JPH10113186A - Gene coding thrombopoietin - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new polypeptide such as thrombopoietin comprising a isolated uniform mpl ligand polypeptide, affecting survival, multiplication, differentiation and maturity of hematopoietic cell such as progenitor cell of platelet and useful for a treatment of thrombocytopenia. SOLUTION: This new polypeptide affects survival, multiplication, differentiation and maturity of a hematopoietic cell, especially a progenitor cell of a platelet, is a isolated and substantially uniform new mpl ligand polypeptide capable of bonding to mpl of a member of a cytokine receptor super family and activating the mpl, and is useful for treatment, etc., of an immunological or hematopoietic disease including thrombocytopenia. The polypeptide is obtained by screening cDNA library of a human embryo hepar cell line by using an oligonucleotide probe hybridizing with a DNA coding mpl ligand, introducing the obtained mpl ligand polypeptide gene into a replicative vector, introducing and transforming the vector to a host cell such as a prokaryotic cell and culturing the host cell.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、造血細胞、特に血
小板祖先細胞の生存、増殖、分化または成熟に影響する
蛋白の分離、精製および組換えまたは化学合成に関する
ものである。特に本発明は、サイトカインレセプタース
ーパーファミリーの一員であるｍｐｌに結合しこれを活
性化できる蛋白リガンドをコードしている核酸のクロー
ニングおよび発現に関するものである。本発明はさら
に、血小板減少症を包含する免疫または造血疾患を処置
するための、単独でのまたは他のサイトカインと組み合
わせたこれらの蛋白の用途に関するものである。The present invention relates to the isolation, purification and recombinant or chemical synthesis of proteins which influence the survival, proliferation, differentiation or maturation of hematopoietic cells, especially platelet progenitor cells. In particular, the present invention relates to the cloning and expression of nucleic acids encoding protein ligands capable of binding and activating mpl, a member of the cytokine receptor superfamily. The invention further relates to the use of these proteins, alone or in combination with other cytokines, for treating immune or hematopoietic disorders, including thrombocytopenia.

【０００２】[0002]

【発明の背景】BACKGROUND OF THE INVENTION

Ｉ．造血系 造血系は、全ての哺乳動物の生存に必要であることが知
られている、高度に専門化した成熟血液細胞を産生す
る。これらの成熟細胞は、酸素および二酸化炭素を輸送
するために専門化した赤血球、細胞および抗体仲介免疫
反応を司るＴおよびＢリンパ球、血餅の形成のために専
門化した血小板または栓球、ならびに清掃屋としておよ
び感染と戦うための補助細胞として専門化した顆粒球お
よびマクロファージを包含する。顆粒球はさらに、別個
の機能を有する専門化した細胞型である、好中球、好酸
球、好塩基球および肥満細胞に細分化される。驚くべき
事に、これらの専門化した成熟血液細胞は全て、主とし
て骨髄に見いだされる多能性（または全能性）幹細胞と
呼ばれる一つの共通する原始細胞型から誘導される（デ
クスター等、Ann.Rev.Cell Biol.、３巻４２３−４４１
頁［１９８７］）。I. Hematopoietic system The hematopoietic system produces highly specialized mature blood cells that are known to be necessary for the survival of all mammals. These mature cells are specialized in red blood cells to transport oxygen and carbon dioxide, T and B lymphocytes that are responsible for cell and antibody-mediated immune reactions, platelets or thrombocytes specialized for clot formation, and Includes specialized granulocytes and macrophages as scavengers and as accessory cells to fight infection. Granulocytes are further subdivided into specialized cell types with distinct functions, neutrophils, eosinophils, basophils and mast cells. Surprisingly, all these specialized mature blood cells are derived from one common primitive cell type called pluripotent (or totipotent) stem cells found primarily in bone marrow (Dexter et al., Ann. Rev. .Cell Biol., Volume 3, 423-441
Page [1987]).

【０００３】高度に専門化した成熟血液細胞は、哺乳動
物の生涯を通じて絶えず大量に生産されねばならない。
これら専門化した血液細胞の大半は、わずか数時間ない
し数週間しか機能的に活性であり続けない運命にある
（クロンカイト等、Blood Cells、２巻２６３−２８４
頁［１９７６］）。したがって、哺乳動物の正常で安定
した状態の血液細胞の要求を支えるためには、成熟血液
細胞、原始幹細胞自身、ならびに原始および成熟細胞の
間にある全ての中間体または系統が決定付けられている
祖先セルラインの連続的再生が必要である。[0003] Highly specialized mature blood cells must be continuously produced in large quantities throughout the life of a mammal.
The majority of these specialized blood cells are destined to remain functionally active for only a few hours to a few weeks (Clonkite et al., Blood Cells, Vol. 263-284).
Page [1976]). Thus, mature blood cells, the primordial stem cells themselves, and any intermediates or lineages between primordial and mature cells are dictated to support the demand for normal, stable blood cells in mammals. Continuous regeneration of ancestral cell lines is required.

【０００４】造血系の核心には多能性幹細胞がある。こ
れらの細胞は比較的少数であって、増殖により自己再生
を受け娘幹細胞を産生し、または一連の分化工程におい
てだんだん成熟する系統制限された祖先細胞へと変換さ
れ、最終的には高度に専門化した成熟血液細胞を形成す
る。[0004] At the heart of the hematopoietic system are pluripotent stem cells. These cells are relatively small in number, undergo self-renewal by proliferation to produce daughter stem cells, or are transformed in a series of differentiation steps into lineage-restricted ancestor cells that gradually mature and eventually become highly specialized. Form matured blood cells.

【０００５】例えば、幹細胞から誘導されＣＦＣ−Ｍｉ
ｘと呼称される或る種の多能性祖先細胞は、増殖（自己
再生）および発達を受け、異なった骨髄細胞の全て：赤
血球、好中球、巨核球（血小板の先祖）、マクロファー
ジ、好塩基球、好酸球、および肥満細胞、を含むコロニ
ーを作る。リンパ系統の別の祖先細胞は、Ｔ細胞および
Ｂ細胞への増殖および発達を受ける。For example, CFC-Mi derived from stem cells
Certain pluripotent progenitor cells, called x, undergo proliferation (self-renewal) and development, and all of the different bone marrow cells: erythrocytes, neutrophils, megakaryocytes (platelet ancestors), macrophages, Make colonies that contain basophils, eosinophils, and mast cells. Another ancestor of the lymphoid lineage undergoes proliferation and development into T cells and B cells.

【０００６】さらに、ＣＦＣ−Ｍｉｘ祖先細胞および骨
髄細胞の間には、それらの子孫への中間体になることが
決定付けられている別の列の祖先細胞が存在する。系統
に制限されるこれらの祖先細胞は、それらの生成する子
孫を基に分類される。即ち、知られている骨髄性細胞の
直接の先祖は、赤血球に対しては赤血球コロニー形成単
位（ＣＦＵ−Ｅ）、好中球およびマクロファージに対し
ては顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞（ＧＭ−
ＣＦＣ）、巨核球に対しては巨核球コロニー形成細胞
（Ｍｅｇ−ＣＦＣ）、好酸球に対しては好酸球コロニー
形成細胞（Ｅｏｓ−ＣＦＣ）、そして肥満細胞に対して
は好塩基球コロニー形成細胞（Ｂａｓ−ＣＦＣ）であ
る。多能性幹細胞および成熟血液細胞の間のその他の中
間体の先祖は既知である（下記を参照されたい）か、ま
たは異なった程度の系統制限および自己再生能を持つこ
とが発見される可能性があろう。[0006] In addition, between the CFC-Mix progenitor cells and the bone marrow cells, there is another row of ancestral cells that have been determined to be intermediates to their progeny. These progenitor cells, which are restricted to lineages, are classified based on their progeny. That is, the immediate ancestors of known myeloid cells are erythroid colony forming units (CFU-E) for erythrocytes and granulocyte / macrophage colony forming cells (GM-E) for neutrophils and macrophages.
CFC), megakaryocyte colony forming cells (Meg-CFC) for megakaryocytes, eosinophil colony forming cells (Eos-CFC) for eosinophils, and basophil colonies for mast cells Forming cells (Bas-CFC). The ancestors of other intermediates between pluripotent stem cells and mature blood cells are known (see below) or may be found to have different degrees of lineage restriction and self-renewal capacity There will be.

【０００７】正常な造血細胞系の根底にある原則は、多
能性が失われ系統制限および成熟が獲得されるにつれて
自己再生能が低下する事のようである。したがって、造
血細胞スペクトルの一端には、自己再生する能力、およ
び様々な系統特異的な、分化方向の決定付けられている
祖先細胞の全てに分化する能力を有する多能性幹細胞が
存在する。この能力は、原始幹細胞が造血細胞系全体に
再度位置を占める骨髄移植治療の基礎である。該スペク
トルの他端には、高度に系統制限された祖先と、自己再
生能は喪失したが成熟した機能的活性を獲得したそれら
の子孫とが存在する。[0007] The principle underlying the normal hematopoietic cell line appears to be a loss of self-renewal capacity as pluripotency is lost and lineage restriction and maturity are achieved. Thus, at one end of the hematopoietic cell spectrum are pluripotent stem cells that have the ability to self-renew and to differentiate into all lineage-specific, committed ancestral ancestor cells. This ability is the basis for bone marrow transplantation therapy where primitive stem cells are relocated throughout the hematopoietic cell lineage. At the other end of the spectrum are highly phylogenetic ancestors and their progeny that have lost their ability to self-renew but have acquired mature functional activity.

【０００８】幹細胞および系統制限された祖先細胞の増
殖および発達は、様々な造血成長因子またはサイトカイ
ンにより注意深く調節されている。これらの成長因子の
インビボでの役割は複雑であり、完全には理解されてい
ない。インターロイキン３（ＩＬ−３）のような幾つか
の成長因子は、多能性幹細胞と、例えば巨核球を包含す
る、分化方向を決定付けられた幾つかの系統の祖先細胞
の両方を刺激することができる。顆粒球／マクロファー
ジコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような別の因子
は、最初、その作用がＧＭ−ＣＦＣに限定されていると
考えられていた。しかしながら後に、ＧＭ−ＣＳＦは、
とりわけ巨核球の増殖および発達にも影響を及ぼしてい
ることが発見された。即ち、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳ
Ｆは、その強さは異なっているものの、部分重複する生
物活性を有することが判明した。より近年になり、イン
ターロイキン６（ＩＬ−６）およびインターロイキン１
１（ＩＬ−１１）はいずれも単独ではｍｅｇコロニー形
成に明らかな影響力を持たないが、ＩＬ−３と相乗的に
作用して巨核球の成熟を刺激する（ヨネムラ等、Exp.He
matol.、２０巻１０１１−１０１６頁［１９９２］）。[0008] The proliferation and development of stem cells and lineage-restricted ancestor cells is carefully regulated by various hematopoietic growth factors or cytokines. The in vivo role of these growth factors is complex and not completely understood. Some growth factors, such as interleukin 3 (IL-3), stimulate both pluripotent stem cells and ancestral cells of some committed lineage, including, for example, megakaryocytes. be able to. Other factors, such as granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), were initially thought to be limited in their action to GM-CFC. However, later, GM-CSF
In particular, it has been discovered that it also affects megakaryocyte proliferation and development. That is, IL-3 and GM-CS
F was found to have partially overlapping biological activities, albeit with different strengths. More recently, interleukin 6 (IL-6) and interleukin 1
1 (IL-11) alone has no apparent effect on meg colony formation, but acts synergistically with IL-3 to stimulate megakaryocyte maturation (Yonemura et al., Exp.
matol., 20: 1011-1016 [1992]).

【０００９】このように、造血成長因子は１またはそれ
以上の系統の成長および分化に影響するかも知れず、単
一の祖先細胞セルラインへの影響において他の成長因子
と部分重複するかも知れず、または他の因子と相乗的に
作用するかも知れない。Thus, hematopoietic growth factors may affect the growth and differentiation of one or more lineages and may partially overlap other growth factors in affecting a single ancestral cell line. Or may act synergistically with other factors.

【００１０】さらに造血成長因子は、全能性幹細胞か
ら、分化方向の決定付けられている系統制限された様々
な祖先を経て成熟血液細胞に至る細胞発達の異なった段
階でそれらの作用を表すことができるようである。例え
ば、エリスロポエチン（ｅｐｏ）は成熟赤血球の祖先細
胞の増殖をのみ亢進するように見える。ＩＬ−３はその
作用をより早く行使し、原始幹細胞および中間体系統制
限祖先細胞に影響を及ぼすように見える。幹細胞因子
（ＳＣＦ）のような他の成長因子はさらにより原始的な
細胞の発達に影響を及ぼし得る。In addition, hematopoietic growth factors may exert their actions at different stages of cell development, from totipotent stem cells, through a variety of lineage-limited ancestors whose direction of differentiation is determined, to mature blood cells. Seems to be able to. For example, erythropoietin (epo) appears to only enhance the proliferation of mature red blood cell ancestral cells. IL-3 appears to exert its action earlier, affecting primitive stem cells and intermediate lineage restricted ancestral cells. Other growth factors such as stem cell factor (SCF) can affect the development of even more primitive cells.

【００１１】任意の血液細胞またはそれらの祖先の生
存、増殖、分化または成熟に影響する新規な造血成長因
子は、特に、疾病により惹起されたまたは照射もしくは
化学療法後の減衰した造血系の再確立を援助するために
役立つという事が、前記の事から理解されるであろう。Novel hematopoietic growth factors that affect the survival, proliferation, differentiation or maturation of any blood cells or their ancestors are particularly reestablished by disease-induced or attenuated hematopoietic systems following irradiation or chemotherapy. It will be appreciated from the foregoing that it will help to assist.

【００１２】II．巨核球形成 − 血小板の産生 巨核球形成および血小板産生の調節は、マズーア、Exp.
Hematol.、１５巻２４８頁［１９８７］およびホフマ
ン、Blood、７４巻１１９６−１２１２頁［１９８９］
により総説されている。簡潔に述べると、骨髄多能性幹
細胞が巨核球の、赤血球の、そして骨髄球のセルライン
に分化する。幹細胞と巨核球の間には、分化方向の決定
された巨核球祖先細胞の階層があると信じられている。
少なくとも三つのクラスの巨核球祖先細胞、即ち、バー
スト形成単位巨核球（ＢＦＵ−ＭＫ）、コロニー形成単
位巨核球（ＣＦＵ−ＭＫ）、および軽密度巨核球祖先細
胞（ＬＤ−ＣＦＵ−ＭＫ）が同定されている。巨核球の
成熟それ自体は、標準的形態学上の判断基準に基づく段
階に分離された発達の連続体である。巨核球（ＭＫまた
はｍｅｇ）ファミリーの最も早期に認識できる成員は巨
核芽球である。この細胞は、最初、好塩基性細胞質と、
緩い、幾分網状のクロマチンおよび数個の仁を伴う僅か
に不規則な核とを有する直径２０ないし３０μｍのもの
である。後に巨核芽球は３２個までの核を含み得る（プ
ロイプロイド）が、細胞質は依然としてまばらで未熟な
ままである。成熟が進むにつれて、核はより分葉および
濃縮し、細胞質はその量を増加させそしてより好酸性且
つ顆粒性となる。このファミリーの最も成熟した細胞
は、その辺縁に血小板を放出する外観を与えるかも知れ
ない。正常では、巨核球の１０％未満が芽球段階であ
り、５０％以上が成熟している。巨核球系列に一般に適
用される自由裁量による形態学的分類は、最も初期の型
に対して巨核芽球；中間の形に対して前巨核球または好
塩基性巨核球；そして後期の型に対して成熟（好酸性、
顆粒、または血小板産生性）巨核球である。成熟巨核球
では、細胞質の線維が類洞空間へと伸張し、そこでこれ
らは分離して個々の血小板へと破片化している（ウィリ
アムズ等、Hematology、１９７２）。II. Megakaryocyte formation-platelet production.The regulation of megakaryocyte formation and platelet production is described in Mazur, Exp.
Hematol., 15: 248 [1987] and Hoffman, Blood, 74: 1196-1212 [1989].
Has been reviewed by Briefly, myeloid pluripotent stem cells differentiate into megakaryocyte, erythroid, and myeloid cell lines. It is believed that there is a hierarchy of megakaryocytic ancestral cells between stem cells and megakaryocytes whose direction of differentiation has been determined.
At least three classes of megakaryocyte progenitor cells have been identified: burst forming unit megakaryocytes (BFU-MK), colony forming unit megakaryocytes (CFU-MK), and light density megakaryocyte progenitor cells (LD-CFU-MK). Have been. Megakaryocyte maturation itself is a continuum of development separated into stages based on standard morphological criteria. The earliest recognizable member of the megakaryocyte (MK or meg) family is megakaryoblasts. The cells initially contain a basophil cytoplasm,
20-30 μm in diameter with loose, somewhat reticulated chromatin and slightly irregular nuclei with several kernels. Later, megakaryoblasts may contain up to 32 nuclei (proiploids), but the cytoplasm still remains sparse and immature. As maturation progresses, the nucleus becomes more lobulated and concentrated, the cytoplasm increases in quantity and becomes more eosinophilic and granular. The most mature cells of this family may give their margins the appearance of releasing platelets. Normally, less than 10% of megakaryocytes are at the blast stage and more than 50% are mature. The discretionary morphological classification generally applied to megakaryocyte lineages is megakaryoblastic for the earliest type; prokaryotic or basophilic megakaryocyte for the intermediate type; and for the late type. Mature (acidophilic,
Granules, or platelet-producing) megakaryocytes. In mature megakaryocytes, cytoplasmic fibers extend into the sinusoidal space, where they separate and fragment into individual platelets (Williams et al., Hematology, 1972).

【００１３】巨核球形成は幾つかの調節因子を含むと信
じられている（ウィリアムズ等、Br.J.Haematol.、５２
巻１７３頁［１９８２］およびウィリアムズ等、J.Cell
Physiol.１１０巻１０１頁［１９８２］）。巨核球形
成の初期の段階は、有糸***性であり、ＣＦＵ−ＭＫか
らの細胞増殖およびコロニー形成開始と関わっていると
されているが、血小板の数による影響は受けない（バー
スタイン等、J.Cell Physiol.、１０９巻３３３頁［１
９８１］およびキムラ等、Exp.Hematol.、１３巻１０４
８頁［１９８５］）。成熟の後期段階は、非有糸***性
であり、核の倍数体化および細胞質成熟と関連があり、
そして恐らくは末梢の血小板数によるフィードバック機
構で調節されている（オデル等、Blood、４８巻７６５
頁［１９７６］およびエブ等、Blood、３２巻７８７頁
［１９６８］）。[0013] Megakaryocyte formation is believed to involve several regulators (Williams et al., Br. J. Haematol., 52
173 [1982] and Williams et al., J. Cell.
Physiol. 110, 101 [1982]). The early stages of megakaryocyte formation are mitotic and have been implicated in cell growth and initiation of colony formation from CFU-MK, but are not affected by platelet counts (Burstein et al. J. Cell Physiol., 109, 333 [1
981] and Kimura et al., Exp. Hematol., 13: 104.
8 [1985]). The late stages of maturation are non-mitotic and are associated with nuclear polyploidization and cytoplasmic maturation,
It is probably regulated by a feedback mechanism based on peripheral platelet counts (Odell et al., Blood, 48: 765.
Page [1976] and Ebb et al., Blood, 32, 787 [1968]).

【００１４】明確なそして特異的な巨核球コロニー刺激
因子（ＭＫ−ＣＳＦ）の存在が論じられてきた（マズー
ア、Exp.Hematol.、１５巻３４０−３５０頁［１９８
７］）。しかしながら、殆どの論者は、血小板産生のよ
うに生存にとって極めて重大な過程は、この過程を独占
的に司るサイトカインによって調節されているであろう
と信じている。巨核球／血小板特異的サイトカインが存
在するという仮説は３０年以上もの間、研究の根拠を提
供してきた。しかしながら、現在のところそのようなサ
イトカインは、特異なＭＫ−ＣＳＦ（ＴＰＯ）として精
製され、配列決定されそして検定により確立されていな
い。The existence of a distinct and specific megakaryocyte colony stimulating factor (MK-CSF) has been discussed (Mazoo, Exp. Hematol. 15, pp. 340-350 [198].
7]). However, most observers believe that processes critical to survival, such as platelet production, may be regulated by cytokines that exclusively control this process. The hypothesis that megakaryocyte / platelet-specific cytokines exist has provided the basis for research for more than 30 years. However, at present such cytokines have been purified as specific MK-CSF (TPO), sequenced and not established by assays.

【００１５】実験的に作り出された血小板減少症（ヒル
等、Exp.Hematol.、１４巻７５２頁［１９８６］）およ
びヒト胚腎臓条件培地［ＣＭ］（マクドナルド等、J.La
b.Clin.Med.、８５巻５９頁［１９７５］）から、なら
びに人間の増殖性貧血および特発性血小板減少性紫斑病
の尿抽出物（カワキタ等、Blood、６巻５５６頁［１９
８３］）および血漿（ホフマン等、J.Clin.Invest.、７
５巻１１７４頁［１９８５］）から、ＭＫ−ＣＳＦが部
分精製されたと報告されてはいるが、それらの生理機能
は殆どの場合なお知られていない。Experimentally created thrombocytopenia (Hill et al., Exp. Hematol., Vol. 14, p. 752 [1986]) and human embryonic kidney conditioned medium [CM] (McDonald et al., J. La.
b. Clin. Med., 85:59 [1975]) and urine extracts of human proliferative anemia and idiopathic thrombocytopenic purpura (Kawakita et al., Blood, 6, 556 [19].
83]) and plasma (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 7
5, 1174 [1985]), although it has been reported that MK-CSF was partially purified, but their physiological functions are still largely unknown.

【００１６】アメリカヤマゴボウ***促進因子により活
性化された脾臓細胞（ＰＷＭ−ＳｐＣＭ）およびマウス
骨髄単球セルラインＷＥＨＩ−３（ＷＥＨＩ−３ＣＭ）
の条件培地を巨核球増強物質として使用した。ＰＷＭ−
ＳｐＣＭはＣＦＵ−ＭＫの増殖を亢進する因子を含み
（メトカーフ等、Pro.Natl.Acad.Sci.USA、７２巻１７
４４−１７４８頁［１９７５］；ケセンベリー等、Bloo
d、６５巻２１４頁［１９８５］；およびＮ．Ｎ．イス
コーヴ、ヘマトポエティック・セル・ディファレンシエ
ーション、分子および細胞生物学に関するＩＣＮ−ＵＣ
ＬＡシンポジウム、１０巻、ゴールド等編［ニューヨー
ク、アカデミー・プレス］３７−５２頁［１９７
８］）、それらの一つがインターロイキン３（ＩＬ−
３）、多系統コロニー刺激因子である（マルチＣＳＦ
［バースタイン、Blood Cells、１１巻４６９頁［１９
８６］）。この培地中のその他の因子はまだ同定および
分離されていない。ＷＥＨＩ−３は、比較的大量のＩＬ
−３およびより少量のＧＭ−ＣＳＦを分泌するマウス骨
髄単球セルラインである。ＩＬ−３は、広範囲の造血細
胞の成長を強化することが見いだされている（イール
等、J.Immunol.、１３巻２８２頁［１９８３］）。ＩＬ
−３は、ごく初期の多能性前駆体の誘導および極めて大
きな混合造血コロニーの形成において、エリスロポエチ
ン（ＥＰＯ）およびインターロイキン１（ＩＬ−１）の
両者を包含する既知の造血ホルモンまたは成長因子の多
くと相乗作用することが見いだされている（バーテルメ
ッツ等、J.Cell Physiol.、１２２巻３６２−３６９頁
［１９８５］およびワレン等、Cell、４６巻６６７−６
７４頁［１９８８］）。Spleen cells activated by American pokeweed mitogen (PWM-SpCM) and mouse bone marrow monocyte cell line WEHI-3 (WEHI-3CM)
Was used as a megakaryocyte enhancing substance. PWM-
SpCM contains factors that enhance the growth of CFU-MK (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 72:17).
447-1748 [1975]; Kesenberry et al., Bloo.
d, 65: 214 [1985]; N. Iscove, ICN-UC for Hematopoietic Cell Differentiation, Molecular and Cell Biology
LA Symposium, Volume 10, Gold, etc. [New York, Academy Press] 37-52 [197
8]), one of which is interleukin 3 (IL-
3) a multilineage colony stimulating factor (multi-CSF)
[Burstein, Blood Cells, Vol. 11, p. 469 [19
86]). Other factors in this medium have not yet been identified and isolated. WEHI-3 is a relatively large amount of IL
3 is a mouse bone marrow monocyte cell line secreting -3 and less GM-CSF. IL-3 has been found to enhance the growth of a wide range of hematopoietic cells (Eill et al., J. Immunol., 13: 282 [1983]). IL
-3 is a known hematopoietic hormone or growth factor that includes both erythropoietin (EPO) and interleukin 1 (IL-1) in the induction of very early pluripotent precursors and the formation of very large mixed hematopoietic colonies. Have been found to act synergistically with many (Barthermetz et al., J. Cell Physiol., 122, 362-369 [1985] and Warren et al., Cell, 46: 667-6.
74 [1988]).

【００１７】巨核球強化物質のその他の供給源は、マウ
ス肺、骨、マクロファージセルライン、腹膜滲出液細胞
およびヒト胚腎臓細胞の条件培地に見いだされている。
幾つかの相反するデータ（マズーア、Exp.Hematol.、１
５巻３４０−３５０頁［１９８７］）にも拘わらず、単
球ではなく活性化Ｔリンパ球が巨核球形成を増強する役
割を果たしているという幾つかの証拠がある（ガイスラ
ー等、Br.J.Haematol.、６０巻２３３−２３８頁［１９
８５］）。これらの発見は、インターロイキンのような
活性化Ｔリンパ球分泌物がＭＫの発達の調節因子である
かも知れないということを示唆している（ガイスラー
等、Exp.Hematol.、１５巻８４５−８５３頁［１９８
７］）。精製エリスロポエチンＥＰＯを用いた巨核球形
成に関する幾つかの研究（ヴァインチェンカー等、Bloo
d、５４巻９４０頁［１９７９］；マクレオド等、Natur
e、２６１巻４９２−４頁［１９７６］；およびウィリ
アムズ等、Exp.Hematol.、１２巻７３４頁［１９８
４］）は、このホルモンがＭＫコロニー形成において増
強効果を有することを示している。この事は、無血清お
よび血清含有培養においてそしてアクセサリー細胞不在
下でも証明された（ウィリアムズ等、Exp.Hematol.、１
２巻７３４頁［１９８４］）。巨核球発達の四細胞段階
で関与するＰＷＭ−ＳｐＣＭの効果に反して、ＥＰＯ
は、巨核球形成の一および二細胞段階でより関与が大き
いとされた。巨核球発達の初期および後期の両者に及ぼ
すこれらの因子の相互作用は、なお解明されねばならな
い。Other sources of megakaryocyte potentiators have been found in the conditioned medium of mouse lung, bone, macrophage cell lines, peritoneal exudate cells and human embryonic kidney cells.
Some conflicting data (Mazoo, Exp. Hematol., 1
Nevertheless, there is some evidence that activated T lymphocytes, but not monocytes, play a role in enhancing megakaryopoiesis (Geisler et al., Br. J., Vol. 5, pp. 340-350 [1987]). Haematol., 60, 233-238 [19
85]). These findings suggest that activated T lymphocyte secretions, such as interleukins, may be regulators of MK development (Geisler et al., Exp. Hematol. 15, 845-853). Page [198
7]). Some studies on megakaryocyte formation using purified erythropoietin EPO (Weinchenker et al., Bloo
d, 54: 940 [1979]; MacLeod et al., Natur
e, 261: 492-4 [1976]; and Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [198].
4]) shows that this hormone has an enhancing effect on MK colony formation. This has been demonstrated in serum-free and serum-containing cultures and in the absence of accessory cells (Williams et al., Exp. Hematol., 1
2, 734 [1984]). Contrary to the effects of PWM-SpCM, which is involved in the four-cell stage of megakaryocyte development, EPO
Has been implicated at one and two cell stages of megakaryocyte formation. The interaction of these factors, both during the early and late stages of megakaryocyte development, must still be elucidated.

【００１８】幾つかの研究室から導き出されたデータ
は、個別的にＭＫコロニー刺激活性を有する唯一の多系
統因子は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３ならびに、より
程度は低いがＢ細胞刺激因子ＩＬ−６であることを示唆
している（イケブチ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８４
巻９０３５頁［１９８７］）。より近年になって、幾人
かの著者が、ＩＬ−１１および白血病阻害因子（ＬＩ
Ｆ）はＩＬ−３と相乗的に作用して巨核球の大きさと倍
数性を増大させると報告した（ヨネムラ等、British Jo
urnal of Hematology、８４巻１６−２３頁［１９８
３］；バースタイン等、J.Cell.Physiol.、１５３巻３
０５−３１２頁［１９９２］；メトカーフ等、Blood、
７６巻５０−５６頁［１９９０］；メトカーフ等、Bloo
d、７７巻２１５０−２１５３頁［１９９１］；ブルー
ノ等、Exp.Hematol.、１９巻３７８−３８１頁［１９９
１］；およびヨネムラ等、Exp.Hematol.、２０巻１０１
１−１０１６頁［１９９２］）。Data derived from several laboratories indicate that the only multi-lineage factors that individually have MK colony stimulating activity are GM-CSF and IL-3 and, to a lesser extent, the B cell stimulating factor IL. −6 (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84
Volume 9035 [1987]). More recently, some authors have suggested that IL-11 and leukemia inhibitory factor (LI
F) reported to act synergistically with IL-3 to increase the size and ploidy of megakaryocytes (Yonemura et al., British Jo
urnal of Hematology, 84: 16-23 [198
3]; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153, 3
05-312 [1992]; Metcalfe et al., Blood,
76, 50-56 [1990]; Metcalfe et al., Bloo
d, 77, 2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19, 378-381 [199].
1]; and Yonemura et al., Exp. Hematol., 20: 101
1-11016 [1992]).

【００１９】その他の興味深い文献は、エプスタイン
等、米国特許第４９６２０９１号；チョング、米国特許
第４８７９１１１号；フェルナンデス等、米国特許第４
６０４３７７号；ウィスラー等、米国特許第４５１２９
７１号；ゴットリープ、米国特許第４４６８３７９号；
ベネット等、米国特許第５２１５８９５号；コーガン
等、米国特許第５２５０７３２号；キムラ等、Eur.J.Im
munol.、２０（９）巻１９２７−１９３１頁［１９９
０］；シーコー等、J.of Immunol.、１４４（４）巻１
４８４−１４８９頁［１９９０］；ワレン等、J.of Imm
unol.、１４０（１）巻９４−９９頁［１９８８］；ワ
レン等、Exp.Hematol.、１７（１１）巻１０９５−１０
９９頁［１９８９］；ブルーノ等、Exp.Hematol.、１７
（１０）巻１０３８−１０４３頁［１９８９］；タニカ
ワ等、Exp.Hematol.、１７（８）巻８８３−８８８頁
［１９８９］；コイケ等、Blood、７５（１２）巻２２
８６−２２９１頁［１９９０］；ローテム、Blood、７
５（５）巻１５４５−１５５１頁［１９８９］；レニッ
ク等、Blood、７３（７）巻１８２８−１８３５頁［１
９８９］；およびクルターバック等、Blood、７３
（６）巻１５０４−１５１２頁［１９８９］を包含す
る。Other interesting references are Epstein et al., US Pat. No. 4,962,091; Chong, US Pat. No. 4,879,111; Fernandez et al., US Pat.
No. 604377; Whistler et al., US Pat.
No. 71; Gottliep, U.S. Pat. No. 4,468,379;
U.S. Pat. No. 5,215,895; Kogan et al., U.S. Pat. No. 5,250,732; Kimura et al., Eur. J. Im.
munol., 20 (9), 1927-1931 [199
0]; Seiko et al., J. of Immunol., 144 (4), vol.
484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Imm.
unol., 140 (1) 94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17 (11) 1095-10.
P. 99 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17
(10) Vol. 1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17 (8) Vol. 883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75 (12) Volume 22.
86-2291 [1990]; Rotem, Blood, 7
5 (5) Vol. 1545-1551 [1989]; Lenick et al., Blood, 73 (7) Vol. 1828-1835 [1].
989]; and Culterbach et al., Blood, 73.
(6) Volume 1504-1512 [1989].

【００２０】III．血小板減少症 血小板は血液凝固機構の決定的要素である。血小板減少
症と呼ばれる循環レベルの血小板の涸渇は、様々な臨床
状態および疾病を引き起こす。血小板減少症は一般に、
リットル当たり１５０ｘ１０⁹以下の血小板数として定
義される。血小板減少症の主たる原因は、血小板の寿命
に基づいて大きく三つの範疇に分けることができる。即
ち、（１）骨髄による血小板の産生障害、（２）脾臓で
の血小板の破壊（脾腫）、または、（３）末梢循環にお
ける血小板の破壊の増加（例えば自己免疫血小板減少症
または化学および照射療法）である。加えて、血小板の
少ない大量の血液製剤を迅速に投与された患者において
は、希釈による血小板減少症を発症するかも知れない。III. Thrombocytopenia Platelets are a critical component of the blood coagulation mechanism. Depletion of circulating levels of platelets, called thrombocytopenia, causes a variety of clinical conditions and diseases. Thrombocytopenia is generally
It is defined as 150 × 10 ⁹ or less platelet count per liter. The main causes of thrombocytopenia can be broadly divided into three categories based on platelet life. That is, (1) impaired production of platelets by bone marrow, (2) destruction of platelets in the spleen (splenoma), or (3) increased destruction of platelets in the peripheral circulation (eg, autoimmune thrombocytopenia or chemo- and radiation therapy) ). In addition, thrombocytopenia due to dilution may develop in patients who have been rapidly administered large amounts of blood products with low platelets.

【００２１】血小板減少症の臨床的な出血の発現は、血
小板減少症の重篤度、その原因、および起こり得る随伴
凝固障害に依存する。一般に、血小板数が１リットル当
たり２０および１００ｘ１０⁹の間の患者は、外傷後過
度の出血の危険性があり、血小板数が１リットル当たり
２０ｘ１０⁹以下の患者は自然出血し得る。この後者の
患者は、免疫およびウイルスの危険を随伴する血小板輸
血の候補者である。いかなる血小板減少症の程度につい
ても、その原因が血小板生産の低下である場合の出血傾
向は、血小板破壊の増加の場合よりも重篤である。後者
の状況においては、血小板の代謝回転を加速すれば、若
齢の、大きな、そして止血の点でより有効な血小板の循
環がもたらされる。血小板減少症は、下に簡潔に記載さ
れる様々な疾患からもたらされ得る。より詳細な説明
は、Ａ．Ｉ．シャフナー、「血小板減少症および血小板
機能の疾患」、インターナル・メディスン、３版、ジョ
ン・Ｊ．ハットン等編、リトル・ブラウン・アンド・Ｃ
ｏ．、ボストン／トロント／ロンドン［１９９０］に見
いだすことができる。The onset of clinical hemorrhage of thrombocytopenia depends on the severity of thrombocytopenia, its cause, and possible concomitant coagulopathies. In general, patients with a platelet count between 20 and 100 × 10 ⁹ per liter are at risk of excessive bleeding after trauma, and patients with a platelet count below 20 × 10 ⁹ per liter may bleed spontaneously. This latter patient is a candidate for platelet transfusion with associated immune and viral risks. For any degree of thrombocytopenia, the bleeding tendency when the cause is reduced platelet production is more severe than with increased platelet destruction. In the latter situation, accelerating platelet turnover results in young, large, and more effective platelet circulation in terms of hemostasis. Thrombocytopenia can result from a variety of diseases as described briefly below. A more detailed description can be found in A.I. I. Schaffner, "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function," Internal Medicine, 3rd Edition, John J. et al. Hutton et al., Little Brown & C
o. Boston / Toronto / London [1990].

【００２２】（ａ）血小板産生障害による血小板減少症 先天性血小板減少症の原因には、体質性再生不良性貧血
（ファンコニ症候群）および、骨格奇形を随伴し得る先
天性無巨核球性血小板減少症が包含される。血小板産生
の後天性疾患は、巨核球の過形成または無効な血小板形
成のいずれかによって引き起こされる。巨核球過形成
は、骨髄無形成（特発型または化学療法剤もしくは照射
療法による骨髄抑制を包含する）、骨髄線維症、白血
病、および転移腫瘍または肉芽腫による骨髄の侵襲を包
含する様々な状態からもたらされ得る。幾つかの状況に
おいては、毒素、感染性物質、または薬物が比較的選択
的に血小板形成を妨害する。例には、アルコールおよび
或る種のウイルス感染により引き起こされる一過性血小
板減少症ならびにサイアザイド利尿剤の投与に随伴する
緩和な血小板減少症が包含される。最後に、巨赤芽球の
工程に二次的な無効血小板形成（葉酸またはＢ₁₂欠乏）
もまた、通常共存する貧血および白血球減少症と共に血
小板減少症を引き起こし得る。(A) Thrombocytopenia due to impaired platelet production Congenital thrombocytopenia is caused by constitutional aplastic anemia (Fanconi syndrome) and congenital akaryocytic thrombocytopenia which may accompany skeletal malformation. Is included. An acquired disease of platelet production is caused by either megakaryocyte hyperplasia or ineffective platelet formation. Megakaryocyte hyperplasia can occur from a variety of conditions, including bone marrow aplasia (including idiopathic or myelosuppression with chemotherapeutic agents or radiation therapy), myelofibrosis, leukemia, and bone marrow invasion by metastatic tumors or granuloma. Can be brought. In some situations, toxins, infectious agents, or drugs relatively selectively interfere with platelet formation. Examples include transient thrombocytopenia caused by alcohol and certain viral infections and mild thrombocytopenia associated with the administration of thiazide diuretics. Finally, the process of megaloblastic secondary invalid platelet formation (folate or B ₁₂ deficiency)
Can also cause thrombocytopenia, usually with coexisting anemia and leukopenia.

【００２３】血小板産生低下に起因する血小板減少症の
現行の処置は、骨髄の機能不全の根底にある原因の同定
と逆転に依っている。同種免疫はさらなる血小板輸注へ
の不応性を導くかも知れないため、血小板輸注は、通
常、重篤な出血合併症を持つ患者のために、または外科
処置の間に適用するためにとっておかれる。重篤な血小
板減少症が原因の粘膜出血は、抗フィブリン溶解剤の経
口または静脈内投与によって緩和され得る。しかしなが
ら、もし抗フィブリン溶解剤が播種性血管内凝固（ＤＩ
Ｃ）の患者に用いられると、血栓症の合併症が発症する
かも知れない。Current treatments for thrombocytopenia due to reduced platelet production rely on the identification and reversal of the underlying cause of bone marrow dysfunction. Platelet transfusions are usually reserved for patients with severe bleeding complications or to apply during surgery because alloimmunity may lead to refractory to additional platelet transfusions. Mucosal bleeding due to severe thrombocytopenia can be alleviated by oral or intravenous administration of antifibrinolytic agents. However, if the antifibrinolytic agent is disseminated intravascular coagulation (DI
When used in patients of C), thrombotic complications may develop.

【００２４】（ｂ）脾臓による血小板の破壊に起因する
血小板減少症 いかなる原因による脾腫も、緩和なないし中等度の血小
板減少症を随伴し得る。これは、下に論じられる免疫仲
介血小板減少症の場合の脾臓による血小板の積極的な破
壊とは対照的に、主として脾臓の血小板破壊の受動的工
程（脾機能亢進症）である。脾機能亢進症の最も一般的
な原因はアルコール性硬変による門脈高血圧からのうっ
血性脾腫であるが、他の型のうっ血性、浸潤性、または
リンパ球増殖性脾腫もまた血小板減少症を随伴する。脾
機能亢進症単独の結果としては、血小板数は一般に１リ
ットル当たり５０ｘ１０⁹を下回ることはない。(B) Thrombocytopenia due to destruction of platelets by the spleen Splenomegaly of any cause can be accompanied by mild to moderate thrombocytopenia. This is primarily a passive process of splenic platelet destruction (hypersplenism), as opposed to the active destruction of platelets by the spleen in the case of immune-mediated thrombocytopenia discussed below. The most common cause of hypersplenism is congestive splenomegaly from portal hypertension due to alcoholic cirrhosis, but other forms of congestive, invasive, or lymphoproliferative splenomegaly also cause thrombocytopenia. Accompany. As a result of hypersplenism alone, platelet counts generally do not fall below 1 liter per 50 × 10 ^9.

【００２５】（ｃ）非免疫仲介性血小板破壊による血小
板減少症 血小板減少症は、種々の非免疫学的過程による血小板破
壊の加速から起こり得る。この型の疾患は、播種性血管
内凝固、静脈内補綴器具、血液の過度の身体循環、およ
び血栓症性栓球紫斑病のような血栓症性微小血管障害を
包含する。これら全ての状況において、人工的表面また
は異常な脈管内膜に暴露された循環血小板は、これらの
部位で消費されるかまたは損傷を受け、次いで網内系に
より早々と一掃される。播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の
起こる病的状態または異常は、ブラウンワルド等
（編）、ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インター
ナル・メディスン、１１版、１４７８頁、マクグロウ・
ヒル［１９８７］に極めて詳細に開示されている。心臓
弁および大動脈内バルーンを包含する静脈内補綴器具は
緩和なないし中等度の破壊的血小板減少症を引き起こし
得、心肺バイパスまたは血液透析を受けている患者にお
ける一過性血小板減少症は、過度の身体循環における血
小板の消耗または損傷から引き起こされ得る。(C) Thrombocytopenia due to non-immune-mediated thrombocytopenia Thrombocytopenia can result from the acceleration of thrombocytopenia by various non-immunological processes. Diseases of this type include disseminated intravascular coagulation, intravenous prosthetic devices, excessive systemic circulation of blood, and thrombotic microvascular disorders such as thrombotic thrombocytopenic purpura. In all of these situations, circulating platelets exposed to artificial surfaces or abnormal intima are consumed or damaged at these sites and then quickly cleared by the retinal system. Pathological conditions or abnormalities that cause disseminated intravascular coagulation (DIC) are described in Brownwald et al. (Eds.), Harrisons Principles of Internal Medicine, 11th edition, p. 1478, McGraw.
Hill [1987] discloses in great detail. Intravenous prosthetic devices, including heart valves and intra-aortic balloons, can cause mild to moderate destructive thrombocytopenia, and transient thrombocytopenia in patients undergoing cardiopulmonary bypass or hemodialysis It can result from platelet exhaustion or damage in the systemic circulation.

【００２６】（ｄ）薬物誘発性免疫血小板減少症 １００以上の薬物が免疫学的に仲介される血小板減少症
に関わっている。しかしながら、キニジン、キニン、
金、スルホンアミド類、セファロチン、およびヘパリン
のみが良く性格決定されているに過ぎない。薬物誘発性
血小板減少症は極めて重篤であることが多く、そして典
型的には、患者が感作薬物療法を受けている最中に、数
日のうちに急激に起こる。(D) Drug-induced immune thrombocytopenia More than 100 drugs are involved in immunologically mediated thrombocytopenia. However, quinidine, quinine,
Only gold, sulfonamides, cephalotin, and heparin are only well characterized. Drug-induced thrombocytopenia is often very severe, and typically occurs rapidly within a few days while the patient is receiving sensitizing drug therapy.

【００２７】（ｅ）免疫（自己免疫）血小板減少性紫斑
病（ＩＴＰ） 成人のＩＴＰは、自己免疫血小板破壊を特徴とする慢性
疾患である。自己抗体は通常ＩｇＧであるが、他の免疫
グロブリンもまた報告されている。ＩＴＰの自己抗体は
血小板の膜ＧＰII_bIII_aに付随していることが判明して
いるが、血小板抗原の特異性は殆どの場合同定されてい
ない。感作された血小板の血管外破壊は脾臓および肝臓
の網内系で起こる。ＩＴＰの全症例の半数以上は特発性
であるが、多くの患者は、基礎となるリウマチ性もしく
は自己免疫疾患（例えば、全身性紅斑性狼瘡）またはリ
ンパ球増殖性疾患(例えば慢性リンパ球性白血病)を有す
る。(E) Immune (autoimmune) Thrombocytopenic Purpura (ITP) ITP in adults is a chronic disease characterized by autoimmune platelet destruction. The autoantibodies are usually IgG, but other immunoglobulins have also been reported. While ITP autoantibodies have been found to be associated with membrane GPII _b III _a platelet-specific platelet antigen has not been identified in most cases. Extravascular destruction of sensitized platelets occurs in the reticular system of the spleen and liver. Although more than half of all cases of ITP are idiopathic, many patients have an underlying rheumatic or autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus) or a lymphoproliferative disorder (eg, chronic lymphocytic leukemia). ).

【００２８】（ｆ）ＨＩＶ誘発ＩＴＰ ＩＴＰはますますＨＩＶ感染の一般的合併症となってお
り（モリス等、Ann.Intern.Med.、９６巻７１４−７１
７頁［１９８２］）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）と診断された患者、ＡＩＤＳ関連複合体を有する患
者、およびＡＩＤＳの徴候は無いがＨＩＶに感染してい
る患者のいずれにおいても、疾病の進行の任意の段階で
起こり得る。ＨＩＶ感染は、細胞性免疫機能の深刻な不
全ならびに日和見感染および悪性腫瘍の発生によって最
終的に特徴付けられる、伝染性疾患である。ＨＩＶによ
る感染が招く主たる免疫学的異常は、ＣＤ４細胞表面糖
蛋白を発現するＴリンパ球の進行性涸渇および機能不全
である（レイン等、Ann.Rev.Immunol.、３巻４７７頁
［１９８５］）。恐らくＣＤ４ヘルパー／インデューサ
ーＴ細胞機能の喪失が、細胞性および液性免疫の深刻な
不全の根底にあり、これが、ＡＩＤＳの特徴である日和
見感染および悪性腫瘍につながるのであろう（Ｈ．レイ
ン、上記）。(F) HIV-induced ITP ITP is increasingly becoming a common complication of HIV infection (Morris et al., Ann. Inn. Med., 96: 714-71).
7 [1982]), acquired immunodeficiency syndrome (AID)
It can occur at any stage of disease progression in any of the patients diagnosed with S), those who have the AIDS-related complex, and those who have no signs of AIDS but are infected with HIV. HIV infection is a contagious disease that is ultimately characterized by a severe failure of cellular immune function and the development of opportunistic infections and malignancies. The major immunological abnormalities that result in infection by HIV are the progressive depletion and dysfunction of T lymphocytes that express CD4 cell surface glycoproteins (Raine et al., Ann. Rev. Immunol., 3: 477 [1985]. ). Presumably, the loss of CD4 helper / inducer T cell function underlies the severe failure of cellular and humoral immunity, which leads to opportunistic infections and malignancies that are characteristic of AIDS (H. Rein, the above).

【００２９】ＨＩＶに随伴するＩＴＰの機構は未知であ
るが、これは、ＨＩＶに随伴しないＩＴＰの機構とは相
違すると信じられている（ワルシュ等、N.Eng.J.Med.、
３１１巻６３５−６３９頁［１９８４］；およびラトナ
ー、Am.J.Med.、８６巻１９４−１９８頁［１９８
９］）。Although the mechanism of ITP associated with HIV is unknown, it is believed that it differs from the mechanism of ITP not associated with HIV (Walsh et al., N. Eng. J. Med.,
311 635-639 [1984]; and Ratner, Am. J. Med., 86, 194-198 [198].
9]).

【００３０】IV．血小板減少症のための現行の治療 血小板減少症の患者の処置に対する治療的アプローチ
は、臨床状況の重篤度および緊急性に支配される。その
処置はＨＩＶ付随性と非ＨＩＶ関連性血小板減少症につ
いて似通っており、幾つかの異なった治療的アプローチ
が用いられてはいるが、その治療にはなお論争がある。IV. Current Therapy for Thrombocytopenia Therapeutic approaches to treatment of patients with thrombocytopenia are governed by the severity and urgency of the clinical situation. The treatment is similar for HIV-associated and non-HIV-associated thrombocytopenia, and although several different therapeutic approaches have been used, the treatment is still controversial.

【００３１】血小板減少症と診断された患者の血小板数
は、グルココルチコイド（例えばプレドニソロン）療法
によってうまく増加したが、殆どの患者においてその反
応は不完全であるか、またはグルココルチコイドの用量
が減らされもしくはその投与が中断されると再発が起こ
る。ＨＩＶ付随性ＩＴＰを有する患者での研究に基づ
き、幾人かの研究者は、グルココルチコイド療法がＡＩ
ＤＳの素因を招くかも知れないと示唆している。グルコ
コルチコイドは通常、血小板数が２０ｘ１０⁹／リット
ル未満に下がった時、または自然出血が起こる時に投与
される。The platelet count in patients diagnosed with thrombocytopenia has been successfully increased by glucocorticoid (eg, prednisolone) therapy, but in most patients the response is incomplete or the dose of glucocorticoid is reduced. Or relapse occurs when the administration is discontinued. Based on studies in patients with HIV-associated ITP, some researchers have suggested that glucocorticoid therapy is
Suggests that it may lead to a predisposition to DS. Glucocorticoids are usually administered when the platelet count drops below 20 × 10 ⁹ / liter or when spontaneous bleeding occurs.

【００３２】グルココルチコイドに対し不応性の患者に
対しては、化合物：４−（２−クロロフェニル）−９−
メチル−２−［３−（４−モルホリニル）−３−プロパ
ノン−１−イル］６Ｈ−チエノ［３，２，ｆ］［１，
２，４］トリアゾロ［４，３，ａ］［１，４］ジアゼピ
ン（ＷＥＢ２０８６）を使用して非ＨＩＶ付随性ＩＴＰ
の重篤な症例が首尾良く処置された。血小板数３７００
０−５８０００／μｌの患者をＷＥＢ２０８６で処置
し、１−２週間の処置の後、血小板数は１４００００−
１９００００／μｌに増加した（ＥＰ３６１０７７およ
びローマン等、Lancet、１１４７［１９８８］）。For patients refractory to glucocorticoids, the compound: 4- (2-chlorophenyl) -9-
Methyl-2- [3- (4-morpholinyl) -3-propan-1-yl] 6H-thieno [3,2, f] [1,
Non-HIV Associated ITP Using 2,4] Triazolo [4,3, a] [1,4] diazepine (WEB2086)
Severe cases were successfully treated. Platelet count 3700
0-58000 / μl patients were treated with WEB 2086 and after 1-2 weeks of treatment the platelet count was 140000-
Increased to 190,000 / μl (EP 361077 and Roman et al., Lancet, 1147 [1988]).

【００３３】後天性無巨核球性血小板減少症紫斑病（Ａ
ＡＴＰ）のための最適な処置は不確定であるが、抗胸腺
細胞グロブリン（ＡＴＧ）、ヒト胸腺組織に対するウマ
抗血清が、長期の完全な寛解を産むことが示された（ト
リンブル等、Am.J.Hematol.、３７巻１２６−１２７頁
［１９９１］）。しかしながら、最近の報告は、ＡＴＧ
の造血効果はチメロサルに帰することができ、ここでこ
の蛋白は恐らく水銀担体として作用していると指摘して
いる（パネラ等、Cancer Research、５０巻４４２９−
４４３５頁［１９９０］）。Acquired akaryocytic thrombocytopenic purpura (A
The optimal treatment for ATP) is uncertain, but antithymocyte globulin (ATG), an horse antiserum against human thymic tissue, has been shown to produce long-term complete remission (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37, 126-127 [1991]). However, recent reports indicate that ATG
Can be attributed to thimerosal, which points out that this protein probably acts as a mercury carrier (Panella et al., Cancer Research, 50: 4429-).
4435 [1990]).

【００３４】脾臓切除術で良好な結果が報告されてい
る。脾臓切除術は、多くの患者において血小板破壊の主
たる部位および自己抗体産生の主たる源を除去する。こ
の手法は、多数の患者において長期の無処置寛解をもた
らす。しかしながら、一般に、免疫が傷つけられている
患者では外科的手法は回避すべきであるから、脾臓切除
術は、血小板減少症の重篤な症例（例えば、重篤なＨＩ
Ｖ付随ＩＴＰ）、２ないし３週間のグルココルチコイド
処置に応答しない患者、またはグルココルチコイド投与
の中断後に応答の持続が達成されない患者にのみ推奨さ
れる。現在の科学知識に基づいた時、脾臓切除術が患者
をＡＩＤＳに罹患させ易くするかどうかは明らかでな
い。Good results have been reported with splenectomy. Splenectomy removes a major site of platelet destruction and a major source of autoantibody production in many patients. This approach results in long-term remission in many patients. In general, however, surgical procedures should be avoided in patients with compromised immunity, so splenectomy may be used in severe cases of thrombocytopenia (eg, severe HI
V-associated ITP) Recommended only for patients who do not respond to glucocorticoid treatment for 2 to 3 weeks, or who do not achieve sustained response after discontinuation of glucocorticoid administration. Based on current scientific knowledge, it is not clear whether splenectomy will predispose patients to AIDS.

【００３５】プレドニソロン療法および脾臓切除術に加
えて、或る種の細胞毒性物質、例えばビンクリスチン、
およびアジドチミジン（ＡＺＴ、ジドブジン）もまたＨ
ＩＶ誘発ＩＴＰを処置する見込みがある。しかしながら
その結果は予備的なものである。In addition to prednisolone therapy and splenectomy, certain cytotoxic substances such as vincristine,
And azidothymidine (AZT, zidovudine) are also H
There is promise for treating IV-induced ITP. However, the results are preliminary.

【００３６】前記のことから、血小板減少症を処置する
一つの方法は、巨核球またはその前駆体の血小板産生型
への分化および成熟を加速することのできる物質を得る
ことであるという事が理解できるであろう。一般に「ト
ロンボポエチン」（ＴＰＯ）と呼ばれるこのような物質
の同定に、かなりの努力が費やされてきた。文献中に一
般的に見いだされるＴＰＯの別名は、血小板形成刺激因
子（ＴＳＦ）、巨核球コロニー刺激因子（ＭＫ−ＣＳ
Ｆ）、巨核球刺激因子および巨核球強化物質を包含す
る。ＴＰＯの活性は、古く１９５９年に観察されており
（ラック等、Med.Exp.、１巻１２５頁）、この物質を特
性決定し精製する試みが今日まで続けられてきた。ＴＰ
Ｏ活性ポリペプチドの部分的精製の報告が存在するもの
の（例えば、タイリーン等、J.Biol.Chem.、２６２巻３
２６２［１９８７］およびホフマン等、J.Clin.Inves
t.、７５巻１１７４頁［１９８５］）、他は、ＴＰＯは
それ自身独立した実体ではなく、単に既知ホルモンの多
機能の具現であるとしている（ＩＬ−３、スパロウ等、
Prog.Clin.Biol.Res.、２１５巻１２３頁［１９８
６］）。その形態または起源に拘わらず、血小板形成活
性を有する分子には有意な治療的価値があろう。ＴＰＯ
として明確に同定された蛋白は無いが、推定的サイトカ
インレセプターであるｍｐｌが血小板形成シグナルを変
換し得るという最近の発見には、かなりの関心が集まっ
ている。From the above, it is understood that one method of treating thrombocytopenia is to obtain a substance capable of accelerating the differentiation and maturation of megakaryocytes or their precursors into platelet-producing forms. I can do it. Considerable effort has been expended in identifying such substances, commonly referred to as "thrombopoietin" (TPO). Alternative names for TPO commonly found in the literature are platelet formation stimulating factor (TSF), megakaryocyte colony stimulating factor (MK-CS
F), megakaryocyte stimulating factors and megakaryocyte potentiators. The activity of TPO has long been observed in 1959 (Lack et al., Med. Exp., Vol. 1, p. 125), and attempts to characterize and purify this material have been ongoing to this day. TP
Although there are reports of partial purification of O-active polypeptides (eg, Tyleen et al., J. Biol. Chem., 262: 3).
262 [1987] and Hoffman et al., J. Clin. Inves.
et al., 75, 1174 [1985]), others state that TPO is not an independent entity itself, but merely a multifunctional embodiment of a known hormone (IL-3, Sparrow, et al.
Prog. Clin. Biol. Res., 215: 123 [198
6]). Regardless of their form or origin, molecules with platelet forming activity would be of significant therapeutic value. TPO
Although no protein has been unambiguously identified as, there has been considerable interest in recent discoveries that the putative cytokine receptor, mpl, can transduce platelet forming signals.

【００３７】Ｖ．ｍｐｌは巨核球形成サイトカインレセ
プターである。V. mpl is a megakaryocyte forming cytokine receptor.

【００３８】造血細胞の増殖および成熟は、多能性幹細
胞の増殖および多系統分化を正にまたは負に調節する因
子により緊密に調節されていると信じられている。これ
らの作用は、特異的細胞表面レセプターに対する細胞外
蛋白因子の高親和性結合を介して仲介される。これらの
細胞表面レセプターは、かなりの相同性を共有し、そし
て一般にサイトカインレセプタースーパーファミリーの
成員として分類される。このスーパーファミリーの成員
は、ＩＬ−２（βおよびγ鎖）（ハタケヤマ等、Scienc
e、２４４巻５５１−５５６頁［１９８９］；タケシタ
等、Science、２５７巻３７９−３８２頁［１９９
１］）；ＩＬ−３（イトウ等、Science、２４７巻３２
４−３２８頁［１９９０］；ゴーマン等、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA、８７巻５４５９−５４６３頁［１９９
０］；キタムラ等、Cell、６６巻１１６５−１１７４頁
［１９９１ａ］；キタムラ等、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、８８巻５０８２−５０８６頁［１９９１ｂ］）、Ｉ
Ｌ−４（モスレイ等、Cell、５９巻３３５−３４８頁
［１９８９］、ＩＬ−５（タカキ等、EMBO J.、９巻４
３６７−４３７４頁［１９９０］；タヴァーニア等、Ce
ll、６６巻１１７５−１１８４頁［１９９１］、ＩＬ−
６（ヤマサキ等、Science、２４１巻８２５−８２８頁
［１９８８］；ヒビ等、Cell、６３巻１１４９−１１５
７頁［１９９０］）、ＩＬ−７（グッドウィン等、Cel
l、６０巻９４１−９５１頁［１９９０］）、ＩＬ−９
（ルノー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９巻５６９０
−５６９４頁［１９９２］）、顆粒球−マクロファージ
コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ギアリング等、EM
BO J.、８巻３６６７−３６７６頁［１９９１］；ハヤ
シダ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、２４４巻９６５５−
９６５９頁［１９９０］）、顆粒球コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ）（フクナガ等、Cell、６１巻３４１−３
５０頁［１９９０ａ］；フクナガ等、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA、８７巻８７０２−８７０６頁［１９９０ｂ］；
ラーセン等、J.Exp.Med.、１７２巻１５５９−１５７０
頁［１９９０］）、ＥＰＯ（ドゥアンドレア等、Cell、
５７巻２７７−２８５頁［１９８９］；ジョーンズ等、
Blood、７６巻３１−３５頁［１９９０］）、白血病阻
害因子（ＬＩＦ）（ギアリング等、EMBO J.、１０巻２
８３９−２８４８頁［１９９１］）、オンコスタチンＭ
（ＯＳＭ）（ローズ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８８
巻８６４１−８６４５頁［１９９１］）のためのレセプ
ター、そしてさらにプロラクチン（ブーティン等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻７７４４−７７４８頁
［１９８８］：エダリー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、
８６巻２１１２−２１１６頁［１９８９］）、成長ホル
モン（ＧＨ）（リュング等、Nature、３３０巻５３７−
５４３頁［１９８７］）および繊毛神経栄養因子（ＣＮ
ＴＦ）（デイヴィス等、Science、２５３巻５９−６３
頁［１９９１]のためのレセプターをも包含する。It is believed that the proliferation and maturation of hematopoietic cells is tightly regulated by factors that positively or negatively regulate the proliferation and multilineage differentiation of pluripotent stem cells. These effects are mediated through high affinity binding of extracellular protein factors to specific cell surface receptors. These cell surface receptors share considerable homology and are generally classified as members of the cytokine receptor superfamily. Members of this superfamily include IL-2 (β and γ chains) (Hatakeyama et al., Sciencec.
e, 244, 551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257, 379-382 [199].
1]); IL-3 (Ito et al., Science, 247, 32)
4-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Ac.
ad.Sci. USA, Vol. 87, pp. 5559-5463 [199
0]; Kitamura et al., Cell, 66, 1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, Vol. 88, pp. 5082-5086 [1991b]), I
L-4 (Mosley et al., Cell, Vol. 59, pages 335-348 [1989]; IL-5 (Takaki et al., EMBO J., Vol. 9, No. 4)
367-4374 [1990]; Tavania et al., Ce.
ll, 66, 1175-1184 [1991], IL-
6 (Yamasaki et al., Science, 241, 825-828 [1988]; Hibiki et al., Cell, 63, 1149-115).
7 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cel.
1, 60, 941-951 [1990]), IL-9
(Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 5690
-5694 [1992]), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (Gearing et al., EM
BO J., 8: 3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244: 9655-.
9659 [1990]), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61, 341-3).
50 [1990a]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. S.
ci. USA, 87, 8702-8706 [1990b];
Larsen et al., J. Exp. Med., Vol. 172, 1559-1570
P. [1990]), EPO (Doandrea et al., Cell,
57, 277-285 [1989]; Jones et al.
Blood, 76, 31-35 [1990]), leukemia inhibitory factor (LIF) (Gearing et al., EMBO J., 10: 2)
839-2848 [1991]), Oncostatin M
(OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88
8641-8645 [1991]), and also prolactin (Butin et al., Pro.
USA, 88, 7744-7748 [1988]: Edary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86, 2112-2116 [1989]), growth hormone (GH) (Lung et al., Nature, 330, 537-).
543 [1987]) and ciliary neurotrophic factor (CN
TF) (Davis et al., Science, 253, 59-63)
Also includes the receptor for page [1991].

【００３９】サイトカインレセプタースーパーファミリ
ーの成員は三つの機能的範疇に分けることができる（総
説についてはニコラ等、Cell、６７巻１−４頁［１９９
１］を参照されたい）。第一のクラスは、エリスロポエ
チンレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）または顆粒球コロニー刺
激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ）のような一本鎖レ
セプターを含み、これらは細胞外ドメインを介してリガ
ンドと高い親和性で結合し、さらに細胞内シグナルを作
り出す。第二のクラスのレセプター、いわゆるαサブユ
ニットは、インターロイキン６レセプター（ＩＬ６−
Ｒ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子レセプ
ター（ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ）、インターロイキン３レセプ
ター（ＩＬ３−Ｒα）およびサイトカインレセプタース
ーパーファミリーのその他の成員を包含する。これらの
αサブユニットは、リガンドを低い親和性で結合させる
が、細胞内シグナルを変換することはできない。シグナ
ルを送ることのできる高親和性レセプターは、αサブユ
ニットと、βサブユニットと呼ばれるサイトカインレセ
プターの第三のクラスの成員、例えば三つのαサブユニ
ットＩＬ３−ＲαおよびＧＭ−ＣＳＦ−Ｒに対する共通
のβサブユニット、βｃ、との間のヘテロ二量体によっ
て生成される。The members of the cytokine receptor superfamily can be divided into three functional categories (for a review, see Nicola et al., Cell 67: 1-4 [199].
1]). The first class includes single-chain receptors such as the erythropoietin receptor (EPO-R) or the granulocyte colony stimulating factor receptor (G-CSF-R), which have a high affinity for the ligand via the extracellular domain. To generate an intracellular signal. A second class of receptors, the so-called α-subunits, are interleukin-6 receptors (IL6-
R), granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor (GM-CSF-R), interleukin 3 receptor (IL3-Rα) and other members of the cytokine receptor superfamily. These α subunits bind the ligand with low affinity but cannot transduce intracellular signals. High-affinity receptors that can signal are the α subunit and members of a third class of cytokine receptors called the β subunit, such as the three α subunits IL3-Rα and GM-CSF-R. Produced by a heterodimer between the β subunit, βc.

【００４０】ｍｐｌがサイトカインレセプタースーパー
ファミリーの一員であるという証拠は、配列の相同性
（ギアリング、EMBO J、８巻３６６７−３６７６頁［１
９８８］；バザン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７巻６
８３４−６９３８頁［１９９０］；デイヴィス等、Scie
nce、２５３巻５９−６３頁［１９９１］およびヴィゴ
ン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９巻５６４０−５６
４４頁［１９９２］）および増殖のシグナルを変換する
その能力に由来する。Evidence that mpl is a member of the cytokine receptor superfamily is based on sequence homology (Gearing, EMBO J, 8, 3667-3676 [1
988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6
834-6938 [1990]; Davis et al., Scie.
253, 59-63 [1991] and Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5640-56.
44 [1992]) and its ability to transduce signals of proliferation.

【００４１】マウスｃ−ｍｐｌの分子クローニングから
導き出された蛋白配列は、この蛋白が他のサイトカイン
レセプターと相同性であることを明らかにしている。細
胞外ドメインは４６５アミノ酸残基を含んでおり、二つ
のサブドメインで構成され、その各々は４個の高度に保
存されたシステイン、ならびにＮ末端サブドメインおよ
びＣ末端サブドメインに特別なモチーフを持っている。
リガンド結合細胞外ドメインは、類似の二重βバレル折
り畳み構造形態を有すると予想される。この二重の細胞
外ドメインは、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ
レセプターに共通するシグナル変換鎖ならびにＬＩＦの
低親和性結合ドメインと極めて相同的である（ヴィゴン
等、Oncogene、８巻２６０７−２６１５頁［１９８
３］）。したがって、ｍｐｌはサイトカインレセプター
の低親和性リガンド結合クラスに属しているかも知れな
い。A protein sequence derived from the molecular cloning of mouse c-mpl reveals that this protein is homologous to other cytokine receptors. The extracellular domain contains 465 amino acid residues and is composed of two subdomains, each with four highly conserved cysteines and special motifs in the N- and C-terminal subdomains. ing.
The ligand binding extracellular domain is expected to have a similar double beta barrel fold configuration. This dual extracellular domain contains IL-3, IL-5 and GM-CSF
Very homologous to the signal transduction chain common to receptors and the low affinity binding domain of LIF (Vigon et al., Oncogene, 8: 2607-1615 [198].
3]). Thus, mpl may belong to the low affinity ligand binding class of cytokine receptors.

【００４２】マウスｍｐｌと成熟ヒトｍｐｌＰとの比較
は、これら二つの蛋白が８１％の配列一致を示すことを
明らかにしている。より詳細には、Ｎ末端およびＣ末端
細胞外サブドメインは、各々７５％および８０％の配列
一致を共有している。最も保存されたｍｐｌ領域は、９
１％のアミノ酸一致を示す細胞質ドメインであり、貫膜
ドメイン付近の３７残基から成る配列が、両方の種で一
致している。したがって、ｍｐｌは、サイトカインレセ
プタースーパーファミリーの最も保存された成員の一つ
であると報告されている（ヴィゴン、上記）。A comparison between mouse mpl and mature human mplP reveals that these two proteins show 81% sequence identity. More specifically, the N-terminal and C-terminal extracellular subdomains share 75% and 80% sequence identity, respectively. The most conserved mpl region is 9
This is a cytoplasmic domain showing 1% amino acid identity, and the sequence of 37 residues near the transmembrane domain is identical in both species. Thus, mpl has been reported to be one of the most conserved members of the cytokine receptor superfamily (Vigon, supra).

【００４３】ｍｐｌが増殖シグナルを変換できる機能的
レセプターであるという証拠は、ｍｐｌ細胞質ドメイン
を持つ既知のサイトカインに対して高親和性を有するサ
イトカインレセプター由来の細胞外ドメインを含むキメ
ラレセプターの組み立てに依っている。ｍｐｌに対する
既知のリガンドは報告されていないことから、ＩＬ−４
ＲまたはＧ−ＣＳＦＲのようなクラス１サイトカインレ
セプター由来の細胞外ドメインを結合させるキメラ高親
和性リガンドを組み立てる必要があった。ヴィゴン等、
上記、は、Ｇ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインをｃ−ｍｐｌ
の貫膜および細胞質ドメインの両者と融合させた。ＩＬ
−３依存性セルライン、ＢＡＦ／Ｂ０３（Ｂａ／Ｆ３）
を、全長のＧ−ＣＳＦＲ対照と共にＧ−ＣＳＦＲ／ｍｐ
ｌキメラによりトランスフェクトさせた。このキメラに
よりトランスフェクトさせた細胞は、サイトカインＩＬ
−３またはＧ−ＣＳＦの存在下で等しく良好に生育し
た。同様に、Ｇ−ＣＳＦＲでトランスフェクトさせた細
胞もまた、ＩＬ−３またはＧ−ＣＳＦいずれかの中で良
好に生育した。成長因子の不在下では全ての細胞が死滅
した。同様の実験が、スコダ等、EMBO J．、１２（７）
巻２６４５−２６５３頁［１９９３］によって行われた
が、ここでは、ヒトＩＬ−４レセプター（ｈＩＬ−４−
Ｒ）の細胞外および貫膜ドメインの両方をマウスｍｐｌ
細胞質ドメインに融合させ、マウスＩＬ−３依存Ｂａ／
Ｆ３セルライン中にトランスフェクトさせた。野生型ｈ
ＩＬ−４−ＲでトランスフェクトさせたＢａ／Ｆ３細胞
は、種特異的ＩＬ−４またはＩＬ−３のいずれかの存在
下で正常に増殖した。ｈＩＬ−４Ｒ／ｍｐｌでトランス
フェクトさせたＢａ／Ｆ３細胞はｈＩＬ−４の存在下で
（ＩＬ−３の存在下または不在下で）正常に増殖し、Ｂ
ａ／Ｆ３細胞においてｍｐｌ細胞質ドメインが増殖シグ
ナルを変換するために必要な全ての要素を含んでいるこ
とを立証した。Evidence that mpl is a functional receptor capable of transducing a growth signal relies on the assembly of a chimeric receptor containing an extracellular domain from a cytokine receptor that has a high affinity for known cytokines with the mpl cytoplasmic domain. ing. Since no known ligand for mpl has been reported, IL-4
There was a need to assemble chimeric high affinity ligands that bind extracellular domains from class 1 cytokine receptors such as R or G-CSFR. Vigon, etc.
The above describes the extracellular domain of G-CSFR as c-mpl
Was fused with both the transmembrane and cytoplasmic domains. IL
-3 dependent cell line, BAF / B03 (Ba / F3)
With G-CSFR / mp along with full length G-CSFR control
Transfected with 1 chimera. Cells transfected with this chimera contain the cytokine IL
Grew equally well in the presence of -3 or G-CSF. Similarly, cells transfected with G-CSFR also grew well in either IL-3 or G-CSF. All cells died in the absence of growth factors. A similar experiment was performed by Skoda et al. , 12 (7)
Vol. 2645-2653 [1993], but here the human IL-4 receptor (hIL-4-
R) Both the extracellular and transmembrane domains of mouse mpl
Fused to the cytoplasmic domain, the mouse IL-3-dependent Ba /
Transfected into the F3 cell line. Wild type h
Ba / F3 cells transfected with IL-4-R grew normally in the presence of either species-specific IL-4 or IL-3. Ba / F3 cells transfected with hIL-4R / mpl grew normally in the presence of hIL-4 (in the presence or absence of IL-3);
It was demonstrated that in a / F3 cells the mpl cytoplasmic domain contains all the elements necessary to transduce a growth signal.

【００４４】これらのキメラ実験は、ｍｐｌ細胞質ドメ
インの増殖シグナル伝達能を証明しているが、ｍｐｌ細
胞外ドメインがリガンドを結合できるかどうかに関して
はわからない。これらの結果は、少なくとも二つの可能
性、即ち、ｍｐｌはＥＰＯ−ＲまたはＧ−ＣＳＦＲのよ
うな一本鎖（クラス１）レセプターであるか、またはこ
れはＩＬ−３のようなα−サブユニットを要するシグナ
ル変換β−サブユニット（クラス３）であるという可能
性に合致する（スコダ等、上記）。Although these chimeric experiments demonstrate the ability of the mpl cytoplasmic domain to propagate growth signals, it is not known whether the mpl extracellular domain can bind ligand. These results indicate that at least two possibilities exist: mpl is a single-chain (class 1) receptor such as EPO-R or G-CSFR, or it is an α-subunit such as IL-3. (Skoda et al., Supra).

【００４５】VI．ｍｐｌリガンドはトロンボポエチン
（ＴＰＯ）である。VI. The mpl ligand is thrombopoietin (TPO).

【００４６】上に記載のように、血清は、様々な他のサ
イトカインと相乗的に作用して巨核球の成長および成熟
を促進する、時にはトロンボポエチン（ＴＰＯ）と呼ば
れる特異な因子を含むことが示唆された。多数のグルー
プによりかなりの努力が費やされてきたにも拘わらず、
このような天然の因子は血清または他のいかなる供給源
からも分離されたことはなかった。ｍｐｌが巨核球刺激
因子を直接結合させることができるかどうかは未知であ
るとしても、最近の実験は、ｍｐｌが、無形成性骨髄の
患者の血清に見いだされる因子または因子群からの増殖
シグナルの変換に関わっていることを証明している（メ
シア等、Blood、８２（５）巻１３９５−１４０１頁
［１９９３］）。As noted above, serum suggests that it contains a unique factor, sometimes called thrombopoietin (TPO), that acts synergistically with various other cytokines to promote megakaryocyte growth and maturation. Was done. Despite considerable effort being expended by numerous groups,
Such natural factors have never been isolated from serum or any other source. Even though it is not known whether mpl can directly bind megakaryocyte stimulating factors, recent experiments have shown that mpl is capable of detecting the growth signal from a factor or group of factors found in the serum of patients with aplastic bone marrow. It is proved that it is involved in the conversion (Messia et al., Blood, 82 (5): 1394-1401 [1993]).

【００４７】ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−
６、ＩＬ−１１、ＳＣＦ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、および
ＧＭ−ＣＳＦとは別個の特異な血清コロニー形成因子が
ｍｐｌを介して増殖シグナルを変換するという証拠は、
原始および分化方向が決定付けられた造血セルラインに
おけるｃ−ｍｐｌ発現の分布の調査ならびにこれらセル
ラインの一つにおけるｍｐｌアンチセンスの研究に由来
する。IL-1α, IL-3, IL-4, IL-
6. Evidence that distinct serum colony forming factors distinct from IL-11, SCF, EPO, G-CSF, and GM-CSF transduce growth signals via mpl,
It originates from a survey of the distribution of c-mpl expression in hematopoietic cell lines with primitive and differentiated orientation and studies of mpl antisense in one of these cell lines.

【００４８】免疫精製されたヒト造血細胞での逆転写酵
素（ＲＴ）−ＰＣＲを使用して、メシア等、上記、は、
強いｍｐｌ ｍＲＮＡメッセージはＣＤ３４⁺精製された
細胞、巨核球および血小板にのみ見いだされることを証
明した。骨髄（ＢＭ）から精製されたＣＤ３４⁺細胞
は、全ＢＭ細胞の約１％をなし、全系統の原始および分
化方向を決定付けられた祖先細胞に富んでいる（例え
ば、赤血球、顆粒球マクロファージ、および巨核球）。Using reverse transcriptase (RT) -PCR on immunopurified human hematopoietic cells, Messia et al.
Strong mpl mRNA messages proved to be found only in CD34 ⁺ purified cells, megakaryocytes and platelets. CD34 ⁺ cells purified from bone marrow (BM) make up about 1% of all BM cells and are enriched in primordial and committed ancestral cells of all lineages (eg, erythrocytes, granulocyte macrophages, And megakaryocytes).

【００４９】ｍｐｌアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドは、無形成性骨髄の患者由来の血清（巨核球コロ
ニー刺激活性［ＭＫ−ＣＳＡ］の豊富な供給源）で培養
された多能性ＣＤ３４⁺細胞からの巨核球コロニー形成
を抑制することが示された。この同じアンチセンスオリ
ゴデオキシヌクレオチドは、赤血球または顆粒球マクロ
ファージコロニー形成には影響を及ぼさなかった。The mpl antisense oligodeoxynucleotides are used for megakaryogenesis from pluripotent CD34 ⁺ cells cultured in serum (a rich source of megakaryocyte colony stimulating activity [MK-CSA]) from patients with aplastic bone marrow. It was shown to suppress bulb colony formation. This same antisense oligodeoxynucleotide had no effect on erythroid or granulocyte macrophage colony formation.

【００５０】ｍｐｌがリガンドを直接結合させるかどう
か、そして巨核球形成を引き起こすことが示された血清
因子がｍｐｌを介して働いているかどうかは未だ不明で
あった。しかしながら、もしｍｐｌが事実リガンドと直
接結合するならば、そのアミノ酸配列は、高度に保存さ
れ、そしてヒトおよびマウスのｍｐｌ細胞外ドメインの
間のかなりの配列一致のために、種交差反応性を有する
と思われるという事が示唆された（ヴィゴン等、上記
［１９９３］）。It is still unknown whether mpl directly binds the ligand and whether serum factors that have been shown to cause megakaryopoiesis work via mpl. However, if mpl actually binds directly to the ligand, its amino acid sequence is highly conserved and has species cross-reactivity due to considerable sequence identity between the human and mouse mpl extracellular domains. (Vigon et al., Supra [1993]).

【００５１】VII．目的 前記の事柄に鑑み、当分野では、血小板減少症の処置に
おける治療用途のための、造血細胞、特に巨核球または
その先祖の増殖、分化および成熟を刺激できる分子を分
離および同定する必要性が、現在、そして継続して、あ
ることが理解されるであろう。このような分子はｍｐｌ
リガンドであり、したがって、細胞の成長および分化に
おけるそれらの役割を評価するため、係るリガンドを分
離するさらなる必要性が存在すると信じられる。VII. In view of the foregoing, there is a need in the art to isolate and identify molecules capable of stimulating proliferation, differentiation and maturation of hematopoietic cells, particularly megakaryocytes or their ancestors, for therapeutic use in the treatment of thrombocytopenia. It will be understood that there is, now and continuously. Such a molecule is mpl
It is believed that there is a further need to separate ligands to assess their role in cell growth and differentiation, and thus such ligands.

【００５２】従って、巨核球の成熟血小板産生型への増
殖、分化および／または成熟を刺激することのできる薬
学上純粋な分子を得ることが本発明の一つの目的であ
る。Accordingly, it is an object of the present invention to obtain a pharmaceutically pure molecule capable of stimulating the proliferation, differentiation and / or maturation of megakaryocytes into mature platelet-producing forms.

【００５３】造血疾患、特に血小板減少症の処置におけ
る治療用途のための型で当該分子を提供することが、も
う一つの目的である。It is another object to provide such molecules in a form for therapeutic use in the treatment of hematopoietic disorders, especially thrombocytopenia.

【００５４】ｍｐｌとして知られるサイトカインスーパ
ーファミリーレセプターをインビボで結合することので
きる蛋白リガンドを分離、精製および特異的に同定し、
増殖シグナルを変換することが、本発明のさらなる目的
である。Isolating, purifying and specifically identifying a protein ligand capable of binding in vivo the cytokine superfamily receptor known as mpl;
Transducing the growth signal is a further object of the present invention.

【００５５】係る蛋白リガンドをコードしている核酸分
子を提供し、そして、これらの核酸分子を用いて診断お
よび治療用途のために組換え細胞培養中でｍｐｌ結合リ
ガンドを生成させることが、また別の目的である。Providing nucleic acid molecules encoding such protein ligands and using these nucleic acid molecules to produce mpl-binding ligands in recombinant cell culture for diagnostic and therapeutic applications is another alternative. Is the purpose.

【００５６】それらのアミノ酸配列変異体、変異体糖蛋
白型および共有結合誘導体を包含する、該蛋白リガンド
の誘導体および修飾された型を提供することがさらに別
の目的である。It is yet another object to provide derivatives and modified forms of the protein ligands, including their amino acid sequence variants, variant glycoprotein types and covalent derivatives.

【００５７】ｍｐｌリガンドおよびヘテロローガスな蛋
白を結びつけた融合ポリペプチド型およびそれらの共有
結合誘導体を提供することが、さらなる目的である。It is a further object to provide fusion polypeptide types that link the mpl ligand and heterologous protein and their covalent derivatives.

【００５８】血小板および赤血球祖先細胞の両方の増殖
および成長を調節することのできる蛋白を産生させるた
めの、ｍｐｌリガンドをＥＰＯ配列からのアミノ酸付加
および置換と結びつけた変異体ポリペプチド型を提供す
ることが、さらなる目的である。To provide a mutant polypeptide type combining an mpl ligand with amino acid additions and substitutions from an EPO sequence to produce a protein capable of regulating the proliferation and growth of both platelet and erythroid progenitor cells. Is a further purpose.

【００５９】ｍｐｌリガンドまたはその融合型に対する
抗体を作製するための免疫原を製造すること、および係
るリガンドを結合することのできる抗体を取得すること
が、さらに別の目的である。It is yet another object to produce an immunogen for the production of antibodies to the mpl ligand or a fusion thereof, and to obtain antibodies capable of binding such ligands.

【００６０】本発明のこれらのおよびその他の目的は、
本明細書を全体として考える時、当業者には明らかであ
ろう。[0060] These and other objects of the present invention are:
It will be apparent to one of ordinary skill in the art when considering the specification as a whole.

【００６１】[0061]

【発明の要約】本発明の目的は、巨核球の成熟血小板産
生型への増殖、成熟および／または分化を刺激すること
のできる、「ｍｐｌリガンド」（ＭＬ）または「トロン
ボポエチン」（ＴＰＯ）と呼ばれる、分離された哺乳動
物の巨核球形成性増殖および成熟促進蛋白を提供するこ
とによって達成される。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is called "mpl ligand" (ML) or "thrombopoietin" (TPO), which can stimulate the proliferation, maturation and / or differentiation of megakaryocytes into mature platelet-producing forms. By providing an isolated mammalian megakaryocyte-promoting growth and maturation promoting protein.

【００６２】この実質上均質な蛋白は、（１）精製すべ
きｍｐｌリガンド分子を含有する供給源の血漿を、固定
されたレセプターポリペプチド、特に、支持体上に固定
されたｍｐｌまたはｍｐｌ融合ポリペプチドと、精製す
べきｍｐｌリガンド分子が固定されたレセプターポリペ
プチド上に選択的に吸着されるような条件下で、接触さ
せ、（２）この固定されたレセプターポリペプチドおよ
びその支持体を洗浄して、非吸着物質を除去し、そし
て、（３）ｍｐｌリガンド分子を、それらが吸着されて
いる固定されたレセプターポリペプチドから、溶離緩衝
液によって溶出する、ことからなる方法によって、天然
供給源から精製することができる。好ましくは、この天
然供給源は、ｍｐｌリガンドを含有する哺乳動物の血漿
または尿である。所望によりこの哺乳動物は再生不良性
であり、固定されたレセプターはｍｐｌ−ＩｇＧ融合物
である。This substantially homogenous protein can be used to (1) convert the source plasma containing the mpl ligand molecule to be purified to an immobilized receptor polypeptide, in particular an mpl or mpl fusion polypeptide immobilized on a support. The peptide is brought into contact with the peptide under conditions such that the mpl ligand molecule to be purified is selectively adsorbed on the immobilized receptor polypeptide, and (2) the immobilized receptor polypeptide and its support are washed. And (3) eluting the mpl ligand molecules from the immobilized receptor polypeptide to which they are adsorbed by an elution buffer, from a natural source. It can be purified. Preferably, the natural source is mammalian plasma or urine containing mpl ligand. Optionally, the mammal is aplastic and the immobilized receptor is an mpl-IgG fusion.

【００６３】所望により、好ましい巨核球形成性増殖お
よび成熟促進蛋白は、合成または組換え手段により作成
された、分離された実質上均質なｍｐｌリガンドポリペ
プチドである。If desired, a preferred megakaryogenic proliferative and maturation promoting protein is an isolated, substantially homogeneous mpl ligand polypeptide made by synthetic or recombinant means.

【００６４】本発明に係る「ｍｐｌリガンド」ポリペプ
チドまたは「ＴＰＯ」は、好ましくは、高度に精製され
た実質上均質なブタｍｐｌリガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列と少なくとも通算７０％の配列一致、そしてこ
のブタｍｐｌリガンドポリペプチドの「ＥＰＯドメイ
ン」と少なくとも８０％の配列一致を有する。所望によ
り、本発明に係るｍｐｌリガンドは、図１および図２
（配列番号１）に供される成熟アミノ酸配列を有する成
熟ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはその変異体もし
くは転写後修飾された型であるか、または、成熟ヒトｍ
ｐｌリガンドと約８０％の配列一致を有する蛋白であ
る。所望により、ｍｐｌリガンド変異体は、成熟ヒトｍ
ｐｌリガンド（ｈＭＬ）のフラグメント、特にアミノ末
端または「ＥＰＯドメイン」フラグメントである。好ま
しくは、このアミノ末端フラグメントは、第一および第
四のシステイン残基の間のヒトＭＬ配列の実質上全てを
保持しているが、その領域外の実質的な付加、除去また
は置換を含むこともある。この態様に従うと、当該フラ
グメントポリペプチドは、式：An “mpl ligand” polypeptide or “TPO” according to the present invention preferably has at least 70% overall sequence identity with the amino acid sequence of a highly purified, substantially homogeneous porcine mpl ligand polypeptide, and Has at least 80% sequence identity with the "EPO domain" of the porcine mpl ligand polypeptide. Optionally, the mpl ligand according to the invention can be prepared according to FIGS.
A mature human mpl ligand (hML) having the mature amino acid sequence provided in SEQ ID NO: 1 or a variant or post-transcriptionally modified form thereof;
It is a protein having about 80% sequence identity with pl ligand. Optionally, the mpl ligand variant is a mature human m
Fragments of pl ligand (hML), especially amino-terminal or "EPO domain" fragments. Preferably, the amino-terminal fragment retains substantially all of the human ML sequence between the first and fourth cysteine residues, but includes substantial additions, removals or substitutions outside that region. There is also. According to this embodiment, the fragment polypeptide has the formula:

【数１】Ｘ−ｈＭＬ（７−１５１）−Ｙ ［式中、ｈＭＬ（７−１５１）はＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹
（両端の番号を含む）までのヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）アミ
ノ酸配列を表し；Ｘは、Ｃｙｓ⁷のアミノ基または成熟
ｈＭＬもしくはそのアミノ酸残基伸長物の１もしくはそ
れ以上のアミノ末端アミノ酸残基、例えばＭｅｔ、Ｔｙ
ｒまたは、蛋白分解的開裂部位（例えば因子Ｘａまたは
トロンビン）を含むリーダー配列を表し；そしてＹは、
Ｃｙｓ^１５１のカルボキシ末端基または成熟ｈＭＬもし
くはその伸長物の１もしくはそれ以上のカルボキシ末端
アミノ酸残基を表す］によって表すことができる。X-hML (7-151) -Y wherein hML (7-151) is Cys ⁷ to Cys ¹⁵¹
It represents human TPO (HML) the amino acid sequence of up to (including the number of the ends); X is one or more amino-terminal amino acid residue of the amino group or mature HML or its amino acid residue extension of Cys ^7, e.g. Met, Ty
r or a leader sequence comprising a proteolytic cleavage site (eg factor Xa or thrombin); and Y is
Representing the carboxy terminal group of Cys ¹⁵¹ or one or more carboxy terminal amino acid residues of mature hML or an extension thereof.

【００６５】所望により、ｍｐｌリガンドポリペプチド
またはそのフラグメントは、ヘテロローガスなポリペプ
チドと融合させることができる（キメラ）。好ましいヘ
テロローガスなポリペプチドは、サイトカイン、コロニ
ー刺激因子またはインターロイキンもしくはそのフラグ
メント、特にｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ
−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦま
たはＬＩＦである。所望による好ましいヘテロローガス
ポリペプチドは、免疫グロブリン鎖、特にヒトＩｇＧ
１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、
ＩｇＤ、ＩｇＭまたはそれらのフラグメント、特にＩｇ
Ｇ重鎖の不変ドメインを含むものである。If desired, the mpl ligand polypeptide or fragment thereof can be fused to a heterologous polypeptide (chimera). Preferred heterologous polypeptides are cytokines, colony stimulating factors or interleukins or fragments thereof, especially kit ligand (KL), IL-1, IL
-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF or LIF. Optionally preferred heterologous polypeptides are immunoglobulin chains, especially human IgG.
1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE,
IgD, IgM or fragments thereof, especially Ig
It contains the constant domain of the G heavy chain.

【００６６】本発明の別の態様は、生物学的に活性であ
り、且つ好ましくはヒトｍｐｌでトランスフェクトされ
たＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡ中への標識さ
れたヌクレオチド（例えば、³Ｈ−チミジン）の取り込
みを刺激することのできる、分離されたｍｐｌアゴニス
トを含む組成物を提供する。所望によりこのｍｐｌアゴ
ニストは生物活性なｍｐｌリガンドであり、そして好ま
しくはマウス血小板リバウンド検定において循環血小板
への³⁵Ｓの取り込みを刺激することができる。好適なｍ
ｐｌアゴニストは、ｈＭＬ₁₅₃、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、
Ｒ１５４Ａ）、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ４、ｍＭ
Ｌ、ｍＭＬ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬ、およびｐＭＬ２また
はそれらのフラグメントを包含する。Another aspect of the present invention is directed to labeled nucleotides (eg, such as those described in US Pat. capable of stimulating ³ H- thymidine) incorporation provides a composition comprising an isolated mpl agonist. Optionally, the mpl agonist is a biologically active mpl ligand, and is preferably capable of stimulating ³⁵ S incorporation into circulating platelets in a mouse platelet rebound assay. Suitable m
pl agonists, hML _153, hML (R153A,
R154A), hML2, hML3, hML4, mM
L, mML2, mML3, pML, and pML2 or fragments thereof.

【００６７】別の態様において、本発明はｍｐｌリガン
ドに結合することのできる分離された抗体を提供する。
ｍｐｌリガンドに結合できる分離された抗体は、所望に
より第二のポリペプチドと融合していてよく、該抗体ま
たはその融合物は、固定されたｍｐｌについて上に記載
されたような供給源からｍｐｌリガンドを分離および精
製するために使用することができる。この態様のさらな
る側面において、本発明は、該抗体を、リガンドの含有
が疑われる試料、特に血清試料と接触させ、結合が起こ
っているか否かを検出することからなる、インビトロま
たはインビボでｍｐｌリガンドを検出する方法を提供す
る。In another aspect, the invention provides an isolated antibody capable of binding an mpl ligand.
An isolated antibody capable of binding an mpl ligand may optionally be fused to a second polypeptide, wherein the antibody or a fusion thereof comprises a mpl ligand from a source as described above for immobilized mpl. Can be used to separate and purify. In a further aspect of this embodiment, the invention relates to an in vitro or in vivo mpl ligand comprising contacting the antibody with a sample suspected of containing the ligand, particularly a serum sample, and detecting whether binding has occurred. To provide a method for detecting

【００６８】さらなる態様において、本発明は、ｍｐｌ
リガンドまたはそのフラグメントをコードしている核酸
分子であって、その核酸分子が所望により検出し得る原
子団で標識されていてよい、分離された核酸分子、およ
び、ｍｐｌリガンドをコードしている配列を有する核酸
分子に対し相補的であるか、または中等度ないし高度緊
縮条件下でこれとハイブリダイズする配列を有する核酸
分子を提供する。好ましい核酸分子は、ヒト、ブタ、お
よびマウスｍｐｌリガンドをコードしているものであ
り、ＲＮＡおよびＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両者
を包含する。この態様のさらなる側面において、該核酸
分子はｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡであり、
さらに、複製可能なベクターを含んでおり、ここで該Ｄ
ＮＡはベクターにより形質転換された宿主により認識さ
れる調節配列と機能的に結合している。所望により、こ
のＤＮＡは、図１および図２の５'−３'（配列番号
２）、３'−５'に供される配列を有するｃＤＮＡまたは
それらのフラグメントである。この側面はさらに、該ベ
クターにより形質転換された宿主細胞、好ましくはＣＨ
Ｏ細胞、および、該ＤＮＡを用いてｍｐｌリガンドの生
産をさせる方法であって、好ましくは該ｍｐｌリガンド
をコードしているｃＤＮＡを形質転換させた宿主細胞の
培養で発現させ、このｍｐｌリガンドを宿主細胞または
宿主細胞培養から回収することからなる方法を包含す
る。この方法により製造されたｍｐｌリガンドは、好ま
しくはヒトｍｐｌリガンドである。In a further embodiment, the present invention provides
An isolated nucleic acid molecule encoding a ligand or fragment thereof, wherein the nucleic acid molecule may be optionally labeled with a detectable moiety, and a sequence encoding an mpl ligand. Provided are nucleic acid molecules having a sequence that is complementary to, or hybridizes with, a nucleic acid molecule under moderate to high stringency conditions. Preferred nucleic acid molecules are those encoding human, porcine, and mouse mpl ligands, and include both RNA and DNA, genomic and cDNA. In a further aspect of this embodiment, the nucleic acid molecule is DNA encoding an mpl ligand,
In addition, it contains a replicable vector, wherein the D
NA is operably linked to regulatory sequences recognized by the host transformed by the vector. Optionally, the DNA is a cDNA having the sequence provided in 5′-3 ′ (SEQ ID NO: 2), 3′-5 ′ of FIGS. 1 and 2, or a fragment thereof. This aspect further relates to host cells transformed with the vector, preferably CH
A method for producing mpl ligand using O cells and said DNA, preferably expressing in a culture of a transformed host cell a cDNA encoding said mpl ligand; And recovering from the cell or host cell culture. The mpl ligand produced by this method is preferably a human mpl ligand.

【００６９】本発明はさらに、治療上有効な量のｍｐｌ
リガンドを哺乳動物に投与することからなる、造血疾
患、とりわけ血小板減少症を有する哺乳動物を処置する
方法を包含する。所望によりこのｍｐｌリガンドは、サ
イトカイン、とりわけコロニー刺激因子またはインター
ロイキンと組み合わせて投与されてよい。好ましいコロ
ニー刺激因子またはインターロイキンは、ｋｉｔリガン
ド（ＫＬ）、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およ
びＩＬ−１１を包含する。The present invention further provides a therapeutically effective amount of mpl
A method of treating a mammal having a hematopoietic disease, especially thrombocytopenia, comprising administering a ligand to the mammal. If desired, the mpl ligand may be administered in combination with a cytokine, especially a colony stimulating factor or an interleukin. Preferred colony stimulating factors or interleukins are kit ligand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-
Includes CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6, and IL-11.

【００７０】本発明はさらに、（１）ＴＰＯを含有する
細胞を破壊または溶菌し、（２）所望により、可溶性物
質をＴＰＯを含有する不溶性物質から分離し、（３）不
溶性物質中のＴＰＯを可溶化緩衝剤で可溶化し、（４）
可溶化されたＴＰＯを他の可溶性および不溶性物質から
分離し、（５）酸化還元緩衝液中でＴＰＯを再折り畳み
し、そして、（６）正しく折り畳まれたＴＰＯを誤折り
畳みされたＴＰＯから分離する、ことからなる、ＴＰＯ
産生微生物からＴＰＯ（ＭＬ）を分離および精製するた
めの方法を包含する。The present invention further provides (1) destroying or lysing cells containing TPO, (2) separating a soluble substance from an insoluble substance containing TPO if desired, and (3) separating TPO in the insoluble substance. Solubilization with a solubilization buffer, (4)
Separates solubilized TPO from other soluble and insoluble materials, (5) refolds TPO in redox buffer, and (6) separates correctly folded TPO from misfolded TPO , Consisting of TPO
Includes a method for separating and purifying TPO (ML) from a producing microorganism.

【００７１】この方法は、ＴＰＯを含有する不溶性物質
を、カオトロピック剤で可溶化することを提供してお
り、ここでこのカオトロピック剤は、グアニジンの塩、
チオシアン酸ナトリウム、または尿素から選択される。
この方法はさらに、可溶化されたＴＰＯを、遠心、ゲル
濾過および逆相クロマトグラフィーから選ばれる１また
はそれ以上の工程によって他の可溶性および不溶性物質
から分離することを提供している。この方法の再折り畳
み工程は、酸化および還元剤の両者を含む酸化還元緩衝
液を提供している。一般に、酸化剤は酸素または少なく
とも１個のジスルフィド結合を含む化合物であり、還元
剤は少なくとも１個の遊離スルフヒドリルを含む化合物
である。好ましくは、酸化剤は酸化型グルタチオン（Ｇ
ＳＳＧ）およびシスチンから選ばれ、還元剤は還元型グ
ルタチオン（ＧＳＨ）およびシステインから選ばれる。
最も好ましくは、酸化剤は酸化型グルタチオン（ＧＳＳ
Ｇ）であり、還元剤は還元型グルタチオン（ＧＳＨ）で
ある。酸化剤のモル比は還元剤のモル比と等しいかまた
はより大であることもまた好ましい。酸化還元緩衝液は
さらに、好ましくはＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯから
選ばれ少なくとも１％のレベルで存在する洗浄剤を含有
する。酸化還元緩衝液はさらに、好ましくは約０．１−
０．５Ｍの濃度範囲のＮａＣｌ、および好ましくは１５
％以上の濃度のグリセロールを含有する。酸化還元緩衝
液のｐＨは、好ましくは約ｐＨ７．５−ｐＨ９．０の範
囲であり、再折り畳み工程は４度で１２−４８時間実施
する。再折り畳み工程は、ＥＰＯドメインのアミノ末端
に最も近いＣｙｓとカルボキシ末端に最も近いＣｙｓの
間にジスルフィド結合が形成された、生物活性なＴＰＯ
を生成する。The method provides for solubilizing an insoluble material containing TPO with a chaotropic agent, wherein the chaotropic agent comprises a salt of guanidine,
It is selected from sodium thiocyanate or urea.
The method further provides for separating the solubilized TPO from other soluble and insoluble materials by one or more steps selected from centrifugation, gel filtration, and reverse phase chromatography. The refolding step of this method provides a redox buffer containing both oxidizing and reducing agents. Generally, the oxidizing agent is oxygen or a compound containing at least one disulfide bond, and the reducing agent is a compound containing at least one free sulfhydryl. Preferably, the oxidizing agent is oxidized glutathione (G
SSG) and cystine, and the reducing agent is selected from reduced glutathione (GSH) and cysteine.
Most preferably, the oxidizing agent is oxidized glutathione (GSS
G), and the reducing agent is reduced glutathione (GSH). It is also preferred that the molar ratio of the oxidizing agent is equal to or greater than the molar ratio of the reducing agent. The redox buffer further contains a detergent, preferably selected from CHAPS and CHAPSO, and present at a level of at least 1%. The redox buffer is further preferably, about 0.1-
NaCl in a concentration range of 0.5M, and preferably 15
Contains glycerol in a concentration of at least%. The pH of the redox buffer is preferably in the range of about pH 7.5-pH 9.0, and the refolding step is performed at 4 degrees for 12-48 hours. The refolding step involves the formation of a bioactive TPO in which a disulfide bond has been formed between Cys closest to the amino terminus and Cys closest to the carboxy terminus of the EPO domain.
Generate

【００７２】本発明はさらに、（１）微生物の少なくと
も細胞外膜を溶菌し、（２）ＴＰＯを含有する溶菌液を
カオトロピック剤で処理し、（３）このＴＰＯを再折り
畳みし、そして、（４）不純物および誤折り畳みされた
ＴＰＯを正しく折り畳まれたＴＰＯから分離する、こと
からなる、生物活性なＴＰＯを微生物から精製するため
の方法を包含する。The present invention further provides (1) lysing at least the extracellular membrane of a microorganism, (2) treating a lysate containing TPO with a chaotropic agent, (3) refolding the TPO, and 4) Separating impurities and misfolded TPO from correctly folded TPO, comprising a method for purifying bioactive TPO from microorganisms.

【００７３】 〔発明の詳細な説明〕 Ｉ．定義 一般に以下の語または句は、説明、実施例、および請求
の範囲に使用される場合、示される定義を有する。「カ
オトロピック剤」とは、水溶液および適当な濃度におい
て、蛋白の正常な二次および三次構造の維持を司る力を
少なくとも部分的に破壊することにより、該蛋白の空間
的コンフィギュレーションまたはコンホメーションに変
化を起こすことのできる化合物を指す。このような化合
物は、例えば、尿素、グアニジンＨＣｌ、およびチオシ
アン酸ナトリウムを包含する。蛋白にコンホメーション
の作用を及ぼすには、高濃度、通常４−９Ｍのこれらの
化合物が必要である。[Detailed Description of the Invention] Definitions In general, the following words or phrases have the indicated definitions when used in the description, examples, and claims. "Chaotropic agents" refer to the spatial configuration or conformation of a protein in aqueous solution and at appropriate concentrations by at least partially disrupting the forces responsible for maintaining the normal secondary and tertiary structure of the protein. Refers to a compound capable of effecting a change. Such compounds include, for example, urea, guanidine HCl, and sodium thiocyanate. High concentrations, usually 4-9M, of these compounds are required to exert a conformational effect on the protein.

【００７４】「サイトカイン」とは、細胞間仲介物質と
して別の細胞に作用する、一つの細胞集団により放出さ
れる蛋白の総称である。係るサイトカインの例は、リン
ホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホル
モンである。成長ホルモン、インシュリン様成長因子、
ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、
牛成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、イン
シュリン、プロイインシュリン、リラキシン、プロリラ
キシン、糖蛋白ホルモン類、例えば卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄
体化ホルモン（ＬＨ）、造血成長因子、肝細胞成長因
子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲ
ン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−
β）、ミュレリアン阻害物質、マウスゴナドトロピン付
随ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞成
長因子、インテグリン、神経成長因子、例えばＮＧＦ−
β、血小板成長因子、トランスフォーミング成長因子
（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、イン
シュリン様成長因子−Ｉおよび−II、エリスロポエチン
（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、例えばイ
ンターフェロン−α、−β、および−γ、コロニー刺激
因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−
ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インター
ロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ
−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ
−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２な
らびにＬＩＦ、ＳＣＦ、およびｋｉｔ−リガンドを包含
するその他のポリペプチド因子である。本明細書中使用
される前記の語は、天然供給源からのまたは組換え細胞
培養からの蛋白の包含を意味する。同様に、これらの語
は、生物活性な等価物、例えば１またはそれ以上のアミ
ノ酸によってアミノ酸配列が相違、またはグリコシル化
の型もしくは程度が相違している等価物を包含すること
を意図している。“Cytokine” is a generic term for proteins released by one cell population that act on another cell as intercellular mediators. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and conventional polypeptide hormones. Growth hormone, insulin-like growth factor,
Human growth hormone, N-methionyl human growth hormone,
Bovine growth hormone, parathyroid hormone, thyroxine, insulin, pleuinsulin, relaxin, prorelaxin, glycoprotein hormones such as follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH), and luteinizing hormone (LH), hematopoietic growth Factor, hepatocyte growth factor, fibroblast growth factor, prolactin, placental lactogen, tumor necrosis factor-α (TNF-α and TNF-
β), Murerian inhibitor, mouse gonadotropin-associated peptide, inhibin, activin, vascular endothelial cell growth factor, integrin, nerve growth factor such as NGF-
β, platelet growth factor, transforming growth factor (TGF), such as TGF-α and TGF-β, insulin-like growth factors-I and -II, erythropoietin (EPO), osteoinductive factor, interferon, such as interferon-α,- β and -γ, colony stimulating factor (CSF) such as macrophage-CSF (M-
CSF), granulocyte-macrophage-CSF (GM-C
SF) and granulocyte-CSF (G-CSF), interleukin (IL) such as IL-1, IL-1α, IL
-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL
-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 and other polypeptide factors including LIF, SCF, and kit-ligand. The term as used herein refers to the inclusion of proteins from natural sources or from recombinant cell culture. Similarly, these terms are intended to include biologically active equivalents, such as those that differ in amino acid sequence by one or more amino acids, or that differ in the type or degree of glycosylation. .

【００７５】「ｍｐｌリガンド」、「ｍｐｌリガンドポ
リペプチド」、「ＭＬ」、「トロンボポエチン」または
「ＴＰＯ」は本明細書中、互換的に使用され、ｍｐｌ、
サイトカインレセプタースーパーファミリーの一員に結
合する特性を持ち、そして下に定義されるようなＭＬの
生物学的性質を有する任意のポリペプチドを含む。生物
学的性質の例は、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトさせ
たＩＬ−３依存Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの標識された
ヌクレオチド（例えば³Ｈ−チミジン）の取り込みを刺
激する能力である。生物学的性質のもう一つの例は、マ
ウス血小板リバウンド検定において循環血小板中への³⁵
Ｓの取り込みを刺激する能力である。この定義は、本明
細書に記載の再生不良性ブタ血漿のようなｍｐｌリガン
ド供給源から、またはヒトを包含する他の動物種のよう
な別の供給源から分離された、または、組換えもしくは
合成法により製造された該ポリペプチドを包含し、ま
た、その機能的誘導体、フラグメント、対立遺伝子、イ
ソ型および類似体を含む変異体型を包含する。“Mpl ligand”, “mpl ligand polypeptide”, “ML”, “thrombopoietin” or “TPO” are used interchangeably herein and refer to mpl,
Includes any polypeptide that has the property of binding to a member of the cytokine receptor superfamily and has the biological properties of ML as defined below. An example of a biological property is the ability to stimulate the incorporation of labeled nucleotides (eg, ³ H-thymidine) into the DNA of IL-3-dependent Ba / F3 cells transfected with human mplP. Another example of a biological property is the ³⁵ platelet in circulating platelets in the mouse platelet rebound assay.
Ability to stimulate S uptake. This definition may be isolated from a mpl ligand source, such as the aplastic porcine plasma described herein, or from another source, such as other animal species, including humans, or may be recombinant or It encompasses the polypeptides produced by synthetic methods, as well as mutant forms including functional derivatives, fragments, alleles, isoforms and analogs thereof.

【００７６】「ｍｐｌリガンドフラグメント」または
「ＴＰＯフラグメント」は、１またはそれ以上のアミノ
酸残基または炭水化物単位が除去された、天然に存在す
る成熟全長ｍｐｌリガンドまたはＴＰＯ配列の一部分で
ある。除去されるアミノ酸残基は、Ｎ末端もしくはＣ末
端または内部を包含する該ペプチドのどこにあってもよ
い。このフラグメントは、ｍｐｌリガンドに共通する少
なくとも一つの生物学的性質を共有するであろう。ｍｐ
ｌリガンドフラグメントは典型的には、再生不良性ブタ
血漿またはヒトもしくはマウスリガンドから分離される
リガンドを包含する哺乳動物から分離されたｍｐｌリガ
ンド、とりわけそのＥＰＯドメインの配列と同一の、少
なくとも１０、１５、２０、２５、３０、または４０ア
ミノ酸残基の連続する配列を有するであろう。Ｎ末端フ
ラグメントの代表例はｈＭＬ₁₅₃またはＴＰＯ（Ｍｅｔ
^-1１−１５３）である。A "mpl ligand fragment" or "TPO fragment" is a portion of a naturally occurring mature full-length mpl ligand or TPO sequence with one or more amino acid residues or carbohydrate units removed. The amino acid residues to be removed may be anywhere in the peptide, including the N-terminus or C-terminus or inside. This fragment will share at least one biological property common to mpl ligands. mp
The l-ligand fragment is typically at least 10, 15 identical to the sequence of the amplifying porcine plasma or mpl ligand isolated from mammals, including ligands isolated from human or mouse ligands, especially its EPO domain. , 20, 25, 30, or 40 amino acid residues. Representative examples of N-terminal fragments HML ₁₅₃ or TPO (Met
^-1 1-153).

