4 6,5 0,091
    10 mM NaPO4 7 0,94
    50 mM NaOAc 5 5,24
    5 mM NaOAc 5,5 4,59
    10 mM NaOAc 5,5 5,05
    20 mM NaOAc 5,5 5,04
    50 mM NaOAc 5,5 5,71
    100 mM NaOAc 5,5 1,4
    200 mM NaOAc 5,5 1,32
    5 mM NaOAc, 5 mM NaCl 5,5 4,85
    5 mM NaOAc, 10 mM NaCl 5,5 5,04
    5 mM NaOAc, 50 mM NaCl 5,5 0,56
    5 mM NaOAc, 100 mM NaCl 5,5 0,43
    5 mM NaOAc, 200 mM NaCl 5,5 0,8
    5 mM NaOAc 4,5 7,27
    10 mM NaOAc 4,5 6,5
    20 mM NaOAc 4,5 8,32
    50 mM NaOAc 4,5 9,17
    5 mM NaOAc 5,5 8,98
    10 mM NaOAc 5,5 8,08
    20 mM NaOAc 5,5 8,99
    Forts. Tabelle 1
    50 mM NaOAc 5,5 2,92
    5 mM NaOAc, 150 mM NaCl 4,5 2,6
    10 mM NaOAc, 150 mM NaCl 4,5 2,59
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 4,5 2,55
    50 mM NaOAc, 150 mM NaCl 4,5 2,1
    5 mM NaOAc, 150 mM NaCl 5,5 0,65
    10 mM NaOAc, 150 mM NaCl 5,5 0,69
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl 5,5 0,71
    50 mM NaOAc, 150 mM NaCl 5,5 0,91
    Hydrophobe Kettenlänge
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    10 mM NaPO4, 50 mM Ameisensäure 7 0,12
    10 mM NaPO4, 50 mM Essigsäure 7 0,16
    10 mM NaPO4, 50 mM Propionsäure 7 0,16
    10 mM NaPO4, 50 mM Buttersäure 7 0,13
    10 mM NaPO4, 50 mM Pentansäure 7 0,14
    10 mM NaPO4, 50 mM Hexansäure 7 0,11
    Andere
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    20 mM NaOAc, 3% Mannit, 2% Saccharose, 5% PEG-400 4 19,9
    20 mM Na Citrat, 3% Mannit, 2% Saccharose, 5% PEG-400 6,5 0,72
    20 mM Na Citrat, 150 mM NaCl, 5% PEG-400 6,5 2,18
    20 mM NaOAc, 150 mM NaCl, 5% PEG-400 4 19,8
    20 mM Na Citrat, 130 mM NaCl, 1% Glycin, 0,25% Tween-80, 5% PEG-400 6,5 1,48
    20 mM Na Citrat, 130 mM NaCl, 1% Glycin, 0,25% Tween-80 6,5 1,32
    Löslichkeit
    Gehalt pH c (mg/ml) uv
    5 mM NaAcetat 5,5 8,9
    5 mM NaAcetat, 8% Saccharose 5,5 11
    5 mM NaAcetat, 0,01% Polysorbat-80 5,5 7
    5 mM NaAcetat, 8% Saccharose, 0,01% Polysorbat-80 5,5 12
    Forts. Tabelle 1
    10 mM NaAcetat 5,5 7,6
    10 mM NaAcetat, 8% Saccharose 5,5 10
    10 mM NaAcetat, 8% Saccharose, 0,01% Polysorbat-80 5,5 12,1
    5 mM NaAcetat, 5% Sorbit 5,5 7,8
    5 mM NaAcetat, 4,5% Mannit 5,5 9,2
    5 mM Histidin 6 5,5
    5 mM Histidin 6,5 1
    5 mM NaCitrat 5,5 0,1
    5 mM NaCitrat 6 0,1
    5 mM NaCitrat 6,5 0,1
    5 mM NaSuccinat 5,5 0,6
    5 mM NaSuccinat 6 0,3
    5 mM NaSuccinat 6,5 0,2
    10 mM Imidazol 6,5 2,5, 10,8
    10 mM Imidazol 7 0,8
    10 mM Imidazol, 8% Saccharose 6,5 12,2
    5 mM NaAcetat 6 8,2
    10 mM Imidazol, 5 mM NaAcetat 6,5 12,8
    10 mM NaCitrat 6 0,2
    100 mM NaCitrat 6 8,1
    100 mM NaCitrat 7 9,3
    10 mM NaPhosphat, 260 mM Na2SO4 6 9,1
    10 mM NaPhosphat, 100 mM NaCitrat 8 8,8
    10 mM NaCitrat, 1% L-Glutaminsäure 6 4,6
    10 mM NaCitrat, 2% L-Lysin 6 1,1
    10 mM NaCitrat, 0,5% L-Asparaginsäure 6 0,4
    10 mM NaCitrat, 0,1% Phosphatglas 7 5,9
    10 mM Tris, 100 mM NaCitrat 8 8,5
    10 mM NaCitrat, 1 M Glycin 6 0,3
    10 mM NaCitrat, 300 mM Glycin 6 0,3
    10 mM NaCitrat, 280 mM Glycerin 6 0,3
    10 mM NaCitrat, 0,5 M (NH4)2SO4 6 8,3
    10 mM NaCitrat, 120 mM (NH4)2SO4 6 8,8
    10 mM NaCitrat, 260 mM Na2SO4 6 9,4
    10 mM NaPO4, 0,1% Phosphatglas 7 15,8
    10 mM NaCitrat, 0,1% SDS 6 11,2
    10 mM NaCitrat, 0,02% SDS 6 7,8
    10 mM NaAcetat, 8% PEG-400 5,5 13,7
    10 mM NaAcetat, 150 mM NaCl, 8% PEG-400 5,5 0,6
    10 mM NaAcetat, 8% PEG-400 6 16,2
    10 mM NaCitrat, 8% PEG-400 6 0,2
  • Beispiel 4
  • Die Stabilität von bei verschiedenen pH-Bedingungen gelagertem TFPI wurde geprüft. TFPI wurde wie zuvor beschrieben mittels Dialyse in 10 mM Na-Phosphat, 150 mM NaCl und 0,005% (Gew./Vol.) Polysorbat-80 hergestellt. Stabilitätsproben, die 150 mg/ml TFPI enthielten, wurden 20 Tage lang bei 40°C inkubiert. Die kinetische Geschwindigkeitskonstante für das verbleibende lösliche TFPI wurde analysiert, indem die Abnahme des Hauptpeaks auf Kationenaustauschchromatogrammen verfolgt wurde. Wie in 5 zu sehen ist, nimmt die Zerfallsgeschwindigkeitkonstante bei einem pH oberhalb 6,0 zu, was auf eine höhere Aggregation bei höheren pH-Bedingungen hinweist.
