PT1491208E - Composições farmacêuticas contendo polipéptido líquidas estabilizadas - Google Patents
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Description
ΡΕ1491208 1
DESCRIÇÃO
"COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO POLIPÉPTIDO LÍQUIDAS ESTABILIZADAS"
DOMÍNIO DO INVENTO O presente invento refere-se de uma maneira geral à preparação de composições farmacêuticas líquidas, mais particularmente a composições farmacêuticas compreendendo inibidor da via do factor tissular (TFPI) ou variantes deste, que tipicamente são instáveis em formulações farmacêuticas líquidas.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Os avanços recentes no desenvolvimento da tecnologia da engenharia genética proporcionaram uma grande variedade de polipéptidos biologicamente activos em quantidades suficientemente grandes para utilização como fármacos. Os polipétidos, contudo, podem perder actividade biológica como resultado de instabilidades físicas, incluindo a desnaturação e a formação de agregados solúveis e insolúveis e uma variedade de instabilidades químicas, tais como hidrólise, oxidação e desamidação. A estabilidade dos polipétidos em formulações farmacêuicas líquidas pode ΡΕ1491208 ser afectada, por exemplo, através de factores tais como o pH, a força iónica, a temperatura, ciclos repetidos de congelação-descongelação e exposição a forças de corte mecânicas, tais como as que ocorrem durante o processamento. A formação de agregados e a perda de actividade biológica podem também ocorrer como resultado de uma agitação física e interacções de moléculas de polipéptidos em solução e nas interfaces líquido-ar em frascos de armazenamento. A formação de agregados de TFPI é discutida em Chen et al. (1999, J. Pharm. Sciences, 88 (9), 881-888) assim como vias para reverter a agregação. Outras alterações conformacionais podem ocorrer em polipéptidos adsorvidos nas interfaces ar-líquido e sólido-líquido durante a compressão-extensão das interfaces que resultam da agitação durante o transporte ou de outro modo. Tal agitação pode fazer com que as proteínas se emaranhem, agreguem, formem partículas e finalmente precipitem com outras proteínas adsorvidas. Para uma revisão geral da estabilidade dos produtos farmacêuticos de proteínas, ver por exemplo, Manning et al. (1989), Pharm. Res. 6:903-918 e Wang e Hanson (1988) J. Parenteral Sei. Tech. 42:S14. A instabilidade das formulações farmacêuticas líquidas contendo polipéptido tem a ver com a prontidão de embalagem destas formulações numa forma liofilizada em conjunto com um meio líquido para reconstituição. Embora a liofilização melhore a estabilidade da composição, muitos polipéptidos apresentam uma diminuição da actividade, quer 3 ΡΕ1491208 durante o armazenamento quer no estado seco (Pikal (1990) Biopharm. 27: 26-30) ou como resultado da formação de agregados ou perda de actividade catalítica após reconstituição como formulação líquida (ver, por exemplo, Carpenter et al. (1991) Develop. Biol. Standard 74: 225-239; Broadhead et al. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20; Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). Embora a utilização de aditivos tenha melhorado a estabilidade das proteínas secas, muitas formulações re-hidratadas continuam a ter quantidades inaceitáveis ou indesejáveis de proteínas inactivas agregadas (ver, por exemplo, Townsend e deLuca (1983) J. Pharm. Sei 80: 63-66; Hora et al. (1992) Pharm. Res. 9: 33-36; Yoshiaka et al. (1993) Pharm. Res. 10 : 687-691). A necessidade de reconstituição é também uma inconveniência e introduz a possibilidade de doseamento incorrecto.
Embora um certo número de composições farmacêuticas líquidas tenha sido formulado para estabilizar a actividade biológica dos polipéptidos aí contidos, a degradação dos polipéptidos em formulações liquidas continua a criar problemas para os profissionais de saúde. Consequentemente, existe uma necessidade de composições farmacêuticas adicionais compreendendo estabilizantes fisiologicamente compatíveis que promovem a estabilidade dos componentes de polipéptidos, mantendo assim a sua eficácia terapêutica. 4 ΡΕ1491208
SUMÁRIO DO INVENTO
Composições compreendendo a proteína do inibidor da via do factor tissular (TFPI) ou uma variante deste (daqui para a frente referido como "um polipéptido TFPI") como componente terapeuticamente activo e métodos úteis para a sua preparação são proporcionados. As composições são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas que incluem um polipéptido TFPI cuja eficácia como componente terapeuticamente activo está normalmente comprometida durante o armazenamento em formulações líquidas como resultado da agregação do polipéptido. As composições farmacêuticas líquidas estabilizadas do invento compreendem, adicionalmente a um polipéptido TFPI que apresenta formação de agregados durante o armazenamento numa formulação líquida, uma quantidade de um aminoácido base suficiente para diminuir a formação de agregados do polpipéptido durante o armazenamento, em que o aminoácido base é um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, em que qualquer aminoácido está presente quer na sua forma de base livre quer na sua forma de sal. As composições compreendem ainda um agente de tamponamento para manter o pH da composição líquida dentro de uma gama aceitável para a estabilidade do polipéptido TFPI, em que o agente de tamponamento é um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e a sua forma de sal. 0 aminoácido base serve para estabilizar o polipéptido TFPI contra a formação de agregados durante o 5 ΡΕ1491208 armazenamento da composição farmacêutica liquida, enquanto que a utilização de um ácido substancialmente livre da sua forma de sal , um ácido na sua forma de sal ou uma mistura de um ácido e da sua forma de sal como agente de tampo-namento resulta numa composição líquida possuindo uma osmolaridade que é aproximadamente isotónica. A composição farmacêutica liquida pode incorporar, adicionalmente, outros agentes de estabilização, mais particularmente metionina, um tensioactivo não iónico, tal como o polisorbato 80, e EDTA, para aumentar ainda mais a estabilidade do polipéptido. Tais composições farmacêuticas líquidas são ditas como estando estabilizadas, dado que a adição do aminoácido base em combinação com um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal ou uma mistura de um ácido e a sua forma de sal, resulta em composições que possuem uma melhor estabilidade ao armazenamento em relação às composições farmacêuticas liquidas formuladas na ausência da combinação deste dois componentes. Métodos para aumentar a estabilidade de um polipéptido TFPI numa composição farmacêutica liquida e para aumentar a estabilidade ao armazenamento de uma tal composição farmacêutica são também proporcionados. Os métodos compreendem a incorporação na composição farmacêutica líquida de uma quantidade de um aminoácido base suficiente para diminuir a formação de agregados do polipéptido TFPI durante o armazenamento da composição, e um agente de tamponamento, em que o agente de tamponamento 6 ΡΕ1491208 é um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal ou uma mistura de um ácido e a sua forma de sal. Os métodos encontram uso na preparação das composições farmacêuticas liquidas do invento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 apresenta a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras de estabilidade armazenadas a 40°C, com análise por RP-HPLC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6, e 270 mM de sorbitol ou sacarose ou manitol. A Figura 2 apresenta a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras de estabilidade armazenadas a 50°C, com análise por RP-HPLC. As formulações continham 0,1 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6, e 150 mM de vários aminoácidos, tal como indicado na figura. A Figura 3 apresenta a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras de estabilidade armazenadas a 40°C, com análise por RP-HPLC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6, e 50, 100 ou 270 mM de sorbitol. A Figura 4 apresenta a percentagem remanescente de IL-2 solúvel em amostras de estabilidade armazenadas a 50°C, com análise por RP-HPLC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6, e 50, 100 ou 150 mM de arginina. 7 ΡΕ1491208 A Figura 5 mostra a meia-vida (ti/2, em dias) da 11-2 solúvel remanescente analisada por RP-HPLC em função do pH a 50°C. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de tampão (glicina, acetato de sódio, citrato de sódio, succinato de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio) e 150 mM de NaCl, 270 mM de sorbitol, ou 150 mM de arginina. A Figura 6 mostra o registo Ln-Ln da meia-vida (ti/2) versus a concentração inicial de proteína para amostras de estabilidade armazenadas a 50°C. As formulações continham 0,1, 0,2 ou 0,5 mg/ml de IL-2 em 10 mM de succinato de sódio a pH 6, e 150 mM de L-arginina. A Figura 7 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel analisada por RP-HPLC, em amostras tratadas com 1, 3 e 5 ciclos de congelação-descongelação de -70°C até à temperatura ambiente. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6, 150 mM de L-arginina e 0 a 0,1% de polisorbato 80. A Figura 8 mostra a percentagem remanescente de IL-2 solúvel analisada por RP-HPLC, em amostras tratadas com envio de Emeryville, Califórnia para St. Louis, Missouri e de St. Louis de volta para Emeryville em gelo. Foram utilizadas duas formulações contendo várias quantidades de polisorbato 80: uma formulação de arginina, contendo 0,2 mg/ml de IL-2 em 10 mM de succinato de sódio a ΡΕ1491208 ρΗ 6 e, 150 mM de L-arginina; e uma formulação de NaCl contendo 0,2 mg/ml de IL-2 em 10 mM de citrato de sódio a pH 6,5, 200 mM de NaCl.
A Figura 9 mostra a meia-vida (11/2, em dias) do TPFI solúvel remanescente em quatro formulações analisadas por IEX-HPLC como função da concentração de arginina a 50°C. Todas as formulações continham 0,15 mg/ml de TFPI e quer L-arginina base quer L-arginina HC1, tamponada a pH 5.5 quer com ácido cítrico quer com 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio. As formulações de TFPI específicas continham: (a) 20-250 mM de L-arginina HC1, 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio como tampão; (b) 20-150 mM de L-arginina base, titulada com ácido cítrico; (c) 100-300 mM de L-arginina HC1, 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio como tampão; (d) 100-300 de mM L-arginina base titulada com ácido cítrico.
A Figura 10 mostra a meia-vida (11/2, em dias) do TPFI solúvel remanescente em quatro formulações analisadas por IEX-HPLC como função da concentração de arginina a 50°C. Todas as formulações continham 0,15 mg/ml de TFPI e quer L-arginina base quer L-arginina HC1, tamponada a pH 5.5 quer com ácido cítrico quer com 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio. As formulações de TFPI específicas continham: (a) 20-150 mM de L-arginina HC1, 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio como tampão; (b) 20-150 mM de L-arginina base, titulada com ácido cítrico; (c) 100-300 mM de L-arginina HC1, 10 mM de ácido cítrico e citrato de ΡΕ1491208 sódio como tampão; e (d) 100-300 de mM L-arginina base titulada com ácido cítrico. A Figura 11 mostra a meia-vida (ti/2, em dias) do TPFI solúvel remanescente em quatro formulações analisadas por IEX-HPLC como função da concentração de arginina a 50°C. Todas as formulações continham 0,15 mg/ml de TFPI e L-arginina base, titulada a pH 5,5 quer com ácido succínico quer com ácido cítrico. As formulações de TFPI específicas continham: (a) 20-150 mM de L-arginina base, titulada com ácido cítrico; (b) 20-150 mM de L-arginina base, titulada com ácido cítrico; (c) 100-300 mM de L-arginina base, titulada com ácido cítrico; e (d) 100-300 de mM L-arginina base titulada com ácido cítrico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento refere-se a composições farmacêuticas líquidas compreendendo um polipéptido TFPI como componente terapeuticamente activo e a métodos úteis para a sua preparação. Para os fins do presente invento, o termo "líquido" em relação da composições ou formulações farmacêuticas pretende incluir o termo "aquoso". O termo "polipéptido", tal como aqui utilizado, engloba polipépti-dos TFPI e proteínas que ocorrem naturalmente (nativas), sintéticas e recombinantes e variantes biologicamente activas destes, como aqui qualificado. Por "componente terapeuticamente activo" pretende significar-se que o polipéptido está especificamente incorporado na composição 10 ΡΕ1491208 para conferir a desejada resposta terapêutica no que se refere ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição de um sujeito quando a composição farmacêutica é administrada a tal sujeito.
Mais particularmente, as composições do invento são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente activos incluem polipéptido TFPI que normalmente apresenta formação de agregado durante o armazenamento em formulações farmacêuticas líquidas. Por "formação de agregado" pretende significar-se uma interacção física entre as moléculas de polipéptido que resultam na formação de oligómeros, que podem permanecer solúveis, ou grandes agregados visíveis que precipitam da solução. Por "durante o armazenamento" pretende significar-se uma composição ou formulação farmacêutica líquida que uma vez preparada não é imediatamente administrada a um sujeito. Em vez disso, a seguir à preparação, esta é embalada para armazenamento, quer numa forma líquida, num estado congelado, quer numa forma seca para posterior reconstituição numa forma líquida ou outra forma adequada para administração um sujeito. Por "forma seca" pretende significar-se a composição ou formulação farmacêutica líquida que é seca quer por secagem por congelação (i.e. liofilização; ver, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Scl. Technol. 38: 48-59), quer por secagem por pulverização (ver Masters (1991) em Spray-Drying Handbook (5a ed.; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), p. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 11 ΡΕ1491208 18: 1169-1206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20) quer por secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). A formação de agregados por um polipétido durante o armazenamento de uma composição farmacêutica liquida pode afectar negativamente a actividade biológica desse polipéptido, resultando na perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Para além disso, a formação de agregados pode provocar outros problemas, tais como o blo-queamento de tubagens, membranas ou bombas quando a composição farmacêutica contendo o polipéptido é administrada utilizando um sistema de infusão.
As composições farmacêuticas liquidas estabilizadas do invento compreendem ainda uma quantidade de um aminoácido base suficiente para diminuir a formação de agregados pelo polipéptido durante o armazenamento da composição. Por "aminoácido base" pretende significar-se um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, em que qualquer dado aminoácido está presente quer na sua forma de base livre quer na sua forma de sal. Quando é utilizada uma combinação de aminoácidos, todos os aminoácidos podem estar presentes nas suas formas de base livre, todos podem estar presentes nas suas formas de sal ou alguns podem estar presentes nas suas formas de base livre enquanto outros estão presentes nas suas formas de sal. O aminoácido que é utilizado na preparação das composições do invento, é a arginina. Qualquer estereoisómero (i.e. isómero L, D ou DL) do aminoácido ou combinações destes estereoisómeros, podem 12 ΡΕ1491208 estar presentes nas composições farmacêuticas do invento desde que o aminoácido particular esteja presente quer na sua forma de base livre quer na sua forma de sal. Preferencialmente é utilizado o estereoisómero L.
Em combinação com o aminoácido base, tal como aqui definido, as composições farmacêuticas liquidas estabilizadas do invento compreendem ainda um sal substancialmente livre da sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal ou uma mistura de um ácido e da sua forma de sal para manter o pH da solução. Preferencialmente, o pH é mantido utilizando o aminoácido base em combinação com um ácido substancialmente livre da sua forma de sal. Uma tal combinação proporciona uma menor osmolaridade da solução do que a que existira se fossem utilizados um ácido e a sua forma de sal como agentes de tamponamento em combinação com um aminoácido base para formular uma composição farmacêutica estabilizada. A vantagem de uma tal combinação é a de que se pode incorporar uma maior concentração do estabilizador, o aminoácido base, na composição farmacêutica sem exceder a isotonicidade da solução. Por "um ácido substancialmente livre da sua forma de sal" pretende significar-se que o ácido que serve como agente de tamponamento na composição farmacêutica liquida está presente na ausência de qualquer das suas formas de sal. Tipicamente, quando é utilizado um tampão compreendendo um ácido numa composição farmacêutica liquida, este é preparado utilizando uma forma de sal do ácido ou uma combinação do ácido e da forma de sal do ácido. Deste modo, por exemplo, o tampão é preparado 13 ΡΕ1491208 utilizando o ácido com o seu contra-ião, tal como sódio, potássio, amónio, cálcio ou magnésio. Assim, um tampão succinato consiste geralmente de um sal de ácido succinico, tal como succinato de sódio, ou uma mistura de ácido succinico e succinato de sódio. Embora o ácido utilizado como agente de tamponamento nas composições farmacêuticas liquidas estabilizadas do invento possa estar sob a forma de sal do ácido ou de uma mistura do ácido e da sua forma de sal, preferencialmente o ácido que serve como agente de tamponamento está somente na sua forma de ácido. Ácidos adequados para utilização na formulação das composições contendo péptido liquidas estabilizadas do presente invento incluem, mas não estão limitados a, ácido succinico, ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido glutâmico, ácido maleico, ácido málico, ácido acético, ácido tartárico e ácido aspártico, mais preferencialmente ácido succinico e ácido cítrico, muito preferencialmente ácido succinico.
As composições farmacêuticas contendo péptido TFPI líquidas do invento são composições "estabilizadas". Por "estabilizadas" pretende significar-se que as composições líquidas aumentaram a estabilidade ao armazenamento em relação às composições preparadas na ausência da combinação de um aminoácido base e um agente de tamponamento tal como aqui descrito. Esta estabilidade ao armazenamento aumentada é observada na formulação líquida, quer seja armazenada directamente nessa forma para uso posterior, armazenada num estado congelado e descongelada antes da utilização ou preparada numa forma seca, tal como 14 ΡΕ1491208 uma forma liofilizada, seca ao ar ou seca por pulverização, para posterior reconstituição numa forma liquida ou outra forma antes de utilização. Preferencialmente, as composições do invento são armazenadas directamente na sua forma liquida para assumir todas as vantagens da conveniência de ter uma estabilidade ao armazenamento aumentada na forma liquida, facilidade de administração sem reconstituição, e capacidade de fornecer a formulação em seringas pré-cheias prontas a utilizar ou como preparações multidose se a formulação for compatível com agentes bacteriostáticos.
As composições do invento referem-se à descoberta de que a adição do aminoácido arginina na sua forma de base livre ou na sua forma de sal em combinação com um ácido substancialmente livre ou na sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal, ou uma mistura de um ácido e a sua forma de sal, resulta numa composição farmacêutica contendo polipéptido TFPI líquida que tem uma maior estabilidade ao armazenamento em relação à composição farmacêutica contendo polipéptido TFPI líquida preparada sem a combinação destes dois componentes. A maior estabilidade ao armazenamento da composição é conseguida através da influência do aminoácido na estabilidade do polipéptido TFPI terapeuticamente activo, mais particularmente a sua influência na agregação do polipéptido de TFPI durante o armazenamento em formulações líquidas. Para além disto, a incorporação de um aminoácido base, tal como aqui definido e um ácido substancialmente livre da sua forma de sal nas formulações contendo polipéptido de TFPI líquidas resulta em composições 15 ΡΕ1491208 farmacêuticas que são quase isotónicas sem terem que incluir agentes de isotonicidade adicionais, tais como cloreto de sódio. Por "quase isotónica" pretende significar-se que a composição líquida tem uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg até cerca de 360 mmol/kg, preferencialmente cerca de 240 até cerca de 340 mmol/kg, mais preferencialmente cerca de 250 até cerca de 330 mmol/kg, e ainda mais preferencialmente cerca de 260 até cerca de 320 mmol/kg, muito preferencialmente cerca de 270 até cerca de 310 mmol/kg. O aminoácido base incorporado nas composições farmacêuticas líquidas estabilizadas do invento protege o polipéptido TFPI terapeuticamente activo contra a agregação, aumentando assim a estabilidade do polipéptido durante o armazenamento da composição. Por "aumento de estabilidade" pretende significar-se que a formação de agregado pelo polipéptido TFPI durante o armazenamento da composição farmacêutica líquida diminui em relação à formação de agregado do polipéptido TFPI durante o armazenamento na ausência deste particular agente de estabilização. A diminuição da formação de agregado com a adição de aminoácido base ocorre de forma dependente da concentração. Ou seja, o aumento das concentrações do aminoácido base conduz a um aumento de estabilidade de um polipéptido TFPI numa composição farmacêutica líquida quando esse polipéptido apresenta normalmente formação de agregado durante o armazenamento numa formulação liquida na ausência do aminoácido base. A determinação da quantidade 16 ΡΕ1491208 do particular aminoácido base a ser adicionado a uma composição farmacêutica liquida para diminuir a formação de agregados aumentando assim a estabilidade do polipéptido e aumentando, deste modo, a estabilidade ao armazenamento da composição, pode ser prontamente determinada para qualquer polipétido particular de interesse sem a indevida experimentação utilizando métodos geralmente conhecidos pelos especialistas na matéria.
