PT1523553E - Variantes de protease de substituições múltiplas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Variantes de protease de substituições múltiplas" Antecedentes do invento

As serina-proteases são um subgrupo de carbonil-hidrolases. Estas constituem uma classe diversificada de enzimas possuindo uma vasta gama de especificidades e funções biológicas. Stroud, R. Sei. Amer., 131:74-88. Apesar da sua diversidade funcional, a maquinaria catalítica das serina-proteases tem sido aproximada por pelo menos duas famílias de enzimas geneticamente distintas: 1) as subtilisinas e 2) as serina-proteases relacionadas com quimotripsina de mamífero e bacterianas homólogas (e.g., tripsina e tripsina de S. gresius). Estas duas famílias de serina-proteases apresentam mecanismos de catálise notavelmente similares. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46:331-358. Adicionalmente, ainda que a estrutura primária não esteja relacionada, a estrutura terciária destas duas famílias de enzimas associa uma tríade catalítica conservada de aminoácidos consistindo em serina, histidina e aspartato.

As subtilisinas são serina-proteases (aprox. MW 27 500) que são segregadas em grandes quantidades a partir de uma ampla variedade de espécies Bacillus e outros microrganismos. A sequência de proteína de subtilisina foi determinada a partir de pelo menos nove espécies diferentes de Bacillus. Markland, F.S. et al. (1983), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364:1537-1540. Foi noticiada a estrutura cristalográfica tridimensional de subtilisinas a partir de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis e várias variantes naturais de B. lentus. Estes estudos indicam que, embora não esteja geneticamente relacionada com as serina-proteases de mamífero, a subtilisina tem uma estrutura de centro activo similar. As estruturas cristalinas de raios x de subtilisina, contendo inibidores de péptido ligados covalentemente (Robertus, J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) ou complexos de produto (Robertus, J.D., et al. (1976), J. Biol. Chem., 251:1097-1103). têm também proporcionado informação referente ao centro activo e ao entalhe de ligação de substrato putativo de subtilisina. Adicionalmente, tem sido noticiado um grande número de estudos cinéticos e de modificação química para subtilisina; 2 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Svendsen, Β. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41:237-291; Markland, F.S. Id.) bem como pelo menos um artigo onde a cadeia lateral de metionina no resíduo 222 de subtilisina foi convertida por peróxido de hidrogénio em metionina-sulfóxido (Stauffer, D.C., et al. (1965), J. Biol. Chem., 244:5333- 5338) e tem sido realizada extensa mutagénese específica (Wells e Estell (1988) TIBS 13:291-297). W098/55634, WO99/20727 e W099/20770 descrevem todas variantes de subtilisina possuindo substituições em várias combinações de posições. A variante descrita pode ser utilizada (por exemplo) em composições de limpeza.

Sumário do invento 0 invento proporciona uma variante de protease, que é uma variante de uma protease subtilisina de Bacillus lentus precursora possuindo a sequência apresentada na Figura 3, a referida variante sendo caracterizada por possuir a mesma carga electrostática resultante a pH 7 ou o mesmo ponto isoeléctrico que a referida protease precursora, e compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo as substituições R170S-A1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R ou R170S-G100R em relação à referida protease precursora, onde as posições das referidas substituições são equivalentes às posições especificadas na subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura apresentada na Figura 1. 0 invento proporciona ainda um ADN codificando uma tal variante de protease, bem como um vector de expressão compreendendo uma tal sequência de ADN, e uma célula hospedeira transformada com um tal vector de expressão. 0 invento proporciona ainda uma composição de limpeza compreendendo a variante de protease acima descrita. 0 invento proporciona também um método para melhorar o desempenho de lavagem de uma protease subtilisina de Bacillus lentus precursora possuindo a sequência apresentada na Figura 3, compreendendo a introdução das substituições R170S-AlR, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R ou R170S-G100R na referida protease precursora para produzir uma protease variante, onde a referida protease variante tem a mesma carga electrostática resultante a pH 7 ou o mesmo ponto isoeléctrico que a referida protease precursora, e onde a 3 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ referida protease variante tem desempenho de lavagem melhorado em relação à referida protease precursora, onde as posições das referidas substituições são equivalentes às posições especificadas na subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura apresentada na Figura 1. 0 método pode compreender a modificação de uma sequência de ADN codificando a referida protease precursora para produzir uma sequência de ADN modificada codificando a protease variante. Pode ainda compreender a transformação de uma célula hospedeira com um vector contendo a sequência de ADN modificada e a expressão da protease variante a partir da célula hospedeiro transformada.

Breve descrição dos desenhos

As Figs. 1A-C ilustram as sequências de ADN (SEQ ID N0:1) e de aminoácidos (SEQ ID NO:2) para a subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens e um mapa de restrição parcial deste gene. A Fig. 2 ilustra os resíduos de aminoácido conservados entre subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' e

Bacillus lentus (tipo selvagem).

As Figs. 3a e 3b ilustram a sequência de aminoácidos de quatro subtilisinas. A linha de cima representa a sequência de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (também por vezes referida como subtilisina BPN') (SEQ ID NO:3). A segunda linha ilustra a sequência de aminoácidos de subtilisina de Bacillus subtilis (SEQ ID N0:4). A terceira linha ilustra a sequência de aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis (SEQ ID N0:5). A quarta linha ilustra a sequência de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus (também referida como subtilisina 309 no pedido PCT WO89/06276) (SEQ ID NO:6). O símbolo indica a ausência de resíduos de aminoácido específicos em comparação com subtilisina BPN'. A Fig. 4 representa o vector de expressão pVS08 de B. bustilis. 4 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ A Fig. 5 representa a orientação do iniciador Apal directo, do iniciador Apal inverso, do iniciador mutagénico inverso e do iniciador mutagénico directo.

Descrição detalhada do invento

As proteases são carbonil-hidrolases que geralmente actuam para clivar ligações peptidicas de proteínas ou péptidos. Como aqui utilizado, "protease" significa uma protease de ocorrência natural ou uma protease recombinante. Proteases de ocorrência natural incluem a-aminoacilpéptido-hidrolase, peptidilaminoácido-hidrolase, acilamino-hidrolase, serina-carboxipeptidase, metalocarboxipeptidase, tiol-proteinase, carboxil-proteinase e metaloproteinase. Incluem-se proteases de serina, metalo, tiol e ácido, bem como endo e exo-proteases. A presente invenção inclui enzimas protease que são variantes da carbonil-hidrolase (variantes de protease) que não de ocorrência natural possuindo diferentes actividade proteolítica, estabilidade, especificidade para substratos, perfil de pH e/ou característica de desempenho, em comparação com a carbonil-hidrolase precursora a partir da qual a sequência de aminoácidos da variante é derivada. Especificamente, tais variantes de protease têm uma sequência de aminoácidos não encontrada na natureza, que é derivada por substituição de uma pluralidade de resíduos de aminoácido de uma protease precursora por diferentes aminoácidos. A protease precursora pode ser uma protease de ocorrência natural ou uma protease recombinante.

Ao longo deste pedido de patente é feita referência a vários aminoácidos através dos habituais códigos de uma e de três letras. Estes códigos estão identificados em Dale, M.w. (1989), Molecular Genetics of Bactéria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B.

As variantes de protease úteis aqui são derivadas de subtilisina de Bacillus lentus.

As subtilisinas são proteases bacterianas ou fúngicas que actuam geralmente para clivar ligações peptidicas de proteínas ou péptidos. Como aqui utilizado, "subtilisina" significa uma subtilisina de ocorrência natural ou uma 5 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ subtilisina recombinante. Conhece-se uma série de subtilisinas de ocorrência natural que é produzida e muitas vezes segregada por várias espécies microbianas. As sequências de aminoácidos dos membros desta série não são totalmente homólogas. No entanto, as subtilisinas nesta série exibem a mesma, ou um tipo similar de, actividade proteolitica. Esta classe de serina-proteases partilha uma sequência de aminoácidos comum definindo uma triade catalítica que a distingue da classe de serina-proteases relacionadas com a quimotripsina. As subtilisinas e as serina-proteases relacionadas com quimotripsina possuem ambas uma tríade catalítica compreendendo aspartato, histidina e serina. Nas proteases relacionadas com subtilisina a ordem relativa destes aminoácidos, do terminal amino para o terminal carboxi, é aspartato-histidina-serina. Nas proteases relacionadas com quimotripsina, a ordem relativa é porém histidina-aspartato-serina. Assim, subtilisina refere-se aqui a uma serina-protease possuindo a tríade catalítica de proteases relacionadas com subtilisina. Exemplos incluem, mas não estão limitados às subtilisinas aqui identificadas na Fig. 3. Geralmente e para efeitos do presente invento, a numeração dos aminoácidos em proteases corresponde aos números atribuídos à sequência da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura apresentada na Fig. 1. "Subtilisina recombinante" ou "protease recombinante" referem-se a uma subtilisina ou uma protease em que a sequência de ADN codificando a subtilisina ou a protease é modificada para produzir uma sequência de adn variante (ou mutante) que codifica uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos de ocorrência natural. Os métodos adequados para produzir uma tal modificação, e que podem ser combinados com os aqui revelados, incluem os revelados em Patente US RE 34606, Patente US 5204015 e Patente US 5185258, Patente US 5700676, Patente US 5801038 e Patente US 5763257.