  • TFPI wurde auch bei einer Konzentration von 150 mg/ml in 150 mM NaCl und 0,005% (Gew./Vol.) Polysorbat-80 bei pH 7 bei variierenden Phosphatkonzentrationen formuliert. 5A zeigt den Prozentsatz an verbleibenden löslichem TFPI, gemessen mittels Kationenaustausch-HPLC. Steigende Konzentrationen von Phosphation in Lösung führten zu höheren Konzentrationen von löslichem TFPI, das nach Inkubation bei 40°C zurückblieb. Höhere Konzentrationen von Phosphation führten auch zu höheren Konzentrationen von aktivem TFPI, wie durch den Prothrombinzeit-Test getestet wurde. Diese Ergebnisse sind in 5B angegeben.
  • Die Stabilität von TFPI bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml und formuliert in 10 mM Na-Citrat, pH 6 und 150 mM NaCl wurde auch bei 40°C über einen Zeitraum von 40 Tagen geprüft. Wie in 6 zu sehen ist, zeigt die Kationenaustausch-HPLC (Dreieck) das Vorliegen von löslichem TFPI bei Konzentrationen von größer als anfänglich 60%, selbst nach den 40 Tagen Inkubation. Auf gleiche Weise zeigt der Prothrombinzeit-Test (Kreise) das Vorliegen von aktivem TFPI bei Spiegeln von größer als ursprünglich 60%, selbst nach der Inkubation von 40 Tagen.
  • 7 zeigt den Verlust an löslichem TFPI bei 40°C, gemessen sowohl als Kationenaustausch-HPLC (offenes Symbol) als auch als Prothrombinzeit-Test (geschlossenes Symbol) für 0,5 mg/ml TFPI formuliert in 10 mM Na-Phosphat, pH 6 und entweder 150 mM NaCl (Dreieck) oder 500 mM NaCl (Kreis).
  • 8 zeigt den Verlust an löslichem TFPI bei 40°C, gemessen sowohl mittels Kationenaustausch-HPLC (offenes Symbol), als auch Prothrombinzeit-Test (geschlossenes Symbol) für 0,5 mg/ml TFPI, formuliert in 10 mM Na-Acetat und pH 5,5, welches 150 mM NaCl (Dreieck) oder 8% (Gew./Vol.) Saccharose (Quadrat) oder 4,5% (Gew./Vol.) Mannit (Kreis) enthielt.
  • 9 zeigt zwei nicht-reduzierende SDS-Gele für TFPI-Formulierungsproben in 10 mM NaPO4, 150 mM NaCl und 0,005% Polysorbat-80 bei pH 4 bis pH 9, die 0 Tage (untere) und 20 Tage (obere) bei 40°C gelagert wurden. Bei 0 Tagen ist kein Verlust an TFPI zu sehen. Bei 20 Tagen sind jedoch bei dem niederen pH-Bereich (d. h. pH 4 und pH 5) Abspaltungsfragmente von TFPI zu sehen. Ohne an eine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass diese Fragmente von einer säurekatalysierten Reaktion herrühren können.
  • Tabelle 2 schließlich zeigt die Halbwertszeit von verbleibendem löslichen TFPI bei 40°C für verschiedene Formulierungen. 0,5 mg/ml TFPI wurde in diesen Formulierungsbedingungen formuliert und bei 40°C inkubiert. Bei vorher bestimmten Zeitintervallen wurden Proben entnommen und der Verlust an löslichem und aktivem TFPI wurde mittels IEX-HPLC und dem PT-Assay geprüft. Die Halbwertszeit für verbleibendes lösliches TFPI wurde dann berechnet, indem eine einfache exponentielle Anpassung an die Ergebnisse von IEX-HPLC und die PT-Assay-Ergebnisse durchgeführt wurde.
  • Beispiel 5
  • Elution von TFPI im Verdrängungsmodus aus Chromatographieharzen unter Verwendung polyionischer Verbindungen.
  • TFPI wird zuerst in einem niedrigen Salzpuffer an ein Harz gebunden. Als nächstes wird ein Puffer, der die zum Eluieren von TFPI im Verdrängungsmodus verwendete polyionische Bindung enthält, durch die Säule gepumpt. Diese Verbindung bindet stärker an das Harz als TFPI und verdrängt TFPI. Für ein positiv geladenes Harz (Anionenaustauscher) wird eine negativ geladene Verbindung verwendet und für ein negativ geladenes Harz (Kationenaustauscher) wird eine positiv geladene Verbindung verwendet.
  • Es wurde partiell gereinigtes TFPI als Ausgangsmaterial verwendet. TFPI, in 6 M Harnstoff, 20 mM Tris, pH 8,0, wurde auf eine mit einem Anionenaustauscherharz gepackte Säule geladen, Q-Sepharose HP, und zwar 20 mg/ml Harz. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 6 M Harnstoff, 20 mM Tris, pH 9,0, gewaschen. TFPI wurde eluiert und 10 mg/ml Glass H (Polyphosphat) in 6 M Harnstoff, 10 mM Tris, pH 9,0.
