PT101627B - ISOLATED AND SUBSTANTIALLY HOMOGENEOUS POLYMPEPTIDEE, CODIFYING DNA AND RECOMBINANT METHODS OR SYNTHESIS FOR PREPARATION AND PURIFICATION - Google Patents

Abstract

Isolated thrombopoietin (TPO), isolated DNA encoding TPO, and recombinant or synthetic methods of preparing and purifying TPO are disclosed. Various forms of TPO are shown to influence the replication, differentiation or maturation of blood cells, especially megakaryocytes and megakaryocyte progenitor cells. Accordingly, these compounds may be used for treatment of thrombocytopenia.

Description

Este invento está relacionado com o isolamento, purificção e síntese recombinante ou química de proteínas que influenciam a sobrevivência, proliferação, diferenciação ou maturação de células hematopoiéticas, especialmente as células progenitoras das plaquetas. Este invento está especificamente relacionado com a clonagem e expressão de ácidos nucleicos codificadores de um ligando proteico capaz de se ligar e activar mpl, um membro da superfamília de receptores das citocinas. Este invento está ainda relacionado com a utilização destas proteínas por si só ou em combinação com outras citocinas para tratar perturbações imunes ou hematopoiéticas incluindo trombocitopoenia.This invention is related to the isolation, purification and recombinant or chemical synthesis of proteins that influence the survival, proliferation, differentiation or maturation of hematopoietic cells, especially platelet progenitor cells. This invention is specifically related to the cloning and expression of nucleic acids encoding a protein ligand capable of binding and activating mpl, a member of the cytokine receptor superfamily. This invention is also related to the use of these proteins alone or in combination with other cytokines to treat immune or hematopoietic disorders including thrombocytopenia.

FUNDAMENTO DO INVENTOBACKGROUND OF THE INVENTION

I. O Sistema Hematopoiético sistema hematopoiético produz as células do ) sangue maduras altamente especializadas que se sabe serem necessárias à sobrevência de todos os mamíferos. Estas células maduras incluem: eritrócitos, especializados no transporte de oxigénio e dióxido de carbono, linfócitos T e B, responsáveis pelas respostas imunes mediadas por células e por anticorpos, plaquetas ou trombócitos, especializados na formação de coágulos sanguíneos e granulócitos e macrófagos, especializados como depuradores e como células acessórias para combater a infecção. Os granulócitos subdividem-se rI. The Hematopoietic System hematopoietic system produces highly specialized mature blood cells that are known to be necessary for the survival of all mammals. These mature cells include: erythrocytes, specialized in the transport of oxygen and carbon dioxide, T and B lymphocytes, responsible for immune responses mediated by cells and antibodies, platelets or thrombocytes, specialized in the formation of blood clots and granulocytes and macrophages, specialized as purifiers and as accessory cells to fight infection. Granulocytes are subdivided r

ainda em neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos, tipos celulares especializados tendo funções distintas. Saliente-se que todas estas células do sangue maduras especializadas derivam de um único tipo celular primitivo comum, referido como célula esteminal pluripotente (ou totipotente), que se encontra basicamente na medula óssea (Dexter et a 1. , Ann. Rev. Cell Biol., 3.:423-441 [1987]).also in neutrophils, eosinophils, basophils and mast cells, specialized cell types having different functions. It should be noted that all these specialized mature blood cells are derived from a single common primitive cell type, referred to as a pluripotent (or totipotent) stem cell, which is found primarily in the bone marrow (Dexter et a 1., Ann. Rev. Cell Biol ., 3.:423-441 [1987]).

As células do sangue maduras altamente especializadas devem ser produzidas em grandes números continuamente ao longo da vida de um mamífero. A grande maioria destas células do sangue especializadas destinam-se a permanecer funcionalmente activas durante apenas algumas horas a semanas (Cronkite et al., Blood Cells, 2:263-284 [1976]). Assim, a renovação contínua das células do sangue maduras, as próprias células esteminais primitivas, assim como quaisquer linhas celulares progenitoras intermédias ou comprometidas numa linhagem situando-se entre as células primitivas e as maduras, é necessária para manter o estado de equilíbrio normal das células do sangue do mamífero.The highly specialized mature blood cells must be produced in large numbers continuously throughout the life of a mammal. The vast majority of these specialized blood cells are intended to remain functionally active for only a few hours to weeks (Cronkite et al., Blood Cells, 2: 263-284 [1976]). Thus, the continuous renewal of mature blood cells, the primitive stem cells themselves, as well as any intermediate or compromised progenitor cell lines in a lineage between the primitive and mature cells, is necessary to maintain the normal equilibrium state of the cells of the mammal's blood.

No centro do sistema hematopoiético estão as células esteminais pluripotentes. Estas células são relativamente poucas em número e sofrem auto-renovação por proliferação para produzir células esteminais filhas ou são transformadas, numa série de passos de diferenciação, em células progenitoras de linhagem restringida cada vez mais maduras, formando por último células do sangue maduras altamente especializadas.At the center of the hematopoietic system are pluripotent stem cells. These cells are relatively few in number and undergo self-renewal by proliferation to produce daughter stem cells or are transformed, in a series of differentiation steps, into increasingly mature restricted-progenitor cells, ultimately forming highly specialized mature blood cells. .

Por exemplo, certas células progenitoras multipotentes, referidas como CFC-Mix, derivadas de células esteminais sofrem proliferação (auto-renovação) e desenvolvimento para produzirem colónias contendo todas diferentes células mielóides; eritrócitos, neutrófilos, megacariócitos (predecessores das plaquetas), macrófagos, basófilos, eosinófilos e mastócitos. Outras células progenitoras da linhagem linfóide sofrem proliferação e desenvolvimento para dar células T e células B.For example, certain multipotent progenitor cells, referred to as CFC-Mix, derived from stem cells undergo proliferation (self-renewal) and development to produce colonies containing all different myeloid cells; erythrocytes, neutrophils, megakaryocytes (predecessors of platelets), macrophages, basophils, eosinophils and mast cells. Other progenitor cells of the lymphoid lineage undergo proliferation and development to give T cells and B cells.

Ainda, entre as células progenitoras CFC-Mix e as células mielóides fica uma outra série de células progenitoras de comprometimento intermédio relativamente à sua progénie. Estas células progenitoras restringidas na linhagem são classificadas com base na progénie que produzem. Assim, os predecessores imediatos conhecidos das células mielóides são: unidades formadoras de colónias eritróides (CFU-E) para eritrócitos, células formadoras de de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CFC) para neutrófilos e macrófagos, células formadoras de megacariócitos (Meg-CFC) para megacariócitos, células formadoras de de colónias de eosinófilos (Eos-CFC) para eosinófilos e células formadoras de colónias de basófilos (Bas-CFC) para mastócitos. Conhecem-se (ver abaixo) ou serão descobertas outras células predecessoras intermédias entre as células esteminais pluripotentes e as células do sangue maduras tendo vários graus de restrição na linhagem e de capacidade auto-renovação.Also, between the CFC-Mix progenitor cells and the myeloid cells is another series of progenitor cells with intermediate impairment in relation to their progeny. These progenitor cells restricted in the lineage are classified based on the progeny they produce. Thus, the immediate known predecessors of myeloid cells are: erythroid colony-forming units (CFU-E) for erythrocytes, granulocyte / macrophage colony-forming cells (GM-CFC) for neutrophils and macrophages, megakaryocyte-forming cells (Meg- CFC) for megakaryocytes, eosinophil colony-forming cells (Eos-CFC) for eosinophils and basophil colony-forming cells (Bas-CFC) for mast cells. Other intermediate predecessor cells are known (see below) or will be discovered between pluripotent stem cells and mature blood cells having varying degrees of lineage restriction and self-renewal ability.

O princípio subjacente ao sistema de células hematopoiéticas normal parece ser a capacidade decrescente de auto-renovação à medida que a pluripotência se perde e se adquire a restrição na linhagem e maturidade. Assim, num extremo do espectro das células hematopoiéticas fica a célula esteminais pluripotente possuindo a capacidade de auto-renovação e diferenciação em todas as células progenitoras comprometidas específicas de linhagem. Esta capacidade é a base da terapia por transplante de medula óssea onde as células esteminais primitivas repovoam todo o sistema de células hematopoiéticas. No outro extremo do espectro ficam os progenitores altamente restringidos na linhagem e a sua progénie que perdeu a capacidade de auto-renovação mas que adquiriu a actividade funcional madura.The principle underlying the normal hematopoietic cell system appears to be the decreasing capacity for self-renewal as pluripotency is lost and restriction in lineage and maturity is acquired. Thus, at one end of the spectrum of hematopoietic cells is the pluripotent stem cell having the capacity for self-renewal and differentiation in all lineage-specific compromised progenitor cells. This ability is the basis of bone marrow transplant therapy where primitive stem cells repopulate the entire hematopoietic cell system. At the other end of the spectrum are the parents highly restricted in the lineage and their progeny who lost their capacity for self-renewal but who acquired mature functional activity.

A proliferação e o desenvolvimento das células esteminais e das células progenitoras restringidas na linhagem são cuidadosamente controlados por uma variedade de factores de crescimento hematopoiéticos ou citocinas. O papel destes factores de crescimento in vivo é complexo e não totalmente compreendido. Alguns factores de crescimento, tais como interleucina-3 (IL-3) são capazes de estimular células esteminais pluripotentes assim como células progenitoras comprometidas de várias linhagens, incluindo por exemplo, megacariócitos. Outros factores tais como factor estimulador de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) foram inicialmente pensados como sendo restringidos na sua acção a GM-CFC. No entanto, mais tarde descobriu-se que GM-CSF também influencia a proliferação e desenvolvimento entre outros de megacariócitos. Assim, IL-3 e GM-CSF possuem actividades biológicas sobreponíveis, no entanto potência diferente.The proliferation and development of stem cells and progenitor cells restricted in the lineage are carefully controlled by a variety of hematopoietic growth factors or cytokines. The role of these growth factors in vivo is complex and not fully understood. Some growth factors, such as interleukin-3 (IL-3) are able to stimulate pluripotent stem cells as well as compromised progenitor cells from various strains, including for example, megakaryocytes. Other factors such as granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) were initially thought to be restricted in their action to GM-CFC. However, it was later discovered that GM-CSF also influences the proliferation and development of megakaryocytes, among others. Thus, IL-3 and GM-CSF have overlapping biological activities, however different potency.

Mais recentemente, tanto a interleucina-6 (IL-6) como a interleucina-11 (IL-11), ainda que não tendo influência aparente na formação de colónias de megacariócios sozinhas, actuam sinergisticamente com IL-3 para estimular a maturação de megacariócitos (Yonemura et al. , Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).More recently, both interleukin-6 (IL-6) and interleukin-11 (IL-11), while having no apparent influence on the formation of megakaryocyte colonies alone, act synergistically with IL-3 to stimulate megakaryocyte maturation. (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20: 1011-1016 [1992]).

Assim, os factores de crescimento hematopoiéticos podem influenciar o crescimento e diferenciação de uma ou mais linhagens, podem sobrepor-se a outros factores de crescimento ao afectarem uma única linha celular progenitora ou podem actuar sinergisticamente com outros factores.Thus, hematopoietic growth factors can influence the growth and differentiation of one or more strains, can overlap with other growth factors by affecting a single parent cell line, or can act synergistically with other factors.

Também parece que os factores de crescimento hematopoiéticos podem apresentar o seu efeito em diferentes fases do desenvolvimento celular desde a célula esteminais totipotente através de vários progenitores comprometidos restringidos pela linhagem até à célula do sangue madura. Por exemplo, a eritropoietina (epo) parece promover a proliferação apenas de células progenitoras eritróides maduras. IL-3 parece exercer o seu efeito mais cedo influenciando as células esteminais primitivas e as células progenitoras intermédias restringidas na linhagem. Outros factores de crescimento tais como factor das células esteminais (SCF) podem influenciar desenvolvimento celular ainda mais primitivo.It also appears that hematopoietic growth factors can have their effect at different stages of cell development from the totipotent stem cell through several compromised progenitors restricted by the lineage to the mature blood cell. For example, erythropoietin (epo) appears to promote the proliferation of only mature erythroid progenitor cells. IL-3 appears to exert its effect earlier by influencing primitive stem cells and intermediate progenitor cells restricted in the lineage. Other growth factors such as stem cell factor (SCF) can influence even more primitive cell development.

Do que foi dito pode-se concluir que novos factores de crescimento hematopoiéticos que afectem a sobrevivência, proliferação, diferenciação ou maturação de qualquer uma das células do sangue ou seus predecessores serão úteis, especialmente para o restabelecimento de um sistema hematopoiético diminuido causado por doença ou após terapia com radiação ou quimioterapia.From what has been said, it can be concluded that new hematopoietic growth factors that affect the survival, proliferation, differentiation or maturation of any of the blood cells or their predecessors will be useful, especially for the restoration of a reduced hematopoietic system caused by disease or after radiation therapy or chemotherapy.

II. Megacariocitopoiese - Produção de PlaquetasII. Megakaryocytopoiesis - Platelet Production

A regulação da megacariocitopoiese e da produção de plaquetas foi revista por Mazur, Exp. Hematol., 15:248 [1987] e Hoffman, Blood, 74.:1196-1212 [1989]. Resumidamente, as células esteminais pluripotentes da medula óssea diferenciam-se em linhas celulares megacariocíticas, eritrocíticas e mielocíticas. Pensa-se que existe uma hierarquia de células progenitoras megacariocíticas comprometidas entre as células esteminais e os megacariócitos. Foram identificadas pelo menos três classes de células progenitoras megacariocíticas, nomeadamente megacariócitos de unidades formadoras de eclosões (BFU-MK), megacariócitos de unidades formadoras de colónias (CFU-MK) e células progenitoras de megacariócitos pouco densas (LD-CFU-MK). A própria maturação dos megacariócitos é um desenvolvimento contínuo que foi separado em fases com base em critérios morfológicos padronizados. 0 membro mais precocemente reconhecível da família dos megacariócitos (MK ou meg) são os megacarioblastos. Estas células têm inicialmente 20 a 30 μπι de diâmetro tendo citoplasma basófilo e um núcleo ligeiramente irregular com cromatina ligeiramente reticular e esparsa e vários nucléolos.Mais tarde, os megacarioblastos podem conter até 32 núcleos (poliplóides) mas o citoplasma permanece esparso e imaturo. Á medida que a maturação avança os núcleos tornam-se mais lobulados e picnóticos, o citoplasma aumenta de quantidade e torna-se mais acidófilo e granular. As células mais maduras desta família podem dar o aspecto de libertarem plaquetas na sua periferia. Normalmente, menos de 10% dos megacariócitos estão na fase de blasto e mais de 50% estão maduros. Classificações morfológicas arbitrárias normalmente empregues na série dos megacariócitos são megacarioblastos para a forma mais precoce; promegacariócito ou megacariócito basófilo para a forma intermédia; e megacariócito maduro (acidófilo, granular ou produtor de plaquetas) para as formas mais tardias. O megacariócito maduro estende filamentos de citoplasma para os espaços sinusoidais onde se destacam e se fragmentam em plaquetas individuais (Williams et al., Hematology, 1972).The regulation of megakaryocytopoiesis and platelet production was reviewed by Mazur, Exp. Hematol., 15: 248 [1987] and Hoffman, Blood, 74.:1196-1212 [1989]. In summary, pluripotent stem cells in the bone marrow differentiate into megakaryocytic, erythrocytic and myelocytic cell lines. A hierarchy of compromised megakaryocytic progenitor cells is thought to exist between stem cells and megakaryocytes. At least three classes of megakaryocyte progenitor cells have been identified, namely hatch-forming unit megakaryocytes (BFU-MK), colony-forming unit megakaryocytes (CFU-MK) and low-dense megakaryocyte progenitor cells (LD-CFU-MK). Megakaryocyte maturation itself is a continuous development that has been separated into phases based on standardized morphological criteria. The earliest recognizable member of the megakaryocyte family (MK or meg) is megakaryoblasts. These cells are initially 20 to 30 μπι in diameter having a basophilic cytoplasm and a slightly irregular nucleus with a slightly sparse reticular chromatin and several nucleoli. Later, megacarioblasts may contain up to 32 nuclei (polyploids) but the cytoplasm remains sparse and immature. As maturation progresses, the nuclei become more lobulated and pycnotic, the cytoplasm increases in quantity and becomes more acidophilic and granular. The more mature cells in this family can look like they release platelets on their periphery. Typically, less than 10% of megakaryocytes are in the blast phase and more than 50% are mature. Arbitrary morphological classifications normally used in the megakaryocyte series are megakaryoblasts for the earliest form; promegakaryocyte or basophilic megakaryocyte for the intermediate form; and mature megakaryocyte (acidophilic, granular or platelet-producing) for later forms. The mature megakaryocyte extends cytoplasm filaments to the sinusoidal spaces where they detach and fragment into individual platelets (Williams et al., Hematology, 1972).

Pensa-se que a megacariocitopoiese envolva vários factores reguladores (Williams et al. Br. J. Haematol., 52.:173 [1982] e Williams et al. . J. Cell Physiol., 110:101 [1982]). O nível mais precoce da megacariocitopoiese postula-se como sendo mitótico, relacionando-se com a proliferação celular e iniciação de colónias a partir de CFU-MK mas não é afectado pela contagem de plaquetas (Burstein et al., J. Cell. Physiol., 109:333 [1981] e Kimura et al., Exp. Hematol., 13.:1048 [1985]). A fase mais tardia da maturação não é mitótica, envolvendo poliploidização e maturação citoplasmática e é provavelmente regulada num mecanismo de retroactivação pelo número de plaquetas periféricas (Odell et al. , Blood, 48.:765 [1976] e Ebbe et al. , Blood, 32:787 [1968]) .Megakaryocytopoiesis is thought to involve several regulatory factors (Williams et al. Br. J. Haematol., 52.:173 [1982] and Williams et al. J. Cell Physiol., 110: 101 [1982]). The earliest level of megakaryocytopoiesis is postulated to be mitotic, related to cell proliferation and colony initiation from CFU-MK but is not affected by platelet count (Burstein et al., J. Cell. Physiol. , 109: 333 [1981] and Kimura et al., Exp. Hematol., 13.:1048 [1985]). The later stage of maturation is not mitotic, involving polyploidization and cytoplasmic maturation and is probably regulated in a retroactivation mechanism by the number of peripheral platelets (Odell et al., Blood, 48.:765 [1976] and Ebbe et al., Blood , 32: 787 [1968]).

Foi descrita a existência de um factor estimulador das colónias de megacariócitos (MK-CSF) distinto e específico (Mazur, Exp. Hematol., .15:340-350 [1987]). No entanto a rThe existence of a distinct and specific megakaryocyte colony stimulating factor (MK-CSF) (Mazur, Exp. Hematol., .15: 340-350 [1987]). However the r

maior parte dos autores pensam que um processo tão vital para a sobrevivência como é a produção de plaquetas seja regulado por citocina(s) exclusivamente responsável(eis) por este processo. A hipótese de que existem citocina(s) especificais) de megacariócitos/plaquetas proporcionou a base para mais de 30 anos de pesquisa, mas até à data tal citocina não foi purificada, sequenciada e estabelecida por ensaio como uma MK-CSF (TPO).most authors think that a process as vital for survival as platelet production is regulated by cytokine (s) exclusively responsible for this process. The hypothesis that there are specific megakaryocyte / platelet cytokines (s) has provided the basis for more than 30 years of research, but to date this cytokine has not been purified, sequenced and established by assay as an MK-CSF (TPO).

Ainda que tenha sido descrito que MK-CSFs tenham sido parcialmente purificadas a partir de trombocitopenia produzida experimentalmente (Hill et al., Exp. Hematol., 14:752 [1986]) e meio condicionado de rim embrionário humano [CM] (McDonald et al. , J. Lab. Clin. Med. , .85.:59 [1975]) e no homem a partir de extratos urinários (Kawakita et al., Blood, .6:556 [1983]) e plasma (Hoffman et al. . J. Clin. Invest., 7_5:1174 [1985]) de anemia plástica e de púrpura trombocitopenica idiopática, a sua função fisiológica é ainda desconhecida na maior parte dos casos.Although it has been reported that MK-CSFs have been partially purified from experimentally produced thrombocytopenia (Hill et al., Exp. Hematol., 14: 752 [1986]) and human embryonic kidney [CM] conditioned medium (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., .85.: 59 [1975]) and in man from urinary extracts (Kawakita et al., Blood, .6: 556 [1983]) and plasma (Hoffman et al. J. Clin. Invest., 7_5: 1174 [1985]) of plastic anemia and idiopathic thrombocytopenic purpura, its physiological function is still unknown in most cases.

meio condicionado de células activadas pelo mitogénio da erva dos cancros (PWM-ApCM) e a linha celular de mielomonócito murina WEHI-3 (WEHI-3CM) foram usados como potenciadores de megacariócitos. PWM-SpCM contem factores que aumentam o crescimento de CFU-MK (Metcalf et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 72.:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al,, Blood, 61:214 [1985]; e Iscove, N. N., em Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al., eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1978]) um dos quais é a interleucina-3 (IL-3), um factor estimulador de colónias de linhagens múltiplas (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, .11:469 [1986]). Os outros factores neste meio não foram ainda identificados e isoaldos. WEHI-3 é uma linha celular mielomonocítica de murganho que secreta quantidades relativamente grandes de IL-3 e quantidades menores de GM-CSF. Encontrou-se que IL-3 potência o crescimento de uma gama larga de célulasconditioned medium from cancer herb mitogen activated cells (PWM-ApCM) and the murine myelomonocyte cell line WEHI-3 (WEHI-3CM) were used as megakaryocyte enhancers. PWM-SpCM contains factors that increase the growth of CFU-MK (Metcalf et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72.:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al ,, Blood, 61: 214 [1985]; and Iscove, NN, in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al., Eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1978]) one of which is interleukin-3 (IL-3), a multi-strain colony stimulating factor (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, .11: 469 [1986]). The other factors in this medium have not yet been identified and identified. WEHI-3 is a mouse myelomonocytic cell line that secretes relatively large amounts of IL-3 and minor amounts of GM-CSF. IL-3 has been found to potentiate the growth of a wide range of cells

hematopoiéticas (Ihle et al.. J. Immunol., 13:282 [1983]). Tamhém se encontrou que que IL-3 sinergiza muitas hormonas hematopoiéticas conhecidas (Bartelmez et al. . J. Cell Physiol. 122:362-369 [1985]) e Warren et al., Cell, 46:667-674 [1988]), incluindo tanto eritropoietina (EPO) como interleucina-1 (IL-1) na indução de percursores multipotenciais muito precoces e a formação de colónias hematopoiéticas mistas muito grandes.hematopoietic (Ihle et al .. J. Immunol., 13: 282 [1983]). It has also been found that IL-3 synergizes many known hematopoietic hormones (Bartelmez et al. J. Cell Physiol. 122: 362-369 [1985]) and Warren et al., Cell, 46: 667-674 [1988]) , including both erythropoietin (EPO) and interleukin-1 (IL-1) in the induction of very early multipotential precursors and the formation of very large mixed hematopoietic colonies.

Foram encontradas outras fontes de potenciadores de megacariócitos nos meios condicionados de linhas celulares de pulmão, osso e macrófagos de murganho, células de exudado peritoneal e células de rim embrionário humano. Apesar de alguns dados discordantes (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]) existe alguma evidência (Geisser et al., Br. J- Haematol., .60:233-238 [1985]) linfócitos T activados em vez de monócitos desempenham um papel potenciador na megacariocitopoiese. Estes resultados sugerem que as secreções de linfócitos T activados tais como interleuquinas poem ser factores reguladores do desenvolvimento de MK (Geissler et al., Exp. Hematol., 15:845-853 [1987]). Uma série de estudos em megacariocitopoiese com eritropoietina (EPO) purificada (Vainchenker et al. Blood, 54.:940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261:492-4 [1976]; e Williams et al., Exp. Hematol., 12.:734 [ 1984]) indicam que esta hormona tem um efeito potenciador na formação de colónias de MK. Isto foi também demonstrado em culturas sem soro e com soro e na ausência de células acessórias (Williams et al., Exp. Hematol., 12.:734 [1984]). Foi postulado que EPO está envolvido mais nos aspectos da fase de uma única célula e de duas células da magacariocitopoiese em oposição ao efeito de PWM-SpCM que está envolvido na fase quatro células do desenvolvimento de megacariócitos. A interacção de todos estes factores nas fases precoce e tardia do desenvolvimento de megacariócitos ainda não está elucidada.Other sources of megakaryocyte enhancers have been found in the conditioned media of lung cell lines, bone and mouse macrophages, peritoneal exudate cells and human embryonic kidney cells. Despite some conflicting data (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]) there is some evidence (Geisser et al., Br. J- Haematol., .60: 233-238 [1985]) T lymphocytes activated instead of monocytes play a potentiating role in megakaryocytopoiesis. These results suggest that secretions of activated T lymphocytes such as interleukins may be regulatory factors for the development of MK (Geissler et al., Exp. Hematol., 15: 845-853 [1987]). A series of studies on megakaryocytosis with purified erythropoietin (EPO) (Vainchenker et al. Blood, 54.:940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261: 492-4 [1976]; and Williams et al., Exp Hematol., 12.:734 [1984]) indicate that this hormone has a potentiating effect on the formation of MK colonies. This has also been demonstrated in cultures without serum and with serum and in the absence of accessory cells (Williams et al., Exp. Hematol., 12.:734 [1984]). It has been postulated that EPO is more involved in the single cell and two cell aspects of magakaryocytopoiesis as opposed to the effect of PWM-SpCM which is involved in the four cell phase of megakaryocyte development. The interaction of all these factors in the early and late stages of the development of megakaryocytes is still unclear.

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Resultados produzidos por outros laboratórios sugerem que os únicos factores multi-linhagem que individualmente possuem actividade estimuladora de colónias MK são GM-CSF e IL-3 e até certo grau o factor estimulador de células B IL-6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84.:9035 [1987]). Mais recentemente, vários autores descreveram que IL-11 e o factor inibidor de leucemia (LIF) actuam sinergisticamente com IL-3 para aumentar o tamanho e ploidia dos megacariócitos (Yonemura et al. British Journal of Hematology, 84.:16-23 [1983]; Burstein et al. . J. Cell. Physiol., 153 :305-312 [1992]; Metcalf et al. , Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et al. , Exp. Hematol·, .19.:378-381 [1991]; e Yonemura et a 1. , Exp. Hematol., .20: 1011-1016 [1992]).Results produced by other laboratories suggest that the only multi-lineage factors that individually have MK colony-stimulating activity are GM-CSF and IL-3 and to some degree the B-cell stimulating factor IL-6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84.:9035 [1987]). More recently, several authors have described that IL-11 and the leukemia inhibiting factor (LIF) act synergistically with IL-3 to increase the size and ploidy of megakaryocytes (Yonemura et al. British Journal of Hematology, 84.:16-23 [ 1983]; Burstein et al. J. Cell. Physiol., 153: 305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76: 50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77: 2150 -2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., .19.: 378-381 [1991]; and Yonemura et a., Exp. Hematol., .20: 1011-1016 [1992]).

Outros documentos com interesse incluem: Eppstein et al. , Patente U.S. N² 4 962 091; Chong, Patente U.S.Other documents of interest include: Eppstein et al. , US Patent 4,962,091 ^2; Chong, US Patent

N2 4 879 111; Fernandes et al., Patente U.S. N² 4 604 377; Wissler et a 1. , Patente U.S. N² 4 512 971; Gottlieb, Patente U.S. N2 4 468 379; Bennett et al.. Patente U.S. 5 215 895; Kogan et al., Patente U.S. N² 5 250 732; Kimura et al., Eur.No. 4,879,111; Fernandes et al, US Patent No. 4,604,377 ^2.; Wissler et 1., ² US Patent 4,512,971; Gottlieb, US Patent No. 4,468,379; Bennett et al .. US Patent 5,215,895; Kogan et al, US Patent No. 5,250,732 ^2.; Kimura et al., Eur.

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Immunol., 140(1):94-99 [1988]; Warren et al., 17(11):1095-1099 [1989]; Bruno et al..Immunol., 140 (1): 94-99 [1988]; Warren et al., 17 (11): 1095-1099 [1989]; Bruno et al ..

17(10):1038-1043 [1989]; Tanikawa et al, 17(8):883-888 [1989]; Koike et al., Blood, [1990]; Lotem, Blood,17 (10): 1038-1043 [1989]; Tanikawa et al, 17 (8): 883-888 [1989]; Koike et al., Blood, [1990]; Lotem, Blood,

Exp.Exp.

Exp.Exp.

ab,ab,

Hematol.,Hematol.,

Hematol.,Hematol.,

J.J.

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Hematol.,Hematol.,

Exp.Exp.

(12) :2286-2291(12): 2286-2291

75(5):1545-1551 [1989]; Rennick et al.. Blood, 73 (7) :1828-1335 [ 1989]; e Clutterbuck et al.,75 (5): 1545-1551 [1989]; Rennick et al .. Blood, 73 (7): 1828-1335 [1989]; and Clutterbuck et al.,

Blood, 73 (6) : 1504-1512 [1989].Blood, 73 (6): 1504-1512 [1989].

III. TrombocitopeniaIII. Thrombocytopenia

As plaquetas são elementos críticos do mecanismo de coaqulação do sangue. A depleção do nível de plaquetas circulantes, chamada trombocitopenia, surge em várias estados e perturbações clínicos. A trombocitopenia é rPlatelets are critical elements of the blood coagulation mechanism. Depletion of the level of circulating platelets, called thrombocytopenia, appears in several conditions and clinical disorders. Thrombocytopenia is r

normalmente definida como uma contagem de plaquetas abaixousually defined as a platelet count below

......

de 150 x 10 por litro. As principais causas da trombocitopenia podem ser divididas de uma modo geral em três categorias com base do tempo de vida das plaquetas, nomeadamente;150 x 10 per liter. The main causes of thrombocytopenia can be broadly divided into three categories based on the lifetime of the platelets, namely;

(1) inibição da produção de plaquetas pela medula óssea, (2) sequestração de plaquetas no baço (esplenomegália), ou (3) maior destruiçãode plaquetas na circulação periférica (e.g., trombocitopenia auto-imune ou terapia química ou por radições). Ainda, nos doentes nos doentes que recebem grandes volumes de produtos do sangue pobres em plaquetas administrados rapidamente, pode ocorrer trombocitopenia devido à diluição.(1) inhibition of platelet production by the bone marrow, (2) sequestration of platelets in the spleen (splenomegaly), or (3) greater destruction of platelets in the peripheral circulation (e.g., autoimmune thrombocytopenia or chemical or radiation therapy). In addition, in patients in patients who receive large volumes of platelet-poor blood products administered rapidly, thrombocytopenia may occur due to dilution.

As manifestações clínicas de hemorregia na trombocitopenia depende da gravidade da trombocitopenia, da sua causa e possíveis defeitos de coagulação associados. Em geral, os doentes com contagens de plaquetas entre 20 e 100 . .The clinical manifestations of haemorrhea in thrombocytopenia depends on the severity of thrombocytopenia, its cause and possible associated coagulation defects. In general, patients with platelet counts between 20 and 100. .

x 10 por litro correm o risco de hemorregias excessivas pós trauma, enquanto que os que possuem contagens abaixo de 20 x . .x 10 per liter are at risk of post-traumatic haemorrhages, while those with counts below 20 x. .

por litro sangrar espontaneamente. Estes últimos pacientes são candidatos à transfusão de plaguetas com risco imune e virai latente. Para qualquer grau de trombocitopenia as hemorregias tendem a ser mais graves quando a causa é o decréscimo da produção em vez do aumento da destruição das plaquetas. Nesta última situação, uma reciclagem de plaquetas acelerada resulta na circulação de plaquetas mais jovens, maiores e hemostaticamente mais eficazes. A trombocitopenia pode resultar de uma variedade de perturbações que ) se descrevem resumidamente a seguir. Uma descrição mais detalhada pode ser encontrada em Schafner, A. I., Thrombocitopenia and Disorders of Platelet Function, Internai Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et al., Eds. Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [1990].per liter bleed spontaneously. These latter patients are candidates for transfusion of platelets with immune risk and latent viral. For any degree of thrombocytopenia, hemoregions tend to be more severe when the cause is decreased production rather than increased platelet destruction. In the latter situation, accelerated platelet recycling results in the circulation of younger, larger and hemostatically more effective platelets. Thrombocytopenia can result from a variety of disorders that are briefly described below. A more detailed description can be found in Schafner, A. I., Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Internai Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et al., Eds. Little Brown and Co., Boston / Toronto / London [1990].

(a) Trombocitopenia devida à inibição da produção de plaquetas.(a) Thrombocytopenia due to inhibition of platelet production.

trombocitopenia congénita (síndrome de congénita, as do esqueleto.congenital thrombocytopenia (congenital syndrome, those of the skeleton.

sãoare

As causas de anemia aplástica constitutiva trombocitopenia megacariocítica estar associadas a malformações ções da formação de plaquetas adquiridas hipoplasia de megacariócitos ou trombopoiese incluem Fanconi) e quais podem As perturbacausadas por ineficaz. A hipoplasia megacariocítica pode resultar de uma variedade de estados, incluindo aplasia da medula (incluindo formas idiopáticas ou mielo-supressão por agentes quimioterapêuticos ou terapia com radiações), mielfibrose, leucémia e invasão da medula óssea por tumores metásticos ou granulomas. Nalgumas situações, toxinas agentes infecciosos ou drogas podem interferir com a trombopoiese de uma forma relativamente selectiva; exemplos incluem trommbocitopenias transitórias causadas por álcool e certas infecções virais e trombocitopenia suave associada à administração de diuréticos de tiazida. Finalmente, trombopoiese infeicaz após processos megaloblásticos (deficiência em folato ou B^) pode também causar trombocitopenia, geralmente coexistindo com anemia e leucopenia.The causes of aplastic anemia constituting megakaryocytic thrombocytopenia are associated with malformations of platelet formation acquired from megakaryocyte hypoplasia or thrombopoiesis include Fanconi) and which may be disturbed by ineffective. Megakaryocytic hypoplasia can result from a variety of conditions, including marrow aplasia (including idiopathic forms or myelo-suppression by chemotherapeutic agents or radiation therapy), myelfibrosis, leukemia and bone marrow invasion by metastatic tumors or granulomas. In some situations, toxins, infectious agents or drugs can interfere with thrombopoiesis in a relatively selective way; examples include transient thrombocytopenia caused by alcohol and certain viral infections and mild thrombocytopenia associated with the administration of thiazide diuretics. Finally, ineffective thrombopoiesis after megaloblastic processes (folate or B deficiency) can also cause thrombocytopenia, usually coexisting with anemia and leukopenia.

O tratamento normal das trombocitopenias devido ao decréscimo da produção de plaquetas depende da identificação e reversão da causa subjacente à falha da medula óssea. As transfusões de plaquetas são geralmente reservadas a doentes com complicações graves de hemorregia ou para cobrir processos cirúrgicos, uma vez que a isoimunização pode levar ã impossibilidade de fazer novas transfusões de plaquetas. As hemorregias de mucosas resultantes de trombocitopenia grave podem ser melhoradas pela administração oral ou intravenosa de agentes antifibrinolíticos. As complicações trombóticas podem desenvolver-se, no entanto, se se usarem agentes antifibrinolíticos em doentes com coagulação intravascular dessiminada (DIC).The normal treatment of thrombocytopenia due to decreased platelet production depends on the identification and reversal of the underlying cause of bone marrow failure. Platelet transfusions are generally reserved for patients with severe complications of haemorrhea or to cover surgical procedures, since isoimmunization may lead to the impossibility of making new platelet transfusions. Mucosal hemoregions resulting from severe thrombocytopenia can be improved by oral or intravenous administration of antifibrinolytic agents. Thrombotic complications can develop, however, if antifibrinolytic agents are used in patients with discriminated intravascular coagulation (DIC).

(b) Trombocitopenia deviada à sequestração esplénica.(b) Thrombocytopenia due to splenic sequestration.

A esplenomegália devida a qualquer cusa pode estar associada a trombocitopenia suave a moderada. Este é um processo essencialmente passivo (hiperesplenismo) da sequestração esplénica de plaquetas, ao contrário das destruição activa das plaquetas pelo baço nos casos da trombocitopenia imune discutida abaixo. Se bem que a causa mais comum do hiperesplenismo seja a esplenomegália congestiva de hipertensão porta devido a cirrose alcoólica, outras formas de esplenomegália linfoproliferativa, congestiva ou infiltrante estão também associadas à trombocitopenia. A contagem de g plaquetas geralmente não vai abaixo de 50 x 10 por litro como resultado de hiperesplenismo por si só.Splenomegaly due to any cause can be associated with mild to moderate thrombocytopenia. This is an essentially passive process (hypersplenism) of splenic platelet sequestration, as opposed to active destruction of platelets by the spleen in the cases of immune thrombocytopenia discussed below. Although the most common cause of hypersplenism is congestive splenomegaly of portal hypertension due to alcoholic cirrhosis, other forms of lymphoproliferative, congestive or infiltrating splenomegaly are also associated with thrombocytopenia. The platelet g count generally does not go below 50 x 10 per liter as a result of hypersplenism alone.

(c) Trombocitopenia devida à destruição de plaquetas por um processo não imunológico(c) Thrombocytopenia due to the destruction of platelets by a non-immunological process

A trombocitopenia pode resultar da destruição acelerada das plaquetas por vários processos não imunológicos. As perturbações deste tipo incluem coagulação intravascular disseminada, sistemas intravasculares prostéticos, circulação extra-corporal do sangue e microangiopatias trombóticas tais como púrpura trombocítica trombótica. Em todas estas situações, as plaquetas circulantes que estão expostas a superfícies artificiais ou a íntima vascular anormal são consumidas nestes locais ou são danificadas e depois eliminadas prematuramente pelo sistema reticuloendotelial. Os estados de doença ou perturbações em que a coagulação intravascular disseminada (DIC) pode surgir estão descritos detalhadamente em BraunWald et al., (eds), Harrison's Principies of Internai Medicine, 11^^ Ed., p. 1478, McGraw Hill (1987). Os sistemas intravasculares prostéticos, incluindo as valvas cardíacas e os balões intra-aórticos podem causar uma trombocitopenia destrutiva suave a moderada e trombocitopenia transitória em doentes rThrombocytopenia can result from the accelerated destruction of platelets by various non-immunological processes. Disorders of this type include disseminated intravascular coagulation, prosthetic intravascular systems, extra-bodily blood circulation and thrombotic microangiopathies such as thrombotic thrombocytic purpura. In all of these situations, circulating platelets that are exposed to artificial surfaces or the abnormal vascular intima are consumed in these places or are damaged and then prematurely eliminated by the reticuloendothelial system. The disease states or disorders in which disseminated intravascular coagulation (DIC) can arise are described in detail in BraunWald et al., (Eds), Harrison's Principies of Internai Medicine, 11 ^^ Ed., P. 1478, McGraw Hill (1987). Prosthetic intravascular systems, including cardiac valves and intra-aortic balloons, can cause mild to moderate destructive thrombocytopenia and transient thrombocytopenia in r patients

que façam desvio cardiopulmonar ou hemodiálise pode resultar do consumo ou danificação das plaquetas no circuito extracorporal.who undergo cardiopulmonary deviation or hemodialysis may result from the consumption or damage of platelets in the extracorporeal circuit.

(d) Trombocitopenia imune induzida por drogas(d) Drug-induced immune thrombocytopenia

Mais de 100 drogas foram associadas a trombocitopenia mediada pelo sistema imune. No entanto, apenas foram bem caracterizadas as provocadas por quinidina, quinino, ouro, sulfonamidas, cefalotina e heparina. A trombocitopenia induzida por drogas é frequentemente muito grave e ocorre tipicamente de uma forma rápida dentro de dias durante a ingestão do medicamento.More than 100 drugs have been associated with immune-mediated thrombocytopenia. However, only those caused by quinidine, quinine, gold, sulfonamides, cephalothin and heparin were well characterized. Drug-induced thrombocytopenia is often very severe and typically occurs quickly within days of taking the drug.

(e) Púrpura trombocitopénica imune (autoimune) (ITP)(e) Immune thrombocytopenic (autoimmune) purpura (ITP)

ITP em adultos é uma doença crónica caracterizada pela destruição autoimune de plaquetas. 0 autoanticorpo é qeralmente IqG se bem que outras imunoqlobulinas tenham também sido associadas. Apesar do autoanticorpo de ITP ter sido associado à membrana das plaquetas GPII,III , a D â especificidade do antigénio das plaquetas não foi identificada na maior parte dos casos.A destruição extravascular das plaquetas sensibilizadas ocorre no sistema reticuloendotelial do baço e fígado. Se bem que cerca de metade dos casos de ITP sejam idiopáticos, muitos doentes sofrem de doenças reumáticas ou autoimunes (e.g., lupus sitémico eritematoso) ou perturbações linfoproliferativas (e.g., leucémia linfocítica crónica).ITP in adults is a chronic disease characterized by the autoimmune destruction of platelets. The autoantibody is generally IqG although other immunoglobulins have also been associated. Although the ITP autoantibody has been associated with platelet membrane GPII, III, D for platelet antigen specificity has not been identified in most cases. Extravascular destruction of sensitized platelets occurs in the reticuloendothelial system of the spleen and liver. Although about half of the cases of ITP are idiopathic, many patients suffer from rheumatic or autoimmune diseases (e.g., erythematous lupus) or lymphoproliferative disorders (e.g., chronic lymphocytic leukemia).

(f) ITP induzida por HIV(f) HIV-induced ITP

ITP é uma complicação cada vez mais comum da infecção por HIV (Morris et al., Ann. Intern. Med., 89:714-717 [1982]) e pode ocorrer em qualquer fase de progressão da doença, em doentes onde se diagnosticou o Síndrome da rITP is an increasingly common complication of HIV infection (Morris et al., Ann. Intern. Med., 89: 714-717 [1982]) and can occur at any stage of disease progression, in patients diagnosed o R syndrome

Imunodeficiência Adquirida (SIDA), os ue possuem o complexo relacionado com SIDA e os que têm infecção por HlVmas sem sintomas de SIDA. A infecção por HIV é uma doença transmissível caracterizada por uma deficiência profunda da função imune celular assim como a ocorrência de infecção oportunista e tumorigenese. A anormalidade imunológica primária , resultante da infecção pelo HIV é a depleção progressiva e incapacidade funcional dos linfócitos T expressarem a glicoproteína de superfície celular CD4(Lane et al., Ann.Acquired Immunodeficiency (AIDS), eu have the AIDS-related complex and those who have HIV infection without AIDS symptoms. HIV infection is a communicable disease characterized by a profound deficiency of cellular immune function as well as the occurrence of opportunistic infection and tumorigenesis. The primary immunological abnormality resulting from HIV infection is the progressive depletion and functional inability of T lymphocytes to express the CD4 cell surface glycoprotein (Lane et al., Ann.

Rev. Immunol., 3.:477 [1985]). A perda da função das células T CD4 auxiliar/indutora provavelmente está na base dos profundos defeitos da imunidade celular e humoral que conduzem às infecções oportunistas e tumorigenese características da SIDA (H. Lane supra).Rev. Immunol., 3.:477 [1985]). The loss of CD4 helper / inducer T cell function is probably at the root of the profound defects in cellular and humoral immunity that lead to the opportunistic infections and tumorigenesis characteristic of AIDS (H. Lane supra).

Se bem que os mecanismos de ITP associados a HIV sejam desconhecidos, pensa-se que sejam diferentes do mecanismo de ITP não associado à infecção por HIV. (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; e Ratner, Am. J. Med., 86:194-198 [1989]).Although the mechanisms of HIV-associated ITP are unknown, it is thought to be different from the ITP mechanism not associated with HIV infection. (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311: 635-639 [1984]; and Ratner, Am. J. Med., 86: 194-198 [1989]).

IV. Terapia Típica da TrombocitopeniaIV. Typical Thrombocytopenia Therapy

A abordagem terapêutica ao tratamento de doentes com trombocitopenia é ditada pela gravidade e urgência da situação clínica. O tratamento é semelhante para trombocitopenia associada a HIV e não relacionada com HIV e se bem que um tenha sido usada uma série de abordagens terapêuticas J diferentes, a terapia permanece controversa.The therapeutic approach to the treatment of patients with thrombocytopenia is dictated by the severity and urgency of the clinical situation. The treatment is similar for HIV-associated and non-HIV-related thrombocytopenia, and although a number of different therapeutic approaches have been used, the therapy remains controversial.

A contagem de plaquetas em doentes onde se diagnosticou trombocitopenia foi aumentada com êxito por terapia com glucocorticóides (e.g., prednisolona), no entanto na maior parte dos doentes, a resposta é incompleta ou ocorre recidiva quando a dose de glucocorticóide é reduzida ou a sua administração descontínua. Com base em estudos com doentes tendo ITP associada a HIV, alguns investigadores rPlatelet count in patients diagnosed with thrombocytopenia has been successfully increased by glucocorticoid therapy (eg, prednisolone), however in most patients, the response is incomplete or relapse occurs when the glucocorticoid dose is reduced or administered. discontinuous. Based on studies of patients with HIV-associated ITP, some

sugeriram que a terapia com glucocorticóides possa resultar na presdisposição à SIDA. Os glucocorticóides são geralmente administrados se a contagem de plaquetas é abaixo de 20 x 9 /litro ou quando ocorre hemorregias espontâneas.have suggested that glucocorticoid therapy may result in a predisposition to AIDS. Glucocorticoids are usually administered if the platelet count is below 20 x 9 / liter or when spontaneous haemorrhea occurs.

Para os doentes refractários aos glucocorticóides, o composto: 4-(2-clorofenil)-9-metil-2-[3-(4-morfolinil)-3-propanon-l-il]6H-tieno[2,3,f][1,2,4]triazolo[4,3,a][1,4]diazepina (WEB 2086) foi usado com êxito para tratar um caso grave de ITP não associada a HIV. Um doente tendo contagens de plaquetas de 37000-58000/μ1 foi tratado com WEB 2086 e após 1-2 semanas de tratamento a contagem de plaquetas aumentou para 140000-190000/μ1. (E.P. 361 077 e Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).For glucocorticoid-refractory patients, the compound: 4- (2-chlorophenyl) -9-methyl-2- [3- (4-morpholinyl) -3-propanon-l-yl] 6H-thieno [2,3, f ] [1,2,4] triazole [4,3, a] [1,4] diazepine (WEB 2086) has been used successfully to treat a severe case of ITP not associated with HIV. A patient having platelet counts of 37000-58000 / μ1 was treated with WEB 2086 and after 1-2 weeks of treatment the platelet count increased to 140000-190000 / μ1. (E.P. 361 077 and Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).

Se bem que o tratamento trombocitopenia amegacariocítica incerto, globulina antitimócito óptimo para a púrpura de adquirida (AATP) seja (ATG), um anti-soro de cavalo contra tecido de , timo humano, mostrou produzir remissão completa prolongada (Trimble et al., Am. J. Hematol., 22=126-127 [1991]). No entanto uma descrição recente indica que os efeitos hematopoiéticos do ATG são atribuíveis ao timerosal, onde presumivelmente as proteínas actuam como transportadores de mercúrio (Panella et al.,Although the uncertain amegakaryocytic thrombocytopenia treatment, optimal antithymocyte globulin for acquired purpura (AATP) is (ATG), a horse antiserum against human thymus tissue, has been shown to produce prolonged complete remission (Trimble et al., Am J. Hematol., 22 = 126-127 [1991]). However, a recent description indicates that the hematopoietic effects of ATG are attributable to thimerosal, where presumably proteins act as mercury transporters (Panella et al.,

Câncer Research, 50: 4429-4435 [1990]).Cancer Research, 50: 4429-4435 [1990]).

Foram descritos bons resultados com esplenectomia.Good results have been described with splenectomy.

A esplenectomia remove o principal sítio de formação de s plaquetas e uma fonte importante da produção de auto-anticorpos em muitos doentes. Este processo resulta em remissões prolongadas sem tratamento num grande número de doentes. No entanto, uma vz que os processos cirúrgicos devem ser geralmente evitados em doentes imunocomprometidos, a esplenectomia é recomendada apenas em casos graves de trombocitopenia (e.g.. ITP grave associada a HIV), em doentes que não respondem ao tratamento de 2 a 3 semanas com glucocorticóides ou que não atingem uma resposta sustida após rSplenectomy removes the main site of platelet formation and an important source of autoantibody production in many patients. This process results in prolonged remissions without treatment in a large number of patients. However, since surgical procedures should generally be avoided in immunocompromised patients, splenectomy is recommended only in severe cases of thrombocytopenia (eg. Severe HIV-associated ITP), in patients who do not respond to treatment for 2 to 3 weeks with glucocorticoids or that do not achieve a sustained response after r

descontinuação da administração de glucocorticóides. Com base- no conhecimento científico disponível é pouco claro se a esplenectomia predispõe os doentes à SIDA.discontinuation of glucocorticoid administration. Based on available scientific knowledge, it is unclear whether splenectomy predisposes patients to AIDS.

Para além da terapia com prednisolona e esplenectomia, certos agentes citotóxicos , e. g. , vincristina e azidotimidina (AZT, zidovudina) também se mostram promissores no tratamento de ITP induzida por HIV; no entanto, os resultados são preliminares.In addition to prednisolone therapy and splenectomy, certain cytotoxic agents, e.g. g. , vincristine and azidothymidine (AZT, zidovudine) are also promising in the treatment of HIV-induced ITP; however, the results are preliminary.

Do que foi dito pode-se avaliar que uma maneira de tratar trombocitopenia será obter um agente capaz de acelerar a diferenciação e maturação de megacariócitos ou seus precursores para a forma produtora de plaquetas. Têm sidos dispendidos esforços consideráveis na identificação de tal agente, vulgarmente referido como trombopoietina (TPO). Outros nomes para TPO normalmente encontrados na literatura incluem; factor estimulador de trombocitopoiese (TSF), factor estimulador das colónias de megacariócitos (MK-CSF), factor estimulador de megacariócitos e potenciador de megacariócitos. A actividade de TPO foi observada em 1959 (Rak et al. , Med. Exp., 1:125) e tentativas para caracterizar e purificar este agente têm continuado até agora. Se bem que existam descrições da purificação parcial de polipaptídeos TPO-activos (ver, por exemplo, Tayrien et a 1,, J. Biol. Chem., 262:3262 [1987] e Hoffman et al., J. Clin. Invest.From what has been said, one can evaluate that one way to treat thrombocytopenia will be to obtain an agent capable of accelerating the differentiation and maturation of megakaryocytes or their precursors to the platelet-producing form. Considerable efforts have been expended in identifying such an agent, commonly referred to as thrombopoietin (TPO). Other names for TPO commonly found in the literature include; thrombocytopoiesis stimulating factor (TSF), megakaryocyte colony stimulating factor (MK-CSF), megakaryocyte stimulating factor and megakaryocyte enhancer. TPO activity was observed in 1959 (Rak et al., Med. Exp., 1: 125) and attempts to characterize and purify this agent have continued until now. Although there are descriptions of partial purification of TPO-active polypeptides (see, for example, Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262: 3262 [1987] and Hoffman et al., J. Clin. Invest.

autores postularam que TPO não é uma si só mas antes é simplesmente a uma hormona conhecida (IL-3,authors postulated that TPO is not one but rather is simply a known hormone (IL-3,

Res., 115:123 [1986]) origem, uma molécula seria de significante nenhuma proteína tenha como TPO, interesse descoberta de que mpl.Res., 115: 123 [1986]) origin, a molecule would be of significance no protein has as TPO, interest discovered that mpl.

poderá transduzir umyou can transduce a

Biol.Biol.

75:1174 [1985]), outros entidade discreta por manifestação polifuncional de Sparrow et al., Prog. Clin.75: 1174 [1985]), other discrete entities due to the polyfunctional manifestation of Sparrow et al., Prog. Clin.

Independentemente da sua forma ou possuindo actividade trombopoiética importância terapêutica. Se bem que sido sem ambiguidade identificada considerável anda à volta da recente um receptor putativo de citocinas, sinal trombopoiético.Regardless of its form or having thrombopoietic activity, therapeutic importance. Although there has been considerable unambiguity identified, a putative cytokine receptor, a thrombopoietic signal, surrounds the recent one.

rr

V. Mpl é um Receptor de Citocina MegacariocitopoiéticaV. Mpl is a Megakaryocytopoietic Cytokine Receptor

Pensa-se que a proliferação e maturação de células hematopoiéticas está estreitamente regulada por factores que positiva ou negativamente modulam a proliferação de células esteminais pluripotentes e a diferenciação de múltiplas linhagens. Estes efeitos são mediados através da ligação de alta afinidade de factores proteicos extracelulares a receptores específicos da superfície celular. Estes receptores da superfície celular partilham homologia considerável e são geralmente classificados como membros da superfamília das citocinas. Os membros da superfamília incluem receptores de : IL-2 (cadeias β e τ 244:551-556 [1989]; Takeshita [1991 9), IL-3 (Itoh et al., Gorman et al., Proc. Natl. [1990]; Kitamura et al., Kitamura et al., Proc. Natl.Hematopoietic cell proliferation and maturation is thought to be closely regulated by factors that positively or negatively modulate the proliferation of pluripotent stem cells and the differentiation of multiple strains. These effects are mediated through the high affinity binding of extracellular protein factors to specific cell surface receptors. These cell surface receptors share considerable homology and are generally classified as members of the cytokine superfamily. Members of the superfamily include receptors for: IL-2 (β and τ 244 chains: 551-556 [1989]; Takeshita [1991 9), IL-3 (Itoh et al., Gorman et al., Proc. Natl. [ 1990]; Kitamura et al., Kitamura et al., Proc. Natl.

(Hatakeyama et al., Science, et al., Science, 257 : 379-382 Science, 247:324-328 [1990];(Hatakeyama et al., Science, et al., Science, 257: 379-382 Science, 247: 324-328 [1990];

Acad. Sei. USA, 87:5459-5463 Cell, 66:1165-1174 [1991a]; Acad. Sei. USA, 88:5082-5086 [1991b]), IL-4 (Moslev et al.. Cell, 59:335-348 [1989], IL-5 (Takai et al. , EMBO J., 9.:4367-4374 [1990]; Tavernier et al, Cell, 66:1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al·, Science, 241:825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63;1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:5690-5694 [1992]), factor estimulador de colónias de granulóci tos-macrófagos (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., £:3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 244:9655-9659 [1990]), factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61341-350 [1990a]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, £7:8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172:1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea et al·., Cell, 57:277-285 [1989]; Jones et al. , Blood, 7.6:31-35 [1990]), factor inibidor de leucémia (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), oncostatina M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, £8:8641-8645 [1991]) e também receptores da prolactina (Boutin et al. , Proc. Natl. Acad. Sei.· USA, 88.:7744-7748 [1988]; Ederv et al. . Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:2112-2116 [ 1989]), hormona de crescimento (GH) (Leung et a 1. , Nature, 33:537-543 [ 1987]) e factor neurotrófico ciliar (CNTF) (Davis et al., Science, 253:59-63 [1991].Acad. Know. USA, 87: 5459-5463 Cell, 66: 1165-1174 [1991a]; Acad. Know. USA, 88: 5082-5086 [1991b]), IL-4 (Moslev et al .. Cell, 59: 335-348 [1989], IL-5 (Takai et al., EMBO J., 9.:4367- 4374 [1990]; Tavernier et al, Cell, 66: 1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al ·, Science, 241: 825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63; 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60: 941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5690-5694 [1992]), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., £: 3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244: 9655-9659 [1990]), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61341-350 [1990a]; Fukunaga et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, £ 7: 8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172: 1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea et al ·., Cell , 57: 277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 7.6: 31-35 [1990]), leukemia inhibiting factor (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10: 2839-2848 [ 1991]), oncostatin M (OSM) (Rose et al., Pr oc. Natl. Acad. Know. USA, £ 8: 8641-8645 [1991]) and also prolactin receptors (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. · USA, 88.:7744-7748 [1988]; Ederv et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2112-2116 [1989]), growth hormone (GH) (Leung et a 1., Nature, 33: 537-543 [1987]) and ciliary neurotrophic factor (CNTF) (Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991].

Os membros da superfamília de receptores de citocinas podem ser agrupados em três categorias funcionais (para revisão ver Nicola et al., Cell, 67:1-4 [1991]). A primeira classe compreende receptores de cadeia simples, tais como reeptor da eritropoietina (EPO-R) ou receptor do factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF-R), os quais se ligam ao ligando com elevada afinidade via domínio extracelular e também geram um sinal intracelular. Uma segunda classe de receptores, designados subunidades a, inclui o receptor da interleuquina-6 (IL-6R), receptor do factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF-R), receptor da interleuquina-3 (IL3-Rct) e outros membros da superfamília dos receptores de citocinas. Estas subunidades cr ligam-se ao ligando com baixa afinidade mas não podem transduzir um sinal intracelular. Um receptor de afinidade elevada capaz de sinalizar é gerado por um heterodímero entre uma subunidade cr e um membro de uma terceira classe de receptores de citocinas, designadas subunidades β, e.g., B_c,a subunidade β comumàs três subuindades cr IL3-Rcr e GM-CSF-R.Members of the cytokine receptor superfamily can be grouped into three functional categories (for review see Nicola et al., Cell, 67: 1-4 [1991]). The first class comprises single chain receptors, such as erythropoietin reeptor (EPO-R) or granulocyte colony stimulating factor receptor (G-CSF-R), which bind to the ligand with high affinity via the extracellular domain and also generate an intracellular signal. A second class of receptors, called a subunits, includes the interleukin-6 receptor (IL-6R), granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor (GM-CSF-R), interleukin-3 receptor (IL3-Rct ) and other members of the cytokine receptor superfamily. These cr subunits bind to the ligand with low affinity but cannot transduce an intracellular signal. A high affinity receptor capable of signaling is generated by a heterodimer between a cr subunit and a member of a third class of cytokine receptors, called β subunits, eg, B _c , the β subunit common to the three cr IL3-Rcr and GM subunits -CSF-R.

A evidência de que mpl é um membro da superfamília de receptores de citocinas vem da homologia de sequências (Gearing, EMBO J., 8:3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. SCi. USA, 87.:6834-6938 [1990]; Davis et al. . . Science, 253:59-63 [1991] e Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89.:5640-5644 [1992]) e a sua capacidade para transduzir sinais proliferativos.The evidence that mpl is a member of the cytokine receptor superfamily comes from sequence homology (Gearing, EMBO J., 8: 3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. SCi. USA, 87 .: 6834-6938 [1990]; Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991] and Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89.:5640-5644 [1992]) and its ability to transduce proliferative signals.

rr

A sequência deduzida da proteína a partir de clonagem molecular de c-mpl de murganho revela que esta proteína é homóloga de outros receptores de citocinas. O domínio extracelular contem 465 resíduos de aminoácidos e é composto por dois subdomínios cada um deles com quatro císteinas altamente conservadas e um motivo particular no subdomínio N-terminal e no subdomínio C-terminal. Previu-se que os domínios extracelulares de ligação ao ligando possuem geometrias estruturais enroladas em barril β duplo semelhantes. Este domínio extracelular duplicado é altamente homólogo da cadeia transdutora de sinal comum aos receptores de IL-3, IL-5 e GM-CSF assim como o domínio de ligação de baixa afinidade de LIF (Vigon et al. , Oncogene, 8.:2607-2615 [1993]) . Assim, mpl pode pertencer à classe de ligação ao ligando com baixa afinidade dos receptores das citocinas.The deduced sequence of the protein from the molecular cloning of mouse c-mpl reveals that this protein is homologous to other cytokine receptors. The extracellular domain contains 465 amino acid residues and is composed of two subdomains each with four highly conserved cysteines and a particular motif in the N-terminal and C-terminal subdomains. The extracellular ligand-binding domains were predicted to have similar structural geometries wrapped in double β-barrel. This duplicated extracellular domain is highly homologous to the signal transducer chain common to IL-3, IL-5 and GM-CSF receptors as well as the low affinity binding domain of LIF (Vigon et al., Oncogene, 8.:2607 -2615 [1993]). Thus, mpl may belong to the ligand binding class with low affinity for cytokine receptors.

Uma comparação entre mpl de murganho e mpl P humana madura, revela que estas duas proteínas possuem 81% de identidade de sequências. Mais especificamente, os subdomínios extracelulares do extremo Ne do extremo C partilham 75% e 80% de identidade de sequências respectivamente. A região mpl mais conservada é o domínio citoplasmático apresentando 91% de identidade de aminoácidos, com uma sequência de 37 resíduos perto do domínio transmembranar idêntica em ambas as espécies. Assim, mpl é descrito como sendo um dos membros mais conservados da superfamília de receptores de citocinas (Vigon supra).A comparison between mouse mpl and mature human mpl P reveals that these two proteins have 81% sequence identity. More specifically, the C- and N-terminal extracellular subdomains share 75% and 80% sequence identity respectively. The most conserved mpl region is the cytoplasmic domain presenting 91% amino acid identity, with a sequence of 37 residues close to the identical transmembrane domain in both species. Thus, mpl is described as being one of the most conserved members of the cytokine receptor superfamily (Vigon supra).

A evidência de que mpl é um receptor funcional capaz de transduzir um sinal proliferativo vem da construção de receptores quiméricos contendoum domínio extracelular derivado de um receptor de citocinas tendo afinidade elevada para uma citocina conhecida com o domínio citoplasmático de mpl. Uma vez que não foi descrito qualquer ligando conhecido para mpl, foi necessário construir o domínio extracelular quimérico de ligação a ligando com alta afinidade derivado de um receptor de citocinas classe um como seja IL-4R ou rThe evidence that mpl is a functional receptor capable of transducing a proliferative signal comes from the construction of chimeric receptors containing an extracellular domain derived from a cytokine receptor having high affinity for a known cytokine with the cytoplasmic domain of mpl. Since no known ligand for mpl has been described, it was necessary to construct the chimeric extracellular ligand-binding domain with high affinity derived from a class one cytokine receptor such as IL-4R or r

G-CSFR. Vigon et al·., supra, fundido com o domínio extracelular de G-CSFR com os domínios transmembranar e citoplasmático de c-mpl. Um linha celular dependente de IL-3, BAF/B03 (Ba/F3) foi transfectada com a quimera G-CSFR/mpl juntamente com uma testemunha G-CSFR de tamanho completo. As células transfectadas com a quimera cresceram igualmente bem na presença de citocina IL-3 ou G-CSF. De forma semelhante, as células transfectadas com G-CSFR também cresceram bem com IL-3 ou G-CSF. Todas as células morreram na ausência de factores de crescimento. Uma experiência semelhante foi conduzida por Skoda et a 1., EMBO J., 12 (7):2645-2653 [1983] em que tanto os domínios transmembranar como extracelular do receptor de IL-4 humano (hIL-4-R) foram fundidos com o domínio citoplasmático de mplde murganho e usados para transfectar a linha celular de murganho Ba/F3 dependente de IL-3. As células Ba/F3 transfectadas com hIL-4-R tipo selvagem proliferaram normalmente na presença de IL-4 ou IL-3 específicas de espécie. As células Ba/F3 transfectadas com hIL-4R/mpl proliferaram, normalmente na presença de hIL-4 (na presença ou ausência de IL-3) demonstrando que nas células Ba/F3 o domínio citoplasmático de mpl contem todos os elementos necessários para transduzir um sinal proliferativo.G-CSFR. Vigon et al ·., Supra, fused with the extracellular domain of G-CSFR with the transmembrane and cytoplasmic domains of c-mpl. An IL-3-dependent cell line, BAF / B03 (Ba / F3) was transfected with the G-CSFR / mpl chimera together with a full-sized G-CSFR control. The cells transfected with the chimera grew equally well in the presence of cytokine IL-3 or G-CSF. Similarly, cells transfected with G-CSFR also grew well with IL-3 or G-CSF. All cells died in the absence of growth factors. A similar experiment was conducted by Skoda et a 1., EMBO J., 12 (7): 2645-2653 [1983] in which both the transmembrane and extracellular domains of the human IL-4 receptor (hIL-4-R) were fused to the mouse mploid cytoplasmic domain and used to transfect the IL-3 dependent Ba / F3 mouse cell line. Ba / F3 cells transfected with wild-type hIL-4-R proliferated normally in the presence of species-specific IL-4 or IL-3. Ba / F3 cells transfected with hIL-4R / mpl proliferated, usually in the presence of hIL-4 (in the presence or absence of IL-3) demonstrating that in Ba / F3 cells the cytoplasmic mpl domain contains all the elements necessary to transduce a proliferative signal.

Estas experiências com quimeras demonstram a capacidade de sinalizar a proliferação do domínio citoplasmático de mpl mas não dizem nada relativamente a se o domínio extracelular de mpl pode ligar um ligando. Estes resultados são consistentes com pelo menos duas possibilidades, designadamente, mpl é um receptor de cadeia simples (classe um) tipo EPO-R ou G-CSFR ou é uma subunidade Btransdutora de sinal (classe três) requerendo uma subunidade a como IL-3 (Skoda et al. supra).These chimera experiments demonstrate the ability to signal the proliferation of the cytoplasmic domain of mpl but say nothing as to whether the extracellular domain of mpl can bind a ligand. These results are consistent with at least two possibilities, namely, mpl is a single chain receptor (class one) type EPO-R or G-CSFR or is a signal transducer B-subunit (class three) requiring a subunit a such as IL-3 (Skoda et al. Supra).

VI. O Ligando mpl é uma Trombopoietina (TPO)SAW. Ligand mpl is a Thrombopoietin (TPO)

Como descrito atrás, foi sugerido que o soroAs described above, it has been suggested that serum

contem um factor único, por vezes referido como trombopoietina (TPO), que actua sinergisticamente com outras citocinas para promover o crescimento e maturação de megacariócitos. Nunca foi isolado tal factor natural a partir do soro ou de qualguer outra fonte apesar de ter sido dispendido grnade esforço por numerosos grupos. Mesmo assim não se sabe se mpl é capaz de se ligar directamente a um factor estimulador de megacariócitos, experiências recentes demonstraram que mpl está envolvido na transdução de sinal a partir de um factor ou factores encontrados no soro de doentes com medula óssea aplástica (Methia et al., Blood, 82.(5):1395-1401 [ 1993 ]).contains a unique factor, sometimes referred to as thrombopoietin (TPO), which acts synergistically with other cytokines to promote the growth and maturation of megakaryocytes. Such a natural factor has never been isolated from serum or any other source despite the fact that great effort has been expended by numerous groups. Even so, it is not known whether mpl is able to bind directly to a megakaryocyte stimulating factor, recent experiments have shown that mpl is involved in signal transduction from a factor or factors found in the serum of patients with aplastic bone marrow (Methia et al., Blood, 82. (5): 1395-1401 [1993]).

A evidência de que um factor único do soro formador de colónias distinto de IL-Ια, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF e GM-CSF tranduz um sinal proliferativo através de mpl deriva do estudo da distribuição da expressão de c-mpl em linhas celulares primitivas e hematopoiéticas comprometidas e de estudos com anticodões de mpl numa destas linhas celulares.Evidence that a single colony-forming factor other than IL-Ια, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF and GM-CSF translates a proliferative signal through of mpl derives from the study of the distribution of expression of c-mpl in primitive and hematopoietic cell lines compromised and from studies with anti-codons of mpl in one of these cell lines.

Usando PCR com transcriptase reversa (RT)-PCR em células hematopoiéticas humanas imunopurifiçadas, Methia et al., supra demonstraram que só se encontravam mensageiros abundantes de mpl em células purificadas CD34 , megacariócitos e plaquetas. As células CD34⁺ purificadas a partir de medula óssea (BM) representam cerca de 1% de todas as células BM e estão enriquecidas em progenitores primitivos e comprometidos de todas as linhagens (e.g., eritróide, granulomacrófago e megacariocítico).Using PCR with reverse transcriptase (RT) -PCR in immunopurified human hematopoietic cells, Methia et al., Supra demonstrated that only abundant mpl messengers were found in purified CD34 cells, megakaryocytes and platelets. CD34 ⁺ cells purified from bone marrow (BM) represent about 1% of all BM cells and are enriched in primitive and compromised progenitors of all strains (eg, erythroid, granulomacrophage and megakaryocytic).

Encontrou-se que oligodesoxinucleótidos anticodão de mpl suprimem a formação de colónias megacariocíticas a partir de células CD34⁺ pluripotentes cultivadas em soro de doentes com medula aplástica (uma fonte rica de actividade estimuladora de colónias megacariocíticas [MK-CSA]). EstesAnti-cpl mpl oligodeoxynucleotides have been found to suppress the formation of megakaryocytic colonies from CD34 ⁺ pluripotent cells cultured in serum from patients with aplastic marrow (a rich source of megakaryocytic colony stimulating activity [MK-CSA]). These

mesmos oligodesoxinucleótidos anticodão nao têm efeito na formação de colónias eritróides ou de granulomacrófagos.the same anti-cotton oligodeoxynucleotides have no effect on the formation of erythroid or granulomacrophage colonies.

Se mpl ligou directamente um ligando e se o factor do soro que se mostrou causar megacariocitopoiese actuou através de mpl era ainda desconhecido. No entanto, foi sugerido que se mpl se liga directamente a um ligando, a sua sequência de aminoácidos provavelmente seria altamente conservada e daria reacção cruzada entre espécies devido à considerável identidade de sequências entre domínios extracelulares de mpl humano e de murganho. (Vigon et al., supra [ 19 9 3]) .Whether mpl directly linked a ligand and whether the serum factor that was shown to cause megakaryocytopoiesis acted through mpl was still unknown. However, it has been suggested that if mpl binds directly to a ligand, its amino acid sequence is likely to be highly conserved and cross-species due to the considerable sequence identity between extracellular domains of human and mouse mpl. (Vigon et al., Supra [19 9 3]).

VII. ObjectivosVII. Objectives

Face ao que foi dito, poderá ser apreciado que existe uma necessidade corrente e contínua de isolar e identificar moléculas capazes de estimularem a proliferação, diferenciação e maturação de células hematopoiéticas, especialmente megacariócitos ou seus predecessores para uso terapêutico no tratamento de trombocitopenia. Pensa-se que tal molécula seja um ligando de mpl e portanto existe ainda a necessidade de isolar tal ou tais ligandos para avliar os seus papéis no crescimento e diferenciação celulares.In light of what has been said, it may be appreciated that there is a current and continuous need to isolate and identify molecules capable of stimulating the proliferation, differentiation and maturation of hematopoietic cells, especially megakaryocytes or their predecessors for therapeutic use in the treatment of thrombocytopenia. Such a molecule is thought to be a mpl ligand and therefore there is still a need to isolate such or such ligands to assess their roles in cell growth and differentiation.

Assim, é um objectivo deste invento obter uma molécula farmaceuticamente pura capaz de estimular a proliferação, diferenciação e/ou maturação de megacariócitos para a forma madura produtora de plaquetas.Thus, it is an object of this invention to obtain a pharmaceutically pure molecule capable of stimulating megakaryocyte proliferation, differentiation and / or maturation to the mature platelet-producing form.

Um outro objectivo é conseguir a molécula numa forma para uso terapêutico no tratamento de de uma perturbação hematopoiética, especialmente trombocitopenia.Another objective is to get the molecule in a form for therapeutic use in the treatment of a hematopoietic disorder, especially thrombocytopenia.

É ainda um outro objectivo do presente invento isolar, purificar e especificamente identificar ligandos proteicos capazes de se ligarem in vivo a um receptor da rIt is yet another object of the present invention to isolate, purify and specifically identify protein ligands capable of binding in vivo to a receptor for fr

superfamília das citocinas conhecido como mpl e transduzir um sinal 1imfoproliferativo.superfamily of cytokines known as mpl and transducing an 1imfoproliferative signal.

Constitui ainda um outro objectivo proporcionar moléculas de ácido nucleico codificadoras de tais ligandos proteicos e usar estas moléculas para produzir ligandos de mpl em culturas de células recombinantes para diagnóstico e uso terapêutico.It is a further object to provide nucleic acid molecules encoding such protein ligands and to use these molecules to produce mpl ligands in recombinant cell cultures for diagnostic and therapeutic use.

É ainda um outro objectivo proporcionar derivados e formas modificadas dos ligandos proteicos incluindo variantes da sequência de aminoácidos, formas glicoproteicas variantes e seus derivados covalentes.It is yet another object to provide derivatives and modified forms of protein ligands including variants of the amino acid sequence, variant glycoprotein forms and their covalent derivatives.

Ainda um outro objectivo é proporcionar formas polipeptidicas variantes combinando um ligando de mpl com adições de aminoácidos e substituições a partir da sequência de EPO para produzir uma proteína capaz de regular a proliferação e crescimento de plaquetas e de células progenitoras de eritrócitos.Yet another object is to provide variant polypeptide forms by combining a mpl ligand with amino acid additions and substitutions from the EPO sequence to produce a protein capable of regulating the proliferation and growth of platelets and erythrocyte progenitor cells.

Constitui um objectivo adicional preparar imunogénios para induzir anticorpos contra ligandos de mpl ou suas formas de fusão, assim como para obter anticorpos capazes de se ligarem a tais ligandos.It is an additional object to prepare immunogens to induce antibodies against mpl ligands or their fusion forms, as well as to obtain antibodies capable of binding to such ligands.

Estes e outros objectivos do invento serão óbvios para os familiarizados com a áreaquando considerando a especificação como um todo.These and other objectives of the invention will be obvious to those familiar with the field when considering the specification as a whole.

SUMÁRIO DO INVENTOSUMMARY OF THE INVENTION

Os objectivos do invento são conseguidos proporcionando uma proteína isolada promotora da proliferação e maturação megacariocitopoiética de mamífero, denominada ligando de mpl (ML) ou trombopoietina (TPO), capaz deThe objectives of the invention are achieved by providing an isolated protein that promotes proliferation and megakaryocytopoietic maturation of mammal, called ligand of mpl (ML) or thrombopoietin (TPO), capable of

estimular a proliferação, maturação e/ou diferenciação de megacariócitos na forma madura produtora de plaquetas.stimulate the proliferation, maturation and / or differentiation of megakaryocytes in the mature platelet-producing form.

Esta proteína substancialmente homogénea pode ser purificada a partir de uma fonte natural por um método caracterizado por; (1) pôr em contacto um plasma contendo as moléculas do ligando de mpl a serem purificadas com um polipeptídeo receptor imobilizado, especificamente mpl ou um polipeptídeo de fusão de mpl num suporte, em condições que as moléculas de ligando a mpl a serem purificadas sejam selectivamente adsorvidas ao polipeptídeo receptor imobilizado, (2) lavagem do polipeptídeo receptor imobilizado e seu suporte para remover material não adsorvido e (3) eluição das moléculas de ligando de mpl a partir do polipeptídeo receptor imobilizado ao qual adsorveram com um tampão de eluição. De preferência a fonte natural é plasma de mamífero ou urina contendo o ligando de mpl. Facultativamente o mamífero é aplástico e o receptor imobilizado é um uma fusão mpl-IqG.This substantially homogeneous protein can be purified from a natural source by a method characterized by; (1) contacting a plasma containing the mpl ligand molecules to be purified with an immobilized receptor polypeptide, specifically mpl or a mpl fusion polypeptide on a support, under conditions that the mpl ligand molecules to be purified are selectively adsorbed to the immobilized receptor polypeptide, (2) washing the immobilized receptor polypeptide and its support to remove unabsorbed material and (3) eluting the mpl ligand molecules from the immobilized receptor polypeptide to which they have adsorbed with an elution buffer. Preferably the natural source is mammalian plasma or urine containing the mpl ligand. Optionally, the mammal is aplastic and the immobilized receptor is an mpl-IqG fusion.

Facultativamente, a proteína promotora de proliferção e maturação megacariocitopoiéticas preferida é um polipeptídeo ligando de mpl isolado e substancialmente homogéneo feito por meios sintéticos ou recombinantes. 0 polipeptídeo ligando de mpl ou TPO deste invento de preferência tem pelo menos 70% de identidade global de sequências com a sequência de aminoácidos do polipeptídeoligando de mpl de porco substancialmente homogéneo e altamente purificadoe pelo menos 80% de identidade de sequências com o domínio EPO do polipeptídeo ligando de mpl de porco. Facultativamente, o ligando de mpl deste invento é um ligando de mpl humano (hML) maduro tendo a sequência de aminoácidos madura fornecida na Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) ou uma variante ou sua forma modificada após transcrição ou uma proteína tendo cerca de 80% de identidade de sequências como ligando de mpl humano maduro. Facultativamente a variante do ligando de mpl é um fragmento, especialmente um extremoOptionally, the preferred megakaryocytopoietic proliferation and maturation promoting protein is an isolated and substantially homogeneous mpl ligand polypeptide made by synthetic or recombinant means. The mpl ligand polypeptide or TPO of this invention preferably has at least 70% overall sequence identity with the substantially homogeneous and highly purified pig mpl polypeptide ligand amino acid and at least 80% sequence identity with the EPO domain of the pig mpl ligand polypeptide. Optionally, the mpl ligand of this invention is a mature human mpl ligand (hML) having the mature amino acid sequence provided in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) or a variant or its modified form after transcription or a protein having about 80% sequence identity as a mature human mpl ligand. Optionally the variant of the mpl ligand is a fragment, especially an extreme

amina ou o fragmento domínio EPO do ligando de mpl humano (hML) maduro. De preferência o fragmento do extremo amina retem substancialmente toda a sequência ML humana entre o primeiro e o quarto resíduos de císteina mas pode conter adições substanciais, deleções ou substituições fora daquela região. De acordo com esta realização, o fragmento polipeptídico pode ser representado pela fórmula:amine or the EPO domain fragment of the mature human mpl ligand (hML). Preferably, the amine end fragment retains substantially the entire human ML sequence between the first and the fourth cysteine residues but may contain substantial additions, deletions or substitutions outside that region. According to this embodiment, the polypeptide fragment can be represented by the formula:

X-hML(7-151)-Y onde hML(7-151) representa a sequência de amino*7 ácidos de TPO (hML) humano desde Cis até Cis inclusive;X-hML (7-151) -Y where hML (7-151) represents the amino acid sequence * 7 of human TPO (hML) from Cys to Cys inclusive;

X representa o grupo amina de Cis⁷ ou um ou mais dos resíduos de aminoácidos do extremo amina de hML madura ou as extensões de resíduos de aminoácidos dele tais como Met, Tir ou sequências líder contendo, por exemplo, sítios de clivagem proteolítica (e.g. Factor Xa ou trombina); e Y represen. 151 ta o grupo terminal carbonilo de Cis ou um ou mais resíduos de aminoácidos do . extremo carbonilo de hMl madura ou suas extensões.X represents the Cys ⁷ amino group or one or more of the amino acid residues of the mature hML amino end or the extensions of amino acid residues therein such as Met, Tir or leader sequences containing, for example, proteolytic cleavage sites (eg Factor Xa or thrombin); and Y represent. 151 is the C1 carbonyl terminal group or one or more amino acid residues from. carbonyl end of mature hMl or its extensions.

Facultativamente o polipeptídeo ligando de mpl ou seu fragmento pode ser fundido com um polipeptídeo heterólo1 go (quimera). Um polipeptídeo heterólogo preferido é uma citocina, factor estimulador de colónias ou interleuquina ou seu fragmento, especialmente um ligando de kit (KL), IL-1,Optionally the mpl ligand polypeptide or fragment thereof can be fused to a heterologous (chimera) polypeptide. A preferred heterologous polypeptide is a cytokine, colony stimulating factor or interleukin or its fragment, especially a kit ligand (KL), IL-1,

IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF ou LIF. Um polipeptídeo heterólogo preferido é uma cadeia de imunoglobulina, espe) cialmente IgGl humana, IgG2, IgG3, IgG4, IGA, IgE, IgD, IgM ou seu fragmento, especialmente compreendendo o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG.IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF or LIF. A preferred heterologous polypeptide is an immunoglobulin chain, especially human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IGA, IgE, IgD, IgM or its fragment, especially comprising the constant domain of an IgG heavy chain.

Um outro aspecto deste invento proporciona uma composição compreendendo um agonista isolado de mpl que é biologicamente activo e é de preferência capaz de estimular 3 . .Another aspect of this invention provides a composition comprising an isolated mpl agonist that is biologically active and is preferably capable of stimulating 3. .

a incorporação de nucleótidos marcados (e.g., H-timidina) no DNA de células Ba/F3 dependentes de IL_3 transfectadas com mpl humano. Facultativamente o agonista de mol é o ligando de mol biologicamente activo e é de preferênciathe incorporation of labeled nucleotides (e.g., H-thymidine) in the DNA of IL_3-dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl. Optionally the mole agonist is the biologically active mole ligand and is preferably

5 capaz de estimular a incorporação de S nas plaquetas circulantes num ensaio de plaquetas religadas de murganho. O agonista de mpl adequado inclui hML>₁₅₃, hML(R153A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2 , mML3, pML e pML2 ou seus fragmentos.5 capable of stimulating the incorporation of S into circulating platelets in a mouse reconnected platelet assay. The suitable mpl agonist includes hML> ₁₅₃ , hML (R153A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML and pML2 or fragments thereof.

Numa outra realização, este invento proporciona um anticorpo isolado capaz de se ligar ao ligando de mol. O anticorpo isolado capaz de se ligar ao ligando de mplpode ser facultativamente fundido com um segundo polipeptídeo e o anticorpo ou seu produto de fusão pode ser usado para isolar e purificar o ligando de mpl a partir de uma fonte como descrito para mpl imobilizado. Num outro aspecto desta realização, o invento proporciona um método para a detecção do ligando de mpl in vitro ou in vivo caracterizado por se pôr em contacto o anticorpo com uma amostra, especialmente uma amostra de soro suspeita de conter o ligando e detecção da ligação.In another embodiment, this invention provides an isolated antibody capable of binding the mol ligand. The isolated antibody capable of binding to the mpl ligand may optionally be fused to a second polypeptide and the antibody or its fusion product can be used to isolate and purify the mpl ligand from a source as described for immobilized mpl. In another aspect of this embodiment, the invention provides a method for detecting the mpl ligand in vitro or in vivo characterized by contacting the antibody with a sample, especially a serum sample suspected of containing the ligand and detecting binding.

Ainda noutras realizações, o invento proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada, codificadora do ligando mpl ou seus fragmentos, essa molécula de ácido nucleico tendo uma sequência que é complementar ou que hibrida em condições altamente restringentes com uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência codificadora de um ligando de mpl. As moléculas de ácido nucleico preferidas são as codificadoras do ligando de mpl humano, de porco e de murganho e incluem RNA e DNA, genómico ou cDNA. Num outro aspecto desta realização, a molécula de ácido nucleico é DNA codificador do ligando de mpl e ainda compreende um vector replicável em que o DNA está operacionalmente ligado a sequências de controle reconhecidas por um hospedeiro transformado com o vector. Facultativamente o DNA é cDNA tendo a sequência apresentada na Fig. 1 5'-3' (SEQ ID NO:In still other embodiments, the invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding the mpl ligand or fragments thereof, that nucleic acid molecule having a sequence that is complementary or that hybridizes under highly stringent conditions to a nucleic acid molecule having the coding sequence of an mpl ligand. Preferred nucleic acid molecules are those encoding the human, pig and mouse mpl ligand and include RNA and DNA, genomic or cDNA. In another aspect of this embodiment, the nucleic acid molecule is DNA encoding the mpl ligand and further comprises a replicable vector in which the DNA is operably linked to control sequences recognized by a host transformed with the vector. Optionally the DNA is cDNA having the sequence shown in Fig. 1 5'-3 '(SEQ ID NO:

2), 3'-5' ou um seu fragmento. Este aspecto inclui ainda células hospedeiras, de preferência células CHO, transformadas com o vector e um método de usar o DNA para efectuar a produção do ligando de mpl, de preferência compreendendo a a expressão de cDNA codificador do ligando de mpl numa cultura das células hospedeiras transformadas e recuperação do ligando de mpl a partir daas células hospedeiras ou da cultura de células hospedeiras. 0 ligando de mpl preparado desta forma é de preferência o ligando de mpl humano.2), 3'-5 'or a fragment thereof. This aspect further includes host cells, preferably CHO cells, transformed with the vector and a method of using DNA to effect the production of the mpl ligand, preferably comprising the expression of cDNA encoding the mpl ligand in a culture of the transformed host cells. and recovering the mpl ligand from host cells or host cell culture. The mpl ligand prepared in this way is preferably the human mpl ligand.

O invento inclui ainda um método para o tratamento de um mamífero tendo uma perturbação hematopoiética, especialmente trombocitopenia, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligando de mpl a um mamífero. Facultativamente o ligando de mpl é administrado em combinação com uma citocina, especialmente um factor estimulador de colónias ou interleucina. Os factores estimuladores de colónias preferidos ou interleucina incluem; ligando de kit (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 e IL-11. ,The invention further includes a method for treating a mammal having a hematopoietic disorder, especially thrombocytopenia, comprising administering a therapeutically effective amount of a mpl ligand to a mammal. Optionally, the mpl ligand is administered in combination with a cytokine, especially a colony stimulating factor or interleukin. Preferred colony stimulating factors or interleukin include; kit ligand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 and IL-11. ,

O invento inclui ainda um processo para o isolamento e purificação de TPO (ML) a partir de um microorganismo produtor de TPO caracterizado por:The invention also includes a process for the isolation and purification of TPO (ML) from a TPO-producing microorganism characterized by:

(1) destruição ou lise das células contendo TPO, (2) separação facultativa do material solúvel e insolúvel contendo TPO, (3) solubilização do TPO no material insolúvel com um tampão solubilizante, (4) separação do TPO solubilizado de outro material solúvel e insolúvel, (5) renaturação de TPO num tampão redox e (6) separação do TPO correctamente renaturado do mal renaturado.(1) destruction or lysis of cells containing TPO, (2) optional separation of soluble and insoluble material containing TPO, (3) solubilization of TPO in insoluble material with a solubilizing buffer, (4) separation of solubilized TPO from other soluble material and insoluble, (5) renaturation of TPO in a redox buffer and (6) separation of correctly renatured TPO from renatured evil.