【００７７】本明細書に定義される「ｍｐｌリガンド変
異体」または「ｍｐｌリガンド配列変異体」とは、組換
え細胞培養または再生不良性ブタ血漿から分離されたｍ
ｐｌリガンドまたは図１および図２に記載の導き出され
た配列（配列番号１）を有するヒトリガンドと１００％
未満の配列一致を有する、下に定義される生物活性ｍｐ
ｌリガンドを意味する。通常、生物活性なｍｐｌリガン
ド変異体は、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌ
リガンドまたは成熟マウスもしくはヒトリガンドまたは
そのフラグメントと少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、
さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましく
は少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくと
も約９５％のアミノ酸配列一致を有するアミノ酸配列を
有するであろう（図１および図２［配列番号１］を参照
されたい）。As used herein, “mpl ligand variant” or “mpl ligand sequence variant” refers to recombinant cell culture or mRNA isolated from aplastic porcine plasma.
pl ligand or a human ligand having the derived sequence (SEQ ID NO: 1) set forth in FIGS.
A biological activity mp as defined below with less than a sequence match
means 1 ligand. Usually, the biologically active mpl ligand variant is mpl isolated from aplastic pig plasma.
At least 70%, preferably at least about 75%, more preferably at least about 80% with the ligand or mature mouse or human ligand or fragment thereof,
More preferably it will have an amino acid sequence with at least about 85%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95% amino acid sequence identity (see FIGS. 1 and 2 [SEQ ID NO: 1]. I want to.)

【００７８】「キメラｍｐｌリガンド」は、全長のｍｐ
ｌリガンドを含むポリペプチド、または第二のヘテロロ
ーガスポリペプチドと融合または結合したその１もしく
はそれ以上のフラグメント、またはそれらの１もしくは
それ以上のフラグメントである。このキメラは、ｍｐｌ
リガンドに共通する少なくとも一つの生物学的性質を共
有するであろう。第二のポリペプチドは典型的にはサイ
トカイン、免疫グロブリンまたはそのフラグメントであ
ろう。“Chimeric mpl ligand” refers to full length mp
A polypeptide comprising a ligand, or one or more fragments thereof, or one or more fragments thereof, fused or linked to a second heterologous polypeptide. This chimera is mpl
The ligands will share at least one biological property in common. The second polypeptide will typically be a cytokine, immunoglobulin or fragment thereof.

【００７９】「分離されたｍｐｌリガンド」、「高度に
精製されたｍｐｌリガンド」および「実質上均質なｍｐ
ｌリガンド」は互換的に使用され、ｍｐｌリガンド供給
源から精製され、または組換えもしくは合成法により製
造され、（１）スピニングカップシークエネーターまた
は入手し得る最良の市販アミノ酸シークエネーターを使
用することにより、または本出願の出願日現在公表され
ている方法により修飾された、少なくとも１５および好
ましくは２０アミノ酸残基のＮ末端または内部アミノ酸
配列を取得するに十分な程、または、（２）クマシーブ
ルーもしくは好ましくは銀染色を用いる非還元もしくは
還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質に至るに十
分な程、他のペプチドもしくは蛋白を実質上含まない、
ｍｐｌリガンドを意味する。本明細書における均質性と
は、他の供給源蛋白による、約５％未満の汚染を意味す
る。“Isolated mpl ligand”, “highly purified mpl ligand” and “substantially homogeneous mpl ligand”
"Ligand" is used interchangeably, purified from mpl ligand source, or produced recombinantly or synthetically, by (1) using a spinning cup sequenator or the best commercially available amino acid sequenator available. Or sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 and preferably 20 amino acid residues modified by the methods published as of the filing date of the present application, or (2) Coomassie blue or Substantially free of other peptides or proteins sufficient to achieve homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions, preferably using silver staining.
mpl ligand. Homogeneity herein means less than about 5% contamination by other source proteins.

【００８０】「ｍｐｌリガンド」または「分離されたｍ
ｐｌリガンド」のいずれかと共に使用される場合、「生
物学的性質」とは、血小板形成活性を有すること、また
は、ｍｐｌリガンド（天然または変性コンホメーション
の如何に拘わらず）もしくはそのフラグメントにより直
接的または間接的に惹起または遂行されるインビボエフ
ェクターもしくは抗原機能もしくは活性を意味する。エ
フェクター機能とは、ｍｐｌ結合および任意の担体結合
活性、ｍｐｌのアゴニズムまたはアンタゴニズム、特に
複製を包含する増殖シグナルの変換、ＤＮＡ調節機能、
他のサイトカインの生物活性の調節、レセプター（特に
サイトカイン）活性化、不活性化、上方または下方調
節、細胞の成長または分化等を包含する。抗原機能と
は、天然ｍｐｌリガンドに対して作製された抗体と交差
反応できるエピトープまたは抗原部位の所有を意味す
る。ｍｐｌリガンドポリペプチドの主要な抗原機能は、
それが、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガ
ンドに対して作製された抗体と、少なくとも約１０⁶ｌ
／ｍｏｌｅの親和性で結合することである。普通、該ポ
リペプチドは、少なくとも約１０⁷ｌ／ｍｏｌｅの親和
性で結合する。最も好ましくは、抗原的に活性なｍｐｌ
リガンドポリペプチドは、上記エフェクター機能のうち
一つを有するｍｐｌリガンドに対して作製された抗体と
結合するポリペプチドである。「生物活性」を定義する
ために使用される抗体は、組換え細胞培養または再生不
良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガンドを完全フロ
イントアジュバント中に調合し、この調合物を皮下注射
し、そしてｍｐｌリガンド抗体の力価がプラトーに達す
るまでこの調合物の腹腔内注射により免疫反応を追加免
疫することによって作成されるウサギポリクローナル抗
体である。“Mpl ligand” or “isolated m”
"Biological property" when used in conjunction with any of the "pl ligands" refers to having platelet forming activity, or directly to the mpl ligand (whether in a native or denatured conformation) or a fragment thereof. Means an in vivo effector or antigen function or activity that is triggered or performed, either directly or indirectly. Effector functions include mpl binding and any carrier binding activity, agonism or antagonism of mpl, particularly transduction of growth signals, including replication, DNA regulatory functions,
Modulation of biological activity of other cytokines, activation and inactivation of receptors (particularly cytokines), up- or down-regulation, cell growth or differentiation and the like are included. Antigen function refers to possession of an epitope or antigenic site capable of cross-reacting with an antibody raised against a natural mpl ligand. The major antigenic function of the mpl ligand polypeptide is
It comprises antibodies raised against mpl ligand isolated from aplastic pig plasma and at least about 10 ⁶ l
/ Mole affinity. Usually, the polypeptide binds with an affinity of at least about 10 ⁷ l / mole. Most preferably, the antigenically active mpl
A ligand polypeptide is a polypeptide that binds to an antibody generated against an mpl ligand having one of the above effector functions. Antibodies used to define "biological activity" consist of formulating mpl ligand isolated from recombinant cell culture or aplastic pig plasma in complete Freund's adjuvant, injecting the formulation subcutaneously, and mpl Rabbit polyclonal antibody generated by boosting the immune response by intraperitoneal injection of this formulation until the ligand antibody titer plateaus.

【００８１】「ｍｐｌリガンド」または「分離されたｍ
ｐｌリガンド」のいずれかと共に使用される場合、「生
物活性な」とは、血小板形成活性を示す、または再生不
良性ブタ血漿から分離される、もしくは本明細書に記載
の組換え細胞培養中で発現される、ｍｐｌリガンドのエ
フェクター機能を共有する、ｍｐｌリガンドまたはポリ
ペプチドを意味する。本発明に係るｍｐｌリガンドまた
はポリペプチドの主要な既知のエフェクター機能は、ｍ
ｐｌへの結合、および、ヒトｍｐｌＰでトランスフェク
トさせたＩＬ−３依存Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの標識
ヌクレオチド（³Ｈ−チミジン）の取り込みの刺激であ
る。本発明に係るｍｐｌリガンドまたはポリペプチドの
もう一つの既知のエフェクター機能は、マウス血小板リ
バウンド検定における循環血小板への³⁵Ｓの取り込みを
刺激する能力である。さらに別の知られているｍｐｌリ
ガンドのエフェクター機能は、巨核球糖蛋白ＧＰII_bIII
_aに特異的な放射標識されたモノクローナル抗体を用い
ることにより定量され得る、インビトロヒト巨核球形成
の刺激能力である。“Mpl ligand” or “isolated m”
"Bioactive" when used in conjunction with any of the "pl ligands" refers to platelet forming activity, or isolated from aplastic porcine plasma, or in a recombinant cell culture as described herein. A mpl ligand or polypeptide is expressed that shares the effector function of the mpl ligand. The major known effector functions of the mpl ligand or polypeptide according to the invention are:
binding to pl, and a capture stimulation were transfected with human mplP IL-3 dependent Ba / F3-labeled nucleotides into the cellular DNA ⁽³ H- thymidine). Another known effector function of the mpl ligand or polypeptide according to the invention is the ability to stimulate ³⁵ S uptake into circulating platelets in a mouse platelet rebound assay. Furthermore effector function of mpl ligand Another known are megakaryocyte glycoprotein GPII _b III
_The ability to stimulate human megakaryocyte formation in vitro, which can be quantified by using a radiolabeled monoclonal antibody specific for a.

【００８２】ｍｐｌリガンド配列に関する「パーセント
アミノ酸配列一致」とは、本明細書において、同類置換
は配列一致の一部とは考えずに、最大の配列一致パーセ
ントを達成するために、必要ならば間隙を導入して配列
を並べた後の、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐ
ｌリガンド配列、または、図１および図２に記載される
導き出されたアミノ酸配列(配列番号１)を有するマウス
もしくはヒトのリガンド中の残基と一致する、候補配列
中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
ｍｐｌリガンド配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸
長、除去または挿入は配列一致または相同性に影響を及
ぼすとはみなさない。したがって、同一の配列を有する
と考えられる生物活性なｍｐｌリガンドポリペプチドの
例は、プレプロ−ｍｐｌリガンド、プロ−ｍｐｌリガン
ド、および成熟ｍｐｌリガンドを包含する。“Percent amino acid sequence identity” with respect to the mpl ligand sequence, as used herein, refers to conservative substitutions that are not considered part of the sequence identity, but are used to achieve maximum percent sequence identity, if any, Mp isolated from aplastic pig plasma after introducing
l as a percentage of the amino acid residues in the candidate sequence that correspond to the residues in the ligand sequence or mouse or human ligand having the derived amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) set forth in FIGS. Defined.
N-terminal, C-terminal, or internal extensions, deletions or insertions into the mpl ligand sequence are not considered to affect sequence identity or homology. Thus, examples of biologically active mpl ligand polypeptides that are considered to have the same sequence include prepro-mpl ligand, pro-mpl ligand, and mature mpl ligand.

【００８３】「ｍｐｌリガンド微細配列決定」は、その
方法が十分感受性である限り、任意の適当な標準法によ
って達成することができる。一つのこのような方法にお
いては、ＳＤＳゲルまたは最終的ＨＰＬＣ工程から得ら
れた高度に精製されたポリペプチドを、１２０Ａフェニ
ルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析機を備えた
モデル４７０Ａアプライド・バイオシステムズ・気相シ
ークエンサーを用いて自動化エドマン（フェニルイソチ
オシアナート）分解により直接配列決定する。さらに、
化学的（例えばＣＮＢｒ、ヒドロキシアミン、２−ニト
ロ−５−チオシアノベンゾアート）または酵素的（例え
ばトリプシン、クロストリパイン、スタフィロコッカス
プロテアーゼ）消化とその後のフラグメント精製（例え
ばＨＰＬＣ）によって製造されたｍｐｌリガンドフラグ
メントを同様に配列決定することができる。ＰＴＨアミ
ノ酸はクロムパーフェクトデータシステム（ジャスティ
ス・イノヴェーションズ、パロ・アルト、ＣＡ）を用い
て分析する。配列の解釈を、ヘンゼル等、J.Chromatogr
athy、４０４巻４１−５２頁［１９８７］に記載のよう
にＶＡＸ １１／７８５ディジタル・イクイップメント
・Ｃｏ．コンピューター上で実施する。所望により、Ｈ
ＰＬＣ画分のアリコートを５−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（プロブロット、ＡＩＢ、
フォスターシティー、ＣＡ）に電気的に転移させ、クマ
シーブリリアントブルーで染色することもできる（マト
ゥサーディアラ、J.Biol.Chem.、２６２巻１００３５−
１００３８頁［１９８７］。染色により同定された特異
蛋白をブロットから切り取り、Ｎ末端配列決定を上記の
気相シークエネーターで実施する。内部蛋白配列につい
ては、ＨＰＬＣ画分を減圧下に乾燥し（スピードヴァ
ク）、適当な緩衝液に再懸濁し、臭化シアン、Ｌｙｓ特
異的酵素Ｌｙｓ−Ｃ（ワコー・ケミカルズ、リッチモン
ド、ＶＡ）、またはＡｓｐ−Ｎ（ベーリンガー・マンハ
イム、インディアナポリス、ＩＮ）で消化する。消化
後、得られたペプチドを、混合物として配列決定する
か、または、０．１％ＴＦＡ中のプロパノール勾配で展
開するＣ４カラム上でのＨＰＬＣ分解後に気相配列決定
する。"Mpl ligand microsequencing" can be accomplished by any suitable standard method, so long as the method is sufficiently sensitive. In one such method, highly purified polypeptide obtained from an SDS gel or a final HPLC step is combined with a Model 470A Applied Biosystems equipped with a 120A phenylthiohydantoin (PTH) amino acid analyzer. Direct sequencing by automated Edman (phenylisothiocyanate) digestion using a phase sequencer. further,
Produced by chemical (eg, CNBr, hydroxyamine, 2-nitro-5-thiocyanobenzoate) or enzymatic (eg, trypsin, clostripain, staphylococcal protease) digestion followed by fragment purification (eg, HPLC). The mpl ligand fragment can be similarly sequenced. PTH amino acids are analyzed using the Chrom Perfect Data System (Justice Innovations, Palo Alto, CA). Interpretation of the sequence by Hansel et al., J. Chromatogr
athy, VAX 11/785 Digital Equipment Co. as described in 404, 41-52 [1987]. Implement on a computer. H if desired
An aliquot of the PLC fraction is 5-20% SDS-PAGE
On a PVDF membrane (Problot, AIB,
(Foster City, Calif.) And stained with Coomassie Brilliant Blue (Matsardiala, J. Biol. Chem., 262: 10035-).
10038 [1987]. Specific proteins identified by staining are excised from the blot and N-terminal sequencing is performed on the gas phase sequenator described above. For internal protein sequences, HPLC fractions were dried under reduced pressure (Speedvac), resuspended in a suitable buffer, and cyanogen bromide, Lys-specific enzyme Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA). Or Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). After digestion, the resulting peptides are sequenced as a mixture or gas phase sequence after HPLC digestion on a C4 column developed with a propanol gradient in 0.1% TFA.

【００８４】「血小板減少症」とは、血液１リットルに
つき１５０ｘ１０⁹未満の血小板数として定義される。“Thrombocytopenia” is defined as a platelet count of less than 150 × 10 ⁹ per liter of blood.

【００８５】「血小板形成活性」とは、巨核球または巨
核球前駆体がこれらの細胞の血小板産生型へと増殖、分
化および／または成熟する事を加速することを構成する
生物活性として定義される。この活性は、インビボマウ
ス血小板リバウンド合成検定、ヒト白血病巨核芽球セル
ライン（ＣＭＫ）のための抗血小板イムノアッセイ（抗
ＧＰII_bIII_a）により測定される血小板細胞表面抗原検
定の誘導、および巨核芽球セルライン（ＤＡＭＩ）にお
ける多能化の誘導を包含する様々な検定で測定すること
ができる。"Platelet forming activity" is defined as the biological activity that constitutes the acceleration of megakaryocytes or megakaryocyte precursors to proliferate, differentiate and / or mature these cells into a platelet-producing form. . This activity, in vivo mouse platelet rebound synthesis assay, induction of platelet cell surface antigen assay as measured by an anti-platelet immunoassay (anti-GPII _b III _a) for human leukemia megakaryoblastic cell line (CMK), and megakaryocytes It can be measured in a variety of assays involving induction of pluripotency in cell lines (DAMI).

【００８６】「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）とは、血
小板形成活性を有する、または哺乳動物において血清の
血小板数を増加させることのできる化合物として定義さ
れる。ＴＰＯは好ましくは、内因性血小板数を少なくと
も１０％、より好ましくは５０％増加させることがで
き、最も好ましくは人間の血小板数を血液１リットル当
たり１５０ｘ１０⁹以上に上昇させることができる。"Thrombopoietin" (TPO) is defined as a compound having platelet forming activity or capable of increasing serum platelet count in a mammal. TPO is preferably a number of endogenous platelet least 10%, more preferably can be increased 50%, and most preferably a number of human platelets can be increased to 150 × 10 ⁹ or more per blood liter.

【００８７】「分離されたｍｐｌリガンド核酸」とは、
生物活性なｍｐｌリガンドもしくはそのフラグメントを
コードしている１６好ましくは２０またはそれ以上の連
続したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡもしくはＤＮＡで
あるか、該ＲＮＡもしくはＤＮＡに相補的であるか、ま
たは該ＲＮＡもしくはＤＮＡとハイブリダイズして中等
度ないし緊縮条件下で安定に結合し続ける。このＲＮＡ
またはＤＮＡは、普通天然供給源に付随している少なく
とも一つの汚染源核酸を含まず、好ましくは他のいかな
る哺乳動物のＲＮＡまたはＤＮＡをも実質上含まない。
「普通付随している少なくとも一つの汚染源核酸を含ま
ない」という句は、該核酸がその供給源または天然細胞
中に存在してはいるが、異なった染色***置にある、ま
たはその他の状態でその供給源細胞に正常では見いださ
れない核酸配列と隣接している場合を包含する。分離さ
れたｍｐｌリガンド核酸の例は、ヒト、マウスまたはブ
タｍｐｌリガンドと少なくとも７５％の配列一致、より
好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なく
とも８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは
９５％の配列一致を共有する生物活性なｍｐｌリガンド
をコードしているＲＮＡまたはＤＮＡである。“Isolated mpl ligand nucleic acid”
An RNA or DNA comprising 16 preferably 20 or more contiguous nucleotide bases encoding a biologically active mpl ligand or fragment thereof, complementary to said RNA or DNA, or said RNA or DNA And remain stable under moderate to stringent conditions. This RNA
Alternatively, the DNA is free of at least one contaminant nucleic acid normally associated with natural sources, and is preferably substantially free of any other mammalian RNA or DNA.
The phrase "does not include at least one contaminant nucleic acid that is normally associated with" means that the nucleic acid is present in its source or natural cell, but at a different chromosomal location or otherwise. Includes flanking nucleic acid sequences not normally found in the source cell. An example of an isolated mpl ligand nucleic acid is at least 75% sequence identity with a human, mouse or porcine mpl ligand, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably 90%, and most preferably 95%. RNA or DNA encoding a biologically active mpl ligand sharing the sequence identity of

【００８８】発現に言及する場合の「調節配列」とは、
特定の宿主生物における機能的に結合したコード化配列
の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適
な調節配列は、例えば、プロモーター、所望によりオペ
レーター配列、リボソーム結合部位、そして恐らくはま
だあまり理解されていない配列を包含する。真核生物細
胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および
エンハンサーを利用することが知られている。“Regulatory sequences” when referring to expression include:
A DNA sequence necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. The control sequences that are suitable for prokaryotes, for example, include a promoter, optionally an operator sequence, a ribosome binding site, and possibly a poorly understood sequence. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

【００８９】核酸に言及する場合の「機能的に結合し
た」とは、当該核酸が別の核酸配列と機能的な関係に位
置することを意味する。例えば、プレ配列または分泌リ
ーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に
参加するプレ蛋白として発現されるならば、そのポリペ
プチドのためのＤＮＡと機能的に結合しており；プロモ
ーターまたはエンハンサーは、それがコード化配列の転
写に影響するならば、その配列と機能的に結合してお
り；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進
するように位置しているならば、コード化配列と機能的
に結合している。一般に、「機能的に結合した」とは、
結合しているＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リ
ーダーの場合には、隣接し且つ読み取り枠内にある。し
かしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。
結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成さ
れる。もしそのような部位が存在しない場合、常法に従
って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカー
を使用する。"Operably linked" when referring to a nucleic acid means that the nucleic acid is in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a presequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer Is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of that sequence; or, if the ribosome binding site is located so as to facilitate translation, Functionally associated with the sequence. Generally, "functionally linked"
The DNA sequences being linked are contiguous and, in the case of a secretory leader, contiguous and in reading frame. However, enhancers need not be contiguous.
Binding is achieved by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to standard methods.

【００９０】要素に言及する場合の「外因性」とは、そ
の細胞にとって外来性であるか、またはその細胞にとっ
てホモローガスではあるがその要素が通常見いだされな
い宿主細胞核酸内の位置にある、核酸を意味する。“Exogenous” when referring to an element refers to a nucleic acid that is either exogenous to the cell or is homologous to the cell but at a location within the host cell nucleic acid where the element is not normally found. Means

【００９１】「細胞」、「セルライン」、および「細胞
培養」は本明細書中、互換的に用いられ、係る表現は或
る細胞またはセルラインの子孫全てを包含する。したが
って、例えば、「形質転換体」および「形質転換された
細胞」というような語は、第一番目の対象細胞および、
転移の回数に拘わらずそれから誘導された培養を包含す
る。全ての子孫は、故意のまたは偶然の突然変異のため
に、ＤＮＡ含有量が厳密に同一ではないかも知れないと
いうこともまた理解される。最初に形質転換された細胞
においてスクリーニングされたものと同じ機能または生
物活性を有する突然変異体子孫が包含される。明確な表
記が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。The terms “cell,” “cell line,” and “cell culture” are used interchangeably herein, and such expressions include all progeny of a cell or cell line. Thus, for example, terms such as "transformants" and "transformed cells" include the first subject cell and
Includes cultures derived therefrom regardless of the number of transfers. It is also understood that all progeny may not be exactly identical in DNA content, due to deliberate or accidental mutations. Mutant progeny that have the same function or biological activity as screened for in the originally transformed cell are included. If a clear notation is intended, it will be clear from the context.

【００９２】「プラスミド」は、独立した複製起点を有
する自立的に複製する環状ＤＮＡ分子であり、本明細書
では、大文字および／または数字の前および／または後
の小文字「ｐ」によって表記される。本発明における出
発プラスミドは、市販品を入手できるか、無制限に一般
に入手できるか、または公表されている方法に従って係
る入手可能なプラスミドから組み立てることができる。
加えて、その他の等価なプラスミドが当分野で知られて
おり、当業者には明らかであろう。A “plasmid” is an autonomously replicating circular DNA molecule having an independent origin of replication, herein designated by a lower case “p” before and / or after a capital letter and / or number. . The starting plasmids in the present invention are commercially available, generally available without limitation, or can be assembled from such available plasmids according to published methods.
In addition, other equivalent plasmids are known in the art and will be apparent to those skilled in the art.

【００９３】ＤＮＡに言及する場合の「制限酵素消化」
とは、ＤＮＡ配列の或る位置または部位にのみ作用する
酵素でそのＤＮＡの内部ホスホジエステル結合を触媒的
に開裂することを意味する。このような酵素は「制限エ
ンドヌクレアーゼ」と呼ばれる。それぞれの制限エンド
ヌクレアーゼは、二倍対称を示す「制限部位」と呼ばれ
る特異的ＤＮＡ配列を認識する。本発明において使用さ
れる種々の制限酵素は市販品が入手でき、酵素供給者に
より確立されたそれらの反応条件、補助因子、およびそ
の他の要件が用いられる。制限酵素は一般に、それぞれ
の制限酵素が最初に得られた微生物を表す大文字とその
後の他の文字、そして次に特定の酵素を指定する数字か
ら成る略語によって表記される。一般に、プラスミドま
たはＤＮＡフラグメント約１μｇが、緩衝溶液約２０μ
ｌ中約１−２単位の酵素と共に使用される。特定の制限
酵素のための適当な緩衝液および基質量は、製造者によ
り明記されている。３７℃で約１時間のインキュベーシ
ョンが普通用いられるが、供給者の指示によって変わり
得る。インキュベーションの後、蛋白またはポリペプチ
ドをフェノールおよびクロロホルムでの抽出により除去
し、消化された核酸をエタノールによる沈澱化により水
性画分から回収する。制限酵素による消化の後に、末端
５'ホスファートの細菌アルカリホスファターゼ加水分
解を行い、ＤＮＡフラグメントの二つの制限開裂端の
「環化」、または制限部位への別のＤＮＡフラグメント
の挿入を妨害する閉鎖ループの形成、を防止する。別途
記載の無い限り、プラスミドの消化の後の５'末端脱燐
酸化は行われない。脱燐酸化のための手法および試薬
は、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリー・マニュアル［ニューヨーク：コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９
８９］の１．５６−１．６１項に記載のように常套的で
ある。"Restriction enzyme digestion" when referring to DNA
By "enzyme" is meant that an enzyme that acts only at a certain position or site in a DNA sequence catalytically cleaves the internal phosphodiester bond of the DNA. Such enzymes are called "restriction endonucleases". Each restriction endonuclease recognizes a specific DNA sequence called a "restriction site" that exhibits a twofold symmetry. The various restriction enzymes used in the present invention are commercially available and use their reaction conditions, cofactors, and other requirements established by the enzyme supplier. Restriction enzymes are generally abbreviated by a capital letter representing the microorganism from which each restriction enzyme was originally obtained, followed by other letters, and then a number designating the particular enzyme. Generally, about 1 μg of plasmid or DNA fragment is
Used with about 1-2 units of enzyme per liter. Appropriate buffers and substrate amounts for particular restriction enzymes are specified by the manufacturer. Incubations of about 1 hour at 37 ° C. are commonly used, but can vary according to the instructions of the supplier. After incubation, proteins or polypeptides are removed by extraction with phenol and chloroform, and the digested nucleic acids are recovered from the aqueous fraction by precipitation with ethanol. After digestion with a restriction enzyme, bacterial alkaline phosphatase hydrolysis of the terminal 5 'phosphate is performed, resulting in a "cyclization" of the two restriction cleavage ends of the DNA fragment, or a closed loop which prevents insertion of another DNA fragment into the restriction site. The formation of. Unless otherwise stated, 5 ′ end dephosphorylation after digestion of the plasmid is not performed. Techniques and reagents for dephosphorylation are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19
89], section 1.56-1.61.

【００９４】制限消化物からのＤＮＡの所定のフラグメ
ントの「回収」または「分離」とは、電気泳動によるポ
リアクリルアミドまたはアガロースゲル上での消化物の
分離、その移動度を既知分子量のマーカーＤＮＡフラグ
メントの移動度に対して比較することによる目的フラグ
メントの同定、所望フラグメントを含有するゲル切片の
切り取り、およびＤＮＡからのそのゲルの分離を意味す
る。この方法は一般に知られている。例えば、ローン
等、Nucleic Acids Res.、９巻６１０３−６１１４頁
［１９８１］、およびゲッデル等、Nucleic Acids Re
s.、８巻４０５７頁［１９８０］を参照されたい。"Recovery" or "separation" of a predetermined fragment of DNA from a restriction digest refers to separation of the digest by electrophoresis on a polyacrylamide or agarose gel, and determination of the mobility of a marker DNA fragment having a known molecular weight. Identification of the fragment of interest by comparing against the mobility of the DNA fragment, excising the gel slice containing the desired fragment, and separating the gel from the DNA. This method is generally known. For example, Loan et al., Nucleic Acids Res., Vol. 9, pp. 6103-6114 [1981], and Geddel et al., Nucleic Acids Re.
s., 8, 4057 [1980].

【００９５】「サザン分析」または「サザンブロッティ
ング」は、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物また
はＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の標
識されたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメント
とのハイブリダイゼーションによって確認する方法であ
る。サザン分析は典型的には、アガロースゲル上でのＤ
ＮＡ消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のＤＮＡの
変性、および、サムブルック等、上記、の９．３７−
９．５２項に記載のような放射標識された、ビオチニル
化された、または酵素標識されたプローブによる分析の
ための、ニトロセルロース、ナイロン、またはその他の
適当な膜支持体へのＤＮＡの転移を含む。“Southern analysis” or “Southern blotting” refers to the confirmation of the presence of a DNA sequence in a restriction endonuclease digest of DNA or a DNA-containing composition by hybridization to a known labeled oligonucleotide or DNA fragment. How to Southern analysis is typically performed using D on agarose gel.
9.37- described above, including electrophoretic separation of NA digest, denaturation of DNA after electrophoretic separation, and Sambrook et al.
Transfer of DNA to nitrocellulose, nylon, or other suitable membrane support for analysis with radiolabeled, biotinylated, or enzyme-labeled probes as described in Section 9.52. Including.

【００９６】「ノーザン分析」または「ノーザンブロッ
ティング」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメン
ト、ｃＤＮＡもしくはそのフラグメント、またはＲＮＡ
フラグメントのような既知のプローブとハイブリダイズ
するＲＮＡ配列を同定するために用いられる方法であ
る。プローブは³²Ｐのような放射性同位元素で、または
ビオチニル化により、または酵素によって標識する。分
析すべきＲＮＡは、通常、アガロースまたはポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動分離し、ニトロセルロース、
ナイロン、またはその他の適当な膜に転移させ、そし
て、サムブルック等、上記、の７．３９−７．５２項に
記載のような当分野で良く知られる標準技術を用いてプ
ローブとハイブリダイズさせる。“Northern analysis” or “Northern blotting” refers to oligonucleotides, DNA fragments, cDNA or fragments thereof, or RNA.
A method used to identify RNA sequences that hybridize to known probes, such as fragments. The probe is labeled with a radioisotope such as ³² P, or by biotinylation, or by an enzyme. The RNA to be analyzed is usually electrophoretically separated on an agarose or polyacrylamide gel and nitrocellulose,
Transfer to nylon or other suitable membrane and hybridize to the probe using standard techniques well known in the art, such as those described in Sambrook et al., Supra, paragraphs 7.39-7.52. .

【００９７】「ライゲーション」は、二つの核酸フラグ
メントの間にホスホジエステル結合を形成させる工程で
ある。二つのフラグメントのライゲーションのために
は、そのフラグメントの末端は互いに適合性でなければ
ならない。幾つかの場合においては、末端はエンドヌク
レアーゼ消化の後、直ちに適合性となろう。しかしなが
ら、まず、エンドヌクレアーゼ消化の後に普通生成され
る互い違いに切断された末端を、ライゲーションに適合
性とするため、平滑末端に変換する必要があるかも知れ
ない。末端を平滑化するためには、そのＤＮＡを、約１
０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共に、４種のデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸の存在下で、適当な緩衝液中
で、少なくとも１５分間１５℃で処理する。次いでこの
ＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノー
ル沈澱化により精製する。ライゲーションすべきＤＮＡ
フラグメントをほぼ当モル量で溶液中に入れる。この溶
液はさらにＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、およびＤＮＡ０．
５μｇに付き約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼのような
リガーゼを含む。このＤＮＡをベクター中にライゲーシ
ョンしたい場合は、ベクターをまず適当なエンドヌクレ
アーゼで消化することにより線状化する。次にこの線状
化されたフラグメントを細菌アルカリホスファターゼま
たは子牛腸ホスファターゼで処理してライゲーション工
程中の自己ライゲーションを防止する。"Ligation" is a process of forming a phosphodiester bond between two nucleic acid fragments. For ligation of two fragments, the ends of the fragments must be compatible with each other. In some cases, the ends will be compatible immediately after endonuclease digestion. However, first the staggered ends normally produced after endonuclease digestion may need to be converted to blunt ends to make them compatible for ligation. To blunt the ends, the DNA should be
Treat with 0 units of Klenow fragment of DNA polymerase I or T4 DNA polymerase in the presence of four deoxyribonucleotide triphosphates in a suitable buffer for at least 15 minutes at 15 ° C. The DNA is then purified by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation. DNA to be ligated
The fragments are brought into solution in approximately equimolar amounts. This solution further contains ATP, ligase buffer, and DNA
Contains about 10 units of ligase such as T4 DNA ligase per 5 μg. If it is desired to ligate this DNA into a vector, the vector is first linearized by digestion with an appropriate endonuclease. This linearized fragment is then treated with bacterial alkaline phosphatase or calf intestinal phosphatase to prevent self-ligation during the ligation step.

【００９８】細胞からのＤＮＡの「調製」とは、宿主細
胞の培養からプラスミドＤＮＡを分離することを意味す
る。ＤＮＡの調製に一般的に用いられる方法は、サムブ
ルック等、上記、の１．２５−１．３３項に記載の大規
模および小規模プラスミド製造である。ＤＮＡの調製
後、これは、サムブルック等、上記、の１．４０項に記
載のような当分野で良く知られる方法によって精製する
ことができる。"Preparing" DNA from cells refers to isolating plasmid DNA from cultures of host cells. A commonly used method for the preparation of DNA is large- and small-scale plasmid production as described in Sambrook et al., Supra, paragraphs 1.25-1.33. After preparation of the DNA, it can be purified by methods well known in the art, such as described in Sambrook et al., Supra, section 1.40.

【００９９】「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法
（例えば、１９８８年５月４日公開のＥＰ２６６０３２
に記載の固相技術を使用する、または、フレーラー等、
Nucl.Acids Res.、１４巻５３９９−５４０７頁［１９
８６］に記載のデオキシヌクレオシドＨ−ホスホナート
中間体を経た、ホスホトリエステル、ホスファイト、ま
たはホスホルアミダイト化学）によって化学合成され
る、短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチド
である。さらなる方法には、下に定義されるポリメラー
ゼ連鎖反応およびその他の自己プライマー法および固体
支持体上でのオリゴヌクレオチド合成が包含される。こ
れらの方法は全てエンゲルス等、Agnew.Chem.Int.Ed.En
gl.、２８巻７１６−７３４頁（１９８９）に記載され
ている。当該遺伝子の全核酸配列が知られている場合、
またはコーディング鎖に対し相補的な核酸の配列が知ら
れている場合、これらの方法を用いる。別法として、も
し標的アミノ酸配列が既知であるならば、各アミノ酸残
基に対する既知のそして好ましいコーディング残基を用
いて、可能性ある核酸配列を推論することができる。次
いでそのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル
上で精製する。The term “oligonucleotide” refers to a known method (for example, EP 266032 published May 4, 1988).
Use the solid-phase technology described in or, or a flavorer,
Nucl. Acids Res., Vol. 14, p. 5399-5407 [19.
86], a short single-stranded or double-stranded polydeoxynucleotide chemically synthesized by phosphotriester, phosphite, or phosphoramidite chemistry via a deoxynucleoside H-phosphonate intermediate. Additional methods include the polymerase chain reaction and other self-priming methods defined below and oligonucleotide synthesis on a solid support. All of these methods are based on Engels et al., Agnew.Chem.Int.Ed.En.
gl., 28, 716-734 (1989). If the entire nucleic acid sequence of the gene is known,
Alternatively, if the sequence of the nucleic acid complementary to the coding strand is known, these methods are used. Alternatively, if the target amino acid sequence is known, the known and preferred coding residues for each amino acid residue can be used to infer a potential nucleic acid sequence. The oligonucleotide is then purified on a polyacrylamide gel.

【０１００】「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣ
Ｒ」とは、わずかな量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤ
ＮＡの特異的断片を、１９８７年７月２８日登録の米国
特許第４６８３１９５号に記載のように増幅させる方法
または技術を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライ
マーが設計されるよう、目的の領域の末端またはそれ以
上からの配列情報が得られる必要があり；これらのプラ
イマーは、増幅されるべき鋳型の反対の鎖と同一または
類似の配列であろう。二つのプライマーの５'末端ヌク
レオチドは、増幅されたものの末端と一致するかも知れ
ない。ＰＣＲは、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡか
らの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写さ
れたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配
列等の増幅に使用することができる。一般に、ミュリス
等、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.、５１巻２
６３頁［１９８７］；アーリッヒ編、ＰＣＲテクノロジ
ー（ストックトン・プレス、ＮＹ、１９８９）を参照さ
れたい。本明細書中使用されるＰＣＲは、プライマーと
しての既知の核酸および核酸の特異的断片を増幅または
生成させるための核酸ポリメラーゼを使用することから
なる、核酸被験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ
反応法の一つの例であって、唯一の例ではないと考えら
れる。"Polymerase chain reaction" or "PC
R "refers to small amounts of nucleic acid, RNA and / or D
Refers to a method or technique for amplifying a specific fragment of NA as described in US Pat. No. 4,683,195, issued Jul. 28, 1987. In general, sequence information from the end of the region of interest or beyond must be obtained so that oligonucleotide primers can be designed; these primers should have a sequence identical or similar to the opposite strand of the template to be amplified. Will. The 5 'terminal nucleotides of the two primers may match the ends of the amplified ones. PCR can be used to amplify specific RNA sequences, specific DNA sequences from total genomic DNA, and cDNA, bacteriophage or plasmid sequences transcribed from total cellular RNA. In general, Murris et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, 2
63 [1987]; Erich, PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989). As used herein, PCR refers to a nucleic acid polymerase reaction method for amplifying a nucleic acid test sample, which comprises using a nucleic acid polymerase to amplify or generate known nucleic acids and specific fragments of nucleic acids as primers. It is considered to be one example and not the only example.

【０１０１】「緊縮条件」とは、（１）洗浄に低イオン
強度および高温、例えば５０℃で０．０１５Ｍ ＮａＣ
ｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％Ｎａ
ＤｏｄＳＯ₄（ＳＤＳ）を使用し、または（２）ハイブ
リダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤、例
えば、０．１％牛血清アルブミン／０．１％フィコール
／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを伴う５０ｍＭ燐酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と共に５０％（容量／容
量）ホルムアミドを４２℃で使用する条件である。別の
例は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ燐酸ナ
トリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理鮭***ＤＮ
Ａ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％
硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２ｘＳＳＣお
よび０．１％ＳＤＳ中４２℃で洗浄するものである。"Constriction conditions" means that (1) low ionic strength and high temperature such as 0.015 M NaC at 50 ° C.
1 / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% Na
Using DodSO ₄ (SDS), or (2) a denaturing agent such as formamide during hybridization, eg, 0.1% bovine serum albumin / 0.1% ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 750 mM NaC
1, 50% (v / v) formamide at 42 ° C. with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) with 75 mM sodium citrate. Another example is 50% formamide, 5xSSC (0.75M
NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 m
M sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5x Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DN
A (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10%
Dextran sulfate is used at 42 ° C and washed at 42 ° C in 0.2xSSC and 0.1% SDS.

【０１０２】「中等度の緊縮条件」は、サムブルック
等、上記、に記載されており、上の記載より緊縮性の低
い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例え
ば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含
む。中等度の緊縮条件の例は、２０％ホルムアミド、５
ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三
ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．
６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、
および２０μｌ／ｍｌ変性剪断鮭***ＤＮＡからなる溶
液中３７℃で一夜インキュベートし、その後フィルター
を１ｘＳＳＣ中約３７−５０℃で洗浄するような条件で
ある。当業者は、プローブの長さ等のような因子に適合
させるのに必要な温度、イオン強度等をいかにして調節
するかがわかるであろう。"Moderate stringency conditions" are described in Sambrook et al., Supra, and are less stringent than washing solutions and hybridization conditions (eg, temperature, ionic strength, and% SDS). Including the use of Examples of moderate stringency conditions are 20% formamide, 5%
xSSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.
6) 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate,
And in a solution consisting of 20 μl / ml denatured sheared salmon sperm DNA at 37 ° C. overnight, after which the filters are washed at about 37-50 ° C. in 1 × SSC. One skilled in the art will know how to adjust the temperature, ionic strength, etc., necessary to accommodate factors such as probe length and the like.

【０１０３】「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリ
ン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖蛋白である。
抗体は特異抗原に対する結合特異性を示すのに対し、免
疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠く他の抗体
様分子の両方を包含する。後者の種類のポリペプチド
は、例えばリンパ系によって低レベルが、そして骨髄腫
によって高レベルが産生される。“Antibodies” (Abs) and “immunoglobulins” (Igs) are glycoproteins having the same structural characteristics.
Antibodies exhibit binding specificity for a specific antigen, whereas immunoglobulins include both antibodies and other antibody-like molecules that lack antigen specificity. The latter type of polypeptide produces low levels, for example, by the lymphatic system and high levels by myeloma.

【０１０４】「天然の抗体および免疫グロブリン」は、
通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖および二つの同一の重
（Ｈ）鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ
三量体糖蛋白である。それぞれの軽鎖は一つのジスルフ
ィド共有結合により重鎖に連結しているが、但しジスル
フィド結合の数は異なる免疫グロブリンイソタイプの重
鎖間で異なっている。各々の重および軽鎖はさらに、規
則的に間隔のあいた鎖間ジスルフィド橋を有する。それ
ぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（Ｖ_H）、その後
に幾つかの不変ドメインを持っている。それぞれの軽鎖
は一方の端に可変ドメイン（Ｖ_L）、そして他方の端に
不変ドメインを持っている。軽鎖の不変ドメインは重鎖
の最初の不変ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメイン
は重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸が
軽および重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると
信じられている（クロチア等、J.Mol.Biol.、１８６巻
６５１−６６３頁［１９８５］；ノヴォトニーおよびヘ
イバー、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２巻４５９２−４
５９６頁［１９８５］）。"Natural antibodies and immunoglobulins"
Usually, it is a heterotrimeric glycoprotein of about 150,000 daltons composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to a heavy chain by one covalent disulfide bond, provided that the number of disulfide bonds differs between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain further has regularly spaced interchain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain ( _VH ) followed by a number of constant domains. Each light chain has at one end a variable domain (V _L ) and at the other end a constant domain. The constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. It is believed that certain amino acids form the interface between the light and heavy chain variable domains (Crocia et al., J. Mol. Biol., 186, 651-663 [1985]; Novotney and Haver, Proc. .Natl.Acad.Sci.USA, 82, 4592-4
596 [1985]).

【０１０５】「可変」という語は、可変ドメインの或る
部分が配列の上で抗体間で甚だしく異なっている事実を
指し、特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特
異性に用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変
ドメインに平均して分布してはいない。それは、軽鎖お
よび重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに
集中している。可変ドメインの、より高度に保存された
部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重お
よび軽鎖の可変ドメインはそれぞれ四つのＦＲ領域を含
んでおり、これらは大抵βシートコンフィギュレーショ
ンを採用しており、三つのＣＤＲによって連結している
が、それらはこのβシート構造につながるループを形成
するか、幾つかの場合にはそのβシート構造の一部を形
成している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近
接して保持されており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の
抗原結合部位の形成に寄与している（カバット等、シー
クエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジ
カル・インタレスト、ナショナル・インスティテュート
・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ［１９８７］を参照さ
れたい）。不変ドメインは抗体の抗原への結合に直接関
与している訳ではないが、抗体の抗体依存細胞毒性への
参加といったような様々なエフェクター機能を示す。The term "variable" refers to the fact that certain portions of the variable domains differ extensively in sequence between antibodies, and are used for the binding and specificity of each particular antibody to a particular antigen. However, the variability is not evenly distributed over the variable domains of the antibody. It consists of the complementarity-determining regions (CC) in both the light and heavy chain variable domains.
DR) or three segments called hypervariable regions. The more highly conserved portion of the variable domain is called the framework (FR). The variable domains of the natural heavy and light chains each contain four FR regions, which often adopt a β-sheet configuration and are linked by three CDRs, which add to this β-sheet structure. It forms a connected loop or, in some cases, forms part of its beta sheet structure. The CDRs of each chain are held in close proximity by the FR region, and together with the CDRs of the other chains, contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody (Kabat et al., Sequences of Proteins of Proteins). See Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). The constant domains are not involved directly in binding an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular toxicity.

【０１０６】抗体のパパイン消化は、それぞれが１個の
抗原結合部位を伴う「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる
二つの等しい抗原結合フラグメント、および、その名称
が容易に結晶化する能力を反映している、残りの「Ｆ
ｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処理は、二つの
抗原結合部位を持ち、なお抗原と交差反応できるＦ(ａ
ｂ')₂フラグメントを生成する。Papain digestion of an antibody yields two equal antigen-binding fragments, called "Fab" fragments, each with one antigen-binding site, and the name reflects the ability to readily crystallize. "F
c "Generate a fragment. Pepsin treatment has two antigen binding sites, F (a
b ′) Generate _two fragments.

【０１０７】「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部
位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、
緊密に非共有結合している１個の重鎖および１個の軽鎖
可変ドメインの二量体で構成されている。各可変ドメイ
ンの三つのＣＤＲが相互作用してＶ_H−Ｖ_L二量体表面の
抗原結合部位を規定しているのはこのコンフィギュレー
ションにおいてである。まとめると、６個のＣＤＲが抗
体に抗原結合特異性を付与している。しかしながら、た
だ一つの可変ドメイン（または、或る抗原に特異的な３
個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全
体より親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力
を持っている。"Fv" is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This area is
It is composed of a dimer of one heavy and one light chain variable domain in tight, non-covalent association. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the _VH - _VL dimer surface. In summary, the six CDRs confer antigen-binding specificity to the antibody. However, only one variable domain (or 3 antigen specific 3)
(One half of an Fv containing only one CDR) have the ability to recognize and bind antigen, albeit with lower affinity than the entire binding site.

【０１０８】Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の不変ド
メインおよび重鎖の最初の不変ドメイン（ＣＨ１）を含
んでいる。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体のヒンジ領域
由来の１またはそれ以上のシステインを含む数個の残基
が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に加わっている
点でＦａｂフラグメントと異なっている。Ｆａｂ'−Ｓ
Ｈは本明細書において、不変ドメインのシステイン残基
が遊離チオール基を持っているＦａｂ'の表記である。
Ｆ（ａｂ')₂抗体フラグメントは元々、間にヒンジシス
テインを持っているＦａｂ'フラグメントの対として生
成された。別の、抗体フラグメントの化学的結合もまた
知られている。[0108] The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab 'fragments differ from Fab fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the hinge region of the antibody. Fab'-S
H is herein the designation Fab 'in which the cysteine residue of the constant domain has a free thiol group.
F (ab ') ₂ antibody fragments originally were produced as pairs of Fab' fragments which have hinge cysteines between them. Other chemical linkages of antibody fragments are also known.

【０１０９】任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブ
リン）の「軽鎖」は、それらの不変ドメインのアミノ酸
配列に基づいて、カッパおよびラムダ（λ）と呼ばれる
極めて明瞭な二つのタイプの一つに割り当てることがで
きる。The “light chains” of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species, based on the amino acid sequences of their constant domains, are one of two distinct types, called kappa and lambda (λ). Can be assigned to

【０１１０】重鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に応じ
て、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることが
できる。五つの主要な免疫グロブリンのクラス：Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、があり、こ
れらのうち幾つかはさらにサブクラス（イソタイプ）、
例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩ
ｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２、に分けること
ができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重
鎖不変ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、
γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラ
スのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーシ
ョンは良く知られている。Depending on the amino acid sequence of the constant domain of the heavy chain, immunoglobulins can be assigned to different classes. Five major immunoglobulin classes: Ig
A, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are further subclasses (isotypes),
For example, IgG-1, IgG-2, IgG-3, and I
gG-4; IgA-1 and IgA-2. The heavy chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are α, delta, epsilon,
They are called γ and μ. The subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known.

【０１１１】「抗体」という語は最も広い意味で用いら
れ、詳細には、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト
およびアンタゴニスト抗体を包含する）、多エピトープ
特異性を有する抗体組成物、そして、それらが所望の生
物活性を示す限り、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、
Ｆ(ａｂ')₂およびＦｖ）を包含する。The term "antibody" is used in the broadest sense, and specifically includes single monoclonal antibodies (including agonist and antagonist antibodies), antibody compositions with multiple epitope specificities, and those in which Antibody fragments (eg, Fab,
F (ab ') ₂ and Fv).

【０１１２】本明細書中使用される「モノクローナル抗
体」という語は、実質上均質な抗体の集団から得られた
抗体、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存
在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いては同一
である抗体を指す。モノクローナル抗体は、極めて特異
的であり、単一の抗原部位に対するものである。さら
に、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して作
製される異なった抗体を含む常套的（ポリクローナル）
抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原
上の一つの決定基に対して作製されたものである。それ
らの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫
グロブリンにより汚染されないハイブリドーマ培養によ
って合成されるという点で有利である。修飾語句「モノ
クローナル」は、実質上均質な抗体の集団から得られる
抗体の性格を示すものであり、特定の方法によりその抗
体を産生することを要求すると解してはならない。例え
ば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、
コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９
５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドー
マ法により作製することができ、または、組換えＤＮＡ
法により作製することができる（例えば、米国特許第４
８１６５６７号[キャビリー等]を参照されたい）。As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, ie, the individual antibodies that make up the population are naturally occurring antibodies that may be present in small amounts. Refer to antibodies that are identical except for possible mutations. Monoclonal antibodies are very specific, being directed against a single antigenic site. In addition, conventional (polyclonal) including different antibodies typically raised against different determinants (epitope)
In contrast to antibody preparations, each monoclonal antibody is directed against one determinant on the antigen. In addition to their specificity, monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized by hybridoma cultures that are not contaminated by other immunoglobulins. The modifier "monoclonal" indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, the monoclonal antibodies used in accordance with the present invention include:
Kohler and Milstein, Nature, 256, 49
5 (1975) or can be made by the hybridoma method, or
(For example, see US Pat.
816567 [Cabilly et al.]).

【０１１３】本明細書に記載のモノクローナル抗体は、
それらが所望の生物活性を示す限り、重および／または
軽鎖の一部が特定の種から誘導されるまたは特定の抗体
クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同
一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別
の種から誘導されるまたは別の抗体クラスもしくはサブ
クラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガ
スである、「キメラ」抗体および係る抗体のフラグメン
トを特に包含する（米国特許第４８１６５６７号（キャ
ビリー等）；およびモリソン等、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、８１巻６８５１−６８５５頁［１９８４］）。The monoclonal antibodies described herein include:
A portion of the heavy and / or light chains is identical or homologous to the corresponding sequence of an antibody derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, as long as they exhibit the desired biological activity. The remainder of the chain specifically includes "chimeric" antibodies and fragments of such antibodies that are identical or homologous to the corresponding sequence of the antibody derived from another species or belonging to another antibody class or subclass (US Pat. No. 4,816,567). No. (Cavily et al.); And Morrison et al., Proc. Natl. Acad.
SA, 81, 6851-6855 [1984]).

【０１１４】非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」
型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列
を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖また
はそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ'、Ｆ（ａｂ')₂またはその他の抗体の抗原結合サブ配
列）である。大抵は、ヒト化抗体は、受容者の相補性決
定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性
および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのよう
なヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によ
り置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗
体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦ
ｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基に置き換
えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体にも
取り入れられたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見
いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の
挙動をさらに洗練および最適化するためになされる。一
般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個
の可変ドメインの実質上全てを含み、ここで、全てまた
は実質上全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのも
のに対応し、全てまたは実質上全てのＦＲ領域はヒト免
疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、最
適には、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的には
ヒト免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部をも含
むであろう。さらなる詳細については、ジョーンズ等、
Nature、３２１巻５２２−５２５頁［１９８６］；リー
チマン等、Nature、３３２巻３２３−３２９頁［１９８
８］；およびプレスタ、Curr.Op.Struct.Biol.、２巻５
９３−５９６頁［１９９２］）を参照されたい。"Humanization" of non-human (eg, mouse) antibodies
A type is a chimeric immunoglobulin, immunoglobulin chain or fragment thereof (eg, Fv, Fab, Fa) containing the minimum sequence derived from a non-human immunoglobulin.
b ', F (ab') ₂ or the antigen-binding subsequence of another antibody). For the most part, humanized antibodies will have residues from the complementarity-determining regions (CDRs) of the recipient which are of a non-human species (such as mouse, rat or rabbit) having the desired specificity, affinity and capacity (donor antibody ) Is a human immunoglobulin (recipient antibody), which has been replaced by residues from the CDRs of (a). In some examples, the human immunoglobulin F
The v framework residues have been replaced with the corresponding non-human residues. In addition, humanized antibodies can contain residues that are not found in the recipient antibody nor in the incorporated CDRs or framework sequences. These modifications are made to further refine and optimize antibody behavior. Generally, a humanized antibody will comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, wherein all or substantially all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin; Alternatively, substantially all FR regions are of a human immunoglobulin consensus sequence. The humanized antibody optimally will also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin. See Jones et al. For more details.
Nature, 321, 522-525 [1986]; Leachman et al., Nature, 332, 323-329 [198].
8]; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
93-596 [1992]).

【０１１５】「人間において非免疫原性」とは、薬学上
許容し得る担体中の治療的有効量の当該ポリペプチドを
人間の適当な組織に接触させ、適当な潜伏期（例えば８
ないし１４日間）の後に該ポリペプチドの二回目の投与
を行う時、そのポリペプチドに対する過敏性または耐性
の状態が立証され得ない事を意味する。“Non-immunogenic in humans” is defined as contacting a therapeutically effective amount of the polypeptide in a pharmaceutically acceptable carrier with suitable human tissue and treating the cells with a suitable incubation period (eg, 8 hours).
-14 days), the second administration of the polypeptide means that no state of hypersensitivity or resistance to the polypeptide can be demonstrated.

【０１１６】II．発明の好ましい態様 本発明の好ましいポリペプチドは、ｍｐｌ、レセプター
サイトカインスーパーファミリーの一員に結合する性質
を持ち、そして、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクトさせ
たＩＬ−３依存Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡ中への標識され
たヌクレオチド（³Ｈ−チミジン）の取り込みを刺激す
る生物学的性質を有する、ｍｐｌリガンドまたはトロン
ボポエチン（ＴＰＯ）と呼ばれる実質上均質なポリペプ
チドである。より好ましいｍｐｌリガンドは、造血、特
に巨核球形成または血小板形成活性を有する、即ち、未
熟な巨核球またはその祖先の、成熟血小板産生型への増
殖、成熟および／または分化を刺激することのできる、
分離された哺乳動物の蛋白である。本発明に係る最も好
ましいポリペプチドは、造血、巨核球形成または血小板
形成活性を有する、フラグメントを包含するヒトｍｐｌ
リガンドである。所望により、これらのヒトｍｐｌリガ
ンドはグリコシル化を欠く。その他の好ましいヒトｍｐ
ｌリガンドは、ｈＭＬ₁₅₃またはｈＴＰＯ₁₅₃と呼ばれる
ｈＭＬの「ＥＰＯドメイン」、ｈＭＬ₂₄₅またはｈＴＰ
Ｏ₂₄₅と呼ばれるｈＭＬの末端切除型、および、ｈＭ
Ｌ、ｈＭＬ₃₃₂またはｈＴＰＯ₃₃₂と呼ばれる、図１およ
び図２（配列番号１）に示されるアミノ酸配列を有する
成熟全長ポリペプチド、ならびに生物活性な置換変異体
ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）である。II. Preferred Embodiments of the Invention Preferred polypeptides of the invention have the property of binding to mpl, a member of the receptor cytokine superfamily, and are labeled in DNA of IL-3-dependent Ba / F3 cells transfected with human mplP. having a biological property of stimulating the incorporation of nucleotides ⁽³ H- thymidine) is a substantially homogeneous polypeptide called mpl ligand or thrombopoietin (TPO). More preferred mpl ligands have hematopoiesis, especially megakaryocyte or platelet forming activity, ie are capable of stimulating the proliferation, maturation and / or differentiation of immature megakaryocytes or their ancestors into mature platelet-producing forms.
Isolated mammalian protein. Most preferred polypeptides according to the present invention are human mpl including fragments having hematopoietic, megakaryocyte or platelet forming activity.
Is a ligand. Optionally, these human mpl ligands lack glycosylation. Other preferred human mp
l ligand, "EPO-domain" of hML called hML ₁₅₃ or hTPO _153, hML ₂₄₅ or hTP
Truncated form of hML called O _245, and, hM
L, called HML ₃₃₂ or hTPO _332, a 1 and 2 the mature full length polypeptide having the amino acid sequence shown in (SEQ ID NO: 1), as well as biologically active substitution variant hML (R153A, R154A).

【０１１７】所望による好ましい本発明に係るポリペプ
チドは、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ４、ｍＭＬ、ｍＭ
Ｌ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬおよびｐＭＬ２から選ばれる生
物学的にまたは免疫学的に活性なｍｐｌリガンド変異体
である。Optionally preferred polypeptides according to the invention include hML2, hML3, hML4, mML, mM
It is a biologically or immunologically active mpl ligand variant selected from L2, mML3, pML and pML2.

【０１１８】所望による好ましい本発明に係るポリペプ
チドは、ヒトｍｐｌリガンド（図１および図２［配列番
号１］を参照されたい）、マウスｍｐｌリガンド（図２
４および図２５［配列番号１２および１３］を参照され
たい）、組換えブタｍｐｌリガンド（図２９［配列番号
１８］を参照されたい）、または再生不良性ブタ血漿か
ら分離されたブタｍｐｌリガンドと、少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少な
くとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さ
らに好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましく
は少なくとも９５％の配列一致を有する生物活性なｍｐ
ｌリガンド変異体である。Optionally preferred polypeptides of the invention include human mpl ligand (see FIGS. 1 and 2 [SEQ ID NO: 1]), mouse mpl ligand (FIG. 2).
4 and FIG. 25 [see SEQ ID NOs: 12 and 13]), recombinant porcine mpl ligand (see FIG. 29 [SEQ ID NO: 18]), or porcine mpl ligand isolated from aplastic pig plasma. , At least 70
%, Preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% sequence identity.
l-ligand variant.

【０１１９】再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌ
リガンドは以下の性格を持っている： （１）部分精製されたリガンドは、ＰＢＳ、０．１％Ｓ
ＤＳを含有するＰＢＳ、または４Ｍ ＭｇＣｌ₂を含有す
るＰＢＳのいずれかで溶離されるゲル濾過カラムからＭ
ｒ６００００−７００００で溶出し； （２）このリガンドの活性はプロナーゼにより破壊さ
れ； （３）このリガンドは、低いｐＨ（２．５）、０．１％
までのＳＤＳ、および２Ｍ尿素に対して安定であり； （４）このリガンドは、様々なレクチンカラムへの結合
に基づき、糖蛋白であり； （５）高度に精製されたリガンドは、非還元ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥからＭｒ２５０００−３５０００で溶出する。よ
り少量の活性もまたＭｒ〜１８０００−２２０００およ
び６００００で溶出し； （６）高度に精製されたリガンドは、還元ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥでＭｒ２８０００および３１０００のダブレットと
して分離され； （７）１８０００−２２０００、２８０００および３１
０００のバンドのアミノ末端配列は同じＳＰＡＰＰＡＣ
ＤＰＲＬＬＮＫＬＬＲＤＤＨＶＬＨＧＲ（配列番号２
９）であり；そして、 （８）このリガンドは、以下の親和カラム：ブルー−セ
ファロース、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−
Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンズマメレクチン−セファロー
ス、ＷＧＡ−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、
エーテル６５０ｍトヨパール、ブチル６５０ｍトヨパー
ル、フェニル６５０ｍトヨパール、および、フェニル−
セファロース、に結合し、それらから溶出する。Mpl isolated from aplastic porcine plasma
The ligand has the following characteristics: (1) The partially purified ligand is PBS, 0.1% S
M from the gel filtration column eluted with either PBS containing DS or PBS containing 4M MgCl _2.
eluted at r60000-70000; (2) the activity of this ligand is destroyed by pronase; (3) this ligand has a low pH (2.5), 0.1%
(4) The ligand is a glycoprotein based on binding to various lectin columns; (5) The highly purified ligand is non-reduced SDS −P
Elution from AGE with Mr 25000-35000. Lesser amounts of activity also eluted at Mr １８18000-22000 and 60,000; (6) highly purified ligand was reduced SDS-PA
Separated by GE as doublets with Mr 28000 and 31000; (7) 18000-22000, 28000 and 31
The amino terminal sequence of the 000 band is the same SPAPAC
DPLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO: 2
9); and (8) the ligand is the following affinity column: Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-
Q, MONO-S, lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, ConA-Sepharose,
Ether 650m Toyopearl, butyl 650m Toyopearl, phenyl 650m Toyopearl, and phenyl-
Binds to and elutes from Sepharose.

【０１２０】より好ましいｍｐｌリガンドポリペプチド
は、図１および図２（配列番号１）に記載のアミノ酸配
列を有するヒトゲノムまたはｃＤＮＡによりコードされ
ているものである。More preferred mpl ligand polypeptides are those encoded by the human genome or cDNA having the amino acid sequences set forth in FIGS. 1 and 2 (SEQ ID NO: 1).

【０１２１】その他の好ましい本発明に係る天然に存在
する生物活性ｍｐｌリガンドポリペプチドは、プレプロ
−ｍｐｌリガンド、プロ−ｍｐｌリガンド、成熟ｍｐｌ
リガンド、ｍｐｌリガンドフラグメントおよびそれらの
グリコシル化変異体を包含する。Other preferred naturally occurring biologically active mpl ligand polypeptides of the present invention include prepro-mpl ligand, pro-mpl ligand, mature mpl ligand.
Includes ligands, mpl ligand fragments and glycosylated variants thereof.

【０１２２】さらに別の本発明に係る好ましいポリペプ
チドは、ｍｐｌリガンド配列変異体およびキメラを包含
する。通常、好ましいｍｐｌリガンド配列変異体および
キメラは、ヒトｍｐｌリガンドまたは再生不良性ブタ血
漿から分離されたｍｐｌリガンドと、少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少な
くとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さ
らに好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましく
は少なくとも９５％のアミノ酸配列一致を有するアミノ
酸配列を持つ生物活性なｍｐｌリガンド変異体である。
好ましいｍｐｌリガンド変異体の例は、Ｎ末端ドメイン
ｈＭＬ変異体（エリスロポエチンに対するその配列相同
性の故に「ＥＰＯ−ドメイン」と呼ばれる）である。好
ましいｈＭＬ ＥＰＯ−ドメインは、成熟ｈＭＬの最初
の約１５３のアミノ酸残基を含み、ｈＭＬ₁₅₃と呼ばれ
る。所望により好ましいｈＭＬ配列変異体は、Ｃ末端ド
メイン中の１またはそれ以上の塩基性または二塩基性ア
ミノ酸残基が非塩基性アミノ酸残基（例えば、疎水性、
中性、酸性、芳香族、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ等）で置換されて
いるものを含む。好ましいｈＭＬ Ｃ末端ドメイン配列
変異体は、Ａｒｇ残基１５３および１５４がＡｌａ残基
に置き換わっているものを含む。この変異体はｈＭＬ
₃₃₂（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）と呼ばれる。これに代
わる好ましいｈＭＬ変異体は、アミノ残基１１１−１１
４（ＱＬＰＰまたはＬＰＰＱ）が除去されまたは異なる
テトラペプチド配列（例えばＡＧＡＧ等）に置き換わっ
ているｈＭＬ₃₃₂またはｈＭＬ₁₅₃のいずれかを含む。前
記の除去突然変異体は、△４ｈＭＬ ₃₃₂または△４ｈＭ
Ｌ₁₅₃と呼ばれる。Still another preferred polypep according to the present invention
Tides include mpl ligand sequence variants and chimeras
I do. Usually preferred mpl ligand sequence variants and
The chimeras are human mpl ligand or aplastic porcine blood
Mpl ligand isolated from plasma, at least 70
%, Preferably at least 75%, more preferably less
At least 80%, more preferably at least 85%,
More preferably at least 90%, and most preferably
Is an amino acid having at least 95% amino acid sequence identity
It is a biologically active mpl ligand variant with an acid sequence.
An example of a preferred mpl ligand variant is the N-terminal domain
hML mutant (its sequence homology to erythropoietin)
Because of its nature it is called "EPO-domain"). Good
The preferred hML EPO-domain is the first of mature hML
Contains about 153 amino acid residues of hML₁₅₃Called
You. An optionally preferred hML sequence variant is a C-terminal domain.
One or more basic or dibasic
The amino acid residue is a non-basic amino acid residue (eg, hydrophobic,
Neutral, acidic, aromatic, Gly, Pro etc)
Including those that are Preferred hML C-terminal domain sequence
The mutant has Arg residues 153 and 154 as Ala residues.
Including those that have been replaced by This variant is hML
₃₃₂(R153A, R154A). This
Another preferred hML variant is amino acid residues 111-11.
4 (QLPP or LPPQ) removed or different
Replace with tetrapeptide sequence (eg, AGAG etc.)
HML₃₃₂Or hML₁₅₃Including any of Previous
The deletion mutant described above is $ 4hML ₃₃₂Or $ 4hM
L₁₅₃Called.

【０１２３】好ましいキメラは、ｍｐｌリガンドまたは
そのフラグメント（下記に定義される）とヘテロローガ
スなポリペプチドまたはそのフラグメントとの間の融合
である。例えば、ｈＭＬ₁₅₃はＩｇＧフラグメントと融
合させて血清半減期を改善し、または、ＩＬ−３、Ｇ−
ＣＳＦまたはＥＰＯと融合させて血小板形成活性または
キメラ造血活性を向上させた分子を生成させることがで
きる。A preferred chimera is a fusion between an mpl ligand or a fragment thereof (defined below) and a heterologous polypeptide or a fragment thereof. For example, HML ₁₅₃ improves the serum half-life are fused with IgG fragment, or, IL-3, G-
It can be fused with CSF or EPO to produce a molecule with improved platelet forming activity or chimeric hematopoietic activity.

【０１２４】これに代わる好ましいヒトｍｐｌリガンド
キメラは、図１１（配列番号７）に示されるようにおお
よそ並べられたヒトＥＰＯ残基の１またはそれ以上（但
し全てではない）で置換されたＮ末端１５３ないし１５
７ｈＭＬ残基で構成される「ＭＬ−ＥＰＯドメインキメ
ラ」である。この態様において、ｈＭＬキメラは約１５
３−１６６残基の長さであり、ヒトＥＰＯ配列由来の個
々のまたはひとかたまりの残基が、図１１（配列番号
６）に示される並置に対応する位置でｈＭＬ中に付加ま
たは置換されている。ｈＭＬのＮ末端部分へのブロック
配列挿入物の例は、２４−２７、３８−４０、および８
３−８５位（ＥＰＯ）のＮグリコシル化部位の１または
それ以上；９−２２、５９−７６、９０−１０７、およ
び１３２−１５２位（ＥＰＯ）の４個の予想される両親
媒性αヘリックスの束の１またはそれ以上；ならびにＮ
末端およびＣ末端領域および残基位置（ｅｐｏ）４４−
５２を包含するその他の高度に保存された領域、を包含
する（例えば、ウェン等、Blood、８２巻１５０７−１
５１６頁［１９９３］およびボイセル等、J.Biol.Che
m.、２６８（２１）巻１５９８３−１５９９３頁［１９
９３］を参照されたい）。この「ＭＬ−ＥＰＯドメイン
キメラ」は、混成の血小板形成−赤血球形成（ＴＥＰ
Ｏ）生物活性を有するであろうと考えられる。An alternative preferred human mpl ligand chimera is the N-terminus substituted with one or more (but not all) of the human EPO residues roughly aligned as shown in FIG. 11 (SEQ ID NO: 7). 153 to 15
It is a “ML-EPO domain chimera” composed of 7 hML residues. In this embodiment, the hML chimera comprises about 15
3 to 166 residues in length, with individual or lump residues from the human EPO sequence being added or substituted in hML at positions corresponding to the alignments shown in FIG. 11 (SEQ ID NO: 6). . Examples of block sequence inserts into the N-terminal portion of hML are 24-27, 38-40, and 8
One or more of the N-glycosylation sites at positions 3-85 (EPO); four possible amphipathic α-helices at positions 9-22, 59-76, 90-107, and 132-152 (EPO). One or more of the bundles of
Terminal and C-terminal regions and residue position (epo) 44-
52, including other highly conserved regions (e.g., Wen et al., Blood, 82, 1507-1).
516 [1993] and Boyel et al., J. Biol.
m., 268 (21) Vol. 15983-15993 [19.
93]). This “ML-EPO domain chimera” is a hybrid of platelet formation-erythropoiesis (TEP)
O) It is believed that it will have biological activity.

【０１２５】その他の本発明に係る好ましいポリペプチ
ドは、再生不良性ブタ血漿から分離されたｍｐｌリガン
ドまたは本明細書に記載のヒトｍｐｌリガンドの配列に
等しい少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、また
は４０アミノ酸残基の連続配列を有するｍｐｌリガンド
フラグメントを包含する（例えば、表１６、実施例２４
を参照されたい）。好ましいｍｐｌリガンドフラグメン
トは、Ｘが１５３、１６４、１９１、２０５、２０７、
２１７、２２９、または２４５であるヒトＭＬ［１−
Ｘ］である（残基１−Ｘの配列については図１および図
２［配列番号１］を参照されたい）。その他の好ましい
ｍｐｌリガンドフラグメントは、精製されたこのリガン
ドの化学的または酵素的加水分解または消化の結果とし
て生成されるものを包含する。Other preferred polypeptides according to the present invention are mpl ligands isolated from aplastic pig plasma or at least 10, 15, 20, 25, 30, Or mpl ligand fragments having a contiguous sequence of 40 amino acid residues (see, eg, Table 16, Example 24).
Please refer to). Preferred mpl ligand fragments are those wherein X is 153, 164, 191, 205, 207,
Human ML [1-
X] (see FIGS. 1 and 2 [SEQ ID NO: 1] for the sequence of residues 1-X). Other preferred mpl ligand fragments include those produced as a result of chemical or enzymatic hydrolysis or digestion of the purified ligand.

【０１２６】本発明のもう一つの好ましい態様は、ｍｐ
ｌリガンド分子を精製する方法であって、この方法は、
ｍｐｌリガンド分子を含有するｍｐｌリガンド供給源
を、精製すべきｍｐｌリガンド分子が、固定されたレセ
プターポリペプチドに選択的に吸着される条件下で、固
定されたレセプターポリペプチド、特にｍｐｌまたはｍ
ｐｌ融合ポリペプチドと接触させ、この固定された支持
体を洗浄して非吸着物質を除去し、そして精製すべき分
子を、固定されたレセプターポリペプチドから溶離緩衝
液で溶出することからなる。ｍｐｌリガンドを含有する
供給源は血漿であってよく、その場合固定されたレセプ
ターは好ましくはｍｐｌ−ＩｇＧ融合物である。Another preferred embodiment of the present invention relates to mp
A method for purifying a ligand molecule, comprising:
The mpl ligand source containing the mpl ligand molecule is purified under conditions in which the mpl ligand molecule to be purified is selectively adsorbed to the immobilized receptor polypeptide, especially mpl or m.
contacting the pl fusion polypeptide, washing the immobilized support to remove non-adsorbed material, and eluting the molecule to be purified from the immobilized receptor polypeptide with an elution buffer. The source containing the mpl ligand may be plasma, in which case the immobilized receptor is preferably an mpl-IgG fusion.

【０１２７】別法として、ｍｐｌリガンドを含有する供
給源は組換え細胞培養であり、その場合、培地または細
胞溶菌液中のｍｐｌリガンドの濃度は一般に、血漿また
はその他の天然供給源中の濃度より高い。この場合、上
記のｍｐｌ−ＩｇＧ免疫親和法は、尚有用ではあるが通
常必要なく、より伝統的な当分野で知られる蛋白精製法
を適用することができる。簡潔に述べると、実質上均質
なｍｐｌリガンドを提供するための好ましい精製法は、
粒状の断片、宿主細胞または溶菌されたフラグメント
を、例えば遠心または限外濾過によって除去し；所望に
より、入手し得る市販の蛋白濃縮フィルターで蛋白を濃
縮し；その後、免疫親和、イオン交換（例えばＤＥＡＥ
またはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含
むマトリックス）、ブルー−セファロース、ＣＭブルー
−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンズ
マメレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、
Ｃｏｎ Ａ−セファロース、エーテル・トイパール、ブ
チル・トイパール、フェニル−トイパール、プロテイン
Ａセファロース、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ（例
えば、脂肪族基を付けたシリカゲル）またはセファデッ
クス分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィー、およ
びエタノールまたは硫酸アンモニウム沈澱化から選ばれ
る１またはそれ以上の工程によって、その他の不純物か
ら当該リガンドを分離することを含む。メチルスルホニ
ルフルオリド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒ
ビターを前記の工程のいずれかに加えて蛋白分解を阻害
することができる。Alternatively, the source containing the mpl ligand is a recombinant cell culture, in which case the concentration of the mpl ligand in the medium or cell lysate will generally be higher than that in plasma or other natural sources. high. In this case, the above-mentioned mpl-IgG immunoaffinity method is still useful but usually unnecessary, and more traditional protein purification methods known in the art can be applied. Briefly, a preferred purification method to provide a substantially homogeneous mpl ligand is
The particulate fragments, host cells or lysed fragments are removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration; if desired, the protein is concentrated with commercially available protein concentration filters;
Or a matrix containing a carboxymethyl or sulfopropyl group), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose,
Con A-sepharose, ether toypearl, butyl toypearl, phenyl-toypearl, protein A sepharose, SDS-PAGE, reverse phase HPLC (eg, silica gel with aliphatic groups) or Sephadex molecular sieve or size exclusion chromatography, and Separating the ligand from other impurities by one or more steps selected from ethanol or ammonium sulfate precipitation. Protease inhibitors such as methylsulfonyl fluoride (PMSF) can be added to any of the above steps to inhibit proteolysis.

【０１２８】もう一つの好ましい態様において、本発明
は、ｍｐｌリガンドに結合することのできる分離された
抗体を提供する。好ましいｍｐｌリガンドの分離された
抗体はモノクローナルである（コーラーおよびミルシュ
タイン、Nature、２５６巻４９５−４９７頁［１９７
５］；キャンベル、ラボラトリー・テクニークス・イン
・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオ
ロジー、バードン等編、１３巻、エルセヴィア・サイエ
ンス・パブリスラーズ、アムステルダム［１９８５］；
およびヒューズ等、Science、２４６巻１２７５−１２
８１頁［１９８９］）。好ましいｍｐｌリガンドの分離
された抗体は、少なくとも約１０⁶ｌ／ｍｏｌｅの親和
性でｍｐｌリガンドに結合するものである。より好まし
くは、この抗体は少なくとも約１０⁷ｌ／ｍｏｌｅの親
和性で結合する。最も好ましくは、この抗体は上記のエ
フェクター機能のうち一つを有するｍｐｌリガンドに対
して作製される。ｍｐｌリガンドに結合することのでき
る分離された抗体は、所望により第二のポリペプチドと
融合させてもよく、該抗体またはその融合物は、固定さ
れたｍｐｌポリペプチドについて上に記載されたよう
に、ｍｐｌリガンドを供給源から分離および精製するた
めに使用することができる。この態様のさらなる好まし
い側面において、本発明は、抗体を、該リガンドの含有
が疑われる試料、特に血清試料と接触させ、そして結合
が起こったか否かを検出することからなる、インビトロ
またはインビボでｍｐｌリガンドを検出する方法を提供
する。In another preferred embodiment, the present invention provides an isolated antibody capable of binding mpl ligand. Preferred mpl ligand isolated antibodies are monoclonal (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 [197].
5]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bardon et al., Volume 13, Volume 13, Elsevier Science Publislers, Amsterdam [1985];
And fuses, etc., Science, Vol.
81 [1989]). Preferred mpl ligand isolated antibodies are those that bind mpl ligand with an affinity of at least about 10 ⁶ l / mole. More preferably, the antibody binds with an affinity of at least about 10 ⁷ l / mole. Most preferably, the antibodies are raised against mpl ligands that have one of the effector functions described above. An isolated antibody capable of binding an mpl ligand may optionally be fused to a second polypeptide, wherein the antibody or fusion thereof is as described above for the immobilized mpl polypeptide. , Mpl ligand can be used to separate and purify from the source. In a further preferred aspect of this embodiment, the invention provides an in vitro or in vivo mpl comprising contacting an antibody with a sample suspected of containing the ligand, particularly a serum sample, and detecting whether binding has occurred. A method for detecting a ligand is provided.

【０１２９】さらに別の好ましい態様において、本発明
は、ｍｐｌリガンドまたはそのフラグメントをコードし
ている分離された核酸分子（この核酸分子は検出し得る
原子団によって標識されていてもいなくてもよい）、お
よび、ｍｐｌリガンドをコードしている配列を有する核
酸分子に対し相補的、または緊縮もしくは中等度緊縮条
件下でこれとハイブリダイズする配列を有する核酸分子
を提供する。好ましいｍｐｌリガンド核酸は、ヒトｍｐ
ｌリガンドと、少なくとも７５％の配列一致、より好ま
しくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも
８５％、さらに好ましくは９０％、そして最も好ましく
は９５％の配列一致を共有する生物活性なｍｐｌリガン
ドをコードしているＲＮＡまたはＤＮＡである。より好
ましい分離された核酸分子は、（ａ）哺乳動物ｍｐｌリ
ガンド遺伝子のコード化領域に基づくＤＮＡ（例えば、
図１および図２（配列番号２）に供されるヌクレオチド
配列を含むＤＮＡまたはそのフラグメント）；（ｂ）少
なくとも中等度緊縮条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリ
ダイズできるＤＮＡ；、および、（ｃ）遺伝コードの縮
重からもたらされる（ａ）または（ｂ）に定義のＤＮＡ
に対して縮重しているＤＮＡ、から選ばれる、生物活性
なｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡ配列である。
本明細書に記載される新規なｍｐｌリガンドは、それら
のＤＮＡが、低ないし中等度緊縮条件下で図１および図
２（配列番号２）のＤＮＡ（またはその相補物もしくは
フラグメント）とハイブリダイズできるという適当な配
列同一性を有するリガンドまたはサイトカインのファミ
リーの成員であり得るということが意図される。したが
って、本発明のさらなる側面は、ｍｐｌリガンドポリペ
プチドをコードしているＤＮＡと低ないし中等度緊縮条
件下でハイブリダイズするＤＮＡを包含する。In yet another preferred embodiment, the invention relates to an isolated nucleic acid molecule encoding an mpl ligand or a fragment thereof, wherein the nucleic acid molecule may or may not be labeled with a detectable moiety. And a nucleic acid molecule having a sequence that is complementary to, or hybridizes to, a nucleic acid molecule having a sequence encoding an mpl ligand under stringent or moderate stringency conditions. Preferred mpl ligand nucleic acids are human mp
encodes a bioactive mpl ligand that shares at least 75% sequence identity with the 1 ligand, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, even more preferably 90%, and most preferably 95% sequence identity. RNA or DNA. More preferred isolated nucleic acid molecules are (a) DNA based on the coding region of a mammalian mpl ligand gene (eg,
(B) DNA capable of hybridizing with the DNA of (a) at least under moderately stringent conditions; and (c) a DNA comprising the nucleotide sequence provided in FIGS. 1 and 2 (SEQ ID NO: 2) or a fragment thereof. ) DNA as defined in (a) or (b), resulting from the degeneracy of the genetic code
DNA sequence encoding a biologically active mpl ligand selected from DNA degenerate with respect to
The novel mpl ligands described herein allow their DNA to hybridize under low to moderate stringency conditions with the DNA of FIGS. 1 and 2 (SEQ ID NO: 2) (or its complement or fragment). It is contemplated that they may be members of a family of ligands or cytokines having the appropriate sequence identity. Thus, a further aspect of the invention includes DNA that hybridizes under low to moderate stringency conditions with DNA encoding the mpl ligand polypeptide.

【０１３０】本発明のさらなる好ましい態様において、
該核酸分子はｍｐｌリガンドをコードしているｃＤＮＡ
であり、そしてさらに複製可能なベクターを含み、ここ
で該ｃＤＮＡは、該ベクターにより形質転換された宿主
により認識される調節配列と機能的に結合している。こ
の側面はさらに、該ベクターにより形質転換された宿主
細胞、および、該ｃＤＮＡを使用してｍｐｌリガンドの
生産を行う方法であって、ｍｐｌリガンドをコードして
いるｃＤＮＡを、形質転換された宿主細胞の培養中で発
現させ、この宿主細胞培養からｍｐｌリガンドを回収す
ることからなる方法を包含する。このやり方で製造され
たｍｐｌリガンドは、好ましくは実質上均質なヒトｍｐ
ｌリガンドである。ｍｐｌリガンドの生産にとって好ま
しい宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞である。In a further preferred embodiment of the present invention,
The nucleic acid molecule is a cDNA encoding an mpl ligand
And further comprising a replicable vector, wherein the cDNA is operably linked to regulatory sequences recognized by a host transformed with the vector. This aspect further relates to a host cell transformed with the vector and a method for producing mpl ligand using the cDNA, the method comprising transforming the host cell transformed with cDNA encoding mpl ligand. And recovering the mpl ligand from the host cell culture. The mpl ligand produced in this manner is preferably substantially homogeneous human mp
l ligand. Preferred host cells for production of mpl ligand are Chinese hamster ovary (CH
O) Cells.

【０１３１】本発明はさらに、哺乳動物に治療的有効量
のｍｐｌリガンドを投与することからなる、免疫学的ま
たは造血疾患、特に血小板減少症を有する哺乳動物を処
置する好ましい方法を包含する。所望により、ｍｐｌリ
ガンドは、サイトカイン、特にコロニー刺激因子または
インターロイキンと組み合わせて投与してよい。好まし
いコロニー刺激因子またはインターロイキンは、ｋｉｔ
−リガンド、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ
−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９または
ＩＬ−１１を包含する。The invention further encompasses a preferred method of treating a mammal having an immunological or hematopoietic disorder, particularly thrombocytopenia, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of mpl ligand. If desired, the mpl ligand may be administered in combination with a cytokine, especially a colony stimulating factor or an interleukin. A preferred colony stimulating factor or interleukin is kit
-Ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-
CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL
-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 or IL-11.

【０１３２】III．作成の方法 血小板の産生は、長い間幾人かの著者によって、複数の
系統特異的液性因子により調節されると考えられてき
た。巨核球コロニー刺激因子（ｍｅｇ−ＣＳＦ）および
トロンボポエチンと称される二つの明確なサイトカイン
活性が、巨核球形成および血小板形成を調節するとされ
てきた（ウィリアムズ等、J.Cell Physiol.、１１０巻
１０１−１０４頁［１９８２］；ウィリアムズ等、Bloo
d Cells、１５巻１２３−１３３頁［１９８９；および
ゴードン等、Blood、８０巻３０２−３０７頁［１９９
２］）。この仮説によれば、ｍｅｇ−ＣＳＦは祖先巨核
球の増殖を刺激し、一方トロンボポエチンは主として、
より分化した細胞の成熟に、そして最終的に血小板放出
に影響する。１９６０年代以来、血小板減少症の症状発
現後の、動物および人間の血漿、血清および尿における
ｍｅｇ−ＣＳＦおよびトロンボポエチン活性の誘導およ
び出現は、詳細に証明されてきた（オーデル等、Proc.S
oc.Exp.Biol.Med.、１０８巻４２８−４３１頁［１９６
１］；ネイケフ等、Acta Haematol.、５４巻３４０−３
４４頁［１９７５］；スペクター、Proc.Soc.Exp.Bio
l.、１０８巻１４６−１４９頁［１９６１］；シュライ
ナー等、J.Clin.Invest.、４９巻１７０９−１７１３頁
［１９７０］；エブ、Blood、４４巻６０５−６０８頁
［１９７４］；ホフマン等、N.Engl.J.Med.、３０５巻
５３３頁［１９８１］；ストラニーヴァ等、Exp.Hemato
l.、１７巻１１２２−１１２７頁［１９８８］；マズー
ア等、Exp.Hematol.、１３巻１１６４頁［１９８５］；
マズーア等、J.Clin.Invest.、６８巻７３３−７４１頁
［１９８１］；シャイナー等、Blood、５６巻１８３−
１８８頁［１９８０］；ヒル等、Exp.Hematol.、２０巻
３５４−３６０頁［１９９２］；およびヘギー等、Int.
J.Cell Cloning、８巻２３６−２４４頁［１９９
０］）。これらの活性は、系統特異的であり、既知のサ
イトカインから識別できると報告された（Ｒ．Ｊ．ヒル
等、Blood、８０巻３４６頁（１９９２）；Ｃ．Ｌ．エ
リクソン−ミラー等、Brit.J.Haematol.、８４巻１９７
−２０３頁（１９９３）；Ｊ．Ｅ．ストラニーヴァ等、
Exp.Hematol.、２０巻４７５０頁（１９９２）；および
Ｊ．ツカダ等、Blood、８１巻８６６−８６７頁［１９
９３］）。今まで、ｍｅｇ−ＣＳＦまたはトロンボポエ
チンを血小板減少症の血漿または尿から精製する試みは
成功していない。III. Methods of Generation Platelet production has long been considered by several authors to be regulated by multiple strain-specific humoral factors. Two distinct cytokine activities, called megakaryocyte colony-stimulating factor (meg-CSF) and thrombopoietin, have been implicated in regulating megakaryocyte formation and platelet formation (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-). P. 104 [1982]; Williams et al., Bloo
d Cells, 15, 123-133 [1989; and Gordon et al., Blood, 80, 302-307 [199]
2]). According to this hypothesis, meg-CSF stimulates the proliferation of ancestral megakaryocytes, while thrombopoietin mainly
Affects the maturation of more differentiated cells and ultimately platelet release. Since the 1960s, the induction and appearance of meg-CSF and thrombopoietin activity in animal and human plasma, serum and urine following episodes of thrombocytopenia has been well documented (Oder et al., Proc. S.
oc. Exp. Biol. Med., 108, 428-431 [196]
1]; Neikef et al., Acta Haematol., 54, 340-3.
Page 44 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Bio.
I., 108: 146-149 [1961]; Schleiner et al., J. Clin. Invest., 49: 1709-1713 [1970]; Ebb, Blood, 44: 605-608 [1974]; Hoffman et al. J. Med., 305: 533 [1981]; Straniva et al., Exp. Hemato.
I., 17: 1122-1127 [1988]; Mazua et al., Exp. Hematol., 13: 1164 [1985];
J. Clin. Invest. 68: 733-741 [1981]; Shiner et al., Blood 56: 183-183.
188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol. 20, 354-360 [1992]; and Heggy et al., Int.
J. Cell Cloning, 8, 236-244 [199
0]). These activities were reported to be lineage specific and distinguishable from known cytokines (RJ Hill et al., Blood, 80: 346 (1992); CL Ericsson-Miller et al., Brit. J. Haematol., 84, 197
-Page 203 (1993); E. FIG. Straniva, etc.
Exp. Hematol., 20: 4750 (1992); Tsukada et al., Blood, 81, 866-867 [19
93]). To date, attempts to purify meg-CSF or thrombopoietin from thrombocytopenic plasma or urine have been unsuccessful.

【０１３３】血小板減少症の血漿を説明している上記の
観察と一致して、本発明者等は、照射されたブタから得
られた再生不良性ブタ血漿（ＡＰＰ）がヒトの巨核球形
成をインビトロで刺激することを見いだした。本発明者
等は、この刺激活性が、ｃ−ｍｐｌの可溶性細胞外ドメ
インによって破壊されることを見いだし、ＡＰＰが推定
のｍｐｌリガンド（ＭＬ）の可能性ある供給源であるこ
とを確認した。現在本発明者等は、ＡＰＰからｍｐｌリ
ガンドをうまく精製しており、そして、アミノ酸配列情
報を用いてマウス、ブタおよびヒトＭＬ ｃＤＮＡを分
離した。これらのＭＬはエリスロポエチンと配列相同性
があり、ｍｅｇ−ＣＳＦおよびトロンボポエチン様活性
の両方を持っている。Consistent with the above observations describing thrombocytopenic plasma, we believe that aplastic porcine plasma (APP) obtained from irradiated pigs is not responsible for megakaryocyte formation in humans. It has been found to stimulate in vitro. We have found that this stimulatory activity is disrupted by the soluble extracellular domain of c-mpl, confirming that APP is a potential source of putative mpl ligand (ML). We have now successfully purified the mpl ligand from APP and used the amino acid sequence information to separate mouse, pig and human ML cDNAs. These MLs have sequence homology to erythropoietin and have both meg-CSF and thrombopoietin-like activity.

【０１３４】１．血漿からのｍｐｌリガンドの精製およ
び同定 上に開示されるように、様々な種由来の再生不良性血漿
はインビトロで造血を刺激する活性を含むと報告されて
いるが、但し、造血刺激因子が血漿から分離されたとい
う報告はかつて無い。再生不良性血漿の一つの供給源
は、照射されたブタから得られる。この再生不良性ブタ
血漿（ＡＰＰ）はヒトの造血をインビトロで刺激する。
ＡＰＰがｍｐｌリガンドを含むかどうかを決定するた
め、ヒトｍｐｌ ＰでトランスフェクトされたＢａ／Ｆ
３細胞（Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ）中への³Ｈ−チミジンの
取り込みを図３に示される手法によって測定することに
より、その効果を検定した。ＡＰＰはＢａ／Ｆ３−ｍｐ
ｌ細胞への³Ｈ−チミジンの取り込みを刺激したが、Ｂ
ａ／Ｆ３対照細胞（即ち、ヒトｍｐｌＰでトランスフェ
クトされていない）への取り込みは刺激しなかった。加
えて、正常なブタ血漿では係る活性は観察されなかっ
た。これらの結果は、ＡＰＰが、ｍｐｌレセプターを介
して増殖シグナルを変換する因子（群）を含み、故にこ
のレセプターの天然リガンドであるかも知れないという
ことを示した。この事はさらに、可溶性ｍｐｌ−ＩｇＧ
でＡＰＰを処理するとＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞に対する
ＡＰＰの刺激効果が遮断されるという発見によって支持
された。1. Purification and identification of mpl ligand from plasma As disclosed above, aplastic plasma from various species has been reported to contain hematopoietic stimulating activity in vitro, provided that hematopoietic stimulating factors There has never been a report that it has been separated from. One source of aplastic plasma is obtained from irradiated pigs. This aplastic porcine plasma (APP) stimulates human hematopoiesis in vitro.
To determine if APP contains mpl ligand, Ba / F transfected with human mpl P
The effect was assayed by measuring the incorporation of ³ H-thymidine into 3 cells (Ba / F3-mpl) by the technique shown in FIG. APP is Ba / F3-mp
stimulated the incorporation of ³ H-thymidine into cells,
Uptake into a / F3 control cells (ie, not transfected with human mplP) did not stimulate. In addition, no such activity was observed in normal porcine plasma. These results indicated that APP contains the factor (s) that transduce the growth signal via the mpl receptor and may therefore be the natural ligand for this receptor. This further indicates that soluble mpl-IgG
Was supported by the finding that treatment of APP with S.A. blocked the stimulatory effect of APP on Ba / F3-mpl cells.

【０１３５】プロナーゼ、ＤＴＴ、または熱がＡＰＰ中
の活性を破壊することから、ＡＰＰ中の活性は蛋白であ
るらしい（図４）。さらにこの活性は透析され得ない。
しかしながらこの活性は、低いｐＨ（ｐＨ２．５で２時
間）に対して安定であり、幾つかのレクチン親和カラム
に結合し且つそこから溶出されることが示され、この事
はこれが糖蛋白であることを示した。この活性の構造お
よび実体をさらに解明するために、ｍｐｌ−ＩｇＧキメ
ラを用いてこれをＡＰＰから親和精製した。The activity in APP appears to be a protein, as pronase, DTT, or heat destroy the activity in APP (FIG. 4). Furthermore, this activity cannot be dialyzed.
However, this activity is stable to low pH (2 hours at pH 2.5) and has been shown to bind to and elute from some lectin affinity columns, which are glycoproteins. That was shown. To further elucidate the structure and identity of this activity, it was affinity purified from APP using the mpl-IgG chimera.

【０１３６】実施例１および２に開示されるプロトコル
に従ってＡＰＰを処理した。簡潔に述べると、ｍｐｌリ
ガンドを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ
Ｃ）、固定された色素クロマトグラフィー、およびｍｐ
ｌ−親和クロマトグラフィーを用いて精製した。各工程
からの活性の回収を図５に示し、比純度を表１に供す
る。ｍｐｌ−親和カラムからの活性の通算回収はおよそ
１０％であった。ｍｐｌ−親和カラムからのピーク活性
画分（Ｆ６）は、９．８ｘ１０⁶単位／ｍｇの推定比活
性を有する。ＡＰＰ５リットルからの通算の精製は、お
よそ４ｘ１０⁶倍（０．８単位／ｍｇから３．３ｘ１０⁶
単位／ｍｇに）で、８３ｘ１０⁶倍の蛋白の減少（２５
０ｇから３μｇに）を伴った。本発明者等は、ｍｐｌ−
親和カラムから溶離されたリガンドの比活性を〜３ｘ１
０⁶単位／ｍｇであると評価した。The APP was processed according to the protocols disclosed in Examples 1 and 2. Briefly, mpl ligands are subjected to hydrophobic interaction chromatography (HI
C), immobilized dye chromatography, and mp
Purified using l-affinity chromatography. Recovery of activity from each step is shown in FIG. 5 and specific purity is provided in Table 1. Total recovery of activity from the mpl-affinity column was approximately 10%. The peak active fraction from the mpl-affinity column (F6) has an estimated specific activity of 9.8 × 10 ⁶ units / mg. Total purification from 5 liters of APP is approximately 4 × 10 ⁶ times (from 0.8 units / mg to 3.3 × 10 ⁶
83 × 10 ⁶ fold reduction in protein (25 units / mg)
0 g to 3 μg). The present inventors have found that mpl-
The specific activity of the ligand eluted from the affinity column was ３3 × 1
It was estimated to be 0 ⁶ units / mg.

【表１】 ｍｐｌリガンドの精製 試料 容量 蛋白 単位/ml 単位 比活性 収率 比純度 ml mg/ml 単位/mg ％ APP 5000 50 40 200000 0.8 - 1フェニル 4700 0.8 40 200000 50 94 62フ゛ルー -Sep. 640 0.93 400 256000 430 128 538 mpl(μl)(Fxns5-7) 12 5x10^-4 1666 20000 3300000 10 4100000 蛋白はブラッドフォード検定により測定した。mpl溶出
画分５−７の蛋白濃度は、銀染色されたＳＤＳ−ゲルの
染色強度に基づく推定値である。１単位とは、Ｂa／Ｆ
３−mpl細胞増殖の５０％最大刺激を惹起する単位とし
て定義される。Table 1 Purification of mpl ligand Sample volume Protein unit / ml unit Specific activity Yield Specific purity ml mg / ml unit / mg% APP 5000 50 40 200000 0.8-1 phenyl 4700 0.8 40 200000 50 94 62 Full 0.93 400 256000 430 128 538 mpl (μl) (Fxns5-7) 125 × 10 ^-4 1666 20000 3300000 10 4100000 Protein was measured by Bradford test. The protein concentration of the mpl eluted fraction 5-7 is an estimated value based on the staining intensity of the silver-stained SDS-gel. One unit is Ba / F
3-mpl Defined as the unit that elicits a 50% maximal stimulation of cell proliferation.

【０１３７】還元条件下で実施するＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（４−２０％、ノヴェックス・ゲル）によりｍｐｌ親和
カラムから溶離された画分の分析は、幾つかの蛋白の存
在を明らかにした（図６）。最も強い強度で銀染色され
た蛋白は、見掛けのＭｒ６６０００、５５０００、３０
０００、２８０００および１８０００−２２０００に分
離した。これらの蛋白のうちのどれがＢａ／Ｆ３−ｍｐ
ｌ細胞培養の増殖を刺激したかを決定するために、蛋白
を実施例２に記載のようにゲルから溶出した。SDS-PAGE performed under reducing conditions
Analysis of the fraction eluted from the mpl affinity column by (4-20%, Novex gel) revealed the presence of some proteins (FIG. 6). The silver-stained proteins with the strongest intensity were apparent Mr 66000, 55000, 30
000, 28000 and 18000-22000. Which of these proteins is Ba / F3-mp
Protein was eluted from the gel as described in Example 2 to determine if it stimulated the growth of the cell culture.

【０１３８】この実験の結果は、Ｍｒ２８０００−３２
０００の蛋白を含むゲル切片から殆どの活性が溶出し、
ゲルの１８０００−２２０００領域に、より低い活性が
溶出することを示した（図７）。これらの領域内で可視
的な唯一の蛋白は、３００００、２８０００および１８
０００−２２０００のＭｒを持っていた。ゲルのこの領
域に分離する蛋白（即ち、３０、２８および１８−２２
ｋＤａのバンド）の蛋白配列を同定し取得するために、
これら三つの蛋白をＰＶＤＦに電気ブロットし、実施例
３に記載のように配列決定した。得られたアミノ末端配
列を表２に供する。The result of this experiment was that Mr 28000-32
Most activity elutes from gel sections containing 000 proteins,
Lower activity was shown to elute in the 18000-22000 region of the gel (FIG. 7). The only proteins visible in these regions are 30,000, 28000 and 18
Had a Mr of 000-22000. Proteins segregating in this region of the gel (ie, 30, 28 and 18-22)
kDa band).
These three proteins were electroblotted onto PVDF and sequenced as described in Example 3. The amino terminal sequence obtained is provided in Table 2.

【表２】 コンピューター援用分析により、これらのアミノ酸配列
は新規であることが明らかとなった。三つの配列は全て
同じであったため、３０ｋＤａ、２８ｋＤａおよび１８
−２２ｋＤａの蛋白は関連しており、同じ新規な蛋白の
異なる型であろうと信じられた。さらに、活性がＳＤＳ
−ＰＡＧＥ上で４−２０％ゲルの同じ領域（２８０００
−３２０００）に分離されることから、この蛋白は天然
ｍｐｌリガンドの有望な候補物質であった。加えて、部
分的に精製されたリガンドは、スーパーロース１２（フ
ァルマシア）カラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィ
ーに付す時、Ｍｒ１７０００−３００００で移動した。
このリガンドの異なったＭｒ型は、蛋白分解またはグリ
コシル化の相違またはその他の翻訳前もしくは翻訳後修
飾の所産であると信じられる。[Table 2] Computer-aided analysis revealed that these amino acid sequences were novel. Since all three sequences were identical, 30 kDa, 28 kDa and 18 kDa
The -22 kDa protein was related and was believed to be a different form of the same novel protein. Furthermore, the activity is SDS
-Same area of 4-20% gel on PAGE (28000
-32000), this protein was a promising candidate for a natural mpl ligand. In addition, the partially purified ligand migrated at Mr 17000-30,000 when subjected to gel filtration chromatography using a Superose 12 (Pharmacia) column.
The different Mr forms of this ligand are believed to be the result of differences in proteolysis or glycosylation or other pre- or post-translational modifications.

【０１３９】先に記載されたように、アンチセンスヒト
ｍｐｌＲＮＡは、他の造血細胞系統の分化に影響を及ぼ
すことなく、ＣＤ３４⁺祖先細胞に富ませたヒト骨髄培
養の巨核球形成を破壊した（メシア等、上記）。この結
果は、ｍｐｌレセプターがインビトロの巨核球の分化お
よび増殖で役割を果たしているかも知れないということ
を示唆した。巨核球形成におけるｍｐｌリガンドの役割
をさらに解明するために、インビトロのヒト巨核球形成
に及ぼすＡＰＰおよびｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰの効果
を比較した。ヒト巨核球形成に及ぼすＡＰＰの効果は、
実施例４に記載の液体懸濁巨核球形成検定の変法を用い
て測定した。この検定において、ヒト末梢幹細胞（ＰＳ
Ｃ）を、ｍｐｌ−ＩｇＧ親和クロマトグラフィーの前お
よび後にＡＰＰで処理した。巨核球形成のＧＰII_bIII_a
刺激を¹²⁵Ｉ−抗II_bIII_a抗体で定量した（図８）。図８
に示されるように、１０％ＡＰＰはおよそ３倍の刺激を
惹起したが、ｍｐｌリガンドを涸渇させたＡＰＰは効果
が無かった。重要なことに、ｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰ
はＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞の増殖を誘導しなかった。As described previously, antisense human mplRNA disrupted megakaryocyte formation in human bone marrow cultures enriched for CD34 ⁺ ancestral cells without affecting the differentiation of other hematopoietic cell lineages ( Messiah, etc., supra). This result suggested that the mpl receptor might play a role in megakaryocyte differentiation and proliferation in vitro. To further elucidate the role of mpl ligand in megakaryocyte formation, the effects of APP and mpl ligand depleted APP on human megakaryocyte formation in vitro were compared. The effect of APP on human megakaryocyte formation is
Measurements were made using a modification of the liquid suspension megakaryocyte formation assay described in Example 4. In this assay, human peripheral stem cells (PS
C) was treated with APP before and after mpl-IgG affinity chromatography. GPII _b III _a megakaryocyte formation
Stimulation was quantified by ¹²⁵ I- anti II _b III _a antibody (Figure 8). FIG.
As shown in Figure 10, 10% APP elicited an approximately 3-fold stimulation while APP depleted in mpl ligand had no effect. Importantly, the mpl ligand depleted APP
Did not induce proliferation of Ba / F3-mpl cells.

【０１４０】別の実験において、１０％ＡＰＰを含有す
る培養に０、２および４日目に添加された可溶性ヒトｍ
ｐｌ−ＩｇＧは、ヒト巨核球形成に及ぼすＡＰＰの刺激
効果を中和した（図９）。これらの結果は、ｍｐｌリガ
ンドはヒト巨核球形成を調節する役割を果たし、故に血
小板減少症の処置に有用であり得ることを示すものであ
る。In another experiment, soluble human m added at days 0, 2 and 4 to cultures containing 10% APP.
pl-IgG neutralized the stimulatory effect of APP on human megakaryocyte formation (FIG. 9). These results indicate that mpl ligands play a role in regulating human megakaryocyte formation and may therefore be useful in treating thrombocytopenia.

【０１４１】２．ｍｐｌリガンドの分子クローニング ３０ｋＤａ、２８ｋＤａおよび１８−２２ｋＤａ蛋白か
ら得られたアミノ末端アミノ酸配列に基づき（上記表２
を参照されたい）、二つの縮重したオリゴヌクレオチド
プライマーのプールを設計し、ＰＣＲによってブタゲノ
ムＤＮＡの増幅に使用した。もしこのアミノ末端アミノ
酸配列が単一のエクソンによってコードされているのな
らば、正しいＰＣＲ産物は６９ｂｐ長であると予想され
るという事が推論された。この大きさの一つのＤＮＡフ
ラグメントが発見されｐＧＥＭＴ中にサブクローニング
された。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーおよび得
られた３個のクローンの配列を実施例５に示す。ＰＣＲ
プライマー間にコードされているペプチドのアミノ酸配
列（ＰＲＬＬＮＫＬＬＲ［配列番号３３］）は、ブタリ
ガンドのアミノ末端蛋白配列決定により得られたものと
同一であった（上記の２８および３０ｋＤａブタ蛋白配
列の残基９−１７を参照されたい）。[0141] 2. Molecular cloning of mpl ligand Based on the amino terminal amino acid sequences obtained from the 30 kDa, 28 kDa and 18-22 kDa proteins (see Table 2 above).
), A pool of two degenerate oligonucleotide primers was designed and used for amplification of porcine genomic DNA by PCR. If the amino-terminal amino acid sequence was encoded by a single exon, it was inferred that the correct PCR product would be expected to be 69 bp long. One DNA fragment of this size was found and subcloned into pGEMT. The oligonucleotide PCR primers and the sequences of the three clones obtained are shown in Example 5. PCR
The amino acid sequence of the peptide encoded between the primers (PRLLNKLLR [SEQ ID NO: 33]) was identical to that obtained by amino terminal protein sequencing of the porcine ligand (residues of the 28 and 30 kDa porcine protein sequences described above). 9-17).

【０１４２】ＰＣＲフラグメントの配列に基づいた合成
オリゴヌクレオチドを用いてヒトゲノムＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングした。ｐＲ４５と命名された４５
量体のオリゴヌクレオチドを設計し、ＰＣＲフラグメン
トの配列に基づいて合成した。このオリゴヌクレオチド
は以下の配列：A human genomic DNA library was screened using synthetic oligonucleotides based on the sequence of the PCR fragment. 45 designated pR45
Multimeric oligonucleotides were designed and synthesized based on the sequence of the PCR fragment. This oligonucleotide has the following sequence:

【化４】5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-
TTT-ATT-TAG-GAG-TCG3'（配列番号３４）を持ってい
た。Embedded image 5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-
It had TTT-ATT-TAG-GAG-TCG3 '(SEQ ID NO: 34).

【０１４３】このデオキシオリゴヌクレオチドを、実施
例６に従い、低緊縮のハイブリダイゼーションおよび洗
浄条件の下でλｇｅｍ１２中のヒトゲノムＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングに使用した。陽性クローンを選
び、プラークを精製し、制限地図作成およびサザンブロ
ッティングにより分析した。４５量体とハイブリダイズ
した３９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを
ｐBluescriptＳＫ−中にサブクローニングした。このク
ローンのＤＮＡ配列決定は、ブタｍｐｌリガンドのヒト
同族体をコードしているＤＮＡが分離されたことを確認
した。このヒトＤＮＡ配列および導き出されたアミノ酸
配列を図１０（配列番号３および４）に示す。ゲノム配
列中のイントロンの予想位置を矢印で示し、推定のエク
ソンを規定する（「エクソン３」）。This deoxyoligonucleotide was used for screening a human genomic DNA library in λgem12 under low stringency hybridization and washing conditions, according to Example 6. Positive clones were selected, plaques were purified and analyzed by restriction mapping and Southern blotting. The 390 bp EcoRI-XbaI fragment hybridized with the 45-mer was subcloned into pBluescriptSK-. DNA sequencing of this clone confirmed that the DNA encoding the human homolog of the porcine mpl ligand had been isolated. The human DNA sequence and the derived amino acid sequence are shown in FIG. 10 (SEQ ID NOS: 3 and 4). The expected position of the intron in the genomic sequence is indicated by an arrow, defining the putative exon ("exon 3").

【０１４４】ヒト「エクソン３」配列（実施例６）に基
づき、このエクソン配列の３'および５'末端に対応する
オリゴヌクレオチドを合成した。これらの二つのプライ
マーを、様々なヒト組織から調製されるｃＤＮＡを鋳型
として使用するＰＣＲ反応に使用した。予想される正し
いＰＣＲ生成物の大きさは１４０ｂｐであった。ＰＣＲ
生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析した
後、予想された大きさのＤＮＡフラグメントが、ヒト成
人腎臓から調製されたｃＤＮＡライブラリー、２９３胎
児腎臓細胞およびヒト胎児肝臓から調製されたｃＤＮＡ
に検出された。Based on the human "exon 3" sequence (Example 6), oligonucleotides corresponding to the 3 'and 5' ends of this exon sequence were synthesized. These two primers were used in a PCR reaction using as a template cDNA prepared from various human tissues. The expected correct PCR product size was 140 bp. PCR
After analyzing the products on a 12% polyacrylamide gel, the expected size DNA fragments were obtained from cDNA libraries prepared from human adult kidney, 293 fetal kidney cells and cDNA prepared from human fetal liver.
Was detected.

