PT1021534E - Proteina cd81 receptora da hepatite c - Google Patents

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DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "PROTEÍNA CD81 RECEPTORA DA HEPATITE C" O presente invento relaciona-se com o uso de um fragmento EC2 da proteína CD81 e com o ácido nucleico codificando para esta proteína no tratamento e diagnóstico da hepatite C, e com composições farmacêuticas, modelos animais e kits de diagnóstico para tais usos. 0 HCV (anteriormente conhecido como vírus da Hepatite Não-A Não-B - NANBV)é um vírus RNA de cadeia positiva de cerca de 10000 nucleótidos com uma grelha de leitura aberta codificando para uma poliproteína de cerca de 3000 aminoácidos. Se bem que a estrutura do vírus tenha já sido elucidada através de técnicas de DNA recombinante (pedido de patente europeia EP-A-0318216 e pedido de patente europeia EP-A-0388232), o vírus em si ainda não foi isolado e as funções das diversas proteínas virais produzidas por proteólise da poliproteína foram apenas inferidas por analogia com outros vírus similares de organização genómica semelhante (Choo et al., PNAS USA (1991) 88 2451-2455) .

Todas as proteínas virais estão disponíveis sob a forma recombinante, sendo expressas numa variedade de células e tipos celulares, incluindo células de leveduras, bactérias, insectos, plantas e mamíferos (Chien, D.Y. et al., PNAS USA (1992) 89 10011-10015 e Spaete, R.R. et al., Virology (1992) 188 819-830) .

Foi já sugerido que duas proteínas, designadas por EI e E2 (correspondendo aos aminoácidos 192-383 e 384-750 da poliproteína de HCV, respectivamente), correspondam a 1 proteínas externas do envelope virai responsáveis pela ligação do vírus às células-alvo. A pesquisa sobre o HCV é consideravelmente prejudicada pela limitada gama de hospedeiros do vírus. 0 único modelo animal fiável para a infecção por HCV é o chimpanzé, e o HCV não se propaga facilmente em culturas de tecidos.

No pedido de patente internacional co-pendente PCT/IB95/00692 (WO 96/05513) é descrito um método que utiliza a citometria de fluxo para identificar as células que são portadoras do receptor para o HCV. Foi demonstrado que, através da marcação das células com a proteína E2 recombinante do envelope, é possível separar as células através de citometria de fluxo, isolando as células que têm a capacidade de se ligar especificamente à proteína E2 e que deste modo são potencialmente portadoras de um receptor para o HCV.

No pedido de patente internacional co-pendente PCT/IB96/00943 (WO 97/09349) foi identificada uma proteína que tem a capacidade de se ligar à proteína E2 do envelope de HCV.

Foi agora conseguida, com alguma dificuldade, a clonagem do DNA que codifica para o receptor de HCV e foi surpreendentemente descoberto que o DNA codifica para uma proteína celular conhecida como CD81. Não se conhece qualquer associação anteriormente estabelecida na literatura entre a proteína CD81 e o HCV. A proteína CD81 foi inicialmente identificada, usando anticorpos monoclonais, como correspondendo ao alvo de um anticorpo anti-proliferativo (TAPA-1) que inibe a proliferação celular in vitro. Tendo como base esta nova informação e o conhecimento da sequência de CD81 que consta das bases de dados públicas, é agora possível a concepção e produção de uma bateria de reagentes para terapêutica e diagnóstico dirigidos contra o HCV.

De acordo com esta invenção, é fornecido um fragmento EC2 da proteína CD81 que é formado pelos aminoácidos 113-201 da 2 sequência de CD81 humana listada na base de dados SWISSPROT (N° de Acesso P18582) ou na base de dados EMBL/GENBANK (N° de Acesso M33680), ou que possui pelo menos 80% de homologia com os aminoácidos 113-201 da sequência de CD81 humana, sendo a homologia definida através do uso do pacote de software para análise de sequências Pileup (Wisconsin, 1996), para uso na terapêutica ou diagnóstico de uma infecção por HCV. O termo "proteína CD81, ou um seu equivalente funcional", tal como aqui é usado, pretende indicar a proteína CD81 tal como definida pela sequência de proteína listada na base de dados SWISSPROT (N° de Acesso P18582) ou na base de dados EMBL/GENBANK (N° de Acesso M33680) ou um equivalente funcional desta. Um equivalente funcional de CD81 é um composto que tem a capacidade de se ligar ao HCV, preferencialmente à proteína E2 do HCV. Preferencialmente, o equivalente funcional é um péptido ou uma proteína. O termo "equivalente funcional" inclui um análogo de CD81, um fragmento de CD81 e mutantes e muteínas de CD81.

Uma região da proteína CD81 humana que aqui é evidenciada como estando envolvida na ligação à proteína E2 do HCV é a região "EC2" que compreende os aminoácidos 113-201 da sequência humana de extensão completa que é apresentada na Figura 1. O invento descreve proteínas e fragmentos de proteínas contendo esta região da CD81 humana, ou contendo equivalentes funcionais desta região, tal como, por exemplo, a sequência do chimpanzé identificada na Figura 1. Preferencialmente, o equivalente funcional tem uma homologia de pelo menos 80% com a sequência da CD81 humana ao longo da região EC2 da proteína, e preferencialmente uma homologia de 90%, tal como avaliado por um algoritmo convencional de análise como, por exemplo, o software de análise de sequências Pileup (Program Manual for the Wisconsin Package, 1996) . 3 0 termo "um fragmento funcionalmente equivalente", tal como aqui é usado, pretende indicar qualquer fragmento ou conjunto de fragmentos da proteína completa que se liga ao HCV, ligando-se preferencialmente à proteína E2 do HCV. A proteína completa pode estar truncada numa ou em ambas as extremidades, ou poderão ser removidos domínios internos, desde que a proteína retenha a função definida. Por exemplo, uma ou mais regiões da proteína responsável pela ligação à membrana (TMl a TM4 na Figura 1) poderão ser removidas para tornar a proteína solúvel quando produzida através de um processo recombinante. 0 fragmento de escolha compreende o loop extracelular 2 (EC2 na Figura 1) da proteína CD81 (aminoácidos 113-201).

No caso de serem elementos proteicos, os fragmentos ou análogos funcionalmente equivalentes poderão pertencer à mesma família de proteínas da proteína CD81 humana aqui identificada. Por "família de proteínas" pretende-se indicar um grupo de proteínas que partilham uma função comum e que exibem uma homologia de sequência comum. Por homologia de sequência quer-se significar que as sequências de proteínas são aparentadas por divergência a partir de um antepassado comum, tal como acontece com o homem e o chimpanzé. A CD81 de chimpanzé constitui deste modo um exemplo de uma proteína funcionalmente equivalente que se liga ao HCV. A homologia entre sequências de proteínas funcionalmente equivalentes é de pelo menos 80% ao longo de toda a sequência de aminoácidos da proteína completa ou do fragmento EC2 completo (aminoácidos 113-201). O termo "um análogo funcionalmente equivalente" é usado para descrever os compostos que possuem uma função análoga a uma actividade da proteína CD81 e poderão, por exemplo, compreender um péptido, um péptido cíclico, um polipéptido, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Estes compostos 4 poderão ser proteínas ou poderão corresponder a agentes de síntese concebidos para emular certas estruturas ou epitopos da proteína inibidora. Preferencialmente, o composto corresponde a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo. 0 termo "análogo funcionalmente equivalente" inclui igualmente qualquer análogo de CD81 obtido por alteração da sequência de aminoácidos, por exemplo por uma ou mais delecções, substituições ou adições de aminoácidos, de tal modo que o análogo da proteína retenha a capacidade de se ligar ao HCV, preferencialmente à proteína E2 do HCV. Podem, por exemplo, fazer-se substituições de aminoácidos por mutação pontual do DNA que codifica para a sequência de aminoácidos. 0 equivalente funcional de CD81 poderá ser um análogo ou um fragmento de CD81. A proteína CD81 ou o seu equivalente funcional poderá sofrer uma modificação química, desde que retenha a capacidade de se ligar ao HCV, preferencialmente à proteína E2 do HCV.