O processo proporciona a solubilização do material insolúvel contendo TPO com um agente caotrópico em que o agente caotrópico é seleccionado de entre um sal de guanidina, tiocianato de sódio ou ureia. 0 processo proporciona aind a separação do TPO solubilizado de outro material solúvel e insolúvel em um ou mais passos seleccionados entre centrifugação, filtração em gel e cromatografia de fase reversa. O passo de reenrolamento do processo proporcionado por um tampão redox contendo um agente oxidante e um agente redutor. De uma forma geral o agente oxidante é oxigénio ou um composto contendo pelo menos uma ligação dissulfureto e o agente redutor é um composto contendo pelo menos um sulfidrilo livre. De preferência, o agente oxidante é seleccionado entre glutationa oxidada (GSSG) e cistina e o agente redutor é seleccionado entre glutationa reduzida (GSH) e císteina. Mais preferencialmente o agente oxidante é glutationa oxidada (GSSG) e o agente redutor é glutationa reduzida (GSH). Prefere-se também que a proporção molar do agente oxidante seja igual ou superior à do agente redutor. 0 tampão redox contem ainda um detergente, de preferência seleccionado entre CHAPS e CHAPSO, presente num nível de pelo menos 1%. 0 tampão redox contem ainda NaCl preferencialmente numa gama de concentrações de aproximadamente 0,1-0,5 M e glicerol preferencialmente numa concentração superior a 15%. 0 pH do tampãp redox de preferência varia entre pH 7,5 e pH 9,0 e o passo de renaturação é conduzido a 4 graus durante cerca de 12-48 horas. 0 passo de renaturação produz TPO biologicamente activo em que a ligação dissulfureto se forma entre a Cis mais perto do extremo amina e a Cis mais perto do extremo carbonilo do domínio de EPO.The process provides for the solubilization of insoluble material containing TPO with a chaotropic agent in which the chaotropic agent is selected from a salt of guanidine, sodium thiocyanate or urea. The process further provides for the separation of the solubilized TPO from another soluble and insoluble material in one or more steps selected from centrifugation, gel filtration and reverse phase chromatography. The rewinding step of the process is provided by a redox buffer containing an oxidizing agent and a reducing agent. In general, the oxidizing agent is oxygen or a compound containing at least one disulfide bond and the reducing agent is a compound containing at least one free sulfhydryl. Preferably, the oxidizing agent is selected from oxidized glutathione (GSSG) and cystine and the reducing agent is selected from reduced glutathione (GSH) and cysteine. Most preferably the oxidizing agent is oxidized glutathione (GSSG) and the reducing agent is reduced glutathione (GSH). It is also preferred that the molar ratio of the oxidizing agent is equal to or greater than that of the reducing agent. The redox buffer also contains a detergent, preferably selected from CHAPS and CHAPSO, present at a level of at least 1%. The redox buffer further contains NaCl preferably in a concentration range of approximately 0.1-0.5 M and glycerol preferably in a concentration greater than 15%. The pH of the redox buffer preferably ranges between pH 7.5 and pH 9.0 and the renaturation step is carried out at 4 degrees for about 12-48 hours. The renaturation step produces biologically active TPO in which the disulfide bond forms between the Cis closest to the amine end and the Cis closest to the carbonyl end of the EPO domain.

O invento inclui ainda um processo para a purificação de TPO biologicamente activo a partir de um microorganismo caracterizado por:The invention further includes a process for the purification of biologically active TPO from a microorganism characterized by:

r (1) lise de pelo menos a membrana extracelular do microorganismo, (2) tratamento do lisado contendo TPO com um agente caotrópico, (3) reenrolamento do TPO e (4) separação de impurezas e TPO mal renaturado do TPO correctamente renaturado.r (1) lysis of at least the extracellular membrane of the microorganism, (2) treatment of the TPO-containing lysate with a chaotropic agent, (3) refolding of the TPO and (4) separation of impurities and poorly renatured TPO from the correctly renatured TPO.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Fig. 1 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) do cDNA do ligando de mpl humano (hML) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 2). Os nucleótidos estão numerados no começo de cada linha. As regiões não traduzidas 5' e 3' estão indicadas estão indicadas com letras minúsculas. Os resíduos de aminoácidos estão numerados por cima da sequência começando na Ser 1 da sequência proteica do ligando de mpl maduro. As fronteiras do presumido exão estão indicadas pelas setas e os potenciais sítios de N-glicosilação estão enquadrados. Os resíduos de císteina estão indicados por uma vírgula acima da sequência.A sequência sublinhada corresponde à sequência N-terminal determinada a partir do ligando de mpl purificado a partir de plasma de porco.Fig. 1 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the human mpl ligand cDNA (hML) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2). The nucleotides are numbered at the beginning of each line. The 5 'and 3' untranslated regions are indicated with lowercase letters. The amino acid residues are numbered above the sequence starting at Ser 1 of the mature mpl ligand protein sequence. The boundaries of the presumed exon are indicated by arrows and the potential N-glycosylation sites are framed. Cysteine residues are indicated by a comma above the sequence. The underlined sequence corresponds to the N-terminal sequence determined from the mpl ligand purified from pig plasma.

Fig. 2 mostra o processo usado para o ensaio de 3 incorporação de H-timidina para o ligando de mpl. Para determinar a presença do ligando de mpl derivado de várias fontes, as células Ba/F3 com mpl foram cultivadas na ausência de IL-3 durante 24 horas numa câmara humidificada a 37°C em 5% de C0₂ e ar. Após ausência de IL-3 as células foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 96 cavidades com ou sem amostras diluídas e e cultivadas durante 24 horas numa câmara de cultura de tecidos. Adicionou-se 20 μΐ deFig. 2 shows the process used for the H-thymidine incorporation assay for the mpl ligand. To determine the presence of the mpl ligand derived from various sources, Ba / F3 cells with mpl were cultured in the absence of IL-3 for 24 hours in a humidified chamber at 37 ° C in 5% CO ₂ and air. After the absence of IL-3, cells were seeded in 96-well tissue culture plates with or without diluted samples and cultured for 24 hours in a tissue culture chamber. 20 μΐ of

meio RPMI sem soro contendo 1 μθί de H-timidina para as últimas 6-8 horas. As células foram então colhidas em placas de 96 cavidades com filtros e lavadas com água. Os filtros foram então contados.serum-free RPMI medium containing 1 μθί of H-thymidine for the last 6-8 hours. The cells were then harvested in 96-well plates with filters and washed with water. The filters were then counted.

Fig. 3 mostra o efeito da pronase, DTT e calor na capacidade de APP para estimular a proliferação das células Ba/F3-mpl. Para a digestão de APP com pronase esta enzima (Boehringer Mannheim) ou albumina sérica bovina foi acoplada a Affi-gellO (Biorad) e incubado individualmente com APP durante 18 horas a 37°C. Subsequentemente, as resinas foram removidas por centrifugação e testados os sobrenadantes. APP foi também aquecido a 80°C durante 4 min. ou ajustado a 100 μΜ de DTT seguido de diáise contra PBS.Fig. 3 shows the effect of pronase, DTT and heat on the ability of APP to stimulate the proliferation of Ba / F3-mpl cells. For digestion of APP with pronase, this enzyme (Boehringer Mannheim) or bovine serum albumin was coupled to Affi-gellO (Biorad) and incubated individually with APP for 18 hours at 37 ° C. Subsequently, the resins were removed by centrifugation and the supernatants were tested. APP was also heated to 80 ° C for 4 min. or adjusted to 100 μΜ of DTT followed by dialysis against PBS.

Fig. 4 mostra a eluição da actividade do ligando de mpl de colunas de Pheny1-Toyopearl, Blue-Sepharose e Ultralink-mpl. As fracções 4-8 da coluna de afinidade de mpl foram as fracções do pico de actividade eluidas da coluna.Fig. 4 shows the elution of mpl ligand activity from Pheny1-Toyopearl, Blue-Sepharose and Ultralink-mpl columns. Fractions 4-8 of the mpl affinity column were the peak activity fractions eluted from the column.

Fig. 5 mostra o SDS-PAGE das fracções eluidas de Ultralink-mpl. A 200 μΐάβ cada uma das fracções 2-8, adicionou-se 1 ml de acetona contendo HC1 1 mM a -20°C. Após 3 horas a -20°C as amostras foram centrifugadas e os sedimentos resultantes foram lavados 2 x com acetona a -20°C. Os sedimentos de acetona foram subsequentemente dissolvidos em 30 μΐ de tampão de solubilização com SDS, ajustado a 100 μΜ de DTT e aquecidos a 90°C durante 5 min. As amostras foram então separadas num gel de 4-20% SDS-poliacrilamida e as proteínas foram visualizadas por coloração com prata.Fig. 5 shows the SDS-PAGE of the eluted fractions of Ultralink-mpl. To 200 μΐάβ each of fractions 2-8, 1 ml of acetone containing 1 mM HCl at -20 ° C was added. After 3 hours at -20 ° C the samples were centrifuged and the resulting pellets were washed twice with acetone at -20 ° C. The acetone pellets were subsequently dissolved in 30 μΐ of SDS solubilization buffer, adjusted to 100 μΜ of DTT and heated at 90 ° C for 5 min. The samples were then separated on a 4-20% SDS-polyacrylamide gel and the proteins were visualized by silver staining.

Fig. 6 mostra a eluição da actividade do ligando de mpl de SDS-PAGE. A fracção 6 da coluna de afinidade de mpl foi separada num gel de 4-20% SDS-poliacrilamida em condições não redutoras. Após electroforese o gel foi cortado em 12 regiões iguais e electroeluidas como descrito nos exemplos. As amostras electroeluidas foram dialisadas rFig. 6 shows the elution of SDS-PAGE mpl ligand activity. Fraction 6 of the mpl affinity column was separated on a 4-20% SDS-polyacrylamide gel under non-reducing conditions. After electrophoresis the gel was cut into 12 equal regions and electroeluted as described in the examples. Electro-eluted samples were dialyzed r

contra PBS e testadas numa diluição de 1/20. Os padrões de PM usados para calibrar o gel foram 12 padrões Novex Mark.against PBS and tested at a 1/20 dilution. The PM standards used to calibrate the gel were 12 Novex Mark standards.

Fig. 7 mostra o efeito do APP sem ligando de mpl sobre megacariocitopoiese humana. APP sem ligando de mpl foi obtido fazendo passar 1 ml numa coluna de afinidade de mpl de 1 ml (700 Mg de mpl-IqG/ml NHS-superose, Pharmacia). Culturas de células esteminais periféricas humanas foram ajustadas a 10% de APP ou a 10% de APP sem ligando de mpl e cultivadas durante 12 dias. A megacariocitopoiese foi quantificada como descrito nos exemplos.Fig. 7 shows the effect of APP without mpl ligand on human megakaryocytopoiesis. APP without mpl ligand was obtained by passing 1 ml on a 1 ml mpl affinity column (700 mg mpl-IqG / ml NHS-superose, Pharmacia). Cultures of human peripheral stem cells were adjusted to 10% APP or 10% APP without mpl ligand and cultured for 12 days. Megakaryocytopoiesis was quantified as described in the examples.

Fig. 8 mostra o efeito de mpl-IqGna estimulação de megacariocitopoiese humana por APP. As culturas de células esteminais periféricas humanas foram ajustadas a 10% com APP e cultivadas durante 12 dias. No dia 0, 2 e 4, adicionou-se mpl-IqG (0,5 Mg) ou ANP-R-IgG (0,5 M9)· Após 12 dias a megacariocitopoiese foi quantificada como descrito nos exemplos. A média de amostras em duplicado foi colocada em gráfico com os resultados reais dos duplicados entre parêntesis .Fig. 8 shows the effect of mpl-IqG on stimulation of human megakaryocytopoiesis by APP. Cultures of human peripheral stem cells were adjusted to 10% with APP and cultured for 12 days. On day 0, 2 and 4, mpl-IqG (0.5 Mg) or ANP-R-IgG (0.5 M9) was added · After 12 days, megakaryocytopoiesis was quantified as described in the examples. The average of duplicate samples was plotted with the actual results of the duplicates in parentheses.

Fig. 9 mostra ambas as cadeias de um fragmento de 390 pb de DNA genómico humano codificador do ligando de mpl. Estão apresentadas a sequência de aminoácidos deduzida do exão 3 (SEQ ID NO: 3), a sequência codificadora (SEQ ID NO: 4) e o seu complemento (SEQ ID NO: 5)Fig. 9 shows both strands of a 390 bp fragment of human genomic DNA encoding the mpl ligand. The amino acid sequence deduced from exon 3 (SEQ ID NO: 3), the coding sequence (SEQ ID NO: 4) and its complement (SEQ ID NO: 5) are shown

Fig. 10 mostra a sequência de aminoácidos deduzida do ligando de mpl humano (hML) maduro (SEQ ID NO: 6) e eritropoietina humana madura (hEPO) (SEQ ID NO: 7). A sequência de aminoácidos prevista para humano está alinhada com a sequência o ligando de mpl da eritropoietina humana. Os aminoácidos idênticos estão enquadrados e os intervalos introduzidos para um alinhamento óptimo estão indicados por traços. Os potenciais sítios de N-glicosila ção estão sublinhados com uma linha a cheio para hML e com rFig. 10 shows the deduced amino acid sequence of mature human mpl ligand (hML) (SEQ ID NO: 6) and mature human erythropoietin (hEPO) (SEQ ID NO: 7). The predicted human amino acid sequence is aligned with the human erythropoietin mpl ligand sequence. The identical amino acids are framed and the ranges entered for optimal alignment are indicated by dashes. Potential N-glycosylation sites are underlined with a solid line for hML and with r

uma linha a tracejado para hEPO. As duas císteinas importantes para a actividade de eritropoietina estão indicadas por um ponto grande.a dashed line for hEPO. The two cysteines important for erythropoietin activity are indicated by a large dot.

Fig. 11 mostra a sequência de aminoácidos deduzida de isoformas do ligando de mpl maduro hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) e hML4 (SEQ ID NO: 10). Os aminoácidos idênticos estão enquadrados e os intervalos introduzidos para um alinhamento óptimo estão indicados por traços.Fig. 11 shows the deduced amino acid sequence of mature mpl ligand isoforms hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) and hML4 (SEQ ID NO: 10 ). The identical amino acids are framed and the ranges entered for optimal alignment are indicated by dashes.

Figs. 12Ά, 12B e 12C mostram o efeito do ligando de mpl humano na proliferação de células Ba/F3-mpl (A), megacariocitopoiese humana in vitro quantificada usando um anticorpo monoclonal IgG de murganho marcado radioactivamente específico da glicoproteína de megacariócitos ΘΡΙΙ^ΙΙ^ (B) e trombopoiese de murganho medidas num ensaio de plaquetas religadas (C).Figs. 12Ά, 12B and 12C show the effect of the human mpl ligand on the proliferation of Ba / F3-mpl (A) cells, human in vitro quantified megakaryocytopoiesis using a radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody specific for ac ^ ΙΙ ^ ( B) and mouse thrombopoiesis measured in a reconnected platelet assay (C).

Duzentas e noventa e três células foram transfecCloning: A New pRK5 sozinho, (pRK5-ML,foi paragem após oTwo hundred and ninety-three cells were transfecCloning: The New pRK5 alone, (pRK5-ML, was stopped after

O meio foi então condicionadoThe medium was then conditioned

CaPO₄ (Gorman, C [1985]) pRK5-ML₁₅₃ de um com o duante a codão de em DNA vector noiteCaPO ₄ (Gorman, C [1985]) pRK5-ML ₁₅₃ of one with the codon during DNA vector night

153 resíduo durante à estimulação da proliferação celular tadas pelo método do153 residue during the stimulation of cell proliferation taken by the method of

Approach 2.:143-190 pRK5-hML ou com gerado por introduçãoApproach 2.:143-190 pRK5-hML or with generated by introduction

153 de hML por PCR).153 hML per PCR).

h e testado quanto de Ba/F3-mpl como descrito no Exemplo 1 (A) ou megacariocitopoiese humana in vitro (B). A megacariocitopoiese foi quantificada usando um anticorpo monoclonal IgG de murganho 125 (HP1-1D) marcado radioactivamente com I contra a a glicoproteína específica de megacariócitos GPII^III^ como descrito (Grant et al., Blood 69:1334-1339 [1987]). 0 efeito de ML recombinante (rML) parcialmente purificado na produção de plaquetas in vivo (C) foi determinado usando o ensaio de trombocitose religada descrito por McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144:1006-10012 (1973). rML parcialmente purificado foi preparado a partir de 200 ml de meio condicionado contendo ML recombinante. O meio foi passado através de uma coluna de 2 ml de Blue-Sepharose equilibrada em PBS e a coluna foi lavada com PBS e eluida com PBS contendo ureia e NaCl 2M. A fracção activa foi dialisada contra PBS e ajustada a 1 mg/ml de BSA sem endotoxinas. A amostra continha menos de uma unidade de endotoxina/ml. Os murganhos foram injectados com 64000, 32000 ou 16000 unidades de rML ou de excipiente sozinho. Cada um dos grupos consistiu em seis murganhos. Estão apresentados a média e o desvio padrão de cada grupo. Os valores de p foram determinados por um Teste de T comparando medianas.h and tested for Ba / F3-mpl as described in Example 1 (A) or human megakaryocytopoiesis in vitro (B). Megakaryocytopoiesis was quantified using a mouse IgG monoclonal antibody 125 (HP1-1D) radiolabelled with I against the specific megakaryocyte glycoprotein GPII ^ III ^ as described (Grant et al., Blood 69: 1334-1339 [1987]). The effect of partially purified recombinant ML (rML) on platelet production in vivo (C) was determined using the rewired thrombocytosis assay described by McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144: 1006-10012 (1973). Partially purified rML was prepared from 200 ml of conditioned medium containing recombinant ML. The medium was passed through a 2 ml column of Blue-Sepharose balanced in PBS and the column was washed with PBS and eluted with PBS containing urea and 2M NaCl. The active fraction was dialyzed against PBS and adjusted to 1 mg / ml BSA without endotoxins. The sample contained less than one unit of endotoxin / ml. The mice were injected with 64,000, 32,000 or 16,000 units of rML or excipient alone. Each group consisted of six mice. The mean and standard deviation for each group are shown. The p values were determined by a T test comparing medians.

Fig. 13 compara o efeito de cada uma das isoformas e variantes do ligando de mpl no ensaio de proliferação de células Ba/F3-mpl. hML, testemunha, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) e hML₁₅₃ foram ensaiados a várias diluções como descrito no Exemplo 1.Fig. 13 compares the effect of each of the mpl ligand isoforms and variants in the Ba / F3-mpl cell proliferation assay. hML, control, hML2, hML3, hML (R153A, R154A) and hML ₁₅₃ were tested at various dilutions as described in Example 1.

Figs. 14A, 14B e 14C mostram a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N0:l) do ligando de mpl humano (hML) ou do TPO humano (hTPO) e a sequência codificadora de DNA genómico humano (SEQ ID: 11). Os resíduos de nucleótidos e de aminoácidos estão numerados no começo de cada linha.Figs. 14A, 14B and 14C show the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of human mpl ligand (hML) or human TPO (hTPO) and the human genomic DNA coding sequence (SEQ ID: 11). The nucleotide and amino acid residues are numbered at the beginning of each line.

Fig. 15 mostra um SDS-PAGE de 293-rhML₃₃₂ purificado e de 293-rhML₁₅₃ purificado.Fig. 15 shows a purified 293-rhML ₃₃₂ and purified 293-rhML ₁₅₃ SDS-PAGE.

Fig. 16 mostra a sequência de nucleótidos: cDNA codificador (SEQ ID NO: 12) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 13) da grelha de leitura aberta de uma isoforma de ML de murganho. Esta isoforma madura do ligando de mpl de murganho contem 331 resíduos de aminoácidos, menos 4 do que mML putativo de tamanho completo e é portanto designada mML2. Os nucleótidos estão numerados no começo de cada linha. Os resíduos de aminoácidos estão numerados por cima da sequência começando com Ser 1. Os potenciais sítios rFig. 16 shows the nucleotide sequence: encoding cDNA (SEQ ID NO: 12) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) from the open reading frame of a mouse ML isoform. This mature mouse mpl ligand isoform contains 331 amino acid residues, 4 less than putative full size mML and is therefore designated mML2. The nucleotides are numbered at the beginning of each line. Amino acid residues are numbered above the sequence starting with Ser 1. Potential sites r

de glicosilação estão sublinhados. Os resíduos de císteina estão indicados por um ponto acima da sequência.glycosylation levels are underlined. Cysteine residues are indicated by a dot above the sequence.

Fig. 17 mostra a sequência de cDNA (SEQ ID NO: 14) e a sequência de proteica prevista (SEQ ID NO: 15) desta isoforma ML de murganho (mML). Os nucleótidos estão numerados no começo de cada linha. Os resíduos de aminoácidos estão numerados por cima da sequência começando com Ser 1. Esta isoforma do ligando de mpl de murganho contem 335 resíduos de aminoácidos e pensa-se ser o ligando de mpl de tamanho completo, designado mML. A sequência sinal está indicada com sublinhado a tracejadoe o ponto de clivagem provável está assinalado com uma seta. As regiões não traduzidas 5' e 3' estão indicadas com letras minúsculas. As duas deleções encontradas alternativo (mML2 e mML3) resíduos de císteina estão como resultado de splicing estão sublinhadas. Os quatro indicados por pontos. Os sete potenciais sítios de glicosilação estão enquadrados.Fig. 17 shows the cDNA sequence (SEQ ID NO: 14) and the predicted protein sequence (SEQ ID NO: 15) of this mouse ML isoform (mML). The nucleotides are numbered at the beginning of each line. The amino acid residues are numbered above the sequence starting with Ser 1. This isoform of the mouse mpl ligand contains 335 amino acid residues and is thought to be the full size mpl ligand, designated mML. The signal sequence is indicated with a dotted underline and the probable cleavage point is marked with an arrow. The 5 'and 3' untranslated regions are indicated with lowercase letters. The two deletions found alternate (mML2 and mML3) cysteine residues are as a result of splicing are underlined. The four indicated by points. The seven potential glycosylation sites are framed.

Fig. 18 compara a sequência de aminoácidos deduzida da isoforma hML3 de ML humano (SEQ ID NO: 9) e a isoforma de ML de murganho designada mML3 (SEQ ID NO: 16). A sequência de aminoácidos prevista para o ligando de mpl humano está alinhada com a sequência do ligando de mpl de murganho. Os aminoácidos idênticos estão enquadrados e os intervalos introduzidos para optimizar o alinhamento estão indicados por traços. Os aminoácidos estão numerados no começo de cada linha.Fig. 18 compares the deduced amino acid sequence of the human ML hML3 isoform (SEQ ID NO: 9) and the mouse ML isoform designated mML3 (SEQ ID NO: 16). The predicted amino acid sequence for the human mpl ligand is aligned with the sequence of the mouse mpl ligand. The identical amino acids are framed and the ranges entered to optimize alignment are indicated by dashes. Amino acids are numbered at the beginning of each line.

Fig. 19 compara as sequências de aminoácidos previstas das isoformas de ML maduras de ML de murganho (SEQ ID NO: 17), ML de porco (SEQ ID NO: 18) e ML humano (SEQ ID NO: 6). As sequências de aminoácidos estão alinhadas com intervalos, indicados por traços, introduzidos para se obter um alinhamento óptimo. Os aminoácidos estão numerados no começo de cada linha com resíduos idênticos enquadrados. Os potenciais sítios de glicosilação estão indicados com uma rFig. 19 compares the predicted amino acid sequences of the mature ML isoforms of mouse ML (SEQ ID NO: 17), pig ML (SEQ ID NO: 18) and human ML (SEQ ID NO: 6). The amino acid sequences are aligned with intervals, indicated by dashes, introduced to obtain an optimal alignment. Amino acids are numbered at the beginning of each line with identical framed residues. Potential glycosylation sites are indicated with a r

caixa sombreada e os resíduos de císteina estão designados com um ponto. O motivo de aminoácidos dibásico conservado que representa um sítio potencial para a clivagem por proteases está sublinhado. A deleção de quatro aminoácidos que ocorre nas três espécies (ML2) está delimitada por uma janela de contorno mais carregado.shaded box and cysteine residues are designated with a dot. The conserved dibasic amino acid motif that represents a potential site for protease cleavage is underlined. The deletion of four amino acids that occurs in the three species (ML2) is delimited by a more loaded contour window.

Fig. 20 mostra a sequência de cDNA(SEQ ID NO: 19) e sequência prevista da proteína madura (SEQ ID NO: 18) de uma isoforma de ML de porco (pML). Esta isoforma do ligando de mpl de porco contem 332 resíduos de aminoácidos e pensa-se ser o ligando de mpl de porco de tamanho completo, designado pML. Os nucleótidos estão numerados no começo de cada linha. Os resíduos de aminoácidos estão numerados por cima da sequência começando na Ser 1.Fig. 20 shows the cDNA sequence (SEQ ID NO: 19) and predicted mature protein sequence (SEQ ID NO: 18) from a pig ML isoform (pML). This isoform of the pig mpl ligand contains 332 amino acid residues and is thought to be the full size pig mpl ligand, called pML. The nucleotides are numbered at the beginning of each line. The amino acid residues are numbered above the sequence starting at Ser 1.

Fig. 21 mostra a sequência de cDNA (SEQ ID NO:20) e a sequência prevista da proteína madura (SEQ ID NO: 21) de uma isoforma de ML de porco (pML2). Esta isoforma do ligando de mpl de porco contem 328 resíduos de aminoácidos e é uma forma do ligando de mpl de porco de tamanho completo com uma deleção de quatro resíduos, designada pML2. Os nucleótidos estão numerados no começo de cada linha. Os resíduos de aminoácidos estão numerados acima da sequência começando com Ser 1.Fig. 21 shows the cDNA sequence (SEQ ID NO: 20) and the predicted mature protein sequence (SEQ ID NO: 21) from a pig ML isoform (pML2). This isoform of the pig mpl ligand contains 328 amino acid residues and is a form of the full size pig mpl ligand with a four residue deletion, designated pML2. The nucleotides are numbered at the beginning of each line. Amino acid residues are numbered above the sequence starting with Ser 1.

Fig. 22 compara a sequência de aminoácidos deduzida da isoforma de ML de porco de tamanho completo (pML) (SEQ ID NO: 18) com a isoforma de ML de porco designada pML2 (SEQ ID NO: 21). A sequência de aminoácidos prevista para pML está alinhada com a sequência de pML2. Os aminoácidos idênticos estão enquadrados e os intervalos para um alinhamento óptimo estão indicados por traços. Os aminoácidos estão numerados no começo de cada linha.Fig. 22 compares the deduced amino acid sequence of the full-size pig ML isoform (pML) (SEQ ID NO: 18) with the pig ML isoform designated pML2 (SEQ ID NO: 21). The predicted amino acid sequence for pML is aligned with the pML2 sequence. The identical amino acids are framed and the ranges for optimal alignment are indicated by dashes. Amino acids are numbered at the beginning of each line.

Fig. 23 mostra as características mais importantes do plasmídeo pSV15.ID.LL.MLORF (tamanho completo ouFig. 23 shows the most important characteristics of plasmid pSV15.ID.LL.MLORF (full size or

TPO₃₃₂) usado para transfectar células hospedeiras CHO-DP12 para a produção de CHO-rhTPO^₃₂.TPO ₃₃₂ ) used to transfect CHO-DP12 host cells for the production of CHO-rhTPO ^ ₃₂ .

Fig. 24 mostra as caracteristicas mais importantes do plasmídeo pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncado ou TPO₁₅₃) usado para transfectar células hospedeiras CHO-DP12 para a produção de CHO-rhTPO₁₅₃.Fig. 24 shows the most important characteristics of the plasmid pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncated or TPO ₁₅₃ ) used to transfect CHO-DP12 host cells for the production of CHO-rhTPO ₁₅₃ .

Figs. 25A, 25B e 25C mostram o efeito de E.Figs. 25A, 25B and 25C show the effect of E.

coli-rhTPO153) ^nas plaquetas (A), eritrócitos (B) e células brancas do sangue em murganhos normais. Dois grupos de 6 murganhos C57 B6 fêmeas foram injectados diariamente com tampão PBS ou 0.3 uq de E. coli-rhTPO,.. .-1 /100coli-rhTPO153) ⁱⁿ platelets (A), erythrocytes (B) and white blood cells in normal mice. Two groups of 6 female C57 B6 mice were injected daily with PBS buffer or 0.3 uq of E. coli-rhTPO, ..-1/100

--------- (Met , 153) ' μΐ sc.). No dia 0 e nos dias 3-7 retirou-se 40 μΐ de sangue do sinus orbital. Este sangue foi imediatamente diluido em ml de diluente comercial e as contagens completas do sangue foram obtidas num Serrono Baker Hematology Analyser 9018. Os resultados estão apresentados como médias ± desvio padrão da média.--------- (Met, 153) 'μΐ sc.). On day 0 and days 3-7, 40 μΐ of blood was drawn from the orbital sinus. This blood was immediately diluted in ml of commercial diluent and complete blood counts were obtained on a Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. The results are presented as means ± standard deviation from the mean.

Figs. 26A, 26B e 26C mostram o efeito de ' coli-rhTPO 153) ^nas pl^a<5^uetas (A) t eritrócitos (B) e células brancas do sangue em murganhos irradiados subletal mente. Dois grupos de 10 murganhos C57 B6 fêmeas foram irradiados com 750cGy de radiação gama origi137 . . . .Figs. 26A, 26B and 26C show the effect of 'coli-rhTPO 153) ^{in the} pl ^<uetas 5 (A) t erythrocytes (B) and white blood cells in sublethally irradiated mice mind. Two groups of 10 female C57 B6 mice were irradiated with 750cGy of original gamma radiation. . . .

fonte de Cs e injectados diariamente com _ . E. coli-rhTPO -1 (100 μΐsource of Cs and injected daily with _. E. coli-rhTPO -1 (100 μΐ

0,3 μς de _________ (Met , 153) '0.3 μς of _________ (Met, 153) '

No dia 0 e em tempos intermédios subsequentes retirou-se 40 μΐ de sangue do sinus orbital. Este sangue foi imediatamente diluido em 10 ml de diluente comercial e as subletalmente nária de uma tampão PBS ou sc. ) .On day 0 and at subsequent intermediate times, 40 μΐ of blood was drawn from the orbital sinus. This blood was immediately diluted in 10 ml of commercial diluent and sublethally naria from a PBS or sc buffer. ).

contagens completas do sangue foram obtidas num SerronoBaker Hematology Analyser 9018. Os resultados estão apresentados como médias ± desvio padrão da média.Complete blood counts were obtained on a SerronoBaker Hematology Analyzer 9018. The results are presented as means ± standard deviation from the mean.

Figs. 27A, 27B e 27C mostram o efeito deFigs. 27A, 27B and 27C show the effect of

CHO-rhTPO₃₃₂ nas plaquetas (A), eritrócitos (B) e células brancas do sangue em murganhos normais. Dois grupos de 6 rCHO-rhTPO ₃₃₂ in platelets (A), erythrocytes (B) and white blood cells in normal mice. Two groups of 6 r

murganhos C57 B6 fêmeas foram injectados diariamente com tampão PBS ou 0,3 pg de CHO-rhTPO₃₃₂ (100 μΐ sc.). No dia 0 e nos dias 3-7 retirou-se 40 μΐ de sangue do sinus orbital. Este sangue foi imediatamente diluido em 10 ml de diluente comercial e as contagens completas do sangue foram obtidas num Serrono Baker Hematology Analyser 9018. Os resultados estão apresentados como médias ± desvio padrão da média.Female C57 B6 mice were injected daily with PBS buffer or 0.3 pg of CHO-rhTPO ₃₃₂ (100 μΐ sc.). On day 0 and days 3-7, 40 μΐ of blood was drawn from the orbital sinus. This blood was immediately diluted in 10 ml of commercial diluent and complete blood counts were obtained on a Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. The results are presented as means ± standard deviation from the mean.

Fig. 28 mostra as curvas para várias formas de rhTPO obtidas a partir de várias linhas celulares. As curvas de dose resposta foram construidas para rhTPO a partir das seguintes linhas celulares: hTPO₃₃₂ a partir de CHO (tamanho completo a partir das células de ovário de hamster chinês); hTPO„ (forma truncada derivada de E. coli com umaFig. 28 shows the curves for various forms of rhTPO obtained from various cell lines. Dose response curves were constructed for rhTPO from the following cell lines: hTPO ₃₃₂ from CHO (full size from Chinese hamster ovary cells); hTPO „(truncated form derived from E. coli with a

Met lo3 -------metionina N-terminal); hTPO₃₃₂ (TPO de tamanho completo derivado de células humanas 293); Met-less 155 E. coli (a forma truncada [rhTPO₁₅₅J sem a metionina terminal de E. coli). Grupos de 6 murganhos C57B6 fêmeas foram injectados diariamente durante 7 dias^ com rhTPO dependendo do grupo. Diariamente foram retirados 40 μΐ de sangue do sinus orbital para contagens completas do sangue. Os dados apresentados acima são os efeitos máximos observados com os vários tratamentos e com excepção de (met 153 E. coli) este ocorreu no dia 7 do tratamento. No grupo atrás referido met 153 E. coli o efeito máximo foi observado ao dia 5. Os dados estão apresentados como as médias ± desvio padrão da média.Met lo3 ------- N-terminal methionine); hTPO ₃₃₂ (full size TPO derived from human 293 cells); Met-less 155 E. coli (the truncated form [rhTPO ₁₅₅ J without the E. coli terminal methionine). Groups of 6 female C57B6 mice were injected daily for 7 days with rhTPO depending on the group. 40 μΐ of blood was taken daily from the orbital sinus for complete blood counts. The data presented above are the maximum effects observed with the various treatments and with the exception of (met 153 E. coli) this occurred on day 7 of treatment. In the aforementioned group met 153 E. coli the maximum effect was observed on day 5. The data are presented as the means ± standard deviation of the mean.

Fig. 29 mostra as curvas de dose resposta comparando a actividade de formas de rhTPO de tamanho completo e truncadas produzidas em células CHO com a forma truncada derivada de E. coli. Grupos de 6 murganhos C57B6 fêmeas foram injectados diariamente com 0,3 μg de rhTPO de vários tipos. Nos dias 2-7 colheu-se 40 μΐ de sangue do sinus orbital para contagens completas do sangue. Os grupos de tratamento foram TPO,_C_ a forma truncada de TPO derivada de E. coli; TPO₃₃₂ (fracção mista) TPO de tamanho completo contendo aproximadamente 80-90% de tamanho completo e 10-20%Fig. 29 shows the dose response curves comparing the activity of full-length and truncated rhTPO forms produced in CHO cells with the E. coli-derived truncated form. Groups of 6 female C57B6 mice were injected daily with 0.3 μg of rhTPO of various types. On days 2-7, 40 μΐ of blood was collected from the orbital sinus for complete blood counts. The treatment groups were TPO, _C _ the truncated form of TPO derived from E. coli; TPO ₃₃₂ (mixed fraction) Full size TPO containing approximately 80-90% full size and 10-20%

de formas truncadas; TPO332 (fracção 30K) = fracção truncada purificada derivada da preparação mista original; TPO332 (fracção 70K) = fracção de TPO de tamnho completo purifcado derivada da fracção mista original. Os dados estão apresentados como médias ± desvio padrão da média.in truncated forms; TPO332 (30K fraction) = purified truncated fraction derived from the original mixed preparation; TPO332 (70K fraction) = purified full-size TPO fraction derived from the original mixed fraction. The data are presented as means ± standard deviation from the mean.

Fig. 30 é um desenho mostrando o ensaio KIRA ELISA para a medição de TPO. A figura mostra a quimera MPL/se.gD e partes relevantes dos receptores parentais assim como a construção final (parte direita da figura) e um esquema (parte esquerda da figura) mostrando os passo importantos do ensaio).Fig. 30 is a drawing showing the KIRA ELISA assay for measuring TPO. The figure shows the chimera MPL / se.gD and relevant parts of the parental receptors as well as the final construction (right part of the figure) and a diagram (left part of the figure) showing the important steps of the test).

Fig. 31 é um esquema do ensaio KIRA ELISA mostrando cada um dos passos do processo.Fig. 31 is a schematic of the KIRA ELISA assay showing each of the process steps.

Figs. 32A-32L proporcionam a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 22) do vector de expressão pSVI17.ID.LL usado para a expressão de Rse.gD no Exemplo 17.Figs. 32A-32L provide the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of the expression vector pSVI17.ID.LL used for the expression of Rse.gD in Example 17.

ração doration of

Fig. 33 é uma representação plasmídeo pMPl.Fig. 33 is a plasmid representation of pMPl.

esquemática da preparação doschematic of the preparation of the

Fig. 34 é uma representação plasmídeo pMP21.Fig. 34 is a plasmid representation of pMP21.

esquemática da preparação doschematic of the preparation of the

Fig. 35 é uma representação plasmídeo pMP151.Fig. 35 is a plasmid representation of pMP151.

esquemática da prepaFig. 36 é preparação do plasmídeo uma representação esquemática da pMP202.schematic of prepaFig. 36, the plasmid preparation is a schematic representation of pMP202.

Fig. 37 é uma representação esquemática da preparação do plasmídeo pMP172.Fig. 37 is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP172.

Fig. 38 é uma representação esquemática da preparação do plasmídeo pMP210.Fig. 38 is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP210.

rr

Fig. 39 é uma para expressão de TPO doFig. 39 is one for TPO expression of the

NOS: 23,NOS: 23,

24, 25, 26, 27 e tabela dos cinco melhores clones banco de plasmídeo pMP210 (SEQ ID 28) .24, 25, 26, 27 and table of the five best clones pMP210 plasmid bank (SEQ ID 28).

ração doration of

Fig. 40 é uma representação plasmídeo pMP41.Fig. 40 is a plasmid representation of pMP41.

esquemática da preparação doschematic of the preparation of the

Fig. 41 é uma representação plasmídeo pMP57.Fig. 41 is a plasmid representation of pMP57.

esquemática da preparaçao doschematic of the preparation of the

Fig. 42 é uma representação plasmídeo pMP251.Fig. 42 is a plasmid representation of pMP251.

esquemática da prepaDESCRIÇÃO DETALHADA DOschematic of the preparation DETAILED DESCRIPTION OF THE

INVENTOINVENTION

I. DefiniçõesI. Definitions

Em geral as palavras ou frases que se seguem têm a definição indicada quando usadas na descrição, exemplos e reivindicações.In general, the following words or phrases have the definition indicated when used in the description, examples and claims.

Agente caotrópico refere-se a um composto que, em solução aquosa e em concentrações adequadas, pode causar uma alteração na configuração espacial ou conformação de uma proteína destruindo pelo menos parcialmente responsáveis pela manutenção da estrutura normal e terciária da proteína, pio, ureia, guanidina-HCl ções elevadas, geralmente mente necessárias para exercer o efeito conformacional nas proteínas.Chaotropic agent refers to a compound that, in aqueous solution and in appropriate concentrations, can cause a change in the spatial configuration or conformation of a protein, destroying at least partially responsible for maintaining the normal and tertiary structure of the protein, pio, urea, guanidine -HCl elevations, generally necessary to exert the conformational effect on proteins.

Tais compostos incluem, e tiocianato de sódio.Such compounds include, and sodium thiocyanate.

4-9M, destes compostos as forças secundária por exemConcentrasão normalCitocina é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de células que actuam noutra célula como mediadores intercelulares. São exemplos de tais citocinas linfocinas, monocinas e hormonas polipeptídicas r4-9M, of these compounds the secondary forces for exampleNormal concentrationCytokine is a generic term for proteins released by a population of cells that act in another cell as intercellular mediators. Examples of such cytokines are lymphokines, monocines and polypeptide hormones r

tradicionais. Estão incluídas entre as citoquinas a hormona de crescimento, os factores de crescimento tipo insulina, hormona de crescimento humana, hormona de crescimento humana com N-metionil, hormona de crescimento bovina, hormona paratiróide, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorelaxina, hormonas glicoproteicas tais como hormona estimuladora dos folículos (FSH), hormona estimuladora da tiróide (TSH) e hormona leutinizante (LH), factor de crescimento hematopoiético, factor de crescimento hepático, factor de crescimento de fibroblastos, prolactina, lactogénio placentário, factor de necrose tumoral α (TNF-α e TNF-β) substância inibidora de muleriana, peptídeo associado à gonadotropina de murganho, inibina, activina, factor de crescimento do endotélio vascular, integrina, factores de crescimento dos nervos tais como NGF-β, factor de crescimento das plaquetas, factores de crescimento transformantes (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β, factor de crescimento tipo insulina I e II, eritropoietina (EPO), factores osteoinductivos, interferões tais como interferão-α, -β e -r, factores estimuladores de colónias (CSFs) tais como CSF de macrófagos (M-CSF), CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e CSF de granulócitos (G-CSF), interleuquinas (IL's) tais como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9,traditional. Included among cytokines are growth hormone, insulin-like growth factors, human growth hormone, N-methionyl human growth hormone, bovine growth hormone, parathyroid hormone, thyroxine, insulin, proinsulin, relaxin, prorelaxin, hormones glycoproteins such as follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH) and leutinizing hormone (LH), hematopoietic growth factor, liver growth factor, fibroblast growth factor, prolactin, placental lactogen, tumor necrosis factor α (TNF-α and TNF-β) mulerian inhibiting substance, peptide associated with mouse gonadotropin, inhibin, activin, vascular endothelial growth factor, integrin, nerve growth factors such as NGF-β, growth factor of platelets, transforming growth factors (TGFs) such as TGF-α and TGF-β, insulin-like growth factor I and II , erythropoietin (EPO), osteoinductive factors, interferons such as interferon-α, -β and -r, colony stimulating factors (CSFs) such as macrophage CSF (M-CSF), granulocyte-macrophage CSF (GM-CSF) and granulocyte CSF (G-CSF), interleukins (IL's) such as IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- 8, IL-9,

IL-11, IL-12 e outros factores polipeptídicos incluindo LIF, SCF e ligando de kit. Como aqui é usado os termos referidos pretendem proteínas derivadas de fontes naturais ou de culturas de células recombinantes. De modo semelhante os termos destinam-se a incluir equivalentes biologicamente activos; e.q. diferindo na sequência de aminoácidos em um ou mais aminoácidos ou no tipo ou grau de glicosilação.IL-11, IL-12 and other polypeptide factors including LIF, SCF and kit ligand. As used herein the terms referred to are proteins derived from natural sources or cultures of recombinant cells. Similarly, the terms are intended to include biologically active equivalents; e.q. differing in the sequence of amino acids by one or more amino acids or in the type or degree of glycosylation.

Ligando de mpl. polipeptídeo ligando de mpl. ML, trombopoietina ou TPO são usados aqui indiscriminadamente e compreendem qualquer polipeptídeo que possua a propriedade de se ligar a mpl, um membro da superfamília de receptores das citocinas e tendo uma propriedade biológica do ML como definido abaixo. Uma propriedade biológica rCalling from mpl. mpl. ligand polypeptide. ML, thrombopoietin or TPO are used here indiscriminately and comprise any polypeptide that has the property of binding to mpl, a member of the cytokine receptor superfamily and having a biological property of ML as defined below. A biological property r

exemplificativa é a capacidade para estimular a incorporação 3 de nucleótidos marcados (e.q., H-timidina) no DNA de células Ba/F3 dependentes de IL-3 transfectadas com mpl P humano. Um outro exemplo de propriedade biológica é aexemplary is the ability to stimulate the uptake of labeled nucleotides (e.g., H-thymidine) into the DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P. Another example of biological property is the

5 capacidade para estimular a incorporação de S em plaquetas circulantes num ensaio de plaquetas religadas de murganho. Esta definição engloba o polipeptídeo isolado a partir de uma fonte do ligando de mpl como seja plasma de porco aplãstico aqui descrito ou a partir de uma outra fonte, como seja uma outra espécie animal, incluindo humanos ou preparado por métodos recombinantes ou sintéticoas e inclui formas variantes incluindo derivados funcionais, fragmentos alelos, isoformas e seus análogos.5 ability to stimulate the incorporation of S into circulating platelets in a mouse reconnected platelet assay. This definition encompasses the polypeptide isolated from a source of the mpl ligand such as aplastic pig plasma described herein or from another source, such as another animal species, including humans or prepared by recombinant or synthetic methods and includes forms variants including functional derivatives, allele fragments, isoforms and their analogs.

Um fragmento do ligando de mpl ou fragmento TPO é uma fracção de um ligando de mpl natural de tamanho completo maduro ou sequência de TPO tendo um ou mais resíduos de aminoácidos ou unidades de açúcar eliminadas. 0(s) resíduo(s) de aminoácido(s) eliminados podem ocorrer em qualquer sítio no peptídeo incluindo o extremo N ou extremo C ou internamente. 0 fragmento partilhará pelo menos uma propriedade biológica com o ligando de mpl. Os fragmentos do ligando de mpl tipicamente terão uma sequência consecutiva de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 resíduos de aminoácidos que são idênticos às sequências do ligando de mpl isolado a partir de um mamífero incluindo o ligando isolado a partir de plasma de porco aplástico ou o ligando humano ou de murganho, especialemnte o seu domínio EPO. São exemplos representativos de fragmentos N-terminais hML^^^ ^ou TPO(Met^_1l-153).A fragment of the mpl ligand or TPO fragment is a fraction of a mature full-size natural mpl ligand or TPO sequence having one or more amino acid residues or sugar units deleted. The eliminated amino acid residue (s) can occur anywhere on the peptide including the N-terminus or the C-terminus or internally. The fragment will share at least one biological property with the mpl ligand. Mpl ligand fragments will typically have a consecutive sequence of at least 10, 15, 20, 25, 30 or 40 amino acid residues that are identical to the sequences of the mpl ligand isolated from a mammal including the ligand isolated from aplastic pig plasma or human or mouse ligand, especially its EPO domain. Representative examples of N-terminal fragments are hML ^^^ ^or TPO (Met _ ¹ l-153).

Variantes do ligando de mpl ou variantes da sequência do ligando de mpl como aqui é definido significa um ligando de mpl biologicamente activo como definido abaixo tendo menos de 100% de identidade de sequência com o ligando de mpl isolado a partir de cultura de células recombinantes ou a aprtir de plasma de porco aplástico ou com o ligandoVariants of the mpl ligand or variants of the mpl ligand sequence as defined herein means a biologically active mpl ligand as defined below having less than 100% sequence identity with the mpl ligand isolated from recombinant cell culture or from aplastic pig plasma or ligand

humano tendo a sequência deduzida descrita na Fig. 1 (SEQ ID NO:1). Normalmente, uma variante do ligando de mpl biologicamente activo terá uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 70% de identidade da sequência de aminoácidos com o ligando de mol isolado a partir de plasma de porco aplástico ou com o ligando maduro de murganho ou humano ou seus fragmentos (ver Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), de preferência pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 85%, mesmo mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%.human having the deduced sequence described in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1). Typically, a biologically active mpl ligand variant will have an amino acid sequence having at least about 70% identity of the amino acid sequence to the mol ligand isolated from aplastic pig plasma or the mature mouse or human ligand or fragments thereof (see Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), preferably at least about 75%, more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 85%, even more preferably at least about 90% and more preferably at least about 90% and most preferably at least about 95%.

Um ligando de mpl quimérico é um polipeptídeo compreendendo o ligando de mpl de tamanho completo ou um ou mais fragmentos seus fundidos ou ligados a um segundo polipeptídeo heterólogo ou a um ou mais fragmentos seus. A quimera partilhará pelo menos uma propriedade biológica em comum com o ligando de mpl. O segundo polipeptídeo será tipicamente uma citocina, imunoglobulina ou seu fragmento.A chimeric mpl ligand is a polypeptide comprising the full-length mpl ligand or one or more fragments thereof or fused to a second heterologous polypeptide or one or more fragments thereof. The chimera will share at least one biological property in common with the mpl ligand. The second polypeptide will typically be a cytokine, immunoglobulin or fragment thereof.

Ligando de mpl isolado, ligando de mpl altamente purificado e ligando de mpl subastancialmente homogéneo são usados indiferentemente e significam um ligando de mpl que foi purificado a partir de uma fonte do ligando de mpl ou foi preparado por métodos recombinantes ou sintéticos e está substancialmente livre de outros peptidos ou proteínas (1) para se obter pelo menos 15 e de preferência 20 resíduos de aminoácidos do extremo N ou de uma sequência de aminoácidos interna usando um sequenciador de copo centrifugador ou o melhor sequenciador de aminoácidos do mercado ou conforme modificado por métodos publicados até à data da entrega deste pedido ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE em condições não redutoras ou redutoras usando azul Coomassie ou de preferência, coloração com prata. A homogeneidade aqui significa menos de cerca de 5% de contaminação com proteínas da fonte.Isolated mpl ligand, highly purified mpl ligand and substantially homogeneous mpl ligand are used interchangeably and mean an mpl ligand that has been purified from a source of the mpl ligand or has been prepared by recombinant or synthetic methods and is substantially free of other peptides or proteins (1) to obtain at least 15 and preferably 20 amino acid residues from the N-terminus or from an internal amino acid sequence using a centrifuge cup sequencer or the best amino acid sequencer on the market or as modified by published methods until the date of delivery of this order or (2) until homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using Coomassie blue or preferably, silver staining. Homogeneity here means less than about 5% contamination with proteins from the source.

Propriedade biológica quando usado em associação com ligando de mpl ou ligando de mpl isolado significa que possui actividade trombopoiética ou que possui uma função efectora ou antigénica in vivo ou actividade que causada ou efectuada directa ou indirectamente por um ligando de mpl (na sua conformação nativa ou desnaturada)ou um seu fragmento. As funções efectoras incluem ligação a mpl e qualquer actividade de ligação transportadora, agonismo ou antagonismo de mpl, especialmente transdução de um sinal proliferativo incluindo replicação, função reguladora do DNA, modulação da actividade biológica de outras citoquinas, activação de receptores (especialmente citocina), desactivação, regulação positiva ou negativa, crescimento celular ou diferenciação e similares. Uma função antigénica significa possuir um epítopo ou sítio antigénico que é capaz de dar reacção cruzada com anticorpos induzidos contra o ligando de mpl nativo. A pprincipal função antigénica de um polipeptídeo ligando de mpl é que se liga com afinidade a pelo menos cerca de 10⁶l/mole a um anticorpo induzido contra o ligando de mpl isolado a partir de plasma de porco aplástico. Normalmente o polipeptídeo liga-se com uma afinidade de pelo menos cerca de 10⁷ 1/mole. Mais preferencialmente o polipeptídeo ligando de mpl antigenicamente activo é um polipeptídeo que se liga a um anticorpo induzido contra o ligando de mpl tendo uma ou mais das funções efectoras descritas atrás. Os anticorpos usados para definir actividade biológica são anticorpos policlonais de coelho induzidos através da formulação do ligando de mpl isolado a partir de cultura de células recombinantes ou a partir de plasma de porco aplástico em adjuvante completo de Freund, injecção subcutânea da formulação e reforço da resposta imune por injecção intraperitoneal da formulação até o título dos anticorpos contra o ligando de estabilizar.Biological property when used in combination with mpl ligand or isolated mpl ligand means that it has thrombopoietic activity or that it has an effector or antigenic function in vivo or activity that is caused or carried out directly or indirectly by an mpl ligand (in its native conformation or denatured) or a fragment thereof. Effector functions include mpl binding and any mpl carrier binding activity, agonism or antagonism, especially transduction of a proliferative signal including replication, DNA regulatory function, modulation of the biological activity of other cytokines, activation of receptors (especially cytokine), deactivation, positive or negative regulation, cell growth or differentiation and the like. An antigenic function means having an epitope or antigenic site that is capable of cross-reacting with antibodies induced against the native mpl ligand. The main antigenic function of an mpl ligand polypeptide is that it affinity binds at least about 10 ⁶ l / mole to an antibody induced against the mpl ligand isolated from aplastic pig plasma. Usually the polypeptide binds with an affinity of at least about 10 ⁷ 1 / mole. Most preferably the antigenically active mpl ligand polypeptide is a polypeptide that binds to an antibody induced against the mpl ligand having one or more of the effector functions described above. The antibodies used to define biological activity are rabbit polyclonal antibodies induced by formulating the mpl ligand isolated from recombinant cell culture or from aplastic pig plasma in complete Freund's adjuvant, subcutaneous injection of the formulation and enhancement of the response immune by intraperitoneal injection of the formulation up to the antibody titer against the stabilizing ligand.

Biologicamente activo quando usado juntamente com ligando de mpl ou ligando de mpl isoladosignifica um ligando de mpl ou polipeptídeo que apresenta actividadeBiologically active when used in conjunction with isolated mpl ligand or mpl ligand means a mpl ligand or polypeptide that exhibits activity

trombopoiética ou que partilha uma função efectora do ligando de mpl isolado a partir de plasma de porco aplástico ou expressa em cultura de células recombinantes aqui descrito. Uma função efectora importante conhecida do ligando de mpl ou polipeptídeo aqui tratado é a ligação a mpl e estimu. · 3 lação da incorporação de nucleotidos marcados ( -timidina) no DNA de células Ba/F3 dependentes de IL-3 transfectadas com mpl humano. Uma outra função efectora conhecida do ligando de mpl ou polipeptídeo aqui descrito é a capacidade 35 para estimular a incorporação de S nas plaquetas circulantes num ensaio de plaquetas religadas de murganho. Ainda uma outra função efectora conhecida do ligando de mpl é a capacidade para estimular a megacariocitopoiese humana in vitro que pode ser quantificada usando um anticorpo monoclonal marcado radioactivamente específico contra a glicoproteína GPII^III de megacariócitos.thrombopoietic or that shares an effector function of the mpl ligand isolated from aplastic pig plasma or expressed in recombinant cell culture described herein. An important effector function known to the mpl ligand or polypeptide treated herein is binding to mpl and stimuli. · 3 lation of the incorporation of labeled nucleotides (-thymidine) in the DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl. Another known effector function of the mpl ligand or polypeptide described herein is the ability to stimulate the incorporation of S into circulating platelets in a mouse reconnected platelet assay. Yet another known effector function of the mpl ligand is the ability to stimulate human megakaryocytosis in vitro which can be quantified using a radiolabeled monoclonal antibody specific against the megakaryocyte GPII ^ III glycoprotein.

A percentagem da identidade da sequência de aminoácidos relativamente à sequência do ligando de mpl é aqui definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos da sequência do ligando de mpl isolada a partir de plasma de porco aplástico ou do ligando de murganho ou humano tendo a sequência de aminoácidos deduzida descrita na Fig. (SEQ ID NO: 1), após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para se conseguir a percentagem máxima de identidade de sequências e não considerando quaisquer substituições conservadas como parte da identidade da sequência. Nenhumas das extensões, deleções ou inserções do extremo N, do extremo C ou internas na sequência do ligando de mpl devem ser encaradas como afectando a identidade ou homologia da sequência. Assim, exemplos de polipeptídeos ligandos de mpl biologicamente activos considerados como tendo sequências idênticas incluem; preproligando de mpl, ligando proligando de mpl e ligando maduro de mpl.The percentage of amino acid sequence identity to the mpl ligand sequence is defined here as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the residues of the mpl ligand sequence isolated from aplastic pig plasma or the ligand of mouse or human having the deduced amino acid sequence described in Fig. (SEQ ID NO: 1), after aligning the sequences and introducing intervals, if necessary, to achieve the maximum percentage of sequence identity and not considering any conserved substitutions as part of the sequence identity. None of the N, C-terminus or internal extensions, deletions or insertions in the sequence of the mpl ligand should be viewed as affecting the identity or homology of the sequence. Thus, examples of biologically active mpl ligand polypeptides considered to have identical sequences include; preproligating from mpl, ligating from mpl and mature from mpl.

Micro-sequenciação do ligando de mpl pode ser conseguida por qualquer um dos processos convencionais adequados desde que o processo seja suficientemente sensível. Um desses métodos polipeptídeo altamente purificado obtido a partir de géis de SDS ou a partir de um passo final de HPLC é sequenciado directamente por degradação de Edman (isotiocianato de fenilo) automática usando um sequenciador de fase gasosa Applied Biosystems modelo 470A equipado com um analisador de aminoácidos modificados com feniltioidantoina (PTH) 120A. Ainda, os fragmentos do ligando de mpl preparados por digestão química (e.g., CNBr, hidroxilamina, 2-nitro-5-tiocianobenzoato) ou enzimática (e.g., tripsina, clostripaina, protease estafilocócica) seguido de purificação dos fragmentos (e.g., HPLC) podem ser igualmente sequenciados. Os aminoácidos PTH são analisados usando o sistema de dados ChromPerfect (Justice Inovations, Paio Alto, CA). A interpretação de sequências foi realizada num computador VAX 11/785 Digital Equipment Co. como descrito por Henzel et a 1. , J. Chromatography, 404:41-52 (1987). Facultativamente, amostras das fracções de HPLC podem ser sujeitas a electroforese em 5-20% SDS-PAGE, electrotansferidas para uma membrana PVDF (ProBlott, AIB, Foster City, CA) e coradas com Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987]. Uma proteína específica identificada pela coloração foi removida da membrana e realizada sequenciação N-terminal num sequenciador de fase gasosa como descrito atrás. Para as sequências internas das proteínas, as fracções de HPLC foram secas sob vácuo (SpeedVac), ressuspensas em tampões adequados e digeridas com brometo de cianogénio, a enzima específica de Lis, Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA), ou Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Após digestão, os peptídeos resultantes foram sequenciados como uma mistura ou após separação por HPLC numa coluna C4 eluida com um gradiente de propanol em 0,1% TFA antes da sequenciação em fase gasosa.Micro-sequencing of the mpl ligand can be achieved by any of the suitable conventional processes as long as the process is sufficiently sensitive. One of these highly purified polypeptide methods obtained from SDS gels or from a final HPLC step is sequenced directly by automatic Edman degradation (phenyl isothiocyanate) using an Applied Biosystems model 470A gas phase sequencer equipped with an analyzer. amino acids modified with phenylthioidantoin (PTH) 120A. In addition, fragments of the mpl ligand prepared by chemical digestion (eg, CNBr, hydroxylamine, 2-nitro-5-thiocyanobenzoate) or enzyme (eg, trypsin, clostripain, staphylococcal protease) followed by purification of the fragments (eg, HPLC) also be sequenced. PTH amino acids are analyzed using the ChromPerfect data system (Justice Innovations, Paio Alto, CA). Sequence interpretation was performed on a VAX 11/785 Digital Equipment Co. computer as described by Henzel et al., J. Chromatography, 404: 41-52 (1987). Optionally, samples of the HPLC fractions can be electrophoresed in 5-20% SDS-PAGE, electrotransferred to a PVDF membrane (ProBlott, AIB, Foster City, CA) and stained with Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem. ., 262: 10035-10038 [1987] A specific protein identified by staining was removed from the membrane and N-terminal sequencing was performed on a gas phase sequencer as described above. For the internal protein sequences, the HPLC fractions were dried under vacuum (SpeedVac), resuspended in suitable buffers and digested with cyanogen bromide, the Lis specific enzyme, Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA), or Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). the resulting peptides were sequenced as a mixture or after separation by HPLC on a C4 column eluted with a propanol gradient in 0.1% TFA prior to gas phase sequencing.

rr

Trombocitopenia é definida como uma contagem de 9 plaquetas abaixo de 150 x 10 por litro de sangue.Thrombocytopenia is defined as a count of 9 platelets below 150 x 10 per liter of blood.

Acitvidade trombopoiética é definida como actividade biológica que consiste na aceleração de proliferação, diferenciação e/ou maturação de megacariócitos ou precursores de megacariócitos para a forma produtora de plaquetas destas células. Esta actividade pode ser medida em vários ensaios incluindo um ensaio de síntese de plaquetas religadas de murganho in vivo conforme medido por um imuno-ensaio anti-plaquetas (anti-GPII_bIII_a) contra uma linha celular megacartioblástica de leucemia (CMK) e indução de poliploidização numa linha celular megacarioblástica (DAMI).Thrombopoietic activity is defined as biological activity that consists of the acceleration of proliferation, differentiation and / or maturation of megakaryocytes or megakaryocyte precursors to the platelet-producing form of these cells. This activity can be measured in several assays including an in vivo mouse platelet synthesis assay as measured by an anti-platelet immunoassay (anti-GPII _b III _a ) against a leukemia (CMK) megacartioblastic cell line and induction polyploidization in a megacarioblastic cell line (DAMI).

Trombocitopenia (TPO) é definida como um composto tendo actividade tromboopoiética ou sendo capaz de aumentar as contagens de plaquetas do soro num mamífero. TPO é de preferência capaz de aumentar as contagens de plaquetas endógenas em pelo menos 10%, mais preferencialmente capaz de aumentar em 50% e mais preferencialmente capaz de aumentar a 9 contagem de plaquetas num ser humano para mais de 150 x 10 por litro de sangue.Thrombocytopenia (TPO) is defined as a compound having thromboopoietic activity or being able to increase serum platelet counts in a mammal. TPO is preferably capable of increasing endogenous platelet counts by at least 10%, more preferably capable of increasing by 50% and most preferably capable of increasing platelet count in a human to more than 150 x 10 per liter of blood .

Ácido nucleico isolado do ligando de mpl¹¹ é RNA ou DNA contendo mais de 16 e de preferência 20 ou mais bases de nucleótidos seguidas que codificam ligando de mpl biologicamente activo ou um seu fragmento, sendo complementar do RNA ou DNA, ou hibrida com RNA ou DNA e permanece estavelmente ligado em condições moderadas a restringentes. Este RNA ou DNA não tem pelo menos um ácido nucleico contaminante com o qual está normalmente associado na fonte natural e de preferência substancialmente livre de qualquer outro RNA ou DNA de mamífero. A frase sem peo menos um ácido nucleico contamimante com o qual está normalmente associado inclui o caso em que o ácido nucleico está presente na fonte ou célula natural mas está numa localização cromossómica diferente ou de outra forma está delimitado por sequências rNucleic acid isolated from the mpl ¹¹ ligand is RNA or DNA containing more than 16 and preferably 20 or more consecutive nucleotide bases that encode biologically active mpl ligand or a fragment thereof, being complementary to RNA or DNA, or hybridizing to RNA or DNA and remains stably bound under moderate to stringent conditions. This RNA or DNA does not have at least one contaminating nucleic acid with which it is normally associated in the natural source and preferably substantially free of any other mammalian RNA or DNA. The phrase without at least one contaminating nucleic acid with which it is normally associated includes the case where the nucleic acid is present in the source or natural cell but is in a different chromosomal location or is otherwise delimited by r sequences

de ácido nucleico normalmente não encontradas na célula fonte. Um exemplo de ácido nucleico do ligando de mpl isolado é RNA ou DNA que codifica ligando de mpl biologicamente activo partilhando pelo menos 75% de identidade da sequência, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85% , ou mesmo mais preferencialmente 90% e mais preferencialmente 95% de identidade da sequência com o ligando de mpl humano, de murganho ou de porco.nucleic acid not normally found in the source cell. An example of isolated mpl ligand nucleic acid is RNA or DNA encoding biologically active mpl ligand sharing at least 75% sequence identity, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, or even more preferably 90% and more preferably 95% sequence identity to the human, mouse or pig mpl ligand.

Sequências de controle quando se referenm a expressão significa sequências de DNA necessárias à expressão de uma sequência codificadora ligada operacionalmente num organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, facultativamente uma sequência de operador, um sítio de ligação ao reibossoma e,possivelmente, outras sequências mal conhecidas. As células eucariotas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores.Control sequences when referring to expression means DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. Control sequences that are suitable for prokaryotes, for example, include a promoter, optionally an operator sequence, a reibosome binding site and possibly other poorly known sequences. Eukaryotic cells use promoters, polyadenylation signals and enhancers.

Ligado operacionalmente quando se refere a ácidos nucleicos significa que os ácidos nucleicos estão colocados numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder de secreção está operacionalmente ligado a DNA codificador de um polipeptídeo se é expresso como proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potenciador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se afectar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se estiver posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, operacionalmente significa que as sequências de DNA de DNA que estão ligadas são contíguas e no caso de um líder de secreção, contíguo e na mesma grelha de leitura. No entanto, os potenciadores não têm de ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em rOperationally linked when referring to nucleic acids means that the nucleic acids are placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to DNA encoding a polypeptide if it is expressed as a protein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operationally linked to a coding sequence if it is positioned to facilitate translation. Generally, operationally means that the DNA sequences of DNA that are linked are contiguous and in the case of a secretion leader, contiguous and in the same reading frame. However, enhancers do not have to be contiguous. The connection is achieved by connecting in r

sítios de restrição adequados. Se existirem tais sítios, os oligonucleótidos adaptadores sintéticos são usados de acordo com métodos convencionais.suitable restriction sites. If such sites exist, synthetic adapter oligonucleotides are used according to conventional methods.

Exógeno quando se refere a um elemento significa uma sequência de ácido nucleico que é estranha para a célula ou homóloga para a célula mas numa posição dentro do ácido nucleico da célula hospedeira em que normalmente não é encontrado.Exogenous when referring to an element means a nucleic acid sequence that is foreign to the cell or homologous to the cell but in a position within the host cell's nucleic acid where it is not normally found.

Célula, linha celular e cultura de células são aqui usados indiferentemente e tais designações incluem toda a progénie de uma célula ou linha celular. Assim, por exemplo, termos tais como transformantes e células transformadas incluem células primárias e culturas derivadas delas independentemente do número de passagens. Também se entende que toda a progénie possa não ser precisamente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Está incluída progénie mutante que tenha a mesma função ou actividade biológica da testada na célula transformada original. Quandose pretender designações distintas serão claras dentro do contexto.Cell, cell line and cell culture are used interchangeably here and such designations include the entire progeny of a cell or cell line. Thus, for example, terms such as transformants and transformed cells include primary cells and cultures derived from them regardless of the number of passages. It is also understood that the entire progeny may not be exactly identical in DNA content, due to deliberate or inadvertent mutations. Included is a mutant progeny that has the same biological function or activity as the one tested in the original transformed cell. When you want different designations, they will be clear in context.

Plasmídeos são moléculas de DNA circulares de replicação autónoma possuindo origens de replicação independentes e são aqui designados pela letra minúscula p precedida e/ou seguida de letras maiúsculas e/ou números. Os plasmídeos de partida aqui usados podem ser adquiridos comercialmente, disponíveis ao público numa bse sem restrições ou podem ser construídos a partir de tais plasmídeos disponíveis de acordo com processos publicados. Ainda, são conhecidos outros plasmídeos equivalentes e serão óbvios para os familiarizados com a área.Plasmids are circular DNA molecules of autonomous replication having independent origins of replication and are here designated by the lower case letter p preceded and / or followed by capital letters and / or numbers. The starting plasmids used herein can be purchased commercially, available to the public on an unrestricted basis, or can be constructed from such available plasmids according to published procedures. Still, other equivalent plasmids are known and will be obvious to those familiar with the field.

Digestão com enzimas de restrição quando se refere a DNA significa clivagem catalítica de ligações fosfodiéster internas do DNA com uma enzima que actua apenas rRestriction enzyme digestion when referring to DNA means catalytic cleavage of internal DNA phosphodiester bonds with an enzyme that acts only r

'7'7

J em certos locais ou sítios na sequência de DNA. Tais enzimas são chamadas endonucleases de restrição. Cada uma das endonucleases de restrição reconhece uma sequência de DNA específica designada sítio de restrição que apresenta simetria axial. As várias enzimas de restrição aqui usadas podem ser adquridas comercialmente e as suas condições de reacção, cofactores e outros requesitos são usados de acordo com o estabelecido pelo fornecedor. As enzimas de restrição normalmente são designadas por abreviaturas compostas por uma letra maiúscula seguida de outras letras representando o microorganismo a partir do qual a enzima de restrição foi originalmente obtida e depois um número designando a enzima particular. Em geral usa-se cerca de 1 pg de plasmideo ou fragmento de DNA com cerca de 1-2 unidades de enzima em cerca de 20 μΐ de solução tampão. Os tampões e quantidades de substrato adequados lar são especificados uma incubação de cerca de com as instruções para uma enzima de restrição particupelo de 1 fabricante.J at certain sites or sites in the DNA sequence. Such enzymes are called restriction endonucleases. Each of the restriction endonucleases recognizes a specific DNA sequence called a restriction site that has axial symmetry. The various restriction enzymes used here can be purchased commercially and their reaction conditions, cofactors and other requirements are used according to the established by the supplier. Restriction enzymes are usually referred to as abbreviations consisting of a capital letter followed by other letters representing the microorganism from which the restriction enzyme was originally obtained and then a number designating the particular enzyme. In general, about 1 pg of plasmid or DNA fragment is used with about 1-2 units of enzyme in about 20 μΐ of buffer solution. Appropriate buffers and substrate quantities are specified for an incubation of about 1 manufacturer's instructions for a particular restriction enzyme.

Normalmente usa-se hora a 37°C, do , fornecedor, proteína ou polipeptideo é removido por mas pode-se variar Após incubação, a extracção com fenol e clorofórmio e o ácido nucleico digerido é recuperado da fracção aquosa por precipitação com etanol. A digestão com uma enzima de restrição pode ser seguida de hidrólise com fosfatase alcalina bacteriana dos fosfatos terminais 5' para evitar que os dois extremos cortados de um fragmento de DNA circularizem ou formem uma ansa fechada que possa impedir a inserção de um fragmento de DNA no sito de restrição. A não ser que de outra forma seja estabelecido, a digestão dos plasmidos não é seguida de desfosforilação terminal 5'. Os processos e reagentes para a desfosforilação são os convencionais e estão descritos nas secções 1.56-1.61 de Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].Normally hour is used at 37 ° C, the supplier, protein or polypeptide is removed by but can be varied After incubation, extraction with phenol and chloroform and digested nucleic acid is recovered from the aqueous fraction by precipitation with ethanol. Digestion with a restriction enzyme can be followed by hydrolysis with bacterial alkaline phosphatase of the 5 'terminal phosphates to prevent the two cut ends of a DNA fragment from circulating or forming a closed loop that could prevent the insertion of a DNA fragment into the restriction situation. Unless otherwise stated, digestion of plasmids is not followed by 5 'terminal dephosphorylation. The processes and reagents for dephosphorylation are conventional and are described in sections 1.56-1.61 of Sambrook et al .. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

Recuperação” ou isolamento” de uma dado fragmento de DNA a partir de uma mistura de reacção de digestão significa separação do produto de digestão por electroforese rRecovery ”or isolation” of a given DNA fragment from a digestion reaction mixture means separation of the digestion product by electrophoresis

em gel de poliacrilamida ou de agarose, identificação do fragmento com interesse por comparação da sua mobilidade versus a de fragmentos de DNA marcadores de peso molecular conhecido, remoção da secção do gel contendo o fragmento pretendido e separação do gel do DNA. Este processo é conhecido de uma forma geral. Por exemplo, ver Lawn et al.. Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 [1981] e Goeddel et al.. Nucleic Acids Res. 8:4057 [1980].in polyacrylamide or agarose gel, identification of the fragment of interest by comparing its mobility versus that of DNA fragments markers of known molecular weight, removal of the section of the gel containing the desired fragment and separation of the gel from the DNA. This process is generally known. For example, see Lawn et al .. Nucleic Acids Res., 9: 6103-6114 [1981] and Goeddel et al .. Nucleic Acids Res. 8: 4057 [1980].

Análise Southern ou transferência Southern é um método pelo qual a digestão com endonucleases de restrição de contendo DNA é confirmada pela hibridação marcado. A cleótido ou fragmento de DNA tipicamente envolve separação de digestão de após separação nitrocelulose, adequada para análise com uma sonda marcada te, secções 9.37-9.52 de Sambrook et al., supra.Southern analysis or Southern blotting is a method by which digestion with restriction endonucleases containing DNA is confirmed by labeled hybridization. A cleotide or DNA fragment typically involves separation of digestion after nitrocellulose separation, suitable for analysis with a probe marked te, sections 9.37-9.52 by Sambrook et al., Supra.

presença de sequências de DNA numa DNA ou composição oligonuSouthern com um análise electroforética dospresence of DNA sequences in a DNA or oligonuSouthern composition with an electrophoretic analysis of

DNA em géis de electroforética nylon ou uma produtos agarose, desnaturação do DNA e transferência do DNA para outra membrana de suporte radioactivamenbiotinilada ou marcada com uma enzima como descrito nasDNA in nylon electrophoretic gels or an agarose product, DNA denaturation and DNA transfer to another radioactively supported biotinylated membrane or marked with an enzyme as described in

Análise Northern ou transferência Northern é > um método usado para identificar sequências de RNA que hibridam com uma sonda conhecida como seja um oligonucleótido, fragmento de DNA, cDNA ou seu fragmento, fragmento de RNA. A sonda é marcada com um isótopo radioactivo como seja 32 ....Northern analysis or Northern blot is> a method used to identify RNA sequences that hybridize to a probe known as an oligonucleotide, DNA fragment, cDNA or its fragment, RNA fragment. The probe is marked with a radioactive isotope such as 32 ....

P ou por biotinilaçao ou com uma enzima. 0 RNA para ser J analisado é geralmente separado por electroforese num gel de agarose ou poliacrilamida, transferido para nitrocelulose, nylon ou outra membrana adequada e hibrida com a sonda, usando técnicas convencionais bem conhecidas como sejam as descritas nas secções 7.39-7.52 de Sambrook et al.. supra.P or by biotinylation or with an enzyme. The RNA to be analyzed is generally separated by electrophoresis on an agarose or polyacrylamide gel, transferred to nitrocellulose, nylon or another suitable membrane and hybridizes with the probe, using conventional techniques well known as those described in sections 7.39-7.52 by Sambrook et al .. supra.

Ligação é o processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico. Para a ligação dos dois fragmentos, os extremos dos fragmentos rBonding is the process of forming phosphodiester bonds between two fragments of nucleic acid. For the connection of the two fragments, the ends of the fragments r

devem ser compatíveis uns com os outros. Nalguns casos, os extremos serão directamente compatíveis após digestão com endonucleases. No entanto, pode ser necessário converter primeiro os extremos coesivos normalmente produzidos após digestão com endonucleases em extremos cerses para tornar os compatíveis para a ligação. Para os extremos cerses, o DNA é tratado num tampão adequado durante pelo menos 15 minutos a 15°C com cerca de 10 unidades do fragmento Klenow da DNA-polimerase I ou com DNA-polimerase de T4 na presença dos quatro trifosfatos de desoxirribonucleótido. O DNA é então purificado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. Os fragmentos de DNA a ligar são colocados em solução em quantidades aproximadamente equimolares. A solução conterá também ATP, tampão ligase e uma ligase como seja a DNA-ligase de T4 a cerca de 10 unidades por 0,5 gg de DNA. Caso se pretenda ligar o DNA a um vector, este deve ser primeiro linearizado por digestão com a ou as endonucleases de restrição adeuadas. O fragmento linearizado é então tratado com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfatase de intestino de vitela para evitar auto-ligação durante o passo de ligação.must be compatible with each other. In some cases, the extremes will be directly compatible after digestion with endonucleases. However, it may be necessary to first convert the cohesive ends normally produced after digestion with endonucleases into blunt ends to make them compatible for binding. For the short ends, the DNA is treated in a suitable buffer for at least 15 minutes at 15 ° C with about 10 units of the Klenow fragment of DNA polymerase I or with T4 DNA polymerase in the presence of the four deoxyribonucleotide triphosphates. The DNA is then purified by extraction with phenol-chloroform and precipitation with ethanol. The DNA fragments to be ligated are placed in solution in approximately equimolar amounts. The solution will also contain ATP, ligase buffer and a ligase such as T4 DNA ligase at about 10 units per 0.5 gg of DNA. If DNA is to be linked to a vector, it must first be linearized by digestion with the appropriate restriction endonucleases. The linearized fragment is then treated with bacterial alkaline phosphatase or calf intestine phosphatase to prevent self-ligation during the ligation step.

Preparação de DNA a partir de células significa isolamento do DNA de plasmídeo a partir de uma cultura de células hospedeiras. Os métodos normalmente usados para a preparação de DNA são as preparações de plasmídeo em larga e pequena escala descritas nas secções 1.25-1.33 de Sambrook et al. supra. Após preparação do DNA, ele pode ser purificado por métodos bem conhecidos como sejam os descritos na secção 1.40 de Sambrook et al. , supra.Preparation of DNA from cells means isolating plasmid DNA from a culture of host cells. The methods commonly used for DNA preparation are the large and small scale plasmid preparations described in sections 1.25-1.33 by Sambrook et al. supra. After preparing the DNA, it can be purified by well-known methods such as those described in section 1.40 of Sambrook et al. , supra.

Oligonucleótidos são polidesoxinucleótidos curtos de cadeia simples ou dupla que são obtidos por síntese química por métodos conhecidos (tais como química de fosfotriésteres, fosfitos ou fosforamidetos usando técnicas de fase sólida como as descritas na EP 266,032 publicada em 4 de Maio de 1988 ou através de intermediários H-fosfonato de desoxinucleósido como descrito por Froehler et al. , Nucl. Acids Res. , 14.: 5399-5407 [1986]). Outros métodos incluem a reacção em cadeia com polimerase definida abaixo e outros métodos com auto-iniciadores e síntese de oligonucleótidos em suportes sólidos. Todos estes métodos estão descritos emOligonucleotides are short single or double chain polydeoxynucleotides that are obtained by chemical synthesis by known methods (such as phosphotriester, phosphite or phosphoramide chemistry using solid phase techniques such as those described in EP 266,032 published on May 4, 1988 or through intermediates Deoxynucleoside H-phosphonate as described by Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14 .: 5399-5407 [1986]). Other methods include the polymerase chain reaction defined below and other methods with autoinitiators and synthesis of oligonucleotides on solid supports. All of these methods are described in

Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 (1989). Estes métodos são usados se fôr conhecida toda a sequência de ácido nucleico do gene ou se se conhecer a sequência do ácido nucleico complementar da codificadora. Como alternativa, se se conhecer a de aminoácidos alvo, pode-se inferir sequências sequência sequência de ácido nucleico potenciais usando resíduos codificadores conhecidos e preferidos. Os oligonucleótidos são então purificados em géis de poliacrilamida.Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989). These methods are used if the entire nucleic acid sequence of the gene is known or if the complementary nucleic acid sequence of the encoder is known. Alternatively, if the target amino acid is known, potential nucleic acid sequence sequences can be inferred using known and preferred coding residues. The oligonucleotides are then purified on polyacrylamide gels.

Reacção em cadeia com polimerase ou PCR refere-se a um processo ou técnica em que quantidades diminutas de um fragmento específico de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificados como descrito na Patente U.S. N2 4,683,195 publicada em 28 de Julho de 1987. De um modo geral a informação da sequência dos extremos da região com interesse ou para lá deles deve ser conhecida, de forma a poder-se projectar oligonucleótidos iniciadores; estes iniciadores terão uma sequência idêntica ou semelhanteàs cadeias opostas do molde a ser amplificado. Os nucleótidos terminais 5' dos dois iniciadores podem coincidir com os extremos do material amplificado. Pode-se usar PCR para amplificar sequências específicas de RNA, sequências específicas de DNA de um DNA genómico total e o cDNA transcrito a partir de RNA celular total, sequências de bacteriófago ou de plasmídeo, etc. Ver de um modo geral Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51.:263 [1987]; Erlich, ed. PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) . Conforme aqui é usado, PCR é considerado como sendo um, mas não o único, exemplo de um método de reacção em cadeia com polimerase para amplificação de ácido nucleico numa amostra a testar compreendendo a utilização de um ácido nucleico conhecido rPolymerase or PCR chain reaction refers to a process or technique in which minute amounts of a specific nucleic acid fragment, RNA and / or DNA, are amplified as described in US Patent No. 4,683,195 published on July 28, 1987. In general, the information on the sequence of the extremities of the region of interest or beyond must be known, in order to be able to project oligonucleotide primers; these primers will have a sequence identical or similar to the opposite strands of the template to be amplified. The 5 'terminal nucleotides of the two primers can match the ends of the amplified material. PCR can be used to amplify specific RNA sequences, specific DNA sequences from a total genomic DNA and the cDNA transcribed from total cellular RNA, bacteriophage or plasmid sequences, etc. See in general Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51.:263 [1987]; Erlich, ed. PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). As used herein, PCR is considered to be one, but not the only, example of a polymerase chain reaction method for amplifying nucleic acid in a test sample comprising the use of a known nucleic acid r

como iniciador e uma polimerase de ácidos nucleicos para amplificar ou gerar um fragmento específico de ácido nucleico.as a primer and a nucleic acid polymerase to amplify or generate a specific nucleic acid fragment.

Condições restringentes são aquelas que (1) empregam força iónica baixa e temperatura alta para a lavagem, por exemplo, NaC10,015M/ citrato de sódio 0,0015M/0,l% de NaDodS0₄ (SDS) a 50°C ou (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante como seja a formamida, por exemplo, 50% (vol/vol) de formamida com 0,1% albumina/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/ tampão fosfato de sódio 75 mM a 42°C. Um outro exemplo é a utilização de formamida a 50%, SSC 5x (NaCl 0,75M, citrato de sódio 0,075M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, solução de Denhardt 5x, DNA de esperma de salmão (50 ^g/ml) partido com ultrassons, 0,1% SDS e 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C em SSC 0,2x e 0,1% SDS.Strict conditions are those that (1) employ low ionic strength and high temperature for washing, for example, NaC10.015M / sodium citrate 0.0015M / 0.1% NaDodS0 ₄ (SDS) at 50 ° C or (2 ) employ during denaturation a denaturing agent such as formamide, for example 50% (vol / vol) formamide with 0.1% albumin / 0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 75 mM sodium phosphate buffer at 42 ° C. Another example is the use of 50% formamide, 5x SSC (0.75M NaCl, 0.075M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, sodium Denhardt 5x, salmon sperm DNA (50 µg / ml) broken with ultrasound, 0.1% SDS and 10% dextran sulfate at 42 ° C, with washes at 42 ° C in 0.2x and 0 SSC, 1% SDS.

Condições moderadamente restringentes estão descritas em Sambrook et al., supra e incluem a utilização de uma solução de lavagem e condições de hibridação (e.q.. temperatura, força iónica e %SDS) menos restringentes do que descrito atrás. É exemplo de condições moderadamente restringentes a incubação durante a noite a 37°C numa compreendendo: 20% formamida, SSC 5x (NaCl 150 mM, trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução citrato solução de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano e 20 μΐ/ml de DNA de esperma de salmão partido e desnaturado, seguido de lavagem dos filtros em SSC lx a cerca de 37-50°C. Os familiarizados com a matéria saberão como ajustar a temperatura, força iónica etc. conforme necessário para conjugar factores tais como comprimento da sonda e similares.Moderately stringent conditions are described in Sambrook et al., Supra and include the use of a washing solution and hybridization conditions (e.g. temperature, ionic strength and% SDS) less stringent than described above. An example of moderately restrictive conditions is incubation overnight at 37 ° C in one comprising: 20% formamide, 5x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), citrate solution Denhardt 5x, 10% dextran sulfate and 20 μΐ / ml of broken and denatured salmon sperm DNA, followed by washing the filters in lx SSC at about 37-50 ° C. Those familiar with the matter will know how to adjust the temperature, ionic strength, etc. as needed to combine factors such as probe length and the like.

Anticorpos (Abs) e imunoglobulinas (Igs) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorpos apresentam especificidade de ligação rAntibodies (Abs) and immunoglobulins (Igs) are glycoproteins having the same structural characteristics. While antibodies show specificity of r binding

a um antigénio específico, as imunoglobulinas incluem anticorpos e outras moléculas tipo anticorpo que não possuem especificidade de antigénio. Os polipeptídeos deste último tipo são por exemplo produzidos em níveis baixos pelo sistema linfático e em número elevado pelos mielomas.to a specific antigen, immunoglobulins include antibodies and other antibody-like molecules that lack antigen specificity. Polypeptides of the latter type are produced, for example, at low levels by the lymphatic system and in high numbers by myelomas.

Anticorpos e imunoglobulinas nativos são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada uma das cadeias leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissul.' fureto covalente, enquanto que o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e cada cadeia leve também possui ligações dissulfureto dentro de cada cadeia regularmente espaçadas. Cada uma das cadeias pesadas tem num extremo um domínio variável (V„) seguido de uma série de ri domínios constantes. Cada uma das cadeias leves tem um domínio variável num extremo e um domínio constante no outro extremo; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Pensa-se que resíduos de aminoáj eidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leve e pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 [1985]; Novotny e Haber, Proc. Natl.Native antibodies and immunoglobulins are generally heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 daltons, composed of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H). Each of the light chains is linked to a heavy chain by a disul bond. ' covalent fureto, while the number of disulfide bonds varies between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy chain and light chain also has disulfide bonds within each regularly spaced chain. Each of the heavy chains has a variable domain (V „) at one end followed by a series of constant domains. Each of the light chains has a variable domain at one end and a constant domain at the other end; the light chain constant domain is aligned with the first heavy chain constant domain and the light chain variable domain is aligned with the heavy chain variable domain. Particular amino acid residues are thought to form an interface between the variable domains of the light and heavy chains (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl .

Acad. Sei. USA, 82.:4592-4596 [1985]).Acad. Know. USA, 82.:4592-4596 [1985]).

termo variável refere-se ao facto de certas fraeções dos domínios variáveis diferirem extensivamente nas sequências dos diferentes anticorpos e serem usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não está distribuída ao acaso dentro dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em três segmentos chamados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis tanto nos domínios variáveis da cadeia leve rvariable term refers to the fact that certain fractions of the variable domains differ extensively in the sequences of the different antibodies and are used in the binding and specificity of each particular antibody to its particular antigen. However, variability is not randomly distributed within the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable regions both in the variable domains of the light chain r

como da pesada. As fracções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas a armação (FR)]. Os domínios variáveis das cadeias nativas compreendem cada um quatro regiões essencialmente uma configuração emfolha β, ligados por CDRs, parte, a estrutura em folha β. Os domínios são mantidos próximos pelas CDRs da outra cadeia, contribuem para ligação ao antigéniodos anticorposlike the heavy one. The most highly conserved fractions of the variable domains are called the frame (FR)]. The variable domains of the native chains each comprise four regions essentially a β-leaf configuration, linked by CDRs, partly, the β leaf structure. The domains are kept close by the CDRs of the other chain, they contribute to the binding to the antigen antibodies

Sequences of Proteins of Immunological Interest, Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Os constantes não estão directamente [(framework) pesada e leveSequences of Proteins of Immunological Interest, Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). The constants are not directly [(framework) heavy and light

FR, adoptando três os quais formam ansas ligando, e nalguns casos fazendo CDRs em cada um dos regiões FR e, com os a formação do (ver Kabat sítio de et al., National domínios envolvidos na ligação de um anticorpo ao antigénio, mas apresentam várias funções efectoras, como seja a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpos.FR, adopting three which form looping ligands, and in some cases making CDRs in each of the FR regions and, with the formation of the (see Kabat site of et al., National domains involved in the binding of an antibody to the antigen, but present various effector functions, such as the participation of the antibody in antibody-dependent cellular toxicity.

A digestão dos anticorpos com papeína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antigénio designados fragmentos Fab, cada um deles com um sítio único de ligação ao antigénio e um fragmento residual Fc, cujo nome reflete a sua capacidade para cristalizar facilmente. O tratamento com pepsina dá um fragmento F(ab')₂ que tem dois sítios que se combinam com o antigénio e é capaz de fazer ligação cruzada com o antigénio.Digestion of antibodies with papein produces two identical antigen-binding fragments called Fab fragments, each with a unique antigen-binding site and a residual Fc fragment, the name of which reflects its ability to crystallize easily. Treatment with pepsin gives an F (ab ') ₂ fragment that has two sites that combine with the antigen and is capable of cross-linking with the antigen.

Fv é o fragmento mínimo de anticorpo que contem um sítio de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Esta região consiste num dímero de um domínio variável da cadeia pesada e de um da cadeia leve numa associação estreita não covalente. É nesta configuração que os três CDRs de cada domínio variável interactuam para definir um sítio de ligação ao antigénio na superfície do dímero V^-V^. Colectivamente, os seis CDRs conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antigénio. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicos para um antigénio) tem a capacidade de rFv is the minimum antibody fragment that contains a complete antigen-recognition and binding site. This region consists of a dimer of a variable domain of the heavy chain and one of the light chain in a close non-covalent association. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the V ^ -V ^ dimer surface. Collectively, the six CDRs confer antigen-binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three antigen-specific CDRs) has the ability to r

reconhecer e ligar o antigénio, se bem que numa afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação.recognize and bind the antigen, albeit at a lower affinity than the entire binding site.

