PT95741B - Processo para a preparacao de uma composicao de limpeza enzimatica de carbonil-hidrolase compreendendo subtilisina - Google Patents

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novas mutantes de carbonil-hidrolase tendo uma sequência de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos de uma carbonil-hidrolase, precursora especificamente os que das posições correspondemaos resíduos +123 e/ou. +274 em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens,foram substituídos por um aminoácido diferente. Essas carbonil-hidrolase mutantes, em geral, obtêm-se por modificação in vitro de uma sequência de ADN precursora que codifica uma carbonil-hidrolase de ocorrência natural ou recombinante para codificar a substituição de um ou dos dois resíduos desses aminoácidos numa sequência precursora de aminoáci dos sozinha ou em combinação com outra substituição, inserção ou supressão na sequência de aminoácidos precursora.

Enquadramento Geral da Invenção

As serina-proteases são um subgrupo das carbonil-hidrolases. Compreendem uma classe diversa de enzimas que. têm uma larga gama de especificidades e de funções biológicas (R. M. Stroud, (1974) Sei. Amer., 131, 74 - 88). Não obstante a sua diversidade funcional, o mecanismo catalítico das se rina-proteases foi abordado por pelo menos duas famílias geneticamente distintas de enzimas: as subtilisinas e as serina-proteases relacionadas· com a quimotripsina dos mamíferos e de bactérias homólogas (por exemplo, tripsina e tripsina de S. gresius). Estas duas famílias de serina-proteases reúnem macanismos de catálise notavelmente semelhantes (J. Kraut (1977) Ann. Rev. Biochem., 46, 331 - 358). Além disso, muito embora as estruturas primárias não estejam relacionadas,

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as estruturas terciárias destas duas famílias de enzimas reúnem uma tríade catalítica conservada de aminoácidos que consiste em serina, histidina e aspartato.

A subtilisina é uma serina-endoprotease (peso molecular 27 500), que é segregada em grandes quantidades por uma grande variedade de espécies Bacillus e de outros microorganismos. A sequência de proteína da subtilisina foi determinada a partir de pelo menos quatro espécies diferentes de Bacillus (F. S. Markland e col. (1983), Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364, 1537 - 1540). A estrutura cristalográfica a três dimensões de subtilisina de Bacillus amyloliquefa ciens com a resolução de 2,5 A foi também já referida (G. S. Wright e col. (1969), Nature, 221, 235 - 242; J. Drenth e col (1972), Eur.J. Biochem., 26, 177 - 181).

Estes estudos indicam que, muito embora a subtilisina não esteja geneticamente relacionada com as serina-proteases de mamíferos, tem uma estrutura de sítios activos semelhante. As estruturas cristalinas determinadas por raios X de inibidores de péptidos ligados covalentemente que contêm subtilisina (J. D. Robertus e col. (1972), Biochemistry 11, 2439 - 2449) ou produtos complexos (J. D. Robertus e col. (1976), J. Biol. Chem. 251, 1097 - 1103), também proporcionaram informação relativamente ao sítio activo e à putativa fissura da ligação de subtilisina com o substrato.Além disso, um grande número de estudos de cinética e de modificação química foram feitos para a subtilisina (M. Philipp e col (1983), Mol. Cell. Biochem. 51, 5 - 32; B. Svendsen (1976), Carlsbera Res. Comm. 41, 237 - 291; F. S. Markland, ibidem), assim como pelo menos um estudo em que a cadeia lateral de metiona do resíduo 222 de subtilisina foi transformada por peróxido de hidrogénio de maneira a obter-se sulfóxido de metionina (D. C. Stauffer e col. (1965) J. Biol. Chem, 5333 5338) e a cadeia lateral de serina do resíduo 221 foi transformada em cisteína por modificação química (Polgar e col. (1981), Biochimica et Biophysica Acta, 667, 351 - 354).

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A patente de Invenção Norte-Americana Número 4 760 025, e a Publicação do Pedido de Patente Europeia Núme. ro 0 130 756, publicada em 9 de Janeiro de 1985, descrevem a modificação de resíduos de aminoácidos de subtilisina que correspondem a posição na-subtilisina de Bacillus amylolique-faciens da tirosina -1, aspartato +32, asparagina +155, tirosina +104, metionina +222, glicina +166, histidina +64, glicina +169, fenilalanina +189, serina +33, serina +221, ti. rosina +217, glutamato +156 e alanina +152.

A Publicação do Pedido de Patente Europeia Número 0 251 446, publicado em 7 de Janeiro de 1988, refere outros resíduos de aminoácidos na subtilisina de Bacillus amyloliquefacièns e os seus equivalentes que podem ser modi^ ficados por meio de qualquer substituição, inserção ou supre^ são e que podem ser combinadas com modificações para os resí. duos identificados na Patente de Invenção Norte-Americana Número 4 760 025, para formar mutantes úteis de subtilisina. 0s resíduos particulares identificados na presente memória descritiva, no entanto, não são identificados nestas referên cias.

De maneira semelhante, as publicações dos Pe. didos PCT W0 89/09819 e W0 89/09830, ambas publicadas em 19 de Outubro de 1989, referem-se a enzimas de subtilisina preparadas fazendo a mutação de uma sequência de nucleótidos que codifica uma subtilisina. São identificados numerosos re. síduos de aminoácidos em cada uma dessas publicações, que po. dem ser assim-modificados. No entanto, como acontece com as referências previamente identificadas, nenhuma delas identifica os resíduos de acordo com a presente invenção.

Por consequência, é um objectivo da presente invenção proporcionar carbonil-hidrolases mutantes que contêm a substituição dos resíduos de aminoácidos numa carbonil^

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-hidrolase precursora que corresponde às posições +123 e/ou +274 da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Geralmente, essas mutantestêm uma propriedade, pelo menos, que é diferente da mesma propriedade da carbonil-hidrolase precursora de que deriva o aminoácido da referida mutante.

É ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar sequências de ADN que codificam essas carbonil-hidrolases mutantes assim como os vectores de expressão que contêm essas sequências de ADN mutantes.

Assim nm outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar células hospedeiras transformadas com esses vectores, assim como células hospedeiras capazes de expressar esse ADN para produzir carbonil-hidrolases mutantes intracelularmente ou extracelularmente.

Sumário da Invenção

A presente invenção inclui carbonil-hidrolases mutantes que não ocorrem naturalmente e que têm uma activida de proteolítica diferente, uma característica de estabilidade e/ou de comportamento diferentes em comparação com a carboni)^ -hidrolase precursora na qual a sequência de aminoácidos mu-tante deriva. A carbonil-hidrolase precursora pode ser uma carbonil-hidrolase de ocorrência natural ou uma hidrolase recombinante. Especificamente, essas carbonil-hidrolases mutantes têm uma sequência de aminoácidos que não se encontra na Natureza, que derivam da substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos de uma carbonil-hidrolase precursora por um ou mais aminoácidos diferentes .Um ou mais resíduos de ami. nóácidos da enzima precursora correspondem a posições Asn +123 e/ou Ala + 274 de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens ou resíduos de aminoácidos equivalentes em outras carbonil-hidrolases ou subtilisinas.

A invenção também inclui sequências de ADN mutantes que codificam essas carbonil-hidrolases ou de subtilisinas mutantes.

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Essas sequências de ADN mutantes derivam de uma sequência de ADN precursora que codifica uma enzima precursora de ocorrência natural ou recombinante. As sequências de ADN mutantes são obtidas modificando a sequência de ADN precursora de maneira a codificar a substituição de um ou mais resíduos específicos de aminoácidos codificados pela sequência precursora de ADN que corresponde à posição +123 e/ou +274 em Bacillus amyloliquefaciens. Estas sequências de ADN recombinantes codificam carbonil-hidrolase mutantes que têm uma nova sequência de aminoácidos e, em geral, pelo menos, uma propriedade que é substancialmente diferente da mesma pro priedade da enzima codificada pela sequência de.ADN -de carbonil-hidrolase precursora. Essas· propriedades incluem actividade proteolítica, estabilidade e/ou características de ren dimento melhoradas.

A invenção também inclui subtilisina procarióticas í.ea.eucaríóticas com um resíduo de aminoácido diferente tal como serina, em posições equivalentes a Asn +123 em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens e a subtilisina com resíduos de aminoácidos diferentes em posições equivalentes à posição +274 em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens .

