JP2004315541A - タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 - Google Patents
タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004315541A JP2004315541A JP2004184539A JP2004184539A JP2004315541A JP 2004315541 A JP2004315541 A JP 2004315541A JP 2004184539 A JP2004184539 A JP 2004184539A JP 2004184539 A JP2004184539 A JP 2004184539A JP 2004315541 A JP2004315541 A JP 2004315541A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tfpi
- protein
- urea
- regeneration
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
- A23L19/09—Mashed or comminuted products, e.g. pulp, purée, sauce, or products made therefrom, e.g. snacks
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
- A23L19/10—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof of tuberous or like starch containing root crops
- A23L19/12—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof of tuberous or like starch containing root crops of potatoes
- A23L19/18—Roasted or fried products, e.g. snacks or chips
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L21/00—Marmalades, jams, jellies or the like; Products from apiculture; Preparation or treatment thereof
- A23L21/10—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products
- A23L21/15—Marmalades; Jams; Jellies; Other similar fruit or vegetable compositions; Simulated fruit products derived from fruit or vegetable juices
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
- A23L29/212—Starch; Modified starch; Starch derivatives, e.g. esters or ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
- A23L29/212—Starch; Modified starch; Starch derivatives, e.g. esters or ethers
- A23L29/219—Chemically modified starch; Reaction or complexation products of starch with other chemicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
- A23L7/10—Cereal-derived products
- A23L7/109—Types of pasta, e.g. macaroni or noodles
- A23L7/111—Semi-moist pasta, i.e. containing about 20% of moist; Moist packaged or frozen pasta; Pasta fried or pre-fried in a non-aqueous frying medium, e.g. oil; Packaged pasta to be cooked directly in the package
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
- A23L7/10—Cereal-derived products
- A23L7/161—Puffed cereals, e.g. popcorn or puffed rice
- A23L7/165—Preparation of puffed cereals involving preparation of meal or dough as an intermediate step
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L9/00—Puddings; Cream substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L9/10—Puddings; Dry powder puddings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L9/00—Puddings; Cream substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L9/20—Cream substitutes
- A23L9/22—Cream substitutes containing non-milk fats but no proteins other than milk proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23P—SHAPING OR WORKING OF FOODSTUFFS, NOT FULLY COVERED BY A SINGLE OTHER SUBCLASS
- A23P20/00—Coating of foodstuffs; Coatings therefor; Making laminated, multi-layered, stuffed or hollow foodstuffs
- A23P20/10—Coating with edible coatings, e.g. with oils or fats
- A23P20/12—Apparatus or processes for applying powders or particles to foodstuffs, e.g. for breading; Such apparatus combined with means for pre-moistening or battering
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
- A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
【手段】 ポリイオンポリマーを用いたタンパク質の溶解度の修飾方法が開示される。ポリイオンポリマーは、タンパク質、特に誤って折りたたまれたタンパク質や凝集したタンパク質の可溶化、製剤、精製、および再生を促進する。TFPIの製剤に適した組成が開示されている。この組成を用いると0.2 mg/ml以上および10mg/ml以上の濃度の医薬品として許容可能なTFPI組成の調製が可能である。
【選択図】 なし
Description
本発明はタンパク質の再生方法を提供することを目的とする。
本発明はTFPIの水溶性製剤を提供することも目的とする。
本発明は荷電ポリマーを使用してタンパク質の溶解度を修飾する方法を提供することも目的とする。
本発明はTFPIを再生させる前に変性TFPI溶液に荷電ポリマーを添加するステップを含む、TFPIの再生方法を記載することも目的とする。
さらに、本発明はカラム上に荷電ポリマーを固定化し、変性TFPI溶液をこのカラムに通し、再生が起きた後に再生したTFPIを溶出するステップを含むTFPIの再生方法を記載することも目的とする。
〔2〕 TFPIの濃度が5mg/mlより大きい〔1〕記載の水性組成物。
〔3〕 TFPIの濃度が10mg/mlより大きい〔1〕記載の水性組成物。
〔4〕 TFPIの濃度が20mg/mlより大きい〔1〕記載の水性組成物。
〔5〕 TFPIが、N末端にアラニン残基を有するTFPI類似体のala-TFPIである、〔1〕記載の水性祖生物。
〔6〕 薬学的に許容される〔1〕記載の水性組成物。
〔7〕 荷電ポリマーが硫酸化ポリサッカライドである〔1〕記載の水性組成物。
〔8〕 荷電ポリマーがヘパリンである〔1〕記載の水性組成物。
〔9〕 荷電ポリマーが硫酸化デキストランである〔1〕記載の水性組成物。
〔10〕 荷電ポリマーがポリリン酸塩である〔1〕記載の水性組成物。
〔11〕 実効正電荷をもつ第一ドメインおよび実効負電荷をもつ第二ドメインを有するタンパク質の溶解性を改変する方法であって、
前記タンパク質に荷電したポリマーの水性溶液を加えて正および負に荷電したドメイン間の分子間または分子内相互作用を減少させる工程
を含む方法であって、
前記タンパク質は、
(i) 図4に示されるアミノ酸配列を含むヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)記載のムテインからなる群から選択される。