Prevê-se que tais moléculas se tornem extremamente úteis na terapêutica preventiva da infecção por HCV, uma vez que estas moléculas se ligarão especificamente ao vírus e deste modo evitarão a internalização do vírus pelas células. Tal como aqui é usado, o termo "ligação específica" significa que o análogo funcionalmente equivalente possui uma alta afinidade para a proteína E2 do vírus HCV e não se liga a qualquer outra proteína com uma afinidade similarmente alta. A ligação específica pode ser medida através de diversas técnicas tais como Western blot, análise FACS ou imunoprecipitação. De preferência, o análogo funcionalmente equivalente liga-se à proteína E2 com uma afinidade de pelo menos 1CT8, preferencialmente de pelo menos 1CT9 e mais preferencialmente ainda com uma afinidade superior a 1CT10. 0 fragmento de proteína CD81, ou um seu equivalente funcional, pode ser produzido por qualquer meio adequado, tal 5 como se tornará evidente aos peritos na técnica. De modo a produzir quantidades suficientes da proteína CD81 ou dos seus equivalentes funcionais para uso de acordo com esta invenção, a expressão poderá ser convenientemente conseguida através da cultura, sob condições adequadas, de células hospedeiras recombinantes contendo a proteína CD81 ou um seu equivalente funcional. São já bem conhecidos os sistemas de clonagem e expressão de um polipéptido numa variedade de células hospedeiras diferentes.

Dois métodos preferidos para a construção de proteínas transportadoras de acordo com a invenção são a síntese química directa e a produção de proteína recombinante. De preferência, a proteína CD81 é produzida por meios recombinantes, por expressão a partir de uma molécula de ácido nucleico codificante. A expressão recombinante tem a vantagem de tornar a produção de proteína pouco dispendiosa, segura, fácil e sem envolver o uso de compostos tóxicos que poderão requerer a sua remoção subsequente.

Quando expressa sob a forma recombinante, o fragmento de proteína CD81 ou o seu equivalente funcional é preferencialmente gerado por expressão a partir de um ácido nucleico codificante numa célula hospedeira. Poderá usar-se qualquer célula hospedeira, consoante os requisitos individuais de um sistema particular. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamífero, células de planta, leveduras e sistemas de baculovírus. As linhas celulares de mamífero, disponíveis neste campo técnico para a expressão de um polipéptido heterólogo, incluem células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebé e muitos outros. Preferencialmente, são usados hospedeiros bacterianos para a produção da proteína recombinante, devido à facilidade com que as bactérias podem 6 ser manipuladas e cultivadas. Um hospedeiro bacteriano comum e preferido é a E. coli.

De preferência, se produzido por via recombinante, o fragmento de proteína CD81 ou o seu equivalente funcional é expresso a partir de um plasmídeo que contém uma inserção de ácido nucleico sintético. 0 local de inserção no plasmídeo de expressão sobre o qual é clonado o ácido nucleico que codifica para a proteína CD81 ou para o seu equivalente funcional poderá permitir a ligação da proteína a um tag, tal como o péptido "flag" ou a polihistidina. Este arranjo facilita a purificação subsequente da proteína recombinante.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é igualmente fornecida uma molécula de ácido nucleico codificando para a proteína CD81 ou para um seu equivalente funcional, para uso na terapêutica ou diagnóstico da infecção por HCV. Preferencialmente, o ácido nucleico codifica para a proteína CD81 humana. Tal como se tornará evidente a um perito na técnica, uma tal molécula de ácido nucleico será concebida usando o código genético de modo a codificar para a proteína ou péptido desejado. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com este aspecto da presente invenção poderá compreender DNA, RNA ou cDNA e poderá adicionalmente compreender análogos de nucleótidos na sequência codificante. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico compreenderá DNA.

As sequências de nucleótidos incluídas no âmbito nesta forma de realização da invenção são as que se hibridizam com o ácido nucleico que codifica para o fragmento de proteína CD81 sob condições padronizadas. Tal como aqui é usado, o termo "condições padronizadas" pretende indicar condições de elevada restringência, p.ex. 2 x scc, 65°C (em que scc = NaCl 0,15 M, citrato de sódio 0,015 M, pH 7,2). 7

Preferencialmente, tais moléculas de ácido nucleico reterão a capacidade para se hibridizar especificamente com o ácido nucleico que codifica para o fragmento de proteína CD81. 0 ácido nucleico que codifica para o fragmento de proteína CD81 ou para o seu equivalente funcional poderá ser clonado sob o controlo de um promotor indutível, deste modo permitindo a regulação precisa da expressão da proteína. Os sistemas indutíveis adequados serão bem conhecidos dos peritos neste campo técnico.

Os vectores adequados para a expressão do fragmento de proteína CD81 ou do seu equivalente funcional poderão ser seleccionados a partir de fontes comerciais ou construídos de modo a se adequar a um sistema de expressão particular. Tais vectores conterão sequências reguladoras apropriadas, tais como sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências enhancer e genes marcadores. Os vectores poderão corresponder a plasmídeos ou basear-se em vírus. Para mais detalhes ver Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989). Muitas das técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácidos nucleicos e para a análise de proteínas são descritos em detalhe em "Short Protocols in Molecular Biology", 2a edição, Ausubel et al. (John Wiley & Sons, 1992).

Os métodos para o isolamento e purificação de proteínas recombinantes são bem conhecidos dos peritos neste campo e encontram-se resumidos, por exemplo, em Sambrook et al. (1989). Particularmente em bactérias como E. coli, a proteína recombinante formará corpos de inclusão no interior da célula bacteriana, deste modo facilitando a sua preparação. Se produzida em corpos de inclusão, a proteína transportadora poderá necessitar de voltar a ser dobrada na sua conformação natural. 8

Adicionalmente, de modo a ajustar com precisão as propriedades exactas do fragmento de proteína CD81 ou do seu equivalente funcional, o técnico experimentado terá em conta que é possível introduzir modificações ao nível dos nucleótidos partindo de sequências de CD81 conhecidas e recorrendo à adição, substituição, delecção ou inserção de um ou mais nucleótidos. A mutagénese dirigida (SDM) constitui o método preferencialmente usado para gerar proteínas mutadas de acordo com a presente invenção. Existem muitas técnicas de SDM presentemente conhecidas dos peritos neste campo, incluindo a mutagénese dirigida com oligonucleótidos usando PCR, tal como exposto, por exemplo, em Sambrook et al. (1989), ou os kits comercialmente disponíveis.

Os vectores adequados poderão ser escolhidos, ou construídos, de modo a conter sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências enhancer, genes marcadores e outras sequências apropriadas. Os vectores poderão ser plasmídicos, virais, p.ex., fágicos, ou fasmídeos, segundo apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a Ed., Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas das técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácidos nucleicos, por exemplo para a preparação de construções de ácidos nucleicos, mutagénese, sequenciação, introdução de DNA nas células e expressão de genes, e para a análise de proteínas são descritos em detalhe em "Short Protocols in Molecular Biology", 2a edição, Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 1992. As menções feitas a Sambrook et al. e a Ausubel et al. são aqui apresentadas como referência. A invenção descreve igualmente o tratamento de uma infecção por HCV que compreende a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína CD81, ou 9 de um equivalente funcional desta, eficaz na redução da infectividade do vírus.

Uma vez que o mecanismo de infecção por HCV parece depender, em parte, da disponibilidade de um receptor da superfície celular, a disponibilização de uma forma solúvel da proteína CD81, ou de um seu equivalente funcional, actuará como antagonista da ligação do HCV ao receptor celular, reduzindo ou evitando assim o processo de infecção e, deste modo, tratando a doença.

Uma forma solúvel adequada da proteína CD81 ou de um seu equivalente funcional poderá compreender, por exemplo, uma forma truncada da proteína da qual um ou mais dos domínios transmembranares TM1-TM4 foram removidos, o que é conseguido através de um passo de corte proteolítico ou, por construção, através de um processo de síntese química ou de DNA recombinante. A forma solúvel da proteína preferida compreende o domínio EC2 (resíduos 113-201 identificados na Figura 1). O domínio EC1 poderá actuar no sentido de aumentar a afinidade ou a especificidade da proteína para o HCV.