Além disso, a invenção inclui também vectores de expressão que contêm essas sequências de ADN de carbonil-hidrolase mutante, assim como células hospedeiras.trans formadas com esses vectores que são capazes de produzir essas mutantes. A invenção também se refere a composições detergentes qúe compreendem as carbonil-hidrolases mutantes de acordo com a presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 representa a sequência de ADN e aminoácidos para a subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens e um mapa de restrição parcial deste gene.

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A Figura 2 representa os- resíduos de aminoácidos conservados entre as subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens, B, subtilis varI168 e B. licheniformis (carlsbergensis).

As Figuras 3A e 3B representam a sequência de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis varI168 e B. licheniformis.

A Figura 4 representa a sequência de aminoácidos de três subtilisinas. A linha superior representa a sequêncig de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (também por vezes designada como subtilisina BPN'). A segunda linha representa a sequência de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus (subtilisina 309 como se refere na Publicação do Pedido PCT WO 89/06276). A linha inferior representa a sequência de aminoácidos de uma forma de realização preferida da presente invenção, designada GC-RYSA. 0 símbolo * significa a ausência de resíduos de aminoácidos específicog em comparação com a subtilisina BPN’;

A Figura 5 representa a construção do plasmídio pGC A274.

A Figura 6 representa a construção de pGC-KVNA, que é um intermediário do plasmídio pGC-RYSA.

A Figura 7 representa o método de oligonucleóti dos duplos para construir um gene de subtilisina sintético de Bacillus lentus . - . ..

A Figura 8' representa a estratégia para a construção de um gene sintético que codifica a subtilisina de Bacillus lentus .

A Figura 9 representa a cassete utilizada para fazer as substituições no ADN na posição do codão +123 por mutagénese da cassete. XXX representa o codão modificado para codificar as substituições de aminoácidos dna posição ' +123.

A Figura 10 representa a sequência de ADN e de aminoácidos de uma forma de realização preferida da presente invenção em que a sequência de ADN é um ADN sintético . 0

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ADN desta figura foi modificada de maneira a codificar arginina na posição 27, serina na posição 78, tirosina na posiçãc 104, serina na posição 123 e alanina na posição 274.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Verificou-se que mutações in vitro na subtilisina de carbonilrhidrolase num resíduo de aminoácido equivalente a +123 na subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens produzem mutantes de subtilisina que possuem actividade proteolítica alterada relativamente às subtilisinas precursoras.

Verificou-se também que a mutação in vitro nos resíduos equivalentes a +274 na subtilisina' de Bacillus amyloliquefaciens produz subtilisina mutantes que possuem uma estabilidade alterada, por exemplo, estabilidade antoproteolítica modificada. Em alguns casos, estas últimas mutantes também possuem um comportamento melhorado quado são utilizadas em composições detergentes.

As carbonil-hidrolase são enzimas que hidrolisam compostos que contêm ligações de fórmula:

-X em que X é oxigénio ou azoto. Elas incluem carbonil-hidrolases de ocorrência natural e carbonil-hidrolases recombinantes. As carbonil-hidrolases de ocorrência natural incluem orincipalmente hidrolases, por exemplo, hidrolases de péptidos. tais como subtilisinas ou metaloproteases.As hidrolases de péptidos incluem alfa-amino-acil-péptido-hidrolase, péptidilamino-ácido hidrolase, acilamino hidrolase, serina carboxipeptidase metalocarboxipeptidase, tiol-proteinase, carboxil proteinase e metaloproteinase. As serina, metalo, tiol e ácido proteases são também inclúídas quer sejam endoprotea, ses quer exoproteases.

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A expressão carbonil-hidrolase recombinante refere-se a uma carbonil-hidrolase em que a sequência de ADN que codifica carbonil-hidrolase que ocorre naturalmente é modificada para originar uma sequência de ADN mutante que codifica a substituição, a inserção ou a supressão de um ou mais aminoácidos na sequência dos aminoácidos de carbonil-hidrolase. Os métodos de modificação apropriados são referidos na presente memória descritiva, na Publicação do Pedido de Patente Europeia Número 0 130 756, publicado em 9 de Janeiro de 1985 e na publicação do Pedido de Patente Europeia Número 0 251 446, publicado em 7 de Janeiro de 1988.

As subtilisinas são carbonil-hidrolase de origem bacteriana ou fúngica que actuam de maneira e clivar as ligações de péptidos das proteínas ou dos péptidos. Tal como é utilizado na presente memória descritiva, o termo sul tilisina significa uma subtilisina de ocorrência natural ou uma subtilisina recombinante. Sabe-se como se produzir uma série de subtilisinas de ocorrência natural e que são muitas vezes segregadas por várias espécies microbianas. As sequências de aminoácidos nos membros desta série não são inteiramente homólogas. No entanto,as.subtilisinas desta série possuem o mesmo tipo ou uo um tipo semelhante de actividade proteolítica. Esta classe de serina proteases compartilha uma sequência comum de aminoácidos que definem uma tríade catalítica que as distingue da classe relacionada com quimotripsina de serina proteases. As subtilisinas e as serina proteases realcionadas com quinotripsina têm ambas uma tríade catalítica que compreende aspartato, histidina e serina. Nas proteases relacionadas com subtilisina, a ordem realtiva des. tes aminoácidos a contar da extremidade amino para a extremidade carboxi é aspartato-histidina-serina. Nas proteases relacionadas com quimotripsina, a ordem relativa é, no entan to, histidina-aspartato-serina. Assim, o termo subtilisina na presente memória descritiva refere-se a uma serina protea se que tem a tríade catalítica das proteases realcionadas com subtilisina. Os exemplos incluem as subtilidinas identi—

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ficadas da Figura 3 da presente memória descritiva e como se descrevem na Publicação do Pedido PCT Número WO 89/06276 e na Publicação do Pedido de Patente Europeia Número 0 283 075.

A expressão subtilisina recombinante refere-se a uma subtilisina em que a sequência de ADN que codifica a subtilisina é modificada para produzir uma sequência de ADN mutante que codifica a substituição, a supressão ou a inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da subtilisina de ocorrência natural. Os métodos apropriados pa. ra produzir essas modificações e que podem combinar-se com os referidos na presente memória descritiva incluem os descritos nas Publicações dos Pedidos de Patente Europeia Números 0 130 756 e 0 251 446 e nas Publicações dos Pedidos PCT Números W0 89/06279, W0 89/09830 e W0 89/09819.

’ As carbonil-hidrolasesnão humanas e o ADN que as codifica podem ser obtidos a partir de muitos organismos procarióticos e eucarióticos. Exemplos apropriados de organismos procarióticos incluem organismos gram-negativos tais como E. coli ou Pseudomonas e bactérias gram-positivas. tais como Micrococcus ou Bacillus. Exemplos de organismos eucarióticos a partir dos quais se podem obter carbonil-hidrolases e os seus genes incluem leveduras como, por exemplo, Saccaromycees cerevisiae fungos tais como Aspergillus sp. e organismos de mamíferos não humanos, tais como, por exemplo, da espécie bovina, a partir do qual se pode obter o gene que codifica a carbonil-hidrolase quimosina. Tal como acontece com as subtilisinas, pode obter-se uma série de carbonil-hidrolases a partir de várias espécies relacionadas que têm sequências de aminoácidos que não são inteiramente homólogas entre os membros daquela série bz.auA

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Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 mas que, não obstante, possuem o mesmo tipo ou um tipo semelhante de actividade biológica. Assim, uma carbonil-hidrolase não humana tal como é utilizada n:a presente memória descri tiva tem uma definição funcional que se refere a carbonil-bfdrolases que são associadas, directa ou indirectamente, com fontes procarióticas e eucarióticas.

Uma carbonil-hidrolase mutante tem uma sequer cia de aminoácidos que é derivada da sequência de aminoácidos de uma carbonil-hidrolase precursora. As carbonil-hidrolases precursoras incluem carbonil-hidrolases de ocorrência natural e carbonil-hidrolases recombinantes. A sequência de aminoácidos de carbonil-hidrolase mutante é derivada da sequência de aminoácidos da hidrolase precursora por subtituição, supressão ou inserção de um ou mais aminoácidos da sequência precursora de aminoácidos. Esta modificação é a da sequência de ADN precursora que codifica a sequência de ami noácidos da carbonil-hidrolase, precursora de preferência, à manipulação da enzima de carbonil-hidrolase precursora per se. Os métodos apropriados para essa manipulação da sequência prj. cursora de ADN incluem os métodos descritos na presente memó_ ria descritiva e nas Publicações dos Pedidos de Patente Europeia Números 0 130 756 e 0 251 446.