【０１４５】次に、λＤＲ２中の胎児肝臓ｃＤＮＡライ
ブラリー（７ｘ１０⁶クローン）を、低緊縮ハイブリダ
イゼーション条件下でヒトゲノムライブラリーおよび胎
児肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いら
れた同じ４５量体オリゴヌクレオチドでスクリーニング
した。陽性クローンを選び、プラークを精製し、挿入物
の大きさをＰＣＲにより決定した。１．８ｋｂ挿入物を
伴う１個のクローンを、さらなる分析のために選択し
た。実施例７に記載の方法を用いて、ヒトｍｐｌリガン
ド（ｈＭＬ）のヌクレオチドおよび導き出されたアミノ
酸の配列を得た。これらの配列を図１および図２（配列
番号１および２）に示す。Next, the fetal liver cDNA library in λDR2 (7 × 10 ⁶ clones) was cloned under low stringency hybridization conditions with the same 45-mer oligonucleotide used to screen the human genomic library and fetal liver cDNA library. Screened. Positive clones were selected, plaques were purified, and insert sizes were determined by PCR. One clone with the 1.8 kb insert was selected for further analysis. Using the method described in Example 7, the nucleotide and derived amino acid sequences of human mpl ligand (hML) were obtained. These sequences are shown in FIGS. 1 and 2 (SEQ ID NOs: 1 and 2).

【０１４６】３．ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）の構造 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）ｃＤＮＡ配列（図１およ
び図２［配列番号２］）は、１７７４ヌクレオチドとそ
の後のポリ（Ａ）尾を含んでいる。これは２１５ヌクレ
オチドの５'非翻訳配列および４９８ヌクレオチドの３'
非翻訳領域を含んでいる。ヌクレオチド位置（２１６−
２１８）の仮定の開始コドンは、真核生物の翻訳開始に
とって好適な共通配列内にある。オープンリーディング
フレームは１０５９ヌクレオチド長であり、ヌクレオチ
ド位置２２０で始まる３５３アミノ酸残基のポリペプチ
ドをコードしている。予想アミノ酸配列のＮ末端は極め
て疎水性であり、恐らくシグナルペプチドに対応してい
るであろう。予想アミノ酸配列のコンピューター分析
（フォン・ヘイジュヌ等、Eur.J.Biochem.、１３３巻１
７−２１頁［１９８３］）は、シグナルペプチダーゼの
ための可能性ある開裂部位が残基２１および２２の間で
あることを示している。その位置での開裂は、ブタ血漿
から精製されたｍｐｌリガンドから得られたアミノ末端
配列で始まる３３２アミノ酸残基の成熟ポリペプチドを
生成するであろう。この３３２アミノ酸残基のリガンド
の、グリコシル化されていない予想分子量は、約３８ｋ
Ｄａである。６個の可能性あるＮ−グリコシル化部位お
よび４個のシステイン残基がある。[0146] 3. Structure of human mpl ligand (hML) The human mpl ligand (hML) cDNA sequence (FIGS. 1 and 2 [SEQ ID NO: 2]) contains 1774 nucleotides followed by a poly (A) tail. This is a 5 'untranslated sequence of 215 nucleotides and a 3' of 498 nucleotides.
Contains untranslated regions. The nucleotide position (216-
The postulated start codon of 218) is within a consensus sequence suitable for eukaryotic translation initiation. The open reading frame is 1059 nucleotides in length and encodes a 353 amino acid residue polypeptide starting at nucleotide position 220. The N-terminus of the predicted amino acid sequence is extremely hydrophobic and probably corresponds to a signal peptide. Computer analysis of predicted amino acid sequences (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133, 1)
7-21 [1983]) indicate that a potential cleavage site for signal peptidase is between residues 21 and 22. Cleavage at that position will generate a mature polypeptide of 332 amino acid residues beginning with the amino-terminal sequence obtained from the mpl ligand purified from porcine plasma. The predicted unglycosylated molecular weight of this 332 amino acid residue ligand is approximately 38 k.
Da. There are six potential N-glycosylation sites and four cysteine residues.

【０１４７】ｍｐｌリガンド配列とジーンバンク配列デ
ータベースとの比較は、成熟ヒトｍｐｌリガンドのアミ
ノ末端１５３残基とヒトエリスロポエチンとの間の２３
％の一致を明らかにした（図１１［配列番号６および
７］）。同類置換を考慮に入れると、ｈＭＬのこの領域
はヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）と５０％の類似性
を示す。ｈＥＰＯおよびｈＭＬはいずれも４個のシステ
インを含む。４個のシステインのうち最初と最後のシス
テインを含む３個がｈＭＬで保存されている。位置指定
突然変異生成実験は、エリスロポエチンの最初と最後の
システインが、機能に必要なジスルフィド結合を形成す
ることを示した（Ｆ．Ｆ．ワング等、Endocrinology、１
１６巻２２８６−２２９２頁［１９８３］）。類推によ
り、ｈＭＬの最初と最後のシステインもまた重要なジス
ルフィド結合を形成しているかも知れない。グリコシル
化部位のどれもｈＭＬで保存されてはいない。可能性あ
るｈＭＬのＮ結合グリコシル化部位は全てｈＭＬポリペ
プチドのカルボキシ末端側の半分に位置している。A comparison of the mpl ligand sequence with the Genebank sequence database shows that the amino acid sequence between the amino terminal 153 residue of the mature human mpl ligand and human erythropoietin.
A% match was revealed (Figure 11 [SEQ ID NOs: 6 and 7]). Taking into account conservative substitutions, this region of hML shows 50% similarity to human erythropoietin (hEPO). hEPO and hML both contain four cysteines. Three of the four cysteines, including the first and last, are conserved in hML. Site-directed mutagenesis experiments have shown that the first and last cysteines of erythropoietin form disulfide bonds required for function (F. F. Wang et al., Endocrinology, 1;
16, 2286-2292 [1983]). By analogy, the first and last cysteines of hML may also form important disulfide bonds. None of the glycosylation sites are conserved in hML. All potential N-linked glycosylation sites of hML are located in the carboxy-terminal half of the hML polypeptide.

【０１４８】ｈＥＰＯと同様に、ｈＭＬｍＲＮＡは共通
ポリアデニル化配列ＡＡＵＡＡＡを含まず、また、多く
のサイトカインの３'非翻訳領域に存在しｍＲＮＡの安
定性に影響していると考えられる調節要素ＡＵＵＵＡも
また含まない（シャウ等、Cell、４６巻６５９−６６７
頁［１９８６］）。ノーザンブロット分析では、胎児お
よび成人いずれの肝臓にも、低レベルの単一の１．８ｋ
ｂ ｈＭＬ ＲＮＡ転写物が現れている。より長く露光し
た後に、同じ大きさのより弱いバンドを、成人の腎臓で
検出することができた。比較すると、ヒトエリスロポエ
チンは、胎児肝臓に、そして低酸素症に応答して成人の
腎臓および肝臓に発現される（ジェイコブズ等、Natur
e、３１３巻８０４−８０９頁［１９８５］およびボン
デュラント等、Molec.Cell.Biol.、６巻２７３１−２７
３３頁［１９８６］）。Like hEPO, hML mRNA does not contain the consensus polyadenylation sequence AAUAAAA, nor does the regulatory element AAUUA, which is present in the 3 'untranslated region of many cytokines and is thought to affect mRNA stability. Not included (Shaw et al., Cell, 46, 659-667)
Page [1986]). Northern blot analysis showed low levels of a single 1.8k in both fetal and adult liver.
b hML RNA transcripts appear. After longer exposure, a weaker band of the same size could be detected in the adult kidney. In comparison, human erythropoietin is expressed in fetal liver and in adult kidney and liver in response to hypoxia (Jacobs et al., Natur
e, 313, 804-809 [1985] and Bondurant et al., Molec. Cell. Biol., 6, 2731-27.
33 [1986]).

【０１４９】ｈＭＬのＣ末端領域の重要性は尚、解明さ
れる必要がある。Ｎ結合グリコシル化のための６個の可
能性ある部位の存在およびレクチン親和カラムと結合す
るこのリガンドの能力に基づくと、ｈＭＬのこの領域は
グリコシル化されそうである。幾つかのゲル溶離実験に
おいて、本発明者等は、Ｍｒ６００００前後で活性が分
離することを観察したが、これは全長のグリコシル化さ
れた分子を表しているかも知れない。故に、Ｃ末端領域
は、循環するｈＭＬを安定化しその半減期を増大させる
ような作用をするのかも知れない。エリスロポエチンの
場合、非グリコシル化型は完全なインビトロ生物活性を
持つが、グリコシル化されたエリスロポエチンと比較し
て有意に短縮した血漿半減期を有する（タケウチ等、J.
Biol.Chem.、２６５巻１２１２７−１２１３０頁［１９
９０］；ナーヒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６
巻２３０２２−２３０２６頁［１９９１］およびスピヴ
ァック等、Ｂｌｏｏｄ、７巻９０−９９頁［１９８
９］）。ｈＭＬのＣ末端ドメインは、可能性あるプロセ
シング部位として働き得る２個の二塩基性アミノ酸配列
［１５３−１５４および２４５−２４６位のＡｒｇ−Ａ
ｒｇモチーフ］を含んでいる。これらの部位での開裂
が、ＡＰＰから分離されるＭＬの３０、２８および１８
−２２ｋＤａ型の生成を司っているのかも知れない。重
要なことに、Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄配列は、ＭＬのエリ
スロポエチン様ドメインの直後に存在する。これらの観
察は、全長のＭＬは、成熟リガンドを生成するための限
定された蛋白分解を受ける前駆体蛋白であり得るという
事を示している。The significance of the C-terminal region of hML still needs to be elucidated. Based on the presence of six potential sites for N-linked glycosylation and the ability of this ligand to bind to a lectin affinity column, this region of hML is likely to be glycosylated. In some gel elution experiments, we observed a separation of activity around Mr 60000, which may represent a full-length glycosylated molecule. Thus, the C-terminal region may act to stabilize circulating hML and increase its half-life. In the case of erythropoietin, the non-glycosylated form has full in vitro biological activity, but has a significantly reduced plasma half-life compared to glycosylated erythropoietin (Takeuchi et al., J. Am.
Biol. Chem., 265, 12127-12130 [19.
90]; Biol. Chem. , 266
Volume 23022-23026 [1991] and Spivak et al., Blood, Vol. 7, pages 90-99 [198].
9]). The C-terminal domain of hML contains two dibasic amino acid sequences [Arg-A at positions 153-154 and 245-246] that can serve as potential processing sites.
rg motif]. Cleavage at these sites will result in 30, 28 and 18 of ML being separated from APP.
It may be responsible for the generation of the -22 kDa type. Importantly, the Arg ₁₅₃ -Arg ₁₅₄ sequence immediately follows the erythropoietin-like domain of ML. These observations indicate that full length ML may be a precursor protein that undergoes limited proteolysis to generate the mature ligand.

【０１５０】４．ヒトｍｐｌリガンドのイソ型および変
異体 成人肝臓でのＰＣＲにより、ヒトｍｐｌリガンドのイソ
型または択一的スプライス型が検出された。簡潔に述べ
ると、ｈＭＬのコード化配列の各末端および選ばれた内
部領域に対応するプライマーが合成された。これらのプ
ライマーをＲＴ−ＰＣＲに使用して実施例１０に記載の
ように成人肝臓ＲＮＡを増幅した。ｈＭＬと命名された
全長型に加えて、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３およびｈＭＬ４と
命名される他の三つの型が観察されまたは導き出され
た。４個のイソ型全てについての導き出された成熟アミ
ノ酸配列を図１２および図１３（配列番号６、８、９お
よび１０）に示す。ｈＭＬ３は７００位に１１６のヌク
レオチド除去があり、これはアミノ酸の除去およびフレ
ームシフトの両方をもたらしている。このｃＤＮＡは、
今や、２６５アミノ酸長でアミノ酸残基１３９でｈＭＬ
から分岐する成熟ポリペプチドをコードしている。最後
に、ｈＭＬ４はヌクレオチド位置６１８の後の１２ヌク
レオチドの除去（マウスおよびブタの配列にも見いださ
れる［下記参照］）およびｈＭＬ３に見いだされる１１
６ｂｐ除去を有している。１２ｂｐ除去（ヌクレオチド
６１９の後に）のみを有するクローンはヒトにおいて分
離されていないが（ｈＭＬ２と命名される）、係るイソ
型がマウスおよびブタの両者で同定されている事（下記
参照）、そしてそれはｈＭＬ４の１１６ヌクレオチド除
去に関連して同定されている事から、この型は存在しそ
うである。4. Isoforms and variants of human mpl ligand PCR in adult liver detected isoforms or alternatively splice forms of human mpl ligand. Briefly, primers corresponding to each end of the coding sequence of hML and selected internal regions were synthesized. These primers were used in RT-PCR to amplify adult liver RNA as described in Example 10. In addition to the full-length form, designated hML, three other forms, designated hML2, hML3 and hML4, were observed or derived. The derived mature amino acid sequences for all four isoforms are shown in FIGS. 12 and 13 (SEQ ID NOs: 6, 8, 9, and 10). hML3 has 116 nucleotides removed at position 700, resulting in both amino acid removal and frameshifting. This cDNA is
Now hML with 265 amino acids long and 139 amino acid residues
Encodes a mature polypeptide diverging from. Finally, hML4 is removed at nucleotide 12 after nucleotide position 618 (also found in mouse and pig sequences [see below]) and 11 found in hML3.
Has 6 bp removal. A clone with only a 12 bp deletion (after nucleotide 619) has not been isolated in humans (designated hML2), but such an isoform has been identified in both mouse and pig (see below), and This type is likely, as it has been identified in connection with the 116 nucleotide removal of hML4.

【０１５１】二塩基性Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄配列が２個
のアラニン残基に置き換えられたｈＭＬの置換変異体お
よびｈＭＬの「ＥＰＯ−ドメイン」末端切除型の両方を
組み立てて、全長ＭＬが生物活性にとって必要であるか
否かを決定した。ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）と
呼ばれるＡｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄二塩基性配列置換変異体
は実施例１０に記載のようにＰＣＲを用いて組み立て
た。「ＥＰＯ−ドメイン」末端切除型、ｈＭＬ１５３も
またＰＣＲを使用し、Ａｒｇ１５３の後に停止コドンを
導入することによって作成した。Both the substitution mutant of hML, in which the dibasic Arg ₁₅₃ -Arg ₁₅₄ sequence was replaced by two alanine residues, and the "EPO-domain" truncated version of hML, were assembled to make the full-length ML biologically active. Was determined to be necessary. An Arg ₁₅₃ -Arg ₁₅₄ dibasic sequence substitution mutant called hML (R153A, R154A) was assembled using PCR as described in Example 10. The "EPO-domain" truncated version, hML153, was also created using PCR and introducing a stop codon after Arg153.

【０１５２】５．一過性トランスフェクトされたヒト胚
腎（２９３）細胞における組換えヒトｍｐｌリガンド
（ｒｈＭＬ）の発現 クローニングされたヒトｃＤＮＡがｍｐｌのためのリガ
ンドをコードしていることを確認するため、このリガン
ドを、発現ベクターｐＲＫ５−ｈＭＬまたはｐＲＫ５−
ｈＭＬ₁₅₃を用いてサイトメガロウイルス即時初期プロ
モーターの調節下に、哺乳動物２９３細胞で発現させ
た。一過性トランスフェクトさせたヒト胚腎２９３細胞
からの上清は、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞における³Ｈ−
チミジン取り込みを刺激するが、親のＢａ／Ｆ３細胞で
は刺激しないことが判明した（図１４）。ｐＲＫベクタ
ー単独でトランスフェクトさせた２９３細胞からの培地
はこの活性を含まなかった。この培地へのｍｐｌ−Ｉｇ
Ｇの添加は、この刺激を破壊した（データは示されてい
ない）。これらの結果は、クローニングされたｃＤＮＡ
は機能的ヒトＭＬ（ｈＭＬ）をコードしていることを示
している。[0152] 5. Expression of recombinant human mpl ligand (rhML) in transiently transfected human embryonic kidney (293) cells. To confirm that the cloned human cDNA encodes a ligand for mpl, , Expression vector pRK5-hML or pRK5-
under the control of the cytomegalovirus immediate early promoter using HML _153, was expressed in mammalian 293 cells. Supernatants from transiently transfected human embryonic kidney 293 cells were purified from ³ H-
It was found to stimulate thymidine incorporation but not parental Ba / F3 cells (FIG. 14). Medium from 293 cells transfected with the pRK vector alone did not contain this activity. Mpl-Ig to this medium
Addition of G disrupted this stimulus (data not shown). These results indicate that the cloned cDNA
Indicates that it encodes functional human ML (hML).

【０１５３】「ＥＰＯ−ドメイン」単独がｍｐｌに結合
しこれを活性化できるかどうかを決定するため、ｈＭＬ
の末端切除型、ｒｈＭＬ₁₅₃を２９３細胞で発現させ
た。トランスフェクトさせた細胞からの上清は、全長ｈ
ＭＬを発現する細胞からの上清に存在するものと類似の
活性を有することが判明し（図１４）、この事により、
ＭＬのＣ末端ドメインはｃ−ｍｐｌの結合および活性化
に必要ないことが示された。To determine whether the "EPO-domain" alone can bind and activate mpl, hML
The truncated form was expressed RHML ₁₅₃ in 293 cells. The supernatant from the transfected cells is full length h
It was found to have activity similar to that present in supernatants from cells expressing ML (FIG. 14),
It was shown that the C-terminal domain of ML was not required for c-mpl binding and activation.

【０１５４】６．ｍｐｌリガンドは巨核球形成および血
小板形成を刺激する 組換えｈＭＬの全長ｒｈＭＬおよび末端切除されたｒｈ
ＭＬ₁₅₃型はいずれもインビトロでヒト巨核球形成を刺
激した（図１５）。この効果は、他の、外から加えられ
た造血成長因子の不在下で観察された。ＩＬ−３を除い
て、ＭＬは、この活性を表す試験された唯一の造血成長
因子であった。ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ−１、エリ
スロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−９、ＬＩＦ、ｋｉｔ
リガンド（ＫＬ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＯＳＭおよびＧＭ−Ｃ
ＳＦは、本発明者等の検定で個別に試験する時、巨核球
形成への影響が無かった（データは示されていない）。
この結果はＭＬが巨核球刺激活性を有することを立証
し、巨核球形成の調節におけるＭＬの役割を示すもので
ある。6. mpl ligand stimulates megakaryocyte formation and platelet formation Full-length rhML and truncated rh of recombinant hML
Both _ML153 types stimulated human megakaryocyte formation in vitro (FIG. 15). This effect was observed in the absence of other, exogenously added hematopoietic growth factors. With the exception of IL-3, ML was the only hematopoietic growth factor tested to exhibit this activity. IL-11, IL-6, IL-1, erythropoietin, G-CSF, IL-9, LIF, kit
Ligand (KL), M-CSF, OSM and GM-C
SF had no effect on megakaryocyte formation when tested individually in our assay (data not shown).
This result proves that ML has megakaryocyte stimulating activity and indicates the role of ML in regulating megakaryocyte formation.

【０１５５】血小板減少症の動物の血漿に存在する血小
板形成活性は、マウスリバウンド血小板増加検定におい
て血小板の産生を刺激することが示された（マクドナル
ド、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１４巻１００６−１００
１頁［１９７３］およびマクドナルド等、Scand.J.Haem
atol.、１６巻３２６−３３４頁［１９７６］）。この
モデルにおいて、特異的抗血小板血清を用いてマウスを
急性血小板減少症とし、予言可能なリバウンド血小板増
加症を引き起こさせる。ちょうど低酸素症のマウスが正
常マウスよりエリスロポエチンに対してより感受性であ
る（マクドナルド等、J.Lab.Clin.Med.、７７巻１３４
−１４３頁［１９７１］）ように、係る免疫血小板血症
マウスは正常マウスより、外来性のトロンボポエチン様
活性に、より応答性が高い（マクドナルド、Proc.Soc.E
xp.Biol.Med.、１４巻１００６−１００１頁［１９７
３］）。ｒＭＬがインビボで血小板産生を刺激するかど
うかを決定するため、リバウンド血小板増加症のマウス
に部分精製されたｒｈＭＬを注射した。次いで、血小板
数および血小板への³⁵Ｓの取り込みを定量した。処置さ
れたマウスにおいて、賦形剤のみを注射された対照マウ
スに対して血小板数で〜２０％の増加（それぞれｐ＝
０．０００５および０．０００１）、そして血小板への
³⁵Ｓ取り込み〜で４０％の増加（ｐ＝０．００３）があ
ったことで証明されるように、マウスへの６４０００ま
たは３２０００単位のｒＭＬの注射は、血小板の産生を
有意に増加させた（図１６）。このレベルの刺激は、本
発明者等がＩＬ−６によってこのモデルで観察したもの
に匹敵する（データは示されていない）。１６０００単
位のｒＭＬでの処置は血小板産生を有意に刺激しなかっ
た。これらの結果は、ＭＬが血小板産生を用量依存的に
刺激し、故にトロンボポエチン様活性を有していること
を示すものである。The thrombopoietic activity present in the plasma of thrombocytopenic animals has been shown to stimulate platelet production in a mouse rebound thrombocytosis assay (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14 Volume 1006-100
Page 1 [1973] and McDonald et al., Scand. J. Haem
atol., 16: 326-334 [1976]). In this model, mice are made acute thrombocytopenia with specific antiplatelet serum, causing predictable rebound thrombocytosis. Just hypoxic mice are more sensitive to erythropoietin than normal mice (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med. 77: 134).
-143 [1971]), such immune thrombocythemia mice are more responsive to exogenous thrombopoietin-like activity than normal mice (McDonald, Proc. Soc. E).
xp. Biol. Med., 14: 1006-1001 [197
3]). To determine whether rML stimulates platelet production in vivo, mice with rebound thrombocytosis were injected with partially purified rhML. Then, to quantify the uptake of ³⁵ S to the platelet count and platelets. In treated mice, a ２０20% increase in platelet count over control mice injected with vehicle alone (p =
0.0005 and 0.0001) and to platelets
Injection of mice with 64000 or 32,000 units of rML significantly increased platelet production, as evidenced by a 40% increase (p = 0.003) in ³⁵ S incorporation. (FIG. 16). This level of stimulation is comparable to what we observed in this model with IL-6 (data not shown). Treatment with 16000 units of rML did not significantly stimulate platelet production. These results indicate that ML stimulates platelet production in a dose-dependent manner and therefore has thrombopoietin-like activity.

【０１５６】さらに、２９３細胞を上記の別なｈＭＬイ
ソ型組み立て物でトランスフェクトさせ、上清をＢａ／
Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定を用いて検定した（図１７を参照
されたい）。ｈＭＬ２およびｈＭＬ３はこの検定で検出
し得る活性を示さなかったが、ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ
１５４Ａ）の活性はｈＭＬおよびｈＭＬ₁₅₃と似通って
おり、この事は、Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄二塩基部位での
プロセシングは活性にとって必要でもなければ有害でも
ないことを示すものである。In addition, 293 cells were transfected with another hML isoform assembly as described above and the supernatant was Ba /
Assayed using the F3-mpl proliferation assay (see FIG. 17). Although hML2 and hML3 showed no detectable activity in this assay, hML (R153A, RML
Activity 154A) is similar with HML and HML _153, This is processed at Arg ₁₅₃ -Arg ₁₅₄ dibasic site is an indication that no detrimental if also required for activity.

【０１５７】７．巨核球形成とｍｐｌリガンド 巨核球形成は複数の細胞レベルで調節されているという
事が提唱されている（ウィリアムズ等、J.Cell Physio
l.、１１０巻１０１−１０４頁［１９８２］およびウィ
リアムズ等、Blood Cells、１５巻１２３−１３３頁
［１９８９］）。これは概して、或る造血成長因子は巨
核球祖先の増殖を刺激し、一方別のものは主として成熟
に影響するという観察に基づいている。本明細書に提示
された結果は、ＭＬは増殖および成熟因子の両方として
作用するという事を示唆している。ＭＬが巨核球祖先の
増殖を刺激するという事は、幾つかの方面の証拠によっ
て支持される。第一に、ＡＰＰはインビトロでヒト巨核
球の増殖および成熟の両方を刺激し、この刺激はｍｐｌ
−ＩｇＧにより完全に阻害される（図８および９）。さ
らに、ｃ−ｍｐｌアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
る巨核球コロニー形成の阻害（メシア等、Blood、８２
巻１３９５−１４０１頁［１９９３］）および、ｃ−ｍ
ｐｌが、それがトランスフェクトされる細胞において増
殖シグナルを変換できるという発見（スコダ等、EMBO、
１２巻２６４５−２６５３頁［１９９３］およびヴィゴ
ン等、Oncogene、８巻２６０７−２６１５頁［１９９
３］）もまた、ＭＬが増殖を刺激するという事を示して
いる。巨核球分化の全ての段階で明らかにｃ−ｍｐｌが
発現されること（メシア等、Blood、８２巻１３９５−
１４０１頁［１９９３］）、そしてインビボで血小板産
生を迅速に刺激する組換えＭＬの能力は、ＭＬが成熟に
も影響することを示している。組換えＭＬが利用できる
ことにより、巨核球形成および血小板形成の調節におけ
るその役割ならびに他の造血系統にそれが影響している
可能性を注意深く評価することが可能になる。[0157] 7. Megakaryocyte formation and mpl ligand It has been proposed that megakaryocyte formation is regulated at multiple cell levels (Williams et al., J. Cell Physio
I., 110, 101-104 [1982] and Williams et al., Blood Cells, 15, 123-133 [1989]). This is generally based on the observation that some hematopoietic growth factors stimulate proliferation of megakaryocyte ancestry, while others primarily affect maturation. The results presented herein suggest that ML acts as both a growth and maturation factor. The fact that ML stimulates proliferation of megakaryocyte ancestors is supported by several lines of evidence. First, APP stimulates both proliferation and maturation of human megakaryocytes in vitro, and this stimulation is mpl
-Completely inhibited by IgG (Figures 8 and 9). Furthermore, inhibition of megakaryocyte colony formation by c-mpl antisense oligonucleotide (Messia et al., Blood, 82
Volume 1394-1401 [1993]) and cm
discovery that pl can transduce growth signals in the cells in which it is transfected (Skoda et al., EMBO,
12, 2645-2653 [1993] and Vigon et al., Oncogene, 8 2607-2615 [199].
3]) also shows that ML stimulates proliferation. Clear expression of c-mpl at all stages of megakaryocyte differentiation (Messia et al., Blood, 82, 1395-
1401 [1993]) and the ability of recombinant ML to rapidly stimulate platelet production in vivo indicates that ML also affects maturation. The availability of recombinant ML makes it possible to carefully assess its role in the regulation of megakaryocyte formation and platelet formation and its potential impact on other hematopoietic lineages.

【０１５８】８．ヒトｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）遺伝子
の分離 ｐＲ４５を伴うλ−Ｇｅｍ１２中のヒトゲノムライブラ
リーを、低緊縮条件下または高緊縮条件下で、ｍｐｌリ
ガンドをコードしているヒトｃＤＮＡの３'側半分に対
応するフラグメントでスクリーニングすることにより、
ＴＰＯ遺伝子のヒトゲノムＤＮＡクローンを分離した。
３５ｋｂの２個の部分重複するλクローンが分離され
た。ＴＰＯ遺伝子全体を含む２個の部分重複するフラグ
メント（ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲＩ）をサブクローニ
ングし配列決定した（図１８、１９および２０を参照さ
れたい）。8. Isolation of the human mpl ligand (TPO) gene The human genomic library in λ-Gem12 with pR45 corresponds to the 3 'half of the human cDNA encoding the mpl ligand under low stringency or high stringency conditions. By screening with fragments,
A human genomic DNA clone of the TPO gene was isolated.
Two partially overlapping λ clones of 35 kb were isolated. Two overlapping fragments (BamH1 and EcoRI) containing the entire TPO gene were subcloned and sequenced (see FIGS. 18, 19 and 20).

【０１５９】このヒト遺伝子の構造は、７ｋｂのゲノム
ＤＮＡ内の６個のエクソンで構成されている。全エクソ
ン／イントロン接合部の境界は、哺乳動物遺伝子のため
に確立された共通モチーフと一致する（Ｍ．Ｂ．シャピ
ロ等、Nucl.Acids Res.、１５巻７１５５頁［１９８
７］）。エクソン１およびエクソン２は、５'非翻訳配
列およびシグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸を含
む。分泌シグナルの残部および成熟蛋白の最初の２６ア
ミノ酸は、エクソン３内部にコードされている。全カル
ボキシドメインおよび３'非翻訳ならびにエリスロポエ
チン様ドメインの〜５０アミノ酸は、エクソン６内部に
コードされている。ｈＭＬ−２（ｈＴＰＯ−２）内部に
観察される除去に含まれる４個のアミノ酸は、エクソン
６の５'末端にコードされている。The structure of this human gene is composed of six exons in a 7 kb genomic DNA. The boundaries of the entire exon / intron junction are consistent with a common motif established for mammalian genes (MB Shapiro et al., Nucl. Acids Res. 15, 7155 [198].
7]). Exon 1 and exon 2 contain the 5 'untranslated sequence and the first four amino acids of the signal peptide. The remainder of the secretion signal and the first 26 amino acids of the mature protein are encoded within exon 3. The entire carboxy domain and the 3 'untranslated and ~ 50 amino acids of the erythropoietin-like domain are encoded within exon 6. The four amino acids involved in the deletion observed within hML-2 (hTPO-2) are encoded at the 5 'end of exon 6.

【０１６０】サザンブロットによるヒトゲノムＤＮＡの
分析は、ＴＰＯのための遺伝子が単一のコピーで存在す
ることを示した。この遺伝子の染色体上の位置が蛍光イ
ンサイトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により
決定され、これは染色体３ｑ２７−２８に位置付けられ
た。Analysis of human genomic DNA by Southern blot showed that the gene for TPO was present in a single copy. The chromosomal location of this gene was determined by fluorescence in situ hybridization (FISH), which was mapped to chromosome 3q27-28.

【０１６１】９．２９３細胞からのＴＰＯの発現および
精製 ２９３細胞からのＭＬまたはＴＰＯの製造および精製を
実施例１９に詳細に記載する。簡潔に述べると、ＴＰＯ
の全オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡ
を、ｐＲＫ５−ｈｍｐｌ Ｉを用いるＰＣＲによって取
得した。このＰＣＲ生成物を精製し、プラスミドｐＲＫ
５ｔｋｎｅｏ（チミジンキナーゼプロモーターの調節の
下にネオマイシン耐性遺伝子を発現するよう修飾したｐ
ＲＫ５から誘導されたベクター）の制限部位ＣｌａＩお
よびＸｂａｌの間にクローニングして、ベクターｐＲＫ
５ｔｋｎｅｏ.ＯＲＦ（全オープンリーディングフレー
ムをコードしているベクター）を得た。9. Expression and Purification of TPO from 293 Cells The production and purification of ML or TPO from 293 cells is described in detail in Example 19. In short, TPO
CDNA corresponding to all open reading frames
Was obtained by PCR using pRK5-hmpl I. The PCR product is purified and the plasmid pRK
5tkneo (p modified to express the neomycin resistance gene under the control of the thymidine kinase promoter)
Cloned between the restriction sites ClaI and Xbal of the vector derived from RK5)
5tkneo.ORF (a vector encoding the entire open reading frame) was obtained.

【０１６２】ＥＰＯホモローガスドメインをコードして
いる第二のベクターを、異なるＰＣＲプライマーを使用
する外は同様にして生成し、ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏＥＰ
Ｏ−Ｄと呼ばれる最終組み立て物を得た。A second vector encoding the EPO homologous domain was generated in a similar manner except that different PCR primers were used, and pRK5-tkneoEP
A final assembly called O-D was obtained.

【０１６３】これら二つの組み立て物をＣａＰＯ₄法に
よりヒト胚腎臓細胞中にトランスフェクトさせ、ネオマ
イシン耐性クローンを選択し、密集成長させた。条件培
地でのこれらのクローンからのＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂の
発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定を用いて評価し
た。These two constructs were transfected into human embryonic kidney cells by the CaPO ₄ method, and neomycin-resistant clones were selected and grown to confluence. Expression of ML ₁₅₃ or ML ₃₃₂ from these clones in conditioned media was assessed using the Ba / F3-mpl proliferation assay.

【０１６４】ｒｈＭＬ₃₃₂の精製を実施例１９に記載の
ように実施した。簡潔に述べると、２９３−ｒｈＭＬ
₃₃₂条件培地をブルー−セファロース（ファルマシア）
カラムに適用し、その後２Ｍ尿素を含有する緩衝液で洗
浄した。このカラムを２Ｍ尿素および１Ｍ ＮａＣｌを
含有する緩衝液で溶離した。次に、このブルー−セファ
ロース溶出プールをＷＧＡ−セファロースカラムに直接
適用し、２Ｍ尿素および１Ｍ ＮａＣｌを含有する１０
カラム容量の緩衝液で洗浄し、０．５Ｍ Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンを含有する同じ緩衝液で溶離した。
ＷＧＡ−セファロース溶出液をＣ４−ＨＰＬＣカラム
（シンクロム、Ｉｎｃ．）に適用し、不連続プロパノー
ル勾配で溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製され
た２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂は、ゲルの６８−８０ｋＤａ領
域の幅広いバンドとして移動した（図２３を参照された
い）。[0164] was carried out as described in Example 19 Purification of RHML _332. Briefly, 293-rhML
₃₃₂ conditioned medium with Blue-Sepharose (Pharmacia)
The column was applied and then washed with a buffer containing 2M urea. The column was eluted with a buffer containing 2M urea and 1M NaCl. This Blue-Sepharose elution pool was then applied directly to a WGA-Sepharose column, containing 10M containing 2M urea and 1M NaCl.
Washed with column volume of buffer and eluted with the same buffer containing 0.5M N-acetyl-D-glucosamine.
The WGA-Sepharose eluate was applied to a C4-HPLC column (Synchrome, Inc.) and eluted with a discontinuous propanol gradient. By SDS-PAGE, 293-rhML ₃₃₂ purified migrated as broad band of 68-80kDa region of the gel (see Figure 23).

【０１６５】ｒｈＭＬ₁₅₃の精製もまた実施例１９に記
載のように実施した。簡潔に述べると、２９３−ｒｈＭ
Ｌ₁₅₃条件培地をｒｈＭＬ３３２について記載されたよ
うにブルー−セファロース上で分離した。このブルー−
セファロース溶出液を上記のようにｍｐｌ−親和カラム
に直接適用した。ｍｐｌ−親和カラムから溶出したｒｈ
ＭＬ₁₅₃を、ｒｈＭＬ₃₃₂に用いたのと同じ条件下で稼働
させるＣ４−ＨＰＬＣカラムを用いて、均質となるまで
精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、この精製されたｒ
ｈＭＬ１５３は、Ｍｒ〜１８０００−２２０００の２個
の主要なそして２個の重要性の低いバンドに分離する
（図２３を参照されたい）。[0165] was carried out as described in Purification also Example 19 RHML _153. Briefly, 293-rhM
They were separated on Sepharose - Blue as described for L ₁₅₃ conditioned media RhML332. This blue-
The Sepharose eluate was applied directly to the mpl-affinity column as described above. rh eluted from the mpl-affinity column
ML ₁₅₃ was purified to homogeneity using a C4-HPLC column operating under the same conditions as used for rhML ₃₃₂ . By SDS-PAGE, the purified r
hML153 separates into two major and two minor bands of Mr 〜18000-22000 (see FIG. 23).

【０１６６】１０．マウスｍｐｌリガンド ヒトｍｐｌリガンドのコード化領域に対応するＤＮＡフ
ラグメントをＰＣＲによって取得し、ゲル精製し、そし
て³²Ｐ−ｄＡＴＰおよび³²Ｐ−ｄＣＴＰの存在下で標識
した。このプローブを用いてλＧＴ１０中のマウス肝ｃ
ＤＮＡライブラリーの１０⁶のクローンをスクリーニン
グした。１４４３塩基対の挿入物を含むマウスクローン
（図２４および図２５［配列番号１２および１３］）を
分離し配列決定した。ヌクレオチド位置１３８−１４１
の仮定開始コドンは、真核生物の翻訳開始にとって望ま
しい共通配列内部にあった（Ｍ．コザック、J.Cell Bio
l.、１０８巻２２９−２４１頁［１９８９］）。この配
列は、３５２アミノ酸の一次翻訳産物が予想される１０
５６ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを規
定する。このオープンリーディングフレームには、５'
の１３７ヌクレオチドおよび３'非翻訳配列の２４７ヌ
クレオチドが隣接する。３'非翻訳領域に続くポリ
（Ａ）尾は無く、この事は、このクローンが恐らく完全
ではないことを示している。予想されるアミノ酸配列の
Ｎ末端は極めて疎水性であり、恐らくはシグナルペプチ
ドを表しているであろう。コンピューター分析（Ｇ．フ
ォン・ヘイジュヌ、Eur.J.Biochem.、１３３巻１７−２
１頁［１９８３］）は、残基２１および２２の間のシグ
ナルペプチダーゼのための可能性ある開裂部位を示し
た。その位置での開裂は、ｍＭＬ₃₃₁（または下記の理
由でｍＭＬ２）として同定される３３１アミノ酸の成熟
ポリペプチド（３５ｋＤａ）を産むであろう。この配列
は、ヒトの配列で全てが保存されている４個のシステイ
ン、および、ヒトの配列でそのうち５個が保存されてい
る７個の可能性あるＮグリコシル化部位を含んでいる。
さらに、ｈＭＬと同様に、７個の可能性あるＮグリコシ
ル化部位は全てこの蛋白のＣ末端側の半分に位置してい
る。10. Mouse mpl ligand The DNA fragment corresponding to the coding region of the human mpl ligand was obtained by PCR, gel purified and labeled in the presence of ³² P-dATP and ³² P-dCTP. Using this probe, mouse liver c in λGT10
10 ⁶ clones of the DNA library were screened. Mouse clones containing the 1443 base pair insert (FIGS. 24 and 25 [SEQ ID NOs: 12 and 13]) were isolated and sequenced. Nucleotide positions 138-141
Hypothetical initiation codon was within the consensus sequence desired for eukaryotic translation initiation (M. Kozak, J. Cell Bio.
l., 108, pp. 229-241 [1989]). This sequence is a 10% predicted primary translation product of 352 amino acids.
Defines an open reading frame of 56 nucleotides. This open reading frame has 5 '
137 nucleotides and 247 nucleotides of the 3 'untranslated sequence are flanked. There is no poly (A) tail following the 3 'untranslated region, indicating that this clone is probably not complete. The N-terminus of the predicted amino acid sequence is extremely hydrophobic and probably represents a signal peptide. Computer analysis (G. von Heijne, Eur. J. Biochem., 133, 17-2)
Page 1 [1983]) showed a potential cleavage site for signal peptidase between residues 21 and 22. Cleavage at that position will yield a 331 amino acid mature polypeptide (35 kDa) identified as mML ₃₃₁ (or mML2 for the reasons described below). This sequence contains four cysteines, all conserved in the human sequence, and seven potential N-glycosylation sites, five of which are conserved in the human sequence.
In addition, like hML, all seven potential N-glycosylation sites are located in the C-terminal half of the protein.

【０１６７】ヒトＭＬと比較した時、これらのＭＬの
「ＥＰＯドメイン」には、ヌクレオチドおよび導き出さ
れたアミノ酸配列の両方にかなりの一致が観察された。
しかしながら、ヒトおよびマウスＭＬの導き出されたア
ミノ酸配列を並べた場合、マウスの配列は、ヒト（上記
参照）およびブタ（下記参照）ｃＤＮＡの両者に見られ
るヌクレオチド位置６１８に続く１２ヌクレオチドの除
去に対応する残基１１１−１１４の間のテトラペプチド
の除去を有するようであった。したがって、可能性ある
マウスＭＬイソ型を検出するため、さらなるクローンを
調べた。１個のクローンが、「失われている」テトラペ
プチドＬＰＬＱを含む３３５アミノ酸の導き出される配
列のポリペプチドをコードしていた。この型は全長のマ
ウスＭＬであると信じられ、ｍＭＬまたはｍＭＬ₃₃₅と
呼ばれる。ｍＭＬに対するヌクレオチドおよび導き出さ
れたアミノ酸配列を図２６および図２７（配列番号１４
および１５）に提供する。このｃＤＮＡクローンは、１
４４３塩基対とこれに続くポリ（Ａ）尾で構成される。
これは、５'の１３４塩基および３'非翻訳配列の２４１
塩基が隣接する１０６８ｂｐのオープンリーディングフ
レームを有している。仮定された開始コドンはヌクレオ
チド位置１３８−１４０にある。このオープンリーディ
ングフレームは３５６アミノ酸の予想蛋白をコードして
おり、その最初の２１個は極めて疎水性で、分泌シグナ
ルとして機能していそうである。When compared to human ML, considerable agreement was observed in the "EPO domain" of these MLs, both in nucleotides and in the derived amino acid sequence.
However, when aligning the derived amino acid sequences of human and mouse ML, the mouse sequence corresponds to the removal of the 12 nucleotides following nucleotide position 618 found in both human (see above) and porcine (see below) cDNAs. It appears to have removal of the tetrapeptide between residues 111-114. Therefore, additional clones were examined to detect potential mouse ML isoforms. One clone encoded a polypeptide of 335 amino acids of derived sequence, including the "missing" tetrapeptide LPLQ. This type believed to be murine ML full length called mML or mML _335. The nucleotide and deduced amino acid sequences for mML are shown in FIGS. 26 and 27 (SEQ ID NO: 14).
And 15). This cDNA clone contains 1
Consists of 443 base pairs followed by a poly (A) tail.
This consists of 5 '134 bases and 241 of the 3' untranslated sequence.
It has a 1068 bp open reading frame flanked by bases. The postulated start codon is at nucleotide positions 138-140. This open reading frame encodes a predicted protein of 356 amino acids, the first 21 of which are extremely hydrophobic and likely function as secretion signals.

【０１６８】最後に、第三のマウスクローンを分離し、
配列決定し、ｈＭＬ３に対応する１１６のヌクレオチド
除去を含むことが見いだされた。このマウスイソ型は、
故にｍＭＬ３と命名する。これら２個のイソ型の導き出
されたアミノ酸配列の比較を図２８（配列番号９および
１６）に示す。Finally, a third mouse clone was isolated,
It was sequenced and found to contain 116 nucleotide deletions corresponding to hML3. This mouse isoform
Therefore, it is named as mML3. A comparison of the derived amino acid sequences of these two isoforms is shown in FIG. 28 (SEQ ID NOs: 9 and 16).

【０１６９】ヒトおよびマウスＭＬ（図２９［配列番号
６および１７］）の間の通算のアミノ酸配列一致は７２
％であるが、この相同性は均一に分布してはいない。
「ＥＰＯドメイン」として定義される領域（ヒト配列に
ついてはアミノ酸１−１５３、マウスについては１−１
４９）は、該蛋白のカルボキシ末端領域（６２％相同
性）より良好に保存されている（８６％相同性）。この
事はさらに、「ＥＰＯドメイン」のみが該蛋白の生物活
性にとって重要であるという事を示し得る。興味深いこ
とに、ｈＭＬに見いだされる２個の二塩基性アミノ酸モ
チーフのうち、ヒト配列中「ＥＰＯドメイン」の直後の
二塩基性モチーフ（残基位置１５３−１５４）のみがマ
ウス配列に存在する。この事は、全長ＭＬが、成熟リガ
ンドを生成するために限定的蛋白分解を受ける前駆体蛋
白であるかも知れないという可能性と一致する。これと
は別に、Ａｒｇ₁₅₃−Ａｒｇ₁₅₄の間の蛋白分解はｈＭＬ
のクリアランスを促進し得る。The total amino acid sequence identity between human and mouse ML (FIG. 29 [SEQ ID NOs: 6 and 17]) was 72
%, But this homology is not evenly distributed.
Region defined as "EPO domain" (amino acids 1-153 for human sequence, 1-1 for mouse)
49) is better conserved (86% homology) than the carboxy-terminal region of the protein (62% homology). This may further indicate that only the "EPO domain" is important for the biological activity of the protein. Interestingly, of the two dibasic amino acid motifs found in hML, only the dibasic motif (residue positions 153-154) immediately following the "EPO domain" in the human sequence is present in the mouse sequence. This is consistent with the possibility that full length ML may be a precursor protein that undergoes limited proteolysis to generate the mature ligand. Separately, proteolysis between Arg _{153 and} Arg ₁₅₄ is hML
Can promote clearance.

【０１７０】ｍＭＬの全コード化配列を含む発現ベクタ
ーを、実施例１に記載のように２９３細胞中に一過性ト
ランスフェクトした。これらの細胞からの条件培地は、
マウスまたはヒトｍｐｌのいずれかを発現するＢａ／Ｆ
３細胞中への³Ｈ−チミジン取り込みを刺激したが、親
（ｍｐｌ無し）のセルラインには影響を及ぼさなかっ
た。この事は、クローニングされたマウスＭＬ ｃＤＮ
Ａは、マウスおよびヒトＭＬレセプター（ｍｐｌ）の両
者を活性化することのできる機能的リガンドをコードし
ているという事を示している。An expression vector containing the entire coding sequence of mML was transiently transfected into 293 cells as described in Example 1. The conditioned medium from these cells
Ba / F expressing either mouse or human mpl
Stimulated ³ H-thymidine incorporation into 3 cells, but did not affect the parental (no mpl) cell line. This is because the cloned mouse ML cDN
A indicates that it encodes a functional ligand capable of activating both mouse and human ML receptors (mpl).

【０１７１】１１．ブタｍｐｌリガンド ブタＭＬ（ｐＭＬ）ｃＤＮＡを実施例１３に記載のよう
にＲＡＣＥ ＰＣＲによって分離した。１３４２ｂｐの
ＰＣＲ ｃＤＮＡ生成物が腎臓に見いだされ、サブクロ
ーニングされた。幾つかのクローンが配列決定され、図
２０（配列番号１８および１９）に示されるヌクレオチ
ドおよび導き出されたアミノ酸配列を有する、ｐＭＬ
（またはｐＭＬ３３２）と呼ばれる３３２アミノ酸残基
のブタｍｐｌリガンドをコードしていることが判明し
た。(11) Porcine mpl ligand Porcine ML (pML) cDNA was isolated by RACE PCR as described in Example 13. A 1342 bp PCR cDNA product was found in the kidney and subcloned. Several clones have been sequenced and have the nucleotide and deduced amino acid sequences shown in FIG. 20 (SEQ ID NOs: 18 and 19), pML
(Or pML332) was found to encode a 332 amino acid residue porcine mpl ligand.

【０１７２】さらに、４個のアミノ酸残基除去を有する
蛋白（２２８アミノ酸残基）をコードしているｐＭＬ２
と命名された第二の型が同定された（図３２および図３
３［配列番号２１］を参照されたい）。ｐＭＬおよびｐ
ＭＬ２アミノ酸配列の比較は、後者の型は、残基１１１
−１１４（両端を含む）に対応するテトラペプチドＱＬ
ＰＰが除去されている外は同一であることを示す（図３
４［配列番号１８および２１］を参照されたい）。マウ
スおよびブタＭＬｃＤＮＡの両者で観察される４アミノ
酸の除去は、予想された蛋白の正確に同じ位置で起こっ
ている。Furthermore, pML2 encoding a protein with four amino acid residue deletions (228 amino acid residues)
A second type, identified as (FIGS. 32 and 3)
3 [SEQ ID NO: 21]). pML and p
A comparison of the ML2 amino acid sequences shows that the latter form has residues 111
Tetrapeptide QL corresponding to -114 (inclusive)
It is the same except that PP is removed (FIG. 3)
4 [see SEQ ID NOs: 18 and 21]). The four amino acid deletions observed in both mouse and porcine ML cDNA occur at exactly the same position of the predicted protein.

【０１７３】ヒト、マウス、およびブタからの成熟ＭＬ
の予想アミノ酸配列の比較（図２９［配列番号６、１７
および１８］）は、全体の配列一致が、マウスおよびヒ
ト間で７２％、マウスおよびブタ間で６８％、そしてブ
タおよびヒト間で７３％であることを示す。相同性は、
実質上、ＭＬのアミノ末端側の半分（ＥＰＯホモローガ
スドメイン）で、より大きい。このドメインはどの二つ
の種間でも８０ないし８４％が同一であるが、カルボキ
シ末端側の半分（炭水化物ドメイン）は５７ないし６７
パーセントが一致するに過ぎない。プロテアーゼ開裂部
位を表し得る二塩基性アミノ酸モチーフは、エリスロポ
エチン相同性ドメインのカルボキシ末端に存在する。こ
のモチーフは、三つの種の間でこの位置に保存されてい
る（図２９［配列番号６、１７および１８］）。ヒトの
配列の２４５および２４６位に存在する第二の二塩基性
部位はマウスまたはブタ配列には存在しない。マウスお
よびブタＭＬ配列は４個のシステインを含み、全てがヒ
ト配列で保存されている。７個の可能性あるＮグリコシ
ル化部位がマウスリガンド内に、そして６個がブタＭＬ
内にあり、そのうち５個がヒト配列内で保存されてい
る。さらに、可能性あるＮグリコシル化部位は全てこの
蛋白のＣ末端側の半分に位置している。Mature ML from humans, mice, and pigs
Comparison of the predicted amino acid sequences (FIG. 29 [SEQ ID NOs: 6, 17]
And 18]) show that the overall sequence identity is 72% between mouse and human, 68% between mouse and pig, and 73% between pig and human. Homology is
Substantially larger in the amino-terminal half of the ML (EPO homologous domain). This domain is 80-84% identical between any two species, but the carboxy-terminal half (carbohydrate domain) is 57-67.
Only the percentages match. A dibasic amino acid motif that can represent a protease cleavage site is located at the carboxy terminus of the erythropoietin homology domain. This motif is conserved at this position among the three species (FIG. 29 [SEQ ID NOs: 6, 17 and 18]). The second dibasic site present at positions 245 and 246 of the human sequence is absent from the mouse or pig sequence. The mouse and pig ML sequences contain four cysteines, all conserved in human sequence. Seven potential N-glycosylation sites are within the mouse ligand and six are porcine ML
Of which five are conserved in the human sequence. In addition, all potential N-glycosylation sites are located in the C-terminal half of the protein.

【０１７４】１２．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞からのＴＰＯの発現および精製 ＣＨＯ細胞をトランスフェクトするのに用いられる発現
ベクターを指定する：ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲ
Ｆ（全長またはＴＰＯ₃₃₂）、およびｐＳＶＩ５.ＩＤ.
ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄ（末端切除されたまたはＴＰ
Ｏ₁₅₃）。これらのプラスミドの関連する特徴を図３５
および３６に示す。12. Chinese hamster ovary (CH
O) Expression and purification of TPO from cells Specify the expression vector used to transfect CHO cells: pSVI5.ID.LL.MLOR
F (full-length or TPO _332), and pSVI5.ID.
LL. MLEPO-D (truncated or TP
O ₁₅₃ ). The relevant features of these plasmids are shown in FIG.
And 36.

【０１７５】トランスフェクトの方法は実施例２０で説
明する。簡潔に述べると、ＴＰＯのオープンリーディン
グフレーム全体に対応するｃＤＮＡをＰＣＲにより取得
した。このＰＣＲ生成物を精製し、プラスミドｐＳＶＩ
５.ＩＤ.ＬＬの２個の制限部位（ＣｌａＩおよびＳａｌ
Ｉ）の間にクローニングして、ベクターｐＳＶＩ５.Ｉ
Ｄ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦを得た。ＥＰＯホモローガスドメイ
ンに対応する第二の組み立て物を、異なる逆プライマー
（ＥＰＯＤ.Ｓａｌ）を使用する外は同じやり方で作成
した。ＴＰＯのＥＰＯホモローガスドメインをコードし
ているベクターのための最終組み立て物はｐＳＶＩ５.
ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄと呼ぶ。The method of transfection is described in Example 20. Briefly, cDNA corresponding to the entire open reading frame of TPO was obtained by PCR. The PCR product is purified and the plasmid pSVI
5. Two restriction sites in ID.LL (ClaI and Sal
Cloning during I), the vector pSVI5.I
D.LL.MLORF was obtained. A second assembly corresponding to the EPO homologous domain was made in the same manner except using a different reverse primer (EPOD.Sal). The final construct for the vector encoding the EPO homologous domain of TPO is pSVI5.
It is called ID.LL.MLEPO-D.

【０１７６】これら二つの組み立て物をＮｏｔＩで線状
化し、電気穿孔によってチャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞、１９８９年３月１５日公開
のＥＰ３０７２４７）中にトランスフェクトした。１０
⁷の細胞を、記載のように（Ｇ．Ｌ．アンドレアソン、
J.Tissue Cult.Meth.、１５，５６［１９９３］）１
０、２５または５０ｍｇのＤＮＡの存在下でＢＲＬ電気
穿孔装置で電気穿孔した（３５０ボルト、３３０ｍＦ、
低キャパシタンス）。トランスフェクションの翌日、細
胞をＤＨＦＲ選択培地（グリシン無しの高グルコースＤ
ＭＥＭ−Ｆ１２５０：５０、２ｍＭグルタミン、２−５
％透析牛胎児血清）で***させた。１０ないし１５日
後、個々のコロニーを９６ウェルプレートに移し、密集
成長させた。これらのクローンからの条件培地中のＭＬ
₁₅₃またはＭＬ₃₃₂の発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検
定を用いて評価した（実施例１に記載）。The two constructs were linearized with NotI and transfected by electroporation into Chinese hamster ovary cells (CHO-DP12 cells, EP 307247 published March 15, 1989). 10
⁷ cells as described (GL Andreason,
J. Tissue Cult. Meth., 15, 56 [1993]) 1
Electroporated on a BRL electroporator in the presence of 0, 25 or 50 mg DNA (350 volts, 330 mF,
Low capacitance). The day after transfection, cells were plated in DHFR selective medium (high glucose D without glycine).
MEM-F1250: 50, 2 mM glutamine, 2-5
% Dialyzed fetal calf serum). After 10 to 15 days, individual colonies were transferred to 96-well plates and grown to confluence. ML in conditioned medium from these clones
The expression of ₁₅₃ or ML _332, was assessed using the Ba / F3-mpl proliferation assay (described in Example 1).

【０１７７】収穫されたＣＨＯ細胞培養の液体からのＴ
ＰＯの精製および分離の方法は実施例２０に記載する。
簡潔に述べると、収穫された細胞培養液（ＨＣＣＦ）
を、樹脂１リットルにつきおよそ１００ＬのＨＣＣＦの
比率でブルーセファロースカラム（ファルマシア）に適
用する。次にこのカラムを３ないし５カラム容量の緩衝
液、続いて２．０Ｍ尿素を含有する３ないし５カラム容
量の緩衝液で洗浄する。次いで２．０Ｍ尿素および１．
０Ｍ ＮａＣｌの両方を含有する緩衝液３ないし５カラ
ム容量でＴＰＯを溶離する。T from harvested CHO cell culture fluid
The method of purification and separation of PO is described in Example 20.
Briefly, harvested cell culture fluid (HCCF)
Is applied to a Blue Sepharose column (Pharmacia) at a ratio of approximately 100 L of HCCF per liter of resin. The column is then washed with 3-5 column volumes of buffer, followed by 3-5 column volumes of buffer containing 2.0M urea. Then 2.0M urea and 1.M.
The TPO is eluted with 3-5 column volumes of buffer containing both 0M NaCl.

【０１７８】次に、ＴＰＯを含有するブルーセファロー
ス溶出液のプールを、樹脂１ｍｌに付き８ないし１６ｍ
ｌのブルーセファロース溶出液の比率で、ブルーセファ
ロース溶離緩衝液中で平衡化した小麦胚芽レクチンセフ
ァロースカラム（ファルマシア）に適用する。次にこの
カラムを２ないし３カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄す
る。次いでＴＰＯを、２．０Ｍ尿素および０．５Ｍ Ｎ
−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する緩衝液２ない
し５カラム容量で溶離する。The pool of Blue Sepharose eluate containing TPO was then added to 8 to 16 m / ml of resin.
Apply at a ratio of 1 Blue Sepharose eluate to a wheat germ lectin Sepharose column (Pharmacia) equilibrated in Blue Sepharose elution buffer. The column is then washed with 2-3 column volumes of equilibration buffer. The TPO was then treated with 2.0 M urea and 0.5 M N
Elution with 2 to 5 column volumes of buffer containing -acetyl-D-glucosamine.

【０１７９】次に、ＴＰＯを含有する小麦胚芽レクチン
溶出液を酸性化し、Ｃ₁₂Ｅ₈を最終濃度０．０４％まで
加える。得られたプールを、樹脂１ｍｌに付きおよそ
０．２ないし０．５ｍｇ蛋白のロードで、０．１％ＴＦ
Ａ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈で平衡化したＣ４逆相カラムに
適用する。Next, the wheat germ lectin eluate containing TPO is acidified and C ₁₂ E ₈ is added to a final concentration of 0.04%. The resulting pool is loaded with 0.1% TF at a load of approximately 0.2-0.5 mg protein / ml resin.
A, it applied to a C4 reversed phase column equilibrated in 0.04% C ₁₂ E _8.

【０１８０】蛋白を、０．１％ＴＦＡおよび０．０４％
Ｃ₁₂Ｅ₈を含有するアセトニトリルの二相直線勾配で溶
離し、プールをＳＤＳ−ＰＡＧＥを基礎に作成する。The protein was made 0.1% TFA and 0.04%
Elution with biphasic linear gradient of acetonitrile containing C ₁₂ E _8, to create a pool based on SDS-PAGE.

【０１８１】次にＣ４プールを、１００００ないし３０
０００ダルトン分子量カットオフを有するアミコンＹＭ
等のような限外濾過膜上で、およそ６容量の緩衝液に対
して希釈およびダイアフィルトレーションする。次い
で、得られたダイアフィルトレートを直接処理しても、
または限外濾過によってさらに濃縮してもよい。ダイア
フィルトレート／濃縮液は通常、０．０１％トゥイーン
−８０の最終濃度に調節する。Next, the C4 pool was prepared at 10,000 to 30
Amicon YM with 000 dalton molecular weight cutoff
Dilution and diafiltration against approximately 6 volumes of buffer on an ultrafiltration membrane such as Then, even if the obtained diafiltrate is directly processed,
Alternatively, it may be further concentrated by ultrafiltration. Diafiltrate / concentrate is usually adjusted to a final concentration of 0.01% Tween-80.

【０１８２】次に、算出されたカラム容量の２ないし５
％に相当するダイアフィルトレート／濃縮液の全量また
は一部を、０．０１％トゥイーン−８０を含有する緩衝
液で平衡化したセファクリルＳ−３００ ＨＲカラム
（ファルマシア）に適用し、クロマトグラフィーに付
す。次いで、凝集物および蛋白分解産物を含まないＴＰ
Ｏ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥを基礎にプールする。得
られたプールを濾過し、２−８℃で保存する。Next, 2 to 5 of the calculated column capacity
% Of the diafiltrate / concentrate, which corresponds to a%, is applied to a Sephacryl S-300 HR column (Pharmacia) equilibrated with a buffer containing 0.01% Tween-80 and subjected to chromatography. . The TP is then free of aggregates and proteolysis products.
O-containing fractions are pooled on a SDS-PAGE basis. The resulting pool is filtered and stored at 2-8 ° C.

【０１８３】１３．微生物における形質転換およびＴＰ
Ｏ合成の誘導ならびにそこで生成されたＴＰＯの分離、
精製、および再折り畳みの方法 Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＰＯ発現ベクターの組み立ては実施例
２１に詳細に記載されている。簡潔に述べると、プラス
ミドｐＭＰ２１、ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐＭＰ５
７およびｐＭＰ２０２を、全て、異なった組み立て物間
で相違する小さなリーダーの下流のＴＰＯの１５５アミ
ノ酸を発現するよう設計した。このリーダーは主に高レ
ベルの翻訳開始および迅速な精製を提供する。プラスミ
ドｐＭＰ２１０−１、−Ｔ８、−２１、−２２、−２
４、−２５は、開始メチオニンの下流のＴＰＯの最初の
１５３アミノ酸を発現するよう設計し、ＴＰＯの最初の
６アミノ酸に対するコドン使用法のみが相違するが、一
方プラスミドｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端
が２アミノ酸だけ伸長しているｐＭＰ２１０−１の誘導
体である。上のプラスミドは全てトリプトファンプロモ
ーターの誘導時に大腸菌においてＴＰＯの高レベルの細
胞内発現を産むであろう（Ｄ．Ｇ．ヤンスラ等、Method
s in Enzymology（Ｄ．Ｖ．ゲッデル編）、１８５巻５
４−６０頁、アカデミック・プレス、サンディエゴ[１
９９０]）。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は
上記のＴＰＯ細胞内発現プラスミドの組み立ての際の中
間体である。13. Transformation in microorganisms and TP
Induction of O synthesis and separation of the TPO produced therefrom,
Methods of purification and refolding The construction of the E. coli TPO expression vector is described in detail in Example 21. Briefly, plasmids pMP21, pMP151, pMP41, pMP5
7 and pMP202 were all designed to express the 155 amino acids of TPO downstream of the small leader that differed between the different constructs. This leader provides primarily high levels of translation initiation and rapid purification. Plasmid pMP210-1, -T8, -21, -22, -2
4, -25 are designed to express the first 153 amino acids of TPO downstream of the starting methionine, differing only in the codon usage for the first 6 amino acids of TPO, whereas plasmid pMP251 has the carboxy terminus of TPO It is a derivative of pMP210-1 extended by 2 amino acids. All of the above plasmids will produce high levels of intracellular expression of TPO in E. coli upon induction of the tryptophan promoter (DG Jansula et al., Method
s in Enzymology (edited by DV Geddel), 185 5
4-60 pages, Academic Press, San Diego [1]
990]). Plasmids pMP1 and pMP172 are intermediates during the assembly of the TPO intracellular expression plasmid described above.

【０１８４】上のＴＰＯ発現プラスミドは、ＣａＣｌ₂
熱衝撃法（Ｍ．マンデル等、J.Mol.Biol.、５３巻１５
９−１６２頁［１９７０］）および実施例２１に記載さ
れるその他の方法を用いて大腸菌の形質転換に使用され
た。簡潔に述べると、形質転換された細胞は、まず、培
養の光学密度（６００ｎｍ）がおよそ２−３に達するま
で３７℃で増殖させた。次にこの培養を希釈し、そして
通気しつつ増殖させた後、酸を添加した。次いで培養を
通気しながら１５時間増殖を続けさせ、その後細胞を遠
心により収穫した。The above TPO expression plasmid was CaCl ₂
Thermal shock method (M. Mandel et al., J. Mol. Biol., 53:15)
9-162 [1970]) and other methods described in Example 21 were used to transform E. coli. Briefly, transformed cells were first grown at 37 ° C. until the optical density of the culture (600 nm) reached approximately 2-3. The culture was then diluted and grown with aeration before acid addition. The culture was then allowed to continue growing for 15 hours with aeration of the culture, after which the cells were harvested by centrifugation.

【０１８５】生物活性な、再折り畳みされたヒトＴＰＯ
またはそのフラグメントの生産のために下記に供される
分離、精製および再折り畳み法は実施例２２に説明され
ており、そして、２３は、ＮおよびＣ末端伸長型を包含
する任意のＴＰＯ変異体の回収のために適用することが
できる。組換えまたは合成ＴＰＯの再折り畳みに好適な
その他の方法は、大腸菌において不溶性型で発現される
様々な組換え蛋白のための回収および再折り畳み過程の
一般的記載に関する以下の特許；ビルダー等、米国特許
４５１１５０２；ジョーンズ等、米国特許４５１２９２
２；オルソン、米国特許４５１８５２６およびビルダー
等、米国特許４６２０９４８に見いだすことができる。Biologically active, refolded human TPO
Or the separation, purification, and refolding methods provided below for the production of fragments thereof are described in Example 22 and 23 is a fragment of any of the TPO variants, including the N- and C-terminal extensions. Can be applied for recovery. Other methods suitable for refolding of recombinant or synthetic TPO are described in the following patents for a general description of the recovery and refolding process for various recombinant proteins expressed in insoluble form in E. coli; US Pat. No. 4,512,502; Jones et al., US Pat.
2: Olson, US Pat. No. 4,518,526 and Builders, et al., In US Pat. No. 4,620,948.

【０１８６】Ａ．非可溶性ＴＰＯの回収 任意の適当なプラスミドによりコードされているＴＰＯ
を発現する大腸菌のような微生物は、ＴＰＯが不溶性
「屈折体」に蓄積される条件の下で発酵させる。所望に
より、細胞を最初に細胞破壊緩衝液で洗浄してもよい。
典型的には、例えばポリトロンホモジナイザーを用い
て、細胞約１００ｇを細胞破壊緩衝液約１０容量（例え
ば、１０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再
懸濁し、細胞を５０００ｘｇで３０分間遠心する。次に
細胞を、浸透圧衝撃、超音波処理、圧力サイクル、化学
的または酵素的方法のような任意の常套的技術を用いて
溶菌する。例えば、上記の洗浄した細胞ペレットは、ホ
モジナイザーを用いてさらに１０容量の細胞破壊緩衝液
に再懸濁することができ、この細胞懸濁液を、製造者の
指示に従って、ＬＨ細胞破砕機（ＬＨインセルテク、Ｉ
ｎｃ．）またはマイクロフルイダイザー（マイクロフル
イディクス・インターナショナル）に通す。次に、ＴＰ
Ｏを含有する粒状物質を液相から分離し、所望により適
当な液体で洗浄する。例えば、細胞溶菌液の懸濁液を５
０００ｘｇで３０分間遠心し、再懸濁し、所望により二
回目の遠心を行い、洗浄された屈折体ペレットを作成す
ることができる。洗浄されたペレットは直ちに使用する
ことができ、または所望により凍結保存することもでき
る（例えば−７０℃）。A. Recovery of insoluble TPO TPO encoded by any suitable plasmid
Microorganisms such as Escherichia coli that express E. coli are fermented under conditions in which TPO accumulates in insoluble "refractors". If desired, the cells may be washed first with a cell disruption buffer.
Typically, about 100 g of cells are resuspended in about 10 volumes of cell disruption buffer (eg, 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) using, for example, a Polytron homogenizer, and the cells are centrifuged at 5000 × g for 30 minutes. The cells are then lysed using any conventional technique such as osmotic shock, sonication, pressure cycling, chemical or enzymatic methods. For example, the washed cell pellet described above can be resuspended in an additional 10 volumes of cell disruption buffer using a homogenizer, and the cell suspension can be reconstituted according to the manufacturer's instructions using an LH cell disrupter (LH cell disrupter). Inseltech, I
nc. ) Or Microfluidizer (Microfluidics International). Next, TP
The particulate matter containing O is separated from the liquid phase and, if desired, washed with a suitable liquid. For example, a cell lysate suspension
Centrifuge at 000 × g for 30 minutes, resuspend, and optionally centrifuge a second time to produce a washed refractor pellet. The washed pellet can be used immediately or, if desired, can be stored frozen (e.g., -70C).

【０１８７】Ｂ．単量体ＴＰＯの可溶化および精製 次いで、屈折体ペレット中の不溶性ＴＰＯを可溶化緩衝
液で可溶化する。可溶化緩衝液はカオトロピック剤を含
有し、通常、塩基性ｐＨに緩衝化されており、そして単
量体ＴＰＯの収量を改善するために還元剤を含有してい
る。代表的カオトロピック剤は、尿素、グアニジンＨＣ
ｌ、およびチオシアン酸ナトリウムが包含される。好ま
しいカオトロピック剤はグアニジンＨＣｌである。カオ
トロピック剤の濃度は通常４−９Ｍ、好ましくは６−８
Ｍである。可溶化緩衝液のｐＨは、任意の適当な緩衝剤
により、ｐＨ範囲約７．５−９．５、好ましくは８．０
−９．０、そして最も好ましくは８．０に維持する。好
ましくは、可溶化緩衝液は、単量体型ＴＰＯの形成を助
けるために還元剤をも含有する。好適な還元剤は、遊離
チオールを含む有機化合物（ＲＳＨ）を包含する。代表
的還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエ
リスリトール（ＤＴＥ）、メルカプトエタノール、グル
タチオン（ＧＳＨ）、システアミンおよびシステインを
包含する。好ましい還元剤はジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）である。所望により、可溶化緩衝液は、緩和な酸化
剤（例えば分子酸素）および亜硫酸分解を介して単量体
ＴＰＯを形成させるための亜硫酸塩を含有させることが
できる。この態様においては、得られたＴＰＯ−Ｓ−ス
ルホナートを後で酸化還元緩衝液（例えばＧＳＨ／ＧＳ
ＳＧ）の存在下で再折り畳みして、正しく折り畳まれた
ＴＰＯを形成させる。B. Solubilization and Purification of Monomeric TPO Next, the insoluble TPO in the refractor pellet is solubilized with a solubilization buffer. The solubilization buffer contains a chaotropic agent, usually buffered to a basic pH, and contains a reducing agent to improve the yield of monomeric TPO. Representative chaotropic agents include urea, guanidine HC
l, and sodium thiocyanate. A preferred chaotropic agent is guanidine HCl. The concentration of the chaotropic agent is usually 4-9M, preferably 6-8M.
M. The pH of the solubilization buffer is adjusted with any suitable buffer to a pH range of about 7.5-9.5, preferably 8.0.
-9.0, and most preferably maintained at 8.0. Preferably, the solubilization buffer also contains a reducing agent to aid in the formation of monomeric TPO. Suitable reducing agents include organic compounds containing free thiols (RSH). Representative reducing agents include dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), mercaptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine and cysteine. A preferred reducing agent is dithiothreitol (DT
T). If desired, the solubilization buffer can contain a mild oxidizing agent (eg, molecular oxygen) and sulfite to form monomeric TPO via sulfite decomposition. In this embodiment, the obtained TPO-S-sulfonate is later exchanged with a redox buffer (eg, GSH / GS).
Refold in the presence of SG) to form a correctly folded TPO.

【０１８８】通常ＴＰＯ蛋白は、例えば遠心、ゲル濾過
クロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラフィ
ーを用いてさらに精製する。Usually, the TPO protein is further purified using, for example, centrifugation, gel filtration chromatography and reverse phase column chromatography.

【０１８９】例示のために、以下の方法で適当な収量の
単量体ＴＰＯを生成した。屈折体ペレットを約５容量／
重量の可溶化緩衝液（６−８Ｍグアニジンおよび２５ｍ
ＭＤＴＴを伴う２０ｍＭトリス、ｐＨ８）に再懸濁し、
１−３時間、または一夜攪拌して、ＴＰＯ蛋白の可溶化
を起こさせる。高濃度の尿素（６−８Ｍ）もまた有用で
あるが、一般にグアニジンと比べて幾分低い収量をもた
らす。可溶化の後、この溶液を３００００ｘｇで３０分
間遠心し、変性した単量体ＴＰＯ蛋白を含有する透明な
上清を生成させる。次に上清を、流速２ｍｌ／分でスー
パーデックス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア、
２．６ｘ６０ｃｍ）上のクロマトグラフィーに付し、１
０ｍＭ ＤＴＴを伴う２０ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ６．０で
蛋白を溶出する。１６０および２００ｍｌの間に溶出す
る単量体の変性ＴＰＯ蛋白を含有する画分をプールす
る。このＴＰＯ蛋白を半調製用Ｃ４逆相カラム（２ｘ２
０ｃｍＶＹＤＡＣ）上でさらに精製する。３０％アセト
ニトリルを伴う０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で
平衡化したカラムに試料を５ｍｌ／分で適用する。蛋白
をアセトニトリルの直線勾配（６０分間で３０−６０
％）で溶出する。精製された還元された蛋白はおよそ５
０％アセトニトリルの時点で溶出する。この物質を再折
り畳みに使用して生物活性なＴＰＯ変異体を得る。For illustrative purposes, a suitable yield of monomeric TPO was produced in the following manner. About 5 volumes /
Weight of solubilization buffer (6-8M guanidine and 25m
Resuspend in 20 mM Tris, pH 8) with MDTT,
Stir for 1-3 hours or overnight to allow solubilization of the TPO protein. Higher concentrations of urea (6-8M) are also useful, but generally result in somewhat lower yields compared to guanidine. After solubilization, the solution is centrifuged at 30,000 xg for 30 minutes to produce a clear supernatant containing the denatured monomeric TPO protein. The supernatant was then applied to a Superdex 200 gel filtration column (Pharmacia,
(2.6 × 60 cm) and 1
Elute the protein with 20 mM Na phosphate with 0 mM DTT, pH 6.0. Fractions containing monomeric denatured TPO protein eluted between 160 and 200 ml are pooled. This TPO protein was converted to a semi-preparative C4 reverse phase column (2 × 2
(0 cm VYDAC). The sample is applied at 5 ml / min to a column equilibrated with 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) with 30% acetonitrile. The protein was subjected to a linear gradient of acetonitrile (30-60 minutes in 60 minutes).
%). Approximately 5 purified reduced proteins
Elute at 0% acetonitrile. This material is used for refolding to yield a biologically active TPO variant.

【０１９０】Ｃ．生物活性型を生成させるためのＴＰＯ
の再折り畳み ＴＰＯの可溶化およびさらなる精製の後、変性した単量
体ＴＰＯを酸化還元緩衝液中で再折り畳みすることによ
り、生物活性型を取得する。ＴＰＯの力価が高い（Ｂａ
／Ｆ３検定における半最大刺激はおよそ３ｐｇ／ｍｌで
達成される）ため、多くの異なる緩衝液、洗浄剤および
酸化還元条件を利用して生物活性物質を取得することが
可能である。しかしながら、殆どの条件の下では、正し
く折り畳まれた物質は少量（＜１０％）得られるに過ぎ
ない。商業的製造工程のためには、少なくとも１０％、
より好ましくは３０−５０％、そして最も好ましくは＞
５０％の再折り畳み収率であることが望ましい。トリト
ンＸ−１００、ドデシル−β−マルトシド、ＣＨＡＰ
Ｓ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、サルコシル、トゥイーン２
０およびトゥイーン８０、ツヴィッタージェント３−１
４およびその他を包含する多くの異なる洗浄剤が、少な
くとも幾らかの正しく折り畳まれた物質を生成するのに
好適であることが見いだされた。しかしながらこれらの
うち、最も好ましい洗浄剤はＣＨＡＰＳファミリー（Ｃ
ＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯ）のものであって、これら
は再折り畳み反応で最も良好に働き、蛋白凝集および不
適正なジスルフィド形成を制限するとわかった。約１％
より高いレベルのＣＨＡＰＳが最も好ましかった。最良
の収率には塩化ナトリウムが必要であり、最適レベルは
０．１Ｍおよび０．５Ｍの間であった。幾つかの調製物
で観察される、金属で触媒される酸化（および凝集）の
量を制限するため、酸化還元緩衝液中にＥＤＴＡ（１−
５ｍＭ）を存在させることが好ましかった。１５％より
高いグリセロール濃度は最適の再折り畳み条件を産ん
だ。最大収率のためには、酸化されたそして還元された
有機チオール（ＲＳＨ）の両方で構成される酸化還元緩
衝液中の酸化還元対があることが必須であった。好適な
酸化還元対には、メルカプトエタノール、グルタチオン
（ＧＳＨ）、システアミン、システインおよびそれらの
対応する酸化型が包含される。好ましい酸化還元対はグ
ルタチオン（ＧＳＨ）：酸化型グルタチオン（ＧＳＳ
Ｇ）またはシステイン：シスチンであった。最も好まし
い酸化還元対はグルタチオン（ＧＳＨ）：酸化型グルタ
チオン（ＧＳＳＧ）であった。一般に、酸化還元対の酸
化型のモル比が酸化還元対の還元型と等しいかまたは過
剰である時に高い収率が観察された。７．５および約９
の間のｐＨ値がこれらのＴＰＯ変異体の再折り畳みにと
って最適であった。有機溶媒（例えば、エタノール、ア
セトニトリル、メタノール）は１０−１５％またはこれ
以下の濃度では寛容された。より高い濃度の有機溶媒
は、不適切に折り畳まれた型の量を増加させた。トリス
および燐酸緩衝液が一般に有用であった。４℃でのイン
キュベーションもまた高レベルの正しく折り畳まれたＴ
ＰＯを生産した。C. TPO for producing bioactive forms
After solubilization and further purification of TPO, the bioactive form is obtained by refolding the denatured monomeric TPO in a redox buffer. High titer of TPO (Ba
Since half-maximal stimulation in the / F3 assay is achieved at approximately 3 pg / ml), it is possible to utilize many different buffers, detergents and redox conditions to obtain bioactive agents. However, under most conditions, only a small amount (<10%) of correctly folded material is obtained. For commercial manufacturing processes, at least 10%,
More preferably 30-50%, and most preferably>
A refolding yield of 50% is desirable. Triton X-100, dodecyl-β-maltoside, CHAP
S, CHAPSO, SDS, Sarkosyl, Tween 2
0 and Tween 80, Zwittergent 3-1
Many different detergents, including No. 4 and others, have been found to be suitable for producing at least some correctly folded material. However, among these, the most preferred detergents are the CHAPS family (C
HAPS and CHAPSO), which have been found to work best in refolding reactions and limit protein aggregation and improper disulfide formation. About 1%
Higher levels of CHAPS were most preferred. The best yield required sodium chloride and the optimal level was between 0.1M and 0.5M. To limit the amount of metal-catalyzed oxidation (and aggregation) observed in some preparations, EDTA (1-
(5 mM) was preferred. Glycerol concentrations higher than 15% yielded optimal refolding conditions. For maximum yield, it was essential that there be a redox couple in a redox buffer composed of both oxidized and reduced organic thiols (RSH). Suitable redox couples include mercaptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine, cysteine and their corresponding oxidized forms. A preferred redox couple is glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSS
G) or cysteine: cystine. The most preferred redox couple was glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSSG). In general, high yields were observed when the molar ratio of the oxidized form of the redox couple was equal to or in excess of the reduced form of the redox couple. 7.5 and about 9
PH values between were optimal for refolding of these TPO variants. Organic solvents (eg, ethanol, acetonitrile, methanol) were tolerated at concentrations of 10-15% or less. Higher concentrations of organic solvents increased the amount of improperly folded forms. Tris and phosphate buffers were generally useful. Incubation at 4 ° C. also resulted in high levels of correctly folded T
Produced PO.

【０１９１】最初のＣ４工程で精製されたＴＰＯの製造
では、４０−６０％（再折り畳み反応に用いられた還元
および変性されたＴＰＯの量に基づく）の再折り畳み収
率が典型的である。活性物質は純度の低い調製物からも
得られるが（例えば、スーパーデックス２００カラム後
または最初の屈折体抽出後に直ちに）、長時間の沈澱化
およびＴＰＯ再折り畳み工程中の非ＴＰＯ蛋白の妨害の
ため、収率は、より低い。For the production of purified TPO in the first C4 step, a refolding yield of 40-60% (based on the amount of reduced and denatured TPO used in the refolding reaction) is typical. The active substance can also be obtained from impure preparations (eg, after a Superdex 200 column or immediately after the first refractor extraction), but due to prolonged precipitation and interference of non-TPO proteins during the TPO refolding step. , The yield is lower.

【０１９２】ＴＰＯは４個のシステイン残基を含むた
め、この蛋白では３個の異なったジスルフィド型の生成
が可能である： 第一の型：システイン残基１−４および２−３の間のジ
スルフィド、 第二の型：システイン残基１−２および３−４の間のジ
スルフィド、 第三の型：システイン残基１−３および２−４の間のジ
スルフィド。Since TPO contains four cysteine residues, three different disulfide forms can be generated in this protein: First type: between cysteine residues 1-4 and 2-3. Disulfide, second type: disulfide between cysteine residues 1-2 and 3-4, third type: disulfide between cysteine residues 1-3 and 2-4.

【０１９３】再折り畳み条件を決定する際の初期の探究
中に、ＴＰＯ蛋白を含有する幾つかの異なったピークが
Ｃ４逆相クロマトグラフィーにより分離された。これら
のピークのうちただ一つが、Ｂａ／Ｆ３検定を用いて測
定したところ有意な生物活性を持っていた。続いて、再
折り畳み条件を、専らその型が生成するように最適化し
た。これらの条件の下で、誤って折り畳まれた型は、可
溶化工程から得られた総単量体ＴＰＯの１０−２０％未
満であった。During an early search in determining refolding conditions, several different peaks containing the TPO protein were separated by C4 reverse phase chromatography. Only one of these peaks had significant biological activity as determined using the Ba / F3 assay. Subsequently, the refolding conditions were optimized exclusively to generate that type. Under these conditions, the misfolded form was less than 10-20% of the total monomeric TPO obtained from the solubilization step.

【０１９４】生物活性なＴＰＯのジスルフィドパターン
は、質量分析および蛋白配列決定により１−４および２
−３であると決定された（ここでシステインはアミノ末
端から順に番号を付す）。このシステイン架橋パターン
は、関連分子エリスロポエチンの既知のジスルフィド結
合パターンと一致している。The disulfide pattern of the biologically active TPO was determined by mass spectrometry and protein sequencing by 1-4 and 2
-3 (where cysteines are numbered sequentially from the amino terminus). This cysteine crosslinking pattern is consistent with the known disulfide bond pattern of the related molecule erythropoietin.

【０１９５】Ｄ．組換え再折り畳みＴＰＯの生物活性 再折り畳みされ精製されたＴＰＯはインビトロおよびイ
ンビボ検定の両方で活性を持っている。例えばＢａ／Ｆ
３検定において、ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の、Ｂ
ａ／Ｆ３細胞中へのチミジン取り込みの半最大刺激は
３．３ｐｇ／ｍｌ（０．３ｐＭ）で達成された。ｍｐｌ
レセプターに基づくＥＬＩＳＡにおいては、半最大活性
は１．９ｎｇ／ｍｌ（１２０ｐＭ）で出現した。正常の
および近致死Ｘ線照射により作り出された骨髄抑制動物
では、再折り畳みされたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）
は、極めて強力に（わずか３０ｎｇ／マウスの用量で活
性が見られた）新しい血小板の産生を刺激した。上に記
載の方法に従って再折り畳みされたＴＰＯの他の型につ
いても、同様の生物活性が観察された（図３７、３８、
３９、４０、４１、４２および４６を参照されたい）。D. Biological Activity of Recombinant Refolded TPO Refolded and purified TPO is active in both in vitro and in vivo assays. For example, Ba / F
In three assays, TPO (Met ^-1 1-153), B
Half-maximal stimulation of thymidine incorporation into a / F3 cells was achieved at 3.3 pg / ml (0.3 pM). mpl
In the receptor-based ELISA, half-maximal activity appeared at 1.9 ng / ml (120 pM). In myelosuppressed animals created by normal and near lethal X-irradiation, refolded TPO (Met ^- 11-153)
Stimulated the production of new platelets extremely strongly (activity was seen at doses of only 30 ng / mouse). Similar biological activity was observed with other forms of TPO refolded according to the method described above (FIGS. 37, 38,
39, 40, 41, 42 and 46).

【０１９６】１４．血小板形成活性の測定方法 血小板形成活性は、実施例１に記載のＢａ／Ｆ３ ｍｐ
ｌリガンド検定、インビボマウス血小板リバウンド合成
検定、ヒト白血病巨核芽球セルライン（ＣＭＫ）のため
の抗血小板イムノアッセイ（抗ＧＰII_bIII_a）により測
定される血小板細胞表面抗原の誘導検定（サトー等、Br
it.J.Heamatol.、７２巻１８４−１９０頁［１９８
９］）（実施例４に記載の液体懸濁巨核球形成検定をも
参照されたい）、および巨核芽球セルライン（ＤＡＭ
Ｉ）における多能化の誘導（オグラ等、Blood、７２
（１）巻４９−６０頁［１９８８］を参照されたい）を
包含する様々な検定で測定することができる。未熟な、
大抵は非ＤＮＡ合成細胞から形態学的に同定し得る巨核
球への巨核球の成熟は、細胞質小器官の出現、膜抗原
（ＧＰII_bIII_a）の獲得、背景に記載のような血小板の
細胞内複製および放出を包含する工程を含む。巨核球成
熟の系統特異的プロモーター（即ち、ｍｐｌリガンド）
は、未熟な巨核球におけるこれらの変化のうち少なくと
も幾つかを誘発し、血小板放出および血小板減少症の寛
解に導くと予想される。したがって、未熟な巨核球セル
ライン、即ちＣＭＫおよびＤＡＭＩ細胞でこれらのパラ
メータの出現を測定するような検定を設計した。ＣＭＫ
検定（実施例４）は、特異的血小板マーカー、ＧＰII_bI
II_aの出現および血小板放散を測定する。ＤＡＭＩ検定
（実施例１５）は、倍数性の増加が成熟巨核球の証拠で
あることから、細胞内複製を測定するものである。認識
し得る巨核球は、倍数値が２Ｎ、４Ｎ、８Ｎ、１６Ｎ、
３２Ｎ等である。最後に、インビボマウス血小板リバウ
ンド検定（実施例１６）は、被験化合物（本明細書では
ｍｐｌリガンド）の投与が血小板数の上昇を招くことを
立証するのに有用である。14. Method for Measuring Platelet-Forming Activity The platelet-forming activity was measured using the Ba / F3mp described in Example 1.
l ligand assays, in vivo mouse platelet rebound synthesis assay, anti-platelet immunoassay (anti-GPII _b III _a) induction assays platelet cell surface antigen as measured by for human leukemia megakaryoblastic cell line (CMK) (SATO like, Br
it.J.Heamatol., 72, 184-190 [198
9]) (see also the liquid suspension megakaryocyte formation assay described in Example 4), and the megakaryoblast cell line (DAM
Induction of pluripotency in I) (Ogura et al., Blood, 72
(1), see pages 49-60 [1988]). Immature,
Maturation of megakaryocytes mostly from non-DNA synthesizing cells into megakaryocytes which may morphologically identified, the appearance of cytoplasmic organelles, membranes acquire antigens (GPII _b III _a), platelet as described in the background cell Including steps involving internal replication and release. A lineage-specific promoter for megakaryocyte maturation (ie, mpl ligand)
Is expected to induce at least some of these changes in immature megakaryocytes, leading to remission of platelet release and thrombocytopenia. Therefore, assays were designed to measure the appearance of these parameters in immature megakaryocyte cell lines, namely CMK and DAMI cells. CMK
Test (Example 4), a specific platelet marker, GPII _b I
To measure the appearance and platelet dissipation of II _a. The DAMI assay (Example 15) measures intracellular replication since increased ploidy is evidence of mature megakaryocytes. Recognizable megakaryocytes have multiple values of 2N, 4N, 8N, 16N,
32N. Finally, the in vivo mouse platelet rebound assay (Example 16) is useful in demonstrating that administration of a test compound (here, mpl ligand) results in an increase in platelet count.

【０１９７】ＴＰＯ活性を測定するために、さらに二つ
のインビトロ検定が開発されている。第一はキナーゼレ
セプター活性化（ＫＩＲＡ）ＥＬＩＳＡであって、ここ
では、ＣＨＯ細胞をｍｐｌ−Ｒｓｅキメラでトランスフ
ェクトさせ、このキメラのｍｐｌ部分をｍｐｌリガンド
に暴露させた後、ＥＬＩＳＡによってＲｓｅのチロシン
燐酸化を測定するものである（実施例１７を参照された
い）。第二はレセプターに基づくＥＬＩＳＡであって、
ここでは、ウサギ抗ヒトＩｇＧで被覆したＥＬＩＳＡプ
レートが、検定されるｍｐｌリガンドを結合させるヒト
キメラレセプターｍｐｌ−ＩｇＧを捕捉する。ｍｐｌリ
ガンド（ＴＰＯ₁₅₅）に対するビオチニル化ウサギポリ
クローナル抗体を用いて、結合したｍｐｌリガンドを検
出し、これを実施例１８に記載のようにストレプトアビ
ジン−ペルオキシダーゼを用いて測定する。Two additional in vitro assays have been developed to measure TPO activity. The first is a kinase receptor activation (KIRA) ELISA, in which CHO cells are transfected with an mpl-Rse chimera, the mpl portion of the chimera is exposed to mpl ligand, and then the tyrosine phosphate of Rse is detected by ELISA. (See Example 17). The second is a receptor-based ELISA,
Here, an ELISA plate coated with rabbit anti-human IgG captures the human chimeric receptor mpl-IgG that binds the mpl ligand to be assayed. Bound mpl ligand is detected using a biotinylated rabbit polyclonal antibody to the mpl ligand (TPO ₁₅₅ ), which is measured using streptavidin-peroxidase as described in Example 18.

【０１９８】１５．ＴＰＯで処置された正常のおよび近
致死量を照射されたマウスのインビボ生物学的反応 正常のおよび近致死量を照射されたマウスを、チャイニ
ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、大腸菌、およびヒ
ト胚腎臓（２９３）細胞から分離された、末端切除およ
び全長ＴＰＯで処置した。これら三つの宿主で産生され
たＴＰＯのいずれの型も、マウスで血小板産生を刺激し
たが、ＣＨＯから分離された全長ＴＰＯが最も大きいイ
ンビボ反応をもたらしたようであった。これらの結果
は、カルボキシ末端ドメインの適正なグリコシル化が、
最適なインビボ活性にとって必要であるかも知れないこ
とを示している。15. In vivo biological response of normal and near lethal irradiated mice treated with TPO Normal and near lethal irradiated mice were isolated from Chinese hamster ovary (CHO) cells, E. coli and human embryo kidney 293) Treated with truncated and full length TPO separated from cells. Although all forms of TPO produced in these three hosts stimulated platelet production in mice, full-length TPO isolated from CHO appeared to produce the greatest in vivo response. These results indicate that proper glycosylation of the carboxy-terminal domain
Indicates that it may be necessary for optimal in vivo activity.

【０１９９】（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ
^-1，１５３） 大腸菌で産生された（実施例２３を参照されたい）ＥＰ
Ｏドメインの「Ｍｅｔ」型（−１位のＭｅｔにヒトＴＰ
Ｏの最初の１５３残基を加えたもの）を、図３７、３８
および３９に対する凡例に記載のように、正常な雌性Ｃ
５７ Ｂ６マウスに毎日注射した。これらの図は、大腸
菌で産生され上記のように再折り畳みされたＴＰＯの非
グリコシル化末端切除型は、赤血球または白血球数に影
響を及ぼすことなく、正常マウスにおいて血小板産生の
約２倍の増加を刺激できることを示している。(A) E. coli-rhTPO (Met
^-1 , 153) EP produced in E. coli (see Example 23).
"Met" type of O domain (Met at position -1 is replaced with human TP
O with the first 153 residues added)
Normal female C as described in the legend to and 39
57 B6 mice were injected daily. These figures show that the non-glycosylated truncated form of TPO produced in E. coli and refolded as described above increases platelet production approximately two-fold in normal mice without affecting red or white blood cell counts. Indicates that it can be stimulated.

【０２００】同じ分子を、図４０、４１および４２に対
する凡例に記載のように、近致死量を照射された（¹³⁷
Ｃｓ）雌性Ｃ５７Ｂ６マウスに毎日注射すると、血小板
の回復を刺激し、最下点を緩和したが、赤血球または白
血球には影響しなかった。The same molecule was exposed to near lethal doses as described in the legend to FIGS. 40, 41 and 42 ( ^137).
Cs) Daily injections into female C57B6 mice stimulated platelet recovery and alleviated the nadir, but did not affect red or white blood cells.

【０２０１】（ｂ）ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂ ＣＨＯで産生され、図４３、４４および４５に対する凡
例に記載のように正常な雌性Ｃ５７Ｂ６マウスに毎日注
射された全長型ＴＰＯは、正常マウスにおいて赤血球ま
たは白血球の数に影響することなく血小板産生に約５倍
の増加をもたらした。(B) Full-length TPO produced in CHO-rhTPO ₃₃₂ CHO and injected daily into normal female C57B6 mice as described in the legend to FIGS. This resulted in an approximately 5-fold increase in platelet production without affecting number.

【０２０２】（ｃ）ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂；Ｅ．ｃｏ
ｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1，１５３）；２９３−ｒｈ
ＴＰＯ₃₃₂；およびＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ₁₅₅ 図４６に対する凡例に記載のように種々のセルライン由
来のｒｈＴＰＯ（ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂；Ｅ．ｃｏｌ
ｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1，１５３）；２９３−ｒｈＴ
ＰＯ₃₃₂；およびＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ₁₅₅）による
正常マウスの処置に対して用量反応曲線を組み立てた。
この図は、試験された全ての型の分子が血小板産生を刺
激するが、ＣＨＯで産生された全長型が最も高いインビ
ボ活性を有することを示している。(C) CHO-rhTPO ₃₃₂ ; co
^{li-rhTPO (Met -1, 153} ); 293-rh
TPO ₃₃₂ ; coli-rhTPO ₁₅₅ rhTPO from various cell lines (CHO-rhTPO ₃₃₂ ; E. col) as described in the legend to FIG.
^{i-rhTPO (Met -1, 153} ); 293-rhT
PO ₃₃₂ ; A dose response curve was constructed for treatment of normal mice with E. coli-rhTPO ₁₅₅ ).
This figure shows that while all types of molecules tested stimulate platelet production, the full-length version produced in CHO has the highest in vivo activity.

【０２０３】（ｄ）ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₁₅₃、ＣＨＯ−
ｒｈＴＰＯ「切り取り」およびＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂ 図４７に対する凡例に記載のようにＣＨＯで産生された
様々な型のｒｈＴＰＯ（ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₁₅₃、ＣＨ
Ｏ−ｒｈＴＰＯ「切り取り」およびＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ
₃₃₂）による正常マウスの処置に対して、やはり用量反
応曲線を組み立てた。この図は、試験された全てのＣＨ
Ｏ型が血小板産生を刺激するが、全長の７０Ｋｄａ型が
最も高いインビボ活性を有することを示している。(D) CHO-rhTPO ₁₅₃ , CHO-
rhTPO “Cut” and CHO-rhTPO ₃₃₂ Various forms of rhTPO (CHO-rhTPO ₁₅₃ , CH) produced in CHO as described in the legend to FIG.
O-rhTPO "cut" and CHO-rhTPO
_A dose response curve was also constructed for the treatment of normal mice with ₃₃₂ ). This figure shows all the CHs tested.
Although type O stimulates platelet production, it has been shown that full-length 70Kda type has the highest in vivo activity.

【０２０４】１６．ｍｐｌリガンドおよび変異体の一般
的組換え製造 好ましくはｍｐｌリガンドは、（典型的には細胞を発現
ベクターで形質転換することにより）ｍｐｌリガンド核
酸を発現するようトランスフェクトさせた細胞を培養
し、この細胞から該ポリペプチドを回収することによっ
てｍｐｌリガンドポリペプチドを産生させることを含
む、標準的組換え法によって製造する。しかしながら、
所望により、ｍｐｌリガンドをホモローガスな組換えに
よって、またはｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡ
を既に含んでいる細胞中に導入された調節要素を利用す
る組換え生産を用いてｍｐｌリガンドを産生できるとい
う事もまた考えられる。例えば、強力なプロモーター／
エンハンサー要素、サプレッサー、または外因性転写調
節要素を、所望のｍｐｌリガンドポリペプチドをコード
しているＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な近さおよ
び方向で、意図される宿主細胞のゲノムに挿入すること
ができる。調節要素はｍｐｌリガンドをコードせず、む
しろこのＤＮＡは宿主細胞ゲノムに固有のものである。
次いで、本発明に係るレセプターポリペプチドを作る細
胞について、または増強または低減したレベルの発現に
ついて希望に応じてスクリーニングする。16. General Recombinant Production of mpl Ligands and Mutants Preferably, mpl ligand is cultured in cells transfected to express mpl ligand nucleic acid (typically by transforming the cells with an expression vector). Produced by standard recombinant methods, including producing the mpl ligand polypeptide by recovering the polypeptide from the cells. However,
Optionally, the mpl ligand is homologous recombinantly or the DNA encoding the mpl ligand
It is also conceivable that the mpl ligand can be produced using recombinant production utilizing regulatory elements introduced into cells already containing the mpl ligand. For example, strong promoters /
Inserting an enhancer element, suppressor, or exogenous transcriptional regulatory element into the genome of the intended host cell in sufficient proximity and orientation to affect the transcription of the DNA encoding the desired mpl ligand polypeptide. be able to. The regulatory element does not encode an mpl ligand, rather this DNA is unique to the host cell genome.
The cells making the receptor polypeptide of the present invention are then screened as desired or for enhanced or reduced levels of expression.

【０２０５】したがって、本発明は、ｍｐｌリガンド核
酸分子を含有する細胞のゲノム中に、転写調節要素を、
その転写に影響を与えるに十分な、該核酸分子に対する
近さおよび方向で挿入することからなる、そして転写調
節要素および該核酸分子を含む細胞を培養することから
なる所望によるさらなる工程を伴う、ｍｐｌリガンドを
生産するための方法を意図するものである。本発明はさ
らに、宿主細胞により認識される外因性調節配列と機能
的に結合した固有のｍｐｌリガンド核酸分子を含む宿主
細胞を意図するものである。Thus, the present invention provides for the transcriptional regulatory element in the genome of a cell containing an mpl ligand nucleic acid molecule.
Mpl, comprising insertion in proximity and orientation to the nucleic acid molecule sufficient to affect its transcription, and with optional further steps of culturing cells containing the transcription regulatory element and the nucleic acid molecule. It is intended a method for producing a ligand. The present invention further contemplates a host cell comprising a unique mpl ligand nucleic acid molecule operably linked to an exogenous regulatory sequence recognized by the host cell.

【０２０６】Ａ．ｍｐｌリガンドポリペプチドをコード
しているＤＮＡの分離 ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしているＤＮＡ
は、ｍｐｌリガンドｍＲＮＡを持ち、それを検出し得る
レベルで発現すると信じられる組織から調製される任意
のｃＤＮＡライブラリーから取得することができる。ｍ
ｐｌリガンド遺伝子はさらに、ゲノムＤＮＡライブラリ
ーから、または完全なヌクレオチドまたはアミノ酸配列
からインビトロオリゴヌクレオチド合成によって取得す
ることもできる。A. Isolation of DNA encoding mpl ligand polypeptide DNA encoding mpl ligand polypeptide
Can be obtained from any cDNA library prepared from a tissue that has mpl ligand mRNA and is believed to express it at detectable levels. m
The pl ligand gene can also be obtained by in vitro oligonucleotide synthesis from a genomic DNA library or from the complete nucleotide or amino acid sequence.

【０２０７】ライブラリーを、目的とする遺伝子または
それによりコードされている蛋白を同定するよう設計さ
れたプローブでスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライ
ブラリーのためには、好適なプローブは、ｍｐｌリガン
ドを認識し且つこれに特異的に結合するモノクローナル
またはポリクローナル抗体を包含する。ｃＤＮＡライブ
ラリーのためには、好適なプローブは、同じまたは異な
る種由来のｍｐｌリガンドｃＤＮＡの既知のまたはそれ
が疑われる部分をコードしている約２０−８０塩基長の
オリゴヌクレオチド；および／または同じまたは類似の
遺伝子をコードしている相補的もしくはホモローガスｃ
ＤＮＡまたはそのフラグメントを包含する。ゲノムＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングするための適当なプロ
ーブは、同じもしくは類似の遺伝子をコードしているオ
リゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはそれらのフラグメ
ント、および／またはホモローガスなゲノムＤＮＡまた
はそのフラグメントを包含するが、これらに限定される
訳ではない。選ばれたプローブによるｃＤＮＡまたはゲ
ノムライブラリーのスクリーニングは、サムブルック
等、上記、の１０−１２章に記載のような標準法を用い
て実施することができる。The library is screened with a probe designed to identify the gene of interest or the protein encoded thereby. For cDNA expression libraries, suitable probes include monoclonal or polyclonal antibodies that recognize and specifically bind to mpl ligand. For cDNA libraries, suitable probes are oligonucleotides of about 20-80 bases in length encoding a known or suspected portion of mpl ligand cDNA from the same or different species; and / or Or a complementary or homologous c encoding a similar gene
DNA or fragments thereof. Genome DN
Suitable probes for screening A libraries include, but are not limited to, oligonucleotides, cDNA, or fragments thereof, encoding the same or similar genes, and / or homologous genomic DNA or fragments thereof. It is not limited. Screening of a cDNA or genomic library with the selected probe can be performed using standard methods as described in Sambrook et al., Supra, Chapters 10-12.

【０２０８】ｍｐｌリガンドをコードしている遺伝子を
分離する代替手段は、サムブルック等、上記、の１４項
に記載のＰＣＲ法を使用することである。この方法は、
ｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡとハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とす
る。オリゴヌクレオチドの選択のための戦略を下に述べ
る。An alternative means of isolating the gene encoding the mpl ligand is to use the PCR method described by Sambrook et al. This method
It requires the use of oligonucleotide probes that hybridize to the DNA encoding the mpl ligand. Strategies for oligonucleotide selection are described below.

【０２０９】本発明を実施する好ましい方法は、注意深
く選択されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、様々
な組織、好ましくはヒトまたはブタの腎臓（成体または
胎児）または肝臓セルラインからのｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングすることである。例えば、ヒト胎児
肝臓セルラインｃＤＮＡライブラリーをこのオリゴヌク
レオチドプローブでスクリーニングする。別法として、
ヒトゲノムライブラリーをこのオリゴヌクレオチドプロ
ーブでスクリーニングする。A preferred method of practicing the present invention is to use carefully selected oligonucleotide sequences to generate cDNA libraries from various tissues, preferably human or porcine kidney (adult or fetal) or liver cell lines. Screening. For example, a human fetal liver cell line cDNA library is screened with this oligonucleotide probe. Alternatively,
A human genomic library is screened with this oligonucleotide probe.

【０２１０】プローブとして選択されたオリゴヌクレオ
チド配列は、十分な長さがあり、且つ偽陽性を最小とす
るに十分明確であるべきである。実際のヌクレオチド配
列は通常、コドンの重複が最小であるｍｐｌリガンドの
領域を元に設計される。このオリゴヌクレオチドは、１
またはそれ以上の位置で縮重していてよい。縮重オリゴ
ヌクレオチドの使用は、或るライブラリーが、優先的コ
ドンの使用が知られていない種からスクリーニングされ
る場合、特に重要である。[0210] The oligonucleotide sequence selected as a probe should be long enough and well-defined to minimize false positives. The actual nucleotide sequence is usually designed based on the region of the mpl ligand with minimal codon overlap. This oligonucleotide is 1
Or it may be degenerate at a higher position. The use of degenerate oligonucleotides is particularly important when certain libraries are screened from species where the use of preferential codons is not known.

【０２１１】このオリゴヌクレオチドは、スクリーニン
グされるライブラリー中のＤＮＡとハイブリダイズする
時に検出できるよう、標識しなければならない。好まし
い標識方法は、ＡＴＰ（例えば、γ³²Ｐ）およびポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの５'
末端を放射標識することである。しかしながら、ビオチ
ニル化または酵素標識化を包含するその他の方法を用い
てオリゴヌクレオチドを標識することもできるが、これ
らに限定される訳ではない。[0211] The oligonucleotide must be labeled so that it can be detected when hybridized to DNA in the library being screened. A preferred labeling method uses ATP (eg, γ ³² P) and polynucleotide kinase to 5 ′ the oligonucleotide.
Radiolabeling the ends. However, other methods can be used to label the oligonucleotide, including but not limited to biotinylation or enzymatic labeling.

【０２１２】全長ｍｐｌリガンドポリペプチドをコード
しているｍｐｌリガンド核酸は特に興味深い。幾つかの
好ましい態様において、この核酸配列は天然ｍｐｌリガ
ンドシグナル配列を含む。全ての蛋白コード化配列を有
する核酸は、導き出されたアミノ酸配列を用いて、選ば
れたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニン
グすることによって得られる。Of particular interest are mpl ligand nucleic acids encoding full length mpl ligand polypeptides. In some preferred embodiments, the nucleic acid sequence comprises a native mpl ligand signal sequence. Nucleic acids with all protein coding sequences can be obtained by screening a selected cDNA or genomic library using the derived amino acid sequence.

【０２１３】Ｂ．天然ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変
異体 ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体は、ｍｐｌリガン
ドＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することに
より、または、所望ｍｐｌリガンドポリペプチドのイン
ビトロ合成により、製造される。係る変異体は、例え
ば、ブタｍｐｌリガンドのためのアミノ酸配列中の残基
を除去、または挿入もしくは置換することを包含する。
例えば、成熟全長ｍｐｌリガンドのカルボキシ末端部分
は、インビボまたはインビトロいずれかの蛋白分解的開
裂によって、または、フラグメントまたは全長ｍｐｌリ
ガンドをコードしているＤＮＡをクローニングおよび発
現させることによって、除去し、生物活性な変異体を生
成させることができる。最終組み立て物が所望の生物活
性を有する限り、最終組み立て物に到達するために除
去、挿入、および置換の任意の組み合わせが施される。
アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置
の変更といったような、ｍｐｌリガンドの翻訳後処理を
変化させ得る。ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体の
設計のためには、突然変異部位の位置および突然変異の
性格は、修飾されるべきｍｐｌリガンドの特性に依存す
るであろう。突然変異のための部位は、例えば（１）最
初に同類アミノ酸選択肢で、次いで、達成される結果に
応じて、より過激な選択で置換することにより、(２）
標的残基を除去することにより、または、(３）存在す
る部位に隣接して、同じまたは異なるクラスの残基を挿
入することにより、または選択肢１−３の組み合わせに
より、個別に、または連続して修飾することができる。B. Amino acid sequence variants of the native mpl ligand Amino acid sequence variants of the mpl ligand are produced by introducing appropriate nucleotide changes into the mpl ligand DNA, or by in vitro synthesis of the desired mpl ligand polypeptide. Such variants include, for example, removing, inserting or replacing residues in the amino acid sequence for porcine mpl ligand.
For example, the carboxy-terminal portion of the mature full-length mpl ligand is removed by proteolytic cleavage, either in vivo or in vitro, or by cloning and expressing a fragment or DNA encoding the full-length mpl ligand, resulting in the biological activity. Various mutants can be generated. Any combination of removal, insertion, and substitution can be made to arrive at the final assembly, as long as the final assembly has the desired biological activity.
Amino acid changes may also alter post-translational processing of the mpl ligand, such as changing the number or position of glycosylation sites. For the design of amino acid sequence variants of the mpl ligand, the location of the mutation site and the nature of the mutation will depend on the properties of the mpl ligand to be modified. Sites for mutation can be reduced, for example, by (1) replacing first with a conservative amino acid alternative and then with a more radical choice depending on the results achieved.
By removing target residues, or (3) inserting residues of the same or a different class adjacent to the site present, individually or consecutively by a combination of options 1-3 Can be modified.