〔12〕 第一ドメインが一連の連続する10個のアミノ酸中少なくとも5個のカチオン性アミノ酸の電荷濃度をもつ〔11〕記載の方法。
〔13〕 第一ドメインが5個の連続するカチオン性アミノ酸を含む〔11〕記載の方法。
〔14〕 第二ドメインが5個の連続するアニオン性アミノ酸を含む〔11〕記載の方法。
〔15〕 第二ドメインが一連の連続する10個のアミノ酸中5個のアニオン性アミノ酸を含む〔11〕記載の方法。
〔16〕 タンパク質がTFPIである〔11〕記載の方法。
〔17〕 TFPIが、N末端にアラニン残基を有するTFPI類似体のala-TFPIである、〔16〕記載の方法。
〔18〕 タンパク質がTFPIムテイン(mutein)である〔11〕記載の方法。
〔19〕 タンパク質がTFPI-2である〔11〕記載の方法。
〔20〕 タンパク質が添加前は不溶性の型である〔11〕記載の方法。
〔21〕 カオトロピック物質もまたタンパク質に添加される〔11〕記載の方法。
〔22〕 タンパク質の特異的活性が添加工程によって上昇する〔11〕記載の方法。
〔23〕 荷電ポリマーが固体支持体に固定化される〔11〕記載の方法。
〔24〕 荷電ポリマーを添加する前にタンパク質を固体支持体に適用することをさらに含む〔11〕記載の方法。
〔25〕 荷電ポリマーを添加した後にタンパク質を固体支持体に適用することをさらに含む〔11〕記載の方法。
〔26〕 固体支持体がイオン交換樹脂である〔24〕記載の方法。
〔27〕 固体支持体がイオン交換樹脂である〔25〕記載の方法。
〔28〕 タンパク質の特異的活性が添加工程によって上昇し、タンパク質がTFPIである〔11〕記載の方法。
〔29〕 TFPIが、N末端にアラニン残基を有するTFPI類似体のala-TFPIである、〔28〕記載の方法。
〔30〕 樹脂およびポリマーが反対の実効電荷をもっている〔26〕記載の方法。
〔31〕 樹脂およびポリマーが反対の実効電荷をもっている〔27〕記載の方法。
〔32〕 樹脂およびポリマーが同じ実効電荷をもっている〔26〕記載の方法。
〔33〕 樹脂およびポリマーが同じ実効電荷をもっている〔27〕記載の方法。
〔34〕 固体支持体から選択的溶出をおこなうため荷電ポリマーが濃度勾配で添加される〔26〕記載の方法。
〔35〕 TFPIを折りたたむ前に、荷電ポリマーの水溶液を前記TFPIを含む溶液に添加する工程を含む、不正確に折りたたまれた、または変性されたTFPIを再生する方法。
〔36〕 ポリマーが硫酸化ポリサッカライドである〔35〕記載の方法。
〔37〕 硫酸化ポリサッカライドが硫酸デキストランである〔36〕記載の方法。
〔38〕 硫酸化ポリサッカライドが硫酸ヘパリンである〔36〕記載の方法。
〔39〕 TFPIを折りたたむ前に、荷電ポリマーの水溶液を不正確に折りたたまれた、または変性されたTFPIを含む溶液に添加する工程を含む、タンパク質を再生する方法。
〔40〕 ポリマーが硫酸デキストランである〔39〕記載の方法。
〔41〕 ポリマーがヘパリンである〔39〕記載の方法。
〔42〕 ヘパリンが溶液中に添加される〔41〕記載の方法。
〔43〕 TFPIを折りたたむ前に、荷電ポリマーの水溶液を不正確に折りたたまれた、または変性されたTFPIを含む溶液に添加する工程、および、溶液をインキュベーションして該TFPIを折りたたませ、塩を加えてポリマーをTFPIから分離し、前記溶液をHICカラムに通し、そしてTFPIを回収する工程を含む、TFPIを再生する方法。
〔44〕 TFPIが、N末端にアラニン残基を有するTFPI類似体のala-TFPIである、〔43〕記載の方法。
〔45〕 硫酸化ポリサッカライドのポリマーをカラムに固定化し、変性されたTFPIの溶液を前記カラムに通し、再生されたTFPIを、再生が起こったあとに溶出する工程を含むTFPIを再生する方法。
〔46〕 TFPIが、N末端にアラニン残基を有するTFPI類似体のala-TFPIである、〔45〕記載の方法。
〔47〕 硫酸化ポリサッカライドが硫酸デキストランである〔45〕記載の方法。
〔48〕 硫酸化ポリサッカライドが硫酸ヘパリンである〔45〕記載の方法。
〔49〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含むヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)記載のムテイン
から選択されるポリペプチドを1mg/ml以上、並びに、少なくとも0.1%(w/v)のポリリン酸塩を含む、pHが5から10である水溶液。
〔50〕 ポリペプチドが図4に記載のアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPIである、〔49〕に記載の溶液。
〔51〕 医薬的に許容され得る、〔50〕に記載の溶液。
〔52〕 医薬的に許容され得る、〔49〕に記載の溶液。
〔53〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含むヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)記載のムテイン
からなる群より選択されるポリペプチドの溶解性を増加させる方法であって、ポリペプチドおよび荷電ポリマーを含む水性組成物を調製する工程を含む方法。
〔54〕 硫酸デキストラン、グリコサミノグリカン、ヘパリン、ポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩、アガロペクチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリリン酸塩、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミンセルロース、DEAEデキストラン、ポリリジン、およびポリアルギニンからなる群より荷電ポリマーが選択される、〔53〕記載の方法。
〔55〕 荷電ポリマーがポリリン酸塩である、〔54〕記載の方法。
〔56〕 水性組成物が少なくとも約0.5mg/mlのポリペプチドを含む、〔53〕記載の方法。
〔57〕 ポリリン酸塩が1から20mg/mlの最終濃度で添加される、〔55〕記載の方法。
〔58〕 水性組成物が3M尿素、および50mM Trisを含み、pH10.5である、〔55〕記載の方法。
〔59〕 水性組成物が少なくとも約0.5mg/mlポリペプチド、4mg/mlポリリン酸塩、0.1mMシステイン、0.05mMシスチン、および50mM Trisを含み、pHが約10.5である、〔55〕記載の方法。
〔60〕 ポリペプチド対ポリリン酸塩の重量比が約2:1から約1:8となるような最終濃度でポリリン酸塩が添加される、〔55〕記載の方法。
〔61〕 ポリリン酸塩の添加前に、ポリペプチドが6M尿素、125mM塩化ナトリウム、および20mMリン酸ナトリウムバッファーを含む、pHが約7.4の溶液中に存在する、〔60〕記載の方法。
〔62〕 ポリペプチドおよびポリリン酸塩を含む組成物から低分子量の溶質を除き、組成物中でのポリペプチドの濃度が0.5mg/mlより高く、ポリペプチドおよびポリリン酸塩を実質的に他の溶質を含まないように含む水性組成物を形成する工程をさらに含む、〔60〕記載の方法。
〔63〕 ポリペプチドが水性組成物調製前には不溶性の形で存在する、〔53〕記載の方法。
〔64〕 不溶性の形が封入体である、〔63〕記載の方法。
〔65〕 水性組成物がさらにカオトロープを含む、〔53〕記載の方法。
〔66〕 水性組成物を調製する前に、ポリペプチドを固体担体に加える工程をさらに含む、〔53〕記載の方法。
〔67〕 水性組成物が、固体担体からのポリペプチドの選択的な溶出を可能にする濃度勾配でポリリン酸塩を添加することにより形成される、〔66〕記載の方法。
〔68〕 固体担体がイオン交換樹脂である、〔66〕記載の方法。
〔69〕 樹脂が実効負電荷を有する、〔68〕記載の方法。
〔70〕 樹脂が実効正電荷を有する、〔68〕記載の方法。
〔71〕 水性組成物の調製の工程の後に、ポリペプチドを固体担体に加える工程をさらに含む、〔53〕記載の方法。
〔72〕 固体担体がイオン交換樹脂である、〔71〕記載の方法。
〔73〕 樹脂が実効負電荷を有する、〔72〕記載の方法。
〔74〕 樹脂が実効正電荷を有する、〔72〕記載の方法。
〔75〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPIである、〔53〕から〔74〕のいずれか一項に記載の方法。
〔76〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含むヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)記載のムテイン
からなる群より選択されるポリペプチドの再生を補助する方法であって、ポリペプチドおよび荷電ポリマーを含む水性組成物を調製する工程を含む方法。
〔77〕 硫酸デキストラン、グリコサミノグリカン、ヘパリン、ポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩、アガロペクチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリリン酸塩、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミンセルロース、DEAEデキストラン、ポリリジン、およびポリアルギニンからなる群より荷電ポリマーが選択される、〔76〕記載の方法。
〔78〕 荷電ポリマーがポリリン酸塩である、〔76〕記載の方法。
〔79〕 溶液がさらに尿素を含む、〔76〕記載の方法。
〔80〕 溶液が実質的に尿素を含まない、〔76〕記載の方法。
〔81〕 溶液のpHが約9から少なくとも約11である、〔76〕記載の方法。
〔82〕 ポリペプチドが少なくとも約72時間再生される、〔76〕記載の方法。
〔83〕 再生工程が約72から約120時間後に溶液のpHを5.9±0.1に低めることによって終了される、〔76〕記載の方法。