  • Beispiel 6
  • Elution von TFPI aus Chromatographieharz in wässrigem Puffer unter Verwendung von polyionischen Verbindungen.
  • Tabelle 2
    t1/2 (Tage) bei 40°C
    0,5 mg/ml TFPI formuliert in: IEX-HPLC PT-Assay
    10 mM Na-Acetat, 150 mM NaCl, pH 5,5 10,8 17,2
    10 mM Na-Citrat, 150 mM NaCl, pH 5,5 12,2 24,4
    10 mM Na-Acetat, 8% (Gew./Vol.) Saccharose, pH 5,5 43,2 42,2
    10 mM Na-Acetat, 4,5% Mannit, pH 5,5 47,7 46,6
    10 mM Na-Succinat, 150 mM NaCl, pH 6,0 7,8 11,0
    10 mM Na-Citrat, 150 mM NaCl, pH 6,0 13,0 18,8
    10 mM Na-Phosphat, 150 mM NaCl, pH 6,0 7,8 11,2
    10 mM Na-Phosphat, 500 mM NaCl, pH 6,0 52,2 68,9
    10 mM Na-Citrat, 150 mM NaCl, pH 6,5 10,0 14,8
  • Für ein positiv geladenes Harz wird eine positiv geladene Verbindung verwendet und für ein negativ geladenes Harz wird eine negativ geladene Verbindung verwendet.
  • TFPI in 3,5 M Harnstoff, 1 mg/ml Polyphosphat, 50 mM Tris, pH 5,9 wurden auf ein Kationenaustauscherharz, SP-Sepharose HP, geladen. Nach dem Beladen wurde die Säule mit einem nicht-harnstoffhaltigen Puffer gewaschen, 10 mg/ml Polyphosphat, 10 mM Natriumphosphat, pH 5,0. TFPI wurde in dem selben Puffer bei pH 7,5 ohne Harnstoff eluiert.
  • Beispiel 7
  • Selektive Elution von TFPI aus Ionenaustauscherharzen unter Verwendung polyionischer Verbindungen.
  • Aufgrund der geladenen Enden von TFPI können entgegengesetzt geladene polyionische Verbindungen an diese Enden binden. Wenn die polyionische Verbindung eine größere Bindungsstärke an TFPI aufweist als das Harz, kann das TFPI von dem Chromatographieharz selektiv eluiert werden.
  • TFPI, in 3,5 M Harnstoff, 1 mg/ml Polyphosphat, 50 mM Tris, pH 5,9, wurde auf ein Kationenaustauscherharz, SP-Sepharose HP, geladen. Nach dem Laden wurde die Säule mit 6 M Harnstoff, 1 mg/ml Polyphosphat, 10 mM Natriumphosphat, pH 5,9, gewaschen. TFPI wurde in einem 25 Säulenvolumengradienten bis zu 20 mg/ml Polyphosphat eluiert. TFPI beginnt bei etwa 2 bis 3 mg/ml Polyphosphat zu eluieren.
  • Beispiel 8
  • Neutralisation polyionischer Verbindungen vor der chromatographischen Abtrennung von TFPI.
  • TFPI kann mit geladenen Polymeren wechselwirken. Diese Wechselwirkung kann ein Binden und Reinigen an Chromatographieharzen verhindern. Durch Neutralisieren des geladenen Polymers mit einem entgegengesetzt geladenen Polymer kann TFPI an das Harz binden.
  • In einem Polyphosphat (Glass H) enthaltenden Puffer bindet TFPI nicht an Express Ion S (Whatman) und es wird keine Reinigung erzielt. Durch Mischen von PEI in die Säulenbeladung, bindet TFPI nun an das Harz und das TFPI kann gereinigt werden.
  • Beispiel 9
  • Rückfaltung und Reinigung von rekombinantem menschlichem TFPI (rhTFPI) unter Verwendung des durch Polyphosphat (Glass H) unterstützten Rückfaltungsprozesses.
  • Einschlusskörper, die etwa 40 Gramm rhTFPI enthielten, wurden aufgetaut, indem die Behälter aus dem –20°C kalten Gefrierschrank entnommen wurden und sie in einem Kühlraum bei 4 bis 10°C für etwa 196 Stunden inkubiert wurden. Die aufgetauten Einschlusskörper wurden dann mit einem Mischer mit hoher Scherkraft dispergiert, um das Klumpen, das während des Gefrierens eintritt, zu vermindern. Die aufgetauten Einschlusskörper wurden zu 80 Liter eines Puffers mit 3 M Harnstoff, 50 mM Tris-Cl, pH 10,5 zugegeben, der 2 g/l Glass H enthielt, welche in einem 100-Liter-Polyethylentank, der mit einem Rührwerk ausgestattet war, enthalten waren. Der Inhalt wurde etwa 15 Minuten lang gemischt und dann wurde das Absorptionsvermögen der Lösung bei 280 nm gemessen. Wenn die Absorption größer ist, dann wurde das Gemisch mit ausreichend Auflösungspuffer verdünnt, um eine Absorption bei 280 nm von 1,0 bis 1,1 zu erhalten. Die Lösung wurde unter leichter Bewegung 15 bis 30 Minuten lang inkubiert und dann wurde ausreichend Cystein zugegeben, um eine Cysteinkonzentration von 0,1 mM zu erhalten. Das feste L-Cystein wurde in etwa 50 ml gereinigtem Wasser aufgelöst und zu dem Rückfaltungsgemisch zugegeben. Der pH wurde geprüft und falls notwendig auf pH 10,2 eingestellt. Das Rückfaltungsgemisch wurde unter leichtem Bewegen 96–120 Stunden lang inkubiert.