Deste modo, por exemplo, o efeito do aminoácido base arginina na agregação do polipéptido TFPI durante o armazenamento numa composição liquida pode ser prontamente determinado através da medição da alteração de polipéptido solúvel na solução ao longo do tempo. A quantidade de polipéptido TFPI solúvel em solução pode ser quantificada através de um certo número de ensaios analíticos adaptados para a detecção do polipéptido de interesse. Tais ensaios incluem, por exemplo, HPLC de fase inversa (RP) , HPLC de exclusão molecular (SEC) e absorvância de UV, tal como aqui descrito nos Exemplos abaixo. Quando o polipéptido TFPI de interesse forma agregados solúveis e insolúveis durante o armazenamento em formulações liquidas, pode ser utilizada uma combinação de RP-HPLC e SEC-HPLC para distinguir entre essa porção do polipéptido solúvel que está presente como agregados solúveis e essa porção que está presente na forma molecular não agregada biologicamente activa, tal como descrito no Exemplo 1 abaixo.
No caso da agregação, uma quantidade eficaz de 17 ΡΕ1491208 aminoácido base para incorporar numa composição farmacêutica liquida contendo polipéptido TFPI para se obter a composição farmacêutica estabilizada do invento seria vista como uma quantidade que tenha resultado numa menor formação de agregado ao longo do tempo e assim uma maior retenção de polipéptido solúvel em solução na sua forma molecular não agregada biologicamente activa. Deste modo, tal como aqui descrito nos Exemplos abaixo, uma quantidade eficaz de agente de estabilização para utilização na preparação de uma composição estabilizada do invento seria uma quantidade que resulte numa maior retenção do TFPI na sua forma molecular monomérica. A estabilidade ao armazenamento aumentada das composições líquidas contendo polipéptido TFPI do invento pode estar também associada aos factores inibitórios do aminoácido base na desamidação dos resíduos de glutamina e/ou asparagina num polipéptido terapeuticamente activo durante o armazenamento. 0 efeito de um aminoácido base particular na desamidação destes resíduos durante o armazenamento numa composição líquida pode ser prontamente determinado monitorizando a quantidade de polipéptido TFPI presente na sua forma desamidada ao longo do tempo. Métodos para mediar as espécies moleculares, i.e., nativas ou desamidadas, de um particular polipéptido TFPI presente na fase de solução, são geralmente conhecidos na arte. Tais métodos incluem separação cromatográfica das espécies moleculares e identificação utilizando padrões de peso molecular de polipéptido, tais como RP-HPLC, tal como descrito nos Exemplos abaixo. 18 ΡΕ1491208 A utilização de uma combinação de um aminoácido base tamponado com um ácido substancialmente livre da sua forma de sal para aumentar a estabilidade do polipéptido TFPI em composições farmacêuticas liquidas estabilizadas do invento proporciona vantagens em relação, por exemplo, à utilização de um aminoácido num sistema tampão de ácido succinico/succinato de sódio. Esta nova combinação permite a preparação de formulações quase isotónicas possuindo maiores concentrações do aminoácido estabilizador que podem ser conseguidas com a utilização de um sistema tampão que seja uma mistura de um ácido e a sua forma de sal. A maior concentração do aminoácido estabilizador permite ainda maiores aumentos na estabilidade do polipéptido e, deste modo, em maior estabilidade ao armazenamento da formulação.
Similarmente, quando o ácido cítrico é utilizado para tamponar a arginina base numa formulação liquida compreendendo a proteína do inibidor da via do factor tissular (TFPI) e possuindo um pH adequado para essa proteína (pH 5,5) , a concentração de arginina pode ser aumentada até 300 mM ao mesmo tempo que se mantém a isotonicidade da formulação. Isto resulta num aumento de quase 50% da duração no armazenamento do TFPI a 50 °C. Embora uma duração no armazenamento do TFPI semelhante possa ser conseguida utilizando a mesma concentração de arginina e ácido cítrico/citrato de sódio como agente de tamponamento, a arginina deve ser novamente adicionada na sua forma acídica para se conseguir um pH semelhante, e a 19 ΡΕ1491208 formulação resultante é hipertónica (ver Exemplo 8, Tabela 18). A capacidade de utilizar concentrações mais elevadas de um aminoácido como agente de estabilização primário elimina a necessidade de estabilizadores de polipéptidos mais tradicionais tais como albumina de soro bovino ou albumina de soro humano, que são agentes de estabilização menos desejáveis por causa de potencial contaminação virai.
Adicionalmente, a isotonicidade das composições farmacêuticas liquidas é desejável dado que resulta em menos dores após administração e minimiza potenciais efeitos hemoliticos associados às composições hipertónicas e hipotónicas. Deste modo, as composições estabilizadas do invento não apenas têm uma maior estabilidade ao armazenamento como também possuem o beneficio extra de reduzir substancialmente a dor após administração quando comparadas com formulações que utilizam outros sistemas de tampona-mento mais tradicionais consistindo de um ácido e a forma de sal do ácido. Por exemplo, a composição farmacêutica liquida estabilizada quando injectada apresenta menos dor associada a queimadura e picada em relação à injecção de solução salina normal (ver Exemplo 7).
Tendo identificado as vantagens de preparar composições líquidas de polipéptido TFPI do invento com um aminoácido base como agente de estabilização primário e um ácido substancialmente livre da sua forma de sal como agente de tamponamento, está dentro dos conhecimentos dos especialistas na matéria determinar, sem a indevida 20 ΡΕ1491208 experimentação, concentrações preferidas de cada um destes componentes a ser incorporado numa composição farmacêutica liquida compreendendo um polipéptido terapeuticamente activo de interesse que apresente a formação de agregados aqui descrita para conseguir uma maior estabilidade do polipéptido TFPI durante o armazenamento dessa composição. Seguindo os protocolos descritos, por exemplo, no Exemplo 1 abaixo, um especialista na matéria poderá avaliar uma gama de concentrações desejadas do aminoácido base e dos vários ácidos de tamponamento para utilização nas composições farmacêuticas liquidas aqui descritas. Preferencialmente, a quantidade de aminoácido base incorporada na composição está numa gama de concentração de cerca de 100 mM até cerca de 400 mM, preferencialmente de cerca de 130 mM até cerca de 3 75 mM, mais preferencialmente de cerca de 150 mM até cerca de 350 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 175 mM até cerca de 325 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 180 mM até cerca de 300 mM, ainda mais preferencialmente de cerca de 190 mM até cerca de 280 mM, muito preferencialmente de cerca de 200 mM até cerca de 260 mM, dependendo da proteína presente na composição. Embora o agente de tamponamento possa ser o ácido na sua forma de sal, ou uma mistura do ácido e da sua forma de sal, preferencialmente o agente de tamponamento é o ácido substancialmente livre da sua forma de sal, pelas razões vantajosas aqui descritas. O ácido utilizado como agente de tamponamento é, preferencialmente, adicionado numa gama de concentração de cerca de 40 mM até cerca de 250 mM, cerca de 50 mM até cerca de 240 mM, cerca de 60 mM até cerca de 21 ΡΕ1491208 230 mM, cerca de 70 mM até cerca de 220 mM, mais preferencialmente cerca de 80 mM até cerca de 210 mM, muito preferencialmente cerca de 90 mM até cerca de 200 mM, dependendo do ácido utilizado como agente de tamponamento e o pH óptimo para o polipéptido TFPI ser estabilizado contra a formação de agregados.
Numa forma de concretização, o aminoácido base é arginina base presente numa concentração de cerca de 230 mM e o ácido utilizado como agente de tamponamento é ácido succinico com uma concentração de cerca de 128 mM. Isto permite a preparação de uma composição farmacêutica liquida contendo polipéptido possuindo uma osmolaridade que é quase isotónica e um pH de cerca de 5,8. Noutra forma de concretização, o aminoácido base é arginina base presente numa concentração de cerca de 300 mM e o ácido utilizado como agente de tamponamento é ácido cítrico com uma concentração de cerca de 120 mM. Isto permite a preparação de uma composição farmacêutica líquida contendo polipéptido TFPI possuindo uma osmolaridade que é próxima da isotónica e um pH de cerca de 5,5. Ainda noutra forma de concretização, o aminoácido base é arginina base presente numa concentração de cerca de 200 mM até cerca de 300 mM e o ácido utilizado como agente de tamponamento é ácido succí-nico com uma concentração de cerca de 120 mm até cerca de 180 mM. Isto permite a preparação de uma composição farmacêutica líquida contendo polipéptido possuindo uma osmolaridade de cerca de 256 mmol/kg até cerca de 363 mmol/kg e um pH de cerca de 5,5. 22 ΡΕ1491208
Ainda noutra forma de concretização do invento, a composição farmacêutica liquida estabilizada compreende TFPI ou uma variante deste como polipéptido, arginina base numa concentração de cerca de 100 mM até cerca de 400 mM e ácido succinico numa concentração de cerca de 80 mM até cerca de 190 mM. Numa forma de concretização preferida, a arginina base está presente na composição farmacêutica liquida com TFPI com uma concentração de cerca de 200 mM até cerca de 300 mM e o ácido succinico está presente numa concentração de cerca de 120 mM até cerca de 180 mM. Esta composição de TFPI preferida tem um pH de cerca de 5,5 e uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg até cerca de 360 mmol/kg. A concentração de TFPI ou de uma variante deste nestas composições é de cerca de 0,01 mg/ml até cerca de 0,5 mg/ml, preferencialmente cerca de 0,05 mg/ml até cerca de 2,0 mg/ml, mais preferencialmente cerca de 0,10 mg/ml até cerca de 1,0 mg/ml, muito preferencialmente cerca de 0,10 mg/ml até cerca de 0,60 mg/ml.
Noutra forma de concretização do invento, a composição farmacêutica liquida estabilizada compreende TFPI ou uma variante deste como polipéptido, arginina base numa concentração de cerca de 175 mM até cerca de 400 mM e ácido cítrico numa concentração de cerca de 40 mM até cerca de 200 mM. Numa forma de concretização preferida, a arginina base está presente na composição farmacêutica liquida com TFPI com uma concentração de cerca de 250 mM até cerca de 350 mM e o ácido cítrico está presente numa 23 ΡΕ1491208 concentração de cerca de 100 mM até cerca de 150 mM. Esta composição de TFPI preferida tem um pH de cerca de 5,0-6,5 e uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg até cerca de 360 mmol/kg. Ainda noutra forma de concretização, a arginina base está presente numa concentração de cerca de 300 mM e o ácido cítrico está presente numa concentração de cerca de 120 mM. Esta composição de TFPI tem um pH de cerca de 5,5 e uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg até cerca de 360 mmol/kg. A concentração de TFPI ou de uma variante deste nestas composições é de cerca de 0,01 mg/ml até cerca de 0,5 mg/ml, preferencialmente cerca de 0,05 mg/ml até cerca de 2,0 mg/ml, mais preferencialmente cerca de 0,10 mg/ml até cerca de 1,0 mg/ml, muito preferencialmente cerca de 0,10 mg/ml até cerca de 0,60 mg/ml.
Tal como mostrado nos exemplos abaixo, o pH de uma composição farmacêutica líquida contendo polipéptido TFPI afecta a estabilidade do polipéptido aí contido, principalmente através do seu efeito na formação de agregados pelo polipéptido de TFPI. Deste modo, a quantidade de ácido de tamponamento presente nas composições farmacêuticas do invento variará dependendo do pH óptimo para a estabilidade de um particular polipéptido de interesse. A determinação deste pH óptimo pode ser conseguida utilizando métodos geralmente disponíveis na arte e ser ainda ilustrada nos Exemplos aqui descritos. As gamas de pH preferidas para as composições do invento são de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 9,0, mais particularmente cerca de pH 5,0 a cerca de 6,5, dependendo do polipéptido. - 24 - ΡΕ1491208
Deste modo, numa forma de concretização, o pH é de cerca de 5,5, mais particularmente quando o polipéptido é TFPI ou uma variante deste.
As composições farmacêuticas estabilizadas compreendendo um aminoácido base tamponado com um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, a forma de sal do ácido ou uma mistura do ácido e a sua forma de sal, podem também compreender agentes de estabilização adicionais, o que melhora ainda a estabilidade de um polipéptido TFPI terapeuticamente activo ai existente. Agentes de estabilização de interesse particular do presente invento incluem, mas não estão limitados a, metionina e EDTA, que protege o polipéptido TFPI contra a oxidação da metionina; e um tensioactivo não iónico, que protege o polipéptido TFPI contra a agregação associada à congelação-descongelação ou ao corte mecânico.
Desta maneira, o aminoácido metionina pode ser adicionado para inibir a oxidação dos resíduos de metionina em sulfóxido de metionina quando o polipéptido TFPI que actua como agente terapêutico é um polipéptido compreendendo, pelo menos, um resíduo de metionina susceptível a tal oxidação. Por "inibir" pretende significar-se a acumulação mínima de espécies oxidadas de metionina ao longo do tempo. A inibição da oxidação da metionina resulta numa maior retenção do polipéptido TFPI na sua forma molecular adequada. Pode ser utilizado qualquer estereo-isómero de metionina (isómero L, D ou DL) ou combinações 25 ΡΕ1491208 destes. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina de forma a que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável para as instituições reguladoras. Tipicamente, isto significa que a composição não contém mais do que cerca de 10% até cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente, isto pode ser conseguido por adição de metionina de forma a que a razão de metionina adicionada em relação aos resíduos de metionina varie de cerca de 1:1 até cerca de 1000:1, muito preferencialmente 10:1 até cerca de 100:1. A quantidade preferida de metionina a ser adicionada pode ser prontamente determinada empiricamente preparando a composição compreendendo o polipéptido TFPI de interesse com diferentes concentrações de metionina e determinando o efeito relativo na formação de espécies oxidativas do polipéptido utilizando, por exemplo, separação cromatográfica das espécies moleculares e identificação utilizando padrões com o peso molecular do polipéptido, tais como com RP-HPLC, tal como descrito abaixo no Exemplo 2. Essa concentração de metionina que maximiza a inibição da oxidação dos resíduos de metionina, sem ter efeitos adversos na inibição relacionada com aminoácidos da agregação do polipéptido TFPI, representará uma quantidade preferida de metionina a ser adicionada à composição para melhorar ainda mais a estabilidade do polipéptido. 26 ΡΕ1491208 A degradação do polipéptido devido à congelação-descongelação ou corte mecânico durante o processamento da composição liquida do presente invento pode ser inibida por incorporação de tensioactivos nas composições liquidas contendo polipéptido TFPI do invento de modo a baixar a tensão superficial na interface solução-ar. Os tensioactivos típicos empregues são tensioactivos não iónicos, incluindo ésteres de sorbitol de polioxietileno, tais como polisorbato 80 (Tween 80) e polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxietileno, tais como Pluronic F68; álcoois de polioxietileno, tais como Brij 35; simeticone, polietilenoglicol, tal como PEG400; lisofos-fatidilcolina; e polioxietileno-p-t-octilfenol, tal como Triton X—100. A estabilização clássica dos produtos farmacêuticos por tensioactivos ou emulsionantes é descrita, por exemplo, em Levine et al. (1991) J. Parenteral Sei. Technol. 45(3): 160-165, aqui como referência. Um tensio-activo preferido empregue na prática do presente invento é o polisorbato 80.
Adicionalmente aos agentes descritos atrás, outros agentes de estabilização, tais como albumina, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou um dos seus sais, tal como o EDTA dissódico, podem ser adicionados para aumentar ainda mais a estabilidade das composições farmacêuticas líquidas. A quantidade de albumina pode ser adicionada com concentrações de cerca de 1,0% p/v ou menos. O EDTA actua como um captor de iões metálicos conhecidos como catalizando muitas reacções de oxidação proporcionando, deste modo, um agente de estabilização adicional. 27 ΡΕ1491208
Quando desejável, açúcares ou álcoois de açúcares podem ser também incluídos nas composições farmacêuticas líquidas contendo polipéptido TFPI do presente invento. Pode ser utilizado qualquer açúcar, tal como mono, di ou polissacáridos ou glucanos solúveis em água, incluindo, por exemplo, frutose, glucose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose. Sacarose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, hidroxietil-amido e carboximetilcelulose-Na. A sacarose é o aditivo de açúcar mais prefrido. Álcool de açúcar é definido como um hidro-carboneto C4-C8 possuindo um grupo OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galacititol, dulci-tol, xilitol e arabitolm com o manitol a ser o aditivo de álcool de açúcar mais preferido. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados atrás podem ser utilizados individualmente ou em combinação. Não existe um limite fixo para a quantidade utilizada, desde que o açúcar ou o álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afecte negativamente os efeitos de estabilização conseguidos utilizando os métodos do invento. Preferencialmente, a concentração de açúcar ou de álcool de açúcar está entre cerca de 1,0% p/v e cerca de 15,0% p/v, mais preferencialmente entre cerca de 2,0% p/v e cerca de 10,0% p/v.
As composições farmacêuticas líquidas estabilizadas do invento podem conter outros compostos que aumentem a eficácia ou promovam as qualidades desejáveis do polipéptido TFPI de interesse que serve como componente tera- 28 ΡΕ1491208 peuticamente activo desde que o efeito de estabilização principal conseguido com o aminoácido base não seja afec-tado negativamente. A composição deve ser segura para ser administrada pela via que for escolhida, deve ser estéril e deve reter a sua desejada actividade terapêutica.
As composições do presente invento são preferencialmente preparadas pré-misturando os agentes de estabilização e de tamponamento e quaisquer outros excipientes antes da incorporação do polipéptido de interesse. Quaisquer excipientes adicionais que podem ser adicionados para ainda estabilizar mais as composições do presente invento não devem afectar negativamente os efeitos de estabilização do agente de estabilização principal, i.e. um aminoácido base, em combinação com o agente de tamponamento, i.e., um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, a forma de sal do ácido ou uma mistura do ácido e da sua forma de sal, tal como utilizado para obter as novas composições aqui descritas. A seguir à adição de uma quantidade preferida de um aminoácido base para se conseguir que a formação de agregados de um polipéptido de interesse diminua, o pH da composição liquida é ajustado utilizando um agente tampão, preferencialmente numa gama aqui descrita, mais preferencialmente ao pH óptimo para o polipéptido de interesse. Embora o pH possa ser ajustado a seguir à adição do polipéptido de interesse na composição, preferencialmente, é ajustado antes da adição deste polipéptido, dado que isto pode reduzir o risco de desnaturação do polipéptido. Dispositivos mecânicos 29 ΡΕ1491208 adequados sao então utilizados para se conseguir uma mistura adequada dos constituintes.