Uma "variante de enzima" tem uma sequência de aminoácidos que é derivada da sequência de aminoácidos de uma "enzima precursora". As proteases enzimas precursoras incluem enzimas de ocorrência natural e enzimas recombinantes. A sequência de aminoácidos da variante de enzima é "derivada" da sequência de aminoácidos da enzima precursora por uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos 6 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ da sequência de aminoácidos precursora. Uma tal modificação é da "sequência de ADN da enzima precursora" que codifica a sequência de aminoácidos da enzima precursora em vez de manipulação da enzima precursora per se. Métodos adequados para uma tal manipulação da sequência de ADN precursora incluem métodos aqui revelados, bem como métodos conhecidos dos peritos na especialidade.

Uma "variante de protease" possui uma sequência de aminoácidos que é derivada a partir da sequência de aminoácidos de uma "protease precursora". As proteases precursoras incluem proteases de ocorrência natural e proteases recombinantes. A sequência de aminoácidos da variante de protease é "derivada" a partir da sequência de aminoácidos da protease precursora pela substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos da sequência de aminoácidos precursora. Uma tal modificação é da "sequência de ADN precursora" que codifica a sequência de aminoácidos da protease precursora em vez de manipulação da enzima protease precursora per se. Os métodos adequados para uma tal manipulação da sequência de ADN precursora incluem métodos aqui revelados, bem como métodos conhecidos dos peritos na especialidade (ver, por exemplo, EP 0 328299, WO89/06279 e as patentes US e os pedidos de patente já aqui referenciados). "Aminoácido carregado" é definido como um aminoácido que é potencialmente ionizável, altera a carga e proporciona uma carga electrostática a um pH ou gama de pH especificados. Estes aminoácidos incluem, por exemplo, aminoácidos ácidos, aminoácidos básicos e alguns aminoácidos polares. Aminoácidos ácidos são aqueles que estão carregados negativamente a pH 6,0, por exemplo ácido aspártico (Asp ou D) e/ou ácido glutâmico (Glu ou E) . Aminoácidos básicos são aqueles que estão carregados positivamente a pH 6,0, por exemplo lisina (Lys ou K), arginina (Arg ou R), e/ou histidina (His ou H). "Aminoácido não carregado" é definido como um aminoácido que não é potencialmente ionizável. Estes aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos não polares não carregados e/ou aminoácidos polares não carregados. Aminoácidos não polares não carregados incluem, mas não estão limitados a alanina (Ala ou A), valina (Vai ou V), leucina (Leu ou L), isoleucina (Ile ou I), prolina (Pro ou P), fenilalanina (Phe ou F), triptofano (Trp ou w), e/ou 7 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ metionina (Met ou Μ). Aminoácidos polares não carregados incluem, mas não estão limitados a, glicina (Gly ou G), serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), cisteina (Cys ou C), tirosina (Tyr ou Y), asparagina (Asn ou N) e/ou glutamina (Gin ou Q). "Carga electrostática resultante" é definida como a soma das cargas electrostáticas da enzima ou protease variante ou precursora a um dado pH ou gama de pH. Um pH exemplar é pH 6,0. "Ponto Isoeléctrico" (plG) é definido como o valor de pH onde a proteína ou complexo de proteína, e.g., a protease ou complexo de protease (com opcionalmente metal ou outros iões ligados) é neutro, i.e. a soma de cargas electrostáticas (carga electrostática resultante = NEC) no complexo é igual a zero. Nesta soma tem de ser tida em consideração a natureza positiva ou negativa das cargas electrostáticas individuais. O "mesmo ponto isoeléctrico" (pl0) é definido como o pl0 que está dentro de uma gama definida de unidades de pH. Por exemplo, uma gama definida de unidades de pH poderá ser não superior a 1 unidade de pH, entre 0,25 e 0,75, por exemplo 0,5 unidades de pH, preferivelmente dentro de 0,01 e 0,5 unidades de pH, por exemplo 0,1 unidades de pH, e mais preferivelmente dentro de 0,001 e 0,05 unidades de pH, por exemplo 0,01 unidades de pH do pl0 com o qual o outro pl0 está a ser comparado. O mesmo ponto isoeléctrico pode ser determinado a um dado pH ou a uma gama de pH definida. "Carga electrostática idêntica" é definida como a manutenção de "Z" ou do mesmo número de resíduos carregados específicos na variante de protease como existem na protease precursora. Embora o número dos resíduos carregados possa ser o mesmo, os resíduos aminoácido específicos podem estar substituídos noutras posições próximas do exterior da variante de protease desde que a carga electrostática resultante seja a mesma da protease precursora a um dado pH. A "mesma carga electrostática resultante" é definida como a manutenção de Z, ou da soma das cargas electrostáticas do precursor de protease dentro de uma gama definida da soma de cargas electrostáticas da variante de protease. Manutenção da mesma soma de carga electrostática significa manter a 8 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ carga electrostática resultante dentro de uma gama definida de unidades de carga numa gama definida de pH. Uma variante de protease possuindo a mesma carga electrostática resultante que o precursor de protease terá uma carga electrostática resultante dentro de um número definido de unidades de carga da protease precursora. Por exemplo, a variante de protease possuindo a mesma carga electrostática resultante pode estar a não mais do que 1 unidade de pH, dentro de 0,25 a 0,75 unidades de carga, e.g., 0,5 unidades, da carga electrostática resultante da protease precursora. Ainda mais preferivelmente, a variante de protease possuindo a mesma carga electrostática resultante pode estar dentro de 0,05 a 0,25 unidades, e.g., 0,1 unidades da carga electrostática resultante da protease precursora. Ainda mais preferivelmente, a variante de protease possuindo a mesma carga electrostática resultante pode estar dentro de 0,001 a 0,05 unidades, e.g., 0,01 unidades da carga electrostática resultante da protease precursora. As unidades de carga podem ser definidas como o número de protões doados (ácidos) ou aceites (básicos). A carga electrostática de um aminoácido individual pode ser geralmente comprovada por determinação do número de protões aceite ou doado a um dado pH, por exemplo 6,0 ou 7,0. Os valores de Z podem também ser determinados pelas equações descritas mais tarde neste pedido de patente. "Conteúdo de carga total" da protease variante ou precursora é definido como o número total de cargas electrostáticas da protease respectiva. Uma variante de protease com a mesma carga electrostática resultante pode ter um conteúdo de carga total diferente do da protease precursora.

Como reconhecido pelos peritos na especialidade, o ponto isoeléctrico pode ser convenientemente calculado por utilização de considerações de equilíbrio utilizando valores de pK para os vários resíduos carregados na enzima em questão e depois determinando por iteração o valor de pH para o qual a NEC da molécula de enzima é igual a zero, como descrito na EP 0945502 e nos exemplos ai apresentados.

Um problema com este cálculo é que os valores de pK para os resíduos carregados estão dependentes do seu ambiente e consequentemente sujeitos a variação. No entanto, podem ser obtidos resultados muito bons por atribuição de valores de pK 9 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ aproximados específicos aos resíduos carregados, independentemente do valor real. É também possível realizar cálculos mais sofisticados, tendo parcialmente em consideração o ambiente. 0 pl0 pode também ser determinado experimentalmente por focagem isoeléctrica ou por titulação de uma solução contendo a enzima. Adicionalmente, os vários valores de pK para os resíduos carregados podem ser determinados experimentalmente por titulação.

Num aspecto adicional do invento, as observações anteriores acerca do pl0 são ainda utilizadas num método para determinação ou selecção da(s) posição(ões) e do(s) aminoácido(s) a ser(em) eliminado(s), substituído(s) ou inserido(s) em vez do(s) aminoácido(s) na protease precursora, tal que a carga electrostática resultante ou o ponto isoeléctrico da protease variante sejam os mesmos que a NEC ou o pl0 da protease precursora, calculados para o mesmo valor de pH ou para uma gama de pH definida.

Outra forma de exprimir este princípio abrangido pelo invento é que a(s) posição(ões) e o(s) aminoácido(s) a ser(em) eliminado(s), substituído(s) ou inserido(s) em vez do(s) aminoácido(s) na referida protease ou enzima precursora são seleccionados de um modo pelo qual o número total de cargas ou o conteúdo de carga total (=TCC) e/ou a NEC, numa protease ou enzima variante resultante, são mantidos constantes para proporcionar um protease ou enzima variante possuindo um ponto isoeléctrico que é o mesmo a um pH ou gama de pH definidos para um desempenho de lavagem óptimo da protease ou enzima, pH óptimo que deverá ser tão próximo quanto possível do pH do licor de lavagem, onde a referida protease mutante se destina a ser utilizada.

Como acima indicado, o pl0 de uma macromolécula, tal como uma enzima, é calculado como o pH onde a NEC da molécula é zero. 0 procedimento é exemplificado nos exemplos descritos na EP 0945502, mas os princípios são aqui descritos em mais detalhe.

Atribuem-se valores de pK a cada resíduo aminoácido potencialmente carregado. Depois calcula-se a razão da ocorrência de um resíduo aminoácido a um dado pH, em forma 10 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ carregada ou não carregada (carregada/não carregada, C/U(i)), para ambas as cargas negativa e positiva, utilizando as fórmulas Ia e Ib: C/U (i) =10 (pH~pKl) (carga negativa) (Ia) C/U (i) =10 (pKl~pH) (carga positiva) (Ib).

De acordo com as fórmulas acima, se o pH igualar o pKi, C/U(i) é igual a 1. A carga relativa, Qr(i), ou contribuição de carga atribuída a cada residuo carregado, é depois calculada utilizando as fórmulas lia e Ilb:

Qr (i)=C/U(i)/(1+C/U(i)) (carga negativa) (lia)

Qr(i)= -C/U(i)/(1+C/U(i)) (carga positiva) (Ilb). O valor de pH para o qual a soma de todas as contribuições de carga dos residuos carregados é igual a zero pode ser determinado por iteração ou através de interpolação numa tabela de pH-soma de carga suficientemente densa.