【０２１４】突然変異生成にとって好ましい位置である
ｍｐｌリガンドポリペプチドの或る残基または領域を特
定する有用な方法は、カニングハムおよびウェルズ、Sc
ience、２４４巻１０８１−１０８５頁［１９８９］に
記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異生
成」と呼ばれる。ここでは、或る残基または標的残基群
を特定し（例えば、ａｒｇ、asp、ｈｉｓ、ｌｙｓ、お
よびＧｌｕのような荷電残基）、任意の、但し好ましく
は中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはア
ラニンまたはポリアラニン）によって置き換え、細胞内
外を取り巻く水性環境と該アミノ酸との相互作用を起こ
させる。次に、この置換に対する機能的感受性を示すド
メインを、置換部位にまたは置換部位のためのさらなる
またはその他の変異体を導入することによってさらに改
良する。このように、アミノ酸配列変異を導入する部位
は予め決められているが、突然変異自体の性質は予め決
めておく必要がない。例えば、与えられた部位での突然
変異の挙動を最適化するため、標的コドンまたは領域で
ａｌａスキャニングまたは無作為突然変異生成を実施
し、発現されたｍｐｌリガンド変異体を、所望の活性の
最適な組み合わせについてスクリーニングする。Useful methods to identify certain residues or regions of the mpl ligand polypeptide that are preferred positions for mutagenesis are described in Cunningham and Wells, Sc.
ience, 244: 1081-1085 [1989], referred to as "alanine scanning mutagenesis." Here, certain residues or groups of target residues are identified (eg, charged residues such as arg, asp, his, lys, and Glu) and any, but preferably, neutral or negatively charged amino acids (Most preferably alanine or polyalanine) to cause the interaction of the amino acid with the aqueous environment surrounding the cell. The domain that is functionally sensitive to this substitution is then further refined by introducing additional or other variants at or for the site of the substitution. As described above, the site for introducing an amino acid sequence mutation is predetermined, but the nature of the mutation itself does not need to be predetermined. For example, to optimize the behavior of the mutation at a given site, ala scanning or random mutagenesis is performed at the target codon or region to express the expressed mpl ligand variant with the optimal activity of the desired activity. Screen for combinations.

【０２１５】アミノ酸配列変異体の組み立てには二つの
主要な変数：突然変異部位の位置および突然変異の性質
がある。例えば、ｍｐｌリガンドポリペプチドの変異体
はｍｐｌリガンド配列からの変異体を包含し、天然に存
在する対立遺伝子（これはｍｐｌリガンドＤＮＡの操作
を必要としないであろう）、または、天然に見いだされ
ない対立遺伝子または変異体に到達するためにＤＮＡを
突然変異させることにより作成される前もって決定され
ている突然変異体型を表し得る。一般に、選ばれた突然
変異の位置および性質は、修飾されるべきｍｐｌリガン
ドの性格に依存するであろう。The construction of amino acid sequence variants has two main variables: the location of the mutation site and the nature of the mutation. For example, variants of the mpl ligand polypeptide include variants from the mpl ligand sequence and are found in naturally occurring alleles (which would not require manipulation of the mpl ligand DNA) or in nature. It may represent a pre-determined mutant type created by mutating DNA to arrive at a non-allele or variant. In general, the location and nature of the mutation chosen will depend on the nature of the mpl ligand to be modified.

【０２１６】アミノ酸配列の除去は一般に約１から３０
残基まで、より好ましくは約１ないし１０残基の範囲で
あり、典型的には隣接している。別法として、ｍｐｌリ
ガンドのためのアミノ酸配列除去は、カルボキシ末端糖
蛋白ドメインの一部または全体を含み得る。アミノ酸配
列除去は、成熟蛋白の最初の６個のアミノ末端残基のう
ち１またはそれ以上を含むこともできる。所望によるア
ミノ酸配列除去は、「ヘリックス束」の間に存在するル
ープ領域のうち１またはそれ以上にある１またはそれ以
上の残基を含む。隣接する除去は、通常偶数の残基に施
されるが、１個のまたは奇数の除去もまた本発明の範囲
内にある。殆どの配列一致を共有するｍｐｌリガンド間
で相同性が低い領域に除去を導入して、ｍｐｌリガンド
の活性を修飾することができる。または、ヒトｍｐｌリ
ガンドに対して殆どの配列一致を共有する他の哺乳動物
ｍｐｌリガンドポリペプチドとヒトｍｐｌリガンド間で
相同性の低い領域に除去を導入することができる。他の
哺乳動物ｍｐｌリガンドと実質的な相同性を有する領域
での哺乳動物ｍｐｌリガンドポリペプチドからの除去
は、ｍｐｌリガンドの生物活性をより有意に修飾する可
能性が高い。連続した除去の数は、影響を受けるドメイ
ンにおけるｍｐｌリガンドの三次構造、例えばβプリー
ツシートまたはαヘリックスを保存するように選択され
るであろう。The removal of the amino acid sequence is generally about 1 to 30.
Up to residues, more preferably in the range of about 1 to 10 residues, typically contiguous. Alternatively, amino acid sequence removal for the mpl ligand may involve part or all of the carboxy-terminal glycoprotein domain. Amino acid sequence removal can also include one or more of the first six amino terminal residues of the mature protein. Optional amino acid sequence removal involves one or more residues in one or more of the loop regions present between the “helix bundles”. Adjacent removals are usually applied to even residues, but single or odd removals are also within the scope of the invention. Removal can be introduced into regions of low homology between mpl ligands that share most sequence matches to modify the activity of the mpl ligand. Alternatively, deletions can be introduced into regions of low homology between human mpl ligand and other mammalian mpl ligand polypeptides that share most sequence matches with human mpl ligand. Removal of a mammalian mpl ligand polypeptide from regions having substantial homology to other mammalian mpl ligands is more likely to modify the biological activity of the mpl ligand more significantly. The number of consecutive deletions will be chosen to preserve the tertiary structure of the mpl ligand in the affected domain, such as a β-pleated sheet or α-helix.

【０２１７】アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基から
１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの
範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、なら
びに単一もしくは複数アミノ酸残基の配列内挿入を包含
する。配列内挿入（即ち、成熟ｍｐｌリガンド配列内部
への挿入）は一般に、約１ないし１０残基、より好まし
くは１ないし５、最も好ましくは１ないし３残基の範囲
であり得る。好ましい融合の例は、ｍｐｌリガンドまた
はそのフラグメントと、他のサイトカインまたはそのフ
ラグメントとの融合である。末端挿入の例には、組換え
細胞培養中での成熟ｍｐｌリガンドの直接発現の所産で
ある、Ｎ末端メチオニン残基を有する成熟ｍｐｌリガン
ド、および、組換え宿主からの成熟ｍｐｌリガンドの分
泌を促進させるための、成熟ｍｐｌリガンド分子のＮ末
端へのヘテロローガスなＮ末端シグナル配列の融合が包
含される。このようなシグナル配列は一般に、意図され
る宿主細胞の種から得られ、従ってこれとホモローガス
であろう。好適な配列には、大腸菌のためのＳＴIIまた
はｌｐｐ、酵母のためのα因子、および哺乳動物細胞の
ためのヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルが包含さ
れる。Amino acid sequence insertions may include amino and / or carboxy terminal fusions ranging from 1 residue to a polypeptide containing 100 or more residues, as well as single or multiple amino acid residue sequences. Includes insertion. Intra-sequence insertions (ie, insertions within the mature mpl ligand sequence) may generally range from about 1 to 10 residues, more preferably 1 to 5, and most preferably 1 to 3 residues. An example of a preferred fusion is a fusion of an mpl ligand or a fragment thereof with another cytokine or a fragment thereof. Examples of terminal insertions are the product of direct expression of the mature mpl ligand in recombinant cell culture, the mature mpl ligand with an N-terminal methionine residue, and the secretion of the mature mpl ligand from a recombinant host. Fusion of a heterologous N-terminal signal sequence to the N-terminus of the mature mpl ligand molecule to effect Such a signal sequence will generally be derived from, and therefore homologous to, the intended host cell species. Suitable sequences include STII or lpp for E. coli, α-factor for yeast, and viral signals such as herpes gD for mammalian cells.

【０２１８】ｍｐｌリガンド分子のその他の挿入変異体
は、ｍｐｌリガンドのＮまたはＣ末端への、免疫原性ポ
リペプチド（即ち、融合が施される宿主にとって内因性
でない）、例えば細菌性ポリペプチド、例えばβラクタ
マーゼまたはＥ．ｃｏｌｉｔｒｐ遺伝子座によりコード
されている酵素、または酵母蛋白の融合、および、１９
８９年４月６日公開のＷＯ８９／０２９２２に記載の、
半減期の長い蛋白、例えば免疫グロブリン不変領域（ま
たは他の免疫グロブリン領域）、アルブミン、またはフ
ェリチンを用いたＣ末端融合を包含する。Other insertional variants of the mpl ligand molecule include immunogenic polypeptides (ie, not endogenous to the host to which the fusion is made), eg, bacterial polypeptides, at the N- or C-terminus of the mpl ligand. For example, β-lactamase or E. coli. fusion of an enzyme or yeast protein encoded by the collitrp locus, and 19
WO89 / 02922 published on April 6, 1989,
Includes C-terminal fusions with long half-life proteins such as immunoglobulin constant regions (or other immunoglobulin regions), albumin, or ferritin.

【０２１９】変異体の第三の群はアミノ酸置換変異体で
ある。これらの変異体は、ｍｐｌリガンド分子中の少な
くとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所に異な
る残基が挿入されている。置換突然変異生成のための最
も興味深い部位は、ｍｐｌリガンドの活性部位として同
定される部位、および、他の類似体中に見いだされるア
ミノ酸が側鎖のかさ、電荷、または疎水性の点で実質上
異なっており、それでいて種々のmplリガンド種および
／または一つのmplリガンド成員の種々の動物類似体の
中の選ばれた部位に高度の配列一致もまた存在する部位
を包含する。A third group of variants are amino acid substitution variants. These variants have at least one amino acid residue in the mpl ligand molecule removed and a different residue inserted in its place. The most interesting sites for substitution mutagenesis are the sites identified as the active site of the mpl ligand, and the amino acids found in other analogs are substantially different in side chain bulk, charge, or hydrophobicity. Include sites that are different but still have a high degree of sequence identity at selected sites in various animal analogs of various mpl ligand species and / or one mpl ligand member.

【０２２０】他の重要な部位は、様々なファミリー成員
から、そして／または一つの成員の中の様々な動物種か
ら得られるｍｐｌリガンドの特定の残基が一致している
部位である。これらの部位、特に、少なくともあと３
個、完全に保存されている部位を持つ配列の内部にある
部位は、比較的保守的なやり方で置換される。このよう
な同類置換は、表３で、好ましい置換という項の下に示
されている。もしこのような置換が生物活性の変化をも
たらすならば、表３中、例示的置換と称されている、ま
たはアミノ酸クラスに関する下のさらなる記載のよう
な、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニン
グする。Other sites of interest are sites where certain residues of the mpl ligand from various family members and / or from various animal species within a member are identical. These sites, especially at least 3 more
Individually, sites within the sequence that have completely conserved sites are replaced in a relatively conservative manner. Such conservative substitutions are shown in Table 3 under the heading of preferred substitutions. If such a substitution results in a change in biological activity, a more substantial change is introduced, referred to in Table 3 as an exemplary substitution, or as further described below for amino acid classes, and Screen things.

【表３】元の残基 例示的置換 好ましい置換 Ala(A) Val;Leu;Ile Val Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro Pro His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe;ノルロイシン Leu Leu(L) ノルロイシン;Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg Met(M) Leu;Phe;Ile Leu Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala Leu Pro(P) Gly Gly Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr Tyr Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser PheVal(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala;ノルロイシン Leu ｍｐｌリガンドの機能または免疫学的同一性における実
質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチドバックボ
ーンの構造、例えばシートまたはらせんコンホメーショ
ンとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷ま
たは疎水性、または、（ｃ）側鎖のかさ、の維持に及ぼ
すそれらの影響が有意に相違する置換を選択することに
よって達成される。天然に存在する残基は、共通する側
鎖の性質に基づく群に分けられる： (1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr； (3)酸性：Asp、Glu； (4)塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg； (5)鎖の向きに影響する残基：Gly、Pro；および、 (6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。Table 3 Original residue Exemplary substitution Preferred substitution Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro Pro His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe ; Norleucine Leu Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala Leu Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Substantive modifications in the function or immunological identity of the norleucine Leu mpl ligand include (a) the structure of the polypeptide backbone of the replacement region, eg, as a sheet or helical conformation, (b) the molecule at the target site By selecting substitutions that differ significantly in their effect on the maintenance of the charge or hydrophobicity of the Achieved. Naturally occurring residues are divided into groups based on common side chain properties: (1) hydrophobicity: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutral hydrophilicity: Cys, Ser. (3) acidic: Asp, Glu; (4) basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) residues that affect chain orientation: Gly, Pro; and (6) aromatic Tribe: Trp, Tyr, Phe.

【０２２１】非同類置換は、これらのクラスのうち或る
ものの成員を別のものに交換することを必要とする。こ
のような置換された残基もまた同類置換部位に導入する
ことができ、または、より好ましくは、残っている（非
保存的）部位に導入することができる。Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another. Such substituted residues can also be introduced at conservative substitution sites, or more preferably, at remaining (non-conservative) sites.

【０２２２】本発明の一つの態様において、当該分子に
存在する１またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を不
活性化することが望ましい。これらの部位は、例えばト
リプシンの場合にはアルギニンまたはリジン残基につい
て、コードされているアミノ酸配列を調べることによっ
て特定される。プロテアーゼ開裂部位が特定されたなら
ば、標的とされる残基を別の残基、好ましくはグルタミ
ンのような塩基性残基またはセリンのような疎水性残基
で置換することにより；当該残基を除去することによ
り；または当該残基の直後にプロリン残基を挿入するこ
とにより、それらを蛋白分解的開裂に対して不活性とな
るようにする。In one embodiment of the invention, it is desirable to inactivate one or more protease cleavage sites present on the molecule. These sites are identified, for example, by examining the encoded amino acid sequence for arginine or lysine residues in the case of trypsin. Once the protease cleavage site has been identified, by replacing the targeted residue with another residue, preferably a basic residue such as glutamine or a hydrophobic residue such as serine; By removing them; or by inserting a proline residue immediately after the residue to make them inert to proteolytic cleavage.

【０２２３】別の態様においては、シグナル配列の開始
メチオニン残基以外のメチオニン残基、または係る各メ
チオニン残基に対するＮまたはＣ末端の約３残基以内に
位置する残基を、別の残基（好ましくは表３に従う）に
より置換、または除去する。別法として、このような部
位に隣接して約１−３の残基を挿入する。In another embodiment, a methionine residue other than the starting methionine residue in the signal sequence, or a residue located within about 3 residues of the N or C terminus for each such methionine residue is replaced with another residue. (Preferably according to Table 3). Alternatively, about 1-3 residues are inserted adjacent to such a site.

【０２２４】ｍｐｌリガンドの適正なコンホメーション
の維持に関わっていないシステイン残基もまた、一般に
セリンで置換して、当該分子の酸化的安定性を改善し且
つ異常な交差反応を防止することができる。ｅｐｏドメ
イン中、アミノ末端から数えて第一および第四のシステ
インは適正なコンホメーションの維持に必要であるが、
第二および第三のシステインは必要でないことが判明し
ている。したがって、ｅｐｏドメインの第二および第三
のシステインは置換することができる。Cysteine residues that are not involved in maintaining the proper conformation of the mpl ligand can also be replaced, generally by serine, to improve the oxidative stability of the molecule and prevent abnormal cross-reactivity. it can. In the epo domain, the first and fourth cysteines, counting from the amino terminus, are required to maintain a proper conformation,
It has been found that the second and third cysteines are not required. Thus, the second and third cysteines of the epo domain can be replaced.

【０２２５】ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列変異体をコ
ードしている核酸分子は、当分野で知られる様々な方法
によって製造される。これらの方法には、天然の供給源
からの分離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場
合）またはオリゴヌクレオチド仲介（または位置指定）
突然変異生成、ＰＣＲ突然変異生成、および、先に製造
されたｍｐｌリガンドポリペプチドの変異体または非変
異体のカセット突然変異生成による製造が包含される
が、これらに限定される訳ではない。[0225] Nucleic acid molecules encoding amino acid sequence variants of the mpl ligand can be produced by various methods known in the art. These methods include separation from natural sources (for naturally occurring amino acid sequence variants) or oligonucleotide-mediated (or localization)
Includes, but is not limited to, mutagenesis, PCR mutagenesis, and the production of mutant or non-mutant variants of the mpl ligand polypeptide previously produced by cassette mutagenesis.

【０２２６】オリゴヌクレオチド仲介突然変異生成は、
ｍｐｌリガンドＤＮＡの置換、除去および挿入変異体の
製造のための好ましい方法である。この技術は、アーデ
ルマン等、ＤＮＡ、２巻１８３頁［１９８３］に記載さ
れるように、当分野で良く知られている。簡潔に述べる
と、ｍｐｌリガンドＤＮＡを、所望の突然変異をコード
しているオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型に対してハイ
ブリダイズすることによって変化させるのであるが、こ
こでこの鋳型は、変化していないまたは天然のｍｐｌリ
ガンドのＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオ
ファージの一本鎖型である。ハイブリダイズの後、ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて鋳型の第二相補鎖全体を合成
し、これは該オリゴヌクレオチドプライマーを取り込
み、選択された変化をｍｐｌリガンドＤＮＡにコードす
るであろう。Oligonucleotide-mediated mutagenesis is
It is a preferred method for the replacement, removal of mpl ligand DNA and production of insertional variants. This technique is well known in the art, as described in Adelman et al., DNA, 2: 183 (1983). Briefly, mpl ligand DNA is altered by hybridizing an oligonucleotide encoding the desired mutation to a DNA template, where the template is either unaltered or native. A single-stranded form of a plasmid or bacteriophage containing the DNA sequence of the mpl ligand. After hybridization, DN
The entire second complementary strand of the template is synthesized using A-polymerase, which will incorporate the oligonucleotide primer and will encode the selected change in mpl ligand DNA.

【０２２７】一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長の
オリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオ
チドは、突然変異をコードしているヌクレオチドの両側
に、鋳型と完全に相補的な１２ないし１５のヌクレオチ
ドを有するであろう。この事により、オリゴヌクレオチ
ドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子と正しくハイブリダイズする
ことが保証される。このオリゴヌクレオチドは、クレア
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７５巻５７６５頁［１９
７８］に記載のような当分野で知られる技術を用いて容
易に合成される。Generally, oligonucleotides of at least 25 nucleotides in length are used. An optimal oligonucleotide would have 12 to 15 nucleotides perfectly complementary to the template on each side of the nucleotide encoding the mutation. This ensures that the oligonucleotide will hybridize correctly with the single-stranded DNA template molecule. This oligonucleotide is described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765 [19].
78], and is readily synthesized using techniques known in the art, as described in

【０２２８】ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３
ベクター（入手し得る市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１
３ｍｐ１９ベクターが適当である）から誘導されるベク
ター、またはヴィエラ等、Meth.Enzymol.、１５３巻３
頁［１９８７］に記載のような一本鎖ファージ複製起点
を含むベクターによって作り出すことができる。即ち、
突然変異させようとするＤＮＡをこれらのベクターの一
つに挿入して一本鎖鋳型を作成する。一本鎖鋳型の製造
は、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、ＮＹ、１９８９）の
４．２１−４．４１項に記載されている。The DNA template was bacteriophage M13
Vectors (available commercially available M13mp18 and M1
3mp19 vector is suitable), or from Viera et al., Meth. Enzymol., 153, 3
It can be created by a vector containing a single-stranded phage origin of replication as described on page [1987]. That is,
The DNA to be mutated is inserted into one of these vectors to create a single-stranded template. For the production of single-stranded templates, see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring.
Harbor Laboratory Press, NY, 1989), section 4.21-4.41.

【０２２９】別法として、一本鎖ＤＮＡ鋳型は、標準技
術を用いて二本鎖プラスミド（またはその他の）ＤＮＡ
を変性させることによって作成することもできる。Alternatively, the single-stranded DNA template is converted to double-stranded plasmid (or other) DNA using standard techniques.
Can also be created by denaturing

【０２３０】天然ＤＮＡ配列を変化させるため（例えば
アミノ酸配列変異体を作成するために）、オリゴヌクレ
オチドを適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本
鎖鋳型とハイブリダイズさせる。次に、ＤＮＡ重合酵
素、通常ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
を加えて、合成のためのプライマーとして該オリゴヌク
レオチドを用いて鋳型の相補鎖を合成する。このように
して、ＤＮＡの一方の鎖はｍｐｌリガンドの突然変異型
をコードし、他の鎖（元の鋳型）は天然の変化していな
いｍｐｌリガンドの配列をコードしているようなヘテロ
二本鎖分子が形成される。次いでこのヘテロ二本鎖分子
を適当な宿主細胞、通常Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１のよ
うな原核生物中に導入する。細胞が増殖した後、これら
をアガロース平板上に蒔き、３２−ホスファートで放射
標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリ
ーニングし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを
同定する。次いで、突然変異している領域を取り、蛋白
産生のための適当なベクター、一般に適当な宿主の形質
転換のために典型的に使用される型の発現ベクターに入
れる。[0230] To alter the native DNA sequence (eg, to create amino acid sequence variants), the oligonucleotide is hybridized to a single-stranded template under appropriate hybridization conditions. Next, a DNA polymerase, usually Klenow fragment of DNA polymerase I, is added, and the complementary strand of the template is synthesized using the oligonucleotide as a primer for synthesis. In this way, one strand of the DNA encodes a mutated version of the mpl ligand, while the other strand (the original template) encodes a heteroduplex that encodes the sequence of the native unaltered mpl ligand. A chain molecule is formed. This heteroduplex molecule is then transferred to a suitable host cell, usually E. coli. E. coli JM101. After the cells have grown, they are plated on agarose plates and screened using oligonucleotide primers radiolabeled with 32-phosphate to identify bacterial colonies containing the mutated DNA. The mutated region is then removed and placed in a suitable vector for protein production, generally an expression vector of the type typically used for transformation of a suitable host.

【０２３１】直前に記載した方法は、プラスミドの両方
の鎖が突然変異を含む、ホモ二本鎖分子が作り出される
ように改変することができる。この改変は以下の通りで
ある：一本鎖オリゴヌクレオチドを上記のように一本鎖
鋳型とアニーリングする。３種のデオキシリボヌクレオ
チド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシ
リボグアノシン（ｄＧＴＰ）、およびデオキシリボチミ
ジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼
ばれる修飾されたチオ−デオキシリボシトシン（これは
アマーシャム・コーポレーションから入手することがで
きる）と合する。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチ
ド複合体に加える。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを
添加すると、突然変異した塩基の外は鋳型と同一のＤＮ
Ａ鎖が生成する。加えて、この新たなＤＮＡの鎖はｄＣ
ＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これは制限
エンドヌクレアーゼ消化から防護する役割を有する。The method just described can be modified to create a homoduplex molecule in which both strands of the plasmid contain the mutation. The modifications are as follows: Anneal the single-stranded oligonucleotide with the single-stranded template as described above. A mixture of three deoxyribonucleotides, deoxyriboadenosine (dATP), deoxyriboguanosine (dGTP), and deoxyribothymidine (dTTP) was obtained from a modified thio-deoxyribocytosine called dCTP- (aS), which was obtained from Amersham Corporation. Can be). This mixture is added to the template-oligonucleotide complex. When a DNA polymerase is added to this mixture, the same DN as the template is obtained except for the mutated bases.
A chain is generated. In addition, this new strand of DNA is dC
Includes dCTP- (aS) instead of TP, which has a role in protecting against restriction endonuclease digestion.

【０２３２】ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素で
切り目を入れた後、鋳型鎖をＥｘｏIIIヌクレアーゼま
たは他の適当なヌクレアーゼを用いて、突然変異させよ
うとする部位を含む領域を超えて消化することができ
る。そして、この反応を、分子が部分的にしか一本鎖に
なっていないまま停止させる。次いで、４種全てのデオ
キシリボヌクレオチド三燐酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリ
ガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全な
二本鎖のＤＮＡホモ二本鎖を形成させる。次にこのホモ
二本鎖分子を、上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０
１のような適当な宿主細胞中に導入することができる。After the heteroduplex template strand is nicked with an appropriate restriction enzyme, the template strand is excised with ExoIII nuclease or another appropriate nuclease to extend beyond the region containing the site to be mutated. Can be digested. The reaction is then stopped while the molecule is only partially single-stranded. A complete double-stranded DNA homoduplex is then formed using DNA polymerase in the presence of all four deoxyribonucleotide triphosphates, ATP, and DNA ligase. This homoduplex molecule is then transformed into E. coli as described above. coli JM10
1 can be introduced into a suitable host cell.

【０２３３】１以上のアミノ酸が置換されているｍｐｌ
リガンド突然変異体をコードしているＤＮＡは、幾つか
の方法のうち一つで生成させることができる。アミノ酸
がポリペプチド鎖中接近して位置している場合は、所望
のアミノ酸置換の全てをコードしている一つのオリゴヌ
クレオチドを用いてこれらを同時に突然変異させること
ができる。しかしながら、もしそのアミノ酸が互いに幾
らかの距離をおいて位置している（約１０アミノ酸以上
離れている）と、所望の変化の全てをコードしている１
個のオリゴヌクレオチドを作成することは、より困難で
ある。その代わりに、二つの別法のうち一つを利用する
ことができる。Mpl with one or more amino acid substitutions
DNA encoding a ligand mutant can be generated in one of several ways. If the amino acids are located close together in the polypeptide chain, they can be mutated simultaneously using a single oligonucleotide encoding all of the desired amino acid substitutions. However, if the amino acids are located at some distance from each other (more than about 10 amino acids apart), they encode all of the desired changes.
Making individual oligonucleotides is more difficult. Instead, one of two alternatives can be used.

【０２３４】第一の方法では、置換しようとする各アミ
ノ酸のための別々のオリゴヌクレオチドを作成する。次
いでそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時
にアニーリングすると、その鋳型から合成される第二の
ＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換の全てをコードしている
であろう。In the first method, a separate oligonucleotide is made for each amino acid to be replaced. Then, when the oligonucleotides are simultaneously annealed to the single-stranded template DNA, the second DNA strand synthesized from the template will encode all of the desired amino acid substitutions.

【０２３５】これに代わる方法は、所望の突然変異を産
むための２回またはそれ以上の突然変異生成を含むもの
である。第一回目は単一突然変異体について記載された
通りである：野生型ＤＮＡを鋳型に使用し、第一の所望
アミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこ
の鋳型にアニーリングし、するとヘテロ二本鎖ＤＮＡ分
子が生成される。第二回目の突然変異生成は、第一回目
の突然変異生成で作成された突然変異したＤＮＡを鋳型
として利用する。即ち、この鋳型は既に１またはそれ以
上の突然変異を含んでいる。そこで、さらなる所望のア
ミノ酸置換をコードしているオリゴヌクレオチドをこの
鋳型にアニーリングし、得られたＤＮＡの鎖はその結
果、第一および第二回目両方の突然変異生成由来の突然
変異をコードしていることになる。この得られたＤＮＡ
は第三回目の突然変異生成で鋳型として使用することが
でき、以下同様である。An alternative method involves two or more mutagenesis to produce the desired mutation. The first is as described for the single mutant: using wild-type DNA as a template, annealing the oligonucleotide encoding the first desired amino acid substitution to this template, and A strand DNA molecule is produced. The second mutagenesis uses the mutated DNA created in the first mutagenesis as a template. That is, the template already contains one or more mutations. Thus, an oligonucleotide encoding an additional desired amino acid substitution was annealed to this template, and the resulting strand of DNA thus encoded for mutations from both the first and second mutagenesis. Will be. This obtained DNA
Can be used as a template in the third mutagenesis, and so on.

【０２３６】ＰＣＲ突然変異生成もまたｍｐｌリガンド
ポリペプチドのアミノ酸変異体の作成に好適である。以
下の記述はＤＮＡに関するものであるが、この技術はＲ
ＮＡにも適用されることが理解できる。ＰＣＲ技術は一
般に以下の方法を指す（アーリッヒ、上記、Ｒ．ヒグチ
による章、６１−７０頁を参照されたい）：少量の鋳型
ＤＮＡをＰＣＲでの出発物質として使用する時、鋳型Ｄ
ＮＡの対応領域と僅かに異なる配列のプライマーを用い
て、そのプライマーが鋳型と相違している位置でのみ鋳
型配列と異なっている比較的大量の特異的ＤＮＡフラグ
メントを生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中
に突然変異を導入するためには、一方のプライマーは突
然変異の位置に一部重複し且つその突然変異を含むよう
に設計し；他方のプライマーの配列は、プラスミドの反
対の鎖の配列一つながりと一致させねばならないが、こ
の配列は該プラスミドＤＮＡのどこに位置してもよい。
しかしながら、第二のプライマーの配列は、プライマー
により境界を与えられるＤＮＡの増幅された領域全体が
最終的に容易に配列決定されるよう、第一プライマーの
配列の２００ヌクレオチド以内に位置させるのが好まし
い。今記載したようなプライマー対を用いるＰＣＲ増幅
は、プライマーにより特定される突然変異の位置で、そ
して鋳型の複製は多少誤りが起こり易いのであるいはそ
の他の位置で相違するＤＮＡフラグメントの集団を生成
する。PCR mutagenesis is also suitable for generating amino acid variants of the mpl ligand polypeptide. The following description is for DNA, but this technique
It can be seen that it also applies to NA. The PCR technique generally refers to the following method (see Arich, supra, chapter by R. Higuchi, pp. 61-70): When using small amounts of template DNA as starting material in PCR, the template D
Using a primer with a sequence slightly different from the corresponding region of NA, a relatively large amount of a specific DNA fragment that differs from the template sequence only at positions where the primer differs from the template can be generated. To introduce a mutation into the plasmid DNA, one primer was designed to partially overlap and contain the mutation at the position of the mutation; the sequence of the other primer was designed to contain the opposite strand of the plasmid. This sequence, which must be consistent with the sequence sequence, can be located anywhere on the plasmid DNA.
However, the sequence of the second primer is preferably located within 200 nucleotides of the sequence of the first primer so that the entire amplified region of the DNA bounded by the primer is finally easily sequenced. . PCR amplification using a primer pair as just described produces a population of DNA fragments that differ at the location of the mutation specified by the primer, and because replication of the template is somewhat error-prone or at other locations.

【０２３７】生成物に対する鋳型の比が極端に低い場
合、生成物のＤＮＡフラグメントの大多数に所望の突然
変異（群）が組み込まれる。この生成物は、標準的ＤＮ
Ａ技術を用いて、ＰＣＲ鋳型として働いたプラスミド中
の対応領域を置き換えるのに使用される。別々の位置に
ある突然変異は、突然変異体第二プライマーを使用する
ことにより、または、異なる突然変異体プライマーによ
る第二のＰＣＲを行い、得られた二つのＰＣＲフラグメ
ントを三部（またはそれ以上の）ライゲーションでベク
ターフラグメントに同時にライゲーションすることによ
って同時に導入することができる。If the ratio of template to product is extremely low, the majority of the product's DNA fragments will incorporate the desired mutation (s). This product has the standard DN
Used to replace the corresponding region in the plasmid that served as the PCR template using the A technique. Mutations at different positions can be made by using a mutant second primer or by performing a second PCR with a different mutant primer and dividing the resulting two PCR fragments into three (or more) ) At the same time by simultaneous ligation to the vector fragment.

【０２３８】ＰＣＲ突然変異生成の特別な例において
は、プラスミドＤＮＡの増幅される領域の外に特異な認
識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化すること
により、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を線状化す
る。この物質から１００ｎｇを、４種のデオキシヌクレ
オチド三燐酸を含有しジーンアンプ（商標）キット（パ
ーキン−エルマー・シータス、ノルウォーク、ＣＴおよ
びエメリーヴィル、ＣＡ、より入手）に含まれるＰＣＲ
緩衝液、および各オリゴヌクレオチドプライマー２５ｐ
ｍｏｌｅを含有するＰＣＲ混合物に加え、最終容量５０
μｌとする。この反応混合物を鉱油３５μｌに積層す
る。反応混合物を１００℃で５分間変性させ、短時間氷
上に置き、次いで鉱油層の下にサーマス・アクアティク
ス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（５単位／μ
ｌ、パーキン−エルマー・シータスより購入）を添加す
る。次いでこの反応混合物を、以下のようにプログラム
したＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキン−エルマー
・シータスより購入）中に入れる：５５℃２分間、７２
℃３０秒間、次いで以下を１９サイクル：９４℃３０秒
間、５５℃３０秒間、そして７２℃３０秒間。In a specific example of PCR mutagenesis, the template plasmid DNA (1 μg) is linearized by digestion with a restriction endonuclease having a unique recognition site outside the region to be amplified of the plasmid DNA. . From this material, 100 ng of PCR containing 4 deoxynucleotide triphosphates and contained in a GeneAmp ™ kit (obtained from Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA)
Buffer and each oligonucleotide primer 25p
to the PCR mixture containing the
μl. The reaction mixture is layered on 35 μl of mineral oil. The reaction mixture was denatured at 100 ° C. for 5 minutes, briefly placed on ice, and then 1 μl of Thermos Aquatics (Taq) DNA polymerase (5 units / μm) under the mineral oil layer.
l, purchased from Perkin-Elmer Cetus). The reaction mixture is then placed in a DNA thermal cycler (purchased from Perkin-Elmer Cetus) programmed as follows: 55 ° C. for 2 minutes, 72 ° C.
C for 30 seconds, then 19 cycles of: 94 C for 30 seconds, 55 C for 30 seconds, and 72 C for 30 seconds.

【０２３９】このプログラムの終了時に反応バイアルを
サーマルサイクラーから取り出し、水相を新しいバイア
ルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容
量）で抽出し、そしてエタノール沈澱させ、ＤＮＡを標
準法により回収する。この物質を、続いてベクターへの
挿入のための適当な処理に付す。At the end of the program, the reaction vial is removed from the thermal cycler, the aqueous phase is transferred to a new vial, extracted with phenol / chloroform (50:50 by volume), and ethanol precipitated and the DNA recovered by standard methods. This material is subsequently subjected to appropriate processing for insertion into a vector.

【０２４０】変異体を製造するためのもう一つの方法、
カセット突然変異生成は、ウェルズ等、Ｇｅｎｅ、３４
巻３１５頁（１９８５）に記載の技術に基づく。出発物
質は、突然変異させようとするｍｐｌリガンドＤＮＡを
含むプラスミド（またはその他のベクター）である。突
然変異させるｍｐｌリガンドＤＮＡ中のコドンを特定す
る。特定された突然変異部位の両側には特異な制限エン
ドヌクレアーゼ部位がなければならない。このような制
限部位が存在しない場合は、それらをｍｐｌリガンドＤ
ＮＡの適当な位置に導入するための上記オリゴヌクレオ
チド仲介突然変異生成法を用いてそれらを作り出すこと
ができる。制限部位がプラスミド中に導入された後、こ
のプラスミドをこれらの部位で切断して線状化する。制
限部位間のＤＮＡの配列をコードしており所望の突然変
異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを標準法を用
いて合成する。２本の鎖を別々に合成し、次いで標準技
術を用いてハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌク
レオチドをカセットと称する。このカセットは、プラス
ミドに直接ライゲーションできるよう、線状化されたプ
ラスミドの末端と適合する３'および５'末端を有するよ
う設計される。その結果このプラスミドは突然変異した
ｍｐｌリガンドＤＮＡ配列を含むことになる。Another method for producing variants,
Cassette mutagenesis is described by Wells et al., Gene, 34.
Vol. 315 (1985). The starting material is a plasmid (or other vector) containing the mpl ligand DNA to be mutated. Identify the codons in the mpl ligand DNA to be mutated. There must be a unique restriction endonuclease site on each side of the identified mutation site. If such restriction sites do not exist, they are added to the mpl ligand D
They can be created using the above-described oligonucleotide-mediated mutagenesis method to introduce the appropriate position in the NA. After the restriction sites have been introduced into the plasmid, the plasmid is cut at these sites to linearize it. A double-stranded oligonucleotide encoding the sequence of the DNA between the restriction sites and containing the desired mutation is synthesized using standard techniques. The two strands are synthesized separately and then hybridized using standard techniques. This double-stranded oligonucleotide is called a cassette. This cassette is designed to have 3 'and 5' ends that match the ends of the linearized plasmid so that it can be directly ligated to the plasmid. As a result, this plasmid will contain the mutated mpl ligand DNA sequence.

【０２４１】Ｃ．複製可能なベクターへの核酸の挿入 天然または変異体ｍｐｌリガンドポリペプチドをコード
している核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）
を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現
のために、複製可能なベクター中に挿入する。多くのベ
クターが利用可能であり、適当なベクターの選択は、
（１）それがＤＮＡ増幅に使用されるのかまたはＤＮＡ
発現に使用されるのか、（２）ベクター中に挿入される
核酸の大きさ、および、（３）ベクターにより形質転換
される宿主細胞、に依存するであろう。各々のベクター
は、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およ
びそれが適合する宿主細胞に応じて様々な構成成分を含
んでいる。ベクターの構成成分は一般に、１またはそれ
以上の以下のもの：シグナル配列、複製起点、１または
それ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモ
ーター、および転写終止配列を含むが、これらに限定さ
れる訳ではない。C. Insertion of a nucleic acid into a replicable vector Nucleic acid encoding a natural or mutant mpl ligand polypeptide (eg, cDNA or genomic DNA)
Is inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of the DNA) or expression. Many vectors are available, and the selection of a suitable vector is
(1) whether it is used for DNA amplification or DNA
It will depend on whether it is used for expression, (2) the size of the nucleic acid inserted into the vector, and (3) the host cell transformed with the vector. Each vector contains various components depending on its function (amplification of DNA or expression of DNA) and the host cell to which it is compatible. The components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Absent.

【０２４２】(i)シグナル配列成分 本発明に係るｍｐｌリガンドは、直接的のみならず、ヘ
テロローガスなポリペプチド（これは好ましくはシグナ
ル配列、または成熟蛋白もしくはポリペプチドのＮ末端
に特異的開裂部位を有する他のポリペプチドである）と
の融合ポリペプチドとしても発現され得る。一般に、シ
グナル配列はベクターの構成成分であってよく、または
これは、ベクター中に挿入されるｍｐｌリガンドＤＮＡ
の一部であってよい。選ばれたヘテロローガスなシグナ
ル配列は、宿主細胞によって認識され且つ処理される
（即ち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）もの
でなければならない。天然ｍｐｌリガンドシグナル配列
を認識および処理しない原核生物宿主細胞のためには、
シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニ
シリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシン
IIリーダーの群から選ばれる原核生物シグナル配列によ
って置換する。酵母の分泌のためには、天然シグナル配
列を、例えば酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホ
スファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラ
ーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ３６２１
７９）、または１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０
／１３６４６に記載のシグナルによって置換することが
できる。哺乳動物細胞の発現においては天然のシグナル
配列（即ち、天然の哺乳動物細胞からインビボでｍｐｌ
リガンドの分泌を正常に指令するｍｐｌリガンドプレ配
列）でよいが、他の哺乳動物シグナル配列、例えば他の
ｍｐｌリガンドポリペプチド由来のまたは異なる動物種
からの同じｍｐｌリガンド由来のシグナル配列、ｍｐｌ
リガンド由来のシグナル配列、および同じまたは関連す
る種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、な
らびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤ
シグナルもまた好適である。(I) Signal sequence component The mpl ligand of the present invention can be used not only directly but also as a heterologous polypeptide (preferably a signal sequence or a specific cleavage site at the N-terminus of a mature protein or polypeptide). And other polypeptides having the same). In general, the signal sequence may be a component of the vector, or it may be the mpl ligand DNA that is inserted into the vector.
May be part of The heterologous signal sequence chosen must be recognized and processed (ie, cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize and process the native mpl ligand signal sequence,
The signal sequence may be, for example, alkaline phosphatase, penicillinase, lpp, or a thermostable enterotoxin.
Replaced by a prokaryotic signal sequence selected from the group of II leaders. For yeast secretion, the native signal sequence may be, for example, a yeast invertase, α-factor, or acid phosphatase leader, C. elegans. Albicans glucoamylase leader (EP3621 published on April 4, 1990)
79) or WO90 published on November 15, 1990
/ 13646. For expression in mammalian cells, the native signal sequence (ie, mpl in vivo from native mammalian cells).
Mpl ligand presequence that normally directs secretion of the ligand), but other mammalian signal sequences, eg, signal sequences from other mpl ligand polypeptides or from the same mpl ligand from different animal species, mpl
A signal sequence from a ligand, and a signal sequence from a secreted polypeptide of the same or related species, and a viral secretion leader, eg, herpes simplex gD
Signals are also suitable.

【０２４３】(ii)複製起点成分 発現およびクローニングベクターの両者は、そのベクタ
ーを１またはそれ以上の選ばれた宿主細胞で複製できる
ようにする核酸配列を含んでいる。一般に、クローニン
グベクターにおいては、この配列は、そのベクターを宿
主染色体ＤＮＡとは独立して複製できるようにする配列
であって、複製起点または自立的複製配列を含む。この
ような配列は様々な細菌、酵母、およびウイルスについ
て良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複
製起点は殆どのグラム陰性菌に適しており、２μプラス
ミド起点は酵母に適しており、そして様々なウイルス起
点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶま
たはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベク
ターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物の
発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は、それが初
期プロモーターを含むという理由でのみ典型的に使用さ
れ得る）。(Ii) Origin of Replication Component Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Generally, in cloning vectors, this sequence will allow the vector to replicate independently of the host chromosomal DNA, and will include an origin of replication or an autonomously replicating sequence. Such sequences are well known for a variety of bacteria, yeast, and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are cloned in mammalian cells. Useful for vectors. Generally, an origin of replication component is not required for mammalian expression vectors (the SV40 origin can typically be used only because it contains an early promoter).

【０２４４】殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクタ
ーであり、即ちこれらは少なくとも一つのクラスの生物
で複製可能であるが、発現のため別の生物中にトランス
フェクトすることができる。例えば、或るベクターは大
腸菌中でクローニングされ、次いでその同じベクター
が、たとえそれが宿主細胞染色体と独立して複製できな
くても、発現のため酵母または哺乳動物細胞中にトラン
スフェクトされる。Most expression vectors are "shuttle" vectors, ie, they are replicable in at least one class of organism, but can be transfected into another organism for expression. For example, a vector is cloned in E. coli and then the same vector is transfected into yeast or mammalian cells for expression, even if it cannot replicate independently of the host cell chromosome.

【０２４５】ＤＮＡは宿主ゲノム中への挿入によって増
幅することもできる。これは、バシルス種を宿主に用い
て、例えば、バシルスゲノムＤＮＡ中に見いだされる配
列に相補的なＤＮＡ配列を該ベクターに含ませることに
よって容易に達成される。このベクターによるバシルス
のトランスフェクションは、ゲノムによるホモローガス
な組換えおよびｍｐｌリガンドＤＮＡの挿入をもたら
す。しかしながら、ｍｐｌリガンドをコードしているゲ
ノムＤＮＡの回収は、mplリガンドＤＮＡの切除に制限
酵素消化を必要とするため、外因性複製ベクターの回収
より複雑である。[0245] DNA can also be amplified by insertion into the host genome. This is readily accomplished using Bacillus species as hosts, for example, by including in the vector a DNA sequence that is complementary to the sequence found in Bacillus genomic DNA. Transfection of Bacillus with this vector results in homologous recombination with the genome and insertion of mpl ligand DNA. However, the recovery of genomic DNA encoding mpl ligand is more complicated than the recovery of exogenous replicating vector, since excision of mpl ligand DNA requires restriction enzyme digestion.

【０２４６】(iii)選択遺伝子成分 発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも
呼ばれる選択遺伝子を含んでいなければならない。この
遺伝子は、選択培養基中で生育する形質転換された宿主
細胞の生存または生育に必要な蛋白をコードしている。
選択遺伝子を含むベクターにより形質転換されなかった
宿主細胞は、その培養基中で生き残らないであろう。典
型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒
素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキサ
ート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、
（ｂ）栄養要求性突然変異体の欠失を補完し、または
（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給す
る、蛋白をコードしている（例えばバシルスのためのＤ
−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子）。(Iii) Selection Gene Component Expression and cloning vectors must contain a selection gene, also termed a selectable marker. This gene encodes a protein necessary for the survival or growth of the transformed host cells grown in the selective medium.
Host cells not transformed with the vector containing the selection gene will not survive in the culture medium. Typical selection genes are: (a) confer resistance to an antibiotic or other toxin, such as ampicillin, neomycin, methotrexate, or tetracycline;
(B) encodes a protein that complements the deletion of the auxotrophic mutant or (c) supplies a key nutrient not available from complex media (eg, D for Bacillus)
-The gene encoding alanine racemase).

【０２４７】選択計画の一例は、宿主細胞の生育を停止
させる薬物を利用する。ヘテロローガスな遺伝子によっ
てうまく形質転換されている細胞は、薬物耐性を付与す
る蛋白を発現し、よって選択処方中で生き残る。このよ
うな優性選択の例は、薬物ネオマイシン（サザン等、J.
Molec.Appl.Genet.、１巻３２７頁［１９８２］）、ミ
コフェノール酸（ミュリガン等、Science、２０９巻１
４２２頁［１９８０］）またはハイグロマイシン（サグ
デン等、Mol.Cell.Biol.、５巻４１０−４１３頁［１９
８５］）を使用する。上に挙げた３つの例は、細菌遺伝
子を真核生物の調節の下で使用して、それぞれ適当な薬
物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘ
ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシン
に対する耐性を伝達する。One example of a selection strategy utilizes a drug to arrest growth of a host cell. Cells that have been successfully transformed by the heterologous gene express proteins that confer drug resistance and thus survive in the selection regime. An example of such a dominant selection is the drug neomycin (Southern et al., J. Am.
Molec. Appl. Genet., Vol. 1, p. 327 [1982]), mycophenolic acid (Mueligan et al., Science, 209: 1).
422 [1980]) or hygromycin (Sagden et al., Mol. Cell. Biol., 5, 410-413 [19].
85]). The three examples listed above illustrate the use of bacterial genes under eukaryotic regulation to control the appropriate drug G418 or neomycin (Geneticin), x, respectively.
Transmits resistance to gpt (mycophenolic acid), or hygromycin.

【０２４８】哺乳動物細胞のためのその他の好適な選択
マーカーの例は、ｍｐｌリガンド核酸の取り込みに対し
てコンピテントな細胞の同定を可能にするマーカー、例
えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミ
ジンキナーゼである。哺乳動物細胞形質転換体を、マー
カーを取り込んだために形質転換体のみが特異に適合し
て生き残るという選択圧の下に置く。培地中の選択薬物
の濃度を連続的に変化させる条件の下で形質転換体を培
養することによって選択圧を課し、それにより選択遺伝
子およびｍｐｌリガンドポリペプチドをコードしている
ＤＮＡの両者の増幅を導く。増幅は、それによって、生
育に必須の蛋白の産生にとって極めて重要な遺伝子が、
連続する世代の組換え細胞の染色体内部で縦に反復され
る工程である。増幅されたＤＮＡから、増加した量のｍ
ｐｌリガンドが合成される。Examples of other suitable selectable markers for mammalian cells are markers that enable the identification of cells competent for uptake of mpl ligand nucleic acid, such as dihydrofolate reductase (DHFR) or thymidine kinase. is there. The mammalian cell transformant is placed under selective pressure so that only the transformant has specifically adapted and survives because of the incorporation of the marker. Imposing selection pressure by culturing the transformants under conditions that continuously change the concentration of the selection drug in the medium, thereby amplifying both the selection gene and the DNA encoding the mpl ligand polypeptide. Lead. Amplification, by which genes critical for the production of proteins essential for growth,
It is a process that is repeated vertically within the chromosome of successive generations of recombinant cells. From the amplified DNA, an increased amount of m
The pl ligand is synthesized.

【０２４９】例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転
換された細胞を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであ
るメソトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地中で全形質転
換体を培養することによってまず同定する。野生型ＤＨ
ＦＲを使用する場合の適当な宿主細胞は、ウアラウプお
よびチェイシン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４２
１６頁［１９８０］による記載のように製造され増殖さ
れる、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）セルラインである。次にこの形質転換さ
れた細胞を、増強したレベルのＭｔｘに暴露する。これ
により多数のＤＨＦＲ遺伝子のコピーの合成が導かれ、
そして同時に、該発現ベクターを含む他のＤＮＡ、例え
ばｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡのコピーが多
数合成される。この増幅技術は、他の点で好適な任意の
宿主、例えばＭｔｘに対し高度に耐性な突然変異体ＤＨ
ＦＲ遺伝子が使用されるならば、内因性ＤＨＦＲの存在
にも拘わらず、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１ ＣＨ
Ｏ−Ｋ１と共に利用することができる（ＥＰ１１７０６
０）。別法として、ｍｐｌリガンド、野生型ＤＨＦＲ蛋
白、およびアミノグリコシド３'ホスホトランスフェラ
ーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択マーカーをコードして
いるＤＮＡ配列により形質転換または同時形質転換され
た宿主細胞［特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主］
を、その選択マーカーに対する選択薬剤、例えばアミノ
グリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシ
ン、またはＧ４１８を含有する培地中での細胞増殖によ
って選択することができる。米国特許第４９６５１９９
号を参照されたい。For example, cells transformed with the DHFR selection gene are first identified by culturing all transformants in a medium containing methotrexate (Mtx), a competitive antagonist of DHFR. Wild type DH
Suitable host cells when FRs are used are Oualaup and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 42.
A Chinese hamster ovary (CHO) cell line lacking DHFR activity, produced and propagated as described on page 16 [1980]. The transformed cells are then exposed to enhanced levels of Mtx. This leads to the synthesis of multiple copies of the DHFR gene,
At the same time, a large number of copies of another DNA containing the expression vector, for example, a DNA encoding the mpl ligand are synthesized. This amplification technique can be performed using any otherwise suitable host, such as mutant DH, which is highly resistant to Mtx.
If the FR gene is used, despite the presence of endogenous DHFR, for example, ATCC No. CCL61 CH
It can be used together with O-K1 (EP11706)
0). Alternatively, host cells transformed or co-transformed with DNA sequences encoding mpl ligand, wild-type DHFR protein, and other selectable markers such as aminoglycoside 3 'phosphotransferase (APH) [particularly endogenous Wild-type host containing DHFR]
Can be selected by cell growth in media containing a selection agent for the selectable marker, such as an aminoglycoside antibiotic, such as kanamycin, neomycin, or G418. U.S. Pat. No. 4,965,199
See issue No.

【０２５０】酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母
プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である
（スティンチコウム等、Nature、２８２巻３９頁［１９
７９］；キングズマン等、Gene、７巻１４１頁［１９７
９］；またはチェンパー等、Gene、１０巻１５７頁［１
９８０］）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増
殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ
Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マー
カーを提供する（ジョーンズ、Genetics、８５巻１２頁
［１９７７］）。そうすると、酵母宿主細胞ゲノム中の
ｔｒｐ１損傷の存在が、トリプトファンの不在下で増殖
させることによる形質転換の検出のための有効な環境を
提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠失酵母株（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝
子を有する既知のプラスミドによって補完される。A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 (Stintikoum et al., Nature, 282, 39 [19].
79]; Kingsman et al., Gene, 7: 141 [197
9]; or Chemer et al., Gene 10, p. 157 [1
980]). The trp1 gene is a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, such as ATCC
No. Provides selectable markers for 44076 or PEP4-1 (Jones, Genetics, 85, 12 [1977]). Then, the presence of the trp1 lesion in the yeast host cell genome provides an effective environment for detecting transformation by growing in the absence of tryptophan. Similarly, the Leu2-deleted yeast strain (ATCC
No. 20622 or 38626) is complemented by a known plasmid carrying the Leu2 gene.

【０２５１】(iv)プロモーター成分 発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物によ
り認識され且つｍｐｌリガンド核酸と機能的に結合して
いるプロモーターを含んでいる。プロモーターは、構造
遺伝子の開始コドンの上流（５'）に位置する（一般に
約１００ないし１０００ｂｐ以内）翻訳されない配列で
あって、それらが機能的に結合している特定の核酸配
列、例えばｍｐｌリガンド核酸配列の転写および翻訳を
調節する。このようなプロモーターは、典型的には二つ
のクラス、誘導性および構成性に分類される。誘導性プ
ロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば或る栄
養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答した
それらの調節の下で、ＤＮＡからの増強されたレベルの
転写を開始するプロモーターである。現時点において、
可能性ある様々な宿主細胞により認識される多数のプロ
モーターが良く知られている。これらのプロモーター
は、制限酵素消化によりそのプロモーターを供給源のＤ
ＮＡから取り出し、この分離されたプロモーター配列を
ベクター中に挿入することにより、ｍｐｌリガンドコー
ド化ＤＮＡと機能的に結合する。天然ｍｐｌリガンドプ
ロモーター配列および多くのヘテロローガスなプロモー
ターはいずれもｍｐｌリガンドＤＮＡの直接的増幅およ
び／または発現に使用することができる。しかしなが
ら、ヘテロローガスなプロモーターは、天然ｍｐｌリガ
ンドプロモーターと比較して一般により大量の転写およ
び高収量のｍｐｌリガンドの発現を可能にするため、こ
れが好ましい。(Iv) Promoter component Expression and cloning vectors usually contain a promoter that is recognized by the host organism and is operably linked to the mpl ligand nucleic acid. A promoter is a non-translated sequence (generally within about 100 to 1000 bp) located upstream (5 ') of the start codon of a structural gene, and is a specific nucleic acid sequence to which they are operably linked, eg, an mpl ligand nucleic acid. Regulates transcription and translation of the sequence. Such promoters typically fall into two classes, inducible and constitutive. An inducible promoter is a promoter that initiates enhanced levels of transcription from DNA under some changes in culture conditions, such as the presence or absence of certain nutrients, or their regulation in response to changes in temperature. At this time,
Numerous promoters that are recognized by a variety of potential host cells are well known. These promoters are prepared by restriction digestion of the promoter with the source D
The DNA is removed from the NA, and the isolated promoter sequence is inserted into a vector so as to be functionally linked to the mpl ligand-encoding DNA. Both the native mpl ligand promoter sequence and many heterologous promoters can be used for direct amplification and / or expression of mpl ligand DNA. However, heterologous promoters are preferred because they generally allow for greater transcription and expression of higher yields of mpl ligand compared to the native mpl ligand promoter.

【０２５２】原核生物宿主と共に使用するのに好適なプ
ロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプ
ロモーター系（チャング等、Nature、２７５巻６１５頁
［１９７８］；およびゲッデル等、Nature、２８１巻５
４４頁［１９７９］）、アルカリホスファターゼ、トリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲッデル、Nucl
eic Acids Res.、８巻４０５７頁［１９８０］およびＥ
Ｐ３６７７６）およびｔａｃプロモーターのようなハイ
ブリッドプロモーター（デボーア等、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA、８０巻２１−２５頁［１９８３］）が包含され
る。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターもまた
好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されてお
り、それによって当業者は、必要な制限部位を供給する
リンカーまたはアダプターを使用して、それらをｍｐｌ
リガンドをコードしているＤＮＡに機能的にライゲーシ
ョンすることができる（ジーベンリスト等、Cell、２０
巻２６９頁［１９８０］）。細菌系に使用するためのプ
ロモーターはさらに、ｍｐｌリガンドポリペプチドをコ
ードしているＤＮＡに機能的に結合したシャイン−ダル
ガルノ（S.D.）配列をも含んでいるであろう。Suitable promoters for use with prokaryotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems (Chang et al., Nature, 275: 615 [1978]; and Geddel et al., Nature, 281: 5-5).
44 [1979]), alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system (Geddel, Nucl.
eic Acids Res., 8, 4057 [1980] and E
P36776) and hybrid promoters such as the tac promoter (Debore et al., Proc. Natl. Acad. S.
ci. USA, 80, 21-25 [1983]). However, other known bacterial promoters are also suitable. These nucleotide sequences have been published so that those skilled in the art can compile them using a linker or adapter that provides the necessary restriction sites.
It can be functionally ligated to the DNA encoding the ligand (Siebenlist et al., Cell, 20
269 [1980]). Promoters for use in bacterial systems will also contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to the DNA encoding the mpl ligand polypeptide.

【０２５３】真核生物のためのプロモーター配列が知ら
れている。実際全ての真核生物遺伝子は、転写が開始さ
れる部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置する
ＡＴに富む領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始
位置から７０ないし８０塩基上流に見いだされるもう一
つの配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域（ここでＸは任意のヌク
レオチドであってよい）である。殆どの真核生物遺伝子
の３'末端には、コーディング配列の３'末端にポリＡ尾
を付加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列
がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクター中
に適当に挿入される。[0253] Promoter sequences for eukaryotes are known. In fact, all eukaryotic genes have an AT-rich region located approximately 25 to 30 bases upstream from the site where transcription is initiated. Another sequence found 70 to 80 bases upstream from the start of transcription of many genes is the CXCAAT region, where X can be any nucleotide. At the 3 'end of most eukaryotic genes is an AATAAA sequence that can be a signal to add a poly A tail to the 3' end of the coding sequence. All of these sequences are suitably inserted into eukaryotic expression vectors.

【０２５４】酵母宿主と共に使用するための好適なプロ
モーター配列の例は、３−ホスホグリセラートキナーゼ
（ヒッツェマン等、J.Biol.Chem.、２５５巻２０７３頁
［１９８０］）またはその他の解糖酵素（ヘス等、J.Ad
v.Enzyme Reg.、７巻１４９頁［１９６８］；およびホ
ランド、Biochemistry、１７巻４９００頁［１９７
８］）、例えばエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−
ホスファートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルク卜キナーゼ、
グルコース−６−ホスファートイソメラーゼ、３−ホス
ホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ
ースホスファートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーター
を包含する。Examples of suitable promoter sequences for use with yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase (Hitzemann et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980]) or other glycolytic enzymes ( Hess, J.Ad
v. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; and Holland, Biochemistry, 17: 4900 [197]
8]), for example, enolase, glyceraldehyde-3-
Phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase,
Includes promoters for glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate tomase, pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.

【０２５５】増殖条件により転写が調節されるというさ
らなる利点を有する誘導性プロモーターである、その他
の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ
２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に
関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセロアルデ
ヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼ、ならびにマ
ルトースおよびガラクトース利用を司る酵素のプロモー
ター領域である。酵母の発現で用いられる好適なベクタ
ーおよびプロモーターは、ヒッツェマン等、ＥＰ７３６
５７Ａにさらに記載されている。酵母のエンハンサーも
また酵母プロモーターと共に有利に使用される。Other yeast promoters, which are inducible promoters that have the added advantage that transcription is regulated by growth conditions, include alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, a degrading enzyme involved in nitrogen metabolism, metallothionein, glycerol. It is a promoter region of aldehyde-3-phosphate dehydrogenase and enzymes responsible for maltose and galactose utilization. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are described in Hitzeman et al., EP 736.
57A. Yeast enhancers are also advantageously used with yeast promoters.

【０２５６】哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの
ｍｐｌリガンド転写は、プロモーターが宿主細胞系と共
存し得る限り、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイ
ルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０
４）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウ
シ乳頭腫ウイルス、鳥の肉腫ウイルス、サイトメガロウ
イルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も
好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のような
ウイルスのゲノムから得られるプロモーター、ヘテロロ
ーガスな哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモ
ーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱衝撃
プロモーターから、そしてｍｐｌリガンド配列に通常付
随するプロモーターから得られるプロモーターによって
調節される。[0256] Transcription of mpl ligand from vectors in mammalian host cells can be carried out, for example, by polyomavirus, fowlpox virus (UK221150 published July 5, 1989) as long as the promoter is compatible with the host cell system.
4) from the genome of viruses such as adenovirus (eg adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and most preferably Simian virus 40 (SV40). It is regulated by the resulting promoter, a heterologous mammalian promoter such as an actin promoter or immunoglobulin promoter, from a heat shock promoter, and from a promoter normally associated with mpl ligand sequences.

【０２５７】ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモ
ーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含むＳＶ４０
制限フラグメントとして簡便に得られる。フィアズ等、
Nature、２７３巻１１３頁［１９７８］；ミュリガンお
よびバーグ、Science、２０９巻１４２２−１４２７頁
［１９８０］；パヴラキス等、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、７８巻７３９８−７４０２頁［１９８１］。ヒトサ
イトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、Ｈｉｎ
ｄIII Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる。グリ
ーナウェイ等、Gene、１８巻３５５−３６０頁［１９８
２］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳
動物宿主でのＤＮＡを発現する系が米国特許第４４１９
４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第
４６０１９７８号に記載されている。さらに、サルの細
胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡ
の発現に関するグレイ等、Nature、２９５巻５０３−５
０８頁［１９８２］；単純ヘルペスウイルス由来のチミ
ジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞にお
けるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現に関するレ
イエス等、Nature、２９７巻５９８−６０１頁［１９８
２］；培養されたマウスおよびウサギの細胞におけるヒ
トインターフェロンβ１遺伝子の発現に関するキャナー
ニおよびバーグ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻５１
６６−５１７０頁［１９８２］；ならびに、プロモータ
ーとしてラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を用いた、
ＣＶ−１サル腎臓細胞、鶏の胚線維芽細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮ
ＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現に関す
るゴーマン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻６７７
７−６７８１頁［１９８２］を参照されたい。The early and late promoters of the SV40 virus are SV40, which also contains the SV40 viral origin of replication.
It is conveniently obtained as a restriction fragment. Fears, etc.
Nature, 273, 113 [1978]; Mülligan and Berg, Science, 209, 1422-1427 [1980]; Pavraquis et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
A, 78, 7398-7402 [1981]. The immediate early promoter of human cytomegalovirus is Hin
It is conveniently obtained as a dIII E restriction fragment. Greenaway et al., Gene 18, 355-360 [198
2]. A system for expressing DNA in a mammalian host using bovine papilloma virus as a vector is disclosed in US Pat.
No. 446. Modifications of this system are described in U.S. Patent No. 4,601,978. Furthermore, cDNA encoding immune interferon in monkey cells
Gray, et al., Nature, 295: 503-5.
08 [1982]; Rays et al., Nature, 297 598-601 [198] for expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of the thymidine kinase promoter from herpes simplex virus.
2]; Cannani and Berg, Proc.
66-5170 [1982]; and using the long terminal repeat of Rous sarcoma virus as the promoter,
CV-1 monkey kidney cells, chicken embryo fibroblasts, Chinese hamster ovary cells, HeLa cells, and mouse N
Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 677 for expression of bacterial CAT sequences in IH-3T3 cells.
See pages 7-6781 [1982].

【０２５８】(v)エンハンサー要素成分 本発明に係るｍｐｌリガンドをコードしているＤＮＡ
の、高等真核生物による転写は、しばしばベクター中に
エンハンサー配列を挿入することによって増強される。
エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増
大させる、通常約１０ないし３００ｂｐの、ｃｉｓ作動
要素のＤＮＡである。エンハンサーは相対的に、方向お
よび位置に独立しており、転写ユニットの５'（ライミ
ンズ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７８巻９９３頁［１
９８１］）および３'（ラスキー等、Mol.Cell Bio.、３
巻１１０８頁［１９８３］）、イントロン内部（バネル
ジ等、Cell、３３巻７２９頁［１９８３］）、およびコ
ーディング配列自身の内部（オスボーン等、Mol.Cell B
io.、４巻１２９３頁［１９８４］）に、見いだされて
いる。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が
現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミ
ン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）。し
かしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエン
ハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の後
期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、
サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、
複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびア
デノウイルスエンハンサーが包含される。真核生物プロ
モーターの活性化のための増強要素についてのヤニヴ、
Nature、２９７巻１７−１８頁［１９８２］もまた参照
されたい。エンハンサーはｍｐｌリガンドコード化配列
の５'または３'位でベクター中にスプライスされ得る
が、好ましくはプロモーターから５'部位に位置する。(V) Enhancer element component DNA encoding mpl ligand according to the present invention
Transcription by higher eukaryotes is often enhanced by inserting an enhancer sequence into the vector.
Enhancers are cis-acting element DNAs, usually about 10 to 300 bp, that act on a promoter to increase its transcription. Enhancers are relatively direction- and position-independent and are 5 'of the transcription unit (Reimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 993 [1
981]) and 3 ′ (Lasky et al., Mol. Cell Bio., 3
Volume 1108 [1983]), inside the intron (Vanerge et al., Cell, 33, 729 [1983]), and inside the coding sequence itself (Osborn et al., Mol. Cell B.
io., vol. 4, p. 1293 [1984]). Many enhancer sequences from mammalian genes are currently known (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein, and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the SV40 enhancer on the late side of the replication origin (bp 100-270),
Cytomegalovirus early promoter enhancer,
Polyoma enhancers on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers are included. Yaniv on enhancing elements for activation of eukaryotic promoters,
See also Nature, 297: 17-18 [1982]. The enhancer may be spliced into the vector at a position 5 'or 3' to the mpl ligand coding sequence, but is preferably located at a site 5 'from the promoter.

【０２５９】(vi)転写終止成分 真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、人間、
または他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発
現ベクターはさらに、転写の終止およびｍＲＮＡの安定
化に必要な配列を含むであろう。このような配列は普
通、真核生物のまたはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡ
の５'および時には３'非翻訳領域から取得することがで
きる。これらの領域は、ｍｐｌリガンドをコードしてい
るｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメント
として転写されるヌクレオチドセグメントを含んでい
る。(Vi) Transcription termination component Eukaryotic host cells (yeast, fungi, insects, plants, animals, humans,
Or nucleated cells from other multicellular organisms) will further contain sequences necessary for termination of transcription and stabilization of the mRNA. Such sequences are usually eukaryotic or viral DNA or cDNA.
Can be obtained from the 5 'and sometimes 3' untranslated regions. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the mpl ligand.

【０２６０】(vii)ベクターの組み立ておよび分析 上に列挙された構成成分の１またはそれ以上を含む適当
なベクターの組み立てには、標準的ライゲーション技術
を使用する。分離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグ
メントを開裂させ、整え、そして必要なプラスミドの生
成のために望まれる型に再ライゲーションする。(Vii) Vector Construction and Analysis Construction of suitable vectors containing one or more of the above-listed components employs standard ligation techniques. The isolated plasmid or DNA fragment is cleaved, trimmed, and re-ligated into the desired form for production of the required plasmid.

【０２６１】組み立てられたプラスミドが正しい配列で
あることを確認する分析のために、ライゲーション混合
物を用いてＥ．coli Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．３１４４６）を形質転換し、成功した形質転換体を
適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって
選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限エ
ンドヌクレアーゼ消化により分析し、そして／またはメ
シング等、Nucleic Acids Res.、９巻３０９頁［１９８
１］の方法によって、またはマクサム等、Methods in E
nzymology、６５巻４９９頁［１９８０］の方法によっ
て配列決定する。The ligation mixture was used to analyze E. coli for analysis to confirm that the assembled plasmid was the correct sequence. coli K12 strain 294 (ATCC N
o. 31446) and successful transformants are selected for ampicillin or tetracycline resistance as appropriate. Plasmids were prepared from transformants, analyzed by restriction endonuclease digestion, and / or messing, etc., Nucleic Acids Res., 9 309 [198
1] or by Maxam et al., Methods in E
Sequence is determined by the method of nzymology, 65: 499 [1980].

【０２６２】(viii)一過性発現ベクター 哺乳動物細胞においてｍｐｌリガンドポリペプチドをコ
ードしているＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクタ
ーは、本発明の実施において特に有用である。一般に、
一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピー
を蓄積し、その発現ベクターによりコードされている所
望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細
胞中で効率的に複製できる発現ベクターを使用すること
を含む。サムブルック等、上記、１６．１７−１６．２
２頁。適当な発現ベクターおよび宿主細胞からなる一過
性発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードさ
れているポリペプチドの簡便な正の同定、および、所望
の生物学的または生理学的性質についての係るポリペプ
チドの迅速なスクリーニングを可能にする。よって、一
過性発現系は、ｍｐｌリガンドポリペプチドの生物活性
を有するｍｐｌリガンドポリペプチドの類似体および変
異体を同定する目的のために本発明において特に有用で
ある。(Viii) Transient Expression Vectors Expression vectors that provide for the transient expression of DNA encoding a mpl ligand polypeptide in mammalian cells are particularly useful in the practice of the present invention. In general,
Transient expression is an expression that can replicate efficiently in a host cell such that the host cell accumulates multiple copies of the expression vector and synthesizes high levels of the desired polypeptide encoded by the expression vector. Including the use of vectors. 16.17-16.2, Sambrook et al., Supra.
2 pages. Transient expression systems consisting of appropriate expression vectors and host cells provide convenient positive identification of the polypeptide encoded by the cloned DNA, and such polypeptides for desired biological or physiological properties. Enables rapid screening of Thus, transient expression systems are particularly useful in the present invention for the purpose of identifying analogs and variants of the mpl ligand polypeptide that have the biological activity of the mpl ligand polypeptide.

【０２６３】(ix)好適な例示的脊椎動物細胞ベクター 組換え脊椎動物細胞培養でのｍｐｌリガンドの合成に当
てはめるのに好適なその他の方法、ベクター、および宿
主細胞は、ゲシング等、Nature、２９３巻６２０−６２
５頁［１９８１］；マンテイ等、Nature、２８１巻４０
−４６頁［１９７９］；レヴィンソン等；ＥＰ１１７０
６０；およびＥＰ１１７０５８に記載されている。ｍｐ
ｌリガンドの哺乳動物細胞培養発現にとって特に有用な
プラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７２４７米国特許第
５２５８２８７号）またはｐＳＶＩ６Ｂ（ＰＣＴ公開第
ＷＯ９１／０８２９１号）である。(Ix) Suitable Exemplary Vertebrate Cell Vectors Other methods, vectors, and host cells suitable for adapting mpl ligand synthesis in recombinant vertebrate cell culture are described in Gessing et al., Nature, vol. 293. 620-62
5 [1981]; Mantei et al., Nature, 281: 40.
-46 [1979]; Levinson et al .; EP 1170.
60; and EP 117058. mp
A particularly useful plasmid for mammalian cell culture expression of the 1 ligand is pRK5 (EP307247 U.S. Pat. No. 5,258,287) or pSVI6B (PCT Publication No. WO 91/08291).

【０２６４】Ｄ．宿主細胞の選択および形質転換 本明細書に記載のベクターのクローニングまたは発現に
好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、または上記の高等
真核生物細胞である。適当な原核生物は、真性細菌、例
えばグラム陰性またはグラム陽性菌、例えば大腸菌、
Ｂ．サブティリスのようなバシルス、Ｐ．アエルギノー
サのようなシュードモナス種、サルモネラ・ティフィム
リウム、またはセラティア・マルセスキャンスを包含す
る。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主はＥ．ｃｏ
ｌｉ２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１４４６）であるが、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７３２５）のようなその他の菌株
もまた適当である。これらの例は限定的ではなく例示的
なものである。好ましくは、宿主細胞は最少量の蛋白分
解酵素を分泌すべきである。別法として、インビトロの
クローニング方法、例えばＰＣＲまたはその他の核酸ポ
リメラーゼ反応もまた好適である。D. Selection and Transformation of Host Cells Suitable host cells for cloning or expressing the vectors described herein are prokaryotes, yeast, or higher eukaryotic cells as described above. Suitable prokaryotes are eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive bacteria, such as E. coli,
B. Bacillus, such as Subtilis, Pseudomonas species, such as Aeruginosa, Salmonella typhimurium, or Serratia marcecancus. One preferred E. coli cloning host is E. coli. co
li294 (ATCC No. 31446),
E. FIG. coli B, E. coli. coli X1776 (ATCC
No. 31537) and E.C. coli W3110
Other strains such as (ATCC No. 27325) are also suitable. These examples are illustrative rather than limiting. Preferably, the host cells should secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. Alternatively, in vitro cloning methods such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions are also suitable.

【０２６５】原核生物に加えて、糸状菌または酵母のよ
うな真核微生物は、ｍｐｌリガンドをコードしているベ
クターのための好適な宿主である。サッカロミセス・セ
レヴィシアエ、またはパン酵母は、下等真核宿主微生物
の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、幾つか
のその他の属、種、および菌株、例えばシゾサッカロミ
セス・ポンベ（ビーチおよびナース、Nature、２９０巻
１４０頁［１９８１］；１９８５年５月２日公開のＥＰ
１３９３８３）、クルイヴェロミセス宿主（米国特許第
４９４３５２９号）、例えばＫ．ラクティス（ルーヴェ
ンコート等、J.Bacteriol.、７３７頁［１９８３］）、
Ｋ．フラギリス、Ｋ．ブルガリクス、Ｋ．サーモトレラ
ンス、およびＫ．マルクシアヌス、ヤロウィア［ＥＰ４
０２２２６］、ピチア・パストリス（ＥＰ１８３０７
０；スリークリシュナ等、J.BasicMicrobiol.、２８巻
２６５−２７８頁［１９８８］）；カンディダ、トリコ
デルマ・リーシア（ＥＰ２４４２３４）、ニューロスポ
ラ・クラッサ（ケイス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７
６巻５２５９−５２６３頁［１９７９］）、および糸状
菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラ
ディウム（１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００
３５７）、およびアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニデ
ュランス（バランス等、Biochem.Biophys.Res.Commu
n.、１１２巻２８４−２８９頁［１９８３］；ティルバ
ーン等、Gene、２６巻２０５−２２１頁［１９８３］；
イェルトン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻１４７
０−１４７４頁［１９８４］）およびＡ．ニガー（ケリ
ーおよびハインズ、EMBO J.、４巻４７５−４７９頁[１
９８５]）もまた一般的に利用でき且つ本発明において
有用である。In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable hosts for vectors encoding mpl ligand. Saccharomyces cerevisiae, or baker's yeast, is the most commonly used among lower eukaryotic host microorganisms. However, some other genera, species and strains, such as Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290, 140 [1981]; EP published May 2, 1985)
139383), Kluyveromyces host (U.S. Pat. No. 4,943,529), e.g. Lactis (Leuvencourt et al., J. Bacteriol., P. 737 [1983]),
K. Fragilis, K .; Bulgarix, K. Thermotolerance, and K. Marcianus, Yarrowia [EP4
02226], Pichia pastoris (EP18307)
0; Three Krishna et al., J. Basic Microbiol. 28: 265-278 [1988]); Candida, Trichoderma Licia (EP244234);
6, 5259-5263 [1979]), and filamentous fungi such as Neurospora, Penicillium, Tripocladium (WO 91/00 published on January 10, 1991).
357), and Aspergillus hosts, such as A. Nidurance (balance, Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 112, 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26, 205-221 [1983];
Yarton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 147.
0-1474 [1984]) and A.I. Niger (Kelly and Hines, EMBO J., Vol. 4, pp. 475-479 [1
985]) are also generally available and useful in the present invention.

【０２６６】グリコシル化ｍｐｌリガンドの発現のため
の好適な宿主細胞が、多細胞生物から誘導される。この
ような宿主細胞は、複雑な処理およびグリコシル化活動
が可能である。原則として、脊椎動物または無脊椎動物
培養由来の如何に拘わらず、任意の高等真核生物細胞培
養が使用可能である。無脊椎動物細胞の例には、植物お
よび昆虫細胞が包含される。多数のバキュロウイルス株
および変異体ならびに、スポドプテラ・フルギペルダ
（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蛾）、アエデス・
アルボピクトゥス（蛾）、ドゥロソフィラ・メラノガス
ター（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリの
ような宿主からの対応する受容可能な昆虫宿主細胞が特
定されている。例えば、ラッコウ等、Bio/Technology、
６巻４７−５５頁［１９８８］；ミラー等、Genetic En
gineering、セットロウ等編、８巻（プレナム・パブリ
ッシング、１９８６）、２７７−２７９頁；およびマエ
ダ等、Nature、３１５巻５９２−５９４頁［１９８５］
を参照されたい。トランスフェクションのための様々な
ウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮ
ＰＶのＬ−１変異体およびボンビクス・モリＮＰＶのＢ
ｍ−５株が広く入手可能であり、このようなウイルス
は、本発明に従い本明細書に記載のウイルスとして、特
にスポドブテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクシ
ョンに使用することができる。Suitable host cells for the expression of glycosylated mpl ligand are derived from multicellular organisms. Such host cells are capable of complex processing and glycosylation activities. In principle, any higher eukaryotic cell culture, whether from vertebrate or invertebrate culture, can be used. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus strains and variants and Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (moth), Aedes
Corresponding acceptable insect host cells from hosts such as Albopictus (moth), Drosophila melanogaster (Drosophila), and Bombix mori have been identified. For example, Bio / Technology,
6, 47-55 [1988]; Miller et al., Genetic En.
gineering, Setrow et al., 8 (Plenum Publishing, 1986), 277-279; and Maeda et al., Nature, 315, 592-594 [1985].
Please refer to. Various virus strains for transfection, such as Autographa californica N
L-1 mutant of PV and B of Bombix mori NPV
The m-5 strain is widely available, and such viruses can be used according to the invention as the viruses described herein, especially for transfection of Spodoptera frugiperda cells.

【０２６７】綿花、トウモロコシ、馬鈴薯、ダイズ、ペ
チュニア、トマト、およびタバコといった植物細胞培養
を宿主として利用できる。典型的には、ｍｐｌリガンド
ＤＮＡを含むよう前もって操作しておいた細菌アグロバ
クテリウム・トゥメファシエンスの或る菌株と共にイン
キュベートすることにより、植物細胞をトランスフェク
トする。Ａ．トゥメファシエンスと共に植物細胞培養を
インキュベートする間に、ｍｐｌリガンドをコードして
いるＤＮＡがその植物細胞宿主に移され、これがトラン
スフェクトされ、そして適当な条件の下でｍｐｌリガン
ドＤＮＡを発現する。加えて、ノパリンシンターゼプロ
モーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植
物細胞と共存し得る調節およびシグナル配列が利用でき
る。デピッカー等、J.Mol.Appl.Gen.、１巻５６１頁
［１９８２］。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流
領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ
含有植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化
または増強することができる。１９８９年６月２１日公
開のＥＰ３２１１９６。Plant cell cultures such as cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, and tobacco can be used as hosts. Typically, plant cells are transfected by incubation with a strain of the bacterium Agrobacterium tumefaciens that has been previously engineered to contain mpl ligand DNA. A. While incubating the plant cell culture with Tumefaciens, the DNA encoding the mpl ligand is transferred to the plant cell host, which is transfected and expresses the mpl ligand DNA under appropriate conditions. In addition, regulatory and signal sequences compatible with plant cells such as the nopaline synthase promoter and polyadenylation signal sequence are available. J. Mol. Appl. Gen. 1: 561 [1982]. Furthermore, the DNA segment separated from the upstream region of the T-DNA780 gene is a recombinant DNA segment.
The transcription level of a plant-expressed gene in the containing plant tissue can be activated or enhanced. EP 321196 published June 21, 1989.

【０２６８】しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最
も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖
は、近年常套的手法となっている（ティシュー・カルチ
ャー、アカデミック・プレス、クルースおよびパターソ
ン編［１９７３］）。有用な哺乳動物宿主セルラインの
例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１ラ
イン（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト
胚腎臓ライン（２９３または懸濁培養での増殖のために
サブクローニングされた２９３細胞。グラハム等、J.Ge
n Virol.、３６巻５９頁［１９７７］。）；ハムスター
乳児腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ウア
ラウプおよびチェイシン、Proｃ.Natl.Acad.Sci.USA、
７７巻４２１６頁［１９８０］）；マウスセルトリ細胞
（ＴＭ４、マザー、Biol.Reprod.、２３巻２４３−２５
１頁［１９８０］）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７
６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞
（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤ
ＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝
細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト
肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細
胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス胸部腫瘍
（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ
Ｉ細胞（マザー等、Annals.N.Y.Acad.Sci.、３８３巻４
４−６８頁［１９８２］）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細
胞；およびヒト肝癌ライン（Ｈｅｐ Ｇ２）である。However, interest has been greatest in vertebrate cells, and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine technique in recent years (Tissue Culture, Academic Press, Cruz and Patterson). (1973)). Examples of useful mammalian host cell lines are the SV40 transformed monkey kidney CV1 line (COS-7, ATCC CRL1651); the human embryonic kidney line (293 or 293 subcloned for growth in suspension culture). Cells, Graham et al., J. Ge
n Virol., 36, 59 [1977]. Hamster infant kidney cells (BHK, ATCC CCL10); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Oualaup and Chacin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77: 4216 [1980]); mouse Sertoli cells (TM4, mother, Biol. Reprod., 23: 243-25).
1 [1980]); monkey kidney cells (CV1 ATCC C)
CL70); African green monkey kidney cells (VERO-7)
6, ATCC CRL-1587); human cervical cancer cells (HELA, ATCC CCL2); canine kidney cells (MD
CK, ATCC CCL34); Buffalorat hepatocytes (BRL 3A, ATCC CRL1442); human lung cells (W138, ATCC CCL75); human hepatocytes (Hep G2, HB8065); mouse breast tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TR
I cells (Mother et al., Annals. NYAcad. Sci., 383: 4
4-68 [1982]); MRC 5 cells; FS4 cells; and human liver cancer line (Hep G2).

【０２６９】宿主細胞をトランスフェクトし、そして好
ましくは本発明に係る上記の発現またはクローニングベ
クターにより形質転換し、プロモーターの誘導、形質転
換体の選択、または所望配列をコードしている遺伝子の
増幅のために適宜修飾した常套的栄養培地で培養する。The host cells are transfected and preferably transformed with the above-described expression or cloning vector according to the present invention to induce a promoter, select for transformants, or amplify the gene encoding the desired sequence. In a conventional nutrient medium that has been appropriately modified.

【０２７０】トランスフェクションとは、コーディング
配列が実際に発現されるか否かに拘わらず、宿主細胞に
よる発現ベクターの取り込みを指す。多数のトランスフ
ェクションの方法、例えばＣａＰＯ₄および電気穿孔が
当業者に知られている。一般に、宿主細胞内にこのベク
ターの作用の何らかの徴候が存在した時、トランスフェ
クションの成功が認められる。Transfection refers to the uptake of an expression vector by a host cell whether or not the coding sequence is actually expressed. Numerous transfection methods are known to those skilled in the art, such as CaPO ₄ and electroporation. Generally, successful transfection is noted when any indication of the operation of the vector is present in the host cell.

【０２７１】形質転換とは、ＤＮＡが生物中に導入され
その結果そのＤＮＡが染色体外要素としてまたは染色体
構成要素により複製可能となることを意味する。使用さ
れる宿主細胞に応じて、形質転換は、係る細胞にとって
適当な標準技術を用いて行われる。サムブルック等、上
記、の１．８２項に記載される塩化カルシウムを使用す
るカルシウム処理は、原核生物または実質的な細胞壁障
壁を含むその他の細胞に対して一般的に使用される。シ
ャウ等、Gene、２３巻３１５頁［１９８３］および１９
８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載さ
れるように、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス
による感染が、或る植物細胞の形質転換に使用される。
さらに、１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３
５８に記載のように、超音波処理を用いて植物をトラン
スフェクトすることができる。このような細胞壁の無い
哺乳動物細胞に対しては、グラハムおよびヴァン・デル
・エプ、Virology、５２巻４５６−４５７頁［１９７
８］の燐酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳動物細胞
宿主系の形質転換の一般的側面は、アクセルにより１９
８３年８月１６日登録の米国特許第４３９９２１６号に
記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、ヴァ
ン・ゾーリンゲン等、J.Bact.、１３０巻９４６頁［１
９７７］およびシャオ等、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、
７６巻３８２９頁［１９７９］の方法に従って実施す
る。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入するその他の
方法、例えば、核注入、電気穿孔、またはプロトプラス
ト融合もまた使用できる。Transformation means that DNA has been introduced into an organism so that it can be replicated as an extrachromosomal element or by a chromosomal element. Depending on the host cell used, transformation is carried out using standard techniques appropriate for such cells. Calcium treatment using calcium chloride, as described in Section 1.82, supra, by Sambrook et al., Is commonly used for prokaryotes or other cells that contain a substantial cell wall barrier. Shaw et al., Gene, 23, 315 [1983] and 19
Infection with Agrobacterium tumefaciens is used to transform certain plant cells, as described in WO 89/05859 published June 29, 89.
Further, WO 91/003 published on January 10, 1991
Plants can be transfected using sonication as described in 58. For mammalian cells without such cell walls, Graham and Van der Ep, Virology, 52, 456-457 [197].
8] The calcium phosphate precipitation method is preferred. The general aspects of mammalian cell host system transformation are described in
No. 4,399,216, issued Aug. 16, 1983. Transformation of yeast is typically performed by Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 [1
977] and Xiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
76, 3829 [1979]. However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear injection, electroporation, or protoplast fusion, can also be used.

【０２７２】Ｅ．宿主細胞の培養 本発明に係るｍｐｌリガンドポリペプチドの産生に使用
される原核細胞は、サムブルック等、上記、に一般的に
記載される適当な培地で培養される。E. Cultivation of Host Cells The prokaryotic cells used to produce the mpl ligand polypeptides of the present invention are cultured in a suitable medium as generally described above, such as Sambrook et al.

【０２７３】本発明に係るｍｐｌリガンドの産生に使用
される哺乳動物宿主細胞は様々な培地で培養することが
できる。ハムのＦ１０（シグマ）、最少必須培地（［Ｍ
ＥＭ］、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、お
よびダルベッコの改良イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、シ
グマ）のような市販品が入手できる培地が、当該宿主細
胞の培養に適している。さらに、ハムおよびワレス、Me
th.Enz.、５８巻４４頁［１９７９］、バーンズおよび
サトー、Anal.Biochem.、１０２巻２５５頁［１９８
０］、米国特許第４７６７７０４号；４６５７８６６
号；４９２７７６２号；もしくは４５６０６５５号；Ｗ
Ｏ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；米国特許
Ｒｅ．３０９８５；または同時係属のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．
０７／５９２１０７または０７／５９２１４１（共に１
９９０年１０月３日出願）に記載される任意の培地を当
該宿主細胞のための培養基として使用することができ、
これらの内容は全て引用して本明細書の一部とする。こ
れらの培地はいずれも、ホルモンおよび／またはその他
の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、
または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、
カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩）、緩衝剤
（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシ
ンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン
（商標）薬）、微量元素（通常最終濃度がマイクロモル
の範囲で存在する無機化合物と定義される）、およびグ
ルコースまたは同等のエネルギー源を、必要に応じて添
加することができる。他の必要な添加物もまた、当業者
により知られる適当な濃度で含有させることができる。
温度、ｐＨ等といった培養条件は、発現のために選択さ
れた宿主細胞についてかつて用いられた条件であり、当
業者には明らかであろう。The mammalian host cells used for producing the mpl ligand according to the present invention can be cultured in various media. Ham F10 (Sigma), minimal essential medium ([M
Commercially available media such as EM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), and Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) are suitable for culturing the host cells. In addition, Ham and Wallace, Me
th.Enz., 58:44 [1979]; Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 [198].
0], U.S. Patent No. 4,767,704;
No. 4927762; or 4560655; W
WO 90/00430; WO 87/00195; U.S. Pat. 30985; or co-pending U.S.A. S. S. N.
07/592107 or 07/592141 (both are 1
Any of the media described in U.S. Pat.
All of these contents are incorporated herein by reference. All of these media can contain hormones and / or other growth factors (eg, insulin, transferrin,
Or epidermal growth factor), salts (eg, sodium chloride,
Calcium, magnesium, and phosphates), buffers (eg, HEPES), nucleosides (eg, adenosine and thymidine), antibiotics (eg, gentamicin ™ drug), trace elements (usually inorganic, whose final concentration is in the micromolar range). (Defined as a compound), and glucose or an equivalent energy source can be added as needed. Other necessary additives may also be included at appropriate concentrations known by those skilled in the art.
Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are those conditions previously used for the host cell selected for expression and will be apparent to those skilled in the art.

【０２７４】本明細書中で言及される宿主細胞は、イン
ビトロ培養中の細胞および宿主動物内にある細胞を包含
する。The host cells referred to herein include cells in in vitro culture and cells that are within a host animal.

【０２７５】Ｆ．遺伝子の増幅／発現の検出 遺伝子の増幅および／または発現は、例えば、本明細書
中に供される配列に基づき、適当に標識されたプローブ
を用いて、常套的サザンブロッティング、ｍＲＮＡの転
写を定量するためのノーザンブロッティング（トマス、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻５２０１−５２０５頁
［１９８０］）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分
析）、またはインサイトゥハイブリダイゼーションによ
って直接試料中で測定することができる。様々な標識、
最も一般的には放射性同位元素、特に³²Ｐが使用でき
る。しかしながら、ポリヌクレオチド中への導入のため
のビオチン修飾されたヌクレオチドの使用といったよう
なその他の技術を利用することもできる。次いでこのビ
オチンは、広範囲の標識、例えば放射性核種、蛍光剤、
酵素等で標識することのできるアビジンまたは抗体への
結合部位として働く。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮ
Ａ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖ま
たはＤＮＡ−蛋白二本鎖を包含する特異的二本鎖を認識
できる抗体を使用することもできる。次いで、抗体を標
識し、二本鎖が表面に結合しているところで検定を実施
し、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本
鎖に結合した抗体の存在が検出できる。F. Detection of Gene Amplification / Expression Gene amplification and / or expression can be determined, for example, by conventional Southern blotting, mRNA transcription using appropriately labeled probes based on the sequences provided herein. Northern blotting (Thomas,
USA, 77, 5201-5205 [1980]), dot blotting (DNA analysis), or in situ hybridization directly in the sample. Various signs,
Most commonly, radioactive isotopes, particularly ³² P, can be used. However, other techniques can be utilized, such as the use of biotin-modified nucleotides for introduction into a polynucleotide. This biotin can then be used for a wide range of labels, such as radionuclides, fluorescent agents,
It functions as a binding site to avidin or an antibody that can be labeled with an enzyme or the like. Alternatively, double-stranded DNA, RN
It is also possible to use an antibody capable of recognizing A duplex, and a specific duplex including a DNA-RNA hybrid duplex or a DNA-protein duplex. The antibody is then labeled and an assay is performed where the duplex is bound to the surface, such that at the time of duplex formation on the surface, the presence of the antibody bound to the duplex can be detected. .

【０２７６】別法として、遺伝子の発現を、組織切片の
免疫組織化学的染色および細胞培養または体液の検定と
いった免疫学的方法により測定して、遺伝子産物の発現
を直接定量することもできる。免疫組織化学的染色技術
では、典型的には脱水および固定により細胞試料を作成
し、その後、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化
抗体と反応させるが、この標識は通常、酵素的標識、蛍
光標識、ルミネセンス標識等のような視覚的に検出でき
るものである。本発明における使用に好適な特に鋭敏な
染色技術は、シュー等、Am.J.Clin.Path.、７５巻７３
４−７３８頁［１９８０］に記載されている。Alternatively, gene expression can be measured directly by immunohistochemical staining of tissue sections and immunological methods such as cell culture or body fluid assays to directly quantify gene product expression. In immunohistochemical staining techniques, a cell sample is typically prepared by dehydration and fixation and then reacted with a labeled antibody specific for the bound gene product, which is typically an enzymatic label, It can be detected visually, such as a fluorescent label or a luminescent label. Particularly sensitive dyeing techniques suitable for use in the present invention are described by Shu et al., Am. J. Clin. Path., 75:73.
Page 4-738 [1980].

【０２７７】試料液の免疫組織化学的染色および／また
は検定に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクロ
ーナルのいずれかであってよく、任意の哺乳動物で作成
することができる。簡便には、この抗体は、下にさらに
記載されるように、天然ｍｐｌリガンドポリペプチドに
対して、または本明細書に供されるＤＮＡ配列に基づく
合成ペプチドに対して作製することができる。Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of a sample solution may be either monoclonal or polyclonal and may be made in any mammal. Conveniently, the antibodies can be raised against natural mpl ligand polypeptides, or against synthetic peptides based on the DNA sequences provided herein, as described further below.

【０２７８】Ｇ．ｍｐｌリガンドポリペプチドの精製 ｍｐｌリガンドは、好ましくは分泌されたポリペプチド
として培地から回収されるが、分泌シグナル無しで直接
発現される場合は、宿主細胞溶菌液から回収することも
できる。G. Purification of mpl ligand polypeptides The mpl ligand is preferably recovered from the medium as a secreted polypeptide, but can also be recovered from host cell lysates if directly expressed without a secretory signal.

【０２７９】ｍｐｌリガンドがヒト起源以外の組換え細
胞で発現される場合、このｍｐｌリガンドは、ヒト起源
の蛋白またはポリペプチドを全く含んでいない。しかし
ながら、ｍｐｌリガンド自体に関して実質上均質な製品
を得るためには、通常、ｍｐｌリガンドを他の組換え細
胞蛋白またはポリペプチドから精製することがやはり必
要である。第一段階として、培地または溶菌液を遠心し
て粒状の細胞破片を除去する。次に、膜および可溶性蛋
白画分を分離する。別法として、市販品を入手し得る蛋
白濃縮フィルター（例えば、アミコンまたはミリポア・
ペリコン限外濾過ユニット）を使用することもできる。
次いで、ｍｐｌリガンドが膜に結合しているかどうかに
応じて、可溶性蛋白画分および培養溶菌液の膜画分から
ｍｐｌリガンドを精製することができる。その後ｍｐｌ
リガンドを、塩析および種々のゲルマトリックスを用い
る交換またはクロマトグラフィー法により、混在する可
溶性蛋白およびポリペプチドから精製する。これらのマ
トリックスは、蛋白精製のために一般的な、アクリルア
ミド、アガロース、デキストラン、セルロースおよびそ
の他を包含する。蛋白精製に好適なクロマトグラフィー
法の例は、免疫親和（例えば、抗ｈｍｐｌリガンドＭａ
ｂ）、レセプター親和（例えば、ｍｐｌ−ＩｇＧまたは
プロテインＡセファロース）、疎水性相互作用クロマト
グラフィー（ＨＩＣ）（例えば、エーテル、ブチル、ま
たはフェニルトヨパール）、レクチンクロマトグラフィ
ー（例えば、ＣｏｎＡ−セファロース、レンズマメレク
チン−セファロース）、サイズ排除（例えば、セファデ
ックスＧ−７５）、陽イオン−および陰イオン−交換カ
ラム（例えば、ＤＥＡＥまたはカルボキシメチル−およ
びスルホプロピル−セルロース）および逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（例えば、二つの
連続したＲＰ−ＨＰＬＣ工程を用いて組み換えヒトＩＬ
−２を精製している、アーダル等、J.Chromatog.、２９
６巻１７１頁［１９８４］を参照されたい）を包含す
る。その他の精製工程は、所望により、エタノール沈澱
化；硫酸アンモニウム沈澱化；クロマトフォーカシン
グ；調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等を包含する。When the mpl ligand is expressed in a recombinant cell of non-human origin, the mpl ligand does not contain any protein or polypeptide of human origin. However, to obtain a substantially homogenous product with respect to the mpl ligand itself, it is usually still necessary to purify the mpl ligand from other recombinant cellular proteins or polypeptides. As a first step, the medium or lysate is centrifuged to remove particulate cell debris. Next, the membrane and the soluble protein fraction are separated. Alternatively, commercially available protein concentration filters (eg, Amicon or Millipore®)
Pellicon ultrafiltration unit) can also be used.
The mpl ligand can then be purified from the soluble protein fraction and the membrane fraction of the culture lysate, depending on whether the mpl ligand is bound to the membrane. Then mpl
The ligand is purified from contaminating soluble proteins and polypeptides by salting out and exchange or chromatographic methods using various gel matrices. These matrices include acrylamide, agarose, dextran, cellulose and others common for protein purification. Examples of suitable chromatography methods for protein purification include immunoaffinity (eg, anti-hmpl ligand Ma).
b), receptor affinity (eg, mpl-IgG or protein A sepharose), hydrophobic interaction chromatography (HIC) (eg, ether, butyl, or phenyltoyopearl), lectin chromatography (eg, ConA-Sepharose, lentil) Lectin-Sepharose), size exclusion (eg, Sephadex G-75), cation- and anion-exchange columns (eg, DEAE or carboxymethyl- and sulfopropyl-cellulose) and reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP- HPLC) (e.g., recombinant human IL using two consecutive RP-HPLC steps).
J. Chromatog., 29, Purifying -2.
6, 171 [1984]). Other purification steps include, if desired, ethanol precipitation; ammonium sulfate precipitation; chromatofocusing; preparative SDS-PAGE and the like.

【０２８０】残基が除去され、挿入され、または置換さ
れたｍｐｌリガンド変異体は、その変異により惹起され
た実質的な性質の変化を考慮に入れて、天然ｍｐｌリガ
ンドと同じ様式で回収される。例えば、別の蛋白または
ポリペプチド、例えば細菌またはウイルス抗原とのｍｐ
ｌリガンド融合物の製造は、精製を促進し；当該抗原に
対する抗体を含む免疫親和カラムを用いて該融合ポリペ
プチドを吸着することができる。ウサギポリクローナル
抗ｍｐｌリガンドカラムのような免疫親和カラムを使用
して、少なくとも１個の残存している免疫エピトープと
ｍｐｌリガンド変異体を結合させることにより、ｍｐｌ
リガンド変異体を吸収することができる。別法として、
ｍｐｌリガンドは、アフイ−ゲル１０（バイオ−ラド、
リッチモンド、ＣＡ）等のような固定された樹脂に（好
ましくは）結合させた精製ｍｐｌ−ＩｇＧを使用する親
和クロマトブラフィーにより、当分野で良く知られる手
段によって精製することができる。フェニルメチルスル
ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼイ
ンヒビターもまた、精製中の蛋白分解的減成を阻害する
のに有用であり、また、偶発的汚染物質の成長を防止す
るため、抗生物質を含有させることができる。当業者に
は、天然ｍｐｌリガンドに好適な精製法は、組換え細胞
培養中での発現時のｍｐｌリガンドまたはその変異体の
性質の変化を説明できる修飾が必要となり得るという事
が理解できるであろう。A variant of an mpl ligand in which residues have been removed, inserted or substituted, is recovered in the same manner as the native mpl ligand, taking into account the substantial property changes caused by the mutation. . For example, mp with another protein or polypeptide, such as a bacterial or viral antigen.
Production of the lligand fusion facilitates purification; the fusion polypeptide can be adsorbed using an immunoaffinity column containing antibodies to the antigen. Using an immunoaffinity column, such as a rabbit polyclonal anti-mpl ligand column, to bind at least one remaining immune epitope to the mpl ligand variant
The ligand variant can be absorbed. Alternatively,
The mpl ligand was purchased from Affi-Gel 10 (Bio-Rad,
Purification can be accomplished by means well known in the art by affinity chromatography using purified mpl-IgG (preferably) bound to an immobilized resin such as Richmond, CA). Protease inhibitors such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) are also useful for inhibiting proteolytic degradation during purification and also contain antibiotics to prevent the growth of accidental contaminants. Can be done. One skilled in the art will appreciate that a suitable purification method for the native mpl ligand may require modifications that can account for changes in the properties of the mpl ligand or a variant thereof during expression in recombinant cell culture. Would.

【０２８１】Ｈ．ｍｐｌリガンドポリペプチドの共有結
合的修飾 ｍｐｌリガンドポリペプチドの共有結合的修飾は本発明
の範囲内に包含される。天然ｍｐｌリガンドおよびｍｐ
ｌリガンドのアミノ酸配列変異体の両者は共有結合的に
修飾することができる。本発明の範囲内に包含される共
有結合的修飾の一つの型は、ｍｐｌリガンドフラグメン
トである。約４０までのアミノ酸残基を有する変異体ｍ
ｐｌリガンドフラグメントは、化学合成または全長のも
しくは変異体のｍｐｌリガンドポリペプチドの酵素的ま
たは化学的開裂によって簡便に製造することができる。
ｍｐｌリガンドもしくはそのフラグメントの共有結合的
修飾の別の型は、ｍｐｌリガンドもしくはそのフラグメ
ントの標的アミノ酸残基を、選ばれた側鎖またはＮもし
くはＣ末端残基と反応できる有機誘導体形成試薬と反応
させることによって、当該分子中に導入される。H. Covalent modification of mpl ligand polypeptide Covalent modifications of mpl ligand polypeptide are included within the scope of the invention. Natural mpl ligand and mp
Both amino acid sequence variants of the ligand can be covalently modified. One type of covalent modification included within the scope of the invention is an mpl ligand fragment. Variant m having up to about 40 amino acid residues
The pl ligand fragment can be conveniently prepared by chemical synthesis or by enzymatic or chemical cleavage of the full-length or mutant mpl ligand polypeptide.
Another type of covalent modification of the mpl ligand or fragment thereof involves reacting the target amino acid residue of the mpl ligand or fragment thereof with an organic derivatizing reagent capable of reacting with a selected side chain or N- or C-terminal residue. Thereby, it is introduced into the molecule.

【０２８２】システイン残基は、最も一般的にはα−ハ
ロアセタート（および対応するアミン）、例えばクロロ
酢酸またはクロロアセトアミドと反応させてカルボキシ
メチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。シ
ステイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α
−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、ク
ロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、
３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピ
リジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２
−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−
７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと
の反応により、誘導体化される。A cysteine residue is most commonly reacted with an α-haloacetate (and the corresponding amine), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to give a carboxymethyl or carboxamidomethyl derivative. The cysteine residue is also bromotrifluoroacetone, α
-Bromo-β- (5-imidozoyl) propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimide,
3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl 2-pyridyl disulfide, p-chloromercury benzoate,
-Chloromercury-4-nitrophenol or chloro-
It is derivatized by reaction with 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.

【０２８３】ヒスチジン残基はｐＨ５．５−７．０でジ
エチルピロカルボナートとの反応により誘導体化される
が、これは、この試薬がヒスチジン側鎖に対し相対的に
特異的であるためである。ｐ−ブロモフェナシルブロミ
ドもまた有用であり、この反応は好ましくは０．１Ｍカ
コジル酸ナトリウム中ｐＨ６．０で実施する。Histidine residues are derivatized by reaction with diethylpyrocarbonate at pH 5.5-7.0 because this reagent is relatively specific for the histidine side chain. . Also useful is p-bromophenacyl bromide, the reaction preferably being carried out at pH 6.0 in 0.1 M sodium cacodylate.

【０２８４】リジンおよびアミノ末端残基は無水琥珀酸
またはその他のカルボン酸無水物と反応する。これらの
試薬を用いた誘導体形成は、リジン残基の電荷を逆転さ
せる効果を有する。−アミノ含有残基を誘導体化するた
めのその他の好適な試薬は、イミドエステル類、例えば
メチルピコリンイミダート；燐酸ピリドキサル；ピリド
キサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスル
ホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオ
ン；およびグリオキシラートを用いたトランスアミナー
ゼにより触媒される反応を包含する。The lysine and amino terminal residues are reacted with succinic or other carboxylic anhydrides. Derivative formation using these reagents has the effect of reversing the charge on lysine residues. -Other suitable reagents for derivatizing amino-containing residues are imide esters, such as methylpicolinimidate; pyridoxal phosphate; pyridoxal; chloroborohydride; trinitrobenzenesulfonic acid; O-methylisourea; -Reactions catalyzed by transaminases with pentanedione; and glyoxylate.

【０２８５】アルギニン残基は１または数種の常套的試
薬との反応により修飾され、それらの中にはフェニルグ
リオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘ
キサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン
残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫ_aのた
め、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、こ
れらの試薬は、アルギニンのε−アミノ基と同時にリジ
ンの基とも反応するかも知れない。Arginine residues are modified by reaction with one or several conventional reagents, among which are phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione, and ninhydrin. Derivatization of arginine residues, because of the high of the guanidine functional group pK _a, it is necessary that the reaction be performed in alkaline conditions. In addition, these reagents may react with the lysine group as well as the arginine ε-amino group.

【０２８６】チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジア
ゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によ
るチロシン残基へのスペクトル標識の導入に特段の興味
を伴って行われる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミ
ジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞ
れＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体が形
成される。チロシン残基は、ラジオイムノアッセイに使
用するための標識化蛋白を製造するために¹²⁵Ｉまたは
¹³¹Ｉを用いてヨウ素化され、上記のクロラミンＴ法が
適当である。The specific modification of tyrosine residues takes place with particular interest in introducing spectral labels into tyrosine residues by reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane. Most commonly, N-acetylimidizole and tetranitromethane are used to form O-acetyltyrosyl species and 3-nitro derivatives, respectively. Tyrosine residues, to produce a labeled proteins for use in radioimmunoassay ¹²⁵ I or
The chloramine T method described above, which is iodinated using ¹³¹ I, is suitable.

【０２８７】カルボキシ側鎖（アスパルチルまたはグル
タミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）
［式中、ＲおよびＲ'は異なるアルキル基である］、例
えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４
−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４
−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミ
ドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アス
パラギン酸およびグルタミン酸残基はアンモニウムイオ
ンとの反応により、アスパラギンおよびグルタミン残基
に変換される。The carboxy side chain (aspartyl or glutamyl) is a carbodiimide (RN = C = NR ′)
Wherein R and R ′ are different alkyl groups, for example, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl-4
-Ethyl) carbodiimide or 1-ethyl-3- (4
-Azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide for selective modification. Further, aspartic acid and glutamic acid residues are converted to asparagine and glutamine residues by reaction with ammonium ions.

【０２８８】二価の試薬による誘導体形成は、抗ｍｐｌ
リガンド抗体の精製のための方法で使用するための、水
不溶性支持体マトリックスまたは表面へのｍｐｌリガン
ドの架橋にとって有用であり、逆もまた同様である。一
般的に用いられる架橋剤は、例えば１,１−ビス（ジア
ゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒ
ド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例え
ば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３,３'−ジチ
オビス（スクシンイミジルプロピオナート）のようなジ
スクシンイミジルエステル類を包含するホモ二価イミド
エステル類、およびビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オ
クタンのような二価マレイミド類を包含する。メチル−
３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダ
ートのような誘導体形成試薬は、光の存在下で架橋を形
成することのできる光活性化中間体を生成する。別法と
して、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶
性マトリックスおよび米国特許第３９６９２８７号；３
６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２
号；４２２９５３７号；および４３３０４４０号に記載
の反応性基質を、蛋白の固定に使用する。Derivative formation with divalent reagents is achieved by anti-mpl
Useful for crosslinking mpl ligand to a water-insoluble support matrix or surface for use in a method for purification of ligand antibodies, and vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example, esters with 4-azidosalicylic acid, 3,3′- Includes homodivalent imide esters, including disuccinimidyl esters such as dithiobis (succinimidyl propionate), and divalent maleimides, such as bis-N-maleimide-1,8-octane. . Methyl-
Derivative-forming reagents such as 3-[(p-azidophenyl) dithio] propioimidate produce photoactivated intermediates that can form crosslinks in the presence of light. Alternatively, a reactive water-insoluble matrix such as cyanogen bromide activated carbohydrate and US Pat. No. 3,969,287;
691016; 4195128; 4247642
No. 4229537; and 4330440 are used for the immobilization of proteins.

【０２８９】グルタミンおよびアスパラギン残基はしば
しば、各々対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸
残基に脱アミド化される。これらの残基は中性または塩
基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミ
ド化型は本発明の範囲内にある。Glutamine and asparagine residues are often deamidated to the corresponding glutamic and aspartic acid residues, respectively. These residues are deamidated under neutral or basic conditions. Deamidated forms of these residues are within the scope of the invention.

【０２９０】その他の修飾には、プロリンおよびリジン
のヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒド
ロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチ
ジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．クレイト
ン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュ
ラー・プロパティーズ、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・
Ｃｏ．、サンフランシスコ、７９−８６頁［１９８
３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カ
ルボキシ基のアミド化が包含される。Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxy group of serine or threonine residues, methylation of the α-amino group of lysine, arginine, and histidine side chains (T.E. Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman and
Co. , San Francisco, pp. 79-86 [198
3]), acetylation of the N-terminal amine, and amidation of the C-terminal carboxy group.

