CZ192296A3 - Thrombopoietin - Google Patents

Abstract

Isolated thrombopoietin (TPO), isolated DNA encoding TPO, and recombinant or synthetic methods of preparing and purifying TPO are disclosed. Various forms of TPO are shown to influence the replication, differentiation or maturation of blood cells, especially megakaryocytes and megakaryocyte progenitor cells. Accordingly, these compounds may be used for treatment of thrombocytopenia.

Description

Oblast technikyTechnical field

Patent se týká nebo chemické syntézy proliferaci, diferenciaci nebo zrání hematopoetických buněk, zvláště destičkových progenitorových buněk. Tento vynález se zvláště týká klonování a exprese nukleových kyselin kódujících proteinové ligandy schopné vázat a aktivovat mpl, člena podskupiny cytokinových receptorů. Vynález dále popisuje použití těchto proteinů samotných nebo v kombinaci s dalšími cytokiny k léčení imunitních nebo hematopoetických onemocnění včetně trombocytopenie.The patent relates to or chemical synthesis of the proliferation, differentiation or maturation of hematopoietic cells, particularly platelet progenitor cells. In particular, the invention relates to the cloning and expression of nucleic acids encoding protein ligands capable of binding and activating mpl, a member of the cytokine receptor subfamily. The invention further provides the use of these proteins alone or in combination with other cytokines for the treatment of immune or hematopoietic diseases including thrombocytopenia.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

I. Hernatopoetický systémI. Hernatopoietic system

Hematopoetický systém produkuje zralé vysoce specializované krevní buňky, o kterých je známo, že jsou nezbytné pro přežití všech savců. Tyto zralé buňky zahrnují erythrocyty, specializované na transport kyslíku a oxidu uhličitého, T- a B-lymfocyty, zodpovědné za buňkami a protilátkami zprostředkovanou imunitní odpověď, destičky nebo trombocyty, specializované na tvoření krevních sraženin, a granulocyty a makrofágy, specializované k odstraňování nečistot a jako pomocné buňky při boji s infekcí. Granulocyty jsou dále rozděleny na neutrofily, eosinofily, basofily a mastocyty, specializované buněčné typy mají své specializované funkce. Je pozoruhodné, že všechny tyto specializované zralé krevní buňky jsou odvozeny od jediného společného primitivního buněčného typu, uváděného jako pluripotentní (nebo totipotentní) kmenová buňka, který se nachází zejména v kostní dřeni (Dexter a kol., Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441 (1987)).The hematopoietic system produces mature highly specialized blood cells known to be essential for the survival of all mammals. These mature cells include erythrocytes specialized in the transport of oxygen and carbon dioxide, T- and B-lymphocytes responsible for the cell and antibody-mediated immune response, platelets or thrombocytes specialized in the formation of blood clots, and granulocytes and macrophages specialized in removing impurities and as helper cells to fight infection. Granulocytes are further divided into neutrophils, eosinophils, basophils and mast cells, specialized cell types having their specialized functions. It is noteworthy that all these specialized mature blood cells are derived from a single common primitive cell type, referred to as a pluripotent (or totipotent) stem cell, found mainly in the bone marrow (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441 (1987)).

Zralé vysoce specializované krevní buňky musí být ve velkých množstvích produkovány kontinuálně v průběhu života savce. Převážná většina těchto specializovaných krevních buněk je odsouzena k tomu, aby byly funkčně aktivní pouze několik hodin až týdnů (Cronkite a kol., Blood Cells, 2: 263-284 1976)). Tedy kontinuální obnova zralých krevních buněk, samotných primitivních kmenových buněk, stejně jako jakýchkoliv mezistupňů, které leží mezi primitivními a zralými buňkami, je nezbytná k udržení normálního stabilního stavu krevních buněk, nutného u savců.Mature highly specialized blood cells must be produced in large quantities continuously throughout the life of the mammal. The vast majority of these specialized blood cells are doomed to be functionally active for only a few hours to weeks (Cronkite et al., Blood Cells, 2: 263-284 1976). Thus, the continuous recovery of mature blood cells, primitive stem cells themselves, as well as any intermediate steps that lie between primitive and mature cells, is necessary to maintain the normal steady state blood cells required in mammals.

Ve středu hematopoetického systému leží pluripotentní kmenová buňka (buňky). Těchto buněk je na počet relativně málo a prodělávají sebeobnovu proliferaci a produkují dceřinné kmenové buňky nebo jsou transformovány, v řadě diferenciačních kroků, na kmenově-vymezené progenitorové buňky se stoupající zralostí, a nakonec vznikají vysoce specializované zralé krevní buňky.In the center of the hematopoietic system lies the pluripotent stem cell (s). These cells are relatively few in number and undergo self-renewal proliferation and produce daughter stem cells or are transformed, in a number of differentiation steps, into stem-delimited progenitor cells with increasing maturity, and ultimately, highly specialized mature blood cells are formed.

Například, některé multipotentní progenitorové buňky, uváděné jako CFC-Mix, odvozené z kmenových buněk prodělávajících proliferaci (sebeobnovu) a vývoj, a produkují kolonie obsahující všechny různé myeloidní buňky, erythrocyty, neutrofily, megakaryocyty (předchůdci destiček), makrofágy, basofily, eosinofily, a mastocyty. Ostatní progenitorové buněčné lymfoidní kmeny prodělávají proliferaci a vývoj na T-buňky a B-buňky.For example, some multipotent progenitor cells, referred to as CFC-Mix, derived from stem cells undergoing proliferation and development, and produce colonies containing all different myeloid cells, erythrocytes, neutrophils, megakaryocytes (platelet precursors), macrophages, basophils, eosinophils and mast cells. Other progenitor cell lymphoid strains undergo proliferation and development into T-cells and B-cells.

Dále mezi CFC-Mix progenitovovými buňkami a myeloidními buňkami leží další řada progenitorových buněk intermediárních ve vztahu k jejich potomkům. Tyto kmenověkolonieOstatní pluripotentními pluripotentní sebeobnovu a vymezené progenitorové buňky jsou klasifikovány na základě potomků, které produkují. Známí přímí předchůdci myeloidních buněk jsou: erythroidní kolony-tvořící jednotky (CFU-E) pro erythrocyty, granulocytové/makrofágové kolonietvořící buňky pro megakaryocyty, eosinofilní tvořící buňky' (Eos-CFC) pro mastocyty. intermediární předchůdci buněk mezi kmenovými buňkami a zralými krevními buňkami jsou známí (viz níže) nebo budou pravděpodobně objeveni, a mají měnící se stupeň rodového vymezení a sebeobnovní kapacity.Further, between the CFC-Mix of progenit cells and myeloid cells lies another row of progenitor cells intermediate in relation to their progeny. These stem coloniesOther pluripotent pluripotent self-renewal and defined progenitor cells are classified based on the offspring they produce. Known direct ancestors of myeloid cells are: erythroid colony forming units (CFU-E) for erythrocytes, granulocyte / macrophage colony forming cells for megakaryocytes, eosinophilic forming cells (Eos-CFC) for mast cells. the intermediate cell ancestors between stem cells and mature blood cells are known (see below) or are likely to be discovered, and have varying degrees of gender delimitation and self-renewal capacity.

Vlastním vedoucím činitelem normálního hematopoetického buněčného systému se jeví být snížení kapacity samoobnovy při ztrátě multipotence a získání kmenovém vymezení a zralosti. Tedy na jednom konci hematopoetického buněčného spektra leží kmenové buňky, které mají kapacitu pro diferenciaci na všechny různé kmenově-vymezené zaměřené progenitorové buňky. Tato kapacita je základem terapie transplantací kostní dřeně, kdy primitivní kmenové buňky znovu osídlí celý hematopoetický buněčný systém. Na druhém konci spektra leží vysoce kmenově-vymezené progenitory a jejich potomci, kteří ztratili schopnost samoobnovy, ale získali zralou funkční aktivitu.The actual leading factor of the normal hematopoietic cell system appears to be the reduction of self-renewal capacity in the event of loss of multipotency and the acquisition of stem delineation and maturity. Thus, at one end of the hematopoietic cell spectrum lies stem cells that have the capacity to differentiate into all different stem-delimited targeted progenitor cells. This capacity is the basis of bone marrow transplant therapy, where primitive stem cells re-populate the entire hematopoietic cell system. At the other end of the spectrum lies highly stem-delimited progenitors and their descendants who have lost the ability to self-renew but have acquired mature functional activity.

Proliferace a vývoj kmenových buněk a kmenověvymezených progenitorových buněk je pečlivě kontrolován různými hematopoetickými růstovými faktory nebo cytokiny. Úloha těchto růstových faktorů in vivo je komplexní a není zcela pochopena. Některé růstové faktory, jako je interleukin-3 (IL-3), jsou schopné stimulovat multipotentní kmenové buňky stejně dobře jako zaměřené progenitorové buňky některých kmenů, včetně například megakaryocytů. Předpokládalo se, že u dalších faktorů jako je granulocytový/makrofágový kolonie-stimulující faktor (GMCSF) je jejich působení omezeno na GM-CFC. Později však bylo objeveno, že GM-CSF také ovlivňuje proliveraci a vývoj interalia megakaryocytů. Bylo zjištěno, že biologické aktivity IL-3 a GM-CSF se překrývají, i když účinnost se různí. Nedávno bylo zjištěno, že interleukin-6 (IL-6) i interleukin-11 (IL-11) naproti tomu nemají zjevný vliv na samotnou meg-kolonovou formaci, působí synergicky s IL-3, stimulují zrání megakaryocytů (Yonemura a kol., Exp. Hematol., 20: 1011-1016 (1992)).Proliferation and development of stem cells and stemmed progenitor cells is carefully controlled by various hematopoietic growth factors or cytokines. The role of these growth factors in vivo is complex and not fully understood. Some growth factors, such as interleukin-3 (IL-3), are capable of stimulating multipotent stem cells as well as targeted progenitor cells of some strains, including, for example, megakaryocytes. Other factors such as granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (GMCSF) were thought to be limited to GM-CFC. However, it was later discovered that GM-CSF also affects the proliferation and development of interalia megakaryocytes. The biological activities of IL-3 and GM-CSF were found to overlap, although the efficacy varies. Recently, interleukin-6 (IL-6) and interleukin-11 (IL-11) have been found to have no apparent effect on megonone formation alone, acting synergistically with IL-3, stimulating megakaryocyte maturation (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20: 1011-1016 (1992)).

Hematopoetické růstové faktory mohou ovlivňovat růst a diferenciaci jednoho nebo více rodů, mohou se překrývat s ostatními růstovými faktory v ovlivňování jednotlivých progenitorových buněčných linií, nebo mohou působit synergicky s dalšími faktory.Hematopoietic growth factors may affect the growth and differentiation of one or more genera, may overlap with other growth factors in influencing individual progenitor cell lines, or may act synergistically with other factors.

Také bylo objeveno, že hematopoetické růstové faktory mohou projevovat své účinky v různých fázích buněčného vývoje od totipotentních kmenových buněk přes různě zaměřené buňky kmenově-vymezených progenitorů až po zralé krevní buňky. Například u erythropoetinu (epo) bylo objeveno, že zahajuje proliferaci pouze zralých erythroidních progenitorových buněk. IL-3 uplatňuje své účinky dříve, ovlivňuje primitivní kmenové buňky a mezíštupňové kmenově-vymezené progenitorové buňky. Další růstové faktory jako je kmenový buněčný faktor (SCF) mohou ovlivňovat více vývoj primitivních buněk.It has also been discovered that hematopoietic growth factors can exert their effects in different stages of cellular development, from totipotent stem cells to differently targeted stem-progenitor cells to mature blood cells. For example, erythropoietin (epo) has been found to initiate the proliferation of only mature erythroid progenitor cells. IL-3 exerts its effects earlier, affecting primitive stem cells and interstage stem-defined progenitor cells. Other growth factors such as stem cell factor (SCF) may influence the development of primitive cells more.

Vzhledem k předcházejícím informacím bude oceněno, že mohou být použity nové hematopoetické růstové faktory, které ovlivňují životnost, proliferaci, diferenciaci nebo zrání jakýchkoliv krevních buněk nebo jejich předchůdců, zvláště pomáhají při rekonstrukci oslabeného hematopoetického systému, může být oslaben onemocněním nebo po radiační nebo chemoterapii.In view of the foregoing, it will be appreciated that novel hematopoietic growth factors that affect the viability, proliferation, differentiation or maturation of any blood cells or their predecessors, particularly assist in the reconstruction of an attenuated hematopoietic system, may be attenuated by disease or after radiation or chemotherapy.

megakaryocytů megakaryocytůmegakaryocytes megakaryocytes

II. Megakaryocytopoesa - produkce destičekII. Megakaryocytopoesis - platelet production

Regulace megakaryocytopoesy a produkce destiček byly popsány v: Mazur, Exp. Hematol., 15: 248 (1987) a Hoffman,Regulation of megakaryocytopoiesis and platelet production have been described in: Mazur, Exp. Hematol., 15: 248 (1987) and Hoffman,

Blood, 74: 1196-1212 (1989). Krátce, pluripotentní kmenové buňky kostní dřeně se diferencují na megakaryocyty, erythrocyty a myelocytické buněčné linie. Věří se, že mezi kmenovými buňkami a megakaryocyty existuje hierarchie specialisovaných megakaryocytických progenitorových buněk. Byly identifikovány nejméně tři třídy megakaryocytických progenitových buněk, a to blasty-tvořící jednotka (BFU-MK), kolonie-tvořící jednotka (CFU-MK) a světelně husté megakarytocytové progenitové buňky (LD-CFU-MK). Samotné zrání megakaryocytů je kontinuální vývoj, který může být rozdělen na stupně založené na standardních morfologických kritériích. Nej ranějším rozpoznatelným členem skupiny megakaryocytů (MK nebo meg) jsou megakaryoblasty. Tyto buňky mají nejprve 20 až 30 μπι v průměru a mají basofilní cytoplasmu a mírně nepravidelné jádro s volným, poněkud retikulárním chromatinem a několika jadérky. Později mohou megakaryoblasty obsahovat až 32 jader (polyploid), ale cytoplasma zůstává řídká a nezralá. Zrání pokračuje, jádro se stává lobulární a zakulacené, a zvyšuje se množství cytoplasmy a stává se více acidofilní a zrnitá. U nejvíce zralých buněk této skupiny se může objevovat uvolňování destiček na jejich periférii. Normálně je méně než 10% megakaryocytů ve stádiu blastů a více než 50% je zralých. Modrologická klasifikace obvykle uplatňovaná na řady megakaryocytů jsou megakaryoblasty pro nej ranější formu;Blood, 74: 1196-1212 (1989). Briefly, pluripotent bone marrow stem cells differentiate into megakaryocytes, erythrocytes, and myelocytic cell lines. It is believed that there is a hierarchy of specialized megakaryocytic progenitor cells between stem cells and megakaryocytes. At least three classes of megakaryocytic progenite cells, blast-forming unit (BFU-MK), colony-forming unit (CFU-MK) and light-dense megakarytocyte progenite cells (LD-CFU-MK) have been identified. Megakaryocyte maturation alone is a continuous development that can be divided into grades based on standard morphological criteria. The most early recognizable member of the megakaryocyte group (MK or meg) are megakaryoblasts. These cells initially have 20 to 30 μπι in diameter and have basophilic cytoplasm and a slightly irregular nucleus with loose, somewhat reticular chromatin and several nucleoli. Later, megakaryoblasts may contain up to 32 nucleos (polyploid), but the cytoplasm remains sparse and immature. Maturation continues, the nucleus becomes lobular and rounded, and the amount of cytoplasm increases and becomes more acidophilic and granular. Most mature cells in this group may experience platelet release at their periphery. Normally, less than 10% of megakaryocytes are in the blast stage and more than 50% are mature. The rheological classification usually applied to rows of megakaryocytes are megakaryoblasts for the earliest form;

promegakaryocyty nebo basofilní megakaryocyty pro střední mezistupňovou formu; a zralé (acidofilní, granulám! nebo destičky-produkující) megakaryocyty pro pozdní formu. Zralé megakaryocyty natahují filamenta cytoplasmy do sinusoidálních prostor, kde se oddělují a fragmentují do jednotlivých destiček (Williams a kol., Hematology, 1972).promegakaryocytes or basophilic megakaryocytes for the intermediate intermediate stage; and mature (acidophilic, granular or platelet-producing) megakaryocytes for the late form. Mature megakaryocytes stretch filaments of the cytoplasm into the sinusoidal spaces where they separate and fragment into individual platelets (Williams et al., Hematology, 1972).

Soudí se, že megakaryocytopoéza zahrnuje několik regulačních faktorů (Williams a kol., Br. J. Haematol., 52: 173 (1982) a Williams a kol., J. Cell Physiol., 110: 101 (1082)). Rané stadium megakaryocytopoézy je považováno za mitotické, zahrnuje buněčnou proliferaci a kolonovou inciaci z CFU-MK, ale není ovlivněno počtem destiček (Burstein a kol., J. Cell Physiol., 109: 333 (1981) a Kimura a kol., Exp. Hematol., 13: 1048 (1985)). Pozdější stadium zrání je non-mitotické, zahrnuje jadernou polyploidizaci a cyptoplasmické zrání a je pravděpodobně regulováno zpětnovazebným mechanismem počtem periferálních destiček (Oděli a kol., Blood, 48: 765 (1976) a Ebbe a kol., Blood, 32:787 (1968)).Megakaryocytopoiesis is believed to include several regulatory factors (Williams et al., Br. J. Haematol., 52: 173 (1982) and Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101 (1082)). The early stage of megakaryocytopoiesis is considered to be mitotic, including cell proliferation and column initiation from CFU-MK, but not affected by platelet count (Burstein et al., J. Cell Physiol., 109: 333 (1981) and Kimura et al., Exp. Hematol., 13: 1048 (1985)). The later stage of maturation is non-mitotic, involves nuclear polyploidization and cyptoplasmic maturation, and is probably regulated by the feedback mechanism of peripheral platelet counts (Odessa et al., Blood, 48: 765 (1976) and Ebbe et al., Blood, 32: 787 (1968) )).

Byla diskutována existence rozdílných a specifických megakaryocytických kolonie-stimulujících faktorů (MK-CSF) (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 (1987). Nicméně většina autorů věří, že proces tak životně důležitý k přežití jako je produkce destiček bude regulován cytokinem (cytokiny) výhradně odpovědným za tento proces. Hypotéza, že existuje megakaryocytově/destičkově specifický citokin (cytokiny), tvoří základ více než 301etého výzkumu - ale do dneška žádné takovéto cytokiny nebyly purifikovány, sekvenovány ani stanoveny jako specifický MK-CSF (TPO).The existence of different and specific megakaryocytic colony-stimulating factors (MK-CSF) has been discussed (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 (1987). However, most authors believe that a process as vital to survival as platelet production will be The hypothesis that there is a megakaryocyte / platelet-specific citokine (cytokines) is the basis of more than 301 years of research - but to date no such cytokines have been purified, sequenced or determined as specific MK-CSF (TPO) ).

Ačkoliv bylo publikováno, že MK-CSF byly částečně purifikovány u experimentálně vzniklé trombocytopenie (Hill a kol., Exp. Hematol., 14: 752 (1986)) z média kondiciovaného lidskými embryonálními játry (CM) (McDonald a kol., J. Lab. Clin. Med., 85: 59 (1975) a u člověka při plastické anémii a idiopathické trombocytopenické purpuře z urinárních extraktů (Kawakita a kol., Blood, 6: 556 (1983)) a plasmy (Hoffman a kol., J. Clin. Invest., 75: 1174 (1985)), jejich fyziologická funkce je ještě stále v mnoha případech neznámá.Although it has been reported that MK-CSF was partially purified in experimentally produced thrombocytopenia (Hill et al., Exp. Hematol., 14: 752 (1986)) from human embryonic liver (CM) conditioned medium (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 85: 59 (1975) and in humans in plastic anemia and idiopathic thrombocytopenic purpura from urinary extracts (Kawakita et al., Blood, 6: 556 (1983)) and plasma (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75: 1174 (1985)), their physiological function is still unknown in many cases.

Jako megakaryocytových potenciátorů bylo použito kondiciované médium, mitogeny líčidla amerického aktivovaných slezinných buněk (PWM-SpCM) a myší myelomonocytové buněčné linie WEHI-3 (WEHI-3CM). PWM-SpCM obsahují faktory zvyšující CFU-MK růst (Metcalf a kol., Pro. Nati., Acad. Sci., USA, 72: 1744-1748 (1975); Quesenberry a kol., Blood, 65: 214 (1985); a Iscove, N.N., v Hematopoetic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular biology, Vol. 10, Golde a kol., editoři, (New York, Academy Press) str. 37-52 (1978)), jeden z nich je interleukin-3 (IL-3), multikmenový kolonie stimulující faktor (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11: 469 (1986)]. Ostatní faktory v tomto médiu nebyly dosud identifikovány a isolovány. WEHI-3 je myší myelomonocytová buněčná linie vylučující relativně velká množství IL-3 a menší množství GM-CSF; bylo zjištěno, že IL-3 potenciuje růst velké skupiny hematopoetických buněk (Ihle a kol., J. Immunol., 13: 282 [1983]). Dále bylo zjištěno, že IL-3 také působí synergicky s mnoha známými hematopoetickými hormony nebo růstovými faktory (Bartelmez a kol., J. Cell Physiol., 122: 362-369 [1985] a Warren a kol., Cell, 46: 667-674 [1988]), včetně erythropoetinu (EPO) i interleukinu-1 (IL-1), při indukci velmi raných multipotenciálních prekursorů a formování velmi rozsáhlých smíšených hematopoetických kolonií.Conditioned media, American activated spleen cell make-up mitogens (PWM-SpCM), and murine myelomonocytic cell line WEHI-3 (WEHI-3CM) were used as megakaryocyte potentiators. PWM-SpCM contains factors that increase CFU-MK growth (Metcalf et al., Pro. Natl., Acad. Sci., USA, 72: 1744-1748 (1975); Quesenberry et al., Blood, 65: 214 (1985) and Iscove, NN, in Hematopoetic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al., editors, (New York, Academy Press) pp. 37-52 (1978), one among them is interleukin-3 (IL-3), a multi-strain colony stimulating factor (multi-CSF [Burstein, Blood Cells, 11: 469 (1986)]. Other factors in this medium have not yet been identified and isolated. WEHI-3 is a mouse a myelomonocytic cell line secreting relatively large amounts of IL-3 and less GM-CSF, IL-3 has been found to potentiate the growth of a large group of hematopoietic cells (Ihle et al., J. Immunol., 13: 282 [1983]). IL-3 has also been found to act synergistically with many known hematopoietic hormones or growth factors (Bartelmez et al., J. Cell Physiol., 122: 362-369 [1985] and Wa rren et al., Cell, 46: 667-674 [1988]), including erythropoietin (EPO) and interleukin-1 (IL-1), in inducing very early multipotential precursors and forming very large mixed hematopoietic colonies.

Další zdroje megakaryocytových potenciátorů byly objeveny v kondiciovaném médiu myších plicních, kostních, makrofágových buněčných linií, buněk peritoneálního exudátu a buňkách lidských zárodečných ledvin. Přes některé sporné údaje (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]), existuje několik důkazů (Geissler a kol., Br. J. Haematzol., 60: 233-238 [1985], že aktivované T lymfocyty spíše než monocyty mají důležitou úlohu v megakayocytopoese. Tato zjištění předpokládají, že sekrety aktivovaných T-lymfocytů jako jsou interleukiny mohou být regulačními faktory ve vývoji MK (Geissler a kol., Exp. Hematol., 15: 845-853 [1987]). Množství studií megakaryocytopoesy s purifikovaným erythropoetinem EPO (Vainchenker a kol., Blood, 54: 940 [1979]; McLeod a kol., 261: 492-4 [1976]; a Williams a kol., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]) naznačují, že tento hormon má silný vliv na MK formaci kolon. To bylo také demonstrováno v kulturách bez séra i obsahujících sérum a v nepřítomnosti pomocných buněk (Williams a kol., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]). Předpokládá se, že EPO zasahuje více do jedno- a dvoubuněčné fáze z hlediska megakaryocytopoézy tak, že působí proti účinku PWM-SpCM, které zasahuje do čtyřbuněčné fáze vývoje megakaryocytů. Interakce všech těchto faktorů v časné i v pozdní fázi vývoje megakaryocytů zbývá objasnit.Additional sources of megakaryocyte potentiators have been discovered in conditioned media of mouse lung, bone, macrophage cell lines, peritoneal exudate cells, and human germ kidney cells. Despite some controversial data (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]), there is some evidence (Geissler et al., Br. J. Haematzol., 60: 233-238 [1985] that activated T lymphocytes rather than monocytes play an important role in megakayocytopoiesis.These findings suggest that secretion of activated T cells such as interleukins may be regulatory factors in the development of MK (Geissler et al., Exp. Hematol., 15: 845-853 [1987]) A number of studies of megakaryocytopoiesis with purified erythropoietin EPO (Vainchenker et al., Blood, 54: 940 [1979]; McLeod et al., 261: 492-4 [1976]; and Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]) suggest that this hormone has a strong effect on MK column formation, and this has also been demonstrated in serum-free and serum-free cultures and in the absence of helper cells (Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984] It is believed that EPO extends more into the one- and two-cell phase in terms of megakaryocytopoiesis by e counteracts the effect of PWM-SpCM, which interferes with the four-cell phase of megakaryocyte development. The interaction of all these factors in the early and late stages of megakaryocyte development remains to be elucidated.

Údaje zjištěné v některých laboratořích předpokládají, že jediné multi-kmenové faktory, které individuálně mají MK-kolony stimulující aktivitu jsou GM-CSF a IL-3 a, v menší míře, B-buněčný stimulační faktor IL-6 (Ikebuchi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84: 9035 [1987]). Nedávno několik autorů publikovalo, že IL-11 leukémii inhibující faktor (LIF) působí synergicky s IL-3 na zvýšení magakaryocytové velikosti a ploidie (Yonemura a kol.,Data found in some laboratories suggest that the only multi-stem factors that individually have MK-columns stimulating activity are GM-CSF and IL-3 and, to a lesser extent, B-cell stimulation factor IL-6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 9035 [1987]). Recently, several authors have reported that IL-11 leukemia inhibiting factor (LIF) acts synergistically with IL-3 to increase magakaryocyte size and ploidy (Yonemura et al.,

British Journal of Hematology, 84: 16-23 [1993]; Burstein a kol., J. Cell. Physiol., 153: 305-312 [1992]; Metcalf a kol., Blood, 76, 50-56 [1990]); Metcalf a kol., Blood, 77: 2150-2153 [1991]; Bruno a kol., Exp. Hematol., 19: 378-381; a Yonemura a kol., Exp. Hematol., 20: 1011-1016 [1992]).British Journal of Hematology, 84: 16-23 (1993); Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153: 305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76, 50-56 [1990]); Metcalf et al., Blood, 77: 2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19: 378-381; and Yonemura et al., Exp. Hematol., 20: 1011-1016 [1992]).

Ostatní dokumenty, které se tímto zabývají, zahrnují: Eppstein a kol., U.S. Patent č. 4,946,091; Chong, U.S. Patent č. 4,879,111; Fernandes a kol., U.S. Patent č. 4,604,377; Wissler a kol., U.S. Patent č. 4,512,971; Gottlieb, U.S. Patent č. 4,468,379; Bennet a kol., U.S. Patent č. 5,215,895; Kogan a kol., U.S. Patent č.Other documents dealing with this include: Eppstein et al., U.S. Pat. U.S. Patent No. 4,946,091; Chong, U.S. Pat. U.S. Patent No. 4,879,111; Fernandes et al. U.S. Patent No. 4,604,377; Wissler et al. U.S. Patent No. 4,512,971; Gottlieb, U.S. Pat. U.S. Patent No. 4,468,379; Bennet et al., U.S. Pat. U.S. Patent No. 5,215,895; Kogan et al. U.S. Pat.

5,250,732; Kimura a kol., Eur. J. Immunol., 20(9): 1927);5,250,732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20 (9): 1927);

Secor a kol., J. of Immunol., 144(4) 1484-1489 [1990];Secor et al., J. of Immunol., 144 (4) 1484-1489 [1990];

Warrena kol., J. of Immunol., 140(1): 94-99 [1988]; Waren a kol., Eex. Hematol., 17(11): 1095-1099 [1989]; Bruno a kol., Exp. Hematol., 17(10): 1038-1043 [1989]; Tanikawa a kol., Exp. Hematol., 17(8): 883-888 [1989]; Koike a kol.,Warren et al., J. of Immunol., 140 (1): 94-99 [1988]; Waren et al., Eex. Hematol., 17 (11): 1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17 (10): 1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17 (8): 883-888 [1989]; Koike et al.,

Blood, 75(12): 2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5): 15451551 [1989]; Rennick a kol·., Blood, 73(7):1828-1835 [1989]; a Clutterbuck a kol., Blood, 73(6): 1504-1512 [1989].Blood, 75 (12): 2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75 (5): 1545- 1551 [1989]; Rennick et al., Blood, 73 (7): 1828-1835 [1989]; and Clutterbuck et al., Blood, 73 (6): 1504-1512 [1989].

III. TrombocytopenieIII. Thrombocytopenia

Destičky jsou rozhodujícím prvkem krevního srážecího mechanismu. Deplece hladiny cirkulujících destiček, nazývaná trombocytopenie, se vyskytuje za různých klinických stavů a u různých onemocnění. Trombocytopenie je obvykle definována jako počet destiček pod 150xl0⁹ na litr. Hlavní příčiny trombocytopenie mohou být rozděleny na tři kategorie na základě životnosti destičky, a to: (1) snížená produkce cestiček kostní dření, (2) sekvestrování destiček ve slezině (splenomegalie), nebo (3) zvýšená destrukce destiček v periferální cirkulaci (např. autoimunitníPlatelets are a critical element of the blood coagulation mechanism. Depletion of circulating platelet levels, called thrombocytopenia, occurs in various clinical conditions and in various diseases. Thrombocytopenia is usually defined as platelet counts below 150x10 ⁹ per liter. The main causes of thrombocytopenia can be divided into three categories based on platelet lifetime, namely: (1) decreased bone marrow pathway production, (2) platelet sequestration in spleen (splenomegaly), or (3) increased platelet destruction in peripheral circulation (e.g. autoimmune

Obecně pacienti s 10⁹ na litr jsou v trombocytopenie nebo chemoterapie a radiační terapie). Dále u pacientů, kteří dostávají velké objemy rychle podávaných krevních produktů, chudých na destičky, se může rozvinout trombocytopenie způsobená zředěním.Generally patients with 10 ⁹ per liter are in thrombocytopenia (or chemotherapy and radiation therapy). Furthermore, patients receiving large volumes of rapidly administered platelet-poor blood products may develop thrombocytopenia due to dilution.

Klinické krvácivé projevy trombocytopenie závisí na intenzitě trombocytopenie, která je způsobila, a možných přidružených koagulačních defektech.The clinical bleeding manifestations of thrombocytopenia depend on the intensity of the thrombocytopenia that caused them and the possible associated coagulation defects.

počtem destiček mezi 20 a 100 x nebezpečí excesivního post traumatického krvácení, zatímco pacienti s počtem destiček pod 20 a lOOxlO⁹ na litr mohou krvácet spontánně. Tito druzí pacienti jsou kandidáty transfúze destiček s kontrolovaným imunitním a virálním rizikem. Při jakémkoliv stupni trombocytopenie budou sklony ke krvácení silnější, pokud příčinou je snížená produkce spíše než zvýšená destrukce destiček. Trombocytopenie mohou být následkem různých onemocnění stručně popsaných níže. Podrobnější popis je možné nalézt v Schafner, A.I., „Trombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Internal Medicine, 3. vydání, John J. Hutton a editoři, Little Brown and Co., kol.,platelet counts between 20 and 100 times the risk of excessive post traumatic bleeding, while patients with platelet counts below 20 and 100x10 ⁹ per liter may bleed spontaneously. These second patients are candidates for platelet transfusion with controlled immune and viral risk. At any degree of thrombocytopenia, the tendency to bleed will be stronger if the cause is decreased production rather than increased platelet destruction. Thrombocytopenia may result from various diseases briefly described below. A more detailed description can be found in Schafner, AI, "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Internal Medicine, 3rd edition, John J. Hutton and editors, Little Brown and Co., et al.,

Boston/Toronto/London [1190] .Boston / Toronto / London [1190].

(a) Trombocytopenie způsobená sníženou produkcí destiček(a) Thrombocytopenia caused by decreased platelet production

Příčiny kongenitální trombocytopenie zahrnují konstitucionální aplastickou anemii (Fanconiho syndrom) a kongenitální amegakaryocytickou trombocytopenii, které mohou být spojeny se skeletálními malformacemi. Získaná onemocnění produkce destiček jsou způsobena buď hypoplasií megakaryocytů nebo neefektivní trombopoesou. Megakaryocytická hypoplasie může být následkem různých stavů, včetně aplasie dřeně (včetně idiopathických forem nebo myelosuprese chemoterapeutickými činidly nebo radiační terapií), myelfibrózy, leukémie a napadení kostní dřeně metastatickým tumorem nebo granulomasou. U některých případů, toxinů, infekčních agens nebo léků mohou relativně selektivně interferovat s trombopoézou; příklady zahrnují přechodné trombocytopenie způsobené alkoholem a některými virálními infekcemi a mírnou trombocytopenii spojenou s podáváním triazidových diuretik. Nakonec, neefektivní trombocytopoéza sekundární k megaloblastickým procesům (deficience folátu nebo B12) může také způsobit trombocytopenii, obvykle s koexistující anémií a leukopenií.Causes of congenital thrombocytopenia include constitutional aplastic anemia (Fanconi syndrome) and congenital amegakaryocytic thrombocytopenia, which may be associated with skeletal malformations. Acquired platelet production diseases are caused by either megakaryocyte hypoplasia or ineffective thrombopoiesis. Megakaryocytic hypoplasia may result from a variety of conditions, including pulp aplasia (including idiopathic forms or myelosuppression by chemotherapeutic agents or radiation therapy), myelfibrosis, leukemia, and metastatic tumor or granulomas to the bone marrow. In some cases, toxins, infectious agents, or drugs may relatively selectively interfere with thrombopoiesis; examples include transient thrombocytopenia caused by alcohol and some viral infections and mild thrombocytopenia associated with the administration of triazide diuretics. Finally, ineffective thrombocytopoiesis secondary to megaloblastic processes (folate deficiency or B12) may also cause thrombocytopenia, usually with coexisting anemia and leukopenia.

Současné léčení trombocytopenii způsobených snížením produkce destiček závisí na rozpoznání a zvrácení základní příčiny nedostatečnosti kostní dřeně. Transfúze destiček jsou obvykle vyhrazeny pro pacienty s vážnými krvácivými komplikacemi, nebo pro pokrytí potřeby během chirurgických zákroků, poněvadž isoimunisace může vést k tomu, že další transfúze destiček nezabírají. Mukózní krvácení, které je následkem silné trombocytopenie může být zlepšeno orálním nebo intravenózním podáváním antifibrinolytických agens. Mohou se ale rozvinout trombotické komplikace, pokud jsou antifibrinolytická agens použita u pacientů s rozšířenou intravaskulární koagulací (DIC).Concomitant treatment of thrombocytopenia caused by decreased platelet production depends on the recognition and reversal of the underlying cause of bone marrow insufficiency. Platelet transfusions are usually reserved for patients with severe bleeding complications or to meet the need during surgery, as isoimmunization may result in further platelet transfusions not being involved. Mucosal bleeding resulting from severe thrombocytopenia can be improved by oral or intravenous administration of antifibrinolytic agents. However, thrombotic complications may develop when antifibrinolytic agents are used in patients with enhanced intravascular coagulation (DIC).

(b) Trombocytopenie způsobená slezinnou sekvestrací(b) Thrombocytopenia caused by spleen sequestration

Splenomegalie způsobená jakoukoliv příčinou může být spojena s mírnou až slabou trombocytopenii. Je to převážně pasivní proces (hypersplenismus) slezinné destičkové sekvestrace, ve srovnání s aktivní destrukcí destiček slezinou případech imunitou zprostředkované trombocytopenie diskutované níže. Ačkoliv nejobvyklejší příčinou hypersplenismu je kongestivní splenomegalie z portální hypertense způsobená alkoholickou cirhózou, další intravaskulární koagulace popsány v Braunwald a formy kongestivní, infiltrativní nebo lymfoproliferativní splenomegalie jsou také spojeny s trombocytopenií. Jako následek samotného hypersplenismu obvykle neklesne počet destiček po 50xl0⁹ na litr.Splenomegaly caused by any cause may be associated with mild to weak thrombocytopenia. It is predominantly a passive process (hypersplenism) of spleen platelet sequestration, as compared to the active destruction of platelets by the spleen cases of immune-mediated thrombocytopenia discussed below. Although the most common cause of hypersplenism is congestive splenomegaly from portal hypertension caused by alcoholic cirrhosis, other intravascular coagulation described in Braunwald and forms of congestive, infiltrative or lymphoproliferative splenomegaly are also associated with thrombocytopenia. As a result of hypersplenism alone, the number of platelets of 50x10 ⁹ per liter usually does not decrease.

(c) Trombocytopenie způsobená neimunitnězpřbstředkovanou destrukcí destiček(c) Thrombocytopenia caused by non-immune mediated platelet destruction

Trombocytopenie může být následkem zrychlené destrukce destiček různými neimunologickými procesy.Thrombocytopenia may be due to accelerated platelet destruction through various non-immunological processes.

Onemocnění tohoto typu zahrnují rozšířenou intravaskulární koagulaci, prostetické intravaskulární prostředky, mimotělní cirkulaci krve, a trombotickou mikroangiopatii jako je trombotická trombocytická purpura. Ve všech těchto případech cirkulující destičky, které jsou vystaveny působení buď umělých povrchů nebo abnormálních vaskulárních ztenčení, v obou případech jsou zničeny na těchto místech nebo jsou poškozeny a poté předčasně odstraněny retikuloendoteliálním systémem. Chorobné stavy nebo onemocnění, u kterých se může objevit rozšířená (DIC), jsou dále detailněji kol., (editoři), Harrison'sDiseases of this type include widespread intravascular coagulation, prosthetic intravascular devices, extracorporeal blood circulation, and thrombotic microangiopathy such as thrombotic thrombocytic purpura. In all these cases, circulating platelets that are exposed to either artificial surfaces or abnormal vascular thinning are both destroyed at these sites or damaged and then prematurely removed by the reticuloendothelial system. Diseases or conditions that may be widespread (DIC) are further discussed in more detail, (eds), Harrison's

Principles of Internal Medicine, 11. vydání, str. 1478, McGraw Hill [1987]. Intravaskulární prostetické prostředky, včetně srdečních chlopní a intra-aortických balónků mohou způsobovat mírnou až slabou destruktivní trombocytopenií, a přechodná trombocytopenie u pacientů prodělávajících kardiopulmonární bypass nebo hemodialýzu může být následkem spotřeby nebo zničení destiček při mimotělním oběhu.Principles of Internal Medicine, 11th Edition, p. 1478, McGraw Hill [1987]. Intravascular prosthetic agents, including heart valves and intra-aortic balloons, may cause mild to weak destructive thrombocytopenia, and transient thrombocytopenia in patients undergoing cardiopulmonary bypass or hemodialysis may be due to consumption or destruction of platelets in extracorporeal circulation.

(d) Léky-indukovaná imunitní trombocytopenie(d) Drug-induced immune thrombocytopenia

Bylo prokázáno, že více než 100 léků má vliv na imunologicky zprostředkovanou trombocytopenií. Avšak pouze quinidin, quinin, zlato, sulfonamidy, cephalothin a heparin byly charakterizovány dobře. Léky-indukovaná trombocytopenie je často velmi silná a obvykle se prudce projeví během dnů, kdy pacient užívá tyto sensitivující léky.Over 100 drugs have been shown to affect immunologically mediated thrombocytopenia. However, only quinidine, quinine, gold, sulfonamides, cephalothin and heparin were well characterized. Drug-induced thrombocytopenia is often very strong and usually manifests sharply during the days when the patient is taking these sensitive drugs.

(e) Imunitní (autoimunitní) trombocytopenická purpura (ITP)(e) Immune (autoimmune) thrombocytopenic purpura (ITP)

ITP u dospělých je chronické onemocnění charakterizované autoimunitní destrukcí destiček. Autoprotilátky jsou obvykle IgG, i když byly publikovány i další imunoglobuliny. I když byla zjištěno spojení autoprotilátky ITP s destičkovou membránovou GPIIbUIaz destičková antigenní specifita nebyla dosud ve většině případů identifikována. Extravaskulární destrukce senzitivovaných destiček probíhá v retikuoendoteliálním systému sleziny a jater. Ačkoliv přes polovinu všech případů ITP je idiopatických, u mnoha pacientů je základem revmatické nebo autoimunitní onemocnění (např. systemic lupus erythematosus) nebo lymfoproliferativní onemocnění (např. chronická lymgocytická leukemie).ITP in adults is a chronic disease characterized by autoimmune platelet destruction. Autoantibodies are usually IgG, although other immunoglobulins have also been reported. Although the association of ITP autoantibody with platelet membrane GPIIbUIaz has been found, platelet antigen specificity has not yet been identified in most cases. Extravascular destruction of sensitized platelets occurs in the reticuloendothelial system of the spleen and liver. Although over half of all ITP cases are idiopathic, in many patients rheumatic or autoimmune disease (eg systemic lupus erythematosus) or lymphoproliferative disease (eg chronic lymphocytic leukemia) is essential.

(f) HlV-indukovaná ITP(f) HIV-induced ITP

ITP je stále častější komplikací infekce HIV (Morris a kol., Ann. Intern. Med., 96: 714-717 [1982] ) , a může se vyskytnou v jakémkoliv stadiu progrese choroby, jak u pacientů s diagnózou Syndromu získané imunodeficience (AIDS), i u komplexu onemocnění příbuzných AIDS i u HIV infekce bez symptomů AIDS. HIV infekce je přenosné onemocnění v konečné fázi charakterizované hlubokou deficiencí buněčné imunitní funkce, stejně jako výskytu oportunních infekcí a malignit. Primární imunologická abnormalita, která je následkem infekce HIV je progresivní deplece a funkční narušení T lymfocytů exprimujících CD4 buněčné povrchové glykoproteiny (Lané a kol., Ann. Rev. Immunol., 3: 477 [1985]). Ztráta CD4 pomahačské/induktorovéITP is an increasingly common complication of HIV infection (Morris et al., Ann. Intern. Med., 96: 714-717 [1982]), and may occur at any stage of disease progression, as in patients diagnosed with Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). ), even in the complex of AIDS-related diseases and in HIV infection without symptoms of AIDS. HIV infection is a terminally communicable disease characterized by a profound deficiency of cellular immune function, as well as the occurrence of opportunistic infections and malignancies. The primary immunological abnormality resulting from HIV infection is progressive depletion and functional disruption of T cells expressing CD4 cell surface glycoproteins (Lané et al., Ann. Rev. Immunol., 3: 477 [1985]). Loss of CD4 helper / inductor

T buněčné funkce je pravděpodobně příčinou těžkých defektů v buněčné a humorální imunitě vedoucí k oportunním infekcím a malignitám charakteristickým pro AIDS (H. Lané výše).T cell function is likely to cause severe defects in cellular and humoral immunity leading to opportunistic infections and malignancies characteristic of AIDS (H. Lané, supra).

Ačkoliv mechanismus ITP spojeného s HIV je neznámý, předpokládá se, že se liší od mechanismu ITP nespojeného s HIV infekcí. (Walsh a kol., N. Eng. J. Med., 311: 636-639 [1984]; a Ratner, Am. J. Med. 86: 194-198 [1989]).Although the mechanism of ITP associated with HIV is unknown, it is believed to be different from that of ITP not associated with HIV infection. (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311: 636-639 [1984]; and Ratner, Am. J. Med. 86: 194-198 [1989]).

IV. Současná terapie trombocytopenieIV. Current therapy of thrombocytopenia

Terapeutický postup při léčení pacientů s trombocytopenií je řízen silou a naléhavostí klinické situace. Léčení je podobné pro trombocytopenií spojenou s HIV a trombocytopenií ne-HIV typu, a ačkoliv se užívá mnoho postupů, terapie zůstává u kterých byla úspěšně zvyšuje různých terapeutických kontroverzní.The therapeutic approach to treating patients with thrombocytopenia is driven by the strength and urgency of the clinical situation. The treatment is similar for HIV-associated thrombocytopenia and non-HIV-type thrombocytopenia, and although many procedures are used, therapy remains that has been successfully increased in various therapeutic controversies.

Počet destiček u pacientů, diagnostikována trombocytopenie, se glukokortikoidovou (např. prednisolon) terapií, ale u mnoha pacientů je odpověď nedokonalá, nebo dojde k opětovnému zhoršení při snížení dávky nebo při přerušení podávání. Na základě těchto studií s pacienty s ITP spojeným s HIV výzkumníci předpokládají, že glukokortikoidová může mít za následek predispozici k AIDS.Platelet counts in patients diagnosed with thrombocytopenia with glucocorticoid (eg, prednisolone) therapy, but in many patients the response is imperfect or worsens when dose is reduced or discontinued. Based on these studies with HIV-associated ITP patients, researchers suggest that glucocorticoid may result in a predisposition to AIDS.

Glukokortikoidy jsou obvykle podávány, pokud počet destiček klesne pod 20xl0⁹/litr nebo pokud se objeví spontánní krvácení.Glucocorticoids are usually administered when the platelet count falls below 20x10 ⁹ / liter or if spontaneous bleeding occurs.

Pacientům, u kterých nezabírají glukokortikoidy, byla k léčení těžkých případů ITP ne-HIV typu s úspěchem použita sloučenina: 4-(2-chlorfenyl)-9-methyl-2-[3-(4-morfolinyl)3-propanon-l-yl]6Hthieno[3,2,f][1,2,4]thiazolo[4,3,a][1,4]diazepin (WEBPatients who do not engage glucocorticoids have been successfully used the compound: 4- (2-chlorophenyl) -9-methyl-2- [3- (4-morpholinyl) 3-propanone-1-] to treat severe non-HIV type ITP cases. yl] 6Hthieno [3,2, f] [1,2,4] thiazolo [4,3, a] [1,4] diazepine (WEB)

2086). Pacient s počtem destiček 37000-58000/μ1 byl léčen někteří terapie2086). A patient with a platelet count of 37000-58000 / μ1 has been treated with some therapies

WEB 2086 a po 1 až 2 týdenním léčení počet destiček vzrostl na 140000-190000/μί. (EP 361,077 a Lohman a kol., Lancet, 1147 [1988], .WEB 2086 and after 1-2 weeks of treatment the platelet count increased to 140000-190000 / μί. (EP 361,077 and Lohman et al., Lancet, 1147 [1988],.

Ačkoliv optimální léčení získané amegakaryocytické trombocytopenické purpury (AATP) je nejasné, bylo zjištěno, že antithymocytový globulin (ATGT), koňské antiserum k lidské thymové tkáni vyvolává prolongovanou kompletní remisi (Trimble a kol., Am. J. Hematol., 37: 126-127 [1991]). Poslední zprávy ovšem naznačují, že hematopoetické efekty ATG je možné přisoudit thimerosalu, kde pravděpodobně protein působí jako nosič rtuti (Panella a kol., Cancer Research, 50: 4429-4435 [1990]).Although the optimal treatment of the obtained amegakaryocytic thrombocytopenic purpura (AATP) is unclear, it has been found that antithymocyte globulin (ATGT), an horse antiserum to human thymic tissue, induces a prolonged complete remission (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37: 126-) 127 [1991]). However, recent reports suggest that the hematopoietic effects of ATG are attributable to thimerosal, where the protein is believed to act as a mercury carrier (Panella et al., Cancer Research, 50: 4429-4435 [1990]).

Byly publikovány dobré výsledky při splenektomii. Splenektomie odstraní hlavní místo destrukce destiček a hlavní zdroj produkce autoprotilátek u mnoha pacientů. Tento postup má u velkého množství pacientů za výsledek prolongované remise, ve kterých není třeba léčení. Ale poněvadž chirurgickému řešení se vyhýbáme u imunitně ohrožených pacientů, je splenektomie doporučována pouze v těžkých případech trombocytopenie (např. těžké s HIV spojená ITP), u pacientů, u kterých je neúčinná dvou až třítýdenní léčba glukokortikoidy, nebo kterých nebylo dosaženo zachování odpovědi po přerušení podávání glukokortikoidů. Na základě současných vědeckých poznatků je nejasné, zda splenektomie predisponuje pacienty k AIDS.Good splenectomy results have been reported. Splenectomy removes the major site of platelet destruction and a major source of autoantibody production in many patients. This procedure results in prolonged remissions in a large number of patients in which no treatment is required. However, since surgery is avoided in immunocompromised patients, splenectomy is recommended only in severe cases of thrombocytopenia (eg severe HIV-associated ITP), in patients who are ineffective for two to three weeks of glucocorticoid therapy, or who have not maintained a response after discontinuation. administration of glucocorticoids. Based on current scientific knowledge, it is unclear whether splenectomy predisposes patients to AIDS.

Kromě prednisolonové terapie a splenektomie, mohou se některá cytotoxická činidla např. vincristin a azidothimidin (AZT, zidovudin) také projevovat slibně v léčení HlV-indukované ITP, ovšem výsledky jsou předběžné.In addition to prednisolone therapy and splenectomy, some cytotoxic agents such as vincristine and azidothimidine (AZT, zidovudine) may also be promising in the treatment of HIV-induced ITP, but the results are preliminary.

Z předcházejícího bude oceněno, že jednou cestou léčení trombocytopenie by bylo získáno agens schopné urychlit diferenciaci a zrání megakaryocytů nebo jejich prekursorů do destičky produkující formy. Značné úsilí bylo vynaloženo na identifikaci takovéhoto činidla, obvykle uváděného jako „trombopoetin (TPO). Další názvy pro TPO, které můžeme nalézt v literatuře, zahrnují: trombocytopoesu stimulující faktor (TSF), megakaryocytový koloniestimulující faktor (MK-CSF), megakaryocyty-stimulujicí faktor a megakaryocytový potenciátor. TPO aktivita byla poprvé pozorována v roce 1959 (Rak a kol., Med. Exp., 1:125) a až do dnešní doby probíhají pokusy charakterizovat a purifikovat toto agens. Zatímco existují zprávy o částečné purifikaci TPO-aktivních polypeptidů (viz, např. Tayrien a kol., J. Biol. Chem., 262: 3262 [1987] a Hoffman a kol., J. Clin. Invest. 75: 1174 [1985]), další zprávy naznačují, že TPO není samostatný subjekt v pravém slova smyslu, ale spíše je to polyfunkční projev známého hormonu IL-3, (Sparrow a kol., Prog. Clin. Biol. Res., 215: 123 [1986]). Bez ohledu na jeho formu nebo původ, molekula vykazující trombopoetickou aktivitu by měla významnou terapeutickou hodnotu. Ačkoliv žádný protein nebyl jednoznačně identifikován jako TPO, značným zájmem byl provázen nedávný objev, že mpl, předpokládaný cytokinový receptor, může transdukovat trombopoetický signál.It will be appreciated from the foregoing that one way of treating thrombocytopenia would be to obtain agents capable of accelerating the differentiation and maturation of megakaryocytes or their precursors into a platelet-producing form. Considerable efforts have been made to identify such an agent, commonly referred to as "thrombopoietin (TPO)". Other names for TPO that can be found in the literature include: thrombocytopoiesis stimulating factor (TSF), megakaryocyte colony stimulating factor (MK-CSF), megakaryocyte-stimulating factor and megakaryocyte potentiator. TPO activity was first observed in 1959 (Rak et al., Med. Exp., 1: 125) and attempts have been made to characterize and purify this agent to date. While there are reports of partial purification of TPO-active polypeptides (see, e.g., Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262: 3262 [1987] and Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75: 1174 [1985] ]), further reports suggest that TPO is not a separate subject in the true sense, but rather a multifunctional manifestation of the known hormone IL-3, (Sparrow et al., Prog. Clin. Biol. Res., 215: 123 [1986] ). Regardless of its form or origin, a molecule exhibiting thrombopoietic activity would have significant therapeutic value. Although no protein has been unequivocally identified as TPO, the recent discovery that mpl, a putative cytokine receptor, can transduce a thrombopoietic signal has been of great interest.

V. je megakaryocytopoetický cytokinový receptorV. is a megakaryocytopoietic cytokine receptor

Věřilo se, že proliferace a zrání hematopoetických buněk jsou citlivě regulovány faktory, které positivně nebo negativně ovlivňují proliferaci pluripotentních kmenových buněk a multikmenovou diferenciaci. Tyto efekty jsou zprostředkovány vysokoafinitní vazbou extracelulárních proteinových faktorů na specifické buněčné povrchové receptory. Tyto buněčné povrchové receptory mají společnou značnou homologii a jsou obecně klasifikovány jako členové cytokinové ' receptorové nadskupiny. Členové nadskupiny zahrnují receptory pro: IL-2 (β a γ řetězce)(Hatakeyama a kol., Science, 244: 551-556 [1989]; Takeshita a kol., Science, 257: 379-382 [1991]), IL-3 (Itoh a kol., Science, 247: 324-328 [1990]; Gorman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87: 5459-5463 [1990]; Kitamura a kol., cell, 66: 11651174 [1991a]; Kitamura a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88: 5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley a kol., Cell, 59: 335348 [1989]), IL-5 (Takaki a kol., EMBO J., 9: 4367-4374 [1990]; Tavernier a kol., Cell, 66: 1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki a kol., Science, 241: 825-828 [1988]; Hibi a kol., Cell, 63: 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin a kol., Cell, 60: 941-951 [1990]), IL-9 (Renault a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5690-5694 [1992]), granulocytovýmakrofágový kolony-stimulující faktor (GM-CSF)(Gearing a kol., EMBO J., 8: 3667-3676 [1991]; Hyashida a kol., Proč. Nati. Adac. Sci. USA, 244: 9655-9659 [1990]), granulocytový kolony-stimulující faktor (G-CSF)(Fukunaga a kol., Cell, 61: 341-350 [1990a]; Fukunaga a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA, 87: 8702-8706 [1990b]; Larsen a kol., J. Exp. Med., 172: 1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea a kol., Cell, 57: 277-285 [1989]; Jones a kol., Blood, 76: 31-35 [1990]), leukémii inhibující faktor (LIF) (Gearing a kol., EMBO J., 10: 2839-2848 [1991]), oncostatin M (OSM) (Rose a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 8641-8645 [1991]) a také receptory pro prolaktin (Boutin a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 7744-7748 [1988]; Edery a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 2112-2116 [1989]), růstový hormon (GH) (Leung a kol., Nátuře, 330: 537-543 [1987]) a ciliární neutrofilní faktor (CNTF) (David a kol., Science, 253: 5963 [1991]).It was believed that the proliferation and maturation of hematopoietic cells are sensitively regulated by factors that positively or negatively affect the proliferation of pluripotent stem cells and multicellular differentiation. These effects are mediated by high affinity binding of extracellular protein factors to specific cell surface receptors. These cell surface receptors have a common substantial homology and are generally classified as members of the cytokine receptor superfamily. Members of the superfamily include receptors for: IL-2 (β and γ chains) (Hatakeyama et al., Science, 244: 551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257: 379-382 [1991]), IL -3 (Itoh et al., Science, 247: 324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5459-5463 [1990]; Kitamura et al., Cell, 66: 11651174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al., Cell, 59: 335348 [1989]) IL-5 (Takaki et al., EMBO J., 9: 4367-4374 [1990]; Tavernier et al., Cell, 66: 1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al., Science , 241: 825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63: 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60: 941-951 [1990]), IL- 9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5690-5694 [1992]), granulocyte macrophage-stimulating factor (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., 8: 3667 Hyashida et al., Proc. Natl. Adac. Sci. USA, 244: 9655-9659 [1990]), granulocyte column-stimulating factor (G-CSF) (Fukuna) ga et al., Cell, 61: 341-350 [1990a]; Fukunaga et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 87: 8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172: 1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea et al., Cell, 57: 277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 76: 31-35 [1990]), leukemia inhibiting factor (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10: 2839-2848 [1991]), oncostatin M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8641 -8645 [1991]) as well as prolactin receptors (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86: 2112-2116 [1989]), growth hormone (GH) (Leung et al., Nature, 330: 537-543 [1987]) and ciliary neutrophil factor (CNTF) (David et al., Science, 253: 5963 [1991]).

Členové citokinové receptorové nadskupiny mohou být rozděleny do třech funkčních kategorií (pro přehled viz Nicola a kol., Cell, 67: 1-4 [1991]). První třída obsahuje jednořetězcové receptory, jako je receptor erythropoetinový (EPO-R) nebo receptor granulocytového kolonového stimulujícího receptoru (G-CSF-R), který váže ligandy s vysokou afinitou přes extracelulární doménu a také generuje intracelulární signál. Druhá třída receptorů, také nazývaná α-podjednotky, zahrnuje receptor interleukinu-6 (IL6-R), receptor granulocytového-makrofágového kolony stimulujícího faktoru (GM-CSF-R), receptor interleukinu-3 (IL3-Ra) a další členové cytokinové receptorové nadskupiny. Tyto α-podjednotky váží ligandy s nízkou afinitou, ale nemohou transdukovat intracelulární signál. Vysokoafinitní receptor schopný signalizace je generován heterodimerem mezi apodjednotkou a členem třetí skupiny cytokinových receptorů, nazývaných β-podjednotky, např. βο běžná β-podjednotka pro tři α-podjednotky IL3-Ra a GM-CSF-R.Members of the citokine receptor superfamily can be divided into three functional categories (for review see Nicola et al., Cell, 67: 1-4 [1991]). The first class comprises single chain receptors such as the erythropoietin (EPO-R) receptor or the granulocyte column stimulating receptor (G-CSF-R) receptor, which binds high affinity ligands through the extracellular domain and also generates an intracellular signal. The second class of receptors, also called α-subunits, includes the interleukin-6 receptor (IL6-R), the granulocyte-macrophage-stimulating factor (GM-CSF-R) receptor, the interleukin-3 receptor (IL3-Ra), and other cytokine receptor members supergroups. These α-subunits bind low affinity ligands but cannot transduce an intracellular signal. A high affinity receptor capable of signaling is generated by a heterodimer between the α-subunit and a member of a third family of cytokine receptors called β-subunits, eg the βο common β-subunit for the three α-subunits of IL3-Ra and GM-CSF-R.

Důkaz, že mpl je členem nadskupiny cytokinových receptorů, vychází ze sekvenční homologie (Gearing, EMBO J., 8: 3667-3676 [1988]; Bazan, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87: 6834-6938 [1990]; David a kol., Acience, 253: 59-63 [1991] a Vigon a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5640-5644 [1992]) a z jeho schopnosti transdukovat proliferativní signály.Evidence that mpl is a member of the cytokine receptor superfamily is based on sequence homology (Gearing, EMBO J., 8: 3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6834-6938 [1990] David et al., Acience, 253: 59-63 [1991] and Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5640-5644 [1992]) and its ability to transduce proliferative signals.

Odvozená proteinová sekvence z molekulárního klonování myší c-mpl ukazuje, že tento protein je homologický k dalším cytokinovým receptorům. Extracelulární domény obsahují 465 aminokyselinových zbytků a skládají se z dvou subdomén, každá se čtyřmi vysoce konzervovanými cysteiny a partikulárními prvky na N-koncové subdoméně a na C-koncové subdoméně. Předpokládá se, že ligandy vázající extracelulární domény mají podobnou dvojitou β-barelovou násobnou strukturální geometrii. Tato duplikovaná extracelulární doména je vysoce homologická k signál transdukujícímu řetězci společnému s IL-3, IL-5 a GM-CSF receptorům, stejně jako nízko-afinitně vázající doméně LIF (Vigon a kol., Oncogene, 8.2607-2615 [1993]). Mpl tedy může patřit k nízko-afinitně vázající třídě cytokinových receptorů.Derived protein sequence from molecular cloning of mouse c-mpl shows that this protein is homologous to other cytokine receptors. The extracellular domains comprise 465 amino acid residues and consist of two subdomains, each with four highly conserved cysteines and particulate elements on the N-terminal subdomain and the C-terminal subdomain. Extracellular domain-binding ligands are believed to have similar double β-barrel multiple structural geometry. This duplicated extracellular domain is highly homologous to the signal transduction chain common to IL-3, IL-5 and GM-CSF receptors, as well as the low affinity-binding domain of LIF (Vigon et al., Oncogene, 8.2607-2615 [1993]). Thus, Mpl may belong to the low-affinity binding class of cytokine receptors.

Srovnání myší mpl a zralé lidské mpl P ukazuje, že tyto dva proteiny vykazují 81% sekvenční identitu. Specifičtěji, N-koncové a C-koncové extracelulární subdomény vykazují 70% a 80% sekvenční identitu, respektive. Nej zachovanější mpl oblast je cytoplasmická doména vykazující 91% aminokyselinovou identitu, s sekvencí 37 zbytků blízko transmembránové doméně identickou pro oba druhy. Na základě toho je publikováno, že mpl je jeden z nejvíce zachovaných členů nadskupiny cytokinových receptorů (Vigon, výše).Comparison of mouse mpl and mature human mpl P shows that the two proteins exhibit 81% sequence identity. More specifically, the N-terminal and C-terminal extracellular subdomains exhibit 70% and 80% sequence identity, respectively. The most conserved mpl region is the cytoplasmic domain having 91% amino acid identity, with a sequence of 37 residues near the transmembrane domain identical for both species. Based on this, mpl is reported to be one of the most conserved members of the cytokine receptor superfamily (Vigon, supra).

Důkazem, že mpl je fuknční receptor, schopný transdukce proliferativního signálu, pochází z konstrukce chimérických receptorů obsahujících extracelulární doménu z cytokinového receptoru mající vysokou afinitu pro známý cytokin s mpl cytoplasmickou doménou. Poněvadž nebyly publikovány žádné známé ligandy pro mpl, bylo nutné konstruovat chimérický vysokoafinitní ligand vázající extracelulární doménu z třídy jedna cytokinových receptorů jako je IL-4R nebo G-CSFR. Vigon a kol., výše, fúzoval extracelulární doménu G-CSFR s transmembránovou a cytoplasmickou doménou c-mpl. IL-3 dependentní buněčná linie, BAF/B03 (Ba/F3) byla transfektována G-CSFR/mpl chimérou spolu s kontrolou G-CSFR plné délky. Buňky transfektované s chimérou rostly stejně dobře v přítomnosti cytokinu IL-3 nebo G-CSF. Podobně buňky transfektované s G-CSFR také rostly dobře v IL-3 nebo G-CSF. V nepřítomnosti růstových faktorů všechny buňky uhynuly. Podobný experiment byl proveden Škodou a kol., EMBO J., 12(7): 2645-2653 [19'93], ve kterém byly i extracelulární i transmembránové domény lidského IL-4 receptoru (hIL-4-R) fúzovány do myší mpl cytoplasmické domény, a transfektovány do myší IL-3 dependentní Ba/F3 buněčné linie. Ba/F3 buňky transfektované s divokým typem hIL-4-R proliferovaly normálně v přítomnosti bud’ druhově specifického IL-4 nebo IL-3. Ba/F3 buňky transfektované s hIL-4R/mpl proliferovaly normálně v přítomnosti hIL-4 (v přítomnosti nebo nepřítomnosti IL-3), což ukazuje, že v Ba/F3 buňkách mpl cytoplasmické domény obsahují všechny prvky nutné k indukci proliferativního signálu.Evidence that mpl is a functional receptor capable of transducing a proliferative signal comes from the construction of chimeric receptors containing the extracellular domain of a cytokine receptor having a high affinity for the known cytokine with the mpl cytoplasmic domain. Since no known ligands for mpl were published, it was necessary to construct a chimeric high affinity ligand binding the extracellular domain of a class one cytokine receptor such as IL-4R or G-CSFR. Vigon et al., Supra, fused the extracellular domain of G-CSFR to the transmembrane and cytoplasmic domains of c-mpl. The IL-3 dependent cell line, BAF / B03 (Ba / F3) was transfected with the G-CSFR / mpl chimera along with a full-length G-CSFR control. Cells transfected with the chimera grew equally well in the presence of the cytokine IL-3 or G-CSF. Similarly, cells transfected with G-CSFR also grew well in IL-3 or G-CSF. In the absence of growth factors, all cells died. A similar experiment was performed by Skoda et al., EMBO J., 12 (7): 2645-2653 [19'93], in which both the extracellular and transmembrane domains of human IL-4 receptor (hIL-4-R) were fused to mice mpl cytoplasmic domains, and transfected into murine IL-3 dependent Ba / F3 cell lines. Ba / F3 cells transfected with wild-type hIL-4-R proliferated normally in the presence of either species-specific IL-4 or IL-3. Ba / F3 cells transfected with hIL-4R / mpl proliferated normally in the presence of hIL-4 (in the presence or absence of IL-3), indicating that in Ba / F3 cells the mpl cytoplasmic domains contain all the elements necessary to induce a proliferative signal.

Tyto chimérické experimenty ukazují schopnost proliferativní signalizace mpl cytoplasmické domény ale latentně sledují, jestli mpl extracelulární doména může vázat ligand. Tyto výsledky jsou v souladu s posledními dvěma možnostmi, konkrétně mpl je jednořetězcový (třída jedna) receptor jako je EPO-R nebo G-CSFR nebo je to signál transdukující β-podjednotka (třída tři) vyžadující apodjednotku jako je IL-3 (Skoda a kol., výše).These chimeric experiments show the ability of proliferative signaling of the mpl cytoplasmic domain but latently monitor whether the mpl extracellular domain can bind a ligand. These results are consistent with the latter two options, namely mpl is a single chain (class one) receptor such as EPO-R or G-CSFR, or is a signal transducing β-subunit (class three) requiring a subunit such as IL-3 (Skoda and col., supra).

VI. Mpl ligand je trombopoetin (TPO)VI. Mpl ligand is thrombopoietin (TPO)

Jak je popsáno níže, předpokládalo se, že sérum obsahuje jedinečný faktor, někdy zmiňovaný jako trombopoetin (TPO), který působí synergicky s různými dalšími cytokiny při podpoře růstu a zrání megakaryocytů. Dosud nebyly nikdy izolovány žádné takovéto přírodní faktory ze séra ani ze žádného jiného zdroje i když bylo provedeno velké množství pokusů mnoha skupinami. I když není známo, zda mpl je schopný přímé vazby megakaryocytového stimulujícího faktoru, nedávné pokusy ukázaly, že mpl je zapojen do proliferativní signální transdukce z faktoru nebo faktorů nalezených v séru pacientů s aplastickou kostní dření (Methia a kol., blood, 82(5): 1395: 1395-1401 [1993]).As described below, serum was believed to contain a unique factor, sometimes referred to as thrombopoietin (TPO), that acts synergistically with various other cytokines to promote megakaryocyte growth and maturation. So far, no such natural factors have been isolated from serum or any other source, although many trials have been carried out by many groups. Although it is not known whether mpl is capable of directly binding megakaryocyte stimulating factor, recent experiments have shown that mpl is involved in proliferative signal transduction from factor or factors found in the serum of patients with aplastic bone marrow (Methia et al., Blood, 82 (5). ): 1395: 1395-1401.

Důkaz, že se jedinečný sérový kolony-formující faktor lišící se od IL-Ια, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, GCSF a GM-CSF transdukuje proliferativní signál přes mpl pochází z testování distribuce c-mpl exprese v primitivních a zaměřených hematopoetických buněčných linií a z mpl komplementárních studií v jedné z těchto buněčných linií.Evidence that a unique serum column-forming factor other than IL-Ι, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, GCSF, and GM-CSF transduces a proliferative signal through mpl comes from testing distribution of c-mpl expression in primitive and targeted hematopoietic cell lines and from mpl complementary studies in one of these cell lines.

Užití reversní transkriptasy (RT)-PCR v imunopurifikovaných lidských hemetopoetických buňkách, Methia a kol., výše ukázalo, že silné mpl mRNA odezvy byly nalezeny pouze v CD34⁺ purifikovaných buňkách, megakaryocytech a destičkách. CD34⁺ buňky purifikované z kostní dřeně (BM) představují 1% procento všech BM buněk a jsou rozšířené v primitivních a specializovaných progenitorech všech kmenů (např. erythroidy, granulomakrofágy a megakaryocyty).The use of reverse transcriptase (RT) -PCR in immunopurified human hemetopoietic cells, Methia et al., Above, showed that strong mpl mRNA responses were found only in CD34 ⁺ purified cells, megakaryocytes and platelets. Bone marrow (BM) purified CD34 ⁺ cells represent 1% of all BM cells and are widespread in primitive and specialized progenitors of all strains (eg erythroids, granulomacrophages and megakaryocytes).

Ukázalo se, že mpl stejnosměrné oligodeoxynukleotidy suprimují megakariotické formace kolon z pluripotentních CD34⁺ buněk kultivovaných v séru z pacientů s aplastickou dření (bohatý zdroj megakaryocytické kolony-stimulující aktivity [MK-CSA]). Tyto stejné komplementární oligodeoxynukleotidy nemají žádný efekt na formaci kolon erythroidů nebo granulomakrofágů.Mpl DC oligodeoxynucleotides have been shown to suppress megakariotic column formation from pluripotent CD34 ⁺ cells cultured in serum from patients with aplastic pulp (a rich source of megakaryocytic column-stimulating activities [MK-CSA]). These same complementary oligodeoxynucleotides have no effect on the formation of erythroid or granulomacrophage columns.

Jestli mpl přímo váže ligand a jestli sérový faktor způsobuje megakaryocytopoesu řízenou přes mpl není dosud známo. Předpokládá se, že pokud mpl přímo váže ligand, jeho aminokyselinová sekvence je pravděpodobně vysoce zachovaná a má kmeny mající křížovou reaktivitu vzhledem ke značně velké sekvenční identitě mezi lidskými a myšími mpl extracelulárními doménami (Vigon a kol., výše [1993]).Whether mpl directly binds the ligand and whether serum factor causes mpl-controlled megakaryocytopoiesis is not yet known. It is believed that when mpl directly binds a ligand, its amino acid sequence is likely to be highly conserved and has strains having cross-reactivity due to the fairly large sequence identity between human and murine mpl extracellular domains (Vigon et al., Supra [1993]).

VII. CíleVII. Objectives

- Vzhledem k předcházejícímu je třeba uznat, že existuje v této oblasti nynější i budoucí potřeba isolovat a identifikovat molekuly schopné stimulování proliferace, diferenciace a zrání hematopoetických buněk, zvláště megakaryocytů nebo jejich předchůdců pro terapeutické účely pri léčení trombocytopenie. Věří se, že takováto molekula je mpl ligand a tedy existuje dále potřeba izolovat takového ligandy (ligand), aby mohla být zhodnocena jeho (jejich) role v buněčném růstu a diferenciaci.In view of the foregoing, it should be recognized that there is a current and future need in this field to isolate and identify molecules capable of stimulating the proliferation, differentiation and maturation of hematopoietic cells, particularly megakaryocytes or their precursors for therapeutic purposes in the treatment of thrombocytopenia. Such a molecule is believed to be an mpl ligand, and hence there is a further need to isolate such a ligand in order to assess its (their) role in cell growth and differentiation.

Cílem tohoto vynálezu je získat farmaceuticky čistou molekulu schopnou stimulovat proliferaci, diferenciaci a/nebo zrání megakaryocytů na zralou destičky produkující formu.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutically pure molecule capable of stimulating the proliferation, differentiation and / or maturation of megakaryocytes to mature platelet-producing forms.

Dalším cílem je získání molekuly ve formě pro terapeutické použití k léčení hematopoetických onemocnění, zvláště trombocytopenie.Another object is to obtain a molecule in a form for therapeutic use in the treatment of hematopoietic diseases, in particular thrombocytopenia.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je izolovat, purifikovat a specificky identifikovat proteinové ligandy schopné vazby in vivo a cytokinové nadskupiny receptorů známých jako mpl a trandsdukujících proliferativní signál.It is another object of the present invention to isolate, purify and specifically identify protein ligands capable of binding in vivo and cytokine superfamily of receptors known as mpl and trandsuding proliferative signal.

Dalším cílem je získat molekuly nukleových kyselin kédujících takovéto proteinové ligandy a použití těchto molekul nukleových kyselin k produkci mpl vázajících ligandu v kultuře rekombinantních buněk pro diagnostiké a terapeutické použití.A further object is to provide nucleic acid molecules coding for such protein ligands and the use of these nucleic acid molecules to produce mpl ligand binding in recombinant cell culture for diagnostic and therapeutic use.

Dalším cílem je získat deriváty a modifikované formy proteinových ligandů zahrnujících varianty aminokselinových sekvencí, varianty glykoproteinových forem a jejich kovalentní deriváty.Another object is to obtain derivatives and modified forms of protein ligands comprising amino acid sequence variants, glycoprotein form variants, and covalent derivatives thereof.

Dalším cílem je získání fúzních polypeptidových forem kombinujících mpl ligandy a heterologní protein a jejich kovalentní deriváty.Another object is to provide fusion polypeptide forms combining mpl ligands and heterologous protein and covalent derivatives thereof.

- Dalším cílem je získání variant polypeptidových forem kombinujících mpl ligand s aminokyselinovými doplňky a substitucemi z EPO sekvence, aby produkoval protein schopný regulování proliferace a růstu destiček i progenitorů červených krevních buněk.Another object is to obtain variants of polypeptide forms combining the mpl ligand with amino acid additions and substitutions from the EPO sequence to produce a protein capable of regulating the proliferation and growth of both platelets and red blood cell progenitors.

Dalším cílem je připravit imunogeny pro přípravu protilátek proti mpl ligandům nebo jejich fúzním formám, stejně jako získat protilátky schopné vázat takovéto ligandy.Another object is to prepare immunogens for preparing antibodies against mpl ligands or fusion forms thereof, as well as to obtain antibodies capable of binding such ligands.

Tyto a další cíle předkládaného vynálezu budou, s ohledem na celkovou specifikaci, zřejmé pro osoby vzdělané v dané problematice.These and other objects of the present invention will be apparent to those skilled in the art with respect to the overall specification.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Cíle vynálezu jsou dosaženy zajištěním isolované savčí megakaryocytopoetické proliferace a proteinu zahajujícího zrání, pojmenovaného „mpl ligand (ML) nebo „trombopoetin (TPO), schopného stimulování proliferace, zrání a/nebo diferenciace megakaryocytů na zralou destičky produkující formu.The objectives of the invention are achieved by providing isolated mammalian megakaryocytopoietic proliferation and a maturation initiating protein, named "mpl ligand (ML) or" thrombopoietin (TPO), capable of stimulating the proliferation, maturation and / or differentiation of megakaryocytes into mature platelet-producing forms.

Substanciálně homogenní protein může být purífikován z přírodního zdroje metodou obsahující: (1) kontaktování zdrojové plasmy obsahující mpl ligandové molekuly, které mají být purifikovány, s imobilizovaným receptorovým polypeptidem, konkrétně mpl nebo mpl fúzním polypeptidem imobilizovaným na nosiči, za podmínek při kterých mpl ligandové molekuly, které mají být purifikovány, jsou selektivně polypeptid, polypeptidu materiálu, a jeho nosiče a (3) eluce adsorbovány na imobilizovaný receptorový (2) promytí imobilizovaného receptorového k odstranění neadsorbovaného mpl ligandových molekul z imobilizovaného receptorového polypeptidu, na kterém jsou adsorbovány, elučním pufrem. Výhodněji je přírodním zdrojem savčí plasma nebo moč obsahující mpl ligand. Nepovinně je savec aplastický a imobilizovaný receptor je mpl-IqG fúze.The substantially homogeneous protein may be purified from a natural source by a method comprising: (1) contacting the source plasma containing the mpl ligand molecules to be purified with the immobilized receptor polypeptide, in particular the mpl or mpl fusion polypeptide immobilized on a carrier, under conditions in which the mpl ligand molecules (3) eluting adsorbed on the immobilized receptor (2) washing the immobilized receptor to remove unadsorbed mpl ligand molecules from the immobilized receptor polypeptide on which they are adsorbed with elution buffer. More preferably, the natural source is mammalian plasma or urine containing the mpl ligand. Optionally, the mammal is aplastic and the immobilized receptor is an mpl-IqG fusion.

Nepovinně, preferovaný megakaryocytopoetickou proliferaci a zrání zahajující protein je izolovaný substanciálně homogenní mpl ligandový polypeptid připravený syntetickými nebo rekombinantními postopy.Optionally, the preferred megakaryocytopoietic proliferation and maturation initiating protein is an isolated, substantially homogeneous mpl ligand polypeptide prepared by synthetic or recombinant post-processing.

„Mpl ligandový polypeptid nebo „TOP v tomto vynálezu má výhodněji nejméně 70% celkové sekvenční identity s aminokyselinovou sekvencí vysoce purifikovaného substanciálně homogenního vepřového mpl ligandového polypeptidu a nejméně 80% sekvenční identity s „EPOdoménou vepřového mpl ligandového polypeptidu. Nepovinně, mpl ligand z tohoto vynálezu je zralý lidský mpl ligand (hML), který má zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1), nebo jeho posttranskripčně modifikovaná forma nebo protein, který má 80% sekvenční identity se zralým lidským mpl ligandem. Nepovinně je varianta mpl ligandu fragment, zvláště amino-koncový nebo „EPO-doménový fragment, zralého lidského mpl ligandu (hML). Výhodněji si amino-koncový fragment ponechává substanciálně všechny lidské ML sekvence mezi prvním a čtvrtým cysteinovým zbytkem, ale může obsahovat substanciální doplňky, delece nebo substituce mimo tuto oblast. Podle tohoto provedení polypeptidu vyjádřen vzorcem:The "Mpl ligand polypeptide" or "TOP" in this invention more preferably has at least 70% total sequence identity to the amino acid sequence of a highly purified substantially homogeneous porcine mpl ligand polypeptide and at least 80% sequence identity to the "EPOdomain of porcine mpl ligand polypeptide." Optionally, the mpl ligand of the invention is a mature human mpl ligand (hML) having the mature amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), or a post-transcriptionally modified form or protein thereof having 80% sequence identity to the mature human mpl ligand. Optionally, the variant mpl ligand is a fragment, particularly an amino-terminal or "EPO-domain fragment," of a mature human mpl ligand (hML). More preferably, the amino-terminal fragment retains substantially all of the human ML sequences between the first and fourth cysteine residues, but may contain substantial additions, deletions, or substitutions outside this region. According to this embodiment, the polypeptide is represented by the formula:

může být fragmentmay be a fragment

X-hML(7-151)-YX-hML (7-151) -Y

Kde hML(7-151) představuje lidskou TPO (hML) aminokyselinovou sekvenci od Cys⁷ po Cys¹⁵¹ včetně, X představuje aminoskupinu Cys⁷ nebo jeden nebo vice amino-koncových aminokyselinových zbytků zralého hML nebo aminokyselinové zbytky jeho prodlouženi jako je Met, Tyr nebo leaderové sekvence, obsahující např. proteolytická štěpící místa (např. faktor Xa nebo trombin); a Y představuje karboxy-koncovou skupinu Cys¹⁵¹ nebo jeden nebo více karboxy-koncových aminokyselinových zbytků zralého hML nebo aminokyselinové zbytky jeho prodloužení.Where hML (7-151) represents the human TPO (hML) amino acid sequence from Cys ⁷ to Cys ¹⁵¹ inclusive, X represents the amino group of Cys ⁷ or one or more amino-terminal amino acid residues of mature hML or its extension amino acids such as Met, Tyr or leader sequences comprising, eg, proteolytic cleavage sites (eg, factor Xa or thrombin); and Y represents a carboxy-terminal group of Cys ¹⁵¹ or one or more carboxy-terminal amino acid residues of mature hML or amino acid residues thereof.

Nepovinně mpl ligandové polypeptidy nebo jejich fragmenty mohou být fúzovány do heterologního polypeptidu (chiméry). Preferovaný heterologní polypeptid je cytokin, kolony stimulující faktor nebo inteleukin nebo jejich fragment, zvláště kit-ligand (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF nebo LIF. Nepovinný preferovaný heterologní polypeptid je imunoglobinový řetězec, zvláště lidský IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM nebo jejich fragment, zejména obsahující konstantní doménu IgG těžkého řetězce.Optionally, mpl ligand polypeptides or fragments thereof may be fused to a heterologous polypeptide (chimera). A preferred heterologous polypeptide is a cytokine, a column stimulating factor or inteleukin or a fragment thereof, particularly kit-ligand (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF or LIF. An optional preferred heterologous polypeptide is an immunoglobulin chain, particularly human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM, or a fragment thereof, particularly comprising an IgG heavy chain constant domain.

Další provedení tohoto vynálezu poskytuje prostředek obsahující izolovaného mpl agonistu, který je biologicky aktivní a je výhodněji schopen stimulace inkorporace značených nukleotidů (např. ³H-thymidinu) do DNA IL-3 depedentních Ba/F3 buněk transfektovaných lidským mpl. Nepovinně mpl agonista je biologicky aktivní mpl ligand a je nepovinně schopný stimulování inkorporace ³⁵S do cirkulujících destiček v myším destičkovém revazebném stanovení. Vhodný mpl agonista zahrnuje hMLi53, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML a pML2 nebo jejich fragmenty.Another embodiment of the invention provides a composition comprising an isolated mpl agonist that is biologically active and is more preferably capable of stimulating the incorporation of labeled nucleotides (eg, ³ H-thymidine) into IL-3 DNA of depedent Ba / F3 cells transfected with human mpl. The optional mpl agonist is a biologically active mpl ligand and is optionally capable of stimulating ³⁵ S incorporation into circulating platelets in a mouse platelet binding assay. Suitable mpl agonists include hML153, hML (R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML and pML2, or fragments thereof.

V dalším provedení tento vynález poskytuje izolované protilátky schopné vazby na mpl ligand. Izolovaná protilátka schopná vazby na mpl ligand může být nepovinně fúzována do druhého polypeptidu a protilátka nebo její fúze může být použita k izolace a purifikaci ligandu ze zdroje, jak je popsáno výše pro imobilizovaný mpl. V dalším provedení tohoto provedení vynález poskytuje metodu detekce mpl- ligandu in' vitro nebo in vivo obsahující kontakt protilátky se vzorkem, zvláště sérového vzorku, u kterého předpokládáme obsah ligandu, a detekci, zda se objeví vazba.In another embodiment, the invention provides isolated antibodies capable of binding to an mpl ligand. An isolated antibody capable of binding to an mpl ligand may be optionally fused to a second polypeptide, and the antibody or fusion thereof may be used to isolate and purify the ligand from a source as described above for immobilized mpl. In another embodiment of this embodiment, the invention provides a method for detecting mpl-ligand in vitro or in vivo comprising contacting the antibody with a sample, particularly a serum sample suspected of containing ligand, and detecting whether binding occurs.

V dalším provedení vynález poskytuje izolovanou molekulu mukleové kyseliny, kódující mpl ligand nebo jeho fragmenty, kde molekula nukleové kyseliny může být nepovinně značena detekovatelnou skupinou, molekula nukleové kyseliny mající sekvenci, která je komplementární k, nebo hybridizované za mírných až vysoce náročných podmínek s, molekulou nukleové kyseliny mající sekvenci kódující mpl ligand. Preferované molekuly mukleové kyseliny jsou ty, které kódují lidský, vepřový a myší mpl ligand,a včetně genomické RNA a DNA, a cDNA. V dalším provedení tohoto provedení molekula nukleové kyseliny je DNA kódující mpl ligand a dále poskytuje replikovatelný vektor, v kterém je DNA operabilně navázána na kontrolní sekvence rozpoznané hostitelem transformovaného s vektorem. Nepovinně DNA je cDNA mající sekvenci uvedenou na Obr.l 5'-3' (SEQ ID N0:2), 3'-5' nebo jejich fragment. Toto provedení dále zahrnuje hostitelské buňky, výhodněji CHO buňky, transformované s vektorem a metodu použití DNA k ovlivnění produkce mpl ligandu, výhodněji zahrnujícího expresi cDNA kódující mpl ligand v kultuře transformovaných hostitelných buněk a získání mpl ligandu z hostitelných buněk nebo hostitelské buněčné kultury. Mpl ligand připravený tímto způsobem je výhodněji liský mpl ligand.In another embodiment, the invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding an mpl ligand or fragments thereof, wherein the nucleic acid molecule may be optionally labeled with a detectable moiety, a nucleic acid molecule having a sequence that is complementary to, or hybridized under mild to highly demanding, conditions. nucleic acids having the sequence encoding the mpl ligand. Preferred nucleic acid molecules are those encoding human, porcine and murine mpl ligand, and including genomic RNA and DNA, and cDNA. In another embodiment of this embodiment, the nucleic acid molecule is DNA encoding the mpl ligand and further provides a replicable vector in which the DNA is operably linked to control sequences recognized by the host transformed with the vector. Optionally, the DNA is a cDNA having the sequence shown in Fig. 1 5'-3 '(SEQ ID NO: 2), 3'-5', or a fragment thereof. This embodiment further comprises host cells, more preferably CHO cells transformed with the vector, and a method of using DNA to effect production of mpl ligand, more preferably comprising expressing cDNA encoding the mpl ligand in a transformed host cell culture and recovering the mpl ligand from the host cells or host cell culture. The Mpl ligand prepared by this method is more preferably a human mpl ligand.

Vynález dále zahrnuje metody léčení savců s hematopoetickými onemocněními, zvláště trombocytopenií, zahrnující podávání terapeuticky účinného množství mpl ligandu savci. Nepovinně mpl ligand je podáván v kombinaci s cytokinem, zvláště kolony stimulujícím faktorem nebo interleukinem. Prefrované kolony stimulující faktory nebo interleukiny zahrnují; kit-ligand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 a IL-11.The invention further encompasses methods of treating mammals with haematopoietic diseases, particularly thrombocytopenia, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of an mpl ligand. Optionally, the mpl ligand is administered in combination with a cytokine, particularly a column stimulating factor or interleukin. Preferred columns stimulating factors or interleukins include; kit-ligand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6, and IL-11.

Vynález dále zahrnuje postup izolace a purifikace TPO (ML) z TPO produkujícím mikroogranismů zahrnující:The invention further includes a process for isolating and purifying TPO (ML) from TPO producing microorganisms comprising:

(1) rozrušení nebo lýzi buněk obsahujících TPO, (2) nepovinně separaci rozpustného materiálu z nerozpustného materiálu obsahujícího TPO, (3) solubilizaci TPO v nerozpustném materiálu se solubilizačním pufrem, (4) separaci solubilizovaného TPO z dalších rozpustních a nerozpoustných materiálů, (5) znovurozmícháni TPO v redoxním pufru (6) separace dobře rozmíchaných TPO z nerozmíchaných(1) disruption or lysis of TPO-containing cells, (2) optionally separating soluble material from insoluble material containing TPO, (3) solubilizing TPO in insoluble material with solubilizing buffer, (4) separating solubilized TPO from other soluble and insoluble materials, (5) ) re-mixing TPO in redox buffer (6) separating well-mixed TPO from unmixed

TPO.TPO.

Postup zahrnuje pro solubilizaci nerozpustných materiálů obsahujících TPO chaotropické agens, kdy chaotropické agens je vybráno ze skupiny: sůl guanidinu, thiokyanát sodný nebo urea. Postup dále zahrnuje, že solibilizovaný TPO je separován od dalších rozustných a nerozpustných materiálů jedním nebo více kroky vybranými ze skupiny: centrifugace, gelová filtrace a chromatografie na reversní fázi. Krok znovurozmíchání v procesu zahrnuje redoxní pufr obsahující jak oxidační tak redukční agens. Obecně oxidační agens je kyslík nebo sloučenina obsahující nejméně jednu disulfidovou vazbu a redukční činidlo je sloučenina obsahující nejméně jeden volný sulfhydril.The process includes, for solubilizing insoluble materials containing TPO, a chaotropic agent wherein the chaotropic agent is selected from the group: guanidine salt, sodium thiocyanate or urea. The method further comprises separating the TPO from other soluble and insoluble materials by one or more steps selected from the group: centrifugation, gel filtration, and reverse phase chromatography. The re-mixing step in the process comprises a redox buffer containing both an oxidizing and a reducing agent. Generally, the oxidizing agent is oxygen or a compound containing at least one disulfide bond and the reducing agent is a compound containing at least one free sulfhydril.

Výhodně, oxidační agens je vybráno z oxidovaného glutahionu(GSSG) a cystinu a redukční agens je vybráno z redukovaného glutathionu(GSH) a cysteinu. Výhodněji je oxidační činidlo oxidovaný glutathion(GSSG) a redukční agens je redukovaný glutathion(GSH). Také je preferován, že molární poměr oxidačního agens je stejný nebo větší než redukčního agens. Redoxní pufr dále obsahuje detergent, výhodně vybrán z CHAPS a CHAPSO, přítomný v koncentraci nejméně 1%. Redoxní pufer dále obsahuje NaCl výhodně v koncentračním rozmezí od 0,1 do 0,5M, a glycerol výhodně v koncentraci větší než 15%. pH redoxního pufru je výhodně v rozmezí od 7,5 do 9,0, a rozmíchávací krok je prováděn ve 4 stupních 12 až 48 hodin. Výsledkem rozmíchávací kroku je biologicky aktivní TPO, kde jsou vzniklé disulfidové vazby mezi Cys nejbližším amino-konci s Cys nejblíž karboxy-konci EPO domény.Preferably, the oxidizing agent is selected from oxidized glutahione (GSSG) and cystine and the reducing agent is selected from reduced glutathione (GSH) and cysteine. More preferably, the oxidizing agent is oxidized glutathione (GSSG) and the reducing agent is reduced glutathione (GSH). It is also preferred that the molar ratio of the oxidizing agent is equal to or greater than the reducing agent. The redox buffer further comprises a detergent, preferably selected from CHAPS and CHAPSO, present at a concentration of at least 1%. The redox buffer further comprises NaCl preferably in a concentration range of 0.1 to 0.5M, and glycerol preferably at a concentration greater than 15%. The pH of the redox buffer is preferably in the range of 7.5 to 9.0, and the mixing step is performed in 4 stages for 12 to 48 hours. The resultant mixing step results in biologically active TPO where the disulfide bonds formed between the Cys nearest the amino terminus with the Cys nearest the carboxy terminus of the EPO domain.

Vynález dále zahrnuje způsob purifikace biologicky aktivního TPO z mikroorganismu zahrnující:The invention further includes a method of purifying biologically active TPO from a microorganism comprising:

(1) lýze alespoň extracelulární membrány mikroorganismu, (2) působení na lysat, obsahující TPO, chaotropickým agens (3) znovurozmícháni TPO, a (4) separace nečistot a nerozmíchaného TPO z dobře rozmíchaného TPO.(1) lysing at least the extracellular membrane of the microorganism, (2) treating the lysate containing TPO, the chaotropic agent (3) re-mixing the TPO, and (4) separating the impurities and unmixed TPO from the well-mixed TPO.

Stručný popis obrázkůBrief description of the pictures

Obr. 1 ukazuje vyvozené aminokyselinové sekvence (SEQ IDGiant. 1 shows the deduced amino acid sequences (SEQ ID

NO:1) lidského mpl ligandu (hML) cDNA a kódující nukleotidové sekvence (SEQ ID NO:2). Nukleotidy jsou číslovány na začátku každé řádky. 5' a 3' netranslatované oblasti jsou označeny menšími psacími písmeny. Aminokyselinové zbytky jsou číslovány nad sekvencí začínající na Ser 1 zralé mpl ligandové (ML) proteinové sekvence. Hranice předpokládaného exonu 3 označeného šipkami a potenciální N-glykosylovaná místa jsou ve čtverci. Cysteinové zbytky jsou označeny tečkou nad sekvencí. Podtržené sekvence odpovídají N-koncové sekvenci stanovené z mpl ligandu purifikovaného z vepřové plasmy.NO: 1) human mpl ligand (hML) cDNA and coding nucleotide sequences (SEQ ID NO: 2). Nucleotides are numbered at the beginning of each row. 5 'and 3' untranslated regions are indicated by smaller letters. The amino acid residues are numbered above the sequence beginning with the Ser 1 mature mpl ligand (ML) protein sequence. The boundaries of the putative exon 3 indicated by the arrows and the potential N-glycosylated sites are square. Cysteine residues are indicated by a dot above the sequence. The underlined sequences correspond to the N-terminal sequence determined from the mpl ligand purified from porcine plasma.

Obr. 2 ukazuje postup použitý pro mpl ligandové ³Hthymidinové inkorporační stanovení. Stanovení přítomnosti mpl ligandu z různých zrojů, mpl P Ba/F3 buňky vyhladovělé IL-3 po 24 hodin v zvlhčeném inkubátoru při 37°C v 5% CO2 a vzduchu. Následně IL-3 vyhladovělé buňky byly naneseny na 96-jamkové kultivační misky s nebo bez rozpuštěných vzorků a kultivovány 24 hodin v inkubátoru buněčných kultur. 20 μΐ séra média bez RPMI obsahujícího 1 μθί ³H-thymidinu bylo přidáno do každé misky posledních 6 až 8 hodin. Buňky byly poté odebrány na 96 filtračních papírů a promyty vodou. Filtráty byly poté odečteny.Giant. 2 shows the procedure used for the mpl ligand ³ Hthymidine incorporation assay. Determination of the presence of mpl ligand from various sources, mpl P Ba / F3 starved IL-3 cells for 24 hours in a humidified incubator at 37 ° C in 5% CO 2 and air. Subsequently, IL-3 starved cells were plated in 96-well culture dishes with or without dissolved samples and cultured for 24 hours in a cell culture incubator. 20 μΐ serum of RPMI free medium containing 1 μθβ of ³ H-thymidine was added to each dish for the last 6 to 8 hours. The cells were then collected on 96 filter papers and washed with water. The filtrates were then subtracted.

Obr. 3 ukazuje vliv pronasy, DTT a tepla na schopnost APP stimulovat Bs/F3-mpI buněčnou proliferaci. Pro pronasové digesci APP, pronasa (Boehringer Mannheim) nebo hovězí sérový albumin byly navázány na Affi-gellO (Biorad) a inkubovány individuálně s APP 18 hodin při 37°C. Následně byla pryskyřice odstraněna centrifugací a supernatanty byly stanoveny. APP byl také zahřát na 80°C po dobu 4 minut nebo přidáno ΙΟΟμΜ DTT a poté dialýza proti PBS.Giant. 3 shows the effect of pronase, DTT and heat on the ability of APP to stimulate Bs / F3-mpI cell proliferation. For pronase digestion of APP, pronase (Boehringer Mannheim) or bovine serum albumin were coupled to AffigellO (Biorad) and incubated individually with APP for 18 hours at 37 ° C. Subsequently, the resin was removed by centrifugation and the supernatants were determined. APP was also heated to 80 ° C for 4 minutes or ΙΟΟμΜ DTT was added followed by dialysis against PBS.

Obr. 4 ukazuje eluci mpl ligandové aktivity z kolony Phenyl-Toyopearl, kolony Blue-Sepharose a Ultralink-mpl kolony. Frakce 4-8 z mpl afinitní kolony měly maximum aktivity frakcí eluovaných z kolony.Giant. 4 shows the elution of mpl ligand activity from a Phenyl-Toyopearl column, a Blue-Sepharose column, and an Ultralink-mpl column. Fractions 4-8 from the mpl affinity column had maximum activity of the fractions eluted from the column.

Obr. 5 ukazuje SDS-PAGE eluovaných Ultralink-nzpl frakcí. Ke 200 μΐ každé z frakcí 2 až 8 byl přidán při -20°C 1 ml acetonu obsahujícího lmM HCl. Po třech hodinách při -20°C byly vzorky centrifugovány a výsledké pelety byly promyty 2x acetonem při -20°C. Acetonové pelety byly následně rozpuštěny v 30 μΐ SDS-solubilizačního pufru, přidáno 100μΜ DTT a zahřátý na 90°C po 5 min. Vzorky byly poté rozpuštěny v 4 až 20% SDS-polyakrylamidovém gelu a proteiny byly visualizovány barvením stříbrem.Giant. 5 shows SDS-PAGE of the eluted Ultralink-npl1 fractions. To 200 μΐ of each of fractions 2 to 8, 1 ml of acetone containing 1 mM HCl was added at -20 ° C. After three hours at -20 ° C, the samples were centrifuged and the resulting pellets were washed twice with acetone at -20 ° C. Acetone pellets were then dissolved in 30 μΐ SDS-solubilization buffer, added 100μΜ DTT and heated to 90 ° C for 5 min. The samples were then dissolved in a 4 to 20% SDS-polyacrylamide gel and the proteins were visualized by silver staining.

Obr. 6 ukazuje eluci mpl ligandové aktivity z SDS-PAGE. Frakce 6 z mpl-afinitní kolony byla rozpuštěna v 4 až 20% SDS-polyakrylamidovém gelu za neredukujících podmínek. Následně byla elektroforéza gelu rozdělena na 12 stejných částí a elektroeluována, jak je popsáno v příkladech. Elektroeluované vzorky byly dialyzovány do PBS a stanoveny při 1/20 ředění. Standardy použité ke kalibraci gelu byly standardy Novex Mark 12.Giant. 6 shows the elution of mpl ligand activity from SDS-PAGE. Fraction 6 from the mpl-affinity column was dissolved in a 4-20% SDS-polyacrylamide gel under non-reducing conditions. Subsequently, gel electrophoresis was divided into 12 equal portions and electrophoresed as described in the examples. The electroeluted samples were dialyzed into PBS and determined at 1/20 dilution. The standards used to calibrate the gel were Novex Mark 12 standards.

Obr. 7 ukazuje vliv mpl ligandové deplečních APP na lidskou megakaryocytopoesu. Mpl ligandové depleční APP byl připraven průchodem 1 ml přes lml mpl-afinitní kolonu (700μ1 mpl-IgG/ml HMS-superose, Pharmacia). Ke kulturám lidských periferních kmenových buněk byl přidán 10% APP nebo 10% mpl ligandové depleční APP a byly kultivovány 12 dní. Megakaryocytoposa byla kvantifikována, jak je popsáno v příkladech.Giant. 7 shows the effect of mpl ligand depleted APP on human megakaryocytopoiesis. The Mpl ligand depleted APP was prepared by passing 1 ml through a 1 ml mpl-affinity column (700μ1 mpl-IgG / ml HMS-superose, Pharmacia). 10% APP or 10% mpl ligand depleted APP was added to human peripheral stem cell cultures and cultured for 12 days. Megakaryocytoposis was quantified as described in the examples.

Obr. 8 ukazuje vliv mpl-IgG na stimulaci lidské megakaryocytopoesy APP. Do kultury lidských periferních kmenových buněk byl přidán 10% s APP a byly kultivovány 12 dní. Ve dnech 0, 2 a 4, byly přidány mpI-IgG (0,5 μΐ) nebo AN/-R-IgG (0,5jil). Po 12 dnech megakaryocytopoésy byla provedena kvantifikace, jak je popsáno v příkladech. Průměr duplicitných vzorků je znázorněn v grafu s aktuálními párovými daty ve dvojici.Giant. 8 shows the effect of mpl-IgG on stimulation of human megakaryocytopoiesis of APP. 10% of APP was added to human peripheral stem cell culture and cultured for 12 days. On days 0, 2 and 4, mpI-IgG (0.5 μΐ) or AN / -R-IgG (0.5 µl) was added. After 12 days of megakaryocytopoiesis, quantification was performed as described in the Examples. The average of duplicate samples is shown in the graph with the current paired data in pairs.

Obr. 9 ukazuje pásy 390 bp fragmentu lidské genomické DNA kódující mpl ligand. Je znázorněna vyvozená aminokyselinová sekvence „exonu 3 (SEQ ID NO: 3) , kódující sekvence (SEQ ID NO: 4), a jeho odpovídající vzorek (SEQ ID NO: 5).Giant. 9 shows bands of a 390 bp fragment of human genomic DNA encoding the mpl ligand. The deduced amino acid sequence of "exon 3 (SEQ ID NO: 3), the coding sequence (SEQ ID NO: 4), and its corresponding sample (SEQ ID NO: 5) is depicted.

Obr. 10 ukazuje aminokyselinovou sekvnci zralého lidského mpl ligandu (hML) (SEQ ID NO: 6) a zralého lidského erythropoetinu (hEPO) (SEQ ID NO: 7) . Vyvozená aminokyselinová sekvence lidského mpl ligandu je srovnána s lidskou erythropoetinovou sekvencí. Identické aminokyxeliny jsou ve čtverečku a mezery vložené pro optimální porovnání jsou označeny pomlčkou. Potenciální N-glykosylovaná místa jsou podtržena jednoduchou čarou pro hML a přerušovanou čarou pro hEPO. Dva cysteiny důležité pro erythropoetinovou aktivitu jsou označeny velkou tečkou.Giant. 10 shows the amino acid sequence of mature human mpl ligand (hML) (SEQ ID NO: 6) and mature human erythropoietin (hEPO) (SEQ ID NO: 7). The deduced amino acid sequence of the human mpl ligand is aligned with the human erythropoietin sequence. Identical amino acids are in a square and the gaps inserted for optimal comparison are indicated by a dash. Potential N-glycosylated sites are underlined by the single line for hML and the dashed line for hEPO. Two cysteines important for erythropoietin activity are indicated by a large dot.

Obr. 11 ukazuje vyvozenou aminokyselinovou sekvenci isoformy zralého lidského mpl ligandu hML (SWQ ID NO: 6) , hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) a hML4 (SEQ ID NO: 10). Identické aminokyseliny jsou ve čtverečku a mezery zavedené pro optimální položení vedle sebe jsou označeny pomlčkou.Giant. 11 shows the deduced amino acid sequence of the mature human mpl ligand hML (SWQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) and hML4 (SEQ ID NO: 10). Identical amino acids are in a square and the gaps introduced for optimal juxtaposition are indicated by a dash.

Obr. 12A, 12B a 12C ukazují vliv lidského mpl ligandu naGiant. 12A, 12B and 12C show the effect of human mpl ligand on

Ba/F3-mpI buněčnou proliferaci (A) , in vitro lidské megakaryocytopoesy s kvantifikačním použitím radioznačené myší IgG monoklonální protilátky specifické k megakaryocytovému glykoproteinů GPIIbIIIa (B) , a myší trombopoesa měřená v destičkovém revazebném stanovení (C).Ba / F3-mpI cell proliferation (A), in vitro human megakaryocytopoiesis quantitatively using radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody specific to megakaryocyte glycoproteins GPIIbIIIa (B), and mouse thrombopoiesis measured in platelet binding assay (C).

293 buňky byly transfektovány CaPO^ metodou (Gorman, C in DNA Cloning: A New Approach 2: 143-190 [1985]) s pRK5 samotným vektorem, pRK5 nebo s pRKS-ML^ přes noc (pRK5ML153 byl generován zavedením stop kodónu za zbytek 153 hML pomocí PCR). Médium bylo poté kondiciováno 36 hodin a stanoveno na stimulaci buněčné proliferace Ba/F3-mpl, jak je posáno v příkladu 1 (A) nebo in vitro lidské megakaryocytopoésy (B). Megakaryocytopoesa byla kvantifikována s použitím ¹²⁵I radioznačené myší IgG monoklonální protilátky (HP1-1D) k megakaryocytovému specifickému glykoproteinů GPIIbIIIa jak je popsáno (Grant a kol., Blood 69: 1334-1339 [1987]). Vliv parciálně pufikovaného rekombinantu ML (rML) na in vivo produkci destiček (C) byl stanoven s použitím revazebného trombocytosového testu popsaného McDonaldem, T.P. Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 144: 1006-10012 (1973). Částečně purifikovaný rML byl připraven z 200ml kondiciovaného média obsahujícího rekombinant ML. Médium bylo naneseno na 2ml Blue-Separose kolonu ekvilibrovanou v PBS a kolona byla byla promyta PBS a eluována PBS obsahujícím 2M urei a 2M NaCl. Aktivní frakce byla dializována do PBS a přidáno lmg/ml s BSA bez toxinů. Vzorek obsahoval méně než jednu jednotku endotoxinu/ml. Myši bylo injektováno 64000, 32000 nebo 16000 jednotek rML nebo samotný excipient. Každá skupina se skládala ze šesti myší. Jsou ukázány hlavní a standardní odchylky každé skupiny. Hodnoty p byly stanoveny mediány dvojdílného srovnávacího T-testu.293 cells were transfected with the CaPO4 method (Gorman, C in DNA Cloning: A New Approach 2: 143-190 [1985]) with pRK5 alone vector, pRK5 or with pRKS-ML ^ overnight (pRK5ML153 was generated by introducing a stop codon beyond the residue 153 hML by PCR). The medium was then conditioned for 36 hours and determined to stimulate Ba / F3-mpl cell proliferation as described in Example 1 (A) or in vitro human megakaryocytopoiesis (B). Megakaryocytopoiesis was quantified using ¹²⁵ L of radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody (HP1-1D) to the megakaryocyte specific glycoproteins GPIIbIIIa as described (Grant et al., Blood 69: 1334-1339 [1987]). The effect of partially buffered recombinant ML (rML) on the in vivo production of platelets (C) was determined using the binding thrombocytosis assay described by McDonald, TP Proc. Soc. Exp. Biol. Copper. 144: 1006-10012 (1973). Partially purified rML was prepared from 200 ml conditioned media containing recombinant ML. The medium was loaded onto a 2 ml Blue-Separose column equilibrated in PBS and the column was washed with PBS and eluted with PBS containing 2M urea and 2M NaCl. The active fraction was dialyzed into PBS and added 1mg / ml with toxin-free BSA. The sample contained less than one unit of endotoxin / ml. Mice were injected with 64000, 32000 or 16000 units of rML or excipient alone. Each group consisted of six mice. The main and standard deviations of each group are shown. The p values were determined by the medians of the two-part comparative T-test.

Obr. 13 srovnává vliv lidských mpl ligandových isoforem a variant v Ba/F3-mp2 buněčném proliferačním stanovení. hML, imitace (mock) , hML2, hML3, hML(Rl53A, R154A) a hMLi₅₃ byly stanoveny v různých ředěních, jak je popsáno v Příkladu 1.Giant. 13 compares the effect of human mpl ligand isoforms and variants in the Ba / F3-mp2 cell proliferation assay. hML imitation (mock), hML2, hML3, hML (Rl53A, R154A) and hMLi ₅₃ were determined at different dilutions, as described in the Example 1.

Obr. 14A, 14B a 14C ukazuje vyvozené aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 1) lidského mpl ligandu (hML) nebo lidského TPO (hTPO) a lidské genomické DNA kódující sekvence (SEQ ID NO: 11). Nukleotidy a minokyselinové zbytky jsou číslovány na začátku každé řádky.Giant. 14A, 14B and 14C show the deduced amino acid sequences (SEQ ID NO: 1) of human mpl ligand (hML) or human TPO (hTPO) and human genomic DNA coding sequences (SEQ ID NO: 11). Nucleotides and amino acid residues are numbered at the beginning of each row.

Obr. 15 ukazuje SDS-PAGE purifikovaného 293-rhML332 a purifikovaného 293-rhMLi₅₃.Giant. 15 shows SDS-PAGE of purified 293-rhML332 and purified 293-rhMLi _53rd

Obr. 16 ukazuje nukleotidovou sekvenci: cDNA kódující (SEQ ID NO: 12) a vyvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 13) otevřeného čtecího rámu myší ML isoformy. Tato isoforma zralého myšího mpl ligandu obsahuje 331 aminokyselinových zbytků, o čtyři méně než předpokládaná plná délka mML, a je označena mML2. Nukleotidy jsou číslovány na začátku každé řádky. Aminokyselinové zbytky jsou číslovány nad sekvencí se začátkem na Ser 1. Potenciální N-glykosylovaná místa jsou potržena. Cysteinové zbytky jsou označeny tečkou nad sekvencí.Giant. 16 shows the nucleotide sequence: cDNA encoding (SEQ ID NO: 12) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) of the open reading frame of the murine ML isoform. This isoform of mature mouse mpl ligand contains 331 amino acid residues, four less than the predicted full length mML, and is designated mML2. Nucleotides are numbered at the beginning of each row. The amino acid residues are numbered above the sequence beginning at Ser 1. Potential N-glycosylated sites are truncated. Cysteine residues are indicated by a dot above the sequence.

Obr. 17 ukazuje cDNA sekvenci (SEQ ID NO: 14) a vyvozenou proteinovou sekvenci (SEQ ID NO: 15) této myší ML isoformy (mML). Nukleototidy jsou číslovány na začátku každé řádky. Aminokyselnové zbytky jsou číslovány nad sekvencí se začátkem na Ser 1. Tato isoforma zralého myšího mpl ligandu obsahuje 335 aminokyselinových zbytků a předpokládá se, že je stejně dlouhá jako mpl ligand plné délky, označený mML. Signální sekvence je označena čárkovaným podtržením a štěpící místa jsou označena šipkou. 5' a 3' netranslatované oblasti jsou označeny menšími psacími písmeny. Dvě delece, které jsou výsledkem alternativního spojení (mML2 a mML3) jsou podtrženy. Čtyři cysteinové zbytky jsou označeny tečkou. Sedm potenciálních N-glykosylačních míst je ve čtverečku.Giant. 17 shows the cDNA sequence (SEQ ID NO: 14) and the deduced protein sequence (SEQ ID NO: 15) of this murine ML isoform (mML). Nucleotides are numbered at the beginning of each row. The amino acid residues are numbered above the sequence beginning at Ser 1. This isoform of mature mouse mpl ligand contains 335 amino acid residues and is believed to be as long as the full length mpl ligand, designated mML. The signal sequence is indicated by dashed underline and the cleavage sites are indicated by an arrow. 5 'and 3' untranslated regions are indicated by smaller letters. The two deletions that result from the alternative join (mML2 and mML3) are underlined. Four cysteine residues are indicated by a dot. The seven potential N-glycosylation sites are in a square.

Obr. 18 srovnává vyvozenou aminokyselinovou sekvenci lidské ML isoformy hML3 (SEQ ID NO: 9) a myší ML isoformy označené mML3 (SEQ ID NO: 16). Vyvozená aminokyselinová sekvence pro lidský mpl ligand je položena vedle myší mpl ligandové sekvence. Identické aminokyseliny jsou ve čtverečku a mezery zavedené pro optimální porovnání jsou označeny pomlčkou. Aminokyseliny jsou číslovány na začátku každého řádku.Giant. 18 compares the deduced amino acid sequence of the human ML isoform of hML3 (SEQ ID NO: 9) and the murine ML isoform designated mML3 (SEQ ID NO: 16). The deduced amino acid sequence for the human mpl ligand is placed next to the murine mpl ligand sequence. Identical amino acids are in a square and the gaps introduced for optimal comparison are indicated by a dash. Amino acids are numbered at the beginning of each line.