  • Nach etwa 96 Stunden wurde der Rückfaltungsprozess durch Einstellen des pH des rückgefalteten Gemischs auf pH 5,9 unter Verwendung von Eisessig beendet. Es wurde weitere 90 Minuten lang gerührt und der pH überprüft. Falls notwendig, wurde mehr Säure zugegeben, um den pH auf 5,9 +/– 0,1 einzustellen. Es wurde ein zweistufiges Filtrationsverfahren eingesetzt, um die Teilchen zu entfernen, die sich während der vorhergehenden Schritte gebildet hatten und um das angesäuerte Rückfaltungsgemisch für die SP-Sepharose-HP-Chromatographie vorzubereiten. Zunächst wird das angesäuerte Rückfaltungsgemisch durch einen A Cuno 60LP-Tiefenfilter (Filtergehäuse Modell 8ZP1P) unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe (1/4 – 3/8 Inch Innendurchmesser des Silikonschlauchs) geleitet.
  • Das Filtersystem wurde vor der Verwendung mit 8 bis 10 Liter entionisiertem 6 M Harnstoff gewaschen. Das Filtrat wurde in einem 100-Liter-Polyethylentank gesammelt. Der Gegendruck wurde bei konstanten 20 PSI gehalten. Die Anfangsfließgeschwindigkeit für einen neuen Filter betrug etwa 5 bis 6 Liter pro Minute. Die Filter wurden ersetzt, wenn die Fließgeschwindigkeit unterhalb 1 Liter pro Minute fiel, um den Gegendruck bei 20 PSI aufrecht zu erhalten. Für die zweite Stufe der Filtration wurde eine 0,45 Micron Filterpatrone (Sartorius Sartobran pH oder ein Äquivalent) mit einem peristaltischen Pumpensystem verwendet. Nach der Filtration wurde der pH geprüft und falls notwendig auf pH 5,9 eingestellt.
  • Die angesäuerte abfiltrierte Rückfaltung wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 80,0 ml/min auf die äquilibrierte SP-Sepharose-HP-Säule geladen. Die Fließgeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass sie für ein Beladen des angesäuerten abfiltrierten Rückfaltungsgemisches über Nacht passte. Die Säule wurde vor dem Beladen in 6 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 5,9 äquilibriert. Nach dem Beladen wurde die Säule vor dem Schritt der Gradienteneluierung mit 2 CF 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,9 gewaschen. Die Säulenfließgeschwindigkeit wurde für den Waschschritt und sämtliche nachfolgende Schritte auf 190 bis 200 ml/min erhöht (lineare Geschwindigkeit = ~47 cm/Std.). Das Produkt wurde unter Verwendung eines linearen Salzgradienten von 0,3 bis 0,5 M NaCl in 6 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,9, von der Säule eluiert. Die Gradientenbildung erfolgte durch Verwendung von 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 20 mM Natriumphosphatpuffer und 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Natriumphosphatpuffer. Der Grenzpuffer wurde mit einer Masterflexpumpe (Modell 7553-20) mit einem Masterflexkopf (Modell 7015.21) bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 ml/min unter starkem Mischen gepumpt, wobei ein Paratrol A Mischer von Parametrics (Modell 250210) verwendet wurde. Das Gesamtvolumen des Gradienten betrug 71,0 Liter oder 13.0 CV. Der pH des Gradientenpuffers betrug 5,92 (+/–0,02). Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE qualitativ bestimmt und auf der Basis des Gehalts des korrekt gefalteten SC-59735 relativ zu anderen Missfaltungen und Verunreinigungen gepoolt. Nach dem Poolen wird der Prozessstrom als S-Pool bezeichnet.
  • Der pH des S-Pools wurde als Nächstes mit 2,5 N NaOH auf pH 8,0 eingestellt. Der S-Pool wurde zwei- bis dreifach auf etwa zwei Liter aufkonzentriert, wobei eine Amicon-DC-10L-Ultrafiltrationseinheit, die eine Amicon-YM10-Spiralpatrone (10.000-M.W.-cut-off-Membran) enthielt, verwendet wurde. Nach dem Aufkonzentrieren wurde der konzentrierte S-Pool gegen 7 Volumen 6 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl Puffer, pH 8,0, diafiltriert. Die Diafiltration wurde als beendet angesehen, wenn die Leitfähigkeit des Retentats unterhalb 2 mS lag. Das diafiltrierte Konzentrat wurde von der Ultrafiltrationseinheit abgelassen und die Einheit wurde mit etwa einem Liter Diafiltrationspuffer gewaschen. Das Waschwasser wurde mit dem Konzentrat unter Bildung der Q-Beladung vereinigt.
  • Eine Amiconsäule (Durchmesser 7,0 cm) wurde mit etwa 700 ml Q-Sepharose-Hochleistungsmedium (Pharmacia Q-Sepharose HP) gepackt. Die Säule wurde bei 20 psi mit 20% Ethanol gepackt. Die Betthöhe nach dem Packen betrug etwa 18 cm. Die Säule wurde mit 5 CF 6 M Harnstoff, 0,02 M Tris/HCl-Puffer, pH 8 äquilibriert. Das Ziel für die Proteinbeladung ist 8–10 mg Protein/ml Q-Sepharose-Harz. Die Q-Beladung wurde auf die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 bis 35 ml/Minute (50 cm/Stunde) aufgebracht. Nach dem Beladen wurde die Säule mit etwa 5 CV 6 M Harnstoff, 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0, gewaschen oder bis die Absorption bei 280 nm zur Grundlinie zurückkehrte. Das Produkt wurde unter Verwendung eines Natriumchloridgradienten von 0 bis 0,15 M NaCl in 6 M Harnstoff, 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0 über 25 Säulenvolumen eluiert. Die ersten sieben Säulenvolumen wurden als eine einzelne Fraktion gesammelt, gefolgt von 30 Fraktionen von jeweils 0,25 Säulenvolumen.
