CN101426520A - 通过给予组织因子途径抑制剂（tfpi）治疗社区获得性重症肺炎 - Google Patents

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Abstract

预防性或治疗性治疗重症肺炎的方法，包括给予患有或处于该疾病风险的患者组织因子途径抑制剂(TFPI)或TFPI类似物。所述方法包括采用TFPI或TFPI类似物的连续静脉内输液，优选低剂量以避免不良副作用。

Description

通过给予组织因子途径抑制剂（TFPI）治疗社区获得性重症肺炎
发明领域
本发明涉及治疗性治疗社区获得性重症肺炎(severe community-acquiredpneumonia)的方法。更具体地说，本发明涉及给予组织因子途径抑制剂蛋白来缓解重症肺炎相关生理途径的过度扩张。
发明背景
一种或多种肺部功能性物件，包括肺泡间隙和间质组织的急性感染可导致肺炎。美国每年约有2百万人染上肺炎，40,000-70,000人死亡。肺炎在所有致死疾病中排名第6，它是最常见的致死性医院内(医院获得性)感染。在美国，社区获得性肺炎(CAP)对医疗保健经费影响显著，估计每年直接费用为140亿美元，工资损失达90亿美元(Lynch J P，Martinez F J.，“社区获得性肺炎”(Community-acquired pneumonia.)，Curr Opin Pulm Med.，1998；4：162-172)。在发展中国家，下呼吸道感染通常是主要的致死原因，仅次于感染性腹泻而排名第二(《Merck手册》(The Merck Manual)，第6部分，第73章，Pneumonia，2000)。
可根据各种组织，包括美国胸科协会(American Thoracic Society(ATS))(Am J Respir Crit Care Med，2001；163：1730-1754)提出的指南来特征鉴定称为“重症肺炎”的疾病。例如，除了其它诊断重症肺炎的标准以外，ATS要求至少负荷一项主要标准，如需要机械方法换气(mechanical ventilation)或(存在)败血性休克。总体上，急性肺病、肺部炎性疾病或例如由于炎症或阻塞等因素所致肺功能干扰可导致重症肺炎。可根据准入的肺炎专用ICU的患者作出重症CAP的诊断。流行病学上，该患者人群约占所有ICU准入(患者)的10％。与一般住院治疗的CAP患者低于15％的死亡率相比，ICU中肺炎患者在所有CAP患者中死亡率最高(30％-40％)。
美国每年约4百万成年人诊断为感染社区获得性肺炎(CAP)，其中多达600,000人需要住院。Fine等，N.Engl.J.Med.，336，243-50，1997。总体上，CAP的发病率随年龄而增加，65岁与更年长人中最普遍。Marston等，Arch InternMed.，1997；157：1709-1718。该发病率在共患疾病(comorbidity)，例如慢性阻塞性肺病、哮喘、糖尿病、酗酒、免疫抑制、肾功能不全、慢性肝病和心脏病患者中也增加。Marrie，Curr Opin Pulm Med.，1996，2：192-197；Niedermann等，Am Rev Respir Dis.，1993，148：1418-1426。
在美国，肺炎是首位的感染致死原因，在总致死原因中排名第6。肺炎相关死亡率从1979到1992年上升了22％，在1992年，老年患者(65岁和更年长)占所有肺炎相关死亡的89％。参见《肺炎和流感死亡率—美国》(Pneumonia andinfluenza death rates--United States)，1979-1994[MMWR.，1995，44：782公布的校正]。MMWR.，1995，44：535-537。Fine和他的同事(1997)报道了某些共患疾病(肿瘤病、充血性心力衰竭(CHF)、脑血管疾病、肾病和肝病)和某些体检发现(精神状态改变、心率升高、呼吸加速、收缩压降低和体温异常降低或升高)也与CAP相关死亡率升高有关。此外，CAP对美国医疗保健经费影响显著，估计每年直接费用为140亿美元，工资损失达90亿美元。Lynch J P和Martinez，Curr Opin Pulm Med.，1998；4：162-172)。
组织因子途径抑制剂(TFPI)是一种存在于哺乳动物血浆中的蛋白质和丝氨酸蛋白酶抑制剂。Thomas，Bull.Johns Hopkins Hosp.，81，26，(1947)；Schneider，Am.J.Physiol.，149，123，(1947)；Broze和Miletich，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，1886，(1987)。TFPI也称为组织因子抑制剂、组织促凝血酶原激酶抑制剂、因子II抑制剂、外源途径抑制剂(EPI)和脂蛋白相关促凝剂抑制物(LACI)。国际血栓形成和止血协会(International Society on Thrombosis andHemostasis)在1991年6月30日接受了“组织因子途径抑制剂”(TFPI)这个名称。
血液凝结活化是液态血液转变为固体凝胶或凝块。此外，凝血蛋白酶的消耗可导致大出血。主要变化是可溶性血纤蛋白原转变为不可溶的血纤蛋白，虽然血纤蛋白本身只形成总血液凝块的0.15％，但该转变过程是复杂的酶级联反应的最后一步。其中的各组分(因子)以酶原(蛋白水解酶的无活性前体)形式存在，通过在特定位点经蛋白酶水解切割转变为活性酶。激活少量的某种因子可催化形成大量的下一步(因子)，导致放大(作用)极快形成血纤蛋白。
据信，血管损伤使因子VIIa与在内皮下方细胞上表达的组织因子(TF)接触从而启动凝血。因子VIIa-TF复合物切割因子X产生因子Xa，切割因子IX产生因子IXa。TFPI可与因子VIIa和因子Xa二者结合。TFPI、因子VIIa(与其结合的TF)和因子Xa之间形成的复合物抑制了维持止血所需因子Xa和IXa的进一步形成。Broze，Jr.，Ann.Rev.Med.，46：103，(1995)。
直接引入血流的细菌产物，包括内毒素激活凝血级联反应可导致大量血纤蛋白沉积在动脉表面，以及消耗血纤蛋白原、凝血酶原、因子V和VIII与血小板。此外，刺激溶纤***可导致进一步形成血纤蛋白降解产物。
在细菌产物(例如，内毒素)明显启动凝血激活的同时，凝血似乎也激活了相反的机制，即激活了纤溶***。激活的因子XIII将血纤蛋白溶酶原前激活物转变为血纤蛋白溶酶原激活物，然后将血纤蛋白溶酶原转变为血纤蛋白从而介导了血凝块的溶解。因此，激活血浆纤溶***也造成出血趋势。
内毒素血症与组织血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂(PAI)的循环水平增加有关。该抑制剂能使组织血纤蛋白溶酶原激活物(TPA)快速灭活从而阻碍了其通过激活血纤蛋白溶酶原成为血纤蛋白溶酶来启动血纤蛋白溶解的能力。血纤蛋白溶解受影响可导致血纤蛋白沉积在血管中，从而造成败血性休克相关的DIC。
人们正在努力鉴定满意的干预方法来预防或治疗重症肺炎和相关的凝血病。采用能打断凝血途径的药物不一定是重症肺炎的有效治疗性或预防性治疗方法。例如，肝素是常用的抗凝剂。然而，肝素的使用难以控制，因为肝素可导致大出血并且发现虽可减弱凝血异常但对存活没有益处。参见例如，Aoki等，“激活的C蛋白和传统肝素治疗弥散性血管内凝血的比较性双盲随机试验”(A Comparative Double-BLIND randomized Trial of Activated Protein C andUnfractionated Heparin in the Treatment of Disseminated IntravascularCoagulation)，Int.J.Hematol.，75，540-47，(2002)。主要在脑膜炎球菌内毒素血症(其主要特征是爆发型DIC)中进行的几项临床试验未能证明肝素治疗降低了脓毒症的死亡率。参见，例如Corrigan等，“肝素治疗爆发型弥散性血管内凝血败血症对死亡率和止血缺陷纠正的作用”(＂Heparin Therapy in Septacemiawith Disseminated Intravascular Coagulation.Effecton Mortality and on Correctionof Hemostatic Defects)，N.Engl.J.Med.，283：778-782，(1970)；Lasch等，“弥散性血管内凝血(DIC)的肝素治疗”(Heparin Therapy of Diffuse IntravascularCoagulation(DIC))，Thrombos.Diathes.Haemorrh.，33：105，(1974)；Straub，“肝素治疗血管内凝血的病例”(A Case Against Heparin Therapy of IntravascularCoagulation)，Thrombos.Diathes.Haemorrh.，33：107，(1974)。
