RU2245365C2 - Thrombopoietin - Google Patents

Thrombopoietin Download PDF

Info

Publication number
RU2245365C2
RU2245365C2 RU96115932/13A RU96115932A RU2245365C2 RU 2245365 C2 RU2245365 C2 RU 2245365C2 RU 96115932/13 A RU96115932/13 A RU 96115932/13A RU 96115932 A RU96115932 A RU 96115932A RU 2245365 C2 RU2245365 C2 RU 2245365C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
seq
polypeptide
mpl ligand
mpl
cells
Prior art date
Application number
RU96115932/13A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU96115932A (en
Inventor
Дэн Л. ИТОН (US)
Дэн Л. ИТОН
СОВАЖ Фредерик Ж. ДЕ (BE)
СОВАЖ Фредерик Ж. ДЕ
Original Assignee
Генентек Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/249,376 external-priority patent/US8192955B1/en
Application filed by Генентек Инк. filed Critical Генентек Инк.
Publication of RU96115932A publication Critical patent/RU96115932A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2245365C2 publication Critical patent/RU2245365C2/en

Links

Images

Abstract

FIELD: medicine, molecular biology, polypeptides.
SUBSTANCE: invention describes homogenous polypeptide ligand mpI representing polypeptide fragment of the formula: X-hTPO-Y wherein hTPO has amino acid sequence of human fragments TPO (hML); X means a amino-terminal amino-group or amino acid(s) residue(s); Y means carboxy-terminal carboxy-group or amino acid(s) residue(s), or chimeric polypeptide, or polypeptide fragment comprising N-terminal residues of amino acid sequence hML. Also, invention relates to nucleic acid encoding polypeptide and expressing vector comprising nucleic acid. Invention describes methods for preparing the polypeptide using cell-host transformed with vector, and antibodies raised against to polypeptide. Invention describes methods and agents using active agents of this invention. The polypeptide ligand mpI effects on replication, differentiation or maturation of blood cells being especially on megacaryocytes and progenitor megacaryocyte cells that allows using polypeptides for treatment of thrombocytopenia.
EFFECT: valuable medicinal properties of polypeptide.
21 cl, 92 dwg, 14 tbl, 24 ex

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к выделению, очистке и рекомбинантному или химическому синтезу белков, которые влияют на выживаемость, пролиферацию, дифференцировку или созревание кроветворных клеток, в особенности прогениторных клеток тромбоцитов. Настоящее изобретение, в частности, относится к клонированию и экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих белковые лиганды, способные к связыванию и активации mpl, члена суперсемейства цитокиновых рецепторов. Настоящее изобретение далее относится к использованию этих белков самих по себе или в сочетании с другими цитокинами для лечения заболеваний кроветворения, включая тромбоцитопению.The present invention relates to the isolation, purification and recombinant or chemical synthesis of proteins that affect the survival, proliferation, differentiation or maturation of hematopoietic cells, especially platelet progenitor cells. The present invention, in particular, relates to the cloning and expression of nucleic acids encoding protein ligands capable of binding and activating mpl, a member of the cytokine receptor superfamily. The present invention further relates to the use of these proteins alone or in combination with other cytokines for the treatment of hematopoietic diseases, including thrombocytopenia.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

I. Система кроветворенияI. Hematopoietic system

Кроветворная система производит зрелые высокоспецифичные клетки крови, как известно, необходимые для жизнедеятельности всех млекопитающих. Эти зрелые клетки включают: эритроциты, специализированные для транспорта кислорода и углекислого газа; Т- и В-лимфоциты, ответственные за клеточный и опосредованный антителами иммунные ответы; кровяные пластинки или тромбоциты, специализированные для образования кровяных тромбов; и гранулоциты и макрофаги, специализированные как ловушки или как вспомогательные клетки для борьбы с инфекцией. Гранулоциты далее подразделяются на: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки, специализированные типы клеток, обладающие дискретными функциями. Необходимо отметить, что все эти специализированные клетки происходят из одного общего примитивного типа клеток, обозначаемых как плюрипотентные (или тотипотентные) стволовые клетки, первично обнаруживаемые в костном мозге (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441 [1987]).The hematopoietic system produces mature highly specific blood cells, which are known to be necessary for the life of all mammals. These mature cells include: erythrocytes specialized for oxygen and carbon dioxide transport; T- and B-lymphocytes, responsible for cellular and antibody-mediated immune responses; blood platelets or platelets specialized for the formation of blood clots; and granulocytes and macrophages specialized as traps or as helper cells to fight infection. Granulocytes are further subdivided into: neutrophils, eosinophils, basophils and mast cells, specialized cell types with discrete functions. It should be noted that all these specialized cells originate from one common primitive cell type, designated as pluripotent (or totipotent) stem cells, primarily found in bone marrow (Dexter et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3: 423-441 [1987]).

Зрелые высокоспециализированные клетки крови должны производиться непрерывно в большом количестве в течение всей жизни млекопитающего. Подавляющему большинству этих специализированных клеток предназначено сохраняться функционально активными только в течение от нескольких часов до нескольких недель (Cronkite et al., Blood Cells, 2: 263-284 [1976]). Таким образом, непрерывное обновление зрелых клеток крови, самих примитивных стволовых клеток, так же как и любых промежуточных или предназначенных для дифференцировки прогениторных клеточных линий, лежащих между примитивными и зрелыми клетками, являются необходимыми для поддержания постоянного нормального состояния клеток крови, требующегося млекопитающему.Mature highly specialized blood cells must be produced continuously in large quantities throughout the life of the mammal. The vast majority of these specialized cells are designed to remain functionally active for only a few hours to several weeks (Cronkite et al., Blood Cells, 2: 263-284 [1976]). Thus, the continuous renewal of mature blood cells, the primitive stem cells themselves, as well as any intermediate or intended for differentiation progenitor cell lines lying between primitive and mature cells, are necessary to maintain a constant normal state of the blood cells required by the mammal.

В центре гемапоэтической системы лежит плюрипотентная стволовая клетка(клетки). Этих клеток относительно немного по количеству и они подлежат самообновлению путем пролиферации с получением дочерних стволовых клеток или трансформируются в течение серии этапов дифференцировки в возрастающе зрелые, ограниченно дифференцированные клетки, однозначно образующие высокоспециализированную зрелую клетку(клетки) крови.At the center of the hematopoietic system is a pluripotent stem cell (s). These cells are relatively few in number and they are subject to self-renewal by proliferation to produce daughter stem cells or are transformed during a series of stages of differentiation into increasingly mature, limitedly differentiated cells that uniquely form highly specialized mature blood cell (s).

Например, определенные мультипотентные прогениторные клетки, обозначаемые как CFC-Mix, происходящие от стволовых клеток, подвергаются пролиферации (самообновлению) и развитию с получением колоний, содержащих все различные миелоидные клетки: эритроциты, нейтрофилы, мегакариоциты (предшественники тромбоцитов), макрофаги, базофилы, эозинофилы и тучные клетки. Другие прогениторные клетки лимфоидной линии дифференцировки подвергаются пролиферации и развитию в Т-клетки или В-клетки.For example, certain multipotent progenitor cells, referred to as stem cells derived from CFC-Mix, undergo proliferation (self-renewal) and development to produce colonies containing all the different myeloid cells: red blood cells, neutrophils, megakaryocytes (platelet precursors), macrophages, basophils, eososis and mast cells. Other progenitor cells of the lymphoid line of differentiation undergo proliferation and development into T cells or B cells.

Помимо этого между CFC-Mix прогениторными клетками и миелоидными клетками лежат прогениторные клетки другого уровня, промежуточно комитированные по отношению к своему потомству. Эти ограниченно дифференцированные прогениторные клетки классифицируются на основании своего потомства, которое они производят. То есть известными прямыми предшественниками миелоидных клеток являются: эритроидные колониеобразующие единицы (КОЕ-Э) для эритроцитов, гранулоцит/макрофаг колониеобразующие клетки (ГМ-КОК) для нейтрофилов и макрофагов, мегакариоцит колониеобразующие клетки (Мег-КОК) для мегакариоцитов, эозинофил колоние-образующие клетки (Эоз-КОК) для эозинофилов и базофил колоние-образующие клетки (Баз-КОК) для тучных клеток. Другими клетками предшественниками, промежуточными между плюрипотентными стволовыми клетками и зрелыми клетками крови, являются известные клетки (см. выше), или клетки, которые, вероятно, будут открыты, имеющие различную степень ограниченной дифференцировки и способности к самообновлению.In addition, between CFC-Mix progenitor cells and myeloid cells lie progenitor cells of a different level, intermediate commits with respect to their offspring. These limitedly differentiated progenitor cells are classified based on their offspring, which they produce. That is, the known direct precursors of myeloid cells are: erythroid colony forming units (CFU-E) for red blood cells, granulocyte / macrophage colony forming cells (GM-COC) for neutrophils and macrophages, megakaryocyte colony forming cells (Meg-KOC) for megakaryocytes, colony-eosino cells (Eos-COCs) for eosinophils and basophil colony-forming cells (Baz-COCs) for mast cells. Other precursor cells intermediate between pluripotent stem cells and mature blood cells are known cells (see above), or cells that are likely to be opened, with varying degrees of limited differentiation and self-renewing ability.

Основополагающим принципом нормальной гемапоэтической клеточной системы, по-видимому, является пониженная способность к самообновлению, выражающаяся в виде потери мультипотентности и приобретения ограниченной дифференцировки и созревания. Таким образом, у одного конца спектра гемапоэтической клетки лежит плюрипотентная стволовая клетка, проявляющая способность к самообновлению и дифференцировке во все различные подлежащие специфической дифференцировке прогениторные клетки. Эта способность является основой терапии костно-мозговыми трансплантантами, где примитивные стволовые клетки восстанавливают популяцию полной гемапоэтической системы клеток. С другого конца спектра лежат высокоограниченной дифференцировки прогениторные клетки и их потомства, которые потеряли способность самообновления, но приобрели функциональные способности зрелых клеток.The fundamental principle of a normal hematopoietic cell system, apparently, is a reduced ability to self-renewal, expressed in the form of loss of multipotency and the acquisition of limited differentiation and maturation. Thus, at one end of the spectrum of the hematopoietic cell lies a pluripotent stem cell, exhibiting the ability to self-renew and differentiate into all different progenitor cells subject to specific differentiation. This ability is the basis of bone marrow transplant therapy, where primitive stem cells restore the population of the complete hematopoietic system of cells. At the other end of the spectrum lie highly limited differentiation of progenitor cells and their offspring, which have lost the ability to self-renew, but have acquired the functional abilities of mature cells.

Пролиферация и развитие стволовых клеток и ограниченно-дифференцированных прогениторных клеток находится под тщательным контролем различных гемапоэтических факторов роста или цитокинов. Роль этих факторов in vivo сложна и недостаточно понятна. Некоторые факторы роста, такие как интерлейкин-3 (ИЛ-3), способны стимулировать как мультипотентные стволовые клетки, так и комитированные прогениторные клетки нескольких дифференцирующихся линий, включая, например, мегакариоциты. Первоначально предполагалось, что другие факторы, такие как гранулоцит/макрофаг колоние-стимулирующий фактор (ГМ-КСФ), ограничиваются в своем действии на ГМ-КОК. Однако позднее, было обнаружено, что ГМ-КСФ также влияет на пролиферацию и развитие interalia мегакариоцитов. Таким образом, было обнаружено, что ИЛ-3 и ГМ-КСФ обладают частично перекрывающимися активностями, хотя с различающейся силой действия. Недавно было обнаружено, что интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерлейкин-11, хотя и не обладают заметным влиянием на Мег-колониеобразование сами по себе, действуют синергично вместе с ИЛ-3 на стимуляцию созревания мегакариоцитов (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).The proliferation and development of stem cells and limited-differentiated progenitor cells is closely monitored by various hematopoietic growth factors or cytokines. The role of these factors in vivo is complex and not well understood. Some growth factors, such as interleukin-3 (IL-3), are capable of stimulating both multipotent stem cells and comitated progenitor cells of several differentiating lines, including, for example, megakaryocytes. It was initially assumed that other factors, such as granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), are limited in their effect on GM-COC. However, later, it was found that GM-CSF also affects the proliferation and development of interalia megakaryocytes. Thus, it was found that IL-3 and GM-CSF have partially overlapping activities, although with varying strengths. Recently, it was found that interleukin-6 (IL-6) and interleukin-11, although they do not have a noticeable effect on Meg colony formation per se, act synergistically with IL-3 to stimulate the maturation of megakaryocytes (Yonemura et al., Exp Hematol., 20: 1011-1016 [1992]).

Следовательно, гемапоэтические факторы роста могут влиять на рост и дифференцировку одной или более дифференцирующихся линий, могут перекрываться с другими факторами роста во влиянии на отдельные прогениторные клеточные линии или могут действовать синергично с другими факторами.Therefore, hematopoietic growth factors may affect the growth and differentiation of one or more differentiating lines, may overlap with other growth factors in influencing individual progenitor cell lines, or may act synergistically with other factors.

Также вероятно, что гемапоэтические факторы роста могут проявлять свои эффекты на различных стадиях развития клетки от тотипотентной стволовой клетки, различных комитированных прогениторных клеток с ограниченной дифференцировкой, до зрелых клеток крови. Например, эритропоэтин (эпо), по-видимому, вызывает пролиферацию только зрелых эритроидных прогениторных клеток. ИЛ-3, по-видимому, проявляет свой эффект ранее, влияя на примитивные стволовые клетки и промежуточные ограниченно-дифференцированные прогениторные клетки. Другие факторы роста, такие как фактор стволовых клеток (ФСК), могут влиять на развитие даже более примитивных клеток.It is also likely that hematopoietic growth factors can exert their effects at various stages of cell development, from totipotent stem cells, various comitated progenitor cells with limited differentiation, to mature blood cells. For example, erythropoietin (epo) appears to cause proliferation of only mature erythroid progenitor cells. IL-3, apparently, exerts its effect earlier, affecting primitive stem cells and intermediate limited-differentiated progenitor cells. Other growth factors, such as stem cell factor (CSF), can influence the development of even more primitive cells.

Из последующего будет понятно, что новые гематопоэтические факторы роста, которые влияют на выживание, пролиферацию, дифференцировку или созревание любых клеток крови или их предшественников, были бы полезны, особенно для содействия восстановления ослабленной гематопоэтической системы, что является следствием заболевания или радиационной или химиотерапии.From the following it will be understood that new hematopoietic growth factors that affect the survival, proliferation, differentiation or maturation of any blood cells or their precursors would be useful, especially to help restore a weakened hematopoietic system, which is a consequence of disease or radiation or chemotherapy.

II. Мегакариоцитопоэз - продукция тромбоцитовII. Megakaryocytopoiesis - platelet production

Регуляция мегакариоцитопоэза и продукции тромбоцитов рассмотрены Mazur, Exp. Hematol., 15: 248 [1987] и Hoffman, Blood, 74: 1196-1212 [1989]. Вкратце, плюрипотентные стволовые клетки костного мозга дифференцируются в мегакариоцитарные, эритроцитарные и миелоцитарные клеточные линии. Предполагается, что существует иерархия комитированных мегакариоцитарных прогениторных клеток среди стволовых клеток и мегакариоцитов. Были идентифицированы, по крайней мере три класса мегакариоцитарных прогениторных клеток, а именно: мегакариоциты очаг-формирующей единицы (ОФЕ-МК), мегакариоциты колоние-формирующей единицы (КФЕ-МК) и мегакариоцитарные прогениторные клетки легкой плотности (МК-КФЕ-ЛП). Созревание мегакариоцитов само по себе представляет непрерывность развития, которое было разделено на стадии на основании обычных морфологических критериев. Самыми ранними распознаваемыми членами мегакариоцитарной (МК или Мег) семьи являются мегакариобласты. Эти клетки, первоначально от 20 до 30 мкм в диаметре, обладают базофильной цитоплазмой и слегка неправильным ядром с утраченным, каким-либо образом, ретикулярным хроматином и несколькими нуклеолями. Поздние мегакариоцитобласты могут содержать до 32 ядер (полиплоидия), но цитоплазма остается разреженной и незрелой. Как только наступает созревание, ядро становится более сегментированным и пикнотическим, цитоплазма увеличивается в количестве и становится более ацидофильной и гранулярной. Большинство зрелых клеток этого семейства могут дать появление высбождаемых тромбоцитов на своей периферии. Обычно менее чем 10% мегакариоцитов находятся на стадии бласта и более чем 50% являются зрелыми. По условной морфологической классификации, обычно применяемой для мегакариоцитарной серии, мегакариоцитобласт является самой ранней формой; промегакариоцит или базофильный мегакариоцит является промежуточной формой; и зрелый (ацидофильный, гранулярный или продуцирующий тромбоциты мегакариоцит) является последней формой. Зрелые мегакариоциты распространяют филаменты цитоплазмы в синусоидальное пространство, где они отрываются и фрагментируются на отдельные тромбоциты (Williams et al., Hematology, 1972).Regulation of megakaryocytopoiesis and platelet production reviewed by Mazur, Exp. Hematol., 15: 248 [1987] and Hoffman, Blood, 74: 1196-1212 [1989]. Briefly, bone marrow pluripotent stem cells differentiate into megakaryocytic, erythrocytic, and myelocytic cell lines. It is assumed that there is a hierarchy of committed megakaryocytic progenitor cells among stem cells and megakaryocytes. At least three classes of megakaryocytic progenitor cells were identified, namely: focal-forming unit megakaryocytes (OFE-MK), colony-forming unit megakaryocytes (KFE-MK) and light-density megakaryocytic progenitor cells (MK-KFE-LP). The maturation of megakaryocytes in itself represents a continuity of development that has been divided into stages based on conventional morphological criteria. The earliest recognizable members of the megakaryocytic (MK or Meg) family are megakaryoblasts. These cells, initially from 20 to 30 microns in diameter, possess a basophilic cytoplasm and a slightly irregular nucleus with, in some way, lost reticular chromatin and several nucleoli. Late megakaryocytoblasts can contain up to 32 nuclei (polyploidy), but the cytoplasm remains sparse and immature. As soon as maturation occurs, the nucleus becomes more segmented and pyknotic, the cytoplasm increases in number and becomes more acidophilic and granular. Most mature cells of this family can give rise to excreted platelets at their periphery. Typically, less than 10% of megakaryocytes are at the blast stage and more than 50% are mature. According to the conditional morphological classification usually used for the megakaryocytic series, megakaryocytoblast is the earliest form; promegacaryocyte or basophilic megakaryocyte is an intermediate form; and mature (acidophilic, granular or platelet producing megakaryocyte) is the last form. Mature megakaryocytes spread cytoplasmic filaments into the sinusoidal space, where they break away and fragment into individual platelets (Williams et al., Hematology, 1972).

В мегакариоцитопоэзе, как представляется, участвуют несколько регуляторных факторов (Williams et al., Br. J. Haematol., 52:173 [1982] и Williams et al., J. Cell Phisiol., 110: 101 [1982]). Ранний уровень мегакариоцитопоэза постулирован как митотический, имеющий отношение к пролиферации клетки и инициации колонии из КФЕ-МК, но не к количеству тромбоцитов (Burstein et al., J. Cell Phisiol., 109:333 [1981] и Kimura et al., Exp. Hematol., 13: 1048 [1985]). Поздняя стадия созревания является не митотической, связанной с ядерной полиплоидизацией и цитоплазматическим созреванием и, по-видимому, регулируется по механизму обратной связи, зависящему от количества периферических тромбоцитов (Odell et al.. Blood, 48: 765 [1976] и Ebbe et al., Blood, 32: 787 [1968]).Several regulatory factors appear to be involved in megakaryocytopoiesis (Williams et al., Br. J. Haematol., 52: 173 [1982] and Williams et al., J. Cell Phisiol., 110: 101 [1982]). An early level of megakaryocytopoiesis is postulated as mitotic, related to cell proliferation and colony initiation from KFE-MK, but not to platelet count (Burstein et al., J. Cell Phisiol., 109: 333 [1981] and Kimura et al., Exp Hematol., 13: 1048 [1985]). The late stage of maturation is non-mitotic, associated with nuclear polyploidization and cytoplasmic maturation and, apparently, is regulated by a feedback mechanism depending on the number of peripheral platelets (Odell et al .. Blood, 48: 765 [1976] and Ebbe et al. , Blood, 32: 787 [1968]).

Обсуждалось существование отдельного и специфического колоние-стимулирующего фактора мегакариоцитов (МК-КСФ) (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]). Однако большинство авторов полагают, что процессы, столь жизненно важные для выживания, как продукция тромбоцитов, должны были бы регулироваться цитокином(ами), ответственным исключительно за этот процесс. Гипотеза, что существует мегакариоцит/тромбоцит специфический цитокин(ы), представляла основу для поисков в течение более чем 30 лет, но на настоящий день ни одного цитокина, подобного уникальному МК-КСФ (ТРО), не было очищено, секвенировано и установлено в исследовании.The existence of a separate and specific colony-stimulating factor of megakaryocytes (MK-CSF) was discussed (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]). However, most authors believe that processes as vital for survival as platelet production should be regulated by the cytokine (s), which is solely responsible for this process. The hypothesis that there is a megakaryocyte / platelet-specific cytokine (s) provided the basis for searches for more than 30 years, but to date, not a single cytokine similar to the unique MK-CSF (TPO) has been purified, sequenced and established in the study .

Хотя, было сообщено, что МК-КСФ был частично очищен при экспериментально полученной тромбоцитопении (Hill et al., Exp. Hematol., 14: 752 [1986]), из кондиционированной среды почки эмбриона человека [КС] (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med., 85: 59 [1975]), из экстрактов мочи человека с пластической анемией и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (Kawakita et al., Blood, 6: 556 [1983]) и из плазмы (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75: 1174 [1985]), в большинстве случаев их физиологическая функция до сих пор неизвестна.Although it was reported that MK-CSF was partially purified by experimentally obtained thrombocytopenia (Hill et al., Exp. Hematol., 14: 752 [1986]), from the conditioned medium of the human embryo kidney [COP] (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med. 85: 59 [1975]), from human urine extracts with plastic anemia and idiopathic thrombocytopenic purpura (Kawakita et al., Blood, 6: 556 [1983]) and from plasma (Hoffman et al ., J. Clin. Invest., 75: 1174 [1985]), in most cases their physiological function is still unknown.

В качестве потенциаторов мегакариоцитов была использована кондиционированная среда клеток селезенки, активированных митогеном из фитолакки американской (PWM-SpCM), и клеточной линии миеломоноцитов мыши WEHI-3 (WEHI-3CM). PWM-SpCM содержит факторы, усиливающие рост КФЕ-МК (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65:214 [1985]; Iscove, N.N., Hemapoetic Cell Differentiation, ICN-UCLA Simposia on Molecular and Cell Biology, Vol. 10, Golde et al., eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1978], один из которых является интерлейкином-3 (ИЛ-3), мультидифференцирующим колоние-стимулирующим фактором (мульти-КСФ) (Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]). Другие факторы в этой среде еще не были определены и выделены. WEHI-3 является миеломоноцитарной клеточной линией мыши, секретирующей сравнительно большое количество ИЛ-3 и небольшое количество ГМ-КСФ. Было обнаружено, что ИЛ-3 потенцирует рост широкого круга гемапоэтических клеток (Ihle et al., J. Immunol., 13:282 [1983]). Было также обнаружено, что ИЛ-3 обладает синергизмом со многими известными гематопоэтическими гормонами или факторами роста (Barteliaez et al., J. Cell Physiol., 122:362-369 [1985] и Warren et al., Cell, 46:667-674 [1988]), включая и эритропоэтин (ЭП), и интерлейкин-1 (ИЛ-1), в индукции самых ранних мультипотентных предшественников и в образовании очень больших смешанных гематопоэтических колоний.As potentiators of megakaryocytes, we used the conditioned medium of spleen cells activated by mitogen from American phytolacca (PWM-SpCM), and the mouse myelomonocyte cell line WEHI-3 (WEHI-3CM). PWM-SpCM contains factors enhancing the growth of CFU-MK (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 72: 1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood, 65: 214 [1985] ; Iscove, NN, Hemapoetic Cell Differentiation, ICN-UCLA Simposia on Molecular and Cell Biology, Vol. 10, Golde et al., Eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1978], one of which is interleukin -3 (IL-3), a multi-differentiating colony stimulating factor (multi-CSF) (Burstein, Blood Cells, 11: 469 [1986]). Other factors in this medium have not yet been identified and isolated. WEHI-3 is a myelomonocytic cell a mouse line secreting a relatively large amount of IL-3 and a small amount of GM-CSF. IL-3 has been shown to potentiate the growth of a wide range of hematopoietic cells (Ihle et al., J. Immunol., 13: 282 [1983]). It has also been found that IL-3 has synergies with many known hematopoietic hormones or growth factors ( Barteliaez et al., J. Cell Physiol., 122: 362-369 [1985] and Warren et al., Cell, 46: 667-674 [1988]), including erythropoietin (EP), and interleukin-1 (IL -1), in the induction of the earliest multipotent precursors and in the formation of very large mixed hematopoietic colonies.

В кондиционированной среде легких, кости, клеточных линиях макрофагов, перитонеальных экссудатных клетках мыши и в эмбриональных клетках почки человека были обнаружены другие источники потенциаторов мегакариоцитов. Несмотря на некоторые противоречивые данные (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]), существует доказательство (Geissler et al., Br.J.Haematol., 60: 233-238 [1985]), что скорее активированные Т-лимфоциты, чем моноциты играют усиливающую роль в мегакариоцитопоэзе. Эти данные свидетельствуют о том, что секреты активированных Т-лимфоцитов, такие как интерлейкины, могут быть регуляторными факторами в развитии МК (Geissler et al., Exp. Hematol., 15: 845-853 [1987]). Род исследований мегакариоцитопоэза при использовании очищенного эритропоэтина ЭПО (Vainchenker et al., Blood, 54:940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261: 492-4 [1976]; Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]) указывает, что этот гормон обладает усиливающим действием на образование колонии МК. Это было также показано и на свободной от сыворотки, и на содержащей сыворотку культурах, и в отсутствии вспомогательных клеток (Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]). Было постулировано, что ЭПО участвует в большей степени на одно- или двух клеточной стадии мегакариоцитопоэза в противоположность к действию PWM-SрСМ, который участвует на четырехклеточной стадии развития мегакариоцита. Взаимодействие этих факторов на обеих, ранней и поздней, фазах развития мегакариоцита остается требующим разъяснения.Other sources of megakaryocyte potentiators were found in the conditioned medium of the lungs, bones, macrophage cell lines, mouse peritoneal exudate cells, and human kidney embryonic cells. Despite some conflicting data (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]), there is evidence (Geissler et al., Br.J. Haematol., 60: 233-238 [1985]) that rather activated T-lymphocytes than monocytes play an increasing role in megakaryocytopoiesis. These data suggest that the secrets of activated T-lymphocytes, such as interleukins, may be regulatory factors in the development of MK (Geissler et al., Exp. Hematol., 15: 845-853 [1987]). Gender studies of megakaryocytopoiesis using purified EPO erythropoietin (Vainchenker et al., Blood, 54: 940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261: 492-4 [1976]; Williams et al., Exp. Hematol., 12 : 734 [1984]) indicates that this hormone has an enhancing effect on the formation of MK colony. This has also been shown in serum-free and serum-containing cultures, and in the absence of auxiliary cells (Williams et al., Exp. Hematol., 12: 734 [1984]). It has been postulated that EPO is involved to a greater degree in one or two cell stages of megakaryocytopoiesis, in contrast to the action of PWM-SpCM, which is involved in the four-cell stage of megakaryocyte development. The interaction of these factors in both early and late phases of megakaryocyte development remains to be clarified.

Из данных, полученных в нескольких лабораториях, предполагается, что только мультидифференцирующие факторы, которыми являются ГМ-КСФ и ИЛ-3, и, в меньшей степени, ИЛ-6, стимулирующий фактор В-клеток, обладают индивидуально МК-колоние-стимулирующей активностью, (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Совсем недавно несколько авторов доложили, что ИЛ-11 и фактор ингибирующий лейкемию (ФИЛ) действуют синергично вместе с ИЛ-3 на увеличение размеров мегакариоцитов и плоидию (Yonemura et al., British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et al.. Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al.. Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991]; Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).From the data obtained in several laboratories, it is assumed that only multi-differentiating factors, which are GM-CSF and IL-3, and, to a lesser extent, IL-6, a stimulating factor of B cells, have individually MK-colony stimulating activity, (Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 9035 [1987]). More recently, several authors have reported that IL-11 and leukemia inhibiting factor (PHL) act synergistically with IL-3 to increase megakaryocyte size and ploidy (Yonemura et al., British Journal of Hematology, 84: 16-23 [1993]; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153: 305-312 [1992]; Metcalf et al .. Blood, 76: 50-56 [1990]; Metcalf et al .. Blood, 77: 2150-2153 [ 1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19: 378-381 [1991]; Yonemura et al., Exp. Hematol., 20: 1011-1016 [1992]).

Другие материалы, представляющие интерес, включают: Eppstein et al., US Patent No. 4962091; Chong, US Patent No. 4879111; Fernandes et al., U.S. Patent No. 4604377; Wissler et al., US Patent No. 4512971; Gottlieb, US Patent No. 4468379; Bennet et al., US Patent No. 5215895; Kogan et al., US Patent No. 5250732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20(9): 1927-1931 [1990]; Secor et al., J. of Immunol., 144 (4): 1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140(1): 94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17(11): 1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17(10): 1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17 (8): 883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75 (12): 2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5): 1545-1551 [1989]; Rennik et al., Blood, 73(7): 1828-1835 [1989]; и Clutterbuck et al.. Blood, 73(6): 1504-1512 [1989].Other materials of interest include: Eppstein et al., US Patent No. 4,962,091; Chong, US Patent No. 4,879,111; Fernandes et al., U.S. Patent No. 4,604,377; Wissler et al., US Patent No. 4,512,971; Gottlieb, US Patent No. 4,468,379; Bennet et al., US Patent No. 5,215,895; Kogan et al., US Patent No. 5,250,732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20 (9): 1927-1931 [1990]; Secor et al., J. of Immunol., 144 (4): 1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140 (1): 94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17 (11): 1095-1099 [1989]; Bruno et al., Exp. Hematol., 17 (10): 1038-1043 [1989]; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17 (8): 883-888 [1989]; Koike et al., Blood, 75 (12): 2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75 (5): 1545-1551 [1989]; Rennik et al., Blood, 73 (7): 1828-1835 [1989]; and Clutterbuck et al .. Blood, 73 (6): 1504-1512 [1989].

III. ТромбоцитопенияIII. Thrombocytopenia

Тромбоциты являются ключевым элементом в механизме свертывания крови. Обеднение уровня циркулирующих тромбоцитов, называемое тромбоцитопения, наблюдается при различных клинических состояниях и заболеваниях. Тромбоцитопению обычно определяют, когда содержание тромбоцитов ниже 150×109 на литр. Большинство причин заболевания тромбоцитопенией может быть подразделено на три категории на основании продолжительности жизни тромбоцитов, а именно: (1) нарушенная продукция тромбоцитов костным мозгом, (2) секвестрация тромбоцитов в селезенке (сплиномегалия), или (3) увеличенное разрушение тромбоцитов в периферическом круге кровообращения (т.е. аутоиммунная тромбоцитопения или химио- и радиационная терапия). Кроме того, у пациентов, получающих большие объемы быстро вводимых обедненных тромбоцитами продуктов крови, тромбоцитопения может развиться из-за разведения.Platelets are a key element in the mechanism of blood coagulation. An impoverishment of the level of circulating platelets, called thrombocytopenia, is observed in various clinical conditions and diseases. Thrombocytopenia is usually determined when the platelet count is below 150 × 10 9 per liter. Most causes of thrombocytopenia can be divided into three categories based on platelet life, namely: (1) impaired platelet production by bone marrow, (2) sequestration of platelets in the spleen (splenomegaly), or (3) increased platelet destruction in the peripheral circulation (i.e. autoimmune thrombocytopenia or chemo- and radiation therapy). In addition, in patients receiving large volumes of rapidly administered platelet-poor blood products, thrombocytopenia may develop due to dilution.

Клиническое проявление кровотечения при тромбоцитопении зависит от тяжести тромбоцитопении, ее причины и возможной взаимосвязи с нарушениями свертываемости. В общем, пациенты со счетом тромбоцитов между 20 и 100×109 на литр имеют риск усиленного посттравматического кровотечения, когда этот счет тромбоцитов ниже 20×109 на литр, может быть спонтанное кровотечение. Эти последние пациенты являются кандидатами для трансфузии тромбоцитов, сопровождающуюся иммунным или вирусным риском. Для любых данных степеней тромбоцитопении кровотечение имеет тенденцию быть более тяжелым, когда причиной является пониженная продукция, чем при увеличенном распаде тромбоцитов. В последней ситуации ускоренный оборот тромбоцитов приводит к появлению в круге циркуляции более молодых, больших и гемастатически более эффективных тромбоцитов. Тромбоцитопения может быть следствием различных нарушений, кратко описанных ниже. Более детальное описание может быть найдено у Schafner, A.I., Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Internal Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et al., Eds., Little Brown and Co., Boston/Toronto/London [1990].The clinical manifestation of bleeding with thrombocytopenia depends on the severity of thrombocytopenia, its cause and a possible relationship with coagulation disorders. In general, patients with a platelet count between 20 and 100 × 10 9 per liter have a risk of increased post-traumatic bleeding, when this platelet count is lower than 20 × 10 9 per liter, there may be spontaneous bleeding. These latter patients are candidates for platelet transfusion with an immune or viral risk. For any given degree of thrombocytopenia, bleeding tends to be more severe when the cause is reduced production than with increased platelet breakdown. In the latter situation, accelerated platelet turnover leads to the appearance of younger, larger, and more hematically more effective platelets in the circulation circle. Thrombocytopenia can be the result of various disorders, briefly described below. A more detailed description can be found in Schafner, AI, Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function, Internal Medicine, 3 rd Ed., John J. Hutton et al., Eds., Little Brown and Co., Boston / Toronto / London [ 1990 ].

(а) Тромбоцитопения вследствие пониженной продукции тромбоцитов(a) Thrombocytopenia due to decreased platelet production

Причины врожденной тромбоцитопении включают конституциональную апластическую анемию (синдром Фанкони) и врожденную амегакариоцитарную тромбоцитопению, которая может быть связана с пороком развития скелета. Приобретенные нарушения продукции тромбоцитов являются вызванными или гипоплазией мегакариоцитов, или неэффективным тромбопоэзом. Мегакариоцитарная гипоплазия может быть следствием различных состояний, включая костную аплазию (включая идиопатические формы или миелосупрессию химиотерапевтическими агентами или радиационной терапией), миелофиброз, лейкемия и инвазия в костный мозг опухоли или гранулемы. В некоторых ситуациях токсины, инфекционные агенты или лекарственные препараты могут влиять на тромбоцитопению относительно избирательно; примеры включают перемежающуюся тромбоцитопению, вызванную алкоголем или определенными вирусными инфекциями, и умеренную тромбоцитопению, связанную с введением тиазидовых диуретиков. Наконец, неэффективный тромбоцитопоэз, вторичный по отношению к мегалобластическим процессам (дефицит фолиевой кислоты или B12), может также вызывать тромбоцитопению, обычно сопровождающуюся анемией и лейкопенией.Causes of congenital thrombocytopenia include constitutional aplastic anemia (Fanconi syndrome) and congenital amegakaryocytic thrombocytopenia, which may be associated with skeletal malformations. Acquired platelet production disorders are caused either by megakaryocyte hypoplasia, or by ineffective thrombopoiesis. Megakaryocytic hypoplasia can be the result of various conditions, including bone aplasia (including idiopathic forms or myelosuppression with chemotherapeutic agents or radiation therapy), myelofibrosis, leukemia, and invasion of a tumor or granuloma in the bone marrow. In some situations, toxins, infectious agents, or drugs can affect thrombocytopenia relatively selectively; examples include intermittent thrombocytopenia caused by alcohol or certain viral infections, and mild thrombocytopenia associated with the administration of thiazide diuretics. Finally, ineffective thrombocytopoiesis secondary to megaloblastic processes (folic acid deficiency or B 12 ) can also cause thrombocytopenia, usually accompanied by anemia and leukopenia.

Текущее лечение тромбоцитопениоза, вызванного сниженной продукцией тромбоцитов, зависит от определения и обращения, определяющей причины недостаточности костного мозга. Вливания тромбоцитов обычно резервируются для пациентов с серьезными осложнениями с кровотечениями или для восполнения при хирургических операциях, поскольку изоиммунизация может привести далее к рефрактерности к вливаниям тромбоцитов. Кровотечения слизистой, проявляющиеся при тяжелой тромбоцитопении, могут быть уменьшены путем перорального или внутривенного введения антифибринолитических агентов. Однако тромботические осложнения могут развиваться, если применяются антифибринолитические агенты у пациентов с диссиминированными внутривенными коагуляциями (ДВК).Current treatment for thrombocytopeniosis caused by decreased platelet production depends on the definition and treatment that determines the cause of bone marrow failure. Platelet infusions are usually reserved for patients with serious complications with bleeding or for replenishment during surgical operations, since isoimmunization may further lead to refractivity to platelet infusions. Mucosal bleeding resulting in severe thrombocytopenia can be reduced by oral or intravenous administration of antifibrinolytic agents. However, thrombotic complications can develop if antifibrinolytic agents are used in patients with disseminated intravenous coagulation (DVK).

(b) Тромбоцитопения вследствие захвата в селезенке(b) Thrombocytopenia due to capture in the spleen

Увеличение селезенки, возникшее вследствие любой причины, может сопровождаться мягкой, до умеренной тромбоцитопенией. Это в значительной степени пассивный процесс (гиперспленизм) захвата тромбоцитов, в противоположность активному разрушению тромбоцитов селезенкой в результате иммуноопосредованной тромбоцитопении, обсужденной ниже. Хотя самой распространенной причиной гиперспленизма является застойное увеличение селезенки из-за гипертонии воротной вены, вследствие алкогольного цирроза, другие формы застоя, инфильтрационная или лимфопролиферативная спленомегалия также связаны с тромбоцитопенией. Счет тромбоцитов в результате только гиперспленизма в целом не падает ниже 50×109 на литр.An enlarged spleen arising from any cause may be accompanied by mild to moderate thrombocytopenia. This is a largely passive process (hypersplenism) of platelet uptake, as opposed to the active destruction of platelets by the spleen as a result of immuno-mediated thrombocytopenia, discussed below. Although the most common cause of hypersplenism is congestive enlargement of the spleen due to portal hypertension due to alcoholic cirrhosis, other forms of stagnation, infiltration or lymphoproliferative splenomegaly are also associated with thrombocytopenia. The platelet count as a result of hypersplenism alone does not generally fall below 50 × 10 9 per liter.

(c) Тромбоцитопения вследствие неиммуноопосредованного разрушения тромбоцитов(c) Thrombocytopenia due to non-immune-mediated platelet destruction

Тромбоцитопения может быть следствием ускорения разрушения тромбоцитов при различных неиммунологических процессах. Нарушения этого типа включают диссиминированную внутривенную коагуляцию, внутрисосудистые протезные приспособления, экстракорпоральную циркуляцию крови, тромботические микроангиопатии, такие как тромботическая тромбоцитарная пурпура. Во всех этих ситуациях циркулирующие тромбоциты, которые задерживаются либо на искусственной поверхности, либо на нарушенной интиме сосуда, либо утилизируются на этих участках, либо разрушаются и затем преждевременно очищаются ретикуло-эндотелиальной системой. Заболевание или нарушение, при котором может возникать диссиминированная внутрисосудистая коагуляция (ДВК), изложено в деталях Braunwald et al. (eds), Harrison’s Priciples of Internal Medicine, 11th Ed., p.1478, McGrow Hill [1987]. Внутривенные протезные приспособления, включая сердечные клапаны и внутриаортальные баллоны, могут быть причиной мягкой, до умеренной, деструктивной тромбоцитопении и перемежающейся тромбоцитопении; у пациентов, подлежащих сердечно-легочному шунтированию или гемодиализу, могут быть следствием утилизации или повреждения тромбоцитов при экстракорпоральном кровообращении.Thrombocytopenia may be due to accelerated platelet destruction in various non-immunological processes. Disorders of this type include disseminated intravenous coagulation, intravascular prosthetic devices, extracorporeal blood circulation, thrombotic microangiopathies, such as thrombotic platelet purpura. In all these situations, circulating platelets that are delayed either on the artificial surface or on the disturbed intima of the vessel, are either disposed of in these areas, or are destroyed and then prematurely cleaned by the reticulo-endothelial system. A disease or disorder in which disseminated intravascular coagulation (DVC) may occur is set forth in detail by Braunwald et al. (eds), Harrison's Priciples of Internal Medicine, 11 th Ed., p. 1478, McGrow Hill [1987]. Intravenous prosthetic devices, including heart valves and intra-aortic cylinders, can cause mild, to moderate, destructive thrombocytopenia and intermittent thrombocytopenia; in patients undergoing cardiopulmonary bypass or hemodialysis, they may be due to the disposal or damage of platelets during extracorporeal circulation.

(d) Иммунная тромбоцитопения, индуцированная лекарственными препаратами(d) Drug-induced immune thrombocytopenia

Более чем 100 лекарственных препаратов вовлечены в иммунологически опосредованную тромбоцитопению. Охарактеризованы, однако, только хинидин, хинин, золото, сульфонамиды, цефалотины и гепарин. Вызванная лекарственными препаратами тромбоцитопения часто является очень тяжелой и обычно наблюдается стремительно в течение нескольких дней, пока пациент принимает предрасполагающую медикацию.More than 100 drugs are involved in immunologically mediated thrombocytopenia. However, only quinidine, quinine, gold, sulfonamides, cephalotins and heparin are characterized. Drug-induced thrombocytopenia is often very severe and usually occurs rapidly for several days while the patient is taking a predisposing medication.

(e) Иммунная (аутоиммунная) тромбоцитопеническая пурпура (ИТП)(e) Immune (autoimmune) thrombocytopenic purpura (ITP)

ИТП у взрослых является хроническим заболеванием, характеризующимся аутоиммунным разрушением тромбоцитов. Аутоантитела являются обычно IgG, хотя было доложено и о других иммуноглобулинах. Несмотря на то, что обнаруженные при ИТП аутоантитела связаны на мембране тромбоцитов с GPIIbIIIa, в большинстве случаев специфичность антигена тромбоцитов не идентифицирована. В ретикулоэндотелиальной системе селезенки и печени наблюдается внесосудистая деструкция сенсибилизированных тромбоцитов. Хотя более чем половина всех случаев ИТП является идиопатической, многие пациенты заболевают ревматическим или аутоиммунным заболеваниями (например, эритроматозной системной волчанкой), или лимфопролиферативными заболеваниями (например, хронической лимфоцитарной лейкемией).ITP in adults is a chronic disease characterized by autoimmune platelet destruction. Autoantibodies are usually IgG, although other immunoglobulins have been reported. Despite the fact that autoantibodies detected during ITP are associated on the platelet membrane with GPII b III a , in most cases the specificity of platelet antigen has not been identified. In the reticuloendothelial system of the spleen and liver, extravascular destruction of sensitized platelets is observed. Although more than half of all cases of ITP are idiopathic, many patients develop rheumatic or autoimmune diseases (e.g., erythromatous systemic lupus erythematosus), or lymphoproliferative diseases (e.g., chronic lymphocytic leukemia).

(f) ВИЧ-индуцированная ИТП(f) HIV-induced ITP

ИТП является всевозрастающим обычным осложнением при инфекции ВИЧ (Morris et al., Ann. Intern. Med., 96: 714-717 [1982]) и может наблюдаться на различных стадиях развития заболевания и у пациентов с диагносцированным синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), у которых имеется СПИД-зависимый комплекс, и у инфицированных ВИЧ, но без синдрома СПИД. ВИЧ инфекция является передаваемым заболеванием, однозначно характеризующимся выраженным дефицитом клеточной иммунной функции, так же как и сопровождающимися сопутствующими инфекциями и злокачественными новообразованиями. Первичные иммунологические нарушения, являющиеся следствием ВИЧ инфекции, - это прогрессирующее уменьшение и функциональная ослабленность Т-лимфоцитов, экспрессирующих клеточный поверхностный гликопротеин CD4 (Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3: 477 [1985]). Потеря CD4 хелперной/индукторной Т-клеточной функции, очевидно, подчеркивает глубокий дефект в клеточном и гуморальном иммунитете, приводящий к сопутствующим инфекциям и злокачественности, характеризующей СПИД (Н. Lane, выше). Хотя механизм ИТП, связанной со СПИДом, неизвестен, представляется, что он отличен от механизма ИТП, не ассоциированной с ВИЧ инфекцией. (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311: 635-639 [1984]; и Ratner, Am. J. Med., 86: 194-198 [1989]).ITP is an ever-increasing common complication of HIV infection (Morris et al., Ann. Intern. Med. 96: 714-717 [1982]) and can be observed at various stages of the disease and in patients diagnosed with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), who have an AIDS-dependent complex, and those infected with HIV, but without AIDS syndrome. HIV infection is a transmitted disease that is uniquely characterized by a pronounced deficiency of cellular immune function, as well as accompanying infections and malignant neoplasms. Primary immunological disorders resulting from HIV infection are a progressive decrease and functional weakening of T-lymphocytes expressing CD4 cell surface glycoprotein (Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3: 477 [1985]). Loss of CD4 helper / induction T-cell function, obviously, emphasizes a deep defect in cellular and humoral immunity, leading to concomitant infections and the malignancy that characterizes AIDS (N. Lane, above). Although the mechanism of ITP related to AIDS is unknown, it appears to be different from the mechanism of ITP not associated with HIV infection. (Walsh et al., N. Eng. J. Med., 311: 635-639 [1984]; and Ratner, Am. J. Med. 86: 194-198 [1989]).

IV. Современная терапия тромбоцитопенииIV. Modern therapy for thrombocytopenia

Терапевтические подходы к лечению пациентов с тромбоцитопенией определяются тяжестью и быстротой клинической ситуации. Лечение одинаково для ВИЧ-зависимой и не зависисмой от ВИЧ тромбоцитопении, и хотя применяется множество терапевтических подходов, терапия остается противоречивой.The therapeutic approaches to treating patients with thrombocytopenia are determined by the severity and speed of the clinical situation. The treatment is the same for HIV-dependent and HIV-independent thrombocytopenia, and although many therapeutic approaches are used, the therapy remains controversial.

Счет тромбоцитоов у пациентов с диагносцированной тромбоцитопенией успешно увеличивается под воздействием глюкокортикоидной (например, преднизолона) терапии, однако у большинства пациентов вылечивание неполное или наблюдаются рецидивы, когда дозировка глюкокортикоида снижается или лечение прерывается. Опираясь на пациентов, имеющих ВИЧ-связанную ИТП, некоторые исследователи предположили, что терапия глюкокортикоидами может привести к предрасположенности к СПИДу. Глюкокортикоиды обычно используются, если счет тромбоцитов падает ниже 20×109/литр или когда наблюдаются спонтанные кровотечения.The platelet count in patients diagnosed with thrombocytopenia is successfully increased by glucocorticoid (e.g., prednisolone) therapy, however, in most patients, cure is incomplete or relapse occurs when glucocorticoid dosage is reduced or treatment is interrupted. Based on patients with HIV-related ITP, some researchers have suggested that glucocorticoid therapy may lead to a predisposition to AIDS. Glucocorticoids are commonly used if the platelet count falls below 20 × 10 9 / liter or when spontaneous bleeding is observed.

Для пациентов с рефрактерностью к глюкокортикоидам успешно применяли соединение 4-(2-хлорфенил)-9-метил-2-[3-(морфолинил)-3-пропанон-1-ил]6Н-тиено[3,2,f][1,2,4]триазоло-[4,3,а][1,4]диазепин (WEB 2086) для лечения тяжелых случаев ИТП, не связанной с ВИЧ. Пациентов, имеющих счет тромбоцитов 37000 - 58000/ мкл, лечили WEB 2086 и через две недели лечения счет тромбоцитов увеличился до 14000-190000/ мкл. (ЕР 361077 и Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).For patients with glucocorticoid refractoriness, the compound 4- (2-chlorophenyl) -9-methyl-2- [3- (morpholinyl) -3-propanon-1-yl] 6H-thieno [3,2, f] [1 , 2,4] triazolo- [4,3, a] [1,4] diazepine (WEB 2086) for the treatment of severe cases of ITP not associated with HIV. Patients with a platelet count of 37,000 to 58,000 / μl were treated with WEB 2086 and after two weeks of treatment, the platelet count increased to 14000-190000 / μl. (EP 361077 and Lohman et al., Lancet, 1147 [1988]).

Хотя оптимальное лечение приобретенной амегакариоцитарной тромбоцитопенической пурпуры (ПАТП) не определено, было показано, что антитимоцитарный глобулин (АТГ) лошадиной антисыворотки к ткани тимуса человека дает продолжительную полную ремиссию (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37: 126-127 [1991]). Однако в недавней публикации отмечают, что гематопоэтические эффекты АТГ могут быть отнесены к тимеросалу, который действует преимущественно на белки как несущий ртуть (Panella et al., Cancer Research, 50: 4429-4435 [1990]).Although the optimal treatment for acquired amoegakaryocytic thrombocytopenic purpura (PATP) has not been determined, it has been shown that antithymocytic globulin (ATG) of horse antisera to human thymus tissue provides long-term complete remission (Trimble et al., Am. J. Hematol., 37: 126-127 [1991]). However, a recent publication notes that the hematopoietic effects of ATG can be attributed to thimerosal, which acts primarily on proteins as carrying mercury (Panella et al., Cancer Research, 50: 4429-4435 [1990]).

Было сообщено о хороших результатах по спенэктомии. При спенэктомиии удаляется основной участок разрушения тромбоцитов и основной источник продукции аутоантител у многих пациентов. Эта операция приводит к длительной, не требующей лечения ремисси у большого количества пациентов. Однако поскольку хирургическое вмешательство, в общем, у иммунокомпромисных пациентов избегается, спленэктомия рекомендуется только в тяжелых случаях тромбоцитопении (например, при тяжелой ВИЧ-зависимой ИТП), у пациентов, которые не способны отвечать в течение 2-3 недель на лечение глюкокортикоидами, или при не достижении длительного ответа, после прерывания лечения глюкокортикоидами. Основываясь на современных научных данных, не ясно, предрасполагает ли спленэктомия пациентов к СПИДу.Good results on spenectomy have been reported. Spenectomy removes the main platelet destruction site and the main source of autoantibody production in many patients. This operation leads to prolonged, treatment-free remission in a large number of patients. However, since surgery is generally avoided in immunocompromised patients, splenectomy is recommended only in severe cases of thrombocytopenia (for example, with severe HIV-dependent ITP), in patients who are not able to respond to glucocorticoid treatment for 2–3 weeks, or not achieving a long-term response after interruption of glucocorticoid treatment. Based on current scientific evidence, it is not clear whether splenectomy predisposes patients to AIDS.

Помимо преднизолоновой терапии и спленэктомиии определенные цитотоксические агенты, а именно винкристин и азидотимидин (AST, zid.ovud.ine), также проявляют обещания при лечении ИТП, индуцированной ВИЧ; однако эти результаты являются предварительными.In addition to prednisone therapy and splenectomy, certain cytotoxic agents, namely vincristine and azidothymidine (AST, zid.ovud.ine), also show promise in the treatment of HIV-induced ITP; however, these results are preliminary.

Из последующего будет понятно, что одним из путей лечения тромбоцитопении могло бы быть получение агента, способного ускорять дифференциацию и созревание мегакариоцитов или их предшественников в формах, продуцирующих тромбоциты. Были потрачены значительные усилия по поиску такого агента, называемого обычно как "тромбопоэтин" (ТП). Другие названия ТП, обычно встречаемые в литературе, включают: фактор, стимулирующий тромбоцитопоэз (ФСТ); колоние-стимулирующий фактор мегакариоцитов (МК-КСФ); мегакариоцит-стимулирующий фактор и потенциатор мегакариоцитов. Активность ТП обнаружили достаточно рано, уже в 1959 г. (Rak et al., Med. Exp., 1: 125), но и по настоящее время продолжаются попытки охарактеризовать и очистить этот агент. Несмотря на существующие данные по частичной очистке ТП-активного полипептида (см., например, Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262: 3262 [1987] и Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75: 1174 [1985]), некоторые авторы постулировали, что ТП по своей сути не является отдельно существующей реальностью, но скорее это просто полифункциональное проявление известных гормонов (ИЛ-3, Sparrow et al.. Prog. Clin. Biol. Res., 215: 123 [1986]). Независимо от ее формы или природы молекула, проявляющая тромбопоэтическую активность, представляла бы значительную терапевтическую ценность. Хотя ни один белок не был однозначно идентифицирован как ТП, значительным интересом окружено недавнее открытие того, что mpl, естественный рецептор цитокинов, может опосредовать тромбопоэтический сигнал.From the following it will be clear that one of the ways to treat thrombocytopenia could be to obtain an agent capable of accelerating the differentiation and maturation of megakaryocytes or their precursors in platelet-producing forms. Considerable effort has been expended in finding such an agent, commonly referred to as “thrombopoietin” (TP). Other TP names commonly found in the literature include: thrombocytopoiesis stimulating factor (FST); colony stimulating factor megakaryocytes (MK-CSF); megakaryocyte-stimulating factor and potentiator of megakaryocytes. TP activity was discovered early enough, already in 1959 (Rak et al., Med. Exp., 1: 125), but attempts to characterize and purify this agent continue to date. Despite existing data on partial purification of TP-active polypeptide (see, for example, Tayrien et al., J. Biol. Chem., 262: 3262 [1987] and Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75: 1174 [1985]), some authors postulated that TP is not inherently a separately existing reality, but rather it is simply a multifunctional manifestation of known hormones (IL-3, Sparrow et al .. Prog. Clin. Biol. Res., 215: 123 [1986]). Regardless of its form or nature, a molecule exhibiting thrombopoietic activity would be of significant therapeutic value. Although no protein has been unambiguously identified as TP, considerable interest has been raised in the recent discovery that mpl, a natural cytokine receptor, can mediate a thrombopoietic signal.

V. Mpl является мегакариоцитопоэтическим рецептром цитокиновV. Mpl is a megakaryocytopoietic cytokine receptor

Предполагается, что пролиферация и созревание гематопоэтических клеток тесно регулируются факторами, которые положительно или отрицательно модулируют пролиферацию и дифференцировку полидифференцирующихся плюрипотентных стволовых клеток. Эти эффекты опосредуются путем высокоаффинного связывания внеклеточного белкового фактора со специфическими поверхностными клеточными рецепторами. Эти поверхностные рецепторы проявляют определенную гомологию и обычно классифицируются как члены суперсемейства цитокиновых рецепторов. Члены этого семейства включают рецепторы для: ИЛ-2 (β и γ-цепи) (Hatakeayma et al., Science, 244: 551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257: 379-382 [1991]), ИЛ-3 (Itoh et al.. Science, 247: 324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Accad. Sci. USA, 87: 5459-5463 [1990]; Kitamura et al., Cell, 66: 1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5082-5086 [1991b]), ИЛ-4 (Mosley et al., Cell, 59: 335-348 [1989]), ИЛ-5 (Takaki et al., EMBO J., 9: 4367-4374 [1990]; Tavernier et al.. Cell, 66: 1175-1184 [1991]), ИЛ-6 (Yamasaki et al., Science, 241: 825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63:1149-1157 [1990]), ИЛ-7 (Goodwin et al., Cell, 60: 941-951 [1990]), ИЛ-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5690-5694 [1992]), гранулоцит-макрофаг колоние-стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (Gearing et al., EMBO J., 8: 3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 244: 9655-9659 [1990]), гранулоцит колоние-стимулирующий фактор (Г-КСФ) (Fukunaga et al., Cell, 61: 341-350 [1990а]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172: 1559-1570 [1990]), ЭП (D’Andrea et al.. Cell, 57: 277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 76: 31-35 [1990]), фактор ингибирования лейкемии (ФИЛ) (Gearing et al., EMBO J., 10: 2839-2848 [1991]), онкостатин М (ОСМ) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8641-8645 [1991]) и также рецепторы пролактина (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2112-2116 [1989]), гормона роста (ГР) (Leung et al.. Nature, 330: 537-543 [1987]) и цилиарный нейротропный фактор (ЦНТФ) (Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991]).It is assumed that the proliferation and maturation of hematopoietic cells is closely regulated by factors that positively or negatively modulate the proliferation and differentiation of polydifferentiated pluripotent stem cells. These effects are mediated by high affinity binding of extracellular protein factor to specific surface cell receptors. These surface receptors exhibit a certain homology and are usually classified as members of the cytokine receptor superfamily. Members of this family include receptors for: IL-2 (β and γ chains) (Hatakeayma et al., Science, 244: 551-556 [1989]; Takeshita et al., Science, 257: 379-382 [1991]) , IL-3 (Itoh et al .. Science, 247: 324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Accad. Sci. USA, 87: 5459-5463 [1990]; Kitamura et al., Cell, 66: 1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al., Cell, 59: 335 -348 [1989]), IL-5 (Takaki et al., EMBO J., 9: 4367-4374 [1990]; Tavernier et al .. Cell, 66: 1175-1184 [1991]), IL-6 ( Yamasaki et al., Science, 241: 825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63: 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60: 941-951 [ 1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5690-5694 [1992]), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (Gearing et al. , EMBO J., 8: 3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA, 244: 9655-9659 [1990]), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61: 341-350 [1990a]; Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8702-8706 [1990b]; Larsen et al., J. Exp. Med., 172: 1559-1570 [1990]), EP (D'Andrea et al .. Cell, 57: 277-285 [1989]; Jones et al., Blood, 76: 31-35 [1990]), leukemia inhibition factor (PHL) (Gearing et al., EMBO J., 10: 2839-2848 [1991]), Oncostatin M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8641 8645 [1991]) and also prolactin receptors (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2112-2116 [1989]), growth hormone (GH) (Leung et al .. Nature, 330: 537-543 [1987]) and ciliary neurotropic factor (CNTF) (Davis et al., Science, 253: 59 -63 [1991]).

Члены суперсемейства цитокиновых рецепторов могут быть сгруппированы в три функциональные категории (для обзора см. Nicola et al., Cell, 67:1-4 [1991]). Первый класс включает рецепторы с одной цепью, такие как рецептор эритропоэтина (ЭП-Р) или рецептор колоние-стимулирующего фактора гранулоцитов (Г-КСФ-Р), которые связывают лиганд с высоким сродством благодаря внеклеточному домену, а также генерируют внутриклеточный сигнал. Второй класс рецепторов, так называемых α-субъединичных, включает рецептор интерлейкина-6 (ИЛ-6-Р), рецептор гранулоцит-макрофаг колоние-стимулирующего фактора (ГМ-КСФ-Р), рецептор интерлейкина-3 (ИЛ-3-Рα) и других членов суперсемейства цитокиновых рецепторов. Эти α-субъединицы связывают лиганды с низким сродством, но не способны передавать внутриклеточный сигнал. Высокоаффинные рецепторы способны к передаче сигнала, генерированного гетеродимером, между α-субъединицей и членом третьего класса цитокиновых рецепторов, обозначенного β-субъединицей, а именно βс, общей β-субъединицей для трех α-субъединиц ИЛ-3-Рα и ГМ-КСФ-Р.Members of the cytokine receptor superfamily can be grouped into three functional categories (for a review, see Nicola et al., Cell, 67: 1-4 [1991]). The first class includes single-chain receptors, such as the erythropoietin receptor (EP-R) or the colony stimulating factor granulocyte receptor (G-CSF-R), which bind the ligand with high affinity due to the extracellular domain, and also generate an intracellular signal. The second class of receptors, the so-called α-subunit receptors, includes the interleukin-6 receptor (IL-6-P), the granulocyte macrophage receptor colony stimulating factor (GM-KSF-R), the interleukin-3 receptor (IL-3-Pα) and other members of the cytokine receptor superfamily. These α-subunits bind ligands with low affinity, but are not able to transmit an intracellular signal. High affinity receptors are capable of transmitting a signal generated by a heterodimer between an α-subunit and a member of the third class of cytokine receptors, designated a β-subunit, namely β c , a common β-subunit for the three α-subunits of IL-3-Pα and GM-CSF- R.

Доказательство того, что mpl является членом суперсемейства цитокиновых рецепторов вытекает из гомологии последовательности (Gearing, EMBO J., 8: 3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6834-6938 [1990]; Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991] и Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5640-5644 [1992]) и его способности передавать пролиферативные сигналы.Evidence that mpl is a member of the cytokine receptor superfamily stems from sequence homology (Gearing, EMBO J., 8: 3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6834-6938 [1990] ; Davis et al., Science, 253: 59-63 [1991] and Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5640-5644 [1992]) and its ability to transmit proliferative signals.

Выведенная последовательность белка при молекулярном клонировании c-mpl мыши обнаруживает, что этот белок является гомологичным к другим цитокиновым рецепторам. Внутриклеточный домен содержит 465 аминокислотных остатков и составляет два субдомена, каждый с четырьмя высококонсервативными цистеинами, и конкретную структуру в N-терминальном субдомене и в С-терминальном субдомене. Лиганд-связывающий внеклеточный субдомен предположительно должен иметь складчатую структурную геометрию, подобную двойной β-бочонкообразной. Этот дублированный внеклеточный домен является высокогомологичным сигнальной передающей цепи, общей для ИЛ-3, ИЛ-5 и ГМ-КСФ рецепторов, так же как и низкоаффинному связывающему домену ФИЛ (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Таким образом, mpl может принадлежать к низкоаффинному лиганд-связывющему классу цитокиновых рецепторов.The derived protein sequence upon molecular cloning of mouse c-mpl reveals that this protein is homologous to other cytokine receptors. The intracellular domain contains 465 amino acid residues and comprises two subdomains, each with four highly conserved cysteines, and a specific structure in the N-terminal subdomain and in the C-terminal subdomain. The ligand-binding extracellular subdomain is expected to have a folded structural geometry similar to a double β-barrel-shaped. This duplicated extracellular domain is highly homologous to the signal transmission chain common to IL-3, IL-5 and GM-CSF receptors, as well as to the low affinity binding domain of PHIL (Vigon et al., Oncogene, 8: 2607-2615 [1993]) . Thus, mpl may belong to the low affinity ligand-binding class of cytokine receptors.

Сравнение mpl мыши и зрелого mpl P человека обнаружило, что эти два белка проявляют 81% идентичности в последовательности. Более специфические N-концевой и С-концевой внеклеточные субдомены проявляют 75 и 80% идентичности в последовательности соответственно. Наиболее консервативным регионом является цитоплазматический домен, проявляющий 91% идентичности аминокислот, с последовательностью из 37 аминокислот, полностью идентичных в области около трансмембранного домена у обоих видов. Таким образом, сообщается, что mpl является одним из наиболее консервативных членов суперсемейства цитокиновых рецепторов (Vigon, там же).Comparison of mouse mpl and mature human mpl P found that these two proteins show 81% sequence identity. The more specific N-terminal and C-terminal extracellular subdomains exhibit 75 and 80% sequence identity, respectively. The most conservative region is the cytoplasmic domain, exhibiting 91% amino acid identity, with a sequence of 37 amino acids that are completely identical in the region near the transmembrane domain in both species. Thus, mpl is reported to be one of the most conservative members of the cytokine receptor superfamily (Vigon, ibid.).

Доказательство того, что mpl является функциональным рецептором, способным к передаче пролиферативного сигнала, вытекает из конструкции химерного рецептора, содержащего внеклеточный домен из цитокинового рецептора, имеющего высокое сродство к известным цитокинам, вместе с цитоплазматическим доменом mpl. Поскольку не доложено ни об одном известном лиганде к mpl, было необходимым сконструировать химерный высокоаффинный лиганд-связывающий внеклеточный домен из класса цитокиновых рецепторов, таких как ИЛ-4-Р или Г-КСФ-Р. Vigon et al., там же, соединил внеклеточный домен Г-КСФ-Р с обоими трансмембранным и цитоплазматическим доменами c-mpl. ИЛ-3 зависимая клеточная линия BAF/B03 (Ba/F3), была трансфецирована химерой Г-КСФ-P/mpl вместе с контролем Г-КСФ-Р полной длины. Клетки, трансфецированные химерой, росли одинаково хорошо в присутствии цитокина ИЛ-3 или Г-КСФ. Подобным образом клетки, трансфецированные Г-КСФ-Р также хорошо росли и в присутствии ИЛ-3, и Г-КСФ. Все клетки гибли в отсутствии факторов роста. Подобные эксперименты были проведены Skoda et al., EMBO J., 12(7): 2645-2653 [1993], в которых оба, внеклеточный и трансмембранный домены рецептора ИЛ-4 человека (РЧ-ИЛ-4), были слиты в цитоплазматический домен mpl мыши, и трансфецированы в ИЛ-3-зависимую Ba/F3 клеточную линию мыши. Клетки Ba/F3, трансфецированные диким типом РЧ-ИЛ-4, нормально делились в присутствии видоспецифического либо ИЛ-4, либо ИЛ-3. Ba/F3 клетки, трансфецированные РЧ-ИЛ-4/mpl, нормально делились в присутствии РЧ-ИЛ-4 (в присутствии или отсутствии ИЛ-3), показывая, что у Ba/F3 клеток mpl цитоплазматический домен содержит все элементы, необходимые для передачи пролиферативного сигнала.The evidence that mpl is a functional receptor capable of transmitting a proliferative signal stems from the design of a chimeric receptor containing an extracellular domain from a cytokine receptor having a high affinity for known cytokines, together with the cytoplasmic domain of mpl. Since no known ligand was reported to mpl, it was necessary to construct a chimeric high affinity ligand-binding extracellular domain from a class of cytokine receptors such as IL-4-R or G-CSF-R. Vigon et al., Ibid., Linked the extracellular domain of G-CSF-R with both transmembrane and cytoplasmic domains of c-mpl. IL-3 dependent cell line BAF / B03 (Ba / F3) was transfected with the G-CSF-P / mpl chimera along with the full-length G-CSF-R control. Cells transfected with the chimera grew equally well in the presence of the cytokine IL-3 or G-CSF. Similarly, cells transfected with G-CSF-R also grew well in the presence of IL-3 and G-CSF. All cells died in the absence of growth factors. Similar experiments were carried out by Skoda et al., EMBO J., 12 (7): 2645-2653 [1993], in which both the extracellular and transmembrane domains of the human IL-4 receptor (RF-IL-4) were fused to the cytoplasmic mouse mpl domain, and transfected into the IL-3-dependent Ba / F3 mouse cell line. Ba / F3 cells transfected with wild type RF-IL-4 were normally divided in the presence of species-specific either IL-4 or IL-3. The Ba / F3 cells transfected with RF-IL-4 / mpl were normally divided in the presence of RF-IL-4 (in the presence or absence of IL-3), showing that in Ba / F3 cells the mpl cytoplasmic domain contains all the elements necessary for transmit proliferative signal.

Эти эксперименты с химерами показывают способность к проведению пролиферативного сигнала у цитоплазматического домена mpl, но молчащего, не обращающего внимания, может ли связать лиганд внеклеточный домен mpl. Эти данные включают, по крайней мере, две возможности, а именно, mpl представляет рецептор с одной цепью (первый класс), подобный ЭП-Р или Г-КСФ-Р, или представляет сигнал-передающую β-субъединицу (третий класс), требующую α-субъединицу, подобно ИЛ-3 Skoda et al., там же).These experiments with chimeras show the ability to conduct a proliferative signal in the cytoplasmic domain of mpl, but silent, not paying attention to whether the ligand can bind the extracellular domain of mpl. These data include at least two possibilities, namely, mpl represents a single-chain receptor (first class), similar to EP-R or G-CSF-R, or represents a signal-transmitting β-subunit (third class) requiring α-subunit, like IL-3 by Skoda et al., ibid.).

VI. Лиганд mpl является тромбопоэтином (ТП)VI. Ligand mpl is thrombopoietin (TP)

Как описано выше, было предположено, что сыворотка содержит уникальный фактор, называемый иногда как тромбопоэтин (ТП), который действует синергично с различными другими цитокинами по стимуляции роста и созревания мегакариоцитов. Несмотря на значительные усилия, приложенные многочисленными группами, никакого подобного природного фактора не было выделено из сыворотки или любого другого источника. Несмотря на то, что неизвестно, способен ли mpl непосредственно связывать мегакариоцит-стимулирующий фактор, недавние эксперименты показывают, что mpl участвует в передаче пролиферативного сигнала фактора или факторов в сыворотке пациентов с апластическим костным мозгом (Mathia et al., Blood, 82(5):1395-1401 [1993]).As described above, it has been suggested that serum contains a unique factor, sometimes called thrombopoietin (TP), which acts synergistically with various other cytokines to stimulate the growth and maturation of megakaryocytes. Despite the considerable efforts made by numerous groups, no similar natural factor was isolated from serum or any other source. Although it is not known whether mpl is able to directly bind a megakaryocyte-stimulating factor, recent experiments show that mpl is involved in the transmission of the proliferative signal of a factor or factors in the serum of patients with aplastic bone marrow (Mathia et al., Blood, 82 (5) : 1395-1401 [1993]).

Доказательство того, что уникальный колониеобразующий фактор, отличный от ИЛ-1α, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-11, СКФ, ЭП, Г-КСФ и ГМ-КСФ, передает пролиферативный сигнал через mpl, вытекает из исследования распределения экспресии с-mpl у примитивных и комитированных гематопоэтических клеточных линий, и из антисенсорных (с использованием нуклеотидов с обратной последовательностью) исследований на одной из этих клеточных линий.The proof that a unique colony forming factor other than IL-1α, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, GFR, EP, G-CSF and GM-CSF transmits a proliferative signal via mpl follows from studies of the distribution of c-mpl expression in primitive and committed hematopoietic cell lines, and from antisensory (using reverse sequence nucleotides) studies on one of these cell lines.

Используя обратную транскриптазу (RT)-PCR в иммуноочищенных гематопоэтических клетках человека, Mathia et al., там же, показал, что сильный сигнал мРНК mpl был обнаружен только в CD34+ очищенных клетках, мегакариоцитах и тромбоцитах.Using reverse transcriptase (RT) -PCR in human immunopurified hematopoietic cells, Mathia et al., Ibid., Showed that a strong mpl mRNA signal was found only in CD34 + purified cells, megakaryocytes and platelets.

CD34+, очищенные от костного мозга (КМ) клетки, представляют около 1% всех клеток КМ и обогащены примитивными и комитированными прогениторными клетками всех дифференцирующихся линий (а именно, эритроидными, грануломакрофагами и мегакариоцитами).CD34 + cells purified from bone marrow (CM) represent about 1% of all CM cells and are enriched with primitive and commited progenitor cells of all differentiating lines (namely, erythroid, granulomacrophages and megakaryocytes).

Было показано, что олигодезоксинуклеотиды mpl с обратной последовательностью подавляют образование колоний мегакариоцитов из плюрипотентных CD34+, культивируемых на сыворотке пациентов с апластическим костным мозгом (богатый источник колоние-стимулирующей активности мегакариоцитов [МК-КСА]). Те же самые олигодезоксинуклеотиды с обратной последовательностью не обладали действием на образование эритроидных или грануломакрофагальных колоний.Inverse sequence mpl oligodeoxynucleotides have been shown to inhibit colony formation of megakaryocytes from pluripotent CD34 + cultured in the serum of patients with aplastic bone marrow (a rich source of megakaryocyte colony-stimulating activity [MK-KSA]). The same reverse sequence oligodeoxynucleotides did not have an effect on the formation of erythroid or granulomacrophage colonies.

Непосредственно ли связывает mpl лиганд и действует ли фактор сыворотки, вызывающий мегакариоцитопоэз, через mpl, до сих пор неизвестно. Было предположено, однако, что, если mpl действует непосредственно, связывая лиганд, его аминокислотная последовательность была бы подобна высококонсервативной и имеются виды обладающие перекрестной реактивностью с определенной идентичной последовательностью между внеклеточными доменами mpl человека и мыши (Vigon et al., там же [1993]).Whether mpl ligand directly binds and whether the serum factor causing megakaryocytopoiesis acts via mpl is still unknown. It has been suggested, however, that if mpl acts directly by binding to the ligand, its amino acid sequence would be highly conserved and there would be species with cross-reactivity with a certain identical sequence between the extracellular domains of human and mouse mpl (Vigon et al., Ibid [1993] )

VII. Предметы изобретенияVII. Subjects of the invention

С точки зрения последующего будет понятно, что существует настоящая и постоянная потребность в способе выделения и идентификации молекул, способных стимулировать пролиферацию, дифференциацию и созревание гематопоэтичеких клеток, в особенности, мегакариоцитов или их предшественников для терапевтического использования при лечении тромбоцитопении. По-видимому, такая молекула представляет лиганд mpl и, следовательно, существует необходимость для дальнейшего выделения такого лиганда (лигандов), для оценки его роли (ролей) для роста и дифференцировки клеток.From the point of view of the following, it will be understood that there is a real and ongoing need for a method for isolation and identification of molecules capable of stimulating the proliferation, differentiation and maturation of hematopoietic cells, in particular megakaryocytes or their precursors for therapeutic use in the treatment of thrombocytopenia. Apparently, such a molecule represents the mpl ligand and, therefore, there is a need for the further isolation of such a ligand (s), for assessing its role (roles) for cell growth and differentiation.

Соответственно предметом настоящего изобретения является получение фармацевтически чистой молекулы, способной стимулировать деление, дифференциацию и/или созревание мегакариоцитов в зрелую форму, продуцирующую тромбоциты.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutically pure molecule capable of stimulating the division, differentiation and / or maturation of megakaryocytes into a mature platelet producing form.

Другим предметом является получение молекулы в виде, пригодном для терапевтического использования при лечении гематопоэтических нарушений, в особенности тромбоцитопении.Another subject is the preparation of a molecule in a form suitable for therapeutic use in the treatment of hematopoietic disorders, especially thrombocytopenia.

Далее, предметом настоящего изобретения является выделение, очистка и специфическое определение лигандов, способных к связыванию in vivo с рецептором суперсемейства цитокинов, известному как mpl, для передачи пролиферативного сигнала.Further, the subject of the present invention is the isolation, purification and specific determination of ligands capable of binding in vivo to a cytokine superfamily receptor known as mpl to transmit a proliferative signal.

Еще другим предметом является получение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих подобные белковые лиганды, и использование этих молекул нуклеиновых кислот для производства mpl связывающих лигандов в рекомбинантных культурах клеток, для диагностики и терапевтического использования.Another subject is the production of nucleic acid molecules encoding such protein ligands, and the use of these nucleic acid molecules for the production of mpl binding ligands in recombinant cell cultures, for diagnosis and therapeutic use.

Еще одним предметом является получение производных и модифицированных видов белковых лигандов, включая варианты аминокислотной последовательности, варианты типов гликопротеидов и их ковалентные производные.Another subject is the preparation of derivatives and modified types of protein ligands, including amino acid sequence variants, glycoprotein type variants and their covalent derivatives.

Дополнительным предметом является получение сплавленных видов полипептидов, объединяющих лиганд mpl и гетерологический белок, и их ковалентные производные.An additional subject is the production of fused types of polypeptides combining the mpl ligand and the heterologous protein, and their covalent derivatives.