  • Die Fraktionen werden routinemäßig mittels reduzierender und nicht-reduzierender SDS-PAGE und Größenausschlusschromatographie analysiert. Die Fraktionen werden basierend auf Aggregatgehalt (kleiner 5% mittels SEC-HPLC-Verfahren MSL 13929) und qualitativer Evaluierung mittels SDS-PAGE zur Bewertung der Reinheit gepoolt. Die Fraktionen werden bei –20°C gefroren gelagert, bis sie gepoolt werden.
  • Akzeptable Q-Sepharose-Fraktionen wurden gepoolt, und der pH des Pools wurde mittels 2 M HCl auf 7,2 eingestellt. Der Pool wurde dann etwa 5fach in einem Amicon-DC-1-Ultrafiltrationssystem, das eine S1Y1-Amicon-YM-10 Patrone (10.000 MWCO Spiralpatronenmembran) enthielt, aufkonzentriert. Der konzentrierte Q-Pool wurde dann gegen 7 Säulenvolumen 2 M Harnstoff, 0,15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, diafiltriert. An die Ultrafiltration anschließend wurde die Lösung von dem Ultrafiltrationssystem abgelassen. Es wurden etwa 100 ml 2 M Harnstoff, 0,15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2 etwa fünf Minuten lang durch das Ultrafiltrationssystem zirkulieren gelassen. Die Spüllösung wurde mit dem Originalkonzentrat vereinigt und die Lösung wurde durch einen 0,45 Micron Vakuumfiltereinheit (Nalgene) filtriert.
  • Beispiel 10
  • Rückfaltung und Reinigung von rhTFPI unter Verwendung des Polyethylenimin (PEI)-unterstützten Rückfaltungsprozesses.
  • Einschlusskörper, die etwa 40 g rhTFPI enthielten, wurden aufgetaut, indem die Behälter aus dem –20°C Gefrierschrank entfernt wurden und in einem Kühlraum bei 4 bis 10°C etwa 96 Stunden lang inkubiert wurden. Die aufgetauten Einschlusskörper wurden dann mit einem Mischer mit hoher Scherkraft dispergiert, um das Klumpen, das während des Gefrierens eintritt, zu vermindern. Die Einschlusskörperaufschlämmung wurde etwa eine Minute lang unter Verwendung eines Polytronhomogenisators (Brinkman Modell PT45/80) kräftig gemischt oder bis die Einschlusskörper dann zu 40 Liter 6 M Harnstoff 100 mM Tris/HCl Puffer pH 9,8, die 300 mM NaCl und 0,4 g/l PEI enthielten, die in einem 100-Liter-Polyethylentank enthalten waren, der mit einem Rührwerk ausgestattet war, zugegeben wurden. Das Gemisch wurde 20 bis 30 Minuten lang kräftig gerührt. Der pH wurde überwacht und falls notwendig auf pH 9,8 eingestellt. Die Absorption des aufgelösten Einschlusskörpergemischs wurde bei 280 nm gemessen, und wenn die Absorption größer als 2,1 war, wurde die Probe mit 10 Liter des zuvor beschriebenen Auflösungspuffers verdünnt, um einen A280-Wert von 2,0 bis 2,1 zu erhalten. Leichte Bewegung wurde für weitere 15 bis 30 Minuten fortgesetzt. Dann wurde die aufgelöste Einschlusskörperlösung mit einem gleichen Volumen einer Lösung von 0,1 M Harnstoff, 300 mM NaCl verdünnt. Schließlich wurde L-Cystein zugegeben, wobei eine Endkonzentration von 0,25 mM erhalten wurde. Das feste L-Cystein wurde in 50 ml WFI aufgelöst und als eine Lösung zu der verdünnten Rückfaltung zugegeben. Der pH wurde geprüft und falls notwendig eingestellt. Die Rückfaltung wurde unter leichtem Rühren 96 bis 120 Stunden lang fortgesetzt, wobei der pH periodisch geprüft wurde und falls notwendig auf einen pH von 9,8 eingestellt wurde. Das Fortschreiten der Rückfaltung wurde mittels Mon-S-Kationenaustausch und Prothrombinzeit-Tests überwacht.
  • Nach etwa 96 Stunden wurde der Rückfaltungsprozess beendet, indem der pH der Rückfaltung unter Verwendung von Eisessig auf pH 5,9 eingestellt wurde. Es wurde weitere 90 Minuten lang gerührt und der pH geprüft. Falls notwendig wurde zum Einstellen des pH auf 5,9 +/– 0,1 mehr Säure zugegeben.
  • Ein zweistufiger Filtrationsprozess wurde verwendet, um die Teilchen, die sich während der vorhergehenden Schritte gebildet hatten, zu entfernen und die angesäuerte Rückfaltung für den SP-Sepharose-HP-Chromatographen vorzubereiten. Zunächst wird die angesäuerte Rückfaltung durch einen Cuno-60LP-Tiefenfilter (Filtergehäuse Modell 8ZP1P) durchgeleitet, wobei eine peristaltische Pumpe (1/4 bis 3/8 Inch Innendurchmesser des Silikonschlauchs).
  • Das Filtersystem wurde mit 8 bis 10 Litern entionisiertem 6 M Harnstoff gewaschen, bevor es verwendet wurde. Das Filtrat wurde in einem 100-Liter-Polyethylentank gesammelt. Der Gegendruck wurde bei konstanten 20 PSI gehalten. Die anfängliche Fließgeschwindigkeit für einen neuen Filter betrug etwa 5 bis 6 l/min. Die Filter wurden ersetzt, wenn die Fließgeschwindigkeit unter 1 l/min fiel, um den Gegendruck bei 20 PSI aufrecht zu erhalten. Bei der zweiten Stufe der Filtration wurde eine 0,45-Micron-Filterpatrone (Sartorius Sartobran pH oder ein Äquivalent) mit einem peristaltischen Pumpensystem verwendet. Nach der Filtration wurde der pH geprüft und falls notwendig auf pH 5,9 eingestellt.