Alternativamente, uma partícula híbrida compreendendo pelo menos uma proteína formadora de partículas, tal como o antigénio de superfície da hepatite B ou um seu fragmento formador de partículas, em combinação com a proteína CD81 ou com um seu equivalente funcional, poderá ser usada como antagonista da ligação do HCV ao receptor celular. A invenção descreve ainda um método para o tratamento de uma infecção por HCV que compreende a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que se liga especificamente à proteína CD81, tal como um anticorpo monoclonal dirigido contra CD81. A base teórica que sustenta esta estratégia terapêutica é a de que a ligação do receptor da superfície celular a outro composto evitará a 10 ligação do HCV ao receptor, pelo que o processo de infecção é evitado e a doença é tratada. A invenção descreve ainda uma composição farmacêutica que compreende uma proteína CD81 ou um seu equivalente funcional, opcionalmente sob a forma de sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção descreve também uma composição farmacêutica compreendendo um composto que se liga especificamente à proteína CD81, opcionalmente sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica poderá encontrar-se sob uma forma apropriada para administração, incluindo composições orais, parentéricas e transdérmicas. A composição poderá ser administrada isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, em simultâneo ou sequencialmente, dependendo do estado patológico a ser tratado. É igualmente descrito um processo para produzir a composição farmacêutica, segundo o qual uma proteína da presente invenção é colocada em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção descreve ainda o uso de uma proteína CD81 ou de um seu equivalente funcional, ou de um composto que se liga especificamente à proteína CD81, para uso como produto farmacêutico. A invenção descreve também o uso de uma proteína CD81 ou de um seu equivalente funcional, ou de um composto que se liga especificamente à proteína CD81, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma infecção por HCV. A capacidade de uma proteína CD81 ou de um seu equivalente funcional para se ligar ao HCV permite o uso da proteína como agente de diagnóstico da infecção por HCV, por exemplo num ensaio de ELISA ou de RIA. 11

Como exemplo, poderá usar-se uma forma solúvel da proteína num formato de ensaio ELISA com o fim de determinar a concentração de anticorpos neutralizantes no soro. Mais preferencialmente, os anticorpos contra CD81 serão adequados para uso neste contexto, uma vez que estas moléculas constituirão anticorpos anti-idiotipo face ao próprio HCV.

De acordo com um outro aspecto deste invento, é fornecido um ensaio para os anticorpos anti-HCV presentes numa amostra de soro que compreende o passo de permissão da liqação competitiva entre os anticorpos da amostra, uma quantidade conhecida de uma proteína de HCV e uma quantidade conhecida de um fraqmento da proteína CD81 ou de um seu equivalente funcional, tal como aqui descrito, e subsequentemente a medição da quantidade da proteína de HCV conhecida que se ligou ao fragmento de proteína CD81.

Preferencialmente, o fragmento de proteína CD81 ou o seu equivalente funcional é imobilizado sobre um suporte sólido e a proteína do HCV, que poderá adequadamente corresponder à proteína E2 do envelope de HCV ou opcionalmente a proteína E2 recombinante, é marcada. 0 marcador poderá ser um marcador radioactivo, um péptido, um epitopo, uma enzima, ou qualquer outro composto bioactivo. Preferencialmente, o marcador compreende uma enzima.

Num ensaio deste formato, a ligação competitiva entre os anticorpos e a proteína do HCV para a ligação ao fragmento de proteína CD81 ou ao seu equivalente funcional resulta em que a proteína do HCV ligada fornece uma medida dos anticorpos presentes na amostra de soro, mais particularmente dos anticorpos neutralizantes anti-HCV na amostra de soro.

Uma vantagem significativa do ensaio é a de que é feita uma medição directa dos anticorpos neutralizantes de liqação (i.e., os anticorpos que interferem com a ligação da proteína do envelope de HCV ao receptor celular). Um tal ensaio, 12 particularmente sob a forma de um teste ELISA, possui aplicações consideráveis no contexto clinico e no rastreio de rotina de amostras de sangue.

Adicionalmente, uma vez que o ensaio mede o titulo de anticorpos neutralizantes de ligação, o ensaio constitui uma medida simples da hipotética eficácia da vacina, estando o titulo de anticorpos neutralizantes de ligação correlacionado com a protecção do hospedeiro.

Num aspecto adicional da invenção, é fornecido um kit para diagnóstico compreendendo o fragmento da proteína CD81 ou o seu equivalente funcional tal como aqui descrito. Preferencialmente, o kit contém ainda pelo menos uma proteína de HCV marcada, opcionalmente marcada por enzima. 0 kit conterá igualmente outros componentes necessários para a análise da presença de HCV ou de anticorpos anti-HCV no soro. Tais componentes tornar-se-ão prontamente evidentes aos peritos na técnica. A proteína CD81 ou o seu equivalente funcional pode ser usada para a pesquisa de compostos químicos que emulem a estrutura da superfície do HCV que é responsável pela ligação ao receptor do HCV.

De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para o rastreio de compostos químicos quanto à capacidade para se ligarem à região do HCV que é responsável pela ligação a uma célula hospedeira, compreendendo a medição da ligação de um composto químico a rastrear a um fragmento da proteína CD81 ou a um seu equivalente funcional tal como aqui descrito. A célula hospedeira poderá corresponder a qualquer célula de mamífero, preferencialmente a uma célula humana.

Este aspecto da invenção abrange os produtos do processo de rastreio, quer isolados, sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável, quer em combinação com um ou mais de outros compostos activos e/ou em combinação com um ou mais 13 veículos farmaceuticamente aceitáveis. São igualmente fornecidos processos para a produção de uma composição farmacêutica em que um composto químico identificado pelo processo da invenção é colocado em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 composto químico poderá ser um composto orgânico e poderá conter aminoácidos ou análogos de aminoácidos. De preferência, no entanto, o composto químico é um péptido, um polipéptido ou um polipéptido que foi quimicamente modificado para alterar as suas propriedades específicas, tais como a afinidade de ligação à proteína CD81 ou ao seu equivalente funcional ou a sua estabilidade in vivo.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um ácido nucleico codificando para o fragmento de proteína CD81 ou para o seu equivalente funcional, tal como aqui descrito, para uso no diagnóstico ou terapêutica do HCV. 0 ácido nucleico poderá ser modificado a nível dos nucleótidos pela adição, substituição, delecção ou inserção de um ou mais nucleótidos, sendo que estas modificações se poderão ou não reflectir a nível dos aminoácidos, dependendo da degeneração do código genético. 0 ácido nucleico poderá ser incluído num vector, opcionalmente um vector de expressão que permita a expressão do ácido nucleico num hospedeiro apropriado para produzir a proteína CD81 ou o seu equivalente funcional. A identificação do DNA codificando para o receptor de HCV, nomeadamente CD81, faz uso de todos os recursos da biologia molecular para a análise molecular do HCV e em particular do seu mecanismo infeccioso, oferecendo pela primeira vez a possibilidade de concepção de métodos para o tratamento do vírus. Poderão usar-se métodos de PCR para identificar as células portadoras do receptor e poderão conceber-se moléculas de DNA para actuar como primers de reacção em cadeia por 14 polimerase (PCR) neste âmbito. Se bem que a proteína CD81 seja ubiquitária e esteja associada com o funcionamento humano normal, o presente invento descreve ainda moléculas anti-senso inibidoras da produção de CD81 para uso no tratamento do HCV e no fabrico de um medicamento para o tratamento da infecção por HCV.

Os polimorfismos identificados para a proteína CD81 poderão estar associados com a susceptibilidade à infecção por HCV ou com o seu prognóstico provável. Deste modo, a identificação do gene que codifica para o receptor de HCV permite a avaliação dos polimorfismos presentes na população humana. A invenção descreve ainda um anticorpo contra a proteína CD81 ou contra um seu equivalente funcional para uso no tratamento de uma infecção por HCV e no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma infecção por HCV. 0 anticorpo será preferencialmente um anticorpo monoclonal. Um tal anticorpo poderá ser usado para bloquear temporariamente o receptor CD81 evitando a infecção por HCV, por exemplo, imediatamente após uma infecção acidental com sangue infectado com HCV.

Presentemente, o único modelo animal disponível de infecção por HCV é o chimpanzé, o qual pertence a uma espécie protegida. As experiências em tais animais colocam diversas dificuldades, as quais no seu conjunto resultam numa considerável despesa (um período experimental de um ano com um chimpanzé pode custar 70.000 dólares). Em comparação com isto, um modelo de ratinho seria muito mais aceitável. Infelizmente, tal como se descreve abaixo, o receptor de HCV, sendo embora ubiquitário no homem e encontrado no chimpanzé, está ausente em outros mamíferos. Um mamífero transgénico, por exemplo um ratinho, portador do receptor de HCV à superfície das células, talvez expresso em maiores ou menores quantidades do que as 15 normalmente encontradas, seria de grande benefício para a investigação do HCV e para o desenvolvimento de vacinas. A expressão de proteínas CD81 mutantes à superfície das células constituiria igualmente uma útil ferramenta para a pesquisa.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um ratinho transgénico portador de um transgene que codifica para um fragmento de proteína CD81 ou para um seu equivalente funcional tal como aqui descrito. 0 ratinho transgénico poderá ser portador de um ou mais outros transgenes que auxiliem a manutenção de uma infecção por HCV. É igualmente fornecido um processo para a produção de um animal transgénico compreendendo o passo de introdução de um DNA codificando para um fragmento de proteína CD81 ou para um seu equivalente funcional tal como aqui descrito no embrião de um ratinho. Preferencialmente, a proteína CD81 ou o seu equivalente funcional é uma proteína CD81 humana.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é fornecida uma proteína CD81 ou um seu equivalente funcional para uso como imunogénio protector no controlo do HCV.