O fragmento Fab também contem o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos ao extremo carbonilo do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui dada a Fab' em que o ou os resíduos de císteina dos domínios constantes são portadores de um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')₂ originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' os quais têm císteinas charneira (hinge) entre eles. São também conhecidas outras acoplagens químicas dos fragmentos de anticorpos.The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CHI) of the heavy chain. Fab 'fragments differ from Fab fragments by adding some residues to the carbonyl end of the heavy chain CHI domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab'-SH is the name given here to Fab 'in which the cysteine residue (s) of the constant domains carry a free thiol group. The F (ab ') ₂ antibody fragments were originally produced as pairs of Fab' fragments which have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

As cadeias leves dos anticorpos (imunoglobulinas) derivadas de qualquer . espécie de vertebrado podem ser inseridas em um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa e lambda com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.The light chains of antibodies (immunoglobulins) derived from any. vertebrate species can be inserted into one of two clearly distinct types, called kappa and lambda based on the amino acid sequences of their constant domains.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser ser classsifiçadas em diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias destas podem ser ainda subdivididas em subclasses (isotipos), e.g., IgG-1, IgG-2, IgG3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Os domínios constantes das cadeias pesadas que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas a, delta, epsilon, gama e μ, respectivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas estão bem conhecidas.Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, immunoglobulins can be classified into different classes. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM and several of these can be further subdivided into subclasses (isotypes), e.g., IgG-1, IgG-2, IgG3 and IgG-4; IgA-1 and IgA-2. The heavy chain domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called a, delta, epsilon, gamma and μ, respectively. The subunit structures and three-dimensional configurations of the different classes of immunoglobulins are well known.

rr

O termo anticorpo é usado na no seu sentido mais lato- e cobre especificamente anticorpos monoclonais simples (incluindo anticorpos agonistas e antagonistas), as composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, assim como fragmentos de anticorpos (e.g., Fab, F(ab')₂ e Fv) desde que apresentem a actividade biológica pretendida.The term antibody is used in its broadest sense and specifically covers simple monoclonal antibodies (including agonist and antagonist antibodies), antibody compositions with polyepitopic specificity, as well as antibody fragments (eg, Fab, F (ab ') ₂ and Fv) as long as they have the desired biological activity.

O termo anticorpo monoclonal como aqui é usado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i . e. , os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos excepto possíveis mutações naturais que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigénico. Ainda, ao contrário das preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos) , cada um dos anticorpos monoclonais sendo dirigidos contra um único determinante no antigénio. para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por serem sintetizados pela cultura de hibridoma, não contaminados por outras imunoglobulinas. O adjectivo monoclonal indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, e não deve ser pensado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com o presente invento podem ser produzidos pelo método dos hibridomas descrito pela primeira vez por Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975) ou pode ser feito por métodos de DNA recombinante (ver, e.g.. Patente U.S. N2 4,816,567 [Cabilly et al.1).The term monoclonal antibody as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i. and. , the individual antibodies comprising the population are identical except for possible natural mutations that may be present in smaller amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In addition, unlike conventional (polyclonal) antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each of the monoclonal antibodies being directed against a single determinant in the antigen. in addition to their specificity, monoclonal antibodies are advantageous because they are synthesized by the hybridoma culture, not contaminated by other immunoglobulins. The adjective monoclonal indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and should not be thought of as requiring production of the antibody by any particular method. For example, the monoclonal antibodies to be used according to the present invention can be produced by the hybridoma method first described by Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975) or can be made by recombinant DNA methods (see , eg US Patent No. 4,816,567 [Cabilly et al.1).

Os anticorpos monoclonais aqui tratados incluem especificamente anticorpos quiméricos (imunoglobulinas) em que uma fracção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos rThe monoclonal antibodies treated herein specifically include chimeric antibodies (immunoglobulins) in which a fraction of the heavy and / or light chain is identical or homologous to the corresponding sequences in the r antibodies.

derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o resto da cadeia ou cadeias são idênticas ou homólogas às sequências corespondentes nos anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a actividade biológica pretendida (Patente U.S. N^a 4,816,567 (Cabilly et al.) : e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Csi. USA, 81:6851-6855 [1984]).derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the rest of the chain or chains are identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as such antibodies fragments so long as they exhibit the desired biological activity (U.S. Patent No. 4,816,567 ^to (Cabilly et al.): and Morrison et al, Proc Natl Acad Sci USA Csi, 81:..... 6851-6855 [1984]) .

As formas humanizadas de anticorpos não humanos (e. q. de murganho) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ ou outras subsequências do anticorpo que se liguem ao antigénio) os quais contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) como seja de murganho, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidades e capacidades pretendidas. Nalguns casos, os resíduos estruturais da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Ainda, o anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo recipiente nem no CDR ou sequêncis estruturais importados. Estas modificações são feitas para refinar e optimizar a função do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um e tipicamnete dois domínios variáveis em que a totalidade ou quase toda as regiões CDR correspondem às da imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência consensus da imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado facultativamente também compreenderá pelo menos uma fracção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a da imunoglobulina humana. Para rHumanized forms of non-human antibodies (mouse eq) are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (such as Fv, Fab, Fab ', F (ab') ₂ or other subsequences of the antibody that bind to the antigen) which contain the minimum sequence derived from non-human immunoglobulin. For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibody) in which residues from a complementarity determining region (CDR) of the recipient are replaced by residues from a CDR of a non-human species (donor antibody) such as from mice , rat or rabbit having the desired specificity, affinities and capabilities. In some cases, the structural residues of human immunoglobulin are replaced by the corresponding non-human residues. In addition, the humanized antibody may comprise residues that are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or structural sequences. These modifications are made to refine and optimize the function of the antibody. In general, the humanized antibody will comprise substantially all of at least one and typically two variable domains where all or almost all of the CDR regions correspond to those of non-human immunoglobulin and all or substantially all of the FR regions are those of a consensus sequence of human immunoglobulin. The humanized antibody optionally will also comprise at least a fraction of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of human immunoglobulin. Stop

mais detalhes ver: Jones et al, Nature, 321:522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332:323-329 [1988]; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 [1992]).more details see: Jones et al, Nature, 321: 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 [1988]; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 [1992]).

Não imunogénico num humano significa que quando do contacto do polipeptídeo, num veículo farmaceuticamente aceitável e numa quantidade terapeuticamente eficaz, com o tecido apropriado de um ser humano, não se observa sensibilidade ou resistência ao polipeptídeo quando de uma segunda administração do polipeptídeo após um período de latência adequado (e . q ., 8 a 14 dias).Non-immunogenic in a human means that upon contact of the polypeptide, in a pharmaceutically acceptable carrier and in a therapeutically effective amount, with the appropriate tissue of a human, no sensitivity or resistance to the polypeptide is observed when a second administration of the polypeptide after a period of adequate latency (e.g., 8 to 14 days).

II. Realizações Preferidas do InventoII. Preferred Realizations of the Invention

Os polipeptídeos preferidos deste invento são polipeptídeos substancialmente homogéneos, referidos como ligandos de mpl ou trombopoietina, que possuem a propriedade de se ligarem a mpl, um membro da superfamília dos receptores de citocinas e tendo a propriedade biológica de estimu3 larem a incorporação de nucleótidos marcados ( H-timidina) no DNA de células Ba/F3 dependentes de IL-3 transfectadas com pml humano. Os ligandos de mpl mais preferidos são proteínas de mamífero isoladas tendo actividade hematopoiética, especialmente megacariocitopoiética ou trombocitipoiética - nomeadamente, sendo capaz de estimular a proliferação, maturação e/ou diferenciação de megacariócitos maduros ou seus predecessores na forma madura produtora de plaquetas. Os polipeptídeos mais preferidos deste invento são ligandos de mpl humano incluindo seus fragmentos tendo actividade hematopoiética, megacariocitopoiética ou trombopoiética. Facultativamente estes ligandos de mpl humanos não são glicosilados. Outros ligandos de mpl humano preferidos são domínio EPO de hML referido como hML_1c_ ou hTPO,^,The preferred polypeptides of this invention are substantially homogeneous polypeptides, referred to as mpl or thrombopoietin ligands, which have the property of binding to mpl, a member of the cytokine receptor superfamily and having the biological property of stimulating the incorporation of labeled nucleotides ( H-thymidine) in the DNA of IL-3-dependent Ba / F3 cells transfected with human pml. The most preferred mpl ligands are isolated mammalian proteins having hematopoietic activity, especially megakaryocytopoietic or thrombocytopoietic - namely, being able to stimulate the proliferation, maturation and / or differentiation of mature megakaryocytes or their predecessors in the mature platelet-producing form. The most preferred polypeptides of this invention are human mpl ligands including fragments having hematopoietic, megakaryocytopoietic or thrombopoietic activity. These human mpl ligands are optionally not glycosylated. Other preferred human mpl ligands are HML EPO domain referred to as KLH or hTPO _1c _, ^,

153 153r, uma forma truncada de hML referida como I1ML245 e o polipeptídeo maduro de tamanho completo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), referido como r153 153r, a truncated form of hML referred to as I1ML245 and the full-length mature polypeptide having the amino acid sequence shown in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), referred to as r

hML, hML₃₃₂ ou hTPC>₃₃₂ e a variante substituída biologicamente activa hML(R153A, R154A).hML, hML ₃₃₂ or hTPC> ₃₃₂ and the biologically active substituted variant hML (R153A, R154A).

Polipeptídeos preferidos facultativos deste invento são variantes dos ligandos de mpl imunologicamente activos seleccionados de entre hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML e pML2.Preferred preferred polypeptides of this invention are variants of the immunologically active mpl ligands selected from hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML and pML2.

Polipeptídeos preferidos facultativos deste invento são variantes do ligando de mpl biologicamnete activos que possuem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos com o ligando de mpl humano (ver Fig. 1 [SEQ ID NO:: 1]), o ligando de mpl de murganho (ver Fig. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), o ligando de mpl recombinante de porco (verFig. 19[SEQ ID NO: 18]) ou o ligando de mpl de porco isolado a partir de plasma de porco aplástico, de preferência 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, mesmo mais preferencialmente 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%.Preferred preferred polypeptides of this invention are biologically active mpl ligand variants that have an amino acid sequence having at least 70% amino acid sequence identity with the human mpl ligand (see Fig. 1 [SEQ ID NO :: 1]) , the mouse mpl ligand (see Fig. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]), the recombinant pig mpl ligand (see Fig. 19 [SEQ ID NO: 18]) or the isolated pig mpl ligand from aplastic pig plasma, preferably 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably 90% and most preferably at least 95%.

O ligando de mpl isolado a partir de plasma de porco aplástico tem as seguintes características:The mpl ligand isolated from aplastic pig plasma has the following characteristics:

(1) O ligando parcialmente purificado elui a partir de uma coluna de filtração em gel com PBS, PBS contendo 0,1% SDS ou PBS contendo MgCl₂ 4M com um peso molecular de 60000-70000;(1) The partially purified ligand elutes from a gel filtration column with PBS, PBS containing 0.1% SDS or PBS containing 4M MgCl ₂ with a molecular weight of 60000-70000;

(2) A actividade do ligando é destruída por pronase;(2) Ligand activity is destroyed by pronase;

(3) O ligando é estável a pH baixo (2,5), SDS até 0,1% e ureia 2M;(3) The ligand is stable at low pH (2.5), SDS up to 0.1% and 2M urea;

(4) O ligando é uma glicoproteína baseado na sua capacidade de ligação a uma variedade de colunas de lectina;(4) The ligand is a glycoprotein based on its ability to bind to a variety of lectin columns;

rr

(5) O ligando altamente purificado migra em(5) The highly purified ligand migrates in

SDS-PAGE não redutora com uma Mr de 25000-35000. Quantidades mais pequenas de actividade também migram com Mr ~ 18000-22000 e 60000;Non-reducing SDS-PAGE with a Mr of 25000-35000. Smaller amounts of activity also migrate with Mr ~ 18000-22000 and 60000;

(6) O ligando altamente purificado migra em SDS-PAGE redutor com uma Mr de 28000 e 31000.(6) The highly purified ligand migrates on reducing SDS-PAGE with a Mr of 28000 and 31000.

(7) A sequência terminal amina das bandas 18000-22000, 28000 e 31000 é a mesma - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO:29); e (3) O ligando liga-se e elui das colunas de afinidade(7) The amino terminal sequence for the bands 18000-22000, 28000 and 31000 is the same - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); and (3) The ligand binds and elutes from the affinity columns

Blue-Sepharose,Blue-Sepharose,

CM Blue Sepharose,CM Blue Sepharose,

MONO-Q,MONO-Q,

MONO-S, Lectina de lentilha-Sepharose, WGA-Sepharose,MONO-S, Lentil Lectin-Sepharose, WGA-Sepharose,

Con A-Sepharose,Con A-Sepharose,

Eter 650m Toyopearl,Ether 650m Toyopearl,

Butil 650m Toyopearl, Fenil 650m Toyopearl e Feni1-Sepharose.Butil 650m Toyopearl, Fenil 650m Toyopearl and Feni1-Sepharose.

Os polipeptídeos ligando de mpl mais preferidos são os codificados por DNA genómico humano ou cDNA tendo uma J sequência de aminoácidos descrita na Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).The most preferred mpl ligand polypeptides are those encoded by human genomic DNA or cDNA having an amino acid sequence described in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

Outros polipeptídeos naturais biologicamente activos preferidos do ligando de mpl deste invento incluem o prepro-ligando de mpl, o pro-ligando de mpl, o ligando de mpl maduro, fragmentos do ligando de mpl e suas variações de glicosilação.Other preferred biologically active natural polypeptides of the mpl ligand of this invention include the mpl prepro-ligand, the mpl pro-ligand, the mature mpl ligand, mpl ligand fragments and their glycosylation variations.

Ainda outros polipeptídeos preferidos deste invento incluem variantes da sequência do ligando de mpl e quimeras. Normalmente, as variantes preferidas da sequência do ligando de mpl e quimeras são variantes do ligando de mpl biologicamente activas que possuem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com o ligando de mpl humano ou o ligando de mpl isolado a partir de plasma de porco aplástico, de preferência pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, mesmo mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%. Um exemplo de uma variante preferida do ligando de mpl é uma variante do domínio N-terminal de hML (referido como domínio EPO devido à homologia da sua sequência com eritropoietina). O domínio EPO de hML preferido compreende aproximadamente os primeiros 153 aminoácidos de hML maduro e é referido como hML_ncn. Uma variante daStill other preferred polypeptides of this invention include variants of the mpl ligand sequence and chimeras. Typically, preferred variants of the mpl ligand sequence and chimeras are biologically active mpl ligand variants that have an amino acid sequence having at least 70% identity of the amino acid sequence to the human mpl ligand or the isolated mpl ligand from aplastic pig plasma, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably at least 90% and most preferably at least 95%. An example of a preferred variant of the mpl ligand is a variant of the N-terminal domain of hML (referred to as the EPO domain due to the homology of its sequence to erythropoietin). The preferred hML EPO domain comprises approximately the first 153 amino acids of mature hML and is referred to as hML _ncn . A variant of

IDJ sequência de hML facultativamente preferida compreende uma em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos dibásicos no domínio C-terminal é substituído por resíduos de aminoácidos não básicoa (e.g., hidrofóbos, neutros, ácidos, aromáticos, Gli, Pro e similares). Uma variante preferida da sequência do domínio C-terminal de hML compreende uma em que os resíduos Arg 153 e 154 são substituídos com resíduos Ala. Esta variante é referida como hML₃₂₂(R153A, R154A). Uma variante de hML alternativa preferida compreende hML₃₃₂ ou hML₁₅₃ em que os resíduos de aminoácidos 111-114 (QLPP ou LPPQ) foram eliminados ou substituídos com uma sequência tetrapeptídica diferente (e.g.AGAG ou similares) . Os mutantes de deleção referidos são designados como /\4hML₂₂₂ ou Zi4hML₁₅₃.The optionally preferred hML sequence comprises one where one or more of the dibasic amino acid residues in the C-terminal domain is replaced by non-basic amino acid residues (eg, hydrophobes, neutrals, acids, aromatics, Gly, Pro and the like). A preferred variant of the hML C-terminal domain sequence comprises one in which the Arg 153 and 154 residues are replaced with Ala residues. This variant is referred to as hML ₃₂₂ (R153A, R154A). A preferred alternative hML variant comprises hML ₃₃₂ or hML ₁₅₃ in which amino acid residues 111-114 (QLPP or LPPQ) have been eliminated or replaced with a different tetrapeptide sequence (egAGAG or the like). The deletion mutants referred to are designated / / 4hML ₂₂₂ or Zi4hML ₁₅₃ .

Uma quimera preferida é uma fusão entre o ligando de mpl ou seu fragmento (definido abaixo) com um polipeptídeo heterólogo ou seu fragmento. Por exemplo, hML₁₅₃ pode ser fundido com um fragmento IgG para aumentar a semi-vida no soro ou com IL-3, G-CSF ou EPO para produzir uma moléculaA preferred chimera is a fusion between the mpl ligand or its fragment (defined below) with a heterologous polypeptide or fragment. For example, hML ₁₅₃ can be fused with an IgG fragment to increase serum half-life or with IL-3, G-CSF or EPO to produce a molecule

com maior actividade trombopoiética ou hematopoiética quimérica.with greater thrombopoietic or chimeric hematopoietic activity.

Uma quimera do ligando de mpl humano alternativa preferida é uma quimera do domínio EPO de ML que consiste em 153 a 157 resíduos do extremo N de hML substituídos com um ou mais, mas não todos, os resíduos EPO humanos alinhados aproximadamente como se mostra na Fig. 10 (SEQ ID NO: 7). Nesta realização, a quimera de hML terá cerca de 153-166 resíduos de comprimento em que resíduos individuais ou blocos de resíduos da sequência de EPO humana foram adicionados ou substituídos na sequência hML nas posições correspondentes ao alinhamento mostrado na Fig. 10 (SEQ ID NO: 6). Exemplos de insertos de blocos de sequências na fracção do extremo N de hML incluemum ou mais dos sítios de N-glicosilação nas posições (EPO) 24-27, 38-40 e 83-85; um ou mais dos quatro feixes α-helicoidais anfipáticos previstos nas posições (EPO) 9-22, 59-76, 90-107, e 132-152; e outras regiões altamente conservadas incluindo as regiões do extremo Ne do extremo C e as posições de resíduos (epo) 44-52 (ver e.g., Wen et al. , Blood, .82.: 1507-1516 [1993] e Boissel et al. , J. Biol. Chem., 268 (21) :15983-15993 [1993]). Considera-se que esta quimera do domínio EPO de ML terá uma actividade biológica mista trombopoiética-eritropoiética (TEPO).A preferred alternative human mpl ligand chimera is a chimera of the EPO domain of ML consisting of 153 to 157 residues of the N-terminus of hML replaced with one, but not all, human EPO residues aligned approximately as shown in Fig 10 (SEQ ID NO: 7). In this embodiment, the hML chimera will be about 153-166 residues in length where individual residues or blocks of residues from the human EPO sequence have been added or replaced in the hML sequence at positions corresponding to the alignment shown in Fig. 10 (SEQ ID NO : 6). Examples of sequence block inserts in the N-end fraction of hML include one or more of the N-glycosylation sites at (EPO) positions 24-27, 38-40 and 83-85; one or more of the four amphipathic α-helical bundles provided for in positions (EPO) 9-22, 59-76, 90-107, and 132-152; and other highly conserved regions including the extreme N and extreme C regions and the residue positions (epo) 44-52 (see eg, Wen et al., Blood, .82 .: 1507-1516 [1993] and Boissel et al ., J. Biol. Chem., 268 (21): 15983-15993 [1993]). This chimera of the EPO domain of ML is considered to have mixed thrombopoietic-erythropoietic biological activity (TEPO).

Outros polipeptídeos preferidos deste invento incluem fragmentos de ligando de mpl tendo uma sequência consecutiva de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 resíduos de aminoácidos mpl isoladas a ligando Exemplo ML[1-X] que são idênticos às sequências do ligando de partir de plasma de porco humano aqui descrito (ver frragmento do ligando deOther preferred polypeptides of this invention include mpl ligand fragments having a consecutive sequence of at least 10, 15, 20, 25, 30 or 40 isolated mpl amino acid residues to ligand Example ML [1-X] which are identical to the ligand sequences from human pig plasma described here (see fragmentation of the ligand of

164, 191, 205, de mpl164, 191, 205, from mpl

24). Um humano onde X é 153, aplástico ou do24). A human where X is 153, aplastic or

e.g. Tabela 14, mpl preferido ée.g. Table 14, preferred mpl is

207, 217, 229 ou207, 217, 229 or

245 (ver Fig. 1 (SEQ ID N0: 1) para a sequência de resíduos245 (see Fig. 1 (SEQ ID N0: 1) for the waste sequence

1-X). Outros fragmentos ligandos de mpl preferidos incluem r1-X). Other preferred mpl ligand fragments include r

os produzidos como resultado da hidrólise ou digestão química ou enzimática do ligando purificado.those produced as a result of the hydrolysis or chemical or enzymatic digestion of the purified ligand.

Um outro aspecto preferido do invento é um método de purificação das moléculas do ligando de mpl caracterizado pelo contacto de uma fonte de moléculas do ligando de mpl com um plipeptídeo receptor imobilizado, especificamente mpl ou um polipeptideo de fusão com mpl. em condições tais que as moléculas de ligando de mpl a serem purificadas sejam adsorvidas selectivamente ao polipeptideo receptor imobilizado, lavagem do suporte imobilizado para remover o material não adsorvido e eluição das moléculas a serem purificadas do polipeptideo receptor imobilizado com um tampão de eluição. A fonte contendo o ligando de mpl pode ser plasma e o receptor imobilizado é de preferência uma fusão mpl-IqG.Another preferred aspect of the invention is a method of purifying mpl ligand molecules characterized by contacting a source of mpl ligand molecules with an immobilized receptor plipeptide, specifically mpl or an mpl fusion polypeptide. under conditions such that the mpl ligand molecules to be purified are selectively adsorbed to the immobilized receptor polypeptide, washing the immobilized support to remove the non-adsorbed material and eluting the molecules to be purified from the immobilized receptor polypeptide with an elution buffer. The source containing the mpl ligand can be plasma and the immobilized receptor is preferably an mpl-IqG fusion.

Como alternativa, a fonte contendo o ligando de mpl é uma cultura de células recombinantes onde a concentração do ligando de mpl no meio de cultura ou nos lisados celulares é geralmente superior do que no plasma ou noutras fontes naturais. Neste caso o método de imunoafinidade acima descrito com mpl-Iq, se bem que ainda útil, não é geralmente necessário e métodos de purificação de proteína mais tradicionais podem ser aplicados. Resumidamente, o método de purificação preferido para proporcionar ligando de mpl substancialmente homogéneo compreende: remoção de deritos, quer de células hospedeiras ou fragmentos lisados, por exemplo por centrifugação ou ultrafiltração; facultativamente a proteína pode ser concnetrada com um filtro concentrador de proteínas disponível no mercado; seguido de separação do ligando de outras impurezas em um ou mais passos seleccionados de entre: imunoafinidade, permuta iónica f e. q.. DEAE ou matrizes contendo grupos carboximetilo ou sulfopropilo), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lectina de lentilha-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Éter Toypearl, Butilo ToyPearl, Fenilo Toypearl, proteína A Sepharose, SDS-PAGE, HPLC em fase reversa (e.q..sílicaAlternatively, the source containing the mpl ligand is a recombinant cell culture where the concentration of the mpl ligand in the culture medium or in cell lysates is generally higher than in plasma or other natural sources. In this case the immunoaffinity method described above with mpl-Iq, although still useful, is generally not necessary and more traditional protein purification methods can be applied. Briefly, the preferred purification method for providing substantially homogeneous mpl ligand comprises: removal of deritoses, either from host cells or lysed fragments, for example by centrifugation or ultrafiltration; optionally the protein can be concentrated with a commercially available protein concentrating filter; followed by separation of the ligand from other impurities in one or more steps selected from: immunoaffinity, ion exchange f e. q .. DEAE or matrices containing carboxymethyl or sulfopropyl groups), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil-Sepharose lectin, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Toypearl ether, Toyyl butyl ToyPearl , Phenyl Toypearl, protein A Sepharose, SDS-PAGE, reverse phase HPLC (silica eq.

gel com grupos alifáticos apensos) ou cromatografia de filtração molecular ou de exclusão por tamanhos e precipitação com etanol ou sulfato de amónio. Em qualquer um dos passos referidos pode ser incluido um inibidor de proteases como seja metilsulfonilfluoreto (PMSF) para inibir proteólise.gel with attached aliphatic groups) or molecular filtration or size exclusion chromatography and precipitation with ethanol or ammonium sulphate. A protease inhibitor such as methylsulfonylfluoride (PMSF) can be included in any of the steps mentioned to inhibit proteolysis.

Numa outra realização preferida, este invento proporciona um anticorpo isolado capaz de se ligar ao ligando de mpl. Um anticorpo isolado preferido contra o ligando de mpl é monoclonal (Kohler e Milsteins, Nature, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques inIn another preferred embodiment, this invention provides an isolated antibody capable of binding the mpl ligand. A preferred isolated antibody against the mpl ligand is monoclonal (Kohler and Milsteins, Nature, 256: 495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in

Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985]; e Huse et al. , Science, 246: 1275-1281 [1989]). O anticorpo isolado preferido contra o ligando é um que se ligue ao ligando de mpl com uma afinidade de pelo menos cerca de 10⁶ 1/mole. Mais preferencialmente o anticorpo liga-se com uma afinidade de pelo menos cerca de 10 1/mole. Mais preferencialmente , o anticorpo é induzido contra o ligando de mpl tendo uma das funções efectoras acima descritas. O anticorpo isolado capaz de se ligar ao ligando de mpl pode ser facultativamente fundido com um segundo polipeptídeo e o anti- corpo ou seu produto de fusão pode ser usado para isolar e purificar o ligando de mpl a partir de uma fonte como descrito atrás para o polipeptídeo mpl imobilizado. Num outro aspecto preferido desta realização, o invento proporciona um método para detecção do ligando de mpl in vitro ou > in vivo caracterizado pelo contacto do anticorpo com uma amostra, especialmente uma amostra de soro, de que se suspeita conter o ligando e detecção da ligação.Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985]; and Huse et al. , Science, 246: 1275-1281 [1989]). The preferred isolated antibody against the ligand is one that binds the mpl ligand with an affinity of at least about 10 ⁶ 1 / mole. More preferably, the antibody binds with an affinity of at least about 10 1 / mole. Most preferably, the antibody is induced against the mpl ligand having one of the effector functions described above. The isolated antibody capable of binding to the mpl ligand can optionally be fused to a second polypeptide and the antibody or its fusion product can be used to isolate and purify the mpl ligand from a source as described above for the immobilized mpl polypeptide. In another preferred aspect of this embodiment, the invention provides a method for detecting the mpl ligand in vitro or> in vivo characterized by contacting the antibody with a sample, especially a serum sample, suspected of containing the ligand and detecting binding .

Ainda noutras realizações preferidas, o invento proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora do ligando de mpl ou seu fragmento, molécula de ácido nucleico essa que pode ser marcada ou não marcada com uma marca detectável e uma molécula de ácido nucleico tendo a rIn still other preferred embodiments, the invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding the mpl ligand or its fragment, which nucleic acid molecule can be labeled or unmarked with a detectable tag and a nucleic acid molecule having the r

sequência que é complementar ou que hibrida em condições restringentes ou moderadamente restringentes com uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência codificadora de um ligando de mpl. Um ácido nucleico preferido do ligando de mpl mpl é RNA ou DNA que codifique um ligando de mpl biologicamnete activo partilhando pelo meos 75% da identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais prefrencialmente pelo menos 85%, mesmo mais preferencialmente 90% e mais preferencialmente 95% da identidade de sequência com o ligando de mpl humano. Moléculas de ácido nucleico isoladas mais preferidas são sequências de DNA codificadoras do ligando de mpl biologicamente activo, seleccionado entre: (a) DNA baseado na região codificadora de um gene do ligando de mpl de mamífero (e.g., DNA compreendendo a sequência de nucleótidos proporcionada na Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) ou seu fragmento); (b) DNA capaz de hibridar com um DNA de (a) pelo menos em condições moderadamente restringentes; e (c) DNA que é degenerado com um DNA definido em (a) ou (b) o qual resulta da degenerescência do código genético. Considera-se que os novos ligandos de mpl aqui descritos podem ser membros de uma família de ligandos ou citoquinas tendo identidade de sequências adequada de forma a que o seu DNA possa hibridar com o DNA da Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) (ou o complemento ou seus fragmentos) em condições de restringências baixas a moderadas. Assim, um outro aspecto deste invento inclui DNA que hibrida em condições de restringência baixas a moderadas com DNA codificador dos polipeptídeos ligandos de mpl.sequence that is complementary or that hybridizes under stringent or moderately stringent conditions to a nucleic acid molecule having a sequence encoding an mpl ligand. A preferred nucleic acid of the mpl mpl ligand is RNA or DNA encoding a biologically active mpl ligand sharing at least 75% of the sequence identity, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably 90 % and most preferably 95% of the sequence identity with the human mpl ligand. Most preferred isolated nucleic acid molecules are DNA sequences encoding the biologically active mpl ligand, selected from: (a) DNA based on the coding region of a mammalian mpl ligand gene (eg, DNA comprising the nucleotide sequence provided in the Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) or its fragment); (b) DNA capable of hybridizing to DNA from (a) at least under moderately stringent conditions; and (c) DNA that is degenerated with a DNA defined in (a) or (b) which results from the degeneracy of the genetic code. It is considered that the new mpl ligands described herein may be members of a family of ligands or cytokines having adequate sequence identity so that their DNA can hybridize with the DNA of Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) ( or the complement or its fragments) under conditions of low to moderate restrictions. Thus, another aspect of this invention includes DNA that hybridizes under low to moderate stringency to DNA encoding the mpl ligand polypeptides.

Ainda numa outra realização preferida deste invento, a molécula de ácido nucleico é cDNA codificador do ligando de mpl e compreende ainda um vector replicável em que o cDNA estja operacionalmente ligado a sequências de controle reconhecidas por um hospedeiro transformado com o vector. Este aspecto inclui ainda células hospedeiras transformadas com o vector e um método de utilização do cDNA ra a produção do ligando de mpl, caracterizado pela rIn yet another preferred embodiment of this invention, the nucleic acid molecule is cDNA encoding the mpl ligand and further comprises a replicable vector in which the cDNA is operably linked to control sequences recognized by a host transformed with the vector. This aspect also includes host cells transformed with the vector and a method of using the cDNA for the production of the mpl ligand, characterized by the r

expressão do cDNA codificador do ligando de mpl numa cultura de células hospedeiras transformadas e recuperação do ligando de mpl a partir da cultura de células hospedeiras. 0 ligando de mpl preparado desta forma é de preferência ligando de mpl humano substancialmente homogéneo. Uma célula hospedeira preferida para a produção do ligando de mpl são as células ovário de hamster chinês (CHO).expression of the mpl ligand encoding cDNA in a transformed host cell culture and recovery of the mpl ligand from the host cell culture. The mpl ligand prepared in this way is preferably substantially homogeneous human mpl ligand. A preferred host cell for the production of the mpl ligand is Chinese hamster ovary (CHO) cells.

O invento ainda inclui um método preferido para o tratamento de um mamífero tendo uma perturbação imunológica ou hematopoiética, especialmente trombocitopenia, caracterizado pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligando de mpl ao mamífero. Facultativamente, o ligando de mpl é administrado em combinação com uma citoquina, especialmente um factor estimualdor de colónias ou interleucina. Os factores estimuladores de colónias preferidos ou interleucina incluem: ligando de kit, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 ou IL-11.The invention further includes a preferred method for treating a mammal having an immunological or hematopoietic disorder, especially thrombocytopenia, characterized by the administration of a therapeutically effective amount of a mpl ligand to the mammal. Optionally, the mpl ligand is administered in combination with a cytokine, especially a colony stimulating factor or interleukin. Preferred colony stimulating factors or interleukin include: kit ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 or IL-11.

III. MétodosIII. Methods

A produção de plaquetas foi durante muito tempo pensada por alguns autores como sendo controlada por factores humorais específicos de linhagens múltiplas. Foi postulado que duas actividades de citocina específicas, referidas como factor estimulador de colónias de megacariócitos (meg-CSF) e trombopoietina, regulam a megacariocitopoiese e a trombopoiese (Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982]; Williams et al. , Blood Cells, 15:123-133 [1989]; e Gordon et al., Blood, 20:302-307 [1992]). De acordo com esta hipótese, meg-CSF estimula a proliferação de megacariócitos progenitores enquanto que a trombopoietina afecta principalmente a maturação de células mais diferenciadas e finalmente a libertação de plaquetas. Desde 1960 a indução e aparecimento das actividades de meg-CSF e trombopoietina no plasma, soro e urina de animais e humanos após rPlatelet production has long been thought by some authors to be controlled by specific humoral factors of multiple lineages. It has been postulated that two specific cytokine activities, referred to as megakaryocyte colony stimulating factor (meg-CSF) and thrombopoietin, regulate megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982 ]; Williams et al., Blood Cells, 15: 123-133 [1989]; and Gordon et al., Blood, 20: 302-307 [1992]). According to this hypothesis, meg-CSF stimulates the proliferation of progenitor megakaryocytes whereas thrombopoietin mainly affects the maturation of more differentiated cells and finally the release of platelets. Since 1960, the induction and appearance of meg-CSF and thrombopoietin activities in plasma, serum and urine of animals and humans after r

casos de trombocitopenia está bem documentada (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol., 54:340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108:146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin. Invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608 [1974]; Hoffman et al,N. Engl. J. Med., 305:533 [1981]; Straneva et al. , Exp. Hematol., 17.:1122-1127 [1988]; Mazur et al. , Exp. Hematol., 13.:1164 [1985]; Mazur et al. , J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner et al. , Blood, 56:183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20:354-360 [1992]; e Hegyi et al., Int. J. Cell Cloning, 8:236-244 [1990]). Estas actividades forma descritas como sendo específicas de linhagem e distintas das citoquinas conhecidas (Hill R.J. et al., Blood 80:346 (1992); Erickson-Miller C.L. et al. , Brit. J. Haematol., 84.:197-203 (1993); Straneva J.E. et al. . Exp. Hematol. .20:4750 (1992); e Tsukada J. et al., Blood 81:866-867 [1993]). Daqui em diante, as tentativas para purificar meg-CSF ou trombopoietina a partir do plasma ou urina trombocitop.énico foram infrutíferas.cases of thrombocytopenia are well documented (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108: 428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol., 54: 340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108: 146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin. Invest., 49: 1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44: 605-608 [1974]; Hoffman et al, N. Engl. J. Med., 305: 533 [1981]; Straneva et al., Exp. Hematol., 17.:1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp Hematol., 13.:1164 [1985]; Mazur et al., J. Clin. Invest., 68: 733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood, 56: 183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20: 354-360 [1992]; and Hegyi et al., Int. J. Cell Cloning, 8: 236-244 [1990]). These activities were described as being lineage specific and distinct from known cytokines (Hill RJ et al., Blood 80: 346 (1992); Erickson-Miller CL et al., Brit. J. Haematol., 84.:197-203 (1993); Straneva JE et al. Exp. Hematol. 20: 4750 (1992); and Tsukada J. et al., Blood 81: 866-867 [1993]). Henceforth, attempts to purify meg-CSF or thrombopoietin from plasma or thrombocytopenic urine have been unsuccessful.

Consistente com as observações atrás referidas descrevendo plasma trombocitopénico, encontrámos que o plasma aplástico de porco (APP) obtido a partir de porcos irradiados estimula a megacariocitopoiese humana in vitro. Encontrámos que esta actividade estimuladora é inibida pelo domínio extracelular solúvel de c-mpl, confirmando APP como uma fonte potencial do ligando de mpl (ML) putativo. Purificámos agora com êxito o ligando de mpl a partir de APP e a informação da sequência de aminoácidos foi usada paras isolar cDNA de ML de murganho, de porco e humano. Estes MLs têm homologia de sequência com eritropoietina e têm actividades do tipo meg-CSF e trombopoietina.Consistent with the aforementioned observations describing thrombocytopenic plasma, we found that aplastic pig plasma (APP) obtained from irradiated pigs stimulates human megakaryocytopoiesis in vitro. We found that this stimulatory activity is inhibited by the soluble extracellular domain of c-mpl, confirming APP as a potential source of the putative mpl ligand (ML). We have now successfully purified the mpl ligand from APP and the amino acid sequence information was used to isolate mouse, pig and human ML cDNA. These MLs have sequence homology with erythropoietin and have meg-CSF and thrombopoietin activities.

1. Purificação e Identificação do Ligando de mpl a partir de Plasma1. Purification and Identification of the mpl Ligand from Plasma

Conforme estabelecido atrás, plasma aplásticoAs stated above, aplastic plasma

derivado de uma variedade de espécies foi descrito como possuindo actividades que estimulam a heraatopoiese in vitro, no entanto, não foi ainda descrito qualquer factor estimulador hematopoiético isolado a partir de plasma. Uma fonte de plasma aplástico é o obtido a partir de porcos irradiados. Este plasma de porco aplástico (APP) estimula a hematopoiese humana in vitro. Para determinar se APP continha o ligando de mpl. o seu efeito foi testado medindo a incorporação de ^H-timidina em células Ba/F3 transfectadas com mpl P humano (Ba/F3-mpl) pelo processo mostrado na Fig. 2. APP estimulou 3 a incorporação de H-timidina em células Ba/F3-mpl mas não nas células testemunhas Ba/F3 ( i.e., não transfectadas com mpl P). Ainda, Tal actividade não foi observada em plasma normal d eporco. Estes resultados indicam que APP continha um factor ou factores que transduziram um sinal proliferativo através do receptor de mpl e portanto devem ser o ligando natural deste receptor. Isto foi ainda apoiado pelo facto de o tratamento de APP com mpl-IqG solúvel ter bloqueado os efeitos estimuladores de APP sobre as células Ba/F3-mpl.derived from a variety of species has been described as having activities that stimulate heraatopoiesis in vitro, however, no hematopoietic stimulating factor isolated from plasma has yet been described. A source of aplastic plasma is obtained from irradiated pigs. This aplastic pig plasma (APP) stimulates human hematopoiesis in vitro. To determine whether APP contained the mpl ligand. its effect was tested by measuring the incorporation of ^ H-thymidine in Ba / F3 cells transfected with human mpl P (Ba / F3-mpl) by the process shown in Fig. 2. APP stimulated the incorporation of H-thymidine in Ba cells / F3-mpl but not in Ba / F3 control cells (ie, not transfected with P mpl). In addition, such activity has not been observed in normal pig plasma. These results indicate that APP contained a factor or factors that transduced a proliferative signal through the mpl receptor and therefore must be the natural ligand for this receptor. This was further supported by the fact that treatment of APP with soluble mpl-IqG has blocked the stimulatory effects of APP on Ba / F3-mpl cells.

A actividade em APP parece ser uma proteína pois pronase, DTT ou calor destruírem a actividade em APP (Fig. 3). A actividade também não é dialisável. A actividade foi, no entanto, estável a pH baixo (pH 2,5 durante 2 horas) e liga-se e elui de várias colunas de afinidade com lectinas, indicando que é uma glicoproteína. Para elucidar melhor a estrutura e identidade desta actividade ela foi purificada a partir de APP usando uma quimera mpl-IqG.APP activity appears to be a protein because pronase, DTT or heat destroys APP activity (Fig. 3). The activity is also not dialysable. The activity was, however, stable at low pH (pH 2.5 for 2 hours) and binds and elutes from several lectin affinity columns, indicating that it is a glycoprotein. To better elucidate the structure and identity of this activity, it was purified from APP using an mpl-IqG chimera.

APP foi tratado de acordo com o protocolo estabelecido nos Exemplos 1 e 2. Resumidamente, o ligando de mpl foi purificado usando cromatografia de interacção hidrófoba (HIC), cromatografia de corante imobilizado e cromatografia de afinidade com mpl. A recuperação da actividade em cada passo está apresentada na Fig. 4 e o número de vezes da purificação está apresentado na Tabela 1. A recuperação global da actividade após coluna de afinidade com mpl foi de rAPP was treated according to the protocol established in Examples 1 and 2. Briefly, the mpl ligand was purified using hydrophobic interaction chromatography (HIC), immobilized dye chromatography and mpl affinity chromatography. The recovery of activity in each step is shown in Fig. 4 and the number of times of purification is shown in Table 1. The overall recovery of activity after mpl affinity column was r

aproximadamente 10%. A fracção com o pico de actividade (F6) derivada da coluna de afinidade com mol tinha uma actividade específica calculada em 9,8 xlO⁶ unidades/mg. A purificação global a partir de 5 litros de APP foi de aproximadamente 4 xlO⁶ vezes (0,8 unidades/mg para 3,3 xlO⁶ unidades/mg) com uma redução de 83 xlO⁶ vezes na proteína (250 g para 3 Mg). Estimámos a actividade específica do ligando eluido a partir da coluna de afinidade com mpl como sendo 2:3 xlO⁶ unidades/mg.approximately 10%. The peak activity fraction (F6) derived from the mol affinity column had a specific activity calculated at 9.8 x ^{10 6} units / mg. The overall purification from 5 liters of APP was approximately 4 x ^{10 6} times (0.8 units / mg to 3.3 x ^{10 6} units / mg) with an 83 x ^{10 6} times reduction in protein (250 g to 3 mg ). We estimated the specific activity of the ligand eluted from the mpl affinity column as being 2: 3 x ^{10 6} units / mg.

TABELA 1TABLE 1

Purificação de Ligando mplPurification of Mpl Ligand

Análise Analyze Volume mis Volume mis Proteína mg/ml Protein mg / ml Unidades /ml Units / ml Unidades Units Activida de específica Unidades/mg Specific activity Units / mg Rendimento % Yield % No.de vezes da purificação No. of purification times APP APP 5000 5000 50 50 4 0 4 0 200,000 200,000 0,8 0.8 - - 1 1 Fenil Fenil 4700 4700 0,8 0.8 40 40 200,000 200,000 50 50 94 94 62 62 Blue-Sep. Blue-Sep. 640 640 0,93 0.93 400 400 256,000 256,000 430 430 128 128 538 538 mpl/(μΐ) (Fxns 5-7) mpl / (μΐ) (Fxns 5-7) 12 12 -4 5X10 -4 5X10 1666 1666 20,000 20,000 3,300,000 3,300,000 10 10 4,100,000 4,100,000

A proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford. concentração proteica das fracções eluidas de mpl 5-7 são estimativas baseadas na intensidade da coloração de um gel de SDS corado com prata. Uma unidade é definida como a que causa 50% da estimulação máxima da proliferação de Ba/F3-mplThe protein was determined by the Bradford assay. Protein concentration of the eluted fractions of mpl 5-7 are estimates based on the intensity of the staining of a silver stained SDS gel. One unit is defined as the one that causes 50% of the maximum stimulation of Ba / F3-mpl proliferation

A análise das fracções eluidas a partir da coluna de afinidade com mpl por SDS-PAGE (4-20%, gel Novex) em condições redutoras, revelou a presença de várias proteínas (Fig. 5). As proteínas coradas com prata com maior intensidade migraram com uma Mr aparente de 66000, 55000, 30000, 28000 e 18000-22000. Para determinar qual destas proteínasAnalysis of the fractions eluted from the mpl affinity column by SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) under reducing conditions, revealed the presence of several proteins (Fig. 5). The silver-stained proteins with greater intensity migrated with an apparent Mr of 66000, 55000, 30000, 28000 and 18000-22000. To determine which of these proteins

estimulou a proliferação de culturas de células Ba/F3 mpl. as proteínas foram eluidas do gel como descrito no Exemplo 2 .stimulated the proliferation of cultures of Ba / F3 mpl cells. the proteins were eluted from the gel as described in Example 2.

Os resultados desta experiência mostraram que a maior parte da actividade eluiu da fatia de gel que incluia as proteínas com Mr 28000-32000, com menos actividade eluindo na região 18000-22000 do gel (Fig 6). As únicas proteínas visíveis nestas regiões tinham Mr de 30000, 28000 e 18000-22000. Para identificar e obter a sequência proteica das proteínas nesta região do gel (i.e. bandas a 30, 28 e 18-22 KDa), estas três proteínas foram electrotransferidas para PVDF e sequenciadas como descrito no Exemplo 3. As sequências do extremo amina obtidas estão apresentadas na Tabela 2.The results of this experiment showed that most of the activity eluted from the gel slice that included the proteins with Mr 28000-32000, with less activity eluting in the 18000-22000 region of the gel (Fig 6). The only proteins visible in these regions had Mr of 30000, 28000 and 18000-22000. To identify and obtain the protein sequence of the proteins in this region of the gel (ie bands at 30, 28 and 18-22 KDa), these three proteins were electrotransferred to PVDF and sequenced as described in Example 3. The obtained amino end sequences are shown in Table 2.

TABELA 2TABLE 2

Sequências do Extremo Amina do Ligando de MplMpl Ligand Extreme Amine Sequences

3 0 KDa 15 10 15 20 25 (S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL 3 0 KDa 15 10 15 20 25 (S) PAPPA (C) DPRLLNKLLRDD (H / S) VLH (G) RL (SEQ ID NO:30) (SEQ ID NO: 30) 28KDa 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR 28KDa 1 5 10 15 20 25 (S) PAPPAXDPRLLNKLLRDD (H) VL (H) GR (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO: 31) 18-22 KDa 1 5 10 XPAPPAXDPRLX(N)(K) 18-22 KDa 1 5 10 XPAPPAXDPRLX (N) (K) (SEQ ID NO:32) (SEQ ID NO: 32)

A análise com computador revelou que estas sequências de aminoácidos são novas. Devido às três sequências rComputer analysis revealed that these amino acid sequences are new. Due to the three r sequences

serem as mesmas, pensou-se que as proteínas de 30 KDa, 28 KDa -e 18-22 KDa estavam relacionadas e deviam ser formas diferentes da mesma proteína nova. Ainda, esta(s) proteína (s) era um candidato provável como ligando natural de mpl devido à actividade ter migrado na mesmam região (280000-32000) do gel de 4-20% SDS-PAGE. Ainda, o ligando parcialmente purificado migrou com uma Mr de 17000-30000 quando sujeito a cromatografia de filtração em gel usando uma coluna de Superose 12 (Pharmacia)Pensa-se que as diferentes formas de Mr do ligando sejam resultado de diferenças de proteólise ou de glicosilação ou de outras modificações posou pre-tradução.being the same, the 30 KDa, 28 KDa-and 18-22 KDa proteins were thought to be related and must be different forms of the same new protein. In addition, this protein (s) was a likely candidate as a natural mpl ligand because the activity migrated in the same region (280000-32000) of the 4-20% SDS-PAGE gel. In addition, the partially purified ligand migrated with a Mr of 17000-30000 when subjected to gel filtration chromatography using a Superose 12 column (Pharmacia) The different forms of ligand Mr are thought to be the result of differences in proteolysis or glycosylation or other modifications posed pre-translation.

Como descrito anteiormente, o RNA anticodão de mpl humano inibe a megacariocitopoiese em culturas de medula óssea humana enriquecidas em células progenitoras CD 34⁺ sem afectar a diferenciação de outras linhagens de células hematopoiéticas (Methia et al.. supra). Este resultado sugere que o receptor de mpl deva desempenhar um papel na diferenciação e proliferação de megacariócitos in vitro. Para elucidar melhor o papel do ligando de mpl na megacariocitopoiese, compararam-se os efeitos de APP e de APP sem ligando de mpl sobre megacariocitopoiese humana in vitro. O efeito de APP sobre megacariocitopoiese foi determinado usando uma moficação do ensaio de megacariocitopoiese em suspensão líquido descrito no Exemplo 4. Neste ensaio, células esteminais periféricas humanas (PSC) foram tratadas com APP antes e depois de cromatografia de afinidade com mpl-IqG. A estimulação de GPII, III da megacariocitopoiese ° 125 foi quantificada com um anticorpo I-anti-II^III^ (Fig.As previously described, human mpl anti-cotton RNA inhibits megakaryocytopoiesis in human bone marrow cultures enriched in CD 34 ⁺ progenitor cells without affecting the differentiation from other hematopoietic cell lines (Methia et al .. supra). This result suggests that the mpl receptor should play a role in the differentiation and proliferation of megakaryocytes in vitro. To better elucidate the role of the mpl ligand in megakaryocytopoiesis, the effects of APP and APP without mpl ligand on human megakaryocytopoiesis were compared in vitro. The effect of APP on megakaryocytopoiesis was determined using a modification of the liquid suspension megakaryocytopoiesis assay described in Example 4. In this assay, human peripheral stem cells (PSC) were treated with APP before and after mpl-IqG affinity chromatography. The stimulation of GPII, III of ° 125 megakaryocytopoiesis was quantified with an I-anti-II ^ III ^ antibody (Fig.

7). Como se mostra na Fig. 7, 10% App causou uma estimulação de aproximadamente 3 vezes enquanto que APP a que foi retirado o ligando de mpl não teve qualquer efeito. Significativamente, APP sem o ligando de mpl não induziu a proliferação das células Ba/F3-mpl.7). As shown in Fig. 7, 10% App caused a stimulation of approximately 3 times while APP to which the mpl ligand was removed had no effect. Significantly, APP without the mpl ligand did not induce the proliferation of Ba / F3-mpl cells.

rr

Numa outra experiência, mpl-IqG solúvel adicionada ás culturas nos dias 0, 2 e 4 contendo 10% APP neutralizou os efeitos de APP na megacariocitopoiese humana (Fig. 8). Estes resultados indicam que o ligando de mpl desempenha um papel regulador na megacariocitopoiese humana e portanto pode ser útil no tratamento da trombocitopenia.In another experiment, soluble mpl-IqG added to cultures on days 0, 2 and 4 containing 10% APP neutralized the effects of APP on human megakaryocytopoiesis (Fig. 8). These results indicate that the mpl ligand plays a regulatory role in human megakaryocytopoiesis and therefore may be useful in the treatment of thrombocytopenia.

2. Clonagem Molecular do Ligando de mpl2. Molecular Cloning of the mpl Ligand

Com base na sequência de aminoácidos do extremo amina obtida a partir das proteínas de 20 KDa, 28 KDa e 18-22 KDa (ver Tabela 2 atrás), projectaram-se dois conjuntos de oligonicleótidos iniciadores degenerados e usaram-se para amplificar DNA genómico de porco por PCR. Assumiu-se que se a sequência de aminoácidos do extremo amina fosse codificada por um único exão então o produto de PCR correcto teria 69 pb de comprimento. Um fragmento de DNA deste tamanho foi encontrado e subclonado em pGEMT. As sequências do oligonucleótido iniciadores para PCR e os três clones obtidos estão apresentados no Exemplo 5. A sequência de aminoácidos (PRLLNKLLR [SEQ ID NO: 33]) do peptídeo codificado entre os iniciadores de PCR era idêntica à obtida pela sequenciação N-terminal da proteína do ligando de porco (ver resíduos 9-17 para as sequências da proteína de porco de 28 e 30 KDa atrás apresentadas).Based on the amino acid sequence of the extreme amine obtained from the 20 KDa, 28 KDa and 18-22 KDa proteins (see Table 2 above), two sets of degenerate primer oligonicleotides were used and used to amplify genomic DNA from pig by PCR. It was assumed that if the amino acid sequence of the amino terminus were encoded by a single exon then the correct PCR product would be 69 bp in length. A DNA fragment of this size was found and subcloned into pGEMT. The sequences of the PCR primer oligonucleotide and the three clones obtained are shown in Example 5. The amino acid sequence (PRLLNKLLR [SEQ ID NO: 33]) of the peptide encoded between the PCR primers was identical to that obtained by the N-terminal sequencing of pig ligand protein (see residues 9-17 for the 28 and 30 KDa pig protein sequences shown above).

Um oligonucleótido sintético baseado na sequência do fragmento de PCR foi usado para o despiste de uma biblioteca de DNA genómico humano. Um oligonucleótido de 45.meros, designado pR45, foi projectado e sintetizado com base na sequência do fragmento de PCR. Este oligonucleótido tinha a seguinte sequência:A synthetic oligonucleotide based on the sequence of the PCR fragment was used to screen a human genomic DNA library. A 45-mer oligonucleotide, designated pR45, was designed and synthesized based on the sequence of the PCR fragment. This oligonucleotide had the following sequence:

5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG3' (SEQ ID NO: 34)5 'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG3' (SEQ ID NO: 34)

Este desoxioligonucleótido foi usado no despiste de uma biblioteca de DNA genómico humano em lambda geml2 em condições de hibridação e lavagem de baixa restringência de acordo com o Exemplo 6. Picaram-se os clones positivos, purificaram-se por plaqueamento e analisaram-se por mapeamento de restrição e transferência Southern. Um fragmento EcoRI-Xba-I de 390 pb que hibridou com o 45 meros foi subclonado em Bluescript SK-. A sequenciação do DNA deste clone confirmou que o DNA codificador do homólogo humano do ligando de mpl de porco tinha sido isolado. A sequência de DNA humano e a sequência de aminoácidos deduzida estão apresentadas na Fig. 9 (SEQ ID NO: 3 & 4). As posições previstas dos intrões na sequência genómica estão também indicadas por setas e definem um exão putativo (exão 3).This deoxy oligonucleotide was used to screen a human genomic DNA library in lambda geml2 under hybridization and low stringency washing conditions according to Example 6. The positive clones were picked, plated purified and analyzed by mapping Southern restriction and transfer. A 390 bp EcoRI-Xba-I fragment that hybridized to the 45 mer was subcloned in Bluescript SK-. The DNA sequencing of this clone confirmed that the DNA encoding the human homologue of the pig mpl ligand had been isolated. The human DNA sequence and the deduced amino acid sequence are shown in Fig. 9 (SEQ ID NO: 3 & 4). The predicted positions of introns in the genomic sequence are also indicated by arrows and define a putative exon (exon 3).

Com base na sequência do exão 3 humano (Exemplo 6) sintetizaram-se oligonucleótidos correspondendo aos extremos 3' e 5' da sequência do exão. Estes 2 iniciadores foram usados em reacções de_; PCR empregando como molde cDNA preparado a partir de vários tecidos humanos. O tamnho esperado para o produto de PCR correcto era de 140 pb. Apôs análise dos produtos de PCR num gel de 12% de poliacrilamida, um fragmento de DNA com o tamanho esperado foi detectado em bibliotecas de cDNA preparadas a partir de rim adulto, células de rim fetal 293 e cDNA preparado a partir de fígado fetal humano.Based on the sequence of human exon 3 (Example 6) oligonucleotides corresponding to the 3 'and 5' ends of the exon sequence were synthesized. These 2 primers were used in reactions of _; PCR using cDNA template prepared from various human tissues. The expected size for the correct PCR product was 140 bp. After analyzing the PCR products on a 12% polyacrylamide gel, a DNA fragment of the expected size was detected in cDNA libraries prepared from adult kidney, 293 fetal kidney cells and cDNA prepared from human fetal liver.

gg

Uma biblioteca de cDNA de fígado fetal (7 xlO clones) em lambda DR2 foi em seguida despistada com o mesmo oligonucleótido de 45-meros usado no despiste da biblioteca genómica humana e da biblioteca de cDNA de fígado fetal em condições de hibridação de baixa restringência. Os clones positivos foram picados, purificados por plaqueamento e o tamanho do inserto foi determinado por PCR. Um clone com um inserto de 1,8 Kb foi seleccionado para posterior análise. Usando os processos descritos no Exemplo 7 obtiveram-se as sequências de nucleótidos e de aminoácidos deduzida do rA fetal liver cDNA library (7 x105 clones) in DR2 lambda was then screened with the same 45-mer oligonucleotide used in screening the human genomic library and fetal liver cDNA library under low stringency hybridization conditions. Positive clones were chopped, purified by plating and the size of the insert was determined by PCR. A clone with a 1.8 Kb insert was selected for further analysis. Using the procedures described in Example 7, the nucleotide and amino acid sequences deduced from the r were obtained

ligando de mpl humano (hML) . Estas sequências estão apresentadas na Fig.l (SEQ ID NOS: 1&2).human mpl ligand (hML). These sequences are shown in Fig.l (SEQ ID NOS: 1 & 2).

Estrutura do Ligando de mpl Humano (hML) sequência 1 [SEQ ID do cDNA do ligando deStructure of Human mpl Ligand (hML) sequence 1 [SEQ ID of the ligand cDNA of

NO: 2]) compreende 1774NO: 2]) comprises 1774

Ela possui 215 mpl humano nucleótidos nucleótidosIt has 215 mpl human nucleotides nucleotides

A (hML) (Fig.A (hML) (Fig.

seguido de uma cauda de poli(A).followed by a poly (A) tail.

da sequência 5' não traduzida e a região não traduzida 3^Z deof the 5 'untranslated sequence and the 3 ^Z untranslated region of

498 nucleótidos. 0 presumível codão de iniciação na posição de nucleótidos (216-218) está dentro de uma sequência consensus favorável à iniciação da tradução eucariótica. A grelha de leitura aberta tem 1059 nucleótidos de comprimento e codifica um polipeptídeo de 353 resíduos de aminoácidos, começando no nucleótido na posição 220. O extremo N da sequência de aminoácidos prevista é altamente hidrófobo e provavelmente corresponde a um peptídeo sinal. A análise por computador da sequência de aminoácidos prevista (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133:17-2119831) indica um sítio de clivagem potencial para apeptidase sinal entre os resíduos 21 e 22. A clivagem naquela posição geraria um polipeptídeo maduro de 332 resíduos de aminoácidos começando com a sequência do extremo amina obtida a partir do ligando de mpl purificado a partir de plasma de porco. O peso molecular previsto para o ligando de 332 resíduos de aminoácidos não glicosilado é e cerca de 38KDa. Existem 6 sítios potenciais de N-glicosilação e 4 resíduos de císteina.498 nucleotides. The presumed initiation codon at the position of nucleotides (216-218) is within a consensus sequence favorable to the initiation of eukaryotic translation. The open reading frame is 1059 nucleotides in length and encodes a polypeptide of 353 amino acid residues, starting at the nucleotide at position 220. The N-terminus of the predicted amino acid sequence is highly hydrophobic and probably corresponds to a signal peptide. Computer analysis of the predicted amino acid sequence (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133: 17-2119831) indicates a potential cleavage site for signal apeptidase between residues 21 and 22. Cleavage at that position would generate a mature polypeptide of 332 amino acid residues starting with the amine end sequence obtained from the mpl ligand purified from pig plasma. The predicted molecular weight for the ligand of 332 non-glycosylated amino acid residues is about 38KDa. There are 6 potential N-glycosylation sites and 4 cysteine residues.

A comparação da sequência do ligando de mpl com a base de dadosde sequências do GenBank revelou 23% de identidade entre os 153 resíduos do extremo amina do ligando de mpl humano maduro e a eritropoietina humana (Fig. 10 [SEQ ID NOS: 6 & 7]). Quando se têm em consideração substituições conservadas, esta região de hML possui 50% de semelhança com a eritropoietina humana (hEPO). Tanto hEPO como hML possuem quatro císteinas. Três das 4 císteinas estão conservadas em hML, incluindo as primeira e última císteinas. As rComparison of the sequence of the mpl ligand with the GenBank sequence database revealed 23% identity between the 153 amino acid residues of the mature human mpl ligand and human erythropoietin (Fig. 10 [SEQ ID NOS: 6 & 7 ]). When conserved substitutions are taken into account, this hML region is 50% similar to human erythropoietin (hEPO). Both hEPO and hML have four cysteines. Three of the 4 cysteines are conserved in hML, including the first and last cysteines. As r

experiências de mutagénese dirigida mostraram que a primeira e última císteinas da eritropoietina formam uma ligação dissulfureto que é necessária à função (Wang, F.F. et al. , Endocrinology 116:2286-2292 [1983]). Por analogia, a primeira e a última císteinas de hML podem também formar um ligação dissulfureto crítica. Nenhum dos sítios de glicosilação está conservado em hML.experiments of directed mutagenesis have shown that the first and last cysteines of erythropoietin form a disulfide bond that is necessary for function (Wang, F.F. et al., Endocrinology 116: 2286-2292 [1983]). By analogy, the first and last hML cysteines can also form a critical disulfide bond. None of the glycosylation sites are conserved in hML.

De forma semelhante a hEPO, o mRNA de hML não contem a sequência de poliadenilação consensus AAUAAA, nem o elemento regulador AUUUA que está presente nas regiões não traduzidas 3' de muitas citocinas e que se pensa influenciar a estabilidade do mRNA (Shaw et al., Cell, 46:659-667 [1986]). A análise de transferência Northern revela a presença de níveis baixos de um único RNA produto de transcrição de hML de 1,8 Kb em fígado fetal e adulto. Após uma exposição mais prolongada, surgiu uma banda mais fraca do mesmo tamanho em rim adulto. Por comparação, a eritropoietina humana é expressa em fígado fetal e como resposta a hipóxia, no rim e o fígado adultos (Jacobs et al. . Nature, 313:804-809 [1985] e Boundurant et al., Molec. Cell.Biol., 6:2731-2733 [1986]).Similar to hEPO, the hML mRNA does not contain the consensus polyadenylation sequence AAUAAA, nor the AUUUA regulatory element that is present in the 3 'untranslated regions of many cytokines and is thought to influence mRNA stability (Shaw et al. , Cell, 46: 659-667 [1986]). Northern blot analysis reveals the presence of low levels of a single 1.8 Kb hML transcription product RNA in fetal and adult liver. After a longer exposure, a weaker band of the same size appeared in an adult kidney. By comparison, human erythropoietin is expressed in fetal liver and in response to hypoxia, in the adult kidney and liver (Jacobs et al. Nature, 313: 804-809 [1985] and Boundurant et al., Molec. Cell.Biol ., 6: 2731-2733 [1986]).

A importância da região C-terminal de hML está ainda por elucidar. Com base na presença de seis potenciais sítios de glicosilação para glicosilação ligada em N e a capacidade do ligando para se ligar a colunas de afinidade com lectina, esta região de hML é provavelmente glicosilada. Nalgumas experiências de eluição do gel, observámos actividade que migrou com uma Mr de aproximadamente 60000 a qual pode representar a molécula de tamnho completo glicosilada. A região C-terminal pode portanto actuar de forma a estabilizar e aumentar a semi-vida de hML circulante. No caso da eritropoietina, a forma não glicosilada tem actividade biológica in vitro mas tem uma semi-vida no plasma significativamente reduzida relativamente à eritropoietina glicosilada (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265:12127-12130The importance of the hML C-terminal region remains to be elucidated. Based on the presence of six potential glycosylation sites for N-linked glycosylation and the ability of the ligand to bind lectin affinity columns, this hML region is likely to be glycosylated. In some gel elution experiments, we observed activity that migrated with a Mr of approximately 60000 which can represent the glycosylated full-size molecule. The C-terminal region can therefore act to stabilize and increase the circulating hML half-life. In the case of erythropoietin, the non-glycosylated form has biological activity in vitro but has a significantly reduced plasma half-life compared to glycosylated erythropoietin (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265: 12127-12130

[1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266:23022-23026 [1991] e Spivack et al., Blood, 7:90-99 [1989]). 0 domínio C-terminal de hML contem duas sequências de aminoácidos dibásicas [motivos Arg-Arg nas posições 153-154 e 245-246] que poderão servir como potenciais sítios de processamento. A clivagem nestes sítios pode ser responsável pela geração de formas de 30, 28 e 18-22 KDa do ML isolado a partir de APP. Significativamente, a sequência ^Ar<3₁5 3~^Ar(J].54 ocorre imediatamente após o domínio tipo eritropoietina do ML. Estas observações indicam que ML de tamanho completo pode representar uma proteína precursora que sofre proteólise limitada para gerar o ligando maduro.[nineteen ninety]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266: 23022-23026 [1991] and Spivack et al., Blood, 7: 90-99 [1989]). The C-terminal hML domain contains two dibasic amino acid sequences [Arg-Arg motifs at positions 153-154 and 245-246] that could serve as potential processing sites. Cleavage at these sites may be responsible for generating 30, 28 and 18-22 KDa forms of ML isolated from APP. Significantly, the sequence ^{Ar <} 3 ₁ 5 3 ~ ^{Ar (} J] .54 occurs immediately after the ML erythropoietin-like domain. These observations indicate that full-sized ML may represent a precursor protein that undergoes limited proteolysis to generate the mature ligand.

4. Isoformas e Variantes do Ligando de mpl Humano4. Isoforms and Variants of the Human mpl Ligand

As isoformas ou formas de splicing alternativo do ligando de mpl humano foram detectadas por PCR em fígado adulto humano. Resumidamente, sintetizaram-se iniciadores correspondendo a cada um . dos extremos assim de regiões internas seleccionadas da sequência codificadora de hML. Estes iniciadores foram usados em RT-PCR para amplificar RNA de fígado adulto humano como descrito no Exemplo 10. Para além da forma de tamanho completo, designada hML, foram observadas ou deduzidas três outras formas designadas hML2, hML3 e hML4. As sequências de aminoácidos maduras deduzidas para as quatro isoformas está apresentada na Fig. 11 (SEQ ID NOS: 6, 8, 9 & 10). hML3 tem uma deleção de 116 nucleótidos na posição 700 que resulta numa deleção de aminoácidos e numa mudança de grelha de leitura. 0 cDNA codifica um polipeptídeo maduro que tem 265 aminoácidos de comprimento e diverge da sequência de hML no resíduo de aminoácido 139. Finalmente, hML4 tem uma deleção de 12 nucleótidos a seguir ã posição 618 (também encontrada nas sequências de murganho e de porco [ver abaixo]) e a deleção de 116 pb encontrada em hML3. A+pesar de não se ter encontrado clones com apenas a deleção de 12 pb (após o nucleótido 619)no humano (designada hML2), esta forma provavelmente existe pois talIsoforms or alternative splicing forms of the human mpl ligand were detected by PCR in adult human liver. Briefly, primers corresponding to each one were synthesized. of the ends as well as selected internal regions of the hML coding sequence. These primers were used in RT-PCR to amplify human adult liver RNA as described in Example 10. In addition to the full-size form, called hML, three other forms called hML2, hML3 and hML4 were observed or deduced. The mature amino acid sequences deduced for the four isoforms is shown in Fig. 11 (SEQ ID NOS: 6, 8, 9 & 10). hML3 has a deletion of 116 nucleotides at position 700 that results in a deletion of amino acids and a change in the reading frame. The cDNA encodes a mature polypeptide that is 265 amino acids long and diverges from the hML sequence at amino acid residue 139. Finally, hML4 has a 12 nucleotide deletion after position 618 (also found in the mouse and pig sequences [see below]) and the 116 bp deletion found in hML3. In spite of not having found clones with only the 12 bp deletion (after nucleotide 619) in humans (called hML2), this form probably exists because such

isoforma foi identificada tanto no murganho como no porco (ver abaixo) e porque foi identificada juntamente com a deleção de 116 nucleótidos em hML4.isoform was identified in both mice and pigs (see below) and because it was identified together with the 116 nucleotide deletion in hML4.

Tanto uma variante substituída de hML em que a sequência dibásica Arg₁₅₃~Arg₁₅₄ foi substituída por dois resíduos de alanina e uma forma truncada com domínio EPO de hML foram construídas para determinar se é necessário um ML de tamanho completo para a actividade biológica. A variante com sequência dibásica Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ substituída, referida como hML(R153A, R154A), foi construída usando PCR como descrito no Exemplo 10. A forma truncada com domínio EPO, hML_ir, foi também feita usando PCR através da introdu1DJ ção de um codão de paragem após Argl53.Both a substituted variant of hML in which the dibasic sequence Arg ₁₅₃ ~ Arg ₁₅₄ was replaced by two alanine residues and a truncated form with an EPO domain of hML were constructed to determine whether a full size ML is required for biological activity. The substituted Arg ₁₅₃ -Arg ₁₅₄ dibasic sequence variant, referred to as hML (R153A, R154A), was constructed using PCR as described in Example 10. The truncated form with EPO domain, hML _ir , was also made using PCR by introducing 1DJ tion of a stop codon after Argl53.

5. Expressão do Ligando de mpl Humano Recombinante (rhML) em Células de Rim Embrionário Humano (293) Transfectadas Transitoriamente5. Expression of the Recombinant Human mpl Ligand (rhML) in Human Embryonic Kidney Cells (293) Transiently Transfected

Para confirmar que o cDNA humano clonado codificava um ligando de mpl, o ligando foi expresso em células 293 de mamífero sob o controle do promotor precoce imediato de citamegalovírus usando os vectores de expressão pRK5-hML ou pRK5-hML₁₅₃· Encontrou-se que os sobrenadantes de células 293 de rim embrionário humano transfectadas transitoriamente estimulam a incorporação de ³H-timidina em células Ba/F3-mpl. mas não nas células parentais Ba/F3 (Fig. 12A). Os meios derivados das células 293 transfectadas com o vector pRK sozinho não possuem esta actividade. A adição de mpl-IqG ao meio inibe anula a estimulação (dados não apresentados). Estes resultados mostram o cDNA clonado codifica um ML humano (hML) funcional.To confirm that the cloned human cDNA encoded an mpl ligand, the ligand was expressed in mammalian 293 cells under the control of the cytomegalovirus immediate early promoter using the expression vectors pRK5-hML or pRK5-hML ₁₅₃ · supernatants of transiently transfected human embryonic kidney 293 cells stimulate the incorporation of ³ H-thymidine into Ba / F3-mpl cells. but not in the Ba / F3 parental cells (Fig. 12A). Media derived from 293 cells transfected with the pRK vector alone do not have this activity. The addition of mpl-IqG to the medium inhibits stimulation (data not shown). These results show the cloned cDNA encoding a functional human ML (hML).

Para determinar se o domínio EPO sozinho pode ligar-se a mpl e activá-lo, a forma truncada de hML, rhML₁₅₃, foi expressa em células 293. Encontrou-se que os sobrenadantes das células transfectadas possuem actividadeTo determine whether the EPO domain alone can bind to mpl and activate it, the truncated form of hML, rhML ₁₅₃ , was expressed in 293 cells. The supernatants of the transfected cells were found to have activity

semelhante à presente nos sobrenadantes das células que expressam hML de tamanho completo (Fig. 12A) indicando que o domínio C-terminal de ML não é necessário à ligação e activação de c-mpl.similar to that found in supernatants of cells expressing full-length hML (Fig. 12A) indicating that the C-terminal domain of ML is not necessary for binding and activation of c-mpl.

6. O Ligando de mpl estimula Megacariocitopoiese e Trombopoiese6. The ligand of mpl stimulates Megakaryocytopoiesis and Thrombopoiesis

Tanto a forma rhML de tamanho completo como a de rhML₁₅₃ truncado estimulam a megacariocitopoiese humana in vitro (Fig. 12B). este efeito foi observado na ausência de outros factores de crescimento hematopoiéticos adicionados exogenamente. Com excepção de IL-3, o Ml foi o único factor de crescimento hematopoiético testado que apresentou esta actividade. IL-11, IL-6, IL-1, eritropoietina, G-CSF, IL-9, LIF, ligando de kit (KL), M-CSF, OSM e GM-CSF não têm qualquer efeito na megacariocitopoiese quando testados separadamente no nosso ensaio (resultados não apresentados). Isto demonstra que ML tem actividade estimuladora de megacariócitos e indica um papel para ML na regulação de megacariocitopoiese .Both the full-size rhML and the truncated rhML _{153 form} stimulate human megakaryocytopoiesis in vitro (Fig. 12B). this effect was observed in the absence of other exogenously added hematopoietic growth factors. With the exception of IL-3, Ml was the only hematopoietic growth factor tested that exhibited this activity. IL-11, IL-6, IL-1, erythropoietin, G-CSF, IL-9, LIF, kit ligand (KL), M-CSF, OSM and GM-CSF have no effect on megakaryocytopoiesis when tested separately in our essay (results not shown). This demonstrates that ML has megakaryocyte-stimulating activity and indicates a role for ML in the regulation of megakaryocytosis.

Mostrou-se que as actividades trombopoiéticas j presentes no plasma de animais trombocitopénicos estimulam a produção de plaquetas num ensaio de trombocitose religada (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1010 [1973]) e McDonald et al. . Scand. J. Haematol., 1.6:326-334 [1976]).Thrombopoietic activities already present in the plasma of thrombocytopenic animals have been shown to stimulate platelet production in a rewired thrombocytosis assay (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14: 1006-1010 [1973]) and McDonald et al. . Scand. J. Haematol., 1.6: 326-334 [1976]).

Neste modelo os murganhos tornam-se agudamente trombocitopé7 nicos usando um soro específico antiplaquetas, resultando numa trombocitose religado previsível. Tais murganhos imuno-trombocitopénicos respondem melhor às actividades do tipo trombopoietina exógenas do que os murganhos normais (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., .14.:1006-1010 [1973]), tal como murganhos ex-hipóxicos são mais sensíveis à eritropoietina do que os murganhos normais (McDonald, et al.. J. Lab. Clin. Med., 77.: 134.143 [1971]). Para determinar se rML estimula a produção de plaquetas in vivo, murganhos foramIn this model, mice become acutely thrombocytopenic using a specific antiplatelet serum, resulting in predictable rewired thrombocytosis. Such immuno-thrombocytopenic mice respond better to exogenous thrombopoietin-like activities than normal mice (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., .14.: 1006-1010 [1973]), as do ex-hypoxic mice they are more sensitive to erythropoietin than normal mice (McDonald, et al .. J. Lab. Clin. Med., 77 .: 134.143 [1971]). To determine whether rML stimulates platelet production in vivo, mice were

injectados com rhML parcialmente purificado. As contagens de 3 5 plaquetas e incorporação de S em plaquetas foram então quantificadas. A injecção de murganhos com 64000 ou 32000 unidades de rML aumentou significativamente a produção de plaquetas conforme evidenciado por um aumento ~20% na contagem de plaguetas (p=0,0005 e 0,0001, respectivamente) einjected with partially purified rhML. The platelet counts and incorporation of S into platelets were then quantified. Injection of mice with 64,000 or 32,000 units of rML significantly increased platelet production as evidenced by a ~ 20% increase in platelet count (p = 0.0005 and 0.0001, respectively) and

5 um aumento de ~40% na incorporação de S em piquetas (p=0,003) em murganhos tratados versus murganhos testemunha injectados com excipiente apenas (Fig. 12C). Este nível de estimulação é comparável ao observado com IL-6 neste modelo (resultados não apresentados). O tratamento com 16000 unidades de rML não estimulou significativamente a produção de plaquetas. estes resultados indicam que ML estimula a produção de plaquetas numa forma dependente da dose e portanto possui actividade do tipo trombopoietina.5 a ~ 40% increase in S-padding (p = 0.003) in treated mice versus control mice injected with excipient only (Fig. 12C). This level of stimulation is comparable to that observed with IL-6 in this model (results not shown). Treatment with 16,000 units of rML did not significantly stimulate platelet production. these results indicate that ML stimulates the production of platelets in a dose-dependent manner and therefore has thrombopoietin-like activity.

As células 293 foram também transfectadas com outras construções de isoformas de hML descritas atrás e os sobrenadantes forma testados usando o ensaio de proliferação de Ba/F3-mpl (ver Fig. 13). hML2 e hML3 não apresentaram qualquer actividade detectável neste ensaio, no entanto a actividade de hML(R153A, R154A) foi semelhante à de hML e à de hML₁₅₃ indicando que o processamento no sítio dibásico Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ não é necessária nem prejudicial à actividade.The 293 cells were also transfected with other hML isoform constructs described above and the supernatants were tested using the Ba / F3-mpl proliferation assay (see Fig. 13). hML2 and hML3 showed no detectable activity in this assay, however the activity of hML (R153A, R154A) was similar to that of hML and that of hML ₁₅₃ indicating that processing at the dibasic Arg ₁₅₃ -Arg _{154 site} is neither necessary nor detrimental to activity.

7. Megacariocitopoiese e o Ligando de mpl7. Megakaryocytopoiesis and the ligand of mpl

Foi proposto que a megacariocitopoiese é regulada a múltiplos níveis celulares (Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982] e Williams et al., Blood Cells, 15:123-13 3 [1989]). Isto baseia-se largamente na observação de que certos factores de crescimento hematopoiéticos estimulam a proliferação de progenitores de megacariócitos enquanto que outros parecem afectar basicamente a maturação. Os resultados apresentados aqui sugerem que ML actue tanto como factor proliferativo como de maturação. O facto de ML estimular a proliferação de progenitores de megacariócitos éMegakaryocytosis has been proposed to be regulated at multiple cell levels (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982] and Williams et al., Blood Cells, 15: 123-13 3 [1989]) . This is largely based on the observation that certain hematopoietic growth factors stimulate the proliferation of megakaryocyte progenitors while others appear to affect maturation basically. The results presented here suggest that ML acts as both a proliferative and a maturation factor. The fact that ML stimulates the proliferation of megakaryocyte progenitors is

apoiado por várias linhas de evidência. Primeiro, APP estimula tanto a proliferação como a maturação de megacariócitos humanos in vitro e esta estimulação é completamente inibida por mpl-IqG (Figs. 7 e 8). Ainda, a inibição da formação de colónias de megacariócitos por oligonucleótidos anticodão de c-mpl (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) e o facto de c-mpl poder transduzir um sinal proliferativo nas células em que foi transfectado (Skoda et al., EMBO, 12.:2645-2653 [1993] e Vigon et al. . Oncogene, 8:2607-2615 [1993]) também indicam que ML estimula a proliferação. A expressão aparente de c-mpl durante todas as fases da diferenciação de megacariócitos (Methia et al., Blood,supported by several lines of evidence. First, APP stimulates both the proliferation and maturation of human megakaryocytes in vitro and this stimulation is completely inhibited by mpl-IqG (Figs. 7 and 8). In addition, the inhibition of megakaryocyte colony formation by c-mpl anti-cotton oligonucleotides (Methia et al., Blood, 82: 1395-1401 [1993]) and the fact that c-mpl can transduce a proliferative signal in the cells in which has been transfected (Skoda et al., EMBO, 12.:2645-2653 [1993] and Vigon et al. Oncogene, 8: 2607-2615 [1993]) also indicate that ML stimulates proliferation. The apparent expression of c-mpl during all stages of megakaryocyte differentiation (Methia et al., Blood,

82:1395-1401 [1993]) e a capacidade de ML recombinante para rapidamente estimular a produção de plaquetas in vivo indicam que ML também afecta a maturação. A diusponibilidade de ML recombinante torna possível uma avaliação cuidadosa do seu papel na regulação da megacariocitopoiese assim como da sua potencial influência sobre outras linhagens hematopoiéticas.82: 1395-1401 [1993]) and the ability of recombinant ML to rapidly stimulate platelet production in vivo indicate that ML also affects maturation. The availability of recombinant ML makes it possible to carefully assess its role in the regulation of megakaryocytopoiesis as well as its potential influence on other hematopoietic strains.

8. Isolamento do Gene do Ligando de mpl Humano (TPO) ,j Isolaram-se clones do gene TPO a partir de DNA genómico humano por despiste de uma biblioteca genómica humana em Iambda-Geml2 com pR45, em condições de baixa restringência ou em condições de alta restringência com um fragmento correspondendo à metade 3' do cDNA humano codifi/ cador do ligando de mpl. Os dois clones de lambda sobreponíveis abrangendo 35 Kb foram isolados. Os dois fragmentos sobreponíveis (BamHl e EcoRl) contendo todo o gene TPO foram subclonados e sequenciados (ver Figs. 14Ά, 14B e 14C) .8. Isolation of the Human mpl Ligand Gene (TPO), j TPO gene clones were isolated from human genomic DNA by screening a human genomic library in Iambda-Geml2 with pR45, under low stringency conditions or under conditions high stringency with a fragment corresponding to the 3 'half of the human cDNA encoding the mpl ligand. The two overlapping lambda clones spanning 35 Kb were isolated. The two overlapping fragments (BamHl and EcoRl) containing the entire TPO gene were subcloned and sequenced (see Figs. 14Ά, 14B and 14C).

A estrutura do gene humano é composta por 6 exões dentro de 7 Kb do DNA genómico. As fronteiras de todas as junções exão/intrão são consistentes com o motivo consensus estabelecido para os genes de mamífero (Shapiro, M.B., et al. . Nucl. Acids Res. .15:7155 [1987]). O exão 1 e o exão 2 contêm a sequência 5' não traduzida e quatro aminoácidos do peptídeo sinal. O restante sinal de secreção e os primeiros 26 aminoácidos da proteína madura são codificados pelo exãoThe structure of the human gene is composed of 6 exons within 7 Kb of genomic DNA. The boundaries of all exon / intron junctions are consistent with the consensus motif established for mammalian genes (Shapiro, M.B., et al. Nucl. Acids Res .15: 7155 [1987]). Exon 1 and exon 2 contain the 5 'untranslated sequence and four amino acids of the signal peptide. The remaining secretion signal and the first 26 amino acids of the mature protein are encoded by the exon

3. Todo o domínio carbonilo e 3' não traduzido assim como «50 aminoácidos do domínio tipo eritropoietina são codificados pelo exão 6.3. The entire carbonyl and 3 'untranslated domain as well as' 50 amino acids of the erythropoietin-like domain are encoded by exon 6.

A análise de DNA genómico humano por transferência Southern indicou que o gene para TPO está presente numa única cópia. A localização cromossómica do gene foi determinada por hibridação in situ através de fluorescência (FISH) tendo-se mapeado no cromossoma 3q27-28.Analysis of human genomic DNA by Southern blotting indicated that the gene for TPO is present in a single copy. The chromosomal location of the gene was determined by in situ hybridization using fluorescence (FISH) and mapped to chromosome 3q27-28.

9. Expressão e Purificação de TPO a partir de células 2939. Expression and Purification of TPO from 293 cells

A preparação e purificação de ML ou TPO a partir de células 293 está descrito detalhadamente no Exemplo 19. Resumidamente, cDNA correspondendo a toda a grelha de leitura aberta foi obtido por PCR usando pRK5-hmpl I. 0 produto de PCR foi purificado e clonado entre os sítios de restrição Ciai e Xbal do plasmídeo pRK5tkneo (um vector derivado de pRK5 modificado para expressar um gene de resistência à neomicina sob o controle do promotor da cinase de proteínas) para se obter o vector pRKStkneo.ORF (um vector codificador de toda a grelha de leitura aberta).The preparation and purification of ML or TPO from 293 cells is described in detail in Example 19. Briefly, cDNA corresponding to the entire open reading frame was obtained by PCR using pRK5-hmpl I. The PCR product was purified and cloned between the Ciai and Xbal restriction sites of plasmid pRK5tkneo (a vector derived from pRK5 modified to express a neomycin resistance gene under the control of the protein kinase promoter) to obtain the vector pRKStkneo.ORF (a vector encoding the entire open reading grid).

Um segundo vector codificador do domínio homólogo de EPO foi gerado de forma semelhante mas usando iniciadores de PCR diferentes para se obter a construção final chamada pRK5-tkneoEPO-D.A second vector encoding the homologous EPO domain was generated in a similar manner but using different PCR primers to obtain the final construct called pRK5-tkneoEPO-D.

Estas duas construções foram usadas para transfectar células de rim embrionário humano pelo método de CaPO^ e os clones resistentes à neomicina foram seleccionados e deixados crescer atá à confluência. A expressão de ML__C_ ouThese two constructs were used to transfect human embryonic kidney cells by the CaPO ^ method and neomycin resistant clones were selected and allowed to grow until confluence. The expression of ML_ _C _ or

ML₃₃₂no meio condicionado ensaio de proliferação de destes clonesML ₃₃₂ in the conditioned medium proliferation assay of these clones

Ba/F3-mpl.Ba / F3-mpl.

foi testado usando owas tested using the

A purificação de rhML₃₃₂ foi conduzida como descrito no Exemplo 19. Resumidamente, meio condicionado com 293-rhML>₃₃₂ foi aplicado numa coluna de Blue-Sepharose (Pharmacia) que foi subsequentemente lavada com um tampão contendo ureia 2M. A coluna foi eluida com um tampão conten do ureia 2M e NaCl 1M. O conjunto das fracções eluidas daPurification of rhML ₃₃₂ was conducted as described in Example 19. Briefly, 293-rhML> ₃₃₂ conditioned medium was applied to a Blue-Sepharose column (Pharmacia) which was subsequently washed with a buffer containing 2M urea. The column was eluted with a buffer containing 2M urea and 1M NaCl. The set of fractions eluted from the

Blue-Sepharose foi então directamente aplicado numa de WGA-Sepharose, lavado com 10 volumes de coluna de coluna tampão contendo ureia 2M e NaCl 1M e eluida com o mesmo tampão contendo N-acetil-D-glucosamina WGA-Sepharose foi aplicado numa Inc.) e eluida com um gradienteBlue-Sepharose was then applied directly to a WGA-Sepharose, washed with 10 column volumes of buffer column containing 2M urea and 1M NaCl and eluted with the same buffer containing N-acetyl-D-glucosamine WGA-Sepharose was applied to an Inc. ) and eluted with a gradient

0,5M. O material eluido de coluna de C4-HPLC (Synchrom, descontínuo de propanol. Em0.5M. The material eluted from the C4-HPLC column (Synchrom, propanol batch).

SDS-PAGE 293-rhML₃₃₂ purificado migra como uma banda larga na região de 68-80 KDa do gel (ver Fig. 15).Purified SDS-PAGE 293-rhML ₃₃₂ migrates as a broadband in the 68-80 KDa region of the gel (see Fig. 15).

OO

·)·)

A purificação de rhML₁₅₃ foi também realizada como descrito no Exemplo 19. Resumidamente meio condicionado contendo 293-rhML₁₅₃ foi separado em Blue-Sepharose como descrito para rhML_332r. θ _mat_eri_a]_ eluido da Blue Sepharose foi aplicado directamente numa coluna de afinidade de mpl como descrito atrás. RhML,__ eluido da coluna de afinidade de mpl foi purificado até à homogeneidade usando uma coluna de HPLC C4 eluida nas mesmas condições usadas para rhML₃₃₂Por SDS-PAGE rhML₁₅₃ purificado migra como 2 bandas principais e 2 bandas mais fracas com Mr »18000-22000 (ver Fig. 15) .Purification of rhML ₁₅₃ was also carried out as described in Example 19. Briefly conditioned medium containing 293-rhML ₁₅₃ was separated into Blue-Sepharose as described for rhML _332r . θ _ma t _er i _a ] _ eluted from Blue Sepharose was applied directly to a mpl affinity column as described above. RhML, __ eluted from the mpl affinity column was purified to homogeneity using a HPLC C4 column eluted under the same conditions used for rhML ₃₃₂ By SDS-PAGE purified rhML ₁₅₃ migrates as 2 main bands and 2 weaker bands with Mr »18000 -22000 (see Fig. 15).