易患严重的社区获得性肺炎的患者是那些需要进入重症监护病房(ICU)的社区获得性肺炎患者。社区获得性肺炎患者临床上鉴定为具有肺部薄壁组织感染和/或经放射摄影和临床体征证实。重症肺炎包括社区获得性重症肺炎，通常其病原体已明确，包括肺炎链球菌、军团菌、流感嗜血菌或各种革兰阴性细菌。大多数社区获得性重症肺炎患者在CAP发作前生活在社区中，其中只有约20％允许自医院、疗养院或长期照料中转移出来。美国的重症CAP患者男性约50％和女性约50％，但倾向于更年长者。美国约17％的重症CAP患者在50岁以下，约24％在50和64岁之间，约21％在64和74岁之间，约38％超过75岁。大多数重症CAP患者具有一种或多种明显的共患疾病。在2003年，接受ICU照料治疗的美国CAP患者通常患有相应的心脏病、COPD/囊性纤维化、糖尿病、肾病、癌症、酗酒和/或药物滥用。
给予重组人ala-TFPI(TFPI类似物)在脓毒血症动物模型中显示提高了存活率。参见，例如美国专利号6,063,764。TFPI作为内源性蛋白耐受良好。已证明通过静脉内输液或皮下注射给予TFPI显示可降低凝血能力，表现为凝血酶原时间(PT)增加。在动物和人研究中，PT的延长与血浆TFPI增加呈线性相关。A.A.Creasey，Sepsis，3：173，(1999)。
本领域仍然需要能抑制重症肺炎的致死作用同时最大程度降低可能的严重副作用的治疗方法。
发明简述
本发明的一个实施方案是治疗或预防重症肺炎的方法，包括给予患有或处于重症肺炎风险的患者TFPI或TFPI类似物。在一些实施方案中，患者具有可证实的感染。
本发明的另一实施方案是治疗重症肺炎的方法，包括给予患者选自TFPI或TFPI类似物的药物连续静脉内输液。在一些实施方案中，患者具有可证实的感染。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中通过连续静脉内输液给予所述TFPI或TFPI类似物，其剂量率(dosing rate)等于以低于约2.0mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。在一优选的实施方案中，所述剂量率等于以约0.00025-2.0，或者约0.001-1.75mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。在另一优选实施方案中，所述剂量率等于以约0.005-1.50mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。在一更优选的实施方案中，所述剂量率等于以约0.010-0.75mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。在还要优选的实施方案中，所述TFPI或所述TFPI类似物的给药剂量率等于以约0.2-0.8mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。在另一优选实施方案中，给予所述剂量率所提供的总剂量等于以约0.024-4.8mg/kg的总剂量给予参比ala-TFPI。在另一优选实施方案中，给予所述剂量率提供的每日剂量等于以至少约0.006mg/kg到小于约1.2mg/kg的每日剂量给予参比ala-TFPI。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中给予所述TFPI或TFPI类似物至少72小时。在一优选实施方案中，给予所述TFPI或TFPI类似物至少96小时。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中所述TFPI类似物包含由SEQID NO：1的氨基酸19-89构成的第一Kunitz结构域。在一优选的实施方案中，所述TFPI类似物还包含由SEQ ID NO：1的氨基酸90-160构成的第二Kunitz结构域。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中所述TFPI类似物包含SEQ IDNO：1的氨基酸1-160或者其中所述TFPI类似物包含由SEQ ID NO：1的氨基酸90-160构成的第二Kunitz结构域。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中所述TFPI或TFPI类似物从含有TFPI或TFPI类似物的冻干组合物制备。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中所述TFPI或TFPI类似物以含有精氨酸的制剂给予。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中所述TFPI或TFPI类似物以含有柠檬酸盐的制剂给予。
其它实施方案包括任一以上实施方案，其中所述TFPI或TFPI类似物在含有约300mM盐酸精氨酸和约20mM柠檬酸钠，pH约5.5的制剂中浓度为0.15mg/ml。
其它实施方案包括任一以上实施方案，还包括在给予所述TFPI或TFPI类似物的同时或24小时内给予选自以下的其它药物：抗生素、抗体、内毒素拮抗剂、具有抗凝血活性的组织因子类似物、免疫刺激剂、细胞粘着阻断剂、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗剂、pafase(PAF酶抑制剂)、TNF抑制剂、IL-6抑制剂和补体抑制剂。在一优选的实施方案中，所述其它药物是能与选自TNF、IL-6和MCSF的抗原特异性结合的抗体。
阅读以下附图和详述可以进一步明白本发明的实施方案。
发明详述
给予TFPI或TFPI类似物可有效地预防和治疗重症肺炎。连续给予低剂量TFPI或TFPI类似物(下文称为“低剂量TFPI给药”)也可有效地预防或治疗重症肺炎。TFPI或TFPI类似物给药，特别是低剂量给药抑制或缓解了急性或慢性炎症、特别是重症肺炎。低剂量TFPI给药持续至少3天降低了重症肺炎的死亡危险，同时最大程度降低了不良副作用导致的并发症发生率，特别是出血性疾病(bleeding disorder)。低剂量TFPI给药的其它优点是避免了足够高的剂量可能降低TFPI血浆浓度的耐受作用。血浆TFPI浓度约850ng/ml时可刺激半数最大的耐受作用，而低剂量TFPI给药的血浆水平一般维持在500ng/ml以下。一般通过TFPI或TFPI类似物的连续静脉内输液实施低剂量TFPI给药。
TFPI和TFPI类似物
本文所用的“TFPI”指具有SEQ ID NO：1所示276个氨基酸残基序列和分子量为约38,000道尔顿的成熟血清糖蛋白。它是组织因子活性和凝血激活的天然抑制剂。美国专利号5,110,730描述了组织因子(TF)，美国专利号5,106,833描述了TFPI。Wun等的美国专利号4,966,852描述了TFPI cDNA的克隆。TFPI是一种蛋白酶抑制剂，具有3个Kunitz结构域，其中两个已知分别与因子VII和Xa相互作用。第三个结构域的功能未知。据信，TFPI通过形成惰性的四因子Xa：TFPI：因子VIIa：组织因子复合物来抑制凝血启动而在体内(in viva)起作用。参见Rapaport的综述，Blood，73：359-365，(1989)和Broze等，Biochemistry，29：7539-7546，(1990)。可从TFPI与其它研究透彻的蛋白酶抑制剂的同源性推测其许多结构特征。TFPI不是一种酶，因此它可能以化学计量方式抑制其靶蛋白酶，即TFPI的Kunitz结构域之一能抑制一种蛋白酶分子。本发明的TFPI分子中优选存在Kunitz结构域1和/或2。Kunitz结构域3的功能未知。