Os peritos na especialidade reconhecerão que outro método de determinação da carga electrostática resultante Z como, se o grupo (tal como o grupo R ou amino) tiver uma forma ácida catiónica, α representa a carga positiva fraccionária: Z = + a= +1 1 + i0(pH‘pKa)

Por outro lado, para grupos tais como o carboxilo, com uma forma ácida neutra e uma base conjugada aniónica, α representa a fracção não carregada. A carga fraccionária é então: Z = -(1- α) = α -1 = _zl_ 1 + io*pKa'pH>

Foi observado que várias propriedades em massa de protease ou enzima estão dependentes da NEC e/ou do ponto isoeléctrico da molécula de protease ou enzima. Por exemplo, a solubilidade, estabilidade, distribuição de fase em meios 11 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ de múltiplas fases e/ou carga de superfície da protease ou enzima são propriedades que são afectadas por uma alteração da NEC e/ou do ponto isoeléctrico da molécula. Surpreendentemente, podem ser realizadas características de protease melhoradas ao mesmo tempo mantendo o mesmo ponto isoeléctrico ou a mesma carga electrostática resultante. Sem pretender estar ligado a uma qualquer teoria particular, os inventores acreditam que existem situações onde é desejável manter as propriedades em massa da proteína, enzima ou protease em questão, modificando ao mesmo tempo a cinética da interacção da molécula, e.g. a distribuição de cargas ou a orientação da molécula em relação a um substrato, superfície ou meio. A variante de protease e a protease precursora têm uma carga electrostática resultante idêntica ou um ponto isoeléctrico idêntico. A mesma carga electrostática resultante pode ser mantida com a carga electrostática idêntica ou compensando a alteração de carga resultante das posições modificadas adicionalmente por modificações adicionais na sequência de aminoácidos da protease precursora. Estas modificações adicionais incluem, mas não estão limitadas a, substituição ou inserção de um resíduo que tem uma carga oposta à desse resíduo adicional (adição de um resíduo ácido adicional para compensar um resíduo básico adicional). Assim é contemplado que o número de resíduos carregados na variante de protease possa ser diferente do número de resíduos carregados do precursor de protease, por exemplo, quando o número de resíduos carregados é maior do que no precursor de protease. Para compensar o resíduo carregado adicional, pode ser efectuada uma substituição de aminoácido carregado de modo oposto correspondente para manter a mesma carga electrostática resultante. Adicionalmente, o número de resíduos carregados na variante de protease ou enzima pode ser menor do que o número de resíduos carregados no precursor de protease ou enzima se uma deleção de aminoácido carregado de modo oposto correspondente ou substituição de outro resíduo não carregado quando um resíduo carregado é eliminado ou substituído por um resíduo não carregado. A NEC ou o pl0 são idênticos, por exemplo, quando o conteúdo de carga total da variante de protease e da protease precursora são o mesmo; ou quando o mesmo número de resíduos 12 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ carregados na protease precursora é mantido. Quando o aminoácido carregado é reposicionado para manter a NEC ou o pl0 idênticos, pelo menos um destes aminoácidos carregados está substituído numa posição de resíduo diferente da posição de resíduo da protease precursora. Se existir um número especificado de um aminoácido carregado específico no precursor de protease, "X" lisinas em Bacillus lentus (GG36), então a protease variante manterá o mesmo número de resíduos lisina, i.e., "X", mas em diferentes posições em relação à protease precursora. Assim, por exemplo, K27 pode estar substituído por um resíduo diferente e o K correspondente substituído noutra posição, preferivelmente uma posição à superfície. Numa concretização, um resíduo carregado, e.g., ácido glutâmico, ácido aspártico, lisina ou arginina, pode estar substituído numa posição diferente. Para manter a carga electrostática idêntica, o resíduo do precursor específico que está substituído pelo resíduo carregado, e.g., resíduo K da posição 27, pode estar substituído na posição 27. Por exemplo um R45N-N204R têm posições de resíduo idênticas substituídas para manter uma carga electrostática idêntica. Adicionalmente, se o resíduo do precursor específico que está substituído pelo resíduo carregado for um resíduo não carregado, outros resíduos não carregados podem estar substituídos numa posição possuindo originalmente um resíduo carregado. Por exemplo, uma combinação R170S-A1R substitui uma alanina por uma arginina substituindo ao mesmo tempo uma arginina por uma serina. Claro que, se são efectuadas múltiplas modificações, qualquer resíduo substituído pode ser substituído em qualquer um dos outros resíduos que estão a ser modificados, desde que seja mantido o mesmo número de cada aminoácido respectivo. A carga electrostática pode ser determinada a qualquer pH predeterminado, desde que a determinação seja efectuada ao mesmo pH para a variante de protease e para a protease precursora. A mesma carga electrostática resultante da molécula pode ser mantida compensando a alteração em carga electrostática resultante devida à modificação na protease precursora. Por exemplo, um modo de conseguir uma tal alteração é inserir ou substituir um resíduo aminoácido carregado de modo oposto adicional ou eliminar um resíduo aminoácido carregado de modo similar mas diferente. Se, por exemplo, existirem mais aminoácidos ácidos presentes na variante de protease do que na protease precursora, a variante incluirá aminoácidos 13 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ básicos adicionais. Se, por exemplo, existirem mais de um aminoácido ácido especifico, por exemplo, ácido glutâmico, presentes na variante de protease do que na protease precursora, para compensar tais modificações, um número correspondente de residuos ácido aspártico poderá ser eliminado ou substituído por um aminoácido não carregado. Por exemplo, se existir um número especificado de um aminoácido carregado na protease precursora, os inventores contemplam aumentar ou diminuir o número desse aminoácido na variante de protease por um aumento ou diminuição correspondentes nos aminoácidos que compensam a alteração no número de aminoácidos carregados. Assim, como acima descrito, resíduos carregados positivamente adicionais poderão ser compensados pela adição de um número correspondente de aminoácidos carregados negativamente ou pela substituição de um número correspondente de outros aminoácidos carregados positivamente por um resíduo não carregado ou suas combinações. Um menor número de resíduos carregados positivamente poderá ser compensado pela deleção de um número correspondente de aminoácidos carregados negativamente, substituição de um número correspondente de resíduos não carregados em vez de um número correspondente de aminoácidos carregados negativamente ou suas combinações.

Numa concretização, o mesmo resíduo aminoácido carregado, que é substituído por um resíduo não carregado numa primeira posição de aminoácido, está substituído numa segunda posição de aminoácido quando o mesmo aminoácido não carregado substituindo o resíduo carregado está presente. Um resíduo não carregado pode estar substituído na posição original do aminoácido carregado, enquanto o aminoácido carregado substituído pode substituir a posição do aminoácido não carregado. Por exemplo, R45N-N204R reflecte uma substituição de um aminoácido não carregado, asparagina, em vez de um aminoácido carregado, arginina. 0 mesmo aminoácido não carregado substituído em vez do aminoácido carregado não necessita de estar presente na posição onde o aminoácido carregado é reinserido. Por exemplo, um aminoácido não carregado, seleccionado entre o grupo de alanina (Ala ou A), glicina (Gly ou G), asparagina (Asn ou N), prolina (Pro ou P), serina (Ser ou S) e/ou treonina (Thr ou T), pode estar substituído na posição do aminoácido carregado enquanto o resíduo aminoácido carregado está substituído numa posição de aminoácido originalmente ocupada por outro no grupo acima. 14 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Por exemplo, na variante E271T-G100E, o aminoácido ácido glutâmico na posição 271 está substituído por um aminoácido treonina, enquanto um residuo glicina na posição 100 está substituído por um aminoácido ácido glutâmico. Do mesmo modo, o aminoácido carregado idêntico não necessita de estar substituído na posição originalmente não carregada, e.g., K27T-G100E. Os aminoácidos carregados ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), lisina (K) e arginina (R) são úteis em relação a este aspecto.

Ainda noutro aspecto do invento, a NEC da variante de protease varia menos do que uma gama de 0,5 unidades de carga (Z) em relação à NEC da protease precursora em toda a gama de pH de 0-14.

Ainda noutro aspecto do invento, a NEC da variante de protease varia menos do que uma gama de 1 unidade de carga em relação à NEC da protease precursora numa gama de pH definida. Essa gama de pH definida poderá estar, por exemplo, dentro de 2 unidades de pH daquele reconhecido na especialidade como o pH óptimo ou desejado para o ambiente de protease ou enzima desejado ou dentro de uma gama de 4 unidades de pH.

Noutro aspecto do invento, foi determinado que a modificação dos resíduos carregados encontrados na protease precursora, mantendo ao mesmo tempo a mesma ou idêntica carga electrostática resultante, pode resultar numa variante de protease apresentando características de lavagem benéficas aumentadas.

Ainda noutro aspecto do invento, foi determinado que a modificação dos resíduos carregados encontrados na protease precursora, mantendo ao mesmo tempo a mesma ou idêntica carga electrostática resultante a um pH definido, numa gama de pH definida, e.g. numa gama de 4 unidades de pH, ou na gama de pH de 0,001 a 14, pode resultar numa variante de protease apresentando características de lavagem benéficas aumentadas.

Resíduos aminoácido carregados exemplares contemplados para modificação pelos inventores incluem, por exemplo, aminoácidos básicos tais como lisina, arginina e/ou histidina; aminoácidos ácidos, por exemplo ácido aspártico 15 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ e/ou ácido glutâmico; e/ou de outro modo grupos R polares, por exemplo tirosina.