10. Ligando de mpl de Murganho10. Calling from Murganho mpl

Um fragmento de DNA correspondendo à região codificadora do ligando de mpl humano foi obtido por PCR,A DNA fragment corresponding to the coding region of the human mpl ligand was obtained by PCR,

2 purificado em gel e marcado na presença de P-dATP e P-dCTP. Esta sonda foi usada no despiste de 10 clones de uma biblioteca de cDNA de fígado de murganho em lambda GT10.2 purified on gel and labeled in the presence of P-dATP and P-dCTP. This probe was used to screen 10 clones of a mouse liver cDNA library in lambda GT10.

rr

Um clone de murganho (Fig. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]) contendo um inserto de 1443 pares de bases foi isolado e sequenciado. 0 presumível codão de iniciação na posição de nculeótido 138-141 estava dentro de uma sequência consensus favorável à iniciação da tradução eucariótica (Kozak, M. J. Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Esta sequência define uma grelha de leitura aberta de 1056 nucleótidos, a qual prevê um produto de tradução primário de 352 aminoácidos. A delimitar esta grelha de leitura estão 137 nucleótidos do 5' e 247 nucleótidos da sequência 3' não traduzida. Não existe cauda poli(A) a seguir à região 3' não traduzida indicando que o clone provavelmente não está completo. O extremo N da sequência de aminoácidos prevista é altamente hidrófobo e provavelmente representa um peptídeo sinal. A análise por computador (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133:17-21 [1983]) indicou um sítio de clivagem potencial para a peptidase sinal entre os resíduos 21 e 22. A clivagem naquela posição geraria um polipeptideo maduro de 331 aminoácidos (35 KDa) identificado como motivos descritos abaixo). A sequência todas conservadas na sequência humana sítios de N-glicosilação, 5 dos quais mML₃₃₁ (ou mML2 por contem 4 císteinas, e sete potenciais são conservados na sequência humana.A mouse clone (Fig. 16 [SEQ ID NOS: 12 & 13]) containing a 1443 base pair insert was isolated and sequenced. The presumed initiation codon at nculeotide position 138-141 was within a consensus sequence favorable to the initiation of eukaryotic translation (Kozak, MJ Cell Biol., 108: 229-241 [1989]). This sequence defines an open reading frame of 1056 nucleotides, which provides for a primary translation product of 352 amino acids. Bordering this reading frame are 137 nucleotides from the 5 'and 247 nucleotides from the 3' untranslated sequence. There is no poly (A) tail following the 3 'untranslated region indicating that the clone is probably not complete. The N-terminus of the predicted amino acid sequence is highly hydrophobic and probably represents a signal peptide. Computer analysis (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133: 17-21 [1983]) indicated a potential cleavage site for the signal peptidase between residues 21 and 22. Cleavage at that position would generate a mature polypeptide 331 amino acids (35 KDa) identified as reasons described below). The sequence all conserved in the human sequence N-glycosylation sites, 5 of which mML ₃₃₁ (or mML2 per contain 4 cysteines, and seven potentials are conserved in the human sequence.

Novamente, tal como para hML, os sete sítios potenciais de N-glicosilação estão situados na metade terminal C da proteína.Again, as for hML, the seven potential N-glycosylation sites are located on the C-terminal half of the protein.

Quando comparado com o ML humano, foi observada considerável identidade para as sequências de nucleótidos e de aminoácidos deduzida nos domínios EPO destes MLs. No entanto, quando as sequências de aminoácidos deduzidas de MLs humana e de murganho foram alinhadas, a sequência de murganho parece ter uma deleção de um tetrapeptídeo entre os resíduos 111-114 correspondendo à deleção de 12 nucleótidos após a posição de nculeótido 618 observada tanto em cDNA humano (ver atrás) como de porco (ver abaixo). Assim, clones adicionais foram examinados para detectar possíveis isoformas de ML de murganho. Um clone codificou uma sequência rWhen compared to the human ML, considerable identity was observed for the nucleotide and amino acid sequences deduced in the EPO domains of these MLs. However, when the deduced amino acid sequences of human and mouse MLs were aligned, the mouse sequence appears to have a tetrapeptide deletion between residues 111-114 corresponding to the deletion of 12 nucleotides after the position of 618 nculeotide observed both in human cDNA (see above) and pig (see below). Thus, additional clones were examined for possible mouse ML isoforms. One clone encoded an r sequence

polipeptídica deduzida de 335 aminoácidos contendo o tetrapeptídeo que faltava LPLQ. Pensa-se que esta forma seja ML de murganho de tamanho completo e é referida mML ou mML_,__c. A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos deduzida de mML estão apresentadas na Fig. 17 (SEQ ID NOS: 14 & 15). Este clone de cDNA consiste em 1443 pares de bases seguido de uma cauda poli(A). Ele possui uma grelha de leitura aberta de 1068 pb delimitada por 134 bases de 5' e 241 bases da sequência 3' não traduzida. O presumível codão de inciação está na posição de nucleótidos 138-140. Agrelha de leitura aberta codifica uma proteína prevista de 356 aminoácidos, os primeiros 21 dos quais são altamente hidrófobos e provavelmente funcionam como um sinal de secreção.polypeptide deducted from 335 amino acids containing the missing tetrapeptide LPLQ. This form is thought to be full-sized mouse ML and is referred to as mML or mML _, _ _c . The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of mML are shown in Fig. 17 (SEQ ID NOS: 14 & 15). This cDNA clone consists of 1443 base pairs followed by a poly (A) tail. It has a 1068 bp open reading grid bounded by 134 5 'bases and 241 bases of the 3' untranslated sequence. The presumed start codon is at nucleotide position 138-140. An open reading cluster encodes a predicted protein of 356 amino acids, the first 21 of which are highly hydrophobic and likely to function as a secretion signal.

Finalmente, um terceiro clone de murganho foi isolado, sequenciado e observou-se conter a deleção de 116 nucleótidos correspondendo a hML3. Esta isoforma de murganho é portanto designada mML3. A comparação das sequências de aminoácidos deduzidas destas duas isoformas está apresentada na Fig. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).Finally, a third mouse clone was isolated, sequenced and found to contain the deletion of 116 nucleotides corresponding to hML3. This mouse isoform is therefore called mML3. The comparison of the deduced amino acid sequences of these two isoforms is shown in Fig. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).

A identidade global da sequência de aminoácidos entre ML humano e de murganho (Fig.19 [SEQ ID NOS: 6 & 17]) é de 72% mas esta homilogia não está distribuída fe forma homogénea. A região definida como domínio EPO (aminoácidos 1-153 da sequência humana e 1-149 para o murganho) está melhor conservada (89% de homologia) do que a região do extremo carbonilo (62% de homologia). Isto pode ainda indicar que apenas o domínio EPO é importante para a actividade biológica da proteína. É interessante que dos dois motivos de aminoácidos di-básicos encontrados em hML, apenas o motivo di-básico imediatamente a seguir ao domínio EPO (posição de resíduo 153-154) na sequência humana está presente na sequência de murganho. Isto é consistente com a possibilidade de ML de tamanho completo poder representar uma proteína precursora que sofre proteólise limitada paraThe global amino acid sequence identity between human and mouse ML (Fig.19 [SEQ ID NOS: 6 & 17]) is 72% but this homilogy is not distributed in a homogeneous way. The region defined as the EPO domain (amino acids 1-153 of the human sequence and 1-149 for the mouse) is better conserved (89% homology) than the extreme carbonyl region (62% homology). This may further indicate that only the EPO domain is important for the biological activity of the protein. It is interesting that of the two di-basic amino acid motifs found in hML, only the di-basic motif immediately following the EPO domain (residue position 153-154) in the human sequence is present in the mouse sequence. This is consistent with the possibility that full-sized ML may represent a precursor protein that undergoes limited proteolysis for

gerar um ligando maduro. Como alternativa, a proteólise entre Arg₁₅₃~Arg₁₅₄ pode facilitar a eliminação de hML.generate a mature ligand. Alternatively, proteolysis between Arg ₁₅₃ ~ Arg ₁₅₄ can facilitate the elimination of hML.

Um vector de expressão contendo toda a sequência codificadora de mML foi usado na transfecção transitória de células 293 como descrito no Exemplo 1. O meio condicionado derivado destas células estimulou a incorporação de ³H-timidina de células Ba/F3 expressando mpl de murganho ou humano mas não teve qualquer efeito na linha celular parental (queAn expression vector containing the entire mML coding sequence was used in the transient transfection of 293 cells as described in Example 1. The conditioned medium derived from these cells stimulated the incorporation of ³ H-thymidine from Ba / F3 cells expressing mouse or human mpl. but it had no effect on the parental cell line (which

não expressa mpl). murganho codifica activar o receptor does not express mpl). mouse codes activate the receptor Isto indica que o cDNA clonado de ML This indicates that the cloned ML cDNA de de in in um de one in ligando ML (mpl) calling ML (mpl) funcional de murganho functional mouse que é capaz e humano. who is capable and human. 11. Ligando 11. Calling de mpl de of mpl of ! Porco ! Pig

cDNA de ML de porco (pML) foi isolado por PCR RACE como descrito no Exemplo 13. Um cDNA produto de PCR de 1342 pb foi encontrado no rim e subclonado. Vários clones foram sequenciados e encontrou-se. que codificam um ligando de mpl de porco de 332 resíduos de aminoácidos referido como pML (ou pML₃₃₂) tendo a sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos deduzida mostrada na Fig. 20 (SEQ ID NOS: 18 & 19) .Pig ML cDNA (pML) was isolated by RACE PCR as described in Example 13. A 1342 bp PCR product cDNA was found in the kidney and subcloned. Several clones were sequenced and found. encoding a pig mpl ligand of 332 amino acid residues referred to as pML (or pML ₃₃₂ ) having the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence shown in Fig. 20 (SEQ ID NOS: 18 & 19).

Novamente, uma segunda forma, designada pML2, codificadora de uma proteína com uma deleção de 4 resíduos de aminoácidos (228 resíduos de aminoácidos) foi identificada (ver Fig. 21 [SEQ ID NO: 21]). A comparação das sequências de aminoácidos de pML e pML2 mostra que esta última forma é idêntica excepto ter sido eliminado o tetrapeptídeo QLPP correspondendo aos resíduos 111-114 inclusive (ver Fig. 22 [SEQ ID NOS: 18 21]). As deleções de quatro aminoácidos observadas no cDNA de ML de murganho e de porco ocorrem precisamente na mesma posição dentro das proteínas previstas .Again, a second form, called pML2, encoding a protein with a deletion of 4 amino acid residues (228 amino acid residues) was identified (see Fig. 21 [SEQ ID NO: 21]). Comparison of the amino acid sequences of pML and pML2 shows that the latter form is identical except that the tetrapeptide QLPP corresponding to residues 111-114 was eliminated (see Fig. 22 [SEQ ID NOS: 18 21]). The deletions of four amino acids observed in the mouse and pig ML cDNA occur at precisely the same position within the predicted proteins.

A comparação das sequências de aminoácidos previstas do ML maduro de humano, murganho e porco (Fig. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 & 18]) indica que a identidade de sequência é de 72% entre murganho e humano, 68% entre murganho e porco e 73% entre porco e humano. A homologia é substancialmente maior na metade terminal amina do ML (domínio homólogo de EPO). Este domínio é 80 a 84% idêntico entre qualquer uma de duas daquelas espécies enquanto que a metade terminal carbonilo (domínio com açúcar) é apenas idêntica em 57 a 67%. Um motivo de aminoácido dibásico que pode representar um sítio de clivagem por proteases está presente no extremo carbonilo do domínio homólogo da eritropoietina. Este motivo é conservado entre as três espécies nesta posição (Fig. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 18]). Um segundo sítio dibásico presente na posição 245 e 246 na sequência humana não está presente nas sequências de murganho ou de porco. A sequência de ML de murganho ou de porco contem 4 císteinas, todas conservadas na sequência humana. Existem sete sítios potenciais de glicosilação dentro do ligando de murganho e seis dentro de ML de porco, 5 dos quais estão conservados na sequência humana. Novamente, todos os potenciais sítios de glicosilação estão situados na metade C-terminal da proteína.The comparison of the predicted amino acid sequences of the mature human, mouse and pig ML (Fig. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 & 18]) indicates that the sequence identity is 72% between mouse and human, 68% between mouse and pig and 73% between pig and human. Homology is substantially greater in the amino terminal half of ML (homologous EPO domain). This domain is 80 to 84% identical between any of two of those species while the carbonyl terminal half (sugar domain) is only identical in 57 to 67%. A dibasic amino acid motif that may represent a protease cleavage site is present at the carbonyl end of the homologous domain of erythropoietin. This motif is conserved among the three species in this position (Fig. 19 [SEQ ID NOS: 6, 17 18]). A second dibasic site present at position 245 and 246 in the human sequence is not present in the mouse or pig sequences. The mouse or pig ML sequence contains 4 cysteines, all conserved in the human sequence. There are seven potential glycosylation sites within the mouse ligand and six within pig ML, 5 of which are conserved in human sequence. Again, all potential glycosylation sites are located on the C-terminal half of the protein.

12. Expressão e Purificação de TPO a partir de Células de Ovãrio de Hamster Chinês (CHO)12. Expression and Purification of TPO from Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells

Os vectores de expressão usados para transfectar células CHO são designados: pSV15.ID.LL.MLORF (tamanho completo ou TPO₃₃₂) r pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncado ou TPO₁₅₃). As principais caracteristicas destes plasmídeos estão descritas no Exemplo 20. Resumidamente, cDNA correspondendo a toda a grelha de leitura aberta de TPO foi obtida por PCR. 0 produto de PCR foi purificado e clonado entre dois sítios de restrição (Ciai e Sall) do plasmídeo pSV15.ID.LL para obter o vector pSV15.ID.LL.MLORF. Uma segunda construção correspondendo ao domínio homólogo de EPO foi gerada da mesma maneira mas usando um iniciador reversoThe expression vectors used to transfect CHO cells are designated: pSV15.ID.LL.MLORF (full size or TPO ₃₃₂ ) r pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncated or TPO ₁₅₃ ). The main characteristics of these plasmids are described in Example 20. Briefly, cDNA corresponding to the entire open TPO reading frame was obtained by PCR. The PCR product was purified and cloned between two restriction sites (ClaI and SalI) of plasmid pSV15.ID.LL to obtain the vector pSV15.ID.LL.MLORF. A second construct corresponding to the homologous EPO domain was generated in the same way but using a reverse primer

diferente (EPOD.Sal). A construção final para o vector codificador do domínio homólogo de EPO do TPO foi chamado pSV15.ID.LL.MLEPO-D.different (EPOD.Sal). The final construction for the vector encoding the TPO EPO homologous domain was called pSV15.ID.LL.MLEPO-D.

Estas duas construções foram linearizadas com Notl e usadas para transfectar células de ovário de hamster chinês (células CHO-DP12, EP 307,247 publicada em 25 de Março de 1989) por electroporação. 10 células foram electroporadas num aparelho de electroporação da BRL (350 Volts, 330 mF, capacitância baixa) na presença de 10, 25 ou 50 mg de DNA como descrito (Andreason, G.L: J. Tissue Cult. Meth. .15.:56 [1993]). No dia seguinte à transfecção, as células foram cultivadas em meio selectivo DHFR (DMEM-F12 com alto teor de glucose 50:50 sem glicina, glutamina 2 mM, 2-5% de soro fetal dialisado).10 a 15 dias mais tarde colónias individuais foram transferidas para placas de 96 cavidades e deixadas crescer até à confluência. A expressão de ML,_e_ ou 153 de ML₃₃2 ^no m®io condicionado derivado destes clones foi ensaiada usando o ensaio, de proliferação de Ba/F3-mpl (descrito no Exemplo 1).These two constructs were linearized with Notl and used to transfect Chinese hamster ovary cells (CHO-DP12 cells, EP 307,247 published March 25, 1989) by electroporation. 10 cells were electroporated in a BRL electroporation device (350 Volts, 330 mF, low capacitance) in the presence of 10, 25 or 50 mg of DNA as described (Andreason, GL: J. Tissue Cult. Meth.... 56 [1993]). The day after transfection, cells were cultured in a selective DHFR medium (DMEM-F12 with 50:50 high glucose content without glycine, 2 mM glutamine, 2-5% dialysed fetal serum) .10 to 15 days later colonies individual cells were transferred to 96 well plates and allowed to grow until confluence. The expression of ML, _and _ or 153 of ML ₃₃ 2 ⁱⁿ conditioned medium derived from these clones was assayed using the Ba / F3-mpl proliferation assay (described in Example 1).

O processo para a purificaçãoe isolamento de TPO a partir do líquido de cultura de células CHO está descrito no Exemplo 20. resumidamente o líquido de cultura celular colhido (HCCF) foi aplicado numa coluna de Blue Sepharose (Pharmacia) numa proporção de 1001 de HCCF por litro de resina. A coluna foi então lavada com 3 a 5 volumes de coluna de tampão seguido de 3 a 5 volumes de coluna de tampão contendo ureia 2,0M. TPO foi então eluido com 3a 5 volumes de coluna de tampão contendo ureia 2,0M e NaCl l,0M.The process for purifying and isolating TPO from the CHO cell culture liquid is described in Example 20. Briefly the harvested cell culture liquid (HCCF) was applied to a Blue Sepharose column (Pharmacia) in a ratio of 1001 HCCF per liter of resin. The column was then washed with 3 to 5 column volumes of buffer followed by 3 to 5 column volumes of buffer containing 2.0M urea. TPO was then eluted with 35 column volumes of buffer containing 2.0 M urea and 1.0 M NaCl.

conjunto de material eluido da Blue Sepharose contendo TPO foi entaão aplicadoa numa coluna de Lectina de Germen de Trigo Sepharose (Pharmacia) equilibrada com tampão de eluição de Blue Sepharose numa proporção de 8 a 16 ml de eluato de Blue Sepharose por ml de resina. A coluna foi então lavada com 2 a 3 volumes de coluna de tampão de rA set of material eluted from Blue Sepharose containing TPO was then applied to a column of Wheat Germ Lectin Sepharose (Pharmacia) equilibrated with Blue Sepharose elution buffer in a ratio of 8 to 16 ml of Blue Sepharose eluate per ml of resin. The column was then washed with 2 to 3 column volumes of r

equilíbrio. TPO foi então eluído com 2 a 5 volumes de coluna de um tampão contendo ureia 2 , OM e N-acetil-D-glucosamina 0,5M.balance. TPO was then eluted with 2 to 5 column volumes of a buffer containing urea 2, OM and 0.5M N-acetyl-D-glucosamine.

O material eluido da Lectina de Germen de Trigo contendo TPO foi então acidificado e ^C ₁₂ ^E8 adicionado para uma concentração final de 0,04%. O material resultante foi aplicado a uma coluna de fase reversa C4 equilibrada em 0,1% TFA, 0,04% C E_ usando aproximadamente 0,2 a 0,5 mg de 12 o proteína por ml de resina.The material eluted from the Wheat Germ Lectin containing TPO was then acidified and ^C ₁₂ ^E 8 added to a final concentration of 0.04%. The resulting material was applied to a C4 reverse phase column equilibrated in 0.1% TFA, 0.04% C E_ using approximately 0.2 to 0.5 mg of 12 o protein per ml of resin.

A proteína foi eluida com um gradiente linear de duas fases de acetonitrilo contendo 0,1% TFA e 0,04% C E_Q e 12 o reuniram-se fracções com bases na análise por SDS-PAGE.The protein was eluted with a two-phase linear gradient of acetonitrile containing 0.1% TFA and 0.04% EC _Q and 12 fractions were pooled on the basis of SDS-PAGE analysis.

O conjunto de material saído da coluna de C4 foi então diluído e diafiltrado contra aproximadamente 6 volumes de tampão numa membrana Amicon YM ou outra membrna de diafiltração semelhante tendo um peso molecular de exclusão de 10000 a 30000 Dalton. 0 diafiltrado resultante pode ser então directamente processado ou ainda concentrado por ultrafiltração. 0 diafiltrado/concentrado é geralmente ajustado a uma concentração final de 0,01% Tween-80.The pool of material exiting the C4 column was then diluted and diafiltered against approximately 6 volumes of buffer on an Amicon YM membrane or other similar diafiltration membrane having an exclusion molecular weight of 10,000 to 30,000 Dalton. The resulting diafiltrate can then be directly processed or further concentrated by ultrafiltration. The diafiltrate / concentrate is generally adjusted to a final concentration of 0.01% Tween-80.

Toda ou parte do diafiltrado/concentrado equivalente a 2 a 5% do volume da coluna foi então aplicada numa coluna Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) equilibrada num tampão contendo 0,01% de Twenn-80 e cromatografado. As fracções contendo TPO sem agregados e produtos de degradação proteolítica foram então reunidass com base no SDS-PAGE. O conjunto de fracções reunidas foi filtrado e guardado a 2-8°C.All or part of the diafiltrate / concentrate equivalent to 2 to 5% of the column volume was then applied to a Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) column equilibrated in a buffer containing 0.01% Twenn-80 and chromatographed. Fractions containing TPO without aggregates and proteolytic degradation products were then pooled based on the SDS-PAGE. The pool of pooled fractions was filtered and stored at 2-8 ° C.

13. Métodos para a Transformação e Indução da Síntese de TPO num Microorganismo e Isolamento, Purificação e Renaturação do TPO Produzido13. Methods for the Transformation and Induction of TPO Synthesis in a Microorganism and Isolation, Purification and Renaturation of the TPO Produced

A construção de vectores de expressão de TPO em E.The construction of TPO expression vectors in E.

r coli está descrita detalhadamente no Exemplo 21. Resumidamente, os plasmídeos pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 e pMP202 foram todos destinados à expressão dos primeiros 155 aminoácidos de TPO a jusante de um pequeno líder que varia entre as diferentes construções. Os líderes proporcionam basicamente um nível de tradução alto e rápida purificação. Os plasmídeos pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 foram projectados para expressarem os primeiros 153 aminoácidos do TPO a jusante de uma metionina de iniciação e diferem apenas na utilização de codões dos 6 primeiros aminoácidos de TPO, enquanto que o plasmídeo pMP251 é um derivado de pMP210-lem que o extremo carbonilo do TPO tem mais dois aminoácidos. Todos os plasmídeos referidos produzirão níveis elevados de expressão intracelular de TPO em E. coli quando da incução do promotor do triptofano (Yansura, D.G. et al. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Ed.) 18554-60. Academic Press, San Diego [1990]). Os plasmídeos pMPl e pMP172 esão intermediários na construção dos plasmídeos de expressão intracelular de TPO:r coli is described in detail in Example 21. Briefly, plasmids pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 and pMP202 were all designed to express the first 155 amino acids of TPO downstream from a small leader that varies between different constructs. Leaders basically provide a high level of translation and quick cleansing. Plasmids pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 were designed to express the first 153 amino acids of TPO downstream of an initiating methionine and differ only in the use of codons from the first 6 amino acids of TPO , while plasmid pMP251 is a derivative of pMP210-lem whereas the carbonyl end of TPO has two more amino acids. All of the above plasmids will produce high levels of intracellular TPO expression in E. coli upon the induction of the tryptophan promoter (Yansura, DG et al. Methods in Enzymology (Goeddel, DV, Ed.) 18554-60. Academic Press, San Diego [nineteen ninety]). Plasmids pMPl and pMP172 are intermediates in the construction of intracellular TPO expression plasmids:

Os plasmídeos de expressão de TPO foram usados para transformar E. coli usando o método de choque térmico e CaCl₂ (Mandei, M. et al. J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970]) e outros processos descritos no Exemplo 21. Resumidamente, as células transformadas foram primeiro crescidas a 37°C até a densidade óptica (600 nm) da cultura ter atingido aproximadamente 2-3. A cultura foi então diluida e após crescimento com arejamento, adicionou-se ácido. A cultura foi então deixada a crescer com arejamento durante mais 15 horas após o que as células foram colhidas por centrifugação.TPO expression plasmids were used to transform E. coli using the thermal shock method and CaCl ₂ (Mandei, M. et al. J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]) and other processes described in Example 21. Briefly, the transformed cells were first grown at 37 ° C until the optical density (600 nm) of the culture reached approximately 2-3. The culture was then diluted and after growth with aeration, acid was added. The culture was then allowed to grow with aeration for an additional 15 hours after which the cells were harvested by centrifugation.

Os processos de Isolamento, Purificação e Renaturação referidos abaixo para a produção de TPO humano renaturado biologicamente activo ou seus fragmentos está descrito nos Exemplos 22 e 23 e podem ser aplicados para a recuperação de qualquer variante de TPO incluindo formas prolongadas nos extremos N e C. Outros processos adequados aoThe Isolation, Purification and Renaturation processes mentioned below for the production of biologically active renatured human TPO or fragments thereof are described in Examples 22 and 23 and can be applied for the recovery of any variant of TPO including prolonged forms at the N and C ends. Other processes suitable for

reenrolamento de TPO recombinante ou sintético podem ser encontrados nas patentes que se seguem; Builder et al.. Patente U.S. 4,511,502; Jones et al. , Patente U.S. 4,512,922; Olson Patente U.S. 4,518,526 e Builder et al.. Patente U.S. 4,620,948; para uma descrição geral do processo de recuperação e renaturação de uma variedade de proteínas recombinantes expressas numa forma insolúvel em E. coli.refolding of recombinant or synthetic TPO can be found in the following patents; Builder et al. U.S. Patent 4,511,502; Jones et al. , U.S. Patent 4,512,922; Olson U.S. Patent 4,518,526 and Builder et al .. U.S. Patent 4,620,948; for a general description of the recovery and renaturation process of a variety of recombinant proteins expressed in an insoluble form in E. coli.

A. Recuperação de TPO não solúvelA. Recovery of non-soluble TPO

Um microorganismo como E. coli expressando TPO codificado por qualquer plasmídeo adequado é cultivado em condições que originam o depósito de TPO em corpos refractáveis insolúveis. Facultativamente, as células são primeiro lavadas num tampão de destruição das células. Tipicamente cerca de lOOg de células são suspensas em cerca de 10 volumes de tampão de destruição de células (e.g. Tris lOmM, EDTA 5mM, pH 8), por exemplo com um homogenizador Polytron e as células foram centrifugadas a 5000xg durante 30 minutos. As células foram então lisadas usando qualquer técnica convencional como seja choque osmótico, sonicação, ciclos de pressão, métodos químicos ou enzimáticos. Por exemplo, o sedimento de células lavado referido pode ser ressuspenso noutros 10 volumes de tampão de destruição de células com um homogenizador e a suspensão de células foi passada através de um Destruidor de Células LH (LH Inceltech, Inc.) ou através de um Microfluidizer (Microfluidics International) de acordo com as instruções do fabricante. O material granular contendo TPO foi então separado da fase líquida e facultativamente lavado com qualquer líquido adequado. Por exemplo, uma suspensão de lisado celular pode ser centrifugada a 5000xg durante 30 minutos, ressuspensa e facultativamente centrifugada uma segunda vez para lavar o sedimento de corpos refractáveis. 0 sedimento lavado pode ser usado imediatamente ou facultativamente guardado congelado (e.g. -70°C).A microorganism like E. coli expressing TPO encoded by any suitable plasmid is grown under conditions that cause TPO to deposit in insoluble refractile bodies. Optionally, the cells are first washed in a cell destruction buffer. Typically about 100 g of cells are suspended in about 10 volumes of cell destruction buffer (e.g. 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8), for example with a Polytron homogenizer and the cells were centrifuged at 5000 x g for 30 minutes. The cells were then lysed using any conventional technique such as osmotic shock, sonication, pressure cycles, chemical or enzymatic methods. For example, the washed cell pellet referred to can be resuspended in another 10 volumes of cell destruction buffer with a homogenizer and the cell suspension was passed through an LH Cell Destroyer (LH Inceltech, Inc.) or through a Microfluidizer (Microfluidics International) according to the manufacturer's instructions. The granular material containing TPO was then separated from the liquid phase and optionally washed with any suitable liquid. For example, a cell lysate suspension can be centrifuged at 5000xg for 30 minutes, resuspended and optionally centrifuged a second time to wash the pellet from refractile bodies. The washed pellet can be used immediately or optionally kept frozen (e.g. -70 ° C).

rr

B. Solubilização e Purificação de TPO MonoméricoB. Solubilization and Purification of Monomeric TPO

TPO insolúvel no sedimento de corpos refractáveis foi então solubilizado com um tampão de solubilização. O tampão de solubilização contem um agente caotrópico e é geralmente tamponado a um pH básico e contem um agente redutor para melhorar o rendimento do TPO monomérico. Agentes caotrópicos representativos incluem ureia, gaunidina.HCl e tiocianato de sódio. Um agente caotrópico preferido +é a guanidina.HC1. A concentração de agente caotrópico é geralmente 4-9M, de preferência 6-8M. O pH do tampão de solubilização é mantido por qualquer tampão adequado num gama de pH entre cerca de 7,5-9,5, de preferência 8,0-9,0 e mais preferencialmente 8,0. De preferência o tampão de solubilização também contem um agente redutor para ajudar à formação da forma monomérica do TPO. Agentes redutores adequados incluem compostos orgânicos contendo um tiol livre (RSH). Agentes redutores representativos incluem ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), mercaptoetanol, glutationa (GSH), cisteamina e císteina. Um agente redutor preferido é o ditiotreitol (DTT). Facultativamente, o tampão de solubilização pode conter um agente oxidante suave (e.g. oxigénio molecular) e um sal sulfito para formar TPO monomérico via sulfitólise. Nesta realização do invento, o TPO-S-sulfonato resultante é mais tarde renaturado na presença do tampão redox (e.g. GSH/GSSG) para formar o TPO correctamente renaturado.TPO insoluble in the refractile bodies pellet was then solubilized with a solubilization buffer. The solubilization buffer contains a chaotropic agent and is generally buffered at a basic pH and contains a reducing agent to improve the yield of the monomeric TPO. Representative chaotropic agents include urea, gaunidine.HCl and sodium thiocyanate. A preferred chaotropic agent + is guanidine.HC1. The concentration of chaotropic agent is generally 4-9M, preferably 6-8M. The pH of the solubilization buffer is maintained by any suitable buffer in a pH range between about 7.5-9.5, preferably 8.0-9.0 and more preferably 8.0. Preferably the solubilization buffer also contains a reducing agent to assist in the formation of the monomeric form of the TPO. Suitable reducing agents include organic compounds containing a free thiol (RSH). Representative reducing agents include dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), mercaptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine and cysteine. A preferred reducing agent is dithiothreitol (DTT). Optionally, the solubilization buffer may contain a mild oxidizing agent (e.g. molecular oxygen) and a sulfite salt to form monomeric TPO via sulfitolysis. In this embodiment of the invention, the resulting TPO-S-sulfonate is later renatured in the presence of the redox buffer (e.g. GSH / GSSG) to form the correctly renatured TPO.

A proteína TPO é geralmente ainda mais purificada usando, por exemplo, centrifugação, cromatografia de filtração em gel e cromatografia em coluna de fase reversa.The TPO protein is generally further purified using, for example, centrifugation, gel filtration chromatography and reverse phase column chromatography.

Como exemplo, o processo que se segue produziu rendimentos adequados do TPO monomérico. O sedimento de corpos refractáveis é ressuspenso em cerca de 5 volumes por peso do tampão solubilizante (Tris 20 mM, pH 8, com guanidina 6-8M e DTT 25 mM) e agitado durante 1-3 horas, ou durante rAs an example, the following process produced adequate yields of the monomeric TPO. The pellet of refractile bodies is resuspended in about 5 volumes by weight of the solubilizing buffer (20 mM Tris, pH 8, with 6-8M guanidine and 25 mM DTT) and stirred for 1-3 hours, or for r

a noite a 4°C para efectuar a solubilização da proteína TPO. Foram também usadas concentrações altas de hidroxiureia (6-8M) mas geralmente resultam em rendimentos mais baixos comparado com aguanidina. Após solubilização, a solução foi centrifugada a 30000xg durante 30 minutos para produzir um sobrenadante clarificado contendo proteína TPO monomérica desnaturada. O sobrenadante foi então sujeito a cromatografia numa coluna de filtração em gel Superdex (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) a um fluxo de 2 ml/min e a proteína eluida com fosfato de sódio 20 mM, pH 6,0, com DTT lOmM. As fracções contendo proteína TPO desnaturada monomérica que eluiu entre 160 e 200 ml foram reunidas. A proteína TPO foi ainda purificada numa coluna de fase reversa C4 semi-preparativa (2 x 20 cm VYDAC). A amostra foi aplicada a 5 ml/min. a uma coluna equilibrada em 0,1% TFA (ácido troifluoroacético) com 30% de acetonitrilo. A proteína foi eluida a aproximadamente 50% de acetonitrilo. Este material foi usado para renaturação para se obter uma variante de TPO biologicamente activa.overnight at 4 ° C to effect the TPO protein solubilization. High concentrations of hydroxyurea (6-8M) have also been used but generally result in lower yields compared to aguanidine. After solubilization, the solution was centrifuged at 30000xg for 30 minutes to produce a clarified supernatant containing denatured monomeric TPO protein. The supernatant was then chromatographed on a Superdex gel filtration column (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) at a flow rate of 2 ml / min and the protein eluted with 20 mM sodium phosphate, pH 6.0, with DTT 10mM. Fractions containing monomeric denatured TPO protein that eluted between 160 and 200 ml were pooled. The TPO protein was further purified on a semi-preparative C4 reverse phase column (2 x 20 cm VYDAC). The sample was applied at 5 ml / min. to a column equilibrated in 0.1% TFA (troifluoroacetic acid) with 30% acetonitrile. The protein was eluted to approximately 50% acetonitrile. This material was used for renaturation to obtain a biologically active TPO variant.

C. Renaturação de TPO para Gerar a Forma Biologicamente ActivaC. TPO renaturation to generate the biologically active form

Após solubilização e posterior purificação do TPO, a forma biologicamente activa obtida por renaturação do TPO monomérico desnaturado num tampão redox. Devido à elevada potência do TPO (metade da estimulção máxima nas células Ba/F3 é conseguida a aproximadamente 3 pg/ml), é possível > obter material biologicamente activo usando muitas tampões, detergentes e condições redox diferentes. No entanto, na maior parte das condições apenas se obtem uma pequena quantidade de material correctamente renaturado (<10%) . Para os processos de produção comercial, é desejável que a renaturação dê pelo menos 10%, mais preferencialmente 30-50% e mais preferencialmente >50%. Muitos detergentes diferentes incluindo Triton X-100, dodecil-beta-maltosido, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosil, Tween 20 e Tween 80, Zwittergent 3-14 rAfter solubilization and subsequent purification of the TPO, the biologically active form obtained by renaturing the denatured monomeric TPO in a redox buffer. Due to the high potency of TPO (half the maximum stimulation in Ba / F3 cells is achieved at approximately 3 pg / ml), it is possible to> obtain biologically active material using many different buffers, detergents and redox conditions. However, in most conditions, only a small amount of correctly rebuilt material is obtained (<10%). For commercial production processes, it is desirable that the renaturation gives at least 10%, more preferably 30-50% and more preferably> 50%. Many different detergents including Triton X-100, dodecyl-beta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosil, Tween 20 and Tween 80, Zwittergent 3-14 r

e outros são adequados à produção de pelo menos algum material correctamente renaturado. Destes, os detergentes mais preferidos são os da família do CHAPS (CHAPS e CHAPSO) que funcionam melhor na reacção de renaturação e limitam a agregação de proteínas e formação incorrecta de ligações dissulfureto. Níveis de CHAPS superiores a cerca de 1% foram os preferidos. Foi necessário cloreto de sódio para os melhores rendimentos, com níveis óptimos entre 0,1M e 0,5M. A presença de EDTA (l-5mM) no tampão redox foi preferido para limitar a quantidade de oxidação catalisada por metais (e agregação) a qual se observou com algumas preparações. As concentrações de glicerol superiores a 15% produziram reacções de renaturação óptimas. Para níveis máximos, foi essencial ter um par redox no tampão redox consistindo num tiol orgânico oxidado e reduzido (RSH). Pares redox adequados incluem mercaptoetanol, glutationa (GSH), cisteamina, císteina e as correspondentes formas oxidadas. Os pares redox preferidos foram glutationa(GSH):glutationa oxidada (GSSG) ou císteina:cistina.. O par redox mais preferido foi glutationa(GSH):glutationa oxidada (GSSG). geralmente rendimentos mais altos foram observados quando a proporção molar do membro oxidado do par redox era igual ou estava em excesso relativamente oa membro reduzido do par redox. Valores de pH entre 7,5 e cerca de 9 foram óptimos para o reenrolamento destas variantes de TPO. Solventes orgânicos (e.g. etanol, acetonitrilo, metanol) foram tolerados em concentrações de 10-15% ou mais baixas. Níveis mais altos de solventes orgânicos foram geralmente úteis. A incubação a 4°C também produziu níveis mais altos de TPO correctamente renaturado.and others are suitable for the production of at least some correctly rebuilt material. Of these, the most preferred detergents are those of the CHAPS family (CHAPS and CHAPSO) that work best in the renaturation reaction and limit protein aggregation and incorrect formation of disulfide bonds. CHAPS levels greater than about 1% were preferred. Sodium chloride was needed for the best yields, with optimum levels between 0.1M and 0.5M. The presence of EDTA (1-5mM) in the redox buffer was preferred to limit the amount of metal-catalyzed oxidation (and aggregation) which was observed with some preparations. Glycerol concentrations above 15% produced optimal renaturation reactions. For maximum levels, it was essential to have a redox pair in the redox buffer consisting of an oxidized and reduced organic thiol (RSH). Suitable redox pairs include mercaptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine, cysteine and the corresponding oxidized forms. The preferred redox pairs were glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSSG) or cysteine: cystine .. The most preferred redox pair was glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSSG). generally higher yields were observed when the molar ratio of the oxidized member of the redox pair was equal to or in excess of that of the reduced member of the redox pair. PH values between 7.5 and about 9 were optimal for refolding these TPO variants. Organic solvents (e.g. ethanol, acetonitrile, methanol) were tolerated at concentrations of 10-15% or lower. Higher levels of organic solvents were generally useful. Incubation at 4 ° C also produced higher levels of correctly renatured TPO.

Rendimentos de renaturação de 40-60% (baseado na quantidade de TPO reduzido e desnaturado usado na reacção de renaturação) são típicos para preparações de TPO que forma purificadas no primeiro passo C4. Pode-se obter material activo quando preparações menos puras (e.g., directamente após coluna de Superdex ou após a extracção inicial dos rRenaturation yields of 40-60% (based on the amount of reduced and denatured TPO used in the renaturation reaction) are typical for TPO preparations that were purified in the first step C4. Active material can be obtained when less pure preparations (e.g., directly after Superdex column or after initial extraction of the r

corpos refractáveis) se bem os rendimentos sejam inferiores devido à extensa precipitação e interferência das proteínas contaminantes durante o processo de reenrolamento do TPO.refractile bodies) although yields are lower due to extensive precipitation and interference from contaminating proteins during the TPO rewinding process.

Uma vez que o TPO contem 4 resíduos de císteina, é possível gerar três versões dissulfureto desta proteína:Since the TPO contains 4 cysteine residues, it is possible to generate three disulfide versions of this protein:

versão 1: dissulfuretos entre os resíduos de císteina 1-4 e 2-3version 1: disulfides between cysteine residues 1-4 and 2-3

versão 2: version 2: dissulfuretos disulfides entre in between resíduos waste de in císteina cysteine 1-2 1-2 e 3-4 versão 3: and 3-4 version 3: dissulfuretos disulfides entre in between resíduos waste de in císteina cysteine 1-3 1-3 e 2-4 . and 2-4.

Durante a exploração inicial na determinação das condições de renaturação, vários picos diferentes contendo a proteína TPO foram separados por cromatografia em fase reversa C4. Apenas um destes picos tinha actividade biológica significativa conforme determinado usando o ensaio com Ba/F3. Subsequentemente, as condições de renaturação foram optimizadas para dar preferencialmente aquela versão. Nestas condições, as versões mal enroladas eram inferiores a 10-20% do TPO monomérico totalobtido no passo de solubilização.During the initial exploration to determine the renaturation conditions, several different peaks containing the TPO protein were separated by C4 reverse phase chromatography. Only one of these peaks had significant biological activity as determined using the Ba / F3 assay. Subsequently, the renaturation conditions were optimized to give preference to that version. Under these conditions, the poorly rolled versions were less than 10-20% of the total monomeric TPO obtained in the solubilization step.

padrão dissulfureto para o TPO biologicamente activo foi determinado como sendo 1-4 e 2-3 por espectrometria de massa e sequenciação da proteína, onde as císteinas estão numeradas sequenciadamente a partir do extremo amina. Este padrão de ligação cruzada de císteinas é consistente com o padrão de pontes dissulfureto da molécula eritropoietina que lhe é aparentada.disulfide pattern for the biologically active TPO was determined to be 1-4 and 2-3 by mass spectrometry and protein sequencing, where the cysteines are numbered sequentially from the amine end. This cross-linking pattern of cysteines is consistent with the pattern of disulfide bridges in the related erythropoietin molecule.

D. Actividade Biológica do TPO Recombinante RenaturadoD. Biological Activity of Recombinant Recombinant TPO

TPO renaturado e purificado tem actividade tantoRenatured and purified TPO has activity both

em ensaios in vitro como in vivo. Por exemplo, no ensaio com Ba/F3, metade da estimulação máxima da incorporação de tomidina nas células Ba/F3 para TPO (Met^-1 1-153) foi conseguida a 3,3 pg/ml (0,3 pM) . Na ELISA baseada no receptor mpl, metade da actividade máxima ocorreu a 1,9 ng/ml (120 pM). Nos animais normais e mielo-suprimidosproduzidos por radiação X quase letal, TPO (Met ¹ 1-153) renaturado foi altamente potente (a acitividade foi observada em doses tão baixas quanto 30 ng/murganho) na restimulação da produção de novas plaquetas. Actividade biológica semelhante foi observada para outras formas de TPO renaturado de acordo com os processos acima descritos (ver Figs. 25, 26 e 28).in in vitro as well as in vivo assays. For example, in the Ba / F3 assay, half of the maximum stimulation of the incorporation of tomidine into the Ba / F3 cells for TPO (Met ^-1 1-153) was achieved at 3.3 pg / ml (0.3 pM). In the ELISA based on the mpl receptor, half of the maximum activity occurred at 1.9 ng / ml (120 pM). In normal and myelo-suppressed animals produced by near-lethal X-radiation, renatured TPO (Met ¹ 1-153) was highly potent (activity was observed at doses as low as 30 ng / mouse) in restimulating the production of new platelets. Similar biological activity has been observed for other forms of renatured TPO according to the processes described above (see Figs. 25, 26 and 28).

14. Método para a Medição da Actividade Trombopoiética14. Method for Measuring Thrombopoietic Activity

A actividade trombopoiética pode ser medida em vários ensaios incluindo o ensaio do ligando de mpl com Ba/F3 descrito no Exemplo 1, um ensaio in vivo de síntese religado a plaquetas de murganho, ensaio de indução do antigénio de superfície celular de plaquetas conforme medido por um imuno-ensaio anti-plaquetas (anti-GPII_bIII_a) para a linha celular megacarioblástica de leucémia humana CMK) (ver Sato et al., Brit. J. Heamatol., 72:184-190 [1989]) (ver também o ensaio de megacariocitopoiese em suspensão descrito no Exemplo 4) e indução da poliploidização numa linha celular megacarioblástica (DAMI) (ver Ogura et al. , Blood, 72.(1):49-60 [1988]). A maturação de megacariócitos a partir de células imaturas que não sintetizam DNA, para megacariócitos morfologicamente identificáveisenvolve um processo que inclui o aparecimento de organelos citoplasmáticos, aquisição de antigénios de membrana (GPII. III ), endo-replicação e libertação de plaquetas como descrito no fundamento do invento. Será de esperar que um promotor específico de linhagem (i.e., o ligando de mpl) da maturação de megacariócitos induza pelo menos algumas das alterações nos megacariócitos imaturos conduzindo à libertação de plaquetas e melhoria da trombocitopenia. Assim, projectarm-se ensaios para medir a emergênica destes parâmetros em linhas celulares de megacariócitos imaturos, i.e.. células CMK e DAMI. O ensaio com CMK (Exemplo 4) mede o aparecimento de um marcador de plaquetas específico, GPII_bIII_a e destruição de plaquetas. 0 ensaio com DAMI (Exemplo 15) mede a endo-replicação uma vez que aumentos de ploidia são característicos de megacariócitos maduros. Os megacariócitos reconhecíveis têm valores de ploidia de 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, etc. Finalmente, o ensaio in vivo de plaquetas religadas (Exemplo 16) é útil na demonstração de que a administração do composto a testar (aqui o ligando de mpl) resultano aumento dos números de plaquetas.Thrombopoietic activity can be measured in several assays including the Ba / F3 mpl ligand assay described in Example 1, an in vivo mouse platelet-linked synthesis assay, platelet cell surface antigen induction assay as measured by an anti-platelet immunoassay (anti-GPII _b III _a ) for the human leukemia megakaryoblastic cell line CMK) (see Sato et al., Brit. J. Heamatol., 72: 184-190 [1989]) (see also the suspension megakaryocytopoiesis assay described in Example 4) and induction of polyploidization in a megacarioblastic cell line (DAMI) (see Ogura et al., Blood, 72. (1): 49-60 [1988]). The maturation of megakaryocytes from immature cells that do not synthesize DNA, to morphologically identifiable megakaryocytes involves a process that includes the appearance of cytoplasmic organelles, acquisition of membrane antigens (GPII. III), endo-replication and platelet release as described in the foundation of the invention. A lineage specific promoter (ie, the mpl ligand) of megakaryocyte maturation would be expected to induce at least some of the changes in immature megakaryocytes leading to platelet release and improvement of thrombocytopenia. Thus, tests were designed to measure the emergence of these parameters in immature megakaryocyte cell lines, ie. CMK and DAMI cells. The CMK assay (Example 4) measures the appearance of a specific platelet marker, GPII _b III _a and platelet destruction. The DAMI assay (Example 15) measures endo-replication since increases in ploidy are characteristic of mature megakaryocytes. Recognizable megakaryocytes have ploidy values of 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, etc. Finally, the in vivo assay of reconnected platelets (Example 16) is useful in demonstrating that administration of the test compound (here the mpl ligand) results in increased platelet numbers.

Foram desenvolvidos mais dois ensaios in vitro para medir actividade de TPO. 0 primeiro é uma ELISA de activação do receptor de cinase (KIRA) (kinase receptor activation ELISA) em que células CHO são transfectadas com uma quimera mpl-Rse e fosforilação de tirosina de Rse foi medida por ELISA após exposição da fracção mpl da quimera ao ligando de mpl (ver Exemplo 17). 0 segundo é uma ELISA baseada em receptores em que a placa de ELISA revestida comanticorpos de coelho anti-IgG humana captura o receptor quimérico humano mpl-IqG que se liga ao ligando de mpl a ser testado. Um anticorpo policlonal de coelho biotinilado contra o ligando de mpl (ΤΡΟ^^.) foi usado para detectar o ligando de mpl ligado o qual se mede usando estreptavidina-peroxidase como descrito no Exemplo 18.Two more in vitro assays have been developed to measure TPO activity. The first is a kinase receptor activation (KIRA) ELISA (kinase receptor ELISA activation) in which CHO cells are transfected with an mpl-Rse chimera and Rse tyrosine phosphorylation was measured by ELISA after exposure of the chimera's mpl fraction to ligand from mpl (see Example 17). The second is a receptor-based ELISA in which the ELISA plate coated with rabbit anti-human IgG antibodies captures the human chimeric receptor mpl-IqG that binds to the mpl ligand to be tested. A biotinylated rabbit polyclonal antibody against the mpl ligand (ΤΡΟ ^^.) Was used to detect the bound mpl ligand which is measured using streptavidin-peroxidase as described in Example 18.

JJ

15. Resposta Biológica In Vivo de Murganhos Normais e Subletalmente Irradiados, Tratados com TPO15. In Vivo Biological Response of Normal and Subletly Irradiated Mice Treated with TPO

Tanto murganhos normais como subletalmente irradiados foram tratados com TPO truncado e de tamano completo isolado a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO, E. coli e células de rim embrionário humano (293).Both normal and sublethally irradiated mice were treated with truncated TPO and full size isolated from Chinese hamster ovary cells (CHO, E. coli and human embryonic kidney cells (293).

Ambas as formas de TPO produzidas nestes três hospedeiros estimularam a produção de plaquetas em murganhos, no entanto, TPO de tamanho completo isolado a partir de CHO pareceu produzir a maior resposta in vivo. Estes resultados indicam que a glicosilação correcta do domínio C-terminal pode ser necessária para actividade óptima in vivo.Both forms of TPO produced in these three hosts stimulated platelet production in mice, however, full-size TPO isolated from CHO appeared to produce the greatest response in vivo. These results indicate that the correct glycosylation of the C-terminal domain may be necessary for optimal activity in vivo.

ía) E. coli-rhTPO,„ .-1 — ' ' --------- (Met ,15 3)1a) E. coli-rhTPO, „.-1 - '' --------- (Met, 15 3)

A forma Met do domínio EPO (Met na posição -1 mais os primeiros 153 resíduos do TPO humano) produzida emThe Met form of the EPO domain (Met at position -1 plus the first 153 residues of human TPO) produced in

E. coli (ver Exemplo 23) foi injectada diariamente em murganhos C57B6 fêmeas normais como descrito nas legendas da Fig. 25A, B e C. Estas figuras mostram que a forma truncada não glicosilada do TPO produzido em E. coli e renaturado como descrito atrás é capaz de estimular um aumento de cerca de duas vezes na produção de plaquetas em murganhos normais sem afectar a população de eritrócitos ou de células brancas do sangue.E. coli (see Example 23) was injected daily into normal female C57B6 mice as described in the captions to Fig. 25A, B and C. These figures show that the non-glycosylated truncated form of TPO produced in E. coli and renatured as described above it is able to stimulate an increase of about two times in the production of platelets in normal mice without affecting the population of erythrocytes or white blood cells.

Esta mesma molécula injectada diariamente em murganhos C57B6 fémea subletalmente irradiadas ( cs) como descrito nas legendas da Fig. 26A, B e C estimulou a recuperação de plaquetas e diminuiu o nadir mas não teve qualquer efeito nos eritrócitos ou leucócitos.This same molecule injected daily into sublethally irradiated (Cs) female C57B6 mice as described in the captions to Fig. 26A, B and C stimulated platelet recovery and decreased nadir but had no effect on erythrocytes or leukocytes.

(b) CHO-rhTPO₃₃₂ (b) CHO-rhTPO ₃₃₂

A forma de tamanho completo do TPO produzido em CHO e injectada diariamente em murganhos C57B6 fêmea normal como descrito nas legendas da Fig. 27A, B e C produziu um aumento de cerca de cinco vezes na produção de plaquetas em murganhos normais sem afectar a população de eritrócitos ou leucócitos.The full-size form of TPO produced in CHO and injected daily into normal female C57B6 mice as described in the legends to Fig. 27A, B and C produced a five-fold increase in platelet production in normal mice without affecting the population of erythrocytes or leukocytes.

r (c) CHO-rhTPO.,₃₂: E^oii-rhTPO_(Met-_lil53); r (c) CHO-rhTPO., ₃₂ : E2 Oii-rhTPO _(Met - _lil53);

293-rhTPO ; e E.coli-rhTPO.__c 293-rhTPO; and E.coli-rhTPO._ _c

332332

Construiram-se curvas de dose-resposta para o tratamento de murganhos normais com rhTPO derivado de várias linhas celulares (CHO-rhTPO___; E. coli-rhTPO,.. .-1 ,Dose-response curves were constructed for the treatment of normal mice with rhTPO derived from various cell lines (CHO-rhTPO ___; E. coli-rhTPO, ...-1,

3 2 ( 15 3 J /3 2 (15 3 J /

293-rhTPO₃₃₂; e E. coli-rhTPO^^^) como descrito na legenda da Fig. 28. esta figura mostra que todas as formas testadas da molécula estimulam a produção de plaquetas, no entanto a forma de tamanho completo produzida em CHO mostrou a maior actividade in vivo.293-rhTPO ₃₃₂ ; and E. coli-rhTPO ^^^) as described in the legend to Fig. 28. This figure shows that all tested forms of the molecule stimulate the production of platelets, however the full-size form produced in CHO showed the greatest activity alive.

(d) CHO-rhTPO , CHO-rhTPO.. , „ e ^v ' 153' truncado(d) CHO-rhTPO, CHO-rhTPO .., 'and ^v' 153 'truncated

CHO-rhTPO₃₃₂ CHO-rhTPO ₃₃₂

Construiram-se curvas de dose-resposta para o tratamento de murganhos normais com várias formas de rhTPO produzido em CHO (CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPO„_trUncado ^e CHO-rhTPO₃₃₂) como descrito na legenda da Fig. 29. Esta figura mostra que todas as formas CHO testadas da molécula estimulam a produção de plaquetas, mas a forma de 70 KDa de tamanho completo tem a maior actividade in vivo.Dose-response curves were constructed for the treatment of normal mice with various forms of rhTPO produced in CHO (CHO-rhTPO ₁₅₃ , CHO-rhTPO „ _trU ncado ^and CHO-rhTPO ₃₃₂ ) as described in the legend to Fig. 29. This The figure shows that all tested CHO forms of the molecule stimulate platelet production, but the full-size 70 KDa form has the greatest activity in vivo.

16. Preparação Geral de Recombinantes do Ligando de mpl e Variantes16. General Preparation of Recombinants of the MPL Ligand and Variants

De preferência o ligando de mpl é preparado por processos recombinantes convencionais que envolvem a produção do polipeptídeo ligando de mpl através da cultura de células transfectadas de forma a expressarem o ácido nucleico do ligando de mpl (tipicamente por transformação das células com um vector de expressão) e recuperação do polipeptídeo a partir das células. No entanto, o ligando de mpl pode ser produzido por recombinação homóloga ou com métodos de produção recombinante utilizando elementos de controle introduzidos nestas células já contendo DNA codificador de rPreferably the mpl ligand is prepared by conventional recombinant processes that involve producing the mpl ligand polypeptide by culturing transfected cells to express the nucleic acid of the mpl ligand (typically by transforming the cells with an expression vector) and recovering the polypeptide from the cells. However, the mpl ligand can be produced by homologous recombination or with recombinant production methods using control elements introduced into these cells already containing DNA encoding r

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ligando de mpl. Por exemplo, um elemento promotor/potenciador forte, um supressor ou um elemnto modulador da transcrição exógeno podem ser inseridos no genoma da célula hospedeira pretendida na proximidade e orientação suficientes para influenciar a transcrição de DNA codificador do polipeptídeo ligando de mpl. 0 elemnto de controle não codifica o ligando de mpl, em vez disso o DNA jã está no genoma da célula hospedeira. Em seguida faz-se o despiste das células que produzem o polipetídeo receptor deste invento ou de níveis altos ou baixos de expressão.calling from mpl. For example, a strong promoter / enhancer element, a suppressor or an exogenous transcription modulating element can be inserted into the desired host cell genome in sufficient proximity and orientation to influence the transcription of DNA encoding the mpl ligand polypeptide. The control element does not encode the mpl ligand, instead the DNA is already in the host cell genome. Then, the cells that produce the polypeptide receptor of this invention or of high or low levels of expression are screened.

Assim, o invento engloba um método para a produção do ligando de mpl compreedendo inserção no genoma de uma célula contendo a molécula de ácido nucleico do ligando de mpl um elemnto modulador da transcrição numa proximidade suficiente e orientação relativamente à molécula de ácido nucleico que influencie a sua transcrição, com um passo facultativo compreendendo a cultura da célula contendo o elemento modulador da transcrição e a molécula de ácido nucleico. Este invento também engloba uma célula hospedeira contendo a molécula de ácido nucleico do ligando de mpl operacionalmente ligado a sequências de controle exógenas reconhecidas pela célula hospedeira.Thus, the invention encompasses a method for the production of the mpl ligand comprising insertion into the genome of a cell containing the nucleic acid molecule of the mpl ligand, a transcription modulating element in sufficient proximity and orientation with respect to the nucleic acid molecule that influences the its transcription, with an optional step comprising the cell culture containing the transcription modulating element and the nucleic acid molecule. This invention also encompasses a host cell containing the nucleic acid molecule of the mpl ligand operably linked to exogenous control sequences recognized by the host cell.

A. Isolamento de DNA codificador do polipeptídeo ligando de mplA. Isolation of DNA encoding the mpl ligand polypeptide

DNA codificador do polipeptídeo ligando de mpl pode ser obtido a partir de qualquer biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que se pensa possuir mRNA do ligando de mpl e que o expresse num nível detectável. O gene do ligando de mpl pode também ser obtido a partir de uma biblioteca de DNA genómico ou por síntese de oligonucleótidos in vitro a partir da sequência de nucleótidos ou de aminoácidos completa.DNA encoding the mpl ligand polypeptide can be obtained from any cDNA library prepared from tissue thought to have mpl ligand mRNA and which expresses it at a detectable level. The mpl ligand gene can also be obtained from a genomic DNA library or by in vitro oligonucleotide synthesis from the complete nucleotide or amino acid sequence.

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As bibliotecas foram despistadas com sondas destinadas a identificar o gene com interesse ou a proteína por ele codificada. Para bibliotecas de expressão de cDNA, sondas adequadas incluem anticorpos monoclonais ou policionais que reconhecem e ligam especificamente o ligando de mpl. Para as bibliotecas de cDNA sondas adequadas incluem oligonucleótidos com cerca de 20-80 bases de comprimento que codificam fracções conhecidas ou suspeitas do cDNA do ligando de mpl da mesma espécie ou de espécies diferentes; e/ou cDNAs complementares ou homólogos ou seus fragmentos que codificam o mesmo gene ou um gene semelhante. Sondas adequadas para o despiste de bibliotecas de DNA genómico incluem mas não estão limitadas a oligonucleótidos, cDNAs ou seus fragmentos que codificam o mesmo gene ou um gene semelhante e/ou DNAs genómicos homólogos ou seus fragmentos. O despiste do cDNA ou da biblioteca genómica com a sonda seleccionada pode ser efectuado usando procesos convencionais como descrito nos Capítulos 10-12 de Sambrook et al., supra.The libraries were screened with probes designed to identify the gene of interest or the protein encoded by it. For cDNA expression libraries, suitable probes include monoclonal or polyclonal antibodies that specifically recognize and bind the mpl ligand. For suitable cDNA libraries probes include oligonucleotides about 20-80 bases in length that encode known or suspected mpl ligand cDNA fractions of the same or different species; and / or complementary or homologous cDNAs or fragments thereof that encode the same or a similar gene. Probes suitable for screening genomic DNA libraries include, but are not limited to, oligonucleotides, cDNAs or fragments encoding the same or a similar gene and / or homologous genomic DNAs or fragments thereof. Screening of the cDNA or genomic library with the selected probe can be performed using conventional procedures as described in Chapters 10-12 of Sambrook et al., Supra.

Um meio alternativo para isolar o gene codificador do ligando de mpl é usar metodologia de PCR como descrito na secção 14 de Sambrook et al.. supra. Este método requere a utilização de oligonucleótidos que hibridarão com DNA codificador do ligando de mpl. Descrevem-se abaixo as estratégias para a selecção de oligonucleótidos.An alternative means to isolate the gene encoding the mpl ligand is to use PCR methodology as described in section 14 of Sambrook et al .. supra. This method requires the use of oligonucleotides that will hybridize to DNA encoding the mpl ligand. Strategies for the selection of oligonucleotides are described below.

Um método preferido para a realização deste 7 invento é usar sequências de oligonucleótidos cuidadosamente seleccionadas para o despiste de bibliotecas de cDNA derivadas de vários tecidos, de preferência linhas celulares de rim (adulto ou fetal) ou de fígado humano ou de porco. Por exemplo, bibliotecas de cDNA de linhas celulares de fígado fetal humano foram despistados com os oligonucleótidos sonda.A preferred method for carrying out this invention is to use carefully selected oligonucleotide sequences for screening cDNA libraries derived from various tissues, preferably kidney (adult or fetal) or human or pig liver cell lines. For example, cDNA libraries from human fetal liver cell lines were screened with the probe oligonucleotides.

As sequências de oligonucleótidos seleccionadas rThe selected oligonucleotide sequences r

102 como sondas deverão ter um comprimento suficiente e serem suficientemente pouco ambíguas para se minimizarem os falsos positivos. A(s) sequência(s) de nucleótidos é geralmente designada com base nas regiões do ligando de mpl que têm a menor redundância de codões. Os oligonicleótidos podem ser degenerados numa ou mais posições. A utilização de oligonucleótidos degenerados é de particular importância sempre que uma biblioteca despistada é de uma espécie em que se desconhece a utilização preferencial de codões.102 as probes should be of sufficient length and unambiguous enough to minimize false positives. The nucleotide sequence (s) is generally designated based on the regions of the mpl ligand that have the least codon redundancy. Oligonicleotides can be degenerated in one or more positions. The use of degenerate oligonucleotides is of particular importance whenever a screened library is of a species where the preferred use of codons is unknown.

oligonucleótido deve ser marcado de forma a que possa ser detectado quando da hibridação com DNA na biblioteca a ser despistada. O método de marcação preferido é é a 32 utilização de ATP (e.q., gama P) e cinase de polinucleótidos para marcar radioactivamente o extremo 5' do oligonucleótido. No entanto, podem ser usados outros métodos para marcar o oligonucleótido, incluindo, mas não estando limitados a biotinilação ou marcação com enzimas.oligonucleotide must be labeled so that it can be detected when hybridizing with DNA in the library to be screened. The preferred labeling method is to use ATP (e.g., gamma P) and polynucleotide kinase to radiolabel the 5 'end of the oligonucleotide. However, other methods can be used to label the oligonucleotide, including, but not limited to, biotinylation or enzyme labeling.

É de particular interesse o ácido nucleico do ligando de mpl que codifica um polipeptideo ligando de mpl de tamanho completo. Nalgumas realizações preferidas, a sequência de ácido nucleico inclui a sequência sinal nativa do ligando de mpl. O ácido nucleico contendo toda a sequência codificadora da proteína é obtido por despiste de bibliotecas de cDNA ou genómicas seleccionadas usando a sequência de aminoácidos deduzida.Of particular interest is the nucleic acid of the mpl ligand encoding a full-length mpl ligand polypeptide. In some preferred embodiments, the nucleic acid sequence includes the native signal sequence of the mpl ligand. The nucleic acid containing the entire protein coding sequence is obtained by screening selected cDNA or genomic libraries using the deduced amino acid sequence.

B. Variantes da sequência de aminoácidos do ligando de mpl nativoB. Variants of the amino acid sequence of the native mpl ligand

As variantes da sequência de aminoácidos do ligando de mpl são preparadas por introdução das alterações de nucleótidos adequadas no DNA do ligando de mpl ou por síntese in vitro do polipeptideo ligando de mpl pretendido. Tal variante inclui, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos rThe amino acid sequence variants of the mpl ligand are prepared by introducing the appropriate nucleotide changes into the DNA of the mpl ligand or by in vitro synthesis of the desired mpl ligand polypeptide. Such a variant includes, for example, deletions, insertions or substitutions of residues within the amino acid sequence r

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do ligando de mpl de porco. Por exemplo, fracções do extremo carbonilo do ligando de mpl de tamanho completo maduro podem ser removidas por clivagem proteolítica, quer in vivo quer in vivo, ou por clonagem e expressão de um fragmento ou DNA codificador do ligando de mpl de tamanho completo para produzir uma variante biologicamente activa. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para se chegar à construção final, desde que a construção final possua a actividade biológica pretendida. As alterações de aminoácidos podem também alterar processos pós-tradução do ligando de mpl, como seja a alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação. Para a projecção de variantes da sequência de aminoácidos do ligando de mpl. a localização do sítio da mutação e a natureza da mutação características do ligando de mpl a ser sítios para a mutação podem ser modificados dependerão das modificado. Os individualmente ou em série, e.g. por (1) substituição primeiro com escolhas de aminoácidos conservados e depois com selecções mais radicais dependndo dos resultados conseguidos, (2) deleção do resíduo alvo ou (3) inserção de resíduos da mesma classe ou de classe diferente adjacentes ao sítio localizado ou combinações das opções 1-3.of pork mpl ligand. For example, fractions of the carbonyl end of the mature full-size mpl ligand can be removed by proteolytic cleavage, either in vivo or in vivo, or by cloning and expression of a fragment or DNA encoding the full-size mpl ligand to produce a biologically active variant. Any combination of deletion, insertion and substitution is done to arrive at the final construction, as long as the final construction has the desired biological activity. Amino acid changes can also alter post-translational processes of the mpl ligand, such as changing the number or position of glycosylation sites. For the design of variants of the amino acid sequence of the mpl ligand. the location of the mutation site and the nature of the mutation characteristic of the mpl ligand to be sites for the mutation can be modified will depend on the modified ones. The individual or in series, eg by (1) substitution first with choices of conserved amino acids and then with more radical selections depending on the results achieved, (2) deletion of the target residue or (3) insertion of residues of the same or different class adjacent to the site located or combinations of options 1-3.

Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do polipeptídeo ligando de mpl que são localizações preferidas para a mutagénese é chamado mutagénese de varrimento com alanina, como descrito por Cunningham e Wells, Science, 244:1081-108519891. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (e.g., resíduos carregados tais como arg, asp, his, lis e glu) e substituídos por qualquer aminoácido, de preferência um aminoácido neutro ou carregado negativamente (mais preferencialmente alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o ambiente aquoso envolvente dentro ou fora da célula. Aqueles domínios demonstrando sensibilidade funcional às substituições forma mais trabalhados introduzindo mais variantes ou outrasnos sítios de substituição.A useful method for identifying certain residues or regions of the mpl ligand polypeptide that are preferred locations for mutagenesis is called alanine scanning mutagenesis, as described by Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-108519891. Here, a target residue or group of residues is identified (eg, charged residues such as arg, asp, his, lis and glu) and replaced with any amino acid, preferably a neutral or negatively charged amino acid (more preferably alanine or polyalanine) for affect the interaction of amino acids with the surrounding aqueous environment inside or outside the cell. Those domains showing functional sensitivity to substitutions were more worked on by introducing more variants or others in the substitution sites.

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Assim, se bem que o sítio para a introdução de uma variação na sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita de ser predeterminada. Por exemplo, para optimizar a actuação de uma mutação num determinado sítio, o varrimento com alanina ou mutagénese ao acaso é realizado no codão ou região alvo e as variantes do ligando de mpl expressas são despistadas relativamente à combinação óptima da actividade pretendida.Thus, although the site for introducing a variation in the amino acid sequence is predetermined, the nature of the mutation per se does not need to be predetermined. For example, to optimize the action of a mutation at a given site, scanning with alanine or random mutagenesis is performed on the target codon or region and the expressed mpl ligand variants are screened for the optimal combination of the desired activity.

Existem duas variáveis principais na construção das variantes da sequência de aminoácidos: a localização do sítio da mutação e a natureza da mutação. Por exemplo, variantes do polipeptídeo ligando de mpl incluem variantes da sequência do ligando de mpl e podem representar alelos naturais (os quais não requerem manipulação do DNA do ligando de mpl) ou formas mutantes predeterminadas feitas por mutação do DNA, para chegar a um alelo ou variante não encontrado na natureza. Em geral, a localização e natureza da mutação escolhida dependerá das caracteristicas do ligando de mpl a ser modificado.There are two main variables in the construction of the amino acid sequence variants: the location of the mutation site and the nature of the mutation. For example, variants of the mpl ligand polypeptide include variants of the mpl ligand sequence and may represent natural alleles (which do not require manipulation of the mpl ligand DNA) or predetermined mutant forms made by mutating the DNA to arrive at an allele or variant not found in nature. In general, the location and nature of the chosen mutation will depend on the characteristics of the mpl ligand to be modified.

As deleções da sequência de aminoácidos geralmente variam entre cerca de 1 e 30 resíduos, mais preferencialmente cerca de la 10 resíduos e tipicamente são contíguas. Como alternativa as deleções de sequências de aminoácidos para o ligando de mpl podem incluir uma fracção ou todo o domínio de glicoproteína do extremo carbonilo. As deleções da sequência de aminoácidos podem também incluir um ou mais dos 6 primeiros resíduos de aminoácidos da proteína madura. As deleções da sequência de aminoácidos facultativas compreendem um ou mais resíduos em uma ou mais regiões em ansa que existem entre as porções helicoidais(helical bundels). As deleções contíguas normalmente são feitas em números impares de resíduos, mas também estão dentro do âmbito do invento deleções em números pares. As deleções podem ser introduzidas em regiões de baixa homologia entre os ligandos de mpl que partilham mais identidade de sequênciapara rDeletions of the amino acid sequence generally range between about 1 and 30 residues, more preferably about 1 to 10 residues and are typically contiguous. Alternatively, amino acid sequence deletions for the mpl ligand may include a fraction or the entire carbonyl end glycoprotein domain. Deletions of the amino acid sequence can also include one or more of the first 6 amino acid residues of the mature protein. Deletions of the optional amino acid sequence comprise one or more residues in one or more loop regions that exist between the helical bundels. Contiguous deletions are normally made on odd numbers of residues, but are also within the scope of the invention even numbered deletions. Deletions can be introduced in regions of low homology between the mpl ligands that share more sequence identity to r

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modificar a actividade do ligando de mpl. Por outro lado podem ser introduzidas deleções em regiões de baixa homologia entre polipeptídeo ligando de mpl humano e polipeptídeos de ligando de mpl de outros mamíferos que partilham identidade da maior parte da sequência com o ligando de mpl humano. As deleções de um polipeptídeo ligando de mpl de mamífero em áreas de substancial homologia com outros ligandos de mpl de mamífero provavelmente modificarão a actividade biológica do ligando de mpl mais significativamente. 0 número de deleções consecutivas será seleccionado de forma a preservar a estrutura terciária dos ligandos de mpl no domínio afectado, e.g·. folha dobrada em beta ou hélice alfa.modify the activity of the mpl ligand. On the other hand, deletions can be introduced in regions of low homology between human mpl ligand polypeptide and other mammalian mpl ligand polypeptides that share identity of most of the sequence with the human mpl ligand. Deletions of a mammalian mpl ligand polypeptide in areas of substantial homology to other mammalian mpl ligands are likely to modify the biological activity of the mpl ligand more significantly. The number of consecutive deletions will be selected in order to preserve the tertiary structure of the mpl ligands in the affected domain, e.g. sheet folded in beta or alpha helix.

As inserções na sequência de aminoácidos incluem fusões no extremo amina ou no extremo carbonilo variando de comprimento entre um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções dentro da sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos. Inserções dentro das sequências (i.e., inserções dentro da sequência do ligando de mpl maduro) podem variar entre cerca de 1 e 10 resíduos, mais preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente la 3. Um exemplo de fusão preferida é a do ligando de mpl ou seu fragmento e uma outra citocina ou seu fragmento. Exemplos de inserções terminais incluem o ligando de mpl maduro com um resíduo metionilo N-terminal, um artefacto da expressão directa do ligando de mpl maduro em culturas de células recombinantes e fusão de uma sequência sinal N-terminal heteróloga com o extremo N da molécula do ligando de mpl maduro para facilitar a secreção do ligando de mpl maduro, obtido em hospedeiros recombinantes. Tais sequências sinal geralmente são obtidas a partir da espécie da célula hospedeira usada e portanto são homólogas. Sequências adequadas incluem STII ou Ipp para E. coli. factor alfa para levedura e sinais virais tais como gD de herpes para células de mamífero.Insertions in the amino acid sequence include fusions at the amine or carbonyl end varying in length from one residue to polypeptides containing one hundred or more residues, as well as insertions within the sequence of one or more amino acid residues. Insertions within the sequences (ie, insertions within the mature mpl ligand sequence) can vary between about 1 and 10 residues, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3. An example of preferred fusion is that of the mpl ligand or its fragment and another cytokine or its fragment. Examples of terminal inserts include the mature mpl ligand with an N-terminal methionyl residue, an artifact of direct expression of the mature mpl ligand in recombinant cell cultures and fusion of a heterologous N-terminal signal sequence with the N-terminus of the mature mpl ligand to facilitate secretion of mature mpl ligand, obtained in recombinant hosts. Such signal sequences are generally obtained from the host cell species used and are therefore homologous. Suitable sequences include STII or Ipp for E. coli. alpha factor for yeast and viral signals such as herpes gD for mammalian cells.

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Outras variantes de inserção da molécula do ligando de mpl incluem a fusão com o extremo N ou C do ligando de mpl, de polipeptídeos imunogénicos (i . e., não endógenos para o hospedeiro a que é administrado o produto de fusão), e.g., polipeptídeos bacterianos tais como beta-lactamase ou uma enzima codificada pelo locus trp de E. coli ou proteína de levedura e fusões do extremo C com proteínas tendo uma semi-vida longa como sejam regiões constantes de imunoglobulina (ou outras regiões de imunoglobulina), albumina ou ferritina, conforme descrito em WO 89/02922 publicado em 6 de Abril de 1989.Other variants of insertion of the mpl ligand molecule include fusion with the N or C end of the mpl ligand, of immunogenic polypeptides (i.e., not endogenous to the host to which the fusion product is administered), eg, bacterial polypeptides such as beta-lactamase or an enzyme encoded by the E. coli trp locus or yeast protein and C-end fusions with proteins having a long half-life such as immunoglobulin constant regions (or other immunoglobulin regions), albumin or ferritin, as described in WO 89/02922 published on April 6, 1989.

Um terceiro grupo de variantes são variantes de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido removido da molécula do ligando de mpl e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagénese dirigida incluem sítios identificados como os sítios activos do ligando de mpl e sítios onde os aminoácidos encontrados noutros análogos são substancialmente diferentes em termos de volume da cadeia lateral, carga ou hidrofobicidade, mas onde também há um alto grau de identidade de sequência no sítio seleccionado entre várias espécies de ligando de mpl e/ou dentro de vários análogos animais de um membro ligando de mpl.A third group of variants are amino acid substitution variants. These variants have at least one amino acid residue removed from the mpl ligand molecule and a different residue inserted in its place. Sites of greatest interest for targeted mutagenesis include sites identified as the active sites of the mpl ligand and sites where the amino acids found in other analogs are substantially different in terms of side chain volume, charge or hydrophobicity, but where there is also a high degree of sequence identity at the site selected among various species of mpl ligand and / or within various animal analogs of an mpl ligand member.

Outros sítios com interesse são aqueles em que resíduos particulares do ligando de mpl obtido a partir de vários membros de uma família e/ou espécie animal dentro de um membro são idênticos. Estes sítios, especialmente os que caem dentro de uma sequência de pelo menos três outros sítios identicamente conservados, são substituídos de uma forma relativamente conservada. Tais substituições conservadoras estão apresentadas na Tabela 3 na coluna de substituições preferidas. Se tais substituições resultam numa alteração da actividade biológica, então alterações substanciais, denominadas substituições exemplificativas na Tabela 3 ou rOther sites of interest are those in which particular residues of the mpl ligand obtained from several members of a family and / or animal species within a member are identical. These sites, especially those that fall within a sequence of at least three other identically conserved sites, are replaced in a relatively conserved manner. Such conservative substitutions are shown in Table 3 in the column of preferred substitutions. If such substitutions result in a change in biological activity, then substantial changes, called exemplary substitutions in Table 3 or r

107 como descrito abaixo como referência às classes de aminoácidos,· são introduzidas e os produtos analisados.107 as described below with reference to the classes of amino acids, · are introduced and the products analyzed.

Tabela 3Table 3

ResíduoResidue

OriginalOriginal

Substituições Exemplif icativasExemplary Substitutions

Substituições PreferidasPreferred Substitutions

Ala (A) Wing (A) Vai; Leu, Ile Go; Leu, Ile Vai Go Arg (R) Arg (R) Lis; Gin; Asn Lis; Gin; Asn Lis Lis Asn (N) Asn (N) Gin; His; Lis; Arg Gin; His; Lis; Arg Gin Gin Asp (D) Asp (D) Glu Glu Glu Glu Cis (C) Cis (C) Ser To be Ser To be Gin (Q) Gin (Q) Asn Asn Asn Asn Glu (E) Glu (E) Asp Asp Asp Asp Gli (G) Gly (G) Pro Pro Pro Pro His (H) His (H) Asn; Gin; Lis; Arg Asn; Gin; Lis; Arg Arg Arg Ile (I) Ile (I) Leu; Vai; Met; Ala; Fen Read; Go; Met; Allah; Fen norleucina norleucine Leu Read Leu (L) Leu (L) norleucina; ile; vai norleucine; ile; go Met; Ala; Fen Met; Allah; Fen Ile Ile Lis (K) Lis (K) Arg; Gin; Asn Arg; Gin; Asn Arg Arg Met (M) Met (M) Leu; Fen; Ile Read; Fen; Ile Leu Read Fen (F) Fen (F) Leu; Vai; Ile; Ala Read; Go; Ile; Allah Leu Read Pro (P) Pro (P) Gli Gli Gli Gli Ser (S) Being (S) Tre Tre Tre Tre Tre (T) Tre (T) Ser To be Ser To be Trp (W) Trp (W) Tir Tir Tir Tir Tir (Y) Tir (Y) Trp; Fen; Tre; Ser Trp; Fen; Tre; To be Fen Fen Vai (V) Go (V) Ile; Leu; Met; Fen; Ile; Read; Met; Fen; Ala; norleucina Allah; norleucine Leu Read

Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do ligando de mpl são conseguidas por selecção de substiruições que diferem significativamente no seu efeito na manutenção de (a) estrutura do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo, como uma rSubstantial modifications in the function or immunological identity of the mpl ligand are achieved by selecting substitutions that differ significantly in their effect on maintaining (a) structure of the polypeptide skeleton in the substitution area, for example, as a r

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conformação em folha ou helicoidal, (b) carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) volume da cadeia lateral. Os resíduos naturais estão divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:leaf or helical conformation, (b) charge or hydrophobicity of the molecule at the target site or (c) volume of the side chain. Natural waste is divided into groups based on common side chain properties:

(1) hidrófobos; norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile;(1) hydrophobic; norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrofílicos neutros: Cis, Ser, Tre;(2) neutral hydrophilic: Cis, Ser, Tre;

(3) acídicos: Asp, Glu;(3) acidic: Asp, Glu;

(4) básicos: Asn, Gin, His, Lis, Arg;(4) basic: Asn, Gin, His, Lis, Arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gli,(5) residues that influence the orientation of the chain: Gly,

Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tir, Fen.Pro; and (6) aromatics: Trp, Tir, Fen.

As substituições não conservadoras incluem a troca de um membro de uma destas classes por um outro da mesma classe. Tais resíduos substituídos podem também ser introduzidos nos sítios de substituição conservadora ou, mais preferencialmente, nos restantes sítios (não conservadores).Non-conservative substitutions include exchanging a member of one of these classes for another member of the same class. Such substituted residues can also be introduced in the conservative replacement sites or, more preferably, in the remaining (non-conservative) sites.

Numa realização do invento, é desejável inactivar um ou mais sítios de clivagem por proteases que estão presentes na molécula. Estes sítios são identificados por análise da sequência de aminoácidos codificada, no caso da tripsina, e.g., por um resíduo arginilo ou lisinilo. Quando os sítios de clivagem por proteases são identificados são inactivados relativamente à substituição do resíduo alvo preferência um resíduo básico clivagem proteolítica por com um outro resíduo, de como seja glutamina ou um resíduo hidrófobo como seja serina; eliminando o resíduo; ou por inserção de um resíduo prolilo imediatamente após o resíduo.In an embodiment of the invention, it is desirable to inactivate one or more protease cleavage sites that are present in the molecule. These sites are identified by analysis of the encoded amino acid sequence, in the case of trypsin, e.g., by an arginyl or lysinyl residue. When protease cleavage sites are identified, they are inactivated with respect to the replacement of the target residue, preferably a basic proteolytic cleavage residue with another residue, such as glutamine or a hydrophobic residue such as serine; eliminating the residue; or by inserting a prolyl residue immediately after the residue.

Numa outra realização, qualquer resíduo metionilo que não seja o resíduo metionilo inicial da sequência sinal ou qualquer outro resíduo situado dentro de três resíduos relativamente ao extremo N ou C de tal resíduo metionilo é substituído por um outro resíduo (de preferência de acordo rIn another embodiment, any methionyl residue other than the initial methionyl residue of the signal sequence or any other residue located within three residues with respect to the N or C end of such methionyl residue is replaced by another residue (preferably in accordance with r

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com a Tabela 3) ou eliminado. Como alternativa, cerca de 1-3 resíduos são inseridos adjacentes a tais sítios.Table 3) or eliminated. Alternatively, about 1-3 residues are inserted adjacent to such sites.

Quaisquer resíduos císteina não envolvidos na manutenção da conformação correcta do ligando de mpl podem também ser substituídos, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e para evitar ligações cruzadas aberrantes. Encontrou-se que a primeira e quarta císteinas no domínio epo, numeradas a partir do extremo amina, são necessárias para a manutençaõ da conformação correcta mas que o segundo e o terceiro não são. Assim, a segunda e terceira císteinas no domínio epo podem ser substituídas.Any cysteine residues not involved in maintaining the correct conformation of the mpl ligand can also be replaced, usually with serine, to improve the oxidative stability of the molecule and to avoid aberrant cross-linking. It has been found that the first and fourth cysteines in the epo domain, numbered from the amine end, are necessary for maintaining the correct conformation but that the second and third are not. Thus, the second and third cysteines in the epo domain can be replaced.

As moléculas de ácido nucleico codificadoras de variantes de sequências de aminoácidos do ligando de mpl são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos. Estes métodos incluem, mas não estão limitados ao isolamento a partir de uma fonte natural· (no caso de variantes naturais da sequência de aminoácidos) ou preparação por mutagénse mediada por oligonucleótidos (ou dirigida), mutagénese por PCR e mutagenése com cassete de uma versão variante anteriormente preparada ou não variante do polipeptídeo ligando de mpl.The nucleic acid molecules encoding variants of mpl ligand amino acid sequences are prepared by a variety of known methods. These methods include, but are not limited to, isolation from a natural source · (in the case of natural variants of the amino acid sequence) or preparation by oligonucleotide-mediated (or directed) mutagenesis, PCR mutagenesis and cassette mutagenesis of one version variant previously prepared or not variant of the mpl ligand polypeptide.

A mutagénese mediada por oligonucleótidos é um método preferido para a preparação de variantes de substituição, deleção e inserção do DNA do ligando de mpl. Esta técnica é bem conhecida conforme descrito por Adelman et al. , DNA, 2.:183 [1983]. Resumidamente, o DNA do ligando de mpl é alterado por hibridação com um oligonucleótido codiifcador da mutação pretendida sobre um DNA molde, em que o molde é uma forma de cadeia simples de um plasmídeo ou bacteriófago contendo a sequência de DNA inalterada ou nativa do ligando de mpl. Após hibridação, usa-se uma DNA-polimerase para sintetizar uma segunda cadeia complementar completa do molde que assim incorporará oOligonucleotide-mediated mutagenesis is a preferred method for the preparation of mpl ligand DNA substitution, deletion and insertion variants. This technique is well known as described by Adelman et al. , DNA, 2.:183 [1983]. Briefly, the DNA of the mpl ligand is altered by hybridization with an oligonucleotide encoding the desired mutation on a template DNA, where the template is a single-stranded form of a plasmid or bacteriophage containing the unchanged or native DNA sequence of the ligand. mpl. After hybridization, a DNA polymerase is used to synthesize a second complete complementary strand of the template that will thus incorporate the

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oligonucleótido iniciador e codificará a alteração seleccionada no DNA do ligando de mpl.oligonucleotide primer and will encode the selected change in mpl ligand DNA.

De uma forma geral, usam-se oligonucleótidos de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento. Um oligonucleótido óptimo terá 12 a 15 nucleótidos que são completamente complementares do molde de ambos os lados dos nucleótidos codificadores da mutação. Isto assegura que o oligonucleótido hibrida correctamente com a molécula de DNA molde de cadeia simples. Os oligonucleótidos são facilmente sintetizados usando técnicas conhecidas como sejam a descrita por Crea et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7.5:5765 [1978].In general, oligonucleotides of at least 25 nucleotides in length are used. An optimal oligonucleotide will have 12 to 15 nucleotides that are completely complementary to the template on both sides of the nucleotides encoding the mutation. This ensures that the oligonucleotide properly hybridizes to the single-stranded template DNA molecule. Oligonucleotides are easily synthesized using techniques known as those described by Crea et al. , Proc. Natl. Acad. Know. USA, 7.5: 5765 [1978].

DNA molde pode estar em vectores derivados do bacteriófago M13 (os vectores comerciais M13mpl8 e M13mpl9 são adequados) ou em vectores que contêm uma origem de replicação de fagos de cadeia simples como descrito por Vieira et al., Meth.Enzymol., 153:3 [1987]. Assim, o DNA a ser mutagenizado pode ser inserido num destes vectores para gerar um molde de cadeia simples. A produção de molde de cadeia simples está descrita nas Secções 4.21-4.14 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).Template DNA can be in vectors derived from bacteriophage M13 (commercial vectors M13mpl8 and M13mpl9 are suitable) or in vectors containing a single-stranded phage origin of replication as described by Vieira et al., Meth.Enzymol., 153: 3 [1987]. Thus, the DNA to be mutagenized can be inserted into one of these vectors to generate a single-stranded template. The production of single-stranded mold is described in Sections 4.21-4.14 of Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

Como alternativa, DNA molde de cadeia simples pode ser gerado por desnaturação de DNA de plasmídeo de cadeia dupla (ou outro) usando técnicas convencionais.Alternatively, single-stranded template DNA can be generated by denaturing double-stranded plasmid DNA (or other) using conventional techniques.

Para alteração da sequência de DNA nativa (para gerar variantes da sequência de aminoácidos, por exemplo), o oligonucleótido é hibridado com molde de cadeia simples em condições de hibridação adequadas. Uma enzima de polimerização de DNA, geralmente o fragmento Klenow da DNA-polimerase I, é então adicionado para sintetizar a cadeia complementar do molde usando o oligonucleótido como iniciador da síntese. Uma molécula heteroduplex é assim formada de forma a que uma cadeia de DNA codifica a forma mutagenizada do ligando de rFor altering the native DNA sequence (to generate variants of the amino acid sequence, for example), the oligonucleotide is hybridized with single-stranded template under suitable hybridization conditions. A DNA polymerization enzyme, usually the Klenow fragment of DNA polymerase I, is then added to synthesize the complementary template strand using the oligonucleotide as a primer for synthesis. A heteroduplex molecule is thus formed so that a strand of DNA encodes the mutagenized form of the ligand of r

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mpl e a outra cadeia (o molde original) codifica a sequência inalterada do ligando de mpl. Esta molécula heteroduplex é então usada para transformar uma célula hospedeira adequada, geralmente um procariota como seja E. coli JM101. Após crescimento das células, elas são semeadas em placas de agarose e despistadas usando o oligonucleótido iniciador 3 2 .mpl and the other strand (the original template) encodes the unchanged sequence of the mpl ligand. This heteroduplex molecule is then used to transform a suitable host cell, usually a prokaryote such as E. coli JM101. After growth of the cells, they are seeded on agarose plates and screened using the primer 3 2 oligonucleotide.

marcado com -fosfato para identificar as colónias bacterianas que contêm o DNA alterado. A região alterada é então retirada e colocada num vector adequado à produção de proteína, geralmente um vector de expressão do tipo tipicamente empregue para transformação de um hospedeiro adequado.labeled with -phosphate to identify bacterial colonies that contain the altered DNA. The altered region is then removed and placed in a vector suitable for protein production, generally an expression vector of the type typically employed for transformation of a suitable host.