“TFPI类似物”是经一个或多个氨基酸添加或取代(一般是保守性的)、一个或多个氨基酸删除(例如TFPI片段)、或在一个或多个氨基酸加上一个或多个化学基团而修饰的TFPI衍生物，只要这些修饰不破坏TFPI的生物学活性。制备多肽类似物的方法是本领域已知的，下文将进一步描述。优选的TFPI类似物是氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-丙氨酰基-TFPI(ala-TFPI)。用下文所述的生物活性试验测定的TFPI类似物具有TFPI的一些活性。TFPI和类似物的优选生物活性试验是凝血酶原时间(PT)试验(参见下文)。
TFPI和TFPI类似物可以糖基化或非糖基化。美国专利号5,106,833描述了TFPI的类似物。Ala-TFPI是国际药物名称为“tifacogin”的TFPI类似物。Ala-TFPI包含成熟的全长人TFPI的整个氨基酸序列加上氨基末端的一个额外丙氨酸残基。将ala-TFPI的氨基末端丙氨酸残基工程改造加入TFPI序列提高了其在大肠杆菌中的表达和切割位点，否则此处是氨基末端甲硫氨酸残基。参见美国专利号5,212,091。
特别优选的TFPI类似物可包含保守性取代，即在侧链相似的氨基酸家族内发生的取代。具体地说，氨基酸通常可分为4个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。例如，可合理地预计用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸、用谷氨酸单独取代天冬氨酸、用丝氨酸单独取代苏氨酸、或用结构相似的氨基酸类似地保守性取代某种氨基酸，对生物学活性不会有重要影响。例如，感兴趣的多肽可含有多达约1-70个保守性或非保守性氨基酸取代，如1、2、3、4、5、6-50、15-25、5-10、或1-70的任一整数取代，只要该分子的所需功能维持完好。本领域技术人员不难确定感兴趣分子中的可被修饰同时能合理保留本文所定义生物学活性的区域。
“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相似性百分比。当两条多肽序列在二分子的限定长度上显示至少约50％、优选至少约75％、更优选至少约80％-85％、还优选至少约90％、最优选至少约95％-98％的序列同源性，或者在特定范围之间显示任何同源性百分比时，则这二序列是相互“基本上同源”。本文所用“基本上同源”也指显示与具体的多肽序列完全相同的序列。
总体上，“相同性”指两条多肽序列的氨基酸-与-氨基酸精确相一致。可通过比对序列、计数所比对的两条序列之间确切的匹配数目、除以较短序列的长度并将所得结果乘以100，直接比较两分子之间的序列信息来确定相同性百分比。
天然或非天然产生的TFPI类似物优选与SEQ ID NO：1的TFPI具有至少70％、80％、85％、90％或95％或更高同源性的氨基酸序列。更优选这些分子98％或99％同源。可利用Smith-Waterman同源性检索算法确定序列同源性百分比，该算法利用相关空格(affine gap)检索，所用参数为空格开放罚分12、空格延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482-489，(1981)。
可通过凝血酶原试验测定TFPI和TFPI类似物的生物学活性。美国专利号5,888,968和WO96/40784描述了合适的凝血酶原试验。简言之，可用血凝度计(例如，Organon Teknika的Coag-A-Mate MTX II)测定凝血酶原时间。合适的试验缓冲液是含有1mg/ml牛血清白蛋白、调节至pH7.5的100mM NaCl、50mM Tris。其它所需试剂是正常人血浆(例如，Organon Teknika的“Verify1”)、促凝血酶原激酶试剂(例如，Organon Teknika的“Simplastin Excel”)和TFPI标准溶液(例如，每毫升试验缓冲液20μg100％纯的ala-TFPI(或其相当量))。通过分析一系列TFPI标准溶液的稀释液(例如，稀释至终浓度范围1-5μg/ml)的凝血时间获得标准曲线。为测定凝血时间，先用试验缓冲液稀释样品或TFPI标准品。然后加入正常人血浆。加入促凝血酶原激酶试剂启动凝血反应。然后用仪器记录凝血时间。以凝血时间的对数值与TFPI浓度对数值作图得到线性TFPI标准曲线。根据TFPI标准品的纯度将标准曲线调整为相应于100％纯标准品的等价TFPI浓度。例如，如果标准品是97％生化纯的ala-TFPI制剂(即，以重量计其含有的3％分子无TFPI生物学活性)，则标准品的每种稀释液的浓度应乘以0.97得到TFPI的确切浓度。因此，按照97％纯制剂的每毫升实际重量，1.0μg/ml的TFPI标准品等于和处理为1.0乘以0.97的浓度，或0.97μg/ml。
获得TFPI和TFPI类似物
可从细胞或组织分离和纯化、化学合成或在原核或真核细胞中重组产生TFPI和TFPI类似物。
可用几种方法分离TFPI。例如，可分泌TFPI的细胞包括已用TNF处理约3到4天的衰老的内皮细胞、年轻的内皮细胞、肝细胞和肝癌细胞。可通过常规方法纯化TFPI，包括Pedersen等，1990，J.Biol.Chem.，265，16786-93；Novotny等，1989，J.Biol.Chem.，264，18832-′37；Novotny等，1991，Blood，78，394-400；Wun等，1990，J.Biol.Chem.，265，16096-101；和Broze等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，1886-90所述的层析方法。TFPI看来存在于血流中故可从血液中纯化，参见Pedersen等，1990。
可用化学方法合成其氨基酸序列来产生TFPI或TFPT变体，例如通过采用固相技术(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149-2154，1963；Roberge等，Science，269，202-204，1995)直接合成肽。可采用手工或自动技术合成蛋白质。例如可利用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。TFPI或TFPI变体的片段可任选分别合成再用化学方法组合以产生全长分子。
可如美国专利号4,966,852所示重组产生TFPI和TFPI类似物。例如，可将所需蛋白质的cDNA掺入能在原核生物或真核生物中表达的质粒中。美国专利号4,847,201提供了用特定的DNA序列转化微生物并表达这些DNA序列的细节。本领域普通技术人员知道的许多其它参考文献提供了利用微生物表达蛋白质的细节。美国专利号4,847,201引用了许多这样的参考文献，例如Maniatas等，1982，《分子克隆》(Molecular Cloning)，冷泉港出版社。
可采用各种技术转化微生物并利用这些微生物表达TFPI和TFPI类似物。以下只是可能的方法的例子。必须分离TFPI DNA序列并使之与合适的控制序列相连。TFPI DNA序列如美国专利号4,966,852所示，可将其掺入到例如pUNC13或pBR3822质粒中，这些质粒可购自例如Boehringer-Mannheim公司。TFPI DNA一旦***载体，可将其克隆入合适的宿主。可采用例如Mullis的美国专利4,683,202和Mullis等的美国专利4,683,195所示技术扩增该DNA。可通过诱导细胞，例如肝癌细胞(如HepG2和SKHep)来制备TFPI mRNA，然后鉴定、分离该mRNA并将其逆转录以获得TFPI的cDNA。将该表达载体转化入例如大肠杆菌宿主细胞后，发酵该细菌表达蛋白质。优选的细菌是原核微生物，特别优选大肠杆菌。优选用于本发明的微生物是根据布达佩斯条约的条款于1984年2月14日由ATCC保藏的大肠杆菌K-12，菌株MM294(登录号39607)。