Breve descrição dos esquemas A Figura 1 corresponde a um alinhamento de sequências que mostra a homologia entre as sequências genéticas de CD81 do homem, chimpanzé, macaco verde, hamster, rato e ratinho. A Figura IA constitui uma descrição em esquema dos procedimentos primário, secundário e terciário de rastreio. A Figura 1B constitui uma descrição em esquema do último procedimento de rastreio. A Figura 2 corresponde a uma análise FACS das células ligadas a E2. A Figura 3 mostra a inibição dose-dependente da ligação de anti-CD81 às células B por parte da E2 recombinante. Os dados 16 são expressos como % de inibição da intensidade média de fluorescência. A Figura 4 é um imunoblot que mostra o reconhecimento da fracção de proteina de membrana que é imunoprecipitada pelo anticorpo anti-CD81. Carreira 2: E2 recombinante precipitada com antisoro de chimpanzé contra E2; carreira 3, E2 recombinante precipitada com soro pré-imune de chimpanzé; carreira 4: 20 μς de mAc anti-CD81 (clone JS81, Pharmingen) precipitado com IgG de cabra anti-ratinho; carreira 5: controlo (20 μρ de um anticorpo monoclonal irrelevante, CD9 anti-humano, ATCC) precipitado com IgG de cabra anti-ratinho ligada a proteina A-sefarose. Carreira 1: controlo positivo, preparação de proteínas de membrana. A Figura 5 apresenta a sequência de nucleótidos e a sequência deduzida de aminoácidos do fragmento EC2 clonado em pTio-His C e a sequência plasmidica a montante que codifica para a extremidade carboxilica da tioredoxina e para o local de corte por enteroquinase. A Figura 6 mostra a aparência de uma banda de proteína com a massa molecular esperada para tioredoxina-EC2 no extracto da amostra induzida. A Figura 7 é um gel corado por azul de Coomassie que mostra a purificação de tioredoxina-EC2. A Figura 8 representa a sequência de nucleótidos e a sequência deduzida de aminoácidos do fragmento EC2-His6 clonado em pGEX-KG, assim como a sequência plasmidica a montante que codifica para a extremidade carboxilica de GST, o local de corte por trombina e um pequeno espaçador de glicina. A Figura 9 representa uma análise por SDS-PAGE das proteínas totais do clone de E. coli TOP10 que expressa GST-EC2-(His)6. A Figura 10 representa um gel de SDS-PAGE corado por azul de Coomassie mostrando o corte por trombina de GST-EC2-(His)6 17 após purificação da proteína numa coluna de glutationa-sefarose. A Figura 11 expõe a inibição dose-dependente da ligação de E2 a células de hepatocarcinoma por uma molécula recombinante que expressa o loop extracelular principal (EC2) da CD81 humana. A Figura 12 mostra a ligação do HCV à CD81.

As Figuras 13-17 mostram a construção de vectores de ácidos nucleicos para uso na geração de ratinhos transgénicos para o gene da CD81 humana.

Descrição detalhada da invenção

Exemplo 1. E2 recombinante, linhas celulares, DNA vector e anticorpos usados no presente estudo A E2 recombinante usada nesta análise foi produzida em células CHO (E2-CH0) (WO 97/09349). A E2-CHO liga-se à linha celular humana de linfoma de células T Molt-4. Uma sub-linha de Molt-4 (designada por A2A6) foi identificada por expansão de colónias individuais de células Molt-4 e teste da quantidade de E2-CHO que se ligou à superfície celular. Verificou-se que a sublinha A2A6 ligava mais E2-CHO à sua superfície do que a linha progenitora, tendo por esta razão sido escolhida como fonte de RNA, na expectativa de que esta sublinha possibilitasse uma maior representação do produto de transcrição codificando para a molécula de ligação a E2. Estas células foram escolhidas usando um ensaio no qual se incubaram células humanas de linfomas B e T e linhas celulares de hepatocarcinoma com E2 recombinante expressa em células de mamífero (CHO) tal como descrito por D. Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 1759 (1996), procedendo-se a marcação com anticorpos anti-E2 marcados com biotina tal como descrito por Rosa et al. (1996). As células com a mais elevada 18 capacidade de ligação a E2 foram separadas usando um equipamento FacsVantage (Becton Dickinson) e foram subclonadas por diluição limitante. Os clones em desenvolvimento foram testados quanto à ligação a E2 nos Facs e os clones com uma Intensidade Média de Fluorescência mais elevada foram subsequentemente expandidos. A linha celular WOP é formada por células derivadas de N1H3T3 que expressam o antigénio de polioma T (L. Dallev e C. Basilico. J. Virol. 54, 739 (1985)). Nesta linha celular, os plasmideos contendo a origem de amplificação de polioma podem ser epissomicamente amplificados. É possível recuperar DNA recombinante construído com pCDM8 (Invitrogen) a partir de transfectantes seleccionados, sendo que o DNA contém a origem de replicação de polioma e se destina à manipulação de bibliotecas de expressão em células eucarióticas.

Foi usado um anticorpo monoclonal anti-E2 de ratinho (291A2) para a detecção de E2-CH0 ligada à superfície celular dos transf ectantes. Este anticorpo foi obtido tal como se segue: imunizaram-se ratinhos BALB-c por três vezes com E2 recombinante (10 μρ) em adjuvante completo de Freund. Recorrendo a métodos padronizados, foram produzidas fusões celulares entre esplenócitos e células de mieloma não produtoras. O sobrenadante das fusões foi então analisado quanto à ligação à E2 ligada às células Molt-4, de modo a se identificarem anticorpos monoclonais que se ligam a um local exposto na molécula de E2. O anticorpo mais adequado que foi identificado deste modo foi designado por 291A2.

Exemplo 2: Construção da biblioteca de cDNA

Extraiu-se o RNA total da linha celular A2A6 de acordo com o método descrito por Chomczinsky e Sacchi (Chomczinsky, P. e Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159). O RNA poli(A)+ foi enriquecido duas vezes usando oligo(dT)celulose. Começando 19 com 2 μg deste RNA como molde, foi sintetizado o DNA complementar de cadeia dupla usando um kit de síntese de cDNA Superscript II (Life Technologies) na presença de oligo(dT) (100 ng) e de primers hexaméricos ao acaso (1100 ng) . Criaram-se extremidades cegas no cDNA por acção da DNA polimerase T4, ligando-se este a um linker de BstXI, o qual permite a inserção do fragmento ao nivel do mesmo local de restrição na região de polilinker do vector de expressão pCDM8. O cDNA ligado ao linker foi extraído com fenol e precipitado com etanol usando sulfato de amónio para remover os mononucleótidos livres, seguindo-se uma cromatografia em Sephacryl 500 (Lifetechnologies) para fraccionar o cDNA por dimensões. Os fragmentos de cDNA purificados acima de 500 pb foram reunidos num pool e ligados com pCDM8 digerido com BstXI a uma razão molecular de aproximadamente 1:1. Esta reacção de ligação final foi usada a partir da transformação da E. coli MC1061/P3 por electroporação usando o equipamento Gene-Pulser (BIORAD). Amplificou-se um total de 2 x 106 CFU, constituindo-se um pool no meio líquido de cultura bacteriana como biblioteca de cDNA.

Exemplo 3: Rastreio da biblioteca O procedimento de rastreio baseou-se em grande medida no método descrito por Campbell et al. (Campbell, I.G., Jones, T.A., Foulkes, W.D. e Trowsdale, J. Câncer Res. 51:5329-5338, 1991) . O enriquecimento foi efectuado usando esferas magnéticas (do primeiro ao terceiro ciclos)(Figura IA) e técnicas de panning (o quarto ciclo)(Figura 1B). 3.1. O primeiro ciclo de rastreio