As proteases variantes do presente invento podem ter, em relação à referida protease precursora, o mesmo número de resíduo(s) aminoácido(s) carregado(s) positivamente, não só os aminoácidos idênticos como na protease precursora mas também aminoácidos diferentes possuindo a mesma carga, e o mesmo número de resíduo(s) aminoácido carregado(s) negativamente como na protease precursora; ou quer mais quer menos resíduo(s) aminoácido carregado(s) positivamente e mais ou menos resíduo(s) aminoácido carregado(s) negativamente correspondentes, tal que a carga electrostática resultante e/ou o ponto isoeléctrico da variante de protease sejam os mesmos que os da protease precursora.

As proteases variantes do presente invento podem ter, em relação à referida protease precursora, o mesmo número de resíduo(s) aminoácido carregado(s) positivamente, não só aminoácidos idênticos como na protease precursora mas também aminoácidos diferentes possuindo a mesma carga, e o mesmo número de resíduo(s) aminoácido carregado(s) negativamente como na protease precursora; ou quer mais quer menos resíduo(s) aminoácido carregado(s) positivamente e mais ou menos resíduo(s) aminoácido carregado(s) negativamente correspondentes, tal que a carga electrostática resultante e/ou o ponto isoeléctrico da variante de protease sejam os mesmos que os da protease precursora. Foi observado que um aumento no número de resíduos carregados positivos por substituição dos mesmos pode resultar num aumento na eficácia dessa variante particular num ambiente de lavagem particular, enquanto uma alteração de carga oposta correspondente poderá resultar em eficácia aumentada num ambiente de lavagem diferente. Por exemplo, é antecipado que mutações de carga negativa proporcionam características benéficas em ambientes de lavagem de força iónica baixa e que mutações de carga positiva proporcionam características benéficas em ambientes de lavagem de força iónica elevada. É antecipado que variantes que envolvem não só um aumento positivo mas também um aumento negativo, mantendo ao mesmo tempo a mesma carga electrostática resultante ou ponto isoeléctrico, resultarão numa molécula de protease que exibe características melhoradas em ambos os ambientes em comparação com o desempenho da protease precursora. 16 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Estas substituições são efectuadas em subtilisina (recombinante ou do tipo nativo) de Bacillus lentus. A variante de protease pode ainda compreender pelo menos um aminoácido substituído adicional em uma ou mais posições de resíduo equivalentes às posições de resíduo seleccionadas entre o grupo consistindo de 1 , 2-4, 6, 9-12, 14, 15, 17 -20 25, 27, 36- -38, - 40, 44, 49, 51, 52, 54-61, 68, 71, 75, 76, 87 CO kO 91, 97 , 100 -102, 104, 108, 111, 112, 115, 117, 118, 120 123, 128, 129, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 143 -146, 159 164, 165, 167, 171, 173, 175, 180, 182- -187, 191, 192, 194 195, 204, 206, 209- 212, 216, 218, 222, 224, 226 , 234- 245 252, 255, 257 -263 265, 268 , 269 e 274 . Substituiçõe específicas contempladas pelos inventores incluem aquelas equivalentes a: I122A, Y195E, M222A, M222S, Y167A, R170S, A194P, D36, N76D, H120D, G195E e K235N de subtilisina de Bacillus lentus. São de interesse particular variantes nestas posições demonstrando desempenho de lavagem aumentado com uma substituição de aminoácido carregado. Têm interesse variantes de combinação incluindo estas posições e aquelas possuindo originalmente um aminoácido carregado.

Os peritos na especialidade reconhecerão que as variantes de protease possuindo estas modificações podem ser preparadas e são descritas nas Patentes U.S. 5741694, 6190900 e 6197567. Adicionalmente, estas modificações podem também ser efectuadas utilizando métodos directos de transformação de Bacillus como descrito no Pedido de Patente Provisório N.° de Série 60/423087 (depositado em 1 de Novembro de 2002; Neelam Amin e Volker Schellenberger). Numa concretização, as modificações foram realizadas utilizando técnicas de PCR de fusão (Teplyakov, A.V., et al., Protein Eng., 1992 Jul 5(5):413-20) .

Os números das posições de aminoácidos especificados referem-se aos atribuídos à sequência da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura apresentada na Fig. 1. O invento, porém, não é dirigido à mutação desta subtilisina particular. 17 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Pelo contrário, a protease precursora é subtilisina de Bacillus lentus (SEQ ID N0:6) e as substituições são efectuadas nas posições de resíduos de aminoácidos equivalentes em B. lentus correspondentes às acima listadas.

Uma posição de resíduo (aminoácido) de uma protease precursora é equivalente a um resíduo de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se esta for homóloga (í.e., correspondente em posição e estrutura primária), a um resíduo específico em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

De modo a estabelecer homologia com a estrutura primária, a sequência de aminoácidos de uma protease precursora é comparada directamente com a sequência primária de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens e particularmente com um conjunto de resíduos que se sabe serem invariantes em subtilisinas para os quais a sequência é conhecida. Por exemplo, a Fig. 2 aqui apresentada mostra os resíduos conservados entre subtilisina de B. amyloliquefaciens e subtilisina de B. lentus. Após alinhamento dos resíduos conservados, permitindo as necessárias inserções e deleções de modo a manter o alinhamento (í.e., evitando a eliminação de resíduos conservados através deleção e inserção arbitrárias), são definidos os resíduos equivalentes a aminoácidos particulares na sequência primária de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. 0 alinhamento de resíduos conservados deverá preferivelmente conservar 100% destes resíduos. No entanto, um alinhamento superior a 98%, superior a 95%, superior a 90%, superior a 85%, superior a 80%, superior a 75%, superior a 50% ou pelo menos superior a 45% de resíduos conservados é também adequado para definir resíduos equivalentes. A conservação da tríade catalítica, Asp32/His64/Ser221 deverá ser mantida. Siezen et al. (1991) Protein Eng., 4(7):719-737 mostra o alinhamento de um grande número de serina-proteases. Siezen et al. referem-se ao agrupamento como subtilases ou serina-proteases tipo subtilisina.

Por exemplo, na Fig. 3, as sequências de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) e Bacillus lentus estão alinhadas para proporcionar a máxima quantidade de homologia entre sequências de aminoácidos. Uma comparação 18 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ destas sequências mostra que existe um número de resíduos conservados contidos em cada sequência. Estes resíduos conservados (como entre BPN' e B. lentus) estão identificados na Fig. 2.

Estes resíduos conservados podem assim ser utilizados para definir os resíduos de aminoácido equivalentes correspondentes de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens na subtilisina de Bacillus lentus (Publicação PCT N.° WO89/06279 publicado em 13 de Julho de 1989) .

As sequências de aminoácidos de certas subtilisinas estão alinhadas nas Figs. 3A e 3B com a sequência da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para produzir a máxima homologia de resíduos conservados. Como se pode observar, existe um número de deleções na sequência de Bacillus lentus em comparação com a subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Assim, por exemplo, o aminoácido equivalente a Vall65 na subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens nas outras subtilisinas é isoleucina para B. lentus e B. lícheniformis.

Alguns dos resíduos identificados para substituição são resíduos conservados enquanto outros não são. No caso de resíduos que não são conservados, a substituição de um ou mais aminoácidos está limitada a substituições que produzem uma variante que possui uma sequência de aminoácidos que não corresponde a uma encontrada na natureza. No caso de resíduos conservados, tais substituições não deverão resultar numa sequência de ocorrência natural. As variantes de protease do presente invento incluem as formas maduras de variantes de protease, bem como as formas pró e pré-pró dessas variantes de protease. As formas pré-pró são a construção preferida uma vez que isto facilita a expressão, secreção e maturação das variantes de protease. "Pró-sequência" refere-se a uma sequência de aminoácidos ligada à porção N-terminal da forma madura de uma protease que quando removida resulta no aparecimento da forma "madura" da protease. Muitas enzimas proteolíticas são encontradas na natureza como produtos de tradução pró-enzima e, na ausência de processamento pós-tradução, são expressos nesta forma. Uma pró-sequência preferida para produção de variantes de protease é a pró-sequência putativa de subtilisina de 19 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Bacillus amyloliquefaciens, ainda que se possam utilizar outras pró-sequências de protease.

Uma "sequência de sinal" ou "pré-sequência" refere-se a qualquer sequência de aminoácidos liqada à porção N-terminal de uma protease ou à porção N-terminal de uma pró-protease que pode participar na secreção das formas madura ou pró da protease. Esta definição de sequência de sinal é uma definição funcional, destinada a incluir todas aquelas sequências de aminoácidos codificadas pela porção N-terminal do gene de protease que participam na efectivação da secreção de protease sob condições nativas. 0 presente invento utiliza tais sequências para efectuar a secreção das variantes de protease como aqui definidas. Uma sequência de sinal possivel compreende os primeiros sete residuos de aminoácido da sequência de sinal da subtilisina de Bacillus subtilis fundidos com o restante da sequência de sinal da subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).

Uma forma "pré-pró" de uma variante de protease consiste da forma madura da protease possuindo uma pró-sequência ligada operativamente ao terminal amino da protease e uma sequência "pré" ou "de sinal" ligada operativamente ao terminal amino da pró-sequência. "Vector de expressão" refere-se a uma construção de ADN contendo uma sequência de ADN que está ligada operativamente a uma sequência de controlo adequada capaz de efectuar a expressão do referido ADN num hospedeiro adequado. Estas sequências de controlo incluem um promotor para efectuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar esta transcrição, uma sequência codificando locais adequados de ligação ao ribossoma de ARNm e sequências que controlam a terminação de transcrição e da tradução. 0 vector pode ser um plasmideo, uma partícula fágica ou simplesmente uma inserção genómica potencial. Uma vez transformado num hospedeiro adequado, o vector pode replicar e funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou, em alguns casos, pode integrar-se no próprio genoma. No presente fascículo, "plasmideo" e "vector" são por vezes utilizados indiferentemente uma vez que o plasmideo é presentemente a forma mais habitualmente utilizada de vector. No entanto, pretende-se incluir no invento quaisquer outras formas de 20 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ vectores de expressão que sirvam funções equivalentes e que sejam, ou venham a ser, conhecidas na especialidade.