当然也可能在得自多细胞生物的真核宿主细胞培养物中表达编码多肽的基因。参见，例如《组织培养》(Tissue Culture)，1973，Cruz和Patterson编，科学出版社。可用的哺乳动物细胞系包括小鼠骨髓瘤N51、VERO、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS、C127、Hep G2和SK Hep。TFPI和TFPI类似物也可在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达(也可参见上文引用的美国专利号4,847,201)。也可参见Pedersen等，1990，J.of Biological Chemistry，265：16786-16793。真核细胞表达载体通常包含与哺乳动物细胞相容的启动子和控制序列，例如常用的猿病毒40(SV40)早期和晚期启动子(Fiers，et al.，1978，Nature，273：113)，或例如得自多瘤病毒、腺病毒2、牛***瘤病毒或禽肉瘤病毒的其它病毒启动子，或免疫球蛋白启动子和热激(蛋白)启动子。Axel的美国专利号4,399,216描述了哺乳动物宿主细胞***转化的总体方面。目前，“增强子”区域也显示对优化表达很重要；这些“增强子”区域一般是在启动子区域上游发现的序列。如果需要，可获得病毒来源的复制起点。然而，就真核生物中DAN复制而言，整合入染色体是一种常规机制。目前，植物细胞也可用作宿主，并可采用与植物细胞相容的控制序列，例如胭脂氨酸合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列(Depicker，A.等，1982，J.Mol.Appl.Gen.，1：561)。WO85/04899公开了转化植物细胞的方法和载体。
用于纯化哺乳动物细胞表达的TFPI和TFPI类似物的方法包括依次应用肝素-琼脂糖、MonoQ、MonoS和反相HPLC层析。参见Pedersen等，同上；Novotny等，1989，J.Biol.Chem.，264：18832-18837；Novotny等，1991，Blood，78：394-400；Wun等，1990，J.Biol.Chem.，265：16096-16101；Broze等，1987，PNAS，(USA)，84：1886-1890；美国专利号5,106,833；和美国专利号5,466,783。这些参考文献描述了纯化哺乳动物(细胞)所产生TFPI的各种方法。
也可利用哺乳动物宿主细胞，例如小鼠C127 cells(Day等，Blood，76，1538-45，1990)、幼仓鼠肾细胞(Pedersen等，1990)、中国仓鼠卵巢细胞和人SK肝癌细胞将TFPI表达为重组的糖基化蛋白。已将C127 TFPI用于动物研究，显示其在家兔中能有效抑制组织因子诱导的血管内凝血(Day等，同上)，在狗中能防止血栓溶解后的动脉再阻塞(Haskel等，Circulation，84：821-827，(1991))，在狒狒的大肠杆菌脓毒血症模型中降低了死亡率(Creasey等，J.Clin.Invest.，91：2850，(1993))。可利用大肠杆菌宿主细胞将ala-TFPI表达为重组的非糖基化蛋白。通过使大肠杆菌产生的重组蛋白在体外重折叠从而得到高活性ala-TFPI的方法已见描述。参见，例如WO 96/40784。
也可在细菌或酵母中产生TFPI和TFPI类似物，然后纯化。通常可采用美国专利号5,212,091；6,063,764和6,103,500或WO 96/40784所示的方法。可按照纳入本文作为参考的WO 96/40784和Gustafson等，Prot.Express.Pur.，5：233，(1994)所述进行ala-TFPI和其它TFPI类似物的纯化、溶解和重折叠。例如，按照WO 96/40784的实施例9制备时，获得的TFPI制剂以重量计总蛋白中含有约85％到90％的成熟、适当折叠、生物学活性的ala-TFPI，其中约10％到15％具有一个或多个氧化的甲硫氨酸残基。凝血酶原试验测定到这些氧化形式具有与非衍生化ala-TFPI相等的生物学活性，预计它们在本文公开的发明中有活性。其余物质含有ala-TFPI的各种修饰形式，包括二聚体、凝聚体和乙酰化形式。
TFPI和TFPI类似物具有明显数目的半胱氨酸残基，美国专利号4,929,700所示方法是关于TFPI的重折叠。可采用各种层析方法，例如上述方法从缓冲溶液中纯化TFPI和类似物。如果需要，可采用美国专利号4,929,700所示方法。可采用能获得适合人体给药的一定纯度和活性水平的任何方法来纯化TFPI和TFPI类似物。
治疗方法和组合物
总体上，TFPI和TFPI类似物可用于治疗或预防因TNF、IL-1或其它细胞因子造成的组织因子表达上调从而提高了TF活性所致的那些疾病。TFPI给药，特别是低剂量TFPI给药可降低患者的细胞因子，例如IL-6的浓度。低剂量TFPI给药可用于治疗炎症和凝血异常，通常包括急性和慢性炎性疾病，例如重症肺炎。
根据美国胸科协会所述指南定义“重症肺炎”。具体地说，重症肺炎要求诊断为肺炎和存在a)两种主要标准之一，b)三种次要标准中的两种或c)英国胸科协会(British Thoracic Society)四种标准中(Thorax，2001，56，[增刊IV]：1-64)的两种。主要标准是1)需要机械方法换气和2)败血性休克或需要升压剂超过4小时。次要标准是1)收缩血压大于等于(ltoreq)90mmHg，2)多叶肺炎，和3)血氧过低标准(PaO2/FiO2)<250。英国胸科协会的标准是1)呼吸速率等于大于(gtoreq)30次呼吸/分钟，2)舒张血压等于低于60mmHg，3)血尿氮(BUN)>7.0mM(>19.6mg/dL)和4)意识模糊。本领域知道血氧过低标准(PaO2/FiO2)指动脉氧分压是所吸入氧的分数，其表示气体交换受损的水平。
重症肺炎患者宜具有可用本领域已知方法证明的感染。这些方法包括但不限于：通过例如革兰染色、培养、组织化学染色、免疫化学试验或核酸试验来检测血液或其它常规无菌体液或组织培养物中的病原性生物。也可通过与构成全身性抗感染治疗理由的肺炎诊断以及感染的任何临床症状相符合的胸部放射摄影来证明可证实的感染，所述临床症状包括但不限于：呼吸速率>/＝30次/分钟或PaCO2/FiO2<250、血压降低和体温升高。
TFPI和TFPI类似物的制剂
优选通过静脉内输液给予TFPI和TFPI类似物的制剂。优选基本上连续的静脉内输液。本领域普通技术人员已知实施这种给药的方法。可经中心线(central line)和外周线(peripheral line)进行输液。虽然应避免剂量率的大波动，但本发明剂量率的短期偏差可以接受，只要给予TFPI产生的血浆水平在本发明优选实施方案恒定剂量率连续输液所预计的20％以内。
给予患者之前，可加入TFPI和TFPI类似物制剂。优选液体制剂。可利用不同的制剂、在与TFPI蛋白给药途径、溶解性和稳定性相容的任何合适生理pH下配制不同浓度的TFPI和TFPI类似物。静脉内输液的优选制剂包括多达约0.6mg/ml的ala-TFPI、多达约300mM的盐酸精氨酸和pH5.0-6.0的柠檬酸钠缓冲液。某些溶质，例如精氨酸、NaCl、蔗糖和甘露醇作用是增溶和/或稳定ala-TFPI。参见WO 96/40784。用于静脉内输液特别优选的制剂含有约0.15mg/ml的ala-TFPI、300mM盐酸精氨酸和20mM pH5.5的柠檬酸钠。也可用任选含0.005％或0.01％(w/v)聚山梨酯80(Tween80)的150mM NaCl和20mM磷酸钠或另一种pH5.5-7.2的缓冲液将TFPI和TFPI类似物配制为浓度高达约0.15mg/ml。其它制剂含有用pH5.5的10mM乙酸钠配制的高达约0.5mg/ml的TFPI或TFPI类似物，其中含有150mM NaCl、8％(w/v)蔗糖或4.5％(w/v)甘露醇。也可用高浓度盐将TFPI和TFPI类似物配制为高达几个mg/ml的较高浓度。例如，一种制剂含有用500mM NaCl和pH7.0的20mM磷酸钠配制的高达约6.7mg/ml的ala-TFPI。此外，TFPI制剂可含有甲硫氨酸，甲硫氨酸的范围优选约1-10mM。
TFPI制剂的一优选实施方案是约0.1-0.7mg/ml的ala-TFPI、200-500mML-精氨酸、1-7mM甲硫氨酸、pH5.0-6.0的5-50mM柠檬酸钠缓冲液。TFPI制剂的一优选实施方案是约0.1-约0.5mg/ml的ala-TFPI、250-400mML-精氨酸、3-6.5mM甲硫氨酸、pH5.0-6.0的15-30mM柠檬酸钠缓冲液。TFPI制剂的一优选实施方案含有约0.15mg/ml的ala-TFPI、约300mM盐酸L-精氨酸、5mM甲硫氨酸、pH5.5的20mM柠檬酸钠缓冲液。TFPI制剂的另一优选实施方案含有约0.45mg/ml的ala-TFPI、约300mM盐酸L-精氨酸、4mM甲硫氨酸、pH5.5的20mM柠檬酸钠缓冲液。
TFPI和TFPI类似物制剂的其它例子含有油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲液、白蛋白、表面活性剂或填充剂。优选的碳水化合物包括糖或糖醇，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或它们的混合物。最优选蔗糖。糖醇定义为具有OH基团的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和***糖醇。最优选甘露醇。这些糖或糖醇可单独使用或联用。其用量无固定限制，只要所述糖或糖醇能溶解于水性制备物中。糖或糖醇的浓度优选为1.0w/v％和7.0w/v％之间，更优选在2.0和6.0w/v％之间。