Resíduos específicos que correspondem às posições +123 e +274 da subtilisina de Bacillus amyloliquefacien;i_ são identificados na presente memória descritiva para substituição. Esses números da posição dos aminoácidos referem-se aos atribuídos à sequência de subtilisina de B. amyloliquefaciens madura representada na Figura 1. A invenção, no entanto, não se limita à mutação desta subtilisina particular mas alarga-se às carbonil-hidrolase precursoras que contêm resíduos de aminoácidos nas posições que são equivalentes aos resíduos particulares identificados na subtilisina de B. amy loliquefaciens .

Um resíduo (aminoácido) de uma carbonil-hidrolase precursora é equivalente a um resíduo de uma subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se for ou homólogo (isto é,

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correspondendo em posição na estrutura ou priméria ou terci£ ria) ou análogo a um resíduo específico ou a uma parte desse resíduos em subtilisina de B. amyloliquefaciens (isto é, que tem a mesma capacidade funcional ou uma capacidade funciQnal semelhante para combinar, reagir ou interactuar quimicamente).

A fim de estabelecer a homologia com a estrutura primária, a sequência de aminoácidos de uma carbonil-hidrolase precursora é directamente comparada com a sequência primária de subtilisina de B. amyloliquefaciens e particuiarmente com um conjunto de resíduos que se sabe serem invariantes em todas as subtilisinas para as quais se conhece a sequência (Figura 2). Depois de se alinharem os resíduos conservados, se permitirem as inserções necessárias e as supressões necessárias a fim de manter o alinha?ento (isto é, se evitar a eliminação de resíduos conservados por supressão e inserção arbitárias), são definidos os resíduos equivalentes aos aminoácidos particulares na sequência primária de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. 0 alinhamento dos resíduos conservados deve preferivelmente conservar 100% desses resíduos. No entanto, um alinhamento maior do que 75% e tão pequeno como 50% dos resíduos conservados é também adequê do para definir resíduos equivalentes. Deve manter-se a conservação de tríade catalítica Asp 32/His64/Ser221.

Por exemplo, na Figura 3, as sequências de amnoácidos da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis var.—1168 e de B. lichenformis (carlsbergensis) são alinhadas para proporcionar a produção máxima de homologia entre as sequências de aminoácidos. Uma comparação destas sequências mostra que há um certo número de resíduos con servados contidos em cada sequência. Estes são os resíduos identificados na Figura 2.

Estes resíduos conservados podem assim ser usados para definir os correspondentes resíduos deaminoácidos τ 1

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equivalentes de subtilisina de B. amyloliquefaciens em outras carbonil-hidrolases como por exemplo subtilisina de B. lentus (Publicação do Pedido PCT Número WO 89/06279, publicado em 13 de Julho fr 1989) e a subtilisina mutante preferida de acordo com a presente memória descritiva.

Estas sequências particulares de aminoácidos estão alinhadas na Figura 4 com a sequência de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens de modo a originar a homologia máxima de resíduos conservados·. Como se pode ver, há um certc número de supressões na sequência de Bacillus lentus e na subtilisina mutante preferida de acordo com a presente'invenção em comparação com a subtilisina de B. amyloliquefaciens. Assim, o aminoácido equivalente de Vai -165 na subtilisina de B. amyloliquefaciens nas outras subtilisinas é a isoleucina particular representada por baixo de Vai -165.

Na figura 4, o aminoácido na posição 123 é asparagina na subtilisina de B. amyloliquefaciens . Na subti lisina de B. lentus, o resíduo equivalente é-a asparagina pai ticular representada. Na subtilisina mutante preferida de acordo com a presente invenção, no entanto, o aminoácido equi valente a +123 na subtilisina de B. amyloliquefaciens é um aminoácido diferente de asparagina e preferivelmente é a serina representada na figura 4. De maneira semelhante, na figura 4, o aminoácido na posição +274 da subtilisina de B. amy loiiquefaciens é alanina. Como se pode ver, o aminoácido equivalente na subtilisina de B. lentus é.a treonina particular representada na figura 4. Numa subtilisina mutante particularmente preferida de acordo com a presente invenção, a posição do aminoácido equivalente 274 é ocupada pela alanina representada na figura 4.

Assim, as posições +123 e'*+274 são identificadas pelas sequências primárias de aminoácidos na figura 4 para a subtilisina de B. lentus e para a forma de realização preferida da presente invenção. No entanto, podem ser modificados vários outros resíduos de aminoácidos que são equivalei _ 10 _

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tes a aminoácidos específicos na subtilisina de B. amyloliquefaciens . Assim, na forma de realização preferida, o aminoácido lisina na posição 27 na subtilisina de B.amyloliquefaciens tem uma lisina equivalente na posição 27 na subtilisina de B. lentus. Como de indica nos Exemplos, a subtilisina que compreende uma das formas de realização preferidas de acordo com a presente invenção foi derivada modificando uma sequência de ADN que codifica a subtilisina de B. lentus .

Essas modificações introdizidas no ADN incluíram a modificação de codões equivalentes às posições 123 e 274 de subtilisina de B. amyloliquefaciens. No entanto, fize ram-se duas outras modificações na sequência de aminoácidos de B. lentus nas posições equivalentes aos resíduos 27 e 104 da subtilisina de B, amyloliquefaciens . Assim, como se pode ver na figura 4, a lisina no resíduos equivalente 27 da subtilisina de B. lentus foi modificada para codificar argi. nina na forma de realização preferida. De maneira semelhante, o resíduos de valina na posição 104 de B. lentus,.que é'equi valente à tirosina 104 da subtilisina de B.amyloliquefaciens foi também modificada para codificar tirosina. Assim, a forma de realização preferida representada na figura 4 contém uma sequência de aminoácidos derivada da subtilisina de B. lentus modificando os resíduos daquela subtilisina equiva lentes às posições 27, 104 123 e 274 de subtilisina de B.amy loliquefaciens.

Os resíduos equivalentes podem também ser defi nidos determinando a homologia ao nível da estrutura terciária para uma carbonil-hidrolase precursora cuja estrutura terciária para uma carbonil-hidrolase precursora cuja estrutura terciária doi determinada por cristalografia de raios X. Definem-se os resíduos equivalentes como sendo aqueles para os quais as coordenadas atómicas de dois ou mais átomos de cadeia principal de um resíduo de aminoácido particular de carbonil-hidrolase precursora e da subtilisina de B. amyloli quefaciens (N em N, CA em CA, C em C e 0) estão compreendidas dentro do intervalo de 0,13 nm e, preferivelmente, 0,1

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nm depois do alinhamhento.

Realiza-se o alinhamento depois de se ter orientado e posicionado o melhor modelo de maneira a dar a máxima sobreposição das coordenadas atómicas de átomos de proteínas diferentes de hidrogénio da carbonil-hidrolase em questão para a subtilisina de B. amyloliquefaciens . 0 melhor modelo é o modelo cristalográfico que origina o menor factor R para os dados experimentais de difracção com a resolução máxima disponível:

Factor E = ? h ^F0(h) -^Fc(h) ’ í h ^M(h’

Os resíduos equivalentes que são funcionalmente análogos ao resíduo específico de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens são definidos como os aminoácidos das carbonil-hidrolase precursoras que podem adoptar uma conforma— ção tal que ou alteram, ou modificam ou contribuem para a es. trutura da proteína, a ligação do sbstrato ou a catálise duma maneira definida e atribuída a um resíduo específico da subtilisina de B. amyloliquefaciens .Além disso, há também ainda os resíduos da carbonil-hidrolase precursora (para os quais se obteve uma estrutura terciária por cristalografia . de raios X) que ocupam uma posição análoga na medida em que, embora os áfomos de cadeia principal do dado resíduo possam não satisfazeros critérios de equivalência com base na ocupação de uma posição homóloga, as coordenadas atómicas de pe^ lo menos dois dos átomos de cadeia lateral do resíduo ficam dentro do intervalo de 0,13 nm dos correspondentes átomos das cadeias laterais da subtilisina de B. amyloliquefaciens. As coordenadas da estrutura tridimensional da subtilisina de B. amyloliquefaciens estão indicadas na Publicação do Pedido de Patente Europeia Número 0 251 446 e podem ser utilizadas como se esboçou acima para determinar os resíduos equivalentes ao nível da estrutura terciária.