〔84〕 再生が約1mg/mlのポリペプチド、約2mg/mlのポリリン酸塩、3M尿素、0.1mMシステイン、および50mM Trisを含むpHが約10.5の溶液中で行なわれる、〔78〕記載の方法。
〔85〕 再生が約0.5mg/mlのポリペプチド、約4mg/mlのポリリン酸塩、0.1mMシステイン、0.05mMシスチン、および50mM Trisを含むpHが約10.5の溶液中で行なわれる、〔79〕記載の方法。
〔86〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含むヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)記載のムテイン
からなる群より選択される精製されたポリペプチドを得る方法であって、該ポリペプチドと荷電ポリマーとを含む水溶液中で該ポリペプチドを再生する工程、並びに、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群より選択される方法を用いてポリペプチドが精製される工程を含む方法。
〔87〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含むヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)記載のムテイン
からなる群より選択される細菌中で発現された組換えポリペプチドから細菌由来のコンタミネーションを除去する方法であって、
陽イオンポリマーの水溶液を該組換えポリペプチドの可溶性形態を含む溶液に添加し細菌由来のコンタミネーションを沈澱させる工程、並びに、沈澱させた細菌性のコンタミネーションを除去する工程を含む方法。
〔88〕 添加する工程に可溶性形態のポリペプチドを含む溶液を陽イオンポリマーを0.5%(w/v)含む溶液中に少なくとも10倍希釈する、〔87〕記載の方法。
〔89〕 陽イオンポリマーがBetzポリマー624である、〔87〕記載の方法。
〔90〕 荷電ポリマーの添加前の溶液が3.5M塩酸グアニジウム、および50mMジチオスレイトール、および50mM Trisを含む、pH7.1である、〔87〕記載の方法。
〔91〕 沈澱が遠心により除去される、〔87〕記載の方法。
〔92〕 沈澱が濾過により除去される、〔87〕記載の方法。
〔93〕 組換ポリペプチドが大腸菌で発現されたものである、〔87〕記載の方法。
〔94〕 組換ポリペプチドが封入体に含まれる形で発現される、〔87〕記載の方法。
〔95〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含むala-ヒトTFPIである、〔87〕から〔94〕のいずれか一項に記載の方法。
〔96〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長ヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含む、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)からなる群より選択される適切に折りたたまれた全長ムテイン
からなる群より選択される大腸菌中で発現された組換えポリペプチドを精製する方法であって、該ポリペプチドを含む第一調製物を樹脂に結合させるよう陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に加える工程、樹脂を洗浄バッファーで洗浄する工程、並びに、樹脂をポリイオン性化合物を含む水溶性の溶出バッファーで洗い、樹脂より該ポリペプチドが該第一調製物より富化された第二調製物を溶出する工程を含む方法。
〔97〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長TFPIである、〔96〕記載の方法。
〔98〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を有する、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPIである、〔96〕記載の方法。
〔99〕 第一調製物が尿素を含む、〔96〕記載の方法。
〔100〕 第一調製物が約6M尿素を含む、〔96〕記載の方法。
〔101〕 第一調製物がpH約8である、〔96〕記載の方法。
〔102〕 第一調製物が約6M尿素、および約20mM Trisを含み、pH約8である、〔96〕記載の方法。
〔103〕 洗浄バッファーがより尿素を含む、〔96〕記載の方法。
〔104〕 洗浄バッファーがより約6M尿素を含む、〔96〕記載の方法。
〔105〕 洗浄バッファーのpHが約9である、〔96〕記載の方法。
〔106〕 洗浄バッファーが約6M尿素、および約20mM Trisを含み、pH約9である、〔96〕記載の方法。
〔107〕 溶出バッファーが尿素を含む、〔96〕記載の方法。
〔108〕 溶出バッファーが約6M尿素を含む、〔96〕記載の方法。
〔109〕 ポリイオン性化合物がポリアニオンである、〔96〕記載の方法。
〔110〕 ポリイオン性化合物がポリリン酸塩である、〔109〕記載の方法。
〔111〕 溶出バッファーが約10mg/mlのポリリン酸塩を含む、〔110〕記載の方法。
〔112〕 溶出バッファーがpH約9である、〔96〕記載の方法。
〔113〕 溶出バッファーが約6M尿素、約10mg/mlポリリン酸、および約10mM Trisを含み、pH約9である、〔96〕記載の方法。
〔114〕 陰イオン交換樹脂が第4アンモニウム化合物群を含む、〔96〕記載の方法。
〔115〕 陰イオン交換樹脂がQセファロースである、〔114〕記載の方法。
〔116〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長ヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含む、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)からなる群より選択される適切に折りたたまれた全長ムテイン
からなる群より選択される大腸菌中で発現された組換えポリペプチドを精製する方法であって、該ポリペプチドを含み、さらに尿素および樹脂の実効電荷と同じ電荷を有する荷電ポリマーを含む、水溶液である第一調製物を樹脂に結合させるようイオン交換樹脂に加える工程、樹脂を実質的に尿素を含まず、荷電ポリマーを含む洗浄バッファーで洗浄する工程、並びに、樹脂を実質的に尿素を含まず、荷電ポリマーを洗浄バッファーよりも高濃度で含む溶出バッファーで洗い、樹脂より該ポリペプチドが該第一調製物より富化された第二調製物を溶出する工程を含む方法。
〔117〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長TFPIである、〔116〕記載の方法。
〔118〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を有する、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPIである、〔116〕記載の方法。
〔119〕 第一調製物が尿素を含む、〔116〕記載の方法。
〔120〕 第一調製物が約3.5M尿素を含む、〔119〕載の方法。
〔121〕 第一調製物がpHが約5.5から約6.0である、〔116〕記載の方法。
〔122〕 第一調製物が約3.5M尿素、および約50mM Trisを含み、pH約5.9である、〔116〕記載の方法。
〔123〕 第一調製物がさらに約1mg/mlポリリン酸塩を含む、〔121〕記載の方法。
〔124〕 荷電ポリマーが負に荷電しており、樹脂が陽イオン交換樹脂である、〔116〕記載の方法。
〔125〕 荷電ポリマーがポリリン酸塩である、〔124〕記載の方法。
〔126〕 洗浄バッファーが約10mg/mlポリリン酸塩を含む、〔125〕記載の方法。
〔127〕 溶出バッファーがpH約5である、〔126〕記載の方法。
〔128〕 溶出バッファーが約10mMリン酸ナトリウムを含む、〔126〕記載の方法。
〔129〕 溶出バッファーが約10mg/mlのポリリン酸塩を含む、〔125〕記載の方法。
〔130〕 溶出バッファーがpH約7.5である、〔129〕記載の方法。
〔131〕 溶出バッファーが約10mg/mlポリリン酸を含む、〔130〕記載の方法。
〔132〕 樹脂がSPセファロースである、〔116〕記載の方法。
〔133〕 荷電ポリマーが正に荷電しており、樹脂が陰イオン交換樹脂である、〔116〕記載の方法。
〔134〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長ヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含む、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)からなる群より選択される適切に折りたたまれた全長ムテイン
からなる群より選択される大腸菌中で発現された組換えポリペプチドを精製する方法であって、該ポリペプチドを含み、さらに尿素および樹脂の実効荷電と同じ荷電を有する荷電ポリマーを含む水溶液である、第一調製物を樹脂に結合させるようイオン交換樹脂に加える工程、樹脂を尿素および荷電ポリマーを含む洗浄バッファーで洗浄する工程、並びに、樹脂を尿素を含み、荷電ポリマーを洗浄バッファーよりも高濃度で含む溶出バッファーで洗い、樹脂より該ポリペプチドが該第一調製物より富化された第二調製物を溶出する工程を含む方法。
〔135〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長TFPIである、〔134〕記載の方法。
〔136〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を有する、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPIである、〔134〕記載の方法。
〔137〕 第一調製物が約6M尿素を含む、〔134〕記載の方法。