As "células hospedeiras" utilizadas no presente invento são qeralmente hospedeiros procariotas ou eucariotas que preferivelmente foram manipulados pelos métodos revelados na Patente US RE 34606 e/ou na Patente US 5441882 para os tornar incapazes de segregarem endoprotease enzimaticamente activa. Uma célula hospedeira útil para expressar protease é a estirpe de Bacillus BG2036 que é deficiente em protease neutra enzimaticamente activa e protease alcalina (subtilisina). A construção da estirpe BG2036 é descrita em detalhe na Patente US 5264366. Outras células hospedeiras para expressar protease incluem Bacillus subtilis 1168 (também descrita na Patente US RE 34606, na Patente US 5441882 e na Patente US 5264366) bem como qualquer estirpe de Bacillus adequada tal como B. licheniformis, B. lentus, etc. Uma célula hospedeira particularmente útil é a estirpe de Bacillus BG2864. A construção da estirpe BG2864 está descrita em detalhe em D. Naki, C. Paech, G. Ganshaw, V. Schellenberger. Appl. Microbiol Biotechnol (1998) 49:290-294.

As células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com vectores construídos utilizando técnicas de ADN recombinante. Tais células hospedeiras transformadas são capazes quer de replicar vectores codificando as variantes de protease quer de expressar a variante de protease desejada. No caso de vectores que codificam a forma pré ou pré-pró da variante de protease, estas variantes, quando expressas, são tipicamente segregadas pela célula hospedeira para o meio da célula hospedeira. "Ligado operativamente", quando se descreve a relação entre duas regiões de ADN, significa simplesmente que estas estão relacionadas funcionalmente uma com a outra. Por exemplo, uma pré-sequência está ligada operativamente a um péptido se esta funcionar como sequência de sinal, participando na secreção da forma madura da proteína muito provavelmente envolvendo clivagem da sequência de sinal. Um promotor está ligado operativamente a uma sequência de codificação se este controlar a transcrição da sequência; um local de ligação ao ribossoma está ligado operativamente a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. 21 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Os genes codificando a protease precursora de ocorrência natural podem ser obtidos de acordo com os métodos gerais conhecidos dos peritos na especialidade. Os métodos compreendem geralmente sintese de sondas marcadas possuindo regiões codificando sequências putativas da protease de interesse, preparação de bibliotecas genómicas a partir de organismos que expressam a protease e rastreio das bibliotecas quanto ao gene de interesse por hibridação com as sondas. Os clones hibridados positivamente são depois mapeados e sequenciados. A protease clonada é depois utilizada para transformar uma célula hospedeira de modo a expressar a protease. 0 gene da protease é depois ligado num plasmídeo de elevado número de cópias. Este plasmideo replica em hospedeiros no sentido que este contém os elementos bem conhecidos necessários para replicação do plasmideo: um promotor ligado operativamente ao gene em questão (que pode ser fornecido na forma do promotor homólogo do próprio gene, se este for reconhecido, i.e., transcrito, pelo hospedeiro), uma região de terminação da transcrição e de poliadenilação (necessária para estabilidade do ARNm transcrito pelo hospedeiro a partir do gene da protease em certas células hospedeiras eucariotas) que é exógena ou é fornecida pela região terminadora endógena do gene da protease e, desejavelmente, um gene de selecção tal como um gene de resistência a antibiótico que possibilita a manutenção em cultura contínua de células hospedeiras infectadas com plasmídeo por crescimento em meios contendo antibiótico. Os plasmídeos de elevado número de cópias contêm também uma origem de replicação para o hospedeiro, possibilitando por isso gerar grandes números de plasmídeos no citoplasma sem limitações cromossómicas. No entanto, está dentro do presente âmbito integrar múltiplas cópias do gene da protease no genoma do hospedeiro. Isto é facilitado por organismos procariotas e eucariotas que são particularmente susceptíveis a recombinação homóloga. 0 gene pode ser um gene de B. lentus natural. Alternativamente, pode-se produzir um gene sintético codificando uma protease precursora de ocorrência natural ou mutante. Numa tal abordagem, determina-se a sequência de ADN e/ou de aminoácidos da protease precursora. Depois sintetizam-se múltiplos fragmentos de ADN de cadeia simples 22 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ sintéticos, sobrepostos, que após hibridação e ligação produzem um ADN sintético codificando a protease precursora. Um exemplo de uma construção de gene sintético é apresentada no Exemplo 3 da Patente US 5204015.

Uma vez clonado o gene da protease precursora de ocorrência natural ou sintética, são levadas a cabo várias modificações para melhorar a utilização do gene para além da sintese da protease precursora de ocorrência natural. Estas modificações incluem a produção de proteases recombinantes como revelado na Patente US RE 34606, 5741694, 6190900; 6197567; 5972682; 5185258; 5700676 e Publicação do EPO N.° 0251446 e a produção de variantes de protease aqui descritas. O método seguinte de mutagénese por cassetes pode ser utilizado para facilitar a construção das variantes de protease do presente invento, ainda que possam ser utilizados outros métodos. Em primeiro lugar, o gene de ocorrência natural codificando a protease é obtido e sequenciado em todo ou em parte. Depois a sequência é pesquisada para identificar um ponto no qual se deseja efectuar uma mutação (deleção, inserção ou substituição) de um ou mais aminoácidos na enzima codificada. As sequências que flanqueiam este ponto são avaliadas quanto à presença de locais de restrição para substituir um segmento curto do gene por um conjunto de oligonucleótidos que, quando expresso, codificará vários mutantes. Tais locais de restrição são preferivelmente locais únicos dentro do gene da protease de modo a facilitar a substituição do segmento de gene. No entanto, pode-se utilizar qualquer local de restrição conveniente que não seja excessivamente redundante no gene da protease, desde que os fragmentos de gene gerados pela digestão de restrição possam ser de novo montados na sequência correcta. Se não estiverem presentes locais de restrição em localizações a uma distância conveniente do ponto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), tais locais são gerados substituindo nucleótidos no gene de um modo tal que nem o quadro de leitura nem os aminoácidos codificados fiquem alterados na construção final. A mutação do gene de modo a alterar a sua sequência para estar conforme com a sequência desejada é realizada por extensão do iniciador Ml3 de acordo com métodos genericamente conhecidos. A tarefa de localizar regiões de flanqueamento adequadas e de avaliar as alterações necessárias, para chegar a duas sequências de locais de restrição convenientes, é tornada de 23 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ rotina pela redundância do código genético, por um mapa de enzimas de restrição do gene e pelo grande número de diferentes enzimas de restrição. Note-se que, se estiver disponível um local de restrição de flanqueamento conveniente, o método anterior apenas necessita de ser utilizado em relação à região de flanqueamento que não contém um local.

Uma vez clonado o ADN de ocorrência natural ou o ADN sintético, os locais de restrição flanqueando as posições a mutar são digeridos com as enzimas de restrição cognatas e uma pluralidade de cassetes de oligonucleótidos complementares com as extremidades terminais são ligadas no gene. A mutagénese é simplificada por este método porque todos os oligonucleótidos podem ser sintetizados de modo a terem os mesmos locais de restrição, e não são necessários quaisquer ligantes sintéticos para criar os locais de restrição.

As proteases variantes expressas após transformação dos hospedeiros adequados podem ser pesquisados quanto a enzimas isoladas ou recuperadas exibindo características desejadas, e.g. melhores desempenho de lavagem, especificidade por substrato, estabilidade à oxidação, perfis de pH-actividade e outras.

Como aqui utilizada, actividade proteolítica é definida como a velocidade de hidrólise de ligações peptídicas por miligrama de enzima activa. Existem muitos procedimentos bem conhecidos para medição da actividade proteolítica (K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases," Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988). Outros exemplos de métodos para determinação da actividade proteolítica incluem os vários ensaios espectrofotométricos medindo a conversão de substratos seleccionados, indirectamente, por medição da alteração em absorção por uma protease adicionada numa concentração predeterminada de substrato. Substratos exemplares incluem dimetilcaseína, succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA e queratina (ver Patente U.S. N.° de Série 60/344702).

Adicionalmente ou em alternativa à actividade proteolítica modificada, as enzimas variantes do presente invento podem ter outras propriedades modificadas tais como 24 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Km, kcat, razão kcat/Km e/ou especificidade pelo substrato modificadas e/ou perfil de actividade pH modificado. Estas enzimas podem ser desenhadas para o substrato particular que se prevê que esteja presente, por exemplo, na preparação de péptidos, ou para processos hidrolíticos tais como utilizações em lavandaria.