Еще дополнительным предметом является получение варианта вида полипептида, сочетающего лиганд mpl с аминокислотными добавлениями и заменами из последовательности ЭП для получения белка, способного регулировать деление и рост обеих прогениторных клеток тромбоцитов и красных кровяных клеток.Another additional subject is the production of a variant of the polypeptide type combining the mpl ligand with amino acid additions and substitutions from the EP sequence to obtain a protein capable of regulating the division and growth of both progenitor platelet and red blood cell cells.

Еще одним дополнительным предметом является приготовление иммуногенов для увеличения антител против лигандов mpl или их объединенных видов, так же, как и получение антител, способных к связыванию подобных лигандов.Another additional subject is the preparation of immunogens to increase antibodies against mpl ligands or their combined species, as well as the production of antibodies capable of binding such ligands.

Эти и другие предметы изобретения будут очевидны для обычного работника при рассмотрении деталей в целом.These and other objects of the invention will be apparent to the average worker when considering the details as a whole.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Предметы изобретения получены путем получения выделенного белка млекопитающих, стимулирующего мегакариоцитопоэтическую пролиферацию и созревание, обозначаемого "mpl лиганд" (МЛ) или "тромбопоэтин" (ТП), способного стимулировать пролиферацию, созревание и/или дифференциацию мегакариоцитов в зрелую форму, продуцирующую тромбоциты.The objects of the invention are obtained by obtaining an isolated mammalian protein that stimulates megakaryocytopoietic proliferation and maturation, referred to as “mpl ligand” (ML) or “thrombopoietin” (TP), capable of stimulating the proliferation, maturation and / or differentiation of megakaryocytes into a mature platelet producing form.

Этот существенно гомогенный белок может быть очищен из природного источника способом, включающим: (1) контактирование источника плазмы, содержащего молекулу лиганда mpl для очистки на иммобилизованном рецепторном полипептиде, специфического mpl или mpl слитого белка, иммобилизованного на подложке, в условиях, когда очищаемая молекула лиганда mpl селективно адсорбируется на иммобилизованном полипептидном рецепторе, (2) промывание иммобилизованного рецепторного полипептида и его подложки для удаления неадсорбированного материала и (3) смывание молекулы mpl лиганда с иммобилизованного рецепторного полипептида, к которому он был адсорбирован, буфером элюции. Природным источником, предпочтительно, является плазма млекопитающих или моча, содержащая лиганд mpl. Млекопитающее необязательно является апластическим, и иммобилизованный рецептор представляет собой слияние mpl и IgG.This substantially homogeneous protein can be purified from a natural source by a method comprising: (1) contacting a plasma source containing an mpl ligand molecule for purification on an immobilized receptor polypeptide, a specific mpl or mpl fusion protein immobilized on a substrate, under conditions when the ligand molecule to be purified mpl is selectively adsorbed on an immobilized polypeptide receptor, (2) washing the immobilized receptor polypeptide and its substrate to remove non-adsorbed material, and (3) washed off e mpl ligand molecules from the immobilized receptor polypeptide to which it was adsorbed, the elution buffer. The natural source is preferably mammalian plasma or urine containing the mpl ligand. The mammal is not necessarily aplastic, and the immobilized receptor is a fusion of mpl and IgG.

Предпочтительным белком, стимулирующим мегакариоцитопоэтическую пролиферацию и созревание, необязательно, является выделенный, существенно гомогенный лиганд mpl полипептид, полученный синтетическим или рекомбинантным способом.A preferred protein stimulating megakaryocytopoietic proliferation and maturation is optionally an isolated, substantially homogeneous mpl ligand polypeptide obtained by synthetic or recombinant methods.

Полипептидный "mpl лиганд" или "ТП" по настоящему изобретению, предпочтительно, имеет, по крайней мере, более 70% идентичной последовательности по отношению к аминокислотной последовательности высокоочищенного, существенно гомогенного полипептидного лиганда mpl свиньи и, по крайней мере, 80% идентичной последовательности по отношению к "ЭП-домену" полипептидного лиганда mpl свиньи. Выборочно лигандом mpl настоящего изобретения является зрелый лиганд mpl человека (МЛч), обладающий зрелой аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.1 (Посл. No.1), или вариант, или его посттранскрипционная модифицированная форма, или белок, имеющий около 80% идентичной последовательности по отношению к зрелому лиганду mpl человека. Необязательно, вариантом лиганда mpl является фрагмент, особенно амино-конец (N-конец), или фрагмент "ЭП-домена" зрелого лиганда mpl человека (МЛч). Предпочтительно, фрагментом амино-конца остается существенно вся последовательность МЛ человека между первым и четвертым остатками цистеина, но могущая содержать существенные вставки, делеции или замены вне этого региона. В соответствии с этим осуществлением фрагмент полипептида может быть представлен формулой:The polypeptide "mpl ligand" or "TP" of the present invention preferably has at least more than 70% identical sequence with respect to the amino acid sequence of a highly purified, substantially homogeneous pig mpl polypeptide ligand and at least 80% identical sequence with relative to the "EP domain" of the pig mpl polypeptide ligand. Optionally, the mpl ligand of the present invention is a mature human mpl ligand (MLC) having the mature amino acid sequence shown in FIG. 1 (Pos. No.1), or a variant, or its post-transcriptional modified form, or a protein having about 80% identical sequence in relation to the mature ligand of human mpl. Optionally, a variant of the mpl ligand is a fragment, especially an amino terminus (N-terminus), or a fragment of the "EP domain" of a mature human mpl ligand (MLC). Preferably, the entire amino acid sequence of the human between the first and fourth cysteine residues remains substantially fragment of the amino terminus, but which can contain significant insertions, deletions or substitutions outside this region. In accordance with this implementation, the fragment of the polypeptide can be represented by the formula:

Х-МЛч(7-151)-YX-MLCh (7-151) -Y

где МЛч(7-151) представляет аминокислотную последовательность ТП человека (ТПч) от Цис7 до Цис151 включительно; Х представляет аминогруппу Цис7 или одну или более амино концевого(ых) аминокислотного(ых) остатка(ов) зрелого МЛч, или аминокислотный остаток, распространяющийся, кроме того, на такие, как Мет, Тир или лидерную последовательность, содержащую, например, места для протеолитического расщепления (а именно, Фактор Ха или тромбина); и Y представляет карбокси концевую группу Цис151 или одну или более концевого(ых) аминокислотного(ых) остатка(ов) зрелого МЛч, или, помимо этого, их расширение.where MLCh (7-151) represents the amino acid sequence of human TP (TPC) from Cis 7 to Cis 151 inclusive; X represents an amino group of Cis 7 or one or more amino terminal (s) amino acid (s) residue (s) of mature MLC, or an amino acid residue extending, in addition, to Met, Tyr or a leader sequence containing, for example, for proteolytic cleavage (namely, Factor Xa or thrombin); and Y represents a carboxy terminal group of Cis 151 or one or more terminal amino acid residue (s) of mature MLC, or, in addition, their expansion.

Полипептидный лиганд mpl или его фрагмент необязательно могут быть слиты в гетерологический полипептид (химеру). Предпочтительным гетерологическим полипептидом является цитокин, колоние-стимулирующий фактор или интерлейкин или его фрагмент, в особенности кит-лиганд (КЛ), ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-11, ЭП, ГМ-КСФ или ФИЛ. Предпочтительным выборочным гетерологическим полипептидом является цепь иммуноглобулина, в особенности IgG1 человека, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM или их фрагменты, в особенности, включающие домены тяжелой цепи IgG.The mpl polypeptide ligand or fragment thereof may optionally be fused to a heterologous polypeptide (chimera). A preferred heterologous polypeptide is a cytokine, a colony stimulating factor or interleukin, or a fragment thereof, in particular a whale ligand (CL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EP, GM-CSF or PHIL. A preferred selective heterologous polypeptide is an immunoglobulin chain, in particular human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgD, IgM, or fragments thereof, in particular including IgG heavy chain domains.

Другим аспектом настоящего изобретения является получение композиции, включающий выделенный агонист mpl, обладающий биологической активностью и, предпочтительно, способный стимулировать включение меченых нуклеотидов (а, именно, 3H-тимидина) в ДНК ИЛ-3 зависимых Ba/F3 клеток, трансфецированных mpl человека. Агонист mpl необязательно является биологически активным лигандом mpl, но предпочтительной является его способность стимулировать включение 35S в циркулирующие тромбоциты в исследовании восстановления тромбоцитов мыши.Another aspect of the present invention is to provide a composition comprising an isolated mpl agonist having biological activity and, preferably, capable of stimulating the incorporation of labeled nucleotides (namely 3 H-thymidine) into the DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl. The mpl agonist is not necessarily a biologically active mpl ligand, but its ability to stimulate the incorporation of 35 S into circulating platelets in a mouse platelet recovery study is preferred.

Подходящие mpl агонисты включают МЛч153, МЛч(Р153А, Р154А), МЛч2, МЛч3, МЛч4, МЛм, МЛм2, МЛм3, МЛп и МЛп2 или их фрагменты.Suitable mpl agonists include Mlch 153 , Mlch (P153A, P154A), Mlch2, Mlch3, Mlch4, MLm, MLm2, MLm3, MLp and MLp2 or fragments thereof.

В другом воплощении настоящее изобретение описывает выделение антитела, способного связываться с лигандом mpl. Выделенное антитело, способное связываться с лигандом mpl, может быть, необязательно, соединено со вторым полипептидом, и это антитело или его соединение могут быть использованы для выделения и очистки лиганда mpl из источников, как описано выше для иммобилизованного mpl. В дальнейшем аспекте настоящего воплощения изобретение описывает способ определения лиганда mpl in vivo, включающего контактирование антитела с образцом, в особенности с образцом сыворотки, подозреваемого на содержание лиганда, и регистрацию связывания, если оно наблюдается.In another embodiment, the present invention describes the isolation of an antibody capable of binding to the mpl ligand. An isolated antibody capable of binding to the mpl ligand may optionally be coupled to a second polypeptide, and this antibody or its compound can be used to isolate and purify the mpl ligand from sources, as described above for immobilized mpl. In a further aspect of the present embodiment, the invention describes a method for determining an mpl ligand in vivo, comprising contacting an antibody with a sample, especially a serum sample suspected of containing a ligand, and detecting binding, if any.

В дальнейшем воплощении изобретение описывает выделение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд mpl или его фрагменты, молекула нуклеиновой кислоты которого, необязательно, может быть мечена детектируемым радикалом, и молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая комплементарна к, или гибридизована в умеренных до высоко строгих условий с, молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, кодирующую mpl лиганд. Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты являются те, которые кодируют лиганд mpl человека, свиньи и мыши, и включают РНК и ДНК, и геномную и кДНК. В дальнейшем аспекте настоящего воплощения молекула нуклеиновой кислоты представляет ДНК, кодирующую лиганд mpl и, далее, включающую реплицируемый вектор, в котором ДНК оперативно сцеплена с контрольной последовательностью, распознаваемой хозяином, которого трансформировали вектором. ДНК необязательно представляет собой кДНК, имеющую последовательность, представленную на фиг.1 5’-3’ (Посл. No.2), 3’-5’, или их фрагменты. Настоящий аспект далее включает клетки хозяина, предпочтительно, СНО клетки, трансформированные вектором, и способ использования ДНК для стимуляции продукции лиганда mpl, предпочтительно включающий экспрессию кДНК, кодирующую лиганд mpl, в культуре трансформированных клеток хозяина, и обратного получения лиганда mpl из клеток хозяина, или культуру клеток хозяина. Лиганд mpl, получаемый подобным способом, предпочтительно является лигандом mpl человека.In a further embodiment, the invention describes the isolation of a nucleic acid molecule encoding an mpl ligand or fragments thereof, the nucleic acid molecule of which may optionally be labeled with a detectable radical, and the nucleic acid molecule has a sequence that is complementary to, or hybridized under mild to very stringent conditions with , a nucleic acid molecule having a sequence encoding an mpl ligand. Preferred nucleic acid molecules are those that encode the human, pig and mouse mpl ligand, and include RNA and DNA, and genomic and cDNA. In a further aspect of the present embodiment, the nucleic acid molecule is a DNA encoding an mpl ligand and further comprising a replicable vector in which the DNA is operatively linked to a control sequence recognized by the host that has been transformed with the vector. The DNA is optionally a cDNA having the sequence shown in Fig. 1 5’-3 ’(Pos. No.2), 3’-5’, or fragments thereof. The present aspect further includes host cells, preferably CHO cells transformed with the vector, and a method of using DNA to stimulate the production of mpl ligand, preferably comprising expressing cDNA encoding the mpl ligand in a culture of transformed host cells, and reverse generating the mpl ligand from the host cells, or host cell culture. The mpl ligand obtained in a similar manner is preferably a human mpl ligand.

Изобретение далее включает способ лечения животных, имеющих гематопоэтическое нарушение, в особенности тромбоцитопению, включающий введение млекопитающему терапевтически активного количества лиганда mpl. Лиганд mpl, необязательно, вводится в комбинации с цитокином, в особенности с колоние-стимулирующим фактором или интерлейкином. Предпочтительные колоние-стимулирующие факторы или интерлейкины включают: кит-лиганд (КЛ), ФИЛ, Г-КСФ, ГМ-КСФ, М-КСФ, ЭП, ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-6 и ИЛ-11.The invention further includes a method of treating animals having a hematopoietic disorder, in particular thrombocytopenia, comprising administering to the mammal a therapeutically active amount of the mpl ligand. The mpl ligand is optionally administered in combination with a cytokine, especially with a colony stimulating factor or interleukin. Preferred colony stimulating factors or interleukins include: whale ligand (CL), PHIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EP, IL-1, IL-3, IL-6 and IL-11.

Изобретение далее включает способ выделения и очистки ТП (МЛ) из ТП-продуцирующих микроорганизмов, включающий:The invention further includes a method for the isolation and purification of TP (ML) from TP-producing microorganisms, including:

(1) разрушение или лизис клеток, содержащих ТП,(1) destruction or lysis of cells containing TP,

(2) необязательное отделение растворимого материала от нерастворимого материала, содержащего ТП,(2) optional separation of soluble material from insoluble material containing TP,

(3) солюбилизацию ТП из нерастворимого материала с помощью солюбилизирующего буфера,(3) solubilizing TP from insoluble material using a solubilizing buffer,

(4) отделение солюбилизированного ТП от другого растворимого и нерастворимого материала,(4) separating the solubilized TP from another soluble and insoluble material,

(5) укладывание ТП в окислительно/восстановительном буфере, и(5) laying TP in a redox buffer, and

(6) отделение правильно уложенного ТП от неуложившегося ТП.(6) separating a correctly laid TP from a non-laid TP.

Способ описывает солюбилизацию нерастворимого материала, содержащего ТП, хаотропным агентом, когда хаотропный агент выбирается среди солей гуанидина, тиоцианата натрия или мочевины. Способ далее описывает то, что солюбилизированный ТП отделяется от другого растворимого и нерастворимого материала при помощи одного или более этапов, выбранных среди центрифугирования, гель-фильтрации и хроматографии с обращенной фазой. Этап укладывания способа получения описывает окислительно/востановительный буфер, содержащий как окисляющий, так и восстанавливающий агент. В общем, окислителем является кислород или соединение, содержащее, по крайней мере, одну дисульфидную связь, и восстановителем является соединение, содержащее, по крайней мере, одну свободную сульфгидрильную группу. Предпочтительно, окислитель выбирается из окисленного глютатиона (GSSG) и цистина, и восстановитель выбирается из восстановленного глютатиона (GSH) и цистеина. Более предпочтительно окислителем является окисленный глютатион (GSSG), и восстановителем является восстановленный глютатион (GSH). Также является предпочтительным, чтобы молярное отношение окислителя было равно или больше, чем для восстановителя. Окислительно/восстановительный буфер дополнительно содержит детергент, предпочтительно выбираемый из CHAPS и CHAPSO, присутствующий, по крайней мере, на уровне 1%. Окислительно/восстановительный буфер дополнительно содержит NaCl, предпочтительно в ряду концентрации от около 0,1-0,5 М, и глицерин, предпочтительно в концентрации выше, чем 15%. рН окислительно/восстановительного буфера лежит, предпочтительно, в ряду от около рН 7,5-рН 9,0, и этап укладки проводится при 4 градусах в течение 12-48 часов. Этап укладки дает биологически активный ТП, у которого дисульфидная связь образуется между ближайшем к амино концу Цис и Цис, ближайшем к карбокси концу ЭП домена.The method describes the solubilization of an insoluble material containing TP, a chaotropic agent, when the chaotropic agent is selected from salts of guanidine, sodium thiocyanate or urea. The method further describes that the solubilized TP is separated from another soluble and insoluble material by one or more steps selected from centrifugation, gel filtration and reverse phase chromatography. The laying step of the production method describes an oxidation / reduction buffer containing both an oxidizing and a reducing agent. In general, the oxidizing agent is oxygen or a compound containing at least one disulfide bond, and the reducing agent is a compound containing at least one free sulfhydryl group. Preferably, the oxidizing agent is selected from oxidized glutathione (GSSG) and cystine, and the reducing agent is selected from reduced glutathione (GSH) and cysteine. More preferably, the oxidizing agent is oxidized glutathione (GSSG), and the reducing agent is reduced glutathione (GSH). It is also preferred that the molar ratio of the oxidizing agent is equal to or greater than for the reducing agent. The redox buffer additionally contains a detergent, preferably selected from CHAPS and CHAPSO, present at least at the level of 1%. The redox buffer further comprises NaCl, preferably in a concentration range from about 0.1-0.5 M, and glycerol, preferably in a concentration higher than 15%. The pH of the redox buffer is preferably in the range of about pH 7.5 to pH 9.0, and the stacking step is carried out at 4 degrees for 12-48 hours. The stacking step yields a biologically active TP in which a disulfide bond forms between the end of Cis closest to the amino end and Cis, the end of the EP domain closest to the carboxy.

Изобретение далее включает способ очистки биологически активного ТП из микроорганизма, включающий:The invention further includes a method for purifying a biologically active TP from a microorganism, including:

(1) лизис, по крайней мере, внеклеточной мембраны микроорганизма,(1) lysis of at least the extracellular membrane of a microorganism,

(2) обработку лизата, содержащего ТП хаотропным агентом,(2) processing the lysate containing TP with a chaotropic agent,

(3) укладку ТП и(3) laying TP and

(4) отделение примесного и неправильно сложившегося ТП от правильным образом сложившегося ТП.(4) separating impurity and improperly formed TP from the properly formed TP.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг.1 показывает выведенную аминокислотную последовательность (Посл. No.1) mpl лиганда (МЛч), кДНК и кодирующей нуклеотидной последовательности (Посл. No.2). Нуклеотиды пронумерованы с начала каждой линии. 5’ и 3’ нетранслируемые области отмечены буквами снизу. Аминокислотные остатки пронумерованы выше последовательности, начинающейся от Сер 1 лиганда mpl (МЛ) зрелой белковой последовательности. Связи предполагаемого эксона 3 отмечены стрелками, и возможный участок N-гликозилирования отделен перегородкой. Остатки цистеина отмечены пунктиром над последовательностью. Подчеркнутая последовательность соответствует N-концевой последовательности mpl лиганда, очищенного из плазмы свиньи.Figure 1 shows the deduced amino acid sequence (Pos. No.1) of the mpl ligand (MLC), cDNA and the coding nucleotide sequence (Pos. No.2). Nucleotides are numbered from the beginning of each line. 5 ’and 3’ non-broadcast areas are marked with letters below. Amino acid residues are numbered above the sequence starting from Ser 1 ligand mpl (ML) of the mature protein sequence. The bonds of putative exon 3 are indicated by arrows, and a possible N-glycosylation site is separated by a septum. Cysteine residues are dotted above the sequence. The underlined sequence corresponds to the N-terminal sequence of the mpl ligand purified from pig plasma.

Фиг.2 показывает способ определения, использованного для включения 3H-тимидина в mpl лиганд. Для определения наличия mpl лиганда в различных источниках клетки mplPBa/F3 оставляли голодать без ИЛ-3 в течение 24 часов в увлажняемом инкубаторе при 37°С в присутствие 5% СO2 и воздуха. После голодания без ИЛ-3 клетки поместили в культуральные плашки с 96 ячейками с или без разведении образцов и культивировали в течение 24 часов в клеточном культуральном инкубаторе. В каждую ячейку добавляли по 20 мкл среды RPMI, свободной от сыворотки, содержащей 1 мкСi 3H-тимидина и оставляли на 6-8 часов. Затем клетки собирали на фильтровальной пластине с 96 ячейками и промывали водой. Затем подсчитывали счет на фильтрах.Figure 2 shows the method of determination used to incorporate 3 H-thymidine into the mpl ligand. To determine the presence of mpl ligand in various sources, mplPBa / F3 cells were left to starve without IL-3 for 24 hours in a humidified incubator at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 and air. After fasting without IL-3, the cells were placed in 96-well culture plates with or without dilution of the samples and cultured for 24 hours in a cell culture incubator. 20 μl of serum-free RPMI medium containing 1 μCi 3 H-thymidine was added to each well and left for 6-8 hours. Then the cells were collected on a 96-well filter plate and washed with water. Then counted the score on the filters.

Фиг.3 показывает действие проназы, ДТТ и нагревания на способность АПС стимулировать пролиферацию клеток Ba/F3-mpl. Для гидролиза АПС проназой проназу (Boehringer Mannheim) или бычий сывороточный альбумин привязали к Affi-гель10 (Biorad) и отдельно инкубировали с АПС в течение 18 часов. После этого гель удаляли путем центрифугирования, а супернатанты исследовали. АПС также прогревали до 80°С в течение 4 минут или обрабатывали 100 мкМ ДТТ, после чего диализовали против PBS.Figure 3 shows the effect of pronase, DTT and heating on the ability of APS to stimulate the proliferation of Ba / F3-mpl cells. For hydrolysis of APS by pronase pronase (Boehringer Mannheim) or bovine serum albumin was attached to Affi-gel10 (Biorad) and separately incubated with APS for 18 hours. After this, the gel was removed by centrifugation, and the supernatants were examined. APS was also heated to 80 ° C for 4 minutes or treated with 100 μM DTT, and then dialyzed against PBS.

Фиг.4 показывает элюцию активности mpl лиганда с колонок с Фенил-Toyoperl, Blue-Sepharose и Ultralink-mpl. Фракции 4-8 с mpl аффинной колонки были фракциями с пиком активности, элюировавшейся с колонки.Figure 4 shows elution of mpl ligand activity from phenyl-Toyoperl, Blue-Sepharose and Ultralink-mpl columns. Fractions 4-8 with the mpl affinity column were fractions with peak activity eluting from the column.

Фиг.5 показывает SDS-гельэлектрофорез на полиакриламидном геле (SDS-PAGE) фракций, элюировавшихся с Ultralink-mpl колонки. К 200 мкл из каждой фракции 2-8 было добавлено по 1 мл ацетона, содержащего 1 mM HCl при -20°С. Через 3 часа при -20°С образцы центрифугировали и полученный осадок промыли 2 раза ацетоном при -20°С. После этого ацетоновый осадок растворили в 30 мкл SDS-солюбилизирующего буфера, обработали 100 мкМ ДТТ и прогревали при 90°С в течение 5 минут. Образцы затем были разогнаны на 4-20% полиакриламидном геле и белки визуализировали прокрашиванием серебром.Figure 5 shows SDS-gel electrophoresis on polyacrylamide gel (SDS-PAGE) fractions eluted from an Ultralink-mpl column. To 200 μl from each fraction 2-8 was added 1 ml of acetone containing 1 mM HCl at -20 ° C. After 3 hours at -20 ° C, the samples were centrifuged and the resulting precipitate was washed 2 times with acetone at -20 ° C. After that, the acetone precipitate was dissolved in 30 μl of SDS-solubilizing buffer, treated with 100 μM DTT and heated at 90 ° C for 5 minutes. Samples were then dispersed on a 4-20% polyacrylamide gel and proteins were visualized by silver staining.

Фиг.6 показывает элюцию активности mpl лиганда после SDS-PAGE. Фракция 6 после mpl-аффинной колонки была разогнана на 4-20% SDS-полиакриламидном геле при невосстанавливающих условиях. После электрофореза гель разрезали на 12 равных долей и электроэлюировали, как описано в примерах. Электроэлюированные образцы диализовали в PBS и исследовали при 1/20 разведения. Mr стандарты, использованные для калибровки геля, представляли собой 12 стандартов Novex Mark.6 shows elution of mpl ligand activity after SDS-PAGE. Fraction 6 after the mpl-affinity column was dispersed on 4-20% SDS-polyacrylamide gel under non-reducing conditions. After electrophoresis, the gel was cut into 12 equal shares and electroeluted, as described in the examples. Electroeluted samples were dialyzed in PBS and examined at 1/20 dilution. Mr standards used to calibrate the gel were 12 Novex Mark standards.

Фиг.7 показывает влияние АПС, лишенную лиганда mpl, на мегакариоцитопоэз у человека. АПС, лишенная лиганда mpl, была получена путем пропускания 1 мл через 1 мл mpl-аффинной колонки (700 мкг mpl-IgG/мл NHS-Superose, Pharmacia). Культуру периферических стволовых клеток человека обработали 10% АПС или 10% АПС, лишенного mpl лиганда, и культивировали в течение 12 дней. Мегакариоцитопоэз подсчитывали, как описано в примерах.7 shows the effect of APS lacking the mpl ligand on human megakaryocytopoiesis. APS lacking the mpl ligand was obtained by passing 1 ml through 1 ml of an mpl-affinity column (700 μg mpl-IgG / ml NHS-Superose, Pharmacia). A human peripheral stem cell culture was treated with 10% APS or 10% APS lacking mpl ligand and cultured for 12 days. Megakaryocytopoiesis was counted as described in the examples.

Фиг.8 показывает действие mpl-IgG на стимуляцию АПС мегакариоцитопоэза у человека. Культуру периферических стволовых клеток человека обработали 10% АПС и культивировали в течение 12 дней. На 0, 2 и 4 дни добавили mpl-IgG (0,5 мкг) или ANP-R-IgG (0,5 мкг). Через 12 дней подсчитывали мегакариоцитопоэз, как описано в примерах. Графики построены по средним значениям дубликатов образцов, в скобках действительные данные дублей.Fig. 8 shows the effect of mpl-IgG on the stimulation of APS by megakaryocytopoiesis in humans. A human peripheral stem cell culture was treated with 10% APS and cultured for 12 days. On days 0, 2, and 4, mpl-IgG (0.5 μg) or ANP-R-IgG (0.5 μg) was added. After 12 days, megakaryocytopoiesis was counted as described in the examples. The graphs are based on the average values of duplicate samples, in brackets are the actual data of duplicates.

Фиг.9 показывает обе нити фрагмента 390 пар оснований геномной ДНК человека, кодирующий mpl лиганд. Показаны выведенная аминокислотная последовательность "эксона 3" (Посл. No:3), кодирующей последовательности (Посл. No: 4) и его комплемента (Посл. No: 5).Fig. 9 shows both strands of a 390 base pair fragment of a human genomic DNA encoding an mpl ligand. The deduced amino acid sequence of exon 3 (Pos. No: 3), the coding sequence (Pos. No: 4) and its complement (Pos. No: 5) are shown.

Фиг.10 показывает выведенную аминокислотную последовательность зрелого лиганда mpl человека (МЛч) (Посл. No: 6) и зрелого эритропоэтина человека (ЭПч) (Посл. No: 7). Предсказанная аминокислотная последовательность для лиганда mpl человека расположена в ряд с последовательностью эритропоэтина человека. Идентичные аминокислоты отделены перегородкой, а разрывы, введенные для оптимального расположения, отмечены штриховкой. Места для возможного N-гликозилирования подчеркнуты прямой чертой для МЛч и ломаной линией для ЭПч. Два цистеина, важных для активности эритропоэтина, отмечены жирным пунктиром.Figure 10 shows the deduced amino acid sequence of the mature human mpl ligand (MLC) (Ser.No. 6) and mature human erythropoietin (EPH) (Ser.No. 7). The predicted amino acid sequence for the human mpl ligand is located in a row with the sequence of human erythropoietin. Identical amino acids are separated by a septum, and gaps introduced for optimal location are indicated by hatching. Places for possible N-glycosylation are underlined by a straight line for HFM and a broken line for HF. Two cysteines, important for erythropoietin activity, are marked with a bold dotted line.

Фиг.11 показывает выведенную аминокислотную последовательность изоформ зрелого лиганда mpl человека МЛч (Посл. No: 6), МЛч2 (Посл. No: 8), МЛч3 (Посл. No: 9) и МЛч4 (Посл. No: 10). Идентичные аминокислоты отделены перегородкой, а разрывы, введенные для оптимального расположения, отмечены штриховкой.11 shows the deduced amino acid sequence of the isoforms of the mature human mpl ligand MLCh (Pos. No: 6), Mlch2 (Pos. No: 8), Mlch3 (Pos. No: 9) and Mlch4 (Pos. No: 10). Identical amino acids are separated by a septum, and gaps introduced for optimal location are indicated by hatching.

Фиг.12А, 12В и 12С показывают влияние лиганда nipl человека на пролиферацию Ba/F3 клеток (А), количество мегакариоцитопоэзов у человека in vitro, подсчитанное при использовании меченого IgG моноклонального антитела мыши, специфического к гликопротеину GPIIbIIIa мегакариоцита (В), и определение тромбоцитопоэзов у мыши, исследуемое по восстановительному синтезу тромбоцитов (С).Figa, 12B and 12C show the effect of the human nipl ligand on the proliferation of Ba / F3 cells (A), the number of human megakaryocytopoiesis in vitro, calculated using mouse IgG labeled monoclonal antibody specific for megaparyocyte GPII b III a glycoprotein (B), and determination of thrombocytopoiesis in a mouse, studied by reductive synthesis of platelets (C).

Клетки двести девяносто три были трансфецированы согласно CaPO4 методу (Gorman, С in DNA Cloning: A New Approach 2:143-190 [1985]), только вектором pRK5, pRK5-МЛЧ или pRK5-МЛЧ153 в течение ночи (pRK5-MЛЧ153 был получен введением стоп кодона после остатка 153 МЛЧ методом РПЦ). Затем среду уравновесили на 36 часов и исследовали ее на стимуляцию пролиферации Ba/F3-mpl клеток, как описано в Примере 1 (А) или мегакариоцитопоэза у человека in vitro (В). Мегакариоцитопоэзы подсчитывали, используя меченное 125IIgG моноклональное антитело мыши (НР1-ID) к специфическому гликопротеину GPIIbIIIa, как описано (Grant et al., Blood, 69: 1334-1339 [1987]). Действие частично очищенного рекомбинантного МЛ (рМЛ) на продукцию тромбоцитов in vivo (С) определяли, используя исследование восстановительного синтеза тромбоцитов, описанное McDonald, Т.Р. Рrос. Sоc. Ехр. Biol. Med. 144: 1006-1012 (1973). Частично очищенный рМЛ получили из 200 мкл кондиционированной среды, содержащей рекомбинантный МЛ. Среду пропустили через колонку с 2 мл Blue-Sepharose, уравновешенную PBS, колонку промыли PBS и элюировали PBS, содержащим по 2 М мочевины и NaCl, каждого. Фракции с активностью диализовали в PBS и создали концентрацию 1 мг/мл БСА, свободным от эндотоксина. Образцы содержали менее чем одну единицу эндотоксина/мл. Мышам инъецировали по 64000, 32000 или 16000 единиц рМЛ или только наполнитель. Каждая группа состояла из шести мышей. Представлено среднее и стандартное отклонение в каждой группе. Значение р было определено по парному Т-тесту сравнения медиан.Two hundred ninety-three cells were transfected according to the CaPO 4 method (Gorman, C in DNA Cloning: A New Approach 2: 143-190 [1985]), only with the vector pRK5, pRK5-MLC or pRK5-MLC 153 overnight (pRK5-MLC 153 was obtained by introducing a stop codon after the remainder of 153 MLC by the ROC method). Then the medium was balanced for 36 hours and examined for stimulation of the proliferation of Ba / F3-mpl cells, as described in Example 1 (A) or megakaryocytopoiesis in humans in vitro (B). Megakaryocytopoiesis was counted using a 125 IIgG-labeled mouse monoclonal antibody (HP1-ID) against specific GPII b III a glycoprotein as described (Grant et al., Blood, 69: 1334-1339 [1987]). The effect of partially purified recombinant ML (rML) on platelet production in vivo (C) was determined using a reductive platelet synthesis study described by McDonald, T.P. Roc. Soc. Exp Biol. Med. 144: 1006-1012 (1973). Partially purified rML was obtained from 200 μl of conditioned medium containing recombinant ML. The medium was passed through a 2 ml Blue-Sepharose column equilibrated with PBS, the column was washed with PBS and eluted with PBS containing 2 M urea and NaCl each. Fractions with activity were dialyzed in PBS and a concentration of 1 mg / ml BSA free of endotoxin was established. Samples contained less than one unit of endotoxin / ml. Mice were injected with 64,000, 32,000, or 16,000 rML units or just vehicle. Each group consisted of six mice. The mean and standard deviation in each group are presented. The p value was determined by the paired T-test for comparing medians.

Фиг.13 сравнивает действие изоформ и вариантов лиганда mpl человека при исследовании пролиферации Ba/F3 клеток. Были исследованы МЛч, mock, МЛч2, МЛч(Р153А, Р154А) и МЛч153 при различных разведениях, как описано в Примере 1.Fig. 13 compares the effect of isoforms and variants of the human mpl ligand in the study of Ba / F3 cell proliferation. MLC, mock, MLCh, MLC (P153A, P154A) and MLC 153 were studied at various dilutions, as described in Example 1.

Фиг.14А, 14В и 14С показывают выведенную аминокислотную последовательность (Посл. No: 1) лиганда mpl человека (МЛч) или ТП человека (ТПч) геномной ДНК человека, кодирующей последовательность (Посл. No: 11). Нуклеотиды и аминокислотные остатки пронумерованы с начала каждой линии.Figa, 14B and 14C show the deduced amino acid sequence (Pos. No: 1) of the human mpl ligand (MLC) or human TP (Tpc) of the human genomic DNA encoding the sequence (Pos. No: 11). Nucleotides and amino acid residues are numbered from the beginning of each line.

Фиг.15 показывает SDS-PAGE (электорофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) очищенного 293-рМЛч332 и очищенного 293-рМЛч153.Fig. 15 shows SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate) of purified 293-rMLCh 332 and purified 293-rMLCh 153 .

Фиг.16 показывает нуклеотидную последовательность: кодирующей кДНК (Посл. No: 12) и выведенную аминокислотную последовательность (Посл. No: 13) открытой рамки считывания изоформы МЛ мыши. Это изоформа зрелого лиганда mpl мыши содержит 331 аминокислотный остаток, на четыре меньше, чем естественный полной длины МЛм, и поэтому обозначена как МЛм2. Нуклеотиды пронумерованы с начала каждой линии. Аминокислотные остатки пронумерованы поверх последовательности, начинающейся с Сер 1. Участки возможного N-гликозилирования подчеркнуты. Остатки цистеина отмечены пунктиром над последовательностью.Fig. 16 shows the nucleotide sequence of the cDNA coding (Pos. No: 12) and the deduced amino acid sequence (Pos. No: 13) of the open reading frame of mouse isoform of mouse. This isoform of the mature mouse mpl ligand contains 331 amino acid residues, four less than the natural full length MLM, and is therefore designated MLM2. Nucleotides are numbered from the beginning of each line. Amino acid residues are numbered over the sequence starting with Ser 1. The sites of possible N-glycosylation are underlined. Cysteine residues are dotted above the sequence.

Фиг.17 показывает последовательность кДНК (Посл. No: 14) и предсказанной белковой последовательности (Посл. No: 15) данной изоформы МЛ мыши (МЛм). Нуклеотиды пронумерованы с начала каждой линии. Аминокислотные остатки пронумерованы поверх последовательности, начинающейся с Сер 1. Данная изоформа зрелого лиганда mpl мыши содержит 335 аминокислотных остатков, и представляется, что является лигандом mpl полной длины, обозначенным МЛм. Сигнальная последовательность обозначена подчеркнутой штриховкой и вероятные места расщепления обозначены стрелкой. 5’ и 3’ нетранслируемые области отмечены расположенными ниже буквами. Две обнаруженные делеции как результат альтернативного сплайсинга (МЛм2 и МЛм3) подчеркнуты. Четыре цистеиновых остатка отмечены штриховкой. Семь возможных мест N-гликозилирования отделены перегородкой.17 shows the cDNA sequence (Pos. No: 14) and the predicted protein sequence (Pos. No: 15) of this mouse ML isoform (MLM). Nucleotides are numbered from the beginning of each line. Amino acid residues are numbered over the sequence starting with Ser 1. This isoform of the mature mouse mpl ligand contains 335 amino acid residues and appears to be the full length mpl ligand, designated MLM. The signal sequence is indicated by underlined shading and probable cleavage sites are indicated by an arrow. 5 ’and 3’ non-broadcast areas are indicated by the letters below. Two detected deletions as a result of alternative splicing (MLm2 and MLm3) are underlined. Four cysteine residues are indicated by hatching. Seven possible N-glycosylation sites are separated by a septum.

Фиг.18 сравнивает выведенную аминокислотную последовательность МЛч3 изоформы МЛ человека (Посл. No: 9) и изоформы МЛ мыши, обозначенной МЛм3 (Посл. No: 16). Предсказанная аминокислотная последовательность лиганда mpl человека расположена вдоль последовательности лиганда mpl мыши. Идентичные аминокислоты отделены перегородкой, а разрывы введены для оптимального расположения в ряд и отмечены штриховкой. Аминокислоты пронумерованы с начала каждой линии.Fig. 18 compares the deduced amino acid sequence of MLCh3 of the human ML isoform (Pos. No: 9) and mouse isoforms of the mouse designated Mlm3 (Pos. No: 16). The predicted amino acid sequence of the human mpl ligand is located along the mouse mpl ligand sequence. Identical amino acids are separated by a septum, and gaps are introduced for optimal row alignment and are indicated by hatching. Amino acids are numbered from the beginning of each line.

Фиг.19 сравнивает предсказанную аминокислотную последовательность зрелого МЛ, изоформ МЛ мыши (Посл. No: 17), МЛ свиньи (Посл. No: 18) и МЛ человека (Посл. No: 6). Аминокислотные последовательности расположены вдоль с разрывами, отмеченными штриховкой, вставленные для оптимального расположения. Аминокислоты пронумерованы с начала каждой линии, с разделенными перегородкой идентичными аминокислотами. Места возможного N-гликозилирования отмечены затемненными перегородками, а цистеиновые остатки обозначены пунктиром. Структура с консервативными двухосновными аминокислотами, которая представляет место для потенциального расщепления протеазами, подчеркнута. Обнаруженная четвертая аминокислотная делеция, наблюдающаяся у всех трех видов (МЛ2) отделена жирной перегородкой.Fig. 19 compares the predicted amino acid sequence of mature ML, isoforms of mouse ML (Pos. No: 17), pig ML (Pos. No: 18) and human ML (Pos. No: 6). Amino acid sequences are arranged along with gaps marked by hatching, inserted for optimal arrangement. Amino acids are numbered from the beginning of each line, with identical amino acids separated by a septum. Places of possible N-glycosylation are marked by darkened partitions, and cysteine residues are indicated by a dashed line. A structure with conserved dibasic amino acids, which provides a place for potential protease cleavage, is underlined. The found fourth amino acid deletion observed in all three species (ML2) is separated by a thick septum.

Фиг.20 показывает последовательность кДНК (Посл. No: 19) и предсказанную последовательность (Посл. No:18) изоформы зрелого белка МЛ свиньи (МЛс). Данная изоформа лиганда mpl свиньи содержит 332 аминокислотных остатка и, предположительно, является лигандом mpl свиньи полной длины, обозначаемым МЛс. Нуклеотиды пронумерованы с начала каждой линии. Аминокислотные остатки пронумерованы поверх последовательности, начинающейся с Сер 1.Fig. 20 shows the cDNA sequence (Pos. No: 19) and the predicted sequence (Pos. No: 18) of the mature form of pig ML pig protein (ML). This isoform of the pig mpl ligand contains 332 amino acid residues and, presumably, is the full length pig mpl ligand, denoted by MLs. Nucleotides are numbered from the beginning of each line. Amino acid residues are numbered over the sequence starting with Ser 1.

Фиг.21 показывает последовательность кДНК (Посл. No: 20) и предсказанную последовательность (Посл. No: 21) изоформы зрелого белка МЛ свиньи (МЛс2). Данная изоформа лиганда mpl свиньи содержит 228 аминокислотных остатков и представляет форму с четырьмя делениями остатков по сравнению с лигандом mpl полной длины, обозначаемая МЛс2. Нуклеотиды пронумерованы с начала каждой линии. Аминокислотные остатки пронумерованы поверх последовательности, начинающейся с Сер 1.Figure 21 shows the cDNA sequence (Pos. No: 20) and the predicted sequence (Pos. No: 21) of the isoform of mature pig ML protein (MLc2). This isoform of the pig mpl ligand contains 228 amino acid residues and represents a form with four divisions of residues compared to the full length mpl ligand, denoted MLC2. Nucleotides are numbered from the beginning of each line. Amino acid residues are numbered over the sequence starting with Ser 1.

Фиг.22 сравнивает выведенную аминокислотную последовательность МЛ свиньи с полной длиной изоформы МЛс (Посл. No: 18) и изоформу МЛ свиньи, обозначенную МЛс2 (Посл. No: 21). Предсказанная аминокислотная последовательность для МЛ расположена в ряд с последовательностью МЛс2. Идентичные аминокислоты разделены перегородками, а разрывы, введенные для оптимального расположения, отмечены штриховкой. Аминокислоты пронумерованы с начала каждой линии.Fig. 22 compares the deduced amino acid sequence of pig ML with the full length of the ML isoform (Pos. No: 18) and the pig ML isoform indicated by MLs2 (Pos. No: 21). The predicted amino acid sequence for ML is in a row with the sequence of MLc2. Identical amino acids are separated by partitions, and gaps introduced for optimal location are indicated by hatching. Amino acids are numbered from the beginning of each line.

Фиг.23 показывает существенные свойства плазмиды p3V15. ID.LL.MLORF ("полная длина" или ТП332), используемой для трансфекции хозяина CHO-DP12 клеток для продукции СНО-rhТП332.23 shows the essential properties of plasmid p3V15. ID.LL.MLORF ("full length" or TP 332 ) used to transfect the host CHO-DP12 cells for the production of CHO-rhTP 332 .

Фиг.24 показывает существенные свойства плазмиды p3V15.ID.LL.MLEPO-D ("усеченной" или ТП153), используемой для трансфекции хозяина CHO-DP12 клеток для продукции СНО-rhТП153.24 shows the essential properties of the plasmid p3V15.ID.LL.MLEPO-D ("truncated" or TP 153 ) used to transfect the host of CHO-DP12 cells to produce CHO-rhTP 153 .

Фиг.25А, 25В и 25С показывает действие Е.colirhin (Мет-1, 153) на тромбоциты (А), красные кровяные клетки (В) и белые кровяные клетки (С) обычных мышей. Двум группам по шесть самок С57 В6 мышей инъецировали ежедневно либо PBS буфер, либо 0,3 мкг Е.coli-rhTn (Meт-1, 153) (100 мкл/п.к.). На 0 день и на 3-7 дни забирали по 40 мкл крови из глазного синуса. Данную кровь немедленно разводили в 10 мл коммерческого разбавителя и получали полный счет крови на Serrono Baker Heiaatology Analyzer 9018. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка определения.Figa, 25B and 25C shows the effect of E. colirhin (Met -1 , 153) on platelets (A), red blood cells (B) and white blood cells (C) of ordinary mice. Two groups of six female C57 B6 mice were injected daily with either PBS buffer or 0.3 μg E. coli-rhTn (Met -1 , 153) (100 μl / bp). On day 0 and days 3-7, 40 μl of blood was taken from the sinus eye. This blood was immediately diluted in 10 ml of a commercial diluent and a complete blood count was obtained on a Serrono Baker Heiaatology Analyzer 9018. The data are presented as mean ± standard error of determination.

Фиг.26А, 26В и 26С показывают действие Е.coli-rhTu (Мет-1, 153) на тромбоциты (А), красные кровяные клетки (В) и белые кровяные клетки (С) облученных в сублетальной дозе мышей. Две группы по 10 самок С57 В6 мышей облучили в сублетальной дозе 750 cGy гамма облучением из источника с 137Сs, которые ежедневно получали в виде инъекций либо PBS буфер, либо 3,0 мкг Е.coli-rhТГКМет-1, 153) (100 мкл/п.к.). На 0 день и в последующие промежуточные сроки отбирали по 40 мкл крови из глазного синуса. Данную кровь немедленно разводили в 10 мл коммерческого разбавителя и получали полный счет крови на Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка определения.Figures 26A, 26B and 26C show the effect of E. coli-rhTu (Met -1 , 153) on platelets (A), red blood cells (B) and white blood cells (C) in a sublethal dose of mice. Two groups of 10 female C57 B6 mice were irradiated at a sublethal dose of 750 cGy gamma by irradiation from a source of 137 Cs, which were injected daily with either PBS buffer or 3.0 μg E. coli-rhTGKMet -1 , 153) (100 μl /PC.). On day 0 and at subsequent interim periods, 40 μl of blood was taken from the ophthalmic sinus. This blood was immediately diluted in 10 ml of a commercial diluent and a complete blood count was obtained on a Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Data are presented as mean ± standard error of determination.

Фиг.27А, 27В и 27С показывает действие СНО-rhТП332 на тромбоциты (А), красные кровяные клетки (эритроциты) (В) и белые кровяные клетки (лейкоциты) (С) обычных мышей. Двум группам по шесть самок С57 В6 мышей инъецировали ежедневно либо PBS буфер, либо 0,3 мкг СНО-rhТП332,) (100 мкл/п.к.). На 0 день и на 3-7 дни забирали по 40 мкл крови из глазного синуса. Данную кровь немедленно разводили в 10 мл коммерческого разбавителя и получали полный счет крови на Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка определения.27A, 27B and 27C show the effect of CHO-rhTP 332 on platelets (A), red blood cells (erythrocytes) (B), and white blood cells (leukocytes) (C) in normal mice. Two groups of six female C57 B6 mice were injected daily with either PBS buffer or 0.3 μg CHO-rhTP 332 ,) (100 μl / bp). On day 0 and days 3-7, 40 μl of blood was taken from the sinus eye. This blood was immediately diluted in 10 ml of a commercial diluent and a complete blood count was obtained on a Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Data are presented as mean ± standard error of determination.

Фиг.28 показывает кривую дозозависимого ответа на различные формы рТПч, полученные из различных клеточных линий. Построены кривые дозозависимых ответов на рТПч из следующих клеточных линий: ТПч332 из СНО (полной длины из клеток яичника китайского хомячка); ТПчМет-1 153 (производное Е.coli, усеченной формы с N-концевым метионином); ТПч332 (ТП полной длины из 293 клеток); без Мет 155 Е.coli (усеченная форма [рТПч155] из Е.coli без конечного метионина). Группам по 6 самок С57В6 мышей ежедневно инъецировали в течение 7 дней рТПч в зависимости от группы. Каждый день отбирали по 40 мкл крови из глазного синуса для полного счета крови. Данные, представленные выше, представляют максимальные эффекты, наблюдаемые при различных введениях, за исключением (мет 153 Е.coli), которые проявляются на 7 день введения. В вышеупомянутой "мет 153 Е.coli" группе максимальный эффект наблюдался на 5 день. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка определения.Fig. 28 shows a dose response curve for various forms of rhfp obtained from different cell lines. Curves of dose-dependent responses to rTrh were constructed from the following cell lines: Tpr 332 from CHO (full length from Chinese hamster ovary cells); TmpMet -1 153 (derivative of E. coli, truncated form with an N-terminal methionine); TPC 332 (TP full length of 293 cells); without Met 155, E. coli (truncated form [rhp 155 ] from E. coli without final methionine). Groups of 6 female C57B6 mice were injected daily for 7 days with rTPCh, depending on the group. Each day, 40 μl of blood was taken from the ophthalmic sinus for a complete blood count. The data presented above represent the maximum effects observed with various administrations, with the exception of (met 153 E. coli), which appear on the 7th day of administration. In the aforementioned "met 153 E. coli" group, the maximum effect was observed on day 5. Data are presented as mean ± standard error of determination.

Фиг.29 показывает сравнение кривых ответов дозовой зависимости активностей рТПч полной длины и "обрезанной" формы рТПч, продуцируемой СНО клетками, с усеченной формой из Е.coli. Группам из 6 самок С57В6 мышей ежедневно вводили по 0,3 мкг рТПч различных типов. На 2-7 дни забирали кровь из глазного синуса для полного подсчета крови. Обработанные группы следующие: ТП153 усеченная форма ТП из Е.coli; ТП332 (смешанная фракция), ТП полной длины, содержащий приблизительно 80-90% ТП полной длины и 10-20% обрезанной формы; ТП332(30К фракция) = очищенной обрезанной фракции из оригинального "смешанного" препарата; ТП332(70К фракция) = очищенно фракции ТП полной длины из оригинального "смешанного" препарата. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка определения.Fig. 29 shows a comparison of response curves for the dose-response of full length rHTP activities and the "trimmed" rhpH form produced by CHO cells with a truncated E. coli form. Groups of 6 female C57B6 mice were injected daily with 0.3 μg of rTPCh of various types. For 2-7 days, blood was taken from the ophthalmic sinus for a complete blood count. The treated groups are as follows: TP 153 truncated form of TP from E. coli; TP 332 (mixed fraction), TP full length, containing approximately 80-90% TP full length and 10-20% cropped shape; TP332 (30K fraction) = purified trimmed fraction from the original "mixed"preparation; TP332 (70K fraction) = purified TP fractions of full length from the original "mixed" preparation. Data are presented as mean ± standard error of determination.

Фиг.30 представляет картинку, показывающую исследование KIRA ELISA для определения ТП. Чертеж показывает химеру MPL/Rse.gD и соответствующие части родительских рецепторов, так же как и окончательную конструкцию (правая часть чертежа) и плавную диаграмму (левая часть чертежа), показывающую соответствующие этапы исследования.FIG. 30 is a picture showing a KIRA ELISA assay for determining TP. The drawing shows the MPL / Rse.gD chimera and the corresponding parts of the parent receptors, as well as the final construction (the right side of the drawing) and a flowing diagram (the left side of the drawing) showing the corresponding stages of the study.

Фиг.31 представляет плавную диаграмму исследования KIRA ELISA, показывающую каждый этап в определении.31 is a flowchart of a KIRA ELISA study showing each step in the determination.

Фиг.32A-32L описывает нуклеотидную последовательность (Посл. No:22) вектора p3VI17.ID.LL экспрессии, использованного для экспрессии Rse.gD в Примере 17.Figa-32L describes the nucleotide sequence (Pos. No: 22) of the expression vector p3VI17.ID.LL used for the expression of Rse.gD in Example 17.

Фиг.33 является схематическим представлением приготовления плазмиды pMP1.Fig is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP1.

Фиг.34 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР21.Fig is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP21.

Фиг.35 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР151.Fig is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP151.

Фиг.36 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР202.Fig. 36 is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP202.

Фиг.37 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР172.Fig is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP172.

Фиг.38 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР210.Fig. 38 is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP210.

Фиг.39 является таблицей пяти лучших экспрессии ТП клонов из плазмиды рМР210 банка плазмид (Посл. No: 23, 24, 25, 26, 27 и 28).Fig. 39 is a table of the five best expression of TP clones from plasmid pMP210 plasmid bank (Pos. No: 23, 24, 25, 26, 27 and 28).

Фиг.40 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР41.40 is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP 41.

Фиг.41 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР57.Fig is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP57.

Фиг.42 является схематическим представлением приготовления плазмиды рМР251.Fig is a schematic representation of the preparation of plasmid pMP251.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

1. Определения1. Definitions

В основном, следующие слова или фразы имеют указанное определение, когда используются в описаниях, примерах и формуле изобретения.Basically, the following words or phrases have the indicated definition when used in the descriptions, examples and claims.

"Хаотропный агент" относится к соединению, которое в водном растворе и подходящей концентрации может вызвать изменения в пространственной конфигурации или конформации белка, по крайней мере, частично разрушая силы, ответственные за поддержку нормальной вторичной или третичной структуры белка. Подобные соединения включают, например, мочевину, гуанидин-НСl и тиоцианат натрия. Для оказания конформационного воздействия на белок обычно требуются высокие концентрации, 4-9 М, этих соединений.A "chaotropic agent" refers to a compound which, in an aqueous solution and in a suitable concentration, can cause changes in the spatial configuration or conformation of the protein, at least partially destroying the forces responsible for maintaining the normal secondary or tertiary structure of the protein. Such compounds include, for example, urea, guanidine-Hcl and sodium thiocyanate. High concentrations, 4–9 M, of these compounds are usually required to provide a conformational effect on the protein.

"Цитокин" - термин, характерный для белков, выделяемых одной клеточной популяцией, которые действуют на другие клетки как межклеточные медиаторы. Примерами подобных цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные полипептидные гормоны. К цитокинам относятся: гормон роста, инсулиноподобные факторы роста, гормон роста человека, N-метионил гормон роста человека, бычий гормон роста, паратиреоидный гормон, тироксин, инсулин, проинсулин, релаксин, прорелаксин, гормоны гликопротеинового ряда, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреостимулирующий гормон (ТСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ), гематопоэтический фактор роста, фактор роста печени, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, фактор некроза опухолей α (ФНО-α или ФНО-β), мюллериан-ингибирующая субстанция, ассоциированная с гонадотропином белок мыши, ингибин, активин, эндотелиальный фактор роста сосудов, интегрин, фактор роста нейронов, такой как ФРН-β, фактор роста тромбоцитов, трансформирующие факторы роста (ТФР), такие как ТФР-α и ТФР-β, инсулиноподобный фактор роста-1 и -2, эритропоэтин (ЭП), остеоиндуктивные факторы, интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ, колоние-стимулирующие факторы (КСФ), такие как макрофаг-КСФ (М-КСФ), гранулоцит-макрофаг-КСФ (ГМ-КСФ), и гранулоцит-КСФ (Г-КСФ), интерлейкины (ИЛ), такие как ИЛ-1, ИЛ-1α, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-12 и другие полипептидные факторы, включая КСФ, ФИЛ и kit-лиганд. Как здесь использовано, последующие термины предназначены для охвата белков из природных источников или рекомбинантных форм клеточных линий. Подобным же образом термины предназначаются для охвата биологически активных эквивалентных производных, а именно, различающихся в аминокислотной последовательности по одной или более аминокислот, или типу, или степени гликозилирования."Cytokine" is a term characteristic of proteins secreted by one cell population, which act on other cells as intercellular mediators. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and the usual polypeptide hormones. Cytokines include: growth hormone, insulin-like growth factors, human growth hormone, N-methionyl human growth hormone, bovine growth hormone, parathyroid hormone, thyroxine, insulin, proinsulin, relaxin, prorelaxin, glycoprotein hormones such as follicle-stimulating) thyroid-stimulating hormone (TSH) and luteinizing hormone (LH), hematopoietic growth factor, liver growth factor, fibroblast growth factor, prolactin, placental lactogen, tumor necrosis factor α (TNF-α or TNF-β), mullerian-inhibitory mouse gonadotropin-associated substance, inhibin, activin, endothelial vascular growth factor, integrin, neuron growth factor such as NGF-β, platelet growth factor, transforming growth factors (TGF), such as TGF-α and TGF-β, insulin-like growth factor-1 and -2, erythropoietin (EP), osteoinductive factors, interferons, such as interferon-α, -β and -γ, colony stimulating factors (CSF), such as macrophage-CSF (M-CSF), granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF), and granulocyte-CSF (G-CSF), interleukins (IL), such as IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 and other polypeptide factors, including CSF, PHIL and kit ligand. As used here, the following terms are intended to encompass proteins from natural sources or recombinant forms of cell lines. Similarly, the terms are intended to encompass biologically active equivalent derivatives, namely, those that differ in amino acid sequence in one or more amino acids, or in the type or degree of glycosylation.

"Лиганд mpl", "полипептидный лиганд mpl", "МЛ", тромбопоэтин" или "ТП" используются здесь взаимозаменяемо и включают любой полипептид, который проявляет способность связывания с mpl, членом супергруппы цитокиновых рецепторов, и обладающий биологическими свойствами МЛ, как показано ниже. Примером биологической особенности является способность стимулировать включение меченых нуклеотидов (а именно, 3H-тимидина) в ДНК ИЛ-3 зависимых Ba/F3 клеток, трансфецированных mpl P человека. Другим примером биологической особенности является способность стимулировать включение 35S в циркулирующие тромбоциты в исследовании восстановительного синтеза тромбоцитов. Данное определение заключает в себе полипептид, выделенный из источника mpl лиганда, такого как апластическая плазма свиньи, описанная здесь, или другого вида животных, включая человека, или полученный рекомбинантными путями или методами синтеза, и содержит различные формы, включая функциональные производные, фрагменты, аллели, изоформы и его аналоги.The “mpl ligand”, “mpl polypeptide ligand”, “ML”, thrombopoietin or “TP” are used interchangeably herein and include any polypeptide that exhibits binding ability to mpl, a member of the cytokine receptor supergroup, and having biological properties of ML, as shown below An example of a biological feature is the ability to stimulate the incorporation of labeled nucleotides (namely, 3 H-thymidine) into the DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P. Another example of a biological feature is the ability of to include the incorporation of 35 S into circulating platelets in a reductive platelet synthesis study.This definition includes a polypeptide isolated from a mpl ligand source, such as pig aplastic plasma described here, or another animal species, including humans, or obtained by recombinant pathways or synthetic methods , and contains various forms, including functional derivatives, fragments, alleles, isoforms and its analogues.

"Фрагмент лиганда МЛ" или "фрагмент ТП" - это часть естественно обнаруживаемого зрелого лиганда mpl полной длины, или последовательности ТП, имеющей делецию по одному или более аминокислотных остатков, или лишенных углеводных частей. Делеция аминокислотного остатка (остатков) может наблюдаться в любом месте белка, включая и N-терминальный, и С-терминальный конец, или внутри. Фрагмент имеет, по крайней мере, одно биологическое свойство, общее с лигандом mpl. Фрагменты лиганда mpl обычно будут иметь порядковую последовательность как минимум 10, 15, 20, 25, 30, или 40 аминокислотных остатков, которые идентичны последовательности лиганда mpl, выделенного из млекопитающего, включая лиганд, выделенный из апластической плазмы свиньи, или лиганд человека, или лиганд мыши, в особенности их ЭП-домен. Характерными примерами N-концевых фрагментов являются МЛч или ТП (Met-1 1-153).A “ML ligand fragment” or “TP fragment” is part of a naturally-occurring mature full length mpl ligand, or TP sequence, having a deletion of one or more amino acid residues, or lacking carbohydrate moieties. The deletion of amino acid residue (s) can be observed anywhere in the protein, including the N-terminal and C-terminal end, or inside. A fragment has at least one biological property common with the mpl ligand. Fragments of the mpl ligand will typically have an ordinal sequence of at least 10, 15, 20, 25, 30, or 40 amino acid residues that are identical to the sequence of the mpl ligand isolated from a mammal, including the ligand isolated from porcine aplastic plasma, or a human ligand or ligand mice, in particular their EP domain. Typical examples of N-terminal fragments are HF or TP (Met -1 1-153).

"Варианты лиганда mpl" или "варианты последовательности лиганда mpl", как здесь определено, означает биологически активный лиганд mpl, как определено ниже, имеющий менее чем 100% идентичности в последовательности с лигандом mpl, выделенным из рекомбинантной культуры клеток или апластической плазмы свиньи, или лиганд человека, имеющий выведенную последовательность, описанную в фиг.1 (Посл. No:l). Обычно биологически активный лиганд mpl будет обладать аминокислотной последовательностью, имеющей, по крайней мере, 70% идентичности с аминокислотной последовательностью лиганда mpl, выделенного из апластической плазмы свиньи или зрелого лиганда мыши, или человека, или их фрагментов, (см. фиг.1 [Посл. No:l]), предпочтительно, по крайней мере, около 75%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, еще более предпочтительно, не менее 85%, и еще более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95%.“Mpl ligand variants” or “mpl ligand sequence variants,” as defined herein, means a biologically active mpl ligand, as defined below, having less than 100% identity in sequence with an mpl ligand isolated from a recombinant pig cell or aplastic plasma culture, or a human ligand having the deduced sequence described in FIG. 1 (Ser. No: l). Typically, the biologically active mpl ligand will have an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of the mpl ligand isolated from aplastic plasma of a pig or mature mouse or human ligand, or fragments thereof, (see FIG. 1 [Post. . No: l]), preferably at least about 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, and even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%.

"Химерный лиганд mpl" - это полипептид, содержащий лиганд mpl полной длины, или один или более их фрагментов, слитых или связанных со вторым гетерологическим полипептидом, или с одним или более их фрагментами. Химера обладает, по крайней мере, одним биологическим свойством, общим с лигандом mpl. Второй полипептид обычно является цитокином, иммуноглобулином или их фрагментом.A “chimeric ligand mpl" is a polypeptide comprising a full length mpl ligand, or one or more fragments thereof, fused or linked to a second heterologous polypeptide, or one or more fragments thereof. A chimera has at least one biological property common with the mpl ligand. The second polypeptide is usually a cytokine, immunoglobulin, or a fragment thereof.

"Выделенный лиганд mpl", "высоко очищенный лиганд mpl" и "существенно гомогеннный лиганд mpl" используются взаимозаменяемо и обозначают лиганд mpl, который был очищен из источника для лиганда mpl или был получен рекомбинантным способом или методами синтеза и был существенно очищен от других пептидов или белков (1), с получением, по крайней мере, 15 и, предпочтительно, 20 аминокислотных остатков С-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, используя секвенатор с вращающимся реактором, или лучший коммерчески доступный аминокислотный секвенатор, или при помощи опубликованных способов согласно модификациям на дату заполнения данной заявки, или (2) до гомогенного состояния при помощи SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях, используя Coomassie blue или, предпочтительно, прокрашивание серебром. Гомогенное состояние здесь означает менее чем 5% загрязнение другими белками.The “isolated mpl ligand”, “highly purified mpl ligand” and “substantially homogeneous mpl ligand” are used interchangeably and refer to the mpl ligand that has been purified from the source for the mpl ligand or obtained by recombinant or synthetic methods and has been substantially purified from other peptides or proteins (1), with at least 15 and preferably 20 amino acid residues of the C-terminal or internal amino acid sequence using a rotary reactor sequencer, or the best commercially available amino acid with the Equator, or using published methods according to modifications on the date of filling out this application, or (2) to a homogeneous state using SDS-PAGE in non-reducing or restoring conditions, using Coomassie blue or, preferably, silver staining. A homogeneous state here means less than 5% contamination with other proteins.

"Биологическое свойство", когда использовано в связи с "лигандом mpl" или "выделенным лигандом mpl", обозначает наличие тромбопоэтической активности, или наличие in vivo эффекторной или антигенной функции, или активности, которая прямо или косвенно связана или вызвана лигандом mpl (так или иначе в естественной или денатурированной конформации) или его фрагментом. Эффекторные свойства включают в себя: связывание mpl и любая связывающая активность переносчика, агонизм или антагонизм mpl, в особенности в передаче пролиферативного сигнала, включая репликацию, функцию регуляции ДНК, модуляцию биологической активности других цитокинов, активацию рецепторов (особенно цитокиновых), деактивацию, прямую и обратную регуляцию, регуляцию роста клеток и дифференциацию и тому подобное. Антигенная функция означает обладание эпитопом или антигенным сайтом, который способен перекрестно реагировать с антителами, образовавшимися против природного лиганда mpl. Главное антигенное свойство полипептидного лиганда mpl состоит в том, что он связывается по сродству, по крайней мере, около 106 л/моль, с антителом, вырабатывающимся против лиганда mpl, выделенного из апластической плазмы свиньи. Обычно полипептид связывается по сродству, по крайней мере, около 107 л/моль. Наиболее предпочтительно, чтобы антигенно активный полипептидный лиганд mpl являлся полипептидом, который связывается с антителами, вырабатывающимися против лиганда mpl, имеющего одну из описанных выше эффекторных функций. Антитела, используемые для определения "биологической активности", являются поликлональными антителами кролика, вырабатывающимися на препарат лиганда mpl, выделенного из рекомбинантной культуры клеток или из апластической плазмы свиньи с полным адьювантом Freund'a при подкожной инъекции препарата и усилении иммунного ответа путем внутрибрюшинной инъекции препарата, до выхода на плато титра антител к лиганду mpl.“Biological property” when used in connection with the “mpl ligand” or “isolated mpl ligand” means the presence of a thrombopoietic activity, or the presence in vivo of an effector or antigenic function, or activity that is directly or indirectly related or caused by the mpl ligand (either otherwise in a natural or denatured conformation) or a fragment thereof. Effector properties include: mpl binding and any binding vector activity, mpl agonism or antagonism, especially in the transmission of a proliferative signal, including replication, DNA regulation, modulation of the biological activity of other cytokines, activation of receptors (especially cytokines), deactivation, direct and reverse regulation, regulation of cell growth and differentiation and the like. Antigenic function means having an epitope or antigenic site that is able to cross-react with antibodies formed against the natural mpl ligand. The main antigenic property of the mpl polypeptide ligand is that it binds by affinity of at least about 10 6 L / mol to an antibody produced against the mpl ligand isolated from pig aplastic plasma. Typically, a polypeptide binds by affinity of at least about 10 7 L / mol. Most preferably, the antigenically active mpl polypeptide ligand is a polypeptide that binds to antibodies produced against the mpl ligand having one of the above effector functions. The antibodies used to determine "biological activity" are rabbit polyclonal antibodies produced on the mpl ligand preparation isolated from recombinant cell culture or from aplastic pig plasma with Freund complete adjuvant by subcutaneous injection of the drug and enhancing the immune response by intraperitoneal injection of the drug, before reaching the plateau titer of antibodies to the ligand mpl.

"Биологически активный", когда использован в связи либо с термином "лиганд mpl", либо с "выделенный лиганд mpl", обозначает лиганд mpl или полипептид, который проявляет тромбопоэтическую активность, или обладает эффекторной функцией лиганда mpl, выделенного из апластической плазмы свиньи или экспрессированного в рекомбинантной клеточной культуре, описанной здесь. Основной известной эффекторной функцией лиганда mpl или его полипептида является связывание с mpl и стимуляция включения меченных нуклеотидов (3H-тимидина) в ДНК ИЛ-3 зависимых клеток Ba/F3, трансфецированных mpl P человека. Другой известной эффекторной функцией лиганда mpl или его полипептида является способность стимулировать включение 35S в циркулирующие тромбоциты в исследовании обратного связывания тромбоцитов у мыши. Еще одной известной эффекторной функцией лиганда mpl является способность стимулировать in vitro мегакириоцитопоэз у человека, который можно подсчитать путем использования радиоактивно меченных антител, специфических к гликопротеину GPllbllla мегакариоцита.“Biologically active” when used in connection with either the term “mpl ligand” or “isolated mpl ligand” means an mpl ligand or polypeptide that exhibits thrombopoietic activity, or has an effector function of an mpl ligand isolated from pig aplastic plasma or expressed in recombinant cell culture described herein. The main known effector function of the mpl ligand or its polypeptide is to bind to mpl and stimulate the incorporation of labeled nucleotides ( 3 H-thymidine) into the DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P. Another known effector function of the mpl ligand or its polypeptide is the ability to stimulate the incorporation of 35 S into circulating platelets in a mouse platelet reverse binding assay. Another well-known effector function of the mpl ligand is the ability to stimulate in vitro megakiriocytopoiesis in humans, which can be counted by using radioactively labeled antibodies specific for the megakaryocyte GPll b lll a glycoprotein.

"Процент идентичности аминокислотной последовательности", принимая во внимание последовательность лиганда mpl, определяется здесь в виде процентного соотношения аминокислотных остатков выбранной идентичной последовательности к остаткам последовательности лиганда mpl, выделенного из апластической плазмы свиньи, или лиганда мыши или человека, имеющего аминокислотную последовательность установленного происхождения, описанную на фиг.1 (Посл. No:1), после выпрямления последовательности и введения разрывов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности и, не учитывая любые консервативные замены, как часть идентичной последовательности. Никакие из N-концевых, или С-концевых, или внутренних расширений, делеций или вставок в последовательности лиганда mpl не должны быть истолкованы как влияющие на идентичность последовательности или гомологию. Таким образом, рассмотренные примеры биологически активных полипептидов лиганда mpl должны иметь идентичные последовательности, включая: препро-mpl лиганд, про-mpl лиганд и зрелый mpl лиганд."Percentage of amino acid sequence identity", taking into account the sequence of the mpl ligand, is defined here as the percentage of amino acid residues of the selected identical sequence to the residues of the mpl ligand isolated from aplastic pig plasma, or a mouse or human ligand having an amino acid sequence of an established origin described figure 1 (pos. No: 1), after straightening the sequence and introducing gaps, if necessary, to achieve ma the maximum percent sequence identity and, without considering any conservative substitutions, as part of an identical sequence. None of the N-terminal, or C-terminal, or internal extensions, deletions or insertions in the mpl ligand sequence should be construed as affecting sequence identity or homology. Thus, the considered examples of biologically active mpl ligand polypeptides should have identical sequences, including: prepro-mpl ligand, pro-mpl ligand and mature mpl ligand.

"Микросеквенирование лиганда mpl" может быть выполнено любым подходящим обычным способом, если способ достаточно чувствителен. В одном из таких способов высокоочищенные полипептиды, полученные из SDS геля, или на конечной стадии ЖХВР секвенируются непосредственно путем автоматизированного расщепления (фенилизотиоцианатного) по Edman, используя модель секвенатора 470А Applied Biosystems с газовой фазой, снабженным 120А фенилтиогидантоиновым (ФТГ) аминокислотным анализатором. Кроме этого, фрагменты лиганда mpl, полученные химическим путем (а именно, с CNBr, гидроксиламином, 2-нитро-5-тиоцианобензо-атом) или ферментативным (а именно, с трипсином, клострипаном, стафилококковой протеазой) расщеплением с последующей очисткой фрагментов (а именно, путем ЖХВР), могут быть секвенированы подобным же образом."Microsequencing of the mpl ligand" can be performed by any suitable conventional method if the method is sufficiently sensitive. In one of these methods, highly purified polypeptides obtained from an SDS gel, or at the final stage of HPLC, are sequenced directly by Edman automated phenylisothiocyanate cleavage using an Applied Biosystems 470A sequencer model with a gas phase equipped with 120A phenylthiohydantoin (FTG) amino acid analysis. In addition, fragments of the mpl ligand obtained chemically (namely, with CNBr, hydroxylamine, 2-nitro-5-thiocyanobenzo atom) or enzymatic (namely, with trypsin, clostripan, staphylococcal protease) cleavage followed by purification of the fragments (a namely, by HPLC) can be sequenced in a similar manner.

ФТГ аминокислоты исследовали при помощи системы данных ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA). Интерпретация последовательностей провели на компьютере VAX 11/785 Digital Equipment Co. как описано Henzel et al., J. Chromatography, 404: 41-52 [1987]. Равные доли фракций ЖХВР, необязательно, могут быть подвергнуты электрофорезу в 5-20% SDS-PAGE, перенесены под воздействие электротока на PDVF мембрану (ProBlott, AIB, Foster City, СА) и окрашены Кумасси бриллиантовым синим (Matsurdiara J. Biol. Chem., 262: 10035-10038 [1987]. Идентифицированный по окраске специфический белок вырезают из блота, а N-концевую последовательность подвергают обработке при помощи секвенатора с газовой фазой, описанного выше. Для внутренних последовательностей белка, фракции ЖХВР высушивают под вакуумом (SpeedVac), ресуспендируют в подходящем буфере и подвергают взаимодействию с цианоген бромидом, Лиз-специфическим ферментом Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA), или Acп-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). После гидролиза полученные белки секвенируются в смеси или после разделения на ЖХВР при разгонке на С4 колонке в градиенте пропанола и 0,1% TFA, перед секвенированием в газообразной фазе.PTH amino acids were examined using the ChromPerfect data system (Justice Innovations, Palo Alto, CA). The interpretation of the sequences was carried out on a computer VAX 11/785 Digital Equipment Co. as described by Henzel et al., J. Chromatography, 404: 41-52 [1987]. Equal fractions of HPLC fractions, optionally, can be electrophoresed in 5-20% SDS-PAGE, transferred by electric current to a PDVF membrane (ProBlott, AIB, Foster City, CA) and stained with Coomassie brilliant blue (Matsurdiara J. Biol. Chem. , 262: 10035-10038 [1987]. The color-identified specific protein was cut from the blot and the N-terminal sequence was processed using a gas phase sequencer described above. For internal protein sequences, HPLC fractions were dried under vacuum (SpeedVac), resuspend in a suitable buffer and confirm They interact with cyanogen bromide, the Lys-specific Lys-C enzyme (Wako Chemicals, Richmond, VA), or Ac-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). After hydrolysis, the obtained proteins are sequenced in a mixture or after separation in HPLC during distillation to C4 column in a gradient of propanol and 0.1% TFA, before sequencing in the gaseous phase.

"Тромбоцитопения" определяется как количество тромбоцитов в крови ниже 150×109 на литр."Thrombocytopenia" is defined as the number of platelets in the blood below 150 × 10 9 per liter.

"Тромбопоэтическая активность" определяется как биологическая активность, которая включает ускорение пролиферации, дифференциации и/или созревания мегакариоцитов или предшественников мегакариоцитов в тромбоцитообразующие формы этих клеток. Эта активность может быть измерена в различных исследованиях, включая исследование восстановительного синтеза тромбоцитов мыши in vivo, исследование индукции клеточного поверхностного антигена тромбоцитов, измеренное путем антитромбоцитарного иммуноанализа (anti-GPllbllla) для мегакариобластической клеточной лейкемии человека (СМК), и исследование индукции полиплоидизации в линии мегакариобластических клеток (DAMI)."Thrombopoietic activity" is defined as biological activity, which includes the acceleration of proliferation, differentiation and / or maturation of megakaryocytes or megakaryocyte precursors into platelet-forming forms of these cells. This activity can be measured in various studies, including an in vivo study of the reductive synthesis of mouse platelets, a study of the induction of cell surface platelet antigen, measured by anti-platelet immunoassay (anti-GPll b lll a ) for megakaryoblastic cell leukemia (QMS), and a polyploidization induction study in the megakaryoblastic cell line (DAMI).

"Тромбопоэтин" (ТП) определяется как соединение, имеющее тромбопоэтическую активность или способное увеличивать количество тромбоцитов в сыворотке млекопитающих. ТП преимущественно способен увеличивать количество эндогенных тромбоцитов, по крайней мере, на 10%, более предпочтительно, на 50%, и наиболее предпочтительно, способен увеличивать количество тромбоцитов у человека, более чем до 150×109 на литр крови."Thrombopoietin" (TP) is defined as a compound having thrombopoietic activity or capable of increasing platelet count in mammalian serum. TP is predominantly capable of increasing the number of endogenous platelets by at least 10%, more preferably 50%, and most preferably, it is able to increase the number of platelets in humans, more than 150 × 10 9 per liter of blood.