Os polipéptidos TFPI presentes nas composições farmacêuticas liquidas estabilizadas do invento podem ser nativos ou obtidos através de técnicas recombinantes e podem ser de qualquer origem, incluindo origem em mamíferos tais como, e.g. ratos, ratazanas, coelhos, primatas, porcos e seres humanos, desde que estes satisfaçam os critérios aqui especificados, ou seja, desde que estes formem agregados durante o armazenamento em formulações liquidas. Preferencialmente, tais polipéptidos TFPI são derivados de origem humana e, mais preferencialmente, são proteínas humanas recombinantes de hospedeiros microbianos.
Variantes biologicamente activas do polipéptido TFPI de interesse que servem como componente terapeu-ticamente activo nas composições farmacêuticas do invento estão também englobadas no termo "polipéptido" tal como aqui utilizado. Tais variantes devem reter a desejada actividade biológica do polipéptido TFPI nativo, de forma a que a composição farmacêutica que compreende a variante do polipéptido TFPI tenha o mesmo efeito terapêutico que a composição farmacêutica que compreende o polipéptido TFPI nativo quando administrado a um sujeito. Ou seja, a variante de polipéptido TFPI servirá como componente terapeuticamente activo na composição farmacêutica de uma maneira semelhante à observada para o polipéptido TFPI nativo. Estão disponíveis métodos na arte para determinar 30 ΡΕ1491208 se a variante do polipéptido TFPI retém a desejada actividade biológica e assim serve como componente terapeuticamente activo na composição farmacêutica. A actividade biológica pode ser medida utilizando ensaios especificamente projectados para medirem a actividade do polipéptido ou proteína TFPI nativos, incluindo os ensaios descritos no presente invento. Adicionalmente, podem ser testados anticorpos do polipéptido TFPI nativo biologicamente activo no que se refere à sua capacidade de se ligar à variante do polipéptido TFPI, em que a ligação eficaz é indicativa de um polipéptido possuindo uma conformação semelhante à do polipéptido TFPI nativo.
Variantes biologicamente activas adequadas de polipéptidos de interesse que ocorrem naturalmente podem set fragmentos, análogos e derivados desse polipéptido. Por "fragmento" pretende significar-se um polipéptido que consiste apenas em parte da sequência e estrutura polipeptídica intacta e pode ser uma eliminação C-terminal ou N-terminal do polipéptido nativo. Por "análogo" pretende significar-se um análogo quer do polipéptido nativo quer de um fragmento do polipéptido nativo, em que o análogo compreende uma sequência polipéptida nativa e uma estrutura possuindo uma ou mais substituições, inserções ou eliminações de aminoácidos. "Muteínas" tais como as aqui descritas, e péptidos possuindo um ou mais peptóides (mímicos do péptido), são também englobados pelo termo análogo (ver Publicação de Patente Internacional No. WO 91/04282). Por "derivado" pretende significar-se qualquer 31 ΡΕ1491208 modificação adequada do polipéptido nativo de interesse, de um fragmento do polipéptido nativo ou dos seus análogos respectivos, tal como glicosilação, fosforilação, ou outra adição de porções estranha, desde que a desejada actividade biológica do polipéptido nativo seja mantida. Métodos para produzir fragmentos, análogos e derivados do polipéptido estão geralmente disponíveis na arte.
Por exemplo, variantes da sequência de aminoácido do polipéptido TFPI podem ser preparadas através de mutações na sequência de ADN clonada que codifica o polipéptido nativo de interesse. Métodos de mutagénese e alterações da sequência de nucleótidos são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkal et al. (198 7) Methods Enzymol. 154: 367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); Patente US No. 4.873.192; e as referências aí citadas. Um guia de como as substituições adequadas de aminoácidos não afectam a actividade biológica do polipéptido de interesse pode ser encontrado no modelo de Dayhoff et al. (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Substituições conservativas, tais como a permuta de um aminoácido com outro possuindo propriedades semelhantes, podem ser preferidas. Exemplos de substituições conservativas incluem, mas não estão limitadas a, Gly<-»Ala, ValolleoLeu, AspO-Glu, Lys<-»Arg, AsnO-Gln e PheOTrp^Tyr. 32 ΡΕ1491208
Ao construir variantes do polipéptido TFPI são feitas modificações de forma a que as variantes continuem a possuir a desejada actividade. Obviamente, quaiquer mutações feitas no ADN que codificam o polipéptido variante não devem colocar a sequência fora da estrutra de leitura e, preferencialmente, não criarão regiões complementares que possam possuir uma estrutura mARN secundária. Ver, a Publicação do Pedido de Patente EP No. 75 444.
Variantes bilogicamente activas de um polipéptido TFPI de interesse terá, geralmente, pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente cerca de 90% a 95% ou mais e muito preferencialmente cerca de 98% ou mais da identidade da sequência de aminoácido em relação à sequência de aminoácido da molécula de polipéptido TFPI de referência, que serve como base para comparação. Uma variante biologicamente activa de um polipéptido de TFPI nativo de interesse pode diferir do polipéptido nativo por tão pouco como 1-15 aminoácidos, tão pouco como 1-10, tal como 6-10, tão pouco como 5, tão pouco como 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácidos. Por "identidade da sequência" pretende significar-se que os mesmos resíduos de aminoácidos se encontram na variante de polipéptido e que a molécula de polipéptido que serve como referência quando um segmento contíguo específico da sequência de aminoácidos da variante está alinhado e comparado com a sequência de aminoácido da molécula de referência. A percentagem da identidade de sequência entre 33 ΡΕ1491208 duas sequências de aminóacido é calculada determinando o número de composições nas quais ocorre idêntico resíduo de aminoácido em ambas as sequências para originar o número de posições que correspondem, dividindo o número de posições que correspondem pelo número total de posições no segmento que esta a ser comparado com a molécula de referência e multiplicando o resultado por 100 para originar a percentagem de identidade de sequência.
Com o fim de se obter um alinhamento óptimo de duas sequências, o segmento contíguo da sequência de aminoácido da variante de TFPI pode ter resíduos de aminoácidos adicionais ou resíduos de aminoácidos eliminados em relação à sequência de aminoácido da molécula de referência. O segmento contíguo utilizado para comparação com a sequência de aminoácidos de referência compreenderá, pelo menos, vinte (20) resíduos de aminoácido contíguos e pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais resíduos. As correcções para uma maior identidade de sequência associada à inclusão de intervalos na sequência de aminoácido da variante podem ser feitas atribuindo penalizações pelos intervalos. Métodos de alinhamento das sequências são bem conhecidos na arte quer para as sequências de aminoácidos quer para as sequências de aminoácidos que codificam sequências de nucleótidos.
Deste modo, a determinação da percentagem da identidade entre quaisquer duas sequências pode ser conseguida utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo 34 ΡΕ1491208 preferido não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Meyers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Um tal algoritmo é utilizado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do programa informático CGC de alinhamento de sequências. Uma tabela de residuos em peso PAM120, uma penalização de comprimento do intervalo de 12, e uma penalização de intervalo de 4 pode ser utilizado com o programa ALIGN quando se comparam as sequências de aminoácidos. Outro exemplo preferido não limitativo de um algoritmo matemático para utilização ao comparar duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264, modificado tal como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877. Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. As pesquisas de nucleótidos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, caracteres = 12, para se obterem sequências de nucleótidos homólogas a uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido de interesse. A pesquisa de proteínas BLAST pode ser realizada com o programa XBLAST, pontuação = 50, caracteres = 3, para se obterem sequências de aminoácidos homólogas às do polipéptido de interesse. Para se obterem alinhamentos intervalados para fins de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST, tal como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Alternativamente, pode ser utilizado PSI-Blast para realizar um pesquisa iterativa que detecta relações distantes entre as moléculas. Ver Altschul 35 ΡΕ1491208 et al. (1997) supra. Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, podem ser utilizados parâmetros por defeito dos programas respectivos (e.g., XBLAST e NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Ver também o programa ALIGN (Dayhoff (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Supl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) e programas do Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponível na Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), por exemplo, o programa GAP, em que são utilizados os parâmetros por defeito dos programas.
Quando se considera a percentagem da identidade da sequência de aminoácido, algumas posições dos resíduos de aminoácidos podem diferir como resultado das substituições conservativas de aminoácidos, que não afectam as propriedades da função da proteína. Nestas circunstâncias, a identidade da identidade da sequência pode ser ajustada para cima para entrar em linha de conta com a similaridade dos aminoácidos conservativamente substituídos. Tais ajustes são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Myers e Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sei. 4: 11-17. A estrutura química precisa de um polipéptio depende de um certo número de factores. Como grupos ionizáveis amino e carboxilo estão presentes na molécula, pode ser obtido um polipéptido particular como sal acídico ou básico ou sob forma neutra. Todas estas preparações que 36 ΡΕ1491208 retêm a sua actividade biológica quando colocadas em condições ambientais adequadas estão incluídas na definição dos polipéptidos como aqui utilizado. Além disso, a principal sequência de aminoácidos dos polipéptidos pode ser aumentada por derivatização utilizando porções açúcar (glicosilação) ou através de outras moléculas suplementares, tais como lípidos, fosfato, grupos acetilo e outros do género. Pode ser também aumentada por conjugação com sacáridos. Certos aspectos de tal aumento são conseguidos através de sistemas de processamento pós-translacionais do hospedeiro produtor; outras destas modificações podem ser introduzidas in vitro. Em qualquer caso, tais modificações estão incluídas na definição do polipéptido aqui utilizado desde que a actividade do polipéptido não seja destruída. Espera-se que tais modificações possam afectar quantitativamente ou qualitativamente a actividade, quer aumentando quer diminuindo a actividade do polipéptido, nos vários casos. Além disso, resíduos de aminoácidos individuais na cadeia podem ser modificados por oxidação, redução ou outra derivatização e o polipéptido pode ser clivado para se obterem fragmentos que retêm a actividade. Tais alterações que não destroiem a actividade não removem a sequência do polipéptido da definição do polipéptido de interesse tal como aqui utilizada. A arte proporciona orientações substanciais no que se refere à preparação e utilização de variantes de polipéptidos. Na preparação das variantes de polipéptidos, um especialista na matéria pode rapidamente determinar que 37 ΡΕ1491208 modificações do nucleótido de proteína nativa ou sequência de aminoácido resultarão numa variante que seja adequada para utilização como componente terapeuticamente activo de uma composição farmacêutica do presente invento e cuja formação de agregados seja diminuída pela presença de um aminoácido base e um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, a forma de sal do ácido ou uma mistura do ácido e da sua forma de sal, tal como aqui descrito.
Numa forma de concretização, o polipéptido presente como componente terapeuticamente activo na composição farmacêutica líquida do invento é um inibidor da via do factor tissular (TFPI) ou variante deste, preferencialmente TFPI recombinante. Este polipéptido, que é um inibidor da cascata de coagulação, é também conhecido como lipoproteína associada ao inibidor de coagulação (LACI) , inibidor do factor tissular (TFI)e inibidor da via extrínseca (EPI). 0 TFPI foi primeiramente purificado a partir de uma célula de hepatoma humano, Hep G2 (Broze e Miletich (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 1886-1890) e, subsequentemente, a partir de plasma humano (Novotny et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 18832-18837); e células de fígado Chang e de hepatoma SK (Wun et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 16096-16101). cADN de TFPI foi isolado a partir de bibliotecas de cADN placentário e endotelial (Wun et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:6001-6004); Girard et al. (1989) Thromb. Res. 55: 37-50). Para revisões, ver Rapaport (1989) Blood 73: 359-365 (1989); Broze et al. (1990) Biochemistry 29: 7539-7546. A clonagem do cADN de TFPI que codifica a 38 ΡΕ1491208 proteína de resíduo de aminoácido 276 do TFPI, é ainda descrito na patente U.S. No. 4.996.852; ver também as patentes U.S. Nos. 5.773.251 e 5.849.875.
As variantes de TFPI são conhecidas na arte. Ver, por exemplo, a patente U.S. No. 5.212.091, em que uma forma não glicosilada do TFPI recombinante foi produzida e isolada a partir de E. Coli; a patente U.S. No. 5.106.833, em que são descritos análogos e fragmentos; e patente U.S. No. 5.378.614, em que é descrita a produção de análogos de TFPI em fermento.
Uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma composição farmacêutica líquida estabilizada contendo polipéptido TFPI do invento é administrada a um sujeito. Por "quantidade farmaceuticamente eficaz" pretende significar-se uma quantidade que é útil no tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição. Vias típicas de administração incluem, mas não estão limitadas a, administração oral ou parentérica, incluindo injecção ou infusão intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-arterial e intraperitoneal. Numa tal forma de concretização, a administração é por injecção, preferencialmente injecção subcutânea. Formas injectáveis das composições do invento incluem, mas não estão limitadas a, soluções, suspensões e emulsões. A composição farmacêutica líquida estabilizada compreendendo o polipéptido de interesse deve ser formulada 39 ΡΕ1491208 numa dosagem unitária e pode ser numa forma injectável ou de infusão tal como uma solução, suspensão ou emulsão. Para além disto, esta pode ser armazenada congelada ou preparada em forma seca, tal como um pó liofilizado, que pode ser reconstituído numa solução, suspensão ou emulsão líquida antes da administração através de qualquer um de vários métodos incluindo vias de administração oral ou parentérica. Preferencialmente é armazenada na formulação líquida para ter a vantagem de uma maior estabilidade ao armazenamento conseguida de acordo com os métodos do presente invento, tal como sublinhado atrás. A composição farmacêutica estabilizada é, preferencialmente, esterilizada através de filtração em membrana e é armazenada em recipientes uni-dose ou multi-dose, tais como frascos ou ampolas selados. Métodos adicionais para formular uma composição farmacêutica geralmente conhecidos na arte podem ser utilizados para melhorar ainda a estabilidade ao armazenamento das composições farmacêuticas líquidas aqui descritas desde que estes não afectem negativamente os efeitos benéficos dos agentes de estabilização e tamponamento preferidos descritos no método do invento. Uma discussão pormenorizada da formulação e selecção de portadores, estabilizadores etc. farmaceuticamente aceitáveis pode ser encontrada em Remington 's Pharmaceutical Sciences (1990) (18th ed. Mack Pub. Co., Eaton, Pensil-vânia).
Por "sujeito" pretende significar-se qualquer animal. Preferencialmente o sujeito é um mamífero, muito 40 ΡΕ1491208 preferencialmente o sujeito é um ser humano. Os mamíferos de particular importância que não os humanos incluem, mas não estão limitados a, cães, gatos, vacas, cavalos, ovelhas e porcos.
Quando a administração é para fins de tratamento, a administração pode ser quer para fins profilácticos quer terapêuticos. Quando proporcionada profilaticamente, a substância é proporcionada antes de qualquer sintoma. A administração profilática das substância serve para evitar ou atenuar qualquer sintoma subsequente. Quando proporcionada terapeuticamente, a substância é proporcionada no início (ou pouco depois do início) de um sintoma. A administração terapêutica da substância serve para atenuar qualquer sintoma actual.
Formulações compreendendo uma quantidade eficaz de composições farmacêuticas do invento compreendendo inibidor da via do factor tissular (TFPI) ou uma variante deste são úteis para o diagnóstico, prevenção e tratamento (local ou sistémico) de situações clínicas que respondem a terapia com este polipéptido. Tais situações clínicas incluem, por exemplo, indicações associadas com o aumento da síntese e libertação de elastase neutrofílica, tais como doenças inflamatórias incluindo pancreatite aguda grave, enfisema, artrite reumatóide, falha múltipla de órgãos, fibrose quística, Síndroma de Dificuldade Respiratória do Adulto (ARDS) e sepsis; e para o diagnóstico e o tratamento de doenças associadas ao aumento de síntese e libertação de 41 ΡΕ1491208 IL-8, incluindo doenças inflamatórias, tais como ARDS, lesão de reperfusão (incluindo lesão de reperfusão do pulmão), sepsis e artrite. Ver WO 96/40224. A administração de IFN-β ou das suas muteinas a humanos ou animais pode ser efecutada oralmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intravenosamente, intranasalmente, ou através de administração pulmonar como considerado adequado pelo médico. O presente invento proporciona também um método para aumentar e estabilidade de um polipéptido TFPI numa composição farmacêutica liquida, em que o polipéptido TFPI, que serve como componente terapeuticamente activo, apresenta formação de agregados durante o armazenamento numa formulação líquida. O método compreende a incorporação na composição farmacêutica líquida de um aminoácido base numa quantidade suficiente para diminuir a formação de agregados do polipéptido TFPI durante o armazenamento da composição farmacêutica líquida, e um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal ou uma mistura de um ácido e a sua forma de sal, em que o ácido serve como agente de tamponamento para manter o pH da composição líquida dentro de uma gama aceitável, tal como previamente aqui descrito.
Aumentar a estabilidade do polipétido TFPI ou sua variante incorporando um aminoácido base ou um aminoácido base mais um ou mais agentes de estabilização adicionais aqui descritos, em combinação com o agente de tamponamento 42 ΡΕ1491208 aqui descrito, i.e., um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, a forma de sal do ácido ou uma mistura do ácido e da sua forma de sal, conduz a um aumento da estabilidade da composição farmacêutica liquida contendo polipéptido durante o armazenamento. Deste modo, o invento proporciona também um método para aumentar a estabilidade no armazenamento de uma composição farmacêutica liquida quando essa composição compreende um polipéptido TFPI que forma agregados durante o armazenamento numa formulação liquida. Por "aumento da estabilidade ao armazenamento" pretende significar-se que a composição farmacêutica apresenta uma maior retenção do polipéptido TFPI ou de uma variante deste na sua adequada conformação adequada, não agregada, biologicamente activa durante o armazenamento e, deste modo, menos declínio na eficácia terapêutica do que que uma composição farmacêutica líquida preparada na ausência de um aminoácido base ou um aminoácido base mais um ou mais agentes de estabilização adicionais aqui descritos, em combinação com o agente de tamponamento aqui descrito. A estabilidade ao armazenamento de composições farmacêuticas contendo polipéptidos de TFPI de acordo com os métodos do invento pode ser avaliada utilizando procedimentos correntes conhecidos na arte. Tipicamente, a estabilidade ao armazenamento de tais composições é avaliada utilizando perfis de estabilidade ao armazenamento. Estes perfis são obtidos monitorizando as alterações na quantidade de polipéptido TFPI presente na sua forma 43 ΡΕ1491208 molecular não agregada, biologicamente activa e na sua potência ao longo do tempo em resposta à variável de interesse, tal como pH, concentração, agente de estabilização, concentração do agente de estabilização, etc., tal como demonstrado nos Exemplos a seguir. Estes perfis de estabilidade podem ser gerados a várias temperaturas representativas de possíveis condições de armazenamento, tais como temperatura de congelação, temperatura de refrigeração, temperatura ambiente, ou temperatura elevada, tal como 40-50°C. A estabilidade ao armazenamento é então comparada entre perfis determinando, por exemplo, a meia-vida da forma molecular não agregada biologicamente activa do polipéptido TFPI de interesse. Por "meia-vida" pretende significar-se o tempo necessário para uma diminuição de 50% da forma molecular não agregada biologicamente activa do polipéptido TFPI de interesse. Composições compreendendo arginina base e um ácido substancialmente livre da sua forma de sal preparadas de acordo com os métodos do presente invento terão uma meia-vida que é de, pelo menos, duas vezes até cerca de dez vezes superior, preferencialmente, pelo menos, três vezes até pelo menos dez vezes superior, mais preferencialmente de, pelo menos, quatro vezes até cerca de dez vezes superior, muito preferencialmente, pelo menos, cerca de cinco vezes até cerca de 10 vezes superior do que a meia-vida de uma composição líquida na ausência de um aminoácido base ou de um aminoácido base mais um ou mais dos agentes de estabilização adicionais aqui descritos, em combinação com um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, a forma de sal do ácido, ou uma 44 ΡΕ1491208 mistura do ácido e da sua forma de sal. Para fins do presente invento, uma composição farmacêutica possuindo uma maior estabilidade ao armazenamento como resultado de ser preparado de acordo com o presente invento é considerada uma composição farmacêutica "estabilizada". Uma tal composição estabilizada tem preferencialmente uma meia-vida de, pelo menos, 18 meses, mais preferencialmente, pelo menos, 20 meses, ainda mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 22 meses, muito preferencialmente, pelo menos, 24 meses quando armazenada a 2-8°C.