Uma alteração em especificidade por substrato pode definida como uma diferença entre a razão kcat/Km da enzima precursora e da enzima mutante. A razão kcat/Km é uma medida da eficiência catalítica. Descrevem-se nos exemplos carbonil-hidrolases procariotas com razões kcat/Km aumentadas ou diminuídas. Geralmente, o objectivo será conseguir um mutante possuindo uma razão kcat/Km mais elevada (numericamente superior) para um dado substrato, possibilitando desse modo a utilização da enzima para actuar mais eficientemente sobre um substrato alvo. Um aumento na razão de kcat/Km para um substrato pode ser acompanhado por uma redução na razão kcat/Km para outro substrato. Isto é um desvio em especificidade de substrato, e mutantes exibindo estes desvios têm utilidade quando os precursores são indesejáveis, e.g. para prevenir hidrólise indesejada de um substrato particular numa mistura de substratos. kcat e Km podem ser medidos de acordo com procedimentos conhecidos, ou como descrito no Exemplo 18 da Patente U.S. N.° 5441882. A estabilidade à oxidação é um outro objectivo que poderá ser concretizado por variantes de protease descritas nos exemplos. A estabilidade pode ser melhorada ou diminuída como desejado para várias utilizações. Uma estabilidade melhorada poderá ser conseguida eliminando um ou mais resíduos metionina, triptofano, cisteína ou lisina e, opcionalmente, substituindo outro resíduo aminoácido que não um de metionina, triptofano, cisteína ou lisina. As substituições opostas resultam em estabilidade à oxidação diminuída. 0 resíduo substituído poderá ser alanilo, mas são também adequados resíduos neutros. A estabilidade, por exemplo termoestabilidade, é um objectivo adicional que poderá ser conseguido pela variante de protease descrita nos exemplos. A estabilidade pode ser aumentada ou diminuída como desejado para várias utilizações. 25 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Uma estabilidade aumentada poderá ser efectuada por substituição de um ou mais resíduos identificados no presente pedido de patente e, opcionalmente, substituindo outro resíduo aminoácido que não um dos mesmos. A termoestabilidade é a manutenção da actividade enzimática ao longo do tempo a uma dada temperatura. Uma termoestabilidade melhorada envolve a manutenção pela variante de uma maior quantidade de actividade enzimática em comparação com a protease precursora, por exemplo, um nível aumentado de actividade enzimática da variante em comparação com a da precursora a uma dada temperatura, tipicamente a temperatura de operação conforme medida.

Variantes de protease aqui descritas poderão exibir desempenho de lavagem melhorado sob condições de lavagem especificadas. Por exemplo, as variantes de protease poderão exibir diferente desempenho de lavagem sob diferentes condições de lavagem, e.g. temperatura, dureza de água e/ou concentrações de detergente como mostrado pelo desempenho determinado por vários ensaios conhecidos na especialidade, e.g. WO 99/34011 ("An Improved Method of Assaying for a Preferred enzyme and/or Preferred Detergent composition.", publicado em 8 de Julho de 1999) .

No caso de subtilisina de Bacillus ou suas formas pre, prepro e pro, mutações nas posições anteriormente descritas produzem mutantes possuindo alterações nas características acima descritas ou no processamento da enzima. Note-se que estes números de posição de aminoácido são aqueles atribuídos à subtilisina de B. amyloliquefaciens como se pode observar na FIG. 1. Deverá ser entendido que uma deleção ou inserção no sentido N-terminal a partir de uma dada posição deslocará as posições de aminoácido relativas tal que um resíduo não ocupará a sua posição numérica original ou do tipo selvagem. Também, diferenças alélicas e a variação entre várias espécies procariotas resultará em desvios de posições, tal que a posição 169 nestas subtilisinas não será ocupada por glicina. Nestes casos, as novas posições para glicina serão consideradas equivalentes e abrangidas na designação glicina+169. A nova posição para glicina+169 é facilmente identificada por pesquisa da subtilisina em questão no que se refere a uma região homóloga à da glicina+169 na FIG. 1. 26 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Podem ser mutados um ou mais, habitualmente até cerca de 10, resíduos aminoácido. Contudo, não existe qualquer limite ao número de mutações que se podem fazer à parte de considerações de viabilidade comercial.

As presentes enzimas podem ser obtidas como sais. É claro que o estado de ionização de uma proteína dependerá do pH do meio circundante, se estiver em solução, ou da solução a partir da qual é preparada, se estiver em forma sólida. Proteínas ácidas são qeralmente preparadas, por exemplo, como os sais de amónio, sódio ou potássio; proteínas básicas como os cloretos, sulfatos ou fosfatos. Por conseguinte, o presente pedido de patente inclui ambas as formas electricamente neutras e de sal das proteases variantes designadas, e o termo protease refere-se ao esqueleto estrutural orgânico independentemente do estado de ionização.

As variantes de protease são particularmente úteis nas especialidades do processamento de alimentos e da limpeza. As carbonil-hidrolases, incluindo variantes de protease e proteases precursoras, são produzidas por fermentação como aqui descrito e recuperadas por técnicas adequadas. Ver por exemplo K. Anstrup, 1974, Industrial Aspects of Biochemistry, ed. B. Spencer págs. 23-46.

Num aspecto do invento, o objectivo é assegurar uma protease variante possuindo desempenho de lavagem alterado, preferivelmente melhorado, em comparação com uma protease precursora em pelo menos uma formulação de detergente e/ou sob pelo menos um conjunto de condições de lavagem. Estas são formuladas com detergentes ou outros tensioactivos de acordo com métodos conhecidos per se para utilização em processos industriais, especialmente lavandaria. No último caso, as enzimas são combinadas com detergentes, agentes anticalcário, lixívia e/ou agentes de branqueamento fluorescentes, como é conhecido na especialidade para enzimas proteolíticas. Detergentes incluem benzenossulfonatos de alquilo linear, sulfato etoxilado de alquilo, álcool linear sulfatado ou álcool linear etoxilado. As composições podem ser formuladas em forma granular ou líquida. Ver por exemplo Patentes U.S. N.os 3623957, 4404128, 4381247, 4404115, 4318818, 4261868, 4242219, 4142999, 4111855, 4011169, 4090973, 3985686, 3790482, 3749671, 3560392, 3558498 e 3557002. 27 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Existem uma variedade de condições de lavagem, incluindo várias formulações de detergente, volume de água de lavagem, temperatura da água de lavagem e duração do tempo de lavagem, a que uma variante de protease pode estar exposta. Por exemplo, formulações de detergente utilizadas em diferentes regiões têm diferentes concentrações dos seus componentes relevantes presentes na água de lavagem. Por exemplo, um detergente europeu tem tipicamente cerca de 3000-8000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem enquanto um detergente japonês tem tipicamente menos de 800, por exemplo 667 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Na América do Norte, particularmente nos Estados Unidos, um detergente tem tipicamente cerca de 800 a 2000 ppm, por exemplo 975 ppm, de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

Um sistema de baixa concentração de detergente inclui detergentes onde estão presentes menos de cerca de 800 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Os detergentes japoneses são tipicamente considerados um sistema de baixa concentração de detergente uma vez que têm aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

Uma concentração média de detergente inclui detergentes onde estão presentes entre cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Os detergentes da América do Norte são geralmente considerados sistemas de média concentração de detergente uma vez que têm aproximadamente 975 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem. O Brasil tem tipicamente aproximadamente 1500 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem.

Um sistema de elevada concentração de detergente inclui detergentes onde estão presentes mais de cerca de 2000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Os detergentes europeus são geralmente considerados sistemas de elevada concentração de detergente uma vez que têm aproximadamente 3000-8000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem.

Os detergentes da América Latina são geralmente detergentes de agentes anti-calcário de fosfato de elevada 28 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ espuma e a gama de detergentes utilizados na América Latina pode situar-se nas concentrações de detergente tanto médias como elevadas uma vez que estas vão desde 1500 ppm a 6000 ppm de componentes de detergente na água de lavagem. Como acima mencionado, o Brasil tem tipicamente aproximadamente 1500 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem. No entanto, outras geografias de detergentes de agentes anti-calcário de fosfato de elevada espuma, não limitadas a outros paises da América Latina, podem ter sistemas de elevada concentração de detergente com até cerca de 6000 ppm de componentes de detergente presentes na água de lavagem. À luz do anterior, é evidente que concentrações de composições de detergente em soluções de lavagem típicas em todo o mundo variam desde menos do que 800 ppm de composição de detergente ("geografias de baixa concentração de detergente"), por exemplo cerca de 667 ppm no Japão, até entre cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm ("geografias de média concentração de detergente"), por exemplo cerca de 975 ppm nos E.U.A. e cerca de 1500 ppm no Brasil, até mais de 2000 ppm ("geografias de elevada concentração de detergente"), por exemplo cerca de 4500 ppm a cerca de 5000 ppm na Europa e cerca de 6000 ppm em geografias de agentes anti-calcário de fosfato de elevada espuma.

As concentrações das soluções de lavagem típicas são determinadas empiricamente. Por exemplo, nos E.U.A. uma máquina de lavar típica contém um volume de cerca de 64,4 L de solução de lavagem. Por conseguinte, de modo a obter uma concentração de cerca de 975 ppm de detergente na solução de lavagem têm de ser adicionados cerca de 62,79 g de composição de detergente aos 64,4 L de solução de lavagem. Esta quantidade é a quantidade típica medida pelo consumidor para a água de lavagem utilizando o copo de medição fornecido com o detergente.

Como um outro exemplo, diferentes geografias utilizam diferentes temperaturas de lavagem. A temperatura da água de lavagem no Japão é tipicamente inferior à utilizada na Europa. Por exemplo, a temperatura da água de lavagem europeia é geralmente da ordem de 30 a 50 graus centígrados, tipicamente cerca de 40 graus centígrados. A temperatura na água de lavagem norte-americana e/ou japonesa é geralmente inferior à da água de lavagem europeia, por exemplo da ordem 29 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ de 10 a 30 graus centígrados, tipicamente cerca de 20 graus centígrados.