"Нуклеиновая кислота выделенного лиганда mpl" - это РНК или ДНК, содержащая более чем 16 и предпочтительно 20 или более последовательных оснований нуклеотидов, которые кодируют биологически активный лиганд mpl или его фрагмент, являющийся комплементарным к РНК или ДНК, или гибридизующимся с РНК или ДНК и сохраняющим стабильную связь при умеренных, до жестких условий. Данные РНК или ДНК свободны, по крайней мере, от единственного источника примесной нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природных условиях и, предпочтительно, существенно свободна от любой другой РНК или ДНК млекопитающих. Фраза "свободна, по крайней мере, от единственного источника примесной нуклеиновй кислоты, с которым она обычно связана" включает место, в котором обычно находятся нуклеиновые кислоты в источнике, или природную клетку, но в различном хромосомном положении, или в противном случае сцеплены с последовательностью нуклеиновых кислот, обычно не встречающихся в источнике клеток. Примером нуклеиновой кислоты выделенного лиганда mpl является РНК или ДНК, которые кодируют биологически активный лиганд mpl, обладая, по крайней мере 75% идентичности в последовательности, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, еще более предпочтительно 85%, и еще более предпочтительно 90%, и наиболее предпочтительно, 95% идентичности в последовательности с лигандом mpl человека, мыши или свиньи.An “isolated mpl ligand nucleic acid” is RNA or DNA containing more than 16 and preferably 20 or more consecutive nucleotide bases that encode the biologically active mpl ligand or a fragment thereof that is complementary to RNA or DNA, or that hybridizes with RNA or DNA and maintaining a stable bond under moderate to severe conditions. These RNAs or DNAs are free from at least the only source of impurity nucleic acid with which it is usually associated under natural conditions and, preferably, substantially free from any other mammalian RNA or DNA. The phrase "free from at least a single source of impurity nucleic acid with which it is usually associated" includes a place where nucleic acids are usually located in the source, or a natural cell, but in a different chromosomal position, or otherwise linked to a sequence nucleic acids not commonly found in the source of cells. An example of a nucleic acid of an isolated mpl ligand is RNA or DNA that encodes a biologically active mpl ligand having at least 75% sequence identity, more preferably at least 80%, even more preferably 85%, and even more preferably 90 %, and most preferably, 95% identity in sequence with the human, mouse, or pig mpl ligand.

"Контрольные последовательности", когда относятся к экспрессии, означают последовательности ДНК, необходимые для экспрессии операционно сцепленной к кодирующей последовательности в конкретном организме хозяина. Контрольные последовательности, применимые, например, для прокариот, включают промотор, необязательно операторную последовательность, участок связывания рибосом и, возможно, другие, еще недостаточно изученные последовательности. Клетки эукариотов, как известно, используют промоторы, сигналы полиаденилирования и усилители."Control sequences," when referring to expression, means DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. Control sequences useful, for example, for prokaryotes, include a promoter, optionally an operator sequence, a ribosome binding site, and possibly other, sequences that have not yet been studied. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signals and amplifiers.

"Операционно сцепленный", когда относится к нуклеиновым кислотам, означает, что нуклеиновые кислоты находятся в функциональной взаимосвязи с другими последовательностями нуклеиновых кислот. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторного лидера операционно сцеплена с ДНК для полипептида, если он экспрессирован как препротеин, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или усилитель является операционно сцепленным с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы, операционно сцеплен с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы усиливать трансляцию. В общем, "операционно сцепленный" означает, что сцепленные последовательности ДНК соприкасаются, и в случае секреторного лидера соприкасаются и в фазе считывания. Однако, усилители не должны соприкасаться. Сцепливание сопровождается лигацией в сайтах, подходящих для рестрикции. Если такие сайты не существуют, синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры используются в соответствии с общепринятым опытом.“Operationally linked” when referring to nucleic acids, means that the nucleic acids are in functional relationship with other nucleic acid sequences. For example, DNA for a subsequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein that is involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or amplifier is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site, operably linked to a coding sequence, if it is positioned to enhance translation. In general, “operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact, and in the case of a secretory leader, are also in contact in the reading phase. However, the amplifiers should not be in contact. Linking is accompanied by ligation at sites suitable for restriction. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with generally accepted experience.

"Экзогенная", когда относится к элементу, означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая является чужеродной для клетки или гомологичной для клетки, но в таком положении в нуклеиновой кислоте клетки хозяина, в котором элемент обычно не обнаруживается.“Exogenous” when referring to an element, means a nucleic acid sequence that is foreign to the cell or homologous to the cell, but at that position in the nucleic acid of the host cell, in which the element is not normally found.

"Клетка", "линия клеток" и "культура клеток" взаимозаменяемо используются здесь, и подобные обозначения включают всех потомков клетки или линии клетки. Таким образом, например, термины, такие как "трансформанты" и "трансформированные клетки", включают в себя предмет первичной клетки и происходящие из нее культуры вне зависимости от количества пересевов. Также понятно, что все потомки не могут быть совершенно идентичны по составу ДНК благодаря преднамеренным или случайным мутациям. Потомки мутантов, имеющие такие же функции или биологическую активность, как просеивается для обычно трансформированной клетки, также включены. Где предполагаются отличающиеся обозначения, они будут удалены из контекста."Cell", "cell line" and "cell culture" are used interchangeably herein, and similar designations include all descendants of a cell or cell line. Thus, for example, terms such as “transformants” and “transformed cells” include the subject of the primary cell and cultures derived from it, regardless of the number of transfers. It is also clear that all descendants cannot be completely identical in DNA composition due to intentional or random mutations. Descendants of mutants having the same functions or biological activity as sifted for a normally transformed cell are also included. Where different designations are intended, they will be removed from the context.

"Плазмиды" - автономно реплицирующиеся молекулы кольцевой ДНК, проявляющие независимую репликационную природу, и обозначены здесь маленькой буквой "р", которая ставится до и/или после заглавной буквы и/или номера. Исходные плазмиды здесь либо коммерчески доступны, открыто доступны без ограничений, либо могут быть получены из таких же доступных плазмид в соответствии с описанными способами. Помимо этого в технике известны другие эквивалентные плазмиды, которые будут доступны для обычного работника."Plasmids" are autonomously replicating molecules of circular DNA that exhibit an independent replicative nature, and are indicated here by the small letter "p", which is placed before and / or after the capital letter and / or number. The source plasmids here are either commercially available, openly available without limitation, or can be obtained from the same available plasmids in accordance with the described methods. In addition, other equivalent plasmids are known in the art that will be available to the average worker.

"Ограниченное ферментативное расщепление", когда относится к ДНК, означает каталитическое расщепление фосфодиэфирных связей ферментом, который реагирует только по определенным положениям или сайтам в последовательности ДНК. Такие ферменты названы "рестрикционными эндонуклеазами". Каждая рестрикционная эндонуклеаза узнает специфическую последовательность ДНК, называемую "рестрикционный сайт", который проявляет двустороннюю симметрию. Различные рестрикционные ферменты, используемые здесь, коммерчески доступны, и применены условия для реакции, кофакторы и другие требования, как установлено поставщиками ферментов. Рестрикционые ферменты обычно обозначены сокращениями, составленными из заглавной буквы и следующими за ней другими буквами, представляющими микроорганизм, из которого каждый рестрикционный фермент изначально был получен, и затем номер, обозначающий конкретный фермент. Обычно используют около 1 мкг плазмид или фрагмента ДНК с около 1-2 единицами фермента в около 20 мкл буферного раствора. Подходящие буферы и количество субстрата для конкретного рестрикционных ферментов определяются производителем. Обычно используют инкубацию в течение около 1 часа при 37°С, но их можно изменять в соответствии с указаниями поставщика. После инкубации белки или полипептиды удаляются путем экстракции фенолом и хлороформом, а расщепленная нуклеиновая кислота извлекается из водной фракции путем осаждения этанолом. Расщепление рестрикционным ферментом может быть продолжено гидролизом бактериальной щелочной фосфатазой концевых 5’фосфатов для предотвращения появления двух рестрикционно расщепленных концов фрагмента ДНК из "циркуляризующейся" (образующей кольцо) или формирующей замкнутую петлю, которая могла бы препятствовать инсерции (вставке) другого фрагмента ДНК в рестрикционный сайт. Если не установлено другое, расщепление плазмид не следует за 5’концевым дефосфорилированием. Общепринятые способы и реактивы для дефосфорелирования подробно описаны в разделах 1.56-1.61 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]."Limited enzymatic cleavage," when referring to DNA, means catalytic cleavage of phosphodiester bonds by an enzyme that reacts only at certain positions or sites in the DNA sequence. Such enzymes are called "restriction endonucleases." Each restriction endonuclease recognizes a specific DNA sequence called a "restriction site" that exhibits bilateral symmetry. The various restriction enzymes used herein are commercially available, and reaction conditions, cofactors, and other requirements are applied as established by enzyme suppliers. Restriction enzymes are usually indicated by abbreviations made up of a capital letter followed by other letters representing the microorganism from which each restriction enzyme was originally obtained, and then a number indicating a specific enzyme. Typically, about 1 μg of plasmid or DNA fragment is used with about 1-2 units of the enzyme in about 20 μl of buffer solution. Suitable buffers and the amount of substrate for a particular restriction enzyme are determined by the manufacturer. Usually incubation is used for about 1 hour at 37 ° C, but they can be changed according to the instructions of the supplier. After incubation, proteins or polypeptides are removed by extraction with phenol and chloroform, and the cleaved nucleic acid is extracted from the aqueous fraction by precipitation with ethanol. Cleavage with a restriction enzyme can be continued by hydrolysis of terminal 5'phosphates by bacterial alkaline phosphatase to prevent the appearance of two restriction cleaved ends of the DNA fragment from the "circulating" (forming a ring) or forming a closed loop that could prevent the insertion of another DNA fragment into the restriction site . Unless otherwise stated, plasmid cleavage does not follow 5’s dephosphorylation. Conventional methods and reagents for dephosphorylation are described in detail in sections 1.56-1.61 of Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

"Выход" или "выделение" данного фрагмента ДНК из расщепленного рестрикционного остатка означает выделение расщепленного остатка путем электрофореза на полиакриламиде или агарозном геле, идентификацию интересующего фрагмента путем сравнения его подвижности по отношению к маркерным фрагментам ДНК с известным молекулярным весом, выделяя из геля секцию, содержащую интересующий фрагмент, и разделяя гель и ДНК. Эти способы хорошо известны. Например, см. в Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9: 6103-6114 [1981] и Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980].“Exit” or “isolation” of a given DNA fragment from a cleaved restriction residue means the isolation of the cleaved residue by polyacrylamide or agarose gel electrophoresis, identification of the fragment of interest by comparing its mobility with respect to marker DNA fragments of known molecular weight, isolating from the gel a section containing fragment of interest, and separating gel and DNA. These methods are well known. For example, see Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9: 6103-6114 [1981] and Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980].

"Southern анализ" или "Southern блоттинг" - это метод, при помощи которого подтверждается присутствие последовательности ДНК в остатке ДНК или в композиции, содержащей ДНК, после расщепления рестрикционной эндонуклеазой путем гибридизации с известным меченым олигонуклеотидом или фрагментом ДНК. Southern анализ, как правило, включает в себя электрофоретическое разделение фрагментов ДНК и агарозного геля, денатурацию ДНК после электрофоретического разделения и перенос ДНК на нитроцеллюлозу, нейлон или другую подходящую мембранную подложку для анализа с радиоактивно меченным, биотинилированным или ферментативно-меченым зондом, как описано в разделах 9.37-9.52 Sambrook et al., там же."Southern analysis" or "Southern blotting" is a method by which the presence of a DNA sequence in a DNA residue or in a composition containing DNA is confirmed after cleavage with a restriction endonuclease by hybridization with a known labeled oligonucleotide or DNA fragment. Southern analysis typically involves electrophoretic separation of DNA fragments and an agarose gel, denaturation of DNA after electrophoretic separation, and transfer of DNA to nitrocellulose, nylon, or another suitable membrane substrate for analysis with a radiolabeled, biotinylated, or enzymatically labeled probe, as described in sections 9.37–9.52 of Sambrook et al., ibid.

"Nothern анализ" или "Nothern блот" - метод, используемый для идентификации последовательностей РНК, которые гибридизуются с известным зондом, таким как олигонуклеотид, фрагмент ДНК, кДНК или ее фрагмент, или фрагмент РНК. Зонд мечен радиоактивным изотопом, таким как 32P, или путем биотинилирования, или ферментативно. Анализируемую РНК обычно электрофоретически разделяют на агарозе или полиакриламидном геле, переносят на нитроцеллюлозу, нейлон или другую подходящую мембрану и гибридизируют с зондом, используя обычные способы, хорошо известные в методах, подобных тем, которые описаны в разделах 7.39-7.52 Sambrook et al., там же."Nothern analysis" or "Nothern blot" is a method used to identify RNA sequences that hybridize with a known probe, such as an oligonucleotide, DNA fragment, cDNA or fragment thereof, or RNA fragment. The probe is labeled with a radioactive isotope, such as 32 P, either by biotinylation or enzymatically. The analyzed RNA is usually electrophoretically separated on agarose or polyacrylamide gel, transferred onto nitrocellulose, nylon or another suitable membrane and hybridized with a probe using conventional methods well known in methods similar to those described in sections 7.39-7.52 of Sambrook et al., There same.

"Лигирование" - процесс образования фосфодиэфирных связей между двумя фрагментами нуклеиновых кислот. Для лигирования двух фрагментов концы данных фрагментов должны быть совместимы друг с другом. В некоторых случаях концы будут совместимы непосредственно после эндонуклеазного расщепления. Однако может возникнуть необходимость сначала преобразовать свободно колеблющиеся концы, обычно получающиеся в процессе эндонуклеазного расщепления, для выравнивания концов, чтобы придать им совместимость для лигирования. Для выравнивания концов ДНК обрабатывают в подходящем буфере, по крайней мере, 15 минут при 15°С с примерно 10 частями Klenow фрагмента ДНК-полимеразы I или Т4 ДНК-полимеразы в присутствии четырех дезоксирибонуклеотид трифосфатов. Затем ДНК очищают путем экстракциии фенол-хлороформом и осаждением этанолом. Фрагменты ДНК, которые должны быть лигированы, помещают в раствор в примерно эквимолярных количествах. Раствор также содержит АТФ, лигазный буфер и лигазу, такую как Т4 ДНК-лигаза в количестве примерно 10 единиц на 0,5 мкг ДНК. Если эта ДНК должна быть лигирована в вектор, вектор сначала выпрямляют путем расщепления подходящей рестрикционной эндонуклеазой (эндонуклеазами). Затем выпрямленный в линию фрагмент связывают с бактериальной щелочной фосфатазой или фосфатазой из кишечника теленка для предотвращения самолигации во время этапов лигации."Ligation" is the process of the formation of phosphodiester bonds between two fragments of nucleic acids. To ligate two fragments, the ends of these fragments must be compatible with each other. In some cases, the ends will be compatible immediately after endonuclease cleavage. However, it may be necessary to first convert the freely oscillating ends, usually obtained in the process of endonuclease cleavage, to align the ends to give them compatibility for ligation. To align the ends of the DNA, they are treated in a suitable buffer for at least 15 minutes at 15 ° C with about 10 parts of the Klenow fragment of DNA polymerase I or T4 DNA polymerase in the presence of four deoxyribonucleotides of triphosphates. The DNA is then purified by extraction with phenol-chloroform and ethanol precipitation. DNA fragments to be ligated are placed in solution in approximately equimolar amounts. The solution also contains ATP, ligase buffer and ligase, such as T4 DNA ligase in an amount of about 10 units per 0.5 μg of DNA. If this DNA is to be ligated into a vector, the vector is first straightened by cleavage with a suitable restriction endonuclease (endonuclease). The straightened fragment is then linked to bacterial alkaline phosphatase or calf intestine phosphatase to prevent self-ligation during ligation steps.

"Получение" ДНК из клеток означает выделение плазмидной ДНК из культуры клеток хозяина. Обычно для получения ДНК используется метод крупно- и мелкомасштабного получения плазмид, описанный в разделах 1.25-1.33 Sambrook et al., там же. После получения ДНК она может быть очищена при помощи способов, хорошо известных в технике, таких как описанные в разделе 1.40 Sambrok et al., там же."Obtaining" DNA from cells means the isolation of plasmid DNA from a host cell culture. Typically, the large- and small-scale plasmid production method described in sections 1.25-1.33 of Sambrook et al., Ibid., Is used to obtain DNA. Once DNA is obtained, it can be purified using methods well known in the art, such as those described in section 1.40 of Sambrok et al., Ibid.

"Олигонуклеотиды" - это короткие по длине, одиночные или двухнитевые полидезоксинуклетиды, которые химически синтезированы согласно известным химическим способам, таким как фосфотриэфирный, фосфитный или фосфорамидный, используя твердофазные технологии, такие, как описано в ЕР 266032, опубликованном 4 мая 1988 г., или через дезоксинуклеозид Н-фосфонатные интермедиаты, как описано Froeler et al., Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407 [1986]). Далее способы включают реакцию полимеразной цепи, описанную ниже, и другие аутопраймерные способы и синтез олигонуклеотидов на твердых субстратах. Все эти методы описаны Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engi., 28: 716-734 (1989). Данные способы применяются, если известна полная последовательность нуклеиновых кислот в гене или доступна последовательность нуклеиновых кислот, комплементарная кодирующей нити. Альтернативно, если мишень последовательности аминокислот известна, можно вывести возможные последовательности нуклеиновых кислот, используя известные и предпочтительные кодирующие остатки для каждого аминокислотного остатка. Олигонуклеотиды затем очищают на полиакриламидном геле."Oligonucleotides" are short, single or double-stranded polydeoxynucleotides that are chemically synthesized according to known chemical methods, such as phosphotriether, phosphite or phosphoramide, using solid-phase technologies such as described in EP 266032 published May 4, 1988, or via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates as described by Froeler et al., Nucl. Acids Res. 14: 5399-5407 [1986]). Further, the methods include the polymerase chain reaction described below, and other autoprimer methods and the synthesis of oligonucleotides on solid substrates. All of these methods are described by Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engi., 28: 716-734 (1989). These methods are used if the complete nucleic acid sequence in the gene is known or if a nucleic acid sequence complementary to the coding strand is available. Alternatively, if the target of the amino acid sequence is known, possible nucleic acid sequences can be deduced using known and preferred coding residues for each amino acid residue. The oligonucleotides are then purified on a polyacrylamide gel.

"Реакция полимеразной цепи" или "РПЦ" относится к методу или способу, в которой небольшие количества специфического фрагмента нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК размножают, как описано в Патенте США No.4683195, опубликованном 28 июля 1987 г. В целом, если требуется для доступности информация о последовательности из концов и интересующей области или помимо требующейся могут быть созданы подобные олигонуклеотидные праймеры; эти праймеры для амплификации будут идентичны или близки последовательности нити противоположного направления шаблона. 5’ нуклеотиды двух праймеров могут совпадать с концами амплифицируемого материала. РПЦ может быть использована для размножения специфических последовательностей РНК, специфических последовательностей ДНК из всей геномной ДНК и кДНК, считываемой со всей последовательности РНК клетки, бактериофага или плазмиды, и т.д. В целом, см. Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol., 51: 263 [1987]; Eriich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Как использовано здесь, РПЦ предположительно является одной, но не единственной, примером способа полимеразной реакции нуклеиновой кислоты для размножения исследуемого образца нуклеиновой кислоты, включающего использование известной нуклеиновой кислоты в виде праймера и нуклеиновой кислоты полимеразы для умножения или производства специфических фрагментов нуклеиновой кислоты."Polymerase chain reaction" or "ROC" refers to a method or method in which small amounts of a specific fragment of a nucleic acid, RNA and / or DNA are propagated as described in US Pat. No. 4,683,195, published July 28, 1987. Generally, if information about the sequence from the ends and the region of interest is required for accessibility, or similar oligonucleotide primers can be created in addition to the required one; these amplification primers will be identical or close to the sequence of the strand in the opposite direction of the template. The 5 ’nucleotides of the two primers may coincide with the ends of the amplified material. ROC can be used to propagate specific RNA sequences, specific DNA sequences from the entire genomic DNA and cDNA read from the entire RNA sequence of a cell, bacteriophage or plasmid, etc. In general, see Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol., 51: 263 [1987]; Eriich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). As used here, the ROC is presumably one, but not the only, example of a method for the polymerase reaction of a nucleic acid to propagate a test nucleic acid sample, comprising using a known nucleic acid in the form of a primer and nucleic acid polymerase to multiply or produce specific nucleic acid fragments.

"Строгие условия" - это те, когда (1) для промывки применяют низкая ионная сила и высокая температура, например, 0,015 М NaCl/0,0015 M цитрата натрия/0,1% NaDodSO4 (SDS) при 50°С, или (2) применяют в течение гибридизации денатурирующий агент, такой как формадид, например, 50% (об./об.) формадид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/01%, Фиколл/0,1% поливинилпирролидон/50 mM фосфатного буфера при рН 6,5 с 750 mM NaCl, 75 тМ цитрата натрия при 42°С. Другим примером является использование 50% формадида, 5×SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 mM фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5×раствор Denhardt’a, обработанная ультразвуком ДНК сперма лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS, и 10% сульфат декстрана при 42°С, с промывкой в 0,2×SSC и 0,1% SDS."Strict conditions" are those when (1) low ionic strength and high temperature are used for washing, for example, 0.015 M NaCl / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% NaDodSO 4 (SDS) at 50 ° C, or (2) a denaturing agent such as formadide, for example, 50% (v / v) formadide with 0.1% bovine serum albumin / 01%, Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM phosphate buffer, is used during hybridization at pH 6.5 with 750 mM NaCl, 75 tM sodium citrate at 42 ° C. Another example is the use of 50% formidide, 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhardt’s solution, treated ultrasound DNA of salmon sperm (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate at 42 ° C, with washing in 0.2 × SSC and 0.1% SDS.

"Умеренно строгие условия" описаны Sambrook et.al., там же, и включают в себя использование промывающего раствора и гибридизационных условий (а именно, температура, ионная сила и %SDS), менее строгих, чем описанные выше. Примерами умеренно строгих условий являются такие условия, как инкубация в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем: 20% формадида, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрия цитрата), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5×раствора Denhardt’a, 10% сульфата декстрана и 20 мкл/мл денатурированной порезанной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 1×SSC при около 37-50°С. Опытный работник разберет, как довести температуру, ионную силу и т.д. при необходимости согласования таких факторов, как длина зонда и подобное."Moderately stringent conditions" are described by Sambrook et.al., ibid., And include the use of a washing solution and hybridization conditions (namely, temperature, ionic strength and% SDS), less stringent than those described above. Examples of moderately stringent conditions are conditions such as overnight incubation at 37 ° C in a solution containing: 20% formidide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6) , 5 × Denhardt’s solution, 10% dextran sulfate and 20 μl / ml denatured cut salmon sperm DNA, followed by washing the filters in 1 × SSC at about 37-50 ° C. An experienced worker will figure out how to bring temperature, ionic strength, etc. if necessary, coordination of factors such as probe length and the like.

"Антитела" (AT) и "Иммуноглобулины" (ИГ) - это гликопротеины, имеющие одинаковые структурные характеристики. Во время того как антитела проявляют специфичность в связывании со специфическими антигенами, иммуноглобулины включают и антитела, и другие подобные антителам молекулы, которые лишены антигенной специфичности. Полипептиды последнего вида, например, продуцируются лимфатической системой на низких уровнях и на повышенном уровне при миеломах.Antibodies (AT) and Immunoglobulins (IG) are glycoproteins that have the same structural characteristics. While antibodies exhibit specificity in binding to specific antigens, immunoglobulins include antibodies and other antibody-like molecules that lack antigenic specificity. The polypeptides of the latter species, for example, are produced by the lymphatic system at low levels and at an elevated level in myelomas.

"Естественные антитела и иммуноглобулины" представляют обычно гетеротетрамерные гликопротеины массой около 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (Л) цепей и двух идентичных тяжелых (Т) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связью, хотя количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями различается у различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет обычно расположенные внутри цепи дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VT), следующий после многочисленных постоянных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VЛ) и постоянный домен на другом его конце; постоянный домен легкой цепи располагается вдоль первого постоянного домена тяжелой цепи, а легкий вариабельный домен располагается вдоль вместе с вариабельным доменом тяжелой цепи. Предполагается, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу раздела между легкой и тяжелой цепью вариабельных доменов (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-4596 [1985])."Natural antibodies and immunoglobulins" are usually heterotetrameric glycoproteins weighing about 150,000 daltons, consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (T) chains. Each light chain is linked to the heavy chain through a single covalent disulfide bond, although the number of disulfide bonds between the heavy chains varies for different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also typically has disulfide bridges located within the chain. Each heavy chain has at one end a variable domain (V T ) following the multiple constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (V L ) and a constant domain at its other end; the constant domain of the light chain is located along the first constant domain of the heavy chain, and the light variable domain is located along with the variable domain of the heavy chain. Specific amino acid residues are believed to form the interface between the light and heavy chains of the variable domains (Clothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4592-4596 [1985]).

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что определенные части вариабельного домена обширно различаются в последовательности между антителами и используются для связывания и (придания) специфичности каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. Однако вариабильность не равным образом распределена по вариабельным доменам антител. Она концентрируется в трех фрагментах, называемых областями определения комплементарности (ООК) или гипервариабельными областями в обеих: и в легкой цепи, и в тяжелой цепи вариабельных доменов. Более высококонсервативная часть вариабельных доменов называется рабочей рамкой (РР). Вариабельные домены естественных тяжелой и легкой цепей, каждая, содержит четыре области РР, в значительной степени, адаптирована к β-складчатой конфигурации, соединенных тремя ООК, которые образуют петли соединений и в некоторых случаях образуют часть β-складчатой структуры. ООК в каждой цепи поддерживаются вместе в тесной близости к РР области и к ООК из другой цепи, вносящей вклад в образование участка связывания антигена на антителах (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, [1987]). Постоянные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела к антигену, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависимой от антител клеточной токсичности.The term "variable" refers to the fact that certain parts of the variable domain vary widely in sequence between antibodies and are used to bind and (impart) the specificity of each specific antibody to its specific antigen. However, the variability is not equally distributed across the variable domains of antibodies. It is concentrated in three fragments, called complementarity determining regions (KLOs) or hypervariable regions in both: the light chain and the heavy chain of variable domains. The more highly conservative part of variable domains is called the working frame (PP). The variable domains of the natural heavy and light chains, each containing four regions of PP, are largely adapted to the β-folded configuration, connected by three OOKs, which form loop compounds and in some cases form part of the β-folded structure. The OOKs in each chain are maintained together in close proximity to the PP region and to the OOKs from the other chain, contributing to the formation of an antigen binding site on antibodies (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, [1987]). Permanent domains are not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as the participation of an antibody in antibody-dependent cellular toxicity.

Расщепление антител папаином дает два идентичных фрагмента связывания антигена, называемых "Fab" фрагментами, каждый с одним участком связывания антигена, и оставшимся "Fc" фрагментом, чье имя отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка трипсином дает F(ab’)2 фрагмент, который имеет две соединенных области связывания антигена, и по-прежнему способный к перекрестному связыванию антигена.Papain digestion of antibodies produces two identical antigen binding fragments, called "Fab" fragments, each with one antigen binding site, and the remaining "Fc" fragment, whose name reflects its ability to crystallize easily. Trypsin treatment gives the F (ab ') 2 fragment, which has two connected antigen binding sites and is still capable of cross-linking the antigen.

"Fv" представляет минимальный фрагмент антитела, который содержит полный участок распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной связи. Именно в этой конфигурации, в которой взаимодействуют три ООК каждого из вариабельных доменов, устанавливается участок связывания антигена на поверхности VT-VЛ димера. Все вместе шесть ООК придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже в одном вариабельном домене (или половине Fv, содержащей только три ООК, специфических к антигену) имеется способность для распознавания и связывания антигена, хотя при более низком сродстве, чем у полного участка связывания."Fv" represents a minimal fragment of an antibody that contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of the variable domain of one heavy and one light chain in close non-covalent bond. It is in this configuration, in which three OOKs of each of the variable domains interact, that the antigen binding site is established on the surface of the V T -V L dimer. Together, six KLOs give the antibody specificity for antigen binding. However, even in one variable domain (or half of the Fv, containing only three KLOs specific for the antigen), there is the ability to recognize and bind antigen, although at a lower affinity than the full binding site.

Fab фрагмент также содержит постоянный домен легкой цепи и первый постоянный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab’ фрагменты отличаются от Fab фрагментов добавлением нескольких остатков в карбокси-конце тяжелой цепи СН1 домена, включая один или более цистеинов из области петли антитела. Fab’-SH является здесь обозначением для Fab’, в котором остаток(и) цистеина постоянного домена несут три свободных тиольных группы. Фрагменты F(ab’)2 антитела обычно продуцируются в виде пар Fab’ фрагментов, которые имеют цистеины в петле между ними. Известно также другое химическое соединение фрагментов антитела.The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab 'fragments differ from Fab fragments by the addition of several residues at the carboxy terminus of the heavy chain of the CH1 domain, including one or more cysteines from the loop region of the antibody. Fab'-SH is the designation for Fab 'here, in which three free thiol groups are carried by the cysteine residue (s) of the constant domain. Antibody F (ab ') 2 fragments are typically produced as pairs of Fab' fragments that have cysteines in the loop between them. Another chemical compound of antibody fragments is also known.

"Легкие цепи" антител (иммуноглобулины) из любого вида позвоночных могут быть определены к одному или двум четко различающимся типам, называемым каппа и ламбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их постоянных доменов.The light chains of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species can be identified to one or two distinctly different types, called kappa and lambda (λ), based on the amino acid sequences of their constant domains.

Иммуноглобулины могут быть разделены на различные классы в зависимости от их аминокислотных последовательностей постоянного домена тяжелых цепей. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из этих классов могут быть подразделены далее на подклассы (изотипы), а именно: IgG-1, IgG-2, IgG-3 и IgG-4; IgA-1 и IgA-2. Постоянные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов названы α, дельта, эпсилон, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов хорошо известна.Immunoglobulins can be divided into different classes depending on their amino acid sequences of the constant domain of heavy chains. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and several of these classes can be further subdivided into subclasses (isotypes), namely: IgG-1, IgG-2, IgG-3 and IgG-4; IgA-1 and IgA-2. The heavy chain constant domains that correspond to different classes of immunoglobulins are named α, delta, epsilon, γ, and μ, respectively. The structure of the subunits and the three-dimensional configuration of various classes of immunoglobulins are well known.

Термин "антитело" используется в самом широком смысле и специфически охватывает одни моноклональные антитела (включая агонисты и антагонисты антител), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, так же как и фрагменты антител (а именно, Fab, F(ab’)2 и Fv) и так далее, пока они проявляют желаемую биологическую активность.The term “antibody” is used in its broadest sense and specifically encompasses monoclonal antibodies alone (including antibody agonists and antagonists), antibody compositions with polyepitopic specificity, as well as antibody fragments (namely, Fab, F (ab ') 2 and Fv) and so on, until they exhibit the desired biological activity.

Термин "моноклональное антитело", как здесь использовано, относится к антителу, полученному из популяции существенно гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных естественно наблюдающихся мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональые антитела являются высокоспецифическими, поскольку направлены против одного антигенного участка. Более того, в противоположность к общепринятым (поликлональным) препаратам антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело является направленным против одного детерминанта на антигене. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела выгодны в том, что они синтезируются гибридомной культурой, не загрязненной другими иммуноглобулинами. Модифицированный "моноклон" отмечает характер антитела как получаемого из существенно гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано, как требующееся получение антител любым другим конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые должны использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975), или получены методами рекомбинации ДНК (см., например, Патент США No.4816567 [Cabilly et.al.]).The term "monoclonal antibody", as used here, refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies that make up the population are identical except for naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific because they are directed against a single antigenic site. Moreover, in contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against one determinant on the antigen. In addition to their specificity, monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized by a hybridoma culture not contaminated with other immunoglobulins. The modified "monoclone" marks the nature of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and should not be construed as required to produce antibodies in any other specific way. For example, monoclonal antibodies to be used in accordance with the present invention can be obtained by the hybridoma method first described by Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975), or obtained by DNA recombination methods (see, for example, US Patent No. 4816567 [Cabilly et.al.]).

Моноклональные антитела здесь включают в себя "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антител, происходящих от определенных видов или относящихся к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи (цепей) идентичен с, либо гомологичен соответствующей последовательности антител, происходящих от другого вида, либо относящихся к другому классу или подклассу антител, так же, как и фрагменты таких антител, пока они проявляют желаемую биологическую активность (Патент США No.4816567 (Cabilly et al.); и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]).Monoclonal antibodies here include "chimeric" antibodies (immunoglobulins), in which part of the heavy and / or light chain is identical or homologous to the corresponding sequence of antibodies, originating from certain species or belonging to a specific class or subclass of antibodies, while the remainder of the chain ( chains) is identical with, or homologous to the corresponding sequence of antibodies, derived from another species, or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as fragments of such antibodies, while they manifest yayut desired biological activity (U.S. Patent No.4816567 (Cabilly et al); and Morrison et al, Proc Natl Acad Sci USA, 81:...... 6851-6855 [1984]).

"Очеловеченные" формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие, как Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 или другие связывающие антиген подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого иммуноглобулина. В основной части очеловеченные антитела являются иммуноглобулинами человека (антитела реципиента), в которых участки из области, определяющей комплементарность (ООК) реципиента, заменены участками из (ООК) нечеловеческих видов (антитела донора), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемой специфичностью, сродством и емкостью. В некоторых случаях остатки рабочей рамки у Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Более того, очеловеченные антитела могут включать в себя остатки, которые не находят ни в антителах реципиента, ни во внесенных ООК, или последовательностях рабочей рамки. Эти модификации сделаны для дальнейшего усовершенствования и упорядочивания представления антител. В основном, очеловеченные антитела будут включать существенно все из, по крайней мере, одного и обычно двух изменяемых доменов, в которых все или существенно все ООК области соответствуют тем нечеловеческим иммуноглобулинам, и все или существенно все FR области являются теми согласованным последовательностям иммуноглобулина человека. Очеловеченные антитела оптимально будут также включать, по крайней мере, часть постоянной области иммуноглобулина (Fc), которая типична для иммуноглобулина человека. Для дальнейших подробностей см.: Jones et al., Nature, 321: 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 [1988]; и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 [1992])."Humanized" forms of non-human (eg, murine) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (such as Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 or other antigen-binding antibody subsequences) that contain a minimal sequence, originating from non-human immunoglobulin. In the main part, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibodies), in which regions from the complementarity determining region (KLO) of the recipient are replaced by regions from (KLO) non-human species (donor antibodies), such as a mouse, rat or rabbit, having the desired specificity , affinity and capacity. In some cases, the remnants of the working frame of the Fv human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Moreover, humanized antibodies can include residues that are not found either in the recipient's antibodies, nor in the inserted OOK, or the sequences of the working frame. These modifications are made to further improve and streamline the presentation of antibodies. Basically, humanized antibodies will include essentially all of at least one and usually two variable domains, in which all or substantially all of the KLO regions correspond to those non-human immunoglobulins, and all or substantially all FR regions are those consistent sequences of human immunoglobulin. Humanized antibodies will optimally also include at least part of the constant region of immunoglobulin (Fc), which is typical for human immunoglobulin. For further details see: Jones et al., Nature, 321: 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 [1988]; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 [1992]).

"He иммуногенный у человека" означает, что при условиях контактирования полипептида на фармацевтически приемлемом носителе и в терапевтически эффективных количествах с подходящей тканью человека состояние чувствительности или устойчивости к полипептиду вплоть до второго введения полипептида после надлежащего латентного периода (а именно, от 8 до 14 дней) не проявляется.“He is immunogenic in humans” means that under conditions of contacting the polypeptide on a pharmaceutically acceptable carrier and in therapeutically effective amounts with a suitable human tissue, the state of sensitivity or resistance to the polypeptide up to the second administration of the polypeptide after an appropriate latent period (namely, from 8 to 14 days ) does not appear.

II. Предпочтительные воплощения изобретенияII. Preferred Embodiments

Предпочтительные пептиды настоящего изобретения являются существенно гомогенным полипептидом(ами), касаясь как лиганда(ов) mpl или тромбопоэтина (ТП), которые проявляют свойство связывания с mpl, членом суперсемейства цитокиновых рецепторов, обладающие биологическим свойством стимуляции включения меченых нуклеотидов (3H-тимидина) в ДНК ИЛ-3 зависимых Ba/F3 клеток, трансфецированных mpl P человека. Более предпочтительным лигандом(ами) mpl является выделенный белок(ки), обладающие гематопоэтической, в особенности мегакариоцитопоэтической или тромбоцитопоэтической активностью - а именно, способные к стимуляции пролиферации, созреванию и/или дифференциации незрелых мегакариоцитов или их предшественников в зрелые продуцирующие тромбоциты формы. Большинство предпочтительных полипептидов настоящего изобретения являются лигандом(ами) mpl человека, включая их фрагменты, обладающие гематопоэтической, мегакариоцитопоэтической или тромбоцитопоэтической активностью. Этот лиганд(ы) mpl человека необязательно лишены гликозилирования. Другие предпочтительные лиганды mpl человека являются "доменом ЭП" МЛч, касаясь как МЛч153 или ТПч153, усеченной формы МЛч, так и касаясь МЛЧ245 или ТПЧ245, и зрелым полипептидом полной длины, имеющим аминокислотную последовательность, показанную на фиг.1 (Посл. No:1), касаясь как МЛч, МЛч332 или ТПч332 и вариантов биологически активных заменителей МЛч(R153А, R154A).Preferred peptides of the present invention are substantially homogeneous polypeptide (s), touching either ligand (s) mpl or thrombopoietin (TP), which exhibit binding property to mpl, a member of the cytokine receptor superfamily, having biological property to stimulate the incorporation of labeled nucleotides ( 3 H-thymidine) in the DNA of IL-3 dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P. A more preferred mpl ligand (s) is the isolated protein (s) having hematopoietic, especially megakaryocytopoietic or thrombocytopoietic activity - namely, capable of stimulating the proliferation, maturation and / or differentiation of immature megakaryocytes or their precursors into mature platelet-producing forms. Most preferred polypeptides of the present invention are human mpl ligand (s), including fragments thereof having hematopoietic, megakaryocytopoietic or thrombocytopoietic activity. This ligand (s) of human mpl is not necessarily devoid of glycosylation. Other preferred human mpl ligands are the “EP domain" of MLC, touching both MLC 153 or TFC 153 , truncated form of MLC, and touching MLC 245 or TFC 245, and a mature full-length polypeptide having the amino acid sequence shown in Fig. 1 (Last. : 1), referring to both Mlch, Mlch 332 or TPC 332 and variants of biologically active substitutes of Mlch (R153A, R154A).

Необязательно предпочтительными полипептидами настоящего изобретения являются биологически или иммунологически активные варианты лигандов mpl, выбранные среди МЛч2, МЛч3, МЛч4, МЛм, МЛм2, МЛм3, МЛс иМЛс2.Optionally preferred polypeptides of the present invention are biologically or immunologically active variants of the mpl ligands selected from Mlch2, Mlch3, Mlch4, MLm, MLm2, MLm3, MLs and MLs2.

Необязательно предпочтительными полипептидами настоящего изобретения является биологически активный вариант(ы) лиганда mpl, который имеет аминокислотную последовательность, обладающую, по крайней мере, 70% идентичной аминокислотной последовательности с лигандом mpl человека (см. фиг.1 [Посл. No: 1]), лиганд mpl мыши (см. фиг.16 [Посл. No: 12 и 13]), рекомбинантный лиганд mpl свиньи (см. фиг.19 [Посл. No: 18]), или лиганд mpl свиньи, выделенный из апластической плазмы свиньи, предпочтительно, по крайней мере, 75%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, еще более предпочтительно, по крайней мере, 85%, и еще более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95%.Optional preferred polypeptides of the present invention are the biologically active variant (s) of the mpl ligand, which has an amino acid sequence having at least 70% of the identical amino acid sequence with the human mpl ligand (see FIG. 1 [Ser. No: 1]), mouse mpl ligand (see FIG. 16 [Last No: 12 and 13]), a recombinant pig mpl ligand (see FIG. 19 [Last No: 18]), or a pig mpl ligand isolated from aplastic pig plasma, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more pre respectfully, at least 85%, and even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%.

Лиганд mpl, выделенный из апластической плазмы свиньи, имеет следующие характеристики:The mpl ligand isolated from pig aplastic plasma has the following characteristics:

(1) Частично очищенный лиганд элюируется с колонки при гель фильтрации как PBS; PBS, содержащим 1% SDS или PBS, содержащим 4М MgCl2, при Mr 60000-70000;(1) The partially purified ligand is eluted from the column by gel filtration as PBS; PBS containing 1% SDS or PBS containing 4M MgCl 2 at Mr 60000-70000;

(2) Активность лиганда нарушается проназой;(2) Ligand activity is disturbed by pronase;

(3) Лиганд стабилен при низком рН (2,5), SDS до 0,1% и 2М мочевине;(3) The ligand is stable at low pH (2.5), SDS up to 0.1% and 2M urea;

(4) Лиганд является гликопротеином, что основано на его способности связываться к различными лектиновыми колонками;(4) A ligand is a glycoprotein based on its ability to bind to various lectin columns;

(5) Высокоочищенный лиганд элюируется при SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях с Mr 25000-35000. Меньшее количество активности также элюируется при Mr 18000-22000 и 60000;(5) The highly purified ligand elutes with SDS-PAGE under non-reducing conditions with Mr 25000-35000. Less activity is also eluted at Mr 18000-22000 and 60,000;

(6) Высокоочищенный лиганд разделяется при восстанавливающих условиях при SDS-PAGE в виде дублета с Mr 28000 и 31000;(6) The highly purified ligand is separated under reducing conditions under SDS-PAGE as a doublet with Mr 28000 and 31000;

(7) Амино-концевая последовательность полос при 18000-22000, 28000 и 31000 является одинаковой SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (Посл. No: 29); и(7) The amino-terminal sequence of the bands at 18000-22000, 28000 and 31000 is the same SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (Last No: 29); and

(8) Лиганд связывается и элюируется со следующих колонок(8) The ligand binds and elutes from the following columns

Blue-Sepharose,Blue-sepharose,

CM Blue-Sepharose,CM Blue-Sepharose,

MONO-Q,MONO-Q,

MONO-S,MONO-S,

Лентил-лектин-Сефароза,Lentil-Lectin-Sepharose,

WGA-Sepharose,WGA-Sepharose,

Кон-А-Сефароза,Con-A-Sepharose,

Эфир 650м Toyoperl,Ether 650m Toyoperl,

Бутил 650 м Toyoperl,Butyl 650 m Toyoperl,

Фенил 650 м Toyoperl, иPhenyl 650 m Toyoperl, and

Фенил-Сефароза.Phenyl Sepharose.

Более предпочтительными полипептидами лиганда mpl являются те, которые кодируют геномную или кДНК, имеющую аминокислотную последовательность, описанную на фиг.1 (Посл. No: 1).More preferred mpl ligand polypeptides are those that encode a genomic or cDNA having the amino acid sequence described in FIG. 1 (Ser. No: 1).

Другие предпочтительные естественно встречающиеся биологически активные полипептиды лиганда mpl настоящего изобретения включают лиганд препро-mpl, лиганд про-mpl, зрелый лиганд mpl, фрагменты лиганда mpl и их гликозилированные варианты.Other preferred naturally occurring biologically active mpl ligand polypeptides of the present invention include the prepro-mpl ligand, the pro-mpl ligand, the mature mpl ligand, the mpl ligand fragments, and glycosylated variants thereof.

Еще другие предпочтительными полипептидами настоящего изобретения включают последовательности вариантов и химер лиганда mpl. Обычно предпочтительной последовательностью вариантов и химер лиганда mpl являются биологически активные варианты лиганда mpl, которые имеют аминокислотную последовательность, обладающую, по крайней мере, 70% идентичностью последовательности с лигандом mpl человека, или лигандом mpl, выделенным из апластической плазмы свиньи, предпочтительно, по крайней мере, 75%, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, еще более предпочтительно, по крайней мере, 85%, и еще более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95%. Примером предпочтительного варианта лиганда mpl является N-концевой домен варианта МЛч (называемый как "ЭП-домен" из-за его гомологии с эритропоэтином). Предпочтительный ЭП-домен МЛч включает около 153 первых аминокислотных остатков зрелого МЛч и обозначен как МЛч153. Предпочтительная последовательность варианта МЛч, необязательно, включает одну, в которой один или более основной или два основных аминокислотных остатка(ков) в С-концевом домене являются замененными на неосновной аминокислотный остаток(ки) (например, гидрофобный, нейтральный, кислый, ароматический, Гли, Про и подобный). Предпочтительная последовательность С-концевого домена варианта МЛч включает одну, в которой остатки Арг 153 и 154 заменены на остатки Aла. Этот вариант обозначен как МЛч332 (R153A, R154A). Альтернативно предпочтительный вариант МЛч включает либо МЛч332 или МЛч153, в которых аминокислотные остатки 111-114 (QLPP или LPPQ) удалены или заменены различными тетрапептидными последовательностями (например, AGAG или подобная). Последующие мутанты с делениями обозначены как Δ4МЛч332 или Δ4МЛч153.Still other preferred polypeptides of the present invention include variant sequences and mpl ligand chimeras. Generally, the preferred sequence of variants and chimeras of the mpl ligand are biologically active variants of the mpl ligand, which have an amino acid sequence having at least 70% sequence identity with the human mpl ligand or mpl ligand isolated from pig aplastic plasma, preferably at least , 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, and even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% . An example of a preferred variant of the mpl ligand is the N-terminal domain of the MLC variant (referred to as the "EP domain" because of its homology with erythropoietin). A preferred HF EP domain includes about 153 first amino acid residues of mature HF and is designated as HF 153 . The preferred sequence of the HFM variant optionally includes one in which one or more basic or two basic amino acid residues (s) in the C-terminal domain are replaced by non-basic amino acid residue (s) (e.g., hydrophobic, neutral, acidic, aromatic, Gly , Pro and the like). A preferred sequence of the C-terminal domain of the HF variant includes one in which Arg residues 153 and 154 are replaced by Al residues. This option is designated as MLC 332 (R153A, R154A). Alternatively, the preferred HFM variant includes either HF 332 or HF 153 , in which amino acid residues 111-114 (QLPP or LPPQ) are deleted or replaced with various tetrapeptide sequences (e.g., AGAG or the like). Subsequent mutants with divisions are designated as Δ4MLch 332 or Δ4MLch 153 .

Предпочтительной химерой является слияние между лигандом mpl или его фрагментом (определенным ниже) с гетерологическим полипептидом или его фрагментом. Например, МЛч153 может быть слит с фрагментом IgG для улучшения времени полужизни в плазме или с ИЛ-3, Г-КСФ или ЭП для получения молекулы с увеличенной тромбопоэтической или химерной гематопоэтической активностью.A preferred chimera is fusion between an mpl ligand or fragment thereof (as defined below) with a heterologous polypeptide or fragment thereof. For example, MLC 153 can be fused with an IgG fragment to improve plasma half-life or with IL-3, G-CSF or EP to produce a molecule with increased thrombopoietic or chimeric hematopoietic activity.

Альтернативно предпочтительным химерным лигандом mpl человека является "химера МЛ-ЭП домен", включающий N-концевые от 153 до 157 остатки, замененные на один или более, но не все, остатки ЭП человека, расположенные в ряд, как показано на фиг. 10 (Посл. No: 7). В настоящем воплощении химера МЛч была бы около 153-166 остатков длиной, в которых отдельные или сгруппированные в блок остатки из последовательности ЭП человека добавлены или заменены на последовательность МЛч в положениях, соответствующих расположению в ряд, показанному на фиг. 10 (Посл. No: 6). Примерная блок-последовательность, вводимая в N-конецевую часть МЛч, включала бы один или более участков N-гликозилирования в положениях (ЭП) 24-26, 38-40 и 83-85; один или более предсказанных алифатичеких α-спиральных складок в положениях (ЭП) 9-22, 59-76, 90-107 и 132-152; и другие высококонсервативные области, включая N-концевую и С-концевую области, и положения остатков (ЭП) 44-52 (см., например. Wen et al., Blood, 82: 1507-1516 [1993] и Boissel et al., J. Biol. Chem., 268(21): 15983-15993 [1993]). Предполагается, этот "химера МЛ-ЭП домен" будет иметь смешанную тромбопоэтическую-эритропоэтическую (ТЭП) биологическую активность.Alternatively, the preferred human mpl chimeric ligand is a "ML-EP domain chimera" comprising N-terminal 153 to 157 residues replaced by one or more, but not all, human EP residues arranged in a row, as shown in FIG. 10 (Last No: 7). In the present embodiment, the MLC chimera would have about 153-166 residues in length in which individual or grouped residues from the human EP sequence are added or replaced with the MLC sequence at positions corresponding to the row arrangement shown in FIG. 10 (Last No: 6). An exemplary block sequence introduced into the N-terminal portion of the MLC would include one or more N-glycosylation sites at positions (EP) 24-26, 38-40 and 83-85; one or more predicted aliphatic α-helical folds at positions (EP) 9-22, 59-76, 90-107 and 132-152; and other highly conserved regions, including the N-terminal and C-terminal regions, and residue positions (EP) 44-52 (see, for example, Wen et al., Blood, 82: 1507-1516 [1993] and Boissel et al. J. Biol. Chem., 268 (21): 15983-15993 [1993]). It is assumed that this "ML-EP domain chimera" will have mixed thrombopoietic-erythropoietic (TEP) biological activity.

Другие предпочтительные полипептиды настоящего изобретения включают фрагменты лиганда mpl, имеющие порядковую последовательность, по крайней мере, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 аминокислотных остатков, которые идентичны последовательности лиганда mpl, выделенного из апластической плазмы свиньи или лиганда mpl человека, описанных здесь (см., например, Таблицу 14, Пример 24). Предпочтительный фрагмент лиганд mpl является лигандом человека, где МЛ[1-Х], где Х является 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 или 245 (см. фиг. 1 [Посл. No: 1] для последовательности остатков 1-Х). Другие предпочтительные фрагменты лиганда mpl включают те, которые получены в результате химического или ферментативного гидролиза или расщепления очищенного лиганда.Other preferred polypeptides of the present invention include mpl ligand fragments having an ordinal sequence of at least 10, 15, 20, 25, 30, or 40 amino acid residues that are identical to the mpl ligand sequence isolated from the aplastic pig plasma or human mpl ligand described herein (see, for example, Table 14, Example 24). A preferred fragment of the mpl ligand is a human ligand, where ML [1-X], where X is 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 or 245 (see Fig. 1 [Last No: 1] for the sequence of residues 1-X). Other preferred fragments of the mpl ligand include those obtained by chemical or enzymatic hydrolysis or cleavage of the purified ligand.

Другим предпочтительным аспектом изобретения является способ очистки молекулы лиганда mpl, включающий контактирование источника лиганда mpl, содержащего молекулы лиганда mpl, с иммобилизованным рецепторным полипептидом, особенно mpl, или слитого полипептида mpl, в условиях, вследствие которых очищаемые молекулы лиганда mpl являются селективно адсорбированными на иммобилизованном рецепторном полипептиде, промывание иммобилизованной подложки для удаления неадсорбированного материала, и элюцию очищаемых молекул с иммобилизованного рецепторного полипептида буфером элюции. Когда иммобилизованный рецептор является предпочтительно слитым mpl-IgG, источником, содержащим лиганд mpl, может быть плазма.Another preferred aspect of the invention is a method for purifying an mpl ligand molecule, comprising contacting an mpl ligand source containing mpl ligand molecules with an immobilized receptor polypeptide, especially mpl, or an mpl fusion polypeptide, under conditions whereby the mpl ligand molecules to be purified are selectively adsorbed to the immobilized receptor polypeptide, washing the immobilized substrate to remove non-adsorbed material, and eluting the molecules to be purified from the immobilized receptor polypeptide elution buffer. When the immobilized receptor is preferably fused with mpl-IgG, the source containing the mpl ligand may be plasma.

Альтернативно, источником, содержащим лиганд mpl, является рекомбинантная культура клеток, где концентрация лиганда mpl и в культуральной среде, и в лизате клеток, в целом, выше, чем в плазме или другом природном источнике. В этом случае вышеописанный mpl-IgG иммуноаффинный способ, хотя, по-прежнему, полезный, обычно не необходим, могут быть применены известные в технике более традиционные способы очистки белков. В кратком виде предпочтительный способ очистки, обеспечивающий получение существенно гомогенного лиганда mpl, включает: удаление частичек остатков как клеток хозяина, так и фрагментов лизата, например, центрифугированием или ультрафильтрацией; белок, необязательно, может быть сконцентрирован при помощи коммерчески доступного фильтра для концентрации белка; последующее разделение лиганда от других примесей при помощи одного или более этапов, выбранных из: иммуноаффинной, ионообменной (например, ДЭАЭ или на матриксе, содержащем карбоксиметильные или сульфгидрильные группы), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Лентил лектин-Сефарозе, WGA-Sepharose, Кон А-Сефарозе, Эфир-Toyoperl, Бутил-Toyoperl, Фенил-Toyoperl, протеин А Сефарозе, SDS-PAGE, ЖХВР с обращенной фазой (а именно, силикагель с добавленными алифатическими группами) хроматографии, или хроматографии на молекулярных ситах из Сефадекса, или хроматографией по размеру; и осаждение этанолом или сульфатом аммония. На любом из предшествующих этапов для ингибирования протеаз может быть включен ингибитор протеаз, такой как метилфенилсульфонилфторид (МФСФ).Alternatively, the source containing the mpl ligand is a recombinant cell culture, where the concentration of the mpl ligand in both the culture medium and the cell lysate is generally higher than in a plasma or other natural source. In this case, the above mpl-IgG immunoaffinity method, although still useful, is usually not necessary, more conventional protein purification methods known in the art can be used. Briefly, a preferred purification method that provides a substantially homogeneous mpl ligand includes: removing particles of both the host cell residues and lysate fragments, for example, by centrifugation or ultrafiltration; the protein optionally can be concentrated using a commercially available filter for protein concentration; subsequent separation of the ligand from other impurities using one or more steps selected from: immunoaffinity, ion exchange (for example, DEAE or on a matrix containing carboxymethyl or sulfhydryl groups), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S , Lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether-Toyoperl, Butyl-Toyoperl, Phenyl-Toyoperl, Protein A Sepharose, SDS-PAGE, reverse phase HPLC (namely, silica gel with added aliphatic groups) or chromatography on molecular sieves of Sephadex, or size chromatography; and precipitation with ethanol or ammonium sulfate. In any of the preceding steps, a protease inhibitor such as methylphenylsulfonyl fluoride (MPSF) can be included to inhibit proteases.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение описывает выделение антитела, способного связываться с лигандом mpl. Предпочтительное выделенное антитело к лиганду mpl является моноклональным (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985]; и Huse et al., Science, 246: 1275-1281 [1989]). Предпочтительным выделенным антителом к лиганду mpl является то, которое связывается к лиганду mpl со сродством, по крайней мере, около 106 л/моль. Более предпочтительно, антитело связывается со сродством, по крайней мере, около 107 л/моль. Более предпочтительно, антитело, вырабатывается против лиганда mpl, имеющего одну из вышеописанных эффекторных функций. Выделенное антитело, способное к связыванию с лигандом mpl, может быть, необязательно, сплавлено со вторым полипептидом, и антитело, или их сплав, может быть использован для выделения и очистки лиганда mpl из источника, описанного выше для иммобилизованного полипептида mpl. В дальнейшем предпочтительном аспекте настоящего воплощения изобретение описывает способ для обнаружения лиганда mpl in vitro или in vivo, включающего контактирование антитела с образцом, в особенности с образцом сыворотки, подозреваемым на содержание лиганда, и обнаружение, если наблюдается связывание.In another preferred embodiment, the present invention describes the isolation of an antibody capable of binding to the mpl ligand. A preferred isolated anti-mpl ligand antibody is monoclonal (Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [ 1985]; and Huse et al., Science, 246: 1275-1281 [1989]). A preferred isolated mpl ligand antibody is one that binds to the mpl ligand with an affinity of at least about 10 6 L / mol. More preferably, the antibody binds with an affinity of at least about 10 7 L / mol. More preferably, the antibody is produced against the mpl ligand having one of the above effector functions. An isolated antibody capable of binding to the mpl ligand may optionally be fused to the second polypeptide, and the antibody, or alloy thereof, can be used to isolate and purify the mpl ligand from the source described above for the immobilized mpl polypeptide. In a further preferred aspect of the present embodiment, the invention provides a method for detecting an mpl ligand in vitro or in vivo, comprising contacting an antibody with a sample, especially a serum sample suspected of containing a ligand, and detecting if binding is observed.

Еще далее, в предпочтительном воплощении изобретение описывает выделение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд mpl или его фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты которого может быть мечена или не мечена по обнаруживаемому радикалу, и молекула нуклеиновой кислоты, имеющая последовательность, которая комплементарна к, или гибридизуется в строгих или умеренно строгих условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, кодирующую лиганд mpl. Предпочтительной нуклеиновой кислотой лиганда mpl является РНК или ДНК, которая кодирует биологически активный лиганд mpl, обладающий, по крайней мере, 75% идентичной последовательности, более предпочтительно, по крайней мере, 80%, еще более предпочтительно, по крайней мере, 85%, и еще более предпочтительно, по крайней мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95% идентичной последовательности с лигандом mpl. Более предпочтительной молекулой выделенной нуклеиновой кислоты является последовательность ДНК, кодирующая биологически активный лиганд mpl, выбранная из: (а) ДНК, основанная на кодирующей области гена лиганда mpl млекопитающих (а именно, ДНК, включающая последовательность нуклеотидов, представленная на фиг.1 (Посл. No: 2) (или комплемент или ее фрагмент) в условиях с низкой до умеренной жесткости. Таким образом, дальнейший аспект настоящего изобретения включает ДНК, которое гибридизуется в условиях с низкой до умеренной жесткостью с ДНК, кодирующей полипептиды лиганда mpl.Still further, in a preferred embodiment, the invention describes the isolation of a nucleic acid molecule encoding an mpl ligand or fragment thereof, a nucleic acid molecule of which may or may not be labeled with a detectable radical, and a nucleic acid molecule having a sequence that is complementary to, or hybridizes in strict or moderately stringent conditions with a nucleic acid molecule having a sequence encoding a mpl ligand. A preferred mpl ligand nucleic acid is RNA or DNA that encodes a biologically active mpl ligand having at least 75% identical sequence, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, and even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% of the identical sequence with the mpl ligand. A more preferred molecule of the isolated nucleic acid is a DNA sequence encoding the biologically active mpl ligand selected from: (a) DNA based on the coding region of the mammalian mpl ligand gene (namely, the DNA including the nucleotide sequence shown in Fig. 1 (Pos. No: 2) (or complement or fragment thereof) under conditions of low to moderate stringency Thus, a further aspect of the present invention includes DNA that hybridizes under conditions of low to moderate stringency with DNA, encoded polypeptide ligand mpl.

В дальнейшем предпочтительном воплощении настоящего изобретения молекулой нуклеиновой кислоты является кДНК, кодирующая лиганд mpl, и далее, включающая реплицирующийся вектор, в котором кДНК оперативно сцеплена с контрольной последовательностью, распознающейся хозяином, трансформированным вектором. Данный аспект далее включает клетки хозяина, трансформированные вектором, и способ использования кДНК для воздействия на продукцию лиганда mpl, включающий экспрессию кДНК, кодирующую лиганд mpl в культуре трансформированных клеток хозяина, и выделение лиганда mpl из культуры клеток хозяина. Лиганд mpl, полученный таким образом, является предпочтительно, существенно гомогенным лигандом mpl человека. Предпочтительными клетками хозяина для продуцирования лиганда mpl являются клетки яичника хомяка (СНО).In a further preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule is a cDNA encoding an mpl ligand, and further comprising a replicating vector in which the cDNA is operably linked to a control sequence recognized by the host transformed by the vector. This aspect further includes vector transformed host cells, and a method of using cDNA to affect mpl ligand production, comprising expressing cDNA encoding the mpl ligand in a culture of transformed host cells, and isolating the mpl ligand from the host cell culture. The mpl ligand thus obtained is preferably a substantially homogeneous human mpl ligand. Preferred host cells for producing the mpl ligand are hamster ovary (CHO) cells.

Изобретение далее включает предпочтительный способ для лечения млекопитающего, имеющего иммунологическое или гематопоэтическое заболевание, в особенности, тромбоцитопению, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества лиганда mpl. Лиганд mpl, необязательно, вводится в сочетании с цитокином, в особенности, с колоние-стимулирующим фактором или интерлейкином. Предпочтительные колоние-стимулирующие факторы или интерлейкины включают: kit-лиганд, ФИЛ, Г-КСФ, ГМ-КСФ, М-КСФ, ЭП, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9 или ИЛ-11.The invention further includes a preferred method for treating a mammal having an immunological or hematopoietic disease, in particular thrombocytopenia, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of the mpl ligand. The mpl ligand is optionally administered in combination with a cytokine, in particular with a colony stimulating factor or interleukin. Preferred colony stimulating factors or interleukins include: kit ligand, PHIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EP, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL -7, IL-8, IL-9 or IL-11.

III. Способы полученияIII. Production methods

Продукция тромбоцитов, с давних пор исследуемая некоторыми авторами, находится под контролем многочисленных специфических дифференцирующих гуморальных факторов. Было постулировано, что две различных активности цитокина, обозначаемых как колоние-стимулирующий фактор (мег-КСФ) и тромбопоэтин, регулируют мегакариоцитопоэз и тромбоцитопоэз (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982]; Williams et al., Blood Cells, 15: 123-133 [1989]; и Gordon et al. Blood, 80: 302-307 [1992]). В соответствии с этой гипотезой мег-КСФ стимулирует пролиферацию прогениторных мегакариоцитов, тогда как тромбопоэтин сначала воздействует на созревание более дифференцированных клеток и, в конечном счете, на высвобождение тромбоцитов. Начиная с 1960-х годов данные об индукции и обнаружении обеих активностей - мег-КСФ и тромбопоэтина в плазме, сыворотке и моче животных и человека, после тромбоцитопенических приступов, хорошо документированы (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108: 428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol., 54: 340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108: 146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin. Invest., 49: 1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44: 605-608 [1974]; Hoffman et al., N. Engi. J. Med., 305: 533 [1981]; Straneva ey al., Exp. Hematol., 17: 1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp. Hematol., 13: 1164 [1985]; Mazur et al., J. Clin. Invest., 68: 733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood, 56: 183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20: 354-360 [1992]; и Hegyi et al.. Int. J. Cell. Cloning, 8: 236-244 [1990]). Было сообщено, что эти активности проявляют специфичность по отношению к дифференцирующимся линиям и отличны от активностей известных цитокинов (Hill R.J. et al., Blood, 80: 346 [1992]; Erickson-Miller C.L. et al., Brit. J. Haematol., 84: 197-203 [1993]; Staneva J.E. et al., Exp. Hematol., 20: 4750 [1992]; и Tsukada J. et al., Blood, 81: 866-867 [1993]). После этого попытки очистить мег-КСФ или тромбопоэтин из тромбоцитопенической плазмы или мочи были безуспешными.Platelet production, which has long been studied by some authors, is under the control of numerous specific differentiating humoral factors. It has been postulated that two different cytokine activities, designated as colony stimulating factor (mega-CSF) and thrombopoietin, regulate megakaryocytopoiesis and thrombocytopoiesis (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982]; Williams et al., Blood Cells, 15: 123-133 [1989]; and Gordon et al. Blood, 80: 302-307 [1992]). According to this hypothesis, meg-CSF stimulates proliferation of progenitor megakaryocytes, while thrombopoietin first affects the maturation of more differentiated cells and, ultimately, the release of platelets. Since the 1960s, data on the induction and detection of both activities - meg-CSF and thrombopoietin in plasma, serum and urine of animals and humans, after thrombocytopenic attacks, have been well documented (Odell et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ., 108: 428-431 [1961]; Nakeff et al., Acta Haematol., 54: 340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108: 146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin. Invest., 49: 1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44: 605-608 [1974]; Hoffman et al., N. Engi. J. Med., 305: 533 [1981]; Straneva ey al., Exp. Hematol., 17: 1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp. Hematol., 13: 1164 [1985]; Mazur et al., J. Clin. Invest ., 68: 733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood, 56: 183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20: 354-360 [1992]; and Hegyi et al .. Int. J. Cell. Cloning, 8: 236-244 [1990]). These activities have been reported to be specific for differentiating lines and different from those of known cytokines (Hill RJ et al., Blood, 80: 346 [1992]; Erickson-Miller CL et al., Brit. J. Haematol., 84: 197-203 [1993]; Staneva JE et al., Exp. Hematol., 20: 4750 [1992]; and Tsukada J. et al., Blood, 81: 866-867 [1993]). After this, attempts to purify meg-CSF or thrombopoietin from thrombocytopenic plasma or urine were unsuccessful.

Согласно с вышеупомянутыми наблюдениями, описывающими тромбоцитопеническую плазму, было обнаружено, что апластическая плазма свиньи (АПС), полученная от облученных свиней, стимулирует мегакариоцитопоэз у человека in vitro. Было обнаружено, что данная стимуляторная активность предотвращается растворимым внеклеточным доменом с-mpl, подтверждая, что АПС является потенциальным источником естественного лиганда mpl (МЛ). В настоящее время лиганд mpl успешно очищен из плазмы АПС, а информация об аминокислотной последовательности была использована для выделения кДНК МЛ мыши, свиньи и человека. Эти последовательности МЛ гомологичны эритропоэтину и обладают и мег-КСФ, и тромбопоэтино-подобной активностью.According to the above observations describing thrombocytopenic plasma, it was found that pig aplastic plasma (APS) obtained from irradiated pigs stimulates human in vitro megakaryocytopoiesis. It was found that this stimulatory activity is prevented by the soluble extracellular domain of c-mpl, confirming that APS is a potential source of the natural mpl ligand (ML). Currently, the mpl ligand has been successfully purified from APS plasma, and amino acid sequence information has been used to isolate mouse, pig, and human ML cDNAs. These ML sequences are homologous to erythropoietin and possess both meg-CSF and thrombopoietin-like activity.

1. Очистка и идентификация mpl лиганда из плазмы1. Purification and identification of mpl ligand from plasma

Как было изложено выше, апластическая плазма различных видов, как сообщалось, содержит активности, которые стимулируют гематопоэз in vitro, однако, как сообщалось ранее, никакого гематопоэтического стимуляторного фактора из плазмы не выделяли. Один источник апластической плазмы является тот, который получают из облученных свиней. Данная апластическая плазма свиньи (АПС) стимулирует гематопоэз у человека in vitro. Для определения, содержит ли АПС лиганд mpl, ее эффект был исследован по измерению включения 3H-тимидина в Ba/F3 клетки, трансфецированные mpIP (Ba/F3-mpl) человека, способом, показанном на фиг.2. АПС стимулирует включение 3H-тимидина в Ba/F3-mpl клетки, но не в контрольные Ba/F3 клетки (т.е., нетрансфецированные mpl P человека). Кроме этого, никакой другой активности в обычной плазме свиньи не наблюдали. Эти результаты отмечают, что АПС содержит фактор или факторы, которые передают пролиферативный сигнал через mpl рецептор и, следовательно, могут быть естественным лигандом для данного рецептора. Это было далее подтверждено обнаружением того, что обработка АПС растворимым mpl-IgG подавляет стимуляторное действие АПС на Ba/F3-mpl клетки.As described above, various types of aplastic plasma have been reported to contain activities that stimulate hematopoiesis in vitro; however, as previously reported, no hematopoietic stimulatory factor was isolated from plasma. One source of aplastic plasma is that obtained from irradiated pigs. This pig aplastic plasma (APS) stimulates hematopoiesis in humans in vitro. To determine whether the APS contains the mpl ligand, its effect was investigated by measuring the incorporation of 3 H-thymidine into Ba / F3 cells transfected with human mpIP (Ba / F3-mpl), according to the method shown in FIG. 2. APS stimulates the incorporation of 3 H-thymidine into Ba / F3-mpl cells, but not into control Ba / F3 cells (i.e., untransfected human mpl P). In addition, no other activity was observed in normal pig plasma. These results indicate that APS contains a factor or factors that transmit a proliferative signal through the mpl receptor and, therefore, can be a natural ligand for a given receptor. This was further confirmed by the discovery that treatment of APS with soluble mpl-IgG suppresses the stimulatory effect of APS on Ba / F3-mpl cells.

Активность АПС, по-видимому, представляет белок, поскольку проназа, ДТТ или нагревание разрушают активность АПС (фиг.3). Активность также является недиализуемой. Однако активность была стабильной при низких значениях рН (рН 2,5 в течение 2,5 часов), и было показано связывание и элюция с различных лектинаффинных колонок, отмечая, что она являлась гликопротеином. В дальнейшем, чтобы пролить свет на структуру и идентификацию данной активности, она была очищена из АПС по сродству, используя mpl-IgG химеру.The activity of the APS, apparently, is a protein, because pronase, DTT or heating destroy the activity of APS (figure 3). Activity is also not dialyzable. However, the activity was stable at low pH values (pH 2.5 for 2.5 hours), and binding and elution from various lectin-affinity columns were shown, noting that it was a glycoprotein. Subsequently, in order to shed light on the structure and identification of this activity, it was purified from APS by affinity using the mpl-IgG chimera.

АПС обработали согласно протоколу, изложенному в Примерах 1 и 2. В кратком виде mpl лиганд очистили, используя хроматографию по гидрофобному взаимодействию (ГХ), хроматографию с иммобилизованным красителем и хроматографию mpl по сродству. Выход активности на каждом этапе показан на фиг.4, а степень очистки представлена в Таблице 1. Общий выход активности после mpl-аффинной колонки составлял приблизительно 10%. Фракции с пиком активности (F6) после mpl-аффинной колонки имели согласно определению специфическую активность 9,8×106 единиц/мг. Общая очистка из 5 литров АПС составляла приблизительно 4×106 раз (от 0,8 единиц/мг до 3,3×106 единиц/мг), с 86×10° степени потери по белку (от 250 г до 3 мкг). Была определена специфическая активность лиганда, элюированного с mpl-аффинной колонки, составляющая 3×106 единиц/мг.APS was processed according to the protocol set forth in Examples 1 and 2. In summary, the mpl ligand was purified using hydrophobic interaction chromatography (GC), immobilized dye chromatography and affinity chromatography mpl. The activity yield at each step is shown in FIG. 4, and the degree of purification is shown in Table 1. The total activity yield after the mpl affinity column was approximately 10%. The fractions with peak activity (F6) after the mpl affinity column had, by definition, a specific activity of 9.8 × 10 6 units / mg. The total purification of 5 liters of APS was approximately 4 × 10 6 times (from 0.8 units / mg to 3.3 × 10 6 units / mg), with an 86 × 10 ° degree of protein loss (from 250 g to 3 μg) . The specific activity of the ligand eluted from the mpl affinity column was determined to be 3 × 10 6 units / mg.

ТАБЛИЦА 1TABLE 1

Очистка mpl лигандаPurification of mpl ligand

ОбразецSample Объем млMl volume Белок мг/млProtein mg / ml Единиц/млUnits / ml ЕдиницUnits Специфич. активн. единиц/мгSpecific active units / mg Выход %Exit % Степень очисткиDegree of purification АПСAPS 50005000 50fifty 4040 200000200,000 0,80.8 -- 11 ФенилPhenyl 47004700 0,80.8 4040 200000200,000 50fifty 9494 6262 Blue-Seph.Blue-seph. 640640 0,930.93 400400 256000256,000 430430 128128 538538 mpl(мкл) (Фракции 5-7)mpl (μl) (Fractions 5-7) 1212 5×10-4 5 × 10 -4 16661666 2000020000 33000003,300,000 1010 41000004,100,000

Белок определяли по методу Bradford. Концентрацию белка во фракциях 5-7 с элюированным mpl измеряли на основе интенсивности окраски серебром SDS-геля. Одну единицу активности определяли как способность вызывать 50% эффекта от максимальной стимуляции пролиферации Ba/F3-mpl клеток.Protein was determined according to the Bradford method. Protein concentration in fractions 5-7 with mpl eluted was measured based on the silver staining intensity of the SDS gel. One unit of activity was defined as the ability to cause 50% of the effect of maximum stimulation of proliferation of Ba / F3-mpl cells.

Анализ фракций после элюции с mpl-аффинной колонки на SDS-PAGE (4-20%, Novex гель), разогнанных при восстанавливающих условиях, выявил наличие нескольких белков (фиг.5). Белки, которые окрашивались серебром более интенсивно, дали разрешение при кажущемся Mr 60000, 55000, 30000, 28000 и 18000-22000. Для определения, какой из этих белков стимулирует пролиферацию Ba/F3-mpl клеток, белки элюировали из геля как описано в Примере 2.Analysis of fractions after elution from the mpl-affinity column on SDS-PAGE (4-20%, Novex gel), dispersed under reducing conditions, revealed the presence of several proteins (figure 5). Proteins, which were stained with silver more intensively, gave resolution with an apparent Mr 60000, 55000, 30000, 28000 and 18000-22000. To determine which of these proteins stimulates the proliferation of Ba / F3-mpl cells, the proteins were eluted from the gel as described in Example 2.

Результаты данных экспериментов показали, что большая активность элюируется с нарезанного геля, который включал белки с Mr 28000-32000, меньшая активность элюировалась из области геля с 18000-22000 (фиг.6). Единственные белки, видимые в данной области имели Mr 30000, 28000 и 18000-22000. Для определения и получения белковой последовательности белков, проявившихся в этой области геля (а именно, полосы при 30, 28 и 18-22 kDa), три этих белка подвергли электроблоттингу на PVDF и секвенировали, как описано в Примере 3. Полученная аминокислотная последовательность представлена в Таблице 2.The results of these experiments showed that greater activity was eluted from the cut gel, which included proteins with Mr 28000-32000, less activity was eluted from the gel region from 18000-22000 (Fig.6). The only proteins visible in this area had Mr 30000, 28000 and 18000-22000. To determine and obtain the protein sequence of the proteins that appeared in this area of the gel (namely, the bands at 30, 28, and 18-22 kDa), these three proteins were electro-blotted on PVDF and sequenced as described in Example 3. The obtained amino acid sequence is presented in Table 2.