Os exemplos seguintes são apresentados como via de ilustração e não como via de limitação. Aqueles exemplos que não se referem especificamente ao invento reivindicado estão apenas incluídos para informação.
PARTE EXPERIMENTAL O IL-2 é um potente mitogénio que estimula a proliferação das células T. Este tem uma larga aplicação terapêutica tal como no tratamento da metastização de cancro, como auxiliar na terapia do cancro, e como agente conjuntivo para doenças infecciosas.
Com o progresso de vários ensaios clínicos utilizando terapia com IL-2, verificou-se que o desenvolvimento de uma formulação líquida estável para esta proteína é altamente desejável. Uma tal formulação seria mais versátil do que as formulações liofilizadas 45 ΡΕ1491208 tradicionais, dado que pode ser fornecida com várias graduações de acordo com vários regimes de dosagem. Uma formulação liquida será também mais adequada para administrar, dado que não é necessária reconstituição. Uma tal formulação pode ser fornecida em seringas pré-cheias prontas a utilizar, ou como preparações multidose se verificado compatível com os agentes bacteriostáticos.
Foi relatado que a IL-2 em formulações líquidas se degrada através de, pelo menos, três vias durante o armazenamento: agregação, oxidação da metionina e desamidação (Kunitani et al. (1986) J. Chromatography 359: 391-401; Kenney et al. (1986) Lymphokine Res. 5: 523-527). Adicionalmente, o IL-2 é susceptível de provocar danos graves causados por congelação e tensões de corte mecânico. Em consequência, o desenvolvimento da formulação de IL-2 necessita ter em atenção quer os danos graves quer a degradação crónica.
De acordo com isto, foi desenvolvida uma nova formulação estável monomérica de rhIL-2. Nesta formulação as moléculas de proteína estão presentes em solução na sua forma monomérica, não numa forma agregada. Assim, oligómeros ou agregados covalentes ou hidrofóbicos de rhlL-2 não estão presentes. A formulação contém vários agentes de estabilização, os mais importantes arginina e metionina, para estabilizar a proteína em relação aos danos físicos e químicos, tais como agregação, oxidação de metionina e desamidação durante o armazenamento a longo termo. 46 ΡΕ1491208
Adicionalmente, um tensioactivo não iónico, polisorbato 80, foi incluído na formulação para evitar que a proteína sofra danos graves provocados por congelação-descongelação e tensão de corte mecânico. Tal como mostrado nos exemplos seguintes, a adição dos agentes de estabilização do invento à formulação de rhIL-2 aumenta a sua estabilidade ao armazenamento. A molécula de IL-2 utilizada nestes exemplos é a muteína IL-2 humana recombinante, aldesleucina, com a cisteína-125 substituída por serina (des-alanil-1, serina-125 interleucina-2 humana) . É expressada pela E. Coli e, subsequentemente, purificada por diafiltração e cromato-grafia de permuta catiónica, tal como descrito na patente U.S. No. 4,931.543. A massa purificada para posterior utilização tinha cerca de 3 mg/ml de IL-2 e foi formulada quer com 10 mM de citrato de sódio a pH 6, 200-250 mM de NaCl (o tampão CM) ou num tampão contendo 10 mM de succinato de sódio e pH 6 e 150 mM de L-arginina. O inibidor da via do factor tissular (TFPI) é outra proteína que apresenta degradação por agregação durante o armazenamento numa formulação farmacêutica líquida (Chen et al. (1999) J. Pharm. Sei. 88 : 881-888). O Exemplo 8 abaixo refere-se a formulações líquidas que demonstram a eficácia de utilizar um ácido na sua forma de base livre para diminuir a formação de agregação e um sistema de tamponamento fornecido por um ácido substancialmente livre da sua forma de sal. 47 ΡΕ1491208
Foram utilizados os protocolos seguintes nos exemplos para determinar o efeito de um particular agente de estabilização na degradação do IL-2 ou TFPI, e assim da estabilidade desta proteína durante o armazenamento em formulações liquidas.
Medição da Absorvância de UV A absorvância de UV de soluções de proteínas foi medida utilizando um espectrómetro Hewlett Packard Diode Array (Modelo 8452). Foi feita a medição de um branco no equipamento com o tampão de formulação adequada. A absorvância a 280 nm foi registada utilizando uma célula de quartzo com um percurso de 1,0 cm. O coeficiente de extinção de 0,70 (mg/ml) _1cm_1 foi utilizado para converter os dados de absorvância em concentração de IL-2 em mg/ml.
RP-HPLC
Foi realizada RP-HPLC num sistema Waters 626 LC equipado com um sistema de amostragem 717 (Waters Corporation, Milford, Maine) utilizando uma coluna Vydac 214BTP54 C4 e uma pré-coluna Vydac 214GC54 (Separations Group, Hesparia, Califórnia). As colunas foram inicialmente equilibradas com uma fase A móvel (10% acetonitrilo, 0,1% TFA). Então 20 μρ de uma amostra de IL-2 foi carregada e a proteína foi eluída aplicando uma fase B móvel (100% acetonitrilo, 0,1% TFA) de 0 a 100% em 50 minutos com um 48 ΡΕ1491208 caudal de 1,0 ml/min. A principal espécie de IL-2 solúvel foi eluida aos aproximadamente 32 min e detectada por UV a 214 nm utilizando um detector Waters 486. A aquisição e o processamento de dados foram realizados num sistema Perkins-Elmer Turbochrom (PE Nelson, Cupertino, Califórnia) .
Este método de RP-HPLC detecta a principal espécie monomérica de IL-2 como pico B, uma espécie oxidativa de metionina (principalmente Met104 oxidada) como pico A, uma espécie desamidada (provavelmente Asn88) como B', e outras espécies desconhecidas que são eluidas quer mais cedo quer mais tarde do que estes picos.
SEC-HPLC HPLC de exclusão por tamanho foi realizada numa coluna TOSOHAAS G2000SWxl e num cartucho TSK SWxl (TOSOHAAS, Montgomeryville, Pensilvânia). Uma fase móvel única contendo 10 mM de fosfato de sódio a pH 7 e 200 mM de sulfato de amónio foi aplicada com um caudal de 1,0 ml/min. A espécie de monómero de IL-2 foi eluida aos aproximadamente 14 minutos e detectada por UV a 214 nm utilizando um detector Waters 486. A aquisição e o processamento de dados foram realizados num sistema Perkins-Elmer Turbochrom.
Utilizando um protocolo SEC-HPLC nativo especialmente desenvolvido para monitorizar o IL-2, o rhIL- 49 ΡΕ1491208 2 foi eluído principalmente como espécie única, tal como na forma monomérica uma vez que a adição de agentes de dissociação da agregação, tais como SDS, ureia e DTT, não afectaram a eluição desta espécie.
IEX-HPLC HPLC de permuta iónica (IEX) foi realizada numa coluna de vidro Pharmacia Mono-S HR 5/5 utilizando um sistema Waters 626 LC com um sistema de auto-amostragem aquecedor/arrefecedor 717, tal como descrito em Chen et al. (1999) J. Pharm. Sei. 88: 881-888. A coluna foi equilibrada com 80% de fase móvel A (70:30 v/v, 20 mM de acetato de sódio: acetonitrilo a pH 5,4) e 20% de fase móvel B (70:30 v/v, 20 mM de acetato de sódio e 1M de cloreto de amónio:acetonitrilo a pH 5,4). Após injecção, TFPOI recombinante humano (rh) foi eluido aumentando a fase móvel B a 85% em 21 minutos com um caudal de 0,7 ml/min. O rhTFPI elui a aproximadamente 16,5 minutos como um pico único e foi detectado por absorvância UV a 280 nm com um detector de absorvância Waters 486. A aquisição e o processamento de dados foram realizados num sistema Perkin-Elmer Turbochrom. A concentração de proteína foi estimada integrando a área do pico e comparando-a com uma curva padrão gerada a partir de amostras de concentrações conhecidas.
SDS—PAGE SDS—PAGE foi realizada de acordo com o protocolo 50 ΡΕ1491208 de Laeinmli. Cerca de 5 μg de IL-2 foi carregado em cada placa pré-preparada de 18% de Norvex Tris-glicina gel e foi realizada electroforése a 100 volts. As bandas de proteína foram coradas com o corante azul Coomassie e foram analisadas através de um densitómetro Molecular Dynamics equipado com o sistema Imagequan T (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Califórnia).
Proliferação de Células HT-2 e Coloração MTT para a Bioactividade de IL-2 A potência de IL-2 foi determinada através de um bioensaio in vitro utilizando proliferação de células HT-2 e coloração MTT (Gillis et al. (1978) J. Immunology 120: 2027-2032; Watson (1979) J. Exp. Med. 150(6): 1510). Resumidamente, lxlO4 de células HT-2 de murídeo, que eram dependentes de IL-2 para crescimento, foram carregadas para um poço de uma placa de cultura de tecidos contendo padrões, controlos e amostras. Após 22 a 26 horas de incubação a 37°C, corante MTT foi adicionado aos poços e a incubação foi continuada, a 37°C, durante 3 a 4 horas. Então foi adicionado 20% de SDS para descolorir durante a noite à temperatura ambiente. A absorvância dos poços foi lida a 570 nm e convertida na actividade do IL-2 com base em padrões WHO International. pH e Medições de Osmolaridade O pH da solução das várias formulações foi medido 51 ΡΕ1491208 através de um medidor de pH da Orion (Modelo 611, Orion Research Incorporated Laboratory Products Group, Boston, Massachustts). 0 medidor de pH foi calibrado através do procedimento de calibração de dois tampões sugerido pelo fabricante utilizando um padrão de pH 4 (Fisher Scientific, No. Cat. SB101-500) e um padrão de pH 7 Fisher Scientific, No. Cat. SB107-500). A osmolaridade da solução destas formulações foi medida através de um Osmómetro de Pressão de Vapor da Wescor (Modelo 5500, Wescor Inc., Logan, Utah). O osmómetro foi calibrado através de padrões fornecidos pelo fabricante: padrão de 290 mmol/kg (Wescor, reorder No. OA-010) e 1000 mmol/kg (Wescor, reorder No. OA-029).
Estes protocolos foram utilizados para quantificar os efeitos dos vários agentes de estabilização na degradação da rhIL-2 através da agregação de proteínas, oxidação da metionina e desamidação.
Exemplo 1: Efeitos de Vários Agentes de Solubi-lização na Agregação de Proteínas e Estabilidade ao Armazenamento da rhIL-2 A agregação de proteínas é a principal via de degradação da rhIL-2 em meio líquido variando de condições de pH ligeiramente acídicas a alcalinas. A rhIL-2 em soluções formuladas com estas condições de pH, quando armazenadas a temperaturas elevadas, resultou em agregação ΡΕ1491208 de proteínas, o que conduz a uma precipitação visível. A proteína precipitada visível é removível por filtração através de um filtro de 0,2 μιη. A proteína solúvel remanescente em solução pode ser quantificada através de um certo número de ensaios analíticos, tais como RP-HPLC, SEC-HPLC e absorvância UV. A aqreqação resulta também numa diminuição de bioactividade que pode ser determinada através de um bioensaio in vitro aqui descrito.
Utilizando os procedimentos analíticos aqui descritos, a estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 sob várias condições foi sequida monitorizando as alterações na quantidade solúvel de rhIL-2 em função do tempo de incubação a temperaturas elevadas. 1.A. Efeitos de Açúcares e Aminoácidos O efeito dos açúcares na estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 foi examinado para o sorbitol e o manitol em formulações contendo 0,2 mq/ml de rhIL-2, 10 mM de succionato de sódio e pH 6 e 270 mM de um destes açúcares. A quantidade do rhIL-2 solúvel remanescente em amostras de estabilidade foi reqistado em relação ao tempo de incubação, tal como mostrado na Figura 1. As curvas da sacarose e manitol sobrepostas indicam que os seus efeitos sobre a estabilidade ao armazenamento da IL-2 são semelhantes. A curva para o sorbitol é ligeiramente superior do que para os outros dois açúcares, sugerindo que o sorbitol tem um efeito de estabilização ligeiramente superior ao dos outros dois açúcares. 53 ΡΕ1491208 0 efeito dos aminoácidos na estabilidade ar armazenamento é mostrado na Figura 2. As formulações continham 0,1 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6, e 150 mM de um dos nove aminoácidos escolhidos. Tal como mostrado na Figura 2, a classificação de estabilidade é Arg > Asp > Lys > Mrt > Asn > Leu = Ser = Pro = Gly. 0 efeito da estabilização do sorbitol e da arginina foi confirmado em mais estudos, que demonstraram que a estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 foi afectada de modo dependente da concentração. Deste modo, a estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 é aumentada quando a concentração de sorbitol aumenta de 50 mM para 150 mM e, finalmente, para 270 mM (Figura 3). Similarmente, a estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 aumenta com o aumento da concentração da arginina na formulação (Figura 4). 1.B. Efeito do pH da Formulação
Foram analisados os perfis de pH na estabilidade ao armazenamento do rhIL-2 em formulações contendo NaCl, sorbitol e arginina. As meias-vidas do IL-2 solúvel remanescente a 50°C foram registados em função do pH na Figura 5. A meia-vida (11/2) foi aqui definida como o tempo necessário para uma diminuição de 50% de proteína solúvel em amostras de estabilidade. A maior meia-vida indica uma maior estabilidade ao armazenamento. 54 ΡΕ1491208
Tal como mostrado na Figura 5, o pH óptimo para estabilizar a rhIL-2 no que se refere à agregação de proteínas depende do agente de estabilização presente em solução. A estabilidade ao armazenamento máxima do rhIL-2 em NaCl é atingida a pH 4, em que a rhIL-2 possui uma meia-vida a 50°C de aproximadamente 23 dias. A rhIL-2 em formulações de sorbitol mostra uma maior estabilidade quando o pH diminui, com o máximo de estabilidade a ocorrer a pH 5, em que a meia-vida a 50°C é de cerca de 26 dias. A maior estabilidade (i.e. a meia-vida mais longa) pode ser conseguida com arginina como agente de estabilização, numa formulação possuindo um pH de cerca de 6,0, em que a meia-vida da proteína a 50°C era de cerca de 32 dias. Estes resultados sugerem que a arginina é um agente de estabilização preferido em relação ao sorbitol ou NaCl, dado que o pH óptimo para a estabilização da proteína ocorre a um pH fisiologicamente mais aceitável. 1.C. Efeito do Sistema Tampão É bastante corrente a utilização de um sistema tampão 10 mM numa formulação para proporcionar um pH adequado e para manter uma certa quantidade de capacidade de tamponamento. Por exemplo, um pH da formulação de 5,8 pode ser conseguida utilizando 10 mM de uma mistura de ácido succínico e da sua forma de sal, tal como succinato de sódio. Se for seleccionado um sistema tampão, pode ser utilizado 150 mM de arginina HC1 mas não 150 mM de arginina base como agente de estabilização primário na formulação, 55 ΡΕ1491208 uma vez que 150 mM de arginina base proibirão que o pH seja ajustado a pH 5,8 pelo tampão 10 mM.
Contudo, arginina HC1 originará uma maior osmo-laridade do que o que acontece com a arginina base. Deste modo, uma formulação contendo 150 mM de arginina HC1 ajustada a pH 5,8 com 10 mM de tampão de ácido succinico e succinato de sódio está próxima da isotonicidade, possuindo uma osmolaridade de cerca de 253 mmol/kg e uma meia-vida a 50°C de cerca de 8 dias (Tabela 1). Ainda é desejável uma maior concentração de arginina na formulação, dado que o aumento da estabilidade ao armazenamento aumenta com este agente de estabilização. Quando a concentração de arginina é aumentada até 230 mM com a adição de arginina HC1 e o pH é ajustado a 5,8 com 10 mM de tampão de ácido succinico e succinato de sódio, a meia-vida a 50°C é dobrada (cerca de 17 dias) e mesmo assim a solução é hipertónica, possuindo uma osmolaridade de cerca de 372 mmol/kg.
Quando o ácido succinico serviu como sistema de tamponamento para ajustar o pH da solução a 5,8 e a arginina estava presente com o arginina base, aumentando a concentração da arginina base até 230 mM resultou num aumento para o dobro semelhante da meia-vida a 50°C, aumentando-a até cerca de 16 dias. Contudo, este aumento da estabilidade em armazenamento foi conseguido enquanto se mantinha a solução próximo de isotónica, com a formulação possuindo uma osmolaridade de cerca de 271 mmol/kg (ver Tabela 1). Desta maneira, 230 mM de arginina base pode ser 56 ΡΕ1491208 utilizada na formulação para aumentar a estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 sem exceder a isotonicidade da formulação.
Tabela 1: Osmolaridade da solução e estabilidade ao armazenamento de formulações de rhIL-2. A estabilidade ao armazenamento é apresenta em meias -vidas (ti/2) da rhlL-2 solúvel remanescente medida por RP-HPLC após armazenamento a 50°C. Formulações de arginina HC1 continham 0,5 mg/ml de rhIL-2, 1 mM EDTA e 150 mM ou 230 mM de L-arginina HC1 e 10 mM de ácido succinico e succinato de sódio para ajustar o pH a 5,8. Formulações de arginina base continham 0,5 mg/ml de rhIL-2, 2 mM EDTA e 150 mM ou 230 mM de L-arginina base e 81 mM ou 128 mM de ácido succinico para ajustar o pH a 5,8.
Formulação (continham todos 1 mM EDTA e pH 5,8) Osmolaridade (mmol/kg) t]_/2 3. 50°C (dia) 150 mM ArgHCl, 10 mM succinato/ácido succinico 253 8,0 150 mM ArgBase, 81 mM ácido succinico 192 9,9 230 mM ArgHCl, 10 mM succinato/ácido succinico 372 16,9 230 mM ArgBase, 128 mM ácido succinico 271 16,0
Estes dois métodos de ajuste de pH foram examinados com outros sistemas tampão (Tabela 2). Quando foi utilizado 150 mM de arginina HC1 na formulação e o pH foi ajustado a 5,8 com 10 mM de um ácido e o seu sal de sódio, todas as formulações estavam abaixo de isotónicas, o que é aproximadamente 290 mmol/kg. A meia-vida a 50°C da 57 ΡΕ1491208 rhIL-2 nestas formulações varia de cerca de 15 até cerca de 20 dias. Quando foi utilizado 230 mM de arginina base na formulação e o pH foi titulado a 5,8 utilizando um ácido substancialmente livre da sua forma de sal como sistema tampão, as formulações possuindo um pH ajustado com ácido cítrico ou ácido succínico mostraram osmolaridades da solução ainda abaixo da isotonicidade, enquanto as outras formulações estavam quer ligeiramente acima da isotonicidade, tal como no caso do ácido fosfórico, quer eram hipertónicas, tal como no caso do ácido glutâmico ou acético. Contudo, a meia-vida a 50°C para todas as formulações tinha aumentado para mais de 30 dias. Deste modo, ao utilizar ácido cítrico ou ácido succínico, ambos substancialmente livres das suas formas de sal, como agente de tamponamento, a concentração de arginina pode ser aumentada até 230 mM utilizando arginina base, resultando numa maior estabilidade ao armazenamento do rhIL-2.