Obr. 19 srovnává vyvozené aminokyselinové sekvence zralých ML isoforem z myší-ML (SEQ ID NO: 17, vepřové-ML (SEQ ID NO: 18) a lidské-ML (SEQ ID NO: 6). Aminokyselinové sekvence jsou položeny vedle sebe s mezerami, označenými pomlčkami, zavedenými pro optimální porovnání. Aminokyseliny jsou číslovány na začátku každé řádky s identickými zbytky ve čtverečku. Potenciální Nglykosylovaná místa jsou označena vystínovanými čtverečky a cysteinové zbytky jsou označeny tečkou. Konservované dibasické aminokyselinové prvky, které představují potenciální proteasová štěpící místa, jsou podtržena. Čtyři aminokyselinové delece, u kterých bylo zjištěno, že se nacházejí u třech kmenů (ML2) jsou vyznačeny silným čtverečkem.Giant. Figure 19 compares the deduced amino acid sequences of the mature ML isoforms from murine-ML (SEQ ID NO: 17, porcine-ML (SEQ ID NO: 18) and human-ML (SEQ ID NO: 6)). Amino acids are numbered at the beginning of each line with identical residues in a square Potential Nglycosylated sites are indicated by shaded squares and cysteine residues are indicated by a dot Conserved dibasic amino acid elements that represent potential protease cleavage sites are underlined. The four amino acid deletions found to be found in three strains (ML2) are indicated by a thick square.

Obr. 20 ukazuje cDNA sekvenci (SEQ ID NO: 19) a vyvozenou zralou proteinovou sekvenci (SEQ ID NO: 18) vepřové ML isóformy (pML). Tato vepřové mpl ligandové isoforma obsahuje 332 aminokyselinových zbytků a předpokládá se, že je to celá délka vepřového mpl ligandu, označeného pML. Nukleotidy jsou číslovány na začátku každé řádky. Aminokyselinové zbytky jsou číslovány nad sekvencí se začátkem na Ser 1.Giant. 20 shows the cDNA sequence (SEQ ID NO: 19) and the deduced mature protein sequence (SEQ ID NO: 18) of porcine ML isoform (pML). This porcine mpl ligand isoform contains 332 amino acid residues and is believed to be the full length porcine mpl ligand, designated pML. Nucleotides are numbered at the beginning of each row. The amino acid residues are numbered above the sequence beginning at Ser 1.

Obr. 21 ukazuje cDNA sekvenci a vyvozenou sekvenci zralého proteinu (SEQ ID NO: 21) vepřové ML isoformy (pML2) . Tato isoforma vepřového mpl ligandu obsahuje 328 aminokyselinových zbytků a je čtyřzbytkovou deleční formou vepřového mpl ligandu plné délky, označeného pML2. Nukleotidy jsou číslovány na začátku každé řádky. Aminokyselinové zbytky jsou číslovány nad sekvencí se začátkem na Ser 1.Giant. 21 shows the cDNA sequence and deduced mature protein sequence (SEQ ID NO: 21) of porcine ML isoform (pML2). This isoform of porcine mpl ligand contains 328 amino acid residues and is a four-residue deletion form of full-length porcine mpl ligand, designated pML2. Nucleotides are numbered at the beginning of each row. The amino acid residues are numbered above the sequence beginning at Ser 1.

Obr. 22 srovnává vyvozenou aminokyselinovou sekvenci vepřové ML isoformy pML plné délky (SEQ ID NO: 18) a vepřové ML isoformy označené pML2 (SEQ ID NO: 21). Vyvozená aminokyselinová sekvence pro pML je položena vedle pML2 sekvence. Identické aminokyseliny jsou ve čtverečku a mezery zavedené pro optimální porovnání jsou označeny pomlčkou. Aminokyseliny jsou číslovány na začátku každého řádku.Giant. 22 compares the deduced amino acid sequence of porcine ML isoform of full-length pML (SEQ ID NO: 18) and porcine ML isoform designated pML2 (SEQ ID NO: 21). The deduced amino acid sequence for pML is placed next to the pML2 sequence. Identical amino acids are in a square and the gaps introduced for optimal comparison are indicated by a dash. Amino acids are numbered at the beginning of each line.

Obr. 23 ukazuje příslušné znaky plasmidu pSVI5.ID.LL.MLORF („plné délky nebo TPO₃₃₂) používaného k transf ekci hostitelských CHO-DP12 buněk pro produkci CHO-rhTPO₃₃2 .Giant. 23 shows the respective features of the plasmid pSVI5.ID.LL.MLORF ("full length or TPO _332" ) used to transfect host CHO-DP12 cells to produce CHO-rhTPO ₃₃ 2.

Obr. 24 ukazuje.příslušné znaky plasmidu pSVI5.ID.LL.MLEPOD („zkráceného nebo TPO153) používaného k transfekci hostitelských CHO-DP12 buněk pro produkci CHO-rhTPOis₃.Giant. 24 shows the corresponding features of the plasmid pSVI5.ID.LL.MLEPOD ("truncated or TPO153") used to transfect host CHO-DP12 cells to produce CHO-rhTPOis ₃ .

Obr. 25A, 25B, a 25C ukazují vliv E. coli-rhTPO (_Met-i, 153) na destičky (A) , červené krevní buňky (B) a (c) bílé krevní buňky u normální myši. Dvěma skupinám 6 samic C57 B6 myší byly injektovány denně buď PBS pufrem nebo 0,3μς E. colirhTPO(_Met-i, is₃) (ΙΟΟμΙ sc.). Ve dni 0 a ve dnech 3 až 7 bylo odebráno 40μ1 krve z orbitálního sinusu. Krev byla okamžitě naředěna 10 ml komerčního diluantu a k celkovému krevnímu stanovení byl použit Serrono Baker Hametology Analyzer 9018. Data jsou uvedena s + standartní odchylkou.Giant. 25A, 25B, and 25C show the effect of E. coli-rhTPO ( _Me ti, 153) on platelets (A), red blood cells (B) and (c) white blood cells in normal mice. Two groups of 6 female C57 B6 mice were injected daily with either PBS buffer or 0.3μς of E. colirhTPO ( _Met- i, is ₃ ) (ΙΟΟμΙ sc.). On day 0 and days 3 to 7, 40μ1 blood was collected from the orbital sinus. Blood was immediately diluted with 10 ml of commercial diluent and Serrono Baker Hametology Analyzer 9018 was used for the whole blood assay. Data are shown with + standard deviation.

Obr. 26A, 26B a 26C ukazují vliv E. coli-rhTPO (_Met-i, 153) na destičky (A) , červené krevní buňky (B) a (C) bílé krevní buňky u subletálně ozářených myší. Dvě skupiny 10 samic C57 B6 myší byly subletálně ozářeny 750 cGy gama záření ze zdroje ¹³⁷Cs a injektovány denně buď PBS pufrem nebo 0,3μρ E. coli-rhTPO (net-i, 153) (ΙΟΟμΙ sc.). Ve dni 0 a v subsekventních mezičasech bylo odebráno 40μ1 krve z orbitálního sinusu. Krev byla okamžitě naředěna 10 ml komerčního diluantu a k celkovému krevnímu stanovení byl použit Serrono Baker Hametology Analyzer 9018. Data jsou uvedena s + standartní odchylkou.Giant. 26A, 26B and 26C show the effect of E. coli-rhTPO ( _Me ti, 153) on platelets (A), red blood cells (B) and (C) white blood cells in sublethally irradiated mice. Two groups of 10 female C57 B6 mice were sublethally irradiated with 750 cGy gamma radiation from a ¹³⁷ Cs source and injected daily with either PBS buffer or 0.3 µρ of E. coli-rhTPO (net-i, 153) (ΙΟΟμΙ sc.). On day 0 and at sub-sequential splits, 40μ1 blood was collected from the orbital sinus. Blood was immediately diluted with 10 ml of commercial diluent and Serrono Baker Hametology Analyzer 9018 was used for the whole blood assay. Data are shown with + standard deviation.

Obr. 27A, 27B a 27C ukazují vliv CHO-rhTPO332 na (A) destičky (trombocyty), (B) červené krevní buňky (erythrocyty) a (C) bílé krevní buňky (leukocyty) u normální myši. Dvě skupiny 6 samic C57 B6 myší byly inj-ektovány denně buď PBS pufrem nebo 0,3μς CHO-rhTPO332 (ΙΟΟμΙ sc.) . Ve dni 0 a ve dnech 3 až 7 bylo odebráno 4 0μ1 krve z orbitálního sinusu. Krev byla okamžitě naředěna 10 ml komerčního diluantu a k celkovému krevnímu stanovení byl použit Serrono Baker Hametology Analyzer 9018. Data jsou uvedena s + standartní odchylkou.Giant. 27A, 27B and 27C show the effect of CHO-rhTPO332 on (A) platelets (thrombocytes), (B) red blood cells (erythrocytes) and (C) white blood cells (leukocytes) in normal mice. Two groups of 6 female C57 B6 mice were injected daily with either PBS buffer or 0.3μς CHO-rhTPO332 (ΙΟΟμΙ sc.). On day 0 and days 3 to 7, 40 µl of blood was collected from the orbital sinus. Blood was immediately diluted with 10 ml of commercial diluent and Serrono Baker Hametology Analyzer 9018 was used for the total blood assay. Data are shown with + standard deviation.

Obr. 28 ukazuje křivky odpovědi na dávku pro různé formy rhTPO získaných z různých buněčných linií. Křivky odpovědi na dávku byly sestrojeny k rhTPO z následujících buněčných linií: hTPO₃₃₂ z CHO (plné délky z buněk křečcích vaječníků) ; hTPO _Met-i is3 (E. coli-produkovaná zkrácená forma s N-terminálním methioninem) ; I1TPO332 (TPO plné délky z lidských 293 buněk); E-Coli 155 bez Met (zkrácená forma [rhTPO155] bez terminálního methioninu z E. coli). Skupinám 6 samic C57B6 myší bylo injektováno denně 7 dní rhTPO v závislosti na skupině. Každý den bylo odebráno 40μ1 krve z orbitálního sinusu pro celkové krevní stanovení. Data uvedená výše mají maximální efekt při různém léčení a kromě (met 152 E-Coli) se projevil v sedmém dni léčení. U zmíněné „met 153 E-Coli skupiny se projevil maximální efekt v pátém dni. Data jsou uvedena s + standartní odchylkou.Giant. 28 shows dose response curves for different forms of rhTPO obtained from different cell lines. Dose response curves were constructed for rhTPO from the following cell lines: hTPO ₃₃₂ from CHO (full length from ovarian hamster cells); hTPO _Met- i is3 (E. coli-produced truncated form with N-terminal methionine); ITPO332 (full-length TPO from human 293 cells); Met-free E-Coli 155 (truncated form [rhTPO155] without terminal methionine from E. coli). Groups of 6 female C57B6 mice were injected daily with rhTPO for 7 days depending on the group. Every day, 40μ1 blood was collected from the orbital sinus for a total blood count. The data presented above have the maximum effect in various treatments and, in addition to (met 152 E-Coli), occurred on the seventh day of treatment. The met-153 E-Coli group showed the maximum effect on the fifth day. Data are shown with + standard deviation.

Obr. 29 ukazuje křivky odpovědi na dávku srovnáním aktivity plné délky a zkrácených forem rhTPO produkovaných CHO buňkami se zkrácenými formami z E. coli. Skupiny 6 samic C57B6 myší byly injektovány denně 0,3μg fh TPO různých typů. Ve dnech 2 až 7 bylo odebráno 40μ1 krve z orbitálního sinusu pro celkové krevní stanovení. Skupiny byly léčeny TPO153 zkrácenou formou TPO z E. coli; TPO332 (Mix frakce) plné délky TPO obsahující přibližně 80 až 90% forem plné délky a 10 až 20% zkrácených forem, TPO332(30K frakce) = pufirikovaná TPO frakce plné délky z původní „mix preparace; TPO332(70K frakce) = pufirikovaná TPO frakce plné délky z původní „mix preparace. Data jsou uvedena s + standartní odchylkou.Giant. 29 shows dose response curves by comparing full-length activity and truncated forms of rhTPO produced by CHO cells with truncated forms of E. coli. Groups of 6 female C57B6 mice were injected daily with 0.3 µg fh TPO of various types. On days 2 to 7, 40μ1 blood was collected from the orbital sinus for total blood counts. Groups were treated with TPO153 truncated form of TPO from E. coli; TPO332 (full length mix) TPO containing approximately 80 to 90% full length forms and 10 to 20% truncated forms, TPO332 (30K fraction) = buffered full length TPO fraction from original mix preparation; TPO332 (70K fraction) = Buffered full length TPO fraction from original mix preparation. Data are shown with + standard deviation.

Obr. 30 ukazuje stanovení KIRA ELISA pro měření TPO. Obr. ukazuje MPL/Rse.gD chiméru a odpovídající části receptorů stejně jako finální konstrukci (pravá část obrázku) a průběhový diagram (levá část obrázku) ukazující kroky stanovení.Giant. 30 shows a KIRA ELISA for TPO measurement. Giant. shows the MPL / Rse.gD chimera and corresponding receptor parts as well as the final construction (right side of the figure) and a flow chart (left side of the figure) showing the assay steps.

Obr. 31 ukazuje schéma pro stanovení KIRA ELISA ukazující každý krok postupu.Giant. 31 shows a diagram for determining a KIRA ELISA showing each step of the procedure.

Obr. 32A-32L ukazují nukleotidovou sekvenci (SEQ ID NO: 22) pSVI17.ID.LL expresního vektoru použitého pro expresi Rse.gD v příkladu 17.Giant. 32A-32L show the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of pSVI17.ID.LL expression vector used to express Rse.gD in Example 17.

Obr. Giant. 33 33 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidú plasmidú pMPl. pMPl. Obr. Giant. 34 34 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidú plasmidú pMP21. pMP21. Obr. Giant. 35 35 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidú plasmidú PMP151. PMP151. Obr. Giant. 36 36 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidú plasmidú pMP202. pMP202. Obr. Giant. 37 37 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidú plasmidú pMP172. pMP172.

Obr. 38 je schematická ukázka přípravy plasmidů pMP210.Giant. 38 is a schematic illustration of the preparation of plasmids pMP210.

Obr. 39 je tabulka pěti nej lepších expresních TPO klonů z pMP210 plasmidové banky (SEQ ID NO: 23,24,25,26,27 a 28).Giant. 39 is a table of the five best TPO expression clones from the pMP210 plasmid bank (SEQ ID NOs: 23,24,25,26,27 and 28).

Obr. Giant. 40 40 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidů plasmids pMP41. pMP41. Obr. Giant. 41 41 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidů plasmids pMP57. pMP57. Obr. Giant. 42 42 je Yippee schematická schematic ukázka example přípravy preparation plasmidů plasmids pMP251. pMP251.

Podrobný popis vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

I. DefiniceI. Definitions

Obecně, následující slova nebo slovní spojení jsou definicemi, pokud jsou použita v popisu, příkladech a patentových nárocích.In general, the following words or phrases are definitions when used in the description, examples, and claims.

„Chaotropní agens znamená sloučeninu, která, ve vodném roztoku a ve vhodných koncentracích, může způsobit změny v prostorové konfiguraci nebo konformaci proteinů přinejmenším parciálním narušením sil odpovědných za udržení normální sekundární a terciální struktury proteinu. Takovéto sloučeniny zahrnují např. močovinu, guanidin.HCl a thiokyanát sodný. K dosažení těchto konformacionálních efektů na proteiny jsou obvykle třeba vysoké koncentrace těchto sloučenin, obvykle 4 až 9M."Chaotropic agent" means a compound that, in aqueous solution and at appropriate concentrations, may cause changes in the spatial configuration or conformation of proteins by at least partial disruption of the forces responsible for maintaining the normal secondary and tertiary structure of the protein. Such compounds include, for example, urea, guanidine, HCl and sodium thiocyanate. To achieve these conformational effects on proteins, high concentrations of these compounds, usually 4 to 9M, are usually required.

„Cytokin je obecně použitelný termín pro proteiny uvolňované jednobuněčnou populací, které působí na jinéí buňky jako intracelulární mediátory. Příklady takovýchto cytokinů jsou lymfokiny, monokiny a obvyklé popypeptidové hormony. Mezi tyto cytokiny jsou zahrnuty růstový hormon, insulinu podobné růstové faktory, lidský růstový hormon, Nmethionylový lidský růstový hormon, hovězí růstový hormon, parathyroidní hormon, thyroxin, insulin, proinsulin, relaxin, prorelaxin, glykoproteinové hormony jako je folikuly stimulující hormon (FSH), thiroidový stimulační hormon (TSH), a leutinizační hormon (LH), hematopoetický růstový faktor, hepatický růstový faktor, fibroblastový růstový faktor, prolaktin, placentální laktogen, tumorický nekrotizující faktor-α (TNF-a a TNF-β) mullerian-inhibující substance, myšší gonadotropin-příbuzný peptid, inhibin, aktivin, vaskulární endotheliální růstový faktor, integrin, nervový růstové faktory jako je NGF-β, destičkový-růstový faktor, transformující růstové faktory (TGF) jako je TGF-a a TGF-β, insulinu podobný růstový faktor-I a -II, eryhtropoetin (EPO), osteoinduktivní faktory, interferony jako je interferon-α, -β, a -γ, kolony stimulující faktory (CSF) jako je fakrofágový-CSF (M-CSF), granulocytmakrofágový-CSF (GM-CSF), a granulocytový-CSF (G-CSF), interleukiny (IL) jako je IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8,k IL-9, IL-11, IL-12 a další poplypeptidické faktory zahrnující LIF, SCF a kit-ligand. Je míněno, že předcházející termíny, jak jsou zde použity, zahrnují proteiny z přírodních zdrojů nebo z rekombinantní buněčné kultury. Podobně termíny zahrnují biologicky aktivní ekvivalenty, které se liší např. v aminokyselinové sekvenci jednou nebo více aminokyselinami nebo v typu nebo v rozsahu glykosylace.“Cytokine is a generic term for proteins released by the unicellular population that act on other cells as intracellular mediators. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and common polypeptide polypeptides. These cytokines include growth hormone, insulin-like growth factors, human growth hormone, Nmethionyl human growth hormone, bovine growth hormone, parathyroid hormone, thyroxine, insulin, proinsulin, relaxin, prorelaxin, glycoprotein hormones such as follicle stimulating hormone (FSH), thiroid stimulating hormone (TSH), and leutinizing hormone (LH), hematopoietic growth factor, hepatic growth factor, fibroblast growth factor, prolactin, placental lactogen, tumor necrosis factor-α (TNF-α and TNF-β) mullerian-inhibiting substances, mouse gonadotropin-related peptide, inhibin, activin, vascular endothelial growth factor, integrin, nerve growth factors such as NGF-β, platelet-growth factor, transforming growth factors (TGFs) such as TGF-α and TGF-β, insulin-like growth factor-I and -II, erythropoietin (EPO), osteoinductive factors, interferons such as interferon-α, -β , α-γ, column stimulating factors (CSFs) such as phage-phage-CSF (M-CSF), granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF), and granulocyte-CSF (G-CSF), interleukins (IL) such as IL-1 , IL-2α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, and other poplypeptide factors including LIF, SCF and kit-ligand. It is intended that the foregoing terms as used herein include proteins from natural sources or from recombinant cell culture. Similarly, the terms include biologically active equivalents that differ, eg, in an amino acid sequence by one or more amino acids or in the type or extent of glycosylation.

„mpl ligand, „mpl ligandový polypeptid, „ML, „trombopoetin nebo „TPO jsou použité vzájemně zde zaměnitelně a zahrnují jakýkoliv polypeptid, který vykazuje schopnost vazby na mpl, člena cytokinové receptorové nadskupiny, a má biologické vlastnosti ML, jak je definováno výše. Exemplární biologickou vlalstností je schopnost stimulovat inkorporaci značených nukleotidů (např. ³H-thymidinu) do DNA IL-3 dependentních Ba/F3 buněk transfektovaných lidským mpl P. Další exemplární biologickou vlastností je schopnost stimulovat inkorporaci ³⁵S do cirkulujících destiček v myšším destičkovém revazebném stanovení. Tato definice zahrnuje popypeptidy isolované z mpl ligandového zdroje jako je aplastická vepřová plasma zde popsaná nebo z dalších zdrojů, stejně jako dalších zvířecích druhů, zhahrnujicich lidské nebo připravené rekombinaci nebo syntetickými metodami a zahrnujícími variantní formy zahrnující jejich funkční deriváty, fragmenty, alely, isoformy a analogy."Mpl ligand," mpl ligand polypeptide, "ML," thrombopoietin or "TPO" are used interchangeably herein and include any polypeptide that exhibits the ability to bind to mpl, a cytokine receptor superfamily member, and has the biological properties of ML as defined above. An exemplary biological property is the ability to stimulate the incorporation of labeled nucleotides (eg, ³ H-thymidine) into DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P. Another exemplary biological property is the ability to stimulate ³⁵ S incorporation into circulating platelets in a mouse plate binding assay. . This definition includes polypeptides isolated from an mpl ligand source such as aplastic porcine plasma described herein or from other sources, as well as other animal species, including human or prepared recombination or synthetic methods, and including variant forms including functional derivatives, fragments, alleles, isoforms and analogs.

„mpl ligandový fragment nebo „TPO fragment je část přirozeně se vyskytujího materiálu plné délky mpl ligandu nebo TPO sekvence, které chybí jedna nebo více aminokyselinových zbytků nebo uhlovodíků. Chybějící aminokyselinový zbytek (zbytky) se mohou vyskytovat kdekoliv v peptidu včetně N- terminálního nebo Cterminálního konce nebo uvnitř. Fragment bude vykazovat nejméně jednu biologickou vlastnost společnou s mpl ligandem. Mpl ligandové fragmenty budou mít konsekutivní sekvenci nejméně 10, 15, 20, 25, 30 nebo 40 aminokyselinových zbytků, které sjou identické k sekvencím mpl ligandu isolované u savců včetně ligandu isolovaného z aplastické vepřové plasmy nebo lidského nebo myššího ligandu, zvláště jeho EPO-domény. Reprezentativním příkladem N-terminálních fragmentů jsou hML₁₅₃ nebo TPO(_Met-l 1-153)· „Mpl ligandové varianty nebo „varianty mpl ligandové sekvence jako jsou zde definovány znamenají biologicky aktivní mpl ligand jako je devinováno výše, která má méně než 100% sekvenční identity z mpl ligandem isolovaným z rekombinanční buněčné kultury nebo aplastické vepřové plasmy nebo lidského ligandu majícího vyvozenou sekvenci popsanou na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1) . Obvykle biologicky aktivní mpl ligandový variant má aminokyselinovou sekvenci nejméně 70% aminokyselinové sekvenční identity s mpl ligandem isolovaným z aplastické vepřové plasmy nebo zralého myššího nebo lidského ligandu nebo jejich fragmentů (viz Obr. 1 [SEQ ID NO:1], výhodně nejméně 75%, výhodněji nejméně 80%, více výhodněji 85%, ještě více výhodněji nejméně 90% a nej výhodněji nejméně 95%.An "mpl ligand fragment" or "TPO fragment" is part of a naturally occurring full-length mpl ligand material or TPO sequence that lacks one or more amino acid residues or hydrocarbons. The missing amino acid residue (s) can occur anywhere in the peptide, including the N-terminal or Cterminal tail, or within. The fragment will exhibit at least one biological property in common with the mpl ligand. The Mpl ligand fragments will have a consecutive sequence of at least 10, 15, 20, 25, 30 or 40 amino acid residues that are identical to the mammalian isolated mpl ligand sequences, including a ligand isolated from aplastic porcine plasma or a human or mouse ligand, particularly its EPO-domain. . Representative examples of N-terminal fragments are hML ₁₅₃ or TPO ( _Me tl 1-153). "Mpl ligand variants or" mpl ligand sequence variants as defined herein refer to a biologically active mpl ligand as devinated above having less than 100% sequence sequence. identity from the mpl ligand isolated from recombinant cell culture or aplastic porcine plasma or human ligand having the deduced sequence described in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Typically, the biologically active mpl ligand variant has an amino acid sequence of at least 70% amino acid sequence identity with the mpl ligand isolated from aplastic porcine plasma or mature mouse or human ligand or fragments thereof (see Figure 1 [SEQ ID NO: 1], preferably at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%.

„Chimérický mpl ligand je polypeptid obsahující plnou délku mpl ligandu nebo jeden nebo více jeho fragmentů fúzovaných nebo navázaných na sekundární helerologní polypeptid nebo jeden nebo více jeho fragmentů. Chiméra vykazuje nejméně jednu biologickou vlastnost obvyklou u mpl ligandu. Sekundární polypeptid je obvykle cytokin, imunoglobin nebo jejich fragment.A chimeric mpl ligand is a polypeptide comprising a full length mpl ligand or one or more fragments thereof fused to or linked to a secondary helerologic polypeptide or one or more fragments thereof. The chimera exhibits at least one biological property common to the mpl ligand. Typically, the secondary polypeptide is a cytokine, an immunoglobin, or a fragment thereof.

„Isolovaný mpl ligand, „vysoce purifikovaný mpl ligand a „substanciálně homogenní mpl ligand jsou použity zaměnitelně a znamenají mpl ligand, který je purifikován ze zdroje mpl ligandu nebo je připraven rekombinací nebo dynterickými metodami a je dostatečně vyčištěn od dalších peptidů nebo proteinů (1) , aby bylo získáno nejméně 15 a výhodně 20 aminokyselinových zbytků N-terminální nebo vnitřní aminokyselinové sekvence s použitím spinning cup sekvenátoru nebo nej lepšího komerčně dostupného aminokyselinového sekvenátoru nebo modifikací publikovaných metod po datu vstoupení v plastnost této aplikace, nebo (2) aby byla dosažena homogenita s redukuj ících blue nebo, použitím SDS-PAGE za podmínek s použitím výhodněji, stříbrem. 5% kontaminace dalšími neredukujících nebo barvení Coomassie Homogenita zde znamená méně ne zdroji proteinů."Isolated mpl ligand," highly purified mpl ligand, and "substantially homogeneous mpl ligand are used interchangeably and refer to an mpl ligand that is purified from an mpl ligand source or is prepared by recombination or dynteric methods and is sufficiently purified from other peptides or proteins (1) to obtain at least 15 and preferably 20 amino acid residues of the N-terminal or internal amino acid sequence using the spinning cup sequencer or the best commercially available amino acid sequencer or modification of published methods after the date of entry into plasticity of the application, or (2) to achieve homogeneity with reducing blue or, using SDS-PAGE under conditions using more preferably silver. 5% contamination with other non-reducing or Coomassie staining Homogeneity here means less than protein sources.

„Biologické vlastnosti, pokud jsou použity buď s „mpl ligandem nebo „isolovaným mpl ligandem znamenají trombopoetickou aktivitu nebo in vivo efektorovou nebo antigenní funkci nebo aktivitu, která je přímo nebo nepřímo způsobena nebo provedena mpl ligandem (v nativní nebo denaturované konformaci) nebo jeho fragmentem. Efektorové funkce zahrnují mpl vazbu a jakoukoliv vazebnou aktivitu nosiče, agonismus nebo antagonismus mpl, zvláště transdukci proliferativního signálu včetně replikace, DNA regulační funkci, modulaci biologické aktivity dalších cytokinů, receptorovou (zvláště cytokinovou) aktivaci, deaktivaci, regulaci zvýšení nebo snížení, buněčného růstu nebo diferenciace atd. Antigenní funkce znamená výskyt epitopu nebo antigenního místa, které je schopno křížové reakce s protilátkami produkovanými proti mpl ligandu. Principem antigenní funkce mpl ligandového polypeptidu je to, že se váže s afinitou nejméně 10⁶l/mol na protilátku produkovanou proti mpl ligandu izolovaného z aplastické vepřové plasmy. Obvykle se polypeptid váže s afinitou nejméně 10⁷l/mol. Nejvýhodněji je antigennně aktivní mpl ligandový polypeptid polypeptid, který se váže na protilátku produkovanou proti mpl ligandu mající jednu z výše popsaných efektorových funkcí. Protilátky použité k definici „biologické aktivity jsou králičí polyklonální protilátky připravené upravením mpl ligandu izolovaného z rekombinantní buněčné kultury nebo aplastické vepřové plasmy ve Freundově kompletním adjuvans, subkutánní injektací preparátu, a posilováním imunitní odpovědi intraperitoneální injektací preparátu až je titr mpl ligandové protilátky stálý."Biological properties, when used with either" mpl ligand or "isolated mpl ligand, mean thrombopoietic activity or in vivo effector or antigenic function or activity that is directly or indirectly caused or performed by the mpl ligand (in native or denatured conformation) or a fragment thereof . Effector functions include mpl binding and any carrier binding activity, agonist or antagonism of mpl, particularly transducing a proliferative signal including replication, DNA regulatory function, modulating the biological activity of other cytokines, receptor (particularly cytokine) activation, inactivation, regulation of increase or decrease, cell growth or differentiation, etc. Antigenic function means the occurrence of an epitope or antigenic site that is capable of cross-reacting with antibodies produced against the mpl ligand. The principle of the antigenic function of an mpl ligand polypeptide is that it binds with an affinity of at least 10 ⁶ l / mol to an antibody produced against an mpl ligand isolated from aplastic pig plasma. Typically, the polypeptide binds with an affinity of at least 10 ⁷ L / mol. Most preferably, the antigenically active mpl ligand polypeptide is a polypeptide that binds to an antibody produced against an mpl ligand having one of the effector functions described above. Antibodies used to define "biological activity" are rabbit polyclonal antibodies prepared by treating an mpl ligand isolated from recombinant cell culture or aplastic porcine plasma in Freund's complete adjuvant, subcutaneously injecting the preparation, and boosting the immune response by intraperitoneal injection until the mpl ligand antibody titer is stable.

„Biologicky aktivní, pokud je použito ve spojení buď s „mpl ligandem nebo „isolovaným mpl ligandem znamená mpl ligand nebo polypeptid, který vykazuje trombopoetickou aktivitu nebo vykazuje efektorovou funkci mpl ligandu izolovaného z aplastické vepřové plasmy nebo produkovaného v rekombinantní buněčné kultuře zde popsané. Principiálně známá efektorová funkce mpl ligandu nebo polypeptidu je zde vazba na mpl a stimulace inkorporace značeného nukleotidu (³H-thymidin) do DNA IL-3 dependentních Ba/F3 buněk transfektovaných lidským mpl P. Dalším známou efektorovou funkcí mpl ligandu nebo polypeptidu je zde schopnost stimulovat inkorporaci ³⁵S do cirkulujících destiček v myším destičkovém revazebném stanovení. Dosud známá další efektorová funkce mpl ligandu je schopnost stimulovat in vitro lidskou megakaryocytopoézu, které může být kvantifikována s použitím radioznačených monoklonálních protilátek specifických k megakaryocytovému glykoproteinu GPII_bIII_a."Biologically active when used in conjunction with either" mpl ligand or "isolated mpl ligand" means an mpl ligand or polypeptide that exhibits thrombopoietic activity or exhibits the effector function of an mpl ligand isolated from aplastic porcine plasma or produced in recombinant cell culture described herein. The principally known effector function of an mpl ligand or polypeptide is here to bind to mpl and stimulate the incorporation of labeled nucleotide ( ³ H-thymidine) into DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P. Another known effector function of mpl ligand or polypeptide is stimulate ³⁵ S incorporation into circulating platelets in a mouse platelet binding assay. Other heretofore known effector function of mpl ligand is the ability to stimulate in vitro human megakaryocytopoiesis that may be quantitated using a radiolabeled monoclonal antibody specific to the megakaryocyte glycoprotein GPIIa _and III _b.

„Procentuální aminokyselinová sekvenční identita ve vztahu k mpl ligandové sekvenci je zde definována jako procento aminokyselinových zbytků v posuzované sekvenci, které je identické se zbytky v mpl ligandové sekvenci izolované z aplastické vepřové plasmy nebo myší nebo lidské ligandy, které mají vyvozenou aminokyselinovou sekvenci uvedenou na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1); po položení sekvencí vedle sebe a vložení pomlček, pokud je to nutné, se zjišťuje maximální procento sekvenční identity, a neberou se v úvahu žádné konservativní substituce jako část sekvenční identity. Nesmí být konstruovány žádné Nterminální, C-terminální nebo interní prodloužení, delece nebo inserce do mpl ligandové sekvence k ovlivnění sekvenční identity nebo homologie. Tedy u exeplárních biologicky aktivních mpl ligandových polypeptidu se bere v úvahu, že mají identické sekvence včetně prepro-mpl ligandu, pro-mpl ligandu a zralého mpl ligandu."Percent amino acid sequence identity relative to the mpl ligand sequence is defined herein as the percentage of amino acid residues in the sequence being considered that is identical to the residues in the mpl ligand sequence isolated from aplastic porcine plasma or murine or human ligands having the deduced amino acid sequence shown in Fig. . 1 (SEQ ID NO: 1); after placing the sequences side by side and inserting dashes, if necessary, the maximum percentage of sequence identity is determined, and no conservative substitutions are taken into account as part of the sequence identity. No non-terminal, C-terminal or internal extension, deletion or insertion into the mpl ligand sequence must be constructed to affect sequence identity or homology. Thus, exeplar biologically active mpl ligand polypeptides are considered to have identical sequences including the prepro-mpl ligand, the pro-mpl ligand, and the mature mpl ligand.

„Mpl ligandové mikrosekvenování může být provedeno jakýmkoliv vhodným standardním postupem, pokud je tento postup dostatečně citlivý. V jedné takovéto metodě je získán vysoce purifikovaný polypeptid z SDS gelů nebo z filnálního kroku HPLC jsou sekvenovány přímo automatickou Edmanovou (fenylisothiokyanátovou) degradací s použitím modelu 470A Applied Biosystems sekvenátoru na plynné fázi, vybaveného 120A fenylthiohydationovým (PTH) aminokyselinovým analyzátorem. Navíc mpl ligandové fragmenty připravené chemickou (např. CNBr, hydroxylamin, 2-nitro-5-thiokyanobenzoát) nebo enzymatickou (např. trypsin, klostripain, stafylokoková proteasa) digesci a následující fragmentovou purifikaci (např. HPLC) mohou být podobně sekvenované. PTH aminokyseliny jsou analyzovány s použitím informačního systému ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA) . Sekvenční interpretace je provedena na VAX 11/785 Digital Equipment Co. počítači tak jak popsal Henzel a kol., J. Chromatography, 404: 31-52 [1987]. Nepovinně, alikvoty HPLC frakcí mohou být elektroforézovány na 5-20% SDS-PAGE, efektrotransferovány do PVDF membrány (ProBlott, AIB, Foster City, CA) a barveny Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262: 10035-10038 [1987]. Specifický protein identifikovaný barvením je vyříznut z blotu je provedeno N-koncové sekvenování sekvenátorem na plynné fázi popsaným výše. Pro vnitřní proteinové sekvence jsou HPLC frakce vysušeny ve vakuu (SpeedVac), resuspendovány ve vhodných pufrech, a digestovány kyanogenbromidem, Lys-specifickým enzymem Lys-C (Wako Chemicals, Richmong, Va), nebo Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) . Po digesci jsou výsledné peptidy sekvenovány jako směs nebo po výsledné HPLC ná C4 koloně s propanolovým gradientem v 0,1% TFA jsou sekvenovány před zplynováním.Mpl ligand microsequencing can be performed by any suitable standard procedure, provided that the procedure is sufficiently sensitive. In one such method, highly purified polypeptide is obtained from SDS gels or from a final HPLC step sequenced directly by automatic Edman (phenylisothiocyanate) degradation using a 470A Applied Biosystems gas phase sequencer model equipped with a 120A phenylthiohydation (PTH) amino acid analyzer. In addition, mpl ligand fragments prepared by chemical (eg, CNBr, hydroxylamine, 2-nitro-5-thiocyanobenzoate) or enzymatic (eg, trypsin, clostripain, staphylococcal protease) digestion and subsequent fragment purification (eg, HPLC) may be similarly sequenced. PTH amino acids are analyzed using the ChromPerfect information system (Justice Innovations, Palo Alto, CA). Sequential interpretation is performed on VAX 11/785 Digital Equipment Co. computers as described by Henzel et al., J. Chromatography, 404: 31-52 [1987]. Optionally, aliquots of HPLC fractions can be electrophoresed on 5-20% SDS-PAGE, effected into a PVDF membrane (ProBlott, AIB, Foster City, CA) and stained with Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262: 10035-). 10038 [1987] The specific protein identified by staining is excised from the blot, N-terminal sequencing is performed using the gas phase sequencer described above For internal protein sequences, HPLC fractions are vacuum dried (SpeedVac), resuspended in suitable buffers, and digested with cyanogen bromide, Lys -specific enzyme Lys-C (Wako Chemicals, Richmong, Va), or Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) After digestion, the resulting peptides are sequenced as a mixture or after the resulting HPLC on a C4 column with a propanol gradient in 0.1 % TFA are sequenced prior to gasification.

„Trombocytopenie je definována jako počet destiček pod 150xl0⁹ na litr krve.“Thrombocytopenia is defined as platelet counts below 150x10 ⁹ per liter of blood.

„Trombopoetická aktivita je definována jako biologická aktivita, která se skládá z akcelerace proliferace, diferenciace a/nebo zrání megakaryocytů nebo megakaryocytových prekursorů na destičky-produkující formy těchto buněk. Tato aktivita může být měřena různými stanoveními včetně in vivo myšího destičkového revazebného stanovení, stanovení indukce destičkového povrchového antigenú měřeného (anti-GPII_bIIIa) magakaryoblastickou jako anti-destičkové imunostanovení pro lidskou leukemickou buněčnou linii (CMK), a indukce polyploidizace v megakaryoblastické buněčné linii (DAMI).'Thrombopoietic activity is defined as a biological activity that consists of accelerating the proliferation, differentiation and / or maturation of megakaryocytes or megakaryocyte precursors to platelet-producing forms of these cells. This activity can be measured by various assays including an in vivo mouse platelet binding assay, a platelet surface antigen induction assay measured (anti-GPII _b IIIa) magacaryoblastic as an anti-platelet immunoassay for a human leukemia cell line (CMK), and induction of polyploidization in a megakaryoblastic cell line. (DAMI).

„Trombopoetin (TPO) je definován jako sloučenina, která má trombopoetickou aktivitu nebo je schopná zvyšovat počet destiček v séru u savců. TPO je výhodně schopný zvyšovat endogenní počet destiček nejméně 10%, výhodněji 50% a nejvýhodněji zvyšovat počet destiček u člověka více než 150xl0⁹ na litr krve.'Thrombopoietin (TPO) is defined as a compound that has thrombopoietic activity or is capable of increasing serum platelet count in mammals. The TPO is preferably capable of increasing the endogenous platelet count by at least 10%, more preferably 50%, and most preferably increasing the platelet count in humans by more than 150x10 ⁹ per liter of blood.

„Isolovaná mpl ligandová nukleová kyselina je RNA nebo DNA obsahující více než 16 a výhodně 20 nebo více sekvenčních nukleotidových bází, které kódují biologickou aktivitu mpl ligandu nebo jeho fragmentu, je komplementární k RNA nebo DNA, nebo hybridní k RNA nebo DNA a ponechává si stabilní vazby i při ovlivnění náročnými podmínkami. Tato RNA nebo DNA je vyčištěná od nejméně jednoho kontaminujícího zdroje nukleových kyselin, které jí normálně doprovází v přirozených zdrojích a výhodně je substanciální čistá od jakýchkoliv savčích RNA nebo DNA. Fráze „vyčištěná od nejméně jednoho kontaminující ho zdroje nukleových kyselin, které jí normálně doprovází zahrnuje případ, kdy nukleová kyselina je přítomna ve zdroji nebo přírodní buňce, ale v jiné chomosomální lokalizaci nebo jinak obklopena aminokyselinovými sekvencemi, které se v normální zdrojové buňce nenachází. Příkladem isolované mpl ligandové nukleové kyseliny je RNA a DNA, která kóduje biologicky aktivní mpl ligand vykazující nejméně 75% sekvenční identity, výhodně 80%, výhodněji 85%, ještě výhodněji 90% a nejvýhodněji 95% sekvenční identity s lidským, myším nebo vepřovým mpl ligandem.An isolated mpl ligand nucleic acid is RNA or DNA containing more than 16 and preferably 20 or more sequence nucleotide bases that encode the biological activity of the mpl ligand or fragment thereof, is complementary to RNA or DNA, or hybrid to RNA or DNA, and retains stable even when influenced by demanding conditions. The RNA or DNA is purified from at least one contaminating source of nucleic acids that normally accompanies it in natural sources and preferably is substantially pure from any mammalian RNA or DNA. The phrase "purified from at least one contaminating nucleic acid source that normally accompanies it includes the case where the nucleic acid is present in the source or natural cell but in another chomosomal location or otherwise surrounded by amino acid sequences not found in the normal source cell. An example of an isolated mpl ligand nucleic acid is RNA and DNA that encodes a biologically active mpl ligand having at least 75% sequence identity, preferably 80%, more preferably 85%, even more preferably 90%, and most preferably 95% sequence identity to human, mouse or porcine mpl ligand. .

„Kontrolní sekvence ve vztahu k expresi znamená DNA sekvence nutné pro expresi operabilně navázané kódující sekvence v konkrétním hostitelském organismu. Kontrolní sekvence, které jsou vhodné pro prokaryota, např. zahrnují promoteorovou, nepovinně operátorovou sekvenci, ribosomové vazebné místo a možno i další dosud málo prozkoumané sekvence. Je známo, že eukaryotické buňky používají promotory, polyadenylačni signalizaci a enhancery."Expression control sequences" means DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. For example, control sequences that are suitable for prokaryotes include the promoteor, optionally operator sequence, the ribosome binding site, and possibly other hitherto less explored sequences. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signaling, and enhancers.

„Operabilně navázané ve vztahu k nukleovým kyselinám znamená nukleové kyseliny, které jsou umístěny ve funkčním vztahu s další sekvencí nukleové kyseliny. Např. DNA pro presekvenci nebo sekretorický leader jsou operabilně navázané na DNA pro polypeptid, pokud je exprimován jako preprotein, který participuje v sekreci popypeptidu; promotor nebo enhancer je operabilně navázán na kódující sekvenci, když má vliv na transkripci sekvence; nebo rybosomové vazebné místo je operabilně navázáno na kódující sekvenci, když je umístěno tak, že usnadňuje translaci. Obecně „operabilně navázaný znamená, že DNA sekvence, takto navázané, sousedí, a v případě sekretorického leaderu, sousedí a jsou ve fázi čtení. Ovšem enhancery nemusí být sousední. Vazba je provedena ligací na vhodných restrikčních místech. Pokud tato místa neexistují, jsou použity v souladu s běžným postupem syntetické oligonukleotidové adaptory nebo linkery."Operably linked to nucleic acids" means nucleic acids that are placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. E.g. DNA for a presequence or secretory leader are operably linked to DNA for a polypeptide when it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence when it affects the transcription of the sequence; or a fisheriesome binding site is operably linked to a coding sequence when positioned so as to facilitate translation. Generally, "operably linked" means that the DNA sequences so linked are contiguous, and in the case of a secretory leader, contiguous and in the reading phase. However, enhancers need not be adjacent. Binding is performed by ligation at appropriate restriction sites. In the absence of such sites, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with conventional procedures.

„Exogenní ve vztahu k prvkům znamená sekvence nukleových kyselin, které jsou buňce cizí, nebo jsou homologní k buňce, ale v pozici uvnitř nukleové kyseliny hostitelské buňky, v které se prvek obvykle nenachází."Exogenous to elements means nucleic acid sequences that are foreign to the cell or homologous to the cell but at a position within the host cell nucleic acid in which the element is not normally found.

„Buňka, „buněčná linie, a „buněčná kultura jsou zde použity zaměnitelně a jako termín zahrnují všechny potomky buňky nebo buněčné linie. Tedy například termíny jako „transformanty a „transformované buňky zahrnují primární subjekty buňky a kultury od nich odvozené bez ohledu na počet transferů. Také je zřejmé, že všechny potomci nemusí mít přesně identický obsah DNA, kvůli omezeným nebo rozvinutým mutacím. Zahrnují mutantní potomky, kteří mají stejnou funkční nebo biologickou aktivitu, která byla zjištěna u originálních transformovaných buněk. Pokud popis není jasný, bude jasný v kontextu."Cell," cell line, and "cell culture are used interchangeably herein and include all descendants of a cell or cell line as a term. Thus, for example, terms such as "transformants and" transformed cells include primary subjects of the cell and cultures derived therefrom regardless of the number of transfers. It is also apparent that not all offspring may have exactly identical DNA content due to limited or developed mutations. They include mutant offspring that have the same functional or biological activity that was found in the original transformed cells. If the description is not clear, it will be clear in context.

„Plasmidy jsou autonomní replikační cirkulární DNA molekuly mající nezávislé zdroje replikace a jsou zde označeny malým písmenem „p, které předchází a/nebo následují velká písmena a/nebo čísla. Všechny zde uvedené výchozí plasmidy jsou komerčně dostupné, obecně dostupné na neomezeném základě nebo mohou být sestrojeny z takto dostupných plasmidů podle publikovaných postupů. Dále další odpovídající plasmidy jsou v oboru dobře známy a jsou uvedeny v metodice."Plasmids are autonomous replicating circular DNA molecules having independent sources of replication and are indicated herein by the lowercase letter" p "that precedes and / or follows capital letters and / or numbers. All of the starting plasmids disclosed herein are commercially available, generally available on an unrestricted basis, or can be constructed from such available plasmids according to published procedures. Further, other corresponding plasmids are well known in the art and are disclosed in the methodology.

„Digesce restrikčním enzymem ve vztahu k DNA znamená katalytické štěpení vnitřních fosfodiesterových vazeb DNA enzymem, který působí pouze na některá místa v sekvenci DNA. Takovéto enzymy se nazývají „restrikční endonukleasy. Každá restrikční endonukleasa rozpozná spedifickou DNA sekvenci nazývanou „restrikční místo, které vykazuje dvojčetnou symetrii. Různé restrikční enzymy zde použité jsou komerčně dostupné a jejich reakční podmínky, kofaktory a další požadavky pro provedení jsou použity podle výrobce enzymu. Restrikční enzymy jsou obvykle označeny zkratkami složenými z velkých písmen následovanými dalšími písmeny představujícími mikroorganismus, z kterého restrikční enzym pochází a z kterého byl získán a poté následuje číslo označení samotného enzymu. Obecně, na 1 pg plasmidu nebo fragmentu DNA jsou použity 1-2 jednotky enzymu v 20 μΐ pufračního roztoku. Vhodná množství pufru a substrátu pro jednotlivé restrikční enzymy jsou specifikována výrobcem. Obvykle je použita inkubace 1 hod při 37°C, ale může se lišit podle instrukcí dodavatele. Po inkubaci je protein nebo polypeptid odstraněn extrakcí s fenolem nebo floroformem a digestovaná nukleová kyselina je získána z vodné frakce precipitací s ethanolem. Digesci restrikčními enzymy může následovat hydrolýza koncových 5' fosfátů bakteriální alkalickou fosfatasou jako prefence dvou restrikcí štěpených konců DNA fragmentu z cirkularizace nebo vznik uzavřené smyčky, které by bránila vložení dalšího fragmentu DNA do restrikčního místa. Digesce plasmidů nemusí být následována 5' koncovou defosforylací. Postupy a reagens pro defosforylaci jsou popsány v sekcích 1.56 - 1.61 Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].“Digestion with a restriction enzyme in relation to DNA means catalytic cleavage of internal phosphodiester bonds by DNA by an enzyme that acts only at certain sites in the DNA sequence. Such enzymes are termed "restriction endonucleases." Each restriction endonuclease recognizes a spedific DNA sequence called a " restriction site that exhibits double symmetry. The various restriction enzymes used herein are commercially available and their reaction conditions, cofactors, and other performance requirements are used according to the enzyme manufacturer. Restriction enzymes are usually indicated by abbreviations consisting of capital letters followed by additional letters representing the microorganism from which the restriction enzyme originated and from which it was derived, followed by the identification number of the enzyme itself. In general, 1-2 units of enzyme in 20 μΐ of buffer solution are used per 1 g of plasmid or DNA fragment. Appropriate amounts of buffer and substrate for each restriction enzyme are specified by the manufacturer. Usually an incubation of 1 hour at 37 ° C is used, but may vary according to the supplier's instructions. After incubation, the protein or polypeptide is removed by phenol or floroform extraction and the digested nucleic acid is recovered from the aqueous fraction by precipitation with ethanol. Restriction enzyme digestion may be followed by hydrolysis of the terminal 5 'phosphates by bacterial alkaline phosphatase as a precedence of the two restriction cleavage of the DNA fragment from circularization or the formation of a closed loop that would prevent the insertion of another DNA fragment at the restriction site. Digestion of the plasmids need not be followed by 5 'terminal dephosphorylation. Procedures and reagents for dephosphorylation are described in Sections 1.56 - 1.61 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

„Získání” nebo „izolace za zisku fragmentu DNA z restrikční digesce znamená separaci digestu na polyakrylamidu nebo agarosovém gelu elektroforézou, identifikaci fragmentu, který nás zajímá, srovnáním jeho mobility proti markérům DNA fragmentů, u kterých známe molekulovou hmotnost, vyjmutí gelové sekce, která obsahuje požadovaný fragment, a separaci DNA z gelu. Postup je obecně znám. Např. viz Lawn a kol., Nuckleic Acids Res., 9: 6103-6114 [1981], a Goeddel a kol., Nuckleic Acids Res., 8: 4057 [1980]."Obtaining" or "isolation to obtain a DNA fragment from restriction digestion means separating the digest on polyacrylamide or agarose gel by electrophoresis, identifying the fragment of interest, by comparing its mobility against the markers of DNA fragments of known molecular weight, removing the gel section containing the desired fragment, and separating the DNA from the gel. The procedure is generally known. E.g. see Lawn et al., Nuckleic Acids Res., 9: 6103-6114 [1981], and Goeddel et al., Nuckleic Acids Res., 8: 4057 [1980].

„Southern analýza” nebo „Souther blotting je metoda, kde přítomnost DNA sekvencí v restrikčním endonukleasovém digenstu DNA, nebo v DNA-obsahující směsi, je potvrzena hybridizací na známé, značené oligonukleotidy nebo DNA fragmenty. Southern analýza obvykle zahrnuje elektroforetickou separaci DNA digestů na agarosóvých gelech, denaturaci DNA po elektroforetické separaci a přenesení DNA do nitrocelulózy, nylonu nebo jiné vhodné membrány pro analýzu radioznačením, byotinylací, nebo stanovením enzymovým značením jak je popsáno v sekcích 9.37 - 9.52 Sambrook a kol., viz výše.Southern analysis or Southern blotting is a method wherein the presence of DNA sequences in a restriction endonuclease digenst DNA, or in a DNA-containing mixture, is confirmed by hybridization to known, labeled oligonucleotides or DNA fragments. Southern analysis typically involves electrophoretic separation of DNA digests on agarose gels, denaturation of the DNA after electrophoretic separation, and transfer of the DNA to nitrocellulose, nylon, or other suitable membrane for analysis by radiolabelling, byotinylation, or by enzyme labeling as described in Sections 9.37-9.52 Sambrook et al. , see above.

„Nothern analýza nebo „Nothern blotting je metoda používaná k identifikaci RNA sekvencí, které jsou hybridizovány na známé vzorky jako jsou oligonukleotidy, DNA fragmenty, cDNA nebo jejich fragmenty, nebo RNA fragmenty. Vzorky jsou značeny radioisotopy jako je ³²P, nebo biotinylací nebo enzymem. RNA je obvykle analyzována elektroforetickou separací na agarosovém nebo polyakryamidovém gelu, přenesena do nitrocelulosy, nylonu nebo jiné vhodné membrány a hybridizována se vzorkem, s použitím standardních technik dobře známých v oborů·!, které jsou popsány v sekcích 7.39 - 7.52 Sambrook a kol., viz výše."Northern blotting" or "Northern blotting" is a method used to identify RNA sequences that are hybridized to known samples such as oligonucleotides, DNA fragments, cDNA or fragments thereof, or RNA fragments. Samples are labeled with radioisotopes such as ³² P, or by biotinylation or enzyme. RNA is typically analyzed by electrophoretic separation on an agarose or polyacryamide gel, transferred to nitrocellulose, nylon, or other suitable membrane, and hybridized to the sample using standard techniques well known in the art, described in sections 7.39-7.52 of Sambrook et al., see above.

„Ligace je proces vzniku fosfodiesterových vazeb mezi dvěma fragmenty nukleových kyselin. Pro ligaci dvou fragmentů, musí být konce fragmentů navzájem kompatibilní. V některých případech mohou být konce kompatibilní přímo po endonukleasové digesci. Ovšem může být nejprve nutné konců, obvykle vzniklých po na tupé konce, aby byly kompatibilní pro ligaci. Pro otupení konců se na DNA působí ve vhodném pufru nejméně 15 minut při 15°C 10 jednotkami Klenowova fragmentu DNA polymerasy I nebo T4 DNA polyměrasy v přítomnosti čtyřideoxyribonukleotidtrifosfatasy. DNA je poté purifikována fenol-choroform extrakcí a ethanolovou precipitací. DNA fragmenty, které mají být spolu ligovány, jsou poté uvedeny do roztoku v ekvimolárním množství.“Ligation is the process of forming phosphodiester bonds between two fragments of nucleic acids. For ligation of two fragments, the ends of the fragments must be compatible with each other. In some cases, the ends may be compatible directly after endonuclease digestion. However, it may first be necessary to terminate, usually formed after blunt ends, to be compatible for ligation. To blunt the ends, the DNA is treated in a suitable buffer for at least 15 minutes at 15 ° C with 10 units of Klenow fragment of DNA polymerase I or T4 DNA polymerase in the presence of quadideoxyribonucleotide triphosphatase. The DNA is then purified by phenol-choroform by extraction and ethanol precipitation. The DNA fragments to be ligated together are then dissolved in equimolar amounts.

převedení roztřepených endonukleasové digesci,transfer of frayed endonuclease digestion,

Roztok bude také obsahovat ATP, ligasový pufr a ligasu jako je T4 DNA ligasa v množství 10 jednotek na 0,5 μg DNA. Pokud má být DNA ligována do vektoru, vektor je nejprve linealizován digescí s vhodnou restrikční endonukleasou (endonukleasami) . Na linearizovaný vektor poté působí bakteriální alkalická fosfatasa nebo telecí intestinální fosfatasa jako prefence autoligace během ligačního kroku.The solution will also contain ATP, ligase buffer, and a ligase such as T4 DNA ligase at 10 units per 0.5 µg of DNA. If the DNA is to be ligated into the vector, the vector is first linearized by digestion with a suitable restriction endonuclease (s). The linearized vector is then treated with bacterial alkaline phosphatase or calf intestinal phosphatase as a preference for autoligation during the ligation step.

„Preparace DNA z buněk znamená isolaci plasmidové DNA z kultury hostitelských buněk. Obvykle používané metody DNA preparace jsou preparace ve velkém nebo malém měřítku, popsané v sekcích 1.25 - 1.33. Sambrook a kol., viz výše. Po preparaci může být DNA purifikována metodami v oboru dobře známými, které jsou popsány v sekci 1.40 Sambrook s kol., viz výše."Preparation of DNA from cells means isolation of plasmid DNA from a host cell culture. Commonly used DNA preparation methods are large or small-scale preparations described in sections 1.25-1.33. Sambrook et al., Supra. After preparation, the DNA can be purified by methods well known in the art, as described in section 1.40 of Sambrook et al., Supra.

„Oligonukleotidy jsou krátké, jedno- nebo dvouvláknové polydeoxynukleotidy, které jsou chemicky syntetizovány známými metodami (jako je fosfotriensterová, fosfitová nebo fosforamiditová chemie, s použitím technik na pevné fázi jak je popsáno v EP 266, 032 publikovaném 4. kvěna 1988, nebo přes deoxynukleositové H-fosfonátové intermediáty jak je popsáno Froehlerem a kol., Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407 [1986]. Další metody zahrnují reakci polymerasových řetězců definovanou níže a další autoprimerové metody a oligonukleotidové syntézy na pevných nosičích. Všechny tyto metody jsou popsány v Engels a kol., Agnew. Chem. Ing. Ed. Eng., 28: 716-734 (1989). Tyto metody jsou použity, pokud je známá celá sekvence nukleových kyselin genu, nebo je vhodná sekvence nukleové kyseliny komplementární kódujícímu vláknu. Nebo pokud je známá cílová aminokyselinová sekvence, můžeme odvodit potenciální aminokyselinovou sekvenci s použitím známých a preferovaných kódujících zbytků pro každý aminokyselinový zbytek. Poté jsou oligonukleotidy purifikovány na polyakrylamidových gelech.Oligonucleotides are short, single or double stranded polydeoxynucleotides that are chemically synthesized by known methods (such as phosphotrienster, phosphite or phosphoramidite chemistry, using solid phase techniques as described in EP 266,032 published May 4, 1988, or via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates as described by Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407 [1986] Other methods include the polymerase chain reaction defined below and other autoprimer methods and oligonucleotide syntheses on solid supports. described in Engels et al., Agnew Chem., Ed. Eng., 28: 716-734 (1989) These methods are used when the entire nucleic acid sequence of the gene is known or a suitable nucleic acid sequence is complementary to the coding strand. Or, if the target amino acid sequence is known, we can deduce a potential amino acid sequence using known and preferred coding residues for each amino acid residue. Then the oligonucleotides are purified on polyacrylamide gels.

„Polymerasová řetězová reakce nebo „PCR znamená postup nebo techniku kde malé množství specifické části nukleové kyseliny, RNA a/nebo DNA, je prodlouženo jak popisuje v U.S. Patent č. 4,683,195 vydaný 28. července 1987. Obecně, musí být dostupné sekvenční informace z konců regionu, který nás zajímá nebo který je třeba, takže mohou být zkonstruovány oligonukleotidové primery; tyto primery budou indentické nebo sekvenčně podobné k protějšímu řetězci šablony, která má být prodloužena. 5' koncové nukleotidy dvou primerů se mohou shodovat s konci prodlužovaného materiálu. PCR může být použita k prodloužení specifických RNA sekvencí, specifických DNA sekvencí z celkové genomické DNA a cDNA transkribované z celkové buněčné RNA, bakteriof agových nebo plasinidových sekvencí, atd. Viz obecně Mullis a kol., Cold Spring Harbor Symp. Quant. biol., 51: 263 [1987]; Erlich, editor, PCR Technology, (Stockrton Press, NY, 1989) . Jak je zde použita, PCR je považována za jeden, ne však ¹ jediný, příklad metody polymerasové reakce nukleových kyselin, pro prodloužení testovaného vzorku nukleové kyseliny zahrnujícího použití známé nukleové kyseliny jako primeru a polymerasy nukleových kyselin k prodloužení nebo přípravu specifické části nukleové kyseliny."Polymerase Chain Reaction" or "PCR" refers to a process or technique wherein a small amount of a specific portion of a nucleic acid, RNA and / or DNA, is extended as described in US Patent No. 4,683,195 issued July 28, 1987. In general, sequence information from the ends the region of interest or need, so that oligonucleotide primers can be constructed; these primers will be identical or sequentially similar to the opposite strand of the template to be extended. The 5 'terminal nucleotides of the two primers may coincide with the ends of the elongated material. PCR can be used to extend specific RNA sequences, specific DNA sequences from total genomic DNA, and cDNA transcribed from total cellular RNA, bacteriophage or plasinide sequences, etc. See generally Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 [1987]; Erlich, editor, PCR Technology, (Stockrton Press, NY, 1989). As used herein, PCR is considered to be one, but not the only ^one, example the polymerase reactions of nucleic acids, the elongation of the test sample nucleic acid comprising the use of a known nucleic acid as a primer and a nucleic acid polymerase to extend or prepare a specific portion of the nucleic acid.

„Náročné podmínky jsou (1) použití nízké iontové síly a vysoké teploty pro promývání, například 0,015 M NaCl/0,0015 M citrát sodný/0,1% NaDodS0₄ (SDS) při 50°C, nebo (2) použití denaturačních agens během hybridizace jako je formamid, například, 50% obj. formamidu s 0,1% hovězího sérového albuminu/0,1% Ficoll/0,1% polyvinylpyrrolidonu/50mM sodný fosfátový pufr při pH 6,5 s"Challenging conditions are (1) use of low ionic strength and high temperature for washing, for example 0.015 M NaCl / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% NaDodSO ₄ (SDS) at 50 ° C, or (2) use of denaturing agents during hybridization such as formamide, for example, 50% by volume of formamide with 0.1% bovine serum albumin / 0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50mM sodium phosphate buffer at pH 6.5 sec

750 mM NaCl, 75 mM citrát sodný při 42°C. Dalším příkladem je použití 50% formamidu, 5xSSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrát sodný), 50 mM fosfát sodný (pH 6,8), 0,1% pyrofosfát sodný, 5x Denhardtův roztok, ultrazvukovaná DNA z lososího spermatu (50 μς/πιΐ) , 0,1 SDS, a 10% dextran sulfátu při 42°C, s promytím při 42°C v 0,2 x SSC a 0,1% SDS.750 mM NaCl, 75 mM sodium citrate at 42 ° C. Another example is the use of 50% formamide, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5x Denhardt's solution, ultrasound salmon sperm DNA ( 50 μς / πιΐ), 0.1 SDS, and 10% dextran sulfate at 42 ° C, washing at 42 ° C in 0.2 x SSC and 0.1% SDS.

„Mírně náročné podmínky jsou popsány v Sambrook a kol., viz výše, a zahrnují použití promývacího roztoku a hybridizačních podmínek (např. teplota, intová síla a %SDS) méně náročných, než je popsáno výše. Příkladem mírně náročných podmínek jsou podmínky jako je inkubace přes noc při 37°C v roztoku obsahujícím: 20% formamidu, 5xSSC (150 mM NaCl, 15mM citrát trisodný), 50mM fosfát sodný (pH 7,6), 5xDenhardtův roztok, 10% dextran sulfát a 20 μΙ/ml denaturované DNA z lososího spermatu, a následné promytí filtru lxSSC při 37-50°C. Člověk vzdělaný v daném oboru dokáže posoudit nastavení teploty, iontové síly a pod., pokud bude nutné tyto faktory přizpůsobit délce vzorku a podobně.The milder conditions are described in Sambrook et al., Supra, and include the use of wash solution and hybridization conditions (e.g., temperature, intensity and% SDS) less demanding than described above. Examples of moderately challenging conditions are conditions such as overnight incubation at 37 ° C in a solution containing: 20% formamide, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate and 20 μΙ / ml denatured salmon sperm DNA, followed by washing the 1xSSC filter at 37-50 ° C. A person skilled in the art can judge the setting of temperature, ionic strength, etc., if these factors need to be adapted to the length of the sample and the like.

„Protilátky (Abs) a „imunoglobuliny (Igs) jsou glykoproteiny, které mají stejnou strukturální charakteristiku. Zatímco protilátky vykazují vazebnou specifitu ke specifickému antigenu, imunoglobuliny zahrnují jak protilátky tak molekuly podobné protilátkám, kterým chybí antigenní specifita. Polypeptidy druhého druhu jsou např. produkovány v nižších úrovních lymfatického systému a při zvyšování hladiny při myelomázách."Antibodies (Abs) and" immunoglobulins (Iggs) are glycoproteins having the same structural characteristics. While antibodies show binding specificity to a specific antigen, immunoglobulins include both antibodies and antibody-like molecules lacking antigen specificity. For example, polypeptides of the second species are produced at lower levels of the lymphatic system and at elevated levels in myelomases.

„Nativní protilátky a imunoglobuliny jsou obvykle heterotetramerické glykoproteiny kolem 150000 daltonů, složené ze dvou identických lehkých (L) řetězců a dvou identických těžkých (H) řetězců. Každý lehký řetězec je navázán na lehký řetězec jednou kovelentní disulfidovou vazbou, zatímco počet disulfidových vazeb mezi těžkými řetězci se liší u různých imunoglobulinových isotypů. Každý těžký a lehký řetězec také má pravidelné prostorové intrařetězcové disulfidové můstky. Každý těžký řetězec má na jednom konci variabilní doménu (Vh) následovanou množstvím konstantních domén. Každý lehký řetězec má variabilní doménu na jednom (V_L) a konstantní doménu na svém druhém konci; konstatní doména na lehkém řetězci je svázána s první konstantní doménou těžkého řetězce, a variabilní doména lehkého řetězce je svázána s variabilní doménou těžkého řetězce. Předpokládá se, že spojení mezi variabilními doménami lehkého a těžkého řetězce tvoří jednotlivé aminokyselinové zbytky (Clothia a kol., J. Mol. Biol., 186: 651-663 [1985]; Novotný a Haber, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 4592-4596 [1985]).“Native antibodies and immunoglobulins are usually heterotetrameric glycoproteins of about 150,000 daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to the light chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds between the heavy chains varies among different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has regular spatial intra-chain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain (V H) followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain at one (V _L ) and a constant domain at its other end; the constant domain on the light chain is linked to the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is linked to the heavy chain variable domain. Links between the light and heavy chain variable domains are believed to form individual amino acid residues (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-4596 [1985]).

Termín „variabilní znamená skutečnost, že některé části variabilních domén se významně liší v sekvenci mezi protilátkami a jsou použity k vazbě a specifitě každé jednotlivé protilátky pro její jednotlivý antigen. Ovšem variabilita není vždy lokalizována na variabilních doménách protilátek. Je soustředěna ve třech segmentech, nazývaných komplemetaritu determinující oblasti (CDR) nebo hypervariabilní regiony variabilních domén těžkého a lehkého řetězce. Nejvíce konzervované části variabilních domén jsou nazývány jako framework (FR). Variabilní domény nativních těžkých a lehkých řetězců obsahují každá čtyři FRoblasti, rozsáhlé konfigurace β-hřbetu, spojené třemi CDR, které tvoří smyčky, v některých případech jejich část, a spojují β-hřbety. CDR na každém řetězci drží pohromadě v těsné blízkosti FR regiony a s CDR z dalších řetězců tvoří formaci antigenního vazebného místa protilátky (viz Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest,The term "variable" refers to the fact that some portions of the variable domains differ significantly in sequence between antibodies and are used to bind and specific to each individual antibody for its individual antigen. However, variability is not always localized to antibody variable domains. It is concentrated in three segments, called complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable regions of the heavy and light chain variable domains. The most conserved portions of the variable domains are referred to as framework (FR). The variable domains of native heavy and light chains each contain four FR regions, extensive β-back configurations, joined by three CDRs that form loops, in some cases part thereof, and link β-backs. The CDRs on each strand hold together the FR regions in close proximity and form with the CDRs from other strands the formation of the antigen binding site of the antibody (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,

National Instutite of Heath, Bethesda, MD [1987]. Konstantní domény nejsou přímo zahrnuty do vazby protilátky na antigen, ale vykazují různé efektorové funkce, jako je participace protilátky v protilátkově-dependentní celulární toxicitě.National Institute of Heath, Bethesda, MD [1987]. The constant domains are not directly involved in the binding of the antibody to the antigen, but exhibit various effector functions, such as antibody participation in antibody-dependent cellular toxicity.

'Při papainové digesci protilátek vznikají dva identické antigenní vazebné fragmenty, nazývané „Fab fragmenty, každý s jedním antigenním vazebným místem, a resukuální „Fc fragment, jehož název odráží jeho schopnost snadno krystalizovat. Výsledkem pepsinového působení je F(ab')2 fragment, který má dvě antigenní kombinovaná místa a je stále schopný křížové vazby antigenu.Papain digestion of antibodies results in two identical antigen binding fragments, called "Fab fragments, each with a single antigen binding site," and a resuccal "Fc fragment" whose name reflects its ability to crystallize readily. Pepsin treatment results in an F (ab ') 2 fragment that has two antigenic combination sites and is still capable of cross-linking antigen.

„Fv je minimální protilátkový fragment, který obsahuje kompletní antigenní rozpoznávací a vazebné místo. Tato oblast se skládá z dimeru variabilních domén jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce v těsném, nekovalentním spojení. Je to konfigurace, kde tři CDR kažedé variabilní domény interagují a definují antigenní vazebné místo na povrchu V_H-V_L dimeru. Celkově šest CDR tvoří antigenní vazebnou specifitu protilátky. Ovšem každá jednotlivá variabilní doména (nebo polovina Fv obsahující pouze CDR specifické pro antigen) má schopnost rozpoznat a vázat antigen, ovšem s nižší afinitou než úplné vazebné místo.Fv is a minimal antibody fragment that contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of the variable domains of one heavy and one light chain in tight, non-covalent association. It is a configuration where three CDRs of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the V _H -V _L dimer. A total of six CDRs constitute the antigen binding specificity of the antibody. However, each individual variable domain (or half of an Fv containing only antigen-specific CDRs) has the ability to recognize and bind antigen, but with a lower affinity than the complete binding site.

Fab fragment také obsahuje konstantní doménu lehkého řetězce a první konstantní doménu (CH1) těžkého řetězce. Fab' fragmenty se liší od Fab fragmentů tím, že mají navíc několik zbytků na karboxykonci CH1 domén těžkého řetězce, včetně jedno nebo více cysteinů z protilátkové otočné oblasti. Fab'-SH je zde označení pro Fab', v kterém cysteinové zbytky konstantních domén nesou volnou thiolovou skupinu. F(ab')2 protilátkové fragmenty jsou produkovány jako páry Fab' fragmentů, které mají mezi sebou cysteinové spoje. Jsou známé i další chemické páry protilátkových fragmentů.The Fab fragment also contains the light chain constant domain and the first heavy chain constant domain (CH1). Fab 'fragments differ from Fab fragments in that they additionally have several residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domains, including one or more cysteines from the antibody turntable region. Fab'-SH is the designation herein for Fab ', in which the cysteine residues of the constant domains carry a free thiol group. F (ab ') 2 antibody fragments are produced as pairs of Fab' fragments having cysteine junctions between them. Other chemical pairs of antibody fragments are known.

„Lehké řetězce protilátek (imunoglobulinů) jakéhokoliv druhu mohou být označeny jako jeden ze dvou zřetelně se lišících typů, nazývaných kappa a lambda (λ) , založených na aminokyselinových sekvencích jejich konstantních domén.“Light chains of antibodies (immunoglobulins) of any kind can be labeled as one of two distinctly different types, called kappa and lambda (λ), based on the amino acid sequences of their constant domains.

V závislosti na aminokyselinové sekvenci konstantní domény jejich těžkého řetězce mohou být imunoglobuliny rozděleny do různých tříd. Existuje pět hlavních tříd imunoglobulinů: IgA, IgD, IgE, IgG a IgM, a některé z nich jsou dále rozděleny do podtříd (isotypů), např. IgG-1, IgG2, IgG-3 a IgG-4; IgA-1 a IgA-2. Konstantní domény těžkého řetězce, které odpovídají různým třídám imunoglogulinů, se nazývají a, delta, epsilon, γ a μ. Podjednotkové struktury a trojrozměrné konfigurace jednotlivých skupin imunoglobulinů jsou dobře známy.Depending on the amino acid sequence of their heavy chain constant domain, immunoglobulins can be divided into different classes. There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and some of them are subdivided into subclasses (isotypes), eg IgG-1, IgG2, IgG-3 and IgG-4; IgA-1 and IgA-2. The heavy chain constant domains that correspond to different classes of immunoglogulins are called α, delta, epsilon, γ, and μ. The subunit structures and three-dimensional configurations of individual immunoglobulin groups are well known.

Termín „protilátka je používán v obsáhlém významu a specificky vyjadřuje jednotlivé monoklonální protilátky (včetně agonistů a antagonistů protilátek), protilátkové směsi s polyepitopickou specifitou, stejně jako protilátkové fragmenty (např. Fab, F(ab')₂, a Fv) , pokud vykazují požadovanou biologickou aktivitu.The term "antibody" is used extensively and specifically refers to individual monoclonal antibodies (including antibody agonists and antagonists), antibody mixtures with polyepitopic specificity, as well as antibody fragments (eg, Fab, F (ab ') ₂ , and Fv) when they exhibit desired biological activity.

Termín „monoklonální protilátka zde označuje protilátku získanou z populace substanciálně homogenních protilátek, tj. populace obsahující individuální protilátky,které jsou identické kromě nožných přirozeně se vyskytujících mutací, které se mohou vyskytnou v minoritním množství. Monoklonální protilátky jsou vysoce specifické, jsou směrovány proti jednotlivému antigennímu místu. Dále na rozdíl od preparátů polyklonálních protilátek, které obvykle zahrnují různé protilátky, směrované proti různým determinantám (epitopům), každá monoklonální protilátka je směrována proti jedné determinantě antigenu. Dále k jejich specifitě, monoklonální protilátky jsou výhodně proto, že jsou syntetizovány hybridomovou kulturou, nejsou kontaminovány jinými imunoglobuliny. Přívlastek „monoklonální označuje charakter protilátky, znamená to, že byla získána ze substanciálně homogenní populace protilátek a požadovaná protilátka nebyla připravena žádnou jinou metodou. Například monoklonální protilátky používané podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny hybridomovou metodou poprvé popsanou Kohlerem a Milsteinem, Nátuře, 256: 495 (1975), nebo připraveny rekombinantní DNA metodou (viz, např. U.S. Patent č. 4.816.567 [Cabillz a kol.].The term "monoclonal antibody" as used herein refers to an antibody derived from a population of substantially homogeneous antibodies, ie populations containing individual antibodies that are identical except for the naturally occurring foot mutations, which may occur in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against a single antigenic site. Further, unlike polyclonal antibody preparations, which usually include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against one antigen determinant. In addition to their specificity, monoclonal antibodies are preferably because they are synthesized by a hybridoma culture and are not contaminated with other immunoglobulins. The term "monoclonal" refers to the nature of the antibody, that is, it was obtained from a substantially homogeneous population of antibodies and the desired antibody was not prepared by any other method. For example, the monoclonal antibodies used in the present invention may be prepared by the hybridoma method first described by Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975), or prepared by recombinant DNA method (see, eg, US Patent No. 4,816,567 [Cabillz et al.] .

Monoklonální protilátky zde zahrnují zejména „chimérické protilátky (imunoglobuliny), v kterých část lehkého a/nebo těžkého řetězce je identická nebo homologní k odpovídajícím sekvencím v protilátkách odvozených z konkrétních druhů nebo patřících ke konkrétní třídě nebo podtřídě protilátek, zatímco zbytek řetězce (řetězců) je identický nebo homologní k odpovídajícím sekvencím v protilátkách odvozených z jiných druhů nebo patřících k jiné třídě nebo podtřídě protilátek, stejně jako k fragmentům těchto protilátek, pokud vykazují požadovanou biologickou aktivitu (U.S. Patent č. 4,816,567 (Cabilly a kol.); a Morrison a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]) .In particular, monoclonal antibodies include "chimeric antibodies (immunoglobulins) in which a portion of the light and / or heavy chain is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular class or subclass of antibodies, while the rest of the chain (s) is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies derived from other species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as fragments of these antibodies, when they exhibit the desired biological activity (US Patent No. 4,816,567 (Cabilly et al.); and Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]).

„Humanizované formy non-humánních (např. myších) protilátek jsou chimérické imunoglobuliny, imunuglobulinové řetězce nebo jejich fragmenty (jako jsou Fv, Fab, Fab', F(ab')2 nebo další antigen-vážící subsekvence imunoglobulinu) které obsahují minimálně sekvenci odvozenou z non-humánního imunoglobulinu. Z největší části jsou humanizované protilátky lidské imunoglobuliny (příjemcové protilátky) v kterých zbytky koomplementárních determinujících regionů (CDR) příjemce jsou nahrazeny zbytky CDR non-humánních druhů (donorové protilátky) jako jsou myší, krysí nebo králičí, které mají požadovanou specifitu, afinitu a kapacitu. V některých případech Fv rámcové zbytky lidského imunoglubulinu jsou nahrazeny odpovídajícími non-humánními zbytky. Dále, humanizované protilátky mohou obsahovat zbytky, které se nenachází ani v příjemcové protilátkce ani v importované CDR nebo rámcové sekvenci. Tyto modifikace jsou provedeny kvůli další optimalizaci protilátkové specifity. Obecně, humanizované protilátky budou zahrnovat substanciálně všechny protilátky s nejméně jednou a obvykle dvěma variabilními doménami, u kterých všechny nebo substanciálně všechny CDR řégiony odpovídají těmto regionům non-humánních imunoglobulinu a všechny nebo substanciálně všechny FR regiony odpovídají těmto regionům humánní imunoglobulinové shodné sekvence. Humanizované protilátky optimálně také obsahují nejméně část imunoglobulinové konstantního regionu (Fc), obvykle lidského imunoglobulinu. Další podrobnosti viz: Jonés a kol., Nátuře, 321. 522-525 [1986]; Reichmann a kol., Nátuře, 332: 323-329 [1988]; a Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 [1992]."Humanized forms of non-human (eg, murine) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunuglobulin chains or fragments thereof (such as Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 or other antigen-binding immunoglobulin subsequences) that contain at least a sequence derived from a non-human immunoglobulin. For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibodies) in which the residues of the complementary determining regions (CDRs) of the recipient are replaced by CDR residues of non-human species (donor antibodies) such as mouse, rat or rabbit having the desired specificity, affinity and capacity. . In some instances, the Fv framework residues of the human immunoglubulin are replaced by corresponding non-human residues. Further, humanized antibodies may comprise residues that are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequence. These modifications are made to further optimize antibody specificity. In general, humanized antibodies will include substantially all antibodies with at least one and usually two variable domains in which all or substantially all of the CDR regions correspond to these regions of non-human immunoglobulins and all or substantially all FR regions correspond to these regions of human immunoglobulin consensus sequence. Optimally, humanized antibodies also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically a human immunoglobulin. For further details see: Jones et al., Nature, 321. 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 [1988]; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

„Non-imunogenní pro člověka znamená, že po kontaktu polypeptidů, ve farmaceuticky přijatelném nosiči a v terapeuticky účinném množství, s vhodnou lidskou tkání se neobjeví žádný projev sensitivity nebo resistence k polypeptidů po druhé dávce polypeptidů po vhodné latentní periodě (např. 8 až 14 dní)."Non-immunogenic to humans" means that upon contact of the polypeptides, in a pharmaceutically acceptable carrier and in a therapeutically effective amount, with appropriate human tissue, there is no manifestation of sensitivity or resistance to the polypeptides after a second dose of polypeptides after a suitable latent period (e.g. days).

II. Preferovaná provedení vynálezuII. Preferred embodiments of the invention

Preferované polypeptidy tohoto vynálezu jsou substanciálně homogenní polypeptidy, vztahující se k mpl ligandu (ligandům) nebo trombopoetinu (TPO), který vykazuje schopnost vazby na mpl, člena receptorové cytokinové skupiny, a má biologickou schopnost stimulace inkorporace značených nukleotidů (³H-thymidin) do DNA IL-3 dependentních Ba/F3 buněk transfektovaných lidským mpl P. Více preferované mpl ligandy jsou izolované savčí proteiny, které mají hematopoetickou, zvláště megakaryopoetickou nebo trombopoetickou aktivitu - konkrétně jsou schopné stimulovat proliferaci, zrání a/nebo diferenciaci nezralých megakaryocytů nebo jejich předchůdců na zralou destičkyprodukující formu. Nejvíce preferované polypeptidy tohoto vynálezu jsou lidské mpl ligandy včetně jejich fragmentů, které mají hematopoetickou, megakaryocytopoetickou nebo trombopoetickou aktivitu. Nepovinně tyto lidské mpl ligandy postrádají glykosylaci. Další preferované lidské mpl ligandy jsou „EPO-domény hML označované jako hMLi53 nebo hTPOi.53, zkrácené formy hML označované jako hML245 nebo hTPO₂₄5 a zralý polypeptid plné délky, který má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1), označovaný jako hML, hML₃₃₂ nebo ΙΊΤΡΟ332 a biologicky aktivní substitucionální varianty hML(R153A, R154A).Preferred polypeptides of the invention are substantially homogeneous polypeptides related to mpl ligand (s) or thrombopoietin (TPO), which exhibits the ability to bind to mpl, a member of the receptor cytokine moiety, and has the biological ability to stimulate incorporation of labeled nucleotides ( ³ H-thymidine) into IL-3 dependent Ba / F3 cells DNA transfected with human mpl P. More preferred mpl ligands are isolated mammalian proteins having hematopoietic, particularly megakaryopoietic or thrombopoietic activity - specifically capable of stimulating the proliferation, maturation and / or differentiation of immature megakaryocytes or their predecessors into a mature plate producing a form. The most preferred polypeptides of the invention are human mpl ligands including fragments thereof having hematopoietic, megakaryocytopoietic or thrombopoietic activity. Optionally, these human mpl ligands lack glycosylation. Another preferred human mpl ligands are the "EPO-domain hML called hMLi53 or hTPOi.53, truncated forms of hML referred to as hML245 or hTPO ₂₄ 5 and the mature full length polypeptide having the amino acid sequence shown in Fig. 1 (SEQ ID NO: 1), referred to as hML, hML ₃₃₂ or 32332, and biologically active hML substitution variants (R153A, R154A).

Nepovinně preferované polypeptidy tohoto vynálezu jsou biologicky nebo imunologicky aktivní varianty mpl ligandu vybrané ze skupiny skládající se z: hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML a pML2.Optionally preferred polypeptides of the invention are biologically or immunologically active variants of mpl ligand selected from the group consisting of: hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML and pML2.

Nepovinně preferované polypeptidy tohoto vynálezu jsou biologicky aktivní varianty mpl ligandu, jejichž aminokyselinová sekvence má nejméně 70% aminokyselinovou sekvenční identitu s lidským mpl ligandem (viz Obr. 1 [SEQ ID NO: 1], myším mpl ligandem (viz Obr. 16 [SEQ ID NO: 12 a 13], rekombinantním vepřovým mpl ligandem isolovaným z aplastické vepřové plasmy, výhodně nejméně 75%, výhodněji nejméně 80%, ještě výhodněji nejméně 85%, ještě více výhodněji nejméně 90% a nej výhodněji nejméně 95%.Optionally preferred polypeptides of the invention are biologically active variants of the mpl ligand whose amino acid sequence has at least 70% amino acid sequence identity to the human mpl ligand (see Figure 1 [SEQ ID NO: 1], the mouse mpl ligand (see Figure 16 [SEQ ID NO)). NO: 12 and 13], a recombinant porcine mpl ligand isolated from aplastic porcine plasma, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably at least 90% and most preferably at least 95%.

Mpl ligand isolovaný z aplastické vepřové plasmy má následující charakteristiky:Mpl ligand isolated from aplastic porcine plasma has the following characteristics:

1. Parciálně purifikovaný ligand eluovaný z gelové filtrační kolony buď v PBS, PBS obsahující 0,1% SDS nebo PBS obsahující 4M MgCl2 s Mr 60000 až 70000;A partially purified ligand eluted from a gel filtration column in either PBS, PBS containing 0.1% SDS or PBS containing 4M MgCl 2 with a Mr 60000 to 70000;

2. Ligandové aktivita je zrušena pronasou;2. Ligand activity is abolished by pronase;

3. Ligand je stabilní do nízkého pH (2,5), SDS do 0,1% a 2M močoviny3. The ligand is stable to low pH (2.5), SDS to 0.1% and 2M urea

4. Ligand je glykoprotein, na základě jeho vazby na různé lektinové kolony;4. The ligand is a glycoprotein, based on its binding to various lectin columns;

5. Vysoce purifikovaný ligand je eluován z neredukující SDS-PAGE s Mr 25000 až 35000. Menší množství aktivity také eluováno Mr 18000, 22000 a 60000;5. The highly purified ligand is eluted from non-reducing SDS-PAGE with a Mr 25000 to 35000. Smaller amounts of activity also eluted with Mr 18000, 22000 and 60000;

6. Vysoce purifikovaný ligand se objevil na redukující SDSPAGE jako dublet s Mr 28000 a 31000;6. The highly purified ligand appeared on reducing SDSPAGE as a doublet with Mr 28000 and 31000;

7. Aminokoncová sekvence pásů 18000-22000, 28000 a 31000' je stejná - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR(SEQ ID NO:29); aThe amino-terminal sequence of the bands 18000-22000, 28000, and 31000 'is the same - SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 29); and

8. Ligand se váže a eluuje z následujících afinitních kolon Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lentil lektin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether 650m Toyopearl, Butyl 650m Toyopearl, Fenyl 650m Toyopearl a Fenyl-Sepharose.8. The ligand binds and elutes from the following Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether 650m Toyopearl, Butyl 650m Toyopearl, Phenyl 650m Toyopearl and Phenyl-Sepharose.

Výhodnější mpl ligandové polypeptidy jsou kódovány lidskou genomickou nebo cDNA, která má aminokyselinovou sekvenci popsanou na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1).More preferred mpl ligand polypeptides are encoded by human genomic or cDNA having the amino acid sequence described in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).

Další preferované přirozeně se vyskytující biologicky aktivní mpl ligandové polypeptidy tohoto vynálezu zahrnují prepro-mpl ligand, pro-mpi ligand, zralý mpl ligand, fragmenty mpl ligandu a jejich glykosylované varianty.Other preferred naturally occurring biologically active mpl ligand polypeptides of the invention include prepro-mpl ligand, pro-mpi ligand, mature mpl ligand, mpl ligand fragments, and glycosylated variants thereof.

Ještě další preferované polypeptidy tohoto vynálezu zahrnují mpl ligandové sekvenční varianty a chiméry. Obvykle preferované mpl ligandové sekvenční varianty a chiméry jsou biologicky aktivní mpl ligandové varianty, které mají nejméně 70% aminokyselinovou sekvenční identitu s lidským mpl ligandem nebo mpl ligandem isolovaným z aplastické vepřové plasmy, výhodně nejméně 75%, výhodněji nejméně 80%, ještě výhodněji nejméně 85%, ještě více výhodněji nejméně 90% a nej výhodněji nejméně 95%. Zvláště preferovanou variantou mpl ligandu je N-koncová doména hML varianty (označovaná jako „EPO-doména pro její sekvenční homologii s erythropoetinem). Preferovaná hML EPO-doména obsahující prvních 153 aminokyselinových zbytků zralého hML a je označována jako hML 153. Nepovinně preferovaná hML sekvenční varianta zahrnuje variantu, kde jedna nebo více basických nebo dibasických aminokyselinových zbytků v Ckoncové doméně jsou substituovány nebasickými aminokyselinovými zbytky (např. hydrofobními, neutrálními, kyselými, aromatickými, Gly, Pro atd.). Preferovaná sekvenční varianta hML C-koncové domény zahrnuje variantu, kde Arg zbytky 153 a 154 jsou zaměněny za zbytky Ala. Tato varianta je označována jako hML332 (R153A, R154A) . Jiná preferovaná hML varianta zahrnuje buď I1ML332 nebo hMLi₅3, kde aminokyselinové zbytky 111-114 (QLPP nebo LPPQ) jsou vynechány nebo nahrazeny jinou tetrapeptidovou sekvencí (např. AGAG nebo podobnou). Následující deleční mutanti jsou označováni jako Á4hML332 nebo 4hMLi53.Still other preferred polypeptides of the invention include mpl ligand sequence variants and chimeras. Typically preferred mpl ligand sequence variants and chimeras are biologically active mpl ligand variants having at least 70% amino acid sequence identity to human mpl ligand or mpl ligand isolated from aplastic porcine plasma, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85 %, even more preferably at least 90% and most preferably at least 95%. A particularly preferred variant of the mpl ligand is the N-terminal domain of the hML variant (referred to as the "EPO-domain for its sequence homology with erythropoietin). The preferred hML EPO-domain comprising the first 153 amino acid residues of mature hML and is referred to as hML 153. An optional preferred hML sequence variant comprises a variant wherein one or more of the basic or dibasic amino acid residues in the End-Domain are substituted with non-basic amino acid residues (e.g. , acidic, aromatic, Gly, Pro, etc.). A preferred sequence variant of the hML C-terminal domain comprises a variant wherein Arg residues 153 and 154 are exchanged for Ala residues. This variant is referred to as hML332 (R153A, R154A). Another preferred hML variant comprises either I1ML332 hMLi ₅ or 3, wherein the amino acid residues 111-114 (QLPP or LPPQ) are eliminated or replaced with other tetrapeptide sequences (e.g. Agag or similar). The following deletion mutants are referred to as 44hML332 or 4hML153.

Preferovaná chiméra je fúze mezi mpl ligandem nebo jeho fragmentem (definovaným výše) s heterologním polypeptidem nebo jeho fragmentem. Například, hML153 může být fúzován do IgG fragmentu, aby se zlepšil sérový poločas, nebo do IL-3, G-CSF nebo EPO, aby vznikla molekula s -vyšší tombopoetickou nebo chimérickou hematopoetickou aktivitou.A preferred chimera is a fusion between an mpl ligand or fragment thereof (as defined above) with a heterologous polypeptide or fragment thereof. For example, hML153 can be fused to an IgG fragment to improve serum half-life, or to IL-3, G-CSF or EPO to produce a molecule with the highest tombopoietic or chimeric hematopoietic activity.

Jinou preferovanou lidskou mpl ligandovou chimérou je „ML-EPO doménová chiméra, která se skládá z N-koncových zbytků 153 až 157 hML substituovaných jedním nebo více, ale ne všemi, lidskými EPO zbytky, jak je naznačeno na Obr. 10 (SEQ ID NO: 7) . V tomto provedení by byla hML chiméra dlouhá 153-166 zbytků, kdy jednotlivé zbytky nebo bloky zbytků z lidské EPO sekvence jsou přidány nebo substituovány do hML sekvence v pozicích odpovídajícím tomu, jak je naznačeno na Obr. 10 (SEQ ID NO: 6). Příklad blokových sekvenčních insertů do N-koncové části hML může zahrnovat jeden nebo více N-glykosylovaných míst v pozicích (EPO) 24-27, 38-40 a 83-85; jeden nebo více než čtyři předpokládané alifatické α-helikální závity v polohách (EPO) 9-22, 56-76, 90-107 a 132-152; a další vysoce rigidní oblasti zahrnující N-terminální a C-terminální oblasti a zbytky v polohách (EPO) 44-52 (viz např. Wen a kol., Blood, 82: 1507-1516 [1993] a Boissel a kol., J. Biol. Chem., 268(21): 15983-15993 [1993]). U této „ML-EPO doménové chiméry se předpokládá, že bude mít smíšenou trombopoeticko-erythropoetickou (TEPO) biologickou aktivitu.Another preferred human mpl ligand chimera is the ML-EPO domain chimera, which consists of the N-terminal residues 153-157 of hML substituted by one or more, but not all, human EPO residues, as indicated in FIG. 10 (SEQ ID NO: 7). In this embodiment, the hML chimera would be 153-166 residues long, wherein individual residues or blocks of residues from the human EPO sequence are added or substituted to the hML sequence at positions as indicated in FIG. 10 (SEQ ID NO: 6). An example of block sequence inserts into the N-terminal portion of hML may include one or more N-glycosylated sites at positions (EPO) 24-27, 38-40 and 83-85; one or more than four predicted aliphatic α-helical threads at (EPO) positions 9-22, 56-76, 90-107 and 132-152; and other highly rigid regions including N-terminal and C-terminal regions and residues at positions (EPO) 44-52 (see, eg, Wen et al., Blood, 82: 1507-1516 [1993] and Boissel et al., J Biol. Chem., 268 (21): 15983-15993 [1993]). This ML-EPO domain chimera is expected to have mixed thrombopoietic-erythropoietic (TEPO) biological activity.

Další preferované polypeptidy tohoto vynálezuzahrnují mpl ligandové fragmenty, které mají po sobě jdoucí sekvence nejméně 10, 15, 20, 25, 30 nebo 40 aminokyselinových zbytků, které jsou identické se sekvencemi mpl ligandu izololovaného z aplastické vepřové plasmy nebo lidského mpl ligandu zde popsaného (viz např. Tab. 14, Příklad 24) . Preferovaný fragment mpl ligandu je lidský ML[1-X], kde X je 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 nebo 245 (viz Obr. 1 [SEQ ID NO:1] pro sekvenci zbytku 1-X]). Další preferované fragmenty mpl ligandu zahrnují fragmenty, které jsou produkovány jako výsledek chemické nebo enzymatické hydrolýzy nebo digesce purifikovaného ligandu.Other preferred polypeptides of the invention include mpl ligand fragments having consecutive sequences of at least 10, 15, 20, 25, 30 or 40 amino acid residues that are identical to the mpl ligand sequences isolated from aplastic porcine plasma or the human mpl ligand described herein (see, e.g. eg Table 14, Example 24). A preferred mpl ligand fragment is human ML [1-X], wherein X is 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 or 245 (see Figure 1 [SEQ ID NO: 1] for residue sequence 1-X] ). Other preferred mpl ligand fragments include fragments that are produced as a result of chemical or enzymatic hydrolysis or digestion of the purified ligand.

Dalším preferovaným aspektem vynálezu je metoda purifikacemolekul mpl ligandů kontaktem zdroje mpl ligandu obsahujícího molekuly mpl ligandu s zmobilizovaným receptorovým polypeptidem, konkrétně s mpl nebo mpl fúzním polypeptidem, za podmínek, kdy molekuly mpl ligandu, které mají být purifikovány, jsou selektivně adsorbovány na imobilizovaný receptorový polypeptid, nosič je promyt, aby byl odstraněn neadsorbovaný materiál, a molekuly, které mají být purifikovány, jsou eluovány z imobilizovaného receptorového polypeptidu elučním pufrem.Another preferred aspect of the invention is a method of purifying mpl ligand molecules by contacting an mpl ligand source comprising mpl ligand molecules with a mobilized receptor polypeptide, particularly an mpl or mpl fusion polypeptide, under conditions where the mpl ligand molecules to be purified are selectively adsorbed to the immobilized receptor polypeptide. , the carrier is washed to remove unadsorbed material, and the molecules to be purified are eluted from the immobilized receptor polypeptide by elution buffer.

obsahujícím mpl ligand může být plazma, imobilizovaný receptor výhodně mpl-IgG fúze.containing the mpl ligand may be a plasma, immobilized receptor, preferably an mpl-IgG fusion.

Jinou možností je, že zdrojem obsahujícím mpl ligand je rekombinantní buněčná kultura, kde je koncentrace mpl ligandu buď v kultivačním médiu nebo v buněčném lysátu obecně vyšší než v plazmě nebo dalších přirozených zdrojích. Výše uvedenou mpl-IgG imunoafinitní metodu obvykle není nutné použít, mohou být použity běžnější metody purifikace proteinů, které jsou v dané oblasti dobře známy. Krátce, preferované purifikační metody k získání substanciálně homogenního mpl ligandu zahrnují: odstranění větších nečistot, buď hostitelských buněk nebo lýzováných fragmentů, např. centrifugací nebo ultrafiltrací; nepovinně mohou být proteiny koncentrovány komerčně dostupnýmAlternatively, the source containing the mpl ligand is a recombinant cell culture, wherein the concentration of the mpl ligand in either culture medium or cell lysate is generally higher than in plasma or other natural sources. The above mpl-IgG immunoaffinity method is usually not required, more conventional protein purification methods well known in the art may be used. Briefly, preferred purification methods to obtain a substantially homogeneous mpl ligand include: removing larger impurities, either host cells or lysed fragments, eg, by centrifugation or ultrafiltration; optionally, the proteins may be concentrated by commercially available

Zdroj em kde j e proteinovým koncentračním filtrem; následuje separace ligandu od dalších nečistot jedním nebo více kroky, které se skládají z; imunoafinitní chromatografie, iontové výměny (např. DEAE nebo matrice obsahující karboxymethylové nebo sulfopropylové skupiny), chromatografie na těchto materiálech - Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lektin-Sepharose, WHA-Sepharose, Con ASepharose, Ether Toypearl, Butyl Toypearl, Fenyl Toypearl, protein A Sepharose, SDS-PAGE, HPLC s reversní fází (např. silikagel s připojenými alifatickými skpinami) nebo Sephadexové molekulární síto nebo exkluzní chromatogafie, nebo precipitace v ethanolu nebo amonium sulfátu. Kterýkoliv předcházející krok může obsahovat inhibici proteolysy pomocí methylsulfonylfluoridu (PMSF).A source wherein the protein concentration filter; followed by separation of the ligand from the other impurities by one or more steps consisting of; immunoaffinity chromatography, ion exchange (eg DEAE or matrices containing carboxymethyl or sulfopropyl groups), chromatography on these materials - Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lentil lectin-Sepharose, WHA-Sepharose, Con ASepharose, Ether Toypearl, Butyl Toypearl, Phenyl Toypearl, Protein A Sepharose, SDS-PAGE, reverse phase HPLC (e.g., silica gel with aliphatic skins attached) or Sephadex molecular sieve or exclusive chromatogaphy, or precipitation in ethanol or ammonium sulfate. Any preceding step may include inhibition of proteolysis by methylsulfonyl fluoride (PMSF).

V dalším preferovaném provedení předkládaný vynález zahrnuje isolovanou protilátku schopnou vazby na,,, mpl ligand. Preferován mpl ligandové izolovaná protilátka je monoklonální (Kohler a Milstein, Nátuře, 256: 195-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon a kol., editoři, Vol. 13, Elsvier Science Publishers, Amsterdam [1985]; a Huse a kol., Science, 246: 1295-1281 [1989]). Preferovaná mpl liganďová izolovaná protilátka je protilátka, která se váže na mpl ligand s afinitou nejméně 10⁶ 1/mol. Výhoději se protilátka váže s afinitou nejméně 10⁷ 1/mol. Nej výhodněji protilátka proti mpl ligandu má jednu nebo více výše uvedených efektorových funkcí. Isolovaná protilátka schopná vázat mpl ligand může být nepovinně fúzována do sekundárního polypeptidu a protilátka nebo jejich fúze může být použita k izolaci nebo purifikaci mpl ligandu ze zdroje, jak bylo popsáno výše pro imobilizovaný mpl polypeptid. V dalším preferovaném aspektu tohoto provedení vynález zahrnuje způsob detekce mpl ligandu in vitro nebo in vivo zahrnující kontakt protilátky se vzorkem, zvláště vzorkem séra, u kterého se předpokládá obsah ligandu, a detekce, jestli se objeví vazba.In another preferred embodiment, the present invention comprises an isolated antibody capable of binding to an mpl ligand. A preferred mpl ligand isolated antibody is monoclonal (Kohler and Milstein, Nature, 256: 195-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Editors, Vol. 13, Elsvier Science Publishers, Amsterdam [ And Huse et al., Science, 246: 1295-1281 [1989]). A preferred mpl ligand isolated antibody is an antibody that binds to an mpl ligand with an affinity of at least 10 ⁶ L / mol. More preferably, the antibody binds with an affinity of at least 10 ⁷ L / mol. Most preferably, the anti-mpl ligand antibody has one or more of the above effector functions. An isolated antibody capable of binding an mpl ligand may be optionally fused to a secondary polypeptide, and the antibody or fusion thereof may be used to isolate or purify the mpl ligand from a source as described above for the immobilized mpl polypeptide. In another preferred aspect of this embodiment, the invention encompasses a method of detecting an mpl ligand in vitro or in vivo comprising contacting the antibody with a sample, particularly a serum sample suspected of containing ligand, and detecting whether binding occurs.

V dalším preferovaném provedení vynález zahrnuje izolaci molekuly nukleové kyseliny kódující mpl ligand nebo jeho fragment, kde molekula nukleové kyseliny může být značená nebo neznačená detekovatelnou skupinou, a molekula nukleové kyseliny má sekvenci, která je komplementární k molekule nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci kódující mpl ligand, nebo hybridizovaná za náročných nebo mírně náročných podmínek na molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci kódující mpl ligand. Preferovaná nukleová kyselina mpl ligandu je RNA nebo DNA, která kóduje biologicky aktivní mpl ligand vykazující nejméně 75% sekvenční identity, výhodněji nejméně 80%, ještě výhodněji nejméně 85%, ještě více výhodněji nejméně 90% a nejvýhodněji nejméně 95% sekvenční identity s lidským mpl ligandem. Více preferovanými isolovanými molekulami nukleové kyseliny jsou DNA sekvence kódující biologicky aktivní mpl ligand, vybrané ze skupiny, sestávající se z: (a) DNA založená na kódující oblasti savčího mpl ligandového genu (např. DNA obsahující nukleotidové sekvence uvedené na Obr. 1 (SEQ ID NO: 2), nebo její fagmenty); (b) DNA schopná hybridizace na DNA z bodu (a) za nejméně mírně náročných podmínek; a (c) DNA je degenerovaná na DNA definovanou v bodě (a) nebo (b) , což je výsledkem degenerace genetického kódu. Je pozorováno, že nové mpl ligandy zde popsané mohou být členy skupiny ligandů nebo citokinů, které mají vhodnou sekvenční identitu, když jejich DNA může hybridizovat s DNA, která je na Obr. 1 (SEQ ID NO: 2)(nebo komplementem nebo jejich fragmenty) za slabě až mírně náročných podmínek. Tedy další aspekty tohoto vynálezu zahrnují DNA, která hybridizuje za mírně slabě až mírně národních podmínek s DNA kódující mpl ligandové polypeptidy.In another preferred embodiment, the invention comprises isolating a nucleic acid molecule encoding the mpl ligand or fragment thereof, wherein the nucleic acid molecule may be labeled or unlabeled with a detectable moiety, and the nucleic acid molecule has a sequence that is complementary to a nucleic acid molecule comprising a sequence encoding mpl ligand. , or hybridized under stringent or moderately stringent conditions to a nucleic acid molecule comprising a sequence encoding an mpl ligand. A preferred mpl ligand nucleic acid is RNA or DNA that encodes a biologically active mpl ligand having at least 75% sequence identity, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% sequence identity to human mpl ligand. More preferred isolated nucleic acid molecules are DNA sequences encoding a biologically active mpl ligand selected from the group consisting of: (a) DNA based on the coding region of a mammalian mpl ligand gene (e.g., DNA containing the nucleotide sequences shown in Figure 1 (SEQ ID NO); NO: 2), or phagments thereof); (b) DNA capable of hybridizing to the DNA of (a) under at least moderately severe conditions; and (c) the DNA is degenerate to the DNA defined in (a) or (b) as a result of the degeneracy of the genetic code. It is observed that the novel mpl ligands described herein may be members of a family of ligands or citokines having a suitable sequence identity when their DNA can hybridize to the DNA shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) (or complement or fragments thereof) under mild to moderate conditions. Thus, other aspects of the invention include DNA that hybridizes under mild to moderate national conditions to DNA encoding mpl ligand polypeptides.

V dalším preferovaném provedení vynálezu je molekula nuk-leové kyseliny cDNA kódující mpl ligand a dále zahrnuje replikovatelný vektor, v kterém je cDNA oddělitelně navázána na kontrolní sekvence rozpoznané vektorem transformovaným hostitelem. Tento aspekt dále zahrnuje hostitelské buňky transformované vektorem a metodu použití cDNA k ovlivnění produkce mpl ligandu, zahrnující expresi cDNA kódující mpl ligand v kultuře transformovaných hostitelských buněk a odstranění mpl ligandu z hostitelské buněčné kultury. Mpl ligand připravený tímto způsobem je výhodně substanciálně homogenní lidský mpl ligand. Preferované hostitelské buňky pro produkci mpl ligandu jsou buňky vaječníků čínských křečků Chinese hamster ovary (CHO).In another preferred embodiment of the invention, the nucleic acid molecule is a cDNA encoding the mpl ligand and further comprises a replicable vector in which the cDNA is severably linked to control sequences recognized by the host transformed vector. This aspect further includes vector-transformed host cells and a method of using cDNA to effect mpl ligand production, comprising expressing the cplNA encoding the mpl ligand in a transformed host cell culture and removing the mpl ligand from the host cell culture. The Mpl ligand prepared in this manner is preferably a substantially homogeneous human mpl ligand. Preferred host cells for mpl ligand production are Chinese hamster ovary (CHO) cells.

Vynález dále zahrnuje preferované metody léčení savců, kteří trpí imunologickým nebo hematopoetickým onemocněním, zejména trombocytopenií, zahrnující podávání terapeuticky účinného množství mpl ligandu savci. Nepovinně je mpl ligand podáván v kombinace s cytokinem, zvláště kolony-stimulujícím faktorem nebo interleukinem. Preferované kolony-stimulující faktory nebo interleukiny zahrnují: kit-ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 nebo IL-11.The invention further encompasses preferred methods of treating a mammal suffering from an immunological or hematopoietic disease, particularly thrombocytopenia, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of an mpl ligand. Optionally, the mpl ligand is administered in combination with a cytokine, particularly a column-stimulating factor or interleukin. Preferred column-stimulating factors or interleukins include: kit-ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL -7, IL-8, IL-9, or IL-11.

III. Způsoby provedeníIII. Methods of implementation

Mnoho autorů se dlouho domnívalo, že produkce destiček je kontrolovaná mnohočetnými kmenově specifickými humorálními faktory. Bylo zjištěno, že dvě různé cytikinové trombopoetin diferenciaciMany authors have long believed that platelet production is controlled by multiple stem-specific humoral factors. It was found that two different cytikine thrombopoietin differentiation

Exp. Acta Exp.Exp. Acta Exp.

aktivity, označené jako megakaryocytový kolony-stimulující faktor (meg-CSF) a trombopoetin, regulují megakaryocytopoesu a trombopoesu (Williams a kol., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982] Williams a kol., Blood Cells, 15: 123-133 [1989]; a Gordon a kol., Blood, 80. 302-307 [1992]). Podle těchto hypotéz, meg-CSF stimuluje proliferaci progenitorových megakaryocytů, zatímco v první řadě ovlivňuje zrání nebo další buněk a omezeně· uvolňování destiček. Od šedesátých let dvacátého století byla dobře dokumentována indukce, vznik a výskyt aktivit meg-CSF a trombopoetinu v plasmě, séru a moči zvířat a lidí a následné trombocytopenické příhody (Oděli a kol., Proč. Soc.activities referred to as megakaryocyte column-stimulating factor (meg-CSF) and thrombopoietin regulate megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982] Williams et al., Blood Cells, 15 : 123-133 [1989] and Gordon et al., Blood, 80, 302-307 [1992]). According to these hypotheses, meg-CSF stimulates proliferation of progenitor megakaryocytes, while primarily affecting maturation or other cells and limited platelet release. Since the 1960s, the induction, formation and occurrence of meg-CSF and thrombopoietin activities in plasma, serum and urine of animals and humans and the subsequent thrombocytopenic episode have been well documented (Odessa et al., Proc. Soc.

Biol. Med., 108: 428-431 [1961], Nakeff a kol.,Biol. Med., 108: 428-431 [1961], Nakeff et al.

Haematol., 54: 340-344 [1975]; Specter, Proč. Soc.Haematol., 54: 340-344 [1975]; Specter, Why. Soc.

Biol., 108: 146-149 [1961]; Schreiner a kol., J. Clin.Biol., 108: 146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin.

Invest., 49: 1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44: 605-608 [1974]; Hoffman a kol., N. Engl. J. Med., 305: 533 [1981]; Straneva a kol., Exp. Hematol., 17:1122-1127 [1988]; Mazur a kol., Exp. Hematol., 13: 1164 [1985]; Mazur a kol., J.Invest., 49: 1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44: 605-608 [1974]; Hoffman et al., N. Engl. J. Med., 305: 533 [1981]; Straneva et al., Exp. Hematol., 17: 1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp. Hematol., 13: 1164 [1985]; Mazur et al., J.

Clin. Invest. 68: 733-741 [1981]; Sheiner a kol., Blood,Clin. Invest. 68: 733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood,

56: 183-188 [1980] ; Hill a kol. Exp. Hematol., 20: 354-360 [1992]; Hegyi a kol., Int. J. Cell Cloning. 8. 236-244 [1990]. Bylo publikováno, že tyto aktivity jsou kmenově specifické a liší se od známých cytokinů (Hill R.J. a kol., Blood 80: 346 (1992); Erickson-Miller C.L. a kol., Brit. J. Hematol., 84: 197-203 (1993); Straneva J.E. a kol., Exp.56: 183-188 [1980]; Hill et al. Exp. Hematol., 20: 354-360 [1992]; Hegyi et al., Int. J. Cell Cloning. 8, 236-244 [1990]. These activities have been reported to be strain-specific and different from known cytokines (Hill RJ et al., Blood 80: 346 (1992); Erickson-Miller CL et al., Brit. J. Hematol., 84: 197-203 (1993) Straneva JE et al., Exp.

Hematol. 20: 4750 (1992); a Tsukada J. a kol., Blood 81:Hematol. 20: 4750 (1992); and Tsukada J. et al., Blood 81:

866-867 [1993]. Až dosud byly pokusy purifikovat meg-CSF nebo trombopoetin z trombocytopenické plasmy nebo moči neúspěšné.866-867 [1993]. Until now, attempts to purify meg-CSF or thrombopoietin from thrombocytopenic plasma or urine have failed.

V souladu s výše uvedenými pozorováními popisujícími trombocytopenickou plasmu, jsme zjistili, že aplastická vepřová plasma (APP) získaná z ozářených vepřů stimuluje lidskou megakaryocytopoesu in vitro. Zjistili jsme, že tato stimulační aktivita je zrušena rozpustou extracelulární doménou c-mpl, · potvzující APP jako potenciální zdroj předpokládaného mpl ligandu (ML). Nyní jsme úspěšně pufirikovali mpl ligand z APP a aminokyselinová sekvenční informace byla použita k isolaci myší, vepřové a lidské ML cDNA. Tyto ML vykazují sekvenční homologii s erythropoetinem a mají aktivitu meg-CSF i aktivitu trombopoetinového typu.In accordance with the above observations describing thrombocytopenic plasma, we found that aplastic porcine plasma (APP) obtained from irradiated pigs stimulates human megakaryocytopoiesis in vitro. We have found that this stimulating activity is abolished by the soluble extracellular domain of c-mpl, confirming APP as a potential source of putative mpl ligand (ML). We have now successfully buffered the mpl ligand from APP and the amino acid sequence information was used to isolate mice, porcine and human ML cDNAs. These MLs exhibit sequence homology to erythropoietin and have both meg-CSF activity and thrombopoietin type activity.