ТАБЛИЦА 2TABLE 2

Амино-концевые последовательности mpl лигандаAmino terminal sequences of the mpl ligand

30 kDa30 kDa 11 55 1010 15fifteen 20twenty 2525   (S)P A P P A(C)D PRLLNKLLRD D(H/S)V L H(G)R L(S) P A P P A (C) D PRLLNKLLRD D (H / S) V L H (G) R L Посл.No: 30Last No: 30 28 kDa28 kDa 11 55 1010 15fifteen 20twenty 2525   (S)P APPAXDPRLLNKLLRD D(H)V L(H)G R(S) P APPAXDPRLLNKLLRD D (H) V L (H) G R Посл.No: 31Last No: 31 18-22 kDa18-22 kDa 11 55 1010         X P A P P A X D P R L X (N) (K)X P A P P A X D P R L X (N) (K) Посл.No: 32Last No: 32

Анализ с применением компьютера выявил новизну этих аминокислотных последовательностей. Поскольку все три последовательности были близкими, было предположено, что 30, 28 и 18-22 kDa белки являются родственными и, возможно, являются различными формами одного и того же нового белка. Более того, этот белок(и) был вероятным кандидатом естественного mpl лиганда, поскольку активности, разогнанные на SDS-PAGE, были в тех же самых областях (28000-32000) 4-20% геля. Помимо этого частично очищенный лиганд мигрирует с Mr 17000-30000, когда его подвергают гель-хроматографии на колонке с Superose 12 (Pharmacia). Было предположено, что различные Mr формы лиганда являются результатом протеолиза или различий в гликозилировании или других пост- или пре-трансляционных модификаций.Computer analysis revealed the novelty of these amino acid sequences. Since all three sequences were close, it was suggested that 30, 28, and 18-22 kDa proteins are related and possibly different forms of the same new protein. Moreover, this protein (s) was a likely candidate for the natural mpl ligand, since the activities dispersed on SDS-PAGE were in the same areas (28000-32000) of 4-20% of the gel. In addition, the partially purified ligand migrates with Mr 17000-30000 when subjected to gel chromatography on a Superose 12 column (Pharmacia). It was suggested that various Mr forms of the ligand are the result of proteolysis or differences in glycosylation or other post- or pre-translational modifications.

Как описано ранее, антисенсная РНК mpl человека отменяет мегакариоцитопоэз в культуре клеток костного мозга человека, обогащенных CD 34+ прогениторными клетками без воздействия на дифференцировку других дифференцирующихся клеточных линий (Methia et al., там же). Эти результаты подтверждают, что mpl рецептор может играть роль в дифференцировке и пролиферации мегакариоцитов in vitro. Для дальнейшего прояснения роли лиганда mpl в мегакариоцитопоэзе были сравнены эффекты АПС и АПС, лишенной лиганда mpl, на мегакариоцитопоэз человека in vitro. Действие АПС на мегакариоцитопоэз человека определяли используя модификацию исследования мегакариоцитопоэза в жидкой суспензии, описанной в Примере 4. В данном исследовании периферические стволовые клетки человека (ПСК) обработали АПС до и после mpl-IgG аффинной хроматографии. Стимуляцию мегакариоцитопоэза по активности GPIIbIIIa подсчитывали при помощи 125I-анти-IIbIIIа антитела (фиг.7). Как показано на фиг.7, 10% АПС вызывает приблизительно 3-кратную стимуляцию, тогда как АПС, лишенная лиганда mpl, не обладала эффектом. Примечательно, что АПС, лишенная лиганда mpl, не индуцировала пролиферацию Ba/FS-mpI клеток.As described previously, human mpl antisense RNA abolishes megakaryocytopoiesis in human bone marrow cell culture enriched with CD 34 + progenitor cells without affecting the differentiation of other differentiating cell lines (Methia et al., Ibid.). These results confirm that the mpl receptor may play a role in the differentiation and proliferation of megakaryocytes in vitro. To further clarify the role of the mpl ligand in megakaryocytopoiesis, the effects of APS and APS lacking the mpl ligand on human megakaryocytopoiesis were compared in vitro. The effect of APS on human megakaryocytopoiesis was determined using a modification of the study of megakaryocytopoiesis in a liquid suspension described in Example 4. In this study, human peripheral stem cells (UCS) were treated with APS before and after mpl-IgG affinity chromatography. Stimulation of megakaryocytopoiesis by the activity of GPII b III a was calculated using 125 I-anti-II b III a antibodies (Fig. 7). As shown in FIG. 7, 10% APS causes approximately 3-fold stimulation, while APS lacking the mpl ligand did not have an effect. It is noteworthy that APS lacking the mpl ligand did not induce proliferation of Ba / FS-mpI cells.

В другом эксперименте растворимый mpl-IgG человека, добавленный в 0, 2 и 4 дни к культуре, содержащей 10% АПС, нейтрализовал стимуляторный эффект АПС на мегакариоцитопоэз человека (фиг.8). Данные результаты отмечают, что mpl лиганд играет роль в регуляции мегакариоцитопоэза у человека и, следовательно, может быть использован для лечения тромбоцитопении.In another experiment, soluble human mpl-IgG added on days 0, 2, and 4 to a culture containing 10% APS neutralized the stimulatory effect of APS on human megakaryocytopoiesis (Fig. 8). These results indicate that the mpl ligand plays a role in the regulation of human megakaryocytopoiesis and, therefore, can be used to treat thrombocytopenia.

2. Молекулярное клонирование mpl лиганда2. Molecular cloning of mpl ligand

Основываясь на аминокислотной последовательности амино-конца, полученной из белков 30, 28 и 18-22 kDa (см. Таблицу 2 выше), были сконструированы два олигонуклеотидных праймерных пула, использованных для амплификации геномной ДНК свиньи методом РПЦ. Было рассуждено, что, если аминокислотная последовательность амино-конца кодируется единым эксоном, тогда было бы ожидаемо, что правильный PCR продукт будет длиной 69 пар оснований. Фрагмент ДНК данного размера был найден и субклонирован в pGEMT. Последовательность олигонуклеотидного РПЦ праймера и полученных трех клонов представлены в Примере 5. Аминокислотная последовательность (PRLLNKLLR [Посл. No: 33]) пептида, промежуточно кодируемого праймерами, была идентичной к той полученной при белковом секвенсе амино-конца лиганда свиньи (см. остатки 9-17 для последовательности белков 28 и 30 kDa свиньи выше).Based on the amino acid amino acid sequence obtained from 30, 28, and 18-22 kDa proteins (see Table 2 above), two oligonucleotide primer pools were constructed that were used to amplify porcine genomic DNA using the ROC method. It was reasoned that if the amino acid sequence of the amino terminus is encoded by a single exon, then it would be expected that the correct PCR product would be 69 base pairs long. A DNA fragment of this size was found and subcloned into pGEMT. The sequence of the oligonucleotide ROC primer and the obtained three clones are presented in Example 5. The amino acid sequence (PRLLNKLLR [Ser.No. 33]) of the peptide intermediate encoded by primers was identical to that obtained from the protein sequence of the amino end of the pig ligand (see residues 9- 17 for the protein sequence of 28 and 30 kDa pigs above).

Синтетический олигонуклеотид, полученный на основе последовательности РПЦ фрагмента, использовали для скрининга геномной библиотеки ДНК человека. Был сконструирован и синтезирован олигонуклеотид из 45 оснований, обозначенный как pR45, на основе последовательности фрагмента РПЦ. Данный нуклеотид имел следующую последовательность:A synthetic oligonucleotide derived from the sequence of the ROC fragment was used to screen a human DNA genomic library. A 45-base oligonucleotide, designated pR45, was designed and synthesized based on the sequence of the ROC fragment. This nucleotide had the following sequence:

5’GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3’ (Посл. No: 34).5’GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3 ’(Serial No: 34).

Данный нуклеотид использовали для скрининга геномной библиотеки ДНК человека в λgem12 при низкой строгости гибридизации, и отмывочных условиях в соответствии с Примером 6. Положительные клоны были отобраны, плашки очищены и анализированы методами рестрикционного картирования и southern блоттинга. Фрагмент 390 пар оснований EcoRI-Xbal, который гибридизовали с 45-и членом, субклонировали в pBluescript SK-. Секвенирование ДНК этого клона подтвердило, что данная ДНК кодирует выделенный лиганд mpl человека, гомологичный свиному. Последовательность ДНК человека и выведенная аминокислотная последовательность представлены на фиг.9 (Посл. No: 3 и 4). Предсказанные положения интронов геномной последовательности, также отмеченные стрелками, определяют естественный эксон ("эксон 3").This nucleotide was used for screening a genomic library of human DNA in λgem12 with low stringency hybridization and washing conditions in accordance with Example 6. Positive clones were selected, plates were purified and analyzed by restriction mapping and southern blotting. A fragment of 390 base pairs EcoRI-Xbal, which was hybridized with a 45-member, was subcloned into pBluescript SK-. DNA sequencing of this clone confirmed that this DNA encodes an isolated human mpl ligand homologous to swine. The human DNA sequence and the deduced amino acid sequence are shown in Fig. 9 (Posl. No: 3 and 4). The predicted intron positions of the genomic sequence, also marked by arrows, determine the natural exxon ("exon 3").

Основываясь на последовательности "эксона 3" человека (Пример 6), был синтезирован олигонуклеотид, соответствующий 3’ и 5’ концам последовательности эксона. Эти два праймера были использованы в выделенный mpl лиганд человека РПЦ реакции, использующей в качестве матрицы кДНК, полученную из различных тканей человека. Ожидаемые размеры правильного продукта РПЦ составляли 140 пар оснований. После анализа продукта РПЦ в 12% полиакриламидном геле был обнаружен фрагмент кДНК ожидаемого размера в библиотеке кДНК, полученной из почек взрослого человека, клеток 293 эмбриональной почки человека, и кДНК, полученной из эмбриональной печени человека.Based on the human exon 3 sequence (Example 6), an oligonucleotide corresponding to the 3 ’and 5’ ends of the exon sequence was synthesized. These two primers were used in the isolated mpl human ligand of the ROC reaction, using cDNA obtained from various human tissues as a template. The expected size of the correct product of the Russian Orthodox Church was 140 base pairs. After analyzing the ROC product in a 12% polyacrylamide gel, a cDNA fragment of the expected size was detected in a cDNA library obtained from adult kidneys, 293 human embryonic kidney cells, and cDNA obtained from human embryonic liver.

Следующей была просеяна библиотека кДНК эмбриональной печени (7×106 клонов) в ламбда DR2 с тем же самым 45-и членным олигонуклеотидом, используемым для скрининга геномной библиотеки человека и для библиотеки кДНК эмбриональной печени при низкой строгости гибридизационных условий. Один клон с включением 1,8 тыс. оснований был отобран для дальнейшего анализа. Используя процедуры, описанные в Примере 7, были получены нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность лиганда mpl человека (МЛч). Эти последовательности представлены на фиг.1 (Посл. No: 1 и 2).Next, the embryonic liver cDNA library (7 × 10 6 clones) was sieved in lambda DR2 with the same 45-membered oligonucleotide used for screening the human genomic library and for the embryonic liver cDNA library under low stringency hybridization conditions. One clone with 1.8 thousand bases was selected for further analysis. Using the procedures described in Example 7, the nucleotide and deduced amino acid sequence of the human mpl ligand (MLC) was obtained. These sequences are shown in FIG. 1 (Ser. No: 1 and 2).

3. Структура лиганда mpl человека (МЛч)3. The structure of the ligand mpl person (MLC)

Последовательность кДНК лиганда mpl человека (МЛч) (фиг.1 [Посл. No: 2]) содержит 1774 нуклеотида, следующих за окончанием поли(А). Он содержит 215 нуклеотидов 5’ нетранслируемой последовательности, и 3’ нетранслируемую область из 498 нуклеотидов. Предполагаемый инициирующий кодон при (216-218) положении нуклеотидов располагается внутри согласованной последовательности, благоприятной для инициации трансляции у эукариот. Открытая рамка считывания составляет 1059 нуклеотидов длиной и кодирует полипептид из 353 аминокислотных остатков, начинающийся на 220 нуклеотидном положении. N-конец предсказанной аминокислотной последовательности является высокогидрофобным и, вероятно, соответствует сигнальному пептиду. Компьютерный анализ предсказанной аминокислотной последовательности (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133: 17-21 [1983]) отмечает места потенциального расщепления для сигнальной пептидазы между остатками 21 и 22. Расщепление в этой позиции дало бы зрелый полипептид из 332 аминокислотных остатков, начинающийся с амино-концевой последовательности, полученной из лиганда mpl, очищенного из плазмы свиньи. Предсказанный молекулярный вес негликозилированного лиганда из 332 аминокислотных остатков составляет около 38 kDa. Имеется 6 потенциальных участков N-гликозилирования и 4 цистеиновых остатка.The cDNA sequence of the human mpl ligand (HMF) (FIG. 1 [Ser. No: 2]) contains 1774 nucleotides following the end of poly (A). It contains 215 nucleotides of 5 ’untranslated sequence, and 3’ untranslated region of 498 nucleotides. The putative initiating codon at (216-218) position of the nucleotides is located within a coordinated sequence favorable for translation initiation in eukaryotes. The open reading frame is 1059 nucleotides long and encodes a polypeptide of 353 amino acid residues starting at 220 nucleotide position. The N-terminus of the predicted amino acid sequence is highly hydrophobic and probably corresponds to a signal peptide. A computer analysis of the predicted amino acid sequence (von Heijne et al., Eur. J. Biochem., 133: 17-21 [1983]) marks the potential cleavage sites for signal peptidase between residues 21 and 22. Cleavage at this position would produce a mature polypeptide from 332 amino acid residues starting with an amino-terminal sequence derived from mpl ligand purified from pig plasma. The predicted molecular weight of a non-glycosylated ligand of 332 amino acid residues is about 38 kDa. There are 6 potential N-glycosylation sites and 4 cysteine residues.

Сравнение последовательности лиганда mpl с последовательностью банка данных Genbank выявило 23% идентичности между 153 аминоконцевыми остатками зрелого mpl лиганда человека и эритропоэтином (фиг. 10 [Посл. No: 6 и 7]). Если принять во внимание консервативные замены, данная область МЛч проявляет 50% сходства с эритропоэтином человека (ЭПч). Оба ЭПч и МЛч содержат четыре цистеина. Три из 4 цистеинов консервативны у МЛч, включая первый и последний цистеины. Эксперименты по точечно направленному мутагенезу показали, что первый и последний цистеины эритропоэтина образуют дисульфидную связь, которая требуется для функционирования (Wang, F.F. et al., Endocrinology, 116: 2286-2292 [1983]). По аналогии, первый и последний цистеины МЛч могут также образовывать значимую дисульфидную связь. Ни одно из гликозилирумых участков не является консервативным у МЛч. Все возможные участки гликозилирования МЛч расположены в карбокси-концевой половине полипептида МЛч.Comparison of the sequence of the mpl ligand with the sequence of the Genbank data bank revealed a 23% identity between the 153 amino-terminal residues of the mature mpl human ligand and erythropoietin (Fig. 10 [Last No: 6 and 7]). If conservative substitutions are taken into account, this MLC region shows 50% similarity with human erythropoietin (EPC). Both HEP and HF contain four cysteines. Three of the 4 cysteines are conserved in HM, including the first and last cysteines. Point directed mutagenesis experiments have shown that the first and last cysteines of erythropoietin form a disulfide bond that is required for functioning (Wang, F.F. et al., Endocrinology, 116: 2286-2292 [1983]). By analogy, the first and last HM cysteines can also form a significant disulfide bond. None of the glycosylated sites is conserved in MLC. All possible MLC glycosylation sites are located in the carboxy-terminal half of the MLC polypeptide.

Подобно ЭПч, мРНК МЛч не содержит ни согласованной последовательности полиаденилирования AAUAAA, ни регуляторного элемента AUUUA, который присутствует в 3’ нетранслируемой области многих цитокинов, и, тем самым, влияет на стабильность мРНК (Shaw et al., Cell, 46: 659-667 [1986]). Northern блот анализ выявил низкий уровень единого в 1,8 тыс. оснований РНК транскрипта МЛч и в эмбриональной, и во взрослой печени. После долгого выдерживания можно было определить и во взрослой почке слабую полосу того же самого размера. Для сравнения, эритропоэтин человека экспрессировался в эмбриональной печени, во взрослых почке и печени (Jacobs et al., Nature, 313: 804-809 [1985] и Boudurant et al., Molec. Cell. Biol., 6: 2731-2733 [1985]) в ответ на гипоксию.Like EPP, MLCh mRNA contains neither a coordinated AAUAAA polyadenylation sequence, nor an AUUUA regulatory element, which is present in the 3 'untranslated region of many cytokines, and thereby affects the stability of mRNA (Shaw et al., Cell, 46: 659-667 [1986]). Northern blot analysis revealed a low level of a single, 1.8 thousand base, RNA of the MLC transcript in both embryonic and adult liver. After long aging, it was possible to determine in the adult kidney a weak band of the same size. In comparison, human erythropoietin was expressed in the embryonic liver, in the adult kidney and liver (Jacobs et al., Nature, 313: 804-809 [1985] and Boudurant et al., Molec. Cell. Biol., 6: 2731-2733 [ 1985]) in response to hypoxia.

Важность С-концевой области МЛч остается необходимой для разъяснения. Основываясь на наличии шести возможных мест для N-связанного гликозилирования и способности лиганда связываться с лектин-аффинной колонкой, эта область МЛч, по-видимому, является гликозилированной. В некоторых экспериментах по элюции с геля наблюдалась активность при разрешении с Mr около 60000, которая может представлять гликозилированную молекулу полной длины. С-концевая область, следовательно, может стабилизировать и увеличивать время полужизни циркулирующего МЛч. В случае эритропоэтина негликозилированная форма обладает полной биологической активностью in vitro, но имеет заметно уменьшенное время полужизни в плазме по сравнению с гликозилированным эритропоэитном (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265: 12127-12130 [1990]; Narhi et al., J. Biol. Chem., 266: 23022-23026 [1991] и Spivack et al., Blood, 7: 90-99 [1989]). С-концевой домен МЛч содержит две последовательности из двух основных аминокислот [Арг-Арг структуру в положениях 153-154 и 245-246], которые могли бы служить как возможные участки для процессинга. Расщепление по этим участкам могло бы быть ответственным за образование 30, 28 и 18-22 kDa форм МЛ, выделенного из АПС. Важно, что последовательность Apr153-Apr154 наблюдается сразу же после эритропоэтин-подобного домена МЛ. Эти наблюдения отмечают, что МЛ полной длины может представлять собой предшественник, который подлежит ограниченному протеолизу с образованием зрелого лиганда.The importance of the C-terminal region of HFM remains necessary for clarification. Based on the availability of six possible sites for N-linked glycosylation and the ability of the ligand to bind to a lectin-affinity column, this region of MLC is likely to be glycosylated. In some gel elution experiments, activity was observed at a resolution with Mr of about 60,000, which may represent a full-length glycosylated molecule. The C-terminal region, therefore, can stabilize and increase the half-life of circulating HFM. In the case of erythropoietin, the non-glycosylated form has complete in vitro biological activity, but has a markedly reduced plasma half-life compared to glycosylated erythropoietic (Takeuchi et al., J. Biol. Chem., 265: 12127-12130 [1990]; Narhi et al ., J. Biol. Chem., 266: 23022-23026 [1991] and Spivack et al., Blood, 7: 90-99 [1989]). The C-terminal domain of HFM contains two sequences of two basic amino acids [Arg-Arg structure at positions 153-154 and 245-246], which could serve as possible sites for processing. Cleavage at these sites could be responsible for the formation of 30, 28 and 18-22 kDa forms of ML isolated from APS. It is important that the sequence Apr 153 -Apr 154 is observed immediately after the erythropoietin-like domain of ML. These observations indicate that full-length ML can be a precursor that is subject to limited proteolysis to form a mature ligand.

4. Изоформы и варианты mpl лиганда человека4. Isoforms and variants of mpl human ligand

Изоформы, или альтернативно сплайсинговые формы, mpl лиганда человека были определены методом РПЦ во взрослой печени человека. В кратком виде, были синтезированы праймеры, соответствующие каждому концу, так же как и выбранным областям, кодирующим последовательность МЛч. Эти праймеры были использованы в ОТ-РПЦ для умножения РНК взрослой печени человека, как описано в Примере 10. В добавление к полной форме, обозначенной МЛч, были обнаружены или выведены три других формы, обозначенные МЛч2, МЛч3 и МЛч4. Выведенная зрелая аминокислотная последовательность всех четырех изоформ представлена на фиг.11 (Посл. No: 6, 8, 9, и 10). МЛч3 имеет 116 нуклеотидную делецию в положении 700, которая приводит и к аминокислотной делеции, и к сдвигу рамки. Теперь кДНК кодирует зрелый полипептид, который является длиной в 265 аминокислот, и происходит от последовательности МЛч со 139 аминокислотного остатка. Наконец, МЛч4 имеет как делецию в 12 (пар) нуклеотидов после 618 положения нуклеотида (также обнаруженную в последовательности у мыши и свиньи [см. ниже]), так и делецию в 116 пар оснований, найденную у МЛч3. Хотя у (обозначенной МЛч2) человека не было выделено клонов с делецией только в 12 пар оснований (после 619 нуклеотида), эта форма, предположительно, существует, поскольку такая изоформа была идентифициована и у мыши, и у свиньи (см. ниже) и к тому же она была идентифицирована в конъюгации со 116 нуклеотидной делецией в МЛч4.Isoforms, or alternatively splicing forms, of mpl human ligand were determined by the ROC method in an adult human liver. In short, the primers were synthesized corresponding to each end, as well as the selected regions encoding the sequence of MLC. These primers were used in RT-ROC to multiply RNA of an adult human liver, as described in Example 10. In addition to the full form indicated by MLC, three other forms, designated MLC2, MLC3 and MLC4, were detected or displayed. The derived mature amino acid sequence of all four isoforms is shown in FIG. 11 (Pos. No: 6, 8, 9, and 10). MLCh3 has a 116 nucleotide deletion at position 700, which leads to both an amino acid deletion and a frame shift. Now the cDNA encodes a mature polypeptide, which is 265 amino acids long, and is derived from a sequence of MLC with 139 amino acid residues. Finally, MLCh4 has both a deletion of 12 (pairs) nucleotides after 618 nucleotide positions (also found in the mouse and pig sequence [see below]) and a 116 base pair deletion found in MLC3. Although clones with a deletion of only 12 base pairs (after 619 nucleotides) were not isolated in the (designated MLC2) human, this form presumably exists, since such an isoform was identified in both the mouse and the pig (see below) and in addition, it was identified in conjugation with 116 nucleotide deletion in MLCh4.

Для определения, действительно ли МЛ полной длины необходим для биологической активности, были сконструированы и вариант МЛч с замещением, в котором последовательность из двух основных аминокислот Apr153-Apr154 заменена на два остатка аланина, и усеченная форма МЛч, "ЭП-домен. Используя РПЦ, как описано в Примере 10, был сконструирован замененный вариант с двумя основными аминокислотами в последовательности Apr153-Apr154, обозначенный как МЛч(В.153А, R154A). Используя РПЦ, была также создана усеченная форма "ЭП-домена" МЛч153, путем введения стоп кодона после Арг153.To determine whether full-length ML is really necessary for biological activity, a substitutional variant MLC was constructed in which the sequence of the two main amino acids Apr 153 -Apr 154 was replaced by two alanine residues and the truncated form of the MLC was "EP domain. Using The ROC, as described in Example 10, constructed a substituted variant with two basic amino acids in the sequence Apr 153 -Apr 154 , designated as MLCh (B.153A, R154A). Using the ROC, a truncated form of the "EP domain" MLC 153 was also created. by introducing a stop codon p donkey Arg153.

5. Экспрессия рекомбинантного лиганда mpl человека (рМЛч) в транзиторно трансфецированных клетках эмбриональной почки человека (293)5. Expression of the recombinant human mpl ligand (rMLC) in transiently transfected cells of the human embryonic kidney (293)

Для подтверждения того, что клонированная кДНК человека кодирует лиганд для mpl, лиганд был экпрессирован в клетки 293 млекопитающих, применяя экспрессию векторами рRК5-МЛч или pRK5-МЛч153, в условиях непосредственного подавления раннего промотера цитомегаловируса. Было обнаружено, что супернатанты из транзиторно трансфецированных клеток 293 эмбриональной почки человека стимулируют включение 3H-тимидина в Ba/F3-mpl клетки, но не в родительские Ba/F3 клетки (фиг.12А). Среда от клеток 293, трансфецированных только pRK вектором, не содержит данной активности. Добавление mpl-IgG к среде предотвращает стимуляцию (данные не представлены). Эти результаты показывают, что клонированная кДНК кодирует функциональный МЛ человека (МЛч).To confirm that the cloned human cDNA encodes a ligand for mpl, the ligand was expressed in 293 mammalian cells using expression with pRK5-MLCh or pRK5-MLC 153 vectors, while directly inhibiting the early cytomegalovirus promoter. It was found that supernatants from transiently transfected 293 human embryonic kidney cells stimulate the incorporation of 3 H-thymidine into Ba / F3-mpl cells, but not into parent Ba / F3 cells (Fig. 12A). The medium from 293 cells transfected with only pRK vector does not contain this activity. Adding mpl-IgG to the medium prevents stimulation (data not shown). These results indicate that the cloned cDNA encodes a functional human ML (MLC).

Для определения, способен ли "ЭП-домен" сам по себе связываться и активировать mpl, была экспрессирована усеченная форма МЛч, рМЛч153, в клетках 293. Было обнаружено, что супернатанты трансфецированных клеток обладают активностью, близкой к той, которая имеется в супернатантах клеток, экспрессирующих МЛч полной длины (фиг.12А), показывая, что С-концевой конец МЛ не требуется для связывания и активации с-mpl.To determine whether the "EP domain" can bind and activate mpl on its own, a truncated form of MLCh, rMLCh 153 , was expressed in 293 cells. It was found that supernatants of transfected cells have activity similar to that found in cell supernatants expressing full-length MLC (Fig. 12A), showing that the C-terminal end of the ML is not required for binding and activation of c-mpl.

7. Мегакариоцитопоээ и mpl лиганд7. Megakaryocytopoies and mpl ligand

Было предположено, что мегакариоцитопоэз регулируется на многих клеточных уровнях (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982] и Williams et al., Blood Cells, 15: 123-133 [1989]). Это основано, главным образом, на наблюдении, что определенные гематопоэтические факторы роста стимулируют пролиферацию прогениторов мегакариоцитов, тогда как другие, в основном, проявляют действие на созревание. Данные, представленные здесь, подтверждают, что МЛ действует как пролиферативный фактор, так и как фактор созревания. То, что МЛ стимулирует пролиферацию прогениторов мегакариоцитов, подтверждается несколькими путями доказательств. Первое, АПС стимулирует и пролиферацию, и созревание мегакариоцитов человека in vitro, и эта стимуляция полностью подавляется mpl-IgG (фиг.7 и 8). Более того, ингибирование формирования колоний с-mpl антисенсными нуклеотидами (Methia et al., Blood, 82: 1395-1401 [1993]), и обнаружение того, что с-mpl может передавать пролиферативный сигнал в клетки, которые трансфецированы (Skoda et al., EMBO, 12: 2645-2653 [1993] и Vigon et al., Oncogene, 8: 2607-2615 [1993]), также отмечает, что МЛ стимулирует пролиферацию. Видимая экспрессия с-mpl в течение всех стадий дифференциации мегакариоцитов (Methia et al., Blood, 82: 1395-1401 [1993]) и способность рекомбинантного МЛ быстро стимулировать продукцию тромбоцитов in vivo отмечает, что МЛ также действует на созревание. Способность к активации у рекомбинантного МЛ создает возможности для более тщательной оценки его роли в регуляции мегакариоцитопоэза и тромбоцитопоэза, так же как и его способность влиять на другие гематопоэтические дифференцирующиеся линии.It has been suggested that megakaryocytopoiesis is regulated at many cellular levels (Williams et al., J. Cell Physiol., 110: 101-104 [1982] and Williams et al. Blood Cells, 15: 123-133 [1989]). This is mainly based on the observation that certain hematopoietic growth factors stimulate the proliferation of megakaryocyte progenitors, while others mainly show maturation. The data presented here confirm that ML acts both as a proliferative factor and as a maturation factor. The fact that ML stimulates the proliferation of megakaryocyte progenitors is supported by several ways of evidence. First, APS stimulates both proliferation and maturation of human megakaryocytes in vitro, and this stimulation is completely suppressed by mpl-IgG (Figs. 7 and 8). Moreover, inhibition of colony formation with c-mpl antisense nucleotides (Methia et al., Blood, 82: 1395-1401 [1993]), and the discovery that c-mpl can transmit a proliferative signal to cells that are transfected (Skoda et al ., EMBO, 12: 2645-2653 [1993] and Vigon et al., Oncogene, 8: 2607-2615 [1993]), also notes that ML stimulates proliferation. Visible expression of c-mpl during all stages of megakaryocyte differentiation (Methia et al., Blood, 82: 1395-1401 [1993]) and the ability of recombinant ML to rapidly stimulate platelet production in vivo indicates that ML also acts on maturation. The ability to activate in recombinant ML creates opportunities for a more thorough assessment of its role in the regulation of megakaryocytopoiesis and thrombocytopoiesis, as well as its ability to influence other hematopoietic differentiating lines.

8. Выделение гена лиганда mpl (ТП) человека8. Isolation of the human ligand mpl (TP) gene

Клоны геномной ДНК человека гена ТП выделили методом просеивания геномной библиотеки человека в X-Geml2 с pR45 в условиях с низкой строгостью или в условиях с высокой строгостью с фрагментом, соответствующим 3’ половине кДНК человека, кодирующей лиганд mpl. Было выделено два перекрывающихся ламбда клона протяженностью 35 тыс. оснований. Были клонированы и секвенированы два перекрывающихся фрагмента (BamHl и EcoRI), содержащие полный ген ТП (см. фиг.14А, 14В и 14С).Clones of the human genomic DNA of the TP gene were isolated by sieving the human genomic library in X-Geml2 with pR45 under conditions of low stringency or in conditions of high stringency with a fragment corresponding to 3 ’half of the human cDNA encoding the mpl ligand. Two overlapping lambda clones with a length of 35 thousand bases were isolated. Two overlapping fragments (BamHl and EcoRI) containing the complete TP gene were cloned and sequenced (see FIGS. 14A, 14B and 14C).

Структура гена человека состоит из 6 эксонов по 7 тыс. оснований геномной ДНК. Связи всех соединений эксон/интрон состоят из согласованных структур, характерных для генов млекопитающих (Shapiro, M.B., et al., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Эксон 1 и эксон 2 содержат 5’ нетранслируемую последовательность и начальные четыре аминокислоты сигнального пептида. Оставшиеся для секреторного сигнала и первые 26 аминокислот зрелого белка кодируются 3 эксоном. Полный карбоксильный домен и 3’ нетранслируемый, так же как и -50 аминокислот эритропоэтин-подобного домена, кодируются эксоном 6. Четыре аминокислоты, включенные в делецию, наблюдающиеся между МЛч-2 (ТП-2), кодируются у 5’ конца эксона 6.The structure of the human gene consists of 6 exons of 7 thousand bases of genomic DNA. The bonds of all exxon / intron compounds consist of coordinated structures characteristic of mammalian genes (Shapiro, M.B., et al., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exxon 1 and Exxon 2 contain a 5 ’untranslated sequence and the initial four amino acids of the signal peptide. The remaining for the secretory signal and the first 26 amino acids of the mature protein are encoded by 3 exon. The complete carboxyl domain and 3 ’untranslated, as well as -50 amino acids of the erythropoietin-like domain, are encoded by exon 6. The four amino acids included in the deletion observed between MLC-2 (TP-2) are encoded at the 5’ end of exon 6.

Анализ геномной ДНК человека при помощи Sauthern блота отметил, что ген ТП имеется в единственной копии. Хромосомное расположение гена было определено с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), которой картировали хромосому 3q27-28.Analysis of human genomic DNA using Sauthern blot noted that the TP gene is available in a single copy. The chromosome location of the gene was determined using in situ fluorescence hybridization (FISH), which mapped the chromosome 3q27-28.

9. Экспрессия и очистка ТП из клеток 2939. Expression and purification of TP from cells 293

Получение и очистка МЛ или ТП из клеток 293 подробно описана в Примере 19. В кратком виде, кДНК, соответствующая полному ТП с открытой рамкой, была получена при помощи РПЦ, используя pRK5-hmpl I. Продукт РПЦ очистили и клонировали между участками рестрикции Clal и Xbal плазмиды pRK5tkneo (производный вектор pRK5, модифицированный для экспрессии гена устойчивости к неомицину, в условиях подавления промотора киназы тимидина) для получения вектора pRK5tkneo.ORF (вектора, кодирующего полную открытую рамку считывания).The preparation and purification of ML or TP from 293 cells is described in detail in Example 19. In brief, the cDNA corresponding to the full TP with open frame was obtained using ROC using pRK5-hmpl I. The ROC product was purified and cloned between the Clal restriction sites and Xbal plasmids pRK5tkneo (a derivative of the pRK5 vector modified to express the neomycin resistance gene under conditions of suppression of the thymidine kinase promoter) to obtain the pRK5tkneo.ORF vector (a vector encoding a full open reading frame).

Второй вектор, кодирующий гомологичный домен ЭП, был получен таким же образом, но используя различные РПЦ праймеры для получения окончательной конструкции, названной pRK5-tkneoSn-A.The second vector encoding the homologous domain of EP was obtained in the same way, but using different ROC primers to obtain the final construct, called pRK5-tkneoSn-A.

Эти две конструкции были трансфецированы в клетки эмбриональной почки человека при помощи СаРO4 метода и были отобраны клоны устойчивые к неомицину, которые выращивали до конфлуентного состояния. Экспрессия MЛ153 или МЛ332 в кондиционированной среде из данных клонов была оценена при помощи исследования пролиферации Ba/F3-mpl.These two constructs were transfected into human embryonic kidney cells using the CaPO 4 method and neomycin-resistant clones that were grown to a confluent state were selected. The expression of ML 153 or ML 332 in a conditioned medium from these clones was evaluated using a Ba / F3-mpl proliferation assay.

Очистку рМЛч332 провели, как описано в Примере 19. В кратком виде, 293-рМЛч332 кондиционированную среду нанесли на колонку с Blue-Sepharose (Pharmacia), которую сразу же промыли буфером, содержащим 2 М мочевину. Колонку элюировали буфером, содержащим 2 М мочевину и 1 М NaCl. Объем элюции после колонки с Blue-Sepharose затем непосредственно нанесли на колонку с WGA-Sepharose, промыли 10 объемами колонки буфера, содержащего 2 М мочевину и 1 М NaCl, и элюировали тем же буфером, содержащим 0,5 М N-ацетил-D-глюкозамин. Элюат с колонки с WGA-Sepharose нанесли на С4-ЖХВР колонку (Synchron, Inc.) и элюировали непрерывным градиентом пропанола. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) очищенный 293-рМЛч332 мигрирует в геле в виде широкой полосы в области 68-70 kDa (см. фиг.15).Purification of rMLC 332 was performed as described in Example 19. In brief, 293 rMLC 332 332 conditioned medium was applied to a Blue-Sepharose column (Pharmacia), which was immediately washed with 2 M urea buffer. The column was eluted with a buffer containing 2 M urea and 1 M NaCl. The elution volume after the Blue-Sepharose column was then directly applied to the WGA-Sepharose column, washed with 10 column volumes of a buffer containing 2 M urea and 1 M NaCl, and eluted with the same buffer containing 0.5 M N-acetyl-D- glucosamine. The eluate from the WGA-Sepharose column was loaded onto a C4-HPLC column (Synchron, Inc.) and eluted with a continuous gradient of propanol. Upon polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE), purified 293-rMLC 332 migrates in the gel as a wide band in the region of 68-70 kDa (see FIG. 15).

Очистку рКЛч153 также провели, как описано в Примере 19. В кратком виде, 293-pMЛч153 кондиционированную среду пропустили через колонку с Blue-Sepharose, как описано для рМЛч332. Элюат с колонки с Blue-Sepharose непосредственно нанесли на mpl-аффинную колонку, как описано выше. Элюированный с mpl-колонки рМЛч153, очистили до гомогенного состояния, используя С4-ЖХВР колонку, разогнав при тех же условиях, что и для рМЛч332. На SDS-PAGE очищенный рМЛч153 разогнался на 2 большие и 2 малые полосы с Mr около 18000-22000 (см. фиг.15).The purification of rCCL 153 was also carried out as described in Example 19. In brief, 293-pMLC 153 conditioned medium was passed through a Blue-Sepharose column as described for rMLC 332 . The Blue-Sepharose column eluate was directly applied to the mpl-affinity column as described above. Eluted from the mpl-column rMLCh 153 was purified to a homogeneous state using a C4-HPLC column, dispersing under the same conditions as for rMLCh 332 . On SDS-PAGE, the purified rMLCh 153 was dispersed into 2 large and 2 small bands with Mr about 18000-22000 (see FIG. 15).

10. Лиганд mpl мыши10. Ligand mouse mpl

Фрагмент ДНК, соответствующий области кодирования лиганда mpl человека, полученный при помощи РПЦ, очистили и пометили в присутствии 32Р-dАТФ и 32Р-dАТФ. Данные зонды использовали для скрининга 106 клонов библиотеки кДНК печени мыши в λGT10. Был выделен и секвенирован клон мыши (фиг.16 [Посл. No: 12 и 13]), содержащий 1443 пар оснований включения. Предполагаемый кодон инициации в положении 138-141 нуклеотидов находился в согласованной последовательности, благоприятной для инициации трансляции у эукариот (Kozak, M.J. Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Последовательность определяется открытой рамкой считывания в 1056 нуклеотидов, которые предсказывают первичный продукт трансляции в 352 аминокислоты. Окаймляют данную открытую рамку считывания 137 5’ нуклеотидов и 247 3’ нуклеотидов несчитываемой последовательности. Окончание поли(А) после 3’ нетранслируемой области отсутствует, что отмечает, что клон, по-видимому, не завершен. N-конец предсказанной аминокислотной последовательности является очень гидрофобным и, по-видимому, представляет сигнальный пептид. Компьютерный анализ (von Heijne, G. Eur. J. Biochem., 133: 17-21 [1983]) отметил возможные места для разрыва для сигнальной пептидазы между 21 и 22 остатками. Разрыв в данном месте мог дать зрелый полипептид из 331 аминокислоты (35 kDa), идентичный МЛм331 (или МЛм2 по причине, описанной выше). Последовательность содержит 4 цистеина, все консервативны в последовательности человека, и 7 возможных участков N-гликозилирования, 5 из которых являются консервативными в последовательности человека. Снова, как у МЛч, все семь возможных участков N-гликозилирования расположены в С-концевой половине белка.The DNA fragment corresponding to the coding region of the human mpl ligand obtained using ROC was purified and labeled in the presence of 32 P-dATP and 32 P-dATP. These probes were used to screen 10 6 clones of the mouse liver cDNA library in λGT10. A mouse clone was isolated and sequenced (Fig. 16 [Last No: 12 and 13]) containing 1443 base pairs of inclusion. The putative initiation codon at position 138-141 nucleotides was in a consistent sequence favorable for translation initiation in eukaryotes (Kozak, MJ Cell Biol., 108: 229-241 [1989]). The sequence is determined by an open reading frame of 1056 nucleotides, which predict the primary translation product of 352 amino acids. Border this open reading frame of 137 5 'nucleotides and 247 3' nucleotides of an unreadable sequence. The termination of poly (A) after 3 ′ of the untranslated region is absent, which indicates that the clone does not appear to be complete. The N-terminus of the predicted amino acid sequence is very hydrophobic and appears to be a signal peptide. Computer analysis (von Heijne, G. Eur. J. Biochem., 133: 17-21 [1983]) noted possible breakdown sites for signal peptidase between 21 and 22 residues. A gap at this location could result in a mature 331 amino acid polypeptide (35 kDa) identical to MLm 331 (or MLm2 for the reason described above). The sequence contains 4 cysteines, all conserved in the human sequence, and 7 possible N-glycosylation sites, 5 of which are conserved in the human sequence. Again, as in HMF, all seven possible N-glycosylation sites are located in the C-terminal half of the protein.

Когда сравнили с МЛ человека, была обнаружена значительная идентичность и нуклеотидной, и выведенной аминокислотной последовательности у "ЭП-доменов" данных МЛ. Однако когда выведенные аминокислотные последовательности МЛ человека и мыши расположили в ряд, выяснилось, что последовательность мыши имеет тетрапептидную делецию между остатками 111 и 114, соответствующую 12 нуклеотидной делеции после 618 положения нуклеотида, видимую у обеих кДНК, человека (см. выше) и свиньи (см. ниже). Поэтому были исследованы дополнительные клоны для обнаружения возможных изоформ МЛ мыши. Один клон кодировал выведенную 335 аминокислотную последовательность полипептида, содержащего "утерянный" тетрапептид LPLQ. Данная форма представляется МЛ мыши полной длины и обозначена как МЛм или МЛм335. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательность МЛм представлены на фиг.17 (Посл. No: 14 и 15). Данный клон кДНК содержит 1443 пары оснований, оканчивающихся поли(А) окончанием. Он проявляет открытую рамку считывания из 1068 пар оснований, окаймленных 134 основаниями 5’ и 241 основанием 3’ нетранслируемой последовательности. Предполагаемый кодон инициации лежит в положении нуклеотидов 138-140. Открытая рамка считывания кодирует предсказанный белок из 356 аминокислот, 21 первых которого являются высокогидрофобными и, по-видимому, функционируют как секреторный сигнал.When compared with human ML, a significant identity of both the nucleotide and the deduced amino acid sequence was found in the "EP domains" of these MLs. However, when the deduced amino acid sequences of human and mouse MLs were arranged in a row, it turned out that the mouse sequence has a tetrapeptide deletion between residues 111 and 114, corresponding to 12 nucleotide deletions after 618 nucleotide positions, visible in both cDNAs, humans (see above) and pigs ( see below). Therefore, additional clones were investigated to detect possible isoforms of mouse ML. One clone encoded the deduced 335 amino acid sequence of a polypeptide containing the "lost" LPLQ tetrapeptide. This form is represented by the full-length ML of the mouse and is designated as MLm or MLm 335 . The nucleotide and deduced amino acid sequence of MLM are presented in Fig. 17 (Posl. No: 14 and 15). This cDNA clone contains 1,443 base pairs ending in poly (A) terminus. It exhibits an open reading frame of 1068 base pairs, bordered by 134 5 ′ bases and 241 3 ′ base untranslated sequences. The putative initiation codon lies at nucleotide position 138-140. An open reading frame encodes a predicted protein of 356 amino acids, the first 21 of which are highly hydrophobic and appear to function as a secretory signal.

Наконец, третий выделенный и секвенированный клон мыши, было найдено, что он содержит 116 нуклеотидную делецию, соответствующую МЛч3. Эта изоформа мыши, следовательно, была обозначена МЛм3. Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей этих двух изоформ показано на фиг.18 (Посл. No: 9 и 16).Finally, the third isolated and sequenced mouse clone, it was found that it contains a 116 nucleotide deletion corresponding to Mlch3. This mouse isoform, therefore, was designated MLm3. A comparison of the deduced amino acid sequences of these two isoforms is shown in Fig. 18 (Posl. No: 9 and 16).

Общая идентичность аминокислотной последовательности между МЛ человека и мыши (фиг.19 [Посл. No: 6 и 17]) составляет 72%, но эта гомология распределена неравномерно. Область, обозначенная как "ЭП-домен" (аминокислотные остатки 1-153 для последовательности человека и 1-149 для мыши) является более консервативной (86% гомологии), чем карбокси-концевая область белка (62% гомологии). Это может далее указывать, что только "ЭП-домен" является важным для биологической активности белка. Интересно, относительно двух структур из двух основных аминокислот, обнаруженных у МЛч, только структура из двух основных аминокислот, непосредственно следующая за "ЭП-доменом" (положение остатков 153-154) в последовательности человека, присутствует в последовательности мыши. Это находится в соответствии с возможностью, что МЛ полной длины может представлять белок предшественник, который подлежит ограниченному протеолизу с получением зрелого лиганда. Альтернативно, протеолиз между Арг153-Apr154 может ускорять выведение МЛч.The overall amino acid sequence identity between human and mouse ML (Fig. 19 [Last No: 6 and 17]) is 72%, but this homology is not evenly distributed. The region designated as the "EP domain" (amino acid residues 1-153 for the human sequence and 1-149 for the mouse) is more conserved (86% homology) than the carboxy-terminal region of the protein (62% homology). This may further indicate that only the "EP domain" is important for the biological activity of the protein. Interestingly, with respect to the two structures of the two basic amino acids found in HMF, only the structure of the two basic amino acids immediately following the "EP domain" (position of residues 153-154) in the human sequence is present in the mouse sequence. This is consistent with the possibility that full-length ML can be a precursor protein that is subject to limited proteolysis to give a mature ligand. Alternatively, proteolysis between Arg 153 -Apr 154 can accelerate the excretion of MLC.

Вектор экспрессии, содержащий полную кодирующую последовательность МЛм, временно трансфецировали в клетки 293, как описано в Примере 1. Кондиционированная среда от этих клеток стимулировала включение 3H-тимидина в Ba/F3 клетки, экспрессирующие mpl и человека и мыши, но не оказывала действия на родительскую (лишенную mpl) линию клеток. Это свидетельствует, что клонированная кДНК МЛ мыши кодирует функциональный лиганд, который способен активировать оба МЛ рецептора (mpl), мыши и человека.An expression vector containing the complete coding sequence of MLM was temporarily transfected into 293 cells as described in Example 1. The conditioned medium from these cells stimulated the incorporation of 3 H-thymidine into Ba / F3 cells expressing mpl and human and mouse, but had no effect on parent (mpl-deprived) cell line. This suggests that the cloned mouse ML cDNA encodes a functional ligand that is capable of activating both ML receptors (mpl), mouse and human.

11. Лиганд mpl свиньи11. Ligand pig mpl

кДНК МЛ свиньи (МЛс) выделили путем RACE РПЦ, как описано в Примере 13. кДНК из 1342 пар оснований, продукт РПЦ, была обнаружена в почках и субклонирована. Было секвенировано несколько клонов и обнаружено 332 аминокислотных остатка для кодирования лиганда mpl свиньи, обозначенных как МЛс (или МЛс332), имеющих нуклеотидную и выведенную аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 20 (Посл. No: 18 и 19).pig ML cDNA (MLS) was isolated by RACE ROC, as described in Example 13. cDNA of 1342 base pairs, a product of ROC, was detected in the kidneys and subcloned. Several clones were sequenced and 332 amino acid residues were found to encode the pig mpl ligand, designated as MLS (or MLS 332 ) having the nucleotide and deduced amino acid sequence shown in FIG. 20 (Pos. No: 18 and 19).

Была снова идентифицирована вторая форма, обозначенная МЛс2, кодирующая белок с 4 делециями аминокислотных остатков (228 аминокислотных остатков) (см. фиг.21 [Посл. No: 21]. Сравнение аминокислотных последовательностей МЛс и МЛс2 показало, что последняя форма является идентичной за исключением того, что тетрапептид QLPP, соответствующий остаткам 111-114 включительно, был удален (см. фиг.22 [Посл. No: 18 и 19]). Выпадение четырех аминокислот, обнаруженное в кДНК МЛ и у мыши, и у свиньи, наблюдается точно в том же положении в предсказанных белках.The second form, identified as MLC2, encoding a protein with 4 deletions of amino acid residues (228 amino acid residues) was again identified (see Fig. 21 [Last No: 21]. Comparison of the amino acid sequences of MLC and MLC2 showed that the latter form is identical except for that the QLPP tetrapeptide corresponding to residues 111-114 inclusive was deleted (see FIG. 22 [Last No: 18 and 19]. The loss of four amino acids detected in ML cDNA in both mouse and pig is accurately observed in the same position in the predicted proteins.

Сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей зрелых МЛ человека, мыши и свиньи (фиг.19 [Посл. No: 6, 17 и 18] отмечает, что в общем последовательности идентичны и составляют 72 процента между мышью и человеком, 68 процентов между мышью и свиньей и 73 процента между свиньей и человеком. Гомология существенно выше в амино-концевой половине МЛ (гомологичный домен ЭП). Этот домен от 80 до 84 процентов идентичен между любыми двумя видами, тогда как карбокси-концевая половина (углеводный домен) идентичен только на 57-67 процентов. Структура из двух основных аминокислот, которая могла бы представлять участок для расщепления протеазами, присутствует в карбоксильном конце гомологичного домена эритропоэтина. Эта структура является консервативной у трех видов в данном положении (фиг.19 [Посл. 6, 17 и 18]). Второй участок с двумя основаниями присутствует в положении 245 и 246 у человека и не присутствует в последовательности у мыши или свиньи. Последовательность МЛ мыши и свиньи содержит 4 цистеина, все консервативны в последовательности человека. Имеется семь участков возможного N-гликозилирования в лиганде мыши и шесть в МЛ свиньи, 5 из них консервативны с последовательностью человека. Все возможные участки N-гликозилирования расположены снова в С-концевой половине белка.A comparison of the predicted amino acid sequences of mature human, mouse, and pig MLs (Fig. 19 [Last No: 6, 17, and 18] notes that, in general, the sequences are identical and comprise 72 percent between the mouse and the human, 68 percent between the mouse and the pig and 73 percent between pig and human. Homology is significantly higher in the amino-terminal half of ML (homologous domain of EP). This domain is 80 to 84 percent identical between any two species, while the carboxy-terminal half (carbohydrate domain) is only 57-67 percent. The structure of two of basic amino acids, which could represent a site for cleavage by proteases, is present at the carboxyl end of the homologous domain of erythropoietin.This structure is conserved in three species in this position (Fig. 19 [Pos. 6, 17 and 18]). The second site with two bases present at positions 245 and 246 in humans and not present in the sequence in mice or pigs The mouse and pig ML sequence contains 4 cysteines, all conservative in the human sequence. There are seven sites of possible N-glycosylation in the mouse ligand and six in ML pigs, 5 of which are conserved with the human sequence. All possible N-glycosylation sites are located again in the C-terminal half of the protein.

12. Экспрессия и очистка ТП из клеток яичника китайского хомячка (СНО)12. Expression and purification of TP from Chinese hamster ovary cells (CHO)

Использованные векторы экспрессии для трансфекции СНО клеток обозначены: pSVIS.ID.LL.MLORF (полная длина или ТП332), и p3V15.ID.LL.MLEPO-D (усеченный или ТП153). Имеющие отношения к делу особенности этих плазмид представлены на фиг.23 и 24.Used expression vectors for transfection of CHO cells are designated: pSVIS.ID.LL.MLORF (full length or TP 332 ), and p3V15.ID.LL.MLEPO-D (truncated or TP 153 ). Relevant features of these plasmids are presented in FIGS. 23 and 24.

Процедуры трансфекции описаны в Примере 20. В кратком виде, кДНК, соответствующая полной открытой рамке считывания ТП, получена путем РПЦ. Продукт РПЦ очищали и клонировали между двумя сайтами рестрикции (Clal и Sall) плазмид p3V15.ID.LL. для получения вектора pSV15.ID.LL.MLORF. Вторую конструкцию, соответствующую гомологичному домену ЭП, получили тем же путем, но используя другой обратный праймер (EPOD.Sal). Конечную конструкцию для вектора, кодирующего гомологичный домен ЭП у ТП назвали pSV15.ID.LL.MLEPO-D.Transfection procedures are described in Example 20. In short, the cDNA corresponding to the full open reading frame of TP was obtained by ROC. The ROC product was purified and cloned between two restriction sites (Clal and Sall) of plasmids p3V15.ID.LL. to obtain the vector pSV15.ID.LL.MLORF. The second construct, corresponding to the homologous domain of EP, was obtained in the same way, but using a different reverse primer (EPOD.Sal). The final construct for the vector encoding the homologous domain of EP in TP was named pSV15.ID.LL.MLEPO-D.

Эти две конструкции линеаризовали с Notl и трансфецировали в клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO-DP12, Европейский патент 307247, опубликованный 15 марта 1989 г.) путем электропорации. Были электропорированы 107 клеток при помощи BRL аппарата для электоропорации (350 вольт, 350 мФ, низкая емкость) в присутствии 10, 25 или 50 мг ДНК, как описано (Andreason, G.L. J. Tissue Cult. Meth. 15, 56, [1993]). На следующий день после трансфекции клетки расслоили в DHFR селективной среде (DMEM-F12 с высоким содержанием глюкозы 50:50 без глицина, 2 мМ глютамин, 2-5% диализованной телячьей сыворотки). Через 10-15 дней отдельные колонии перенесли в платы с 96 ячейками и оставили расти до конфлуентности. Эксперессию MA153 или МЛ332 определяли в кондиционированной среде из данных клонов, используя исследование пролиферации Ba/F3-mpl клеток (описано в Примере 1).These two constructs were linearized with Notl and transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO-DP12 cells, European patent 307247, published March 15, 1989) by electroporation. 10 7 cells were electroporated using a BRL electroporation apparatus (350 volts, 350 mF, low capacitance) in the presence of 10, 25 or 50 mg of DNA as described (Andreason, GLJ Tissue Cult. Meth. 15, 56, [1993]) . The day after transfection, the cells were stratified in DHFR selective medium (DMEM-F12 with a high glucose content of 50:50 without glycine, 2 mM glutamine, 2-5% dialyzed calf serum). After 10-15 days, individual colonies were transferred to 96-well plates and allowed to grow to confluence. Expression MA 153 or ML 332 was determined in a conditioned medium from these clones using a study of the proliferation of Ba / F3-mpl cells (described in Example 1).

Способ очистки и выделения ТП из культуральной жидкости выращенных клеток СНО описан в Примере 20. В кратком виде, культуральную жидкость после выращивания клеток (КЖК) наносили на колонку с Blue Sepharose (Pharmacia) в соотношении приблизительно 100 л КЖК на литр гранул носителя. Затем колонку промывали 3-5 объемами колонки буфером, содержащим 2,0 М мочевину. Затем элюировали ТП 3-5 объемами колонки буфером, содержащим и 2,0 М мочевину, и 1 М NaCl.A method for purifying and isolating TP from the culture fluid of the grown CHO cells is described in Example 20. In brief, the culture fluid after cell growth (SCFA) was applied to a Blue Sepharose (Pharmacia) column in a ratio of approximately 100 L SCFA per liter of carrier granules. Then the column was washed with 3-5 column volumes with buffer containing 2.0 M urea. Then TP was eluted with 3-5 column volumes with a buffer containing both 2.0 M urea and 1 M NaCl.

Объем элюата с колонки с Blue Sepharose, содержащий ТП, наносили затем на колонку Wheat Germ Lectin Spharose (Сефарозу с лектином проростков пшеницы) (Pharmacia), уравновешенную элюирующим буфером Blue Sepharose, в соотношении от 8 до 16 объемов элюата на мл объема гранул Blue Sepharose. Затем колонку промыли 2-3 объемами буфера уравновешивания. Затем элюировали ТП 2-5 объемами буфера, содержащего 2,0 М мочевину и 0,5 М N-ацетил-D-глюкозамин.The volume of the eluate from the Blue Sepharose column containing TP was then applied to the Wheat Germ Lectin Spharose column (Pharmacia Sepharose), equilibrated with Blue Sepharose elution buffer, in a ratio of 8 to 16 eluate volumes per ml of Blue Sepharose pellet volume . Then the column was washed with 2-3 volumes of equilibration buffer. Then TP was eluted with 2-5 volumes of buffer containing 2.0 M urea and 0.5 M N-acetyl-D-glucosamine.

Затем элюат с колонки с Weat Germ Lectin, содержащий ТП, подкислили и добавили С12Е8 до конечной концентрации 0,04%. Конечный объем нанесли на колонку С4 с обращенной фазой, уравновешенную 0,1% TFA, 0,04% С12Е8 при загрузке, приблизительно, от 0,2 до 0,5 мг белка на мл носителя.Then the eluate from the Weat Germ Lectin column containing TP was acidified and C 12 E 8 was added to a final concentration of 0.04%. The final volume was applied to a C4 column with a reversed phase, balanced with 0.1% TFA, 0.04% C 12 E 8 when loading from about 0.2 to 0.5 mg of protein per ml of carrier.

Белок элюировали в две фазы линейным градиентом ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA и 0,04% С12Е8, и создали объем основе данных SDS-PAGE.The protein was eluted in two phases by a linear gradient of acetonitrile containing 0.1% TFA and 0.04% C 12 E 8 , and a volume was created based on SDS-PAGE data.

Объем с С4 развели и диафильтровали против, приблизительно, 6 объемов буфера на Amicon YM или подобной ультрафильтрационной мембране, имеющей отсечение по молекулярному весу от 10000 до 30000 дальтон. Конечный диафильтрат затем может быть прямо обработан или далее сконцентрирован путем ультрафильтрации. Диафильтрат/концентрат обычно доводят до конечной концентрации с помощью 0,01% Твин-80.The C4 volume was diluted and diafiltered against approximately 6 volumes of buffer on an Amicon YM or similar ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 10,000 to 30,000 daltons. The final diafiltrate can then be directly processed or further concentrated by ultrafiltration. The diafiltrate / concentrate is usually adjusted to a final concentration with 0.01% Tween-80.

Весь или часть диафильтрата/концентрата, эквивалентную 2-5% рассчитанного объема колонки, затем наносят на колонку с Сефакрил S-300 HR (Pharmacia), уравновешенную буфером, содержащим 0,01% Твин-80, и хроматографируют. Фракции, содержащие ТП, которые свободны от агрегатов и продуктов деградации, затем объединили на основе данных SDS-PAGE. Конечный объем профильтровали и хранили при 2-8°С.All or part of the diafiltrate / concentrate, equivalent to 2-5% of the calculated column volume, is then applied to a Sephacryl S-300 HR column (Pharmacia), equilibrated with a buffer containing 0.01% Tween-80, and chromatographed. The fractions containing TP, which are free from aggregates and degradation products, were then combined based on SDS-PAGE data. The final volume was filtered and stored at 2-8 ° C.

13. Способы трансформирования и индукции синтеза ТП в микроорганизме и выделение, очистка и укладывание полученного здесь ТП13. Methods for transforming and inducing TP synthesis in a microorganism and isolating, cleaning, and stacking TP obtained here

Конструирование вектора экспрессии ТП в Е.coli описано в подробностях в Примере 21. В кратком виде, плазмиды рМР21, рМР151, рМР41, рМР57 и рМР202 все созданы для экспрессии первых 155 аминокислот ТП вниз по течению маленьким лидером, который варьирует для различных конструкций. Лидеры получают главным образом для инициации трансляции высокого уровня и быстрой очистки. Плазмиды рМР210-1, -Т8, -21, -22, -24, -25 созданы для экспрессии первых 153 аминокислот ТП вниз по течению инициации метионина и различаются только по кодону, используемому для первых 6 аминокислот ТП, тогда как плазмида рМР251 является производной от рМР210-1, в которой карбоксильный конец ТП увеличен на две аминокислоты. Все вышеуказанные плазмиды будут производить внутриклеточную экспрессию высокого уровня ТП в Е.coli в условиях индукции триптофанового промотера (Yansura, D.G. et al.. Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Ed.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Плазмиды pMP1 и рМР172 являются промежуточными в конструкциях вышеуказанных плазмид внутриклеточной экспрессии ТП.The construction of TP expression vector in E. coli is described in detail in Example 21. Briefly, plasmids pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 and pMP202 are all designed to express the first 155 amino acids of TP downstream by a small leader that varies for different constructs. Leaders get mainly to initiate high-level translation and quick cleanup. The plasmids pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 are designed to express the first 153 amino acids of TP downstream of methionine initiation and differ only in the codon used for the first 6 amino acids of TP, while plasmid pMP251 is a derivative from pMP210-1, in which the carboxyl terminus of TP is increased by two amino acids. All of the above plasmids will produce intracellular expression of high levels of TA in E. coli under the induction of a tryptophan promoter (Yansura, DG et al .. Methods in Enzymology (Goeddel, DV, Ed.) 185: 54-60, Academic Press, San Diego [ 1990]). Plasmids pMP1 and pMP172 are intermediate in the constructs of the above plasmids for intracellular expression of TP.

Вышеуказанные плазмиды экспрессии ТП были использованы для трансформации Е.coli, применяя метод теплового шока с CaCl2 (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162 [1970]) и другие способы, описанные в Примере 21. В кратком виде, трансформированные клетки сначала выращивали при 37°С до достижения оптической плотности культуры при (600 нм) приблизительно 2-3. Затем культуру разводили и после выращивания при аэрации добавляли кислоту. Культуру затем оставляли для продолжения роста при аэрации на следующие 15 часов, по истечение которых клетки собирали путем центрифугирования.The above plasmids for the expression of TP were used to transform E. coli using the heat shock method with CaCl 2 (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162 [1970]) and other methods described in Example 21. In short form, the transformed cells were first grown at 37 ° C until the optical density of the culture at (600 nm) was approximately 2-3. Then the culture was diluted and after growing under aeration, acid was added. The culture was then left to continue growing under aeration for the next 15 hours, after which the cells were harvested by centrifugation.

Способы выделения, очистки и укладывания, приведенные ниже, для получения биологически активного, сложившегося ТП человека или его фрагментов, описанные в Примерах 22 и 23, могут быть применены для получения любого варианта ТП, включая N- и С-концевые расширенные формы. Другие способы, подходящие для укладывания рекомбинантного или синтетического ТП, могут быть найдены в следующих патентах: Builder et al., Патент США 4511502; Jones et al.. Патент США 4512922; Olson, Патент США 4518526 и Builder et al., Патент США 4620948; для общего описания способов выхода и укладывания для различных рекомбинантных белков, экспрессированных в нерастворимом виде в Е.coli.The methods of isolation, cleaning, and stacking below to obtain a biologically active, established human TP or fragments thereof, described in Examples 22 and 23, can be used to obtain any variant of TP, including N- and C-terminal extended forms. Other methods suitable for laying recombinant or synthetic TP can be found in the following patents: Builder et al., US Patent 4,511,502; Jones et al .. US Patent 4,512,922; Olson, U.S. Patent 4,518,526 and Builder et al., U.S. Patent 4,620,948; for a general description of the exit and folding methods for various recombinant proteins expressed in insoluble form in E. coli.

А. Получение нерастворимого ТПA. Preparation of Insoluble TP

Микроорганизм подобный Е.coli, экспрессирующий ТП, кодируемый любыми подходящими плазмидами, ферментировали в условиях, в которых ТП откладывается в нерастворимых "рефрактильных или преломляющих тельцах". Необязательно, клетки сначала промывали в буфере для разрушения клеток. Обычно, около 100 г клеток ресуспендировали в 10 объемах буфера разрушения клеток (а именно, 10 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, рН 8) при помощи, например, гомогенизатора типа Политрон, и клетки центрифугировали при 5000×g в течение 30 минут. Затем клетки лизировали, используя любые общепринятые способы, такие как тонический шок, озвучивание, циклическое продавливание, химические или ферментативные способы. Например, промытый вышеупомянутый осадок клеток может быть ресуспендирован в других 10 объемах буфера для разрушения клеток при помощи гомогенизатора, а затем клеточную суспензию пропускали через LH Cell Disrupter (LH Iceltech, Inc.) или через Microfluidizer (Microfluidics International) в соответствии с инструкциями. Частички вещества, содержащего ТП, затем отделяли от жидкой фазы и, необязательно, промывали любой подходящей жидкостью. Например, суспензия клеточного лизата может быть центрифугирована при 5000×g в течение 30 минут, ресуспендирована и, необязательно, центрифугирована во второй раз для получения осадка рефрактильных телец. Отмытый осадок может быть использован немедленно или, необязательно, сохранен при заморозке (при, например, -70°С).A microorganism like E. coli expressing TP encoded by any suitable plasmids was fermented under conditions in which TP was deposited in insoluble "refractory or refractive bodies." Optionally, the cells were first washed in cell disruption buffer. Typically, about 100 g of cells were resuspended in 10 volumes of cell disruption buffer (namely, 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) using, for example, a Polytron type homogenizer, and the cells were centrifuged at 5000 x g for 30 minutes. Cells were then lysed using any conventional method, such as tonic shock, dubbing, cyclic bursting, chemical or enzymatic methods. For example, the washed cell pellet mentioned above can be resuspended in another 10 volumes of cell disruption buffer using a homogenizer, and then the cell suspension is passed through an LH Cell Disrupter (LH Iceltech, Inc.) or through a Microfluidizer (Microfluidics International) according to the instructions. The particles of the TP-containing material were then separated from the liquid phase and optionally washed with any suitable liquid. For example, a cell lysate suspension can be centrifuged at 5000 xg for 30 minutes, resuspended, and optionally centrifuged a second time to obtain a pellet of refractile bodies. The washed precipitate can be used immediately or, optionally, stored during freezing (at, for example, -70 ° C).

В. Солюбилизация и очистка мономерного ТПB. Solubilization and purification of monomeric TP

Нерастворимый ТП в осадке рефрактильных телец затем солюбилизировали в буфере солюбилизации. Буфер солюбилизации содержит хаотропный агент, и обычно создают буфер при основных значениях рН, и содержит восстанавливающий агент для увеличения выхода мономерного ТП. Примерные хаотропные агенты могут включать мочевину, гуанидин-НСl и тиоцианат натрия. Предпочтительным хаотропным агентом является гуанидин-НСl. Концентрация хаотропного агента обычно 4-9 М, предпочтительно, 6-8 М. рН солюбилизирующего буфера поддерживается любым подходящим буфером в ряду рН от около 7,5 до 9,5, предпочтительно 8,0-9,0, и наиболее предпочтительно, 8,0. Предпочтительно, солюбилизирующий буфер также содержит восстанавливающий агент для способствования образования мономерной формы ТП. Подходящий восстанавливающий агент включает органические вещества, содержащие свободный тиол (RSH). Примерные восстанавливающие агенты включают дитиотреитол (ДТТ), дитиоэритрит (ДТЭ), меркптоэтанол, глютатион (GSH), цистеамин и цистеин. Предпочтительным восстанавливающим агентом является дитиотреитол (ДТТ). Буфер солюбилизации может, необязательно, содержать мягкий окисляющий агент (например, молекулярный кислород) и подходящую соль для образования мономерного ТП через сульфитолизиз. В этом воплощении конечный ТП-3-сульфонат далее складывается в присутствии окислительно-восстановительного буфера (например, GSH/GSSH) для образования надлежащим образом уложенного ТП.The insoluble TP in the pellet of refractile bodies was then solubilized in a solubilization buffer. The solubilization buffer contains a chaotropic agent, and usually create a buffer at basic pH values, and contains a reducing agent to increase the yield of monomeric TP. Exemplary chaotropic agents may include urea, guanidine-Hcl and sodium thiocyanate. A preferred chaotropic agent is guanidine-Hcl. The concentration of the chaotropic agent is usually 4-9 M, preferably 6-8 M. The pH of the solubilizing buffer is maintained by any suitable buffer in the range of pH from about 7.5 to 9.5, preferably 8.0-9.0, and most preferably 8 , 0. Preferably, the solubilizing buffer also contains a reducing agent to promote the formation of the monomeric form of TP. Suitable reducing agent includes organic substances containing free thiol (RSH). Exemplary reducing agents include dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), mercptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine and cysteine. A preferred reducing agent is dithiothreitol (DTT). The solubilization buffer may optionally contain a mild oxidizing agent (e.g., molecular oxygen) and a suitable salt to form monomeric TP through sulfitolysis. In this embodiment, the final TP-3-sulfonate is further folded in the presence of a redox buffer (e.g., GSH / GSSH) to form a properly laid TP.

Белок ТП обычно далее очищали используя, например, центрифугирование, хроматографию при гель фильтрацию и хроматографию на колонке с обращенной фазой.TP protein was usually further purified using, for example, centrifugation, gel chromatography and reverse phase column chromatography.

Согласно иллюстрации следующие процедуры дают удовлетворительный выход мономерного ТП. Осадок рефрактильных телец ресуспендировали в около 5 объемах по весу буфера солюбилизации (20 мМ Трис, рН 8, с 6-8 М гуанидина и 25 мМ ДТТ) и перемешивали в течение 1-3 часов или в течение ночи при 4°С для солюбилизации белка ТП. Высокие концентрации гуанидина также применимы, но в целом приводят к несколько пониженному выходу по сравнению с гуанидином. После солюбилизации раствор центрифугировали при 30000×g в течение 30 минут для получения прозрачного супернатанта, содержащего денатурированный мономерный белок ТП. Затем супернатант хроматографировали путем гель фильтрации на колонке с Супердекс 200 (Pharmacia, 2,6×60 см) при скорости тока 2 мл/мин, и элюировали белок 20 мМ Na фосфата, рН 6,0, в присутствие 10 мМ ДТТ. Фракции, содержащие мономерный денатурированный белок ТП, элюировавшиеся между 160 и 200 мл, объединяли. Далее белок ТП очищали на полупрепаративной колонке С4 с обращенной фазой (2×20 см VYDAC). Образцы наносили при скорости 5 мл/мин на колонку, уравновешенную 0,1% ТФК (трифторуксусной кислотой) с 30% ацетонитрилом. Белок элюировали линейным градиентом ацетонитрила (30-60% за 60 минут). Очищенный восстановленный белок элюируется при приблизительно 50% ацетонитрила. Данный материал использовали для укладывания с целью получения биологически активного варианта ТП.According to the illustration, the following procedures give a satisfactory yield of monomeric TP. The pellet of refractile bodies was resuspended in about 5 volumes by weight of the solubilization buffer (20 mM Tris, pH 8, with 6-8 M guanidine and 25 mM DTT) and stirred for 1-3 hours or overnight at 4 ° C to solubilize the protein TP High concentrations of guanidine are also applicable, but generally lead to a slightly lower yield compared to guanidine. After solubilization, the solution was centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes to obtain a clear supernatant containing the denatured monomer TP protein. The supernatant was then chromatographed by gel filtration on a Superdex 200 column (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) at a flow rate of 2 ml / min, and 20 mM Na phosphate protein, pH 6.0, was eluted in the presence of 10 mM DTT. Fractions containing monomeric denatured TP protein eluted between 160 and 200 ml were combined. Next, TP protein was purified on a reversed-phase C4 semi-preparative column (2 × 20 cm VYDAC). Samples were applied at a rate of 5 ml / min on a column balanced with 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) with 30% acetonitrile. The protein was eluted with a linear gradient of acetonitrile (30-60% in 60 minutes). The purified reconstituted protein elutes at approximately 50% acetonitrile. This material was used for laying in order to obtain a biologically active version of TP.

С. Укладывание ТП для получения биологически активной формыC. Laying TP to obtain a biologically active form

После солюбилизация и дальнейшей очистки ТП получали биологически активную форму путем укладывания денатурированного мономерного ТП в окислительно-восстановительном буфере. Благодаря высокой активности ТП (полумаксимальная стимуляция в исследовании на Ba/F3 клетках достигается при приблизительно 3 пг/мл) было возможно получить биологичкски активный материал, используя многие различные буферы, детергенты и окислительно-восстановительные условия. Однако в большинстве условий получали только небольшое количество надлежащим образом уложенного материала (<10%). Для коммерческого производственного способа желательно иметь выход уложенного материала, по крайней мере, 10%, более предпочтительно, 30-50%, и, наиболее предпочтительно, >50%. Было обнаружено, что многочисленные различные детергенты, включая Тритон Х-100, додецил-бета-мальтозид, CHAPS, CHAPSO, SDS, саркозил, Твин 20 и Твин 80, Цвиттергент 3-14 и другие для получения, по крайней мере, некоторого надлежащим образом уложенного материала. Однако среди них наиболее предпочтительными детергентами были те, из семейства CHAPS (CHAPS и CHAPSO), которые, как было обнаружено, наилучшим образом работали при реакции укладывания, и ограничивали агрегацию белка и неправильное образование дисульфидных связей. Наиболее предпочтительным был уровень CHAPS более чем около 1%. Хлорид натрия требовался для лучшего выхода, с оптимальным уровнем между 0,1 М и 0,5 М. Было предпочтительным присутствие ЭДТА (1-5 мМ) в окислительно-восстановительном буфере для ограничения уровня катализируемого металлом окисления (и агрегации), которое наблюдалось в некоторых приготовлениях. Концентрация глицерина более чем 15% создавала оптимальные условия для укладки. Для максимального выхода было обязательным иметь окислительно-восстановительную пару в окислительно-восстановительном буфере, содержащую оба, и окисленный, и восстановленный органический тиол (RSH). Подходящее окислительно-восстановительные пары включают меркаптоэтанол, глютатион (GSH), цистеамин, цистеин и их соответствующие окисленные формы. Предпочтительной окислительно-восстановительной парой были глютатион (GSH) : окисленный глютатион (GSSH) или цистеин : цистин. Наиболее предпочтительной окислительно-восстановительной парой был глютатион (GSH) : окисленный глютатион (GSSH). В целом, высокий выход наблюдали, когда молярное отношение окисленного члена окислительно-восстановительной пары было равно или превышало молярное отношение восстановленного члена окислительно-восстановительной пары. Для укладывания этих вариантов ТП было оптимальным значение рН между 7,5 и около 9. Органические растворители (например, этанол, ацетонитрил, метанол) в концентрациях 10-15% или ниже были индифферентными. Высокие уровни органических растворителей увеличивали количество неправильно уложенных форм. В общем, применимыми были Трис и фосфатный буферы. Инкубация при 4°С также давала повышенный уровень уложенного надлежащим образом ТП.After solubilization and further purification of the TP, a biologically active form was obtained by placing the denatured monomeric TP in a redox buffer. Due to the high activity of TP (half-maximal stimulation in the study on Ba / F3 cells is achieved at approximately 3 pg / ml), it was possible to obtain biologically active material using many different buffers, detergents, and redox conditions. However, in most conditions, only a small amount of properly laid material was obtained (<10%). For a commercial production process, it is desirable to have a yield of stacked material of at least 10%, more preferably 30-50%, and most preferably> 50%. It has been found that numerous different detergents, including Triton X-100, dodecyl beta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosyl, Tween 20 and Tween 80, Zwittergent 3-14 and others to obtain at least some proper way stacked material. However, among them, the most preferred detergents were those from the CHAPS family (CHAPS and CHAPSO), which were found to work best in the folding reaction and limited protein aggregation and improper disulfide bond formation. Most preferred was a CHAPS level of more than about 1%. Sodium chloride was required for a better yield, with an optimal level between 0.1 M and 0.5 M. It was preferable to have EDTA (1-5 mM) in the redox buffer to limit the level of metal-catalyzed oxidation (and aggregation) observed in some preparations. A concentration of glycerol of more than 15% created optimal conditions for styling. For maximum yield, it was mandatory to have a redox pair in a redox buffer containing both oxidized and reduced organic thiol (RSH). Suitable redox pairs include mercaptoethanol, glutathione (GSH), cysteamine, cysteine and their corresponding oxidized forms. A preferred redox pair was glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSSH) or cysteine: cystine. The most preferred redox pair was glutathione (GSH): oxidized glutathione (GSSH). In general, a high yield was observed when the molar ratio of the oxidized member of the redox pair was equal to or greater than the molar ratio of the reduced member of the redox pair. For stacking these TP options, the pH was optimal between 7.5 and about 9. Organic solvents (for example, ethanol, acetonitrile, methanol) at concentrations of 10-15% or lower were indifferent. High levels of organic solvents increased the number of improperly laid forms. In general, Tris and phosphate buffers were applicable. Incubation at 4 ° C also gave an elevated level of properly laid TP.