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Alguns dos resíduos identificados para substitui, ção, inserção ou supressão são resíduos conservados enquanto outros o não são. No caso dos resíduos não conservados, a substituição de um ou mais aminoácidos limita-se a substitui çõés que produzem uma mutante que tem uma sequência de aminoácidos que não corresponde a nenhuma que'se encontre na Natu reza. No caso dos resíduos conservados, essas substituições não devem resultar numa sequência de ocorrência natural.

As carbonil-hidrolases mutantes de acordo com a presente invenção incluem as formas maduras de carbonil-hidrolases mutantes, assim como as pró-formas e as pré-pró-for mas dessas hidrolases mutantes. As pré-pró-formas são as construções preferidas , visto que isso facilita a expressão a secreção e a maturação das carbonil-hidrolases mutantes.

termo pró-sequência refere-se a uma sequência de aminoácidos ligada à parte da extremidade N da forma madura de uma carbonil-hidrolase que, quando removida, tem como resultado o aparecimento da forma madura- da' carbonil-hidrolase.

Na Natureza,encontram-se muitas enzimas proteolíticas sob a forma de produtos pró-enzimáticos translacionais e, na ausência de processamento pós-translacional, são expressas desta maneira. Uma pró-sequência preferida para produzir carbonil-hidrolases mutantes,.especificamente subtilisinas mutantes, é o pró-sequência putativa da subtilisina de B. amyloliquefaciens , muito embora possam ser utilizadas outras pró-sequências de subtilisina . Nos Exemplos, utilizou-se a pró-sequência putativa da subtilisina de B. lentus (ATCC 21536).

A expressão uma sequência de sinal ou pré-sequência refere-se a qualquer sequência de aminoácidos ligada à parte da extremidade N de uma carbonil-hidrolase ou à parte da extremidade N de uma pró-hidrolase que pode participar na secreção das formas maduras ou nas pró-formas da hi drolâse. Esta definição da sequência de sinal é uma defini35

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ção funcional, que se pretende que inclua todas as sequências de aminoácidos codificadas pela parte da extremidade N do gene de subtilisina ou de outras carbonil-hidrolase segregáveis, que participam na efectivação da segregação de subtilisina ou de outras carbonil-hidrolases nas condições naturais. A presente invenção utiliza essas sequências para efectuar a segregação das carbonil-hidrolases mutantes como se define ns presente memória descritiva. Uma sequência de sinal preferidc utilizada nos Exemplos compreende os primeiros sete resíduos de aminoácidos da sequência de sinal da subtilisina de Bacillus subtilis com a parte restante da sequência de sinal da subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).

Uma pré-pró-forma de uma carbonil-hidrolase mutante consiste na forma madura da hidrolase que tem uma pre -sequência operavelmente ligada à extremidade amino da hidro. lase e uma pré-sequência ou sequência de sinal operavelmente ligada à extremidade de amino da pró-sequência.

A expressão vector de expressão refere-se a um construto de ADN que contém uma sequência de ADN que'é operavelmente ligada a uma sequência de controlo apropriada capaz de efectuar a expressão do mencionado ADN num hospedei, ro apropriado.

Essas sequências de controlo incluem um prome. tor para efectuar a transcrição, uma sequência operatória opcional para controlar essa transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação apropriados para o ribossoma de mRNA e sequências que controlam a terminação da transcrição e translação. 0 vector pode ser um plasmídio, uma partícula de um fago ou simplesmente um inserto genómico potencial. Uma vez transformado num hospedeiro apropriado, o vector pode re^ plicar-se e funcionar independentemente do genoma hospedeiro ou, em alguns casos, podem intergrar-se no genoma propriamente dito. Na presente memória descritiva,os termos plasmídio' e vector são algumas vezes utilizados intermutavelmente,

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visto que o plasmídio é a forma mais correntemente utilizada de vector no momento actual. No entanto, pretende-se que a invenção inclua as outras formas de vectores de expressão que servem funções equivalentes e que são ou se tornem conhe cidas da técnica.

Ascélulas hospedeiras utilizadas na presente invenção são geralmente hospedeiras procarióticos ou eucarióticos que, preferivelmente, foram manipulados pelos métodos referidos na Publicação EPO Número 0 130 756 para os tornar incapazes de segregar endoproteases enzimaticamente acti. vas. Uma cálula hospedeira preferida para expressar subtilisina é a estirpe BG2036 de Bacillus, que é deficiente em pro. tease neutra enzimaticamente activa e em protease alcalina (subtilisina). A construção da estirpe BG2036_é descrita em pormenor na publicação do EPO Número 0 130 756 e ainda por Μ. Y. Yang e col. (1984), J, Bacteriol., 160, 15 - 21. Outras células hospedeiras apropriadas para expressar subtilisina incluem Bacillus suhtilis 1168 (Publicação'EPO Número 0 130 756).

As células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com vectores construídos usando técnicas de ADN recombinante. Essas células hospedeiras transformadas são capazes quer de replicar vectores que codificam as carbo. nil-hidrolases mutantes, quer de exprimir a carbonil-hidrola se mutante pretendida. No caso de vectores que codificam a pré-forma ou a pré-pró-forma da carbonil-hidrolase mutante, essas mutantejs-, quando são expressas, são tipicamente segregadas pela célula hospedeira para o meio de desenvolvimento das células hospedeiras.

A expressãaoperàveimente ligada, quando se descreve a relação entre suas regiões de ADN, significa simplesmente que estas estão funcionalmente relacionadas uma com a outra. Por exemplo, uma pré-sequência está operavelmen te ligada a um péptido se funcionar como sequência de sinal

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L

Mod. 71-10000 βχ. -89/07

30.0í'TJ990 participando na segregação da forma madura de proteína envolvendo mais provavelmente a clivagem da sequência de sinal. Uri promotor é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se controlar a transcrição da sequência; um sítio de ligc^ ção de ribossomas é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se for posicionado de modo a permitir a translar ção.

Os genes que codificam a carbonil-hidrolase precursora de ocorrência natural podem ser obtidos de acordo com os métodos gerais descritos nas Publicações des EPO Numeros 0 130 756 e 0 251 446. Como se pode concluir dos Exemplos descritos mais adiante na presente memória descritiva, os métodos compreendem geralmente realizar- · a síntese de amostras etiquetadas que têm sequências putativas que codificam regiões da hidrolase de interesse, a preparação de bibliotecas genómicas a partir de organismos que expressam a hidrolase e a selecção de bibliotecas relativamente ao gene de interesse por hibridização das amostras. Os clones que se hibridizam positivamente são em seguida mapeados e sequencia-dos.

A-carbonil-hidrolase clonada- é então utili. zada para transformar uma célula hospedeira a fim de expri-?·mir a hidrolase. 0 gene da hidrolase é entãó ligado a um plajs. mídio com um grande número de cópias. Este plasmídio reproduz-se em hospedeiros na medida em que ele contém os elementos bem conhecidos necessários à replicação dos plasmídios: um promotor operavelmente ligado ao gene em questão (que pode ser fornecido como o próprio promotor homólogo do gene se ele for reconhecido, isto é, transcrito pelo hospedeiro), uma região de terminação de transcrição e de poli-adenilação (necessária para a;estabilidade do RNA. transcrito pelo hospedeiro a partir do gene de hidrolase em certas células hospedeiras eucarióticas), que é exógeno ou é fornecido pela re gião dè?termináçãa endógena do gene de hidrolase e, desejavelmente, um gene de selecção tal como um gene de resistência a antibióticos que permite a manutenção contínua da cultura

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das células hospedeiras infectadas com o plasmídio por desenvolvimento em meios que contém antibióticos. Os plasmídios de grande número de cópias contêm também uma origem de replicação para o hospedeiro, permitindo dessa forma que um grande número de plasmídios seja gerado no citoplasma sem limitações cromossómicas. No entanto, está incluído dentro do âmbito da · presente invenção integrar cópias múltiplas do gene de hidro. lase no genoma do hospedeiro. Este facto é facilitado por o.r ganismos procarióticos e eucarióticos que são particularmente susceptíveis de recombinação homóloga.