【０２９１】本発明の範囲に包含されるｍｐｌリガンド
ポリペプチドのもう一つの型の共有結合的修飾は、該ポ
リペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。
変更とは、天然ｍｐｌリガンド中に見いだされる１また
はそれ以上の炭水化物部分を除去し、そして／または天
然ｍｐｌリガンドに存在しない１またはそれ以上のグリ
コシル化部位を付加することを意味する。Another type of covalent modification of the mpl ligand polypeptide included within the scope of this invention involves altering the native glycosylation pattern of the polypeptide.
Altering means removing one or more carbohydrate moieties found in the natural mpl ligand and / or adding one or more glycosylation sites that are not present in the natural mpl ligand.

【０２９２】ポリペプチドのグリコシル化は典型的には
Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、ア
スパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。
トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアス
パラギン−Ｘ−スレオニン［ここでＸは、プロリン以外
の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭
水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。した
がって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペ
プチド中に存在すると、可能性あるグリコシル化部位が
作り出される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの
うちの一つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセ
リンまたはスレオニンに結合することを指すが、５−ヒ
ドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使われ
ることもある。Glycosylation of polypeptides is typically either N-linked or O-linked. N-linked refers to the attachment of the carbohydrate moiety to the side chain of an asparagine residue.
The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are the recognition sequences for enzymatic attachment of the carbohydrate moiety to the asparagine side chain. Thus, the presence of any of these tripeptide sequences in a polypeptide creates a potential glycosylation site. O-linked glycosylation refers to the binding of one of the sugars N-acetylgalactosamine, galactose, or xylose to a hydroxy amino acid, most commonly serine or threonine, but not to 5-hydroxyproline or 5-hydroxyproline. Lysine is sometimes used.

【０２９３】ｍｐｌリガンドポリペプチドへのグリコシ
ル化部位の付加は、アミノ酸配列が、上記トリペプチド
配列の１またはそれ以上を含むよう、該アミノ酸配列を
変化させることにより、簡便に達成される（Ｎ結合グリ
コシル化部位の場合）。この変化は、天然ｍｐｌリガン
ド配列への１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン
残基の付加、またはそれらによる置換によっても行うこ
とができる（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。容易に
するためには、ｍｐｌリガンドアミノ酸配列は、好まし
くはＤＮＤレベルでの変化によって、特に、ｍｐｌリガ
ンドポリペプチドをコードしているＤＮＡを、所望アミ
ノ酸に翻訳されるようなコドンが生成するように、前も
って選択された塩基の位置で突然変異させることによっ
て変化させる。このＤＮＡ突然変異は、「ｍｐｌリガン
ドのアミノ酸配列変異体」という表題の下に上で記載さ
れた方法を用いて行うことができる。Addition of glycosylation sites to the mpl ligand polypeptide is conveniently achieved by altering the amino acid sequence so that it contains one or more of the above tripeptide sequences (N-linked For glycosylation sites). This change can also be made by the addition or substitution of one or more serine or threonine residues to the native mpl ligand sequence (in the case of O-linked glycosylation sites). To facilitate, the mpl ligand amino acid sequence is preferably altered such that changes at the DND level produce codons that, in particular, translate the DNA encoding the mpl ligand polypeptide into the desired amino acid. , By mutating at a preselected base position. This DNA mutation can be made using the methods described above under the heading "Amplic Acid Amino Acid Sequence Variants."

【０２９４】ｍｐｌリガンド上の炭水化物部分の数を増
す、もう一つの手段は、該ポリペプチドへのグリコシド
の化学的または酵素的結合によるものである。これらの
方法は、ＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシ
ル化能を有する宿主細胞中で該ポリペプチドを産生させ
る必要が無いという点で有利である。使用される結合様
式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジ
ン、（ｂ）遊離カルボキシ基、（ｃ）遊離スルフヒドリ
ル基、例えばシステインの遊離スルフヒドリル基、
（ｄ）遊離ヒドロキシ基、例えばセリン、スレオニン、
またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシ基、（ｅ）
芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、また
はトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミ
ンのアミド基、に結合することができる。これらの方法
は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３
０、およびアプリンおよびリストン、CRC Crit.Rev.Bio
chem.、２５９−３０６頁［１９８１］に記載されてい
る。Another means of increasing the number of carbohydrate moieties on the mpl ligand is by chemical or enzymatic attachment of glycosides to the polypeptide. These methods are advantageous in that the polypeptide need not be produced in a host cell that has glycosylation capabilities for N- or O-linked glycosylation. Depending on the mode of attachment used, the sugar can be (a) arginine and histidine, (b) a free carboxy group, (c) a free sulfhydryl group, such as the free sulfhydryl group of cysteine,
(D) free hydroxy groups such as serine, threonine,
Or a free hydroxy group of hydroxyproline, (e)
It can be attached to an aromatic residue such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan, or (f) an amide group of glutamine. These methods are described in WO 87/0533 published Sep. 11, 1987.
0, and April and Liston, CRC Crit. Rev. Bio
chem., pp. 259-306 [1981].

【０２９５】ｍｐｌリガンドポリペプチド上に存在する
炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成でき
る。化学的脱グリコシル化は、該ポリペプチドを、化合
物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物
に暴露させる必要がある。この処理は、該ポリペプチド
を無傷のまま残しつつ、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサ
ミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆どま
たは全ての糖の開裂をもたらす。化学的脱グリコシル化
は、ハキムディン等、Arch.Biochem.Biophys.、２５９
巻５２頁［１９８７］およびエッジ等、Anal.Bioche
m.、１１８巻１３１頁［１９８１］に記載されている。
ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、ソタク
ラ等、Meth.Enzymol.，１３８巻３５０頁［１９８７］
に記載のような様々なエンドおよびエキソグリコシダー
ゼの使用によって達成することができる。[0295] Removal of the carbohydrate moiety present on the mpl ligand polypeptide can be accomplished chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation requires exposing the polypeptide to the compound trifluoromethanesulfonic acid, or an equivalent compound. This treatment results in the cleavage of most or all sugars other than the linked sugar (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine), while leaving the polypeptide intact. Chemical deglycosylation is described by Hakimudin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259.
Vol. 52 [1987] and Edge et al., Anal. Bioche.
m., 118, 131 [1981].
Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on polypeptides is described by Sotakura et al., Meth. Enzymol., 138, 350 [1987].
Can be achieved by the use of various endo and exoglycosidases as described in

【０２９６】可能性あるグリコシル化部位でのグリコシ
ル化は、ダスキン等、J.Biol.Chem.、２５７巻３１０５
頁［１９８２］に記載されるように化合物ツニカマイシ
ンの使用によって防止することができる。ツニカマイシ
ンは、蛋白−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。Glycosylation at potential glycosylation sites is described in Duskin et al., J. Biol. Chem., 257: 3105.
It can be prevented by the use of the compound tunicamycin as described on page [1982]. Tunicamycin blocks the formation of protein-N-glycosidic bonds.

【０２９７】ｍｐｌリガンドの共有結合的修飾のもう一
つの型は、米国特許第４６４０８３５号；４４９６６８
９号；４３０１１４４号；４６７０４１７号；４７９１
１９２号または４１７９３３７号に開示される方法で、
ｍｐｌリガンドポリペプチドを、様々な非蛋白性ポリマ
ー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレング
リコール、またはポリオキシアルキレン類のうちの一つ
に結合させることを含む。前記のポリマーと共有結合し
たｍｐｌリガンドポリペプチドを、本明細書中、ペギレ
イティドｍｐｌリガンドポリペプチドと称する。Another type of covalent modification of the mpl ligand is described in US Pat. No. 4,640,835;
No. 9; 4301144; 4670417; 4791
192 or 4179337,
It involves attaching the mpl ligand polypeptide to one of a variety of non-proteinaceous polymers, such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes. The mpl ligand polypeptide covalently linked to the polymer is referred to herein as a pegylated mpl ligand polypeptide.

【０２９８】ｍｐｌへの結合および上に定義された免疫
学的および／または生物学的活性の所有について最適な
変異体を選択するため、回収されたｍｐｌリガンド変異
体の何らかのスクリーニングが必要であることは理解さ
れるであろう。組換え細胞培養中または血漿中での安定
性（例えば、蛋白分解的開裂に対する）、ｍｐｌ成員に
対する高親和性、酸化的安定性、高収量で分泌される能
力等についてスクリーニングすることができる。例え
ば、与えられた抗体に対する親和性といったようなｍｐ
ｌリガンドポリペプチドの免疫学的性格の変化は、競合
型イムノアッセイにより測定される。酸化還元または熱
安定性、疎水性、または蛋白分解的減成の受け易さとい
ったようなその他の可能性ある蛋白またはポリペプチド
の性質の修飾は、当分野で良く知られる方法によって検
定される。The need for some screening of recovered mpl ligand variants to select the best variant for binding to mpl and possessing the immunological and / or biological activity as defined above. Will be understood. One can screen for stability in recombinant cell culture or plasma (eg, for proteolytic cleavage), high affinity for mpl members, oxidative stability, ability to be secreted in high yield, and the like. For example, mp such as affinity for a given antibody
Changes in the immunological character of the lligand polypeptide are measured by a competitive immunoassay. Modifications of the properties of the protein or polypeptide, such as redox or thermostability, hydrophobicity, or susceptibility to proteolytic degradation, are assayed by methods well known in the art.

【０２９９】１７．ｍｐｌリガンドに対する抗体製造の
ための一般的方法 抗体の製造 （ｉ）ポリクローナル抗体 ｍｐｌリガンドポリペプチドまたはフラグメントに対す
るポリクローナル抗体は一般に、ｍｐｌリガンドおよび
アジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉ
ｐ）注射することにより、動物において作製される。ｍ
ｐｌリガンドまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメン
トを、二価または誘導体形成試薬、例えばマレイミドベ
ンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残
基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒ
ド、無水琥珀酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ
［式中、ＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である］を用
いて、免疫される種において免疫原性である蛋白、例え
ばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログ
ロブリン、または大豆トリプシンインヒビターとコンジ
ュゲートさせることが有用であるかも知れない。[0299] 17. General Methods for Production of Antibodies to mpl Ligands Production of Antibodies (i) Polyclonal Antibodies Polyclonal antibodies to mpl ligand polypeptides or fragments are generally prepared by subcutaneously (sc) or intraperitoneally (i) multiple times with mpl ligand and an adjuvant.
p) Made in animals by injection. m
The pl ligand or fragment containing the target amino acid sequence can be converted to a divalent or derivatizing reagent such as maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester (conjugation via cysteine residues), N-hydroxysuccinimide (via lysine residues), glutaraldehyde, anhydrous Succinic acid, SOCl ₂ , or R ¹ N = C = NR
Wherein R and R ¹ are different alkyl groups using a conjugate with a protein that is immunogenic in the species to be immunized, such as keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor. It may be useful to let them.

【０３００】動物は、ペプチドまたはコンジュゲート１
ｍｇまたは１μｇ（それぞれウサギまたはマウスの場
合）を完全フロイントアジュバント３容量と合し、この
溶液を複数部位に皮内注射することによって、ｍｐｌリ
ガンドポリペプチドもしくはフラグメント、免疫原性コ
ンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１ヶ月
後、この動物を、完全フロイントアジュバントに入れた
初回量の１／５ないし１／１０のペプチドまたはコンジ
ュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、
追加免疫する。７ないし１４日後、動物を採血し、ｍｐ
ｌリガンド抗体価について血清を検定する。動物は、力
価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、
動物は、同じｍｐｌリガンドのコンジュゲートで、但し
異なった蛋白にコンジュゲートさせた、そして／または
異なった架橋剤を介してコンジュゲートさせたコンジュ
ゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた、蛋白融
合として組換え細胞培養中で製造することができる。さ
らに、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強
のために使用される。The animals are treated with peptide or conjugate 1
mg or 1 μg (in the case of rabbits or mice, respectively) with 3 volumes of complete Freund's adjuvant and injecting the solution intradermally at multiple sites to provide mpl ligand polypeptides or fragments, immunogenic conjugates or derivatives. Immunize. One month later, the animals are injected subcutaneously at multiple sites with 1/5 to 1/10 the original amount of peptide or conjugate in complete Freund's adjuvant.
Booster immunization. After 7 to 14 days, the animals are bled and mp
Serum is assayed for l ligand antibody titer. Animals are boosted until the titer reaches a plateau. Preferably,
Animals are boosted with a conjugate of the same mpl ligand, but conjugated to a different protein and / or conjugated via a different cross-linking agent. The conjugate can also be produced in recombinant cell culture as a protein fusion. In addition, aggregating agents such as alum are used to enhance the immune response.

【０３０１】（ii）モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は、実質上均質な抗体の集団、即
ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在するか
も知れない天然に起こる可能性のある突然変異を除いて
同一であるような集団から取得される。したがって、修
飾語「モノクローナル」とは、別々の抗体の混合物では
ないという、抗体の性格を示している。(Ii) Monoclonal Antibodies Monoclonal antibodies are substantially homogenous populations of antibodies, ie, the individual antibodies that make up the population are free of naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Obtained from groups that are identical. Thus, the modifier "monoclonal" indicates the character of the antibody as not being a mixture of discrete antibodies.

【０３０２】例えば、本発明に係るｍｐｌリガンドモノ
クローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Na
ture、２５６巻４９５頁［１９７５］により最初に記載
されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、または組換
えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号［キャビリー
等］）によって作製することができる。For example, the mpl ligand monoclonal antibodies according to the present invention are described in Kohler and Milstein, Na
, 256, 495 [1975], or can be made by recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,567 [Cabilly et al.]).

【０３０３】ハイブリドーマ法においては、マウスまた
はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記の
ように免疫し、免疫に用いられた蛋白と特異的に結合す
る抗体を産生する、または産生することのできるリンパ
球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免
疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレン
グリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と
融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（ゴディン
グ、モノクローナル・アンティボディーズ：プリンシプ
ルズ・アンド・プラクティス、５９−１０３頁［アカデ
ミック・プレス、１９８６］）。In the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal, for example, a hamster, is immunized as described above, and an antibody that specifically binds to the protein used for the immunization is produced or produced. Deriving lymphocytes. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. The lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusing agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103). [Academic Press, 1986]).

【０３０４】このようにして製造されたハイブリドーマ
細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生
存を阻害する１またはそれ以上の物質を好ましくは含有
する適当な培養基に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨
髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を
欠失するならば、ハイブリドーマのための培養基は、典
型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質で
あるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン
を含有するであろう（ＨＡＴ培地）。[0304] The hybridoma cells thus produced are plated and grown on a suitable culture medium, preferably containing one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parental myeloma cells. For example, if the parental myeloma cells lack the enzyme hypoxanzing anidine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the culture medium for the hybridoma is typically a substance that prevents the growth of HGPRT-deficient cells. It will contain certain hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT medium).

【０３０５】好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、
選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの
発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して
感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨
髄腫セルラインは、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソー
ク・インスティテュート・セル・ディストリビューショ
ン・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡ
より入手し得るＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウ
ス腫瘍、ならびに、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡよ
り入手し得るＳＰ−２細胞から誘導されるものである。
ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫セルライン
もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載され
ている（コズボア、J.Immunol.、１３３巻３００１頁
［１９８４］；ブロデュア等、モノクローナル・アンテ
ィボディー・プロダクション・テクニークス・アンド・
アプリケーションズ、５１−６３頁、マーセル・デッカ
ー、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）。Preferred myeloma cells fuse efficiently,
Cells that support stable high level expression of antibody by the selected antibody-producing cells and are sensitive to a medium such as HAT medium. Among these, preferred myeloma cell lines are mouse myeloma lines, such as the Soak Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA
MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors, available from American Type Cultures Inc.
Derived from SP-2 cells available from the Collection, Rockville, Maryland, USA.
Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies (Cosboa, J. Immunol. 133: 3001 [1984]; monoclonal antibody production, Brodure et al.・ Technics and
Applications, pages 51-63, Marcel Decker, Inc. New York, 1987).

【０３０６】ハイブリドーマ細胞が生育している培養基
を、ｍｐｌリガンドに対するモノクローナル抗体の産生
について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞に
より産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免
疫沈降またはインビトロ結合検定、例えばラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬ
ＩＳＡ）によって測定する。The culture medium in which the hybridoma cells are growing is assayed for the production of monoclonal antibodies to mpl ligand. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is determined by an immunoprecipitation or in vitro binding assay, such as a radioimmunoassay (RIA) or an enzyme-linked immunosorbent assay (EL).
ISA).

【０３０７】モノクローナル抗体の結合親和性は、例え
ば、マンソンおよびポラード、Anal.Biochem.、１０７
巻２２０頁［１９８０］のスキャッチャード分析により
測定することができる。The binding affinity of the monoclonal antibody can be determined, for example, by the method of Manson and Pollard, Anal. Biochem., 107
Vol. 220, p. 1980, by Scatchard analysis.

【０３０８】ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和
性、および／または活性の抗体を産生することが確定さ
れた後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニ
ングし、標準法により増殖させることができる（ゴディ
ング、上記）。この目的にとって好適な培養基は、例え
ば、ダルベッコの改良イーグル培地またはＲＰＭＩ１６
４０培地を包含する。加えて、このハイブリドーマ細胞
は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させ
ることができる。After it has been determined that the hybridoma cells produce antibodies of the desired specificity, affinity, and / or activity, the clones can be subcloned by limiting dilution and expanded by standard techniques (Goding). ,the above). Suitable culture media for this purpose are, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium or RPMI16
40 media. In addition, the hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals.

【０３０９】サブクローンにより分泌されたモノクロー
ナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、
透析、または親和クロマトグラフィーのような常套的免
疫グロブリン精製法により、培地、腹水、または血清か
ら好適に分離される。The monoclonal antibody secreted by the subclone can be obtained by, for example, protein A-sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis,
It is conveniently separated from the medium, ascites, or serum by conventional immunoglobulin purification methods such as dialysis or affinity chromatography.

【０３１０】本発明に係るモノクローナル抗体をコード
しているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体
の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結
合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによ
り）容易に分離および配列決定される。本発明に係るハ
イブリドーマ細胞は、係るＤＮＡの好ましい供給源とし
て働く。分離されたならば、このＤＮＡは発現ベクター
中に入れ、次にこれを、この状況以外では免疫グロブリ
ン蛋白を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような
宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞にお
けるモノクローナル抗体の合成を獲得することができ
る。このＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖不
変ドメインのコード化配列を、ホモローガスなマウス配
列の代わりに置換することにより（キャビリー等、上
記；モリソン等、Proc.Nat.Acad.Sci.、８１巻６８５１
頁［１９８４］）、または、免疫グロブリンコード化配
列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の一
部または全てを共有結合させることにより、修飾するこ
とができる。The DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be prepared by a conventional method (for example, using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of a mouse antibody). Easily separated and sequenced. The hybridoma cells according to the present invention serve as a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA is placed in an expression vector, which is then transformed into a host, such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells, that do not otherwise produce immunoglobulin proteins. It can be transfected into cells to obtain monoclonal antibody synthesis in recombinant host cells. This DNA can also be obtained, for example, by substituting the coding sequences for the human heavy and light chain constant domains for homologous mouse sequences (Cavilie et al., Supra; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 81, 6851
(1984)), or by covalently attaching some or all of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide to the immunoglobulin coding sequence.

【０３１１】典型的には、このような非免疫グロブリン
ポリペプチドは、本発明に係る抗体の不変ドメインを置
換し、または本発明に係る抗体の１個の抗原結合部位の
可変ドメインを置換して、ｍｐｌリガンドに対する特異
性を有する１個の抗原結合部位、および異なる抗原に対
する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメ
ラ二価抗体を作り出す。Typically, such non-immunoglobulin polypeptides replace the constant domain of an antibody of the invention, or replace the variable domain of one of the antigen binding sites of an antibody of the invention. , Creating a chimeric bivalent antibody comprising one antigen binding site with specificity for the mpl ligand and another antigen binding site with specificity for a different antigen.

【０３１２】キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤
を用いる方法を包含する、合成蛋白化学において既知の
方法を用いてインビトロで製造することもできる。例え
ば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、また
はチオエステル結合を形成することにより、組み立てる
ことができる。この目的のための好適な試薬は、イミノ
チオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダ
ートを包含する。[0312] Chimeric or hybrid antibodies can also be produced in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents. For example, immunotoxins can be assembled using a disulfide exchange reaction or by forming a thioester bond. Suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate.

【０３１３】診断への適用のため、本発明に係る抗体
は、典型的には検出し得る原子団で標識されるであろ
う。検出し得る原子団は、検出し得るシグナルを直接的
または間接的に生成することのできる任意のものとする
ことができる。例えば、検出し得る原子団は、³Ｈ、¹⁴
Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、または¹²⁵Ｉのような放射性同位元
素、蛍光または化学ルミネセンス化合物、例えばフルオ
レセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシ
フェリン；放射性同位元素標識、例えば¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、
¹⁴Ｃ、または³Ｈ、または酵素、例えばアルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペル
オキシダーゼであってよい。For diagnostic applications, the antibodies according to the invention will typically be labeled with a detectable moiety. The detectable moiety can be any that can directly or indirectly generate a detectable signal. For example, the detectable groups are ³ H, ¹⁴
Radioisotopes such as C, ³² P, ³⁵ S, or ¹²⁵ I, fluorescent or chemiluminescent compounds, such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine, or luciferin; radioisotope labels, such as ¹²⁵ I, ³² P,
It may be ¹⁴ C, or ³ H, or an enzyme, such as alkaline phosphatase, β-galactosidase or horseradish peroxidase.

【０３１４】ハンター等、Nature、１４４巻９４５頁
［１９６２］；デイヴィッド等、Biochemistry、１３巻
１０１４頁［１９７４］；ペイン等、J.Immunol.Met
h.、４０巻２１９頁［１９８１］；およびニグレン、J.
Histochem.and Cytochem.、３０巻４０７頁［１９８
２］に記載の方法を包含する、検出し得る原子団と抗体
を個別にコンジュゲートするための当分野で知られる任
意の方法を使用することができる。Hunter et al., Nature, 144: 945 [1962]; David et al., Biochemistry, 13: 1014 [1974]; Paine et al., J. Immunol. Met.
h., 40, 219 [1981]; and Nigren, J. et al.
Histochem. And Cytochem., Vol. 30, p. 407 [198
Any method known in the art for individually conjugating a detectable group and an antibody, including the method described in 2], can be used.

【０３１５】本発明に係る抗体は、競合的結合検定、直
接および間接サンドイッチ検定、および免疫沈降検定と
いったような任意の既知の検定法に使用することができ
る。ゾラ、モノクローナル・アンティボディーズ：ア・
マニュアル・オブ・テクニークス、１４７−１５８頁
（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ．、１９８７）。The antibodies of the present invention can be used in any known assays, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays. Zora, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Technics, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

【０３１６】競合的結合検定は、標識された標準（これ
はｍｐｌリガンドまたはその免疫学的に活性な部分であ
ってよい）が限られた量の抗体との結合について被験試
料検体（ｍｐｌリガンド）と競合する能力に依るもので
ある。被験試料中のｍｐｌリガンドの量は、抗体と結合
するようになる標準の量と逆比例する。結合するように
なる標準の量の測定を容易にするため、抗体は一般に競
合の前または後で不溶化し、その結果抗体に結合する標
準および検体が、未結合のままである標準および検体か
ら簡便に分離され得るようにする。A competitive binding assay is a test in which a labeled standard (which may be an mpl ligand or an immunologically active portion thereof) is tested for the binding of a limited amount of antibody to a test sample (mpl ligand). It depends on your ability to compete. The amount of mpl ligand in the test sample is inversely proportional to the amount of standard that becomes bound to the antibody. Antibodies are generally insolubilized before or after competition to facilitate determination of the amount of standard that becomes bound, so that standards and analytes that bind to the antibody are easily separated from standards and analytes that remain unbound. To be separated.

【０３１７】サンドイッチ検定は二つの抗体の使用を含
み、各々が、検出すべき蛋白（ｍｐｌリガンド）の異な
る免疫原性部分またはエピトープと結合することができ
る。サンドイッチ検定においては、被験試料検体は、固
体支持体上に固定された第一の抗体と結合し、その後第
二の抗体が検体と結合し、こうして不溶性三部複合体が
形成される。デイヴィッドおよびグリーン、米国特許第
４３７６１１０号。第二の抗体は、自身検出し得る原子
団で標識されていてよく（直接サンドイッチ検定）、ま
たは検出し得る原子団で標識された抗免疫グロブリン抗
体を用いて測定することもできる（間接サンドイッチ検
定）。例えば、サンドイッチ検定の一つの型はＥＬＩＳ
Ａ検定であり、この場合検出し得る原子団は酵素（例え
ば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）である。A sandwich assay involves the use of two antibodies, each of which can bind to a different immunogenic portion or epitope of the protein to be detected (mpl ligand). In a sandwich assay, a test sample analyte binds to a first antibody immobilized on a solid support, after which a second antibody binds to the analyte, thus forming an insoluble three-part complex. David and Green, U.S. Pat. No. 4,376,110. The second antibody may be labeled with a self-detectable group (direct sandwich assay) or may be measured using an anti-immunoglobulin antibody labeled with a detectable group (indirect sandwich assay). ). For example, one type of sandwich assay is an ELISA
The A assay, where the detectable group is an enzyme (eg, horseradish peroxidase).

【０３１８】（iii）ヒト化およびヒト抗体 非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で良く知られてい
る。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入
された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これ
らの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ば
れ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られ
ている。ヒト化は、本質的にはウィンターおよび共同研
究者の方法（ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２−
５２５頁［１９８６］；リーチマン等、Nature、３３２
巻３２３−３２７頁［１９８８］；ベルホーエン等、Sc
ience、２３９巻１５３４−１５３６頁［１９８８］）
に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の
対応配列を置換することにより、実施することができ
る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷の
ヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来
の対応配列によって置換されている、キメラ抗体である
（キャビリー等、上記）。実際、ヒト化抗体は、典型的
には、幾つかのＣＤＲ残基およびことによると幾つかの
ＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって
置換されているヒト抗体である。(Iii) Humanization and Human Antibodies Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced from a non-human source. These non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are typically taken from an "import" variable domain. Humanization is essentially the method of Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321 522-522).
525 [1986]; Leachman et al., Nature, 332.
323-327 [1988]; Belhouen et al., Sc.
ience, 239, 1534-1536 [1988])
By replacing the corresponding sequence of a human antibody with a rodent CDR or CDR sequence according to Thus, such "humanized" antibodies are chimeric antibodies in which substantially less than an intact human variable domain has been substituted by the corresponding sequence from a non-human species (Cavily et al., Supra). In fact, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues have been replaced by residues from analogous sites in rodent antibodies. .

【０３１９】ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖および
重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下さ
せるために極めて重要である。いわゆる「ベストフィッ
ト」法に従うと、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既
知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してス
クリーニングする。次いで、その齧歯類の配列に最も近
いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク
（ＦＲ）として受け入れる（シムズ等、J.Immunol.、１
５１巻２２９６頁［１９９３］；チョシアおよびレス
ク、J.Mol.Biol.、１９６巻９０１頁［１９８７］）。
もう一つの方法は、軽鎖および重鎖の特定のサブグルー
プにある、全てのヒト抗体の共通配列から誘導される特
定のフレームワークを使用するものである。同じフレー
ムワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することが
できる（カーター等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９巻
４２８５頁［１９９２］；プレスタ等、J.Immunol.、１
５１巻２６２３頁［１９９３］）。The choice of human variable domains, both light and heavy, to be used in making the humanized antibodies is very important to reduce antigenicity. According to the so-called "best fit" method, the sequence of the variable domain of a rodent antibody is screened against the entire library of known human variable domain sequences. The human sequence closest to the rodent sequence is then accepted as the human framework (FR) for a humanized antibody (Sims et al., J. Immunol., 1
51, 2296 [1993]; Chosia and Resque, J. Mol. Biol., 196, 901 [1987]).
Another method uses a specific framework derived from the consensus sequence of all human antibodies in specific subgroups of light and heavy chains. The same framework can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol., 1
51, 2623 [1993]).

【０３２０】さらに、抗体は、抗原に対する高親和性お
よびその他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト
化することが重要である。この目的を達成するため、好
ましい態様によれば、親配列および様々な概念的ヒト化
生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて
分析する工程によって、ヒト化抗体を製造する。三次元
免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良
く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可
能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコン
ピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調
べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能におけ
る当該残基の可能な役割の分析、即ち、候補免疫グロブ
リンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の
分析、が可能となる。このようにして共通および移入配
列からのＦＲ残基を選択しそして、結びつけることがで
き、その結果、所望の抗体の性格、例えば標的抗原に対
する親和性の増加が達成される。一般に、ＣＤＲ残基
は、直接且つ最も実質的に抗原結合への影響に関与す
る。さらなる詳細については、１９９１年６月１４日出
願の出願番号第０７／７１５２７２号の一部継続出願で
ある１９９２年８月２１日出願の米国出願第０７／９３
４３７３号を参照されたい。[0320] It is further important that antibodies be humanized with retention of high affinity for the antigen and other desirable biological properties. To this end, according to a preferred embodiment, a humanized antibody is produced by analyzing the parent sequence and various conceptual humanized products using a three-dimensional model of the parent and humanized sequence. Three-dimensional immunoglobulin models are generally available and are well known to those skilled in the art. Computer programs are available that illustrate and display the possible three-dimensional conformational structure of the selected candidate immunoglobulin sequence. Examination of these representations allows analysis of the possible role of the residue in the function of the candidate immunoglobulin sequence, i.e., analysis of residues that affect the ability of the candidate immunoglobulin to bind its antigen. . In this way, FR residues from the consensus and import sequences can be selected and linked, resulting in the desired antibody character, eg, increased affinity for the target antigen. In general, the CDR residues are directly and most substantially involved in influencing antigen binding. For further details, see US application Ser. No. 07/93, filed Aug. 21, 1992, which is a continuation-in-part of application Ser. No. 07 / 715,272, filed Jun. 14, 1991.
See No. 4373.

【０３２１】別法として、免疫時に内因性免疫グロブリ
ンの産生無しにヒト抗体の全レパートリーを産生するこ
とのできる、形質転換動物（例えば、マウス）を作るこ
とが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突
然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_H）遺伝
子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもた
らすということが記載されている。このような生殖系列
突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝
子列の転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をも
たらすであろう。例えば、ジャコボヴィッツ等、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA、９０巻２５５１−２５５頁［１９９
３］；ジャコボヴィッツ等、Nature、３６２巻２５５−
２５８頁［１９９３］；ブラガーマン等、Year in Immu
no.、７巻３３頁［１９９３］を参照されたい。ヒト抗
体は、ファージディスプレーライブラリーで産生させる
こともできる（フーゲンブームおよびウィンター、J.Mo
l.Biol.、２２７、３８１［１９９１］；マークス等、
J.Mol.Biol.、２２２、５８１［１９９１］）。Alternatively, it is now possible to create transgenic animals (eg, mice) that can produce the entire repertoire of human antibodies upon immunization without the production of endogenous immunoglobulins. For example, it has been described that homozygous removal of the antibody heavy-chain joining region ( _JH ) gene in chimeric and germ-line mutant mice results in complete inhibition of endogenous antibody production. Transfer of the human germ-line immunoglobulin gene sequence in such germ-line mutant mice will result in the production of human antibodies upon antigen challenge. For example, Jacobowitz, Proc.N
atl. Acad. Sci. USA, 90, 2551-255 [199
3]; Jakobowitz et al., Nature, 362, 255-
258 [1993]; Bragerman et al., Year in Immu.
No. 7, page 33 [1993]. Human antibodies can also be produced in phage display libraries (Hughenboom and Winter, J. Mo.
l. Biol., 227, 381 [1991]; Marks et al.
J. Mol. Biol., 222, 581 [1991]).

【０３２２】（iv）二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対す
る結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくは
ヒト抗体またはヒト化抗体である。二重特異性抗体を作
製する方法は当分野において既知である。(Iv) Bispecific antibodies Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized, antibodies that have binding specificities for at least two different antigens. Methods for making bispecific antibodies are known in the art.

【０３２３】常套的には、二重特異性抗体の組換え産生
は二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基
づき、ここでこの二つの重鎖は異なる特異性を持ってい
る（ミルシュタインおよびキュエロ、Nature、３０５巻
５３７−５３９頁［１９８３］）。免疫グロブリン重鎖
および軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これら
のハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分
子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正
しい二重特異性構造を有する。通常、親和クロマトグラ
フィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり
煩わしく、そして生成物の収率は低い。同様の方法は、
ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０８８２９号（１９９３年５月
１３日公開）およびトラウネッカー等、EMBO、１０巻３
６５５−３６５９頁［１９９１］に開示されている。Conventionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy-light chain pairs, wherein the two heavy chains have different specificities. (Milstein and Cuero, Nature, 305: 537-539 [1983]). Due to the random assortment of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadruple hybrids) produce a possible mixture of ten different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Having. The purification of the correct molecule, usually performed by an affinity chromatography step, is rather cumbersome and the product yield is low. A similar method is
PCT Publication No. WO93 / 08829 (published May 13, 1993) and Traunecker et al., EMBO, Vol.
655-3659 [1991].

【０３２４】異なったそしてより好ましいアプローチに
よると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン
（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイ
ン配列と融合させる。この融合は好ましくは、少なくと
もヒンジの一部、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グ
ロブリン重鎖不変ドメインとの融合である。軽鎖の結合
に必要な部位を含む第一の重鎖不変領域（ＣＨ１）を、
融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免
疫グロブリン重鎖の融合、および、所望ならば免疫グロ
ブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベク
ター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェク
トする。この事により、組み立てに使用される三つのポ
リペプチド鎖の等しくない比率が最適の収率を提供する
態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互
の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少
なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が
高収率をもたらす時、または、その比率が特に重要性を
持たない時は、２または３個全てのポリペプチド鎖のた
めのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入すること
が可能である。このアプローチの好ましい態様におい
て、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方
の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖、そして他方の
腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の
結合特異性を提供する）で構成される。その二重特異性
分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な
分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の
二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わ
せから分離することを容易にするとわかった。このアプ
ローチは、１９９２年８月１７日出願の同時係属出願第
０７／９３１８１１号に開示されている。According to a different and more preferred approach, antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) are fused to immunoglobulin constant domain sequences. The fusion is preferably with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge, CH2 and CH3 regions. A first heavy chain constant region (CH1) containing the site necessary for light chain binding,
Desirably it is present in at least one of the fusions. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusions and, if desired, the immunoglobulin light chain, is inserted into a separate expression vector and co-transfected into a suitable host organism. This provides great flexibility in controlling the mutual proportions of the three polypeptide fragments in an embodiment where unequal proportions of the three polypeptide chains used in the assembly provide optimal yields. However, when expression of at least two polypeptide chains in equal proportions results in high yields, or when the proportions are not particularly significant, the coding for two or all three polypeptide chains It is possible to insert the sequence into one expression vector. In a preferred embodiment of this approach, the bispecific antibody comprises a hybrid immunoglobulin heavy chain of one arm having a first binding specificity, and a hybrid immunoglobulin heavy-light chain pair of the other arm (the second arm). To provide binding specificity). This asymmetric structure allows the desired bispecific compound to be separated from unwanted immunoglobulin chain combinations because only half of the bispecific molecule has an immunoglobulin light chain, providing an easy separation method. I found it easy to do. This approach is disclosed in co-pending application Ser. No. 07/931811 filed Aug. 17, 1992.

【０３２５】二重特異性抗体を作製するさらなる詳細に
ついては、例えばスレッシュ等、Methods in Enzymolog
y、１２１巻２１０頁［１９８６］を参照されたい。For further details on generating bispecific antibodies, see, eg, Thresh et al., Methods in Enzymolog.
y, 121, 210 [1986].

【０３２６】（ｖ）ヘテロコンジュゲート抗体 ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内にあ
る。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により連結
した二つの抗体で構成される。このような抗体は、例え
ば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため
（米国特許第４６７６９８０号）、そしてＨＩＶ感染の
処置のため（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／００３６０および
ＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）に提唱され
た。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法
を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当分野
において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米
国特許第４６７６９８０号に開示されている。(V) Heteroconjugate antibodies Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently linked antibodies. Such antibodies are, for example, for targeting immune system cells to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980) and for treating HIV infection (PCT Publication Nos. WO91 / 00360 and WO92 / 00373; EP03089). Was proposed. Heteroconjugate antibodies can be made using any convenient cross-linking methods. Suitable crosslinkers are well known in the art and are disclosed in U.S. Patent No. 4,676,980, along with several crosslinking techniques.

【０３２７】IV．巨核球形成蛋白ｍｐｌリガンドの治療
用途 造血エフェクター機能を持ち本明細書中巨核球形成また
は血小板形成蛋白（ＴＰＯ）と称される生物活性ｍｐｌ
リガンドは、無菌薬用調製物または製剤に使用され、血
小板の産生障害、破壊、または破壊の増加による血小板
減少症に罹患している患者において巨核球形成または血
小板形成活性を刺激することができる。血小板減少症に
随伴する骨髄形成不全（例えば、化学療法または骨髄移
植後の再生不良性貧血）は、播種性血管内凝固（ＤＩ
Ｃ）、免疫血小板減少症（ＨＩＶ誘発性ＩＴＰおよび非
ＨＩＶ誘発性ＩＴＰを包含する）、慢性特発性血小板減
少症、先天性血小板減少症、脊髄異形成、および血栓性
血小板減少症と同様、本発明に係る化合物を用いて有効
に処置することができる。さらに、これらの巨核球形成
蛋白は、骨髄増殖性血小板増加疾患および炎症状態から
の血小板増加症の処置ならびに鉄欠乏症に有用であり得
る。IV. Therapeutic uses of megakaryocyte forming protein mpl ligand Biologically active mpl having hematopoietic effector function and referred to herein as megakaryocyte forming or platelet forming protein (TPO)
Ligands can be used in sterile pharmaceutical preparations or formulations to stimulate megakaryocyte or thrombopoietic activity in patients suffering from thrombocytopenia due to impaired, disrupted, or increased destruction of platelets. Myelodysplasia (eg, aplastic anemia after chemotherapy or bone marrow transplantation) associated with thrombocytopenia is associated with disseminated intravascular coagulation (DI
C), immunothrombocytopenia (including HIV-induced and non-HIV-induced ITP), chronic idiopathic thrombocytopenia, congenital thrombocytopenia, myelodysplasia, and thrombotic thrombocytopenia. It can be effectively treated with the compounds according to the invention. In addition, these megakaryocyte forming proteins may be useful for treating thrombocytosis from myeloproliferative thrombocytopenic disease and inflammatory conditions and for iron deficiency.

【０３２８】本発明に係る巨核球形成または血小板形成
蛋白（ＴＰＯ）の好ましい用途は、白血病または充実性
腫瘍の処置のための骨髄毒性化学療法、オートロガスな
または同種内の骨髄移植のための骨髄切除化学療法、脊
髄異形成、特発性再生不良性貧血、先天性血小板減少
症、および免疫血小板減少症への用途である。Preferred uses of megakaryocyte forming or platelet forming proteins (TPO) according to the present invention include myelotoxic chemotherapy for the treatment of leukemia or solid tumors, myeloablation for autologous or allogeneic bone marrow transplantation Use for chemotherapy, spinal dysplasia, idiopathic aplastic anemia, congenital thrombocytopenia, and immune thrombocytopenia.

【０３２９】本発明に係る巨核球形成蛋白により有効に
処置されるさらに別の疾患は、薬物、人工的表面上での
毒作用または活性化からもたらされる血小板の欠損また
は損傷を包含する。これらの場合、本化合物を使用し
て、新たな「損傷を受けていない」血小板の「放散」を
刺激することができる。有用な適用のさらに完全な一覧
については、上記「背景」、特に（ａ）−（ｆ）項およ
びそこに引用されている文献を参照されたい。Still other diseases that are effectively treated by the megakaryocyte forming proteins of the present invention include platelets deficiency or damage resulting from toxic effects or activation on drugs, artificial surfaces. In these cases, the compounds can be used to stimulate the "dissipation" of new "undamaged" platelets. For a more complete list of useful applications, see the Background above, especially paragraphs (a)-(f) and the references cited therein.

【０３３０】本発明に係る巨核球形成蛋白は、単独で、
または他のサイトカイン、造血素、インターロイキン、
成長因子、または抗体と組み合わせて、上に定義された
疾患および状態の処置に使用することができる。よって
本化合物は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、Ｍ−
ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、エリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）、ｋｉｔリガンド、ＩＬ−６、およびＩＬ−１１を
包含する、血小板形成活性を有する他の蛋白またはペプ
チドと組み合わせて使用できる。The megakaryocyte forming protein according to the present invention may be
Or other cytokines, hematopoiesis, interleukins,
They can be used in combination with growth factors, or antibodies, for the treatment of the diseases and conditions defined above. Therefore, the present compound can be used for G-CSF, GM-CSF, LIF, M-
CSF, IL-1, IL-3, erythropoietin (EP
It can be used in combination with other proteins or peptides having platelet forming activity, including O), kit ligand, IL-6, and IL-11.

【０３３１】本発明に係る巨核球形成蛋白は、薬学上許
容し得る担体と混合して製造される。この治療用組成物
は、静脈内または鼻もしくは肺を介して投与することが
できる。さらにこの組成物は、所望により非経口的また
は皮下投与することもできる。全身的に投与される場
合、この治療用組成物は発熱性物質を含まず、ｐＨ、等
張性、および安定性に十分配慮した非経口投与のために
許容し得る溶液中にあるべきである。これらの条件は当
業者には知られている。簡潔に述べると、本発明に係る
化合物の投薬用製剤は、所望の純度を有する本化合物
を、生理学上許容し得る担体、賦形剤、または安定剤と
混合することによって貯蔵用または投与用に製造され
る。係る材料は、用いられる用量および濃度において受
容者にとって非毒性であり、燐酸、クエン酸、酢酸およ
びその他の有機酸塩のような緩衝剤；アスコルビン酸の
ような抗酸化剤；ポリアルギニンのような低分子量（約
１０残基未満）のペプチド、血清アルブミン、ゼラチ
ン、または免疫グロブリンのような蛋白；ポリビニルピ
ロリジノンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンのようなア
ミノ酸；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マ
ンノース、またはデキストリンを包含する、単糖類、二
糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレ
ート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖
アルコール；ナトリウムのような対イオンおよび／また
はトゥイーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコ
ールのような非イオン性界面活性剤を包含する。The megakaryocyte forming protein of the present invention is produced by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier. The therapeutic composition can be administered intravenously or via the nose or lung. Further, the composition can be administered parenterally or subcutaneously as desired. When administered systemically, the therapeutic composition should be pyrogen free and in a solution acceptable for parenteral administration, with due regard for pH, isotonicity, and stability. . These conditions are known to those skilled in the art. Briefly, dosage formulations of a compound of the present invention are prepared for storage or administration by mixing a compound of the desired purity with a physiologically acceptable carrier, excipient, or stabilizer. Manufactured. Such materials are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers such as phosphoric acid, citric acid, acetic acid and other organic acid salts; antioxidants such as ascorbic acid; Low molecular weight (less than about 10 residues) peptides, proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidinone; amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid, or arginine; cellulose or Monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including derivatives thereof, glucose, mannose or dextrin; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; counterions such as sodium and / or tween , Pluroni It encompasses non-ionic surfactants such as scan or polyethylene glycol.

【０３３２】遊離の酸もしくは塩基型または薬学上許容
し得る塩としての巨核球形成蛋白の一つの化合物または
混合物約０．５ないし５００ｍｇを、容認されている薬
学上の実務が要求するように、生理学上許容し得る媒
質、担体、賦形剤、結合材、保存剤、安定剤、香料等と
混合する。これらの組成物中の活性成分の量は、指示さ
れた範囲内の適切な用量が得られるような量である。About 0.5 to 500 mg of one compound or mixture of megakaryocyte-forming proteins, either in free acid or base form or as a pharmaceutically acceptable salt, can be prepared as required by accepted pharmaceutical practice. It is mixed with physiologically acceptable media, carriers, excipients, binders, preservatives, stabilizers, flavors and the like. The amount of active ingredient in these compositions is such that a suitable dosage in the range indicated is obtained.

【０３３３】注射用無菌組成物は、常套的薬学実務に従
って調合することができる。例えば、水、またはゴマ、
落花生もしくは綿実油のような天然に存在する植物油の
ような媒質、またはオレイン酸エチル等のような合成脂
肪媒質への活性化合物の溶解または懸濁が望ましいかも
知れない。容認されている薬学実務に従って、緩衝剤、
保存剤、抗酸化剤などを加えることができる。Injectable sterile compositions can be prepared according to conventional pharmaceutical practice. For example, water, or sesame,
It may be desirable to dissolve or suspend the active compound in media such as naturally occurring vegetable oils such as peanut or cottonseed oil, or in synthetic fatty media such as ethyl oleate and the like. According to accepted pharmaceutical practice, buffers,
Preservatives, antioxidants and the like can be added.

【０３３４】徐放製剤の適当な例は、当該ポリペプチド
を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス
であって、このマトリックスが、成型された物体、例え
ばフィルムまたはマイクロカプセルである、マトリック
スを包含する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステ
ル類、ヒドロゲル類［例えば、ランガー等、J.Biomed.M
ater.Res.、１５巻１６７−２７７頁［１９８１］およ
びランガー、Chem.Tech.、１２巻９８−１０５頁［１９
８２］に記載のポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリ
ラート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリアク
チド類（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８
１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタマ
ートのコポリマー（シドマン等、Biopolymers、２２巻
５４７−５５６頁［１９８３］）、非分解性エチレン−
ビニルアセタート（ランガー等、上記）、分解性乳酸−
グリコール酸コポリマー、例えばルプロン・デポ（商
標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプ
ロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）、およ
びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３
９８８）を包含する。A suitable example of a sustained release formulation is a semipermeable matrix of a solid hydrophobic polymer containing the polypeptide, wherein the matrix is a molded object, such as a film or microcapsule. Include. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels [eg, Langer et al., J. Biomed.
ater. Res., 15, 167-277 [1981] and Langer, Chem. Tech., 12, 98-105 [19].
82], poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)], polyactides (U.S. Pat. No. 3,773,919, EP5848).
1), a copolymer of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), non-degradable ethylene-
Vinyl acetate (Langer, etc., above), degradable lactic acid
Glycolic acid copolymers such as Lupron Depot ™ (injectable microspheres composed of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), and poly-D-(−)-3-hydroxybutyric acid (EP133)
988).

【０３３５】エチレン−ビニルアセタートおよび乳酸−
グリコール酸のようなポリマーは１００日間にわたり分
子を放出できるが、或るヒドロゲルは蛋白をより短時間
放出する。カプセル化された蛋白が長時間体内にとどま
る時、３７℃で水分にさらされる結果としてそれらは変
性または凝集し、生物活性の喪失および免疫原性の変化
が起こり得る。関係する機構に応じた蛋白の安定化のた
めに、合理的な戦略を考え出すことができる。例えば、
凝集の機構が、ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結
合の形成であることが発見されたなら、安定化は、スル
フヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分
含有量の調節、適当な添加剤の使用、および特異的ポリ
マーマトリックス組成物の開発により、達成することが
できる。Ethylene-vinyl acetate and lactic acid
While polymers such as glycolic acid can release molecules for over 100 days, some hydrogels release proteins for shorter periods of time. When encapsulated proteins remain in the body for an extended period of time, they are denatured or aggregated as a result of exposure to water at 37 ° C., which can result in a loss of biological activity and a change in immunogenicity. Rational strategies can be devised for protein stabilization depending on the mechanism involved. For example,
If the mechanism of aggregation is found to be the formation of intermolecular SS bonds by disulfide exchange, stabilization may include modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solution, adjustment of water content, appropriate This can be achieved through the use of additives and the development of specific polymer matrix compositions.

【０３３６】徐放性巨核球形成蛋白組成物は、リポソー
ムに捕捉された巨核球形成蛋白をも包含する。巨核球形
成蛋白を含有するリポソームは、自体既知の方法によっ
て製造される：ＤＥ３２１８１２１；エプシュタイン
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２巻３６８８−３６９
２頁［１９８５］；ファング等、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、７７巻４０３０−４０３４頁［１９８０］；ＥＰ５
２３２２；ＥＰ３６６７６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１４
３９４９；ＥＰ１４２６４１；日本国特許出願８３−１
１８００８；米国特許第４４８５０４５および４５４４
５４５；ならびにＥＰ１０２３２４。通常、リポソーム
は、脂質含有量が約３０ｍｏｌ．％コレステロール以上
である、小さな（約２００−８００オングストローム）
単層型のものであり、選択される比率は最適な巨核球形
成蛋白治療法のために調節される。The sustained-release megakaryocyte-forming protein composition also includes a megakaryocyte-forming protein entrapped in liposomes. Liposomes containing megakaryocyte-forming proteins are produced by methods known per se: DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-369.
2 [1985]; Fang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, Vol. 77, pp. 4030-4034 [1980]; EP5
2322; EP36676; EP88046; EP14
3949; EP142641; Japanese Patent Application 83-1
18008; U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4544;
545; and EP 102324. Typically, liposomes have a lipid content of about 30 mol. Small (about 200-800 Angstroms) with more than% cholesterol
It is of the monolayer type and the ratio selected is adjusted for optimal megakaryocyte forming protein therapy.

【０３３７】用量は、疾患の重篤度および型、体重、性
別、食餌、投与の時間および経路、他の薬物療法ならび
にその他の関連する臨床上の因子を包含する、薬物の作
用を修飾することが知られている様々な因子を考慮に入
れて、処置に臨む医師により決定されるであろう。典型
的には、日用量は０．１−１００μｇ／ｋｇ体重の範囲
であろう。好ましくは、用量は０．１−５０μｇ／ｋｇ
体重の範囲であろう。より好ましくは、初期用量は１な
いし５μｇ／ｋｇ／日となるであろう。所望により、こ
の用量範囲は、他のサイトカイン、特にＧ−ＣＳＦ、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、およびＥＰＯの用量範囲と同じになるであ
ろう。治療上の有効用量はインビトロまたはインビボい
ずれかの方法によって決定することができる。The dose modifies the effect of the drug, including the severity and type of disease, body weight, sex, diet, time and route of administration, other pharmacotherapy and other relevant clinical factors. Will be determined by the attending physician, taking into account various factors that are known. Typically, daily doses will be in the range of 0.1-100 μg / kg body weight. Preferably, the dose is 0.1-50 μg / kg
Will range in weight. More preferably, the initial dose will be between 1 and 5 μg / kg / day. If desired, this dose range may vary with other cytokines, especially G-CSF, G-
It will be the same as the dose range for M-CSF, and EPO. A therapeutically effective dose can be determined by either in vitro or in vivo methods.

【０３３８】[0338]

【実施例】当業者の一人は、これ以上の説明が無くと
も、上の記載および例示的実施例を用いて本発明を完全
に実施および利用できると信じられる。故に、以下の実
用的実施例は、本発明の好ましい態様を特に指摘するも
のであり、いかなるやり方によっても、開示の残りの部
分を限定するものと解してはならない。EXAMPLES It is believed that one of ordinary skill in the art, using the above description and exemplary embodiments, can fully implement and utilize the present invention without further explanation. Therefore, the following working examples specifically point out preferred embodiments of the present invention, and should not be construed as limiting the remainder of the disclosure in any manner.

【０３３９】実施例１ ブタｍｐｌリガンドの部分的精製 正常なまたは再生不良性貧血のブタから血小板の僅少な
血漿を集めた。ブタは、４ｍＥＶ線形加速器を用いて９
００ｃＧｙの全身照射で照射することにより再生不良性
とした。照射されたブタは６−８日間、セファゾリンの
筋肉内注射で支援した。続いて、その全血容量を全身麻
酔下に採取し、ヘパリン処理し、そして１８００ｘｇで
３０分間遠心して血小板僅少血漿を作成した。巨核球刺
激活性は照射の６日後にピークとなることがわかった。 Example 1 Partial Purification of Porcine mpl Ligands Platelet-poor plasma was collected from normal or aplastic anemia pigs. Pigs were tested using a 4mEV linear accelerator for 9
Irradiation with whole body irradiation of 00 cGy was regarded as defective reproduction. Irradiated pigs were assisted with an intramuscular injection of cefazolin for 6-8 days. Subsequently, the whole blood volume was collected under general anesthesia, heparinized, and centrifuged at 1800 × g for 30 minutes to produce platelet-poor plasma. The megakaryocyte stimulating activity was found to peak 6 days after irradiation.

【０３４０】照射されたブタから得られた再生不良性ブ
タ血漿をＮａＣｌで４Ｍとし、室温で３０分間攪拌す
る。得られた沈澱をソルヴォールＲＣ３Ｂ中３８００ｒ
ｐｍで遠心することにより除去し、上清を、４Ｍ Ｎａ
Ｃｌを含有する１０ｍＭ ＮａＰＯ₄で平衡化したフェニ
ル−トヨパールカラム（２２０ｍｌ）にロードする。Ａ
₂₈₀が＜０．０５となるまでカラムをこの緩衝液で洗浄
し、ｄＨ₂Ｏで溶離する。溶出した蛋白のピークをｄＨ₂
Ｏで１５ｍＳの伝導度まで希釈し、ＰＢＳで平衡化した
（２４０ｍｌ）ブルー−セファロースカラムにロードす
る。続いてこのカラムを、２Ｍ尿素を含有する１０ｍＭ
ＮａＰＯ₄（ｐＨ７．４）およびＰＢＳ各々５カラム容
量で洗浄する。蛋白を、２Ｍ尿素および１Ｍ ＮａＣｌ
を含有する１０ｍＭ ＮａＰＯ₄（ｐＨ７．４）でカラム
から溶離する。溶出した蛋白のピークを０．０１％オク
チルグルコシド（ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシ
ド）ならびにＥＤＴＡおよぴペファブロック（ベーリン
ガー・マンハイム）各１ｍＭとし、縦に連結させたＣＤ
４−ＩｇＧ（Ｄ．Ｊ．カポン等、Nature、３３７巻５２
５−５３１頁［１９８９］）およびｍｐｌ−ＩｇＧウル
トラリンク（ピアス）カラムに直接ロードする（下記参
照）。試料をロードした後ＣＤ４−ＩｇＧ（２ｍｌ）カ
ラムをはずし、ｍｐｌ−ＩｇＧ（４ｍｌ）カラムを、各
１０カラム容量のＰＢＳおよび２Ｍ ＮａＣｌを含有す
るＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ
２．２５）で溶離する。画分は１／１０容量の１Ｍトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に集める。The aplastic pig plasma obtained from the irradiated pig is made 4 M with NaCl and stirred at room temperature for 30 minutes. The resulting precipitate is dissolved in Sorvole RC3B at 3800 r.
The supernatant was removed by centrifugation at 4 pm.
Load onto a phenyl-Toyopearl column (220 ml) equilibrated with 10 mM NaPO ₄ containing Cl. A
₂₈₀ washed with the buffer a column until <0.05 and eluted with dH ₂ O. The peak of the eluted protein was identified as dH ₂
Dilute to a conductivity of 15 mS with O and load onto a Blue-Sepharose column equilibrated with PBS (240 ml). The column was then washed with 10 mM containing 2 M urea.
Wash with 5 column volumes each of NaPO ₄ (pH 7.4) and PBS. The protein was treated with 2M urea and 1M NaCl
Elute from the column with 10 mM NaPO ₄ (pH 7.4) containing The peaks of the eluted protein were 0.01% octyl glucoside (n-octyl β-D-glucopyranoside), 1 mM each of EDTA and Pefabloc (Boehringer Mannheim), and the CDs vertically linked.
4-IgG (DJ Capon et al., Nature, 337, 52)
5-531 [1989]) and load directly on mpl-IgG Ultralink (Pierce) columns (see below). After loading the sample, the CD4-IgG (2 ml) column was removed, and the mpl-IgG (4 ml) column was washed with 10 column volumes of PBS and PBS containing 2 M NaCl, and 0.1 M glycine-HCl (pH
2.25). Fractions are collected in 1/10 volume of 1 M Tris-HCl (pH 8.0).

【０３４１】ｍｐｌ−親和カラムから溶出した画分を還
元条件下で実施するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％、ノ
ヴェックスゲル）により分析すると、幾つかの蛋白の存
在が明らかとなった（図６）。銀染色の強度が最も強い
蛋白は、見掛けのＭｒ６６０００、５５０００、３００
００、２８０００および１４０００で分離する。これら
の蛋白のうちいずれがＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞培養の増
殖を刺激するかを決定するため、これらの蛋白を下記実
施例２に記載のようにゲルから溶離した。Analysis of the fractions eluted from the mpl-affinity column by SDS-PAGE (4-20%, Novex gel) performed under reducing conditions revealed the presence of several proteins (FIG. 6). The proteins with the highest silver staining intensity were apparent Mr 66000, 55000, 300
Separate at 00, 28000 and 14000. To determine which of these proteins stimulated the growth of the Ba / F3-mpl cell culture, these proteins were eluted from the gel as described in Example 2 below.

【０３４２】ウルトラリンク親和カラム ＰＢＳ中のｍｐｌ−ＩｇＧまたはＣＤ４−ＩｇＧ １０
−２０ｍｇを製造者の指示に記載のようにウルトラリン
ク樹脂（ピアス）０．５ｇと結合させる。Mpl-IgG or CD4-IgG 10 in Ultralink affinity column PBS
-20 mg is combined with 0.5 g of Ultralink resin (piercing) as described in the manufacturer's instructions.

【０３４３】ｍｐｌ−ＩｇＧの組み立ておよび発現 ヒトｍｐｌの細胞外ドメイン全体（アミノ酸１−４９
１）およびヒトＩｇＧ１分子のＦｃ領域からなるキメラ
分子を２９３細胞で発現させた。ヒトｍｐｌのアミノ酸
１−４９１をコードしているｃＤＮＡフラグメントをヒ
ト巨核球ＣＭＫ細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲに
よって取得し、配列決定した。ＣｌａＩ部位を５'末端
に、そしてＢｓｔＥII部位を３'末端に挿入した。この
フラグメントをブルースクリプトベクターのＩｇＧＩ
Ｆｃコード化領域の上流のＣｌａＩおよびＢｓｔＥII部
位の間に、ＰＣＲ生成物をＢｓｔＥIIで部分消化した
後、クローニングした。何故ならあと２個のＢｓｔＥII
部位がｍｐｌの細胞外ドメインをコードしているＤＮＡ
に存在しているからである。ｍｐｌＰＣＲ生成物の３'
末端に導入されたＢｓｔＥII部位は、ｍｐｌ細胞外ドメ
インを伴うフレーム内Ｆｃ領域を有するよう設計され
た。この組み立て物をｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏベクター中
に、ＣｌａＩおよびＸｂａＩ部位の間にサブクローニン
グし、燐酸カルシウム法によって２９３ヒト胚腎細胞中
にトランスフェクトした。細胞を０．４ｍｇ／ｍｌのＧ
４１８で選択し、個々のクローンを分離した。分離され
たクローンからのｍｐｌ−ＩｇＧ発現をヒトＦｃ特異的
ＥＬＩＳＡを用いて測定した。最良の発現クローンは１
−２ｍｇ／ｍｌのｍｐｌ−ＩｇＧの発現レベルを有して
いた。 Assembly and Expression of mpl-IgG The entire extracellular domain of human mpl (amino acids 1-49)
1) and a chimeric molecule comprising the Fc region of a human IgG1 molecule was expressed in 293 cells. A cDNA fragment encoding amino acids 1-491 of human mpl was obtained from a human megakaryocyte CMK cell cDNA library by PCR and sequenced. A ClaI site was inserted at the 5 'end and a BstEII site was inserted at the 3' end. This fragment was transformed into the bluescript vector IgGI.
The PCR product was partially digested with BstEII and cloned between the ClaI and BstEII sites upstream of the Fc coding region. Because two more BstEII
DNA encoding the extracellular domain whose site is mpl
Because it exists. 3 ′ of the mplPCR product
The BstEII site introduced at the end was designed to have an in-frame Fc region with an mpl extracellular domain. This construct was subcloned into the pRK5-tkneo vector between the ClaI and XbaI sites and transfected into 293 human embryonic kidney cells by the calcium phosphate method. Cells were treated with 0.4 mg / ml G
Selected at 418, individual clones were isolated. The mpl-IgG expression from the isolated clones was measured using a human Fc-specific ELISA. The best expression clone is 1
It had an expression level of mpl-IgG of -2 mg / ml.

【０３４４】Ｂａ／Ｆ３ ｍｐｌ Ｐ 発現細胞 ヒトｍｐｌ Ｐのコード化領域全体に対応するｃＤＮＡ
をｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏ中にクローニングし、これを引
き続きＮｏｔＩで線状化し、ＩＬ−３依存セルラインＢ
ａ／Ｆ３に電気穿孔によってトランスフェクトした（１
ｘ１０⁷細胞、９６０５Ｆ、２５０ボルト）。３日後、
２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択を開始した。プ
ールまたは個々のクローンとして選択された細胞を、９
６ウェルプレートでの限界希釈により取得した。選択さ
れた細胞を、１５％ＦＢＳ、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８、
２０ｍＭグルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０
０μｇ／ｍｌ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ
中に維持した。選択されたクローンでのｍｐｌ Ｐの発
現を、抗ｍｐｌＰウサギポリクローナル抗体を用いるＦ
ＡＣＳ分析により測定した。CDNA corresponding to entire coding region of Ba / F3 mpl P expressing cell human mpl P
Was cloned into pRK5-tkneo, which was subsequently linearized with NotI and the IL-3-dependent cell line B
a / F3 was transfected by electroporation (1
x10 ⁷ cells, 9605F, 250 volts). Three days later,
Selection was started in the presence of 2 mg / ml G418. Cells selected as pools or individual clones were
Obtained by limiting dilution in a 6-well plate. Selected cells were transformed with 15% FBS, 1 mg / ml G418,
20 mM glutamine, 10 mM HEPES and 10 mM
RPMI containing 0 μg / ml Pen-Strep
Kept inside. Expression of mplP in the selected clones was determined by F using an anti-mplP rabbit polyclonal antibody.
Measured by ACS analysis.

【０３４５】Ｂａ／Ｆ３ ｍｐｌリガンド検定 図３に示されるようにｍｐｌリガンド検定を実施した。
種々の供給源からのｍｐｌリガンドの存在を決定するた
め、ｍｐｌ Ｐ Ｂａ／Ｆ３細胞を、３７℃の５％ＣＯ₂
および空気中の加湿インキュベーター中、細胞密度５ｘ
１０⁵細胞／ｍｌで２４時間ＩＬ−３を欠乏させた。Ｉ
Ｌ−３欠乏に続いてこの細胞を、培地２００μｌ中、希
釈試料有りまたは無しで、５００００細胞の密度で９６
ウェル培養皿に蒔き、細胞培養インキュベーター中２４
時間培養した。１μＣｉの³Ｈ−チミジンを含有する無
血清ＲＰＭＩ培地２０μｌを最後の６−８時間の間、各
々のウェルに添加した。次にこの細胞を９６ウェルＧＦ
／Ｃフィルター板に収穫し、水で５回洗浄した。フィル
ターを、シンチレーション液（マイクロシント２０）４
０μｌの存在下にパッカード・トップ・カウント計数器
で係数した。 Ba / F3 mpl ligand assay The mpl ligand assay was performed as shown in FIG.
To determine the presence of mpl ligand from various sources, mpl P Ba / F3 cells were treated with 5% CO _{2 at} 37 ° C.
5x cell density in a humidified incubator in air and
10 ⁵ cells / ml were starved for 24 hours IL-3. I
Following L-3 depletion, the cells were grown at a density of 50,000 cells in 200 μl of medium, with or without diluted samples, at a density of 50,000 cells.
Plate in a well culture dish and place in a cell culture incubator
Cultured for hours. 20 μl of serum-free RPMI medium containing 1 μCi of ³ H-thymidine was added to each well during the last 6-8 hours. The cells were then transferred to 96-well GF
/ C filter plates and washed 5 times with water. Filter the scintillation liquid (micro scint 20) 4
Coefficients were counted on a Packard Top Count counter in the presence of 0 μl.

【０３４６】実施例２ 高精製ブタｍｐｌリガンド ゲル溶出プロトコル 親和精製されたｍｐｌリガンド（ｍｐｌ−ＩｇＧカラム
から溶出した画分６）および２Ｘレムリ試料緩衝液の等
量を還元剤の不在下で室温で混合し、できるだけ速やか
にノヴェックス４−２０％ポリアクリルアミドゲル上に
ロードした。試料は加熱しなかった。対照として、リガ
ンド無しの試料緩衝液を隣接する列で移動させた。この
ゲルを４−６℃、１３５ボルトでおよそ２と４／１時間
稼働させた。流す緩衝液は最初室温とした。次いでこの
ゲルをゲル箱から取り除き、ゲルの片側の平板を除去し
た。[0346] at room temperature in the absence of the second embodiment highly purified porcine mpl ligand gel elution protocol affinity purified mpl ligand (fraction 6 eluted from the mpl-IgG column) and 2X Laemmli sample buffer equivalent amount of reducing agent Mix and load as quickly as possible on Novex 4-20% polyacrylamide gel. The sample was not heated. As a control, sample buffer without ligand was moved in an adjacent row. The gel was run at 135 volts at 4-6 ° C for approximately 2 and 4/1 hours. The running buffer was initially at room temperature. The gel was then removed from the gel box and the plate on one side of the gel was removed.

【０３４７】ゲルのレプリカをニトロセルロース上で以
下のように作成した：一片のニトロセルロースを蒸留水
で湿し、気泡が入らないよう、露出したゲル表面の上に
注意深く積層した。ニトロセルロースおよびゲル平板上
に基準線の印を付け、レプリカが染色後に正確に復位さ
れるようにした。およそ２分後、ニトロセルロースを注
意深く除去し、ゲルをラップで包み冷蔵庫に入れた。こ
のニトロセルロースを、３ｘ１０ｍｌの０．１％トゥイ
ーン２０＋０．５Ｍ ＮａＣｌ＋０．１Ｍトリス−ＨＣ
ｌｐＨ７．５中でおよそ４５分間、引き続き３ｘ１０ｍ
ｌ精製水中で５分間振盪することにより、バイオラドの
金総蛋白染色剤で染色した。次に金染色剤を加え、標準
のバンドが見えるようになるまで発色させた。次いでレ
プリカを水ですすぎ、ゲル上のラップに重ね、基準線の
印と注意深く並べた。ノヴェックス標準の位置をゲル平
板に記録し、切断位置を示す線を引いた。次にニトロセ
ルロースおよびラップを取り除き、ゲルを示された線に
沿って鋭利な剃刀の刃で切った。切断線は試料列を越え
て伸ばし、ゲルを染色した時にこれらを切片の位置の決
定に使用できるようにした。切片を取り除いた後、残り
のゲルを銀染色し、標準および切断の印の位置を測定し
た。切断位置に対応する分子量をノヴェックス標準から
決定した。A replica of the gel was made on nitrocellulose as follows: a piece of nitrocellulose was moistened with distilled water and carefully layered on the exposed gel surface to prevent air bubbles. A fiducial line was marked on the nitrocellulose and gel plates to ensure that the replica was correctly repositioned after staining. After approximately 2 minutes, the nitrocellulose was carefully removed and the gel was wrapped in wrap and placed in the refrigerator. The nitrocellulose was mixed with 3 × 10 ml of 0.1% Tween 20 + 0.5 M NaCl + 0.1 M Tris-HC.
Approximately 45 minutes in pH 7.5 followed by 3 × 10 m
BioRad was stained with gold total protein stain by shaking for 5 minutes in purified water. A gold stain was then added and color developed until a standard band was visible. The replica was then rinsed with water, layered on the wrap on the gel, and carefully aligned with the reference line marking. The position of the Novex standard was recorded on the gel plate and a line indicating the cutting position was drawn. The nitrocellulose and wrap were then removed and the gel was cut with a sharp razor blade along the line indicated. The cutting lines were extended beyond the sample rows so that when the gel was stained they could be used to determine the location of the sections. After removing the sections, the remaining gel was silver stained and the positions of the standard and cut marks were determined. The molecular weight corresponding to the cleavage position was determined from Novex standards.

【０３４８】１２のゲル切片を、二つのバイオラドモデ
ル４２２電気泳動機中のセルに入れた。１２−１４Ｋ分
子量カットオフ膜のキャップをこれらのセルに使用し
た。５０ｍＭ重炭酸アンモニウム＋０．０５％ＳＤＳ
（およそｐＨ７．８）が溶離緩衝液であった。緩衝液１
リットルを使用前におよそ１時間４−６℃の冷室で冷却
した。ゲル切片を４−６℃の冷室内で１０ｍａ／セル
（最初４０Ｖ）で溶離した。溶出にはほぼ４時間かかっ
た。次にセルを注意深くはずし、フリット上部の液体を
ピペットで除去した。溶離チェインバーをはずし、膜キ
ャップ上に液体があればこれをピペットで除去した。膜
キャップ中の液体をピペットマンで取り、保存した。次
に精製水５０μｌアリコートをキャップ内に入れ、ＳＤ
Ｓ結晶が全て溶解するまで攪拌し除去した。これらの洗
液を、保存しておいた上の液体と合した。溶出試料の全
容量はゲル切片当たり３００−５００μｌであった。試
料を、精製水に数時間浸漬しておいた１０ｍｍスペクト
レイパー４ １２−１４Ｋカットオフ透析管に入れた。
これらを試料６個につき６００ｍｌの燐酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳはカリウムがおよそ４ｍＭである）に対して４
−６℃で一夜透析した。緩衝液を翌朝交換し、透析を
２．５時間継続した。次いで試料を透析バッグから取
り、遠心管に入れた。管を１時間氷上に置き、１４Ｋｒ
ｐｍで３分間遠心し、上清を沈澱化したＳＤＳから注意
深く取った。次にこの上清をさらにおよそ１時間氷上に
置き、再度４分間遠心した。上清を燐酸緩衝化食塩水で
希釈し、活性検定に付した。残りの試料は−７０℃で凍
結した。Twelve gel sections were placed in cells in two BioRad model 422 electrophoresis machines. A cap of a 12-14K molecular weight cutoff membrane was used for these cells. 50 mM ammonium bicarbonate + 0.05% SDS
(Approximately pH 7.8) was the elution buffer. Buffer 1
The liter was cooled in a cold room at 4-6 ° C for approximately 1 hour before use. Gel sections were eluted at 10 ma / cell (40V initially) in a cold room at 4-6 ° C. Elution took almost 4 hours. The cell was then carefully removed and the liquid above the frit was pipetted off. The elution chamber was removed and any liquid on the membrane cap was removed with a pipette. The liquid in the membrane cap was removed with a pipetteman and stored. A 50 μl aliquot of purified water is then placed in the cap and
The mixture was stirred and removed until all the S crystals had dissolved. These washings were combined with the liquid stored above. The total volume of the eluted samples was 300-500 μl per gel section. Samples were placed in 10 mm Spectra 412 1-14K cut-off dialysis tubing that had been immersed in purified water for several hours.
These were added to 600 ml phosphate buffered saline (PBS is approximately 4 mM potassium) per 6 samples.
Dialyzed at -6 ° C overnight. The buffer was changed the next morning and dialysis continued for 2.5 hours. The sample was then removed from the dialysis bag and placed in a centrifuge tube. Place the tube on ice for 1 hour, 14 Kr
After centrifugation at pm for 3 minutes, the supernatant was carefully removed from the precipitated SDS. The supernatant was then placed on ice for about another hour and centrifuged again for 4 minutes. The supernatant was diluted with phosphate buffered saline and subjected to an activity assay. The remaining samples were frozen at -70 ° C.

【０３４９】実施例３ ブタｍｐｌリガンド微細配列決定 ｍｐｌ−ＩｇＧ親和カラム由来の画分６（２．６ｍｌ）
をマイクロコン−１０（アミコン）で濃縮した。ｍｐｌ
リガンドがマイクロコンに吸収されるのを防ぐため、膜
を１％ＳＤＳですすぎ、１０％ＳＤＳ５μｌを画分６に
加えた。２Ｘの試料緩衝液（２０μｌ）をマイクロコン
濃縮後の画分＃６（２０μｌ）に加え、全容量（４０μ
ｌ）を４−２０％勾配のアクリルアミドゲル（ノヴェッ
クス）の一つの列にロードした。このゲルはノヴェック
スのプロトコルに従って稼働させた。次にこのゲルを５
分間平衡化し、その後１０％メタノールを含有する１０
ｍＭ ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンス
ルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液、ｐＨ１１．０中で電気ブ
ロッティングした。イモビロン−ＰＳＱ膜（ミリポア）
上での電気ブロッティングを、バイオラドトランス−ブ
ロット転移セル（３２）中、２５０ｍＡ定電流で４５分
間実施した。ＰＶＤＦ膜を４０％メタノール、０．１％
酢酸中０．１％クマシーブルーＲ−２５０で１分間染色
し、５０％メタノール中１０％酢酸で２−３分間脱染し
た。このブロットのＭｒ１８０００−３５０００領域で
見られた唯一の蛋白は、Ｍｒ３００００、２８０００お
よび２２０００を有していた。 Example 3 Porcine mpl ligand fine sequencing Fraction 6 (2.6 ml) from an mpl-IgG affinity column
Was concentrated with Microcon-10 (Amicon). mpl
The membrane was rinsed with 1% SDS and 5 μl of 10% SDS was added to fraction 6 to prevent ligand from being absorbed by the microcon. 2 × sample buffer (20 μl) was added to fraction # 6 (20 μl) after microcon concentration and the total volume (40 μl)
l) was loaded onto one row of a 4-20% gradient acrylamide gel (Novex). The gel was run according to Novex protocol. Next, this gel was
Equilibrate for 10 minutes, then 10% methanol
Electroblotting was performed in mM 3- (cyclohexylamino) -1-propanesulfonic acid (CAPS) buffer, pH 11.0. Immobilon-PSQ membrane (Millipore)
Electroblotting above was performed in a Bio-Rad trans-blot transfer cell (32) at a constant current of 250 mA for 45 minutes. PVDF membrane 40% methanol, 0.1%
Stained with 0.1% Coomassie Blue R-250 in acetic acid for 1 minute and destained with 10% acetic acid in 50% methanol for 2-3 minutes. The only proteins found in the Mr18000-35000 region of this blot had Mr30000, 28000 and 22000.

【０３５０】３０、２８および２２ｋＤａのバンドを蛋
白配列決定に付した。自動蛋白配列決定を、オンライン
ＰＴＨ分析機を備えたモデル４７０Ａアプライドバイオ
システムシークエンサーで実施した。シークエンサー
は、試料の８０−９０％を注入するよう改変した（ロド
リゲス、J.Chromatogr.、３５０巻２１７−２２５頁
［１９８５］）。ＵＶ吸収の平衡を保たせるため、アセ
トン（〜１２μｌ／ｌ）を溶媒Ａに添加した。電気ブロ
ッティングされた蛋白をブロットカートリッジ内で配列
決定した。ピークを、ネルソンアナリティカル９７０イ
ンターフェイスを用い、ジャスティスイノヴェーション
のソフトウェアで統合した。配列の解釈をＶＡＸ５９０
０で実施した（ヘンツェル等、J.Chromatogr.、４０４
巻４１−５２頁［１９８７］）。Ｎ末端配列（一文字コ
ードを使用し、不確実な残基を括弧に入れる）および得
られた物質の量（角括弧に入れる）を表４に示す。The 30, 28 and 22 kDa bands were subjected to protein sequencing. Automated protein sequencing was performed on a Model 470A Applied Biosystem Sequencer equipped with an online PTH analyzer. The sequencer was modified to inject 80-90% of the sample (Rodriguez, J. Chromatogr., 350: 217-225 [1985]). Acetone (〜12 μl / l) was added to solvent A to keep the UV absorption balanced. The electroblotted proteins were sequenced in a blot cartridge. Peaks were integrated with Justice Innovations software using a Nelson Analytical 970 interface. VAX590 for sequence interpretation
0 (Hentzel et al., J. Chromatogr., 404
41-52 [1987]). The N-terminal sequence (using the one-letter code, bracketing uncertain residues) and the amount of material obtained (bracketed) are shown in Table 4.

【表４】 [Table 4]

【０３５１】実施例４ 液体懸濁巨核球形成検定 ヒト末梢幹細胞（ＰＳＣ）（同意を得た患者より取得）
をＩＭＤＭ培地（ジブコ）で５倍に希釈し、室温、８０
０ｘｇで１５分間遠心した。細胞ペレットをＩＭＤＭに
再懸濁し、６０％パーコル（密度１．０７７ｇ／ｍｌ）
（ファルマシア）上に積層し、８００ｘｇで３０分間遠
心した。界面の低密度単核細胞を吸引し、ＩＭＤＭで２
ｘ洗浄し、２４ウェル組織培養クラスター（コスター）
中の３０％ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ（１ｍｌ最終容
量）に１−２ｘ１０⁶細胞／ｍｌで蒔いた。ＡＰＰまた
はｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰを１０％まで加え、５％Ｃ
Ｏ₂および空気中３７℃の加湿インキュベーター中で培
養を１２−１４日間増殖させた。培養は、０、２および
４日目に添加されるｍｐｌ−ＩｇＧ０．５μｇを伴う１
０％ＡＰＰの存在下でも増殖させた。ＡＰＰは、ｍｐｌ
−ＩｇＧ親和カラムを通過させることによりｍｐｌリガ
ンドを涸渇させた。 Example 4 Liquid Suspension Megakaryocyte Formation Assay Human Peripheral Stem Cells (PSCs) (Acquired from Patients with Consent)
Was diluted 5-fold with IMDM medium (Jibco), and
Centrifuged at 0xg for 15 minutes. The cell pellet is resuspended in IMDM and 60% Percoll (density 1.077 g / ml)
(Pharmacia) and centrifuged at 800 × g for 30 minutes. Aspirate the low density mononuclear cells at the interface and apply 2
x washed, 24-well tissue culture cluster (Costar)
Seeded at 1-2 × 10 ⁶ cells / ml in IMDM containing 30% FBS in 1 ml final volume. Add APP or mpl ligand depleted APP to 10% and add 5% C
Cultures were grown for 12-14 days in a humidified incubator at 37 ° C. in O ₂ and air. Cultures were performed with 0.5 μg of mpl-IgG added on days 0, 2 and 4
It was also grown in the presence of 0% APP. APP is mpl
-The mpl ligand was depleted by passing through an IgG affinity column.

【０３５２】これらの液体懸濁培養の巨核球形成を定量
するため、ソルバーグ等の修飾を用い、ＧＰIIbIIIaに
対する放射標識マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＨＰ
１−１Ｄ）を使用する（ニコルズ博士、メイヨー・クリ
ニック、により提供された）。製造者の指示に従い、Ｈ
Ｐ１−１Ｄ（Ｂ．グラント等、Blood、６９巻１３３４
−１３３９頁［１９８７］）１００μｇをエンザイモビ
ーズ（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）を用いてＮａ
¹²⁵Ｉ １ｍＣｉで放射標識した。放射標識されたＨＰ１
−１Ｄは０．０１％オクチル−グルコシドを含有するＰ
ＢＳ中、−７０℃で保存した。典型的な比活性は１−２
ｘ１０⁶ｃｐｍ／μｇ（１２．５％トリクロロ酢酸によ
り＞９５％が沈澱化）であった。In order to quantify megakaryocyte formation in these liquid suspension cultures, radiolabeled mouse IgG monoclonal antibodies against GPIIbIIIa (HP
1-1D) (provided by Dr. Nichols, Mayo Clinic). According to the manufacturer's instructions,
P1-1D (B. Grant et al., Blood, 69, 1334)
-1339 [1987]) using Enzymo beads (Bio-Rad, Richmond, CA).
Radiolabeled with ¹²⁵ I ImCi. Radiolabeled HP1
-1D is a P containing 0.01% octyl-glucoside.
Stored at -70 ° C in BS. Typical specific activity is 1-2
x 10 ⁶ cpm / μg (> 95% precipitated with 12.5% trichloroacetic acid).

【０３５３】液体懸濁培養を各実験点につき三重に準備
した。培養して１２−１４日後に１ｍｌの培養を１．５
ｍｌエッペンドルフ管に移し、室温、８００ｘｇで１０
分間遠心し、得られた細胞ペレットを０．０２％ＥＤＴ
Ａおよび２０％子牛血清を含有するＰＢＳ１００μｌに
再懸濁した。検定緩衝液５０μｌ中１０ｎｇの¹²⁵Ｉ−
ＨＰ１−１Ｄをこの再懸濁された培養に加え、時々振盪
しながら室温（ＲＴ）で６０分間インキュベートした。
続いてＲＴで８００ｘｇで１０分間遠心することにより
細胞を集め、検定緩衝液で２ｘ洗浄した。このペレット
をガンマカウンター（パッカード）で１分間計数した。
標識されたＨＰ１−１Ｄの添加の６０分前に非標識ＨＰ
１−１Ｄ１μｇを添加することにより、非特異結合を測
定した。特異的結合を、結合した全¹²⁵Ｉ−ＨＰ１−１
Ｄから、過剰の非標識ＨＰ１−１Ｄの存在下でのそれを
差し引いたものとして決定した。A liquid suspension culture was prepared in triplicate for each experimental point. After 12 to 14 days of culture, 1 ml of culture was
transfer to an Eppendorf tube at room temperature and 800xg for 10 minutes.
Centrifugation for 0.02% EDT.
Resuspended in 100 μl of PBS containing A and 20% calf serum. 10 ng of ¹²⁵ I- in 50 μl of assay buffer
HP1-1D was added to this resuspended culture and incubated for 60 minutes at room temperature (RT) with occasional shaking.
The cells were then collected by centrifugation at 800 × g for 10 minutes at RT and washed 2 × with assay buffer. The pellet was counted for 1 minute using a gamma counter (Packard).
60 minutes before the addition of labeled HP1-1D, unlabeled HP
Non-specific binding was measured by adding 1 μg of 1-1D. Specific binding was determined by total bound ¹²⁵ I-HP1-1.
D was determined as subtracting that in the presence of excess unlabeled HP1-1D.

【０３５４】実施例５ オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー ３０ｋＤａ、２８ｋＤａおよび１８−２２ｋＤａ蛋白か
ら得られるアミノ末端アミノ酸配列に基づき、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用するた
めの縮重オリゴヌクレオチドを設計した（表５を参照さ
れたい）。アミノ酸残基２−８をコードしている正のセ
ンス２０量体プール（ｍｐｌ１）およびアミノ酸１８−
２４をコードしている配列に相補的なアンチセンス２１
量体プール（ｍｐｌ２）という二つのプライマープール
を合成した。 Example 5 Oligonucleotide PCR Primers Based on the amino terminal amino acid sequences obtained from the 30 kDa, 28 kDa and 18-22 kDa proteins, degenerate oligonucleotides were designed for use as primers in the polymerase chain reaction (PCR) (Table 5). Positive sense 20 mer pool (mpl1) encoding amino acid residues 2-8 and amino acid 18-
Antisense 21 complementary to the sequence encoding
Two primer pools were synthesized, called the dimer pool (mpl2).

【表５】 縮重オリゴヌクレオチドプライマープール mpl1：5' CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3'(2048倍縮重） (SEQ ID NO:35) mpl2：5' NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3'(2048倍縮重) (SEQ ID NO:36)Table 5 Degenerate oligonucleotide primer pool mpl1: 5 'CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (2048-fold degenerate) (SEQ ID NO: 35) mpl2: 5 'NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3' ( (SEQ ID NO: 36)

【０３５５】ブタ末梢血リンパ球から分離されたブタゲ
ノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用した。５０μｌの
反応は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０
ｍＭＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ、４００μＭ ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマープー
ルおよび２．５単位のＴａｑポリメラーゼに入れたブタ
ゲノムＤＮＡ０．８μｇを含んでいた。最初の鋳型変性
は９４℃で８分間、その後、９４℃で４５秒間、５５℃
で１分間、および７２℃で１分間を３５サイクル行っ
た。最終サイクルは、７２℃で１０分間延長させた。Ｐ
ＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳
動により分離し、エチジウムブロミドで染色することに
より可視化した。アミノ末端アミノ酸配列が単一のエク
ソンによりコードされているならば、正しいＰＣＲ生成
物は６９ｂｐであると予想されるということが推理され
た。この大きさのＤＮＡフラグメントがゲルから溶離
し、ｐＧＥＭＴ（プロメガ）中にサブクローニングされ
た。３個のクローンの配列を下の表６に示す。[0355] Porcine genomic DNA isolated from porcine peripheral blood lymphocytes was used as a template for PCR. The 50 μl reaction was performed with 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM
mM KCl, 3 mM MgCl ₂ , 100 μg / ml BS
A, 0.8 μg of porcine genomic DNA in 400 μM dNTPs, 1 μM of each primer pool and 2.5 units of Taq polymerase. Initial template denaturation at 94 ° C. for 8 minutes, then at 94 ° C. for 45 seconds at 55 ° C.
For 1 minute and at 72 ° C. for 1 minute for 35 cycles. The final cycle was extended at 72 ° C. for 10 minutes. P
CR products were separated by electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel and visualized by staining with ethidium bromide. It was inferred that if the amino terminal amino acid sequence was encoded by a single exon, the correct PCR product would be expected to be 69 bp. DNA fragments of this size eluted from the gel and were subcloned into pGEMT (Promega). The sequences of the three clones are shown in Table 6 below.

【表６】 [Table 6]

【０３５６】ＰＣＲプライマーの位置は下線を付した塩
基によって示す。これらの結果は、３０ｋＤａ、２８ｋ
Ｄａおよび１８−２２ｋＤａ蛋白のアミノ酸９−１７に
ついて得られたＮ末端配列を立証し、この配列がブタＤ
ＮＡの単一のエクソンによってコードされていることを
示した。The positions of the PCR primers are indicated by underlined bases. These results are 30 kDa, 28 k
The N-terminal sequence obtained for amino acids 9-17 of the Da and 18-22 kDa proteins was verified, and this sequence was
It was shown to be encoded by a single exon of NA.

【０３５７】実施例６ ヒトｍｐｌリガンド遺伝子 実施例５の結果に基づき、ｐＲ４５と呼ばれる４５量体
デオキシリボヌクレオチドを設計し合成してゲノムライ
ブラリーをスクリーニングした。この４５量体は以下の
配列を持っていた： Example 6 Human mpl Ligand Gene Based on the results of Example 5, a 45-mer deoxyribonucleotide called pR45 was designed and synthesized, and a genomic library was screened. This 45-mer had the following sequence:

【化５】5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-
TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3'（配列番号２８) このオリゴヌクレオチドを（γ³²Ｐ）−ＡＴＰおよびＴ
４キナーゼで³²Ｐ−標識し、低緊縮ハイブリダイゼーシ
ョンおよび洗浄条件下でλｇｅｍ１２中のヒトゲノムＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。（実施
例７を参照されたい）。陽性クローンを選び、プラーク
を精製し制限地図作成およびサザンブロッティングによ
り分析した。さらなる分析用にクローン＃４を選択し
た。Embedded image 5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-
TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3 ′ (SEQ ID NO: 28) This oligonucleotide was converted to (γ ³² P) -ATP and T
Human Kinase D in λgem12 under ³² P-labeled with 4 Kinases and under low stringency hybridization and washing conditions
Used for NA library screening. (See Example 7). Positive clones were selected, plaques were purified and analyzed by restriction mapping and Southern blotting. Clone # 4 was selected for further analysis.

【０３５８】４５量体とハイブリダイズした２．８ｋｂ
ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐBluescriptＳ
Ｋ−中にサブクローニングした。ブタｍｐｌリガンドＤ
ＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーに
使用して、このクローンの部分的ＤＮＡ配列決定を実施
した。得られた配列により、ブタｍｐｌリガンドのヒト
類似体をコードしているＤＮＡが分離されたことが確認
された。この配列中にＥｃｏＲＩ制限部位が検出された
ことにより、本発明者等は、２．８ｋｂ ＢａｍＨＩ−
ＸｂａＩから３９０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグ
メントを分離しそしてこれをｐBluescriptＳＫ−にサブ
クローニングすることができた。2.8 kb hybridized with the 45-mer
The BamHI-XbaI fragment was replaced with pBluescriptS
Subcloned into K-. Swine mpl ligand D
Partial DNA sequencing of this clone was performed using oligonucleotides specific to the NA sequence as primers. The resulting sequence confirmed that the DNA encoding the human analog of the porcine mpl ligand was isolated. The detection of the EcoRI restriction site in this sequence led the inventors to report that the 2.8 kb BamHI-
The 390 bp EcoRI-XbaI fragment from XbaI was isolated and could be subcloned into pBluescriptSK-.

【０３５９】このフラグメントの両方の鎖を配列決定し
た。このヒトＤＮＡ配列および導き出されたアミノ酸配
列を図１０に示す（配列番号３および４）。さらにゲノ
ム配列中のイントロンの予想位置を矢印により示し、推
定のエクソンを規定する（「エクソン３」）。[0359] Both strands of this fragment were sequenced. This human DNA sequence and the derived amino acid sequence are shown in FIG. 10 (SEQ ID NOs: 3 and 4). In addition, the predicted position of the intron in the genomic sequence is indicated by an arrow, defining the putative exon ("exon 3").

【０３６０】この予想アミノ酸配列の調査により、直接
アミノ酸配列分析から決定されるように、セリン残基
が、成熟ｍｐｌリガンドの最初のアミノ酸であることが
確認される。このコドンのすぐ上流には、成熟ｍｐｌリ
ガンドの分泌に関わるシグナル配列であるという示唆に
富む予想アミノ酸配列がある。このシグナル配列コード
化領域は恐らくイントロンによりヌクレオチド位置６８
で中断している。Examination of this predicted amino acid sequence confirms that the serine residue is the first amino acid of the mature mpl ligand, as determined from direct amino acid sequence analysis. Immediately upstream of this codon is a predicted amino acid sequence that is suggestive of a signal sequence involved in secretion of the mature mpl ligand. This signal sequence coding region is likely to be at nucleotide position 68 by an intron.
Has been suspended.

【０３６１】３'方向では、エクソンはヌクレオチド１
９６で終止しているようである。故にこのエクソンは４
２アミノ酸の配列をコードしており、うち１６はシグナ
ル配列の一部であり、２６は成熟ヒトｍｐｌリガンドの
一部であるらしい。In the 3 'orientation, the exon is at nucleotide 1
It appears to end at 96. So this exon is 4
It encodes a two amino acid sequence, of which 16 is part of the signal sequence and 26 appears to be part of the mature human mpl ligand.

【０３６２】実施例７ 全長ヒトｍｐｌリガンドｃＤＮＡ ヒト「エクソン３」配列（実施例６）に基づき、「エク
ソン３」配列の３'および５'末端に対応する２個の非縮
重オリゴヌクレオチドを合成した（表７)。 Example 7 Two non-degenerate oligonucleotides corresponding to the 3 'and 5' ends of the "exon 3" sequence are synthesized based on the full length human mpl ligand cDNA human "exon 3" sequence (Example 6). (Table 7).

【表７】ヒトｃＤＮＡ非縮重ＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマー Fwdフ゜ライマー：5'GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG T
CA TGC TTC T 3'（配列番号４３） Rvsフ゜ライマー：5'CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3'
（配列番号４４）[Table 7] Human cDNA non-degenerate PCR oligonucleotide primer Fwd primer: 5'GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG T
CA TGC TTC T 3 '(SEQ ID NO: 43) Rvs primer: 5' CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3 '
(SEQ ID NO: 44)

【０３６３】これら二つのプライマーは、種々のヒトｃ
ＤＮＡライブラリー由来のＤＮＡまたは種々の組織由来
の１ｎｇのクイッククローンｃＤＮＡ（クロンテク）を
鋳型に使用するＰＣＲ反応で、実施例５に記載の条件を
用いて使用された。正しいＰＣＲ生成物の予想される大
きさは１４０ｂｐであった。１２％ポリアクリルアミド
ゲル上でこのＰＣＲ生成物を分析した後、成人腎臓、２
９３胎児腎細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーお
よびヒト胎児肝から調製されたｃＤＮＡに、予想された
大きさのＤＮＡフラグメントが検出された（クロンテク
カタログ＃７１７１−１）。These two primers are used for various human c
A PCR reaction using DNA from a DNA library or 1 ng of Quick Clone cDNA (Clontech) from various tissues as template was used using the conditions described in Example 5. The expected size of the correct PCR product was 140 bp. After analyzing this PCR product on a 12% polyacrylamide gel, adult kidney, 2
DNA fragments of the expected size were detected in a cDNA library prepared from 93 fetal kidney cells and a cDNA prepared from human fetal liver (Clontech Catalog # 7171-1).

【０３６４】λＤＲ２中の胎児肝ｃＤＮＡライブラリー
（クロンテクカタログ＃ＨＬ１１５１ｘ）を、ヒトゲノ
ムライブラリーのスクリーニングに使用したものと同じ
４５量体オリゴヌクレオチドでスクリーニングした。こ
のオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて（γ³²Ｐ）−ＡＴＰで標識した。ライブラリー
は低緊縮ハイブリダイゼーション条件下にスクリーニン
グした。フィルターを２時間プレハイブリダイゼーショ
ンし、次いで１６時間、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳ
Ｃ、１０ｘデンハート、０．０５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．５）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５０μｇ／
ｍｌの超音波処理鮭***ＤＮＡ中で４２℃で一夜プロー
ブとハイブリダイズさせた。次にフィルターを２ｘＳＳ
Ｃですすぎ、次いで４２℃の０．５ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳで１回洗浄した。フィルターをコダックＸ線フィ
ルムに一夜暴露させた。陽性クローンを選び、プラーク
を精製し、挿入物の大きさを、λＤＲ２にクローニング
しているＢａｍＨＩ−ＸｂａＩに隣接するオリゴヌクレ
オチドを用いるＰＣＲによって決定した（クロンテクカ
タログ＃６４７５−１）。ファージストック５μｇを鋳
型供給源として使用した。最初の変性は９４℃で７分
間、引き続き３０サイクルの増幅（９４℃１分間、５２
℃１分間および７２℃１．５分間）を実施した。最後の
伸長は７２℃で１５分間とした。クローン＃ＦＬ２ｂは
１．８ｋｂ挿入物を持っており、これをさらなる分析の
ために選択した。A fetal liver cDNA library in λDR2 (Clontech Catalog # HL1151x) was screened with the same 45-mer oligonucleotide used for screening the human genomic library. This oligonucleotide was labeled with (γ ³² P) -ATP using T4 polynucleotide kinase. The library was screened under low stringency hybridization conditions. The filters were pre-hybridized for 2 hours and then 16 hours with 20% formamide, 5 × SS
C, 10x Denhardt, 0.05M sodium phosphate (p
H6.5), 0.1% sodium pyrophosphate, 50 μg /
Hybridized with the probe overnight at 42 ° C. in ml of sonicated salmon sperm DNA. Next, filter 2xSS
C, then 0.5 x SSC at 42 ° C, 0.1%
Washed once with SDS. The filters were exposed to Kodak X-ray film overnight. Positive clones were selected, plaques were purified, and insert size was determined by PCR using oligonucleotides flanking BamHI-XbaI cloned into λDR2 (Clontech Catalog # 64775-1). 5 μg of the phage stock was used as a template source. Initial denaturation is 7 minutes at 94 ° C, followed by 30 cycles of amplification (1 minute at 94 ° C, 52 minutes).
C. for 1 minute and 72 ° C. for 1.5 minutes). The final extension was at 72 ° C. for 15 minutes. Clone # FL2b has a 1.8 kb insert, which was selected for further analysis.

【０３６５】λＤＲ２ファージのアーム内に入っている
プラスミドｐＤＲ２（クロンテク、λＤＲ２およびｐＤ
Ｒ２クローニングおよび発現系ライブラリープロトコル
ハンドブック、４２頁）を、製造者の指示（クロンテ
ク、λＤＲ２およびｐＤＲ２クローニングおよび発現系
ライブラリープロトコルハンドブック、２９−３０頁）
に記載のようにして回収した。ＢａｍＨＩおよびＸｂａ
ＩによるプラスミドｐＤＲ２−ＦＬ２ｂの制限分析は、
挿入物中およそ６５０位に内部ＢａｍＨＩ制限部位が存
在することを示した。ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩによるこの
プラスミドの消化は、この挿入物を、一方は０．６５ｋ
ｂであり他方は１．１５ｋｂである２個のフラグメント
に切断した。プラスミドｐＤＲ２−ＦＬ２ｂから誘導さ
れた三つの異なるクラスの鋳型によりＤＮＡ配列を決定
した。二本鎖プラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定を、色
素標識ジデオキシヌクレオシド三燐酸ターミネーター
（色素ターミネーター）および特別に合成した歩行プラ
イマーのための標準プロトコルを用いるＡＢＩ３７３
（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ
ー、カリフォルニア）自動蛍光ＤＮＡシークエンサーで
実施した（サンガー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７４
巻５４６３−５４６７頁［１９７７］；スミス等、Natu
re、３２１巻６７４−６７９頁［１９８６］）。ポリメ
ラーゼ連鎖反応で増幅させたプラスミドからのフラグメ
ントの直接配列決定を、特別製プライマーおよび色素タ
ーミネーター反応を用いてＡＢＩ３７３シークエンサー
で行った。一本鎖鋳型をＭ１３ジェイナスベクター（Ｄ
ＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシ
ン）を用いて作成した（バーランド等、Nucl.Acids Re
s.、２１巻３３８５−３３９０頁［１９９３］）。プラ
スミドｐＤＲ２−ＦＬ２ｂからＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ
（１．１５ｋｂ）およびＢａｍＨＩ（０．６５ｋｂ）フ
ラグメントを分離し、デオキシヌクレオチドの存在下で
末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで満たし、次いでＭ１３
ジェイナスのＳｍａＩ部位にサブクローニングした。配
列決定を、色素標識Ｍ１３普遍および逆プライマー、ま
たは歩行プライマーおよび色素ターミネーターについて
の標準プロトコルで実施した。歩行プライマーおよび標
準ジデオキシターミネーター化学（サンガー等、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA、７４巻５４６３−５４６７頁［１９
７７］）、³³Ｐ−標識されたα−ｄＡＴＰおよびシーク
エナーゼ（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・
Ｃｏｒｐ．、クリーヴランド、オハイオ）を用いて一本
鎖Ｍ１３ＤＮＡについての手動配列決定反応を実施し
た。ＤＮＡ配列の集成をシークエンチャーＶ２．１ｂ１
２（ジーン・コーズ・コーポレーション、アンアーバ
ー、ミシガン）によって実施した。ｈＭＬのヌクレオチ
ドおよび導き出された配列を図１および図２（配列番号
１）に供する。The plasmid pDR2 (Clontech, λDR2 and pD
R2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, page 42), according to the manufacturer's instructions (Clontech, λDR2 and pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, pages 29-30).
Collected as described in. BamHI and Xba
Restriction analysis of plasmid pDR2-FL2b by I
It indicated that there was an internal BamHI restriction site at approximately position 650 in the insert. Digestion of this plasmid with BamHI-XbaI digested the insert,
b and the other was cut into two fragments of 1.15 kb. DNA sequencing was performed on three different classes of templates derived from plasmid pDR2-FL2b. DNA sequencing of double-stranded plasmid DNA was performed using ABI 373 using standard protocols for dye-labeled dideoxynucleoside triphosphate terminators (dye terminators) and specially synthesized walking primers.
(Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Automated fluorescent DNA sequencer (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74).
Vol. 5463-5467 [1977]; Smith et al., Natu
re, 321: 674-679 [1986]). Direct sequencing of fragments from plasmids amplified by the polymerase chain reaction was performed on an ABI 373 sequencer using custom primer and dye terminator reactions. The single-stranded template was transferred to the M13 Jainus vector (D
NASSTAR, Inc. , Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl.
s., 21, 3385-3390 [1993]). Plasmid pDR2-FL2b to BamHI-XbaI
(1.15 kb) and BamHI (0.65 kb) fragments were separated, the ends were filled with T4 DNA polymerase in the presence of deoxynucleotides, and then M13
It was subcloned into the SmaI site of Janas. Sequencing was performed with standard protocols for dye-labeled M13 universal and reverse primers, or walking primers and dye terminators. Walking primer and standard dideoxy terminator chemistry (Sanger et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 [19
77]), ³³ P-labeled α-dATP and Sequenase (United States Biochemical.
Corp .. , Cleveland, Ohio) was used to perform a manual sequencing reaction on single-stranded M13 DNA. The assembly of the DNA sequence was performed using the sequencer V2.1b1.
2 (Gene Cause Corporation, Ann Arbor, MI). The nucleotides of hML and the derived sequence are provided in FIGS. 1 and 2 (SEQ ID NO: 1).

【０３６６】実施例８ ヒトｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）遺伝子の分離 λ−Ｇｅｍ１２中のヒトゲノムライブラリーを、先に記
載のオリゴヌクレオチドプローブｐＲ４５を用いて低緊
縮条件下で（実施例７を参照されたい）、またはｍｐｌ
リガンドをコードしているヒトｃＤＮＡの３'側半分に
対応するフラグメント（ＢａｍＨＩ部位から３'末端ま
で）を用いて高緊縮条件下でスクリーニングすることに
より、ＴＰＯ遺伝子のヒトゲノムＤＮＡクローンを分離
した。３５ｋｂの長さの２個の部分重複したλクローン
が分離された。ＴＰＯ遺伝子の全体を含む２個の部分重
複フラグメント（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）をサブ
クローニングし配列決定した。このヒト遺伝子の構造
は、ゲノムＤＮＡの７ｋｂ以内の６個のエクソンで構成
されている（図１８、１９および２０）。全てのエクソ
ン／イントロン接合部の境界は、哺乳動物遺伝子につい
て確立された共通モチーフと一致している（Ｍ．Ｂ．シ
ャピロ等、Nucl.Acids Res.、１５巻７１５５頁［１９
８７］）。エクソン１およびエクソン２は、５'非翻訳
配列およびシグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸を
含んでいる。分泌シグナルの残部および成熟蛋白の最初
の２６アミノ酸はエクソン３の中にコードされている。
カルボキシドメインの全体、ならびにエリスロポエチン
様ドメインの３'非翻訳および〜５０アミノ酸はエクソ
ン６の中にコードされている。ｈＭＬ−２（ｈＴＰＯ−
２）内部に見られる除去に含まれる４個のアミノ酸はエ
クソン６の５'末端にコードされている。 Example 8 Isolation of the human mpl ligand (TPO) gene The human genomic library in λ-Gem12 was cloned under low stringency using the oligonucleotide probe pR45 described above (see Example 7). Or mpl
A human genomic DNA clone of the TPO gene was isolated by screening under high stringency conditions using a fragment corresponding to the 3 'half of the human cDNA encoding the ligand (from the BamHI site to the 3' end). Two partially overlapping λ clones of 35 kb length were isolated. Two partially overlapping fragments (BamHI and EcoRI) containing the entire TPO gene were subcloned and sequenced. The structure of this human gene is composed of six exons within 7 kb of genomic DNA (FIGS. 18, 19 and 20). The boundaries of all exon / intron junctions are consistent with a common motif established for mammalian genes (MB Shapiro et al., Nucl. Acids Res., 15: 7155 [19].
87]). Exon 1 and exon 2 contain the 5 'untranslated sequence and the first four amino acids of the signal peptide. The remainder of the secretion signal and the first 26 amino acids of the mature protein are encoded in exon 3.
The entire carboxy domain, as well as the 3 'untranslated and ~ 50 amino acids of the erythropoietin-like domain, are encoded in exon 6. hML-2 (hTPO-
2) The four amino acids involved in the internal deletion are encoded at the 5 'end of exon 6.

【０３６７】実施例９ ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）の一過性発現 ｐＤＲ２−ＦＬ２ｂに含まれる全長挿入物をサブクロー
ニングするため、このプラスミドを、ＸｂａＩで完全
に、次にＢａｍＨＩで部分的に消化した。１．８ｋｂ挿
入物に対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製し、サイ
トメガロウイルス即時初期プロモーターの調節の下にｐ
ＲＫ５にサブクローニングした（ｐＲＫ５−ｈｍｐｌ
Ｉ）（ｐＲＫ５の組み立てについては米国特許第５２５
８２８７号を参照されたい）。組み立て物ｐＲＫ５−ｈ
ｍｐｌＩからのＤＮＡをＰＥＧ法により調製し、Ｆ−１
２栄養混合物、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）お
よび１０％牛胎児血清を添加したダルベッコの改良イー
グル培地（ＤＭＥＭ）中に維持したヒト胚腎臓２９３細
胞にトランスフェクトした。細胞は、記載のように燐酸
カルシウム法によりトランスフェクトさせた（Ｃ．ゴー
マン［１９８５］、ＤＮＡクローニング：ア・プラクテ
ィカル・アプローチ（Ｄ．Ｍ．グローヴァー編）、II巻
１４３−１９０頁、ＩＲＬプレス、ワシントンＤ．
Ｃ．）。トランスフェクションの３６時間後、トランス
フェクトされた細胞の上清を、増殖検定で活性について
検定した（実施例１を参照されたい）。ｐＲＫベクター
でトランスフェクトされた２９３細胞の上清のみは、Ｂ
ａ／Ｆ３またはＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞の刺激を与えな
かった（図１４）。ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩでトランスフ
ェクトされた細胞の上清はＢａ／Ｆ３細胞には効果が無
かったが、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞の増殖を劇的に刺激
し（図１４）、この事は、このｃＤＮＡが機能的に活性
なヒトｍｐｌリガンドをコードしていることを示すもの
である。 Example 9 Transient expression of human mpl ligand (hML) To subclone the full-length insert contained in pDR2-FL2b, this plasmid was digested completely with XbaI and then partially with BamHI. The DNA fragment corresponding to the 1.8 kb insert was gel-purified and under control of the cytomegalovirus immediate early promoter
Subcloned into RK5 (pRK5-hmpl
I) (US Pat. No. 525 for pRK5 assembly)
8287). Assembly pRK5-h
DNA from mplI was prepared by the PEG method and F-1
Human embryonic kidney 293 cells maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with the two nutrient mixture, 20 mM Hepes (pH 7.4) and 10% fetal calf serum were transfected. Cells were transfected by the calcium phosphate method as described (C. Gorman [1985], DNA cloning: A Practical Approach (ed by DM Glover), II, pp. 143-190, IRL). Press, Washington, D.C.
C. ). 36 hours after transfection, transfected cell supernatants were assayed for activity in a proliferation assay (see Example 1). Only the supernatant of 293 cells transfected with the pRK vector
No stimulation of a / F3 or Ba / F3-mpl cells was given (FIG. 14). The supernatant of cells transfected with pRK5-hmplI had no effect on Ba / F3 cells, but dramatically stimulated the growth of Ba / F3-mpl cells (Figure 14), indicating that this cDNA Encodes a functionally active human mpl ligand.