1. Pufirikace a identifikace mpl ligandu z plasmy1. Buffering and identification of plasma mpl ligand

Jak je uvedeno dále, bylo publikováno, že aplastická plasma z různých druhů obsahuje aktivity, které stimulují hematopoesu in vitro, ovšem nebylo dříve publikováno,, že by stimulační faktory byly isolovány z plasmy. Jeden zdroj aplastické plasmy byl získán z ozářených vepřů. Tato aplastická vepřová plasma (APP) stimuluje lidskou hematopoesu in vitro. Stanovení, zda APP obsahuje mpl ligand, bylo provedeno měřením ³H-thymidinové inkorporace do Ba/F3 buněk transfektovaných lidským mpl P (Ga/F3-mpl) postupem ukázaným na Obr. 2. APP stimulovala ³H-thimidinovou inkorporací do Ba/F3-mpl buněk, ale ne do Ba/F3 kontrolních buněk (tj. netransfektovaných lidským mpl P). Dále nebyla pozorována žádná aktivita v normální vepřové plasmě. Tyto výsledky ukazují, že APP obsahuje faktor nebo faktory, které transdukuji proliferativní signál přes mpl receptory a tedy mohou být přirozeným ligandem pro tyto receptory. Toto bylo dále podpořeno zjištěním, že působení APP spolu s rozpustným mpl-IgG blokuje stimulační efekty APP na Ba/F3-mpl buňky.As discussed below, aplastic plasma from various species has been reported to contain activities that stimulate hematopoiesis in vitro, but it has not been previously reported that stimulating factors are isolated from plasma. One source of aplastic plasma was obtained from irradiated pigs. This aplastic porcine plasma (APP) stimulates human hematopoiesis in vitro. Determination of whether APP contains an mpl ligand was performed by measuring ³ H-thymidine incorporation into Ba / F3 cells transfected with human mpl P (Ga / F3-mpl) as shown in Figs. 2. APP stimulated ³ H-thimidine incorporation into Ba / F3-mpl cells but not into Ba / F3 control cells (i.e., not transfected with human mpl P). Furthermore, no activity was observed in normal pig plasma. These results indicate that APP contains a factor or factors that transduce a proliferative signal through mpl receptors and thus may be a natural ligand for these receptors. This was further supported by the finding that the treatment of APP together with soluble mpl-IgG blocks the stimulatory effects of APP on Ba / F3-mpl cells.

Zjistilo se, že aktivitu v APP vykazuje protein, protože pronasa, DTT nebo teplo aktivitu v APP ničí (Obr. 3). Aktivita byla také nedializovatelná. Aktivita byla ale stabilní při nízkém pH (pH 2,5 po dobu 2 hod.) a vykazuje vazbu a eluci u některých lektinových afinitních kolon, což ukazuje, že to je glykoprotein. K dalšímu objasnění struktury a indentity této aktivity byla dále aktivita afinitně purifikována z APP s použitím mpl-IqG chiméry.Protein activity was found to occur because pronase, DTT, or heat destroy activity in APP (Fig. 3). The activity was also undializable. However, the activity was stable at low pH (pH 2.5 for 2 hours) and showed binding and elution on some lectin affinity columns, indicating that it was a glycoprotein. To further elucidate the structure and identity of this activity, the activity was further affinity purified from APP using the mpl-IqG chimera.

APP byla upravena podle postupu uvedeného dále v Příkladu 1 a 2. Krátce, mpl ligand byl purifikován s použitím hydrofobní interakční chromatografie (HIC), hrubozrnné imobilizované chromatografie a mpl-afinitní chromatografie. Výskyt aktivity v každém kroku je ukázán na Obr. 4 a stupeň purifikace je uveden v Tab. 1. Celkový výtěžek aktivity po mpl-afinitní koloně byl přibližně 10%. Frakce s nejvyšší aktivitou (F6) z mpl-afinitní kolony vykazovala specifickou aktivitu 9,8 χ 10⁶ jednotek/mg. Celková purifikace z 5 litrů APP byla přibližně 4 χ 10⁶ násobná (z 0,8 jednotek/mg na 3,3 χ 10⁶ jednotek/mg) s 83 χ 10⁶ násobnou redukcí proteinů (z 250 gm na 3 gg) . Předpokládáme, že specifická aktivita ligandu, eluovaného z mpl-afinitní kolony, je přibližně 3xl0⁶ jednotek/mg.APP was adjusted as described in Examples 1 and 2 below. Briefly, the mpl ligand was purified using hydrophobic interaction chromatography (HIC), coarse-grained immobilized chromatography, and mpl-affinity chromatography. The occurrence of activity in each step is shown in FIG. 4 and the degree of purification is shown in Tab. 1. The overall activity yield after the mpl-affinity column was approximately 10%. The fraction with the highest activity (F6) from the mpl-affinity column showed a specific activity of 9.8 χ 10 ⁶ units / mg. Total purification from 5 liters of APP was approximately 4 x 10 ⁶ fold (from 0.8 units / mg to 3.3 x 10 ⁶ units / mg) with a 83 x 10 ⁶ protein reduction (from 250 gm to 3 gg). We assume that the specific activity of the ligand eluted from the mpl-affinity column is approximately 3x10 ⁶ units / mg.

Tab. 1Tab. 1

Purifikace mpl liganduPurification of mpl ligand

Objem ml Volume ml Proteiny mg/ml Proteins mg / ml Jednotky/ml Units / ml Jednotky Units Specifická aktivita Jednotky/mg Specific activity Units / mg Výtěžek % Yield % Stupeň purifikace Degree purification APP- - APP- - 5000 5000 50 50 40 40 200000 200000 0,8 0.8 - - 1 1 Fenyl Phenyl 4700 4700 0,8 0.8 40 40 200000 200000 50 50 94 94 62 62 Blue-Sep. Blue-Sep. 640 640 0, 93 0, 93 400 400 256000 256000 430 430 128 128 538 538 mpl (ml) (Fxns 5-7) mpl (ml) (Fxns 5-7) 12 12 5xl0⁴ 5xl0 ⁴ 1666 1666 20000 20000 3300000 3300000 10 10 4100000 4100000

Protein byl stanoven Bradfordovým stanovením. Koncentrace proteinů mpl-eluovaných frakcí 5 až 7 byly určeny na základě barevné intenzity stříbrem barveného SDS-gelu. Jedna jednotka je definována tak, že způsobuje 50% maximální stimulace Ba/F3 buněčné proliferace.Protein was determined by Bradford assay. Protein concentrations of mpl-eluted fractions 5-7 were determined based on the color intensity of the silver stained SDS-gel. One unit is defined to cause 50% of maximal stimulation of Ba / F3 cell proliferation.

Analýza eluovaných frakcí z mpl afinitní kolony pomocí SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) probíhající za redukujících podmínek ukázala přítomnost několika proteinů (Obr. 5) . Proteiny, které při barvení stříbrem ukázaly nejsilnější intensitu, měly Mr 66000, 55000, 30000, 28000 a 1800022000. Ke stanovení, které z těchto proteinů stimulují proliferaci Ba/F3 buněkčních kultur, byly proteiny eluovány z gelu postupem, který je popsán v Příkladu 2.Analysis of the eluted fractions from the mpl affinity column by SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) under reducing conditions showed the presence of several proteins (Fig. 5). The proteins which showed the strongest intensity in silver staining had Mr 66000, 55000, 30000, 28000 and 1800022000. To determine which of these proteins stimulate proliferation of Ba / F3 cell cultures, the proteins were eluted from the gel by the procedure described in Example 2 .

Výsledky experimentu ukazují, že většinu aktivity eluované z gelu obsahuje protein s Mr 28000-32000, menší aktivita byla eluována z oblasti gelu 18000-22000 (Obr. 6). Jediné proteiny viditelné v této oblasti mají Mr 30000, 28000 a 18000-22000. K identifikaci a získání proteinové sekvence proteinů vyskytujících se v těchto oblastech gelu (tj. pásy 30, 20 a 18-22 kDa) byly tyto tři proteiny elektroblotovány do PVDF a sekvenovány jak je popsáno v Příkladu 3. Získané amino-koncové sekvence jsou uvedeny v Tab. 2.The results of the experiment showed that most of the activity eluted from the gel contained a protein with Mr 28000-32000, less activity was eluted from the 18000-22000 gel region (Fig. 6). The only proteins visible in this region have Mr 30000, 28000 and 18000-22000. To identify and obtain the protein sequence of proteins occurring in these regions of the gel (i.e., bands 30, 20, and 18-22 kDa), the three proteins were electroblotted into PVDF and sequenced as described in Example 3. The amino-terminal sequences obtained are shown in Tab. 2.

Tab. 2Tab. 2

Amino-koncové sekvence mpl liganduAmino-terminal sequences of the mpl ligand

30 kDa 30 kDa 15 10 15 20 25 15 10 (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 29) (S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD(H/S)VLH(G)RL (S) PAPPA (C) DPRLLNKLLRDD (H / S) VLH (G) RL 28 kDa 28 kDa 1 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR \ (H) PAPPAXDPRLLNKLLRDD (H) VL (H) GR \ 18-22 kDA 18-22 kDA 1 5 10 1 5 10 (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33) XPAPPAXDPRLX(N)(K) XPAPPAXDPRLX (N)

Počítačově provedené analýzy ukázaly, že tyto aminokyselinové sekvence jsou nové. Protože všechny tři sekvenci byly stejné, předpokládá se, že 30 kDa, 28 kDa a 18-22 kDa proteiny byly příbuzné a mohou být různými formami stejného nového proteinu. Dále tento protein (proteiny) byl také možným přirozeným mpl ligandem pro aktivitu vykazovanou na SDS-PAGE ve stejné oblasti (28000-32000) 4-20% gelu. Kromě toho parciálně purifikovaný ligand migroval s Mr 17000-30000, pokud byl podroben gelové filtrační chromatografií s použitím kolony Superose 12 (Pharmacia). Předpokládá se, že různé Mr formy ligandu jsou výsledkem proteolysy nebo glykosilační rozdílů nebo jiných post nebo pre-translačních modifikací.Computerized analyzes have shown that these amino acid sequences are new. Since all three sequences were the same, it is assumed that the 30 kDa, 28 kDa, and 18-22 kDa proteins were related and may be different forms of the same novel protein. Furthermore, this protein (s) was also a possible natural mpl ligand for the activity shown on SDS-PAGE in the same region (28000-32000) of 4-20% gel. In addition, the partially purified ligand migrated with Mr 17000-30000 when subjected to gel filtration chromatography using a Superose 12 column (Pharmacia). The various Mr forms of the ligand are believed to be the result of proteolysis or glycosylation differences or other post-translational modifications.

Jak je popsáno dříve, protisměrná mpl RNA ruší kulturách lidské kostní dřeně progenitorovými buňkami aniž by kmenů hematopoetických Tyto výsledky svědčí o megakaryocytopoesu v obohacených CD 34 + zasahovala diferenciaci dalších buněk. (Methia a kol., viz výše) tom, že mpl receptor může hrát roli v diferenciaci a proliferaci megakaryocytů in vitro. K dalšímu objasnění úlohy mpl ligandu v megakaryocytopoese byl srovnán vliv APP a mpl ligandově depleční APP na in vitro lidskou megakaryocytopoesu. Vliv APP na lidskou megakaryocytopoesu byl stanoven s použitím modifikace kapalného suspensního megakaryocytopoesového stanovení popsaného v Příkladu 4. V tomto stanovení byly lidské periferální kmenové buňky (PSC) zpracovány pomocí APP před a po mpl-lgG afinitní chromatografií. GPIIbUIa stimulace megakaryocytopoesy byla kvanitifikována ¹²⁵I-anti-II_bIIIa protilátkou (Obr. 7) : Jak je ukázáno na Obr. 7, 10% APP způsobuje přibližněAs described previously, upstream mpl RNA interferes with human bone marrow cultures by progenitor cells without haematopoietic strains. These results suggest megakaryocytopoiesis in CD 34 + enriched cells interfering with differentiation of other cells. (Methia et al., Supra) that the mpl receptor may play a role in the differentiation and proliferation of megakaryocytes in vitro. To further elucidate the role of mpl ligand in megakaryocytopoiesis, the effect of APP and mpl ligand depleting APP on in vitro human megakaryocytopoiesis was compared. The effect of APP on human megakaryocytopoiesis was determined using a modification of the liquid suspension megakaryocytopoiesis assay described in Example 4. In this assay, human peripheral stem cells (PSCs) were treated with APP before and after mpl-IgG by affinity chromatography. GPIIbUIa stimulation by megakaryocytopoiesis was quantitated with ¹²⁵ I-anti-II _b IIIa antibody (Fig. 7): As shown in Fig. 7. 7, 10% APP causes approximately

3-násobnou stimulaci, zatímco APP bez mpl ligandu nemá žádný efekt. Výrazně se projevilo, že APP bez mpl ligandu neindukuje proliferaci Ba/F3-mpl buněk.3-fold stimulation, while APP without mpl ligand has no effect. It has been demonstrated that APP without mpl ligand does not induce proliferation of Ba / F3-mpl cells.

V dalším experimentu lidský mpl-lgG přidaný ve dni 0, 2 a 4 do kultur obsahujících 10% APP neutralizoval stimulační efekty APP na lidskou megakaryocytopoesu (Obr.8). Tyto výsledky naznačují, že mpl ligand hraje roli v regulaci lidské megakaryocytopoesy a může být použit pro léčení trombocytopenie.In another experiment, human mpl-IgG added on days 0, 2 and 4 to cultures containing 10% APP neutralized the stimulatory effects of APP on human megakaryocytopoiesis (Fig. 8). These results suggest that the mpl ligand plays a role in the regulation of human megakaryocytopoiesis and can be used to treat thrombocytopenia.

2. Molekulární klonování mpl ligandu2. Molecular cloning of mpl ligand

Na základě amino-terminálních aminokyselinových sekvencí získaných z 30 kDa, 28 kDa a 18-22 kDa proteinů (viz Tab. 2 výše) byly sestrojeny dvě skupiny degenerovaných oligonukleotidových primerů a byly použity k rozšíření vepřové genomické DNA pomocí PCR. Pokud aminokoncová amonokyselinová sekvence byla kódována jedním exonem, bylo logicky očekáváno, že správný PCR produkt bude dlouhý 69 bp. DNA fragment této velikosti byl nalezen a subklonován do pGEMT. Sekvence oligonukleotidů PCR primerů a tři získané klony jsou uvedeny v Příkladu 5. Aminokyselinová sekvence (PRLLNKLLR [SWQ ID NO: 33]) peptidů kódovaného mezi PCR primery byla identická se sekvencí získanou amino-koncovým proteinovým sekvenováním vepřového ligandu (viz zbytky 9-17 pro 28 a 30 kDa vepřové proteinové sekvence výše).Based on the amino-terminal amino acid sequences obtained from the 30 kDa, 28 kDa, and 18-22 kDa proteins (see Table 2 above), two sets of degenerate oligonucleotide primers were constructed and used to amplify porcine genomic DNA by PCR. If the amino-terminal amino acid sequence was encoded by a single exon, it was logically expected that the correct PCR product would be 69 bp long. A DNA fragment of this size was found and subcloned into pGEMT. The oligonucleotide sequence of the PCR primers and the three clones obtained are shown in Example 5. The amino acid sequence (PRLLNKLLR [SWQ ID NO: 33]) of the peptides encoded by the PCR primers was identical to the sequence obtained by amino-terminal protein sequencing of porcine ligand (see residues 9-17 for. 28 and 30 kDa porcine protein sequences above).

Systetické oligonukleotidy založené na sekvenci PCR fragmentu byly použity ke screeningu lidské genomické DNA knihovny. 45-merový oligonukleotid, označený pR45, byl označen a syntetizován na bázi sekvence PCR fragmentu. Tento oligonukleotid má následující sekvenci:Systetic oligonucleotides based on the PCR fragment sequence were used to screen the human genomic DNA library. The 45-mer oligonucleotide, designated pR45, was labeled and synthesized based on the PCR fragment sequence. This oligonucleotide has the following sequence:

5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAGTCG 3' (SEQ ID NO: 34)5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAGTCG 3 '(SEQ ID NO: 34)

Teto deoxyoligonukleotid byl použit ke screeningu lidské genomické DNA knihovny v Xgeml2 při slabě náročných hybridizačních a promývacích podmínek podle Příkladu 6. Positivní . klony byly sebrány, plaky purifikovány a analyzovány restrikčním mapováním a Southern blotováním. 390 bp EcoRI-Xbal fragment, který hybridizoval na 45-mer, byl subklonován do pBluescript SC-. DNA sekvenování tohoto klonu potvrdilo, že byl izolován lidský homolog vepřové DNA kódující mpl ligand. Lidská DNA sekvence a její vyvozená aminokyselinová sekvence jsou znázorněny na Obr. 9 (SEQ ID NO: 3 a 4). Předpokládané polohy intronů v genomické sekvenci jsou označeny šipkami, a definují předpokládaný exon („exon 3) .This deoxyoligonucleotide was used to screen the human genomic DNA library in Xgem12 under the low stringency hybridization and wash conditions of Example 6. Positive. clones were harvested, plaques purified and analyzed by restriction mapping and Southern blotting. The 390 bp EcoRI-XbaI fragment that hybridized to the 45-mer was subcloned into pBluescript SC-. DNA sequencing of this clone confirmed that a human porcine DNA homolog encoding the mpl ligand was isolated. The human DNA sequence and its deduced amino acid sequence are shown in FIG. 9 (SEQ ID NOS: 3 and 4). The putative positions of introns in the genomic sequence are indicated by arrows, and define the putative exon ("exon 3").

'Na základě lidské sekvence „exonu 3 (Příklad 6) byly syntetizovány oligonukleotidy odpovídající 3' a 5' koncům exonové sekvence. Tyto dva primery byly použity k PCR reakcím a sloužily jako šablona cDNA připravené z různých lidských tkání. Očekávaná velikost správného PCR produktu byla 140 bp. Po analýzách PCR produktů na 12% polyakrylamidovém gelu byly očekávané velikosti detekovány v cDNA knihovnách připravených z lidských dospělých ledvin, 293 zárodečných ledvinových buněk a dDNA připravené z lidských zárodečných jater.Oligonucleotides corresponding to the 3 'and 5' ends of the exon sequence were synthesized based on the human exon 3 sequence (Example 6). These two primers were used for PCR reactions and served as a template for cDNA prepared from different human tissues. The expected size of the correct PCR product was 140 bp. After analysis of PCR products on a 12% polyacrylamide gel, the expected sizes were detected in cDNA libraries prepared from human adult kidney, 293 germline kidney cells and dDNA prepared from human germline liver.

cDNA knihovna zárodečných jater (7x106 klonů) v lambda DR2 byla potom podrobena screeningu se stejným 45-mérovým oligonukleotidem, který byl použit ke screeningu lidské genomické knihovny a knihovny cDNA zárodečných jater na slabě náročných hybridizačních podmínek. Positivní klony byly sebrány, plak purífikován a velikost insertu byla stanovena PCR. Jeden klon s 1,8 kb insertem byl vybrán pro další analýzu. S použitím postupů popsaných v Příkladu 7 byl získán nukleotid a vyvozená aminokyselinová sekvence lidského mpl ligandu (hML). Tyto sekvence jsou uvedeny na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1 a 2).The germline cDNA library (7x106 clones) in lambda DR2 was then screened with the same 45-mer oligonucleotide that was used to screen the human genomic and germline cDNA libraries under poorly challenged hybridization conditions. Positive clones were collected, plaque purified and insert size determined by PCR. One clone with a 1.8 kb insert was selected for further analysis. Using the procedures described in Example 7, the nucleotide and deduced amino acid sequence of the human mpl ligand (hML) were obtained. These sequences are shown in FIG. 1 (SEQ ID NOS: 1 and 2).

3. Struktura lidského mpl ligandu (hML) cDNA sekvence lidského mpl ligandu (hML) (Obr. 1 [SEQ ID NO: 2] zahrnuje 1774 nukleotidů následovaných póly(A) prodloužením. Obsahuje 215 nukleotidů 5' netranslatované sekvence a 3' netranslatované oblasti 498 nukleotidů.3. Structure of the human mpl ligand (hML) The human mpl ligand (hML) cDNA sequence (Fig. 1 [SEQ ID NO: 2] comprises 1774 nucleotides followed by poles (A) by extension. It contains 215 nucleotides of 5 'untranslated sequence and 3' untranslated regions 498 nucleotides.

Předpokládaný iniciační kodon v nukleotidové pozici (216— 218) včetně sekvence příznivé pro eukaryotickou translační iniciaci. Otevřený čtecí rámec je 1059 nukleotidů dlouhý a kóduje polypeptid s 353 aminokyselinovými zbytky, začínající v poloze nukleotidu 220. N-konec vyvozené aminokyselinové sekvence je vysoce hydrofobní a pravděpodobně odpovídá signálnímu peptidů. Počítačová analýzy vyvozené aminokyselinové sekvence (von Heijne a kol., Eur. J. Biochem. 133: 19-21 [1983]) ukazuje potenciální štěpné místo pro signální peptidasu mezi zbytky 21 a 22. Štěpením v této poloze by vznikl zralý polypeptid s 332 aminokyselinovými zbytky začínající amino-koncovou sekvencí získanou z mpl ligandu purifikovaného z vepřové plasmy. Vyvozená non-glykosylovaná molekulová hmotnost ligandu s 332 aminokyselinovými zbytky je 38 kDa. Má 6 potenciálních N-glykosylačních míst a 4 cysteinové zbytky.The putative initiation codon at the nucleotide position (216-218) including a sequence favorable for eukaryotic translation initiation. The open reading frame is 1059 nucleotides long and encodes a polypeptide with 353 amino acid residues, starting at nucleotide 220. The N-terminus of the deduced amino acid sequence is highly hydrophobic and probably corresponds to the signal peptide. Computer analysis of the deduced amino acid sequence (von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 133: 19-21 [1983]) shows a potential cleavage site for signal peptidase between residues 21 and 22. Cleavage at this position would yield the mature polypeptide with 332 amino acid residues beginning with the amino-terminal sequence obtained from the mpl ligand purified from porcine plasma. The derived non-glycosylated molecular weight of the 332 amino acid ligand is 38 kDa. It has 6 potential N-glycosylation sites and 4 cysteine residues.

Srovnání sekvence mpl ligandu se sekvencí z.databáze Genové banky vykazuje 23% identitu mezi aminokoncovými 153 zbytky zralého lidského mpl ligandu a lidského erythropoetinu (Obr. 10 [SEQ ID NO 6 a 7]). Pokud bereme v úvahu konservativní substituce, tato oblast hML vykazuje 50% podobnost s lidským erythropoetinem (hEPO). hEPO a hML obsahují čtyři cysteiny. Tři ze čtyř cysteinu jsou v hML, včetně prvního a posledního cysteinu. Pokusy s místně cílenou mutagenesi ukázaly, že první a poslední cystein erythropoetinu tvoří disulfidovou vazbu, která je požadována pro funkci (Wang, F. F. a kol., Endocrinology 116: 2286-2292 [1983]). Analogicky první a poslední cystein hML může také tvořit rozhodující disulfidovou vazbu. Žádné z glykosylační míst není v hML zachováno. Všechna hML Nvazebná glykosylační místa jsou lokalizována v karboxykoncové polovině hML polypeptidu.Comparison of the mpl ligand sequence with the gene bank database sequence showed 23% identity between the amino terminal 153 residues of mature human mpl ligand and human erythropoietin (Fig. 10 [SEQ ID NOs 6 and 7]). Considering conservative substitutions, this hML region shows 50% similarity to human erythropoietin (hEPO). hEPO and hML contain four cysteines. Three of the four cysteines are in hML, including the first and last cysteine. Experiments with site-directed mutagenesis have shown that the first and last erythropoietin cysteine forms the disulfide bond that is required for function (Wang, F. F. et al., Endocrinology 116: 2286-2292 [1983]). By analogy, the first and last cysteine hML may also form a critical disulfide bond. None of the glycosylation sites are retained in hML. All hML Binding glycosylation sites are located in the carboxy-terminal half of the hML polypeptide.

Podobně jako hEPO, tak hML mRNA neobsahuje shodné polyadenylační sekvence AAUAAA, ani regulační prvek AUUUA, který je přítomen v 3' netranslační oblasti mnoha cytokinů a předpokládá se, že má vliv na mRNA stabilitu (Shawet a kol., Cell, 46: 659-667 [1986]). Analýza nothern blot ukázala nízké hladiny jednotlivých 1,8 kb hML RNA transkriptů u zárodečných i dospělých ledvin. Pro srovnání, lidský erythropoetin je exprimován ve fetálních játrech a, jako odpověď na hypoxii, dospělými ledvinami a játry (Jacobs a kol., Nátuře, 313: 804-809 [1985] a Bondurant a kol., Molec. Cell. Biol., 6: 2731-2733 [1986]).Like hEPO, hML mRNA does not contain the same AAUAAA polyadenylation sequences, nor the AUUUA regulatory element, which is present in the 3 'non-translational region of many cytokines and is believed to affect mRNA stability (Shawet et al., Cell, 46: 659-). 667 [1986]). Nothern blot analysis showed low levels of individual 1.8 kb hML RNA transcripts in both germ and adult kidneys. For comparison, human erythropoietin is expressed in fetal liver and, in response to hypoxia, by adult kidney and liver (Jacobs et al., Nature, 313: 804-809 [1985] and Bondurant et al., Molec. Cell. Biol., 6: 2731-2733 [1986]).

Význam C-koncové oblasti hML zůstává k objasnění. Na základě přítomnosti šesti potenciálních míst pro N-vazebnou glykosylaci a schopnosti ligandu vázat se na lectinové afinitní kolony je zřejmě, že je tato oblast hML glykosylovaná. V některých gelových elučních pokusech, jsme pozorovali aktivitu odpovídající Mr 60000, která může představovat glykosylovanou molekulu plné délky. C-koncová oblast může tedy působit stabilizačně a zvyšovat poločas cirkulace hML. V případě erythropoetinu mají neglykosylované formy plnou in vitro biologickou aktivitu, ale mají výrazně snížený plasmatický poločas v poměrů ke glykosylovanému erythropoetinu (Takeuchi a kol., J. Biol. Chem., 265: 12127-12130 [1990], Narhi a kol., J. Biol. Chem., 266: 23022-23026 [1991] a Spivack a kol., Blood, 7: 90-99 [1989]). C-koncová doména hML obsahuje dvě dibasické aminokyselinové sekvence [Arg-Arg v polohách 153-154 a 245246], které mohou sloužit jako potenciální funkční místa. Štěpení v těchto místech může být odpovědné za vznik 30, 28 a 18-22 kDa forem ML izolovaných z APP. Je zřejmé, že se Argi53-Argi5₄ objevuje za doménou ML erythropoetinového typu. Tato pozorování znamenají, že ML plné délky může představovat prekursor proteinu, z něhož po limitované proteolyse vzniká zralý ligand.The importance of the C-terminal region of hML remains for clarification. Based on the presence of six potential N-linked glycosylation sites and the ability of the ligand to bind to lectin affinity columns, it appears that this hML region is glycosylated. In some gel elution experiments, we observed activity corresponding to Mr 60000, which may be a full-length glycosylated molecule. Thus, the C-terminal region can act as a stabilizer and increase the half-life of hML. In the case of erythropoietin, non-glycosylated forms possess full in vitro biological activity but have a significantly reduced plasma half-life relative to glycosylated erythropoietin (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265: 12127-12130 [1990], Narhi et al., J. Biol. Chem., 266: 23022-23026 [1991] and Spivack et al., Blood, 7: 90-99 [1989]). The C-terminal domain of hML contains two dibasic amino acid sequences [Arg-Arg at positions 153-154 and 245246] that can serve as potential functional sites. Cleavage at these sites may be responsible for the formation of 30, 28, and 18-22 kDa forms of ML isolated from APP. It is obvious that Argi53 _Argi5-4 comes under the domain of ML-type erythropoietin. These observations mean that full-length ML may be a precursor of the protein from which mature ligand is formed after limited proteolysis.

4. Isoformy a varianty lidského apl ligandu4. Isoforms and variants of human apl ligand

V lidských dospělých játrech byly pomocí PCR zjištěny isoformy nebo alternativně spojené formy lidského mpl ligandu. Krátce, byly syntetizovány primery odpovídající každému konci i vybraným vnitřním oblastem kódující sekvence hML. Tyto primery byly použity v RT-PCR k amplifikaci RNA lidských dospělých jater, jak je popsáno v Příkladu 10. Kromě formy plné délky, nazývané hML, byly pozorovány nebo odvozeny další tři formy, nazývané hML2, hML3 a hML4. Zralá vyvozená aminokyselinová sekvence všech čtyři isoforem je ukázána na Obr. 11 (SEQ ID NO: 6, 8, 9 a 10) . hML má 116 nukleotidovou deleci polohy 700, která způsobuje aminokyselinovou deleci i deleci čtecího rámce. cDNA nyní kóduje zralý polypeptid, který je dlouhý 265 aminokyselin a odchyluje se od hML sekvence v aminokyselinovém zbytku 139. hML4 má 12 nukleotidovou deleci, která následuje za nukleotidovou polohou 618 (která se také nalézá u myší a prasečí sekvence [viz níže] ) a 116 bp delece se nachází v hML3. Ačkoliv u člověka nebyly izolovány žádné klony s 12 bp deleci (následující po nukleotidu 619) (označené hML2), tato forma pravděpodobně existuje, protože takováto isoforma byla identifikována u myší i vepřů (viz níže), a protože byla identifikována ve spojení s 116 nukleotidovoudelecí u hML4.Isoforms or alternatively spliced forms of human mpl ligand were detected by PCR in human adult liver. Briefly, primers corresponding to each end and selected internal regions of the hML coding sequence were synthesized. These primers were used in RT-PCR to amplify human adult liver RNA as described in Example 10. In addition to the full-length form, called hML, three other forms, called hML2, hML3 and hML4, were observed or derived. The mature deduced amino acid sequence of all four isoforms is shown in FIG. 11 (SEQ ID NOS: 6, 8, 9, and 10). hML has a 116 nucleotide deletion of position 700 that causes both the amino acid deletion and the reading frame deletion. The cDNA now encodes a mature polypeptide that is 265 amino acids in length and deviates from the hML sequence at amino acid residue 139. hML4 has a 12 nucleotide deletion that follows nucleotide position 618 (also found in mice and porcine sequences [see below]), and The 116 bp deletion is found in hML3. Although no clones with a 12 bp deletion (following nucleotide 619) (designated hML2) have been isolated in humans, this form is likely to exist because such an isoform has been identified in both mice and pigs (see below) and because it has been identified in conjunction with 116 nucleotide deletions. u hML4.

Aby mohlo být stanoveno, zda je k biologické aktivitě potřebná plná délka ML, byla sestrojena substituovaná varianta hML s dibasickou Argi₅3-Argx5₄ sekvencí nahrazenou dvěma alaninovými zbytky a forma hML se zkrácenou „EPOdoménou. Varianta se substituovanou dibasickou sekvencíIn order to determine whether the biological activity necessary to the full length ML was constructed substituted variant hML dibasic Argi ₅ 3 ₄ Argx5 sequences is replaced with two alanine residues and a truncated form of hML "EPOdoménou. Variant with substituted dibasic sequence

Argi53^-Argi₅₄, označená jako hML(R153A, R154A) , byla sestrojena pomocí PCR, jak je popsáno v příkladu 10. Byla také připravena „EPO-doménově zkrácená forma hMLi₅₃ pomocí PCR zavedením stop kodonu následujího po Argl53.Argi53 ^- Argi _54, identified as hML (R153A, R154A), was constructed by PCR as described in Example 10 was also prepared "EPO-domain truncated form hMLi ₅₃ by PCR by introducing a stop codon after Argl53 Then follow.

5. Exprese rekombinantního lidského spi ligandu (rhML) v přechodně transfektovaných lidských embryonálních ledvinových (293) buňkách5. Expression of recombinant human spi ligand (rhML) in transiently transfected human embryonic kidney (293) cells

Aby bylo potvrzeno, že klonovaná lidská cDNA kóduje ligand pro mpl, byl exprimován ligand v savčích 293 buňkách za kontroly cytomegalovirového přímého časného promotoru s použitím expresních vektorů pRK5-hML nebo pRK5-hMLi₅₃. Bylo zjištěno, že supernatant z přechodně transfektovaných lidských zárodečných ledvinových (293) buněk stimuluje ³H-thymidinovou inkorporaci v Ba/F3-mpl buňkách, ale ne v Ba/F3 buňkách (Obr. 12A). Samotné médium z 293 buněk transfektovaných s pRK vektorem neobsahuje tuto aktivitu. Přidání mpl-IgG do média zrušilo stimulaci (data nejsou uvedena). Tyto výsledky ukazují, že klonovaná dDNA kóduje funkční lidský ML (hML).To confirm that the cloned human cDNA encodes a ligand for mpl, the ligand was expressed in mammalian 293 cells under the control of the cytomegalovirus direct early promoter using the expression vectors pRK5-hML or pRK5-hMLi ₅₃ . Supernatant from transiently transfected human germline kidney (293) cells was found to stimulate ³ H-thymidine incorporation in Ba / F3-mpl cells but not in Ba / F3 cells (Fig. 12A). Medium alone from 293 cells transfected with the pRK vector does not contain this activity. Addition of mpl-IgG to the medium aborted stimulation (data not shown). These results indicate that the cloned dDNA encodes functional human ML (hML).

Ke stanovení, zda „EPO-doména samotná také může vázat a aktivovat mpl, byla v 293 buňkách exprimována zkrácená forma hML, rhMLis₃. Bylo zjištěno, že supernatanty z transfektovaných buněk mají podobnou aktivitu jako supernatanty z buněk exprimujících hML plné délky (Obr. 12A), což znamená, že C-koncová doména ML není pro vazbu a aktivaci c-mpl nutná.To determine whether the "EPO-domain itself can also bind and activate mpl", a truncated form of hML, rhMLis ₃ , was expressed in 293 cells. Supernatants from transfected cells were found to have similar activity to supernatants from cells expressing full-length hML (Fig. 12A), meaning that the C-terminal domain of ML is not required for c-mpl binding and activation.

6. spi ligandová stimulace megakaryocytopoesy a trombopoesy6. spi ligand stimulation of megakaryocytopoieses and thrombopoieses

Forma plné délky rhML i zkrácená rhMLi₅₃ forma rekombinantního hML stimulovaly lidskou megakaryocytopoesu in vitro (Obr. 12B) . Tento efekt byl pozorován v nepřítomnosti dalších exogenně přidaných hematopoetických růstových faktorů. S výjimkou IL-3 je ML jediný hematopoetický testovaný faktor, který vykazuje tuto aktivitu. IL-11, IL-6, IL-1, erythropoetin, G-CSF, IL-9, LIF, kit ligand (KL), M-CSF, OSM a GM-CSF neměli na megakaryocytopoesu žádný vliv, pokud byly testovány samostatně v našem stanovení (data nejsou uvedena). Tyto výsledky ukazují, že ML má megakaryocyty-stimulující aktivitu, a ukazují úlohu ML v regulaci megakaryocytopoesy.Both the full-length form of rhML and the truncated rhMLi ₅₃ form of recombinant hML stimulated human megakaryocytopoiesis in vitro (Fig. 12B). This effect was observed in the absence of other exogenously added hematopoietic growth factors. With the exception of IL-3, ML is the only hematopoietic test factor that exhibits this activity. IL-11, IL-6, IL-1, erythropoietin, G-CSF, IL-9, LIF, kit ligand (KL), M-CSF, OSM, and GM-CSF had no effect on megakaryocytopoies when tested alone in our determination (data not shown). These results show that ML has megakaryocytes-stimulating activity, and show the role of ML in the regulation of megakaryocytopoiesis.

Ukázalo se, že trombopoetické aktivity přítomné v plasmě trombocytopenických zvířat stimulují produkci destiček v myším revazebném trombocytosovém stanovení (McDonald, Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 14: 1006-1001 [1973] a McDonald a kol., Scand. J. Haematol., 16: 326-334 [1976]). V tomto modelu byla u myší vyvolána akutní trombocytopenie s použitím specifického antidestičkového séra, jejímž výsledkem byla předpovídatelná revazebná trombocytosa. Takovéto imuno-trombocythemické myši nyní vykazovaly mnohem silnější odpověď na exogenním aktivity trombopoetinového typu než normální myši (McDonald, Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 14: 1006-1001 [1973]), stejně jako exhypoxické myši jsou citlivější na erythropoetin než normální myši (McDonald, a kol., J. Lab. Clin. Med., 77: 134-143 [1971]). Ke stanovení, zda rML stimuluje produkci destiček in vivo, byl myším pro revazebnou trombocytosu injektován parciálně purifikovaný rhML. Byl kvantifikován počet destiček a inkorporace ³⁵S do destiček. Injekce myší s 64000 nebo 32000 jednotkami rML signifikantně zvýšila produkci destiček, s 20% vzrůstem počtu destiček (p=0,0005 a 0,0001, respektive) a 40% vzrůstem ³⁵S inkorporace do destiček (p=0,003) u léčených myší oproti kontrolním myším, kterým byl injektován pouze excipient (Obr. 12C) . Tento stupeň stimulace je srovnatelný se stupněm stimulace, který byl pozorován u IL-6 v tomto modelu (data nejsou uvedena). Léčení 16000 jednotkami rML nevykazovalo signifikantní stimulaci produkce destiček. Tyto výsledky ukazují, že ML stimuluje produkci destiček způsobem závislým na dávce a tudíž vykazuje aktivitu trombopoetinového typu.Thrombopoietic activities present in the plasma of thrombocytopenic animals have been shown to stimulate platelet production in a mouse binding thrombocytosis assay (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14: 1006-1001 [1973] and McDonald et al., Scand. J. Haematol., 16: 326-334 [1976]). In this model, acute thrombocytopenia was induced in mice using specific anti-platelet serum resulting in predictable binding thrombocytosis. Such immuno-thrombocythemic mice now showed a much stronger response to exogenous thrombopoietin type activities than normal mice (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14: 1006-1001 [1973]), as well as exhypoxic mice are more susceptible to erythropoietin. than normal mice (McDonald, et al., J. Lab. Clin. Med., 77: 134-143 [1971]). To determine whether rML stimulates platelet production in vivo, mice for injected thrombocytosis were injected with partially purified rhML. Platelet count and incorporation of ³⁵ S into platelets were quantified. Injection of mice with 64000 or 32000 rML units significantly increased platelet production, with a 20% increase in platelet counts (p = 0.0005 and 0.0001, respectively) and a 40% increase in ³⁵ S platelet incorporation (p = 0.003) compared to treated mice control mice injected with excipient only (Fig. 12C). This degree of stimulation is comparable to that observed with IL-6 in this model (data not shown). Treatment with 16,000 rML units did not significantly stimulate platelet production. These results indicate that ML stimulates platelet production in a dose-dependent manner and therefore exhibits thrombopoietin type activity.

293 buňky byly transfektovány s dalšími hML isoformami kontruovanými jak je popsáno výše a supernatanty byly stanoveny s použitím Ba/F3-mpl proliferativního stanovení (viz Obr. 13). hML2 a hML3 nevykazují detekovatelnou aktivitu v tomto stanovení, ovšem aktivita hML(R153A, R154A) byla podobná jako u hML a hML153, což ukazuje, že proces na Argi₅3-Arg₁₅₄ dibasickém místě aktivitu ani nepodmiňuje ani neruší.293 cells were transfected with other hML isoforms constructed as described above and supernatants were determined using a Ba / F3-mpl proliferative assay (see Figure 13). hML2 and hML3 did not show detectable activity in this assay, but the activity of hML (R153A, R154A) was similar to hML and hML153, indicating that the process at the Argi ₅ 3-Arg ₁₅₄ dibasic site does not condition or interfere with activity.

7. Megakaryocytopoesa a mpl ligand7. Megakaryocytopoiesis and mpl ligand

Předpokládalo se, že megakaryocytopoesa je regulována na vícenásobných buněčných úrovních (Williams a kol., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982] a Williams a kol., Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Toto je více založeno na pozorování, že některé hematopoetické růstové faktory stimulují proliferaci megakaryocytových progeniťorů, zatímco jiné vykazují primární vliv na zrání. Zde uvedené výsledky předpokládají, že ML má vliv i na proliferaci i na zrání. Tato ML stimulace proliferace megakaryocytových progenitorů je podpořena několika druhy důkazů. Za prvé, APP stimuluje proliferaci i zrání lidských megakaryocytů in vitro, a tato stimulace je kompletně inhibována pomocí mplIgG (Obr. 7 a 8). Dále inhice megakaryocytové kolonové formace pomocí c-mpl protisměrných oligonukleotidů (Methia a kol., Blood, 82: 1395-1401 [1993]) a zjištění, že c-mpl může transdukovat proliferativní signál v buňkách, do kterých je transfektován (Skoda a kol., EMBO, 12: 2645-2653 [1993] a Vigon a kol., Oncogene, 8. 2607-1615 [1993]) také ukazují, že ML stimuluje proliferaci. Zjevná exprese c-mpl během všech stupňů megakaryocytické diferenciace (Methia a kol., Blood, 82: 1395-1401 [1993]) a schopnost rekombinantní ML výrazně stimulovat produkci destiček in vivo ukazuje, že ML také ovlivňuje zrání. Dostupnost ML poskytuje možnost pečlivého zhodnocení jeho úlohy v regulaci megakaryocytopoesy a trombopoesy, stejně jako jeho schopnosti ovlivňovat další hematopoetické kmeny.Megakaryocytopoiesis has been thought to be regulated at multiple cell levels (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982] and Williams et al., Blood Cells, 15: 123-133 [1989]). This is more based on the observation that some hematopoietic growth factors stimulate the proliferation of megakaryocyte progenitors, while others exert a primary effect on maturation. The results presented here suggest that ML has an effect on both proliferation and maturation. This ML stimulation of megakaryocyte progenitor proliferation is supported by several kinds of evidence. First, APP stimulates proliferation and maturation of human megakaryocytes in vitro, and this stimulation is completely inhibited by mplIgG (Figs. 7 and 8). In addition, inhalation of megakaryocyte column formation using c-mpl antisense oligonucleotides (Methia et al., Blood, 82: 1395-1401 [1993]) and the finding that c-mpl can transduce a proliferative signal in cells into which it is transfected (Skoda et al. , EMBO, 12: 2645-2653 [1993] and Vigon et al., Oncogene, 8. 2607-1615 [1993]) also show that ML stimulates proliferation. The apparent expression of c-mpl during all degrees of megakaryocytic differentiation (Methia et al., Blood, 82: 1395-1401 [1993]) and the ability of recombinant ML to significantly stimulate platelet production in vivo shows that ML also affects maturation. The availability of ML provides the opportunity to carefully assess its role in the regulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis, as well as its ability to influence other hematopoietic strains.

8. Isolace genu lidského mpl ligandu (TPO)8. Isolation of human mpl ligand (TPO) gene

Klony lidské genomické DNA TPO genu byly izolovány screeningem lidské genomické knihovny v X-Geml2 s pR45, za málo náročních podmínek nebo za vysoce náročných podmínek s fragmentem, který odpovídá 3' polovině lidské cDNA kódující mpl ligand. Byly isolovány přesahující lambda klony s rozsahem 35 kb. Přesahující fragmenty (BamHI a EcoRI) obsahující celý TPO gen byly subklonovány a sekvenovány (Obr. 14A, 14B a 14C).Human genomic DNA clones of the TPO gene were isolated by screening the human genomic library in X-Gem12 with pR45, under low or high severity conditions, with a fragment corresponding to the 3 'half of the human cDNA encoding the mpl ligand. Overlapping lambda clones of 35 kb were isolated. Overlapping fragments (BamHI and EcoRI) containing the entire TPO gene were subcloned and sequenced (Figs. 14A, 14B and 14C).

Struktura lidského genu je kromě 7 kb genomické DNA složena z 6 exonů. Hranice všech spojení exon/intron jsou shodné s takovýmito prvky, které byly objeveny v savčích genech (Shapiro, M.B. a kol., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exon 1 a exon 2 obsahují 5' netranslatované sekvence a počáteční čtyři aminokyseliny signálního peptidu. Zbytek sekretorického signálu a prvních 26 aminokyselin zralého proteinu jsou kódovány v exonu 3. Celá karboxylové doména a 3' netranslatované sekvence stejně jako přibližně 50 aminokyselin domény erythropoetinového typu jsou kódovány v exonu 6. Čtyři aminokyseliny postihnuté deleci pozorovanou u hML-2 (hTPO-2) jsou kódovány na 5' konci exonu 6.In addition to the 7 kb genomic DNA, the structure of the human gene is composed of 6 exons. The boundaries of all exon / intron junctions are identical to those found in mammalian genes (Shapiro, M.B. et al., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exon 1 and exon 2 contain 5 'untranslated sequences and the initial four amino acids of the signal peptide. The rest of the secretory signal and the first 26 amino acids of the mature protein are encoded in exon 3. The entire carboxyl domain and 3 'untranslated sequences as well as approximately 50 amino acids of the erythropoietin type domain are encoded in exon 6. Four amino acids affected by the deletion observed in hML-2 (hTPO-2 ) are encoded at the 5 'end of exon 6.

Analýza lidské genomické DNA pomocí Southern blotu ukázalo, že gen pro TPO je přítomen v jedné kopii. Chromosomální lokalizace genu byla stanovena fluorescentní in šitu hybridizaci (FISH), která mapovala chromosom 3q27-28.Southern blot analysis of human genomic DNA showed that the TPO gene is present in a single copy. Chromosomal gene localization was determined by fluorescent in situ hybridization (FISH), which mapped chromosome 3q27-28.

9. Exprese a purifikace TPO z 293 buněk9. Expression and purification of TPO from 293 cells

Preparace a purifikace ML nebo TPO z 293 buněk je detailně popsána v Příkladu 19. Krátce, cDNA odpovídající TPO úplnému otevřenému čtecímu rámci byla získána pomocí PCR s použitím pRK5-hmpl I. Produkt PCR byl purifikován a klonován mezi restrikčními místy Clal a Xbal plasmidu pRK5tkneo (pRK5 odvozeného vektoru modifikovaného pro expresi genu resistentního na neomycin za kontroly thimidin kinasové podpory) za získání vektoru pRK5tkneo.ORF (vektor kódující úplný otevřený čtecí rámec).The preparation and purification of ML or TPO from 293 cells is described in detail in Example 19. Briefly, cDNA corresponding to TPO complete open reading frame was obtained by PCR using pRK5-hmpl I. The PCR product was purified and cloned between the ClaI and XbaI restriction sites of plasmid pRK5tkneo (a pRK5 derived vector modified to express a neomycin resistant gene under the control of thimidine kinase support) to obtain the vector pRK5tkneo.ORF (a vector encoding a complete open reading frame).

Druhý vektor kódující EPO homologní doménu byl připraven stejně, ale s použitím jiných PCR primerů, aby byl získán konečný produkt nazývaný pRK5-tkneoEPO-D.A second vector encoding the EPO homology domain was prepared in the same way, but using other PCR primers to obtain a final product called pRK5-tkneoEPO-D.

Tyto dva konstrukty byly transfektovány do buněk lidských embrionálních ledvin metodou CaPOí a neomycinresistentní klony byly selektovány a byly ponechány růst. U těchto klonů byla stanovena exprese ML153 nebo ML332 v obohaceném mediu pomocí Ba/F3-mpl proliferativního stanovení.The two constructs were transfected into human embryonic kidney cells by CaPO 1, and neomycin resistant clones were selected and allowed to grow. These clones were assayed for expression of ML153 or ML332 in the enriched medium by Ba / F3-mpl proliferative assay.

Purifikace rhML₃₃2 byla provedena jak je popsáno v Příkladu 19. Krátce, 293-rhML332 obohacené medium bylo naneseno na kolonu Blue-Sepharose (Pharmacia), která byla náledně promyta pufrem obsahujícím 2M močoviny. Kolona byla eluována pufrem obsahujícím 2M močoviny a 1M NaCl. Eluát zPurification of rhML ₃₃ 2 was performed as described in Example 19. Briefly, 293-rhML332 enriched medium was loaded onto a Blue-Sepharose (Pharmacia) which was washed náledně buffer containing 2M urea. The column was eluted with buffer containing 2M urea and 1M NaCl. Eluát z

Blue-Sepharose byl přímo nanesen na kolonu WGA-Sepharose, promytou desetinásobkem objemu kolony pufru obsahujícího 2M močoviny a 1M NaCl, a eluován stejným pufrem obsahujícím 0,5M N-acetyl-D-glukosamin. WGA-Sepharose eluát byl nanesen na kolonu C4-HPLC (Synchrom, lne.) a eluován diskontinuálním propanolovým gradientem. Pomocí SDS-PAGE purifikovaný 293-rhML3₃₂ migroval jako široký pás v 68-80 kDa oblasti gelu (viz Obr. 15).Blue-Sepharose was directly loaded onto a WGA-Sepharose column, washed 10 times the column volume of a buffer containing 2M urea and 1M NaCl, and eluted with the same buffer containing 0.5M N-acetyl-D-glucosamine. The WGA-Sepharose eluate was loaded onto a C4-HPLC column (Synchrom, Inc) and eluted with a discontinuous propanol gradient. By SDS-PAGE the purified 293-rhML3 ₃₂ migrates as a broad band in the 68-80 kDa region of the gel (see Fig. 15).

Purifikace rhMLi.53 byla také provedena jak je posáno v příkladu 19. Krátce, 293-rhMLi53 obohacené médium bylo analyzováno na Blue-Sepharose jak je uvedeno pro rhML₃3₂ . Blue-Sepharose eluát byl nanesen přímo na mpl-afinitní kolonu jak je popsáno výše. RhMLi.53 eluovaný z mpl-afinitní kolony byl purifikován za účelem homogenisace s použitím C4-HPLC kolony za stejných podmínek, které byly použity pro rhML33₂ . Při SDS-PAGE se purifikovaný rhMLi53 rozdělil na 2 hlavní a 2 menší pásy s Mr 18000-22000 (viz obr. 15). ^{10 * * * * * * * * * * * * *} Purification was also carried rhMLi.53 range as described in Example 19. Briefly, 293-rhMLi53 rich medium were analyzed on Blue-Sepharose as described for rhML ₃ 3 _2nd The Blue-Sepharose eluate was loaded directly onto the mpl-affinity column as described above. RhMLi.53 eluted from the mpl-affinity column was purified for the purpose of homogenization using a C4-HPLC column under the same conditions that were used for rhML33 _second In SDS-PAGE, purified rhML153 was split into 2 major and 2 smaller bands with Mr 18000-22000 (see Figure 15). ^{10 * * * * * * * * * * * * * *}

10. Myší opi ligand10. Mouse opiate ligand

Pomocí PCL byl získán DNA fragment odpovídající kódující oblasti lidského mpl ligandu, gel byl purifikován a značen v přítomnosti ³²P-dATP a ³²P-dCTP. Tento test. byl použit ke screeningu 10⁶ klonů cDNA knihovny myších jater vThe DNA fragment corresponding to the coding region of the human mpl ligand was obtained by PCL, the gel was purified and labeled in the presence of ³² P-dATP and ³² P-dCTP. This test. was used to screen 10 ⁶ mouse liver cDNA library clones

XGTIO. Byl isolován a sekvenován myší klon (Obr. 16 [SEQ IDXGTIO. A mouse clone was isolated and sequenced (Fig. 16 [SEQ ID NO

NO: 16 a 13]) obsahující insert s 1443 páry basí.NO: 16 and 13]) containing a 1443 base pair insert.

Předpokládaný iniciační kodón na nukleotidové pozici 138141 byl v souladu se sekvencí příznivou pro eukaryotickou translační iniciaci (Kozák, M. J. Cell Biol., 108: 229-241 [1989]). Tuto sekvenci definuje otevřený čtecí rámec 1056 nukleotidů, které napovídají, že primární produkt bude mítThe putative initiation codon at nucleotide position 138141 was consistent with a sequence favorable for eukaryotic translation initiation (Kozak, M. J. Cell Biol., 108: 229-241 [1989]). This sequence is defined by an open reading frame of 1056 nucleotides that suggests that it will have a primary product

352 aminokyselin. Tento otevřený čtecí rámec lemuje 137 nukleotidů 5' netranslatované sekvence a 247 nukleotidů 3' netranslatované sekvence. Není tam žádné póly(A) prodloužení za 3' netranslatovanou oblastí, které by znamenalo, že klon je pravděpodobně nekompletní. N-konec předpokládané aminokyselinové sekvence je vysoce hydrofobní a pravděpodobně představuje signální peptid. Počítačová analýza (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133: 17-21 [1983]) ukázala potenciální štěpná místa pro signální peptidasu mezi zbytky 21 a 22. Štěpením v tomto místě vznikne zralý polypeptid s 331 aminokyselinami (35 kDa) identifikovaný jako mML₃3i (nebo mML2 z důvodu popsaných níže) . Sekvence obsahuje 4 cysteiny, všechny zachované v lidské sekvenci, a sedm potenciálních N-glykosylačních míst, 5 z nich je zachováno v lidské sekvenci. Znovu, stejně jako hML, všech sedm potenciálních N-glykosylačních míst je lokalizováno na C-koncové polovině proteinu.352 amino acids. This open reading frame is flanked by 137 nucleotides of the 5 'untranslated sequence and 247 nucleotides of the 3' untranslated sequence. There is no extension pole ()) beyond the 3 'untranslated region, which would indicate that the clone is probably incomplete. The N-terminus of the putative amino acid sequence is highly hydrophobic and probably represents a signal peptide. Computer analysis (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133: 17-21 [1983]) showed potential cleavage sites for signal peptidase between residues 21 and 22. Cleavage at this site yields a mature 331 amino acid (35 kDa) polypeptide. identified as mML ₃ 31 (or mML2 for the reasons described below). The sequence contains 4 cysteines, all retained in the human sequence, and seven potential N-glycosylation sites, 5 of which are retained in the human sequence. Again, like hML, all seven potential N-glycosylation sites are located at the C-terminal half of the protein.

Ve srovnání s lidskou ML, byla u nukleotidů i aminokyselinových sekvencí pozorována značná identita v „EPO-doménách těchto ML. Avšak pokud dáme vyvozené aminokyselinové sekvence lidské a myší ML vedle sebe, myší sekvence vykazuje tetrapeptidovou deleci mezi zbytky 111114 odpovídající 12 nukleotidvé deleci, která následuje za nukleotidovou polohou 618, pozorovanou u lidské (viz výše) a vepřové (viz níže) cDNA. Proto byly zkoumány další klony, aby byly nalezeny další možné isoformy ML. Jeden klon kódoval polypeptid s vyvozenou sekvencí 335 aminokyselin obsahující „chybějící tetrapeptid LPLQ. Předpokládá se, že tato forma je myší ML plné délky a označuje se jako mML nebo mML₃₃5 . Nukleotidová a vyvozená aminokyselinová sekvence mML je uvedna na Obr. 17 (SEQ ID NO: 14 a .15) . Tento cDNA klon se skládá z 1443 párů basí následovaných póly(A) zakončením. Má otevřený čtecí rámec 1068 bp lemovaný 134 basemi 5' netranslatované sekvence a 241 basemi 3' netranslatované sekvence. Vyvozený iniciační kodon leží v poloze nukleotidů 138-140. Otevřený čtecí rámec kóduje vyvozený protein o 356 aminokyselinách, prvních 21 z nich je vysoce hydrofobní a pravděpodobně funguje jako sekreční signál.Compared to human ML, considerable identity was observed for both the nucleotides and amino acid sequences in the "EPO-domains of these MLs." However, if we put the deduced amino acid sequences of human and murine ML side by side, the murine sequence shows a tetrapeptide deletion between residues 111114 corresponding to the 12 nucleotide deletion that follows the nucleotide position 618 observed in human (see above) and porcine (see below) cDNA. Therefore, other clones were screened to find other possible ML isoforms. One clone encoded a polypeptide with a deduced 335 amino acid sequence containing the "missing LPLQ tetrapeptide." It is believed that this form of a murine full length ML and is referred to as mML or mML ₃₃ 5th The nucleotide and deduced amino acid sequence of mML is shown in FIG. 17 (SEQ ID NOs: 14 and 15). This cDNA clone consists of 1443 base pairs followed by a (A) end. It has an open reading frame of 1068 bp flanked by 134 bases of the 5 'untranslated sequence and 241 bases of the 3' untranslated sequence. The deduced initiation codon lies at nucleotide position 138-140. The open reading frame encodes a deduced 356 amino acid protein, the first 21 of which are highly hydrophobic and probably function as a secretory signal.

Nakonec byl isolován třetí myší klon, byl sekvenován a bylo zjištěno, že obsahuje deleci 116 nukleotidů odpovídající hML3. Tato myší isoforma je proto nazvána mML3. Srovnání vyvozené aminokyselinové sekvence těchto dvou isoforem je ukázána na Obr. 18 (SEQ ID NO: 9 a 16).Finally, a third mouse clone was isolated, sequenced and found to contain a 116 nucleotide deletion corresponding to hML3. This mouse isoform is therefore called mML3. A comparison of the deduced amino acid sequence of the two isoforms is shown in FIG. 18 (SEQ ID NOS: 9 and 16).

Celková aminokyselinová sekvenční identita mezi lidskou a myší ML [Obr. 19 SEQ ID NO: 6 a 17]) je 72%, ale homologie není rozložena pravidelně. Oblast definovaná jako „EPO-doména (aminokyseliny 1-153 pro lidskou sekvenci a 1149 pro myší) je lépe zachována (86% homologie) než karboxy-koncová oblast proteinu (62% homologie). Toto může dále znamenat, že „EPO-doména je důležitá pro biologickou aktivitu proteinu. Je zajímavé, že z di-basických aminokyselinových prvků nacházejících se v hML, pouze dibasický prvek následující ihned po „EPO-doméně (zbytek v poloze 153-154) v lidské sekvenci je přítomen v myší sekvenci. Je to v souladu s možností, že ML plné délky představuje prekurson proteinu, který podléhá limitované proteolýze za vzniku zralého ligandu. Eventuelně proteolýza mezi Argi53~Argi54 může napomáhat vyčištění ML.Total amino acid sequence identity between human and murine ML [FIG. 19 SEQ ID NOs: 6 and 17]) is 72%, but homology is not spaced regularly. The region defined as the "EPO-domain (amino acids 1-153 for the human sequence and 1149 for the mouse) is better conserved (86% homology) than the carboxy-terminal region of the protein (62% homology). This may further mean that the EPO-domain is important for the biological activity of the protein. Interestingly, of the dibasic amino acid elements found in hML, only the dibasic element immediately following the "EPO-domain (residue at position 153-154) in the human sequence is present in the mouse sequence. This is consistent with the possibility that full-length ML is a precursor of a protein that undergoes limited proteolysis to form a mature ligand. Alternatively, proteolysis between Arg153-Arg154 may help ML purification.

Expresní vektor obsahující úplnou kódující sekvenci mML byl přechodně transfektován do 293 buněk jak je popsáno v Příkladu 1. Obohacené medium těchto buněk stimulovalo ³H-thymidinovou inkorporaci do Ba/F3 buněk exprimujících buď myší nebo lidský mpl, ale nemá vliv na parentální (bez mpl) buněčnou linii. To znamená, že klonovaná myší ML cDNA kóduje funkční ligand, který je schopen aktivovat myší i lidský ML receptor (mpl).The expression vector containing the complete mML coding sequence was transiently transfected into 293 cells as described in Example 1. The enriched medium of these cells stimulated ³ H-thymidine incorporation into Ba / F3 cells expressing either mouse or human mpl but did not affect the parental (no mpl ) cell line. That is, the cloned murine ML cDNA encodes a functional ligand that is capable of activating both the murine and human ML receptors (mpl).

11. Vepřový mpl ligand11. Pork mpl ligand

Byla isolována vepřová ML (pML) cDNA pomocí RACE PCR jak je popsáno v Příkladu 13. V ledvinách byla nalezen produkt PCR 1342 bp cDNA a byl subklonován. Některé klony byly sekvenovány a nalezen klon, který kóduje vepřový mpl ligand s 332 aminokyselinovými zbytky označený jako pML (nebo PML332) mající nukleotidovou a vyvozenou aminokyselinovou sekvenci zobrazenou na Obr. 20 (SEQ ID NO: 18 a 29).Pig ML (pML) cDNA was isolated by RACE PCR as described in Example 13. A 1342 bp cDNA PCR product was found in the kidneys and subcloned. Some clones were sequenced to find a clone that encodes a porcine mpl ligand with 332 amino acid residues designated as pML (or PML332) having the nucleotide and deduced amino acid sequences shown in FIG. 20 (SEQ ID NOS: 18 and 29).

Opět byla identifikována druhá forma, označená jako pML2, kódující protein s delecí 4 aminokyselinových zbytků (228 aminokyselinových zbytků) (viz Obr. 21 [SEQ ID NO: 21]). Srovnání aminokyselinové sekvence pML a pML2 ukázalo, že pML2 je identický kromě tetrapeptidu QLPP odpovídajícího zbytkům 111-114, které zahrnuje delece (viz Obr. 22 [SEQ ID NO: 18 a 21]). Delece čtyř aminokyselin pozorovaná u myší i vepřové ML cDNA se vyskytuje v přesně stejné poloze vyvozených proteinů.Again, a second form, designated pML2, encoding a protein with a deletion of 4 amino acid residues (228 amino acid residues) was identified (see Fig. 21 [SEQ ID NO: 21]). A comparison of the amino acid sequence of pML and pML2 showed that pML2 is identical except for the tetrapeptide QLPP corresponding to residues 111-114, which includes deletions (see Fig. 22 [SEQ ID NOs: 18 and 21]). The four amino acid deletion observed in both mouse and porcine ML cDNA occurs at exactly the same position of the deduced proteins.

Srovnání vyvozených aminokyselinových sekvencí zralého ML u člověka, myši a vepře (Obr. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 a 18]) ukazuje, že celková sekvenční identita je 72 procent mezi myší a lidskou, 68 procent mezi myší a vepřovou a 73 procent mezi vepřovou a lidskou. Homologie je substanciálně větší v amino-koncové polovině ML (EPO homologní doména). Tato doména je identické mezi dvěma druhy v 80 až 84 procentech, zatímco karboxy-koncová polovina (uhlovodíková doména) je identická pouze od 57 do 67%. Dibasický aminokyselinový prvek, který by mohl představovat proteasové štěpné místo, je přítomen na karboxylovém konci erythropoetinové homologní domény. Tento prvek je zachován mezi třemi druhy v této poloze (Obr. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 a 18]). Druhé dibasické místo přítomné v polohách 245 a 246 v lidské sekvenci není přítomno v myší nebo vepřové sekvenci. Myší a vepřové ML sekvence obsahuje 4 cysteiny, všechny zachované v lidské sekvenci. Existuje sedm potenciálních Nglykosylačních míst v myším ligandu a šest ve vepřovém ML, 5 z nich je zachováno v lidské sekvenci. Opět všechna potenciální N-glykosylační místa jsou lokalizována v Ckoncové polovině proteinu.A comparison of the deduced amino acid sequences of mature ML in human, mouse and pig (Fig. 19 [SEQ ID NOs: 6, 17 and 18]) shows that the overall sequence identity is 72 percent between mouse and human, 68 percent between mouse and pig and 73 percent between pork and human. The homology is substantially greater in the amino-terminal half of the ML (EPO homology domain). This domain is identical between the two species in 80 to 84 percent, while the carboxy-terminal half (hydrocarbon domain) is only 57 to 67% identical. A dibasic amino acid element that could represent a protease cleavage site is present at the carboxyl terminus of the erythropoietin homology domain. This element is retained among the three species at this position (Fig. 19 [SEQ ID NOs: 6, 17 and 18]). The second dibasic site present at positions 245 and 246 in the human sequence is not present in the mouse or porcine sequence. The mouse and porcine ML sequence contains 4 cysteines, all retained in the human sequence. There are seven potential Nglycosylation sites in the mouse ligand and six in porcine ML, 5 of which are conserved in the human sequence. Again, all potential N-glycosylation sites are located in the C-terminal half of the protein.

12. Exprese a purifikace TPO z buněk vaječníků čínských křečků (Chinese Hamster Ovary) (CHO)12. Expression and purification of TPO from Chinese Hamster Ovary (CHO) cells

Expresní vektory použité k transfekci CHO buněk jsou označeny: pSVI5.ID.LL.MLORF (plné délky nebo TPO332) , a pSVI5. ID.LL.MLEPO-D (zkrácený nebo TPO153) . Související znaky těchto plasmidú jsou uvedeny na Obr. 23 a 24.Expression vectors used to transfect CHO cells are designated: pSVI5.ID.LL.MLORF (full length or TPO332), and pSVI5. ID.LL.MLEPO-D (abbreviated or TPO153). The related features of these plasmids are shown in FIG. 23 and 24.

Transfekční postup byl proveden jak je popsáno v Příkladu 20. Krátce, cCNA odpovídající úplnému otevřenému čtecímu rámci TPO byla získána pomocí PCR. Produkt PCR byl purifikován a klonován mezi dvěma restrikčními místy (Clal a Sall) plasmidú pSVI5.ID.LL, aby byl získán vektor pSVI5.ID.LL.MLOLRF. Druhý konstrukt odpovídající EPO homologní doméně byl připraven stejným způsobem, ale s použitím jiného reversního primerů(EPOD.Sal). Konečný konstrukt pro vektor kódující EPO homologní doménu TPO je nazýván pSVI5.ID.LL.MLEPO-D.The transfection procedure was performed as described in Example 20. Briefly, cCNA corresponding to the full TPO open reading frame was obtained by PCR. The PCR product was purified and cloned between two restriction sites (ClaI and SalI) of the plasmids pSVI5.ID.LL to obtain the vector pSVI5.ID.LL.MLOLRF. A second construct corresponding to the EPO homology domain was prepared in the same manner, but using a different reverse primer (EPOD.Sal). The final construct for the vector encoding the EPO homology domain of TPO is called pSVI5.ID.LL.MLEPO-D.

Tyto dva konstrukty byly linearizovány s Notl a transfektovány do buněk vaječníků čínského křečka (CHO-DP12 buňky, EP 307,247 publikovaný 15. března 1989) elektroporací. 10⁷ buněk bylo elektroporováno v BRL elektroporační aparatuře (360 voltú, 330 mF, nízká kapacitance) v přítomnosti 10, 25 nebo 50 mg DNA jak je popsáno (Andreason, G.L. J. Tissue Cult. Meth. 15,56 [1993]). Den po transfekci byly buňky rozrušeny v selektivním mediu (vysoce glukosové DMEM-F12 50:50 bezThe two constructs were linearized with NotI and transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO-DP12 cells, EP 307,247 published March 15, 1989) by electroporation. 10 ⁷ cells were electroporated in a BRL electroporation apparatus (360 volts, 330 mF, low capacitance) in the presence of 10, 25 or 50 mg of DNA as described (Andreason, GLJ Tissue Cult. Meth. 15.56 [1993]). The day after transfection, cells were disrupted in selective medium (high glucose DMEM-F12 50:50 without

glycinu, glycine, 2mM 2mM glutamin, glutamine, 2-5% dialyzované fetální 2-5% dialyzed fetal telecí veal sérum). 0 serum). 0 10 10 až 15 dní up to 15 days později byly later they were jednotlivé individually kolonie colony přeneseny transferred na on 96-j amkové 96-well destičky a Plates a ponechány left růst až Grow up

vznikly shluky. Exprese ML153 nebo ML332 v obohaceném mediu z těchto klonů byla stanovena s použitím Ba/F3-mpi prolifarativního stanovení (popsáno v Příkladu 1).clusters formed. The expression of ML153 or ML332 in the enriched medium from these clones was determined using a Ba / F3-mpi prolifarative assay (described in Example 1).

Postup purifikace a isolace TPO z tekutiny vypěstovaných CHO buněčných kultur je popsán v Příkladu 20. Krátce, tekutina vypěstovaných buněk kultury (HCCF) je nanesena na kolonu Blue Sepharose (Pharmacia) v poměru přibližně 1001 HCCF na litr pryskyřice. Kolona je poté promyta pufrem obsahujícím 2,0M močoviny, množstvím 3 až 5 násobným objemu kolony. TPO je poté eluován pufrem obsahujícím 2,0M močoviny a l,0M NaCl, množstvím 3 až 5 násobným objemu kolony.The procedure for purifying and isolating TPO from liquid cultured CHO cell cultures is described in Example 20. Briefly, cultured cell culture fluid (HCCF) is loaded onto a Blue Sepharose column (Pharmacia) at a ratio of approximately 1001 HCCF per liter of resin. The column is then washed with a buffer containing 2.0 M urea, 3 to 5 times the column volume. The TPO is then eluted with a buffer containing 2.0 M urea and 1.0 M NaCl, 3 to 5 times the column volume.

Eluát z Blue Sepharose obsahující TPO je pak nanesen na kolonu Wheat Germ Lectin Sepharose (Pharmacia) ekvilibrovanou Blue Sepharose elučním pufrem v poměru od 8 do 16 ml Blue Sepharose eluátu na ml pryskyřice. Kolona je poté promyta 2 až 3 objemy kolony ekvilibračního purfu. TPO je poté eluován 2 až 5 objemy kolony pufru obsahujícího 2,0M močoviny a 0,5M N-acetyl-D-glukosaminu.The Blue Sepharose eluate containing TPO is then loaded onto a Wheat Germ Lectin Sepharose (Pharmacia) column equilibrated with Blue Sepharose elution buffer in a ratio of 8 to 16 ml Blue Sepharose eluate per ml resin. The column is then washed with 2-3 column volumes of the equilibration buffer. The TPO is then eluted with 2-5 column volumes of a buffer containing 2.0 M urea and 0.5 M N-acetyl-D-glucosamine.

Wheat Germ Lectin eluát obsahující TPO je poté okyselen a je přidán C12E8 do celkové koncentrace 0,04%. Výsledný eluát je nanesen na C4 kolonu s reversní fázi ekvilibrovanou 0,1% TFA, 0,04% C₁₂E₈ při naplnění 0,2 až 0,5 mg proteinu na ml pryskyřice.The Wheat Germ Lectin eluate containing TPO is then acidified and C12E8 is added to a total concentration of 0.04%. The resulting eluate is loaded onto a C4 reverse phase column equilibrated with 0.1% TFA, 0.04% C ₁₂ E ₈ at filling 0.2 to 0.5 mg protein per ml of resin.

Protein je eluován dvoufázovým lineárním gradientem acetonitrilu obsahujícím 0,1% TFA a 0,04% C12E8 a eluát rozdělen na SDS-PAGE.The protein is eluted with a two-phase linear gradient of acetonitrile containing 0.1% TFA and 0.04% C12E8 and the eluate separated on SDS-PAGE.

C4 eluát byl poté zředěn a diafiltrován proti přibližně 6 objemům pufru na Amiconu YM nebo ultrafiltrační membránou s hranicí 10000 až 30000 Daltonů molekulární hmotnosti. Výsledný diafiltrát může být zpracován přímo, nebo dále koncentrován ultrafiltrací. Diafiltrát/koncentrát je obvykle upraven na výslednou koncentraci 0,01% Tween-80.The C4 eluate was then diluted and diafiltered against approximately 6 volumes of buffer on Amicon YM or an ultrafiltration membrane with a limit of 10,000 to 30,000 Daltons molecular weight. The resulting diafiltrate may be processed directly or further concentrated by ultrafiltration. The diafiltrate / concentrate is usually adjusted to a final concentration of 0.01% Tween-80.

Všechen nebo část diafiltrátu/ultrafiltrátu odpovídající 2 až 5% vypočítaného objemu kolony byl nanesen na Sephacryl S-300 HR kolonu (Pharmacia) ekvilibrovanou pufrem obsahujícím 0,01% Tween-80 a chromatografován. Frakce obsahující TPO, ve kterých nejsou shluky a produkty proteolitické degradace, byly poté rozděleny na SDS-PAGE, zfiltrovány a skladovány při 2-8°C.All or part of the diafiltrate / ultrafiltrate corresponding to 2-5% of the calculated column volume was loaded onto a Sephacryl S-300 HR column (Pharmacia) equilibrated with a buffer containing 0.01% Tween-80 and chromatographed. Fractions containing TPO in which there are no clumps and proteolithic degradation products were then separated on SDS-PAGE, filtered and stored at 2-8 ° C.

13. Způsob transformace a Indukce TPO syntesy v mikroorganismu a isolace, purifikace a znovusvinuti takto připraveného TPO13. Method of transformation and induction of TPO synthesis in microorganism and isolation, purification and rewinding of TPO thus prepared

Konstrukce E. coli TPO expresních vektorů je detailně popsána v Příkladu 21. Krátce, plasmidy pMP21, pME151, pMP41, pMP57 a pMP202 byly všechny konstruovány pro expresi prvních 155 aminokyselin TPO po směru malého leaderu, který se liší mezi různými konstrukty. Leadery zajišťují zejména vysoký stupeň translační iniciace a rychlou purifikaci. Plasmidy pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 jsou konstruovány pro expresi prvních 153 aminokyselin TPO po směru iniciačního methioninu a liší se pouze v použití kodonu pro prvních 6 aminokyselin v TPO, zatímco plasmid pMP251 je derivátem pMP210-l v kterém je karboxykoncový konec TPO prodloužen o dvě aminokyseliny. Všechny výše uvedené plasmidy budou produkovat vysoké hladiny intracelulární exprese TPO v E. coli za indukce tryptofanového promotoru (Yansura, D.G. a kol., Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., editor) 185: 54-60, Academie Press, San Diego [1990]). Plasmidy ρΜΡχ₇2 jsou meziprodukty při konstrukci výše uvedených TPO intracelulárních expresních plasmidů.The construction of E. coli TPO expression vectors is described in detail in Example 21. Briefly, plasmids pMP21, pME151, pMP41, pMP57 and pMP202 were all designed to express the first 155 amino acids of TPO downstream of a small leader that varies between different constructs. In particular, the leaders ensure a high degree of translational initiation and rapid purification. The plasmids pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 are designed to express the first 153 amino acids of TPO downstream of the initiating methionine and differ only in the codon usage for the first 6 amino acids in TPO, while plasmid pMP251 is a derivative pMP210-1 wherein the carboxy terminus of TPO is extended by two amino acids. All of the above plasmids will produce high levels of intracellular expression of TPO in E. coli inducing the tryptophan promoter (Yansura, DG et al., Methods in Enzymology (Goeddel, DV, editor) 185: 54-60, Academic Press, San Diego [1990] ]). Plasmids ρΜΡχ ₇ 2 are intermediates in the construction of the above TPO intracellular expression plasmids.

Výše uvedené TPO expresní plasmidy byly použity k transformaci E.coli s použitím CaCl2 tepelné šokové metody (Mandel, M. a kol., J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]) a dalších postupů uvedených v Příkladu 21. Krátce, transformované buňky byly pěstovány při 37°C za optické hustoty (600nm) kultury dosahující přibližně 2 až 3. Kultura byla poté naředěna a, po růstu s provzdušňováním, byla přidána kyselina. Kultura byla poté ponechána znovu růst se vzdušněním dalších 15 hod. a po této době byly buňky odděleny centrifugací.The above TPO expression plasmids were used to transform E. coli using the CaCl2 thermal shock method (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]) and other procedures described in Example 21. Briefly, transformed cells were grown at 37 ° C at an optical density (600nm) of culture reaching approximately 2-3. The culture was then diluted and, after growth with aeration, acid was added. The culture was then allowed to grow again with aeration for a further 15 hours, after which time the cells were separated by centrifugation.

Isolační, purifikační a znovusvinovací postupy uvedené níže pro získání biologicky aktivního, znovusvinutého TPO nebo jeho fragmentů, jsou popsány v Příkladu 22 a 23, mohou být aplikovány pro získání jakékoliv TPO varianty včetně Na C-koncových prodloužených forem. Další postupy vhodné pro znovusvinutí rekombinantního nebo syntetického TPO mohou být nalezeny v následujících patentech; Builder a kol., U.S. Patent 4,511,502; Jones a kol., U.S. Patent 4,512,922; Olson U.S Patent 4,518,526 a Builder a kol., U.S. Patent 4.620.948; jako obecný popis postupu získání a znovusvinutí pro různé rekombinantní proteiny exprimované v rozpustné formě v E. coli.The isolation, purification, and reclamation procedures set forth below to obtain biologically active, re-developed TPO, or fragments thereof, are described in Examples 22 and 23, can be applied to obtain any TPO variant including Na C-terminal extended forms. Other procedures suitable for the reclamation of recombinant or synthetic TPO can be found in the following patents; Builder et al. Patent 4,511,502; Jones et al. Patent 4,512,922; Olson U.S. Patent 4,518,526 and Builder et al. Patent 4,620,948; as a general description of the recovery and re-up process for various recombinant proteins expressed in soluble form in E. coli.

A. Znovuzískání nerozpustného TPOA. Recovery of insoluble TPO

Mikroorganismus jako je E. coli exprimující TPO kódovaný jakýmkoliv vhodným plasmidem je fermentován za podmínek při kterých je TPO uložen do nerozpustných „refraktilních částic. Nepovinně jsou buňky nejprve prómyty v buňky rozrušujícím pufru. Obvykle je 100 g buněk resuspendováno v desetinásobném objemu buňky rozrušujícího purfu (např. lOmM Tris, 5mM EDTA, pH 8) s, například, Polytron homogenizérem a buňky jsou centrifugovány při 5000xg 30 min. Buňky jsou poté lýzovány s použitím obvyklých technik, jako je tonický šok, ultrazvuk, tlakový cyklus, chemické nebo enzymatické metody. Například promyté buněčné pelety mohou být resuspendovány v dalším desetinásobku objemu buňky rozrušujícího pufru s homogenizérem a buněčná suspense protlačena přes LH buněčný rozrušovač (Cell Disrupter, LH Inceltech, lne.) nebo přes mikrofluidizér (Microfluidics International) podle komerčního návodu. Hmota obsahující TPO je poté separována z kapalné fáze a nepovinně promyta vhodnou kapalinou. Například suspense buněk může být centrifugována při 5000xg 30 min., resuspendována a nepovinně centrifugována podruhé za vzniku promytých pelet refraktilních částic. Promyté pelety mohou být použity ihned nebo nepovinně skladovány zmražené (při -70°C).A microorganism such as E. coli expressing TPO encoded by any suitable plasmid is fermented under conditions where the TPO is embedded in insoluble "refractory particles." Optionally, the cells are first washed in the cell by disruption buffer. Typically, 100 g of cells are resuspended in a 10-fold volume of disruptive cell cell (eg, 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) with, for example, a Polytron homogenizer and the cells are centrifuged at 5000xg for 30 min. The cells are then lysed using conventional techniques such as tonic shock, ultrasound, pressure cycle, chemical or enzymatic methods. For example, the washed cell pellets may be resuspended in an additional ten times the volume of the disruption buffer cell with the homogenizer and the cell suspension passed through an LH cell disrupter (LH Inceltech, Inc) or via a microfluidizer (Microfluidics International) according to commercial instructions. The TPO-containing mass is then separated from the liquid phase and optionally washed with a suitable liquid. For example, the cell suspension may be centrifuged at 5000xg for 30 min, resuspended, and optionally centrifuged a second time to form washed refractile particle pellets. The washed pellets can be used immediately or optionally stored frozen (at -70 ° C).

B. Silubilizace a purifikace monomerního TPOB. Silubilization and purification of monomeric TPO

Nerozpustný TPO v peletách refraktilních částic je poté solubilizován solubilizačním pufrem. Solubilizační pufr obsahuje chaotropní agens a je obvykle pufrován při basickém pH a obsahuje redukční agens ke zlepšení výtěžku monomerního TPO. Představitelem chaotropního agens je močovina, guanidin.HCl a thiokyanát sodný. Preferovaným chaotropním agens je guanidin.HCI. Koncentrace chaotropního agens je obvykle 4-9M, výhodněji 6-8M. pH solibilizačního roztoku je zajištěno vhodným pufrem v rozmezí pH od 7,5 do 9,5, výhodněji 8,0 - 9,0 a nejvýhodněji 8,0. Solubilizační pufr také výhodněji obsahuje redukční agens napomáhající vzniku monomerní formy TPO. Vhodné redukční agens je organická sloučenina obsahující volný thiol (RSH). Představitelem redukčního agens je dithiothreitol (DTT), dithioerythriol (DTE), merkaptoethanol, glutathion (GSH), cysteamin a cystein. Preferovaným redukčním činidlem je dithiothreitol (DTT). Nepovinně může solubilizační pufr obsahovat mírné oxidační agens (např. molekulární kyslík) a siřičitanovou sůl tvoříčí monomerický TPO sulfitolýzou. V tomto provedení je výsledný TPO-S-sulfonát později znovusvinut v přítomnosti redoxního purfu (např. GSH/GSSG) na vzniku správně svinutého TPO.The insoluble TPO in the refractile particle pellets is then solubilized with solubilization buffer. The solubilizing buffer contains a chaotropic agent and is typically buffered at basic pH and contains a reducing agent to improve the yield of monomeric TPO. Representative of the chaotropic agent is urea, guanidine.HCl and sodium thiocyanate. A preferred chaotropic agent is guanidine.HCl. The concentration of the chaotropic agent is usually 4-9M, more preferably 6-8M. The pH of the solitizing solution is provided with a suitable buffer in the pH range of 7.5 to 9.5, more preferably 8.0-9.0 and most preferably 8.0. The solubilization buffer also more preferably comprises a reducing agent to aid in the formation of the monomeric form of TPO. A suitable reducing agent is an organic compound containing free thiol (RSH). Representative of the reducing agent is dithiothreitol (DTT), dithioerythriol (DTE), mercaptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine and cysteine. A preferred reducing agent is dithiothreitol (DTT). Optionally, the solubilization buffer may contain a mild oxidizing agent (eg, molecular oxygen) and a sulfite salt forming monomeric TPO by sulfitolysis. In this embodiment, the resulting TPO-S-sulfonate is later re-wound in the presence of a redox purf (eg, GSH / GSSG) to form a correctly folded TPO.

TPO protein je obvykle dále purifikován s použitím např. centrifugace, gelové filtrační chromatografie a kolonové chromatografie s refersní fází.The TPO protein is usually further purified using, for example, centrifugation, gel filtration chromatography, and reverse phase column chromatography.

Pro ilustraci, vhodný výtěžek monomerního TPO byl získán následujícím postupem. Pelety refraktilních částic byly resuspendovány v 5 objemech hmotnosti solubilizačního pufru (20 mM Tris, pH 8, s 6-8M guanidin a 25mM DTT) a míchány 1-3 hodiny, nebo přes noc, při 4°C, aby byla úspěšná solubilizace TPO proteinu. Vysoké koncentrace močoviny (6-8M) jsou také účinné, ale celkový výsledek ukazuje poněkud nižší výtěžky ve srovnání s guanidinem. Po solubilizaci je roztok centrifugován při 30000xg 30 min. za vzniku čistého supernatantů obsahujícího denaturovaný, monomerní TPO protein. Supernatant je poté chromatografován na Superdex 200 gelové filtrační koloně (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) při průtoku 2 ml/min a protein eluován 20 mMBy way of illustration, a suitable yield of monomeric TPO was obtained by the following procedure. Refractile particle pellets were resuspended in 5 volumes of solubilization buffer weight (20 mM Tris, pH 8, with 6-8M guanidine and 25mM DTT) and mixed for 1-3 hours or overnight at 4 ° C to successfully solubilize the TPO protein . High urea concentrations (6-8M) are also effective, but the overall result shows somewhat lower yields compared to guanidine. After solubilization, the solution is centrifuged at 30000xg for 30 min. to form pure supernatants containing denatured, monomeric TPO protein. The supernatant is then chromatographed on a Superdex 200 gel filtration column (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) at a flow rate of 2 ml / min and the protein eluted with 20 mM

Na fosfátem, pH 6,0, s lOmM DTT. Byly shromážděny frakce obsahující monomerní denaturovaný TPO protein eluovaný mezi 160 a 200 ml. TPO protein je dále purifikován na semipreparativní C4 koloně s reversní fází (2 x 20 cm VYDAC) . Vzorek byl aplikován při 5 ml/min na kolonu ekvilibrovanou 0,1% TFA (kyselina trifluoroctová) s 30% acetonitrilu. Protein je eluován lineárním gradientem acetonitrilu (30— 60% v 60 min). Purifikovaný redukovaný protein eluuje při 50% acetonitrilu. Tento materiál je použit pro znovusvinutí za získání biologicky aktivní varianty TPO.Na phosphate, pH 6.0, with 10 mM DTT. Fractions containing monomeric denatured TPO protein eluting between 160 and 200 ml were collected. The TPO protein is further purified on a reverse phase semi-preparative C4 column (2 x 20 cm VYDAC). The sample was applied at 5 ml / min to a column equilibrated with 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) with 30% acetonitrile. The protein is eluted with a linear gradient of acetonitrile (30-60% in 60 min). The purified reduced protein eluted at 50% acetonitrile. This material is used for refolding to obtain a biologically active variant of TPO.

C. Znovusvinutí TPO na vzniku biologicky aktivní formyC. Rebound of TPO to form biologically active form

Po solubilizaci a další purifikaci TPO je získána biologicky aktivní forma znovusvinutím denaturovaného monomerního TPO v redoxním pufru. Z důvodu vysoké účinnosti TPO (polovina maximální stimulace v Ba/F3 vazebném stanovení je dosažena při 3 pg/ml) je možné k získání biologicky aktivního materiálu použít mnoho různých pufrů, detergentů a redoxních podmínek. Ovšem za mnoha podmínek je získáno velmi malé množství správně svinutého materiálu (<10%). Pro komerční průmyslové způsoby přípravy je požadován výtěžek znovusvinutí nejméně 10%, výhodněji. 3050% a nejvýhodněji >50%. Pro produkci nejméně takto svinutého materiálu bylo nalezeno mnoho různých detergentů zahrnujících Triton X-100, dodecyl-beta-maltosid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkosyl, TWEEN 20 a Tween 80, Zwittergent 314 a další. Z těchto detergentů byly ovšem nejvýhodnější detergenty ze skupiny CHAPS (CHAPS a CHAPSO), u kterých bylo zjištěno, že znovusvinovací reakce probíhá nejlépe a omezuje proteinovou agregaci a nevhodné disulfidové formace. Nejvýhodnější je hladina CHAPS vyšší než 1%. Pro lepší výtěžek byl potřebný chlorid sodný, s optimální hladinou mezi O,1M a 0,5 Μ. V redoxním pufru byla preferován přítomnost EDTA (l-5mM) kvůli omezení rozsahu kovem katalyzované oxidace (a agregace), která byla pozorována u některých preparací. Optimální podmínky pro znovusvinutí jsou při koncentraci glycerolu větší než 15%. Pro maximální výtěžek je nezbytné mít v redoxním pufru redoxní pár skládající se z exidovaného i redukovaného organického thiolu (RSH). Vhodný redoxní pár zahrnuje merkaptoethanol, glutathion (GSH), cysteamin, cystein a jejich odpovídající oxidované formy. Výhodným redoxním párem je glutathion(GSH):oxidovaný glutathion(GSSG) nebo cystein:cystin. Nejvýhodnějším redoxním párem je je glutathion(GSH):oxidovaný glutathion(GSSG). Obecně vyšší výtěžek je pozorován pokud molární poměr oxidovaného člena redoxního páru je stejný nebo v přebytku proti redukovanému členu redoxního páru. Pro znovusvinutí této varianty TPO jsou optimální pH hodnoty mezi 7,5 a 9. Organické rozpouštědlo (např. ethanol, acetonitril, methanol) bylo tolerováno v koncentracích 10-15% nebo nižších. Vyšší hladiny organických rozpouštědel zvyšují množství nesprávně svinutých forem. Tris a fosfátové pufry byly obecně použitelné. Inkubace při 4°C také zvyšuje hladiny správně svinutého TPO.After solubilization and further purification of the TPO, the biologically active form is obtained by rewinding the denatured monomeric TPO in a redox buffer. Because of the high efficiency of TPO (half the maximum stimulation in the Ba / F3 binding assay is achieved at 3 µg / ml), many different buffers, detergents and redox conditions can be used to obtain the biologically active material. However, under many conditions a very small amount of properly rolled material (<10%) is obtained. For commercial industrial preparation processes, a refolding yield of at least 10%, more preferably, is required. 3050% and most preferably> 50%. Many different detergents have been found to produce the least coiled material including Triton X-100, dodecyl-beta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosyl, TWEEN 20 and Tween 80, Zwittergent 314 and others. Of these detergents, however, the most preferred were those of the CHAPS family (CHAPS and CHAPSO), which were found to be the best regrowth reaction to reduce protein aggregation and inappropriate disulfide formulations. Most preferred is a CHAPS level of greater than 1%. For better yield sodium chloride was needed, with an optimal level between 0.1M and 0.5 Μ. The presence of EDTA (1-5 mM) was preferred in the redox buffer to limit the extent of the metal catalyzed oxidation (and aggregation) observed in some preparations. Optimal conditions for rewinding are greater than 15% at glycerol concentration. For maximum yield, it is necessary to have a redox pair in the redox buffer consisting of both exidated and reduced organic thiol (RSH). Suitable redox pairs include mercaptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine, cysteine and their corresponding oxidized forms. A preferred redox pair is glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSSG) or cysteine: cystine. The most preferred redox pair is glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSSG). Generally, a higher yield is observed when the molar ratio of the oxidized redox member is equal to or in excess of the reduced redox member. PH values between 7.5 and 9 are optimal for re-development of this TPO variant. The organic solvent (eg ethanol, acetonitrile, methanol) was tolerated at concentrations of 10-15% or less. Higher levels of organic solvents increase the amount of misfolded forms. Tris and phosphate buffers were generally applicable. Incubation at 4 ° C also raises levels of correctly folded TPO.

Výtěžek znovusvinutí 40-60% (na základě množství redukovaného a denaturovaného TPO použitého v znovusvinovací reakci) je typický pro preparace TPO, kde purifikace probíhá přes první C4 krok. Aktivní materiál může být získán i při omezení purifikační preparace (např. přímo po Superdex 200 koloně nebo po úvodní extrakci refraktilních částic), ovšem výtěžky jsou nižší kvůli rozsáhlé precipitaci a interferenci s non-TPO proteiny během TPO znovusvinovacího procesu.The re-recovery yield of 40-60% (based on the amount of reduced and denatured TPO used in the re-refolding reaction) is typical for TPO preparations where purification occurs through the first C4 step. The active material can also be obtained by limiting the purification preparation (eg directly after the Superdex 200 column or after the initial extraction of refractile particles), but yields are lower due to extensive precipitation and interference with non-TPO proteins during the TPO re-recovery process.

Zatímco TPO obsahuje 4 cysteinové zbytky, je možné připravit tři různé disulfidové verze tohoto proteinu: verze 1: disulfidy mezi cysteinovými zbytky 1-4 a 2-3 verze 2: disulfidy mezi cysteinovými zbytky 1-2 a 3-4 verze 3: disulfidy mezi cysteinovými zbytky 1-3 a 2-4.While TPO contains 4 cysteine residues, it is possible to prepare three different disulfide versions of this protein: version 1: disulfides between cysteine residues 1-4 and 2-3 version 2: disulfides between cysteine residues 1-2 and 3-4 version 3: disulfides between cysteine residues 1-3 and 2-4.

- Během počátečních pokusů při stanovení podmínek znovusvinovací reakce, bylo C4 chromatografií s reversní fází separováno několik různých píků obsahujících TPO protein. Pouze jeden z těchto píků měl signifikantní biologickou aktivitu, jak bylo stanoveno Ba/F3 stanovením. Následně byly svinovací podmínky optimalizovány za přednostního zisku této verze. Za těchto podmínek bylo v solubilizačním kroku získáno méně než 10-20% chybně svinutého TPO z celkového monomerního TPO.Several initial peaks containing TPO protein were separated by C4 reversed phase chromatography during the initial attempts to determine the conditions of the re-uptake reaction. Only one of these peaks had significant biological activity as determined by the Ba / F3 assay. Subsequently, the rolling conditions were optimized for the preferred gain of this version. Under these conditions, less than 10-20% of the misfolded TPO of the total monomeric TPO was recovered in the solubilization step.

Hmostností spektrometrií a sekvenováním proteinu byl jako disulfidový vzor pro biologicky aktivní TPO stanoven 1-4 a 2-3, kde jsou cysteiny číslovány sekvenčně od aminokonce. Tento cysteinem křížově vázaný vzor je v souladu se známým disulfidovým vazebným vzorem odpovídajícím molekule erythropoetinu.By mass spectrometry and protein sequencing, 1-4 and 2-3 were determined as the disulfide pattern for biologically active TPO, where the cysteines are numbered sequentially from the amino terminus. This cysteine cross-linked pattern is consistent with the known disulfide bond pattern corresponding to the erythropoietin molecule.

D. Biologická aktivita rekombinantního, znovusvinutého TPOD. Biological activity of recombinant, re-developed TPO

Znovusvinutý a purifikovaný TPO má aktivitu ve stanoveních in vitro i in vivo. Např. v Ba/F3 stanovení, byla polovina maximální stimulace thymidinové inkorporace do Ba/F3 buněk pro TPO (Met^-1 1-153) zjištěna při 3,3 pg/ml (0,3 pM). V testu ELISA založeném na mpl-receptoru byla polovina maximální aktivity pozorována při 1,9 ng/ml (120 pM) . U normálních a myelosuprimovaných zvířat připravených téměř letální X-radiací, byla znovusvinutá TPO (Met^-1 1153) vysoce účinná (aktivita byla pozorována při dávce nižší než 30 ng/myš) při stimulaci produkce nových destiček. Podobná biologická aktivita byla pozorována u ostatních forem TPO znovusvinutých podle výše popsaných postupů (viz Obr. 25, 26 a 28).Recreated and purified TPO has activity in both in vitro and in vivo assays. E.g. In the Ba / F3 assay, half-maximal stimulation of thymidine incorporation into Ba / F3 cells for TPO (Met ^-1 1-153) were detected at 3.3 pg / ml (0.3 pM). In an mpl-receptor based ELISA, half of the maximal activity was observed at 1.9 ng / ml (120 pM). In normal and myelosuppressed animals prepared by near lethal X-radiation, re-developed TPO (Met ^-1 1153) was highly effective (activity was observed at a dose of less than 30 ng / mouse) in stimulating the production of new platelets. Similar biological activity was observed with other forms of TPO re-developed according to the above described procedures (see Figures 25, 26 and 28).

14. Způsob měření trombopoetické aktivity14. Method of measuring thrombopoietic activity

Trombopoetická aktivita může být měřena různými stanoveními, které zahrnují Ba/F3 mpl ligandové stanovení popsané v Příkladu 1, in vivo myší destičkové revazebné syntézové stanovení, stanovení indukce antigenu buněčného potvrchu destiček a měření anti-destičkového stanovení (anti-GPII_bIII_a) buněčné linii lidských leukemických megakaryoblastů (CMK) (viz Sáto a kol., Brit. J. Heamatol., 72: 184-190 [1989])(viz také kapalné suspensní megakaryocytopoetické stanovení popsané v Příkladu 4), a indukci polyploidizace v megakaryoblastické buněčné linii (DAMI)(viz Ogura a kol., Blood, 72(1): 49-60 [1988]). Zrání megakaryocytů z nezralých, většinou DNA nesyntetizujících buněk, na morfologicky identifikovatelné megakaryocyty představuje proces, který zahrnuje objevení se cytoplasmických organel, získání membránových antigenů (GPII_bIII_a) _t endoreplikaci a uvolnění destiček, jak je popsáno v oddílu Dosavadní stav techniky. Očekává se, že kmenově specifický promotor (tj. mpl ligand) megakaryocytového zrání bude indukovat nejméně některé z těchto změn v nezralých megakaryocytech vedoucí k uvolnění destiček a zmírnění trombocytopenie. Zde byla tedy navržena stanovení pro měření změn těchto parametrů v nezralých megakaryocytových buněčných liniích, tj . CMK a DAMI buňkách. CMK stanovení (Příklad 4) měří výskyt specifického destičkového markéru, GPIIbIIIa/ a produkci destiček. DAMI stanovení (Příklad 15) měří endoreplikaci protože zvýšení ploidity je znakem zralosti megakaryocytů. Rozpoznatelné megakaryocyty mají hodnoty ploidity 2N, 4N, 8N, 16N, 32N atd. Nakonec in vivo myší destičkové revazebné stanovení (Příklad 16) je užitečné při demonstraci, že podávání testované sloučeniny (zde mpl ligandu) vede ke zvýšení počtu destiček.Thrombopoietic activity may be measured in various assays, which include the Ba / F3 mpl ligand assay provided in Example 1, an in vivo mouse platelet revazebné synthese assays, the induction of antigen cell potvrchu platelets and the measurement of anti-platelet assay (anti-gpIII _b III _a) Cell the human leukemic megakaryoblast (CMK) line (see Sato et al., Brit. J. Heamatol., 72: 184-190 [1989]) (see also the liquid suspension megakaryocytopoietic assay described in Example 4), and inducing polyploidization in the megakaryoblastic cell line (DAMI) (see Ogura et al., Blood, 72 (1): 49-60 [1988]). Maturation of megakaryocytes from immature, usually DNA nesyntetizujících cells to morphologically identifiable megakaryocytes is a process that includes appearance of cytoplasmic organelles, acquisition of membrane antigens (III gpIII _{b) t} endoreplikaci and release of platelets as described in the Background section. The strain-specific promoter (ie, the mpl ligand) of megakaryocyte maturation is expected to induce at least some of these changes in immature megakaryocytes leading to platelet release and amelioration of thrombocytopenia. Thus, assays have been proposed for measuring changes in these parameters in immature megakaryocyte cell lines, i. CMK and DAMI cells. The CMK assay (Example 4) measures the incidence of specific platelet marker, GPIIbIIIa / and platelet production. The DAMI assay (Example 15) measures endoreplication because an increase in ploidy is indicative of megakaryocyte maturity. Recognizable megakaryocytes have ploidy values of 2N, 4N, 8N, 16N, 32N etc. Finally, an in vivo mouse platelet binding assay (Example 16) is useful in demonstrating that administration of a test compound (here, mpl ligand) results in an increase in platelet count.

Pro měření TPO aktivity byla vyvinuta dvě další in vitro stanovení. První je kinasová receptorová aktivační (KIRA) ELISA, kdy jsou CHO buňky transfektovány mpl-Rse chimérou a pomocí ELISA je měřena tyrosinová fosforylace Rse po působení mpl části chiméry na mpl ligand (viz Příklad 17) . Druhý je na receptoru založená ELISA, kde ELISA destička pokrytá králičím anti-lidským IgG zachycuje lidský chimérický receptor mpl-IgG, který váže mpl stanovovaný ligand. K detekci navázaného ligandu se používá biotinylovaná králičí protilátka k mpl ligandu (TPO155) a měří se s použitím streptavidin-peroxidasy jak je popsáno v Příkladu 18.Two additional in vitro assays were developed to measure TPO activity. The first is a kinase receptor activation (KIRA) ELISA where CHO cells are transfected with the mpl-Rse chimera and tyrosine phosphorylation of Rse is measured by ELISA after the mpl portion of the chimera is treated with an mpl ligand (see Example 17). The second is a receptor-based ELISA, wherein an ELISA plate coated with rabbit anti-human IgG captures the human chimeric mpl-IgG receptor, which binds the mpl assay ligand. Biotinylated rabbit antibody to mpl ligand (TPO155) is used to detect bound ligand and measured using streptavidin peroxidase as described in Example 18.

15. Zn vivo biologická odpověď normálních a subletálně ozářených myší léčených TPOZn vivo biological response of normal and sublethally irradiated TPO treated mice

Normální a subletálně ozářené myši byly léčeny TPO plné délky a zkráceným TPO, izolovaným z buněk vaječníků čínských křečků (CHO), E. coli a buněk lidských zárodečných ledvin (293) . Obě formy TPO produkované těmito třemi hostiteli stimulovaly produkci destiček u myší, avšak TPO plné délky isolovaný z CHO vykazoval největší in vivo odpověď. Tyto výsledky ukazují, že správná glykosylace karboxy-koncové domény může být nutná pro optimální in vivo aktivitu.Normal and sublethally irradiated mice were treated with full-length TPO and truncated TPO isolated from Chinese Hamster Ovary (CHO), E. coli and human germ kidney cells (293). Both forms of TPO produced by these three hosts stimulated platelet production in mice, but full-length TPO isolated from CHO showed the greatest in vivo response. These results indicate that proper glycosylation of the carboxy-terminal domain may be necessary for optimal in vivo activity.

a) E. coli-rhTPO(_MET \ 153) „Met forma EPO domény (Met v -1 poloze plus prvnícha) E. coli-rhTPO ( _MET \ 153) "Met form of EPO domain (Met at -1 position plus the first

153 zbytků lidského TPO) produkovaná v E. coli (viz Příklad153 residues of human TPO) produced in E. coli (see Example

23) byla injektována denně do normální myší samice C57 B6 jak je popsáno v legendě k Obr. 25A, 25B a 25C. Tyto obrázky ukazují, že neglykosylovaná zkrácená forma TPO produkovaná v E. coli a znovusvinutá jak je popsáno výše je schopná stimulovat dvojnásobného zvýšení produkce destiček u normální výši bez ovlivnění populací červených nebo bílých krevních buněk.23) was injected daily into normal female C57 B6 mice as described in the legend to FIG. 25A, 25B and 25C. These figures show that a non-glycosylated truncated form of TPO produced in E. coli and re-developed as described above is able to stimulate a two-fold increase in platelet production at normal levels without affecting red or white blood cell populations.

Stejná molekula injektovaná denně do subletálně ozářené (¹³⁷Cs) normální myší samice C57 B6 jak je popsáno v legendě k Obr. 26a, 26B a 26C stimulovala regeneraci destiček a snížila spodní hranici, ale neměla vliv na erythrocyty nebo leukocyty.The same molecule injected daily into the sublethally irradiated ( ¹³⁷ Cs) normal C57 B6 female mouse as described in the legend to FIG. 26a, 26B and 26C stimulated platelet regeneration and lowered the lower limit but did not affect erythrocytes or leukocytes.

b) CHO-rhTPO₃₃₂ b) CHO-rhTPO ₃₃₂

TPO plné délky produkovaný v CHO a injektovaný denně do normální myší samice C57 B6 jak je popsáno v legendě k Obr. 27A, 27B a 27C působí pětinásobné zvýšení produkce destiček u normální myši bez vlivu na populaci erythrocytů nebo leukocytů.Full length TPO produced in CHO and injected daily into normal female C57 B6 mice as described in the legend to FIG. 27A, 27B, and 27C cause a 5-fold increase in platelet production in a normal mouse without affecting the erythrocyte or leukocyte population.

c) CHO-rhTPO₃₃₂; E. co2i-rhTP0_(Met-i, i53>; 293-rhTPO₃₃₂; ac) CHO-rhTPO ₃₃₂ ; E. coli-rhTP0 ₍ Mei, 1553; 293-rhTPO ₃₃₂ ; a

E. coIi-rhTPOi55E. coli-rhTPO155

Křivka dávkové odpovědi byla konstruována pro léčení normální myši rhTPO z různých buněčných linií (CHO-rhTPO₃₃₂; E. coIi-rhTPO_(Met-i, 153),' 293-rhTPO₃₃₂; a E. coli-rhTPOiss) jak je popsáno v legendě k Obr. 28. Tento obrázek ukazuje, že všechny testované formy molekuly stimulují produkci destiček, avšak forma plné délky produkovaná v CHO vykazovala nejvyšší in vivo aktivitu.A dose response curve was constructed to treat normal rhTPO mice from different cell lines (CHO-rhTPO ₃₃₂ ; E. coli-rhTPO _(Me ti, 153), 293-rhTPO ₃₃₂ ; and E. coli-rhTPOiss) as described in the legend FIG. This figure shows that all tested forms of the molecule stimulate platelet production, but the full-length form produced in CHO showed the highest in vivo activity.

d) CHO-rhTPOi₅₃, CHO-rhTPO--_zkrácený a CHO-rhTPO₃₃₂ d) CHO-rhTPO1 ₅₃ , CHO-rhTPO-- _shortened and CHO-rhTPO ₃₃₂

Křivka dávkové odpovědi byla konstruována pro léčení normální myši rhTPO produkovaným v CHO (CHO-rhTPOis₃, CHOrhTPO_Zkrácený a CHO-rhTPO₃₃₂) jak je popsáno v legendě Obr. 29. Tento obrázek ukazuje, že všechny testované CHO formyDose response curves were constructed for treatment of normal mice with rhTPO produced in CHO (CHO-rhTPOis ₃ CHOrhTPO _Ex CHOrhTPO ratchets and ₃₃₂₎ as described in the legend to Fig. 29. This figure shows that all tested CHO forms

100 molekuly stimulují produkci destiček, avšak forma plné délky 70 kDa má největší in vivo aktivitu.100 molecules stimulate platelet production, but the full-length form of 70 kDa has the greatest in vivo activity.

nukleové kyseliny, nepovinným dalšímnucleic acids, optional others

16. Obecná rekombinantní preparace mpl ligandu a variant16. General recombinant preparation of mpl ligand and variants

Výhodně je mpl ligand připraven standardními rekombinantními· postupy, které zahrnují produkci mpl ligandového polypeptidu kultivací buněk transfektovaných aby exprimovaly nukleovou kyselinu mpl ligandu (obvykle transformací buněk s expresním vektorem) a získání polypeptidu z buněk. Avšak je nejasné, zda může být mpl ligand produkován homologní rekombinací, nebo produkcí rekombinantními metodami používajícími kontrolní prvky zavedené do buněk již obsahujících DNA kódující mpl ligand. Např. do genomu určené hostitelské buňky může být ve vhodné vzdálenosti a ve vhodné orientaci vložen silný promotor/urychlovací prvek, supressor nebo exogenní transkripci ovlivňující prvek pro ovlivnění transkripce DNA kódující požadovaný mpl ligandový polypeptid. Kontrolní prvek nekóduje mpl ligand a spíše než DNA je pro genom hostitelské buňky indigenní. Dále je třeba prozkoumat buňky produkující receptorový polypeptid podle předkládaného vynálezu, zda zvyšují nebo snižují úroveň exprese, jak je požadováno.Preferably, the mpl ligand is prepared by standard recombinant techniques which involve producing an mpl ligand polypeptide by culturing cells transfected to express the mpl ligand nucleic acid (usually by transforming the cells with the expression vector) and recovering the polypeptide from the cells. However, it is unclear whether the mpl ligand can be produced by homologous recombination or by production by recombinant methods using control elements introduced into cells already containing DNA encoding the mpl ligand. E.g. a strong promoter / accelerator element, supressor, or exogenous transcription affecting element for affecting transcription of the DNA encoding the desired mpl ligand polypeptide may be inserted into the genome of the intended host cell at a suitable distance and orientation. The control element does not encode the mpl ligand and, rather than DNA, is indigenous to the host cell genome. Further, it is necessary to investigate the receptor polypeptide producing cells of the present invention whether they increase or decrease the expression level as desired.

Vynález tedy diskutuje metodu produkce mpl ligandu zahrnující zavedení prvku ovliňujícího transkripci do genomu buňky obsahující molekulu nukleové kyseliny, mpl ligandu ve vhodné vzdálenosti a orientaci k mulekule aby ovlivnila její transkripci, s krokem zahrnující kultivaci buněk obsahujících prvek ovlivňující transkripci a molekulu nukleové kyseliny. Vynález také diskutuje hostitelské buňky obsahující indigenní molekulu mpl ligandu oddělitelněThus, the invention discusses a method of producing an mpl ligand comprising introducing a transcription-affecting element into a genome of a cell containing the nucleic acid molecule, the mpl ligand at a suitable distance and orientation towards the mucule to influence its transcription, with the step of culturing the cells containing the transcription effect element. The invention also discusses host cells comprising an indigenous mpl ligand molecule detachably

101 navázanou na exogenní kontrolní sekvenci rozpoznanou hostitelskou buňkou.101 linked to an exogenous control sequence recognized by the host cell.

A. Isolace DNA kódující mpl ligandový polypeptid.A. Isolation of DNA encoding the mpl ligand polypeptide.

DNA kódující mpl ligand může být získána z jakékoliv cDNA knihovny připravené z tkáně o které se domníváme, že obsahuje mpl ligandovou mRNA a exprimuje ji v detekovatelné hladině. Gen mpl ligandu může být také získán z genomické DNA knihovny nebo in vitro oligonukleotidovou syntésou z kompletního nukleotidu nebo aminokyselinové sekvence.The DNA encoding the mpl ligand can be obtained from any cDNA library prepared from tissue that is believed to contain and express mpl ligand mRNA at a detectable level. The mpl ligand gene can also be obtained from a genomic DNA library or by in vitro oligonucleotide synthesis from a complete nucleotide or amino acid sequence.

Provádí se screening knihoven sondou, aby byl identifikován gen, která nás zajímá, nebo protein, který je jím kódován. Vhodnými sondami pro cDNA expresní knihovny jsou monoklonální nebo polyklonální protilátky, které rozpoznají a specificky se vážou na mpl ligand. Sondy vhodné pro cDNA knihovny zahrnují oligonukleotidy s délkou 20-80 basí, které kódují známé nebo předpokládané části cDNA mpl ligandu stejného nebo jiného druhu; a/nebo komplementární nebo homologní cDNA nebo jejich fragmenty, které kódují stejný nebo podobný gen. Vhodné sondy pro screening genomických DNA knihoven zahrnují, není to však limitující, oligonukleotidy, cDNA nebo jejich fragmenty, které kódují stejné nebo podobné geny, a/nebo homologní genomickou DNA nebo její fragmenty. Screening cDNA nebo genomické knihovny vybranou sondou může být provedeno s použitím standardních postupů, které jsou popsány v kapitolách 10-12 v Sambrook a kol., viz výše.Probe libraries are screened to identify the gene of interest or the protein encoded by it. Suitable probes for cDNA expression libraries are monoclonal or polyclonal antibodies that recognize and specifically bind to the mpl ligand. Probes suitable for cDNA libraries include oligonucleotides with a length of 20-80 bases that encode known or putative portions of the mpl ligand cDNA of the same or another species; and / or complementary or homologous cDNAs or fragments thereof that encode the same or a similar gene. Suitable probes for screening genomic DNA libraries include, but are not limited to, oligonucleotides, cDNA or fragments thereof that encode the same or similar genes, and / or homologous genomic DNA or fragments thereof. Screening of the cDNA or genomic library with a selected probe can be performed using standard procedures as described in Chapters 10-12 in Sambrook et al., Supra.