〔138〕 第一調製物が約6M尿素、約1mg/mlポリリン酸、および約10mMリン酸ナトリウムを含み、pH約5.9である、〔137〕記載の方法。
〔139〕 溶出バッファーが増加する濃度勾配で荷電ポリマーを含む、〔134〕記載の方法。
〔140〕 溶出バッファーが約25カラム容量加えられる、〔139〕記載の方法。
〔141〕 濃度勾配が約1mg/ml荷電ポリマーから始まり約20mg/ml荷電ポリマーで終わる、〔139〕記載の方法。
〔142〕 荷電ポリマーがポリリン酸塩であり、樹脂が陽イオン交換樹脂である、〔139〕記載の方法。
〔143〕 溶出バッファーが約1mg/mlから約20mg/mlの勾配でポリリン酸塩を含む、〔142〕記載の方法。
〔144〕 溶出バッファーが約6mM尿素、10mMリン酸ナトリウム、および、約1mg/mlから約20mg/mlの勾配でポリリン酸を含み、pH約5.9である、〔142〕の方法。
〔145〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長ヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含む、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)からなる群より選択される適切に折りたたまれた全長ムテイン
からなる群より選択されるポリペプチドの精製を補助する方法であって、該ポリペプチドおよび第一の荷電ポリマーを含む水溶性組成物に、第一の荷電ポリマーと逆の実効荷電を持つ第二の荷電ポリマーを第一の荷電ポリマーを実質的に中和するのに十分な量添加する工程を含む方法。
〔146〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長TFPIである、〔145〕記載の方法。
〔147〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を有する、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPIである、〔145〕記載の方法。
〔148〕 第一の荷電ポリマーがポリリン酸塩である、〔145〕記載の方法。
〔149〕 第二の荷電ポリマーがポリエチレンイミンである、〔148〕記載の方法。
〔150〕 (i) 図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長ヒトTFPI、
(ii) 図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を含む、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPI、および
(iii) 1から5個のアミノ酸置換を有する(i)または(ii)からなる群より選択される適切に折りたたまれた全長ムテイン
からなる群より選択される大腸菌中で発現された組換えポリペプチドを精製する方法であって、
(a) ポリペプチドを含む第一水溶液にポリエチレングリコール(PEG)およびポリリン酸塩を添加し、水性の二層系を形成する工程、および
(b) PEGに富む層を回収し、第一水溶液と比べて該ポリペプチドが富化された第二水溶液を形成する工程
を含む方法。
〔151〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列を含む、適切に折りたたまれた全長TFPIである、〔150〕記載の方法。
〔152〕 ポリペプチドが図4に示されるアミノ酸配列、およびN末端アラニンである追加の1アミノ酸残基を有する、適切に折りたたまれた全長ala-ヒトTFPIである、〔150〕記載の方法。
〔153〕 添加工程の前に、ポリペプチドが封入体の可溶化により得られたものである、〔150〕記載の方法。
〔154〕 封入体が約7M尿素、約1%(w/v)モノチオグリセロール、および約10mM CAPSバッファーを含み、pHが約10である溶液中で可溶化された、〔153〕記載の方法。
本発明者は、ポリエチレンイミンおよびポリリン酸塩のようなポリイオンポリマーが、タンパク質内のイオン性相互作用を修飾することができることを見出した。ポリイオンを用いて、タンパク質内の荷電密度の高い特定の領域を覆うと、数多くの効果が現われることがある。反対の電荷を持つ領域が分子内や分子間で中和されるために溶解度が低下しているタンパク質は、荷電領域の1つをポリ陽イオンまたはポリ陰イオンで覆うと、溶解度が改善することがある。再生過程に干渉するような、立体構造の柔軟性への障害、ならびに特異的な引力または反発力も、修飾することができる。精製操作中に、可溶化し可溶性を維持するために、尿素や塩酸グアニジンのような強力な変性剤を必要とするタンパク質は、ポリイオンを使用すると効果的に可溶化し加工処理することができる。
組換えDNA技術によって、通常は天然源から認められるほどの量が単離できなかった多くのタンパク質を、高レベルで発現することが可能になった。大腸菌およびその他の数種類の発現系では、タンパク質はしばしば不活性な変性した状態で発現され、アミノ酸の1次配列は正しいものの、2次構造と3次構造、ならびにシステインのジスルフィド結合は存在しない。封入体に存在する変性タンパク質は、通常は接触しないアミノ酸バックボーンの、異なる部分の荷電残基が相互作用し、正の電荷を持つアミノ酸残基と負の電荷を持つアミノ酸残基の間に強いイオン結合が形成されるような立体構造になっているのかもしれない。これらのイオン結合の形成は、封入体の溶解のために必要な水和を制限することがある。また、封入体中のタンパク質は、膜成分および核酸のような他の細胞成分と複合体を作り、これにより、電荷を持ち通常は水和している残基に溶媒(水)が接近するのが制限されるのかもしれない。また、変性した状態では、通常はタンパク質の内部に埋まっている疎水性の残基が、極性を持つ水性環境に、より露出している。これらのために、封入体は、尿素もしくはグアニジンのような強いカオトロピック剤、またはSDSのような界面活性剤以外の溶媒に溶解しないのかもしれない。
組換えDNA技術によって、通常は天然源から認められるほどの量が単離できなかった多くのタンパク質を高レベルで発現することが可能になった。大腸菌およびその他の数種類の発現系では、タンパク質はしばしば不活性な変性した状態で発現され、アミノ酸の1次配列は正しいものの、2次構造と3次構造、ならびにシステインのジスルフィド結合は存在しない。変性したタンパク質は、活性を持つ正しい立体構造に再生されなくてはならないが、このためにはしばしば、イオン性の引力と反発力、結合の回転の制限、および立体構造に誘導される他の種類のストレスにより強いられる、著しいエネルギー障壁を克服する必要がある。反対の電荷の間の特異的なイオン性の引力や、同様な電荷の間の反発力は、変性タンパク質が利用できる再生経路を著しく制限し、再生過程の効率を低下させる場合がある。
タンパク質はアミノ酸の鎖から構成され、その正確な組成と配列がタンパク質の構造の主要決定因子の1つになる。タンパク質構造の2次的決定因子は、個々のアミノ酸結合がタンパク質の立体構造に対して与える、立体構造の誘導の結果である。第3に、特定のアミノ酸配列は、βシートやαヘリックスのような3次構造の形成を誘導する。タンパク質の立体構造の3次元的性質は、ポリペプチド鎖の直接の配列では通常近接していないアミノ酸残基を、しばしば近付けることになる。タンパク質の機能的な形は、一般に、システインのジスルフィド結合、イオン結合、ならびに疎水性およびファン・デル・ワールスの相互作用の組み合わせにより、ある程度安定な立体構造を持つ。
本明細書に使用される「加工処理」という用語は、医薬品として許容可能な量のタンパク質の精製と調製を意味する。加工処理には、可溶化、再生、クロマトグラフ分離、沈殿、および製剤のような1つまたは複数のステップが含まれることがある。
本明細書に使用される「患者」は、ヒトおよび家畜の患者を意味する。
TFPIは、米国特許第5,212,091号(この開示は参照として本明細書に組み入れられる)に開示の組換え法によって製造することができる。簡単に説明すると、TFPIは大腸菌細胞で発現され、TFPI含有封入体は残余の細胞物質から単離される。封入体を亜硫酸処理し、イオン交換クロマトグラフィを用いて生成し、ジスルフィド交換反応により再生して、カチオン交換クロマトグラフィにより再生した活性TFPIを精製した。TFPIはまた、同時継続中の米国特許出願第08/286,530号に開示される酵母で産生してもよい。
試薬はすべてU.S.P.(米国薬局法)またはA.C.S.(米国化学協会)グレードである。供給元にはJ. T. BakerおよびSigma Co. (St. Louis, MO)が含まれる。
以下の実施例は、原液の製造、HICカラム製造、再生に先立って行うTFPIの最初の回収及び精製、TFPIの再生、そして活性TFPIの回収を説明する。
TFPI試料を0.5 mg/mL TFPI、0.6 mg/mL硫酸デキストラン、3.0 M尿素、200 mM NaClおよび50 mMトリス(pH 5.5)の濃度で再生した。HICカラムは、1.66 mLのスラリー中HIC用のTosohaas Butylビーズ、4.6 mmD/100 mLから作った。HICカラムに流す前に、3.0 M尿素および3.0 M NH4SO4を用い2:3 の割合で最終pH が5.68になるよう試料を希釈しておき、2 mLの試料を流した。勾配開始は、33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM酢酸ナトリウム、1.0 M NH4SO4 および3.0 M尿素、pH 6.0であった。勾配終点は、33 mM MES/33 mM HEPES/33 mM酢酸ナトリウムおよび3.0 M尿素、pH 6.0であった。勾配容量は5.0 CVであった。このカラムから、天然本来のTFPIが68%回収された。結果を図2に示す。