优选的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒碱、精氨酸和甜菜碱；然而，可加入其它氨基酸。优选的聚合物包括平均分子量为2,000-3,000之间的聚乙烯吡咯烷酮(PV)，或平均分子量为3,000-5,000之间的聚乙二醇(PEG)。在该组合物中优选利用缓冲液以最大程度减少冻干前或重建后溶液pH的变化。可利用大多数生理缓冲液，但是优选柠檬酸、磷酸、琥珀酸和谷氨酸缓冲液或它们的混合物。缓冲液的浓度优选为0.01-0.3摩尔。如欧洲专利号270,799和268,110所示可在该制剂中加入表面活性剂。
此外，可化学修饰TFPI和TFPI类似物，例如通过与聚合物共价偶联来增加其循环半衰期。美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546说明了优选的聚合物和将这些聚合物与肽相连的方法。优选的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下溶解于水，其通用分子式为：R(O--CH2--CH2)n--O--R，其中R可以是氢，或是例如烷基或烷醇基的保护性基团。保护性基团优选具有1-8个碳，更优选的甲基。符号n是正整数，优选1-1,000之间，更优选2-500之间。PEG的平均分子量优选在1,000-40,000之间，更优选在2,000-20,000之间，最优选在3,000-12,000之间。PEG优选具有至少一个羟基，更优选是末端羟基。优选激活该羟基以和抑制剂上的游离氨基反应。然而，应该理解反应基团的类型和数量可以不同以获得本发明共价偶联的PEG/TFPI。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本发明。它们包括聚氧乙基化山梨醇、聚乙氧基化葡萄糖、聚乙氧基化甘油(POG)等。优选POG。原因之一是聚乙氧基化甘油的甘油骨架与例如人或动物的单甘油酯、甘油二酯、甘油三酯中的天然骨架相同。因此，该分支化合物在体内不会被视为外来物质。POG的优选分子量与PEG的相同。POG的结构见Knauf等，1988，J.Bio.Chem.，263：15064-15070中所示，对POG-蛋白质偶联物的讨论见美国专利号4,766,106。
TFPI或TFPI类似物的液体药物组合物制备好后，可冻干以防降解并保持无菌。本领域普通技术人员已知冻干液体组合物的方法。可在使用前用含有其它成分的无菌稀释液(例如，林格溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建该组合物。重建后，优选通过连续静脉内输液将组合物给予对象。
TFPI和TFPI类似物的剂量
可以治疗有效浓度给予TFPI或TFPI类似物来治疗和预防重症肺炎。此剂量对其它急性或慢性炎症和细胞因子上调组织因子表达的疾病也有效。为达到此目的，优选静脉内给予TFPI或TFPI类似物。本领域普通技术人员已知实施此种给药的方法。TFPI或TFPI类似物一般以1μg/kg和30mg/kg之间的剂量给予，更优选20μg/kg和25mg/kg之间，最优选1和15mg/kg之间的剂量。
以上剂量通常在至少约150个小时期间给予，优选在至少约100个小时。在一个实施方案中，TFPI连续给药约99-90小时，优选约97-94小时，更优选约96小时。以单剂量或分剂量给予宿主的每日总剂量可以是，例如每日约2-20mg/kg体重，优选每日约2-15mg/kg体重，约4-10mg/kg的用量。剂量单位组成可包括这种用量或其约数构成的每日剂量。较低的每日剂量，例如1μg/kg到2mg/kg可用于预防或其它目的。可与运载体物质组合产生的单剂量形式中活性成分的用量取决于所治疗的患者和具体给药方式而不同。
可根据各种因素选择剂量方案，包括患者的类型、年龄、体重、性别、饮食和医疗条件、疾病的严重性、给药途径、药理学考虑，例如活性、效力、药代动力学和毒理学情况、是否利用药物递送***和化合物是否作为药物组合的一部分给予。因此，实际采用的剂量方案可能极为不同，故而可偏离上述优选剂量方案。TFPI或TFPI类似物的剂量优选不应超过与约0.66mg/kg/小时的ala-TFPI剂量率相等的剂量率。
低剂量给药
当TFPI或TFPI类似物的给药剂量率等于至少约0.00025mg/kg/小时(0.00417μg/kg/分钟)和小于约2.00mg/kg/小时(0.833μg/kg/分钟)给予ala-TFPI的剂量率时，仍可有效治疗重症肺炎并最大程度降低不良副作用，例如出血。在一优选实施方案中，ala-TFPI的给药剂量率至少在约0.02mg/kg/小时到约1.0mg/kg/小时之间，更优选在约0.24mg/kg/小时到约0.8mg/kg/小时之间。为提高联用效力和安全性，剂量率优选等于至少约0.010mg/kg/小时(0.167μg/kg/分钟)和小于约0.045mg/kg/小时(0.833μg/kg/分钟)的ala-TFPI剂量率，或等于至少约0.020mg/kg/小时和小于约0.040mg/kg/小时的ala-TFPI剂量率，最优选等于约0.025mg/kg/小时(0.417μg/kg/分钟))的ala-TFPI剂量率。给药途径通常是静脉内输液，优选连续静脉内输液。输液可进行至少约72、96、120或240小时。连续输液优选进行3-8天，更优选3-6天，最优选约4天。
“通过连续输液”给药意味着在处方指定期间输液大致维持于处方指定的速率而无实质性中断。或者，可采用间歇性静脉内输液。如果采用间歇性输液，则应采用与上述连续输液剂量率相等的时间平均剂量率。此外，间歇性输液方案导致的血清最大浓度不能超过采用连续输液获得的最大浓度的约20％以上。为避免患者产生的不良反应，特别是涉及出血的副作用，剂量率应小于约0.050mg/kg/小时连续静脉内输液(给予)ala-TFPI的剂量率。
由于用凝血酶原试验测定蛋白质浓度和生物学活性中存在误差，本文所述的所有剂量，包括剂量率和总剂量在实施中会有高达10％的差异。因此，高于或低于本文所述剂量10％的任何实际给予剂量均应认为等于所述剂量。为此原因，所有剂量称为“大约的”特定剂量。例如，描述为“约0.025mg/kg/小时”的剂量应认为等于范围0.0225-0.0275mg/kg/小时的任何实际剂量。
实施本发明时，如果其后是低剂量TFPI给药，也可采用TFPI或TFPI类似物的单次药团注射或简言之较高的输液速率。例如，可采用单次药团注射或较高的输液速率来减少所给予的TFPI或TFPI类似物在患者循环***中达到的平衡时间。如此，可更快达到TFPI的最终稳态血浆水平，TFPI的受体可更快饱和。以约0.025mg/kg/小时给予人体ala-TFPI2小时可将TFPI(加上ala-TFPI)的血浆水平从约80ng/ml提高到约125ng/ml，或提高约50％。如果再增加输液速率或采用单次药团注射，还可更快速地达到同一水平。如果连续输液直至获得稳态，较高的输液速率可导致较高的水平。发现以约0.050mg/kg/小时给予ala-TFPI在脓毒症患者体内达到的稳态水平约是300ng/ml，以约0.33或约0.66mg/kg/小时给予ala-TFPI达到的稳态水平至少约2μg/ml。
在单次连续输液或分开的输液剂量中，给予宿主的每日总剂量可以是，例如等于以至少约0.006mg/kg/天到小于约1.2mg/kg/天给予ala-TFPI，或更常见等于以约0.24mg/kg/天到小于约1.2mg/kg/天给予ala-TFPI，优选等于以约0.6mg/kg/天给予ala-TFPI的的用量。该范围内较低的用量可用于预防或其它目的。给予该范围的较高剂量可用于治疗重症CAP。本发明的给药方案也可表示为给予患者的总剂量。总剂量是输液速率与输液总时间的数字乘积。例如，当ala-TFPI的优选剂量率约0.025mg/kg/小时时，优选的输液时间96小时，总剂量约2.4mg ala-TFPI/kg体重。在一个实施方案中，ala-TFPI的优选剂量率约0.25mg/kg/小时，优选的输液时间96小时，总剂量约24mgala-TFPI/kg体重。在一个实施方案中，ala-TFPI的优选剂量率约0.75mg/kg/小时，优选的输液时间96小时，总剂量约72mg ala-TFPI/kg体重。在另一实施方案中，按照本发明所给予的TFPI的总剂量等于至少约0.75μg/kg和小于约4.8mg/kg的ala-TFPI。总剂量优选等于至少约1mg/kg和小于约4.8mg/kg的ala-TFPI。总剂量更优选等于约2.4mg/kg的ala-TFPI。