Alternativním způsobem isolace genu kódujícího mpl ligand je použití PCR metodologie jak je popsáno v sekci 14 v Sambrook a kol., viz výše. Tato metoda vyžaduje použití oligonukleotidových sond, které budou hybridizovat do DNA kódující mpl ligand. Strategie výběru oligonukleotidů je popsána níže.An alternative way to isolate the gene encoding the mpl ligand is to use PCR methodology as described in section 14 of Sambrook et al., Supra. This method requires the use of oligonucleotide probes that will hybridize to the DNA encoding the mpl ligand. The strategy for selecting oligonucleotides is described below.

102102

Preferovanou metodou provedení tohoto vynálezu je použití pečlivě vybraných oligonukleotidových sekvencí ke screeningu cDNA knihoven z různých tkání, výhodněji lidských nebo vepřových ledvin (dospělých nebo zárodečných) nebo buněčných linií jater. Např. screening cDNA knihovny buněčné linie lidských zárodečných jater je prováděn oligonukleotidovou sondou. Nebo může být prováděn screening lidské genomické knihovny oligonukleotidovou sondou.A preferred method of carrying out the invention is to use carefully selected oligonucleotide sequences to screen cDNA libraries from various tissues, more preferably human or porcine kidneys (adult or germline) or liver cell lines. E.g. screening of the human germ cell cell line cDNA is performed by an oligonucleotide probe. Alternatively, the human genomic library can be screened with an oligonucleotide probe.

Oligonukleotidové sekvence vybrané jako sondy by měly být dostatečně dlouhé a dostatečně jednoznačné, aby byly minimalizovány falešně pozitivní výsledky. Aktuální nukleotidová sekvence je obvykle zkonstruována na základě oblastí mpl ligandu, které mají nejméně přebytečných kodonů. Oligonukleotidy mohou být degenerované v jedné nebo více polohách. Použití degenerovaných oligonukleotidů je zvláště důležité pokud je zkoumána knihovna druhu u kterého není známa preference použití kodonů.The oligonucleotide sequences selected as probes should be sufficiently long and unambiguous to minimize false positive results. The actual nucleotide sequence is usually constructed based on the mpl ligand regions having the least excess codons. The oligonucleotides may be degenerate at one or more positions. The use of degenerate oligonucleotides is particularly important when a library of species of unknown codon preference is examined.

Oligonukleotidy musí být značené, aby mohly být detekovány po hybridizací do DNA v knihovně, kde je prováděn screening. Preferovanou metodou značení je použití ATP (tj . γ³²Ρ) a polynukleotid kinasa pro značení 5' konce oligonukleotidu. Ovšem mohou být použity další me.tody značení oligonukleotidu, zahrnující, není to však omezující, biotinylaci nebo enzymatické značení.Oligonucleotides must be labeled so that they can be detected after hybridization to DNA in the screening library. A preferred labeling method is the use of ATP (i.e., γ ³² Ρ) and a polynucleotide kinase to label the 5 'end of the oligonucleotide. However, other oligonucleotide labeling methods may be used, including, but not limited to, biotinylation or enzymatic labeling.

Zvláště zajímavá je nukleová kyselina mpl ligandu, která kóduje mpl ligandový polypeptid plné délky. V některých preferovaných provedeních zahrnuje sekvence nukleové kyseliny nativní mpl ligandovou signální sekvenci. Screeningem vybrané cDNA nebo genomické knihovny s použitím vyvozené aminokyselinové sekvence je získána nukleová kyselina, která má celou protein kódující sekvenci.Of particular interest is the mpl ligand nucleic acid that encodes the full-length mpl ligand polypeptide. In some preferred embodiments, the nucleic acid sequence comprises a native mpl ligand signal sequence. By screening the selected cDNA or genomic library using the deduced amino acid sequence, a nucleic acid having the entire protein coding sequence is obtained.

103103

B. Aminokyselinové sekvenční varianty nativního mpl liganduB. Amino acid sequence variants of the native mpl ligand

Aminokyselinové sekvenční varianty mpl ligandu jsou připraveny zavedením vhodné nukleotidové změny do DNA mpl ligandu, nebo in vitro syntézou požadovaného mpl ligandového polypeptidů. Tyto varianty zahrnují, např. delece, inserce nebo substituce zbytků aminokyselinové sekvence vepřového mpl ligandu. Např. karboxy-koncová část zralého mpl ligandu plné délky může být odstraněna proteolytickým štěpením, buď in vivo nebo in vitro, nebo klonováním a expresí fragmentu nebo DNA kódující mpl ligand plné délky za produkce biologicky aktivní varianty. Může být provedena jakákoli kombinace delece, inserce a substituce pokud povede k finálnímu konstruktu, za předpokladu, že finální konstrukt vykazuje požadovanou biologickou aktivitu. Aminokyselinové změny také mohou upravovat glykosylační místa. U konstrukce aminokyselinové sekvence variant mpl ligandu bude lokalizace mutačních míst a povaha mutací záviset na mpl ligandové charakteristice, která má být modifikována. Místa mutací mohou být modifikována jednotlivě nebo v sériích, např. 1) substituce první s konservativní aminokyselinovou volbou a poté radikální výběry v závislosti na požadovaném cíli, 2) delece cílového zbytku nebo 3) inserce zbytků stejné nebo jiné třídy sousedící s lokalizovaným místem, nebo kombinace možností 1-3.Amino acid sequence variants of the mpl ligand are prepared by introducing a suitable nucleotide change into the mpl ligand DNA, or by in vitro synthesis of the desired mpl ligand polypeptide. Such variants include, eg, deletions, insertions, or substitutions of amino acid sequence residues of porcine mpl ligand. E.g. the carboxy-terminal portion of the mature full length mpl ligand can be removed by proteolytic cleavage, either in vivo or in vitro, or by cloning and expressing a fragment or DNA encoding a full length mpl ligand to produce a biologically active variant. Any combination of deletion, insertion, and substitution can be performed as long as it results in the final construct, provided that the final construct exhibits the desired biological activity. Amino acid changes may also modify glycosylation sites. In the construction of the amino acid sequence of mpl ligand variants, the location of the mutation sites and the nature of the mutations will depend on the mpl ligand characteristic to be modified. The mutation sites may be modified singly or in series, e.g. 1) substitution first with a conservative amino acid choice and then radical selections depending on the desired target, 2) deletion of the target residue or 3) insertion of residues of the same or another class adjacent to the localized site, or combination of options 1-3.

Užitečná metoda identifikace některých zbytků nebo oblastí mpl ligandového polypeptidů, která je preferovánou lokalizací pro mutagenesi je nazývána „alanine scanning mutagenesis, jak popsali Cunningham a Wells, Science, 244: 1081-1085 [1989] . Zde je identifikován zbytek nebo skupina cílových zbytků (např. zbytky s nábojem jako je arg, asp, his, lys a glu) a jsou nahrazeny jakoukoli, ale výhodnějiA useful method for identifying some residues or regions of the mpl ligand polypeptide that is the preferred location for mutagenesis is called "alanine scanning mutagenesis," as described by Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 [1989]. Here, a residue or group of target residues (eg, charged residues such as arg, asp, his, lys, and glu) is identified and replaced with any, but more preferably

104 neutrální nebo negativně nabitou aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyalaninem) kvůli ovlivnění interakcí aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buňky. Tyto domény vykazují funkční citlivost na substituce, když jsou upraveny zavedením další nebo jiné varianty do místa substituce. Tedy zatímco místa pro zavedení variant aminokyselilnové sekvence jsou předem stanovena, povaha mutace per se nemusí být předem stanovena. Např. pro optimalizaci provedení mutace na daném místě je proveden „ala scanning nebo náhodná mutageneze na cílovém kodónu nebo oblasti a exprimovaná mpl ligandová varianta je testována na optimální kombinaci požadované aktivity.104 by a neutral or negatively charged amino acid (most preferably alanine or polyalanine) to influence the interaction of amino acids with the surrounding aqueous environment inside or outside the cell. These domains show functional sensitivity to substitutions when modified by introducing another or other variant at the site of substitution. Thus, while the sites for introducing amino acid sequence variants are predetermined, the nature of the per mutation need not be predetermined. E.g. to optimize the site mutation, ala scanning or random mutagenesis at the target codon or region is performed and the expressed mpl ligand variant is tested for the optimal combination of the desired activity.

Existují dvě hlavní proměnné při konstrukci variant aminokyselinové sekvence; lokalizace mutačního místa a povaha mutace. Např. varianty mpl ligandového polypeptidu zahrnují varianty mpl ligandové sekvence, a mohou představovat přirozeně se vyskytující alely (u kterých nebude nutná manipulace DNA mpl ligandu) nebo předem určené mutantní formy připravené mutací DNA, aby bylo dosaženo alely nebo varianty, která se přirozeně nevyskytuje. Obecné umístění a povaha zvolené mutace budou záviset na charakteristice mpl ligandu, která má být modifikována.There are two main variables in the construction of amino acid sequence variants; the location of the mutation site and the nature of the mutation. E.g. variants of the mpl ligand polypeptide include variants of the mpl ligand sequence, and may represent naturally occurring alleles (which will not require manipulation of the mpl ligand DNA) or predetermined mutant forms prepared by mutating the DNA to achieve an allele or non-naturally occurring variant. The general location and nature of the mutation selected will depend on the characteristics of the mpl ligand to be modified.

Delece aminokyselinové sekvence jsou obvykle v rámci 1 až 30 zbytků, výhodněji 1-10 zbytků a obvykle navazují. Eventuelně mohou aminokyselinové sekvenční delece pro mpl ligand zahrnovat část nebo celou karboxy-koncovou glykoproteinovou doménu. Aminokyselinové sekvenční delece mohou také zahrnovat jeden nebo více z prvních 6 aminokoncových zbytků zralého proteinu. Nepovinně aminokyselinové delece zahrnují jeden nebo více zbytků v jedné nebo více oblastech smyčky, která existuje meziThe amino acid sequence deletions are usually within 1 to 30 residues, more preferably 1-10 residues, and usually contiguous. Alternatively, the amino acid sequence deletions for the mpl ligand may comprise part or all of the carboxy-terminal glycoprotein domain. Amino acid sequence deletions may also include one or more of the first 6 amino-terminal residues of the mature protein. Optionally amino acid deletions include one or more residues in one or more regions of the loop that exists between

105 „helikálním svazkem. Navazující delece jsou obyčejně provedeny u sudých počtů zbytků, ale jednotlivé delece nebo delece lichých počtů jsou v tomto rozsahu. Delece mohou být zavedeny do oblastí s nízkou homologií mezi mpl ligandy, které mají největší sekvenční identitu, aby modifikovaly aktivitu mpl ligandu. Nebo delece nohou být zavedeny do oblastí nízké homologie mezi lidským ligandem a dalšími savčími mpl ligandovými polypeptidy, které mají největší sekvenční identitu s lidským mpl ligandem. U delece savčího mpl ligandového polypeptidu v oblasti substanční homologie s dalšími savčími mpl ligandy bude více pravděpodobné, že bude modifikovat biologickou aktivitu mpl ligandu signifikantněji. Počet následných delecí bude vybrántak aby byla zachována terciální struktura mpl ligandů v účinné doméně, tj. beta-listového hřbetu nebo alfa helixu.105 “helical beam. Subsequent deletions are usually performed on even numbered residues, but single deletions or odd number deletions are within this range. Deletions can be introduced into regions of low homology between mpl ligands having the greatest sequence identity to modify mpl ligand activity. Or, deletions of the legs may be introduced into regions of low homology between the human ligand and other mammalian mpl ligand polypeptides having the greatest sequence identity to the human mpl ligand. Deletion of a mammalian mpl ligand polypeptide in the region of substance homology with other mammalian mpl ligands will be more likely to modify the biological activity of the mpl ligand more significantly. The number of subsequent deletions will be selected to maintain the tertiary structure of the mpl ligands in the active domain, i.e., beta-leaf back or alpha helix.

Inserty aminokyselinových sekvencí zahrnují aminoa/nebo karboxy-koncové fúze s délkou od jednoho zbytku po polypeptid obsahující sto nebo více zbytků, stejně jako intrasekvenční inserty jednotlivých nebo násobných aminokyselinových zbytků. Intrasekvenční inserty (tj. inserty uvnitř sekvence zralého mpl ligandu) mohou být v rozsahu obecně od 1 do 10 zbytků, výhodněji od 1 do 5, nej výhodněji 1 až 3. Zvláště preferovanou fúzí je fúze mpl ligandu nebo jeho fragmentu a dalšího cytokinu nebo jeho fragmentu. Příklady terminálních insertů zahrnují zralý mpl ligand s N-koncovým methionylovým zbytkem, artefakt s přímou expresí zralého mpl ligandu v rekombinantní buněčné kultuře, a fúzi heterologní N-koncové signální sekvencé do N-konce molekuly zralého mpl ligandu pro usnadnění sekrece zralého mpl ligandu z rekombinantního hostitele. Takovéto signální sekvence jsou obecně získány z určitých druhůThe amino acid sequence inserts include amino and / or carboxy-terminal fusions ranging in length from one residue to a polypeptide containing one hundred or more residues, as well as intra-sequence inserts of single or multiple amino acid residues. The intra-sequence inserts (i.e., the inserts within the mature mpl ligand sequence) may range generally from 1 to 10 residues, more preferably from 1 to 5, most preferably 1 to 3. A particularly preferred fusion is the fusion of the mpl ligand or fragment thereof and another cytokine or its fragment. Examples of terminal inserts include mature mpl ligand with an N-terminal methionyl residue, an artifact with direct expression of mature mpl ligand in recombinant cell culture, and fusion of a heterologous N-terminal signal sequence to the N-terminus of mature mpl ligand molecule to facilitate secretion of mature mpl ligand from recombinant host. Such signal sequences are generally obtained from certain species

106 hostitelných buněk nebo jsou k nim homologní. Vhodné sekvence zahrnují STII nebo IPP pro E. coli, alfa faktor pro kvasinky, virální signály jako je herpes gD pro savčí buňky.106 or are homologous thereto. Suitable sequences include STII or IPP for E. coli, alpha factor for yeast, viral signals such as herpes gD for mammalian cells.

Další insertovatelné varianty molekuly mpl ligandu zahrnují fúzi imunogenního polypeptidu do N- nebo C-konce mpl ligandu (tj. neendogenního k hostitelské buňce do které je fúze provedena), např. bakteriální polypeptidy jako je betalaktamasa nebo enzym kódující E. coli trp locus, nebo kvasinkový protein, C-koncové terminální fúze s proteiny majícími dlouhý poločas jako je imunoglobulinová konstantní oblast (nebo další imunoglobulinové oblasti), albumin, nebo ferritin, jak je popsáno v WO 89/02922 publikovaném 6. dubna 1989.Other insertable variants of the mpl ligand molecule include fusion of an immunogenic polypeptide to the N- or C-terminus of the mpl ligand (ie, non-endogenous to the host cell into which the fusion is made), eg, bacterial polypeptides such as beta lactamase or an enzyme encoding E. coli trp locus, or yeast protein, C-terminal terminal fusions with proteins having a long half-life such as an immunoglobulin constant region (or other immunoglobulin regions), albumin, or ferritin as described in WO 89/02922 published April 6, 1989.

Třetí skupinou variant jsou aminokyselinově substituované varianty. Tyto varianty mají nejméně jeden aminokyselinový zbytek v mpl ligandové molekule odstraněný a na toto místo je vložen jiný zbytek. Místa největšího zájmu pro substituční mutagenesi zahrnují místa identická s aktivními místy mpl ligandu a místa, kde aminokyselina vyskytující se v jiných analozích je substanciálně odlišného charakteru co se týče rozměrů postranního řetězce, náboje nebo hydrofobicity, ale kde existuje také vysoký stupeň sekvenční identity na vybraných místech mezi mpl ligandy různých druhů a/nebo mezi analogy jednoho člena mpl ligandu různých zvířat.A third group of variants are amino acid substituted variants. These variants have at least one amino acid residue in the mpl ligand molecule removed and another residue inserted at this site. The sites of greatest interest for substitutional mutagenesis include sites identical to the active sites of the mpl ligand and sites where the amino acid found in other analogs is of substantially different nature in terms of side chain, charge, or hydrophobicity dimensions, but where there is also a high degree of sequence identity at selected sites. between mpl ligands of different species and / or between analogs of one mpl ligand member of different animals.

Další místa, která nás zajímají, jsou místa, u kterých jednotlivé zbytky mpl ligandu získané z různých druhů orgánů a/nebo zvířecích druhů v rámci jednoho orgánu jsou identické. Tato místa, zvláště pokud spadají do rámce sekvence nejméně tří dalších identicky zachovaných míst, jsou substituována relativně konservativním způsobem.Other sites of interest are sites where individual mpl ligand residues obtained from different organ species and / or animal species within one organ are identical. These sites, especially if they fall within the sequence of at least three other identically conserved sites, are substituted in a relatively conservative manner.

107107

Takovéto konservativní substituce jsou ukázány v Tab 3 s uvedením preferovaných substitucí. Pokud substituce mají za následek změny biologické aktivity, potom jsou zavedeny další substanciální změny, označené v Tab. 3 Příklady substitucí, nebo další změny popsané dále níže v referencích prozkoumán.Such conservative substitutions are shown in Table 3, showing preferred substitutions. If the substitutions result in changes in biological activity, then further substantive changes, indicated in Tab. 3 Examples of substitutions, or other changes described below in the references examined.

k aminokyselinovým třídám, a produkt jeto amino acid classes, and the product is

Tab. 3Tab. 3

Původní zbytek Original residue Příklady substitucí Examples substitutions Preferované substituce Preferred substitution Ala (A) Ala (A) Val; Leu, Ile Wall; Leu, Ile Val Wall Arg (R) Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys; Gin; Asn Lys Lys Asn (N) Asn (N) Gin; His; Lys; Arg Gin; His; Lys; Arg Gin Gin Asp (D) Asp (D) Glu Glu Glu Glu Cys (C) Cys Ser Ser Ser Ser Gin (Q) Gin (Q) Asn Asn Asn Asn Glu (E) Glu (E) Asp Asp Asp Asp Gly (G) Gly Pro For Pro For His (H) His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Asn; Gin; Lys; Arg Arg Arg Ile (I) Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Leu; Wall; Met; Ala; Phe; norleucin norleucine Leu Leu Leu (L) Leu (L) norleucin; Ile; Val; norleucine; Ile; Wall; Met; Ala; Phe Met; Ala; Phe Ile Ile Lys (K)/ Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg; Gin; Asn Arg Arg Met (M) Met (M) Leu; Phe; Ile Leu; Phe; Ile Leu Leu Phe (F) Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala Leu; Wall; Ile; Ala Leu Leu Pro (P) Pro (P) Gly Gly Gly Gly Ser (S) Ser (S) Thr Thr Thr Thr Thr (T) Thr (T) Ser Ser Ser Ser

108108

Původní Příklady Preferované zbytek_substitucí_substituceOriginal Examples Preferred_substitution_state

Trp Trp (W) (W) Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr (Y) (Y) Trp; Phe; Thr; Trp; Phe; Thr; Ser Ser Phe Phe Val Wall (V) (IN) lle; Leu; Met; lle; Leu; Met; Phe; Phe; — . - -. - Ala; norleucin Ala; norleucine Leu Leu

Substanciální modifikace ve funkci nebo imunologické identitě mpl ligandu je provedena selekcí substitucí, které se signifikantně liší ve svém efektu na udržení (a) struktury polypeptidové páteře v oblasti substituce, např. hřbetu nebo helikální formace, (b) náboje nebo hýdrofobicity molekuly na cílovém místě, nebo (c) rozměru postranního řetězce. Přirozeně se vyskytující zbytky jsou rozděleny do skupin na základě obecných vlastností postranních řetězců;Substantial modification in the function or immunological identity of the mpl ligand is accomplished by selection of substitutions that differ significantly in their effect on maintaining (a) the structure of the polypeptide backbone in the substitution region, eg, spine or helical formation, (b) charge or hyperophobicity of the molecule at the target site or (c) the side chain dimension. Naturally occurring residues are grouped based on the general side chain properties;

1) 1) hydrofobní: norleucin, Met, Ala, hydrophobic: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, lle; Val, Leu, Ile; 2) 2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr; Thr; 3) 3) kyselé: Asp, Glu; acidic: Asp, Glu; 4) 4) basické: Asn, Gin, His, Lys, Arg basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg t t 5) 5) zbytky které ovlivňují orientaci residues that affect orientation řetězce: Gly, Pro; chains: Gly, Pro; 6) 6) aromatické: Trp, Tyr a Phe. aromatic: Trp, Tyr and Phe.

Nekonservativní substituce budou mít za následek výměnu členů jedné třídy za druhou. Takovéto substituované zbytky mohou být také zavedeny do konservativních substitučních míst nebo, výhodněji, do zbývajících (nekonservovaných) míst.Non-conservative substitutions will result in the exchange of members of one class for another. Such substituted residues may also be introduced into conservative substitution sites or, more preferably, into remaining (non-conserved) sites.

V jednom provedení tohoto vynálezu je žádoucí inaktivace jednoho nebo více proteasových štěpných míst, které jsou přítomny v molekule. Tato místa jsouIn one embodiment of the invention, it is desirable to inactivate one or more protease cleavage sites that are present in the molecule. These places are

109 identifikována kontrolou kódující aminokyselinové sekvence, v případě trypsinu, např. na arginyl nebo lysinyl. Když jsou proteasová štěpná místa identifikována, potom je provedena inaktivace proteolytického štěpení substitucí cílových zbytků dalšími zbytky, výhodněji basickým zbytkem jako je glutamin nebo hydrofobním zbytkem jako je serin; deleci zbytku; nebo insercí prolylového zbytku ihned za zbytek.109 identified by a control of the coding amino acid sequence, in the case of trypsin, eg on arginyl or lysinyl. When the protease cleavage sites are identified, then proteolytic cleavage is inactivated by substitution of the target residues with additional residues, more preferably a basic residue such as glutamine or a hydrophobic residue such as serine; deletion of the residue; or inserting a prolyl residue immediately after the residue.

V dalším provedení je každý methionylový zbytek kromě úvodního methyonylového zbytku signální sekvence, nebo každý zbytek lokalizovaný ve třech zbytcích N- nebo Ckoncových u každého takovéhoto methyonylového zbytku, substituován jiným zbytkem (výhodněji podle Tab. 3) nebo je vypuštěn. Eventuelně jsou do sousedství těchto míst inserovány 1-3 zbytky.In another embodiment, each methionyl residue, in addition to the leading methyonyl residue of the signal sequence, or each residue located in the three N- or C-terminal residues of each such methyonyl residue, is substituted with a different residue (more preferably according to Table 3) or is deleted. Alternatively, 1-3 residues are inserted into the neighborhood of these sites.

Jakékoli cysteinové zbytky nepatřící do zachovávané správné konformace mpl ligandu mohou být také substituovány, obecně serinem, za zlepšení oxidativní stability molekuly a jako prevence chybných křížových vazeb. Bylo zjištěno, že první a čtvrtý cystein v epo doméně, číslováno od amino-konce, jsou nezbytné pro zachování správné konformace, ale druhý a třetí nejsou. Na základě toho tedy druhý a třetí cystein v epo doméně mohou být substituovány.Any cysteine residues not belonging to the maintained correct conformation of the mpl ligand can also be substituted, generally with serine, to improve the oxidative stability of the molecule and to prevent erroneous cross-links. It has been found that the first and fourth cysteine in the epo domain, numbered from the amino-terminus, are necessary to maintain the correct conformation, but the second and third are not. Accordingly, the second and third cysteine in the epo domain may be substituted.

Molekuly nukieové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci variant mpl ligandu jsou připraveny různými metodami, které jsou v daném oboru dobře známy. Tyto metody zahrnují, není to však omezující, isolaci z přirozeného zdroje (v případě přirozeně se vyskytujících variant aminokyselin) nebo preparační oligonukleotidem zprostředkovanou (nebo místně-cílenou) mutagenesi, PCRNucleate acid molecules encoding the amino acid sequence of mpl ligand variants are prepared by a variety of methods well known in the art. These methods include, but are not limited to, isolation from a natural source (in the case of naturally occurring amino acid variants) or preparative oligonucleotide-mediated (or site-directed) mutagenesis, PCR

110 kol., DNA, pozměněna požadovanou nutagenesi, kazetovou mutagenesí dříve připravené varianty nebo non-variantní verse mpl ligandového polypeptidů.110 et al., DNA, altered by desired nutagenesis, cassette mutagenesis of a previously prepared variant or non-variant version of the mpl ligand polypeptide.

Oligonukleotidem zprostředkovaná mutagenese je preferovanou metodou pro přípravu substitučních, delečních a insertních variant mpl ligandové DNA. Tato technika je v daňé oblasti velmi dobře známa, je popsána Adelmanem a Krátce, mpl ligandová DNA je ligonukleotidu kódujícího DNA šablonu, kde šablona jeOligonucleotide-mediated mutagenesis is the preferred method for preparing substitution, deletion, and insertion variants of mpl ligand DNA. This technique is well known in the art, is described by Adelman and Briefly, mpl ligand DNA is a ligonucleotide encoding a DNA template, where the template is

2: 183 [1983] hybridizacío mutaci na jednovláknová forma plasmidů nebo bakteriofágu obsahujícího nepozměněné nebo nativní DNA sekvence mpl ligandu. Po hybridizaci je použita DNA polymerasa k syntéze celého druhého komplementárního vlákna šablony, která takto bude inkorporovat oligonukleotidový primer, a bude kódovat vybranou změnu v mpl ligandové DNA.2: 183 [1983] by hybridization to a single-stranded form of plasmids or bacteriophage containing unaltered or native mpl ligand DNA sequences. After hybridization, DNA polymerase is used to synthesize the entire second complementary strand of the template, which will thereby incorporate the oligonucleotide primer, and encode a selected change in mpl ligand DNA.

Obecně, byly použity nukleotidy s délkou nejméně 25 nukleotidů. Optimální oligonukleotid bude mít 12 až 15 nukleotidů, které jsou zcela komplementární k šabloně na druhé straně nukleotidu (nukleotidů) kódujícího mutaci. To zajišťuje, že oligonukleotid bude hybridisován správně k jednovláknové DNA šablonové molekule. Oligonukleotidy jsou snadno syntetizovány s použitím technik, které jsou v ,dané oblasti dobře známé a které jsou popsány v Crea a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 5765 [1978].In general, nucleotides of at least 25 nucleotides in length were used. The optimal oligonucleotide will have 12 to 15 nucleotides that are completely complementary to the template on the other side of the nucleotide (s) encoding the mutation. This ensures that the oligonucleotide will hybridize correctly to the single stranded DNA template molecule. Oligonucleotides are readily synthesized using techniques well known in the art and described in Crea et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 5765 [1978].

DNA šablona může být vytvořena takovýmito vektory, které jsou buď odvozeny z bakteriofágových M13 vektorů (vhodné jsou komerčně dostupné M13mpl8 a M13mpl9 vektory) nebo vektory obsahujícími jednovláknový zdroj replikace jak je popsáno ve Viera a kol., Meth. Enzymol., 153: 3 [1987]. Tedy DNA, která má být mutována, může být vložena do jednoho z těchto vektorů za vzniku jednovláknové šablony. Produkce jednovláknové šablony je popsána v sekcích 4.21111The DNA template may be generated by such vectors which are either derived from bacteriophage M13 vectors (commercially available M13mp18 and M13mp18 vectors are suitable) or vectors containing a single-stranded replication source as described in Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 [1987]. Thus, the DNA to be mutated can be inserted into one of these vectors to form a single stranded template. The production of the single stranded template is described in sections 4.21111

4.41 Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989) .4.41 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

Eventuelně může být jednovláknová DNA šablona připravena denaturací dvouvláknové plasmidové (nebo jiné) DNA s použitím standardních technik.Alternatively, a single stranded DNA template can be prepared by denaturating double stranded plasmid (or other) DNA using standard techniques.

'Pro úpravy nativní DNA sekvence (např. aby vznikla aminokyselinové sekvenční varianta) je oligonukleotid hybridizován na jednovláknovou šablonu za vhodných hybridizačních podmínek. Poté je přidán DNA polymerizující enzym, obvykle známý jako Klenowův fragment DNA polymerasy I, aby se syntetizovalo komplementární vlákno šablony s použitím nukleotidu jako primeru pro syntézu. Vznikne tedy heteroduplexní molekula, takže jedno vlákno DNA kóduje mutovanou formu rapi ligandu, a další vlákno (originální šablona) kóduje nativní, nezměněnou sekvenci mpl ligandu. Tato heteroduplexní molekula je poté transformována do vhodné hostitelské buňky, obvykle prokaryota jako je E. coli JM101. Po vypěstování jsou buňky naneseny na agarosové plotny a zkoumány pomocí oligonukleotidového primeru radioznačeného 32-fosfátem, aby byly identifikovány bakteriální kolonie obsahující mutovanou DNA. Mutované oblasti jsou poté odebrány a umístěny do vhodného vektoru pro produkci proteinů, obecně expresního vektoru obvykle používaného typu pro transformaci vhodného hostitele.To modify the native DNA sequence (e.g., to produce the amino acid sequence variant), the oligonucleotide is hybridized to a single stranded template under appropriate hybridization conditions. Then, a DNA polymerizing enzyme, usually known as the Klenow fragment of DNA polymerase I, is added to synthesize the complementary strand of the template using the nucleotide as a primer for synthesis. Thus, a heteroduplex molecule is formed so that one strand of DNA encodes a mutated form of a rapi ligand, and the other strand (the original template) encodes a native, unchanged mpl ligand sequence. This heteroduplex molecule is then transformed into a suitable host cell, usually a prokaryote such as E. coli JM101. After cultivation, cells are plated on agarose plates and screened with a 32-phosphate radiolabeled oligonucleotide primer to identify bacterial colonies containing mutated DNA. The mutated regions are then removed and placed in a suitable vector for the production of proteins, generally an expression vector of the type usually used to transform a suitable host.

Metoda popsaná bezprostředně výše může být modifikována tak, že homodupulexní molekula je vytvořena na obou vláknech plasmidů obsahujícího mutaci (mutace). Modifikace jsou následující: jednořetézcový oligonukleotid je zesílený vzhledem k jednořetězcové šabloně popsané výše. Směs tří deoxyribonukleotidů, deoxyriboadenosinu (dATP), deoxyriboguanosinu (dGTP) a deoxyribothymidinu (dTTP) je kombinována s modifikovanou thio-deoxyribocytosinemThe method described immediately above may be modified such that the homodupulex molecule is formed on both strands of plasmids containing the mutation (s). The modifications are as follows: the single-stranded oligonucleotide is enhanced relative to the single-stranded template described above. A mixture of three deoxyribonucleotides, deoxyriboadenosine (dATP), deoxyriboguanosine (dGTP) and deoxyribothymidine (dTTP) is combined with modified thio-deoxyribocytosine

112 nazývaným dCTP-(aS)(který může být získán od Amersham Corporation). Tato směs je přidána do komplexu šablonaoligonukleotid. Při přidání DNA polymerasy do této směsi vznikne vlákno DNA identické k šabloně, kromě mutovaných basí. Navíc nové vlákno DNA bude obsahovat dCTP-(aS) místo dCTP, což slouží k jeho ochraně proti digesci restrikčními endonukleasami.112 called dCTP- (αS) (which can be obtained from Amersham Corporation). This mixture is added to the template oligonucleotide complex. Addition of DNA polymerase to this mixture produces a strand of DNA identical to the template except for the mutated bases. In addition, the new DNA strand will contain the dCTP- (αS) site of dCTP, which serves to protect it from digestion by restriction endonucleases.

Po odštěpení šablonového vlákna dvouvláknového heteroduplexu pomocí vhodného restrikčního enzymu může být šablonové vlákno digestováno ExoIII nukleasou nebo jinou vhodnou nukleasou mimo oblasti, které obsahují místo (místa), na kterých má probíhat mutageneze. Reakce je poté ukončena, aby zůstala mulekula, která je pouze částečně jednovláknová. Kompletní dvouvláknový DNA homoduplex je poté vytvořen pomocí DNA polymerasy v přítomnosti všech čtyř deoxyribonukleotidtrifosfátů, ATP, a DNA ligasy. Tato homoduplexní molekula může být poté transformována do vhodné hostitelské buňky jako je E. coli JM101, jak je popsáno výše.After cleavage of the double stranded heteroduplex template strand by a suitable restriction enzyme, the template strand can be digested with ExoIII nuclease or other suitable nuclease outside the regions containing the site (s) at which mutagenesis is to take place. The reaction is then terminated to leave a mucular which is only partially single-stranded. The complete double-stranded DNA homoduplex is then formed by DNA polymerase in the presence of all four deoxyribonucleotide triphosphates, ATP, and DNA ligase. This homoduplex molecule can then be transformed into a suitable host cell such as E. coli JM101 as described above.

DNA kódující mpl ligandové mutanty s více než jednou aminokyselinou, která má být substituována, mohou být připraveny jednou z několika cest. Pokud jsou aminokyseliny lokalizovány blízko u sebe v polypeptidovém řetězci, mohou být mutovány simultánně s použitím jednoho oligonukleotidu, které kóduje všechny požadované aminokyselinové substituce. Pokud ovšem jsou aminokyseliny umístěny v určitých vzdálenostech od sebe navzájem (odděleny více než deseti aminokyselinami), je mnohem složitější připravit jeden oligonukleotid, který kóduje všechny požadované změny. Místo toho může být použita jedna nebo dvě alternativní metody.DNA encoding mpl ligand mutants with more than one amino acid to be substituted may be prepared by one of several routes. If the amino acids are located close to each other in the polypeptide chain, they can be mutated simultaneously using a single oligonucleotide that encodes all the desired amino acid substitutions. However, if the amino acids are located at certain distances from each other (separated by more than ten amino acids), it is more difficult to prepare one oligonucleotide that encodes all the desired changes. Instead, one or two alternative methods may be used.

113113

U první metody je připraven pro každou aminokyselinu, která má být substituována, samostatný oligonukleotid. Oligonukleotidy jsou poté simultánně zavedeny do jednořetězcové DNA šablony, a druhé vlákno DNA, které je syntetizováno z šablony, bude kódovat všechny požadované aminokyselinové substituce.In the first method, a separate oligonucleotide is prepared for each amino acid to be substituted. The oligonucleotides are then simultaneously introduced into a single-stranded DNA template, and the second strand of DNA that is synthesized from the template will encode all desired amino acid substitutions.

Alternativní metoda zahrnuje dva nebo více cyklů mutagenese za vzniku požadovaného mutantu. První cyklus je popsán pro jednotlivé mutace: pro šablonu je použit „divoký (wild) typ DNA, oligonukleotid kódující první požadovanou aminokyselinovou substituci (substituce) je zaveden do této šablony a poté je generována heteroduplexní DNA molekula. Druhý cyklus mutagenese používá mutovanou DNA připravenou v prvním cyklu mutagenese jako šablonu. Tato šablona tedy již obsahuje jednu nebo více mutací. Oligonukleotid kódující další požadované aminokyselinové substituce je poté zaveden do této šablony a výsledné vlákno DNA nyní kóduje mutace z prvního i druhého cyklu mutagenese. Výsledná DNA může být použita jako šablona v třetím cyklu mutagenese a tak dále.An alternative method involves two or more cycles of mutagenesis to produce the desired mutant. The first cycle is described for each mutation: a wild-type DNA is used for the template, an oligonucleotide encoding the first desired amino acid substitution (s) is introduced into the template, and then a heteroduplex DNA molecule is generated. The second cycle of mutagenesis uses the mutated DNA prepared in the first cycle of mutagenesis as a template. Thus, this template already contains one or more mutations. The oligonucleotide encoding the additional desired amino acid substitutions is then introduced into this template, and the resulting DNA strand now encodes mutations from both the first and second cycles of mutagenesis. The resulting DNA can be used as a template in the third cycle of mutagenesis and so on.

PCR mutagenese je také vhodná pro přípravu aminokyselinových variant mpl ligandového. polypeptidu. I když v následujícím textu je uváděna DNA, je samozřejmé, že tato technika má uplatnění i u RNA. PCR technika obsahuje následující postup (viz Erlich, viz výše, kapitola od R. Higuchi, str. 61-70): Když použijeme jako výchozí látku pro PCR malá množství šablon DNA, může být s použitím primerů, které se mírně liší v sekvenci z odpovídající oblasti v šabloně DNA, připraveno poměrně velké množství specifických DNA fragmentů, které se liší od šablonové sekvence pouze v polohách, kde se primery liší od šablony. Pro zavedení mutací do plasmidu DNA je jeden z primerů určující kPCR mutagenesis is also suitable for preparing amino acid variants of the mpl ligand. of a polypeptide. Although DNA is given below, it is understood that this technique also applies to RNA. The PCR technique includes the following procedure (see Erlich, supra, by R. Higuchi, pp. 61-70): When using small amounts of DNA templates as a starting material for PCR, primers that differ slightly in sequence can be used. corresponding regions in the DNA template, a relatively large number of specific DNA fragments are prepared that differ from the template sequence only at positions where the primers differ from the template. For the introduction of mutations into the plasmid DNA, one of the primers is

114 překryvu polohy mutace a obsahuje mutaci; sekvence dalších primerů musí být identická k natažení sekvence protějšího vlákna plasmidů, ale sekvence může být umístěna kdekoliv podél plasmidové DNA. Je ovšem preferováno, když sekvence druhého primeru je lokalizována uvnitř 200 nukleotidů z toho prvního, tak aby mohly být snadněji sekvenovány primery navázané na konci celé rozšířené oblasti DNA. PCR rozšíření používající primerový pár jež bylo právě popsáno má za výsledek populaci DNA fragmentů lišících se v poloze mutace specifikované primerem, a možno i v dalších polohách, ačkoliv kopírování šablony je poněkud náchylné k chybám.114 includes a mutation position overlap and comprises a mutation; the sequence of the other primers must be identical to the extension of the opposite strand sequence of the plasmids, but the sequence may be located anywhere along the plasmid DNA. However, it is preferred that the second primer sequence is located within 200 nucleotides of the first, so that primers ligated at the end of the entire extended DNA region can be more easily sequenced. The PCR extension using the primer pair just described results in a population of DNA fragments differing at the mutation position specified by the primer, and possibly at other positions, although copying the template is somewhat error-prone.

Poměr šablony k produktu je extrémně nízký, velká většina vyprodukovaných DNA fragmentů zavádí požadované mutace. Tento výsledný materiál je použit k nahrazení odpovídající oblasti plasmidů, který slouží jako CPR šablona s použitím standardní DNA technologie. Mutace v separovaných polohách mohou být zavedeny simultánně buď použitím mutantního druhého primeru, nebo provedením druhé PCR s jinými mutantními primery a ligaci dvou výsledkých PCR fragmentů simultánně na vektorový fragment v tří-(nebo více)-dílné ligaci.The template to product ratio is extremely low, the vast majority of DNA fragments produced introduce the desired mutations. This resulting material is used to replace the corresponding region of the plasmids, which serves as a CPR template using standard DNA technology. Mutations at separate positions can be introduced simultaneously by either using a mutant second primer, or by performing a second PCR with other mutant primers and ligating the two resulting PCR fragments simultaneously to a vector fragment in a three- or more-part ligation.

Ve specifickém příkladu CPR mutagenese je šablonová plasmidová DNA (1 gg) linerizována digescí restrikční endonukleasou, která má specifické rozpoznávací místo v plasmidové DNA vně oblasti, která má být amplifikována. Z tohoto materiálu je 100 ng přidáno do PCR směsi obsahující PCR pufr, který obsahuje čtyři deoxynukleotidové trifosfatasy a je obsažen v GeneAmp® soupravách (získaných od Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT a Emeryville, CA), a 25 pmol každého nukleotidového primeru, do celkového objemu 50 μΐ. Reakční směs byla převrstvena 35 μΐ minerálníhoIn a specific example of CPR mutagenesis, the template plasmid DNA (1 gg) is linearized by restriction endonuclease digestion having a specific recognition site in the plasmid DNA outside the region to be amplified. From this material, 100 ng is added to a PCR mix containing a PCR buffer containing four deoxynucleotide triphosphatases and contained in the GeneAmp® kits (obtained from Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA), and 25 pmol of each nucleotide primer, up to a total volume of 50 μΐ. The reaction mixture was overlaid with 35 μΐ of mineral

115 oleje. Reakční směs je denaturována pět minut při 100°C, umístěna krátce na led a poté je pod vrstvu minerálního oleje přidán 1 μΐ Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerasy (5 jednotek/μΐ, získané od Perkin-Elmer Cetus). Reakční směs je poté vložena do DNA Thermal Cycler (získaného od Peřkin-Elmer Cetus) naprogramovaného následovně:115 oil. The reaction mixture is denatured for five minutes at 100 ° C, placed briefly on ice, and then 1 μΐ of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase (5 units / μΐ, obtained from Perkin-Elmer Cetus) is added under the mineral oil layer. The reaction mixture is then inserted into a DNA Thermal Cycler (obtained from Peřkin-Elmer Cetus) programmed as follows:

min. 55°C s 72°C, potom 19 cyklů následujících:min. 55 ° C with 72 ° C, then 19 cycles of the following:

s 94°C s 55°C, a s 72°C.with 94 ° C with 55 ° C, and with 72 ° C.

Na konci programu je reakční zkumavka vyjmuta z Termal Cycleru a vodní fáze převedena do nové zkumavky, extrahována fenol/chloroformem (50:50 obj.), a precipitována ethanolem, a DNA je získána standardními postupy. Tento materiál je následně podroben vhodnému zpracování pro inserci do vektoru.At the end of the program, the reaction tube is removed from the Termal Cycler and the aqueous phase is transferred to a new tube, extracted with phenol / chloroform (50:50 by volume), and precipitated with ethanol, and DNA is obtained by standard procedures. This material is then subjected to suitable processing for insertion into the vector.

Další metodou pro přípravu variant, kazetová mutagenese, je založena na technice popsané v Wells a kol., Gene, 34: 315 [1985]. Výchozím materiálem je plasmid (nebo jiný vektor) obsahující mpl ligandovou DNA, která má být mutována. Jsou identifikovány kodony mpl ligandové DNA, které mají být mutovány. Na každém identifikovaném mutačním místě musí být specifické restrikční endonukleasové místo. Pokud takováto restrikční místa neexistují, musí být vytvořena s použitím výše popsaných, oligonukleotidy zprostředkovaných mutagenesních metod, a zavedena na vhodná místa v mpl ligandové DNA. Po zavedení restrikčních míst do plasmidu je plasmid v těchto místech rozdělen, aby byl linearisovaný. Je syntetizován dvouvláknový nukleotid kódující sekvenci DNA mezi restrikčními místy ale obsahující požadovanou mutaci s použitím standardníchAnother method for preparing variants, cassette mutagenesis, is based on the technique described by Wells et al., Gene, 34: 315 [1985]. The starting material is a plasmid (or other vector) containing the mpl ligand DNA to be mutated. Mpl ligand DNA codons to be mutated are identified. Each identified mutation site must have a specific restriction endonuclease site. If such restriction sites do not exist, they must be generated using the oligonucleotide-mediated mutagenesis methods described above, and introduced at appropriate sites in the mpl ligand DNA. After the restriction sites have been introduced into the plasmid, the plasmid is split at these sites to be linearized. A double-stranded nucleotide encoding the DNA sequence between the restriction sites but containing the desired mutation is synthesized using standard

116 postupů. Dvě vlákna jsou syntetizovány odděleně a poté hybridizována dohromady s použitím standardních technik. Tento dvouvláknový oligonukleotid je označen jako kazeta. Tato kazeta je konstruována tak, aby měla 3' a 5' konce, které jsou kompatibilní s konci linearizovaného plasmidů, a tak může být přímo ligována do plasmidů. Tento plasmid nyní obsahuje mutovanou mpl ligandovou DNA sekvenci.116 procedures. The two strands are synthesized separately and then hybridized together using standard techniques. This double-stranded oligonucleotide is referred to as a cassette. This cassette is designed to have 3 'and 5' ends that are compatible with the ends of the linearized plasmids, and so can be directly ligated into the plasmids. This plasmid now contains a mutated mpl ligand DNA sequence.

C. Zavedení nukleové kyseliny do replikabilního vektoruC. Introduction of a nucleic acid into a replicable vector

Nukleová kyselina (např. cDNA nebo genomická DNA) kódující nativní nebo variantní mpl ligandový polypeptid je vložena do replikabilního vektoru pro další klonování (amplifikaci DNA) nebo pro expresi. Je vhodných mnoho vektorů, a výběr vhodného vektoru bude záviset (1) na tom, zda bude použit pro DNA amplifikaci nebo pro DNA expresi, (2) na velikosti nukleové kyseliny, která má být vložena do vektoru, a (3) na hostitelské buňce, která má být vektorem transformována. Každý vektor obsahuje různé složky v závislosti na jeho funkci (amplifikace DNA nebo exprese DNA) v závislosti na hostitelské buňce, s kterou je kompatibilní. Vektorové složky obecně zahrnují, ale není to omezující, jednu nebo více následujících položek: signální sekvence, zdroj replikace, jeden nebo více markerových genů, urychlující prvek (enhancer), promotor a transkripční terminační sekvenci.Nucleic acid (e.g., cDNA or genomic DNA) encoding a native or variant mpl ligand polypeptide is inserted into a replicable vector for further cloning (DNA amplification) or for expression. Many vectors are suitable, and the choice of suitable vector will depend on (1) whether it will be used for DNA amplification or for DNA expression, (2) the size of the nucleic acid to be inserted into the vector, and (3) the host cell to be transformed by the vector. Each vector contains different components depending on its function (DNA amplification or DNA expression) depending on the host cell with which it is compatible. Vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, a replication source, one or more marker genes, an enhancer, a promoter, and a transcription termination sequence.

(i) Složka signální sekvence(i) Signal sequence component

Mpl ligand podle tohoto vynálezu může být exprimován ne pouze přímo, ale také jako fúze s heterologním polypeptidem, výhodněji signální sekvencí nebo dalším polypeptidem, který má specifické štěpné místo na N-konci zralého proteinu nebo polypeptidu. Obecně, signální sekvence může být složkou vektoru, nebo může být částí mpl ligandové DNA, která je zavedena do vektoru. Měla by býtThe Mpl ligand of the invention may be expressed not only directly but also as a fusion to a heterologous polypeptide, more preferably a signal sequence or another polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide. In general, the signal sequence may be a component of the vector, or may be part of the mpl ligand DNA that is introduced into the vector. Should be

117 vybrána taková heterologní signální sekvence, která je rozpoznána a zpracována (tj. štěpena signální peptidasou) hostitelskou buňkou. Pro prokaryotické hostitelské buňky, které nerozpoznávají a nezpracovávají nativní mpl ligandovou signální sekvenci, je signální sekvence nahrazena prokařyotickou signální sekvencí, vybranou např. ze skupiny: alkalická fosfatasa, penicilinasa, Ipp nebo tepelně stabilní enterotoxinové II leadery. Pro kvasinky může být sekrece nativní signální sekvence nahrazena např. kvasinkovou invertasou, alfa faktorem nebo kyselými fosfatasovými leadery, C. albicans glukoamilasovým leaderem (EP 362,179 publikovaný 4. dubna 1990), nebo signálem popsaným v WO 90/13646 publikovaným 15. listopadu 1990. U savčích buněk je exprese nativní signální sekvence (tj. mpl ligandová presekvence, která normálně řídí sekreci mpl ligandu ze svých nativních savčích buněk in vivo) uspokojivá, ačkoliv mohou být vhodné další savčí signální sekvence, jako je signální sekvence z dalších mpl ligandových polypeptidů nebo ze stejného mpl ligandu z jiného živočišného druhu, signální sekvence z mpl ligandu, a signální sekvence ze sekretovaných polypeptidů stejného nebo podobného druhu, stejně jako virální sekretorické leadery, např. herpes simplex gD signál.117 is selected such a heterologous signal sequence that is recognized and processed (i.e., cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize and process the native mpl ligand signal sequence, the signal sequence is replaced with a pro-prokaryotic signal sequence selected, for example, from the group of: alkaline phosphatase, penicillinase, Ipp, or heat stable enterotoxin II leaders. For yeast, secretion of the native signal sequence may be replaced by, e.g., yeast invertase, alpha factor or acid phosphatase leaders, C. albicans glucoamilas leader (EP 362,179 published April 4, 1990), or the signal described in WO 90/13646 published November 15, 1990. In mammalian cells, expression of the native signal sequence (i.e., mpl ligand presequence that normally directs mpl ligand secretion from its native mammalian cells in vivo) is satisfactory, although other mammalian signal sequences, such as signal sequences from other mpl ligand polypeptides or from the same mpl ligand from another animal species, the signal sequence from the mpl ligand, and the signal sequence from secreted polypeptides of the same or similar species, as well as viral secretory leaders, eg, the herpes simplex gD signal.

(ii) Zdroj replikační složky(ii) Source of replication component

Expresní i klonovací vektor obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která umožňuje vektoru replikovat v jedné nebo více vybraných hostitelských buňkách. Obecně v klonovacím vektoru je tato sekvence jediná, která umožňuje vektoru replikovat nezávisle na hostitelské chromosomální DNA, a zahrnuje zdroje replikace nebo autonomně replikující sekvence. Tyto sekvence jsou dobře známé u různých bakterií, kvasinek a virů. Zdroj replikace z plasmiduBoth the expression and cloning vector contain a nucleic acid sequence that allows the vector to replicate in one or more selected host cells. Generally, in a cloning vector, this sequence is the only one that allows the vector to replicate independently of the host chromosomal DNA, and includes replication sources or autonomously replicating sequences. These sequences are well known in various bacteria, yeasts and viruses. Plasmid replication source

118 pBR322 je vhodný pro většinu Gram-negativních bakterií, 2 μ plasmidový zdroj je vhodný pro kvasinky a různé virální zdroje (SV40, polyom, adenovirus, VSV nebo BPV) jsou použitelné pro klonovací vektory v savčích buňkách. Obecně zdroj replikační složky není nutný pro savčí expresní vektory (SV40 zdroj může být obvykle použit jedině z toho důvodu, že obsahuje časný promotor).118 pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, a 2 μ plasmid source is suitable for yeast and various viral sources (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are useful for cloning vectors in mammalian cells. Generally, the replication component source is not necessary for mammalian expression vectors (the SV40 source can usually be used only because it contains an early promoter).

Většina expresních vektorů jsou „kyvadlové („shuttle) vektory, tj. jsou schopné replikace v nejméně jedné třídě organismů, ale mohou být transfektovány do jiných organismů kvůli expresi. Např. vektor je klonován v E. coli\ a poté je stejný vektor transfektován do kvasinkových nebo savčích buněk pro expresi přestože není schopný replikace nezávisle na chromosomu hostitelské buňky.Most expression vectors are shuttle vectors, i.e., are capable of replicating in at least one class of organisms, but can be transfected into other organisms for expression. E.g. the vector is cloned in E. coli and then the same vector is transfected into yeast or mammalian cells for expression although it is not capable of replication independently of the host cell chromosome.

DNA může být také amplifikována ensercí do hostitelského genomu. Je to snadno proveditelné s použitím druhu Bacillus jako hostitele, např., ve vektoru je zahrnuta DNA sekvence, která je komplementární k sekvenci nalezené v genomické DNA v Bacillus. Výsledkem transfekce Bacillus s tímto vektorem je homologní rekombinace s genomem a inserce mpl ligandové DNA. Ovšem získání genomické DNA kódující mpl je komplexnější než s exogenním replikačním vektorem, protože k odstranění mpl ligandové DNA je třeba restrikční enzymová digesce.The DNA can also be amplified by insertion into the host genome. This is readily accomplished using a Bacillus species as a host, e.g., a DNA sequence that is complementary to the sequence found in the genomic DNA in Bacillus is included in the vector. Bacillus transfection with this vector results in homologous recombination with the genome and insertion of mpl ligand DNA. However, obtaining genomic DNA encoding mpl is more complex than with an exogenous replication vector, since restriction enzyme digestion is required to remove mpl ligand DNA.

(iii) Výběr genové složky(iii) Selection of the gene component

Expresní a klonovací vektory by měly obsahovat selekční gen, také označovaný jako selektabilní markér. Tento gen kóduje protein nezbytný pro přežití nebo růst transformovaných hostitelných buněk pěstovaných v selektivním kultivačním médiu. Hostitelské buňky netransformované vektorem obsahujícím selekční gen vExpression and cloning vectors should contain a selection gene, also referred to as a selectable marker. This gene encodes a protein necessary for the survival or growth of transformed host cells grown in a selective culture medium. Host cells not transformed with a vector containing the selection gene in

119 kultivačním médiu přežívat nebudou. Typické selekční geny kódují proteiny které (a) poskytují resistenci k antibiotikům nebo jiným toxinům, např. ampicilinu, neomycynu, methotrexátu nebo tetracyklinu, (b) doplňují auxotrofní deficience, nebo (c) dodávají kritické živiny, které nejsou dostupné z komplexního média, např. gen kódující D-alanin racemasu pro Bacilli.They will not survive the culture medium. Typical selection genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycyne, methotrexate or tetracycline, (b) complement auxotrophic deficiencies, or (c) supply critical nutrients that are not available from a complex medium, e.g. a gene encoding D-alanine racemase for Bacilli.

Jeden příklad selekčního schématu používá k zastavení růstu hostitelských buněk léky. Tyto buňky jsou pak transformovány heterologním genem exprimujícím protein poskytující lékovou resistenci a tedy přežití vybrané skupiny. Příkladem léků použitých k takového dominantní selekci je neomycin (Southern a kol., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 [1982]), kyselina mykofenolová (mulligan a kol., Science, 209: 1422 [1980]) nebo hygromycin (Sugden a kol., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 [1985]). Tři výše uvedené příklady používají bakteriální geny pod eukaryotickou kontrolou k předání resistence na vhodný lék G418 nebo neomycin (geneticin), xgpt (kyselina mykofenolová) nebo hygromycin, respektive.One example of a selection scheme uses drugs to stop growth of host cells. These cells are then transformed with a heterologous gene expressing a protein conferring drug resistance and thus survival of the selected group. Examples of drugs used for such dominant selection are neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 [1982]), mycophenolic acid (mulligan et al., Science, 209: 1422 [1980]) or hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 [1985]). The three examples above use bacterial genes under eukaryotic control to impart resistance to a suitable drug G418 or neomycin (geneticin), xgpt (mycophenolic acid) or hygromycin, respectively.

Příklady dalších vhodných selektabilních markérů pro savčí buňky jsou markéry schopné identifikovat buňky odpovědné za převzetí nukleové kyseliny mpl ligandu, jako je dihydrofolátreduktasa (DHFR) nebo thymidinkinasa. Savčí buněčné transformanty jsou umístěny do selekčního tlaku, protože pouze transformanty jsou specificky adaptovány aby přežily, protože mají převzaté markéry. Selekční tlak je využit při kultivaci transformantů za podmínek, v kterých koncentrace selekčního agens v médiu je postupně měněna, což vede k amplifikaci selekčního genu i DNA kódující mpl ligandový polypeptid. Amplifikace je postup, při kterém se geny s větší potřebou produkce proteinů kritických pro růstExamples of other suitable selectable markers for mammalian cells are those capable of identifying cells responsible for the takeover of the mpl ligand nucleic acid, such as dihydrofolate reductase (DHFR) or thymidine kinase. Mammalian cell transformants are placed under selection pressure because only transformants are specifically adapted to survive because they have taken up markers. Selection pressure is utilized in the cultivation of transformants under conditions in which the concentration of the selection agent in the medium is gradually varied, resulting in amplification of both the selection gene and the DNA encoding the mpl ligand polypeptide. Amplification is a procedure in which genes with a greater need to produce proteins critical for growth

120 opakují jeden za druhým v chromosomech následujících generací rekombinantních buněk. Z amplifikované DNA jsou syntetizována stoupající množství mpl ligandu.120 repeat one after the other in the chromosomes of subsequent generations of recombinant cells. Increasing amounts of mpl ligand are synthesized from the amplified DNA.

Např. buňky transformované s DHFR selekčním genem jsou nejprve identifikovány kultivací všech transformantů v kultivačním mediu, které obsahuje methotrexát (Mtx), kompetitivního antagonistů DHFR. Když je použit DHFR „divokéhoů typu, je vhodná hostitelská buněčná linie buněk z vaječníků čínských křečků (CHO) deficientní v DHFR aktivitě, připravená a namnožená jak je popsáno v Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]. Transformované buňky jsou poté vytaveny stoupajícím hladinám Mtx. To vede k syntéze násobných kopií DHFR genu a jako průvodní jev i k syntéze násobných kopií další DNA obsahující expresní vektory, jako je DNA kódující mpl ligand. Tato amplifikační technika může být použita s jakýmkoliv jiným vhodným hostitelem, např. ATCC č. CCL61 CHO-K1, přes přítomnost endogenního DHFR, pokud je použit např. mutantní DHFR gen, který má vysokou resistenci k Mtx. (EP 117,060). Eventuelně, hostitelské buňky [zejména hostitelé divokého typu obsahující endogenní DHFR] transformované nebo ko-transformované s DNA sekvencemi kódujícími mpl ligand, divoký typ DHFR proteinu a další selektabilní markéry jako je aminoglykosid 3' fosfotransferasa (ΑΡΗ), mohou být vybrány pěstováním v médiu obsahujícím selekční agens pro selektabilní markér, jako je aminoglykosidické antibiotikum, např. kanamycin, neomycin, nebo G418. Viz U.S. Patent č. 4,965,199.E.g. cells transformed with the DHFR selection gene are first identified by culturing all transformants in a culture medium containing methotrexate (Mtx), a competitive DHFR antagonist. When using wild-type DHFR, a suitable Chinese hamster ovary (CHO) cell line deficient in DHFR activity, prepared and propagated as described in Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 [1980]. The transformed cells are then melted with increasing levels of Mtx. This results in the synthesis of multiple copies of the DHFR gene and, as a concomitant phenomenon, in the synthesis of multiple copies of additional DNA containing expression vectors such as DNA encoding the mpl ligand. This amplification technique can be used with any other suitable host, eg, ATCC No. CCL61 CHO-K1, despite the presence of endogenous DHFR if, eg, a mutant DHFR gene that has high Mtx resistance is used. (EP 117,060). Alternatively, host cells [particularly, wild-type hosts containing endogenous DHFR] transformed or co-transformed with DNA sequences encoding the mpl ligand, wild-type DHFR protein, and other selectable markers such as aminoglycoside 3 'phosphotransferase (ΑΡΗ) can be selected by growing in media containing a selection agent for a selectable marker, such as an aminoglycoside antibiotic, e.g., kanamycin, neomycin, or G418. See U.S. Pat. U.S. Patent No. 4,965,199.

Vhodným selekčním genem pro použití u kvasinek je trpí gen přítomný v kvasinkovém plasmidú YRp7 (Stinchcomb a kol., Nátuře, 282: 39 [1979]; Kinsman a kol., Gene, 7: 141 [1979]; nebo Tschemper a kol., Gene, 10: 157 [1980]). GenA suitable selection gene for use in yeast is the gene present in the yeast plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 [1979]; Kinsman et al., Gene, 7: 141 [1979]; or Tschemper et al. Gene, 10: 157 [1980]). Gene

121121

44076 nebo Přítomnost trpí poskytuje selekční markér pro mutantní druh kvasinek postrádající schopnost růst v tryptofanu, např ATCC č.44076 or The presence of suffering provides a selection marker for a mutant yeast species lacking the ability to grow in tryptophan, e.g.

PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]).PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]).

trpí nedostatku v genomu kvasinkových hostitelských buněk potom poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace růstem v nepřítomnosti tryptofanu. Podobně Leu2-deficientní kvasinkové druhy (ATCC č. 20,622 nebo 38,626) jsou doplněny známými plasmidy nesoucími Leu2 gen.suffering from a deficiency in the yeast host cell genome then provides an effective environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan. Similarly, Leu2-deficient yeast species (ATCC No. 20,622 or 38,626) are complemented by known plasmids carrying the Leu2 gene.

(iv) Promotorově složka(iv) Promoter component

Expresní a klonovací vektory obvykle obsahují promotor, který je rozpoznán hostitelským organismem a je oddělitelně navázán na mpl ligandovou nukleovou kyselinu. Promotory jsou netranslatované sekvence umístěné protisměrně (5) ke spouštěcímu kodónu strukturáního genu (obecně v 100 až 1000 bp) , které kontrolují transkripci a translaci specifické sekvence nukleové kyseliny, jako je sekvence nukleové kyseliny mpl ligandu, na kterou jsou oddělitelně navázány. Takovéto promotory obvykle spadají do dvou tříd, induktivní a konstitutivní. Induktivní promotory jsou promotory, které iniciují zvýšené hladiny transkripce z DNA za jejich kontroly, jako odpověď na některé změny kultivačního prostřední, např. přítomnost nebo nepřitomnosst výživy nebo teplotní změny. Dnes je dobře známé velké množství promotorů rozpoznaných různými potenciálními hostitelskými buňkami. Tyto promotory jsou oddělíteně navázané na DNA kódující mpl ligand odstraněním promotoru ze zdrojové DNA digescí restrikčním enzymen a vložením isolované promotorové sekvence do vektoru. Nativní mpl ligandová promotorově sekvence i mnoho heterologních promotorů může být použito k přímé amplifikaci a/nebo expresi mpl ligandové DNA. Ovšem preferovány jsouExpression and cloning vectors usually contain a promoter that is recognized by the host organism and is detachably linked to the mpl ligand nucleic acid. Promoters are untranslated sequences located upstream (5) to the triggering codon of the structuring gene (generally at 100 to 1000 bp) that control the transcription and translation of a specific nucleic acid sequence, such as the mpl ligand nucleic acid sequence to which they are detachably linked. Such promoters usually fall into two classes, inductive and constitutive. Inductive promoters are promoters that initiate increased levels of transcription from DNA under their control, in response to certain changes in the culture medium, eg, the presence or absence of nutrition or temperature changes. Today, a large number of promoters recognized by various potential host cells are well known. These promoters are separately bound to the DNA encoding the mpl ligand by removing the promoter from the source DNA by digesting with a restriction enzyme and inserting the isolated promoter sequence into the vector. Native mpl ligand promoter sequences as well as many heterologous promoters can be used to directly amplify and / or express mpl ligand DNA. However, they are preferred

122 heterologní promotory, protože obecně dovolují větší transkripci a vyšší výtěžek exprimovaného mpl ligandu ve srovnání s nativním mpl ligandovým promotorem.122 heterologous promoters since they generally allow for greater transcription and higher yield of expressed mpl ligand compared to the native mpl ligand promoter.

Promotory vhodné pro použití v prokariotických hostitelích zahrnují β-laktamasový a laktosový promotorový systém (Chang a kol., Nátuře, 275: 615 [1978]; Goeddel a kol., Nátuře, 281. 544 [1979], alkalický fosfatasový, tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8. 4057 [1980] a EP 36,776) a hybridní promotory jako je tac promotor (deBoer a kol., Proč. Nati. Acd. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]). Ovšem je možné použít i další známé bakteriální promotory. Jejich nukleotidové sekvence byly publikovány, což umožňuje zkušenému pracovníkovi oddělitelně je ligovat na DNA kódující mpl ligand (Siebenlist a kol., Cell, 20: 369 [1980]) s použitím linkerů nebo adaptorů za získání jakékokoliv restrikčního místa. Promotory pro použití v bakteriálních systémech také budou obsahovat Shine-Dalgarno (S.D.) sekvenci oddělitelně navázanou na DNA kódující mpl ligandový polypeptid.Promoters suitable for use in prokariotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems (Chang et al., Nature, 275: 615 [1978]; Goeddel et al., Nature, 281, 544 [1979], alkaline phosphatase, tryptophan (trp ) a promoter system (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8, 4057 [1980] and EP 36,776) and hybrid promoters such as the tac promoter (deBoer et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 80: 21-25 [ However, other known bacterial promoters may be used, and their nucleotide sequences have been published, allowing the skilled artisan to detachably ligate them to DNA encoding the mpl ligand (Siebenlist et al., Cell, 20: 369 [1980]) using linkers. Promoters for use in bacterial systems will also contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence detachably linked to DNA encoding the mpl ligand polypeptide.

Promotorové sekvence pro eukaryota jsou známé. Potenciálně všechny eukaryotické geny mají AT-bohatou oblast umístěnou 25 až 30 basí protisměrně od místa, kde je iniciována transkripce. Další sekvence mnoha genů nalézající se 70 až 80 basí protisměrně od začátku transkripce je CXCAAT oblast, kde X může být jakýkoliv nukleotid. 3' konec většiny eukaryotických genů je AATAAA která může být signálem pro přidání póly A konec kódující sekvence. Všechny tyto vhodně insertovány do eukaryotických expresních vektorů.Promoter sequences for eukaryotes are known. Potentially all eukaryotic genes have an AT-rich region located 25 to 30 bases upstream of the transcription initiated site. Another sequence of many genes found 70 to 80 bases upstream from the start of transcription is the CXCAAT region where X can be any nucleotide. The 3 'end of most eukaryotic genes is AATAAA, which may be a signal for the addition of the A ends of the coding sequence. All of these suitably inserted into eukaryotic expression vectors.

Příklady vhodných promotorických sekvencí pro použití u kvasinkových hostitelů zahrnují promotory pro sekvence, zakončení na 3' sekvence jsouExamples of suitable promoter sequences for use in yeast hosts include promoters for sequences terminating at the 3 'sequence are

123123

3-fosfoglycerátkinasu (Hitzeman a kol., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980] nebo další glykolytické enzymy (Hess a kol., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; a Holland, Biochemistry, 17: 4900 [1978]), stejně jako enolasu, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasu, hexokinasu, 3fošfoglycerátmutasu, pyruvátkinasu, triosafosfátisomerasu, fosfoglukosaisomerasu a glukokinasu.3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980] or other glycolytic enzymes (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; and Holland, Biochemistry, 17: 4900 [1978]), as well as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, 3phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosaphosphate isomerase, phosphoglucosaisomerase and glucokinase.

Další kvasinkové promotory, které jsou induktivními promotory majícími další výhodu transkripce kontrolované růstovými podmínkami, jsou promotorové oblasti pro alkoholdehydrogenasu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatasu, degradativní enzymymy spojené s metabolismem dusíku, metallothionein, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa a enzymy odpovědné za utilizaci maltosy a galaktosy. Vhodné vektory a promotory pro použití při kvasinkové expresi jsou dále popsány v Hitzeman a kol., EP 73,657A. U kvasinkových promotorů jsou také výhodně používány kvasinkové enhancery.Other yeast promoters that are inductive promoters having the additional benefit of growth-controlled transcription are the promoter regions for alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradative enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and utilization enzymes and malt enzymes galactose. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in Hitzeman et al., EP 73,657A. Yeast enhancers are also preferably used with yeast promoters.

Transkripce mpl ligandu z vektorů v savčích hostitelských buňkách je kontrolována, např., promotory získanými z genomů virů jako je virus obrny, virus slepičích neštovic (UK 2,211,504 publikovaný 5. července 1989), adenovirus (jako je Adenovirus 2), hovězí papilomový virus, virus ptačího sarkomu, cytomegalovirus, z heterologních savčích promotorů, např., aktinového promotoru nebo imunoglobulinového promotoru, z promotorů tepelného šoku, a z promotorů normálně spojených s mpl ligandovou sekvencí, za předpokladu že tyto promotory jsou kompatibilní s hostitelským bunčným systémem.Transcription of mpl ligand from vectors in mammalian host cells is controlled, e.g., by promoters derived from viral genomes such as polio virus, chicken pox virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), adenovirus (such as Adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, heterologous mammalian promoters, e.g., the actin promoter or immunoglobulin promoter, heat shock promoters, and promoters normally associated with the mpl ligand sequence, provided that these promoters are compatible with the host cell system.

Časné a pozdní promotory SV40 viru jsou obvykle získány jako SV40 restrikční fragment, který také obsahuje SV40 virální původ replikace. Fiers a kol., Nátuře, 273, 273: 113 [1978]; Mulligand a Berg, Science, 209: 1422-1427The early and late promoters of the SV40 virus are usually obtained as an SV40 restriction fragment that also contains the SV40 viral origin of replication. Fiers et al., Nature, 273, 273: 113 [1978]; Mulligand and Berg, Science, 209: 1422-1427

124 [1980]; Pavlakis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402 [1981]). Přímý časný promotor lidského cytomegaloviru je obvykle získán jako HindlII E restrikční fragment. Greenaway a kol., Gene, 18: 355-360 [1982]. Systém pro expresi DNA v savčích buňkách používající hovězí papilomový virus jako vektor je popsán v U.S Patentu č. 4,419,446. Modifikace tohoto systému je popsána v U.S. Patentu č. 4,601,978. Viz také v Gray a kol., Nátuře, 295: 503-508 [1982] exprese cDNA kódující imunitní interferon v opičích buňkách; Rexes a kol., Nátuře, 296: 598-601 [1982] exprese lidské β-interferonové cDNA v myší buňce pod kontrolou thymidinkinasového promotoru z herpes simplex viru; Canaani a Berg, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 51665170 [1982] exprese lidského interferonu βΐ genu v kultivovaných myších a králičích buňkách; a Gorman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 6777-6781 [1982] exprese bakteriálních CAT sekvencí v CV-1 buňkách opičích ledvin, kuřecích zárodečných fibroblastů, buňkách vaječníků čínských křečků, HeLa buněk, a myších NIH-3T3 buněk s použitím dlouhého terminálního opakování viru Rousova sarkomu jako promotoru.124 [1980]; Pavlakis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402 [1981]). The direct early promoter of human cytomegalovirus is usually obtained as a HindIII E restriction fragment. Greenaway et al., Gene, 18: 355-360 [1982]. A system for expressing DNA in mammalian cells using bovine papilloma virus as a vector is described in U.S. Patent No. 4,419,446. A modification of this system is described in U.S. Pat. No. 4,601,978. See also in Gray et al., Nature, 295: 503-508 [1982] expression of cDNA encoding immune interferon in monkey cells; Rexes et al., Nature, 296: 598-601 [1982] expression of human β-interferon cDNA in a mouse cell under the control of the thymidine kinase promoter from herpes simplex virus; Canaani and Berg, Why. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 51665170 [1982] expression of human interferon β-gene in cultured mouse and rabbit cells; and Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 6777-6781 [1982] expression of bacterial CAT sequences in monkey kidney CV-1 cells, chicken germ fibroblasts, Chinese hamster ovary cells, HeLa cells, and mouse NIH-3T3 cells using long terminal repeat of Rous sarcoma virus as promoter .

(v) Složky enhancerového prvku(v) Components of the enhancer element

Transkripce DNA kódující mpl ligand podle tohoto vynálezu vyššími eukaryoty je často zvýšena vložením enhancerové sekvence do vektoru. Enhancery jsou cispůsobící prvky DNA, obvykle 10 až 300 bp, které působí na promotor a zvyšují jeho transkripci. Enhancery jsou poměrně orientačně a polohově závislé, nalézají se 5' (Laimins a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78: 993 [1981]) a 3' (Lusky a kol., Mol. Cell Bio., 3: 1108 transkripční jednotce, v intronu (Benerji a kolTranscription of DNA encoding the mpl ligand of the invention by higher eukaryotes is often enhanced by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are DNA manipulators, usually 10 to 300 bp, that act on the promoter and increase its transcription. Enhancers are relatively orientation and position dependent, are found 5 '(Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 993 [1981]) and 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108 transcriptional unit, in the intron (Benerji et al

729 [1983]), i ve vlastní kódující sekvenci (Osborne [1983]) k , Cell, 33:729 [1983]), i in its own coding sequence (Osborne [1983]) k, Cell, 33:

125 kol., Mol. Cess Bio., 4: 1293 [1984]). Nyní je známo mnoho enhancerových sekvencí ze savčích genů (globin, elastasa, albumin, a-fetoprotein a insulin). Obvykle ovšem bude použit enhancer z viru eukaryotické buňky. Příklady zahrnují SV40 enhancer z pozdější strany replikačního zdroje (bp 100-270), cytomegalovirový časný promotorový enhancer, enhancer obrny z pozdější strany replikačního zdroje, a adenovirový enhancer. Viz také Yaniv, Nátuře, 297, 17-18 [1982] urychlující prvky pro aktivaci eukaryotických promotorů. Enhancery mohou být navázány do vektoru v poloze 5' nebo 3' k sekvenci kódující mpl ligand, ale výhodněji jsou lokalizovány na straně 5' od promotoru.125 et al., Mol. Cess Bio., 4: 1293 [1984]). Many enhancer sequences are now known from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Usually, however, an enhancer from a eukaryotic cell virus will be used. Examples include the SV40 enhancer from the later side of the replication source (bp 100-270), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polio enhancer from the later side of the replication source, and the adenovirus enhancer. See also Yaniv, Nature, 297, 17-18 [1982] accelerating elements for activation of eukaryotic promoters. Enhancers can be linked to the vector at the 5 'or 3' position to the mpl ligand coding sequence, but more preferably are located 5 'of the promoter.

(vi) Transkripce terminační složky(vi) Termination component transcription

Expresní vektory používané v eukaryotických hostitelských buňkách (buňky kvasinek, hub, hmyzu, rostlin, zvířat, lidí nebo nukleované buňky z jiných mnohobuněčných organismů) budou také obsahovat sekvence nezbytné pro terminaci transkripce a pro stabilizaci mRNA. Takovéto sekvence jsou obvykle dostupné z 5', příležitostně 3' netranslatovaných oblastí eukaryotických nebo virálních DNA nebo cDNA. Tyto oblasti obsahují nukleotidové segmenty transkribované jako polyadenylované fragmenty v netranslatovaném podílu mRNA kódující mpl ligand.Expression vectors used in eukaryotic host cells (yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or nucleated cells from other multicellular organisms) will also contain sequences necessary for transcription termination and mRNA stabilization. Such sequences are usually available from 5 ', occasionally 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions comprise nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the mpl ligand.

(vii) Konstrukce a analýza vektorů(vii) Construction and analysis of vectors

Konstrukce vhodných vektorů obsahujících jednu nebo více výše uvedených složek se provádí standardními technikami. Isolované plasmidy nebo DNA fragmenty jsou štěpeny, upraveny a znovunavázány ve formě potřebné pro vznik požadovaného plasmidů.The construction of suitable vectors containing one or more of the above components is accomplished by standard techniques. The isolated plasmids or DNA fragments are digested, engineered, and recombined in the form required to produce the desired plasmids.

Pro potvrzení správnosti sekvencí ve zkonstruovaných plasmidech je použita ligační směs pro transformaci E. coliTo confirm the correctness of the sequences in the engineered plasmids, an E. coli transformation ligation mixture was used

K12 kmen 294 (ATCC č. 31,446) a úspěšné transformanty jsouK12 strain 294 (ATCC No. 31,446) and successful transformants are

126 vybrány ampicilinovou nebo tetracyklinovou resistencí, podle vhodnosti. Z transformantů jsou připraveny plasmidy, analyzovány restrikcí endonukleasovou digescí, a/nebo sekvenovány metodou podle Messinga a kol., Nucleic Acids Res., 9: 309 [1981] nebo metodou podle Maxama a kol.,126 selected by ampicillin or tetracycline resistance, as appropriate. Plasmids are prepared from transformants, analyzed by restriction endonuclease digestion, and / or sequenced by the method of Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 [1981] or by the method of Maxam et al.,

Methods in Enzymology, 65: 499 [1980].Methods in Enzymology, 65: 499 [1980].

(viii) Dočasné expresní vektory(viii) Temporary expression vectors

Zvláště užitečné při provedení tohoto vynálezu jsou expresní vektory, které slouží pro dočasnou expresi DNA kódující mpl ligandový polypeptid v savčích buňkách. Obecně dočasná exprese zahrnuje použití expresního vektoru, který je schopen dobře replikovat v hostitelské buňce, takže hostitelská buňka akumuluje kopie expresního vektoru a, naopak, syntetizuje vysoké hladiny požadovaného polypeptidu kódovaného expresním vektorem. Sambrook a kol., viz výše, str. 16.17 - 16.22. Dočasné expresní systémy, zahrnující vhodný expresní vektor a hostitelskou buňky, poskytují positivní identifikaci polypeptidů kódovaných klonovanými DNA, stejné jako rychlý screening takových polypeptidů na požadované biologické nebo fysiologické vlastnosti. Dočasné expresní systémy jsou tedy zvláště vhodné v tomto vynálezu pro účely identifikace analogů a variant mpl ligandových polypeptidů, které mají biologickou aktivitu ligandového polypeptidu.Particularly useful in practicing the present invention are expression vectors that serve to temporarily express the DNA encoding the mpl ligand polypeptide in mammalian cells. Generally, transient expression involves the use of an expression vector that is capable of replicating well in a host cell such that the host cell accumulates copies of the expression vector and, conversely, synthesizes high levels of the desired polypeptide encoded by the expression vector. Sambrook et al., Supra, pp. 16.17-16.22. Temporary expression systems, including a suitable expression vector and host cells, provide positive identification of the polypeptides encoded by the cloned DNA, as well as rapid screening of such polypeptides for the desired biological or physiological properties. Thus, temporary expression systems are particularly useful in the present invention for the purpose of identifying analogs and variants of mpl ligand polypeptides having biological activity of the ligand polypeptide.

(ix) Vhodné příklady buněčných vektorů obratlovců.(ix) Suitable examples of vertebrate cell vectors.

Další metody, vektory a hostitelské buňky vhodné pro adaptaci na syntésu mpl ligandu v rekombinantní buněčné kultuře obratlovců jsou popsány v Gething a kol., Nátuře, 293: 620-625 [1981]; Mentei a kol., Nátuře, 281: 40-46 [1979]; Levinson a kol.; EP 117,060 a EP 117,058. Zvláště užitečný plasmid pro savčí buněčnou expresi mpl ligandu jeOther methods, vectors, and host cells suitable for adapting to mpl ligand synthesis in recombinant vertebrate cell culture are described in Gething et al., Nature, 293: 620-625 [1981]; Mentei et al., Nature, 281: 40-46 [1979]; Levinson et al .; EP 117,060 and EP 117,058. A particularly useful plasmid for mammalian cell expression of the mpl ligand is

127 pRK5 (EP 307,247 U.S. patent č. 5,258,287) nebo pSVl6B (PCT Publikace č. WO 91/08291).127 pRK5 (EP 307,247 U.S. Patent No. 5,258,287) or pSV16B (PCT Publication No. WO 91/08291).

D. Výběr a transformace hostitelských buněkD. Selection and transformation of host cells

Vhodné hostitelské buňky pro klonování a expresi vektorů jsou prokaryota, kvasinky nebo výše uvedené vyšší eukaryotické buňky. Vhodná prokaryota jsou eubakteria, jako Gram-negativní nebo Gram-positivní organismy, např. E. coli, Bacilli jako je B. subtillis, druh Pseudomonas jako P. aeruginosa, Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescans. Jedním preferovaným E. coli klonujícím hostitelem je E. coli 294 (ATCC č. 31,446), ačkoliv i další kmeny jako je E. coli Β, E. coli X1776 (ATCC č. 31,537) aSuitable host cells for cloning and expression of the vectors are prokaryotes, yeast, or the aforementioned higher eukaryotic cells. Suitable prokaryotes are eubacteria such as Gram-negative or Gram-positive organisms, e.g. E. coli, Bacilli such as B. subtillis, Pseudomonas species such as P. aeruginosa, Salmonella typhimurium or Serratia marcescans. One preferred E. coli cloning host is E. coli 294 (ATCC No. 31,446), although other strains such as E. coli, E. coli X1776 (ATCC No. 31,537) and

E. coli W3110 (ATCC č. 27,325) jsou vhodné. Příklady jsou pouze ilustrativní, nejsou omezující. Výhodněji by měla hostitelská buňka vylučovat minimální množství proteolytických enzymů. Eventuelně jsou vhodné in vitro metody klonování, např., PCR nebo jiné reakce polymerasy nukleové kyseliny.E. coli W3110 (ATCC No. 27,325) are suitable. The examples are illustrative only, not limiting. More preferably, the host cell should secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. Alternatively, in vitro methods of cloning, eg, PCR or other nucleic acid polymerase reactions, are suitable.

Dále jsou vhodnými hostiteli pro vektory kódující mpl ligand prokaryota, eukaryotičtí mikrobi jako jsou vláknité houby nebo kvasinky. Z nižších eukaryotických hostitelských mikroorganismů jsou nej častěji používané Saccharomyces cerevisiae nebo běžné pekařské kvasinky. Ovšem je zde možné použít množství dalších druhů, odrůd a linií, jako je Schizosaccharomyces pombe (Beach a Nurse, Nátuře, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publikovaný 2. května 1985), Kluyveromyces (U.S. Patent č. 4,943,529) jako je např. K. lactis (Louvencourt a kol., J. bacteriol., 727 [1983], K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, a K. marxianus, yarowia [EP 402,226], Pichia pastoris (EP 183,070);In addition, suitable hosts for vectors encoding the mpl ligand are prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast. Of the lower eukaryotic host microorganisms, Saccharomyces cerevisiae or common baker's yeast are most commonly used. However, a number of other species, varieties and lines, such as Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 published May 2, 1985), Kluyveromyces (US Patent No. 4,943,529) such as e.g. K. lactis (Louvencourt et al., J. bacteriol., 727 [1983], K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, and K. marxianus, yarowia [EP 402,226], Pichia pastoris (EP 183,070) ;

Sreekrishna kol., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244, 234),Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234),

128128

Neurospora crassa (Čase a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]), a vláknité houby jako, např., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publikovaný 10. ledna 1991), a Aspergillus jako A. nidulans (Ballance a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284289 [1983]; Ťilburn a kol., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton a kol., Procl. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) a A. niger (Kelly a Hyneš, EMBO J., 4: 475-479 [1985] .Neurospora crassa (Tase et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]), and filamentous fungi such as, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 published Jan. 10, 2004). 1991), and Aspergillus as A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284289 [1983]; Gilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985].

Vhodné hostitelské buňky pro expresi glykosylovaného mpl ligandu jsou buňky odvozené od mnohobuněčných organismů. Takovéto hostitelské buňky jsou schopné komplexního zpracování a glykosylačních procesů. V podstatě je použitelná jakákoliv vyšší eukaryotická buněčná kultura, ať už z kultury obratlovců nebo bezobratlých. Příklady buněk bezobratlých zahrnují rostlinné a hmyzí buňky. Bylo identifikováno množství hostitelských buněk z tyčinkových druhů a variant virů a vhodných hmyzích hostitelů jako jsou Spodoptera frugiperda (housenka), Aedes aegypti (komár), Aedes albopictus (komár), Drosophila melanogaster (ovocná muška), a Bombys moři. Viz, např. Luckow a kol., Bio/Technology, 6: 47-55 [1988]; Miller a kol., Genetic Engineering, Wetlow a kol., editoři, Vol. 8 PlenůmSuitable host cells for the expression of glycosylated mpl ligand are those derived from multicellular organisms. Such host cells are capable of complex processing and glycosylation processes. In principle, any higher eukaryotic cell culture, whether from vertebrate or invertebrate culture, is applicable. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. A number of host cells from rod species and virus variants and suitable insect hosts such as Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruit fly), and Bombys sea have been identified. See, e.g., Luckow et al., Bio / Technology, 6: 47-55 [1988]; Miller et al., Genetic Engineering, Wetlow et al., Editors, Vol. 8 Plenum

Publishing, 1986), str. 277-279; a Maeda a kol., Nátuře, 315: 592-594 [1985]. Různé virální druhy pro transfekci jsou veřejně dostupné, např., L-l varianta Autographa californica NPV a Bm-5 druh Bombys moři NPV, a tyto viry mohou být použity jako viry zde uvedené v překládaném zvláště pro transfekci buněk vynálezu, frugipera. JakoPublishing, 1986), pp. 277-279; and Maeda et al., Nature, 315: 592-594 [1985]. Various viral species for transfection are publicly available, eg, the L-1 variant of Autographa californica NPV and the Bm-5 species of the Bombys Sea NPV, and these viruses can be used as viruses disclosed herein specifically translated to transfect cells of the invention, frugipera. Like

Spodoptera hostitelné buňky mohou být použity buňky rozstlinných kultur bavlny, kukuřice, brambor, sojovýchSpodoptera host cells can be used cells of crop cultures of cotton, corn, potato, soybean

129 bobů, petúnií, rajčat a tabáku. Obvykle jsou rostlinné buňky transfektovány inkubací s některým druhem bakterie Agrobacterium tumefaciens, který byl předtím upraven, aby obsahovat mpl ligandovou DNA. Během inkubace roastlinné buněčné kultury s A. tumefaciens je DNA kódující mpl ligand přenesena do · rostlinné hostitelské buňky, takže je transfektována a bude, za vhodných podmínek, exprimovat mpl ligandovou DNA. Navíc jsou dostupné regulační a signální sekvence kompatibilní s rostlinnými buňkami, jako je synthasový promotor z opuncie a polyadenylačni signuální sekvence. Depicker a kol., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 [1982]. Navíc DNA segmenty isolované z protisměrné oblasti T-DNA 780 genu jsou schopné aktivovat nebo zvyšovat transkripční hladiny rostlinně exprimovatelných genů v rekombinantní DNA-obsahující rostlinné tkáni. EP 321,196 publikovaný 21. června 1989.129 beans, petunias, tomatoes and tobacco. Typically, plant cells are transfected by incubation with some species of Agrobacterium tumefaciens that has been previously treated to contain mpl ligand DNA. During incubation of a plant cell culture with A. tumefaciens, the DNA encoding the mpl ligand is transferred to the plant host cell so that it is transfected and will, under appropriate conditions, express the mpl ligand DNA. In addition, regulatory and signal sequences compatible with plant cells such as prickly pear synthase promoter and polyadenylation signal sequences are available. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 [1982]. In addition, DNA segments isolated from the upstream region of the T-DNA 780 gene are capable of activating or increasing transcriptional levels of plant-expressible genes in recombinant DNA-containing plant tissue. EP 321,196 published June 21, 1989.

Avšak největšímu zájmu se těší buňky obratlovců, a množení buněk obratlovců v kultuře (tkáňové kultuře) se stalo v posledních letech běžným postupem (Tissue Culture, Academie Press, Kruše a Patterson, editoři [1973]). Příkladem používané savčí hostitelské buněčné linie je linie opičích jater CV1 transformovaná SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linie lidských zárodečných ledvin (293 nebo 293 buňky) subklonované pro růst v suspensní kultuře, (Graham a kol., J. Gen Virol., 36: 59 [1977]), buňky jater křeččích mláďat (BHK, ATCC CCL 10); buňky vaječníků čínských křečků/-DHFR (CHO, Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); myší sertolické buňky (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); buňky opičích ledvin (CV1 ATCC CCL 70) , buňky ledvin afrických zelených opic (VERO-76, ATCC ARL-1587); buňky lidského krčního karcinomu (HELA, ATCC CCL 2); buňky psích ledvin (MDCK, ATCC CCL 34);However, vertebrate cells enjoy the greatest interest, and the proliferation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a common practice in recent years (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors [1973]). An example of a mammalian host cell line used is the monkey liver CV1 line transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney lines (293 or 293 cells) subcloned for growth in suspension culture, (Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 [1977]), hamster baby cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary cells / -HFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); murine sertolic cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70), African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC ARL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34);

130 buňky jater obojživelných krys (buffalo rat) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); lidské plicní buňky (W138, ATCC CCL 75); lidské jaterní buňky (Hep G2, HB 8065); tumor myší prsní žlázy (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI buňky (Mather a kol., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); MRC 5 buňky; FS4 buňky a -lidská hepatomická linie (Hep G2) .130 liver cells of amphibious rats (buffalo rat) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary gland tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); MRC 5 cells; FS4 cells and the human hepatic line (Hep G2).

Hostitelské buňky jsou transfektovány a výhodněji transformovány výše uvedenými expresními nebo klonovacími vektory podle tohoto vynálezu a kultivovány v obvyklém živném mediu modifikovaném tak, jak je vhodné pro indukci promotorů, vybraných transformací nebo amplifikaci genů kódujících požadované sekvence.Host cells are transfected and more preferably transformed with the above-mentioned expression or cloning vectors of the invention and cultured in a conventional nutrient medium modified as appropriate for inducing promoters, selected by transforming or amplifying the genes encoding the desired sequences.

Transfekce označuje navázání expresního vektoru hostitelskou buňkou. Člověku běžně seznámenému s danou problematikou bude známo mnoho metod transfekce, např., CaPO₄ a elektroporace. Úspěšná trasfekce je obecné rozpoznána pokud se v hostitelské buňce objeví jakýkoliv projev činnosti tohoto vektoru.Transfection refers to the binding of an expression vector by a host cell. Many methods of transfection, such as CaPO ₄ and electroporation, will be known to those of ordinary skill in the art. A successful transfection is generally recognized if any expression of the activity of this vector occurs in the host cell.

Transformace znamená zavedení DNA do organismu tak, že DNA je replikabilní, buď jako extrachromosomální složka nebo jako chromosomální integrát. V závislosti na použité hostitelské buňce je transformace provedena standardními technikami vhodnými pro tuto buňku. Kalciové působení prováděné chloridem vápenatým, jak je popsáno v sekci 1.82 Sambrokk a kol., viz výše, je obecně používáno pro prokaryota nebo další buňky obsahující substanciální bariéry buněčné stěny. Infekce s Agrobakteriem tumefaciens je použita pro transformaci některých rostlinných buněk, jak je popsáno v Shaw a kol., Gene, 23: 315 [1983] a WO 89/05858 publikovaném 29. července 1989. Navíc rostliny mohou být transfektovány s použitím ultrazvukového působení jak je popsáno v WO 91/00358 publikovaném 10. ledna 1991.Transformation means introducing DNA into the body such that the DNA is replicable, either as an extrachromosomal component or as a chromosomal integrate. Depending on the host cell used, transformation is accomplished using standard techniques appropriate to the cell. The calcium treatment performed with calcium chloride as described in section 1.82 of Sambrokk et al., Supra, is generally used for prokaryotes or other cells containing substantial cell wall barriers. Agrobacterium tumefaciens infection is used to transform some plant cells as described in Shaw et al., Gene, 23: 315 [1983] and WO 89/05858 published July 29, 1989. In addition, plants can be transfected using ultrasound treatment as both is described in WO 91/00358 published January 10, 1991.

131131

Pro savčí buňky bez těchto buněčných stěch je preferována precipitace fosfátem vápenatým - metoda podle Grahama a van der Eba, Virology, 52: 456-457 [1978], Obecné aspekty transformací systémů savčích hostitelkých buněk jsou popsány Axelem v U.S Patentu č. 4,399,216 vydaném 16. srpna 1983, Transformace do kvasinek jsou obvykle provedeny podle metody van Solingena a kol., J. Bact., 130: 946 {1977] a Hsiaoa a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 3829 [1979]. Ovšem mohou být také použity další metody pro zavedení DNA do buněk, jako je nukleární injektace, elektroporace, nebo protoplastová fúze.For mammalian cells without these cell walls, calcium phosphate precipitation is preferred - Graham and van der Eb method, Virology, 52: 456-457 [1978]. General aspects of mammalian host cell transformation systems are described by Axel in US Patent No. 4,399,216 issued 16 Transformations into yeast are generally performed according to the method of van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) and Hsiaoa et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 3829 [1979]. However, other methods for introducing DNA into cells, such as nuclear injection, electroporation, or protoplast fusion, may also be used.

E. Kultivace hostitelských buněkE. Culturing of host cells

Prokaryotické buňky použité k produkci mpl ligandového polypeptidu podle tohoto vynálezu jsou kultivovány ve vhodném médiu jak je obecně popsáno v Sambrook a kol., viz výše.The prokaryotic cells used to produce the mpl ligand polypeptide of the invention are cultured in a suitable medium as generally described in Sambrook et al., Supra.

Savčí hostitelské buňky použité k produkci mpl ligandu podle tohoto vynálezu mohou být kultivovány v různých médiích. Pro kulitaci hostitelských buněk jsou vhodná komerčně dostupná média jako je Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), a Sulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma). Navíc mohou být jako kultivační média pro hostitelské buňky použita jakákoliv média popsaná v Ham a Wallace, Meth. Enz., 58: 44 [1979], Barnes a Sáto, Anal. biochem., 102: 255 [1980], U.S.Patent č. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; nebo 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S.Patent Re. 30,985; nebo společně podané U.S.S.N. 07/592,107 nebo 07/592,141, oba zaregistrované 3. října 1990. Kterékoliv z těchto médií může být doplněno v případě potřeby hormony a/nebo dalšími růstovými faktory (jako je insulin, transferrin nebo epidermální růstový faktor), solemi (jakoMammalian host cells used to produce the mpl ligand of the invention can be cultured in various media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), and Sulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) are suitable for host cell culture. In addition, any of the media described in Ham and Wallace, Meth can be used as host cell culture media. Enz., 58: 44 [1979], Barnes and Sato, Anal. biochem., 102: 255 [1980], U.S. Patent No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; or 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S.Patent Re. 30.985; or co-administered by U.S.S.N. 07 / 592,107 or 07 / 592,141, both registered October 3, 1990. Any of these media may be supplemented, if necessary, with hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (such as

132 je chlorid sodný, vápník, hořčík a fosfát), pufry (jako je HEPES), nukleosidy (jako je adenosin a thymidin), antibiotiky (jako Gentamycin™ léčivo), stopovými prvky (definovanými jako anorganické sloučeniny obvykle přítomné v celkových koncentracích v mikromolárním rozmezí), a glukosou nebo ekvivalentním zdrojem energie. Jaké doplňky budou třeba a v jakých koncentracích by mělo být dobře známo osobě vzdělané v dané problematice. Kultivační podmínky, jako je teplota, pH a podobně, jsou podmínky dříve použité u hostitelských buněk vybraných pro expresi, a pro osobu běžně vzdělanou v dané oblasti budou zřejmé.132 is sodium chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers (such as HEPES), nucleosides (such as adenosine and thymidine), antibiotics (such as Gentamycin ™ drug), trace elements (defined as inorganic compounds usually present in total concentrations in micromolar range), and glucose or an equivalent energy source. What supplements will be needed and in what concentrations it should be well known to the person skilled in the art. Culture conditions, such as temperature, pH, and the like, are those previously used with host cells selected for expression, and will be apparent to a person ordinarily skilled in the art.

Hostitelské buňky vztahující se k tomuto vynálezu zahrnují buňky kultury in vitro stejně jako buňky, které jsou v živočišném hostiteli.Host cells related to the invention include in vitro culture cells as well as cells that are in an animal host.

F. Detekce genové amplifikace/expreseF. Detection of gene amplification / expression

Genová amplifikace a/nebo exprese může být měřena ve vzorku přímo, například obvyklým Southern blotem, nothern blotem, aby byla kvantifikována transkripce mRNA (Thomas, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 5101-5205 [1980], bodovým (dot) blotem (DNA analýza), nebo hybridizací in šitu, s použitím vhodně značeného vzorku, na základě zde získaných sekvencí. Mohou být použita různá značení, nejběžnější jsou radioisotopy, zvláště ³²P. Ovšem mohou být také použity další techniky, jako je použití biotinem modifikovaných nukleotidů pro zavedení do nukleotidu. Biotin pak slouží jako místo pro vazbu na avidin nebo protilátky, které mohou být značené různými značkami, jako jsou radioonuklidy, fluorescenty, enzymy atd. protilátky, které mohouGene amplification and / or expression can be measured in a sample directly, for example, by a conventional Southern blot, nothern blot to quantify mRNA transcription (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5101-5205 [1980], spot ( dot) by blotting (DNA analysis), or by in situ hybridization using a suitably labeled sample, based on the sequences obtained herein, different labels may be used, the most common being radioisotopes, particularly ³² P. However, other techniques such as the use of biotin-modified nucleotides for introduction into the nucleotide, which then serves as a site for binding to avidin or antibodies, which may be labeled with various labels, such as radio-nuclides, fluorescents, enzymes, etc., which may

Eventuelně mohou být použity rozpoznat specifické duplexy, včetně DNA duplexů, RNA duplexů, a DNA-RNA hybridních duplexů neo DNA-protein duplexů. Naopak mohou být značeny protilátky a stanovení může být provedena když duplex jeAlternatively, specific duplexes can be used, including DNA duplexes, RNA duplexes, and DNA-RNA hybrid duplexes or DNA-protein duplexes. Conversely, antibodies can be labeled and the assay can be performed when the duplex is

133 navázán na povrch tak, že u formace duplexu na povrchu může být detekována přítomnost protilátky navázané na duplexu.133, such that the presence of an antibody bound to the duplex can be detected in a duplex formation on the surface.

Exprese genu může být eventuálně měřena imunologickými netodami, jako je imunihistochemické barvení částí tkáně a stanovení buněčné kultury nebo tkáňových tekutin, aby byla přímo kvantifikována exprese genového produktu. U imunohistochemických barvících technik je buněčný vzorek preparován, obvykle dehydratací a fixací, pak následuje reakce se značenými protilátkami specifickými pro sdruženou reakci genového produktu, kde je značení obvykle detekováno visuálně, např. enzymatickým značením, fluorescentním značením, luminiscentním značením atd. Zvláště citlivá barvící technika vhodná pro použití v předkládaném vynálezu je popsána v Hsu a kol., Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 [1980].Alternatively, gene expression can be measured by immunological non-methods, such as immunihistochemical staining of tissue sections and determination of cell culture or tissue fluids to directly quantify expression of the gene product. In immunohistochemical staining techniques, the cell sample is prepared, usually by dehydration and fixation, followed by reaction with labeled antibodies specific for the gene product pooled reaction, where the staining is usually detected visually, eg by enzymatic staining, fluorescent staining, luminescent staining, etc. suitable for use in the present invention is described in Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 (1980).

Protilátka použitelná pro imunihostochemické barvení a/nebo stanovení vzorku tekutiny může být monoklonální nebo polyklonální, a může být připravena v jakémkoliv savci. Obvykle mohou být protilátky připraveny proti nativnímu mpl ligandovému polypeptidu nebo proti syntetickému polypeptidu na bázi DNA sekvence získané jak je zde popsáno dále níže.The antibody useful for immunohostochemical staining and / or assay of a fluid sample may be monoclonal or polyclonal, and may be prepared in any mammal. Typically, the antibodies can be prepared against a native mpl ligand polypeptide or a synthetic polypeptide based on the DNA sequence obtained as described hereinbelow.

G. Purifikace mpl ligandového polypeptiduG. Purification of the mpl ligand polypeptide

Mpl ligand je přednostně získán z kultivačního média jako sekretovaný polypeptid, ačkoliv může být také získán z lysátu hostitelské buňky, když je exprimován přímo bez sekretorického signálu.The Mpl ligand is preferably recovered from the culture medium as a secreted polypeptide, although it may also be recovered from a host cell lysate when expressed directly without a secretory signal.

Když je mpl ligand exprimován v rekombinantní buňce jiného než lidského původu, je mpl ligand zcela prostý proteinů nebo polypeptidů lidského původu. Avšak je stále nutné purifikovat mpl od dalších rekombinantních buněčných proteinů nebo polypeptidů, aby byl získán preparát, který je substanciálně homogenní na mpl ligand. Jako první krokWhen the mpl ligand is expressed in a non-human recombinant cell, the mpl ligand is completely free of proteins or polypeptides of human origin. However, it is still necessary to purify mpl from other recombinant cell proteins or polypeptides to obtain a preparation that is substantially homogeneous to the mpl ligand. As a first step

134 je kultivační medium nebo lysat centrifugován, aby byly odstraněny rozrušené buňky. Membrána a rozpustné proteinové frakce jsou poté separovány. Eventuálně může být použit komerčně dostupný proteinový koncentrační filtr (např. Amicon nebo Millipore Pellicon ultrafiltrační jednotka). Mpl může být poté purifikován z frakce rozpustných proteinů nebo z membránové frakce lysátů kultury, v závislosti na tom, zda je mpl membránově vázaný. Mpl je poté purifikován od kontaminujících rozpustných proteinů a polyp.eptidů vysolením a výměnnými nebo chromatografickými postupy s použitím různých gelových matric. Tyto matrice zahrnují: akrylamid, agarosu, dextran, celulosu a další obvyklé matrice pro purifikaci proteinů. Příkladem chromatografických postupů vhodných pro purifikaci proteinu jsou: imunoafinitní (např., anti-hmpi ligandová Mab), receptoafinitní (např. mpl-lgG nepro protein A Sepharose), hydrofobní interakční chromatografie (HIC)(např., ether, butyl nebo fenyl Toyopearl), lektinová chromatografie (např., Con Α-Sepharose, lentil-lectin-Sepharose), exkluze podle velikosti (např. Sehadex G-75), kation- a anionvýměnné kolony (např., DEAE nebo karboxymethyl- a sulfopropyl-celulosa), a vysokotlaká kapalinová chromatografie s reversní fází (RP-HPLC) (viz např., Urdal a kol., J. Chromatog., 296: 171 [1984] kde jsou použity dva následné RP-HPLC kroky k purifikace rekombinantního lidského IL-2). Další purifikační kroky nepovinně zahrnují: ethanolovou precipitaci, precipitaci sulfátem amonným, chromatofokusaci, preparativní SDS-PAGE a další.134, the culture medium or lysate is centrifuged to remove disrupted cells. The membrane and soluble protein fractions are then separated. Alternatively, a commercially available protein concentration filter (eg, Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit) may be used. The Mpl may then be purified from the soluble protein fraction or from the membrane fraction of the culture lysates, depending on whether the mpl is membrane bound. The Mpl is then purified from contaminating soluble proteins and polypeptides by salting-out and exchange or chromatographic techniques using various gel matrices. Such matrices include: acrylamide, agarose, dextran, cellulose, and other conventional matrices for protein purification. Examples of chromatographic techniques suitable for protein purification are: immunoaffinity (eg, anti-hmpi ligand Mab), receptoaffinity (eg, mpl-IgG non-protein A Sepharose), hydrophobic interaction chromatography (HIC) (eg, ether, butyl or phenyl Toyopearl) ), lectin chromatography (e.g., Con Α-Sepharose, lentil-lectin-Sepharose), size exclusion (e.g. Sehadex G-75), cation and anion exchange columns (e.g., DEAE or carboxymethyl- and sulfopropyl-cellulose) , and reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC) (see, eg, Urdal et al., J. Chromatog., 296: 171 [1984] where two successive RP-HPLC steps are used to purify recombinant human IL-2. ). Additional purification steps optionally include: ethanol precipitation, ammonium sulfate precipitation, chromatofocusing, preparative SDS-PAGE, and others.

Varianty mpl ligandu, ve kterých byly zbytky podrobeny deleci, insertovány nebo substituovány, a byly navráceny do stejného tvaru jako nativní mpl ligand, se počítá s tím, že variace mohou být příčinou jakékoliv substanciální změny veVariants of the mpl ligand in which the residues have been deleted, inserted or substituted, and returned to the same shape as the native mpl ligand, are contemplated that variations may be the cause of any substantial change in

135 purifikován purifikovaného afinitní mpl-lgG vlastnostech. Např, preparace mpl ligandové fúze s jiným proteinem nebo polypeptidem, např bakteriálním nebo virálním antigenem, usnadňuje purifikaci; k adsorbci fúzního polypeptidu může být použita imunoafinitní kolona obsahující protilátku k antigenu. Imunoafinitní kolony jako je· králičí aňti-mpl kolona mohou být použity k absorbci variant mpl ligandu jejich vazbou na nejméně jeden zbývající imunitní epitop. Eventuálně může být mpl ligand chromatografií s použitím navázaného na (výhodněji) imobilizovanou pryskyřici jako je Affi-Gel 10 (Bio-Rad,135 purified purified affinity mpl-IgG properties. For example, preparation of an mpl ligand fusion with another protein or polypeptide, e.g., a bacterial or viral antigen, facilitates purification; an immunoaffinity column containing an antibody to the antigen may be used to adsorb the fusion polypeptide. Immunoaffinity columns such as rabbit anti-mpl columns can be used to absorb mpl ligand variants by binding them to at least one remaining immune epitope. Alternatively, the mpl ligand may be chromatographed using a (more preferably) immobilized resin such as Affi-Gel 10 (Bio-Rad,

Richmond, CA) nebo jiný, pomocí postupů v dané oblasti dobře známých. Pro inhibici proteolytické degradace během purifikace mohou být také použity proteasové inhibitory jako je fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), a antibiotika mohou být zahrnuta kvůli prevenci růstu doprovodných kontaminací. Osoba vzdělaná v dané problematice bude moci posoudit, zda purifikační metody vhodné pro nativní mpl ligand budou vyžadovat modifikaci a jaký charakter budou mít změny mpl ligandu nebo jeho variant po expresi v rekombinantní buněčné kultuře.Richmond, CA) or others, using procedures well known in the art. Protease inhibitors such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) may also be used to inhibit proteolytic degradation during purification, and antibiotics may be included to prevent the growth of concomitant contaminants. A person skilled in the art will be able to judge whether purification methods suitable for the native mpl ligand will require modification and what character will the changes of the mpl ligand or its variants be expressed upon expression in recombinant cell culture.

H. Kovalentní modifikace mpl ligandového polypeptiduH. Covalent Modification of mpl Ligand Polypeptide

Kovalentní modifikace mpl ligadových polypeptidů jsou zahrnuty v rámci tohoto vynálezu. Nativní mpl ligand i varianty aminokyselinové sekvence mpl ligandu mohou být kovalentně modifikovány. Jedním typem kovalentní modifikace zahrnuté v rámci tohoto vynálezu je mpl ligandový fragment. Variant mpl ligandových fragmentů mající maximálně 40 aminokyselinových zbytků může být obvykle připravena chemickou syntézou nebo enzymatickým nebo chemickým štěpením mpl ligandového polypeptidu plné déky nebo jeho variant. Další typy kovalentních modifikací mpl liganduCovalent modifications of mpl ligand polypeptides are included within the scope of this invention. Both the native mpl ligand and the amino acid sequence variants of the mpl ligand can be covalently modified. One type of covalent modification encompassed by the invention is the mpl ligand fragment. A variant of mpl ligand fragments having a maximum of 40 amino acid residues can usually be prepared by chemical synthesis or by enzymatic or chemical cleavage of the full length mpl ligand polypeptide or variants thereof. Other types of covalent modifications of the mpl ligand

136 nebo jeho fragmentů jsou zavedeny do molekuly reakcí cíleného aminokyselinového zbytku mpl ligandu jebo jeho fragmentu s organických derivatizujícím agens, které je schopné reagovat s vybranou stranou řetězce nebo N- nebo Ckoncových zbytků.136 or fragments thereof are introduced into the molecule by reacting a targeted amino acid residue of the mpl ligand or fragment thereof with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with a selected side of the chain or N- or C-terminal residues.

-Cysteinylové zbytky jsou nejběžněji ponechány reagovat s α-haloacetáty (a odpovídajícími aminy), jako kyselina chloroctová nebo chloracetamid, na vzniku karboxymethyl nebo karboxyamidomethyl derivátů. Cysteinylové zbytky jsou také derivatizovány reakcí s bromtrifluoroacetonem, a-bromβ-(5-imidozoyl)propionovou kyselinou, chloracetylfosfátem, N-alkylmaleinimidy, 3-nitro-2-pyridyldisuldidem, methyl 2pyridyldisulfidem, p-chlormerkuribenzoátem, 2-chlormerkuri4-nitrofenolem a chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazolem.-Cysteinyl residues are most commonly reacted with α-haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to form carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. Cysteinyl residues are also derivatized by reaction with bromotrifluoroacetone, α-bromo- (5-imidozoyl) propionic acid, chloroacetylphosphate, N-alkylmaleinimides, 3-nitro-2-pyridyldisuldide, methyl 2-pyridyl disulfide, p-chlorometuribibenzoate, 4-chlorometuribenzoate, 2-chloro-chlorofibenzoate, 2-chloro 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.

Hystidylové zbytky jsou derivatizovány reakcí s diethylpyrokarobonátem při pH 5,5-7,0 protože toto agens je relativně specifické pro hystidylový postranní řetězec. Lze použít také bromfenacylbromid, reakce je výhodněji provedena v O,1M kakodylátu sodném při pH 6,0.Hystidyl residues are derivatized by reaction with diethylpyrocarbonate at pH 5.5-7.0 because this agent is relatively specific for the hystidyl side chain. Bromophenacyl bromide can also be used, the reaction is more preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0.

Lysinylové a amino koncové zbytky reagují s sukcinickými nebo karboxylickými kyselými anhydridy. Derivatizace těmito agens mají efekt převrácení náboje lysinylových zbytků. Dalšími vhodnými reagenty pro derivatizaci zbytků obsahujících amin jsou imidoestery jako je methylpikolinimidát, piridoxafosfát, piridoxai, chlorborohydrid, trinitrobenzensulfonová kyselina, 0methylismočovina, 2,4-pentandion a transminasou katalysovaná reakce s glyoxylátem.Lysinyl and amino terminal residues react with succinic or carboxylic acid anhydrides. Derivatization with these agents has the effect of reversing the charge of the lysinyl residues. Other suitable reagents for derivatizing amine-containing moieties are imidoesters such as methyl picolinimidate, piridoxaphosphate, piridoxai, chloroborohydride, trinitrobenzenesulfonic acid, methylmethylurea, 2,4-pentanedione and a transminase catalyzed reaction with glyoxylate.

Arginylové zbytky jsou modifikovány reakcí s jedném nebo několika obvyklými reagenty, jsou to fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin. Derivatizace argininových zbytků vyžaduje, aby reakce byla provedena zaArginyl residues are modified by reaction with one or more conventional reagents, such as phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. Derivatization of the arginine residues requires that the reaction be carried out at

137 alkalických podmínek kvůli vysoké pK_a guanidinové funkční skupiny. Dále tyto reagens mohou reagovat se skupinami lysinu stejně dobře jako argininovou epsilon-amino skupinou.137 alkaline conditions due to high pK _and guanidine functionality. Furthermore, these reagents can react with the lysine groups as well as the arginine epsilon-amino group.

Specifická modifikace tyrosilových zbytků může být provedena se zvláštní pozorností k zavedení spektrálních značek do tyrosylových zbytků reakcí s aromatickými diazoniovými sloučeninami nebo tetraaminomethanem. Nejčastěji je používán N-acetylimidizol a tetranitromethan za vzniku O-acetyltyrosylových druhů a 3-nitroderivátů, respektive. Tyrosilové zbytky jsou iodovány s použitím ¹²⁵I nebo ¹³¹I za vzniku značených proteinů pro použití při radioimunostanovení, vhodná chloramin T metoda je popsána výše.Specific modification of tyrosil residues can be performed with particular attention to the introduction of spectral labels into tyrosyl residues by reaction with aromatic diazonium compounds or tetraaminomethane. Most commonly, N-acetylimidizole and tetranitromethane are used to form O-acetyltyrosyl species and 3-nitroderivatives, respectively. Tyrosil residues are iodinated using ¹²⁵ L or ¹³¹ L to produce labeled proteins for use in radioimmunoassays, a suitable chloramine T method as described above.