2M尿素中約10 mg/mLのTFPIを以下に記載する物質のうちの一つに対して透析した:前述の20 mMリン酸塩、20 mMクエン酸塩、20 mMグリシン、20 mM L-グルタミン酸塩または20 mMコハク酸塩、150 mM NaCl 中の 20 mM酢酸塩。6 〜 10 mg/mLのTFPIバルク原液をSpec/Pro 7透析チューブ(MW cutoff 3,500)に流した。透析は4℃または周囲温度で行った。12〜24 時間にわたる透析中に、1 〜50-100のタンパク質溶液:緩衝液比で緩衝液を三段階に変化させた。TFPI溶液をCostar 0.22 ミクロンフィルターで濾過して可溶性TFPIからTFPI沈殿を分離した。次いで、278 nmにおける吸光係数を0.68 (mg/mL)-1と推定して、UV/可視吸光度によりTFPIの溶解性を測定した。HClまたはNaOHを用いる滴定により、種々のpHレベルの溶液を作った。
種々のpH条件で保存したTFPIの溶解性を調べた。10 mMリン酸ナトリウム、150 mM NaClおよび0.005% (w/v) ポリソルベート80中、上記のように透析してTFPIを作った。150 mg/mL TFPIを含有する溶解性試料を40℃で20日間インキュベーションした。カチオン交換クロマトグラムの主ピーク減少を追跡することによって、残留する可溶性TFPIの動力学的速度係数を分析した。図5からわかるように、崩壊レート定数はpH 6.0を超えるレベルで上昇し、これより高いpH条件ではさらに凝集することを示している。
ポリイオン性化合物を使用するクロマトグラフィ樹脂から置換モードにおけるTFPIの溶出
まず低塩緩衝液中の樹脂にTFPIを結合させる。次に置換モードにおいてTFPIを溶出するのに使われるポリイオン性化合物をポンプでカラムに通す。この化合物はTFPIよりも樹脂の方に強く結合してTFPIを置換する。陽性荷電樹脂(アニオン交換剤)に対しては陰性荷電化合物を使用し、陰性荷電樹脂(カチオン交換剤)に対しては陽性荷電化合物を使用する。
ポリイオン性化合物を使用するイオン交換樹脂からのTFPIの選択的溶出
TFPIの荷電末端のために、反対に荷電したポリイオン性化合物はそれら末端に結合する。ポリイオン性化合物が樹脂に対してよりもTFPIの方に強い結合性を持つ場合には、TFPIをクロマトグラフィ樹脂から選択的に溶出することができる。
TFPIのクロマトグラフィ分離に先立つポリイオン性化合物の中和
TFPIは荷電したポリマーと相互作用することができる。この相互作用は、クロマトグラフィ樹脂に対する結合および精製を妨げることがある。荷電したポリマーを反対荷電のポリマーで中和することにより、TFPIを樹脂と結合させることができる。ポリリン酸(Glass H)を含有する緩衝液において、TFPIはExpress Ion S(Whatman)と結合しないので精製することができない。PEIをカラムロードに混ぜることによってTFPIを樹脂に結合させTFPIを精製することができる。
ポリリン酸(Glass H)による促進再生プロセスを用いるリコンビナントヒトTFPI(rhTFPI)の再生および精製
約40 gのrhTFPIを含有する封入体は、-20℃のフリーザーからその容器を取り出し、これを4〜10℃の冷室に約196時間おいて解凍した。次いで、凍結中に起こる凝集を減少させるため、解凍した封入体を高せん断ミキサーで分散させた。オーバーヘッド撹拌器を備えた100 Lのポリエチレン製タンクに入れた、3 M 尿素、50 mMトリス-Cl、pH 10.5の緩衝液80 Lに、2 g/L Glass Hを含有する解凍した封入体を添加した。内容物を約15分間混合した後、溶液の吸光度を280 nmで測定した。吸光度がより大きい場合には、280 nmで1.0〜1.1の吸光度を得るのに十分な溶解緩衝液で混液を希釈した。穏やかにかき混ぜながら、溶液は15 〜30分間インキュベーションした。次いで0.1 mMのシステイン濃度を与えるに十分なシステインを添加した。固体のL-システインを約50 mlの精製水に溶解して再生物混液に添加した。pHをチェックし、必要なら、pH 10.2に調整した。穏やかにかき混ぜながら、再生物混液を96 〜120時間インキュベーションした。
ポリエチレンイミン(PEI)による促進再生プロセスを用いるrhTFPIの再生および精製
約40 gのrhTFPIを含有する封入体は、-20℃のフリーザーからその容器取り出し、これを4〜10℃の冷室に約96時間おいて解凍した。次いで、凍結中に起こる凝集を減少させるため、解凍した封入体を高せん断ミキサーで分散させた。ポリトロンホモジナイザー(Brinkman model PT45/80)を使って、この封入体スラリーを約1分間激しく混合した。または、オーバーヘッド撹拌器を備えた100 Lのポリエチレン製タンクに入れた、300 mM NaClおよび0.4 g/L PEIを含有する6 M 尿素、100 mM Tris/HCl緩衝液、pH 9.8の40 Lに、この封入体を添加するまで激しく混合した。混液は20〜30分間激しく混合した。pHをモニターし必要ならばpH 9.8に調整した。溶解した封入体混合液の吸光度を280 nmで測定した。吸光度が2.1より大きい場合には、2.0〜2.1のA280値が得られるよう、上記の溶解緩衝液10リットルで試料を希釈した。さらに15〜30分間穏やかな撹拌を続けた。次いで溶解した封入体溶液を等量の1.0 M尿素、300 mM NaCl溶液で希釈した。最後に、0.25 mMの最終濃度になるまでL-システインを添加した。固体のL-システインを50 mlのWFIに溶解し、溶液として希釈した再生物混液に添加した。pHをチェックし、必要なら調整した。定期的にpHをチェックしてpH 9.8に調整すると共に、穏やかにかき混ぜながら、96〜120時間再生を継続した。再生の過程は、Mon-Sカチオン交換およびプロトロンビンタイムアッセイでモニターした。
尿素のようなカオトロプの不存在下ポリリン酸を使用する、封入体からのrhTFPIの可溶化、再生および精製(GDS 5327089,92)
混合しながら、4 g/lポリリン酸(Glass H, FMC Corportaion)を含有する50 mM Tris緩衝液、pH 10.5に約2 gのrhTFPI(46 mg/mlのrhTFPIを含有する43 mlの封入体スラリー)を2〜8℃で溶解した。0.1 mMおよび0.05 mMの各溶液を作るのに十分なシステインおよびシスチンを添加した。溶液のpHを1 N NaOH でpH 10.5に維持した。穏やかに撹拌しながら、再生物溶液を72〜96時間、2〜8℃でインキュベーションした。
TFPIとポリリン酸の複合体形成による改善されたrhTFPIの溶解性(GDS 5327046-47)
2 M尿素、125 mM塩化ナトリウム、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.4の約1リットル中精製したrhTFPI約10 gを2〜8℃で18〜36時間インキュベーションすることによって解凍した。十分乾燥した尿素を添加して6 M尿素溶液を作った。次いでこの溶液を0.2ミクロンフィルターで濾過した。ポリリン酸ガラス(Glass H, FMC)5 gを6 M尿素50 mlに溶解し、1 N NaOHでpH 7に調整した後、これをタンパク質溶液に加えた。次いで限外濾過により、 1スクエアフィートの膜(Amicon S1Y3)を使って約400 ml(〜25 mg/ml)になるまで濃縮し、精製水10容量(約4リットル)に対して膜濾過し、残っている尿素を除いた。膜濾過後、溶液を約250 mlになるまで濃縮し、限外濾過ユニットから除いた。限外濾過ユニットを約150 mlの精製水で洗浄し、タンパク質濃縮液に加えた。最終タンパク質濃縮液は400 mlの水中ほとんど10 gのタンパク質を含んでいた(約24 mg/mlタンパク質)。
TFPI細胞ライセートおよび折れ曲がり体から大腸菌汚染物を除去するためのカチオン性ポリマーの使用
粗TFPI中間体(ライセート、折れ曲がり体)から大腸菌不純物を沈殿除去するためにカチオン性ポリマーを使用すると、以下のプロセス操作(再生、クロマトグラフィなど)を有意に改善することができる。カチオン性ポリマーの無作為スクリーニングによって、TFPIは溶液に残すが菌の汚染物は選択的に沈殿させる候補が同定された。特に、ベッツ(Betz)ポリマー624は、水性環境における溶液にTFPIを残す一方、実質的な量の細菌汚染物を沈殿させた。
ポリエチレングリコール(PEG)、ポリリン酸塩、尿素系での水性二相抽出を使用すると、TFPI精製の処理に有利である。典型的な水性二相抽出系は、二つのポリマー系(例えば、PEGとデキストラン)または一つのポリマーと塩(例えば、PEGと硫酸塩)からなる。本明細書に記載されているシステムは、分離に対してポリリン酸塩鎖の長さを最適化できること、安価であること、そして問題となっている汚染物を再生およびクロマトグラフィに干渉することが知られているTFPIの折りたたみ体から除くことに特異的であるという点で優れている(天然のリン酸塩および関連二価金属類)。
荷電ポリマーは大腸菌封入体から得られたリコンビナント組織プラスミノーゲン活性化因子の再生を促進した。
荷電ポリマーは大腸菌封入体から得られたウシソマトトロピンの再生を促進した。
Claims (1)
- TFPIの濃度が1mg/mlより大きい、TFPIおよび荷電ポリマーを含む水性組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47767795A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
US47366895A | 1995-06-07 | 1995-06-07 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9502126A Division JPH11514334A (ja) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007277137A Division JP2008115176A (ja) | 1995-06-07 | 2007-10-25 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004315541A true JP2004315541A (ja) | 2004-11-11 |