Tabela 2: Osmolaridade da solução e estabilidade ao armazenamento de formulações de rhIL-2. A estabilidade ao armazenamento é apresentada em meias-vidas (ti/2) da rhIL-2 solúvel remanescente medida por RP-HPLC após armazenamento a 50°C. Todas as formulações continham 0,2 mg/ml de rhIL-2, 5 mM de metionina, 1 mM de EDTA dissódico, 0,1% de polisorbato 80 e 150 mM de L-arginina HC1 com o pH ajustado a 5,8 por titulação com um ácido substancialmente livre da sua forma de sal. 58 ΡΕ1491208
Formulação Osmolaridade ti/2 _(mmol/kg)_(dia) 150 mM ArgHCl, 10 mM citrato de sódio/ácido cítrico 248 20,5 230 mM ArgBase, 86 mM ácido cítrico 228 36,1 150 mM ArgHCl, 10 mM succinato de sódio/ácido succínico 257 19,1 230 mM ArgBase, 128 mM ácido succínico 285 29,2 150 mM ArgHCl, 10 mM fosfato de sódio/ácido fosfórico 260 15,6 230 mM ArgBase, 193 mM ácido fosfórico 329 29,9 150 mM ArgHCl, 10 mM glutamato sódio/ácido glutâmico 264 14,6 230 mM ArgBase, 225 mM ácido glutâmico 407 47,5 150 mM ArgHCl, 10 mM acetato de sódio/ácido acético 259 20,8 230 mM ArgBase, 250 mM ácido acético_408_31,9 1.D. Efeito da Concentração da Proteína 0 efeito da concentração da proteína na estabilidade ao armazenamento foi examinado numa formulação contendo 10 mM de succinato de sódio e pH 6 e 150 mM de arginina. Tal como mostrado na Figura 6, em que a meia-vida a 50°C para a rhIL-2 solúvel foi registada em relação à concentração de proteína inicial, a estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 aumenta à medida que a concentração de proteína deiminui. Esta descoberta está de acordo com a observação experimental de que a agregação é a principal via de degradação da rhIL-2 em formulações líquidas. 1.E. Efeito do Tensioactivo Não Iónico Poli- sorbato 80 0 efeito do polisorbato 80 (Tween 80 ou Tw 80) na estabilidade ao armazenamento da rhIL-2 foi testado numa 59 ΡΕ1491208 formulação contendo 0,5 mg/ml de IL-2, 230 mM de arginina base, 128 mM de ácido succínico para ajustar o pH a 5,8, 1 mM de EDTA e 0, 0,02, e 0,1% de polisorbato 80. Tal como mostrado na Tabela 3, ambas as formulações contendo polisorbato 80 apresentam uma redução da meia-vida da IL-2 solúvel a 50°C, de 16 dias para cerca de 9 dias, tal como medido por RP-HPLC. Deste modo, a inclusão de polisorbato 80 na formulação será entendida como desfavorável apenas no que se refere ao seu efeito na agregação de proteínas. Contudo, este agente tem um efeito estabilizante contra os danos graves nas proteínas associados à congelação-descongelação e corte mecânico que é benéfico durante o processamento das formulações líquidas contendo esta proteína, tal como descrito nos exemplos abaixo. A estabilidade ao armazenamento de duas formulações à base de sorbitol foi também examinada. Embora as suas meias-vidas medidas por RP-HPLC e a bioactividade fossem comparáveis às das formulações de arginina, as meias-vidas estimadas a partir de SEC-HPLC eram muito menores, sugerindo que uma maior porção da proteína de rhIL-2 nestas formulações está provavelmente presente em formas de agregação solúveis.
Tabela 3: Meias-vidas (ti/2) ou rhIL-2 solúvel remanescente (pico B) medidos por HPLC, SEC-HPLC e o bioensaio in vitro de formulações de rhIL-2 armazenadas a 50SC. 60 ΡΕ1491208
Formulação ti/2 a 50 °C (dias) (tudo a pH 5,8 e 1 rriM EDTA) RP SEC Bioactividade 230 mM ArgBase, 128 mM ácido Suc, pH 5m8 16,0 21,3 25,6 230 mM ArgBase, 128 mM ácido Suc, 0,02% Tw80, pH 5,8 9,7 12,4 NA 230 mM ArgBase, 128 mM ácido Suc, 0,1% Tw80, pH 5,8 9,1 12,2 24,5 270 mM sorbitol, 10 mM NaSuc, 0,1% Tw80, pH 4,5 31,7 3,6 NA 270 mM sorbitol, 10 mM NaSuc, 0,1% Tw80, pH 5,0 14, 4 2,4 21,3
Na Tabela 3 a meia-vida de uma formulação de rhIL-2 arginina base-ácido succínico tal como determinado através do método de RP-HPLC é ligeiramente inferior à determinada pelo método SEC-HPLC e é mu i t o inferior à determinada pelo método do bioensaio in vitro. A eluição das principais espécies de rhIL-2 em SEC-HPLC foi avaliada para examinar ainda estas diferenças. Exemplos com e sem tratamento de SDS, ureia e DTT não mostraram alterações no tempo de eluição para as principais espécies, indicando que a rhIL-2 nestas formulações estava presente como espécie monomérica. Contudo, o protocolo de SEC-HPLC pode não ser capaz de distinguir outra espécie monomérica, por exemplo, o pico da espécie oxidativa de metionina A da principal espécie intacta monomérica, a espécie do pico B. Por isso, uma pequena diferença na determinação da meia-vida seria de esperar. O bioensaio in vitro utilizado para determinar a bioactividade nos dados apresentados na Tabela 3 foi realizado com 0,1% de SDS no diluente do ensaio. Deste modo, antes de aplicarem as amostras às placas de cultura de tecidos para interagir com células HT-2 de murídeo, as 61 ΡΕ1491208 amostras foram diluídas com diluente de ensaio contendo 0,1% de SDS. Foi possível que a diluição com SDS pudesse ter dissociado algum agregado de rhIL-2 nestas amostras de novo na forma monomérica, resultando numa sobre-estimativa da bioact ividade de uma dada formulação. Por isso, as amostras de estabilidade foram avalaidas utilizando um diluente de ensaio com (+S) e sem (-S) a adição de SDS. As amostras foram também avaliadas com (+F) e sem (-F) um tratamento de filtração a 0,2 μιη, uma vez que a filtração é capaz de remover grandes proteínas agregadas como verificado por inspecção visual. Os valores de bioactividade medidos para amostras com estes tratamentos são mostrados na Tabela 4 em conjunto com os resultados de estabilidade ao armazenamento obtidos utilizando o protocolo de RP-HPLC para comparação. Os valores são apresentados como percentagem dos valores de bioactividade obtidos em amostras semelhantes armazenadas a -70°C.
Em geral, as formulações diluídas com SDS e não filtradas antes do contacto com as células HT-2 mostram maiores valores de bioactividade do que os das formulações diluídas sem SDS no diluente de ensaio e filtradas antes de se realizar o ensaio. Entre estes resultados de bioactividade, os obtidos utilizando filtração e diluição sem SDS são bastante comparáveis aos resultados de RP-HPLC. Deste modo, este método é recomendado para a verdadeira medição de bioactividade da rhIL-2 monomérica. 62 ΡΕ1491208
Tabela 4: Comparação de resultados entre a análise por RP-HPLC para a rhIL-2 solúvel e a análise da bioactividade in vitro para amostras de estabilidade armazenadas 2 semanas a 40SC ou 50SC. Todos os resultados são apresentados como percentagens dos obtidos para as respectivas amostras a -70°C. As formulações continham 0,5 mg/ml de rhIL-2, 230 mM de L-arginina base, 128 mM de ácido succínico a pH 5,8 e 1 mM EDTA com (#1) e sem (#2) 0,1% de polisorbato 80. Amostras para o bioensaio foram tratadas com e sem uma filtração a 0,22 μιη antes da diluição utilizando diluentes com e sem 0,1% SDS.
Amostra HPLC % Bioactividade %RP (percentagem em (percentagem em relaçao a amostras de -70°C) relação a amostras -F+Sa +F+Sa -F-Sâ +F-Sâb de -70°C) #1 a 40°C 106 100 104 100 101 #1 a 50°C 92 79 60 53 58 #2 a 40°C 101 69 106 112 98 #2 a 50°C 60 38 62 47 42 â "-F" para não filtrado, "+F" para filtrado, "-S " para diluente sem SDS e "+S" para diluente sem SDS. b Este é o protocolo recomendado para a IL-2 monomérica. 1.F. Compatibilidade com a Preservação A compatibilidade com a preservação foi investigada com a necessidade de desenvolver uma formulação multidose. O efeito dos conservantes na estabilidade IL-2 foi avaliado em dois estudos acelerados. O estudo 1 avaliou álcool benzilico, m-cresol, e fenol numa formulação contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a 63 ΡΕ1491208 ρΗ 6 e 160 mM de arginina. O estudo 2 avaliou cloreto de benzetónio, cloreto de benzalcónio, metilparabeno/propil-parabeno e clorobutanol numa formulação contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de L-arginina base, 128 mM de ácido succinico a pH 5,8, 1 mM de EDTA dissódico, 0,1% de polisorbato 80. As meias-vidas da rhIL-2 solúvel medidas por RP-HPLC para estas formulações armazenadas a 40 °C são apresentadas na Tabela 5.
Todos os conservantes testados diminuíram a estabilidade da rhIL-2 a temperatura elevada. No estudo 1, a meia-vida da rhIL-2 solúvel era de cerca de 74 dias a 40°C sem quaisquer conservantes. A adição de álcool benzílico ou de m-cresol ou fenol reduziu a meia-vida significativamente em 5 a 10 vezes. No estudo 2, os efeitos dos conservantes foram muito menos intensos. A meia-vida da rhIL-2 solúvel diminuiu menos de metade do que com o cloreto de benzetónio e diminuiu mais do que 2 vezes do que com os outros conservantes. Globalmente, o cloreto de benzetónio tinha a menor redução de estabilidade da rhIL-1 entre os conservantes testados.
Tabela 5: Meia-vida (ti/2) da rhIL-2 solúvel a 402C para formulações contendo conservantes. Estudo 1: as formulações continham 0,2 mg/ml rhIL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6, 150 mM de L-arginina e conservantes. Estudo 2: as formulações continham 0,2 mg/ml rhIL-2, 230 mM de L-arginina, 128 mM de ácido succinico a pH 5,8, 1 mM de EDTA dissódico, 0,1 % de polisorbato 80 e conservantes — 64 — ΡΕ1491208
Conservante ti/2 a 40°C (dia) Estudo 1 Sem conservante 74,0 0,9% (p/v) álcool benzílico 16,0 0,25% (p/v) m-cresol 7,5 0,5% (p/v) fenol 11,0 Estudo 2 Sem conservante 261,0 0,01% (p/v) cloreto de benzetónio 185,0 0,01% (p/v) cloreto de benzalcónio 67,0 0,18% (p/v) metilparabeno e 0,02% (p/v) propilparabeno 113,0 0,5% (p/v) clorobutanol 84,0
Embora os conservantes tenham um pronunciado efeito desestabilizante na rhIL-2 a temperatura elevada, os seus efeitos na estabilidade ao armazenamento a curto prazo da rhIL-2 a 4°C ou a 25°C foram também examinados. Foi realizado um novo estudo para examinar seis conservantes numa mesma formulação contendo 0,2 mg/ml rhIL-2, 230 mM de L-arginina base, 128 mM de ácido succinico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina e 0,1% de polisorbato 80 a pH 5,8. A Tabela 6 relata os resultados da quantidade de rhIL-2 solúvel retida após um ano de armazenamento. Todas as formulações, quando comparadas com o controlo, não apresentam perda significativa do nível de rhIL-2 solúvel quer por RP-HPLC quer por bioensaio in vitro, com a excepção da formulação contendo 0,25% m-cresol, que apresentava uma perda detectável. 65 ΡΕ1491208
Tabela 6. Estabilidade ao armazenamento durante um ano de formulações contendo conservante a 4SC ou 25eC apresentada em percentagem da rhIL-2 solúvel total remanescente determinada por integração de áreas de pico de RH-HPLC e pela bioactividade in vitro. A formulação de controlo continha 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de L-arginina base, 128 mM de ácido succinico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina e 0,1% de polisorbato 80 a pH 5,8.
Conservante % da IL-2 inicial Bioactividade in vitro por RP-HPLC_(x!0° IU/ml) 4°C 25°C t=0 1 ano/4°C 25°C/1 ano Controlo 102 93 3,8 3,3 2,5 0,9% álcool benzilico 100 88 4,8 4,0 5,0 0,25% m-cresol 98 60 5,8 2,6 2,5 0,5% fenol 99 87 4,7 3,9 3,2 0,01% cloreto de benzalcónio 102 93 5,5 3,9 4,4 0,01% cloreto de benzetónio 98 89 5,4 3,2 4,7 0,5% clorobutanol 99 91 5,1 3,6 4,5
Exemplo 2: Efeitos de Vários Factores na Oxidação da Metionina na Estabilidade ao Armazenamento da rhIL-2 A oxidação da metionina em IL-2 foi caracterizada previamente (Kunitani et al. (1986) J. Chromatography 359:391-402; Sasaoki et al. (1989) Chem. Pharm. Buli. 37(8): 2160-2164). A IL-2 tem quatro resíduos de metionina nas posições de resíduo 23, 39, 36 e 104 na cadeia de polipéptido. Entre estes, Met104 está na superfície da proteína e é muito oxidativa. Esta espécie oxidativa de 66 ΡΕ1491208 metionina pode ser resolvida como uma espécie que elui mais cedo (pico A) do que a espécie IL-2 principal (pico B) como se vê no cromatograma de RP-HPLC. Met23 e Met39 são menos susceptiveis à oxidação, que apenas ocorre sob condições oxidativas extremas, provavelmente devido à sua existência no interior da molécula de proteína. A espécie oxidativa destes resíduos MET pode eluir mais cedo do que a Met104 em RP-HPLC. A Met46 está colocada muito dentro da molécula de proteína e não é facilmente oxidada a menos que a proteína se desdobre completamente. A investigação da oxidação da metionina em IL-2 concentrada na oxidação de Met104, dado que é o resíduo de metionina mais susceptível à oxidação e a prevenção da sua oxidação, proibirá também a oxidação de outros resíduos de metionina.
2.A. Efeito do pH A oxidação da metionina foi estudada numa gama de pH de 3 a 9 em formulações contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 150 mM de NaCl e 10 mM de várias espécies de tampões. A oxidação da metionina nestas formulações foi examinada quantificando a percentagem da espécie do pico A (i.e. a espécie oxidada Met104) em amostras de IL-2 a t = 0 e t=3 meses. Tal como relatado na Tabela 7, o efeito do pH não é noticiado a t=0 excepto na amostra tamponada pelo citrato a pH 6. Em comparação com outras amostras, que têm 5% da 67 ΡΕ1491208 espécie do pico A, a amostra de citrato apresentou um aumento do intensidade do pico A para 6%. A t=3 meses, o intensidade do pico A é aumentado para condições de pH superior, sugerindo um mecanismo catalizado por uma base para a oxidação de metionina de Met104. A pH 6, o succinato é um tampão melhor que o citrato na minimização da oxidação de metionina, dado que menores valores do pico A são observados na formulação do succinato.
Tabela 7: Análise por RP-HPLC da oxidação de metionina, expressa como percentagem da quantidade total da IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como a espécie do pico A metionina-oxidada (% do pico A do IL-2 solúvel total) para amostras de formulação a pH 3 a pH 9 e t=0 e 3 meses. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 150 mM de NaCl, e pH ajustado por 10 mM de várias espécies de tampões.
Tampão e pH 0, "0 pico A da IL-2 solúvel total t=0 t=3 meses -70°C 4°C 25°C 40 °C 10 níM glicina, pH 3 5 4 5 6 7 10 níM acetato, pH 4 5 5 6 7 6 10 mM acetato, pH5 NA 7 8 9 9 10 mM citrato, pH6 6 6 8 12 14 10 mM succinato, pH 6 5 6 7 4 9 10 mM fosfato, pH 7 5 7 8 11 5 10 mM borato, pH 9 5 11 15 14 NA 68 ΡΕ1491208 2.Β. Efeitos de EDTA, Polisorbato 20, Polisorbato 80, e MqCl2
Os efeitos de um metal quelador, dois tensio-activos não iónicos e um ião metálico divalente na oxidação da metionina são relatados na Tabela 9. A presença de polisorbato 20 ou polisorbato 80 nas formulações aumenta o nivel da espécie oxidativa da metionina quer a t=0 quer a t=l mês. Em constraste, o EDTA e o MgCl2 reduzem o nivel da espécie oxidativa de metionina após 1 mês de armazenamento a 40 e 50 °C.
Tabela 8: Percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como a espécie do pico A metionina-oxidada (% pico A) em amostras de IL-2 a t=0 e t=l mês. A amostra de controlo continha 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6 e 150 mM de arginina.
Formulação % pico A (oxidaçao de metionina) t=0 -70°C t=l 4°C mês 40°C 50°C Controlo bJ co 3,5 5,1 19,7 36,3 1 mM EDTA 2,5 3,5 5,0 9,5 14,0 0,1% polisorbato 80 5,8 4,3 6,9 21,5 41,4 1 mM EDTA + 0,1% polisorbato 80 5,9 4,2 6,9 12,1 19,2 0,1% polisorbato 20 4,1 5,4 9,6 25,3 42,8 5 mM MgCl2 3,9 4,8 6,9 9,7 12,1 2.C. Efeito da Metionina
Foi investigada a adiçao de metionina em formu- 69 ΡΕ1491208 lações para evitar a IL-2 da oxidação da metionina. A Tabela 9 relata a alteração do pico A e a quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) para formulações contendo várias quantidades de metionina após 2 semanas de armazenamento a 50°C. O aumento da concentração de metionina nas formulações reduz a intensidade do pico A significativamente quer a t=0 quer a 2 semanas, enquanto a quantidade de IL-2 solúvel retida após 2 semanas de armazenamento não era afectada. A 5 mM de metionina, um declineo de 3 vezes no pico A é observado a t=2 semanas. Deste modo, a adição de metionina resulta numa redução signiticativa da oxidação de metionina da proteína e tem pouco efeito na agregação da IL-2.
Tabela 9: Alteração no pico A e em proteína solúvel total em amostras de IL-2 a t=0 e t=2 semanas a 50SC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de arginina, 128 mM de ácido succínico a pH 5,8, 1 mM de EDTA, 0,1% de polisorbato 80 e 0 a 10 mM de metionina.
Formulação % pico A (oxidaçao de metionina) % IL-2 remanescente t=0 t=2 semanas a 50°C t=2 semanas a 50°C Sem metionina 2,1 6,3 76 1 mM metionina 1,4 2,7 77 5 mM metionina 1,2 2,1 77 10 mM metionina 1,2 1,9 76
Adicionalmente aos resultados de alta temperatura foi também registada a oxidação de metionina a 4°C e 25°C após 3 meses de armazenamento para formulações com e sem 5 70 ΡΕ1491208 mM de metionina. Tal como mostrado na Tabela 10, a presença de 5 mM de metionina na formulação resulta numa diminuição de 3 vezes da intensidade do pico A quer a 4°C quer a 25°C. Deste modo, a adição de 5 mM de metionina evita eficazmente a oxidação de Met104.