Karboxylové postranní skupiny (aspartyl nebo glutamyl) jsou selektivně modifikovány reakcí s karbodiimidy (R-N=C=N-R'), kde R a R' jsou různé alkylové skupiny, jako je l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-4-ethyl)karbodiimid nebo 1ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)karbodiimid. Dále aspartylové a glutamylové zbytky jsou převedeny na asparaginylové a glutaminylové zbytky reakcí s amomiovými ionty.Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by reaction with carbodiimides (RN = C = N-R '), where R and R' are various alkyl groups such as 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl-4- ethyl) carbodiimide or 1-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide. Further, aspartyl and glutamyl residues are converted to asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with amomium ions.

Derivatizace s bifunkčními agens je použitelná pro křížovou vazbu mpl ligandu na ve vodě nerozpustnou pomocnou matrix nebo povrch pro použití v metodách pro purifikaci anti-mpl protilátek, a naopak. Obvykle používané křížově vazebné agens zahrnují, např., 1,1-bis(diazoacetyl)-2fenylethan, glutaraldehyd, N-hydroxysukcinimidové estery, např., estery s kyselinovou 4-azidosalicylovou, homobifunkční imidoestery, včetně disukcimidylových esterů jako je 3,3'-dithiobis(sukcinimidylpropionát), a bifunkční maleimidy jako je bis-N-maleimido-1,8-oktan. DerivatizačníDerivatization with bifunctional agents is useful for cross-linking an mpl ligand to a water-insoluble auxiliary matrix or surface for use in methods for purifying anti-mpl antibodies, and vice versa. Commonly used cross-linking agents include, eg, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, eg, esters with 4-azidosalicylic acid, homobifunctional imidoesters, including disuccididyl esters such as 3,3 ' dithiobis (succinimidyl propionate), and bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-octane. Derivatization

138 agens jako je methyl-3-[(p-azidofenyl)dithio]propioimidát poskytují fotoaktivovatelné meziprodukty, které jsou přítomnosti světla, imobilizaci použity matrice jako je schopny vzniku křížové vazby v Eventuelně jsou pro proteinovou reaktivní ve vodě nerozpustné kyartogenbromidem-aktivované uhlovodíky a reaktivní substráty popsané v U.S. Patentech č. 3,969287; 3,691,016, 4,195,128; 4,229,537; a 4,330,440.138 agents such as methyl 3 - [(p-azidophenyl) dithio] propioimidate provide photoactivatable intermediates that are in the presence of light, immobilization used matrices such as capable of crosslinking. Alternatively, protein-reactive water-insoluble cyartogen bromide-activated hydrocarbons and reactive substrates described in US U.S. Patent Nos. 3,969287; 3,691,016, 4,195,128; 4,229,537; and 4,330,440.

Glutaminylové a asparaginylové zbytky jsou často deaminovány na odpovídající glutamylový a aspartylový zbytek, respektive. Tyto zbytky jsou deaminovány za neutrálních nebo basických podmínek. Deaminované formy těchto zbytků spadají do rámce vynálezu.Glutaminyl and asparaginyl residues are often deaminated to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively. These residues are deaminated under neutral or basic conditions. Deaminated forms of these residues are within the scope of the invention.

Další modifikace zahrnují hydroxylací prolinu a lysinu, fosforylaci hydroxylových skupin serylových nebo threonylových zbytků, methylaci α-amino skupin lysinových, argininových a histidinových postranních řetězců (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Col, San Francisco, str. 79-86 [1983]), acetylaci N-koncového aminu a amidaci jakékoliv C-koncové karboxylové skupiny.Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of α-amino groups of lysine, arginine and histidine side chains (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Col, San Francisco, p. 79). -86 [1983]), acetylation of the N-terminal amine and amidation of any C-terminal carboxyl group.

Další typ kovalentní modifikace mpl ligandového polypeptidu zahrnutý v rámci tohoto vynálezu obsahuje změny nativního glykosylovaného modelu polypeptidu. Změnami jsou míněny delece jedné nebo více uhlovodíkových skupin, nalézajících se v nativním mpl ligandu, a/nebo přidání jednoho nebo více glykosylačních míst, které nejsou přítomny v nativním mpl ligandu.Another type of covalent modification of the mpl ligand polypeptide encompassed within the scope of this invention comprises changes in the native glycosylated polypeptide model. By alteration is meant deletions of one or more hydrocarbon groups found in the native mpl ligand and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the native mpl ligand.

Glykosylace polypeptidů je obvykle buď N-vazebná nebo O-vazebná. N-vazebná se týká vazby uhlohydrátové skupiny na postranní řetězec asparaginového zbytku. Tripeptidová sekvence asparagin-X-serin a asparagin-X-threonin, kde X jeGlycosylation of polypeptides is usually either N-linked or O-linked. N-Binding refers to the binding of a carbohydrate moiety to the side chain of an asparagine residue. The tripeptide sequence asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, wherein X is

139 jakákoliv aminokyselina kromě prolinu, jsou rozpoznávacími sekvencemi pro enzymatickou vazbu uhlohydrátové skupiny na asparginový postranní řetězec. Tedy přítomnost jedné z těchto tripeptidových sekvencí v polypeptidů tvoří potenciální glykosylační místo. O-vazebná glykosylace se týká vazby jednoho z cukrů N-acetylgalaktrosaminu, galaktosy nebo xyloxy na hydroxyamino kyselinu, nej častěji serin nebo threonin, ačkoliv může být použit i 5hydroxyprolin nebo 5-hydroxylysin..139 any amino acid except proline are the recognition sequences for the enzymatic binding of the carbohydrate moiety to the aspargine side chain. Thus, the presence of one of these tripeptide sequences in the polypeptides forms a potential glycosylation site. O-linked glycosylation refers to the binding of one of the sugars N-acetylgalactosamine, galactose or xyloxy to a hydroxyamino acid, most commonly serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine may also be used.

Přidání glykosylačních míst oproti mpl ligandovému polypeptidů je obvykle provedeno změnou aminokyselinové sekvence tak, že obsahuje jeden nebo více výše popsaných tripeptidových sekvencí (pro N-vazebná glykosylační místa). Změny mohou také být provedeny přidáním nebo substitucí jednoho nebo více serinových nebo threoninových zbytků oproti nativní mpl ligandové sekvenci (pro O-vazebná glykosylační místa). Pro usnadnění je mpl ligandová aminokyselinová sekvence výhodněji změněna během změn na úrovni DNA, nepovinně mutací DNA kódující mpl ligandový polypeptid za předvolené base, takže kodóny jsou generovány tak, že budou translatovat do požadovaných aminokyselin. DNA mutace může být provedena metodami popsanými výše pod nadpisem „Varianty aminokyselinové sekvence mpl ligandu.Addition of glycosylation sites over mpl ligand polypeptides is usually accomplished by altering the amino acid sequence to include one or more of the tripeptide sequences described above (for N-linked glycosylation sites). Changes may also be made by adding or substituting one or more serine or threonine residues over the native mpl ligand sequence (for O-linked glycosylation sites). For convenience, the mpl ligand amino acid sequence is more preferably altered during DNA-level changes, optionally by mutating the DNA encoding the mpl ligand polypeptide to the preset bases, so that the codons are generated to translate into the desired amino acids. The DNA mutation can be performed by the methods described above under the heading "Amino acid sequence variants of the mpl ligand."

Dalšími způsoby zvýšení početu uhlohydrátových skupin v mpl ligandu je chemická nebo enzymatická vazba glykosidů na polypeptid. Tyto postupy jsou vhodné pokud není požadována produkce polypeptidů v hostitelské buňce, která má glykosylační schopnost pro N- nebo O-vazebnou glykosylaci. V závislosti na použité vazebné technice, mohou být cukry navázány na (a) arginin a histidin, (b) volné karboxylové skupiny, (c) volné sulhydrylové skupiny jako jsou u cysteinu, (d) volné hydroxylové skupiny jakoAnother way to increase the number of carbohydrate groups in an mpl ligand is to chemically or enzymatically bind glycosides to the polypeptide. These procedures are useful when the production of polypeptides in a host cell that has glycosylation capability for N- or O-binding glycosylation is not desired. Depending on the binding technique used, sugars may be attached to (a) arginine and histidine, (b) free carboxyl groups, (c) free sulhydryl groups such as cysteine, (d) free hydroxyl groups such as

140 jsou u šeřinu, threoninu nebo hydroxyprolinu, (e) aromatické zbytky jsou jsou u fenylalaninu, tyrosinu nebo tryptofanu, nebo (f) amidovou skupinu glutaminu. Tyto metody jsou popsány v WO 87/05330 publikovaném 11. září 1987, a v Aplin a Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 [1981]. '(E) the aromatic residues are for phenylalanine, tyrosine or tryptophan, or (f) the glutamine amide group. These methods are described in WO 87/05330 published September 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Roar. Biochem. 259-306 [1981]. '

Ostranění uhlohydrátových skupin přítomných v mpl ligandovém polypeptidu může být provedeno chemicky nebo enzymaticky. Chemická deglykosylace zahrnuje vystavení polypeptidu působení kyseliny trifluormethansufonové, nebo ekvivalentní sloučeniny. Toto působení způsobí štěpení většiny nebo všech cukrů kromě spojených cukrů (Nacetylglukosamin nebo N-acetylgalaktosamin), zatímco polypeptid zůstane nedotčený. Chemická deglykosylace je popsána v Hakimuddin, a kol., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 [1987] a Edge a kol., Anal. Biochem., 118: 131 [1981]. Enzymatické štěpení uhlohydrátových skupin na polypeptidu může být provedeno různými endo- a exo-glykosidasami jak je popsáno v Thotakura a kol., Meth. Enzymol., 138: 350 [1987] .Removal of carbohydrate moieties present in the mpl ligand polypeptide can be accomplished chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation involves exposing the polypeptide to trifluoromethanesulfonic acid, or an equivalent compound. This action causes the cleavage of most or all of the sugars except the associated sugars (Nacetylglucosamine or N-acetylgalactosamine), while the polypeptide remains intact. Chemical deglycosylation is described in Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 [1987] and Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 [1981]. Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on a polypeptide can be accomplished by various endo- and exo-glycosidases as described by Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 [1987].

Glykosylaci potenciálních glykosylačních míst může být zabráněno použitím sloučeniny tunicamycinu jak je popsáno v Duskin a kol., J. Biol., Chem., 257: 3105 [1982]. Tunicamycin blokuje vznik vazeb protein-N-glykosid.Glycosylation of potential glycosylation sites can be prevented using the tunicamycin compound as described in Duskin et al., J. Biol., Chem., 257: 3105 [1982]. Tunicamycin blocks protein-N-glycoside binding.

Další typ kovalentní modifikace mpl ligandu zahrnuje vazbu mpl ligandového polypeptidu na jeden z různých neproteinových polymerů, např., polyethylenglykol, polypropylenglykol, nebo polyoxyalkyleny, způsobem který je uveden v U.S. Patentech č. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 nebo 4,179,337. Mpl ligandové polypeptidy navázané na předcházející polymery jsou zde označeny jako pegylované mpl ligandové polypeptidy.Another type of covalent modification of the mpl ligand involves binding the mpl ligand polypeptide to one of a variety of non-proteinaceous polymers, e.g., polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes, as disclosed in U.S. Pat. U.S. Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337. Mpl ligand polypeptides bound to the preceding polymers are referred to herein as pegylated mpl ligand polypeptides.

141141

Bude posouzeno jaký screening získaných mpl ligandových variant bude třeba k výběru optimálních variant pro vazbu na mpl za zachování imunologické a/nebo biologické aktivity definové výše. Je možné testovat stabilitu v rekombinantní buněčné kultuře nebo v plasmě (např., po protěolytickému štěpení), stupeň afinity k mpl členům, oxidativní stabilitu, schopnost být vylučován s vysokým výtěžkem, atd. Např., změna v imunologickém charakteru mpl ligandového polypeptidu, jako je afinita pro danou protilátku, je měřitelná imunostanovením kompetitivního typu. Další potenciální modifikace proteinových nebo polypeptidových vlatností jako redoxní nebo tepelná stabilita, hydrofobicita, nebo citlivost k proteolytické degradaci jsou stanovitelné metodami v oboru dobře známými.It will be appreciated what screening of the obtained mpl ligand variants will be required to select optimal variants for binding to mpl while maintaining the immunological and / or biological activity defined above. It is possible to test stability in recombinant cell culture or in plasma (e.g., after proteasolytic cleavage), the degree of affinity for mpl members, oxidative stability, the ability to be secreted in high yield, etc. For example, a change in the immunological character of mpl ligand polypeptide, such as is the affinity for a given antibody, it is measurable by a competitive type immunoassay. Other potential modifications of protein or polypeptide properties such as redox or thermal stability, hydrophobicity, or susceptibility to proteolytic degradation are determined by methods well known in the art.

17. Obecné metody přípravy protilátek k mpl ligandu17. General methods for preparing antibodies to the mpl ligand

Příprava protilátek (i) Polyklonální protilátkyPreparation of Antibodies (i) Polyclonal Antibodies

Polyklonální protilátky k mpl ligandovým polypeptidům nebo fragmentům jsou obecně produkovány ve zvířatech vícenásobnými subkutánními (sc) nebo intraperitoneálními (ip) injekcemi mpl ligandu a adjuvans. Může se použít ke konjugaci mpl ligandu nebo fragmentů obsahujících cílovou aminokyselinovou sekvenci na protein, který je imunogenický v druhu, kde má být imunizován, např. hemocyanin z přílepky (keyhole limpet hemocyanin), sérový albumin, hovězí thyroglobulin nebo trypsinový inhibitor ze sojových bobů používající bifunkční nebo derivatizující agens, např. maleimidobenzoylsulfosukcinimidester (konjugace přes cysteinový zbytek), N-hydroxysukcinimid (přes lysinovéPolyclonal antibodies to mpl ligand polypeptides or fragments are generally produced in animals by multiple subcutaneous (sc) or intraperitoneal (ip) injections of mpl ligand and adjuvant. It can be used to conjugate mpl ligand or fragments containing the target amino acid sequence to a protein that is immunogenic in the species to be immunized, eg keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin or soybean trypsin inhibitor using bifunctional or derivatizing agents, eg maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester (conjugation via cysteine residue), N-hydroxysuccinimide (via lysine)

142 zbytky), glytaraldehyd, sukcinanhydrid, SOCI2 nebo R¹N=C=NR, kde R a R¹ jsou různé alkylové skupiny.142 residues), glytaraldehyde, succinic anhydride, SOCl 2 or R ¹ N = C = NR, where R and R ¹ are different alkyl groups.

Zvířata jsou imunizována proti mpl ligandovému polypeptidu nebo fragmentu, imunogenním konjugátům nebo derivátům kombinací 1 mg 1 gg peptidů nebo konjugátu (pro králíky nebo myši, respektive) s 3 objemy Freundova kompletního adjuvans a intradermáně injektována roztokem na mnoha místech. 0 měsíc později jsou zvířata povzbuzena 1/5 až 1/10 původního množství peptidů nebo konjugátu v Freundově kompletním adjuvans subkutánní injekcí na mnoha místech. 0 sedm až čtrnáct dní později je zvířatům odebrána krev a v séru je stanoven titr mpl ligandových protilátek. Zvířata jsou povzbuzována dokud se titr neustálí. Výhodněji zvířata jsou povzbuzována konjugátem se stejným mpl ligandem, ale konjugovaným s jiným proteinem a/nebo přes jiný křížově reagující reagent. Konjugáty mohou být také připraveny v rekombinantní buněčné kultuře jako proteinové fúze. Pro zvýšení imunitní odpovědi jsou také použity agregační agens jako ledek.Animals are immunized against the mpl ligand polypeptide or fragment, immunogenic conjugates or derivatives by combining 1 mg of 1 gg of peptide or conjugate (for rabbits or mice, respectively) with 3 volumes of Freund's complete adjuvant and injected intradermally with solution at many sites. One month later, animals are stimulated with 1/5 to 1/10 of the original amount of peptide or conjugate in Freund's complete adjuvant by subcutaneous injection at many sites. Seven to fourteen days later the animals are bled and the mpl titer of the ligand antibodies is determined in serum. Animals are encouraged until the titer stabilizes. More preferably, the animals are stimulated with a conjugate with the same mpl ligand but conjugated to another protein and / or through another cross-reacting reagent. Conjugates can also be prepared in recombinant cell culture as protein fusions. Aggregation agents such as saltpeter are also used to enhance the immune response.

(ii) Monoklonální protilátky(ii) Monoclonal antibodies

Monoklonální protilátky jsou získány z populace substanciálně homogenních protilátek, tj., individuální protilátky obsažené v populaci jsou identické kromě možných přirozeně se vyskytujících mutací, které mohou být přítomny v menšinovém množství. Tedy slovo „monoklonální označující charakter protilátky znamená, že protilátka není směsí samostatných protilátek.Monoclonal antibodies are obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies contained in the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. Thus, the word "monoclonal indicating the nature of the antibody" means that the antibody is not a mixture of separate antibodies.

Např. mpl ligandové monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu mohou být připraveny použitím hybridomové metody poprvé popsané v Kohle & Milstein, Nátuře, 256: 495 [1975], nebo mohou být připraveny rekombinantními DNA metodami (U.S. Patent č. 4,816,567 [Cabily a kol.]).E.g. The mpl ligand monoclonal antibodies of the invention may be prepared using the hybridoma method first described in Kohle & Milstein, Nature, 256: 495 [1975], or may be prepared by recombinant DNA methods (U.S. Patent No. 4,816,567 [Cabily et al.]).

143143

V hybridomové metodě je myš nebo jiné vhodné hostitelské zvíře, jako je křeček, imunizováno jak je popsáno výše, aby byly vyvolány lymfocyty, které produkují nebo jsou schopné produkovat protilátky, které se budou na protein použitý pro imunizaci, lymfocyty imunizovány specifickyIn the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal, such as a hamster, is immunized as described above to induce lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that will be immunized specifically to the protein used for immunization, lymphocytes

Eventuelně vázat mohou být in vitro.Alternatively, they may bind in vitro.

Lymfocyty poté fúzují s myelomovými buňkami za použití vhodného fúzního agens, vzniku hybridomové buňky Principles and Practise, 1986] ) .The lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusion agent to form a hybridoma cell (Principles and Practice, 1986).

jako je polyethylenglykol, za (Goding, Monoklonal Antigodie: str. 59-103 [Academie Press,such as polyethylene glycol, for (Goding, Monoclonal Antigodia: pp. 59-103 [Academic Press,

Hybridomové buňky takto připravené jsou pěstovány ve vhodném kultivačním médiu, které výhodněji obsahuje jednu nebo více látek, které inhibují růst nebo přežití nefúzovaných, parentálních myelomových buněk. Např. pokud parentální myelomové buňky postrádají enzym hypoxanthinguaninfosforybosyltransferasu (HGPRT nebo HPRT), kultivační médium pro hybridomy obvykle bude zahrnovat hypoxantin, aminopterin a thymidin (HAT medium), které substančně zabraňují růstu HGPRT-deficientních buněk.The hybridoma cells thus prepared are grown in a suitable culture medium, which preferably comprises one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused, parental myeloma cells. E.g. if the parent myeloma cells lack the enzyme hypoxanthinguanine phosphorylbosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma culture medium will usually include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium), which substantially prevent the growth of HGPRT-deficient cells.

Preferované myelomové buňky jsou takové, které fúzují snadno, podporují stabilně vysokou úroveň exprese protilátky selekcí protilátku-produkujících buněk, a jsou sensitivní na medium jako je HAT medium. Mezi tyto preferované myelomové buněčné linie patří myší myelomové linie, které jsou odvozeny z MOPC-21 a MPC-11 myších tumorů získané z Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, a SP-2 buňky získané z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Produkce lidských monoklonálních protilátek byla popsána i pro lidské myelomové a myší-lidské hetero-lidské buněčné linie (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Brodeur a kol.,Preferred myeloma cells are those that fuse readily, support a stable high level of antibody expression by selecting antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. Preferred myeloma cell lines include mouse myeloma lines that are derived from MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors obtained from the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, and SP-2 cells obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. The production of human monoclonal antibodies has also been described for human myeloma and mouse-human hetero-human cell lines (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Brodeur et al.,

144144

Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63, Marcel Dekker, lne., New York, 1987).Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Kultivační médium, ve kterém jsou buňky pěstovány, je stanoveno na produkci monoklonálních protilátek směrovaných proti mpl ligandu. Výhodněji je vazebná specifita monoklonálních ' protilátek produkovaných hybridomovými buňkami stanovena imunoprecipitací nebo in vitro vazebným stanovením, jako je radioimunostanovení (RIA) nebo enzymlinked imunoabsorbční stanovení (ELISA).The culture medium in which the cells are grown is determined to produce monoclonal antibodies directed against the mpl ligand. More preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay, such as a radioimmunoassay (RIA) or an enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA).

Vazebná afinita monoklonální protilátky může být, např., stanovena Scatchardovou analýzou podle Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 [1980].The binding affinity of the monoclonal antibody can, for example, be determined by Scatchard analysis according to Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 [1980].

Po zjištění, zda hybridomové buňky produkují protilátky požadované specifity, afinity, a/nebo aktivity, mohou být klony subklonovány postupem limitního ředění a pěstovány standardními metodami (Goding, viz výše). Vhodné kultivační médium pro tyto účely zahrnuje, např. Dulbecco's Modified Eagle's Medium nebo RPMI-1640 medium. Dále mohou být hybridomové buňky pěstovány in vivo jako ascitické tumory.After determining whether hybridoma cells produce antibodies of the desired specificity, affinity, and / or activity, the clones can be subcloned by limiting dilution and grown by standard methods (Goding, supra). Suitable culture media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium or RPMI-1640 medium. Further, hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors.

Monoklonální protilátky vylučované subklony jsou vhodně separovány z kultivačního média, ascitické tekutiny nebo séra běžnými imunoglobulinovými purifikačními postupy, jako jsou, např., protein A-Sepharose, hydroxylapatitová chromatografie, gelová elektroforesa, dialysa nebo afinitní chromatografie.The monoclonal antibodies secreted by the subclones are suitably separated from the culture medium, ascites fluid or serum by conventional immunoglobulin purification procedures such as, e.g., protein A-Sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography.

DNA kódující monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu je snadno izolována a sekvenována s použitím běžných postupů (např. s použitím oligonukleotidových sond, které jsou schopné se specificky vázat na geny kódující těžké a lehké řetězce myších protilátek). Hybridomové buňky podle tohto vynálezu slouží jako preferovaný zdroj takovétoThe DNA encoding the monoclonal antibodies of the invention is readily isolated and sequenced using conventional procedures (eg, using oligonucleotide probes that are capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies). The hybridoma cells of the invention serve as a preferred source of such

145145

DNA. Když je izolována, může být DNA umístěna do expresních vektorů, které jsou poté transfektovány do hostitelských buněk jako jsou opičí COS buňky, buňky vaječníků čínských křečků (CHO), nebo myelomové buňky které jinak neprodukují imunoglobulinovvý protein, aby došlo k syntéze monoklonálních protilátek v rekombinantních hostitelských buňkách. DNA může být také modifikována, např., substitucí kódující sekvence pro těžký a lehký řetězec lidské konstantní domény namísto homologní myší homologní sekvence, (Cabilly a kol., viz výše; Morisson a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 81: 6851 [1984]), nebo kovalentním připojením na celou imuloglobulin kódující sekvenci nebo část kódující sekvence pro non-imunoglobulinový polypeptid.DNA. When isolated, the DNA may be placed into expression vectors which are then transfected into host cells such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that otherwise do not produce immunoglobulin protein to synthesize monoclonal antibodies in recombinant host cells. The DNA may also be modified, e.g., by substituting a human constant domain heavy and light chain coding sequence instead of a homologous murine homology sequence, (Cabilly et al., Supra; Morisson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81 : 6851 [1984]), or by covalent attachment to the entire immunoglobulin coding sequence or a portion of the coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide.

Obvykle jsou takovéto non-imunoglobulinové polypeptidy substituovány pro konstantní domény protilátky podle tohoto vynálezu, nebo jsou substituovány pro variabilní domény jednoho antigen-spojujícího místa majícího specifitu pro mpl ligand a dalšího antigen-spojujícího místa majícího specifitu pro jiný antigen.Typically, such non-immunoglobulin polypeptides are substituted for the constant domains of an antibody of the invention, or are substituted for the variable domains of one antigen-linking site having specificity for mpl ligand and another antigen-linking site having specificity for another antigen.

Chimérické nebo hybridní protilátky také mohou být přripraveny in vitro s použitím postupů známých v systetické proteinové chemii, včetně zde zahrnutých křížově reakčních agens. Např., imunotoxiny mohou být sestrojeny s použitím disulfidové výměnné reakce nebo tvořením trioetherových vazeb. Příkladem vhodného reagens pro tyto účely je iminothiolát a methyl-4-merkaptobutyrimidát.Chimeric or hybrid antibodies can also be prepared in vitro using procedures known in systetic protein chemistry, including cross-reactive agents included herein. For example, immunotoxins can be constructed using a disulfide exchange reaction or by forming trioether bonds. Examples of suitable reagents for this purpose are iminothiolate and methyl 4-mercaptobutyrimidate.

Pro diagnostické aplikace jsou obvykle protilátky podle tohoto vynálezu značeny detekovatelnou skupinou. Detekovatelná skupina může být jakákoliv skupina, která je schopná produkovat, ať přímo nebo nepřímo, detekovatelný signál. Např., detekovatelná skupina může být radioisotop, jako je ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S nebo ¹²⁵I, fluorescenční neboFor diagnostic applications, the antibodies of the invention are typically labeled with a detectable moiety. The detectable moiety may be any moiety that is capable of producing, directly or indirectly, a detectable signal. For example, the detectable moiety may be a radioisotope, such as ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S or ¹²⁵ L, fluorescent or

146 chemiluminiscenční sloučenina, jako je fluoresceinisothiokyanát, rhodamin nebo luciferin; radioaktivní isotopické značky, jako je např. ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C nebo ³H, nebo enzym, jako je alkalická fosfatasa, betagalaktosidasa nebo křenová peroxidasa.146 a chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin; radioactive isotopic labels, such as ¹²⁵ I, ³² P, ¹⁴ C or ³ H, or an enzyme such as alkaline phosphatase, betagalactosidase, or horseradish peroxidase.

“Může být použita jakákoliv v oboru známá metoda pro oddělenou konjugaci protilátky s detekovatelnou skupinou, včetně těch, které jsou popsány v Hunter a kol., Nátuře, 144 : 945 [1962]; David, a kol., Biochemiostry, 13: 1014 [1974]; Pain, a kol., J. Immunol. Meth., 40: 219 [1981]; a Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 [1982].Any method known in the art for separately conjugating an antibody to a detectable moiety, including those described in Hunter et al., Nature, 144: 945 [1962]; David, et al., Biochemiostry, 13: 1014 [1974]; Pain, et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 [1981]; and Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 [1982].

Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity v jakémkoliv známém stanovení, jako je kompetitivní vazebné stanovení, přímé a nepřímé sendvičové stanovení a imunoprecipitační stanovení. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manul of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, lne., 1987).The antibodies of the present invention can be used in any known assay, such as a competitive binding assay, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manul of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Kompetitivní vazebné stanovení je založeno na schopnosti značeného standardu (kterým může být mpl ligand nebo jeho imunologicky reaktivní část) soutěžit s testovaným vzorkem analytu (mpl ligand) o vazbu s limitovaným množstvím protilátky. Množství mpl ligandu v testovaném vzorku je inversně proporcionální množství standardu, který se navázal na protilátky. K usnadnění stanovení množství standardu, který se navázal, jsou protilátky obvykle insolubilizovány před nebo po kompetici, takže standard a analyt, které jsou vázány na protilátky, mohou být obvykle separovány od standardu a analytu, který zůstal nenavázán.The competitive binding assay is based on the ability of a labeled standard (which may be an mpl ligand or an immunologically reactive portion thereof) to compete with a test sample of the analyte (mpl ligand) for binding with a limited amount of antibody. The amount of mpl ligand in the test sample is inversely proportional to the amount of standard that bound to the antibodies. To facilitate the determination of the amount of standard that has bound, the antibodies are usually insolubilized before or after competition so that the standard and the analyte that are bound to the antibodies can usually be separated from the standard and the analyte that remains unbound.

Sendvičové stanovení zahrnuje použití dvou protilátek, každá je schopná vázat různou imunogenní část nebo epitop proteinu (mpl ligandu) který má být stanoven. V sendvičovém stanovení je testovaný vzorek anylytu vázán prvníThe sandwich assay involves the use of two antibodies, each capable of binding a different immunogenic portion or epitope of the protein (mpl ligand) to be assayed. In a sandwich assay, the test sample is bound first

147 sendvičové stanovení). stanovení je ELISA protilátkou, která je imobilizována na pevný nosič, a poté je na analyt navázána druhá protilátka, která tvoří nerozpustný třísložkový komplex. David & Greene, U.S. Patent č. 4,376,110. Druná protilátka může být značená detekovatelnou skupinou (přímá sendvičová analýza) nebo může být měřena pomocí anti-imunoglobulinové protilátky, která je značena detekovatelnou skupinou (nepřímé Např., jedním typem sendvičového stanovení, v tom případě je detekovatelnou skupinou enzym (např. křenová peroxidasa).(Sandwich determination). the assay is an ELISA antibody that is immobilized on a solid support, and then the second antibody, which forms an insoluble ternary complex, is bound to the analyte. David & Greene, U.S. Pat. U.S. Patent No. 4,376,110. A drunk antibody can be labeled with a detectable moiety (direct sandwich analysis) or can be measured with an anti-immunoglobulin antibody that is labeled with a detectable moiety (indirect, eg, one type of sandwich assay, in which case the detectable moiety is an enzyme (e.g. .

(iii) Humanizované a lidské protilátky(iii) Humanized and human antibodies

Postupy pro humanizaci non-humánních protilátek jsou v oboru dobře známy. Obecně, humanizované protilátky mají v sobě zaveden jeden nebo více aminokyselinových zbytků ze zdroje, který je non-humánní. Tyto non-humánní aminokyselinové zbytky jsou často označeny jako „importované zbytky, které jsou obvykle vzaty z „importních variabilních domén. Humanizace může být v podstatě provedena následující metodou podle Wintera a spolupracovníků (Jones a kol., Nátuře, 321: 522-525 {1986]; Riechmann a kol., Nátuře, 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen a kol., Science, 239: 1534-1536 [1988]), substitucí hlodavcích CDRs nebo CDR sekvencí za odpovídající sekvence lidské protilátky. Takto „humanizované protilátky jsou chimérické protilátky (Cabilly a kol., viz výše), kde substanciálně méně než celá lidská variabilní doména je substituována odpovídající sekvencí z non-humánního druhu. Prakticky, humanizované protilátky jsou obvykle lidské protilátky, ve který jsou některé CDR zbytky a možno některé FR zbytky substituovány zbytky z analogických míst z hlodavcích protilátek.Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, humanized antibodies have one or more amino acid residues introduced therein from a source that is non-human. These non-human amino acid residues are often referred to as "import residues, which are usually taken from" import variable domains. Humanization can essentially be accomplished by the following method of Winter et al. (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen et al. Science, 239: 1534-1536 [1988]), by substituting rodent CDRs or CDR sequences for the corresponding human antibody sequences. Thus, humanized antibodies are chimeric antibodies (Cabilly et al., Supra), wherein substantially less than the entire human variable domain is substituted with the corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are usually human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are substituted with residues from analogous sites from rodent antibodies.

148148

Volba lidské variabilní domény, lehké i těžké, která bude použita při přípravě humanizované protilátky, je velmi důležitá, aby byla redukována antigenicita. V souladu s takzvanou „best-fit metodou je prováděn screening sekvence variabilní domény hlodavci protilátky proti celé knihovně známých sekvencí lidských variabilních domén. Lidská sekvence, která je nejbližší hlodavčí sekvenci, je přijatelná jako rámec (FR) pro humanizovanou protilátku (Sims a kol., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chothia a Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 [1987]). Další metoda užívá speciální rámec odvozený od shodné sekvence všech lidských protilátek speciální podskupiny lehkých nebo těžkých řetězců. Stejná kostra může být použita pro několik různých humanizovaných protilátek (Carter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta a kol., J. Immnol., 151: 2623 [1993]).The choice of a human variable domain, both light and heavy, to be used in the preparation of a humanized antibody is very important in order to reduce antigenicity. In accordance with the so-called "best-fit method", the rodent antibody variable domain sequence is screened against the entire library of known human variable domain sequences. The human sequence, which is the closest rodent sequence, is acceptable as a framework (FR) for a humanized antibody (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 [1987]). Another method uses a special framework derived from the consensus sequence of all human antibodies of a special subgroup of light or heavy chains. The same backbone can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 [1993]) .

Dále je významné, že protilátky jsou humanizovány se zachováním vysoké afinity k antigenu a dalších prospěšných biologických vlastností. K dosažení tohoto cíle, v souladu s preferovanými metodami, jsou humanizované protilátky připraveny metodou analýzy parenterálních sekvencí a různých koncepčních humanizovaných produktů s použitím třírozměrných modelů parenterálních a humanizovaných sekvencí. Třírozměrné imunoglobulinové modely jsou běžně dostupné a jsou známé osobám vzdělaným v oboru. Jsou dostupné počítačové programy, které vysvětlují a zobrazují možné třírozměrné konformační struktury vybraných kandidátů imunoglobulinových sekvencí. Prohlídka těchto zobrazení umožňuje analýzu pravděpodobné úlohy zbytků ve fungování potenciální imunoglobulinové sekvence, t j. analýzu zbytků, které ovlivňují schopnost potenciálního imunoglobulinu vázat jeho antigen. Tímto způsobem mohou být vybrány FRIt is further important that antibodies are humanized while maintaining high affinity for the antigen and other beneficial biological properties. To achieve this goal, in accordance with preferred methods, humanized antibodies are prepared by a method of parenteral sequence analysis and various conceptual humanized products using three-dimensional models of parenteral and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are commonly available and are known to those skilled in the art. Computer programs are available that explain and display possible three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Inspection of these displays allows analysis of the likely role of the residues in the functioning of the potential immunoglobulin sequence, i.e., the analysis of residues that affect the ability of the potential immunoglobulin to bind its antigen. In this way, FRs can be selected

149 zbytky a kombinovány ze shodných a importních sekvencí aby byla získána požadovaná charakteristika, jako je zvýšená afinita pro cílový antigen (antigeny). Obecně, CDR zbytky jsou přímo a většinou substanciálně zahrnuty do ovlivnění vazby antigenu.. Další detaily viz U.S. aplikace sér. č. 07/934,373 registrovaná 21. srpna 1992, která je částečným pokračováním aplikace sér. č. 07/715,272 registrované 14. července 1991.149 residues and combined from identical and import sequences to obtain the desired characteristics, such as increased affinity for the target antigen (s). In general, CDR residues are directly and mostly substantially involved in influencing antigen binding. application of sera. No. 07 / 934,373, filed Aug. 21, 1992, which is a partial continuation of the administration of sera. No. 07 / 715,272, filed July 14, 1991.

Eventuálně je nyní možné připravit transgenní zvířata (např. myši), která jsou schopná, po imunizaci, produkovat celou škálu lidských protilátek bez přítomnosti endogenní imunoglobulinové produkce. Např., bylo popsáno, že homozygní delece genu napojovací oblasti (J_H) těžkého řetězce protilátky v chimérické a zárodečné linii mutantních myší vede k celkové inhibici endogenní produkce protilátek. Přenesení seskupení lidského genu imunoglobulinové zárodečné linie do mutantní zárodečné linie takovýchto myší bude vést k produkci lidských protilátek s vyloučením protilátky. Viz, např., Jakobovits a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255 [1993]; Jakobovits a kol., Nátuře, 362: 255-258 [1993]; Bruggermann a kol., Year in Immuno., 7: 33 [1993]. Lidské protilátky mohou být také produkovány ve fágem představovaných knihovnách (Hoogenboom a Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 [1991]; Marks a kol., J. Mol. Biol. 222, 581 [1991]).Alternatively, it is now possible to prepare transgenic animals (eg, mice) that are capable, upon immunization, of producing a full range of human antibodies in the absence of endogenous immunoglobulin production. For example, it has been reported that homozygous deletion of the antibody heavy chain junction region (J _H ) gene in chimeric and germ-line mutant mice results in overall inhibition of endogenous antibody production. Transferring the human immunoglobulin germline gene assembly to the mutant germline of such mice will result in the production of human antibodies with the exclusion of the antibody. See, eg, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255 [1993]; Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 [1993]; Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 [1993]. Human antibodies can also be produced in phage display libraries (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 [1991]).

(iv) Bispecifické protilátky(iv) Bispecific antibodies

Bispecifické protilátky jsou monoklonální výhodněji lidské nebo humanizované protilátky, která mají vazebnou specifitu pro nejméně dva různé antigeny. Metody pro přípravu bispecifických protilátek jsou v oboru dobře známy.Bispecific antibodies are monoclonal, more preferably, human or humanized antibodies having binding specificity for at least two different antigens. Methods for preparing bispecific antibodies are well known in the art.

150150

Obvykle je rekombinantní produkce bispecifických protilátek založena na koexpresi dvou imunoglobulinových párů těžký řetězec - lehký řetězec, kde mají dva těžké řetězce různé specifity (Millstein a Cuello, Nátuře, 305: 537-539 [1983]). Kvůli náhodnému rozdělení imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců, tyto hybridomy (quadromy) produkují potenciální směs 10 různých protilátkových molekul, z kterých pouze jedna má správnou bispecifickou strukturu. Purifikace správné molekuly, která je obvykle prováděna kroky afinitní chromatografie, jeTypically, recombinant production of bispecific antibodies is based on the coexpression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs, where the two heavy chains have different specificities (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 [1983]). Because of the random distribution of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule, which is usually accomplished by affinity chromatography steps, is

poněkud těžkopádná, a somewhat cumbersome, and výtěžek yield produktu product je Yippee malý. Podobné small. Alike postupy jsou popsány procedures are described v PCT in PCT publikaci publication č. C. WO 93/08829 WO 93/08829 (publikována 13. května (published May 13 1993), 1993), a Traunecker and Traunecker a kol., EMBO, et al., EMBO, 10: 3655-3659 [1991]). V souladu s jinými 10: 3655-3659 [1991]). In line with others a více and more preferovanými preferred postupy, jsou procedures are

protilátkové variabilní domény s požadovanou vazebnou specifitou (kombinujícím místem protilátka-antigen) fúzovány do imunoglobulinové konstantní doménové sekvence. Fúze je výhodnější s těžkým řetězcem konstantní domény imunoglobulinu, obsahujícím nejméně část stěžejního prvku, CH2 nebo CD3 oblasti. Je preferováno, aby první konstantní oblast těžkého řetězce (CH1) obsahovala místo nutné pro vazbu lehkého řetězce, přítomné v nejméně jedné fúzi. DNA kódující fúze imunoglobulinového řetězce a, pokud je třeba, imunoglobulinový lehký řetězec, je vložena do zvláštních expresních vektorů, a je transfektována do vhodného hostitelského organismu. To zajišťuje větší flexibilitu v nastavení vzájemných poměrů tří polypeptidových fragmentů v provedeních pokud jsou použity nestejné poměry tří polypeptidových řetězců použitých při konstrukci zajišťující optimální výtěžky. Je ovšem možné vložit kódující sekvenci pro dva nebo všechny tři polypeptidovéantibody variable domains with the desired binding specificity (antibody-antigen combining site) fused to an immunoglobulin constant domain sequence. Fusion is more preferably with an immunoglobulin constant domain heavy chain comprising at least a portion of a core element, a CH2 or CD3 region. It is preferred that the first heavy chain constant region (CH1) comprises a light chain binding site present in at least one fusion. The DNA encoding the immunoglobulin chain fusions and, if desired, the immunoglobulin light chain is inserted into separate expression vectors, and is transfected into a suitable host organism. This provides greater flexibility in adjusting the relative proportions of the three polypeptide fragments in embodiments when unequal ratios of the three polypeptide chains used in the construction ensuring optimal yields are used. However, it is possible to insert a coding sequence for two or all three polypeptides

151 řetězce do jednoho expresního vektoru, pokud exprese nejméně dvou polypeptidových řetězců ve stejném poměru vede k vysokým výtěžkům nebo pokud poměry nemají zvláštní význam. Je preferováno provedení podle tohoto postupu, bispecifické protilátky jsou složeny z hybridního imunoglobulinového těžkého řetězce s první vazebnou specifitou na jednom rameni, a hybridním imunoglobulinovým párem těžký řetězec - lehký řetězec (poskytujícím druhou vazebnou specifitu) na druhém rameni. Bylo zjištěno, že tato asymetrická struktura usnadňuje separaci požadované bispecifické sloučeniny od nežádoucích kombinací imunoglobulinových řetězců, protože přítomnost imunoglobulinového lehkého řetězce v pouze jedné polovině bispecifické molekuly usnadňuje separaci. Tento postup je popsán v souběžně podané aplikaci sér. č. 07/931,811 registrované 17. srpna 1992.151 chains into a single expression vector if expression of at least two polypeptide chains at the same ratio results in high yields or ratios are of no particular importance. It is preferred that the bispecific antibodies consist of a hybrid immunoglobulin heavy chain with a first binding specificity on one arm, and a hybrid immunoglobulin heavy chain-light chain pair (providing a second binding specificity) on the other arm. This asymmetric structure has been found to facilitate separation of the desired bispecific compound from undesirable combinations of immunoglobulin chains, since the presence of an immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule facilitates separation. This procedure is described in the concomitant administration of sera. No. 07 / 931,811, filed Aug. 17, 1992.

Další detaily přípravy bispecifických protilátek viz, např., Suresh a kol., Methods in Enzymology, 121: 210 [1986].For further details on the preparation of bispecific antibodies, see, eg, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 [1986].

(v) Heterokonjugované protilátky(v) Heteroconjugate antibodies

Heterokonjugované protilátky jsou složeny z dvou kovalentně navázaných protilátek. Takovéto protilátky mohou být, např., použity k zacílení buněk imunitního systému na nežádoucí buňky (U.S. Patent č. 4, 696,980), a pro léčení HIV infekce (PCT publikace č. WO 91/00360 a WO 92/00373; EP 03089). Heterokonjugátové protilátky mohou být připraveny jakýmikoliv běžnými křížově vazebnými metodami. Vhodná křížově vazebná agens jsou v oboru dobře ..známá, a jsou uvedena v U.S. Patentu č. 4,676,980, spolu s množstvím technik křížové vazby.Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently bound antibodies. Such antibodies can, for example, be used to target immune system cells to unwanted cells (US Patent No. 4, 696,980), and to treat HIV infection (PCT Publication Nos. WO 91/00360 and WO 92/00373; EP 03089) . Heteroconjugate antibodies can be prepared by any conventional cross-linking methods. Suitable cross-linking agents are well known in the art and are disclosed in U.S. Pat. No. 4,676,980, along with a number of cross-linking techniques.

152152

IV. Terapeutické použiti megakaryocytopoetického proteinu mpl liganduIV. The therapeutic use of the megakaryocytopoietic protein mpl ligand

Biologicky aktivní mpl ligand mající hematopoetickou efektorou funkci a označený zde jako megakaryocytopoetický nebo trombocytopoetický protein (TPO) může být použit ve sterilním farmaceutickém preparátu nebo prostředku ke stimulaci megakaryocytopoetické nebo trombopoetické aktivity u pacientů trpících trombocytopenií kvůli narušené produkci, sekvestraci, nebo zvýšené destrukci destiček. S trombocytopenií spojená hypoplasie kostní dřeně (např. aplastická anémie po chemoterapii nebo transplantaci kostní dřeně) může být účinně léčena sloučeninami podle tohoto vynálezu, stejně jako onemocnění jako roztroušená intravaskulární koagulace (DIC), imunitní trombocytopenie (včetně HlV-indukovaná ITP a non HlV-indukovaná ITP), chronická idiopatická trombocytopenie, kongenitální trombocytopenie, myelodysplasie a trombotická trombocytopenie. Navíc tyto megakaryocytopoetické proteiny mohou být použity k léčení myeloproliferativních trombocytolických onemocnění stejně jako trombocytosy ze zánětlivých stavů a nedostatku železa.A biologically active mpl ligand having a hematopoietic effector function and referred to herein as a megakaryocytopoietic or thrombocytopoietic protein (TPO) can be used in a sterile pharmaceutical formulation or composition to stimulate megakaryocytopoietic or thrombopoietic activity in patients suffering from thrombocytopenia due to disturbed production, increased sequestration. Thrombocytopenia-associated bone marrow hypoplasia (eg, aplastic anemia following chemotherapy or bone marrow transplantation) can be effectively treated with the compounds of the invention, as well as diseases such as multiple intravascular coagulation (DIC), immune thrombocytopenia (including HIV-induced ITP and non H1V-ITP). induced ITP), chronic idiopathic thrombocytopenia, congenital thrombocytopenia, myelodysplasia, and thrombotic thrombocytopenia. In addition, these megakaryocytopoietic proteins can be used to treat myeloproliferative thrombocytolic diseases as well as thrombocytosis from inflammatory conditions and iron deficiency.

Preferovaná použití megakaryocytopoetického a trombocytopoetického proteinu (TPO) podle tohoto vynálezu je v: myelotoxické chemoterapii k léčení leukémie nebo pevného tumoru, myeloablativní chemoterapie k autologní nebo allogeneické transplantaci kostní dřeně, myelodisplasii, idiopatické aplastické anémii, kongenitální trombocytopenií a imunitní trombocytopenií.Preferred uses of the megakaryocytopoietic and thrombocytopoietic protein (TPO) of the present invention are in: myelotoxic chemotherapy for the treatment of leukemia or solid tumor, myeloablative chemotherapy for autologous or allogeneic bone marrow transplantation, myelodisplasia, idiopathic apocytic anemia and congenital thrombocytopenia.

I další onemocnění jsou s prospěchem léčena megakaryocytopoetickými proteiny podle tohoto vynálezu včetně defektů nebo zničení destiček jako následek účinku léků, jedů nebo aktivace na umělých površích. V těchtoOther diseases are beneficially treated with the megakaryocytopoietic proteins of the invention, including defects or platelet destruction as a result of drug effects, poisons or activation on artificial surfaces. In these

153 případech mohou být tyto sloučeniny použity ke stimulaci „zásoby nových „nezničených destiček. Kompletní seznam použitelných aplikací viz „Dosavadní stav techniky výše, zvláště sekce a)-f), a reference zde citované.153 cases, these compounds can be used to stimulate a "pool of new" undamaged platelets. For a complete list of applicable applications, see "Prior Art above, especially sections a) -f), and references cited therein.

Magakaryopoetické proteiny tohoto vynálezu mohou být použity samostatně nebo v kombinaci s dalšími cytokiny, hematopoetiny, interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami, k léčení výše uvedených onemocnění a stavů. Tedy tyto sloučeniny mohou být použity v kombinaci s dalšími proteiny nebo peptidy, které mají trombopoetickou aktivitu, včetně: G-CSF, LIF, M-CSF, IF-1, IL-3, erythropoetinu (EPO), kit ligandu, IL-6 a IL-11.The magakaryopoietic proteins of the invention may be used alone or in combination with other cytokines, hematopoietins, interleukins, growth factors or antibodies, for the treatment of the above diseases and conditions. Thus, these compounds can be used in combination with other proteins or peptides having thrombopoietic activity, including: G-CSF, LIF, M-CSF, IF-1, IL-3, erythropoietin (EPO), ligand kit, IL-6 and IL-11.

Megakaryocytopoetické proteiny podle tohoto vynálezu jsou připraveny ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem. Tento terapeutický prostředek může být podáván intravenosně nebo přes nos či plíce. Prostředek může být také podáván v případě potřeby parenterálně nebo subkutánně. Pokud je podáván soustavně, terapeutický prostředek by měl být bez pyrogenů a u parenterálně podávaného roztoku je třeba dbát na správné pH, isotonicitu a stabilitu. Tyto podmínky jsou známé každému, kdo je vzdělán v oboru. Krátce, dávkové směsi sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou připraveny pro skladování nebo podávání směsi sloučeniny s požadovaným stupněm čistoty s fyziologicky přijatelným nosičem, excipienty nebo stabilizátory. Tyto materiály jsou netoxické pro příjemce při podávaných dávkách a koncentracích, a zahrnují pufry jako je fosfátový, citrátový, acetátový nebo pufr jiné organické soli, antioxidanty jako je kyselina askorbová, nízkomolekulární (méně než 10 zbytků) peptidy jako je polyarginin, proteiny, jako je sérový albumin, želatina, nebo imunoglobuliny, hydrofilní polymery jako jeThe megakaryocytopoietic proteins of the invention are prepared in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. The therapeutic agent may be administered intravenously or through the nose or lungs. The composition may also be administered parenterally or subcutaneously if desired. When administered consistently, the therapeutic agent should be pyrogen-free and care should be taken to ensure the correct pH, isotonicity and stability of the parenterally administered solution. These conditions are known to anyone skilled in the art. Briefly, dosage mixtures of the compounds of the present invention are prepared for storage or administration of a mixture of a compound of the desired degree of purity with a physiologically acceptable carrier, excipient, or stabilizer. These materials are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations administered, and include buffers such as phosphate, citrate, acetate or other organic salt buffer, antioxidants such as ascorbic acid, low molecular weight (less than 10 residues) peptides such as polyarginine, proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins, hydrophilic polymers such as

154 polyvinylpyrrolidinon; aminokyseliny jako je glycin, kyselina glutamová, kyselina asparagová nebo arginin; monosacharidy, disacharidy a další uhlohydráty včetně celulosy nebo jejích derivátů, glukosy, mannosy nebo destrinů; chelatující činidla jako je EDTA, cukerné alkoholy jako je mannitol nebo sobitol; protionty jako je sodík a/nebo neionické povrchově aktivní látky jako je Tween, Pluronics nebo polyethylenglykol.154 polyvinylpyrrolidinone; amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid, or arginine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including cellulose or its derivatives, glucose, mannose or destrines; chelating agents such as EDTA, sugar alcohols such as mannitol or sobitol; counterions such as sodium and / or nonionic surfactants such as Tween, Pluronics or polyethylene glycol.

0,5 až 500 mg sloučeniny nebo směsi megakaryocytopoetického proteinu ve formě volné kyselé nebo basické formy nebo jako farmaceuticky přijatelná sůl, je smíšeno s fyziologicky přijatelnou přísadou, nosičem, excipientem, pojidlem, konservační látkou, stabilizátorem, aromátem, atd. jak je ve farmacii zvykem. Množství aktivní látky v tomto prostředku je takové, aby bylo získáno vhodné dávkování v požadovaném rozmezí.0.5 to 500 mg of the compound or mixture of megakaryocytopoietic protein in free acid or base form or as a pharmaceutically acceptable salt is mixed with a physiologically acceptable excipient, carrier, excipient, binder, preservative, stabilizer, flavor, etc. as in pharmacy custom. The amount of active ingredient in the composition is such that a suitable dosage will be obtained within the desired range.

Sterilní prostředky pro injekce mohou být upraveny podle běžné farmaceutické praxe. Např. roztok nebo suspense aktivní sloučeniny v nosiči, kterým je voda nebo přirozeně se vyskytující rostlinný olej jako sezamový, arašídový, olej ze semen bavlníku nebo syntetické mastné nosiče jako je ethyl oleát atd. Pufry, konzervační látky, antioxidanty a podobně mohou být přidány podle obvyklé farmaceutické praxe.Sterile injectables may be formulated according to conventional pharmaceutical practice. E.g. a solution or suspension of the active compound in a carrier which is water or a naturally occurring vegetable oil such as sesame, peanut, cottonseed oil or synthetic fatty carriers such as ethyl oleate etc. Buffers, preservatives, antioxidants and the like can be added according to conventional pharmaceutical practice.

Vhodné příklady preparátů se zadržovaným uvolňováním zahrnují semipermeabilní matrice pevných hydrofobních polymerů obsahující polypeptidy, jejichž matrice je tvořena z tvarových částic, např. filmů nebo mikrokapsulí. Příklady matricí se zadržovaným uvolňováním zahrnují polyestery, hydrogely [např. póly(2-hydroxyethylmethakrylát) jak je popsáno v Langer a kol., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167277 [1981] a Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982] neboSuitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing polypeptides, the matrix of which is formed from shaped particles, eg, films or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels [e.g. poly (2-hydroxyethyl methacrylate) as described in Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167277 [1981] and Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982] or

155 póly(vinilalkohol)], polylaktidy (U.S. Patent č. 3,773,919, EP 58,481), kopolymery L-glumamové kyseliny a gamma ethylL-glutamátu (Sidman a kol., biopolymery, 22:547-556 [1983]), nedegradovatelný ethylenvinylacetát (Langer a kol., viz výše), degradabilní kopolymer kyseliny mléčno octové-glykolové jako je Lupron Depot™ (injikovatelné mikrosféry složené z kopolymerů kyseliny mléčno octovéglykolové a leuprolidacetátu) a poly-D-(-)-3hydroxybutyrová kyselina (EP 133,988).155 poles (vinilal alcohol)], polylactides (US Patent No. 3,773,919, EP 58,481), copolymers of L-glumamic acid and gamma ethyl L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), non-degradable ethylene vinyl acetate ( Langer et al., Supra), a degradable lactic acetic-glycolic acid copolymer such as Lupron Depot ™ (injectable microspheres composed of copolymers of lactic acetic glycolic acid and leuprolide acetate) and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid (EP 133,988).

Zatímco polymery jako je ethylen-vinyl acetát a kopolymer kyseliny mléčno octové-glykolové umožňují uvolňovat molekuly přes 100 dní, některé hydrogely uvolňují proteiny po mnohem kratší dobu. Pokud zůstávájí kapsulované proteiny v těle dlouhou dobu, mohou denaturovat nebo se shlukovat následkem vlhkosti při 37°C, což vede ke ztrátě biologické aktivity a možným změnám imunogenicity. Pro protein mohou být navrženy racionální strategie pro stabilizaci proteinu v závislosti na mechanismu. Například pokud je zjištěno, že agregační mechanismus je vznik intermolekulámí S-S vazebné formace přes disulfidovou vzájemnou výměnu, stabilizace může být provedena modifikací sulfhydrylových zbytků, lyofylizací z kyselého roztoku, kontrolou obsahu vlhkosti, použitím vhodných aditiv, a odhalením specifického složení polymeru matrix.While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acetic-glycolic acid copolymers allow release of molecules over 100 days, some hydrogels release proteins for a much shorter time. If capsular proteins remain in the body for a long time, they can denature or clump due to moisture at 37 ° C, resulting in loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Rational strategies for protein stabilization depending on the mechanism can be devised for the protein. For example, if it is found that the aggregation mechanism is the formation of intermolecular S-S bond formation through disulfide interchange, stabilization can be accomplished by modifying sulfhydryl residues, lyophilizing from an acidic solution, controlling moisture content, using suitable additives, and revealing the specific matrix polymer composition.

Megakaryocytopoetické proteinové prostředky se zadržovaným uvolňováním také zahrnují megakaryocytopoetický protein uzavřený liposomech. Liposomy obsahující megakaryocytopoetický protein jsou připraveny metodami známými per se: DE 3,218,121; Epstein a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3600-3692 [1985]; Hwang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 [1980], EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; JaponskáSustained-release megakaryocytopoietic protein compositions also include liposome-sealed megakaryocytopoietic protein. Liposomes containing a megakaryocytopoietic protein are prepared by methods known per se: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3600-3692 [1985]; Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 [1980], EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese

156 patentová aplikace 83-118008; U.S. Patenty č. 4,485,045 a 4,544,545; a EP 102,324. Obvykle jsou liposomy malé (200— 800 Angstromů) unilamelárního typu, kde je lipidový obsah větší než 30% mol. cholesterolu, vybrané míry jsou nastaveny pro optimální megakaryocytopoetickou proteinovou terapii.156 patent application 83-118008; U.S. Pat. U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and EP 102,324. Typically, liposomes are small (200-800 Angstroms) of unilamellar type where the lipid content is greater than 30 mol%. cholesterol, selected rates are adjusted for optimal megakaryocytopoietic protein therapy.

Dávkování bude stanoveno ošetřujícím lékařem s přihlédnutím k různým známým faktorům, které mohou mít vliv na účinek léčiv včetně závažnosti a typu onemocnění, tělesné hmotnosti, pohlaví, diety, doby a typu podávání, dalších léků a dalších závažných klinických faktorů. Obvykle bude denní dávka v rozmezí 0,1-100 gg/kg tělesné váhy. Výhodněji bude dávka v rozmezí 0,1-50 gg/kg/den. Nejvýhodněji bude počáteční dávka v rozmezí 1-5 gg/kg/den. Nepovinně bude dávkování stejné jako u dalších cytokinů, zvláště G-CSF, GM-CSF a EPO. Terapeuticky účinné dávky mohou být stanoveny in vitro i in vivo metodami.The dosage will be determined by the attending physician taking into account various known factors that may affect the effect of the medicines including severity and type of disease, weight, sex, diet, time and type of administration, other drugs and other relevant clinical factors. Usually, the daily dose will be in the range of 0.1-100 gg / kg body weight. More preferably, the dose will be in the range of 0.1-50 gg / kg / day. Most preferably, the initial dose will be in the range of 1-5 gg / kg / day. Optionally, the dosage will be the same as for other cytokines, particularly G-CSF, GM-CSF and EPO. Therapeutically effective dosages can be determined by both in vitro and in vivo methods.

157157

PříkladyExamples

Bez dalšího popisu se předpokládá, že osoba běžně vzdělaná v dané oblasti může, s použitím přecházejícího popisu a ilustrativních příkladů, provést a využít předkládaný vynález v plném rozsahu. Následující pracovní příklady tedy specificky ukazují preferovaná provedení předkládaného vynálezu, a nejsou chápány jako omezující v žádném aspektu oprávnění vynálezu.Without further description, it is believed that one of ordinary skill in the art can, using the foregoing description and illustrative examples, fully practice and utilize the present invention. Thus, the following working examples specifically illustrate preferred embodiments of the present invention, and are not to be construed as limiting in any aspect the entitlement of the invention.

Příklad 1Example 1

Parciální purifikace vepřového mpl liganduPartial purification of porcine mpl ligand

Z normálních nebo aplastických anemických vepřů byla odebrána na destičky chudá plasma. Aplasticita vepřů byla způsobena ozářením 900 cGy celkového tělesného záření s použitím 4mEV linerálního urychlovače. Ozáření vepři dostávali 6-8 dní intramuskulárně injektovaný cefazolin. Následně byl odebrán jejich celkový objem krve za celkové anestesie, heparinizován, a centrifugován při 1800xg 30 min. za vzniku plasmy chudé na destičky. Bylo zjištěno, že megakaryocytová stimulační aktivita měla vrchol 6 dní po ozáření.Poor plasma was collected from normal or aplastic anemic pigs. Pig aplasticity was caused by irradiation of 900 cGy of total body radiation using a 4mEV linear accelerator. Irradiated pigs received intramuscularly injected cefazoline for 6-8 days. Subsequently, their total blood volume was collected under general anesthesia, heparinized, and centrifuged at 1800xg for 30 min. to produce platelet-poor plasma. Megakaryocyte stimulatory activity was found to peak 6 days after irradiation.

Aplastická vepřová plasma získaná z ozářených vepřů byla upravena 4M NaCl a míchána 30 min. při laboratorní teplotě. Výsledné precipitáty byly odděleny centrifugací při 3800 rpm v Sorvall RC3B a supernatant nanesen na Phenyl-Toyopearl kolonu (220 ml) ekvilibrovanou 10 mM NaPO₄ obsahujícím 4M NaCl. Kolona byla promyta tímto pufrem až A280 bylo <0,05 a eluována dH2O. Eluovaný proteinový pík byl naředěn dH2O na konduktivitu 15mS a nanesen na BlueSepharose kolonu ekvilibrovanou (240 ml) PBS. Následně byla kolona promyta, 5 objemy kolony každého, PBS a 10 mM NaPO₄ (pH 7,4) obsahujícího 2M močoviny. Proteiny byly eluovány zAplastic porcine plasma obtained from irradiated pigs was treated with 4M NaCl and stirred for 30 min. at room temperature. The resulting precipitates were collected by centrifugation at 3800 rpm in Sorvall RC3B and the supernatant was loaded onto a Phenyl-Toyopearl column (220 mL) equilibrated with 10 mM NaPO ₄ containing 4M NaCl. The column was washed with this buffer until A280 was <0.05 and eluted with dH2O. The eluted protein peak was diluted with dH2O to a 15mS conductivity and loaded onto a BlueSepharose column equilibrated (240 mL) with PBS. Subsequently, the column was washed, 5 column volumes each, with PBS and 10 mM NaPO ₄ (pH 7.4) containing 2M urea. Proteins were eluted from

158 kolony 10 mM NaPO₄ (pH 7,4) obsahujícím 2M močoviny a 1M NaCl. Eluovaný proteinový pík je upraven na 0,01% oktylglykosid(n-oktyl β-D-glukopiranosidu) a lmM každého z EDTA a Pefabloc (Boehinger Mannheim) a nanesen přímo na za sebou zařazené . CD4-IgG (Capon, D.J. a kol., Nátuře, 337: 525-531 [1989]) a mpl-IgG Ultralink (Pierce) kolony (viz níže) . CD4-IgG (2 ml) je odstraněna po projití vzorku a mpl-IgG (4 ml) kolona je promyta, čtyřmi objemy kolony každého, PBS a PBS obsahujícím 2M NaCl a eluována O,1M glycin-HCl pH 2,25. Frakce jsou shromážděny do 1/10 objemu 1M Tris-HCl (pH 8,0).158 column of 10 mM NaPO ₄ (pH 7.4) containing 2M urea and 1M NaCl. The eluted protein peak is adjusted to 0.01% octyl glycoside (n-octyl β-D-glucopiranoside) and 1mM each of EDTA and Pefabloc (Boehinger Mannheim) and applied directly to each other. CD4-IgG (Capon, DJ et al., Nature, 337: 525-531 [1989]) and mpl-IgG Ultralink (Pierce) columns (see below). CD4-IgG (2 mL) is removed after passing the sample and the mpl-IgG (4 mL) column is washed with four column volumes of each, PBS and PBS containing 2M NaCl and eluted with 0.1M glycine-HCl pH 2.25. Fractions are collected in 1/10 volume of 1M Tris-HCl (pH 8.0).

Analýza eluovaných frakcí z mpl-afinitní kolony pomocí SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) probíhající za redukčních podmínek ukázala přítomnost několika proteinů (Obr. 5) . Proteiny které byly barveny stříbrem s největší intenzitou se rozdělily s Mr 66000, 55000, 30000, 28000 a 14000. Pro stanovení, které z těchto proteinů stimulují proliferaci Ba/F3 buněčných kultur, byly proteiny eluovány z gelu jak je popsáno v Příkladu 2 níže.Analysis of the eluted fractions from the mpl-affinity column by SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) under reducing conditions showed the presence of several proteins (Fig. 5). The proteins that were stained with the highest intensity silver were resolved with Mr 66000, 55000, 30000, 28000 and 14000. To determine which of these proteins stimulate proliferation of Ba / F3 cell cultures, the proteins were eluted from the gel as described in Example 2 below.

Ultralink afinitní kolonyUltralink affinity column

10-20 mg mpl-IgG nebo CD4-IgG v PBS jsou navázány na 0,5 gramů Ultralink pryskyřice (Pierce) jak je popsáno v komerčních instrukcích.10-20 mg of mpl-IgG or CD4-IgG in PBS are bound to 0.5 grams of Ultralink resin (Pierce) as described in the commercial instructions.

Konstrukce a exprese mpl-IgGConstruction and expression of mpl-IgG

Chimérické molekuly obsahující úplnou extracelulární doménu lidského mpl (aminokyseliny 1-491) a Fc oblast lidské IgGI molekuly byly exprimovány v 293 buňkách. cDNA fragment kódující aminokyseliny 1-491 lidského mpl byl získán pomocí PCR z lidské megakaryocytické CMK buněčné cDNA knihovny a sekvenován. Clal místo bylo vloženo na 5' konec a BstEll na 3' konec. Tento fragment byl klonován protisměrně k IgGi Fc kódující oblasti v Bluescript vektoruChimeric molecules comprising the complete extracellular domain of human mpl (amino acids 1-491) and the Fc region of the human IgG1 molecule were expressed in 293 cells. The cDNA fragment encoding amino acids 1-491 of human mpl was obtained by PCR from a human megakaryocytic CMK cell cDNA library and sequenced. The ClaI site was inserted at the 5 'end and BstEll at the 3' end. This fragment was cloned upstream of the IgGi Fc coding region in the Bluescript vector

159 mezi Clal a BstEII místa po parciální digesci PCR produktu s BstEII, kvůli dvěma BstEII místům přítomným v DNA kódující extracelulární doménu mpl. BstEII místo zavedené na 3' konci mpl PCR produktu bylo sestrojeno tak, aby mělo Fc oblast dohromady s mpl extracelulárné doménou. Konstrukt byl subklonován do pRD5-tkneo vektoru mezi Clal a Xbal místa a transfektován do 293 lidských zárodečných ledvinových buněk kalciumfosfátovou metodou. Buňky byly selektovány v 0,4 mg/ml G418 a byly isolovány jednotlivé klony. Mpl exprese z isolovaných klonů byla stanovena s použitím lidské Fc specifické ELISA. Klon s nejlepší expresí měl hladinu exprese 1-2 mg/ml mpl-lgG.159 between the Clal and BstEII sites after partial digestion of the PCR product with BstEII, due to the two BstEII sites present in the DNA encoding the extracellular domain of mpl. The BstEII site introduced at the 3 'end of the mpl PCR product was designed to have the Fc region together with the mpl extracellular domain. The construct was subcloned into the pRD5-tkneo vector between the ClaI and XbaI sites and transfected into 293 human germline kidney cells by the calcium phosphate method. Cells were selected at 0.4 mg / ml G418 and individual clones were isolated. Mpl expression from isolated clones was determined using a human Fc specific ELISA. The clone with the best expression had an expression level of 1-2 mg / ml mpl-IgG.

Ba/F3 mpl P expresní buňky cDNA odpovídající úplné kódující oblasti lidského mpl P byla klonována do pRK5-tkneo, který byl následně linearizován s Notl a transfektován do IL-3 dependentní buněčné linie Ba/F3 elektroporací (lxlO⁷ buněk, 9605F, 250 voltů) . O tři dny později byla započata selekce v přítomnosti 2 mg/ml G418). Buňky byly selektovány a směsné nebo individuální klony byly získány limitním ředěním na destičkách s 96 jamkami. Vybrané buňky byly pěstovány v RPMI obsahujícím 15% FBS, 1 mg/ml G418, 20mM glutaminu, lOmM HEPES a 10 μg/ml Pen-Strep. Exprese mpl P v selektovaných klonech byla stanovena FACS analýzou s použitím anti-mpl P králičí polyklonální protilátky.The Ba / F3 mpl P expression cell cDNA corresponding to the complete coding region of human mpl P was cloned into pRK5-tkneo, which was subsequently linearized with NotI and transfected into the IL-3 dependent cell line Ba / F3 by electroporation (1x10 ⁷ cells, 9605F, 250 volts) ). Three days later, selection was initiated in the presence of 2 mg / ml (G418). Cells were selected and mixed or individual clones were obtained by limiting dilution in 96-well plates. Selected cells were grown in RPMI containing 15% FBS, 1 mg / ml G418, 20 mM glutamine, 10 mM HEPES and 10 µg / ml Pen-Strep. Expression of mpl P in selected clones was determined by FACS analysis using anti-mpl P rabbit polyclonal antibody.

Ba/F3 mpl ligandové stanoveníBa / F3 mpl ligand assay

Mpl ligandové stanovení bylo provedeno jak je ukázáno na Obr. 2. Ke stanovení přítomnosti mpl ligandu z různých zdrojů byly mpl P Ba/F3 buňky vyhladověny IL-3 po dobu 24 hod. při buněčné hustotě 5xl0⁵ buněk/ml v zvlhčovaném inkubátoru při 37°C v 5% CO2 a vzduchu. Po IL-3 vyhladovění byly buňky naneseny na 96-jamkovou kultivační misku sThe Mpl ligand assay was performed as shown in FIG. 2. To determine the presence of mpl ligand from different sources, mpl P Ba / F3 cells were starved by IL-3 for 24 hours at a cell density of 5x10 ⁵ cells / ml in a humidified incubator at 37 ° C in 5% CO 2 and air. After IL-3 starvation, the cells were plated in a 96-well culture dish

160 hustotou 50000 buněk v 200 μΐ média s nebo bez rozpuštěných vzorků a kultivovány 24 hod. v inkubátoru buněčných kultur. Na posledních 6-8 hodin bylo do každé jamky přidáno 20 μΐ sérum-prostého RPMI média obsahujícího 1 pC ³H-thymidinu. Buňky byly poté odebrány na GF/C filtrační destičku a promyty pětkrát vodou. Filtrát byl odečten v přítomnosti 40 μΐ scintilační tekutiny (Mikroscint 20) na čítači Packard Top Count.160 density of 50,000 cells in 200 μ 200 medium with or without dissolved samples and cultured for 24 hours in a cell culture incubator. 20 µl of serum-free RPMI medium containing 1 µC ³ H-thymidine was added to each well for the last 6-8 hours. Cells were then collected on a GF / C filter plate and washed five times with water. The filtrate was read in the presence of 40 μΐ scintillation fluid (Mikroscint 20) on a Packard Top Count.

Příklad 2Example 2

Vysoce purifikovaný vepřový ligandHighly purified pork ligand

Postup gelové eluceGel elution procedure

Bylo smíseno stejné množství afinitně purifikovaného mpl ligandu (frakce 6 eluovaná z mpl-lgG kolony) a 2X Laemmliho vzorkového pufru při laboratorní teplotě bez rekučního činidla a naneseno na Novex 4-20% polyakryamidový gel tak rychle jak je to možné. Vzorek nebyl zahřátý. Gelem probíhalo při 4-6°C 135 voltů přibližně 2 1/4 hod.Equal amounts of affinity purified mpl ligand (fraction 6 eluted from the mpl-IgG G column) and 2X Laemmli sample buffer at room temperature without reagent were mixed and loaded onto Novex 4-20% polyacryamide gel as quickly as possible. The sample was not heated. The gel was run at 4-6 ° C for 135 volts for about 2 1/4 hours.

Průběhový pufr měl na začátku laboratorní teplotu. Gel byl poté vyjmut z gelového boxu a odstraněn plát na stranách.The running buffer was initially at room temperature. The gel was then removed from the gel box and the wafer on the sides removed.

Replikační gel byl připraven na nitrocelulose následovně: Kus nitrocelulosy byl zvlhčen destilovanou vodou a opatrně položen na vrch exponované strany gelu s vyloučením vzduchových bublinek. Na nitrucelulosu a na plát gelu byly umístěny výchozí značky, aby mohla být přesně stanovena poloha kopie po barvení. Po dvou minutách byla nitrocelulosa odebrána, a gel byl zabalen do plastikového obalu a umístěn v lednici. Nitrocelulosa · byla obarvena Biorad zlatým celkovým proteinovým barvením (Bioraďs gold total protein stain) nejprve mícháním v 3x10 ml 0,1 Tween 20 + 0,5M NaCl + 0,lM Tris-HCl pH 7,5 přibližně 45 min. a následně 3x10 ml purifikována vodou 5 min. Potom bylaThe replication gel was prepared for nitrocellulose as follows: A piece of nitrocellulose was moistened with distilled water and gently placed on top of the exposed side of the gel, excluding air bubbles. Starting marks were placed on nitrucellulose and gel plate to accurately determine the copy position after staining. After two minutes, nitrocellulose was collected, and the gel was packaged in a plastic container and placed in a refrigerator. Nitrocellulose was stained with Biorad gold total protein stain first by stirring in 3x10 ml 0.1 Tween 20 + 0.5 M NaCl + 0.1 M Tris-HCl pH 7.5 for approximately 45 min. followed by 3x10 ml of water purification for 5 min. Then she was

161 přidáno zlaté barvivo a prováděno barvení, dokud nebyly vidět pásy standardů. Kopie byla poté promyta vodou, umístěna na plastický obal na gelu a opatrně byly vyrovnány výchozí značky. Polohy Novex standardů byly označeny na plátu gelu a byly označeny pásy, aby bylo vidět, které je třeba je vyříznout. Nitrocelulosa a plastikový obal byly poté odstraněny a gen byl rozřezán podél označených linií ostrou holící čepelkou. Řezy byly vedeny přes linie vzorku, který byl použit ke stanovení polohy plátu při barvení gelu. Po odstranění plátků byl zbývající gel obarven a byly měřeny polohy standardů počátečních značek. Molekulární hmotnosti odpovídající polohám řezu byly stanoveny Novex standardy.161 gold dye was added and dyeing was performed until the bands of standards were visible. The copy was then washed with water, placed on a plastic wrap on the gel, and the starting marks were carefully aligned. The positions of the Novex standards were marked on the gel sheet and the bands were labeled to see which ones had to be cut. The nitrocellulose and plastic sheath were then removed and the gene was cut along the marked lines with a sharp razor blade. Sections were run across the lines of the sample that was used to determine the position of the plate during gel staining. After removing the slices, the remaining gel was stained and the positions of the start tag standards were measured. The molecular weights corresponding to the slice positions were determined by Novex standards.

plátů gelu bylo umístěno do cel dvou Biorad 422 elektroelutorů. V buňkách byly použity membránové čepičky s vylučovací molekulární hmotností 12-14 K. Eluční pufr byl 50 mM hydrogenuhličitan amonný + 0,05% SDS (přibližně pH 7,8). Jeden litr pufru byl před použitím chlazen přibližně 1 hod. v chladícím boxu při 4-6°C. Gelové pláty byly eluovány v 10 ma/celu (40 v původně) při 4-6°C v chladícím boxu. Eluce probíhala přibližně 4 hod. Cely byly poté opatrně vyjmuty a tekutina nad fritou odebrána pipetou. Tekutina v membránové čepičce byla odebrána Pipetmanem a uschována. Do čepičky bylo poté umístěno padesát μΐ alikvotů purifikované vody, zamícháno a a odebráno po rozpuštění všech SDS krystalů. Tato promytí byla zkombinována s uschovanou výše uvedenou kapalinou. Celkový eluční objem byl 300-500 μΐ na plát gelu. Vzorky byly umístěny do 10 mm Spektrapor 4 dialysační trubice s vylučovací hodnotou 12-14K, která byla namočena několik hodin v ultračisté vodě. Byly dialyzovány přes noc při 46°C proti 600 ml fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBSgel plates were placed in cells of two Biorad 422 electric motors. Membrane caps with a molecular weight of 12-14 K were used in the cells. The elution buffer was 50 mM ammonium bicarbonate + 0.05% SDS (approximately pH 7.8). One liter of buffer was cooled in a cooling box at 4-6 ° C for approximately 1 hour before use. The gel plates were eluted at 10mA / cell (40 at the original) at 4-6 ° C in a cooling box. Elution was continued for approximately 4 hours. The cells were then carefully removed and the supernatant was removed by pipette. The liquid in the membrane cap was collected by pipetman and stored. Fifty μΐ aliquots of purified water were then placed in the cap, mixed and collected after dissolution of all SDS crystals. These washes were combined with the stored liquid above. The total elution volume was 300-500 μΐ per gel plate. The samples were placed in a 10 mm Spectrapor 4 dialysis tube with an exclusion value of 12-14K, which was soaked for several hours in ultrapure water. They were dialyzed overnight at 46 ° C against 600 ml phosphate buffered saline (PBS

162 je přibližně 4 mM v draslíku) v 6 vzorcích. Pufr byl vyměněn následující ráno a dialýza pokračovala 2,5 hodiny. Vzorky byly odebrány z dialyzačních trubic a umístěny do mikrofugačních kyvet. Kyvety byly umístěny 1 hod. na led, mikrofugovány při 14K rpm 3 min. a supernatanty byly opatrně odebrány od precipitovaného SDS. Supernatanty byly umístěny na 1 hod. na led a znovu mikrofugovány 4 min. Supernatanty byly rozpuštěny ve fosfátem pufrovaném solném roztoku a podrobeny stanovení aktivity. Zbývající vzorky byly zmraženy na -70°C..162 is approximately 4 mM in potassium) in 6 samples. The buffer was replaced the following morning and dialysis continued for 2.5 hours. Samples were taken from dialysis tubes and placed in microfuge tubes. Cuvettes were placed on ice for 1 hr, microfuged at 14K rpm for 3 min. and the supernatants were carefully collected from the precipitated SDS. Supernatants were placed on ice for 1 hr and re-microfuged for 4 min. Supernatants were dissolved in phosphate buffered saline and assayed for activity. The remaining samples were frozen at -70 ° C.

Příklad 3Example 3

Mikrosekvenování vepřového mpl liganduMicrosquencing of porcine mpl ligand

Frakce 6 (2,6 ml) z mpl-lgG afinitní kolony byla koncentrována na Microcon-10 (Amicon). Aby se předešlo absorbci mpl ligandu na Microcon, byla membrána promyta 1% SDS a do frakce 6 bylo přidáno 5 μΐ 10% SDS. Do frakce č. 6 po Microcon zakoncentrování (20 μΐ) byl přidán vzorkový pufr (20 μΐ) 2X a celkový objem (40 μΐ) byl nanesen na jeden pás 4-20% gradientového akrylamidového gelu (Novex). Gel byl poté vyvíjen podle Novex postupu. Gel byl poté ekvilibrován 5 min. před elektroblotací v lOmM 3(cyklohexylamino)-1-propansufonové kyselině (CAPS), pH 11,0, obsahující 10% methanolu. Elektroblotace na Immobilion-PSQ membrány (Millipore) byla prováděna 45 min. při 250 mA s konstantním průběhem v BioRad Trans-Blot přenosové cele (32). PVDF membrána byla barvena 0,1% Coomassie Blue R-250 v 40% methanolu, 0,1 kyselině octové 1 min a odbarvována 2-3 min. 10% kyselinovou octovou v 50% methanolu. Jediné proteiny, které byly viditelné v Mr 18000-35000 oblasti blotu měly Mr 30000, 28000 a 22000.Fraction 6 (2.6 mL) from the mpl-IgG affinity column was concentrated to Microcon-10 (Amicon). To prevent absorption of mpl ligand on Microcon, the membrane was washed with 1% SDS and 5 µΐ 10% SDS was added to fraction 6. Sample buffer (20 μΐ) 2X was added to fraction # 6 after Microcon concentration (20 μΐ) and the total volume (40 μΐ) was applied to one band of a 4-20% gradient acrylamide gel (Novex). The gel was then developed according to the Novex procedure. The gel was then equilibrated for 5 min. prior to electroblotting in 10 mM 3 (cyclohexylamino) -1-propanesulfonic acid (CAPS), pH 11.0, containing 10% methanol. Electroblotting on Immobilion-PSQ membranes (Millipore) was performed for 45 min. at 250 mA with a constant waveform in a BioRad Trans-Blot transfer cell (32). The PVDF membrane was stained with 0.1% Coomassie Blue R-250 in 40% methanol, 0.1 acetic acid for 1 min and bleached for 2-3 min. 10% acetic acid in 50% methanol. The only proteins that were visible in the Mr 18000-35000 blot region had Mr 30000, 28000 and 22000.

163163

Pásy s 30, 28 a 22 kDa byly podrobeny proteinovému sekvenování. Automatické proteinové sekvenování bylo provedeno na modelu 470A Applied Biosystem sekvenátoru vybaveném on-line PTH analyzátorem. Sekvenátor byl upraven na injektaci 80-90% vzorku (Rodriguez, J. chromatogr., 350: 217-225 [1985]). K vyrovnání UV absorbance byl do rozpouštědla A přidán aceton (12 μΙ/ml). Elektroblotované proteiny byly sekvenovány v Blott zásobníku. Píky byly integrovány softwarem Justice Innovation s použitím Nelson Analytical 970 ingerfaces. Interpretace sekvencí byla provedena na VAX 5900 (Henzel a kol., J. Chromatogr., 404: 41-52 [1987]). N-koncové sekvence (s použitím jednopísmenných kódů s nezaručenými zbytky v závorkách) a kvantifikace získaného materiálu (v závorkách) jsou uvedeny v Tab. 2'.Bands of 30, 28 and 22 kDa were subjected to protein sequencing. Automatic protein sequencing was performed on a 470A Applied Biosystem sequencer model equipped with an on-line PTH analyzer. The sequencer was adapted to inject 80-90% of the sample (Rodriguez, J. chromatogr., 350: 217-225 [1985]). Acetone (12 μΙ / ml) was added to solvent A to equalize the UV absorbance. The electroblotted proteins were sequenced in a Blott stack. The peaks were integrated with Justice Innovation software using Nelson Analytical 970 ingerfaces. Sequence interpretation was performed on VAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404: 41-52 [1987]). The N-terminal sequences (using single letter codes with non-guaranteed residues in parentheses) and quantification of the material obtained (in parentheses) are shown in Tab. 2 '.

Tab. 2'Tab. 2 '

Amino-koncové sekvence mpl liganduAmino-terminal sequences of the mpl ligand

30 kDa [1.8 pmol] 1 5 10 15 20 25 (S) P A P P A(C)D PRLLNKLLRDD (H/S) V L H ÍG) R L 30 kD [1.8 pmol] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (S) P A P P A (C) D PRLLNKLLRDD (H / S) V L H (G) R L (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 29) 28 kDa [0.5 pmol] 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VLÍH)GR 28 kD [0.5 pmol] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (S) PAPPAXDPRLLNKLLRDD (H) VL) GR ÍSEQ ID NO: 31) IDEQ ID NO: 31) 18-22 kDa [0.5 pmol] 1 5 10 XPAPPAXDPRLX(N)ÍK) 18-22 kD [0.5 pmol] 1 5 10 XPAPPAXDPRLX (N)) (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33)

164164

Příklad 4Example 4

Kapalné suspensní megakaryocytopoetické stanoveníLiquid suspension megakaryocytopoietic assay

Liské periferální kmenové buňky (PSC)(získané od souhlasících pacientů) byly naředěny 5 násobně v IMDM médiu (Gibco) a centrifugovány 15 min. při laboratorní teplotě při 800 x g. Pelety destiček byly resuspendovány v IMDM a naneseny na 60% Percoll (hustota 1,077 gm/ml) (Pharmacia) a centrifugovány při 800 x g 30 min. Na rozhraní byly odsáty jednojaderné buňky s nízkou hustotou a byly promyty 2x IMDM a naneseny při 1-2 x 10⁶ buněk/ml v IMDM obsahujícím 30% FBS (1 ml celkový objem) do 24 jamek se shluky buněčné kultury (Costar) . APP nebo APP zbavená mpl ligandu byly přidány v 10% a kultury byly pěstovány 12-14 dní ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C v 5% CO2 a vzduchu. Kultury byly také pěstovány v přítomnosti 10% APP s 0,5 μg mpl-lgG přidaného ve dnech 0, 2 a 4. APP byla zbavena mpl ligandu průchodem APP přes mpl-lgG afinitní kolonu.Human peripheral stem cells (PSC) (obtained from consensus patients) were diluted 5-fold in IMDM medium (Gibco) and centrifuged for 15 min. Platelet pellets were resuspended in IMDM and plated on 60% Percoll (density 1.077 gm / ml) (Pharmacia) and centrifuged at 800 xg for 30 min. At the interface, low density mononuclear cells were aspirated and washed twice with IMDM and plated at 1-2 x 10 ⁶ cells / ml in IMDM containing 30% FBS (1 ml total volume) in 24 well cell culture clusters (Costar). APP or mpl ligand-free APP was added in 10% and cultures were grown for 12-14 days in a humidified incubator at 37 ° C in 5% CO 2 and air. The cultures were also grown in the presence of 10% APP with 0.5 µg mpl-IgG added on days 0, 2 and 4. APP was depleted of the mpl ligand by passing APP through the mpl-IgG affinity column.

Při kvantifikaci megakaryocytopoesy v těchto kapalných suspensních kulturách byla použita modifikace podle Solberga a kol., a byla použita radioznačená myší IgG monoklonální protilátka (HP1-1D) na GPIIbUIa (získaná od Dr. Nicholse, Mayo Clinic). 100 μς HP1-1D (viz Grant, B. a kol., Blood 69: 1334-1339 [1987]) bylo radioznačeno lmCi Na I s použitím Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) podle komerčních instrukcích. Radioznačený HP1-1D byl skladován při -70°C v PBS obsahujícím 0,01% oktyl-glukosidu. Obvyklé specifické aktivity byly 1-2 x 10⁶ cpm/^g (>95% precipitovalo 12,5% kyselinou trichloroctovou).To quantify megakaryocytopoiesis in these liquid suspension cultures, the modification of Solberg et al. Was used, and a radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody (HP1-1D) to GPIIbUIa (obtained from Dr. Nichols, Mayo Clinic) was used. 100 μς HP1-1D (see Grant, B. et al., Blood 69: 1334-1339 [1987]) was radiolabeled with 1mCi Na I using Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) according to commercial instructions. The radiolabeled HP1-1D was stored at -70 ° C in PBS containing 0.01% octyl-glucoside. Typical specific activities were 1-2 x 10 ⁶ cpm / µg (> 95% precipitated with 12.5% trichloroacetic acid).

Kapalné suspensní kultury byly použity pro každý pokus triplicitně. Po 12-14 dnech kultivace byl 1 ml kultur převeden do 1,5 ml eppendorfových zkumavek a centrifugován při 800xg 10 min. při laboratorní teplotě a výsledné peletyLiquid suspension cultures were used in triplicate for each experiment. After 12-14 days of culture, 1 ml cultures were transferred to 1.5 ml eppendorf tubes and centrifuged at 800xg for 10 min. at room temperature and the resulting pellet

165 byly resuspendovány v 100 μΐ PBS obsahujícího 0,02 % PBS a 20% telecího séra. Do resuspendovaných kultur bylo přidáno 10 ng ¹²⁵I-HP1-1D v 50 μΐ stanovovacího pufru a byly inkubovány 60 min. při laboratorní teplotě (RT) s občasným protřepáním. Následně byly buňky shromážděny centrifugací při 800xg 10 min. při RT a promyty 2x stanovovacím pufrem. Pellety byly odečítány 1 min. v gama čítači (Packard) . Nespecifické vazby byly stanoveny přidáním 1 μΐ neznačeného HP1-1D na 60 minut před přidáním značeného HP1-1D. Specifické vazby byly stanoveny jako celková ¹²⁵I-HP1-1D vazba mínus tyto vazby v přítomnosti přebytku neznačeného HPl-lD.165 were resuspended in 100 μΐ PBS containing 0.02% PBS and 20% calf serum. 10 ng of ¹²⁵ I-HP1-1D in 50 μΐ assay buffer was added to the resuspended cultures and incubated for 60 min. at room temperature (RT) with occasional shaking. Subsequently, the cells were collected by centrifugation at 800xg for 10 min. at RT and washed 2x with assay buffer. Pellets were read 1 min. in a gamma counter (Packard). Non-specific binding was determined by adding 1 μΐ of unlabeled HP1-1D for 60 minutes before adding labeled HP1-1D. Specific binding was determined as total ¹²⁵ I-HP1-1D binding minus these binding in the presence of excess unlabeled HP1-1D.

Příklad 5Example 5

Oligonukleotidové PCR primeryOligonucleotide PCR primers

Na základě amino-koncových aminokyselinových sekvencí získaných z 30 kDa, 28 kDa a 18-22 kDa proteinů, byly navrženy degenerované oligonukleotidy pro použití jako primery polymerasové řetězové reakce (PCR)(viz Tab 4). Byly syntetizovány dva pooly primerů, pool 20merů se souhlasným směrem kódující aminokyselinové zbytky 2-8 (mpl 1) a pool protisměrných 21-merů komplementární k sekvencím kódujících aminokyseliny 18-24 (mpl 2).Based on the amino-terminal amino acid sequences obtained from the 30 kDa, 28 kDa, and 18-22 kDa proteins, degenerate oligonucleotides were designed for use as polymerase chain reaction (PCR) primers (see Table 4). Two primer pools, a co-directional 20mer pool encoding amino acid residues 2-8 (mpl 1), and a pool of upstream 21-mer complementary to amino acid sequences encoding 18-24 (mpl 2) were synthesized.

Tab. 4Tab. 4

Pooly degenerovaných oligonukleotidových primerůPools of degenerate oligonucleotide primers

mpl 1:5* CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3’ (2,048-nťkob .'deaehch mpl 1: 5 * CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3 '(2,048-nkk .'deaehch (SEQ ID NO: 35) (SEQ ID NO: 36) mpl 2:5' NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3’ (2,048· hoř ok do? etn·. mpl 2: 5 'NCC RTG NAR RTG RTC RTC 3' (2,048 · burns including. (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 37)

166166

Vepřová genomická DNA, izolovaná z vepřových periferálních krevních lymfocytů, byla použita jako šablona pro PCR. 50 μΐ rekační směsi zahrnovalo: 0,8 μg vepřové genomické DNA v lOmM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM Kel, 3mMPorcine genomic DNA isolated from porcine peripheral blood lymphocytes was used as a template for PCR. 50 μΐ of the reaction mixture included: 0.8 μg of pork genomic DNA in 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM Kel, 3 mM

MgCl2, 100 pg/ml BSA, 400 μΜ dNTPs, ΙμΜ každého příměrového poolu a 2,5 jednotek Taq polymerasy. Počáteční denaturace šablony byla při 94°C 8 min a následovalo 35 cyklů 45 s při 94^eC, 1 min. při 55°C a 1 min. při 72°C. Poslední cyklus byl prodloužen na 10 min při 72 °C. PCR produkty byly separovány elektroforézou na 12% polyakryamidovém gelu a visualizovány barvením ethidium bromidem. Lze předpokládat, že pokud aminokoncová aminokyselinová sekvence kódovala jeden exon, tak správný PCR produkt bude 69bp. DNA fragment této velikost byl eluován z gelu a subklonován do pGEMT (Promega). Sekvence tří klonů jsou uvedeny dole v Tab. 5.MgCl2, 100 pg / ml BSA, 400 μΜ dNTPs, ΙμΜ of each primer pool, and 2.5 Taq polymerase units. Initial denaturation of the template was at 94 ° C for 8 min, followed by 35 cycles of 45 sec at 94 ^e C, 1 min. at 55 ° C and 1 min. at 72 ° C. The last cycle was extended to 10 min at 72 ° C. PCR products were separated by 12% polyacryamide gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. It can be assumed that if the amino-terminal amino acid sequence encoded one exon, the correct PCR product would be 69bp. A DNA fragment of this size was eluted from the gel and subcloned into pGEMT (Promega). The sequences of the three clones are shown in Tab. 5.

Tab. 5 bp fragmenty vepřové genomické DNA gemT3Tab. 5 bp fragments of gemT3 porcine genomic DNA

5OCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCAQI5OCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCAQI

TGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 3η ACTGGTGCAA GTCGTGCCG(SEQ ID NO: 38) gemT7TGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 3) ACTGGTGCAA GTCGTGCCG (SEQ ID NO: 38) gemT7

5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCAQI5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCAQI

CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 39)CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 39)

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG(SEQ ID NO: 40).GCTGGTGCAG GTAGTGCCG (SEQ ID NO: 40).

167 gemT9167 gemT9

PRLLNKL LR (SEQ IDPRLLNKL LR (SEQ ID NO

NO: 32)NO: 32)

5* CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG 3' GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGC5 * CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG 3 'GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGC

ATCATGTCTATCACGGT 3* (SEQ ID NO: 41)ATCATGTCTATCACGGT 3 * (SEQ ID NO: 41)

TAGTACAGATAGTGCCA 5' (SEQ ID NO: 42)·TAGTACAGATAGTGCCA 5 '(SEQ ID NO: 42) ·

Polohy PCR primerů jsou označeny podtržením basí., Tyto výsledky potvrzují N-koncovou sekvenci získanou pro aminokyseliny 9-17 pro 30 kDa, 28 kDa a 18-22 kDa proteiny a znamenají, že tato sekvence je kódována jedním exonem vepřové DNA.The positions of the PCR primers are indicated by underlining. These results confirm the N-terminal sequence obtained for amino acids 9-17 for the 30 kDa, 28 kDa, and 18-22 kDa proteins, and means that this sequence is encoded by a single exon of porcine DNA.

Přiklad 6Example 6

Gen lidského mpl liganduHuman mpl ligand gene

Na základě výsledků z Příkladu 5, byl 45-merový deoxyoligonukleotid, nazvaný pR45, popsán a syntetizován, aby mohl být proveden screening genetické knihovny. 45-mer měl následující sekvenci:Based on the results of Example 5, a 45-mer deoxyoligonucleotide, called pR45, has been described and synthesized to screen a genetic library. The 45-mer had the following sequence:

5' GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAGTCG 3' (SEQ ID NO: 28)5 'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAGTCG 3' (SEQ ID NO: 28)

Tento oligonukleotid byl ³²P-značen s (γ³²Ρ)-ΑΤΡ a T4 kinasou a použit ke screeningu lidské genomické DNA knihovny v Xgeml2 za slabě náročných hybridizačních aThis oligonucleotide was ³² P-labeled with (γ ³² Ρ) -αΤΡ and T4 kinase and used to screen the human genomic DNA library in Xgem12 under weakly challenging hybridization and

168 promývacích podmínek (viz Příklad 7). Byly shromážděny pozitivní klony, plak byl purifikován a restrikčním mapováním a Southern blotováním. analýzu byl vybrán klon č. 4.168 wash conditions (see Example 7). Positive clones were collected, plaque was purified by restriction mapping and Southern blotting. clone # 4 was selected for analysis.

2.8 kb BamHI-Xbal fragment, který hybridizoval na 45mer, byl subklonován do pBluescript SK-. Parciální DNA sekvenování tohoto klonu bylo provedeno s použitím primerů oligonukletidů specifických k vepřové mpl ligandové DNA sekvenci. Získaná sekvence potvrdila, že byla izolována DNA kódující lidský homolog vepřového mpl ligandu. V sekvenci bylo detekováno EcoRI restrikční místo, což nám umožnilo izolovat 390 bp EcoRI-Xbal fragment z 2.8 kb BamHI-Xbal a subklonovat ho do pBluescript SK-.The 2.8 kb BamHI-XbaI fragment that hybridized to 45mer was subcloned into pBluescript SK-. Partial DNA sequencing of this clone was performed using oligonucleotide primers specific to the porcine mpl ligand DNA sequence. The sequence obtained confirmed that DNA encoding a human porcine mpl ligand homolog was isolated. An EcoRI restriction site was detected in the sequence, allowing us to isolate the 390 bp EcoRI-XbaI fragment from the 2.8 kb BamHI-XbaI and subclone it into pBluescript SK-.

Byly sekvenovány obě vlákna tohoto fragmentu. Lidská DNA sekvence a vyvozená aminokyselinová sekvence jsou zobrazeny na Obr. 9 (SEQ ID NO: 3 a 4) . Vyvozené polohy intronů v genomické sekvenci jsou také označeny šipkami, a definují předpokládaný exon („exon 3).Both strands of this fragment were sequenced. The human DNA sequence and deduced amino acid sequence are shown in FIG. 9 (SEQ ID NOS: 3 and 4). The deduced positions of introns in the genomic sequence are also indicated by arrows, and define the putative exon ("exon 3").

Prozkoumání vyvozené aminokyselinové sekvence potvrzuje, že serinový zbytek zralého mpl ligandu, jak aminokyselinovou sekvenční aminokyselinová sekvence bezprostředně proti směru od tohoto kodonů velice připomíná signální sekvenci zapojenou v sekreci zralého mpl ligandu. Oblast kódující signální oblast je pravděpodobně přerušena na nukleotidové pozici 68 intronem.Examination of the deduced amino acid sequence confirms that the serine residue of the mature mpl ligand, as the amino acid sequence amino acid sequence immediately upstream of this codon greatly resembles the signal sequence involved in the secretion of the mature mpl ligand. The region encoding the signal region is likely to be interrupted at nucleotide position 68 by an intron.

Bylo objeveno, že v 3' směru exon končí na nukleotidu 196. Tento exon tedy kóduje sekvenci 42 aminokyselin, 16 z nich je pravděpodobně součástí signální sekvence a 26 z nich je součástí zralého lidského mpl ligandu.It has been discovered that in the 3 'direction the exon ends at nucleotide 196. Thus, this exon encodes a sequence of 42 amino acids, 16 of which are probably part of the signal sequence and 26 of which are part of the mature human mpl ligand.

analyzován Pro další je první aminokyselinou bylo stanoveno přímou analýzou. Vyvozenáanalyzed For the next is the first amino acid was determined by direct analysis. Derived

169169

Přiklad 7 cDNA lidského mpl ligandu plné délkyExample 7 full-length human mpl ligand cDNA

Na základě lidské „exonové 3 sekvence (Příklad 6) byly syntetizovány dvě nedegenerované sekvence odpovídající 3' a 5' koncům „exonu 3 (Tab. 6).Based on the human "exon 3 sequence" (Example 6), two non-degenerate sequences corresponding to the 3 'and 5' ends of "exon 3" were synthesized (Table 6).

Tab. 6Tab. 6

Lidské cDNA nedegerované PCR oligonukleotidové primeryHuman cDNA undigested PCR oligonucleotide primers

Fwd primer 5* GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTC T 3’ Fwd primer 5 * GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCG TCG TGG TCA TGC TTC T 3 ' (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 42) Rvs primer: 5’CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3‘ Rvs primer: 5 'CAG TCT GCC GTG (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 44)

Tyto dva primery byly použity v PCR reakcích a sloužily jako šablony DNA z různých lidských cDNA knihoven nebo 1 ng Quick Cloně cDNA (Clonetech) z různých tkáních za podmínek použití viz Příklad 5. Očekávaná velikost správného PCR produktu byla 140 bp. Po analýze PCR produktů na 12% polyakrylamidovém gelu byl DNA fragment očekávané velikosti detekován v cDNA knihovnách připravených z dospělých ledvinných buněk, 293 zárodečných ledvinných buněk a cDNA připravené z lidských zárodečných jater (Clonetech cat. č. 7171-1).These two primers were used in PCR reactions and served as DNA templates from different human cDNA libraries or 1 ng Quick Clone cDNA (Clonetech) from different tissues under the conditions of use, see Example 5. The expected size of the correct PCR product was 140 bp. After analysis of the PCR products on a 12% polyacrylamide gel, the DNA fragment of the expected size was detected in cDNA libraries prepared from adult kidney cells, 293 germinal kidney cells and cDNA prepared from human germ liver (Clonetech cat. No. 7171-1).

Byl proveden screening cDNA knihovny zárodečných jater v λ DR2 (Clonetech cat. č. HL1151x) se stejným 45-merovým oligonukleotidem, který byl použit ke screeningu lidské genomické knihovny. Oligonukleotid byl značen (³²P)-ATP s použitím T4 polynukleotidkinasy. Byl proveden screening knihovny za slabě náročních hybridizačních podmínek. Filtráty byly prehibridizovány 2 hod., pak hybridizovány se vzorkem přes noc při 42°C v 20% formamidu, 5xSSC, lxDenhardt's, 0,05 fosfátu sodném (pH 6,5),The germline cDNA library in λ DR2 (Clonets cat. No. HL1151x) was screened with the same 45-mer oligonucleotide used to screen the human genomic library. The oligonucleotide was labeled with ( ³² P) -ATP using T4 polynucleotide kinase. The library was screened under weakly stringent hybridization conditions. The filtrates were pre-hybridized for 2 hours, then hybridized to the sample overnight at 42 ° C in 20% formamide, 5xSSC, 1xDenhardt's, 0.05 sodium phosphate (pH 6.5),

170170

0,1% pyrofosfátu sodném, 50 μς/ml sonizované DNA z lososího spermatu 16 hod. Filtráty byly poté promyty v 2xSSC a poté jednou promyty v 0,5xSSC, 0,1% SDS při 42°C. Filtráty byly exponovány přes noc na Kodak rentgenový film. Pozitivní klony byly shromážděny, plak byl purifikován a velikost insertu byla stanovena PCR používající oligonukleotidy lemujících BamHI-Xbal klonující v λ DR2 (Clonetech cat. č. 6475-1). 5 μΐ fágového materiálu bylo použito jako zdroj šablony. Počáteční denaturace byla 7 min. při 94°C a následovalo 30 cyklů amplifikace (1 min. 94°C, 1 min. 52°C a 1,5 min. 72°C) . Konečným stupněm bylo 15 min. při 72°C. Klon č. FL2b měl 1.8 kb insert a byl vybrán pro další analýzu.0.1% sodium pyrophosphate, 50 μς / ml sonicated salmon sperm DNA for 16 hours. The filtrates were then washed in 2xSSC and then washed once in 0.5xSSC, 0.1% SDS at 42 ° C. The filtrates were exposed overnight to Kodak X-ray film. Positive clones were pooled, plaque was purified, and insert size was determined by PCR using oligonucleotides flanking BamHI-XbaI cloning in λ DR2 (Clonetech cat. # 6475-1). 5 μΐ of phage material was used as template source. The initial denaturation was 7 min. at 94 ° C followed by 30 cycles of amplification (1 min. 94 ° C, 1 min. 52 ° C, and 1.5 min. 72 ° C). The final step was 15 min. at 72 ° C. Clone # FL2b had a 1.8 kb insert and was selected for further analysis.

Plasmid pDR2 (Clonetech, ÁDR2 & pDR2 Cloning andPlasmid pDR2 (Clonetech, ADR2 & pDR2 Cloning and

Expression System Library Protocol Handbook, str. 42) obsahující v XDR2 fágové rameno, byl uvolněn podle <s komerčního návodu (Clonetech, Clonetech, ÁDR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, str.29-30). Restrikční analýza plasmidu pDR2-FL2b s BamHI a Xbal ukázala přítomnost interního BamHI restrukčního místa v insertu přibližně v poloze 650. Digesce plasmidu s BamHIXbal rozdělila insert na dva fragmenty, jeden 0,65 kb a jeden 1,15 kb. DNA sekvence byla stanovena s třemi různými třídami šablony odvozenými z plasmidu pDR2-FL2b. DNA sekvenování dvouvláknového plasmidu DNA bylo provedeno s ABI373 (Applied Biosystems, Foster City, California) automatizovaným fluorescenčním DNA sekvenátorem s použitím standardních postupů pro barevně značené dideoxynukleosidtrifosfátterminátory (barvivovéterminátory) a běžně syntetizované „walking primery (Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467The Expression System Library Protocol Handbook (p. 42) containing the phage arm in the XDR2 was released according to the commercial guidelines (Clonetech, Clonetech, ADR2 & pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p.29-30). Restriction analysis of the plasmid pDR2-FL2b with BamHI and XbaI showed the presence of an internal BamHI restriction site in the insert at approximately position 650. Digestion of the plasmid with BamHIXbal divided the insert into two fragments, one 0.65 kb and one 1.15 kb. The DNA sequence was determined with three different classes of template derived from plasmid pDR2-FL2b. DNA sequencing of the double stranded DNA plasmid was performed with ABI373 (Applied Biosystems, Foster City, California) using an automated fluorescent DNA sequencer using standard procedures for color-labeled dideoxynucleoside triphosphate (dye terminators) and commonly synthesized walking primers (Sanger et al., Proc. Natl. Proc. Sci., USA 74: 5463-5467

171 [1977]; Smith a kol., Nátuře, 321: 674-679 [1986]). Přímé sekvenování polymerasovou řetězovou reakcí amplifikovaných fragmentů z plasmidu bylo provedeno ABI373 sekvenátorem s použitím běžných primerů a barvivově-terminátorových reakcí. Jednovláknová šablona byla generována s M13 Janus vektorem (DNASTAR, lne., Madison, Wisconsin)(Burland a kol., Nucl. Acids Res., 21: 3385-3390 [1993]). BamHI-Xbal (1,15 kb) a BamHI (0,65 kb) fragmenty byly isolovány z plasmidu pDR2-FL2b, konce doplněny s T4 DNA polymerasou v přítomnosti deoxynukleotidů, a poté subklonovány na Smál místo M13 Janus. Sekvenování bylo provedeno podle standardních postupů pro barevně značené M13 universální a reversní primery, nebo „walking primery a barvivovéterminátory. Manuální rekvenační reakce byly provedeny na jednořetězcové M13 DNA s použitím „walking primerů a standardní dideoxy-terminátorové chemie (Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA? 74: 5463-5467 [1977]), a za použití ³³P-značené α-dATP a Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Sekvenční složení DNA bylo provedeno s Sequencherem V2.1bl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Nukleotidová sekvence a vyvozené sekvence hML jsou uvedeny na Obr. 1 (SEQ ID NO: 1) .171 [1977]; Smith et al., Nature, 321: 674-679 [1986]). Direct sequencing by the polymerase chain reaction of the amplified fragments from the plasmid was performed by the ABI373 sequencer using conventional primers and dye-terminator reactions. A single stranded template was generated with the M13 Janus vector (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21: 3385-3390 [1993]). The BamHI-XbaI (1.15 kb) and BamHI (0.65 kb) fragments were isolated from plasmid pDR2-FL2b, complemented with T4 DNA polymerase in the presence of deoxynucleotides, and then subcloned into SmaI instead of M13 Janus. Sequencing was performed according to standard procedures for color-labeled M13 universal and reverse primers, or "walking primers and dye terminals". Manual sequencing reactions were performed on single-stranded M13 DNA using walking primers and standard dideoxy terminator chemistry (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA? 74: 5463-5467 [1977]), and using ³³ Β-labeled α-dATP and Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). DNA sequencing was performed with Sequencher V2.1b12 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). The nucleotide sequence and deduced hML sequences are shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).

Příklad 8Example 8

Isolace genu lidského mpl ligandu (TPO)Isolation of the human mpl ligand (TPO) gene

Lidské genomické DNA klony TPO genu byly izolovány screeningem lidské genomické knihovny v X-Geml2 s pR45, výše popsaná oligonukleotidová zkouška za slabě náročných podmínek (viz Příklad 7) nebo za vysoce náročných podmínek s fragmentem odpovídajícím 3' polovině lidské cDNA kódující mpl ligand (od BamHI do 3' konce) . Byly izolovány dvaHuman genomic DNA clones of the TPO gene were isolated by screening the human genomic library in X-Gem12 with pR45, the oligonucleotide assay described above under mildly challenging conditions (see Example 7) or under severe conditions with a fragment corresponding to 3 'half of the human mpl ligand cDNA BamHI to the 3 'end). Two were isolated

172 překrývající se lambda klony s rozpětím 35 kb. Dva překrývající se fragmenty (BamHl a EcoRI) obsahující úplný TPO gen byly subklonovány a sekvenovány. Struktura lidského genu je složena ze 6 exonů se 7 kb genomické DNA (Obr. 14A, B a C) . Hranice všech spojení exon/intron jsou shodné s odpovídajícími prvky potvrzenými u savčích genů (Shapiro, Μ. B., a kol., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exon 1 a exon 2 obsahuje 5' netranslatovanou sekvenci a úvodní čtyři aminokyseliny signálního peptidu. Zbytek sekretorického sekgnálu a prvních 26 aminokyselin zralého proteinu je kódováno v exonu 3. Úplná karboxylová doména a 3' netranslatovaná oblast stejně jako asi 50 aminokyselin domény erythropoetinového typu jsou kódovány v exonu 6. Čtyři aminokyseliny zahrnuté v delecí pozorované v hML-2 (hTPO-2) jsou kódovány v 5' konci exonu 6.172 overlapping lambda clones with a 35 kb span. Two overlapping fragments (BamH1 and EcoRI) containing the full TPO gene were subcloned and sequenced. The structure of the human gene is composed of 6 exons with 7 kb genomic DNA (Fig. 14A, B and C). The boundaries of all exon / intron junctions are consistent with the corresponding elements confirmed in mammalian genes (Shapiro, B., et al., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exon 1 and exon 2 contain the 5 'untranslated sequence and the introductory four amino acids of the signal peptide. The rest of the secretory sequence and the first 26 amino acids of the mature protein are encoded in exon 3. The complete carboxyl domain and the 3 'untranslated region as well as about 50 amino acids of the erythropoietin type domain are encoded in exon 6. The four amino acids included in the deletion observed in hML-2 (hTPO- 2) are encoded at the 5 'end of exon 6.

Příklad 9Example 9

Přechodná exprese lidského mpl ligandu (hML)Transient expression of human mpl ligand (hML)

Aby byl subklonován insert plné délky obsažený v pDR2FL2B, byl piasmid kompletně digestován Xbal a poté parciálně digestován BamHl. DNA fragment odpovídající 1,8 kb insertu byl gelově purifikován a subklonován v pRK5 (pRK5-hmpl I)(viz U.S. Patent č. 5,258,287 konstrukce pRK5) za kontroly cytomegalovirového přímého časného promotoru. DNA z konstruktu pRK5-hmpl I byla připravena PEG metodou a transfektována do 293 buněk lidských zárodečných ledvin udržovaných v Dulbeccosem modifikovaném Eaglově médiu (EMEM) obohaceném F-12 výživovou směsí, 20mM Hepes (pH 7,4) a 10% zárodečného hovězího séra. Buňky byly transfektovány metodou fosfátu vápenatého jak je popsáno v (Gorman, C. [1985] DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., editoři) Vol. II, str. 143-190, IRL Press, Washington,In order to subclone the full length insert contained in pDR2FL2B, the piasmid was completely digested with XbaI and then partially digested with BamH1. The DNA fragment corresponding to the 1.8 kb insert was gel purified and subcloned in pRK5 (pRK5-hmpl I) (see U.S. Patent No. 5,258,287 to the construction of pRK5) under the control of the cytomegalovirus direct early promoter. DNA from the pRK5-hmpl I construct was prepared by PEG method and transfected into 293 human germ kidney cells maintained in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (EMEM) supplemented with F-12 nutritional composition, 20 mM Hepes (pH 7.4) and 10% germline bovine serum. The cells were transfected with the calcium phosphate method as described in (Gorman, C. [1985] DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., editors) Vol. II, pp. 143-190, IRL Press, Washington,

173173

D.C.). 36 hod. po transfekci byla v supernatantu trasfektovaných buněk stanovena aktivita proliferativním stanovením (Viz Příklad 1) . Supernatant 293 buněk transfektovaných pouze s pRK vektorem nevykazoval žádnou stimulaci Ba/F3 nebo Ba/F3-mp2 buněk (Obr. 12A). Supernatant buněk transfektovaný s pRK5-hmp2 I neměl žádný efekt na Ba/F3 buňky ale výrazně stimuloval proliferaci Ba/F3-mp2 buněk (Obr. 12A), což znamená, že tato cDNA kóduje funkčně aktivní lidský mpl ligand.D.C.). 36 hours after transfection, the activity in the supernatant of transfected cells was determined by proliferative assay (See Example 1). The supernatant of 293 cells transfected with the pRK vector only showed no stimulation of Ba / F3 or Ba / F3-mp2 cells (Fig. 12A). Cell supernatant transfected with pRK5-hmp2 I had no effect on Ba / F3 cells but significantly stimulated proliferation of Ba / F3-mp2 cells (Fig. 12A), meaning that this cDNA encodes a functionally active human mpl ligand.