Foi preparado um total de 375 pg de DNA amplificado, que representa 2 x 106 clones de cDNA independentes. Em cada 20 transfecção, misturaram-se 25 μς de DNA com 107 células WOP usando o electroporador Gene-Pulser (BIORAD) sob as condições de 300V/500pF. Foram efectuados quinze conjuntos de transfecções. Após a transfecção, as células foram incubadas a 37°C durante 2 dias, após o que as células foram destacadas por tripsinização e lavadas com PBS suplementado com 5% FCS e EDTA 0,5 mM por duas vezes com centrifugação a 360 x g durante 10 min a 4°C. O pellet de células foi ressuspenso em PBS suplementado com 5% FCS e EDTA 0,5 mM (107 células/ml), adicionando-se então E2-CHO à suspensão celular a uma concentração de 10 pg/ml. As células foram incubadas em gelo durante 60 min. Após duas lavagens com PBS suplementado com 5% FCS e EDTA 0,5 mM, a suspensão celular foi incubada com anticorpo 291A2 em gelo durante 30 min. Após duas lavagens com PBS suplementado com 5% FCS e EDTA 0,5 mM, adicionaram-se à suspensão de células 10 μΐ de Dynabeads (DYNAL) acopladas a Ig de cabra anti-ratinho. A mistura foi agitada suavemente usando um Agitador Coulter (Coulter) durante 60 min a 4°C. As células ligadas foram separadas das não ligadas usando um Concentrador de Partículas Magnéticas (DYNAL) de acordo com as instruções do fabricante, deste modo se enriquecendo os transfectantes que se ligam a E2. O dna plasmídico foi recuperado a partir das células transfectadas ligadas usando o protocolo descrito por Campbell et al. (Campbell, I.G., Jones, T.A., Foulkes, W.D. e Trowsdale, J. Câncer Res. 51:5329-5338, 1991). A E. coli MC1061/P3 foi transformada com este plasmídeo por electroporação. Este pool de DNA foi designado por primeiro pool enriquecido (Io PE). 3.2. O segundo ciclo de rastreio

Foi preparado um total de 150 pg de DNA amplificado derivado do Io PE e foram efectuados 6 conjuntos de 21 transfecções, sendo os transfectantes enriquecidos sob as mesmas condições que foram usadas no primeiro rastreio. Este pool de DNA é designado por 2o PE. 3.3. 0 terceiro ciclo de rastreio

Foi preparado um total de 25 pg de DNA amplificado derivado do 2o PE e foi efectuado 1 conjunto de transfecção. Os transfectantes foram enriquecidos sob as mesmas condições que foram usadas no primeiro rastreio. Durante este passo de separação, os transfectantes formaram agregados, os quais poderão ter sido causados pela expressão de moléculas de adesão irrelevantes. Tal poderia ter reduzido a eficiência do enriquecimento, uma vez que estes agregados conteriam esferas magnéticas às quais estariam não especificamente associados. Para contornar este problema potencial, os transfectantes que sairam da segunda separação pelo Concentrador de Partículas Magnéticas foram diluídos e plaqueados em placas de Terasaki. Aproximadamente 100 células isoladas identificadas ao microscópio foram reunidas num pool e o DNA plasmídico foi extraído a partir destas. O pool de DNA preparado a partir deste passo é designado por 3o PE. 3.4. O quarto ciclo de rastreio O anticorpo monoclonal 291A1 foi incubado numa placa de Petri (90 mm) a uma concentração de 10 pg/ml durante 12 horas a 4 °C.

Foi preparado um total de 25 μρ de DNA amplificado derivado do 3 o PE e foi efectuado um procedimento de transfecção. As células transfectadas foram incubadas com E2-CHO tal como acima descrito e foram colocadas sobre as placas revestidas com 291A2 durante 60 minutos a 4°C. Após lavagem com um grande excesso de PBS suplementado com 5% FCS e EDTA 22 0,5 mM por duas vezes, as células ligadas foram directamente tratadas com a solução de lise e os plasmídeos foram extraídos tal como anteriormente descrito. Este pool de DNA foi designado por 4o PE. 3.5. Identificação do cDNA que codifica para uma molécula que se liga à E2 recombinante

Isolou-se o DNA das colónias isoladas derivadas do 4o PE. Foi efectuada uma só transfecção por cada preparação de plasmídeo usando as mesmas condições que foram usadas nos passos de rastreio anteriores. A ligação dos transformantes à E2 foi detectada usando um fragmento Fab monoclonal de Ig de cabra anti-ratinho conjugado com ficoeritrina em lugar das Dynabeads acopladas a anticorpo. Os transfectantes do 3° PE e do 4o PE foram igualmente analisados desta forma. As células ligadas a E2 foram detectadas num equipamento FACScan (Becton Dickinson) e analisadas pelo programa LYSIS II (Becton Dickinson) (Figura 2) . Observa-se uma ligação crescente das E2-CHO à medida que o passo de purificação progride. Um clone isolado P3 exibiu uma forte ligação a E2.

Exemplo 4: Determinação da sequência de DNA e análise. O clone P3 contém uma inserção de aproximadamente 1 kb. A sequência de DNA da inserção do clone de cDNA que confere às WOP a capacidade de ligação à E2 após a transfecção foi determinada por um sistema de sequenciação automatizado usando o primer T7, cuja sequência está localizada adjacentemente ao local de clonagem de pCDM8. A sequência foi pesquisada ao longo das bases de dados Genbank usando os programas GCG num computador UNIX. Esta análise revelou que a parte 5' da inserção de P3 é idêntica à CD81 humana (TAPA-1). A análise por restrição de P3 usando três enzimas (BstXI, HincII e Ncol) 23 foi igualmente concordante com o mapa de restrição do cDNA de CD81 humana.

Exemplo 5: Ligação de CD81 à E2 recombinante • Foram usados anticorpos anti-CD81 para avaliar a interacção entre E2 e CD81. Incubaram-se células EBV-B com quantidades crescentes de E2 recombinante durante 1 hora a 4°C, marcando-se então as células com um anticorpo monoclonal anti-CD81 (clone JS-81, Pharmingen). Tal como mostra a Figura 3, verificou-se que a E2 recombinante inibia competitivamente a ligação dos anticorpos anti-CD81 às linhas de células B transformadas por EBV (células EBV-B). Os dados foram expressos como % de inibição da intensidade média da fluorescência (Rosa et ai., 1996).

Adicionalmente, a E2 reage num Western blot com material precipitado por anti-CD81 (Figura 4) . Esta Figura mostra o reconhecimento pela E2 da fracção de proteína de membrana que é imunoprecipitada pelo anticorpo anti-CD81. Aproximadamente 300 pg de extracto de proteínas de membrana preparado a partir da linha celular A2A6 foi solubilizado em CHAPS 8 mM em PBS, pH 7,4, e incubado com 10 pg de E2 recombinante (carreiras 2 e 3), com 20 pg de mAc anti-CD81 (clone JS81; Pharmingen) (carreira 4), ou, como controlo, com 20 μg de um anticorpo monoclonal irrelevante (CD9 anti-humano, ATCC)(carreira 5) durante 2 horas a 4°C, sendo por fim precipitado com antisoro de chimpanzé contra E2 (carreira 2), soro pré-imune de chimpanzé (carreira 3), ou IgG de cabra anti-ratinho (carreiras 4 e 5) ligada a proteína A-sefarose (CL-4B, Pharmacia). O pellet foi dissolvido em tampão Laemmli e submetido a SDS-PAGE sob condições não redutoras. Após electroblot, a membrana de PVDF (Millipore) foi incubada durante 12 horas com 1 pg/ml de E2 recombinante à temperatura 24 ambiente, e durante 2 horas com o anticorpo monoclonal anti-E2 291A2. A ligação de E2 às proteínas imunoprecipitadas foi detectada através de um anticorpo policlonal igG anti-ratinho conjugado com peroxidase (Amersham). Como controlo positivo, os geles foram também carregados com proteínas de membrana (carreira 1). A mobilidade dos padrões de peso molecular é indicada à esquerda em kilodaltons .

Os linfócitos e os hepatócitos frescos expressam igualmente CD81, tal como demonstra a marcação imunohistoquimica com E2 marcada com biotina ou com anti-CD81 (dados não apresentados).

Para determinar se a proteína CD81 poderia mediar a internalização dos ligandos, explorou-se o facto de que a CD81 forma um complexo com CD19 e CD21 à superfície dos linfócitos B (D.T. Fearon e R.H. Cárter, 1995, Annu. Rev. Immunol. 13, 127) . Incubaram-se células B com E2 a 37°C e a diversos tempos, após o que os niveis de CD19 ou de CD21 à superfície celular foram medidos por imunofluorescência. A incubação das células B com E2 resultou na regulação negativa de CD19 e de CD21 (dados não apresentados). Deste modo, a proteína CD81 parece ter a capacidade de mediar a internalização de ambos estes ligandos.

Exemplo 6: O loop extracelular principal de CD81 liga-se à E2 recombinante e a partículas virais.