可用于调整剂量方案的因素之一是通常用凝血酶原时间(PT)试验检测的每位患者的凝血功能，或国际标准化比例(INR)。INR是对国际参比品促凝血酶原激酶试剂进行校验的PT试验的标准化。参见，例如R.S.Riley等，J.Clin.Lab.Anal.，14：101-114，(2000)。在所观察到的血浆浓度范围中，健康人志愿者中对ala-TFPI的INR反应大致是线性的(图3)。血浆ala-TFP浓度每增加1μg/ml，INR的总变化是1.2个单位。
在药效学模型中，对数-线性模型最好地描述了对ala-TFPI的INR反应，其中对数INR与ala-TFPI血浆浓度线性相关。反应的对数-线性性质意味着INF基线值(baseline)升高的对象可能比具有相似ala-TFPI循环水平而基线值低的对象经历了更高的抗凝血应答。
上述给药方案，包括基于mg/kg/小时的剂量率和每日总剂量表示为“等于给予参比ala-TFPI”的剂量。这意味着可通过标准化为“参比ala-TFPI”的剂量来定量测定这些剂量，所述“参比ala-TFPI”定义为成熟的100％纯(以蛋白质为基础)、正确折叠、有生物学活性、非糖基化的ala-TFPI。Ala-TFPI是TFP的类似物，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其它形式的TFPI也可用于本发明，包括成熟的全长TFPI及其类似物。为确定用除ala-TFPI以外的TFP形式和纯度小于100％的ala-TFPI或另一种TFPI类似物制剂来实施本发明的合适剂量范围，可根据TFPI具体形式的内在生物学活性调整上述参比ala-TFP的剂量范围，还可根据该制剂的生化纯度来调整。
在一优选实施方案中，患者在接受第一次TFPI给药的10天内不接受抗凝血剂。在一优选实施方案中，患者在接受第一次TFPI给药的7天内不接受抗凝血剂。患者优选在接受第一次TFPI给药的24小时内不接受肝素形式。在一个实施方案中，患者在接受第一次TFPI给药的10小时内、优选12小时内不接受传统肝素。在一个实施方案中，患者在接受第一次TFPI给药的20小时内、优选24小时内不接受低分子量肝素。在一个实施方案中，患者在接受第一次TFPI给药的10小时内、优选12小时内不接受替加色罗-α(drotrecogin-alpha)低分子量肝素。
TFPI或TFPI类似物的内在生物学活性指如同凝血酶原试验测定的成熟、100％纯、正确折叠的TFPI或TFPI类似物的特异形活性。因此，等价剂量计算为(参比ala-TFPI剂量)/((相对的内在活性)乘以(生化纯度))，其中相对的内在活性指(类似物的内在活性)/(参比ala-TFPI的内在活性)。例如，如果具体TFPI类似物具有参比ala-TFPI的内在生物学活性的80％，则可将参比ala-TFPI的剂量值除以0.8得到该具体TFPI类似物的等价剂量。此外，如果给予患者的制剂例如只有90％的生化纯度，即含有10％无TFPI生物学活性的分子，则通过将剂量值除以0.9来额外校正ala-TFPI的参比剂量值。因此，假定给予的TFPI类似物具有ala-TFPI的80％内在活性并且是90％生化纯，则等于给予0.025mg/kg/小时参比ala-TFPI的剂量率是0.0347mg/kg/小时(即，0.025/(0.8×0.9))。
当不知道内在活性或生化纯度时也可通过测定相对生化活性来确定等价剂量。可利用凝血酶原时间试验通过比较具体的TFPI类似物与TFPI生物学活性标准品来测定相对生物学活性。例如，根据WO 96/40784的实施例9的方法产生的ala-TFPI(含有约85％生物学活性的TFPI分子)可用作TFPI生物学活性标准品。在凝血酶原试验中，根据WO 96/40784的实施例9的方法产生的ala-TFPI具有参比ala-TFPI约85％的活性。在绘制凝血酶原时间标准曲线时，按凝血时间的对数与TFPI浓度的对数作图。如果TFPI生物学活性标准品具有参比ala-TFPI的85％的活性，则所制的标准曲线等于参比ala-TFPI的，如果在作图前将TFPI生物学活性标准品的浓度乘以0.85，则图示的活性等于100％纯的参比ala-TFPI的活性。当将具体TFPI类似物的凝血时间与标准曲线比较时，可从曲线读出参比ala-TFPI的相等浓度。或者，如果标准曲线线性部分的斜率是通过线性回归分析得到，则可根据TFPI生物学活性标准品与参比ala-TFPI的活性比较来校正该斜率。因此，具体TFPI类似物的相对生物学活性等于参比ala-TFPI活性与该类似物活性之比。例如，如果某具体类似物需要1.43μg来产生与1.00μg参比ala-TFPI相同的凝血酶原时间活性，则该类似物的相对生物学活性是1.00/1.43或0.7。就该类似物而言，通过将参比ala-TFPI剂量除以该类似物的相对生物学活性获得参比ala-TFPI剂量的等价剂量。例如，0.025mg/kg/小时的参比ala-TFPI剂量等于该类似物的0.0357mg/kg/小时(即，0.025/0.7)。
虽然TFPI或TFPI类似物可作为单用的活性抗凝血药物给予，但这些分子也可与一种或多种其它治疗性药物联用以提供对重症肺炎的联合治疗作用。所述的其它治疗性药物包括抗体，例如抗-内毒素的单克隆抗体(例如，结合内毒素的单克隆抗体)和抗-TNF抗体产品，例如抗-TNF小鼠单克隆抗体。TFPI和TFPI类似物也可与白介素-1受体拮抗剂、杀菌/渗透增加(BPI)蛋白、免疫刺激剂、具有抗炎活性的化合物例如PAF拮抗剂和细胞粘着阻断剂(例如，抗血小板药物，如GPIIb/IIIa抑制剂)联用。当联合给药时，可将这些治疗性药物配制为独立的组合物在同时或不同时间给予。其它治疗性药物优选同时给予(即，在TFPI或TFPI类似物给药期间)或在TFPI或TFPI类似物给药期间的24小时内(即，在TFPI或TFPI类似物给药期间开始之前或开始之后的24小时内)给予。其它治疗性药物也可作为一种组合物与TFPI或TFPI类似物一起给予。
TFPI或TFPI类似物也可与其它能有效治疗重症肺炎的药物联合给予。例如，以下药物可与TFPI或TFPI类似物联合给予：可治疗潜伏细菌感染的抗生素、直接针对细菌细胞壁组分的单克隆抗体、可与参与重症肺炎(发病)途径的细胞因子形成复合物的受体，通常能与细胞因子或其它激活的或扩增的生理途径相互作用的任何药物或蛋白质，包括能缓解重症肺炎和/或其症状的补体蛋白质。
有用的抗生素包括通用类别的：β-内酰胺环(青霉素)、糖苷键中的氨基糖(氨基糖苷类)、大环内酯环(大环内酯类)、并四苯羧酰胺(napthacenecarboxanide)的多元环衍生物(四环素类)、硝基苯的二氯乙酸衍生物、肽(杆菌肽、短杆菌肽和多粘菌素)、含偶联双键***的大环(多烯类)、衍生自磺胺的磺胺类药物(磺胺类)、5-硝基-2-呋喃基(硝基呋喃类)、喹诺酮羧酸(萘啶酸)和许多其它抗生素。其它抗生素和上述特异性抗生素的更多形式见《化学技术百科全书》(Encyclopedia of Chemical Technology)，第三版，Kirk-Othymer(编)，第2卷，第782-1036页，(1978)和第3卷，第1-78页；Zinsser，《微生物学》(MicroBiology)，第17版，W.Joldik等(编)，第235-277页，(1980)或《Dorland图示医学字典》(Dorland′sIllustratedMedical Dictionary)，第27版，W.B.Saunders Company，(1988)。
可与TFPI或TFPI类似物联用的其它药物包括内毒素拮抗剂，例如E5531(脂质A类似物，参见Asai等，Biol.Pharm.Bull.，22：432，(1999))；具有抗凝血活性的TF类似物(参见，例如Kelley等，Blood，89：3219，(1997)；Lee和Kelley，J.Biol.Chem.，273：4149，(1998))；针对细胞因子的单克隆抗体，例如抗IL-6或M-CSF单克隆抗体，参见1989年12月15日提交的美国专利系列号07/451,218，和抗TNF单克隆抗体(参见Cerami等，美国专利号4,603,106)；将成熟的TNF激素原从产生它的细胞上切下的蛋白质的抑制剂(参见1989年8月6日提交的美国专利系列号07/395,253)；IL-1拮抗剂(参见1990年5月1日提交的美国专利系列号07/517,276)；IL-6细胞因子表达的抑制剂，例如抑制素(参见美国专利号5,942,220)和基于各种细胞因子，例如IL-1受体的抑制剂。也可采用补体的抗体或补体蛋白抑制剂，例如CR1、DAF和MCP。