Tabela 10: Nível de oxidação de metionina, expresso como percentagem da quantidade total da IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como espécie do pico A metionina-oxidada (% do pico A de IL-2 solúvel total) e percentagem de IL-2 solúvel remanescente em amostras armazenadas durante 3 meses quer a 4fiC que a 25 SC. As formulações continham 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de arginina, 128 mM de ácido succinico a pH 5,8, 1 mM de EDTA, 0,1% de polisorbato de 80 e 0 ou 5 mM de metionina.
Formulação % pico A de IL-2 solúvel total % IL-2 remanescente (pico principal) 4°C 25°C 4°C 25°C 0 mM 2,7 4,1 101 97 5 mM 0,8 1,4 101 100 2.D. Efeito da Remoção de Oxigénio por Purga de Azoto e Desgasificação
Foi testada a remoção de oxigénio e balões com amostras de IL-2 para minimizar a oxidação da metionina. 0 ar no espaço livre num balão de 3 cc com 1 ml de amostra de IL-2 foi purgado com azoto. O oxigénio molecular dissolvido foi removido por desgasificação por vácuo. A Tabela 11 apresenta a alteração do pico A e a quantidade total de IL- 71 ΡΕ1491208 2 solúvel (pico A + pico B) após 1 semana de armazenamento a 50°C para estas amostras. A purga com azoto só diminui ligeiramente a percentagem da espécie oxidativa da metionina de 6,7% para 6,2%. A combinação da desgasificação da solução e da purga com azoto do espaço livre reduz ainda mais a intensidade do pico A em cerca de um ponto percentual. Por outro lado, a percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel permanece inalterada quer com purga de azoto quer com desgasificação.
Tabela 11: Alteração da percentagem de quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como espécie do pico A metionina-oxidada (% do pico A) e da percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel remanescente em amostras retiradas a t=0 e t=l semana a 50SC. As formulações continham 0,3 mg/ml de IL-2, 230 mM de arginina, 128 mM de ácido succinico, 1 mM de EDTA e 0,1% de polisorbato 80.
Formulação % pico A (oxidaçao da metionina) % IL-2 remanescente t=0 t=l semana a 50°C t=l semana a 50°C Controlo 3,1 6,7 81 Purga de azoto 3,1 6,2 82 Desgasificação/purga de azoto 3,0 5,8 81 2.E. Efeito dos Conservantes 0 efeito dos conservantes na oxidação da metionina foi examinado. A Tabela 12 mostra uma alteração no pico A para amostras da formulação com e sem um de seis 72 ΡΕ1491208 conservantes após 6 a 12 meses de armazenamento a 4°C e a 25°C. Todas as formulações que contêm conservantes apresentaram uma intensidade semelhante do pico A em relação ao controlo indicando que os conservantes não têm um efeito detectável na oxidação da metionina excepto na formulação contendo 0,25% de m-cresol, que apresentava um aumento significativo da intensidade do pico A.
Tabela 12: Percentagem da quantidade total de IL-2 solúvel (pico A + pico B) presente como espécie do pico A metionina-oxidada (% do pico A) em várias formulações contendo conservantes armazenadas 6 meses e 12 meses a 42C e 25SC. A formulação de controlo continha 0,2 mg/ml de IL-2, 230 mM de L-arginina base, 128 mM de ácido succinico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, 0,1% de polisorbato 80 a um pH de 5,8.
Conservante % pico A (oxidação de metionina) t=0 6 meses 12 meses 4°C 25°C 4°C 25°C Controlo 1,5 1,6 1,9 1,8 2,6 0,9% álcool benzílico 1,6 1,7 2,3 1,9 3,3 0,25% m-cresol 1,6 1,8 6,7 2,1 3,5 0,5% fenol 1,6 1,7 2,4 1,8 3,6 0,01% cloreto benzalcónio 1,5 1,6 2,0 1,0 3,0 0,01% cloreto benzetónio 1,5 1,7 2,0 1,8 2,8 0,5% clorobutanol 1,5 1,6 2,0 1,8 3,2
Exemplo 3: Efeito de Vários Factores na Desamidaçao da IL-2 73 ΡΕ1491208 A desamidação da IL-2 foi relatada previamente (Kunitani et al. (1986) J. Chromatography 359: 391-402). Verificou-se que Asp 88 era o principal local para desamidação na IL-2 (Sasaoki et al. (1992) Chem. Pharm. Buli. 40(4): 976-980). A espécie desamidada pode ser detectada por RP-HPLC como um pico lateral (pico B') em relação à espécie principal (pico B). A desamidação da IL-2 foi estudada em formulações contendo arginina, NaCl, e sorbitol. A Tabela 13 mostra que a espécie desamidada pode ser detectada apenas em formulações contendo sorbitol e NaCl, mas não em formulações contendo arginina, após incubação e temperaturas elevadas durante 2 semanas. Por isso, a arginina estabiliza a IL-2 contra a degradação via desamidação.
Tabela 13: Desamidação detectada por RP-HPLC da espécie do pico B' em formulações contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6 e 150 mm de arginina, 150 mM de NaCl ou 270 mM de sorbitol.
Formulação %pico B' (desamidaçao a t=0 e 2 semanas t=Q -70°C 40°C 50°C 10 mm NaSuc, 150 mM Arg, pH 6 0 0 0 0 10 mm NaSuc, 150 mM Arg, pH 6 0 0 0 3 10 mm NaSuc, 150 mM Arg, pH 6 0 0 2 2
Exemplo 4: Efeito de Congelaçao-Descongelação na 74 ΡΕ1491208
Estabilidade da IL-2 0 dano em proteínas induzido por congelação é usualmente provocado através de três mecanismos: (1) a proteína é conformacionalmente instável a temperaturas frias (desnaturação a frio); (2) a proteína é susceptível à desnaturação na interface água-gelo; (3) a proteína é danificada por alterações na concentração de sal ou por desvio de pH por congelação.
No caso da IL-2, a perda de proteína durante as congelações-descongelações é, provavelmente, provocada pela desnaturação e agregação na interface água-gelo uma vez que o tensioactivo não iónico polisorbato 80 protege eficazmente a IL-2 dos danos de congelação-descongelação. Tal como mostrado na Figura 7, a quantidade de IL-2 solúvel diminui após cada ciclo de congelação-descongelação numa formulação contendo 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6 e 150 mM de arginina. A adição de polisorbato 80 na formulação aumenta a estabilidade da IL-2 contra múltiplas congelações-descongelações. Quando a concentração de polisorbato 80 atinge 0,05% e acima, a IL-2 é completamente protegida dos danos de congelação-descongelação .
Exemplo 5: Efeito do Corte Mecânico na Estabilidade da IL-2 75 ΡΕ1491208
Efeito de Polisorbato 80, EDTA, Concentração de Proteína e
Volume de Enchimento
Foram realizados estudos para examinar a perda induzida por tensões de corte de IL-2 solúvel. Dois tipos de tensões de corte são avaliados: agitação num agitador Orbital (VWR Scientific, N° Cat. 57018-754) e agitação com efeito de vórtice num equipamento de vórtice (Fisher Scientific, modelo Genie 2, com a velocidade fixada em 4) . Várias formulações de IL-2 numa quantidade de 1 ml foram colocadas em balões de 3 cc. Estes balões foram armazenados num figorífico (amostras de controlo), colocados numa bancada de laboratório durante a noite (amostras estáticas), agitados a 200 rpm durante noite (amostras agitadas) ou agitadas com efeito de vórtice durante um minuto (amostras de vórtice). A Tabela 14 apresenta resultados da variação da quantidade de IL-2 solúvel para estas amostras.
Em comparação com as amostras de controlo refrigeradas, ambas as amostras estáticas e as amostras agitadas não mostram perda de IL-2. Deste modo, a IL-2 é estável à temperatura ambiente e é estável ao tratamento por agitação. Por outro lado, quando estas formulações foram sujeitas a efeito de vórtice durante um minuto, várias quantidades de perdas foram detectadas. Formulações 76 ΡΕ1491208 contendo 0,1 a 0,5 mg/ml de IL-2 ou 1 e 5 mM de EDTA ou baixas concentrações de polisorbato 80 (0,005 a 0,05%) mostrando todas 25-50% de perda da IL-2 solúvel. Em consequência, o efeito de vórtice durante um minuto era mais prejudicial do que a agitação durante a noite das moléculas de IL-2. A perda de IL-2 pode ser evitada aumentando a concentração de polisorbato 80 na formulação para ser igual ou maior do que 0,1%. Adicionalmente, balões completamente cheios sem ar no espaço vazio apresentavam uma perda mínima de IL-2 solúvel após um minuto de efeito de vórtice, indicando que a interface ar-líquido era o factor principal que provoca danos.
Tabela 14: Alteração da quantidade de IL-2 solúvel para amostras armazenadas à temperatura ambiente durante a noite (estáticas), agitadas a 200 rpm durante a noite (agitadas) e sujeitas a efeito de vórtice durante 1 minuto (vórtice) em comparação com as armazenadas a 4aC. A formulação de controlo continha 0,2 mg/ml de IL-2, 10 mM de succinato de sódio a pH 6 e 150 mM de arginina. A formulação preencheu 1 ml de balões de vidro de 3 cc excepto para a amostra completamente cheia, que tinha a amostra de controlo cheia completamente até ao topo dos balões de 3 cc, não deixando ar no espaço superior. A IL-2 solúvel foi quantificada por RP-HPLC.
Amostra % remanescente de IL-2 solúvel 77 ΡΕ1491208 (cheio 1 ml em balões de 3 cc) Estático durante a noite Agitaçao durante a noite Efeito de vórtice 1 min 0,2 mg/ml IL-2 (controlo) 99,6 100,8 74,7 0,1 mg/ml IL-2 100,3 102,7 72,0 0,5 mg/ml IL-2 99,7 101,0 68,6 1 mM EDTA 97,6 101,2 59,6 5 mM EDTA 99,3 102,7 72,2 0,005% polisorbato 80 100,6 100,0 46,5 0,01% polisorbato 80 99,7 100,4 66,1 0,05% polisorbato 80 99,3 100,3 93,9 0,1% polisorbato 80 99,2 100,0 89,9 0,2% polisorbato 80 99,3 99,2 99,8 0,5% polisorbato 80 99,1 98,4 99,7 1 mM EDTA, 0,1% polisorbato 99,6 100,1 99,8 80 Balões completamente cheios 99,4 100,1 96,5 5.2 Efeito da Arginina 0 efeito da arginina na estabilidade da IL-2 aos danos provocados pelo efeito de vórtice é relatado na Tabela 15. 0 aumento da concentração de arginina de 150 mM até 230 mM resulta num aumento de 3% da quantidade de IL-2 solúvel de 65% a 69% após sujeitar a um minuto de efeito de vórtice. Deste modo, a arginina tem um efeito menor na IL-2 contra os danos de corte embora esta apresentasse previamente um maior efeito de estabilização da IL-2 contra a degradação devida à formação de agregados. O efeito do polisorbato 80 na formulação de 230 mM de arginina foi testado. A adição de uma baixa concentração de polisorbato 80 (0, 02%) desestabiliza a IL-2 e a 78 ΡΕ1491208 adição de uma alta concentração de polisorbato 80 (0,1%) estabiliza a IL-2 contra os danos do efeito de vórtice.
Tabela 15: Percentagem de IL-2 solúvel em várias formulações após vim minuto sob efeito de vórtice analisada por RP-HPLC.
Formulação (contêm todas 0,5 mg/ml de IL-2 excepto se indicado de % IL-2 outro modo)_remanescente 150 mM arginina, 10 mM NaSuc, 1 mM EDTA, pH 5,8 65,5 150 mM arginina, 81 mM ácido Suc, 1 mM EDTA, pH 5,8 65,3 230 mM arginina, 10 mM NaSuc, 1 mM EDTA, pH 5,8 69,0 230 mM arginina, 128 mM ácido Suc, 1 mM EDTA, pH 5,8 68,9 230 mM arginina, 128 mM ácido Suc, 1 mM EDTA, 0,02% Tw 80, pH 5,8 55,1 230 mM arginina, 128 mM ácido Suc, 1 rriM EDTA, 0,1% Tw 80, pH 5,8 99,5 5.3 Estudo de Transporte
Os danos devidos ao corte na IL-2 durante o transporte do produto foram investigados num estudo de transporte real. A IL-2 foi preparada numa formulação de arginina e numa formulação de NaCl, ambas com várias quantidades de polisorbato 80. Estas amostras de IL-2 foram enviadas em gelo por via aérea de Emeryville, Califórnia, para St.Louis, Missouri e de St. Louis de volta para Emeryville. A Figura 8 mostra a análise por RP-HPLC da quantidade de IL-2 solúvel nestas amostras. Sem a presença de polisorbato 80 na formulação, observou-se cerca de 10% de perda de IL-2 quer nas amostras formuladas com arginina quer com NaCl. As diferenças de estabilidade entre a 79 ΡΕ1491208 formulação da arginina e a formulação de NaCl são negligenciáveis, à volta de 1%. Com a presença de polisorbato 80 na formulação, a perda de IL-2 é reduzida. Com polisorbato 80 a 0,1% não se observa perda, indicando qua a IL-2 estava completamente protegida com esta concentração de tensio-activo. Deste modo, o polisorbato 80 a 0,1% é eficaz na formulação para evitar os danos fortes na IL-2 devidos ao corte durante o transporte.
Em conclusão, a arginina pode servir como agente de estabilização primário em formulações farmacêuticas liquidas durante o armazenamento de longo prazo para diminuir a agregação e a desamidação da IL-2. Para aumentar ainda mais a concentração de arginina e para assim se conseguir uma maior estabilidade da IL-2 mas ainda assim manter a isotonicidade da solução, é preferencialmente utilizado ácido succinico para titular a arginina base a pH 5,8. Adicionalmente, metionina e EDTA podem ser incluídos na formulação para evitar a oxidação da metionina da proteína. Finalmente, um tensioactivo não iónico, tal como o polisorbato 80, pode ser incluído na formulação para evitar os danos da IL-2 devidos a congelação-descongelação e corte mecânico.
Exemplo 6: Teste da Eficácia da Conservação Várias formulações contendo conservantes antimi-crobianos foram sujeitas ao teste de eficácia da conservação da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP). Os 80 ΡΕ1491208 resultados são apresentados na Tabela 16. A amostra de controlo sem conservantes falhou no teste enquanto todas as formulações continham um conservante passaram no teste.
Tabela 16: Teste de eficácia da conservação USP para formulações de rhIL-2. A formulação de controlo continha 0,1 mg/ml de rhIL-2, 230 mM de L-arginina base, 128 mM de ácido succinico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, 0,1% de polisorbato 80 a um pH de 5,8. CONSERVANTE TESTE USP Controlo Falhou 0,9% álcool benzilico Passou 1,3% álcool benzilico Passou 1,7% álcool benzilico Passou 0,5% clorobutanol Passou 0,5% fenol Passou
Exemplo 7: Propriedades de Produção de Dor
Foi utilizado um modelo de ratazana desenvolvido na Universidade da Flórida, Colégio de Medicina Dentária, OMSDS Divisão de Neurociência, para avaliar as propriedades de produção de dor, mais particularmente a dor de queimadura e de picada produzida pelas formulações. 0 modelo é baseado num ensaio da corrente induzida em células sensoriais que transportam mensagens de dor. Para conduzir o ensaio, as células sensoriais (gânglio da raiz dorsal da ratazana) são isoladas numa câmara de registo. Os registos 81 ΡΕ1491208 são feitos a partir de células individuais que são pré-seleccionadas com base em critérios nociceptivos (induzindo dor). A dor de queimadura, a dor de picada e classificações de dor normalizadas são computorizadas para a formulação testada. Uma classificação de dor de queimadura é definida pela resposta à formulação de teste em relação à capsaicina (500 nM). A Capsaicina é bem conhecida pela sua capacidade de produzir uma dor de queimadura intensa nos humanos (Cooper et al. (1986) Pain 24: 93-116). A classificação de dor de picada é considerada como a razão da corrente produzida pela formulação de teste em relação à produzida por uma solução tamponada a pH 5,0. A classificação de dor normalizada quantifica a formulação em relação a uma solução salina normal (0,9% de NaCl, não tamponada), um solução parentérica da farmácia hospitalar comum que é conhecida como produzindo uma sensação de picada.
Uma formulação liquida de L-arginina base-ácido succinico foi sujeita à análise da dor através deste modelo. Os resultados destas duas soluções de teste são mostrados na Tabela 17. Com base nas classificações calculadas para a dor de queimadura, dor de picada e a classificação de dor normalizada, a formulação de L-arginina-ácido succinico apresentou excelentes propriedades em comparação com uma solução salina normal. Observou-se também que a corrente de teste diminuía durante a aplicação da formulação (diminuição dependente do tempo) embora não diminuísse com a solução salina normal. Isto demonstra que 82 ΡΕ1491208 esta formulação é melhor toleradada que a solução salina tal como avaliada por este ensaio.
Tabela 17: Queimadura, picada, e classificações de dor normalizadas para a formulação liquida e 0,9% de NaCl. A formulação líquida continha 230 mM de L-arqinina base, 128 mM de ácido succínico, 1 mM de EDTA, 5 mM de metionina, 0,1% de polisorbato 80, a pH 5,8.
Formulação Dor de queimadura Dor de picada Classificaçao de dor normalizada 0,9% NaCl 0,084 ± 0,006 2,44 ± 0,62 1,73 ± 0,73 Formulação líquida de rhIL-2 0,044 ± 0,019 0,65 ± 0,23 0,16 ± 0,05
Exemplo 8: Estudos de Estabilidade com TFPI
Estudos de estabilidade e solubilidade do TFPI em várias formulações demonstraram que a L-arqinina é um estabilizador (dados não mostrados) do TFPI e espécies de tampões carregadas, tais como iões citrato possuem um efeito de solubilização mais profundo. Neste estudo, os efeitos da concentração da L-arginina e do sistema de tamponamento na estabilidade do TFPI em várias formulações fora examinados. Em particular, a influência do sistema de tamponamento na forma de um ácido substancialmente livre da sua forma de sal versus uma mistura de um ácido e da sua forma de sal foi testada tal como previamente referido para formulações de IL-2 nos exemplos precedentes. ΡΕ1491208 83
Materiais e Métodos
Uma solução de TFPI foi formulada a 0,6 mg/ml em 20 mM de citrato de sódio e 300 mM de L-arginina a pH 5,5. Esta solução teve permuta de tampão através de diálise a 4°C utilizando as membranas Spectral Por #7 (MWCO 3,500, ID# 132-110) para várias formulações de L-arginina tampo-nadas a pH 6,5 com um sistema de tamponamento quer de citrato quer de succinato. A seguir à diálise, a concentração de TFPI de cada solução foi medida utilizando espectroscopia UV/Vis. Cada solução foi então diluída até 0,15 mg/ml utilizando o tampão adequado. As soluções preparadas foram então divididas em aliquotas (1 ml cada) am balões de 3 cc para estabilidade ao armazenamento. Balões suficientes foram separados neste ponto para o ponto de tempo t=0. 0 resto dos balões foi colocado num incubador a 50°C para um estudo de estabilidade acelerado. Pontos de tempo foram então tomados aos 3, 7, 14 e 30 dias. Para análise em cada ponto de tempo, o conteúdo de cada balão foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml e então centrifugou-se a 10K rpm durante aproximadamente 2 minutos. O sobrenadante centrifugado das amostras foi retirado deste tubo para análise utilizando IEX-HPLC (descrição necessária) que era conhecido de estudos anteriores como sendo um ensaio que indicava estabilidade.