  • Die angesäuerte gefilterte Rückfaltung wurde auf die äquilibrierte SP-Sepharose-HP-Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 80,0 ml/min aufgetragen. Die Fließgeschwindigkeit wurde so eingestellt, dass sie einer Beladung der angesäuerten gefilterten Rückfaltung über Nacht angepasst war. Diese Säule wurde dann mit 5,5 Säulenvolumen 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat Puffer, pH 5,9, gewaschen. Die Säulenfließgeschwindigkeit wurde für den Waschschritt und sämtliche nachfolgende Schritte auf 190 bis 200 ml/min erhöht (lineare Geschwindigkeit = ~47 cm/Std.). Das Produkt wurde von der Säule mittels eines linearen Salzgradienten von 0,3 bis 0,5 M NaCl in 6 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 5,9, eluiert. Die Gradientenbildung erfolgte durch Verwendung von 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer und 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer zu 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer. Der Grenzpuffer wurde mit einer Masterflexpumpe (Modell 7553-20) mit einem Masterflexkopf (Modell 7015.21) bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 ml/min unter kräftigem Mischen mit einem Paratrol-A-Mischer von Parametrics (Modell 250210) gepumpt. Das Gesamtvolumen des Gradienten betrug 71,0 Liter oder 13,0 CV. Der pH des Gradientenpuffers betrug 5,92 (+/–0,02).
  • Das Sammeln der Fraktionen wurde begonnen, wenn die Säuleneinlassleitfähigkeit, die mit dem Radiometer-inline-Leitfähigkeitsmesser gemessen wurde, 28,0 bis 28,5 mS/cm erreichte. Es wurden vierzig 500 ml Fraktionen (0,1 CV) gesammelt. Es wurde ein Pharmacia-Frac-300-Fraktionssammler mit nummerierten 500 ml-Polypropylenflaschen verwendet. Wenn das Sammeln der Fraktionen beendet wurde, wurde der Rest des Gradienten als ein Pool gesammelt.
  • Die Säulenfraktionen wurden mittels A280, Größenausschluss HPLC und darüber hinaus für Informationszwecke, SDS-PAGE, Reversphase-HPLC und PT-Assays getestet. Die Fraktionen wurden gepoolt, wenn sie die Poolingkriterien erfüllten, nämlich 20% oder weniger Aggregat enthielten, wie in dem SEC-HPLC-Verfahren bestimmt wurde. Gepoolte SP-Sepharose-Fraktionen werden als S-Pool bezeichnet.
  • Der pH des S-Pools wurde als nächstes mit 2,5 N NaOH auf pH 8,0 eingestellt. Der S-Pool wurde zwei- bis dreifach auf etwa 2 Liter aufkonzentriert, wobei eine Amicon-DC-10L-Ultrafiltrationseinheit verwendet wurde, die eine Amicon-YM10-Spiralpatrone (10.000-M.W.-cut-off-Membran) enthielt. Nach dem Aufkonzentrieren wurde der konzentrierte S-Pool gegen 7 Volumen 6 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, diafiltriert. Die Diafiltration wurde als beendet angesehen, wenn die Leitfähigkeit des Retentats unterhalb 2 mS lag. Das diafiltrierte Konzentrat wurde von der Ultrafiltrationseinheit abgelassen und die Einheit wurde mit etwa 1 L Diafiltrationspuffer gewaschen. Die Waschlösung wurde mit dem Konzentrat unter Bildung der Q-Beladung vereinigt.
  • Eine Amiconsäule (7,00 cm Durchmesser) wurde mit etwa 700 ml Q-Sepharose-Hochleistungsmedium (Pharmacia Q-Sepharose HP) gepackt. Die Säule wurde bei 20 PSI in 20% Ethanol gepackt. Die Betthöhe nach dem Packen betrug etwa 18 cm. Die Säule wurde mit 5 CV 6 M Harnstoff, 0,02 M Tris/HCl Puffer, pH 8 äquilibriert. Das Ziel für die Proteinbeladung ist 8 bis 10 mg Protein/ml Q-Sepharose-Harz. Die Q-Beladung wurde auf die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 bis 35 ml/min (50 cm/Std.) aufgebracht. Nach dem Beladen wurde die Säule mit etwa 5 CV 6 M Harnstoff, 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0 oder bis die Absorption bei 280 nm zur Grundlinie zurückkehrte, gewaschen. Das Produkt wurde unter Verwendung eines Natriumchloridgradienten von 0 bis 0,15 M NaCl in 6 M Harnstoff, 20 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0 über 25 Säulenvolumen eluiert. Die ersten 7 Säulenvolumen wurden als eine einzelne Fraktion gesammelt, gefolgt von 30 Fraktionen mit jeweils 0,25 Säulenvolumen.
  • Die Fraktionen wurden mittels reduzierender und nicht-reduzierender SDS-PAGE und Größenausschlusschromatographie routinemäßig analysiert. Die Fraktionen werden auf der Basis des Aggregatgehalts (5% bei SEC HPLC) und qualitativer Evaluierung mit SDS-PAGE zum Beurteilen der Reinheit gepoolt. Die Fraktionen werden bei –20°C gefroren gelagert, bis sie gepoolt werden.
  • Die zu poolenden Q-Sepharose-Fraktionen wurden durch Inkubation bei 2 bis 8°C aufgetaut, gepoolt und der pH des Pools wurde mittels 2 MHCI auf 7,2 eingestellt. Der Pool wurde dann etwa 5fach in einem Amicon-DC-1-Ultrafiltrationssystem, das eine S1Y1-Amicon-YM-10-Patrone (10.000 MWCO Spiralpatronenmembran) enthielt, aufkonzentriert. Der konzentrierte Q-Pool wurde dann gegen 7 Säulenvolumen 2 M Harnstoff, 0,15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, diafiltriert. Auf die Ultrafiltration folgend wurde die Lösung aus dem Ultrafiltrationssystem abgelassen. Etwa 100 ml 2 M Harnstoff, 0,15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, wurden etwa 5 Minuten lang durch das Ultrafiltrationssystem laufen gelassen. Die Spüllösung wurde mit dem ursprünglichen Konzentrat vereinigt und durch eine 0,45-Micron-Vakuumfiltereinheit (Nalgene) abfiltriert.