Выход при укладывании 40-60% (на основании количества восстановленного и денатурированного ТП, использованного в реакции укладки) является типичным для приготовления ТП, который был очищен путем использования первого С4 этапа. Активный материал может быть получен и из менее очищенных препаратов (например, сразу после колонки Супердекс 200, или после первичной экстракции рефрактильных телец), хотя выход является меньшим, из-за увеличенного осаждения и влияния не-ТП белков, в течение процесса укладки ТП.The yield during stacking is 40-60% (based on the amount of recovered and denatured TP used in the stacking reaction) is typical for the preparation of TP, which was purified by using the first C4 stage. Active material can also be obtained from less purified preparations (for example, immediately after the Superdex 200 column, or after the primary extraction of refractile bodies), although the yield is lower due to increased deposition and the influence of non-TP proteins during the process of folding TP.

Поскольку ТП содержит четыре остатка цистеина, возможно получить три различных дисульфидных версии этого белка:Since TP contains four cysteine residues, it is possible to obtain three different disulfide versions of this protein:

версия 1: дисульфидная связь между остатками цистеина 1-4 и 2-3;version 1: disulfide bond between cysteine residues 1-4 and 2-3;

версия 2: дисульфидная связь между остатками цистеина 1-2 и 3-4;version 2: disulfide bond between cysteine residues 1-2 and 3-4;

версия 3: дисульфидная связь между остатками цистеина 1-3 и 2-4.version 3: disulfide bond between cysteine residues 1-3 and 2-4.

В течение первичного исследования определения условий для укладки методом хроматографии с обращенной фазой на С4 было разделено несколько различных пиков, содержащих белок ТП. Только один из этих пиков имел значительную биологическую активность, согласно определению при использовании Ba/F3 клеток. В соответствии с этим условия укладки были оптимизированы для предпочтительного выхода этой версии. В этих условиях неправильно уложившиеся версии составляли менее чем 10-20% от общего мономерного ТП, полученного на этапе солюбилизации.During the initial study of determining the conditions for stacking by reverse phase chromatography, several different peaks containing TP protein were separated into C4. Only one of these peaks had significant biological activity, as determined using Ba / F3 cells. Accordingly, the installation conditions have been optimized for the preferred release of this version. Under these conditions, incorrectly fitting versions accounted for less than 10-20% of the total monomeric TP obtained at the solubilization stage.

Путем масс-спектрометрии и секвенирования белка была определена картина дисульфидных связей для биологически активного ТП, представляющая 1-4 и 2-3 связи, где цистеины пронумерованы по порядку с амино-конца. Картина перекрестных связей находится в соответствии с картиной известных дисульфидных связей родственной молекулы эритропоэтина.By means of mass spectrometry and protein sequencing, a picture of disulfide bonds for biologically active TP was determined, representing 1-4 and 2-3 bonds, where cysteines are numbered in order from the amino end. The cross-linking pattern is consistent with the pattern of known disulfide bonds of a related erythropoietin molecule.

D. Биологическая активность рекомбинантного уложенного ТПD. Biological Activity of Recombinant Stacked TP

Уложенный и очищенный ТП обладает активностью в исследованиях и in vitro, и in vivo. Например, в исследовании на клетках Ba/F3 полумаксимальную стимуляцию включения тимидина в Ba/F3 клетки для ТП (Мет-1 1-153) достигали при 3,3 пг/мл (0,3 пМ). В основанном на mpl рецепторе исследовании ELISA полумаксимальную активность наблюдали при 1,9 нг/мг (120 пМ). У обычных и миелосупрессированных животных, полученных при близком к летальному облучению рентгеновскими лучами, уложенный ТП (Мет-1 1-153) был высоко активен (активность наблюдали в дозах меньше, чем 30 нг/мышь) по стимуляции продукции новых тромбоцитов. Близкая биологическая активность была обнаружена и для других форм ТП, уложенных в соответствии с вышеуказанными способами (см. фиг.25, 26 и 28).Stacked and purified TP has activity in both in vitro and in vivo studies. For example, in a study on Ba / F3 cells, half-maximal stimulation of the incorporation of thymidine into Ba / F3 cells for TP (Met -1 1-153) was achieved at 3.3 pg / ml (0.3 pM). In the mpl-based receptor ELISA, half-maximal activity was observed at 1.9 ng / mg (120 pM). In normal and myelosuppressed animals obtained with near-lethal x-ray exposure, stacked TP (Met -1 1-153) was highly active (activity was observed in doses less than 30 ng / mouse) to stimulate the production of new platelets. Close biological activity was found for other forms of TP laid in accordance with the above methods (see Fig.25, 26 and 28).

14. Способы измерения тромбопоэтической активности14. Methods of measuring thrombopoietic activity

Тромбопоэтическая активность может быть измерена в различных исследованиях, включая исследование лиганда mpl на клетках Ba/F3, описанного в Примере 1, исследование восстановительного синтеза тромбоцитов у мыши in vivo, исследование индукции клеточного поверхностного антигена тромбоцитов по измерению методом антитромбоцитарного иммуноопределения (анти-GРIIbIIIа) на мегакариобластической клеточной линии (СМК) лейкемии человека (см. Sato et al., Brit. J. Haematol., 72: 184-190 [1989]) (см. также исследование мегакариоцитопоэза в жидкой суспензии, описанное в Примере 4), и индукцию полиплоидизации на мегакариоцитобластической клеточной линии (DAMI) (см. Ogura et al.. Blood, 72(1): 49-60 [1988]). Созревание мегакариоцитов из незрелой формы, главным образом, не синтезирующих ДНК клеток, в морфологически идентифицируемые мегакариоциты вовлекает процесс, который включает появление цитоплазматических органелл, приобретение мембранных антигенов (GPIIbIIIa), внутреннюю репликацию и высвобождение тромбоцитов, как описано в предпосылках. Специфически дифференцирующий стимулятор линии (например, лиганд mpl) созревания мегакариоцитов, можно было бы ожидать, будет индуцировать, по крайней мере, некоторые из этих изменений у незрелых мегакариоцитотов, приводящих к высвобождению тромбоцитов и облегчению тромбоцитопении. Таким образом, исследование было построено так, чтобы измерять появление этих параметров у незрелых мегакариоцитарных клеточных линий, например, СМК и DAMI клеток. Исследование СМК определяет появление специфических маркеров тромбоцитов, GPIIbIIIa, и выход тромбоцитов. В определении DAMI (Пример 15) измеряется эндорепликация, поскольку увеличение плоидности является отличительным знаком зрелых мегакариоцитов. Распознаваемые мегакариоциты имеют значение плоидности 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, и т.д. Наконец, исследование восстановительного синтеза тромбоцитов у мышей in vivo (Пример 16) полезно для демонстрации того, что введение исследуемого соединения (здесь лиганда mpl) приводит к увеличению количества тромбоцитов.Thrombopoietic activity can be measured in various studies, including the study of the mpl ligand on Ba / F3 cells described in Example 1, the study of reductive platelet synthesis in mice in vivo, the study of the induction of platelet cell surface antigen by antiplatelet immunoassay (anti-GPII b III a ) on the megakaryoblastic cell line (QMS) of human leukemia (see Sato et al., Brit. J. Haematol., 72: 184-190 [1989]) (see also the study of megakaryocytopoiesis in a liquid suspension described in Example 4) , and the induction of polyploidization on a megakaryocytoblastic cell line (DAMI) (see Ogura et al .. Blood, 72 (1): 49-60 [1988]). The maturation of megakaryocytes from an immature form, mainly non-DNA synthesizing cells, into a morphologically identifiable megakaryocyte involves a process that includes the appearance of cytoplasmic organelles, acquisition of membrane antigens (GPII b III a ), internal replication and release of platelets, as described in the premises. A specifically differentiating stimulator of the megakaryocyte maturation line (for example, the mpl ligand), one would expect to induce at least some of these changes in immature megakaryocytes, leading to the release of platelets and the relief of thrombocytopenia. Thus, the study was designed to measure the appearance of these parameters in immature megakaryocytic cell lines, for example, QMS and DAMI cells. The study of QMS determines the appearance of specific platelet markers, GPII b III a , and platelet output. In the definition of DAMI (Example 15), endoreplication is measured, since increased ploidy is a hallmark of mature megakaryocytes. Recognized megakaryocytes have a ploidy value of 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, etc. Finally, an in vivo study of the reductive platelet synthesis in mice (Example 16) is useful to demonstrate that administration of the test compound (here the mpl ligand) leads to an increase in platelet count.

Были разработаны два дополнительных исследования in vitro для измерения активности ТП. Первое представляет исследование активации рецептора киназы (KIRA) методом ELISA, в котором клетки СНО трансфецированы химерой mpl-Rse, и измеряется фосфорилирование тирозина Rse методом ELISA после выдерживания части mpl химеры с лигандом mpl (см. Пример 17). Второе представляет метод ELISA, основанный на определении рецептора, в котором пластинки для ELISA, покрытые кроличьей сывороткой против человеческого IgG, захватывают химерные рецепторы человека mpl-IgG, которые связывают исследуемый лиганд mpl. Биотинилированное моноклональное антитело кролика к лиганду mpl (ТП155) использовали для определения связанного лиганда mpl, которое измеряли, используя стрептавидин-пероксидазу, как описано в Примере 18.Two additional in vitro studies have been developed to measure TP activity. The first is an ELISA study of kinase receptor activation (KIRA) in which CHO cells are transfected with the mpl-Rse chimera and Rse tyrosine phosphorylation is measured by ELISA after the mpl chimera has been incubated with the mpl ligand (see Example 17). The second is a receptor-based ELISA method in which rabbit serum anti-human IgG ELISA plates capture human mpl-IgG chimeric receptors that bind the mpl ligand under study. The rabbit biotinylated monoclonal anti-mpl ligand antibody (TP 155 ) was used to determine the bound mpl ligand, which was measured using streptavidin peroxidase as described in Example 18.

18. Биологический ответ нормальных и сублетально облученных мышей на введение ТП in vivo18. The biological response of normal and sublethally irradiated mice to the introduction of TP in vivo

Обеим, нормальным и облученным в сублетальной дозе мышам ввели усеченный и полной длины ТП, выделенный из клеток яичника китайского хомячка (СНО), Е.coli и эмбриональных клеток почки человека (293). Обе формы ТП, полученные от этих трех хозяинов, стимулировали продукцию тромбоцитов у мышей, однако ТП полной длины, выделенный из СНО, по-видимому, вызывает самый сильный ответ in vivo. Данные результаты отмечают, что надлежащее гликозилирование карбокси-концевого домена может быть необходимым для оптимальной активности in vivo.Both normal and subletted mice were given truncated and full-length TP isolated from Chinese hamster ovary (CHO) cells, E. coli, and human kidney cells (293). Both forms of TP obtained from these three hosts stimulated platelet production in mice, however, full-length TP isolated from CHO appears to elicit the strongest in vivo response. These results indicate that proper glycosylation of the carboxy-terminal domain may be necessary for optimal in vivo activity.

(а) Е.соli-рТПч(Mет-1,153)(a) E. coli-rTPCh (Met -1 , 153)

Форма "Мет" домена ЭП (Мет в -1 положении +153 первых остатков ТП человека), продуцированный в Е.coli (см. Пример 23), ежедневно инъецировали обычным самкам С57 В6 мышей, как описано в объяснениях к фиг.25А, 25В и 25С. Эти чертежи показывают, что продуцируемая в Е.coli, негликозилированная усеченная форма ТП, уложенная, как описано выше, способна стимулировать приблизительно двукратное увеличение продукции тромбоцитов у обычных мышей без воздействия на популяцию красных и белых клеток крови.The “Met” domain form of the EP domain (Met at the -1 position +153 of the first human TP residues) produced in E. coli (see Example 23) was injected daily with ordinary female C57 B6 mice, as described in the explanations for FIGS. 25A, 25B and 25C. These drawings show that a non-glycosylated truncated form of TP produced in E. coli, laid as described above, can stimulate an approximately twofold increase in platelet production in normal mice without affecting the red and white blood cell population.

Эти самые молекулы, инъецированные ежедневно сублетально облученным (137Сs) самкам С57 В6 мышей, как описано в подписях к фиг. 26А, 26В и 26С, стимулировали выход тромбоцитов и уменьшали период крайнего упадка, но не влияли на эритроциты или лейкоциты.These same molecules injected daily by sublethally irradiated ( 137 Cs) female C57 B6 mice, as described in the captions to FIG. 26A, 26B and 26C, stimulated platelet output and reduced the period of extreme decline, but did not affect red blood cells or white blood cells.

(b) СНО-рТПч332 (b) CHO-rtpch 332

Форма ТП полной длины, продуцируемая в клетка СНО, вводимая ежедневно обычным самкам С57 В6 мышей, как описано выше в подписях к фиг.27А, 27В и 27С, вызывала приблизительно пятикратное увеличение продукции тромбоцитов у обычных мышей без воздействия на популяцию эритроцитов или лейкоцитов.The full-length TP form produced in the CHO cell, administered daily to normal female C57 B6 mice, as described above in the captions to FIGS. 27A, 27B and 27C, caused an approximately five-fold increase in platelet production in normal mice without affecting the red blood cell or white blood cell population.

(c) СНО-рТПЧ332; Е. coli-рТПч (Мет-1, 153); 293-рТПч332 и(c) CHO-rTFCh 332 ; E. coli-rTBC (Met -1 , 153); 293-rtpch 332 and

Е.coli-pTПч155 E. coli-PTPC 155

Была построена кривая дозового ответа на введение обычным мышам рТПч из различных клеточных линий (СНО-рТПч332; Е.coli-рТПч(Мет-1, 153); 293-рTПч332 и Е.соli-рТПч155), как описано в подписи к фиг. 28. Этот чертеж показывает, что все исследуемые формы молекул стимулируют продукцию тромбоцитов, однако форма полной длины, продуцируемая в клетках СНО, имеет наибольшую активность in vivo.A dose response curve was constructed for the administration of rTPh to mice from various cell lines (CHO-rTph 332 ; E. coli-rTpch (Met -1 , 153); 293-rTpch 332 and E.coli-rTpch 155 ), as described in the signature to FIG. 28. This drawing shows that all studied forms of molecules stimulate platelet production, however, the full-length form produced in CHO cells has the highest in vivo activity.

(d) CHO-pTПч153, СНО-рТПч "обрезанный" и СНО-рТПч332 (d) CHO-pTpch 153 , CHO-rTpch “cut off” and CHO-rTpch 332

Была также построена кривая дозового ответа на введение обычным мышам различных формы рТПч, продуцируемых в клетках СНО (СНО-рТПч153, СНО-рТПч "обрезанный" и СНО-рТПч332), как описано в подписи к фиг. 29. Этот чертеж показывает, что все тестируемые формы молекул из клеток СНО стимулируют продукцию тромбоцитов, но что форма полной длины 70 Kda имеет наибольшую активность in vivo.A dose response curve was also plotted for the administration to normal mice of various forms of rTrp produced in CHO cells (CHO-rTrPh 153 , "CHO-rTrh" trimmed and CHO-rTrh 332 ), as described in the caption to FIG. 29. This drawing shows that all test forms of molecules from CHO cells stimulate platelet production, but that the full-length form of 70 Kda has the highest activity in vivo.

16. Общий рекомбинантный препарат и варианты лиганда rnpl16. General recombinant preparation and rnpl ligand variants

Лиганд mpl, предпочтительно, получали согласно обычным рекомбинантным способам, которые включают продукцию полипептида лиганда mpl, путем культивирования клеток, трансфецированных для экспрессии нуклеиновой кислоты лиганда mpl (обычно путем трансфецирования клеток вектором экспрессии) и выделения полипептида из клеток. Однако необязательно является предсказуемым, что лиганд mpl может быть получен гомологичной рекомбинацией или по способам получения рекомбинанта, используя контрольные элементы, введенные в клетки, уже содержащие ДНК, кодирующую лиганд mpl. Например, сильный промотерный/усилительный элемент, ингибитор или экзогенный элемент, модулирующий транскрипцию, могут быть введены в геном предполагаемых клеток хозяина в достаточной близости и ориентации для влияния на транскрипцию ДНК, кодирующую желаемый полипептид лиганда mpl. Контрольный элемент не кодирует лиганд mpl, скорее ДНК является близкой по природе к геному клетки хозяина. Следующий элемент отсеивает клетки, создающие рецепторный полипептид по настоящему изобретению, или для увеличения, или для уменьшения уровня экспрессии по желанию.The mpl ligand is preferably obtained according to conventional recombinant methods, which include the production of the mpl ligand polypeptide, by culturing cells transfected to express the mpl ligand nucleic acid (usually by transfecting cells with an expression vector) and isolating the polypeptide from the cells. However, it is not necessarily predictable that the mpl ligand can be obtained by homologous recombination or by recombinant production methods using control elements introduced into cells already containing DNA encoding the mpl ligand. For example, a strong promoter / enhancer element, inhibitor, or exogenous transcription modulating element can be introduced into the genome of putative host cells in sufficient proximity and orientation to influence the transcription of DNA encoding the desired mpl ligand polypeptide. The control element does not encode the mpl ligand; rather, the DNA is close in nature to the genome of the host cell. The next element weeds out the cells that create the receptor polypeptide of the present invention, either to increase or to reduce the expression level as desired.

Таким образом, изобретение рассматривает способ получения лиганда mpl, включающий введение модуляторного элемента транскрипции в геном клеток, содержащих в молекуле нуклеиновой кислоты лиганда mpl, в достаточной близости и ориентированным на молекулу нуклеиновой кислоты, для влияния на их транскрипцию, с дальнейшим необязательным этапом, включающим культивирование клеток, содержащих модуляторный элемент транскрипции и молекулу нуклеиновой кислоты. Изобретение также рассматривает клетку хозяина, содержащую естественную молекулу нуклеиновой кислоты лиганда mpl, операбельно сцепленную к экзогенной контрольной последовательности, распознаваемой клеткой хозяина.Thus, the invention contemplates a method for producing the mpl ligand, comprising introducing a transcription modulator element into the genome of cells containing the mpl ligand in the nucleic acid molecule, in sufficient proximity and targeting the nucleic acid molecule, to influence their transcription, with a further optional step including cultivation cells containing a modulator element of transcription and a nucleic acid molecule. The invention also contemplates a host cell containing a natural mpl ligand nucleic acid molecule operably linked to an exogenous control sequence recognized by the host cell.

А. Выделение ДНК, кодирующей полипептид лиганда mplA. Isolation of DNA encoding the mpl ligand polypeptide

ДНК, кодирующая полипептид лиганда mpl, может быть получена из любой библиотеки кДНК, полученной из ткани, подозреваемой на содержание мРНК лиганда mpl и экспрессирующей ее на детектируемом уровне. Ген лиганда mpl может также быть получен из библиотеки геномной ДНК или путем олигонуклеотидного синтеза in vitro из полной нуклеотидной или аминокислотной последовательности.DNA encoding the mpl ligand polypeptide can be obtained from any cDNA library obtained from tissue suspected of containing mpl ligand mRNA and expressing it at a detectable level. The mpl ligand gene can also be obtained from a genomic DNA library or by in vitro oligonucleotide synthesis from a complete nucleotide or amino acid sequence.

Библиотеки просеивали с зондами, разработанными для идентификации интересующего гена или белка, кодируемого им. Для библиотек экспрессируемых кДНК подходящие зонды включают моноклональные или поликлональные антитела, которые распознают и специфически связываются с лигандом mpl. Для библиотек кДНК подходящие зонды включают олигонуклеотиды из около 20-80 оснований длиной, которые кодируют известные или подозреваемые участки кДНК лиганда mpl из того же или другого вида; и/или комплементарные или гомологичные кДНК или их фрагменты, которые кодируют тот же или подобный ген. Подходящие зонды для скрининга библиотек кДНК включают, но не ограничиваются этим, олигонуклеотиды, кДНК, или их фрагменты, которые кодируют тот же или подобный ген, и/или гомологичные геномные ДНК или их фрагменты. Скрининг кДНК или геномной библиотеки с выбранным зондом может быть проведен, используя обычные процедуры, как описано в Частях 10-12, Sambrook et al., там же.Libraries were sieved with probes designed to identify the gene of interest or protein encoded by it. For libraries of expressed cDNA, suitable probes include monoclonal or polyclonal antibodies that recognize and specifically bind to the mpl ligand. For cDNA libraries, suitable probes include oligonucleotides of about 20-80 bases long that encode known or suspected sections of the mpl ligand cDNA from the same or different species; and / or complementary or homologous cDNA or fragments thereof that encode the same or similar gene. Suitable probes for screening cDNA libraries include, but are not limited to, oligonucleotides, cDNA, or fragments thereof that encode the same or similar gene, and / or homologous genomic DNA or fragments thereof. Screening of a cDNA or genomic library with a selected probe can be carried out using conventional procedures as described in Parts 10-12, Sambrook et al., Ibid.

Альтернативным способом для выделения гена, кодирующего лиганд mpl, является использование техники РПЦ, как описано в разделе 14, Sambrook et al., там же. Этот способ требует использование олигонуклеотидного зонда, который гибридизуется с ДНК, кодирующей лиганд mpl. Стратегии для выбора нуклеотидов описаны ниже.An alternative way to isolate the gene encoding the mpl ligand is to use the ROC technique as described in section 14, Sambrook et al., Ibid. This method requires the use of an oligonucleotide probe that hybridizes with DNA encoding the mpl ligand. Strategies for selecting nucleotides are described below.

Предпочтительным практикуемым способом настоящего изобретения является использование тщательного отбора нуклеотидных последовательностей для просеивания библиотек кДНК из различных тканей, предпочтительно человека или почки свиньи (взрослой или эмбриона), или линий клеток печени. Например, библиотека кДНК клеточной линии эмбриональной печени человека была просеяна с олигонуклеотидными зондами. Альтернативно, могут быть просеяны с олигонуклеотидными зондами геномные библиотеки человека.The preferred practiced method of the present invention is the use of careful selection of nucleotide sequences for sieving cDNA libraries from various tissues, preferably a human or pig kidney (adult or embryo), or liver cell lines. For example, a cDNA library of a human embryonic liver cell line was sieved with oligonucleotide probes. Alternatively, human genomic libraries can be screened with oligonucleotide probes.

Олигонуклеотидные последовательности, выбранные в качестве зондов, должны быть достаточной длины и достаточно недвусмысленны, чтобы минимизировать фальшивые положительные ответы. Действенная нуклеотидная последовательность(и) обычно разрабатывается на основе областей лиганда mpl, которые имеют наименьший избыточный кодон. Олигонуклеотиды могут быть получены из одного или многих положений. Использование созданных нуклеотидов является особенно важным, когда просеивается библиотека вида, у которого предпочтительно используемый кодон неизвестен.The oligonucleotide sequences selected as probes should be of sufficient length and unambiguous enough to minimize false positive responses. The effective nucleotide sequence (s) are usually designed based on the regions of the mpl ligand that have the smallest excess codon. Oligonucleotides can be obtained from one or many positions. The use of the generated nucleotides is especially important when sifting a library of a species whose preferred codon is unknown.

Олигонуклеотид должен быть помечен таким образом, чтобы его можно было обнаружить при гибридизации с ДНК просеиваемой библиотеки. Предпочтительным способом мечения является использование АТФ (а именно, γ32P) и полинуклеотидкиназы для включения радиоактивной метки в 5’ конец олигонуклеотида. Однако могут быть использованы другие способы мечения олигонуклеотидов, включая, но не ограничивая этим, биотинилирование или ферментативное мечение.The oligonucleotide must be labeled so that it can be detected by hybridization with the DNA of the sifted library. A preferred labeling method is the use of ATP (namely, γ 32 P) and polynucleotide kinase to include a radioactive label at the 5 ′ end of the oligonucleotide. However, other methods for labeling oligonucleotides may be used, including but not limited to biotinylation or enzymatic labeling.

Особенный интерес представляет нуклеиновая кислота лиганда mpl, которая кодирует полный полипептид лиганда mpl. В некоторых предпочтительных воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты включает естественную сигнальную последовательность лиганда mpl. Нуклеиновую кислоту, имеющую все последовательности кодонов белка, получили при скрининге выбранной кДНК или геномных библиотек, используя выведенную аминокислотную последовательность.Of particular interest is the mpl ligand nucleic acid, which encodes the complete mpl ligand polypeptide. In some preferred embodiments, the nucleic acid sequence includes the natural signal sequence of the mpl ligand. A nucleic acid having all protein codon sequences was obtained by screening a selected cDNA or genomic library using the deduced amino acid sequence.

В. Аминокислотная последовательность вариантов естественного лиганда mplB. Amino acid sequence of variants of the natural ligand mpl

Аминокислотные последовательности вариантов лиганда mpl получили путем введения подходящих нуклеотидных изменений в ДНК лиганда mpl или путем синтеза in vitro желаемого полипептида лиганда mpl. Такие варианты включают, например, форму с делецией, или с вставкой, или заменой остатков внутри аминокислотной последовательности лиганда mpl свиньи. Например, части карбокси-конца зрелого лиганда mpl полной длины могут быть удалены при протеолитическом расщеплении как in vivo, так и in vitro или путем клонирования и экспрессии фрагмента или ДНК, кодирующего лиганд mpl полной длины для получения биологически активного варианта. Предусматривается применение любой комбинации из делеции, вставки и замены для достижения конечной конструкции, чтобы конечная конструкция проявляла желаемую биологическую активность. Изменения аминокислот также могут изменить посттрансляционные процессы лиганда mpl, такие как изменение порядка или положения гликозилируемых сайтов. Для разработки вариантов аминокислотной последовательности лиганда mpl положение сайта мутации и природа мутации будут зависеть от модификации характеристики (характеристик) лиганда mpl. Участки мутации могут быть модифицированы индивидуально или в сериях, например, путем: (1) сначала замена выбранными консервативными аминокислотами и затем более радикально выбранными в зависимости от достигаемого результата, (2) удаление целевого остатка или (3) вставка остатков того же класса или другого, приспособленного к участку расположения, или комбинации выборов 1-3.The amino acid sequences of variants of the mpl ligand were obtained by introducing suitable nucleotide changes in the DNA of the mpl ligand or by in vitro synthesis of the desired mpl ligand polypeptide. Such options include, for example, a deletion or insertion or replacement of residues within the amino acid sequence of the pig mpl ligand. For example, portions of the carboxy-terminus of a mature full length mpl ligand can be removed by proteolytic cleavage, both in vivo and in vitro, or by cloning and expression of a fragment or DNA encoding a full length mpl ligand to produce a biologically active variant. Any combination of deletion, insertion, and substitution is contemplated to achieve the final construct so that the final construct exhibits the desired biological activity. Changes in amino acids can also change the post-translational processes of the mpl ligand, such as changing the order or position of glycosylated sites. To develop variants of the amino acid sequence of the mpl ligand, the position of the mutation site and the nature of the mutation will depend on the modification of the characteristics of the mpl ligand. Mutation sites can be modified individually or in series, for example, by: (1) first replacing with selected conservative amino acids and then more radically selected depending on the result achieved, (2) removing the target residue or (3) inserting residues of the same class or another adapted to the location site, or combination of choices 1-3.

Способ, полезный для идентификации определенных остатков или области полипептида лиганда mpl, который предпочтителен для локализации мутагенеза, назван "мутагенез сканирования аланина", как описано Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 [1989]. Здесь, остаток или группу целевых остатков определяли (а именно, заряженные остатки, такие как арг, асп, гис, лиз и глю) и заменяли на любую, но предпочтительно нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (наиболее предпочтительно, аланин или полиаланин) для воздействия на взаимодействие аминокислот с окружающей водной средой внутри или снаружи клетки. Затем те домены, демонстрирующие функциональную чувствительность к заменам, усовершенствовали путем дальнейшего введения или других вариантов у доменов или участков для замены. Таким образом, несмотря на то, что участок для введения вариации аминокислотной последовательности предопределен, природа мутации per se (как таковой) не требует быть предопределенной. Например, для оптимизации выполнения мутации в данном участке проводили сканирование по ала(нину) или проводили случайный мутагенез по целевому кодону или области, а экспрессированные варианты лиганда mpl просеивали для оптимальной комбинации желаемой активности.A method useful for identifying specific residues or regions of an mpl ligand polypeptide that is preferred for localizing mutagenesis is called “alanine scanning mutagenesis” as described by Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 [1989]. Here, a residue or group of target residues was determined (namely, charged residues such as arg, asp, gis, lys and glu) and replaced with any, but preferably neutral or negatively charged amino acid (most preferably alanine or polyalanine) to affect the interaction of amino acids with the surrounding aqueous medium inside or outside the cell. Then, those domains demonstrating functional sensitivity to substitutions were improved by further introduction or other options at domains or sites for substitution. Thus, despite the fact that the site for introducing variations in the amino acid sequence is predetermined, the nature of the mutation per se (as such) does not require to be predetermined. For example, to optimize the performance of a mutation in this area, ala (nin) scanning was performed or random mutagenesis was performed on the target codon or region, and expressed variants of the mpl ligand were sieved for the optimal combination of the desired activity.

Существует две принципиальные возможности варьирования в конструкции аминокислотной последовательности вариантов: расположение участка мутации и природа мутации. Например, варианты полипептида лиганда mpl включают варианты форм последовательности лиганда mpl и могут представлять естественно встречающиеся аллели (которые не будут требовать манипуляций с ДНК лиганда mpl), или предопределенные мутантные формы, полученные путем мутирования ДНК, либо для достижения аллели, либо не обнаруживаемый в природе вариант. В целом, расположение и природа выбранной мутации будут зависеть от модифицируемой характеристики лиганда mpl.There are two fundamental possibilities for varying the amino acid sequence of variants in the design: the location of the mutation site and the nature of the mutation. For example, variants of the mpl ligand polypeptide include variants of the forms of the mpl ligand sequence and may represent naturally occurring alleles (which will not require manipulation of the mpl ligand DNA), or predefined mutant forms obtained by mutating the DNA, either to achieve an allele, or not found in nature option. In general, the location and nature of the selected mutation will depend on the modified characteristics of the mpl ligand.

Аминокислотная последовательность делеций в целом охватывает от около 1 до 30 остатков, более предпочтительно от около 1 до 10 остатков, и они обычно являются смежными. Альтернативно, аминокислотная последовательность делеций может также включать часть или полный карбокси-концевой гликозилированный домен. Аминокислотная последовательность делеции может также включать одну или более из первых 6 амино-концевых остатков зрелого белка. Аминокислотная последовательность делеции, необязательно, охватывает один или более остатков в одной из областей петли, которая расположена "узлами спирали". Смежные делеции обычно получаются по четным номерам остатков, но единичные или нечетные номера делеции находятся внутри этой рамками. Для модификации активности лиганда mpl могут быть введены делеции в области с низкой гомологией между лигандами mpl, которая приходится на большую часть идентичной последовательности. Или делеции могут быть введены в области с низкой гомологией между полипептидами лиганда mpl человека и лиганда mpl других млекопитающих, которые обладают наибольшей идентичностью последовательности к лиганду mpl человека. Делеции у полипептида лиганда mpl млекопитающего в области существенной гомологии с лигандом mpl другого млекопитающего будут более вероятными, чтобы более значимо модифицировать биологическую активность лиганда mpl. Количество порядковых делеции будет выбрано таким образом, чтобы сохранить четвертичную структуру лиганда mpl в изменяемом домене, например, бета-складчатую или альфа-спиральную.The amino acid sequence of deletions generally covers from about 1 to 30 residues, more preferably from about 1 to 10 residues, and they are usually contiguous. Alternatively, the amino acid sequence of deletions may also include a portion or a complete carboxy terminal glycosylated domain. The amino acid deletion sequence may also include one or more of the first 6 amino-terminal residues of the mature protein. The amino acid sequence of a deletion optionally encompasses one or more residues in one of the regions of the loop that is located by “helix nodes”. Adjacent deletions are usually obtained by even numbers of residues, but unit or odd numbers of deletions are within this framework. To modify the activity of the mpl ligand, deletions can be introduced in the region of low homology between the mpl ligands, which accounts for most of the identical sequence. Or deletions can be introduced in areas of low homology between the polypeptides of the human mpl ligand and the mpl ligand of other mammals that have the highest sequence identity to the human mpl ligand. Deletions in a mammalian mpl ligand polypeptide in a region of significant homology with another mammalian mpl ligand will be more likely to more significantly modify the biological activity of the mpl ligand. The number of ordinal deletions will be chosen in such a way as to preserve the quaternary structure of the mpl ligand in a variable domain, for example, beta-folded or alpha-helical.

Аминокислотная последовательность вставок включает амино- и/или карбокси-концевые слияния, различающиеся по длине от одного остатка до полипептида, содержащего сотню или более остатков, так же как и вставки внутри последовательности одной или многих аминокислотных остатков. Вставки внутри последовательности (то есть вставки внутри последовательности зрелого лиганда mpl) могут различаться в размере, в целом, от около 1 до 10 остатков, более предпочтительно, от 1 до 5, наиболее предпочтительно, от 1 до 3. Примерное предпочтительное слияние состоит из лиганда mpl или его фрагмента и другого цитокина или его фрагмента. Образцы конечных вставок включают зрелый лиганд mpl с N-концевым остатком метионина, артифактом прямой экспрессии зрелого лиганда mpl в рекомбинантной клеточной культуре, и слияния гетерологичной N-концевой сигнальной последовательности с N-концом молекулы зрелого лиганда mpl для усиления секреции зрелого лиганда mpl из рекомбинантного хозяина. Такие сигнальные последовательности обычно получают из и благодаря гомологии с предполагаемым видом клетки хозяина. Подходящие последовательности включают STII или Ipp для Е.coli, альфа фактор дрожжей и вирусные сигналы, такие как герпес gD, для клеток млекопитающих.The amino acid sequence of the inserts includes amino and / or carboxy-terminal fusions ranging in length from one residue to a polypeptide containing one hundred or more residues, as well as inserts within the sequence of one or more amino acid residues. Insertions within the sequence (i.e., insertions within the mature mpl ligand sequence) may vary in size from a total of about 1 to 10 residues, more preferably from 1 to 5, most preferably from 1 to 3. An exemplary preferred fusion consists of a ligand mpl or a fragment thereof and another cytokine or its fragment. End insert samples include a mature mpl ligand with an N-terminal methionine residue, an artifact of direct expression of a mature mpl ligand in a recombinant cell culture, and a fusion of a heterologous N-terminal signal sequence with the N-terminus of a mature mpl ligand molecule to enhance secretion of a mature mpl ligand from a recombinant host . Such signal sequences are usually derived from and due to homology with the putative host cell type. Suitable sequences include STII or Ipp for E. coli, yeast alpha factor, and viral signals, such as herpes gD, for mammalian cells.

Другие варианты вставок молекулы лиганда mpl включают сплавление N- и С-концов лигада mpl иммуногенными полипептидами (а именно, не эндогенными по отношению к хозяину, которому эта сплавка вводится), например, бактериальный полипептид, такой как бета-лактамаза, или фермент, кодируемый trp локусом Е.coli, или белок дрожжей, и С-концевая сплавка с белком, имеющим длинную продолжительность полужизни, такого как постоянная область иммуноглобулина (или другая область иммуноглобулина), альбумин, или ферритин, как описано в WO 89/02922, опубликованном 6 апреля 1989 г.Other insertions of the mpl ligand molecule include fusion of the N- and C-terminus of the mpl ligand with immunogenic polypeptides (namely, not endogenous to the host to which this alloy is introduced), for example, a bacterial polypeptide such as beta-lactamase, or an enzyme encoded trp locus of E. coli, or yeast protein, and a C-terminal fusion with a protein having a long half-life, such as a constant region of immunoglobulin (or another region of immunoglobulin), albumin, or ferritin, as described in WO 89/02922, published 6 april 1989 year

Третья группа вариантов является вариантами аминокислотных замен. Эти варианты имеют, по крайней мере, один удаленный аминокислотный остаток в молекуле лиганда mpl, и другой остаток, вставленный на ее место. Участки наибольшего интереса для заместительного мутагенеза включают участки, идентифицированные как активные участки(ок) лиганда mрl, и участки, где аминокислоты, обнаруженные у других аналогов, являются существенно различными в терминах объема боковой цепи, заряда, или гидрофобности, но, где имеется также высокая степень идентичности в выбранном участке, среди лигандов mpl у различных видов, и/или внутри одного лиганда mpl различных членов близких животных.The third group of variants are amino acid substitution variants. These variants have at least one deleted amino acid residue in the mpl ligand molecule, and another residue inserted in its place. Areas of greatest interest for substitutional mutagenesis include sites identified as the active sites (s) of the mpl ligand, and sites where the amino acids found in other analogues are significantly different in terms of side chain volume, charge, or hydrophobicity, but where there is also high the degree of identity in the selected site, among mpl ligands in different species, and / or within the same mpl ligand of different members of close animals.

Другим участком, представляющим интерес, является тот, в котором конкретные остатки лиганда mpl получены от различных членов семьи и/или видов животных, с одним идентичным членом. Эти участки, в особенности те, выпавшие из последовательности, по крайней мере, из трех других идентично консервативных участков, заменены сравнительно консервативным образом. Такие консервативные замены представлены в Таблице 3 под заголовком предпочтительных замен. Если такие замены приводят к изменениям в биологической активности, тогда вводили более существенные замены, обозначенные как примерные замены в Таблице 3, или как описано далее в ссылках на классы аминокислот, и полученные продукты просеяли.Another site of interest is one in which specific mpl ligand residues are obtained from different family members and / or animal species, with one identical member. These plots, especially those dropped out of the sequence of at least three other identically conservative plots, are replaced in a relatively conservative manner. Such conservative substitutions are presented in Table 3 under the heading of preferred substitutions. If such substitutions lead to changes in biological activity, then more substantial substitutions were introduced, designated as exemplary substitutions in Table 3, or as described below in reference to amino acid classes, and the resulting products were sieved.

Figure 00000001
Figure 00000001

Существенные модификации в функции или иммунологической идентичности лиганда mpl сопровождались выбором замен, которые существенно различаются по своему действию на поддержание (а) структуры основы полипептида в области замен, например, в виде складок или спиральной конформации, (б) заряд или гидрофобность молекулы в участке мишени, или (в) объем боковой цепи. Естественно обнаруживаемые остатки разделены на группы, основанные на общих свойствах боковой цепи:Significant modifications in the function or immunological identity of the mpl ligand were accompanied by the choice of substitutions, which significantly differ in their effect on maintaining (a) the structure of the base of the polypeptide in the substitution region, for example, in the form of folds or helical conformation, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule in the target region , or (c) side chain volume. Naturally detectable residues are divided into groups based on the common properties of the side chain:

(1) гидрофобные: норлейцин, Мет, Ала, Вал, Дей, Иле;(1) hydrophobic: norleucine, Met, Ala, Val, Day, Ile;

(2) нейтральные гидрофобные: Цис, Сер, Тре;(2) neutral hydrophobic: Cis, Ser, Tre;

(3) кислые: Асп, Глу;(3) acidic: Asp, Glu;

(4) основные: Асн, Глн, Гис, Лиз, Арг;(4) main: Asn, Gln, Gis, Liz, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Гли, Про;(5) residues that affect chain orientation: Gly, Pro;

(6) ароматические: Трп, Тир, Фен.(6) aromatic: Trp, Tyr, Hairdryer.

Неконсервативные замены повлекут за собой замены членов одного из этих классов на другой. Такие замененные остатки также могут быть введены в участки консервативных замен или, более предпочтительно, в оставшиеся (неконсервативные) участки.Non-conservative substitutions will entail replacing members of one of these classes with another. Such substituted residues can also be introduced into conservative substitution sites or, more preferably, into the remaining (non-conservative) sites.

В одном воплощении изобретения является желательным инактивировать один или более участков расщепления протеазой, который присутствует в молекуле. Эти участки идентифицировали по проверке кодирующей аминокислотной последовательности в случае трипсина, например, на остатки аргинина или лизина. Когда участки расщепления протеазой идентифицировали, их превратили в неактивные для протеолитического расщепления путем замены целевого остатка на другой остаток, предпочтительно основной остаток, такой как глутамин, или гидрофобный остаток, такой как серин; путем удаления остатка или путем вставки остатка пролина сразу после остатка.In one embodiment of the invention, it is desirable to inactivate one or more protease cleavage sites that are present in the molecule. These sites were identified by checking the coding amino acid sequence in the case of trypsin, for example, for arginine or lysine residues. When protease cleavage sites have been identified, they have been made inactive for proteolytic cleavage by replacing the target residue with another residue, preferably a basic residue, such as glutamine, or a hydrophobic residue, such as serine; by removing the residue or by inserting a proline residue immediately after the residue.

В другом воплощении любые остатки метионина, другие чем начальный остаток метионина сигнальной последовательности, или любой остаток, расположенный внутри трех N-концевых или С-концевых остатков по отношению к каждому такому остатку метионина, заменен на другой остаток (предпочтительно в соответствии с Таблицей 3) или удален. Альтернативно, около 1-3 остатков ввели по соседству с таким участком.In another embodiment, any methionine residues other than the initial methionine residue of the signal sequence, or any residue located within the three N-terminal or C-terminal residues with respect to each such methionine residue, is replaced by another residue (preferably in accordance with Table 3) or deleted. Alternatively, about 1-3 residues are introduced adjacent to such a site.

Любые остатки цистеина, не участвующие в поддержании правильной конформации лиганда mpl, также могут быть заменены, обычно на серин, для увеличения стабильности молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного связывания. Было обнаружено, что первый и четвертый цистеины в ЭП домене, пронумерованные с амино-конца, необходимы для поддержания надлежащей конформации, но что второй и третий - нет. Соответственно второй и третий цистеины в ЭП домене могут быть заменены.Any cysteine residues not involved in maintaining the correct conformation of the mpl ligand can also be replaced, usually with serine, to increase the oxidation stability of the molecule and prevent aberrant cross-linking. It was found that the first and fourth cysteines in the EP domain, numbered from the amino end, are necessary to maintain proper conformation, but that the second and third are not. Accordingly, the second and third cysteines in the EP domain can be replaced.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность варианта лиганда mpl, получили различными способами, известными в методологии. Эти способы включают, но не ограничиваются выделением из природного источника (в случае естественно встречающейся аминокислотной последовательности вариантов) или получением путем опосредованного олигонуклеотидом (или сайт-направленного) мутагенеза, мутагенеза РПЦ, и кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или инвариантной версии полипептида лиганда mpl.Nucleic acid molecules encoding the amino acid sequence of the mpl ligand variant were obtained by various methods known in the methodology. These methods include, but are not limited to isolating from a natural source (in the case of a naturally occurring amino acid sequence of variants) or obtaining, by oligonucleotide-mediated (or site-directed) mutagenesis, ROC mutagenesis, and cassette mutagenesis of a previously obtained variant or an invariant version of the mpl ligand polypeptide.

Опосредованный олигонуклеотидом мутагенез является предпочтительным способом для получения вариантов ДНК лиганда mpl с заменой, делецией и вставкой. Эти способы хорошо известны в технике, как описано Adelman et al., DNA, 2: 183 [1983]. В кратком виде, ДНК лиганда mpl изменили путем гибридизации олигонуклеотида, кодирующего желаемую мутацию с матрицей ДНК, где матрица представляет однонитевую форму плазмиды или бактериофага, содержащего неизмененую или нативную последовательность ДНК лиганда mpl. После гибридизации использовали ДНК полимеразу для синтеза полной второй комплементарной нити к матрице, которая будет, таким образом, включать олигонуклеотидный праймер и будет кодировать выбранное изменение в ДНК лиганда mpl.Oligonucleotide-mediated mutagenesis is the preferred method for generating mpl ligand DNA variants with substitution, deletion and insertion. These methods are well known in the art as described by Adelman et al., DNA, 2: 183 [1983]. Briefly, the mpl ligand DNA was altered by hybridizing an oligonucleotide encoding the desired mutation with a DNA matrix, where the matrix is a single-stranded form of a plasmid or bacteriophage containing an unchanged or native mpl ligand DNA sequence. After hybridization, DNA polymerase was used to synthesize a complete second complementary strand to a template, which would thus include an oligonucleotide primer and would encode the selected change in the mpl ligand DNA.

В целом, использовали олигонуклеотиды, по крайней мере, 25 нуклеотидов длиной. Оптимальный нуклеотид будет иметь от 12 до 15 нуклеотидов, которые полностью комплементарны матрице по обеим сторонам нуклеотида(ов), кодирующих мутацию. Это дает уверенность, что нуклеотиды гибридизуются надлежащим образом к однонитевой молекуле ДНК матрицы. Нуклеотиды легко синтезировали, используя способы, известные в технике, такие как описаны Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 [1978].Altogether, oligonucleotides of at least 25 nucleotides in length were used. The optimal nucleotide will have from 12 to 15 nucleotides that are completely complementary to the matrix on both sides of the nucleotide (s) encoding the mutation. This ensures that nucleotides hybridize properly to a single-stranded DNA molecule. Nucleotides were easily synthesized using methods known in the art, such as those described by Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5765 [1978].

Матрицы ДНК могут быть получены при помощи тех векторов, которые либо происходят от вектора бактериофага М13 (применимы коммерчески доступные векторы М13тр18 и М13тр19), либо те векторы, которые содержат однонитевой фаг репликации, как описано Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 [1987]. Таким образом, та ДНК, которая будет мутировать, может быть вставлена в один из этих векторов для создания однонитевой матрицы. Получение однонитевой матрицы описано в Секциях 4.21-4.41 Saiabrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).DNA matrices can be obtained using those vectors that either come from the bacteriophage M13 vector (commercially available vectors M13tr18 and M13tr19 are applicable), or those vectors that contain single-stranded replication phage, as described by Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 [1987]. Thus, the DNA that will mutate can be inserted into one of these vectors to create a single-stranded template. The preparation of a single-stranded matrix is described in Sections 4.21-4.41 by Saiabrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989).

Альтернативно, матрица однонитевой ДНК может быть получена путем денатурирования двухнитевой ДНК плазмиды (или другой), используя обычную технику.Alternatively, a single-stranded DNA matrix can be obtained by denaturing a double-stranded DNA of a plasmid (or another) using a conventional technique.

Для изменения естественной последовательности ДНК (для получения аминокислотной последовательности варианта, например) нуклеотид гибридизовали с однонитевой матрицей при подходящих условиях гибридизации. Затем добавляли фермент, полимеризующий ДНК, обычно Klenow-фрагмент ДНК полимеразы I для синтеза комплементарной нити матрицы, используя нуклеотиды в качестве праймеров для синтеза. Таким образом, формировали гетеродуплексную молекулу, такую, что одна нить ДНК кодирует мутантную форму лиганда mpl, а другая нить (оригинальная матрица) кодирует естественную, неизмененную последовательность лиганда mpl. Затем гетеродуплексную молекулу трансформировали в подходящую клетку хозяина, обычно прокариота, такого как Е.coli JM101. После выращивания клеток их перенесли на агарозные плашки и просеяли, используя нуклеотидный праймер, радиоактивно меченный 32-фосфатом для идентификации бактериальных колоний, которые содержат мутантную ДНК. Мутированную область затем удаляли и помещали в подходящий вектор для получения белка, главным образом вектор экспрессии типа, обычно используемого для трансформации подходящего хозяина.To change the natural DNA sequence (for example, to obtain the amino acid sequence of a variant), the nucleotide was hybridized with a single-stranded matrix under suitable hybridization conditions. Then a DNA polymerizing enzyme was added, usually a Klenow DNA fragment of polymerase I to synthesize a complementary strand of the template using nucleotides as synthesis primers. Thus, a heteroduplex molecule was formed such that one strand of DNA encodes the mutant form of the mpl ligand, and the other strand (original matrix) encodes the natural, unchanged sequence of the mpl ligand. The heteroduplex molecule was then transformed into a suitable host cell, usually a prokaryote, such as E. coli JM101. After growing the cells, they were transferred to agarose plates and sieved using a nucleotide primer radioactively labeled with 32-phosphate to identify bacterial colonies that contain mutant DNA. The mutated region was then removed and placed in a suitable vector to obtain a protein, mainly an expression vector of the type commonly used to transform a suitable host.

Способ, непосредственно описанный выше, может быть модифицирован так, чтобы гетеродуплексную молекулу создавали в обеих нитях плазмиды, содержащей мутацию(и). Модификации следующие: однонитевой олигонуклеотид ренатурировали к однонитевой матрице, как описано выше. Объединяли смесь трех дезоксирибонуклеотидов, дезоксирибоаденозина (дАТФ), дезоксирибогуанозина (дГТФ) и дезоксириботимидина (дТТФ) с модифицированным тио-дезоксирибоцитозином, так называемом дСТФ-(аS) (который может быть поставлен Amersham Corporation). Эту смесь добавляли к матрично-олигонуклеотидному комплексу. При добавлении ДНК полимеразы к данной смеси получали нить ДНК, идентичную матрице, за исключением мутированных оснований. Помимо этого эта новая нить ДНК будет содержать дСТФ-(аS) вместо дСТФ, которые служат для их защиты от расщепления рестрикционной эндонуклеазой.The method directly described above can be modified so that a heteroduplex molecule is created in both strands of the plasmid containing the mutation (s). The modifications are as follows: single-stranded oligonucleotide was renatured to a single-stranded matrix, as described above. A mixture of three deoxyribonucleotides, deoxyriboadenosine (dATP), deoxyriboguanosine (dGTP) and deoxyribotimidine (dTTP) was combined with a modified thio-deoxyribo cytosine, the so-called dSTP- (aS) (which can be supplied by Amersham Corporation). This mixture was added to the matrix-oligonucleotide complex. When DNA polymerase was added to this mixture, a DNA strand identical to the template was obtained, with the exception of mutated bases. In addition, this new DNA strand will contain dSTF- (aS) instead of dSTF, which serve to protect them from restriction endonuclease cleavage.

После разрывания одной нити матрицы двухнитевого гетеродуплекса при помощи подходящего рестрикционного фермента нить матрицы может быть расщеплена ExoIII нуклеазой или другой подходящей нуклеазой после области, которая содержит участок(и), предназначенные для мутагенеза. Затем реакцию останавливали, оставляя молекулу, которая является только частично однонитевой. Затем образовывали полный двухнитевой гетеродуплекс ДНК, используя ДНК полимеразу в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, АТФ и ДНКлигазу. Данная гомодуплексная молекула затем может быть трансформирована в подходящую клетку хозяина, такого как Е.coli JM101, как описано выше.After breaking one strand of the double-stranded heteroduplex matrix using a suitable restriction enzyme, the strand of the matrix can be cleaved with ExoIII nuclease or another suitable nuclease after the region that contains the site (s) for mutagenesis. Then the reaction was stopped, leaving a molecule that is only partially single-stranded. Then a complete double-stranded DNA heteroduplex was formed using DNA polymerase in the presence of all four deoxyribonucleotide triphosphates, ATP and DNA ligase. This homoduplex molecule can then be transformed into a suitable host cell, such as E. coli JM101, as described above.

ДНК, кодирующая мутанты лиганда mpl с более чем одной замененной аминокислотой, может быть получена одним из нескольких путей. Если аминокислоты расположены близко вместе в полипептидной цепи, они могут быть мутированы одновременно, используя один олигонуклеотид, который кодирует все желаемые замены аминокислот. Если, однако, аминокислоты расположены на некотором удалении друг от друга (разделены более чем около десяти аминокислот), значительно более трудно получить единый олигонуклеотид, который кодирует все желаемые изменения. Вместо этого могут быть использованы один или два альтернативных способа.DNA encoding mpl ligand mutants with more than one amino acid replaced can be obtained in one of several ways. If amino acids are located close together in a polypeptide chain, they can be mutated simultaneously using a single oligonucleotide that encodes all the desired amino acid substitutions. If, however, the amino acids are located at some distance from each other (more than about ten amino acids are separated), it is much more difficult to obtain a single oligonucleotide that encodes all the desired changes. Instead, one or two alternative methods may be used.

В первом способе для каждой заменяемой аминокислоты получали отдельный олигонуклеотид. Затем олигонуклеотиды одновременно ренатурировали к однонитевой матрице ДНК, а вторая нить ДНК, которую синтезировали по матрице, будет кодировать желаемые замены аминокислот.In the first method, a separate oligonucleotide was obtained for each amino acid to be replaced. Then the oligonucleotides were simultaneously renatured to a single-stranded DNA matrix, and the second DNA strand, which was synthesized from the matrix, would encode the desired amino acid substitutions.

Альтернативный способ включает два или более циклов мутагенеза для получения желаемого мутанта. Первый цикл таков, как описано для одного мутанта: для матрицы использовали дикий тип ДНК, олигонуклеотид, кодирующий первую желаемую замену(ы) аминокислоты ренатурировали к данной матрице и затем получали гетеродуплексную молекулу ДНК. Во втором цикле мутагенеза использовали мутантную ДНК, полученную в первом цикле мутагенеза по матрице. Таким образом, матрица содержит одну или более мутаций. Затем к данной матрице ренатурировали олигонуклеотид, кодирующий желаемую аминокислотную замену(ы), и полученная теперь нить ДНК кодирует мутации из обоих, первого и второго циклов мутагенеза. Настоящая конечная ДНК может быть использована в качестве матрицы в третьем цикле мутагенеза, и т.д.An alternative method involves two or more cycles of mutagenesis to obtain the desired mutant. The first cycle is as described for one mutant: a wild type of DNA was used for the matrix, the oligonucleotide encoding the first desired change (s) of the amino acid was renatured to this matrix and then a heteroduplex DNA molecule was obtained. In the second cycle of mutagenesis used mutant DNA obtained in the first cycle of mutagenesis on the matrix. Thus, the matrix contains one or more mutations. Then, an oligonucleotide encoding the desired amino acid substitution (s) was renatured to this matrix, and the DNA strand obtained now encodes mutations from both the first and second mutagenesis cycles. Real final DNA can be used as a template in the third cycle of mutagenesis, etc.

Мутагенез РПЦ также подходит для получения аминокислотных вариантов полипептида лиганда mpl. Поскольку следующее обсуждение касается ДНК, понятно, что эта техника также применима и к РНК. Техника РПЦ в целом относится к следующим процедурам (см. Eriich, там же, раздел R. Higuchi, стр.61-70). Когда использовали небольшие количества матрицы в качестве начального материала в РПЦ, для этого можно было использовать праймеры из соответствующих областей матрицы ДНК, которые незначительно различались в последовательности, для получения сравнительно больших количеств специфических фрагментов ДНК, которые различались от последовательности матрицы только в положениях, где праймеры различались с матрицей. Для введения мутации в ДНК плазмиды один из праймеров сконструировали для перекрывания положения мутации и содержания мутации; последовательность другого праймера должна быть идентичной фрагменту секвенирования противоположной нити плазмиды; но эта последовательность может быть расположена где-нибудь далеко в ДНК плазмиды. Предпочтительно, однако, чтобы последовательность второго праймера располагалась в 200 нуклеотидах от первого, так чтобы в конце полной амплифицируемой области ДНК, привязанной к праймеру, могла быть легко секвенирована. Амплификация РПЦ, использующая подобные пары праймеров, только описывает результаты в популяции фрагментов ДНК, которые различаются по положению мутации, определенной праймером, и возможно, по другим положениям, поскольку копирование матрицы до некоторой степени склонно к ошибке.ROC mutagenesis is also suitable for the preparation of amino acid variants of the mpl ligand polypeptide. Since the following discussion is about DNA, it is understood that this technique also applies to RNA. The ROC technique generally refers to the following procedures (see Eriich, ibid., Section R. Higuchi, pp. 61-70). When small amounts of the matrix were used as starting material in the Russian Orthodox Church, primers from the corresponding regions of the DNA matrix, which differed slightly in sequence, could be used to obtain relatively large amounts of specific DNA fragments that differed from the matrix sequence only at the positions where the primers differed with the matrix. To introduce a mutation into the plasmid DNA, one of the primers was designed to overlap the position of the mutation and the content of the mutation; the sequence of the other primer should be identical to the sequence fragment of the opposite strand of the plasmid; but this sequence can be located somewhere far in the plasmid DNA. Preferably, however, the sequence of the second primer is located 200 nucleotides from the first, so that at the end of the entire amplifiable region of the DNA bound to the primer can be easily sequenced. Amplification of the Russian Orthodox Church, using similar pairs of primers, only describes the results in a population of DNA fragments that differ in the position of the mutation determined by the primer, and possibly in other positions, since copying the matrix is somewhat error prone.

Если отношение матрицы к материалу продукта крайне низкое, имеется огромное большинство фрагментов продуктов ДНК для включения желаемой мутации(и). Данный материал продукта использовали для замены соответствующей области в плазмиде, которая служит в качестве матрицы РПЦ, при использовании обычной технологии ДНК. Мутации по раздельным положениям могут быть введены одновременно, путем использования второго мутантного праймера, или проведения второй РПЦ с различными мутантными праймерами и лигированием двух конечных фрагментов РПЦ одновременно к фрагменту вектора при трех- (или более) частей лигации.If the ratio of the matrix to the material of the product is extremely low, there is a vast majority of fragments of DNA products to include the desired mutation (s). This product material was used to replace the corresponding region in the plasmid, which serves as the ROC matrix, using conventional DNA technology. Mutations at separate positions can be introduced simultaneously, by using the second mutant primer, or by conducting a second ROC with various mutant primers and ligating two terminal fragments of the ROC simultaneously to a vector fragment with three (or more) parts of the ligation.

В специфическом примере мутагенеза РПЦ матричную плазмиду ДНК (1 мкг) линеаризовали путем расщепления с рестрикционной эндонуклеазой, которая имеет уникальный участок распознавания ДНК плазмиды вне амплифицируемой области. Данный материал 100 нг добавили к РПЦ смеси, содержащей буфер РПЦ, который содержит четыре дезоксинуклеотидтрифосфата и который включен в наборы GeneAmp® (полученные от Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA), и 25 пмоль каждого олигонуклеотидного праймера до конечного объема 50 мкл. Реакционную смесь покрыли 35 мкл минерального масла. Реакционную смесь денатурировали в течение 5 минут при 100°С, быстро поместили на лед и затем добавили под пленку минерального масла 1 мкл ДНК полимеразы Thermus aquaticus (Taq) (5 единиц/мкл, полученную от Perkin-Elmer Cetus). Затем реакционную смесь поместили в ДНК Thermal Cycler (полученный от Perkin-Elmer Cetus), запрограммированный следующим образом:In a specific example of ROC mutagenesis, the template DNA plasmid (1 μg) was linearized by digestion with a restriction endonuclease, which has a unique plasmid DNA recognition site outside the amplified region. This material 100 ng was added to the ROC mixture containing the ROC buffer, which contains four deoxynucleotide triphosphates and which is included in the GeneAmp® kits (obtained from Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA), and 25 pmol of each oligonucleotide primer to the final volume 50 μl The reaction mixture was coated with 35 μl of mineral oil. The reaction mixture was denatured for 5 minutes at 100 ° C, quickly placed on ice, and then 1 μl of Thermus aquaticus polymerase DNA (Taq) (5 units / μl obtained from Perkin-Elmer Cetus) was added under a film of mineral oil. Then the reaction mixture was placed in Thermal Cycler DNA (obtained from Perkin-Elmer Cetus), programmed as follows:

2 мин 55°С,2 min 55 ° C,

30 сек 72°С, затем 19 циклов:30 sec 72 ° C, then 19 cycles:

30 сек 94°С,30 sec 94 ° C,

30 сек 55°С,30 sec 55 ° C

30 сек 72°С.30 sec 72 ° C.

В конце программы реакционный флакон удалили из температурного циклизатора, а водную фазу перенесли в новый флакон, экстрагировали фенол/хлороформом (50:50 по объему) и осадили этанолом, ДНК выделили согласно обычным способам. Данный материал сразу же подвергли подходящей обработке для включения в вектор.At the end of the program, the reaction vial was removed from the temperature cyclizer, and the aqueous phase was transferred to a new vial, extracted with phenol / chloroform (50:50 v / v) and precipitated with ethanol, DNA was isolated according to conventional methods. This material was immediately subjected to suitable processing for inclusion in the vector.

Другой способ получения вариантов - кассетный мутагенез, основан на технике, описанной Wells et al., Gene, 34: 313 [1985]. Начальным материалом является плазмида (или другой вектор), включающий мутируемую ДНК лиганда mpl. Идентифицируют предназначенный для мутации кодон ДНК лиганда mpl. Здесь должно находиться специальное место для рестрикционной эндонуклеазы, на каждой стороне участка(ков), определенного для мутации. Если таких участков для рестрикции не существует, они должны быть получены, используя вышеописанный опосредованный олигонуклеотидами способ мутагенеза, для введения их в подходящее месторасположение в ДНК лиганда mpl. После этого участки рестрикции были введены в плазмиду, плазмиду отрезали по этим участкам для их линеаризации. Используя обычные способы, синтезировали двухнитевой олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между участками рестрикции, но содержащий желаемую мутацию(и). Две нити синтезировали раздельно, а затем гибридизовали вместе, используя обычные способы. Данный двухнитевой олигонуклеотид называется кассетой. Эта кассета сконструирована так, чтобы иметь 3’ и 5’ концы, которые совместимы с концами линеаризованной плазмиды таким образом, чтобы непосредственно лигировать плазмиду. Данная плазмида теперь содержит мутированную последовательность ДНК лиганда mpl.Another way to obtain options is cassette mutagenesis, based on the technique described by Wells et al., Gene, 34: 313 [1985]. The starting material is a plasmid (or other vector) including mutated mpl ligand DNA. A codon of mpl ligand DNA intended for mutation is identified. There should be a special place for restriction endonuclease, on each side of the site (s) defined for the mutation. If such restriction sites do not exist, they must be obtained using the oligonucleotide-mediated mutagenesis method described above to introduce them at a suitable location in the mpl ligand DNA. After this, restriction sites were introduced into the plasmid, the plasmid was cut into these sites for their linearization. Using conventional methods, a double-stranded oligonucleotide was synthesized that encodes a DNA sequence between restriction sites, but contains the desired mutation (s). The two strands were synthesized separately, and then hybridized together using conventional methods. This double-stranded oligonucleotide is called a cassette. This cassette is designed to have 3 ’and 5’ ends that are compatible with the ends of the linearized plasmid so as to directly ligate the plasmid. This plasmid now contains a mutated mpl ligand DNA sequence.

С. Введение нуклеиновой кислоты в реплицирующийся векторC. Introduction of a nucleic acid into a replicating vector

Нуклеиновую кислоту (например, кДНК или геномная ДНК), кодирующую естественный полипептид или вариант полипептида лиганда mpl, ввели в реплицирующийся вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. Многие векторы являются доступными, поэтому выбор подходящего вектора будет зависеть от: (1) будет ли он применяться для амплификации ДНК или для экспрессии ДНК, (2) размера нуклеиновой кислоты для введения в вектор, (3) трансформируемой вектором клетки хозяина. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его функции (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и клетки хозяина, с которой он должен быть совместим. Компоненты вектора обычно включают, но не ограничиваются этим, одно или более следующее: сигнальную последовательность, образец репликации, один или более маркеров генов, усилительный элемент, промотер и конечную транскрипционную последовательность.A nucleic acid (e.g., cDNA or genomic DNA) encoding a natural polypeptide or a variant of the mpl ligand polypeptide is introduced into a replicating vector for further cloning (DNA amplification) or for expression. Many vectors are available, therefore, the choice of a suitable vector will depend on: (1) whether it will be used for DNA amplification or for expression of a DNA, (2) the size of a nucleic acid to be introduced into a vector, (3) a host cell transformed by a vector. Each vector contains various components depending on its function (DNA amplification or DNA expression) and the host cell with which it must be compatible. Components of a vector typically include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, a replication sample, one or more gene markers, an amplifying element, a promoter, and a terminal transcriptional sequence.

(i) Компонент сигнальной последовательности Лиганд mpl по настоящему изобретению может быть экспрессирован не только непосредственно, но также в сплавленном виде с гетерологическим полипептидом, предпочтительно сигнальной последовательностью, или другим полипептидом, имеющим специфический участок для расщепления в N-конце зрелого белка или полипептида. В целом, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора, или она может быть частью ДНК лиганда mpl, которая введена в вектор. Выбранная гетерологическая сигнальная последовательность должна быть такой, которая распознается и подвергается процессингу (то есть расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой хозяина. Для клеток хозяина прокариота, которые не распознают, не подвергают процессингу сигнальную последовательность естественного лиганда mpl, сигнальную последовательность заменяли на выбранную сигнальную последовательность прокариотов, например, из группы щелочной фосфатазы, пенициллиназы, Ipp, или лидеры устойчивого к нагреванию энтеротоксина II. Для секреции дрожжей естественная сигнальная последовательность может быть заменена на, например, инвертазу дрожжей, альфа фактор или лидеры кислой фосфатазы, лидер глюкоамилазы С.albicans (EP 362179, опубликованный 4 апреля 1990 г.), или сигнал, описанный в WO 90/13646, опубликованном 15 ноября 1990 г. У клеток млекопитающих экспрессия естественной сигнальной последовательности (то есть предпоследовательности лиганда mpl, которая обычно ведет к секреции лиганда mpl из его естественных клеток млекопитающего in vivo), является удовлетворительной, хотя могут быть применимы другие сигнальные последовательности млекопитающих, такие как сигнальные последовательности из других полипептидов лиганда mpl, или из той же формы лиганда mpl других видов животных, сигнальных последовательностей из лиганда mpl, сигнальных последовательностей из секретируемых полипептидов того же или близких видов, так же как и секреторные лидеры вируса, например, gD сигнал герпеса симплекс.(i) The signal sequence component of the mpl ligand of the present invention can be expressed not only directly, but also fused to a heterologous polypeptide, preferably a signal sequence, or another polypeptide having a specific site for cleavage at the N-terminus of a mature protein or polypeptide. In general, the signal sequence may be a component of the vector, or it may be part of the mpl ligand DNA that is introduced into the vector. The selected heterologous signal sequence must be one that is recognized and processed (i.e., cleaved by signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that cannot be recognized, they do not process the signal sequence of the natural mpl ligand, the signal sequence is replaced by the selected signal sequence of prokaryotes, for example, from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, Ipp, or leaders of heat-resistant enterotoxin II. For yeast secretion, the natural signal sequence can be replaced by, for example, yeast invertase, alpha factor or acid phosphatase leaders, C. albicans glucoamylase leader (EP 362179, published April 4, 1990), or the signal described in WO 90/13646, published November 15, 1990, in mammalian cells, expression of the natural signal sequence (i.e., the presequence of the mpl ligand, which usually leads to secretion of the mpl ligand from its natural mammalian cells in vivo) is satisfactory, although there may be other mammalian signal sequences are applicable, such as signal sequences from other mpl ligand polypeptides, or from the same form of mpl ligand from other animal species, signal sequences from mpl ligand, signal sequences from secreted polypeptides of the same or related species, as well as secretory leaders virus, for example, gD herpes simplex signal.

(ii) Точка начала компонента репликации(ii) The origin of the replication component

Оба, экспрессируемый и клонируемый, векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая дает возможность вектору реплицироваться в одних или более выбранных клетках хозяина. В целом, в клонируемых векторах данная последовательность является единственной, которая дает возможность вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина и включает точку начала репликации или автономно реплицирующуюся последовательность. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Точка начала репликации из плазмиды pBR322 применима для большинства Грам-отрицательных бактерий, точка начала плазмиды 2 μ применима для дрожжей, а различные вирусные точки начала (SV40, полиома, аденовирус, VSV или BPV) применимы для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. В целом, точка начала компонента репликации не требуется для экспрессии векторов у млекопитающих (обычно, может быть использована точка начала SV40 только потому, что она содержит ранний промотер).Both expressed and cloned vectors contain a nucleic acid sequence that allows the vector to replicate in one or more selected host cells. In general, in the cloned vectors, this sequence is the only one that allows the vector to replicate independently of the host chromosomal DNA and includes the origin of replication or an autonomously replicating sequence. Such sequences are well known for various bacteria, yeast and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is applicable to most Gram-negative bacteria, the origin of plasmid 2 μ is applicable to yeast, and various viral origin (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are applicable to cloning vectors in mammalian cells. In general, the origin of the replication component is not required for expression of vectors in mammals (usually, the origin of SV40 can be used only because it contains an early promoter).

Большинство векторов экспрессии являются "челночными" векторами, то есть они способны к репликации в, по крайней мере, одном классе организмов, но могут быть трансфецированы для экспрессии в другой организм. Например, вектор клонировали в Е.coli, и затем тот же вектор трансфецировали в дрожжи или клетки млекопитающего для экспрессии, даже не обращая внимания на то, способен ли он к независимой репликации в хромосомах клетки хозяина.Most expression vectors are “shuttle” vectors, that is, they are capable of replication in at least one class of organisms, but can be transfected for expression in another organism. For example, the vector was cloned into E. coli, and then the same vector was transfected into yeast or mammalian cells for expression, not even paying attention to whether it is capable of independent replication in the chromosomes of the host cell.

ДНК также может быть амплифицирована путем введения в геном хозяина. Это легко выполняется, используя виды Bacillus в качестве хозяина, например, путем включения в вектор последовательности ДНК, которая комплементарна к последовательности, обнаруженной в геномной ДНК Bacillus. Трансфецирование Bacillus вектором приводит к гомологической рекомбинации с геномом и встраиванию в ДНК лиганда mpl. Однако выделение геномной ДНК, кодирующей лиганд mpl, является более сложным, чем экзогенно реплицируемого вектора, поскольку требуется расщепление ферментом рестрикции для вырезания ДНК лиганда mpl.DNA can also be amplified by introducing into the host genome. This is easily accomplished using Bacillus species as a host, for example, by incorporating into the vector a DNA sequence that is complementary to the sequence found in Bacillus genomic DNA. Transfection of Bacillus with a vector leads to homologous recombination with the genome and insertion of the mpl ligand into the DNA. However, the isolation of genomic DNA encoding the mpl ligand is more complex than the exogenously replicated vector, since restriction enzyme digestion is required to excise the mpl ligand DNA.

(iii) Отбор компонентов гена(iii) Selection of gene components

Экспрессируемые и клонируемые векторы должны содержать селекционный ген, также называемый селектируемый маркер. Этот ген кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированной клетки хозяина в селективной культуральной среде. Клетки хозяина, нетрансформированные вектором, содержащим селекционный ген, не выживут в культуральной среде. Обычно селекционные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (б) дополняют ауксотрофную недостаточность, или (в) обеспечивают критическими питательными веществами, не доступными из сложной среды, например ген, кодирующий рацемазу D-аланина для Bacilli.Expressed and cloned vectors must contain a selection gene, also called a selectable marker. This gene encodes a protein necessary for the survival or growth of a transformed host cell in a selective culture medium. Host cells not transformed with a vector containing the selection gene will not survive in the culture medium. Typically, selection genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) supplement auxotrophic deficiency, or (c) provide critical nutrients that are not accessible from a complex environment, for example gene encoding racemase D-alanine for Bacilli.

Один пример селекционой схемы, использующей лекарственные препараты для задержки роста клеток хозяина. Те клетки, которые успешно трансформировали гетерологическим геном, экспрессируют белок, придающий устойчивость к лекарственному препарату и, таким образом, выживают в селекционном режиме. В примерах такой доминантной селекции используют препараты неомицин (Southern et al., J, Molec. Appi. Genet., 1: 327 [1982]), микофеноловую кислоту (Mulligan et al., Science, 209: 1422 [1980]) или гигромицин (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 [1985]). В трех примерах, приведенных выше, участвуют бактериальные гены в условиях контроля эукариотами передачи устойчивости к подходящему препарату G418 или неомицину (генетицин), xgpt (микофеноловая кислота) или гигромицину соответственно.One example of a breeding scheme using drugs to inhibit host cell growth. Those cells that have successfully transformed with the heterologous gene express a protein that confers resistance to the drug and, thus, survive in the selection mode. Examples of such dominant selection use neomycin (Southern et al., J, Molec. Appi. Genet., 1: 327 [1982]), mycophenolic acid (Mulligan et al., Science, 209: 1422 [1980]) or hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 [1985]). In the three examples above, bacterial genes are involved under the control of eukaryotic transmission of resistance to a suitable drug G418 or neomycin (geneticin), xgpt (mycophenolic acid) or hygromycin, respectively.

Примерами других подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются те, которые дают возможность идентификации клеточных компонентов для извлечения нуклеиновой кислоты лиганда mpl, такие как дигидрофолат редуктаза (ДГФР) или тимидин киназа. Трансформированные клетки млекопитающих помещали в условия давления отбора, в которых выживают только особенно адаптированные трансформированные клетки благодаря захвату маркера. Давление отбора на трансформированные клетки, примененное путем культивирования в условиях, в которых концентрация селекционного агента в среде последовательно изменяется, приводит посредством этого к амплификации обоих генов, селектируемого гена и ДНК, которая кодирует полипептид лиганда mpl. Амплификация - это процесс, посредством которого гены, имеющие большую потребность для продукции белков, критических для роста, многократно повторяются в тандеме в хромосомах последовательно размножающихся рекомбинантных клеток. Таким образом, синтезировали увеличенное количество лиганда mpl из амплифицированной ДНК.Examples of other suitable breeding markers for mammalian cells are those that enable the identification of cellular components for mpl ligand nucleic acid extraction, such as dihydrofolate reductase (DHFR) or thymidine kinase. Transformed mammalian cells were placed under selection pressure conditions, in which only specially adapted transformed cells survive due to marker capture. The selection pressure on the transformed cells, applied by culturing under conditions in which the concentration of the selection agent in the medium changes sequentially, thereby leads to the amplification of both genes, the breeding gene and the DNA that encodes the mpl ligand polypeptide. Amplification is the process by which genes that have a great need for the production of proteins critical for growth are repeatedly repeated in tandem on the chromosomes of successively multiplying recombinant cells. Thus, an increased amount of mpl ligand was synthesized from amplified DNA.

Например, клетки, трансформированные селекционным геном ДГФР, сначала идентифицировали при культивировании всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист ДГФР. При применении дикого типа ДГФР получали и размножали подходящее количество клеток хозяина из яичника китайского хомячка (СНО), дефицитных по активности ДГФР, как описано Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]. Затем трансформированные клетки выдерживали с увеличивающимся уровнем Mtx. Это приводило к синтезу множества копий гена ДГФР и соответственно множества копий другой ДНК, содержащей экспрессируемые векторы, такие как ДНК, кодирующая лиганд mpl. Техника амплификации может быть использована с любым более или менее подходящим хозяином, например, АТСС No. CCL61 СНО-К1, несмотря на наличие эндогенной ДГФР, если, например, применен мутантный ген ДГФР, который высоко устойчив к Mtx (ЕП 117060). Альтернативно, клетки хозяина (в частности, хозяина дикого типа, который содержит эндогенную ДГФР) трансформировали или трансформировали совместно с последовательностью ДНК, кодирующей лиганд mpl, диким типом белка ДГФР и другим селектируемым маркером, таким как аминогликозид 3’ фосфотрансфераза (АФТ), могут быть отобраны при выращивании клеток в среде, содержащей селекционный агент для селектируемого маркера, такого как аминогликозидный антибиотик, например канамицин, неомицин, или G418. См. Патент США No.4965199.For example, cells transformed with the DHFR selection gene were first identified by culturing all transformants in a culture medium that contains methotrexate (Mtx), a competitive DHFR antagonist. Using wild-type DHFR, a suitable number of host cells from Chinese hamster ovary (CHO) deficient in DHFR activity were obtained and propagated, as described by Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 [1980]. Then, the transformed cells were maintained with increasing levels of Mtx. This led to the synthesis of multiple copies of the DHFR gene and, accordingly, multiple copies of another DNA containing expressed vectors, such as DNA encoding the mpl ligand. The amplification technique can be used with any more or less suitable host, for example, ATCC No. CCL61 CHO-K1, despite the presence of endogenous DHFR, if, for example, a mutant DHFR gene is used that is highly resistant to Mtx (EP 117060). Alternatively, the host cells (in particular, the wild-type host that contains endogenous DHFR) have been transformed or transformed with the DNA sequence encoding the mpl ligand, wild-type DHFR protein and other selectable marker, such as aminoglycoside 3 'phosphotransferase (AFT), selected when growing cells in a medium containing a selection agent for a selectable marker, such as an aminoglycoside antibiotic, for example kanamycin, neomycin, or G418. See U.S. Patent No.4965199.