Como um outro exemplo, diferentes geografias utilizam água de diferente dureza. A dureza da água é tipicamente descrita como grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista. A dureza é uma medida da quantidade de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) na água. A maioria da água nos Estados Unidos é dura, mas o grau de dureza varia. Água moderadamente dura (60-120 ppm) a dura (121-181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão [partes por milhão convertidas em grãos por galão U.S. são os ppm divididos por 17,1 para dar grãos por galão] de minerais de dureza. Água Grãos por galão Partes por milhão Macia inferior a 1,0 inferior a 17 Ligeiramente dura 1,0 a 3,5 17 a 60 Moderadamente dura 3,5 a 7,0 60 a 120 Dura 7,0 a 10,5 120 a 180 Muito dura superior a 10,5 superior a 180 A dureza da água europeia é tipicamente 10-20 grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista, por exemplo cerca de 15 grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista. A dureza da água norte-americana é tipicamente superior à dureza da água japonesa, mas inferior à dureza da água europeia, por exemplo, entre 3 a 10 grãos, 3-8 grãos ou cerca de 6 grãos. A dureza de água japonesa é tipicamente inferior à dureza da água norte-americana, tipicamente inferior a 4, por exemplo 3 grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista.

Por conseguinte, um aspecto do presente invento inclui uma variante de protease que exibe desempenho de lavagem melhorado em pelo menos um conjunto de condições de lavagem. Outro aspecto do presente invento inclui uma variante de protease que exibe desempenho de lavagem melhorado em mais do que um conjunto de condições de lavagem, e.g. em condições europeia, japonesa ou norte-americana.

Com base nos resultados de rastreio obtidos com as proteases variantes, as mutações assinaladas em subtilisina 30 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ de Bacillus são importantes para a actividade proteolítica, desempenho e/ou estabilidade destas enzimas e para o desempenho de limpeza ou lavagem destas enzimas variantes.

Muitas das variantes de protease do invento são úteis na formulação de várias composições de detergente ou em formulações de cuidados pessoais tais como champôs ou loções. Vários compostos conhecidos são tensioactivos adequados úteis em composições compreendendo os mutantes de protease do invento. Estes incluem detergentes não iónicos, aniónicos, catiónicos ou "zwitteriónicos", como revelado na US 4404128 de Barry J. Anderson e na US 4261868 de Jiri Flora, et al. . Uma formulação de detergente adequada é a descrita no Exemplo 7 da Patente US 5204015. A especialidade está familiarizada com as diferentes formulações que podem ser utilizadas como composições de limpeza. Para além de composições de limpeza tipicas, é facilmente entendido que as variantes de protease do presente invento podem ser utilizadas para qualquer dos fins para os quais se utilizam proteases nativas ou do tipo selvagem. Assim, estas variantes podem ser utilizadas, por exemplo, em aplicações de sabão liquido ou em barra, formulações para lavagem de louça, soluções ou produtos para limpeza de lentes de contacto, hidrólise de péptidos, tratamento de resíduos, aplicações têxteis, como enzimas de fusão-clivagem na produção de proteínas, etc. As variantes do presente invento podem ter um desempenho melhorado numa composição de detergente (em comparação com o precursor). Como aqui utilizado, desempenho melhorado num detergente é definido como a limpeza aumentada de certas nódoas sensíveis a enzima tais como erva ou sangue, conforme determinado por avaliação usual após um ciclo de lavagem padrão.

As proteases do invento podem ser formuladas em detergentes conhecidos em pó e líquidos possuindo um pH entre 6,5 e 12,0 para níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (preferivelmente 0,1% a 0,5%) em peso. Estas composições de limpeza de detergente podem também incluir outras enzimas tais como proteases conhecidas, amilases, celulases, lipases ou endoglicosidases, bem como agentes anti-calcário e estabilizantes. 31 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ A adição de proteases do invento a composições de limpeza convencionais não cria qualquer limitação especial à utilização. Por outras palavras, qualquer temperatura e pH adequados para o detergente são também adequados para as presentes composições desde que o pH esteja dentro da gama anterior, e que a temperatura esteja abaixo da temperatura de desnaturação da protease descrita. Adicionalmente, as proteases do invento podem ser utilizadas numa composição de limpeza sem detergentes, mais uma vez quer sozinhas quer em combinação com agentes anti-calcário e estabilizantes. 0 presente invento refere-se também a composições de limpeza contendo as variantes de protease do invento. As composições de limpeza podem conter adicionalmente aditivos que são habitualmente utilizados em composições de limpeza. Estes podem ser seleccionados entre, mas não limitados a, branqueadores, tensioactivos, agentes anti-calcário, enzimas e catalisadores de branqueamento. Será prontamente evidente para um técnico competente na especialidade quais os aditivos que são adequados para inclusão nas composições. A lista aqui fornecida não é de modo algum exaustiva e deverá ser considerada apenas como exemplo de aditivos adequados. Será também prontamente evidente para um técnico competente na especialidade utilizar apenas aqueles aditivos que sejam compatíveis com as enzimas e com outros componentes na composição, por exemplo, tensioactivos.

Quando presentes, a quantidade de aditivo presente na composição de limpeza é de cerca de 0,01% a cerca de 99,9%, preferivelmente cerca de 1% a cerca de 95%, mais preferivelmente cerca de 1% a cerca de 80%.

As proteases variantes da presente invenção podem ser incluídas em alimentos para animais como parte de aditivos de alimentação animal, como descrito, por exemplo, em US 5612055; US 5314692; e US 5147642.

Uma composição para o tratamento de um têxtil pode incluir proteases variantes do presente invento. A composição pode ser utilizada para tratar por exemplo seda ou lã como descrito em publicações tais como RE 216034; EP 134267; US 4533359; e EP 344259. 32 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ Ο seguinte é apresentado a título de exemplo e não deve ser entendido como uma limitação do âmbito das reivindicações.

Exemplo 1

Um grande número de variantes de protease foram produzidas e purificadas utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Todas as mutações foram efectuadas em subtilisina de Bacillus lentus GG36. As variantes são apresentadas na Tabela 1. Algumas destas são variantes do invento. Outras são fornecidas para fins ilustrativos.

Para construir as bibliotecas saturadas em locais de GG36 e as variantes de locais específicos, foram realizadas três reacções de PCR: duas PCR para introduzir o codão mutado de interesse em GG36 e uma PCR de fusão para construir o vector de expressão incluindo a(s) mutação(ões) desejada(s).

Os codões de GG36 de interesse estão numerados de acordo com a numeração bpn' (listados nas Figuras 1A-C e 3A-B).

Para a construção da biblioteca saturada em locais: 0 método de mutagénese foi baseado na abordagem da mutação específica de região (Teplyakov et al., 1992) na qual a criação de todas as mutações possíveis de uma vez num codão de ADN específico foi realizada utilizando um conjunto de iniciadores de oligonucleótido directo e reverso complementar com um comprimento de 30-40 nucleótidos, incluindo uma sequência de ADN tripla desenhada específica NNS ((A, C, T ou G), (A, C, T ou G), (C ou G)) que corresponde à sequência do codão a ser mutado e garante a incorporação aleatória de nucleótidos nesse codão.

Para a construção de variante de local específico: O iniciador mutagénico directo e reverso inclui três mutações desejadas no meio do iniciador com 15 bases de sequências homólogas em ambos os lados. Estas mutações, que cobrem o codão de interesse, são específicas para o aminoácido desejado e são sintetizadas à medida. 33 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ Ο segundo conjunto de iniciador utilizado para construir as bibliotecas e variantes contém o local de digestão ApaI de pVS08 em conjunto com a sua sequência de nucleótidos de flanqueamento.

Iniciadores Apal:

Iniciador Apal directo:

GTGTGTGGGCCCATCAGTCTGACGACC

Iniciador Apal reverso:

GTGTGTGGGCCCTATTCGGATATTGAG A introdução da(s) mutação(ões) em moléculas de GG36 foi realizada utilizando Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity da Invitrogen (Carlsbad, CA, n.° de cat. 11304-102) em conjunto com o ADN de matriz de pVS08 e o iniciador mutagénico directo e o iniciador Apal reverso para a reacção 1, ou o iniciador mutagénico reverso e o iniciador Apal directo para a reacção 2. A construção do vector de expressão, incluindo a(s) mutação(ções) desejada(s), foi realizada por uma PCR de fusão utilizando um fragmento de PCR de ambas as reacções 1 e 2, iniciador Apal directo e reverso e Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity da Invitrogen (n.° de cat. 11304-102) .

Todas as PCR foram executadas de acordo com o protocolo da Invitrogen fornecido com as polimerases, excepto para o número de ciclos: 20 em vez de 30. São realizadas duas reacções PCR separadas utilizando Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity da Invitrogen (n.° de cat. 11304-102): o fragmento de 5,6 kb linear amplificado foi purificado (utilizando o kit de purificação de PCR Qiaquick Qiagen® n.° de cat. 28106) e digerido com enzima de restrição Apal para criar extremidades coesas de ambos os lados do fragmento de fusão: • 35 pL de fragmento de ADN purificado • 4 pL de tampão React® 4 (Invitrogen®: Tris-HCl 20 mM, MgCl2 5 mM, KC1 50 mM, pH 7,4) • 1 pL de Apal, 10 unidades/ml (Invitrogen® n.° de cat. 15440-019) • Condições de reacção: 1 hora, 30°C. 34 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Foi realizada uma digestão adicional com DpnI da Invitrogen para remover o ADN de matriz de pVS08: • 40 pL de fragmento de ADN digerido com Apal • 1 pL de Dpnl, 4 unidades/pL (Invitrogen® n.° de cat. 15242-019) • Condições de reacção: 16-20 horas, 37°C. A ligação do fragmento duplamente digerido e purificado resulta em novo ADN circular contendo a mutação desejada que foi directamente transformado no Bacillus subtilis competente: • 30 pL de fragmento de ADN digerido com Apal e Dpnl purificado • 8 pL de tampão de ADN-ligase T4 (Invitrogen® n.° de cat. 46300-018) • 1 pL de ADN-ligase T4, 1 unidade/pL (Invitrogen® n.° de cat. 15224-017) • Condições de reacção: 16-20 horas, 16°C.