O método acabado de descrever pode ser modificado de forma a que uma molécula homoduplex seja criada onde ambas as cadeias do plasmídeo contêm as mutações. As modificações são as que se seguem. 0 oligonucleótido de cadeia simples é emparelhado com molde de cadeia simples como descrito atrás. Uma mistura dos três desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) e desoxirribotimidina (dTTP), é combinada com uma tio-desoxirribocitosina modificada chamada dCTP-(aS) (a qual pode ser adquirida à Amersham Corporation). Esta mistura é adicionada ao complexo molde-oligonucleótido. Quando da adição da DNA-polimerase a esta mistura, forma-se uma cadeia de DNA idêntica ao molde, excepto nas bases alteradas. Ainda, esta nova cadeia de DNA conterá dCTP-(aS) em vez de dCTP o que serve para a proteger da digestão com endonucleases de restrição.The method just described can be modified so that a homoduplex molecule is created where both strands of the plasmid contain the mutations. The modifications are as follows. The single-stranded oligonucleotide is paired with single-stranded template as described above. A mixture of the three deoxyribonucleotides, deoxyriboadenosine (dATP), deoxyriboguanosine (dGTP) and deoxyribothymidine (dTTP), is combined with a modified thio-deoxyribocytosine called dCTP- (aS) (which can be purchased from Amers Corporation. This mixture is added to the template-oligonucleotide complex. When adding the DNA polymerase to this mixture, a DNA strand identical to the template is formed, except in the altered bases. In addition, this new DNA strand will contain dCTP- (aS) instead of dCTP which serves to protect it from digestion with restriction endonucleases.

Após a cadeia de DNA molde do heteroduplex de cadeia dupla ser cortada com a enzima de restrição adequada, a cadeia molde pode ser digerida com nuclease Exo III ou uma outra nuclease adequada na região que contem o sítio a ser mutagenizado. A reacção é então parada para deixar uma molécula que é apenas parcialmente de cadeia simples. Um homoduplex de DNA de cadeia dupla completa é então formado usando DNA-polimerase na presença de quatro trifosfatos deAfter the template DNA strand of the double stranded heteroduplex is cut with the appropriate restriction enzyme, the template strand can be digested with Exo III nuclease or another suitable nuclease in the region containing the site to be mutagenized. The reaction is then stopped to leave a molecule that is only partially single-stranded. A full-stranded DNA homoduplex is then formed using DNA polymerase in the presence of four triphosphates of

112 desoxirribonucleótidos, ATP e DNA-ligase. Esta molécula homoduplex pode ser então usada para transformar uma célula hospedeira adequada como seja E. coli JM101 como descrito atrás.112 deoxyribonucleotides, ATP and DNA ligase. This homoduplex molecule can then be used to transform a suitable host cell such as E. coli JM101 as described above.

DNA codificador de mutantes do ligando de mpl com mais de um aminoácido para substituir podem ser gerados por uma de várias maneiras. Se os aminoácidos estiverem situados perto uns dos outros na cadeia polipeptídica, podem ser mutagenizados em conjunto usando um oligonucleótido que codifica todas as substituições de aminoácidos pretendidas. Se, no entanto, os aminoácidos estiverem a alguma distância uns dos outros (separados por mais de dez aminoácidos), é mais díficil gerar um único oligonucleótido que codifique todas as alterações pretendidas. Pode neste caso ser empregue um de dois métodos alternativos.DNA encoding mpl ligand mutants with more than one amino acid to replace can be generated in one of several ways. If the amino acids are located close to each other in the polypeptide chain, they can be mutagenized together using an oligonucleotide that encodes all of the desired amino acid substitutions. If, however, the amino acids are some distance from each other (separated by more than ten amino acids), it is more difficult to generate a single oligonucleotide that encodes all the desired changes. In this case, one of two alternative methods can be employed.

No primeiro método, um oligonucleótido separado é gerado para cada aminoácido.substituído. Os oligonucleótidos são então emparelhados com DNA molde de cadeia simples simultaneamente e a segunda cadeia de DNA que é sintetizada a partir do molde codificará todas as substituições de aminoácidos pretendidas.In the first method, a separate oligonucleotide is generated for each substituted amino acid. The oligonucleotides are then paired with single-stranded template DNA simultaneously and the second strand of DNA that is synthesized from the template will encode all desired amino acid substitutions.

O método alternativo envolve dois ou mais ciclos de mutagénese para produzir o mutante pretendido. O primeiro ciclo é como descrito para os mutantes com uma só alteração: DNA selvagem é usado como molde, um oligonucleótido codificador da primeira substituição de aminoácidos pretendida é emparelhado com este molde e a molécula de DNA heteroduplex é então gerada. O segundo ciclo de mutagénese utiliza o DNA alteradoo produzido no primeiro ciclo de mutagénese como molde. Assim, este molde já contem uma ou mais mutações. 0 oligonucleótido codificador da substituição de aminoácido adicional pretendida é então emparelhado com este molde e a cadeia resultante de DNA agora codifica mutações derivadas do primeiro e segundo ciclos de mutagénese. Este DNAThe alternative method involves two or more rounds of mutagenesis to produce the desired mutant. The first cycle is as described for single-change mutants: wild DNA is used as a template, an oligonucleotide encoding the first intended amino acid substitution is paired with this template and the heteroduplex DNA molecule is then generated. The second round of mutagenesis uses the altered DNA produced in the first round of mutagenesis as a template. Thus, this mold already contains one or more mutations. The oligonucleotide encoding the desired additional amino acid substitution is then paired with this template and the resulting DNA strand now encodes mutations derived from the first and second rounds of mutagenesis. This DNA

113 resultante pode ser usado como molde num terceiro ciclo de mutagénese e por aí adiante.The resulting 113 can be used as a template in a third round of mutagenesis and so on.

A mutagénese por PCR é também adequada para fazer variantes de aminoácidos do polipeptídeo ligando de mpl. Se bem que a discussão que se segue se refira a DNA, comprrende-se que a técnica também tem aplicação com RNA. A técnica de PCR geralmente refere-se ao processo que se segue (ver Erlich, supra, o capítulo por R. Higiuchi, p. 61-70): Quando pequenas quantidades de DNA molde são usadas como material de partida num PCR, iniciadores que diferem ligeiramente na sequência da correspondente região num DNA molde podem ser usados para gerar quantidades relativamente grandes de um fragmento de DNA específico que difere da sequência molde apenas nas posições onde os iniciadores diferem do molde. Para a introdução de uma mutação no DNA de plasmídeo, um dos iniciadores é projectado de forma a sobrepor a posição da mutação e a conter a mutação; a sequência do outro iniciador deve ser idêntica ao segmento de sequência da cadeia oposta do plasmídeo, mas esta sequência pode estar situada em qualquer sítio ao longo do DNA do plasmídeo. É no entanto preferido que a sequência do segundo iniciador esteja situada dentro de 200 nucleótidos a partir do primeiro, de forma a que no fim toda a região amplificada do DNA limitado pelos iniciadores possa ser facilmente sequenciada. A amplificação por PCR usando um par de iniciadores como o descrito resulta numa população de fragmentos de DNA que difere na posição da mutação especificada pelo iniciador e possivelmente noutras posições, pois a cópia do molde é sujeita a erros.PCR mutagenesis is also suitable for making amino acid variants of the mpl ligand polypeptide. Although the discussion that follows refers to DNA, it is understood that the technique also has application with RNA. The PCR technique generally refers to the following process (see Erlich, supra, the chapter by R. Higiuchi, p. 61-70): When small amounts of template DNA are used as starting material in a PCR, primers that differ slightly in the sequence of the corresponding region in a template DNA can be used to generate relatively large amounts of a specific DNA fragment that differs from the template sequence only in the positions where the primers differ from the template. For the introduction of a mutation in the plasmid DNA, one of the primers is designed to overlap the position of the mutation and to contain the mutation; the sequence of the other primer must be identical to the sequence segment of the opposite strand of the plasmid, but this sequence can be located anywhere along the plasmid's DNA. It is however preferred that the sequence of the second primer is located within 200 nucleotides from the first, so that in the end the entire amplified region of the DNA limited by the primers can be easily sequenced. PCR amplification using a pair of primers as described results in a population of DNA fragments that differs in the position of the mutation specified by the primer and possibly in other positions as the copy of the template is subject to errors.

Se a proporção de molde-produto for extremamente baixa, a grande maioria dos fragmentos de DNA produzidos incorporam as mutações pretendidas. Este material produto é usado para substituir a região correspondente no plasmídeo que serviu como molde de PCR usando tecnologia de DNA convencional. As mutações em posições separadas podem serIf the mold-product ratio is extremely low, the vast majority of the DNA fragments produced incorporate the desired mutations. This product material is used to replace the corresponding region on the plasmid that served as a PCR template using conventional DNA technology. Mutations in separate positions can be

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introduzidas simultaneamente usando um segundo iniciador mutante ou fazendo um segundo PCR com iniciadores mutantes diferentes e ligando os dois fragmentos de PCR resultantes simultaneamente ao fragmento de vector numa ligação de três ou mais partes.introduced simultaneously using a second mutant primer or making a second PCR with different mutant primers and ligating the resulting two PCR fragments simultaneously to the vector fragment in a bond of three or more parts.

Num exemplo específico da mutagénese com PCR, o DNA plasmídeo molde (1 μg) é linearizado por digestão com uma endonuclease de restrição que tem um sítio de reconhecimento único no DNA de plasmídeo fora da região a ser amplificada. Deste material, 100 ng é adicionado a uma mistura de PCR contendo tampão de PCR, o qual contem os quatro trifosfatos de desoxinucleótido e está incluído nos kits GeneAmp (adquiridos à Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT e Emeryville, CA) e 25 pmoles de cada oligonucleótido iniciador, para um volume final de 50 μΐ. A mistura de reacção foi coberta com 35 μΐ de óleo mineral. A mistura de reacção é desnaturada durante 5 minutos a 100°C, colocada rapidamente em gelo e depois adicionado Ιμΐ de DNA-polimerase de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/μΙ, adquirido à Perkin-Elmer Cetus)é adicionada por baixo da camada de óleo mineral. A mistura de reacção é então inserida num DNA Thermal Cycler (adquirido à Perkin-Elmer Cetus) programado como se segue:In a specific example of PCR mutagenesis, the template plasmid DNA (1 μg) is linearized by digestion with a restriction endonuclease that has a unique recognition site in the plasmid DNA outside the region to be amplified. Of this material, 100 ng is added to a PCR mixture containing PCR buffer, which contains the four deoxynucleotide triphosphates and is included in the GeneAmp kits (purchased from Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA) and 25 pmoles of each oligonucleotide primer, to a final volume of 50 μΐ. The reaction mixture was covered with 35 μΐ of mineral oil. The reaction mixture is denatured for 5 minutes at 100 ° C, quickly placed on ice and then added Ιμΐ of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase (5 units / μΙ, purchased from Perkin-Elmer Cetus) is added under the layer of mineral oil. The reaction mixture is then inserted into a Thermal Cycler DNA (purchased from Perkin-Elmer Cetus) programmed as follows:

2 min. 2 min 55°C 55 ° C 30 30 seg. Mon. 72°C, seguido 72 ° C, followed de 19 ciclos do seguinte: 19 cycles of the following: 30 30 seg. Mon. 94°C 94 ° C 30 30 seg. Mon. 55°C e 55 ° C and 30 30 seg. Mon. 72°C. 72 ° C. No At the fim end do programa, o the program, the tubo da reacção é retirado reaction tube is removed

do ciclizador térmico e a fase aquosa transferida para um outro tubo, extraída com fenol/clorofórmio (50:50 vol) e precipitada com etanol e o DNA recuperado por processos convencionais. Este material é subsequentemente sujeitoaos tratamentos adequados para a inserção num vector.from the thermal cycler and the aqueous phase transferred to another tube, extracted with phenol / chloroform (50:50 vol) and precipitated with ethanol and the DNA recovered by conventional processes. This material is subsequently subjected to treatments suitable for insertion into a vector.

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Um outro método para a preparação de variantes, mutagése com cassete, baseia-se na técnica descrita por Wells et a 1. , Gene, 3.4:315 [1985]. O material de partida é o plasmídeo (ou outro vector) compreendendo o DNA ligando de mpl a ser mutagenizado. O codão ou codões a serem mutagenizados no DNA do ligando de mpl são identificados. Deve existir um sítio de restrição único de cada lado do sítio de mutação identificado. Se não existirem tais sítios de restrição, eles podem ser gerados usando o método de mutagénese mediada por oligonucleótidos atrás descrito para os introduzir nos locais adequados do DNA do ligando de mpl. Após os sítios de restrição terem sido introduzidos no plasmídeo, o plasmídeo é cortado nestes sítios para ser linearizado. Sintetiza-se usando processos convencionais um oligonucleótido de cadeia dupla codificador da sequência do DNA entre os sítios de restrição mas contendo as mutações pretendidas. As duas cadeias são sintetizadas separadamente e depois hibridadas usando técnicas convencionais. Este oligonucleótido de cadeia dupla é referido como a cassete. Esta cassete é projectada de forma a ter extremos 3' e 5' que são compatíveis com os extremos do plasmídeo linearizado, de forma a poder ser ligado directamente ao plasmídeo. Este plasmídeo agora contem a sequência de DNA do ligando de mpl mutagenizada.Another method for preparing variants, cassette mutagenesis, is based on the technique described by Wells et a 1., Gene, 3.4: 315 [1985]. The starting material is the plasmid (or other vector) comprising the mpl ligand DNA to be mutagenized. The codon or codons to be mutagenized in the DNA of the mpl ligand are identified. There must be a unique restriction site on each side of the identified mutation site. If there are no such restriction sites, they can be generated using the oligonucleotide-mediated mutagenesis method described above to introduce them into the appropriate sites of the mpl ligand DNA. After the restriction sites have been introduced into the plasmid, the plasmid is cut at these sites to be linearized. A double-stranded oligonucleotide encoding the DNA sequence between the restriction sites but containing the desired mutations is synthesized using conventional procedures. The two strands are synthesized separately and then hybridized using conventional techniques. This double-stranded oligonucleotide is referred to as the cassette. This cassette is designed to have 3 'and 5' ends that are compatible with the ends of the linearized plasmid, so that it can be connected directly to the plasmid. This plasmid now contains the DNA sequence of the mutated mpl ligand.

C. Inserção de ácido nucleico num vector replicável ácido nucleico (e.g., cDNA ou DNA genómico) codificador do polipeptídeo ligando de mpl nativo ou variante é inserido num vector replicável para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Existem muitos vectores e a seleção do vector adequado dependerá de (1) se é para usar na amplificação de DNA ou para expressão de DNA, (2) do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vector e (3) da célula hospediera a ser transformada com o vector. Cada um dos vectores contem vários componentes dependendo daC. Insertion of nucleic acid into a replicable nucleic acid vector (e.g., cDNA or genomic DNA) encoding the native mpl ligand polypeptide or variant is inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of the DNA) or for expression. There are many vectors and the selection of the appropriate vector will depend on (1) whether it is to be used for DNA amplification or for DNA expression, (2) the size of the nucleic acid to be inserted into the vector and (3) the host cell to be transformed with the vector. Each of the vectors contains several components depending on the

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sua função (amplificação de DNA ou expressão de DNA) e a célula hospedeira com a qual é compatível. Os componentes do vector geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais do seguinte: sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes de marcas, um elemento potenciador e uma sequência de terminação da transcrição.its function (amplification of DNA or expression of DNA) and the host cell with which it is compatible. The components of the vector generally include, but are not limited to one or more of the following: signal sequence, an origin of replication, one or more tag genes, an enhancer element and a transcription termination sequence.

(i) Componente sequência sinal(i) Signal sequence component

O ligando de mpl deste invento pode ser expresso não apenas directamente, mas também como uma fusão com um polipeptídeo heterólogo, de preferência uma sequência sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específicono extremo N da proteína madura ou polipeptídeo. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vector ou pode ser parte do DNA do ligando de mpl que é inserido no vector. A sequência sinal heteróloga seleccionada deverá ser uma que seja reconhecida e processada (i. e, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para as células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a sequência sinal do ligando de mpl nativo, a sequência sinal é substituída por uma sequência sinal procariótica seleccionada por exemplo líderes do grupo constituído por fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enteroxina II estável ao calor. Para a secreção em levedura a sequência sinal nativa pode ser substituída por e.g., a invertase de levedura, factor alfa ou líderes de fosfatase ácida, o líder de glucoamilase de C. albicans (EP 362,179 publicada em 4 de Abril de 1990) ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamífero a sequência sinal nativa (i.e. a pré-sequência do ligando de mpl que normalmente dirige a secreção do ligando de mpl nas células nativas de mamífero in vivo) é satisfatória, se bem que outras sequências sinal de mamífero possam ser adequadas, como sejam sequências sinal de outros polipeptídeos ligandos de mpl ou do mesmo ligando de mpl derivado de uma espécie animal diferente, sequências sinalklThe mpl ligand of this invention can be expressed not only directly, but also as a fusion with a heterologous polypeptide, preferably a signal sequence or other polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide. In general, the signal sequence can be a component of the vector or it can be part of the DNA of the mpl ligand that is inserted into the vector. The selected heterologous signal sequence should be one that is recognized and processed (i.e., cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize and process the signal sequence of the native mpl ligand, the signal sequence is replaced by a prokaryotic signal sequence selected for example leaders from the group consisting of alkaline phosphatase, penicillinase, Ipp or heat-stable enteroxin II. For yeast secretion the native signal sequence can be replaced by eg, yeast invertase, alpha factor or acid phosphatase leaders, the C. albicans glucoamylase leader (EP 362,179 published on April 4, 1990) or the signal described in WO 90/13646 published on November 15, 1990. In expression in mammalian cells the native signal sequence (ie the mpl ligand pre-sequence that normally directs the secretion of the mpl ligand in native mammalian cells in vivo ) is satisfactory, although other mammalian signal sequences may be suitable, such as signal sequences from other mpl ligand polypeptides or from the same mpl ligand derived from a different animal species, sinalkl sequences

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derivadas de um ligando de mple sequências sinal derivadas de põlipeptídeos secretados da mesma espécie ou espécies relacionadas, assim como líderes de secreção, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex.derived from a mple ligand signal sequences derived from secreted polypeptides of the same species or related species, as well as secretion leaders, for example, the herpes simplex gD signal.

(ii) Componente origem de replicação(ii) Origin of replication component

Tanto vectores de expressão como vectores de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite ao vector replicar-se numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Geralmente, nos vectores de clonagem esta sequência é uma que permite ao vector replicar-se independentemente do DNA cromossómico hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónomas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação derivada do plasmídeo pBR322 é adequada para a maior parte das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2 μιη é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. De um modo geral o componente origem de replicação não é necessário para os vectores de espressão de mamíferos (a origem de SV40 pode ser tipicamente usada apenas porque contem o promotor precoce).Both expression vectors and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that allows the vector to replicate in one or more selected host cells. Generally, in cloning vectors this sequence is one that allows the vector to replicate independently of the host chromosomal DNA and includes origins of replication or autonomous replication sequences. Such sequences are well known for a variety of bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication derived from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the origin of plasmid 2 μιη is suitable for yeast and several viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are useful for vectors of cloning into mammalian cells. In general the origin of replication component is not required for mammalian expression vectors (the SV40 origin can typically be used only because it contains the early promoter).

A maior parte dos vectores de expressão são vectores vai-vem, i.e., eles são capazes de se replicar em pelo menos uma clase de organismos mas podem ser usados para transfectar um outro organismo para expressão. Por exemplo, um vector é clonado em E. coli e depois o mesmo vector é transfectado para células de levedura ou de mamífero para expressão mesmo que não seja capaz de se replicar independentemente do cromossoma da célula hospedeira.Most expression vectors are shuttle vectors, i.e., they are capable of replicating in at least one class of organisms but can be used to transfect another organism for expression. For example, a vector is cloned into E. coli and then the same vector is transfected into yeast or mammalian cells for expression even though it is unable to replicate independently of the host cell's chromosome.

O DNA pode também ser amplificado por inserção no genoma hospedeiro. Isto é facilmente conseguido usando espécies de Bacillus como hospedeiros, por exemplo, rDNA can also be amplified by insertion into the host genome. This is easily accomplished by using Bacillus species as hosts, for example, r

118 incluindo no vector uma sequência de DNA que é complementar de uma sequência encontrada no DNA genómico de Baciluus. A transfecção de Bacillus com este vector resulta em recombinação homóloga com o genoma e inserção do DNA do ligando de mpl. No entanto, a recuperação do DNA genómico codificador do ligando de mpl é mais complexa do que a de um vector replicado exogenamnete pois a digestão com enzimas de restrição é necessária para remover o DNA do ligando de mpl.118 including in the vector a DNA sequence that is complementary to a sequence found in Baciluus genomic DNA. Transfection of Bacillus with this vector results in homologous recombination with the genome and insertion of mpl ligand DNA. However, the recovery of the genomic DNA encoding the mpl ligand is more complex than that of an exogenously replicated vector because restriction enzyme digestion is necessary to remove the DNA from the mpl ligand.

(iii) Componente selecção de genes(iii) Gene selection component

Os vectores de clonagem e expressão deverão conter um gene de selecção, também designado uma marca seleccionável. Este gene codifica uma proteína necessária à sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas cultivadas num meio de cultura selectivo. As células hospedeiras não transformadas com o vector contendo o gene de selecção não sobreviverão no meio de cultura. Os gene s de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) deficiências auxotróficas de complemento ou (c) fornecimento de nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, e.g., o gene codificador da racemase de D-alanina para BacilliCloning and expression vectors should contain a selection gene, also called a selectable marker. This gene encodes a protein necessary for the survival or growth of transformed host cells grown in a selective culture medium. Host cells not transformed with the vector containing the selection gene will not survive in the culture medium. Typical selection s genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, eg, ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) complement auxotrophic deficiencies or (c) supply of critical nutrients not available from complex media, eg, the gene encoding the D-alanine racemase for Bacilli

Um exemplo de um esquema de selecção utiliza uma droga para parar o crescimento de uma célula hospdeira. As células que são transformadas com êxito com um gene heterólogo expressam uma proteína que confere resistência a drogas e portanto sobrevive ao regime de selecção. Exemplos de tal selecção dominante usam drogas tais como neomicina (Southern et al. , J. Molec. Appl. Genet., 1.:327 (1982]) ácido micofenólico (Mulligan et al., Science, 209:1422 [1980]) ou higromicina Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 [1985]). Os três exemplos dados atrás empregam genes bacterianos sob o controle eucariótico para conferir resistência à droga rAn example of a selection scheme uses a drug to stop the growth of a host cell. Cells that are successfully transformed with a heterologous gene express a protein that confers resistance to drugs and therefore survives the selection regime. Examples of such a dominant selection use drugs such as neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1.:327 (1982]) mycophenolic acid (Mulligan et al., Science, 209: 1422 [1980]) or hygromycin Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 [1985]). The three examples given above employ bacterial genes under eukaryotic control to confer resistance to the drug r

119 apropriada G418 ou neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) ou higromicina respectivamente.119 appropriate G418 or neomycin (geneticin), xgpt (mycophenolic acid) or hygromycin respectively.

São exemplos de outras marcas seleccionáveis adequadas para células de mamífero as que permitem a identificação de células competentes para internalizarem o ácido nucleico do ligando de mpl, como seja redutase de di-hidrofolato (DHFR) ou timidina cinase. Os transformantes de células de mamífero são colocados sob pressão selectiva em que apenas os transformantes são estão adaptados a sobreviverem devido a terem incorporado a marca. A pressão selectiva é imposta cultivando os trnasformantes em condições tais que a concentração do agente de selecção no meio seja sucessivamente mudado, conduzindo assim à amplificação do gene de selecção e do DNA que codifica o polipeptídeo ligando de mpl. A amplificação é o processo pelo qual os genes mais necessários para a produção de uma proteína crítica para o crescimento sejam repetidos em tandem dentro dos cromossomas de gerações· sucessivas d ecélulas recombinantes. Quantidades cada vez maiores do ligando de mpl são sintetizadas a partir do gene amplificado.Examples of other selectable tags suitable for mammalian cells are those that allow the identification of cells competent to internalize the nucleic acid of the mpl ligand, such as dihydrofolate reductase (DHFR) or thymidine kinase. The mammalian cell transformants are placed under selective pressure where only the transformants are adapted to survive due to having incorporated the tag. Selective pressure is imposed by cultivating the transformants under conditions such that the concentration of the selection agent in the medium is successively changed, thus leading to the amplification of the selection gene and the DNA encoding the mpl ligand polypeptide. Amplification is the process by which the genes most needed for the production of a growth-critical protein are repeated in tandem within the chromosomes of successive generations of recombinant cells. Increasing amounts of the mpl ligand are synthesized from the amplified gene.

Por exemplo, as células transformadas com o gene de selecção DHFR são primeiro identificada pela cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contem metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira adequada quando DHFR selvagem é empregue é a linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em actividade de DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 [1980]. As células transformadas são então expostas a níveis crescentes de Mtx. Isto conduz à síntese de múltiplas cópias do gene DHFR e concomitantemente a múltiplas cópias de outro DNA compreendendo os vectores de expressão, como seja o DNA codificador do ligando de mpl. Esta técnica de amplificação pode ser usada com qualquer hospedeiro adequado, e.g.. ATCC Na CCL61 CHO-K1, que não suporta a presença de DHFR endógeno rFor example, cells transformed with the DHFR selection gene are first identified by culturing all transformants in a culture medium that contains methotrexate (Mtx), a competitive DHFR antagonist. A suitable host cell when wild DHFR is employed is the Chinese hamster ovary (CHO) cell line deficient in DHFR activity, prepared and propagated as described by Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Know. USA, 77: 4216 [1980]. The transformed cells are then exposed to increasing levels of Mtx. This leads to the synthesis of multiple copies of the DHFR gene and concurrently with multiple copies of another DNA comprising the expression vectors, such as the DNA encoding the mpl ligand. This amplification technique can be used with any suitable host, e.g. ATCC Na CCL61 CHO-K1, which does not support the presence of endogenous DHFR r

se por exemplo um gene DHFR mutante que é ligeiramente resistente ao Mtx fõr empregue (EP 117,060). Como alternativa, as células hospedeiras [particularmente hospedeiros tipo selvagem que contêm DHFR endógeno] transformadas ou cotransformadas com sequências de DNA codificadoras do ligando de mpl. proteína DHFR selvagem e outra marca seleccionável como seja 3' fosfotransferase de aminoglicósido (APH) podem ser seleccionadas por crescimento em meio contendo um agente de selecção para uma marca seleccionável como seja um antibiótico aminoglicósido, e. q. . canamicina, neomicina ou G418, Ver Patente U.S. N2 4,965,199.if for example a mutant DHFR gene which is slightly resistant to Mtx has been employed (EP 117,060). Alternatively, host cells [particularly wild-type hosts that contain endogenous DHFR] transformed or cotransformed with DNA sequences encoding the mpl ligand. wild-type DHFR protein and another selectable tag such as 3 'aminoglycoside phosphotransferase (APH) can be selected by growth on medium containing a selection agent for a selectable tag such as an aminoglycoside antibiotic, e.g. q. . kanamycin, neomycin or G418, See U.S. Patent No. 4,965,199.

Um gene de selecção adequado para usar em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al.. Nature, 282:39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7:141 [1979]; ou Tschemper et al, Gene, 10:157 [1980]). 0 gene trpl proporciona uma marca de selecção para uma estirpe mutante de levedura que não possui a capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N2 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). A presença da lesão do trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para a detecção da transformação por crescimento na ausência de triptofano. De forma semelhante, estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC N2 20,622 ou 38,626) são complemntadas por plasmídeos conhecidos portadores do gene Leu2.A suitable selection gene for use in yeast is the trpl gene present in the yeast plasmid YRp7 (Stinchcomb et al .. Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7: 141 [1979]; or Tschemper et al, Gene, 10: 157 [1980]). The trpl gene provides a check mark for a mutant yeast strain that lacks the ability to grow on tryptophan, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). The presence of the trpl lesion in the yeast host cell genome then provides an effective environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan. Similarly, Leu2-deficient yeast strains (ATCC No. 20,622 or 38,626) are complemented by known plasmids carrying the Leu2 gene.

(iv) Componente promotor(iv) Promoting component

Os vectores de expressão e clonagem geralmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operacionalemnte ligado ao ácido nucleico do ligando de mpl. Os promotores são sequências não traduzidas situada sa montante (5') do codão de iniciação d eum gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcriçaõ e tradução de uma sequência de ácido nucleico particular, como seja a sequência do ácido nucleico rExpression and cloning vectors generally contain a promoter that is recognized by the host organism and is operably linked to the nucleic acid of the mpl ligand. Promoters are untranslated sequences located upstream (5 ') of the start codon of a structural gene (usually within about 100 to 1000 bp) that control the transcription and translation of a particular nucleic acid sequence, such as the sequence nucleic acid r

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do ligando de mpl, à qual estão operacionalmente ligados. Tais promotores tipicamente caem em duas classes, indzíveis e constitutivos. Os promotores induzíveis são promotores iniciam níveis aumentados de transcrição a partir de DNA o seu controle como resposta a algumas condições de cultura, e.g., a nutriente ou uma alteração na conhecido um grande número de uma variedade alterações ausência de que sob das presença ou temperatura.of the mpl ligand, to which they are operationally linked. Such promoters typically fall into two classes, indecisive and constitutive. Inducible promoters are promoters that initiate increased levels of transcription from their control DNA in response to some culture conditions, e.g., the nutrient or a change in the known a large number of a variety changes in the absence of under the presence or temperature.

promotores reconhecidos por células hospdeiras. Estes ligados ao DNA codificador i promotor do restrição e inserindo no vector promotor isolada. Tanto a sequência nativa muitos promotores heterólogos podem a amplificação e/ou expressão do DNA entanto, os promotores que geralmente permitem umpromoters recognized by host cells. These linked to the restriction promoter DNA encoding and inserting into the isolated promoter vector. Both the native sequence and many heterologous promoters can amplify and / or express DNA however, the promoters that generally allow a

Nesta altura é promotores do ligando enzimas de são de de potenciais operacionalmente mpl removendo oAt this point it is promoters of the ligand enzymes that are potentially operationally removing mpl

DNA fonte a sequência do promotor heterólogos maior com do do ser do são transcriexpresso compaligando de mpl como usados para dirigir ligando de mpl. No preferidos, uma vez ção e maiores rendimentos do ligando de mpl rado com o promotor do ligando de mpl nativo.Source DNA is the sequence of the largest heterologous promoter with the transcribed expression being composed of mpl as used to direct mpl ligand. Not preferred, once tion and higher yields of the amplified ligand with the native mpl ligand promoter.

Promotores adequados para usar com hospedeiros procarióticos incluem os e sistemas de promotores da β-lactamase e da lactose (Chang et al.. Nature, 275:615 [1978]; e Goeddel et al. Nature, 285:544 [1979]), fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] e EP 36,776) e promotores híbridos tais como o promotor tac (de Boer et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 [1983]). No entanto, são adequados outros promotores bacterianos conhecidos. As suas sequências de nucleótidos forma publicadas, permitindo assim a alguém familiarizado com a área ligá-los operacionalmente ao DNA codificador do ligando de mpl (Siebenlist et al., Cell, £():269 [1980]) usando adaptadores para se conseguir quaisquer sítios de restrição necessários. Os promotores para usar em sistemas bacterianos têm de conter uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operacionalmente ao DNA codificador do polipeptídeo do ligando de mpl.Promoters suitable for use with prokaryotic hosts include β-lactamase and lactose promoter systems (Chang et al. Nature, 275: 615 [1978]; and Goeddel et al. Nature, 285: 544 [1979]), alkaline phosphatase, a tryptophan (trp) promoter system (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980] and EP 36,776) and hybrid promoters such as the tac promoter (de Boer et al. Proc. Natl. Acad. Sei USA, 80: 21-25 [1983]). However, other known bacterial promoters are suitable. Their nucleotide sequences were published, thus allowing someone familiar with the field to operationally link them to the DNA encoding the mpl ligand (Siebenlist et al., Cell, £ (): 269 [1980]) using adapters to achieve any required restriction sites. Promoters for use in bacterial systems must contain a Shine-Dalgarno (S.D.) sequence operably linked to the DNA encoding the mpl ligand polypeptide.

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As sequências dos promotores de eucariotas são conhecidas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em A-T situada aproximadamente 25 a 30 pares de bases a montante do sítio onde é iniciada a transcrição. Uma outra sequência encontrada 70 a 80 pares de bases a montante do sítio de iniciação da transcrição de muitos genes é uma região CXCAAT onde X pode ser qualquer nucleótido. No extremo 3' da maior parte dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A ao extremo 3' da sequência codificadora. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vectores de . ··' expressão eucarióticos.The sequences of eukaryotic promoters are known. Virtually all eukaryotic genes have an A-T-rich region located approximately 25 to 30 base pairs upstream from the site where transcription is initiated. Another sequence found 70 to 80 base pairs upstream from the transcription initiation site of many genes is a CXCAAT region where X can be any nucleotide. At the 3 'end of most eukaryotic genes is an AATAAA sequence which may be the signal for the addition of the poly A tail to the 3' end of the coding sequence. All of these sequences are properly inserted into vectors of. ·· 'eukaryotic expression.

Exemplos de sequências de promotores eucarióticos adequados para usar em hospedeiros tipo levedura incluem os promotores da cinase de 3-fosfoglicerato (Hitzeman et al., J. Biol Chem., 255:2073 [1980]) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al. Adv. Enzyme Reg., 7:149 [1968]; e Holland, Biochemistry, £7:4900 [1978]), como sejam a enolase, desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato, hexocinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutocinase, isomerase de glucose-6-fosfato, mutase de 3-fosfoglicerato, cinase de piruvato, isomerase de triosefosfato, isomerase de fosfoglucose e ; glucocinase.Examples of eukaryotic promoter sequences suitable for use in yeast-like hosts include 3-phosphoglycerate kinase promoters (Hitzeman et al., J. Biol Chem., 255: 2073 [1980]) or other glycolytic enzymes (Hess et al. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; and Holland, Biochemistry, £ 7: 4900 [1978]), such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate-decarboxylase, phosphofrutocinase, isomerase glucose-6-phosphate, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosphosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and; glucokinase.

Outros promotores de leveduras, os quais são promotores induzíveis tendo a vantagem adicional da transcrição ser controlada por condições de crescimento são as > regiões dos promotores da desidrogenase 2 do álcool, isocitocrómio C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneina, desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose. Vactores e promotores adequados para usar na expressão emn leveduras estão ainda descritos em Hitzeman et al., EP 73,657A. Os potenciadores de levedura são também vantajosamente usados com promotores de levedura.Other yeast promoters, which are inducible promoters having the additional advantage that transcription is controlled by growth conditions are the> regions of the promoters of alcohol dehydrogenase 2, isocytochromium C, acid phosphatase, degradation enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein , glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and enzymes responsible for the use of maltose and galactose. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in Hitzeman et al., EP 73,657A. Yeast enhancers are also advantageously used with yeast promoters.

rr

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A transcrição do ligando de mpl a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada por exemplo por promotores obtidos a partir de genomas de vírus tais como polioma, vírus da varíola de avea de capoeira (fowlpox) (UK 2,211,504 publicado em 5 de Julho de 1989), adenovírus (como seja o adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite C e mais preferencialmente Vírus Símio 40 (SB40), de promotores heterólogos de mamíferos , e.g., o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, promotores de choque térmico e do promotor normalmente associado à sequência do ligando de mpl, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.Transcription of the mpl ligand from vectors in mammalian host cells is controlled for example by promoters obtained from virus genomes such as polyoma, poultry pox virus (fowlpox) (UK 2,211,504 published on 5 July 1989), adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, a retrovirus, hepatitis C virus and more preferably Simian Virus 40 (SB40), from heterologous mammalian promoters, eg, the actin promoter or an immunoglobulin promoter, heat shock promoters and the promoter normally associated with the sequence of the mpl ligand, as long as such promoters are compatible with host cell systems.

Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição do SV40 que também contem a origem de replicação virai. Fiers et al.. Nature, 273:113 [1978]; Mulligan e Berg, ScienceThe early and late promoters of the SV40 virus are conveniently obtained as a restriction fragment of the SV40 that also contains the origin of viral replication. Fiers et al .. Nature, 273: 113 [1978]; Mulligan and Berg, Science

209:1422-1427 [1980]; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78:7398-7402 [1981]. 0 promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Greenaway et al., Gene ·) 18:355-360 [1982]. Um sistema para a expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus do papiloma bovino como vector está descrito na Patente US N2 4,419,446. Uma modificação deste sistema está descrita na Patente U.S. N2 4,601,978. ver também Gray et al.. Nature, 295:503-508 > [1982] na expressão de cDNA codificador de interferão imune em células de macaco; Reyes et al., Nature, 297:598-60 [1982] na expressão de cDNA de interferão B humano em células de murganho sob o controle de um promotor de cinase de timidina derivado do vírus herpes simplex; Canaani e209: 1422-1427 [1980]; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Know. USA, 78: 7398-7402 [1981]. The human cytomegalovirus immediate early promoter is conveniently obtained as a HindIII E. Greenaway et al., Gene ·) 18: 355-360 [1982] restriction fragment. A system for the expression of DNA in mammalian hosts using bovine papilloma virus as a vector is described in US Patent No. 4,419,446. A modification of this system is described in U.S. Patent No. 4,601,978. see also Gray et al .. Nature, 295: 503-508> [1982] in the expression of immune interferon encoding cDNA in monkey cells; Reyes et al., Nature, 297: 598-60 [1982] in the expression of human interferon B cDNA in mouse cells under the control of a thymidine kinase promoter derived from the herpes simplex virus; Canaani and

Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 29:5166-5170 [1982] sobnre a expressão do gene do interferão fll humano em células de murganho e de coelho em cultura; e Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:6777-6781 [1982] sobre a expressão rBerg, Proc. Natl. Acad. Know. USA, 29: 5166-5170 [1982] on the expression of the human F1 interferon gene in cultured mouse and rabbit cells; and Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Know. USA, 79: 6777-6781 [1982] on the expression r

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de sequências CAT em células de rim de macaco CV-1, fibroblastos de embrião de galinha, células do ovário de hamster chinês, células HeLa e células de murganho NIH-3T3 usando a repetição terminal maior do vírus do sarcoma de Rous como promotor.of CAT sequences in CV-1 monkey kidney cells, chicken embryo fibroblasts, Chinese hamster ovary cells, HeLa cells and NIH-3T3 mouse cells using the major terminal repeat of the Rous sarcoma virus as a promoter.

(v) Componente elemento potenciador(v) Enhancing element component

A transcrição de um DNA codificador do ligando de mpl deste invento por eucariotas superiores é muitas vezes aumentada pela inserção de uma equência potenciadora no vector. Os potenciadores são elementos do DNA que actuam em cis, geralmente entre cerca de 10 e 300 pb, que actuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Os res são independentes relativamente à orientação e tendo sido potenciadoposição, et al.,The transcription of a DNA encoding the mpl ligand of this invention by higher eukaryotes is often enhanced by the insertion of an enhancing equation into the vector. Enhancers are elements of DNA that act in cis, generally between about 10 and 300 bp, that act on a promoter to increase its transcription. Res are independent from the orientation and having been strengthened by the position, et al.,

Proc.Proc.

Natl.Natl.

aL·., unidade de encontrados potenciadores 5' (LaiminsaL ·., unit of found enhancers 5 '(Laimins

Acad. Sei USA, 78.:993 [1981]) e 3' (Lusky etAcad. I know USA, 78.:993 [1981]) and 3 '(Lusky et

Cell Biol., 3.:1108 [1983]) relativamente 'a transcrição, dentro de um intrão (Banerji et al.,Cell Biol., 3.:1108 [1983]) regarding 'transcription, within an intron (Banerji et al.,

Cell 33:729 [1983]), assim como dentro da própria sequência codificadora (Osborne et al., Mol. Cell Biol., 4:1293[1984]). São agora conhecidas muitas sequências potenciadoras derivadas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, usarCell 33: 729 [1983]), as well as within the coding sequence itself (Osborne et al., Mol. Cell Biol., 4: 1293 [1984]). Many enhancer sequences derived from mammalian genes are now known (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, using

-se-á um potenciador derivado de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o potenciador de SV40 na parte tardia da origem de replicação(pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 [1982] nos elementos potenciadores da activação dos promotores eucariótico. O potenciador pode ser inserido no vector numa posição 5' ou 3' relativamente à sequência codificadora do ligando de mpl, mas está preferencialmente situado num sítio 5' relativamente ao promotor.there will be an enhancer derived from a eukaryotic cell virus. Examples include the SV40 enhancer in the late part of the origin of replication (bp 100-270), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the origin of replication and adenovirus enhancers. See also Yaniv, Nature 297: 17-18 [1982] in the elements that enhance the activation of eukaryotic promoters. The enhancer can be inserted into the vector at a position 5 'or 3' to the coding sequence for the mpl ligand, but is preferably located at a site 5 'to the promoter.

rr

125 (vi) Componente de terminação da transcrição125 (vi) Transcription termination component

Os vectores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (leveduras, fungos, insectos, plantas, animais, humanos ou células nucleadas derivadas de outros organismos multicelulares) também possuirão sequências necessárias à terminação da transcrição e à estabilização do mRNA. Tais sequências encontram-se normalmente nas regiões 5', e ocasionalmente 3', não traduzidas de DNAs eucarióticos ou virais ou cDNAs. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na fracção não traduzida do mRNA codificador do ligando de mpl (vii) Construção e análise de vectoresExpression vectors used in eukaryotic host cells (yeasts, fungi, insects, plants, animals, humans or nucleated cells derived from other multicellular organisms) will also have sequences necessary for termination of transcription and stabilization of mRNA. Such sequences are normally found in the 5 ', and occasionally 3' regions, untranslated from eukaryotic or viral DNAs or cDNAs. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated fraction of the mpl ligand encoding mpl (vii) Vector construction and analysis

A construção de vectores adequados contendo um ou mais dos componentes referidos atrás emprega técnicas de ligação convencionais. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de DNA são cortados, moldados e religados na forma pretendida para gerar os plasmídeos necessários.The construction of suitable vectors containing one or more of the aforementioned components employs conventional ligation techniques. Isolated plasmids or fragments of DNA are cut, shaped and reconnected in the desired way to generate the necessary plasmids.

Para análise de confirmação das sequências correctas nos plasmídeos construídos, as misturas de ligação são usadas para transformar E. coli K12 estirpe 294 (ATCC N2 31446) e os transformantes obtidos seleccionados por resistência à ampicilina ou tetraciclina sempre que adequado. Os plasmídeos dos transformantes são preparados, analisados por digestão com endonucleases de restrição e/ou sequenciados pelo método de Messing et a 1., Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] ou pelo método de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65.:499 [1980].For confirmatory analysis of the correct sequences in the constructed plasmids, ligation mixtures are used to transform E. coli K12 strain 294 (ATCC No. 31446) and the obtained transformants selected for ampicillin or tetracycline resistance where appropriate. Plasmids from transformants are prepared, analyzed by restriction endonuclease digestion and / or sequenced by the method of Messing et a 1., Nucleic Acids Res., 9: 309 [1981] or by the method of Maxam et al., Methods in Enzymology , 65.:499 [1980].

(viii) Vectores de expressão transitória(viii) Transient expression vectors

Na realização deste invento são particularmente úteis os vectores de expressão que proporcionam a expressão transitória em células de mamífero do DNA codificador do rIn carrying out this invention, expression vectors that provide transient expression in mammalian cells of the DNA encoding the r are particularly useful.

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polipeptídeo ligando de mpl. Em geral, a expressão transitória envolve a utilização de um vector de expressão que é cpaz de se replicar eficazmente numa célula hospedeira, de forma que a célula hospedeira acumule muitas cópias do vector de expressão e por sua vez sintetize níveis elevados de um polipeptídeo pretendido codificado pelo vector de expressão. Sambrook et al., supra. pp 16.17-16.22. Os sistemas de expressão transitórios compreendem um vector de expressão adequado e uma célula hospedeira, permitem a identificação positiva adequada dos polipeptídeos codificados pelos DNAs clonados, assim como o despiste rápido de tais polipeptídos relativamente ãs propriedades biológicas ou fisiológicas pretendidas. Assim, os sistemas de expressão transitórios são particularmente úteis no invento para identificar análogos e variantes do ligando de mpl que possuam actividade biológica do polipeptídeo ligando de mpl (ix) Exemplos de vectores adequados para células de vertebradosmpl. ligand polypeptide. In general, transient expression involves the use of an expression vector that is capable of replicating effectively in a host cell, so that the host cell accumulates many copies of the expression vector and in turn synthesizes high levels of a desired encoded polypeptide by the expression vector. Sambrook et al., Supra. pp 16.17-16.22. The transient expression systems comprise a suitable expression vector and a host cell, allow adequate positive identification of the polypeptides encoded by the cloned DNAs, as well as the rapid screening of such polypeptides in relation to the intended biological or physiological properties. Thus, transient expression systems are particularly useful in the invention to identify mpl ligand analogs and variants that have biological activity of the mpl ligand polypeptide (ix) Examples of suitable vectors for vertebrate cells

Outros métodos, vectores e células hospedeiras adequadas à adaptação à síntese do ligando de mpl em culturas de células de vertebrados recombinantes estão descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 [1981]; Mantei et al., Nature, 281:40-46 [1979]; Levinson et al., EP 117,060; e EP 117,058. Um plasmídeo particularmente útil para a expressão em culturas de células de mamífero do ligando de mpl é pRK5 (EP 307,247, patente U.S. n= 5,258,287) ou pSVI6B J (Publicação PCT N2 91/08291).Other methods, vectors and host cells suitable for adaptation to mpl ligand synthesis in recombinant vertebrate cell cultures are described in Gething et al., Nature, 293: 620-625 [1981]; Mantei et al., Nature, 281: 40-46 [1979]; Levinson et al., EP 117,060; and EP 117,058. A particularly useful plasmid for expression in mammalian cell cultures of the mpl ligand is pRK5 (EP 307,247, U.S. patent n = 5,258,287) or pSVI6B J (PCT Publication No. 91/08291).

D. Selecção e transformação de células hospedeirasD. Selection and transformation of host cells

Células hospedeiras adequadas à clonagem ou expressão dos vectores aqui descritos são as procriotas, leveduras ou células de eucariotas superiores descritas acima. Os procariotas adequados incluem eubactérias, tais como organismos Gram-positivos ou Gram-negativos, por rHost cells suitable for cloning or expressing the vectors described herein are the procriotes, yeasts or higher eukaryotic cells described above. Suitable prokaryotes include eubacteria, such as Gram-positive or Gram-negative organisms, for example.

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exemplo, E. coli, Bacilli tais como B. subtilis, espécies de Pseudomonas tais como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium ou Serratia marcescans. Um hospedeiro preferido para clonagem em E. coli é E. coli 294 (ATCC N2 31,446) se bem que sejam adequadas outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC N2 31,537) e E. coli W3110 (ATCC N2 27,325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. De preferência a célula hospedeira deverá secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Como alternativa, são adequados métodos in vitro de clonagem, e.g., PCR ou outras reacções com polimerases de ácidos nucleicos.for example, E. coli, Bacilli such as B. subtilis, Pseudomonas species such as P. aeruginosa, Salmonella typhimurium or Serratia marcescans. A preferred host for E. coli cloning is E. coli 294 (ATCC No. 24,446) although other strains such as E. coli B, E. coli X1776 (ATCC No. 31,537) and E. coli W3110 (ATCC No. 2 are suitable) 27,325). These examples are illustrative and not limiting. Preferably, the host cell should secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. Alternatively, in vitro cloning methods, e.g., PCR or other reactions with nucleic acid polymerases, are suitable.

Para além dos procariotas, são também hospedeiros adequados aos vectores de codificadores do ligando de mpl. microorganismos eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras.Saccharomyces cerevisiae, ou vulgar levedura de padeiro, é o mais usado dos microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, existe uma série de outros géneros, espécies e estirpes que aqui são úteis, como seja Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139,383 publicado em 2 de Maio 1985), hospedeiros Kluyveromyces (Patente U.S. N2 4,943,529) como seja e.g. K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 Γ19831. K fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans e K. marxianus [EP 402,226], Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et a 1. , J. Basic Microbiol., 28:265-278 [ 1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Case et a 1. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:5259-5263 [1979]) e fungos filamentosos tais como e.g., Neurospora. Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de Janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]).In addition to prokaryotes, they are also suitable hosts for vectors encoding the mpl ligand. eukaryotic microorganisms such as filamentous fungi or yeasts. Saccharomyces cerevisiae, or common baker's yeast, is the most widely used of the lower eukaryotic host microorganisms. However, there are a number of other genera, species and strains that are useful here, such as Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published on May 2, 1985), Kluyveromyces hosts (Patent US No. 4,943,529) such as eg K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 Γ19831. K fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans and K. marxianus [EP 402,226], Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et a 1., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Case et a 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]) and filamentous fungi such as, eg, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 published 10 January 1991) and Aspergillus hosts such as A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al .. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and A. niger (Kelly and Hyne s, EMBO J., 4: 475-479 [1985]).

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Células hospedeiras adequadas à expressão do ligando de mpl glicosilado derivam de organismos multicelulares. Tais células hospedeiras são capazes de fazer um processamento complexo e de actividades de glicosilação. Em princípio, qualquer cultura de células eucariotas superiores pode ser usado, quer seja um cultura de vertebrados como de invertebrados. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insectos. Foram identificados numerosoas estirpes de baculovírus e variantes e correspondentes células hospedeiras de insectos permissivas derivadas de hospedeiros tais como Spodoptera fruqiperda (lagarta), Aedes aeqypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Ver e.g., Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 [1988] ; Miller et al., Genetic Engineering, Stlow' et al. , eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; e Maeda et al. , Nature, 315:592-594 [1985]. Uma variedade de estirpes virais para a transfecção existem disponíveis, e.g., a variante L-l de Autoqrapha californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV e tais vírus podem ser usados podem ser usados neste caso de acordo com o presente invento, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera fruqiperda.Host cells suitable for expression of the glycosylated mpl ligand are derived from multicellular organisms. Such host cells are capable of complex processing and glycosylation activities. In principle, any higher eukaryotic cell culture can be used, whether it is a vertebrate or invertebrate culture. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus strains and variants and corresponding permissive insect host cells derived from hosts have been identified such as Spodoptera fruqiperda (caterpillar), Aedes aeqypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruit fly) and Bombyx mori. See e.g., Luckow et al., Bio / Technology, 6: 47-55 [1988]; Miller et al., Genetic Engineering, Stlow 'et al. , eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; and Maeda et al. , Nature, 315: 592-594 [1985]. A variety of viral strains for transfection are available, eg, the Ll variant of Autoqrapha californica NPV and the Bombyx mori NPV strain Bm-5 and such viruses can be used can be used in this case according to the present invention, particularly for transfection of Spodoptera fruqiperda cells.

Também podem ser utilizados como hospdeiros as culutras de células vegetais do algodoeiro, batateira, soja, petunia, tomateiro e tabaco. Tipicamente as células vegetais são transfectadas por inoculação com certas estirpes da bactéria Agrobacterium tumefaciens, a qual foi previamente manipulada para conter o DNA do ligando de mpl. Durante a incubação da cultura de células vegetais com A. tumefaciens, o DNA codificador do ligando de mpl é transferido para a célula hospdeira de forma a que esta seja transfectada e em condições adequadas expressará o DNA do ligando de mpl. Ainda, existem sequências reguladoras e sinal compatíveis com células vegetais, como seja o promotor da sintetase de nopalina e as sequências sinal de poliadenilação. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 [1982]. Adicionalmente, osThe breeds of plant cells from cotton, potato, soy, petunia, tomato and tobacco can also be used as hospdeiros. Typically plant cells are transfected by inoculation with certain strains of the bacterium Agrobacterium tumefaciens, which has previously been engineered to contain the DNA of the mpl ligand. During the incubation of the plant cell culture with A. tumefaciens, the DNA encoding the mpl ligand is transferred to the host cell so that it is transfected and under appropriate conditions will express the DNA of the mpl ligand. In addition, there are regulatory and signal sequences compatible with plant cells, such as the nopaline synthase promoter and the polyadenylation signal sequences. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 [1982]. Additionally,

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segmentos de DNA isoaldos a partir da região a montante do gene 780 do T-DNA são capazes de activar ou aumentar os níveis de transcrição de genes expressáveis em plantas em tecidos vegetais contendo DNA recombinante. EP 321,196 publicado em 21 de Junho de 1989.isoaldos DNA segments from the region upstream of the T80 DNA 780 gene are capable of activating or increasing the transcription levels of plant-expressable genes in plant tissues containing recombinant DNA. EP 321,196 published on June 21, 1989.

No entanto, o interesse foi maior em células de vertebrados e a propagação das células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um processo de rotina nos últimos anos (Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Patterson, editores [1973]). São exemplos de linhas de células hospdeiras de mamíferos a linha CV1 de rim de macaco transformada pelo SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em culturas em suspensão, Graham et al.. J. Gen. Virol., .36:59 [1977]); células de rim de hamster bébé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 [1980]); células sertoli de murganho (TM4, Mather, Biol. Reprod. , 23:243-251 [1980]); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de murganho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383:44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2) .However, interest was greater in vertebrate cells and the propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine process in recent years (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors [1973] ). Examples of mammalian host cell lines are the monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney line (293 cells or 293 cells subcloned for growth in suspension cultures, Graham et al .. J. Gen. Virol., .36: 59 [1977]); baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary / DHFR cells (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); mouse sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); MRC 5 cells; FS4 cells; and a human hepatoma line (Hep G2).

As células hospedeiras são transfectadas e preferencialmente transformadas com os vectores de expressão ou clonagem atrás descritos deste invento e cultivadas em meios nutritivos convencionais conforme adequado ã indução dos promotores, selecção de transformantes ou amplificação de genes codificadores das sequências pretendidas.The host cells are transfected and preferably transformed with the expression or cloning vectors described above of this invention and cultured in conventional nutrient media as appropriate to the induction of promoters, selection of transformants or amplification of genes encoding the desired sequences.

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Transfecção refere-se à captura de um vector de expressão por uma célula hospedeira quer quaisquer sequências sejam expressas ou não. São conhecidos numerosos métodos de transfecção, por exemplo, CaPO₄ e electroporação. Uma transfecção com êxito é reconhecida quando qualquer indicação do funcionamento deste vector ocorre na célula j hospedeira.Transfection refers to the capture of an expression vector by a host cell whether or not any sequences are expressed. Numerous methods of transfection are known, for example, CaPO ₄ and electroporation. A successful transfection is recognized when any indication of the functioning of this vector occurs in the host cell.

Transformação significa introdução de DNA num organismo de forma a que o DNA seja replicável, quer seja como elemento extracromossómico quer seja como parte inte. ¹ grante do cromossoma. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita usando técnicas convencionais adequadas a tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, conforme descrito na secção 1.82 de Sambrook et al., supra é geralmente usada para procariotas ou outras células que contêm substanciais barreiras de parede celular. A infecção com Aqrobacterium tumefaciens é usada na transformação de certas células vegetais, conforme descrito por Shaw et al. , Gene, .23.:315 [1983] e WO 89/05859 publicado em 29 de Junho de 1989. Ainda, as plantas podem ser transfectadas usando o tratamento com ultrassons como descrito em WO 91/00358 publicado em 10 de Janeiro de 1991. Para as células de mamífero sem tais paredes celulares, o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52.:456-457 [1978] é preferido. Os aspectos gerais das transformações nos sistemas hospedeiros de células de mamífero foram descritos por Axel em Patente U.S.Transformation means introducing DNA into an organism so that DNA is replicable, either as an extrachromosomal element or as an integral part. ¹ chromosome layer. Depending on the host cell used, transformation is done using conventional techniques suitable for such cells. Calcium treatment using calcium chloride, as described in section 1.82 of Sambrook et al., Supra is generally used for prokaryotes or other cells that contain substantial cell wall barriers. Infection with Aqrobacterium tumefaciens is used to transform certain plant cells, as described by Shaw et al. , Gene, .23.: 315 [1983] and WO 89/05859 published on June 29, 1989. In addition, plants can be transfected using ultrasound treatment as described in WO 91/00358 published on January 10, 1991 For mammalian cells without such cell walls, the Graham and van der Eb calcium phosphate precipitation method, Virology, 52.:456-457 [1978] is preferred. The general aspects of transformations in mammalian cell host systems have been described by Axel in US Patent

J N2 4,399,216 publicado em 16 de Agosto de 1983. As transformações em leveduras são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 [1977] e Hsiao et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76:3829 [1979].J N2 4,399,216 published on August 16, 1983. Yeast transformations are typically performed according to the method of Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 [1977] and Hsiao et al .. Proc. Natl. Acad. Know. (USA), 76: 3829 [1979].

No entanto, outros métodos para a introdução de DNA em células como seja por injecção nuclear, electroporação ou fusão de protoplastos podem também ser usado.However, other methods for introducing DNA into cells such as by nuclear injection, electroporation or protoplast fusion can also be used.

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E. Cultura das células hospedeirasE. Host cell culture

As células procarióticas usadas para produzir o polipeptídeo ligando de mpl deste invento são cultivadas em meios adequados como descrito de uma forma geral por Sambrook et al. , supra.The prokaryotic cells used to produce the mpl ligand polypeptide of this invention are cultured in suitable media as generally described by Sambrook et al. , supra.

As células hospedeiras de mamíferos usadas para produzir o ligando de mpl deste invento podem ser cultivadas numa variedade de meios. Os meios disponíveis comercialmente tais como Ham's FIO (Sigma), Meio Mínimo Essencial ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificação de Dulbecco ([DMEM], Sigma) são adequados à cultura das células hospedeiras. Em adição, qualquer um dos meios descritos em Ham e Wallace, Meths. Enz. , 58:44 [1979], Barnes e Sato,The mammalian host cells used to produce the mpl ligand of this invention can be grown in a variety of media. Commercially available media such as Ham's FIO (Sigma), Minimum Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) and Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) are suitable for host cell culture . In addition, any of the means described in Ham and Wallace, Meths. Enz. , 58:44 [1979], Barnes and Sato,

Anal. Biochem., 102:255 [1980], Patente U.S. N2 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; ou 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; Pente U.S. Ref. 30,985; ou U.S.S.N. copendente 07/592,107 ouAnal. Biochem., 102: 255 [1980], U.S. Patent No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; or 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S. Comb Ref. 30,985; or U.S.S.N. copending 07 / 592,107 or

07/592,141 ambas entregues, em 3 de Outubro de divulgações das quais são aqui incluídas como podem ser usados como meios de cultura para hospedeiras. Qualquer um destes meios podem ser dos conforme necessário com hormonas e/ou07 / 592,141 both delivered, on October 3, of disclosures of which are included here how they can be used as culture media for hostesses. Any of these means can be used as needed with hormones and / or

1990, as referência, as células suplementafactores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico) , sais (como seja cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como seja HEPES), nucleósidos (como sejam adenosina ou timidina), antibióticos (tais como Gentamycin), micronutrientes (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas que serão conhecidas dos familiarizados com a matéria. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e simulares, são os anteriormente usados com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão óbvios para os entendidos na matéria.1990, references, supplemental growth factor cells (such as insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers (such as HEPES), nucleosides (such as adenosine or thymidine), antibiotics (such as Gentamycin), micronutrients (defined as inorganic compounds generally present in final concentrations in the micromolar range) and glucose or an equivalent energy source. Any other necessary supplements can also be included in appropriate concentrations that will be known to those of skill in the art. Culture conditions, such as temperature, pH and simulation, are those previously used with the host cell selected for expression and will be obvious to those skilled in the art.

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As células hospdeiras referidas nesta divulgação englobam células em cultura in vitro assim como células que estão dentro de um animal hospedeiro.The host cells referred to in this disclosure encompass cells in vitro culture as well as cells that are within a host animal.

F. Detecção da amplificação/expressão de genes λ A amplificação e/ou expressão de genes pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, por transferência Southern convencional, transferência northern para quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad.F. Detection of gene amplification / expression λ Gene amplification and / or expression can be measured in a sample directly, for example, by conventional Southern blotting, northern blotting to quantify mRNA transcription (Thomas, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 7]7:5201-5205 [1980]), transferência de pontosKnow. USA, 7] 7: 5201-5205 [1980]), transfer of points

Z (análise de DNA) ou hibridação in situ, usando uma sonda adequadamente marcada, baseado nas sequências aqui descritas. Podem ser empregues várias marcas, mais normalmente 3 2 isotopos radioactivos, particularmente P. No entanto, podem também ser empregues outras técnicas, tais como usando nucleótidos modificados com biotina para a introdução num polinucleótidos. A biotina serve então como sítio de ligação a avidina ou a anticorpos, . os quais podem ser marcados com uma larga variedade de marcas, tais como radionuclidos, marcas fluorescentes, enzimas ou similares. Como alternativa, podem ser empregues anticorpos que reconhecem duplas hélices específicas, incluindo duplexes de DNA, duplexes de J RNA e duplexes híbridos de DNA-RNA ou duplexes de DNA-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado onde o duplex está ligado a uma superfície, de forma que quando da formação do duplex na superfície, a presença do anticorpo ligado ao duplex possa } ser detectada.Z (DNA analysis) or in situ hybridization, using a suitably labeled probe, based on the sequences described here. Various tags can be employed, more usually 32 radioactive isotopes, particularly P. However, other techniques can also be employed, such as using biotin-modified nucleotides for introduction into a polynucleotide. The biotin then serves as a binding site for avidin or antibodies,. which can be labeled with a wide variety of labels, such as radionuclides, fluorescent labels, enzymes or the like. Alternatively, antibodies that recognize specific double helices, including DNA duplexes, J RNA duplexes and hybrid DNA-RNA duplexes or DNA-protein duplexes, may be employed. The antibodies in turn can be labeled and the assay can be performed where the duplex is attached to a surface, so that when the duplex is formed on the surface, the presence of the antibody attached to the duplex can be detected.

A expressão de genes, como alternativa, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de secções de tecidos e ensaio da cultura celular ou fluidos do corpo, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Com técnicas de coloração imuno-histoquímica, prepara-se uma amostra de células, tipicamente por desidratação e fixação, seguido de reacção rThe expression of genes, as an alternative, can be measured by immunological methods, such as immunohistochemical staining of tissue sections and assaying cell culture or body fluids, to directly quantify the expression of the gene product. With immunohistochemical staining techniques, a sample of cells is prepared, typically by dehydration and fixation, followed by r

com anticorpos marcados específicos para o produto do gene acoplado, em que as marcas são geralmente detectadas visualmente, como sejam marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas luminescentes e similares. Uma técnica de coloração particularmente sensível adequada à utilização no presente invento está descrita por Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 [1980].with labeled antibodies specific for the coupled gene product, where the tags are usually detected visually, such as enzyme tags, fluorescent tags, luminescent tags and the like. A particularly sensitive staining technique suitable for use in the present invention is described by Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 [1980].

Anticorpos úteis na coloraçao imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos da amostra podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipeptideo ligando de mpl nativo ou contra um peptídeo sintético baseado nas sequências de DNA aqui proporcionadas conforme descrito mais abaixo.Antibodies useful in immunohistochemical staining and / or assay of sample fluids can be monoclonal or polyclonal and can be prepared in any mammal. Conveniently, antibodies can be prepared against a native mpl ligand polypeptide or against a synthetic peptide based on the DNA sequences provided herein as described further below.

G. Purificação do polipeptideo ligando de mpl ligando de mpl preferencialmente é recuperado do meio de cultura como um polipeptideo secretado, se bem que também possa ser recuperado a partir de lisados da célula hospedeira quando expresso directamente sem um sinal de secreção.G. Purification of the mpl ligand polypeptide mpl ligand is preferably recovered from the culture medium as a secreted polypeptide, although it can also be recovered from host cell lysates when expressed directly without a secretion signal.

Quando o ligando de mpl é expresso numa célula recombinante que não seja de origem humana, o ligando de mpl está completamente livre de proteínas ou polipeptídeos de origem humana. No entanto, é geralmente necessário purificar o ligando de mpl para remover outras proteínas ou polipeptídeos das células recombinantes para se obter preparações que são substancialmente homogéneas relativamente ao ligando de mpl per se. Como um primeiro passo, o meio de cultura ou lisado é centrifugado para remover detritos celulares. A membrana e fracções proteicas solúveis são então separadas. Como alternativa, pode ser usado um filtro de concentração de proteínas comercial (e.q., unidades de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon). O ligando de mpl pode serWhen the mpl ligand is expressed in a recombinant cell that is not of human origin, the mpl ligand is completely free of proteins or polypeptides of human origin. However, it is generally necessary to purify the mpl ligand to remove other proteins or polypeptides from the recombinant cells to obtain preparations that are substantially homogeneous with the mpl ligand per se. As a first step, the culture medium or lysate is centrifuged to remove cell debris. The membrane and soluble protein fractions are then separated. As an alternative, a commercial protein concentration filter (e.g., Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration units) can be used. The mpl ligand can be

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então purificado a partir da fracção proteica solúvel e a partir da fracção membranar do lisado da cultura , dependendo se o ligando de mpl está ou não ligado à membrana. O ligando de mpl é em seguida purificado das proteínas e polipeptídeos solúveis contaminantes removendo o sal e por processos de permuta ou cromatográficos empregando várias matrizes de gel. Estas matrizes incluem acrilamida, agarose, dextrano, celulose e outros normalmente empregues na purificação de proteínas. Exemplos de processos cromatográficos adequados à purificação de proteínas incluem; imunoafinidade (e.g., Mab anti-ligando de mpl), afinidade para receptores (e.g., mpl-IgG ou proteína A Sepharose), cromatográfia de interacção hidrófoba (HIC) (e.g., éter, butilo ou fenilo Toyopearl), cromatográfia com lectinas (e.g.. Con A-Sepharose, lectinas de lentilha-Sepharose), exclusão por tamamnho (e.g., Sephadex G-75), colunas de permuta catiónica ou aniónica (e.g., DEAE ou carboximeti1- e sulfopropil-celulose) e cromatográfia líquida de alta resolução de fase reversa (RP-HPLC) (ver e.g·. , Urdal et al. , J. Chromatog., 296:171 [1984] onde dois passos sequenciados de RP-HPLC são usados para purificar IL-2 humana recombinante). Outros passos de purificação facultativamente incluem: precipitação com etanol, precipitação com sulfato de amónio, cromatofocagem, SDS-PAGE preparativa e similares.then purified from the soluble protein fraction and from the membrane fraction of the culture lysate, depending on whether or not the mpl ligand is bound to the membrane. The mpl ligand is then purified from contaminating soluble proteins and polypeptides by removing the salt and by exchange or chromatographic processes employing various gel matrices. These matrices include acrylamide, agarose, dextran, cellulose and others commonly employed in protein purification. Examples of chromatographic processes suitable for protein purification include; immunoaffinity (eg, Mab anti-mpl ligand), receptor affinity (eg, mpl-IgG or protein A Sepharose), hydrophobic interaction chromatography (HIC) (eg, ether, butyl or Toyopearl phenyl), chromatography with lectins (eg Con A-Sepharose, lentil-Sepharose lectins), size exclusion (eg, Sephadex G-75), cation or anion exchange columns (eg, DEAE or carboxymethyl1- and sulfopropyl-cellulose) and high-performance liquid chromatography of reverse phase (RP-HPLC) (see eg ·., Urdal et al., J. Chromatog., 296: 171 [1984] where two sequenced RP-HPLC steps are used to purify recombinant human IL-2). Other optional purification steps include: ethanol precipitation, ammonium sulfate precipitation, chromato-focusing, preparative SDS-PAGE and the like.

As variantes do ligando de mpl em que foram eliminados, inseridos ou substituídos resíduos foram recuperados da mesma forma que o ligando de mpl nativo, tendo em conta quaisquer alterações substanciais nas propriedades provocadas por esta variação.Por exemplo, a preparação de uma fusão do ligando de mpl com uma outra proteína ou polipeptídeo, e.g. um antigénio bacteriano ou virai, facilita a purificação; uma coluna de imunoafinidade contendo anticorpo contra o antigénio pode ser usada para adsorver o polipeptídeo de fusão. As colunas de imunoafinidade tais como uma coluna de policlonal de coelho anti-ligando de mpl pode ser empregue para adsorver a variante do rVariants of the mpl ligand in which residues have been eliminated, inserted or replaced have been recovered in the same way as the native mpl ligand, taking into account any substantial changes in properties caused by this variation. For example, the preparation of a ligand fusion mpl with another protein or polypeptide, eg a bacterial or viral antigen, facilitates purification; an immunoaffinity column containing antibody to the antigen can be used to adsorb the fusion polypeptide. Immunoaffinity columns such as a rabbit polyclonal anti-mpl ligand column can be employed to adsorb the variant of the r

135 ligando de mpl através da sua ligaçãoa paelo menos um epítopo imune que reste. Como alternativa o ligando de mpl pode ser purificado por cromatografia de afinidade usando uma mpl-IgG acoplada (de preferência) a uma resina imobilizada como seja Affi-Gel 10 (Bior-Rad, Richmond, CA) ou similares por meios bem conhecidos. Um inibidor de proteases como seja fluoreto de metilfenilsulfonilo (PMSF) pode também ser útil para inibir a degradação proteolítica durante a purificação e e podem ser incluidos antibióticos para evitar o crescimento de contaminantes. Os familiarizados com a matéria apreciarão que os métodos de purificação adequados para o ligando de mpl nativo podem requerer modificação tendo em conta as alterações das características do ligando de mpl ou suas variações quando da expressão em cultura de células recombinantes.135 ligating from mpl through its attachment to at least one immune epitope that remains. Alternatively, the mpl ligand can be purified by affinity chromatography using an mpl-IgG coupled (preferably) to an immobilized resin such as Affi-Gel 10 (Bior-Rad, Richmond, CA) or the like by well known means. A protease inhibitor such as methylphenylsulfonyl fluoride (PMSF) can also be useful for inhibiting proteolytic degradation during purification and antibiotics may be included to prevent the growth of contaminants. Those skilled in the art will appreciate that suitable purification methods for the native mpl ligand may require modification taking into account changes in the characteristics of the mpl ligand or its variations when expressed in recombinant cell culture.

H. Modificações covalentes do polipeptídeo ligando de mplH. Covalent modifications of the mpl ligand polypeptide

As modificações covalentes dos polipeptídeos do ligando de mpl estão incluídas dentro do âmbito deste invento. Tanto a sequência do ligando de mpl nativo como as variantes da sequência de aminoácidos do ligando de mpl podem ser modificadas covalentemente. Um tipo de modificação covalente incluída no âmbito deste invento é um fragmento do ligando de mpl. Fragmentos variante do ligando de mpltendo cerca de 40 resíduos de aminoácidos podem ser covenientemente preparados por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do polipeptídeo ligando de mpl de tamanho completo ou uma variante. Outros tipos de modificações covalentes do ligando de mpl ou seus fragmentos são introduzidos na molécula fazendo reagir os resíduos de aminoácidos alvo do ligando de mpl ou seus fragmentos comum agente de derivatização orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos N- ou C-terminais.Covalent modifications of the mpl ligand polypeptides are included within the scope of this invention. Both the sequence of the native mpl ligand and the amino acid sequence variants of the mpl ligand can be modified covalently. One type of covalent modification included within the scope of this invention is a fragment of the mpl ligand. Variant fragments of the ligand of mpltendo about 40 amino acid residues can be conveniently prepared by chemical synthesis or by enzymatic or chemical cleavage of the full size mpl ligand polypeptide or a variant. Other types of covalent modifications of the mpl ligand or its fragments are introduced into the molecule by reacting the target amino acid residues of the mpl ligand or its fragments with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains or with the N- residues or C-terminals.

rr

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Os resíduos cisteinilo normalmente reagem com α-haloacetatos ( e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para dar derivados carboximetilados ou carboxiamidometilados. Os resíduos cisteinilo também são derivatizados por reacção com bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-β-(5-imidozoil)propiónico., fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, dissulfito de 3-nitro-2-piridilo, dissulfito de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazole.Cysteinyl residues normally react with α-haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to give carboxymethylated or carboxyamidomethylated derivatives. Cysteinyl residues are also derivatized by reaction with bromotrifluoroacetone, α-bromo-β- (5-imidozoyl) propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfite, methyl-2- 2- disulfite pyridyl, p-chloromercuribenzoate, 2-chloromercuri-4-nitrophenol or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.

Os resíduos de histidilo são derivatizados por reacção com dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 pois este agente é relativamente específico para a cadeia lateral histidilo. Brometo de parabromofanacilo também é útil; a reacção é de preferência realizada em cacodilato de sódio a pH 6,0.Histidyl residues are derivatized by reaction with diethylpyrocarbonate at pH 5.5-7.0 as this agent is relatively specific for the histidyl side chain. Parabromophanacil bromide is also useful; the reaction is preferably carried out in sodium cacodylate at pH 6.0.

Resíduos de lisinilo e do extremo amina reagem com anidridos succinicos ou outros anidridos do ácido carboxílico. A derivatização com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos lisinilo. Outros agentes adequados à derivatização de resíduos contendo grupos amina incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroboro-hidreto; ácido trinitrobenzenossulfónico; O-metilisoureia; 2,4-pentanediona e reacção catalisada por transaminasescom glioxilato.Lysinyl and extreme amine residues react with succinic anhydrides or other anhydrides of carboxylic acid. Derivatization with these agents has the effect of reversing the load of lysinyl residues. Other agents suitable for derivatizing residues containing amine groups include imidoesters such as methyl picolinimidate; pyridoxal phosphate; pyridoxal; chloroborohydride; trinitrobenzenesulfonic acid; O-methylisourea; 2,4-pentanedione and reaction catalyzed by transaminases with glyoxylate.

Os resíduos arginilo são modificados por reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre os quais fenilglioxal, 2,3-butanediona, 1,2-ciclo-hexanediona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginina requere que a reacção seja realizada em condições alcalinas devido ao pK alto do grupo funcional da guanidina. Ainda estes â reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como com o grupo epsilon-amina da arginina.Arginyl residues are modified by reaction with one or more conventional reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. Derivatization of arginine residues requires that the reaction be carried out under alkaline conditions due to the high pK of the guanidine functional group. Furthermore, these reagents can react with the lysine groups as well as the epsilon-amine group of arginine.

A modificação específica de resíduos tirosilo pode ser feita, comparticular interessse na introdução de marcas espectrais nos resíduos tirosilo por reacção com compostos aromáticos de diazónio ou tetranitrometano. Mais normalmente, usa-seN-acetilimidizole e tetranitrometano para formar espécies O-acetil-tirosilo e derivados 3-nitro, respectiva• 12 5 mente. Os resíduos tirosilo são íodmados usando I ou ¹³¹I para preparar proteínas marcadas para usar em radioimunoensaio, sendo adequado o método da cloramina T descrito atrás.The specific modification of tyrosyl residues can be made, comparing interest in the introduction of spectral marks in the tyrosyl residues by reaction with aromatic compounds of diazonium or tetranitromethane. More commonly, N-acetylimidizole and tetranitromethane are used to form O-acetyl tyrosyl species and 3-nitro derivatives, respectively. Tyrosyl residues are iodinated using I or ¹³¹ I to prepare labeled proteins for use in radioimmunoassay, the chloramine T method described above being suitable.

Os grupos laterais carbonilo (aspartilo ou glutamilo) são selectivamente modificados por reacção com carbodiimidas (R-N=C=N-R') ounde R e R' são grupos alquilo diferentes, tais como l-ciclo-hexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiiimida. Ainda, os resíduos aspartilo e glutamilo são convertidos em asparaginilo e glutaminilo por reacção com iões amónio.The carbonyl side groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by reaction with carbodiimides (RN = C = N-R ') where R and R' are different alkyl groups, such as 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl) -4-ethyl) carbodiimide or l-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiiimide. In addition, the aspartyl and glutamyl residues are converted to asparaginyl and glutaminyl by reaction with ammonium ions.

A derivatização com agentes bifuncionais é útil para fazer a ligação cruzada do ligando de mpl a uma matriz ou superfície suporte insolúvel em água para usar no método de purificação de anticorpos anti-ligando de mpl e vice versa. Agentes de ligação cruzada normalmente empregues incluem, e.g. 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de hidroxi-succinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicilico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo dissuccinimidilo como seja 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,3-octano. Agentes de derivatização tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propionato dão intermediários fotoactiváveis que são capazes de formar ligações cruzadas na presença de luz. Como alternativa as matrizes reactivas insolúveis em água tais como carboidratos activados com brometo de cianogénio e os substractos reactivos descritos nas Patentes U.S. Nos.3,969,287; 3,691,016: 4,195,128;Derivatization with bifunctional agents is useful to cross-link the mpl ligand to a water-insoluble matrix or support surface for use in the anti-mpl ligand antibody purification method and vice versa. Cross-linking agents commonly employed include, eg 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, hydroxy-succinimide esters, for example, esters with 4-azidosalicylic acid, homobifunctional imidoesters, including disuccinimidyl such as 3.3 '-ditiobis (succinimidylpropionate) and bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,3-octane. Derivatizing agents such as methyl-3 - [(p-azidophenyl) dithio] propionate give photoactivable intermediates that are capable of forming cross-links in the presence of light. Alternatively, water-insoluble reactive matrices such as cyanogen bromide activated carbohydrates and the reactive substrates described in U.S. Patent Nos. 3,969,287; 3,691,016: 4,195,128;

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4,247,642;; 4,229,537; e 4,330,440 foram empregues para a imobilização de proteínas.4,247,642 ;; 4,229,537; and 4,330,440 were used for protein immobilization.

Os resíduos glutaminilo e asparaginilo são frequentemente desamidados para dar os correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo, respectivamente. Estes resíduos são desamidados em condições neutras ou básicas. A forma desamidada destes resíduos está dentro do âmcbito deste invento.The glutaminyl and asparaginyl residues are often deamidated to give the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively. These residues are deamidated in neutral or basic conditions. The deamidated form of these residues is within the scope of this invention.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, metilação dos grupos a-amina das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., ' San Francisco, pp. 79-86 [1983]), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal.Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of the a-amine groups of the side chains of lysine, arginine and histidine (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co. , 'San Francisco, pp. 79-86 [1983]), acetylation of the N-terminal amine and amidation of any C-terminal carboxyl group.

Um outro tipo de modificação covalente do polipeptídeo ligando de mpl incluído dentro do âmbito deste invento compreende a alteração do padrão de glicosilação nativo do polipeptídeo. Por alteração entende-se eliminação de um ou mais grupos de açúcar encontrados no ligando de mpl nativo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no ligando de mpl nativo.Another type of covalent modification of the mpl ligand polypeptide included within the scope of this invention comprises altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. Alteration means the elimination of one or more sugar groups found in the native mpl ligand and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the native mpl ligand.

A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ligada em N ou ligada em 0. Ligada em N refere-se à ligação do grupo açúcar à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para aligação enzimática do grupo de açúcar à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de uma destas sequências tripeptídicas num polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação em 0 refere-se à ligação deum dos açúcaresGlycosylation of polypeptides is typically N-linked or N-linked. N-linked refers to the attachment of the sugar group to the side chain of an asparagine residue. The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are the recognition sequences for enzymatic attachment of the sugar group to the asparagine side chain. Thus, the presence of one of these tripeptide sequences in a polypeptide creates a potential glycosylation site. Glycosylation at 0 refers to the binding of one of the sugars

N-acetilglucosamina, galactose ou xilose umN-acetylglucosamine, galactose or xylose one

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hidroxiaminoácido, mais normalmente serina ou treonina, se bem que 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usados.hydroxyamino acid, more commonly serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine can also be used.

A adição de sítios de glicosilação ao polipeptídeo ligando de mpl é convenientemente conseguido alterando a sequência de aminoácidos de forma a que contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas atrás descritas (para sítios de glicosilação ligados em N). A alteração pode também ser feita pela adição ou substituição de um ou mais resíduos serina ou treonina à sequência do ligando de mpl nativo (para os sítios de glicosilação ligados em O). Para facilitar, a sequência de aminoácidos do ligando de mpl é preferencialmente alterada através de alterações ao nível do DNA, particularmente mutagenizando o DNA codificador do polipeptídeo ligando de mpl em bases pré-seleccionadas de forma a que sejam gerados codões que se traduzirão nos aminoácidos pretendidos. As mutações do DNA podem ser feitas usando métodos descritos atrás com. o título Variantes da sequência de aminoácidos do ligando de mpl.The addition of glycosylation sites to the mpl ligand polypeptide is conveniently accomplished by altering the amino acid sequence so that it contains one or more of the tripeptide sequences described above (for N-linked glycosylation sites). The change can also be made by adding or replacing one or more serine or threonine residues to the native mpl ligand sequence (for the O-linked glycosylation sites). To facilitate, the amino acid sequence of the mpl ligand is preferably altered through changes at the DNA level, particularly mutagenizing the DNA encoding the mpl ligand polypeptide on pre-selected bases so that codons are generated that will translate into the desired amino acids . DNA mutations can be done using methods described above with. the title Variants of the amino acid sequence of the mpl ligand.

Um outro meio para aumentar o número de grupos açúcar no ligando de mpl é por acoplagem química ou enzimática de glicõsidos aos polipeptídeos. Estes açúcares são vantajosos por não necessitarem da produção do polipeptídeo numa célula hospedeira que tenha capacidade para fazer glicosilação ligada em N ou O. Dependendo do modo de acoplagem usado, os açúcares podem ser ligados a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo livres, (c) grupos sulfidrilo livres tais como os de císteina, (d) grupos hidroxilo livres tais como os da serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tais como os da fenilalanina, tirosina ou triptofano ou (f) grupo amida da glutamina. Estes métodos estão descritos em WO 87/05330 publicado em 11 de Setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 [1981].Another means to increase the number of sugar groups in the mpl ligand is by chemical or enzymatic coupling of glycosides to the polypeptides. These sugars are advantageous in that they do not require the production of the polypeptide in a host cell that is capable of making N or O-linked glycosylation. Depending on the coupling mode used, the sugars can be linked to (a) arginine and histidine, (b) groups free carboxyl, (c) free sulfhydryl groups such as cysteine, (d) free hydroxyl groups such as serine, threonine or hydroxyproline, (e) aromatic residues such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan or (f) group glutamine amide. These methods are described in WO 87/05330 published on September 11, 1987 and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 [1981].

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A remoção dos grupos açúcar presentes no polipeptídeo ligando de pml poder conseguido quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requere a exposição do polipeptídeo ao composto ácido trifluorometanossulfónico ou um composto equivalente. Este tratamentoresulta na clivagem da maior parte ou de todos os açúcares excepto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), se bemque deixando o polipeptídeo intacto. A desglicosilação química está descrita por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophvs., 259:52 [1987] e por Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 [1981]. A clivagem enzimática dos grupos de açúcar nos polipeptídeos pode ser conseguida usando uma variedade de endoglicosidades e exoglicosidases como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 [1987].The removal of the sugar groups present in the pml ligand polypeptide can be achieved chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation requires exposure of the polypeptide to the compound trifluoromethanesulfonic acid or an equivalent compound. This treatment results in the cleavage of most or all sugars except binding sugar (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine), although leaving the polypeptide intact. Chemical deglycosylation is described by Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophvs., 259: 52 [1987] and by Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 [1981]. Enzymatic cleavage of the sugar groups in the polypeptides can be achieved using a variety of endoglycosities and exoglycosidases as described by Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 [1987].

A glicosilação de potenciais sítios de glicosilaão pode ser evitada pela utilização do composto tunicamicina como descrito por Duskin et al.. J. Biol. Chem., 257: 3105 [1982]. A tunicamicina bloqueia a formação de ligações proteína-N-glicósido.The glycosylation of potential glycosylation sites can be prevented by using the tunicamycin compound as described by Duskin et al .. J. Biol. Chem., 257: 3105 [1982]. Tunicamycin blocks the formation of protein-N-glycoside bonds.

Um outro tipo de modificação covalente do ligando de mpl compreende a ligação do polipeptídeo ligando de mpl a uma variedade de polímeros não proteicos, e. q. , polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, de forma descrita nas Patentes U.S. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ou 4,179,337.Another type of covalent modification of the mpl ligand comprises binding the mpl ligand polypeptide to a variety of non-protein polymers, e.g. q. , polyethylene glycol, polypropylene glycol or polyoxyalkylenes, as described in U.S. Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337.

Será apreciado que algum despiste da variante do ligando de mpl recuperado necessário para seleccionar a variante óptima para ligação a um mpl e tendo a actividade imunológica e/ou biológica definida atrás. Pode-se fazer o despiste da estabilidade em culturas de células recombinantes ou em plasma (e.g., contra clivagem proteolítica), alta afinidade para um membro de mpl, estabilidade oxidativa, capacidade para ser secretada em níveis elevados eIt will be appreciated that some screening for the recovered mpl ligand variant needed to select the optimal variant for binding to a mpl and having the immunological and / or biological activity defined above. Stability can be screened in recombinant cell cultures or in plasma (e.g., against proteolytic cleavage), high affinity for a mpl member, oxidative stability, ability to be secreted at high levels and

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similiares. Por exemplo, uma alteração no carácter imunológico do poipeptídeo ligando de mpl, como seja afinidade para um determinado anticorpo, é medido por um imunoensaio tipo competitivo. Outras modificações potenciais das propriedades da proteína ou polipeptídeo tais como estabilidade redox ou térmica, hidrofobicidade ou susceptibilidade a degradação proteolítica são testadas por métodos bem conhecidos.similar. For example, a change in the immunological character of the mpl ligand poipeptide, such as affinity for a particular antibody, is measured by a competitive type immunoassay. Other potential modifications of the properties of the protein or polypeptide such as redox or thermal stability, hydrophobicity or susceptibility to proteolytic degradation are tested by well known methods.

17. Métodos Gerais para a Preparação de Anticorpos contra o Ligando de mpl17. General Methods for the Preparation of Antibodies against the mpl Ligand

Preparação de anticorpos (i) Anticorpos policlonaisPreparation of antibodies (i) Polyclonal antibodies

Os anticorpos policlonais contra polipeptídeos ou fragmentos do ligando de mpl são geralmente induzidos em animais por múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip)do ligando de. mpl e de um adjuvante. Pode ser útil conjugar o ligando de mpl ou um seu fragmento contendo a sequência de arçinoácidos alvo a uma proteína que seja imunogénica na espécie a ser imunizada e.g.. hemocianina de lapa, albumina sérica, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja usando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo éster de maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de císteina), N-hidrissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succinico, AOC1₂ ou R¹N=C=NR onde R e R¹ são grupos alquilo diferentes.Polyclonal antibodies against polypeptides or fragments of the mpl ligand are generally induced in animals by multiple subcutaneous (sc) or intraperitoneal (ip) injections of the ligand. mpl and an adjuvant. It may be useful to conjugate the mpl ligand or a fragment thereof containing the target amino acid sequence to a protein that is immunogenic in the species to be immunized eg. keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin or soybean trypsin inhibitor using a bifunctional or derivatizing agent, eg maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester (conjugation via cysteine residues), N-hydrysuccinimide (via lysine residues), glutaraldehyde , succinic anhydride, AOC1 ₂ or R ¹ N = C = NR where R and R ¹ are different alkyl groups.