Походящий селекционный ген для использования на дрожжах представляет ген trp1, присутствующий в плазмиде Yrp7 (Stinchomb et al.. Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7: 141 [1979]; или Tschemper efc al., Gene, 10: 157 [1980]). Ген trp1 производит селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, лишенных способности расти в отсутствии триптофана, например, АТСС No. 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). Наличие повреждения trp1 в геноме дрожжевых клеток хозяина создает эффективную окружающую среду для обнаружения трансформации при выращивании в отсутствии триптофана. Подобным образом, Лей2-дефицитный штамм дрожжей (ФТСС No.20622 или 38626) дополнен известными плазмидами, несущими ген Лей2.A suitable breeding gene for use on yeast is the trp1 gene present in the Yrp7 plasmid (Stinchomb et al .. Nature, 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7: 141 [1979]; or Tschemper efc al., Gene, 10: 157 [1980]). The trp1 gene produces a selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in the absence of tryptophan, for example, ATCC No. 44076 or PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 [1977]). The presence of trp1 damage in the genome of the host yeast cell creates an effective environment for detecting transformation when grown in the absence of tryptophan. Similarly, the Leu2-deficient strain of yeast (FTSS No.20622 or 38626) is supplemented with known plasmids carrying the Leu2 gene.

(iv) Промотерный компонент(iv) Promoter component

Экспрессия и клонирование векторов, обычно содержащих промотеры, которые распознаваемы организмом хозяина и операбельно сцеплены с нуклеиновой кислотой лиганда mpl. Промотеры представляют нетранслируемую последовательность, располагающуюся в обратном направлении (5’) к начальному кодону структурного гена (в общем, от 100 до 1000 пар оснований), который контролирует транскрипцию и трансляцию конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, такой как последовательность нуклеиновой кислоты лиганда mpl, к которой они операбельно сцеплены. Такие промотеры обычно разделяют на два класса, индуцируемые и конституитивные. Индуцируемые промотеры являются промотерами, которые инициируют повышенные уровни транскрипции с ДНК под их контролем в ответ на некоторые изменения в условиях культивирования, например наличие или отсутствие питательного вещества, или изменение в температуре. В настоящее время известно большое количество промотеров, распознаваемых разнообразными потенциальными клетками хозяевами. Эти промотеры опреративно сцепляют к ДНК, кодирующей лиганд mpl, путем удаления промотера из источника ДНК при расщеплении рестрикционным ферментом и включения выделенной последовательности промотера в вектор. И естественные промотерные последовательности лиганда mpl и многие гетерологичные промотеры могут быть использованы для непосредственной амплификации и/или экспрессии ДНК лиганда mpl. Однако предпочтительны гетерологические промотеры, поскольку они в целом позволяют большую транскрипцию и более высокий выход экспрессии лиганда mpl по сравнению с естественным промотером лиганда mpl.Expression and cloning of vectors, usually containing promoters, which are recognized by the host organism and operably linked to the mpl ligand nucleic acid. Promoters represent an untranslated sequence located in the opposite direction (5 ') to the initial codon of the structural gene (in general, from 100 to 1000 base pairs), which controls the transcription and translation of a specific nucleic acid sequence, such as the mpl ligand nucleic acid sequence to which they are operably linked. Such promoters are usually divided into two classes, inducible and constitutive. Inducible promoters are promoters that initiate increased levels of transcription with DNA under their control in response to some changes in culture conditions, for example the presence or absence of a nutrient, or a change in temperature. Currently, a large number of promoters are recognized that are recognized by a variety of potential host cells. These promoters are operatively linked to DNA encoding the mpl ligand by removing the promoter from the DNA source by digestion with a restriction enzyme and including the selected promoter sequence in the vector. Both the natural promoter sequences of the mpl ligand and many heterologous promoters can be used to directly amplify and / or express the mpl ligand DNA. However, heterologous promoters are preferred since they generally allow greater transcription and higher mpl ligand expression yield compared to the natural mpl ligand promoter.

Промотеры, подходящие для использования с хозяевами прокариотами, включают β-лактамазную или лактозную системы промотеров (Chang et al.. Nature, 275: 615 [1978]; и Goeddel et al.. Nature, 281: 544 [1979]), системы промотеров щелочной фосфатазы или триптофана (trp) (Goeddel, Nucleic Acida Res., 8: 4057 [1980] и ЕП 36 776) и гибридные промотеры, такие как tac промотер (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]). Однако применимы другие известные бактериальные промотеры. Их нуклеотидные последовательности опубликованы, таким образом, позволяя опытному работнику операбельно пришить их к ДНК, кодирующей лиганд mpl (Siebenlist et al. Cell, 20: 269 [1980]), используя линкеры или адаптеры для получения любого требуемого участка рестрикции. Промотеры для использования в бактериальных системах также будут содержать Shine-Dalgarno (S.D.) последовательность, операбельно пришитую к ДНК, кодирующую полипептид лиганда mpl.Promoters suitable for use with prokaryotic hosts include β-lactamase or lactose promoter systems (Chang et al .. Nature, 275: 615 [1978]; and Goeddel et al .. Nature, 281: 544 [1979]), promoter systems alkaline phosphatase or tryptophan (trp) (Goeddel, Nucleic Acida Res., 8: 4057 [1980] and EP 36 776) and hybrid promoters such as the tac promoter (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]). However, other known bacterial promoters are applicable. Their nucleotide sequences are published, thus allowing an experienced worker to operably sew them to DNA encoding the mpl ligand (Siebenlist et al. Cell, 20: 269 [1980]) using linkers or adapters to obtain any desired restriction site. Promoters for use in bacterial systems will also contain a Shine-Dalgarno (S.D.) sequence operably linked to DNA encoding the mpl ligand polypeptide.

Известны промотерные последовательности для эукариот. Фактически все гены эукариот имеют AT-обогащенную область, расположенную приблизительно от 25 до 30 оснований в противоположном направлении от участка, где инициируется транскрипция. Другая последовательность найдена от 70 до 80 основания в противоположном направлении от начала транскрипции многих генов представляет СХСААТ область, где Х может быть любым нуклеотидом. На 3’ конце у многих генов эукариот присутствует последовательность ААТААА, которая может являться сигнальной, в добавление к поли А концу 3’ конца кодирующей последовательности. Все эти последовательности применимы для введения в векторы экспрессии эукариот.Promoter sequences for eukaryotes are known. Virtually all eukaryotic genes have an AT-rich region located approximately 25 to 30 bases in the opposite direction from the site where transcription is initiated. Another sequence found from 70 to 80 bases in the opposite direction from the start of transcription of many genes represents the SCXAAT region, where X can be any nucleotide. At the 3 ’end, many eukaryotic genes have an AATAAA sequence, which may be a signal, in addition to the poly A end 3’ end of the coding sequence. All of these sequences are applicable for insertion into eukaryotic expression vectors.

Примеры подходящих последовательностей векторов для использования с клетками хозяевами дрожжей включают промотеры для 3-фосфоглицерокиназы (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980]), или другого гликолитического фермента (Hess et al., J. Adv. Enzyme Res., 7: 149 [1980]; и Holland, Biochemistry, 17: 4900 [1978]), такие как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицеромутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.Examples of suitable vector sequences for use with yeast host cells include promoters for 3-phosphoglycerokinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 [1980]), or another glycolytic enzyme (Hess et al., J. Adv Enzyme Res., 7: 149 [1980]; and Holland, Biochemistry, 17: 4900 [1978]), such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphatisomerase, 3-phosphogase , pyruvate kinase, triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase.

Другими промотерами дрожжей, которые представляют индуцируемые промотеры, имеющие дополнительное преимущество в транскрипции, контролируемой условиями выращивания, являются промотерные области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющими ферментами, связанными с метаболизмом азота, металлотионеин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и ферменты, ответственные за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящими векторами и промотерами для использования в экспрессии у дрожжей являются далее описанные Hitzeman et al., ЕП 73657А. Усилители дрожжей также имеют преимущество при использовании с промотерами дрожжей.Other yeast promoters that are inducible promoters that have an additional advantage in transcription controlled by growing conditions are the promoter regions for alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, digestion enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde-3-phosphate, responsible for the disposal of maltose and galactose. Suitable vectors and promoters for use in expression in yeast are further described by Hitzeman et al., EP 73657A. Yeast enhancers also have an advantage when used with yeast promoters.

Транскрипция лиганда mpl из векторов в клетках хозяина млекопитающего контролируется, например, при помощи промотеров, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы домашних птиц (Патент Великобритании 2211504, опубликованный 5 июля 1989 г.), аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и, наиболее предпочтительно, вакуолизирующий обезьяний вирус 40 (SV 40), из гетерологических промотеров млекопитающих, например промотера актина или промотера иммуноглобулина, промотеров тепловой устойчивости и из промотера, обычно ассоциированного с последовательностью лиганда mpl, при условии, что такие промотеры совместимы с системами клеток хозяина.Transcription of the mpl ligand from vectors in mammalian host cells is controlled, for example, by promoters derived from virus genomes, such as polyoma virus, poultry smallpox virus (UK Patent 2211504, published July 5, 1989), adenovirus (such as adenovirus 2 ), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and, most preferably, vacuolating monkey virus 40 (SV 40), from mammalian heterologous promoters, for example, the actin promoter or the immuno promoter lobulina, promoters and heat resistance of the promoter normally associated with the ligand sequence mpl, provided that such promoters are compatible with the host cell systems.

Ранние и поздние промотеры вируса SV40 получены общепринятым способом в виде рестрикционных фрагментов SV 40, которые также содержат вирусную точку начала репликации SV 40. Fiers et al. Nature, 273: 113 [1978]; Mulligan and Berg, Science, 209: 1422-1427 [1980]; Pevlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402 [1981]. Немедленный ранний промотер цитомегаловируса человека получен общепринятым способом в виде HindIII E фрагмента рестрикции. Greenaway et al. Gene, 18: 355-360 [1982]. Система экспрессии ДНК млекопитающего хозяина, использующая вирус бычьей папилломы в качестве вектора описана в Патенте США No.4419446. Модификация этой системы описана в Патенте США No.4601978, см. также Gray et al., Nature, 295: 503-508 [1982] об экспрессии кДНК, кодирующей иммунный интерферон в клетках обезьян; Reyes et al., Nature, 297: 598-601 [1982] об экспрессии кДНК (3-интерферона человека в клетках мыши под контролем тимидинкиназного промотера из вируса герпеса симплекс; Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. USA, 79: 5166-5170 [1982] об экспрессии гена β1-интерферона человека в культуре клеток мыши и кролика; и German et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6777-6871 [1982] об экспрессии бактериальной CAT последовательности в CV-1 клетках почки обезьяны, фибробластов эмбриона цыпленка, клетках яичника китайского хомячка, клетках HeLa и клетках NIH-3T3 мыши, используя повтор длинного конца вируса саркомы Рауса в виде промотера.The early and late promoters of the SV40 virus are obtained in the conventional manner as SV40 restriction fragments, which also contain the SV40 viral origin of replication. Fiers et al. Nature, 273: 113 [1978]; Mulligan and Berg, Science, 209: 1422-1427 [1980]; Pevlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7398-7402 [1981]. The immediate early promoter of human cytomegalovirus was obtained in the conventional manner as a HindIII E restriction fragment. Greenaway et al. Gene, 18: 355-360 [1982]. A mammalian host DNA expression system using bovine papillomavirus as a vector is described in US Pat. No. 4,419,446. A modification of this system is described in US Patent No. 4601978, see also Gray et al., Nature, 295: 503-508 [1982] on the expression of cDNA encoding immune interferon in monkey cells; Reyes et al., Nature, 297: 598-601 [1982] on the expression of cDNA (human 3-interferon in mouse cells under the control of a thymidine kinase promoter from herpes simplex virus; Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. USA, 79: 5166 -5170 [1982] on the expression of the human β1-interferon gene in mouse and rabbit cell culture; and German et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6777-6871 [1982] on the expression of the bacterial CAT sequence in CV -1 monkey kidney cells, chicken embryo fibroblasts, Chinese hamster ovary cells, HeLa cells and mouse NIH-3T3 cells using a repeat of the long end of Routh sarcoma virus as a promoter a.

(v) Компонент усилительного элемента(v) Component of the amplifier element

Транскрипцию ДНК, кодирующую лиганд mpl по настоящему изобретению, высшими эукариотами часто усиливают путем введения усилительной последовательности в вектор. Усилители представляют цис-действующие элементы ДНК, обычно около от 10 до 300 пар оснований, которые действуют на промотер для увеличения его транскрипции. Усилители являются относительно ориентированными и независимыми в положении, обнаруживая 5’ (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 993 [1981]) и 3’ (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108 [1983]) локализацию в транскрипционной единице, внутри интрона (Banerji et al., Cell, 33: 729 [1983]), так же как и в самой кодирующей последовательности (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4: 1293 [1984]). Многие усилительные последовательности из генов млекопитающих теперь известны (глобин, эластаза, альбумин, α-фетопротеин и инсулин). Обычно, однако, используют усилители из вирусов клеток эукариот. Примеры включают усилитель SV 40 из поздней области точки начала репликации (пары оснований 100-270), усилитель раннего промотера цитомегаловируса, усилитель полиомы из поздней области точки начала репликации и усилители аденовируса. См. также Yaniv, Nature, 297: 17-18 [1982] об усилительных элементах для активации промотеров эукариот. Усилитель может быть врезан в вектор по 5’ или 3’ положению к кодирующей последовательности mpl, но предпочтительно расположен в 5’ участке от промотера.DNA transcription encoding the mpl ligand of the present invention is often enhanced by higher eukaryotes by introducing an amplification sequence into the vector. Amplifiers represent cis-acting DNA elements, usually about 10 to 300 base pairs, that act on a promoter to increase its transcription. Amplifiers are relatively oriented and independent in position, detecting 5 '(Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 993 [1981]) and 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108 [1983]) localization in the transcriptional unit, inside the intron (Banerji et al., Cell, 33: 729 [1983]), as well as in the coding sequence itself (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4: 1293 [1984]). Many amplification sequences from mammalian genes are now known (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Usually, however, amplifiers from eukaryotic cell viruses are used. Examples include an SV 40 enhancer from a late region of a replication start point (base pairs 100-270), an early cytomegalovirus promoter enhancer, a polyoma enhancer from a late replication start point region, and adenovirus enhancers. See also Yaniv, Nature, 297: 17-18 [1982] on enhancing elements for activating eukaryotic promoters. The amplifier can be embedded in a vector at the 5 ’or 3’ position to the mpl coding sequence, but is preferably located in the 5 ’site from the promoter.

(iv) Транскрипция компонента терминации(iv) Transcription of the termination component

Экспрессируемые векторы, используемые в клетках хозяевах эукариот (дрожжах, грибах, насекомых, растениях, животных, человеке или ядерных клетках из других многоклеточных организмов) будут также содержать последовательности, необходимые для остановки транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности из 5’, иногда 3’ нетранслируемых областей эукариот или вирусных ДНК или РНК широко доступны. Эти области содержат сегменты нуклеотидов, транскрибируемых в виде фрагментов полиаденилирования в нетранслируемой части мРНК, кодирующей лиганд mpl.The expressed vectors used in eukaryotic host cells (yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or nuclear cells from other multicellular organisms) will also contain the sequences necessary to stop transcription and to stabilize mRNA. Such sequences of 5 ’, sometimes 3’ untranslated regions of eukaryotes or viral DNA or RNA are widely available. These regions contain segments of nucleotides transcribed as polyadenylation fragments in the untranslated portion of the mpl lNA encoding the mpl ligand.

(vii) Конструкция и анализ векторов(vii) Design and analysis of vectors

Конструкция подходящих векторов, содержащих один или более вышеперечисленных компонентов, включает обычную технику лигации. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепили, получили хвосты и соединили в формы, желаемые для получения требуемых плазмид.The construction of suitable vectors containing one or more of the above components includes the usual ligation technique. The isolated plasmids or DNA fragments were digested, obtained tails and combined into the forms desired to obtain the desired plasmids.

Для анализа и подтверждения правильности последовательностей в сконструированных плазмидах, использовали лигационную смесь для трансформации Е.coli K12 штамма 294 (АТСС No.31446), а удачные трансформанты, где необходимо, отбирали на устойчивость к ампициллину или к тетрациклину. Плазмиды, полученные из трансформантов, анализировали путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой, и/или секвенировали по методу Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 [1981], или по методу Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 [1980].To analyze and confirm the correctness of the sequences in the constructed plasmids, a ligation mixture was used to transform E. coli K12 strain 294 (ATCC No.31446), and successful transformants, where necessary, were selected for resistance to ampicillin or to tetracycline. Plasmids obtained from transformants were analyzed by restriction endonuclease digestion, and / or sequenced by the method of Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 [1981], or by the method of Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 [1980].

(viii) Переходные векторы экспрессии(viii) Transitional expression vectors

Особенно полезными в практике настоящего изобретения являются векторы, которые предусмотрены для переходной экспрессии ДНК в клетках млекопитающих, кодирующей полипептид лиганда mpl. В целом, переходная экспрессия включает в использование экспрессионных векторов, которые способны эффективно реплицироваться в клетках хозяина, так чтобы клетки хозяина накопили множество копий экспрессированного вектора и, в свою очередь, синтезировали высокий уровень желаемого полипептида, кодируемого экспрессированным вектором. Sambrook et al., там же, стр.16.17-16.22. Переходные системы экспрессии, содержащие подходящий вектор экспрессии и клетку хозяина, допускают удобную положительную идентификацию полипептидов, кодируемых клонируемой ДНК, так же как и быстрый скрининг подобных полипептидов с желаемыми биологическими или физиологическими свойствами. Таким образом, системы переходной экспрессии являются особенно полезными в изобретении для целей идентификации аналогов и вариантов полипептида лиганда mpl, которые имеют биологическую активность полипептида лиганда mpl.Especially useful in the practice of the present invention are vectors that are provided for transient expression of DNA in mammalian cells encoding the mpl ligand polypeptide. In general, transient expression involves the use of expression vectors that are able to efficiently replicate in the host cells, so that the host cells accumulate many copies of the expressed vector and, in turn, synthesize a high level of the desired polypeptide encoded by the expressed vector. Sambrook et al., Ibid., Pp. 16.17-16.22. Transient expression systems containing a suitable expression vector and host cell allow convenient, positive identification of the polypeptides encoded by the cloned DNA, as well as the rapid screening of such polypeptides with desired biological or physiological properties. Thus, transition expression systems are particularly useful in the invention for the purpose of identifying analogues and variants of the mpl ligand polypeptide that have the biological activity of the mpl ligand polypeptide.

(ix) Примеры удобных векторов клеток позвоночных(ix) Examples of convenient vertebrate cell vectors

Другие способы, векторы и клетки хозяина, применимые для синтеза лиганда mpl в рекомбинантных культурах клеток, позвоночных описаны в Gething et al., Nature, 293: 620-625 [1981]; Mantel et al., Nature, 281: 40-46 [1979]; Levinson et al., ЕП 117060; ЕП 117058. Особенно полезная плазмида для экспрессии лиганда mpl в культуре клеток млекопитающих является pRK5 (ЕП 307247; Патент США No.5258287) или pSVI6B (Публикация РСТ No. WO 91/08291).Other methods, vectors, and host cells useful for synthesizing mpl ligand in recombinant vertebrate cell cultures are described in Gething et al., Nature, 293: 620-625 [1981]; Mantel et al., Nature, 281: 40-46 [1979]; Levinson et al., EP 117060; EP 117058. A particularly useful plasmid for expression of the mpl ligand in mammalian cell culture is pRK5 (EP 307247; US Pat. No. 5,258,287) or pSVI6B (PCT Publication No. WO 91/08291).

D. Отбор и трансформация клеток хозяинаD. Selection and transformation of host cells

Подходящими клетками хозяина для клонирования или экспрессии векторов в настоящей работе являются прокариоты, дрожжи или высшие эукариоты, описанные выше. Подходящие прокариоты включают эубактерии, такие как Грам-отрицательные или Грам-положительные, например, Е.coli, Bacilli, такие как В.subtilis, виды Pseudomonas, такие как Р. aeruginosa, Salmonella typhimurium, или Serrata marcescans. Одним предпочтительным клонирующим хозяином Е.coli является Е.coli 294 (АТСС No.31446), хотя применимы также другие штаммы, такие как Е.coli В, Е.coli X1776 (АТСС No.31537) и Е.coli W3110 (АТСС No.27325). Эти примеры скорее иллюстративны, чем ограничивающие. Предпочтительная клетка хозяин должна секретировать минимальное количество протеолитических ферментов. Альтернативно, применимы способы клонирования in vitro, например РПЦ или реакции других полимераз нуклеиновой кислоты.Suitable host cells for cloning or expression of vectors in this work are prokaryotes, yeasts, or higher eukaryotes described above. Suitable prokaryotes include eubacteria, such as Gram negative or Gram positive, for example, E. coli, Bacilli, such as B. subtilis, Pseudomonas species, such as P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, or Serrata marcescans. One preferred cloning host of E. coli is E. coli 294 (ATCC No.31446), although other strains such as E. coli B, E. coli X1776 (ATCC No.31537) and E. coli W3110 (ATCC No .27325). These examples are illustrative rather than limiting. A preferred host cell should secrete a minimal amount of proteolytic enzymes. Alternatively, in vitro cloning methods are applicable, for example, ROCs or reactions of other nucleic acid polymerases.

Помимо прокариот подходящими хозяевами для кодирующих лиганд mpl векторов являются прокариотические микробы, такие как нитевидные грибы или дрожжи. Наиболее широко используемыми среди низших эукариотических хозяев микроорганизмами являются Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи. Однако большое количество других родов, видов и штаммов широко доступно и применимо здесь, таких как Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; ЕП 139383, опубликованный 2 мая 1985 г.), в виде хозяев Kluyveromyces (Патент США No.4943529), такие как, например, К. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), К. fragilis, К. bulgaricus, К. termotolerans, и К. marxianus, yarrowia [ЕП 402226], Pichia pastoris (ЕП 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Micribiol., 28: 265-278 [1988], Candida, Nrichoderma reesia (ЕП 244234), и нитевидные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, опубликованный 10 января 1991 г.), и в виде хозяев, такие как A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tiburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) и A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]).In addition to prokaryotes, prokaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable hosts for ligand-encoding mpl vectors. The most widely used microorganisms among lower eukaryotic hosts are Saccharomyces cerevisiae, or common baker's yeast. However, a large number of other genera, species and strains are widely available and applicable here, such as Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139383, published May 2, 1985), in the form of hosts Kluyveromyces (Patent US No.4943529), such as, for example, K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. termotolerans, and K. marxianus, yarrowia [ EP 402226], Pichia pastoris (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Micribiol., 28: 265-278 [1988], Candida, Nrichoderma reesia (EP 244234), and filamentous fungi, such as, for example, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, published January 10, 1991), and as hosts, such as A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289 [1983]; Tiburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]).

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного лиганда mpl происходят от многоклеточных организмов. Такие клетки-хозяева способны к сложному процессингу и гликозилирующей активности. В принципе, любые культуры клеток высших эукариотов работоспособны, будь то культура позвоночных или беспозвоночных. Примеры клеток беспозвоночных включают растительные и клетки насекомых. Были определены многочисленные штаммы и варианты бакуловирусов и соответствующие клетки - хозяева пермессивных (допускающих) насекомых от таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (фруктовая мушка) и Bombix mori. См., например, Lukow et al., Bio/Technology, 6: 47-55 [1988]; Miller et al.. Genetic Engineering, Setlow et al., eds., Vol.8 (Plenum Publishing, 1986) pp.277-279; Maeda et al., Nature, 315: 592-594 [1985]. Свободно доступны разнообразные штаммы вирусов для трансфекции, например, L-1 вариант Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombix mori NPV, подобные вирусы могут быть использованы здесь в качестве вирусов в соответствии с настоящим изобретением, конкретно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.Suitable host cells for expression of the glycosylated mpl ligand are derived from multicellular organisms. Such host cells are capable of complex processing and glycosylating activity. In principle, any higher eukaryotic cell culture is functional, whether it be a vertebrate or invertebrate culture. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous strains and variants of baculoviruses and corresponding cells were identified - hosts of permissive (tolerant) insects from such hosts as Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruit fly) and Bombix mori. See, for example, Lukow et al., Bio / Technology, 6: 47-55 [1988]; Miller et al .. Genetic Engineering, Setlow et al., Eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986) pp. 277-279; Maeda et al., Nature, 315: 592-594 [1985]. Various strains of viruses for transfection are freely available, for example, the L-1 variant of Autographa californica NPV and the Bm-5 strain of Bombix mori NPV, similar viruses can be used here as viruses in accordance with the present invention, specifically for transfection of Spodoptera frugiperda cells.

Могут быть применены в качестве хозяев культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, соевых бобов, петунии, помидоров и табака. Обычно растительные клетки трансфецируют при инкубации с определенным штаммом бактерии Agrobacterium tumefaciens, который ранее обработали для содержания ДНК лиганда mpl. В течение инкубации культуры растительной клетки с A. tumefaciens, ДНК, кодирующая лиганд mpl, переносится в растительную хозяйскую клетку таким образом, что она становится трансфецированной и будет при определенных условиях экспрессировать ДНК лиганда mpl. Помимо этого доступны регуляторные и сигнальные последовательности, совместимые с растительными клетками, такие как промотер нопалин синтетазы и сигнальная последовательность полиаденилирования. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 [1982]. Кроме этого, сегменты ДНК, выделенные из области противоположного направления Т-ДНК гена 780, способна к активации или увеличению уровня транскрипции экспрессируемых в растениях генов в рекомбинантной ДНК-содержащей растительной ткани, ЕП 321196, опубликованный 21 июня 1989 г.They can be used as hosts for the plant cell culture of cotton, corn, potatoes, soybeans, petunias, tomatoes and tobacco. Typically, plant cells are transfected by incubation with a specific strain of the bacterium Agrobacterium tumefaciens, which was previously treated to contain the mpl ligand DNA. During incubation of the plant cell culture with A. tumefaciens, the DNA encoding the mpl ligand is transferred to the plant host cell so that it becomes transfected and will express mpl ligand DNA under certain conditions. In addition, regulatory and signal sequences compatible with plant cells are available, such as the promoter nopalin synthetase and the polyadenylation signal sequence. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 [1982]. In addition, DNA segments isolated from the opposite direction of the T-DNA of the 780 gene are capable of activating or increasing the level of transcription of the genes expressed in plants in recombinant DNA-containing plant tissue, EP 321196, published June 21, 1989.

Однако наибольший интерес к клеткам позвоночных, в последние годы размножение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) стало рутинным способом (Tissue Culture, Academic Press. Kruse and Patterson, editors [1973]). Примером полезной линии клетки хозяина млекопитающего являются линия CV 1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия эмбриональной почки человека (293 или клетки 293, субклонироанные для роста в суспензионой культуре, Gracham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]); клетки почки детеныша хомяка (ВНК, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]); клетки сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки зеленой африканской макаки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки цервикальной карциномы человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCR, ATCC CCL 34); клетки печени крыс buffalo (BRL ЗА, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Нер G2, НВ 8065); опухоли молочных желез мыши (ММТ 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al.. Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Нер G2).However, the greatest interest in vertebrate cells, in recent years, the multiplication of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine method (Tissue Culture, Academic Press. Kruse and Patterson, editors [1973]). An example of a useful mammalian host cell line is the monkey kidney CV 1 transformed SV40 line (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Gracham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]); hamster baby kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980]); mouse sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); monkey kidney cells (CVCC ATCC CCL 70); kidney cells of green African macaque (VERO-76, ATCC CRL-1587); human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); dog kidney cells (MDCR, ATCC CCL 34); rat buffalo liver cells (BRL ZA, ATCC CRL 1442); human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human liver cells (Hep G2, HB 8065); mouse mammary tumors (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells (Mather et al. Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); MRC 5 cells; FS4 cells; and the human hepatoma line (Hep G2).

Клетки хозяина трансфецировали и преимущественно трансформировали вышеописанными векторами экспрессии или клонирования по настоящему изобретению и культивировали в общепринятой питательной среде, модифицированной соответственно для индуцирования промотерами, отбора трансформантов, или амплифицирования генов, кодирующих желаемую последовательность.The host cells were transfected and predominantly transformed with the above expression or cloning vectors of the present invention and cultured in a conventional nutrient medium, modified accordingly to induce promoters, select transformants, or amplify genes encoding the desired sequence.

Трансфекция обозначает захват вектора экспрессии клеткой хозяином независимо от того, кодирует он или нет в действительности любую экспрессируемую последовательность. Обычному квалифицированному работнику известны многочисленные способы трансфекции, например способ с СаРO4 или электропорация. Успешная трансфекция распознается, когда наблюдается любой показатель операции того, что данный вектор находится внутри клетки.Transfection means the capture of an expression vector by a host cell, whether or not it actually encodes any expressed sequence. Numerous transfection methods are known to the ordinary skilled worker, for example, a CaPO 4 method or electroporation. Successful transfection is recognized when any indicator of the operation that a given vector is inside the cell is observed.

Трансформация означает введение ДНК в организм таким образом, что ДНК способна к репликации либо как внехромосомный элемент, либо встроенная в хромосому. В зависимости от используемых клеток хозяина проведенная трансформация использует обычные способы, подходящие для таких клеток. Обработка кальцием включает использование хлорида кальция, как описано в разделе 1.82 Sambrook et al., там же, главным образом, используя прокариотов, или другие клетки, которые содержат существенный барьер из клеточной стенки. Инфекцию Agrobacterium tumefaciens использовали для трансформации определенных клеток растений, как описано Shaw et al. Gene, 23: 315 [1983] и WO 89/05859, опубликованном 29 июня 1989 г. Помимо этого растения можно трансфецировать, используя ультразвуковую обработку, как описано в WO 91/00358, опубликованном 10 января 1991 г. Для клеток млекопитающих, не имеющих такой клеточной стенки, предпочтителен способ осаждения фосфатом кальция по Graham anad van der Eb, Virology, 52: 456-457 [1978]. Общие аспекты систем трансформации клеток хозяев млекопитающих описаны Axel в Патенте США No.4399216, изданном 16 августа 1983 г. Трансформации дрожжей обычно проводятся в соответствии со способом Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 [1977] и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829 [1979]. Однако могут быть использованы другие способы для введения ДНК в клетки, такие как инъекция ядер, электропорация или сплавление протопластов.Transformation means the introduction of DNA into the body in such a way that DNA is capable of replication either as an extrachromosomal element or integrated into the chromosome. Depending on the host cells used, the transformation performed using conventional methods suitable for such cells. Calcium treatment involves the use of calcium chloride, as described in section 1.82 of Sambrook et al., In the same place, mainly using prokaryotes, or other cells that contain a substantial barrier from the cell wall. Agrobacterium tumefaciens infection was used to transform certain plant cells, as described by Shaw et al. Gene, 23: 315 [1983] and WO 89/05859 published June 29, 1989. In addition, plants can be transfected using ultrasound treatment as described in WO 91/00358 published January 10, 1991. For mammalian cells not having of such a cell wall, a calcium phosphate precipitation method is preferred according to Graham anad van der Eb, Virology, 52: 456-457 [1978]. General aspects of mammalian host cell transformation systems are described by Axel in US Pat. No. 4,399,216 published August 16, 1983. Yeast transformations are typically carried out according to the method of Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 [1977] and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3829 [1979]. However, other methods can be used to introduce DNA into cells, such as nuclear injection, electroporation, or protoplast fusion.

Е. Культивирование клеток хозяевE. Cultivation of host cells

Прокариотические клетки, использованные для получения полипептида лиганда mpl по настоящему изобретению, культивировали в подходящей среде, как описано в общем у Sambrook et al., там же.Prokaryotic cells used to prepare the mpl ligand polypeptide of the present invention were cultured in a suitable medium as described generally by Sambrook et al., Ibid.

Клетки хозяева млекопитающих, использованные для получения лиганда mpl по настоящему изобретению, можно культивировать в различных средах. Коммерчески доступные среды, такие как Ham’s F10 (Sigma), минимальная достаточная среда ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная Дульбекко среда Игла ([DMEM], Sigma) применимы для культивирования клеток хозяина. Кроме этого, могут быть использованы в качестве культуральной среды для клеток хозяина любые из сред, описанных Ham and Walles, Meth. Enz., 58: 44 [1979], Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 [1980], патенты США No.4767704; 4657866; 4927762; или 4560655; WO 90/03430; WO 87/00195; патент США Re. 30985; или совместно ожидаемые U.S.S.N. 07/592 107 или 07/592 141, оба заполненные 3 октября 1990 г., все описания которых включены здесь в виде ссылок. Любые из этих сред могут быть дополнены, если необходимо, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или фактор роста эпидермиса), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфаты), буферами (такими как HEPES), нуклеозидами (такими как аденозин или тимидин), антибиотиками (такими как препарат Gentamycin™), следовыми элементами (определенными как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микрограммовой области) и глюкоза или эквивалентный источник энергии. Любые другие необходимые добавки также могут быть включены в подходящих концентрациях, которые должны быть известны опытным работникам. Культуральные условия, такие как температура, рН и подобные, и те, ранее примененные для отбора клеток хозяина для экспрессии, будут очевидны обычному квалифицированному работнику.The mammalian host cells used to obtain the mpl ligand of the present invention can be cultured in various environments. Commercially available media such as Ham’s F10 (Sigma), Minimum Sufficient Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) and Dulbecco's Modified Eagle Medium ([DMEM], Sigma) are useful for culturing host cells. In addition, any of the media described by Ham and Walles, Meth can be used as a culture medium for host cells. Enz., 58: 44 [1979], Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 [1980], US Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; or 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; US patent Re. 30,985; or jointly expected U.S.S.N. 07/592 107 or 07/592 141, both completed on October 3, 1990, all of which are incorporated herein by reference. Any of these media can be supplemented, if necessary, with hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (such as sodium, calcium, magnesium chloride and phosphates), buffers (such as HEPES) , nucleosides (such as adenosine or thymidine), antibiotics (such as the Gentamycin ™ preparation), trace elements (defined as inorganic compounds usually present at final concentrations in the microgram area), and glucose or an equivalent energy source. Any other necessary additives may also be included in suitable concentrations, which should be known to experienced workers. Cultural conditions, such as temperature, pH, and the like, and those previously used to select host cells for expression, will be apparent to the ordinary skilled worker.

Клетки хозяина, отнесенные к настоящему изобретению, включают в себя клетки в культуре in vitro, так же как и клетки животного хозяина.The host cells referred to in the present invention include cells in an in vitro culture, as well as cells of an animal host.

F. Определение амплифицированного/экспрессированного генаF. Determination of the amplified / expressed gene

Амплификация и/или экспрессия гена может быть измерена подсчитыванием транскрипции мРНК непосредственно в образце, например, общепринятым Southern блоттингом, northern блоттингом (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), дот блоттингом (анализ ДНК), или гибридизацией in situ, используя походящие меченые зонды, основанные на описанных здесь последовательностях. Могут быть использованы различные метки, наиболее распространенные радиоизотопы, а именно 32Р. Однако может быть применена другая техника, такая как использование модифицированных биотином нуклеотидов для введения в полинуклеотид. Биотин далее служит в качестве участка связывания авидина или антитела, которое может быть мечено широким разнообразием меток, таких как радионуклиды, флуоресцентные метки, ферменты или подобные им. Альтернативно, могут быть применены антитела, которые распознают специфические дуплексы, включая дуплексы ДНК, дуплексы РНК и гибридные дуплексы ДНК-РНК, или дуплексы ДНК-белок. Эти антитела, в свою очередь, могут быть мечены, и определение может быть проведено там, где дуплекс связался с поверхностью так, что при образовании дуплекса на поверхности, можно определить наличие антитела, связанного в дуплексе.Amplification and / or gene expression can be measured by counting mRNA transcription directly in the sample, for example, conventional Southern blotting, northern blotting (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]), dot blotting ( DNA analysis), or in situ hybridization using suitable labeled probes based on the sequences described herein. Various labels can be used, the most common radioisotopes, namely 32 R. However, other techniques can be used, such as using modified biotin nucleotides for insertion into a polynucleotide. Biotin further serves as an avidin or antibody binding site that can be labeled with a wide variety of labels, such as radionuclides, fluorescent labels, enzymes, or the like. Alternatively, antibodies can be used that recognize specific duplexes, including DNA duplexes, RNA duplexes, and DNA-RNA fusion duplexes, or DNA-protein duplexes. These antibodies, in turn, can be labeled, and a determination can be made where the duplex has bound to the surface so that when a duplex is formed on the surface, the presence of an antibody bound in the duplex can be determined.

Альтернативно, для непосредственного подсчета экспрессии продукта гена экспрессия гена может быть измерена при помощи иммунологических способов, таких как иммуногистохимическое окрашивание кусочков ткани и исследование клеточной культуры или жидкостей тела. При технике иммуногистохимического окрашивания образцы клеток приготавливают, обычно применяя дегидратацию и фиксацию, с последующим реагированием с меченым антителом, специфическим для привязанного продукта гена, где метки обычно визуально обнаруживаемы, такие как ферментативные метки, флуоресцентные метки, люминисцентные метки, и тому подобные. Особенно чувствительная техника окрашивания, пригодная для использования в настоящем изобретении, описана Hsu et al. Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 [1980].Alternatively, to directly calculate the expression of a gene product, gene expression can be measured using immunological methods such as immunohistochemical staining of tissue pieces and examination of cell culture or body fluids. In the immunohistochemical staining technique, cell samples are prepared, usually using dehydration and fixation, followed by reaction with a labeled antibody specific for the bound gene product, where the labels are usually visually detectable, such as enzymatic labels, fluorescent labels, luminescent labels, and the like. A particularly sensitive staining technique suitable for use in the present invention is described by Hsu et al. Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 [1980].

Антитела, применимые для иммуногистохимического окрашивания и/или исследования образцов жидкостей, могут быть как моноклональными, так и поликлональными, и могут быть получены у любого млекопитающего. Удобно, когда антитела можно получить против естественного полипептида лиганда mpl или против синтетического пептида на основе последовательности ДНК, полученной здесь, как описано далее ниже.Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or testing of fluid samples can be either monoclonal or polyclonal, and can be obtained from any mammal. Conveniently, antibodies can be obtained against the natural mpl ligand polypeptide or against a synthetic peptide based on the DNA sequence obtained here, as described below.

G. Очистка полипептида лиганда mplG. Purification of the mpl ligand polypeptide

Лиганд mpl предпочтительно выделяют из культуральной среды как секреторный полипептид, хотя он также может быть выделен из лизата хозяйских клеток, если непосредственная экспрессия не сопровождается секреторным сигналом.The mpl ligand is preferably isolated from the culture medium as a secretory polypeptide, although it can also be isolated from the lysate of the host cells if direct expression is not accompanied by a secretory signal.

Когда лиганд mpl экспрессировали в другой рекомбинантной клетке, отличающейся по происхождению от клетки человека, лиганд mpl полностью свободен от белков или полипептидов человеческой природы. Однако по-прежнему необходимо очищать лиганд mpl от других рекомбинантных белков или полипептидов клетки для получения препарата, который существенно гомогенный, как сам по себе лиганд mpl. На первом этапе культуральную среду или лизат центрифугировали для удаления частичек остатков клетки. Затем разделяли мембранную фракцию и растворимые белки. Альтернативно, может быть применен коммерчески доступный фильтр для концентрирования белков (например, фильтровальная ячейка Amicon или Millipore Pellicone). Лиганд mpl затем может быть очищен из фракции растворимых белков и из мембранной фракции лизата культуры в зависимости, является ли лиганд mpl мембранно-связанным. Согласно этому лиганд mpl очищали от сопутствующих растворимых белков и полипептидов путем высаливания и обмена или хроматографическими способами, используя различные гелевые матриксы. Эти матриксы включают: акриламид, агарозу, декстран, целлюлозу и другие, принятые для очистки белков. Примерные хроматографические процедуры, применимые для очистки белков, включают: иммуноаффиные (например, анти-hmpl лиганд Mab), рецептероаффинные (например, mpl-IgG или протеин А Сефароза), хроматография по гидрофобному взаимодействию (ГХ), (например, эфир, бутил, или фенил Toyopearl), хроматография на лектине (например, Кон А-Сефароза, лентил-лектин-Сефароза), разделение по размеру (например, Сефадекс Г-75), катион- и анионообменная колонка (например, ДЕАЕ или карбоксиметил- и сульфопропил-целлюлоза), и жидкостная хроматография с высоким разрешением с обращенной фазой (ОФ-ЖХВР) (см., например, Urdal et al., J. Chromatog., 296:171 [1984], где использовали два последовательных этапа ОФ-ЖХВР для очистки рекомбинантного ИЛ-2 человека). Другие этапы очистки, необязательно, включают: осаждение этанолом, осаждение сульфатом аммония, хроматофокусирование, препаративный SDS-PAGE и подобные.When the mpl ligand was expressed in another recombinant cell, which is different from the human cell, the mpl ligand is completely free of human proteins or polypeptides. However, it is still necessary to purify the mpl ligand from other recombinant proteins or cell polypeptides to obtain a preparation that is substantially homogeneous as the mpl ligand itself. In the first step, the culture medium or lysate was centrifuged to remove particles of cell debris. Then, the membrane fraction and soluble proteins were separated. Alternatively, a commercially available filter for concentration of proteins (e.g., Amicon or Millipore Pellicone filter cell) may be used. The mpl ligand can then be purified from the soluble protein fraction and from the membrane fraction of the culture lysate, depending on whether the mpl ligand is membrane-bound. Accordingly, the mpl ligand was purified from concomitant soluble proteins and polypeptides by salting out and exchange or by chromatographic methods using various gel matrices. These matrices include: acrylamide, agarose, dextran, cellulose and others accepted for protein purification. Exemplary chromatographic procedures applicable for protein purification include: immunoaffinity (e.g., anti-hmpl Mab ligand), receptor-affinity (e.g. mpl-IgG or Sepharose protein A), hydrophobic interaction chromatography (GC), (e.g. ether, butyl, or Toyopearl phenyl), lectin chromatography (e.g. Con A-Sepharose, lentyl-lectin-Sepharose), size separation (e.g. Sephadex G-75), cation and anion exchange columns (e.g. DEAE or carboxymethyl and sulfopropyl cellulose) and high-performance liquid chromatography with sample gap of phase (RP-HPLC) (see e.g., Urdal et al, J. Chromatog, 296:... 171 [1984] where two sequential phases used in the RP-HPLC for purification of recombinant human IL-2). Other purification steps optionally include: ethanol precipitation, ammonium sulfate precipitation, chromatofocusing, preparative SDS-PAGE and the like.

Варианты лиганда mpl, у которых остатки удалены, вставлены или заменены, получали тем же самым образом, как и естественный лиганд mpl, принимая во внимание любые существенные изменения в свойствах, случающиеся у вариантов. Например, приготовление лиганда mpl, сплавленного с другим белком или полипептидом, например бактериальным или вирусным антигеном, облегчает очистку; может быть использована иммуноаффинная колонка, содержащая антитело к антигену для адсорбции сплавленного полипептида. Иммуноаффинная колонка, такая как колонка с поликлональным анти-mpl лигандом кролика, может быть применена для адсорбции варианта лиганда mpl, путем связывания его к, по крайней мере, одному иммунному эпитопу. Альтернативно, лиганд mpl может быть очищен путем аффинной хроматографии, используя очищенный mpl-IgG, привязанный к (предпочтительно) иммобилизованной смоле, такой как Аффи-гель 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) или подобной, способом, хорошо известным в технике. Для ингибирования протеолитического расщепления в процессе очистки может быть использован ингибитор протеаз, такой как фенилметилсульфонилфторид (PMSF), а антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных загрязнений. Опытный в технике работник поймет, что способы очистки, применимые для естественного лиганда mpl или его вариантов могут потребовать модификации для оценки характера изменений лиганда mpl или его вариантов при экспрессии в рекомбинантной культуре клеток.Variants of the mpl ligand in which residues have been removed, inserted or replaced were obtained in the same manner as the natural mpl ligand, taking into account any significant changes in properties that occur in the variants. For example, the preparation of the mpl ligand fused to another protein or polypeptide, for example a bacterial or viral antigen, facilitates purification; an immunoaffinity column containing an antibody to an antigen can be used to adsorb the fused polypeptide. An immunoaffinity column, such as a column with a polyclonal rabbit anti-mpl ligand, can be used to adsorb a variant of the mpl ligand by binding it to at least one immune epitope. Alternatively, the mpl ligand can be purified by affinity chromatography using purified mpl-IgG bound to a (preferably) immobilized resin, such as Affi-gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) or the like, by a method well known in the art. A protease inhibitor such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) can be used to inhibit proteolytic cleavage during purification, and antibiotics can be included to prevent the growth of accidental contaminants. A person skilled in the art will understand that the purification methods applicable to the natural mpl ligand or variants thereof may require modification to assess the pattern of changes in the mpl ligand or its variants when expressed in recombinant cell culture.

Н. Ковалентные модификации полипептида лиганда mplH. Covalent modifications of the mpl ligand polypeptide

Ковалентные модификации полипептида лиганда mpl включены в рамки настоящего изобретения. И естественный лиганд mpl, и последовательности аминокислотных вариантов лиганда mpl можно ковалентно модифицировать. Один тип ковалентной модификации, включенный в рамки настоящего изобретения, представляет собой фрагмент лиганда mpl. Фрагменты варианта лиганда mpl, имеющие до около 40 аминокислотных остатков, могут быть ковалентно получены путем химического синтеза или путем ферментативного или химического расщепления полипептида лиганда mpl полной длины. Другой тип ковалентных модификаций лиганда mpl или его фрагментов представляет введение в молекулу путем реагирования с целевыми аминокислотными остатками лиганда mpl или его фрагментами, органического агента, образующего производное, которое способно реагировать с выбранной боковой цепью или с N- или С-концевыми остатками.Covalent modifications of the mpl ligand polypeptide are included within the scope of the present invention. Both the natural mpl ligand and the sequence of amino acid variants of the mpl ligand can be covalently modified. One type of covalent modification, included in the scope of the present invention, is a fragment of the mpl ligand. Fragments of an mpl ligand variant having up to about 40 amino acid residues can be covalently prepared by chemical synthesis or by enzymatic or chemical digestion of a full length mpl ligand polypeptide. Another type of covalent modification of the mpl ligand or its fragments is the introduction into the molecule by reacting with the target amino acid residues of the mpl ligand or its fragments an organic derivative forming agent that is capable of reacting with the selected side chain or with the N- or C-terminal residues.

Остатки цистеина чаще всего реагируют с α-галоацетатами (и соответствущими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Остатки цистеина также модифицируют в реакции с бромтрифторацетоном, α-бромо-β-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, р-хлормеркурибензоатом, 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлоро-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.Cysteine residues most often react with α-haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to produce carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. Cysteine residues are also modified by reaction with bromotrifluoroacetone, α-bromo-β- (5-imidazoyl) propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkyl maleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl-2-pyridyl disulphide, p-chloromeric-2-mercuromeriz -4-nitrophenol or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.

Остатки гистидина модифицируют в реакции с диэтилпирокарбонатом при рН 5,5-7,0, поскольку этот агент относительно специфичен для боковой цепи гистидина. Применимым является также парабромфенацилбромид; реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при рН 6,0.Histidine residues are modified by reaction with diethyl pyrocarbonate at pH 5.5-7.0, since this agent is relatively specific for the histidine side chain. Parabromfenacyl bromide is also applicable; the reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodilate at pH 6.0.

Лизинил и аминоконцевые остатки реагируют с янтарным или другими ангидридами карбоновой кислоты. Получение производных с этими агентами оказывает действие по изменению заряда остатков лизина. Другие подходящие агенты для получения производных аминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлороборогидрат; тринитробензенсульфоновая кислота; O-метилизомочевина; 2,4-пентандион и катализируемые трансаминазой реакции с глиоксилатом.Lysinyl and amino-terminal residues react with succinic or other carboxylic acid anhydrides. Derivatives with these agents have an effect on the change in the charge of lysine residues. Other suitable agents for preparing derivatives of amino-containing residues include imido esters, such as methyl picolinimidate; pyridoxalphosphate; pyridoxal; chloroborohydrate; trinitrobenzene sulfonic acid; O-methylisourea; 2,4-pentanedione and transaminase-catalyzed reactions with glyoxylate.

Остатки аргинина модифицируют в реакции с одним или несколькими общепринятыми реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Получение производных остатков аргинина требует, чтобы реакцию проводили в щелочных условиях из-за высокого значения pKa гуанидиновой функциональной группы. Более того, эти реагенты могут реагировать с группами лизина, так же, как и с ипсилон-аминогруппами аргинина.Residues of arginine are modified by reaction with one or more common reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. The preparation of derivatives of arginine residues requires that the reaction be carried out under alkaline conditions due to the high pK a of the guanidine functional group. Moreover, these reagents can react with lysine groups, as well as with the ipsilon amino groups of arginine.

Можно получить особенно интересные специфические модификации остатков тирозина с введенными спектральными метками в остатки тирозина в реакции с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. Наиболее широко для образования видов O-ацетилтирозина и 3-нитро производных используются N-ацетилимидазол и тетранитрометан соответственно. Для получения меченых белков при использовании в радиоиммуноопределении иодируют остатки тирозина, используя 125I или 131I, для чего подходит вышеописаный способ с хлорамином Т.Particularly interesting specific modifications of tyrosine residues with spectral labels introduced into tyrosine residues in reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane can be obtained. The most widely used species for the formation of O-acetyl tyrosine and 3-nitro derivatives are N-acetylimidazole and tetranitromethane, respectively. To obtain labeled proteins when used in radioimmunoassay, tyrosine residues are iodinated using 125 I or 131 I, for which the above method with chloramine T is suitable.

Карбоксильные боковые группы (аспартил или глютамил) селективно модифицируют в реакции с карбодиимидом (R-N=C=N-R’), где R и R’ представляют различные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азония-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Более того, остатки аспартила и глютамила превращают в аспарагинильные или глютаминильные остатки в реакции с ионом аммония.Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by reaction with carbodiimide (RN = C = N-R '), where R and R' are various alkyl groups such as 1-cyclohexyl-3- (morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide or 1-ethyl-3- (4-azonium-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide. Moreover, aspartyl and glutamyl residues are converted to aspartic or glutaminyl residues in reaction with an ammonium ion.

Производные с бифункциональными агентами применимы для перекрестного сшивания лиганда mpl с нерастворимым в воде матриксом подложки или поверхности для использования в способах очистки антител анти-mpl лиганда и наоборот. Обычно используемые перекрестносшивающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глютаровый альдегид, эфиры N-гидроксисукцинимида, например эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая эфиры дисукцинимидила, такие как 3,3’-дитиобис(сукцинимидилпропионат) и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан. Агенты для получения производных, такие как метил-3-[(р-азидофенил)дитио]пропиоимидат дают фотоактивируемые интермедиаты, которые способны к образованию перекрестных связей в присутствии света. Альтернативно, активированные нерастворимые в воде матриксы, такие как активированные цианогенбромидом углеводы и активированные субстраты, описанные в Патентах США No.3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, применяются для иммобилизации белков.Derivatives with bifunctional agents are useful for crosslinking an mpl ligand with a water-insoluble matrix of a substrate or surface for use in anti-mpl ligand antibody purification methods and vice versa. Commonly used cross-linking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example 4-azidosalicylic acid esters, homobifunctional imido esters, including disuccinimidyl esters, such as 3.3 ' dithiobis (succinimidyl propionate) and bifunctional maleimides, such as bis-N-maleimido-1,8-octane. Derivative agents such as methyl 3 - [(p-azidophenyl) dithio] propioimidate produce photoactivated intermediates that are capable of crosslinking in the presence of light. Alternatively, activated water-insoluble matrices, such as cyanogen bromide activated carbohydrates and activated substrates, are described in US Pat. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4229537 and 4330440, are used to immobilize proteins.

Глютаминильные и аспарагинильные остатки часто дезамидируют до соответствующего глютамильного и аспартильного остатков соответственно. Эти остатки дезаминируются в нейтральных или щелочных условиях. Дезаминированные формы этих остатков попадают в рамки настоящего изобретения.Glutaminyl and aspartic residues are often deamidated to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively. These residues are deaminated under neutral or alkaline conditions. The deaminated forms of these residues fall within the scope of the present invention.

Другие модификации, включая гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серина или треонина, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Т.Е.Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 [1983]), ацетилирование N-концевого амина и амидирование любых концевых карбоксильных групп.Other modifications, including hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl groups of serine or threonine residues, methylation of the α-amino groups of the side chains of lysine, arginine and histidine (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco , pp. 79-86 [1983]), acetylation of the N-terminal amine and amidation of any terminal carboxyl groups.

Другой тип ковалентной модификации полипептида лиганда mpl, включенного в рамки настоящего изобретения, состоит в изменении естественной картины гликозилирования полипептида. Под изменением имеется в виду удаление одного или более углеводных радикалов, обнаруженных у естественного лиганда mpl, и/или добавление одного или более участков гликозилирования, которые не присутствуют в естественном лиганде mpl.Another type of covalent modification of the mpl ligand polypeptide included in the scope of the present invention is to alter the natural glycosylation pattern of the polypeptide. By change is meant the removal of one or more carbohydrate radicals found in the natural mpl ligand and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the natural mpl ligand.

Гликозилирование пептидов обычно является N- или С-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводного радикала к боковой цепи остатка аргинина. Последовательности трипептидов аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х представляет любую аминокислоту кроме пролина, являются участками узнавания для ферментативного присоединения углеводного радикала к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие и того и другого из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальные участки гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, наиболее обычно к серину или треонину, хотя может использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.Glycosylation of peptides is usually N- or C-linked. N-linked refers to the attachment of a carbohydrate radical to the side chain of an arginine residue. The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X represents any amino acid except proline, are recognition sites for the enzymatic attachment of a carbohydrate radical to the asparagine side chain. Thus, the presence of both of these tripeptide sequences in the polypeptide creates potential glycosylation sites. O-linked glycosylation refers to the addition of one of the sugars N-acetylgalactosamine, galactose or xylose to a hydroxy amino acid, most commonly to serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine can be used.

Добавление участков гликозилирования к полипептиду лиганда mpl удобно достигается путем изменения аминокислотной последовательности так, что она содержит один или более остатков серина в вышеописанной трипептидной последовательности (для N-связанных участков гликозилирования). Изменения можно также сделать путем добавления или замещения на, одного или более остатков серина или треонина к естественной последовательности лиганда mpl (для O-связанных участков гликозилирования). Для облегчения последовательность аминокислот лиганда mpl предпочтительно изменяют путем изменения на уровне ДНК, в частности, путем мутации ДНК, кодирующей полипептид лиганда mpl по предварительно выбранным основаниям, так, чтобы те, полученные кодоны, будут транслировать желаемые аминокислоты. Мутацию(и) ДНК можно получить, используя способы, описанные выше под заголовком "Аминокислотная последовательность вариантов лиганда mpl."Adding glycosylation sites to the mpl ligand polypeptide is conveniently achieved by changing the amino acid sequence so that it contains one or more serine residues in the above tripeptide sequence (for N-linked glycosylation sites). Changes can also be made by adding or substituting, one or more residues of serine or threonine to the natural sequence of the mpl ligand (for O-linked glycosylation sites). To facilitate, the amino acid sequence of the mpl ligand is preferably changed by changing at the DNA level, in particular by mutating the DNA encoding the mpl ligand polypeptide at preselected bases so that those codons obtained will translate the desired amino acids. DNA mutation (s) can be obtained using the methods described above under the heading "Amino acid sequence of variants of the mpl ligand."

Другие способы увеличения количества углеводных радикалов в лиганде mpl представляют собой химическое или ферментативное пришивание гликозидов к полипептиду. Эти способы имеют преимущество в том отношении, что они не требуют получения полипептида в клетке хозяине, который имеет возможности для N- и O-связанного гликозилирования. В зависимости от использованного способа пришивания сахар(а) могут быть присоединены к (а) аргинину и гистидину, (б) свободной карбоксильной группе, (в) свободным сульфгидрильным группам, таким как у цистеина, (г) свободным гидроксильным группам, таким как у серина, треонина или гидроксипролина, (д) ароматическому остатку, такому как у фенилаланина, тирозина или триптофана, или (е) аминогруппе глютамина. Эти способы описаны в WO 87/05330, опубликованному 11 сентября 1987 г., и у Alpin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306 [1981].Other methods for increasing the amount of carbohydrate radicals in the mpl ligand are chemical or enzymatic suturing of glycosides to the polypeptide. These methods are advantageous in that they do not require the production of a polypeptide in a host cell that has the potential for N- and O-linked glycosylation. Depending on the sewing method used, sugar (a) can be attached to (a) arginine and histidine, (b) a free carboxyl group, (c) free sulfhydryl groups, such as cysteine, (d) free hydroxyl groups, such as serine, threonine or hydroxyproline, (e) an aromatic residue, such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan, or (e) the glutamine amino group. These methods are described in WO 87/05330, published September 11, 1987, and Alpin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 [1981].

Удаление углеводного радикала, присутствующего у полипептида лиганда mpl, может быть выполнено химически или ферментативно. Химическое дегликозилирование требует выдерживания полипептида с соединением трифторметансульфоновой кислоты или равноценного соединения. Эта обработка приводит к расщеплению большинства или всех сахаров за исключением сочлененного сахара (N-ацетилглюкозамина или O-ацетилгалактозамина), оставляя полипептид неизмененым. Химическое дегликозилирование описано Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 [1987] и Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 [1981]. Ферментативного расщепления углеводных остатков полипептида можно достигнуть при использовании различных эндо- и экзогликозидаз, как описано Nhotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 [1987].Removal of the carbohydrate radical present in the mpl ligand polypeptide can be carried out chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation requires maintaining the polypeptide with a trifluoromethanesulfonic acid compound or an equivalent compound. This treatment breaks down most or all of the sugars except articulated sugar (N-acetylglucosamine or O-acetylgalactosamine), leaving the polypeptide unchanged. Chemical deglycosylation is described by Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 [1987] and Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 [1981]. Enzymatic cleavage of the carbohydrate residues of the polypeptide can be achieved using various endo- and exoglycosidases, as described by Nhotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 [1987].

Гликозилирование по потенциальным участкам гликозилирования можно предотвратить при использовании соединения туникамицин, как описано Duskin et al., J. Biol. Chem., 257: 3105 [1982]. Туникамицмн блокирует образование белок-N-гликозидной связи.Glycosylation at potential glycosylation sites can be prevented by using the tunicamycin compound as described by Duskin et al., J. Biol. Chem., 257: 3105 [1982]. Tunicamism blocks the formation of a protein-N-glycosidic bond.

Другой тип ковалентной модификации лиганда mpl включает пришивание полипептида лиганда mpl к одному из разнообразных небелковых полимеров, например полиэтиленгликолю, полипропиленгликолю или полиоксаалкиленам, по способам, описанным в Патентах США No.4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Полипептиды лиганда mpl, ковалентно пришитые к вышеупомянутым полимерам, обозначены здесь как пегилированные (от PEG=ПЕГ - полиэтиленгликоль, пришитые к ПЕГ, прим. переводчика) полипептиды лиганда mpl.Another type of covalent modification of the mpl ligand includes suturing the mpl ligand polypeptide to one of a variety of non-protein polymers, for example polyethylene glycol, polypropylene glycol or polyoxaalkylene, according to the methods described in US Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337. The mpl ligand polypeptides covalently attached to the aforementioned polymers are designated here as pegylated (from PEG = PEG - polyethylene glycol sewn to PEG, translator) mpl ligand polypeptides.

Будет понятно, что будет необходим определенный скрининг полученных вариантов лиганда mpl для отбора оптимального варианта для связывания с mpl, имеющего иммунологическую и/или биологическую активность, определенную выше. Можно просеять по стабильности в рекомбинантной культуре клеток или в плазме (например, по отношению к протеолитическому расщеплению), высокому сродству к членам mpl, устойчивости к окислению, по способности секретироваться в повышенном количестве, и тому подобное. Например, изменения в иммунологическом характере полипептида лиганда mpl, такое как сродство к данному антителу, определяется по иммуноопределению конкурентного типа. Другие потенциальные модификации свойств белка или полипептида, такие как окислительно/восстановительная или температурная стабильность, гидрофобность, или восприимчивость к протеолитической деградации, определяются по способам, хорошо известными из техники.It will be appreciated that certain screening of the resulting mpl ligand variants will be necessary to select the optimal variant for binding to mpl having immunological and / or biological activity as defined above. It can be sieved for stability in a recombinant cell culture or in plasma (for example, with respect to proteolytic cleavage), high affinity for mpl members, oxidation resistance, increased secretion ability, and the like. For example, changes in the immunological nature of the mpl ligand polypeptide, such as affinity for a given antibody, are determined by immunoassay of a competitive type. Other potential modifications to the properties of the protein or polypeptide, such as oxidation / reduction or temperature stability, hydrophobicity, or susceptibility to proteolytic degradation, are determined by methods well known in the art.

17. Общие способы приготовления антител к лиганду mpl17. General methods for preparing antibodies to the mpl ligand

Приготовление антителAntibody Preparation

(i) Поликлональные антитела(i) Polyclonal antibodies

Поликлональные антитела к полипептидам лиганда mpl или фрагментам обычно вырабатываются у животных путем многократных подкожных (п/к) или внутрибрюшинных (в/б) инъекций лиганда mpl и адъюванта. Может быть приемлемо присоединение лиганда mpl или фрагмента, содержащего целевую аминокислотную последовательность, к белку, который иммуногенен у вида, которого иммунизируют, например keyhole limpet гемоцианин, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор трипсина из соевых бобов, используя бифункциональный или модифицирующий агент, например малеимидобензоилсульфосукцинимидный эфир (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимид (через остаток лизина), глютаровый альдегид, ангидрид янтарной кислоты, SOCl12, или R1N=C=NR, где R и R1 являются алкильными группами.Polyclonal antibodies to mpl ligand polypeptides or fragments are usually produced in animals by repeated subcutaneous (s / c) or intraperitoneal (ip) injections of the mpl ligand and adjuvant. It may be acceptable to attach the mpl ligand or a fragment containing the target amino acid sequence to a protein that is immunogenic in the species being immunized, for example keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, soybean thyroglobulin or a soybean trypsin inhibitor using a bifunctional or modifying agent, for example, maleimidesimidobenzo ester (conjugation through cysteine residues), N-hydroxysuccinimide (through lysine residue), glutaraldehyde, succinic anhydride, SOCl 12, or R 1 N = C = NR, rD R and R 1 are alkyl groups.

Животных иммунизируют против полипептида лиганда mpl или фрагментов иммуногенными конъюгатами или производными путем сочетания 1 мг или 1 мкг пептида или конъюгата (для кроликов или мышей соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Freund’а и внутрикожными инъекциями раствора во многих местах. Через месяц животное реиммунизируют 1/5 или 1/10 исходного количества пептида или конъюгата с полным адъювантом Freund’a путем подкожной инъекции во многих местах. Спустя 7 или 14 дней у животного берут кровь и исследуют сыворотку на титр антител к лиганду mpl. Животных реиммунизируют, пока титр не выйдет на плато. Предпочтительно, животное реиммунизируют конъюгатом того же лиганда mpl, но конъюгированного к различным белкам и/или при помощи различных перекрестно-сшивающих реагентов. Конъюгаты также могут быть получены в рекомбинантной культуре клеток в виде сплавленных белков. Агрегирующие агенты, такие как alum, также используют для усиления иммунного ответа.Animals are immunized against the mpl ligand polypeptide or fragments with immunogenic conjugates or derivatives by combining 1 mg or 1 μg of the peptide or conjugate (for rabbits or mice, respectively) with 3 volumes of complete Freund’s adjuvant and intradermal injection of the solution in many places. After a month, the animal is re-immunized with 1/5 or 1/10 of the original amount of the peptide or conjugate with complete Freund’a adjuvant by subcutaneous injection in many places. After 7 or 14 days, blood is drawn from the animal and the serum is examined for mpl ligand antibody titer. Animals are re-immunized until the titer reaches a plateau. Preferably, the animal is immunized with a conjugate of the same mpl ligand, but conjugated to different proteins and / or using different cross-linking reagents. Conjugates can also be obtained in recombinant cell culture as fused proteins. Aggregating agents, such as alum, are also used to enhance the immune response.

(ii) Моноклональные антитела(ii) Monoclonal antibodies

Моноклональные антитела получают из популяции существенно гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природно наблюдающихся мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Таким образом, модификация "моноклональное" отмечает характер антитела как не присутствующего в смеси дискретных антител.Monoclonal antibodies are obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies that make up the population are identical, with the exception of possible naturally-occurring mutations that may be present in minor amounts. Thus, the “monoclonal” modification marks the nature of the antibody as not being present in the mixture of discrete antibodies.

Например, моноклональные антитела к лиганду mpl по изобретению могут быть получены, используя гибридомный способ, впервые описанный Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 [1975], или могут быть получены по способу с рекомбинантной ДНК (Патент США No.4816576 [Cabilyet al.]).For example, monoclonal antibodies to the mpl ligand according to the invention can be obtained using the hybridoma method first described by Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 [1975], or can be obtained by the method with recombinant DNA (US Patent No.4816576 [Cabilyet al .]).

В гибридомном способе мыши или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк, иммунизируют, согласно вышеописанному здесь, для выявления лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связывать белок, использованный для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Лимфоциты затем сплавляют с клетками миеломы, используя подходящий сплавляющий агент, такой как полиэтиленгликоль, для образования клеток гибридомы (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 [Academic Press, 1986]).In a hybridoma method, mice or another suitable host animal, such as a hamster, are immunized as described above to detect lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that will specifically bind the protein used for immunization. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. Lymphocytes are then fused to myeloma cells using a suitable melting agent, such as polyethylene glycol, to form hybridoma cells (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 [Academic Press, 1986]).

Полученные таким образом гибридомные клетки высеваются и выращиваются в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более соединений, которое ингибирует рост или выживаемость несплавленных, родительских миеломных клеток. Например, если родительские миеломные клетки лишены фермента гипоксантин-гуанидин-фосфорибозил-трансферазы (HGPRT [ГГФРТ] или HPRT [ГФРТ)], культуральная среда для гибридом обычно будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT среда), вещества которой препятствуют росту ГГФРТ-дефицитных клеток.The hybridoma cells thus obtained are seeded and grown in a suitable culture medium that preferably contains one or more compounds that inhibits the growth or survival of unmelted, parental myeloma cells. For example, if the parent myeloma cells are deprived of the hypoxanthine guanidine phosphoribosyl transferase enzyme (HGPRT [GGFRT] or HPRT [GGFRT]], hybrid culture media will usually include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium), whose substances inhibit the growth of GGFRT- deficient cells.

Предпочтительные клетки миеломы - это те, которые эффективно сплавляются, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антитела путем отбора продуцирующих антитела клеток и являются чувствительными к среде, такой как HAT среда. Среди этих предпочтительных клеточных линий миеломы находится линия миеломы мышей, таких как происходящие от МОРС-21 или МРС-11 опухоли мыши, доступные в Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Калифорния США, и SP-2 клетки, доступные из American Type Culture Collection, Rockville, Мэриленд, США. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши и человека также описаны как продуцирующие моноклональные антитела человека (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Broder et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).Preferred myeloma cells are those that fuse efficiently, maintain a stable high level of antibody expression by selecting antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. Among these preferred myeloma cell lines is a mouse myeloma line, such as mouse-derived MORS-21 or MPC-11, available from the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, and SP-2 cells available from American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. The cell lines of human myeloma and mouse and human heteromyelomas are also described as producing human monoclonal antibodies (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Broder et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Культуральная среда, в которой растут гибридомные клетки, исследуется на продукцию моноклональных антител, направленных против лиганда mpl. Предпочтительно, связывающая специфичность моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяется по иммунопреципитации или по исследованию связывания in vitro, такому как радиоиммуноисследование (RIA), или в исследовании на ферментативено-пришитом иммуноадсорбенте (ELISA).The culture medium in which the hybridoma cells grow is tested for the production of monoclonal antibodies directed against the mpl ligand. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or an in vitro binding assay, such as a radio immunoassay (RIA), or an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Сродство связывания моноклонального антитела можно, например, определить из анализа Скетчарда (Scatchard) no Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 [1980].The binding affinity of a monoclonal antibody can, for example, be determined from Scatchard analysis no Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 [1980].

После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела желаемой специфичности, сродства, и/или активности, клоны можно субклонировать путем процедуры ограниченного разведения и выращивания по обычным способам, (Goding, там же). Подходящая культуральная среда для этой цели включает, например, модифицированную Дульбекко среду Игла или среду RPMI-1640. Помимо этого клетки гибридомы могут расти in vivo в виде асцитных опухолей у животных.After identifying hybridoma cells that produce antibodies of the desired specificity, affinity, and / or activity, the clones can be subcloned by a limited dilution and culture procedure using conventional methods (Goding, ibid.). A suitable culture medium for this purpose includes, for example, Dulbecco's modified Eagle medium or RPMI-1640 medium. In addition, hybridoma cells can grow in vivo as ascites tumors in animals.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, удобно выделяются из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки путем общепринятых способов для очистки иммуноглобулинов, таких как, например, протеин А-Сефароза, хроматография на гидроксилаппатите, гельэлектрофорез, диализ или хроматография по сродству.Monoclonal antibodies secreted by subclones are conveniently isolated from the culture medium, ascites fluid or serum by conventional methods for purification of immunoglobulins, such as, for example, protein A-Sepharose, chromatography on hydroxylappatite, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела по настоящему изобретению, легко выделяется и секвенируется, используя общепринятые способы (например, путем использования олигонуклеотидных зондов, которые способны к специфическому связыванию с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Гибридомные клетки по изобретению служат как предпочтительный источник подобной ДНК. Для установления синтеза моноклональных антител в рекомбинантной клетке хозяина однажды выделенная ДНК может быть включена в вектор экспресии, который затем трансфецируют в клетку-хозяин, такую как COS клетки обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые не продуцируют иным способом белок иммуноглобулина. ДНК также можно модифицировать, например, путем замены кодирующей последовательности для тяжелой и легкой цепей постоянного домена человека в гомологичном месте последовательности мыши (Cabilly et al., там же; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 [1984]), или путем ковалентного присоединения к иммуноглобулину, кодирующему последовательность всех или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида.DNA encoding the monoclonal antibodies of the present invention is easily isolated and sequenced using conventional methods (for example, by using oligonucleotide probes that are capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of mouse antibodies). The hybridoma cells of the invention serve as a preferred source of such DNA. To establish the synthesis of monoclonal antibodies in a recombinant host cell, once isolated DNA can be included in an expression vector, which is then transfected into a host cell, such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not otherwise produce protein immunoglobulin. DNA can also be modified, for example, by replacing the coding sequence for the heavy and light chains of the human constant domain at the homologous location of the mouse sequence (Cabilly et al., Ibid .; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 6851 [1984]), or by covalent attachment to an immunoglobulin encoding the sequence of all or part of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide.

Обычно такие неиммуноглобулиновые полипептиды заменяют на постоянные домены антитела по изобретению или их заменяют на вариабельные домены объединенного участка антитела по изобретению для создания химерного бивалентного антитела, содержащего один объединенный участок антигена, имеющего специфичность к лиганду mpl, и другой объединенный участок антитела, имеющего специфичность к другому антигену.Typically, such non-immunoglobulin polypeptides are replaced with the constant domains of an antibody of the invention, or they are replaced with the variable domains of a combined region of an antibody of the invention to create a chimeric bivalent antibody containing one integrated region of an antigen having specificity for mpl ligand and another integrated region of an antibody having specificity for another antigen.

Химерные или гибридные антитела также можно получить in vitro, используя известные способы из химии синтеза белков, включая те, которые используют перекрестно-сшивающие агенты. Например, иммунотоксины можно сконструировать, используя реакцию обмена дисульфидами, или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этих целей включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.Chimeric or hybrid antibodies can also be obtained in vitro using known methods from protein synthesis chemistry, including those using cross-linking agents. For example, immunotoxins can be constructed using a disulfide exchange reaction, or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl 4-mercaptobutyrimidate.

Для применения в диагностике антитела по изобретению обычно будут мечены обнаруживаемым радикалом. Обнаруживаемый радикал может быть одним из любых, которые способны производить либо непосредственно, либо опосредованно, детектируемый сигнал. Например, обнаруживаемый радикал может быть радиоизотопом, таким как 3H, 13С, 32P, 35S или 125I, флуоресцирующим или хемилюминисцирующим соединением, таким как флуоресцеин, изотиоцианат, родамин или люциферин; радиоактивной изотопной меткой, такой как, например, 125I, 32P, 14С или 3H, или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена.For use in the diagnosis, antibodies of the invention will typically be labeled with a detectable radical. A detectable radical can be one of any that is capable of producing either a direct or indirectly detectable signal. For example, the detectable radical may be a radioisotope such as 3 H, 13 C, 32 P, 35 S or 125 I, a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein, isothiocyanate, rhodamine or luciferin; a radioactive isotope tag, such as, for example, 125 I, 32 P, 14 C or 3 H, or an enzyme, such as alkaline phosphatase, beta-galactosidase or horseradish peroxidase.

Любой известный в технике способ может быть применен для раздельного присоединения антитела к обнаруживаемому радикалу, включая способы, описанные Hunter, et al., Nature, 144: 945 [1962]; David, et al., Biochemistry, 13: 1014 [1974]; Pain, et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 [1981]; и Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 [1982].Any method known in the art can be used to separately attach an antibody to a detectable radical, including the methods described by Hunter, et al., Nature, 144: 945 [1962]; David, et al., Biochemistry, 13: 1014 [1974]; Pain, et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 [1981]; and Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 [1982].