Family
ID=27044215
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9502126A Pending JPH11514334A (ja) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
JP2003326585A Withdrawn JP2004083591A (ja) | 1995-06-07 | 2003-09-18 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
JP2004184539A Withdrawn JP2004315541A (ja) | 1995-06-07 | 2004-06-23 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
JP2007277137A Pending JP2008115176A (ja) | 1995-06-07 | 2007-10-25 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9502126A Pending JPH11514334A (ja) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
JP2003326585A Withdrawn JP2004083591A (ja) | 1995-06-07 | 2003-09-18 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007277137A Pending JP2008115176A (ja) | 1995-06-07 | 2007-10-25 | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6323326B1 (ja) |
EP (2) | EP0837883B1 (ja) |
JP (4) | JPH11514334A (ja) |
AT (2) | ATE301675T1 (ja) |
CA (1) | CA2223745C (ja) |
DE (2) | DE69635051T2 (ja) |
DK (2) | DK0837883T3 (ja) |
ES (2) | ES2248818T3 (ja) |
PT (1) | PT1602667E (ja) |
WO (1) | WO1996040784A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019156242A1 (ja) * | 2018-02-09 | 2019-08-15 | Spiber株式会社 | 組換えタンパク質の製造方法 |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT1602667E (pt) * | 1995-06-07 | 2007-07-13 | Searle Llc | Formulação aquosa que compreende tfpi e agentes de solubilização |
US5914390A (en) * | 1997-05-12 | 1999-06-22 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for increasing yields of recombinant proteins |
WO2001024814A1 (en) | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Chiron Corporation | Stabilized liquid polypeptide-containing pharmaceutical compositions |
WO2003014736A1 (en) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | Meditech Reserach Limited | Biological molecules comprising glycosaminoglycans |
US7186539B1 (en) | 2001-08-31 | 2007-03-06 | Pharmacia & Upjohn Company | Method for refolding enzymes |
KR20040040489A (ko) | 2001-10-15 | 2004-05-12 | 카이론 코포레이션 | 조직 인자 경로 억제제(tfpi)의 저용량 투여에 의한패혈증의 치료 |
EP1314739A1 (en) * | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
WO2003072733A2 (en) * | 2002-02-21 | 2003-09-04 | Pharmacia & Upjohn Company | Modified bace |
CA2512681A1 (en) * | 2003-01-08 | 2004-07-29 | Chiron Corporation | Stabilized aqueous compositions comprising tissue factor pathway inhibitor (tfpi) or tissue factor pathway inhibitor variant |
JP2008500942A (ja) * | 2003-01-08 | 2008-01-17 | カイロン コーポレイション | 組織因子経路インヒビターまたは組織因子経路インヒビター改変体を含有する安定化凍結乾燥組成物 |
EP1803445A3 (en) * | 2003-01-08 | 2007-11-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Stabilized lyophilized compositions comprising tissue factor pathway inhibitor or tissue factor pathway inhibitor variants |
DE10333317A1 (de) * | 2003-07-22 | 2005-02-17 | Biotecon Therapeutics Gmbh | Formulierung für Proteinarzneimittel ohne Zusatz von humanem Serumalbumin (HSA) |
EP1654283B1 (en) * | 2003-08-13 | 2011-07-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Improved method of purifying tfpi and tfpi analogs |
SG150552A1 (en) * | 2004-03-17 | 2009-03-30 | Chiron Corp | Treatment of severe community-acquired pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
US7148067B2 (en) * | 2004-08-31 | 2006-12-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Thromboplastin reagents |
EP1853926A2 (en) * | 2005-02-16 | 2007-11-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Procoagulants based on metal-chelating lipids |
CN101184775A (zh) * | 2005-03-04 | 2008-05-21 | 伊利诺斯大学理事会 | 凝血及纤溶级联***的调控剂 |
CN101511858A (zh) * | 2005-07-25 | 2009-08-19 | 特鲁比昂药品公司 | 用于蛋白质解聚的组合物和方法 |
WO2007081534A2 (en) * | 2005-12-22 | 2007-07-19 | Pfizer Products Inc | Method of producing catalytically active bace2 enzymes |
JP5274795B2 (ja) * | 2006-07-27 | 2013-08-28 | 三洋化成工業株式会社 | タンパク質のリフォールディング方法 |
US20080083672A1 (en) * | 2006-10-10 | 2008-04-10 | Xing Dong | Adsorbent composition and method of making same |
US20080249286A1 (en) * | 2007-04-05 | 2008-10-09 | Seefeldt Matthew B | High-pressure refolding of proteins in the presence of binding partners |
WO2009046194A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Fibrin sealant |
US20100297257A1 (en) * | 2007-11-09 | 2010-11-25 | National Institutes Of Health (Nih), U.S. Dept. Of Health And Human Services (Dhhs) | Anticoagulant antagonist and hemophillia procoagulant |