Příklad 10Example 10

Lidské mpl ligandové isoformy: hML2, hML3 a hML4Human mpl ligand isoforms: hML2, hML3 and hML4

Aby byly identifikovány alternativně spojené formy hML, byly syntetizovány primery odpovídající každému konci kódující sekvence hML. Tyto primery byly použity v RT-PCR k amplifikaci RNA lidských dospělých jater. Navíc byly konstruovány a podobně použity interní primery lemující vybrané oblati, které nás zajímají (viz níže) . Produkt přímého sekvenování konců pomocí PCR ukázalo jednu sekvenci odpovídající přesně sekvenci cDNA izolované z knihovny lidských zárodečných jater (Viz Obr. 1 [SEQ ID NO: 1]) . Ovšem oblast blízko C-konce EPO-domény (ve středu PCR produktu) vykazuje komplex sekvencí charakterem naznačující existenci možných vazebných variant v této oblasti. Aby mohly být isoovány tyto vazebné varianty, byly primery uvedené v Tab. 7 lemující oblast našeho zájmu použity v PCR jako šablona pro cDNA lidských dospělých jater.To identify alternatively linked forms of hML, primers corresponding to each end of the hML coding sequence were synthesized. These primers were used in RT-PCR to amplify human adult liver RNA. In addition, internal primers flanking selected regions of interest were constructed and similarly used (see below). The product of direct end sequencing by PCR showed a single sequence corresponding exactly to the cDNA sequence isolated from the human germline library (See Fig. 1 [SEQ ID NO: 1]). However, the region near the C-terminus of the EPO-domain (at the center of the PCR product) exhibits a complex of sequences by character indicating the existence of possible binding variants in this region. In order to isolate these binding variants, the primers listed in Tab. The flanking region of interest was used in PCR as a template for human adult liver cDNA.

174174

Tab. 7Tab. 7

PCR primery lidské ML isoformyPCR primers of human ML isoform

phmpllcdna.3e1: phmpllcdna.3e1: 5TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3' 5TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3 ' (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 44) pbx4.f2: pbx4.f2: 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3* 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3 * (SEQ ID NO: 46) (SEQ ID NO: 47)

PCR produkty byly subklonovány do M13. Sekvenování individuálních subklonů ukázalo existence nejméně 3 ML isoforem. Jedna z nich hML (také značovaná jako hML332) , je nejdelší formou a odpovídá přesně sekvenci izolované z knihovny zárodečných jater. Sekvence čtyř lidských mplPCR products were subcloned into M13. Sequencing of individual subclones revealed the existence of at least 3 ML isoforms. One of them, hML (also referred to as hML332), is the longest form and corresponds exactly to the sequence isolated from the germline library. Sequence of four human mpl

ligandových isoforem uvedených ligand isoforms mentioned od from nejdelší the longest (hML) po (hML) after nej kratší (hML-4) the shortest (hML-4) jsou uvedeny na are listed at Obr. Giant. 11 [SEQ ID 11 [SEQ ID NO: 6,8,9 NO: 6.8.9 a 10]). and 10]). Příklad 11 Example 11 Konstrukce a Construction a přechodná temporary exprese isoforem a isoform expression a

substitucionálních variant lidského mpl ligandu (hML2, hML3, a hML(R153A,R154A)human mpl ligand substitution variants (hML2, hML3, and hML (R153A, R154A)

Isoformy hML2 a hML3 a substitucionální varianta hML(R153A,R153A) byly znovuvytvořeny z hML s použitím rekombinantní PCR techniky popsané v Russell a Higuchi, v PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H. Gelfland, J.J.Sninsky & T.J. White Editors.The hML2 and hML3 isoforms and the hML substitution variant (R153A, R153A) were recreated from hML using the recombinant PCR technique described in Russell and Higuchi, in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Acad. Press, M. A.Innis, D.H. Gelfland, J. J. Sninsky & T.J. White Editors.

Použité „vnější primery a jsou ukázány v Tab. 8 a „překrývající se (overlapping) primery v Tab. 9.The outer primers used are shown in Tab. 8 and overlapping primers in Tab. 9.

175175

Tab. 8Tab. 8

Vnější primeryOuter primers

Cla.FL.F2: 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3* Cla.FL.F2: 5'ATC GAT ATC GAT AGC CAG (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 48) HMPLL-R: 5’GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA3' HMPLL-R: 5’GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG (SEQ ID NO: 48) (SEQ ID NO: 47)

Tab. 9Tab. 9

Překrývající se primeryOverlapping primers

frMl,“·?; MU4.F: 5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3' MLA4.R 5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3' frMl, “· ?; MU4.F: 5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3 ' MLA4.R 5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3 ' (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 51) hMLAl 16+: 5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3' hM LA116-: 5'AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3' hMLAl 16+: 5'CTG CTC CGA GGA hM LA116-: 5AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3 ' (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52) (SEQ ID NO: 52) (SEQ ID NO: 51) fíM,L(R35.3Ai_Β154Δ1: RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C 3' RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G 3' film, L (R35.3Ai_1554-1): RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG (SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 54) (SEQ ID NO: 54) (SEQ ID NO: 54)

Všechna PCR rozšíření byla provedena s klonovanou Pfu DNA polymerasou (Stratagene) s použitím následujícíh podmínek: počáteční detaturace šablony byla 94 °C 7 min., následovalo 30 cyklů 1 min 94°C, 1 min. 55°C a 1,5 min 72°C. Konečný cyklus byl prodloužen na 10 min 72°C. Konečný PCR produkt byl digestován Clal-Sbal, gelově purifikován a klonován v pRK5tkneo. 293 buňky byly trasfektovány různýmiAll PCR extensions were performed with cloned Pfu DNA polymerase (Stratagene) using the following conditions: initial template detaturation was 94 ° C for 7 min, followed by 30 cycles of 1 min 94 ° C, 1 min. 55 ° C and 1.5 min 72 ° C. The final cycle was extended to 10 min 72 ° C. The final PCR product was digested with Cla1-Sbal, gel purified and cloned in pRK5tkneo. 293 cells were transfected with various

176 konstrukty jak je popsáno výše a supernatant byl stanoven s použitím Ba/F3-mpl proliferativního stanovení, ovšem aktivity hML(R153A, R154A) byly podobné jako u hML, což znamená, že procesy na tomto dibasickém místě nejsou nutné pro aktivitu (viz Obr. 13).176 constructs as described above and the supernatant was determined using a Ba / F3-mpl proliferative assay, but hML activities (R153A, R154A) were similar to hML, meaning that processes at this dibasic site are not required for activity (see Figs. . 13).

Příklad 12 cDNA myšího mpl ligandu mML, mML-2 a mML-3Example 12 cDNA of mouse mpl ligand mML, mML-2 and mML-3

Isolace cDNA mMLIsolation of mML cDNA

DNA fragment odpovídající úplné kódující oblasti lidského mpl ligandu byl získán pomocí PCR, gelově purifikován a náhodně značen napojením v přítomnosti ³²P-dATP a ³²P-dCTP. Tento vzorek byl použit pro screening 10⁶ klonů cDNA knihovny myších jater v XGTIO (Clontech catč. MLlOOla). Duplikátní filtráty byly hybridizovány v 35% formamidu, 5xSSC, lOxDenhardt's, 0,1% SDS, 0,05M fosfátu sodném (pH 6,5), 0,1% pyrofosfátu sodném, 10 gg/ml sonizované lososí spermatické DNA přes noc v přítomnosti vzorku. Filtráty byly promyty 2xSSC a poté promyty jednou v 0,5xSSC, 0,1% SDS při 42°C. Hybridizuj ící fágy byly plakpurifikovány a cDNA inserty byly subklonovány do Eco R1 místa Bluescript SD-plasmidu. Klon „LD s 1,5 kb insertem byl vybrán pro další analýzu a obě vlákna byla sekvenována jak je popsáno výše pro lidskou ML cDNA. Nukleotidová a vyvozená aminokyselinová sekvence z LD klonu jsou uvedeny na Obr. 14 (SEQ ID NO: 1 a 11) . Vyvozená sekvence zralého ML z tohoto klonu byla 331 aminokyselinových zbytků dlouhá a byla identifikována jako mML33i (nebo mML-2 z důvodů popsaných níže). Značná identita obou nukleotidů a vyvozených aminokyselinových sekvencí byla pozorována u domén EPO-typu těchto ML. Ovšem když byly sekvence lidské a myší HL položeny vedle sebe, myší sekvence vykazujeThe DNA fragment corresponding to the complete coding region of the human mpl ligand was obtained by PCR, gel purified and randomly labeled by fusion in the presence of ³² P-dATP and ³² P-dCTP. This sample was used to screen 10 ⁶ mouse liver cDNA library clones in XGTIO (Clontech cat. ML100a). Duplicate filtrates were hybridized in 35% formamide, 5xSSC, 10xDenhardt's, 0.1% SDS, 0.05M sodium phosphate (pH 6.5), 0.1% sodium pyrophosphate, 10 gg / ml sonicated salmon sperm DNA overnight in the presence of sample. The filtrates were washed 2xSSC and then washed once in 0.5xSSC, 0.1% SDS at 42 ° C. The hybridizing phages were plaque purified and the cDNA inserts were subcloned into the Eco R1 site of the Bluescript SD plasmid. The 1.5 kb insert LD clone was selected for further analysis and both strands were sequenced as described above for human ML cDNA. The nucleotide and deduced amino acid sequences from the LD clone are shown in FIG. 14 (SEQ ID NOS: 1 and 11). The deduced mature ML sequence from this clone was 331 amino acid residues long and was identified as mML33i (or mML-2 for the reasons described below). Considerable identity of both nucleotides and deduced amino acid sequences was observed in the EPO-type domains of these MLs. However, when the human and murine HL sequences were placed side by side, the murine sequences showed

177 tetrapeptidovou delecí mezi lidskými zbytky 111-114 odpovídajícími 12 nukleotidové deleci následující nukleotidovou pozici 618 vyskytující se u lidské (viz výše) i prasečí (viz níže) cDNA. Tedy byly testovány další klony k detekci možných ML isoforem. Jeden klon, „L7, měl 1,4 kb insert s 335 aminokyselinovou vyvozenou sekvencí obsahující „chybějící tetrapeptid LPLQ. Předpokládá se, že tato. forma je myší ML plné délky a je označena jako mML nebo mML335 . Nukleotidová a vyvozená aminokyselinová sekvence mML je znázorněna na Obr. 18 (SEQ ID NO: 12 a 13) . Nakonec, byl isolován a sekvenován klon „L2. Tento klon má 116 nukleotidovou deleci odpovídající hML3 a je tedy označen mML-3. Srovnání vyvozených aminokyselinových sekvencí těchto dvou isoforem je ukázáno na Obr. 16.177 by a tetrapeptide deletion between human residues 111-114 corresponding to the 12 nucleotide deletion following nucleotide position 618 occurring in both human (see above) and porcine (see below) cDNAs. Thus, other clones were tested to detect possible ML isoforms. One clone, "L7," had a 1.4 kb insert with a 335 amino acid deduced sequence containing "missing LPLQ tetrapeptide." It is assumed that this. the form is full length murine ML and is designated as mML or mML335. The nucleotide and deduced amino acid sequence of mML is shown in FIG. 18 (SEQ ID NOS: 12 and 13). Finally, clone L2 was isolated and sequenced. This clone has a 116 nucleotide deletion corresponding to hML3 and is therefore designated mML-3. A comparison of the deduced amino acid sequences of the two isoforms is shown in FIG. 16.

Exprese rekombinantního mML.Expression of recombinant mML.

Expresní vektor pro myší ML byl připraven v podstatě tak jak je popsáno v Příkladu 8. Klony kódující mML a‘mML-2 byly subklonovány do pRK5tneo, savčího expresního vektoru, který poskytuje expresi za kontroly CMV promotoru a SV40 polyadenylačního signálu. Výsledné expresní vektory, mMLpRKtkneo a mML2pRKtneo byly přechodně transfektovány do 293 buněk s použitím kalciumfosfátové metody.Po transfekci bylo médium sledováno pět dní. Buňky byly udržovány ve vysoce glukosovém DMEM médiu obohaceném 10% zárodečným telecím sérem.The mouse ML expression vector was prepared essentially as described in Example 8. Clones encoding mML and mML-2 were subcloned into pRK5tneo, a mammalian expression vector that provides expression under the control of the CMV promoter and SV40 polyadenylation signal. The resulting expression vectors, mMLpRKtkneo and mML2pRKtneo were transiently transfected into 293 cells using a calcium phosphate method. After transfection, the medium was monitored for five days. Cells were maintained in high glucose DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum.

Exprese myšího-mpl (irunpl) v Ba/F3 buňkách.Expression of mouse-mpl (irunpl) in Ba / F3 cells.

Stabilní buněčné linie exprimující c-mpl byly získány transfekcí nunpl pRKtkneo, v podstatě tak jak je popsáno pro lidský mpl v Příkladu 1. Krátce, expresní vektor (20 gg; linearizovaný) obsahující úplnou kódující sekvenci myšího mpl (Skoda, R.C., a kol., EMBO J. 12: 2645-2653 [1993] byl transfektován do Ba/F3 buněk elektroporací (5xl0⁶ buněk,Stable cell lines expressing c-mpl were obtained by transfecting nunpl pRKtkneo, essentially as described for human mpl in Example 1. Briefly, an expression vector (20 gg; linearized) containing the full coding sequence of mouse mpl (Skoda, RC, et al. , EMBO J. 12: 2645-2653 [1993] was transfected into Ba / F3 cells by electroporation (5x10 ⁶ cells,

178178

250 voltů, 960 μΡ) s následující selekcí na neomycinovou resistenci s 2 mg/ml G418. Exprese mpl byla stanovena průtokovou cytometrickou analýzou s použitím králičího anti-myšího mpl-lgG antíséra. Ba/F3 buňky byly udržovány v RPMI 1640 médiu z WEHI -3B buněk jako zdroje IL-3. Supernatanty z 293 buněk přechodně transfektovaných mML i mML-2 byly stanoveny v Ba/F3 buňkách transfektovaných mmpl i hmpl jak je popsáno v Příkladu 1.250 volts, 960 μΡ) followed by selection for neomycin resistance with 2 mg / ml G418. Mpl expression was determined by flow cytometric analysis using a rabbit anti-mouse mpl-IgG antiserum. Ba / F3 cells were maintained in RPMI 1640 medium from WEHI -3B cells as a source of IL-3. Supernatants from 293 cells transiently transfected with both mML and mML-2 were determined in Ba / F3 cells transfected with mmpl and hmpl as described in Example 1.

Příklad 13 cDNA vepřového mpl ligandu: pML a pML-2 cDNA vepřového ML (pML) ligandu byla isolována pomocíExample 13 porcine mpl ligand cDNA: pML and pML-2 Porcine ML (pML) ligand cDNA was isolated using

RACE PCR. Krátce, oligo dT primer a 2 specifické primery byly sestrojeny na základě sekvence exonu vepřového ML genu kódujícího aminokonec ML purifikovaného z aplastického vepřového séra. cDNA připravená z různých aplastických vepřových tkání byla získána a amplifikována. PCR cDNA produkt s 1342 bp byl nalezen v ledvinách a subklonován.RACE PCR. Briefly, the oligo dT primer and 2 specific primers were constructed based on the exon sequence of the porcine ML gene encoding the amino terminus of ML purified from aplastic porcine serum. cDNA prepared from various aplastic porcine tissues was obtained and amplified. A 1342 bp PCR cDNA product was found in the kidney and subcloned.

Některé klony byly sekvenovány a bylo zjištěno, že kódují zralý mpl ligand (nezahrnující kompletní sekreční signál). Bylo zjištěno, že cDNA kóduje 332 aminokyselinový zralý protein (PML332) , který má sekvenci zobrazenou na Obr. 18 (SEQ ID NO: 9 a 16).Some clones were sequenced and were found to encode the mature mpl ligand (not including the complete secretion signal). The cDNA was found to encode a 332 amino acid mature protein (PML332) having the sequence shown in FIG. 18 (SEQ ID NOS: 9 and 16).

Postup:Method:

Isolace pML genu a cDNA. Genomické klony vepřového ML genu byly isolovány screeningem v podstatě tak jak je popsáno v Příkladu 7. Některé klony byly isolovány a byl sekvenován exon kódující aminokyselinovou sekvenci identickou se sekvencí získanou z purifikovaného ML. Vepřová ML cDNA byla získání použitím modifikace RACE PCR postupu. Byly sestrojeny dva specifické ML primery založené na sekvenci vepřového ML genu. Polyadenylovaná mRNA bylaIsolation of pML gene and cDNA. Genomic clones of the porcine ML gene were isolated by screening essentially as described in Example 7. Some clones were isolated and an exon encoding an amino acid sequence identical to that obtained from purified ML was sequenced. Porcine ML cDNA was obtained using a modification of the RACE PCR procedure. Two specific ML primers were constructed based on the porcine ML gene sequence. Polyadenylated mRNA was

179 isolována z ledvin aplastických vepřů v podstatě tak jak bylo dříve popsáno. cDNA byla připravena pomocí reversní transkripce s BamdT primerem (BamdT: 5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3') (SEQ ID NO: 55) přímo proti polyadenosinovanému prodloužení mRNA. Úvodní cyklus PCR amplifikace (28 cyklů 95°C 60 s, 58°C 90 s) byl proveden s použitím ML specifického h-předsunutého-1 primerů (h-předsunutý-l:5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3') (SEQ ID NO: 43) a BAMAD primerů (BAMAD: 5'GACTCGAGGATCCATCG3') (SEQ ID NO: 56) v 100 ml reakční směsi (50 mM KC1, 1,5 mM MgCl, lOmM Tris pH 8,0, 0,2 mM dNTPs, s 0,05 U/ml Amplitaq polymerasy [Perkin Elmer lne.]). Produkt PCR bylo poté digestován Clal, extrahován fenol-chloroformem (1:1), precipitován ethanolem, a ligován na 0,1 mg Bluescript SK-vektor (Stratagene lne.), který byl štěpen Clal a Kpnl.’ Po inkubaci dvě hodiny při laboratoraní teplotě byla čtvrtina ligační směsi přidána přímo do druhého cyklu PCR (22 cyklů jak je popsáno výše) s použitím druhého ML specifického předsunutého-1 primerů (předsunutý-1:5'GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3') (SEQ ID NO: 57) a T3-21 (oligonunukleotid, který se váže na sekvenci sousední k násobné klonovací oblasti v Bluescript SKvektoru):179 isolated from the kidneys of aplastic pigs essentially as previously described. The cDNA was prepared by reverse transcription with a BamdT primer (BamdT: 5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3 ') (SEQ ID NO: 55) directly against polyadenosine mRNA extension. The initial PCR amplification cycle (28 cycles of 95 ° C 60 s, 58 ° C 90 s) was performed using ML specific h-forward-1 primers (h-forward-1: 5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3 ') (SEQ ID NO: 43 ) and BAMAD primers (BAMAD: 5'GACTCGAGGATCCATCG3 ') (SEQ ID NO: 56) in 100 ml reaction mixture (50 mM KCl, 1.5 mM MgCl, 10 mM Tris pH 8.0, 0.2 mM dNTPs, with 0 , 05 U / ml Amplitaq polymerase [Perkin Elmer Inc.]). The PCR product was then digested with Clal, extracted with phenol-chloroform (1: 1), precipitated with ethanol, and ligated to 0.1 mg Bluescript SK-vector (Stratagene Inc) that had been digested with Clal and Kpnl. at room temperature, a quarter of the ligation mixture was added directly to the second PCR cycle (22 cycles as described above) using the second ML-specific forward-1 primers (forward-1: 5'GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3 ') (SEQ ID NO: 57) and T3- 21 (an oligonunucleotide that binds to a sequence adjacent to the multiple cloning region in the Bluescript SKvector):

(5'CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3') (SEQ ID NO: 58).(5'CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3 ') (SEQ ID NO: 58).

180180

Výsledné PCR produkty byly digestovány pomocí Xbal a Clal a subklonovány na Bluescript SK-. Některé klony z nezávislých PCR reakcí byly sekvenovány.The resulting PCR products were digested with XbaI and ClaI and subcloned on Bluescript SK-. Some clones from independent PCR reactions were sequenced.

Opět byla identifikována druhá forma, označena jako pML-2, kódující protein s deleci čtyř aminokyselinových zbytků (328 aminokyselinové zbytky) (viz Obr. 21 [SEQ ID NO: 21]). Srovnání pML a pML-2 aminokyselinových sekvencí ukazuje, že pML-2 je identická kromě tetrapeptidu QLPP odpovídajícího zbytkům 111-114 včetně, které podléhají deleci (viz Obr. 22 [SEQ ID NO: 18 a 21]). Čtyř aminokyselinové delece pozorované v myší, lidské a vepřové ML cDNA se objevuje na přesně stejném místě ve vyvozeném proteinu.Again, a second form, designated pML-2, encoding a protein having a deletion of four amino acid residues (328 amino acid residues) was identified (see Figure 21 [SEQ ID NO: 21]). Comparison of pML and pML-2 amino acid sequences shows that pML-2 is identical except for the tetrapeptide QLPP corresponding to residues 111-114 inclusive that are subject to the deletion (see Fig. 22 [SEQ ID NOs: 18 and 21]). The four amino acid deletions observed in mouse, human and porcine ML cDNA appear at exactly the same site in the deduced protein.

Příklad 14Example 14

CMK stanovení trombopoetinové (TPO) indukce exprese destičkového antigenu GPIIbIIIaCMK assay of thrombopoietin (TPO) induction of GPIIbIIIa platelet antigen expression

CMK buňky byly udržovány v RMPI 1640 médium (Sigma) obohaceném 10% zárodečným vepřovým sérem a lOmM glutaminem. Při přípravě stanovení byly buňky shromážděny, promyty a resuspendovány při 5xlO⁵ buněk/ml v GIF médiu bez séra obohaceným 5mg/l hovězím insulinem, 10mg/l apotransferinem, 1 X stopovými prvky. Do 96 jamkové destičky s jamkami s plochým dnem byl přidán TPO standard nebo experimentální vzorky do každé jamky s příslušným ředěním v 100 μΐ objemu. Do každé jamky je přidáno 100 μΐ CMK buněčné suspenze a destičky jsou inkubovány při 37°C, v 5% CO₂ inkubátoru 48 hodin. Po inkubaci byly destičky odstředěny při 1000 rpm při 4°C 5 min. Supernatant byl odstraněn a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ FITC-konjugované GPIIbIIIa monoklonální 2D2 protilátky. Následovala inkubace při 4°C 1 hod., destičky byly znovu odstředěny při 1000 rpm 5 min.CMK cells were maintained in RMPI 1640 medium (Sigma) supplemented with 10% germline pig serum and 10mM glutamine. To prepare the assay, cells were collected, washed and resuspended at 5x10 ⁵ cells / ml in serum-free GIF medium supplemented with 5mg / L bovine insulin, 10mg / L apotransferin, 1 X trace elements. In a 96-well flat-bottom plate, TPO standard or experimental samples were added to each well with appropriate dilutions in 100 μΐ volume. 100 μΐ of CMK cell suspension is added to each well and the plates are incubated at 37 ° C, in a 5% CO ₂ incubator for 48 hours. After incubation, the plates were centrifuged at 1000 rpm at 4 ° C for 5 min. The supernatant was discarded and 100 μΐ of FITC-conjugated GPIIbIIIa monoclonal 2D2 antibody was added to each well. Following incubation at 4 ° C for 1 hr, the plates were centrifuged again at 1000 rpm for 5 min.

181181

Supernatanty obsahující nenavázanou protilátku byly odstraněny a do každé jamky bylo přidáno 0,1% BSA-PBS promývacího roztoku. 0,1% BSA-PBS promývací krok byl třikrát zopakován. Buňky byly poté analyzovány na FASCAN s použitím jednoparametrové analýzy měřící intensitu relativní fluorescence.Supernatants containing unbound antibody were discarded and 0.1% BSA-PBS wash solution was added to each well. The 0.1% BSA-PBS wash step was repeated three times. The cells were then analyzed for FASCAN using a single parameter analysis measuring the relative fluorescence intensity.

Příklad 15Example 15

DAMI stanovení trombopoetinu (TPO) měřením endomitotické aktivity DAMI buněk na 96 jamkové mikrotitrační destičceDAMI determination of thrombopoietin (TPO) by measuring the endomitotic activity of DAMI cells in a 96 well microtiter plate

DAMI buňky byly uchovávány v IMDM + 10% koňského séra (Gibco) obohaceném lOmM glutaminem, lOOng/ml Penicilinem G, a 50 gg/ml streptomycinem. Při přípravě na stanovení byly buňky shromážděny, promyty a resuspendovány při lxlO⁶ buněk/ml v IMDM + 1% koňského séra. Na 96-jamkovou destičku s kulatým dnem bylo do DAMI buněčné suspense přidáno 100 μΐ TPO standardu nebo experimentálních vzorků. Buňku byly poté inkubovány 48 hodin při 37 °C v 5% CO₂ inkubátoru. Po inkubaci byly destičky odstředěny v Sorvall 600B centrifuze při 1000 rpm 5 min. při 4°C. Supernatanty byly odebrány a bylo opakováno promytí 200 μΐ PBS-0,1% BSA. Buňky byly fixovány přidáním 200 μΐ ledově chladného 70% ethanol-PBS a resuspendovány aspirací. Po inkubaci při 4°C 15 min. byly destičky odstředěny při 2000 rpm 5 min. a do každé jamky bylo přidáno 150 μΐ lmg/ml RNAsy obsahující 0,1 mg/ml propidiumjodidu a 0,05% Tweenu-20. Po 1 hod. inkubaci při 37°C byly změřeny změny obsahu DNA průtokovou cytometrií. Polyploidita je měřena a kvantifikována následovně:DAMI cells were stored in IMDM + 10% horse serum (Gibco) supplemented with 10mM glutamine, 100ng / ml Penicillin G, and 50 gg / ml streptomycin. In preparation for the assay, cells were collected, washed, and resuspended at 1x10 ⁶ cells / ml in IMDM + 1% horse serum. 100 μΐ of TPO standard or experimental samples were added to the DAMI cell suspension in a 96-well round bottom plate. The cell was then incubated for 48 hours at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator. After incubation, the plates were centrifuged in a Sorvall 600B centrifuge at 1000 rpm for 5 min. at 4 ° C. Supernatants were collected and the wash was repeated with 200 μΐ PBS-0.1% BSA. Cells were fixed by adding 200 μ 200 ice-cold 70% ethanol-PBS and resuspended by aspiration. After incubation at 4 ° C for 15 min. Plates were centrifuged at 2000 rpm for 5 min. and 150 μΐ lmg / ml RNAse containing 0.1 mg / ml propidium iodide and 0.05% Tween-20 was added to each well. After 1 hour incubation at 37 ° C, changes in DNA content were measured by flow cytometry. Polyploidy is measured and quantified as follows:

182182

Normalizovaný polyploidní poměr (NPR) = = (%buněk v >G2+M/%buněk v<G2+M) s TPO (%buněk v >G2+M/%buněk v<G2+M) v kontroleNormalized polyploid ratio (NPR) = = (% cells in> G2 + M /% cells in <G2 + M) with TPO (% cells in> G2 + M /% cells in <G2 + M) in control

Příklad 16Example 16

Trombopoetinové (TPO) in vivo stanovení (Myší destičkové revazebné stanovení)Thrombopoietin (TPO) in vivo assay (Mouse platelet binding assay)

In vivo stanovení pro ³⁵S stanovení produkce destičekIn vivo assay for ³⁵ S platelet production assay

C57BL6 myši (získané od Charlese Rivera) byly intraperitoneálně (IP) injektovány s lml kozího anti-myšího destičkového séra (6 amps) v den 1, aby vznikla trombocytopenie. Ve dnech 5 a 6 myši dostaly dvě IP injekce faktoru nebo PBS jako kontroly. V den 7 bylo intravenosně injektováno 30 μθί Na2³⁵SO₄ v 0,1 ml solného roztoku a bylo měřeno procento ³⁵S inkorporace z injikované dávky do cirkulujících destiček ve vzorcích krve získaných z léčených i kontrolních myší. Odečet destiček a leukocytů byl proveden ihned po získání krve z retro-orbitálního sinusu.C57BL6 mice (obtained from Charles River) were injected intraperitoneally (IP) with 1 ml goat anti-mouse platelet serum (6 amps) on day 1 to produce thrombocytopenia. On days 5 and 6, mice received two IP injections of factor or PBS as controls. On day 7, 30 μθί Na 2 ³⁵ SO ₄ was injected intravenously in 0.1 ml saline and the percentage of ³⁵ S incorporation from the injected dose into circulating platelets in blood samples obtained from both treated and control mice was measured. Platelet and leukocyte counting was performed immediately after blood retrieval from the retro-orbital sinus.

Příklad 17Example 17

KIRA ELISA pro trombopoetin (TPO) měřením fosforylace mplRse.gD chimerního receptoruKIRA ELISA for thrombopoietin (TPO) by measuring phosphorylation of the mplRse.gD chimeric receptor

Lidský mpl receptor byl objeven Vigonem a kol., PNAS, USA 89: 5640-5644 (1992). Chimérický receptor obsahující extracelulární doménu (ECD) mpl receptoru a transmembránovou (TM) a intracelulární doménu (ICD) RseThe human mpl receptor was discovered by Vigon et al., PNAS, USA 89: 5640-5644 (1992). Chimeric receptor containing the extracellular domain (ECD) of the mpl receptor and the transmembrane (TM) and intracellular domain (ICD) of Rse

183 (Mark a kol., J. of Biol. Chem. 269(14): 10720-10728 [1994]) s karboxyl-koncovým praporkovým polypeptidem (tj . Rse.gD) byl připraven pro zde popsané KIRA ELISA stanovení. Viz Obr. 30 a 31, kde je uvedeno schéma stanovení.183 (Mark et al., J. of Biol. Chem. 269 (14): 10720-10728 [1994]) with a carboxyl-terminal flag polypeptide (i.e., Rse.gD) was prepared for the KIRA ELISA described herein. See FIG. 30 and 31 for a determination scheme.

(a) Postup získání agens(a) Agents Acquisition Procedure

-- Monoklonální anti-gD (klon 5B6) byl připraven proti peptidů z Herpes simplex virového glykoproteinu D (Paborsky a kol., Protein Engineering 3(6):547-553 [1990]). Purifikovaný zásobní materiál byl upraven na 3,0 mg/ml ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS), pH 7,4 a 1,0 ml alikvoty byly uchovávány při -20°C.Monoclonal anti-gD (clone 5B6) was prepared against peptides from Herpes simplex viral glycoprotein D (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6): 547-553 [1990]). The purified stock was adjusted to 3.0 mg / ml in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 and 1.0 ml aliquots were stored at -20 ° C.

(b) Příprava anti-fosfotyrosinové protilátky(b) Preparation of an anti-phosphotyrosine antibody

Monoklonální anti-fosfotyrosin, klon 4G10, byl získán z UBI (Lake Placin, NY) a byotinylován s použitím dlouhoramenného biotin-N-hydroxysukcinamidu (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).Monoclonal anti-phosphotyrosine, clone 4G10, was obtained from UBI (Lake Placin, NY) and byotinylated using long-arm biotin-N-hydroxysuccinamide (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

(c) Ligand(c) Ligand

Mpl ligand byl připraven zde popsanými rekombinantními technikami. Purifikovaný mpl ligand byl uchováván při 4°C jako zásobní roztok.The Mpl ligand was prepared by recombinant techniques described herein. The purified mpl ligand was stored at 4 ° C as a stock solution.

(d) Příprava Rse.gD nukleové kyseliny(d) Preparation of Rse.gD nucleic acid

Syntetické dvouvláknové oligonukleotidy byly použity pro přetvoření kódující sekvence pro C-koncových 10 aminokyselin (880-890) lidského Rse a přidání dalších 21 aminokyselin obsahujících epitop pro protilátku 5B6 a stop kodón. Tabulka 10 ukazuje výslednou sekvenci syntetické části fúzního genu.Synthetic double stranded oligonucleotides were used to reshape the coding sequence for the C-terminal 10 amino acids (880-890) of human Rse and add another 21 amino acids containing the epitope for antibody 5B6 and the stop codon. Table 10 shows the resulting sequence of the synthetic portion of the fusion gene.

184184

Tab. 10Tab. 10

Syntetická dvouvláknová část lidského Rse fúzního genuSynthetic double stranded portion of the human Rse fusion gene

kóduje/ VÍO-khO .· 5-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA TGGCTG ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3* encodes / VÍO-khO. · 5-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA TGGCTG ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT-3 * (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 59) ne.k°ť?lM jZeZ roliC hnevhoj V 5’-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCA TCTTG AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3' ne.k ° ť? lM jZeZ roleC hnevhoj V 5’-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCA TCTTG AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3 ' (SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 60)

Syntetická DNA byla ligována s cDNA kódující aminokyseliny 1-880 lidského Rse na Pstl místě začínajícím na nukleotidu 2644 publikované lidské Rse cDNA kódující sekvence (Mark a kol., Journal of Biological Chemistry 269(14): 10720-10728 [1994]) a HindlII místech v polylinkeru expresního vektoru pSVl7.ID.LL (viz Obr. 32 AL, SEQ ID NO: 22) za vzniku expresního plasmidu pSV.ID.Rse.gD. Krátce, expresní plasmid obsahuje dicistronický primární transkript, který obsahuje sekvenci kódující DHFR vázaný 5' spojovacím donorem a 3' spojovacím akceptorem intronových spojovacích míst, následovaný sekvencí která kóduje Rse.gD. Message plné délky (nezkrácený) obsahuje DHFR jako první čtecí rámec a tedy generuje DHFR protein, což umožňuje selekci stabilních transformantů.Synthetic DNA was ligated with cDNA encoding amino acids 1-880 of human Rse at a PstI site starting at nucleotide 2644 of the published human Rse cDNA coding sequence (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269 (14): 10720-10728 [1994]) and HindIII sites in the polylinker of the expression vector pSV17.ID.LL (see Fig. 32A1, SEQ ID NO: 22) to form the expression plasmid pSV.ID.Rse.gD. Briefly, the expression plasmid contains a dicistronic primary transcript that contains a DHFR coding sequence linked by a 5 'linker donor and a 3' linker acceptor for intron linkers, followed by a sequence that encodes Rse.gD. The full-length message (unabridged) contains DHFR as the first reading frame and thus generates DHFR protein, allowing selection of stable transformants.

(e) Příprava mpl-Rse.gD nukleové kyseliny(e) Preparation of mpl- Rse.gD nucleic acid

Expresmí plasmid pSV.ID.Rse.gD připravený jak je popsáno výše byl modifikován za vzniku plasmidu pSV.ID.M.tmRd6, který obsahuje kódující sekvence ECD lidského mpl (aminokyseliny 1-491) fúzované doThe expression plasmid pSV.ID.Rse.gD prepared as described above was modified to give plasmid pSV.ID.M.tmRd6 which contains the ECD coding sequences of human mpl (amino acids 1-491) fused to

185 transmembránové domény a intracelulární domény Rse.gD (aminokyseliny 429-911). K navázání kódující sekvence části extracelulární domény lidského mpl na část Rse kódující sekvence ve druhém kroku PCR klonující reakce byly použity syntetické oligonukleotidy, jak popsal Mark a kol., J. Biol. Chem. 267: 26166-26171 [1992]. V prvném PCR reakci byly použity primery Ml (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3*) (SEQ ID NO: 61) a M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3j (SEQ ID NO: 62) s mpl cDNA šablonou a Rl (5’-G G G C C ATG AC ACTGTC A A-3') (SEQ ID NO: 63) a R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) s Rse cDNA šablonou. Pvull-Smal část tohoto fúzního spojení byla použita pro konstrukci chimerního receptoru plné délky.185 transmembrane domains and intracellular domains of Rse.gD (amino acids 429-911). Synthetic oligonucleotides were used to link the coding sequence of a portion of the extracellular domain of human mpl to a portion of the Rse coding sequence in the second step of the PCR cloning reaction as described by Mark et al., J. Biol. Chem. 267: 26166-26171 [1992]. In the first PCR reaction, primers M1 (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3 *) (SEQ ID NO: 61) and M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3j (SEQ ID NO: 62) with mpl cDNA template and R1 (5'-) were used. GGGCC ATG AC ACTGTC A A-3 ') (SEQ ID NO: 63) and R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTTT-3') with the Rse cDNA template. construction of a full-length chimeric receptor.

(f) Buněčná transformace(f) Cell transformation

DP12.CHO buňky (EP 307,247 publikovaný 15. března 1989) byly elektroporovány s pSV.ID.M.tmRd6, který byl linearizován na specifickém Notl místě v páteři plasmidu. DNA byla precipitována ethanolem po fenol/chloroform extrakci a resuspendována v 20 μΐ 1/10 Tris EDTA. Potom bylo 10 μΐ DNA inkubováno s 10⁷ CHO DP12 buněk v 1 ml PBS na ledu 10 minut před elektroporací při 400 voltech a 330μί. Buňky byly vráceny na 10 minut na led před nanesením na neselektivní médium. Po 24 hodinách byly buňky živenyDP12.CHO cells (EP 307,247 published March 15, 1989) were electroporated with pSV.ID.M.tmRd6 which was linearized at a specific NotI site in the plasmid backbone. DNA was ethanol precipitated after phenol / chloroform extraction and resuspended in 20 μΐ of 1/10 Tris EDTA. Then, 10 μΐ of DNA was incubated with 10 ⁷ CHO DP12 cells in 1 ml PBS on ice for 10 minutes before electroporation at 400 volts and 330μί. Cells were returned for 10 minutes on ice before plating on nonselective medium. After 24 hours, the cells were fed

186 médiem bez nukleosidů, aby byly selektovány stabilní DHFR+ klony.186 nucleoside-free medium to select stable DHFR + clones.

(g) Selekce transformovaných buněk pro použití v KIRA ELISA(g) Selection of transformed cells for use in KIRA ELISA

Klony exprimující MPL/Rse.gD 'byly identifikovány western blotingem celého buněčného lyzátu po frakcionaci SDS-PAGE s použitím protilátky 5B6, která detekuje gD epitopový praporek.MPL / Rse.gD 'expressing clones were identified by western blotting of whole cell lysate after fractionation of SDS-PAGE using antibody 5B6, which detects the gD epitope flag.

(h) Médium(h) Medium

Buňky byly pěstovány v F12/DMEM 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Médium bylo obohaceno 10% diafiltrovaného FBS (GyClone, Logan, Utah), 25mM HEPES a 2mM L-glutaminem.Cells were grown in F12 / DMEM 50:50 (Gibco / BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). The medium was enriched with 10% diafiltered FBS (GyClone, Logan, Utah), 25 mM HEPES and 2 mM L-glutamine.

(i) KIRA ELISA(i) KIRA ELISA

Mpl-Pse .gD transformované DP12.CHO buňky byly naočkovány (3xl0⁴ na jamku) do jamek 96-jamkové kultivační destičky s plochým dnem v 100 μΐ média a kultivovány přes noc při 37 °C v 5% CO2. Následující ráno byly jamkové supernatanty dekantovány, a destičky byly lehce osušeny papírovým ručníkem. Do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ média obsahujícího buď experimentální vzorky nebo 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 nebo 0 ng/ml mpl ligandu. Buňky byly stimulováni při 37°C 30 min., supernatanty byly dekantovány a destičky bylo znovu ještě jednou osušeny na papírovém ručníku. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ lýzovacího pufru, aby byly buňky lýzovány a solubilizovány chimérické receptory. Lýzovací pufr se skládá ze 150mM NaCl obsahující mM HEPES (Gibco), 0,5% Tritonu-X 100 (Gibco),Mpl-Pse .gD transformed DP12.CHO cells were seeded (3x10 ⁴ per well) into 96-well flat-bottom culture plates in 100 μΐ medium and cultured overnight at 37 ° C in 5% CO 2. The following morning the well supernatants were decanted, and the plates were gently dried with a paper towel. 50 μΐ of medium containing either experimental samples or 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 or 0 ng / ml mpl ligand was added to each well. The cells were stimulated at 37 ° C for 30 min, the supernatants were decanted, and the plates were dried again on a paper towel. 100 μΐ lysis buffer was added to each well to lyse and solubilize chimeric receptors. The lysis buffer consists of 150 mM NaCl containing mM HEPES (Gibco), 0.5% Triton-X 100 (Gibco),

0,01 % thimerosalu, 30 KlU/ml aprotinu (ICN Biochemicals, Aurora, OH), lmM 4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoridhydrochloridu (AEBSF; ICN0.01% thimerosal, 30 KI / ml aprotin (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF; ICN

Biochemicals), 50 M leupeptinu (ICN Biochemicals), a 2 mM orthovanadátu sodného (Na₃VO4,· Sigma Chemical Co, St.Sigma Chemical Co, St. Biochemicals), 50 M leupeptin (ICN Biochemicals), and 2 mM sodium orthovanadate (Na ₃ VO 4).

187187

Louis, MO), pH 7,5. Destička byla mírně protřepána na destičkové třepačce (Bellco Instruments, Vineland, NJ) 60 min. při laboratorní teplotě.Louis, MO), pH 7.5. The plate was gently shaken on a plate shaker (Bellco Instruments, Vineland, NJ) for 60 min. at room temperature.

Zatímco byly buňky solubilizovány, ELISA mikrotitrační destička (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) byl pokryta přes noc při 4°C 5B5 monoklonální anti-gD protilátkou (5,0 gg/ml v 50 mM karbonátovém pufru, pH 9,6, 10 μΙ/jamku), byla dekantována, usušena na papírovém ručníku a blokována s 150 μΙ/jamku blokovacího pufru [PBS obsahující 0,5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) a 0,01% thimerosalu] 60 minut při laboratorní teplotě za mírného třepání. Po 60 min. byla anti-gD 5d6 pokrytá destička promyta 6 krát promývacím pufrem (PBS obsahující 0,05% Tween-20 a 0,01 % thimerosal) s použitím automatizovaného destičkového promývače (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc, Sterling, VA).While cells were solubilized, an ELISA microtiter plate (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) was coated overnight at 4 ° C with 5B5 monoclonal anti-gD antibody (5.0 gg / ml in 50 mM carbonate buffer, pH 9.6, 10). was decanted, dried on a paper towel, and blocked with 150 μΙ / well blocking buffer [PBS containing 0.5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) and 0.01% thimerosal] for 60 minutes at room temperature at room temperature. gentle shaking. After 60 min. the anti-gD 5d6 coated plate was washed 6 times with wash buffer (PBS containing 0.05% Tween-20 and 0.01% thimerosal) using an automated plate washer (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA).

Lyzát obsahující solubilizovány MPL/Rse.gD z buněčné kultury mikrotitrační destičky byl nanesen (85 μΙ/jamku) do anti-gD 5B6 pokrytou a blokovanou ELISA jamku a inkubován 2 hod. při laboratorní teplotě s mírným třepáním. Nenavázaný mpl-Rse.gD byl odstraněn promytím promývacím pufrem a 100 μΐ biotinylovaného 4G10 (anti-fosfotyrosinu) naředěného 1:180000 v ředícím pufru (PBS obsahujícím 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 5 mM EDTA a 0,01% thimerosalu), t j . na každou misku 56 ng/ml. Destička byla inkubována 30 minut při laboratorní teplotě při mírném třepání. Volné avidinkonjugáty byly odstraněny promytím a do každé misky bylo přidáno 100 μΐ čerstvě připraveného substrátového roztoku (tetramethyl benzidin [TMB]; 2-složkový substrátový kit, Kirkegaard a Perry, Gaithersburg, MD) . Reakce probíhala 10 min. a potom bylo vyvíjení barvy ukončeno přidáním 1,0 MLysate containing solubilized MPL / Rse.gD from microtiter plate cell culture was plated (85 μΙ / well) in an anti-gD 5B6 coated and blocked ELISA well and incubated for 2 hours at room temperature with gentle shaking. Unbound mpl-Rse.gD was removed by washing with wash buffer and 100 μΐ biotinylated 4G10 (anti-phosphotyrosine) diluted 1: 180000 in dilution buffer (PBS containing 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 5 mM EDTA and 0). 01% thimerosal), i.e.. for each dish 56 ng / ml. The plate was incubated for 30 minutes at room temperature with gentle shaking. Free avidin conjugates were removed by washing and 100 μΐ of freshly prepared substrate solution (tetramethyl benzidine [TMB]; 2-component substrate kit, Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) was added to each dish. The reaction was run for 10 min. and then the color development was stopped by adding 1.0 M

188188

H₃PO₄ 100 μΙ/jamku. Byla odečtena absorbance při 450 nm s referenční vlnovou délkou 650 nm (ABS₄so/6so) > s použitím vmax destičkového odečítače (Molecular Devices, Palo alto, CA) za kontroly Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) a DeltaSoft software (BioMetallics, Ing, Princeton, NJ) . .H ₃ PO ₄ 100 μΙ / well. Absorbance at 450 nm with a 650 nm reference wavelength (ABS ₄ so / 6so) was read using a vmax plate reader (Molecular Devices, Palo Alto, CA) under Macintosh Centris 650 controls (Apple Computers, Cupertino, CA) and DeltaSoft software (BioMetallics, Ing., Princeton, NJ). .

Standardní křivka byla generována stimulací dpl2.trkA,B nebo C.gD buněk s 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0,048 nebo 0 ng/ml mpl ligandu a prezentována jako koncentrace které byly získány interpolací jejich absorbance na standardní křivce a byly exprimovány v rozsahu ng/ml TPO aktivity.The standard curve was generated by stimulating dpl2.trkA, B or C.gD cells with 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 or 0 ng / ml mpl ligand and presented as concentrations obtained by interpolating their absorbance on the standard curve and were expressed to the extent of ng / ml TPO activity.

Bylo zjištěno, že mpl-ligand je schopen aktivovat mplRse.gD chimérický receptor v koncentračně-dependentním a ligandově-specifickým způsobem. Dále bylo zjištěno, že mplRse.gD KIRA-ELISA snáší až 100% lidské sérum (je uvedeno) nebo 100% plasmu (není uvedeno), což umožňuje snadný screening pacientů a pK vzorků.The mpl-ligand has been found to be able to activate the mplRse.gD chimeric receptor in a concentration-dependent and ligand-specific manner. Furthermore, mplRse.gD KIRA-ELISA was found to tolerate up to 100% human serum (indicated) or 100% plasma (not shown), allowing easy screening of patients and pK samples.

Křivka 293-produkovaného TPO332293-produced TPO332 curve

(ng/ml)(ng / ml)

189189

Shrnutí TPO EC50Summary of TPO EC50

I TPO Forrna ČUunt¹/)I TPO Forrna Cuunt ¹ /) EC50 (bw./cbj.) EC50 (bw./cbj.) EC50 | (foolaH+A.·) EC50 | (foolaH + A ·) Hu TPO 332 (293) Hu TPO 332 2.56 ng/ml 2.56 ng / ml 67.4 pM 67.4 pM Mu TPO 332 (293) Mu TPO 332 3.69 ng/ml 3.69 ng / ml 97.1 pM 97.1 pM Hu TPO 153 (293) Hu TPO 153 (294) -41 ng/ml -41 ng / ml -1.08 nM -1.08 nM Hu TPO 155 (E coli) Hu TPO 155 E coli 0.44 ng/ml 0.44 ng / ml 11.6 pM 11.6 pM Hu TPO 153met (E coli) Hu TPO 153met (E coli) 0.829 ng/ml 0.829 ng / ml 21.8 pM 21.8 pM

Příklad 18Example 18

Na receptoru založená ELISA pro Trombopoetin (TPO)Receptor Based ELISA for Thrombopoietin (TPO)

ELISA destičky byly potaženy králičím F(ab')₂ antilidským IgG (Fc) v pH 9,6 karbonátového pufru při 4’C přes noc. Destičky byly blokovány 0,5% hovězího sérového albuminu v PBS při laboratorní teplotě jednu hodinu. Produkt fermentace obsahující chimérický receptor, mpl-lgG, byl přidán na destičky a inkubován 2 hod. Dvojnásobné sériové ředění (0,39-25) standardu (TPO332 produkovaného v 293 buňkách s koncentrací stanovenou kvantitativní aminokyselinovou analýzou) a sériově naředěné vzorky v 0,5% hovězím sérovém albuminu, a 0,05% tween 20 byly přidány na destičky a destičky byly inkubovány 2 hodiny. Navázaný TPO byl detekován proteinem A purifikovaných, bionylinovaných králičích protilátek k TPO155, které byly produkovány v E. coli (1 hod inkubace), a následovala streptavidinperoxidasa (30 min. inkubace) a 3,3',5,5'tetramethylbenzidin jako substrát. Absorbance byla odečtena při 450 nm. Destičky byly mezi jednotlivými kroky promyty. Bysta sestrojena standardní křivka s použitím čtyřparametrové křivky podle programu Kaleidagraph. Koncentrace vzorků byly vypočítány ze standardní křivky.ELISA plates were coated with rabbit F (ab ') ₂ anti-human IgG (Fc) in pH 9.6 carbonate buffer at 4 ° C overnight. Plates were blocked with 0.5% bovine serum albumin in PBS at room temperature for one hour. The fermentation product containing the chimeric receptor, mpl-IgG, was added to the plates and incubated for 2 hours. Two-fold serial dilutions (0.39-25) of the standard (TPO332 produced in 293 cells at a concentration determined by quantitative amino acid analysis) and serially diluted samples at 0, 5% bovine serum albumin, and 0.05% tween 20 were added to the plates and the plates were incubated for 2 hours. Bound TPO was detected with protein A purified, bionylinated rabbit antibodies to TPO155, which were produced in E. coli (1 hour incubation), followed by streptavidin peroxidase (30 min incubation) and 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine as substrate. Absorbance was read at 450 nm. Plates were washed between steps. A standard curve was constructed using a four-parameter Kaleidagraph curve. Sample concentrations were calculated from a standard curve.

190190

Příklad 19Example 19

Exprese a purifikace TPO z 293 buněkExpression and purification of TPO from 293 cells

1. Příprava 293 buněčných expresních vektorů cDNA odpovídající TPO úplnému otevřenému čtecímu rámci bylá získána pomocí PCR s použitím následujících oligonukleotidů jako primerů:1. Preparation of 293 cellular cDNA expression vectors corresponding to the TPO complete open reading frame was obtained by PCR using the following oligonucleotides as primers:

Tab. 11Tab. 11

293 PCR Primery293 PCR Primers

CIa.FLF: 5’ ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3' CIa.FLF: 5 'ATC GAT ATC GAT CAG (SEQ ID NO: 65) (SEQ ID NO: 65) hmpll-R: 5’ GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3' hmpll-R: 5 ´ GCT AGC TCT AGA CAG (SEQ ID NO: 48) · (SEQ ID NO: 48) ·

PRK5-h mpl I (popsaný v Příkladu 9) byl použit jako šablona pro reakci v přítomnosti pfu DNA polymerasy (Stratagene). Počáteční denaturace byla provedena 7 min. 94°C a následovalo 25 cyklů amplifikace (1 min. 94°C, 1 min. 55°C a 1 min. 72°C). Nakonec následovalo 15 min. 72°C. PCR produkt byl purifikován a klonován mezi restrikční místa Clal a Xbal plasmidú pRK5tkneo, pRD5 odvozeného vektoru modifikovaného pro expresi genu neomycinové resistence za kontroly thymidinkinasovým promotorem, aby byl získán vektork pRK5tkneo.ORF. Sekundární konstrukt odpovídající epo homologní doméně byl generován stejnýmPRK5-h mpl I (described in Example 9) was used as a template for the reaction in the presence of pfu DNA polymerase (Stratagene). Initial denaturation was performed for 7 min. 94 ° C followed by 25 cycles of amplification (1 min. 94 ° C, 1 min. 55 ° C and 1 min. 72 ° C). Finally 15 min. 72 ° C. The PCR product was purified and cloned between the ClaI and XbaI restriction sites of plasmids pRK5tkneo, a pRD5 derived vector modified to express the neomycin resistance gene under the control of the thymidine kinase promoter to obtain the vector pRK5tkneo.ORF. The secondary construct corresponding to the epo homology domain was generated by the same

192 rhML332 je eluován v 28-30% oblasti gradientu propanolu. Při SDS-PAGE migroval purifikovaný rhMI<332 jako sírový pás v 6880 kDa oblasti gelu (viz obr. 15).192 rhML332 is eluted in the 28-30% region of the propanol gradient. In SDS-PAGE, purified rhMI <332 migrated as a sulfur band in the 6880 kDa region of the gel (see Figure 15).

4. Purifkace rhMLi534. Purification of rhMLi53

293-rhMLi53 obohacené médium bylo rozděleno na BlueSepharose jak jě uvedeno pro rhML₃₃2 . Blue Sepharose eluát byl přímo nanesen na mpl-afinitní kolonu jako je posáno výše. RhMLis3 eluovaný z mpl-afinitní kolony byl purifikován do homogenity s použitím C4-HPLC kolony za stejným podmínek které jsou pospány pro rhML₃₃₂ . Při SDS-PAGE se rhMLi₅₃ dělil do dvou hlavních a dvou menšinových pásů s Mr 18000-21000 (viz obr. 15).293-rhMLi53 enriched media was resolved on Blue-Sepharose as described for rhML ₃₃ second The Blue Sepharose eluate was directly loaded onto the mpl-affinity column as described above. RhMLis3 eluted from the mpl-affinity column was purified to homogeneity using a C4-HPLC column under the same conditions as described for rhML ₃₃₂ . In SDS-PAGE, rhMLi ₅₃ split into two major and two minor bands with Mr 18000-21000 (see Figure 15).

Příklad 20Example 20

Exprese a purifikace TPO z CHOExpression and purification of TPO from CHO

1. Popis CHO expresních vektorů1. Description of CHO expression vectors

Expresní vektory použité v elektroporačních postupech popsaných níže byly označeny:The expression vectors used in the electroporation procedures described below were designated:

pSVI5 . ID. LL.MLORF (plná délka nebo hTPO332) a pSVI5 . ID.LL.MLEPO-D (zkrácený nebo hTPOi.53) .pSVI5. ID LL.MLORF (full length or hTPO332) and pSVI5. ID.LL.MLEPO-D (abbreviated or hTPOi.53).

Významné rysy těchto plasmidů jsou uvedeny na Obr. 23 a 24.Significant features of these plasmids are shown in FIG. 23 and 24.

2. Příprava CHO expresních vektorů cDNA odpovídající TPO úplnému otevřenému čtecímu rámci byla získána pomocí PCR s použitím oligonukleotidových primerů podle Tab. 12.2. Preparation of CHO cDNA expression vectors corresponding to the TPO complete open reading frame was obtained by PCR using the oligonucleotide primers of Tab. 12.

193193

Tab. 12Tab. 12

CHO expresní vektorové PCR primeryCHO expression vector PCR primers

Cla.FLF2 Cla.FLF2 5* ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3* 5 * ATC GAT ATC GAT (SEQIDNO: 47) (SEQIDNO: 47) ORF. Sal ORF. Hall 5* AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3* 5 * AGT CGA CGT CGA CGT (SEQIDNO: 67) (SEQIDNO: 67)

PRK5-hmpI I (popsaný v Příkladu 7 a 9) byl použit jako šablona pro reakci v přítomnosti pfu DNA polymerasy (Stratagene). Počáteční denaturace byla provedena 7 min. 94°C a následovalo 25 cyklů amplifikace (1 min. 94°C, 1 min. 55°C a 1 min. 72°C). Nakonec následovalo 15 min. 72°C. PCR produkt byl purifikován a klonován mezi restrikční místa Clal a Sall plasmidů pSVI5.ID.LL za získání vektoru pSVl5.ID.LL.MLORF. Sekundární konstrukt odpovídající epo homologní doméně byl generován stejným způsobem s použitím Cla.FL.F2 jako úvodního primeru a následujícího reversního primeru:PRK5-hmpI I (described in Examples 7 and 9) was used as a template for the reaction in the presence of pfu DNA polymerase (Stratagene). Initial denaturation was performed for 7 min. 94 ° C followed by 25 cycles of amplification (1 min. 94 ° C, 1 min. 55 ° C and 1 min. 72 ° C). Finally 15 min. 72 ° C. The PCR product was purified and cloned between the ClaI and SalI restriction sites of plasmids pSVI5.ID.LL to give the vector pSV15.ID.LL.MLORF. The secondary construct corresponding to the epo homologous domain was generated in the same manner using Cla.FL.F2 as the start primer and the following reverse primer:

EPOD.Sal 5' AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3' (SEQ ID NO: 68)EPOD.Sal 5 'AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3' (SEQ ID NO: 68)

Konečný konstrukt se nazývá pSVl5.ID.LL.MLEPO-D. Sekvence obou konstruktů byla ověřena jak je popsáno v Příkladu 7 aThe final construct is called pSV15.ID.LL.MLEPO-D. The sequence of both constructs was verified as described in Example 7a

9.9.

Stručně, kódující sekvence pro plnou a zkrácenou délku ligandu byla zavedena do násobného klonovacího místa CHO expresního vektoru pSVl5.ID.LL. Tento vektor obsahuje SV40 časnou promotor/enhancer oblast, modifikovanou spojovací jednotku obsahující myší DHFR cDNA, násobné klonovací místo pro zavedení sledovaného genu (v tomto případě popsané TPOBriefly, the coding sequence for full and shortened ligand length was introduced into the multiple cloning site of the CHO expression vector pSV15.ID.LL. This vector contains the SV40 early promoter / enhancer region, a modified linker containing the mouse DHFR cDNA, a multiple cloning site for the introduction of the gene of interest (in this case described by TPO

194 sekvence), libovolného SV40 polyadenylační signálu a zahajovače replikace a beta laktamasového genu pro plasmidovou selekci a amplifikaci v bakterii.194 sequence), any SV40 polyadenylation signal and replication initiator and beta lactamase gene for plasmid selection and amplification in bacteria.

3. Metodologie pro zajištění stabilních CHO buněčných linií exprimujících rekombinantní lidský TPO332 a TPO1533. Methodology for providing stable CHO cell lines expressing recombinant human TPO332 and TPO153

a. Popis CHO rodičovské buněčné liniea. Description of the CHO of the parent cell line

Hostitelské CHO (Chinese Hamster Ovary) buňky použité pro zde popsanou expresi TPO molekul jsou známé jako CHODP12 (viz EP 307,247 publikovaný 15. března 1989). Tato savčí buněčná linie byla klonálně selektována z transfekční rodičovské linie (CHO-K1 DUX-B11(CHFR-)- získané od Dr. Franka Lea z Stanford University s povolením Dr. L. Chasina) s vektorem exprimujícím preproinsulin za získání klonů s redukovanou potřebou insulinu. Tyto buňky byly také DHFR mínus a klony byly vybrány pro přítomnost CHFR cDNA vektorových sekvencí růstem na médiu bez nukleosidových zdrojů (glycin, hypoxanthin a thymidin). Selekční systém pro stabilně exprimující CHO buněčné linie je běžně používaný.Host CHO (Chinese Hamster Ovary) cells used for the expression of TPO molecules described herein are known as CHODP12 (see EP 307,247 published March 15, 1989). This mammalian cell line was clonally selected from the transfection parental line (CHO-K1 DUX-B11 (CHFR -) - obtained from Dr. Frank Lea of Stanford University with the permission of Dr. L. Chasin) with a vector expressing preproinsulin to obtain clones with reduced need. insulin. These cells were also DHFR minus and clones were selected for the presence of CHFR cDNA vector sequences by growth on a medium without nucleoside sources (glycine, hypoxanthine and thymidine). A selection system for stably expressing CHO cell lines is commonly used.

b. Transfekční metoda (elektroporace)b. Transfection method (electroporation)

TPO332 a TPO153 exprimuj ící buněčné linie byly připraveny trasfekcí DP12 buněk elektroporací (viz např. Andreason, G.L. J. Tiss. Cult. Meth, 15,16 [1993]) s linearizovaným pSVI5.ID.LL.MLORF nebo pSVI5.ID.LL.MLEPO-D plasmidem, respektive. Tři reakční směsi restrikčních enzymů byly připraveny pro každé plasmidové štěpení; ΙΟμςτ, 25μς a 5(^g vektoru s enzymem NOTI podle standardních metod molekulární biologie. Tato restrikční místa se nalézají ve vektoru pouze jednou v linearizační oblasti 3' a mimo TPO ligandovou transkripční jednotku (viz Obr. 23) . 100 μΐ reakční směsi reagovalo přes noc při 37°C. Následující den byla směs jednou extrahována fenol-chloroform195 a poté převedeny do BRL reakční směs byla poté isoamylalkoholem (50:49:1) a precipitována ethanolem na suchém ledu jednu hodinu. Precipitát byl poté 15 minut centrifugován a vysušen. Linearizovaná DNA byla resuspendována v 50 μΐ Ham's DMEM-F12 1:1 média obohaceného standardními antibiotiky a 2mM glutaminu.TPO332 and TPO153 expressing cell lines were prepared by transfection of DP12 cells by electroporation (see, eg, Andreason, GLJ Tiss. Cult. Meth, 15,16 [1993]) with linearized pSVI5.ID.LL.MLORF or pSVI5.ID.LL.MLEPO -D plasmid, respectively. Three restriction enzyme reaction mixtures were prepared for each plasmid digestion; Restrμςτ, 25μς and 5 (^ g of NOTI vector according to standard molecular biology methods. These restriction sites are found in the vector only once in the 3 'linearization region and outside the TPO ligand transcriptional unit (see Figure 23). overnight at 37 [deg.] C. The next day, the mixture was extracted once with phenol-chloroform195 and then transferred to BRL, the reaction mixture was then isoamyl alcohol (50: 49: 1) and precipitated with ethanol on dry ice for one hour. Linearized DNA was resuspended in 50 μΐ Ham's DMEM-F12 1: 1 medium supplemented with standard antibiotics and 2mM glutamine.

V suspensí rostoucí DP12 buňky byly shromážděny, jednou promyty v médiu popsaném pro resuspendaci DNA a nakonec resuspendovány ve stejném médiu při koncentraci 10⁷ buněk na 750μ1. Alikvoty buněk (750μ1) a každá linearizovaná DNA směs byly inkubovány dohromady při laboratorní teplotě jednu hod.The suspension-growing DP12 cells were collected, washed once in the medium described for DNA resuspension, and finally resuspended in the same medium at a concentration of 10 ⁷ cells per 750μ1. Aliquots of cells (750μ1) and each linearized DNA mixture were incubated together at room temperature for one hour.

elektroporační komory. Každá elektroporována v standarndím BRL elektroporačním přístroji při 360 V a 330 μΕ a nízké kapacitanci. Po elektroporaci byly buňky ponechány v přístroji 5 minut a poté byly ponechány na ledu dalších 10 min. Elektroporované buňky byly převedeny do 60mm buněčných kultivačních misek obsahujících 5ml standardního kompletního růstového média pro CHO buňky (vysoce glukosové DMEM-F12 50:50 bez glycinu obohacené IX GHT, 2mM glutaminu, 5% zárodečného telecího séra) a ponechány růst přes noc při 5% CO₂ v buněčném kultivačním inkubátoru.electroporation chambers. Each electroporated in a standard BRL electroporation instrument at 360 V and 330 μΕ and low capacitance. After electroporation, the cells were left in the instrument for 5 minutes and then left on ice for a further 10 minutes. Electroporated cells were transferred to 60mm cell culture dishes containing 5ml of standard complete growth medium for CHO cells (high glucose DMEM-F12 50:50 without glycine-enriched IX GHT, 2mM glutamine, 5% fetal calf serum) and allowed to grow overnight at 5% CO ₂ in a cell culture incubator.

c. Selekční a screeningové metodyc. Selection and screening methods

Následující den byly buňky trypsinem odstraněny z destiček standardními metodami a převedeny do 150 mm tkáňových kultivačních misek obsahujíích DHFR selektivní médium (Ham's DMEM-F12, 1:1 médium popsané výše obohacené 2% nebo 5% dialyzovaným telecím zárodečným sérem ale neobsahující glycin, hypoxanthin a thymidin). Buňky z každé 60mm misky byly přemístěny na 5/150 mm misku. Buňky byly poté inkubovány 10 až 15 dní (s jednou výměnou média) při 37°C/5%CO₂ dokud se nezačaly objevovat klony a postačujícíThe next day, the cells were removed from the plates by trypsin by standard methods and transferred to 150 mm tissue culture dishes containing DHFR selective medium (Ham's DMEM-F12, 1: 1 medium described above enriched with 2% or 5% dialyzed calf serum but not glycine, hypoxanthine and thymidine). Cells from each 60 mm dish were transferred to a 5/150 mm dish. The cells were then incubated for 10-15 days (with one medium change) at 37 ° C / 5% CO ₂ until clones appeared and sufficient

196 misky trypsinizovány a originální misky. Dvě z velikost k přenosu do 96 jamkových misek. Po periodě 4-5 dní byly buněčné linie přeneseny do 96 jamkových misek sterilními žlutými špičkami Pipettmanem 50 μΐ. Buňky byly ponechány růst do shluků (obvykle 3-5 dní) a poté byly byly reprodukovány 2 kopie těchto kopií byly krátkodobě skladovány v mrazícím boxu s buňkami v každé jamce rozpuštěnými v 50 μΐ 10%FCS v DMSO. 5 dní kondiciované bez sérové vzorky média byly stanoveny u splývajících jamek v třetí misce na TPO expresi přes stanovení aktivity na bázi Ba/F buněk. Klony s největší expresí na základě tohoto stanovení byly vyjmuty ze zásobníku a převedeny do 2 spojených 150mm T-baněk pro převedení skupiny buněčné kultury do suspensní adaptace, re-stanovení a uložení,196 dishes trypsinized and original dishes. Two of the sizes to be transferred to 96 well dishes. After a period of 4-5 days, the cell lines were transferred to 96 well dishes with sterile yellow tips with Pipettman 50 μΐ. Cells were allowed to grow into clusters (usually 3-5 days) and then 2 copies were reproduced and stored briefly in a freezer with cells in each well dissolved in 50 μΐ 10% FCS in DMSO. 5-day conditioned serum-free media samples were determined in confluent wells in a third TPO expression dish via Ba / F cell-based assay. The highest-expressing clones based on this assay were removed from the reservoir and transferred to 2 linked 150mm T-flasks to convert the cell culture group into suspension adaptation, re-determination and storage,

d. Postup amplifikaced. Amplification procedure

Některé z buněčných linií z nejvyšším titrem z výběru popsaného výše byly následně podrobeny standardnímu amplifikačnímu postupu za vzniku klonů s vyšším titrem. CHO buněčné klony byly rozšířeny a naneseny na lOcm misky při 4 koncentracím methotrexátu (tj. 50nM, lOOnM, 200nM a 400nM) a při dvou nebo třech různých množstvích buněk (10⁵, 5xl0⁵ a 10⁶ buněk na misku) . Tyto kultury byly poté inkubovány při 37°C/5%CO2 dokud se neobjevily klony a byly schopné přenosu do 96 jamkových misek pro další stanovení. Některé klony s vysokým titrem z tohoto výběru byly opět vystaveny vyšším koncentracím methorexátu (např. 600nM, 800nM, lOOOnM a 1200nM) a jako předtím bylo vyčkáno objevení resistentních klonů a pak byly přeneseny do 96 jamkových misek a stanoveny.Some of the highest titer cell lines from the selection described above were subsequently subjected to a standard amplification procedure to produce higher titer clones. CHO cell clones were expanded and plated on 10 cm dishes at 4 concentrations of methotrexate (ie 50 nM, 100 nM, 200 nM and 400 nM) and at two or three different cell numbers (10 ⁵ , 5x10 ⁵ and 10 ⁶ cells per dish). These cultures were then incubated at 37 ° C / 5% CO 2 until clones appeared and were capable of transfer to 96 well plates for further determination. Some high titer clones from this selection were again exposed to higher concentrations of methorexate (eg, 600nM, 800nM, 100OnM and 1200nM) and, as before, the discovery of resistant clones was wait and then transferred to 96-well plates and assayed.

4. Kultivace stabilní CHO buněčných linií exprimujícíeh rekombinantní lidský TPO332 a TPO1534. Culturing Stable CHO Cell Lines Expressing Recombinant Human TPO332 and TPO153

197197

Skladované buňky byly ponechány roztát a buněčná populace byla rozmnožena standardními metodami buněčného růstu v médiu se sérem nebo bez séra. Po namnožení do potřebné buněčné hustoty byly buňky promyty, aby bylo odstraněno natrávené buněčné kultivační médium. Buňky byly poté kultivovány jakoukoliv standardní metodou zahrnující: dávkovou, vsádkovou nebo kontinuální kultivaci při 25-40°C, neutrální pH, obsah rozpuštěného O2 nejméně 5% pokud byl akumulován významně vylučovaný TPO. Buněčná tekutá kultura je poté separována od buněk např. centrifugací.The stored cells were thawed and the cell population was propagated by standard cell growth methods in serum-free or serum-free medium. After multiplying to the required cell density, cells were washed to remove the digested cell culture medium. The cells were then cultured by any standard method including: batch, batch or continuous cultivation at 25-40 ° C, neutral pH, dissolved O2 content of at least 5% when significantly secreted TPO was accumulated. The cell liquid culture is then separated from the cells by, for example, centrifugation.

5. Purifikace rekombinantního lidského TPO z CHO kultivační tekutiny5. Purification of recombinant human TPO from CHO culture fluid

Získaná tekutina buněčné kultury (HCCF) je přímo nanesena na Blue Sepharose 6 Fast Flow kolonu (Pharmacia) ekvilibrovanou 0,01M Na fosfátem pH 7,4, 0,15M NaCl v poměru 100L HCCF na litr pryskyřice a při lineárním průtoku přibližně 300 ml/hod/cm². Kolona byla poté promyta 3 až 5 objemy ekvilibračního pufru a následně 3 až 5 objemy kolony 0,01M Na fosfátu pH 7,4, 2,0 M močoviny. TPO je poté eluován 3 až 5 objemy kolony 0,01M Na fosfátu pH 7,4, 2,0M močoviny, l,0M NaCl.The obtained cell culture fluid (HCCF) is directly loaded onto a Blue Sepharose 6 Fast Flow column (Pharmacia) equilibrated with 0.01M Na phosphate pH 7.4, 0.15M NaCl in a ratio of 100L HCCF per liter resin and at a linear flow rate of approximately 300 ml / hr / cm ² . The column was then washed with 3-5 volumes of equilibration buffer followed by 3-5 volumes of 0.01 M Na phosphate pH 7.4, 2.0 M urea. The TPO is then eluted with 3-5 column volumes of 0.01M Na phosphate pH 7.4, 2.0M urea, 1.0M NaCl.

Blue Sepharose eluát obsahující TPO je poté nanesen.na Weat Germ Lektin Sepharose 6MB kolonu (Pharmacia) ekvilibrovanou 0,01M Na fosfátu pH 7,4, 2,0 M močoviny a 1,0 NaCl v poměru 8 až 16 ml Blue Sepharose-eluátu na ml pryskyřice při průtoku 50 ml/hod/cm². Kolona je poté promyta 2 až 3 objemy kolony ekvilibračního pufru. TPO je poté eluován 2 až 5 objemy kolony 0,0lM Na fosfátu pH 7,4, 2,0 M močoviny, 0,5 M N-acetyl-d-glukosaminu.The Blue Sepharose eluate containing TPO is then loaded onto a Weat Germ Lectin Sepharose 6MB column (Pharmacia) equilibrated with 0.01 M Na phosphate pH 7.4, 2.0 M urea and 1.0 NaCl in a ratio of 8 to 16 ml Blue Sepharose eluate per ml resin at a flow rate of 50 ml / h / cm ² . The column is then washed with 2-3 column volumes of equilibration buffer. TPO is then eluted with 2 to 5 column volumes of 0.0 M Na phosphate pH 7.4, 2.0 M urea, 0.5 M N-acetyl-d-glucosamine.

Wheat Germ Lectin eluát je poté upraven na celkovou koncentraci 0,04% Ci₂E₈ a 0,1% kyseliny trifluoroctové (TFA) . Výsledná směs je poté nanesena na C4 kolonu sThe Wheat Germ Lectin eluate is then adjusted to a total concentration of 0.04% C ₁₂ E ₈ and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA). The resulting mixture is then loaded onto a C4 column with

198 reverzní fází (Vycad 214TP1022) ekvilibrovanou v 0,1 TFA, 0.04% C₁₂E₈ při zatížení 0,2 až 0,5 mg proteinu na ml pryskyřice při průtoku 157 ml/hod/cm².198 reverse phase (Vyad 214 2141010) equilibrated in 0.1 TFA, 0.04% C ₁₂ E ₈ at a loading of 0.2 to 0.5 mg protein per ml resin at a flow rate of 157 ml / h / cm ² .

Protein je eluován dvoufázovým lineárním gradientem acetonitrilu obsahujího 0,1% TFA, 0,04% Ci2Eg. První fáze se skládá z lineárního gradientu od 0 do 30% acetonitrilu v 15 min. Druhá fáze se skládá z lineárního gradientu od 30 do 60% acetonitrilu v 60 min. TPO eluuje při 50% acetonitrilu. Je provedena SDS-PAGE eluátu.The protein is eluted with a two-phase linear gradient of acetonitrile containing 0.1% TFA, 0.04% C12Eg. The first phase consists of a linear gradient from 0 to 30% acetonitrile in 15 min. The second phase consists of a linear gradient from 30 to 60% acetonitrile in 60 min. TPO elutes at 50% acetonitrile. SDS-PAGE of the eluate is performed.

C4 eluát je poté rozpušěn ve 2 objemech 0,01 M Na fosfátu pH 7,4, 0,15M NaCl a diafiltrován proti přibližně 6 objemům 0,01 M Na fosfátu pH 7,4, 0,15M NaCl na Amicon YM nebo podobné ultrafiltrační membráně s vylučovací hranicí molekulové hmotnosti 10000 až 30000 Daltonů. Výsledný diafiltrát může být poté přímo zpracován nebo dále ultrafiltrován. Diafiltrát/koncentrát je upraven na výslednou koncentraci 0,01% Tweenu-80.The C4 eluate is then dissolved in 2 volumes of 0.01 M Na phosphate pH 7.4, 0.15M NaCl and diafiltered against approximately 6 volumes of 0.01 M Na phosphate pH 7.4, 0.15M NaCl on Amicon YM or similar ultrafiltration membrane with a molecular weight cutoff of 10000 to 30000 Daltons. The resulting diafiltrate can then be directly processed or further ultrafiltered. The diafiltrate / concentrate is adjusted to a final concentration of 0.01% Tween-80.

Celý nebo část diafitrátu/koncentrátu odpovídající 2 až 5% vypočítaného objemu kolony je poté nanesen na Sephacryl S-300 HR kolonu (Pharmacia) ekvilibrovanou 0,01 M Na fosfátem pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,01% Tween-80 a chromatografován malým průtokem přibližně 17 ml/hod'/cm². Frakce obsahující TPO, které neobsahují agregáty a produkty proteolytické degradace jsou rozděleny pomocí SDS-PAGE. Výsledný eluát je filtrován na 0,22μ filtru, Millex-GV nebo podobném a skladován při 2-8°C.All or part of the diafibrate / concentrate corresponding to 2-5% of the calculated column volume is then loaded onto a Sephacryl S-300 HR column (Pharmacia) equilibrated with 0.01 M Na phosphate pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.01% Tween -80 and chromatographed at a low flow rate of approximately 17 mL / hr / cm ² . Fractions containing TPO that do not contain aggregates and proteolytic degradation products are separated by SDS-PAGE. The resulting eluate is filtered on a 0.22μ filter, Millex-GV or the like and stored at 2-8 ° C.

Příklad 21Example 21

Transformace a indukce TPO proteinové syntézy v E. coli 1. Konstrukce E. coli TPO expresních vektorů.Transformation and induction of TPO protein synthesis in E. coli 1. Construction of E. coli TPO expression vectors.

Plasmidy pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 a pMP202 byly všechny zkonstruovány pro expresi 155 minokyseliny TPO poPlasmids pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 and pMP202 were all engineered to express the 155 amino acid TPO after

199 směru malého leaderu, který se liší mezi různými konstrukty. Leadery jsou nezbytné pro vysokou hladinu iniciace translace a rychlou purifikaci. Plasmidy pMP210-l, -T8, -21, -22, 24-25 jsou zkonstruovány pro expresi prvních 153 aminokyselin TPO po směru iniciačního methioninu a liší sepouze v použitém kodonu pro prvních 6 aminokyselin TPO, zatímco plasmid pMP251 je odvozen od pMP210-l kde karboxykonec TPO je prodloužen dvěma aminokyselinami. Všechny výše uvedené plasmidy budou vykazovat vysoké hladiny intracelulární exprese TPO v E. coli za indukce tryptofanového promotoru (Yansura, D.G. a kol. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Editor) 185: 54-60, Academie Press, Sand Diego [1990]). Plasmidy pMPl a pMP172 jsou meziprodukty konstrukce výše uvedených TPO intracelulárních expresních plasmidú.199 direction of a small leader, which differs between different constructs. Leaders are essential for high levels of translation initiation and rapid purification. The plasmids pMP210-1, -T8, -21, -22, 24-25 are designed to express the first 153 amino acids of TPO downstream of the initiating methionine and differ in codon usage for the first 6 amino acids of TPO, while plasmid pMP251 is derived from pMP210-1. wherein the carboxy terminus of TPO is extended by two amino acids. All of the above plasmids will exhibit high levels of intracellular expression of TPO in E. coli inducing a tryptophan promoter (Yansura, DG et al. Methods in Enzymology (Goeddel, DV, Editor) 185: 54-60, Academic Press, Sand Diego [1990] ). The plasmids pMP1 and pMP172 are intermediates in the construction of the above TPO intracellular expression plasmids.

(a) Plasmid pMPl(a) Plasmid pMP1

Plasmid pMPl je sekreční vektor pro prvních 155 aminokyselin TPO, a byl konstruován vzájemnou ligací 5 fragmentů DNA jak ukazuje Obr. 33. První z nich byl vektor pPho21 v kterém byl odstraněn malý Mlul-BamHI fragment. pPho21 je odvozen od phGHl (Chang, C.N. a kol., Gene 55: 189-196 [1987]) v kterém je gen lidského růstového hormonu nahrazen E. coli phoA genem, a Mlul restrikční místo bylo vloženo do kódující sekvence pro STII signální sekvenci aminokyselin 20-21.Plasmid pMP1 is the secretion vector for the first 155 amino acids of TPO, and was constructed by ligating together 5 DNA fragments as shown in FIG. 33. The first was the pPho21 vector in which the small MluI-BamHI fragment was removed. pPho21 is derived from phGH1 (Chang, CN et al., Gene 55: 189-196 [1987]) in which the human growth hormone gene is replaced with the E. coli phoA gene, and a MluI restriction site was inserted into the coding sequence for the STII signal sequence amino acids 20-21.

Následující dva fragmenty, Hinfl-Pstl část DNA o délce 258 párů basí z pRK5-hmplI (Příklad 9) kódující TPO aminokyseliny 19-103, a následující syntická DNA kódující aminokyseliny 1-18The following two fragments, the 258 base pair Hinf1-Pst1 DNA portion of pRK5-hmplI (Example 9) encoding TPO amino acids 19-103, and the following synthetic DNA encoding amino acids 1-18

200 ff-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCG200 ff-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCG

TGTG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGCATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGC

ACTGA-5' (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) byly nejprve ligovány T4-DNA ligasou, a druhý byl štěpen Pstl. Čtvrtý byl fragment Pstl-HaelII fragment o délce 152 párů basí z pRK5hmpll kódující aminokyseliny 104-155 TPO. Poslední byl Stul-BamHI fragment o délce 412 párů basí z pdhl08 obsahující lambda k transkripčnímu terminátoru jak bylo popsáno (Scholtissek, S. a kol., NAR 15: 3185 [1987]).ACTGA-5 '(SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70) were first ligated with T4-DNA ligase, and the second was digested with PstI. The fourth was a 152 bp PstI-HaelII fragment of pRK5hmpl1 encoding amino acids 104-155 TPO. The last was a 412 bp Stul-BamHI fragment of pdh108 containing lambda to the transcriptional terminator as described (Scholtissek, S. et al., NAR 15: 3185 [1987]).

(b) Piasmid pMP21(b) Plasmid pMP21

Piasmid pMP21 byl konstruován pro expresi prvních 155 aminokyselin TPO s pomocí 13 aminokyselinového leaderu obsahujícího STII signální sekvenci. Byl sestrojen vzájemnou ligaci tří DNA fragmentů jak ukazuje Obr. 34, první z nich je vektor pVEG31 ve kterém byl odstraněn 'malý Xbal-Sphl fragment. Vektor pVEG31 je odvozen od pHGH207-l (de Boer, H.A. a kol., Promotér Strukcture and Funcion (Rodriguez, R. L. a Chamberlain, M.JK., Editoři), 462, Praeger, New York [1982]) v kterém byl gen lidského růstového hormonu nahrazen genem pro vaskulární endoteliální růstový faktor (tento indentický vektorový fragment může být získán z tohoto druhého plasmidů).The plasmid pMP21 was constructed to express the first 155 amino acids of TPO using a 13 amino acid leader containing the STII signal sequence. The three DNA fragments were ligated together as shown in FIG. 34, the first of which is the vector pVEG31 in which the small XbaI-SphI fragment was deleted. The vector pVEG31 is derived from pHGH207-1 (de Boer, HA et al., Strukcture and Funcion Promoter (Rodriguez, RL and Chamberlain, M.JK., Editors), 462, Praeger, New York [1982]) in which the gene was human growth hormone was replaced by the vascular endothelial growth factor gene (this indent vector fragment could be obtained from this second plasmid).

Druhou částí při ligaci byl syntetický DNA duplex s následující sekvencí:The second part of the ligation was a synthetic DNA duplex with the following sequence:

201201

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5' (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5 '(SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

Poslední část byl fragment Mlul-Sphl o délce 1072 párů basí z pMPl kódující 155 aminokyselin TPO.The last part was a 1072 base pair MluI-SphI fragment of pMP1 encoding 155 amino acids of TPO.

(c) Plasmid pMP151(c) Plasmid pMP151

Plasmid pMP151 je konstruován pro expresi prvních 155 aminokyselin TPO po směru leaderu obsahujícího 7 aminokyselin STII signální sekvence, 8 histininů a faktor Xa štěpné místo. Jak ukazuje Obr. 35, pMP151 byl konstruován vzájemnou ligací tří DNA fragmentů, první z nich je dříve popsaný vektor pVEG31 ve kterém je odstraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je syntetický DNA duplex s následující sekvencí:Plasmid pMP151 is designed to express the first 155 amino acids of TPO downstream of a leader comprising 7 amino acids of the STII signal sequence, 8 histinins and a factor Xa cleavage site. As shown in FIG. 35, pMP151 was constructed by ligating together three DNA fragments, the first of which is the previously described vector pVEG31 in which a small XbaI-SphI fragment was removed. The second is a synthetic DNA duplex with the following sequence:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG

GTCGTAGCCGTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTCTTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC

CAGCAT-5' (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)CAGCAT-5 '(SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)

Poslední je Bgll-Sphl fragment z pMPll s délkou 1064 párů basí z pMPll kódující 154 aminokyseliny TPO. Plasmid pMPll je identický s pMPl kromě několika změn kódonů v Stll signální sekvenci (tento fragment můžeme získat z pMPl).The last is a Bgl1-SphI fragment of pMP11 with a length of 1064 base pairs of pMP11 encoding 154 amino acids of TPO. Plasmid pMP11 is identical to pMP1 except for several codon changes in the Stll signal sequence (this fragment can be obtained from pMP1).

(d) Plasmid pMO202(d) Plasmid pMO202

202202

Plasmid pMP202 je velmi podobný expresnímu vektoru pMP151 kromě toho, faktor Xa štěpné místo v leaderu bylo nahrazeno trombinovým štěpným místem. Jak ukazuje Obr. 36, pMP202 byl konstruován vzájemnou ligací tří DNA gragmentů. První z nich je dříve popsaný pVEG31 ve kterém je odtraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je systetický DNA duplex s náledující sekvencí:Plasmid pMP202 is very similar to the expression vector pMP151 except that the factor Xa cleavage site in the leader has been replaced by a thrombin cleavage site. As shown in FIG. 36, pMP202 was constructed by ligating three DNA graments together. The first is the previously described pVEG31 in which a small XbaI-SphI fragment is deleted. The second is a systetic DNA duplex with the following sequence:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAA5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAA

CCACGTAGCCCCACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTTTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTT

GGTGCAT-5' (SEQ ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76)GGTGCAT-5 '(SEQ ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76)

Poslední část je Bgll-Sphl fragment o délce 1064 párů basí z dříve popsaného plasmidu pMPll.The last part is a 1064 base pair Bgl1-SphI fragment from the previously described plasmid pMP11.

(e) Plasmid pMP172(e) Plasmid pMP172

Plasmid pMP172 je sekreční vektor pro prvních 153 aminokyselin TPO a je meziproduktem konstrukce pMP210. Jak ukazuje Obr. 37, pMP172 byl připraven vzájemnou ligací tří DNA fragmentů, první z nich je vektor pLS321amB ve kterém je odstraněna mala EcoRl-Hindlll oblast. Druhý je EcoRlHgal fragment o délce 94 6 párů basí z dříve popsaného plasmidu pMPll. Poslední část je syntetický DNA duplex s následující sekvencí.Plasmid pMP172 is the secretory vector for the first 153 amino acids of TPO and is an intermediate of the construction of pMP210. As shown in FIG. 37, pMP172 was prepared by ligating together three DNA fragments, the first being the vector pLS321amB in which the small EcoR1-HindIII region was deleted. The second is an EcoR1Hgal fragment of 946 base pairs in length from the previously described plasmid pMP11. The last part is a synthetic DNA duplex with the following sequence.

5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT

GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO: 77) (SEQ ID NO: 78)GGAGACGCAGTCCATCGA-5 '(SEQ ID NO: 77) (SEQ ID NO: 78)

203 (f) Plasmid pMP210203 (f) Plasmid pMP210

Plasmid pMP210 je konstruován pro expresi prvních 153 aminokyselin TPO po methioninu iniciujícím translaci. Tento plasmid je ve skutečnosti připraven jako banka plasmidů u kterých prvních 6 kodónů TPO bylo náhodně změněno v třetí poloze každého kodónu, a byly konstruovány jak je uvedeno na Obr. 38 ligací tří DNA fragmentů. První z nich byl dříve popsaný vektor pVEG31 v kterém je odtraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je Syntetický DNA duplex zobrazený níže který byl podroben nejprve působení DNA polymerasyl (Klenow) a následně digesci Xbal a Hinfl, a kódující iniciační methionin a náhodně měnící prvních 6 kodónů TPO.Plasmid pMP210 is designed to express the first 153 amino acids of TPO after translation initiating methionine. This plasmid is in fact prepared as a plasmid bank in which the first 6 TPO codons were randomly altered at the third position of each codon, and were constructed as shown in FIG. 38 ligation of three DNA fragments. The first was the previously described vector pVEG31 in which a small XbaI-SphI fragment was deleted. The second is the Synthetic DNA Duplex depicted below which was first treated with DNA polymerasyl (Klenow) and subsequently digested with XbaI and Hinf1, and encoding the initiating methionine and randomly changing the first 6 TPO codons.

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

ACACTGGAGGCTACACTGGAGGCT

GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79)GTTCTCAGTAA (SEQ ID NO: 79)

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5' (SEQ ID NO: 80)CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5 '(SEQ ID NO: 80)

Třetí je Hinfl-Sphl fragment o délce 890 párů basí z pMP172 kódující aminokyseliny 19-153 TPO.The third is an 890 base pair Hinf1-SphI fragment of pMP172 encoding amino acids 19-153 of TPO.

Banka plasmidů pMP210 o 37000 klonech byla retransformována na silně tetracyklinové (50 gg/ml) LB destičky, aby byly vyselektovány sklony s vysokou translační iniciací (Yansura, D.G. a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4: 151-158 [1992]). Z 8 kolonií které se objevily na silně tetracyklinových miskách bylo pět nej lepších z hlediska TPO exprese podrobeno DNA sekvenování a výsledky jsou ukázány na Obr. 39 (SEQ ID NO: 23,24,25,26,27 a 28).A 37,000 clone pMP210 plasmid flask was re-transformed into a strongly tetracycline (50 gg / ml) LB plate to select high translation initiation gradients (Yansura, DG et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4: 151-158 [ 1992]). Of the 8 colonies that appeared on the strongly tetracycline plates, five of the best TPO expression were subjected to DNA sequencing and the results are shown in Figs. 39 (SEQ ID NOs: 23,24,25,26,27 and 28).

204 (g) Plasmid pMP41204 (g) Plasmid pMP41

Plasmid pMP41 je konstruován pro expresi prvních 155 aminokyselin TPO fúzovaných do leaderu skládajícího se z 7 aminokyselin STU signální sekvence následované faktor Xa štěpným místem. Plasmid byl konstruován jak ukazuje Obr. 40 vzájemnou ligací tří částí DNA, první z nich byl dříve popsaný vektor pVEG31 ve kterém je odstraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je následující syntetický DNA duplex:Plasmid pMP41 is designed to express the first 155 amino acids of TPO fused to a leader consisting of the 7 amino acids of the STU signal sequence followed by a factor Xa cleavage site. The plasmid was constructed as shown in FIG. The first one was the previously described vector pVEG31 in which the small XbaI-SphI fragment was removed. The second is the following synthetic DNA duplex:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC 1SEQ ID NO: 81) TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5' (SEQ ID NO: 82)5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC 1SEQ ID NO: 81) TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5 '(SEQ ID NO: 82)

Poslední součástí ligace je Btll-Sphlfragment o délce 1064 párů basí z dříve popsaného plasmidu pMPll.The last part of the ligation is a 1064 base pair BtII-SphI fragment from the previously described plasmid pMP11.

(h) Plasmid pMP57(h) Plasmid pMP57

Plasmid pMP57 exprimuje prvních 155 aminokyselin TPO po směru leaderu skládajícího se z 9 aminokyselin STU signální sekvence a dibasického místa Lys-Arg. Toto dibasické místo slouží při odstranění leaderu proteasou ArgC. Tento plasmid byl konstruován jak je na Obr. 41 vzájemnou ligací tří DNA částí. První z nich je dříve popsaný vektor pVEG31 ve kterém je odtraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je následující syntetický DNA duplex.Plasmid pMP57 expresses the first 155 amino acids of TPO downstream of a leader consisting of the 9 amino acids of the STU signal sequence and the dibasic site of Lys-Arg. This dibasic site serves to remove the leader by ArgC protease. This plasmid was constructed as shown in FIG. 41 by ligating three DNA portions together. The first is the previously described vector pVEG31 in which a small XbaI-SphI fragment is deleted. The second is the following synthetic DNA duplex.

5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83) TTAATACI111ICI IATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO: 84)5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83) TTAATACI111ICI IATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5 '(SEQ ID NO: 84)

Poslední část ligace je Bgll-Sphl fragment o délce 1064 basí z dříve popsaného pMPll.The last part of the ligation is a 1064 base BglI-SphI fragment from the previously described pMP11.

(i) Plasmid pMP251(i) Plasmid pMP251

Plasmid pMP251 je odvoze od pMP210-l ve kterém jsou na karboxykonci zahrnuty další dvě aminokyseliny TPO. Jak ukazuje Obr. 42, tento plasmid byl konstruován vzájemnouPlasmid pMP251 is derived from pMP210-1 in which two additional TPO amino acids are included at the carboxy terminus. As shown in FIG. 42, this plasmid was constructed with each other

205 ligací dvou částí DNA, první z nich je dříve popsaný pMP21 ve kterém je odstraněn malý Xbal-Apal fragment. Druhá část ligace je Xbal-Apal fragment o délce 316 párů basí z pMP210-l.205 ligation of two portions of DNA, the first of which is the previously described pMP21 in which a small XbaI-ApaI fragment is removed. The second part of the ligation is a 316 base pair XbaI-Apal fragment of pMP210-1.

2. Transformace a indukce E. coli TPO expresními vektory2. Transformation and induction of E. coli TPO expression vectors

Výše uvedené TPO expresní plasmidy byly použity k transformaci E. coli kmenu (44C6) w3110 tonA_Á rpoH_ts Ιοη_Δ ο1ρΡ_Δ galE) s použitím CaCÍ₂ metody tepelného šoku (Mandel, M. a kol., J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]).The above TPO expression plasmids were used to transform E. coli strain (44C6) W3110 tonA _Å rpoH _{ts Ιοη} Δ ο1ρΡ Δ galE) using the _CaCl2 heat shock method (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol. 53: 159-162, [1970]).

Transformované buňky byly pěstovány nejprve při 37°C v LB médiu obsahujícím 50 gg/ml karbenicilizu za optické hustoty (600 nm) kultury přibližně 2-3. LB kultura byla poté naředěna 20x v M9 médiu obsahujícím 0,49% casamino kyselin (hm./obj.) a 50 pg/ml karbenicilinu. Po 1. hod růstu se vzdušněním při 30°C byla přidána indol-3-akrylová kyselilna na celkovou koncentraci 50 pg/ml. Kultura byla poté kontinuálně pěstována při 30°C se vzdušněním dalších 15 hodin a poté byly buňky shromážděny centrifugací.The transformed cells were grown first at 37 ° C in LB medium containing 50 gg / ml carbenicillus at an optical density (600 nm) of the culture of about 2-3. The LB culture was then diluted 20X in M9 medium containing 0.49% casamino acids (w / v) and 50 µg / ml carbenicillin. After 1 hour growth with aeration at 30 ° C, indole-3-acrylic acid was added to a total concentration of 50 µg / ml. The culture was then continuously grown at 30 ° C with aeration for an additional 15 hours and then the cells were collected by centrifugation.

Příklad 22Example 22

Produkce biologicky aktivního TPO (Meť¹ 1-153) v E. coliProduction of biologically active TPO (Me ¹ 1-153) in E. coli

Postupy uvedené níže pro produkci biologicky aktivního, znovusvinutého TPO (Meť¹ 1-153) mohou být analogicky aplikovány pro získání dalších TPO variant včetně N a C koncově prodloužených forem (viz Příklad 23).The procedures set forth below for the production of biologically active, re-developed TPO (Me ¹ 1-153) can be applied analogously to obtain other TPO variants including N and C terminally elongated forms (see Example 23).

A. Získání nerozpustného TPO (Meť¹ 1-153)A. Obtaining insoluble TPO (Me ¹ 1-153)

Buňky E. coli exprimující TPO (Meť¹ 1-153) kódovaný plasmidem pMP210-l byly fermentovány jak je. popsáno výše. Obvykle je 1000 g buněk resuspendováno v 11 (10 objemů) buněčného rozrušovacího pufru (10 mM Tris, 5mM EDTA, pH 8) s Polytron homogenizérem a buňky jsou centrifugovány přiE. coli cells expressing TPO (Me ¹ 1-153) encoded by plasmid pMP210-1 were fermented as is. described above. Typically, 1000 g of cells are resuspended in 11 (10 volumes) cell disruption buffer (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) with a Polytron homogenizer and the cells are centrifuged at

203 (f) Plasmid pMP210203 (f) Plasmid pMP210

Plasmid pMP210 je konstruován pro expresi prvních 153 aminokyselin TPO po methioninu iniciujícím translaci. Tento plasmid je ve skutečnosti připraven jako banka plasmidů u kterých prvních 6 kodónů TPO bylo náhodně změněno v třetí poloze každého kodónu, a byly konstruovány jak je uvedeno na Obr. 38 ligací tří DNA fragmentů. První z nich byl dříve popsaný vektor pVEG31 v kterém je odtraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je Syntetický DNA duplex zobrazený níže který byl podroben nejprve působení DNA polymerasyl (Klenow) a následně digesci Xbal a Hinfl, a kódující iniciační methionin a náhodně měnící prvních 6 kodónů TPO.Plasmid pMP210 is designed to express the first 153 amino acids of TPO after translation initiating methionine. This plasmid is in fact prepared as a plasmid bank in which the first 6 TPO codons were randomly altered at the third position of each codon, and were constructed as shown in FIG. 38 ligation of three DNA fragments. The first was the previously described vector pVEG31 in which a small XbaI-SphI fragment was deleted. The second is the Synthetic DNA Duplex depicted below which was first treated with DNA polymerasyl (Klenow) and subsequently digested with XbaI and Hinf1, and encoding the initiating methionine and randomly changing the first 6 TPO codons.

5M3CAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA5M3CAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

ACACTGGAGGCTACACTGGAGGCT

GTTCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79)GTTCTCAGTAA (SEQ ID NO: 79)

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5' (SEQ ID NO: 80)CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5 '(SEQ ID NO: 80)

Třetí je Hinfl-Sphl fragment o délce 890 párů basí z pMP172 kódující aminokyseliny 19-153 TPO.The third is an 890 base pair Hinf1-SphI fragment of pMP172 encoding amino acids 19-153 of TPO.

Banka plasmidů pMP210 o 37000 klonech byla retransformována na silně tetracyklinové (50 μg/ml) LB destičky, aby byly vyselektovány sklony s vysokou translační iniciací (Yansura, D.G. a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4: 151-158 [1992]). Z 8 kolonií které se objevily na silně tetracyklinových miskách bylo pět nej lepších z hlediska TPO exprese podrobeno DNA sekvenování a výsledky jsou ukázány na Obr. 39 (SEQ ID NO: 23,24,25,26,27 a 28) .A 37,000 clone pMP210 plasmid flask was re-transformed into a strongly tetracycline (50 µg / ml) LB plate to select high translation initiation gradients (Yansura, DG et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4: 151-158 [ 1992]). Of the 8 colonies that appeared on the strongly tetracycline plates, five of the best TPO expression were subjected to DNA sequencing and the results are shown in Figs. 39 (SEQ ID NOs: 23,24,25,26,27 and 28).

204 (g) Plasmid pMP41204 (g) Plasmid pMP41

Plasmid pMP41 je konstruován pro expresi prvních 155 aminokyselin TPO fúzovaných do leaderu skládajícího se z 7 aminokyselin STU signální sekvence následované faktor Xa štěpným místem. Plasmid byl konstruován jak ukazuje Obr. 40 vzájemnou ligací tří částí DNA, první z nich byl dříve popsaný vektor pVEG31 ve kterém je odstraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je následující syntetický DNA duplex:Plasmid pMP41 is designed to express the first 155 amino acids of TPO fused to a leader consisting of the 7 amino acids of the STU signal sequence followed by a factor Xa cleavage site. The plasmid was constructed as shown in FIG. The first one was the previously described vector pVEG31 in which the small XbaI-SphI fragment was removed. The second is the following synthetic DNA duplex:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC <SEQ ID NO: 81)5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO: 81)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5' (SEQ ID NO: 82)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5 '(SEQ ID NO: 82)

Poslední součástí ligace je Btll-Sphlfragment o délce 1064 párů basí z dříve popsaného plasmidu pMPll.The last part of the ligation is a 1064 base pair BtII-SphI fragment from the previously described plasmid pMP11.

(h) Plasmid pMP57(h) Plasmid pMP57

Plasmid pMP57 exprimuje prvních 155 aminokyselin TPO po směru leaderu skládajícího se z 9 aminokyselin STU signální sekvence a dibasického místa Lys-Arg. Toto dibasické místo slouží při odstranění leaderu proteasou ArgC. Tento plasmid byl konstruován jak je na Obr. 41 vzájemnou ligací tří DNA částí. První z nich je dříve popsaný vektor pVEG31 ve kterém je odtraněn malý Xbal-Sphl fragment. Druhý je následující syntetický DNA duplex.Plasmid pMP57 expresses the first 155 amino acids of TPO downstream of a leader consisting of the 9 amino acids of the STU signal sequence and the dibasic site of Lys-Arg. This dibasic site serves to remove the leader by ArgC protease. This plasmid was constructed as shown in FIG. 41 by ligating three DNA portions together. The first is the previously described vector pVEG31 in which a small XbaI-SphI fragment is deleted. The second is the following synthetic DNA duplex.

5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCAI I1GIICI IAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83)5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCAI I1GIICI IAAACGTAGCC (SEQ ID NO: 83)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ,D NO: 84)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5 '(SEQ, D NO: 84)

Poslední část ligace je Bgll-Sphl fragment o délce 1064 basí z dříve popsaného pMPll.The last part of the ligation is a 1064 base BglI-SphI fragment from the previously described pMP11.

(i) Plasmid pMP251(i) Plasmid pMP251

Plasmid pMP251 je odvoze od pMP210-l ve kterém jsou na karboxykonci zahrnuty další dvě aminokyseliny TPO. Jak ukazuje Obr. 42, tento plasmid byl konstruován vzájemnouPlasmid pMP251 is derived from pMP210-1 in which two additional TPO amino acids are included at the carboxy terminus. As shown in FIG. 42, this plasmid was constructed with each other

205 ligací dvou částí DNA, první z nich je dříve popsaný pMP21 ve kterém je odstraněn malý Xbal-Apal fragment. Druhá část ligace je Xbal-Apal fragment o délce 316 párů basí z pMP210-l.205 ligation of two portions of DNA, the first of which is the previously described pMP21 in which a small XbaI-ApaI fragment is removed. The second part of the ligation is a 316 base pair XbaI-Apal fragment of pMP210-1.

2. Transformace a indukce E. coli TPO expresními vektory ' Výše uvedené TPO expresní plasmidy byly použity k transformaci E. coli kmenu (44C6) w3110 tonA_A rpoH_ts Ιοη_Δ ο1ρΡ_Δ galE) s použitím CaCl2 metody tepelného šoku (Mandel, M. a kol., J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]).2. Transformation and Induction of E. coli TPO Expression Vectors The above TPO expression plasmids were used to transform the E. coli strain (44C6) w3110 tonA _A rpoH _t Ιοη _Δ ο1ρΡ _Δ galE) using the CaCl2 heat shock method (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]).

Transformované buňky byly pěstovány nejprve při 37°C v LB médiu obsahujícím 50 gg/ml karbenicilizu za optické hustoty (600 nm) kultury přibližně 2-3. LB kultura byla poté naředěna 20x v M9 médiu obsahujícím 0,49% casamino kyselin (hm./obj.) a 50 gg/ml karbenicilinu. Po 1. hod růstu se vzdušněním při 30°C byla přidána indol-3-akrylová kyselilna na celkovou koncentraci 50 gg/ml. Kultura byla poté kontinuálně pěstována při 30 °C se vzdušněním dalších 15 hodin a poté byly buňky shromážděny centrifugací.The transformed cells were grown first at 37 ° C in LB medium containing 50 gg / ml carbenicillus at an optical density (600 nm) of the culture of about 2-3. The LB culture was then diluted 20x in M9 medium containing 0.49% casamino acids (w / v) and 50 gg / ml carbenicillin. After 1 hour growth with aeration at 30 ° C, indole-3-acrylic acid was added to a total concentration of 50 gg / ml. The culture was then continuously grown at 30 ° C with aeration for an additional 15 hours and then the cells were collected by centrifugation.

Příklad 22Example 22

Produkce biologicky aktivního TPO (Meť¹ 1-153) v E. coliProduction of biologically active TPO (Me ¹ 1-153) in E. coli

Postupy uvedené níže pro produkci biologicky aktivního, znovusvinutého TPO (Meť¹ 1-153) mohou být analogicky aplikovány pro získání dalších TPO variant včetně N a C koncově prodloužených forem (viz Příklad 23). A. Získání nerozpustného TPO (Meť¹ 1-153)The procedures set forth below for the production of biologically active, re-developed TPO (Me ¹ 1-153) can be applied analogously to obtain other TPO variants including N and C terminally elongated forms (see Example 23). A. Obtaining insoluble TPO (Me ¹ 1-153)

Buňky E. coli exprimující TPO (Meť¹ 1-153) kódovaný plasmidem pMP210-l byly fermentovány jak je popsáno výše. Obvykle je 1000 g buněk resuspendováno v 11 (10 objemů) buněčného rozrušovacího pufru (10 mM Tris, 5mM EDTA, pH 8) s Polytron homogenizérem a buňky jsou centrifugovány přiE. coli cells expressing TPO (Me ¹ 1-153) encoded by plasmid pMP210-1 were fermented as described above. Typically, 1000 g of cells are resuspended in 11 (10 volumes) cell disruption buffer (10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) with a Polytron homogenizer and the cells are centrifuged at

206206

5000xg 30 min. Promyté buněčné pelety jsou znovu resuspendovány vil buněčného rozrušovacího purfu- s Polytron homogenizérem a buněčná suspense je protlačena přes LH Cell Disrupter (LH Inceltech, lne.) nebo přes Microfluidizer (Microfluidics International) podle komerčních instrukcí. Suspenze je centrifugována při 5000g 30 min. a resuspendována a centrifugována podruhé za vzniku promytých pelet refraktilních částic. Promyté pelety jsou ihned použity nebo jsou skladovány zmražené při -70°C.5000xg 30 min. The washed cell pellets are resuspended in a 1 µ cell disruption buffer with a Polytron homogenizer and the cell suspension is passed through a LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Inc) or via a Microfluidizer (Microfluidics International) according to commercial instructions. The suspension is centrifuged at 5000g for 30 min. and resuspended and centrifuged a second time to form washed refractile particle pellets. The washed pellets are used immediately or stored frozen at -70 ° C.

B. solubilizace a purifikace monomerního TPO (Met^-1 1-153)B. solubilization and purification of monomeric TPO (Met ^-1 1-153)

Výše uvedené pelety jsou resuspendovány v 5 objemech hmotnosti 20 mM Tris, pH 8, s 6-8 M guanidinu a 25 mM DTT (dithiotreitol) a míchány 1-3 hod, nebo přes noc, při 4°C, aby byla zlepšena solubilizace TPO proteinu. Vysoké koncentrace močoviny (6-8M) jsou také obecně použitelné ale ve srovnání s guanidinem jsou nižší výtěžky. Po solubilizace je roztok centrifugován 30 min. při 30000xg za vzniku čirého supernatantu obsahujícího denaturovaný monomerní TPO protein. Supernatant je poté chromatografovén na Superdex 200 gelové filtrační koloně (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) při průtoku 2 ml/min. a protein je eluován 20 mM Na fosfátem, pH 6,0, s 10 mM DTT. Byly shromážděny frakce obsahující monomerní denaturovaný TPO protein eluovaný mezi 160 a 200 ml. TPO protein je dále purifikován na semipreparativní C4 koloně s reverzní fází (2x20 cm VYDAC). Vzorek je nanesen při 5 ml/min na kolonu ekvilibrovanou 0,1% TFA (triflúoroctová kyselina) s 30% acetonitrilu. Protein je eluován lineárním gradientem acetonitrilu (3060% v 60 min). Purifikovaný redukovaný protein eluoval při přibližně 50% acetonitrilu. Tento materiál byl použit pro znovusvinování za vzniku biologicky aktivní TPO varianty.The above pellets are resuspended in 5 volumes of 20 mM Tris, pH 8, with 6-8 M guanidine and 25 mM DTT (dithiotreitol) and stirred for 1-3 hours, or overnight, at 4 ° C to improve TPO solubilization protein. High urea (6-8M) concentrations are also generally applicable but lower yields are compared to guanidine. After solubilization, the solution is centrifuged for 30 min. at 30000xg to form a clear supernatant containing denatured monomeric TPO protein. The supernatant is then chromatographed on a Superdex 200 gel filtration column (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) at a flow rate of 2 ml / min. and the protein is eluted with 20 mM Na phosphate, pH 6.0, with 10 mM DTT. Fractions containing monomeric denatured TPO protein eluting between 160 and 200 ml were collected. The TPO protein is further purified on a reverse phase semi-preparative C4 column (2x20 cm VYDAC). The sample is loaded at 5 ml / min onto a column equilibrated with 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) with 30% acetonitrile. The protein is eluted with a linear gradient of acetonitrile (3060% in 60 min). The purified reduced protein eluted at approximately 50% acetonitrile. This material was used for reclamation to produce a biologically active TPO variant.

207207

C. Příprava biologicky aktivního TPO (Met^-1 1-153)C. Preparation of biologically active TPO (Met ^-1 1-153)

Přibližně 20 mg monomerního redukovaného a denaturovaného TPO proteinu v 40 ml 0,1% TFA/50% acetonitrilu je naředěno na 360 ml znovusvinovacím pufrem obsahujícím následující reagencie: 50mM Tris, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA, 2% CHÁPS detergent, 25% glycerol, 5 mM oxidovaný glutathion, 1 mM redukovaný glutathion, pH nastaveno na 8,3.Approximately 20 mg of monomeric reduced and denatured TPO protein in 40 mL of 0.1% TFA / 50% acetonitrile is diluted to 360 mL with re-upset buffer containing the following reagents: 50 mM Tris, 0.3 M NaCl, 5 mM EDTA, 2% CHAPA detergent, 25% glycerol, 5 mM oxidized glutathione, 1 mM reduced glutathione, pH adjusted to 8.3.