  • Beispiel 11
  • Solubilisieren, Rückfalten und Reinigen von rhTFPI-Einschlusskörpern unter Verwendung von Polyphosphat in Abwesenheit von Chaotropen wie Harnstoff (GDS 5327089,92)
  • Etwa 2 g rhTFPI (43 ml Einschlusskörperaufschlämmung, die 46 mg/ml rhTFPI enthält) wurden mit Mischen in 4 l 50 mM Tris-Puffer, pH 10,5, der 4 g/l Polyphosphat (Glass H, FMC Corporation) bei 2 bis 8°C enthielt, aufgelöst. Es wurde ausreichend Cystein und Cystin zugegeben, um Lösungen von 0,1 mM bzw. 0,05 mM herzustellen. Der pH wurde mit 1 N NaOH bei pH 10,5 gehalten. Die Rückfaltungslösung wurde bei 2 bis 8°C unter leichtem Mischen 72 bis 96 Stunden inkubiert.
  • Die Rückfaltung wurde als nächstes mittels Eisessig auf pH 6 eingestellt und dann durch einen 0,2-Micron-Filter abfiltriert. Ein Aliquot der abfiltrierten Rückfaltung wurde auf eine 200-ml-Säule von SP Sepharose HP (Pharmacia) aufgebracht, die zuvor in einem Puffer mit 0,4% Glass H, 20 mM Natriumphosphat, pH 6 äquilibriert worden war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 4 Säulenvolumen eines Puffers mit 0,4% Glass H, 20 mM Natriumphosphat pH 6 gewaschen. Die Säule wurde unter Verwendung eines linearen pH-Gradienten von 0,4% Glass H, 20 mM Natriumphosphat-Puffer pH 6 und 0,4% Glass H, 50 mM Tris-pH 8-Puffer eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert. Relativ reines rhTFPI konnte rückgefaltet und auf diese Weise gereinigt werden.
  • Beispiel 12
  • Verbesserte Löslichkeit von rhTFPI in Wasser durch Bildung eines Komplexes zwischen TFPI und Polyphosphat (GDS 5327046-47)
  • Etwa 10 g gereinigtes rhTFPI in etwa einem Liter Puffer mit 2 M Harnstoff, 125 mM Natriumchlorid, 20 mM Natriumphosphat pH 7,4 wurden durch Inkubieren bei 2 bis 8°C 18 bis 36 Stunden lang aufgetaut. Es wurde ausreichend trockener Harnstoff zugegeben, um eine 6 M Harnstofflösung herzustellen. Die Lösung wurde dann durch einen 0,2-Micronfilter filtriert. 5 g Polyphosphat (Glass H, FMC) wurden in 50 ml 6 M Harnstoff aufgelöst, mit 1 N NaOH auf pH 7 eingestellt und zu der Proteinlösung zugegeben. Die Lösung wurde dann mittels Ultrafiltration aufkonzentriert, wobei 1 Quadratfuß Membran (Amicon S1Y3) für etwa 400 ml (~25 mg/ml) verwendet wurde und gegen 10 Volumen (etwa 4 Liter) gereinigtes Wasser diafiltriert, um restlichen Harnstoff zu entfernen. Nach der Diafiltration wurde die Lösung auf etwa 250 ml aufkonzentriert und von der Ultrafiltrationseinheit entfernt. Die Ultrafiltrationseinheit wurde mit etwa 150 ml gereinigtem Wasser gewaschen und das Waschwasser zu dem Proteinkonzentrat zugegeben. Das fertige Proteinkonzentrat enthielt etwa 10 g Protein in 400 ml Wasser (etwa 24 mg/ml Protein). Die normale Löslichkeit von rhTFPI in Wasser beträgt weniger als 0,5 mg/ml.
  • Beispiel 13
  • Verwendung von kationischen Polymeren zur Entfernung von E. coli-Verunreinigungen aus TFPI-Zelllysaten und refraktilen Körpern.
  • Die Verwendung von kationischen Polymeren zum Ausfällen und Entfernen von E. coli-Verunreinigungen aus rohen TFPI-Zwischenstufen (Lysaten, refraktilen Körpern) kann nachfolgende Arbeitsgänge (Rückfaltung, Chromatographie u. s. w.) beträchtlich verbessern. Durch Random Screening von kationischen Polymeren wurden Kandidaten identifiziert, die bakterielle Verunreinigungen selektiv ausfällen, während TFPI in der Lösung bleibt. Insbesondere Betzpolymer 624 fällte wesentliche Mengen an bakteriellen Verunreinigungen aus, während es TFPI in Lösung in einer wässrigen Umgebung ließ.
  • Solubilisierte refraktile TFPI-Körper (in 3,5 M Guanidinhydrochlorid, 2 M Natriumchlorid, 50 mM TRIS, 50 mM Dithiothreit, pH 7,1) waren das Ausgangsmaterial, das für ein Polymerscreeningexperiment verwendet wurde. Dieses Material wurde in einer 0,5%igen Lösung verschiedener Polymere auf das 10fache verdünnt. Die Präzipitate aus diesem Experiment wurden mittels SDS-PAGE auf das Vorliegen von TFPI analysiert. Betz-Polymer 624 präzipitierte wesentliche Mengen an Verunreinigungen, kein TFPI, und führte zu einer klaren wässrigen Lösung.