本文引用的所有专利、专利申请和参考文献全文纳入本文作为参考。
下文将参考描述了优选实施方案的以下实施例来说明本发明。然而，应注意这些实施方案是说明性的，不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
重症肺炎患者的ala-TFPI治疗
评价重症肺炎患者来研究ala-TFPI治疗对相对均一(患者)组可能的作用。如果研究人员证明脓毒血症来源之一是肺炎，则肺炎患者得到鉴定。也可存在其它感染部位。由于难于区分化学药物后遗症(chemical sequelae)所致的感染，不包括吸入性肺炎(患者)。然后将鉴定的肺炎患者分为培养物阳性(感染的任一证据，例如培养物或革兰菌株(阳性))或培养物阴性(阴性培养物或未培养)。利用大肠杆菌中表达的非糖基化ala-TFPI制剂，以0.025mg/kg/小时剂量，通过连续静脉内输液治疗患者，所述制剂用含300mM L-精氨酸、20mM柠檬酸钠、pH5.5、摩尔渗透压浓度为560+/-110mOsm的缓冲液配制。安慰剂由不含ala-TFPI的同一缓冲液组成，输液速率与所研究药物相同。这些分析的结果证明ala-TFPI治疗对那些培养物阳性肺炎患者有正面作用(表1)。无感染来源证据的那些患者显示阴性结果。
表1.肺炎状况的死亡率
Figure A200580014406D00271
表2.肺炎状况低INR的死亡率
Figure A200580014406D00272
在给予或未给予肝素的患者群中显示高INR的培养物阴性组的死亡率升高，虽然应注意肺炎培养物阴性、未给予肝素组对象数量相对较少(表3)。培养物阳性/未给予肝素的患者观察到强烈的正面治疗效果。
表3.肺炎状况和(是否给予)肝素(治疗)的死亡率
Figure A200580014406D00281
Figure A200580014406D00282
IL-6是脓毒症早期升高、反映炎性应答强度并与结局相关的炎性细胞因子。IL-6的基线水平在临床鉴定为肺炎但无感染证据的患者中较低(表5)。这提示证明有肺炎感染源和无明显感染源的患者之间存在生物学差异。相矛盾的是培养物阴性TFPI组的基线IL-6水平最低，但死亡率最高。在脓毒血症患者群中，IL-6水平随时间推移而降低。经TFPI治疗的肺炎培养物阴性对象中IL-6的降低速率减慢(表5)。这提示在感染和未感染患者之间TFPI的生物学作用不同。
表5.(不同)肺炎状态时的IL-6
Figure A200580014406D00291
实施例3
分析重症肺炎患者经证实的感染类型
如上所述，在感染最确定的患者，即血液培养阳性的患者中观察到ala-TFPI治疗的总益处。分析了证实感染类型的重症肺炎患者，在血液培养阳性和具有其它证据的对象中观察到ala-TFPI治疗有效(表6)。其作用在菌血症组，即感染可能性最高或有最明显感染源的组中最强。
表6.(不同)培养物状态和肺炎状态的死亡率
Figure A200580014406D00301
如上所示，在不用肝素时，证实感染的患者(血液+“其它”证据)从TFPI治疗中获益。肺炎组的药效最可能导致该结果(表7)。此发现似乎表明内源性抗凝剂的效益在重症肺部感染的患者中最好。
表7.(不同)感染状态、肺炎状态和使用肝素的死亡率
为进一步限制不均匀性，以后的试验致力于社区获得性肺炎(CAP)。在医院染上肺炎(医院内肺炎)的患者最可能有病原生物定居并具有其它肺病而使感染性肺炎更难诊断。此外，CAP患者曾经接触肝素的可能性低于医院内肺炎患者。当利用治疗前住院时间长短来分析数据时，注意到住院多于等于2天但培养物阳性的患者(社区获得性)与住院超过2天的患者(医院内)药效相似。主要在医院组的培养物阴性患者中观察到负面作用(表8)。
表8.住院(染上的)肺炎状态和时间长短的死亡率
Figure A200580014406D00303
利用具体的实施方案描述了本发明。然而，本申请应覆盖本领域技术人员可作出的但不脱离本发明构思与附加权利要求范围的那些变化和替代形式。
序列CWU1
21276PRT智人(Homo sapiens)1Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His ThrIle Ile Thr Asp Thr Glu Leu 15 10 15 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser PheCys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys ArgPhe Phe Phe Asn Ile Phe Thr 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr GlyGly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys LysLys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr ThrLeu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95 Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro GlyIle Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln ThrLys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125 Gly Cys Leu Gly Asn MetAsn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140 Asn Ile Cys Glu AspGly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Gln LeuAsn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys 165 170 175 Val ProSer Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 180 185 190 AlaAsp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn 195 200 205Ser ValIle Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly 210 215220 Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys 225230 235 240 Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys245 250 255 Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu IlePhe 260 265 270Val Lys Asn Met 275 2 277 PRT Homo sapiens 2 Ala Asp SerGlu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu 15 10 15 Leu Pro ProLeu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp 20 25 30 Asp Gly ProCys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe 35 40 45 Thr Arg GlnCys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln 50 55 60 Asn Arg PheGlu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 65 70 75 80 Asn