【０３６８】実施例１０ ヒトｍｐｌリガンドイソ型ｈＭＬ２、ｈＭＬ３およびｈ
ＭＬ４ 択一的にスプライスされた型のｈＭＬを同定するため、
ｈＭＬのコード化配列のそれぞれの末端に対応するプラ
イマーを合成した。これらのプライマーをＲＴ−ＰＣＲ
に使用してヒト成人肝ＲＮＡを増幅した。加えて、目的
とする選択された領域に隣接する内部プライマー（下記
参照）を組み立て、同様に使用した。ＰＣＲ生成物の末
端の直接配列決定は、ヒト胎児肝ライブラリーから分離
されたｃＤＮＡの配列と正確に対応する一つの配列を明
らかにした（図１および図２［配列番号１］を参照され
たい）。しかしながら、ＥＰＯドメインのＣ末端付近の
領域（ＰＣＲ生成物の中程）は複雑な配列パターンを示
し、その領域でスプライス変異体の存在する可能性を示
唆した。これらのスプライス変異体を分離するため、目
的領域に隣接する表８に供されるプライマーをヒト成人
肝ｃＤＮＡのための鋳型としてＰＣＲに使用した。 Example 10 Human mpl ligand isoforms hML2, hML3 and hML
ML4 To identify an alternatively spliced version of hML,
Primers corresponding to each end of the coding sequence of hML were synthesized. These primers were used for RT-PCR
To amplify human adult liver RNA. In addition, an internal primer (see below) adjacent to the selected region of interest was assembled and used as well. Direct sequencing of the ends of the PCR product revealed one sequence that exactly corresponded to the sequence of the cDNA isolated from the human fetal liver library (see FIGS. 1 and 2 [SEQ ID NO: 1]). ). However, the region near the C-terminus of the EPO domain (middle of the PCR product) showed a complex sequence pattern, suggesting the possibility of splice variants in that region. To isolate these splice variants, the primers provided in Table 8 adjacent to the region of interest were used in PCR as a template for human adult liver cDNA.

【表８】ヒトＭＬイソ型ＰＣＲプライマー phmpllcdna.3e1：5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3'
（配列番号４５） pbx4.f2： 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3'
（配列番号４６）Table 8: Human ML isoform PCR primer phmpllcdna.3e1: 5'TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3 '
(SEQ ID NO: 45) pbx4.f2: 5′GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3 ′
(SEQ ID NO: 46)

【０３６９】ＰＣＲ生成物をＭ１３にブラントでサブク
ローニングした。個々のサブクローンの配列決定は、少
なくとも３個のＭＬイソ型の存在を明らかにした。その
うちの一つであるｈＭＬ（ｈＭＬ₃₃₂とも呼ばれる）は
最も長い型であり、胎児肝ライブラリーから分離された
配列に正確に対応する。最長（ｈＭＬ）から最短（ｈＭ
Ｌ−４）までを列挙した４個のヒトｍｐｌリガンドイソ
型の配列を（図１２および図１３［配列番号６、８、９
および１０］）に供する。The PCR product was bluntly subcloned into M13. Sequencing of individual subclones revealed the presence of at least three ML isoforms. Is one HML of which (also called HML ₃₃₂₎ is the longest type, corresponds exactly to the sequence isolated from the fetal liver library. From the longest (hML) to the shortest (hM
L-4) (Fig. 12 and Fig. 13 [SEQ ID NOs: 6, 8, 9]).
And 10]).

【０３７０】実施例１１ ヒトｍｐｌリガンドイソ型および置換変異体の組み立て
および一過性発現 ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、およびｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１
５４Ａ） イソ型ｈＭＬ２およびｈＭＬ３ならびに置換変異体ｈＭ
Ｌ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）を、ラッセル・ヒグチ、
ＰＣＲプロトコルズ、ア・ガイド・トゥー・メソッズ・
アンド・アプリケーションズ、アカデミック・プレス、
Ｍ．Ａ．イニス、Ｄ．Ｈ．ゲルファンド、Ｊ．Ｊ．スニ
ンスキーおよびＴ．Ｊ．ホワイト編、に記載の組換えＰ
ＣＲ技術を用いてｈＭＬから再構成した。 Example 11 Assembly of human mpl ligand isoforms and substitution mutants
And transiently expressed hML2, hML3, and hML (R153A, R1
54A) Isoforms hML2 and hML3 and substitution mutant hM
L (R153A, R154A), Russell Higuchi,
PCR Protocols, A Guide to Methods
And Applications, Academic Press,
M. A. Innis, D. H. Gelfund, J.A. J. Sninsky and T.S. J. Recombinant P described in White
Reconstructed from hML using CR technology.

【０３７１】全組み立て物において、使用された「外
部」プライマーを表８に、そして「一部重複」プライマ
ーを表９に示す。In all assemblies, the "external" primers used are shown in Table 8 and the "partially overlapping" primers are shown in Table 9.

【表９】 [Table 9]

【表１０】 [Table 10]

【０３７２】全てのＰＣＲ増幅は、クローニングされた
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）で、以下
の条件を用いて実施した：最初の鋳型変性は９４℃で７
分間、その後９４℃１分間、５５℃１分間、および７２
℃１．５分間を３０サイクル。最後のサイクルは７２℃
で１０分間延長した。最終的ＰＣＲ生成物をＣｌａＩ−
ＸｂａＩで消化し、ゲル精製し、ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏに
クローニングした。２９３細胞を上記のように種々の組
み立て物でトランスフェクトし、上清をＢａ／Ｆ３−ｍ
ｐｌ増殖検定を用いて検定した。ｈＭＬ−２およびｈＭ
Ｌ−３はこの検定で検出し得る活性を示さなかったが、
ｈＭＬ（Ｒ１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）の活性はｈＭＬと同
様で、この事は、この二塩基部位でのプロセシングが活
性に必要ないことを示すものである（図１７を参照され
たい）。All PCR amplifications were performed with cloned Pfu DNA polymerase (Stratagene) using the following conditions: initial template denaturation was 7 ° C. at 94 ° C.
Minutes, then 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C.
30 cycles of 1.5 ° C. for 1.5 minutes. The last cycle is 72 ° C
For 10 minutes. The final PCR product is ClaI-
Digested with XbaI, gel purified and cloned into pRK5tkneo. 293 cells were transfected with the various assemblies as described above and the supernatant was Ba / F3-m
The assay was performed using the pl proliferation assay. hML-2 and hM
L-3 showed no detectable activity in this assay, but
The activity of hML (R153A, R154A) is similar to hML, indicating that processing at this dibasic site is not required for activity (see FIG. 17).

【０３７３】実施例１２ マウスｍｐｌリガンドｃＤＮＡｍＭＬ、ｍＭＬ−２およ
びｍＭＬ−３ｍＭＬｃＤＮＡの分離 ヒトｍｐｌリガンドの全コード化領域に対応するＤＮＡ
フラグメントをＰＣＲによって取得し、ゲル精製し、³²
Ｐ−ｄＡＴＰおよび³²Ｐ−ｄＣＴＰの存在下でランダム
プライミングにより標識した。このプローブを用いてλ
ＧＴ１０（クロンテクカタログ＃ＭＬ３００１ａ）中の
マウス肝ｃＤＮＡライブラリー１０⁶クローンをスクリ
ーニングした。３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１０
ｘデンハート、０．１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ燐酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．５）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、１
００μｇ／ｍｌの超音波処理鮭***ＤＮＡ中、プローブ
の存在下で二重のフィルターを一夜ハイブリダイズさせ
た。フィルターを２ｘＳＳＣですすぎ、次いで４２℃の
０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで一回洗浄した。ハイ
ブリダイズしているファージをプラーク精製し、ｃＤＮ
Ａ挿入物をブルースクリプトＳＫ−プラスミドのＥｃｏ
ＲＩ部位にサブクローニングした。１．５ｋｂ挿入物を
伴うクローン「ＬＤ」をさらなる分析のために選択し、
両方の鎖をヒトＭＬ ｃＤＮＡについて上に記載したよ
うに配列決定した。クローンＬＤからのヌクレオチドお
よび導き出されたアミノ酸配列を図１８、１９、２０、
２１および２２（配列番号１および１１）に供する。こ
のクローンから導き出された成熟ＭＬ配列は３３１アミ
ノ酸残基の長さであり、ｍＭＬ₃₃₁（または下記の理由
でｍＭＬ−２）と同定された。これらのＭＬのＥＰＯ様
ドメインには、ヌクレオチドおよび導き出されたアミノ
酸配列の両方についてかなりの一致が観察された。しか
し、ヒトおよびマウスＭＬの導き出されたアミノ酸配列
を並べる時、マウス配列は、ヒト（上記参照）およびブ
タ（下記参照）ｃＤＮＡの両方に見られる、ヌクレオチ
ド位置６１８の後の１２ヌクレオチド除去に対応するヒ
ト残基１１１−１１４の間のテトラペプチドの除去を有
するようであった。そこで、可能性あるマウスＭＬイソ
型を検出するため、さらなるクローンを調べた。一つの
クローン「Ｌ７」は、「失われている」テトラペプチド
ＬＰＬＱを含む３３５アミノ酸の導き出された配列を有
する１．４ｋｂ挿入物を持っていた。この型は全長のマ
ウスＭＬであると信じられ、ｍＭＬまたはｍＭＬ₃₃₅と
呼ばれる。ｍＭＬについてのヌクレオチドおよび導き出
されたアミノ酸配列を図２４および図２５（配列番号１
２および１３）に供する。最後に、クローン「Ｌ２」を
分離し配列決定した。このクローンはｈＭＬ３に対応す
る１１６ヌクレオチド除去を持っており、故にｍＭＬ−
３と命名される。これら二つのイソ型の導き出されたア
ミノ酸配列の比較を図２４および図２５に示す。 Example 12 Mouse mpl ligand cDNA mML, mML-2 and
DNA corresponding to the entire coding region of the separating human mpl ligand fine mML-3mMLcDNA
The fragment was obtained by PCR, gel purified, ³²
Labeled by random priming in the presence of P-dATP and ³² P-dCTP. Using this probe
10 ⁶ mouse liver cDNA library clones in GT10 (Clontech Catalog # ML3001a) were screened. 35% formamide, 5xSSC, 10
x Denhardt, 0.1% SDS, 0.05 M sodium phosphate (pH 6.5), 0.1% sodium pyrophosphate, 1
Duplicate filters were hybridized overnight in sonicated salmon sperm DNA at 00 μg / ml in the presence of probe. The filters were rinsed with 2 × SSC, then washed once with 0.5 × SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. The hybridizing phage was plaque purified and cDN
The A insert was inserted into the Bluescript SK-plasmid Eco
It was subcloned into the RI site. The clone "LD" with the 1.5 kb insert was selected for further analysis,
Both strands were sequenced as described above for the human ML cDNA. The nucleotides and derived amino acid sequences from clone LD are shown in FIGS.
21 and 22 (SEQ ID NOs: 1 and 11). The mature ML sequence derived from this clone was 331 amino acid residues long and was identified as mML ₃₃₁ (or mML-2 for the following reasons). Significant agreement was observed in the EPO-like domains of these MLs, both in nucleotides and in the derived amino acid sequence. However, when aligning the derived amino acid sequences of human and mouse ML, the mouse sequence corresponds to a 12 nucleotide deletion after nucleotide position 618 found in both human (see above) and porcine (see below) cDNAs. It appeared to have the removal of the tetrapeptide between human residues 111-114. Therefore, additional clones were examined to detect potential mouse ML isoforms. One clone, "L7", had a 1.4 kb insert with a derived sequence of 335 amino acids, including the "missing" tetrapeptide LPLQ. This type believed to be murine ML full length called mML or mML _335. The nucleotide and deduced amino acid sequences for mML are shown in FIGS.
2 and 13). Finally, clone "L2" was isolated and sequenced. This clone has a 116 nucleotide deletion corresponding to hML3 and hence the mML-
No. 3. A comparison of the derived amino acid sequences of these two isoforms is shown in FIGS.

【０３７４】組換えｍＭＬの発現。マウスＭＬのための
発現ベクターを、本質的には実施例８に記載のように製
造した。ｍＭＬおよびｍＭＬ−２をコードしているクロ
ーンを、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニ
ル化シグナルの調節下での発現を提供する哺乳動物発現
ベクターである、ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏにサブクローニン
グした。得られる発現ベクターｍＭＬｐＲＫｔｋｎｅｏ
およびｍＭＬ２ｐＲＫｔｋｎｅｏを燐酸カルシウム法を
用いて２９３細胞中に一過性トランスフェクトさせた。
一過性トランスフェクションの後、培地を５日間条件付
けた。この細胞は、１０％牛胎児血清を添加した高グル
コースＤＭＥＭ培地中に維持した。Expression of recombinant mML. An expression vector for mouse ML was prepared essentially as described in Example 8. Clones encoding mML and mML-2 were subcloned into pRK5tkneo, a mammalian expression vector that provides for expression under the control of the CMV promoter and SV40 polyadenylation signal. Obtained expression vector mMLpRKtkneo
And mML2pRKtkneo were transiently transfected into 293 cells using the calcium phosphate method.
After transient transfection, the media was conditioned for 5 days. The cells were maintained in high glucose DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum.

【０３７５】Ｂａ／Ｆ３細胞におけるマウス−ｍｐｌ
（ｍｍｐｌ）の発現。ｃ−ｍｐｌを発現する安定なセル
ラインを、本質的には実施例１でヒトｍｐｌについて記
載したようにｍｍｐｌ ｐＲＫｔｋｎｅｏのトランスフ
ェクションによって取得した。簡潔に述べると、マウス
ｍｐｌの全コード化配列（Ｒ．Ｃ．スコダ等、EMBO
J．、１２巻２６４５−２６５３頁［１９９３］）を含
む発現ベクター（２０μｇ；線状化）を電気穿孔（５ｘ
１０⁶細胞、２５０ボルト、９６０μＦ）によりＢａ／
Ｆ３細胞中にトランスフェクトし、続いて２ｍｇ／ｍｌ
Ｇ４１８によりネオマイシン耐性について選択した。
ｍｐｌの発現を、ウサギ抗マウスｍｐｌ−ＩｇＧ抗血清
を用いるフローサイトメトリー分析により評価した。Ｂ
ａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３の供給源としてのＷＥＨＩ−
３Ｂ細胞からのＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。ｍＭ
ＬおよびｍＭＬ−２の両者で一過性トランスフェクトさ
せた２９３細胞からの上清を、実施例１に記載のように
ｍｍｐｌおよびｈｍｐｌでトランスフェクトさせたＢａ
Ｆ３細胞で検定した。Mouse-mpl in Ba / F3 cells
(Mmpl) expression. Stable cell lines expressing c-mpl were obtained by transfection of mmpl pRKtkneo essentially as described for human mpl in Example 1. Briefly, the entire coding sequence of mouse mpl (RC Skoda et al., EMBO
J. , Vol. 12, pp. 2645-2653 [1993]), and electroporated (5 ×; linearized) (5 ×).
10 ⁶ cells, 250 volts, 960 μF) with Ba /
Transfected into F3 cells followed by 2 mg / ml
Selected for neomycin resistance by G418.
The expression of mpl was assessed by flow cytometric analysis using rabbit anti-mouse mpl-IgG antiserum. B
a / F3 cells are WEHI- as a source of IL-3
RPMI 1640 medium from 3B cells was maintained. mM
Supernatants from 293 cells transiently transfected with both L and mML-2 were transfected with mmpl and hmpl Ba as described in Example 1.
Assayed on F3 cells.

【０３７６】実施例１３ ブタｍｐｌリガンドｃＤＮＡ ｐＭＬおよびｐＭＬ−２ ブタＭＬ（ｐＭＬ）ｃＤＮＡをＲＡＣＥ ＰＣＲにより
分離した。簡潔に述べると、再生不良性ブタ血清から精
製されたＭＬのアミノ末端をコードしているブタＭＬ遺
伝子のエクソンの配列に基づき、オリゴｄＴプライマー
および２個の特異的プライマーを設計した。様々な再生
不良性ブタの組織から調製されたｃＤＮＡを得、増幅さ
せた。１３４２ｂｐのＰＣＲｃＤＮＡ生成物が腎臓に見
いだされ、これをサブクローニングした。幾つかのクロ
ーンを配列決定すると、成熟ブタｍｐｌリガンド（完全
な分泌シグナルを含まない）をコードしていることが判
明した。このｃＤＮＡは、図２８（配列番号９および１
６）に示される配列を有する３３２アミノ酸の成熟蛋白
（ｐＭＬ₃₃₂)をコードしていることが見いだされた。 Example 13 Porcine mpl ligand cDNA pML and pML-2 Porcine ML (pML) cDNA were separated by RACE PCR. Briefly, an oligo dT primer and two specific primers were designed based on the exon sequence of the porcine ML gene encoding the amino terminus of ML purified from aplastic pig serum. CDNAs prepared from various aplastic pig tissues were obtained and amplified. A 1342 bp PCR cDNA product was found in the kidney, which was subcloned. Several clones were sequenced and found to encode the mature porcine mpl ligand (without the complete secretion signal). This cDNA is shown in FIG. 28 (SEQ ID NOS: 9 and 1).
It was found to encode a 332 amino acid mature protein (pML ₃₃₂ ) having the sequence shown in 6).

【０３７７】方法：ｐＭＬ遺伝子およびｃＤＮＡの分
離。ＥＭＢＬ３（クロンテクＩｎｃ．）中のブタゲノム
ライブラリーをｐＲ４５でスクリーニングすることによ
り、ブタＭＬ遺伝子のゲノムクローンを分離した。この
ライブラリーは、本質的には実施例７に記載のようにス
クリーニングした。幾つかのクローンを分離し、精製さ
れたＭＬから得られたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配
列をコードしているエクソンを配列決定した。ブタＭＬ
ｃＤＮＡは、ＲＡＣＥ ＰＣＲプロトコルの変法を用い
て取得した。２個の特異的ＭＬプライマーを、ブタＭＬ
遺伝子の配列に基づいて設計した。ポリアデニル化ｍＲ
ＮＡは、本質的には前記のようにして再生不良性ブタの
腎臓から分離した。ｍＲＮＡのポリアデノシン尾に対し
て作成されたＢａｍｄＴプライマーMethod: Separation of pML gene and cDNA. A genomic clone of the porcine ML gene was isolated by screening the porcine genomic library in EMBL3 (Clontech Inc.) with pR45. This library was screened essentially as described in Example 7. Several clones were isolated and exons encoding the same amino acid sequence as obtained from purified ML were sequenced. Pig ML
cDNA was obtained using a modification of the RACE PCR protocol. Two specific ML primers were
It was designed based on the sequence of the gene. Polyadenylated mR
NA was isolated from aplastic pig kidneys essentially as described above. BamdT primer generated against polyadenosine tail of mRNA

【化６】(BamdT：5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTT
TTT3'） （配列番号５５)による逆転写によってｃ
ＤＮＡを製造した。ＰＣＲ増幅の最初のラウンド（９５
℃６０秒間、５８℃６０秒間、および７２℃９０秒間を
２８サイクル）を、１００ｍｌの反応（５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ８．
０、０．２ｍＭ ｄＮＴＰを０．０５Ｕ／ｍｌアンプリ
タクポリメラーゼ［パーキン・エルマーＩｎｃ．］と共
に）中で、ＭＬ特異的ｈ−前進−１プライマーEmbedded image (BamdT: 5′GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTT
TTT3 ′) c by reverse transcription with (SEQ ID NO: 55)
DNA was produced. The first round of PCR amplification (95
28 cycles of 60 ° C. for 60 seconds, 58 ° C. for 60 seconds, and 72 ° C. for 90 seconds) in a 100 ml reaction (50 mM KC
1, 1.5 mM MgCl, 10 mM Tris pH8.
0, 0.2 mM dNTPs at 0.05 U / ml Amplitac polymerase [Perkin Elmer Inc. ML-specific h-forward-1 primer

【化７】(h-前進-1：5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTC
ATGCTTCT3'） （配列番号４３）およびＢＡＭＡＤプラ
イマーEmbedded image (h-forward-1: 5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTC
ATGCTTCT3 ') (SEQ ID NO: 43) and BAMAD primer

【化８】（ＢＡＭＡＤ：5'GACTCGAGGATCCATCG3')
（配列番号５６)を用いて実施した。次にこの
ＰＣＲ生成物をＣｌａＩで消化し、フェノール−クロロ
ホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈澱させ、Ｃｌ
ａ１およびＫｐｎ１で切断しておいたブルースクリプト
ＳＫ−ベクター（ストラタジーンｉｎｃ．）０．１ｍｇ
にライゲーションした。室温で２時間インキュベートし
た後、ライゲーション混合物の四分の一を、第二のＭＬ
特異的前進−１プライマー(BAMAD: 5'GACTCGAGGATCCATCG3 ')
(SEQ ID NO: 56). The PCR product is then digested with ClaI, extracted with phenol-chloroform (1: 1), ethanol precipitated,
0.1 mg of Bluescript SK-vector (Stratagene inc.) cut with a1 and Kpn1
Ligation. After incubation at room temperature for 2 hours, a quarter of the ligation mixture was transferred to the second ML
Specific Forward-1 Primer

【化９】(前進-1：5'GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCT
G3') （配列番号５７)およびＴ３−２１（ブ
ルースクリプトＳＫ−ベクター内の多クローニング領域
に隣接する配列に結合するオリゴヌクレオチド）：(Advance-1: 5'GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCT
G3 ′) (SEQ ID NO: 57) and T3-21 (oligonucleotide that binds to a sequence adjacent to the multiple cloning region in Bluescript SK-vector):

【化１０】(5'CGAAATTAACCCTCACTAAAG3') （配
列番号５８)を用いるＰＣＲの第二ラウンド（上記のよ
うな２２サイクル）に直接加えた。得られたＰＣＲ生成
物をＸｂａ１およびＣｌａ１で消化し、ブルースクリプ
トＳＫ−中にサブクローニングした。独立したＰＣＲ反
応からのクローンを幾つか配列決定した。Embedded image was added directly to the second round of PCR (22 cycles as described above) using (5′CGAAATTAACCCTCACTAAAG3 ′) (SEQ ID NO: 58). The resulting PCR product was digested with Xba1 and Cla1 and subcloned into Bluescript SK-. Several clones from independent PCR reactions were sequenced.

【０３７８】さらに、４アミノ酸残基の除去を有する蛋
白（３２８アミノ酸残基）をコードしているｐＭＬ−２
と命名された第二の型を同定した（図３２および図３３
［配列番号２１］を参照されたい）。ｐＭＬとｐＭＬ−
２アミノ酸配列の比較は、後者では残基１１１−１１４
（両端を含む）に対応するテトラペプチドＱＬＰＰが除
去されている外は同一であることを示す（図３４［配列
番号１８および２１］を参照されたい）。マウス、ヒト
およびブタＭＬｃＤＮＡで観察される４個のアミノ酸の
除去は、導き出された蛋白内の正確に同じ位置で起こっ
ている。In addition, pML-2 encoding a protein with three amino acid residues removed (328 amino acid residues)
A second type, identified as (FIGS. 32 and 33)
[See SEQ ID NO: 21]). pML and pML-
A comparison of the two amino acid sequences shows that in the latter, residues 111-114
It is identical except that the tetrapeptide QLPP corresponding to (including both ends) has been removed (see FIG. 34 [SEQ ID NOS: 18 and 21]). The four amino acid deletions observed in mouse, human and porcine ML cDNAs occur at exactly the same position in the derived protein.

【０３７９】実施例１４ トロンボポエチン（ＴＰＯ）による血小板抗原 ＧＰII_bIII_a発現の誘導のためのＣＭＫ検定 ＣＭＫ細胞を、１０％牛胎児血清および１０ｍＭグルタ
ミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ）中に維
持する。検定用の調製において、細胞を収穫し、洗浄
し、５ｍｇ／ｌ牛インシュリン、１０ｍｇ／ｌアポ−ト
ランスフェリン、１ｘ微量元素を添加した無血清ＧＩＦ
培地中に５ｘ１０⁵細胞／ｍｌで再懸濁する。９６ウェ
ル平底プレートにおいて、ＴＰＯ標準または実験試料を
１００μｌ容量中適当な希釈で各ウェルに加える。ＣＭ
Ｋ細胞懸濁液１００μｌを各ウェルに加え、プレートを
５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃で４８時間インキ
ュベートする。インキュベーションの後、プレートを４
℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清を捨て、Ｆ
ＩＴＣにコンジュゲートさせたＧＰII_bIII_aモノクロー
ナル２Ｄ２抗体１００μｌを各ウェルに加える。４℃で
１時間のインキュベーションの後、プレートを再度１０
００ｒｐｍで５分間遠心する。結合していない抗体を含
有する上清を捨て、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ洗液２００
μｌを各ウェルに加える。０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ洗浄
工程を３回反復する。次いで細胞を、相対蛍光強度を測
定する標準的１パラメータ分析を用いるＦＡＳＣＡＮで
分析する。[0379] maintaining a CMK Assay CMK cells for induction of platelet antigens GPII _b III _a Expression by Example 14 thrombopoietin (TPO), in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 10mM glutamine (Sigma). In preparation for the assay, cells were harvested, washed, and serum-free GIF supplemented with 5 mg / l bovine insulin, 10 mg / l apo-transferrin, 1x trace element.
Resuspend at ⁵ × 10 ⁵ cells / ml in medium. In a 96-well flat bottom plate, add a TPO standard or experimental sample to each well at the appropriate dilution in a 100 μl volume. CM
100 μl of K cell suspension is added to each well and the plate is incubated for 48 hours at 37 ° C. in a 5% CO ₂ incubator. After incubation, plate
Centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes. Discard the supernatant,
Add GPII _b III _a monoclonal 2D2 antibody 100μl conjugated to ITC in each well. After 1 hour incubation at 4 ° C., the plate was
Centrifuge at 00 rpm for 5 minutes. The supernatant containing the unbound antibody is discarded and the 0.1% BSA-PBS wash 200
Add μl to each well. Repeat the 0.1% BSA-PBS wash step three times. The cells are then analyzed on a FASCAN using standard one-parameter analysis to measure relative fluorescence intensity.

【０３８０】実施例１５ ９６ウェル微量定量プレート上でのＤＡＭＩ細胞の核内
有糸***活性を測定することによるトロンボポエチン
（ＴＰＯ）のためのＤＡＭＩ検定 ＤＡＭＩ細胞は、１０ｍＭグルタミン、１００ｎｇ／ｍ
ｌペニシリンＧ、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイ
シンを添加したＩＭＤＭ＋１０％ウマ血清（ジブコ）中
に維持する。検定用の調製において、細胞を収穫し、洗
浄し、そしてＩＭＤＭ＋１％ウマ血清中に１ｘ１０⁶細
胞／ｍｌで再懸濁する。９６ウェル丸底プレート中で、
ＴＰＯ標準または実験試料１００μｌをＤＡＭＩ細胞懸
濁液に加える。次いで細胞を５％ＣＯ₂インキュベータ
ー中３７℃で４８時間インキュベートする。インキュベ
ーションの後、プレートをソルヴォール６０００Ｂ遠心
機中で、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清
を捨て、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ２００μｌの洗浄工程
を反復する。氷冷７０％エタノール−ＰＢＳ２００μｌ
の添加により細胞を固定し、吸引により再懸濁する。４
℃１５分間のインキュベーションの後、プレートを２０
００ｒｐｍで５分間遠心し、０．１ｍｇ／ｍｌ沃化プロ
ピジウムおよび０．０５％トゥイーン−２０を含有する
１ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼ１５０μｌを各ウェルに加え
る。３７℃で１時間のインキュベーション後、ＤＮＡ含
有量の変化をフローサイトメトリーにより測定する。多
能性を測定し以下のように定量化する： Example 15 Nuclear Nuclei of DAMI Cells on a 96-well Microtiter Plate
Thrombopoietin by measuring mitotic activity
DAMI assay for (TPO) DAMI cells were 10 mM glutamine, 100 ng / m
Maintain in IMDM + 10% horse serum (Dibco) supplemented with 1 penicillin G and 50 μg / ml streptomycin. In preparation for the assay, cells are harvested, washed, and resuspended at 1 × 10 ⁶ cells / ml in IMDM + 1% horse serum. In a 96-well round bottom plate,
Add 100 μl of TPO standard or experimental sample to DAMI cell suspension. The cells are then incubated for 48 hours at 37 ° C. in a 5% CO ₂ incubator. After the incubation, the plates are centrifuged in a Sorvall 6000B centrifuge at 4 ° C., 1000 rpm for 5 minutes. Discard the supernatant and repeat the washing step with 200 μl of PBS-0.1% BSA. Ice-cold 70% ethanol-PBS 200μl
The cells are fixed by the addition of and resuspended by suction. 4
After 15 minutes incubation at 20 ° C., the plate is
Centrifuge at 00 rpm for 5 minutes and add 150 μl of 1 mg / ml RNase containing 0.1 mg / ml propidium iodide and 0.05% Tween-20 to each well. After 1 hour incubation at 37 ° C., the change in DNA content is measured by flow cytometry. Pluripotency is measured and quantified as follows:

【数２】 (Equation 2)

【０３８１】実施例１６ インビボ検定でのトロンボポエチン（ＴＰＯ）（マウス
血小板リバウンド検定）血小板産生の³⁵Ｓ測定のための
インビボ検定 血小板減少症を誘発するため、Ｃ５７ＢＬ６マウス（チ
ャールズ・リヴァーより入手）にヤギ抗マウス血小板血
清（６ａｍｐ）１ｍｌを第１日目に腹腔内（ＩＰ）注射
する。５および６日目に、該因子または対照としてのＰ
ＢＳをマウスに２回ＩＰ注射する。７日目に、０．１ｍ
ｌ食塩水中のＮａ₂ ³⁵ＳＯ₄３０μＣｉを静脈内注射し、
注射された用量の、循環血小板中への³⁵Ｓ取り込みパー
セントを、処置および対照マウスから得られた血液試料
で測定する。血小板計数および白血球計数を、後眼窩洞
から得られた血液で同時に行う。 Example 16 Thrombopoietin (TPO) in an in vivo assay (mouse
Platelet rebound assay) for ³⁵ S measurement of platelet production
In Vivo Assay To induce thrombocytopenia, C57BL6 mice (obtained from Charles River) are injected intraperitoneally (IP) on day 1 with 1 ml of goat anti-mouse platelet serum (6 amp). On days 5 and 6, the factor or P as control
The mice are IP injected twice with the BS. On the 7th day, 0.1m
intravenous injection of 30 μCi of Na ₂ ³⁵ SO _{4 in} 1 saline
The percent of ³⁵ S incorporation into circulating platelets of the injected dose is measured in blood samples obtained from treated and control mice. Platelet and leukocyte counts are performed simultaneously on blood obtained from the retro-orbital sinus.

【０３８２】実施例１７ ｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤキメラレセプターの燐酸化を測定
することによるトロンボポエチン（ＴＰＯ）のためのＫ
ＩＲＡ ＥＬＩＳＡ ヒトｍｐｌレセプターがヴィゴン等、ＰＮＡＳ、ＵＳ
Ａ、８９巻５６４０−５６４４頁（１９９２）により開
示されている。ｍｐｌレセプターの細胞外ドメイン（Ｅ
ＣＤ）ならびにカルボキシ末端フラッグポリペプチドを
伴うＲｓｅ（マーク等、J.of Biol.Chem.、２６９（１
４）巻１０７２０−１０７２８頁［１９９４］）の貫膜
（ＴＭ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）（即ち、Ｒｓ
ｅ.ｇＤ）からなるキメラレセプターを、本明細書に記
載のＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡへの使用のために作成した。
この検定の図式的説明については、図４８、４９および
５０を参照されたい。 Example 17 Measurement of phosphorylation of mpl-Rse.gD chimeric receptor
K for thrombopoietin (TPO)
IRA ELISA Human mpl Receptor is Vigon et al., PNAS, US
A, 89, 5640-5644 (1992). mpl receptor extracellular domain (E
CD) and Rse with carboxy terminal flag polypeptide (Mark et al., J. of Biol. Chem., 269 (1
4) The transmembrane (TM) and intracellular domain (ICD) of Volumes 10720-10728 [1994]), ie, Rs
e.gD) was made for use in the KIRA ELISA described herein.
See FIGS. 48, 49 and 50 for a schematic description of this assay.

【０３８３】（ａ）捕捉物質の調製 モノクローナル抗ｇＤ（クローン５Ｂ６）を、単純ヘル
ペス糖蛋白Ｄ由来のペプチドに対して生成させた（パボ
ルスキー等、Protein Engineering、３（６）巻５４７
−５５３頁［１９９０］）。精製された保存調製物を燐
酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で３．０ｍｇ／
ｍｌに調節し、１．０ｍｌアリコートを−２０℃で保存
した。(A) Preparation of Capture Substance Monoclonal anti-gD (clone 5B6) was generated against a peptide derived from herpes simplex glycoprotein D (Pabolsky et al., Protein Engineering, 3 (6) Vol. 547).
-553 [1990]). The purified stock preparation was prepared at 3.0 mg / pH in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4.
Adjusted to 1.0 ml and stored a 1.0 ml aliquot at −20 ° C.

【０３８４】（ｂ）抗ホスホチロシン抗体の調製 モノクローナル抗ホスホチロシン、クローン４Ｇ１０を
ＵＢＩ（レイク・プラシッド、ＮＹ）から購入し、長腕
ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ビオチン−
Ｘ−ＮＨＳ、リサーチ・オーガニクス、クリーヴラン
ド、ＯＨ）を用いてビオチニル化した。(B) Preparation of anti-phosphotyrosine antibody Monoclonal anti-phosphotyrosine, clone 4G10, was purchased from UBI (Lake Placid, NY), and long-arm biotin-N-hydroxysuccinamide (biotin-
X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

【０３８５】（ｃ）リガンド ｍｐｌリガンドは本明細書に記載の組換え技術により調
製した。精製されたｍｐｌリガンドを保存溶液として４
℃で保存した。(C) Ligands The mpl ligand was prepared by the recombinant techniques described herein. Using purified mpl ligand as stock solution 4
Stored at ° C.

【０３８６】（ｄ）Ｒｓｅ.ｇＤ核酸の調製 合成二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてヒトＲｓｅのＣ
末端の１０アミノ酸（８８０−８９０）のためのコード
化配列を再構成し、抗体５Ｂ６に対するエピトープおよ
び停止コドンを含むさらなる２１のアミノ酸を付け加え
た。表１０は、この融合遺伝子の合成部分の最終的な配
列を示す。(D) Preparation of Rse.gD nucleic acid The Cse of human Rse was synthesized using a synthetic double-stranded oligonucleotide.
The coding sequence for the last 10 amino acids (880-890) was reconstructed, adding an additional 21 amino acids including an epitope for antibody 5B6 and a stop codon. Table 10 shows the final sequence of the synthetic portion of this fusion gene.

【表１１】 [Table 11]

【０３８７】この合成ＤＮＡを、公表されているヒトＲ
ｓｅ ｃＤＮＡ配列（マーク等、Journal of Biological
Chemistry、２６９（１４）巻１０７２０−１０７２８
頁［１９９４］）のヌクレオチド２６４４で始まるＰｓ
ｔＩ部位および発現ベクターｐＳＶＩ７.ＩＤ.ＬＬのポ
リリンカー中のＨｉｎｄIII部位でヒトＲｓｅのアミノ
酸１−８８０をコードしているｃＤＮＡとライゲーショ
ンし（図５１−６２；配列番号２２を参照されたい）、
発現プラスミドｐＳＶ.ＩＤ.Ｒｓｅ.ｇＤを作り出し
た。簡潔に述べると、この発現プラスミドは、５'スプ
ライスドナーおよび３'スプライスアクセプターイント
ロンスプライス部位を境界とするＤＨＦＲをコードして
いる配列とその後のＲｓｅ.ｇＤをコードしている配列
を含む二シストロン性一次転写物からなる。全長の（ス
プライスされていない）メッセージは、第一のオープン
リーディングフレームとしてＤＨＦＲを含み、故に安定
な形質転換体の選択を可能とするためのＤＨＦＲ蛋白を
生成する。The synthetic DNA was used to publish human R
se cDNA sequence (Mark etc., Journal of Biological
Chemistry, 269 (14), 10720-10728
Ps starting at nucleotide 2644 of page [1994])
Ligation with the cDNA encoding amino acids 1-880 of human Rse at the Hin site in the polylinker of the tI site and the expression vector pSVI7.ID.LL (Figures 51-62; see SEQ ID NO: 22),
The expression plasmid pSV.ID.Rse.gD was created. Briefly, this expression plasmid contains a bicistron containing a sequence encoding DHFR bounded by a 5 'splice donor and a 3' splice acceptor intron splice site followed by a sequence encoding Rse.gD. Transcripts. The full-length (unspliced) message contains DHFR as the first open reading frame, thus producing a DHFR protein to allow for the selection of stable transformants.

【０３８８】（ｅ）ｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤ核酸の調製 上記のようにして生産された発現プラスミドｐＳＶ.Ｉ
Ｄ.Ｒｓｅ.ｇＤを修飾して、Ｒｓｅ.ｇＤの貫膜ドメイ
ンおよび細胞内ドメイン（アミノ酸４２９−９１１）と
融合したヒトｍｐｌのＥＣＤ（アミノ酸１−４９１）の
コード化配列を含むプラスミドｐＳＶ.ＩＤ.Ｍ.ｔｍＲ
ｄ６を生成させた。合成オリゴヌクレオチドを使用し
て、マーク等、J.Biol.Chem.、２６７巻２６１６６−２
６１７１頁(１９９２)に記載のような二段階ＰＣＲクロ
ーニング反応で、ヒトｍｐｌの細胞外ドメインの一部の
コード化配列をＲｓｅコード化配列の一部と結合させ
た。第一のＰＣＲ反応に使用されたプライマーは、ｍｐ
ｌ ｃＤＮＡ鋳型と共に、Ｍ１(E) Preparation of mpl-Rse.gD nucleic acid Expression plasmid pSV.I produced as described above
D. Rse.gD, a plasmid pSV.ID containing the coding sequence for human mpl ECD (amino acids 1-491) fused to the transmembrane and intracellular domains (amino acids 429-911) of Rse.gD .M.tmR
d6 was generated. Using synthetic oligonucleotides, Mark et al., J. Biol. Chem., 267: 26166-2.
In a two-step PCR cloning reaction as described on page 6171 (1992), the coding sequence for a portion of the extracellular domain of human mpl was linked to a portion of the Rse coding sequence. Primers used in the first PCR reaction were mp
M1 with l cDNA template

【化１１】 およびＭ２Embedded image And M2

【化１２】 ならびにＲｓｅ ｃＤＮＡ鋳型と共に、Ｒ１Embedded image And Rse cDNA template together with R1

【化１３】 およびＲ２Embedded image And R2

【化１４】 であった。この融合接合部のＰｖｕII−ＳｍａＩ部分を
使用して全長のキメラレセプターの組み立てを行った。Embedded image Met. Using the PvuII-SmaI portion of the fusion junction, a full-length chimeric receptor was assembled.

【０３８９】（ｆ）細胞の形質転換 プラスミドバックボーン中の特異なＮｏｔＩ部位で線状
化しておいたｐＳＶ.ＩＤ.Ｍ.ｔｍＲｄ６により、ＤＰ
１２.ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３
０７２４７）を電気穿孔した。フェノール／クロロホル
ム抽出の後ＤＮＡをエタノール沈澱させ、１／１０トリ
スＥＤＴＡ２０μｌに再懸濁した。次に、ＤＮＡ１０μ
ｇをＰＢＳ１ｍｌ中で１０⁷のＣＨＯ ＤＰ１２細胞と氷
上で１０分間インキュベートし、その後４００ボルトお
よび３３０μｆで電気穿孔した。細胞を氷に１０分間戻
し、その後非選択培地に蒔いた。２４時間後、細胞に無
ヌクレオシド培地を与え、安定なＤＨＦＲ＋クローンを
選択した。(F) Cell Transformation pSV.ID.M.tmRd6, which had been linearized at a unique NotI site in the plasmid backbone,
12. CHO cells (EP3 published March 15, 1989)
07247) was electroporated. After phenol / chloroform extraction, the DNA was ethanol precipitated and resuspended in 20 μl of 1/10 Tris EDTA. Next, DNA 10μ
g were incubated with 10 ⁷ CHO DP12 cells in 1 ml of PBS on ice for 10 minutes before electroporation at 400 volts and 330 μf. Cells were returned to ice for 10 minutes before plating on non-selective medium. Twenty-four hours later, cells were fed nucleoside-free medium and stable DHFR + clones were selected.

【０３９０】（ｇ）ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡへの使用のた
めの形質転換細胞の選択 ＭＰＬ／Ｒｓｅ.ｇＤを発現するクローンを、ｇＤエピ
トープ標識を検出する抗体５Ｂ６を使用して、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる分画後の全細胞溶菌液のウェスタンブロ
ッティングにより同定した。(G) Selection of Transformed Cells for Use in KIRA ELISA Clones expressing MPL / Rse.gD were cloned using SDS-antibody 5B6, which detects the gD epitope tag.
The whole cell lysate after fractionation by PAGE was identified by Western blotting.

【０３９１】（ｈ）培地 細胞はＦ１２／ＤＭＥＭ ５０：５０（ジブコ／ＢＲ
Ｌ、ライフ・テクノロジーズ、グランド・アイランド、
ＮＹ）中で増殖させた。この培地に１０％ダイアフィル
トレーションＦＢＳ（ハイクローン、ローガン、ユ
タ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミ
ンを添加した。(H) Medium The cells were F12 / DMEM 50:50 (Jibco / BR)
L, Life Technologies, Grand Island,
NY). To this medium was added 10% diafiltration FBS (HiClone, Logan, Utah), 25 mM HEPES and 2 mM L-glutamine.

【０３９２】（ｉ）ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ ｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤで形質転換されたＤＰ１２.ＣＨＯ
細胞を平底９６ウェル培養プレートのウェル中の培地１
００μｌに蒔き（ウェル当たり３ｘ１０⁴）、５％ＣＯ₂
中３７℃で一夜培養した。翌朝、ウェルの上清をデカン
テーションし、プレートをペーパータオル上で軽く突き
固めた。次に、被験試料または２００、５０、１２．
５、３．１２、０．７８、０．１９、０．０４８、もし
くは０ｎｇ／ｍｌのｍｐｌリガンドのいずれかを含有す
る培地５０μｌを各ウェルに加えた。細胞を３７℃で３
０分間刺激し、ウェルの上清をデカンテーションし、そ
してプレートを再度ペーパータオル上で軽く突き固め
た。細胞を溶菌しキメラレセプターを可溶化するため、
溶菌緩衝液１００μｌを各ウェルに加えた。溶菌緩衝液
は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ジブコ）を含有する１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％トリトン−Ｘ１００（ジブ
コ）、０．０１％チメロサール、３０ＫＩＵ／ｍｌアプ
ロチニン（ＩＣＮバイオケミカルズ、オーロラ、Ｏ
Ｈ）、１ｍＭ４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスル
ホニルフルオリドヒドロクロリド（ＡＥＢＳＦ；ＩＣＮ
バイオケミカルズ）、５０μＭロイペプチン（ＩＣＮバ
イオケミカルズ）、および２ｍＭオルトバナジン酸ナト
リウム（Ｎａ₃ＶＯ₄；シグマ・ケミカル・Ｃｏ．、セン
トルイス、ＭＯ）、ｐＨ７．５、で構成されていた。次
いでこのプレートをプレート振盪機（ベルコ・インスト
ルメンツ、ヴァインランド、ＮＪ）上で、室温で６０分
間穏やかに攪拌した。(I) DP12.CHO transformed with KIRA ELISA mpl-Rse.gD
Cells were plated in medium 1 in the wells of a flat bottom 96-well culture plate.
Seed in 00 μl (3 × 10 ⁴ per well), 5% CO ₂
Incubated at 37 ° C overnight. The next morning, the supernatant from the wells was decanted and the plates were gently tamped on paper towels. Next, the test sample or 200, 50, 12.
50 μl of medium containing either 5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 or 0 ng / ml mpl ligand was added to each well. Cells are incubated at 37 ° C for 3 hours.
Stimulated for 0 min, decanted well supernatants, and tamped plates again on paper towels. To lyse the cells and solubilize the chimeric receptor,
100 μl of lysis buffer was added to each well. The lysis buffer was 150 mM containing 50 mM HEPES (Jibco).
mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (Jibco), 0.01% thimerosal, 30 KIU / ml aprotinin (ICN Biochemicals, Aurora, O
H) 1 mM 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF; ICN
Biochemicals), 50 μM leupeptin (ICN Biochemicals), and 2 mM sodium orthovanadate (Na ₃ VO ₄ ; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), pH 7.5. The plate was then gently agitated on a plate shaker (Belco Instruments, Vineland, NJ) for 60 minutes at room temperature.

【０３９３】細胞を可溶化している間に、５Ｂ６モノク
ローナル抗ｇＤ抗体により４℃で一夜被覆（５０ｍＭ炭
酸緩衝液、ｐＨ９．６中５．０μｇ／ｍｌ。１００μｌ
／ウェル。）したＥＬＩＳＡ微量定量プレート（ナンク
・マキシソープ、インター・メド、デンマーク）をデカ
ンテーションし、ペーパータオル上で突き固め、１５０
μｌ／ウェルのブロック緩衝液［０．５％ＢＳＡ（イン
タージェン・カンパニー、パーチェス、ＮＹ）および
０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ］で、穏やか
に攪拌しながら室温で６０分間ブロックした。６０分
後、この抗ｇＤ ５Ｂ６被覆プレートを、自動プレート
洗浄器（スキャンウォッシャー３００、スカトロン・イ
ンストルメンツ、Ｉｎｃ．、スターリング、ＶＡ）を用
いて６回洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン−２０およ
び０．０１％チメロサールを含有するＰＢＳ）で洗浄し
た。While solubilizing cells, coat overnight with 4B6 monoclonal anti-gD antibody at 4 ° C. (5.0 μg / ml in 50 mM carbonate buffer, pH 9.6; 100 μl
/ Well. ) The ELISA microtiter plate (Nanck Maxisorp, Inter Med, Denmark) was decanted, tamped on a paper towel,
Blocked with μl / well of blocking buffer [PBS containing 0.5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY) and 0.01% thimerosal] for 60 minutes at room temperature with gentle agitation. After 60 minutes, the anti-gD 5B6 coated plate was washed six times with wash buffer (0.05% Tween-20 and (PBS containing 0.01% thimerosal).

【０３９４】細胞培養微量定量ウェルからの可溶化ＭＰ
Ｌ／Ｒｓｅ.ｇＤを含有する溶菌液を、抗ｇＤ ５Ｂ６で
被覆されそして遮断されたＥＬＩＳＡウェルに移し（８
５μｌ／ウェル）、穏やかに攪拌しながら室温で２時間
インキュベートした。結合していないｍｐｌ−Ｒｓｅ.
ｇＤを洗浄緩衝液で洗浄することにより除去し、希釈緩
衝液（０．５％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０１％チメロサールを含有
するＰＢＳ）で１：１８０００に希釈した、即ち５６ｎ
ｇ／ｍｌのビオチニル化４Ｇ１０（抗ホスホチロシン）
１００μｌを各ウェルに加えた。室温で２時間インキュ
ベートした後、プレートを洗浄し、希釈緩衝液で１：６
００００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰＯ）にコンジュゲートさせたストレプトアビジン
（ザイムド・ラボラトリーズ、Ｓ．サンフランシスコ、
ＣＡ）１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを穏や
かに攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。
遊離のアビジンコンジュゲートを洗浄除去し、新たに調
製した基質溶液（テトラメチルベンジジン［ＴＭＢ］；
２成分基質キット；カークガード・アンド・ペリー、ガ
イザーズバーグ、ＭＤ）１００μｌを各ウェルに加え
た。反応を１０分間進行させ、その後１００μｌ／ウェ
ルの１．０Ｍ Ｈ₃ＰＯ₄の添加により発色を止めた。マ
ッキントッシュ・セントリス６５０（アップル・コンピ
ューターズ、クパティーノ、ＣＡ）およびデルタソフト
のソフトウェア（バイオメタリクス、Ｉｎｃ．、プリン
ストン、ＮＪ）で制御されるｖｍａｘプレート読み取り
機（モレキュラー・ディヴァイシズ、パロアルト、Ｃ
Ａ）を使用して、６５０ｎｍの対照波長で４５０ｎｍの
吸収を読み取った（ＡＢＳ_450/650）。Solubilized MP from cell culture microtiter wells
The lysate containing L / Rse.gD was transferred to ELISA wells coated and blocked with anti-gD5B6 (8
(5 μl / well) for 2 hours at room temperature with gentle agitation. Unbound mpl-Rse.
gD was removed by washing with wash buffer and dilution buffer (0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 5
1:18 000 diluted with PBS containing 1 mM mM EDTA and 0.01% thimerosal, ie 56 n
g / ml biotinylated 4G10 (anti-phosphotyrosine)
100 μl was added to each well. After incubation for 2 hours at room temperature, the plates are washed and diluted 1: 6 with dilution buffer.
Horseradish peroxidase (H
RPO) conjugated to streptavidin (Zymed Laboratories, S. San Francisco,
CA) 100 μl was added to each well. Plates were incubated for 30 minutes at room temperature with gentle agitation.
The free avidin conjugate was washed away and the newly prepared substrate solution (tetramethylbenzidine [TMB];
100 μl of a two-component substrate kit; Kirkguard and Perry, Geysersburg, MD) was added to each well. The reaction was allowed to proceed for 10 minutes, after which color development was stopped by the addition of 100 μl / well of 1.0 MH ₃ PO ₄ . A vmax plate reader (Molecular Devices, Palo Alto, C.) controlled by Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, Calif.) And Deltasoft software (Biometallics, Inc., Princeton, NJ).
A) was used to read the absorbance at 450 nm at a control wavelength of 650 nm (ABS _450/650 ).

【０３９５】ｄｐ１２.ｔｒｋＡ、ＢまたはＣ.ｇＤ細胞
を２００、５０、１２．５、３．１２、０．７８、０．
１９、０．０４８もしくは０ｎｇ／ｍｌのｍｐｌリガン
ドで刺激することにより標準曲線を作成し、デルタソフ
トのプログラムを用いて平均ＡＢＳ_450/650±ｓｄに対
するｎｇ／ｍｌ ＴＰＯとして表した。試料濃度を標準
曲線にそれらの吸収を内挿することにより得、ｎｇ／ｍ
ｌ ＴＰＯ活性として表した。Dp12.trkA, B or C. gD cells were prepared at 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.
A standard curve was generated by stimulating with 19, 0.048 or 0 ng / ml mpl ligand and expressed as ng / ml TPO against mean ABS _450/650 ± sd using the program _Deltasoft . Sample concentrations were obtained by interpolating their absorbance into a standard curve, ng / m
1 Expressed as TPO activity.

【０３９６】ｍｐｌリガンドは、濃度依存的且つリガン
ド特異的にｍｐｌ−Ｒｓｅ.ｇＤキメラレセプターを活
性化できることが判明した。さらに、ｍｐｌ−Ｒｓｅ.
ｇＤＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡは、１００％ヒト血清（示さ
れている）または１００％血漿（示されていない）まで
寛容されることが見いだされ、この事は、この検定を患
者およびｐＫ試料の容易なスクリーニングに使用するこ
とを可能にする。The mpl ligand was found to be able to activate the mpl-Rse.gD chimeric receptor in a concentration-dependent and ligand-specific manner. Further, mpl-Rse.
The gDKIRA-ELISA was found to be tolerated to 100% human serum (shown) or 100% plasma (not shown), which makes this assay easy to screen for patient and pK samples. Enable to use.

【化１５】 Embedded image

【０３９７】[0397]

【表１２】 ＴＰＯ ＥＣ５０のまとめ ＥＣ５０ ＥＣ５０ ＴＰＯ型（細胞） （ｗｔ／ｖｏｌ） （モル濃度） ＨｕＴＰＯ３３２（２９３） ２.５６ｎｇ／ｍｌ ６７.４ｐＭ ＭｕＴＰＯ３３２（２９３） ３.６９ｎｇ／ｍｌ ９７.１ｐＭ ＨｕＴＰＯ１５３（２９３） 〜４１ｎｇ／ｍｌ 〜１.０８ｎＭ ＨｕＴＰＯ１５５（大腸菌） ０.４４ｎｇ／ｍｌ １１.６ｐＭＨｕＴＰＯ１５３met（大腸菌） ０.８２９ｎｇ／ｍｌ ２１.８ｐＭ Table 12: Summary of TPO EC50 EC50 EC50 TPO type (cell) (wt / vol) (molarity) HuTPO332 (293) 2.56 ng / ml 67.4 pM MuTPO332 (293) 3.69 ng / ml 97.1 pM HuTPO153 293) ４１41 ng / ml １1.08 nM HuTPO155 (E. coli) 0.44 ng / ml 11.6 pM HuTPO153met (E. coli) 0.829 ng / ml 21.8 pM

【０３９８】実施例１８ トロンボポエチン（ＴＰＯ）のための、レセプターに基
づくＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６の炭酸緩衝液中のウ
サギＦ(ａｂ')₂抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）により４℃で一夜
被覆した。プレートを、ＰＢＳ中の０．５％牛血清アル
ブミンにより室温で１時間ブロックした。キメラレセプ
ター、ｍｐｌ−ＩｇＧを含有する発酵収穫物をこのプレ
ートに加え、２時間インキュベートした。０．５％牛血
清アルブミン、０．０５％トゥイーン２０に入れた標準
（定量的アミノ酸分析により決定された濃度の、２９３
細胞中で産生されたＴＰＯ₃₃₂）の二倍連続希釈液
（０．３９−２５ｎｇ／ｍｌ）および連続希釈試料をプ
レートに加え、２時間インキュベートした。大腸菌で産
生されたＴＰＯ₁₅₅に対するプロテインＡ精製されたビ
オチニル化ウサギ抗体（１時間のインキュベーショ
ン）、その後ストレブトアビジン−ペルオキシダーゼ
（３０分間のインキュベーション）および基質としての
３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンによって、結
合したＴＰＯを検出した。吸収を４５０ｎｍで読み取っ
た。プレートは工程の間に洗浄した。データ分析のた
め、カレイダグラフによる４パラメータ曲線当てはめプ
ログラムを用いて標準曲線を当てはめた。試料の濃度を
標準曲線から算出した。 Example 18 Receptor based for thrombopoietin (TPO)
The ELISA plate was coated overnight at 4 ° C. with rabbit F (ab ′) ₂ anti-human IgG (Fc) in pH 9.6 carbonate buffer. Plates were blocked with 0.5% bovine serum albumin in PBS for 1 hour at room temperature. Fermented harvest containing the chimeric receptor, mpl-IgG, was added to the plate and incubated for 2 hours. Standard in 0.5% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 (293% of the concentration determined by quantitative amino acid analysis).
Two-fold serial dilutions (0.39-25 ng / ml) of TPO ₃₃₂ ) produced in the cells and serially diluted samples were added to the plates and incubated for 2 hours. Protein A purified biotinylated rabbit antibody against TPO ₁₅₅ produced in E. coli (1 hour incubation) followed by streptavidin-peroxidase (30 minute incubation) and 3,3 ', 5,5'- as substrate. Bound TPO was detected by tetramethylbenzidine. The absorption was read at 450 nm. Plates were washed between steps. For data analysis, standard curves were fitted using a Kaleidagraph 4-parameter curve fitting program. The concentration of the sample was calculated from the standard curve.

【０３９９】実施例１９ ２９３細胞からのＴＰＯの発現および精製 １．２９３細胞発現ベクターの調製 ＴＰＯの全オープンリーディングフレームに対応するｃ
ＤＮＡを、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用するＰＣＲによって取得した： Example 19 Expression and purification of TPO from 293 cells 1. Preparation of 293 cell expression vector c corresponding to the entire open reading frame of TPO
DNA was obtained by PCR using the following oligonucleotides as primers:

【表１３】 [Table 13]

【０４００】ＰＲＫ５−ｈｍｐｌ Ｉ（実施例９に記
載）を、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）
の存在下での反応の鋳型として使用した。最初の変性は
９４℃で７分間、続いて２５サイクルの増幅（９４℃１
分間、５５℃１分間、および７２℃１分間）を行った。
最後の伸長は７２℃で１５分間であった。このＰＣＲ生
成物を精製し、チミジンキナーゼプロモーターの調節下
にネオマイシン耐性遺伝子を発現するよう修飾したｐＲ
Ｋ５から誘導されるベクターであるプラスミドｐＲＫ５
ｔｋｎｅｏの制限部位ＣｌａＩおよびＸｂａＩの間にク
ローニングして、ベクターｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ.ＯＲＦ
を得た。ｅｐｏホモローガスドメインに対応する第二の
組み立て物は、前進プライマーとしてのＣｌａ.ＦＬ.Ｆ
および以下の逆プライマー：PRK5-hmpl I (described in Example 9) was replaced with pfu DNA polymerase (Stratagene).
Was used as a template for the reaction in the presence of Initial denaturation was at 94 ° C for 7 minutes, followed by 25 cycles of amplification (94 ° C 1
Min, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute).
The final extension was at 72 ° C. for 15 minutes. The PCR product was purified and modified with a pR modified to express a neomycin resistance gene under the control of the thymidine kinase promoter.
Plasmid pRK5, a vector derived from K5
Cloned between the restriction sites ClaI and XbaI of tkneo, the vector pRK5tkneo.ORF
I got The second assembly corresponding to the epo homologous domain is Cla.FL.F as the forward primer.
And the following reverse primer:

【化１６】 を使用する外は同じ方法で作成した。最終組み立て物は
ｐＲＫ５−tkneoＥＰＯ−Ｄと呼ばれる。両組み立て物
の配列は実施例７に記載のように確認された。Embedded image Use the same method except for using. The final assembly is called pRK5-tkneoEPO-D. The sequence of both assemblies was confirmed as described in Example 7.

【０４０１】２．ヒト胚腎細胞のトランスフェクション これらの２組み立て物を、実施例９に記載のようにＣａ
ＰＯ₄法によりヒト胚腎細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの２４時間後、０．４ｍｇ／ｍｌ
Ｇ４１８.１０の存在下にネオマイシン耐性クローンの
選択を開始し、１５日後に個々のコロニーを９６ウェル
プレートに移し、密集するまで増殖させた。条件培地に
おけるこれらのクローンからのＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂の
発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖検定（実施例１に記
載）を用いて評価した。[0401] 2. Transfection of Human Embryonic Kidney Cells These two constructs were prepared as described in
It was transfected into human embryonic kidney cells by PO ₄ method.
24 hours after transfection, 0.4 mg / ml
Selection of neomycin resistant clones was started in the presence of G418.10, and after 15 days individual colonies were transferred to 96-well plates and grown to confluence. Expression of ML ₁₅₃ or ML ₃₃₂ from these clones in conditioned media was assessed using the Ba / F3-mpl proliferation assay (described in Example 1).

【０４０２】３．ｒｈＭＬ₃₃₂の精製 ２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂条件培地を、１０ｍＭ燐酸ナトリ
ウムｐＨ７．４（緩衝液Ａ）で平衡化したブルー−セフ
ァロース（ファルマシア）カラムに適用した。続いてこ
のカラムを、緩衝液Ａおよび２Ｍ尿素を含有する緩衝液
Ａ各々１０カラム容量で洗浄した。次にカラムを２Ｍ尿
素および１Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで溶出し
た。次いでこのブルー−セファロース溶出プールを、緩
衝液Ａで平衡化したＷＧＡ−セファロースカラムに直接
適用した。次にＷＧＡ−セファロースカラムを、２Ｍ尿
素および１Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ １０カラム
容量で洗浄し、０．５Ｍ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンを含有する同じ緩衝液で溶離した。ＷＧＡ−セファ
ロース溶出液を、０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ４−Ｈ
ＰＬＣカラム（シンクロム、Ｉｎｃ．）に適用した。Ｃ
４−ＨＰＬＣカラムを不連続プロパノール勾配（０−２
５％、２５−３５％、３５−７０％）で溶出した。ｒｈ
ＭＬ₃₃₂は、この勾配の２８−３０％プロパノール領域
で溶出することが判明した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
と、精製されたｒｈＭＬ₃₃₂は、ゲルの６８−８０ｋＤ
ａ領域の幅広いバンドとして移動する（図２３を参照さ
れたい）。[0402] 3. was applied to Sepharose (Pharmacia) column - purified 293-RHML ₃₃₂ conditioned media RHML _332, Blue equilibrated with 10mM sodium phosphate pH 7.4 (buffer A). The column was subsequently washed with 10 column volumes each of buffer A and buffer A containing 2M urea. The column was then eluted with buffer A containing 2M urea and 1M NaCl. This Blue-Sepharose elution pool was then applied directly to a WGA-Sepharose column equilibrated with Buffer A. The WGA-Sepharose column was then washed with 10 column volumes of buffer A containing 2 M urea and 1 M NaCl and eluted with the same buffer containing 0.5 M N-acetyl-D-glucosamine. The WGA-Sepharose eluate was washed with C4-H equilibrated with 0.1% TFA.
Applied to a PLC column (Sinchrome, Inc.). C
The 4-HPLC column was run on a discontinuous propanol gradient (0-2).
(5%, 25-35%, 35-70%). rh
ML ₃₃₂ was found to elute in the 28-30% propanol region of this gradient. According to SDS-PAGE, rhML ₃₃₂ purified, the gel 68-80kD
Move as a broad band in region a (see FIG. 23).

【０４０３】４．ｒｈＭＬ₁₅₃の精製 ２９３−ｒｈＭＬ₁₅₃条件培地をｒｈＭＬ₃₃₂について記
載されたようにブルー−セファロースで分離した。この
ブルー−セファロース溶出液を上記のようにｍｐｌ親和
カラムに直接適用した。ｍｐｌ親和カラムから溶出した
ｒｈＭＬ₁₅₃を、ｒｈＭＬ₃₃₂について記載されたものと
同じ条件で稼働させるＣ４−ＨＰＬＣカラムを用いて均
質となるまで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製
されたｒｈＭＬ₁₅₃はＭｒ〜１８０００−２１０００の
２個の主要なおよび２個の重要性の低いバンドに分離す
る（図２３を参照されたい）。[0403] 4. Blue purified 293-RHML ₁₅₃ conditioned media RHML ₁₅₃ as described for RHML ₃₃₂ - were separated by Sepharose. This blue-Sepharose eluate was applied directly to the mpl affinity column as described above. The RHML ₁₅₃ eluted from the mpl affinity column was purified to homogeneity using a C4-HPLC column to run under the same conditions as those described for RHML _332. By SDS-PAGE, the purified rhML ₁₅₃ separates into two major and two minor bands of Mr-18000-21000 (see Figure 23).

【０４０４】実施例２０ ＣＨＯからのＴＰＯの発現および精製 １．ＣＨＯ発現ベクターの説明 下記の電気穿孔プロトコルで使用される発現ベクター
は、ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦ（全長またはｈ
ＴＰＯ₃₃₂）、および、ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰ
Ｏ−Ｄ（末端切除されたまたはｈＴＰＯ₁₅₃)と命名され
た。これらのプラスミドの関連する特徴を図３５および
３６に示す。 Example 20 Expression and Purification of TPO from CHO Description of CHO expression vector The expression vector used in the electroporation protocol described below is pSVI5.ID.LL.MLORF (full length or h
TPO ₃₃₂ ) and pSVI5.ID.LL.MLEP
It was named O-D (truncated or hTPO ₁₅₃ ). The relevant features of these plasmids are shown in FIGS.

【０４０５】２．ＣＨＯ発現ベクターの調製 ｈＴＰＯの全オープンリーディングフレームに対応する
ｃＤＮＡは、表１４のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いるＰＣＲによって取得した。[0405] 2. Preparation of CHO Expression Vector cDNA corresponding to the entire open reading frame of hTPO was obtained by PCR using the oligonucleotide primers in Table 14.

【表１４】 [Table 14]

【０４０６】ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩ（実施例７および９
に記載）を、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジー
ン）の存在下でこの反応のための鋳型として使用した。
最初の変性は９４℃で７分間、引き続き２５サイクルの
増幅（９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分
間）を行った。最後の伸長は７２℃で１５分間であっ
た。このＰＣＲ生成物を精製し、プラスミドｐＳＶＩ
５.ＩＤ.ＬＬの制限部位ＣｌａＩおよびＳａｌＩの間に
クローニングして、ベクターｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.Ｍ
ＬＯＲＦを得た。ＥＰＯホモローガスドメインに対応す
る第二の組み立て物は、前進プライマーとしてのＣｌ
ａ.ＦＬ.Ｆ２および以下の逆プライマー：PRK5-hmplI (Examples 7 and 9)
Was used as a template for this reaction in the presence of pfu DNA polymerase (Stratagene).
Initial denaturation was performed at 94 ° C for 7 minutes, followed by 25 cycles of amplification (94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute). The final extension was at 72 ° C. for 15 minutes. The PCR product is purified and the plasmid pSVI
5. Cloned between the restriction sites ClaI and SalI of ID.LL, the vector pSVI5.ID.LL.M
LORF was obtained. A second assembly corresponding to the EPO homologous domain contains Cl as a forward primer.
a. FL.F2 and the following reverse primers:

【化１７】 を使用する外は同じ方法で作成した。最終組み立て物は
ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄと呼ばれる。両
組み立て物の配列は実施例７および９に記載のように確
認された。Embedded image Use the same method except for using. The final assembly is called pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. The sequence of both assemblies was confirmed as described in Examples 7 and 9.

【０４０７】本質において、全長のおよび末端切除され
たリガンドのためのコード化配列が、ＣＨＯ発現ベクタ
ーｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬの多クローニング部位に導入さ
れた。このベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター／エ
ンハンサー領域、マウスＤＨＦＲ ｃＤＮＡを含む修飾
されたスプライス単位、目的遺伝子（この場合、記載の
ＴＰＯ配列）の導入のための多クローニング部位、ＳＶ
４０ポリアデニル化シグナルおよび複製起点ならびに細
菌中でのプラスミドの選択および増幅のためのβ−ラク
タマーゼ遺伝子を含んでいる。In essence, the coding sequence for the full-length and truncated ligand was introduced at the multiple cloning site of the CHO expression vector pSVI5.ID.LL. This vector contains the SV40 early promoter / enhancer region, a modified splice unit containing the mouse DHFR cDNA, a multiple cloning site for the introduction of the gene of interest (the TPO sequence described in this case), SV
Includes a 40 polyadenylation signal and origin of replication and the β-lactamase gene for selection and amplification of the plasmid in bacteria.

【０４０８】３．組換えヒトＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃
を発現する安定なＣＨＯセルラインを確立するための方
法論 ａ．ＣＨＯ親セルラインの説明 本明細書に記載のＴＰＯ分子の発現に使用されるための
宿主ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）セルライン
は、ＣＨＯ−ＤＰ１２（１９８９年３月１５日公開のＥ
Ｐ３０７２４７を参照されたい）として知られている。
この哺乳動物セルラインは、インシュリン要求性の低い
クローンを得るためのプレプロインシュリンを発現する
ベクターでトランスフェクトされた親ライン（スタンフ
ォード大学のフランク・リー博士からＬ．チェイシン博
士の許諾によって入手したＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸ−Ｂ１
１（ＤＨＦＲ−）−）からクローン選択された。これら
の細胞はまたＤＨＦＲが無く、クローンは、ヌクレオチ
ド補充（グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン）
の無い培地上で増殖させることにより、ＤＨＦＲｃＤＮ
Ａベクター配列の存在について選択することができる。
安定に発現するＣＨＯセルラインのための選択系は一般
に使用されている。[0408] 3. Recombinant human TPO ₃₃₂ and TPO ₁₅₃
Methodology for establishing a stable CHO cell line that expresses a. Description of the CHO Parent Cell Line The host CHO (Chinese Hamster Ovary) cell line for use in expressing the TPO molecules described herein is CHO-DP12 (E, published March 15, 1989).
P307247).
This mammalian cell line was a parental line transfected with a vector expressing preproinsulin to obtain a clone with low insulin requirement (a CHO- K1 DUX-B1
1 (DHFR-)-). These cells are also devoid of DHFR and clones have nucleotide replacement (glycine, hypoxanthine, and thymidine).
Growth on medium without DHFRcDN
One can select for the presence of the A vector sequence.
Selection systems for stably expressing CHO cell lines are commonly used.

【０４０９】ｂ．トランスフェクション方法（電気穿
孔） ＤＰ１２細胞を、電気穿孔（例えばＧ．Ｌ．アンドレア
ソン、J.Tiss.Cult.Meth.、１５，５６［１９９３］を
参照されたい）により、線状化したｐＳＶＩ５.ＩＤ.Ｌ
Ｌ.ＭＬＯＲＦまたはｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ
−Ｄプラスミドでそれぞれトランスフェクトすることに
より、ＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃発現セルラインを作成
した。三つ（３）の制限酵素反応混合物を、各々のプラ
スミドの切断のために準備した；標準的分子生物学の方
法による、酵素ＮＯＴＩを伴う１０μｇ、２５μｇおよ
び５０μｇのベクター。この制限部位は、ベクターの線
状化領域３'で且つＴＰＯリガンド転写ユニットの外
に、ただ一度見いだされる（図３５を参照されたい）。
１００μｌの反応を、３７度で一夜インキュベートする
ために準備した。翌日、混合物をフェノール−クロロホ
ルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回
抽出し、およそ１時間、ドライアイス上でエタノール沈
澱化させた。次にこの沈澱を１５分間微量遠心すること
により集め、乾燥した。線状化したＤＮＡを、標準抗生
物質および２ｍＭグルタミンを添加したハムのＤＭＥＭ
−Ｆ１２ １：１培地５０μｌ中に再懸濁した。B. Transfection method (electroporation) DP12 cells were linearized by electroporation (see, for example, GL Andreason, J. Tiss. Cult. Meth., 15, 56 [1993]). ID.L
L.MLORF or pSVI5.ID.LL.MLEPO
By transfecting respectively -D plasmid to create a TPO ₃₃₂ and TPO ₁₅₃ expressing cell lines. Three (3) restriction enzyme reaction mixtures were prepared for cleavage of each plasmid; 10 μg, 25 μg and 50 μg of vector with enzyme NOTI by standard molecular biology methods. This restriction site is found only once in the linearized region 3 'of the vector and outside the TPO ligand transcription unit (see FIG. 35).
A 100 μl reaction was prepared for overnight incubation at 37 degrees. The next day, the mixture was extracted once with phenol-chloroform-isoamyl alcohol (50: 49: 1) and ethanol precipitated on dry ice for approximately 1 hour. The precipitate was then collected by microcentrifugation for 15 minutes and dried. The linearized DNA was purified from Ham's DMEM supplemented with standard antibiotics and 2 mM glutamine.
-Resuspended in 50 μl of F12 1: 1 medium.

【０４１０】ＤＰ１２細胞の生育している懸濁液を集
め、ＤＮＡの再懸濁について記載した培地中で１回洗浄
し、最後に、７５０μｌにつき１０⁷細胞の濃度で同じ
培地に再懸濁した。細胞のアリコート（７５０μｌ）お
よびそれぞれの線状化ＤＮＡ混合物を室温で１時間一緒
にインキュベートし、次いでＢＲＬ電気穿孔チェインバ
ーに移した。次に、各反応混合物を、標準的ＢＲＬ電気
穿孔装置中、３３０μＦおよび低キャパシタンスに設定
し３５０ボルトで電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞を
この装置内に５分間放置し、次いでさらなる１０分間の
インキュベーション時間の間氷上に置いた。電気穿孔さ
れた細胞を、ＣＨＯ細胞用の標準的な完全増殖培地（１
Ｘ ＧＨＴ、２ｍＭグルタミン、および５％牛胎児血清
を添加したグリシン無しの高グルコースＤＭＥＭ−Ｆ１
２ ５０：５０）５ｍｌを入れた６０ｍｍの細胞培養皿
に移し、５％ＣＯ₂細胞培養インキュベーター中で一夜
増殖させた。The growing suspension of DP12 cells was collected, washed once in the medium described for DNA resuspension, and finally resuspended in the same medium at a concentration of 10 ⁷ cells per 750 μl. . Aliquots of cells (750 μl) and the respective linearized DNA mixtures were incubated together for 1 hour at room temperature and then transferred to a BRL electroporation chamber. Each reaction mixture was then electroporated in a standard BRL electroporator at 330 μF and 350 volts with low capacitance set. After electroporation, the cells were left in the device for 5 minutes and then placed on ice for an additional 10 minute incubation time. The electroporated cells are transferred to standard complete growth medium for CHO cells (1
X GHT, high glucose DMEM-F1 without glycine supplemented with 2 mM glutamine and 5% fetal calf serum
2 50:50) transferred to the cell culture dish 60mm containing the 5 ml, grown overnight at 5% CO ₂ cell culture incubator.

【０４１１】ｃ．選択およびスクリーニング方法 翌日、細胞を標準法によりトリプシン処理して、プレー
トから、ＤＨＦＲ選択培地（２％または５％いずれかの
透析牛胎児血清を添加しグリシン、ヒポキサンチンおよ
びチミジンを欠く上記のハムのＤＭＥＭ−Ｆ１２、１：
１の培地であり、これは本発明者等の使用する標準的Ｄ
ＨＦＲ選択培地である）を入れた１５０ｍｍ組織培養皿
に移した。それぞれの６０ｍｍの皿からの細胞を、続い
て５個の１５０ｍｍの皿に再度蒔いた。次に細胞を、ク
ローンが現れ始め、９６ウェルの皿に移すのに適当な大
きさに達するまで、３７度／５％ＣＯ₂で１０ないし１
５日間（培地を１回交換）インキュベートした。４−５
日の期間にわたり、セルラインを、５０ｍｌに設定した
ピペットマンの滅菌した黄色の先端部を用いて９６ウェ
ルの皿に移した。細胞を密集成長まで増殖させ（通常３
−５日間）、次いでトレーをトリプシン処理し、元のト
レーのコピーを２個再生産した。これらのコピーのうち
２個は、各ウェルの細胞をＤＭＳＯ中１０％ＦＣＳ５０
μｌで希釈し、冷凍庫に短期間保存した。５日間の無血
清条件培地試料を、Ｂａ／Ｆ細胞に基づく活性検定によ
り、第三のトレーの密集成長しているウェルから、ＴＰ
Ｏ発現について検定した。この検定に基づいて最も良く
発現しているクローンを保存から回復させ、懸濁適応、
再検定および預託用の細胞培養群に移すため、２個の密
集成長１５０ｍｍ Ｔフラスコにスケールアップした。C. Selection and Screening Method The next day, cells were trypsinized by standard methods, and DHFR selective medium (either 2% or 5% dialyzed fetal calf serum was added and the above ham lacking glycine, hypoxanthine and thymidine was added from the plates. DMEM-F12, 1:
No. 1 medium, which is a standard D used by the present inventors.
HFR selective medium) was transferred to a 150 mm tissue culture dish. Cells from each 60 mm dish were subsequently replated into five 150 mm dishes. The cells are then incubated at 37 ° / 5% CO ₂ for 10 to 1 until the clones begin to appear and reach the appropriate size to transfer to a 96-well dish.
Incubated for 5 days (1 medium change). 4-5
Over the course of the day, the cell line was transferred to a 96-well dish using a sterile yellow tip of a Pipetman set at 50 ml. Cells are grown to confluency (usually 3
Trays), then trypsinized the trays and reproduced two copies of the original trays. Two of these copies contained cells from each well with 10% FCS50 in DMSO.
Diluted in μl and stored in the freezer for a short time. Five-day serum-free conditioned media samples were transferred from confluent wells of a third tray by Ba / F cell-based assay to TP
Assayed for O expression. The best expressing clones are recovered from storage based on this assay,
Two confluent 150 mm T-flasks were scaled up for transfer to cell culture groups for reassay and deposit.

【０４１２】ｄ．増幅プロトコル 上記の選択からの最高力価のセルラインの幾つかを引き
続き標準メソトレキサート増幅処方に付し、より高い力
価のクローンを生成させた。ＣＨＯ細胞のクローンを拡
大し、４種のメソトレキサート濃度（即ち、５０ｎＭ、
１００ｎＭ、２００ｎＭおよび４００ｎＭ）の１０ｃｍ
皿に、２または３種の細胞数（皿当たり１０５、５ｘ１
０５、および１０６細胞）で蒔く。次にこれらの培養
を、クローンが確立され、さらなる検定用の９６ウェル
皿に移すのに適当となるまで、３７度／５％ＣＯ₂でイ
ンキュベートする。この選択からの幾つかの高力価クロ
ーンを再度より高濃度のメソトレキサート（即ち、６０
０ｎＭ、８００ｎＭ、１０００ｎＭおよび１２００ｎ
Ｍ）に付し、前と同じように耐性クローンを確立させ、
次いで９６ウェル皿に移して検定した。D. Amplification Protocol Some of the highest titer cell lines from the above selections were subsequently subjected to a standard methotrexate amplification recipe to generate higher titer clones. CHO cell clones were expanded and four methotrexate concentrations (ie, 50 nM,
10 cm of 100 nM, 200 nM and 400 nM)
Plates with 2 or 3 cells (105, 5 x 1 per dish)
05 and 106 cells). Then these cultures, clones were established, until suitable to transfer to 96 well dishes for further assay, incubated at 37 ° / 5% CO _2. Some high titer clones from this selection were again reconstituted at higher concentrations of methotrexate (ie, 60
0 nM, 800 nM, 1000 nM and 1200 n
M) to establish resistant clones as before,
It was then transferred to a 96-well dish and assayed.

【０４１３】４．組換えヒトＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃
を発現する安定なＣＨＯセルラインの培養 預託しておいた細胞を融解し、無血清または血清含有培
地中、標準的な細胞増殖法によって細胞数を拡大する。
十分な細胞密度まで拡大した後、細胞を洗浄して、成分
の無くなった細胞培養基を除去する。次いで細胞を、バ
ッチ、給餌バッチまたは連続培養を包含する任意の標準
法により、２５−４０℃、中性ｐＨ、少なくとも５％の
溶存Ｏ₂含有量で、構成的に分泌されたＴＰＯが蓄積さ
れるまで培養する。次いで細胞培養液を遠心のような機
械的手段で細胞から分離する。[0413] 4. Recombinant human TPO ₃₃₂ and TPO ₁₅₃
Culture of Stable CHO Cell Line Expressing Deposited cells are thawed and expanded in serum-free or serum-containing media by standard cell growth methods.
After expansion to a sufficient cell density, the cells are washed to remove the cell culture media free of components. The cells are then accumulated by any standard method, including batch, feed batch or continuous culture, at 25-40 ° C., neutral pH, at least 5% dissolved O ₂ content and the constitutively secreted TPO is accumulated. Culture until complete. The cell culture is then separated from the cells by mechanical means such as centrifugation.

【０４１４】５．ＣＨＯ培養液からの組換えヒトＴＰＯ
の精製 収穫した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、０．０１Ｍ燐酸Ｎ
ａ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化した
ブルーセファロース６ ファスト・フロー・カラム（フ
ァルマシア）に、樹脂１リットル当たりＨＣＣＦおよそ
１００Ｌの比率、およびおよそ３００ｍｌ／時／ｃｍ²
の線流速で直接適用する。次にこのカラムを、３ないし
５カラム容量の平衡化緩衝液、続いて３ないし５カラム
容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、２．０Ｍ尿
素で洗浄する。次いでＴＰＯを、３ないし５カラム容量
の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、２．０Ｍ尿素、
１．０Ｍ ＮａＣｌで溶出する。[0414] 5. Recombinant human TPO from CHO culture
Purification of the harvested cell culture (HCCF) was performed using 0.01 M phosphate N
a (pH 7.4), a Blue Sepharose 6 Fast Flow column (Pharmacia) equilibrated with 0.15 M NaCl at a ratio of approximately 100 L of HCCF per liter of resin, and approximately 300 ml / h / cm ²
Apply directly at a linear flow rate of. The column is then washed with 3-5 column volumes of equilibration buffer, followed by 3-5 column volumes of 0.01 M Na phosphate (pH 7.4), 2.0 M urea. The TPO was then combined with 3-5 column volumes of 0.01 M Na phosphate (pH 7.4), 2.0 M urea,
Elute with 1.0 M NaCl.

【０４１５】次に、ＴＰＯを含有するブルーセファロー
スプールを、０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、２．
０Ｍ尿素、および１．０Ｍ ＮａＣｌで平衡化した小麦
胚芽レクチンセファロース６ＭＢカラム（ファルマシ
ア）に、樹脂１ｍｌあたり８ないし１６ｍｌのブルーセ
ファロースプールの比率で、およそ５０ｍｌ／時／ｃｍ
²の流速で適用する。次いでカラムを２ないし３カラム
容量の平衡化緩衝液で洗浄する。次いでＴＰＯを、２な
いし５カラム容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．
４）、２．０Ｍ尿素、０．５Ｍ Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンで溶出する。Next, a blue sepharose spool containing TPO was added to 0.01M Na phosphate (pH 7.4);
A wheat germ lectin Sepharose 6 MB column (Pharmacia) equilibrated with 0 M urea and 1.0 M NaCl, at a ratio of 8 to 16 ml of blue sepharose spool per ml of resin, approximately 50 ml / h / cm.
Apply at a flow rate of ² . The column is then washed with 2-3 column volumes of equilibration buffer. The TPO is then diluted with 2 to 5 column volumes of 0.01 M Na phosphate (pH 7.
4) Elution with 2.0 M urea, 0.5 M N-acetyl-D-glucosamine.

【０４１６】次に、小麦胚芽レクチンプールを０．０４
％Ｃ₁₂Ｅ₈および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
の最終濃度に調節する。得られたプールを、０．１％Ｔ
ＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈で平衡化したＣ４逆相カラム
（ヴィダック２１４ＴＰ１０２２）に、樹脂１ｍｌ当た
りおよそ０．２ないし０．５ｍｇ蛋白のロードで、１５
７ｍｌ／時／ｃｍ²の流速で適用する。Next, the wheat germ lectin pool was added to 0.04
% C ₁₂ E ₈ and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)
Adjust to a final concentration of. The pool obtained is 0.1% T
FA, to 0.04% C ₁₂ C4 reversed phase column equilibrated with E ₈ (Vydac 214TP1022), to approximately 0.2 per resin 1ml loading the 0.5mg protein, 15
Apply at a flow rate of 7 ml / hour / cm ² .

【０４１７】蛋白を、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂
Ｅ₈を含有するアセトニトリルの二相直線勾配で溶出す
る。第一の相は１５分間の０から３０％のアセトニトリ
ル直線勾配で構成され、第二の相は６０分間の３０から
６０％のアセトニトリル直線勾配で構成されている。Ｔ
ＰＯはおよそ５０％アセトニトリルで溶出する。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥに基づきプールを作成する。[0417] The protein was purified with 0.1% TFA, 0.04% C ₁₂
Eluting with biphasic linear gradient of acetonitrile containing E _8. The first phase consists of a linear gradient of 0 to 30% acetonitrile for 15 minutes and the second phase consists of a linear gradient of 30 to 60% acetonitrile for 60 minutes. T
PO elutes at approximately 50% acetonitrile. SDS
-Create a pool based on PAGE.

【０４１８】次にこのＣ４プールを２容量の０．０１Ｍ
燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌで希釈
し、１００００ないし３００００ダルトン分子量カット
オフの、アミコンＹＭ等のような限外濾過膜で、およそ
６容量の０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、０．１５
Ｍ ＮａＣｌに対してダイアフィルトレーションする。
次に、得られたダイアフィルトレート液を直ちに処理す
るか、またはさらに限外濾過により濃縮することができ
る。このダイアフィルトレート液／濃縮液を、０．０１
％トゥイーン８０の最終濃度に調節する。Next, this C4 pool was made 2 volumes of 0.01M
Approximately 6 volumes of 0.01 M Na phosphate (pH 7.4), diluted with Na phosphate (pH 7.4), 0.15 M NaCl, with a 10,000-30000 dalton molecular weight cutoff, such as Amicon YM, etc. ), 0.15
Diafiltrate against M NaCl.
The diafiltrate obtained can then be processed immediately or further concentrated by ultrafiltration. This diafiltrate solution / concentrated solution was added to 0.01
Adjust to a final concentration of% Tween 80.

【０４１９】計算されたカラム容量の２ないし５％に相
当するダイアフィルトレート液／濃縮液の全量または一
部を、０．０１Ｍ燐酸Ｎａ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１％トゥイーン８０で平衡化したセ
ファクリルＳ−３００ ＨＲカラム（ファルマシア）に
適用し、およそ１７ｍｌ／時／ｃｍ²の流速でクロマト
グラフィーに付す。凝集物および蛋白分解産物を含まな
いＴＰＯ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいてプール
する。得られたプールを０．２２μフィルター、ミレッ
クス−ＧＸ等で濾過し、２−８℃で保存する。The whole or a part of the diafiltrate solution / concentrate corresponding to 2 to 5% of the calculated column volume was treated with 0.01 M Na phosphate (pH 7.4), 0.15 M
Apply to a Sephacryl S-300 HR column (Pharmacia) equilibrated with NaCl, 0.01% Tween 80 and chromatograph at a flow rate of approximately 17 ml / h / cm ² . TPO-containing fractions free of aggregates and proteolysis products are pooled based on SDS-PAGE. The resulting pool is filtered through a 0.22μ filter, Millex-GX, etc. and stored at 2-8 ° C.

【０４２０】実施例２１ 大腸菌での形質転換およびＴＰＯ蛋白合成の誘導 １．大腸菌ＴＰＯ発現ベクターの組み立て プラスミドｐＭＰ２１、ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐ
ＭＰ５７およびｐＭＰ２０２は全て、異なる組み立て物
の間で相違する小さなリーダーの下流にある、ＴＰＯの
最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。
リーダーは主として高レベルの翻訳開始および迅速な精
製を提供する。プラスミドｐＭＰ２１０−１、−Ｔ８、
−２１、−２２、−２４、−２５は、開始メチオニンの
下流にあるＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよ
う設計されており、ＴＰＯの最初の６アミノ酸に対する
コドンの使用のみが相違しているが、一方、プラスミド
ｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端が２アミノ酸
だけ伸長しているｐＭＰ２１０−１の誘導体である。上
記のプラスミドは全て、トリプトファンプロモーターの
誘導時に、大腸菌において高レベルのＴＰＯの細胞内発
現を産むであろう（Ｄ．Ｇ．ヤンスラ等、Methods in E
nzymology（Ｄ．Ｖ．ゲッデル編）、１８５巻５４−６
０頁、アカデミック・プレス、サンディエゴ［１９９
０］）。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は、上
のＴＰＯ細胞内発現プラスミドの組み立ての際の中間体
である。 Example 21 Transformation in E. coli and induction of TPO protein synthesis Construction of Escherichia coli TPO Expression Vector Plasmids pMP21, pMP151, pMP41, pMP21
MP57 and pMP202 are all designed to express the first 155 amino acids of TPO, downstream of a small leader that differs between different constructs.
Leaders primarily provide high levels of translation initiation and rapid purification. Plasmid pMP210-1, -T8,
-21, -22, -24, -25 are designed to express the first 153 amino acids of TPO downstream of the starting methionine, differing only in the use of codons for the first 6 amino acids of TPO. However, plasmid pMP251 is a derivative of pMP210-1 in which the carboxy terminus of TPO is extended by 2 amino acids. All of the above plasmids will produce high levels of intracellular expression of TPO in E. coli upon induction of the tryptophan promoter (DG Jansula et al., Methods in E.
nzymology (Edited by DV Geddel), 185, 54-6
Page 0, Academic Press, San Diego [199
0]). Plasmids pMP1 and pMP172 are intermediates during assembly of the above TPO intracellular expression plasmid.

【０４２１】（ａ）プラスミドｐＭＰ１ プラスミドｐＭＰ１はＴＰＯの最初の１５５アミノ酸の
ための分泌ベクターであり、図８１および図８２に示さ
れるように、５個のＤＮＡのフラグメントをライゲーシ
ョンすることにより組み立てられた。これらの第一は、
小さなＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントがはずされた
ベクターｐＰｈｏ２１であった。ｐＰｈｏ２１は、ヒト
成長ホルモン遺伝子が大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子に置き換わ
っており、ＭｌｕＩ制限部位がアミノ酸２０−２１のＳ
ＴＩＩシグナル配列のためのコード化配列中に入れられ
たｐｈＧＨ１の誘導体である（Ｃ．Ｎ．チャング等、Ge
ne、５５巻１８９−１９６頁［１９８７］）。(A) Plasmid pMP1 Plasmid pMP1 is a secretion vector for the first 155 amino acids of TPO, and was constructed by ligating 5 DNA fragments as shown in FIGS. . The first of these is
The small MluI-BamHI fragment was the removed vector pPho21. In pPho21, the human growth hormone gene is replaced by the E. coli phoA gene, and the MluI restriction site is an S-amino acid 20-21.
A derivative of phGH1 that is incorporated into the coding sequence for the TII signal sequence (CN Chang et al., Ge.
ne, 55, 189-196 [1987]).

【０４２２】次の二つのフラグメント、即ちＴＰＯアミ
ノ酸１９−１０３をコードしているｐＲＫ５−ｈｍｐｌ
Ｉの２５８塩基対ＨｉｎｆＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片
（実施例９）、および、アミノ酸１−１８をコードして
いる以下の合成ＤＮＡ：The next two fragments, pRK5-hmpl, encoding TPO amino acids 19-103.
The 258 base pair HinfI-PstI DNA fragment of I (Example 9) and the following synthetic DNA encoding amino acids 1-18:

【化１８】 をＴ４−ＤＮＡリガーゼでプレライゲーションし、次に
ＰｓｔＩで切断した。第四番目は、ＴＰＯのアミノ酸１
０４−１５５をコードしているｐＲＫ５ｈｍｐｌＩから
の１５２塩基対ＰｓｔＩ−ＨａｅIIIフラグメントであ
った。最後は、先に記載されたλｔｏ転写ターミネータ
ーを含むｐｄｈ１０８からの４１２塩基対ＳｔｕＩ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントであった（Ｓ．ショルティセク
等、NAR、１５巻３１８５頁［１９８７］）。Embedded image Was preligated with T4-DNA ligase and then cut with PstI. The fourth is amino acid 1 of TPO
A 152 base pair PstI-HaeIII fragment from pRK5hmplI encoding 04-155. Finally, a 412 base pair StuI-B from pdh108 containing the λto transcription terminator described above.
amHI fragment (S. Scholtisek et al., NAR, Vol. 15, p. 3185 [1987]).

【０４２３】（ｂ）プラスミドｐＭＰ２１ プラスミドｐＭＰ２１を、ＳＴＩＩシグナル配列の一部
を含む１３アミノ酸リーダーの助けを受けてＴＰＯの最
初の１５５アミノ酸を発現するよう設計する。これは、
図８３に示されるように３個（３）のＤＮＡフラグメン
トをライゲーションすることにより組み立てられ、その
最初のものは、小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメント
がはずされたベクターｐＶＥＧ３１であった。このベク
ターｐＶＥＧ３１は、ヒト成長ホルモン遺伝子が血管内
皮細胞成長因子のための遺伝子により置き換えられてい
るｐＨＧＨ２０７−１（Ｈ．Ａ．デボーア等、プロモー
ター・ストラクチャー・アンド・ファンクション（Ｒ．
Ｌ．ロドリゲスおよびＭ．Ｊ．チェンバレン編）、４６
２、プレーガー、ニューヨーク［１９８２］）の誘導体
である（この同一のベクターフラグメントが、この後者
のプラスミドから得ることができる）。(B) Plasmid pMP21 Plasmid pMP21 is designed to express the first 155 amino acids of TPO with the help of a 13 amino acid leader containing part of the STII signal sequence. this is,
As shown in FIG. 83, three (3) DNA fragments were assembled by ligation, the first of which was the vector pVEG31 from which the small XbaI-SphI fragment had been removed. This vector, pVEG31, contains a promoter structure and function (R.H.
L. Rodriguez and M.A. J. Chamberlain edition), 46
2, Preger, New York [1982]) (this same vector fragment can be obtained from this latter plasmid).

【０４２４】ライゲーションの第二の部分は、以下の配
列：The second part of the ligation has the following sequence:

【化１９】 を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。最後の断片は、Ｔ
ＰＯの１５５アミノ酸をコードしているｐＭＰ１からの
１０７２塩基対ＭｌｕＩ−ＳｐｈＩフラグメントであっ
た。Embedded image Was a synthetic DNA double-stranded. The last fragment is T
A 1072 base pair MluI-SphI fragment from pMP1 encoding 155 amino acids of PO.

【０４２５】（ｃ）プラスミドｐＭＰ１５１ プラスミドｐＭＰ１５１は、ＳＴIIシグナル配列の７ア
ミノ酸、８ヒスチジン、および因子Ｘａ開裂部位を含む
リーダーの下流にあるＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を
発現するよう設計されている。図８４に示されるよう
に、ｐＭＰ１５１は３個のＤＮＡフラグメントをライゲ
ーションすることによって組み立てられ、それらの第一
のものは、前記のベクターｐＶＥＧ３１であって、ここ
から小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントが除去され
た。二番目は、以下の配列：(C) Plasmid pMP151 Plasmid pMP151 is designed to express 7 amino acids of the STII signal sequence, 8 histidines, and the first 155 amino acids of TPO downstream of the leader containing the factor Xa cleavage site. As shown in FIG. 84, pMP151 was assembled by ligating three DNA fragments, the first of which was the vector pVEG31 from which the small XbaI-SphI fragment had been removed. . Second, the following array:

【化２０】 を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。最後は、ＴＰＯの
１５４アミノ酸をコードしているｐＭＰ１１からの１０
６４塩基対ＢglＩ−ＳphＩフラグメントであった。プラ
スミドｐＭＰ１１は、ＳＴIIシグナル配列中の数個のコ
ドンの変化を除くとｐＭＰ１と同一である(このフラグ
メントはｐＭＰ１から得ることができる）。Embedded image Was a synthetic DNA double-stranded. Finally, the 10 pMO from pMP11 encoding 154 amino acids of TPO
It was a 64 base pair BglI-SphI fragment. Plasmid pMP11 is identical to pMP1 except for a few codon changes in the STII signal sequence (this fragment can be obtained from pMP1).

【０４２６】（ｄ）プラスミドｐＭＰ２０２ プラスミドｐＭＰ２０２は、リーダー中の因子Ｘａ開裂
部位がトロンビン開裂部位に置き換わっていることを除
けば、発現ベクターｐＭＰ１５１と極めて似通ってい
る。図８５に示されるように、ｐＭＰ２０２は３個のＤ
ＮＡフラグメントをライゲーションすることにより組み
立てられた。これらのうち第一番目は、小さなＸｂａＩ
−ＳｐｈＩフラグメントがはずされた前記のｐＶＥＧ３
１であった。第二番目は、以下の配列：(D) Plasmid pMP202 Plasmid pMP202 is very similar to expression vector pMP151 except that the Factor Xa cleavage site in the leader is replaced by a thrombin cleavage site. As shown in FIG. 85, pMP202 has three D
It was assembled by ligating NA fragments. The first of these is a small XbaI
The pVEG3 from which the SphI fragment has been removed
It was one. Second, the following array:

【化２１】 を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。最後の断片は、前
記のプラスミドｐＭＰ１１からの１０６４塩基対Ｂｇｌ
Ｉ−ＳｐｈＩフラグメントであった。Embedded image Was a synthetic DNA double-stranded. The last fragment was a 1064 base pair Bgl from plasmid pMP11 described above.
It was an I-SphI fragment.

【０４２７】（ｅ）プラスミドｐＭＰ１７２ プラスミドｐＭＰ１７２はＴＰＯの最初の１５３アミノ
酸のための分泌ベクターであり、ｐＭＰ２１０の組み立
てのための中間体である。図８６に示されるように、ｐ
ＭＰ１７２は３個のＤＮＡフラグメントをライゲーショ
ンすることによって製造され、その第一番目は、小さな
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部分が除去されたベクター
ｐＬＳ３２ｌａｍＢであった。第二番目は、前記のプラ
スミドｐＭＰ１１からの９４６塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｈｇ
ａＩフラグメントであった。最後の断片は、以下の配
列：(E) Plasmid pMP172 Plasmid pMP172 is a secretion vector for the first 153 amino acids of TPO and is an intermediate for the assembly of pMP210. As shown in FIG. 86, p
MP172 was produced by ligating three DNA fragments, the first of which was the vector pLS32lamB, in which the small EcoRI-HindIII part had been removed. The second is a 946 base pair EcoRI-Hg from the above plasmid pMP11.
aI fragment. The last fragment has the following sequence:

【化２２】 を有する合成ＤＮＡ二本鎖であった。Embedded image Was a synthetic DNA double-stranded.

【０４２８】（ｆ）プラスミドｐＭＰ２１０ プラスミドｐＭＰ２１０は、翻訳開始メチオニンの後の
ＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよう設計され
ている。このプラスミドは実際には、ＴＰＯの最初の６
個のコドンが各コドンの３位で無作為化されているプラ
スミドの群として作成され、図８７に示されるように３
個のＤＮＡフラグメントのライゲーションによって組み
立てられた。これらの第一番目は、小さなＸｂａＩ−Ｓ
ｐｈＩフラグメントが除去された前記ベクターｐＶＥＧ
３１であった。第二番目は、まずＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノウ）で処理し、その後ＸｂａＩおよびＨｉｎｆ
Ｉで消化された下記の合成ＤＮＡ二本鎖であって、開始
メチオニンおよびＴＰＯの無作為化された最初の６個の
コドンをコードしていた：(F) Plasmid pMP210 Plasmid pMP210 is designed to express the first 153 amino acids of TPO after the translation initiation methionine. This plasmid is actually the first 6 of the TPO.
A single codon was created as a group of plasmids randomized at position 3 of each codon, as shown in FIG.
DNA fragments were assembled by ligation. The first of these is a small XbaI-S
The vector pVEG from which the phI fragment has been removed
It was 31. The second is that DNA polymerase I
(Klenow), followed by XbaI and Hinf
The following synthetic DNA duplex, digested with I, encoding the initiation methionine and the first six randomized codons of TPO:

【化２３】 第三番目は、ＴＰＯのアミノ酸１９−１５３をコードし
ているｐＭＰ１７２からの８９０塩基対ＨｉｎｆＩ−Ｓ
ｐｈＩフラグメントであった。Embedded image Third, an 890 base pair HinfI-S from pMP172 encoding amino acids 19-153 of TPO.
It was a phI fragment.

【０４２９】およそ３７００クローンのプラスミドｐＭ
Ｐ２１０群を、高翻訳開始クローンを選択するための高
テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ平板上で再ト
ランスフォームした（Ｄ．Ｇ．ヤンスラ等、Methods:A
Companion to Methods in Enzymology、４巻１５１−１
５８頁［１９９２］）。高テトラサイクリン平板上に出
現した８個のコロニーから、ＴＰＯ発現の点で最良のも
の５個をＤＮＡ配列決定に付し、その結果を図８８（配
列番号２３、２４、２５、２６、２７および２８）に示
す。About 3700 clones of plasmid pM
P210s were re-transformed on high tetracycline (50 μg / ml) LB plates to select high translation initiation clones (DG Jansula et al., Methods: A).
Companion to Methods in Enzymology, Vol. 151-1
58 [1992]). From the eight colonies that appeared on the high tetracycline plate, the five best in terms of TPO expression were subjected to DNA sequencing and the results are shown in FIG. ).

【０４３０】（ｇ）プラスミドｐＭＰ４１ プラスミドｐＭＰ４１は、ＳＴIIシグナル配列の７アミ
ノ酸からなるリーダーとこれに続く因子Ｘａ開裂部位に
融合させたＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよ
う設計されている。このプラスミドは図８９に示される
ように、３個のＤＮＡ断片をライゲーションすることに
より組み立てられ、その第一番目は、先に記載された小
さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントが除去されたベク
ターｐＶＥＧ３１であった。第二番目は以下の合成ＤＮ
Ａ二本鎖：(G) Plasmid pMP41 Plasmid pMP41 is designed to express the leader consisting of 7 amino acids of the STII signal sequence followed by the first 155 amino acids of TPO fused to the factor Xa cleavage site. This plasmid was assembled by ligating three DNA fragments as shown in FIG. 89, the first of which was the vector pVEG31 from which the small XbaI-SphI fragment described above had been removed. The second is the following synthetic DN
A double strand:

【化２４】 であった。ライゲーションの最後の断片は、先に記載の
プラスミドｐＭＰ１１からの１０６４塩基対ＢｇｌＩ−
ＳｐｈＩフラグメントであった。Embedded image Met. The last fragment of the ligation was a 1064 base pair BglI- plasmid from plasmid pMP11 described above.
It was a SphI fragment.

【０４３１】（ｈ）プラスミドｐＭＰ５７ プラスミドｐＭＰ５７は、ＳＴIIシグナル配列の９アミ
ノ酸および二塩基性部位Ｌｙｓ−Ａｒｇよりなるリーダ
ーの下流にあるＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現す
る。この二塩基性部位は、プロテアーゼＡｒｇＣにより
リーダーを除去する手段を提供する。このプラスミドは
図９０に示されるように、３個のＤＮＡ断片をライゲー
ションすることにより組み立てられた。これらの第一番
目は、小さなＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントが除去さ
れた先に記載のベクターｐＶＥＧ３１であった。第二番
目は以下の合成ＤＮＡ二本鎖：(H) Plasmid pMP57 Plasmid pMP57 expresses 9 amino acids of the STII signal sequence and the first 155 amino acids of TPO downstream of the leader consisting of the dibasic site Lys-Arg. This dibasic site provides a means to remove the leader by the protease ArgC. This plasmid was assembled by ligating three DNA fragments as shown in FIG. The first of these was the vector pVEG31 described above, in which the small XbaI-SphI fragment had been removed. The second is the following synthetic DNA duplex:

【化２５】 であった。ライゲーションの最後の部分は、先に記載の
プラスミドｐＭＰ１１からの１０６４塩基対ＢｇｌＩ−
ＳｐｈＩフラグメントであった。Embedded image Met. The last part of the ligation was a 1064 base pair BglI- from plasmid pMP11 described above.
It was a SphI fragment.

【０４３２】（ｉ）プラスミドｐＭＰ２５１ プラスミドｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端に
さらに２個のアミノ酸が加わっているｐＭＰ２１０−１
の誘導体である。図９１に示されるように、このプラス
ミドは２個のＤＮＡ断片をライゲーションすることによ
り組み立てられ、その第一番目は、小さなＸｂａＩ−Ａ
ｐａＩフラグメントが除去された先に記載のｐＭＰ２１
であった。ライゲーションの第二の部分はｐＭＰ２１０
−１からの３１６塩基対ＸｂａＩ−ＡｐａＩフラグメン
トであった。(I) Plasmid pMP251 Plasmid pMP251 is a pMP210-1 in which two more amino acids are added to the carboxy terminus of TPO.
Is a derivative of As shown in FIG. 91, this plasmid was assembled by ligating two DNA fragments, the first of which was a small XbaI-A
pMP21 as described above with the paI fragment removed
Met. The second part of the ligation was pMP210
A 316 base pair XbaI-ApaI fragment from -1.

【０４３３】２．ＴＰＯ発現ベクターによる大腸菌の形
質転換および誘導 上のＴＰＯ発現プラスミドを、ＣａＣｌ₂熱衝撃法
（Ｍ．マンデル等、J.Mol.Biol.、５３巻１５９−１６
２頁［１９７０］）を用いる大腸菌菌株４４Ｃ６（ｗ３
１１０ ｔｏｎＡ△ ｒｐｏＨ_ts ｌｏｎ△ ｃｌｐＰ△
ｇａｌＥ）の形質転換に使用した。形質転換された細胞
を最初にカルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ
培地中３７℃で、培養の光学密度（６００ｎｍ）がおよ
そ２−３に達するまで増殖させた。次いでこのＬＢ培地
を０．４９％カザアミノ酸（ｗ／ｖ）および５０μｇ／
ｍｌカルベニシリンを含有するＭ９培地で２０ｘに希釈
した。３０℃で通気しながら１時間増殖させた後、イン
ドール−３−アクリル酸を最終濃度５０μｇ／ｍｌとな
るまで加えた。次いで、３０℃で通気しながらさらに１
５時間培養を継続し、この時点で細胞を遠心により収穫
した。[0433] 2. Transformation and induction of Escherichia coli with a TPO expression vector The TPO expression plasmid was prepared by CaCl ₂ heat shock method (M. Mandel et al., J. Mol. Biol., 53, 159-16).
E. coli strain 44C6 (w3
110 tonA △ rpoH _ts lon △ clpP △
galE). The transformed cells were first purified from LB containing 50 μg / ml carbenicillin.
The culture was grown at 37 ° C. in the medium until the optical density of the culture (600 nm) reached approximately 2-3. The LB medium was then treated with 0.49% casa amino acid (w / v) and 50 μg /
Diluted 20 × with M9 medium containing ml carbenicillin. After 1 hour of growth with aeration at 30 ° C., indole-3-acrylic acid was added to a final concentration of 50 μg / ml. Then, while venting at 30 ° C.,
The culture was continued for 5 hours, at which point the cells were harvested by centrifugation.

【０４３４】実施例２２ 大腸菌における生物活性なＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５
３）の産生 生物活性な再折り畳みされたＴＰＯ（ｍｅｔ^-1１−１５
３）の産生のための以下に示す方法は、ＮおよびＣ末端
伸長型を包含する他のＴＰＯ変異体の回収に同様に適用
することができる（実施例２３を参照されたい）。 Example 22 Biologically Active TPO in E. coli (Met ^- 11-15)
Production of 3) biologically active refolded TPO (met ^-1 1-15
The method described below for the production of 3) is equally applicable to the recovery of other TPO variants, including N- and C-terminal extensions (see Example 23).

【０４３５】Ａ．不溶性ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）
の回収 プラスミドｐＭＰ２１０−１によりコードされているＴ
ＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）を発現する大腸菌細胞を上
記のように発酵させる。典型的には、細胞約１００ｇを
ポリトロンホモジナイザーを用いて細胞破壊緩衝液（１
０ｍＭトリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）１Ｌ（１０
容量）に再懸濁し、細胞を５０００ｘｇで３０分間遠心
する。洗浄した細胞ペレットをポリトロンホモジナイザ
ーで再度細胞破壊緩衝液１Ｌに再懸濁し、この細胞懸濁
液を、製造者の指示に従ってＬＨセルディスラプター
（ＬＨインセルテク、Ｉｎｃ．）またはマイクロフルイ
ダイザー（マイクロフルイディクス・インターナショナ
ル）を通過させる。懸濁液を５０００ｇで３０分間遠心
し、再懸濁し、二度目の遠心を行って、洗浄された屈折
体ペレットを作成する。洗浄されたペレットを直ちに使
用するか、または−７０℃で保存する。A. Insoluble TPO (Met- ¹ 1-153)
Recovery of T encoded by plasmid pMP210-1
E. coli cells expressing PO (Met- ¹ 1-153) are fermented as described above. Typically, about 100 g of cells are lysed using a Polytron homogenizer in cell disruption buffer (1
1 L of 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8
Volume) and centrifuge the cells at 5000 xg for 30 minutes. The washed cell pellet is resuspended in 1 L of cell disruption buffer with a Polytron homogenizer, and the cell suspension is subjected to LH cell disruptor (LH Inceltech, Inc.) or microfluidizer (Microfluidics) according to the manufacturer's instructions.・ International). The suspension is centrifuged at 5000 g for 30 minutes, resuspended and centrifuged a second time to create a washed refractor pellet. Use the washed pellet immediately or store at -70 ° C.