Para mapear o domínio de CD81 que se liga à proteína E2, centraram-se as atenções no loop extracelular hidrofílico EC2 da proteína. Este fragmento foi expresso em E. coli sob a forma de uma proteína de fusão tioredoxina-EC2 que possui um local para a enteroquinase entre a tioredoxina e EC2, e como uma proteína de fusão GST-EC2 que possui um local para a trombina entre GST e EC2 e um tag de hexa-histidina adicionado à extremidade carboxílica da proteína. Demonstrou-se que ambas 25 as proteínas são expressas e têm a capacidade de se ligar à E2 de HCV. Em ensaios de competição foi igualmente evidenciado que as proteínas de fusão purificadas e o fragmento EC2-His excisado de GST-trombina-EC2-(His)6 têm a capacidade de inibir a ligação de E2 à superfície das células que expressam CD81. 6.1. Clonaqem de EC2 em pThio-His. A Figura 5 apresenta as sequências de nucleótidos e as sequências deduzidas de aminoácidos do fragmento EC2 clonado em pThio-His C e a sequência plasmídica a montante que codifica para a extremidade carboxílica da tioredoxina e para o local de corte pela enteroquinase. Tal como apresentado, EC2 está fundida com a tioredoxina através do local para a enteroquinase, o que pode ser explorado para remover a tioredoxina da proteína de fusão. 0 fragmento codificando para EC2 foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pCDM8/P3 usando os seguintes oligodesoxinucleótidos: EC2 8L Dianteiro

5'G0CaCK3GGTGGATCCGGGGGIGGA(3GCTCX}ACK:i'TTGTCAACAACiGACC

Xkúl Phe Va! Asn Lvs / EC2 BL Reverso

5;€CCCAAGCTI TC A CAG CTT CCC GG A GAA GAG GTC ATC QV

Stop Leu Lys Giv Ser Phe Leu Asp Asp 26

Usando técnicas de clonagem padronizadas (Sambrook et al., 1989), o produto de PCR foi submetido a digestão dupla com Xhol e HindlII, ligado a pThio-His C (Invitrogen) digerido com as mesmas enzimas de restrição, e transformado em células de E. coli ToplO. Após selecção dos transformantes por análise com enzimas de restrição e sequenciação do DNA dos plasmideos, foi identificada uma construção correcta codificando para a proteína de fusão de tioredoxina-local de enteroquinase-EC2 esperada. Os lotes em glicerol dos clones seleccionados foram armazenados a -80°C.

Os extractos de proteínas totais do clone expressando tioredoxina-EC2 antes e depois da adição de IPTG foram submetidos a SDS-PAGE para analisar a expressão de proteínas. A Figura 6 mostra claramente o surgimento de uma banda de proteína com a massa molecular esperada (23,4 kDa) no extracto da amostra induzida. A Figura mostra ainda a reactividade da proteína de fusão com E2. 0 clone ToplO de E. coli contendo o plasmídeo pThio-hisC-EC2 e um clone TOPIO contendo o plasmídeo pThio-HisC sem inserção foram induzidos, foram preparados extractos de proteínas solúveis a partir de ambos os clones e estes foram submetidos a Far Western Blot com proteína E2. Para este blot, as amostras de proteínas foram colocadas em 1 x tampão de carga de amostras (LSB) (5% p/v SDS, 10% v/v glicerol, Tris-HCl 62,5 mM, 0,05% Azul de Bromofenol) usando uma solução de 3x LSB. As amostras foram separadas num gel de poliacrilamida a 15% e transferidas para uma membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore). A membrana foi incubada durante 30 minutos em solução bloqueante (PBS, 10% p/v leite magro evaporado, 0,05% v/v Tween 20). Após uma incubação durante 15 horas a 4°C com solução bloqueante contendo 1 μρ/ηιΐ de CHO-E2, as membranas foram incubadas durante 2 horas com o anticorpo monoclonal anti-E2 291A2 diluído a 1:250, e durante 1 hora com um anticorpo peroxidado de Ig de cabra anti-ratinho (Sigma) 27 diluído a 1:2000. Foram efectuados três passos de lavagem entre todos os passos de incubação usando solução bloqueante, a qual foi igualmente usada para diluir os anticorpos. Após uma lavagem final com PBS, as membranas foram incubadas durante 1 min com luminol (ECL, Amersham) e expostas com Hyper-Film (Amersham).

Tal como se pode ver a partir destas Figuras, foi visível uma banda correspondendo ao peso molecular de Tioredoxina-EC2 na carreira em que foram carregadas as proteínas solúveis de pThio-HisC-EC2. Esta banda esteve ausente na carreira em que as proteínas solúveis do clone pThio-HisC foram carregadas. 6.2. Purificação de Tioredoxina-EC2

Para a purificação de tioredoxina-EC2 foi desenvolvido o procedimento que se segue: 1) choque osmótico das células, 2) precipitação das proteínas com sulfato de amónio a 30% da saturação, e 3)IMAC. Após o choque osmótico, cerca de 50% da proteína de fusão foi libertada das células juntamente com proteínas contaminantes. A precipitação com sulfato de amónio resultou num pellet que continha tioredoxina-EC2 e era desprovido da maior parte das proteínas contaminantes. O IMAC do precipitado ressuspenso resultou numa proteína de fusão com uma pureza de cerca de 85%, tal como avaliado por SDS-PAGE. Com este procedimento purificou-se 5 mg de tioredoxina-EC2 a partir de um litro de cultura. Este procedimento é exposto em detalhe abaixo.

Inoculou-se o clone de E. coli expressando Tioredoxina-EC2 em 500 ml de meio LB contendo 100 pg/ml de ampicilina. À ϋΟεοο = 0,5, adicionou-se IPTG 0,5 mM à cultura e o crescimento prosseguiu a 37°C durante mais 3,5 horas. A cultura foi então 28 centrifugada a 4000 x g durante 10 min a 4°C. O pellet de células foi ressuspenso em 50 ml de solução hipertónica gelada (Tris-HCl 20 mM, EDTA 2,5 mM, sacarose a 20%, pH 8) e deixado em gelo durante 10 min. As células ressuspensas foram de novo centrifugadas como acima referido e o pellet foi ressuspenso em tampão hipotónico (Tris-HCl 20 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8) para promover o choque osmótico das células. Após 20 min a 0°C, a suspensão foi centrifugada a 12.000 x g durante 10 min a 4°C. O sobrenadante foi colocado em NH2(S04)2 a 30% usando uma solução do sal saturada à temperatura ambiente. A suspensão foi incubada durante 12 horas a 4°C e foi então centrifugada a 10.000 x g durante 10 min. O pellet foi ressuspenso usando 15 ml de tampão fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, pH 6, sendo então clarificado por centrifugação e carregado sobre uma coluna de 2 ml de sefarose quelante activada por niquel Fast Flow (Pharmacia) equilibrada com o mesmo tampão.

Após a adsorção, a coluna foi lavada com 10 ml do tampão de equilíbrio (taxa de fluxo 0,5 ml/min), eluindo-se então a Tioredoxina-EC2 com 30 ml de um gradiente de 0-50 mM de imidazol em tampão fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, pH 6, seguindo-se uma eluição isocrática com 10 ml de imidazol 400 mM. Foram recolhidas fracções de 2,4 ml. As fracções contendo a proteína recombinante foram reunidas num pool, dialisadas contra PBS e armazenadas a -20°C. As proteínas foram analisadas por SDS-PAGE e o conteúdo em proteína foi analisado pelo método de Bradford usando BSA como padrão de proteína. A Tioredoxina-EC2 purificada é apresentada na Figura 7.

6.3. Clonaqem de EC2-(His)6 em pGEX-KG A Figura 8 representa a sequência de nucleótidos e a sequência deduzida de aminoácidos do fragmento EC2-(His)6 clonado em pGEX-KG, assim como a sequência plasmídica a montante que codifica para a extremidade carboxílica de GST, o 29 local de corte por trombina e um pequeno espaçador de glicina. Tal como exposto, EC2 está fundida com GST através do local da trombina, o que pode ser explorado para remover a GST da proteína de fusão. 0 espaçador rico em glicina, localizado entre o local da trombina e a EC2, facilita o corte da proteína de fusão pela trombina (Guan, K.L., e Dixon, J.E. (1991) Anal. Biochem. 192, 262-267). 0 fragmento codificando para EC2 foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pCDM8/P3 usando os seguintes oligodesoxinucleótidos: EC2 Dianteiro EC2 5' CAAAAGGAATTCTA ITT GTC AA.C AÂG ÚÂCCA0 ATC GCC AAG3*

EcoR! Phe Vai. Asn Lys Asp Gin He Aia Lys BHL Revêfso liisíag EC2

rXTCCAAGCTTTCAATGATG ΛΤΌ ATG ATO ATG CAG C1T CCG GOA QAAQT

MimãΠ Stõp His ílis Hís Bís Hís His Le« t..ys Gly Ser 0 produto de PCR foi submetido a digestão com Xho I e HindlII, ligado a pGEX-KG (Guan, K.L. e Dixon, J.E. (1991) Anal. Biochem. 192, 262-267), digerido com as mesmas enzimas de restrição, e transformado em células de E. coli TOPIO. Após selecção dos transformantes por análise com enzimas de restrição e sequenciação dos nucleótidos dos plasmídeos, verificou-se que um plasmídeo que possuía uma inserção com a dimensão esperada possuía também a sequência EC2-(His)6 correcta em alinhamento com a sequência a montante codificando 30 para a trombina e para GST. O plasmídeo preparado a partir do clone TOPIO seleccionado foi então transformado em células BL21. Os lotes em glicerol dos clones seleccionados foram armazenados a -80°C. A Figura 9 representa um SDS-PAGE das proteínas totais do clone TOPIO de E. coli que expressa GST-EC2-(His)6. Esta análise mostra claramente que no extracto da amostra induzida existe uma banda de proteína com a massa molecular esperada (39 kDa). 0 Far Western blot correspondente mostra claramente que a E2 reage especificamente com a proteína de fusão. 6.4. Purificação de GST-EC2-(His)6 A proteína de fusão GST-EC2-(His)6 foi purificada numa coluna de glutationa-sefarose e digerida com trombina (Figura 10). Após a digestão, a porção de EC2-(His)6 foi ainda purificada por dois passos cromatográficos adicionais consistindo em uma coluna de glutationa-sefarose para remover o fragmento de GST e uma cromatografia MAC. Este procedimento é abaixo detalhado.