Como variante, pode produzir-se um gene sintético que codifica uma carbonil-hidrolase precursora de ocoí rência natural ou mutante. Neste caso, determina-se o ADN e/ou a sequência de aminoácidos da hidrolase precursora. Sin tetizam-se múltiplos,fragmentos de ADN de cadeia unicá sint£ tica, que se sobrepõem, seguidamente que, mediante hibridiza ção e ligação, produzem um ADN sintético que codifica a hidrc. lase precursora. Esta maneira de proceder proporciona diversas vantagens em relação à clonação do gene natural devido ac facto de poderem ser interpostos sítios de restrição através do ADN sem alteração da sequência de aminoácidos codificada de modo a facilitar que a subsequente modificação forme carbç. nil-hidrolase mutantes. Além disso, o referido processo de síntese permite o ajustamento da utilização de codões no gene sintético de maneira a conformar-se com a tendência do codão para os hospedeiros de expressão particulares a serem usados. Um exemplo defuma .construção de um gene sintético é descrito nos Exemplos.

Uma vez que tenha sido cionado o gene da carbonil-hidrolase precursora de ocorrência natural ou sintético, realiza-se um certo número de modificações para melhorar a utilização do gene para além da síntese das carbonil-h:. drolases precursoras de ocorrência natural. Essas modificações incluem a produção de carbonil-hidrolases recombinantes como se refere nas Publicações EPO Números 0 130 756 e 0 251 44 6 e a produção de carbonil-hidrolase mutantes des19

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3Ο.0ί'Ιί99Ο, i

Mod. 71 - 20.000 «x. - 90/08 critas na presente memória descritiva.

Para facilitar a construção e a identifics.

ção das carbonil-hidrolase mutantes de acordo com a presente invenção, pode utilizar-se o seguinte método de mutagénese dc cassete, muito embora se possam utilizar outros métodos que incluem a mutagénese dirigida para o sítio.Em primeiro lugar, obtêm-se o gene de ocorrência natural que codifica a hidrolase e sequencia-se total ou parcialmente. Em seguida, investiga-se a sequência de modo a determinar-se um ponto no qual se pretende fazer a mutação (supressão, inserção ou substituição) de um ou mais aminoácidos da enzima codificada. As sequências que flanqueiam este ponto são avaliadas realtivamen te à presença de sítios de restrição para substituir um curte segmento do gene por uma piscina de oligonucleótidos que, quando expressada, codifica vários mutante. Esses sítios de restrição são, preferivelmente, sítios únicos dentro do gene da hidrolase de modo a facilitar a substituição do segmento do gene. No entanto, pode ser utilizado qualquer sítio de restrição conveniente que não seja indevidamente redundante no^- gene de hidrolase, desde que os fragmentos dos genes gerados pela digestão de restrição possam ser reagrupados na sequência apropriada. Se os sítios de restrição não estão pre sentes em posições compreendidas dentro de uma distância con veniente a partir do ponto seleccionado (desde dez até quinze nucleótidos), esses sítios são gerados por substituição, de nucleótidos no gene, de tal maneira que nem a- estrutura de leitura nem os aminoácidos-codificados sejam alterados na construção final. A mutação do gene a fim de alterar a sua sj. quência de maneira a conformar-se com a sequência pretendida é realizada por prolongamento com o primário Mlà de acordo' com métodos geralmente conhecidos. A tarefa de localizar regiões de flanqueamento apropriadas e de avaliar as alterações necessárias para chegar a duas sequências com sítios de restrição convenientes é transformada em rotina pela redundância do código genético, um mapa de enzimas de restrição do

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gene e o grande número de enzimas de restrição diferentes. Note-se que se está disponível um sítio de restrição de flan quemanto conveniente, o método acima referido precisa de ser utilizado apenas em conexão com a região de flanqueamento que não contém um sítio.

Uma vez que se tenha clonado o ADN de ocorrência natural ou o ADN sintético, os sítios de restrição que flanqueiam as posições a ser mudadas são digeridas com as en zimas de restrição parentes e uma pluralidade de cassetes de oligonucleótidos como complementares das extremidades é liga da ao gene. A mutagénese é enormemente simplificada por este método porque todos os oligonucleótidos podem ser sintetizados de modo a terem os mesmos sítios de restrição e não são necessários ligadores sintéticos para criar os sítios de res. trição.

Como é utilizada na presente memória descr:. tiva, a expressão actividade proteolítica” é definida como a taxa de hidrólise de ligações de péptidos por miligrama de enzima, activa. Existem muitos métodos bem conhecidos para me dir a actividade proteolítica (K. M. Kalisz, Microbíal Proteinases, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology A. Fiechter Ed., 1988).

De acordo com um dos aspectos da presente invenção, o seu objectivo é garantir uma carbonil-hidrolase mutante tendo uma actividade proteolítica maior (numericamen te grande) em comparação com a carbonil-hidrolase precursora permitindo des-sa forma que a utilização da enzima se faça mais eficientemente actuando sobre um substrato pretendido.

Os aminoácidos específicos úteis para se obter esses resultados em carbonil-hidrolases do tipo da subtilisina em resíduos equivalentes a +123 em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens são referidos nos Exemplos. Em certos casos, pode ser desejável menor actividade proteolítica. Nesses casos pode conseguir-se a diminuição da actividade de proteolítica substituindo os aminoácidos identificados nos Exemplos nos

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Mod. 71 -20.000 »x. - 70/08 resíduos equivalentes a +123 em subtilisina d'e Bacillus amyloliquefaciens .

Para as subtilisinas precursoras em que a serina não é o resíduo na posição equivalente a +123 em B. amyr loliquefaciens, a maior actividade proteolítica é conseguida quando a serina é substituída na precursora na posição +123. Além disso, não se sabe que exista subtilisina de Bacillus de ocorrência natural que contenha serina numa posição equivalente a +123 na subtilisina de B. amyloliqnefaciens. Com base na descoberta de que a serina nesta posição aumenta a actividade proteolítica , qualquer perito no assunto pode identificar e seleccionar subtilisina de Bacillus de ocorrer, cil natural e clonar uma mutante natural que contenha serina nesta posição. Essas subtilisinas mutantes naturais de Bacillus estão compreendidos dentro do âmbito da presente invenção.

Quando a carbonil-hidrolase é diferente da de Bacillus e uma serina se encontra presente na posição +123 na enzima precursora, a substituição pode ser uma substituição que diminua a actividade proteolítica. Isso seria útil, por exemplo( quando se pretenda obterra actividade sin tética das carbonil-hidrolase (como para a síntese de péptidos). Pode pretender-se diminuir esta actividade proteolítica que é capaz de destruir o produto dessa síntese.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, determinou-se que os resíduos equivalentes a +274 na subtilisina de B. amyloliquefaciens são importantes para modular as características de comportamento global da enzima f

em composições detergentes. Assim, tal como se descreve nos Exemplos, a treonina na subtilisina de Bacillus lentusna p£ sição equivalente a +274 pode sre trocada por alanina na for. ma de realização preferida para originar um comportamento me. lhorado da enzima mutante. Como também se descreve nos Exemplos, a substituição deste resíduo por um aminoácido diferen

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¹ te de treonina, por exemplo, leucina, serina, valina e alanina, resulta numa diminuição da estabilidade da mutante. Acredita-se que Jesta diminuição de estabilidade seja o resultado da degradação autocatalítica da mutante. Assim, as modifi5 ✓ cações de resíduos equivalentes a +274 na subtilisina de Bacillus são capazes de melhorar o comportamento global da enzima, na composição detergente e modular a estabilidade global da enzima.

Mod. 71 · 20.000 ·χ. - W/Οβ

De acordo com este aspecto da presente invenção, o objectivo é proporcionar uma carbonil-hidrolase mutante que tem um comportamento melhorado quando utilizada numa composição detergente em comparação com a carbonil-hidrolase precursora. Como é utilizada na presente memória descritiva, . a expressão comportamento melhorado num detergente é definida como o aumento da limpeza de certas nódoas sensíveis a enzimas, tais como as nódoas de erva ou de sangue. Esta limpeza é determinada por avaliação visual depois de um ciclo de lavagem normal.