  • Beispiel 14
  • Die Verwendung der wässrigen Zweiphasenextraktion mit einem Poyethylenglykol (PEG), Polyphosphat, Harnstoffsystem, bietet Verarbeitungsvorteile für die Reinigung von TFPI. Typische wässrige Zweiphasensysteme bestehen aus zwei Polymersystemen (z. B. PEG und Dextran) oder einem Polymer und Salz (z. B. PEG und Sulfat). Das hier beschriebene System weist dadurch Vorteile auf, dass die Polyphosphatkettenlänge für die Abtrennung optimiert werden kann, dass es preisgünstig ist und beim Entfernen problematischer Verunreinigungen aus refraktilen TFPI-Körpern, von denen bekannt ist, dass sie bei der Rückfaltung und Chromatographie stören (natives Polyphosphat und assoziierte zweiwertige Metalle), spezifisch ist.
  • Refraktile TFPI-Körper wurden in 7 M Harnstoff, 10 mM CAPS, 1% Monothioglycerin pH 10 solubilisiert. Polyphosphat und PEG unterschiedlicher Kettenlängen wurden zugegeben, um zwei Phasen zu bilden. Nach der Phasenbildung verteilte sich das TFPI in die PEG reiche obere Phase, und ließ die Polyphosphate und assoziierten Verunreinigungen in der unteren Phase. Die Auftrennung wird sowohl durch die PEG- als auch die Polyphosphat-Kettenlänge bewirkt und kann durch eine Variation beider optimiert werden.
  • Beispiel 15
  • Durch geladenes Polymer unterstützte Rückfaltung von rekombinantem Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) aus E. coli-Einschlusskörpern
  • 5 Gramm (Feuchtgewicht) Einschlusskörper, die etwa 2 Gramm rekombinanten Gewebeplasminogenaktivator enthielten, wurden zu etwa einem Liter 0,5% Glass H, 50 mM Tris-Puffer pH 10,8, der 1 mM reduziertes Glutathion (GSH) und 0,2 mM Glutathiondisulfid (GSSG) enthielt, zugegeben. Das Gemisch wird sorgfältig vermischt, wobei ein Polytron(Brinkman)-Homogenisator 2 bis 3 Minuten lang eingesetzt wird, um die Einschlusskörper sorgfältig zu dispergieren. Das Gemisch wird unter Mischen inkubiert, wobei ein Rührwerk 15 Minuten lang verwendet wird, während der pH unter Verwendung von 1 N NaOH bei 10,5 bis 10,9 gehalten wird. Das Gemisch wird dann bei 2 bis 8°C für 48 bis 72 Stunden leicht gemischt.
  • Beispiel 16
  • Durch geladenes Polymer unterstützte Rückfaltung von bovinem Somatotropin aus E. coli-Einschlusskörpern
  • 10 Gramm (Feuchtgewicht) Einschlusskörper, die 5 Gramm bovines Somatotropin enthielten, wurden zu etwa einem Liter 1% Glass H, 50 mM Tris-Puffer pH 10,5 zugegeben. Das Gemisch wurde sorgfältig gemischt, wobei ein Polytron(Brinkman)-Homogenisator 2 bis 3 Minuten lang eingesetzt wurde, um die Einschlusskörper sorgfältig zu dispergieren. Das Gemisch wird unter Mischen inkubiert, wobei ein Rührwerk 15 Minuten lang eingesetzt wird, während der pH unter Verwendung von 1 N NaOH bei 10,4 bis 10,6 gehalten wird. Festes Cystein (121 mg) wird zugegeben, um eine Reaktion mit 1 mM Cystein zu erhalten, und die Rückfaltungsreaktion wird 48 bis 72 Stunden lang gemischt.

Claims (18)

  1. Wässrige Formulierung, die einen pH-Wert zwischen 5 und 10 aufweist und (a) einen Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor und (b) L-Arginin aufweist, wobei die Konzentration von Arginin zwischen 200 mM und 300 mM ist.
  2. Formulierung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration von Arginin 300 mM ist.
  3. Wässrige Formulierung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, des weiteren umfassend ein solubilisierendes Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Acetat-Ion; einem Sulfat-Ion; Natriumchlorid; einem Citrat-Ion; einem Isocitrat-Ion; Glycin; Glutamat; einem Succinat-Ion; Histidin; Imidazol; Natriumdodecylsulfat (SDS); oder einem geladenen Polymer.
  4. Formulierung nach Anspruch 3, wobei das solubilisierende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Citrat-Ion; einem Isocitrat-Ion; oder einem Sulfat-Ion.
  5. Formulierung nach Anspruch 4, wobei das solubilisierende Agens Citrat ist, und wobei die Konzentration von Citrat zwischen 10 mM und 20 mM ist.
  6. Formulierung nach Anspruch 5, wobei die Konzentration von Citrat 20 mM ist.
  7. Formulierung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei der pH-Wert der Zusammensetzung unter pH 7,0 ist und das solubilisierende Agens nicht Glycin ist.
  8. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Konzentration des Gewebefaktor-Pathway-lnhibitors höher als 0,2 mg/mL ist.
  9. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Formulierung einen Puffer einschließt.
  10. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor (i) TFPI, (ii) ein TFPI-Mutein, das eine einzelne oder multiple Punktmutationen einschließt, oder (iii) ein chimäres TFPI-Molekül ist.
  11. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor einen Alaninrest am aminoterminalen Ende hat.
  12. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor 18 Cysteinreste und 9 Disulfidbrücken enthält.
  13. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor drei Asn-X-Ser/Thr N-verknüpfte Glycosylierungs-Konsensus-Stellen enthält.
  14. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor ein positiv geladenes carboxy-terminales Ende hat.
  15. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor nicht glycosyliert ist.
  16. Formulierung nach Anspruch 15, wobei der Gewebefaktor-Pathway-Inhibitor aus einem Escherichia coli-Wirt gereinigt ist.
  17. Formulierung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Formulierung hypertonisch ist.
  18. Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Formulierung isotonisch ist.
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