Po smíchání byl znovusvinovací purf jemně míchán při 4°C 12-48 hodin kvůli maximálnímu výtěžku správně svinutého TPO se správnými disulfidovými vazbami (viz níže). Roztok byl poté okyselen TFA na celkovou koncentraci 0,2%, zfiltrován přes 0,45 nebo 0,22 mikronový filtr, a přidáno 1/10 objemu acetonitrilu. Roztok byl poté nanesen na C4 kolonu s referzní fází a purifikovaný znovusvinutý TPO (Met^-1 1-153) eluován stejným gradientem jak je uvedeno výše. Znovusvinutý biologicky aktivní TPO je eluován při 45% acetonitrilu za těchto podmínek. TPO verse s nesprávnými disulfidovými vazbami eluují dříve. Výsledný purifikovaný TPO (Meť¹ 1-153) je čistý více jak 95%, jak bylo stanoveno SDS gelem a analytickou C4 chromatografií s reverzní fází. Pro výzkum na zvířatech byl C4 purifikovaný materiál dializován do fysiologicky kompatibilních pufrů. Byly použity isotonické pufry (10 mM Na acetát, pH 5,5, 10 mM sukcinát, pH 5,5 nebo 10 mM Na fosfát, pH 7,4) obsahující 150 mM NaCl a 0,01% Tweenu 80.After mixing, the re-refining buffer was gently stirred at 4 ° C for 12-48 hours to maximize the yield of properly folded TPO with proper disulfide bonds (see below). The solution was then acidified with TFA to a total concentration of 0.2%, filtered through a 0.45 or 0.22 micron filter, and 1/10 volume of acetonitrile was added. The solution was then applied to a C4 column referzní phase znovusvinutý purified TPO (Met ^-1 1-153) eluted with the same gradient as above. The recovered biologically active TPO is eluted at 45% acetonitrile under these conditions. TPO versions with incorrect disulfide bonds elute earlier. The resulting purified TPO (Me ¹ 1-153) is more than 95% pure as determined by SDS gel and reverse phase analytical C4 chromatography. For animal research, the C4 purified material was dialyzed into physiologically compatible buffers. Isotonic buffers (10 mM Na acetate, pH 5.5, 10 mM succinate, pH 5.5 or 10 mM Na phosphate, pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 0.01% Tween 80 were used.

Z důvodu vysoké účinnosti TPO (polovina maximální stimulace v Ba/F3 vazebném stanovení je dosažena při 3 pg/ml) je možné k získání biologicky aktivního materiálu použít mnoho různých pufrů, detergentů a redoxních podmínek. Ovšem za mnoha podmínek je získáno velmi malé množství správně svinutého materiálu (<10%). Pro komerčníBecause of the high efficiency of TPO (half the maximum stimulation in the Ba / F3 binding assay is achieved at 3 µg / ml), many different buffers, detergents and redox conditions can be used to obtain the biologically active material. However, under many conditions a very small amount of properly rolled material (<10%) is obtained. For commercial

208 průmyslové způsoby přípravy je požadován výtěžek znovusvinutí nejméně 10%, výhodněji 30-50% a nejvýhodhěji >50%. Pro produkci nejméně takto svinutého materiálu bylo nalezeno mnoho různých detergentů zahrnujících Triton X100, dodecyl-beta-maltosid, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkosyl, TWEEN 20 a Tween 80, Zwittergent 3-14 a další. Z těchto detergentů byly ovšem nejvýhodnější detergenty ze skupiny CHAPS (CHAPS a CHAPSO), u kterých bylo zjištěno, že znovusvinovací reakce probíhá nejlépe a omezuje proteinovou agregaci a nevhodné disulfidové formace. Nejvýhodnější je hladina CHAPS vyšší než 1%. Pro lepší výtěžek byl potřebný chlorid sodný, s optimální hladinou mezi 0,lM a 0,5 Μ. V redoxním pufru byla preferován přítomnost EDTA (l-5mM) kvůli omezení rozsahu kovem katalyzované oxidace (a agregace), která byla pozorována u některých preparací. Optimální podmínky pro znovusvinutí jsou při koncentraci glycerolu větší než 15%. Pro maximální výtěžek je nezbytné mít jako redoxní pár oxidovaný a redukovaný glutathion nebo oxidovaný a redukovaný cystein. Obecně vyšší výtěžek je pozorován pokud molární poměr oxidovaného člena redoxního páru je stejný nebo v přebytku proti redukovanému členu redoxního páru. Pro znovusvinutí této varianty TPO jsou optimální pH hodnoty mezi 7,5 a 9. Organické rozpouštědlo (např. ethanol, acetonitril, methanol) bylo tolerováno v koncentracích 10-15% nebo nižších. Vyšší hladiny organických rozpouštědel zvyšují množství nesprávně svinutých forem. Tris a fosfátové pufry byly obecně použitelné. Inkubace při 4°C také zvyšuje hladiny správně svinutého TPO.208 of the industrial preparation processes, a refolding yield of at least 10%, more preferably 30-50% and most preferably> 50% is required. Many different detergents have been found to produce the least coiled material including Triton X100, dodecyl-beta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosyl, TWEEN 20 and Tween 80, Zwittergent 3-14 and others. Of these detergents, however, the most preferred were those of the CHAPS family (CHAPS and CHAPSO), which were found to be the best regrowth reaction to reduce protein aggregation and inappropriate disulfide formulations. Most preferred is a CHAPS level of greater than 1%. Sodium chloride was needed for better yield, with an optimal level between 0.1M and 0.5 Μ. The presence of EDTA (1-5 mM) was preferred in the redox buffer to limit the extent of the metal catalyzed oxidation (and aggregation) observed in some preparations. Optimal conditions for rewinding are greater than 15% at glycerol concentration. For maximum yield, it is necessary to have oxidized and reduced glutathione or oxidized and reduced cysteine as the redox pair. Generally, a higher yield is observed when the molar ratio of the oxidized redox member is equal to or in excess of the reduced redox member. PH values between 7.5 and 9 are optimal for re-development of this TPO variant. The organic solvent (eg ethanol, acetonitrile, methanol) was tolerated at concentrations of 10-15% or less. Higher levels of organic solvents increase the amount of misfolded forms. Tris and phosphate buffers were generally applicable. Incubation at 4 ° C also raises levels of correctly folded TPO.

Výtěžek znovusvinutí 40-60% (na základě množství redukovaného a denaturovaného TPO použitého v znovusvinovací reakci) je typický pro preparace TPO, kdeThe rewinding yield of 40-60% (based on the amount of reduced and denatured TPO used in the rewinding reaction) is typical for TPO preparations where

209 purifikace probíhá přes první C4 krok. Aktivní materiál může být získán i při omezení purifikační preparace (např. přímo po Superdex 200 koloně nebo po úvodní extrakci refraktilních částic), ovšem výtěžky jsou nižší kvůli rozsáhlé precipitací a interferenci s non-TPO proteiny během TPO znovusvinovacího procesu.209 purification proceeds through the first C4 step. The active material can also be obtained by limiting the purification preparation (eg, directly after the Superdex 200 column or after the initial extraction of refractile particles), but yields are lower due to extensive precipitation and interference with non-TPO proteins during the TPO re-recovery process.

Zatímco TPO obsahuje 4 cysteinové zbytky, je možné připravit tři různé disulfidové verze tohoto proteinu:While TPO contains 4 cysteine residues, it is possible to prepare three different disulfide versions of this protein:

verze version 1: disulfidy 1: disulfides mezi between cysteinovými cysteine zbytky remnants 1-4 1-4 a and 2-3 2-3 verze version 2: disulfidy 2: disulfides mezi between cysteinovými cysteine zbytky remnants 1-2 1-2 a and 3-4 3-4 verze version 3: disulfidy 3: disulfides mezi between cysteinovými cysteine zbytky remnants 1-3 1-3 a and 2-4. 2-4.

Během počátečních pokusů při stanovení podmínek znovusvinovací reakce, bylo C4 chromatografii s reversní fází separováno několik různých píků obsahujících TPO protein. Pouze jeden z těchto píků měl signifikantní biologickou aktivitu, jak bylo stanoveno Ba/F3 stanovením. Následně byly svinovací podmínky optimalizovány za přednostního zisku této verze. Za těchto podmínek bylo v solubilizačním kroku získáno méně než 10-20% chybně svinutého TPO z celkového monomerního TPO.Several initial peaks containing TPO protein were separated by reverse-phase C4 chromatography during the initial experiments to determine the conditions of the re-uptake reaction. Only one of these peaks had significant biological activity as determined by the Ba / F3 assay. Subsequently, the rolling conditions were optimized for the preferred gain of this version. Under these conditions, less than 10-20% of the misfolded TPO of the total monomeric TPO was recovered in the solubilization step.

Hmotností spektrometrií a sekvenováním proteinu byl jako disulfidový vzor pro biologicky aktivní TPO stanoven 1-4 a 2-3 (tj. verze 1). Digesce směsi byla analyzována laserovou desorpční hmotností spektrometrií s pomocí matrix před a po redukci s DTT. Po redukci byly detekovány hmotnosti odpovídaljící největším tryptickým peptidům TPO. V neredukovaných vzorcích chyběly některé hmotnosti a objevily se nové. Hmotnost nových píků odpovídala součtu jednotlivých tryptických peptidů zahrnutých v disulfidových párech. Tedy je možné jednoznačně označit, že jednotlivé disulfidové vzory znovusvinutého rekombinantního biologickyMass spectrometry and protein sequencing determined 1-4 and 2-3 (i.e., version 1) as the disulfide pattern for biologically active TPO. Digestion of the mixture was analyzed by laser desorption mass spectrometry using matrix before and after reduction with DTT. After reduction, weights corresponding to the largest tryptic TPO peptides were detected. In the non-reduced samples, some weights were missing and new weights appeared. The weight of the new peaks corresponded to the sum of the individual tryptic peptides involved in the disulfide pairs. Thus, it can be unequivocally denoted that individual disulfide patterns of recombinantly recombinant biologically

210 aktivního TPO budou 1-4 a 2-3. To je v souladu se známými disulfidovými vzory odpovídajícími molekule erythropoetinu.210 active TPO will be 1-4 and 2-3. This is consistent with known disulfide patterns corresponding to the erythropoietin molecule.

D. Biologická aktivita rekombinantního, znovusvinutého TPO (met 1-153)D. Biological activity of recombinant, re-developed TPO (met 1-153)

Znovusvinutý a purifikovaný TPO má aktivitu ve stanoveních in vitro i in vivo. Např. v Ba/F3 stanovení, byla polovina maximální stimulace thymidinové inkorporace do Ba/F3 buněk pro TPO (Met^-1 1-153) zjištěna při 3,3 pg/ml (0,3 pM) . V testu ELISA založeném na mpl-receptoru byla polovina maximální aktivity pozorována při 1,9 ng/ml (120 pM). U normálních a myelosuprimovaných zvířat připravených téměř letální X-radiací, byla znovusvinutá TPO (Meť^{1 2} 1153) vysoce účinná (aktivita byla pozorována při dávce nižší než 30 ng/myš) při stimulaci produkce nových destiček.Recreated and purified TPO has activity in both in vitro and in vivo assays. E.g. In the Ba / F3 assay, half-maximal stimulation of thymidine incorporation into Ba / F3 cells for TPO (Met ^-1 1-153) were detected at 3.3 pg / ml (0.3 pM). In an mpl-receptor based ELISA, half of the maximal activity was observed at 1.9 ng / ml (120 pM). In normal and myelosuppressed animals prepared by near lethal X-radiation, re-developed TPO (Me ^{1 2} 1153) was highly effective (activity was observed at a dose of less than 30 ng / mouse) in stimulating the production of new platelets.

Příklad 23Example 23

Produkce dalších biologicky aktivních TPO variant v E. coliProduction of other biologically active TPO variants in E. coli

Níže byly získáni tři různé TPO varianty produkované vBelow were obtained three different TPO variants produced in

E. coli, purifikované a znovusvinutá do biologické aktivity.E. coli, purified and re-wound into biological activity.

(1) MLF - 13 zbytků z bakterií odvozené signální sekvence STU je fúzováno do N-koncové domény TPO (zbytky 1-155). Výsledná sekvence je(1) MLF-13 residues from the bacterially derived STU signal sequence is fused to the N-terminal domain of TPO (residues 1-155). The resulting sequence is

MKKNIAFLLNAYASPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 85) kde leaderové sekvence je podtržena a C.....C představujeMKKNIAFLLNAYASPAPPAC ..... CVRRA (SEQ ID NO: 85) where the leader sequence is underlined and C ..... C represents

Cys⁷ až Cys¹⁵¹. Tato varianta byla konstruována kvůli získání tyrosinu pro radio-jodaci TPO pro receptorové a biologické studie.Cys ⁷ to Cys ¹⁵¹ . This variant was designed to obtain tyrosine for TPI radioiodination for receptor and biological studies.

(2) H8MLF - 7 zbytků z STU sekvence, 8 histidinových zbytků a enzymová štěpná sekvence Faktoru Xa IEGR jsou(2) H8MLF - 7 residues from STU sequence, 8 histidine residues and Factor Xa enzyme cleavage sequence IEGR are

211 fúzovány do N-koncové domény (zbytky 1-155) TPO. Sekvence je211 fused to the N-terminal domain (residues 1-155) of TPO. The sequence is

MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC.....CVRRA (SEQ ID NO: 86) kde leaderová sekvence je podtržena a C.....C představujeMKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC ..... CVRRA (SEQ ID NO: 86) where the leader sequence is underlined and C ..... C represents

Cys⁷ až Cys¹⁵¹. Tato varianta, purifikovaná a znovusvinutá, může být upravena pomocí enzymu Faktor Xa, který bude štěpit za argininovým zbytkem sekvence IEGR za vzniku TPO varianty o délce 155 zbytků s přirozenou serinovou Nkoncovou aminokyselinou.Cys ⁷ to Cys ¹⁵¹ . This variant, purified and refolded, can be engineered with Factor Xa, which will cleave after the arginine residue of the IEGR sequence to form a TPO variant of 155 residues with a natural serine N-terminal amino acid.

(3) T-H8MLF - je připraven jak je popsáno výše pro variantu (2) , pouze do N-koncové domény TPO je fúzována na trombin senzitivní sekvence IEPR. Výsledná sekvence je(3) T-H8MLF - is prepared as described above for variant (2), only the N-terminal domain of TPO is fused to the thrombin-sensitive IEPR sequence. The resulting sequence is

MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPAC.....CMRRA (SEQ ID NO: 87) kde leaderová sekvence je podtržena a C.....C představujeMKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPAC ..... CMRRA (SEQ ID NO: 87) where the leader sequence is underlined and C ..... C represents

Cys⁷ až Cys¹⁵¹. Tato varianta, purifikovaná a znovusvinutá, může být upravena pomocí enzymu trombinu za vzniku TPO varianty o délce 155 zbytků s přirozenou serinovou Nkoncovou aminokyselinou.Cys ⁷ to Cys ¹⁵¹ . This variant, purified and refolded, can be treated with the enzyme thrombin to produce a TPO variant of 155 residues in length with a natural serine N-terminal amino acid.

A. Získání, solubilizace purifikace monomerních biologicky aktivních TPO variant (1), (2) a (3)A. Obtaining, solubilizing the purification of monomerically biologically active TPO variants (1), (2) and (3)

Všechny varianty byly exprimovány v E. coli. Většina variant byla nalezena v refraktilních částicích, ja.íf je pozorováno v Příkladu 22 pro TPO (Meť¹ 1-153) . Identické znovusvinovací podmínky které byly použity pro TPO (Met^-1 1-153 byly použity s celkovým výtěžkem 30-50%. Po znovusvinutí byly TPO varianty purifikovány C4 chromatografií s reverzní fází v 0,1% TFA s použitím acetonitrilového gradientu jak je popsáno dříve. Všechny TPO varianty (ve své neproteolyzované formě) měly biologickou aktivitu, což bylo stanoveno Ba/F3 stanovením, s poloviční maximální aktivitou 2-5 pM.All variants were expressed in E. coli. Most of the variants were found in refractile particles as seen in Example 22 for TPO (Me ¹ 1-153). Identical re-uptake conditions used for TPO (Met ^-1 1-153 were used with a total yield of 30-50%. After re-uptake, TPO variants were purified by reverse phase C4 chromatography in 0.1% TFA using an acetonitrile gradient as described previously. All TPO variants (in their non-proteolyzed form) had biological activity as determined by Ba / F3 assay, with half maximal activity of 2-5 pM.

212212

B. Proteolitické postupy pro varianty (2) a (3) za vzniku pravého N-koncového TPO (1-153)B. Proteolithic procedures for variants (2) and (3) to form true N-terminal TPO (1-153)

TPO varianty (2) a (3) výše byly zkonstruovány s enzymaticky-štěpným leaderovým peptidem před normálním Nkoncovým aminokyselinovým zbytkem TPO. Po znovusvinutí a purifikací variant (2) a (3) jak je popsáno výše byla každá varianta podrobena digescí vhodným enzymem. Pro každou variantu byl odstraněn acetonitril z kroku C4 reverzní fáze průtokem mírného proudu dusíku roztokem. Poté byly obě varianty upraveny faktorem Xa nebo trombinem jak je popsáno níže.TPO variants (2) and (3) above were constructed with an enzymatically-cleaved leader peptide upstream of the normal N-terminal amino acid residue of TPO. After refolding and purification of variants (2) and (3) as described above, each variant was digested with the appropriate enzyme. For each variant, acetonitrile was removed from the reverse phase step C4 by flowing a slight stream of nitrogen through the solution. Then, both variants were treated with Factor Xa or thrombin as described below.

Pro TPO variantu (2) byl do roztoku bez acetonitrilu přidán 1 M Tris pufr, pH 8 do celkové koncentrace 50 mM, v případě potřeby bylo nastaveno pH na 8. NaCl a CaCl2 byly přidány v 0,1 M a 2 mM, respektive. Byl přidán faktor Xa (New England Biolabs) aby byl dosažen moiární poměr enzymu k variantám od 1:25 DO 1:100. Vzorek byl inkubován 1-2 hod. při laboratorní teplotě až došlo k maximálnímu štěpení což se projevilo změnou v migraci na SDS gelech a znamenalo to ztrátu leaderové sekvence. Poté byla reakční směs purifikována C4 chromatografií s feverzní fází s použitím stejného gradientu a podmínek který jsou popsány výše pro purifikací správně znovusvinutých variant. Neštěpená varianta B byla separována od štěpené varianty (2) za těchto podmínek. Ukázalo se, že N-koncové aminokyseliny jsou SPAPP, což znamená, že odstranění N-koncové leaderové sekvence bylo úspěšné. Působením Faktoru Xa také vzniklo variabilní množství vnitřních štěpení uvnitř TPO démény, štěpení bylo pozorováno za argininovým zbytkem v poloze 118 za vzniku další N-koncové sekvence TTAHKDP (SEQ ID NO:88). Pro variantu štěpenou Faktorem Xa byl na neredukujicích SDSFor TPO variant (2), 1 M Tris buffer, pH 8 to a total concentration of 50 mM was added to the acetonitrile-free solution, adjusted to pH 8 if necessary. NaCl and CaCl 2 were added at 0.1 M and 2 mM, respectively. Factor Xa (New England Biolabs) was added to achieve a molar ratio of enzyme to variants of from 1:25 to 1: 100. The sample was incubated for 1-2 hours at room temperature until maximum digestion resulted in a change in migration on SDS gels and meant a loss of leader sequence. Thereafter, the reaction mixture was purified by reverse phase C4 chromatography using the same gradient and conditions as described above for purification of correctly rewound variants. The uncleaved variant B was separated from the cleaved variant (2) under these conditions. The N-terminal amino acids have been shown to be SPAPP, meaning removal of the N-terminal leader sequence has been successful. Factor Xa treatment also produced a variable amount of internal cleavage within the TPO daemon, cleavage was observed after the arginine residue at position 118 to give an additional N-terminal sequence of TTAHKDP (SEQ ID NO: 88). For the Factor Xa cleaved variant, SDS was on non-reducing

213 gelech pozorován jeden pás mající 17000 daltonů, na redukujících gelech byly pozorovány dva pásy s molekulovou hmotností 12000 a 5000 daltonů, obsahující štěpení na argininu 118. Toto pozorování potvrdilo, že dvě části molekuly jsou vzájemně spojeny disulfidovou vazbou mezi prvním a čtvrtým cisternovým zbytkem, jak bylo vyvozeno z digesce trypsinem ve výši popsaných pokusech. V Ba/F3 biologickém stanovení měla purifikovaná TPO (1-155) varianta po odstranění N-koncové leaderové sekvence a vnitřním štěpení polovinu maximální aktivity 0,2 až 0,3 píkomolární. Intaktní varianta s leaderovou sekvencí měla polovinu maximální rychlosti 2-4 píkomolární.213 bands were observed with one band having 17000 daltons, two reducing bands of 12000 and 5000 daltons were observed on reducing gels, containing the cleavage to arginine 118. This observation confirmed that the two parts of the molecule are interconnected by a disulfide bond between the first and fourth tank residues, as deduced from trypsin digestion in the above experiments. In the Ba / F3 bioassay, the purified TPO (1-155) variant had, after removal of the N-terminal leader sequence and internal cleavage, half the maximum activity of 0.2-0.3 picomolar. The intact variant with the leader sequence had half the maximum speed of 2-4 picolar.

Pro variantu (3) obsahoval digestivní pufr 50 mM Tris, pH 8, 2% CHAPS, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA a lidský nebo hovězí trombin (Calbiochem) při 1:25 až 1:50 hmotnosti enzymu k TPO variantnímu proteinu. Digensce byla provádería při laboratorní teplotě 2-6 hodin. Postup digesce byl sledován na SDS gelech jak je popsáno výše pro digesci Faktorem Xa. Obecně bylo za tuto dobu odštěpeno více než 90% leaderových sekvencí. Výsledný TPO byl purifikován na C4 kolonách s reverzní fází jak je popsáno výše a zjistilo se, že má požadovanou N-koncovou aminokyselinovou sekvenci. Bylo získáno velmi malé množství (<5%) interních štěpů stejné arginin-theronin vazby jak bylo pozorováno výše u Faktoru Xa. Výsledný TPO protein měl vysokou biologickou aktivitu s polovinou maximální odpovědi v Ba/F3 stanovení při 0,2-0,4 pikomolech proteinu. V stanovení ELISA založeném na mpl receptoru měl tento protein polovinu maximální odpovědi 2-4 ng/ml purifikovaného proteinu (120-240 pikomol) zatímco intaktní varianta obsahující leaderovou sekvenci aktivitu 5 až 10 krát nižší. Pro studie na zvířatech byl HPLCFor variant (3), the digestion buffer contained 50 mM Tris, pH 8, 2% CHAPS, 0.3 M NaCl, 5 mM EDTA, and human or bovine thrombin (Calbiochem) at 1:25 to 1:50 weight of enzyme to TPO variant protein . Digensce was performed at room temperature for 2-6 hours. The digestion procedure was followed on SDS gels as described above for digestion with Factor Xa. In general, over 90% of the leader sequences have been cleaved during this time. The resulting TPO was purified on reverse phase C4 columns as described above and was found to have the desired N-terminal amino acid sequence. Very small amounts (<5%) of internal grafts of the same arginine-theronin binding were obtained as observed above for Factor Xa. The resulting TPO protein had high biological activity with half the maximal response in the Ba / F3 assay at 0.2-0.4 picomoles of protein. In an mpl receptor-based ELISA, this protein had half the maximal response of 2-4 ng / ml purified protein (120-240 picomol) while the intact variant containing the leader sequence activity was 5-10 times lower. For animal studies it was HPLC

214 purifikovaný štěpený protein dialyzován do fysiologicky přijatelných pufru, s 150 mM NaCl, 0,01% Tweenu 80 a 10 mM sukcinátu sodného, pH 5,5, nebo 10 mM acetátu sodného, pH 5,5, nebo 10 mM fosfátu sodného, pH 7,4. Bylo stanoveno HPLC a SDS gely, že purifikovaný protein byl stabilní několik týdnů při uchování při 4°C. U normálních a myelosuprimovaných myší byl tento TPO se skutečnou Nkoncovou sekvencí vysoce aktivní, stimuloval produkci destiček při dávkách tak nízkých jako 30 ng/myš.214 purified cleaved protein dialyzed into physiologically acceptable buffers, with 150 mM NaCl, 0.01% Tween 80 and 10 mM sodium succinate, pH 5.5, or 10 mM sodium acetate, pH 5.5, or 10 mM sodium phosphate, pH 7.4. It was determined by HPLC and SDS gels that the purified protein was stable for several weeks when stored at 4 ° C. In normal and myelosuppressed mice, this TPO with the true N-terminal sequence was highly active, stimulating platelet production at doses as low as 30 ng / mouse.

Příklad 24Example 24

Syntetický mpl ligandSynthetic mpl ligand

Ačkoliv lidský mpl ligand (hML) je obvykle připraven rekombinantními metodami, může být také syntetizován enzymatickou ligaci syntetických peptidových fragmentů s použitím níže popsaných metod. Systetická produkce hML umožňuje inkorporací nepřirozených aminokyselin nebo syntetických funkčních skupin jako je polyethylenglykol. Zvláště mutant serinové proteasy subtilisinu BPN, subtiligasa (S221C/P225A), byl použit k účinné ligaci peptidových esterů ve vodném roztoku (Abrahmsen a kol., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). Bylo nyní zjištěno, že syntetické peptidy mohou být enzymaticky ligovány v sekvenční oblasti k produkci enzymaticky aktivních dlouhých peptidů a proteinů jako je ribonukleasa A (Jackson a kol., Science, [1994]). Tato technologie, popsaná podrobněji níže, umožňuje chemicky syntetizovat dlouhé proteiny které mohly být dříve připraveny pouze rekombinantní DNA technologií.Although human mpl ligand (hML) is usually prepared by recombinant methods, it can also be synthesized by enzymatic ligation of synthetic peptide fragments using the methods described below. The systematic production of hML allows for the incorporation of unnatural amino acids or synthetic functional groups such as polyethylene glycol. In particular, a subtilisin BPN serine protease mutant, subtiligase (S221C / P225A), has been used to efficiently ligate peptide esters in aqueous solution (Abrahmsen et al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). It has now been found that synthetic peptides can be enzymatically ligated in the sequence region to produce enzymatically active long peptides and proteins such as ribonuclease A (Jackson et al., Science, [1994]). This technology, described in more detail below, makes it possible to chemically synthesize long proteins that could previously only be produced by recombinant DNA technology.

tftf

215215

Obecný postup syntézy hML153 používající subtiligasu je ukázán na schématu 1. Výchozí je plně nechráněný peptid odpovídající C-koncovému fragmentu proteinu, N-koncový chráněný a C-koncový aktivovaný esterový peptid je poté přidán spolu se subtiligasou. Po dokončení reakce je produkt izolován HPLC s reverzní fází a z N-konce je odtraněna chránící skupina. Je ligován následující peptidový fragment, odstraněna chránící skupina a postup se opakuje s použitím následujících peptidů dokud není získán protein plné délky. Postup je podobný jako postup v pevné fázi, při které je N-koncově chráněný C-koncově aktivovaný peptid ligován na N-konec předcházejícího peptidů a protein je syntetizován ve směru C->N. Ovšem protože každým navázáním se může navázat až 50 zbytků a produkt je izolován po každé ligaci, mohou být syntetizovány vysoce čisté proteiny s přiměřenými výtěžky. ”The general procedure for the synthesis of hML153 using subtiligase is shown in Scheme 1. The starting is a fully unprotected peptide corresponding to the C-terminal fragment of the protein, the N-terminal protected and the C-terminal activated ester peptide is then added together with the subtiligase. Upon completion of the reaction, the product is isolated by reverse phase HPLC and the N-terminus is deprotected. The following peptide fragment is ligated, the protecting group removed, and the procedure repeated using the following peptides until a full-length protein is obtained. The procedure is similar to the solid phase procedure in which the N-terminally protected C-terminally activated peptide is ligated to the N-terminus of the preceding peptide and the protein is synthesized in the C-> N direction. However, since up to 50 residues can be bound by each binding and the product is isolated after each ligation, highly pure proteins can be synthesized with reasonable yields. ”

Schéma 1. Princip syntézy hML s použitím subtiligasyScheme 1. Principle of hML synthesis using subtiligase

R-NH-Peptid 2-CO-R* + H₂N-Peptid _rCO₂ | 1) SubtiligasaR-NH-Peptide 2-CO-R * + H ₂ N-Peptide _r CO ₂ | 1) Subtiligase

R-NH-Peptid 2'CO-NH-Peptid _rCO₂ | 2) Zn/CH₃CO₂HR-NH-Peptide 2'CO-NH-Peptide _r CO ₂ | 2) Zn / CH ₃ CO ₂ H

H₂N-Peptid 2“CO-NH-Peptid i-C0₂ | 3) ZtaovqH ₂ N-Peptide 2-CO-NH-Peptide i-CO ₂ | 3) Ztaovq

H₂N-Peptid 3-CO-NH-Peptid ₂-CO-NH-Peptid _rCO₂ H ₂ N-Peptide 3-CO-NH-Peptide ₂ -CO-NH-Peptide _r CO ₂

O (CH2)₄ nh₂ O (CH 2) ₄ nh ₂

216216

Na základě našich znalostí sekvenční specifity subtiligasy stejně jako aminokyselinové sekvence biologicky aktivní „epo-domény hML, rozdělili jsme hML153 do sedmi fragmentů o délce 18-25 zbytků. Byly syntetizovány testovací ligační tetrapeptidy ke stanovení vhodných ligačních spojení pro 18-25mery. Tab. 13 ukazuje výsledky těchto ligačních testů.Based on our knowledge of the sequence specificity of the subtiligase as well as the amino acid sequences of the biologically active epo-domain of hML, we divided hML153 into seven fragments of 18-25 residues in length. Test ligation tetrapeptides were synthesized to determine appropriate ligation junctions for the 18-25mer. Tab. 13 shows the results of these ligation tests.

Tab. 13: hML testovací ligace.Tab. 13: hML test ligation.

Donorové a nukleofilní peptidy byly rozpuštěny při 10 mM v 100 mM tricinu (pH 7,8) při 22°C. Ligasa byla přidána do celkové koncentrace 10 μΜ z 1,6 mg/ml zásobního roztoku (přibližně μ70 M) a ligace probíhala přes noc. Výtěžek jsou % ligace versus hydrolýza donorových peptidů.Donor and nucleophilic peptides were dissolved at 10 mM in 100 mM tricine (pH 7.8) at 22 ° C. Ligase was added to a total concentration of 10 μΜ of the 1.6 mg / ml stock solution (approximately μ70 M) and the ligation was performed overnight. The yields are% ligation versus hydrolysis of donor peptides.

217217

ιΊι'£ΐ~ο ΊΊ '£ ΐ ~ ο Donor (glc-K-NH2) Donor (glc-K-NH1) hJnklAo/ί I -»-NH2 hJnklAo / ί I - »- NH2 % Hydi-cÍv£V % Hygiene £ V %'LÍ33Cc. % 'Li33Cc. 1 (23/24) 1 (23/24) HVLH (SEQ ID NO: 89) HVLH (SEQ ID NO: 90) SRLS (SEQ ID NO: 90) SRLS (SEQ ID NO: 90) 92 92 08 08 / (22/23) (22/23) SHVL (SEQ ID NO: 91) SHVL (SEQ ID NO: 90) HSRL (SEQ ID NO: 92) HSRL (SEQ ID NO: 91) 48 48 52 52 2 (46/47) 2 (45/47) AVDF (SEQ ID NO: 93) AVDF (SEQ ID NO: 92) SLGE (SEQ ID NO: 94) SLGE (SEQ ID NO: 95) 22 22nd 78 78 3 (69/70) 3 (70/70) AVTL (SEQ ID NO: 95) AVTL (SEQ ID NO: 95) LLEG (SEQ ID NO: 96) LLEG (SEQ ID NO: 97) 53 53 47 47 4 (89/90) 4 (90/90) LSSL (SEQ ID NO: 97) LSSL (SEQ ID NO: 96) LGQL (SEQ ID NO: 98) LGQL (SEQ ID NO: 98) 95 95 05 05 / (88/89) (88/89) C(acm)LSS (SEQ ID NO: 99) C (acm) LSS (SEQ ID NO: 100) LLGQ (SEQ ID NO: 100) LLGQ (SEQ ID NO: 100) 00 00 00 00 (90/91) (90/91) SSLL (SEQ ID NO: 101) SSLL (SEQ ID NO: 100) GQLS (SEQ ID NO: 102) GQLS (SEQ ID NO: 101) 45 45 55 55 (88/89) (88/89) CLSS (SEQ ID NO: 103) CLSS (SEQ ID NO: 103) LLGQ (SEQ ID NO: 100) LLGQ (SEQ ID NO: 100) 90 90 JO YEAH 5(107/108) 5 (107/108) LQSL (SEQ ID NO: 104) LQSL (SEQ ID NO: 104) LGTQ (SEQ ID NO: 105) LGTQ (SEQ ID NO: 105) 99 . 99. 01 01 (106/107) (106/107) ALQS (SEQ ID NO: 106) ALQS (SEQ ID NO: 106) LLGT (SEQ ID NO: 107) LLGT (SEQ ID NO: 108) 70 70 30 30 6(128/129) 6 (128/129) NAJF (SEQ ID NO: 108) NAJF (SEQ ID NO: 108) LSFQ (SEQ ID NO: 109) LSFQ (SEQ ID NO: 110) 60 60 40 40

Na základě těchto experimentů mohly být ligační peptidy podle Tab. 14 účinně ligovány subtiligasou. Vhodná chránící skupina pro N-konec každého donorového esterového peptidu je nutná kvůli zabránění vzájemné samoligace. Zvolili jsme isonikotinylovou (iNOC) chránící skupinuBased on these experiments, the ligation peptides of Tab. 14 were effectively ligated by subtiligase. A suitable protecting group for the N-terminus of each donor ester peptide is necessary to avoid mutual self-ligation. We have chosen an isonicotinyl (iNOC) protecting group

i.and.

219219

Tab. 14Tab. 14

Peptidové fragmenty použité pro celkovou syntézu h-ML s použitím subtiligasyPeptide fragments used for the overall synthesis of h-ML using subtiligase

FragmentFragment

Sekvence (SEQ ID NO: 110)Sequence (SEQ ID NO: 110)

INOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2 (1-22) .INOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH 2 (1-22).

(SEQ ID NO: 111)(SEQ ID NO: 110)

INOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2 (23-46) (SEQ ID NO: 112)INOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH 2 (23-46) (SEQ ID NO: 112)

INOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH2 (47-69) (SEQ ID NO: 113)INOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH 2 (47-69) (SEQ ID NO: 113)

INOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2 (70-90) (SEQ ID NO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2 (90-106) (SEQ ID NO: 115)INOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH 2 (70-90) (SEQ ID NO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH 2 (90-106) (SEQ ID NO: 115)

INOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2 (107-128) (SEQ ID NO: 116)INOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH 2 (107-128) (SEQ ID NO: 116)

H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2 (129-153)H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2 (129-153)

224224

Seznam sekvencí 'Sv.(1) Obecné informace (i) APPLICANT: Genentech, lne.Sequence Listing 'St. (1) General Information (i) APPLICANT: Genentech, Inc.

Eaton, Dan L. de Sauvage, Frederic J.Eaton, Dan L. de Sauvage, Frederic J.

(ii) Wcefce-v vyh«-le*ti: TROMfcoPOďTJN (iii) poost ·. 44^ (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:(ii) Wcefce v * le le::: T T: ROM T iii iii ROM iii iii iii iii iii iii iii iii (iii) poost ·. 44 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: Genentech, lne.(A) ADDRESSEE: Genentech, Inc.

(B) STREET: 460 Point San Bruno Blvd (C) CITY: South San Francisco (D) - STATE: California (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 94080 (v) COMPUTER READABLE FORM:(B) STREET: 460 Point San Bruno Blvd (C) CITY: South San Francisco (C) - STATE: California (E) COUNTRY: USA ZIP: 94080 (v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: 5.25 inch, 360 Kb floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC coxnpatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: patin (Genentech) (vi) CURRENT APPLICATION DATA:(A) MEDIUM TYPE: 5.25 inch, 360 Kb floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC coxnpatible (C) OPERATING SYSTEM

(A) APPLICATION NUMBER:(A) APPLICATION NUMBER:

(B) FILING DÁTE:(B) FILING YOU GIVE:

(C) CLASSIFICATION:(C) CLASSIFICATION:

(vii) PRIOR APPLICATION DATA:(vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/176553 (B) FILING DÁTE: 03-JAN-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:(A) APPLICATION NUMBER: 08/176553 (B) FILING YOU: 03-JAN-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/348657 (B) FILING DÁTE: 02-DEC-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:(A) APPLICATION NUMBER: 08/348657 (B) FILING YOU: 02-DEC-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/185607 (B) FILING DÁTE: 21-JAN-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:(A) APPLICATION NUMBER: 08/185607 (B) FILING YOU: 21-JAN-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/348658 (B) FILING DÁTE: 02-DEC-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:(A) APPLICATION NUMBER: 08/348658 (B) FILING YOU: 02-DEC-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/196689 (B) FILING DÁTE: 15-FEB-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:(A) APPLICATION NUMBER: 08/196689 (B) FILING YOU: 15-FEB-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/223263 (B) FILING DÁTE: 04-APR-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:(A) APPLICATION NUMBER: 08/223263 (B) FILING YOU: 04-APR-1994 (vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/249376 (B) FILING DÁTE: 25-MAY-1994(A) APPLICATION NUMBER: 08/249376 (B) FILING YOU: 25-MAY-1994

225 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:225 (viii) ATTORNEY / AGENT INFORMATION

(A) NAME: Winter, Dary! B.(A) NAME: Winter, Gifts! B.

(B) REGISTRATION NUMBER: 32,637 <C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 871P5PCT (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:(B) REGISTRATION NUMBER: 32.637 <C) REFERENCE / DOCKET NUMBER: 871P5PCT (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TELEPHONE: 415/225-1249 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) Informace o SEQ ID NO: _;1 (i) Charakteristiky sekvence:(A) TELEPHONE: 415 / 225-1249 (B) TELEFAX: 415 / 952-9881 (C) TELEX: 910 / 371-7168 (2) Information for SEQ ID _NO; 1 (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 353 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární(A) Length: 353 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear

(Xi) (Xi) Označení sekvence: Sequence designation: : SEQ ID SEQ ID NO: NO: 1 1 Met 1 Met 1 Glu Leu Glu Leu Thr Thr Glu 5 Glu 5 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Wall Val 10 Wall 10 Met Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr 15 Thr 15 Dec Ala Ala Arg Leu Arg Leu Thr Thr Leu 20 Leu 20 May Ser Ser Ser Ser Pro For Ala Ala Pro 25 For 25 Pro For Ala Ala Cys Cys Asp Asp Leu 30 Leu 30 Arg Arg Val Leu Val Leu Ser Ser Lys 35 Lys 35 Leu Leu Leu Leu Arg Arg Asp Asp Ser 40 Ser 40 His His Val Wall Leu Leu His His Ser 45 Ser 45 Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gin Gin Cys 50 Cys 50 Pro For Glu Glu Val Wall His His Pro 55 For 55 Leu Leu Pro For Thr Thr Pro For Val 60 Wall 60 Leu Leu Leu Pro Leu Pro Ala Ala Val 65 Wall 65 Asp Asp Phe Phe Ser Ser Leu Leu Gly 70 Gly 70 Glu Glu Trp Trp Lys Lys Thr Thr Gin 75 Gin 75 Met Met Glu Glu Glu Glu Thr Thr Lys 80 Lys 80 Ala Ala Gin Gin Asp Asp Ile Ile Leu 85 Leu 85 Gly Gly Ala Ala Val Wall Thr Thr Leu 90 Leu 90 Leu Leu Leu Glu Leu Glu Gly Gly Val 95 Wall 95 Met Met Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly 100 Gly 100 ALIGN! Gin Gin Leu Leu Gly Gly Pro For Thr 105 Thr 105 Cys Cys Leu Ser Leu Ser Ser Ser Leu 110 Leu 110 Leu Leu Gly Gly Gin Gin Leu Leu Ser 115 Ser 115 Gly Gly Gin Gin Val Wall Arg Arg Leu 120 Leu 120 Leu Leu Leu.Gly Leu.Gly Ala Ala Leu 125 Leu 125 Gin Gin Ser Ser Leu Leu Leu Leu Gly 130 Gly 130 Thr Thr Gin Gin Leu Leu Pro For Pro 135 For 135 Gin Gin Gly Arg Gly Arg Thr Thr Thr 140 Thr 140 Ala Ala His His Lys Lys Asp Asp Pro 145 For 145 Asn Asn Ala* Ile Ala * Ile Phe Phe Leu 150 Leu 150 Ser Ser Phe Gin Phe Gin His His Leu 155 Leu 155 Leu Leu Arg Arg Gly Gly Lys Lys Val 160 Wall 160 Arg Arg Phe Phe Leu Leu Met Met Leu 165 Leu 165 Val Wall Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr 170 Thr 170 Leu Leu Cys Cys Val Wall Arg Arg Arg 175 Arg 175 Ala Ala Pro For Pro For Thr Thr Thr 180 Thr 180 Ala Ala Val Pro Val Pro Ser Ser Arg 185 Arg 185 Thr Thr Ser Ser Leu Leu Val Wall Leu 190 Leu 190 Thr Thr Leu Leu Asn Asn Glu Glu Leu 195 Leu 195 Pro For Asn Arg Asn Arg Thr Thr Ser 200 Ser 200 Gly Gly Leu Leu Leu Leu Glu Glu Thr 205 Thr 205 Asn Asn Phe Phe Thr Thr Ala Ala Ser 210 Ser 210

226226

Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trin Gin Gin Gly Phe 215 215 220 220 225 225 Arg Arg Ala Ala Lys Lys lle lle Pro For Gly Gly Leu Leu Leu Leu Asn Asn Gin Gin Thr Thr Ser Ser Arg Arg Ser Ser Leu Leu 230 230 235 235 240 240 Asp Asp Gin Gin lle lle Pro For Gly Gly Tyr Tyr Leu Leu Asn Asn Arg Arg lle lle His His Glu Glu Leu Leu Leu Leu Asn Asn 245 245 250 250 255 255 Gly Gly Thr Thr Arg Arg Gly Gly Leu Leu Phe Phe Pro For Gly Gly Pro For Ser Ser Arg Arg Arg Arg Thr Thr Leu Leu Gly Gly 260 260 265 265 270 270 Ala Ala Pro For Asp Asp lle lle Ser Ser Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Asp Thr Thr Gly Gly Ser Ser Leu Leu Pro For 275 275 280 280 285 285 Pro For Asn Asn Leu Leu Gin Gin Pro For Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Pro For Ser Ser Pro For Thr Thr His His Pro For Pro For 290 290 295 295 300 300 Thr Thr Gly Gly Gin Gin Tyr Tyr Thr Thr Leu Leu Phe Phe Pro For Leu Leu Pro For Pro For Thr Thr Leu Leu Pro For Thr Thr 305 305 310 310 315 315 Pro For Val Wall Val Wall Gin Gin Leu Leu His His Pro For Leu Leu Leu Leu Pro For Asp Asp Pro For Ser Ser Ala Ala Pro For 320 320 325 325 330 330 Thr Thr Pro For Thr Thr Pro For Thr Thr Ser Ser Pro For Leu Leu Leu Leu Asn Asn Thr Thr Ser Ser Tyr Tyr Thr Thr His His 335 335 340 340 345 345 Ser Ser Gin Gin Asn Asn Leu Leu Ser Ser Gin Gin Glu Glu Gly Gly

350 353 (2) Informace o SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristiky sekvence:350 353 (2) SEQ ID NO: 2 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 1795 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno ·(D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 2(A) Length: 1795 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one · (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 2

TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50

CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100

CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150

CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200

GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT 250GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT 250

TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG 300TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG 300

ACCTCCGAGT CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC 350ACCTCCGAGT CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC 350

227227

AGACTGAGCC AGTGCCCAGA GGTTCACCCTAGACTGAGCC AGTGCCCAGA GGTTCACCCT

GCCTGCTGTG GACTTTAGCT TGGGAGAATGGCCTGCTGTG GACTTTAGCT TGGGAGAATG

CCAAGGCACA GGACATTCTG GGAGCAGTGACCAAGGCACA GGACATTCTG GGAGCAGTGA

ATGGCAGCAC GGGGACAACT GGGACCCACTATGGCAGCAC GGGGACAACT GGGACCCACT

GCAGCTTTCT GGACÁGGTCC GTCTCCTCCTGCAGCTTTCT GGACÁGGTCC GTCTCCTCCT

TTGGAACCCA GCTTCCTCCA CAGGGCAGGATTGGAACCCA GCTTCCTCCA CAGGGCAGGA

AATGCCATCT TCCTGAGCTT CCAACACCTGAATGCCATCT TCCTGAGCTT CCAACACCTG

CCTGATGCTT GTAGGAGGGT CCACCCTCTGCCTGATGCTT GTAGGAGGGT CCACCCTCTG

CCACAGCTGT CCCCAGCAGA ACCTCTCTAGCCACAGCTGT CCCCAGCAGA ACCTCTCTAG

CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACACCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACA

AACTACTGGC TCTGGGCTTC TGAAGTGGCAAACTACTGGC TCTGGGCTTC TGAAGTGGCA

TTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGTTTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGT

TACCTGAACA GGATACACGA ACTCTTGAATTACCTGAACA GGATACACGA ACTCTTGAAT

TGGACCCTCA CGCAGGACCC TAGGAGCCCCTGGACCCTCA CGCAGGACCC TAGGAGCCCC

CAGACACAGG CTCCCTGCCA CCCAACCTCCCAGACACAGG CTCCCTGCCA CCCAACCTCC

CCAACCCATC CTCCTACTGG ACAGTATACGCCAACCCATC CTCCTACTGG ACAGTATACG

CTTGCCCACC CCTGTGGTCC AGCTCCACCCCTTGCCCACC CCTGTGGTCC AGCTCCACCC

CTCCAACGCC CACCCCTACC AGCCCTCTTCCTCCAACGCC CACCCCTACC AGCCCTCTTC

TCCCAGAATC TGTCTCAGGA AGGGTAAGGTTCCCAGAATC TGTCTCAGGA AGGGTAAGGT

TTGCCTACAC CTGTCCTGCT 400TTGCCTACAC CTGTCCTGCT 400

GAAAACCCAG ATGGAGGAGA 450GAAAACCCAG ATGGAGGAGA 450

CCCTTCTGCT GGAGGGAGTG 500CCCTTCTGCT GGAGGGAGTG 500

TGCCTCTCAT CCCTCCTGGG 550TGCCTCTCAT CCCTCCTGGG 550

TGGGGCCCTG CAGAGCCTCC 600TGGGGCCCTG CAGAGCCTCC 600

CCACAGCTCA CAAGGATCCC 650CCACAGCTCA CAAGGATCCC 650

CTCCGAGGAA AGGTGCGTTT 700CTCCGAGGAA AGGTGCGTTT 700

CGTCAGGCGG GCCCCACCCA 750CGTCAGGCGG GCCCCACCCA 750

TCCTCACACT GAACGAGCTC 800TCCTCACACT GAACGAGCTC 800

AACTTCACTG CCTCAGCCAG 850AACTTCACTG CCTCAGCCAG 850

GCAGGGATTC AGAGCCAAGA 900GCAGGGATTC AGAGCCAAGA 900

CCCTGGACCA AATCCCCGGA 950CCCTGGACCA AATCCCCGGA 950

GGAACTCGTG GACTCTTTCC 1000GGAACTCGTG GACTCTTTCC 1000

GGACATTTCC TCAGGAACAT 1050GGACATTTCC TCAGGAACAT 1050

AGCCTGGATA TTCTCCTTCC 1100AGCCTGGATA TTCTCCTTCC 1100

CTCTTCCCTC TTCCACCCAC 1150CTCTTCCCTC TTCCACCCAC 1150

CCTGCTTCCT GACCCTTCTG 1200CCTGCTTCCT GACCCTTCTG 1200

TAAACACATC CTACACCCAC 1250TAAACACATC CTACACCCAC 1250

TCTCAGACAC TGCCGACATC 1300TCTCAGACAC TGCCGACATC 1300

AGCATTGTCT CATGTACAGC TCCCTTCCCT GCAGGGCGCC CCTGGGAGAC 1350AGCATTGTCT CATGTACAGC TCCCTTCCCT GCAGGGCGCC CCTGGGAGAC 1350

228228

AACTGGACAA AACTGGACAA GATTTCCTAC GATTTCCTAC TTTCTCCTGA TTTCTCCTGA AACCCAAAGC AACCCAAAGC CCTGGTAAAA CCTGGTAAAA 1400 1400 GGGATACACA GGGATACACA GGACTGAAAA GGACTGAAAA GGGAATCATT GGGAATCATT TTTCACTGTA TTTCACTGTA CATTATAAAC CATTATAAAC 1450 1450 CTTCAGAAGC CTTCAGAAGC TATTTTTTTA TATTTTTTTA AGCTATCAGC AGCTATCAGC AATACTCATC AATACTCATC AGAGCAGCTA AGAGCAGCTA 1500 1500 GCTCTTTGGT GCTCTTTGGT CTATTTTCTG CTATTTTCTG CAGAAATTTG CAGAAATTTG CAACTCACTG CAACTCACTG ATTCTCTACA ATTCTCTACA 1550 1550 TGCTCTTTTT TGCTCTTTTT CTGTGATAAC CTGTGATAAC TCTGCAAAGG TCTGCAAAGG CCTGGGCTGG CCTGGGCTGG CCTGGCAGTT CCTGGCAGTT 1600 1600 GAACAGAGGG GAACAGAGGG AGAGACTAAC AGAGACTAAC CTTGAGTCAG CTTGAGTCAG AAAACAGAGA AAAACAGAGA AAGGGTAATT AAGGGTAATT 1650 1650 TCCTTTGCTT TCCTTTGCTT CAAATTCAAG CAAATTCAAG GCCTTCCAAC GCCTTCCAAC GCCCCCATCC GCCCCCATCC CCTTTACTAT CCTTTACTAT 1700 1700 CATTCTCAGT CATTCTCAGT GGGACTCTGA GGGACTCTGA TCCCATATTC TCCCATATTC TTAACAGATC TTAACAGATC TTTACTCTTG TTTACTCTTG 1750 1750 AGAAATGAAT AGAAATGAAT AAGCTTTCTC AAGCTTTCTC TCAGAAAAAA TCAGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1795 AAAAA 1795

(2) Informace o SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristiky sekvence:(2) SEQ ID NO: 3 information (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 42 aminokyselin i (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 3(A) Length: 42 amino acids i (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 3

Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Val Val Wall Met Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr Thr Ala Ala Arg Arg Leu Leu Thr Thr Leu Leu 1 1 5 5 10 10 15 15 Dec Ser Ser Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro For Pro For Ala Ala Cys Cys Asp Asp Leu Leu Arg Arg Val Wall Leu Leu Ser Ser Lys Lys 20 20 May 25 25 30 30 Leu Leu Leu Leu Arg Asp Arg Asp Ser Ser His His Val Wall Leu Leu His His Ser Ser Arg Arg Leu Leu 35 35 40 40 42 42

(2) Informace o SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristiky sekvence:(2) SEQ ID NO: 4 Information (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka-:-.-390 basí-------(B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 4(A) Length -: -.- 390 bases ------- (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence Designation: SEQ ID NO: 4

GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50

CACCTCTCCT CATCTAAGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT TCTCCTAACT 100CACCTCTCCT CATCTAAGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT TCTCCTAACT 100

229229

GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG ACCTCCGAGT 150GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG ACCTCCGAGT 150

CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC AGACTGGTGA 200CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC AGACTGGTGA 200

GAACTCCCAA CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA 250GAACTCCCAA CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA 250

CTCCCAGGAA GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT 300CTCCCAGGAA GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT 300

TCTTCCCATA TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT 350TCTTCCCATA TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT 350

TCTTCACAAT ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 390 (2) Informace o SEQ ID NO: 5 (i) Charakteristiky sekvence:TCTTCACAAT ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 390 (2) SEQ ID NO: 5 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka.: _ 390.basí______ (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 5(A) Length: _ 390 base ______ (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence identification: SEQ ID NO: 5

CTTAAGGACC CTTAAGGACC TTATGGTCGA TTATGGTCGA CTGTTACTAA CTGTTACTAA AGGAGGAGTA AGGAGGAGTA GAAAGTTGGA GAAAGTTGGA 50 50 GTGGAGAGGA GTGGAGAGGA GTAGATTCTT GTAGATTCTT AACGAGGAGC AACGAGGAGC ACCAGTACGA ACCAGTACGA AGAGGATTGA AGAGGATTGA 100 100 ALIGN! ČGTBCCGATT ČGTBCCGATT GCGACAGGTC GCGACAGGTC GGGCCGAGGA GGGCCGAGGA GGACGAACAC GGACGAACAC TGGAGGCTCA TGGAGGCTCA 150 150 GGAGTCATTT GGAGTCATTT GACGAAGCAC GACGAAGCAC TGAGGGTACA TGAGGGTACA GGAAGTGTCG GGAAGTGTCG TCTGACCACT TCTGACCACT 200 200 CTTGAGGGTT CTTGAGGGTT GTAATAGGGG GTAATAGGGG AAATAGGCGC AAATAGGCGC ATTGACCATT ATTGACCATT CTGTGGGTAT CTGTGGGTAT 250 250 GAGGGTCCTT GAGGGTCCTT CTGTGGTAGT CTGTGGTAGT GAAGGAGATT GAAGGAGATT GAGGAACTGG GAGGAACTGG GTTACTGATA GTTACTGATA 300 300 AGAAGGGTAT AGAAGGGTAT AACAGGGGTG AACAGGGGTG GATGACTAGT GATGACTAGT GTGAGAGACT GTGAGAGACT gttcttaata gttcttaata 350 350 AGAAGTGTTA AGAAGTGTTA TGTCGGGCGT TGTCGGGCGT aaattttcga aaattttcga GAGCAGATCT GAGCAGATCT 390 390

(2) Informace o SEQ ID NO: 6 (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 332 aminokyselin(2) SEQ ID NO: 6 information (i) Sequence characteristics: (A) Length: 332 amino acids

230 (B) Typ: aminokyselina230 (B) Type: amino acid

(C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 6 6 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Ser Pro Ala Pro Pro Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Val Leu 1. 3 10 1. 3 10 15 15 Dec Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Arg Ser Ser Val Leu Ser Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Leu Ser Gin 20 25 20 25 30 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Leu Pro Ala Val Asp 35 40 35 40 45 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Phe Ser Glu Glu Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 50 55 60 60 Gin Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Gin Asp Ile Leu Leu Glu Gly Val Met Glu Glu Val Met 65 70 65 70 75 75 Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Ala Ala Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 80 85 90 90 Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Gly Gin Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gin Leu Gly Ala Leu Gin 95 100 95 100 105 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Ser Leu Leu Gin Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 110 115 120 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser His Lys Asp Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Phe Gin His Leu Leu 125 130 125 130 135 135 Arg Gly Lys Val Arg Éhe Leu Met Leu Val Arg Gly Lys Val Arg Gly Gly Ser Thr Leu Gly Gly Ser Thr Leu 140 145 140 145 150 150 Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Cys Val Arg Arg Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Val Ser Ser Thr 155 160 155 160 165 165 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Asn Arg Thr 170 175 170 175 180 180 Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Gly Ser Arg Thr Thr Gly Ser 185 190 185 190 195 195 Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Gly Leu Leys Lp Trin Gin Gin Phly Arg Ala Lys Ile Pro Gly Ala Lys Ile For Gly 200 205 200 205 210 210 Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Leu Leu Asn Gin Thr Ser Gin Ile Pro Gly Tyr Gin Ile For Gly Tyr 215 220 215 220 225 225 Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Leu Asn Arg Ile His Glu Thr Arg Gly Leu Phe Thr Arg Gly Leu Phe 230 235 230 235 240 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Gly Pro Pro Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser For Asp Ile Ser Ser 245 250 245 250 255 255 Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Leu Pro Pro Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Asn Leu Gin Pro Gly Asn Leu Gin For Gly 260 265 260 265 270 270 ’ Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr ´ Tyr Ser Pro Ser Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Gly Gin Tyr Thr Leu 275 280 275 280 285 285

231231

Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gin Leu His 290 295 300Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Pro Thr Pro Val Val Gin His 290 295 300

Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 305 310 315Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 305 310 315

Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin 320 325 330Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin 320 325 330

Glu Gly 332 (2) Informace o SEQ ID NO: 7 (i) Charakteristiky sekvence:Glu Gly 332 (2) SEQ ID NO: 7 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 166 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 7(A) Length: 166 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 7

Ala 1 Ala 1 Pro For Pro For Arg Arg Leu 5 Leu 5 lle lle Cys Cys Asp Asp Ser Ser Arg 10 Arg 10 Val Wall Leu Leu Glu Glu Arg Arg Tyr 15 Tyr 15 Dec Leu Leu Leu Leu Glu Glu Ala Ala Lys 20 Lys 20 May Glu Glu Ala Ala Glu Glu Asn Asn lle 25 lle 25 Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala 30 Ala 30 Glu Glu His His Cys Cys Ser Ser Leu 35 Leu 35 Asn Asn Glu Glu Asn Asn lle lle Thr 40 Thr 40 Val Wall Pro For Asp Asp Thr Thr Lys 45 Lys 45 Val Wall Asn Asn Phe Phe Tyr Tyr Ala 50 Ala 50 Trp Trp Lys Lys Arg Arg Met Met Glu 55 Glu 55 Val Wall Gly Gly Gin Gin Gin Gin Ala 60 Ala 60 Val Wall Glu Glu Val Wall Trp Trp Gin 65 Gin 65 Gly Gly Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu 70 Leu 70 Ser Ser Glu Glu Ala Ala Val Wall Leu 75 Leu 75 Arg Arg Gly Gly Gin Gin Ala Ala Leu 80 Leu 80 Leu Leu Val Wall Asn Asn Ser Ser Ser 85 Ser 85 Gin Gin Pro For Trp Trp Glu Glu Pro 90 For 90 Leu Leu Gin Gin Leu Leu His His Val 95 Wall 95 Asp Asp Lys Lys Ala Ala Val Wall Ser 100 Ser 100 ALIGN! Gly Gly Leu Leu Arg Arg Ser Ser Leu 105 Leu 105 Thr Thr Thr Thr Leu Leu Leu Leu Arg 110 Arg 110 Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gin 115 Gin 115 Lys Lys Glu Glu Ala Ala lle lle Ser 120 Ser 120 Pro For Pro For Asp Asp Ala Ala Ala 125 Ala 125 Ser Ser Ala Ala Ala Ala Pro For Leu 130 Leu 130 Arg Arg Thr Thr lle lle Thr Thr Ala 135 Ala 135 Asp Asp Thr Thr Phe Phe Arg Arg Lys 140 Lys 140 Leu Leu Phe Phe Arg Arg Val Wall Tyr 145 Tyr 145 Ser Ser Asn Asn Phe Phe Leu Leu Arg 150 Arg 150 Gly Gly Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu 155 Leu 155 Tyr Tyr Thr Thr Gly Gly Glu Glu Ala 160 Ala 160 Cys Cys Arg Arg Thr Thr Gly Asp 165 Gly Asp

ArgArg

166166

232 (2) Informace o SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristiky sekvence:232 (2) SEQ ID NO: 3 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 328 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 8(A) Length: 328 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 8

Ser 1 Ser 1 Pro For Ala Ala Pro For Pro 5 For 5 Ala Ala Cys Cys Asp Asp Leu Leu Arg 10 Arg 10 Val Wall Leu Leu Ser Ser Lys Lys Leu 15 Leu 15 Dec Leu Leu Arg Arg Asp Asp Ser Ser His 20 His 20 May Val Wall Leu Leu His His Ser Ser Arg 25 Arg 25 Leu Leu Ser Ser Gin Gin Cys Cys Pro 30 For 30 Glu Glu Val Wall His His Pro For Leu 35 Leu 35 Pro For Thr Thr Pro For Val Wall Leu 40 Leu 40 Leu Leu Pro For Ala Ala Val Wall Asp .45 Asp .45 Phe Phe Ser Ser Leu Leu Gly Gly Glu 50 Glu 50 Trp Trp Lys Lys Thr Thr Gin Gin Met 55 Met 55 Glu Glu Glu Glu Thr Thr Lys Lys Ala 60 Ala 60 Gin Gin Asp Asp Ile Ile Leu Leu Gly 65 Gly 65 Ala Ala Val Wall Thr Thr Leu Leu Leu 70 Leu 70 Leu Leu Glu Glu Gly Gly Val Wall Met 75 Met 75 Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly Gly Gin 80 Gin 80 Leu Leu Gly Gly Pro For Thr Thr Cys 85 Cys 85 Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Leu 90 Leu 90 Gly Gly Gin Gin Leu Leu Ser Ser Gly 95 Gly 95 Gin Gin Val Wall Arg Arg Leu Leu Leu 100 Leu 100 ALIGN! Leu Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Gin 105 Gin 105 Ser Ser Leu Leu Leu Leu Gly Gly Thr 110 Thr 110 Gin Gin Gly Arg Gly Arg Thr Thr Thr 115 Thr 115 Ala Ala His His Lys Lys Asp Asp Pro 120 For 120 Asn Asn Ala Ala Ile Ile Phe Phe Leu 125 Leu 125 Ser Ser Phe Phe Gin Gin His His Leu 130 Leu 130 Leu Leu Arg Arg Gly Gly Lys Lys Val 135 Wall 135 Arg Arg Phe Phe Leu Leu Met Met Leu 140 Leu 140 Val Wall Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr 145 Thr 145 Leu Leu Cys Cys Val Wall Arg Arg Arg 150 Arg 150 Ala Ala Pro For Pro For Thr Thr Thr 155 Thr 155 Ala Ala Val Wall Pro For Ser Ser Arg 160 Arg 160 Thr Thr Ser Ser Leu Leu Val Wall Leu 165 Leu 165 Thr Thr Leu Leu Asn Asn Glu Glu Leu 170 Leu 170 Pro For Asn Asn Arg Arg Thr Thr Ser 175 Ser 175 Gly Gly Leu Leu Leu Leu Glu Glu Thr 180 Thr 180 Asn Asn Phe Phe Thr Thr Ala Ala Ser 185 Ser 185 Ala Ala Arg Arg Thr Thr Thr Thr Gly 190 Gly 190 Ser Ser Gly Gly Leu Leu Leu Leu Lys 195 Lys 195 Trp Trp Gin Gin Gin Gin Gly Gly Phe 200 Phe 200 Arg Arg Ala Ala Lys Lys Ile Ile Pro 205 For 205 Gly Gly Leu Leu Leu Leu Asn Asn Gin 210 Gin 210 Thr Thr Ser Ser Arg Arg Ser Ser Leu 215 Leu 215 Asp Asp Gin Gin Ile Ile Pro For Gly 220 Gly 220 Tyr Tyr Leu Leu Asn Asn Arg Arg Ile 225 Ile 225 His His Glu Glu Leu Leu Leu Leu Asn 230 Asn 230 Gly Gly Thr Thr Arg Arg Gly Gly Leu 235 Leu 235 Phe Phe Pro For Gly Gly Pro For Ser 240 Ser 240 Arg Arg Arg Arg Thr Thr Leu Leu Gly 245 Gly 245 Ala Ala Pro For Asp Asp Ile Ile Ser 250 Ser 250 Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp 255 Asp 255

233233

Thr Thr Gly Gly Ser Ser Leu Leu Pro 260 For 260 Pro For Asn Asn Leu Leu Gin Gin Pro 265 For 265 Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Pro For Ser 270 Ser 270 Pro For Thr Thr His His Pro For Pro 275 For 275 Thr Thr Gly Gly Gin Gin Tyr Tyr Thr 280 Thr 280 Leu Leu Phe Phe Pro For Leu Leu Pro 285 For 285 Pro For Thr Thr Leu Leu Pro For Thr 290 Thr 290 Pro For Val Wall Val Wall Gin Gin Leu 295 Leu 295 His His Pro For Leu Leu Leu Leu Pro 300 For 300 Asp Asp Pro For Ser Ser Ala Ala Pro 305 For 305 Thr Thr Pro For Thr Thr Pro For Thr 310 Thr 310 Ser Ser Pro For Leu Leu Leu Leu Asn 315 Asn 315 Thr Thr Ser Ser Tyr Tyr Thr Thr His His Ser Ser Gin Gin Asn Asn Leu Leu Ser Ser Gin Gin Glu Glu Gly Gly

320 325 328 (2) Informace o SEQ ID NO: 9 (i) Charakteristiky sekvence:320 325 328 (2) SEQ ID NO: 9 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 265 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární(A) Length: 265 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear

(xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 9 (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 9 Ser 1 Ser 1 Pro For Ala Ala Pro For Pro 5 For 5 Ala Ala Cys Cys Asp Asp Leu Leu Arg 10 Arg 10 Val Wall Leu Leu Ser Ser Lys Lys Leu 15 Leu 15 Dec Leu Leu Arg Arg Asp Asp Ser Ser His 20 His 20 May Val Wall Leu Leu His His Ser Ser Arg 25 Arg 25 Leu Leu Ser Ser Gin Gin Cys Cys Pro 30 For 30 Glu Glu Val Wall His His Pro For Leu 35 Leu 35 Pro For Thr Thr Pro For Val Wall Leu 40 Leu 40 Leu Leu Pro For Ala Ala Val Wall Asp 45 Asp 45 Phe Phe Ser Ser Leu Leu Gly Gly Glu 50 Glu 50 Trp Trp Lys Lys Thr Thr Gin Gin Met 55 Met 55 Glu Glu Glu Glu Thr Thr Lys Lys Ala 60 Ala 60 Gin Gin Asp Asp Ile Ile Leu Leu Gly 65 Gly 65 Ala Ala Val Wall Thr Thr Leu Leu Leu 70 Leu 70 Leu Leu Glu Glu Gly Gly Val Wall Met 75 Met 75 Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly Gly Gin 80 Gin 80 Leu Leu Gly Gly Pro For Thr Thr Cys 85 Cys 85 Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Leu 90 Leu 90 Gly Gly Gin Gin Leu Leu Ser Ser Gly 95 Gly 95 Gin Gin Val Wall Arg Arg Leu Leu Leu 100 Leu 100 ALIGN! Leu Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Gin 105 Gin 105 Ser Ser Leu Leu Leu Leu Gly Gly Thr 110 Thr 110 Gin Gin Leu Leu Pro For Pro For Gin 115 Gin 115 Gly Arg Gly Arg Thr Thr Thr Thr Ala 120 Ala 120 His His Lys Lys Asp Asp Pro For Asn 125 Asn 125 Ala Ala Ile Ile Phe Phe Leu Leu Ser 130 Ser 130 Phe Phe Gin Gin His His Leu Leu Leu 135 Leu 135 Arg Arg Gly Gly Lys Lys Asp Asp Phe 140 Phe 140 Trp Trp Ile Ile Val Wall Gly Gly Asp 145 Asp 145 Lys Lys Leu Leu His His Cys Cys Leu 150 Leu 150 Ser Ser Gin Gin Asn Asn Tyr Tyr Trp Trp Leu Leu Trp Trp Ala Ala Ser Ser Glu Glu Val Wall Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ile Ile

155 160 165155 160

Gin Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gin Val Pro 170 175 180Gin Ser Gin Ser Ser Ser Ser Glu Pro Asn Leu Gin Val Pro 170 175 180

234234

Gly Pro Asn Pro Gly Pro Asn Pro Arg 185 Arg 185 Ile Ile Pro Glu Gin Asp Thr Arg Thr Leu Glu Glu Gin Asp Thr Arg Thr Leu Glu 190 190 195 195 Trp Asn Ser Trp Trp Asn Ser Thr 200 Thr 200 Leu Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp Pro 205 Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp Pro 205 Arg 210 Arg 210 Ser Pro .Gly His Ser Pro .Gly His Phe 215 Phe 215 Leu Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro 220 Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala 225 Ala 225 Thr Gin Pro Pro Thr Gin Pro Pro Ala 230 Ala 230 Trp Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser 235 Ile Phe Ser Ase Pro Ser 235 Ser 240 Ser 240 Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala 245 250 Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 265 (2) Informace o SEQ ID NO: 10 (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 261 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 10 Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 265 (2) SEQ ID NO: 10 (i) Sequence Characteristics: (A) Length: 261 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 10 His 255 His 255 Ser Pro Ala Pro 1 Ser Pro Ala Pro 2 Pro 5 For 5 Ala Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys 10 Cys Asp Leu Leu 15 Leu 15 Dec Leu Arg Asp Ser Leu Arg Asp Ser His 20 His 20 May Val Wall Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys 25 Leu Ser Ser Leu Ser Gin Cys 25 Pro 30 Dec 30 Glu Val His Pro Glu Val His Pro Leu 35 Leu 35 Pro For Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val 40 Thr Pro Val Leu Asp 45 Asp 45 Phe Ser Leu Gly Phe Ser Leu Gly Glu 50 Glu 50 Trp Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys 55 Lys Thr Gin Met Ala 60 Ala 60 Gin Asp Ile Leu Gin Asp Ile Leu Gly 65 Gly 65 Ala Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val 70 Val Thr Leu Leu Leu A.. Met 75 AND.. Met 75 Ala Ala Arg Gly Ala Ala Gly Gin 80 Gin 80 Leu Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu 85 Gly Pro Thr Cys Leu Leu 90 Leu 90 Gly Gin Leu Ser Gly Gin Leu Ser Gly 95 Gly 95 Gin Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu 100 Val Arg Leu Leu Gly Ala Leu 100 Gin 105 Gin 105 Ser Leu Leu Gly Ser Leu Leu Gly Thr 110 Thr 110 Gin Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 115 Gly Arg Thr Thr Ala Pro 120 For 120 Asn Ala Ile Phe Asn Ala Ile Phe Leu 125 Leu 125 Ser Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys 130 Phe Gin His Leu Arg Gly Lys 130 Asp 135 Asp 135 Phe Trp Ile Val Phe Trp Gly Asp 140 Gly Asp 140 Lys Leu His Cys Leu Ser Gin Asn 145 Lys Leu His Cys Leu द्वारा किया Ser Gin Asn 145 Tyr 150 Tyr 150 Trp Leu Trp Ala Trp Leu Trp Ala Ser 155 Ser 155 Glu Glu Val Ala Ala Gly Ile Gin Ser Gin 160 Val Ala Ala Gly Ile Gin Ser Gin Asp 165 Asp 165

235235

. Ser . Ser Trp Trp Ser Ser Ala Ala Glu 170 Glu 170 Pro For Ásn Ásn Leu Leu Gin Gin Val 175 Wall 175 Pro For Gly Gly Pro For Asn Asn Pro 180 For 180 Arg Arg Ile Ile Pro For Glu Glu Gin 185 Gin 185 Asp Asp Thr Thr Arg Arg Thr Thr Leu 190 Leu 190 Glu Glu Trp Trp Asn Asn Ser Ser Trp 195 Trp 195 Thr Thr Leu Leu Ser Ser Trp Trp Thr 200 Thr 200 Leu Leu Thr Thr Gin Gin Asp Asp Pro 205 For 205 Arg Arg Ser Ser Pro For Gly Gly His 210 His 210 Phe Phe Leu Leu Arg Arg Asn Asn Ile 215 Ile 215 Arg Arg His His Arg Arg Leu Leu Pro 220 For 220 Ala Ala Thr Thr Gin Gin Pro For Pro 225 For 225 Ala Ala Trp Trp Ile Ile Phe Phe Ser 230 Ser 230 Phe Phe Pro For Asn Asn Pro For Ser 235 Ser 235 Ser Ser Tyr Tyr Trp Trp Thr Thr Val 240 Wall 240 Tyr Tyr Ala Ala Leu Leu Pro For Ser 245 Ser 245 Ser Ser Thr Thr His His Leu Leu Ala 250 Ala 250 His His Pro For Cys Cys Gly Gly Pro 255 For 255

Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 261 (2) Informace o SEQ ID NO: 11 (i) Charakteristiky sekvence:Ala Pro Pro Ala Ser 260 261 (2) SEQ ID NO: 11 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 7849 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 11(A) Length: 7849 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 11

CCCAGCCTCC CCCAGCCTCC TTTCTCTTGT TTTCTCTTGT TCCCTGGTCA TCCCTGGTCA TGCCTGCCTC TGCCTGCCTC CCTGTCTCCT CCTGTCTCCT 50 50 GTCTCTCCCT GTCTCTCCCT CCCACACACA CCCACACACA CCCACTATCC CCCACTATCC TCCCAGCTAT TCCCAGCTAT CCCTACACCC CCCTACACCC 100 100 ALIGN! TCCTTCCTAA TCCTTCCTAA TCTTGGGAGA TCTTGGGAGA CATCTCGTCT CATCTCGTCT GGCTGGACGG GGCTGGACGG GAAAATTCCA GAAAATTCCA 150 150 GGATCTAGGC GGATCTAGGC CACACTTCTC CACACTTCTC AGCAGACATG AGCAGACATG CCCATCCTTG CCCATCCTTG GGGAGGAGGA GGGAGGAGGA 200 200 ACAGGAGAGA ACAGGAGAGA GCCTGAGGAA GCCTGAGGAA GTTCTGGGGG GTTCTGGGGG ACAGGGGGAT ACAGGGGGAT GATGGGATCA GATGGGATCA 250 250 AGGTCAGGCC AGGTCAGGCC AGGAAGCCCC AGGAAGCCCC TGAGGACAGA TGAGGACAGA GACTGTGGGG GACTGTGGGG AGACTGGGAC AGACTGGGAC 300 300 TGGGAAGAAA TGGGAAGAAA GCAAAGGAGC GCAAAGGAGC TAGAGCCAGG TAGAGCCAGG GCCAAAGGAA GCCAAAGGAA AAGGGGGGCC AAGGGGGGCC 350 350 AGCAGGGAGG AGCAGGGAGG TATTTGCGGG TATTTGCGGG GGAGGTCCAG GGAGGTCCAG CAGCTGTCTT CAGCTGTCTT TCCTAAGACA TCCTAAGACA 400 400 GGGACACATG GGGACACATG GGCCTGGTTA GGCCTGGTTA TTCCTCTTGT TTCCTCTTGT CACATGTGGA CACATGTGGA ACGGTAGGAG ACGGTAGGAG 450 450

ATGGAAGACG GAGACAGAAC AAGCAAAGGA GGGCCCTGGG CACAGAGGTC 500ATGGAAGACG GAGACAGAAC AAGCAAAGGA GGGCCCTGGG CACAGAGGTC 500

236236

TGTGTGTGTA GCCATCCAAG CCACTGGACC CCAGCAGACG AGCACCTAAG 550 kTGTGTGTGTA GCCATCCAAG CCACTGGACC CCAGCAGACG AGCACCTAAG 550 hp

CTCAGGCTTA ACCCAGTGCA CGTGTGCGCA CATACATGTG CCCCGCACCT 600CTCAGGCTTA ACCCAGTGCA CGTGTGCGCA CATACATGTG CCCCGCACCT 600

GACAGTCCAC TCAACCCGTC CAAACCCTTT CCCCATAACA CCAACCCATA 650GACAGTCCAC TCAACCCGTC CAAACCCTTT CCCCATAACA CCAACCCATA 650

ACAGGAGATT TCTCTCATGT GGGCAATATC CGTGTTCCCA CTTCGAAAGG 700ACAGGAGATT TCTCTCATGT GGGCAATATC CGTGTTCCCA CTTCGAAAGG 700

GGGAATGACA AGATAGGACT CCCTAGGGGA TTACAGAAAG AAAAGCAGGA 750GGGAATGACA AGATAGGACT CCCTAGGGGA TTACAGAAAG AAAAGCAGGA 750

AAGCAAGCAT CCTGTTGGAT TTCAGCAGCA GGTATGATGT CCAGGGAAAA 800AAGCAAGCAT CCTGTTGGAT TTCAGCAGCA GGTATGATGT CCAGGGAAAA 800

GAAATTTGGA TAGCCAGGGA GTGAAAACCC CACCAATCTT AAACAAGACC 850GAAATTTGGA TAGCCAGGGA GTGAAAACCC CACCAATCTT AAACAAGACC 850

ŤCTGTGCTTC TTCCCCAGCA ACACAAATGT CCTGCCAGAT TCCTCCTGGA 900«CTGTGCTTC TTCCCCAGCA ACACAAATGT CCTGCCAGAT TCCTCCTGGA 900

AAAAAACTTC TGCTCCTGTC CCCCTCCAGG TCCCAGGTTG CCCATGTCCA 950AAAAAACTTC TGCTCCTGTC CCCCTCCAGG TCCCAGGTTG CCCATGTCCA 950

GGAAAAGATG GATCCCCCTA TCCAAATCTT CTCCGTGGTG TGTGTGGGTG 1000GGAAAAGATG GATCCCCCTA TCCAAATCTT CTCCGTGGTG TGTGTGGGTG 1000

GAGGAGTGGA CCCTGGTCCA GGCAGGGGCT CCAGGGAAGA GAAGGCGTCA 1050GAGGAGTGGA CCCTGGTCCA GGCAGGGGCT CCAGGGAAGA GAAGGCGTCA 1050

CTTCCGGGGG CCTTCACCAG TGTCTGGTGG CTCCCTTCTC TGATTGGGCA 1100CTTCCGGGGG CCTTCACCAG TGTCTGGTGG CTCCCTTCTC TGATTGGGCA 1100

GAAGTGGCCC AGGCAGGCGT ATGACCTGCT GCTGTGGAGG GGCTGTGCCC 1150GAAGTGGCCC AGGCAGGCGT ATGACCTGCT GCTGTGGAGG GGCTGTGCCC 1150

CACCGCCACA TGTCTTCCTA CCCATCTGCT CCCCAGAGGG CTGCCTGCTG 1200CACCGCCACA TGTCTTCCTA CCCATCTGCT CCCCAGAGGG CTGCCTGCTG 1200

TGCACTTGGG TCCTGGAGCC CTTCTCCACC CGGTGAGTGG CCAGCAGGGT 1250TGCACTTGGG TCCTGGAGCC CTTCTCCACC CGGTGAGTGG CCAGCAGGGT 1250

GTGGGGTTAT GTGAGGGTAG AAAGGACAGC AAAGAGAAAT GGGCTCCCAG 1300GTGGGGTTAT GTGAGGGTAG AAAGGACAGC AAAGAGAAAT GGGCTCCCAG 1300

CTGGGGGAGG GGCAGGCAAA CTGGAACCTA CAGGCACTGA CCTTTGTCGA 1350CTGGGGGAGG GGCAGGCAAA CTGGAACCTA CAGGCACTGA CCTTTGTCGA 1350

GAAGAGTGTA GCCTTCCCAG AATGGGAGGA GCAGGGCAGA GCAGGGGTAG 1400GAAGAGTGTA GCCTTCCCAG AATGGGAGGA GCAGGGCAGA GCAGGGGTAG 1400

GGGGTGGGGT GCTGGTTTCT GAGGGACTGA TCACTTACTT GGTGGAATAC 1450GGGGTGGGGT GCTGGTTTCT GAGGGACTGA TCACTTACTT GGTGGAATAC 1450

AGCACAGCCC TGGCTGGCCC TAAGGAAAGG GGACATGAGC CCAGGGAGAA 1500AGCACAGCCC TGGCTGGCCC TAAGGAAAGG GGACATGAGC CCAGGGAGAA 1500

237237

AATAAGAGAG GGAGCTGCAC TTAGGGCTTA GCAAACACAG TAGTAAGATG 1550AATAAGAGAG GGAGCTGCAC TTAGGGCTTA GCAAACACAG TAGTAAGATG 1550

GACACAGCCC CAATCCCCAT TCTTAGCTGG TCATTCCTCG TTAGCTTAAG 1600GACACAGCCC CAATCCCCAT TCTTAGCTGG TCATTCCTCG TTAGCTTAAG 1600

GTTCTGAATC TGGTGCTGGG GAAGCTGGGC CAGGCAAGCC AGGGCGCAAG 1650GTTCTGAATC TGGTGCTGGG GAAGCTGGGC CAGGCAAGCC AGGGCGCAAG 1650

GAGAGGGTAA TGGGAGGAGG GCCCACTCAT GTTGACAGAC CTACAGGAAA 1700GAGAGGGTAA TGGGAGGAGG GCCCACTCAT GTTGACAGAC CTACAGGAAA 1700

TCCCAATATT GAATCAGGTG CAAGCCTCTT TGCACAACTT GTGAAAGGAG 1750TCCCAATATT GAATCAGGTG CAAGCCTCTT TGCACAACTT GTGAAAGGAG 1750

GAGGAAGCCA TGTGGGGGGT CCTGTGAAGG AACCGGAAGG GGTTCTGCCA 1800GAGGAAGCCA TGTGGGGGG CCTGTGAAGG AACCGGAAGG GGTTCTGCCA 1800

AGGGGGCAGG GAGGCAGGTG TGAGCTATGA GACAGATATG TTAGTGGGCG 1850AGGGGGCAGG GAGGCAGGTG TGAGCTATGA GACAGATATG TTAGTGGGCG 1850

CCTAAGACAA GGTAAGCCCC .TAAGGTGGGC ATCACCCAGC AGGTGCCCGT 1900CCTAAGACAA GGTAAGCCCC .TAAGGTGGGC ATCACCCAGC AGGTGCCCGT 1900

TCCTGGGCAG CTGGTCTCAG GAAGGAAGTC CCAGAACTGT TAGCCCATCT 1950TCCTGGGCAG CTGGTCTCAG GAAGGAAGTC CCAGAACTGT TAGCCCATCT 1950

CTTGGCCTCA GATAATGGAG TATTTCAGGA CTTGGAGTCC AAAGAAAAGC 2000CTTGGCCTCA GATAATGGAG TATTTCAGGA CTTGGAGTCC AAAGAAAAGC 2000

TCCAGTGGCT TTATGTGTGG GGGTAGATAG GGAAAGAATA GAGGTTAATT 2050TCCAGTGGCT TTATGTGTGG GGGTAGATAG GGAAAGAATA GAGGTTAATT 2050

TCTCCCATAC CGCCTTTTAA TCCTGACCTC TAGTGGTCCC AGTTACAGCT 2100TCTCCCATAC CGCCTTTTAA TCCTGACCTC TAGTGGTCCC AGTTACAGCT 2100

TTGTGCAGTT CCCCTCCCCA GCCCCACTCC CCACCGCAGA AGTTACCCCT 2150TTGTGCAGTT CCCCTCCCCA GCCCCACTCC CCACCGCAGA AGTTACCCCT 2150

CAACATATTG CGCCCGTTTG CCAGTTCCTC ACCCAGGCCC TGCATCCCAT 2200CAACATATTG CGCCCGTTTG CCAGTTCCTC ACCCAGGCCC TGCATCCCAT 2200

TTTCCACTCT CTTCTCCAGG CTGAAGCCAC AATACTTTCC TTCTCTATCC 2250TTTCCACTCT CTTCTCCAGG CTGAAGCCAC AATACTTTCC TTCTCTATCC 2250

CCATCCCAGA TTTTCTCTGA CCTAACAACC AAGGTTGCTC AGAATTTAAG 2300CCATCCCAGA TTTTCTCTGA CCTAACAACC AAGGTTGCTC AGAATTTAAG 2300

GCTAATTAAG ATATGTGTGT ATACATATCA TGTCCTGCTG CTCTCAGCAG 2350GCTAATTAAG ATATGTGTGT ATACATATCA TGTCCTGCTG CTCTCAGCAG 2350

GGGTAGGTGG CACCAAATCC GTGTCCGATT CACTGAGGAG TCCTGACAAA 2400GGGTAGGTGG CACCAAATCC GTGTCCGATT CACTGAGGAG TCCTGACAAA 2400

AAGGAGACAC CATATGCTTT CTTGCTTTCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTTT 2450AAGGAGACAC CATATGCTTT CTTGCTTTCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTTT 2450

TTTTTTTTGA GACGGAGTTT CACTCTTATT GCCCAGGCTG GAGTGCAATG 2500TTTTTTTTGA GACGGAGTTT CACTCTTATT GCCCAGGCTG GAGTGCAATG 2500

GTGCGATCTC GGCTCACCAC AAACCTCCGC CTCCCAGGTA CAAGCGATTC 2550 aGTGCGATCTC GGCTCACCAC AAACCTCCGC CTCCCAGGTA CAAGCGATTC 2550 and

' β'β

TCCTGTCTCA GCCTCCCAAGTCCTGTCTCA GCCTCCCAAG

CCCTGCTAGT TTTTTTGTATCCCTGCTAGT TTTTTTGTAT

GAGGCTGGTG GCGAACTCCTGAGGCTGGTG GCGAACTCCT

CCAAAGTGCT GGGATTACAGCCAAAGTGCT GGGATTACAG

GCTTTCATCA CAAGAAAATGGCTTTCATCA CAAGAAAATG

GCTGGTCAGC ATCTCAAGCCGCTGGTCAGC ATCTCAAGCC

GTCTCTTCCT AGAAACTTGGGTCTCTTCCT AGAAACTTGG

GATAGATTCC TCACCCTTGGGATAGATTCC TCACCCTTGG

AAGTGCAAGA GCCTAAGCCGAAGTGCAAGA GCCTAAGCCG

GAGGCCCCAA ACAGGGAGCCGAGGCCCCAA ACAGGGAGCC

GCTGACTGGT GAGAACACACGCTGACTGGT GAGAACACAC

CAGAAGGGGA GAGAGAAAGGCAGAAGGGGA GAGAGAAAGG

GAACCCATTC TCCCAAAAATGAACCCATTC TCCCAAAAAT

TCAGGTCTGG GTCCTGAATGTCAGGTCTGG GTCCTGAATG

TTCCTCCTCA TCTTTCAACCTTCCTCCTCA TCTTTCAACC

GTGGTCATGC TTCTCCTAACGTGGTCATGC TTCTCCTAAC

TCCTGCTTGT GACCTCCGAGTCCTGCTTGT GACCTCCGAG

TCCTTCACAG CAGACTGGTGTCCTTCACAG CAGACTGGTG

GTAACTGGTA AGACACCCATGTAACTGGTA AGACACCCAT

ACTCCTTGAC CCAATGACTAACTCCTTGAC CCAATGACTA

238238

TAGCTTGGAT TACAGGCATG AGCCACCACA 2600TAGCTTGGAT TACAGGCATG AGCCACCACA 2600

TTCGTAGAGC CGGGGTTTCA CCATGTTAGT 2650TTCGTAGAGC CGGGGTTTCA CCATGTTAGT 2650

GACCTCAGGT GATCCACCCG CCTTGGACTC 2700GACCTCAGGT GATCCACCCG CCTTGGACTC 2700

GCATGAGCCA CTGCACCCGG CACACCATAT 2750GCATGAGCCA CTGCACCCGG CACACCATAT 2750

TGAGAGAATT CAGGGCTTTG GCAGTTCCAG 2800TGAGAGAATT CAGGGCTTTG GCAGTTCCAG 2800

CTCCCCAGCA TCTGTTCACC CTGCCAGGCA 2850CTCCCCAGCA TCTGTTCACC CTGCCAGGCA 2850

TTAAATGTTC ACTCTTCTTG CTACTTTCAG 2900TTAAATGTTC ACTCTTCTTG CTACTTTCAG 2900

CCCGCCTTTG CCCCACCCTA CTCTGCCCAG 2950CCCGCCTTTG CCCCACCCTA CTCTGCCCAG 2950

CCTCCATGGC CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA 30.00CCTCCATGGC CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA 30.00

ACGCCAGCCA GACACCCCGG CCAGAATGGA 3050ACGCCAGCCA GACACCCCGG CCAGAATGGA 3050

CTGAGGGGCT AGGGCCATAT GGAAACATGA 3100CTGAGGGGCT AGGGCCATAT GGAAACATGA 3100

AGACACGCTG CAGGGGGCAG GAAGCTGGGG 3150AGACACGCTG CAGGGGGCAG GAAGCTGGGG 3150

AAGGGGTCTG AGGGGTGGAT TCCCTGGGTT 3200AAGGGGTCTG AGGGGTGGAT TCCCTGGGTT 3200

GGAATTCCTG GAATACCAGC TGACAATGAT 3250GGAATTCCTG GAATACCAGC TGACAATGAT 3250

TCACCTCTCC TCATCTAAGA ATTGCTCCTC 3300TCACCTCTCC TCATCTAAGA ATTGCTCCTC 3300

TGCAAGGCTA ACGCTGTCCA GCCCGGCTCC 3350TGCAAGGCTA ACGCTGTCCA GCCCGGCTCC 3350

TCCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG 3400TCCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG 3400

AGAACTCCCA ACATTATCCC CTTTATCCGC 3450AGAACTCCCA ACATTATCCC CTTTATCCGC 3450

ACTCCCAGGA AGACACCATC ACTTCCTCTA 3500ACTCCCAGGA AGACACCATC ACTTCCTCTA 3500

TTCTTCCCAT ATTGTCCCCA CCTACTGATC 3550TTCTTCCCAT ATTGTCCCCA CCTACTGATC 3550

239239

ACACTCTCTG ACAAGAATTA TTCTTCACAAACACTCTCTG ACAAGAATTA TTCTTCACAA

TCTCGTCTAG AGATAGTACT CATGGAGGACTCTCGTCTAG AGATAGTACT CATGGAGGAC

CATAGCTCTC TCTATTTCAG CTCCCTTCTCCATAGCTCTC TCTATTTCAG CTCCCTTCTC

CAGAGCCAGT GCCCAGAGGT TCACCCTTTGCAGAGCCAGT GCCCAGAGGT TCACCCTTTG

TGCTGTGGAC TTTAGCTTGG GAGAATGGAATGCTGTGGAC TTTAGCTTGG GAGAATGGAA

CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTGCATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG

CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTTCCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT

GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCAGCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA

ATAAGATGAT GGCTTGCAGG TCCAATATGTATAAGATGAT GGCTTGCAGG TCCAATATGT

ACCATGAAAA GCTGGAGAGA AATCGCTCATACCATGAAAA GCTGGAGAGA AATCGCTCAT

CCYGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAGCCYGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG

CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCACCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA

ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGTATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT

AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGGAGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG

GCACTTTGGG AGGCCGAGGC AGGCAGATCAGCACTTTGGG AGGCCGAGGC AGGCAGATCA

AGCAGCCTGG CCAACATGGC GAAACCCCGTAGCAGCCTGG CCAACATGGC GAAACCCCGT

TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAATTAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT

AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGTAAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT

ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGACATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC

TACAGCCCGC ATTTAAAAGC 3600TACAGCCCGC ATTTAAAAGC 3600

TAGCCTGCTT ATTAGGCTAC 3650TAGCCTGCTT ATTAGGCTAC 3650

CCCCCACCAA TCTTTTTCAA 3700CCCCCACCAA TCTTTTTCAA 3700

CCTACACCTG TCCTGCTGCC 3750CCTACACCTG TCCTGCTGCC 3750

AACCCAGATG GTAAGAAAGC 3800AACCCAGATG GTAAGAAAGC 3800

TCTTCAGTTT CCCACTGCTT 3850TCTTCAGTTT CCCACTGCTT 3850

TTAAAAATAT CTCACCTTCA 3900TTAAAAATAT CTCACCTTCA 3900

CCTATGATGA TAGCCTGTGG 3950CCTATGATGA TAGCCTGTGG 3950

GAATAGATTT GAAGCTGAAC 4000GAATAGATTT GAAGCTGAAC 4000

GGCCATGCCT TTGACCTATT 4050GGCCATGCCT TTGACCTATT 4050

AAGCAAGACT CATATGTCAT 4100AAGCAAGACT CATATGTCAT 4100

CTAAAATAAC AAAAGACTGA 4150CTAAAATAAC AAAAGACTGA 4150

CAAAAACAAG GTGAAACAAC 4200CAAAAACAAG GTGAAACAAC 4200

GGCTCACGCC TGTAATCCCA 4250GGCTCACGCC TGTAATCCCA 4250

CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG 4300CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG 4300

CTCTACTAAG AATACAAAAT 4350CTCTACTAAG AATACAAAAT 4350

CCCAGCTACT TGGAAGGCTG 4400CCCAGCTACT TGGAAGGCTG 4400

GGAGGTTGTA GTGAGCTGAG 4450GGAGGTTGTA GTGAGCTGAG 4450

AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 4500AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 4500

AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC 4550AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC 4550

240240

CAGCTTTCAG GCCACAATGC CCTGCTTCCACAGCTTTCAG GCCACAATGC CCTGCTTCCA

AGCACTTCCT ACGAAAAGGA TCTGAGAGAAAGCACTTCCT ACGAAAAGGA TCTGAGAGAA

CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTTCCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT

GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAAGTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA

CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCCCCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC

GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGACGAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC

CTAGAAAGCA GCAGCCTGAA CAGAAAGAGACTAGAAAGCA GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA

CAATAGTTTA AAAAACTAAA ATCTATCCTCCAATAGTTTA AAAAACTAAA ATCTATCCTC

TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGGTTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG

TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATTTAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT

CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAGCATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG

CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAACCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA

CCGGATTCAA GCGATTCTCC TGCCTCAGTCCCGGATTCAA GCGATTCTCC TGCCTCAGTC

AGGTGCCCAC CACCATGCCC AGCTAATTTTAGGTGCCCAC CACCATGCCC AGCTAATTTT

GGTTTCACCA TGTTGGCCAG GCTGATCTTGGGTTTCACCA TGTTGGCCAG GCTGATCTTG

CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGGCCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG

CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAACACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA

CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACCCAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC

GGGCAGATTT CAGCAACGTA AGAAAAAAGGGGGCAGATTT CAGCAACGTA AGAAAAAAGG

AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC TAGAGGACACAGTGTAAGAC CAGGCTGGAC TAGAGGACAC

TCATTTAAGC CTCTGGCCCT 4600TCATTTAAGC CTCTGGCCCT 4600

TTAAATTGCC CCCAAACTTA 4650TTAAATTGCC CCCAAACTTA 4650

AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT 4700AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT 4700

TGCTCGTACA GAACTCTATT 4750TGCTCGTACA GAACTCTATT 4750

TGAACACCGG ACATCCCCCT 4800TGAACACCGG ACATCCCCCT 4800

CATATTAAAC TAACATGTGT 4850CATATTAAAC TAACATGTGT 4850

CTAGAAGCAT GTTTTATGGG 4900CTAGAAGCAT GTTTTATGGG 4900

AAGAACCCTA GCGTCCCTTC 4950AAGAACCCTA GCGTCCCTTC 4950

CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC 5000CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC 5000

ATGGTAGAGT CTCATACCTA 5050ATGGTAGAGT CTCATACCTA 5050

ACGGAGTCTC ACTCTATCCC 5100ACGGAGTCTC ACTCTATCCC 5100

CTCACTGCAA CCTCAGCCTC 5150CTCACTGCAA CCTCAGCCTC 5150

TCCCAAGTAG CTGGGATTAC 5200TCCCAAGTAG CTGGGATTAC 5200

TGTATTTTTG GTAGAGATGG 5250TGTATTTTTG GTAGAGATGG 5250

AACTCCTGAC CTCAGGTGAT 5300AACTCCTGAC CTCAGGTGAT 5300

ATTACAGGCG TGAGCCACTG 5350ATTACAGGCG TGAGCCACTG 5350

ATGATCCTAA GGTTTTGCAG 5400ATGATCCTAA GGTTTTGCAG 5400

AAGAGGTAAA AGCTGTAACA 5450AAGAGGTAAA AGCTGTAACA 5450

AGCTCTTCTC ACTGAAACCA 5500AGCTCTTCTC ACTGAAACCA 5500

GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG 5550GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG 5550

CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG GAATTCCTGC CCTGGGTGGG 5600CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG GAATTCCTGC CCTGGGTGGG 5600

241241

ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC TGCTGGCTAC 5650ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC TGCTGGCTAC 5650

TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT 5700TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT 5700

CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AGGAGGAGAC CAAGGCACAG GACATTCTGG 5750CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AGGAGGAGAC CAAGGCACAG GACATTCTGG 5750

GAGCAGTGAC CCTTCTGCTG GAGGGAGTGA TGGCAGCACG GGGACAACTG 5800GAGCAGTGAC CCTTCTGCTG GAGGGAGTGA TGGCAGCACG GGGACAACTG 5800

GGACCCACTT GCCTCTCATC CCTCCTGGGG CAGCTTTCTG GACAGGTCCG 5850GGACCCACTT GCCTCTCATC CCTCCTGGGG CAGCTTTCTG GACAGGTCCG 5850

TCTCCTCCTT GGGGCCCTGC AGAGCCTCCT TGGAACCCAG GTAAGTCCCC 5900TCTCCTCCTT GGGGCCCTGC AGAGCCTCCT TGGAACCCAG GTAAGTCCCC 5900

AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCACTAGAA 5950AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCACTAGAA 5950

GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG 6000GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG 6000

ATCTACTAAG AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC 6050ATCTACTAAG AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC 6050

TGTCTTTCCT ACTTAGACAA GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG 6100TGTCTTTCCT ACTTAGACAA GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG 6100

GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAGCTTC CTCCACAGGG CAGGACCACA 6150GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAGCTTC CTCCACAGGG CAGGACCACA 6150

GCTCACAAGG ATCCCAATGC CATCTTCCTG AGTTTCCAAC ACCTGCTCCG 6200GCTCACAAGG ATCCCAATGC CATCTTCCTG AGTTTCCAAC ACCTGCTCCG 6200

AGGAAAGGTG CGTTTCCTGA TGCTTGTAGG AGGGTCCACC CTCTGCGTCA 6250AGGAAAGGTG CGTTTCCTGA TGCTTGTAGG AGGGTCCACC CTCTGCGTCA 6250

GGCGGGCCCC ACCCACCACA GCTGTCCCCA GCAGAACCTC TCTAGTCCTC 6300GGCGGGCCCC ACCCACCACA GCTGTCCCCA GCAGAACCTC TCTAGTCCTC 6300

ACACTGAACG AGCTCCCAAA CAGGACTTCT GGATTGTTGG AGACAAACTT 6350ACACTGAACG AGCTCCCAAA CAGGACTTCT GGATTGTTGG AGACAAACTT 6350

CACTGCCTCA GCCAGAACTA CTGGCTCTGG GCTTCTGAAG TGGCAGCAGG 6400CACTGCCTCA GCCAGAACTA CTGGCTCTGG GCTTCTGAAG TGGCAGCAGG 6400

GATTCAGAGC CAAGATTCCT GGTCTGCTGA ACCAAACCTC CAGGTCCCTG 6450GATTCAGAGC CAAGATTCCT GGTCTGCTGA ACCAAACCTC CAGGTCCCTG 6450

GACCAAATCC CCGGATACCT GAACAGGATA CACGAACTCT TGAATGGAAC 6500GACCAAATCC CCGGATACCT GAACAGGATA CACGAACTCT TGAATGGAAC 6500

TCGTGGACTC TTTCCTGGAC CCTCACGCAG GACCCTAGGA GCCCCGGACA 6550TCGTGGACTC TTTCCTGGAC CCTCACGCAG GACCCTAGGA GCCCCGGACA 6550

TTTCCTCAGG AACATCAGAC ACAGGCTCCC TGCCACCCAA CCTCCAGCCT 6600TTTCCTCAGG AACATCAGAC ACAGGCTCCC TGCCACCCAA CCTCCAGCCT 6600

242242

GGATATTCTC CTTCCCCAAC CCATCCTCCTGGATATTCTC CTTCCCCAAC CCATCCTCCT

CCCTCTTCCA CCCACCTTGC CCACCCCTGTCCCTCTTCCA CCCACCTTGC CCACCCCTGT

TTCCTGACCC TTCTGCTCCA ACGCCCACCCTTCCTGACCC TTCTGCTCCA ACGCCCACCC

ACATCCTACA CCCACTCCCA GAATCTGTCTACATCCTACA CCCACTCCCA GAATCTGTCT

GACACTGCCG ACATCAGCAT TGTCTCATGTGACACTGCCG ACATCAGCAT TGTCTCATGT

GCGCCCCTGG GAGACAACTG GACAAGATTTGCGCCCCTGG GAGACAACTG GACAAGATTT

AAAGCCCTGG TAAAAGGGAT ACACAGGACTAAAGCCCTGG TAAAAGGGAT ACACAGGACT

CTGTACATTA TAAACCTTCA GAAGCTATTTCTGTACATTA TAAACCTTCA GAAGCTATTT

TCATCAGAGC AGCTAGCTCT TTGGTCTATTTCATCAGAGC AGCTAGCTCT TTGGTCTATT

CACTGATTCT CTACATGCTC TTTTTCTGTGCACTGATTCT CTACATGCTC TTTTTCTGTG

GCTGGCCTGG CAGTTGAACA GAGGGAGAGAGCTGGCCTGG CAGTTGAACA GAGGGAGAGA

AGAGAAAGGG TAATTTCCTT TGCTTCAAATAGAGAAAGGG TAATTTCCTT TGCTTCAAAT

CATCCCCTTT ACTATCATTC TCAGTGGGACCATCCCCTTT ACTATCATTC TCAGTGGGAC

AGATCTTTAC TCTTGAGAAA TGAATAAGCTAGATCTTTAC TCTTGAGAAA TGAATAAGCT

CTATACACTA GACAAAACTG AGCCTGTATACTATACACTA GACAAAACTG AGCCTGTATA

AAAAGCTCCC TAAAAAGCAA GGGAAAGATGAAAAGCTCCC TAAAAAGCAA GGGAAAGATG

ATCCCCCTCA CCCTGCCACC CCAAACAAAAATCCCCCTCA CCCTGCCACC CCAAACAAAA

AGAGCCTCAC ACCCCAGGTA AGGCTGTGTAAGAGCCTCAC ACCCCAGGTA AGGCTGTGTA

ACCTGGATGT GACAGCTGAG CAAACAGCTAACCTGGATGT GACAGCTGAG CAAACAGCTA

ACTGGACAGT ATACGCTCTT 6650ACTGGACAGT ATACGCTCTT 6650

GGTCCAGCTC CACCCCCTGC 6700GGTCCAGCTC CACCCCCTGC 6700

CTACCAGCCC TCTTCTAAAC 6750CTACCAGCCC TCTTCTAAAC 6750

CAGGAAGGGT AAGGTTCTCA 6800CAGGAAGGGT AAGGTTCTCA 6800

ACAGCTCCCT TCCCTGCAGG 6850ACAGCTCCCT TCCCTGCAGG 6850

CCTACTTTCT CCTGAAACCC 69-00CCTACTTTCT CCTGAAACCC 69-00

GAAAAGGGAA TCATTTTTCA 6950GAAAAGGGAA TCATTTTTCA 6950

TTTTAAGCTA TCAGCAATAC 7000TTTTAAGCTA TCAGCAATAC 7000

TTCTGCAGAA ATTTGCAACT 7050TTCTGCAGAA ATTTGCAACT 7050

ATAACTCTGC AAAGGCCTGG 7100ATAACTCTGC AAAGGCCTGG 7100

CTAACCTTGA GTCAGAAAAC 7150CTAACCTTGA GTCAGAAAAC 7150

TCAAGGCCTT CCAACGCCCC 7200TCAAGGCCTT CCAACGCCCC 7200

TCTGATCCCA TATTCTTAAC 7250TCTGATCCCA TATTCTTAAC 7250

TTCTCTCAGA AATGCTGTCC 7300TTCTCTCAGA AATGCTGTCC 7300

AGGAATAAAT GGGAGCGCCG 7350AGGAATAAAT GGGAGCGCCG 7350

TTCTTCGAGG GTGGCAATAG 7400TTCTTCGAGG GTGGCAATAG 7400

AAGCTAACAG GAAGCCTTGG 7450AAGCTAACAG GAAGCCTTGG 7450

GACAGTTCAG TAAAGACAGG 7500GACAGTTCAG TAAAGACAGG 7500

GAGCTTTGGC AGCTCAGCAG 7550GAGCTTTGGC AGCTCAGCAG 7550

GAGGCTTTGC CAGGCATGGA CGCCTGCCTC CCTCCTGTGG AGGTCAGGAG 7600GAGGCTTTGC CAGGCATGGA CGCCTGCCTC CCTCCTGTGG AGGTCAGGAG 7600

243243

GAAGTGCAGG AAGTGGCATG AGTCAGGCTCGAAGTGCAGG AAGTGGCATG AGTCAGGCTC

GAACAAGTAC AAGTCAAGTA CAAGTTGAAGGAACAAGTAC AAGTCAAGTA CAAGTTGAAG

AAATGCATCT AAAAAGCAGC TCTGTGTGACAAATGCATCT AAAAAGCAGC TCTGTGTGAC

GATCTCTAAA AAGGAGTCAG GCTTATGGGGGATCTCTAAA AAGGAGTCAG GCTTATGGGG

TTGGTGCTCA GGAAAAGGTT TGTGTTGCACTTGGTGCTCA GGAAAAGGTT TGTGTTGCAC

CTTGAGCTCA CACAGCAGGA 7650CTTGAGCTCA CACAGCAGGA 7650

GCTCATTTCC CAGTTCCCGC 7700GCTCATTTCC CAGTTCCCGC 7700

CACCATAAAC TCTGCTAGGG 7750CACCATAAAC TCTGCTAGGG 7750

CTTTGCAAAT AAGTGCTGCC 7800CTTTGCAAAT AAGTGCTGCC 7800

AAAACACAAA TTCCACTGC 7849 (2) Informace o SEQ ID NO: 12 (i) Charakteristiky sekvence:AAAACACAAA TTCCACTGC 7849 (2) SEQ ID NO: 12 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 1|443 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 12(A) Length: 1 | 443 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 12

GAGTCCTTGG GAGTCCTTGG CCCACCTCTC CCCACCTCTC TCCCACCCGA TCCCACCCGA CTCTGCCGAA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG AGAAGCACAG 50 50 AAGCTCAAGC AAGCTCAAGC CGCCTCCATG CGCCTCCATG GCCCCAGGAA GCCCCAGGAA AGATTCAGGG AGATTCAGGG GAGAGGCCCC GAGAGGCCCC 100 100 ALIGN! ATACAGGGAG ATACAGGGAG CCACTTCAGT CCACTTCAGT TAGACACCCT TAGACACCCT GGCCAGAATG GGCCAGAATG GAGCTGACTG GAGCTGACTG 150 150 ATTTGCTCCT ATTTGCTCCT GGCGGCCATG GGCGGCCATG CTTCTTGCAG CTTCTTGCAG TGGCAAGACT TGGCAAGACT aactctgtcc aactctgtcc 200 200 AGCCCCGTAG AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG CTCCTGCCTG TGACCCCAGA TGACCCCAGA CTCCTAAATA CTCCTAAATA AACTGCTGCG AACTGCTGCG 250 250 TGACTCCCAC TGACTCCCAC CTCCTTCACA CTCCTTCACA GCCGACTGAG GCCGACTGAG TCAGTGTCCC TCAGTGTCCC GACGTCGACC GACGTCGACC 300 300 CTTTGTCTAT CTTTGTCTAT CCCTGTTCTG CCCTGTTCTG CTGCCTGCTG CTGCCTGCTG TGGACTTTAG TGGACTTTAG CCTGGGAGAA CCTGGGAGAA 350 350 TGGAAAACCC TGGAAAACCC AGACGGAACA AGACGGAACA GAGCAAGGCA GAGCAAGGCA CAGGACATTC CAGGACATTC TAGGGGCAGT TAGGGGCAGT 400 400 GTCCCTTCTA GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG CTGGAGGGAG TGATGGCAGC TGATGGCAGC ACGAGGACAG ACGAGGACAG TTGGAACCCT TTGGAACCCT 450 450 CCTGCCTCTC CCTGCCTCTC ATCCCTCCTG ATCCCTCCTG GGACAGCTTT GGACAGCTTT CTGGGCAGGT CTGGGCAGGT TCGCCTCCTC TCGCCTCCTC 500 500 TTGGGGGCCC TTGGGGGCCC TGCAGGGCCT TGCAGGGCCT CCTAGGAACC CCTAGGAACC CAGGGCAGGA CAGGGCAGGA CCACAGCTCA CCACAGCTCA 550 550

CAAGGACCCC AATGCCCTCT TCTTGAGCTT GCAACAACTG CTTCGGGGAA 600CAAGGACCCC AATGCCCTCT TCTTGAGCTT GCAACAACTG CTTCGGGGAA 600

244244

aggtgcgctt CCTGCTTCTG GTAGAAGGTC CCACCCTCTG TGTCAGACGG 650 aggtgcgctt CCTGCTTCTG GTAGAAGGTC CCACCCTCTG TGTCAGACGG 650 ACCCTGCCAA ACCCTGCCAA CCACAGCTGT CCACAGCTGT CCCAAGCAGT CCCAAGCAGT ACTTCTCAAC ACTTCTCAAC TCCTCACACT TCCTCACACT 700 700 AAACAAGTTC AAACAAGTTC CCAAACAGGA CCAAACAGGA CTTCTGGATT CTTCTGGATT GTTGGAGACG GTTGGAGACG AACTTCAGTG AACTTCAGTG 750 750 TCACAGCCAG TCACAGCCAG AACTGCTGGC AACTGCTGGC CCTGGACTTC CCTGGACTTC TGAGCAGGCT TGAGCAGGCT TCAGGGATTC TCAGGGATTC 800 800 AGAGTCAAGA AGAGTCAAGA TTACTCCTGG TTACTCCTGG TCAGCTAAAT TCAGCTAAAT CAAACCTCCA CAAACCTCCA GGTCCCCAGT GGTCCCCAGT 850 850 CCAAATCTCT CCAAATCTCT GGATACCTGA GGATACCTGA ACAGGACACA ACAGGACACA CGGACCTGTG CGGACCTGTG AATGGAACTC AATGGAACTC 900 900 ATGGGCTCTT ATGGGCTCTT TGCTGGAACC TGCTGGAACC TCACTTCAGA TCACTTCAGA CCCTGGAAGC CCCTGGAAGC CTCAGACATC CTCAGACATC 950 950 TCGCCCGGAG TCGCCCGGAG CTTTCAACAA CTTTCAACAA AGGCTCCCTG AGGCTCCCTG GCATTCAACC GCATTCAACC TCCAGGGTGG TCCAGGGTGG 1000 1000 ACTTCCTCCT ACTTCCTCCT TCTCCAAGCC TCTCCAAGCC TTGCTCCTGA TTGCTCCTGA TGGACACACA TGGACACACA CCCTTCCCTC CCCTTCCCTC 1050 1050 CTTCACCTGC CTTCACCTGC CTTGCCCACC CTTGCCCACC ACCCATGGAT ACCCATGGAT CTCCACCCCA CTCCACCCCA GCTCCACCCC GCTCCACCCC 1100 1100 CTGTTTCCTG CTGTTTCCTG ACCCTTCCAC ACCCTTCCAC CACCATGCCT CACCATGCCT AACTCTACCG AACTCTACCG CCCCTCATCC CCCCTCATCC 1150 1150 AGTCACAATG AGTCACAATG TACCCTCATC TACCCTCATC CCAGGAATTT CCAGGAATTT GTCTCAGGAA GTCTCAGGAA ACATAGCGCG ACATAGCGCG 1200 1200 GGCACTGGCC GGCACTGGCC CAGTGAGCGT CAGTGAGCGT CTGCAGCTTC CTGCAGCTTC TCTCGGGGAC TCTCGGGGAC AAGCTTCCCC AAGCTTCCCC 1250 1250 AGGAAGGCTG AGGAAGGCTG AGAGGCAGCT AGAGGCAGCT GCATCTGCTC GCATCTGCTC CAGATGTTCT CAGATGTTCT GCTTTCACCT GCTTTCACCT 1300 1300 AAAAGGCCCT AAAAGGCCCT GGGGAAGGGA GGGGAAGGGA TACACAGCAC TACACAGCAC TGGAGATTGT TGGAGATTGT AAAATTTTAG AAAATTTTAG 1350 1350 GAGCTATTTT GAGCTATTTT TTTTTAACCT TTTTTAACCT ATCAGCAATA ATCAGCAATA TTCATCAGAG TTCATCAGAG CAGCTAGCGA CAGCTAGCGA 1400 1400 TCTTTGGTCT TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA ATTTTCGGTA TAAATTTGAA TAAATTTGAA AATCACTAAT AATCACTAAT TCT 1443 TCT 1443