Resultados e discussão O TFPI foi formulado a 0,15 mg/ml de concentração 84 ΡΕ1491208 final em várias formulações contendo quer L-arginina base quer L-arginina HC1. As formulações de L-arginina HC1 foram tamponadas a pH 5,5 com 10 mM de ácido cítrico ou ácido succínico em combinação com o seu respectivo sal de sódio conjugado. As formulações de L-arginina base foram tituladas a pH 5,5 quer por ácido cítrico quer ácido succínico. Um total de oito estudos foram realizados tal como listado abaixo: 1) 20-150 L-arginina HC1 tamponada a pH 5,5 com 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio; 2) 20-150 L-arginina HC1 titulada a pH 5,5 com ácido cítrico; 3) 100-300 mM de L-arginina HC1 tamponada a pH 5,5 com 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio; 4) 100-300 mM de L-arginina base tamponada a pH 5,5 com ácido cítrico; 5) 20-150 L-arginina HC1 tamponada a pH 5,5 com 10 mM de ácido cítrico e succinato de sódio; 6) 20-150 L-arginina base titulada a pH 5,5 com ácido succínico; 7) 100-300 mM de L-arginina HC1 tamponada a pH 5,5 com 10 mM de ácido succínico e succinato de sódio; e 8) 100-300 mM de L-arginina base tamponada a pH 5,5 com ácido succínico. A maior via de degração do TFPI foi previamente determinada como sendo a agregação/precipitação de proteína 85 ΡΕ1491208 (Chen et al. (1999), J. Pharm. Sei. 88: 881-888). A degradação do TFPI pode ser seguida monitorizando a proteína solúvel remanescente em amostras de estabilidade. As soluções de TFPI formuladas com diferentes concentrações de L-arginina foram armazenadas a 50°C para um estudo de estabilidade acelerado. Foram tomadas amostras a intervalos de tempo pré-determinados. A proteína solúvel nas amostras foi separada da proteína agregada/precipitada através de centrifugação num tubo de microcentrífuga. A quantidade de proteína solúvel foi determinada pelo método de IEX-HPLC (Chen et al. (1999) J. Pharm. Sei. 88 : 881-888). Os dados foram então ajustados em função do tempo de armazenamento através de uma equação cinética exponencial única (Y=YoEXP(-kit) para calcular a meia-vida da proteína solúvel remanescente utilizando o programa gráfico KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, Pensilvânia).
Os valores de meia-vida (ti/2) para o TFPI solúvel remanescente para formulações tamponadas por adição de citrato ou para citrato de sódio, tal como mostrado na Tabela 18. Os para formulações tamponadas com ácido succínico ou succinato de sódio são mostrados na Tabela 19. Estes dados demonstram que o valor de meia-vida aumenta com o aumento da concentração de L-arginina nestas formulações. Estes são também registados nas Figuras 9 e 10 para sistemas tampão de citrato e succinato, respectivamente. Os registos de meia-vida apresentam a forma de uma curva parabólica e aumentam em função da concentração da argi- 86 ΡΕ1491208 nina. Isto estabelece que a L-arginina é um estabilizador do TFPI.
Entre dois sistemas de tamponamento a diferença da estabilidade do TFPI parece negligenciável. Embora o sistema de tamponamento de citrato apresente mais variabilidade (Figura 9), as duas curvas de meia-vida vs. arginina para o sistema de tamponamento de succinato eram essencialmente sobreponiveis (Figura 10). O TFPI conseguiu uma estabilidade semelhante para a concentração de L-arginina similar apesar de quais os sistemas de tamponamento que foram utilizados para ajuste de pH. A Figura 11 compara também as curvas de meia-vida vs. concentração de arginina entre o sistema tampão de ácido succinico e o sistema de ácido cítrico. Esta figura mostra que não existe uma grande diferença entre a estabilidade do TFPI desde que a concentração da arginina permaneça a mesma na formulação. Estes dados demonstram que o efeito de estabilização tem uma contribuição principal da arginina.
Contudo, a titulação com ácido quer succinico quer cítrico, permite uma maior concentração da arginina na formulação (e deste modo, uma maior estabilidade) ao mesmo tempo que se mantém a isotonicidade. Deste modo, por exemplo, ambas as formulações 3-3 e 4-3 na Tabela 18 possuem 300 mM de L-arginina nas formulações e os seus valores de meia-vida são similares. Contudo, a formulação 3-3 utilizava 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio para 87 ΡΕ1491208 tamponar 300 mM de L-arginina HC1 a pH 5,5 e tinha uma osmolaridade da solução de 497 mOsm/kg. Esta é uma solução hipertónica e não é preferida como formulação injectável. Por outro lado, a formulação 4-3 utilizava 121 mM de ácido cítrico em combinação com 300 mM de L-arginina base para ajustar o pH a 5,5 e tinha uma osmolaridade da solução de 295 mOsm/kg.
Esta formulação é muito próxima de uma solução isotónica (290 mmol/kg) e, deste modo, é uma formulação injectável mais preferida. Se for utilizada uma via para ajuste de pH convencional, por exemplo, com 10 mM de ácido cítrico e citrato de sódio, pode-se adicionar apenas um pouco mais de 150 mM de L-arginina à formulação sem exceder a isotonicidade. A meia-vida da formulação de 150 mM de L-arginina (Código 1-6) é de 16 dias em comparação com 23 dias para a formulação de 300 mM de L-arginina (Código 4-3). Por isso, a formulação de TFPI com um ácido base (i.e. arginina base) como estabilizador e um tampão compreendendo um ácido substancialmente livre da sua forma de sal (i.e. ácido succínico) proporciona um meio eficaz de adicionar mais estabilizador (i.e. arginina) para maximizar o efeito estabilizante no TFPI.
Conclusão
Este exemplo demonstra que a L-arginina estabiliza o TFPI prolongando a sua meia-vida em armazenamento. 88 ΡΕ1491208
Ao utilizar titulação com ácido, pode adicionar-se mais arginina à formulação para maximizar o efeito estabilizador sem exceder a isotonicidade, o que é preferido para formulações injectáveis.
Tabela 18: Dados de estabilidade para formulações de TFPI arginina-citrato pH 5,5. A meia-vida (11/2) foi obtida ajustando os dados de estabilidade a 50°C utilizando uma equação cinética exponencial única. Código Formulação Osmolaridade (mmol/kg) tj/2 (dias) 1-1 20 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 66 9,4 1-2 40 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 81 12,6 1-3 60 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Ná 91 10,7 1-4 80 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 106 10,9 1-5 100 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 190 12,5 1-6 150 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 276 26,0 2-1 20 nM L-Arg base titulado com 8,9 nM de ácido cítrico 67 5,7 2-2 40 nM L-Arg base titulado com 17,8 nM de ácido cítrico 84 15,0 2-3 60 nM L-Arg base titulado com 26,6 nM de ácido cítrico 95 17,0 2-4 80 nM L-Arg base titulado com 34,2 nM de ácido cítrico 109 14,6 2-5 100 nM L-Arg base titulado com 42,6 nM de ácido cítrico 119 18,2 2-6 150 nM L-Arg base titulado ccm 62,4 nM de ácido cítrico 147 20,4 3-1 100 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 239 14,8 3-2 200 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 358 19,6 3-3 300 nM L-Arg HC1, 10 nM ácido cítrico/citrato Na 497 21,7 4-1 100 nM L-Arg base titulado com 42,2 nM de ácido cítrico 155 16,7 4-2 200 nM L-Arg base titulado com 81,8 nM de ácido cítrico 224 22,5 4-3 300 nM L-Arg base titulado com 121 nM de ácido cítrico 295 23,3 ΡΕ1491208
Tabela 19: Dados de estabilidade para formulações de TFPI arginina-succinato pH 5,5. A meia-vida (ti/2) foi obtida ajustando os dados de estabilidade a 50°C utilizando uma equação cinética exponencial única. Código Formulação (mmol/kg) tj/2 (dias) 1-1 20 rriM L-Arg HC1, 10 nM ácido succinico/succinato Na 66 9,9 1-2 40 rriM L-Arg HC1, 10 nM ácido succinico/succinato Na 97 11,5 1-3 60 rriM L-Arg HC1, 10 nM ácido succinico/succinato Na 129 15,3 1-4 80 rriM L-Arg HC1, 10 rtM ácido succinico/succinato Na 163 16,7 1-5 100 rriM L-Arg HC1, 10 rtM ácido succinico/succinato Na 197 20,5 1-6 150 rnM L-Arg HC1, 10 nM ácido succinico/succinato Na 282 21,9 2-1 20 rriM L-Arg base titulado ccm 8,9 nM de ácido succínico 40 6,7 2-2 40 rriM L-Arg base titulado ccm 17,8 nM de ácido succínico 62 12,6 2-3 60 rriM L-Arg base titulado ccm 26,6 nM de ácido succínico 85 16,4 2-4 80 rriM L-Arg base titulado ccm 34,2 nM de ácido succínico 107 19,6 2-5 100 rriM L-Arg base titulado ccm 42,6 nM de ácido succínico 129 20,9 2-6 150 rriM L-Arg base titulado com 62,4 nM de ácido succínico 192 23,1 3-1 100 rriM L-Arg HC1, 10 rriM ácido succinico/succinato Na 207 16,5 3-2 200 rriM L-Arg HC1, 10 rriM ácido succinico/succinato Na 353 21,6 3-3 300 rriM L-Arg HC1, 10 rriM ácido succinico/succinato Na 515 21,7 4-1 100 rriM L-Arg base titulado com 42,2 mM de ácido succínico 127 17,0 4-2 200 rriM L-Arg base titulado com 81,8 mM de ácido succínico 256 21,4 4-3 300 rriM L-Arg base titulado com 121 mM de ácido succínico 363 22,5
Embora o invento precedente tenha sido descrito com algum detalhe através de ilustração e exemplo para fins 90 ΡΕ1491208 de clareza de compreensão, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do domínio das reivindicações em anexo.
Lisboa, 6 de Maio de 2010
Claims (24)
- ΡΕ1491208 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica liquida estabilizada compreendendo: inibidor da via do factor tissular (TFPI) ou variantes deste, que retém a actividade biológica do TFPI, como componente terapeuticamente activo, em que o referido TFPI ou a variante apresentam formação de agregados durante o armazenamento numa formulação liquida; uma quantidade de aminoácido base suficiente para diminuir a formação de agregados do referido poli-péptido ou de variante deste durante o armazenamento da referida composição, em que o referido aminoácido base é arginina; e um agente de tamponamento em que o referido agente de tamponamento é seleccionado do grupo constituído por um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal e uma mistura de um ácido e da sua forma de sal.
- 2. Composição da reivindicação 1, em que o referido TFPI é TFPI humano recombinante.
- 3. Composição da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a referida composição tem uma osmolaridade de 240 mmol/kg a 360 mmol/kg. 2 ΡΕ1491208
- 4. Composição de qualquer uma das reivindi- cações precedentes, em que a referida composição possui um pH na gama de cerca de pH 4,0 até cerca de pH 9,0
- • 5. Composição da reivindicação 4, em que a referida composição tem um pH de 5,0 a 6,5 e uma osmola- ridade de 240 mmol/kg a 360 mmol/kg.
- 6. Composição de qualquer uma das reivindi- cações precedentes, em que o referido ácido é seleccionado do grupo constituído por ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fosfórico e ácido glutâmico.
- 7. Composição da reivindicação 6, em que o referido ácido é ácido cítrico.
- 8. Composição da reivindicação 1, em que o referido TFPI é formulado a 0,15 mg/ml , a arginina na sua forma de base livre está presente numa concentração de 20-250 mM ou 100-300 mM, o referido ácido é ácido cítrico e em que a referida composição tem um pH de 5,5.
- 9. Composição da reivindicação 1, em que o referido TFPI ou variante deste compreende, pelo menos, um resíduo de metionina que sofre oxidação durante o armazenamento numa formulação líquida.
- 10. Composição da reivindicação 9, compreendendo 3 ΡΕ1491208 ainda metionina numa quantidade suficiente para inibir a oxidação do referido, pelo menos, um resíduo de metionina no referido TFPI ou variante deste durante o armazenamento da referida composição.
- 11. Composição da reivindicação 1, compreendendo ainda um tensioactivo não iónico numa quantidade suficiente para inibir a agregação do referido TFPI ou variante deste em resposta à congelação-descongelação ou corte mecânico durante o armazenamento da referida composição.
- 12. Composição da reivindicação 11, em que o referido tensioactivo não iónico é o polisorbato 80.
- 13. Método para aumentar a estabilidade do TFPI ou variante deste que retém a actividade biológica do TFPI numa composição farmacêutica líquida, em que o rferido TFPI ou variante deste apresenta formação de agregado durante o armazenamento numa formulação líquida, compreendendo o referido método a incorporação na referida composição de um aminoácido base numa quantidade suficiente para diminuir a referida formação de agregado do referido polipéptido ou variante deste e um agente de tamponamento, em que o referido agente de tamponamento é seleccionado do grupo constituído por um ácido substancialmente livre da sua forma de sal, um ácido na sua forma de sal, e uma mistura de um ácido e a sua forma de sal e em que o referido aminoácido base é arginina. 4 ΡΕ1491208
- 14. Composição da reivindicação 14, em que a referida composição tem uma osmolaridade de cerca de 240 mmol/kg até cerca de 360 mmol/kg.
- 15. Composição da reivindicação 13 ou 14, em que a referida composição tem um pH na gama de pH 4,0 a pH 9,0.
- 16. Método de qualquer uma das reivindicações 13-15, em que o referido ácido é seleccionado do grupo constituído por ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fosfórico e ácido glutâmico.
- 17. Forma seca da composição da reivindicação 1, em que a referida forma seca é seleccionada do grupo constituído por uma forma liofilizada e uma forma seca por pulverização.
- 18. Formulação para utilização no diagnóstico, prevenção ou tratamento de doenças que respondem à terapia com o inibidor da via do factor tissular (TFPI), compreendendo a referida formulação a composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações precedentes.
- 19. Formulação tal como reivindicada na reivind-cação 18 para utilização no diagnóstico, prevenção ou tratamento de doenças associadas a um aumento da síntese e libertação da elastase neutrofílica, tais como as doenças inflamatórias. 5 ΡΕ1491208
- 20. Composição da reivindicação 10, em que a referida composição compreende metionina numa quantidade tal que a razão de metionina em relação aos resíduos de metionina no referido TFPI ou variante deste é de cerca de 1:1 a 1000:1.
- 21. Composição da reivindicação 10, em que a razão de metionina em relação aos resíduos de metionina no referido TFPI ou variante deste é de cerca 10:1 até cerca de 100:1.
- 22. Composição da reivindicação 7, em que o referido agente de tamponamento compreende ainda citrato de sódio.
- 23. Composição da reivindicação 1, em que a referida composição tem um pH de cerca de 5,0 até cerca de 6,5.