Os animais são imunizados contra o polipeptídeo ou fragmento do ligando de mpl, conjugados imunogénicos ou derivados por combinação de 1 mg a 1 Mg do peptídeo ou conjugado (para coelhos ou murganhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injecção da solução intradérmica em vários sítios. Um mês mais tarde os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade originalThe animals are immunized against the polypeptide or fragment of the mpl ligand, immunogenic conjugates or derivatives by combining 1 mg to 1 mg of the peptide or conjugate (for rabbits or mice, respectively) with 3 volumes of complete Freund's adjuvant and injection of the solution intradermal in several places. One month later the animals are reinforced with 1/5 to 1/10 of the original quantity

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do peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em vários sítios. Sete a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e o soro é testado relativamente ao título de anticorpos contra o ligando de mpl. São dados reforços até o título atingir um patamar. De preferência o animal recebe um reforço com o conjugado do mesmo ligando de mpl, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de ligação cruzada diferente. Os conjugados podem também ser feitos em culturas de células recombinantes como proteínas de fusão. Também, agentes de agregação tais como aluía são usados para aumentar a resposta imune.of the peptide or conjugate in complete Freund's adjuvant by subcutaneous injection at various sites. Seven to 14 days later the animals are bled and the serum is tested for antibody titer against the mpl ligand. Reinforcements are given until the title reaches a plateau. Preferably, the animal receives a boost with the conjugate of the same mpl ligand, but conjugated to a different protein and / or through a different cross-linking reagent. The conjugates can also be made in recombinant cell cultures as fusion proteins. Also, aggregating agents such as alu are used to increase the immune response.

(ii) Anticorpos monoclonais(ii) Monoclonal antibodies

Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir d euma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais constituindo a população são idênticos excepto a ocorrência de possíveis mutações naturais que podem estar presentes em quantidades extremamente baixas. Assim, o adjectivo monoclonal indica o carácter de um anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.Monoclonal antibodies are obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies constituting the population are identical except for the occurrence of possible natural mutations that can be present in extremely low amounts. Thus, the adjective monoclonal indicates the character of an antibody as not being a mixture of discrete antibodies.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais contra o ligando de mpl do invento podem ser feitos usando o método dos hibridomas primeiro descrito por Kohler & Milstein, Nature, 256:495 [1975] ou pode ser feito por métodos de DNA recombinantes (Patente U.S. N² 4,816,5677 [Cabilly et al.]) .For example, monoclonal antibodies against the mpl ligand of the invention can be made using the hybridoma method first described by Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 [1975] or can be made by recombinant DNA methods (US Patent No. ² 4,816,5677 [Cabilly et al.]).

No método dos hibridomas, um murganho ou outro animal hospedeiro adequado, como seja hamster é imunizado como atrás descrito para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para a imunização. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando umIn the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal, such as a hamster, is immunized as described above to induce lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that will specifically bind to the protein used for immunization. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. The lymphocytes are then fused with myeloma cells using a

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agente de fusão adequado, como seja polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma Antibodies: Principies and Practice, Press, 1986]) .suitable fusion agent, such as polyethylene glycol, to form a hybridoma cell Antibodies: Principies and Practice, Press, 1986]).

As células de hibridoma semeadas e crescidas num meio de (Goding, Monoclonal pp. 59-103 [Academic assim preparadas são cultura adequado que preferencialmente contem uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuírem a enzima transferase de fosforribosilo de hipoxantina guanina (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias essas que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.Hybridoma cells seeded and grown in a medium of (Goding, Monoclonal pp. 59-103 [Academic thus prepared are suitable culture that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parental myeloma cells. For example, if the parental myeloma cells lack the guanine hypoxanthine phosphoribosyl transferase enzyme (HGPRT or HPRT), the culture medium for hybridomas will typically include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium), substances that prevent the growth of deficient cells in HGPRT.

As células de mieloma preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam um nível de expressão alto e estável do anticorpo pelas células produtoras de anticorpos seleccionadas e são sensíveis a um meio como seja o meio HAT. Entre estas, as linhas celulares de mieloma preferidas são as linhas de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de murganho MOPC-21 e MPC-11 que podem ser conseguidas no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e células SP-2 disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. As linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma murganho-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Mareei Dekker, Inc., New York, 1987) .Preferred myeloma cells are those that fuse efficiently, support a high and stable level of antibody expression by selected antibody-producing cells and are sensitive to a medium such as the HAT medium. Among these, the preferred myeloma cell lines are the murine myeloma lines, such as those derived from MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors that can be obtained from the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, and cells SP-2 available from the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 51-63, Maree Dekker, Inc., New York, 1987).

O meio de cultura em que as células de hibridoma crescem é testado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o ligando de mpl. De preferência a rThe culture medium in which the hybridoma cells are grown is tested for the production of monoclonal antibodies directed against the mpl ligand. Preferably r

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especificidade da ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é deteminada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, como seja radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA).The specificity of binding of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

A afinidade da ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada por exemplo pela análise de Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107:220 [1980].The binding affinity of the monoclonal antibody can be determined for example by the Scatchard analysis of Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 [1980].

Após serm identificadas as células de hibridoma produtoras dos anticorpos com a especificidade, afinididade e/ou actividade pretendidas, os clones podem ser subclonados por processos de diluição limite e cultivados segundo processos convencionais (Goding supra). Os meios de cultura adequados a estes fins incluem, por exemplo, Meiod e Eagle Modificação de Dulbecco ou meio RPMI 1640.Em adição, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores asciticos num animal.After the hybridoma cells producing antibodies with the desired specificity, affinity and / or activity have been identified, the clones can be subcloned by limit dilution processes and cultured according to conventional procedures (Goding supra). Suitable culture media for these purposes include, for example, Meiod and Eagle Dulbecco Modification or RPMI 1640 medium. In addition, the hybridoma cells can be cultured in vivo as ascitic tumors in an animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluído ascítico ou soro por processos de purificação de imunoglobulinas convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em hidroxilapatite, electrofrese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.Monoclonal antibodies secreted by the subclones are suitably separated from the culture medium, ascitic fluid or serum by conventional immunoglobulin purification processes such as, for example, protein A-Sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography.

DNA codificador dos anticorpos monoclonais do invento foi isolado facilmente e sequenciado usando processos convencionais (e.q., usando oligonucleótdos sondas que são capazes de se ligar especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve dos anticorpos murinos). As células de hibridoma do invento servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vectores de expressão, os quais são então usados para transfectar células hospedeiras tais como células símias COS, células de ovário de hamster chinês ou células rDNA encoding the monoclonal antibodies of the invention was easily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., using probe oligonucleotides that are capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies). The hybridoma cells of the invention serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed into expression vectors, which are then used to transfect host cells such as simian COS cells, Chinese hamster ovary cells or r cells.

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de mieloma que de outra forma não produzem imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. 0 DNA pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência codificadora dos domínios constantes das cadeias pesada e leve de sequências murinas por sequências homólogas humanas, Cabilly et al.. supra; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 81:6851 [1984]) ou ligando covalentemente a sequência edificadora da imunoglobulinaa toda ou parte da sequência codificadora de um polipeptídeo que não seja imunoglobulina.of myeloma that do not otherwise produce immunoglobulin, to obtain the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. DNA can be modified, for example, by replacing the coding sequence for murine heavy and light chain constant domains with human homologous sequences, Cabilly et al., Supra; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 81: 6851 [1984]) or covalently linking the immunoglobulin building sequence to all or part of the coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide.

Tipicamente tais polipeptídeos que não são imunoglobulinas são substituídos por domínios constantes de um anticorpo do invento ou podem ser substituídos por domínios variáveis de um sítio de combinação com o antigénio de um anticorpo do invento para criar um anticorpo quimérico bivalente compreendendo um sítio de combinação ao antigénio tendo especificidade para um ligando de mpl e um sítio de combinação com um outro antigénio tendo especificidade para um antigénio diferente.Typically such polypeptides that are not immunoglobulins are replaced by constant domains of an antibody of the invention or can be replaced by variable domains of a combination site with the antigen of an antibody of the invention to create a bivalent chimeric antibody comprising an antigen combination site having specificity for an mpl ligand and a combination site with another antigen having specificity for a different antigen.

Os anticorpos quiméricos ou híbridos podem também ser preparados in vitro usando métodos conhecidos de síntese química de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de ligação cruzada. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas usando uma reacção de permuta de dissulfureto ou formando uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.Chimeric or hybrid antibodies can also be prepared in vitro using known methods of chemical protein synthesis, including those involving cross-linking agents. For example, immunotoxins can be constructed using a disulfide exchange reaction or forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate.

Para fins de diagnóstico, os anticorpos do invento tipicamente serão marcados com um grupo detectável. O grupo detectável pode ser um que seja capaz de produzir, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemploo grupo .3 detectável pode ser um isótopo radioactivo, como seja H, 14 32 35 125For diagnostic purposes, the antibodies of the invention will typically be labeled with a detectable group. The detectable group can be one that is capable of producing, directly or indirectly, a detectable signal. For example, the detectable .3 group can be a radioactive isotope, such as H, 14 32 35 125

C, P, S ou I ou um composto fluorescente e quimioluminescente, como seja isotiocianato de fluoresceína,C, P, S or I or a fluorescent and chemiluminescent compound, such as fluorescein isothiocyanate,

rodamina ou luciferina; marcas isotópicas radioactivas tais 125_ 32_ 14_ 3,, como- e.g., I, P, C ou H ou uma enzima, como seja fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre.rhodamine or luciferin; radioactive isotopic marks such as 125_32_14_3, such as - e.g., I, P, C or H or an enzyme, such as alkaline phosphatase, beta-galactosidase or horseradish peroxidase.

Para conjugar separadamente o anticorpo ã fracção detectável qualquer método conhecido pode incluindo os métodos descritos por Hunter, et al., Biochemistry,To separately conjugate the antibody to the detectable fraction any known method can include the methods described by Hunter, et al., Biochemistry,

Meth.,Meth.,

30:407 [1982] .30: 407 [1982].

144:945 [1962]; David,144: 945 [1962]; David,

Pain, et al., J. Immunol.Pain, et al., J. Immunol.

Histochem.Histochem.

and Cytochem., ser empregue, et al. Nature, 13:1014 [1974];and Cytochem., be employed, et al. Nature, 13: 1014 [1974];

40:219 [1981];40: 219 [1981];

e Nygren, J.and Nygren, J.

empregues como seja sanduícheemployed as a sandwich

Os anticorpos em qualquer os ensaios directos ou um de tação. Zola, Monoclonal pp.1476-158 (CRC Press, do presente invento dos métodos de ensaio ligação competitiva, podem ser conhecidos, ensaios em indirectos e ensaios de imunoprecipiAntibodies: A Manual of Techniques,The antibodies in either the direct assays or one of tation. Zola, Monoclonal pp.1476-158 (CRC Press, of the present invention of competitive binding assay methods, can be known, assays in indirect and immunoprecipitation assays: Antibodies: A Manual of Techniques,

Inc., 1987).Inc., 1987).

Os ensaios de ligação competitivos baseiam-se na capacidade de um padrão marcado (o qual pode ser um ligando de mpl ou uma sua fracção imunologicamente reactiva) para competir com a amostra a testar (ligando de mpl) para a ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de ligando de mpl na amostra a testar é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligado aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligado, os anticorpos geralmente são insolu' bilizados antes ou após a competição, de forma que o padrão e a amostra a analisar ligados aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e amostra a testar que não se ligaram.Competitive binding assays are based on the ability of a labeled standard (which may be an mpl ligand or an immunologically reactive fraction thereof) to compete with the test sample (mpl ligand) for binding with a limited amount of antibody. The amount of mpl ligand in the sample to be tested is inversely proportional to the amount of standard that is bound to the antibodies. In order to facilitate the determination of the amount of standard that is bound, antibodies are generally insoluble before or after competition, so that the standard and the sample to be analyzed linked to the antibodies can be conveniently separated from the standard and sample to be tested that does not. connected.

Os ensaios em sanduíche envolvem a utilização de ois anticorpos, cada um deles capaz de se ligar a uma fracção imunogénica ou epítopo diferente da proteína (ligando de mpl) a ser detectada. Num ensaio em sanduíche, o rSandwich assays involve the use of two antibodies, each capable of binding to an immunogenic fraction or epitope other than the protein (mpl ligand) to be detected. In a sandwich test, the r

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analíto da amostra a testar é ligado por um primeiro anticorpo que está imobilizado num suporte sólido e depois um segundo anticorpo liga-se ao analito, formando-se assim um complexo insolúvel constituído por três elementos. David & Greene, Patente U.S. N2 4,376,110. O segundo anticorpo pode ele próprio ser marcado com um grupo detectável (ensaios de sanduíche directa) ou pode ser medido usando um anticorpo anti-imunoglobulina que esteja marcado com um grupo detectável (ensaio de sanduíche indirecta). Por exemplo, um tipo de ensaio em sanduíche é um ensaio de ELISA, em que o grupo detectável é uma enzima (e. q. peroxidase de rábano silvestre) .analyte of the test sample is bound by a first antibody that is immobilized on a solid support and then a second antibody binds to the analyte, thus forming an insoluble complex consisting of three elements. David & Greene, U.S. Patent No. 4,376,110. The second antibody can itself be labeled with a detectable group (direct sandwich assays) or can be measured using an anti-immunoglobulin antibody that is tagged with a detectable group (indirect sandwich assay). For example, a type of sandwich assay is an ELISA assay, in which the detectable group is an enzyme (e.g. horseradish peroxidase).

(iii) Anticorpos humanizados e humanos(iii) Humanized and human antibodies

São bem conhecidos métodos para a humanização de anticorpos não humanos. De um modo geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele derivados de uma fonte não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos importados, os quais são tipicamente retirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter et al. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al.. Nature, 332:323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 [1988]), substituindo sequências CDRs ou CDR de roedores pelas correspondentes sequências de um anticorpo humano. Assim, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Cabilly et a 1, supra) , em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela correspondente sequência derivada de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos derivados de sítios análogos em anticorpos de roedores.Methods for the humanization of non-human antibodies are well known. In general, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced into it derived from a non-human source. These non-human amino acid residues are often referred to as imported residues, which are typically taken from an imported variable domain. Humanization can be performed essentially following the method of Winter et al. (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 [1988]), replacing rodent CDRs or CDR sequences with the corresponding human antibody sequences. Thus, such humanized antibodies are chimeric antibodies (Cabilly et al 1, supra), in which substantially less than an intact human variable domain has been replaced by the corresponding sequence derived from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are replaced by residues derived from sites analogous to rodent antibodies.

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A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem usados na obtenção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de best-fit, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é despistada contra toda a biblioteca de sequências do domínios variáveis humanos. A sequência humana que está mais perto da do roedor é então aceite como a infraestrutura (framework FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 [1993]; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 [1987]). Um outro método usa uma infraestrutura particular derivada da sequência consensus de todos os anticorpos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma infraestrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 [1992]; Presta et al. , J. Immunol., 151:2623 [1993]).The choice of human variable domains, both light and heavy, to be used to obtain humanized antibodies is very important to reduce antigenicity. According to the so-called best-fit method, the variable domain sequence of a rodent antibody is screened against the entire human variable domain sequence library. The human sequence that is closest to that of the rodent is then accepted as the infrastructure (FR framework) for the humanized antibody (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 [1987]). Another method uses a particular infrastructure derived from the consensus sequence of all antibodies in a particular subgroup of light or heavy chains. The same infrastructure can be used for several different humanized antibodies (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 [1993] ).

Ê ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antigénio ou com outras propriedades biológicas favoráveis. Para se conseguir este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos tridimensionais das proteínas podem ser facilemnte encontrados e são familiares para os entendidos na matéria. Existem programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais em três dimensões das sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A observação destas representações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Desta forma, os resíduos FR podem ser seleccionados e combinados a partir da sequência consensus e importada de forma a que a característica pretendida do anticorpo, como seja maior afinidade paraIt is also important that the antibodies are humanized with high affinity retention for the antigen or with other favorable biological properties. To achieve this goal, according to a preferred method, humanized antibodies are prepared by a process of analyzing parental sequences and various humanized products using three-dimensional models of parental and humanized sequences. Three-dimensional models of proteins can be easily found and are familiar to those skilled in the art. There are computer programs that illustrate and present conformational structures in three dimensions of the selected candidate immunoglobulin sequences. Observation of these representations allows the analysis of the probable role of residues in the functioning of the candidate immunoglobulin sequence, i.e., the analysis of residues that influence the ability of the candidate immunoglobulin to bind to its antigen. In this way, FR residues can be selected and combined from the consensus sequence and imported so that the desired characteristic of the antibody, such as greater affinity for

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os antigénios alvo seja conseguida. Em geral, os resíduos de CDR estão directamente e mais substancialmente envolvidos na influência da lugação ao antigénio. Para mais detelhes ver pedido de patente U.S. N2 de Série 07/934,373 entregue em 21 de Agosto de 1992, o qual é uma continuação em parte do pedido de patente N2 de Série 07/715,272 entregue em 14 de Junho de 1991.the target antigens is achieved. In general, CDR residues are directly and more substantially involved in the influence of antigen binding. For more details, see U.S. Patent Application No. 2 Series 07 / 934,373 filed on August 21, 1992, which is a continuation in part of Patent Application No. 2 Series 07 / 715,272 filed on June 14, 1991.

Como alternativa é agora possível produzir animais transgénicos (e. q. murganhos) que sejam capazes, quando da imunização, de produzir um pepertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união da cadeia pesada do anticorpo (J_u) em murganhos mutantes quiméricos e da linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógena. A transferência do arranjo de genes da imunoglobulina de linha germinal humana para tal murganho mutante resultará na produção de anticorpos humapos quando da exposição a antigénios. Ver, e.g., Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei.As an alternative, it is now possible to produce transgenic animals (eq mice) that are capable, upon immunization, of producing a complete set of human antibodies in the absence of endogenous immunoglobulin production. For example, it has been reported that the homozygous deletion of the antibody heavy chain (J _u ) binding region gene in mutant chimeric and germline mice results in complete inhibition of endogenous antibody production. The transfer of the human germline immunoglobulin gene array to such a mutant mouse will result in the production of human antibodies upon exposure to antigens. See, eg, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Know.

USA, 90:2551-2555 [1993]; JakobovitsUSA, 90: 2551-2555 [1993]; Jakobovits

362:255-258 [1993]; Bruggermann et al., et al., Nature,362: 255-258 [1993]; Bruggermann et al., Et al., Nature,

Year in Immunol.,Year in Immunol.,

7:33 [1993] .7:33 [1993].

Podem ser também produzidos anticorpos humanos em bibliotecas de fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol.,Human antibodies can also be produced in phage libraries (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol.,

227:381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 [1991]).227: 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 [1991]).

(iv) Anticorpos bispecíficos(iv) Bispecific antibodies

Os anticorpos bispecíficos são anticorpos monoclonais, de preferência humanos ou humanizados, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. Os métodos para obtenção de anticorpos bispecíficos são conhecidos.Bispecific antibodies are monoclonal antibodies, preferably human or humanized, that have binding specificities for at least two different antigens. Methods for obtaining bispecific antibodies are known.

Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos bispecíficos baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeias leve-pesada de imunoglobulinas, em que asTraditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the coexpression of two pairs of immunoglobulin light-heavy chains, in which

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duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes (Millstein a Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Devido á combinação ao acaso de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura bispecífica correcta. A purificação da molécula correcta, a qual é feita por passos de cromatografia de afinidade é demorada e o rendimento baixo.Processos semelhantes estão descritos na publicação PCT N2 WO 93/08829 (publicada em 13 de Maio 1993) e em Traunecker et al., EMBO, 103655-3659 [1991].two heavy chains have different specificities (Millstein to Cuello, Nature, 305: 537-539 [1983]). Due to the random combination of heavy and light chains of immunoglobulin, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule, which is carried out by affinity chromatography steps, takes time and yields are low. Similar processes are described in PCT publication No. WO 93/08829 (published on 13 May 1993) and in Traunecker et al., EMBO, 103655-3659 [1991].

De acordo com uma abordagem diferente e mais específica, os domínios varáveis dos anticorpos com as especificidades de ligação pretendidas (sítios de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos com sequências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão preferencialmente é com um domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões charneira CH2 e CH3. Prefere-se que tenha a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) tendo o sítio necessário para ligação à cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs codificadores das fusões das cadeias pesadas de imunoglobulina e, caso se pretenda, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são cotransfectados para um organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona uma maior flexibilidade no ajustamento de proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos nas execuções em que proporções diferentes das três cadeias polipeptídicas usadas na construção proporcionem rendimentos óptimos. É no entanto, possível inserir as sequências codificadoras para duas ou três cadeias polipeptídicas num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em rendimentos maiores ou quando as proporções não têm qualquer interesse particular. Numa realização preferida desta abordagem, os anticorpos bispecíficos são compostos por umaAccording to a different and more specific approach, the variable domains of antibodies with the desired binding specificities (antibody-antigen combination sites) are fused with sequences of immunoglobulin constant domains. The fusion preferably is with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge regions CH2 and CH3. It is preferred that it has the first heavy chain constant region (CHI) having the necessary site for light chain binding, present in at least one of the fusions. The DNAs encoding the immunoglobulin heavy chain fusions and, if desired, the immunoglobulin light chain, are inserted into separate expression vectors and are cotransfected to a suitable host organism. This provides greater flexibility in adjusting the mutual proportions of the three polypeptide fragments in runs where different proportions of the three polypeptide chains used in the construction provide optimal yields. It is, however, possible to insert the coding sequences for two or three polypeptide chains in an expression vector when the expression of at least two polypeptide chains in equal proportions results in higher yields or when the proportions are of no particular interest. In a preferred embodiment of this approach, bispecific antibodies are composed of a

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cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par híbrido de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina (dando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Encontrou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto bispecífico pretendido das combinações de cadeias de imunoglobulina não desejáveis, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula bispecífica proporciona uma forma de separação fácil. Esta abordagem está descrita no pedido de patente copendente N² de Série 07/931,811 entregue em 17 de Agosto de 1992.hybrid immunoglobulin heavy chain with a first binding specificity in one arm and a hybrid immunoglobulin light chain-heavy chain pair (giving a second binding specificity) in the other arm. This asymmetric structure has been found to facilitate the separation of the desired bispecific compound from undesirable immunoglobulin chain combinations, as the presence of an immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule provides an easy form of separation. This approach is described in copending patent application No. ² of Series 07 / 931,811 filed on August 17, 1992.

Para mais detalhes sobre a geração de anticorpos bispecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 [1986].For more details on the generation of bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 [1986].

(v) Anticorpos heteroconjugados(v) Heteroconjugate antibodies

Os anticorpos heteroconjugados estão também dentro do âmbito do presente invento. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados covalentemente. Tais anticorpos foram por exemplo propostos para direccionar células do sistema imune contra células indesejáveis (Patente U.S. N² 4,676,980) e para o tratamento de infecções por HIV (publicações PCT Nos. WO 91/00360 e WO 92/03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodos convenientes de ligação cruzada. Agentes de ligação cruzada são bem conhecidos e estão descritos na Patente U.S. N² 4,676,980 juntamente com uma série de técnicas de ligação cruzada.Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently linked antibodies. Such antibodies have for example been proposed to target immune system cells to unwanted cells (US Patent No. ² No. 4,676,980) , and for treatment of HIV infection (PCT publication Nos. WO 91/00360 and WO 92/03089). Heteroconjugate antibodies can be made using any convenient cross-linking methods. Cross-linking agents are well known and are described in US Patent 4,676,980 ² along with a number of cross-linking techniques.

IV. Utilização Terapêutica da ProteínaIV. Therapeutic Use of Protein

Megacariocitopoiética Ligando de mpl ligando de mpl biologicamente activo tendoMegakaryocytopoietic Mpl ligand biologically active mpl ligand having

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função efectora hematopoiética e aqui referido como uma proteína megacariocitopoiética ou trombocitopoiética (TPO) pode ser usado numa preparação ou formulação farmacêutica estéril para estimular a actividade megacariocitopoiética ou trombopoiética em doentes que sofram de trombocitopenia devida à inibição de produção, sequestração ou aumento da destruição de plaquetas. A trombocitopenia associada a hipoplasia da medula óssea (e.g., anemia aplástica após quimioterapia ou transplante de medula óssea) pode ser eficazmente tratada com os compostos deste invento assim como perturbações tais como coagulação intravascular disseminada (DIC), trombocitopenia imune (incluindo ITP induzido por HIV e ITP não induzido por HIV), trombocitopenia idiopática crónica, trombocitopenia congénita, mielodisplasia e trombocitopenia trombótica. Ainda, estas proteínas megacariocitopoiéticas podem ser úteis no tratamento de doenças trombocitóticas mieloproliferativas assim como trombocitose derivada de estados inflamatórios e de deficiência em ferro.hematopoietic effector function and referred to herein as a megakaryocytopoietic or thrombocytopoietic (TPO) protein can be used in a sterile pharmaceutical preparation or formulation to stimulate megakaryocytopoietic or thrombopoietic activity in patients suffering from thrombocytopenia due to inhibition of production, sequestration or increased platelet destruction . Thrombocytopenia associated with bone marrow hypoplasia (eg, aplastic anemia after chemotherapy or bone marrow transplantation) can be effectively treated with the compounds of this invention as well as disorders such as disseminated intravascular coagulation (DIC), immune thrombocytopenia (including HIV-induced ITP) and HIV-induced ITP), chronic idiopathic thrombocytopenia, congenital thrombocytopenia, myelodysplasia and thrombotic thrombocytopenia. In addition, these megakaryocytopoietic proteins may be useful in the treatment of myeloproliferative thrombocytic diseases as well as thrombocytosis derived from inflammatory and iron deficiency states.

As utilizações preferidas da proteína megacriocitopoiética ou trombocitopoiética (TPO) deste invento são conjuntamente com quimioterapia mielotóxica, quimioterapia mieloablativa e trombocitopenia devida a falhas da medula óssea.The preferred uses of the megakryocytopoietic or thrombocytopoietic (TPO) protein of this invention are in conjunction with myelotoxic chemotherapy, myeloablative chemotherapy and thrombocytopenia due to bone marrow failure.

Ainda outras perturbações geralmente tratadas com as proteínas megacariocitopoiéticas deste invento incluem defeitos ou danificação de plaquetas devido a drogas, envenenamento ou activação em superfícies artificiais. Nestes casos, os presentes compostos podem ser empregues para estimular a protecção de novas plaquetas não danificadas. Para uma lista de aplicações úteis mais completa ver o Fundamento supra, especialmente a secção (a)-(f) e as referências aí citadas.Still other disorders generally treated with the megakaryocytopoietic proteins of this invention include defects or damage to platelets due to drugs, poisoning or activation on artificial surfaces. In these cases, the present compounds can be employed to stimulate protection from new, undamaged platelets. For a more complete list of useful applications see the Background above, especially section (a) - (f) and the references cited there.

As proteínas megacariocitopoiéticas do presente invento podem ser empregues sozinhas ou em combinação comThe megakaryocytopoietic proteins of the present invention can be employed alone or in combination with

153 outras citoquinas, hematopoietinas, interleuquinas, factores de crescimento ou anticorpos no tratamento das perturbações e estados atrás identificados. Assim, os presentes compostos podem ser empregues em combinação com outra proteína ou peptídeo tendo actividade trombocitopoiética incluindo: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, eritropoietina (EPO), ligando kit, IL-6 e IL-11.153 other cytokines, hematopoietins, interleukins, growth factors or antibodies in the treatment of the disorders and conditions identified above. Thus, the present compounds can be employed in combination with another protein or peptide having thrombocytopoietic activity including: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, erythropoietin (EPO), ligand kit, IL-6 and IL-11.

As proteínas megacariocitopoiéticas do presente invento são preparadas numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta composição terapêutica pode ser administrada intravenosamente ou através do nariz ou pulmões. A composição pode também ser administrada parenteralmente ou subcutaneamente conforme pretendido. Quando administrada sistematicamente, a composição terapêutica deverá ser apirogénica e numa solução parenteralmente aceitável tendo em conta o pH, isotonicidade e estabilidade. Estas condições são conhecidas dos familiarizados com a matéria. Resumidamente, as formulações de dosagem dos compostos do presente invento são preparadas para armazenamento ou administração misturando o composto tendo o grau de pureza pretendido com veículos, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis. Tais materiais são não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões tais como fosfato, citrato, acetato e outros sais de ácidos orgânicos; antioxidantes tais como ácido ascórbico; peptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos) tas como poliarginina, proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, ácido glutãmico, ácido aspártico ou arginina; monossacáridos, dissacáridos e outros açúcares incluindo celulose ou seus derivados, glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; alcoóis de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contraiões tais como sódio e/ou tensioactivos não iónicos tais como Tween, Pluronics ou polietilenoglicol.The megakaryocytopoietic proteins of the present invention are prepared in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier. This therapeutic composition can be administered intravenously or through the nose or lungs. The composition can also be administered parenterally or subcutaneously as desired. When administered systematically, the therapeutic composition should be pyrogenic and in a parenterally acceptable solution taking into account pH, isotonicity and stability. These conditions are known to those familiar with the subject. Briefly, the dosage formulations of the compounds of the present invention are prepared for storage or administration by mixing the compound having the desired degree of purity with physiologically acceptable vehicles, excipients or stabilizers. Such materials are non-toxic to containers at the dosages and concentrations employed and include buffers such as phosphate, citrate, acetate and other salts of organic acids; antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight peptides (less than about ten residues) such as polyarginine, proteins, such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid or arginine; monosaccharides, disaccharides and other sugars including cellulose or its derivatives, glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; contractions such as sodium and / or non-ionic surfactants such as Tween, Pluronics or polyethylene glycol.

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Cerca de 0,5 a 500 mg de um composto ou mistura da proteína megacariocitopoiética como ácido ou base livre ou como um sal farmaceuticamente aceitável, juntamente com um veículo, excipiente, ligante, preservativo, estabilizador, aromatizante, etc., fisiologicamente aceitável, de acordo com a prática farmacêutica. A quantidade do ingrediente activo nestas composições é tal que se obtém uma dosagem adequada na gama indicada.About 0.5 to 500 mg of a compound or mixture of the megakaryocytopoietic protein as a free acid or base or as a pharmaceutically acceptable salt, together with a physiologically acceptable vehicle, excipient, binder, preservative, stabilizer, flavoring, etc. according to pharmaceutical practice. The amount of the active ingredient in these compositions is such that an adequate dosage in the indicated range is obtained.

Composições estéreis para injecção podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional. Por exemplo, pode-se pretender dissolução ou suspensão do composto activo num veículo tal como água ou um óleo vegetal natural tipo sésamo, de amendoim ou de algodoeiro ou num veículo gordo sintético como seja oleato de etilo ou similares. Tampões preservativos, antioxidantes e similares podem ser incorporados de acordo com a prática farmacêutica aceite.Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice. For example, it may be desired to dissolve or suspend the active compound in a vehicle such as water or a natural vegetable oil such as sesame, peanut or cotton or in a synthetic fatty vehicle such as ethyl oleate or the like. Preservative buffers, antioxidants and the like can be incorporated according to accepted pharmaceutical practice.

Exemplos adequados de preparações de liberação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo, matrizes essas que têm uma determinada forma, e.g. filmes ou microcápsulas. São exemplos de matrizes de libertação controlada incluem hidrogéis Γ e. g., poli(2-hidroxietilmetacrilato) como descrito por Langer, Chem. Tech., 1.2:98-105 [1982] ou polialcoól vinilico] polilactidos (Patente U.S. N2 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al. , Biopolymers, £2.:547-556 [1983]), etileno-acetato de vinilo não degradável (Langer et al., supra), copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácidoSuitable examples of controlled release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the polypeptide, which matrices have a particular shape, e.g. films or microcapsules. Examples of controlled release matrices include og and hydrogels. poly (2-hydroxyethylmethacrylate) as described by Langer, Chem. Tech., 1.2: 98-105 [1982] or polyalcoholic vinyl] polylactides (US Patent No. 3,773,919, EP 58,481), copolymers of L-glutamic acid and ethyl-L-glutamate range (Sidman et al., Biopolymers, £ 2. : 547-556 [1983]), non-degradable ethylene-vinyl acetate (Langer et al., Supra), degradable lactic-acid copolymers

TM glicolico tais como Lupron Depot (microsferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glic+olico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988).Glycolic TM such as Lupron Depot (injectable microspheres composed of copolymer of lactic acid-glycolic acid and leuprolide acetate) and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid (EP 133,988).

rr

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Se bem que os polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitam a libertação de moléculas durante cerca de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos mais curtos. Quando as proteínas encapsuladas permanecem no corpo durante muito tempo, podem desnaturar-se ou agregar-se como resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Podem ser projectadas estratégias racionais para a estabilização da proteína dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação fôr formação de ligações S-S intermoleculares através da troca de dissulfi tos, a estabilização resíduos sulfidrilo, ácidas, controle do pode ser conseguida modificando os liofilização a partir de soluções teôr em humidade, usando aditivos adequados e desenvolvendo composiçoes específicas de matrizes poliméricas.Although polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid allow the release of molecules for about 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter periods. When encapsulated proteins remain in the body for a long time, they can denature or aggregate as a result of exposure to moisture at 37 ° C, resulting in a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Rational strategies for protein stabilization can be designed depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is formation of intermolecular SS bonds through the disulfide exchange, stabilization of sulfhydryl, acidic residues, control of can be achieved by modifying lyophilization from moisture content solutions, using suitable additives and developing compositions specific polymer matrices.

As composições d.e proteína megacariocitopoiética de libertação controlada também incluem proteína megacarioctopoiética inserida dentro de lipossomas. Os lipossomas contendo proteína megacariocitopoiética são preparados por métodos conhecidos per se: DE 3,218,121; Epstein et al.. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4030-4034 [1980]; EP 52,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; pedido de patente japonesa 83-118008; patentes U.S. Nos. 4,485,045 e 4,544,545, e EP 102,324. Normalmente os lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (cerca de 200-800 Angstroms) em que o teôr em lípidos é superior a cerca de 30 mol% de colesterol, a proporção sendo ajustada a uma terapia óptima com a proteína megacariocitopoiética.Controlled-release megakaryocytopoietic protein compositions also include megakaryocytopoietic protein inserted within liposomes. Liposomes containing megakaryocytopoietic protein are prepared by methods known per se: DE 3,218,121; Epstein et al .. Proc. Natl Acad. Know. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Know. USA, 77: 4030-4034 [1980]; EP 52,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese patent application 83-118008; U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545, and EP 102,324. Usually the liposomes are of the small unilamellar type (about 200-800 Angstroms) in which the lipid content is greater than about 30 mol% of cholesterol, the proportion being adjusted to an optimal therapy with the megakaryocytopoietic protein.

A dosagem será determinada atendendo ao médico assistente tendo em consideração vários factores tais como doença, peso, sexo, dieta, tempo e via de administração, outros medicamentos e outros factores clínicos relevantes.The dosage will be determined according to the attending physician taking into account various factors such as disease, weight, sex, diet, time and route of administration, other drugs and other relevant clinical factors.

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Tipicamente, o regime diário será da gama de 0,1-100 Mg/Kg de peso. De preferência a dosagem variará de 0,l-50jng/Kg de peso. Mais preferencialmente, a dosagem variará entre 1 e 5^gKg/dia. Facultativamente, a gama de dosagem será a mesma que para outras citocinas, especialmente G-CSF, GM-CSF e EPO. Doses terapeuticamente eficazes podem ser determinadas por métodos in vitro e in vivo.Typically, the daily regimen will range from 0.1-100 mg / kg of weight. Preferably the dosage will vary from 0.1 to 50 µg / kg of weight. Most preferably, the dosage will vary between 1 and 5 µgKg / day. Optionally, the dosage range will be the same as for other cytokines, especially G-CSF, GM-CSF and EPO. Therapeutically effective doses can be determined by in vitro and in vivo methods.

EXEMPLOSEXAMPLES

Sem mais descrições, pensamos que os familiarizados com a matéria, usando a descrição anterior e os exemplos ilustrativos, podem executar e utilizar o presente invento na sua globalidade. Os exemplos que se seguem portanto apontam especificamente para realizações preferidas do presente invento e não devem ser encarados como limitantes no restante da divulgação.Without further description, we think that those familiar with the subject, using the previous description and illustrative examples, can execute and use the present invention in its entirety. The following examples therefore point specifically to preferred embodiments of the present invention and are not to be construed as limiting the rest of the disclosure.

EXEMPLO 1EXAMPLE 1

Purificação Parcial do Ligando mpl de PorcoPartial Purification of the Pig mpl Ligand

Plasma pobre em plaquetas foi colhido de porcos anémicos aplásticos por irradiação com 900 cGy de irradiação total do corpo usando um acelerador linear de 4mEV. Os porcos irradiados foram suportados durante 6-8 dias com injecções intramusculares de cefalozina. Subsequentemente, o seu volume total de sangue foi removido sob anestesia geral, heparinizado e centrifugado a 1800 x g durante 30 min. para fazer plasma pobre em plaquetas. Encontrou-se que a actividade estimuladora de megacariócitos teve um pico 6 dias após irradiação.Platelet-poor plasma was collected from aplastic anemic pigs by irradiation with 900 cGy of total body irradiation using a 4mEV linear accelerator. The irradiated pigs were supported for 6-8 days with intramuscular injections of cephalazine. Subsequently, their total blood volume was removed under general anesthesia, heparinized and centrifuged at 1800 x g for 30 min. to make platelet-poor plasma. Megakaryocyte-stimulating activity was found to peak 6 days after irradiation.

plasma de porco aplástico obtido a partir de porcos irradiados foi ajustado a 4M còm NaCl e agitado durante 30 min à temperatura ambiente. O precipitado resultante é removido por centrifugação a 3800 rpm numa Sorvallaplastic pig plasma obtained from irradiated pigs was adjusted to 4M with NaCl and stirred for 30 min at room temperature. The resulting precipitate is removed by centrifugation at 3800 rpm in a Sorvall

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RC3B e o sobrenadante aplicado numa coluna Pheny1-Toyopear1 (220 ml) equilibrada em NaPC>₄ 10 mM contendo NaCl 4M. A coluna foi lavada com este tampão até A_2gQ ser <0,05 e eluida com dH₂O. O pico de proteína eluido foi diluido com dH₂O até uma conductividade de 15mS e aplicado numa coluna de Blue-Sepharose equilibrada com PBS (240 ml). Subsequentemente, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de PBS e de NaPC>₄ 10 mM (pH 7,4) contendoureia 2M. As proteínas foram eluidas da coluna com NaPC>₄ 10 mM (pH 7,4) contendo ureia 2M e NaCl 1M. O pico da proteína eluida foi ajustado a 0,01% de octilglucósido(n-octil β-D-glucopiranósido) e EDTA e Pefablo 1 mM cada (Boerhinger Mannheim) e aplicado directamente a colunas ligadas em tandem de CD4-IgG (Capon, D.J. et al., Nature 337:525-531 [1989]) e mpl-IqG Ultralink (Pierce) (ver abaixo). A coluna CD4-IgG (2 ml) foi retirada após a amostra ser aplicada e a coluna de mpl-IqG (4 ml) foi lavada com 10 volumes de coluna de PBS e de PBS contendo NaCl 2M e eluida com glicina-HCl ο,ΙΜ pH 2,25. as fracções foram colhidas em 1/10 de volume de Tris-HCl 1M (pH 8,0).RC3B and the supernatant applied to a Pheny1-Toyopear1 column (220 ml) equilibrated in NaPC> ₄ 10 mM containing 4M NaCl. The column was washed with this buffer until A 2 _gQ was <0.05 and eluted with dH ₂ O. The eluted protein peak was diluted with dH ₂ O to a conductivity of 15mS and applied to a Blue-Sepharose column balanced with PBS ( 240 ml). Subsequently, the column was washed with 5 column volumes of PBS and NAPC> ₄ 10 mM (pH 7.4) contendoureia 2M. The proteins were eluted from the column with NAPC> ₄ 10 mM (pH 7.4) containing 2M urea and 1M NaCl. The peak of the eluted protein was adjusted to 0.01% octylglucoside (n-octyl β-D-glucopyranoside) and EDTA and 1 mM Pefablo each (Boerhinger Mannheim) and applied directly to tandem CD4-IgG linked columns (Capon, DJ et al., Nature 337: 525-531 [1989]) and mpl-IqG Ultralink (Pierce) (see below). The CD4-IgG column (2 ml) was removed after the sample was applied and the mpl-IqG column (4 ml) was washed with 10 column volumes of PBS and PBS containing 2M NaCl and eluted with glycine-HCl ο, ΙΜ pH 2.25. the fractions were collected in 1/10 volume of 1M Tris-HCl (pH 8.0).

A análise das fracções eluidas derivadas da coluna de afinidade com mpl por SDS-PAGE (4-20%, gel Novex) corrido em condições redutoras, revelou a presença de várias proteínas (Fig. 5). As proteínas que coraram com prata com a intensidade mais forte apresentaram Mr aparente de 66000, 55000, 30000, 28000 e 14000. Para determinar quais destas proteínas estimulam a proliferação de culturas de células Ba/F3-mpl estas proteínas foram eluidas do gel como descrito no Exemplo 2 abaixo.Analysis of the eluted fractions derived from the mpl affinity column by SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) run under reducing conditions, revealed the presence of several proteins (Fig. 5). The silver-stained proteins with the strongest intensity showed an apparent Mr of 66000, 55000, 30000, 28000 and 14000. To determine which of these proteins stimulate the proliferation of cultures of Ba / F3-mpl cells these proteins were eluted from the gel as described in Example 2 below.

Colunas de afinidade UltralinkUltralink affinity columns

10-20 mg de mpl-IqG ou CD4-IgG em PBS foram acoplados a 0,5 gramas de resina Ultralink (pierce) como descrito pelas instruções do fabricante.10-20 mg of mpl-IqG or CD4-IgG in PBS were coupled to 0.5 grams of Ultralink resin (pierce) as described by the manufacturer's instructions.

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Construção e expressão de mpl-IqGConstruction and expression of mpl-IqG

Uma molécula quimérica compreende todo o domínio extracelular do mpl humano (aminoácidos 1-491) e a região Fc de uma molécula de IgGl humana foi expressa em células 293. Um fragmento de cDNA codificador dos aminoácidos 1-491 de mpl humano foi obtido por PCR a partir de uma biblioteca de cDNA de células megacariocíticas humanas CMK e sequenciado. Um sítio Ciai foi inserido no extremo 5' e um sítio BstEII no extremo 3'. Este fragmento foi clonado a montante da região codificadora de Fc de IgGl num vector Bluescript entre os sítios Ciai e BstEII após digestão parcial do produto de PCR com BstEII devido à presença de dois outros sítios BstEII presentes no DNA codificador do domínio extracelular de mpl. 0 sítio BstEII introduzido no extremo 3' do produto de PCR foi projectado de forma a ter a região Fc na mesma grelha de leitura do domínio extracelular de mpl. A construção foi subclonada no vector pRK5-tkneo entre os sítios Ciai e Xbal e usada para transfectar células de rim embrionário humano 293 pelo método do fosfato de cálcio. As células foram seleccionadas em 0,4 mg/ml de G418 e isolados clones individuais. A expressão de mpl-IqG a partir de clones isolados foi determinada usando uma ELISA específica para Fc humano. O clone com melhor expressão tinha um nível de expressão de 1-2 mg/ml de mpl-IqG.A chimeric molecule comprises the entire extracellular domain of human mpl (amino acids 1-491) and the Fc region of a human IgGl molecule was expressed in 293 cells. A cDNA fragment encoding amino acids 1-491 of human mpl was obtained by PCR from a CMK human sequenced cDNA library of human megakaryocytes. A Ciai site was inserted at the 5 'end and a BstEII site at the 3' end. This fragment was cloned upstream of the IgGl Fc coding region in a Bluescript vector between the Ciai and BstEII sites after partial digestion of the PCR product with BstEII due to the presence of two other BstEII sites present in the DNA encoding the mpl extracellular domain. The BstEII site introduced at the 3 'end of the PCR product was designed to have the Fc region on the same reading frame as the mpl extracellular domain. The construct was subcloned into the pRK5-tkneo vector between the Ciai and Xbal sites and used to transfect human embryonic kidney 293 cells by the calcium phosphate method. The cells were selected in 0.4 mg / ml of G418 and individual clones were isolated. The expression of mpl-IqG from isolated clones was determined using an ELISA specific for human Fc. The best expressed clone had an expression level of 1-2 mg / ml mpl-IqG.

Células que expressam Ba/F3 mpl PCells that express Ba / F3 mpl P

Um clone de cDNA correspondendo a toda a região codificadora de mplP humano foi clonado em pRK5-tkneo que foi subsequentemente linearizado com Notl e usado para transfectar a linha celular dependente de IL-3 Ba/F3 por electroporação (1 x 10⁷ células, 9605F, 250 Volts). Três dias mais tarde iniciou-se a selecção na presença de 2 mg/ml de G418. As células foram seleccionadas em conjuntos ou clones individuais foram obtidos por diluição limite em placas de 96 cavidades. As células seleccionadas foram rA cDNA clone corresponding to the entire human mplP coding region was cloned into pRK5-tkneo which was subsequently linearized with Notl and used to transfect the IL-3 Ba / F3-dependent cell line by electroporation (1 x 10 ⁷ cells, 9605F , 250 Volts). Three days later, selection started in the presence of 2 mg / ml G418. The cells were selected in sets or individual clones were obtained by limit dilution in 96 well plates. The selected cells were r

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mantidas em RPMI contendo 15% FBS, 1 mg/ml G418, glutamina 20 mM, HEPES 10 mM e 100 Mg/ml de Pen-Strep. A expressão de mpl P em clones seleccionados foi determinada por análise FACS usando um anticorpo policlonal de coelho anti-mpl.maintained in RPMI containing 15% FBS, 1 mg / ml G418, 20 mM glutamine, 10 mM HEPES and 100 mg / ml Pen-Strep. The expression of mpl P in selected clones was determined by FACS analysis using a polyclonal rabbit anti-mpl antibody.

Ensaio do ligando de Ba/F3 mplBa / F3 mpl ligand assay

O ensaio do ligando de mpl foi realizado como se mostra na Fig. 2. Para determinar a presença do ligando de mpl derivado de várias fontes, células mpl P Ba/F3 foram sujeitas a jejum de IL-3 durante 24 horas a uma densidade 5 ) celular de 5 x 10 células/ml numa câmara humidificada aThe mpl ligand assay was performed as shown in Fig. 2. To determine the presence of the mpl ligand derived from various sources, P Ba / F3 mpl cells were fasted from IL-3 for 24 hours at a density 5 ) cell of 5 x 10 cells / ml in a humidified chamber at

37°C em 5% de C0₂ e ar. Após jejum de IL-3 as células foram semeadas em placas de cultura de 96 cavidades a uma densidade de 50000 células em 200 μΐ de meio com ou sem amostras diluídas e cultivadas durante 24 horas numa estufa de cultura de tecidos. 20 μ.1 de meio RPMI sem soro contendo 1 337 ° C in 5% CO ₂ and air. After IL-3 fasting, cells were seeded in 96-well culture plates at a density of 50,000 cells in 200 μΐ of medium with or without diluted samples and cultured for 24 hours in a tissue culture oven. 20 μ.1 RPMI medium without serum containing 1 3

MCi de H-timidma foi adicionado a cada uma das cavidades durante as últimas 6-8 horas. As células foram então colhidas em placas de filtros GF/C e lavadas 5 vezes com água. Os filtros foram contados na presença de 40 μΐ de fluido de cintilação (Microscint 20) num contador Packard Top Count.H-thymidma MCi was added to each well during the last 6-8 hours. The cells were then harvested on GF / C filter plates and washed 5 times with water. The filters were counted in the presence of 40 μΐ of scintillation fluid (Microscint 20) in a Packard Top Count counter.

EXEMPLO 2EXAMPLE 2

Ligando de mpl de Porco Altamente PurificadoHighly Purified Pork mpl binding

Protocolo de eluição do gelGel elution protocol

Quantidades iguais de ligando de mpl purificado por afinidade (fracção 6 eluida a partir da coluna de mpl-IgG) e tampão de amostra de Laemmli 2x foram misturados à temperatura ambiente sem agente redutor e aplicado num gel de 4-20% de poliacrilamida taão depressa quanto possível. A amostra não foi aquecida. Como testemunha, um tampão de amostra sem ligando foi corrido numa faixa adjacente. 0 gel correu a 4-6°C a 135 Volts durante aproximadamente 2 1/4 rEqual amounts of affinity purified mpl ligand (fraction 6 eluted from the mpl-IgG column) and 2x Laemmli sample buffer were mixed at room temperature without reducing agent and applied to a 4-20% polyacrylamide gel as quickly as possible. The sample was not heated. As a control, a sample buffer without ligand was run in an adjacent strip. The gel ran at 4-6 ° C at 135 Volts for approximately 2 1/4 r

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horas. O tampão de corrida estava inicialmente à temperatura ambiente. O gel foi então removido do sistema e a placa de um lado do gel removida.hours. The running buffer was initially at room temperature. The gel was then removed from the system and the plate on one side of the gel removed.

Uma réplica do gel foi feita em nitrocelulose como se segue: um pedaço de nitrocelulose foi molhado com água destilada e cuidadosamente aplicada sobre a face do gel exposto de forma a excluir as bolhas de ar. Colocaram-se marcas na nitrocelulose e no gel de forma a poder-se reposicionar a réplica após coloração. Passados aproximadamente 2 minutos, a nitrocelulose foi cuidadosamente retirada e o gel foi envolvido em película de plástico e colocado no frigorífico. A nitrocelulose foi corada por coloração de proteínas totais com ouro da Biorad agitando-a primeiro em 3x 10 ml de 0,5% Tween 20 + NaCl 0,5M + Tris-HCl 0,1M pH 7,5 durante aproximadamente 45 minutos seguido de 3x 10 ml de água purificada durante 5 minutos. A coloração com ouro foi então adicionada e deixada revelar até as bandas dos padrões ficarem vísiveis. A replica foi então lavada com água, colocada sobre a película de plástico envolvendo o gel e cuidadosamente alinhado com as marcas. As posições dos padrões Novex foram marcados na placa do gel e desenhadas linhas para indicar posições de corte. A nitrocelulose e película de plástico foram então removidas e o gel cortado ao longo das linhas indicadas usando uma lâmina de barbear. Os cortes prolongaram-se para lá das faixas com amostras de forma a poder ser usada para determinar as posições das fatias quando o gel foi corado. Após remoção das fatias, o rstante gel foi corado comprata e as posições dos padrões e das marcas cortadas forma medidas. Os pesos moleculares correspondendo às posições cortadas foram determinados a aprtir dos padrões Novex.A replica of the gel was made in nitrocellulose as follows: a piece of nitrocellulose was wetted with distilled water and carefully applied on the face of the exposed gel in order to exclude air bubbles. Marks were placed on the nitrocellulose and gel in order to be able to reposition the replica after staining. After approximately 2 minutes, the nitrocellulose was carefully removed and the gel was wrapped in plastic wrap and placed in the refrigerator. The nitrocellulose was stained by staining total proteins with gold from Biorad, shaking it first in 3x 10 ml of 0.5% Tween 20 + 0.5M NaCl + 0.1M Tris-HCl pH 7.5 for approximately 45 minutes followed by 3x 10 ml of purified water for 5 minutes. The gold stain was then added and allowed to reveal until the bands of the patterns were visible. The replica was then washed with water, placed on the plastic film surrounding the gel and carefully aligned with the marks. The positions of the Novex standards were marked on the gel plate and lines were drawn to indicate cutting positions. The nitrocellulose and plastic wrap were then removed and the gel cut along the indicated lines using a razor blade. The cuts extended beyond the sample strips so that it could be used to determine the positions of the slices when the gel was stained. After the slices were removed, the remaining gel was stained on the table and the positions of the cut patterns and marks were measured. The molecular weights corresponding to the cut positions were determined from Novex standards.

As doze fatias de gel foram colocadas nas células de dois electroeluidores Biorad modelo 422. nas células usaram-se tampas de membrana com um poro de xclusão de 12-14K. o Tampão de eluição foi bicarbonato de amónio 50 mMThe twelve slices of gel were placed in the cells of two Biorad model 422 electroelucers. In the cells, membrane caps with a 12-14K exclusion pore were used. the Elution buffer was 50 mM ammonium bicarbonate

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+ 0,05% SDS (aproximadamente pH 7,8). Um litro de tampão foi arrefecido aproximadamente durante 1 hora numa câmara fria a 4-6°C antes de ser usado. As fatias de gel foram eluidas a 10 ma/célula (40 v inicialmente) numa câmara fira a 4-6°C. A eluição decorreu durante aproximadamente 4 horas. As células foram então cuidadosamente retiradas e o líquido acima do esmerilado removido com uma pipeta. A câmara de eluição foi retirada e qualquer líquido acima da tampa de membrana foi retirado com uma pipeta. O líquido dentro da tampa de membrana foi retirado com uma Pipetman e guardado. Alíquotas de cinquenta μΐ de água purificada foram então colocadas na tampa, agitadas e removidas até os cristais de SDS dissolverem. Estes líquidos de lavagem foram combinados com o líquido anteriormente guardado. 0 volume total de eluição da amostra foi de 300-500μ1 por fatia de gel. As amostras foram colocadas em tubo de diãlise Spectrapor 4 de 10 mm com uma exclusão de 12-14K o qual tinha sido previamente lavado durante várias horas em água purificada. Dialisaram-se durante a noite a 4-6°C contra 600 ml de tampão de fosfatos salino (PBS é aproximadamente 4 mM relativamente ao potássio) por 6 amostras. 0 tampão foi substituído na manhã seguinte e a diãlise continuou durante 2,5 horas. As amostras forma então retiradas dos sacos de diãlise e colocadas em microtubos. Os tubos foram colocados em gelo durante 1 hora, centrifugados a 14K rpm durante 3 min. e os sobrenadantes cuidadosamente removidos do SDS precipitado. Os sobrenadantes foram então colocados em gelo durante aproximadamente mais 1 hora e microcentrifugados novamente durante 4 min. Os sobrenadantes foram diluídos em tampão de fosfatos salino e sujeitos ao ensaio de actividade. As restantes amostras foram congeladas a -70°C.+ 0.05% SDS (approximately pH 7.8). One liter of buffer was cooled for approximately 1 hour in a cold chamber at 4-6 ° C before use. The gel slices were eluted at 10 ma / cell (40 v initially) in a cold chamber at 4-6 ° C. Elution took place for approximately 4 hours. The cells were then carefully removed and the liquid above the ground glass was removed with a pipette. The elution chamber was removed and any liquid above the membrane cap was removed with a pipette. The liquid inside the membrane cap was removed with a Pipetman and saved. Fifty μΐ aliquots of purified water were then placed on the lid, shaken and removed until the SDS crystals dissolved. These washing liquids were combined with the previously stored liquid. The total elution volume of the sample was 300-500μ1 per slice of gel. The samples were placed in a 10 mm Spectrapor 4 dialysis tube with an exclusion of 12-14K which had previously been washed for several hours in purified water. They were dialyzed overnight at 4-6 ° C against 600 ml of phosphate buffered saline (PBS is approximately 4 mM relative to potassium) for 6 samples. The buffer was replaced the next morning and dialysis continued for 2.5 hours. The samples were then removed from the dialysis bags and placed in microtubes. The tubes were placed on ice for 1 hour, centrifuged at 14K rpm for 3 min. and supernatants carefully removed from the precipitated SDS. The supernatants were then placed on ice for approximately 1 more hour and microcentrifuged again for 4 min. The supernatants were diluted in phosphate buffered saline and subjected to the activity assay. The remaining samples were frozen at -70 ° C.

EXEMPLO 3EXAMPLE 3

Micro-sequenciação do ligando de mpl de porcoMicro-sequencing of pig mpl ligand

A fracção 6 (2,6 ml) da coluna de afinidadeFraction 6 (2.6 ml) of the affinity column

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mpl-IgG foi concentrada em Microcon-10 (Amicon). Para evitar que o ligando de mpl adsorvesse a Microcon, a membrana foi lavada com 1% de SDS e 5μ1 de SDS a 10% foi adicionado à fracção 6. Adicionou-se tampão de amostra (20 μΐ) 2x à fracção #6 após concentração com Microcon (20 μΐ) e o volume total (40μ1) foi aplicado de uma sóvez num gel de gradiente de 4-20% de acrilamida (Novex). O gel correu segundo o protocolo Novex. Equilibrou-se depois o gel durante 5 min. antes de electrotransferência em tampão de ácido 3-(ciclo-hexilamino)-1-propanossulfónico (CAPS), pH 11,0, contendo 10% de metanol. A electrotransferência para membranas Immobilon-PSQ (Millipore) foi realizada durante 45 min. a 250 mA a corrente constante numa célula de transferência Trans-Blot BioRad (32). A membrana PVDF foi corada com 0,1% de azul Coomassie R-250 em 40% de metanol, 0,1% de ácido acético durante 1 min e descorada durante 2-3 min. com ácido acético a 10% em metanol a 50%. As únicas proteínas que foram visíveis na região de Mr 18000-35000 da transferência tinham uma Mr de 30000, 280Ό0 e 22000.mpl-IgG was concentrated on Microcon-10 (Amicon). To prevent the mpl ligand from adsorbing to Microcon, the membrane was washed with 1% SDS and 5μ1 of 10% SDS was added to fraction 6. Sample buffer (20 μΐ) was added to fraction # 6 after concentration with Microcon (20 μΐ) and the total volume (40μ1) was applied all at once on a 4-20% acrylamide gradient gel (Novex). The gel ran according to the Novex protocol. The gel was then equilibrated for 5 min. before electrotransfer in 3- (cyclohexylamino) -1-propanesulfonic acid (CAPS) buffer, pH 11.0, containing 10% methanol. Electrotransfer for Immobilon-PSQ membranes (Millipore) was performed for 45 min. at 250 mA the constant current in a Trans-Blot BioRad transfer cell (32). The PVDF membrane was stained with 0.1% Coomassie R-250 blue in 40% methanol, 0.1% acetic acid for 1 min and bleached for 2-3 min. with 10% acetic acid in 50% methanol. The only proteins that were visible in the Mr 18000-35000 region of the transfer had a Mr of 30000, 280Ό0 and 22000.

As bandas a 30, 28 e 22 kDa foram sujeitas a sequenciação de proteína. Realizou-se sequenciação automática de proteína num sequenciador da Applied Biosystem modelo 470A equipado com um analisador PTH. O sequenciador foi modificado para injectar 80-90% da amostra (Rodriguez, J. Chromatogr., 350:217-225 [1985]). Adicionou-se acetona (~12 μΐ/ΐ) ao solvente A para equilibrar a absorvância de UV. As proteínas electrotransferidas foram sequenciadas na cassete Blott. Os picos foram integrados com software Justice Innovation usando interfaces Nelson Analytical 970. A interpretação da sequência foi realizada num VAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404:41-52 [1987]). As sequências N-terminais (usando o código de uma só letra com alguns resíduos duvidosos entre parêntesis) e a quantidade de material obtido (entre parêntesis rectos) está apresentado na Tabela 2'.The bands at 30, 28 and 22 kDa were subjected to protein sequencing. Automatic protein sequencing was performed on an Applied Biosystem model 470A sequencer equipped with a PTH analyzer. The sequencer was modified to inject 80-90% of the sample (Rodriguez, J. Chromatogr., 350: 217-225 [1985]). Acetone (~ 12 μΐ / ΐ) was added to solvent A to balance the UV absorbance. The electrotransferred proteins were sequenced on the Blott cassette. The peaks were integrated with Justice Innovation software using Nelson Analytical 970 interfaces. Sequence interpretation was performed on a VAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404: 41-52 [1987]). The N-terminal sequences (using the one-letter code with some doubtful residues in parentheses) and the amount of material obtained (in square brackets) is shown in Table 2 '.

rr

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TABELA 2'TABLE 2 '

Sequências do Extremo Amina do Ligando de mplMpl Ligand Extreme Amine Strings

30 KDa [1,8 pmol] 15 10 15 20 25 (S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL 30 KDa [1.8 pmol] 15 10 15 20 25 (S) PAPPA (C) DPRLLNKLLRDD (H / S) VLH (G) RL (SEQ ID NO:30) (SEQ ID NO: 30) 28 KDa [0,5 pmol] 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR 28 KDa [0.5 pmol] 1 5 10 15 20 25 (S) PAPPAXDPRLLNKLLRDD (H) VL (H) GR (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO: 31) 18-22 KDa [0,5 pmol] 1 5 10 XPAPPAXDPRLX(N)(K) 18-22 KDa [0.5 pmol] 1 5 10 XPAPPAXDPRLX (N) (K) (SEQ ID NO:32) (SEQ ID NO: 32)

EXEMPLO 4EXAMPLE 4

Ensaio de Megacariocitopoiese Líquido em SuspensãoSuspended Liquid Megakaryocytosis Assay

Células estemina.is periféricas humanas (PSC) (obtidas de doentes que deram os seu consentimento) foram diluidas 5 vezes com meio IMDM (Gibco) e centrifugadas durante 15 minutos à temperatura ambiente a 800xg. Os sedimentos de células foram ressuspensos em IMDM e colocados sobre 60% de Percoll (densidade 1,077 g/ml) (Pharmacia) e centrifugados a 800xg durante 30 min. As células mononucleares de baixa densidade foram aspiradas na interface e lavadas 2x com IMDM e semeadas a 1-2 x 10⁶ células/ml em IMDM contendo 30% de FBS (1 ml de volume final) em placas de cultura de tecidos de 24 cavidades (Costar). APP ou APP sem ligando de mpl foi adicionado a 10% e as culturas crescidas durante 12-14 dias numa estufa humidificada a 37°C numa atmosfera de 5% de CO₂ e ar. As culturas foram também crescidas na presença de 10% APP com 0,5/xg de mpl-IqG adicionado aos dias 0, 2 e 4. APP foi liberto do ligando de mpl por passagem do APP através de uma coluna de afinidade mpl-IqG.Human peripheral stem cells (PSC) (obtained from patients who have given their consent) were diluted 5 times with IMDM medium (Gibco) and centrifuged for 15 minutes at room temperature at 800xg. The cell pellets were resuspended in IMDM and placed on 60% Percoll (density 1.077 g / ml) (Pharmacia) and centrifuged at 800xg for 30 min. Low-density mononuclear cells were aspirated at the interface and washed 2x with IMDM and seeded at 1-2 x 10 ⁶ cells / ml in IMDM containing 30% FBS (1 ml final volume) in 24-well tissue culture plates (Costar). APP or APP without mpl ligand was added at 10% and the cultures grown for 12-14 days in a humidified greenhouse at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ and air. Cultures were also grown in the presence of 10% APP with 0.5 µg of mpl-IqG added on days 0, 2 and 4. APP was released from the mpl ligand by passing the APP through an mpl-IqG affinity column .

rr

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Para quantificar a megacariocitopoiese nestas culturas em suspensão, usou-se uma modificação de Solberg et al. a qual emprega um anticorpo monoclonal IgG de murganho marcado radioactivamente (HP1-1D) contra GPIIblIIa (fornecido pelo Dr. Nichols, Mayo Clinic). 100 μ9 de HP1-1D (ver Grant, B. et a 1. , Blood 69 : 1334-1339 [1987]) foi marcadoTo quantify megakaryocytopiesis in these suspension cultures, a modification by Solberg et al. which employs a radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody (HP1-1D) against GPIIblIIa (provided by Dr. Nichols, Mayo Clinic). 100 μ9 of HP1-1D (see Grant, B. et a 1., Blood 69: 1334-1339 [1987]) was scored

125 radioactivamente com 1 mCi de Na I usando Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) como descrito nas instruções do fabricante. HP1-1D marcado radioactivamente foi guardado a -70°C em PBS contendo 0,01% de octil-glucósido. Actividades específicas típicas foram de 1-2 x 10° ορτη/μς (>95% precipitado por ácido tricloroacético a 12,5%).125 radioactively with 1 mCi of Na I using Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) as described in the manufacturer's instructions. Radioactively labeled HP1-1D was stored at -70 ° C in PBS containing 0.01% octyl-glucoside. Typical specific activities were 1-2 x 10 ° ορτη / μς (> 95% precipitated by 12.5% trichloroacetic acid).

As culturas em suspensão foram feitas em triplicado para cada ponto experimental. Após 12-14 dias em cultura as culturas de 1 ml foram transferidas para tubos eppendorf de 1,5 ml e centrifugadas a 800xg durante 10 min. à temperatura ambiente e os sedimentos de células resultantes foram ressuspensos em 100μ1 de PB.S contendo 0,02% de EDTA e 20% de 12 5 soro de vitela. 10 ng de I-HP1-1D em 50μ1 de tampão de ensaio foi adicionado às culturas em suspensão e incubado durante 60 minutos à temperatura ambiente (t.a.) com agitação ocasional. Subsequentemente as células form colhidas por centrifugação a 800xg durante 10 min. à t.a. e lavadas 2x com tampão de ensaio. Os sedimentos foram contados durante 1 min. num contador gama (Packard). A ligação inespecífic foi determinada pela adição de lMg de HP1-1D não marcado durante 60 min. antes da adição de HP1-1D marcado. A ligação especí125 fica foi determinada como o total de I-HP1-1D ligado menos o ligado na presença de excesso de HP1-1D não marcado.Suspension cultures were made in triplicate for each experimental point. After 12-14 days in culture, the 1 ml cultures were transferred to 1.5 ml eppendorf tubes and centrifuged at 800xg for 10 min. at room temperature and the resulting cell pellets were resuspended in 100μ1 of PB.S containing 0.02% EDTA and 20% of 12 calf serum. 10 ng of I-HP1-1D in 50μ1 of assay buffer was added to the suspended cultures and incubated for 60 minutes at room temperature (rt) with occasional shaking. Subsequently, the cells were harvested by centrifugation at 800xg for 10 min. at r.t. and washed 2x with assay buffer. Sediments were counted for 1 min. in a gamma counter (Packard). Non-specific binding was determined by adding 1Mg of unlabeled HP1-1D for 60 min. before adding labeled HP1-1D. Specific binding was determined as the total of minus bound I-HP1-1D minus the bound in the presence of excess unlabeled HP1-1D.

EXEMPLO 5EXAMPLE 5

Oligonucleótidos Iniciadores para PCRPCR Primer Oligonucleotides

Com base na sequência de aminoácidos do extremo rBased on the amino acid sequence of the end r

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amino obtida a partir das proteínas de 30 KDa, 28 KDa e 18-22 KDa, projectaram-se oligonucleótidos degenerados para usar como iniciadores da reacção em cadeia com polimerase (PCR) (ver Tabela 4). Sintetizaram-se dois conjuntos de iniciadores, um conjunto de 20 meros codificadores dos resíduos de aminoácidos 2-8 (mpl 1) e um conjunto de 21-meros anticodões complementares de sequências codificadoras dos aminoácidos 18-24 (mpl 2).amino obtained from the 30 KDa, 28 KDa and 18-22 KDa proteins, degenerate oligonucleotides were designed to use as polymerase chain reaction (PCR) primers (see Table 4). Two sets of primers were synthesized, a set of 20 mere coders for amino acid residues 2-8 (mpl 1) and a set of 21-mere complementary anti-codons of coding sequences for amino acids 18-24 (mpl 2).

TABELA 4TABLE 4

Conjuntos de Oligonucleótidos Iniciadores DegeneradosDegenerate Primer Oligonucleotide Sets

mpl 1:5'CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (Degenerado 2048 vezes) mpl 1: 5'CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3 '(Degenerate 2048 times) (SEQ ID NO.35) (SEQ ID NO.35) mpl 2:5'NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3' (Degenerado 2048 vezes) mpl 2: 5'NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3 '(Degenerated 2048 times) (SEQ ID NO:36) (SEQ ID NO: 36)

DNA genómico de porco, isolado a partir de linfócitos do sangue periférico de porco, foi usado como molde para PCR. A reacção de 50 μΐ continha: 0,8 μg de DNA genómico de porco em Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KC1 50 mM, MgCl^ 3mM, 100 Mg/ml BSA, dNTPs 400 gM, cada um dos conjuntos de iniciadores 1 μΜ e 2,5 unidades de polimerase Taq. A desnaturação inicial do molde foi a 94 °C durante 8 min. seguido de 35 ciclos de 45 segundos a 94°C, 1 min. a 55°C e 1 min. a 72°C. Deixou-se prolongar o ciclo final durante 10 minutos a 72°C. Os produtos de PCR foram separados por electroforese num gel de 12% de poliacrilamida e visualizado por coloração com brmeto de etídio. Pensou-se que se a sequaência de aminoácidos do extremo amino fosse codificado por um só exão então o produto de PCR correcto seria de 69 pb. Um fragmento deste tamanho foi eluido do gel e subclonado em pGEMT (Promega). As sequências dos três clones estão apresentadas abaixo na Tabela 5.Pig genomic DNA, isolated from lymphocytes from pig peripheral blood, was used as a template for PCR. The 50 μΐ reaction contained: 0.8 μg of genomic pig DNA in 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 3 mM MgCl, 100 mg / ml BSA, 400 gM dNTPs, each of sets of primers 1 μΜ and 2.5 units of Taq polymerase. The initial denaturation of the mold was at 94 ° C for 8 min. followed by 35 45-second cycles at 94 ° C, 1 min. at 55 ° C and 1 min. at 72 ° C. The final cycle was allowed to extend for 10 minutes at 72 ° C. The PCR products were separated by electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel and visualized by staining with ethidium boride. It was thought that if the amino acid sequence of the amino terminus were encoded by a single exon then the correct PCR product would be 69 bp. A fragment of this size was eluted from the gel and subcloned into pGEMT (Promega). The sequences of the three clones are shown below in Table 5.

rr

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TABELA 5TABLE 5

Fragmentos de DNA Genómico de Porco com 69 pb gemT3Pig Genomic DNA Fragments with 69 bp gemT3

5'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT5'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA IncorporaçõesCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT

TGACCACGTT CAGCACGGC [69 pb] (SEQ ID NO: 37)TGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 37)

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG (SEQ ID NO: 38) gemT7ACTGGTGCAA GTCGTGCCG (SEQ ID NO: 38) gemT7

5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCAÇT5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA IncorporaçõesCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCAÇT

CGACCACGTC CATCACGGC [69 pb] (SEQ ID NO: 39) GCTGGTGCAG GTAGTGCCG (SEQ ID NO: 40) gemT9CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 39) GCTGGTGCAG GTAGTGCCG (SEQ ID NO: 40) gemT9

PRLLNKLL R(SEQ IDPRLLNKLL R (SEQ ID

NO: 32)NO: 32)

5'CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG5'CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG

3'GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCAÇTGÇ3'GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCAÇTGÇ

ATCATGTCTATCACGGT 3'(SEQ ID NO: 41) TAGTACAGATAGTGCCA 5'(SEQ ID NO: 42)ATCATGTCTATCACGGT 3 '(SEQ ID NO: 41) TAGTACAGATAGTGCCA 5' (SEQ ID NO: 42)

A posição dos iniciadores de PCR está sublinhada. Estes resultados estão de acordo com a sequência N-terminal obtida para os aminoácidos 9-17 das proteínas de 30 KDa, 28 KDa e 18-22 KDa e indicaram que esta sequência é codificada por um único exão de DNA de porco.The position of the PCR primers is underlined. These results are in accordance with the N-terminal sequence obtained for amino acids 9-17 of the 30 KDa, 28 KDa and 18-22 KDa proteins and indicated that this sequence is encoded by a single exon of pig DNA.

EXEMPLO 6EXAMPLE 6

Gene do Ligando de mpl HumanoHuman mpl Ligand gene

Com base nos resultados do Exemplo 5, projectou-se e sintetizou-se um desoxioligonucleótido de 45-meros, chamado pR45 para o despiste de uma biblioteca genómica. O 45-mero tinha a seguinte sequência:Based on the results of Example 5, a 45-mer deoxy oligonucleotide, called pR45, was designed and synthesized for screening a genomic library. The 45-mer had the following sequence:

rr

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5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3' (SEQ ID NO:28) • 3 25'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3 '(SEQ ID NO: 28) • 3 2

Este oligonucleótido foi marcado com (gama P)-ATP e cinase de T4 e usado para o despiste de uma biblioteca de DNA genómico humano em lambdageml2 em condições de hibridação e lavagem de baixa restringência (ver Exemplo 7). Os clones positivos foram picados, purificados por placa e analisados por mapeamento de restrição e transferência Southern. 0 clone #4 foi seleccionado para posterior análise.This oligonucleotide was labeled with (gamma P) -ATP and T4 kinase and used for screening a library of human genomic DNA in lambd2 under hybridization and low stringency conditions (see Example 7). Positive clones were minced, plate purified and analyzed by restriction mapping and Southern blotting. Clone # 4 was selected for further analysis.

Um fragmento BamHI-Xbal de 2,8 Kb que hibridou com o 45-mero foi subclonado em pBluescript SK . A sequenciação parcial do DNA deste clone foi realizada usando oligonucleótidos iniciadores específicos da sequência de DNA do ligando de mpl de porco. A sequência obtida confirmou que tinha sido isolado o DNA codificador do homólogo humano do ligando de mpl de porco. Detectou-se um sítio de restrição EcoRI na sequência que permitiu isolar um fragmento EcoRI-Xbal de 390 pb a partir do fragmento BamHI-Xbal de 2,8 Kb para subcloná-lo em pBluescript SK .A 2.8 Kb BamHI-Xbal fragment that hybridized to the 45-mer was subcloned into pBluescript SK. Partial DNA sequencing of this clone was performed using specific oligonucleotide primers from the pig mpl ligand DNA sequence. The obtained sequence confirmed that the DNA encoding the human homologue of the pig mpl ligand had been isolated. An EcoRI restriction site was detected in the sequence that made it possible to isolate a 390 bp EcoRI-Xbal fragment from the 2.8 Kb BamHI-Xbal fragment to subclone it in pBluescript SK.

Ambas as cadeias deste fragmento foram sequenciadas. A sequência do DNA humano e a sequência de aminoácidos deduzida estão apresentadas na Fig. 9 (SEQ ID NOS: 3 & 4). As posições previstas dos intrões na sequência genómica estão também indicadas por setas e definem um exão putativo (exão 3).Both strands of this fragment have been sequenced. The human DNA sequence and the deduced amino acid sequence are shown in Fig. 9 (SEQ ID NOS: 3 & 4). The predicted positions of introns in the genomic sequence are also indicated by arrows and define a putative exon (exon 3).

A análise da sequência de aminoácidos prevista confirma que um resíduo serina é o primeiro aminoácido do ligando maduro de mpl, conforme determinado a partir da análise directa da sequência de aminoácidos. Imediatamente a montante deste codão a sequência de aminoácidos prevista éAnalysis of the predicted amino acid sequence confirms that a serine residue is the first amino acid in the mature mpl ligand, as determined from direct analysis of the amino acid sequence. Immediately upstream of this codon, the predicted amino acid sequence is

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altamente sugestiva de uma sequência sinal envolvida na secreção do ligando de mpl maduro. Esta região codificadora da sequência sinal é provavelmente interrompida na posição de nucleótido 68 por um intrão.highly suggestive of a signal sequence involved in the secretion of the mature mpl ligand. This region encoding the signal sequence is likely to be disrupted at nucleotide position 68 by an intron.

Na direcção 3' o exão parece terminar no nucleótido 196. Este exão codifica portanto uma sequência de 42 aminoácidos, 16 dos quais farão provavelmente parte de uma sequência sinal e 26 dos quais são parte do ligando de mpl maduro.In the 3 'direction the exon appears to end at nucleotide 196. This exon therefore encodes a sequence of 42 amino acids, 16 of which are likely to be part of a signal sequence and 26 of which are part of the mature mpl ligand.

EXEMPLO 7 cDNA do Ligando de mpl Humano de Tamanho CompletoEXAMPLE 7 Full Size Human mpl Ligand cDNA

Com base na sequência do exão 3 humano (Exemplo 6) foram sintetizados dois oligonucleótidos não degenerados correspondendo aos extremos 3' e 5' da sequência do exão 3 (Tabela 6).Based on the sequence of human exon 3 (Example 6) two non-degenerate oligonucleotides were synthesized corresponding to the 3 'and 5' ends of the exon 3 sequence (Table 6).

TABELA 6TABLE 6

Oligonucleótidos iniciadores não degenerados paraNon-degenerate primer oligonucleotides for

PCR com cDNA humanoPCR with human cDNA

Iniciador Fwd: 5' GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTC T 3' Fwd Initiator: 5 'GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTC T 3' (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 43) Iniciador Rvs: 5'CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3' Rvs Initiator: 5'CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3 ' (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 44)

Estes dois iniciadores foram usados nas reacções de PCR empregando como molde DNA de várias bibliotecas de cDNA humano ou 1 ng de Quick Clone cDNA (Clonetech) derivado de vários tecidos usando as condições descritas no Exemplo 5. 0 tamanho esperado para o produto de PCR foi de 140 pb. Após análise dos produtos de PCR num gel de poliacrilamida de 12%, um fragmento de DNA do tamanho esperado foi rThese two primers were used in PCR reactions employing DNA from several human cDNA libraries or 1 ng of Quick Clone cDNA (Clonetech) derived from various tissues using the conditions described in Example 5. The expected size for the PCR product was 140 bp. After analyzing the PCR products on a 12% polyacrylamide gel, a DNA fragment of the expected size was r

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detectado nas bibliotecas de cDNA preparadas a partir de rim adulto, células 293 de rim fetal e cDNA preparado a partir de fígado fetal humano (Clonetech cat.#7171-1).detected in cDNA libraries prepared from adult kidney, fetal kidney 293 cells and cDNA prepared from human fetal liver (Clonetech cat. # 7171-1).

Uma biblioteca de cDNA de fígado fetal em lambda DR2 (Clonetech cat.# HL1151X) foi despistada com o mesmo oligonucleótido de 45 meros usado no despiste da biblioteca genómica humana. O oligonucleótido foi marcado com (ga32 ma P)-ATP usando cinase de polinucleotidos de T4. A biblioteca foi despistada em condições de hibridação de baixa restringência. Os filtros foram pré-hibridados durante 2 hr e depois hibridados com a sonda durante a noita a 42°C em 20% de formamida, SSC 5x, Denhardt lOx, fosfato de sódio (pH 6,5), 0,1% de pirofosfato de sódio, 50μg/ml de DNA desperma de salmão sonicado durante 16 hr. Os filtros foram então lavados em SSC 2x e depois uma vez com SSC 0,5x, 0,1% de SDS a 42°C. Exposeram-se os filtros durante a noite a filme de raios X Kodak. Os clones positivos foram picados, purificados por plaqueamento e o tamanho do inserto determinado por PCR usando oliqonucleótidos delimitantes do sítio de clonagem BamHI-Xbal de lambda DR2 (Clonetech cat. #6475-1). 5 μΐ do stock de fagos foi usado como fonte do molde. A desnaturação inicial foi durante 7 min. a 94°C seguido de 30 ciclos de amplificação (1 min. a 94°C, 1 min. a 52°C e 1,5 min. a 72°C). A extensão final foi durante 15 minutos a 72°C. 0 clone #F12b tinha um inserto de 1,8 Kb e foi seleccionado para posterior análise.A fetal liver cDNA library in lambda DR2 (Clonetech cat. # HL1151X) was screened with the same 45 mer oligonucleotide used in screening the human genomic library. The oligonucleotide was labeled with (ga32 ma P) -ATP using T4 polynucleotide kinase. The library was screened under low stringency hybridization conditions. The filters were pre-hybridized for 2 hr and then hybridized with the probe overnight at 42 ° C in 20% formamide, 5x SSC, Denhardt 10x, sodium phosphate (pH 6.5), 0.1% pyrophosphate sodium, 50μg / ml of DNA wakes up sonicated salmon for 16 hr. The filters were then washed in 2x SSC and then once with 0.5x SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. The filters were exposed to Kodak X-ray film overnight. Positive clones were minced, plated purified and the size of the insert determined by PCR using oligonucleotides delimiting the lambda DR2 BamHI-Xbal cloning site (Clonetech cat. # 6475-1). 5 μΐ of the phage stock was used as the mold source. The initial denaturation was for 7 min. at 94 ° C followed by 30 amplification cycles (1 min at 94 ° C, 1 min at 52 ° C and 1.5 min at 72 ° C). The final extension was for 15 minutes at 72 ° C. Clone # F12b had a 1.8 Kb insert and was selected for further analysis.

plasmídeo pDR2 (Clonetech, lambda DR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook,p 42) entre os braços do fago lambda DR2, foi recuperado como descrito pelas instruções do fabricante (Clonetech, lambda DR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook,p 29-30). A análise de restrição do plasmídeo pDR2-F12b com BamHI e Xbal indicou a presença de um sítio de restrição BamHI interno no inserto aproximadamente na posição 650. A digestão do plasmídeo com BamHI-Xbal corta o rplasmid pDR2 (Clonetech, lambda DR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p 42) between the arms of lambda phage DR2, was retrieved as described by the manufacturer's instructions (Clonetech, lambda DR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook , p 29-30). Restriction analysis of plasmid pDR2-F12b with BamHI and Xbal indicated the presence of an internal BamHI restriction site in the insert at approximately position 650. Digestion of the plasmid with BamHI-Xbal cuts the r

170 inserto em dois fragmentos, um de 0,65 Kb e outro de 1,15 Kb. A sequência de DNA foi determinada com três classes diferentes de molde derivado do plasmídeo pDR2-F12b. A sequenciação do DNA do plasmídeo de cadeia dupla foi realizada com o sequenciador de DNA automático de fluorescência AB1373 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) usando protocolos convencionais para os trifosfatos de didesoxinucleótidos terminadores corados (terminadores corados) e iniciadores caminhantes sintetizados pelo cliente (Sanger et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467 [1977]; Smith et al., Nature, 321:674-679 [1986]). A sequenciação directa dos fragmentos de DNA amplificados por reacção em cadeia com PCR a partir do plasmídeo foi feita com o sequenciador ABI373 usando iniciadores do cliente e reacções com terminadores corados. 0 molde cadeia simples foi gerado com o vector M13 Janus (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21=3385-3390 [1993]). Os fragmentos BamHI-Xbal (1,15 Kb) e BamHI (0,65 Kb) foram isolados a partir do plasm.ídeo pDR2-FL2b, os extremos foram preenchidos com DNA-polimerase de T4 na presença de desoxinucleótidos e depois subclonados no sítio Smal de M13 Janus. A sequenciação foi realizada seguindo protocolos convencionais para os iniciadores universal e reverso para M13 corados ou iniciadores caminhantes e terminadores corados. As reacções de sequenciação manuais foram realizadas em DNA de M13 de cadeia simples usando iniciadores caminhantes e química convencional para terminadores didesoxi (Sanger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74.:5463-5467 [ 1977 ]) , ct-dATP170 inserted in two fragments, one 0.65 Kb and the other 1.15 Kb. The DNA sequence was determined with three different classes of template derived from plasmid pDR2-F12b. DNA sequencing of the double-stranded plasmid was carried out with the AB1373 fluorescence automatic DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California) using conventional protocols for the dyedoxynucleotide triphosphates (colored terminators) and walking primers synthesized by the client ( Sanger et al .. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 [1977]; Smith et al., Nature, 321: 674-679 [1986]). Direct sequencing of the DNA fragments amplified by PCR chain reaction from the plasmid was done with the ABI373 sequencer using client primers and reactions with stained terminators. The single-stranded template was generated with the Janus M13 vector (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21 = 3385-3390 [1993]). The BamHI-Xbal (1.15 Kb) and BamHI (0.65 Kb) fragments were isolated from the plasmid pDR2-FL2b, the ends were filled with T4 DNA polymerase in the presence of deoxynucleotides and then subcloned at the site Smal from M13 Janus. Sequencing was performed following conventional protocols for the universal and reverse primers for stained M13 or stained walkers and terminators. Manual sequencing reactions were performed on single-stranded M13 DNA using walking primers and conventional chemistry for didesoxy terminators (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74.:53463-5467 [1977]), ct-dATP

3 marcado com P e Sequenase (Umted States Biochem Corp., Cleveland, Ohio). A montagem da sequência de DNA foi realizada com Sequencher V2.Ibl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). As sequências de nucleótidos e de aminoácidos deduzida do hML estão apresentadas na Fig. 1 (SEQ ID NO:1).3 marked with P and Sequenase (Umted States Biochem Corp., Cleveland, Ohio). DNA sequence assembly was performed with Sequencher V2.Ibl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). The nucleotide and amino acid sequences deduced from hML are shown in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

rr

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EXEMPLO 8EXAMPLE 8

Isolamento do Gene do Ligando de mpl Humano (TPO)Isolation of the Human mpl Ligand Gene (TPO)

Clones de DNA genómico humano do gene de TPO foram isolados por despiste cde uma biblioteca genómica humana em Iambda-Geml2 com pR45, uma sonda de oligonucleótido anteriormente descrita em condições de baixa restringência (verHuman genomic DNA clones from the TPO gene were isolated by screening a human genomic library in Iambda-Geml2 with pR45, an oligonucleotide probe previously described under low stringency conditions (see

Exemplo 7) ou em condições de alta restringência com um fragmento correspondendo à metade 3' do cDNA humano codificador do ligando mpl (desde o sítio BamHI ate'ao extremoExample 7) or under high stringency conditions with a fragment corresponding to the 3 'half of the human cDNA encoding the mpl ligand (from the BamHI site to the extreme

3'). Isolaram-se dois clones de lambda sobreponíveis abrangendo 35 Kb. Dois fragmentos sobreponíveis (BamHI e EcoRI) contendo todo o gene do TPO foram subclonados e sequenciados. A estrutura do gene humano é composta por 6 exões dentro de 7Kb de DNA genómico (Fig. 14A, B e C). As fronteiras de todas as junções exão/intrão são consistentes com o motivo consensus estabelecido para os genes de mamíferos (Shapiro, M.B., et al. , Nucl. Acids Res. 15:7155 [1987]). O exão 1 e o exão 2 contem a sequência não traduzida 5' e os quatro aminoácidos iniciais do peptídeo sinal. O restante sinal de secreção e os primeiros 26 aminoácidos da proteína madura são codificados pelo exão 3. Todo o domínio carbonilo e 3' não traduzido assim como ~50 aminoácidos do domínio tipo eritropoietina são codificados pelo exão 6. Os quatro aminoácidos envolvidos na deleção observados dentro de hML-2(hTPO-2) são codificados no extremo 5' do exão.3 '). Two overlapping lambda clones spanning 35 Kb were isolated. Two overlapping fragments (BamHI and EcoRI) containing the entire TPO gene were subcloned and sequenced. The structure of the human gene is composed of 6 exons within 7Kb of genomic DNA (Fig. 14A, B and C). The boundaries of all exon / intron junctions are consistent with the consensus motif established for mammalian genes (Shapiro, M.B., et al., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exon 1 and exon 2 contain the 5 'untranslated sequence and the four initial amino acids of the signal peptide. The remaining secretion signal and the first 26 amino acids of the mature protein are encoded by exon 3. The entire carbonyl and 3 'untranslated domain as well as ~ 50 amino acids from the erythropoietin-like domain are encoded by exon 6. The four amino acids involved in the deletion observed within hML-2 (hTPO-2) they are encoded at the 5 'end of the exon.