(2) Informace o SEQ ID NO: 13 (i) Charakteristiky sekvence:(2) SEQ ID NO: 13 information (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 352 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologi,e: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 13(A) Length: 352 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topologi, e: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 13

245245

Met 1 Met 1 Glu Glu Leu Leu Thr Thr Asp 5 Asp 5 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala 10 Ala 10 Met Met Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val 15 Wall 15 Dec Ala Ala Arg Arg Leu Leu Thr Thr Leu 20 Leu 20 May Ser Ser Ser Ser Pro For Val Wall Ala 25 Ala 25 Pro For Ala Ala Cys Cys Asp Asp Pro 30 For 30 Arg Arg Leu Leu Leu Leu Asn Asn Lys 35 Lys 35 Leu Leu Leu Leu Arg Arg Asp Asp Ser 40 Ser 40 His His Leu Leu Leu Leu His His Ser 45 Ser 45 Arg Arg Leu Leu Ser Ser Gin Gin Cys 50 Cys 50 Pro For Asp Asp Val Wall Asp Asp Pro 55 For 55 Leu Leu Ser Ser Ile Ile Pro For Val 60 Wall 60 Leu Leu Leu Leu Pro For Ala Ala Val 65 Wall 65 Asp Asp Phe Phe Ser Ser Leu Leu Gly 70 Gly 70 Glu Glu Trp Trp Lys Lys Thr Thr Gin 75 Gin 75 Thr Thr Glu Glu Gin Gin Ser Ser Lys 80 Lys 80 Ala Ala Gin Gin Asp Asp Ile Ile Leu 85 Leu 85 Gly Gly Ala Ala Val Wall Ser Ser Leu 90 Leu 90 Leu Leu Leu Leu Glu Glu Gly Gly Val 95 Wall 95 Met Met Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly 100 Gly 100 ALIGN! Gin Gin Leu Leu Glu Glu Pro For Ser 105 Ser 105 Cys Cys Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu 110 Leu 110 Leu Leu Gly Gly Gin Gin Leu Leu Ser 115 Ser 115 Gly Gly Gin Gin Val Wall Arg Arg Leu 120 Leu 120 Leu Leu Leu Leu Gly Gly Ala Ala Leu 125 Leu 125 Gin Gin Gly Gly Leu Leu Leu Leu Gly 130 Gly 130 Thr Thr Gin Gin Gly Arg Gly Arg Thr 135 Thr 135 Thr Thr Ala Ala His His Lys Lys Asp 140 Asp 140 Pro For Asn Asn Ala Ala Leu Leu Phe 145 Phe 145 Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gin Gin Gin 150 Gin 150 Leu Leu Leu Leu Arg Arg Gly Gly Lys 155 Lys 155 Val Wall Arg Arg Phe Phe Leu Leu Leu 160 Leu 160 Leu Leu Val Wall Glu Glu Gly Gly Pro 165 For 165 Thr Thr Leu Leu Cys Cys Val Wall Arg 170 Arg 170 Arg Arg Thr Thr Leu Leu Pro For Thr 175 Thr 175 Thr Thr Ala Ala Val Wall Pro For Ser 180 Ser 180 Ser Ser Thr Thr Ser Ser Gin Gin Leu 185 Leu 185 Leu Leu Thr Thr Leu Leu Asn Asn Lys 190 Lys 190 Phe Phe Pro For Asn Asn Arg Arg Thr 195 Thr 195 Ser Ser Gly Gly Leu Leu Leu Leu Glu 200 Glu 200 Thr Thr Asn Asn Phe Phe Ser Ser Val 205 Wall 205 Thr Thr Ala Ala Arg Arg Thr Thr Ala 210 Ala 210 Gly Gly Pro For Gly Gly Leu Leu Leu 215 Leu 215 Ser Ser Arg Arg Leu Leu Gin Gin Gly 220 Gly 220 Phe Phe Arg Arg Val Wall Lys Lys Ile 225 Ile 225 Thr Thr Pro For Gly Gly Gin Gin Leu 230 Leu 230 Asn Asn Gin Gin Thr Thr Ser Ser Arg 235 Arg 235 Ser Ser Pro For Val Wall Gin Gin Ile 240 Ile 240 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Leu Leu Asn 245 Asn 245 Arg Arg Thr Thr His His Gly Gly Pro 250 For 250 Val Wall Asn Asn Gly Gly Thr Thr His 255 His 255 Gly Gly Leu Leu Phe Phe Ala Ala Gly 260 Gly 260 Thr Thr Ser Ser Leu Leu Gin Gin Thr 265 Thr 265 Leu Leu Glu Glu Ala Ala Ser Ser Asp 270 Asp 270 Ile Ile Ser Ser Pro For Gly Gly Ala 275 Ala 275 Phe Phe Asn Asn Lys Lys Gly Gly Ser 280 Ser 280 Leu Leu Ala Ala Phe Phe Asn Asn Leu 285 Leu 285 Gin Gin Gly Gly Gly Gly Leu Leu Pro 290 For 290 Pro For Ser Ser Pro For Ser Ser Leu 295 Leu 295 Ala Ala Pro For Asp Asp Gly Gly His 300 His 300

246246

Thr Thr Pro For Phe Phe Pro For Pro For Ser Ser Pro For Ala Ala Leu Leu Pro For Thr Thr Thr Thr His His Gly Gly Ser Ser 305 305 310 310 315 315 Pro For Pro For Gin Gin Leu Leu His His Pro For Leu Leu Phe Phe Pro For Asp Asp Pro For Ser Ser Thr Thr Thr Thr Met Met 320 320 325 325 330 330 Pro For Asn Asn Ser Ser Thr Thr Ala Ala Pro For His His Pro For Val Wall Thr Thr Met Met Tyr Tyr Pro For His His Pro For 335 335 * * 340 340 345 345 Arg Arg Asn Asn Leu Leu Ser Ser Gin Gin Glu Glu Thr Thr

350 352 (2) Informace o SEQ ID NO: 14 (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 1536 basí350 352 (2) SEQ ID NO: 14 information (i) Sequence characteristics: (A) Length: 1536 bases

-«·····-x·: · ··· - «···· -x ·: · ··· (B) (B) Typ: nukleová kyselina Type: nucleic acid (C) (C) Počet vláken: jedno Number of fibers: one (D) (D) Topologie: lineární Topology: linear (xi) (xi) Označeni sekvence: SEQ ID NO: 14 Sequence designation: SEQ ID NO: 14

GAGTCCTTGG GAGTCCTTGG CCCACCTCTC CCCACCTCTC TCCCACCCGA TCCCACCCGA CTCTGCCGAA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG AGAAGCACAG 50 50 AAGCTCAAGC AAGCTCAAGC CGCCTCCATG CGCCTCCATG GCCCCAGGAA GCCCCAGGAA AGATTCAGGG AGATTCAGGG GAGAGGCCCC GAGAGGCCCC 100 100 ALIGN! ATACAGGGAG ATACAGGGAG CCACTTCAGT CCACTTCAGT TAGACACCCT TAGACACCCT GGCCAGAATG GGCCAGAATG GAGCTGACTG GAGCTGACTG 150 150 ATTTGCTCCT ATTTGCTCCT GGCGGCCATG GGCGGCCATG CTTCTTGCAG CTTCTTGCAG TGGCAAGACT TGGCAAGACT AACTCTGTCC AACTCTGTCC 200 200 AGCCCCGTAG AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG CTCCTGCCTG TGACCCCAGA TGACCCCAGA CTCCTAAATA CTCCTAAATA AACTGCTGCG AACTGCTGCG 250 250 TGACTCCCAC TGACTCCCAC CTCCTTCACA CTCCTTCACA GCCGACTGAG GCCGACTGAG TCAGTGTCCC TCAGTGTCCC GACGTCGACC GACGTCGACC 300 300 CTTTGTCTAT CTTTGTCTAT CCCTGTTCTG CCCTGTTCTG CTGCCTGCTG CTGCCTGCTG TGGACTTTAG TGGACTTTAG CCTGGGAGAA CCTGGGAGAA 350 350 TGGAAAACCC TGGAAAACCC AGACGGAACA AGACGGAACA GAGCAAGGCA GAGCAAGGCA CAGGACATTC CAGGACATTC TAGGGGCAGT TAGGGGCAGT 400 400 GTCCCTTCTA GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG CTGGAGGGAG TGATGGCAGC TGATGGCAGC ACGAGGACAG ACGAGGACAG TTGGAACCCT TTGGAACCCT 450 450 CCTGCCTCTC CCTGCCTCTC ATCCCTCCTG ATCCCTCCTG GGACAGCTTT GGACAGCTTT CTGGGCAGGT CTGGGCAGGT TCGCCTCCTC TCGCCTCCTC 500 500 TTGGGGGCCC TTGGGGGCCC TGCAGGGCCT TGCAGGGCCT CCTAGGAACC CCTAGGAACC CAGCTTCCTC CAGCTTCCTC TACAGGGCAG TACAGGGCAG 550 550 GACCACAGCT GACCACAGCT CACAAGGACC CACAAGGACC CCAATGCCCT CCAATGCCCT CTTCTTGAGC CTTCTTGAGC TTGCAACAAC TTGCAACAAC 600 600

TGCTTCGGGG AAAGGTGCGC TTCCTGCTTC TGGTAGAAGG TCCCACCCTC 650TGCTTCGGGG AAAGGTGCGC TTCCTGCTTC TGGTAGAAGG TCCCACCCTC 650

247247

GTCCCAAGCA GTACTTCTCA 700GTCCCAAGCA GTACTTCTCA 700

GACTTCTGGA TTGTTGGAGA 750GACTTCTGGA TTGTTGGAGA 750

GCCCTGGACT TCTGAGCAGG 800GCCCTGGACT TCTGAGCAGG 800

GGTCAGCTAA ATCAAACCTC 850GGTCAGCTAA ATCAAACCTC 850

GAACAGGACA CACGGACCTG 900GAACAGGACA CACGGACCTG 900

CCTCACTTCA GACCCTGGAA 950CCTCACTTCA GACCCTGGAA 950

AAAGGCTCCC TGGCATTCAA 1000AAAGGCTCCC TGGCATTCAA 1000

CCTTGCTCCT GATGGACACA 1050CCTTGCTCCT GATGGACACA 1050

CCACCCATGG ATCTCCACCC 1100CCACCCATGG ATCTCCACCC 1100

ACCACCATGC CTAACTCTAC 1150ACCACCATGC CTAACTCTAC 1150

TCCCAGGAAT TTGTCTCAGG 1200TCCCAGGAAT TTGTCTCAGG 1200

GTCTGCAGCT TCTCTCGGGG 1250GTCTGCAGCT TCTCTCGGGG 1250

CTGCATCTGC TCCAGATGTT 1300CTGCATCTGC TCCAGATGTT 1300

GATACACAGC ACTGGAGATT 1350GATACACAGC ACTGGAGATT 1350

CTATCAGCAA TATTCATCAG 1400CTATCAGCAA TATTCATCAG 1400

TATAAATTTG AAAATCACTA 1450TATAAATTTG AAAATCACTA 1450

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1500AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1500

AAAAAA 1536AAAAAA 1536

TGTGTCAGAC GGACCCTGCC AACCACAGCTTGTGTCAGAC GGACCCTGCC AACCACAGCT

ACTCCTCACA CTAAACAAGT TCCCAAACAGACTCCTCACA CTAAACAAGT TCCCAAACAG

CGAACTTCAG TGTCACAGCC AGAACTGCTGCGAACTTCAG TGTCACAGCC AGAACTGCTG

CTTCAGGGAT TCAGAGTCAA GATTACTCCTCTTCAGGGAT TCAGAGTCAA GATTACTCCT

CAGGTCCCCA GTCCAAATCT CTGGATACCTCAGGTCCCCA GTCCAAATCT CTGGATACCT

TGAATGGAAC TCATGGGCTC TTTGCTGGAATGAATGGAAC TCATGGGCTC TTTGCTGGAA

GCCTCAGACA TCTCGCCCGG AGCTTTCAACGCCTCAGACA TCTCGCCCGG AGCTTTCAAC

CCTCCAGGGT GGACTTCCTC CTTCTCCAAGCCTCCAGGGT GGACTTCCTC CTTCTCCAAG

CACCCTTCCC TCCTTCACCT GCCTTGCCCACACCCTTCCC TCCTTCACCT GCCTTGCCCA

CAGCTCCACC CCCTGTTTCC TGACCCTTCCCAGCTCCACC CCCTGTTTCC TGACCCTTCC

CGCCCCTCAT CCAGTCACAA TGTACCCTCACGCCCCTCAT CCAGTCACAA TGTACCCTCA

AAACATAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAGCAAACATAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAGC

ACAAGCTTCC CCAGGAAGGC TGAGAGGCAGACAAGCTTCC CCAGGAAGGC TGAGAGGCAG

CTGCTTTCAC CTAAAAGGCC CTGGGGAAGGCTGCTTTCAC CTAAAAGGCC CTGGGGAAGG

GTAAAATTTT AGGAGCTATT TTTTTTTAACGTAAAATTTT AGGAGCTATT TTTTTTTAAC

AGCAGCTAGC GATCTTTGGT CTATTTTCGGAGCAGCTAGC GATCTTTGGT CTATTTTCGG

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA (2) Informace o SEQ ID NO: 15 (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 356 aminokyselinAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA (2) SEQ ID NO: 15 (i) Characteristics of sequence: (A) Length: 356 amino acids

248 (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární248 (B) Type: amino acid (C) Topology: linear

(xi) (xi) Označení sekvence: Sequence designation: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 15 15 Dec Met Glu 1 Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu 5 Leu Thr Asp Leu Leu 4 Leu Ala Ala 10 Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Val 15 Met Leu Leu Ala Val Ala Arg Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser 20 Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala 25 For Val Ala 25 Pro Ala Cys Asp Pro 30 For Ala Cys Asp Pro 30 Arg Leu Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu • 35 Leu Asn Lys Leu Leu • 35 Arg Asp Ser 40 Arg Asp Ser 40 His Leu Leu His Ser 45 His Leu Leu His Ser 45 Arg Leu Arg Leu Ser Gin Cys Pro Asp 50 Ser Gin Cys Pro Asp 50 Val Asp Pro 55 Val Asp Pro 55 Leu Ser Ile Pro Val 60 Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe 65 For Ala Val Asp Phe 65 Ser Leu Gly 70 Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin 75 Glu Trp Lys Thr Gin Thr Glu Thr Glu Gin Ser Lys Ala Gin 80 Gin Ser Lys Ala Gin Asp Ile Leu 85 Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu 90 Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala 95 Glu Gly Val Met Ala 94 Ala Arg Gly 100 Ala Arg Gly Gin Leu Glu Pro Ser 105 Gin Leu Glu Pro Ser Cys Leu Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 110 Ser Ser Leu Leu Gly 110 Gin Leu Ser 115 Gin Leu Ser 115 Gly Gin Val Arg Leu 120 Gly Gin Val Arg Leu 119 Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Gly 125 Gly Ala Leu Gin Gly 126 Leu Leu Gly 130 Leu Leu Gly 130 Thr Gin Leu Pro Leu 135 Thr Gin Leu Gin Gly Gin Gly Arg Thr Thr Ala His 140 Arg Thr Thr Ala His 140 Lys Asp Pro 145 Lys Asp Pro 145 Asn Ala Leu Phe Leu 150 Asn Ala Leu Phe Leu 150 Ser Leu Ser Leu Gin Gin Leu Leu Arg 155 Gin Gin Leu Leu Arg Gly Lys Val 160 Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu 165 Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Val Glu Gly Pro Thr Leu Cys 170 Gly Pro Thr Leu Cys Val Arg Arg 175 Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr 180 Thr Leu Thr Thr 180 Ala Val Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser 185 Pro Ser Ser Thr Ser 185 Gin Leu Leu 190 Gin Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe 195 Thr Leu Asn Lys Phe 198 Pro Asn Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu 200 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr 205 Leu Glu Thr 205 Asn Phe Ser Val Thr 210 Asn Phe Ser Val Thr 210 Ala Arg Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly 215 Thr Ala Gly Pro Gly 215 Leu Leu Ser 220 Leu Leu Ser 220 Arg Leu Gin Gly Phe 225 Arg Leu Gin Gly Phe 225 Arg Val Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly 230 Lys Ile Thr Pro Gly Gin Leu Asn 235 Gin Leu Asn 235 Gin Thr Ser Arg Ser 240 Gin Thr Ser Arg Ser 240 Pro Val Pro Val Gin Ile Ser Gly Tyr 245 Gin Ile Ser Leu Asn Arg 250 Leu Asn Arg 250 Thr His Gly Pro Val 255 Thr His Gly Pro Val Asn Gly Asn Gly Thr His Gly Leu Phe 260 Thr His Gly Leu Phe 260 Ala Gly Thr 265 Ala Gly Thr Ser Leu Gin Thr Leu 270 Ser Leu Gin Thr Leu 270 Glu Ala Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro 275 Ser Asp Ile Ser Pro 275 Gly Ala Phe 280 Gly Ala Phe 280 Asn Lys Gly Ser Leu 285 Asn Lys Gly Ser Leu 285

249249

Ala Phe Asn Leu Ala Phe Asn Leu Gin 290 Gin 290 Gly Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Gly Leu Pro Ser Pro Ser Leu Ala 295 295 300 300 Pro Asp Gly' His For Asp Gly 'His Thr 305 Thr 305 Pro For Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro 310 Phe Pro Pro Pro Pro Ala Leu Pro 310 Thr 315 Thr 315 Thr His Gly Ser Thr His Gly Ser Pro 320 For 320 Pro For Gin Leu His Pro Leu Phe Pro Asp 325 Gin Leu His Leu Phe Pro Asp 325 Pro 330 For 330 Ser Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr 335 340 Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gin Glu Thr 350 355 356 (2) Informace o SEQ ID NO: 16 (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 241 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologi^: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 16 Ser Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr 335 340 Tyr Pro His Pro Asn Leu Ser Gin Glu Thr (+420) 350 355 356 (2) SEQ ID NO: 16 (i) Sequence Characteristics: (A) Length: 241 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topologies: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 16 Met 345 Met 345 Ser Pro Val Ala 1 Ser Pro Val Ala 2 Pro 5 For 5 Ala Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys 10 Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 Leu 15 Dec Leu Arg Asp Ser Leu Arg Asp Ser His 20 His 20 May Leu Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys 25 Leu Ser Ser Leu Ser Gin Cys 25 Pro 30 For 30 Asp Val Asp Pro Asp Val Asp Pro Leu 35 Leu 35 Ser Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val 40 Ile Pro Val Leu Asp 45 Asp 45 Phe Ser Leu Gly Phe Ser Leu Gly Glu 50 Glu 50 Trp Trp Lys Thr Gin Thr Glu Gin Ser Lys 55 Lys Thr Gin Ala 60 Ala 60 Gin Asp Ile Leu Gin Asp Ile Leu Gly 65 Gly 65 Ala Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val 70 Val Ser Leu Leu Leu Met 75 Met 75 Ala Ala Arg Gly Ala Ala Gly Gin 80 Gin 80 Leu Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu 85 Glu Pro Ser Cys Leu Leu 90 Leu 90 Gly Gin Leu Ser Gly Gin Leu Ser Gly 95 Gly 95 Gin Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu „pln 100 105 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu 'full 100 105 Gly Leu Leu Gly Gly Leu Thr 110 Thr 110 Gin Gin Leu Pro Leu Gin Gly Arg Thr Thr 115 Leu Gin Gly Arg Thr Thr 115 Ala 120 Ala 120 His Lys Asp Pro His Lys Asp Pro Asn 125 Asn 125 Ala Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gin Gin Leu 130 Leu Phe Leu Ser Leu Leu 135 Leu 135 Arg Gly Lys Asp Arg. Gly Lys Asp Phe 140 Phe 140 Trp Trp Ile Val Gly Asp Glu Leu Gin Cys 145 Ile Val Gly Glu Leu Gin Cys 145 His 150 His 150 Ser Gin Asn Cys Ser Gin Asn Cys Trp 155 Trp 155 Pro For Trp Thr Ser Glu Gin Ala Ser Gly 160 Trp Thr Ser Glu Ala Ser Gly 160 Ile 165 Ile 165 Gin Ser Gin Asp Gin Ser Gin Asp Tyr 170 Tyr 170 Ser Ser Trp Ser Ala Lys Ser Asn Leu Gin 175 Trp Ser Ala Lys Ser Asn Leu Gin Val 180 Wall 180

250250

Pro For Ser Ser Pro For Asn Asn Leu 185 Leu 185 Trp Trp Ile Ile Pro For Glu Glu Gin 190 Gin 190 Asp Asp Thr Thr Arg Arg Thr Thr Cys 195 Cys 195 Glu Glu Trp Trp Asn Asn Ser Ser Trp 200 Trp 200 Ala Ala Leu Leu Cys Cys Trp Trp Asn 205 Asn 205 Leu Leu Thr Thr Ser Ser Asp Asp Pro 210 For 210 Gly Gly Ser Ser Leu Leu Arg Arg His 215 His 215 Leu Leu Ala Ala Arg Arg Ser Ser Phe 220 Phe 220 Gin Gin Gin Gin Arg Arg Leu Leu Pro 225 For 225 Gly Gly Ile Ile Gin Gin Pro For Pro 230 For 230 Gly Gly Trp Trp Thr Thr Ser Ser Ser 235 Ser 235 Phe Phe Ser Ser Lys Lys Pro For Cys 240 Cys 240

SerSer

241 (2) (i) (A) (B) (C)241 (2) (i) (B) (C)

Informace o SEQ ID NO: 17 Charakteristiky sekvence:SEQ ID NO: 17 Sequence Characteristics:

Délka: 335 aminokyselin Typ: aminokyselina Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 17Length: 335 amino acids Type: amino acid Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 17

Ser 1 Ser 1 Pro For Val Wall Ala Ala Pro 5 For 5 Ala Ala Cys Cys Asp Asp Pro For Arg 10 Arg 10 Leu Leu Leu Leu Asn Asn Lys Lys Leu 15 Leu 15 Dec Leu Leu Arg Arg Asp Asp Ser Ser His 20 His 20 May Leu Leu Leu Leu His His Ser Ser Arg 25 Arg 25 Leu Leu Ser Ser Gin Gin Cys Cys Pro 30 For 30 Asp Asp Val Wall Asp Asp Pro For Leu 35 Leu 35 Ser Ser Ile Ile Pro For Val Wall Leu 40 Leu 40 Leu Leu Pro For Ala Ala Val Wall Asp 45 Asp 45 Phe Phe Ser Ser Leu Leu Gly Gly Glu 50 Glu 50 Trp Trp Lys Lys Thr Thr Gin Gin Thr 55 Thr 55 Glu Glu Gin Gin Ser Ser Lys Lys Ala 60 Ala 60 Gin Gin Asp Asp Ile Ile Leu Leu Gly 65 Gly 65 Ala Ala Val Wall Ser Ser Leu Leu Leu· 70 Leu · 70 Leu Leu Glu Glu Gly Gly Val Wall Met ť5 Met «5 Ala Ala Ala Ala Arg Arg Gly Gly Gin 80 Gin 80 Leu Leu Glu Glu Pro For Ser Ser Cys 85 Cys 85 Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Leu 90 Leu 90 Gly Gly Gin Gin Leu Leu Ser Ser Gly 95 Gly 95 Gin Gin Val Wall Arg Arg Leu Leu Leu 100 Leu 100 ALIGN! Leu Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Gin 105 Gin 105 Gly Gly Leu Leu Leu Leu Gly Gly Thr 110 Thr 110 Gin Gin Leu Leu Pro For Leu Leu Gin 115 Gin 115 Gly Arg Gly Arg Thr Thr Thr Thr Ala 120 Ala 120 His His Lys Lys Asp Asp Pro For Asn 125 Asn 125 Ala Ala Leu Leu Phe Phe Leu Leu Ser 130 Ser 130 Leu Leu Gin Gin Gin Gin Leu Leu Leu 135 Leu 135 Arg Arg Gly Gly Lys Lys Val Wall Arg 140 Arg 140 Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 145 Wall 145 Glu Glu Gly Gly Pro For Thr Thr Leu 150 Leu 150 Cys Cys Val Wall Arg Arg Arg Arg Thr 155 Thr 155 Leu Leu Pro For Thr Thr Thr Thr Ala 160 Ala 160 Val Wall Pro For Ser Ser Ser Ser Thr 165 Thr 165

Ser Gin Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180Ser Gin Leu Le Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180

251251

Leu Leu Glu Thr Glu Thr Asn 185 Asn 185 Phe Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Ser Val Ala Thr Ala Ala Gly Pro 190 190 195 195 Gly Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ser Arg 200 Arg 200 Leu Leu Gin Gly Phe Arg Val Lys Ile 205 Gin Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro 210 Thr Pro 210 Gly Gin Leu Asn Gly Gin Leu Asn Gin 215 Gin 215 Thr Thr Ser Arg Ser Pro Val Gin Ile 220 Ser Arg Ser Pro Val Gin Ile Ser Gly 225 Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Tyr Leu Asn Arg Thr 230 Thr 230 His His Gly Pro Val Asn Gly Thr His 235 Gly Pro Val Asn Gly Leu 240 Gly Leu Phe Ala Gly Thr Phe Ala Gly Thr Ser 245 Ser 245 Leu Leu Gin Thr Leu Glu Ala Ser Asp 250 Gin Thr Leu Glu Ala Ser Asp 250 Ile Ser ' 255 Ile Ser '255 Pro Gly Ala Phe For Gly Ala Phe Asn 260 Asn 260 Lys Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu 265 Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu 265 Gin Gly 270 Gin Gly Gly Leu Pro Pro Gly Leu Pro Ser 275 Ser 275 Pro For Ser Leu Ala Pro Asp Gly His 280 Ser Leu Ala Pro Gly His 280 Thr Pro 285 Thr Pro 285 Phe Pro Pro Ser Phe Pro Pro Ser Pro 290 For 290 Ala Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser 295 Leu Pro Thr Thr Gly Ser 295 Pro Pro 300 For Pro 300 Gin Leu His Pro Gin Leu His Pro Leu 305 Leu 305 Phe Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met 310 Pro Asp Pro Pro Thr Thr Met 310 Pro Asn 315 For Asn 315 Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro 320 325 Leu Ser Gin Glu Thr 335 (2) Informace o SEQ ID NO: 18 (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 332 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 18 Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Pro 320 325 Leu Ser Gin Glu Thr 335 (2) SEQ ID NO: 18 information (i) Sequence characteristics: (A) Length: 332 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 18 Arg Asn 330 Arg Asn 330 Ser Pro Ala Pro 1 Ser Pro Ala Pro 2 Pro 5 For 5 Ala Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn 10 Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn 9 Lys Leu 15 Lys Leu Leu Arg Asp Ser Leu Arg Asp Ser His 20 His 20 May Val Wall Leu His Gly Arg Leu Ser Gin 25 Leu His Gly Arg Cys Pro 30 Cys Pro Asp Ile Asn Pro Asp Ile Asn Pro Leu 35 Leu 35 Ser Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 40 Thr Pro Val Leu Val Asp 45 Val Asp Phe Thr Leu Gly Phe Thr Leu Gly Glu 50 Glu 50 Trp Trp Lys Thr Gin Thr Glu Gin Thr 55 Lys Thr Gin Thr Lys Ala 60 Lys Ala Gin Asp Val Leu Gin Asp Gly 65 Gly 65 Ala Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala 70 Thr Thr Leu Leu Glu Ala 70 Val Met 75 Val Met Thr Ala Arg Gly Thr Ala Arg Gly Gin 80  Gin 80 Val Wall Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser 85 Gly Pro Cys Leu Ser Ser 85 Leu Leu 90 Leu Leu

252252

Val Wall Gin Gin Leu Leu Ser Ser Gly 95 Gly 95 Gin Gin Val Wall Arg Arg Leu Leu Leu 100 Leu 100 ALIGN! Leu Gly Leu Gly Ala Ala Leu Leu Gin 105 Gin 105 Asp Asp Leu Leu Leu Leu Gly Gly Met 110 Met 110 Gin Gin Leu Leu Pro For Pro For Gin 115 Gin 115 Gly Arg Gly Arg Thr Thr Thr Thr Ala 120 Ala 120 His His Lys. Lys. Asp Asp Pro For Ser 125 Ser 125 Ala Ala Ile Ile Phe Phe Leu Leu Asn 130 Asn 130 Phe Phe Gin Gin Gin Gin Leu Leu Leu 135 Leu 135 Arg Arg Gly Gly Lys Lys Val Wall Arg 140 Arg 140 Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 145 Wall 145 Val Wall Gly Gly Pro For Ser Ser Leu 150 Leu 150 cys cys Ala Ala Lys Lys Arg Arg Ala 155 Ala 155 Pro For Pro For Ala Ala Ile Ile Ala 160 Ala 160 Val Wall Pro For Ser Ser Ser Ser Thr 165 Thr 165 Ser Ser Pro For Phe Phe His His Thr 170 Thr 170 Leu Leu Asn Asn Lys Lys Leu Leu Pro 175 For 175 Asn Asn Arg Arg Thr Thr Ser Ser Gly 180 Gly 180 Leu Leu Leu Leu Glu Glu Thr Thr Asn 185 Asn 185 Ser Ser Ser Ser Ile Ile Ser Ser Ala 190 Ala 190 Arg Arg Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ser 195 Ser 195 Gly Gly Phe Phe Leu Leu Lys Lys Arg 200 Arg 200 Leu Leu Gin Gin Ala Ala Phe Phe Arg 205 Arg 205 Ala Ala Lys Lys Ile Ile Pro For Gly 210 Gly 210 Leu Leu Leu Leu Asn Asn Gin Gin Thr 215 Thr 215 Ser Ser Arg Arg Ser Ser Leu Leu Asp 220 Asp 220 Gin Gin Ile Ile Pro For Gly Gly His 225 His 225 Gin Gin Asn Asn Gly Gly Thr Thr His 230 His 230 Gly Gly Pro For Leu Leu Ser Ser Gly 235 Gly 235 Ile Ile His His Gly Gly Leu Leu Phe 240 Phe 240 Pro For Gly Gly Pro For Gin Gin Pro 245 For 245 Gly Gly Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ala 250 Ala 250 Pro For Asp Asp Ile Ile Pro For Pro 255 For 255 Ala Ala Thr Thr Ser Ser Gly Gly Met 260 Met 260 Gly Gly Ser Ser Arg Arg Pro For Thr 265 Thr 265 Tyr Tyr Leu Leu Gin Gin Pro For Gly 270 Gly 270 Glu Glu Ser Ser Pro For Ser Ser Pro 275 For 275 Ala Ala His His Pro For Ser Ser Pro 280 For 280 Gly Gly Arg Arg Tyr Tyr Thr Thr Leu •285 Leu • 285 Phe Phe Ser Ser Pro For Ser Ser Pro 290 For 290 Thr Thr Ser Ser Pro For Ser Ser Pro 295 For 295 Thr Thr Val Wall Gin Gin Leu Leu Gin 300 Gin 300 Pro For Leu Leu Leu Leu Pro For Asp 305 Asp 305 Pro For Ser Ser Ala Ala Ile Ile Thr 310 Thr 310 Pro For Asn Asn Ser Ser Thr Thr Ser 315 Ser 315 Pro For Leu Leu Leu Leu Phe Phe Ala 320 Ala 320 Ala Ala His His Pro For His His Phe 325 Phe 325 Gin Gin Asn Asn Leu Leu Ser Ser Gin 330 Gin 330

Glu Glu 332 (2) Informace o SEQ ID NO: 19 (i) Charakteristiky sekvence:Glu Glu 332 (2) SEQ ID NO: 19 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 1026 basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 19(A) Length: 1026 basis (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 19

253253

AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG TGACCCCCGAAGCCCGGCTC CTCCTGCCTG TGACCCCCGA

TGACTCCCAT GTCCTTCACG GCAGACTGAGTGACTCCCAT GTCCTTCACG GCAGACTGAG

CTTTGTCCAC ACCTGTCCTG CTGCCTGCTGCTTTGTCCAC ACCTGTCCTG CTGCCTGCTG

TGGAAAACCC AGACGGAGCA GACAAAGGCATGGAAAACCC AGACGGAGCA GACAAAGGCA

AACCCTTCTG CTGGAGGCAG TGATGACAGCAACCCTTCTG CTGGAGGCAG TGATGACAGC

CTTGCCTCTC ATCCCTGCTG GTGCAGCTTTCTTGCCTCTC ATCCCTGCTG GTGCAGCTTT

CTCGGGGCCC TGCAGGACCT CCTTGGAATGCTCGGGGCCC TGCAGGACCT CCTTGGAATG

GACCACAGCT CACAAGGATC CCAGTGCCATGACCACAGCT CACAAGGATC CCAGTGCCAT

TGCTCCGAGG AAAGGTGCGT TTCCTGCTCCTGCTCCGAGG AAAGGTGCGT TTCCTGCTCC

TGTGCCAAGA GGGCCCCACC CGCCATAGCTTGTGCCAAGA GGGCCCCACC CGCCATAGCT

ATTCCACACA CTGAACAAGC TCCCAAACAGATTCCACACA CTGAACAAGC TCCCAAACAG

CAAACTCCAG TATCTCAGCC AGAACTACTGCAAACTCCAG TATCTCAGCC AGAACTACTG

CTGCAGGCAT TCAGAGCCAA GATTCCTGGTCTGCAGGCAT TCAGAGCCAA GATTCCTGGT

GTCCCTAGAC CAAATCCCTG GACACCAGAAGTCCCTAGAC CAAATCCCTG GACACCAGAA

GTGGAATTCA TGGACTCTTT CCTGGACCCCGTGGAATTCA TGGACTCTTT CCTGGACCCC

CCAGACATTC CTCCAGCAAC TTCAGGCATGCCAGACATTC CTCCAGCAAC TTCAGGCATG

CCAGCCTGGA GAGTCTCCTT CCCCAGCTCACCAGCCTGGA GAGTCTCCTT CCCCAGCTCA

CTCTCTTCTC TCCTTCACCC ACCTCGCCCTCTCTCTTCTC TCCTTCACCC ACCTCGCCCT

CCTCTGCTTC CTGACCCCTC TGCGATCACACCTCTGCTTC CTGACCCCTC TGCGATCACA

CTCCTAAATA AACTGCTTCG 50CTCCTAAATA AACTGCTTCG 50

CCAGTGCCCA GACATTAACC 100CCAGTGCCCA GACATTAACC 100

TGGACTTCAC CTTGGGAGAA 150TGGACTTCAC CTTGGGAGAA 150

CAGGATGTCC TGGGAGCCAC 200CAGGATGTCC TGGGAGCCAC 200

ACGGGGACAA GTGGGACCCC 250ACGGGGACAA GTGGGACCCC 250

CTGGACAGGT TCGCCTCCTC 300CTGGACAGGT TCGCCTCCTC 300

CAGCTTCCTC CACAGGGAAG 350CAGCTTCCTC CACAGGGAAG 350

CTTCCTGAAC TTCCAACAAC 400CTTCCTGAAC TTCCAACAAC 400

TTGTAGTGGG GCCCTCCCTC 450TTGTAGTGGG GCCCTCCCTC 450

GTCCCGAGCA GCACCTCTCC 500GTCCCGAGCA GCACCTCTCC 500

GACCTCTGGA TTGTTGGAGA 550GACCTCTGGA TTGTTGGAGA 550

GCTCTGGATT TCTCAAGAGG 600GCTCTGGATT TCTCAAGAGG 600

CTGCTGAACC AAACCTCCAG 650CTGCTGAACC AAACCTCCAG 650

TGGGACACAC GGACCCTTGA 700TGGGACACAC GGACCCTTGA 700

AACCCGGGGC CCTCGGAGCT 750AACCCGGGGC CCTCGGAGCT 750

GGCTCCCGGC CAACCTACCT 800GGCTCCCGGC CAACCTACCT 800

CCCTTCTCCT GGACGATACA 850CCCTTCTCCT GGACGATACA 850

CCCCCACAGT CCAGCTCCAG 900CCCCCACAGT CCAGCTCCAG 900

CCCAACTCTA CCAGTCCTCT 950CCCAACTCTA CCAGTCCTCT 950

TCTATTTGCA GCTCACCCTC ATTTCCAGAA CCTGTCTCAG GAAGAGTAAG 1000TCTATTTGCA GCTCACCCTC ATTTCCAGAA CCTGTCTCAG GAAGAGTAAG 1000

254254

GTGCTCAGAC CCTGCCAACT TCAGCA 1026 (2) Informace o SEQ ID NO: 20 (i) Charakteristiky sekvence:GTGCTCAGAC CCTGCCAACT TCAGCA 1026 (2) SEQ ID NO: 20 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 1014 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) PočetvTákehT^-Jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 20(A) Length: 1014 bases (B) Type: Nucleic Acid (C) NumberToTT ^- One (D) Topology: Linear (xi) Sequence Designation: SEQ ID NO: 20

AGCCCGGCTC AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG CTCCTGCCTG TGACCCCCGA TGACCCCCGA CTCCTAAATA CTCCTAAATA AACTGCTTCG AACTGCTTCG 50 50 TGACTCCCAT TGACTCCCAT GTCCTTCACG GTCCTTCACG GCAGACTGAG GCAGACTGAG CCAGTGCCCA CCAGTGCCCA GACATTAACC GACATTAACC 100 100 ALIGN! CTTTGTCCAC CTTTGTCCAC ACCTGTCCTG ACCTGTCCTG CTGCCTGCTG CTGCCTGCTG TGGACTTCAC TGGACTTCAC CTTGGGAGAA CTTGGGAGAA 150 150 TGGAAAACCC TGGAAAACCC AGACGGAGCA AGACGGAGCA GACAAAGGCA GACAAAGGCA CAGGATGTCC CAGGATGTCC TGGGAGCCAC TGGGAGCCAC 200 200 AACCCTTCTG AACCCTTCTG CTGGAGGCAG CTGGAGGCAG TGATGACAGC TGATGACAGC ACGGGGACAA ACGGGGACAA GTGGGACCCC GTGGGACCCC 250 250 CTTGCCTCTC CTTGCCTCTC ATCCCTGCTG ATCCCTGCTG GTGCAGCTTT GTGCAGCTTT CTGGACAGGT CTGGACAGGT TCGCCTCCTC TCGCCTCCTC 300 300 CTCGGGGCCC CTCGGGGCCC TGCAGGACCT TGCAGGACCT CCTTGGAATG CCTTGGAATG CAGGGAAGGA CAGGGAAGGA CCACAGCTCA CCACAGCTCA 350 350 CAAGGATCCC CAAGGATCCC AGTGCCATCT AGTGCCATCT TCCTGAACTT TCCTGAACTT CCAACAACTG CCAACAACTG CTCCGAGGAA CTCCGAGGAA 400 400 AGGTGCGTTT AGGTGCGTTT CCTGCTCCTT CCTGCTCCTT GTAGTGGGGC GTAGTGGGGC CCTCCCTCTG CCTCCCTCTG TGCCAAGAGG TGCCAAGAGG 450 450 GCCCCACCCG GCCCCACCCG CCATAGCTGT CCATAGCTGT CCCGAGCAGC CCCGAGCAGC ACCTCTCCAT ACCTCTCCAT TCCACACACT TCCACACACT 500 500 GAACAAGCTC GAACAAGCTC CCAAACAGGA CCAAACAGGA CCTCTGGATT CCTCTGGATT GTTGGAGACA GTTGGAGACA AACTCCAGTA AACTCCAGTA 550 550 TCTCAGCCAG TCTCAGCCAG AACTACTGGC AACTACTGGC TCTGGATTTC TCTGGATTTC TCAAGAGGCT TCAAGAGGCT GCAGGCATTC GCAGGCATTC 600 600 AGAGCCAAGA AGAGCCAAGA TTCCTGGTCT TTCCTGGTCT GCTGAACCAA GCTGAACCAA ACCTCCAGGT ACCTCCAGGT CCCTAGACCA CCCTAGACCA 650 650 AATCCCTGGA AATCCCTGGA CACCAGAATG CACCAGAATG GGACACACGG GGACACACGG ACCCTTGAGT ACCCTTGAGT GGAÁTTCATG GGAÁTTCATG 700 700 GACTCTTTCC GACTCTTTCC TGGACCCCAA TGGACCCCAA CCCGGGGCCC CCCGGGGCCC TCGGAGCTCC TCGGAGCTCC AGACATTCCT AGACATTCCT 750 750 CCAGCAACTT CCAGCAACTT CAGGCATGGG CAGGCATGGG CTCCCGGCCA CTCCCGGCCA ACCTACCTCC ACCTACCTCC AGCCTGGAGA AGCCTGGAGA 800 800

255255

GTCTCCTTCC GTCTCCTTCC CCAGCTCACC CCAGCTCACC CTTCTCCTGG CTTCTCCTGG ACGATACACT ACGATACACT CTCTTCTCTC CTCTTCTCTC 850 850 CTTCACCCAC CTTCACCCAC CTCGCCCTCC CTCGCCCTCC CCCACAGTCC CCCACAGTCC AGCTCCAGCC AGCTCCAGCC TCTGCTTCCT TCTGCTTCCT 900 900 GACCCCTCTG GACCCCTCTG CGATCACACC CGATCACACC CAACTCTACC CAACTCTACC AGTCCTCTTC AGTCCTCTTC TATTTGCAGC TATTTGCAGC 950 950 TCACCCTCAT TCACCCTCAT TTCCAGAACC TTCCAGAACC TGTCTCAGGA TGTCTCAGGA AGAGTAAGGT AGAGTAAGGT GCTCAGACCC GCTCAGACCC 1000 1000

TGCCAACTTC AGCA 1014 (2) Informace o SEQ ID NO: 21 (i) Charakteristiky sekvence:TGCCAACTTC AGCA 1014 (2) SEQ ID NO: 21 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 328 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologier lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 21(A) Length: 328 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topologier linear (xi) Sequence Designation: SEQ ID NO: 21

Ser 1 Ser 1 Pro For Ala Ala Pro For Pro 5 For 5 Ala Ala Cys Cys Asp Asp Pro For Arg 10 Arg 10 Leu Leu Leu Leu Asn Asn Lys Lys Leu 15 Leu 15 Dec Leu Leu Arg Arg Asp Asp Ser Ser His 20 His 20 May Val Wall Leu Leu His His Gly Gly Arg •25 Arg • 25 Leu Leu Ser Ser Gin Gin Cys Cys Pro 30 For 30 Asp Asp Ile Ile Asn Asn Pro For Leu 35 Leu 35 Ser Ser Thr Thr Pro For Val Wall Leu 40 Leu 40 Leu Leu Pro For Ala Ala Val Wall Asp 45 Asp 45 Phe Phe Thr Thr Leu Leu Gly Gly Glu 50 Glu 50 Trp Trp Lys Lys Thr Thr Gin Gin Thr 55 Thr 55 Glu Glu Gin Gin Thr Thr Lys Lys Ala 60 Ala 60 Gin Gin Asp Asp Val Wall Leu Leu Gly 65 Gly 65 Ala Ala Thr Thr Thr Thr Leu Leu Leu 70 Leu 70 Leu Leu Glu Glu Ala Ala Val Wall Met 75 Met 75 Thr Thr Ala Ala Arg Arg Gly Gly Gin 80 Gin 80 Val Wall Gly Gly Pro For Pro For Cys 85 Cys 85 Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu Leu Leu 90 Leu 90 Val Wall Gin Gin Leu Leu Ser Ser Gly 95 Gly 95 Gin Gin Val Wall Arg Arg Leu Leu Leu 100 Leu 100 ALIGN! Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Leu Gin 105 Gin 105 Asp Asp Leu Leu Leu Leu Gly Gly Met 110 Met 110 Gin Gin Gly Arg Gly Arg Thr Thr Thr 115 Thr 115 Ala Ala His His Lys Lys Asp Asp Pro 120 For 120 Ser Ser Ala Ala Ile Ile Phe Phe Leu 125 Leu 125 Asn Asn Phe Phe Gin Gin Gin Gin Leu 130 Leu 130 Leu Leu Arg Arg Gly Gly Lys Lys Val 135 Wall 135 Arg Arg Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu 140 Leu 140 Val Wall Val Wall Gly Gly Pro For Ser 145 Ser 145 Leu Leu Cys Cys Ala Ala Lys Lys Arg 150 Arg 150 Ala Ala Pro For Pro For Ala Ala Ile 155 Ile 155 Ala Ala Val Wall Pro For Ser Ser Ser 160 Ser 160 Thr Thr Ser Ser Pro For Phe Phe His 165 His 165

256256

Thr Thr Leu Asn Leu Asn Lys Lys Leu 170 Leu 170 Pro For Asn Asn Arg Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Thr Ser Gly Leu Glu Thr 175 175 180 180 Asn Asn Ser Ser Ser Ser Ile Ile Ser Ser Ala Ala Arg Arg Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ser Ser Gly Gly Phe Phe Leu Leu Lys Lys 185 185 190 190 195 195 Arg Arg Leu Leu Gin Gin Ala Ala Phe Phe Arg Arg Ala Ala Lys Lys Ile Ile Pro For Gly Gly Leu Leu Leu Leu Asn Asn Gin Gin 200 200 205 205 210 210 Thr Thr Ser Ser Arg Arg Ser Ser Leu Leu Asp Asp Gin Gin Ile Ile Pro For Gly Gly His His Gin Gin Asn Asn Gly Gly Thr Thr 215 215 220 220 225 225 His His Gly Gly Pro For Leu Leu ser ser Gly Gly Ile Ile His His Gly Gly Leu Leu Phe Phe Pro For Gly Gly Pro For Gin Gin 230 230 235 235 240 240 Pro For Gly Gly Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ala Ala Pro For Asp Asp Ile Ile Pro For Pro For Ala Ala Thr Thr Ser Ser Gly Gly 245 245 250 250 255 255 Met: Met: Gly Gly Ser Ser Arg Arg Pro For Thr Thr Tyr Tyr Leu Leu Gin Gin Pro For Gly Gly Glu Glu Ser Ser Pro For Ser Ser 260 260 265 265 270 270 Pro For Ala Ala His His Pro For Ser Ser Pro For Gly Gly Arg Arg Tyr Tyr Thr Thr Leu Leu Phe Phe Ser Ser Pro For Ser Ser 275 275 280 280 285 285 Pro For Thr Thr Ser Ser Pro For Ser Ser Pro For Thr Thr Val Wall Gin Gin Leu Leu Gin Gin Pro For Leu Leu Leu Leu Pro For 290 290 295 295 300 300 Asp Asp Pro For Ser Ser Ala Ala Ile Ile Thr Thr Pro For Asn Asn Ser Ser Thr Thr Ser Ser Pro For Leu Leu Leu Leu Phe Phe 305 305 310 310 315 315 Ala Ala Ala Ala His His Pro For His His Phe Phe Gin Gin Asn Asn Leu Leu Ser Ser Gin Gin Glu Glu Glu Glu 320 320 325 325 328 328

(2) Informace o SEQ ID NO: 22 (i) Charakteristiky sekvence:(2) SEQ ID NO: 22 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 5141 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dvě (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 22(A) Length: 5141 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: two (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 22

TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGAGTCGATC GACAGCTGTG 50TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGAGTCGATC GACAGCTGTG 50

GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA 100GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA 100

GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG 150GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG 150

TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA 200TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA 200

GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC 250GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC 250

CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG GCTGACTAAT TTTTTTTATT 300CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG GCTGACTAAT TTTTTTTATT 300

257257

TATGCAGAGG CCGAGGCCGCTATGCAGAGG CCGAGGCCGC

AGGAGGCTTT TTTGGAGGCCAGGAGGCTTT TTTGGAGGCC

CCGGGAACGG TGCATTGGAACCGGGAACGG TGCATTGGAA

GTACCGCCTA TAGAGCGATAGTACCGCCTA TAGAGCGATA

TCGACCATTG AACTGCATCGTCGACCATTG AACTGCATCG

AGAACGGAGA CCTACCCTGGAGAACGGAGA CCTACCCTGG

CAAAGAATGA CCACAACCTCCAAAGAATGA CCACAACCTC

TATGGGTAGG AAAACCTGGTTATGGGTAGG AAAACCTGGT

AGGACAGAAT TAATATAGTTAGGACAGAAT TAATATAGTT

GGAGCTCATT TTCTTGCCAAGGAGCTCATT TTCTTGCCAA

ACAACCGGAA TTGGCAAGTAACAACCGGAA TTGGCAAGTA

GTTCTGTTTA CCAGGAAGCCGTTCTGTTTA CCAGGAAGCC

GTGACAAGGA TCATGCAGGAGTGACAAGGA TCATGCAGGA

TGATTTGGGG AAATATAAACTGATTTGGGG AAATATAAAC

AGGTCCAGGA GGAAAAAGGCAGGTCCAGGA GGAAAAAGGC

AAAGACTAAC AGGAAGATGCAAAGACTAAC AGGAAGATGC

ATGCATTTTT ATAAGACCATATGCATTTTT ATAAGACCAT

CTTCGTTAGA ACGCGGCTACCTTCGTTAGA ACGCGGCTAC

ATACGATTTA GGTGACACTAATACGATTTA GGTGACACTA

CTCGGCCTCTCTCGGCCTCT

TAGGCTTTTGTAGGCTTTTG

CGCGGATTCCCGCGGATTCC

AGAGGATTTTAGAGGATTTT

TCGCCGTGTCTCGCCGTGTC

CCTCCGCTCACCTCCGCTCA

TTCAGTGGAATTCAGTGGAA

TCTCCATTCCTCTCCATTCC

CTCAGTAGAGCTCAGTAGAG

AAGTTTGGATAAGTTTGGAT

AAGTAGACATAAGTAGACAT

ATGAATCAACATGAATCAAC

ATTTGAAAGTATTTGAAAGT

CTCTCCCAGACTCTCCCAGA

ATCAAGTATAATCAAGTATA

TTTCAAGTTCTTTCAAGTTC

GGGACTTTTGGGGACTTTTG

AATTAATACAAATTAATACA

TAGATAACATTAGATAACAT

GAGCTATTCC AGAAGTAGTG 350GAGCTATTCC AGAAGTAGTG 350

CAAAAAGCTA GCTTATCCGG 400CAAAAAGCTA GCTTATCCGG 400

CCGTGCCAAG AGTGACGTAA 450CCGTGCCAAG AGTGACGTAA 450

ATCCCCGCTG CCATCATGGT 500ATCCCCGCTG CCATCATGGT 500

CCAAAATATG GGGATTGGCA 550CCAAAATATG GGGATTGGCA 550

GGAACGAGTT CAAGTACTTC 600GGAACGAGTT CAAGTACTTC 600

GGTAAACAGA ATCTGGTGAT 650GGTAAACAGA ATCTGGTGAT 650

700700

750750

800800

850850

900900

950950

10001000

10501050

11001100

11501150

12001200

12501250

TGAGAAGAATTGAGAAGAAT

AACTCAAAGAAACTCAAAGA

GATGCCTTAAGATGCCTTAA

GGTTTGGATAGGTTTGGATA

CAGGCCACCTCAGGCCACCT

GACACGTTTTGACACGTTTT

ATACCCAGGCATACCCAGGC

AGTTTGAAGTAGTTTGAAGT

TCTGCTCCCCTCTGCTCCCC

CTGGCTTTAGCTGGCTTTAG

TAACCTTATGTAACCTTATG

CCACTTTGCCCCACTTTGCC

CGACCTTTAACGACCTTTAA

ACCACCACGAACCACCACGA

GACTTATTGAGACTTATTGA

GTCGGAGGCAGTCGGAGGCA

TAGACTCTTTTAGACTCTTT

TCCCAGAAATTCCCAGAAAT

GTCCTCTCTGGTCCTCTCTG

CTACGAGAAGCTACGAGAAG

TCCTAAAGCTTCCTAAAGCT

ATCCCCTTGGATCCCCTTGG

TATCATACACTATCATACAC

TTTCTCTCCATTTCTCTCCA

CAGGTGTCCA CTCCCAGGTC CAACTGCACC TCGGTTCTAA GCTTCTGCAG 1300CAGGTGTCCA CTCCCAGGTC CAACTGCACC TCGGTTCTAA GCTTCTGCAG 1300

258258

GTCGACTCTA GAGGATCCCC GGGGAATTČAGTCGACTCTA GAGGATCCCC GGGGAATTČA

AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTACAACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC

AAATTTCAGA AATAAAGCAT TTTTTTCACTAAATTTCAGA AATAAAGCAT TTTTTTCACT

CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCTCCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT

CGGCGCAGCA CCATGGCCTG AAATAACCTCCGGCGCAGCA CCATGGCCTG AAATAACCTC

GTACCTTCTG AGGCGGAAAG AACCAGCTGTGTACCTTCTG AGGCGGAAAG AACCAGCTGT

TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGCAGGCTGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGCAGGC

TCTCAATTAG TCAGCAACCA GGTGTGGAAATCTCAATTAG TCAGCAACCA GGTGTGGAAA

GCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATTGCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATT

CCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACTCCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACT

TCCGCCCCAT GGCTGACTAA TTTTTTTTATTCCGCCCCAT GGCTGACTAA TTTTTTTTAT

CCTCGGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGTCCTCGGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGT

CTAGGCTTTT GCAAAAAGCT GTTACCTCGACTAGGCTTTT GCAAAAAGCT GTTACCTCGA

CGCCATTTAA ATCCTGCAGG TAACAGCTTGCGCCATTTAA ATCCTGCAGG TAACAGCTTG

ACGTCGTGAC TGGGAAAACC CTGGCGTTACACGTCGTGAC TGGGAAAACC CTGGCGTTAC

CACATCCCCC CTTCGCCAGC TGGCGTAATACACATCCCCC CTTCGCCAGC TGGCGTAATA

CGCCCTTCCC AACAGTTGCG TAGCCTGAATCGCCCTTCCC AACAGTTGCG TAGCCTGAAT

GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTATGTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT

GCAACCATAG TACGCGCCCT GTAGCGGCGCGCAACCATAG TACGCGCCCT GTAGCGGCGC

TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTGTGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG

ATCGATGGCC ATCGATGGCC GCCATGGCCC GCCATGGCCC 1350 1350 AAATAAAGCA AAATAAAGCA ATAGCATCAC ATAGCATCAC 1400 1400 GCATTCTAGT GCATTCTAGT TGTGGTTTGT TGTGGTTTGT 1450 1450 GGATCGATCG GGATCGATCG GGAATTAATT GGAATTAATT 1500 1500 TGAAAGAGGA TGAAAGAGGA ACTTGGTTAG ACTTGGTTAG 1550 1550 GGAATGTGTG GGAATGTGTG TCAGTTAGGG TCAGTTAGGG 1600 1600 AGAAGTATGC AGAAGTATGC AAAGCATGCA AAAGCATGCA 1650 1650 GTCCCCAGGC GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG TCCCCAGCAG 1700 1700 AGTCAGCAAC AGTCAGCAAC CATAGTCCCG CATAGTCCCG 1750 1750 CCGCCCAGTT CCGCCCAGTT CCGCCCATTC CCGCCCATTC 1800 1800 TTATGCAGAG TTATGCAGAG GCCGAGGCCG GCCGAGGCCG 1850 1850 GAGGAGGCTT GAGGAGGCTT TTTTGGAGGC TTTTGGAGGC 1900 1900 GCGGCCGCTT GCGGCCGCTT AATTAAGGCG AATTAAGGCG 1950 1950 GCACTGGCCG GCACTGGCCG TCGTTTTACA TCGTTTTACA 2000 2000 CCAACTTAAT CCAACTTAAT CGCCTTGCAG CGCCTTGCAG 2050 2050 GCGAAGAGGC GCGAAGAGGC CCGCACCGAT CCGCACCGAT 2100 2100 GGCGAATGGC GGCGAATGGC GCCTGATGCG GCCTGATGCG 2150 2150 TTCACACCGC TTCACACCGC ATACGTCAAA ATACGTCAAA 2200 2200 ATTAAGCGCG ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG GCGGGTGTGG 2250 2250 CCAGCGCCCT CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT AGCGCCCGCT 2300 2300

CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG 2350CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG 2350

259259

GTTCCGATTT AGTGCTTTAC 2400GTTCCGATTT AGTGCTTTAC 2400

GTGATGGTTC ACGTAGTGGG 2450GTGATGGTTC ACGTAGTGGG 2450

TTGACGTTGG AGTCCACGTT 2500TTGACGTTGG AGTCCACGTT 2500

AACAACACTC AACCCTATCT 2550AACAACACTC AACCCTATCT 2550

TGCCGATTTC GGCCTATTGG 2600TGCCGATTTC GGCCTATTGG 2600

AACGCGAATT TTAACAAAAT 2650AACGCGAATT TTAACAAAAT 2650

CAGTACAATC TGCTCTGATG 2700CAGTACAATC TGCTCTGATG 2700

ACGTGACTGG GTCATGGCTG 2750ACGTGACTGG GTCATGGCTG 2750

CGCCCTGACG GGCTTGTCTG 2800CGCCCTGACG GGCTTGTCTG 2800

ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 2850ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 2850

ACGCGCGAGG CAGTATTCTT 2900ACGCGCGAGG CAGTATTCTT 2900

TTTTATAGGT TAATGTCATG 2950TTTTATAGGT TAATGTCATG 2950

ACTTTTCGGG GAAATGTGCG 3000ACTTTTCGGG GAAATGTGCG 3000

ACATTCAAAT ATGTATCCGC 3050ACATTCAAAT ATGTATCCGC 3050

AATAATATTG AAAAAGGAAG 3100AATAATATTG AAAAAGGAAG 3100

CTTATTCCCT TTTTTGCGGC 3150CTTATTCCCT TTTTTGCGGC 3150

AACGCTGGTG AAAGTAAAAG 3200AACGCTGGTG AAAGTAAAAG 3200

GTTACATCGA ACTGGATCTC 3250GTTACATCGA ACTGGATCTC 3250

CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT 3300CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT 3300

TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGGTCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG

GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTTGGGGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTTGG

CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCTCCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT

CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGGCTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG

CGGGCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTTCGGGCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT

TTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTTTTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTT

ATTAACGTTT ACAATTTTAT GGTGCACTCTATTAACGTTT ACAATTTTAT GGTGCACTCT

CCGCATAGTT AAGCCAACTC CGCTATCGCTCCGCATAGTT AAGCCAACTC CGCTATCGCT

CGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACGCGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG

CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTGCTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG

GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAAGTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA

GAAGACGAAA GGGCCTCGTG ATACGCCTATGAAGACGAAA GGGCCTCGTG ATACGCCTAT

ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGCATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC

CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAATCGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT

TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTCTCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC

AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCCAGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC

ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGAATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA

ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGGATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG

AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGCAACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC

GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGATG 3350GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGATG 3350

260260

ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCAACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA

TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAGTTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG

AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAACAGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC

CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGACCCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC

TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGCTTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC

GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCGGCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG

CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAACAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA

GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATGGCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG

ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGGACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG

CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTACTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA

GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATCGATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC

AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGCAACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC

TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTTTTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT

GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGGGATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG

TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACGTGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG

CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGATCGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT

CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAACTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA

GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAACGGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC

GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTGGCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG

TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCATTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA

TACACTATTC TCAGAATGAC 3400TACACTATTC TCAGAATGAC 3400

CATCTTACGG ATGGCATGAC 3450CATCTTACGG ATGGCATGAC 3450

CATGAGTGAT AACACTGCGG 3500CATGAGTGAT AACACTGCGG 3500

CGAAGGAGCT AACCGCTTTT 3550CGAAGGAGCT AACCGCTTTT 3550

CTTGATCGTT GGGAACCGGA 3600CTTGATCGTT GGGAACCGGA 3600

TGACACCACG ATGCCAGCAG 3650TGACACCACG ATGCCAGCAG 3650

CTGGCGAACT ACTTACTCTA 3700CTGGCGAACT ACTTACTCTA 3700

GAGGCGGATA AAGTTGCAGG 3750GAGGCGGATA AAGTTGCAGG 3750

CTGGTTTATT GCTGATAAAT 3800CTGGTTTATT GCTGATAAAT 3800

TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 3850TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 3850

TACACGACGG GGAGTCAGGC 3900TACACGACGG GGAGTCAGGC 3900

TGAGATAGGT GCCTCACTGA 3950TGAGATAGGT GCCTCACTGA 3950

ACTCATATAT ACTTTAGATT 4000ACTCATATAT ACTTTAGATT 4000

ATCTAGGTGA AGATCCTTTT 4050ATCTAGGTGA AGATCCTTTT 4050

TGAGTTTTCG TTCCACTGAG 4100TGAGTTTTCG TTCCACTGAG 4100

CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 4150CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 4150

AAACCACCGC TACCAGCGGT 4200AAACCACCGC TACCAGCGGT 4200

TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 4250TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 4250

TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG 4300TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG 4300

CCGCCTACAT ACCTCGCTCT 4350CCGCCTACAT ACCTCGCTCT 4350

261261

GCTAATCCTG GCTAATCCTG TTACCAGTGG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA TCGTGTCTTA 4400 4400 CCGGGTTGGA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG TAGTTACCGG ATAAGGCGCA ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC GCGGTCGGGC 4450 4450 TGAACGGGGG TGAACGGGGG GTTCGTGCAC GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA TTGGAGCGAA CGACCTACAC CGACCTACAC 4500 4500 CGAACTGAGA CGAACTGAGA TACCTACAGC TACCTACAGC GTGAGCATTG GTGAGCATTG AGAAAGCGCC AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG ACGCTTCCCG 4550 4550 AAGGGAGAAA AAGGGAGAAA GGCGGACAGG GGCGGACAGG TATCCGGTAA TATCCGGTAA GCGGCAGGGT GCGGCAGGGT CGGAACAGGA CGGAACAGGA 4600 4600 GAGCGCACGA GAGCGCACGA GGGAGCTTCC GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC GCCTGGTATC TTTATAGTCC TTTATAGTCC 4650 4650 TGTCGGGTTT TGTCGGGTTT CGCCACCTCT CGCCACCTCT GACTTGAGCG GACTTGAGCG TCGATTTTTG TCGATTTTTG TGATGCTCGT TGATGCTCGT 4700 4700 CAGGGGGGCG CAGGGGGGCG GAGCCTATGG GAGCCTATGG AAAAACGCCA AAAAACGCCA GCAACGCGGC GCAACGCGGC CTTTTTACGG CTTTTTACGG 4750 4750 TTCCTGGCCT TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC TTTTGCTCAC atgttctttc atgttctttc CTGCGTTATC CTGCGTTATC 4800 4800 CCCTGATTCT CCCTGATTCT GTGGATAACC GTGGATAACC GTATTACCGC GTATTACCGC CTTTGAGTGA CTTTGAGTGA GCTGATACCG GCTGATACCG 4850 4850 CTCGCCGCAG CTCGCCGCAG CCGAACGACC CCGAACGACC GAGCGCAGCG GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG CGAGGAAGCG 4900 4900 GAAGAGCGCC GAAGAGCGCC CAATACGCAA CAATACGCAA ACCGCCTCTC ACCGCCTCTC CCCGCGCGTT CCCGCGCGTT GGCCGATTCA GGCCGATTCA 4950 4950 TTAATCCAGC TTAATCCAGC TGGCACGACA TGGCACGACA ggtttcccga ggtttcccga CTGGAAAGCG CTGGAAAGCG GGCAGTGAGC GGCAGTGAGC 5000 5000 GCAACGCAAT GCAACGCAAT TAATGTGAGT TAATGTGAGT TACCTCACTC TACCTCACTC ATTAGGCACC ATTAGGCACC CCAGGCTTTA CCAGGCTTTA 5050 5050 CACTTTATGC CACTTTATGC TTCCGGCTCG TTCCGGCTCG TATGTTGTGT TATGTTGTGT GGAATTGTGA GGAATTGTGA GCGGATAACA GCGGATAACA 5100 5100 ATTTCACACA ATTTCACACA GGAAACAGCT GGAAACAGCT ATGACCATGA ATGACCATGA TTACGAATTA TTACGAATTA A 5141 A 5141

(2) Informace o SEQ ID NO: 23 (i) Charakteristiky sekvence:(2) SEQ ID NO: 23 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 21 basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 23(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 23

ATGTCNCCNG CNCCNCCNGC N 21ATGTCNCCNG CNCCNCCNGC N21

262 (2) Informace o SEQ ID NO: 24 (i) Charakteristiky sekvence:262 (2) SEQ ID NO: 24 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 21 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 24 atgtctccag CGCCGCCAGC G 21 (2) Informace o SEQ ID NO: 25 (i) Charakteristiky sekvence:(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 24 atgtctccag CGCCGCCAGC G 21 (2) SEQ ID NO information : 25 (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 21 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 25(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 25

ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21 (2) Informace o SEQ ID NO: 26 (i) Charakteristiky sekvence:ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21 (2) SEQ ID NO: 26 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 21 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 26(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 26

ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 21 (2) Informaci o SEQ ID NO: 27 (i) Charakteristiky sekvence:ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 21 (2) SEQ ID NO: 27 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 21 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 27(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 27

ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21

263 (2) Informace o SEQ ID NO: 28 (i) Charakteristiky sekvence:263 (2) SEQ ID NO: 28 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 21 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie:'lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 28 atgtcgccag CGCCGCCAGC G 21 « wrfAS.rtÉřU.ÍMMřJífti* (2) Informaci o SEQ ID NO: 29 (1) Charakteristiky sekvence:(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 28 atgtcgccag CGCCGCCAGC G 21 (2) SEQ ID NO: 29 information (1) Sequence characteristics:

(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 29(A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 29

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 10 15Ser Pro Ala Pro Pro Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 10 15

Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25 (2) Informace o SEQ ID NO: 30 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Arg Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25 (2) SEQ ID NO: 30 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 26 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 30(A) Length: 26 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 30

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys LeuSer Pro Ala Pro Pro Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu

1 1 5 5 10 10 15 15 Dec Leu Arg Leu Arg Asp Asp Xaa Val Asp Asp Xaa Val Leu His Gly Arg Leu Leu His Gly Arg 20 20 May 25 26 25 26

(2) Informace o SEQ ID NO: 31 (i) Charakteristiky sekvence:(2) SEQ ID NO: 31 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 31(A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 31

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 10 15Ser Pro Ala Pro Pro Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 10 15

Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25Leu Arg - Asp Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25

264 (2) Informace o SEQ ID NO: 32 (i) Charakteristiky sekvence:264 (2) SEQ ID NO: 32 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označeni sekvence: SEQ ID NO: 32(A) Length: 14 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 32

Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys 15 10 14 (2) Informace o SEQ ID NO: 33 (1) .Charakteristiky sekvence:Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys 15 10 14 (2) SEQ ID NO: 33 (1). Sequence Characteristics:

(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 33(A) Length: 9 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 33

Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg 15 9 (2) Informace o‘SEQ ID NO: 34 (i) Charakteristiky sekvence:For Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg 15 9 (2) Seq ID NO: 34 (i) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 45 basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologié: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:34(A) Length: 45 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 34

GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45 (2) Informace o SEQ ID NO: 35 (i) Charakteristiky sekvence:GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45 (2) SEQ ID NO: 35 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 20 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 35(A) Length: 20 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 35

CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20 (2) Informace o SEQ ID NO: 36 (i) Charakteristiky sekvence:CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20 (2) SEQ ID NO: 36 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 21 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:36(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 36

265265

NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21 (2) Informace o SEQ ID NO: J7 (i) Charakteristiky sekvence:NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21 (2) SEQ ID NO: J7 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 69basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ id NO:37 *«···.· n.(A) Length: 69base (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ id NO: 37

CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50

TGACCACGTT CAGCACGGC 69 (2) intormace o SEQ ID NO:38 (i) Charakteristiky sekvence:TGACCACGTT CAGCACGGC 69 (2) sequence information of SEQ ID NO: 38 (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 69 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární(A) Length: 69 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear

í.xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 38i.xi) Sequence Designation: SEQ ID NO: 38

GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT 50GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT 50

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG 69 (2) Informace o SEQ ID NO:39 (i) Charakteristiky sekvence:ACTGGTGCAA GTCGTGCCG 69 (2) SEQ ID NO: 39 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 69 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:39(A) Length: 69 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 39

CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50

CGACCACGTC CATCACGGC 69CGACCACGTC CATCACGGC 69

266 (2) Informace o SEQ ID NO:40 (i) Charakteristiky sekvence:266 (2) SEQ ID NO: 40 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 69 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:40(A) Length: 69 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 40

GGTCGTGGAG GCCGTACACT' GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50GGTCGTGGAG GCCGTACACT 'GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG 69 (2) Informace o‘SEQ ID NO:41 (i) Charakteristiky sekvence:GCTGGTGCAG GTAGTGCCG 69 (2) Seq ID NO: 41 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 69 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:41(A) Length: 69 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 41

CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50

CGATCATGTC TATCACGGT 69 (2) Informace o SEQ ID NO: 42 (i) Charakteristiky sekvence:CGATCATGTC TATCACGGT 69 (2) SEQ ID NO: 42 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 69 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:42(A) Length: 69 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 42

GGTCGTGGCG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50GGTCGTGGCG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50

GCTAGTACAG ATAGTGCCA 69 (2) Informace o SEQ ID NO: 43 (i) Charakteristiky sekvence:GCTAGTACAG ATAGTGCCA 69 (2) SEQ ID NO: 43 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 37 basí (B) Typ: nukleová kyselina(A) Length: 37 bases (B) Type: nucleic acid

267 (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označer.í sekvence: SEQ ID NO: 43267 (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Reference sequence: SEQ ID NO: 43

GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37 (2) Informace o SEQ ID NO: 44 (i) Charakteristiky sekvence:GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37 (2) SEQ ID NO: 44 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 22 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:44(A) Length: 22 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of fibers: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 44

CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22 (2) Informace o SEQ ID NO:45 (i) Charakteristiky sekvence:CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22 (2) SEQ ID NO: 45 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: · 24 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:45(A) Length: · 24 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 45

TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24 (2) Informace o SEQ ID NO:46 (i) Charakteristiky sekvence:TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24 (2) SEQ ID NO: 46 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 22 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:46(A) Length: 22 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 46

GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22 (2) Informace o SEQ ID NO: 47 (i) Charakteristiky sekvence:GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22 (2) SEQ ID NO: 47 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 31 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 47(A) Length: 31 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 47

268268

ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31 (2) Informacle o SEQ ID NO: 48 (i) Charakteristiky sekvence:ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31 (2) Informacle of SEQ ID NO: 48 (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 36 basí(A) Length: 36 bases

-(B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:48- (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 48

GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36 (2) Informace o SEQ ID NO: 49 (i) Charakteristiky sekvence:GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36 (2) SEQ ID NO: 49 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 24 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:49(A) Length: 24 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 49

CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24 (2) Informace o SEQ. ID NO: 5.0 (i) Charakteristiky sekvence:CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24 (2) SEQ. ID NO: 5.0 (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 24 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:50(A) Length: 24 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 50

GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24 (2) Informace o SEQ ID NO:51 (i) Charakteristiky sekvence:GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24 (2) SEQ ID NO: 51 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 27 basí (β) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ TD NO:5i(A) Length: 27 bases (β) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ TD NO: 5i

269269

CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27 (2) Informace o SEQ ID NO:52 (i) Charakteristiky sekvence:CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27 (2) SEQ ID NO: 52 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 27 basí (B) Typ: nukleová kyselina ;(A) Length: 27 bases (B) Type: nucleic acid;

(C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ^: ID NO:52(C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ^: ID NO: 52

AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27 (2) Informace o SEQ ID NO: 53 (i) Charakteristiky sekvence:AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27 (2) SEQ ID NO: 53 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 28 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:53(A) Length: 28 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 53

CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28 (2) Informace o SEQ ID NO:54 (i) Charakteristiky sekvence:CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28 (2) SEQ ID NO: 54 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 28 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:54(A) Length: 28 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 54

GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28 (2) Informace o SEQ ID NO:55 (i) Charakteristiky sekvencé:GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28 (2) SEQ ID NO: 55 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 35 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:55(A) Length: 35 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 55

270270

GACTCGAGGA TCCATCGATT ττΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTT 35 (2) Informace o SEQ ID NO:56 (i) Charakteristiky sekvence:GACTCGAGGA TCCATCGATT ττΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTT 35 (2) SEQ ID NO: 56 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 17 basí (B) Typ: nukleová kyselina fC) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:56(A) Length: 17 bases (B) Type: nucleic acid fC) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 56

GACTCGAGGA TCCATCG 17 (2) Informace o SEQ ID NO: 57 (i) Charakteristiky sekvence:GACTCGAGGA TCCATCG 17 (2) SEQ ID NO: 57 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 32 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:57(A) Length: 32 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 57

GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32 (2) Informace o SEQ ID NO: 58 (i) Charakteristiky sekvence:GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32 (2) SEQ ID NO: 58 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 21 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:58(A) Length: 21 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 58

CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21 (2) Informace o SEQ ID NO:59 (i) Charakteristiky sekvence:CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21 (2) SEQ ID NO: 59 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 103 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:59(A) Length: 103 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 59

271271

TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50

ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100

GCT 103 (2) Informade o' SEQ ID NO: 60 (i) Charakteristiky sekvence:GCT 103 (2) SEQ ID NO: 60 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 103 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:60(A) Length: 103 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 60

AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50

CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100

GCA 103 (2) Informace o SEQ ID NO:61 (i) Charakteristiky sekvence:GCA 103 (2) SEQ ID NO: 61 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 18 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ NO:61(A) Length: 18 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ NO: 61

TCTCGCTACC GTTTACAG 18 (2) Informace o SEQ ID NO:62 (i) Charakteristiky sekvence:TCTCGCTACC GTTTACAG 18 (2) SEQ ID NO: 62 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 25 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární íxij Označení sekvence: SEQ ID NO:62(A) Length: 25 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear ijix Sequence listing: SEQ ID NO: 62

CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25

272 (2) Informace o SEQ ID NO:63 (i) Charakteristiky sekvence:272 (2) SEQ ID NO: 63 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: Ϊ8 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:63(A) Length: Ϊ8 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 63

GGGCCATGAC ACTGTCAA 18 (2) Informace o SEQ ID NO:64 (i) Charakteristiky sekvence:GGGCCATGAC ACTGTCAA 18 (2) SEQ ID NO: 64 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 40 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:64(A) Length: 40 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 64

GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40 (2) Informace o SEQ ID NO:65 (i) Charakteristiky sekvence:GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40 (2) SEQ ID NO: 65 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 32 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:65(A) Length: 32 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 65

ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32 (2) Informace o SEQ ID NO:66 (i) Charakteristiky sekvence:ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32 (2) SEQ ID NO: 66 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 35 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:66(A) Length: 35 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 66

TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35

273 (2) Informace o SEQ ID NO:67 (i) Charakteristiky sekvence:273 (2) SEQ ID NO: 67 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 33 basí (B) Typ: .nukleová. kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:67(A) Length: 33 bases (B) Type: .nucleic. acid (C) Number of fibers: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 67

AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33 (2) Informace o SEQ ID NO:68 (i) Charakteristiky sekvence:AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33 (2) SEQ ID NO: 68 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 36 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:68(A) Length: 36 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 68

AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36 (2) Informace o SEQ ID NO:69 (i) Charakteristiky sekvence:AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36 (2) SEQ ID NO: 69 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 62 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 69(A) Length: 62 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 69

CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50

AACTGCTTCG TG 62 (2) Informace o SEQ ID NO:70 (i) Charakteristiky sekvence:AACTGCTTCG TG 62 (2) SEQ ID NO: 70 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 61 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:70(A) Length: 61 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 70

ATACGGTCGG GCCGAGGAGG ACGAACACTG GAGGCTCAGG AGTCATTTGA 50ATACGGTCGG GCCGAGGAGG ACGAACACTG GAGGCTCAGG AGTCATTTGA 50

274274

CGAAGCACTG A 61 (2) Informace o SEQ ID NO:71 (i) Charakteristiky sekvence:CGAAGCACTG A 61 (2) SEQ ID NO: 71 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 37 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet-vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:71(A) Length: 37 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 71

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37 (2) Informace o SEQ ID NO:72 (i) Charakteristiky sekvence:CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37 (2) SEQ ID NO: 72 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 37 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet-vláken.:...-j-edna----_T (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:72(A) Length: 37 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of strands: ...- one-one ---- _T (D) Topology: linear (xi) Sequence Designation: SEQ ID NO: 72

TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTGCGC 37 (2) Informace o SEQ ID NO:73 (i) Charakteristiky sekvence:TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTGCGC 37 (2) SEQ ID NO: 73 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 69 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:73(A) Length: 69 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 73

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50

CACATCGAAG GTCGTAGCC 69 (2) Informace o SEQ ID NO:74 (i) Charakteristiky sekvence:CACATCGAAG GTCGTAGCC 69 (2) SEQ ID NO: 74 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 62 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:74(A) Length: 62 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 74

275275

TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50

AGCTTCCAGC AT 62 (2) Informace o SEQ ID NO:75 (i) Charakteristiky sekvence:AGCTTCCAGC AT 62 (2) SEQ ID NO: 75 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délkaj______69 basí____ (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:75(A) Length ______ 69 bases ____ (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 75

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50

CACATCGAAC CACGTAGCC 69 (2) Informace o SEQ ID NO:76 (i) Charakteristiky sekvence:CACATCGAAC CACGTAGCC 69 (2) SEQ ID NO: 76 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 62 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 76(A) Length: 62 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 76

TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50

AGCTTGGTGC AT 62 (2) Informace o SEQ ID NO:77 (i) Charakteristiky sekvence· (A) Délka: 19 basí (B) Typ: nukleová kyselina •'Ci Počet vláken: jedno (0) Topologie: lineární 'xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 77AGCTTGGTGC AT 62 (2) SEQ ID NO: 77 (i) Sequence Characteristics · (A) Length: 19 bases (B) Type: nucleic acid • 'Ci Number of threads: one (0) Topology: linear' xi) Designation SEQ ID NO: 77

TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19

276 (2) Informace o SEQ ID NO:78 (i) Charakteristiky sekvence:276 (2) SEQ ID NO: 78 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: jl8 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:78(A) Length: 18 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 78

GGAGACGCAG TCCATCGA 18 (2) Informace o SEQ ID NO: 79 (i) Charakteristiky sekvence:GGAGACGCAG TCCATCGA 18 (2) SEQ ID NO: 79 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 62 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:79(A) Length: 62 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 79

GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTG TGACCTCCGA 50GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTG TGACCTCCGA 50

GTTCTCAGTA AA 62 (2) Informace o SEQ ID NO:80 (i) Charakteristiky sekvence:GTTCTCAGTA AA 62 (2) SEQ ID NO: 80 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 49 basí (B) Tvp; nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:80(A) Length: 49 bass (B) Tvp; nucleic acid (C) Number of strands: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 80

ACACTGGAGG CTCAAGAGTC ATTTGACGAA GCACTGAGGG TACAGGAAG 49 (2) Informace o SEQ ID NO:81 (i) Charakteristiky sekvence:ACACTGGAGG CTCAAGAGTC ATTTGACGAA GCACTGAGGG TACAGGAAG 49 (2) SEQ ID NO: 81 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 45 basí (B) Typ: nukleová . kyseJJjiá (C) Počet vláken: jedno (D) Topologia: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:81(A) Length: 45 bases (B) Type: nuclear. (C) Number of fibers: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 81

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45

277 (2) Informace o SEQ ID NO:82 (i) Charakteristiky sekvence:277 (2) SEQ ID NO: 82 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 38 basi (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:82(A) Length: 38 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 82

TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAATAGCT TCCAGCAT 38 (2) Informace o SEQ ID NO:83 (i.). Charakteristiky sekvence:TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAATAGCT TCCAGCAT 38 (2) SEQ ID NO: 83 (i.) Information. Sequence characteristics:

(A) Délka: 45 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:83(A) Length: 45 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 83

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45 (2) Informace o SEQ ID NO:84 (i) Charakteristiky sekvence:CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45 (2) SEQ ID NO: 84 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 38 basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:84(A) Length: 38 bases (B) Type: nucleic acid (C) Number of threads: one (D) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 84

TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTTGCAT 38 (2) Informace o SEQ ID NO: 85 (i) Charakteristiky sekvence:TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTTGCAT 38 (2) SEQ ID NO: 85 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 85(A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 85

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Asn Ala Tyr Ala Ser Pro 15 10 15Met Lys Lys Asn Ala Phe Leu Leu Asn Ala Tyr Ala Ser Pro 15 10 15

278278

Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg Ala 20 25 (2) Informace o SEQ ID NO: ^6 (i) Charakteristiky sekvence:Ala Pro Pro Ala Cys Val Arg Arg Ala 20 25 (2) SEQ ID NO: ^ 6 (i) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 31 aminokyselin _: (B) Typ: aminokyselina ' (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 86(A) Length: 31 amino acids _: (B) Type: amino acid '(C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 86

Met Lys Lys Asn Ile Ala.Phe His His His His His His His His 1 '5 10 15Met Lys Lys Asn Ile Ala. His His His His His His His 1 '5 10 15

Ile Glu Gly Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg 20 25 -30Ile Glu Gly Arg Pro Pro Pro Pro Ala Cys Val Arg Arg 20 25 -30

Ala (2) Informace o SEQ ID NO: 87 (1) Charakteristiky sekvence:Ala (2) SEQ ID NO: 87 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 31 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: -lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 87(A) Length: 31 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: -linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 87

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His 15 10 15.Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His 15 10 15.

Ile Glu Pro Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg 20 25 30Ile Glu Pro Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Cys Val Arg Arg 20 25 30

Ala (2) Informace o SEQ ID NO:83 (1) Charakteristiky sekvence:Ala (2) SEQ ID NO: 83 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:88.(A) Length: 7 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 88.

Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 1 5 7 (2) Informace o SEQ ID NO: 89 (i) Charakteristiky sekvence:Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 1 5 7 (2) SEQ ID NO: 89 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 89(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 89

279279

His Val Leu His 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 90 (i) Charakteristiky sekvence:His Val Leu His 14 (2) SEQ ID NO: 90 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) . Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 90(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C). Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 90

Ser Arg Leu Ser .Ser Arg Leu Ser.

4 (2) Informace o SEQ ID NO: 91 (1) Charakteristiky sekvence:4 (2) SEQ ID NO: 91 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 91(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 91

Ser His Val Leu 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 92 (1) Charakteristiky sekvence:Ser His Val Leu 14 (2) SEQ ID NO: 92 (1) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označeni sekvence: SEQ ID NO: 92(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 92

His Ser Arg Leu 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 93 (i) Charakteristiky sekvence:His Ser Arg Leu 14 (2) SEQ ID NO: 93 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 4, aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 93(A) Length: 4, amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 93

Ala Val Asp Phe 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 94 (i) Charakteristiky sekvence:Ala Val Asp Phe 1 4 (2) SEQ ID NO: 94 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ:‘aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 94(A) Length: 4 amino acids (B) Type: ‘amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 94

280280

Ser Leu Gly Glu 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 95 (1) Charakteristiky sekvence:Ser Leu Gly Glu 14 (2) SEQ ID NO: 95 (1) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 95(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 95

Ala Val Thr Leu 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 96 (1) Charakteristiky sekvence:Ala Val Thr Leu 14 (2) Information about SEQ ID NO: 96 (1)

(A) Délka: 4. aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 96(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 96

Leu Leu Glu Gly 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 97 (1) Charakteristiky sekvence:Leu Leu Glu Gly 1 4 (2) SEQ ID NO: 97 (1) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 97(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 97

Leu Ser Ser Leu 1 4 (2) Informaci o SEQ ID NO: 98 (1) Charakteristiky sekvence:Leu Ser Ser Leu 14 (2) SEQ ID NO: 98 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 98(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 98

Leu Gly Gin Leu 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 99 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Gly Gin Leu 1 4 (2) SEQ ID NO: 99 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 99(A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 99

281281

Cys Xaa Leu Ser Ser 1 5 (2) Informacs o SEQ ID NO. 100 (i) Charakteristiky sekvence:Cys Xaa Leu Ser Ser 15 (2) SEQ ID NO. 100 (i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 100(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 100

Leu Leu Gly Gin 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 101 (i). Charakteristiky sekvence:Leu Leu Gly Gin 14 (2) SEQ ID NO: 101 (i) information. Sequence characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označeni sekvence: SEQ ID NO:101(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 101

Ser Ser Leu Leu 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 102 (i) Charakteristiky sekvence:Ser Ser Leu Leu 1 4 (2) SEQ ID NO: 102 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:102(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 102

Gly Gin Leu Ser 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 103 (i) Charakteristiky sekvence:Gly Gin Leu Ser 14 (2) SEQ ID NO: 103 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: č aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 103(A) Length: amino acid number (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 103

Cys Leu Ser Ser 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 104 (i) Charakteristiky sekvence:Cys Leu Ser Ser 14 (2) SEQ ID NO: 104 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:104(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 104

282282

Leu Gin Ser Leu 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 105 (1) Charakteristiky sekvence:Leu Gin Ser Leu 14 (2) SEQ ID NO: 105 (1) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 105(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 105

Leu Gly Thr Gin 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 106 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Gly Thr Gin 14 (2) SEQ ID NO: 106 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 106(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 106

Ala Leu Gin Ser 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 107 (i) Charakteristiky sekvence:Ala Leu Gin Ser 14 (2) SEQ ID NO: 107 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označeni sekvence: SEQ ID NO: 107(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 107

Leu Leu Gly Thr 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 108 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Leu Gly Thr 14 (2) SEQ ID NO: 108 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 108(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 108

Asn Ala Ile Phe 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 109 (i) Charakteristiky sekvence:Asn Ala Ile Phe 1 4 (2) SEQ ID NO: 109 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 109(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 109

283283

Leu Ser Phe Gin 1 4 (2) Informace o SEQ^-ID*NO: ” 110 (1) Charakteristiky sekvence:Leu Ser Phe Gin 1 4 (2) Sequence Information ^- ID * NO: ”110 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka; 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 110(A) Length; 22 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 110

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 · 15Ser Pro Ala Pro Pro Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 · 15

Leu Arg Asp Ser His Val Leu 20 22 (2) Informace o SEQ ID NO: 111 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Arg Asp Ser His Val Leu 20 22 (2) SEQ ID NO: 111 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 24 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 111(A) Length: 24 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 111

His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 15 10 15His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val

Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe ,For Val Leu Leu For Al Val Asp Phe,

24 (2) Informace o SEQ ID NO: 112 (1) Charakteristiky sekvence:24 (2) SEQ ID NO: 112 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 112(A) Length: 23 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 112

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin 15 10 15Ser Glu Glu Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin 15 10 15

Asp Xle Leu Gly Ala Val Thr Leu 20 23 (2) Informace o SEQ ID NO: 113 (i) Charakteristiky sekvence:Asp Xle Leu Gly Ala Val Thr Leu 20 23 (2) SEQ ID NO: 113 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 113(A) Length: 21 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 113

Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr 15 10 15 irLeu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro Thr 15 10 15 ir

284284

Cys Leu Ser Ser Leu Leu 20 21 (2) Informace o SEQ ID NO: 114 (i) Charakteristiky sekvence:Cys Leu Ser Ser Leu Leu 20 21 (2) SEQ ID NO: 114 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:114(A) Length: 16 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 114

Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin 15 10 15Gly Gin Leu Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin 15 10 15

Ser (2) Informace o SEQ ID NO: 115 (1) Charakteristiky sekvence:Ser (2) SEQ ID NO: 115 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 115(A) Length: 22 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 115

Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His 15 10 15Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Gin Gly Thr Thr Ala His 15 10 15

Lys Asp Pro Asn Ala lle Phe 20 22 (2) Informace o SEQ ID NO: 116 (1) .CharaJsXeristiky. sekvence:Lys Asp Pro Asn Ala lle Phe 20 22 (2) SEQ ID NO: 116 (1) .CharaJsXeristics. sequence:

(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina — (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:116(A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid - (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 116

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met 15 10 15Leu Ser Phe Gin His

Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 20 25 (2) Informace o SEQ ID NO: 117 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 20 25 (2) SEQ ID NO: 117 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 4 aminokyseliny...(A) Length: 4 amino acids ...

(B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 117(B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 117

Met Pro Pro AlaMet Pro Pro Ala

44

285 (2) Informace o SEQ ID NO: 118 (i) Charakteristiky sekvence:285 (2) SEQ ID NO: 118 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 118(A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 118

Met Ala Pro Pro Ala 1 5 — (2) Informace o SEQ ID NO: 119 (i) Charakteristiky sekvence:Met Ala Pro Pro Ala 1 5 - (2) SEQ ID NO: 119 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka:- 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO·(A) Length: - 6 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO ·

119119

Met Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 6 (2) Informace o SEQ ID NO: 120 (i) Charakteristiky sekvence:Met Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 6 (2) SEQ ID NO: 120 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 120(A) Length: 7 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 120

Met Ser Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 7 (2) Informace o SEQ ID NO: 121 (i) Charakteristiky sekvence:Met Ser Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 7 (2) SEQ ID NO: 121 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 121(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 121

Ala Pro Pro Ala 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 122 (i) Charakteristiky sekvence:Ala Pro Pro Ala 14 (2) SEQ ID NO: 122 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 122(A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 122

Pro Ala Pro Pro AlaPro Ala Pro Pro Ala

55

286 (2) Informace o SEQ ID NO: 123 (1) Charakteristiky sekvence:286 (2) SEQ ID NO: 123 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 123(A) Length: 6 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 123

Ser Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 6 (2) Informace o SEQ ID NO: 124 (i) Charakteristiky sekvence:Ser Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 6 (2) SEQ ID NO: 124 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 4 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:124(A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 124

Val Arg Arg Ala 1 4 (2) Informace o SEQ ID NO: 125 (1) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala 14 (2) SEQ ID NO: 125 (1) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 125(A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 125

Val Arg Arg Ala Pro 1 5 (2) Informace o SEQ ID NO: 126 (i) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro 1 5 (2) SEQ ID NO: 126 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:126(A) Length: 6 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 126

Val Arg Arg Ala Pro Pro 1 5 6 (2) Informace o SEQ ID NO: 127 (i) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro Pro 1 5 6 (2) SEQ ID NO: 127 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označeni sekvence: SEQ ID NO:(A) Length: 7 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO:

Val Arg Arg Ala Pro Pro ThrVal Arg Arg Ala Pro Pro Thr

5 75 7

127127

297 (2) Informace o SEQ ID NO: 128 (1) Charakteristiky sekvence:297 (2) SEQ ID NO: 128 (1) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 8 aminokyselin (3.) Typ; aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 128(A) Length: 8 amino acids (3) Type; amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 128

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr 1 5 8 (2) Informace o SEQ ID NO:129 (1) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr 1 5 8 (2) SEQ ID NO: 129 (1) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologi?: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:129(A) Length: 9 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topologi ?: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 129

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 15 9 (2) Informace o SEQ ID NO: 130 (1) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 15 9 (2) SEQ ID NO: 130 (1) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 130(A) Length: 10 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 130

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val 1 5 . 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 131 (i) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Pro Pro Thr Thr Ala Val 1 5. 10 (2) SEQ ID NO: 131 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 131(A) Length: 11 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 131

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro 1 5 10 11 (2) Informace o SEQ ID NO: 132 (i) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro 1 5 10 11 (2) SEQ ID NO: 132 (i) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 12 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 132(A) Length: 12 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 132

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser 1 5 10 12Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Ser 1 5 10 12

288 (2) Informace o SEQ ID NO: 133 (i) Charakteristiky sekvence:288 (2) SEQ ID NO: 133 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 133(A) Length: 13 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 133

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg 1 5 10 13 (2) Informace o SEQ ID NO: 134 (i) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Ser Arg 1 5 10 13 (2) SEQ ID NO: 134 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 1.4 aminokyseJ_Ln..(A) Length: 1.4 amino acidJ_Ln ..

(B) Typ: aminokyselina (C) Topologie; lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:134 i(B) Type: amino acid (C) Topology; linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 134 i

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 1 5 10 ¹⁴ (2) Informace o SEQ ID NO: 135 (i) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 1 5 10 ¹⁴ (2) SEQ ID NO: 135 (i) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologii: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 135(A) Length: 15 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 135

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 · 5 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 136 — (i) Charakteristiky sekvence:Val Arg Arg Ala Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 · 5 10 15 (2) SEQ ID NO: 136 - (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:136(A) Length: 16 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 136

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Ser Thr Ser 1 5 10 15

Leu (2) Informace o SEQ ID NO: 137 (i) Charakteristiky sekvence:Leu (2) SEQ ID NO: 137 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 137(A) Length: 17 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 137

1*1 *

289289

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1.5 .10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Arg Thr Ser 1.5 .10 15

Leu Val 17 (2) Informace o SEQ ID NO: 138 (i) Charakteristiky__sekvence:Leu Val 17 (2) SEQ ID NO: 138 (i) Sequence Characteristics:

(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární _(xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 138(A) Length: 18 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear _ (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 138

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu 18 (2) Informace o SEQ ID NO: 139 (1) Charakteristiky sekvence:Leu Val Leu 18 (2) Information about SEQ ID NO: 139 (1)

(A) Délka: 19 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 139(A) Length: 19 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 139

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr 19 (2) Informace o SEQ ID NO: 140 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Val Leu Thr 19 (2) SEQ ID NO: 140 (i) Characteristics of the sequence:

(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie-:--lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 140(A) Length: 20 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology -: - linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 140

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu 20 (2) Informace o SEQ ID NO: 141 (i) Charakteristiky sekvence:Leu Val Leu Thr Leu 20 (2) Information about SEQ ID NO: 141 (i)

(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 141(A) Length: 21 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 141

290290

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Ser Thr Ser 1 5 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn 20 21 (2) Informace o SEQ ID NO: 142 (1) Charakteristiky sekvence:Leu Val Leu Thr Leu Asn 20 21 (2) Information about SEQ ID NO: 142 (1)

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 142(A) Length: 22 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 142

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 1.5Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Ser Arg Pro Thr Ser 10 10 1.5

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu 20 22 (2) Informace o SEQ ID NO: 143 (1) Charakteristiky sekvence:Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu 20 22 (2) SEQ ID NO: 143 (1) Characteristics of sequence:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 143(A) Length: 23 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 143

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Ser Thr Ser 1 5 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 20 .23 (2) Informace o SEQ ID NO: 144 (i) Charakteristiky sekvence: ' (A) Délka: 24 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Topologie: lineární (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:144Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 20 .23 (2) SEQ ID NO: 144 (i) Sequence Characteristics: '(A) Length: 24 amino acids (B) Type: amino acid (C) Topology: linear (xi) Sequence designation: SEQ ID NO: 144

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Ser Thr Ser 1 5 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu ProLeu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro

Claims (33)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Mpl ligandový polypeptid získaný způsobem zahrnujícím:An Mpl ligand polypeptide obtained by a method comprising: (i) screening lidské genomické knihovny oligonukleotidem založeným na genomické sekvenci zobrazené na Obr. 9 tohoto dokumentu, aby byla izolována genomická DNA, která obsahuje kódující sekvenci exonu mpl ligandu zobrazenou na Obr. 9 tohoto dokumentu, spolu se zbývajícími exony genu, (ii) vložení DNA do expresního vektoru, (iii) tranfekci savčích buněk vektorem a expresi genu (iv) získání mpl ligandového polypeptidu z buněčného kultivačního média.(i) screening the human genomic library with an oligonucleotide based on the genomic sequence shown in FIG. 9 of this document to isolate genomic DNA comprising the mpl ligand exon coding sequence shown in FIG. (Ii) inserting DNA into an expression vector, (iii) transfecting mammalian cells with the vector, and expressing the gene (iv) recovering the mpl ligand polypeptide from the cell culture medium. 2. Mpl ligandový polypeptid získaný způsobem zahrnujícím:2. An Mpl ligand polypeptide obtained by a method comprising: (i) izolaci genomické DNA z genomické knihovny, kdy tato DNA hybridizuje za mírných podmínek s DNA sekvencí(i) isolating genomic DNA from the genomic library, wherein the DNA hybridizes under mild conditions to the DNA sequence 5' GCCCTGAAGGACGTGGTCGTCACGAAGCAGTTTATTTAGGAGTCG 3' a obsahuje exony kódující mpl ligandový polypeptid, (ii) vložení DNA do expresního vektoru, (iii) transfekci savčích buněk tímto vektorem a expresi genu, (iv) získání mpl ligandového polypeptidu z buněčného kultivačního média.5 'GCCCTGAAGGACGTGGTCGTCACGAAGCAGTTTATTTAGGAGTCG 3' and contains exons encoding the mpl ligand polypeptide, (ii) introducing DNA into the expression vector, (iii) transfecting mammalian cells with the vector and expressing the gene, (iv) recovering the mpl ligand polypeptide from the cell culture medium. 3. Mpl ligandový polypeptid získaný způsobem zahrnujícím:3. An Mpl ligand polypeptide obtained by a method comprising: (i) identifikaci vhodného buněčného zdroje RNA pro lidský mpl ligand a přípravu jedné nebo více cDNA knihoven z této RNA, (iii) hybridizační-screening knihovny nebo knihoven značeným oligonukleotidem založeným na kódující sekvenci(i) identifying a suitable cellular RNA source for the human mpl ligand and preparing one or more cDNA libraries therefrom, (iii) hybridizing-screening the library (s) with an oligonucleotide labeled based on the coding sequence 292 zobrazené na Obr. 9 tohoto dokumentu, aby byl identifikován a izolován klon obsahující kódující sekvenci mpl ligandu, (iv) vložení kódující DNA do expresního vektoru vhodného pro expresi v savčích buňkách, (v) transfekci savčích buněk vektorem a expresi cDNA, (ví) získání mpl ligandového polypeptidu z buněčného kultivačního média.292 shown in FIG. 9 of this document to identify and isolate a clone containing the mpl ligand coding sequence, (iv) inserting the coding DNA into an expression vector suitable for expression in mammalian cells, (v) transfecting the mammalian cells with a vector and expressing cDNA; from cell culture medium. 4. Mpl ligandový polypeptid získaný způsobem zahrnujícím:4. An Mpl ligand polypeptide obtained by a method comprising: (i) přípravu cDNA knihovny nebo knihoven z mRNA extrahované z lidských ledvinných buněk, (ii) hybridizační-screening knihovny nebo knihoven značeným oligonukleotidem založeným na kódující sekvenci zobrazené na Obr. 9 tohoto dokumentu, aby byl identifikován a izolován klon obsahující kódující sekvenci mpl ligandu, (iii) vložení kódující DNA do expresního vektoru vhodného pro expresi v savčích buňkách, (iv) transfekci savčích buněk vektorem a expresi cDNA, (v) získání mpl ligandového polypeptidu z buněčného kultivačního média.(i) preparing cDNA libraries or libraries from mRNA extracted from human kidney cells; (ii) hybridizing-screening libraries or libraries with a labeled oligonucleotide based on the coding sequence depicted in FIG. (Iii) inserting the coding DNA into an expression vector suitable for expression in mammalian cells, (iv) transfecting the mammalian cells with the vector and expressing the cDNA, (v) obtaining the mpl ligand polypeptide from cell culture medium. 5. Izolovaný substanciálně homogenní mpl ligand, který' (a) stimuluje inkorporaci značených nukleotidů (³H-thymidin) do DNA IL-3 dependentních Ba/F3 buněk transfektovaných lidským mpl P;An isolated substantially homogeneous mpl ligand which (a) stimulates the incorporation of labeled nucleotides ( ³ H-thymidine) into DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P; (b) stimuluje ³⁵S inkorporaci do cirkulujících destiček v destičkovém revazebném stanovení;(b) stimulates ³⁵ S incorporation into circulating platelets in a platelet binding assay; (c) je stabilní do pH 2,5, SDS při 0,1% a 2M močoviny;(c) is stable to pH 2.5, SDS at 0.1% and 2M urea; (d) je glykoprotein;(d) is a glycoprotein; (e) jeho aminokoncová sekvence polypeptidu je(e) its amino-terminal polypeptide sequence is SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGRSPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR 293 nebo293 or SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL 6. Mpl ligand získaný purifikaci z aplastické plasmy hydrofobní interakční chromatografií, barvivovou imdbílizovanou chromatografií a mpl-afinitní chromatografií, a který má zdánlivou molekulovou hmotnost, odhadnutou SDS-PAGE probíhající za redukujících podmínek, v oblasti 18-22 kD, 28 kD nebo 30 kD.6. Mpl ligand obtained by purification from aplastic plasma by hydrophobic interaction chromatography, dye-immobilized chromatography and mpl-affinity chromatography, and having an apparent molecular weight, estimated by SDS-PAGE under reducing conditions, in the 18-22 kD, 28 kD or 30 kD range . 7. Izolovaný mpl ligandový polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou, mající sekvenci, která hybridizuje za mírných podmínek nukleovou kyselinu mající sekvenci od nukleotidu 119 dále podle Obr. 9 (ID NO: 4 nebo ID NO: 5).7. An isolated mpl ligand polypeptide encoded by a nucleic acid having a sequence that hybridizes under mild conditions to a nucleic acid having a sequence from nucleotide 119 further in FIG. 9 (ID NO: 4 or ID NO: 5). 8. Izolace mpl ligandu podle kteréholiv z předcházejících patentových nároků, který je biologicky aktivní.Isolation of the mpl ligand according to any of the preceding claims, which is biologically active. 9. Mpl ligandový polypeptid, který vykazuje nejméně 70% sekvenční identitu s polypeptidem podle kteréhokoliv patentového nároku 1 až 7.An Mpl ligand polypeptide having at least 70% sequence identity to the polypeptide of any one of claims 1 to 7. 10. Mpl ligandový polypeptid, který je alela nebo varianta polypeptidu podle kteréhokoliv z patentových nároků 1 až 7 a zachovává si biologickou aktivitu.An Mpl ligand polypeptide that is an allele or variant of the polypeptide of any one of claims 1 to 7 and retains biological activity. 11. Mpl ligandový polypeptid podle kteréhokoliv z předcházejících patentových nároků pocházející z lidského druhu.The Mpl ligand polypeptide of any one of the preceding claims originating from a human species. 294294 12. Mpl ligandový polypeptid 12. Mpl ligand polypeptide podle nároků according to claims kteréhokoliv pocházející any originating z z of of předcházej ících nehumánního druhu previous ones of a non-human species patentových patent 13. Mpl ligandový polypeptid Mpl ligand polypeptide podle according to kteréhokoliv any z of předcházej ících previous ones patentových patent nároků, claims, který who je Yippee neglykosylovaný. non-glycosylated. 14. Fúze v y z n 14. Merger in y z n a č u j i c i and se ti are you m , že zahrnuje m that includes mpl ligand podle mpl ligand according to kteréhokoliv z předcházejících patentových any of the foregoing nároků fúzovaný do heterologního polypeptidů.claims fused to heterologous polypeptides. 15. Izolovaná molekula nukleová kyseliny, která kóduje polypeptid podle kteréhokoliv z předcházejících patentových nároků.An isolated nucleic acid molecule that encodes a polypeptide according to any one of the preceding claims. 16. Izolovaná molekula nukleové kyseliny vybraná ze skupiny sestávající z:16. An isolated nucleic acid molecule selected from the group consisting of: (a) cDNA klonu získaného z kroku (iii) patentového nároku 3 nebo kroku (ii) patentového nároku 4;(a) a cDNA clone obtained from step (iii) of claim 3 or step (ii) of claim 4; (b) DNA sekvence schopné hybridizace za náročních podmínek na klon (a);(b) DNA sequences capable of hybridizing under severe conditions to clone (a); (c) genetických variant jakékoliv DNA sekvence (a) a (b), které kódují polypeptid vykazující biologické vlastnosti přirozeně se vyskytujícího mpl ligandového polypeptidů.(c) genetic variants of any DNA sequences of (a) and (b) that encode a polypeptide exhibiting the biological properties of a naturally occurring mpl ligand polypeptide. 17. Izolovaná nukleová kyselina mající sekvenci, která hybridizuje za mírných podmínek nukleovou kyselinu mající sekvenci od nukleotidu 119 dále podle Obr. 9 (ID NO: 4 nebo ID NO: 5) a kódující mpl ligand.17. An isolated nucleic acid having a sequence that hybridizes under mild conditions to a nucleic acid having a sequence from nucleotide 119 further in FIG. 9 (ID NO: 4 or ID NO: 5) and encoding the mpl ligand. 295295 18. Genomická DNA nebo cDNA shodující alespoň s částí genu mpl ligandu, a hybridizující za mírných až vysoce náročných podmínek přirozeně se vyskytující molekulu nukleové kyseliny, která má sekvenci kódující mpl ligand, kde mpl ligand je definován podle kteréholiv patentového nároku 1 až 7.Genomic DNA or cDNA coinciding with at least a portion of the mpl ligand gene, and hybridizing under mild to severe conditions a naturally occurring nucleic acid molecule having a sequence encoding an mpl ligand, wherein the mpl ligand is as defined in any one of claims 1 to 7. 19. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 15 až 18, která je oddělitelně navázána na promotor.The nucleic acid of any one of claims 15 to 18, which is detachably linked to a promoter. 20. Expresní vektor obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 15 až 18 oddělitelně navázanou na kontrolní sekvenci rozpoznanou hostitelskou buňkou.An expression vector comprising the nucleic acid of any one of claims 15 to 18 separably linked to a control sequence recognized by the host cell. 21. Hostitelská buňka transformovaná nukleovou kyselinou podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20, aby byla schopná expresí uvedené nukleové kyseliny produkovat mpl ligandový polypeptid.A nucleic acid transformed host cell according to any one of claims 15 to 20, capable of expressing said nucleic acid to produce an mpl ligand polypeptide. 22. Způsob podle kterékoliv z nároků 15 až 20, vyznačující se tím, že zahrnuje expresi rekombinantní nukleové kyseliny ve vhodné hostitelské buňce tak, aby produkovala mpl ligandový polypeptid.The method of any one of claims 15 to 20, comprising expressing the recombinant nucleic acid in a suitable host cell so as to produce an mpl ligand polypeptide. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že mpl ligandový polypeptid je získán z hostitelských buněk nebo kultivačního média hostitelských buněk.23. The method of claim 22, wherein the mpl ligand polypeptide is obtained from host cells or host cell culture medium. 24. Způsob, vyznačující se tím, že zahrnuje krok exprese genu indigenního mpl ligandu v buňce24. A method comprising the step of expressing an indigenous mpl ligand gene in a cell 296 za kontroly promotorového/enhancerového prvku, supresoru, nebo exogenního transkripčního regulačního prvku, který je vložen do genomu buňky ve vzdálenosti a orientaci dostačující k ovlivnění transkripce DNA kódující mpl ligandový polypeptid.296 under the control of a promoter / enhancer element, a suppressor, or an exogenous transcriptional regulatory element that is inserted into the genome of a cell at a distance and orientation sufficient to affect the transcription of the DNA encoding the mpl ligand polypeptide. 25. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje mpl ligand podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 nebo je získán postupem podle nároků 22 nebo 23, a farmaceuticky přijatelný nosič.A composition comprising the mpl ligand of any one of claims 1 to 14 or obtained by the process of claims 22 or 23, and a pharmaceutically acceptable carrier. 26. Použití mpl ligandového polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 nebo získaného postupem podle nároků 22 nebo 23 při přípravě léčiv.Use of the mpl ligand polypeptide of any one of claims 1 to 14 or obtained by the process of claims 22 or 23 in the preparation of medicaments. 27. Prostředek podle nároku 25 nebo získaný postupem, podle nároku 26 vyznačující se tím, že dále obsahuje terapeuticky účinné množství agens vybraného ze skupiny sestávající se z cytokinů, kolon stimulujících faktorů a interleukinů.The composition of claim 25, or obtained by the process of claim 26, further comprising a therapeutically effective amount of an agent selected from the group consisting of cytokines, stimulating factor columns, and interleukins. 28. Prostředek podle nároku 27 vyznačující^- se tím, že agens je vybráno ze skupiny sestávající se z LIF, G-CSF, M-CSF, Epo,' IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 a IL-11.28. The composition according to claim 27, characterized ^- in that the agent is selected from the group consisting of LIF, G-CSF, M-CSF, EPO, the IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL -6, IL-7, IL-8, IL-9, and IL-11. 29. Způsob prodloužení vzorku nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje zahájení reakce polymerasy nukleové kyseliny s nukleovou kyselinou shodnou alespoň s částí genomické nebo cDNA podle nároku29. A method of extending a nucleic acid sample, comprising initiating a reaction of the nucleic acid polymerase with a nucleic acid identical to at least a portion of the genomic or cDNA of claim 18.18. 297297 30. Způsob stanovení přítomnosti mpl ligandového polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje hybridizovanou nukleovou kyselinu podle nároku 18 pro stanovení testovaného vzorku nukleové kyseliny a stanovení přítomnosti nukleové kyseliny mpl ligandového polypeptidu.30. A method for determining the presence of an mpl ligand polypeptide comprising the hybridized nucleic acid of claim 18 for determining a test nucleic acid sample and determining the presence of an mpl nucleic acid polypeptide. 31. Použití mpl ligandového polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14 nebo získaného postupem podle nároků 22 nebo 23 při přípravě mpl ligandové specifické protilátky.Use of the mpl ligand polypeptide of any one of claims 1 to 14 or obtained by the process of claims 22 or 23 in the preparation of an mpl ligand specific antibody. 32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že je připravena monoklonální protilátka.32. The method of claim 31, wherein the monoclonal antibody is prepared. 33. Protilátka, která byla získáno postupem podle nároku 31 nebo 32.An antibody obtained by the process of claim 31 or 32. 34. Protilátka, která je schopná vázat mpl ligandový polypeptid podle kteréhokoliv nároku 1 až 14.An antibody that is capable of binding the mpl ligand polypeptide of any one of claims 1 to 14. 35. Protilátka podle nároku 34, která je monoklonální protilátka.The antibody of claim 34, which is a monoclonal antibody. 36. Hybridomová buněčná linie produkující protilátku podle nároku 33 nebo nároku 35.The antibody-producing hybridoma cell line of claim 33 or claim 35.