- 24. Composição da reivindicação 23, em que a referida composição tem um pH de cerca de 5,5. Lisboa, 6 de Maio de 2010
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US7006874B2 (en) * | 1996-01-05 | 2006-02-28 | Thermage, Inc. | Treatment apparatus with electromagnetic energy delivery device and non-volatile memory |
JP2000247903A (ja) * | 1999-03-01 | 2000-09-12 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 長期安定化製剤 |
ATE464062T1 (de) | 1999-10-04 | 2010-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Stabilisierte flüssige pharmazeutische zusammensetzung enthaltend tfpi |
HUP0204136A3 (en) * | 1999-12-30 | 2005-09-28 | Chiron Corp Emeryville | Methods for pulmonary delivery of interleukin-2 |
EP1935431A3 (en) | 2000-05-15 | 2008-08-13 | Health Research, Inc. | Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2 |
US6495534B2 (en) | 2000-05-15 | 2002-12-17 | Pharmacia & Upjohn Spa | Stabilized aqueous suspensions for parenteral use |
JP4147234B2 (ja) | 2004-09-27 | 2008-09-10 | キヤノン株式会社 | 吐出用液体、吐出方法、カートリッジ及び吐出装置 |
US8703126B2 (en) | 2000-10-12 | 2014-04-22 | Genentech, Inc. | Reduced-viscosity concentrated protein formulations |
ES2332402T5 (es) | 2000-10-12 | 2018-05-14 | Genentech, Inc. | Formulaciones de proteína concentradas de viscosidad reducida |
WO2002076445A1 (fr) * | 2001-03-23 | 2002-10-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Agents utilises pour lutter contre les maladies provoquees par le stress et medicaments associes |
US6887462B2 (en) * | 2001-04-09 | 2005-05-03 | Chiron Corporation | HSA-free formulations of interferon-beta |
DE10149030A1 (de) * | 2001-10-05 | 2003-04-10 | Viscum Ag | Stabile galenische gefriergetrocknete Arzneimittelzubereitung von rViscumin |
HUP0501111A2 (en) | 2001-10-15 | 2007-12-28 | Chiron Corp | Treatment of severe pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor |
DK1450847T3 (da) * | 2001-11-13 | 2010-12-13 | Genentech Inc | Apo2-ligand/TRAIL-formuleringer og anvendelser deraf |
US7842668B1 (en) | 2001-11-13 | 2010-11-30 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand/trail formulations |
EP3210624A1 (en) * | 2002-02-27 | 2017-08-30 | Immunex Corporation | Stabilized tnfr-fc composition comprising arginine |
ATE402716T1 (de) | 2002-02-27 | 2008-08-15 | Immunex Corp | Stabilisierte tnfr-fc formulierung mit arginin |
US6964778B1 (en) * | 2002-09-06 | 2005-11-15 | Health Research, Inc. | Temperature controlled content release from liposomes |
US6991805B1 (en) * | 2002-09-06 | 2006-01-31 | Health Research, Inc. | Temperature sensitive control of liposome-cell adhesion |
AU2003268664A1 (en) * | 2002-09-26 | 2004-04-19 | Shionogi And Co., Ltd. | Stabilized protein compositions |
EP1803445A3 (en) * | 2003-01-08 | 2007-11-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Stabilized lyophilized compositions comprising tissue factor pathway inhibitor or tissue factor pathway inhibitor variants |
EP2174663A1 (en) * | 2003-01-08 | 2010-04-14 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Stabilized aqueous compositions comprising tissue factor pathway inhibitor (TFPI) or tissue factor pathway inhibitor variant |
EP1589949B1 (en) * | 2003-01-08 | 2008-08-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Stabilized lyophilized compositions comprising tissue factor pathway inhibitor or tissue factor pathway inhibitor variants |
US20040208869A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-10-21 | Medimmune, Inc. | Uses of anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations |
US20040208870A1 (en) * | 2003-01-30 | 2004-10-21 | Medimmune, Inc. | Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations |
AU2004227837A1 (en) * | 2003-03-31 | 2004-10-21 | Alza Corporation | Non-aqueous single phase vehicles and formulations utilizing such vehicles |
PT1610820E (pt) | 2003-04-04 | 2010-12-16 | Novartis Ag | Formulações de elevada concentração de anticorpos e proteínas |
US7445933B2 (en) * | 2003-07-16 | 2008-11-04 | Abbott Laboratories, Inc. | Stable calibrators or controls for measuring human natriuretic peptides |
US7291501B2 (en) * | 2003-07-16 | 2007-11-06 | Abbott Laboratories | Stable compositions for measuring human natriuretic peptides |
WO2005019265A1 (en) * | 2003-08-13 | 2005-03-03 | Chiron Corporation | Improved method of purifying tfpi and tfpi analogs |
US7141544B2 (en) | 2003-10-10 | 2006-11-28 | Baxter International, Inc. | Stabilization of pharmaceutical protein formulations with small peptides |
DE10348550A1 (de) * | 2003-10-20 | 2005-06-16 | Hexal Biotech Forschungsgmbh | Stabile wässrige G-CSF-haltige Zusammensetzungen |
JP5019881B2 (ja) | 2003-11-04 | 2012-09-05 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス,インコーポレーテッド | アンタゴニスト抗cd40モノクローナル抗体およびそれらを使用するための方法 |
US20050136542A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Beckman Coulter, Inc. | Stabilized liquid reference solutions |
WO2005063298A1 (en) | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Pharmacia Corporation | Stable growth hormone liquid formulation |
ES2553987T3 (es) * | 2003-12-25 | 2015-12-15 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Preparación farmacéutica de base acuosa estable que contiene anticuerpo |
EP1703916A2 (en) * | 2004-01-13 | 2006-09-27 | Vasogenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating acute myocardial infarction by calcitonin gene related peptide and compositions containing the same |
US7976847B2 (en) * | 2004-01-13 | 2011-07-12 | Vasogenix Pharmaceuticals, Inc. | Controlled release CGRP delivery composition for cardiovascular and renal indications |
WO2005070444A2 (en) * | 2004-01-13 | 2005-08-04 | Vasogenix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating acute myocardial infarction by calcitonin gene related peptide and compositions containing the same |
CN101426520A (zh) * | 2004-03-17 | 2009-05-06 | 诺华疫苗和诊断公司 | 通过给予组织因子途径抑制剂(tfpi)治疗社区获得性重症肺炎 |
US7619066B2 (en) * | 2004-04-02 | 2009-11-17 | Amgen Inc. | IL-1ra variants |
CN1993139B (zh) * | 2004-06-01 | 2011-02-16 | 阿雷斯贸易股份有限公司 | 稳定的干扰素液体制剂 |
DE102004059776A1 (de) * | 2004-09-17 | 2006-04-06 | Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. | Brennstoffzellensystem |
JP4147235B2 (ja) | 2004-09-27 | 2008-09-10 | キヤノン株式会社 | 吐出用液体、吐出方法、液滴化方法、液体吐出カートリッジ及び吐出装置 |
MX2007007580A (es) * | 2004-12-22 | 2007-12-11 | Ambrx Inc | Hormona del crecimiento humana modificada. |
JP2008528509A (ja) * | 2005-01-21 | 2008-07-31 | アルザ コーポレイション | 少なくとも1つの対イオンを含む、向上した安定性でマイクロニードルをコーティングするための治療用ペプチド製剤 |
CN100336557C (zh) * | 2005-05-11 | 2007-09-12 | 北京双鹭药业股份有限公司 | 一种生长抑素的水溶液制剂、其制备方法及应用 |
CN100342909C (zh) * | 2005-05-11 | 2007-10-17 | 北京双鹭药业股份有限公司 | 一种胸腺素α1的水溶液制剂、其制备方法及应用 |
CN100337684C (zh) * | 2005-05-11 | 2007-09-19 | 北京双鹭药业股份有限公司 | 一种胸腺五肽的水溶液制剂、其制备方法及应用 |
WO2006125076A2 (en) | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for immunizing against chlamydia infection |
KR100769709B1 (ko) * | 2005-05-31 | 2007-10-23 | 주식회사 대웅 | 인성장호르몬을 함유하는 안정한 액상 제제 |
CA2610839C (en) | 2005-06-14 | 2019-06-25 | Amgen Inc. | Self-buffering protein formulations |
US20070027105A1 (en) | 2005-07-26 | 2007-02-01 | Alza Corporation | Peroxide removal from drug delivery vehicle |
US8168592B2 (en) * | 2005-10-21 | 2012-05-01 | Amgen Inc. | CGRP peptide antagonists and conjugates |
US20070191271A1 (en) * | 2006-02-10 | 2007-08-16 | Dow Pharmaceutical Sciences | Method for stabilizing polypeptides lacking methionine |
WO2007103425A2 (en) * | 2006-03-06 | 2007-09-13 | Novartis Ag | Kits and methods for preparing pharmaceutical compositions comprising tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
TW200806317A (en) * | 2006-03-20 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Methods for reducing protein aggregation |
MX2008013508A (es) * | 2006-04-21 | 2008-10-31 | Novartis Ag | Composiciones farmaceuticas de anticuerpos antagonistas anti-cd40. |
CN105412910A (zh) * | 2006-07-06 | 2016-03-23 | 株式会社大熊 | 稳定的人生长激素液体制剂 |
LT2049148T (lt) * | 2006-07-06 | 2016-11-25 | Daewoong Co., Ltd. | Žmogaus augimo hormono skysta stabili kompozicija |
US7923425B2 (en) * | 2006-08-21 | 2011-04-12 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Low-foaming, acidic low-temperature cleaner and process for cleaning surfaces |
US7833527B2 (en) | 2006-10-02 | 2010-11-16 | Amgen Inc. | Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies |
EP2170268A2 (en) * | 2007-06-25 | 2010-04-07 | Amgen, Inc. | Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor |
UA107557C2 (xx) * | 2007-07-06 | 2015-01-26 | Композиція антитіла офатумумабу | |
JP2010532790A (ja) * | 2007-07-06 | 2010-10-14 | グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 抗体処方 |
PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
CN102007143B (zh) | 2008-01-09 | 2015-08-26 | 塞诺菲-安万特德国有限公司 | 具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物 |
US10058593B2 (en) | 2008-03-26 | 2018-08-28 | Oramed Ltd. | Methods and compositions for oral administration of proteins |
CN102256618A (zh) | 2008-10-17 | 2011-11-23 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 胰岛素和glp-1激动剂的组合 |
CN102281903B (zh) * | 2008-11-17 | 2013-11-13 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 降低大分子在生理条件下聚集的方法和配方 |
BRPI1006519A2 (pt) | 2009-03-06 | 2016-08-09 | Genentech Inc | formulação de anticorpos |
SG10201403840VA (en) * | 2009-07-06 | 2014-10-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Aqueous insulin preparations containing methionine |
NZ623910A (en) | 2009-07-28 | 2016-06-24 | Shire Human Genetic Therapies | Compositions and methods for treating gaucher disease |
WO2011017070A1 (en) * | 2009-07-28 | 2011-02-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for producing high concentration lyophilized pharmaceutical formulations |
PT2554183T (pt) | 2009-11-13 | 2018-07-09 | Sanofi Aventis Deutschland | Composição farmacêutica que compreende um agonista de glp-1, uma insulina e metionina |
MY159565A (en) | 2009-11-13 | 2017-01-13 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition comprising a glp-1 agonist and methionine |
RU2558821C2 (ru) * | 2009-11-17 | 2015-08-10 | Ипсен Фарма С.А.С. | ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ДЛЯ КОМБИНАЦИИ hGH И rhIGF-1 |
EA031209B9 (ru) | 2010-01-15 | 2021-11-19 | Кирин-Эмджен, Инк. | Фармацевтический состав антитела для лечения воспалительного заболевания и способы его применения |
MX2012009755A (es) | 2010-02-26 | 2012-09-12 | Novo Nordisk As | Composiciones que contienen anticuerpo estable. |
WO2011109452A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Bayer Healthcare Llc | Optimized Monoclonal Antibodies against Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) |
WO2011147921A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Novo Nordisk A/S | Stable multi-dose compositions comprising an antibody and a preservative |
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US11246915B2 (en) | 2010-09-15 | 2022-02-15 | Applied Molecular Transport Inc. | Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo |
AU2011302645B2 (en) | 2010-09-15 | 2015-02-26 | Applied Molecular Transport, Llc | Systems and methods of delivery of bioactive agents using bacterial toxin-derived transport sequences |
US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
WO2013001044A1 (en) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Leukocare Ag | Method for preventing the unfolding of a (poly) peptide and/or inducing the (re- ) folding of a (poly) peptide |
WO2013030160A1 (en) | 2011-08-29 | 2013-03-07 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for use in glycemic control in diabetes type 2 patients |
AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
EP2771033A4 (en) | 2011-10-28 | 2016-02-17 | Integritybio Inc | PROTEIN FORMULATIONS CONTAINING AMINO ACIDS |
US8613919B1 (en) | 2012-08-31 | 2013-12-24 | Bayer Healthcare, Llc | High concentration antibody and protein formulations |
US9592297B2 (en) | 2012-08-31 | 2017-03-14 | Bayer Healthcare Llc | Antibody and protein formulations |
US8883979B2 (en) | 2012-08-31 | 2014-11-11 | Bayer Healthcare Llc | Anti-prolactin receptor antibody formulations |
JP6171331B2 (ja) * | 2012-12-25 | 2017-08-02 | 東ソー株式会社 | Fc結合性タンパク質の精製方法および定量方法 |
CN110151979A (zh) * | 2013-01-03 | 2019-08-23 | 奥拉姆德有限公司 | 用于治疗nafld、肝性脂肪变性及其后遗症的方法和组合物 |
TWI641381B (zh) | 2013-02-04 | 2018-11-21 | 法商賽諾菲公司 | 胰島素類似物及/或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物 |
SI2968467T1 (sl) * | 2013-03-13 | 2020-11-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Pripravki z zmanjšano oksidacijo |
AR095399A1 (es) | 2013-03-13 | 2015-10-14 | Genentech Inc | Formulaciones con oxidación reducida, método |
US20140314778A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-23 | Genentech, Inc. | Formulations with reduced oxidation |
BR112015022529A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Genentech Inc | meios de cultura de células e processos de produção de anticorpo |
IL275388B1 (en) | 2013-09-11 | 2024-06-01 | Eagle Biologics Inc | Liquid protein formulations containing viscosity reducing agents |
JP2014062100A (ja) * | 2013-11-05 | 2014-04-10 | Glaxosmithkline Llc | 抗体処方 |
RU2016132342A (ru) | 2014-01-09 | 2018-02-14 | Санофи | Стабилизированные фармацевтические составы на основе инсулиновых аналогов и/или инсулиновых производных |
WO2015104310A1 (en) | 2014-01-09 | 2015-07-16 | Sanofi | Stabilized pharmaceutical formulations of insulin aspart |
BR112016013832A2 (pt) | 2014-01-09 | 2017-08-08 | Sanofi Sa | Uso de análogo e/ou derivado de insulina, formulação farmacêutica e processo para a preparação da mesma, kit e dispositivo médico |
US10260111B1 (en) | 2014-01-20 | 2019-04-16 | Brett Eric Etchebarne | Method of detecting sepsis-related microorganisms and detecting antibiotic-resistant sepsis-related microorganisms in a fluid sample |
SI3139965T1 (sl) | 2014-05-07 | 2022-01-31 | Applied Molecular Transport Inc. | Fuzijske molekule, izpeljane iz toksina cholix, za peroralno dostavljanje biološko aktivnega tovora |
US11357857B2 (en) | 2014-06-20 | 2022-06-14 | Comera Life Sciences, Inc. | Excipient compounds for protein processing |
US20160074515A1 (en) | 2014-06-20 | 2016-03-17 | Reform Biologics, Llc | Viscosity-reducing excipient compounds for protein formulations |
US10478498B2 (en) | 2014-06-20 | 2019-11-19 | Reform Biologics, Llc | Excipient compounds for biopolymer formulations |
CN106999510B (zh) | 2014-10-01 | 2021-04-30 | 伊格尔生物制品有限公司 | 含有粘度降低剂的多糖和核酸制剂 |
CR20170314A (es) | 2014-12-12 | 2017-10-20 | Sanofi Aventis Deutschland | Formulación de relación fija de insulina glargina/lixisenatida |
AR103173A1 (es) * | 2014-12-22 | 2017-04-19 | Novarits Ag | Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17 |
JP6247241B2 (ja) * | 2015-02-27 | 2017-12-13 | ノバルティス アーゲー | 抗体処方 |
TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患治療 |
TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患之治療 |
EP3287139B1 (en) * | 2015-04-21 | 2021-08-11 | Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Nerve growth factor composition and injection powder |
AU2016380988B2 (en) | 2015-12-30 | 2022-07-21 | Genentech, Inc. | Formulations with reduced degradation of polysorbate |
WO2018038301A1 (en) * | 2016-08-26 | 2018-03-01 | Hugel Inc. | Stabilized liquid formulation of botulinum toxin and preparation method thereof |
US20180110856A1 (en) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | Amgen Inc. | Pharmaceutical Formulations and Methods of Making the Same |
BR112019018915A2 (pt) | 2017-03-15 | 2020-04-14 | Pandion Therapeutics Inc | imunotolerância direcionada |
WO2018217989A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Pandion Therapeutics, Inc. | Targeted immunotolerance |
CN111182887A (zh) * | 2017-06-14 | 2020-05-19 | 株式会社生物解决方案有限公司 | 用于改善皮肤皱纹或抗炎活性的包括物质p的化妆品组合物 |
EP3664893A1 (en) * | 2017-08-08 | 2020-06-17 | CSL Behring AG | Hemopexin formulations |
US10174091B1 (en) | 2017-12-06 | 2019-01-08 | Pandion Therapeutics, Inc. | IL-2 muteins |
US10946068B2 (en) | 2017-12-06 | 2021-03-16 | Pandion Operations, Inc. | IL-2 muteins and uses thereof |
SG11202009925PA (en) | 2018-03-08 | 2020-11-27 | Applied Molecular Transport Inc | Toxin-derived delivery constructs for oral delivery |
CA3093386A1 (en) | 2018-03-08 | 2019-09-12 | Applied Molecular Transport Inc. | Toxin-derived delivery constructs for oral delivery |
CN113166221A (zh) * | 2018-06-13 | 2021-07-23 | 阿科隆生物技术有限责任公司 | 制备在液体药物组合物中高度稳定的具有治疗活性的阿地白介素的方法 |
MX2021014178A (es) | 2019-05-20 | 2022-01-04 | Pandion Operations Inc | Inmunotolerancia dirigida a la molecula de adhesion celular de adresina vascular de mucosas (madcam). |
TW202120521A (zh) | 2019-08-16 | 2021-06-01 | 美商應用分子運輸公司 | 組合物、配方及介白素生產及純化 |
KR20220140711A (ko) | 2020-01-13 | 2022-10-18 | 듀렉트 코퍼레이션 | 불순물이 감소된 지속 방출 약물 전달 시스템 및 관련 방법 |
US20230151102A1 (en) * | 2020-01-13 | 2023-05-18 | Aptevo Research And Development Llc | Methods and compositions for preventing adsorption of therapeutic proteins to drug delivery system components |
WO2021168079A1 (en) | 2020-02-21 | 2021-08-26 | Pandion Operations, Inc. | Tissue targeted immunotolerance with a cd39 effector |
PE20221759A1 (es) * | 2020-03-31 | 2022-11-11 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Nuevos analogos de il-2 inmunoestimuladores |
CN117120070A (zh) * | 2021-03-11 | 2023-11-24 | 89生物公司 | 包含突变型fgf-21肽peg化缀合物的液体制剂 |
AU2022232401A1 (en) * | 2021-03-11 | 2023-09-21 | 89Bio, Inc. | Liquid formulations comprising mutant fgf-21 peptide pegylated conjugates |
CN117883376B (zh) * | 2024-03-14 | 2024-06-25 | 北京四环生物制药有限公司 | 含重组人白细胞介素-2的药物制剂及其制备方法 |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4966843A (en) | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
EP0158487B1 (en) | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
JPS60215631A (ja) * | 1984-04-09 | 1985-10-29 | Takeda Chem Ind Ltd | インタ−ロイキン−2組成物 |
US4650674A (en) * | 1984-07-05 | 1987-03-17 | Genentech, Inc. | Synergistic cytotoxic composition |
US5034225A (en) * | 1985-12-17 | 1991-07-23 | Genentech Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
JPH0645551B2 (ja) * | 1986-01-07 | 1994-06-15 | 塩野義製薬株式会社 | インタ−ロイキン−2組成物 |
US4894226A (en) | 1986-11-14 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation |
US4931543A (en) | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
ES2044941T5 (es) | 1987-08-21 | 1999-02-16 | Mallinckrodt Group Inc | Estabilizador de hormonas promotoras del crecimiento. |
US4883661A (en) | 1987-10-09 | 1989-11-28 | Daly John M | Use of arginine as an lymphokine synergist |
US5078997A (en) * | 1988-07-13 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers |
US5272135A (en) | 1991-03-01 | 1993-12-21 | Chiron Ophthalmics, Inc. | Method for the stabilization of methionine-containing polypeptides |
DE4111393A1 (de) * | 1991-04-09 | 1992-10-15 | Behringwerke Ag | Stabilisierte faktor viii-praeparationen |
FR2684878B1 (fr) | 1991-12-12 | 1994-02-11 | Roussel Uclaf | Composition pharmaceutique stabilisee d'il2 humaine recombinante non glycosylee sous forme reduite et son procede de preparation. |
IL107887A (en) * | 1992-12-08 | 2003-07-06 | Ambi Inc | Stabilized lanthionine containing bacteriocin compositions |
US5358708A (en) | 1993-01-29 | 1994-10-25 | Schering Corporation | Stabilization of protein formulations |
US5580856A (en) * | 1994-07-15 | 1996-12-03 | Prestrelski; Steven J. | Formulation of a reconstituted protein, and method and kit for the production thereof |
ATE216590T1 (de) | 1995-02-06 | 2002-05-15 | Genetics Inst | Arzneimittelformulierungen für il-12 |
US5888968A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | Chiron Corporation | TFPI formulation |
ATE358684T1 (de) | 1995-06-07 | 2007-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Waessrige formulierung enthaltend tfpi und lösungsvermittlers |
EP2275119B1 (en) * | 1995-07-27 | 2013-09-25 | Genentech, Inc. | Stable isotonic lyophilized protein formulation |
KR100408229B1 (ko) * | 1996-10-04 | 2003-12-01 | 암겐 인코포레이티드 | Mpl 리간드를 함유하는 제약학적 조성물 |
EP1005551A2 (en) * | 1997-01-31 | 2000-06-07 | Human Genome Sciences, Inc. | Tissue factor pathway inhibitor-3 |
JP2002510653A (ja) | 1998-04-03 | 2002-04-09 | カイロン コーポレイション | 緩衝剤としてコハク酸を含有する注射可能なigf処方物 |
ATE464062T1 (de) * | 1999-10-04 | 2010-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Stabilisierte flüssige pharmazeutische zusammensetzung enthaltend tfpi |
WO2001085198A1 (en) | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Novo Nordisk A/S | tHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A FACTOR VIIA AND A FACTOR XIII |
ES2332402T5 (es) | 2000-10-12 | 2018-05-14 | Genentech, Inc. | Formulaciones de proteína concentradas de viscosidad reducida |
KR20080067717A (ko) | 2001-01-26 | 2008-07-21 | 쉐링 코포레이션 | 스테롤 흡수 억제제와 혈액 조절제를 포함하는 혈관 질환의치료 또는 예방용 약제학적 조성물 |
-
2000
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