【０４３６】Ｂ．単量体ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）
の可溶化および精製 上で得たペレットを、５容量／重量で、６−８Ｍグアニ
ジンおよび２５ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）を伴
う２０ｍＭトリス、ｐＨ８に再懸濁し、４℃で１−３時
間または一夜攪拌してＴＰＯ蛋白の可溶化を起こさせ
る。高濃度の尿素（６−８Ｍ）もまた有用であるが、一
般にグアニジンと比較して低収率をもたらす。可溶化の
後、この溶液を３００００ｘｇで３０分間遠心して、変
性した単量体ＴＰＯ蛋白を含有する透明な上清を生成さ
せる。次にこの上清を、流速２ｍｌ／分でスーパーデッ
クス２００ゲル濾過カラム（ファルマシア、２．６ｘ６
０ｃｍ）上のクロマトグラフィーに付し、蛋白を、１０
ｍＭ ＤＴＴを伴う２０ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ６．０で溶
出させる。１６０および２００ｍｌの間で溶出する、単
量体の、変性したＴＰＯ蛋白を含有する画分をプールす
る。このＴＰＯ蛋白を半調製用Ｃ４逆相カラム（２ｘ２
０ｃｍＶＹＤＡＣ）でさらに精製する。試料を３０％ア
セトニトリルを加えた０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢
酸）で平衡化したカラムに５ｍｌ／分で適用する。蛋白
をアセトニトリルの直線勾配（６０分間で３０−６０
％）で溶離する。精製された還元された蛋白はおよそ５
０％アセトニトリルの時点で溶出する。この物質を、生
物活性ＴＰＯ変異体を得るための再折り畳みに使用す
る。B. Monomer TPO (Met- ¹ 1-153)
Solubilization and purification of the above The pellet obtained above was resuspended at 5 vol / wt in 20 mM Tris, pH 8 with 6-8 M guanidine and 25 mM DTT (dithiothreitol) and stirred at 4 ° C. for 1-3 hours or overnight To solubilize the TPO protein. Higher concentrations of urea (6-8M) are also useful, but generally result in lower yields compared to guanidine. After solubilization, the solution is centrifuged at 30,000 xg for 30 minutes to produce a clear supernatant containing the denatured monomeric TPO protein. The supernatant was then applied to a Superdex 200 gel filtration column (Pharmacia, 2.6 × 6) at a flow rate of 2 ml / min.
0 cm) and the protein
Elute with 20 mM Na phosphate with mM DTT, pH 6.0. The fractions containing the monomeric, denatured TPO protein, eluting between 160 and 200 ml, are pooled. This TPO protein was converted to a semi-preparative C4 reverse phase column (2 × 2
(0 cm VYDAC). The sample is applied at 5 ml / min to a column equilibrated with 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) with 30% acetonitrile. The protein was subjected to a linear gradient of acetonitrile (30-60 minutes in 60 minutes).
%). Approximately 5 purified reduced proteins
Elute at 0% acetonitrile. This material is used for refolding to obtain a bioactive TPO variant.

【０４３７】Ｃ．生物活性ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５
３）の生成 ０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル４０ｍｌに入れ
た単量体の、還元され変性されたＴＰＯ蛋白およそ２０
ｍｇを、最適には以下の試薬：５０ｍＭトリス、０．３
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＣＨＡＰＳ洗浄
剤、２５％グリセロール、５ｍＭ酸化型グルタチオン、
１ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨを８．３に調節、を含
有する再折り畳み緩衝液３６０ｍｌ中に希釈する。C. Biologically active TPO (Met ^-1 1-15
Production of 3) Approximately 20 monomeric, reduced and denatured TPO protein in 40 ml of 0.1% TFA / 50% acetonitrile.
mg, optimally with the following reagents: 50 mM Tris, 0.3
M NaCl, 5 mM EDTA, 2% CHAPS detergent, 25% glycerol, 5 mM oxidized glutathione,
Dilute in 360 ml of refold buffer containing 1 mM reduced glutathione, pH adjusted to 8.3.

【０４３８】混合後、再折り畳み緩衝液を４℃で１２−
４８時間穏やかに攪拌して、正しいジスルフィド結合型
のＴＰＯの再折り畳み収率が最大となるようにする（下
記参照）。次にこの溶液をＴＦＡで酸性化して最終濃度
０．２％とし、０．４５または０．２２ミクロンフィル
ターで濾過し、１／１０容量のアセトニトリルを加え
る。次いでこの溶液をＣ４逆相カラムに直接ポンプで送
り込み、精製された、再折り畳みされたＴＰＯ（Ｍｅｔ
^-1１−１５３）を上記と同じ勾配プログラムで溶離す
る。再折り畳みされた、生物活性なＴＰＯが、これらの
条件下でおよそ４５％アセトニトリルの時点で溶出す
る。ＴＰＯの正しくないジスルフィド結合型は、より早
く溶出する。最終的な精製されたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−
１５３）は、ＳＤＳゲルおよび分析用Ｃ４逆相クロマト
グラフィーにより評価したところ、９５％以上純粋であ
る。動物での研究用に、Ｃ４精製した物質を生理学的に
適合し得る緩衝液中に透析した。１５０ｍＭ ＮａＣｌ
および０．０１％トゥイーン８０を含有する等張緩衝液
（１０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．５、１０ｍＭ琥珀酸Ｎ
ａ、ｐＨ５．５または１０ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ７．４）
を利用した。After mixing, refold buffer was added at 4 ° C for 12-
Gently agitate for 48 hours to maximize the refolding yield of the correct disulfide-linked form of TPO (see below). The solution is then acidified with TFA to a final concentration of 0.2%, filtered through a 0.45 or 0.22 micron filter and 1/10 volume of acetonitrile is added. This solution was then pumped directly onto a C4 reversed phase column to purify the purified, refolded TPO (Met
^-1 1-153) is eluted with the same gradient program as above. The refolded, bioactive TPO elutes at approximately 45% acetonitrile under these conditions. The incorrect disulfide-bound form of TPO elutes faster. The final purified TPO (Met ^- 11-
153) is more than 95% pure as assessed by SDS gel and analytical C4 reverse phase chromatography. For animal studies, C4 purified material was dialyzed into physiologically compatible buffers. 150 mM NaCl
And 10% Na acetate, pH 5.5, 10 mM succinate N
a, pH 5.5 or 10 mM Na phosphate, pH 7.4)
Was used.

【０４３９】Ｂａ／Ｆ３検定でのＴＰＯの高い力価（半
最大刺激はおよそ３ｐｇ／ｍｌで達成される）の故に、
多くの異なる緩衝液、洗浄剤および酸化還元条件を利用
して生物活性物質を得ることが可能である。しかしなが
ら、殆どの条件においては、正しく折り畳まれた物質は
少量（＜１０％）得られるに過ぎない。商業的な製造工
程のためには、再折り畳み収率が少なくとも１０％、よ
り好ましくは３０−５０％、そして最も好ましくは＞５
０％であることが望ましい。多くの異なった洗浄剤（ト
リトンＸ−１００、ドデシル−β−マルトシド、ＣＨＡ
ＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、サルコシル、トゥイーン
２０およびトゥイーン８０、ツヴィッタージェント３−
１４およびその他）が、高い再折り畳み収率を支持する
有効性について評価された。これらの洗浄剤のうち、Ｃ
ＨＡＰＳファミリー（ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯ）
のみが、一般に、再折り畳み反応において蛋白凝集およ
び正しくないジスルフィド形成を制限するのに有用であ
ることが見いだされた。１％以上のレベルのＣＨＡＰＳ
が最も有用であった。最良の収率には塩化ナトリウムが
必要であり、その最適レベルは０．１Ｍおよび０．５Ｍ
の間であった。ＥＤＴＡ（１−５ｍＭ）の存在は、幾つ
かの製品で観察される金属により触媒される酸化（およ
び凝集）の量を制限した。１５％以上のグリセロール濃
度は最適な再折り畳み条件をもたらした。最大収率のた
めには、酸化還元試薬対として、酸化型および還元型両
方のグルタチオンまたは酸化型および還元型システイン
のあることが必須であった。一般に、酸化還元対の酸化
型試薬のモル比が還元型試薬と等しいかまたは過剰であ
る時、より高い収率が観察された。７．５および約９の
間のｐＨ値がこれらのＴＰＯ変異体の再折り畳みにとっ
て最適であった。有機溶媒（例えば、エタノール、アセ
トニトリル、メタノール）は１０−１５％またはこれ以
下の濃度では寛容された。より高レベルの有機溶媒は、
不適正に折り畳まれた型の量を増加させた。トリスおよ
び燐酸緩衝液が一般に有用であった。４℃でのインキュ
ベーションもまた、より高レベルの正しく折り畳まれた
ＴＰＯを生成させた。Due to the high titer of TPO in the Ba / F3 assay (half-maximal stimulation is achieved at approximately 3 pg / ml)
Many different buffers, detergents and redox conditions can be used to obtain the bioactive agent. However, under most conditions, only small amounts (<10%) of correctly folded material are obtained. For commercial manufacturing processes, the refolding yield is at least 10%, more preferably 30-50%, and most preferably> 5
Desirably, it is 0%. Many different detergents (Triton X-100, dodecyl-β-maltoside, CHA
PS, CHAPSO, SDS, Sarkosyl, Tween 20 and Tween 80, Zwittergent 3-
14 and others) were evaluated for their effectiveness in supporting high refolding yields. Of these cleaning agents, C
HAPS family (CHAPS and CHAPSO)
Only, in general, have been found to be useful in limiting protein aggregation and incorrect disulfide formation in refolding reactions. CHAPS of 1% or more
Was most useful. The best yields require sodium chloride, the optimal levels of which are 0.1M and 0.5M
Was between. The presence of EDTA (1-5 mM) limited the amount of metal-catalyzed oxidation (and aggregation) observed in some products. Glycerol concentrations of 15% and above resulted in optimal refolding conditions. For maximum yield, it was essential to have both oxidized and reduced glutathione or oxidized and reduced cysteine as the redox reagent pair. In general, higher yields were observed when the molar ratio of the redox couple to the oxidized reagent was equal to or in excess of the reduced reagent. PH values between 7.5 and about 9 were optimal for refolding of these TPO variants. Organic solvents (eg, ethanol, acetonitrile, methanol) were tolerated at concentrations of 10-15% or less. Higher levels of organic solvents
Increased the amount of improperly folded molds. Tris and phosphate buffers were generally useful. Incubation at 4 ° C. also produced higher levels of correctly folded TPO.

【０４４０】第一のＣ４工程で精製されたＴＰＯの製造
については、４０−６０％の再折り畳み収率（再折り畳
み反応に使用された還元され変性されたＴＰＯの量に基
づく）が典型的である。甚だしい沈澱化およびＴＰＯ再
折り畳み工程中の非ＴＰＯ蛋白の妨害のため、収率はよ
り低いものの、より不純な調製物から活性物質を得るこ
とができる（例えば、スーパーデックス２００カラムの
後または最初の屈折体抽出の後直ちに）。For the production of TPO purified in the first C4 step, a refolding yield of 40-60% (based on the amount of reduced and denatured TPO used in the refolding reaction) is typical. is there. Due to extensive precipitation and interference of non-TPO proteins during the TPO refolding step, the active substance can be obtained from lower, but more impure, preparations (eg, after or after the first Superdex 200 column). Immediately after refraction extraction).

【０４４１】ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は４個のシ
ステイン残基を含むため、この蛋白から３個の異なるジ
スルフィド型を生成することが可能である： 第一の型：システイン残基１−４および２−３の間のジ
スルフィド、 第二の型：システイン残基１−２および３−４の間のジ
スルフィド 第三の型：システイン残基１−３および２−４の間のジ
スルフィド。Since TPO (Met- ¹ 1-153) contains four cysteine residues, it is possible to generate three different disulfide forms from this protein: First type: cysteine residue 1 Disulfide between -4 and 2-3, second type: disulfide between cysteine residues 1-2 and 3-4 third type: disulfide between cysteine residues 1-3 and 2-4.

【０４４２】再折り畳み条件の決定の際の最初の探査中
に、ＴＰＯ蛋白を含有する幾つかの異なるピークがＣ４
逆相クロマトグラフィーによって分離された。これらの
うちただ一つがＢａ／Ｆ３検定を用いて測定される有意
な生物活性を有していた。続いて、再折り畳み条件を、
専らその型を生成するように最適化させた。これらの条
件の下で、誤って折り畳まれた型は、得られた総単量体
ＴＰＯの１０−２０％未満である。During the initial exploration in determining the refolding conditions, several different peaks containing the TPO protein were detected on the C4
Separated by reverse phase chromatography. Only one of these had significant biological activity measured using the Ba / F3 assay. Next, the refolding condition
Optimized to generate exclusively that type. Under these conditions, the misfolded form is less than 10-20% of the total monomeric TPO obtained.

【０４４３】生物活性なＴＰＯのジスルフィドパターン
は、質量分析および蛋白配列決定により、１−４および
２−３であると決定された（即ち、第一の型）。種々の
Ｃ４分離されたピークのアリコート（５−１０ｎｍｏｌ
ｅ）をトリプシンで消化した（蛋白に対するトリプシン
のモル比は１：２５）。消化混合物をマトリックス支援
レーザー脱着質量分析により、ＤＴＴによる還元の前後
で分析した。還元後、ＴＰＯの大きなトリプシン分解ペ
プチドの殆どに対応する質量が検出された。非還元試料
においてはこれらの質量のうち幾つかが無く、新たな質
量が観察された。この新たなピークの質量は基本的に、
ジスルフィド対に含まれる個々のトリプシン分解ペプチ
ドの合計に対応していた。したがって、再折り畳みされ
た組換えの生物活性ＴＰＯのジスルフィドパターンを、
無条件に１−４および２−３に割り当てることが可能で
ある。これは、関連分子エリスロポエチンの既知のジス
ルフィドパターンと一致する。The disulfide pattern of the bioactive TPO was determined to be 1-4 and 2-3 by mass spectrometry and protein sequencing (ie, the first type). Aliquots of various C4 separated peaks (5-10 nmol
e) was digested with trypsin (trypsin to protein molar ratio of 1:25). The digestion mixture was analyzed by matrix-assisted laser desorption mass spectrometry before and after reduction with DTT. After reduction, the mass corresponding to most of the large tryptic peptides of TPO was detected. Some of these masses were absent in the non-reduced sample and new masses were observed. The mass of this new peak is basically
It corresponded to the sum of the individual tryptic peptides contained in the disulfide pair. Thus, the disulfide pattern of the refolded recombinant bioactive TPO
It can be unconditionally assigned to 1-4 and 2-3. This is consistent with the known disulfide pattern of the related molecule erythropoietin.

【０４４４】Ｄ．組換えの再折り畳みされたＴＰＯ（ｍ
ｅｔ １−１５３）の生物活性 再折り畳みされ精製されたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５
３）は、インビトロおよびインビボの両方の検定で活性
を持っている。Ｂａ／Ｆ３検定において、Ｂａ／Ｆ３細
胞へのチミジン取り込みの半最大刺激は３．３ｐｇ／ｍ
ｌ（０．３ｐＭ）で達成された。ｍｐｌレセプターに基
づくＥＬＩＳＡにおいては、半最大活性は１．９ｎｇ／
ｍｌ（１２０ｐＭ）で出現した。正常のおよび近致死Ｘ
線照射により作り出された骨髄抑制動物において、ＴＰ
Ｏ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は極めて強力に（わずか３０
ｎｇ／マウスの用量で活性が見られた）新たな血小板の
産生を刺激した。D. Recombinant refolded TPO (m
Bioactive refolded and purified TPO of et 1-153) (Met ^-1 1-15
3) has activity in both in vitro and in vivo assays. In the Ba / F3 assay, the half-maximal stimulation of thymidine incorporation into Ba / F3 cells was 3.3 pg / m
1 (0.3 pM). In the mpl receptor-based ELISA, the half-maximal activity is 1.9 ng /
Appeared in ml (120 pM). Normal and near lethal X
In myelosuppressed animals produced by X-ray irradiation, TP
O (Met- ¹ 1-153) is extremely potent (only 30
Stimulation of the production of new platelets (activity was seen at a dose of ng / mouse).

【０４４５】実施例２３ 大腸菌におけるその他の生物活性ＴＰＯ変異体のの生成 大腸菌において生産され、精製され生物活性型に再折り
畳みされた三つの異なるＴＰＯ変異体を下に示す。 Example 23 Generation of Other Biologically Active TPO Mutants in E. coli Three different TPO mutants produced in E. coli, purified and refolded into a bioactive form are shown below.

【０４４６】（１）ＭＬＦ − 細菌由来シグナル配列
ＳＴIIからの１３残基をＴＰＯのＮ末端ドメイン（残基
１−１５５）と融合させる。得られる配列は、(1) 13 residues from the MLF-bacterial signal sequence STII are fused to the N-terminal domain of TPO (residues 1-155). The resulting sequence is

【化２６】MKKNIAFLLNAYASPAPPAC …… CVRRA
（配列番号８５） ［ここで、リーダー配列には下線を付し、Ｃ …… Ｃは
Ｃｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹までを表す］である。この変異体
は、レセプターおよび生物学的研究のためのＴＰＯの放
射性沃素化のためのチロシンを提供するために組み立て
られた。[ Formula 26] MKKNIAFLLNAYA SPAPPAC …… CVRRA
(SEQ ID NO: 85) wherein, underlined leader sequence, C ...... C represents from Cys ⁷ to Cys ^151] is. This variant was assembled to provide tyrosine for radioiodination of TPO for receptor and biological studies.

【０４４７】（２）Ｈ８ＭＬＦ − ＳＴII配列からの
７残基、８個のヒスチジン残基および因子Ｘａ酵素的開
裂配列ＩＥＧＲをＴＰＯのＮ末端ドメイン（残基１−１
５５）と融合させる。この配列は、(2) Seven residues from the H8MLF-STII sequence, eight histidine residues and the factor Xa enzymatic cleavage sequence IEGR were added to the N-terminal domain of TPO (residues 1-1).
55). This array is

【化２７】MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC …… CVRRA
（配列番号８６） ［ここで、リーダー配列には下線を付し、Ｃ …… Ｃは
Ｃｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹までを表す］である。この変異体
は、精製され再折り畳みされる時、配列ＩＥＧＲのアル
ギニン残基の後で開裂して天然セリンＮ末端アミノ酸を
有する長さ１５５残基のＴＰＯ変異体を生成する酵素、
因子Ｘａで処理することができる。[ Formula 27] MKKNIAFHHHHHHHHIEGR SPAPPAC ...... CVRRA
(SEQ ID NO: 86) [Here, the leader sequence is underlined and C represents Cs ⁷ to Cys ¹⁵¹ ]. This variant is an enzyme that, when purified and refolded, cleaves after the arginine residue of the sequence IEGR to produce a 155 residue long TPO variant with the natural serine N-terminal amino acid.
It can be treated with factor Xa.

【０４４８】（３）Ｔ−Ｈ８ＭＬＦ − は、トロンビ
ン感受性配列ＩＥＰＲをＴＰＯのＮ末端ドメインと融合
させる外は変異体（２）について上に記載されるように
して製造する。得られる配列は、(3) T-H8MLF − is prepared as described above for mutant (2) except that the thrombin-sensitive sequence IEPR is fused to the N-terminal domain of TPO. The resulting sequence is

【化２８】MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC …… CVRRA
（配列番号８７） ［ここで、リーダー配列には下線を付し、Ｃ …… Ｃは
Ｃｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹までを表す］である。この変異体
は、精製および再折り畳みの後、酵素トロンビンで処理
して、長さ１５５残基のＴＰＯの天然Ｎ末端変異体を生
成することができる。[ Formula 28] MKKNIAFHHHHHHHHIEPR SPAPPAC ...... CVRRA
(SEQ ID NO: 87) wherein, underlined leader sequence, C ...... C represents from Cys ⁷ to Cys ^151] is. This variant, after purification and refolding, can be treated with the enzyme thrombin to generate a natural N-terminal variant of TPO that is 155 residues long.

【０４４９】Ａ．単量体の生物活性ＴＰＯ変異体
（１）、（２）、および（３）の回収、可溶化および精
製 全ての当該変異体は大腸菌において発現された。この変
異体の大部分はＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）に関して
実施例２２で観察されたように、屈折体中に見いだされ
た。単量体ＴＰＯ変異体の回収、可溶化および精製のた
めの同じ方法が実施例２２に記載されるように達成され
た。ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）に用いられたのと同
一の再折り畳み条件を用いて、通算収率は３０−５０％
であった。再折り畳みの後、このＴＰＯ変異体を、前記
のようにアセトニトリル勾配を利用する０．１％ＴＦＡ
中のＣ４逆相クロマトグラフィーにより精製した。全て
のＴＰＯ変異体（非蛋白分解型において）はＢａ／Ｆ３
検定により評価したところ半最大活性２−５ｐＭの生物
活性を有していた。A. Recovery, solubilization and purification of monomeric bioactive TPO variants (1), (2) and (3) All such variants were expressed in E. coli. The majority of this variant was found in the refractor, as observed in Example 22 for TPO (Met- ¹ 1-153). The same method for recovery, solubilization and purification of the monomeric TPO variant was achieved as described in Example 22. Using the same refolding conditions as used for TPO (Met- ¹ 1-153), the overall yield is 30-50%
Met. After refolding, the TPO variant was converted to 0.1% TFA using an acetonitrile gradient as described above.
Purified by C4 reverse phase chromatography in. All TPO variants (in the non-proteolytic form) have Ba / F3
As assessed by the assay, it had a biological activity of half maximal activity of 2-5 pM.

【０４５０】Ｂ．真性のＮ末端ＴＰＯ（１−１５５）を
生成させるための変異体（２）および（３）の蛋白分解
的処理 上のＴＰＯ変異体（２）および（３）を、ＴＰＯの正常
なＮ末端アミノ酸残基の前に、酵素的に開裂し得るリー
ダーペプチドを有するように設計した。上記のように変
異体（２）および（３）の再折り畳みおよび精製を行っ
た後、各々を適当な酵素での消化に付した。各変異体に
ついて、Ｃ４逆相工程からのアセトニトリルを、溶液上
に穏やかな窒素気流を通気することにより除去した。そ
の後二つの変異体を下記のように因子Ｘａまたはトロン
ビンのいずれかで処理した。B. Proteolytic Processing of Mutants (2) and (3) to Generate Intrinsic N-Terminal TPO (1-155) The TPO variants (2) and (3) on It was designed to have a leader peptide that could be enzymatically cleaved in front of the residue. After refolding and purification of mutants (2) and (3) as described above, each was subjected to digestion with the appropriate enzymes. For each mutant, the acetonitrile from the C4 reverse phase step was removed by bubbling a gentle stream of nitrogen over the solution. The two mutants were then treated with either factor Xa or thrombin as described below.

【０４５１】ＴＰＯ変異体（２）については、１Ｍトリ
ス緩衝液（ｐＨ８）を、アセトニトリルを含まないこの
溶液に最終濃度５０ｍＭとなるまで加え、必要ならばｐ
Ｈを８に調節した。ＮａＣｌおよびＣａＣｌ₂をそれぞ
れ０．１Ｍおよび２ｍＭとなるまで加えた。因子Ｘａ
（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を加えて変異
体に対する酵素のモル比約１：２５ないし１：１００を
達成した。この試料を室温で１−２時間インキュベート
して、リーダー配列の喪失を表すＳＤＳゲル上の移動の
変化により評価される最大の開裂を達成した。その後、
反応混合物を、正しく折り畳まれた変異体の精製につい
て上に記載されたものと同じ勾配および条件を用いるＣ
４逆相クロマトグラフィーによって精製した。開裂しな
かった変異体Ｂは、これらの条件により開裂した変異体
（２）から分離された。Ｎ末端アミノ酸はＳＰＡＰＰで
あることが示され、これはＮ末端リーダー配列の除去が
成功したことを示すものである。因子ＸａはまたＴＰＯ
ドメイン内の変化し得る量の内部開裂を産み；開裂は位
置番号１１８のアルギニン残基の後に観察され、これは
さらなるＮ末端配列ＴＴＡＨＫＤＰ（配列番号８８）を
生成した。非還元ＳＤＳゲル上で、因子Ｘａ開裂変異体
についてはおよそ１７０００ダルトンに単一のバンドが
観察され；還元ゲル上では、アルギニン１１８での開裂
に合致するおよそ１２０００および５０００ダルトンの
分子量である二つのバンドが見られた。この観察はま
た、上記のトリプシン消化実験から導き出されたよう
に、分子の二つの部分が１番目および４番目のシステイ
ン残基の間のジスルフィド結合により結合していること
を確かにした。Ｂａ／Ｆ３生物検定において、Ｎ末端リ
ーダー配列の除去後の内部開裂を伴う精製ＴＰＯ（１−
１５５）変異体は、０．２ないし０．３ピコモルの半最
大活性を有していた。リーダー配列を有する無傷の変異
体は２−４ピコモルの半最大活性を有していた。For the TPO variant (2), 1 M Tris buffer (pH 8) was added to this solution without acetonitrile to a final concentration of 50 mM, p.
H was adjusted to 8. NaCl and CaCl ₂ were added to 0.1 M and 2 mM, respectively. Factor Xa
(New England Biolabs) was added to achieve a molar ratio of enzyme to mutant of about 1:25 to 1: 100. The sample was incubated at room temperature for 1-2 hours to achieve maximum cleavage as assessed by changes in migration on the SDS gel indicating loss of leader sequence. afterwards,
The reaction mixture was purified using the same gradient and conditions as described above for the purification of the correctly folded variant.
4 Purified by reverse phase chromatography. Mutant B that was not cleaved was separated from mutant (2) that was cleaved under these conditions. The N-terminal amino acid was shown to be SPAPP, indicating successful removal of the N-terminal leader sequence. Factor Xa is also TPO
This resulted in a variable amount of internal cleavage within the domain; cleavage was observed after the arginine residue at position 118, which generated an additional N-terminal sequence TTAHKDP (SEQ ID NO: 88). On a non-reducing SDS gel, a single band at approximately 17000 daltons was observed for the factor Xa cleavage mutant; A band was seen. This observation also confirmed that the two parts of the molecule were linked by a disulfide bond between the first and fourth cysteine residues, as derived from the trypsin digestion experiments described above. In the Ba / F3 bioassay, purified TPO (1--with internal cleavage after removal of the N-terminal leader sequence)
155) The variant had a half-maximal activity of 0.2 to 0.3 pmol. The intact mutant with the leader sequence had a half-maximal activity of 2-4 picomoles.

【０４５２】変異体（３）のためには、消化緩衝液は、
５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、２％ＣＨＡＰＳ、０．３Ｍ
ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよびＴＰＯ変異体蛋白に
対する酵素が１：２５ないし１：５０（重量）のヒトま
たは牛トロンビン（カルビオケム）で構成されていた。
消化は室温で２−６時間実施した。消化の進行を、因子
Ｘａ開裂反応について上に記載されたようにＳＤＳゲル
により評価した。一般に、この時点でリーダー配列の９
０％以上の開裂が達成された。得られたＴＰＯを上記の
ようにＣ４逆相カラム上で精製し、アミノ酸配列決定に
より所望のＮ末端を有することが示された。因子Ｘａに
関して上で観察されたのと同じアルギニン−スレオニン
結合において、極めて少量（＜５％）の内部開裂が得ら
れただけであった。得られたＴＰＯ蛋白は、Ｂａ／Ｆ３
検定において０．２−０．４ピコモル蛋白での半最大反
応を有する高い生物活性を持っていた。ｍｐｌレセプタ
ーに基づくＥＬＩＳＡにおいて、この蛋白は２−４ｎｇ
／ｍｌ精製蛋白（１２０−２４０ピコモル）で半最大反
応があったが、一方、リーダー配列を含む無傷の変異体
は両方の検定で５−１０倍力価が低かった。動物研究の
ために、ＨＰＬＣ精製された開裂蛋白を、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．０１％トゥイーン８０および１０ｍＭ琥
珀酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、または１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．５）、または１０ｍＭ燐酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．４）を伴う生理学上許容し得る緩衝液中に
透析した。ＨＰＬＣおよびＳＤＳゲルにより、この精製
された蛋白は４℃で保存した場合、数週間安定であっ
た。正常のおよび骨髄抑制マウスにおいて、真性のＮ末
端配列を有するこの精製ＴＰＯは高度に活性であり、３
０ｎｇ／マウスという低い用量で血小板の産生を刺激し
た。For mutant (3), the digestion buffer was
50 mM Tris (pH 8), 2% CHAPS, 0.3 M
The enzymes for NaCl, 5 mM EDTA and the TPO variant protein consisted of 1:25 to 1:50 (weight) human or bovine thrombin (Calbiochem).
Digestion was performed at room temperature for 2-6 hours. The progress of the digestion was assessed by SDS gel as described above for the Factor Xa cleavage reaction. Generally, at this point 9 of the leader sequence
Cleavage of 0% or more was achieved. The resulting TPO was purified on a C4 reverse phase column as described above and amino acid sequencing showed that it had the desired N-terminus. Only a very small amount (<5%) of internal cleavage was obtained at the same arginine-threonine bond observed above for factor Xa. The resulting TPO protein was Ba / F3
The assay had high biological activity with a half-maximal response at 0.2-0.4 picomolar protein. In an ELISA based on the mpl receptor, this protein is 2-4 ng.
There was a half-maximal response with 1 / ml purified protein (120-240 pmol), while the intact mutant containing the leader sequence was 5-10 fold lower in both assays. For animal studies, the HPLC purified cleaved protein was converted to 150 mM
Dialysis in physiologically acceptable buffer with NaCl, 0.01% Tween 80 and 10 mM sodium succinate (pH 5.5), or 10 mM sodium acetate (pH 5.5), or 10 mM sodium phosphate (pH 7.4). did. By HPLC and SDS gels, the purified protein was stable for several weeks when stored at 4 ° C. In normal and myelosuppressed mice, this purified TPO with a true N-terminal sequence is highly active,
Platelet production was stimulated at doses as low as 0 ng / mouse.

【０４５３】実施例２４ 合成ｍｐｌリガンド ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）は通常組換え法を用いて
作成されるが、これは、下記の方法を用いて、合成ペプ
チドフラグメントの酵素的ライゲーションで合成するこ
ともできる。ｈＭＬの合成による生産は、非天然アミノ
酸またはポリエチレングリコールのような合成官能基の
取り込みを可能にする。かつてセリンプロテアーゼズブ
チリシンＢＰＮの突然変異体、ズブチリガーゼ（Ｓ２２
１Ｃ／Ｐ２２５Ａ）が、ペプチドエステルを水性溶液中
で有効にライゲーションするように組み立てられた（ア
ブラームセン等、Biochem.、３０巻４１５１−４１５９
頁［１９９１］）。現在では、合成ペプチドを連続して
酵素的にライゲーションして、酵素的に活性な長いペプ
チドおよびリボヌクレアーゼＡのような蛋白を生成させ
ることができるということが知られている（ジャクソン
等、Science、［１９９４］）。より詳細に下に記載さ
れるこの技術によって、本発明者等は、かつて組み換え
ＤＮＡ技術でしか製造できなかった長い蛋白を化学合成
することができるようになった。 Example 24 Synthetic mpl ligand Human mpl ligand (hML) is usually prepared using recombinant methods, which can also be synthesized by enzymatic ligation of synthetic peptide fragments using the following method. it can. Production by synthesis of hML allows for incorporation of unnatural amino acids or synthetic functional groups such as polyethylene glycol. Once a mutant of the serine protease subtilisin BPN, subtilisase (S22
1C / P225A) was assembled to effectively ligate the peptide ester in aqueous solution (Abrahamsen et al., Biochem. 30, Vol. 4151-4159).
Page [1991]). It is now known that synthetic peptides can be sequentially enzymatically ligated to produce enzymatically active long peptides and proteins such as ribonuclease A (Jackson et al., Science, [ 1994]). This technique, described in more detail below, has allowed the present inventors to chemically synthesize long proteins that could only previously be produced with recombinant DNA technology.

【０４５４】ｈＭＬ₁₅₃合成のための一般的方法を示す
（図式１）。当該蛋白のＣ末端フラグメントに対応する
完全に脱保護されたペプチドで始まり、Ｎ末端保護され
Ｃ末端活性化されたエステルペプチドをズブチリガーゼ
と共に加える。反応が完結したならば、生成物を逆相Ｈ
ＰＬＣにより分離し、保護基をＮ末端から除去する。次
のペプチドフラグメントをライゲーションし、脱保護
し、そしてこの工程を、次々とペプチドを用いて全長の
蛋白が得られるまで反復する。この方法は、Ｎ末端保護
されＣ末端活性化されたペプチドが、先行するペプチド
のＮ末端にライゲーションされ、蛋白がＣ→Ｎ方向に合
成されるという点において固相法に類似している。しか
し、各合成が５０残基までの付加を産み、そして生成物
が各ライゲーション後に分離されるため、ずっと長い、
高度に純粋な蛋白を妥当な収率で合成することができ
る。[0454] A general method for HML ₁₅₃ Synthesis (Scheme 1). Starting with a fully deprotected peptide corresponding to the C-terminal fragment of the protein, an N-terminal protected C-terminal activated ester peptide is added along with the subtiliser. When the reaction is completed, the product is
Separation by PLC removes protecting groups from N-terminus. The next peptide fragment is ligated, deprotected, and this process is repeated until the full-length protein is obtained using the peptides in sequence. This method is similar to the solid phase method in that an N-terminal protected and C-terminal activated peptide is ligated to the N-terminal of the preceding peptide, and the protein is synthesized in the C → N direction. However, much longer, since each synthesis yielded additions of up to 50 residues, and the products were separated after each ligation.
Highly pure proteins can be synthesized in reasonable yields.

【０４５５】 図式１．ズブチリガーゼを用いるｈＭＬの合成方法 Ｒ−ＮＨ−ペプチド₂−ＣＯ−Ｒ' ＋ Ｈ₂Ｎ−ペプチド₁−ＣＯ₂ ↓１）ズブチリガーゼ Ｒ−ＮＨ−ペプチド₂−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド₁−ＣＯ₂ ↓２）Ｚｎ／ＣＨ₃ＣＯ₂Ｈ Ｈ₂Ｎ−ペプチド₂−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド₁−ＣＯ₂ ↓３）１＋２を反復 Ｈ₂Ｎ−ペプチド₃−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド₂−ＣＯ−ＮＨ−ペプチド₁−ＣＯ₂ Scheme 1 Used Zubuchirigaze synthesis of hML method R-NH- peptide _{2 -CO-R '+ H 2} N- Peptide ₁ -CO ₂ ↓ ₁₎ Zubuchirigaze R-NH- peptide ₂ -CO-NH- peptide ₁ -CO ₂ ↓ 2 _{) Zn / CH 3 CO 2 H} H 2 N- peptide ₂ -CO-NH- peptide _{1 -CO 2 ↓ 3) 1 +} 2 iterations H ₂ N-peptide ₃ -CO-NH- peptide ₂ -CO-NH- peptide ₁ −CO ₂

【０４５６】[0456]

【化２９】 ズブチリガーゼの配列特異性およびｈＭＬの生物活性
「ｅｐｏドメイン」のアミノ酸配列についての知識に基
づき、本発明者等はｈＭＬ₁₅₃を長さ１８−２５残基の
７個のフラグメントに分割した。この１８−２５量体の
ための適当なライゲーション接合部を決定するため、試
験ライゲーションテトラペプチドを合成した。表１５は
これらの試験ライゲーションの結果を示すものである。Embedded image Sequence specificity of Zubuchirigaze and based on knowledge of the amino acid sequence of the biologically active "epo domain" of HML, the present inventors have divided into seven fragments in length 18-25 residues HML _153. Test ligation tetrapeptides were synthesized to determine the appropriate ligation junction for this 18-25 mer. Table 15 shows the results of these test ligation.

【０４５７】[0457]

【表１５】ｈＭＬ試験ライゲーション。ドナーおよび求
核ペプチドを２２℃で１００ｍＭトリシン（ｐＨ７．
８）に１０ｍＭで溶解した。リガーゼを、１．６ｍｇ／
ｍｌ保存液（〜７０μＭ）から最終濃度１０μＭとなる
まで加え、ライゲーションを一夜進行させた。収率は、
ドナーペプチドの加水分解に対するライゲーション％に
基づいている。 部位 ト゛ナー(glc-K-NH₂) 求核基-NH₂ 加水分解％ ライケ゛ーション％ 1 (23/24) HVLH SRLS 92 08 (配列番号89) (配列番号90) (22/23) SHVL HSRL 48 52 (配列番号91) (配列番号92) 2 (46/47) AVDF SLGE 22 78 (配列番号93) (配列番号94) 3 (69/70) AVTL LLEG 53 47 (配列番号95) (配列番号96) 4 (89/90) LSSL LGQL 95 05 (配列番号97) (配列番号98) (88/89) C(acm)LSS LLGQ 00 00 (配列番号99) (配列番号100) (90/91) SSLL GQLS 45 55 (配列番号101) (配列番号102) (88/89) CLSS LLGQ 90 10 (配列番号103) (配列番号100) 5 (107/108) LQSL LGTQ 99 01 (配列番号104) (配列番号105) (106/107) ALQS LLGT 70 30 (配列番号106) (配列番号107) 6 (128/129) NAIF LSFQ 60 40 (配列番号108) (配列番号109) Table 15 hML test ligation. Donor and nucleophilic peptide were added at 22 ° C. to 100 mM Tricine (pH 7.
8) was dissolved at 10 mM. Ligase at 1.6 mg /
Ligations were allowed to proceed overnight from the stock solution (〜70 μM) to a final concentration of 10 μM. The yield is
Based on% ligation for hydrolysis of donor peptide. Site Toner (glc-K-NH ₂ ) Nucleophilic group-NH ₂ hydrolysis% Ligation % 1 (23/24) HVLH SRLS 92 08 (SEQ ID NO: 89) (SEQ ID NO: 90) (22/23) SHVL HSRL 48 52 (SEQ ID NO: 91) (SEQ ID NO: 92) 2 (46/47) AVDF SLGE 22 78 (SEQ ID NO: 93) (SEQ ID NO: 94) 3 (69/70) AVTL LLEG 53 47 (SEQ ID NO: 95) (SEQ ID NO: 96) 4 (89/90) LSSL LGQL 95 05 (SEQ ID NO: 97) (SEQ ID NO: 98) (88/89) C (acm) LSS LLGQ 00 00 (SEQ ID NO: 99) (SEQ ID NO: 100) (90/91) SSLL GQLS 45 55 (SEQ ID NO: 101) (SEQ ID NO: 102) (88/89) CLSS LLGQ 90 10 (SEQ ID NO: 103) (SEQ ID NO: 100) 5 (107/108) LQSL LGTQ 99 01 (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 105) ) (106/107) ALQS LLGT 70 30 (SEQ ID NO: 106) (SEQ ID NO: 107) 6 (128/129) NAIF LSFQ 60 40 (SEQ ID NO: 108) (SEQ ID NO: 109)

【０４５８】これらの実験に基づき、表１６に示される
ライゲーションペプチドはズブチリガーゼにより有効に
ライゲーションされるに違いない。自己ライゲーション
を防止するため、各ドナーエステルペプチドのＮ末端の
ための適当な保護基が必要であった。本発明者等はイソ
ニコチニル（ｉＮＯＣ）保護基（ヴィーバー等、J.Org.
Chem.、４２巻３２８６−３２８９頁［１９７７］）を
選択する。何故ならこれは水溶性であり、固相ペプチド
合成の最終段階で加えることができ、そしてペプチドを
固相樹脂から脱保護および開裂するために用いられる無
水ＨＦに対して安定であるためである。さらにこれは、
各ライゲーションの後、緩和な還元条件下で（Ｚｎ／Ｃ
Ｈ₃ＣＯ₂Ｈ）ペプチドから除去され、次のライゲーショ
ンのための遊離Ｎ末端を与えることができる。グリコラ
ート−リジル−アミド（ｇｌｃ−Ｋ−ＮＨ₂）エステル
がズブチリガーゼにより効果的にアシル化されることを
示した先の実験（アブラームセン等、Biochem.、３０巻
４１５１−４１５９頁［１９９１］）に基づき、これを
Ｃ末端活性化に使用した。ｉＮＯＣ−保護されｇｌｃ−
Ｋ−アミド活性化されたペプチドは、概説されるような
標準的固相法を用いて合成することができる（図式
２）。次にこのペプチドを、完全な蛋白が生成されるま
で連続的にライゲーションし、最終生成物をインビトロ
で再折り畳みする。ＥＰＯとの相同性に基づき、ジスル
フィド対はシステイン残基７および１５１ならびに２８
および８５の間に形成されると信じられる。ジスルフィ
ドの酸化は、還元された物質を単に酸素雰囲気下で数時
間攪拌することによって達成することができる。次いで
再折り畳みされた物質をＨＰＬＣにより精製し、活性蛋
白を含有する画分をプールし凍結乾燥することができ
る。別法として、特定のジスルフィド対間の連続酸化を
調節するため、ジスルフィドを区別を付けて保護するこ
ともできる。アセトアミドメチル（ａｃｍ）基によるシ
ステイン７および１５１の保護は２８および８５の酸化
を確実にするであろう。次いでこのａｃｍ基を除去して
残基７および１５１を酸化することができる。逆に、残
基２８および８５をａｃｍ保護し、連続的酸化が正しい
折り畳みにとって必要とされる場合に酸化することがで
きる。所望により、システイン２８および８５をＣｙｓ
以外の別の天然または非天然残基に置換して、システイ
ン７および１５１の適正な酸化を保証することもでき
る。Based on these experiments, the ligation peptides shown in Table 16 must be effectively ligated by subtilisase. Appropriate protecting groups for the N-terminus of each donor ester peptide were needed to prevent self-ligation. We have identified isonicotinyl (iNOC) protecting groups (Weaver et al., J. Org.
Chem., 42, 3286-3289 [1977]). This is because it is water soluble, can be added at the final stage of solid phase peptide synthesis, and is stable to anhydrous HF used to deprotect and cleave the peptide from the solid phase resin. In addition, this
After each ligation, under mild reducing conditions (Zn / C
The H ₃ CO ₂ H) peptide can be removed to provide a free N-terminus for subsequent ligation. Glycolate - lysyl - amide (glc-K-NH ₂₎ previous experiments ester showed to effectively acylated by Zubuchirigaze (. Aburamusen like, Biochem, 30, pp. 4151-4159 [1991]) to the This was used for C-terminal activation. iNOC-protected glc-
K-amide activated peptides can be synthesized using standard solid phase methods as outlined (Scheme 2). The peptide is then ligated continuously until the complete protein is produced, and the final product is refolded in vitro. Based on the homology with EPO, the disulfide pair was cysteine residues 7 and 151 and 28
And 85 are believed to be formed. Oxidation of the disulfide can be achieved by simply stirring the reduced material under an oxygen atmosphere for several hours. The refolded material can then be purified by HPLC, and the fractions containing the active protein can be pooled and lyophilized. Alternatively, the disulfides can be differentiated and protected to regulate sequential oxidation between specific disulfide pairs. Protection of cysteines 7 and 151 by the acetamidomethyl (acm) group will ensure oxidation of 28 and 85. This acm group can then be removed to oxidize residues 7 and 151. Conversely, residues 28 and 85 can be acm protected and oxidized if sequential oxidation is required for correct folding. Optionally, cysteines 28 and 85 can be replaced with Cys
Other natural or non-natural residues other than can be substituted to ensure proper oxidation of cysteines 7 and 151.

【表１６】 [Table 16]

【０４５９】ペプチドライゲーションを１００ｍＭトリ
シン（ｐＨ８）（新たに調製し、５μＭフィルターで真
空濾過することにより脱気する）中２５℃で実施する。
典型的にはＣ末端フラグメントを緩衝液に溶解し（２−
５ｍＭペプチド）、ズブチリガーゼの１０ｘ保存溶液
（１００ｍＭトリシン、ｐＨ８中１ｍｇ／ｍｌ）を加え
て最終的な酵素濃度を〜５μＭとする。次に、３−５モ
ル過剰のｇｌｃ−Ｋ−ＮＨ₂活性化されたドナーペプチ
ドを固体で加え、溶解し、混合物を２５℃に放置する。
ライゲーションは分析用逆相Ｃ１８ ＨＰＬＣ（０．１
％ＴＦＡを伴うＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ勾配）により監視す
る。ライゲーション生成物を調製用ＨＰＬＣにより精製
し凍結乾燥する。ＨＣｌ活性化された亜鉛末を酢酸中の
保護ペプチドと共に攪拌することにより、イソニコチニ
ル（ｉＮＯＣ）脱保護を遂行した。亜鉛末を濾過により
除き、酢酸を減圧下に蒸発させる。得られたペプチドを
次のライゲーションに直接使用し、この工程を反復す
る。合成ｈＭＬ₁₅₃を、上記の方法と類似の方法により
合成または組換えｈＭＬ_154-332とライゲーションし
て、合成または半合成全長ｈＭＬを生成させることがで
きるPeptide ligation is performed at 25 ° C. in 100 mM Tricine, pH 8, freshly prepared and degassed by vacuum filtration through a 5 μM filter.
Typically, the C-terminal fragment is dissolved in buffer (2-
(5 mM peptide), a 10 × stock solution of subtilisase (1 mg / ml in 100 mM Tricine, pH 8) to give a final enzyme concentration of ５5 μM. Next, a 3-5 molar excess of glc-K-NH ₂ activated donor peptide is added as a solid, dissolved, and the mixture is left at 25 ° C.
Ligation was performed on an analytical reverse phase C18 HPLC (0.1
(CH ₃ CN / H ₂ O gradient with% TFA). The ligation product is purified by preparative HPLC and lyophilized. Isonicotinyl (iNOC) deprotection was accomplished by stirring the HCl activated zinc powder with the protected peptide in acetic acid. The zinc dust is removed by filtration and the acetic acid is evaporated under reduced pressure. The resulting peptide is used directly for the next ligation and the process is repeated. Synthesis HML _153, and ligated with synthetic or recombinant HML _154-332 by methods analogous to the methods described above, synthetic or semisynthetic full length HML can be produced

【０４６０】合成ｈＭＬは組換えに優る多くの利点を有
する。力価または特異性を改善するため、非天然側鎖を
導入することができる。活性の持続性を改善するため、
ポリエチレングリコールのようなポリマー官能基を組み
入れることができる。例えば、１またはそれ以上のライ
ゲーション工程の実施の前または後に、ポリエチレング
リコールを個々のフラグメント（表１６）のリジン残基
に結合させることができる。インビボ安定性を改善する
ため、プロテアーゼ感受性ペプチド結合を除去しまたは
変更することができる。加えて、構造決定の助けとする
ため重原子誘導体を合成することもできる。[0460] Synthetic hML has many advantages over recombination. To improve titer or specificity, non-natural side chains can be introduced. To improve the sustainability of the activity,
Polymer functional groups such as polyethylene glycol can be incorporated. For example, polyethylene glycol can be attached to lysine residues of individual fragments (Table 16) before or after performing one or more ligation steps. To improve in vivo stability, protease sensitive peptide bonds can be removed or altered. In addition, heavy atom derivatives can be synthesized to aid structure determination.

【０４６１】図式２.セグメントのライゲーションのた
めのペプチドフラグメントの固相合成Scheme 2. Solid phase synthesis of peptide fragments for segment ligation

【化３０】 ａ）リジル−パラメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨ
Ａ）樹脂１（０．６３ｍｅｑ／ｇ、アドヴァンスト・ケ
ムテク）を、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中でブロ
モ酢酸（５ｅｑ）およびジイソプロピルカルボジイミド
（５ｅｑ）と共に２５℃で１時間攪拌してブロモアセチ
ル誘導体２を得る。ｂ）樹脂をＤＭＡで良く洗浄し、個
々のＢｏｃ−保護されたアミノ酸（３ｅｑ、バッチェ
ム）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で重炭酸ナト
リウム（６ｅｑ）と共に５０℃で２４時間攪拌すること
によりエステル化して、対応するグリコラート−フェニ
ルアラニル−アミド−樹脂３を得る。このアミノアセチ
ル化された樹脂３をＤＭＦ（３ｘ）およびジクロロメタ
ン（ＣＨ₂Ｃｌ₂）（３ｘ）で洗浄し、室温で数ヶ月保存
することができる。次に樹脂３を自動ペプチド合成機
（アプライド・バイオシステムズ４３０Ａ）にロード
し、標準的固相法を用いてペプチドを伸長することがで
きる（５）。ｃ）Ｎ−α−Ｂｏｃ基をＣＨ₂Ｃｌ₂中の４
５％トリフルオロ酢酸の溶液で除去する。ｄ）次のＢｏ
ｃ−保護アミノ酸（５ｅｑ）を、ＤＭＡ中のベンゾトリ
アゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミ
ノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯ
Ｐ、４ｅｑ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１
０ｅｑ）を用いて前活性化し、１−２時間結合させる。
ｅ）最後のＮ−α−Ｂｏｃ基を除去して（ＴＦＡ／ＣＨ
₂Ｃｌ₂）４を得、前記（４）に記載のように、ＤＭＡ中
の４−イソニコチニル−２−４−ジニトロフェニルカル
ボナート（３ｅｑ）およびＮＭＭ（６ｅｑ）と共に２５
℃で２４時間攪拌することにより、イソニコチニル（ｉ
ＮＯＣ）保護基を導入する。ｆ）無水ＨＦ（５％アニソ
ール／５％エチルメチルスルフィド）を用いる０℃で１
時間の処理によるペプチドの開裂および脱保護は、ｉＮ
ＯＣ−保護された、グリコラート−ｌｙｓ−アミド活性
化されたペプチド５を与え、これを逆相Ｃ１８ ＨＰＬ
Ｃ（ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ勾配、０．１％ＴＦＡ）により精
製する。全ての基質の同定は質量分析により確認する。Embedded image a) Lysyl-paramethylbenzhydrylamine (MBH
A) Resin 1 (0.63 meq / g, Advanced Chemtech) was stirred with bromoacetic acid (5 eq) and diisopropylcarbodiimide (5 eq) in dimethylacetamide (DMA) at 25 ° C. for 1 hour to convert bromoacetyl derivative 2 obtain. b) The resin was washed well with DMA and the individual Boc-protected amino acids (3 eq, batchem) were esterified in dimethylformamide (DMF) by stirring with sodium bicarbonate (6 eq) at 50 ° C. for 24 hours. To give the corresponding glycolate-phenylalanyl-amide-resin 3. The amino acetylated resin 3 is washed with DMF (3x) and dichloromethane _{(CH 2 Cl 2) (3x} ), can be stored for several months at room temperature. Resin 3 can then be loaded into an automated peptide synthesizer (Applied Biosystems 430A) and the peptide can be extended using standard solid phase techniques (5). c) the N-α-Boc group is replaced with 4 in CH ₂ Cl ₂
Remove with a solution of 5% trifluoroacetic acid. d) Next Bo
The c-protected amino acid (5 eq) was converted to benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BO) in DMA.
P, 4 eq) and N-methylmorpholine (NMM, 1
0eq) and allowed to bind for 1-2 hours.
e) Removal of the last N-α-Boc group (TFA / CH
₂ Cl ₂ ) 4, as described in (4) above, along with 4-isonicotinyl-2--4-dinitrophenyl carbonate (3 eq) and NMM (6 eq) in DMA.
By stirring at 24 ° C. for 24 hours, isonicotinyl (i
(NOC) Introduce a protecting group. f) 1 at 0 ° C. with anhydrous HF (5% anisole / 5% ethyl methyl sulfide)
The cleavage and deprotection of the peptide by the treatment of time
OC-protected, glycolate-lys-amide activated peptide 5 was obtained, which was reversed phase C18 HPL
Purify by C (CH ₃ CN / H ₂ O gradient, 0.1% TFA). The identity of all substrates is confirmed by mass spectrometry.

【０４６２】補足的許諾 特許請求されている本発明は、上記の明細書および容易
に入手し得る参考文献および出発物質にしたがって実施
可能である。にもかかわらず、本出願人等は、以下に列
挙されるセルラインをアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション、ロックヴィル、Ｍｄ、ＵＳＡ（ＡＴＣ
Ｃ）に寄託した：エシェリチア・コリ、ＤＨ１０Ｂ−ｐ
ＢＳＫ−ｈｍｐｌＩ １．８、ＡＴＣＣ受理番号ＣＲＬ
６９５７５、１９９４年２月２４日寄託、プラスミド、
ｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦ、ＡＴＣＣ受理番号
ＣＲＬ７５９５８、１９９４年１２月２日寄託；およ
び、ＣＨＯ ＤＰ−１２細胞、ＭＬ １／５０ ＭＣＢ
（標識＃１５９４）、ＡＴＣＣ受理番号ＣＲＬ１１７７
０、１９９４年１２月６日寄託。この寄託は、特許手続
上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約お
よびその規則の規定の下になされた（ブダペスト条
約）。これは、生存培養を寄託の日から３０年間維持す
ることを保証するものである。当該生物は、ブダペスト
条約の下にＡＴＣＣによって入手可能とされ、そして、
関連する米国特許の登録時における無制限の入手可能性
を保証する、出願人およびＡＴＣＣ間の合意の下にある
であろう。寄託された菌株の入手可能性は、任意の政府
当局がその特許法に従って付与した権利に違反して本発
明を実施する許諾と解してはならない。本発明を必然的
に好ましい態様および個々の実用的実施例と結びつけて
説明してきたが、当業者は、前述の明細書を読んだ後
に、本発明の精神および範囲から乖離せずに、種々の変
更、等価物による置き換え、および本明細書に開示され
る主題内容への改変を加えることができるであろう。し
たがって本発明は、本明細書に個別的に記載される以外
の方法で実施することができる。故に、本発明に関する
特許証により付与された保護は、付記される請求の範囲
およびその等価物によってのみ制限されることが意図さ
れている。 Supplemental License The claimed invention can be practiced according to the above specification and readily available references and starting materials. Nevertheless, Applicants have filed the cell lines listed below with the American Type Culture Collection, Rockville, Md, USA (ATC
C): Escherichia coli, DH10B-p
BSK-hmplI 1.8, ATCC accession number CRL
69575, deposited February 24, 1994, plasmid,
pSVI5.ID.LL.MLORF, ATCC Accession No. CRL75958, deposited on Dec. 2, 1994; and CHO DP-12 cells, ML 1/50 MCB
(Sign # 1594), ATCC accession number CRL1177
0, deposited on December 6, 1994. This deposit was made under the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure and its Regulations (Budapest Treaty). This ensures that viable cultures are maintained for 30 years from the date of deposit. The organism has been made available by the ATCC under the Budapest Treaty, and
It will be under agreement between the applicant and the ATCC to ensure unrestricted availability at the time of registration of the relevant US patent. The availability of the deposited strain is not to be construed as a license to practice the present invention in violation of the rights granted by any governmental authority under its patent laws. Although the present invention has been described in conjunction with the necessarily preferred embodiments and individual practical examples, those of ordinary skill in the art, after reading the foregoing specification, may make various modifications without departing from the spirit and scope of the invention. Modifications, equivalent replacements, and modifications to the subject matter disclosed herein could be made. Thus, the present invention may be practiced in other ways than those specifically described herein. It is therefore intended that the protection afforded by the patent relating to the present invention be limited only by the appended claims and equivalents thereof.

【０４６３】本明細書に引用される全ての参考文献は、
説明的に引用されて本明細書の一部とされる。All references cited herein are:
Descriptive citations are incorporated herein by reference.

【０４６４】[0464]

【配列表】[Sequence list]

【０４６５】（２） 配列番号１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３５３アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１： Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ １ ５
１０ １５ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ ２０
２５ ３０ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ ３５
４０ ４５ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ ５０
５５ ６０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ ６５
７０ ７５ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ８０
８５ ９０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ９５
１００ １０５ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ １１０
１１５ １２０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ １２５
１３０ １３５ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ １４０
１４５ １５０ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ １５５
１６０ １６５ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ １７０
１７５ １８０ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ １８５
１９０ １９５ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ ２００
２０５ ２１０ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ２１５
２２０ ２２５ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ２３０
２３５ ２４０ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ ２４５
２５０ ２５５ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ２６０
２６５ ２７０ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ ２７５
２８０ ２８５ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ ２９０
２９５ ３００ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ３０５
３１０ ３１５ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ ３２０
３２５ ３３０ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ ３３５
３４０ ３４５ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ ３５０ ３５３(2) Information of SEQ ID NO: 1 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 353 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 1 Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val
Val Met Leu Leu Leu Thr 15
10 15 Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala
Pro Pro Ala Cys Asp Leu 20
25 30 Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp
Ser His Val Val Leu His Ser 35
40 45 Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His
Pro Leu Pro Thr Pro Val 50
55 60 Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu
Gly Glu Trp Lys Thr Gln 65
70 75 Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile
Leu Gly Ala Val Thr Leu 80
85 90 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg
Gly Gln Leu Gly Pro Thr 95
100 105 Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu
Ser Gly Gln Val Arg Leu 110
115 120 Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu
Gly Thr Gln Leu Pro Pro 125
130 135 Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp
Pro Asn Ala Ile Phe Leu 140
145 150 Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys
Val Arg Phe Leu Met Leu 155
160 165 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg
Arg Ala Pro Pro Thr Thr 170
175 180 Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val
Leu Thr Leu Asn Glu Leu 185
190 195 Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu
Thr Asn Phe Thr Ala Ser 200
205 210 Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu
Lys Trp Gln Gln Gly Phe 215
220 225 Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn
Gln Thr Ser Arg Ser Leu 230
235 240 Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg
Ile His Glu Leu Leu Asn 245
250 255 Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro
Ser Arg Arg Thr Leu Gly 260
265 270 Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser
Asp Thr Gly Ser Leu Pro 275
280 285 Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro
Ser Pro Thr His His Pro Pro 290
295 300 Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu
Pro Pro Thr Leu Pro Thr 305
310 315 Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu
Pro Asp Pro Ser Ala Pro 320
325 330 Thr Pro Thr Pro Thr Thr Ser Pro Leu Leu
Asn Thr Ser Tyr Thr His 335
340 345 Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 350 353

【０４６６】（２） 配列番号２の情報： （ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１７９５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２： TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50 CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100 CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150 CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200 GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT 250 TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG 300 ACCTCCGAGT CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC 350 AGACTGAGCC AGTGCCCAGA GGTTCACCCT TTGCCTACAC CTGTCCTGCT 400 GCCTGCTGTG GACTTTAGCT TGGGAGAATG GAAAACCCAG ATGGAGGAGA 450 CCAAGGCACA GGACATTCTG GGAGCAGTGA CCCTTCTGCT GGAGGGAGTG 500 ATGGCAGCAC GGGGACAACT GGGACCCACT TGCCTCTCAT CCCTCCTGGG 550 GCAGCTTTCT GGACAGGTCC GTCTCCTCCT TGGGGCCCTG CAGAGCCTCC 600 TTGGAACCCA GCTTCCTCCA CAGGGCAGGA CCACAGCTCA CAAGGATCCC 650 AATGCCATCT TCCTGAGCTT CCAACACCTG CTCCGAGGAA AGGTGCGTTT 700 CCTGATGCTT GTAGGAGGGT CCACCCTCTG CGTCAGGCGG GCCCCACCCA 750 CCACAGCTGT CCCCAGCAGA ACCTCTCTAG TCCTCACACT GAACGAGCTC 800 CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACA AACTTCACTG CCTCAGCCAG 850 AACTACTGGC TCTGGGCTTC TGAAGTGGCA GCAGGGATTC AGAGCCAAGA 900 TTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGT CCCTGGACCA AATCCCCGGA 950 TACCTGAACA GGATACACGA ACTCTTGAAT GGAACTCGTG GACTCTTTCC 1000 TGGACCCTCA CGCAGGACCC TAGGAGCCCC GGACATTTCC TCAGGAACAT 1050 CAGACACAGG CTCCCTGCCA CCCAACCTCC AGCCTGGATA TTCTCCTTCC 1100 CCAACCCATC CTCCTACTGG ACAGTATACG CTCTTCCCTC TTCCACCCAC 1150 CTTGCCCACC CCTGTGGTCC AGCTCCACCC CCTGCTTCCT GACCCTTCTG 1200 CTCCAACGCC CACCCCTACC AGCCCTCTTC TAAACACATC CTACACCCAC 1250 TCCCAGAATC TGTCTCAGGA AGGGTAAGGT TCTCAGACAC TGCCGACATC 1300 AGCATTGTCT CATGTACAGC TCCCTTCCCT GCAGGGCGCC CCTGGGAGAC 1350 AACTGGACAA GATTTCCTAC TTTCTCCTGA AACCCAAAGC CCTGGTAAAA 1400 GGGATACACA GGACTGAAAA GGGAATCATT TTTCACTGTA CATTATAAAC 1450 CTTCAGAAGC TATTTTTTTA AGCTATCAGC AATACTCATC AGAGCAGCTA 1500 GCTCTTTGGT CTATTTTCTG CAGAAATTTG CAACTCACTG ATTCTCTACA 1550 TGCTCTTTTT CTGTGATAAC TCTGCAAAGG CCTGGGCTGG CCTGGCAGTT 1600 GAACAGAGGG AGAGACTAAC CTTGAGTCAG AAAACAGAGA AAGGGTAATT 1650 TCCTTTGCTT CAAATTCAAG GCCTTCCAAC GCCCCCATCC CCTTTACTAT 1700 CATTCTCAGT GGGACTCTGA TCCCATATTC TTAACAGATC TTTACTCTTG 1750 AGAAATGAAT AAGCTTTCTC TCAGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1795(2) Information of SEQ ID NO: 2 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 1795 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight chain (xi) SEQ: SEQ ID NO 2: TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50 CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100 CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150 CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200 GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT 250 TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG 300 ACCTCCGAGT CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC 350 AGACTGAGCC AGTGCCCAGA GGTTCACCCT TTGCCTACAC CTGTCCTGCT 400 GCCTGCTGTG GACTTTAGCT TGGGAGAATG GAAAACCCAG ATGGAGGAGA 450 CCAAGGCACA GGACATTCTG GGAGCAGTGA CCCTTCTGCT GGAGGGAGTG 500 ATGGCAGCAC GGGGACAACT GGGACCCACT TGCCTCTCAT CCCTCCTGGG 550 GCAGCTTTCT GGACAGGTCC GTCTCCTCCT TGGGGCCCTG CAGAGCCTCC 600 TTGGAACCCA GCTTCCTCCA CAGGGCAGGA CCACAGCTCA CAAGGATCCC 650 AATGCCATCT TCCTGAGCTT CCAACACCTG CTCCGAGGAA AGGTGCGTTT 700 CCTGATGCTT GTAGGAGGGT CCACCCTCTG CGTCAGGCGG GCCCCACCCA 750 CCACAGCTGT CCCCAGCAGA ACCTCTCTAG TCCTCACACT GAACGAGCTC 800 CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACA AACTTCACTG CCTCAGCCAG 850 AACTACTGGC TCTGGGCTTC TGAAGTGGCA GCAGGGATTC AGAGCCAAGA 900 TTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGT CCCTGGACCA AATCCCCGGA 950 TACCTGAACA GGATACACGA ACTCTTGAAT GGAACTCGTG GACTCTTTCC 1000 TGGACCCTCA CGCAGGACCC TAGGAGCCCC GGACATTTCC TCAGGAACAT 1050 CAGACACAGG CTCCCTGCCA CCCAACCTCC AGCCTGGATA TTCTCCTTCC 1100 CCAACCCATC CTCCTACTGG ACAGTATACG CTCTTCCCTC TTCCACCCAC 1150 CTTGCCCACC CCTGTGGTCC AGCTCCACCC CCTGCTTCCT GACCCTTCTG 1200 CTCCAACGCC CACCCCTACC AGCCCTCTTC TAAACACATC CTACACCCAC 1250 TCCCAGAATC TGTCTCAGGA AGGGTAAGGT TCTCAGACAC TGCCGACATC 1300 AGCATTGTCT CATGTACAGC TCCCTTCCCT GCAGGGCGCC CCTGGGAGAC 1350 AACTGGACAA GATTTCCTAC TTTCTCCTGA AACCCAAAGC CCTGGTAAAA 1400 GGGATACACA GGACTGAAAA GGGAATCATT TTTCACTGTA CATTATAAAC 1450 CTTCAGAAGC TATTTTTTTA AGCTATCAGC AATACTCATC AG AGCAGCTA 1500 GCTCTTTGGT CTATTTTCTG CAGAAATTTG CAACTCACTG ATTCTCTACA 1550 TGCTCTTTTT CTGTGATAAC TCTGCAAAGG CCTGGGCTGG CCTGGCAGTT 1600 GAACAGAGGG AGAGACTAAC CTTGAGTCAG AAAACAGAGA AAGGGTAATT 1650 TCCTTTGCTT CAAATTCAAG GCCTTCCAAC GCCCCCATCC CCTTTACTAT 1700 CATTCTCAGT GGGACTCTGA TCCCATATTC TTAACAGATC TTTACTCTTG 1750 AGAAATGAAT AAGCTTTCTC TCAGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1795

【０４６７】（２） 配列番号３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３： Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ２０
２５ ３０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｈｉｓ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ ３５
４０ ４２(2) Information of SEQ ID NO: 3 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 42 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 3: Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu
Thr Ala Arg Leu Thr Leu 15
10 15 Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp
Leu Arg Val Leu Ser Lys 20
25 30 Leu Leu Arg Asp Ser His His Val Leu His
Ser Arg Leu 35
40 42

【０４６８】（２） 配列番号４の情報： （ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３９０塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４： GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50 CACCTCTCCT CATCTAAGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT TCTCCTAACT 100 GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG ACCTCCGAGT 150 CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC AGACTGGTGA 200 GAACTCCCAA CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA 250 CTCCCAGGAA GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT 300 TCTTCCCATA TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT 350 TCTTCACAAT ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 390(2) Information of SEQ ID NO: 4 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 390 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight chain (xi) SEQ: SEQ ID NO 4: GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50 CACCTCTCCT CATCTAAGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT TCTCCTAACT 100 GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG ACCTCCGAGT 150 CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC AGACTGGTGA 200 GAACTCCCAA CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA 250 CTCCCAGGAA GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT 300 TCTTCCCATA TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT 350 TCTTCACAAT ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 390

【０４６９】（２） 配列番号５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３９０塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５： CTTAAGGACC TTATGGTCGA CTGTTACTAA AGGAGGAGTA GAAAGTTGGA 50 GTGGAGAGGA GTAGATTCTT AACGAGGAGC ACCAGTACGA AGAGGATTGA 100 CGTTCCGATT GCGACAGGTC GGGCCGAGGA GGACGAACAC TGGAGGCTCA 150 GGAGTCATTT GACGAAGCAC TGAGGGTACA GGAAGTGTCG TCTGACCACT 200 CTTGAGGGTT GTAATAGGGG AAATAGGCGC ATTGACCATT CTGTGGGTAT 250 GAGGGTCCTT CTGTGGTAGT GAAGGAGATT GAGGAACTGG GTTACTGATA 300 AGAAGGGTAT AACAGGGGTG GATGACTAGT GTGAGAGACT GTTCTTAATA 350 AGAAGTGTTA TGTCGGGCGT AAATTTTCGA GAGCAGATCT 390(2) Information of SEQ ID NO: 5 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 390 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight chain (xi) SEQ: SEQ ID NO 5: CTTAAGGACC TTATGGTCGA CTGTTACTAA AGGAGGAGTA GAAAGTTGGA 50 GTGGAGAGGA GTAGATTCTT AACGAGGAGC ACCAGTACGA AGAGGATTGA 100 CGTTCCGATT GCGACAGGTC GGGCCGAGGA GGACGAACAC TGGAGGCTCA 150 GGAGTCATTT GACGAAGCAC TGAGGGTACA GGAAGTGTCG TCTGACCACT 200 CTTGAGGGTT GTAATAGGGG AAATAGGCGC ATTGACCATT CTGTGGGTAT 250 GAGGGTCCTT CTGTGGTAGT GAAGGAGATT GAGGAACTGG GTTACTGATA 300 AGAAGGGTAT AACAGGGGTG GATGACTAGT GTGAGAGACT GTTCTTAATA 350 AGAAGTGTTA TGTCGGGCGT AAATTTTCGA GAGCAGATCT 390

【０４７０】（２） 配列番号６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３２２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu 140 145 150 Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 155 160 165 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180 Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser 185 190 195 Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly 200 205 210 Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr 215 220 225 Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser 245 250 255 Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly 260 265 270 Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu 275 280 285 Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His 290 295 300 Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 305 310 315 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln 320 325 330 Glu Gly 332(2) Information of SEQ ID NO: 6 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 322 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 6: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu 140 145 150 Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 155 160 165 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180 Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser 185 190 195 Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly 200 205 210 Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr 215 220 225 Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 230 235 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser 245 250 255 Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly 260 265 270 Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Gly Gln Tyr Thr Leu 275 280 285 Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His 290 295 300 Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 305 310 315 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln 320 325 330 Glu Gly 332

【０４７１】（２） 配列番号７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１６６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７： Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ １ ５
１０ １５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ ２０
２５ ３０ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ３５
４０ ４５ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｌａ ５０
５５ ６０ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ ６５
７０ ７５ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ ８０
８５ ９０ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ９５
１００ １０５ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ １１０
１１５ １２０ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｌａ １２５
１３０ １３５ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ １４０
１４５ １５０ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ １５５
１６０ １６５ Ａｒｇ １６６(2) Information of SEQ ID NO: 7: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 166 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 7 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser
Arg Val Leu Glu Arg Tyr 15
10 15 Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn
Ile Thr Thr Gly Cys Ala 20
25 30 Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile
Thr Val Pro Asp Thr Lys 35
40 45 Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met
Glu Val Gly Gln Gln Ala 50
55 60 Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
Leu Ser Glu Ala Val Leu 65
70 75 Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser
Ser Gln Pro Trp Glu Pro 80
85 90 Leu Gln Leu His Val Val Asp Lys Ala Val
Ser Gly Leu Arg Ser Leu 95
100 105 Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala
Gln Lys Glu Ala Ile Ser 110
115 120 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro
Leu Arg Thr Ile Thr Ala 125
130 135 Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 140
145 150 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
Ala Cys Arg Thr Gly Asp 155
160 165 Arg 166

【０４７２】（２） 配列番号８の情報： （ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３２８アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 110 115 120 Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val 125 130 135 Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg 140 145 150 Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu 155 160 165 Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr 170 175 180 Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys 185 190 195 Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln 200 205 210 Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile 215 220 225 His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser 230 235 240 Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp 245 250 255 Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser 260 265 270 Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro 275 280 285 Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn 305 310 315 Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 320 325 328(2) Information of SEQ ID NO: 8: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 328 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 8 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 110 115 120 Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val 125 130 135 Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg 140 145 150 Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu 155 160 165 Thr Leu Asn Gl u Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr 170 175 180 Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys 185 190 195 Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln 200 205 210 Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile 215 220 225 His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser 230 235 240 Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp 245 250 255 Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser 260 265 270 Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro 275 280 285 Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn 305 310 315 Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 320 325 328

【０４７３】(２) 配列番号９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２６５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号９： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu 140 145 150 Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile 155 160 165 Gln Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro 170 175 180 Gly Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu 185 190 195 Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg 200 205 210 Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala 215 220 225 Thr Gln Pro Pro Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser 230 235 240 Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His 245 250 255 Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 265(2) Information of SEQ ID NO: 9: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 265 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 9 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu 140 145 150 Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile 155 160 165 Gln Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro 170 175 180 Gly Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu 185 190 195 Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg 200 205 210 Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala 215 220 225 Thr Gln Pro Pro Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser 230 235 240 Tyr Trp Thr Val Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His 245 250 255 Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 265

【０４７４】(２) 配列番号１０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２６１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１０： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 110 115 120 Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Asp 125 130 135 Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gln Asn Tyr 140 145 150 Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile Gln Ser Gln Asp 155 160 165 Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro Gly Pro Asn Pro 170 175 180 Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp 185 190 195 Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg Ser Pro Gly His 200 205 210 Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gln Pro Pro 215 220 225 Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val 230 235 240 Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro 245 250 255 Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 261(2) Information of SEQ ID NO: 10: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 261 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 10 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 110 115 120 Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Asp 125 130 135 Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gln Asn Tyr 140 145 150 Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile Gln Ser Gln Asp 155 160 165 Ser Trp Ser Al a Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro Gly Pro Asn Pro 170 175 180 Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp 185 190 195 Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg Ser Pro Gly His 200 205 210 Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gln Pro Pro 215 220 225 Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val 230 235 240 Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro 245 250 255 Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 261

【０４７５】(２) 配列番号１１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：７８４９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１： CCCAGCCTCC TTTCTCTTGT TCCCTGGTCA TGCCTGCCTC CCTGTCTCCT 50 GTCTCTCCCT CCCACACACA CCCACTATCC TCCCAGCTAT CCCTACACCC 100 TCCTTCCTAA TCTTGGGAGA CATCTCGTCT GGCTGGACGG GAAAATTCCA 150 GGATCTAGGC CACACTTCTC AGCAGACATG CCCATCCTTG GGGAGGAGGA 200 ACAGGAGAGA GCCTGAGGAA GTTCTGGGGG ACAGGGGGAT GATGGGATCA 250 AGGTCAGGCC AGGAAGCCCC TGAGGACAGA GACTGTGGGG AGACTGGGAC 300 TGGGAAGAAA GCAAAGGAGC TAGAGCCAGG GCCAAAGGAA AAGGGGGGCC 350 AGCAGGGAGG TATTTGCGGG GGAGGTCCAG CAGCTGTCTT TCCTAAGACA 400 GGGACACATG GGCCTGGTTA TTCCTCTTGT CACATGTGGA ACGGTAGGAG 450 ATGGAAGACG GAGACAGAAC AAGCAAAGGA GGGCCCTGGG CACAGAGGTC 500 TGTGTGTGTA GCCATCCAAG CCACTGGACC CCAGCAGACG AGCACCTAAG 550 CTCAGGCTTA ACCCAGTGCA CGTGTGCGCA CATACATGTG CCCCGCACCT 600 GACAGTCCAC TCAACCCGTC CAAACCCTTT CCCCATAACA CCAACCCATA 650 ACAGGAGATT TCTCTCATGT GGGCAATATC CGTGTTCCCA CTTCGAAAGG 700 GGGAATGACA AGATAGGACT CCCTAGGGGA TTACAGAAAG AAAAGCAGGA 750 AAGCAAGCAT CCTGTTGGAT TTCAGCAGCA GGTATGATGT CCAGGGAAAA 800 GAAATTTGGA TAGCCAGGGA GTGAAAACCC CACCAATCTT AAACAAGACC 850 TCTGTGCTTC TTCCCCAGCA ACACAAATGT CCTGCCAGAT TCCTCCTGGA 900 AAAAAACTTC TGCTCCTGTC CCCCTCCAGG TCCCAGGTTG CCCATGTCCA 950 GGAAAAGATG GATCCCCCTA TCCAAATCTT CTCCGTGGTG TGTGTGGGTG 1000 GAGGAGTGGA CCCTGGTCCA GGCAGGGGCT CCAGGGAAGA GAAGGCGTCA 1050 CTTCCGGGGG CCTTCACCAG TGTCTGGTGG CTCCCTTCTC TGATTGGGCA 1100 GAAGTGGCCC AGGCAGGCGT ATGACCTGCT GCTGTGGAGG GGCTGTGCCC 1150 CACCGCCACA TGTCTTCCTA CCCATCTGCT CCCCAGAGGG CTGCCTGCTG 1200 TGCACTTGGG TCCTGGAGCC CTTCTCCACC CGGTGAGTGG CCAGCAGGGT 1250 GTGGGGTTAT GTGAGGGTAG AAAGGACAGC AAAGAGAAAT GGGCTCCCAG 1300 CTGGGGGAGG GGCAGGCAAA CTGGAACCTA CAGGCACTGA CCTTTGTCGA 1350 GAAGAGTGTA GCCTTCCCAG AATGGGAGGA GCAGGGCAGA GCAGGGGTAG 1400 GGGGTGGGGT GCTGGTTTCT GAGGGACTGA TCACTTACTT GGTGGAATAC 1450 AGCACAGCCC TGGCTGGCCC TAAGGAAAGG GGACATGAGC CCAGGGAGAA 1500 AATAAGAGAG GGAGCTGCAC TTAGGGCTTA GCAAACACAG TAGTAAGATG 1550 GACACAGCCC CAATCCCCAT TCTTAGCTGG TCATTCCTCG TTAGCTTAAG 1600 GTTCTGAATC TGGTGCTGGG GAAGCTGGGC CAGGCAAGCC AGGGCGCAAG 1650 GAGAGGGTAA TGGGAGGAGG GCCCACTCAT GTTGACAGAC CTACAGGAAA 1700 TCCCAATATT GAATCAGGTG CAAGCCTCTT TGCACAACTT GTGAAAGGAG 1750 GAGGAAGCCA TGTGGGGGGT CCTGTGAAGG AACCGGAAGG GGTTCTGCCA 1800 AGGGGGCAGG GAGGCAGGTG TGAGCTATGA GACAGATATG TTAGTGGGCG 1850 CCTAAGACAA GGTAAGCCCC TAAGGTGGGC ATCACCCAGC AGGTGCCCGT 1900 TCCTGGGCAG CTGGTCTCAG GAAGGAAGTC CCAGAACTGT TAGCCCATCT 1950 CTTGGCCTCA GATAATGGAG TATTTCAGGA CTTGGAGTCC AAAGAAAAGC 2000 TCCAGTGGCT TTATGTGTGG GGGTAGATAG GGAAAGAATA GAGGTTAATT 2050 TCTCCCATAC CGCCTTTTAA TCCTGACCTC TAGTGGTCCC AGTTACAGCT 2100 TTGTGCAGTT CCCCTCCCCA GCCCCACTCC CCACCGCAGA AGTTACCCCT 2150 CAACATATTG CGCCCGTTTG CCAGTTCCTC ACCCAGGCCC TGCATCCCAT 2200 TTTCCACTCT CTTCTCCAGG CTGAAGCCAC AATACTTTCC TTCTCTATCC 2250 CCATCCCAGA TTTTCTCTGA CCTAACAACC AAGGTTGCTC AGAATTTAAG 2300 GCTAATTAAG ATATGTGTGT ATACATATCA TGTCCTGCTG CTCTCAGCAG 2350 GGGTAGGTGG CACCAAATCC GTGTCCGATT CACTGAGGAG TCCTGACAAA 2400 AAGGAGACAC CATATGCTTT CTTGCTTTCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTTT 2450 TTTTTTTTGA GACGGAGTTT CACTCTTATT GCCCAGGCTG GAGTGCAATG 2500 GTGCGATCTC GGCTCACCAC AAACCTCCGC CTCCCAGGTA CAAGCGATTC 2550 TCCTGTCTCA GCCTCCCAAG TAGCTTGGAT TACAGGCATG AGCCACCACA 2600 CCCTGCTAGT TTTTTTGTAT TTCGTAGAGC CGGGGTTTCA CCATGTTAGT 2650 GAGGCTGGTG GCGAACTCCT GACCTCAGGT GATCCACCCG CCTTGGACTC 2700 CCAAAGTGCT GGGATTACAG GCATGAGCCA CTGCACCCGG CACACCATAT 2750 GCTTTCATCA CAAGAAAATG TGAGAGAATT CAGGGCTTTG GCAGTTCCAG 2800 GCTGGTCAGC ATCTCAAGCC CTCCCCAGCA TCTGTTCACC CTGCCAGGCA 2850 GTCTCTTCCT AGAAACTTGG TTAAATGTTC ACTCTTCTTG CTACTTTCAG 2900 GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG CCCCACCCTA CTCTGCCCAG 2950 AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA 3000 GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA GACACCCCGG CCAGAATGGA 3050 GCTGACTGGT GAGAACACAC CTGAGGGGCT AGGGCCATAT GGAAACATGA 3100 CAGAAGGGGA GAGAGAAAGG AGACACGCTG CAGGGGGCAG GAAGCTGGGG 3150 GAACCCATTC TCCCAAAAAT AAGGGGTCTG AGGGGTGGAT TCCCTGGGTT 3200 TCAGGTCTGG GTCCTGAATG GGAATTCCTG GAATACCAGC TGACAATGAT 3250 TTCCTCCTCA 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CATATGTCAT 4100 CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC AAAAGACTGA 4150 ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC 4200 AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA 4250 GCACTTTGGG AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG 4300 AGCAGCCTGG CCAACATGGC GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAAAAT 4350 TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT CCCAGCTACT TGGAAGGCTG 4400 AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA GTGAGCTGAG 4450 ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 4500 AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC 4550 CAGCTTTCAG GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT 4600 AGCACTTCCT ACGAAAAGGA TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA 4650 CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT 4700 GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA GAACTCTATT 4750 CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT 4800 GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT 4850 CTAGAAAGCA GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG 4900 CAATAGTTTA AAAAACTAAA ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC 4950 TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC 5000 TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT CTCATACCTA 5050 CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC 5100 CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC 5150 CCGGATTCAA GCGATTCTCC TGCCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC 5200 AGGTGCCCAC CACCATGCCC AGCTAATTTT TGTATTTTTG GTAGAGATGG 5250 GGTTTCACCA TGTTGGCCAG GCTGATCTTG AACTCCTGAC CTCAGGTGAT 5300 CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG TGAGCCACTG 5350 CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG 5400 CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA 5450 GGGCAGATTT CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA 5500 AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG 5550 CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG GAATTCCTGC CCTGGGTGGG 5600 ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC TGCTGGCTAC 5650 TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT 5700 CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AGGAGGAGAC CAAGGCACAG GACATTCTGG 5750 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【０４７６】(２) 配列番号１２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１４４３塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１２： GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50 AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100 ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGAATG GAGCTGACTG 150 ATTTGCTCCT GGCGGCCATG CTTCTTGCAG TGGCAAGACT AACTCTGTCC 200 AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG TGACCCCAGA CTCCTAAATA AACTGCTGCG 250 TGACTCCCAC CTCCTTCACA GCCGACTGAG TCAGTGTCCC GACGTCGACC 300 CTTTGTCTAT CCCTGTTCTG CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CCTGGGAGAA 350 TGGAAAACCC AGACGGAACA GAGCAAGGCA CAGGACATTC TAGGGGCAGT 400 GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGAGGACAG TTGGAACCCT 450 CCTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGACAGCTTT CTGGGCAGGT TCGCCTCCTC 500 TTGGGGGCCC TGCAGGGCCT CCTAGGAACC CAGGGCAGGA CCACAGCTCA 550 CAAGGACCCC AATGCCCTCT TCTTGAGCTT GCAACAACTG CTTCGGGGAA 600 AGGTGCGCTT CCTGCTTCTG GTAGAAGGTC CCACCCTCTG TGTCAGACGG 650 ACCCTGCCAA CCACAGCTGT CCCAAGCAGT ACTTCTCAAC TCCTCACACT 700 AAACAAGTTC CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACG AACTTCAGTG 750 TCACAGCCAG AACTGCTGGC CCTGGACTTC TGAGCAGGCT TCAGGGATTC 800 AGAGTCAAGA TTACTCCTGG TCAGCTAAAT CAAACCTCCA GGTCCCCAGT 850 CCAAATCTCT GGATACCTGA ACAGGACACA CGGACCTGTG AATGGAACTC 900 ATGGGCTCTT TGCTGGAACC TCACTTCAGA CCCTGGAAGC CTCAGACATC 950 TCGCCCGGAG CTTTCAACAA AGGCTCCCTG GCATTCAACC TCCAGGGTGG 1000 ACTTCCTCCT TCTCCAAGCC TTGCTCCTGA TGGACACACA CCCTTCCCTC 1050 CTTCACCTGC CTTGCCCACC ACCCATGGAT CTCCACCCCA GCTCCACCCC 1100 CTGTTTCCTG ACCCTTCCAC CACCATGCCT AACTCTACCG CCCCTCATCC 1150 AGTCACAATG TACCCTCATC CCAGGAATTT GTCTCAGGAA ACATAGCGCG 1200 GGCACTGGCC CAGTGAGCGT CTGCAGCTTC TCTCGGGGAC AAGCTTCCCC 1250 AGGAAGGCTG AGAGGCAGCT GCATCTGCTC CAGATGTTCT GCTTTCACCT 1300 AAAAGGCCCT GGGGAAGGGA TACACAGCAC TGGAGATTGT AAAATTTTAG 1350 GAGCTATTTT TTTTTAACCT ATCAGCAATA TTCATCAGAG CAGCTAGCGA 1400 TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA TAAATTTGAA AATCACTAAT TCT 1443(2) Information of SEQ ID NO: 12: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 1443 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight chain (xi) SEQ: SEQ ID NO 12: GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50 AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100 ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGAATG GAGCTGACTG 150 ATTTGCTCCT GGCGGCCATG CTTCTTGCAG TGGCAAGACT AACTCTGTCC 200 AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG TGACCCCAGA CTCCTAAATA AACTGCTGCG 250 TGACTCCCAC CTCCTTCACA GCCGACTGAG TCAGTGTCCC GACGTCGACC 300 CTTTGTCTAT CCCTGTTCTG CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CCTGGGAGAA 350 TGGAAAACCC AGACGGAACA GAGCAAGGCA CAGGACATTC TAGGGGCAGT 400 GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGAGGACAG TTGGAACCCT 450 CCTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGACAGCTTT CTGGGCAGGT TCGCCTCCTC 500 TTGGGGGCCC TGCAGGGCCT CCTAGGAACC CAGGGCAGGA CCACAGCTCA 550 CAAGGACCCC AATGCCCTCT TCTTGAGCTT GCAACAACTG CTTCGGGGAA 600 AGGTGCGCTT CCTGCTTCTG GTAGAAGGTC CCACCCTCTG TGTCAGACGG 650 ACCCTGCCAA CCACAGCTGT CCCAAGCAGT ACTTCTCAAC TCCTCACACT 700 AAACAAGTTC CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACG AACTTCAGTG 750 TCACAGCCAG AACTGCTGGC CCTGGACTTC TGAGCAGGCT TCAGGGATTC 800 AGAGTCAAGA TTACTCCTGG TCAGCTAAAT CAAACCTCCA GGTCCCCAGT 850 CCAAATCTCT GGATACCTGA ACAGGACACA CGGACCTGTG AATGGAACTC 900 ATGGGCTCTT TGCTGGAACC TCACTTCAGA CCCTGGAAGC CTCAGACATC 950 TCGCCCGGAG CTTTCAACAA AGGCTCCCTG GCATTCAACC TCCAGGGTGG 1000 ACTTCCTCCT TCTCCAAGCC TTGCTCCTGA TGGACACACA CCCTTCCCTC 1050 CTTCACCTGC CTTGCCCACC ACCCATGGAT CTCCACCCCA GCTCCACCCC 1100 CTGTTTCCTG ACCCTTCCAC CACCATGCCT AACTCTACCG CCCCTCATCC 1150 AGTCACAATG TACCCTCATC CCAGGAATTT GTCTCAGGAA ACATAGCGCG 1200 GGCACTGGCC CAGTGAGCGT CTGCAGCTTC TCTCGGGGAC AAGCTTCCCC 1250 AGGAAGGCTG AGAGGCAGCT GCATCTGCTC CAGATGTTCT GCTTTCACCT 1300 AAAAGGCCCT GGGGAAGGGA TACACAGCAC TGGAGATTGT AAAATTTTAG 1350 GAGCTATTTT TTTTTAACCT ATCAGCAATA TTCATCAGAG CAGCTAGCGA 1400 TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA TAAATTTGAA AATCACTAAT TCT 1443

【０４７７】(２) 配列番号１３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３５２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３： Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro 20 25 30 Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser 35 40 45 Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val 50 55 60 Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 65 70 75 Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu 80 85 90 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser 95 100 105 Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu 110 115 120 Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr 125 130 135 Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln 140 145 150 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro 155 160 165 Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser 170 175 180 Ser Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr 185 190 195 Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala 200 205 210 Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile 215 220 225 Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile 230 235 240 Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His 245 250 255 Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp 260 265 270 Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu 275 280 285 Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His 290 295 300 Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser 305 310 315 Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met 320 325 330 Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro 335 340 345 Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr 350 352(2) Information of SEQ ID NO: 13: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 352 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 13 Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro 20 25 30 Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser 35 40 45 Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val 50 55 60 Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 65 70 75 Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu 80 85 90 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser 95 100 105 Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu 110 115 120 Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr 125 130 135 Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln 140 145 150 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro 155 160 165 Thr Leu Cys Va l Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser 170 175 180 Ser Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr 185 190 195 Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala 200 205 210 Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile 215 220 225 Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile 230 235 240 Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His 245 250 255 Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp 260 265 270 Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu 275 280 285 Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His 290 295 300 Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser 305 310 315 Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met 320 325 330 Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro 335 340 345 Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr 350 352

【０４７８】(２) 配列番号１４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１５３６塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１４： GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50 AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100 ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGAATG GAGCTGACTG 150 ATTTGCTCCT GGCGGCCATG CTTCTTGCAG TGGCAAGACT AACTCTGTCC 200 AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG TGACCCCAGA CTCCTAAATA AACTGCTGCG 250 TGACTCCCAC CTCCTTCACA GCCGACTGAG TCAGTGTCCC GACGTCGACC 300 CTTTGTCTAT CCCTGTTCTG CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CCTGGGAGAA 350 TGGAAAACCC AGACGGAACA GAGCAAGGCA CAGGACATTC TAGGGGCAGT 400 GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGAGGACAG TTGGAACCCT 450 CCTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGACAGCTTT CTGGGCAGGT TCGCCTCCTC 500 TTGGGGGCCC TGCAGGGCCT CCTAGGAACC CAGCTTCCTC TACAGGGCAG 550 GACCACAGCT CACAAGGACC CCAATGCCCT CTTCTTGAGC TTGCAACAAC 600 TGCTTCGGGG AAAGGTGCGC TTCCTGCTTC TGGTAGAAGG TCCCACCCTC 650 TGTGTCAGAC GGACCCTGCC AACCACAGCT GTCCCAAGCA GTACTTCTCA 700 ACTCCTCACA CTAAACAAGT TCCCAAACAG GACTTCTGGA TTGTTGGAGA 750 CGAACTTCAG TGTCACAGCC AGAACTGCTG GCCCTGGACT TCTGAGCAGG 800 CTTCAGGGAT TCAGAGTCAA GATTACTCCT GGTCAGCTAA ATCAAACCTC 850 CAGGTCCCCA GTCCAAATCT CTGGATACCT GAACAGGACA CACGGACCTG 900 TGAATGGAAC TCATGGGCTC TTTGCTGGAA CCTCACTTCA GACCCTGGAA 950 GCCTCAGACA TCTCGCCCGG AGCTTTCAAC AAAGGCTCCC TGGCATTCAA 1000 CCTCCAGGGT GGACTTCCTC CTTCTCCAAG CCTTGCTCCT GATGGACACA 1050 CACCCTTCCC TCCTTCACCT GCCTTGCCCA CCACCCATGG ATCTCCACCC 1100 CAGCTCCACC CCCTGTTTCC TGACCCTTCC ACCACCATGC CTAACTCTAC 1150 CGCCCCTCAT CCAGTCACAA TGTACCCTCA TCCCAGGAAT TTGTCTCAGG 1200 AAACATAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAGC GTCTGCAGCT TCTCTCGGGG 1250 ACAAGCTTCC CCAGGAAGGC TGAGAGGCAG CTGCATCTGC TCCAGATGTT 1300 CTGCTTTCAC CTAAAAGGCC CTGGGGAAGG GATACACAGC ACTGGAGATT 1350 GTAAAATTTT AGGAGCTATT TTTTTTTAAC CTATCAGCAA TATTCATCAG 1400 AGCAGCTAGC GATCTTTGGT CTATTTTCGG TATAAATTTG AAAATCACTA 1450 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1500 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1536(2) Information of SEQ ID NO: 14: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 1536 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight chain (xi) SEQ: SEQ ID NO 14: GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50 AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100 ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGAATG GAGCTGACTG 150 ATTTGCTCCT GGCGGCCATG CTTCTTGCAG TGGCAAGACT AACTCTGTCC 200 AGCCCCGTAG CTCCTGCCTG TGACCCCAGA CTCCTAAATA AACTGCTGCG 250 TGACTCCCAC CTCCTTCACA GCCGACTGAG TCAGTGTCCC GACGTCGACC 300 CTTTGTCTAT CCCTGTTCTG CTGCCTGCTG TGGACTTTAG CCTGGGAGAA 350 TGGAAAACCC AGACGGAACA GAGCAAGGCA CAGGACATTC TAGGGGCAGT 400 GTCCCTTCTA CTGGAGGGAG TGATGGCAGC ACGAGGACAG TTGGAACCCT 450 CCTGCCTCTC ATCCCTCCTG GGACAGCTTT CTGGGCAGGT TCGCCTCCTC 500 TTGGGGGCCC TGCAGGGCCT CCTAGGAACC CAGCTTCCTC TACAGGGCAG 550 GACCACAGCT CACAAGGACC CCAATGCCCT CTTCTTGAGC TTGCAACAAC 600 TGCTTCGGGG AAAGGTGCGC TTCCTGCTTC TGGTAGAAGG TCCCACCCTC 650 TGTGTCAGAC GGACCCTGCC AACCACAGCT GTCCCAAGCA GTACTTCTCA 700 ACTCCTCACA CTAAACAAGT TCCCAAACAG GACTTCTGGA TTGTTGGAGA 750 CGAACTTCAG TGTCACAGCC AGAACTGCTG GCCCTGGACT TCTGAGCAGG 800 CTTCAGGGAT TCAGAGTCAA GATTACTCCT GGTCAGCTAA ATCAAACCTC 850 CAGGTCCCCA GTCCAAATCT CTGGATACCT GAACAGGACA CACGGACCTG 900 TGAATGGAAC TCATGGGCTC TTTGCTGGAA CCTCACTTCA GACCCTGGAA 950 GCCTCAGACA TCTCGCCCGG AGCTTTCAAC AAAGGCTCCC TGGCATTCAA 1000 CCTCCAGGGT GGACTTCCTC CTTCTCCAAG CCTTGCTCCT GATGGACACA 1050 CACCCTTCCC TCCTTCACCT GCCTTGCCCA CCACCCATGG ATCTCCACCC 1100 CAGCTCCACC CCCTGTTTCC TGACCCTTCC ACCACCATGC CTAACTCTAC 1150 CGCCCCTCAT CCAGTCACAA TGTACCCTCA TCCCAGGAAT TTGTCTCAGG 1200 AAACATAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAGC GTCTGCAGCT TCTCTCGGGG 1250 ACAAGCTTCC CCAGGAAGGC TGAGAGGCAG CTGCATCTGC TCCAGATGTT 1300 CTGCTTTCAC CTAAAAGGCC CTGGGGAAGG GATACACAGC ACTGGAGATT 1350 GTAAAATTTT AGGAGCTATT TTTTTTTAAC CTATCAGCAA TATTCATCAG 1400 AGCAGCTAGC GATCTTTGGT CTATTTTCGG TATAAATTTG AAAATCACTA 1450 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA AAAAAAAA 1500 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1536

【０４７９】(２) 配列番号１５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３５６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１５： Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro 20 25 30 Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser 35 40 45 Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val 50 55 60 Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 65 70 75 Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu 80 85 90 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser 95 100 105 Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu 110 115 120 Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu 125 130 135 Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu 140 145 150 Ser Leu Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu 155 160 165 Val Glu Gly Pro Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr 170 175 180 Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe 185 190 195 Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr 200 205 210 Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe 215 220 225 Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser 230 235 240 Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val 245 250 255 Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu 260 265 270 Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu 275 280 285 Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala 290 295 300 Pro Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr 305 310 315 Thr His Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro 320 325 330 Ser Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met 335 340 345 Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr 350 355 356(2) Information of SEQ ID NO: 15: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 356 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 15: Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Val 1 5 10 15 Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro 20 25 30 Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser 35 40 45 Arg Leu Ser Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val 50 55 60 Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 65 70 75 Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu 80 85 90 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser 95 100 105 Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu 110 115 120 Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu 125 130 135 Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu 140 145 150 Ser Leu Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu 155 160 165 Val Glu Gly Pr o Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr 170 175 180 Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe 185 190 195 Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr 200 205 210 Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe 215 220 225 Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser 230 235 240 Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val 245 250 255 Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu 260 265 270 Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu 275 280 285 Ala Phe Asn Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala 290 295 300 Pro Asp Gly His Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr 305 310 315 Thr His Gly Ser Pro Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro 320 325 330 Ser Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met 335 340 345 Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gln Glu Thr 350 355 356

【０４８０】(２) 配列番号１６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２４１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１６： Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Glu Leu Gln Cys His 140 145 150 Ser Gln Asn Cys Trp Pro Trp Thr Ser Glu Gln Ala Ser Gly Ile 155 160 165 Gln Ser Gln Asp Tyr Ser Trp Ser Ala Lys Ser Asn Leu Gln Val 170 175 180 Pro Ser Pro Asn Leu Trp Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Cys 185 190 195 Glu Trp Asn Ser Trp Ala Leu Cys Trp Asn Leu Thr Ser Asp Pro 200 205 210 Gly Ser Leu Arg His Leu Ala Arg Ser Phe Gln Gln Arg Leu Pro 215 220 225 Gly Ile Gln Pro Pro Gly Trp Thr Ser Ser Phe Ser Lys Pro Cys 230 235 240 Ser 241(2) Information of SEQ ID NO: 16: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 241 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 16 Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Glu Leu Gln Cys His 140 145 150 Ser Gln Asn Cys Trp Pro Trp Thr Ser Glu Gln Ala Ser Gly Ile 155 160 165 Gln Ser Gln As p Tyr Ser Trp Ser Ala Lys Ser Asn Leu Gln Val 170 175 180 Pro Ser Pro Asn Leu Trp Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Cys 185 190 195 Glu Trp Asn Ser Trp Ala Leu Cys Trp Asn Leu Thr Ser Asp Pro 200 205 210 Gly Ser Leu Arg His Leu Ala Arg Ser Phe Gln Gln Arg Leu Pro 215 220 225 Gly Ile Gln Pro Pro Gly Trp Thr Ser Ser Phe Ser Lys Pro Cys 230 235 240 Ser 241

【０４８１】(２) 配列番号１７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１７： Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro Thr Leu 140 145 150 Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser Thr 155 160 165 Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180 Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro 185 190 195 Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro 200 205 210 Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly 215 220 225 Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu 230 235 240 Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser 245 250 255 Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gln Gly 260 265 270 Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro 275 280 285 Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro 290 295 300 Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn 305 310 315 Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro Arg Asn 320 325 330 Leu Ser Gln Glu Thr 335(2) Information of SEQ ID NO: 17: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 335 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 17 Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 70 75 Ala Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Gly Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro Thr Leu 140 145 150 Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser Thr 155 160 165 Ser Gln Leu Le u Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180 Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro 185 190 195 Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro 200 205 210 Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Pro Val Gln Ile Ser Gly 215 220 225 Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu 230 235 240 Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser 245 250 255 Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gln Gly 260 265 270 Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro 275 280 285 Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro 290 295 300 Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn 305 310 315 Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro Arg Asn 320 325 330 Leu Ser Gln Glu Thr 335

【０４８２】(２) 配列番号１８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１８： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Gly Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Ile Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Thr Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Val Leu Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met 65 70 75 Thr Ala Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Val Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Asp Leu Leu Gly Met Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Ser Ala Ile Phe Leu Asn Phe Gln Gln Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Val Gly Pro Ser Leu 140 145 150 Cys Ala Lys Arg Ala Pro Pro Ala Ile Ala Val Pro Ser Ser Thr 155 160 165 Ser Pro Phe His Thr Leu Asn Lys Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180 Leu Leu Glu Thr Asn Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser 185 190 195 Gly Phe Leu Lys Arg Leu Gln Ala Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly 200 205 210 Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly His 215 220 225 Gln Asn Gly Thr His Gly Pro Leu Ser Gly Ile His Gly Leu Phe 230 235 240 Pro Gly Pro Gln Pro Gly Ala Leu Gly Ala Pro Asp Ile Pro Pro 245 250 255 Ala Thr Ser Gly Met Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Leu Gln Pro Gly 260 265 270 Glu Ser Pro Ser Pro Ala His Pro Ser Pro Gly Arg Tyr Thr Leu 275 280 285 Phe Ser Pro Ser Pro Thr Ser Pro Ser Pro Thr Val Gln Leu Gln 290 295 300 Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Ile Thr Pro Asn Ser Thr Ser 305 310 315 Pro Leu Leu Phe Ala Ala His Pro His Phe Gln Asn Leu Ser Gln 320 325 330 Glu Glu 332(2) Information on SEQ ID NO: 18: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 332 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 18 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Gly Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Ile Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Thr Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Val Leu Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met 65 70 75 Thr Ala Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Val Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Asp Leu Leu Gly Met Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala 110 115 120 His Lys Asp Pro Ser Ala Ile Phe Leu Asn Phe Gln Gln Leu Leu 125 130 135 Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Leu Leu Val Val Gly Pro Ser Leu 140 145 150 Cys Ala Lys Arg Ala Pro Pro Ala Ile Ala Val Pro Ser Ser Thr 155 160 165 Ser Pro Phe Hi s Thr Leu Asn Lys Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly 170 175 180 Leu Leu Glu Thr Asn Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser 185 190 195 Gly Phe Leu Lys Arg Leu Gln Ala Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly 200 205 210 Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly His 215 220 225 Gln Asn Gly Thr His Gly Pro Leu Ser Gly Ile His Gly Leu Phe 230 235 240 Pro Gly Pro Gln Pro Gly Ala Leu Gly Ala Pro Asp Ile Pro Pro 245 250 255 Ala Thr Ser Gly Met Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Leu Gln Pro Gly 260 265 270 Glu Ser Pro Ser Pro Ala His Pro Ser Pro Gly Arg Tyr Thr Leu 275 280 285 Phe Ser Pro Ser Pro Thr Ser Pro Ser Pro Thr Val Gln Leu Gln 290 295 300 Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Ile Thr Pro Asn Ser Thr Ser 305 310 315 Pro Leu Leu Phe Ala Ala His Pro His Phe Gln Asn Leu Ser Gln 320 325 330 Glu Glu 332

【０４８３】(２) 配列番号１９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１０２６塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１９： AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG TGACCCCCGA CTCCTAAATA AACTGCTTCG 50 TGACTCCCAT GTCCTTCACG GCAGACTGAG CCAGTGCCCA GACATTAACC 100 CTTTGTCCAC ACCTGTCCTG CTGCCTGCTG TGGACTTCAC CTTGGGAGAA 150 TGGAAAACCC AGACGGAGCA GACAAAGGCA CAGGATGTCC TGGGAGCCAC 200 AACCCTTCTG CTGGAGGCAG TGATGACAGC ACGGGGACAA GTGGGACCCC 250 CTTGCCTCTC ATCCCTGCTG GTGCAGCTTT CTGGACAGGT TCGCCTCCTC 300 CTCGGGGCCC TGCAGGACCT CCTTGGAATG CAGCTTCCTC CACAGGGAAG 350 GACCACAGCT CACAAGGATC CCAGTGCCAT CTTCCTGAAC TTCCAACAAC 400 TGCTCCGAGG AAAGGTGCGT TTCCTGCTCC TTGTAGTGGG GCCCTCCCTC 450 TGTGCCAAGA GGGCCCCACC CGCCATAGCT GTCCCGAGCA GCACCTCTCC 500 ATTCCACACA CTGAACAAGC TCCCAAACAG GACCTCTGGA TTGTTGGAGA 550 CAAACTCCAG TATCTCAGCC AGAACTACTG GCTCTGGATT TCTCAAGAGG 600 CTGCAGGCAT TCAGAGCCAA GATTCCTGGT CTGCTGAACC AAACCTCCAG 650 GTCCCTAGAC CAAATCCCTG GACACCAGAA TGGGACACAC GGACCCTTGA 700 GTGGAATTCA TGGACTCTTT CCTGGACCCC AACCCGGGGC CCTCGGAGCT 750 CCAGACATTC CTCCAGCAAC TTCAGGCATG GGCTCCCGGC CAACCTACCT 800 CCAGCCTGGA GAGTCTCCTT CCCCAGCTCA CCCTTCTCCT GGACGATACA 850 CTCTCTTCTC TCCTTCACCC ACCTCGCCCT CCCCCACAGT CCAGCTCCAG 900 CCTCTGCTTC CTGACCCCTC TGCGATCACA CCCAACTCTA CCAGTCCTCT 950 TCTATTTGCA GCTCACCCTC ATTTCCAGAA CCTGTCTCAG GAAGAGTAAG 1000 GTGCTCAGAC CCTGCCAACT TCAGCA 1026(2) Information of SEQ ID NO: 19: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 1026 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight chain (xi) SEQ: SEQ ID NO 19: AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG TGACCCCCGA CTCCTAAATA AACTGCTTCG 50 TGACTCCCAT GTCCTTCACG GCAGACTGAG CCAGTGCCCA GACATTAACC 100 CTTTGTCCAC ACCTGTCCTG CTGCCTGCTG TGGACTTCAC CTTGGGAGAA 150 TGGAAAACCC AGACGGAGCA GACAAAGGCA CAGGATGTCC TGGGAGCCAC 200 AACCCTTCTG CTGGAGGCAG TGATGACAGC ACGGGGACAA GTGGGACCCC 250 CTTGCCTCTC ATCCCTGCTG GTGCAGCTTT CTGGACAGGT TCGCCTCCTC 300 CTCGGGGCCC TGCAGGACCT CCTTGGAATG CAGCTTCCTC CACAGGGAAG 350 GACCACAGCT CACAAGGATC CCAGTGCCAT CTTCCTGAAC TTCCAACAAC 400 TGCTCCGAGG AAAGGTGCGT TTCCTGCTCC TTGTAGTGGG GCCCTCCCTC 450 TGTGCCAAGA GGGCCCCACC CGCCATAGCT GTCCCGAGCA GCACCTCTCC 500 ATTCCACACA CTGAACAAGC TCCCAAACAG GACCTCTGGA TTGTTGGAGA 550 CAAACTCCAG TATCTCAGCC AGAACTACTG GCTCTGGATT TCTCAAGAGG 600 CTGCAGGCAT TCAGAGCCAA GATTCCTGGT CTGCTGAACC AAACCTCCAG 650 GTCCCTAGAC CAAATCCCTG GACACCAGAA TGGGACACAC GGACCCTTGA 700 GTGGAATTCA TGGACTCTTT CCTGGACCCC AACCCGGGGC CCTCGGAGCT 750 CCAGACATTC CTCCAGCAAC TTCAGGCATG GGCTCCCGGC CAACCTACCT 800 CCAGCCTGGA GAGTCTCCTT CCCCAGCTCA CCCTTCTCCT GGACGATACA 850 CTCTCTTCTC TCCTTCACCC ACCTCGCCCT CCCCCACAGT CCAGCTCCAG 900 CCTCTGCTTC CTGACCCCTC TGCGATCACA CCCAACTCTA CCAGTCCTCT 950 TCTATTTGCA GCTCACCCTC ATTTCCAGAA CCTGTCTCAG GAAGAGTAAG 1000 GTGCTCAGAC CCTGCCAACT TCAGCA 1026