Uma só colónia de um clone de E. coli expressando a proteína de fusão GST-E2 foi inoculada em 10 ml de LB/100 μg/ml Amp e as células foram cultivadas durante 12 horas a 37°C. A cultura foi então inoculada em 500 ml de meio e, quando se atingiu uma DC>6oo = 0,5, adicionou-se IPTG 0,5 mM. Após 3,5 horas, as células foram recolhidas por centrifugação, ressuspensas em 9 ml de PBS e lisadas por duas passagens a 18.000 psi usando uma prensa francesa (SLM Aminco). O lisado foi centrifugado a 30.000 x g e o sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de 1 ml de Glutationa-Sefarose 4B (Pharmacia) equilibrada em PBS. A coluna foi lavada com 10 ml de PBS e eluída com 4 ml de Tris-HCl 50 mM, glutationa reduzida 10 mM, pH 8. As proteínas eluídas foram dialisadas contra PBS e armazenadas a -20°C. 31 6.5. Digestão de GST-EC2-(His)6 com trombina e purificação de EC2-(His)6

Digeriram-se 9,6 mg da proteína recuperada da coluna de glutationa-sefarose com 22 unidades de trombina (Pharmacia) durante 8 horas à temperatura ambiente, inactivando-se então a enzima com PMSF 0,13 mM (Sigma). A mistura de reacção foi então dialisada contra PBS e carregada sobre uma coluna de 0,5 ml de GST-sefarose equilibrada com PBS. A coluna foi lavada com 1 ml de PBS. O eluato e a lavagem foram reunidos num pool e carregados sobre uma coluna de 0,250 ml de sefarose quelante activada por níquel. Recuperou-se EC2-(His)6 da coluna por eluição com 1 ml de tampão fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 400 mM, pH 7,8. Foi então efectuada uma diálise contra PBS.

Exemplo 7: Ligação do fragmento de CD81 ao vírus

As proteínas que contêm o loop EC2 humano, mas não o de ratinho, de CD81 ligaram-se a E2 num Western blot (dados não apresentados) e inibiram a ligação de E2 a células humanas (Figura 11) . Revestiram-se esferas de poliestireno com as proteínas quiméricas, incubando-se então as esferas com um plasma infeccioso contendo quantidades conhecidas de moléculas de RNA virai. Após lavagem, o vírus associado às esferas foi avaliado por RT-PCR qantitativa para medir a quantidade de RNA de HCV ligado. Esta experiência foi efectuada tal como abaixo se descreve.

As esferas de poliestireno (1/4 de polegada de diâmetro)(Pierce) foram revestidas durante 12 horas com proteína EC2 recombinante purificada em tampão de citrato, pH 4, à temperatura ambiente. Após saturação durante 1 hora com tampão de BSA a 2% em Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 32 100 mM (tampão TEN), cada esfera foi incubada a 37°C durante 2 horas em 200 μΐ de plasma infeccioso de chimpanzé diluido em TEN contendo 5 x 105 moléculas de RNA de HCV.

Para as experiências de inibição, as esferas de poliestireno revestidas com EC2 foram incubadas com 10 μρ/ΓηΙ de anticorpos monoclonais purificados durante uma hora à temperatura ambiente antes da incubação com o virus. Cada esfera foi lavada 5 vezes com 15 ml de tampão TEN num equipamento automático de lavagem (Abbott) e o RNA virai foi extraído usando o Virai Extraction Kit da Qiagen. O RNA (8 ml) foi submetido a transcrição reversa a 42°C durante 90 minutos em 20 ml de Tampão A (Taq Man da Perkin Elmer) contendo 100 pmol do primer anti-senso de HCV CGGTTCCGCAGACCACTATG, 40 U de RNAsina (Promega), 5 nmol de dNTPs, 110 nmol de MgC12, 10 U de M-MuRT (Boehringer); o cDNA (20 ml) foi amplificado usando um Sistema de Detecção de Sequências ABI 7700 da Perkin-Elmer (45 ciclos) em 50 ml de Tampão A contendo 100 pmol do primer de senso de HCV TCTTCACGCAGAAAGCGTCTA, 5 pmol da sonda de detecção por fluorescência 5'(FAM)TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGA (TAMRA) (amavelmente fornecida por David Slade, Pharmacia and Upjohn), 15 nmol de dNTPs, MgCl2 e 1,25 U de Taq Gold (Perkin-Elmer, Foster City, CA). Todas as reacções foram quantificadas usando plasma infectado (titulo de bDNA de 30 mEq/ml) com HCV (genotipo la) para gerar uma curva-padrão. O software Sequence Detector da Perkin-Elmer foi já anteriormente descrito (U.E. Gibson, C.A. Heid e P.M. Williams, Genome Res. 6, 995 (1996)).

Tal como mostra a Figura 12, as moléculas contendo o loop extracelular da CD81 humana ligaram-se ao HCV de um modo dependente da dose, e a pré-incubação das proteínas quiméricas com anticorpos anti-CD81 inibiu a ligação do virus. Adicionalmente, o soro de chimpanzés que foram protegidos contra um inoculo homólogo por vacinação com heterodimero recombinante E1/E2 do envelope (Q.-L. Choo et al., Proc. Natl. 33

Acad. Sei. USA 91, 1294 (1994)) inibiu completamente a ligação do HCV à CD81 revestida nas esferas, enquanto que o soro de animais vacinados e não protegidos não teve este efeito (dados não apresentados).

Estes dados demonstram que a expressão da CD81 humana, e em particular do seu loop extracelular principal, é suficiente para a ligação não só a E2 mas também a partículas de HCV. Tendo em conta a larga distribuição de CD81 (S. Levy, S.C. Todd e H.T. Maecker, Annu. Rev. Immunol. 16, 89 (1998), estes resultados implicam que o HCV se liga e poderá ser internalizado não somente pelos hepatócitos, mas também por diversas outras células. De facto, encontrou-se RNA de HCV em linfócitos T e B e em monócitos (K. Blight, R.R. Lesniewski, J.T. LaBrooy e E.J. Gowans, Hepatology 20, 553 (1994); P. Bouffard et al., J. Infect. Dis. 166, 1276 (1992); Zignego et al., J. Hepatol. 15, 382 (1992)). Não foi ainda possível esclarecer se a ligação do vírus é seguida por entrada e infecção em todos os tipos celulares, por falta de um sistema eficiente de cultura de HCV in vitro. Poderá acontecer que a CD81 constitua um receptor de ligação ao HCV e que sejam necessários factores adicionais para que se dê a fusão virai ou a infectividade. A proteína CD81 participa em diferentes complexos moleculares em tipos celulares diferentes, um facto que poderá influenciar a sua capacidade para funcionar como um receptor para a infecção por HCV ou para enviar sinais reguladores às células-alvo. Por exemplo, a CD81 associa-se às integrinas nas células epiteliais e hematopoiéticas (F. Berditchevski , M. Zutter e M.E. Hemler, Mol. Biol. Cell 7, 193 (1996); B.A. Mannion, F. Berditchevski, S.-K. Kraeft, L.B. Chen e M.E .

Hemler, J. Immunol. 157, 2039 (1996)), mas forma também parte de um complexo de sinalização que contém CD21, CD19 e Leul3 nas células B (L.E. Bradbury, G.S. Kansas, S. Levy, R.L. Evans 34

Tedder e T.F. Tedder, J. Immunol. 149, 2841 (1991)). Foi já demonstrado que este complexo facilita a estimulação especifica de antigénio por baixar o limiar de activação das células B (D.T. Fearon e R.H. Cárter, Annu. Rev. Immunol. 13, 127 (1995)) . Deve notar-se que o HCV parece utilizar uma molécula que faz parte do mesmo complexo que contém o receptor de EBV (CD21) (N.R. Cooper, M.D. Moore e G.R. Nemerow, Annu. Rev. Immunol. 6, 85 (1988)), e que a capacidade evidenciada pelo EBV de activar e imortalizar linfócitos B está já bem documentada.