EXEMPLO 9EXAMPLE 9

Expressão Transitória do Ligando de mpl Humano (hML)Transient Expression of Human mpl Ligand (hML)

Para subclonaro inserto de tamanho completo contido em pDR2-F12b, o plasmídeo foi digerido com Xbal totalmente, depois parcialmente digerido com BamHI. Um fragmento correspondendo a um inserto de 1,8 Kb foi rFor subclonaro full-size insert contained in pDR2-F12b, the plasmid was digested with Xbal fully, then partially digested with BamHI. A fragment corresponding to a 1.8 Kb insert was r

purificado em gel e subclonado em pRK5 (pRK5-hmpl I) (ver Patente U.S. N2 5,258,287 para a construção de pRK5) sob o controle do promotor precoce imediato de citomegalovírua. O DNA da construção pRK5-hmpl I foi preparado pelo método do PEG e usado para transfectar células 293 de rim embrionário humano mantidas em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM) suplementado com mistura de nutrientes F-12, Hepes 20 mM (pH7,4) e 10% de soro fetal bovino. As células foram transfectadas pelo método do fosfato de cálcio como descrito (Gorman, C. [1985] em DNA Cloning: A Praticai Approach (Glover, D.M., ed) Vol.II, pp. 143-190, IRL Press, Washington, D.C.) 36 horas após transfecção, o sobrenadante das células transfectadas foi testado quanto à actividade no ensaio de proliferação (ver Exemplo 1). 0 sobrenadante das células 293 transfectadas com o vector pRK não deu estimulação das células Ba/F3 ou Ba/F3-mpl (Fig. 12A).O sobrenadante das células transfectadas com pRK5-hmplI não teve efeito sobre as células Ba/F3mas estimulou dramaticamente a proliferação das células Ba/F3-mpl (Fig. 12A), indicando que este cDNA codifica um ligando de mpl humano funcionalmente activo.purified on gel and subcloned in pRK5 (pRK5-hmpl I) (see U.S. Patent No. 5,258,287 for the construction of pRK5) under the control of the immediate cytomegaloviral early promoter. The DNA of the pRK5-hmpl I construct was prepared by the PEG method and used to transfect human embryonic kidney 293 cells maintained in Dulbecco's modification Eagle's medium (DMEM) supplemented with a mixture of nutrients F-12, Hepes 20 mM (pH7, 4) and 10% fetal bovine serum. The cells were transfected by the calcium phosphate method as described (Gorman, C. [1985] in DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, DM, ed) Vol.II, pp. 143-190, IRL Press, Washington, DC ) 36 hours after transfection, the supernatant from the transfected cells was tested for activity in the proliferation assay (see Example 1). The supernatant of the 293 cells transfected with the pRK vector did not give stimulation of the Ba / F3 or Ba / F3-mpl cells (Fig. 12A). The supernatant of the cells transfected with pRK5-hmplI had no effect on the Ba / F3 cells but dramatically stimulated the proliferation of Ba / F3-mpl cells (Fig. 12A), indicating that this cDNA encodes a functionally active human mpl ligand.

EXEMPLO 10EXAMPLE 10

Isoformas do Ligando de mpl Humano hML2_z hML3 e hML4Human mpl Ligand isoforms hML2 _z hML3 and hML4

Para identificar formas montadas de forma alternativa do hML, sisntetizaram-se iniciadores correspondendo a cada um dos extremos da sequência codificadora de hML. Estes iniciadores foram empregues em RT-PCR para amplificar RNA de fígado adulto humano. Em adição, iniciadores delimitando regiões internas seleccionadas com interesse (ver abaixo) foram construídos e empregues de forma semelhante. A sequenciação directa dos extremos do produto de PCR revelou uma única sequência correspondendo exactamente à sequência do cDNA isolado a partir da biblioteca de fígado fetal humano (ver Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]). No entanto, uma região perto do rTo identify alternative forms of hML, primers corresponding to each end of the hML coding sequence were synthesized. These primers were employed in RT-PCR to amplify human adult liver RNA. In addition, primers delimiting selected internal regions of interest (see below) were constructed and employed in a similar manner. Direct sequencing of the ends of the PCR product revealed a single sequence corresponding exactly to the sequence of the cDNA isolated from the human fetal liver library (see Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]). However, a region close to the r

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extremo C do domínio EPO (no meio do produto de PCR) apresentou um padrão de sequências complexo sugerindo a existência de possíveis variantes de splicing naquela região. Para isolar tais variantes, os iniciadores apresentados na Tabela 7 delimitando a região com interesse foramusados num PCR como moldes para cDNA de fígado adulto humano.end C of the EPO domain (in the middle of the PCR product) showed a complex sequence pattern suggesting the existence of possible splicing variants in that region. To isolate such variants, the primers shown in Table 7 delimiting the region of interest were used in a PCR as templates for human adult liver cDNA.

TABELA 7TABLE 7

Iniciadores de PCR para isoformas de ML humanoPCR primers for human ML isoforms

phmpllcdna.3el:5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3' phmpllcdna.3el: 5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3 ' (SEQ ID NO:45) (SEQ ID NO: 45) pbx4.f2: 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3· pbx4.f2: 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3 · (SEQ ID NO:46) (SEQ ID NO: 46)

Os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cerses em M13. A sequenciação de subclones individuais revelou a existência de pelo menos 3 isoformas de ML. Uma delas, hML (também referida como hML^^) ® ^a forma maior e corresponde exactamente à sequência isolada a partir da biblioteca de fígado fetal. As sequências das quatro isoformas do ligando de mpl humano apresentadas da maior (hML) para a mais pequena (hML-4) estão descritas na Fig. 11 (SEQ ID NOS: 6, 8, 9 & 10).PCR products were subcloned with M13-cut ends. Sequencing of individual subclones revealed the existence of at least 3 isoforms of ML. One of them, hML (also referred to as hML ^^) ® ^the largest form and corresponds exactly to the sequence isolated from the fetal liver library. The sequences of the four human mpl ligand isoforms presented from the largest (hML) to the smallest (hML-4) are described in Fig. 11 (SEQ ID NOS: 6, 8, 9 & 10).

EXEMPLO 11EXAMPLE 11

Construcção e Expressão Transitória das Isoformas do Ligando de mpl Humano e Variantes de Substituição hML2, hML3 e hML(R153A, R154A)Construction and Transient Expression of Human mpl Ligand Isoforms and Substitution Variants hML2, hML3 and hML (R153A, R154A)

As isoformas hML2 e hML3 e a variante de substituição hML(R153A,R154A) foram reconstituídas a partir de hML usando a técnica de PCR recombinante descrita por Russel Higuchi, em PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Editors.The hML2 and hML3 isoforms and the hML replacement variant (R153A, R154A) were reconstituted from hML using the recombinant PCR technique described by Russel Higuchi, in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Editors.

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Em todas as construções os iniciadores de fora usados estão apresentados na Tabela 8 e os iniciadores sobreponíveis estão apresentados na Tabela 9.In all constructions the outside primers used are shown in Table 8 and the overlapping primers are shown in Table 9.

TABELA 8TABLE 8

Iniciadores de foraOutside initiators

Cla.FL.F2: 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3' Cla.FL.F2: 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3 ' (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 47) HMPLL-R: 5'GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA3 ' HMPLL-R: 5'GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA3 ' (SEQ ID NO: 48) (SEQ ID NO: 48)

TABELA 9TABLE 9

Iniciadores sobreponíveisOverlapping initiators

hML-2: ML/\4.F: 5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3' ML/\4. R: 5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3' hML-2: ML / \ 4.F: 5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3 ' ML / \ 4. A: 5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3 ' (SEQ ID NO:4 9) SEQ ID NO:50) (SEQ ID NO: 4 9) SEQ ID NO: 50) hML-3: hML/\1164-:5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3' hML/\116~:5'AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3' hML-3: hML / \ 1164-: 5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3 'hML / \ 116 ~: 5'AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3' (SEQ ID NO:51) (SEQ ID NO:52) (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52) hML(R153A, R154A) RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C3' RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G3' hML (R153A, R154A) RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C3 ' RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G3 ' (SEQ ID NO:53) (SEQ ID NO.54) (SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO.54)

Todas as amplificações foram realizadas com DNA-polimerase Pfu clonada (Stratagene) usando as seguintes condições: Desnaturação inicial do molde foi a 94°C durante 7 min. seguido de 30 ciclos de 1 min. a 94°C, 1 min. a 55°C e 1,5 min. a 72°C. O ciclo final foi deixado decorrer para prolongamento durante 10 minutos a 72°C. O produto final do PCR foi digerido com Clal-Xbal, purificado em gel e clonadoAll amplifications were performed with cloned Pfu DNA polymerase (Stratagene) using the following conditions: Initial mold denaturation was at 94 ° C for 7 min. followed by 30 cycles of 1 min. at 94 ° C, 1 min. at 55 ° C and 1.5 min. at 72 ° C. The final cycle was allowed to run for 10 minutes at 72 ° C. The final product of the PCR was digested with Clal-Xbal, purified on gel and cloned

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em pRK5tkneo. Células 293 foram transfectadas com as várias construções descritas atrás e o sobrenadante foi testado usando o ensaio de proliferação de Ba/F3-mpl. hML-2 e hML-3 apresentaram actividade detectável neste ensaio, no entanto, a actividade de hML(R153A, R154A) foi semelhante a hML indicando que o processamento neste sitio dibásico não é necessário para ã actividade (ver Fig. 13).in pRK5tkneo. 293 cells were transfected with the various constructs described above and the supernatant was tested using the Ba / F3-mpl proliferation assay. hML-2 and hML-3 showed detectable activity in this assay, however, hML activity (R153A, R154A) was similar to hML indicating that processing at this dibasic site is not necessary for the activity (see Fig. 13).

EXEMPLO 12 cDNA do Ligando de mpl de Murganho mML, mML-2 e mML-3EXAMPLE 12 Mouse mpl Ligand cDNA mML, mML-2 and mML-3

Isolamento de cDNA de mMLIsolation of mML cDNA

Um fragmento de DNA correspondendo a toda a região codificadora do ligando de mpl humano foi obtido por PCR, purificado em gel e marcado por iniciação ao acaso naA DNA fragment corresponding to the entire coding region of the human mpl ligand was obtained by PCR, purified on gel and marked by random initiation in the

2 3 2 presença de P-dATP e P-dCTP. Esta sonda foi usada no g despiste de 10 clones de y.uma biblioteca de cDNA de fígado de murganho em lambdaGTlO (Clontech cat# ML3001a). Filtros em duplicado foram hibridados em 35% de formamida, SSC 5x, Denhardt lOx, 0,1% SDS, fosfato de sódio 0,05M (pH 6,5), 0,1% de pirofosfato de sódio, 100 Mg/ml de DNA de esperma de salmão sonicado, durante a noite na presença da sonda. Os filtros foram lavados em SSC2x e depois lavados uma vez com SSC 0,5x, 0,1% SDS a 42°C. Os fagos que hibridaram foram purificados por plaqueamento e as inserções de cDNA foram subclonadas no sítio EcoRI do plasmídeo Bluescript SK-. O clone LD com um inserto de 1,5 Kb foi escolhido para posterior análise e ambas as cadeias foram sequenciadas como descrito atrás para o cDNA de ML humano. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos deduzida do clone LD estão apresentadas na Fig. 14 (SEQ ID NOS: 1 & 11). A sequência deduzida de ML maduro deste clone tinha 331 resíduos de aminoácidos de comprimento e foi identificada como mML₃₃₁ (ou mML-2 por razões descritas abaixo). Observou-se considerável identidade para as sequências de nucleótidos e de2 3 2 presence of P-dATP and P-dCTP. This probe was used to screen 10 y clones of a mouse liver cDNA library in lambdaGT10 (Clontech cat # ML3001a). Duplicate filters were hybridized to 35% formamide, 5x SSC, Denhardt 10x, 0.1% SDS, 0.05M sodium phosphate (pH 6.5), 0.1% sodium pyrophosphate, 100 Mg / ml Sonicated salmon sperm DNA, overnight in the presence of the probe. The filters were washed in SSC2x and then washed once with 0.5x SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. The phage that hybridized were purified by plating and the cDNA inserts were subcloned into the EcoRI site of the plasmid Bluescript SK-. The LD clone with a 1.5 Kb insert was chosen for further analysis and both strands were sequenced as described above for the human ML cDNA. The nucleotide and amino acid sequences deduced from the LD clone are shown in Fig. 14 (SEQ ID NOS: 1 & 11). The deduced sequence of mature ML from this clone was 331 amino acid residues in length and was identified as mML ₃₃₁ (or mML-2 for reasons described below). Considerable identity was observed for the nucleotide and

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aminoácidos deduzida nos domínios tipo EPO destes Mis. No entanto, quando as sequências de aminoácidos deduzidas dos Mis humano e de murganho foram alinhadas, a sequência de murganho apresentou uma deleção de tetrapeptídeo entre os resíduos humanos 111-114 correspondendo a uma deleção de 12 nucleótidos após a posição de nucleótido 618 observado tanto em cDNA humano (ver atrás) como de porco (ver abaixo). Assim, outros clones foram analisados para detectar possíveis isoformas de ML de murganho. Um clone L7 tinha um inserto de 1,4 Kb com uma sequência deduzida de 335 aminoácidos contendo o tetrapeptídeo ausente” LPLQ. Esta forma pensa-se que seja o ML de murganho de tamanho completo e é referido como mML ou mML335. A sequência de nucleótidos e de aminoácidos deduzida para mML está apresentada na Fig. 16 (SEQ ID NOS: 12 & 13). Finalmente, o clone L2 foi isolado e sequenciado. Este clone tinha a deleção de 116 nucleótidos correspondendo a hML3 e foi portanto denominada mML-3. A comparação das sequências de aminoácidos deduzidas destas duas isoformas está apresentada na Fig. 16.amino acids deduced in the EPO-like domains of these Mis. However, when the deduced amino acid sequences of human and mouse Mis were aligned, the mouse sequence showed a tetrapeptide deletion between human residues 111-114 corresponding to a deletion of 12 nucleotides after nucleotide position 618 observed both in human cDNA (see above) and pig (see below). Thus, other clones were analyzed to detect possible mouse ML isoforms. One L7 clone had a 1.4 Kb insert with a deduced sequence of 335 amino acids containing the missing tetrapeptide ”LPLQ. This form is thought to be the full-sized mouse ML and is referred to as mML or mML335. The deduced nucleotide and amino acid sequence for mML is shown in Fig. 16 (SEQ ID NOS: 12 & 13). Finally, clone L2 was isolated and sequenced. This clone had a deletion of 116 nucleotides corresponding to hML3 and was therefore called mML-3. The comparison of the deduced amino acid sequences of these two isoforms is shown in Fig. 16.

Exepressão de mML recombinante. Prepararam-se vectores de expressão para ML de murganho essencialmente como descrito no Exemplo 8. Os clones codificadores de mML e de mML-2 foram subclonados em pRK5tkneo, um vector de expressão de mamífero que proporciona expressão sob o controle do promotor de CMV e um sinal de poliadenilação de SV40. Os vectores de expressão resultantes, mMLpRKtkneo e mML2pRKtkneo foram transfectados transitoriamente em células 293 usando o método do fosfato de cálcio. Após transfecção transitória, os meios foram condicionados durante 5 dias. As células foram mantidas em meio DMEM com alto teor de glucose suplementado com 10% de soro fetal de vitela.Expression of recombinant mML. Expression vectors for mouse ML were essentially prepared as described in Example 8. The clones encoding mML and mML-2 were subcloned into pRK5tkneo, a mammalian expression vector that provides expression under the control of the CMV promoter and a SV40 polyadenylation signal. The resulting expression vectors, mMLpRKtkneo and mML2pRKtkneo were transiently transfected into 293 cells using the calcium phosphate method. After transient transfection, the media was conditioned for 5 days. The cells were maintained in DMEM medium with high glucose content supplemented with 10% fetal calf serum.

Expressão de mpl de murganho ímmpl em células Ba/F3. Por transfecção com pRKtKneo contendo mmpl. essencialmente como descrito para mpl humano no Exemplo 1, obtiveram-se linhas celulares estáveis expressando c-mpl.Expression of mouse mpl in mm / F3 cells. By transfection with pRKtKneo containing mmpl. essentially as described for human mpl in Example 1, stable cell lines expressing c-mpl were obtained.

177177

Resumidamente, um vector de expressão (20 ; linearizado) contendo toda a sequência codificadora de mpl de murganho (Skoda, R.C., et al., EMBO J. 12:2645-2653 [1993]) foi usado para transfectar células Ba/F3 por electroporação (5 x 10⁶ células, 250 volts, 960 mF) seguido de selecção relativamente à resistência à neomicina com 2 mg/ml de G418. A expressão de mpl foi avaliada por análise de citometria de fluxo usando anti-soro antimpl de murganho. As células Ba/F3 foram mantidas em meio RPMI 1640 de células WEHI -3B como fonte de IL-3. Os sobrenadantes das células 293 transitoriamente transfectadas com mML e mML-2 foram testados em células Ba/F3 transfectadas com mmpl e hmpl como descrito no ExemploBriefly, an expression vector (20; linearized) containing the entire mouse mpl coding sequence (Skoda, RC, et al., EMBO J. 12: 2645-2653 [1993]) was used to transfect Ba / F3 cells by electroporation (5 x 10 ⁶ cells, 250 volts, 960 mF) followed by selection for resistance to neomycin with 2 mg / ml G418. Mpl expression was assessed by flow cytometry analysis using mouse antimip antiserum. Ba / F3 cells were maintained in RPMI 1640 medium from WEHI-3B cells as a source of IL-3. Supernatants from 293 cells transiently transfected with mML and mML-2 were tested on Ba / F3 cells transfected with mmpl and hmpl as described in Example

1.1.

EXEMPLO 13 cDNA do Ligando de mpl de Porco pML e pML-2 cDNA de ML de porco (pML) foi isolado por PCR RACE. resumidamente, um iniciador de oligo dT e 2 iniciadores específicos foram projectados com base na sequência do exão do gene ML de porco codificador do extremo amina de ML purificado a partir de soro de porco aplástico. Preparou-se e amplificou-se cDNA a partir de vários tecidos de porco aplástico. Um cDNA produto de PCR de 1342 pb foi encontrado em rim e subclonado. Vários clones foram sequenciados e encontrou-se codificarem o ligando de mpl maduro de porco (não incluindo um sinal de secreção completo). Encontrou-se que o cDNA codifica uma proteína madura de 332 aminoácidos (pML₃₃₂) tendo a sequência apresentada na Fig. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16) .EXAMPLE 13 PML mpl Ligand cDNA pML and pML-2 Pig ML cDNA (pML) was isolated by RACE PCR. briefly, an oligo dT primer and 2 specific primers were designed based on the exon sequence of the pig ML gene encoding the amine end of ML purified from aplastic pig serum. CDNA was prepared and amplified from various tissues of aplastic pig. A 1342 bp PCR product cDNA was found in the kidney and subcloned. Several clones were sequenced and found to encode the mature pig mpl ligand (not including a complete secretion signal). The cDNA was found to encode a 332 amino acid mature protein (pML ₃₃₂ ) having the sequence shown in Fig. 18 (SEQ ID NOS: 9 & 16).

Método:Method:

Isolamento do gene e cDNA de pML. Clones genómicos do gene de ML de porco foram isolados por despiste de uma biblioteca genómica de porco em EMBL3 (Clontech Inc.) comIsolation of the pML gene and cDNA. Genomic clones of the pig ML gene were isolated by screening a pig genomic library in EMBL3 (Clontech Inc.) with

178 pR45. A biblioteca foi despistada essencialmente como descrito no Exemplo 7. Isolaram-se vários clones e sequenciou-se o exão codificador da sequência de aminoácidos idêntica à obtida a partir de ML purificado. 0 cDNA de ML de porco foi obtido usando uma modificação do protocolo de PCR RACE. Isoluou-se mRNA poliadenilado a partir do rim de porcos aplásticos essencialmente como descrito atrás. O cDNA foi preparado por transcrição reversa com um iniciador BamdT.178 pR45. The library was screened essentially as described in Example 7. Several clones were isolated and the exon encoding the amino acid sequence identical to that obtained from purified ML was sequenced. The pig ML cDNA was obtained using a modification of the PCR RACE protocol. Polyadenylated mRNA was isolated from the kidney of aplastic pigs essentially as described above. The cDNA was prepared by reverse transcription with a BamdT primer.

(BamdT: 5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3') (SEQ ID NO:55) dirigido contra a cauda de poliadenosina do mRNA. Uma volta inicial de amplificação por PCR (28 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 58°C durante 60 segundos e 72°C durante noventa segundos) foi realizado usando o iniciador específico de ML h-direita-1 (h-direita-1 5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3' (SEQ ID NO:43) e o iniciador BAMAD (BAMAD: 5'GACTCGAGGATCCATCG 3^Z) (SEQ ID NO:56) num volume de reacção de 100 μΐ (KC1 50 mM, MgCl 1,5 mM, Tris 10 mM pH 8,0, dNTPs 0,2 mM com 0,05 U/ml de polimerase Amplitaq [Perkin Elmer Inc.]). O produto de PCR foi então digerido com Clal, extraído com fenol-clorofórmio (1:1), precipitado com etanol e ligado a 0,1 mg do vector Bluescript SK (Stratagene inc.) que tinha sido cortado com Clal e Kpnl. Após incubação durante duas horas à temperatura ambiente, um quarto da mistura de ligação foi adicionado directamente a uma segunda volta de PCR (22 ciclos como r(BamdT: 5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 ') (SEQ ID NO: 55) directed against the polyadenosine tail of the mRNA. An initial round of PCR amplification (28 cycles of 95 ° C for 60 seconds, 58 ° C for 60 seconds and 72 ° C for ninety seconds) was performed using the specific ML primer h-right-1 (h-right- 1 5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3 '(SEQ ID NO: 43) and the BAMAD primer (BAMAD: 5'GACTCGAGGATCCATCG 3 ^Z ) (SEQ ID NO: 56) in a reaction volume of 100 μΐ (KC1 50 mM, MgCl 1.5 mM , 10 mM Tris pH 8.0, 0.2 mM dNTPs with 0.05 U / ml Amplitaq polymerase [Perkin Elmer Inc.]). The PCR product was then digested with Clal, extracted with phenol-chloroform (1: 1), precipitated with ethanol and bound to 0.1 mg of the Bluescript SK vector (Stratagene inc.) Which had been cut with Clal and Kpnl. After incubation for two hours at room temperature, a quarter of the ligation mixture was added directly to a second round of PCR (22 cycles as r

179 descrito atrás) usando um segundo iniciador específico de ML direita-!179 described above) using a second ML-specific primer right-!

(direita-1: 5' GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3') (SEQ ID NO:57) e T3-21 (um oligonucleótido que se liga a uma sequência adjacente à região de clonagem múltipla dentro do vector Bluescript SK-):(right-1: 5 'GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3') (SEQ ID NO: 57) and T3-21 (an oligonucleotide that binds to a sequence adjacent to the multiple cloning region within the SK- Bluescript vector):

(5' CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3') (SEQ ID NO:58) .(5 'CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3') (SEQ ID NO: 58).

O produto de PCR resultante foi digerido com Xbal e Clal e subclonado em Bluescript SK-. Sequenciaram-se vários clones a partir de reacções de PCR independentes.The resulting PCR product was digested with Xbal and Clal and subcloned in Bluescript SK-. Several clones were sequenced from independent PCR reactions.

Novamente, uma segunda forma, designada pML-2, codificadora d euma proteína com uma deleção de 4 resíduos de aminoácidos (328 resíduos de mainoácidos) foi identificada (ver Fig. 21 [SEQ ID N0:21]). A comparação das sequências de aminoácidos de pML e de pML-2 mostra que esta última forma é idêntica excepto o tetrapeptídeo QLPP correspondendo aos resíduos 111-114 inclusive ter sido eliminado (ver Fig. 22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). As deleções de quatro aminoácidos observadas em cDNA de ML de murganho, humano e de porco ocorrem precisamente na mesma posição dentro das proteínas previstas.Again, a second form, designated pML-2, encoding a protein with a deletion of 4 amino acid residues (328 amino acid residues) was identified (see Fig. 21 [SEQ ID NO: 21]). Comparison of the amino acid sequences of pML and pML-2 shows that the latter form is identical except that the tetrapeptide QLPP corresponding to residues 111-114 has even been eliminated (see Fig. 22 [SEQ ID NOS: 18 & 21]). The deletions of four amino acids observed in mouse, human and pig ML cDNA occur in precisely the same position within the predicted proteins.

EXEMPLO 14EXAMPLE 14

Ensaio CMK para Indução pela Trombopoietina (TPO) da Expressão do Antigénio de Plaquetas GPII.IIICMK Assay for Induction by Thrombopoietin (TPO) of Platelet Antigen Expression GPII.III

O dThe d

Células CMK foram mantidas em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino e glutamina 10 mM. Na preparação para o ensaio, as células foram rCMK cells were maintained in RPMI 1640 medium (Sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum and 10 mM glutamine. In preparation for the assay, cells were r

180 colhidas, lavadas e ressuspensas a 5x10 células/ml em meio GIF sem sorosuplementado com 5 mg/ml de insulina bovina, 10 mg/1 de apo-transferrina, micronutrientes lx. Numa placa de fundo plano de 96 cavidades, o padrão TPO ou amostras experimentais foram adicionadas a cada uma das cavidades nas diluções adequadas em volumes de 100 μΐ. 100 μΐ da suspensão de células CMK foi adicionado a cada uma das cavidades e as placas foram incubadas a 37°C, numa estufa de 5% de CO^ durante 48 horas. Após incubação, as placas foram centrifugadas a 1000 rpm a 4°C durante cinco minutos. Os sobrenadantes foram rejeitados e adicionado 100 μΐ de anticorpo monoclonal 2D2 anti-GPII^III^ conjugado com FITC a cada uma das cavidades. Após incubação a 4°C durante 1 hora, as placas foram centrifugadas novamente a 1000 rpm durante cinco minutos. Os sobrenadantes contendo o anticorpo não ligado foram rejeitados e adicionado a cada cavidade 200 μΐ de tampão de lavagem 0,1% BSA-PBS. 0 passo de lavagem com 0,1% BSA-PBS foi repetido três vezes. As células foram então analisadas num FASCAN usando análise convencional de um parâmetro medindo a intensidade de fluorescência relativa.180 harvested, washed and resuspended at 5x10 cells / ml in GIF medium without serosupplemented with 5 mg / ml bovine insulin, 10 mg / 1 apo-transferrin, micronutrients lx. In a 96-well flat bottom plate, the TPO standard or experimental samples were added to each well in the appropriate dilutions in 100 μΐ volumes. 100 μΐ of the CMK cell suspension was added to each well and the plates were incubated at 37 ° C in a 5% CO ^ oven for 48 hours. After incubation, the plates were centrifuged at 1000 rpm at 4 ° C for five minutes. Supernatants were discarded and 100 μΐ of 2D2 anti-GPII ^ III ^ monoclonal antibody conjugated with FITC was added to each well. After incubating at 4 ° C for 1 hour, the plates were spun again at 1000 rpm for five minutes. Supernatants containing unbound antibody were discarded and 200 μΐ of 0.1% BSA-PBS wash buffer was added to each well. The washing step with 0.1% BSA-PBS was repeated three times. The cells were then analyzed on a FASCAN using conventional one-parameter analysis by measuring the relative fluorescence intensity.

EXEMPLO 15EXAMPLE 15

Ensaio DAMI para Trombopoietina (TPO) Medindo Actividade Endomitótica de Células DAMI em Placas de Microtitulação de 96 cavidadesDAMI Assay for Thrombopoietin (TPO) Measuring Endomitotic Activity of DAMI Cells in 96-well Microtiter Plates

Células DAMI foram mantidas em IMDM + 10% de soro de cavalo (Gibco) suplementado com glutamina 10 mM, lOOng/ml de Penicilina G e 50 Mg/ml de estreptomicina. Na preapração para o ensaio, as células foram colhidas, lavadas e ressupensas a lxlO⁶ células/ml em IMDM + 1% de soro de cavalo. Numa placa de 96 cavidades de fundo plano circular, 100 μΐ do padrão TPO ou amostras experimentais foi adicionado à suspensão de células DAMI. As células foram então incubadas durante 48 horas a 37°C numa estufa de 5% de C0_. Após incubação, as placas foram centrifugadas numa centrífuga rDAMI cells were maintained in IMDM + 10% horse serum (Gibco) supplemented with 10 mM glutamine, 100 ng / ml Penicillin G and 50 Mg / ml streptomycin. In the pre-preparation for the assay, cells were harvested, washed and resuspended at 1x10 ⁶ cells / ml in IMDM + 1% horse serum. In a 96-well circular flat-bottom plate, 100 μΐ of the TPO standard or experimental samples was added to the DAMI cell suspension. The cells were then incubated for 48 hours at 37 ° C in a 5% CO2 incubator. After incubation, the plates were centrifuged in a centrifuge r

181181

Sorvall 6000B a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram rejeitados e repetiu-se o passo de lavagem com PBS-0,1% BSA. As células foram fixadas pela adição de 200 μΐ de 70% etanol-PBS arrefecido em gelo e ressuspensas por aspiração. Após incubação a 4°C durante 15 minutos, as placas foram centrifugadas a 2000 rpm durante 5 minutos e adicionado a cada cavidade 150 μΐ de RNase a lmg/ml contendo 0,1 mg/ml de iodeto de propídio e 0,05% Tween-20. Após uma hora de incubação a 37 °C as alterações no teor de DNA forma medidas por citometria de fluxo. A poliploidia foi medida e quantificada como se segue:Sorvall 6000B at 1000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The supernatants were discarded and the washing step was repeated with PBS-0.1% BSA. The cells were fixed by adding 200 μΐ of 70% ethanol-PBS cooled on ice and resuspended by aspiration. After incubation at 4 ° C for 15 minutes, the plates were centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes and 150 μΐ of RNase at 1mg / ml containing 0.1 mg / ml of propidium iodide and 0.05% Tween were added to each well. -20. After an hour of incubation at 37 ° C, changes in DNA content were measured by flow cytometry. Polyploidy was measured and quantified as follows:

Razão Poliplóide Normalizada (NPR) = = (% Células em >G2+M%Células em<G2+M)______com TPO (% Células em >G2+M%Células em<G2+M) em testemunhaNormalized Polyploid Ratio (NPR) = = (% Cells in> G2 + M% Cells in <G2 + M) ______ with TPO (% Cells in> G2 + M% Cells in <G2 + M) in control

EXEMPLO 16EXAMPLE 16

Ensaio in vivo com Trombopoietina (TPO) (Ensaio Religado com Plaquetas de Murganho)In vivo Assay with Thrombopoietin (TPO) (Assay Reclosed with Mouse Platelets)

Ensaio in vivo para Determinação de S da Produção de PlaquetasIn vivo assay for S determination of platelet production

Murganhos C57BL6 (adquiridos á Charles River) foram injectados intraperitonealmente (IP) com 1 ml de soro anti-plaquetas de murganho induzido em cabra (6 amps) no dia 1 para produzir trombocitopenia. Nos dias 5 e 6, os murganhos receberam duas injecções IP do factor ou PBS como testemunha. No dia 7, trinta μΰι de Na₂ SO^ em 0,1 ml de soro fisiológico foram injectados intravenosamente e a 3 5 . .C57BL6 mice (purchased from Charles River) were injected intraperitoneally (IP) with 1 ml of goat-induced mouse anti-platelet serum (6 amps) on day 1 to produce thrombocytopenia. On days 5 and 6, mice received two IP injections of the factor or PBS as a control. On day 7, thirty μΰι of Na ₂ SO ^ in 0.1 ml of saline were injected intravenously and at 3 5. .

percentagem de incorporação de S da dose injectada nas plaquetas circulantes foi medida em amostras de sangue obtidas a partir de murganhos tratados e testemunha. As contagens de plaquetas e as contagens de leucócitos foram feitas ao mesmo tempo em sangue obtido do sinus retro-orbital .percentage of S incorporation of the dose injected into circulating platelets was measured in blood samples obtained from treated and control mice. Platelet counts and leukocyte counts were performed at the same time on blood obtained from the retro-orbital sinus.

rr

182182

EXEMPLOEXAMPLE

ELISA KIRA para Trombopoietia (TPO)ELISA KIRA for Thrombopoietia (TPO)

Medindo a Fosforilação do Receptor Quimérico dmpl-Rse.gDMeasuring Chimeric Receptor Phosphorylation dmpl-Rse.gD

O receptor mpl humano foi descrito por Vigon et a 1. , PNAS, USA 89:5640-5644 (1992). Um receptor quimérico compreendendo o domínio extracelular (EDC) do receptor mpl e o domínio transmembranar (TM) e intracelular (ICD) de Rse (Mark et al. . J. of Biol. Chem. 269 (14) :10720-10728 [1994]) com um polipeptídeo bandeira carboxi-terminal (i.e. Rse.gD) foi feito para usar na ELISA KIRA aqui descrita. Ver Fig.30 e 31 para uma descrição esquemática do ensaio.The human mpl receptor has been described by Vigon et al., PNAS, USA 89: 5640-5644 (1992). A chimeric receptor comprising the extracellular (EDC) domain of the mpl receptor and the transmembrane (TM) and intracellular (ICD) domain of Rse (Mark et al. J. of Biol. Chem. 269 (14): 10720-10728 [1994 ]) with a carboxy-terminal flag polypeptide (ie Rse.gD) was made for use in the ELISA KIRA described here. See Fig.30 and 31 for a schematic description of the assay.

(a) Preparação do agente de captura(a) Preparation of the capture agent

O anticorpo monoclonal anti-gD (clone 5B6) foi produzido contra um peptídeo da glicoproteína D do vírus herpes simplex (Paborshy et al., Protein Engineering 3(6):547-553 [1990]). A preparação stock foi ajustadas a 3,0 mg/ml em tampão de fosfatos salino (PBS), pH 7.4 e aliquotas de 1,0 ml foram guardadas a -20°C.The anti-gD monoclonal antibody (clone 5B6) was produced against a herpes simplex virus D glycoprotein peptide (Paborshy et al., Protein Engineering 3 (6): 547-553 [1990]). The stock preparation was adjusted to 3.0 mg / ml in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 and 1.0 ml aliquots were stored at -20 ° C.

(b) Preparação de anticorpos anti-fosfotirosina anticorpo monoclonal anti-fosfotirosina, clone 4G10, foi adquirido à UBI (Lake Placid, NY) e biotinilado usando Biotina-N-hidroxi-succinamida de braço longo (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).(b) Preparation of anti-phosphotyrosine antibodies monoclonal anti-phosphotyrosine antibody, clone 4G10, was purchased from UBI (Lake Placid, NY) and biotinylated using long-arm Biotin-N-hydroxy-succinamide (Biotin-X-NHS, Research Organics , Cleveland, OH).

(c) Ligando(c) Calling

O ligando de mpl foi preparado pelas técnicas recombinantes aqui descritas. 0 ligando de mpl purificado foi guardado a 4°C como solução stock.The mpl ligand was prepared by the recombinant techniques described herein. The purified mpl ligand was stored at 4 ° C as a stock solution.

rr

183 (d) Preparação de ácido nucleico deRse.gD183 (d) Preparation of Rse.gD nucleic acid

Oligonucleótidos sintéticos de cadeia dupla foram usados para reconstituir a cadeia codificadora dos 10 aminoácido C-terminais (880-890) de Rse humano e adicionados mais 21 aminoácidos contendo um epitopo para o anticorpo 5B6 e um codão de paragem. A Tabela 10 apresenta a sequência final da fração sintética do gene de fusão.Synthetic double-stranded oligonucleotides were used to reconstitute the coding chain of the 10 C-terminal amino acids (880-890) of human Rse and an additional 21 amino acids were added containing an epitope for antibody 5B6 and a stop codon. Table 10 shows the final sequence of the synthetic fraction of the fusion gene.

TABELA 10TABLE 10

Fragmento de Cadeia Dupla Sintético do Gene de Fusão de Rse HumanoSynthetic Double Chain Fragment of the Human Rse Fusion Gene

cadeia codificadora: 5'TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTA GCCTCAAGATGGCTGATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTT CCGGTCCTGTAGAAGCT 3' coding chain: 5'TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTA GCCTCAAGATGGCTGATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTT CCGGTCCTGTAGAAGCT 3 ' (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 59) cadeia não codificadora (anti-codão): 5'AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTT GGATCAGCCATCTTGAGGCTAGCATCTGCGAAGCTCGAGTGTGG CAGTAGCCCTTGCTGCA 3' non-coding (anti-codon) chain: 5'AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTT GGATCAGCCATCTTGAGGCTAGCATCTGCGAAGCTCGAGTGTGG CAGTAGCCCTTGCTGCA 3 ' (SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 60)

O DNA sintético foi ligado ao cDNA codificador dos aminoácidos 1-880 de Rse humano no sítio PstI começando no nucleótido2644 da sequência de cDNA de Rse humano publicado (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269(14):10720-10728 [1994]) e sítios HindIII no poli-ligante do vector de expressão pSVI7.ID.LL (ver Fig 32 A-L; SEQ ID NO: 22) para criar o plasmídeo de expressão pSV.ID.Rse.gD. Resumidamente o plasmídeo de expressão compreende um transcrito dicistrónico primário que contem a sequência codificadora de DHFR ligada pelos sítios de splice do intrão, 5' dador de splice e 3'aceitador de splice, seguido da sequência que codifica o Rse.gD. A mensagem de tamanho completo (não spliced) contem DHFR na primeira grelha de leitura aberta e portanto gera proteína DHFR que permite a selecção de transformantes estáveis.The synthetic DNA was linked to the cDNA encoding human Rse amino acids 1-880 at the PstI site starting at nucleotide2644 of the published human Rse cDNA sequence (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269 (14): 10720-10728 [1994 ]) and HindIII sites on the pSVI7.ID.LL expression vector polylinker (see Fig 32 AL; SEQ ID NO: 22) to create the expression plasmid pSV.ID.Rse.gD. Briefly, the expression plasmid comprises a primary dicistronic transcript containing the DHFR coding sequence linked by the intron splice sites, 5 'splice donor and 3' splice acceptor, followed by the sequence encoding Rse.gD. The full-length message (not spliced) contains DHFR in the first open reading frame and therefore generates DHFR protein that allows for the selection of stable transformants.

184 (e) Preparação de ácido nucleico de mpl-Rse.gD184 (e) Preparation of nucleic acid from mpl-Rse.gD

O plasmídeo de expressão pSV.ID.Rse.gD produzido como descrito atrás foi modificado para produzir o plasmídeo pSV.ID.M.tRd6 que continha as sequências codificadoras do ECD do mpl humano (aminoácidos 1-491) fundidas com o domínio transmembranar e com o domínio intracelular de Rse.gD (aminoácidos 429-911) . Usaram-se oligonucleótidos sintéticos para ligar a sequência codificadora de uma fracção do domínio extracelular de mpl humano a uma fracção da sequência codificadora de Rse numa reacção de clonagem com PCR em dois passos como descrito por Mark et al., J. Biol.Chem. 267:26166-26171 (1992). Os iniciadores usados na primeira reacção de PCR foram Ml (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3') (SEQ ID N0:61) e M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3') (SEQ ID NO:62) com um molde de cDNA de mpl e RI (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3') (SEQ ID NO:63) e R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) e um molde de cDNA de Rse. O segmentoPvuII-Smal desta junção de fusão foi usado para a construção do receptor quimérico de tamanho completo.The expression plasmid pSV.ID.Rse.gD produced as described above was modified to produce plasmid pSV.ID.M.tRd6 which contained the human mpl ECD coding sequences (amino acids 1-491) fused to the transmembrane domain and with the intracellular domain of Rse.gD (amino acids 429-911). Synthetic oligonucleotides were used to link the coding sequence of a fraction of the extracellular domain of human mpl to a fraction of the Rse coding sequence in a two-step PCR cloning reaction as described by Mark et al., J. Biol.Chem. 267: 26166-26171 (1992). The primers used in the first PCR reaction were M1 (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3 ') (SEQ ID NO: 61) and M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3') (SEQ ID NO: 62) with a cDNA template of mpl and RI (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3 ') (SEQ ID NO: 63) and R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) and an RSE cDNA template. The PvuII-Smal segment of this fusion junction was used to construct the full-size chimeric receptor.

(f) Transformação de células(f) Transformation of cells

Células DP12.CHO (EP 307,247 publicado em 15 de Março de 1989) foram electroporadas com pSV.ID.M.tmRd6 que tinha sido linearizado num sítio único Notl no esqueleto do plasmídeo. O DNA foi precipitado com etanol após extracção com fenol/clorofórmio e ressuspenso em 20μ1 de 10 mM Tris/EDTA. Em seguida 10 μg de DNA foi incubado com 10⁷ DP12.CHO cells (EP 307,247 published March 15, 1989) were electroporated with pSV.ID.M.tmRd6 which had been linearized to a single Notl site on the plasmid backbone. The DNA was precipitated with ethanol after extraction with phenol / chloroform and resuspended in 20μ1 of 10 mM Tris / EDTA. Then 10 μg of DNA was incubated with 10 ⁷

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células CHO DP12 em 1 ml de PBS em gelo durante 10 min. antes da electroporação a 400 volts e 33 p.F. As células voltaram para o gelo durante 10 min. antes de serem semeadas em meio não selectivo. Após 24 horas as células foram alimentadas com meio sem nuclósidos para seleccionar os clones DHFR-r.DPO CHO cells in 1 ml of PBS on ice for 10 min. before electroporation at 400 volts and 33 p.F. The cells were returned to the ice for 10 min. before being sown in a non-selective medium. After 24 hours the cells were fed with medium without nucleosides to select DHFR-r clones.

(g) Selecção das células transformadas, para usar na ELISA KIRA(g) Selection of transformed cells, to be used in the KIRA ELISA

Clones expressando MPL/Rse.gD foram identificados i por transferência Western dos lisados celulares totais pós fraccionamento por SDS-PAGE usando o anticorpo 5B6 que detecta a marca (tag) epitopo gD.Clones expressing MPL / Rse.gD were identified by Western blotting of the total cell lysates after fractionation by SDS-PAGE using the 5B6 antibody that detects the gD epitope tag.

(h) Meios(h) Means

As células foram cultivadas em F12/DMEM 50:50 (Gibco(BRL, Life Technologi.es, Grand Island, NY) . Os meios foram suplementados com 10% de FBS diafiltrado (Hyclone, Logan, Utah), HEPES 25 mM e L-glutamina 2mM.The cells were cultured in 50:50 F12 / DMEM (Gibco (BRL, Life Technologi.es, Grand Island, NY). The media were supplemented with 10% diafiltered FBS (Hyclone, Logan, Utah), 25 mM and L HEPES - 2mM glutamine.

(i) ELISA KIRA í(i) ELISA KIRA í

Células DP12.CHO transformadas com mpl-Rse.qD 4 foram semeadas (3x10 por cavidade) nas cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 96 cavidades de fundo plano circular em 100 μΐ de meio e cultivadas durante a noite a *DP12.CHO cells transformed with mpl-Rse.qD 4 were seeded (3x10 per well) in the wells of a 96-well circular flat-bottom tissue culture plate in 100 μΐ of medium and grown overnight at *

°C em 5% de ^c°2 seguinte os sobrenadantes das cavidades foram decantados e as placas foramligeiramente secas com toalha de papel. 50 μΐ de meio contendo amostras experimentais ou 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 ou 0 ng/ml do ligando de mpl foi então adicionado a cada uma das cavidades. As células foram estimuladas a 37°C durante 30 minutos, os sobrenadantes das cavidades foram decantados e as placas foram novamente ligeiramente secas com uma toalha de papel. Para lisar as células e solubilizar os receptores r° C in 5% 2 ° ^C following the supernatants were decanted and the wells dried foramligeiramente plates with paper towel. 50 μΐ of medium containing experimental samples or 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 or 0 ng / ml of the mpl ligand was then added to each well. The cells were stimulated at 37 ° C for 30 minutes, the supernatants from the wells were decanted and the plates were dried slightly again with a paper towel. To lyse cells and solubilize r receptors

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quiméricos, adicionou-se 100 μΐ de tampão de lise a cada uma das cavidades. O tampão de lise consistiu em NaCl 150 mM contendo HEPES 50 mM (Gibco), 0,01% de timerosal, 30 KlU/ml de aprotinina (ICN Biochemicals, Aurora, OH), hidrocloreto e fluoreto de 4-(2-aminoetil)-benzenossulfonilo (AEBSF; ICN Biochemicals), leupeptina 50 μΜ (ICN Biochemicals) e ortovanadato de sódio 2 mM (Na^VO^; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7,5. A placa foi então agitada suavemente num agitador de placas (Bellco Instruments, Vineland, NJ) durante 60 min. à temperatura ambiente.chimeric, 100 μΐ of lysis buffer was added to each well. The lysis buffer consisted of 150 mM NaCl containing 50 mM HEPES (Gibco), 0.01% thimerosal, 30 KlU / ml aprotinin (ICN Biochemicals, Aurora, OH), hydrochloride and 4- (2-aminoethyl) fluoride -benzenesulfonyl (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 μΜ leupeptin (ICN Biochemicals) and 2 mM sodium orthovanadate (Na ^ VO ^; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7.5. The plate was then gently shaken on a plate shaker (Bellco Instruments, Vineland, NJ) for 60 min. at room temperature.

Enquanto as células estavam a ser solubilizadas, uma placa de microtitulação de ELISA (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) revestida durante a noite a 4°C com o anticorpo monoclonal 5B6 anti-IgG (5,0 μ^/πιΐ em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6, 100 μΙ/cavidade) foi decantada, seca sobre toalha de papel e bloqueada com 150 μΐ/cavidade de Tampão de Bloqueio [BPS contendo 0,5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) e 0,01% de timerosal] durante 60 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. Após 60 minutos, a placa revestida com o anti-gD 5B6 foi lavada 6 vezes com tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween-20 e 0,01% de timerosal) usando um lavador de placas automático (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA).While the cells were being solubilized, an ELISA microtiter plate (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) coated overnight at 4 ° C with anti-IgG monoclonal antibody 5B6 (5.0 μ ^ / πιΐ in carbonate buffer 50 mM, pH 9.6, 100 μΙ / well) was decanted, dried on paper towel and blocked with 150 μΐ / well of Blocking Buffer [BPS containing 0.5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) and 0 , 01% thimerosal] for 60 minutes at room temperature with gentle agitation. After 60 minutes, the anti-gD 5B6 coated plate was washed 6 times with wash buffer (PBS containing 0.05% Tween-20 and 0.01% thimerosal) using an automatic plate washer (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA).

O lisado contendo MPL/Rse.gD solubilizado derivado da cultura de células na cavidade de microtitulação foi transferido (85 μΐ/cavidade) para cavidades de ELISA revestidas com 5B6 anti-IgG e bloqueadas e foi incubada durante 2 h à temperatura ambiente com agitação suave. Mpl-Rse.gD não ligado foi removido por lavagem com tampão de lavagem e 100 μΐ de 4G10 biotinilado (anti-fosfotirosina) diluida 1:18000 em tampão de diluição (PBS contendo 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, EDTA 5 mM e 0,01% de timerosal), i.e. 56 ng/ml foi adicionadoa cada uma das cavidades. Após incubação durante 2 horas à temperatura ambiente a placa foi lavada e adicionado a cada placa 100 μΐ de estreptavidina conjugadaThe lysate containing solubilized MPL / Rse.gD derived from cell culture in the microtiter well was transferred (85 μΐ / well) to ELISA wells coated with 5B6 anti-IgG and blocked and incubated for 2 h at room temperature with gentle agitation . Unbound Mpl-Rse.gD was removed by washing with washing buffer and 100 μΐ of biotinylated 4G10 (anti-phosphotyrosine) diluted 1: 18000 in dilution buffer (PBS containing 0.5% BSA, 0.05% Tween-20 , 5 mM EDTA and 0.01% thimerosal), ie 56 ng / ml was added to each well. After incubation for 2 hours at room temperature, the plate was washed and 100 μΐ of streptavidin conjugate was added to each plate.

comwith

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peroxidase de rábano silvestre (HRPO) diluida a 1:60000 em tampão de diluição. A placa foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. O conjugado sem avidina foi retirado por lavagem e adicionado a cada cavidade 100 μΐ de de solução de substrato preparada de freco (tetrametilbenzidina [TMB]; kit com 2 componentes de substrato; Kirkegaard e Perry, Gaithersburg, MD). A reacção foi deixada decorrer durante 10 minutos após o que a revelação da cor foi parada pela adição de 100 μΐ/cavidade de H^PO^ 1,0Μ. A absorvância a 450 nm foi lida com um comprimento de onda de referência de 650 nm (ABS . __n . . __.horseradish peroxidase (HRPO) diluted 1: 60000 in dilution buffer. The plate was incubated for 30 minutes at room temperature with gentle shaking. The conjugate without avidin was washed out and 100 μΐ of substrate solution prepared from friction (tetramethylbenzidine [TMB]; kit with 2 substrate components; Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) was added to each well. The reaction was allowed to run for 10 minutes after which the color development was stopped by adding 100 μΐ / well of H ^ PO ^ 1.0Μ. The absorbance at 450 nm was read with a reference wavelength of 650 nm (ABS. _ _N .. __.

450/650) usando um leitor de placas vmax (Molecular Devices, Paio Alto, CA) controlada com um Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) e software Delta Soft (BioMetallics, Inc., Princeton, NJ).450/650) using a vmax card reader (Molecular Devices, Paio Alto, CA) controlled with a Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) and Delta Soft software (BioMetallics, Inc., Princeton, NJ).

A curva padrão foi dpl2.trkA,B ou C.gD com 200, 0,048 ou 0 ng/ml de obtida estimulando célulasThe standard curve was dpl2.trkA, B or C.gD with 200, 0.048 or 0 ng / ml obtained by stimulating cells

As daAs of

TPO vs. média do ligando^{1 ABS}450/650 da amostra concentrações sua absorvância na curvaTPO vs. mean of ligand ^{1 ABS} 450/650 of the sample concentrations its absorbance in the curve

50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, mpl e representada como ng/ml ± sd usando o programa DeltaSoft. foram obtidas por padrão e expressas de interpolação em termos de ng/ml de actividade de TPO.50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, mpl and represented as ng / ml ± sd using the DeltaSoft program. were obtained by standard and expressed as interpolation in terms of ng / ml TPO activity.

Observou-se que o ligando de mpl é capaz de activar o receptor quimérico mpl-Rse.qD numa forma dependente da concentração e específica do ligando. Ainda, observou-se que ELISA KIRA para mpl-Rse.qD é tolerante até 100% de soro (apresentado) ou 100% de plasma (não apresentado), permitindo que o ensaio seja facilmente usado no despiste de amostras de pacientes e de pK.It has been observed that the mpl ligand is capable of activating the chimeric mpl-Rse.qD receptor in a concentration dependent and specific form of the ligand. In addition, it was observed that ELISA KIRA for mpl-Rse.qD is tolerant up to 100% serum (shown) or 100% plasma (not shown), allowing the assay to be easily used in screening patient samples and pK .

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Sumário de EC50s de TPOSummary of TPO EC50s

Formas de TPO (células) TPO forms (cells) EC5 0 (peso/vol) EC5 0 (weight / vol) EC5 0 (molaridade) EC5 0 (molarity) Hu TPO 332 (293) Hu TPO 332 (293) 2,56 ng/ml 2.56 ng / ml 67,4 pM 67.4 pM Mu TPO 332 (293) Mu TPO 332 (293) 3,69 ng/ml 3.69 ng / ml 97,1 pM 97.1 pM Hu TPO 153 (293) Hu TPO 153 (293) «41 ng/ml «41 ng / ml «1,08 nM «1.08 nM Hu TPO 155 (E. coli) Hu TPO 155 (E. coli) 0,44 ng/ml 0.44 ng / ml 11,6 pM 11.6 pM Hu TPO 153met CE. coli) Hu TPO 153met CE. coli) 0,829 ng 0.829 ng 21,8 pM 21.8 pM

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EXEMPLO 18EXAMPLE 18

ELISA para Trombopoietina (TPO) Baseada em ReceptoresReceptor-Based Thrombopoietin (TPO) ELISA

As placas de ELISA forma revestidas com F(ab')₂ de coelho anti-IgG (Fc) humana em tampão carbonato pH 9,6 a 4°C durante a noite. As placas foram bloqueadas com 0,5% de albumina sérica bovina em PBS à temperatura ambiente durante uma hora. A colheita do fermentador contendo o receptor quimérico, mpl-IqG foi adicionado às placas e durante 2 horas. Diluições seriadas de duas vezes incubado (0,39-25 ng/ml) do padrão (TPO₃₂₂ produzido em células 293 concentração determinada por análise quantitativa de com a aminoácidos) e amostras seriadamente diluidas em 0,5% de albumina sérica bovina, 0,05% de Tween 20 foram adicionadas às placas e estas incubadas durante 2 horas. O TPO ligado foi detectado com anticorpos de coelho purificados com proteína A, biotinilados e contra, TPO₁₅₅ que foi produzido em E. coli (1 hora de incubação), seguido de estreptavidina-peroxidase (30 min. de incubação) e 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina como substrato. A absorvância foi lida a 450 nm. As placas foram lavadas entre os passos. Para a análise dos dados, a curva padrão foi ajustada usando um programa de ajustamento de curvas com guatro parâmetros do Kalidagraph. As concentrações das amostras foram calculadas a partir da curva padrão.The ELISA plates were coated with rabbit anti-human IgG (Fc) F (ab ') ₂ in carbonate buffer pH 9.6 at 4 ° C overnight. The plates were blocked with 0.5% bovine serum albumin in PBS at room temperature for one hour. The harvest of the fermenter containing the chimeric receptor, mpl-IqG was added to the plates and for 2 hours. Serial dilutions of twice incubated (0.39-25 ng / ml) of the standard (TPO ₃₂₂ produced in 293 cells concentration determined by quantitative analysis with amino acids) and samples serially diluted in 0.5% bovine serum albumin, 0 , 05% Tween 20 was added to the plates and incubated for 2 hours. Bound TPO was detected with biotinylated protein A purified rabbit antibodies and against TPO ₁₅₅ which was produced in E. coli (1 hour incubation), followed by streptavidin-peroxidase (30 min. Incubation) and 3.3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine as a substrate. The absorbance was read at 450 nm. The plates were washed between steps. For data analysis, the standard curve was adjusted using a curve adjustment program with four Kalidagraph parameters. Sample concentrations were calculated from the standard curve.

EXEMPLO 19EXAMPLE 19

Expressão e Purificação de TPO a Partir deExpression and Purification of TPO from

Células 293Cells 293

1. Preparação de vectores de expressão para células 293 r1. Preparation of expression vectors for 293 r cells

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Um cDNA correspondendo à totalidade da grelha de leitura aberta de TPO foi obtido por PCR usando os seguintes oligonucleótidos como iniciadores:A cDNA corresponding to the entire TPO open reading frame was obtained by PCR using the following oligonucleotides as primers:

TABELA 11TABLE 11

Iniciadores de PCR para 293PCR initiators for 293

Cla.FL.F:5'ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3' Cla.FL.F: 5'ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3 ' (SEQ ID NO:65) (SEQ ID NO: 65) hmpll-R:5'GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3' hmpll-R: 5'GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3 ' (SEQ ID NO:48) (SEQ ID NO: 48)

PRK5-hmpl 1 (descrito no Exemplo 9) foi usado como molde para a reacção na presença de DNA-polimerase pfu (Stratagene) A desnaturação inicial foi durante 7 min. a 94°C seguido de 25 ciclos de amplificação (1 min. a 94°C, 1 min. a 55°C e 1 min. a 72°C). A extensão final foi durante 15 min. a 72°C). O produto de PCR foi purificado e clonado entre os sítios de restrição Ciai e Xbal do plasmídeo pRK5tkneo, um vector derivado de pRK5 modificado de forma a expressar um gene de resistência à neomicina sob o controle do promotor da cinase de timidina, para se obter o vector pRK5tkneo.ORF. Uma segunda consrução correspondendo ao domínio homólogo de epo foi gerado da mesma maneira mas usando Cla.FL.F como iniciador para a direita e o iniciador reverso que se segue:PRK5-hmpl 1 (described in Example 9) was used as a template for the reaction in the presence of pfu DNA polymerase (Stratagene) The initial denaturation was for 7 min. at 94 ° C followed by 25 amplification cycles (1 min at 94 ° C, 1 min at 55 ° C and 1 min at 72 ° C). The final extension was for 15 min. at 72 ° C). The PCR product was purified and cloned between the Ciai and Xbal restriction sites of plasmid pRK5tkneo, a vector derived from pRK5 modified to express a neomycin resistance gene under the control of the thymidine kinase promoter, to obtain the vector pRK5tkneo.ORF. A second construction corresponding to the homologous epo domain was generated in the same way but using Cla.FL.F as the right-hand primer and the following reverse primer:

Arg.STOP.Xba: 5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3' (SEQ ID NO:66)Arg.STOP.Xba: 5 'TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3' (SEQ ID NO: 66)

A construção final foi designada pRK5-tkneoEPO-D. A sequência de ambas as construções foi verificada como descrito no Exemplo 7.The final construction was designated pRK5-tkneoEPO-D. The sequence of both constructs was checked as described in Example 7.

rr

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2. Transfecção de células de rim embrionário humano2. Transfection of human embryonic kidney cells

Estas duas construções foram transfectadas em células de rim embrionátio humano pelo método do CaPO₄ como descrito no Exemplo 9. 24 horas após a transfecção iniciou-se a selecção dos clones resistentes à neomicina na presença de 0,4 mg/ml de G418. 10 a 15 dias mais tarde colónias individuais foram transferidas para placas de 96 cavidades e deixadas crescer atá à confluência. A expressão de ML_irn ou de ML₃₃₂ no meio condicionado derivado destes clones foi testado usando o ensaio de proliferação com Ba/F3-mpl (descrito no Exemplo 1).These two constructs were transfected into human embryonic kidney cells by the method of CaPO ₄ as described in Example 9. 24 hours after the transfection, the selection of neomycin-resistant clones began in the presence of 0.4 mg / ml G418. 10 to 15 days later individual colonies were transferred to 96-well plates and allowed to grow until confluence. The expression of ML _irn or ML ₃₃₂ in the conditioned medium derived from these clones was tested using the Ba / F3-mpl proliferation assay (described in Example 1).

3. Purificação de rhMLf3323. Purification of rhMLf332

Meio condicionado derivado aplicado numa coluna de Blue-Sepharose de 293-rhML₃₃₂ (Pharmacia) que foi foi equilibrada em fosfato de sódio 10 mM pH 7,4 (tampão A). A coluna foi subsequentemente lavada com 10 volumes de coluna de tampão A e 10 volumes de tampão A contendo ureia 2M. A coluna foi então eluida com tampão A contendo ureia 2M e NaCl 1M. 0 conjunto de fracções eluidas da coluna deDerived conditioned medium applied to a Blue-Sepharose column of 293-rhML ₃₃₂ (Pharmacia) which was equilibrated in 10 mM sodium phosphate pH 7.4 (buffer A). The column was subsequently washed with 10 column volumes of buffer A and 10 volumes of buffer A containing 2M urea. The column was then eluted with buffer A containing 2M urea and 1M NaCl. The set of fractions eluted from the

Blue-Sepharose foi então directamente aplicado numa colunaBlue-Sepharose was then applied directly to a column

de WGA-Sepharose of WGA-Sepharose equilibrada em balanced in tampão A. buffer A. A THE coluna column de in WGA-Sepharose foi WGA-Sepharose was então lavada com then washed with 10 volumes 10 volumes de in coluna column de in

tampão A contendo ureia 2M NaCl 1M e eluida com o mesmo tampão contendo N-acetil-D-glucosamina 0,5M. 0 eluato da coluna WGA-Sepharose foi aplicado numa coluna de HPLC C4 (Synchrom, Inc.) equilibrada em 0,1% TFA. A coluna de HPLC C4 foi eluida com um gradiente descontínuo de propanol (0-25%, 25-35%, 35-70%). rhML₃₃₂ eluiu na região de 28-30% de propanol do gradiente. Por SDS-PAGE o rhML₃₃₂ purificado migra como uma banda larga na região dos 68-80 KDa do gel (ver Figura 15) .buffer A containing 2M urea 1M NaCl and eluted with the same buffer containing 0.5M N-acetyl-D-glucosamine. The eluate from the WGA-Sepharose column was applied to an HPLC C4 column (Synchrom, Inc.) equilibrated in 0.1% TFA. The HPLC C4 column was eluted with a batch gradient of propanol (0-25%, 25-35%, 35-70%). rhML ₃₃₂ eluted in the 28-30% propanol region of the gradient. By SDS-PAGE the purified rhML ₃₃₂ migrates as a broadband in the region of 68-80 KDa of the gel (see Figure 15).

rr

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4. Purificação de rhML₁₅₃ 4. Purification of rhML ₁₅₃

Meio condicionado 293-rhML₁₅₃ foi separado em Blue-Sepharose como descrito para rhML₃₃₂· O material eluido da Blue Sepharose foi aplicado directamente numa coluna de afinidade com mpl como descrito atrás. RhML₁₅₃ eluido da coluna de afinidade com mpl foi purificado até à homogeneidade usando uma coluna de HPLC C4 nas mesmas condições descritas para rhML_332< Por SDS-PAGE o rhML₁₅₃ purificado deu duas bandas principais e 2 bandas mais fracas com Mr de ~18000-21000 (ver Figura 15).Conditioned medium 293-rhML ₁₅₃ was separated on Blue-Sepharose as described for rhML ₃₃₂ · The material eluted from Blue Sepharose was applied directly to an mpl affinity column as described above. RhML ₁₅₃ eluted from the mpl affinity column was purified to homogeneity using a HPLC C4 column under the same conditions as described for rhML _{332 <} By SDS-PAGE the purified rhML ₁₅₃ gave two main bands and 2 weaker bands with ~ 18000 Mr -21000 (see Figure 15).

EXEMPLO 20EXAMPLE 20

Expressão e Purificação de TPO a partir de CHOExpression and Purification of TPO from CHO

1. Descrição de vectores de expressão para CHO1. Description of expression vectors for CHO

Os vectores de expressão usados nos protocolos de electroporação descritos abaixo foram designados:The expression vectors used in the electroporation protocols described below have been designated:

pSV15.ID.LL.MLORF (tamanho completo ou hTPO₃₃₂) e pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncado ou hTPO₁₅₃).pSV15.ID.LL.MLORF (full size or hTPO ₃₃₂ ) and pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncated or hTPO ₁₅₃ ).

As caracteristicas pertinentes destes plasmídeos estão apresentadas na Fig. 23 e 24.The pertinent characteristics of these plasmids are shown in Fig. 23 and 24.

2. Preparação de vectores de expressão para CHO2. Preparation of expression vectors for CHO

Um cDNA correspondendo a toda agrelha de leitura aberta do hTPO foi obtido por PCR usando os oligonucleótidos iniciadores da Tabela 12.A cDNA corresponding to the entire hTPO open reading frame was obtained by PCR using the primer oligonucleotides from Table 12.

rr

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TABELATABLE

Iniciadores de PCR do Vector de Expressão para CHOExpression Vector PCR Initiators for CHO

Cla.FL.F2 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3' Cla.FL.F2 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3 ' (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 47) ORF.Sal 5' AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3' ORF.Sal 5 'AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3' (SEQ ID NO: 67) (SEQ ID NO: 67)

PRK5-hmpl 1 (descrito no Exemplo 7 e 9) foi usado como molde para a reacção na presença de DNA-polimerase pfu (Stratagene). A desnaturação inicial foi durante 7 min. a 94°C seguido de 25 ciclos de amplificação (1 min. a 94°C, 1 min. a 55°C e 1 min. a 72°C). A extensão final foi durante 15 min. a 72°C). O produto de PCR foi purificado e clonado entre os sítios de restrição Ciai e Sall do plasmídeo pSV15.ID.LL para se obter o vector pSV15.ID.LL.MLORF. Uma segunda construção correspondendo ao domínio homólogo de EPO foi gerado pela mesma via mas usando Cla.FL.F2 como iniciador directo e o seguinte inciador reverso:PRK5-hmpl 1 (described in Example 7 and 9) was used as a template for the reaction in the presence of pfu DNA polymerase (Stratagene). The initial denaturation was for 7 min. at 94 ° C followed by 25 amplification cycles (1 min at 94 ° C, 1 min at 55 ° C and 1 min at 72 ° C). The final extension was for 15 min. at 72 ° C). The PCR product was purified and cloned between the Ciai and SalI restriction sites of the plasmid pSV15.ID.LL to obtain the vector pSV15.ID.LL.MLORF. A second construct corresponding to the homologous EPO domain was generated by the same route but using Cla.FL.F2 as the direct initiator and the following reverse initiator:

EPOD.Sal 5' AGT CGA EPOD.Sal 5 'AGT CGA CGT CGA CGT CGA CTC ACC CTC ACC TGA CGC AGA TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3' GGG TGG ACC 3 ' (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 68) 68) A construção The construction f inal Final foi was designada designated

pSV15.ID.LL.MLEPO-D. A sequência de ambas as construções foi verificada como descrito no Exemplo 7 e 9.pSV15.ID.LL.MLEPO-D. The sequence of both constructs was checked as described in Example 7 and 9.

Basicamente, as sequências codificadoras do ligando de tamnho completo e truncado foram introduzidas no sítio de clonagem múltipla do vector de expressão para CHO pSV15.ID.LL. Este vector contem a região do promotor/potenciador precoce do SV40, uma unidade de splicing modificada contendo o cDNA de DHFR de murganho um sítio de clonagem múltipla para a introdução do gene com interesse (neste caso as sequências de TPO descritas) e o sinal de poliadenilação rBasically, the coding sequences for the full-length and truncated ligand were introduced into the multiple cloning site of the CHO expression vector pSV15.ID.LL. This vector contains the SV40 early promoter / enhancer region, a modified splicing unit containing the mouse DHFR cDNA, a multiple cloning site for the introduction of the gene of interest (in this case the described TPO sequences) and the polyadenylation r

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e a origem de replicação do SV40 e o gene da beta-lactamase para a selecção do plasmídeo e amplificação em bactérias.and the SV40 origin of replication and the beta-lactamase gene for plasmid selection and bacterial amplification.

3. Metodologia para o estabelecimento de linhas de células CHO estáveis expressando TPO₃₃₂ e TPC>₁₅₃ recombinantes humanos3. Methodology for establishing stable CHO cell lines expressing TPO ₃₃₂ and TPC> ₁₅₃ human recombinants

a. Descrição da linha celular parental CHOThe. Description of the CHO parental cell line

A linha celular hospedeira CHO (Ovário de Hamster Chinês) usada na expressão das moléculas de TPO aqui descritas é conhecida como CHO-DP12 (ver EP 307247 publicado em 15 de Março de 1989). Esta linha celular de mamífero foi seleccionada clonalmente a partir de uma transfecção da linha parental (CHO-K1 DUX-B11(DHFR-)-adquirida ao Dr. Frank Lee da Stanford University com a permissão do Dr. L. Chasin) com um vector expressando preproinsulina para se obter clones com menos requisitos de insulina. Estas células são também DHFR menos e os clones podem ser seleccionados quanto à presença de sequências do vector com cDNA de DHFR por crescimento em emio sem suplementos de nucleósidos (glicina, hipoxantina e timidina). Este sistema de selecção é vulgarmente usado para linhas de células CHO com expressão estável .The host cell line CHO (Chinese Hamster Ovary) used in the expression of the TPO molecules described herein is known as CHO-DP12 (see EP 307247 published on March 15, 1989). This mammalian cell line was selected clonally from a transfection of the parental line (CHO-K1 DUX-B11 (DHFR -) - acquired from Dr. Frank Lee of Stanford University with the permission of Dr. L. Chasin) with a vector expressing preproinsulin to obtain clones with less insulin requirements. These cells are also DHFR minus and clones can be selected for the presence of vector sequences with DHFR cDNA by growth on emio without nucleoside supplements (glycine, hypoxanthine and thymidine). This selection system is commonly used for CHO cell lines with stable expression.

b. Método de transfecção (electroporação)B. Transfection method (electroporation)

Linhas celulares expressando TPO₃₃₂ e TPO₁₅₃ foram geradas por transfecção de células DP12 via electroporação (ver e.g. Andreason, G.L. J. Tiss. Cult. Meth., 15:56 [1993]) com os plasmídeos linearizados pSV15.ID.LL.MLORF ou pSV15.ID.LL.MLEPO-D, respectivamente. Estabeleceram-se três misturas de reacção com enzimas de restrição para cada plasmídeo: 10 μg, 25 μg e 50 μ9 do vector com a enzima NOTI por métodos de biologia molecular convencionais. Este sítio de restrição só se encontra uma vez no vector na região de linearização 3' e fora das unidades de transcrição doCell lines expressing TPO ₃₃₂ and TPO ₁₅₃ were generated by transfection of DP12 cells via electroporation (see eg Andreason, GLJ Tiss. Cult. Meth., 15:56 [1993]) with the linearized plasmids pSV15.ID.LL.MLORF or pSV15 .ID.LL.MLEPO-D, respectively. Three reaction mixtures with restriction enzymes were established for each plasmid: 10 μg, 25 μg and 50 μ9 of the vector with the NOTI enzyme by conventional molecular biology methods. This restriction site is found only once in the vector in the 3 'linearization region and outside the transcription units of the

195 ligando TPO (ver Fig. 23). As reacções de 100 μΐ ficaram durante a noite a incubar a 37°C. No dia seguinte as misturas foram extraídas com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (50:49:1) uma vez e precipitadas com etanol em neve carbónica durante aproximadamente uma hora. 0 precipitado foi então colhido por microcentrifugação durante 15 minutos e seco. O DNA linearizado foi ressuspenso em 50 μΐ de meio de Ham DMEM-F12 1:1 suplementado com os antibióticos convencionais e glutamina 2mM.195 linking TPO (see Fig. 23). The 100 μΐ reactions were incubated overnight at 37 ° C. The following day the mixtures were extracted with phenol-chloroform-isoamyl alcohol (50: 49: 1) once and precipitated with ethanol in dry ice for approximately one hour. The precipitate was then collected by microcentrifugation for 15 minutes and dried. The linearized DNA was resuspended in 50 μΐ of Ham DMEM-F12 medium 1: 1 supplemented with conventional antibiotics and 2mM glutamine.

As células DP12 que cresceram em suspensão foram colhidas, lavadas uma vez no meio descrito para ressupensão de DNA e finalmente ressuspenso no mesmo meio numa concne7 tração de 10 células por 750 μΐ. Aliquotas de células (750 μΐ) e cada uma das misturas de DNA linearizado foram incubadas juntamente à temperatura ambiente durante uma hora e depois transferidas para uma câmara de electroporação BRL. Cada uma das misturas de reacção foi então electroporada num aparelho de electroporação . convencional BRL a 350 volts e 330 mF e baixa capacitância. Após electroporação, as células foram deixadas sedimentar no aparelho durante 5 minutos e depois em gelo durante mais 10 minutos de incubação. As células electroporadas foram então transferidas para placas de cultura de tecidos de 60 mm contendo 5 ml de meio de crescimento completo convencional para células CHO (DMEM-F12 com alto teor de glucose 50:50 sem suplemento de glicina com GHT lx, glutamina 2mM e 5% de soro fetal de vitela) e crescidas durante a noite numa estufa de cultura de tecidos a 5% de CO₂·DP12 cells that grew in suspension were harvested, washed once in the described medium for resupply of DNA and finally resuspended in the same medium in a concentration of 10 cells per 750 μΐ. Cell aliquots (750 μΐ) and each of the linearized DNA mixtures were incubated together at room temperature for one hour and then transferred to a BRL electroporation chamber. Each of the reaction mixtures was then electroporated in an electroporation apparatus. conventional BRL at 350 volts and 330 mF and low capacitance. After electroporation, the cells were allowed to pellet in the apparatus for 5 minutes and then on ice for an additional 10 minutes of incubation. The electroporated cells were then transferred to 60 mm tissue culture plates containing 5 ml of conventional complete growth medium for CHO cells (DMEM-F12 with 50:50 high glucose content without glycine supplementation with 1x GHT, 2mM glutamine and 5% fetal calf serum) and grown overnight in a 5% CO ₂ tissue culture oven ·

c. Método de selecção e despisteç. Selection and screening method

No dia seguinte, as células foram retiradas das placas por tripsinização usando métodos convencionais e transferidas para placas de cultura de tecidos de 150 mm contendo meio selectivo DHFR (meioDMEM Ham-F12, 1:1 meio descrito atrás suplementado com 2% ou 5% de soro fetal deThe next day, cells were removed from the plates by trypsinization using conventional methods and transferred to 150 mm tissue culture plates containing DHFR selective medium (DMEM Ham-F12 medium, 1: 1 medium described above supplemented with 2% or 5% fetal serum

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vitela dialisado, hipoxantina e timidina mas sem glicina. Este é o meio de seleccção para DHFR que usamos). As células derivadas de cada uma das placas de 60 mm foram subsequentemente semeadas novamente em 5 placas de 150 mm. as células foram então incubadas durante 10 a 15 dias (com uma muda de meio) a 37°C/5% C0₂ até os clones começarem a aparecer e atingirem tamanhos adequados à transferência para placas de 96 cavidades usando pontas amarelas estéreis num sistema de pipetagem ajustado para 50 ml. Deixou-se então as células crescerem até à confluência (geralmente 3-5 dias) e depois as placas foram tripsinizadas e 2 cópias da placa original foram reproduzidas. Duas destas cópias foram guardadas a curto prazo num congelador com as células em cada cavidade diluídas em 50μ1 de 10% FCS em DMSO. As amostras de meio sem soro condicionado durante 5 dias foram testadas das cavidades confluentes na terceira placa para a expressão de TPO via ensaio de actividade baseado nas células Ba/F. Os clones com maior expressão baseado nestes ensaios foram descongelados e expandidos em dois frascos T de 150 mm para transferência para o grupo de cultura de células para adaptação à suspensão, novo ensaio de depósito num banco.dialyzed veal, hypoxanthine and thymidine but without glycine. This is the selection method for DHFR we use). The cells derived from each of the 60 mm plates were subsequently seeded again into 5 150 mm plates. the cells were then incubated for 10 to 15 days (with a change of medium) at 37 ° C / 5% CO ₂ until the clones begin to appear and reach sizes suitable for transfer to 96-well plates using sterile yellow tips in a pipetting adjusted to 50 ml. The cells were then allowed to grow to confluence (usually 3-5 days) and then the plates were trypsinized and 2 copies of the original plate were reproduced. Two of these copies were kept for short term in a freezer with the cells in each well diluted in 50μ1 of 10% FCS in DMSO. Samples of medium without conditioned serum for 5 days were tested from confluent wells on the third plate for TPO expression via activity assay based on Ba / F cells. The clones with the highest expression based on these assays were thawed and expanded in two 150 mm T flasks for transfer to the cell culture group for adaptation to the suspension, new bank deposit assay.

d. Protocolo de amplificaçãod. Amplification protocol

Várias das linhas celulares com um título mais alto observado na selecção descrita atrás foram subsequentemente colocadas num regime de amplificação convencional com metotrexato para gerar clones de título elevado. Os clones de células CHO foram expandidos e semeados em placas de 10 cm usando 4 concentrações de metotrexato (i.e.. 50 nM, 100 nM, 200 nM e 400 nM) a dois ou três números de células (105,Several of the higher titer cell lines observed in the selection described above were subsequently placed in a conventional methotrexate amplification regimen to generate high titer clones. The CHO cell clones were expanded and seeded in 10 cm plates using 4 concentrations of methotrexate (i.e. 50 nM, 100 nM, 200 nM and 400 nM) to two or three cell numbers (105,

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5x10 e 10 células por placa). Estas culturas foram então incubadas a 37°C/5% C0₂ até os clones estarem estabelecidos e bons para transferir para placas de 96 cavidades para posterior ensaio. Vários clones com um título alto derivados desta selecção foram novamente sujeitos a maiores concentrações de metotrexato (i.e. 600 nM, 800 nM, 1000 nM e 1200nM)5x10 and 10 cells per plate). These cultures were then incubated at 37 ° C / 5% CO ₂ until the clones were established and good to transfer to 96 well plates for further testing. Several clones with a high titer derived from this selection were again subjected to higher concentrations of methotrexate (ie 600 nM, 800 nM, 1000 nM and 1200nM)

197 e como anteriormente os clones resistentes ficaram a estabe-197 and as previously resistant clones were established

lecer-se e become and depois foram then they went transferidas para transferred to placas de 96 96 plates cavidades e cavities and testadas. tested. 4 4 Cultura de Culture of linhas celulares cell lines CHO estáveis Stable CHO

expressando TPO₃₃₂ e TPO₁₅₃ humano recombinanteexpressing recombinant human TPO ₃₃₂ and TPO ₁₅₃

As células do banco foram descongeladas e a população celular foi expandida por métodos convencionais de crescimento de células em meio contendo ou não soro. Após expansão até uma densidade celular suficiente, as células foram lvadas para remover o meio de cultura metabolizado. As células foram então cultivadas por qualquer método convencional incluindo por lotes, lotes alimentados ou cultura continua a 25-40°C, pH neutro, com um teor de C>₂ dissolvido de pelo menos 5% até estar acumulado TPO secretado constitutivamente. 0 fluido da cultura celular foi então separado a partir das células por meios mecânicos tais como centrifugação .The cells of the bank were thawed and the cell population was expanded by conventional methods of growing cells in medium containing or not serum. After expansion to a sufficient cell density, the cells were washed to remove the metabolized culture medium. The cells were then cultured by any conventional method including batch, fed batch or continuous culture at 25-40 ° C, neutral pH, with a dissolved C> ₂ content of at least 5% until constitutively secreted TPO was accumulated. The cell culture fluid was then separated from the cells by mechanical means such as centrifugation.

5. Purificação de TPO humano recombinante a partir de fluidos de cultura de CHO5. Purification of recombinant human TPO from CHO culture fluids

O meio de cultura celular colhido (HCCF) foi directamente aplicado numa coluna de Blue Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) equilibrada em fosfato de sódio 0,01M pH 7,4, NaCl 0,15M numa proporção de aproximadamente 1001 de HCCF por litro de resina e a um fluxo linear de aproximada2 mente 300 ml/cm . A coluna foi então lavada com 3 a 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio seguido de 3 a 5 volumes de coluna de fosfato de sódio 0,01M pH 7,4, ureia 2,0M. O TPO foi então eluido com 3 a 5 volumes de coluna de fosfato de sódio 0,01M pH 7,4, ureia 2,0M, NaCl l,0M.The harvested cell culture medium (HCCF) was directly applied to a Blue Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) column equilibrated in 0.01M sodium phosphate pH 7.4, 0.15M NaCl in a ratio of approximately 1001 HCCF per liter of resin and a linear flow of approximately 300 ml / cm. The column was then washed with 3 to 5 column volumes of equilibration buffer followed by 3 to 5 column volumes of 0.01M sodium phosphate pH 7.4, 2.0M urea. The TPO was then eluted with 3 to 5 column volumes of 0.01M sodium phosphate pH 7.4, 2.0M urea, 1.0M NaCl.

O conjunto de fracções da Blue Sepharose contendo TPO foi então aplicado a uma coluna de Lectina de germén de trigo Sepharose 6MB (Pharmacia) equilibrada em fosfato deThe set of Blue Sepharose fractions containing TPO was then applied to a column of Sepharose 6MB wheat germ Lectin (Pharmacia) equilibrated in phosphate of

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sódio Ο,ΟΙΜ pH 7,4, ureia 2,0 Me NaCl l,0M numa proporção de 8 para 16 ml do conjunto de fracções da coluna de Blue Sepharose por ml de resina a um fluxo de aproximadamente 50 ml/h/cm . A coluna foi então lavada com 2a 3 colunas de tampão de equilíbrio. O TPO foi então eluido com 2 a 5 volumes de coluna de fosfato de sódio Ο,ΟΙΜ pH 7,4, ureia 2,0M, N-acetil-D-glucosamina 0,5M.sodium Ο, ΟΙΜ pH 7.4, urea 2.0 Me NaCl 1.0M in a ratio of 8 to 16 ml of the set of fractions from the Blue Sepharose column per ml of resin at a flow of approximately 50 ml / h / cm. The column was then washed with 2-3 columns of equilibration buffer. The TPO was then eluted with 2 to 5 column volumes of sodium phosphate Ο, ΟΙΜ pH 7.4, 2.0M urea, 0.5M N-acetyl-D-glucosamine.

O conjunto de fracções da coluna de lectina de germem de trigo foi então ajustado a uma concentração final de 0,04% ^c _12rE8 ^{e 0,1}% ^de ácido trifluoroacético (TFA). 0 conjunto de fracções resultante foi aplicado numa coluna de fase reversa C4 (Vydac 214TP1022) equilibrado em 0,1% TFA, 0,04% C E aplicando aproximadamente 0,2 a 0,5 mg deThe combined fractions of lectin wheat germ column was then adjusted to a final concentration of 0.04% ^and _12r E8 ^{and 0.1%} trifluoroacetic acid (TFA). The resulting set of fractions was applied to a C4 reverse phase column (Vydac 214TP1022) balanced at 0.1% TFA, 0.04% EC by applying approximately 0.2 to 0.5 mg of

L Z o 2 proteína por ml de resina a um fluxo de 157 ml/cm .L Z o 2 protein per ml of resin at a flow of 157 ml / cm.

A proteína foi eluida num gradiente linear de duas fases de acetonitrilo contendo 0,1% TFA, 0,04% CE. A 12 o primeira fase é composta por um gradiente linear de 30 a 60% de acetonitrilo em 60 minutos. O TPO elui a aproximadamente 50% de acetonitrilo. Fez-se um conjunto de fracções com base em SDS-PAGE.The protein was eluted on a two-phase linear gradient of acetonitrile containing 0.1% TFA, 0.04% EC. The 12th phase consists of a linear gradient of 30 to 60% acetonitrile in 60 minutes. TPO elutes at approximately 50% acetonitrile. A set of fractions was made based on SDS-PAGE.

O conjunto de fracções derivado da coluna C4 foi então diluido com 2 volumes de fosfato de sódio 0,01M pH 7,4, NaCl 0,15M e diafiltrado versus aproximadamente 6 volumes de fosfato de sódio 0,01M pH 7,4, NaCl 0,15M numa membrana de ultrafiltração Amicon YM ou similar tendo um peso molecular de exclusão de 10000 a 30000 Dalton. 0 diafiltrado resultante pode ser directamente processado ou ainda concentrado por ultrafiltração. O diafiltrado/concentrado foi ajustado a uma concentração final de 0,01% de Tween-80.The fraction set derived from column C4 was then diluted with 2 volumes of 0.01M sodium phosphate pH 7.4, 0.15M NaCl and diafiltered versus approximately 6 volumes of 0.01M sodium phosphate pH 7.4, NaCl 0 , 15M on an Amicon YM ultrafiltration membrane or the like having an exclusion molecular weight of 10,000 to 30,000 Dalton. The resulting diafiltrate can be directly processed or further concentrated by ultrafiltration. The diafiltrate / concentrate was adjusted to a final concentration of 0.01% Tween-80.

A totalidade ou uma fracção do diafiltrado/concentrado equivalente a 2a 5% do volume de coluna calculado foi então aplicado a uma coluna de Sephacryl S-300 HRAll or a fraction of the diafiltrate / concentrate equivalent to 25% of the calculated column volume was then applied to a Sephacryl S-300 HR column

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(Pharmacia) equilibrada em fosfato de sódio 0,01M pH 7,4, NaCl 0,15M, 0,01% Tween 80 e cromatografado a um fluxo de 2 aproximadamente 17 ml/h/cm . As fracções contendo TPO sem agregados ou produtos de degradação proteolítica foram reunidas com base em SDS-PAGE. O conjunto de fracções resultante foi filtrado num filtro de 0,22μ Millex-GV ou similar e guardado a 2-8°C.(Pharmacia) balanced in 0.01M sodium phosphate pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.01% Tween 80 and chromatographed at a flow rate of approximately 17 ml / h / cm. Fractions containing TPO without aggregates or proteolytic degradation products were pooled on the basis of SDS-PAGE. The resulting fraction set was filtered through a 0.22μ Millex-GV or similar filter and stored at 2-8 ° C.

EXEMPLO 21EXAMPLE 21

Transformação e Indução da SíntesedaTransformation and Induction of Synthesis

Proteína TPO em E. coliTPO protein in E. coli

1. Construção dos vectores de expressão de TPO em1. Construction of TPO expression vectors in

E. coliE. coli

Os plasmídeos pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 e pMP202 foram todos projectados para expressar os 155 primeiros aminoácidos do TPO a jusante de um líder pequeno que varia entre as diferentes construções, basicamente um nível elevado de purificação rápida. Os plasmídeosPlasmids pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 and pMP202 were all designed to express the first 155 amino acids of TPO downstream from a small leader that varies between different constructs, basically a high level of rapid purification. Plasmids

Os líderes proporcionam iniciação da tradução e PMP210-1, -T8, -21, -22,Leaders provide translation initiation and PMP210-1, -T8, -21, -22,

-24, -25 foram projectados para expressar os primeiros 153 aminoácidos de TPO a jusante de uma metionina de iniciação e diferem apenas na utilização de codões para os primeiros 6 aminoácidos de TPO, se bem que o plasmídeo pMP251 seja um derivado de pMP210-l em que o extremo carbonilo do TPO foi prolongado com dois aminoácidos. Todos os plasmídeos acima produzirão níveis de expressão intracelular altos do TPO em E. coli quando da indução do promotor do triptofano (Yansura, D.G. et. al. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V.,Ed.) 185;54-60. Academic Press, San Diego [1990}). Os plasmídeos MP1 e pMP172 são intermediários na construção dos plasmídeos de expressão intracelular do TPO.-24, -25 were designed to express the first 153 amino acids of TPO downstream of an initiating methionine and differ only in the use of codons for the first 6 amino acids of TPO, although plasmid pMP251 is a derivative of pMP210-l where the carbonyl end of the TPO has been extended with two amino acids. All of the above plasmids will produce high levels of intracellular TPO expression in E. coli upon induction of the tryptophan promoter (Yansura, DG et. Al. Methods in Enzymology (Goeddel, DV, Ed.) 185; 54-60. Academic Press , San Diego [1990}). Plasmids MP1 and pMP172 are intermediates in the construction of TPO intracellular expression plasmids.

(a) Plasmídeo pMPl plasmídeo pMPl é um vector de secreção para os r(a) Plasmid pMPl Plasmid pMPl is a secretion vector for r

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primeiros 155 aminoácidos do TPO e foi construído por ligação de 5 fragmentos de DNA como se mostra na Fig. 33. O primeiro destes foi o vector pPho21 em que o fragmento pequeno MluI-BamHI tinha sido removido. pPho21 é um derivado de phGHl (Chang, C.N. et al., Gene 55:189-196 [1987]) em que o gene da hormona de crescimento humano foi substituído com um gene phoA de E. coli e um sítio de restrição MluI foi criado na sequência codificadora da sequência sinal STII nos aminoácidos 20-21.first 155 amino acids from TPO and was constructed by ligating 5 DNA fragments as shown in Fig. 33. The first of these was the vector pPho21 in which the small MluI-BamHI fragment had been removed. pPho21 is a derivative of phGHl (Chang, CN et al., Gene 55: 189-196 [1987]) in which the human growth hormone gene has been replaced with an E. coli phoA gene and an MluI restriction site has been created in the coding sequence of the STII signal sequence at amino acids 20-21.