Uma forma de realização preferida da presente invenção é descrita nos Exemplos em que a lisina na posição 27 é substituída por arginina, a valina na posição 104 é . substituída por tirosina, a asparagina na posição 123 é substituída por serina e a treonina ήο -'-resíduo ;274'.é .substituída' par alanina na subtilisina de Bacillus lentus. Muito embora a estabilidade desta enzima seja ligeiramente reduzida em com paração com a da subtilisina precursora de B. lentus, o nível de rendimentoldessa enzima numa composição detergente é substancialmente melhorado, de modo que se obtem o mesmo comportamento desta subtilisina mutante de B. lentus em comparação i

com a subtilisina de B.- lentus não modificada, quando se utiliza aproximadamente metade da quantidade da enzima.

Com base nos resultados obtidos com esta e com outras subtilisinas mutantes, éeevidente que os resíduos das carbonil-hidrolases equivalentes às posições +123 e +274 no Bacillus amyloliquefaciens são importantes para a acti23

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30.01*11990

Mod. 71 -20.000 ·χ. 90/08 vidade proteolítica, o comportamento e/ou a estabilidade de£ tas enzimas.

Muitas das carbonil-hidrolase mutantes de acordo com a presente invenção, especialmente subtilisina, são úteis na formulação de várias composições detergentes. Um cer to número de compostos conhecidos são agentes tensio-activos apropriados úteis em composições que compreendem as carbonil^ -hidrolases mutantes de acordo com a presente invenção.Ihclir. em detergentes não iónicos, aniónicos, catiónicos ou híbridos como se refere nas memórias descritivas das Patentes de Invenção Norte-Americanas Número 4 404 128, concedida a Barry J. Anderson e Número 4 261 868, concedida a Jiri Flora e col A técnica é familiar com as diferentes formulações que podem ser utilizadas como composições de limpeza. As subtilisinas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas sob a forma de detergentes em pó e em líquido conhecido tendo um pH compreendido entre 6,5 a 12,0 a níveis de cerca de 0,01 até cerca de 5% (preferivelmente, 0,1 a 0,05%) em peso. Estas composições detergentes de limpeza podem também incluir outras enzimas, tais como proteases. a amilases, assim como agentes encorpantes e agentes estabilizantes.

A adição das subtilisinas de acordo com a presen te invenção às composições de limpeza convencionais não tem qualquer limitação especial de utilização. Por outras palavras, qualquer temperatura e pH apropriados para o detergen te são também apropriados para as composições de acordo com a presente invenção, desde que o respectivo pH esteja compre^ endido dentro do intervalo acima mencionado e a temperatura seja inferior à temperatura: de desnaturação das subtilisinas de acordo com a presente invenção. Além disso, as subtilisinas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas numa composição de limpeza sem detergentes, novamente quer sozinhas ou em combinação com agentes encorpantes e estabili.. zadores.

Em seguida, apresentam-se vários Exemplos que não devem ser considerados como uma limitação do âmbito das

File FA 53729-1-PT/DJB/RFT reivindicações.

Exemplo 1

30.0LTJ990

Construções para a Expressão do Gene de Subtilisina de Bacillus lentus em Bacillus subtilis

Mod. 71 - 20.000 ·χ. - 90/08 plasmídio pSAR (Figura 5) conduz uma fusão de translação por intermédio do sítio de restrição Sau3A comum no sétimo/oitavo codão de sinal de sequência dos genes de subtilisina de B, subtilis e de B. amyloliquefaciens .Como se mostra na Figura 5, este gene, num fragmento de EcoRI-BamHI com 2,0 Kb, foi subclonado em Ml3mpl9, a fim de isolar o ADN de modelo de cadeia única a ser clivado para mutagénese dirigida para o sítio para formar pSAR-Q275R. 0 prot£ colo utilizado na mutagénese foi essencialmente o descrito por M. Zoller e col. (1983), Methods Enzymol., 100 ,468 - 50C (1) e utilizou-se um oligonucleótido sintético com a sequência * ** '-C-AAC-GTA-CAG-GCT-GCA-GCT-CGC-TAA-AAC-ATA-A-3' Q275R nã qual os asteriscos significam modificações das sequências w* ^{1 1} do gene do tipo natural e os sublinhados representam um sítio de endonuclease de restrição PstI introduzido usado na. sele£ ção de um gene mutante particular que codifica a alteração Q275R. Estas modificações foram feitas para: (1) transformar o aminoácido nesta posição para o que se encontra na subtilisina de B. lentus e (2) para permitir o enganchamento do terminador em pSAR à região de codificação madura de B. lentus por intermédio de um sítio de Pst introduzido de modo semelhante em pGG36 de Bacillus lentus (ATCC 21536).

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70.OLT.1990

Mod. 71 - 20.000 ex. - W/08

30' plasmídio pCC36 (Figura 5) contém um fragmento de ADN genómico com 2,1 Kb de B. lentus (ATCC 21536) que codifica o gene de subtilisina completo que foi cionado por métodos correntes no vector em lançadeira pBS42 (L. Band e col. (1984), DNA, 3 17 - 21).

A sequência de aminoácido desta subtilisina é a mesma que se referiu para a subtilisina 309 na publicação do PCT Número 89/06279. Este gene foi subclonado em L13 como se descreveu acima relativamente à mutagénase dirigida ao sí tio usando um oligonucleótido com a sequência * * * ^z-C-AAT-GCA-GAA-GCT-GCA-GCT-CGC-TAA-TCA-A-3''

T274A

COM 0 FIM DE: (1) introduzir um sítio de PstI na mesma posição deste gene que corresponde ao sítio introduzido em pSAR acima referido a (2) subtituir a treonina na posição 274 por alanina pata formar pGG36-T274A.

Os genes mutantes pSAR-Q275R e pGG36-T274A foram individualmente subclonados atrás em pBS42 antes das digestões com Pstl/BamHI, isolamento do fragmento e ligação, para originar o plasmídio GG-A274B. amy-term., como se mostra na figura 5, utilizando, em todas estas operações, os métodos convencionais.

Faz-se um ligador de ADN sintético analizando oligonucleótidos de cadeia única complementares com as se quências . 5 ^,-G-ATC-GTC-GeG-TeG-AeC-GeA-CTA-CTC-ATT-TeT-GTT2^{GGrE TTT}· ' AGT-TCA-T-3' Í j

e

5'-CGA-TGA-ACT-AAA-AGC-AAG-AGA-AAT-GAG-TAG-TGC-GGT-CGACGC-GAC-3' parar serobterlò-.fragmentooder-ADN numero '2 de cádeia dupla re presentado na Figura 6.^_s extremidades da esquerda e da di26

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30.01*11990 reita entalhadas deste ligador suplex são complementares em relação à extremidade Sau3A do fragmento número 1 (de pSAR) e da extremidade de Ciai do fragmento númeor 3 (a partir da pGG-A274B. amy.term.), erspectivamente. Estes três fragmen5 tos foram combinados com o fragmento 4 de pSAR-Q275R depois de digestões com endonuclease de restrição de plasmídio, iso. lamento do fragmento e ligação por métodos convencionais, pa ra produzir o plasmídio pGG-KVNA. A designação GG-KVNA indica que esta subtilisina contém a subtilisina codificada por pGG-36, que inclui lisina (K) na posição 27, valina (V) na posição 104, asparagina (N) na posição 123 e a subtituição de treonina na posição 274 por alanina (A).

Mod. 71 - 20.000 βχ.

Exemplo 2

Modificação de PGG-KVNA

Como se mostra na figura 6, o gene GG-KVNA (fragmento de EcoRI-BamHI com 2,1 Kb) foi subclonado em M13 mediante três operações sucessivas de mutagénese dirigida ao sítio usando oligonucleótidos que têm as sequências * * * (a) 5 ^z-GT-TCT-GGT-GTA-AGA-GTT-GCT-GTT-CTA-GAT-ACA-GGT-3 '

K27R * ** (b) 5 ^Z-A-GTA-TTA-GGG-GCT-AGG-GGT-TGA-GGT--TGG-TAC-AGC-TCG-ATT

-3' V104y e

* ** (,c) 5 ^z-GGG-AAC-AAT-GGA-ATG-CAG-GTT-GCT-AGC-TTG-AGT-TTA-3' N123S

0s asteriscos assinalam alterações da sequêr.

cia de genes de tipo natural.Os sublinhados inferiores repre sentam em (a) um sítio de Xbal introduzido e, em (b) e (c) sj.

tios de Nhel introduzidos para seleccionar a presença das mu tações R27, Y104 e S123 ligadas, respectivamente. Além disso.