AlaAsn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp 85 90 95 Phe CysPhe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr 100 105 110 ArgTyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr 115 120 125Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys 130 135140 Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr 145150 155 160 Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln SerThr 165 170 175 Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp CysLeu Thr 180 185 190 Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn ArgPhe Tyr Tyr 195 200 205 Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys TyrSer Gly Cys Gly 210 215 220 Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln GluCys Leu Arg Ala Cys 225 230 235 240 Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile SerLys Gly Gly Leu Ile Lys Thr 245 250 255 Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln ArgVal Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile 260 265 270 Phe Val Lys Asn Met 275

Claims (42)

1.一种治疗或预防重症肺炎的方法，包括：通过连续静脉内输液给予患有或处于重症肺炎风险中的患者TFPI或TFPI类似物，其剂量率等于以低于约1.0mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI，并且患者在给予TFPI或TFPI类似物的24小时内不接受抗凝剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者具有可证实的感染。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉内输液给予，其剂量率等于以低于约0.80mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述剂量率等于以约0.25-0.10mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI，并且所述TFPI或TFPI类似物至少给予约72小时。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述剂量率等于以约0.010-0.10mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述剂量率等于以约0.020-0.08mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物至少给予约96小时。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉内输液给予，提供的总剂量等于以约0.025-2.5mg/kg的总剂量给予参比ala-TFPI。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉内输液给予，其剂量率等于以约0.02-0.09mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物通过连续静脉内输液给予，提供的每日剂量等于以约0.06-4mg/kg的每日剂量给予参比ala-TFPI。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物包含由SEQID NO：1的氨基酸19-89构成的第一Kunitz结构域。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物还包含由SEQ ID NO：1的氨基酸90-160构成的第二Kunitz结构域。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物包含SEQ IDNO：1的氨基酸1-160。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物包含由SEQID NO：1的氨基酸90-160构成的第二Kunitz结构域。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物从包含TFPI或TFPI类似物的冻干组合物制备。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物以含精氨酸的制剂给予。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物以含柠檬酸盐的制剂给予。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TFPI或TFPI类似物在含约300mM盐酸精氨酸和约20mM柠檬酸钠，pH约5.5的制剂中浓度约为0.15mg/ml。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在给予所述TFPI或TFPI类似物的同时或24小时内给予选自以下的其它药物：抗生素、抗体、内毒素拮抗剂、具有抗凝血活性的组织因子类似物、免疫刺激剂、细胞粘着阻断剂、肝素、BPI蛋白、IL-1拮抗剂、pafase(PAF酶抑制剂)、TNF抑制剂、IL-6抑制剂和补体抑制剂。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述其它药物是抗体，其中所述抗体与选自TNF、IL-6和M-CSF的抗原能特异性结合。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
35.一种治疗重症肺炎的方法，包括：给予患者(i)TFPI或TFPI类似物和(ii)选自抗生素、单克隆抗体、细胞因子抑制剂和补体抑制剂的其它药物。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述TFPI类似物是非糖基化的ala-TFPI。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述患者具有可证实的感染。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，通过连续静脉内输液给予TFPI或TFPI类似物，其剂量率等于以低于约1.0mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述剂量率等于以约0.001-0.090mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述剂量率等于以约0.002-0.050mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述剂量率等于以约0.002-0.010mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述剂量率等于以约0.0025-0.075mg/kg/小时的剂量率给予参比ala-TFPI。
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