Exemplo 8: Construção de transgenes

As construções que se seguem foram concebidas e produzidas com o fim de gerar ratinhos transgénicos para a CD81 humana. 1. Adição dos sinais de splicing e de poliadenilação do gene de beta-globina do coelho ao fragmento de cDNA da CD81 humana. 0 fragmento de cDNA da CD81 humana obtido a partir do clone pCDM8/P3 foi transferido para um vector pBluescript KS II(+) (Stratagene) e foi então inserido no plasmídeo pSPP (derivado do vector de expressão BMGSC, uma amável oferta do Dr. Karasuyama, do Instituto de Imunologia de Basel) entre dois fragmentos, um contendo o segundo intron e o outro contendo o sinal de poliadenilação do gene de beta-globina do coelho (posição 902-1547 e 1543-2081, respectivamente, N° de Acesso Genbank M12603)(pSRlP na Figura 11). O fragmento de DNA recombinante resultante foi excisado do vector pBluescript KSH( + ) (Stratagene) por Sall (na extremidade 5') e Bamhl (na extremidade 3'). 35 2. Criação de um transgene para a expressão ubiquitária da CD81 humana 0 fragmento digerido por SalI-BamRl da inserção em pSRI foi inserido nos locais de restrição compatíveis de pCAGmcs, um plasmídeo modificado a partir de pCAGGS (uma amável oferta do Dr. J. Miyazaki, Universidade de Osaka, Japão, sob permissão restringida) que contém o promotor de beta-actina de galinha e o enhancer do citomegalovírus humano (Niwa, H. et al., Gene 108, pl93 (1991))(pCAGSRIPp na Figura 12). O fragmento de restrição por EcoRI-BamHI com 3,8 kb foi submetido a injecção em zigotos. 3. Criação de um transgene para a expressão específica pelo fígado da CD81 humana O local de restrição de Sall em pSRIP foi convertido num local de restrição para Bamtil por ligação de um linker de

BamRI após a formação de extremidades cegas por acção do fragmento de Klenow da DNA polimerase I de E. coli. Este fragmento de restrição por BamRI foi inserido no local de restrição de Bamhl no plasmídeo ALB e/p, portador do promotor e do enhancer da albumina de ratinho (Pinkert, C.A. et al., Genes Dev. 1, p268 (1987) (recebido do Dr. F. Chisari, Scripps Research Institute, La Jolla, San Diego)(pAlbSRlP na Figura 13). O fragmento de restrição por NotI-EcoRV com 4,5 kb foi submetido a injecção em zigotos. 4. Criação de um transgene para a expressão específica por linfócitos B da CD81 humana O fragmento de restrição por BamRI com 700 pb do enhancer de cadeias pesadas de imunoglobulina de ratinho (uma amável oferta do Dr. A. Kudo, do Instituto de Imunologia de Basel) e o fragmento de restrição por Xbal-SacI com 2,3 kb do promotor de cadeias leves kappa de ratinho foram subclonados num vector 36 pBluescript KSH(+). 0 local de restrição de Saci foi convertido num local de restrição de HindIII através da ligação do linker de HindIII tal como acima descrito. 0 local de restrição de BamHl em pCAGSRlP foi inicialmente convertido num local de restrição de NotI. Então, a região promotora da construção modificada de pCAGSRlP foi removida por digestão por HcoRl-HíndlII e substituída pelo fragmento de promotor-enhancer de imunoglobulina (pEhKpSRlP na Figura 15). 0 fragmento de restrição por EcoRI-BamRI com 5,2 kb foi submetido a injecção em zigotos.

Em conjunto, os nossos dados indicam que CD81 constitui um receptor de ligação para o HCV e que esta proteina pode fornecer novas orientações relativamente aos mecanismos de patogénese da infecção por HCV. Uma vez que a CD81 se associa a um complexo de activação à superfície das células B, o presente achado poderá explicar a patogénese da crioglobulinémia associada ao HCV, ainda que possa não se dar a replicação virai nas células B. Ainda, a identificação da interacção entre o HCV e a CD81 poderá auxiliar o processo de mapeamento dos epitopos neutralizantes conservados do envelope do virus que deverão ser importantes para o desenvolvimento de vacinas eficazes e para o fornecimento de um receptor substituto para a neutralização virai.

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Claims (17)

1. Reivindicações 1- Um fragmento EC2 da proteína CD81, caracterizado por consistir nos aminoácidos 113-201 da sequência da CD81 humana listada na base de dados SWISSPROT (N° de Acesso P18582) ou na base de dados EMBL/GENBANK (N° de Acesso M33680), ou que possui pelo menos 80% de homologia com os aminoácidos 113-201 da sequência da CD81 humana, sendo a homologia definida através do uso do pacote de software de análise de sequências Pileup (Wisconsin, 1996), para uso na terapêutica ou diagnóstico da infecção por HCV.
2. 2- Um fragmento, de acordo com a Reivindicação N°.l, caracterizado por ser um análogo funcionalmente equivalente de CD81 obtido pela alteração da sequência de aminoácidos através de uma ou mais delecções, substituições ou adições de aminoácidos, de tal modo que o análogo de proteína retenha a capacidade de se ligar à proteína E2 do HCV, para uso na terapêutica ou diagnóstico da infecção por HCV.
3. 3- Uma composição farmacêutica caracterizada por compreender um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou com a Reivindicação N°.2, opcionalmente sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. 4- Um processo para a preparação de uma composição farmacêutica, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por um fragmento de uma proteína CD81 ser colocado em associação a um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. 5- O uso de um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou com a Reivindicação N°.2, caracterizado por ser utilizado no fabrico de um medicamento para o tratamento ou diagnóstico de uma infecção por HCV. 1
6. 6- Um ensaio para os anticorpos anti-HCV presentes numa amostra de soro, caracterizado por compreender o passo de permissão da ligação competitiva entre os anticorpos na amostra, uma quantidade conhecida de proteina de HCV e uma quantidade conhecida de um fragmento de uma proteina CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou a Reivindicação N°.2, e subsequentemente a medição da quantidade da proteína de HCV conhecida que se ligou ao fragmento de proteína CD81.
7. 7- Um ensaio para HCV presente numa amostra de soro, caracterizado por compreender o passo de permissão da ligação competitiva entre os anticorpos na amostra e uma quantidade conhecida de um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou com a Reivindicação N°.2, e subsequentemente a medição da quantidade da proteína CD81 conhecida que ficou ligada.
8. 8- Um kit para diagnóstico, caracterizado por compreender um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou a Reivindicação N°.2, opcionalmente marcado.
9. 9- Um kit para diagnóstico, de acordo com a Reivindicação N°.8, caracterizado por o marcador compreender um marcador radioactivo, um péptido, um epitopo, uma enzima ou outro composto bioactivo.
10. 10- Um método para o rastreio de compostos químicos quanto à sua capacidade para se ligar à região do HCV que é responsável pela ligação a uma célula hospedeira, caracterizado por compreender a medição da ligação de um composto quimico a ser rastreado a um fragmento de uma proteina CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou a Reivindicação N°.2.
11. 11- Um ratinho transgénico, portador de um transgene que codifica para um fragmento de uma proteina CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou com a Reivindicação N°.2. 2
12. 12- Um processo para a produção de um ratinho transgénico, caracterizado pelo facto de compreender o passo de introdução de um DNA codificando para um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou a Reivindicação N°.2 no embrião de um ratinho.
13. 13- Uma molécula de ácido nucleico que codifica para um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou a Reivindicação N°.2, para uso no tratamento ou no diagnóstico de uma infecção por HCV.
14. 14- Uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a Reivindicação N°,13, sob condições de elevada restringência (2 x scc, 65°C), para uso no tratamento ou no diagnóstico de uma infecção por HCV.
15. 15- A molécula de ácido nucleico, de acordo com a Reivindicação N°.13 ou a Reivindicação N°.14, caracterizada por compreender DNA.
16. 16- Um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou a Reivindicação N°.2, caracterizado por ser utilizado como um imunogénio.
17. 17- Uma proteína de fusão, caracterizada por compreender um fragmento de uma proteína CD81, de acordo com a Reivindicação N°.l ou a Reivindicação N°.2, para uso no tratamento ou no diagnóstico de uma infecção por HCV. Lisboa, 24 de Fevereiro de 2010 3