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Mod. 71 - 20.000 βχ. · 90/08 em (c) os traços superiores assinalam sítios de Sphl destruí dos. Finalmente, subclonou-se atrás o gene GG-RYSA com 2,1 Kb em pBS42 para expresão em hospedeiros de Bacillus subtilis.

plasmídio resultante foi designado pGG-RYSA. Esta designação indica que se modificaram quatro resíduos no plaqmídio pGG-KVNA: lisina (K) na posição 27 por arginina (R' valina (V) por tirosina (Y)-na posição 104 e-asparagina (N) na posição 123 por serina (S). A alanina previamente substituída no resíduo 274 não foi modificada por esta maneira de proceder.

A lisina na posição 27 foi substituída por arginina com base no sequenciamento de aminoácidos da subtilisina 309. Como se indica na Publicação do PCT Números W0 89/06279, a lisina está qituada na posição 27. No entanto, depois de se sequenciar independentemente esta proteína de subtilisina, os dados iniciais indicaram que a arginina era um resíduo que se encontrava na posição 27. No caso da substituição de tirosina por valina, no resíduo 104, a substitui ção fez-se para diminuir o perfil de actividade do pH e melhorar o comportamento da enzima com base nos resultados pre viamente obtidos para a subtilisina de B., amyloliquefaciens (algumas vezes referido como BPN’). A substituição da aspara gina na posição-123 por serina baseia-se nos resultados obti. dos como se descreve na presente memória descritiva mais adiante em que se constatou que a substituição da serina, na posição 123 maximizava a actividade proteólítica da enzima numa mutante infimamente realcionada.

Exemplo 3

Construção de Gene Sintético de Subtilisina de Bacillus lentus

Preparou-se também ADN que codifica a sequência de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus construindo um gene que codifica uma sequência de ADN sintética.

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Sequenciou-se o fragmento genómico de HindIII com 2,1 Kb do plasmídio pGG36 . Utilizou-se a sequência de aminoácidos deduzida do produto-dO gene maduro (subtilisina GG36) para conceber uma sequência de codificação madura sintética com as seguintes propriedades:

(1) Em geral, utilizaram-se os codões mais correntemente encontrados para cada aminoácidos em sete genes diferentes de B. subtilis (com base numa tabela de utilização dos codões Tabela 2, de T. Màruyama e col. (1986), Nucl. Acids Res., Suplemento 14, páginas rl51 - rl97), excepto nos casos em que codões alternativos resultaram em sítios de reconhecimen to com enzimas de restrição convenientemente localizadas den tro do genej

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 (2) Utilizaram-se em aproximadamente cada 40-60 b.p. da régião de codificação aproximadamente 0,8 madura, combinações de dois ou três codões especificamente escolhidos que tiveram como resultado a introdução de sítios de restrição apr£ ximadamente homogeneamente distanciados.

Estes sítios foram escolhidos para facilitar :

(a) a posterior mutagenese de cassetes e estudos de selecção e (b) construções que envolvem mais do que uma mutaçãoj (3) Concebeu-se um único sítio de reconhecimento com PstI para cobrir os codões 272-274 que permitem enganchar com as sequências terminadoras de um.gene de B. amyloliquefaciens semelhantemeifte modificado sobre os mesmos três codões e subs. tituindo a treonina na posição 274 por alaninaj (4) Introduziu-se um sítio único de NruI para cobrir os resíduos dos codões maduros 9-10 que permitem o enganchamento a uma sequência de pré-pró-codificaçao GG36 por intermédio de um ligador de ADN duplo»sintético curto.

Com base nesta concepção, sintetizaram-se oligonucleótidos (oligos) tais que, depois da : .fusão..·, os olã. gos de codificação e de não codificação para uma determinada

9Q

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região de codificação com aproximadamente 60 p.b., o fragmento de ADN duplex resultante teria nas suas extremidades regiões de cadeia simples complementares à extremidade do fragmento duplex seguinte do gene (veja-se Figura 7).

No esquema, utilizou-se um total de trinta e seis oligos separados (compreendendo dezoito duplexos individuais) como se esboçou acima, tendo como resultado uma regiãc de codificação madura sintética duplex com aproximadamente 0,8 Kb (fragmento 3 da figura 8).

Finalmente, sintetizou-se um par adicional de oligos sintéticos que, depois da fusão (para originar o fragmento 2 na figura 8), tem um sítio de Ncol na sua extremidade 5’ (complementar do sítio de Ncol de GG36 nos codões ma duros 5-6) e um sítio de NruI na sua extremidade 3’ (complementar da extremidade 5’ de 3’ do fragmento 3).

Realizou-se a construção final para originar uma unidade de expressão completa que consiste no promotor de B. subtilis e nos primeiros sete aminoácidos da sequência de sinal enganchada nas sequências de GG36 que codificam a parte restante da sequência de sinal, a pró-sequência comple. ta e os primeiros seis aminoácidos maduros (fragmento 1 de GG-KVNA), os resíduos maduros que codificam o gene sintético 7-274 (fragmentos 2 + 3) e a região do terminador (incluindo o codão final genético maduro 279) de B. amyloliquefaciens (fragmentos 4) como uma ligação de quatro vias, como se repre: senta na Figura 6.

=Finalmente, introduziram-se três mutações adicionais separadas na região de codificação madura desre gene híbrido de comprimento completo. A primeira substitui a lisina na posição 27 por arginina. A5 segunda substitui a valina na posição 104 por tirosina. A terceira substitui a asparagi. na na posição 123 por serina. 0 plasmídio resultante é designado pBC3-RYSA.

exemplo seguinte descreve o método utilizado para modificar a posição 123 no gene sintético.Utilizaram-se métodos semelhantes para modificar as posições 27 e

- qn 62.804

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104 neste gene sintético.

Exemplo 4

Construção de Mutantes na Posição 123 '

Sobre os codões 111/112 no gene sintético do Exemplo 3, introduziu-se um sítio de Xhol fazendo três mutações fenotipicamente silenciosas por intermédio de mutagénese dirigida para o sítio (mutagénese com prolongamento do primá. rio em M12).

Digeriu-se o plasmídip resultante, pX123 (Figura 9), com Xhol e Aval e isolou-se o fragmento que contém o vector de grandes dimensões por electro-eluição em geral de agarose. Fundiram-se os oligonucleótidos sintéticos complementares, ligaram-se com o fragmento de grandes dimensões pX123 e transformou-se em E; coli estirpe MM294. Estas casse; tes codificaram, individualmente, todos os vinte aminoácidos de ocorrência natural na posição 123 e, além disso, continham uma mutação silenciosa que destruía um único sítio de Sphl que fica entre os sítios de Xhol e Aval em pX123. Selejc cionaram-se os plasmídios resultantes de transformantes de E. coli relativamente à perda do sítio de Sphl único. Sequen ciaram-se os transformantes positivos por análise de restrição (isto é, nagativos a Sphl) para confirmar a presença das mutações pretendidas na posição 123 clonadas no vector de lançadeira pBS42 e transformaram-se em B. subtilis BG2036 pa ra expressão.

Exemplo 5 í

Actividade de Vários Mutantes +123

Ensaiou-se a actividade preteolítica de cada uma das subtilisinas mutantes codificadas pelas mutantes modificadas na posição +123 acima referidas misturando 0,04 ml do sobrenadante de caldos de cultura centrifugados com 0,56 ml de caseína a 1% em peso/volume em tris 0,1 M, pH 8,60.

62.804

File FA 53729-1-PT/DJB/RFT ?0. OL’T. 199Q,

Mod. 71-10000βχ.-89/07

Depois de incubação durante vinte minutos a 37^QC, interromperam-se as reacções por precipitação com ácido tricloro-acético (TCA) a 10%. Determinou-se a actividade a partir da absorvância a um comprimento de onda de 280 nm do sobrenadante depois de precipitação com TCA a 10%.