Os dois fragmentos seguintes, um fragmento de DNA de 258 pares de bases Hinfl-PstI derivado de pRK5-hmpl (Exemplo 9) codificador dos aminoácidos de TPO 19-103 e o seguinte DNA sintético codificador dos aminoácidos 1-18.The following two fragments, a 258 base pair Hinfl-PstI DNA fragment derived from pRK5-hmpl (Example 9) encoding TPO 19-103 amino acids and the following synthetic DNA encoding amino acids 1-18.

5'-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTG5'-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGCACTGA-5' (SEQ ID NO:69) (SEQ ID NO:70) foram pré-ligados com DNA-ligase de T4 e depois cortadas com BstI. 0 quarto foi um fragmento PstI-HaelI de 152 pares de bases derivado de pRKShmpll codificador dos aminoácidos 104-155 de TPO. O último foi um fragmento StuI-BamHI de 412 pares de bases derivado de pdhl08 contendo o lambda até ao terminador como anteriormente descrito (Scholtissek, S. et al.. NAR 15:3185 [1987]).ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGCACTGA-5 '(SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) were pre-ligated with T4 DNA ligase and then cut with BstI. The fourth was a 152 base pair PstI-HaelI fragment derived from pRKShmpll encoding amino acids 104-155 of TPO. The last was a 412 base pair StuI-BamHI fragment derived from pdhl08 containing the lambda to the terminator as previously described (Scholtissek, S. et al .. NAR 15: 3185 [1987]).

(b) Plasmídeo pMP21(b) Plasmid pMP21

O plasmídeo pMP21 foi projectado para expressar os primeiros 155 aminoácidos de TPO coma ajuda de um líder de 13 aminoácidos compreendendo parte da sequência sinal de STII. Construiu-se ligando três fragmentos de DNA como sePlasmid pMP21 was designed to express the first 155 amino acids of TPO with the help of a 13 amino acid leader comprising part of the STII signal sequence. It was constructed by ligating three DNA fragments as if

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mostra na Fig. 34, o primeiro destes sendo o vector pVEG31 em que o fragmento pequeno Xbal-Sphl foi removido. O vector pVEG31 é um derivado de pHGH207-l (de Boer, H.A. et al., em Promotor Structure and Functiona (Rodriguez, R.L. e Chamberlain, M.J., Ed), 462, Praeger, New York [1982]) em que o gene da hormona de crescimento humana foi substituído pelo gene do factor de crescimento endotelial (este fragmento de vector idêntico pode ser obtido a partir deste último plasmídeo).shown in Fig. 34, the first of these being the vector pVEG31 in which the small Xbal-Sphl fragment was removed. The pVEG31 vector is a derivative of pHGH207-l (by Boer, HA et al., In Promoter Structure and Functiona (Rodriguez, RL and Chamberlain, MJ, Ed), 462, Praeger, New York [1982]) in which the gene of human growth hormone has been replaced by the endothelial growth factor gene (this identical vector fragment can be obtained from the latter plasmid).

A segunda parte na ligação foi uma dupla cadeia de DNA sintético com a seguinte sequência:The second part of the link was a double strand of synthetic DNA with the following sequence:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5' (SEQ ID NO:71) (SEQ ID NO:72)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5 '(SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

O último fragmento foi um fragmento Mlul-Sphl de 1072 pares de bases derivado de pMPl codificador de 155 aminoácidos de TPO.The last fragment was a 1072 base pair Mlul-Sphl fragment derived from pMPl encoding 155 amino acids of TPO.

(c) Plasmídeo pMP151(c) Plasmid pMP151

O plasmídeo pMP151 foi projectado de forma a expressar os 155 primeiros aminoácidos de TPO a jusante de um líder compreendendo 7 aminoácidos da sequência sinal STII, 8 histidinas, e um sítio de clivagem do Factor Xa.Plasmid pMP151 was designed to express the first 155 amino acids of TPO downstream from a leader comprising 7 amino acids of the STII signal sequence, 8 histidines, and a Factor Xa cleavage site.

Como mostrado na Fig. 35, o pMP151 foi construído por ligação uns aos outros de três fragmentos de DNA, sendo o primeiro destes o vector pVEG31 previamente partir do qual o fragmento Xbal-Sphl pequeno removido. O segundo era uma cadeia dupla de seguinte sequência:As shown in Fig. 35, pMP151 was constructed by ligating three DNA fragments together, the first of which being the vector pVEG31 from which the small Xbal-Sphl fragment was removed. The second was a double string of the following sequence:

descrito a tinha sido DNA com adescribed the had been DNA with the

5·-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG r5 · -CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG r

202202

GTCGTAGCCGTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTCTTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC

CAGCAT-5' (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)CAGCAT-5 '(SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)

O último era um fragmento de Bgll-Sphl com 1064 pares de bases a partir de 154 aminoácidos de TPO codificadores de pMPll. O plasmídeo pMPll é idêntico a pMPl com excepção de algumas variações de codão na sequência sinal de STII (este fragmento pode ser obtido a partir de pMPl).The latter was a 1064 base pair Bgll-Sphl fragment from 154 amino acids of TPO encoding pMP11. Plasmid pMP11 is identical to pMPl with the exception of some codon variations in the STII signal sequence (this fragment can be obtained from pMPl).

(d) Plasmídeo pMP202(d) Plasmid pMP202

O plasmídeo pMP202 é muito semelhante ao vector de expressão pMP151 com excepção de o sítio de clivagem do factor Xa no líder ter sido substituído com um sítio de clivagem da trombina. Como se mostra na Fig. 36, pMP202 foi construído ligando os três fragmentos uns aos outros. O primeiro destes foi o pVEG31 anteriormente descrito em que foi removido o fragmento pequeno Xbal-Sphl. O segundo foi uma cadeia dupla de DNA com a seguinte sequência:Plasmid pMP202 is very similar to the expression vector pMP151 except that the factor Xa cleavage site in the leader has been replaced with a thrombin cleavage site. As shown in Fig. 36, pMP202 was constructed by linking the three fragments together. The first of these was pVEG31 previously described in which the small Xbal-Sphl fragment was removed. The second was a double strand of DNA with the following sequence:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAACCACGTAGCC5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAACCACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTGGTGCAT-5' (SEQ ID NO:75) (SEQ ID NO:76)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTGGTGCAT-5 '(SEQ ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76)

O último fragmento foi um fragmento BglII-Sphl de 1064 pares de bases derivado do plasmídeo pMPll anteriormente descrito.The last fragment was a 1064 base pair BglII-Sphl fragment derived from the previously described plasmid pMP11.

rr

203203

(e) Plasmídeo pMP172(e) Plasmid pMP172

O plasmídeo pMP172 é um vector de secreção para os primeiros 153 aminoácidos do TPO e é um intermediário para a construção de pMP210. Como se mostra na Fig. 37, pMP172 foi preparado ligando três fragmentos de DNA, o primeiro dos quais foi o vector pLS321amB em que a secção EcoRI-HindIII pequena foi retirada. O segundo foi um fragmento EcoRI-Hgal de 946 pares de bases do plasmídeo pMPll anteriormente descrito. 0 último fragmento foi um DNA sintético com a seguinte sequência:Plasmid pMP172 is a secretion vector for the first 153 amino acids in TPO and is an intermediate for the construction of pMP210. As shown in Fig. 37, pMP172 was prepared by ligating three DNA fragments, the first of which was the vector pLS321amB in which the small EcoRI-HindIII section was removed. The second was a 946 base pair EcoRI-Hgal fragment from the previously described plasmid pMP11. The last fragment was synthetic DNA with the following sequence:

5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO:77)5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO: 77)

GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO:78) (f) Plasmídeo pMP210 plasmídeo pMP210 foi projectado para expressar s primeiros 153 aminoácidos de TPO após uma metionina de iniciação da tradução. Este plasmídeo foi de facto feito como um banco de plasmídeos em que os 6 primeiros codões do TPO foram escolhidos ao acaso para a terceira posição de cada codão e foi construído como se mostra na Fig. 38 pela ligação de três fragmentos de DNA. 0 primeiro destes foi o vector anteriormente descrito pVEG31 em que o fragmento pequeno Xbal-Sphl foi removido. 0 segundo foi um DNA sintético apresentado abaixo tratado primeiro com DNA-polimerase I (Klenow) seguido de digestão com Xbal e Hinfl e codificador da metionina de iniciação e os 6 primeiros codões de TPO.GGAGACGCAGTCCATCGA-5 '(SEQ ID NO: 78) (f) Plasmid pMP210 Plasmid pMP210 was designed to express the first 153 amino acids of TPO after a translation initiation methionine. This plasmid was in fact made as a plasmid bank in which the first 6 codons of the TPO were chosen at random for the third position of each codon and was constructed as shown in Fig. 38 by ligating three DNA fragments. The first of these was the previously described vector pVEG31 in which the small Xbal-Sphl fragment was removed. The second was a synthetic DNA presented below treated first with DNA polymerase I (Klenow) followed by digestion with Xbal and Hinfl and encoding the initiation methionine and the first 6 TPO codons.

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA ACACTGGAGGCT (SEQ ID NO:79)5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA ACACTGGAGGCT (SEQ ID NO: 79)

GTTCTCAGTAAAGTTCTCAGTAAA

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5' (SEQ ID NO:80)CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5 '(SEQ ID NO: 80)

terceiro foi um fragmento Hinfl-Sphl de 890 pares de bases derivado do pMP712 codificador dos aminoãcidos 19-153 de TPO.third was an 890 base pair Hinfl-Sphl fragment derived from the pMP712 encoding amino acids 19-153 of TPO.

O banco do plasmídeo pMP210 de aproximadamente 3700 clones foi retransformado para placas de LB com uma concentração alta de tetraciclina (50 Mg/ml) para seleccionar clones com uma iniciação da tradução alta (Yansura, D.G. et al., Methods: A Companion to Methods in EnzymologyThe pMP210 plasmid bank of approximately 3700 clones was re-transformed to LB plates with a high concentration of tetracycline (50 Mg / ml) to select clones with a high translation initiation (Yansura, DG et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology

4.:151-158 [1992]). Das 8 colónias que surgiram nas placas de alta concentração de tetraciclina, cinco das melhores em termos de expressão de TPO foram sujeitas a sequenciação de DNA e os resultados estão apresentados na Fig. 39 (SEQ ID NOS:23, 24, 25, 26, 27 E 28).4.151-158 [1992]). Of the 8 colonies that appeared on the plates of high tetracycline concentration, five of the best in terms of TPO expression were subjected to DNA sequencing and the results are shown in Fig. 39 (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 AND 28).

(g) Plasmídeo pMP41 plasmídeo pMP41 foi projectado para expressar os primeiros 155 aminoácidos do TPO fundidos com um líder consistindo em 7 aminoácidos da sequência sinal STII seguido de uma sítio de clivagem pelo factor Xa. 0 plasmídeo fo construído como se mostra na Fig. 40 ligando os três fragmentos de DNA, o primeiro dos quais foi o vector anteriormente descrito pVEG31 em que o fragmento pequeno Xbal-Sphl foi removido. 0 segundo foi o seguinte DNA de cadeia dupla sintético:(g) Plasmid pMP41 Plasmid pMP41 was designed to express the first 155 amino acids of the TPO fused to a leader consisting of 7 amino acids of the STII signal sequence followed by a factor Xa cleavage site. The plasmid was constructed as shown in Fig. 40 linking the three DNA fragments, the first of which was the previously described vector pVEG31 in which the small Xbal-Sphl fragment was removed. The second was the following synthetic double-stranded DNA:

5·-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO:81)5 · -CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO: 81)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5' (SEQ ID NO:82)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5 '(SEQ ID NO: 82)

O último fragmento da ligação foi o fragmento BglII-Sphl de 1064 pares de bases derivado do plasmídeo anteriormente descrito pMPll.The last fragment of the ligation was the 1064 base pair BglII-Sphl fragment derived from the previously described plasmid pMP11.

rr

205205

(h) Plasmídeo pMP57(h) Plasmid pMP57

O plasmídeo pMP57 expressa os 155 primeiros aminoácidos do TPO a jusante de um líder consistindo em 9 aminoácidos da sequência sinal STII e o sítio dibásico Lis-Arg. Este sítio dibásico proporciona um meio de remover o líder com a protease ArgC. Este plasmídeo foi construído como se mostra na Fig. 41 ligando os três fragmentos de DNA. O primeiro destes foi o vector anteriormente descrito pVEG31 em que o fragmento pequeno Xbal-Sphl foi removido. 0 segundo foi o seguinte DNA de cadeia dupla sintético:Plasmid pMP57 expresses the first 155 amino acids of TPO downstream from a leader consisting of 9 amino acids of the STII signal sequence and the dibasic Lis-Arg site. This dibasic site provides a means of removing the leader with the ArgC protease. This plasmid was constructed as shown in Fig. 41 by linking the three DNA fragments. The first of these was the vector previously described pVEG31 in which the small Xbal-Sphl fragment was removed. The second was the following synthetic double-stranded DNA:

5' -CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO:83) TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO:84)5 '-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83) TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO: 84)

A última parte da ligação foi o fragmento Bgll-Sphl de 1064 pares de bases derivado do plasmídeo anteriormente descrito pMPl.l.The last part of the ligation was the 1064 base pair Bgll-Sphl fragment derived from the previously described plasmid pMPl.l.

(i) Plasmídeo pMP251(i) Plasmid pMP251

O plasmídeo pMP251 é um derivado do pMP210-l em que mais dois aminoácidos do TPO estão incluídos no extremo carbonilo. Como se mostra na Fig. 42, este plasmídeo foi construído por ligação de dois fragmentos de DNA, o primeiro destes sendo o pMP21 anteriormente descrito em que o fragmento pequeno Xbal-Apal foi removido. A segunda parte da ligação foi um fragmento Xbal-Apal de 316 pares de bases derivado do pMP210-l.Plasmid pMP251 is a derivative of pMP210-l in which two more TPO amino acids are included at the carbonyl end. As shown in Fig. 42, this plasmid was constructed by ligating two DNA fragments, the first of which being the pMP21 previously described in which the small Xbal-Apal fragment was removed. The second part of the ligation was a 316 base pair Xbal-Apal fragment derived from pMP210-1.

2. Transformação e indução de E. coli com vectores de expressão de TPO2. Transformation and induction of E. coli with TPO expression vectors

Os plasmídeos de expressão de TPO atrás referidos foram usados para transformar E. coli estirpe 44C6 (w3110The aforementioned TPO expression plasmids were used to transform E. coli strain 44C6 (w3110

rr

206206

choque térmico com CaCl₂ (Mandei, M. et al., J. Mol. Biol., .53.:159-162, [1970]). As células transformadas foram primeiro crescidas a 37°C em meio LB contendo 50 gg/ml de carbeniclina até a densidade óptica (600 nm) da cultura atingir aproximadamente 2-3. A cultura de LB foi então diluida 20x com meio M9 contendo 0,4% de casaminoácidos (p/v) e 50 gg/ml de carbenicilina. Após crescimento com arejamento a 30°C durante 1 hora, adicionou-se ácido indolo-3-acrílico para uma concentração final de 50μg/ml. A cultura foi então deixada continuar a crescer a 30°C com arejamento durante mais 15 horas , altura em que as células foram colhidas por centrifugação.thermal shock with CaCl ₂ (Mandei, M. et al., J. Mol. Biol., .53.: 159-162, [1970]). The transformed cells were first grown at 37 ° C in LB medium containing 50 gg / ml carbenicline until the optical density (600 nm) of the culture reached approximately 2-3. The LB culture was then diluted 20x with M9 medium containing 0.4% casamino acids (w / v) and 50 gg / ml carbenicillin. After growth with aeration at 30 ° C for 1 hour, indole-3-acrylic acid was added to a final concentration of 50μg / ml. The culture was then allowed to continue to grow at 30 ° C with aeration for an additional 15 hours, at which time the cells were harvested by centrifugation.

EXEMPLO 22EXAMPLE 22

Produção de TPO Met ^-153) biologicamnete activo em E. coliProduction of TPO Met ^ -153) biologically active in E. coli

Os processos apresentados abaixo para a produção de TPO biologicamente activo, TPO (met ¹ 1-153) renaturado podem ser aplicados em analogia para a recuperação de outras variantes de TPO incluindo formas prolongadas nos extremos N e C (ver Exemplo 23)The processes presented below for the production of biologically active TPO, renatured TPO (met ¹ 1-153) can be applied in analogy to the recovery of other TPO variants including prolonged forms at the N and C ends (see Example 23)

A. Recuperação de TPO (Met ¹ 1-153) não solúvelA. Recovery of non-soluble TPO (Met ¹ 1-153)

As células de E. coli expressando TPO (Met ¹ E. coli cells expressing TPO (Met ¹

1-153) codificado pelo plasmídeo pMP210-l foram fermentadas como descrito atrás. Tipicamente cerca de lOOg de células são ressuspensas em 1 1 (10 volumes) de tampão de rebentamento de células (10 mM Tris, EDTA 5 mM, pH 8) com um homogenizador Polytron e as células centrifugadas a 5000 x g durante 30 minutos. O sedimento de células lavado foi novamente ressuspenso em 1 1 de tampão de rebentamento de células com um homogenizador Polytron e a suspensão de células foi passada através de um destruidor de células LH (LH Inceltech, Inc.) ou através de um microfluizador (Microfluidics International) de acordo com as instruções do r1-153) encoded by plasmid pMP210-l were fermented as described above. Typically about 100 g of cells are resuspended in 1 l (10 volumes) of cell burst buffer (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) with a Polytron homogenizer and the cells centrifuged at 5000 x g for 30 minutes. The washed cell pellet was resuspended in 1 l of cell bursting buffer with a Polytron homogenizer and the cell suspension was passed through an LH cell destroyer (LH Inceltech, Inc.) or through a microfluidizer (Microfluidics International ) according to the instructions

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fabricante. A suspensão foi centrifugada a 5000g durante 30 minutos e ressuspensa e centrifugada uma segunda vez para fazer um sedimento de corpos refractáveis. 0 sedimento lavado foi usado imediatamente ou guardado a -70°C.manufacturer. The suspension was centrifuged at 5000g for 30 minutes and resuspended and centrifuged a second time to make a refractory body pellet. The washed pellet was either used immediately or stored at -70 ° C.

B. Solubilização e purificação do TPO (Met^-1 1-153) monoméricoB. Solubilization and purification of monomeric TPO (Met ^-1 1-153)

O sedimento obtido atrás foi ressuspenso em 5 volumes por peso de Tis 20 mM, pH 8, com guanidina 6-8 M e DTT (ditiotreitol) 25 mM e agitado durante 1-3 horas ou durante a noite a 4°C para efectuar a solubilização da proteína TPO. Concentrações elevadas de ureia (6-8M) foram também úteis mas geralmente resultam em rendimentos mais baixos comparado com guanidina. Após solubilização, a solução foi centrifugada a 30000 xg durante 30 minutos para produzir um sobrenadante clarificado contendo proteína TPO monomérica desnaturada. O sobrenadante foi então cromatografado numa coluna de filtração em Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) a um fluxo de 2 ml/min. e a proteína eluida com fosfato de sódio 20 mM, pH 6,0, com as fracções reunidas tendo DTT lOmM e proteína TPO desnaturada monomérica eluindo entre 160 e 200 ml. A proteína TPO foi ainda purificada numa foi aplicada de TFA (ácido proteína foi (30-60% reversa C4 (2 x 20 cm a 5ml/min. a uma coluna trifluoroacético) com 30% eluida com um em 60 min.) A coluna semi-preparativa de faseThe pellet obtained above was resuspended in 5 volumes by weight of 20 mM Tis, pH 8, with 6-8 M guanidine and 25 mM DTT (dithiothreitol) and stirred for 1-3 hours or overnight at 4 ° C to carry out the solubilization of the TPO protein. High concentrations of urea (6-8M) were also useful but generally resulted in lower yields compared to guanidine. After solubilization, the solution was centrifuged at 30,000 xg for 30 minutes to produce a clarified supernatant containing denatured monomeric TPO protein. The supernatant was then chromatographed on a Superdex 200 filtration column (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) at a flow rate of 2 ml / min. and the protein eluted with 20 mM sodium phosphate, pH 6.0, with the combined fractions having 10 mM DTT and denatured monomeric TPO protein eluting between 160 and 200 ml. The TPO protein was further purified in an application of TFA (protein acid was (30-60% reverse C4 (2 x 20 cm at 5ml / min. To a trifluoroacetic column) with 30% eluted with one in 60 min.) The column semi-preparatory phase

VYDAC). A amostra equilibrada em 0,1% de acetonitrilo. a linear de acetonitrilo reduzida purificada elui a aproximadamente 50% de trilo, este material foi usado para renaturaçâo gradiente proteína acetonipara se obter a variante TPO biologicamente activa.VYDAC). The sample is equilibrated in 0.1% acetonitrile. the purified reduced acetonitrile linear elutes at approximately 50% tryl, this material was used for gradient renaturation of acetonitrile protein to obtain the biologically active TPO variant.

C. Geração de TPO (Met ¹ 1-153) biologicamente activoC. Generation of biologically active TPO (Met ¹ 1-153)

Aproximadamente 20 mg de TPO reduzido eApproximately 20 mg of reduced TPO and

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desnaturado monomérico em 40 ml de 0,1% TFA/50% de acetonitrilo foi diluido em 360 ml de tampão de renaturação contendo os seguintes reagentes:monomeric denatured in 40 ml of 0.1% TFA / 50% acetonitrile was diluted in 360 ml of renaturation buffer containing the following reagents:

Tris 50 mM50 mM Tris

NaCl 0,3M EDTA 5 mM 2% de detergente CHAPS 25% de glicerol glutationa oxidada 5 mM glutationa reduzida 1 mM pH ajustado a 8,30.3M NaCl 5 mM EDTA 2% CHAPS detergent 25% oxidized glycerol glutathione 5 mM reduced glutathione 1 mM pH adjusted to 8.3

Após mistura o tampão de renaturação foi suavemente agitado a 4°C durante 12-48 hr para se obterem os melhores rendimentos de renaturação da forma ligada por pontes dissulfureto correctas do TPO (ver abaixo). A solução foi então acidificada com TFA para uma concentração final 0,2%, filtrada através de um filtro de 0,45 ou 0,22 microns e 1/10 do volume de acetonitrilo foi adicionado. Esta solução foi então bombeada directamente para uma coluna de fase reversa C4 e TPO (Met ¹ 1-153) renaturado purificado eluido com o mesmo programa de gradiente atrás. TPO renaturado biologicamente activo eluiu a aproximadamente 45% de acetonitrilo nestas condições. As versões incorrectas das ligações dissulfureto do TPO aluem mais cedo. O TPO (Met ¹ 1-153) final purificado está mais de 95% puro conforme avaliado em géis de SDS e cromatográfia analítica em fase reversa C4. Para estudos com animais o material purificado de C4 foi dialisado contra tampões fisiologicamente compatíveis. Usaram-se tampões isotónicos (acetato de Na 10 mM, pH 5,5, succinato de Na pH 5,5 ou fosfato de Na 10 mM, pH 7,4) contendo NaCl 150 mM e 0,01% de Tween 80.After mixing, the renaturation buffer was gently stirred at 4 ° C for 12-48 hr to obtain the best renaturation yields from the correct TPO disulfide bonded form (see below). The solution was then acidified with TFA to a final concentration of 0.2%, filtered through a 0.45 or 0.22 micron filter and 1/10 of the volume of acetonitrile was added. This solution was then pumped directly into a purified renatured TPO (Met ¹ 1-153) reversed phase column eluted with the same gradient program above. Biologically active renatured TPO eluted at approximately 45% acetonitrile under these conditions. Incorrect versions of the TPO disulfide bonds work earlier. The final purified TPO (Met ¹ 1-153) is more than 95% pure as assessed on SDS gels and C4 reverse phase analytical chromatography. For animal studies, the purified C4 material was dialyzed against physiologically compatible buffers. Isotonic buffers (10 mM Na acetate, pH 5.5, Na succinate pH 5.5 or 10 mM Na phosphate, pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 0.01% Tween 80 were used.

Devido à elevada potência do TPO no ensaio com Ba/F3 (metade da estimulação máxima é conseguida a aproximadamente 3 pg/ml) é possível obter material biologicamenteDue to the high potency of TPO in the Ba / F3 assay (half of maximum stimulation is achieved at approximately 3 pg / ml) it is possible to obtain material biologically

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activo utilizando muitos tampões diferentes, detergentes e reacções redox. No entanto, na maior parte das condições obtem-se apenas uma pequena quantidade de material correctamente renaturado (<10%). Para processos de produção comerciais, é desejável ter rendimentos de reenrolamento de pelo menos 10%, mais preferencialmente 30-50% e mais preferencialmente >50%. Muitos detergentes diferentes (Triton X-100, dodecil-beta-maltósido, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosil, Tween 20 e Tween 80, Zwittergent 3-14 e outros) foram testados quanto à sua eficácia nos rendimentos de renaturaçã. Observou-se que destes detergentes, apenas a família do CHAPS (CHAPS e CHAPSO) são úteis na reacção de reenrolamento para limitar a gregação de proteína e formação de ligações dissulfureto incorrectas. Níveis de CHAPS superiores a 1% foram os mais úteis. Foi necessário cloreto de sódio para melhorar os rendimentos, com níveis óptimos entre 0,lM e 0,5M. A presença de EDTA (1-5 mM) limitou a quantidade de oxidação (e agregação) catalisada por metais que foi observada com algumas preparações. As concentrações de glicerol superiores a 15% produziram condições de renaturação óptimas. Para rendimentos máximos, foi essencial ter como par de reagentes redox glutationa oxidada e reduzida ou císteina oxidada e reduzida. Geralmente os rendimentos mais altos foram observados quando a proporção molar de reagente oxidado é igual ou está em excesso relativamente ao membro reagente reduzido do par redox. Os valores de pH entre 7,5 e cerca de 9 foram óptimos para o reenrolamento destas variantes de TPO. Os solventes orgânicos (e.g., etanol, acetonitrilo, metanol) foram tolerados em concentrações de 10-15% ou mais baixas. Níveis mais altos de solventes orgânicos aumentaram a quantidade de formas incorrectamente enroladas. Os tampões Tris e de fosfatos foram geralmente úteis. A incubação a 4°C também produziram níveis elevados de TPO correctamente enrolado.active using many different buffers, detergents and redox reactions. However, in most conditions, only a small amount of correctly refurbished material (<10%) is obtained. For commercial production processes, it is desirable to have refolding yields of at least 10%, more preferably 30-50% and more preferably> 50%. Many different detergents (Triton X-100, dodecyl-beta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosil, Tween 20 and Tween 80, Zwittergent 3-14 and others) have been tested for their effectiveness on renaturation yields. It was observed that of these detergents, only the CHAPS family (CHAPS and CHAPSO) are useful in the refolding reaction to limit protein clumping and the formation of incorrect disulfide bonds. CHAPS levels above 1% were the most useful. Sodium chloride was needed to improve yields, with optimum levels between 0.1M and 0.5M. The presence of EDTA (1-5 mM) limited the amount of oxidation (and aggregation) catalyzed by metals that was observed with some preparations. Glycerol concentrations above 15% produced optimum renaturation conditions. For maximum yields, it was essential to have oxidized and reduced glutathione redox or oxidized and reduced cysteine as a pair of reagents. Generally the highest yields were observed when the molar ratio of oxidized reagent is equal to or in excess of the reduced reagent member of the redox pair. The pH values between 7.5 and about 9 were optimal for the refolding of these TPO variants. Organic solvents (e.g., ethanol, acetonitrile, methanol) were tolerated at concentrations of 10-15% or lower. Higher levels of organic solvents increased the amount of improperly rolled forms. Tris and phosphate buffers were generally useful. Incubation at 4 ° C also produced high levels of correctly rolled TPO.

Rendimentos de renaturação de 40-60% (com base na quantidade de TPO reduzido e desnaturado usado na reacção de rRenaturation yields 40-60% (based on the amount of reduced and denatured TPO used in the reaction of r

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renaturação) são típicos para preparações de TPO que foram purificadas com o primeiro passo de C4. Pode-se obter material activo quando preparações menos puras (e.g. directamente após a coluna de Superdex ou após a extracção inicial de corpos refractáveis) se bem que os rendimentos sejam inferiores devido à precipitação extensiva e interferência de proteínas não TPO durante o processo de renaturação .renaturation) are typical for TPO preparations that were purified with the first C4 step. Active material can be obtained when less pure preparations (e.g. directly after the Superdex column or after the initial extraction of refractile bodies) although yields are lower due to extensive precipitation and interference from non-TPO proteins during the renaturation process.

Uma vez que TPO (Met ¹ 1-153) contem 4 resíduos de císteina, é possível gerar três versões dissulfureto diferentes desta proteína:Since TPO (Met ¹ 1-153) contains 4 cysteine residues, it is possible to generate three different disulfide versions of this protein:

versão version 1: 1: dissulfuretos 1-4 e 2-3 disulfides 1-4 and 2-3 entre in between os the resíduos waste císteina cysteine versão version 2 : 2 : dissulfuretos 1-2 e 3-4 disulfides 1-2 and 3-4 entre in between os the resíduos waste císteina cysteine versão version 3 : 3: dissulfuretos disulfides entre in between os the resíduos waste císteina cysteine

1-3 e 2-4.1-3 and 2-4.

Durante a exploração inicial na determinação de condições de reenrolamento, vários picos diferentes contendo a proteína TPO foram separados por cromatografia de fase reversa em C4. Apenas um destes picos teve actividade biológica significativa conforme determinado por ensaio Ba/F3. Subsequentemente, as condições de reenrolamento foram optimizadas para dar preferencialmente aquela versão. Nestas condições, as versões mal renaturadas foram menos de 10-20% do TPO monómero tótal obtido.During the initial exploration in determining refolding conditions, several different peaks containing the TPO protein were separated by C4 reverse phase chromatography. Only one of these peaks had significant biological activity as determined by the Ba / F3 assay. Subsequently, the refolding conditions were optimized to give that version preferentially. Under these conditions, the poorly renatured versions were less than 10-20% of the total monomer TPO obtained.

padrão dissulfureto para o TPO biologicamente activo foi determinado como sendo 1-4 e 2-3 por espectrometria de massa e sequenciação de proteína ( i . e. versão 1). Alíquotas dos váriso picos separados por C4 (5-10 nmoles) foram digeridas com tripsina (proporção molar de 1:25 de tripsina para proteína). A mistura de digestão foi analisada por espectrometria de massa auxiliada com laser antes e após rdisulfide pattern for the biologically active TPO was determined to be 1-4 and 2-3 by mass spectrometry and protein sequencing (i.e. version 1). Aliquots of the various peaks separated by C4 (5-10 nmoles) were digested with trypsin (1:25 molar ratio of trypsin to protein). The digestion mixture was analyzed by laser-assisted mass spectrometry before and after r

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indução com DTT. Após redução, foram detectadas massas correspondentes à maior parte dos peptideos trípticos maiores do TPO. Nas amostras não reduzidas, algumas destas massas faltaram e outras novas surgiram. A massa dos novos picos correspondiam basicamente à soma de peptideos trípticos individuais envolvidos no par dissulfureto. Assim, foi possível atribuir sem ambiguidade o padrão dissulfureto do TPO recombinante, renaturado e biologicamenter activo como sendol-4 e 2-3. Isto é consistente com o adrão dissulfureto conhecido da molécula relacionada eritropoietina.induction with DTT. After reduction, masses corresponding to most of the larger TPO tryptic peptides were detected. In the non-reduced samples, some of these masses were missing and new ones appeared. The mass of the new peaks corresponded basically to the sum of individual triptych peptides involved in the disulfide pair. Thus, it was possible to unambiguously assign the disulfide pattern of recombinant, renatured and biologically active TPO as sendol-4 and 2-3. This is consistent with the known disulfide cell of the related molecule erythropoietin.

) D. Acividade biológica do TPO (met 1-153) recombinante renaturado) D. Biological activity of recombinant TPO (met 1-153) renatured

TPO (Met ¹ 1-153) renaturado e purificado tem actividade em ensaios in vitro e in vivo. No ensaio com Ba/F3, metade da estimulação máxima da incorporação de 3 . . .Renewed and purified TPO (Met ¹ 1-153) has activity in in vitro and in vivo assays. In the Ba / F3 assay, half the maximum stimulation of incorporation of 3. . .

H-timidina foi conseguida a 3,3 pg/ml (0,3 pM). Na ELISA baseada no receptor mpl, metade da actividade máxima ocorreu a 1,9 ng/ml (120 pM). Em animais normais e mielo-suprimidos obtidos por radiação X quase letal, TPO (Met ¹ 1-153) mostrou-se altamente potente (a actividade foi observada em doses tão baixas quanto 30 ng/murganho) para estimular a _; produção de novas plaquetas.H-thymidine was achieved at 3.3 pg / ml (0.3 pM). In the ELISA based on the mpl receptor, half of the maximum activity occurred at 1.9 ng / ml (120 pM). In normal and myelo-suppressed animals obtained by almost lethal X-radiation, TPO (Met ¹ 1-153) was shown to be highly potent (activity was observed at doses as low as 30 ng / mouse) to stimulate _; production of new platelets.

EXEMPLO 23EXAMPLE 23

Produção em E. coli de outras variantes do TPO / biologicamente activasE. coli production of other TPO / biologically active variants

São apresentadas abaixo três variantes de TPO diferentes produzidas em E. coli, purificadas e reenroladas em formas biologicamente activas.Below are three different TPO variants produced in E. coli, purified and refolded in biologically active forms.

(1) MLF - 13 resíduos da sequência sinal bacteriana derivada de STII são fundidos com o domínio N-terminal de TPO (resíduos 1-155). A sequência resultante é r(1) MLF - 13 residues of the bacterial signal sequence derived from STII are fused to the N-terminal domain of TPO (residues 1-155). The resulting string is r

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MKKNIAFLLNAYASPAPPAC...CVRRA (SEQ ID NO:85) onde a sequência líder está sublinhada e C...C representa 7.151MKKNIAFLLNAYASPAPPAC ... CVRRA (SEQ ID NO: 85) where the leading sequence is underlined and C ... C represents 7,151

Cis a Cis . Esta variante foi construída para proporcionar uma tirosina para radio-iodinação de TPO para estudos de receptores e biológicos.Cis to Cis. This variant was built to provide a tyrosine for TPO radioiodination for receptor and biological studies.

(2) H8MLF - 7 resíduos da sequência STII, 8 resíduos de histidina e a sequência de clivagem enzimática pelo Factor Xa IEGR foram fundidos com o domínio N-terminal (resíduos 1-155) do TPO. A sequência é(2) H8MLF - 7 residues of the STII sequence, 8 histidine residues and the enzyme cleavage sequence by Factor Xa IEGR were fused to the N-terminal domain (residues 1-155) of the TPO. The sequence is

MKKNIAFHHHHHHHIEGRSPAPPAC. . .CVRRA (SEQ ID NO:86) onde a sequência líder está sublinhada e C...C representa . 151 . ·MKKNIAFHHHHHHHIEGRSPAPPAC. . .CVRRA (SEQ ID NO: 86) where the leading sequence is underlined and C ... C represents. 151. ·

Cis a Cis . Esta variante, quando purificada e renaturada, pode ser tratada com a enzima Factor Xa que clivará a seguir ao resíduo arginina da sequência IEGR dando uma variante do TPO de 155 resíduos de comprimento com um aminoácido natural serina N-terminal.Cis to Cis. This variant, when purified and renatured, can be treated with the Factor Xa enzyme which will cleave after the arginine residue of the IEGR sequence giving a TPO variant of 155 residues in length with a natural N-terminal serine amino acid.

(3) T-H8MLF - foi preparado como descrito atrás para a variante (2), excepto uma sequência sensível ã trombina IEPR estar fundida com o domínio N-terminal do TPO. A sequência resultante é(3) T-H8MLF - was prepared as described above for variant (2), except a thrombin sensitive sequence IEPR is fused to the N-terminal domain of the TPO. The resulting string is

MKKNIAFHHHHHHHIEPRSPAPPAC...CVRRA (SEQ ID NO:87) onde a sequência líder está sublinhada e C...C representa Cis⁷ a Cis¹⁵¹,. esta variante, após purificação e renaturação pode ser tratada com a enzima trombina para gerar uma variante natural N-terminal do TPO de 155 resíduos de comprimento.MKKNIAFHHHHHHHIEPRSPAPPAC ... CVRRA (SEQ ID NO: 87) where the leading sequence is underlined and C ... C represents Cis ⁷ to Cis ¹⁵¹ ,. this variant, after purification and renaturation, can be treated with the enzyme thrombin to generate a natural N-terminal variant of the TPO of 155 residues in length.

rr

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A. Recuperação, solubilização e purificação variantes do TPO monoméricas b biologicamente activas (1), (2) e (3)A. Biologically active monomeric b variant TPO recovery, solubilization and purification (1), (2) and (3)

Todas as variantes foram expressas em E. coli. A maioria das variantes foram encontradas em corpos refractáveis, conforme observado no Exemplo 22 para TPO (Met^-1 1-153). Processos idênticos para a recuperação, solubilização e purificação de variantes de TPO monoméricas foi conseguido como descrito no Exemplo 22. Condições de renaturação idênticas às usadas para TPO (Met ¹ 1-153) foram usadas com rendimentos globais de 30-50%. Após renaturação, as variantes de TPO foram purificadas por cromatografia de fase reversa em 0,1% de TFA utilizando um gradiente de acetonitrilo como descrito anteriormente. Todas as variantes do TPO (nas suas formas não clivadas) tinham actividade biológica conforme demonstrado pelo ensaio comBa/F3, com actividades semi-máximas de 2-5 pM.All variants were expressed in E. coli. Most variants were found in refractile bodies, as noted in Example 22 for TPO (Met ^-1 1-153). Similar processes for the recovery, solubilization and purification of monomeric TPO variants were achieved as described in Example 22. Renaturation conditions identical to those used for TPO (Met ¹ 1-153) were used with overall yields of 30-50%. After renaturation, the TPO variants were purified by reverse phase chromatography in 0.1% TFA using an acetonitrile gradient as previously described. All TPO variants (in their non-cleaved forms) had biological activity as demonstrated by the comBa / F3 assay, with semi-maximum activities of 2-5 pM.

B. Processamento proteolítico das variantes (2) (3) para gerar TPO (1-155) com extremo N autênticoB. Proteolytic processing of variants (2) (3) to generate TPO (1-155) with an authentic N-end

As variantes do TPO (2) e (3) atrás referidas foram projectadas com um peptídeo líder clivável antes do resíduo de aminoácido N-terminal normal. Após renaturação e purificação as variantes (2) e (3) como descrito atrás, cada uma delas foi sujeita a digestão com a enzima adequada. Para cada uma das variantes, o acetonitrilo do passo de fase reversa C4 foi removido fazendo passar uma corrente de azoto na solução. Depois as duas variantes foram tratadas com o Factor Xa ou trombina como descrito abaixo.The TPO variants (2) and (3) mentioned above were designed with a cleavable leader peptide before the normal N-terminal amino acid residue. After renaturation and purification, variants (2) and (3) as described above, each was subjected to digestion with the appropriate enzyme. For each of the variants, the acetonitrile from the C4 reverse phase step was removed by passing a stream of nitrogen into the solution. Then the two variants were treated with Factor Xa or thrombin as described below.

Para a variante TPO (2), adicionou-se tampão Tris 1M, pH 8, à solução sem acetonitrilo para uma concentração final de 50 mM e o pH foi ajustado a 8 se necessário. NaCl e CaCl₂ foram adicionados para O,1M e 2 mM, respectivamente. 0 Factor Xa (New England Biolabs) foi adicionado para se rFor the variant TPO (2), 1M Tris buffer, pH 8, was added to the solution without acetonitrile to a final concentration of 50 mM and the pH was adjusted to 8 if necessary. NaCl and CaCl ₂ were added to O, 1M and 2 mM, respectively. Factor Xa (New England Biolabs) was added to ensure

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conseguir uma proporção molar de cerca de 1:25 a 1:100 de enzima para avariante. A amostra foi incubada à temperatura ambiente durante 1-2 horas para se conseguir clivagem máxima conforme avaliado por alteração na migração em géis de SDS representando a perda da sequência líder. Em seguida a mistura de reacção foi purificada por cromatografia de fase ; reversa usand o mesmo gradiente e condições descritas atrás para a purificação de variantes correctamente enroladas. A variante B não renaturada foi separada da variante (2) por estas condições. Os aminoácidos N-terminais foram SPAPP, indicando que a remoção da sequência líder N-terminal foi ) correcta. O Factor Xa gerou também quantidades variáveis de uma clivagem interna dentro do domínio TPO; a clivagem foi observada após o resíduo arginina na posição número 118 gerando mais uma sequência N-terminal de TTAHKDP.(SEQ ID NI:88). Nos géis de SDS-PAGE redutores observou-se uma única banda de 17000 daltons para a variante clivada com o Factor Xa; nos géis redutores foram observadas duas bandas de peso molecular de aproximadamente 12000 e 5 000 daltons, consistente com a clivagem de arginina 118. Esta observação também confirmou que as duas partes da molécula eram mantidas juntas por uma ligação dissulfureto entre o 12 e 42 resíduos de císteina, conforme deduzido das experiências de digestão ) tríptica descrita atrás. No ensaio biológico com Ba/F3, a variante TPO (1-155) purificada, após remoção da sequência líder N-terminal e com a clivagem interna, tinha uma semi-actividade máxima de 0,2 a 0,3 picomolar. A variante intacta com a sequência líder tinha semi-actividade máxima ) de 2-4 picomolar.achieve a molar ratio of about 1:25 to 1: 100 of enzyme to variant. The sample was incubated at room temperature for 1-2 hours to achieve maximum cleavage as assessed by change in migration in SDS gels representing the loss of the leader sequence. Then the reaction mixture was purified by phase chromatography; reverse using the same gradient and conditions described above for the purification of correctly rolled variants. Variant B not renatured was separated from variant (2) by these conditions. The N-terminal amino acids were SPAPP, indicating that the removal of the N-terminal leader sequence was) correct. Factor Xa also generated varying amounts of an internal cleavage within the TPO domain; cleavage was observed after the arginine residue at position number 118 generating another N-terminal sequence of TTAHKDP (SEQ ID NI: 88). In the reducing SDS-PAGE gels, a single band of 17000 daltons was observed for the variant cleaved with Factor Xa; in the reducing gels two bands of molecular weight of approximately 12,000 and 5,000 daltons were observed, consistent with the cleavage of arginine 118. This observation also confirmed that the two parts of the molecule were held together by a disulfide bond between the 12 and 42 residues of cysteine, as deduced from the triptych experiments described above. In the biological assay with Ba / F3, the purified TPO (1-155) variant, after removal of the N-terminal leader sequence and with internal cleavage, had a maximum semi-activity of 0.2 to 0.3 picomolar. The intact variant with the leader sequence had maximum semi-activity) of 2-4 picomolar.

Para a variante (3), o tampão de digestão consistiu em Tris 50 mM, pH 8, 2% CHAPS, NaCl 0,3M, EDTA 5 mM e trombina humana ou bovina (Calbiochem) entre 1:25 e 1:50 por peso de enzima para proteína variante de TPO. A digestão foi realizada à temperatura ambiente durante 2-6 horas. O progresso da digestão foi analisado em géis de SDS como descrito atrás para a reacção de clivagem com o Factor Xa.For variant (3), the digestion buffer consisted of 50 mM Tris, pH 8, 2% CHAPS, 0.3 M NaCl, 5 mM EDTA and human or bovine thrombin (Calbiochem) between 1:25 and 1:50 by weight of enzyme for TPO variant protein. Digestion was carried out at room temperature for 2-6 hours. Digestion progress was analyzed on SDS gels as described above for the cleavage reaction with Factor Xa.

rr

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De um modo geral, mais de 90% da clivagem da sequência líder foi conseguida neste tempo. O TPO resultante foi purificado em colunas de fase reversa C4 como descrito atrás e verificou-se ter o extremo N pretendido por sequenciação de aminoácidos. Foram obtidas apenas quantidades muito pequenas (<5%) de clivagem interna na mesma ligação arginina-treonina como observado atrás como Factor Xa. A proteína TPO resultante tinha elevada actividade biológica com respostas semi-máximas no ensaio com Ba/F3 em concentrações de proteína de 0,2-0,4 picomolar. Na ELISA baseada em receptores de mpl, esta proteína teve uma resposta semi-máxima a 2-4 ng/ml de proteína purificada (120-240 picomolar) enquanto que a variante intacta contendo a sequência líder era menos potente em ambos os ensaios em 5 a 10 vezes. Para estudos com animais a proteína clivada purificada por HPLC foi dialisada contra tampões fisiologicamente aceitáveis, com NaCl 150 mM, 0,01% Tween 80 e succinato de sódio 10 mM, pH 5,5 ou acetato de sódio 10 mM, pH 5,5 ou fosfato de sódio 10 mM pH 7,4. Por HPLC e géis de SDS a proteína purificada era estável durante várias semanas quando guardada a 4°C. Em murganhos normais e mielo-suprimidos, este TPO purificado com a sequência N-terminal autêntica foi altamente activo, estimulando a produção de plaquetas em doses tão baixas quanto 30 ng/murganho.Overall, more than 90% of the leader sequence cleavage was achieved at this time. The resulting TPO was purified on C4 reverse phase columns as described above and was found to have the desired N-terminus by amino acid sequencing. Only very small amounts (<5%) of internal cleavage were obtained at the same arginine-threonine bond as noted above as Factor Xa. The resulting TPO protein had high biological activity with semi-maximum responses in the Ba / F3 assay at protein concentrations of 0.2-0.4 picomolar. In the ELISA based on mpl receptors, this protein had a semi-maximal response to 2-4 ng / ml of purified protein (120-240 picomolar) while the intact variant containing the leader sequence was less potent in both trials at 5 to 10 times. For animal studies the HPLC purified cleaved protein was dialyzed against physiologically acceptable buffers, with 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80 and 10 mM sodium succinate, pH 5.5 or 10 mM sodium acetate, pH 5.5 or 10 mM sodium phosphate pH 7.4. By HPLC and SDS gels the purified protein was stable for several weeks when stored at 4 ° C. In normal and myelo-suppressed mice, this TPO purified with the authentic N-terminal sequence was highly active, stimulating platelet production at doses as low as 30 ng / mouse.

EXEMPLO 24EXAMPLE 24

Ligando de mpl SintéticoSynthetic mpl binding

Se bem que o ligando de mpl humano (hML) seja geralmente feito usando métodos recombinantes, também pode ser sintetisado via ligação enzimática dos fragmentos sintéticos usando métodos descritos abaixo. A produção sintética de hML permite a incorporação de aminoácidos não naturais ou grupos funcionais sintéticos tais como polietilenoglicol. Anteriormente, um mutante da protease serina subtilisina BPN, subtiligase (S221C/P225A) foi modificada deAlthough the human mpl ligand (hML) is generally made using recombinant methods, it can also be synthesized via enzymatic ligation of the synthetic fragments using methods described below. The synthetic production of hML allows the incorporation of unnatural amino acids or synthetic functional groups such as polyethylene glycol. Previously, a mutant of the serine protease subtilisin BPN, subtiligase (S221C / P225A) was modified from

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forma a ligar eficazmente ésteres de peptídeos em solução aquosa (Abrahmsen et al., Biochem., £0:4151-4159 [1991]).in order to effectively bind peptide esters in aqueous solution (Abrahmsen et al., Biochem., £ 0: 4151-4159 [1991]).

Mostrou-se agora que peptídeos sintéticos podem ser ligados enzimaticamente a peptídeos longos e proteínas tais como ribonuclease A (Jackson et al. , Science [1994]). Esta tecnologia, descrita mais detalhadamente abaixo permitiu-nos sintetizar quimicamente proteínas longas que anteriormente só podima ser feitos com tecnologia de DNA recombinante.It has now been shown that synthetic peptides can be enzymatically linked to long peptides and proteins such as ribonuclease A (Jackson et al., Science [1994]). This technology, described in more detail below, allowed us to chemically synthesize long proteins that previously could only be made with recombinant DNA technology.

Uma estratégia geral para a síntese de hML, usando subtiligase está apresentado abaixo (Esquema 1). Começando com um peptídeo totalmente desprotegido correspondendo ao fragmento C-terminal da proteína, adiciona-se um éster de peptídeo activado no extremo C e protegido no extremo N juntamente com subtiligase. Quando a reacção está completa, oproduto foi isolado por HPLC de fase reversa e o grupo protector foi removido do extremo N. O fragmento peptídico seguinte foi ligado, desprotegido e o processo repetido usando peptídeos sucessivos até se obter a proteína de tamanho completo. O processo é semelhante à metodologia de fase sólida pois um peptídeo activado no extremo C e protegido no extremo N ser ligado ao extremo N do peptídeo anterior e a proteína ser sintetizada numa direcção C->N. No entanto, devido a cada uma das acoplagens resultar na adição de até 50 resíduos e os produtos serem isolados após cada uma das ligações, podem ser sintetizadas proteínas altamente puras com rendimentos razoáveis.A general strategy for the synthesis of hML using subtiligase is presented below (Scheme 1). Starting with a totally unprotected peptide corresponding to the C-terminal fragment of the protein, a peptide ester activated at the C-end and protected at the N-end is added along with subtiligase. When the reaction is complete, the product was isolated by reversed-phase HPLC and the protecting group was removed from the N-terminus. The next peptide fragment was ligated, unprotected and the process repeated using successive peptides until the full-length protein was obtained. The process is similar to the solid phase methodology in that a peptide activated at the C end and protected at the N end is linked to the N end of the previous peptide and the protein is synthesized in a C-> N direction. However, because each coupling results in the addition of up to 50 residues and the products are isolated after each connection, highly pure proteins can be synthesized in reasonable yields.

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Esquema 1. Estratégia para a síntese de hML usando subtiligaseScheme 1. Strategy for the synthesis of hML using subtiligase

R-NH-Peptídeo₂~CO-R' + I^N-Peptídeo^CC^ _v 1) SubtiligaseR-NH-Peptide ₂ ~ CO-R '+ I ^ N-Peptide ^ CC ^ _v 1) Subtiligase

R-NH-Peptídeo₂-C0-NH-Peptídeo₁-C0_{2 v} 2) Zn/CH₃CO₂HR-NH-Peptide ₂ -C0-NH-Peptide ₁ -C0 _{2 v} 2) Zn / CH ₃ CO ₂ H

H₂N-Peptídeo₂-Co-NH-Peptldeo₁-C0_{2 v} 3) repetir 1+2H ₂ N-Peptide ₂ -Co-NH-Peptide ₁ -C0 _{2 v} 3) repeat 1 + 2

H₂N-Peptídeo₃~CO-NH-Peptídeo₂-CONH-Peptídeo^COH ₂ N-Peptide ₃ ~ CO-NH-Peptide ₂ -CONH-Peptide ^ CO

O (CH₂)z nh₂ O (CH ₂ ) z nh ₂

Com base no nosso conhecimento da especificidade da sequência da subtiligase assim como da sequência de aminoácidos do domínio epo biologicamente activo de hML, dividimos hML₁₅₃ em sete fragmentos de 18-25 resíduos cada de comprimento. Os tetrapeptídeos da ligação a testar foram sintetizados para determinar as junções de ligação adequadas para os 18-25 meros. A Tabela 13 mostra os resultados destas ligações teste.Based on our knowledge of the specificity of the subtiligase sequence as well as the amino acid sequence of the biologically active epo domain of hML, we divided hML ₁₅₃ into seven fragments of 18-25 residues each in length. The tetrapeptides from the linkage to be tested were synthesized to determine the appropriate linker junctions for the 18-25 mer. Table 13 shows the results of these test connections.

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TABELA 13TABLE 13

Ligações teste de hML. Peptídeos dadores e nucleófilos foram dissolvidos a lOmM em tricina 100 mM (pH 7,8) a 22°C. A ligase foi adicionada para uma concentração final de 10 μΜ a partir de uma solução stock (~70 μΜ) e a ligação decorreu durante a noite. Os rendimentos baseiam-se na % de ligações vs. hidrólise dos peptídeos dadores.Test hML links. Donor and nucleophile peptides were dissolved at 10 mM in 100 mM tricine (pH 7.8) at 22 ° C. The ligase was added to a final concentration of 10 μΜ from a stock solution (~ 70 μΜ) and the bonding took place overnight. Yields are based on% of calls vs. hydrolysis of donor peptides.

Sítio Site Dador (glc-K-NH ) Donor (glc-K-NH) Nucleóf ilo-NH₂ Nucleophile-NH ₂ %Hidrólise %Hydrolysis %Ligação %Link 1 (23/24) 1 (23/24) HVLH (SEQ ID NO:89) HVLH (SEQ ID NO: 89) SRLS (SEQ ID NO.90) SRLS (SEQ ID NO.90) 92 92 08 08 (22/23) (22/23) SHVL (SEQ ID NO:91) SHVL (SEQ ID NO: 91) HSRL (SEQ ID NO:92) HSRL (SEQ ID NO: 92) 48 48 52 52 2 (46/47) 2 (46/47) AVDF (SEQ ID NO. 93) AVDF (SEQ ID NO. 93) SLGE (SEQ ID NO:94) SLGE (SEQ ID NO: 94) 22 22 78 78 3 (69/70) 3 (69/70) AVTL (SEQ ID NO:95) AVTL (SEQ ID NO: 95) LLEG (SEQ ID NO:96) LLEG (SEQ ID NO: 96) 53 53 47 47 4 (89/90) 4 (89/90) LSSL (SEQ ID NO:97) LSSL (SEQ ID NO: 97) LGQL (SEQ ID NO:98) LGQL (SEQ ID NO: 98) 95 95 05 05 (88/89) (88/89) C(acm)LSS (SEQ ID NO:99) C (acm) LSS (SEQ ID NO: 99) LLGQ (SEQ ID NO:100) LLGQ (SEQ ID NO: 100) 00 00 00 00 (90/91) (90/91) SSLL (SEQ ID NO:101) SSLL (SEQ ID NO: 101) GQLS (SEQ ID N0:102) GQLS (SEQ ID NO: 102) 45 45 55 55 (88/89) (88/89) CLSS (SEQ ID NO:103) CLSS (SEQ ID NO: 103) LLGQ (SEQ ID N0:100) LLGQ (SEQ ID NO: 100) 90 90 10 10 5(107/108) 5 (107/108) LQSL (SEQ ID NO:104) LQSL (SEQ ID NO: 104) LGTQ (SEQ ID NO:105) LGTQ (SEQ ID NO: 105) 99 99 01 01 (106/107) (106/107) ALQS (SEQ ID NO:106) ALQS (SEQ ID NO: 106) LLGT (SEQ ID NO:107) LLGT (SEQ ID NO: 107) 70 70 30 30 6(128/129) 6 (128/129) NAIF (SEQ ID NO:108) NAIF (SEQ ID NO: 108) LSFQ (SEQ ID NO:109) LSFQ (SEQ ID NO: 109) 60 60 40 40

Com base nestas experiências os peptídeos de ligação indicados na Tabela 14 deverão ser eficazmente ligados pe a subtiligase. Um grupo protector adequado ao extremo N de cada um dos ésteres de peptídeo dador foi necessário para evitar a auto-ligação. Escolhemos um grupoBased on these experiments, the binding peptides shown in Table 14 should be effectively bound by subtiligase. A suitable protecting group at the N-terminus of each of the donor peptide esters was necessary to prevent self-binding. We choose a group

219219

protector isonicotinilo (iNOC) (Veber et al., J. Org. Chem., 4.2:3286-3289 [1977]) pois é solúvel em água, pode ser incorporado no último passo da síntese peptídica em fase sólida e é adequado para usar HF anidro para desproteger e clivar os peptídeos da resina que constitui a fase sólida.isonicotinyl protector (iNOC) (Veber et al., J. Org. Chem., 4.2: 3286-3289 [1977]) as it is soluble in water, can be incorporated in the last step of peptide synthesis in solid phase and is suitable for use Anhydrous HF to deprotect and cleave peptides from the resin that constitutes the solid phase.

Ainda, pode ser removido do peptídeo após cada uma das ligações em condições redutoras suaves (Zn/CH₃CO₂H) para dar um extremo N livre para subsequentes ligações. Um éster glicolato-lisil-amida (glc-K-NH/ foi usado para C-terminal baseado em experiências anteriores que que este é eficazmente acilado pela subtiligase activação mostraram (Abrahmsen et al. , Biochem., 30:4151-4159 [1991]). Os peptídeos activa dos com glc-K-amida e protegidos com iNOC podem ser sinteti zados usando métodos de fase sólida convencionais como apresentado (Esquema 2). Os peptídeos foram então sequenciadamente ligados até uma proteína com o tamanho pretendido ser produzida e o produto final renaturado in vitro. Com base na homologia com EPO, pensa-se que se formem pares dissulfureto entre os resíduos císteina 7 e 151 e entre 28 e 85. A oxidação dos dissulfuretos pode ser conseguida agitando simplesmente o material reduzido numa atmosfera de oxigénio durante várias horas. O material renaturado pode ser então purificado por HPLC e as fracções contendo proteína activa reunidas e liofilizadas. Como alternativa, as ligações dissulfureto podem ser diferencialmente protegidas para controlar a oxidação sequenciada entre pares dissulfureto. A protecção das císteinas 7 e 151 com grupos acetamidometilo (acm) assegurará a oxidação de 28 e 85. Os grupos acm podem então ser removidos e os resíduos 1 e 151 oxidados. Por outro lado, os resíduos 28 e 85 podem ser protegidos com acm e oxidados no caso de oxidação sequenciada ser necessária para corrigir a renaturação. Facultativamente, Císteina 28 e 85 podem ser substituídas com outros resíduos naturais ou não diferentes de Cis para assegurar oxidação correcta das císteinas 7 e 151.In addition, it can be removed from the peptide after each of the bonds in mild reducing conditions (Zn / CH ₃ CO ₂ H) to give a free N end for subsequent bonds. A glycolate-lysyl-amide ester (glc-K-NH / has been used for C-terminal based on previous experiments that this is effectively acylated by the subtiligase activation showed (Abrahmsen et al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991 The active peptides with glc-K-amide and protected with iNOC can be synthesized using conventional solid phase methods as shown (Scheme 2). The peptides were then sequentially linked until a protein of the desired size was produced and the final product renatured in vitro Based on the homology with EPO, disulfide pairs are thought to form between cysteine residues 7 and 151 and between 28 and 85. Disulfide oxidation can be achieved by simply stirring the reduced material in an atmosphere of oxygen for several hours. The renatured material can then be purified by HPLC and the fractions containing active protein collected and lyophilized. Alternatively, the disulfide bonds may be different initially protected to control oxidation sequenced between disulfide pairs. The protection of cysteines 7 and 151 with acetamidomethyl groups (mAm) will ensure the oxidation of 28 and 85. The mAm groups can then be removed and residues 1 and 151 oxidized. On the other hand, residues 28 and 85 can be protected with mAb and oxidized in the event that sequential oxidation is necessary to correct renaturation. Optionally, Cysteine 28 and 85 can be replaced with other natural or non-Cis residues to ensure correct oxidation of cysteines 7 and 151.

rr

220220

TABELATABLE

Fragmentos Peptidicos Usados para a Síntese Total de hML Usando SubtiligasePeptide Fragments Used for Total Synthesis of hML Using Subtiligase

FragmentoFragment

SequênciaSequence

1(SEQ ID N0:110) ) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH₂ (1-22)1 (SEQ ID NO: 110)) iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH ₂ (1-22)

2(SEQ ID NO:111) iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH₂(23-46)2 (SEQ ID NO: 111) iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH ₂ (23-46)

3(SEQ ID NO:112)3 (SEQ ID NO: 112)

ÍNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH₂ (47-69)ÍNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH ₂ (47-69)

4(SEQ ID NO:112)4 (SEQ ID NO: 112)

ÍNOC-HN-LLEG-VMAARGQLGPTCLSSLL-glC-K-NH₂ (70-90)ÍNOC-HN-LLEG-VMAARGQLGPTCLSSLL-glC-K-NH ₂ (70-90)

5(SEQ ID N0:114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH₂ (90-106)5 (SEQ ID NO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH ₂ (90-106)

6(SEQ ID NO:115)6 (SEQ ID NO: 115)

ÍNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH₂(107-128) > 7(SEQ ID NO:116)ÍNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH ₂ (107-128)> 7 (SEQ ID NO: 116)

H₂N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO₂ (129-153)H ₂ N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO ₂ (129-153)

As ligações peptídicas são realizadas a 25°C em tricina 100 mM, pH 8 (preparada e desgaseada por filtração sob vácuo através de um filtro de 5μΜ). Tipicamente o fragmento terminal C é dissolvido em tampão (peptídeo 2-5 mM) e uma solução ”stock lOx de subtiligase (1 mg/ml em rPeptide bonds are performed at 25 ° C in 100 mM tricine, pH 8 (prepared and degassed by vacuum filtration through a 5μΜ filter). Typically the C-terminal fragment is dissolved in buffer (2-5 mM peptide) and a ”10X stock subtiligase solution (1 mg / ml in r

221 tricina lOOmM, pH 8) é adicionado para levar a concentração final de enzima até »5μΜ. Um excesso molar de 3-5 do peptídeo dador activado com glc-K-NH₂ é então adicionado como um sólido, dissolvido e a mistura deixada em repouso a 25°C. As ligações são controladas por HPLC de fase reversa analítica em C18 (gradiente CH₃CN/H₂O com 0,1% TFA). Os produtos de ligação são purificados por HPLC preparativa e liofilizados. A desprotecção de isonicotinilo (iNOC) foi realizada agitando pó de zinco activado com HC1 com o peptídeo protegido em ácido acético. 0 pó de zinco é removido por filtração e o ácido acético evaporado sob vácuo. O peptídeo resultante pode ser usado directamente na ligação seguinte e o processo repetido. hML₁₅₃ sintético pode ser ligado por processos análogos aos descritos atrás a hML,_. ___ sintético ou recombinante para produzir hML de tamanho completo sintético ou semi-sintético.221 100mM tricine, pH 8) is added to bring the final enzyme concentration to »5μΜ. A 3-5 molar excess of the donor peptide activated with glc-K-NH ₂ is then added as a solid, dissolved and the mixture left to stand at 25 ° C. The bonds are controlled by C18 analytical reverse phase HPLC (gradient CH ₃ CN / H ₂ O with 0.1% TFA). The binding products are purified by preparative HPLC and lyophilized. Deprotection of isonicotinyl (iNOC) was performed by stirring zinc powder activated with HCl with the peptide protected in acetic acid. The zinc powder is removed by filtration and the acetic acid evaporated in vacuo. The resulting peptide can be used directly for the next link and the process repeated. synthetic hML ₁₅₃ can be linked by processes analogous to those described above to hML, _. ___ synthetic or recombinant to produce synthetic or semi-synthetic full size hML.

hML sintético tem muitas vantagens relativamente ao recombinante. Cadeias laterais não naturais podem ser introduzidas de forma a aumentar a potência ou especificidade. Grupos funcionais de polímeros tais como polietilenoglicol podem ser incorporados para aumentar a duração da acção. Por exemplo, polietilenoglicol pode ser ligado a resíduos lisina dos fragmentos individuais (Tabela 14) antes ou depois de um ou mais passos de ligação terem sido realizados. As ligações peptídicas sensíveis a proteases podem ser removidas ou alteradas para aumentar a estabilidade in vivo. Ainda, derivados de átomos pesados podem ser sintetizados para ajudar a determinação da estrutura.Synthetic hML has many advantages over the recombinant. Unnatural side chains can be introduced to increase potency or specificity. Functional groups of polymers such as polyethylene glycol can be incorporated to increase the duration of action. For example, polyethylene glycol can be linked to lysine residues of the individual fragments (Table 14) before or after one or more binding steps have been carried out. Protease-sensitive peptide bonds can be removed or altered to increase in vivo stability. Also, derivatives of heavy atoms can be synthesized to help determine the structure.

rr

222222

Esquema 2. Síntese em Fase Sólida dos Fragmentos Peptídicospara a Ligação de FragmentosScheme 2. Solid Phase Synthesis of Peptide Fragments for Fragment Binding

O R O (CH-h.O R O (CH-h.

i · “i · “

glicolato-lisil-amida (glc-K-NH^)glycolate-lysyl-amide (glc-K-NH ^)

Isonicotinils (iNOC)Isonicotinils (iNOC)

a)Resina lisil-parametilbenzidrilamina (MBHA) 1 (0,63 meq./gm., Advanced ChemTech) é agitada com ácido bromoacético (5 eq.) e diisopropilcarbodiimida (5 eq.) durante 1 h. a 25°C em dimetilacetamida (DMA) para dar um derivado bromoacetilado.a) Lysyl-paramethylbenzhydrylamine resin (MBHA) 1 (0.63 meq./gm., Advanced ChemTech) is stirred with bromoacetic acid (5 eq.) and diisopropylcarbodiimide (5 eq.) for 1 h. at 25 ° C in dimethylacetamide (DMA) to give a bromoacetylated derivative.

2.b) A resina é lavada extensivamente com DMA e aminoácidos individuais protegidos com Boc (3 eq., Bachem) são esterifiçados por agitação com bicarbonato de sódio (6 eq.) em dimetilformamida (DMF) durante 24 h a 50°C para dar2.b) The resin is washed extensively with DMA and individual amino acids protected with Boc (3 eq., Bachem) are esterified by stirring with sodium bicarbonate (6 eq.) In dimethylformamide (DMF) for 24 h at 50 ° C to give

223 a correspondente glicolatofenilalanilamida-resina 3. A resina aminoacetilada 3 foi lavada com DMF (3x) e diclorometano (CH₂C1₂) (3x) e pode ser guardada ã temperatura ambiente durante vários mese. A resina 3 pode ser aplicada num sintetizador de peptideos automático (Applied Biosystems 430A) e os peptideos prolongados usando processos defase sólida convencionais (5). c) 0 grupo Ν-α-Boc foi removido com uma solução de ácido trifluoroacético a 45% em CH₂C1₂. d) Subsequentes aminoácidos protegidos com Boc (5 eq.9 foram pré-activados usando hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-(dimetilamino)fosfónio (BOP, 4 eq.) e N-metilmoracoplado durante 1-2 h. e) O (TFA/CH₂C1₂) para dar 4 e o introduzido como (ÍNOC) é agitação223 the corresponding glycolatophenylalanylamide-resin 3. The aminoacetylated resin 3 was washed with DMF (3x) and dichloromethane (CH ₂ C _{1 2} ) (3x) and can be stored at room temperature for several months. The resin 3 can be applied to an automatic peptide synthesizer (Applied Biosystems 430A) and the extended peptides using conventional solid phase processes (5). c) The Ν-α-Boc group was removed with a 45% solution of trifluoroacetic acid in CH ₂ C1 ₂ . d) Subsequent Boc-protected amino acids (5 eq.9 were pre-activated using benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP, 4 eq.) and N-methylmorcoplated for 1-2 h. e) The (TFA / CH ₂ C1 ₂ ) to give 4 and the introduced as (ÍNOC) is agitation

f) A clivagem com HF anidro com carbonato de em dof) Cleavage with anhydrous HF with carbonate

5% e NMM (6 eq.) e desprotecção (5% anisolo/5% and NMM (6 eq.) And deprotection (5% anisole /

0°C durante 1 horas dá o peptídeo 5 iNOC o qual (gradiente substratos folina (NMM, 10 eq.) em DMA e grupo final Ν-α-Boc é removido grupo protector isonicotinilo descrito anteriormente (4) via 4-isonicotinil-2-4-dinitrofenilo (3 eq.) DMA a 25°C durante 24 h. peptídeo via tratamento sulfito de etilmetilo) a activado com glicolato-lis-amida e protegido com é purificado por HPLC em fase reversa C18 CH₃CN/H₂O, 0,1% TFA). A identidade de todos os foi confirmada por espectrometria de massa.0 ° C for 1 hour gives the peptide 5 iNOC which (gradient folin substrates (NMM, 10 eq.) In DMA and final group Ν-α-Boc is removed isonicotinyl protecting group described above (4) via 4-isonicotinyl-2 -4-dinitrophenyl (3 eq.) DMA at 25 ° C for 24 h. Peptide via ethyl methyl sulfite treatment) activated with glycolate-lys-amide and protected with is purified by reverse phase HPLC C18 CH ₃ CN / H ₂ O, 0.1% TFA). The identity of all was confirmed by mass spectrometry.

INFORMAÇÃO SUPLEMENTARSUPPLEMENTARY INFORMATION

Este invento conforme reivindicado é exequível de acordo com a especificação acima e referências e materiais de partida facilmente disponíveis. No entanto, Os Requerentes depositaram na American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) a lista de linhas celulares abaixo:This invention as claimed is feasible according to the above specification and references and starting materials readily available. However, Claimants deposited the list of cell lines below at the American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC):

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224224

Escherichia coli, DHlOB-pBSK-hmpl 1.8, ATCC rrt de acesso CRL 69575, depositado em 24 de Fevereiro de 1994.Escherichia coli, DHlOB-pBSK-hmpl 1.8, ATCC access rrt CRL 69575, deposited on February 24, 1994.

Plasmídeo pSVI5.ID.LL.MLORF, ATCC acesso naPlasmid pSVI5.ID.LL.MLORF, ATCC accessed on

CRL----, depositado em----de Dezembro, 1994; eCRL ----, deposited on ---- December, 1994; and

Células CHO DP-12, Ml 1/50 MCB (marcado #1594), ATCC na de acesso CRL 11770, depositado em 6 de Dezembro, 1994 .CHO DP-12 cells, Ml 1/50 MCB (marked # 1594), ATCC in access CRL 11770, deposited on December 6, 1994.

Este depósito foi feito de acordo com as condições do Tratado de Budapeste sobre Reconhecimento Internacional do Depóstio de Microorganismos para Fins de Processos de Patente e seu regulamento (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção d euma cultura viável durante 30 anos a partir da data do depósito. osorganismos serão tornados disponíveis pela ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e submetidos a um acordo entre os Requerentes e a ATCC que assegura a disponibilidade sem restrições quando da publicação da pertinene Patente U.S. A disponibilidade da estirpe depositada não deve ser pensada como uma licença para a prática do invento em contravenção dos direitos garantidos sob a alçada de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes .This deposit was made in accordance with the conditions of the Budapest Treaty on International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of Patent Processes and its regulation (Treaty of Budapest). This ensures the maintenance of a viable culture for 30 years from the date of deposit. the organisms will be made available by the ATCC under the terms of the Budapest Treaty and subject to an agreement between the Applicants and the ATCC that ensures unrestricted availability upon publication of the relevant US Patent. The availability of the deposited strain should not be thought of as a license for the practice of the invention in contravention of the rights guaranteed under the purview of any government in accordance with its patent laws.

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Se bem que o invento não tenha necessariamente de ser descrito juntamente com as realizações preferidas e exemplos específicos de trabalho, os familiarizados com a matéria, após leitura da especificação atrás, serão capazes de efectuar várias alterações, substituições de equivalentes e alterações na matéria em questão sem se afastarem do espirito e âmbito do invento. Assim, o invento pode ser realizado de várias formas diferentes das especificamente rAlthough the invention does not necessarily have to be described together with preferred embodiments and specific examples of work, those familiar with the matter, after reading the specification above, will be able to make several changes, substitutions of equivalents and changes in the matter in question without departing from the spirit and scope of the invention. Thus, the invention can be carried out in a number of ways other than specifically

225 aqui descritas. Pretende-se pois, que a protecção garantida pela presente patente seja limitada apenas pelas reivindicações apensas e seus equivalentes.225 described herein. It is intended, therefore, that the protection guaranteed by the present patent is limited only by the attached claims and their equivalents.

Todas as referências aqui citadas são neste caso expressamente incorporadas como referência.All references cited herein are hereby expressly incorporated by reference.

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES 1·. - Polipeptídeo trombopoietina isolado e substancialmente homogéneo, caracterizado por ser ligando de mpl, isolado e substancialmente homogéneo.1·. - Isolated and substantially homogeneous thrombopoietin polypeptide, characterized by being a mpl ligand, isolated and substantially homogeneous. 2*. - Polipeptídeo ligando de mpl de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por ser seleccionado de entre o grupo constituído por (a) um fragmento polipeptídico;2*. Mpl ligand polypeptide according to Claim 1, characterized in that it is selected from the group consisting of (a) a polypeptide fragment; (b) uma variante do polipeptídeo; e (c) um polipeptídeo quimérico.(b) a variant of the polypeptide; and (c) a chimeric polypeptide. - Polipeptídeo ligando de mpl de acordo com a caracterizado por ser seleccionado de entre- Mpl ligand polypeptide according to that characterized by being selected from among 3* .3 *. Reivindicação 1, o grupo constituído por (a) o polipeptídeo mamífero;Claim 1, the group consisting of (a) the mammalian polypeptide; (b) o polipeptídeo recombinantes; e (c) o polipeptídeo cos.(b) the recombinant polypeptide; and (c) the polypeptide cos. que é isolado a partir de um que é produzido por meios produzido por meios sintétithat is isolated from one that is produced by means produced by synthetic means 4*. - Polipepídeo ligando de mpl de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por ser seleccionado do grupo constituído por (a) o polipeptídeo que é humano; e (b) o polipeptídeo que não é imunogénico num ser humano.4 *. Mpl ligand polypeptide according to Claim 1, characterized in that it is selected from the group consisting of (a) the polypeptide that is human; and (b) the polypeptide that is not immunogenic in a human. 5*. - Agonista de mpl isolado e substancialmente homogéneo, caracterizado por:5 *. - Isolated and substantially homogeneous mpl agonist, characterized by: (a) o agonista estimular a incorporação de nucleó- • 3 tidos marcados ( H-timidina) no DNA de células Ba/F3 dependentes de IL-3 transfectadas com mpl P humano; ou . . . 35 (b) o agonista que estimula a incorporação de S em plaquetas circulantes num ensaio de plaquetas religadas.(a) the agonist stimulates the incorporation of • labeled nucleotides (H-thymidine) into the DNA of IL-3-dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P; or. . . 35 (b) the agonist that stimulates the incorporation of S into circulating platelets in a reconnected platelet assay. 6®. - Fragmento polipeptídico de acordo com a6®. - Polypeptide fragment according to Reivindicação 2, caracterizado por ser representado porClaim 2, characterized by being represented by X-hTPO(7-151)-Y onde hTPO(7-151) representa a sequência de aminoácidos . 7 . 151 .X-hTPO (7-151) -Y where hTPO (7-151) represents the amino acid sequence. 7. 151. de TPO humana (hML) desde Cis até Cis inclusive;human TPO (hML) from Cys to Cys inclusive; X representa X represents um one grupo group amino de amino of Cis Cis ou o(s) or the resíduo(s) de aminoácido(s) amino acid residue (s) do of extremo amino extreme amino seleccionado de selected from entre o grupo between the group M, M, MA, BAD, MPA, MPA, MPPA, MPPA, (SEQ (SEQ ID ID NO: AT THE: 117) 117) MAPPA, MAPPA, (SEQ (SEQ ID ID NO: AT THE: 118) 118) MPAPPA, MPAPPA, (SEQ (SEQ ID ID NO: AT THE: 119) 119) MSPAPPA, MSPAPPA, (SEQ (SEQ ID ID NO: AT THE: 120) 120) A, THE, PA, PAN, PPA, PPA, APPA, APPA, (SEQ (SEQ ID ID NO: AT THE: 121) 121) PAPPA, PAPPA, (SEQ (SEQ ID ID NO: AT THE: 122) 122) SPAPPA, SPAPPA, (SEQ (SEQ ID ID NO: AT THE: 123) 123) . . 151. . 151 Y representa o grupo terminal carbonilo de Cis ou o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) do extremo carbonilo seleccionado de entre o grupoY represents the C1 carbonyl terminal group or the amino acid residue (s) of the carbonyl end selected from the group V,V, VR,VR, VRR,VRR, VRRA, (SEQ ID NO: 124) VRRAP, (SEQ ID NO: 125) VRRAPP, (SEQ ID NO: 126) VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127) VRRAPPTT, (SEQ ID NO: 128) VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129) VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO: 130) VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO: 131) VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132) VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133) VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134) VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO: 135) VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136) VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137) VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138) VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO: 140) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO: 144) e as extensões de resíduo(s) de aminoácido(s) do extremo amino compreendendo um ou mais dos resíduos 176-332 de ML humano como se mostra na Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).VRRA, (SEQ ID NO: 124) VRRAP, (SEQ ID NO: 125) VRRAPP, (SEQ ID NO: 126) VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127) VRRAPPTT, (SEQ ID NO: 128) VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129) VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO: 130) VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO: 131) VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132) VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133) VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134) VRRAPPTTAVPSRTS , (SEQ ID NO: 135) VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 136) VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138) VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139) VRRAPLTAV : 140) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP (s) (s) amino acid (SEQ ID NO: 143) s) the amino terminus comprising one or more of residues 176-332 of human ML as shown in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1). 7a. - Fragmento polipeptídico de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por ser seleccionado de entre o o grupo constituído por TPO(1-153) e TPO(l-245).7th. Polypeptide fragment according to Claim 6, characterized in that it is selected from the group consisting of TPO (1-153) and TPO (1-245). 89. - Fragmento polipeptídico de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por a sequência de aminoácidos do fragmento polipeptídico compreender89. The polypeptide fragment according to Claim 2, characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide fragment comprises SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL, (SEQ ID NO: 110)SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL, (SEQ ID NO: 110) HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF, (SEQ ID NO: 111)HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF, (SEQ ID NO: 111) SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL, (SEQ ID NO: 112)SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL, (SEQ ID NO: 112) LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL, (SEQ ID NO: 113)LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL, (SEQ ID NO: 113) GQLSGQVRLLLGALQS, (SEQ ID NO: 114)GQLSGQVRLLLGALQS, (SEQ ID NO: 114) LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF, (SEQ ID NO: 115)LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF, (SEQ ID NO: 115) LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR (SEQ ID NO: 116) e combinações delas.LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR (SEQ ID NO: 116) and combinations thereof. 93. - Polipeptídeo de acordo com a Reivindicação93. - Polypeptide according to Claim 6, caracterizado por não ser glicosilado.6, characterized by not being glycosylated. 103. - Polipeptídeo isolado de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por ser codificado por um ácido nucleico tendo a sequência que hibrida, em condições moderadamente restringentes, com moléculas de ácido nucleico tendo a sequência de ácido nucleico descrita na Fig. 1 (SEQ ID NO: 2).103. An isolated polypeptide according to Claim 1, characterized in that it is encoded by a nucleic acid having the sequence that hybridizes, under moderately stringent conditions, to nucleic acid molecules having the nucleic acid sequence described in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2). lia. - o polipeptídeo de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por ser biologicamente activo.read. the polypeptide according to Claim 10, characterized in that it is biologically active. 123. - polipeptídeo de acordo com a Reivindicação123. - polypeptide according to Claim 1, caracterizado por ser seleccionado de entre o grupo hML, hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pMLe pML2.1, characterized by being selected from the group hML, hML ₁₅₃ , hML (R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML and pML2. 133. - polpeptídeo de acordo com a Reivindicação133. - polypeptide according to Claim 2, caracterizado por a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreender os resíduos de aminoácidos 1 a X da Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), onde X é seleccionado do grupo 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 e 332.2, characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide comprises amino acid residues 1 to X of Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), where X is selected from the group 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 and 332. 14a. - Polipeptídeo, caracterizado por ser ligando de mpl. isolado e substancialmente homogéneo, partilhando pelo menos 80% de identidade da sequência com o polipeptídeo de acordo com a Reivindicação 13.14a. - Polypeptide, characterized by being a ligand of mpl. isolated and substantially homogeneous, sharing at least 80% sequence identity with the polypeptide according to Claim 13. 15». - Polipeptídeo de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por em X ser 153.15 ». Polypeptide according to Claim 13, characterized in that X is 153. 16a. - Quimera, caracterizada por compreender o ligando de mpl de acordo com a Reivindicação 13 fundido com um polipeptídeo heterólogo.16th. Chimera, characterized in that it comprises the mpl ligand according to Claim 13 fused to a heterologous polypeptide. 172. - Quimera de acordo com a Reivindicação 16, caracterizada por o polipeptídeo heterólogo ser um polipeptídeo de imunoglobulina.172. The chimera according to Claim 16, characterized in that the heterologous polypeptide is an immunoglobulin polypeptide. 182. - Quimera de acordo com a Reivindicação 16, caracterizada por o polipeptídeo heterólogo ser um polipeptídeo de interleuquina.182. A chimera according to Claim 16, characterized in that the heterologous polypeptide is an interleukin polypeptide. 192. - Quimera, caracterizada por compreender os resíduos do extremo N 1 até aproximadamente 153 a 157 do fragmento polipeptídico de acordo com a Reivindicação 2 substituído com um ou mais, mas não todos, resíduos de EPO humano adicionados ou substituídos nos resíduos do extremo N de hML nas posições correspondendo ao alinhamento mostrado na Fig. 10.192. Chimera, characterized in that it comprises the residues of the N 1 end to approximately 153 to 157 of the polypeptide fragment according to Claim 2 substituted with one or more, but not all, human EPO residues added or substituted in the residues of the N end of hML in the positions corresponding to the alignment shown in Fig. 10. 202. - Anticorpo, caracterizado por ser capaz de se ligar ao polipeptídeo ligando de mpl de acordo com a Reivindicação 13.202. Antibody, characterized in that it is capable of binding to the mpl ligand polypeptide according to Claim 13. 212. - Linha celular de hibridoma, caracterizada por ser produtora do anticorpo de acordo com a Reivindicação212. - Hybridoma cell line, characterized by being an antibody producer according to Claim 20.20. 22a. - Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada por ser codificadora do polipeptideo ligando de mpl de acordo com a Reivindicação 1.22a. An isolated nucleic acid molecule, characterized in that it encodes the mpl ligand polypeptide according to Claim 1. 23». - Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada por ser codificadora do polipeptideo ligando de mpl de acordo com a Reivindicação 13.23 ». An isolated nucleic acid molecule, characterized in that it encodes the mpl ligand polypeptide according to Claim 13. 249. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a Reivindicação 22, caracterizada por compreender a sequência de ácido nucleico da grelha de leitura aberta mostrada na Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) .249. An isolated nucleic acid molecule according to Claim 22, characterized in that it comprises the nucleic acid sequence of the open reading frame shown in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2). 259. - Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a Reivindicação 24, caracterizada por ser codificadora de um polipeptideo ligando de mpl seleccionado de entre o grupo hML, hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pMLe pML2.259. An isolated nucleic acid molecule according to Claim 24, characterized in that it encodes an mpl ligand polypeptide selected from the group hML, hML ₁₅₃ , hML (R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML and pML2. 269. - Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada por ser seleccionada de entre o grupo constituído por (a) um clone de cDNA compreendendo a sequência de nucleótidos da região codificadora do gene do ligando de mpl;269. - Isolated nucleic acid molecule, characterized in that it is selected from the group consisting of (a) a cDNA clone comprising the nucleotide sequence of the coding region of the mpl ligand gene; (b) uma sequência de DNA capaz de hibridar em condições moderadamente restríngentes a restringentes com um clone de (a); e (c) uma variante genética de qualquer uma das sequências de DNA de (a) e (b) que codifica um polipeptideo possuidor de uma propriedade biológica de um polipeptideo natural ligando de mpl.(b) a DNA sequence capable of hybridizing under moderately stringent to stringent conditions with a clone of (a); and (c) a genetic variant of any of the DNA sequences of (a) and (b) that encodes a polypeptide having a biological property of a natural mpl ligand polypeptide. 273. - Molécula de DNA isolada de acordo com a Reivindicação 26, caracterizada por ter a sequência capaz de hibridar com uma sequência de DNA descrita na Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) em condições moderadamente restringentes, em que a molécula de DNA codifica um polipeptídeo ligando de mpl biologicamente activo.273. An isolated DNA molecule according to Claim 26, characterized in that it has the sequence capable of hybridizing to a DNA sequence described in Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) under moderately stringent conditions, wherein the DNA molecule encodes a biologically active mpl ligand polypeptide. 283. - Molécula de ácido nucleico de acordo com a Reivindicação 25, caracterizada por compreender ainda um promotor operacionalmente ligado à molécula de ácido nucleico.283. The nucleic acid molecule according to Claim 25, characterized in that it further comprises a promoter operably linked to the nucleic acid molecule. 293. - Vector de expressão, caracterizado por compreender a sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 25 operacionalmente ligada a sequências de controle reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vector.293. An expression vector, characterized in that it comprises the nucleic acid sequence according to claim 25 operationally linked to control sequences recognized by a host cell transformed with the vector. 30a. - célula hospedeira, caracterizada por ser transformada com o vector da Reivindicação 29.30a. host cell, characterized in that it is transformed with the vector of Claim 29. 3ia. - Processo para a utilização de uma molécula de ácido nucleico codificadora do polipeptídeo ligando de ~ ttpl para dar origem à produção do polipeptídeo ligando de mpl, caracterizado por compreender a cultura da célula hospedeira de acordo com a Reivindicação 30.3ia. Process for using a nucleic acid molecule encoding the tplpl ligand polypeptide to give rise to the production of the mpl ligand polypeptide, characterized in that it comprises the culture of the host cell according to Claim 30. 323. - Processo de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por o polipeptídeo ligando de mpl ser recuperado a partir da célula hospedeira.323. The method of Claim 31 wherein the mpl ligand polypeptide is recovered from the host cell. 333. - Processo da Reivindicação 31, caracterizado por o polipeptídeo ligando de mpl ser recuperado a partir do meio de cultura da célula hospedeira.333. The process of Claim 31, characterized in that the mpl ligand polypeptide is recovered from the host cell culture medium. 343. - Método para a determinação da presença do polipeptídeo ligando de mpl, caracterizado por compreender a hibridação de DNA codificador do polipeptídeo ligando de mpl com uma amostra de ácido nucleico a testar e a determinação da presença do DNA do polipeptídeo ligando de mpl.343. - Method for determining the presence of the mpl ligand polypeptide, characterized by comprising the hybridization of DNA encoding the mpl ligand polypeptide with a nucleic acid sample to be tested and the determination of the presence of the DNA of the mpl ligand polypeptide. 35». - Método de amplificação de uma amostra de ácido nucleico a testar, caracterizado por compreender a iniciação de uma reacção em cadeia de DNA polimerase com ácido nucleico codificador do ligando de mpl.35 ». - Method of amplification of a sample of nucleic acid to be tested, characterized by comprising the initiation of a DNA polymerase chain reaction with nucleic acid encoding the mpl ligand. 36a. - Composição, caracterizada por compreender o polipeptídeo ligando de mpl da Reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável36a. Composition, characterized in that it comprises the mpl ligand polypeptide of Claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier 37a. - Composição de acordo com a Reivindicação 36, caracterizada por ser utilizada para o tratamento de um mamífero tendo ou correndo o risco de ter trombocitopenia.37a. Composition according to Claim 36, characterized in that it is used for the treatment of a mammal having or at risk of having thrombocytopenia. 383. - Composição de acordo com a Reivindicação 36, caracterizada por compreender ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente seleccionado de entre o grupo constituído por uma citocina, factor estimulador de colónias e interleuquina.383. The composition of Claim 36, further comprising a therapeutically effective amount of an agent selected from the group consisting of a cytokine, colony stimulating factor and interleukin. 393. - Composição de acordo com a Reivindicação393. - Composition according to Claim 38, caracterizada por o agente ser seleccionado de entre KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL_8, IL-9 e IL-11.38, characterized in that the agent is selected from KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL- 7, IL_8, IL-9 and IL-11.