As misturas de ligação foram transformadas em Bacillus subtilis BG2864 (Naki et al., 1997) utilizando o método de Anagnostopoulos e Spizizen (1961) e seleccionadas pela resistência a cloranfenicol e actividade de protease. Método para produção de proteína

Inocular 1-50 pL de cultura de glicerol em meio MOPS (Frederick C. Neidhardt et al., 1974) contendo fontes de carbono (glucose e maltodextrina, 10,5 e 17,5 g/1), uma fonte de azoto (ureia, 3,6 g/1) e nutrientes essenciais, tais como fosfato (0,5 g/1) e sulfato (0,5 g/1), e ainda suplementada com elementos vestigiários (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, 1-4 mg/ml). O meio foi tamponando com uma mistura de MOPS/Tricina resultando num pH variando de 7 a 8. Incubar a cultura durante 1-5 dias a 37°C/220 rpm (Infors HT® Multitron II).

Referências: "Protein engineering of the high-alkaline serine protease PB92 from Bacillus alcalophilus: functional and structural consequences of mutation at the S4 substrate binding pocket", Teplyakov A.V., van der Laan J.M., Lammers 35 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ Α.Α., Kelders Η., Kalk Κ.Η., Misset 0., Mulleners L.J., Dijkstra B.W., Protein Eng. Jul. 1992; 5(5):413-20. "Selection of a subtilisin-hyper producing Bacillus in a highly structured environment" por D. Naki, C. Paech, G. Ganshaw, V. Schellenberger em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1998) 49:290-294. "Requirements for transformation in Bacillus subtilis" por Anagnostopoulos, C. e Spizizen, J. em J. Bacteriol. 81, 741-746 (1961) . "Culture Médium for Enterobacteria" por Frederick C. Neidhardt, Philip L. Bloch e David F. Smith em Journal of Bacteriology, Set 1974, págs. 736-747 Vol. 119. N.° 3.

Tabela 1

GG36 R45N G118E E27IR R45N P14R R45N N204R D181N G118D R45N G258R R170S N204R R45N S216R R170S P14R R170S G61R R170S S49R R170S S216R R170S S128R R170S G258R R170S AIR R170S G100R R45N S128R R45N G61R R45N AIR 36 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

D181N G258D E271T S49E E271T T66E E271T G102E E271T G100E E271T S128E K2 7T G100E K251G S87K

Exemplo 2

As variantes de protease produzidas no Exemplo 1 foram testadas quanto ao desempenho em dois tipos de detergentes e condições de lavagem utilizando um ensaio microswatch descrito em "An improved method of assaying for a prefered enzyme and/or prefered detergent compositions", N.° de Série U.S. 09/554 992 [WO 99/34011].

As Tabelas 2 e 3 listam as proteases variantes ensaiadas e os resultados do ensaio em dois detergentes diferentes. Para a coluna A e C, o material ensaiado foi produzido cultivando as estirpes transformantes numa placa MTP. Para as colunas B e D, o material ensaiado foi produzido cultivando as estirpes transformantes num balão agitado (250 ml) . Para as colunas A e B, o detergente foi Ariel Regular filtrado 7,6 g/1 (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, E.U.A.), numa solução contendo 15 grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista, e utilizaram-se 0,5 ppm de enzima em cada poço a 40°C [condições europeias]. Para as colunas C e D, o detergente foi Tide Opal filtrado 0,67 g/1 (Procter & Gamble,

Cincinnati, OH, E.U.A.), numa solução contendo 3 grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista, e utilizaram-se 0,5 ppm de enzima em cada poço a 20°C [condições japonesas]. Um indice de desempenho foi calculado pela fórmula seguinte:

Desempenho de lavagem da variante dividido pelo desempenho de lavagem de GG36 (tipo selvagem)

Calculou-se a média de quatro valores de desempenho para chegar aos valores apresentados na Tabela 2. 37 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Tabela 2 GG36 1,00 R170S-A1R 2, 09 R170S-G61R 2, 03 R170S-N204R 1, 79 R45N-G118E-E271R 1, 75 D181N-G118D 1,54 R45N-N204R 1,47 K251G-S87K 1,39 R45N-P14R 1,28 R45N-G258R 1,23 R170S-S216R 1,21 R45N-S216R 1, 05 R170S-P14R 1, 03 R45N-A1R 1, 01 R170S-S49R 0, 93 R45N-G61R 0,87 D181N-G258D 0, 81 R45N-S128R 0, 80 R170S-S128R 0,63 R170S-G258R 0,36 E271T-S49E 0,34 E271T-G100E * Ε271Τ-Τ66Ε * E271T-G102E * R170S-G100R * E271T-S128E * K27T-G100E * * nível de protease demasiado baixo para a realização de um teste de des ;empenho fiável 38 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Tabela 3 Variante índice de desempenho GG36 1,00 E271T-G100E 3,22 E271T-S128E 2,33 K251G-S87K 2, 06 K27T-G100E 2, 04 E271T-G102E 1, 85 R170S-G100R 1, 79 R170S-A1R 1,55 E271T-S49E 1, 43 R170S-S128R 0, 85 R170S-S49R 0, 80 R170S-N204R 0, 77 R170S-P14R 0, 76 R45N-A1R 0, 75 R170S-G61R 0,67 R170S-S216R 0,61 R45N-P14R 0,53 R45N-G258R 0,53 R170S-G258R 0, 45 R45N-G61R 0,43 R45N-S216R 0,32 R45N-N204R 0,31 D181N-G258D 0,28 D181N-G118D 0,28 R45N-G118E-E271R 0,25 R45N-S128R 0,22 Ε271Τ-Τ66Ε * *nível de protease demasiado baixo para a realização de um teste de desempenho fiável ^036 é a protease do tipo selvagem de Bacillus lentus (SEQ ID N0:4) 39 ΕΡ 1 523 553/ΡΤ

Como resultado dos ensaios acima descritos, algumas variantes exibiram um índice de desempenho superior ao da protease do tipo selvagem GG36. Por exemplo, as variantes R45N-G118E-E271R, R45N-P14R, R45N-N204R, D181N-G118D e R45N-G258R exibiram índices de desempenho de 1,75, 1,28, 1,28, 1,24 e 1,23, respectivamente (Tabela 2), num ensaio de microswatch (wo 99/34011) sob condições europeias (15 grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista, 40 graus centígrados, 0,5 ppm). As variantes R170S-A1P, R170S-G61R, R170S-N204R, K251G-S87K e R170S-S216R exibiram índices de desempenho de 2,09, 2,03, 1,79, 1,54, 1,47, 1,39 e 1,21, respectivamente (Tabela 3). As variantes E271T-G100E, E271T-G102E, E271T-S128E, K27T-G100E, R170S-G100R e E271T-S49E exibiram índices de desempenho de 3,22, 1,85, 2,33, 2,04, 1, 79 e 1,43, respectivamente (Coluna Tabela 3), no ensaio da placa de microtitulação de 96 poços (WO 99/34011) Microswatch sob condições japonesas (3 grãos por galão de dureza Ca2+/Mg2+ mista, 20 graus centígrados, 0,5 ppm). As variantes K251G-S87K, R170S-A1R e E271T-S128E exibiram índices de desempenho de 2,06, 1,55 e 1,20, respectivamente (Tabela 3). Variantes K251G-S87K e R170S-A1R exibiram índices de desempenho superiores a 1,00 sob ambas as condições japonesas e europeias.

Lisboa, 2010-02-25

Claims (8)

1. ΕΡ 1 523 553/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Variante de protease, que é uma variante de uma protease subtilisina de Bacillus lentus precursora possuindo a sequência apresentada na Figura 3, a referida variante sendo caracterizada por possuir a mesma carga electrostática resultante a pH 7 ou o mesmo ponto isoeléctrico que a referida protease precursora, e compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo as substituições R170S-A1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R ou R170S-G100R em relação à referida protease precursora, onde as posições das referidas substituições são equivalentes às posições especificadas na subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura apresentada na Figura 3.
2. 2. ADN codificando uma variante de protease da reivindicação 1.
3. 3. Vector de expressão compreendendo o ADN da reivindicação 2.
4. 4. Célula hospedeira transformada com o vector de expressão da reivindicação 3.
5. 5. Composição de limpeza compreendendo a variante de protease da reivindicação 1.
6. 6. Método para melhorar o desempenho de lavagem de uma protease subtilisina de Bacillus lentus precursora possuindo a sequência apresentada na Figura 3, compreendendo a introdução das substituições R170S-A1R, R170S-G61R, R170S- N204R, R170S-S216R ou R170S-G100R na referida protease precursora para produzir uma protease variante, onde a referida protease variante tem a mesma carga electrostática resultante a pH 7 ou o mesmo ponto isoeléctrico que a referida protease precursora, e onde a referida protease variante tem desempenho de lavagem melhorado em relação à referida protease precursora, onde as posições das referidas substituições são equivalentes às posições especificadas na subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura apresentada na Figura 3.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6 compreendendo a modificação de uma sequência de ADN que codifica a ΕΡ 1 523 553/ΡΤ 2/2 referida protease precursora para produzir uma sequência de ADN modificada codificando a referida protease variante.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7 compreendendo a transformação de uma célula hospedeira com um vector contendo a referida sequência de ADN modificada e a expressão da referida protease variante a partir da célula hospedeira transformada. Lisboa, 2010-02-25