JP5816550B2 (ja) * | 2009-06-22 | 2015-11-18 | 株式会社メディネット | 蛋白質の修飾剤 |
CN104854131A (zh) * | 2012-12-21 | 2015-08-19 | 默沙东公司 | 脂蛋白的柱上重折叠和纯化 |
KR20190129061A (ko) | 2017-03-31 | 2019-11-19 | 메이지 세이카 파루마 가부시키가이샤 | 수성 제제 및 주사기 내 수성 제제, 및 항체 단백질 탈응집제 및 항체 단백질 탈응집 방법 |
CN108373494A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-08-07 | 武汉伊艾博科技有限公司 | 一种防止重组蛋白质降解的保护技术 |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3325223A1 (de) | 1983-07-13 | 1985-01-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gegen denaturierung bestaendige, waessrige proteinloesungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
US4766224A (en) * | 1985-08-19 | 1988-08-23 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
US5276016A (en) | 1986-06-03 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Small peptides which inhibit binding to T-4 receptors and act as immunogens |
US4966852A (en) | 1987-07-23 | 1990-10-30 | Monsanto Company | DNA clone of human tissue factor inhibitor |
JPH0662666B2 (ja) * | 1988-01-25 | 1994-08-17 | コンソルテイウム・フュア・エレクトロケミッシェ・インドゥストリー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 不溶蛋白質の可溶化法 |
DE3880122D1 (de) * | 1988-01-25 | 1993-05-13 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur solubilisierung von unloeslichem protein. |
US5466893A (en) | 1989-02-21 | 1995-11-14 | Tatsuta Electric Wire & Cable Co., Ltd. | Printed circuit board having enhanced EMI suppression |
US5378614A (en) * | 1989-08-18 | 1995-01-03 | Novo Nordisk A/S | Vector and method for making tissue factor pathway inhibitor (TFPI) analogues in yeast |
JPH0791318B2 (ja) * | 1989-09-21 | 1995-10-04 | 三井東圧化学株式会社 | 蛋白質水溶液、蛋白質水溶液の濃度増大方法および蛋白質製剤 |
US5849703A (en) * | 1990-08-27 | 1998-12-15 | G. D. Searle & Co. | Pre-formed anticoagulant heparin/TFPI complexes |
PT98779B (pt) | 1990-08-27 | 1999-06-30 | Monsanto Co | Processo para a preparacao de uma composicao anticoagulante contendo inibidor sulfatados e metodos para a sua utilizacao |
JPH07500651A (ja) | 1990-11-28 | 1995-01-19 | タプコ インタナシャナル,インコーポレイティッド | スライド バルブ |
DE4126983A1 (de) | 1991-08-15 | 1993-02-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von humanprotein-enthaltenden, konservierten arzneimitteln fuer infusions- oder injektionszwecke |
US5212091A (en) | 1992-03-02 | 1993-05-18 | Monsanto Company | Method of producing tissue factor pathway inhibitor |
US5276015A (en) | 1992-03-18 | 1994-01-04 | Washington University | Method of inhibiting microvascular thrombosis |
KR950701820A (ko) | 1992-06-11 | 1995-05-17 | 로저 에이. 윌리암스 | 패혈증 및 패혈증-연관 옹고장애의 예방 및 치료(prophylaxs and treatment of sepsis and sepsis-associated coagulation disorders) |
US5358708A (en) | 1993-01-29 | 1994-10-25 | Schering Corporation | Stabilization of protein formulations |
JP3428687B2 (ja) * | 1993-06-30 | 2003-07-22 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組織因子凝固系インヒビターの調製法 |
US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
CA2194443A1 (en) | 1994-07-07 | 1996-01-25 | Dana R. Abendschein | Method of attenuating arterial stenosis |
ATE226249T1 (de) * | 1994-08-05 | 2002-11-15 | Chiron Corp | Herstellung des inhibitors fuer die komplexbildung des gewebefaktors |
PT1602667E (pt) * | 1995-06-07 | 2007-07-13 | Searle Llc | Formulação aquosa que compreende tfpi e agentes de solubilização |
EP1654283B1 (en) * | 2003-08-13 | 2011-07-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Improved method of purifying tfpi and tfpi analogs |
-
1996
- 1996-06-07 PT PT05076848T patent/PT1602667E/pt unknown
- 1996-06-07 EP EP96924269A patent/EP0837883B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 EP EP05076848A patent/EP1602667B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 DK DK96924269T patent/DK0837883T3/da active
- 1996-06-07 AT AT96924269T patent/ATE301675T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 WO PCT/US1996/009980 patent/WO1996040784A2/en active IP Right Grant
- 1996-06-07 AT AT05076848T patent/ATE358684T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-07 US US08/973,211 patent/US6323326B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-07 ES ES96924269T patent/ES2248818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 DE DE69635051T patent/DE69635051T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 ES ES05076848T patent/ES2285632T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 CA CA002223745A patent/CA2223745C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-07 JP JP9502126A patent/JPH11514334A/ja active Pending