【０４８４】(２) 配列番号２０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１０１４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２０： AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG TGACCCCCGA CTCCTAAATA AACTGCTTCG 50 TGACTCCCAT GTCCTTCACG GCAGACTGAG CCAGTGCCCA GACATTAACC 100 CTTTGTCCAC ACCTGTCCTG CTGCCTGCTG TGGACTTCAC CTTGGGAGAA 150 TGGAAAACCC AGACGGAGCA GACAAAGGCA CAGGATGTCC TGGGAGCCAC 200 AACCCTTCTG CTGGAGGCAG TGATGACAGC ACGGGGACAA GTGGGACCCC 250 CTTGCCTCTC ATCCCTGCTG GTGCAGCTTT CTGGACAGGT TCGCCTCCTC 300 CTCGGGGCCC TGCAGGACCT CCTTGGAATG CAGGGAAGGA CCACAGCTCA 350 CAAGGATCCC AGTGCCATCT TCCTGAACTT CCAACAACTG CTCCGAGGAA 400 AGGTGCGTTT CCTGCTCCTT GTAGTGGGGC CCTCCCTCTG TGCCAAGAGG 450 GCCCCACCCG CCATAGCTGT CCCGAGCAGC ACCTCTCCAT TCCACACACT 500 GAACAAGCTC CCAAACAGGA CCTCTGGATT GTTGGAGACA AACTCCAGTA 550 TCTCAGCCAG AACTACTGGC TCTGGATTTC TCAAGAGGCT GCAGGCATTC 600 AGAGCCAAGA TTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGT CCCTAGACCA 650 AATCCCTGGA CACCAGAATG GGACACACGG ACCCTTGAGT GGAATTCATG 700 GACTCTTTCC TGGACCCCAA CCCGGGGCCC TCGGAGCTCC AGACATTCCT 750 CCAGCAACTT CAGGCATGGG CTCCCGGCCA ACCTACCTCC AGCCTGGAGA 800 GTCTCCTTCC CCAGCTCACC CTTCTCCTGG ACGATACACT CTCTTCTCTC 850 CTTCACCCAC CTCGCCCTCC CCCACAGTCC AGCTCCAGCC TCTGCTTCCT 900 GACCCCTCTG CGATCACACC CAACTCTACC AGTCCTCTTC TATTTGCAGC 950 TCACCCTCAT TTCCAGAACC TGTCTCAGGA AGAGTAAGGT GCTCAGACCC 1000 TGCCAACTTC AGCA 1014(2) Information of SEQ ID NO: 20: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 1014 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of strands: single strand (D) Topology: straight chain (xi) SEQ: SEQ ID NO 20: AGCCCGGCTC CTCCTGCCTG TGACCCCCGA CTCCTAAATA AACTGCTTCG 50 TGACTCCCAT GTCCTTCACG GCAGACTGAG CCAGTGCCCA GACATTAACC 100 CTTTGTCCAC ACCTGTCCTG CTGCCTGCTG TGGACTTCAC CTTGGGAGAA 150 TGGAAAACCC AGACGGAGCA GACAAAGGCA CAGGATGTCC TGGGAGCCAC 200 AACCCTTCTG CTGGAGGCAG TGATGACAGC ACGGGGACAA GTGGGACCCC 250 CTTGCCTCTC ATCCCTGCTG GTGCAGCTTT CTGGACAGGT TCGCCTCCTC 300 CTCGGGGCCC TGCAGGACCT CCTTGGAATG CAGGGAAGGA CCACAGCTCA 350 CAAGGATCCC AGTGCCATCT TCCTGAACTT CCAACAACTG CTCCGAGGAA 400 AGGTGCGTTT CCTGCTCCTT GTAGTGGGGC CCTCCCTCTG TGCCAAGAGG 450 GCCCCACCCG CCATAGCTGT CCCGAGCAGC ACCTCTCCAT TCCACACACT 500 GAACAAGCTC CCAAACAGGA CCTCTGGATT GTTGGAGACA AACTCCAGTA 550 TCTCAGCCAG AACTACTGGC TCTGGATTTC TCAAGAGGCT GCAGGCATTC 600 AGAGCCAAGA TTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGT CCCTAGACCA 650 AATCCCTGGA CACCAGAATG GGACACACGG ACCCTTGAGT GGAATTCATG 700 GACTCTTTCC TGGACCCCAA CCCGGGGCCC TCGGAGCTCC AGACATTCCT 750 CCAGCAACTT CAGGCATGGG CTCCCGGCCA ACCTACCTCC AGCCTGGAGA 800 GTCTCCTTCC CCAGCTCACC CTTCTCCTGG ACGATACACT CTCTTCTCTC 850 CTTCACCCAC CTCGCCCTCC CCCACAGTCC AGCTCCAGCC TCTGCTTCCT 900 GACCCCTCTG CGATCACACC CAACTCTACC AGTCCTCTTC TATTTGCAGC 950 TCACCCTCAT TTCCAGAACC TGTCTCAGGA AGAGTAAGGT GCTCAGACCC 1000 TGCCAACTTC AGCA 1014

【０４８５】(２) 配列番号２１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３２８アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２１： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Gly Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Ile Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Thr Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Val Leu Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met 65 70 75 Thr Ala Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Val Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Asp Leu Leu Gly Met Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 110 115 120 Ser Ala Ile Phe Leu Asn Phe Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val 125 130 135 Arg Phe Leu Leu Leu Val Val Gly Pro Ser Leu Cys Ala Lys Arg 140 145 150 Ala Pro Pro Ala Ile Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Pro Phe His 155 160 165 Thr Leu Asn Lys Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr 170 175 180 Asn Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Phe Leu Lys 185 190 195 Arg Leu Gln Ala Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln 200 205 210 Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly His Gln Asn Gly Thr 215 220 225 His Gly Pro Leu Ser Gly Ile His Gly Leu Phe Pro Gly Pro Gln 230 235 240 Pro Gly Ala Leu Gly Ala Pro Asp Ile Pro Pro Ala Thr Ser Gly 245 250 255 Met Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Leu Gln Pro Gly Glu Ser Pro Ser 260 265 270 Pro Ala His Pro Ser Pro Gly Arg Tyr Thr Leu Phe Ser Pro Ser 275 280 285 Pro Thr Ser Pro Ser Pro Thr Val Gln Leu Gln Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Ile Thr Pro Asn Ser Thr Ser Pro Leu Leu Phe 305 310 315 Ala Ala His Pro His Phe Gln Asn Leu Ser Gln Glu Glu 320 325 328(2) Information of SEQ ID NO: 21: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 328 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 21: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Gly Arg Leu Ser Gln Cys Pro 20 25 30 Asp Ile Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 40 45 Phe Thr Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Thr Lys Ala 50 55 60 Gln Asp Val Leu Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met 65 70 75 Thr Ala Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 85 90 Val Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 95 100 105 Asp Leu Leu Gly Met Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 110 115 120 Ser Ala Ile Phe Leu Asn Phe Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val 125 130 135 Arg Phe Leu Leu Leu Val Val Gly Pro Ser Leu Cys Ala Lys Arg 140 145 150 Ala Pro Pro Ala Ile Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Ser Phe His 155 160 165 Thr Leu Asn Ly s Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr 170 175 180 Asn Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Phe Leu Lys 185 190 195 Arg Leu Gln Ala Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln 200 205 210 Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly His Gln Asn Gly Thr 215 220 225 His Gly Pro Leu Ser Gly Ile His Gly Leu Phe Pro Gly Pro Gln 230 235 240 Pro Gly Ala Leu Gly Ala Pro Asp Ile Pro Pro Ala Thr Ser Gly 245 250 255 Met Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Leu Gln Pro Gly Glu Ser Pro Ser 260 265 270 Pro Ala His Pro Ser Pro Gly Arg Tyr Thr Leu Phe Ser Pro Ser 275 280 285 Pro Thr Ser Pro Ser Pro Thr Val Gln Leu Gln Pro Leu Leu Pro 290 295 300 Asp Pro Ser Ala Ile Thr Pro Asn Ser Thr Ser Pro Leu Leu Phe 305 310 315 Ala Ala His Pro His Phe Gln Asn Leu Ser Gln Glu Glu 320 325 328

【０４８６】(２) 配列番号２２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：５１４１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２２： TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGAGTCGATC GACAGCTGTG 50 GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA 100 GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG 150 TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA 200 GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC 250 CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG GCTGACTAAT TTTTTTTATT 300 TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG 350 AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAAAGCTA GCTTATCCGG 400 CCGGGAACGG TGCATTGGAA CGCGGATTCC CCGTGCCAAG AGTGACGTAA 450 GTACCGCCTA TAGAGCGATA AGAGGATTTT ATCCCCGCTG CCATCATGGT 500 TCGACCATTG AACTGCATCG TCGCCGTGTC CCAAAATATG GGGATTGGCA 550 AGAACGGAGA CCTACCCTGG CCTCCGCTCA GGAACGAGTT CAAGTACTTC 600 CAAAGAATGA CCACAACCTC TTCAGTGGAA GGTAAACAGA ATCTGGTGAT 650 TATGGGTAGG AAAACCTGGT TCTCCATTCC TGAGAAGAAT CGACCTTTAA 700 AGGACAGAAT TAATATAGTT CTCAGTAGAG AACTCAAAGA ACCACCACGA 750 GGAGCTCATT 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450 GTACCGCCTA TAGAGCGATA AGAGGATTTT ATCCCCGCTG CCATCATGGT 500 TCGACCATTG AACTGCATCG TCGCCGTGTC CCAAAATATG GGGATTGGCA 550 AGAACGGAGA CCTACCCTGG CCTCCGCTCA GGAACGAGTT CAAGTACTTC 600 CAAAGAATGA CCACAACCTC TTCAGTGGAA GGTAAACAGA ATCTGGTGAT 650 TATGGGTAGG AAAACCTGGT TCTCCATTCC TGAGAAGAAT CGACCTTTAA 700 AGGACAGAAT TAATATAGTT CTCAGTAGAG AACTCAAAGA ACCACCACGA 750 GGAGCTCATT TTCTTGCCAA AAGTTTGGAT GATGCCTTAA GACTTATTGA 800 ACAACCGGAA TTGGCAAGTA AAGTAGACAT GGTTTGGATA GTCGGAGGCA 850 GTTCTGTTTA CCAGGAAGCC ATGAATCAAC CAGGCCACCT TAGACTCTTT 900 GTGACAAGGA TCATGCAGGA ATTTGAAAGT GACACGTTTT TCCCAGAAAT 950 TGATTTGGGG AAATATAAAC CTCTCCCAGA ATACCCAGGC GTCCTCTCTG 1000 AGGTCCAGGA GGAAAAAGGC ATCAAGTATA AGTTTGAAGT CTACGAGAAG 1050 AAAGACTAAC AGGAAGATGC TTTCAAGTTC TCTGCTCCCC TCCTAAAGCT 1100 ATGCATTTTT ATAAGACCAT GGGACTTTTG CTGGCTTTAG ATCCCCTTGG 1150 CTTCGTTAGA ACGCGGCTAC AATTAATACA TAACCTTATG TATCATACAC 1200 ATACGATTTA GGTGACACTA TAGATAACAT CCACTTTGCC TTTCTCTCCA 1250 CAGGTGTCCA CTCCCAGGTC CAACTGCACC TCGGTTCTAA GCTTCTGCAG 1300 GTCGACTCTA GAGGATCCCC GGGGAATTCA ATCGATGGCC GCCATGGCCC 1350 AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC AAATAAAGCA ATAGCATCAC 1400 AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT GCATTCTAGT TGTGGTTTGT 1450 CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT GGATCGATCG GG AATTAATT 1500 CGGCGCAGCA CCATGGCCTG AAATAACCTC TGAAAGAGGA ACTTGGTTAG 1550 GTACCTTCTG AGGCGGAAAG AACCAGCTGT GGAATGTGTG TCAGTTAGGG 1600 TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGCAGGC AGAAGTATGC AAAGCATGCA 1650 TCTCAATTAG TCAGCAACCA GGTGTGGAAA GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG 1700 GCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATT AGTCAGCAAC CATAGTCCCG 1750 CCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACT CCGCCCAGTT CCGCCCATTC 1800 TCCGCCCCAT GGCTGACTAA TTTTTTTTAT TTATGCAGAG GCCGAGGCCG 1850 CCTCGGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGT GAGGAGGCTT TTTTGGAGGC 1900 CTAGGCTTTT GCAAAAAGCT GTTACCTCGA GCGGCCGCTT AATTAAGGCG 1950 CGCCATTTAA ATCCTGCAGG TAACAGCTTG GCACTGGCCG TCGTTTTACA 2000 ACGTCGTGAC TGGGAAAACC CTGGCGTTAC CCAACTTAAT CGCCTTGCAG 2050 CACATCCCCC CTTCGCCAGC TGGCGTAATA GCGAAGAGGC CCGCACCGAT 2100 CGCCCTTCCC AACAGTTGCG TAGCCTGAAT GGCGAATGGC GCCTGATGCG 2150 GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT TTCACACCGC ATACGTCAAA 2200 GCAACCATAG TACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG 2250 TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT 2300 CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTT CTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG 2350 TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG GTTCCGATTT AGTGCTTTAC 2400 GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTTGG GTGATGGTTC ACGTAGTGGG 2450 CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG AGTCCACGTT 2500 CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT 2550 CGGGCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG 2600 TTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATT TTAACAAAAT 2650 ATTAACGTTT ACAATTTTAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 2700 CCGCATAGTT AAGCCAACTC CGCTATCGCT ACGTGACTGG GTCATGGCTG 2750 CGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG CGCCCTGACG GGCTTGTCTG 2800 CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 2850 GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGAGG CAGTATTCTT 2900 GAAGACGAAA GGGCCTCGTG ATACGCCTAT TTTTATAGGT TAATGTCATG 2950 ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG 3000 CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC 3050 TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG 3100 AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTATTCCCT TTTTTGCGGC 3150 ATTTTG CCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGGTG AAAGTAAAAG 3200 ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC 3250 AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT 3300 GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGATG 3350 ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC 3400 TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC 3450 AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG 3500 CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT 3550 TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA 3600 GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCAGCAG 3650 CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA 3700 GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG 3750 ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT 3800 CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 3850 GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC 3900 AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA 3950 TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT ACTCATATAT AC TTTAGATT 4000 GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT 4050 TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG 4100 CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 4150 CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT 4200 GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 4250 GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG 4300 TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT 4350 GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA 4400 CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC 4450 TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA CGACCTACAC 4500 CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCATTG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG 4550 AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA 4600 GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC 4650 TGTCGGGTTT CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT 4700 CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG 4750 TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC CTGCGTTATC 4800 CCCTGATTCT GTGGATAACC GTAT TACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG 4850 CTCGCCGCAG CCGAACGACC GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG 4900 GAAGAGCGCC CAATACGCAA ACCGCCTCTC CCCGCGCGTT GGCCGATTCA 4950 TTAATCCAGC TGGCACGACA GGTTTCCCGA CTGGAAAGCG GGCAGTGAGC 5000 GCAACGCAAT TAATGTGAGT TACCTCACTC ATTAGGCACC CCAGGCTTTA 5050 CACTTTATGC TTCCGGCTCG TATGTTGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA 5100 ATTTCACACA GGAAACAGCT ATGACCATGA TTACGAATTA A 5141

【０４８７】(２) 配列番号２３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２３： ATGTCNCCNG CNCCNCCNGC N 21(2) Information of SEQ ID NO: 23: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 23: ATGTCNCCNG CNCCNCCNGC N 21

【０４８８】(２) 配列番号２４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２４： ATGTCTCCAG CGCCGCCAGC G 21(2) Information of SEQ ID NO: 24: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 24: ATGTCTCCAG CGCCGCCAGC G 21

【０４８９】(２) 配列番号２５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２５： ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21(2) Information of SEQ ID NO: 25: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 25: ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21

【０４９０】(２) 配列番号２６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２６： ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 21(2) Information of SEQ ID NO: 26: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single strand (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 26: ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 21

【０４９１】(２) 配列番号２７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２７： ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21(2) Information of SEQ ID NO: 27: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 27: ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21

【０４９２】(２) 配列番号２８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２８： ATGTCGCCAG CGCCGCCAGC G 21(2) Information of SEQ ID NO: 28: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of strands: single strand (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 28: ATGTCGCCAG CGCCGCCAGC G 21

【０４９３】(２) 配列番号２９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号２９： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25(2) Information of SEQ ID NO: 29: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 29 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25

【０４９４】(２) 配列番号３０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３０： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Asp Xaa Val Leu His Gly Arg Leu 20 25 26(2) Information of SEQ ID NO: 30: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 26 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 30 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Asp Xaa Val Leu His Gly Arg Leu 20 25 26

【０４９５】(２) 配列番号３１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３１： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25(2) Information of SEQ ID NO: 31: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 31: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg 20 25

【０４９６】(２) 配列番号３２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３２： Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys 1 5 10 14(2) Information of SEQ ID NO: 32: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 14 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 32 Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys 1 5 10 14

【０４９７】(２) 配列番号３３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：９アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 33: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 9 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０４９８】(２) 配列番号３４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３４： GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45(2) Information of SEQ ID NO: 34: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 45 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 34: GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45

【０４９９】(２) 配列番号３５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２０塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３５： CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20(2) Information of SEQ ID NO: 35: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 20 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 35: CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20

【０５００】(２) 配列番号３６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３６： NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21(2) Information of SEQ ID NO: 36: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 36: NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21

【０５０１】(２) 配列番号３７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３７： CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50 TGACCACGTT CAGCACGGC 69(2) Information of SEQ ID NO: 37: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 37: CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50 TGACCACGTT CAGCACGGC 69

【０５０２】(２) 配列番号３８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３８： GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT 50 ACTGGTGCAA GTCGTGCCG 69(2) Information of SEQ ID NO: 38: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 38: GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT 50 ACTGGTGCAA GTCGTGCCG 69

【０５０３】(２) 配列番号３９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号３９： CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50 CGACCACGTC CATCACGGC 69(2) Information of SEQ ID NO: 39: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 39: CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50 CGACCACGTC CATCACGGC 69

【０５０４】(２) 配列番号４０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４０： GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50 GCTGGTGCAG GTAGTGCCG 69(2) Information of SEQ ID NO: 40: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 40: GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50 GCTGGTGCAG GTAGTGCCG 69

【０５０５】(２) 配列番号４１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４１： CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50 CGATCATGTC TATCACGGT 69(2) Information of SEQ ID NO: 41: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 41: CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50 CGATCATGTC TATCACGGT 69

【０５０６】(２) 配列番号４２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４２： GGTCGTGGCG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50 GCTAGTACAG ATAGTGCCA 69(2) Information of SEQ ID NO: 42: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 42: GGTCGTGGCG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50 GCTAGTACAG ATAGTGCCA 69

【０５０７】(２) 配列番号４３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３７塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４３： GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37(2) Information of SEQ ID NO: 43: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 37 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 43: GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37

【０５０８】(２) 配列番号４４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４４： CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22(2) Information of SEQ ID NO: 44: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 22 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 44: CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22

【０５０９】(２) 配列番号４５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４５： TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24(2) Information of SEQ ID NO: 45: (i) Characteristics of sequence: (A) Length: 24 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 45: TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24

【０５１０】(２) 配列番号４６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４６： GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22(2) Information of SEQ ID NO: 46: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 22 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 46: GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22

【０５１１】(２) 配列番号４７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４７： ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31(2) Information of SEQ ID NO: 47: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 31 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 47: ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G31

【０５１２】(２) 配列番号４８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３６塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４８： ＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡ ＧＡＣＡＧＧＧＡＡＧ ＧＧＡ
ＧＣＴＧＴＡＣ ＡＴＧＡＧＡ ３６(2) Information of SEQ ID NO: 48: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 36 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 48: GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGA
GCTGTAC ATGAGA 36

【０５１３】（２) 配列番号４９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号４９： CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24(2) Information of SEQ ID NO: 49: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 24 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 49: CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24

【０５１４】(２) 配列番号５０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２４塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５０： GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24(2) Information of SEQ ID NO: 50: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 24 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 50: GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24

【０５１５】(２) 配列番号５１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２７塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５１： CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27(2) Information of SEQ ID NO: 51: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 27 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 51: CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27

【０５１６】(２) 配列番号５２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２７塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５２： AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27(2) Information of SEQ ID NO: 52: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 27 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 52: AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27

【０５１７】(２) 配列番号５３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５３： CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28(2) Information of SEQ ID NO: 53: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 28 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 53: CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28

【０５１８】(２) 配列番号５４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５４： GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28(2) Information of SEQ ID NO: 54: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 28 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 54: GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28

【０５１９】(２) 配列番号５５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５５： GACTCGAGGA TCCATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35(2) Information of SEQ ID NO: 55 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 35 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 55: GACTCGAGGA TCCATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35

【０５２０】(２) 配列番号５６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１７塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５６： GACTCGAGGA TCCATCG 17(2) Information of SEQ ID NO: 56: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 17 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 56: GACTCGAGGA TCCATCG 17

【０５２１】(２) 配列番号５７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５７： GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32(2) Information of SEQ ID NO: 57: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 32 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 57: GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32

【０５２２】(２) 配列番号５８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５８： CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21(2) Information of SEQ ID NO: 58: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 58: CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21

【０５２３】(２) 配列番号５９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１０３塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号５９： TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50 ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100 GCT 103(2) Information of SEQ ID NO: 59: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 103 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 59: TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50 ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100 GCT 103

【０５２４】(２) 配列番号６０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１０３塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６０： AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50 CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100 GCA 103(2) Information of SEQ ID NO: 60: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 103 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 60: AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50 CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100 GCA 103

【０５２５】(２) 配列番号６１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６１： TCTCGCTACC GTTTACAG 18(2) Information of SEQ ID NO: 61: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 18 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 61: TCTCGCTACC GTTTACAG 18

【０５２６】(２) 配列番号６２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６２： CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25(2) Information of SEQ ID NO: 62: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 25 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 62: CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25

【０５２７】(２) 配列番号６３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６３： GGGCCATGAC ACTGTCAA 18(2) Information of SEQ ID NO: 63: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 18 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 63: GGGCCATGAC ACTGTCAA 18

【０５２８】(２) 配列番号６４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４０塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６４： GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40(2) Information of SEQ ID NO: 64: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 40 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 64: GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40

【０５２９】(２) 配列番号６５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６５： ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32(2) Information of SEQ ID NO: 65: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 32 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 65: ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32

【０５３０】(２) 配列番号６６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６６： TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35(2) Information of SEQ ID NO: 66: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 35 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 66: TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35

【０５３１】(２) 配列番号６７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３３塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６７： AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33(2) Information of SEQ ID NO: 67: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 33 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 67: AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33

【０５３２】(２) 配列番号６８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３６塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６８： AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36(2) Information of SEQ ID NO: 68: (i) Characteristics of sequence: (A) Length: 36 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 68: AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36

【０５３３】(２) 配列番号６９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号６９： CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50 AACTGCTTCG TG 62(2) Information of SEQ ID NO: 69: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 62 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 69: CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50 AACTGCTTCG TG 62

【０５３４】(２) 配列番号７０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６１塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７０： ATACGGTCGG GCCGAGGAGG ACGAACACTG GAGGCTCAGG AGTCATTTGA 50 CGAAGCACTG A 61(2) Information of SEQ ID NO: 70: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 61 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 70: ATACGGTCGG GCCGAGGAGG ACGAACACTG GAGGCTCAGG AGTCATTTGA 50 CGAAGCACTG A 61

【０５３５】(２) 配列番号７１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３７塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７１： CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37(2) Information of SEQ ID NO: 71: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 37 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 71: CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37

【０５３６】(２) 配列番号７２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３７塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７２： TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTGCGC 37(2) Information of SEQ ID NO: 72: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 37 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 72: TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTGCGC 37

【０５３７】(２) 配列番号７３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７３： ＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴ ＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴ ＡＴＣＧＣＡＴＴＴＣ ＡＴ
ＣＡＣＣＡＴＣＡ ＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴ ５０ ＣＡＣＡＴＣＧＡＡＧ ＧＴＣＧＴＡＧＣＣ ６９(2) Information of SEQ ID NO: 73: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 73: CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTCAT
CACCATCA CCATCACCAT 50 CACATCGAAG GTCGTAGCC 69

【０５３８】（２) 配列番号７４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７４： TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50 AGCTTCCAGC AT 62(2) Information of SEQ ID NO: 74: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 62 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 74: TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50 AGCTTCCAGC AT 62

【０５３９】(２) 配列番号７５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７５： CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50 CACATCGAAC CACGTAGCC 69(2) Information of SEQ ID NO: 75: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 69 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 75: CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50 CACATCGAAC CACGTAGCC 69

【０５４０】(２) 配列番号７６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７６： TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50 AGCTTGGTGC AT 62(2) Information of SEQ ID NO: 76: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 62 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 76: TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50 AGCTTGGTGC AT 62

【０５４１】(２) 配列番号７７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７７： TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19(2) Information of SEQ ID NO: 77 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 19 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 77: TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19

【０５４２】(２) 配列番号７８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７８： GGAGACGCAG TCCATCGA 18(2) Information of SEQ ID NO: 78 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 18 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 78: GGAGACGCAG TCCATCGA 18

【０５４３】(２) 配列番号７９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６２塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号７９： ＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣ ＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧ ＴＣＮＣＣＮＧＣＮＣ ＣＮ
ＣＣＮＧＣＮＴＧ ＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡ ５０ ＧＴＴＣＴＣＡＧＴＡ ＡＡ ６２(2) Information of SEQ ID NO: 79: (i) Characteristics of sequence: (A) Length: 62 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 79: GCAGCAGTTC TAGAATTATG TNCCCNGCNC CN
CCNGCNTG TGACCCTCCGA 50 GTTCTCAGTA AA 62

【０５４４】（２) 配列番号８０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４９塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８０： ACACTGGAGG CTCAAGAGTC ATTTGACGAA GCACTGAGGG TACAGGAAG 49(2) Information of SEQ ID NO: 80: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 49 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 80: ACACTGGAGG CTCAAGAGTC ATTTGACGAA GCACTGAGGG TACAGGAAG 49

【０５４５】(２) 配列番号８１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８１： CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45(2) Information of SEQ ID NO: 81: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 45 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 81: CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45

【０５４６】(２) 配列番号８２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８２： TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAATAGCT TCCAGCAT 38(2) Information of SEQ ID NO: 82: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 38 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 82: TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAATAGCT TCCAGCAT 38

【０５４７】(２) 配列番号８３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４５塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８３： CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45(2) Information of SEQ ID NO: 83: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 45 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 83: CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45

【０５４８】(２) 配列番号８４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３８塩基対 (Ｂ) 型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８４： TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTTGCAT 38(2) Information of SEQ ID NO: 84: (i) Characteristics of sequence: (A) Length: 38 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: straight Linear (xi) sequence: SEQ ID NO: 84: TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTTGCAT 38

【０５４９】(２) 配列番号８５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８５： Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Asn Ala Tyr Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg Ala 20 25(2) Information of SEQ ID NO: 85: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 85 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Asn Ala Tyr Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg Ala 20 25

【０５５０】(２) 配列番号８６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８６： Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg 20 25 30 Ala 31(2) Information of SEQ ID NO: 86: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 31 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 86: Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg 20 25 30 Ala 31

【０５５１】(２) 配列番号８７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：３１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号８７： Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His 1 5 10 15 Ile Glu Pro Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg 20 25 30 Ala 31(2) Information of SEQ ID NO: 87: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 31 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 87 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His 1 5 10 15 Ile Glu Pro Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg 20 25 30 Ala 31

【０５５２】(２) 配列番号８８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：７アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 88: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 7 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５５３】(２) 配列番号８９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 89: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５５４】(２) 配列番号９０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 90: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５５５】(２) 配列番号９１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 91: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５５６】(２) 配列番号９２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 92: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５５７】(２) 配列番号９３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 93: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５５８】(２) 配列番号９４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 94: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５５９】（２) 配列番号９５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 95: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６０】(２) 配列番号９６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 96: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６１】(２) 配列番号９７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 97: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６２】(２) 配列番号９８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 98: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６３】(２) 配列番号９９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 99: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６４】(２) 配列番号１００の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 100: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６５】(２) 配列番号１０１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 101: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６６】(２) 配列番号１０２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 102 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６７】(２) 配列番号１０３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 103 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６８】(２) 配列番号１０４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 104: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５６９】(２) 配列番号１０５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 105: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５７０】(２) 配列番号１０６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 106: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５７１】(２) 配列番号１０７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 107: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５７２】(２) 配列番号１０８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 108: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５７３】(２) 配列番号１０９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 109: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５７４】(２) 配列番号１１０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１０： Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu 20 22(2) Information of SEQ ID NO: 110: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 22 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 110: Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Ser His Val Leu 20 22

【０５７５】(２) 配列番号１１１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１１： His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 1 5 10 15 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe 20 24(2) Information of SEQ ID NO: 111: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 24 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 111 His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 1 5 10 15 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe 20 24

【０５７６】(２) 配列番号１１２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２３アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１２： Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln 1 5 10 15 Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu 20 23(2) Information of SEQ ID NO: 112: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 23 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 112 Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln 1 5 10 15 Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu 20 23

【０５７７】(２) 配列番号１１３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１３： Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr 1 5 10 15 Cys Leu Ser Ser Leu Leu 20 21(2) Information of SEQ ID NO: 113: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 113: Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr 1 5 10 15 Cys Leu Ser Ser Leu Leu 20 21

【０５７８】(２) 配列番号１１４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１４： Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 1 5 10 15 Ser 16(2) Information of SEQ ID NO: 114: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 16 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 114: Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 1 5 10 15 Ser 16

【０５７９】(２) 配列番号１１５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１５： Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His 1 5 10 15 Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 20 22(2) Information of SEQ ID NO: 115: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 22 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 115: Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His 1 5 10 15 Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 20 22

【０５８０】(２) 配列番号１１６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１１６： Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met 1 5 10 15 Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 20 25(2) Information of SEQ ID NO: 116: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 25 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 116: Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met 1 5 10 15 Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 20 25

【０５８１】(２) 配列番号１１７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 117: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８２】(２) 配列番号１１８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 118: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８３】(２) 配列番号１１９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 119 (i) Sequence characteristics: (A) Length: 6 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８４】(２) 配列番号１２０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：７アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 120: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 7 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８５】(２) 配列番号１２１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 121: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８６】(２) 配列番号１２２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 122: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８７】(２) 配列番号１２３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 123: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 6 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８８】(２) 配列番号１２４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 124: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 4 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５８９】(２) 配列番号１２５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 125: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 5 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９０】(２) 配列番号１２６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 126: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 6 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９１】(２) 配列番号１２７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：７アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 127: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 7 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９２】(２) 配列番号１２８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：８アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 128: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 8 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９３】(２) 配列番号１２９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：９アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 129: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 9 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９４】(２) 配列番号１３０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１０アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 130: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 10 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９５】(２) 配列番号１３１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 131: (i) Characteristics of sequence: (A) Length: 11 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９６】（２) 配列番号１３２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (2) Information of SEQ ID NO: 132: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 12 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear

【０５９７】(２) 配列番号１３３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１３アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３３： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg 1 5 10 13(2) Information of SEQ ID NO: 133: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 13 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 133: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg 1 5 10 13

【０５９８】(２) 配列番号１３４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３４： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 1 5 10 14(2) Information of SEQ ID NO: 134: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 14 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 134 Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 1 5 10 14

【０５９９】(２) 配列番号１３５の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１５アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３５： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15(2) Information of SEQ ID NO: 135: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 15 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 135: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15

【０６００】(２) 配列番号１３６の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１６アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３６： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu 16(2) Information of SEQ ID NO: 136: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 16 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 136: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu 16

【０６０１】(２) 配列番号１３７の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１７アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３７： Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｌｅｕ Ｖａｌ １７(2) Information of SEQ ID NO: 137: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 17 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 137: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala
Val Pro Ser Arg Thr Ser 15
10 15 Leu Val 17

【０６０２】（２) 配列番号１３８の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１８アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３８： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu 18(2) Information of SEQ ID NO: 138: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 18 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 138: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu 18

【０６０３】(２) 配列番号１３９の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：１９アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１３９： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr 19(2) Information of SEQ ID NO: 139: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 19 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 139: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr 19

【０６０４】(２) 配列番号１４０の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２０アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１４０： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu 20(2) Information of SEQ ID NO: 140: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 20 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 140 Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu 20

【０６０５】(２) 配列番号１４１の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２１アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１４１： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn 20 21(2) Information of SEQ ID NO: 141: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 21 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 141 Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn 20 21

【０６０６】(２) 配列番号１４２の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２２アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１４２： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu 20 22(2) Information of SEQ ID NO: 142: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 22 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 142: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu 20 22

【０６０７】(２) 配列番号１４３の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２３アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１４３： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 20 23(2) Information of SEQ ID NO: 143: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 23 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 143: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 20 23

【０６０８】(２) 配列番号１４４の情報： (ｉ) 配列の特徴： (Ａ) 長さ：２４アミノ酸 (Ｂ) 型：アミノ酸 (Ｄ) トポロジー：直鎖状 (xi) 配列：配列番号１４４： Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro 20 24(2) Information of SEQ ID NO: 144: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 24 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence: SEQ ID NO: 144: Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro 20 24

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）ｃＤＮＡの導
き出されたアミノ酸配列（配列番号１）およびコード化
ヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。ヌク
レオチドは各列の始まりに番号を付してある。５'およ
び３'非翻訳領域を小文字で示す。アミノ酸残基は配列
上部に、成熟ｍｐｌリガンド（ＭＬ）蛋白配列のＳｅｒ
１で始まる番号を付してある。推定のエクソン３の境界
を矢印で示し、可能性あるＮグリコシル化部位に囲みを
付す。システイン残基を配列上部の点により示す。下線
を付した配列は、ブタ血漿から精製されたｍｐｌリガン
ドから決定されたＮ末端配列に対応する。FIG. 1 shows the derived amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the encoded nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the human mpl ligand (hML) cDNA. Nucleotides are numbered at the beginning of each column. The 5 'and 3' untranslated regions are shown in lower case. Amino acid residues are at the top of the sequence, Ser of the mature mpl ligand (ML) protein sequence.
Numbers starting with 1 are assigned. Putative exon 3 boundaries are indicated by arrows, and potential N-glycosylation sites are boxed. Cysteine residues are indicated by dots above the sequence. The underlined sequence corresponds to the N-terminal sequence determined from mpl ligand purified from porcine plasma.

【図２】 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）ｃＤＮＡの導
き出されたアミノ酸配列（配列番号１）およびコード化
ヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。ヌク
レオチドは各列の始まりに番号を付してある。５'およ
び３'非翻訳領域を小文字で示す。アミノ酸残基は配列
上部に、成熟ｍｐｌリガンド（ＭＬ）蛋白配列のＳｅｒ
１で始まる番号を付してある。推定のエクソン３の境界
を矢印で示し、可能性あるＮグリコシル化部位に囲みを
付す。システイン残基を配列上部の点により示す。下線
を付した配列は、ブタ血漿から精製されたｍｐｌリガン
ドから決定されたＮ末端配列に対応する。FIG. 2 shows the derived amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the encoding nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the human mpl ligand (hML) cDNA. Nucleotides are numbered at the beginning of each column. The 5 'and 3' untranslated regions are shown in lower case. Amino acid residues are at the top of the sequence, Ser of the mature mpl ligand (ML) protein sequence.
Numbers starting with 1 are assigned. Putative exon 3 boundaries are indicated by arrows, and potential N-glycosylation sites are boxed. Cysteine residues are indicated by dots above the sequence. The underlined sequence corresponds to the N-terminal sequence determined from mpl ligand purified from porcine plasma.

【図３】 ｍｐｌリガンド³Ｈ−チミジン取り込み検定
に用いられる手順を示す図である。様々な供給源由来の
ｍｐｌリガンドの存在を決定するために、５％ＣＯ₂お
よび空気中３７℃の加湿インキュベーター中でｍｐｌ
Ｐ Ｂａ／Ｆ３細胞を２４時間ＩＬ−３を欠乏させた。
ＩＬ−３欠乏後、この細胞を、希釈試料有りまたは無し
の９６ウェル培養皿に蒔き、細胞培養インキュベーター
中で２４時間培養した。最後の６−８時間は³Ｈ−チミ
ジン１μＣｉを含有する無血清ＲＰＭＩ培地２０μｌを
各ウェルに加えた。次にこの細胞を９６ウェルフィルタ
ー板に収穫し、水で洗浄した。次いでこのフィルターを
計数した。FIG. 3 shows the procedure used for the mpl ligand ³ H-thymidine incorporation assay. To determine the presence of mpl ligand from various sources, mpl in a humidified incubator at 37 ° C. in 5% CO ₂ and air.
PBa / F3 cells were depleted of IL-3 for 24 hours.
After IL-3 depletion, the cells were plated in 96-well culture dishes with or without diluted samples and cultured for 24 hours in a cell culture incubator. For the last 6-8 hours, 20 μl of serum-free RPMI medium containing 1 μCi of ³ H-thymidine was added to each well. The cells were then harvested on a 96-well filter plate and washed with water. The filters were then counted.

【図４】 ＡＰＰのＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖の刺激
に及ぼすプロナーゼ、ＤＴＴおよび熱の影響を示す図で
ある。ＡＰＰのプロナーゼ消化については、プロナーゼ
（ベーリンガー・マンハイム）または牛血清アルブミン
をＡｆｆｉ−ゲル１０（バイオラド）と結合させ、ＡＰ
Ｐと共に１８時間３７℃で個別にインキュベートした。
続いて樹脂を遠心により除去し、上清を検定した。ＡＰ
Ｐはまた、８０℃に４分間加熱し、または１００μＭ
ＤＴＴとしその後ＰＢＳに対して透析した。FIG. 4 shows the effect of pronase, DTT and heat on APP stimulation of Ba / F3-mpl cell proliferation. For pronase digestion of APP, pronase (Boehringer Mannheim) or bovine serum albumin was bound to Affi-gel 10 (Biorad) and AP
Incubated individually with P for 18 hours at 37 ° C.
Subsequently, the resin was removed by centrifugation and the supernatant was assayed. AP
P is also heated to 80 ° C. for 4 minutes, or 100 μM
DTT was then dialyzed against PBS.

【図５】 フェニル−トヨパール、ブルー−セファロー
スおよびウルトラリンク−ｍｐｌカラムからのｍｐｌリ
ガンド活性の溶出を示す図である。ｍｐｌ親和カラムか
らの画分４−８は、このカラムから溶離されたピーク活
性画分であった。FIG. 5 shows elution of mpl ligand activity from phenyl-Toyopearl, Blue-Sepharose and Ultralink-mpl columns. Fractions 4-8 from the mpl affinity column were the peak active fractions eluted from this column.

【図６】 溶離されたウルトラリンク−ｍｐｌ画分のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。画分２−８それぞれ２
００μｌに、−２０℃の１ｍＭ ＨＣｌを含有するアセ
トン１ｍｌを加えた。３時間後、−２０℃の試料を遠心
し、得られたペレットを−２０℃のアセトンで２ｘ洗浄
した。このアセトンペレットを引き続きＳＤＳ−可溶化
緩衝液３０μｌに溶解し、１００μＭ ＤＴＴとし、９
０℃に５分間加熱した。次にこの試料を４−２０％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、蛋白を銀染色
によって可視化した。FIG. 6. S of the eluted Ultralink-mpl fraction
It is a figure which shows DS-PAGE. Fractions 2-8 each 2
To 00 μl was added 1 ml of acetone containing 1 mM HCl at −20 ° C. After 3 hours, the sample at −20 ° C. was centrifuged, and the obtained pellet was washed 2 × with acetone at −20 ° C. The acetone pellet was subsequently dissolved in 30 μl of SDS-solubilization buffer to make 100 μM DTT,
Heated to 0 ° C. for 5 minutes. This sample is then used for 4-20% SD
Separated on S-polyacrylamide gel and proteins were visualized by silver staining.

【図７】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのｍｐｌリガンド活性
の溶離を示す図である。ｍｐｌ−親和カラムからの画分
６を、非還元条件下で４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル上で分離した。電気泳動後、このゲルを１２
の等しい領域に薄く切り、実施例に記載のように電気溶
出した。電気溶出された試料をＰＢＳ中に透析し、１／
２０希釈で検定した。ゲルの標定に用いられたＭｒ標準
はノヴェックス・マーク１２標準であった。FIG. 7 shows elution of mpl ligand activity from SDS-PAGE. Fraction 6 from the mpl-affinity column was separated on a 4-20% SDS-polyacrylamide gel under non-reducing conditions. After electrophoresis, the gel was
And electroeluted as described in the Examples. The electroeluted sample was dialyzed into PBS and 1 /
Assayed at 20 dilutions. The Mr standard used for gel standardization was Novex Mark 12 standard.

【図８】 ｍｐｌリガンド涸渇ＡＰＰがヒト巨核球形成
に及ぼす効果を示す図である。ｍｐｌリガンド涸渇ＡＰ
Ｐは、１ｍｌを１ｍｌのｍｐｌ−親和カラム（７００μ
ｇ ｍｐｌ−ＩｇＧ／ｍｌ ＮＨＳ−スーパーロース、フ
ァルマシア）に通すことにより作成した。ヒト末梢幹細
胞培養を１０％ＡＰＰまたは１０％ｍｐｌリガンド涸渇
ＡＰＰとし、１２日間培養した。巨核球形成を実施例に
記載のように定量した。FIG. 8 shows the effect of mpl ligand depleted APP on human megakaryocyte formation. mpl ligand depleted AP
P: 1 ml of 1 ml mpl-affinity column (700 μl)
g mpl-IgG / ml NHS-Superose, Pharmacia). Human peripheral stem cell cultures were 10% APP or 10% mpl ligand depleted APP and cultured for 12 days. Megakaryocyte formation was quantified as described in the examples.

【図９】 ｍｐｌ−ＩｇＧがＡＰＰによるヒト巨核球形
成の刺激に及ぼす効果を示す図である。ヒト末梢幹細胞
培養をＡＰＰで１０％とし、１２日間培養した。０、２
および４日目にｍｐｌ−ＩｇＧ（０．５μｇ）またはＡ
ＮＰ−Ｒ−ＩｇＧ（０．５μｇ）を加えた。１２日後、
巨核球形成を実施例に記載のように定量した。二重の試
料の平均をグラフ化し、実際の二重のデータを括弧に入
れて付記する。FIG. 9 shows the effect of mpl-IgG on stimulation of human megakaryocyte formation by APP. The human peripheral stem cell culture was adjusted to 10% with APP and cultured for 12 days. 0, 2
And on day 4 mpl-IgG (0.5 μg) or A
NP-R-IgG (0.5 μg) was added. 12 days later,
Megakaryocyte formation was quantified as described in the examples. Graph the average of duplicate samples and add the actual duplicate data in parentheses.

【図１０】 ｍｐｌリガンドをコードしているヒトゲノ
ムＤＮＡの３９０ｂｐフラグメントの両方の鎖を示す図
である。「エクソン３」（配列番号３）の導き出された
アミノ酸配列、コード化配列（配列番号４）、およびそ
の相補体（配列番号５）を示す。FIG. 10 shows both strands of a 390 bp fragment of human genomic DNA encoding mpl ligand. 1 shows the derived amino acid sequence of “Exon 3” (SEQ ID NO: 3), the coding sequence (SEQ ID NO: 4), and its complement (SEQ ID NO: 5).

【図１１】 成熟ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）（配列
番号６）および成熟ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）
（配列番号７）の導き出されたアミノ酸配列を示す図で
ある。ヒトｍｐｌリガンドについて予想されるアミノ酸
配列をヒトエリスロポエチン配列と並べる。同一のアミ
ノ酸に囲みを付し、最適の並置のために導入された間隙
をダッシュにより示す。可能性あるＮグリコシル化部位
に、ｈＭＬについては実線で、ｈＥＰＯについては破線
で下線を付す。エリスロポエチン活性にとって重要な二
つのシステインを大きな点により示す。FIG. 11. Mature human mpl ligand (hML) (SEQ ID NO: 6) and mature human erythropoietin (hEPO)
It is a figure which shows the deduced amino acid sequence of (SEQ ID NO: 7). The predicted amino acid sequence for the human mpl ligand is aligned with the human erythropoietin sequence. Identical amino acids are boxed and gaps introduced for optimal juxtaposition are indicated by dashes. Possible N-glycosylation sites are underlined with a solid line for hML and a dashed line for hEPO. Two cysteines important for erythropoietin activity are indicated by large dots.

【図１２】 成熟ヒトｍｐｌリガンドイソ型ｈＭＬ（配
列番号６）、ｈＭＬ２（配列番号８）、ｈＭＬ３（配列
番号９）、およびｈＭＬ４（配列番号１０）の導き出さ
れたアミノ酸配列を示す図である。同一のアミノ酸に囲
みを付し、最適の並置のために導入された間隙をダッシ
ュにより示す。FIG. 12 shows the derived amino acid sequences of the mature human mpl ligand isoforms hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9), and hML4 (SEQ ID NO: 10). Identical amino acids are boxed and gaps introduced for optimal juxtaposition are indicated by dashes.

【図１３】 成熟ヒトｍｐｌリガンドイソ型ｈＭＬ（配
列番号６）、ｈＭＬ２（配列番号８）、ｈＭＬ３（配列
番号９）、およびｈＭＬ４（配列番号１０）の導き出さ
れたアミノ酸配列を示す図である。同一のアミノ酸に囲
みを付し、最適の並置のために導入された間隙をダッシ
ュにより示す。FIG. 13 shows the derived amino acid sequences of the mature human mpl ligand isoforms hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9), and hML4 (SEQ ID NO: 10). Identical amino acids are boxed and gaps introduced for optimal juxtaposition are indicated by dashes.

【図１４】 Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖（Ａ）、巨核
球糖蛋白ＧＰII_bIII_aに特異的な放射標識されたマウス
ＩｇＧモノクローナル抗体を用いて定量されたインビト
ロヒト巨核球形成（Ｂ）、および血小板リバウンド検定
において測定されたマウス栓球形成（Ｃ）に及ぼすヒト
ｍｐｌリガンドの効果を示す図である。２９３細胞をＣ
ａＰＯ₄法（Ｃ．ゴーマン、DNA Cloning:A New Approac
h、２巻１４３−１９０頁［１９８５］）により、ｐＲ
Ｋ５ベクター単独、ｐＲＫ５−ｈＭＬまたはｐＲＫ５−
ＭＬ₁₅₃を用いて一夜トランスフェクトさせた（ｐＲＫ
５−ＭＬ₁₅₃は、ｈＭＬの残基１５３の後にＰＣＲによ
って停止コドンを導入することにより作成された）。次
に培地を３６時間条件設定し、実施例１に記載のように
Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌの細胞増殖について（Ａ）またはイ
ンビトロヒト巨核球形成について（Ｂ）検定した。巨核
球形成は、巨核球特異的糖蛋白ＧＰII_bIII_aに対する¹²⁵
Ｉ放射標識されたマウスＩｇＧモノクローナル抗体（Ｈ
Ｐ１−１Ｄ）を用いて記載のように定量した（グラント
等、Blood、６９巻１３３４−１３３９頁［１９８
７］）。インビボ血小板産生に及ぼす部分精製された組
換えＭＬ（ｒＭＬ）の効果（Ｃ）は、Ｔ．Ｐ．マクドナ
ルド、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１４４巻１００６−１
００１２頁（１９７３）に記載のリバウンド栓球増加検
定を用いて決定した。部分精製されたｒＭＬは、組換え
ＭＬを含有する条件培地２００ｍｌから調製した。この
培地をＰＢＳで平衡化した２ｍｌブルー−セファロース
カラムに通し、このカラムをＰＢＳで洗浄し、尿素およ
びＮａＣｌ各２Ｍを含有するＰＢＳで溶出した。活性画
分をＰＢＳ中に透析し、エントドキシンを含まないＢＳ
Ａで１ｍｇ／ｍｌとした。この試料は１単位／ｍｌ未満
のエンドトキシンを含んでいた。マウスに、６４００
０、３２０００または１６０００単位のｒＭＬまたは賦
形剤のみを注射した。各群は６匹のマウスで構成されて
いた。各群の平均および標準偏差を示す。メジアンを比
較する二端Ｔ検定によりｐ値を決定した。[14] Ba / F3-mpl cell proliferation (A), in vitro human megakaryocytopoiesis that are quantified using a mouse IgG monoclonal antibody specific radiolabeled megakaryocyte glycoprotein GPII _b III _{a (B),} FIG. 4 shows the effect of human mpl ligand on mouse thrombus formation (C) measured in platelet rebound assay. 293 cells to C
aPO ₄ method (C. Gorman, DNA Cloning: A New Approac
h, Vol. 14, pp. 143-190 [1985]).
K5 vector alone, pRK5-hML or pRK5-
It was overnight transfected with ML ₁₅₃ (pRK
5-ML ₁₅₃ is created by introducing a stop codon by PCR after residue 153 of HML). The medium was then conditioned for 36 hours and assayed for Ba / F3-mpl cell proliferation (A) or in vitro human megakaryocyte formation (B) as described in Example 1. Megakaryocyte formation ¹²⁵ for megakaryocyte specific glycoprotein GPII _b III _a
I radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody (H
P1-1D) as described (Grant et al., Blood, 69, 1333-1339 [198].
7]). The effect of partially purified recombinant ML (rML) on in vivo platelet production (C) is described in P. McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 144, 1006-1
It was determined using the rebound thrombocytosis assay described on page 0012 (1973). Partially purified rML was prepared from 200 ml of conditioned medium containing recombinant ML. The medium was passed through a 2 ml blue-Sepharose column equilibrated with PBS, the column was washed with PBS and eluted with PBS containing 2 M each of urea and NaCl. The active fraction was dialyzed into PBS and the endotoxin-free BS
A adjusted to 1 mg / ml. This sample contained less than 1 unit / ml endotoxin. 6400 mouse
0, 32000 or 16000 units of rML or vehicle alone were injected. Each group consisted of 6 mice. The mean and standard deviation of each group are shown. The p-value was determined by a two-tailed T test comparing the medians.

【図１５】 Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖（Ａ）、巨核
球糖蛋白ＧＰII_bIII_aに特異的な放射標識されたマウス
ＩｇＧモノクローナル抗体を用いて定量されたインビト
ロヒト巨核球形成（Ｂ）、および血小板リバウンド検定
において測定されたマウス栓球形成（Ｃ）に及ぼすヒト
ｍｐｌリガンドの効果を示す図である。２９３細胞をＣ
ａＰＯ₄法（Ｃ．ゴーマン、DNA Cloning:A New Approac
h、２巻１４３−１９０頁［１９８５］）により、ｐＲ
Ｋ５ベクター単独、ｐＲＫ５−ｈＭＬまたはｐＲＫ５−
ＭＬ₁₅₃を用いて一夜トランスフェクトさせた（ｐＲＫ
５−ＭＬ₁₅₃は、ｈＭＬの残基１５３の後にＰＣＲによ
って停止コドンを導入することにより作成された）。次
に培地を３６時間条件設定し、実施例１に記載のように
Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌの細胞増殖について（Ａ）またはイ
ンビトロヒト巨核球形成について（Ｂ）検定した。巨核
球形成は、巨核球特異的糖蛋白ＧＰII_bIII_aに対する¹²⁵
Ｉ放射標識されたマウスＩｇＧモノクローナル抗体（Ｈ
Ｐ１−１Ｄ）を用いて記載のように定量した（グラント
等、Blood、６９巻１３３４−１３３９頁［１９８
７］）。インビボ血小板産生に及ぼす部分精製された組
換えＭＬ（ｒＭＬ）の効果（Ｃ）は、Ｔ．Ｐ．マクドナ
ルド、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１４４巻１００６−１
００１２頁（１９７３）に記載のリバウンド栓球増加検
定を用いて決定した。部分精製されたｒＭＬは、組換え
ＭＬを含有する条件培地２００ｍｌから調製した。この
培地をＰＢＳで平衡化した２ｍｌブルー−セファロース
カラムに通し、このカラムをＰＢＳで洗浄し、尿素およ
びＮａＣｌ各２Ｍを含有するＰＢＳで溶出した。活性画
分をＰＢＳ中に透析し、エントドキシンを含まないＢＳ
Ａで１ｍｇ／ｍｌとした。この試料は１単位／ｍｌ未満
のエンドトキシンを含んでいた。マウスに、６４００
０、３２０００または１６０００単位のｒＭＬまたは賦
形剤のみを注射した。各群は６匹のマウスで構成されて
いた。各群の平均および標準偏差を示す。メジアンを比
較する二端Ｔ検定によりｐ値を決定した。[15] Ba / F3-mpl cell proliferation (A), in vitro human megakaryocytopoiesis that are quantified using a mouse IgG monoclonal antibody specific radiolabeled megakaryocyte glycoprotein GPII _b III _{a (B),} FIG. 4 shows the effect of human mpl ligand on mouse thrombus formation (C) measured in platelet rebound assay. 293 cells to C
aPO ₄ method (C. Gorman, DNA Cloning: A New Approac
h, Vol. 14, pp. 143-190 [1985]).
K5 vector alone, pRK5-hML or pRK5-
It was overnight transfected with ML ₁₅₃ (pRK
5-ML ₁₅₃ is created by introducing a stop codon by PCR after residue 153 of HML). The medium was then conditioned for 36 hours and assayed for Ba / F3-mpl cell proliferation (A) or in vitro human megakaryocyte formation (B) as described in Example 1. Megakaryocyte formation ¹²⁵ for megakaryocyte specific glycoprotein GPII _b III _a
I radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody (H
P1-1D) as described (Grant et al., Blood, 69, 1333-1339 [198].
7]). The effect of partially purified recombinant ML (rML) on in vivo platelet production (C) is described in P. McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 144, 1006-1
It was determined using the rebound thrombocytosis assay described on page 0012 (1973). Partially purified rML was prepared from 200 ml of conditioned medium containing recombinant ML. The medium was passed through a 2 ml blue-Sepharose column equilibrated with PBS, the column was washed with PBS and eluted with PBS containing 2 M each of urea and NaCl. The active fraction was dialyzed into PBS and the endotoxin-free BS
A adjusted to 1 mg / ml. This sample contained less than 1 unit / ml endotoxin. 6400 mouse
0, 32000 or 16000 units of rML or vehicle alone were injected. Each group consisted of 6 mice. The mean and standard deviation of each group are shown. The p-value was determined by a two-tailed T test comparing the medians.

【図１６】 Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖（Ａ）、巨核
球糖蛋白ＧＰII_bIII_aに特異的な放射標識されたマウス
ＩｇＧモノクローナル抗体を用いて定量されたインビト
ロヒト巨核球形成（Ｂ）、および血小板リバウンド検定
において測定されたマウス栓球形成（Ｃ）に及ぼすヒト
ｍｐｌリガンドの効果を示す図である。２９３細胞をＣ
ａＰＯ₄法（Ｃ．ゴーマン、DNA Cloning:A New Approac
h、２巻１４３−１９０頁［１９８５］）により、ｐＲ
Ｋ５ベクター単独、ｐＲＫ５−ｈＭＬまたはｐＲＫ５−
ＭＬ₁₅₃を用いて一夜トランスフェクトさせた（ｐＲＫ
５−ＭＬ₁₅₃は、ｈＭＬの残基１５３の後にＰＣＲによ
って停止コドンを導入することにより作成された）。次
に培地を３６時間条件設定し、実施例１に記載のように
Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌの細胞増殖について（Ａ）またはイ
ンビトロヒト巨核球形成について（Ｂ）検定した。巨核
球形成は、巨核球特異的糖蛋白ＧＰII_bIII_aに対する¹²⁵
Ｉ放射標識されたマウスＩｇＧモノクローナル抗体（Ｈ
Ｐ１−１Ｄ）を用いて記載のように定量した（グラント
等、Blood、６９巻１３３４−１３３９頁［１９８
７］）。インビボ血小板産生に及ぼす部分精製された組
換えＭＬ（ｒＭＬ）の効果（Ｃ）は、Ｔ．Ｐ．マクドナ
ルド、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、１４４巻１００６−１
００１２頁（１９７３）に記載のリバウンド栓球増加検
定を用いて決定した。部分精製されたｒＭＬは、組換え
ＭＬを含有する条件培地２００ｍｌから調製した。この
培地をＰＢＳで平衡化した２ｍｌブルー−セファロース
カラムに通し、このカラムをＰＢＳで洗浄し、尿素およ
びＮａＣｌ各２Ｍを含有するＰＢＳで溶出した。活性画
分をＰＢＳ中に透析し、エントドキシンを含まないＢＳ
Ａで１ｍｇ／ｍｌとした。この試料は１単位／ｍｌ未満
のエンドトキシンを含んでいた。マウスに、６４００
０、３２０００または１６０００単位のｒＭＬまたは賦
形剤のみを注射した。各群は６匹のマウスで構成されて
いた。各群の平均および標準偏差を示す。メジアンを比
較する二端Ｔ検定によりｐ値を決定した。[16] Ba / F3-mpl cell proliferation (A), in vitro human megakaryocytopoiesis that are quantified using a mouse IgG monoclonal antibody specific radiolabeled megakaryocyte glycoprotein GPII _b III _{a (B),} FIG. 4 shows the effect of human mpl ligand on mouse thrombus formation (C) measured in platelet rebound assay. 293 cells to C
aPO ₄ method (C. Gorman, DNA Cloning: A New Approac
h, Vol. 14, pp. 143-190 [1985]).
K5 vector alone, pRK5-hML or pRK5-
It was overnight transfected with ML ₁₅₃ (pRK
5-ML ₁₅₃ is created by introducing a stop codon by PCR after residue 153 of HML). The medium was then conditioned for 36 hours and assayed for Ba / F3-mpl cell proliferation (A) or in vitro human megakaryocyte formation (B) as described in Example 1. Megakaryocyte formation ¹²⁵ for megakaryocyte specific glycoprotein GPII _b III _a
I radiolabeled mouse IgG monoclonal antibody (H
P1-1D) as described (Grant et al., Blood, 69, 1333-1339 [198].
7]). The effect of partially purified recombinant ML (rML) on in vivo platelet production (C) is described in P. McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 144, 1006-1
It was determined using the rebound thrombocytosis assay described on page 0012 (1973). Partially purified rML was prepared from 200 ml of conditioned medium containing recombinant ML. The medium was passed through a 2 ml blue-Sepharose column equilibrated with PBS, the column was washed with PBS and eluted with PBS containing 2 M each of urea and NaCl. The active fraction was dialyzed into PBS and the endotoxin-free BS
A adjusted to 1 mg / ml. This sample contained less than 1 unit / ml endotoxin. 6400 mouse
0, 32000 or 16000 units of rML or vehicle alone were injected. Each group consisted of 6 mice. The mean and standard deviation of each group are shown. The p-value was determined by a two-tailed T test comparing the medians.

【図１７】 ヒトｍｐｌリガンドイソ型および変異体の
効果をＢａ／Ｆ３−ｍｐｌ細胞増殖検定で比較する図で
ある。ｈＭＬ、偽似、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ（Ｒ
１５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）、およびｈＭＬ₁₅₃を実施例１
に記載のように様々な希釈で検定した。FIG. 17 compares the effects of human mpl ligand isoforms and variants in a Ba / F3-mpl cell proliferation assay. hML, pseudo, hML2, hML3, hML (R
153A, R154A), and carrying out the HML ₁₅₃ Example 1
Assays were performed at various dilutions as described.

【図１８】 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはヒト
ＴＰＯ（ｈＴＰＯ）の導き出されたアミノ酸配列（配列
番号１）およびヒトゲノムＤＮＡコード化配列（配列番
号１１）を示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸
残基は各列の始まりに番号を付す。FIG. 18 shows the derived amino acid sequence of human mpl ligand (hML) or human TPO (hTPO) (SEQ ID NO: 1) and the human genomic DNA coding sequence (SEQ ID NO: 11). Nucleotide and amino acid residues are numbered at the beginning of each column.

【図１９】 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはヒト
ＴＰＯ（ｈＴＰＯ）の導き出されたアミノ酸配列（配列
番号１）およびヒトゲノムＤＮＡコード化配列（配列番
号１１）を示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸
残基は各列の始まりに番号を付す。FIG. 19 shows the derived amino acid sequence of human mpl ligand (hML) or human TPO (hTPO) (SEQ ID NO: 1) and the human genomic DNA coding sequence (SEQ ID NO: 11). Nucleotide and amino acid residues are numbered at the beginning of each column.

【図２０】 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはヒト
ＴＰＯ（ｈＴＰＯ）の導き出されたアミノ酸配列（配列
番号１）およびヒトゲノムＤＮＡコード化配列（配列番
号１１）を示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸
残基は各列の始まりに番号を付す。FIG. 20 shows the derived amino acid sequence of human mpl ligand (hML) or human TPO (hTPO) (SEQ ID NO: 1) and the human genomic DNA coding sequence (SEQ ID NO: 11). Nucleotide and amino acid residues are numbered at the beginning of each column.

【図２１】 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはヒト
ＴＰＯ（ｈＴＰＯ）の導き出されたアミノ酸配列（配列
番号１）およびヒトゲノムＤＮＡコード化配列（配列番
号１１）を示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸
残基は各列の始まりに番号を付す。FIG. 21 shows the derived amino acid sequence of human mpl ligand (hML) or human TPO (hTPO) (SEQ ID NO: 1) and the human genomic DNA coding sequence (SEQ ID NO: 11). Nucleotide and amino acid residues are numbered at the beginning of each column.

【図２２】 ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）またはヒト
ＴＰＯ（ｈＴＰＯ）の導き出されたアミノ酸配列（配列
番号１）およびヒトゲノムＤＮＡコード化配列（配列番
号１１）を示す図である。ヌクレオチドおよびアミノ酸
残基は各列の始まりに番号を付す。FIG. 22 shows the derived amino acid sequence of human mpl ligand (hML) or human TPO (hTPO) (SEQ ID NO: 1) and the human genomic DNA coding sequence (SEQ ID NO: 11). Nucleotide and amino acid residues are numbered at the beginning of each column.

【図２３】 精製された２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂および精
製された２９３−ｒｈＭＬ₁₅₃のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示
す図である。23 is a diagram showing an SDS-PAGE of purified 293-RHML ₃₃₂ and purified 293-rhML _153.

【図２４】 ヌクレオチド配列：マウスＭＬイソ型のオ
ープンリーディングフレームのｃＤＮＡコード化（配列
番号１２）および導き出されたアミノ酸配列（配列番号
１３）を示す図である。この成熟マウスｍｐｌリガンド
イソ型は、推定の全長ｍＭＬより４個少ない３３１のア
ミノ酸残基を含んでおり、よってｍＭＬ２と命名する。
ヌクレオチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残
基は配列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。可能性あ
るＮグリコシル化部位に下線を付す。システイン残基は
配列上部の点により示す。FIG. 24 shows the nucleotide sequence: cDNA encoding of the open reading frame of the mouse ML isoform (SEQ ID NO: 12) and the derived amino acid sequence (SEQ ID NO: 13). This mature mouse mpl ligand isoform contains 331 amino acid residues four fewer than the predicted full length mML, and is therefore termed mML2.
Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence. Possible N-glycosylation sites are underlined. Cysteine residues are indicated by dots above the sequence.

【図２５】 ヌクレオチド配列：マウスＭＬイソ型のオ
ープンリーディングフレームのｃＤＮＡコード化（配列
番号１２）および導き出されたアミノ酸配列（配列番号
１３）を示す図である。この成熟マウスｍｐｌリガンド
イソ型は、推定の全長ｍＭＬより４個少ない３３１のア
ミノ酸残基を含んでおり、よってｍＭＬ２と命名する。
ヌクレオチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残
基は配列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。可能性あ
るＮグリコシル化部位に下線を付す。システイン残基は
配列上部の点により示す。FIG. 25 shows the nucleotide sequence: cDNA encoding of the open reading frame of the mouse ML isoform (SEQ ID NO: 12) and the derived amino acid sequence (SEQ ID NO: 13). This mature mouse mpl ligand isoform contains 331 amino acid residues four fewer than the predicted full length mML, and is therefore termed mML2.
Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence. Possible N-glycosylation sites are underlined. Cysteine residues are indicated by dots above the sequence.

【図２６】 このマウスＭＬイソ型（ｍＭＬ）のｃＤＮ
Ａ配列（配列番号１４）および予想蛋白配列（配列番号
１５）を示す図である。ヌクレオチドは各列の始まりに
番号を付す。アミノ酸残基は配列上部にＳｅｒ１で始ま
る番号を付す。この成熟マウスｍｐｌリガンドイソ型は
３３５のアミノ酸残基を含むので、ｍＭＬと命名される
全長のｍｐｌリガンドであると信じられる。シグナル配
列を破線の下線で示し、開裂されそうな点を矢印で示
す。５'および３'非翻訳領域を小文字で示す。択一的ス
プライシングの結果として見いだされる２個の除去（ｍ
ＭＬ２およびｍＭＬ３）に下線を付す。４個のシステイ
ン残基を点により示す。７個の可能性あるＮグリコシル
化部位に囲みを付す。FIG. 26: cDN of this mouse ML isoform (mML)
FIG. 9 shows the A sequence (SEQ ID NO: 14) and the predicted protein sequence (SEQ ID NO: 15). Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence. Since this mature mouse mpl ligand isoform contains 335 amino acid residues, it is believed to be a full-length mpl ligand designated as mML. The signal sequence is indicated by a dashed underline, and points that are likely to be cleaved are indicated by arrows. The 5 'and 3' untranslated regions are shown in lower case. The two eliminations found as a result of alternative splicing (m
ML2 and mML3) are underlined. Four cysteine residues are indicated by dots. Seven potential N-glycosylation sites are boxed.

【図２７】 このマウスＭＬイソ型（ｍＭＬ）のｃＤＮ
Ａ配列（配列番号１４）および予想蛋白配列（配列番号
１５）を示す図である。ヌクレオチドは各列の始まりに
番号を付す。アミノ酸残基は配列上部にＳｅｒ１で始ま
る番号を付す。この成熟マウスｍｐｌリガンドイソ型は
３３５のアミノ酸残基を含むので、ｍＭＬと命名される
全長のｍｐｌリガンドであると信じられる。シグナル配
列を破線の下線で示し、開裂されそうな点を矢印で示
す。５'および３'非翻訳領域を小文字で示す。択一的ス
プライシングの結果として見いだされる２個の除去（ｍ
ＭＬ２およびｍＭＬ３）に下線を付す。４個のシステイ
ン残基を点により示す。７個の可能性あるＮグリコシル
化部位に囲みを付す。FIG. 27. cDN of this mouse ML isoform (mML)
FIG. 9 shows the A sequence (SEQ ID NO: 14) and the predicted protein sequence (SEQ ID NO: 15). Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence. Since this mature mouse mpl ligand isoform contains 335 amino acid residues, it is believed to be a full-length mpl ligand designated as mML. The signal sequence is indicated by a dashed underline, and points that are likely to be cleaved are indicated by arrows. The 5 'and 3' untranslated regions are shown in lower case. The two eliminations found as a result of alternative splicing (m
ML2 and mML3) are underlined. Four cysteine residues are indicated by dots. Seven potential N-glycosylation sites are boxed.

【図２８】 ヒトＮＬイソ型ｈＭＬ３の導き出されたア
ミノ酸配列（配列番号９）およびｍＭＬ３と命名された
マウスＭＬイソ型（配列番号１６）を比較する図であ
る。ヒトｍｐｌリガンドの予想アミノ酸配列をマウスｍ
ｐｌリガンド配列と並べる。同一のアミノ酸に囲みを付
し、最適な並置のために導入された間隙をダッシュで示
す。アミノ酸は各列の始まりに番号を付す。FIG. 28 compares the derived amino acid sequence of human NL isoform hML3 (SEQ ID NO: 9) and the mouse ML isoform designated as mML3 (SEQ ID NO: 16). The predicted amino acid sequence of human mpl ligand
Align with pl ligand sequence. Identical amino acids are boxed and gaps introduced for optimal alignment are indicated by dashes. Amino acids are numbered at the beginning of each column.

【図２９】 マウスＭＬ（配列番号１７）、ブタＭＬ
（配列番号１８）およびヒトＭＬ（配列番号６）由来の
成熟ＭＬイソ型の予想アミノ酸配列を比較する図であ
る。アミノ酸は、最適な並置のために導入されたダッシ
ュで示される間隙を入れて並べる。アミノ酸は各列の始
まりに番号を付し、同一の残基に囲みを付す。可能性あ
るＮグリコシル化部位を陰付きの囲みで表し、システイ
ン残基を点で示す。可能性あるプロテアーゼ開裂部位で
ある保存された二塩基アミノ酸モチーフに下線を付す。
三つの種（ＭＬ２）全てに存在することが判明した４個
のアミノ酸除去に太線の囲みで輪郭を付す。FIG. 29 shows mouse ML (SEQ ID NO: 17) and pig ML
FIG. 9 compares predicted amino acid sequences of mature ML isoforms from (SEQ ID NO: 18) and human ML (SEQ ID NO: 6). Amino acids are spaced with gaps indicated by dashes introduced for optimal alignment. Amino acids are numbered at the beginning of each column and identical residues are boxed. Possible N-glycosylation sites are indicated by shaded boxes and cysteine residues are indicated by dots. The conserved dibasic amino acid motif, a potential protease cleavage site, is underlined.
The deletion of the four amino acids found to be present in all three species (ML2) is outlined by a thick line.

【図３０】 ブタＭＬイソ型（ｐＭＬ）のｃＤＮＡ配列
（配列番号１９）および予想される蛋白配列（配列番号
１８）を示す図である。このブタｍｐｌリガンドイソ型
は３３２アミノ酸残基を含み、ｐＭＬと命名される全長
のブタｍｐｌリガンドであると信じられる。ヌクレオチ
ドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配列上
部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。FIG. 30 shows the cDNA sequence of the porcine ML isoform (pML) (SEQ ID NO: 19) and the predicted protein sequence (SEQ ID NO: 18). This porcine mpl ligand isoform contains 332 amino acid residues and is believed to be a full-length porcine mpl ligand designated pML. Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence.

【図３１】 ブタＭＬイソ型（ｐＭＬ）のｃＤＮＡ配列
（配列番号１９）および予想される蛋白配列（配列番号
１８）を示す図である。このブタｍｐｌリガンドイソ型
は３３２アミノ酸残基を含み、ｐＭＬと命名される全長
のブタｍｐｌリガンドであると信じられる。ヌクレオチ
ドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配列上
部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。FIG. 31 shows the cDNA sequence of the porcine ML isoform (pML) (SEQ ID NO: 19) and the predicted protein sequence (SEQ ID NO: 18). This porcine mpl ligand isoform contains 332 amino acid residues and is believed to be a full-length porcine mpl ligand designated pML. Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence.

【図３２】 ブタＭＬイソ型（ｐＭＬ２）のｃＤＮＡ配
列（配列番号２０）および予想成熟蛋白配列（配列番号
２１）を示す図である。このブタｍｐｌリガンドイソ型
は３２８のアミノ酸残基を含み、ｐＭＬ２と命名される
全長ブタｍｐｌリガンドの４残基除去型である。ヌクレ
オチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配
列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。FIG. 32 shows the cDNA sequence of the porcine ML isoform (pML2) (SEQ ID NO: 20) and the predicted mature protein sequence (SEQ ID NO: 21). This porcine mpl ligand isoform contains 328 amino acid residues and is a 4-residue deleted version of the full-length porcine mpl ligand designated pML2. Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence.

【図３３】 ブタＭＬイソ型（ｐＭＬ２）のｃＤＮＡ配
列（配列番号２０）および予想成熟蛋白配列（配列番号
２１）を示す図である。このブタｍｐｌリガンドイソ型
は３２８のアミノ酸残基を含み、ｐＭＬ２と命名される
全長ブタｍｐｌリガンドの４残基除去型である。ヌクレ
オチドは各列の始まりに番号を付す。アミノ酸残基は配
列上部にＳｅｒ１で始まる番号を付す。FIG. 33 shows the cDNA sequence of the porcine ML isoform (pML2) (SEQ ID NO: 20) and the predicted mature protein sequence (SEQ ID NO: 21). This porcine mpl ligand isoform contains 328 amino acid residues and is a 4-residue deleted version of the full-length porcine mpl ligand designated pML2. Nucleotides are numbered at the beginning of each column. Amino acid residues are numbered starting with Ser1 at the top of the sequence.

【図３４】 全長ブタＭＬイソ型ｐＭＬ（配列番号１
８）およびｐＭＬ２と命名されたブタＭＬイソ型（配列
番号２１）の導き出されたアミノ酸配列を比較する図で
ある。ｐＭＬの予想アミノ酸配列をｐＭＬ２配列と並置
する。同一のアミノ酸に囲みを付し、最適の並置のため
に導入された間隙をダッシュで示す。アミノ酸は各列の
始まりに番号を付す。FIG. 34. Full length porcine ML isoform pML (SEQ ID NO: 1)
FIG. 8 compares the derived amino acid sequences of the porcine ML isoforms designated 8) and pML2 (SEQ ID NO: 21). The predicted amino acid sequence of pML is aligned with the pML2 sequence. Identical amino acids are boxed and gaps introduced for optimal alignment are indicated by dashes. Amino acids are numbered at the beginning of each column.

【図３５】 ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₃₃₂の産生のための宿
主ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞のトランスフェクトに使用され
るプラスミドｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＯＲＦ（「全
長」またはＴＰＯ₃₃₂）の適切な特徴を示す図である。FIG. 35 shows appropriate features of plasmid pSVI5.ID.LL.MLORF (“full length” or TPO ₃₃₂ ) used to transfect host CHO-DP12 cells for production of CHO-rhTPO ₃₃₂ . .

【図３６】 ＣＨＯ−ｒｈＴＰＯ₁₅₃の産生のための宿
主ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞のトランスフェクトに使用され
るプラスミドｐＳＶＩ５.ＩＤ.ＬＬ.ＭＬＥＰＯ−Ｄ
（「末端切除された」またはＴＰＯ₁₅₃）の適切な特徴
を示す図である。[Figure 36] Plasmid pSVI5.ID.LL.MLEPO-D which is used to transfect host CHO-DP12 cells for production of CHO-rhTPO ₁₅₃
FIG. 4 shows the relevant features of (“truncated” or TPO ₁₅₃ ).

【図３７】 正常なマウスの血小板（Ａ）、赤血球
（Ｂ）、および白血球（Ｃ）に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ−ｒ
ｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示す図である。
６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液または
Ｅ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）０．３
μｇのいずれか（１００μｌ皮下）を毎日注射した。０
日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼窩洞より採
取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈
し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマトロジー・
アナライザー９０１８で得た。このデータを平均値±平
均値の標準誤差として表す。FIG. 37. Effect of E. coli on platelets (A), red blood cells (B), and white blood cells (C) of normal mice. coli-r
It is a figure which shows the effect of hTPO (Met ^- 1,153).
Two groups of 6 female C57B6 mice were given PBS buffer or E. coli. coli-rhTPO (Met- ¹ , 153) 0.3
Any of μg (100 μl subcutaneous) was injected daily. 0
On day 3 and days 7-7, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. This blood was immediately diluted with 10 ml of a commercially available diluent, and the complete blood count was determined by Serono Baker Hematology.
Obtained with an analyzer 9018. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図３８】 正常なマウスの血小板（Ａ）、赤血球
（Ｂ）、および白血球（Ｃ）に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ−ｒ
ｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示す図である。
６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液または
Ｅ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）０．３
μｇのいずれか（１００μｌ皮下）を毎日注射した。０
日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼窩洞より採
取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈
し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマトロジー・
アナライザー９０１８で得た。このデータを平均値±平
均値の標準誤差として表す。FIG. 38. Effect of E. coli on platelets (A), erythrocytes (B), and leukocytes (C) of normal mice. coli-r
It is a figure which shows the effect of hTPO (Met ^- 1,153).
Two groups of 6 female C57B6 mice were given PBS buffer or E. coli. coli-rhTPO (Met- ¹ , 153) 0.3
Any of μg (100 μl subcutaneous) was injected daily. 0
On day 3 and days 7-7, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. This blood was immediately diluted with 10 ml of a commercially available diluent, and the complete blood count was determined by Serono Baker Hematology.
Obtained with an analyzer 9018. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図３９】 正常なマウスの血小板（Ａ）、赤血球
（Ｂ）、および白血球（Ｃ）に及ぼすＥ．ｃｏｌｉ−ｒ
ｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示す図である。
６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液または
Ｅ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）０．３
μｇのいずれか（１００μｌ皮下）を毎日注射した。０
日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼窩洞より採
取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈
し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマトロジー・
アナライザー９０１８で得た。このデータを平均値±平
均値の標準誤差として表す。FIG. 39. Effect of E. coli on platelets (A), erythrocytes (B), and leukocytes (C) of normal mice. coli-r
It is a figure which shows the effect of hTPO (Met ^- 1,153).
Two groups of 6 female C57B6 mice were given PBS buffer or E. coli. coli-rhTPO (Met- ¹ , 153) 0.3
Any of μg (100 μl subcutaneous) was injected daily. 0
On day 3 and days 7-7, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. This blood was immediately diluted with 10 ml of a commercially available diluent, and the complete blood count was determined by Serono Baker Hematology.
Obtained with an analyzer 9018. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４０】 近致死量を照射されたマウスの血小板
（Ａ）、赤血球（Ｂ）および（Ｃ）白血球に及ぼすＥ．
ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示
す図である。１０匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群に¹³⁷
Ｃｓ線源からの７５０ｃＧｙガンマ線で近致死量の照射
を行い、ＰＢＳ緩衝液またはＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ
（Ｍｅｔ^-1、１５３）３．０μｇのいずれか（１００μ
ｌ皮下）を毎日注射した。０日目およびその後の中間時
点で４０μｌの血液を眼窩洞より採取した。この血液を
直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈し、完全血球数をセ
ローノ・ベイカー・ヘマトロジー・アナライザー９０１
８で得た。このデータを平均値±平均値の標準誤差とし
て表す。FIG. 40. Effect of E. coli on platelets (A), erythrocytes (B) and (C) leukocytes of mice exposed to near lethal doses.
^{coli-rhTPO (Met -1, 153} ) shows the effect of. ^{137 in} 2 groups of 10 female C57B6 mice
Near lethal irradiation was performed with 750 cGy gamma rays from a Cs source, PBS buffer or E. coli. coli-rhTPO
(Met ^-1 , 153) Any of 3.0 μg (100 μg)
1 sc) was injected daily. At day 0 and at intermediate time points thereafter, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. The blood was immediately diluted with 10 ml of a commercially available diluent, and the complete blood count was determined using a Serono Baker Hematology Analyzer 901.
8 obtained. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４１】 近致死量を照射されたマウスの血小板
（Ａ）、赤血球（Ｂ）および（Ｃ）白血球に及ぼすＥ．
ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示
す図である。１０匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群に¹³⁷
Ｃｓ線源からの７５０ｃＧｙガンマ線で近致死量の照射
を行い、ＰＢＳ緩衝液またはＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ
（Ｍｅｔ^-1、１５３）３．０μｇのいずれか（１００μ
ｌ皮下）を毎日注射した。０日目およびその後の中間時
点で４０μｌの血液を眼窩洞より採取した。この血液を
直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈し、完全血球数をセ
ローノ・ベイカー・ヘマトロジー・アナライザー９０１
８で得た。このデータを平均値±平均値の標準誤差とし
て表す。FIG. 41. Effect of E. coli on platelets (A), erythrocytes (B) and (C) leukocytes of mice exposed to near lethal doses.
^{coli-rhTPO (Met -1, 153} ) shows the effect of. ^{137 in} 2 groups of 10 female C57B6 mice
Near lethal irradiation was performed with 750 cGy gamma rays from a Cs source, PBS buffer or E. coli. coli-rhTPO
(Met ^-1 , 153) Any of 3.0 μg (100 μg)
1 sc) was injected daily. At day 0 and at intermediate time points thereafter, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. The blood was immediately diluted with 10 ml of a commercially available diluent, and the complete blood count was determined using a Serono Baker Hematology Analyzer 901.
8 obtained. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４２】 近致死量を照射されたマウスの血小板
（Ａ）、赤血球（Ｂ）および（Ｃ）白血球に及ぼすＥ．
ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1、１５３）の効果を示
す図である。１０匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウス２群に¹³⁷
Ｃｓ線源からの７５０ｃＧｙガンマ線で近致死量の照射
を行い、ＰＢＳ緩衝液またはＥ．ｃｏｌｉ−ｒｈＴＰＯ
（Ｍｅｔ^-1、１５３）３．０μｇのいずれか（１００μ
ｌ皮下）を毎日注射した。０日目およびその後の中間時
点で４０μｌの血液を眼窩洞より採取した。この血液を
直ちに市販の希釈剤１０ｍｌで希釈し、完全血球数をセ
ローノ・ベイカー・ヘマトロジー・アナライザー９０１
８で得た。このデータを平均値±平均値の標準誤差とし
て表す。FIG. 42. Effect of E. coli on platelets (A), erythrocytes (B) and (C) leukocytes of mice exposed to near lethal doses.
^{coli-rhTPO (Met -1, 153} ) shows the effect of. ^{137 in} 2 groups of 10 female C57B6 mice
Near lethal irradiation was performed with 750 cGy gamma rays from a Cs source, PBS buffer or E. coli. coli-rhTPO
(Met ^-1 , 153) Any of 3.0 μg (100 μg)
1 sc) was injected daily. At day 0 and at intermediate time points thereafter, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. The blood was immediately diluted with 10 ml of a commercially available diluent, and the complete blood count was determined using a Serono Baker Hematology Analyzer 901.
8 obtained. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４３】 正常なマウスの（Ａ）血小板（栓球）、
（Ｂ）赤血球、および（Ｃ）白血球に及ぼすＣＨＯ−ｒ
ｈＴＰＯ₃₃₂の効果を示す図である。６匹の雌性Ｃ５７
Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液またはＣＨＯ−ｒｈＴＰ
Ｏ₃₃₂ ０．３μｇのいずれか(１００μｌ皮下)を毎日注
射した。０日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼
窩洞より採取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０
ｍｌで希釈し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマ
トロジー・アナライザー９０１８で得た。このデータを
平均値±平均値の標準誤差として表す。FIG. 43. (A) Platelets (thrombocytes) of normal mice,
(B) Effect of CHO-r on erythrocytes and (C) leukocytes
is a diagram showing the effect of hTPO _332. 6 female C57
PBS buffer or CHO-rhTP was added to two groups of B6 mice.
Any of 0.3 μg of O ₃₃₂ (100 μl subcutaneous) was injected daily. On day 0 and days 3-7, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. Immediately remove this blood from commercial diluent 10
After dilution in ml, complete blood counts were obtained on a Serono Baker Hematology Analyzer 9018. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４４】 正常なマウスの（Ａ）血小板（栓球）、
（Ｂ）赤血球、および（Ｃ）白血球に及ぼすＣＨＯ−ｒ
ｈＴＰＯ₃₃₂の効果を示す図である。６匹の雌性Ｃ５７
Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液またはＣＨＯ−ｒｈＴＰ
Ｏ₃₃₂ ０．３μｇのいずれか(１００μｌ皮下)を毎日注
射した。０日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼
窩洞より採取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０
ｍｌで希釈し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマ
トロジー・アナライザー９０１８で得た。このデータを
平均値±平均値の標準誤差として表す。FIG. 44: (A) Platelets (thrombocytes) of normal mice,
(B) Effect of CHO-r on erythrocytes and (C) leukocytes
is a diagram showing the effect of hTPO _332. 6 female C57
PBS buffer or CHO-rhTP was added to two groups of B6 mice.
Any of 0.3 μg of O ₃₃₂ (100 μl subcutaneous) was injected daily. On day 0 and days 3-7, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. Immediately remove this blood from commercial diluent 10
After dilution in ml, complete blood counts were obtained on a Serono Baker Hematology Analyzer 9018. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４５】 正常なマウスの（Ａ）血小板（栓球）、
（Ｂ）赤血球、および（Ｃ）白血球に及ぼすＣＨＯ−ｒ
ｈＴＰＯ₃₃₂の効果を示す図である。６匹の雌性Ｃ５７
Ｂ６マウス２群にＰＢＳ緩衝液またはＣＨＯ−ｒｈＴＰ
Ｏ₃₃₂ ０．３μｇのいずれか(１００μｌ皮下)を毎日注
射した。０日目および３−７日目に４０μｌの血液を眼
窩洞より採取した。この血液を直ちに市販の希釈剤１０
ｍｌで希釈し、完全血球数をセローノ・ベイカー・ヘマ
トロジー・アナライザー９０１８で得た。このデータを
平均値±平均値の標準誤差として表す。FIG. 45: (A) Platelets (thrombocytes) of normal mice,
(B) Effect of CHO-r on erythrocytes and (C) leukocytes
is a diagram showing the effect of hTPO _332. 6 female C57
PBS buffer or CHO-rhTP was added to two groups of B6 mice.
Any of 0.3 μg of O ₃₃₂ (100 μl subcutaneous) was injected daily. On day 0 and days 3-7, 40 μl of blood was collected from the orbital sinus. Immediately remove this blood from commercial diluent 10
After dilution in ml, complete blood counts were obtained on a Serono Baker Hematology Analyzer 9018. This data is expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４６】 様々なセルラインから得られたｒｈＴＰＯ
の様々な型に対する用量反応曲線を示す図である。用量
反応曲線は、以下のセルライン由来のｒｈＴＰＯに対し
て組み立てられた：ＣＨＯからのｈＴＰＯ₃₃₂（チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞からの全長）；ｈＴＰＯ_Met
^-1 ₁₅₃（Ｎ末端メチオニンを有するＥ．ｃｏｌｉから誘
導された末端切除型）；ｈＴＰＯ₃₃₂（ヒト２９３細胞
からの全長ＴＰＯ）；Ｍｅｔ無し１５５ Ｅ−Ｃｏｌｉ
（大腸菌由来の末端メチオニン無しの末端切除型［ｒｈ
ＴＰＯ₁₅₅］）。６匹の雌性Ｃ５７Ｂ６マウスの群に、
群に応じてｒｈＴＰＯを毎日７日間注射した。完全血球
数測定のため、４０μｌの血液を毎日眼窩より採取し
た。上に示したデータは種々の処置について見られた最
大効果であり、（ｍｅｔ１５３Ｅ−Ｃｏｌｉ）を除き、
これは処置の７日目に起こった。上記の「ｍｅｔ１５３
Ｅ−Ｃｏｌｉ」群では、最大効果は５日目に見られた。
データを平均値±平均値の標準誤差として表す。FIG. 46. rhTPO obtained from various cell lines.
FIG. 4 shows dose response curves for various types of. Dose response curves were constructed for rhTPO from the following cell lines: hTPO ₃₃₂ from CHO (full length from Chinese hamster ovary cells); hTPO _Met
^-1 ₁₅₃ (truncated form derived from E. coli with N-terminal methionine); hTPO ₃₃₂ (full-length TPO from human 293 cells); 155 E-Coli without Met
(Truncation without terminal methionine derived from Escherichia coli [rh]
TPO _155]). In a group of six female C57B6 mice,
RhTPO was injected daily for 7 days, depending on the group. For a complete blood count, 40 μl of blood was collected daily from the orbit. The data shown above are the maximal effects seen for the various treatments, except for (met153E-Coli)
This occurred on day 7 of treatment. The above "met153
In the "E-Coli" group, the maximum effect was seen on day 5.
Data are expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４７】 ＣＨＯ細胞で産生された全長および「切り
取られた」型のｒｈＴＰＯの活性を、大腸菌からの末端
切除型と比較する用量反応曲線を示す図である。６匹の
雌性Ｃ５７Ｂ６マウスの群に、種々の型のｒｈＴＰＯ
０．３μｇを毎日注射した。２−７日目に、完全血球数
測定のため、４０μｌの血液を眼窩より採取した。処置
群は、大腸菌由来のＴＰＯの末端切除型ＴＰＯ₁₅₃；お
よそ８０−９０％の全長および１０−２０％の切り取ら
れた型を含む全長ＴＰＯ、ＴＰＯ₃₃₂（混合画分）：Ｔ
ＰＯ３３２（３０Ｋ画分）＝元の「混合」調製物からの
精製された切り取られた画分；ＴＰＯ３３２（７０Ｋ画
分）＝元の「混合」調製物からの精製全長ＴＰＯ画分。
データを平均値±平均値の標準誤差として表す。FIG. 47 shows a dose response curve comparing the activity of full-length and “truncated” forms of rhTPO produced in CHO cells with a truncated form from E. coli. Groups of six female C57B6 mice were treated with different types of rhTPO.
0.3 μg was injected daily. On days 2-7, 40 μl of blood was collected from the orbit for a complete blood count. The treatment group was truncated TPO ₁₅₃ of E. coli-derived TPO; full-length TPO containing approximately 80-90% full-length and 10-20% truncated, TPO ₃₃₂ (mixed fraction): T
PO332 (30K fraction) = purified excised fraction from the original "mixed"preparation; TPO332 (70K fraction) = purified full-length TPO fraction from the original "mixed" preparation.
Data are expressed as mean ± standard error of the mean.

【図４８】 ＴＰＯを測定するためのＫＩＲＡ ＥＬＩ
ＳＡ検定を示す図である。この図は、ＭＰＬ／Ｒｓｅ.
ｇＤキメラおよび親レセプターの関連部分ならびに最終
組み立て物（図の右部分）、ならびにこの検定の関連工
程を示す流れ図（図の左部分）を示す。FIG. 48: KIRA ELI for measuring TPO
It is a figure which shows SA test. This figure shows MPL / Rse.
Shown are the relevant parts of the gD chimera and parent receptor and the final assembly (right part of the figure), and a flow diagram (left part of the figure) showing the relevant steps of this assay.

【図４９】 ＴＰＯを測定するためのＫＩＲＡ ＥＬＩ
ＳＡ検定を示す図である。この図は、ＭＰＬ／Ｒｓｅ.
ｇＤキメラおよび親レセプターの関連部分ならびに最終
組み立て物（図の右部分）、ならびにこの検定の関連工
程を示す流れ図（図の左部分）を示す。FIG. 49: KIRA ELI for measuring TPO
It is a figure which shows SA test. This figure shows MPL / Rse.
Shown are the relevant parts of the gD chimera and parent receptor and the final assembly (right part of the figure), and a flow diagram (left part of the figure) showing the relevant steps of this assay.

【図５０】 操作の各工程を示すＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡ
検定のためのフローチャートである。FIG. 50: KIRA ELISA showing each step of the operation
It is a flowchart for a test.

【図５１】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 51 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５２】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 52 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５３】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 53 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５４】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 54 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５５】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 55 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５６】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 56 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５７】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 57 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５８】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 58 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図５９】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 59 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６０】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 60 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６１】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 61 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６２】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 62 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６３】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 63 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６４】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 64 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６５】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 65 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６６】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 66 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６７】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 67 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６８】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 68 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図６９】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 69 shows a nucleotide sequence of a pSVI17.ID.LL expression vector (SEQ ID NO: 22) to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７０】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 70 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７１】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 71 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７２】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 72 is a view showing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７３】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 73 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７４】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 74 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７５】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 75 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７６】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 76 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７７】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 77 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７８】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 78 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図７９】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 79 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図８０】 実施例１７のＲｓｅ.ｇＤの発現に使用さ
れるためのｐＳＶＩ１７.ＩＤ.ＬＬ発現ベクターのヌク
レオチド配列（配列番号２２）を示す図である。FIG. 80 shows a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 22) of a pSVI17.ID.LL expression vector to be used for expression of Rse.gD in Example 17.

【図８１】 プラスミドｐＭＰ１の製造の模式的表現で
ある。FIG. 81 is a schematic representation of the production of plasmid pMP1.

【図８２】 プラスミドｐＭＰ１の製造の模式的表現で
ある。FIG. 82 is a schematic representation of the production of plasmid pMP1.

【図８３】 プラスミドｐＭＰ２１の製造の模式的表現
である。FIG. 83 is a schematic representation of the production of plasmid pMP21.

【図８４】 プラスミドｐＭＰ１５１の製造の模式的表
現である。FIG. 84 is a schematic representation of the production of plasmid pMP151.

【図８５】 プラスミドｐＭＰ２０２の製造の模式的表
現である。FIG. 85 is a schematic representation of the production of plasmid pMP202.

【図８６】 プラスミドｐＭＰ１７２の製造の模式的表
現である。FIG. 86 is a schematic representation of the production of plasmid pMP172.

【図８７】 プラスミドｐＭＰ２１０の製造の模式的表
現である。FIG. 87 is a schematic representation of the production of plasmid pMP210.

【図８８】 ｐＭＰ２１０プラスミドバンクからの五つ
の最良のＴＰＯクローンの表である（配列番号２３、２
４、２５、２６、２７および２８）。FIG. 88 is a table of the five best TPO clones from the pMP210 plasmid bank (SEQ ID NO: 23, 2).
4, 25, 26, 27 and 28).

【図８９】 プラスミドｐＭＰ４１の製造の模式的表現
である。FIG. 89 is a schematic representation of the production of plasmid pMP41.

【図９０】 プラスミドｐＭＰ５７の製造の模式的表現
である。FIG. 90 is a schematic representation of the production of plasmid pMP57.

【図９１】 プラスミドｐＭＰ２５１の製造の模式的表
現である。FIG. 91 is a schematic representation of the production of plasmid pMP251.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ Ｃ１２Ｑ 1/68 37/24 ＡＣＢ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ２２３２６３ (32)優先日 1994年４月４日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ２４９３７６ (32)優先日 1994年５月25日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ３４８６５７ (32)優先日 1994年12月２日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ３４８６５８ (32)優先日 1994年12月２日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ）──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C07K 19/00 C12Q 1/68 A C12N 5/10 C12P 21/08 C12P 21/02 A61K 37/02 ABY C12Q 1/68 37 / 24 ACB // C12P 21/08 C12N 5/00 B (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) (31) Priority claim number 223263 (32) Priority date April 1994 4th (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 249376 (32) Priority date May 25, 1994 (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 348657 (32) Priority Date December 2, 1994 (33) Priority Country United States (US) (31) Priority Claim Number 348658 (32) Priority Date December 2, 1994 (33) Priority Country United States (US)

Claims (39)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 分離された実質上均質なｍｐｌリガンド
ポリペプチド。1. An isolated substantially homogeneous mpl ligand polypeptide. 【請求項２】 （ａ）フラグメントポリペプチド； （ｂ）変異体ポリペプチド；および、 （ｃ）キメラポリペプチド、 より成る群から選ばれる、請求項１に記載のｍｐｌリガ
ンドポリペプチド。2. The mpl ligand polypeptide of claim 1, wherein the mpl ligand polypeptide is selected from the group consisting of: (a) a fragment polypeptide; (b) a mutant polypeptide; and (c) a chimeric polypeptide. 【請求項３】 （ａ）哺乳動物から分離された該ポリペ
プチド； （ｂ）組換え手段により作成された該ポリペプチド；お
よび、 （ｃ）合成手段により作成された該ポリペプチド、 より成る群から選ばれる、請求項１に記載のｍｐｌリガ
ンドポリペプチド。3. A polypeptide comprising: (a) the polypeptide isolated from a mammal; (b) the polypeptide produced by recombinant means; and (c) the polypeptide produced by synthetic means. The mpl ligand polypeptide according to claim 1, which is selected from: 【請求項４】 （ａ）人間のポリペプチド；および、 （ｂ）人間において非免疫原性であるポリペプチド、 より成る群から選ばれる、請求項１に記載のｍｐｌリガ
ンドポリペプチド。4. The mpl ligand polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of: (a) a human polypeptide; and (b) a polypeptide that is non-immunogenic in humans. 【請求項５】 （ａ）該アゴニストが、ヒトｍｐｌＰで
トランスフェクトされたＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞
中への標識されたヌクレオチド（³Ｈ−チミジン）の取
り込みを刺激し；または、 （ｂ）該アゴニストが、血小板リバウンド検定において
循環血小板中への³⁵Ｓ取り込みを刺激する、ことを特徴
とする、分離された実質上均質なｍｐｌアゴニスト。(A) the agonist stimulates the uptake of labeled nucleotides ( ³ H-thymidine) into IL-3-dependent Ba / F3 cells transfected with human mplP; b) An isolated substantially homogeneous mpl agonist, characterized in that the agonist stimulates ³⁵ S uptake into circulating platelets in a platelet rebound assay. 【請求項６】 Ｘ−ｈＴＰＯ（７−１５１）−Ｙ ［式中、ｈＴＰＯ（７−１５１）は、Ｃｙｓ⁷からＣｙ
ｓ¹⁵¹まで（両端を含む）のヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）アミ
ノ酸配列を表し；Ｘは、Ｃｙｓ⁷のアミノ基または群： 【化１】 から選ばれるアミノ末端アミノ酸残基を表し、 Ｙは、Ｃｙｓ¹⁵¹のカルボキシ末端基または群： 【化２】 から選ばれるカルボキシ末端アミノ酸残基を表す］で表
される請求項２に記載のフラグメントポリペプチドであ
って、アミノ末端アミノ酸残基の伸長が図１および図２
（配列番号１）に供されるヒトＭＬの残基１７６−３３
２の１またはそれ以上を含むフラグメントポリペプチド
およびそのペギレイティド型。6. X-hTPO (7-151) -Y wherein hTPO (7-151) is Cys ⁷ to Cy
s represents the amino acid sequence of human TPO (hML) up to ¹⁵¹ inclusive; X is the amino group or group of Cys ⁷ : Represents an amino terminal amino acid residue selected from: Y is a carboxy terminal group or group of Cys ¹⁵¹ : And a carboxy terminal amino acid residue selected from the group consisting of:
Residues 176-33 of human ML provided for (SEQ ID NO: 1)
2. A fragment polypeptide comprising one or more of the two and pegylated forms thereof. 【請求項７】 群ＴＰＯ（１−１５３）およびＴＰＯ
（１−２４５）から選ばれる請求項６に記載のフラグメ
ントポリペプチド。7. Groups TPO (1-153) and TPO
The fragment polypeptide according to claim 6, which is selected from (1-245). 【請求項８】 該フラグメントポリペプチドのアミノ酸
配列が、 【化３】 およびその組み合わせからなる、請求項２に記載のフラ
グメントポリペプチド。8. The fragment polypeptide according to claim 1, wherein the amino acid sequence is 3. The fragment polypeptide according to claim 2, consisting of and a combination thereof. 【請求項９】 グリコシル化されていない請求項６に記
載のポリペプチド。9. The polypeptide according to claim 6, which is not glycosylated. 【請求項１０】 図１および図２（配列番号２）に示さ
れる核酸配列を有する核酸分子と中等度の緊縮条件下で
ハイブリダイズする配列を有する核酸によりコードされ
ている、分離されたポリペプチド。10. An isolated polypeptide encoded by a nucleic acid having a sequence that hybridizes under moderate stringency conditions with a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in FIGS. 1 and 2 (SEQ ID NO: 2). . 【請求項１１】 生物活性である請求項１１に記載のポ
リペプチド。11. The polypeptide according to claim 11, which is biologically active. 【請求項１２】 群ｈＭＬ、ｈＭＬ₁₅₃、ｈＭＬ（Ｒ１
５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ
４、ｍＭＬ、ｍＭＬ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬ、およびｐＭ
Ｌ２から選ばれる請求項１に記載のポリペプチド。12. The group hML, hML ₁₅₃ , hML (R1
53A, R154A), hML2, hML3, hML
4, mML, mML2, mML3, pML, and pM
The polypeptide according to claim 1, which is selected from L2. 【請求項１３】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、図１
および図２（配列番号１）のアミノ酸残基１ないしＸ
［ここでＸは、群１５３、１５５、１６４、１７４、１
９１、２０５、２０７、２１７、２２９、２４５および
３３２から選ばれる］を含む、請求項２に記載のポリペ
プチド。13. The amino acid sequence of the polypeptide shown in FIG.
And amino acid residues 1 to X in FIG.
[Where X is the group 153, 155, 164, 174, 1
91, 205, 207, 217, 229, 245 and 332]. 【請求項１４】 請求項１３に記載のポリペプチドと少
なくとも８０％の配列一致を共有する、分離された実質
上均質なｍｐｌリガンドポリペプチド。14. An isolated substantially homogeneous mpl ligand polypeptide sharing at least 80% sequence identity with the polypeptide of claim 13. 【請求項１５】 Ｘが１５３である、請求項１３に記載
のポリペプチド。15. The polypeptide according to claim 13, wherein X is 153. 【請求項１６】 ヘテロローガスなポリペプチドと融合
した請求項１３に記載のｍｐｌリガンドを含むキメラ。16. A chimera comprising the mpl ligand of claim 13 fused to a heterologous polypeptide. 【請求項１７】 ヘテロローガスなポリペプチドが免疫
グロブリンポリペプチドである、請求項１６に記載のポ
リペプチド。17. The polypeptide of claim 16, wherein the heterologous polypeptide is an immunoglobulin polypeptide. 【請求項１８】 ヘテロローガスなポリペプチドがイン
ターロイキンポリペプチドである、請求項１６に記載の
キメラ。18. The chimera according to claim 16, wherein the heterologous polypeptide is an interleukin polypeptide. 【請求項１９】 図１１に示される整列に対応する位置
でｈＭＬのＮ末端残基中に加えられまたはそこに置換さ
れているヒトＥＰＯ残基の１またはそれ以上（但し全て
ではない）により置換されている、ｈＭＬのＮ末端残基
１ないし約１５３ないし１５７を含むキメラ。19. Substitution by one or more (but not all) of the human EPO residues added or substituted in the N-terminal residue of hML at positions corresponding to the alignment shown in FIG. A chimera comprising the N-terminal residues 1 to about 153 to 157 of hML. 【請求項２０】 請求項１３に記載のｍｐｌリガンドポ
リペプチドを結合することのできる抗体。20. An antibody capable of binding the mpl ligand polypeptide according to claim 13. 【請求項２１】 請求項２０に記載の抗体を産生するハ
イブリドーマセルライン。21. A hybridoma cell line that produces the antibody according to claim 20. 【請求項２２】 請求項１に記載のｍｐｌリガンドポリ
ペプチドをコードしている、分離された核酸分子。22. An isolated nucleic acid molecule encoding the mpl ligand polypeptide of claim 1. 【請求項２３】 請求項１３に記載のｍｐｌリガンドポ
リペプチドをコードしている、分離された核酸分子。23. An isolated nucleic acid molecule encoding the mpl ligand polypeptide of claim 13. 【請求項２４】 図１および図２（配列番号２）に示さ
れるオープンリーディングフレーム核酸配列を含む、分
離された核酸分子。24. An isolated nucleic acid molecule comprising the open reading frame nucleic acid sequence shown in FIGS. 1 and 2 (SEQ ID NO: 2). 【請求項２５】 群ｈＭＬ、ｈＭＬ₁₅₃、ｈＭＬ（Ｒ１
５３Ａ、Ｒ１５４Ａ）、ｈＭＬ２、ｈＭＬ３、ｈＭＬ
４、ｍＭＬ、ｍＭＬ２、ｍＭＬ３、ｐＭＬおよびｐＭＬ
２から選ばれるｍｐｌリガンドポリペプチドをコードし
ている、請求項２４に記載の分離された核酸分子。25. The group hML, hML ₁₅₃ , hML (R1
53A, R154A), hML2, hML3, hML
4, mML, mML2, mML3, pML and pML
25. The isolated nucleic acid molecule of claim 24, which encodes an mpl ligand polypeptide selected from 2. 【請求項２６】 （ａ）ｍｐｌリガンド遺伝子のコーデ
ィング領域のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡクロー
ン； （ｂ）緊縮条件下で（ａ）のクローンとハイブリダイズ
することのできるＤＮＡ配列；および、 （ｃ）天然に存在するｍｐｌリガンドポリペプチドの生
物活性を有するポリペプチドをコードしている、（ａ）
および（ｂ）のＤＮＡ配列のいずれかの遺伝的変異体、
より成る群から選ばれる、分離された核酸分子。26. (a) a cDNA clone containing the nucleotide sequence of the coding region of the mpl ligand gene; (b) a DNA sequence capable of hybridizing with the clone of (a) under stringent conditions; Encoding a polypeptide having the biological activity of the mpl ligand polypeptide present in (a)
And any genetic variant of the DNA sequence of (b),
An isolated nucleic acid molecule selected from the group consisting of: 【請求項２７】 中等度の緊縮条件下で図１および図２
（配列番号２）に供されるＤＮＡ配列とハイブリダイズ
することのできる配列を有する、分離されたＤＮＡ分子
であって、生物活性なｍｐｌリガンドポリペプチドをコ
ードしているＤＮＡ分子。27 and FIG. 2 under moderate stringency conditions.
An isolated DNA molecule having a sequence capable of hybridizing with the DNA sequence provided in (SEQ ID NO: 2), which encodes a biologically active mpl ligand polypeptide. 【請求項２８】 当該核酸分子に機能的に結合したプロ
モーターをさらに含む、請求項２５に記載の核酸分子。28. The nucleic acid molecule of claim 25, further comprising a promoter operably linked to said nucleic acid molecule. 【請求項２９】 当該ベクターにより形質転換された宿
主細胞により認識される調節配列と機能的に結合してい
る請求項２５に記載の核酸配列を含む発現ベクター。29. An expression vector comprising the nucleic acid sequence of claim 25 operably linked to a regulatory sequence recognized by a host cell transformed with the vector. 【請求項３０】 請求項２９に記載のベクターにより形
質転換された宿主細胞。30. A host cell transformed by the vector according to claim 29. 【請求項３１】 請求項３０に記載の宿主細胞を培養す
ることを含む、ｍｐｌリガンドポリペプチドの産生をも
たらすための、ｍｐｌリガンドポリペプチドをコードし
ている核酸分子を使用する方法。31. A method of using a nucleic acid molecule encoding an mpl ligand polypeptide to effect production of an mpl ligand polypeptide, comprising culturing the host cell of claim 30. 【請求項３２】 ｍｐｌリガンドポリペプチドが宿主細
胞から回収される、請求項３１に記載の方法。32. The method of claim 31, wherein the mpl ligand polypeptide is recovered from a host cell. 【請求項３３】 ｍｐｌリガンドポリペプチドが宿主細
胞培養基から回収される、請求項３１に記載の方法。33. The method of claim 31, wherein the mpl ligand polypeptide is recovered from the host cell culture. 【請求項３４】 ｍｐｌリガンドポリペプチドをコード
しているＤＮＡを被験試料の核酸とハイブリダイズさ
せ、ｍｐｌリガンドポリペプチドＤＮＡの存在を決定す
ることからなる、ｍｐｌリガンドポリペプチドの存在を
決定する方法。34. A method for determining the presence of an mpl ligand polypeptide, comprising hybridizing DNA encoding the mpl ligand polypeptide with a nucleic acid of a test sample and determining the presence of the mpl ligand polypeptide DNA. 【請求項３５】 核酸ポリメラーゼ反応をｍｐｌリガン
ドポリペプチドをコードしている核酸で開始することを
含む、核酸被験試料を増幅する方法。35. A method for amplifying a nucleic acid test sample, comprising initiating a nucleic acid polymerase reaction with a nucleic acid encoding an mpl ligand polypeptide. 【請求項３６】 請求項１に記載のｍｐｌリガンドポリ
ペプチドおよび薬学上許容し得る担体からなる組成物。36. A composition comprising the mpl ligand polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 【請求項３７】 サイトカイン、コロニー刺激因子、お
よびインターロイキンより成る群から選ばれる物質の治
療的有効量をさらに含む、請求項３６に記載の組成物。37. The composition of claim 36, further comprising a therapeutically effective amount of a substance selected from the group consisting of a cytokine, a colony stimulating factor, and an interleukin. 【請求項３８】 該物質が、ＫＬ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１１から選
ばれる、請求項３７に記載の組成物。38. The substance may be KL, LIF, G-CS.
F, GM-CSF, M-CSF, M-CSF, EPO,
IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6,
38. The composition of claim 37, wherein the composition is selected from IL-7, IL-8, IL-9, and IL-11. 【請求項３９】 （ａ）ヒトｍｐｌリガンドポリペプチ
ドをコードしているＤＮＡ分離物を含む宿主細胞培養を
生育させ、 （ｂ）この培養からヒトｍｐｌリガンドポリペプチドを
回収し、そして、 （ｃ）実質上均質な生物活性ヒトｍｐｌリガンドポリペ
プチドを得るためにこのｍｐｌリガンドポリペプチドを
精製する、ことからなる、一つのヒトｍｐｌリガンドポ
リペプチドのアミノ酸配列、例えば図１および図２（配
列番号１）に開示される配列を特徴とするヒトｍｐｌリ
ガンドポリペプチドの生合成のための方法。39. growing a host cell culture comprising a DNA isolate encoding a human mpl ligand polypeptide; (b) recovering the human mpl ligand polypeptide from the culture; and (c) Purifying the mpl ligand polypeptide to obtain a substantially homogenous, biologically active human mpl ligand polypeptide, comprising the amino acid sequence of one human mpl ligand polypeptide, eg, FIG. 1 and FIG. A method for the biosynthesis of a human mpl ligand polypeptide characterized by the sequences disclosed in