TABELA I

Actividade Proteolítica Relativa de Variantes do Codão 123 Normalizadas em Relação à Mutante Asn-123~

Codão 123		Percentagem de Actividade: Proteolítica
Ser		116
Asn		100
Cys		22
Gly		12
Ala		9
Thr		7
Gin		7
Vai		6
Glu		<5
Ile		<5
Trp		<5
Phe		<5
Asp		<5
His		<5
Leu		<5
Met		<5
Pro		<5
Tyr		<5 !

No processo de confirmação final da sequência / de ADN do gene sintético que codifica a enzima BG3-RYSA, verificou-se que, na posição 78, se encontrava prolina em vez de serina (o aminoácido nesta posição da subtilisina de B. lentus).

62.804

File FA 53729-1-PT/DJB/RFT

OUT1990

Ensaiaram-se as propriedades·. iniciais. das mutações na posição 123 desta enzima , BC3-REYA. (prolina na posição 7’8). Estes resultados estão reunidos na Tabela I. 0 ami. noácido da posição 78 foi depois trocado por serina para for5 mar o ADN e a sequência de aminoácidos representada na Figura 10, substituindo o ADN sintético duplex que corresponde a esta porção do gene.

Como se pode ver, a substituição de Asn por Ser na posição +123 tem como resultado o aumento substancial da actividade proteolítica. A relação entre as várias subtilisinas referidas na presente memória descritiva está resumida para as posições 27, 78, 104, 123 e 274 na Tabela II.

Mod. 71-10000 βχ. -89/07

TABELA II

Posição

	27	78	104 -	123	274
GC36 (genomico)	Lys(K)	Ser(S)	Val(V)	Asn(N)	'Thr(T)
Gene sintético de B. lentus-	Lys(K)	Pro(P)	Val(V)	Asn(N)	Ala(A)
Subtilisina de B. am£ loliquefaciens (BPN)	Lys(K)	Ser(S)	Tyr(Y)	Asn(N)	Ala(A)
Subtilisina 309 como publicada	Lys(K)	Ser(S)	Val(V)	Asn(N)	Thr(T)
Forma de realização pre ferida de acordo com a presente!invenção	Arg(R)	Ser(S)	Tyr(Y)	Ser(S)	Ala(A)

EXEMPLO 6

Estabilidade de Mutantes na Posiçãó'-274

Na Tabela III, encontra-se indicada a estabilidade de mutantes na posição 274 de BC3-RPY (arginina na po

File FA 53729-1-PT/DJB/RFT

sição 27, prolina na posição 78 e tirosina na posição 104 na subtilisina de B. lentus). Qs dados são relativos a activida. des percentuais que se mantêm a seguir à incubação a 37⁹C em EDTA 50 nM durante sessenta minutos.

TABELA III

Aminoácido Actividade

na Posição 274	Percentual
Leucina	2%
Serina	79%
Treonina	91%
Valina	42%
Alanina	43%

As mutações nesta posição afectam nitidamente a estabilidade da enzima. Muito embora a mutação da alanina não fosse tão estável como a da serina ou a da treonina nesta posição, esta enzima proporcionou um comportamento superior relativamente à subtilisina de B. lentus nas condições de utilização descritas. Para diferentes aplicações, po. dem utilizar-se outros aminoácidos na posição 274.

Exemplo 7

Composição Detergente

Preparou-se uma composição granular detergen te contendo fTTsfato, seca por pulverização, com a seguinte composição:

- 34 File FA 53729-1-PT/DJB/RFT

30.0011990

Componente	Percentagem em
Alquilo linear em C^-benzeno-sulfonato de sódio	8,45
Sal de sódio de sulfato de álco- ol de sebo	4,23
Alquilo linear em C|^-C^5~sulfato de sódio	4,23
Tolueno-sulfonato de sódio	1,00
Tripolifosfato de sódio	5,60
Pi-rofosfato de sódio	22,40
Silicato (proporção 1,6)	5,50
Sulfato de sódio	29,83
Poliacrilato de sódio (45Ό0
de peso molecular)	1,17
Abrilhantador	0,22
Carbonato de sódio	12,30
Polietileno-glicol (peso molecular = 8000)	0,47
Pôlietoxilato (6,5) de álcool em C«ι*2*	0,50
Diversos + água atá perfazer	100%
„ ** Protease	0,034

* Excluindo o álcool mono-etoxilado.

** Miligramas de enzima activa por grama (2,0 mg de enzima activà/grama de produto armazenado).

Uma solução com 0,1% em peso desta composi ção em água tinha um valor de pH de 10,0. A composição com a subtilisina mutante de acordo com a presente invenção (Figura 7) proporcionou propriedades superiores de limpeza de nódoas sensíveis a enzima em comparação com Bacillus lentus

- File FA 53729-1-PT/DJB/RFT OUT. 1990

CbL·^ a 0,068 mg de enzima activa/grama de produto numa lavagem a 35⁹C (95⁹ F) com uma dureza de 6 grãos por galão (gpg) (3:1 de Ga/Mg).

Ao longo de toda esta memória descritiva, faz-se referência a vários aminoácidos por meio de códigos vulgares de uma e três letras. Esses códigos são identificados em Proteins : Structures and Molecular Proteases, Thomas E. Creighton,Edà·. W. N. Freeman, N. Y., N. Y. (1983), página 3.

Muito embora se tenha descrito anteriormente a forma de realização preferida da presente invenção, é obvio para os peritos nõ assunto à qual esta invenção diz respeito que, depois de se compreender a invenção como um todo, se po. dem fazer várias alterações e modificações equivalentes sem afastamento do âmbito da invenção tal como e definido pelas reivindicações anexas.

Todas as publicações referidas são expressamente incorporadas na presente memória descritiva como referência.

Claims (11)

1. -REIVINDICAÇÕESl^â. - Processo para a preparação de uma composição de limpeza enzimática capaz de degradar proteínas-, caracterizado pelo facto de conter

   a) uma mistura detergente tensioactiva; e

   b) jjma carbonil-hidrolase mutante que tem uma sequência de amino-ácidos que não se encontra na natureza que é uma forma derivada de uma carbo, nil-hidrolase precursora por substituição de um resíduo de aminoácido por um aminoácido dife. rente numa posição da citada precursora equivalente a +123 ou +274 na subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.
2. 2^ã. - Processo de acordo com a reivindicação

   - 36 File FA 53729-1-PT/DJB/RFT

   1, caracterizado pelo facto de na composição a referida enzima carbonil-hidrolase compreender uma subtilisina.
3. 3^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo facto de na subtilisina mutante a citada substituição ser numa posição equivalente a +123.
4. 4^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o resíduo de amino-ácido na referida posição da mencionada subtilisina mutante ser serina.
5. 5^ã. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de a subtilisina mutante derivar de uma subtilisina de Bacillus .
6. 6^â. - Proc-esso de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a subtilisina de Bacillus mutante possuir actividade proteolítica melhorada e derivar de subtilisina de Bacillus de ocorrência natural ot. precursora da mutante que tem o resíduo de amino-ácido numa posição equivalente a +123 em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens mudado para serina.
7. 7-. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a subtilisina de Bacillus ter serina numa posição equivalente a +123 em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens .
8. 8^ã. - Processo de acordo com as rneivindicações 6 e 7, caracterizado pelo facto de a subtilisina de Bacillus mutante ter a seguinte sequência de amino-ácidos

   AQSVPWGOSRVQAPAAHNRGLTGSGVRVAVLDTGISTHEDLNIRGGASFVPGE

   PSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSYSSIA

   QGLEWAGNNGMHVASLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSI í

   SYPARYANAMOGATDQNNNRASFSQYGAGIÍDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLN

   GTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAE

   AAAR.
9. 9^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo facto de a mencionada subtilisina ter a

   File FA 53729-1-PT/DJB/RFT seguinte sequência de amino-ácidos aqsvpwgosrvqapaahnrgltgsgvrvavldtgisthpdlnirggasfvpge

   PSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAEEYAVKVLGASGSGSYSSIA

   -QGLEWAGNNGMHVASLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSI

   SYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLN

   GTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAE

   AAAR:
10. 10^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na referida composição a mistura tensioactiva comprender um detergente.
11. 11-. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a referida composição compreender grânulos detergentes secos por pulverização.