- 1996-06-07 DE DE69637012T patent/DE69637012T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-07 DK DK05076848T patent/DK1602667T3/da active
-
1999
- 1999-11-18 US US09/443,098 patent/US6319896B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-11-30 US US09/996,588 patent/US7022672B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-09-18 JP JP2003326585A patent/JP2004083591A/ja not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-23 JP JP2004184539A patent/JP2004315541A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-01-24 US US11/337,518 patent/US7226757B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-04-05 US US11/697,188 patent/US20080281084A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-25 JP JP2007277137A patent/JP2008115176A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019156242A1 (ja) * | 2018-02-09 | 2019-08-15 | Spiber株式会社 | 組換えタンパク質の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0837883B1 (en) | 2005-08-10 |
EP1602667B1 (en) | 2007-04-04 |
PT1602667E (pt) | 2007-07-13 |
US20060128947A1 (en) | 2006-06-15 |
ES2248818T3 (es) | 2006-03-16 |
CA2223745A1 (en) | 1996-12-19 |
US20020137884A1 (en) | 2002-09-26 |
JP2008115176A (ja) | 2008-05-22 |
CA2223745C (en) | 2004-03-16 |
US6319896B1 (en) | 2001-11-20 |
WO1996040784A2 (en) | 1996-12-19 |
ATE358684T1 (de) | 2007-04-15 |
JPH11514334A (ja) | 1999-12-07 |
US7022672B2 (en) | 2006-04-04 |
US6323326B1 (en) | 2001-11-27 |
DE69637012D1 (de) | 2007-05-16 |
EP1602667A1 (en) | 2005-12-07 |
WO1996040784A3 (en) | 1997-03-13 |
DK1602667T3 (da) | 2007-07-23 |
EP0837883A2 (en) | 1998-04-29 |
DK0837883T3 (da) | 2005-12-19 |
DE69635051T2 (de) | 2006-06-14 |
ATE301675T1 (de) | 2005-08-15 |
US7226757B2 (en) | 2007-06-05 |
ES2285632T3 (es) | 2007-11-16 |
JP2004083591A (ja) | 2004-03-18 |
DE69637012T2 (de) | 2009-01-08 |
DE69635051D1 (de) | 2005-09-15 |
US20080281084A1 (en) | 2008-11-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7226757B2 (en) | Formulation, solubilization, purification, and refolding of tissue factor pathway inhibitor | |
JP3537440B2 (ja) | 可溶性トロンボモジュリンを長期保存安定化させる方法 | |
FI85335C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av lyofiliserad, farmaceutisk vaevnadsplasminogenaktivator(t-pa)-komposition. | |
SE462893B (sv) | Vattenhaltig parenteral loesning av vaevnadsplasminogenaktivator och saett foer framstaellning av den | |
US5888968A (en) | TFPI formulation | |
ES2233924T3 (es) | Un procedimiento para preparar fragmentos terapeuticos de factor von willebrand. | |
JP4233114B2 (ja) | フォン・ブィレブランド因子の治療用フラグメント | |
AU713338B2 (en) | Method of solubilizing, purifying, and refolding protein | |
AU713338C (en) | Method of solubilizing, purifying, and refolding protein | |
AU759412B2 (en) | Method of solubilizing, purifying and refolding protein and compositions comprising proteins and solubilizing agents | |
AU2003200506B2 (en) | Method of solubilizing, purifying and refolding protein and compositions comprising proteins and solubilizing agents | |
CA2451973A1 (en) | Method of increasing the solubility of tissue factor pathway inhibitor | |
JPH03218399A (ja) | 尿由来の抗血液疑固物質、その製法およびそれを含有する医薬組成物 | |
CA2054190A1 (en) | Proteins suitable for combating disease and for protecting grazing cattle from ticks | |
WO1992014832A1 (en) | Processes for purifying human bcdf | |
JPH04279598A (ja) | 血清カルシウム降下因子 | |
WO1999061474A1 (fr) | Activine humaine purifiee et son procede de production | |
JPH0625011A (ja) | ヒト尿性トリプシンインヒビター含有液状製剤及びその製造方法 | |
JPH08259595A (ja) | 血小板抗凝集剤、血栓形成予防剤及び止血剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070425 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070719 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070726 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070823 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070828 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070919 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070925 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071025 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080507 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080507 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080507 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100209 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100216 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20100511 |