Антитела по настоящему изобретению можно применять в любых известных способах исследования, таких как исследование конкурентного связывания, прямое и непрямое исследование типа сэндвич, и иммунопреципитационное исследование. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).The antibodies of the present invention can be used in any known assay methods, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Исследование конкурентного связывания основано на способности стандарта (которым может быть лиганд mpl или его иммунологически реактивная часть) конкурировать с тестируемым исследуемым образцом (лигандом mpl) по связыванию с ограниченным количеством антител. Количество лиганда mpl в тестируемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, который связан с антителами. Для облегчения определения количества стандарта, который будет связан, антитела обычно переводят в нерастворимое состояние перед или после конкурентного связывания, так чтобы стандарт и исследуемое вещество, которое связывается с антителом, можно было легко отделить от стандарта и от исследуемого вещества, которое осталось несвязанным.Competitive binding assays are based on the ability of a standard (which may be the mpl ligand or its immunologically reactive moiety) to compete with a test sample being tested (mpl ligand) to bind to a limited number of antibodies. The amount of mpl ligand in the test sample is inversely proportional to the amount of standard that is bound to antibodies. To facilitate the determination of the amount of standard that will be bound, antibodies are usually rendered insoluble before or after competitive binding, so that the standard and the analyte that binds to the antibody can be easily separated from the standard and from the analyte that remains unbound.

Исследование типа сэндвич включает использование двух антител, каждое способное к связыванию с различными иммуногенными частями, или эпитопами определяемого белка (лиганда mpl). В исследовании типа сэндвич тестируемый исследуемый образец связывается первым антителом, которое иммобилизовано на твердой подложке, и после этого второе антитело связывается с исследуемым образцом, таким образом образуя нерастворимый комплекс из трех частей. David and Greene, Патент США No.4376110. Второе антитело может быть само по себе мечено детектируемым радикалом (прямое исследование типа сэндвич), или может быть измерено, используя анти-иммуноглобулиновое антитело, которое мечено детектируемым радикалом (непрямое исследование типа сэндвич). Например, первый тип исследования типа сэндвич представляет исследование ELISA, в этом случае детектируемым радикалом является фермент (например, пероксидаза хрена).A sandwich type study involves the use of two antibodies, each capable of binding to different immunogenic parts, or epitopes of a designated protein (mpl ligand). In a sandwich study, the test sample to be tested is bound by the first antibody that is immobilized on a solid support, and after that the second antibody is bound to the sample to be tested, thereby forming an insoluble three-part complex. David and Greene, U.S. Patent No.4376110. The second antibody may itself be labeled with a detectable radical (direct sandwich assay), or may be measured using an anti-immunoglobulin antibody that is labeled with a detectable radical (indirect sandwich assay). For example, the first type of sandwich type assay is an ELISA assay, in which case the detectable radical is an enzyme (for example, horseradish peroxidase).

(iii) Очеловеченные антитела и антитела человека(iii) Humanized Antibodies and Human Antibodies

Способы с очеловеченными и нечеловеческими антителами хорошо известны в технике. В общем, очеловеченное антитело имеет введенные в него аминокислотные остатки из источника, который является нечеловеческим. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто обозначают как "импортные" остатки, которые обычно берут из "импортного" вариабельного домена. Очеловечивание можно, по существу, провести, следуя способу Winter с соавторами (Jones et al., Nature, 321: 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen et ai.. Science, 239: 1534-1536 [1988]), путем замены CDRs (остатков постоянного домена, прим. переводчика) грызунов или последовательности CDR на соответствующую последовательность антитела человека. Таким образом, такие "очеловеченные" антитела являются химерными антителами (Cabilly et al., там же), где заменено существенно меньше на соответствующую последовательность из нечеловеческих видов, чем интактный вариабельный домен человека. В действительности, очеловеченные антитела являются обычно антителами человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые FR остатки (рабочей рамки) замещаются остатками из аналогичных участков антител грызунов.Methods with humanized and non-human antibodies are well known in the art. In general, a humanized antibody has amino acid residues introduced into it from a source that is non-human. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are usually taken from the “import” variable domain. Humanization can essentially be carried out following the method of Winter et al. (Jones et al., Nature, 321: 522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen et ai. Science, 239: 1534-1536 [1988]), by replacing the CDRs (residues of the constant domain, approx. Translator) of the rodent or CDR sequence with the corresponding human antibody sequence. Thus, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (Cabilly et al., Ibid.), Where much less is replaced by the corresponding sequence of non-human species than the intact human variable domain. In fact, humanized antibodies are usually human antibodies, in which some CDR residues and, possibly, some FR residues (working frames) are replaced by residues from similar regions of rodent antibodies.

Выбор вариабельных доменов человека, обоих, легкого и тяжелого, для использования с получении очеловеченных антител очень важен для того, чтобы снизить антигенность. В соответствии с так называемым "best-fit" (наилучшего соответствия) способом последовательность вариабельного домена антитела грызуна просеивается против полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Последовательность человека, которая наиболее близка к таковой у грызунов, затем принимается в качестве рабочей рамки (FR -РР) для очеловеченного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chotia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901 [1987]). Другие способы использования конкретной рабочей рамки происходят от согласованной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких и тяжелых цепей. Та же рабочая рамка может быть использована для нескольких очеловеченных антител (Carter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 [1993]).The choice of human variable domains, both light and heavy, for use in obtaining humanized antibodies is very important in order to reduce antigenicity. In accordance with the so-called "best-fit" method, the sequence of the variable domain of a rodent antibody is screened against a complete library of known sequences of human variable domains. The human sequence that is closest to that of rodents is then adopted as the working frame (FR-PP) for the humanized antibody (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 [1993]; Chotia and Lesk, J. Mol Biol., 196: 901 [1987]). Other ways to use a specific working framework come from a consistent sequence of all human antibodies of a particular subgroup of light and heavy chains. The same working frame can be used for several humanized antibodies (Carter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 [1993] )

Далее важно, чтобы антитела были очеловечены с сохранением высокого сродства и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в соответствии с предпочтительными способами очеловеченные антитела получают при помощи анализа родственных последовательностей и различных задуманных очеловеченных продуктов, используя трехмерные модели родственных и очеловеченных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина широко доступны в технике и знакомы для опытного работника. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и представляют возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатов последовательностей иммуноглобулинов. Рассмотрение данных представлений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании предполагаемой последовательности иммуноглобулина, то есть анализ остатков, которые влияют на способность предполагаемого иммуноглобулина связываться с антигеном. В этом направлении остатки FR (рабочей рамки) могут быть выбраны и объединены с согласованной и импортной последовательностью так, чтобы получить желательные характеристики антитела, такие как увеличенное сродство к антигену(ам)-мишени. В целом, остатки CDR, непосредственно и наиболее существенно участвуют во влиянии на связывание антигена. Для дальнейших подробностей см. Заявки США, Серийные No.07/934373, поданную 21 августа 1992 г., которая является составной частью заявки с серийным No.07/715272, поданной 14 июня 1991 г.Further, it is important that antibodies are humanized while maintaining high affinity and other favorable biological properties. To achieve this, in accordance with preferred methods, humanized antibodies are obtained by analysis of related sequences and various conceived humanized products using three-dimensional models of related and humanized sequences. Three-dimensional models of immunoglobulin are widely available in the art and are familiar to an experienced worker. Computer programs are available that illustrate and represent possible three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Consideration of these representations allows us to analyze the likely role of residues in the functioning of the putative immunoglobulin sequence, that is, the analysis of residues that affect the ability of the putative immunoglobulin to bind to the antigen. In this direction, FR residues (of the working frame) can be selected and combined with an agreed upon and imported sequence to obtain the desired antibody characteristics, such as increased affinity for the target antigen (s). In general, CDR residues are directly and most significantly involved in influencing antigen binding. For further details see US Applications Serial No.07 / 934373, filed August 21, 1992, which is part of the application with serial No.07 / 715272, filed June 14, 1991.

Альтернативно, в настоящее время возможно получить трансгенных животных (например, мышей), которые способны при иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция в гене области соединения (JH) тяжелой цепи антигена у химерных и линии зародышевых мутантных мышей приводит к полному ингибированию эндогенной продукции антитела. Пересадка всего ряда гена зародышевой линии иммуноглобулина человека в такую зародышевую линию мутантных мышей приведет к продукции антител человека при замене антигена. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255? [1993]; Jakobovita et al., Nature, 362: 255-258 [1993]; Bruggermann et al. Year in Immuno., 7: 3 [1993]. Антитела человека также можно продуцировать в проявляемых фагом библиотеках (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 [1991]).Alternatively, it is currently possible to obtain transgenic animals (e.g., mice) which, upon immunization, are able to produce a complete repertoire of human antibodies in the absence of endogenous production of immunoglobulins. For example, it has been described that a homozygous deletion in the gene region of the compound (J H ) of the antigen heavy chain in chimeric and germline mutant mouse lines leads to complete inhibition of endogenous antibody production. The transplantation of the entire gene series of the germline of a human immunoglobulin gene into such a germline of mutant mice will lead to the production of human antibodies when replacing the antigen. See, for example, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255? [1993]; Jakobovita et al., Nature, 362: 255-258 [1993]; Bruggermann et al. Year in Immuno., 7: 3 [1993]. Human antibodies can also be produced in phage libraries (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 [1991]).

(iv) Биспецифические антитела(iv) Bispecific antibodies

Биспецифические антитела являются моноклональными, предпочтительно очеловеченными или антителами человека, которые обладают способностью связываться, по крайней мере, с двумя различными антигенами. Способы для получения биспецифических антител известны в технике.Bespecifically antibodies are monoclonal, preferably humanized or human antibodies that have the ability to bind to at least two different antigens. Methods for producing bispecific antibodies are known in the art.

По традиции, продукция рекомбинантами биспецифических антител основана на совместной экспрессии двух пар иммуноглобулинов тяжелой цепи - легкой цепи, где две тяжелые цепи имеют различную специфичность (Millstein and Cuello, Nature, 305: 53-539 [1983]). Из-за случайности разнообразия тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов эти гибридромы (квадромы) продуцируют смесь возможных 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно проводят при помощи этапов аффинной хроматографии, является более чем затруднительной и дает низкий выход продукта. Близкие способы описаны в публикациях РСТ No. WO 93/08829 (опубликоваая 13 мая 1993 г.) и у Trauneker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 [1991].By tradition, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two pairs of heavy chain immunoglobulins - the light chain, where the two heavy chains have different specificities (Millstein and Cuello, Nature, 305: 53-539 [1983]). Due to the randomness of the diversity of the heavy and light chains of immunoglobulins, these hybridomas (quadromas) produce a mixture of possible 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule, which is usually carried out using the steps of affinity chromatography, is more than difficult and gives a low yield. Similar methods are described in PCT publication No. WO 93/08829 (published May 13, 1993) and Trauneker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 [1991].

В соответствии с различными и более предпочтительными подходами вариабельные домены антитела с желаемой специфичностью связывания (комбинированные участки антитело-антиген) сплавляют с последовательностями постоянных доменов иммуноглобулина. Сплавляют предпочтительно внутри постоянного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, включающей, по крайней мере, часть петли областей СН2 и СН3. Предпочтительно иметь первую постоянную область тяжелой цепи (СН1), содержащей участок, необходимый для связывания легкой цепи, представляющий, по крайней мере, одно из сплавлений. ДНК, кодирующую сплавленную тяжелую цепь иммуноглобулина и, если желательно, легкую цепь иммуноглобулина, вводят в отдельный вектор экспрессии и совместно трансфецируют в подходящий организм хозяина. Этим обеспечивается большая гибкость в подстраивании взаимных соотношений трех фрагментов полипептидов в воплощении, когда используются неравные части цепей трех полипептидов в конструкции, дающей оптимальный выход. Однако возможно ввести кодирующую последовательность для двух или трех цепей полипептидов в один вектор экспрессии, когда экспрессия, по крайней мере, двух полипептидных цепей в равных отношениях приводит к высокому выходу или когда соотношения не имеют особого значения. В предпочтительном воплощении данного подхода биспецифические антитела составляют тяжелую цепь гибридного иммуноглобулина с одной специфичностью связывания в первой ручке, и гибридной паре тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) в другой ручке. Было обнаружено, что эти асимметрические структуры облегчают отделение желаемых биспецифических соединений от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку наличие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь для разделения. Эти подходы описаны в нерешенной заявке, серийный No.07/931811, поданной 17 августа 1992 г.In accordance with various and more preferred approaches, the variable domains of an antibody with the desired binding specificity (combined antibody-antigen sites) are fused to the sequences of the constant domains of the immunoglobulin. It is preferably fused within the constant domain of the immunoglobulin heavy chain, comprising at least part of the loop of the CH2 and CH3 regions. It is preferable to have a first constant region of the heavy chain (CH1) containing the site necessary for binding the light chain, representing at least one of the alloys. DNA encoding the fused immunoglobulin heavy chain and, if desired, the immunoglobulin light chain are introduced into a separate expression vector and co-transfected into a suitable host organism. This provides great flexibility in adjusting the mutual relations of the three fragments of the polypeptides in the embodiment, when the unequal parts of the chains of the three polypeptides are used in a design that gives an optimal yield. However, it is possible to introduce a coding sequence for two or three chains of polypeptides into a single expression vector when expression of at least two polypeptide chains in equal proportions leads to a high yield or when the ratios are not significant. In a preferred embodiment of this approach, the bispecific antibodies comprise a heavy chain of a hybrid immunoglobulin with one binding specificity in the first handle, and a hybrid pair of a heavy chain - an immunoglobulin light chain (providing second binding specificity) in the other handle. It has been found that these asymmetric structures facilitate the separation of the desired bispecific compounds from undesired combinations of immunoglobulin chains, since the presence of an immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule provides an easy route for separation. These approaches are described in Unsolved Application Serial No.07 / 931811, filed August 17, 1992.

Для дальнейших подробностей получения биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 [1986].For further details on the preparation of bispecific antibodies, see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 [1986].

(v) Гетероконъюгированные антитела(v) Heteroconjugate Antibodies

Гетероконъюгированные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела, например, было предположено, нацеливают иммунную систему на нежелательные клетки (Патент США No.4676980) и для лечения инфекции ВИЧ (публикации РСТ No.WO 91/00360 и WO 92/00373; ЕР 03089). Гетероконъюгатные антитела можно получить, используя способы ковалентного перекрестного связывания. Подходящие перекрестно-сшивающие агенты хорошо известны в технике и описаны в Патенте США No.4676980 по порядку номеров способов перекрестного пришивания.Heteroconjugate antibodies are also included in the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently linked antibodies. Such antibodies, for example, have been suggested to target the immune system to unwanted cells (US Pat. No. 4,669,980) and for treating HIV infection (PCT Publication No. WO 91/00360 and WO 92/00373; EP 03089). Heteroconjugate antibodies can be prepared using covalent crosslinking methods. Suitable cross-linking agents are well known in the art and are described in US Pat.

IV. Терапевтическое использование мегакариоцитопоэтического белка лиганда mplIV. The therapeutic use of megakaryocytopoietic mpl ligand protein

Биологически активный лиганд mpl, обладающий гематопоэтической эффекторной функцией, обозначен здесь как мегакариоцитопоэтический или тромбопоэтический белок (ТП), может быть использован в стерильном фармацевтическом препарате для стимуляции мегакариоцитопоэтической или тромбопоэтической активности у пациентов, страдающих от тромбоцитопении, в результате нарушения продукции, захвата или повышенного распада тромбоцитов. Ассоциированную с тромбоцитопенией гипоплазию костного мозга (например, апластическую анемию после хемотерапии или трансплантации костного мозга) можно эффективно лечить соединениями настоящего изобретения, так же как и такие нарушения, как диссиминированная внутрисосудистая свертываемость (DIC=ДВС), иммунная тромбоцитопения (включая ВИЧ-индуцированную ИТП и не-ВИЧ-индуцированную ИТП), хроническая идиопатическая тромбоцитопения, наследственная тромбоцитопения, миелодисплазия и тромботическая тромбоцитопения. Кроме этого, данные мегакариоцитопоэтические белки могут быть полезны при лечении миелопролиферативных тромбоцитарных заболеваний, так же как и тромбоцитоза после воспалительных состояний и при дефиците железа.The mpl biologically active ligand having a hematopoietic effector function, designated here as a megakaryocytopoietic or thrombopoietic protein (TP), can be used in a sterile pharmaceutical preparation to stimulate megakaryocytopoietic or thrombopoietic activity in patients suffering from thrombocytopenia, or from thrombocytopenia, platelet count. Thrombocytopenia-associated bone marrow hypoplasia (e.g., aplastic anemia after chemotherapy or bone marrow transplantation) can be effectively treated with the compounds of the present invention, as well as disorders such as disseminated intravascular coagulation (DIC = DIC), immune thrombocytopenia (including HIV-induced and non-HIV-induced ITP), chronic idiopathic thrombocytopenia, hereditary thrombocytopenia, myelodysplasia and thrombotic thrombocytopenia. In addition, these megakaryocytopoietic proteins can be useful in the treatment of myeloproliferative platelet diseases, as well as thrombocytosis after inflammatory conditions and in iron deficiency.

Предпочтительное использование мегакариоцитопоэтического или тромбоцитопоэтического белка (ТП) по настоящему изобретению представляет: миелотоксическая хемотерапия при лечении лейкемии или солидных опухолей, миелоаблативная (подавляющая миелоидные линии клеток - прим. переводчика) хемотерапия при аутологичной или аллогенной пересадке костного мозга, идиопатическая апластическая анемия, наследственная тромбоцитопения и иммунная тромбоцитопения.Preferred uses of the megakaryocytopoietic or thrombocytopoietic protein (TP) of the present invention are: myelotoxic chemotherapy in the treatment of leukemia or solid tumors, myeloid ablative chemotherapy for autologous or allogeneic bone marrow transplantation, idiopathic idiopathic arthritis immune thrombocytopenia.

Еще другие нарушения, пригодные для лечения мегакариоцитопоэтическими белками по настоящему изобретению, включают дефекты или повреждения тромбоцитов в результате приема лекарств, яда или активации на искусственных поверхностях. В этих случаях можно использовать настоящие соединения для стимуляции "шеддинга - конечной стадии тромбоцитопоэза" новыми "неповрежденными" тромбоцитами. Для более полного перечисления пригодных применений см. выше, в особенности раздел (a)-(f) и цитируемые здесь ссылки.Still other disorders suitable for treating the megakaryocytopoietic proteins of the present invention include platelet defects or damage due to medication, poison or activation on artificial surfaces. In these cases, you can use these compounds to stimulate "shedding - the final stage of thrombocytopoiesis" new "intact" platelets. For a more complete listing of suitable applications, see above, in particular section (a) - (f) and the references cited here.

Мегакариоцитопоэтические белки по настоящему изобретению можно применять сами по себе или в комбинации с другими цитокинами, гематопоэтинами, интерлейкинами, факторами роста или антителами для лечения вышеобозначенных нарушений и заболеваний. Таким образом, настоящие соединения можно применять в сочетании с другими белками или пептидами, имеющими тромбопоэтическую активность, включая Г-КСФ, ГМ-КСФ, ФИЛ, М-КСФ, ИЛ-1, ИЛ-3, эритропоэтин (ЭП), кит-лиганд, ИЛ-6 и ИЛ-11.The megakaryocytopoietic proteins of the present invention can be used alone or in combination with other cytokines, hematopoietins, interleukins, growth factors or antibodies to treat the aforementioned disorders and diseases. Thus, the present compounds can be used in combination with other proteins or peptides having thrombopoietic activity, including G-CSF, GM-CSF, PHIL, M-CSF, IL-1, IL-3, erythropoietin (EP), kit ligand , IL-6 and IL-11.

Мегакариоцитопоэтические белки по настоящему изобретению приготавливают в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Данные терапевтические составы можно вводить внутривенно или через нос или легкие. Композиции можно также вводить парентерально или подкожно по желанию. При систематическом введении терапевтические композиции должны быть апирогенными и представлять парентерально применимый раствор, считающийся со значением рН, изотоничности и стабильности. Эти условия известны опытному в технике сотруднику. В кратком виде дозовые составы соединений по настоящему изобретению приготавливают для хранения или применения путем смешивания соединений, обладающих желаемой степенью чистоты, с физиологически применимыми носителями, наполнителями или стабилизаторами. Такие материалы являются нетоксичными для реципиента в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный, ацетатный и другие соли органических кислот; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; пептиды низкого молекулярного веса (менее чем около 10 остатков), такие как полиаргинин, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин, или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глютаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту или аргинин; моносахара, дисахара и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннитол или сорбитол; противоионы, такие как натрий и/или неионные сурфактанты (поверхностно-активные вещества), такие как Твин, Pluronics или полиэтиленгликоль.The megakaryocytopoietic proteins of the present invention are prepared in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. These therapeutic compositions can be administered intravenously or through the nose or lungs. The compositions may also be administered parenterally or subcutaneously as desired. When systematically administered, therapeutic compositions should be pyrogen-free and present a parenterally applicable solution that is considered pH, isotonic, and stable. These conditions are known to those skilled in the art. In brief, the dosage formulations of the compounds of the present invention are prepared for storage or use by mixing compounds having the desired degree of purity with physiologically applicable carriers, excipients or stabilizers. Such materials are non-toxic to the recipient at the dosages and concentrations used and include buffers such as phosphate, citrate, acetate and other salts of organic acids; antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight peptides (less than about 10 residues), such as polyarginine, proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid or arginine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including cellulose or its derivatives, glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; counterions such as sodium and / or nonionic surfactants (surfactants) such as Tween, Pluronics or polyethylene glycol.

Около от 0,5 до 500 мг соединения или смеси мегакариоцитопоэтического белка как в свободной кислоте, или в виде основания, или в виде фармацевтически приемлемой соли смешивается с физиологически приемлемым разбавителем, носителем, наполнителем, связывающим, консервантом, стабилизатором, ароматизатором, и т.п., как предусмотрено для общепринятой фармацевтической практики. Количество активного ингредиента в данной композиции таково, чтобы получить подходящую дозировку в ряду положенных.About 0.5 to 500 mg of a compound or mixture of megakaryocytopoietic protein, both in the free acid, or in the form of a base, or in the form of a pharmaceutically acceptable salt, is mixed with a physiologically acceptable diluent, carrier, excipient, binding agent, preservative, stabilizer, flavoring agent, etc. n., as provided for in conventional pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in this composition is such as to obtain a suitable dosage in a series of prescribed.

Стерильная композиция для инъекции может быть составлена в соответствии с общепринятой фармацевтической практикой. Например, может быть желательно разведение или суспендирование активного соединения в разбавителе, таком как вода или встречающемся в природе растительном масле, подобном сезамовому, арахисовому или хлопковому, или синтетическом жирном разбавителе, подобном этилолеату или подобному. Могут быть включены буферы, консерванты, антиоксиданты и подобные в соответствии с принятой фармацевтической практикой.A sterile composition for injection may be formulated in accordance with generally accepted pharmaceutical practice. For example, it may be desirable to dilute or suspend the active compound in a diluent such as water or a naturally occurring vegetable oil like sesame, peanut or cottonseed, or a synthetic fatty diluent like ethyl oleate or the like. Buffers, preservatives, antioxidants and the like may be included in accordance with accepted pharmaceutical practice.

Подходящие примеры долговременно высвобождающихся препаратов включают полупроницаемые матриксы или твердые гидрофобные полимеры, содержащие полипептид, матрикс которых представляет вид заключенных в форму частиц, например пленку, или микрокапсулы. Примеры долговременно высвобождающихся матриксов включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гироксиметилметакрилат), как описано Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] и Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982], или поли(винилалкоголь)), полилактиды (Патент США No. 3773919, ЕП 58481), сополимеры L-глютаминовой кислоты и гамма этил-L-глютамата (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), нераспадающийся этиленвинилацетат (Langer et al., там же), распадающийся сополимер молочной кислоты и гликоловой кислоты, такой как Lupron Depot™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликоловой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕП 133988).Suitable examples of sustained release formulations include semipermeable matrices or solid hydrophobic polymers containing a polypeptide, the matrix of which is a particulate form, such as a film, or microcapsules. Examples of long release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxymethylmethacrylate), as described by Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] and Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982], or poly (vinyl alcohol)), polylactides (US Patent No. 3773919, EP 58481), copolymers of L-glutamic acid and gamma ethyl L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), non-degradable ethylene vinyl acetate (Langer et al., Ibid.), A degradable copolymer of lactic acid and glycolic acid, such as Lupron Depot ™ (injection microspheres consisting of a lactic acid-hl copolymer glycolic acid and leuprolide acetate), and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid (EP 133988).

Хотя полимеры, такие как этилен-винил ацетат и полимер молочной кислоты-гликолевой кислоты, позволяют высвобождаться молекулам более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки за более короткий период времени. Когда заключенные в капсулы белки остаются в теле на более длительное время, они могут денатурировать или агрегировать в результате выдерживания во влажных условиях при 37°С, приводя к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Можно спланировать рациональную стратегию для стабилизации белка, зависящую от вовлеченных механизмов. Например, если обнаруживается, что механизм агрегации представляет внутримолекулярное образование S-S связей через дисульфидный взаимообмен, то стабилизацию можно достигнуть путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислых растворов, контролем содержания влаги, используя подходящие добавки и разрабатывая специальные композиции полимерных матриксов.Although polymers such as ethylene-vinyl acetate and a lactic acid-glycolic acid polymer allow molecules to be released for more than 100 days, certain hydrogels release proteins in a shorter period of time. When the proteins in capsules remain in the body for a longer time, they can denature or aggregate as a result of exposure to humid conditions at 37 ° C, leading to a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. A rational strategy for protein stabilization can be planned, depending on the mechanisms involved. For example, if it is discovered that the aggregation mechanism represents the intramolecular formation of S-S bonds through disulfide exchange, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, controlling the moisture content using suitable additives and developing special polymer matrix compositions.

Долговременно высвобождающие композиции мегакариоцитопоэтического белка также включают заключенный в липосомальную ловушку мегакариоцитопоэтический белок. Липосомы, содержащие мегакариоцитопоэтические белки, получают по таким способам: DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 4030-4034 [1980]; ЕП 36676; ЕП 143949; ЕП 142641; Японская патентная заявка 83-118008; Патенты США No.4485045 и 4544641; и ЕП 102324. Обычно липосомы являются униламеллярного типа, небольшие (около 200-800 Ангстрем), в которых содержание липидов больше чем 30 мол.% холестерина, выбранные пропорции подобраны для оптимальной терапии мегакариоцитопоэтическим белком.Long-release megakaryocytopoietic protein compositions also include a liposomal trapped megakaryocytopoietic protein. Liposomes containing megakaryocytopoietic proteins are prepared by the following methods: DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 [1985]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 4030-4034 [1980]; EP 36676; EP 143949; EP 142641; Japanese Patent Application 83-118008; U.S. Patent Nos. 4,450,045 and 4,544,641; and EP 102324. Typically, liposomes are unilamellar type, small (about 200-800 Angstroms), in which the lipid content is more than 30 mol.% cholesterol, the selected proportions are selected for optimal therapy megakaryocytopoietic protein.

Дозировка будет определяться наблюдающим врачом при рассмотрении различных известных факторов, модифицирующих действие препаратов, включая тяжесть и тип заболевания, вес тела, пол, диету, время и путь приема, другие механизмы и другие имеющие отношение клинические факторы. Обычно дневной режим будет варьировать от 0,1 до 100 мкг/кг веса тела. Предпочтительно, дозировка будет варьировать от 0,1 до 50 мкг/кг веса тела. Более предпочтительно, начальная доза будет варьировать от 1 до 5 мкг/кг/день. Необязательно, уровень дозировки будет таким же, как для других цитокинов, в особенности, Г-КСФ, ГМ-КСФ и ЭП. Терапевтически эффективные дозировки можно определять по способам in vitro или in vivo.The dosage will be determined by the observing physician when considering various known factors modifying the effect of the drugs, including the severity and type of disease, body weight, gender, diet, time and route of administration, other mechanisms and other relevant clinical factors. Typically, the daily regimen will vary from 0.1 to 100 mcg / kg body weight. Preferably, the dosage will vary from 0.1 to 50 μg / kg body weight. More preferably, the initial dose will vary from 1 to 5 μg / kg / day. Optionally, the dosage level will be the same as for other cytokines, especially G-CSF, GM-CSF and EP. Therapeutically effective dosages can be determined by in vitro or in vivo methods.

ПримерыExamples

Очевидно, что любой специалист исходя из предыдущего описания и иллюстрирующих его примеров, может осуществить и использовать настоящее изобретение во всей его полноте без каких-либо дополнительных описаний. Поэтому нижеприведенные рабочие примеры описывают лишь предпочтительные варианты настоящего изобретения и не должны рассматриваться как некое ограничение изобретения.Obviously, any specialist based on the previous description and examples illustrating it, can implement and use the present invention in its entirety without any further descriptions. Therefore, the following working examples describe only preferred embodiments of the present invention and should not be construed as limiting the invention.

Пример 1Example 1

Частичная очистка свиного лиганда mplPartial purification of the pig ligand mpl

Обедненную тромбоцитами плазму собирали от нормальных свиней или анемичных свиней с аплазией. Аплазию у свиней индуцировали путем облучения всего тела животного излучением в 900 сантигрэй (cGy) с использованием линейного ускорителя при потоке энергии 4 МэВ. Облученным свиньям в течение 6-8 дней вводили внутримышечные инъекции цефазолина. Затем у животных под общей анестезией удаляли кровь в полном объеме и эту кровь гепаринизировали и центрифугировали при 1800×g в течение 30 минут, в результате чего получали обедненную тромбоцитами плазму. Пик мегакариоцитстимулирующей активности наблюдался через 6 дней после облучения.Platelet-poor plasma was collected from normal pigs or anemic pigs with aplasia. Pig aplasia was induced by irradiating the entire body of the animal with 900 centigray (cGy) radiation using a linear accelerator at an energy flux of 4 MeV. Irradiated pigs were given intramuscular injections of cefazolin for 6-8 days. Then, the animals were completely removed from the animals under general anesthesia and this blood was heparinized and centrifuged at 1800 × g for 30 minutes, resulting in platelet-poor plasma. The peak megakaryocyte-stimulating activity was observed 6 days after irradiation.

Плазму, полученную от облученных свиней с аплазией, обрабатывали 4 М NaCl и размешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученный преципитат удаляли путем центрифугирования при 3800 об/мин в Sorvall RC3B, а супернатант загружали в колонку с Phenyl-Toyopearl (220 мл), уравновешенную в 10 мМ NaPO4, содержащий 4М NaCl. Колонку промывали этим буфером до тех пор, пока А280 не достигал значения менее 0,05, после чего колонку элюировали dH2O. Элюированный пик белка разводили dH2O так, чтобы его проводимость составляла 15 мСим, после чего его загружали в колонку с Blue-Sepharose, уравновешенную (240 мл) в PBS. Затем колонку промывали 5 колоночными объемами из PBS и 10 мМ NaPO4 (pH 7,4), содержащего 2М мочевины. Белки элюировали с колонки 10 мМ NaPO4 (pH 7,4), содержащим 2М мочевины и 1 М NaCl. Элюированный пик ьелка обрабатывали 0,01%-ным октилглюкозидом (н-октил β - D глюкопиранозидом) и 1 мМ каждого из EDTA и Pefabloc (Boehinger Mannheim) и непосредственно загружали в тандемно соединенные колонки с CD4 - IgG (Capon D.J/ et al. Nature 337: 525-531 (1989)) и mpl-IgG Ultralink (Pierce) (см. ниже). После загрузки образца, колонки с CD4-IgG (2 мл) удаляли, а колонку с mpl - IgG (4 мл) промывали 10 объемами каждого из PBS и PBS, содержащего 2М NaCl, и элюировали 0,1М глицином-HCl (pH 2,25). Фракции собирали в 1/10 объема 1 М Трис-HCl (pH 8,0).Plasma obtained from irradiated aplasia pigs was treated with 4 M NaCl and stirred at room temperature for 30 minutes. The resulting precipitate was removed by centrifugation at 3800 rpm in Sorvall RC3B, and the supernatant was loaded onto a Phenyl-Toyopearl column (220 ml), equilibrated in 10 mM NaPO 4 containing 4 M NaCl. The column was washed with this buffer until A 280 reached less than 0.05, after which the column was eluted with dH 2 O. The eluted peak of the protein was diluted with dH 2 O so that its conductivity was 15 mSim, after which it was loaded into the column with Blue-Sepharose, balanced (240 ml) in PBS. The column was then washed with 5 column volumes of PBS and 10 mM NaPO 4 (pH 7.4) containing 2M urea. Proteins were eluted from a 10 mM NaPO 4 column (pH 7.4) containing 2 M urea and 1 M NaCl. The eluted spruce peak was treated with 0.01% octyl glucoside (n-octyl β-D glucopyranoside) and 1 mM each of EDTA and Pefabloc (Boehinger Mannheim) and directly loaded into tandem connected CD4 - IgG columns (Capon DJ / et al. Nature 337: 525-531 (1989)) and mpl-IgG Ultralink (Pierce) (see below). After loading the sample, the CD4-IgG columns (2 ml) were removed, and the mpl-IgG column (4 ml) was washed with 10 volumes of each of PBS and PBS containing 2 M NaCl and eluted with 0.1 M glycine-HCl (pH 2, 25). Fractions were collected in 1/10 volume of 1 M Tris-HCl (pH 8.0).

Анализ элюированных фракций с mpl-аффинной колонки, проведенный с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) (4-20%, Novex gel) в условиях восстановления, выявил присутствие несколько белков (фиг.5). Белки, которые окрашивались серебром с наибольшей интенсивностью, имели кажущуюся молекулярную массу Мг 66000, 55000, 30000, 28000 и 140000. Для того что определить, которые из этих белков стимулируют пролиферацию Ba/F3-mp1- клеточных культур, эти белки элюировали из геля, как описано ниже в Примере 2.Analysis of the eluted fractions from the mpl-affinity column, performed by polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) (4-20%, Novex gel) under reduction conditions, revealed the presence of several proteins (Fig. 5). The proteins that were stained with silver with the highest intensity had an apparent molecular weight of M g of 66,000, 55,000, 30,000, 28,000 and 140,000. In order to determine which of these proteins stimulate the proliferation of Ba / F3-mp1 cell cultures, these proteins were eluted from the gel as described below in Example 2.

Ultralink аффинная колонкаUltralink affinity column

10-20 мг mpl-IgG или CD4-IgG в PBS объединяли с 0,5 г смолы Ultralink (Pierce), как описано в инструкциях производителей.10-20 mg of mpl-IgG or CD4-IgG in PBS was combined with 0.5 g of Ultralink resin (Pierce), as described in the manufacturers instructions.

Коструирование и экспрессия mpl-IgGCostrosis and expression of mpl-IgG

Химерную молекулу, содержащую полный внеклеточный домен mpl человека (аминокислоты 1-491) и Fc-фрагмент молекулы IgGI человека, экспрессировали в клетках 293. кДНК-фрагмент, кодирующий аминокислоты 1-491 mpl человека, получали с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) из кДНК мегакариоцитов СМК и секвенировали. Clal-сайт вводили в 5’-конец, а BstEll-сайт вводили в 3’-конец. Этот фрагмент клонировали выше IgGl-Fc-кодирующей области в векторе Bluescript, между сайтами Clal и BstEll, после частичного гидролиза PCR-продукта ферментом BstEll, поскольку в ДНК, кодирующей внеклеточный домен mpl, присутствуют два других BstEll-сайта. BstEll-сайт, введенный в 3’-конец PCR-продукта mpl, конструировали так, чтобы Fc-область имела ту же рамку считывания, что и внеклеточный домен mpl. Эту конструкцию субклонировали в вектор pPK5-tkneo между сайтами Clal и Xbal, и трансфицировали в эмбриональные клетки почки человека 293 методом с использованием фосфата кальция. Эти клетки отбирали в 0,4 мг/мл G418 и отдельные клоны выделяли. Экспрессию mpl-IgG из выделенных клонов оценивали с помощью чел. Fc-специфического ELISA. Наиболее высокоэкспрессирующий клон имел уровень экспрессии 1-2 мг/мл mpl-IgG.A chimeric molecule containing the complete extracellular domain of human mpl (amino acids 1-491) and the Fc fragment of a human IgGI molecule was expressed in 293 cells. A cDNA fragment encoding amino acids 1-491 of human mpl was obtained by polymerase chain reaction (PCR) from The cDNA of megakaryocytes QMS and sequenced. The Clal site was introduced at the 5’-end, and the BstEll site was introduced at the 3’-end. This fragment was cloned above the IgGl-Fc coding region in the Bluescript vector, between the Clal and BstEll sites, after partial hydrolysis of the PCR product with the BstEll enzyme, since two other BstEll sites are present in the DNA encoding the extracellular domain of mpl. The BstEll site inserted at the 3’ end of the mpl PCR product was designed so that the Fc region had the same reading frame as the extracellular domain of mpl. This construct was subcloned into the pPK5-tkneo vector between the Clal and Xbal sites, and transfected into 293 human kidney cells using the calcium phosphate method. These cells were selected in 0.4 mg / ml G418 and individual clones were isolated. The expression of mpl-IgG from the isolated clones was evaluated using humans. Fc-specific ELISA. The most highly expressive clone had an expression level of 1-2 mg / ml mpl-IgG.

Клетки, эксперессируюцие mpl Ba/F3Cells expressing mpl Ba / F3

кДНК, соответствующую полной кодирующей области mpl F, клонировали в pPKS-tkneo, который затем линеаризовали ферментом Notl, и трансфецировали в IL-3-зависимую клеточную линию Ba/Fe путем электропорации (1×107 клеток, 9605F, 250В). Через три дня проводили отбор в присутствии 2 мг/мл G-418. Клетки отбирали в виде пулов либо получали отдельные клоны путем серийного разведения в 96-луночных планшетах. Отобранные клетки выдерживали в RPM1, содержащей 15% FBS, 1 мг/мл G-418, 20 мМ глутамина, 10 мМ HEPES и 100 мкг/мл Pen-Strep. Экспрессию mpl P в отобранных клонах оценивали флуоресцентным методом разделения клеток (FAC-анализ) с использованием кроличьих поликлональных антител против mpl Р.The cDNA corresponding to the full coding region of mpl F was cloned into pPKS-tkneo, which was then linearized with Notl enzyme and transfected into an IL-3-dependent Ba / Fe cell line by electroporation (1 × 10 7 cells, 9605F, 250B). Three days later, selection was performed in the presence of 2 mg / ml G-418. Cells were selected as pools or individual clones were obtained by serial dilution in 96-well plates. The selected cells were incubated in RPM1 containing 15% FBS, 1 mg / ml G-418, 20 mM glutamine, 10 mM HEPES and 100 μg / ml Pen-Strep. The expression of mpl P in selected clones was evaluated by fluorescence cell separation (FAC analysis) using rabbit polyclonal antibodies against mpl P.

Анализ на присутствие лиганда mpl Ba/F3Analysis for the presence of the ligand mpl Ba / F3

Анализ на присутствие лиганда mpl проводили, как показано на фиг.2. Для определения присутствия mpl-лиганда от различных источников клетки mpl P-Ba/F3 культивировали в среде, не содержащей IL-3, в течение 24 часов при клеточной плотности 5×105 кл./мл во влажной камере при 37°С в атмосфере 5% СO2 и воздуха. После выращивания клеток в среде, не содержащей IL-3, эти клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 50000 клеток в 200 мкл среды в присутствии или в отсутствие разведенных образцов и культивировали в течение 24 часов в термостате для клеточных культур. Затем в течение последних 6-8 часов к каждой лунке добавляли бессывороточную RPMl-среду (20 мкл), содержащую 1 мкКи 3H-тимидина. После этого клетки собирали на в 96-луночных планшетах с фильтром GF/C, и 5 раз промывали водой. Фильтры подвергали анализу в счетчике Packard Top Count в присутствии 40 мкл сцинтилляционной жидкости (Microscint 20).Analysis for the presence of the mpl ligand was performed as shown in FIG. To determine the presence of mpl ligand from various sources, m-P-Ba / F3 cells were cultured in an environment that did not contain IL-3 for 24 hours at a cell density of 5 × 10 5 cells / ml in a humid chamber at 37 ° C in the atmosphere 5% CO 2 and air. After growing cells in an IL-3-free medium, these cells were seeded in 96-well plates at a density of 50,000 cells in 200 μl of medium in the presence or absence of diluted samples and cultured for 24 hours in a cell culture incubator. Then, over the past 6-8 hours, serum-free RPMl medium (20 μl) containing 1 μCi 3 H-thymidine was added to each well. After this, cells were harvested in 96-well plates with a GF / C filter, and washed 5 times with water. Filters were analyzed on a Packard Top Count in the presence of 40 μl of scintillation fluid (Microscint 20).

Пример 2Example 2

Высокоочищенный свиной лиганд mplHighly purified pork ligand mpl

Протокол гель-элюированияGel Elution Protocol

Равные количества аффиноочищенного mpl-лиганда (фракция 6, элюированная с mpl-IgG-колонки) и 2× буфера Лэммли смешивали при комнатной температуре в отсутствие восстановителя и как можно быстро загружали на 4-20% полиакриламидный гель Novex. Образец не нагревали. В качестве контроля на соседней дорожке проводили электрофорез буфера без лиганда. Гель подвергали электрофорезу при 135 вольт в течение приблизительно 2 1/4 часа при 4-6°С. Сначала пропускали буфер при комнатной температуре. Затем гель удаляли из лотка и пластину с одной стороны геля удаляли.Equal amounts of affinity purified mpl ligand (fraction 6 eluted from the mpl IgG column) and 2 × Laemmli buffer were mixed at room temperature in the absence of a reducing agent, and Novex polyacrylamide gel was loaded as quickly as possible. The sample was not heated. As a control, an electrophoresis buffer without ligand was performed on a neighboring lane. The gel was subjected to electrophoresis at 135 volts for approximately 2 1/4 hours at 4-6 ° C. First, a buffer was passed at room temperature. Then the gel was removed from the tray and the plate on one side of the gel was removed.

Реплики геля на нитроцеллюлозе приготавливали следующим образом. Кусок нитроцеллюлозы, смоченный дистиллированной водой, осторожно помещали верхней стороной на поверхность геля так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха. На нитроцеллюлозе и пластине геля делали ориентировочные метки для того, чтобы реплики можно было точно репозиционировать после окрашивания. Примерно через 2 минуты нитроцеллюлозу осторожно удаляли, а гель оборачивали полимерной пленкой и помещали в холодильник. Нитроцеллюлозу окрашивали красителем для полного белка Biorad gold (золотым) сначала путем ее размешивания в 3×10 мл 0,1% Твин 20+0,5 М NaCl+0,1 M Трис-HCl (рН 7,5) в течение приблизительно 45 минут, а затем в 3×10 мл очищенной воды в течение 5 минут. Затем добавляли золотой краситель и оставляли для развития окраски до тех пор, пока полосы в стандартах не становились видимыми. После этого реплики промывали водой, помещали поверх полиэтиленовой пленки на геле, осторожно совмещали с ориентировочными метками. На пластине геля были размечены положения стандартов Novex и проведены линии, указывающие места для вырезания. Затем нитроцеллюлозу и полиэтиленовую пленку удаляли и гель вырезали вдоль указанных линий острым лезвием бритвы. Разрезы продолжались за пределы дорожек геля для образцов так, чтобы они могли быть использованы для определения положений срезов при окрашивании геля. После удаления срезов оставшийся гель окрашивали серебром и положения стандартов и меток измеряли. Молекулярные массы, соответствующие положениям вырезания, определяли исходя из стандартов Novex.Gel replicas on nitrocellulose were prepared as follows. A piece of nitrocellulose moistened with distilled water was carefully placed with its top side on the surface of the gel so that no air bubbles formed. Reference marks were made on nitrocellulose and the gel plate so that the replicas could be accurately repositioned after staining. After about 2 minutes, nitrocellulose was carefully removed, and the gel was wrapped with a polymer film and placed in a refrigerator. Nitrocellulose was stained with Biorad gold complete protein dye (gold), first by stirring it in 3 × 10 ml 0.1% Tween 20 + 0.5 M NaCl + 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) for approximately 45 minutes, and then in 3 × 10 ml of purified water for 5 minutes. Then a gold dye was added and left to develop color until the bands in the standards became visible. After that, the replicas were washed with water, placed on top of a plastic film on a gel, carefully combined with indicative marks. On the gel plate, Novex standards were marked and lines were drawn to indicate where to cut. Then, nitrocellulose and a plastic film were removed and the gel was cut along the indicated lines with a sharp razor blade. The cuts continued beyond the gel paths for the samples so that they could be used to determine the position of the slices when staining the gel. After sections were removed, the remaining gel was stained with silver and the positions of the standards and labels were measured. Molecular weights corresponding to the cutting positions were determined based on Novex standards.

12 Срезов геля помещали в ячейки двух аппаратов для электроэлюирования модели Biorad 422. В этих ячейках использовали мембраны, отсекающие молекулярные массы 12-14 кДа. В качестве элюирующего буфера использовали 50 мМ бикарбоната аммония +0,05% ДСН (приблизительно рН 7,8). Один литр буфера охлаждали примерно в течение 1 часа перед его использование в холодном помещении при 4-5°С. Срезы геля элюировали при 10 мА/ячейка (начальное напряжение 40 В) в холодном помещении при 4-6°С. Элюцию проводили примерно 4 часа. Затем ячейки осторожно вынимали и жидкость поверх фрита удаляли пипеткой. Затем камеру для элюирования вынимали и всю жидкость поверх мембраны удаляли пипеткой. Жидкость в мембране удаляли пипеткой Pipetman и сохраняли. Затем в мембрану добавляли 50 мкл очищенной воды, размешивали и удаляли до тех пор, пока не растворялись все кристаллы ДСН. После этого промывки объединяли с вышеупомянутой сохраненной жидкостью. Полный объем образца для элюции составлял 300-500 мкл на срез геля. Образцы помещали в 10-миллиметровую 12-14 К-отсекающую диализную трубку Spectrapor 4, которую предварительно в течение нескольких часов пропитывали очищенной водой. Диализ проводили в течение ночи при 4-6°С против 600 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS-приблизительно 4 мМ в калии) на 6 образцов. Затем на следующее утро буфер заменяли и диализ продолжали еще в течение 2,5 часов. Затем образцы удаляли из диализационных мешков и помещали в пробирки для микроцентрифугирования. Эти пробирки на 1 час помещали на лед, центрифугировали в течение 3 минут при скорости (об/мин) на отметке 14К и супернатанты осторожно удаляли из осажденного ДСН. Эти супернатанты помещали примерно на 1 час на лед и еще раз центрифугировали в течение 4 минут. Затем супернатанты разводили в физиологическом растворе, забуференном фосфатом, и подвергали анализу на активность. Оставшиеся образцы замораживали при -70°С.12 sections of the gel were placed in the cells of two electroelution apparatuses of the Biorad 422 model. In these cells membranes were used that cut off the molecular masses of 12-14 kDa. As an elution buffer, 50 mM ammonium bicarbonate + 0.05% SDS (approximately pH 7.8) was used. One liter of buffer was cooled for about 1 hour before being used in a cold room at 4-5 ° C. The gel sections were eluted at 10 mA / cell (initial voltage 40 V) in a cold room at 4-6 ° C. Elution was performed for approximately 4 hours. Then the cells were carefully removed and the liquid over the frit was removed with a pipette. The elution chamber was then removed and all liquid over the membrane was pipetted. The fluid in the membrane was removed with a Pipetman pipette and stored. Then, 50 μl of purified water was added to the membrane, stirred and removed until all SDS crystals were dissolved. After this washing was combined with the above-mentioned stored liquid. The total volume of the elution sample was 300-500 μl per gel section. Samples were placed in a 10 mm 12-14 K-cut-off Spectrapor 4 dialysis tube, which was pre-soaked in purified water for several hours. Dialysis was performed overnight at 4-6 ° C. against 600 ml of phosphate buffered saline (PBS-approximately 4 mM in potassium) in 6 samples. Then the next morning, the buffer was replaced and dialysis continued for another 2.5 hours. Then the samples were removed from dialysis bags and placed in microcentrifuge tubes. These tubes were placed on ice for 1 hour, centrifuged for 3 minutes at a speed (rpm) at 14K, and supernatants were carefully removed from the precipitated SDS. These supernatants were placed on ice for approximately 1 hour and centrifuged again for 4 minutes. Then the supernatants were diluted in physiological saline, phosphate buffered, and subjected to analysis for activity. The remaining samples were frozen at -70 ° C.

Пример 3Example 3

Микросеквенирование лиганда mpl свиньиMicrosequencing of a pig mpl ligand

Фракцию 6 (2,6 мл) из mpl-IgG-аффинной колонки концентрировали на Microcon-10 (Amicon). Во избежание абсорбции лиганда mpl на Microcon мембрану промывали 1% ДСН и к фракции 6 добавляли 10% ДСН. После концентрирования фракции 6 на Microcon (20 мкл) добавляли буфер для образца (20 мкл) (2х) и полученный объем (40 мкл) загружали на одну дорожку 4-20% градиента акриламидного геля (Novex). Затем гель подвергали электрофорезу в соответствии с протоколом Novex. После этого до проведения электроблотирования гель уравновешивали в течение 5 минут в 10 мМ САРS-буфере (CAPS=3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновая кислота), рН 11/0, содержащем 10%-ный метанол. Электроблоттинг на мембранах Immobilon-PSQ (Millipore) проводили в течение 45 минут при постоянном токе 250 мА в ячейке для электрофоретического переноса (32) BioRad Trans-Blot. PVDF-мембрану окрашивали 0,1% кумасси синим Р-250 в 40%-ном метаноле, 0,1%-ной уксусной кислоте в течение 1 минуты, после чего краситель отмывали в течение 2-3 минут с использованием 10%-ной уксусной кислоты в 50%-ном метаноле. Белки, которые были видны в 18000-35000-области блота, имели Mr=30000, 28000 и 22000.Fraction 6 (2.6 ml) from the mpl-IgG affinity column was concentrated on Microcon-10 (Amicon). To avoid the absorption of the mpl ligand on Microcon, the membrane was washed with 1% SDS and 10% SDS was added to fraction 6. After concentrating fraction 6 on a Microcon (20 μl), a sample buffer (20 μl) (2x) was added and the resulting volume (40 μl) was loaded onto one 4-20% acrylamide gel gradient (Novex) lane. The gel was then subjected to electrophoresis according to the Novex protocol. After that, before electro-blotting, the gel was balanced for 5 minutes in 10 mM CAPS buffer (CAPS = 3- (cyclohexylamino) -1-propanesulfonic acid), pH 11/0, containing 10% methanol. Electroblotting on Immobilon-PSQ membranes (Millipore) was carried out for 45 minutes at a constant current of 250 mA in a cell for electrophoretic transfer (32) of BioRad Trans-Blot. The PVDF membrane was stained with 0.1% Coomassie blue P-250 in 40% methanol, 0.1% acetic acid for 1 minute, after which the dye was washed for 2-3 minutes using 10% acetic acids in 50% methanol. Proteins that were visible in the 18000-35000 region of the blot had Mr = 30000, 28000 and 22000.

Полосы белков 30, 28 и 22 кДа подвергали секвенированию. Для этого осуществляли автоматическое секвенирование на секвенаторе модели 470А (Applied Biosystem), снабженном анализатором РТН, работающем в реальном масштабе времени. Указанный секвенатор был модифицирован для введения 80-90% образца (Rodriguez, J. Chromatogr., 350: 217-225 [1985]). Для регулирования оптической плотности в УФ-диапазоне к растворителю А добавляли ацетон (≈12 мкл/л). Электроблотированные белки секвенировали в кассете Blott. Пики интегрировали с помощью программного обеспечения Justic Innovations с использованием интерфейсов Nelson Analitycal 970. Интерпретацию последовательностей проводили на приборе vAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404: 41-52 [1987]). N-концевые последовательности (с использованием однобуквенного кода; неопределенные остатки приведены в скобках) и количества полученного материала (в квадратных скобках) представлены в Таблице 4.The protein bands of 30, 28 and 22 kDa were subjected to sequencing. For this, automatic sequencing was performed on a 470A model sequencer (Applied Biosystem) equipped with a real-time PTH analyzer. The specified sequencer was modified to introduce 80-90% of the sample (Rodriguez, J. Chromatogr., 350: 217-225 [1985]). To control the optical density in the UV range, acetone (≈12 μl / L) was added to solvent A. Electroblotted proteins were sequenced in a Blott cassette. Peaks were integrated using Justic Innovations software using Nelson Analitycal 970 interfaces. Sequence interpretation was performed on a vAX 5900 instrument (Henzel et al., J. Chromatogr., 404: 41-52 [1987]). N-terminal sequences (using a one-letter code; undefined residues are given in parentheses) and the amounts of material obtained (in square brackets) are presented in Table 4.

Figure 00000002
Figure 00000002

Пример 4Example 4

Анализ на мегакариоцитопоэз в жидкой суспензионной культуреAnalysis for megakaryocytopoiesis in a liquid suspension culture

Периферические стволовые клетки человека (PSC) (полученные с согласия пациентов) 5-кратно разводили 1М М-средой (Gibco), и центрифугировали в течение 15 минут при 800×g при комнатной температуре. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 MDM и покрывали слоем поверх 60% Percoll (плотность 1,077 г/мл) (Pharmacia), после чего центрифугировали в течение 30 минут при 800×g. Мононуклеарные клетки небольшой плотности отсасывали у границы и промывали 2×1 MDM, после чего их высевали при плотности (1-2)·106 кл./мл в среду 1 MDM, содержащую 30% FBS (конечный объем 1 мл), в 24-луночные планшеты для культивирования тканевых культур (Costar). Затем добавляли (до 10%) АРР или АРР, не содержащий лиганд mpl, и культуры выращивали в течение 12-14 дней во влажной камере при 37°С в атмосфере 5% CO2 и воздуха. После этого культуры инкубировали в присутствии 10% АРР с 0,5 мкг добавленного mpl-IgG, добавленного в дни 0, 2 и 4. Удаление лиганда mpl из АРР осуществляли путем пропускания АРР через mpl-IgG-аффинную колонку.Human Peripheral Stem Cells (PSC) (obtained with patient consent) were 5-fold diluted with 1M M-medium (Gibco), and centrifuged for 15 minutes at 800 × g at room temperature. The cell pellet was resuspended in 1 MDM and coated with a layer on top of 60% Percoll (density 1.077 g / ml) (Pharmacia), and then centrifuged for 30 minutes at 800 x g. Low density mononuclear cells were aspirated at the border and washed with 2 × 1 MDM, after which they were plated at a density of (1-2) · 10 6 cells / ml in 1 MDM medium containing 30% FBS (final volume 1 ml) in 24 well plates for tissue culture (Costar). Then (up to 10%) APP or APP without mpl ligand was added, and cultures were grown for 12-14 days in a humid chamber at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 and air. After this, cultures were incubated in the presence of 10% APP with 0.5 μg of added mpl-IgG added on days 0, 2 and 4. Removal of the mpl ligand from APP was performed by passing APP through an mpl-IgG affinity column.

Для количественной оценки мегакариоцитопоэза в этих жидких суспензионных культурах использовали модифицированный метод Solberg и др. И радиоактивно меченные мышиные моноклональные антитела IgG (HP1-1D) к Gpllbllla (поставляемые Dr.Nichols, Mayo Clinic). 100 мкг HP1-D (см. Grant, В. Et al., Blood 69: 1334-1339 [1987]) подвергали радиоактивному мечению 1 мКи Na125 с использованием Enzzmobeads (Biorad, Richmond, CA) в соответствии с инструкциями производителей. Радиоактивно меченные HP1-1D хранили при 70°С в PBS, содержащем 0,01% октилгликозид. Типичная специфическая активность составляла 1-2-10° им./мин/мкг (>95%, осажденных 12,5%-ной трихлоруксусной кислотой).To quantify megakaryocytopoiesis in these liquid suspension cultures using a modified method of Solberg et al. And radiolabeled murine monoclonal antibody IgG (HP1-1D) to Gpll b lll a (supplied Dr.Nichols, Mayo Clinic). 100 μg of HP1-D (see Grant, B. Et al., Blood 69: 1334-1339 [1987]) was radiolabeled with 1 mCi Na 125 using Enzzmobeads (Biorad, Richmond, CA) according to the manufacturers instructions. Radioactively labeled HP1-1D was stored at 70 ° C. in PBS containing 0.01% octyl glycoside. Typical specific activity was 1-2–10 ° N / min / μg (> 95% precipitated with 12.5% trichloroacetic acid).

Жидкие суспензионные культуры приготавливали в тройном дубликате для каждой экспериментальной стадии. Через 12-14 дней выдерживания 1 мл культур переносили в 1,5-миллилитровые пробирки Эппендорфа, затем центрифугировали при 800×g в течение 10 минут при комнатной температуре, и полученные клеточные осадки ресуспендировали в 100 мкл PBS, содержащего 0,02% EDTA и 20% телячьей сыворотки. К ресуспендированным культурам добавляли 10 нг 125l-HPI-ID в 50 мкл аналитического буфера и инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре (КТ), периодически встряхивая. После этого клетки собирали путем центрифугирования при 800×g в течение 10 минут при КТ и промывали 2х буфером для анализа. Клеточный осадок помещали на 1 минуту в гамма-счетчик для подсчета (Packard). Неспецифическое связывание оценивали путем добавления 1 мкг немеченого HP1-1D с последующим выдерживанием смеси в течение 60 минут перед добавление меченого HP1-1D. Специфическое связывание определяли как общую величину 125l-НРl-lD-связывания минус связывание в присутствии избыточного количества немеченого HP1-1D.Liquid suspension cultures were prepared in triplicate for each experimental step. After 12-14 days of incubation, 1 ml of cultures was transferred to 1.5 ml Eppendorf tubes, then centrifuged at 800 xg for 10 minutes at room temperature, and the resulting cell pellets were resuspended in 100 μl of PBS containing 0.02% EDTA and 20% calf serum. To the resuspended cultures, 10 ng 125 l-HPI-ID in 50 μl assay buffer was added and incubated for 60 minutes at room temperature (CT), shaking occasionally. After this, the cells were harvested by centrifugation at 800 × g for 10 minutes at RT and washed with 2x assay buffer. A cell pellet was placed for 1 minute in a gamma counter for counting (Packard). Nonspecific binding was evaluated by adding 1 μg of unlabeled HP1-1D, followed by maintaining the mixture for 60 minutes before adding labeled HP1-1D. Specific binding was defined as the total value of 125 l-HPl-lD binding minus binding in the presence of an excess of unlabeled HP1-1D.

Пример 5Example 5

Олигонуклеотидне PCR-праймерыOligonucleotide PCR Primers

Исходя из амино-концевой аминокислотной последовательности, полученной для белков 30, 28 и 18-22 кДа, конструировали вырожденные олигонуклеотиды в качестве PCR-праймеров (PCR-полимеразная цепная реакция) (см. Таблицу 5). Было синтезировано два пула праймеров: один смысловой 20-мерный пул, кодирующий аминокислотные остатки 2-8 (mpl 1) и антисмысловой 21-мерный пул, комплементарный последовательностям, кодирующим аминокислоты 18-24 (mpl 2).Based on the amino-terminal amino acid sequence obtained for the 30, 28, and 18-22 kDa proteins, degenerate oligonucleotides were constructed as PCR primers (PCR polymerase chain reaction) (see Table 5). Two primer pools were synthesized: one semantic 20-dimensional pool encoding amino acid residues 2-8 (mpl 1) and an antisense 21-dimensional pool complementary to sequences encoding amino acids 18-24 (mpl 2).

Figure 00000003
Figure 00000003

Свиную геномную ДНК, выделенную из лимфоцитов свиной периферической крови, использовали в качестве матрицы для PCR. 50 мкл реакционной смеси содержали: 0,8 мкл свиной геномной ДНК в 10 мМ Трис-НСl (рН 8,3), 50 MM KCl, 3 мМ MgCl2, 100 мкг/мл BSA, 400 мкМ dNTP, 1 мкМ каждого праймерного пула и 2,5 ед. полимеразы Тао. Первоначальную денатурацию матрицы проводили при 94°С в течение 8 минут с последующими 35 циклами по 45 сек при 94°С, 1 мин при 55°С и 1 мин при 72°С. Конечный цикл проводили в течение 10 минут при 72°С. PCR-продукты разделяли с помощью электрофореза на 12%-ном полиакриламидном геле и визуализировали путем окрашивания этидийбромидом. Разумно предположить, что если амино-концевая аминокислотная последовательность кодируется одним экзоном, то правильный PCR-продукт, очевидно, составляет 69 п.о. ДНК-фрагмент этого размера элюировали из геля и сублокировали в pGEMT (Promega). Последовательности трех клонов показаны ниже:Pork genomic DNA isolated from porcine peripheral blood lymphocytes was used as a template for PCR. 50 μl of the reaction mixture contained: 0.8 μl of porcine genomic DNA in 10 mm Tris-Hcl (pH 8.3), 50 mm KCl, 3 mm MgCl 2 , 100 μg / ml BSA, 400 μm dNTP, 1 μm of each primer pool and 2.5 units Tao polymerase. Initial denaturation of the matrix was carried out at 94 ° C for 8 minutes, followed by 35 cycles of 45 sec at 94 ° C, 1 min at 55 ° C and 1 min at 72 ° C. The final cycle was carried out for 10 minutes at 72 ° C. PCR products were separated by electrophoresis on a 12% polyacrylamide gel and visualized by ethidium bromide staining. It is reasonable to assume that if the amino-terminal amino acid sequence is encoded by one exon, then the correct PCR product is obviously 69 bp. A DNA fragment of this size was eluted from the gel and sublocated into pGEMT (Promega). The sequences of the three clones are shown below:

Свиные геномные ДНК-фрагменты длиной 69 п.о.69 bp pork genomic DNA fragments

gem T3gem T3

5`CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC СТАААТАААС TGCCTCGTGA5`CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA UDPCGACTC STAAATAAAS TGCCTCGTGA

3`GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT3`GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT

TGACCACGTT CAGCACGGC [69 п.о.] Посл. NO: 37TGACCACGTT CAGCACGGC [69 bp] Last NO: 37

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG Посл.NO: 38ACTGGTGCAA GTCGTGCCG Last Post NO: 38

gem T7gem T7

5`CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC СТАААТАААС TGCTTCGTGA5`CCAGCACCTC CGGCATGTGA UDPCGACTC STAAATAAAS TGCTTCGTGA

3`GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT3`GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT

CGACCACGTC CATCACGGC [69 п.о.] Посл.NO: 39CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] Last NO: 39

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG Посл.NO: 40GCTGGTGCAG GTAGTGCCG Last NO: 40

Пример 6Example 6

Ген лиганда mpl человекаHuman mpl ligand gene

Исходя из результатов, полученных, как описано в Примере 5, конструировали и синтезировали 45-мерный дезоксиолигонуклеотид, обозначенный pR45, для скрининга геномной библиотеки. Указанный 45-мер имел следующую последовательность:Based on the results obtained as described in Example 5, a 45-mer deoxy oligonucleotide designated pR45 was designed and synthesized for screening the genomic library. The specified 45-mer had the following sequence:

5’ GCC-GTG-AGG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3’ (Посл.NO: 28)5 ’GCC-GTG-AGG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3’ (LastNO: 28)

Этот олигонуклеотид подвергали 32Р-мечению с использованием (γ32P)-ATP и киназы Т4 и использовали для скрининга геномной ДНК-библиотеки в λgеm 12 в жестких условиях гибридизации и промывания (см. Пример 7). Положительные клоны собирали, бляшки очищали и анализировали путем рестрикционного картирования и Саузерн-блоттинга. Клон №4 отбирали для дополнительного анализа.This oligonucleotide was subjected to 32 P-labeling using (γ 32 P) -ATP and T4 kinase and used to screen the genomic DNA library in λgem 12 under stringent hybridization and washing conditions (see Example 7). Positive clones were collected, plaques were purified and analyzed by restriction mapping and Southern blotting. Clone No. 4 was selected for further analysis.

BamHl-Xbal-фрагмент (2,8 кв), который гибридизировался с 45-мером, субклонировали в вектор pBluescript SK-. Частичное ДНК-секвенирование этого клона осуществляли с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных к ДНК-последовательности свиного лиганда mpl. Полученная последовательность подтвердила, что была выделена ДНК, кодирующая человеческий гормон лиганда mpl свиньи. В этой последовательности был обнаружен рестрикционный EcoRl-сайт, что позволило авторам этой заявки выделить 390 п.о. -EcoRl-Xbal-фрагмент из 2,8кв-ВатН1-Xbal-фрагмента для его субклонирования в вектор pBluescript SK-.The BamHl-Xbal fragment (2.8 kb), which hybridized with the 45 mer, was subcloned into the pBluescript SK- vector. Partial DNA sequencing of this clone was carried out using oligonucleotide primers specific for the mpl porcine ligand DNA sequence. The obtained sequence confirmed that DNA encoding the human hormone of the pig mpl ligand was isolated. The restriction EcoRl site was found in this sequence, which allowed the authors of this application to isolate 390 bp -EcoRl-Xbal fragment from a 2.8 kb-WatH1-Xbal fragment for subcloning into the pBluescript SK- vector.

Обе нити этого фрагмента секвенировали. Человеческая ДНК-последовательность и выведенная аминокислотная последовательность показаны на фиг.9 (Посл. NOS 3 и 4). Предсказанные положения интронов в геномной последовательности также показаны стрелками и определяют предполагаемый экзон ("экзон 3").Both strands of this fragment were sequenced. The human DNA sequence and the deduced amino acid sequence are shown in FIG. 9 (Pos. NOS 3 and 4). The predicted positions of introns in the genomic sequence are also shown by arrows and determine the putative exon ("exon 3").

Исследование предсказанной аминокислотной последовательности подтвердило, что сериновый остаток является первой аминокислотой зрелого лиганда mpl, как было определено из прямого анализа аминокислотной последовательности. Предполагается, что непосредственно выше от этого кодона находится сигнальная последовательность, участвующая в секреции зрелого лиганда mpl. Область, кодирующая сигнальную последовательность, очевидно, прерывается интроном в положении нуклеотида 68.Examination of the predicted amino acid sequence confirmed that the serine residue is the first amino acid of the mature mpl ligand, as determined from direct amino acid sequence analysis. It is assumed that immediately above this codon is the signal sequence involved in the secretion of the mature mpl ligand. The region encoding the signal sequence is obviously interrupted by an intron at position 68 of the nucleotide.

Этот экзон, вероятно, оканчивается в положении нуклеотида 196 в направлении 3`. Поэтому этот экзон кодирует последовательность в 42 аминокислот, из которых 16, очевидно, являются частью сигнальной последовательности, а 26 являются частью зрелого лиганда inpl человека.This exon probably ends at position 196 in the 3` direction. Therefore, this exon encodes a 42 amino acid sequence, of which 16 are obviously part of the signal sequence, and 26 are part of the mature human inpl ligand.

Пример 7Example 7

Полноразмерная кДНК лиганда mpl человекаFull length human mpl ligand cDNA

Исходя из последовательности "экзон 3" человека (Пример 6) синтезировали два невырожденных олигонуклеотида, соответствующие 3`- и 5`-концам последовательности "экзон 3" (Таблица 6).Based on the human exon 3 sequence (Example 6), two non-degenerate oligonucleotides corresponding to the 3`- and 5`-ends of the exon 3 sequence were synthesized (Table 6).

Таблица 6Table 6

Невырожденные чел. кДНК-олигонуклеотидные PCR-праймерыNon-degenerate people cDNA oligonucleotide PCR primers

Прям.праймер: 5’GCT AGC TCT AGA ААТ TGC TCC TCG TGG ТСА TGC ТТС Т 3’Direct primer: 5’GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTS T 3 ’ Посл.NО: 43Last NO: 43 Обрати.праймер: 5’ CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3’Primer: 5 ’CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3’ Посл. NO: 44Last NO: 44

Эти два праймера были предназначены для полимеразной цепной реакции, которую проводили в условиях, описанных в Примере 5 с использованием в качестве матрицы ДНК от различных чел.кДНК-библиотек или 1 нг кДНК-клона (Quick DNA, Clonetech) от различных тканей. Ожидаемый размер правильного PCR-продуктов на 12%-ном полиакриламидном геле, ДНК-фрагмент ожидаемого размера был обнаружен в кДНК-библиотеках, полученных от почки взрослого индивидуума, из клеток фетальной почки 293 и ДНК, полученной из фетальной печени человека (Clonetech кат.№7171-1).These two primers were designed for polymerase chain reaction, which was carried out under the conditions described in Example 5 using DNA from different human cDNA libraries or 1 ng cDNA clone (Quick DNA, Clonetech) from various tissues as a template. The expected size of the correct PCR products on a 12% polyacrylamide gel, the DNA fragment of the expected size was found in cDNA libraries obtained from the kidney of an adult individual, from cells of a fetal kidney 293 and DNA obtained from a human fetal liver (Clonetech Cat.No. 7171-1).

кДНК-библиотеку от фетальной печени в DR2 (Clonetech кат. №Н 1151 х) скринировали с использованием того же самого 45-мерного олигонуклеотида, который был использован для скрининга геномной библиотеки. Олигонуклеотид метили (γ32Р)-АТР с использованием полинуклеотид-киназы Т4. Библиотеку скринировали в гибридизационных условиях низкой жесткости. Фильтры предварительно гибридизировали в течение 2 часов, а затем гибридизировали с зондом в течение ночи при 42°С в 20%-ном формамиде, 5×SSC, 10х растворе Денхардта, 0,05 М фосфата натрия (рН 6,5), 0,1% пирофосфате натрия, 50 мкг/мл обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося в течение 16 часов. Затем фильтры промывали в 2×SSC, а затем один раз в 0,5×SSC, 0,1% ДСН при 42°С. Фильтры экспонировали с рентгеновской пленкой (Kodak) в течение ночи. Положительные клоны собирали, бляшки очищали и размер вставки определяли посредством полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидов, фланкирующих BamHl-Xbal-франмент, клонированный в λ DR2 (Clonetech кат.№6475-1). В качестве источника матрицы использовали 5 мкл исходной фаговой культуры. Начальную денатурацию проводили 7 минут при 94°С с последующими 30 циклами амплификации (1 мин при 94°С, 1 мин при 52°С и 1,5 мин при 72°С). Конечное удлинение проводили в течение 15 минут при 72°С. Клон №FL2b имел 1,8 ко-вставку и был отобран для последующего анализа.The fetal liver cDNA library in DR 2 (Clonetech Cat. No. H 1151 x) was screened using the same 45-dimensional oligonucleotide that was used to screen the genomic library. The oligonucleotide was labeled with (γ 32 P) -ATP using T4 polynucleotide kinase. The library was screened under hybridization conditions of low stringency. The filters were pre-hybridized for 2 hours and then hybridized with the probe overnight at 42 ° C in 20% formamide, 5 × SSC, 10x Denhardt's solution, 0.05 M sodium phosphate (pH 6.5), 0, 1% sodium pyrophosphate, 50 μg / ml sonicated salmon sperm DNA for 16 hours. Then the filters were washed in 2 × SSC, and then once in 0.5 × SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. Filters were exposed to an X-ray film (Kodak) overnight. Positive clones were collected, plaques were purified, and insert size was determined by polymerase chain reaction using oligonucleotides flanking the BamHl-Xbal-France cloned in λ DR2 (Clonetech Cat. No. 6475-1). 5 μl of the original phage culture was used as the matrix source. Initial denaturation was carried out for 7 minutes at 94 ° C followed by 30 amplification cycles (1 min at 94 ° C, 1 min at 52 ° C and 1.5 min at 72 ° C). Final elongation was carried out for 15 minutes at 72 ° C. Clone No. FL2b had a 1.8 co-insert and was selected for further analysis.

"Спасение" плазмиды pDR2 (Clonetech, DR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p.42), содержащейся λ ВР2-фаговых плечах, осуществляли, как описано в инструкциях производителей (Clonetech, DR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p.29-30). Рестрикционный анализ плазмиды pDR2-FL2b, проведенный с использованием ферментов BamHl и Xbal, выявил присутствие рестрикционного BamHl-сайта внутри вставки приблизительно в положении 650. Гидролиз плазмиды ферментами BarnHl-Xbal разрезал вставку на два фрагмента, один 0,65 кв и один 1,15 кв. ДНК-последовательность определяли с использованием матрицы трех различных классов, происходящей от плазмиды pDR2-FL2b. ДНК-секвенирование двухцепочечной плазмидой ДНК осуществляли с помощью автоматического флуоресцентного ДНК-секвенатора АВ1373 (Applied Biosystems, Foster City, California) с использованием стандартной схемы секвенирования с применением меченных красителем дидезоксинуклеозидтрифосфат-терминаторов (краситель-терминатор) и синтезированных традиционным способом праймеров для "прогулки по геному" (Sanger et al., Proc. Nati.Acad.Sci. USA, 74: 5463-5467 [1977]; Smith et ai., Nature, 321: 674-679 [1986]). Прямое секвенирование PCR-амплифицированных фрагментов, полученных из плазмиды, осуществляли с помощью секвенатора АВ1373 с использованием обычных праймеров и меченый терминатор. Одноцепочечную матрицу генерировали с использованием вектора М13 Janus (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids res., 21: 3385-3390 [1993]). BamHI-Xbal (1,15 кв) - и BamHl (0,65 кв)-фрагменты выделяли из плазмиды pDR2, концы застраивали с помощью ДНК-полимеразы Т4 в присутствии дезоксинуклеотидов, а затем субклонировали в Smal-сайт М13 Janus. Секвенирование осуществляли в соответствии со стандартной методикой, предусматривающей использование меченных красителем универсального и обратного праймеров М13 либо праймеров для "прогулки по геному" и красителей-терминаторов. Обычное неавтоматическое секвенирование проводили в соответствии со стандартной методикой на одноцепочечной ДНК М13 с использование праймеров для "прогулки по геному" и традиционной техники дидезокси-терминации (Sanger et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 74: 5463-5467 [1977] с применением 32Р-меченного α-dATP и Секвеназы (United States Biochemical Corp. Cleveland, Ohio). Сборку ДНК-последовательности осуществляли с использованием секвенатора v2.1bl2 (Gene Codes Corporation. Ann Arbor, Michigan). Нуклеотидная и выведенная последовательности hML представлены на фиг.1 (Посл.NO: 1).The "salvation" of the pDR2 plasmid (Clonetech, DR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p.42) contained in the λ BP2 phage arms was carried out as described in the manufacturers instructions (Clonetech, DR2 & pDR2 cloning and Expression System Library Protocol Handbook, p.29-30). Restriction analysis of the pDR2-FL2b plasmid using BamHl and Xbal enzymes revealed the presence of the BamHl restriction site inside the insert at position 650. Hydrolysis of the plasmid by BarnHl-Xbal enzymes cut the insert into two fragments, one 0.65 kb and one 1.15 sq. The DNA sequence was determined using a matrix of three different classes, derived from plasmid pDR2-FL2b. DNA sequencing with double-stranded plasmid DNA was performed using an AB1373 automatic fluorescent DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California) using a standard sequencing scheme using dye-labeled dideoxynucleoside triphosphate terminators (terminator dye) and traditionally synthesized walking primers genome "(Sanger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 [1977]; Smith et ai., Nature, 321: 674-679 [1986]). Direct sequencing of PCR amplified fragments obtained from the plasmid was carried out using an AB1373 sequencer using conventional primers and labeled terminator. A single chain matrix was generated using the Janus M13 vector (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids res., 21: 3385-3390 [1993]). BamHI-Xbal (1.15 sq) and BamHl (0.65 sq) fragments were isolated from pDR2 plasmid, the ends were built using T4 DNA polymerase in the presence of deoxynucleotides, and then subcloned into Janus M13 Smal site. Sequencing was carried out in accordance with the standard method, which involves the use of dye-labeled universal and reverse primers M13 or primers for "walking along the genome" and dye terminators. Conventional non-automatic sequencing was performed according to the standard procedure on M13 single-stranded DNA using genome walk primers and the traditional dideoxy termination technique (Sanger et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 74: 5463-5467 [ 1977] using 32 P-labeled α-dATP and Sequenase (United States Biochemical Corp. Cleveland, Ohio). DNA sequence was assembled using a v2.1bl2 sequencer (Gene Codes Corporation. Ann Arbor, Michigan). Nucleotide and deduced sequences hML are presented in FIG. 1 (Ser.NO: 1).

Пример 8Example 8

Выделение гена лиганда mpl человека (ТРО)Isolation of the human mpl ligand gene (TPO)

Геномные чел. ДНК-клоны гена ТРО выделяли путем скрининга геномной библиотеки в X-Geml2 с использованием pR45, ранее описанного олигонуклеотидного зонда, а условиях низкой жесткости (см. Пример 7), либо в условиях высокой жесткости с использованием фрагмента, соответствующего 3’-половине чел.кДНК, кодирующей лиганд mpl (от BamHl-сайта до 3’-конца). Были выделены два перекрывающиеся клона лямбда протяженностью 35 ко. Два перекрывающиеся фрагмента (BamHl и EcoRl), содержащие полный ген ТРО, были субклонированы и секвенированы. Структура этого гена человека состояла из 6 экзонов в 7 ко. геномной ДНК (фиг.14А, В и С). Границы всех экзон-интронных сочленений соответствовали консенсусному элементу, установленному для генов млекопитающих (Shapiro M.B., Nucl.Acids Res. 15:7155 [1987]). Экзон 1 и экзон 2 содержат 5-нетранслируемую последовательность и начальные четыре аминокислоты сигнального пептида. Оставшийся секреторный сигнал и первые 26 аминокислот зрелого белка кодировались в экзоне 3. Полный карбокси-домен и 3’-нетранслируемая область, а также -50 аминокислоты эритропоэтин-подобного домена кодировали в экзоне 6.. Четыре аминокислоты, входящие в делецию, наблюдаемую в hML-2 (hTPO-2), кодировались в 5'-конце экзона 6.Genomic people TPO gene clones were isolated by screening the genomic library in X-Geml2 using pR45, the previously described oligonucleotide probe, under conditions of low stringency (see Example 7), or under high stringency conditions using a fragment corresponding to 3'-half of the person. cDNA encoding the mpl ligand (from the BamHl site to the 3'-end). Two overlapping 35 kb lambda clones were isolated. Two overlapping fragments (BamHl and EcoRl) containing the full TPO gene were subcloned and sequenced. The structure of this human gene consisted of 6 exons in 7 ko. genomic DNA (figa, b and C). The boundaries of all exon-intron joints corresponded to the consensus element established for mammalian genes (Shapiro M. B., Nucl. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Exon 1 and exon 2 contain a 5-untranslated sequence and the initial four amino acids of the signal peptide. The remaining secretory signal and the first 26 amino acids of the mature protein were encoded in exon 3. The complete carboxy domain and the 3'-untranslated region, as well as the -50 amino acids of the erythropoietin-like domain, were encoded in exon 6. Four amino acids included in the deletion observed in hML -2 (hTPO-2), encoded at the 5'-end of exon 6.

Пример 9Example 9

Кратковременная экспрессия лиганда mpl человека (hML)Short-term expression of the human mpl ligand (hML)

В целях субклонирования полноразмерной вставки, содержащейся в pDR2-FL2b, плазмиду полностью гидролизовали ферментом Xbal, а затем частично ферментом Bamhl. ДНК-фрагмент, соответствующий 1,8 ко-вставке подвергали гель-очистке и субклонировали в pRK5 (pRK5-hmpl 1) (см. Патент США №5258287 для конструирования pRK5) под контролем предраннего промотора цитомегаловируса. ДНК из конструкции pRK5-hmpl 1) получали REG-методом и трансфицировали в человеческие эмбриональные клетки почки 293, поддерживаемые в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), в которую были добавлены: питательная смесь F-12, 20 мМ Hepes (pH 7,4) и 10% фетальная коровья сыворотка. Клетки были трансфицированы кальцийфосфатным методом, как описано (Corman С. [1985] в DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., ed.) Vol.11, pp.143-190, IRL Press, Washington, D.C.). Через 36 часов после трансфекции супернатант трансфицированных клеток анализировали на пролиферативную активность (см. Пример 1). Супернатант клеток 293, трансфицированных лишь одним вектором pRK, не обнаруживал стимуляции ни клеток Ba/F3, ни клеток Ba/F3-mpl (фиг.12А). Супернатант от клеток, трансфицированных pRK5-hmpl 1, не дал какого-либо эффекта в отношении клеток Ba/F3, но обнаруживал значительную стимуляцию пролиферации клеток Ba/F3-mpl (фиг.12А), что свидетельствует о том, что эта кДНК кодирует функционально активный лиганд mpl человека.In order to subclone the full-size insert contained in pDR2-FL2b, the plasmid was completely hydrolyzed with the Xbal enzyme, and then partially with the Bamhl enzyme. The DNA fragment corresponding to the 1.8-insert was gel purified and subcloned into pRK5 (pRK5-hmpl 1) (see US Patent No. 5,258,287 for the construction of pRK5) under the control of the early cytomegalovirus promoter. DNA from the pRK5-hmpl construct 1) was obtained by the REG method and transfected into 293 human embryonic kidney cells, maintained in the Needle Dulbecco modified medium (DMEM), to which were added: F-12 nutrient mixture, 20 mM Hepes (pH 7 , 4) and 10% fetal cow serum. Cells were transfected with a calcium phosphate method as described (Corman C. [1985] in DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D.M., ed.) Vol. 11, pp. 143-190, IRL Press, Washington, D.C.). 36 hours after transfection, the supernatant of transfected cells was analyzed for proliferative activity (see Example 1). The supernatant of 293 cells transfected with only one pRK vector showed no stimulation of either Ba / F3 cells or Ba / F3-mpl cells (Fig. 12A). The supernatant from cells transfected with pRK5-hmpl 1 did not give any effect on Ba / F3 cells, but showed significant stimulation of proliferation of Ba / F3-mpl cells (Fig. 12A), which indicates that this cDNA encodes functionally active ligand of human mpl.

Пример 10Example 10

Изоформы hML2, hML3 и hML4 чел. лигандаIsoforms hML2, hML3 and hML4 people ligand

Для идентификации форм hML, продуцированных в результате альтернативного сплайсинга, синтезировали праймеры, соответствующие каждому концу кодирующей последовательности hML.To identify forms of hML produced by alternative splicing, primers were synthesized corresponding to each end of the hML coding sequence.

Эти праймеры использовали для ампликации РНК печени взрослого человека с помощью полимеразной цепной реакции при комнатной температуре (RT-PCR). Кроме того, были сконструированы и аналогичным образом использованы внутренние праймеры, фланкирующие выбранные нужные области (см. ниже). Прямое секвенирование концов PCR-продукта выявило одну последовательность, которая точно соответствовала последовательности кДНК, выделенной из библиотеки фетальной печени человека (см. фиг.1 (Посл.NO: 1)). Однако область, расположенная возле С-конца ЕРО-домена (в середине PCR-продукта), обнаруживала комплексные последовательности, позволяющие предположить существование вариантов возможного сплайсинга в этой области. Для выделения этих вариантов сплайсинга праймеры, проиллюстрированные в Таблице 7 и фланкирующие нужную область, были использованы в PCR в качестве матриц для кДНК печени взрослого человека.These primers were used to amplify adult human liver RNA using a room temperature polymerase chain reaction (RT-PCR). In addition, internal primers flanking selected desired regions were designed and similarly used (see below). Direct sequencing of the ends of the PCR product revealed one sequence that exactly corresponded to the cDNA sequence isolated from the human fetal liver library (see FIG. 1 (Ser.NO: 1)). However, the region located near the C-terminus of the EPO domain (in the middle of the PCR product) showed complex sequences suggesting the existence of variants of possible splicing in this region. To highlight these splice variants, the primers illustrated in Table 7 and flanking the desired region were used in PCR as matrices for adult human liver cDNAs.

Таблица 7Table 7

PCR-праймеры для выделения изоформы ML человекаPCR primers for isolating human ML isoforms

phmpllcdna.3е1: 5’ TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3’phmpllcdna.3е1: 5 ’TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3’ (Посл.NO 45)(Last NO 45) pbx4.f2: 5’ GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3’pbx4.f2: 5 ’GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3’ (Посл.NO 46)(Last NO 46)

PCR-продукты субклонировали по тупым концам в М13. Секвенирование отдельных субклонов выявило существование, по крайней мере, трех изоформ ML. Одна из них hML (обозначаемая также hML332) является самой длинной и точно соответствует последовательности, выделенной из библиотеки фетальной печени. Последовательности изоформ чел. лиганда mpl от самой длинной до самой короткой (hML-4) показаны на фиг.11 (Посл.NO 6, 8,9 и 10).PCR products were subcloned at blunt ends in M13. Sequencing of individual subclones revealed the existence of at least three ML isoforms. One of them, hML (also referred to as hML 332 ), is the longest and corresponds exactly to the sequence isolated from the fetal liver library. Sequences of isoforms the mpl ligand from longest to shortest (hML-4) is shown in FIG. 11 (Pos. NO 6, 8.9 and 10).

Пример 11Example 11

Конструирование и кратковременная экспрессия изоформ чел. лиганда Mpl и его вариантов замещения hML2, hML3 и hML (R153A, R154A)Design and short-term expression of isoforms Mpl ligand and its substitution variants hML2, hML3 and hML (R153A, R154A)

Изоформы hML2 и hML3 и субституционные варианты (варианты замещения) hML (R153A, R154A) конструировали из hML с использованием рекомбинантной PCR-техники, описанной Russell Higuchi, в PCR Protocols, A guide to Methods and Applications Acad. Press, M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.J.Sninsky & T.J.White Editors.The hML2 and hML3 isoforms and substitutional variants (substitution variants) of hML (R153A, R154A) were constructed from hML using the recombinant PCR technique described by Russell Higuchi in PCR Protocols, A guide to Methods and Applications Acad. Press, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Editors.

Во всех конструкциях "фланкирующие" праймеры были такими, как показано в Таблице 8, а "перекрывающиеся" праймеры были такими, как показано в Таблице 9.In all designs, the “flanking” primers were as shown in Table 8, and the “overlapping” primers were as shown in Table 9.

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Все PCR-ампликации проводили с использованием готовой к употреблению ДНК-полимеразы (Stratagene) при следующих условиях: начальную денатурацию матрицы осуществляли при 94°С в течение 7 минут, а затем проводили 30 циклов: 1 мин при 94°С; 1 мин при 55°С; 1,5 мин при 72°С. Конечный цикл продолжался 10 минут при 72°С. Полученный PCR-продукт гидролизовали Clal-Xbal-ферментами, подвергали очистке на геле и клонировали в pRK5tkneo. Клетки 293 трансфицировали различными конструкциями, описанными выше, а супернатант от этих клеток анализировали на пролиферацию Ba/F3-mpl. В этом анализе hML-2 и hML-3 не показали заметной активности, однако активность hML (R153A, R154A) оказалась аналогичной активности hML, что свидетельствует о том, что для активности не требуется процессинга в этом двухосновном сайте (см.фиг.13).All PCR amplifications were performed using ready-to-use DNA polymerase (Stratagene) under the following conditions: initial denaturation of the matrix was carried out at 94 ° C for 7 minutes, and then 30 cycles were performed: 1 min at 94 ° C; 1 min at 55 ° C; 1.5 min at 72 ° C. The final cycle lasted 10 minutes at 72 ° C. The resulting PCR product was hydrolyzed with Clal-Xbal enzymes, gel purified and cloned into pRK5tkneo. 293 cells were transfected with the various constructs described above, and the supernatant from these cells was analyzed for Ba / F3-mpl proliferation. In this analysis, hML-2 and hML-3 showed no noticeable activity, however, the activity of hML (R153A, R154A) turned out to be similar to the activity of hML, which indicates that activity does not require processing in this dibasic site (see Fig. 13) .

Пример 12Example 12

кДНК мышиного лиганда mpl, mML, mML-2, inML-3mouse ligand cDNA mpl, mML, mML-2, inML-3

Выделение кДНК mMLIsolation of cDNA mML

ДНК-фрагмент, соответствующий полной кодирующей области чел.лиганда mpl, получали с помощью PCR, а затем подвергали гель-очистке и мечению методом случайного праймирования в присутствии 32P-dATP и 32P-dCTP. Этот зонд использовали для скрининга кДНК-библиотеки от мышиной печени в GT10 (Clontech кат. №М 3001а). Дубликатные фильтры гибридизировали в 35% формамиде, 5×SSC, 10× растворе Денхардта, 0,1% ДСН, 0,05 М фосфате натрия (рН 6,5), 0,1% пирофосфате натрия, 100 мкг/мл обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, в присутствии зонда в течение ночи. Фильтры промывали в 2×SSC, а затем один раз промывали в 0,5×SSC, 0,1% ДСН при 42°С. Гибридизирующий фаг очищали методом бляшек, и кДНК-вставки сублокировали в EcoRl-сайт плазмиды Bluescript SK-. Клон "LD", содержащий 1,5 кb-вставку, отбирали для последующего анализа и обе нити секвенировали, как описано выше для чел. кДНК ML. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности клона LD представлены на фиг.14 (SEQ ID NOS 1 и 11). Выведенная последовательность зрелого ML от этого клона имела длину в 331 аминокислотных остатков и была идентифицирована как mМL331 (или mML-2 из соображений, указанных ниже). Значительная степень идентичности обеих нуклеотидной и выведенной аминокислотной последовательностей наблюдалась в ЕРО-подобном домене этих ML. Однако при сравнении выведенных первичных аминокислотных последовательностей человеческого и мышиного ML было обнаружено, что мышиная последовательность имеет делецию в четыре пептида, расположенную между чел. остатками 111-114, и соответствующую делецию в 12 нуклеотидов, расположенной за нуклеотидом в положении 618 и наблюдаемой в обеих как челов. (см. выше), так и свиной (см. ниже) кДНК. В связи с этим для обнаружения возможных мышиных ML-изоформ были исследованы дополнительные клоны. Один клон "14" имел 1,4 кb-вставку, соответствующую выведенной аминокислотной последовательности из 335 аминокислот, в которой отсутствовал тетрапептид LPLQ. Эта форма, которая, очевидно, является полноразмерным мышиным ML, была обозначена mML или mМL335. Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности для ML представлены на фиг.16 (SEQ ID NOS 12 и 13). И наконец, был выделен и секвенирован клон "12". Этот клон имел делецию в 116 нуклеотидов, соответствующую чел.МL3, а поэтому он был обозначен ML-3. Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей этих двух изоформ показано на фиг.16.A DNA fragment corresponding to the full coding region of the human mpl ligand was obtained by PCR and then gel purified and randomly labeled in the presence of 32 P-dATP and 32 P-dCTP. This probe was used to screen a cDNA library from mouse liver in GT10 (Clontech Cat. No. M 3001a). Duplicate filters were hybridized in 35% formamide, 5 × SSC, 10 × Denhardt's solution, 0.1% SDS, 0.05 M sodium phosphate (pH 6.5), 0.1% sodium pyrophosphate, 100 μg / sonicated DNA salmon sperm in the presence of a probe during the night. The filters were washed in 2 × SSC, and then washed once in 0.5 × SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. The hybridization phage were plaque-purified and cDNA inserts sublocated to the EcoRl site of the Bluescript SK- plasmid. Clone LD containing a 1.5 kb insert was selected for subsequent analysis and both strands were sequenced as described above for humans. cDNA ML. The nucleotide and deduced amino acid sequences of clone LD are shown in FIG. 14 (SEQ ID NOS 1 and 11). The derived sequence of mature ML from this clone was 331 amino acid residues in length and was identified as mML 331 (or mML-2 for reasons listed below). A significant degree of identity of both nucleotide and deduced amino acid sequences was observed in the EPO-like domain of these ML. However, when comparing the derived primary amino acid sequences of human and mouse ML, it was found that the mouse sequence has a deletion of four peptides located between people. residues 111-114, and a corresponding deletion of 12 nucleotides located behind the nucleotide at position 618 and observed in both as a human. (see above) and pork (see below) cDNA. In this regard, additional clones were investigated to detect possible murine ML isoforms. One clone “14” had a 1.4 kb insert corresponding to the derived 335 amino acid sequence in which the LPLQ tetrapeptide was absent. This form, which is obviously a full-sized murine ML, was designated mML or mML 335 . The nucleotide and deduced amino acid sequences for ML are shown in FIG. 16 (SEQ ID NOS 12 and 13). Finally, clone "12" was isolated and sequenced. This clone had a 116 nucleotide deletion corresponding to human ML3, and therefore it was designated ML-3. A comparison of the deduced amino acid sequences of these two isoforms is shown in FIG.

Экспрессия рекомбинантных mML.Expression of recombinant mML.

Экспрессирующие векторы для мышиного ML получали в основном, как описано в Примере 8. Клоны, кодирующие mMl и mML-2, субклонировали a pRK5-tkneo, экспрессирующий вектор млекопитающего, который обеспечивает экспрессию под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования SV40. Полученные экспрессирующие векторы. MMlpRKtkneo и mML2pRKtkneo были кратковременно трансфицированы в клетки 293 методом с использование фосфата кальция. После кратковременной трансфекции среды кондиционировали в течение пяти дней. Клетки поддерживали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и с добавленной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой.Mouse ML expression vectors were obtained mainly as described in Example 8. Clones encoding mMl and mML-2 were subcloned with a pRK5-tkneo, a mammalian expression vector that provides expression under the control of the CMV promoter and SV40 polyadenylation signal. The resulting expression vectors. MMlpRKtkneo and mML2pRKtkneo were briefly transfected into 293 cells using the calcium phosphate method. After a short transfection, the medium was conditioned for five days. Cells were maintained in high glucose DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.

Экспрессия мышиного mpl (mmpl) в клетках Ba/F3.Expression of mouse mpl (mmpl) in Ba / F3 cells.

Стабильные клеточные линии, экспрессирующие с-mpl, бьши получены путем трансфекции mmpl-pRKtkneo в основном так же, как описано в Примере 1 для человеческого mpl. Для этого экспрессирующий вектор (20 мкг, линеаризованный), содержащий полную последовательность, кодирующую mpl (Skoda R.C. et al., EMBO J. 12: 2645-2653 (1993)), трансфицировали в клетки Ba/F3 путем электропорации (5×106 клеток, 250 Вольт, 960 мкФ) с последующим отбором резистентности к неомицину с использованием 2 мг/мл G418. Экспрессию mpl оценивали посредством проточной цитометрии с использованием антисыворотки против мышиных mpl-IgG. Клетки Ba/F3 поддерживали в среде RPM1 1640 от клеток WEH1-3B, используемых в качестве источника 1L-3. Супернатанты от клеток 293, кратковременно трансфицированных обоими mML и mMl-2, анализировали в ВаF3-клетках, трансфицированных обоими mmpl и hrnpl, как описано в Примере 1.Stable cell lines expressing c-mpl were obtained by transfection of mmpl-pRKtkneo, basically the same as described in Example 1 for human mpl. For this, an expression vector (20 μg, linearized) containing the complete sequence encoding mpl (Skoda RC et al., EMBO J. 12: 2645-2653 (1993)) was transfected into Ba / F3 cells by electroporation (5 × 10 6 cells, 250 Volts, 960 uF) followed by selection of neomycin resistance using 2 mg / ml G418. The expression of mpl was evaluated by flow cytometry using antiserum against mouse mpl-IgG. Ba / F3 cells were maintained in RPM1 1640 medium from WEH1-3B cells used as a 1L-3 source. Supernatants from 293 cells transiently transfected with both mML and mMl-2 were analyzed in BaF3 cells transfected with both mmpl and hrnpl, as described in Example 1.

Пример 13Example 13

кДНК свиного лиганда mpl, pML и рМ1-2porcine ligand cDNA mpl, pML and pM1-2

кДНК свиного ML (pML) выделяли с помощью PACE-PCR. Для этого были сконструированы olioo dT-праймер и 2 специфических праймера исходя из последовательности экзона гена свиного ML, кодирующего амино-конец ML и выделенного из сыворотки свиньи с аплазией. Затем из различных тканей апластических свиней получали и амплифицировали кДНК. PCR-продукт кДНК, состоящий из 1342 п.о. и обнаруженный в ткани почки, был субклонирован. Несколько клонов было секвенировано, в результате чего было обнаружено, что они кодируют зрелый свиной лиганд mpl (не включая полный сигнал секреции). Было установлено, что кДНК кодирует 332 аминокислоты зрелого белка (pML332), имеющего последовательность, показанную на фиг.18 (SEQ ID NOS: 9 и 6).porcine ML cDNA (pML) was isolated using PACE-PCR. For this, an olioo dT primer and 2 specific primers were designed based on the exon sequence of the porcine ML gene encoding the amino terminus of ML and isolated from pig serum with aplasia. Then cDNA was obtained and amplified from various tissues of aplastic pigs. PCR cDNA product consisting of 1342 bp and found in kidney tissue, was subcloned. Several clones were sequenced, resulting in the discovery that they encode the mature porcine ligand mpl (not including the full secretion signal). It was found that cDNA encodes 332 amino acids of a mature protein (pML 332 ) having the sequence shown in FIG. 18 (SEQ ID NOS: 9 and 6).

МетодMethod

Выделение гена pML и кДНК.Isolation of the pML gene and cDNA.

Геномные клоны гена свиного ML были выделены путем скрининга геномной библиотеки свиньи в EMBL3 (Clontech Inc.) с pR45. Библиотеку скринировали методом, в основном описанном в Примере 7. Несколько клонов было выделено и экзон, кодирующий аминокислотную последовательность, идентичную последовательности, полученной из очищенного ML, секвенировали. КДНК свиного ML получали в соответствии с модифицированной схемой для PAGE-PCR. Исходя из последовательности свиного гена ML были сконструированы два ML-специфических праймера. Полиаденилированную МРНК выделяли из почечной ткани апластических свиней, как описано выше. КДНК получали путем обратной транскрипции с использованием BamdT-праймера:Genomic clones of the porcine ML gene were isolated by screening the porcine genomic library in EMBL3 (Clontech Inc.) with pR45. The library was screened by the method mainly described in Example 7. Several clones were isolated and an exon encoding the amino acid sequence identical to the sequence obtained from purified ML was sequenced. Swine ML cDNA was prepared according to a modified scheme for PAGE-PCR. Based on the sequence of the porcine ML gene, two ML-specific primers were designed. Polyadenylated mRNA was isolated from renal tissue of aplastic pigs, as described above. The cDNA was obtained by reverse transcription using a BamdT primer:

(BamdT: 5’ GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3’(BamdT: 5 ’GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3’

(Посл. NO: 55),(Serial NO: 55),

направленного против полиаденозин-хвоста мРНК. Начальную серию PCR-амплификации (28 циклов в течение 60 сек при 95°С, в течение 60 сек при 58°С и в течение 90 сек при 72°С) проводили с использованием Мг-специфического прямого праймераdirected against the polyadenosine tail of mRNA. The initial series of PCR amplification (28 cycles for 60 sec at 95 ° C, for 60 sec at 58 ° C and for 90 sec at 72 ° C) was performed using Mg-specific direct primer

(h-forward-1: 5’ GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3’)(h-forward-1: 5 ’GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT 3’)

(Посл. NO: 43)(Last NO: 43)

и праймера BAMADand primer BAMAD

(BAMAD: 5’ GACTCGAGGATCCATCG 3’)(BAMAD: 5 ’GACTCGAGGATCCATCG 3’)

(Посл. NO: 56)(Last NO: 56)

в 100 мл реакционной смеси (50 мМ КСl, 1,5 VgCl, 10 мМ Трис, рН 8,0, 0,2 мМ dNTPs и 0,05 ед./мл полимеразы Perkin (Elmer Amplitaqst)). Затем PCR-продукт гидролизовали ферментом Clal, экстрагировали фенолом-хлороформом (1:1), осаждали этанолом и лигировали в вектор Bluescript (0,1 мг) (Stratagene Inc.), который был разрезан ферментами Clal и Kpnl. После 2-часового инкубирования при комнатной температуре одну четвертую смеси для лигирования добавляли непосредственно во вторую серию PCR (22 цикла, как описано выше), проводимую с использованием второго ML-специфического праймера forward-1.in 100 ml of the reaction mixture (50 mm KCl, 1.5 VgCl, 10 mm Tris, pH 8.0, 0.2 mm dNTPs and 0.05 units / ml Perkin polymerase (Elmer Amplitaqst)). The PCR product was then hydrolyzed with Clal enzyme, extracted with phenol-chloroform (1: 1), precipitated with ethanol and ligated into a Bluescript vector (0.1 mg) (Stratagene Inc.), which was cut with Clal and Kpnl enzymes. After 2 hours of incubation at room temperature, one fourth of the ligation mixture was added directly to the second series of PCR (22 cycles, as described above), carried out using the second ML-specific forward-1 primer.

(forward-1: 5’ GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3’(forward-1: 5 ’GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3’

(Посл. NO: 57)(Last NO: 57)

и Т3-21 (олигонуклеотид, который связывается с последовательностью, смежной с областью множественного клонироания в векторе Bluescript SK-):and T3-21 (an oligonucleotide that binds to a sequence adjacent to the multiple cloning region in the Bluescript SK- vector):

(5’ CGAAATTAACCCTCACTAAAG 3’(5 ’CGAAATTAACCCTCACTATAAG 3’

(Посл. NO: 58)(Last NO: 58)

Полученный PCR-продукт гидролизовали ферментами Xbal и Clal и субклонировали в Bluescript SK-. Несколько клонов от независимых PCR-реакцией секвенировали.The resulting PCR product was hydrolyzed with Xbal and Clal enzymes and subcloned into Bluescript SK. Several clones from independent PCRs were sequenced.

И снова идентифицировали вторую форму (обозначенную pML-2), кодирующую белок с делецией в 4 аминокислотных остатка (328 аминокислотных остатков) (см. фиг.21 (SEQ ID NO: 21)). Сравнение аминокислотных последовательностей pML и pML-2 показало, что эти последовательности являются идентичными за исключением того, что в форме pML-2 отсутствует тетрапептид QLPP, соответствующий остаткам 111-114, которые были делетитрованы (см. фиг.22 (SEQ ID NOS: 18 и 21)). Таким образом, делеции из 4 аминокислот наблюдались в мышиной, человеческой и свиной кДНК, причем в тех же самых положениях предсказанных белков.And again identified the second form (designated pML-2) encoding a protein with a deletion of 4 amino acid residues (328 amino acid residues) (see Fig.21 (SEQ ID NO: 21)). Comparison of the amino acid sequences pML and pML-2 showed that these sequences are identical except that in the form of pML-2 there is no QLPP tetrapeptide corresponding to residues 111-114 that were deleted (see FIG. 22 (SEQ ID NOS: 18 and 21)). Thus, deletions of 4 amino acids were observed in mouse, human and porcine cDNA, moreover, in the same positions of the predicted proteins.

Пример 14Example 14

Анализ клеток СМК на ТРО (тромбопоэтин) - индуцирование экспрессии тромбоцитарного антигена GPIIbIIIa Analysis of QMS cells for TPO (thrombopoietin) - inducing the expression of platelet antigen GPII b III a

Клетки СМК поддерживали в среде RMPI 1640 (Sigma), в которую были добавлены 10%-ная фетальная коровья сыворотка и 10 мМ глутамина. Для получения препаратов для анализа клетки собирали, промывали и ресуспендировали при плотности 5×105 кл./мл в бессывороточной среде GIF, в которую было добавлено 5 мг/л коровьего инсулина, 10 мг/л апо-трансферрина, 1х микроэлементов. Затем в каждую лунку плоскодонного 96-луночного планшета добавляли стандартный ТРО или экспериментальные образцы при соответствующем разведении в 100 мкл объемах. После этого, в каждую лунку добавляли 100 мкл СМК-клеточной суспензии и планшеты инкубировали в течение 48 часов в инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% CO2. После инкубирования планшеты подвергали центрифугированию при 1000 об/мин при 4°С в течение 5 минут. Супернатанты отбрасывали и в каждую лунку, добавляли FITC-конъюгированное (FITC-флюоресцеинизотиоцианат) моноклональное антитело 2D2 к GPIIbIIIa. После 1-часового инкубирования при 4°С планшеты снова центрифугировали при 100 об/мин в течение 5 минут. Супернатанты, содержащие несвязанные антитела, отбрасывали и в каждую лунку добавляли 200 мкл 0,1% BSA-PBS-промывки. Стадию промывки 0,1% BSA-PBS повторяли три раза. Затем клетки анализировали FASCAN с использованием стандартного однопараметрического анализа с измерением относительной интенсивности флюоресценции.QMS cells were maintained in RMPI 1640 medium (Sigma), to which 10% fetal bovine serum and 10 mM glutamine were added. To obtain preparations for analysis, cells were harvested, washed and resuspended at a density of 5 × 10 5 cells / ml in serum-free GIF medium, to which 5 mg / l of cow insulin, 10 mg / l of apo-transferrin, 1 x trace elements were added. Then, standard TPO or experimental samples were added to each well of a flat-bottomed 96-well plate with appropriate dilution in 100 μl volumes. Thereafter, 100 μl of QMS cell suspension was added to each well and the plates were incubated for 48 hours in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 . After incubation, the plates were centrifuged at 1000 rpm at 4 ° C for 5 minutes. Supernatants were discarded and in each well, FITC conjugated (FITC fluorescein isothiocyanate) monoclonal antibody 2D2 to GPII b III a was added. After 1 hour incubation at 4 ° C., the plates were again centrifuged at 100 rpm for 5 minutes. The supernatants containing unbound antibodies were discarded and 200 μl of 0.1% BSA-PBS wash was added to each well. The washing step of 0.1% BSA-PBS was repeated three times. Cells were then analyzed by FASCAN using standard one-parameter analysis measuring relative fluorescence intensity.

Пример 15Example 15

Анализ клеток DAMI на тромбопоэтин (ТРО) путем измерения эндомитотической активности этих клеток на 96-луночных планшетах для микротитрованияAnalysis of DAMI cells for thrombopoietin (TPO) by measuring the endomitotic activity of these cells in 96-well microtiter plates

Клетки DAMI поддерживали в среде IMDM + 10% лошадиной сыворотки (Gibco) с добавлением в эту среду 10 мМ глутамина, 100 нг/мл пенициллина G и 50 мкг/мл стрептомицина. Для получения препаратов для анализа клетки собирали. Промывали и ресуспендировали (при плотности 1×106 кл./мл) в IMDM + 1% лошадиной сыворотки. К DAMI-клеточной суспензии в 96-луночном круглодонном планшете добавляли 100 мкл ТРО-стандарта или экспериментальных образцов. Затем клетки инкубировали в течение 48 часов при 37°С в инкубаторе в присутствии 5% СО2. После инкубирования планшеты подвергали центрифугированию на центрифуге Sorvall 6000B при 1000 об/мин в течение 5 минут при 4°С. Супернатанты отбрасывали и повторяли стадию промывки 200 микролитрами PBS-0,1% BSA. Затем клетки фиксировали путем добавления 200 мкл охлажденного льдом 70% этанола-РВ и ресуспендировали путем аспирации. После 15 минут инкубирования при 4°С планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут и в каждую лунку добавляли 150 мкл 1 мг/мл РНКазы, содержащие 0,1 мг/мл пропидийиодида и 0,05% Твина 20. После 1-часового инкубирования при 37°С оценивали изменения в составе ДНК с помощью проточной цитометрии. Количественное измерение полиплоидии проводили по следующему уравнениюDAMI cells were maintained in IMDM + 10% horse serum (Gibco) supplemented with 10 mM glutamine, 100 ng / ml penicillin G and 50 μg / ml streptomycin. To obtain preparations for analysis, cells were harvested. Washed and resuspended (at a density of 1 × 10 6 cells / ml) in IMDM + 1% horse serum. To a DAMI cell suspension in a 96-well round-bottom plate was added 100 μl of TPO standard or experimental samples. Then the cells were incubated for 48 hours at 37 ° C in an incubator in the presence of 5% CO 2 . After incubation, the plates were centrifuged on a Sorvall 6000B centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The supernatants were discarded and the washing step was repeated with 200 microliters of PBS-0.1% BSA. The cells were then fixed by adding 200 μl of ice-cold 70% ethanol-RV and resuspended by aspiration. After 15 minutes of incubation at 4 ° C, the plates were centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes and 150 μl of 1 mg / ml RNase containing 0.1 mg / ml propidium iodide and 0.05% Tween 20 were added to each well. After 1 -hour incubation at 37 ° C evaluated changes in the composition of DNA using flow cytometry. Quantitative measurement of polyploidy was carried out according to the following equation

Нормализованный коэффициент полиплоидии (NPR)=Normalized Polyploidy Ratio (NPR) =

Figure 00000006
Figure 00000006

Пример 16Example 16

Тромбопоэтин (ТРО) в in vivo-анализе (анализ на повторное связывание мышиных тромбоцитов)Thrombopoietin (TPO) in an in vivo assay (mouse platelet re-binding assay)

In vivo-анализ для определения (35S) продуцирования тромбоцитовIn vivo assay to determine ( 35 S) platelet production

Мышам C57BL6 (полученным из Charies River) инъецировали внутрибрюшинно (IP) 1 мл козьей антисыворотки против мышиных тромбоцитов (6 амп.) (на день 1) для продуцирования тромбоцитопении. На дни 5 и 6 мышам вводили две внутрибрюшинные инъекции фактора или PBS для контроля. На день 7 мышам вводили внутрибрюшинно инъекцию 30 мкКи Na 35 2 SO4 в 0,1 мл физиологического раствора, после чего в пробах крови, полученных от обработанных и контрольных мышей, подсчитали процент включения 35S из инъецированной дозы в циркулирующие тромбоциты. Подсчет тромбоцитов и подсчет лейкоцитов в пробах крови, полученных из задней глазничной полости (ретроорбитального синуса), проводили в одно и то же время.C57BL6 mice (obtained from Charies River) were injected intraperitoneally (IP) with 1 ml of goat anti-mouse platelet antiserum (6 amp.) (On day 1) to produce thrombocytopenia. On days 5 and 6, mice were given two intraperitoneal injections of factor or PBS for control. On day 7, mice were given an intraperitoneal injection of 30 μCi Na 35 2 SO 4 in 0.1 ml of physiological saline, after which the percentage of inclusion of 35 S from the injected dose into circulating platelets was calculated in blood samples obtained from treated and control mice. Platelet counts and leukocyte counts in blood samples obtained from the posterior orbital cavity (retroorbital sinus) were performed at the same time.

Пример 17Example 17

KIRA-ELISА-анализ на тромбопоэтин, проводимый путем измерения фосфорилирования mpl-Rse.gD-химерного рецептораKIRA-ELISA thrombopoietin assay by measuring the phosphorylation of mpl-Rse.gD chimeric receptor

Рецептор чел. mрl был описан Vigon и др. (PNAS, USA, 89: 5640-5644 91992)). Для использования в KIRA-ELISA-анализе, описанном в настоящей заявке, конструировали химерный рецептор, содержащий внеклеточный домен (ECD) рецептора mpl и трансмембранный (ТМ) и внутриклеточный (ICD) домены Rse (Mark et al., J. of Biol. Chem. 269(14): 10720-10728 (1994)). С карбокси-концевым флагеллярным полипептидом (т.е. Rse.gD). См. фиг.30 и 31, представленные для схематического описания анализа.Receptor people mpl has been described by Vigon et al. (PNAS, USA, 89: 5640-5644 91992)). For use in the KIRA-ELISA assay described herein, a chimeric receptor was constructed containing the extracellular domain (ECD) of the mpl receptor and the transmembrane (TM) and intracellular (ICD) Rse domains (Mark et al., J. of Biol. Chem 269 (14): 10720-10728 (1994)). With a carboxy-terminal flagellar polypeptide (i.e., Rse.gD). See FIGS. 30 and 31 presented for a schematic description of the analysis.

(a) Получение захватывающего агента(a) Obtaining an exciting agent

Моноклональное антитело к gD (клон 5В6) было продуцировано против пептида, гликопротеина D, вируса простого герпеса (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 [1990]). Очищенный исходный препарат доводили до концентрации 3,0 мг/мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), рН 7,4 и 1/0 мл-аликвоты хранили при -20°С.A monoclonal antibody to gD (clone 5B6) was produced against the peptide, glycoprotein D, herpes simplex virus (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6): 547-553 [1990]). The purified starting preparation was adjusted to a concentration of 3.0 mg / ml in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 and 1/0 ml aliquots were stored at -20 ° C.

(b) Получение антитела против фосфотирозина(b) Obtaining antibodies against phosphotyrosine

Моноклональное антитело против фосфотирозина (клон 4G10) закупали у UBI (Lake Placid NY) и биотинилировали с использованием высокоразветвленного биотин-N-гидроксисукцинамида (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, ОН)Monoclonal anti-phosphotyrosine antibody (clone 4G10) was purchased from UBI (Lake Placid NY) and biotinylated using highly branched biotin-N-hydroxysuccinamide (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH)

(с) Лиганд(c) Ligand

Лиганд mpl получали с использованием техники рекомбинантных ДНК, описанной в настоящей заявке. Очищенный лиганд mpl хранили в виде маточного раствора при 4°С.The mpl ligand was obtained using the recombinant DNA technique described in this application. The purified mpl ligand was stored as a mother liquor at 4 ° C.

(d) Получение нуклеиновой кислоты Rse.gD(d) Obtaining nucleic acid Rse.gD

Синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды были использованы для реконстрирования последовательности, кодирующей С-концевые 10 аминокислот (880-890) чел-Rse с добавлением еще 21 аминокислоты, содержащих эпитоп для антитела 5В6 и стоп-кодон. В Таблице 10 представлена конечная последовательность синтезированной части гибридного генаSynthetic double-stranded oligonucleotides were used to reconstruct the sequence encoding the C-terminal 10 amino acids (880-890) cel-Rse with the addition of another 21 amino acids containing the epitope for 5B6 antibody and a stop codon. Table 10 presents the final sequence of the synthesized portion of the hybrid gene

Figure 00000007
Figure 00000007

Синтетические ДНК лигировали с кДНК, кодирующей аминокислоты 1-880 чел-Rse, в Pstl-сайте, начинающегося с нуклеотида 2644, опубликованной кДНК-последовательности чел-Rse (Mark et al. Journal of Biological Chem. 269(14): 10720-10728, и Hindl I-сайты в полилинкере экспрессирующего вектора pSV17.ID.LL (см. фиг.32 A-L; SEQ ID NO: 22), для создания экспрессирующей плазмиды pSV17.ID.Rse.gD. Короче говоря, экспрессирующая плазмида включает в себя дицистронный первичный транскрипт, который содержит последовательность, кодирующую DHFR и ограниченную 5'-сайтом сплайсинта (донорным сайтом) и 3'-сайтом сплайсинга (акцепторным сайтом), а за этой последовательностью находится последовательность, которая кодирует Rse.gD. Полноразмерный (несплайсированный) транскрипт содержит DHFR в качестве первой открытой рамки считывания, а поэтому продуцирует белок DHFR, что позволяет проводить отбор стабильных трансформантов.Synthetic DNAs were ligated with cDNA encoding amino acids 1-880 cel-Rse at the Pstl site starting at nucleotide 2644, published cdel-cse Rse cDNA sequence (Mark et al. Journal of Biological Chem. 269 (14): 10720-10728 and Hindl I sites in the polylinker of the expression vector pSV17.ID.LL (see FIG. 32 AL; SEQ ID NO: 22) to create the expression plasmid pSV17.ID.Rse.gD. In short, the expression plasmid includes a dicistronic primary transcript that contains a sequence encoding DHFR and limited to the 5'-site of the splicint (donor site) and 3'-site of splicing (a acceptor site), and for this sequence is a sequence which encodes the Rse.gD. The full length (unspliced) transcripts contains DHFR as the first open reading frame, and therefore produces a protein DHFR, which allows for selection of stable transformants.

(е) Получение нуклеиновой кислоты mpl-Rse.gD(e) Obtaining nucleic acid mpl-Rse.gD

Экспрессирующую плазмиду pSV.ID.Rse.gD., продуцированную как описано выше, модифицировали в целях получения плазмиды pSV. ID.M.tmRd.6, которая содержит кодирующую последовательность ECD чел.mрl (аминокислоты 1-491), соединенную с трансмембранным доменом и внутриклеточным доменом Rse.gD (аминокислоты 429-911). Для присоединения кодирующей последовательности части внеклеточного домена чел.mрl к кодирующей последовательности части Rse проводили двухстрадийную реакцию клонирования посредством PCR с использованием синтетических олигонуклеотидов, как описано Mark и др. (J. Biol. Chem. 267: 26166-26171 91992)). Праймерами, использованными в первой PCR-реакции, были: M1The expression plasmid pSV.ID.Rse.gD., produced as described above, was modified to obtain the plasmid pSV. ID.M.tmRd.6, which contains the coding sequence of ECD people.mrl (amino acids 1-491), connected to the transmembrane domain and the intracellular domain Rse.gD (amino acids 429-911). To attach the coding sequence of a part of the extracellular domain of cel.mrl to the coding sequence of a part of Rse, a two-stage cloning reaction was performed by PCR using synthetic oligonucleotides as described by Mark et al. (J. Biol. Chem. 267: 26166-26171 91992)). The primers used in the first PCR reaction were: M1

(5’ TCTCGCTACCGTTTACAG 3’)(5 ’TCTCGCTACCGTTTACAG 3’)

(Посл. NO: 61)(Last NO: 61)

и М2and M2

(5’ CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT 3’)(5 ’CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT 3’)

(Посл. NO: 62)(Last NO: 62)

с mpl-кДНК-матрицей; и R1with mpl cDNA template; and R1

(5’ GGGCCATGACACTGTCAA 3’)(5 ’GGGCCATGACACTGTCAA 3’)

(Посл. NO: 63)(Last NO: 63)

и R2and R2

(5’ GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT 3’)(5 ’GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT 3’)

(Посл. NO: 64)(Last NO: 64)

с Rse-кДНК-матрицей. Pvull-Smal-фрагмент этого участка соединения использовали для конструирования полноразмерного химерного рецептора.with an Rse cDNA template. A pvull-Smal fragment of this portion of the compound was used to construct a full-sized chimeric receptor.

(f) Трансформация клеток(f) Transformation of cells

Плазмиду pSV. ID.M. tmRd.6, которая была линеаризована в уникальном Notl-сайте в плазмидном остове, вводили в клетки DP12.CHO (ЕР 307247, опубликованный 15 марта 1989) путем электропорации. После экстракции фенолом/хлороформом ДНК осаждали этанолом и ресуспендировали в 20 мкл 1/10 Трис-ЭДТК. Затем 10 мкг ДНК инкубировали с 107 клетками СНО Р12 в 1 мл PBS на льду в течение 10 минут, после чего подвергали электропорации при 400 Вольт и 330 мкФ. Клетки возвращали на 10 минут на лед, а затем высевали на неселективную среду. Через 24 часа, клетки переносили на среду, не содержащую нуклеозид, для отбора на стабильные DHFR+-клоны.Plasmid pSV. ID.M. tmRd.6, which was linearized at a unique Notl site in the plasmid backbone, was introduced into DP12.CHO cells (EP 307247, published March 15, 1989) by electroporation. After extraction with phenol / chloroform, the DNA was precipitated with ethanol and resuspended in 20 μl 1/10 Tris-EDTA. Then, 10 μg of DNA was incubated with 10 7 CHO P12 cells in 1 ml of PBS on ice for 10 minutes, after which it was electroporated at 400 Volts and 330 μF. Cells were returned for 10 minutes to ice, and then plated on non-selective medium. After 24 hours, the cells were transferred onto a nucleoside-free medium for selection on stable DHFR + clones.

(g) Отбор трансформированных клеток для использования в KIRA-ELISA(g) Selection of transformed cells for use in KIRA-ELISA

Клоны, экспрессирующие MPL/Rse.gD, идентифицировали путем Вестерн-блоттинга цельных клеточных лизатов после фракционирования с помощью ДСН-ПААГ с использованием антитела 5В6, которое обнаруживает метку эпитопа gD.Clones expressing MPL / Rse.gD were identified by Western blotting of whole cell lysates after fractionation using SDS-PAGE using 5B6 antibody, which detects a gD epitope tag.

(h) Среды(h) Wednesdays

Клетки культивировали в F12/DMEM (Gibco/BPL, Life Technologies, Grand Island, NY). В эти среды добавляли 10% диафильтрованного FBS (HyClone, Logan, Utah), 25 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина.Cells were cultured in F12 / DMEM (Gibco / BPL, Life Technologies, Grand Island, NY). 10% diafiltered FBS (HyClone, Logan, Utah), 25 mM HEPES and 2 mM L-glutamine were added to these media.

(i) KIRA-ELISA(i) KIRA-ELISA

Mpl-Rse.gD-трансформированные клетки DP12.CHO высевали в лунки (3×104 клеток на лунку) плоскодонного 96-луночного планшета в 100 мкл среды и культивировали в течение ночи при 37°С в 5% СO2. На следующее утро, супернатанты декантировали, а планшеты слегка промокали бумажной салфеткой. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл среды, содержащей либо экспериментальные образцы, либо 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78, 0,19, 0,048 или 0 нг/мл лиганда mpl. Клетки стимулировали в течение 30 минут при 37°С, супернатанты декантировали, а планшеты еще раз слегка промокали бумажной салфеткой. Для лизиса клеток и солюбилизации химерных рецепторов в каждую лунку добавляли 100 мкл буфера для лизиса. Буфер для лизиса состоял из 150 мМ NaCl, содержащего 50 мМ HEPES (Gibco), 0/5% Тритон-Х (Gibco), 0,01% тимерозал, 30 КИЕ/мл апротинина (ICN Biochemicals, Aurora, ОН), 1 мМ 4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонилфторида гидрохлорида (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 мкМ лейпептина (ICN Biochemicals) и 2 мМ ортованадата натрия (Na3VO4; Sigma Chemicals Co, St. Lous, MO), pH 7,5. Затем планшеты слегка размешивали на шейкере для планшетов (Belico, Instruments, Vineland, NJ) в течение 60 минут при комнатной температуре.Mpl-Rse.gD-transformed DP12.CHO cells were seeded into wells (3 × 10 4 cells per well) of a flat-bottomed 96-well plate in 100 μl of medium and cultured overnight at 37 ° C in 5% CO 2 . The next morning, the supernatants were decanted, and the tablets were slightly blotted with a paper towel. Then, 50 μl of medium containing either experimental samples or 200, 50, 12.5, 3.12, 0.78, 0.19, 0.048 or 0 ng / ml mpl ligand was added to each well. Cells were stimulated for 30 minutes at 37 ° C, the supernatants were decanted, and the plates were again slightly blotted with a paper towel. For cell lysis and solubilization of chimeric receptors, 100 μl of lysis buffer was added to each well. Lysis buffer consisted of 150 mM NaCl containing 50 mM HEPES (Gibco), 0/5% Triton-X (Gibco), 0.01% thimerosal, 30 KIU / ml aprotinin (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 μM leupeptin (ICN Biochemicals) and 2 mM sodium orthovanadate (Na 3 VO 4 ; Sigma Chemicals Co, St. Lous, MO), pH 7.5 . The plates were then lightly stirred on a plate shaker (Belico, Instruments, Vineland, NJ) for 60 minutes at room temperature.

Когда клетки были солюбилизированы, ELISA-микропланшеты (Nunc Maxis, Inter Med, Denmark), сенсибилизированные в течение ночи при 4°С моноклональным антителом 5В6 против gD (5,0 мкг/мл в 50 мМ карбонатного буфера, рН 9,6, 100 мкл/лунка), декантировали, промокали бумажной салфеткой и блокировали 150 мкл/лунка блокирующим буфером (PBS, содержащим 0,5% BSA (Intergen Company, Purchase, NJ) и 0,01% тимерозал) в течение 60 минут при комнатной температуре с легким помешиванием. Через 60 минут анти-gD5В6-сенсибилизированные планшеты промывали 6 раз промывочным буфером (PBS, содержащим 0,05% Твин-20 и 0,01% тимерозал) с использованием автоматического устройства планшетов (ScanWasher 300, Skatron Insrtuments, Inc., Sterling, VA).When cells were solubilized, ELISA microplates (Nunc Maxis, Inter Med, Denmark) sensitized overnight at 4 ° C with anti-gD 5B6 monoclonal antibody (5.0 μg / ml in 50 mM carbonate buffer, pH 9.6, 100 μl / well), decanted, blotted with a paper towel and blocked with 150 μl / well with blocking buffer (PBS containing 0.5% BSA (Intergen Company, Purchase, NJ) and 0.01% thimerosal) for 60 minutes at room temperature with stirring lightly. After 60 minutes, anti-gD5B6-sensitized plates were washed 6 times with wash buffer (PBS containing 0.05% Tween-20 and 0.01% thimerosal) using an automatic plate device (ScanWasher 300, Skatron Insrtuments, Inc., Sterling, VA) )

Лизат, содержащий солюбилизированный MPL/Rse.gD, переносили из культурального планшета для микротитрования в анти-gD 5В6-сенсибилизированные и блокированные ELISA-лунки (85 мкл/лунка) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, слегка помешивая. Несвязанные mpl-Rse.gD удаляли путем промывания промывочным буфером и в каждую лунку добавляли 100 мкл биотинилированных 4G10 (против фосфотирозина), разведенных 1:18000 в буфере для разведения (PBS, содержащем 0,5% BSA, 0,05% Твин-20, 5ММ EDTA и 0,01% тимерозал), т.е. 56 нг/мл. После 2-часового инкубирования при комнатной температуре планшеты промывали и в каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена (НРРО) стрептавидина (Zymed Laboratores, S. San Francisco, CA), разведенного в соотношении 1:60000 в буфере для разведения. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, слегка помешивая при этом. Свободный авидиновый конъюгат отмывали и в каждую лунку добавляли 100 мкл свежеприготовленного субстратного раствора (тетраметилбензидин) (ТМВ); 2-компонентный субстратный набор; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD). Смесь оставляли на 10 минут для протекания реакции, после чего развитие окраски прекращали путем добавления 100 мкл/лунка 1,0 М Н3РО4. Оптическую плотность при 450 нм определяли по сравнению с оптической плотностью при 650 нм (АВ450/650) с использованием планшет-ридера (vmax) (Molecular Devices, palo Alto, CA), контролируемого Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) и программным обеспечением Deltasoft (Biometallics, Inc., Princeton, NJ).The lysate containing solubilized MPL / Rse.gD was transferred from the microtiter culture plate to anti-gD 5B6 sensitized and blocked ELISA wells (85 μl / well) and incubated for 2 hours at room temperature, stirring slightly. Unbound mpl-Rse.gD was removed by washing with washing buffer, and 100 μl of biotinylated 4G10 (anti-phosphotyrosine) diluted 1: 18000 in dilution buffer (PBS containing 0.5% BSA, 0.05% Tween-20) was added to each well. 5MM EDTA and 0.01% thimerosal), i.e. 56 ng / ml. After 2 hours of incubation at room temperature, the plates were washed and 100 μl of horseradish peroxidase conjugated streptavidin (Zymed Laboratores, S. San Francisco, Calif.) Diluted 1: 60,000 in dilution buffer was added to each well. The plates were incubated for 30 minutes at room temperature, while stirring slightly. The free avidin conjugate was washed and 100 μl of a freshly prepared substrate solution (tetramethylbenzidine) (TMB) was added to each well; 2-component substrate kit; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD). The mixture was left for 10 minutes for the reaction to proceed, after which the development of color was stopped by adding 100 μl / well of 1.0 M H 3 PO 4 . The optical density at 450 nm was determined compared to the optical density at 650 nm (AB 450/650 ) using a tablet reader (vmax) (Molecular Devices, palo Alto, CA) controlled by a Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) and Deltasoft software (Biometallics, Inc., Princeton, NJ).

Стандартную кривую строили путем стимулирования клеток dp12.trkA,B или C.gD 200, 50, 12,5, 0,78, 0,19, 0,048 или 0 нг/мл лиганда mpl и представляли (с использованием программы Deltasoft) в виде графика зависимости ТРО (нг/мл) от (АВ450/650)±ср. отклонение. Концентрации образца получали путем интерполяции их оптической плотности на стандартной кривой и выражали в виде активности ТРО (нг/мл).A standard curve was constructed by stimulating dp12.trkA, B or C.gD cells 200, 50, 12.5, 0.78, 0.19, 0.048 or 0 ng / ml mpl ligand and was plotted (using the Deltasoft program) as a graph Dependence of SRW (ng / ml) on (AB 450/650 ) ± cf. deviation. The concentration of the sample was obtained by interpolating their optical density on a standard curve and expressed as TPO activity (ng / ml).

Было установлено, что mpl-лиганд способен активировать химерный рецептор mpl-Rse.gD лиганд-специфическим способом в зависимости от концентрации. Кроме того, анализ KIRA-ELISA на mpl-Rse.gD, как было установлено, пригоден почти для 100% чел.сыворотки (показано) или 100% плазмы (не показано), что позволяет легко проводить скрининг пациента и рК-образцов.It was found that the mpl ligand is able to activate the chimeric receptor mpl-Rse.gD ligand-specific method depending on the concentration. In addition, the KIRA-ELISA assay for mpl-Rse.gD was found to be suitable for almost 100% human serum (shown) or 100% plasma (not shown), which makes it easy to screen the patient and pK samples.

Figure 00000008
Figure 00000008

Суммарное значение ЕС50 для ТРОTotal EC50 value for SRW

Summary of TPO EC50’sSummary of TPO EC50’s

форма клетки ТРО Form (cells)TPO cell form (cells) ЕС50 масс./об. (wt/vol.)EC50 wt./about. (wt / vol.) ЕС50 молярность (molarltv)EC50 molarity (molarltv) Нu ТРО 332 (293)Nu TPO 332 (293) 2.56 nq/ml2.56 nq / ml 67.4 рM пM67.4 pM pM Мu ТРО 332 (293)Mu TPO 332 (293) 3.69 nq/ml3.69 nq / ml 97.1 рМ пМ97.1 pM PM Нu ТРО 153 (293)Nu TPO 153 (293) ~41 nq/ml~ 41 nq / ml ~1.08 пМ пМ~ 1.08 pM pM Нu ТРО 155 (Е.соli)Nu TPO 155 (E. coli) 0.44 nq/ml0.44 nq / ml 11.6 рМ пМ11.6 pM pM Нu ТРО 153met (E.соli)Nu TPO 153met (E. coli) 0.829 nq/ml0.829 nq / ml 21.8 рМ21.8 rM

Пример 18Example 18

ELISA-анализ, проведенный с использованием рецептора для тромбопоэтина (ТРО)ELISA Assay Using Thrombopoietin Receptor (TPO)

ELISA-планшеты сенсибилизировали F(ab’)2-фрагментами кроличьего антитела против человеческого IgG (Fc) в карбонатном буфере (рН 9,6) при температуре 4°C в течение ночи. Затем планшеты блокировали 0,5% альбумином бычьей сыворотки в PBS при комнатной температуре в течение одного часа. Сбор, полученный из ферментера и содержащий химерный рецептор mpl-IgG, был добавлен в планшеты, после чего полученную смесь инкубировали в течение 2 часов. Двукратные серийные разведения (0,39-25 нг/мл) стандарта (ТРО332, продуцированного в клетках 293 с использованием концентрации, определенной путем количественного аминокислотного анализа) и серийно разведенные образцы в 0,5%-ном альбумине бычьей сыворотки и 0,05% Твине 20 добавляли в планшеты и полученную смесь инкубировали в течение 2 часов. Связанный ТРО детектировали с помощью очищенных белком А биотинилированных кроличьих антител к TPO155, которые были продуцированы в E.coli (время инкубирования = 1 час), а затем с помощью стрептавидин-пероксидазы (время инкубирования = 30 минут) и 3,3`,5,5`-тетраметилбензидина, используемых в качестве субстрата. Оптическую плотность считывали при 450 нм. Между стадиями планшеты промывали. Для данных анализа стандартную кривую строили с использованием программы Kaleidagraph для построения кривой с четырьмя параметрами. Концентрации образцов вычисляли с помощью стандартной кривой.ELISA plates sensitized F (ab ') 2 fragments of a rabbit anti-human IgG antibody (Fc) in carbonate buffer (pH 9.6) at 4 ° C. overnight. The plates were then blocked with 0.5% bovine serum albumin in PBS at room temperature for one hour. The collection obtained from the fermenter and containing the chimeric receptor mpl-IgG was added to the tablets, after which the resulting mixture was incubated for 2 hours. Twice serial dilutions (0.39-25 ng / ml) of the standard (TPO 332 produced in 293 cells using a concentration determined by quantitative amino acid analysis) and serially diluted samples in 0.5% bovine serum albumin and 0.05 % Tween 20 was added to the tablets and the resulting mixture was incubated for 2 hours. Bound TPO was detected using Protein A-purified biotinylated rabbit anti-TPO 155 antibodies that were produced in E. coli (incubation time = 1 hour), and then with streptavidin peroxidase (incubation time = 30 minutes) and 3.3`, 5,5`-tetramethylbenzidine used as a substrate. The optical density was read at 450 nm. Between stages, the plates were washed. For the analysis data, a standard curve was constructed using the Kaleidagraph program to construct a curve with four parameters. The concentration of the samples was calculated using a standard curve.

Пример 19Example 19

Экспрессия и очистка ТРО из клеток 293Expression and purification of TPO from cells 293

1. Получение экспрессирующих векторов клеток 2931. Obtaining expressing vectors of cells 293

кДНК, соответствующую полной открытой рамке считывания ТРО, получали с помощью полимеразной цепной реакции, используя в качестве праймеров соответствующие олигонуклеотиды (табл.11).The cDNA corresponding to the complete open reading frame of the TPO was obtained using the polymerase chain reaction using the corresponding oligonucleotides as primers (Table 11).

Таблица 11Table 11

PCR-праймеры 293PCR primers 293

Cla.FL.F: 5’ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3’Cla.FL.F: 5’ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3 ’ (Посл. NO: 65)(Last NO: 65) hmpll-R: 5’ GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3’hmpll-R: 5 ’GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3’ (Посл. NO: 48)(Last NO: 48)

PRKS-hrnpl I (описанную в Примере 9) использовали в качестве матрицы для реакции в присутствии готовой к употреблению (Stratagene) ДНК-полимеразы. Первоначальную денатурацию осуществляли в течение 7 минут при температуре 94°С, а затем с помощью 25 циклов амплификации (в течение 1 минуты при 94°С, 1 минуты при 55°С и 1 минуты при 72°С). Конечное удлинение проводили в течение 15 минут при температуре 72°С. PCR-продукт очищали и клонировали между рестрикционными сайтами Clal и Xbal плазмиды pRK5tkneo, а вектор, происходящий от pRK5, модифицировали так, чтобы он экспрессировал ген резистентности к неомицину под контролем тимидинкиназного промотора с получением открытой рамки считывания вектора pRK5tkneo.ORF. Вторую конструкцию, соответствующую гомологичному домену еро, получали тем же самым способом, но с использованием Cla.FL.F в качестве прямого праймера и соответствующего обратного праймера:PRKS-hrnpl I (described in Example 9) was used as a template for the reaction in the presence of ready-to-use (Stratagene) DNA polymerase. Initial denaturation was carried out for 7 minutes at a temperature of 94 ° C, and then using 25 cycles of amplification (for 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C). Final elongation was carried out for 15 minutes at a temperature of 72 ° C. The PCR product was purified and cloned between the Clal and Xbal restriction sites of the plasmid pRK5tkneo, and the vector derived from pRK5 was modified to express the neomycin resistance gene under the control of the thymidine kinase promoter to obtain an open reading frame of the pRK5tkneo.ORF vector. The second construct, corresponding to the homologous domain of EPO, was obtained in the same way, but using Cla.FL.F as the forward primer and the corresponding reverse primer:

Arg.STOP.Xba: 5’ TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA СС 3’Arg.STOP.Xba: 5 ’TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA SS 3’

(Посл.NO: 66)(Last NO: 66)

Конечную конструкцию обозначали pRKS-tkneoEPO-D. Последовательность обеих конструкций проверяли способом, описанным в Примере 7.The final construct was designated pRKS-tkneoEPO-D. The sequence of both constructs was checked by the method described in Example 7.

2. Трансфекция эмбриональных клеток почек человека2. Transfection of human kidney embryonic cells

Эти 2 конструкции трансфицировали в эмбриональные клетки почек человека посредством метода с использованием СаРO4, как описано в Примере 9. Через 24 часа после трансфекции отбор клонов, резистентных к неомицину, инициировали в присутствии 0,4 мг/мл G418,10 и через 15 дней отдельные колонии переносили в 96-луночные планшеты, а затем оставляли для культивирования до состояния сплошности. Экспрессию ML153 или ML332 в кондиционированной среде от этих клонов анализировали с помощью анализа на пролиферацию Ba/F3-mpl (как описано в Примере 1).These 2 constructs were transfected into human kidney embryonic cells using the CaPO 4 method as described in Example 9. 24 hours after transfection, the selection of neomycin-resistant clones was initiated in the presence of 0.4 mg / ml G418.10 and after 15 days individual colonies were transferred to 96-well plates and then allowed to culture until solid. Expression of ML 153 or ML 332 in conditioned medium from these clones was analyzed by Ba / F3-mpl proliferation assay (as described in Example 1).

3. Очистка rhML332.3. Cleaning up rhML 332 .

293-rhМL332-кондиционированную среду наносили на колонку с Blue-Sepharose (Pharmacia), которую уравновешивали в 10 мМ фосфата натрия при рН 7,4 (буфер А). После этого колонку промывали 10 колоночными объемами 2М буфера А и 2М буфера В. Затем колонку элюировали буфером А, содержащим 2М NaCl и 1М NaCl. Сбор после элюирования Blue-Sepharose сразу наносили на колонку с WGA-Sepharose, уравновешенную в буфере А. Колонку с WGA-Sepharose промывали промывали 10 колоночными объемами 2М буфера А, содержащего 2М NaCl и 1М NaCl, а затем элюировали тем же буфером, содержащим 0,5М N-ацетил-D-глюкозамин. Элюат WGA-Sepharose наносили на ВРЖХ-колонку с С4 (Synchrom, Inc.), уравновешенную в 0,1% трифторуксусной кислоте. ВРЖХ-колонку с С4 элюировали ступенчатым пропаноловым градиентом (0-25, 25-35 и 35-70%). Выделенный rhML332 подвергали элюированию в 28-30% пропаноловом градиенте. Очищенный с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН rhМL332 перемещался в виде широкой полосы в 68-80 кДа-области геля (см.фиг.15).A 293-rhML 332- conditioned medium was applied to a Blue-Sepharose column (Pharmacia), which was equilibrated in 10 mM sodium phosphate at pH 7.4 (buffer A). After that, the column was washed with 10 column volumes of 2M buffer A and 2M buffer B. Then the column was eluted with buffer A containing 2M NaCl and 1M NaCl. Collection after elution of Blue-Sepharose was immediately applied to a WGA-Sepharose column equilibrated in buffer A. The WGA-Sepharose column was washed with 10 column volumes of 2M buffer A containing 2M NaCl and 1M NaCl, and then eluted with the same buffer containing 0 5M N-acetyl-D-glucosamine. The WGA-Sepharose eluate was loaded onto a C4 HPLC column (Synchrom, Inc.), equilibrated in 0.1% trifluoroacetic acid. An HPLC column with C4 was eluted with a stepwise propanol gradient (0-25, 25-35, and 35-70%). The isolated rhML 332 was eluted in a 28-30% propanol gradient. The rhML 332 purified by electrophoresis in SDS page with SDS moved in the form of a wide band in the 68-80 kDa region of the gel (see Fig. 15).

4. Очистка rhML153 4. Cleaning rhML 153

293-rhМL153-кондиционированную среду подвергали разделению на колонке Biue-Sepharose, как описано в методе для rhМL332. Элюат Blue-Sepharose сразу наносили на mpl-аффинную колонку, как описано выше. RhML153, проэлюированный на mpl-аффинной колонке, очищали до получения гомогенной массы с использованием ВРЖХ-колонки с С4 при тех же самых условиях, описанных для rhМL332. RhML153, очищенный с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, разделяли на 2 мажорных и 2 минорных полосы с массой (Mr), равной около 18000-21000 (см. фиг.15).The 293-rhML 153- conditioned medium was separated on a Biue-Sepharose column as described in the method for rhML 332 . The Blue-Sepharose eluate was immediately applied to the mpl-affinity column as described above. RhML 153 , eluted on an mpl affinity column, was purified to obtain a homogeneous mass using a C4 HPLC column under the same conditions described for rhML 332 . RhML 153 , purified by SDS page PAGE, was divided into 2 major and 2 minor bands with a mass (Mr) of about 18000-21000 (see FIG. 15).

Пример 20Example 20

Экспрессия и очистка ТРО из СНОExpression and purification of SRW from CHO

1. Очистка экспрессируюцих векторов СНО1. Purification of expressed CHO vectors

Сконструированные экспрессирующие векторы, используемые в электропорации, описаны ниже:Designed expression vectors used in electroporation are described below:

pSVI5. ID.LL.MLORF (полноразмерная или hТРО332), и pSVl5.ID.LL.MLEPO-D (усеченная или hТРО153). Соответствующие отличительные особенности этих плазмид представлены на фиг.23 и 24.pSVI5. ID.LL.MLORF (full-size or hTPO 332 ), and pSVl5.ID.LL.MLEPO-D (truncated or hTPO 153 ). Corresponding features of these plasmids are presented in FIGS. 23 and 24.

2. Получение экспрессируюцих векторов СНО2. Obtaining expressing CHO vectors

кДНК, соответствующую полной открытой рамке считывания hTPO, получали с помощью полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров, указанных в Таблице 12.cDNA corresponding to the full open reading frame of hTPO was obtained by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers indicated in Table 12.

Таблица 12Table 12

PCR-праймеры для эрепрессирующего вектора в СНОPCR primers for an expression vector in CHO

Cla.FL.F2 5’ АТС GAT АТС GAT AGC CAG АСА ССС CGG ССА G 3’Cla.FL.F2 5 ’PBX GAT PBX GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3’ (Посл. NO: 47)(Last NO: 47) ORF.Sal 5’ AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3’ORF.Sal 5 ’AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3’ (Посл. NO: 67)(Last NO: 67)

PRKS-hmpI I (описанную в Примере 7 и 9) использовали в качестве матрицы для реакции в присутствии готовой к употреблению (Stratagene) ДНК-полимеразы. Первоначальную денатурацию осуществляли в течение 7 минут при 94°С, а затем с использованием 25 циклов амплификации (в течение 1 минуты при 94°С, 1 минуты при 55°С и 1 минуты при 72°С). Конечное удлинение проводили в течение 15 минут при температуре 72°С. PCR-продукт очищали и клонировали между рестрикционными сайтами Clal и Sall плазмиды pSVI5.ID.LL с получением вектора pSVI5.ID.LL.MLORF. Вторую конструкцию, соответствующую домену ЕРО, получали тем же самым способом, но с использованием Cla.FL.F2 в качестве прямого праймера и обратного праймера, указанного ниже:PRKS-hmpI I (described in Examples 7 and 9) was used as a template for the reaction in the presence of ready-to-use (Stratagene) DNA polymerase. Initial denaturation was carried out for 7 minutes at 94 ° C, and then using 25 cycles of amplification (for 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C). Final elongation was carried out for 15 minutes at a temperature of 72 ° C. The PCR product was purified and cloned between the Clal and Sall restriction sites of the plasmid pSVI5.ID.LL to obtain the vector pSVI5.ID.LL.MLORF. The second construct corresponding to the EPO domain was obtained in the same manner, but using Cla.FL.F2 as the forward primer and the reverse primer indicated below:

EPOD.Sal 5’ AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3’ (Посл. NO: 68)EPOD.Sal 5 ’AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3’ (Last NO: 68)

Конечную конструкцию обозначали pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Последовательность обеих конструкций проверяли, как описано в Примере 7 и 9.The final structure was designated pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. The sequence of both constructs was checked as described in Example 7 and 9.

В основном кодирующие последовательности для полноразмерного и усеченного лиганда вводили в сайт множественного клонирования экспрессирующего вектора pSVI5.ID.LL клеток CHO. Этот вектор содержал область раннего промотора/энхансера вируса SV40, модифицированный сайт сплайсинга, содержащий мышиную кДНК DHFR; сайт множественного клонирования для введения гена нужного (описанные в этом случае последовательности ТРО) сигнала полиаденилирования SV40; сайт инициации репликации и ген бета-лактамазы для отбора плазмиды и ее амплификации в бактерии.In general, the coding sequences for the full-size and truncated ligand were introduced into the multiple cloning site of the expression vector pSVI5.ID.LL of CHO cells. This vector contained the SV40 early promoter / enhancer region, a modified splicing site containing mouse DHFR cDNA; a multiple cloning site for introducing a gene of the desired (described in this case, the sequence of TPO) polyadenylation signal SV40; replication initiation site and beta-lactamase gene for selection of the plasmid and its amplification in bacteria.

3. Методика получения стабильных клеточных линий CHO, экспрессируюцих рекомбинантные ТРО332 и TPO153 человека3. Methodology for the production of stable CHO cell lines expressing recombinant human TPO 332 and TPO 153

а. Описание родственных клеточных линий CHOa. Description of related CHO cell lines

Хозяйские клеточные линии CHO (яичник китайского хомячка), используемые для экспрессии молекул ТРО, описаны в настоящем изобретении как CHO-DP12 (см. ЕР 307247, опубликованный 15 марта 1989 г). Клеточную линию млекопитающего клонально отбирали в результате трансфекции родственной линии (CHO-KI DUX-BII (DHFR)-, полученной от Dr.Frank Lee Станфордского университета с разрешения Dr. L.Chaisi) вектором, экспрессирующим препроинсулин, с получением клонов с пониженными требованиями инсулина. Эти клетки также являлись отрицательными по DHFR, а клоны могут быть отобраны на присутствие последовательностей DHFR-кДНК-вектора путем культивирования на среде, не содержащей нуклеотидных добавок (глицина, гипоксантина и тимидина). В основном была использована система селекции стабильной экспрессии клеточных линий CHO.The host CHO (Chinese Hamster Ovary) cell lines used to express TPO molecules are described in the present invention as CHO-DP12 (see EP 307247 published March 15, 1989). The mammalian cell line was cloned as a result of transfection of the related line (CHO-KI DUX-BII (DHFR) - obtained from Dr. Frank Stanley University with permission of Dr. L. Chaisi) a vector expressing preproinsulin to obtain clones with reduced insulin requirements . These cells were also negative for DHFR, and clones can be selected for the presence of sequences of the DHFR cDNA vector by cultivation on a medium containing no nucleotide additives (glycine, hypoxanthine and thymidine). The selection system for stable expression of CHO cell lines was mainly used.

b. Метод трансфекции (электроперация)b. Transfection Method (electrooperation)

Клеточные линии, экспрессирующие ТРО332 и TPO153, получали путем трансфекции клеток DP12 путем электропорации (см., например, Adreason, G.L. J.Tiss. Cult.Meth., 1556 (1993)) с помощью линеаризованных плазмид pSVI5.ID.LL.MLORF или pSVI5.ID.LL.MLEPO-D соответственно. Три реакционных смеси рестриктирующих ферментов брали для каждого разрезания плазмиды; 10, 25 и 50 мкг вектора гидролизовали ферментом NOTI стандартными методами, используемыми в молекулярной биологии. Лишь один рестрикционный сайт находился в векторе в области линеаризации 3 и в области, находящейся вне области транскрипции лиганда ТРО (см. фиг.23). Инкубирование 100 мкл реакционной смеси осуществляли в течение ночи при температуре 37°С. На следующий день смесь один раз экстрагировали фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом (50:49:1), а затем осаждали этанолом, помещая на сухой лед. Процедуру проводили приблизительно в течение одного часа. Образовавшийся осадок собирали путем 150-минутного микроцентрифугирования, а затем осушали. Лианеризованную ДНК ресуспендировали в 50 мкл среды DMEM-F12 (1:1) Хема, содержащей стандартные антибиотики и 2 мМ глутамин.Cell lines expressing TPO 332 and TPO 153 were obtained by transfection of DP12 cells by electroporation (see, for example, Adreason, GLJTiss. Cult.Meth., 1556 (1993)) using linearized plasmids pSVI5.ID.LL.MLORF or pSVI5 .ID.LL.MLEPO-D respectively. Three restriction enzyme reaction mixtures were taken for each plasmid cut; 10, 25 and 50 μg of the vector were hydrolyzed with the NOTI enzyme by standard methods used in molecular biology. Only one restriction site was in the vector in the region of linearization 3 and in the region outside the region of transcription of the TPO ligand (see Fig. 23). Incubation of 100 μl of the reaction mixture was carried out overnight at a temperature of 37 ° C. The next day, the mixture was extracted once with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (50: 49: 1), and then precipitated with ethanol, placed on dry ice. The procedure was carried out for approximately one hour. The resulting precipitate was collected by 150 minutes microcentrifugation, and then dried. The lanerized DNA was resuspended in 50 μl of DMEM-F12 (1: 1) Hem medium containing standard antibiotics and 2 mM glutamine.

Клетки DP112, выращенные в суспензионной среде, собирали, один раз промывали в той среде, что была использована для ресуспендирования ДНК, и наконец, ресуспендировали в этой среде при концентрации 107 клеток на 750 мкл. Аликвоты клеток (750 мкл) и каждую лианеризованную ДНк-смесь вместе инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа, а затем переносили в камеру BRL для элетропорации. Каждую реакционную смесь подвергали элетропорации в стандартном устройстве BRL для элетропорации при 350 В, 330 мкФ и низкой емкости. После проведения элетропорации клетки оставляли в этом устройстве на 5 минут, а затем помещали на лед и осуществляли дополнительное инкубирование в течение 10 минут. Затем клетки, обработанные путем элетропорации, переносили в 60-мм чашки для культивирования клеток, содержащие 5 мл стандартной полной ростовой среды для клеток СНО (высокомолекулярная глюкоза; DMEM-F12 (50:50), не содержащая глицина, с добавлением 1х GHT, 2 мМ глутамина и 5%-ную бычью фетальную сыворотку), после чего культивировали в течение ночи в инкубаторе для культивирования клеток в присутствии 5% СO2.DP112 cells grown in suspension medium were harvested, washed once in the medium that was used to resuspend the DNA, and finally resuspended in this medium at a concentration of 10 7 cells per 750 μl. Aliquots of cells (750 μl) and each lanerized DNA mixture were incubated together at room temperature for one hour and then transferred to a BRL chamber for electroporation. Each reaction mixture was electroporated in a standard BRL electroporation apparatus at 350 V, 330 μF and low capacitance. After electroporation, the cells were left in this device for 5 minutes, and then placed on ice and additional incubation was carried out for 10 minutes. Then, the cells treated by electroporation were transferred to a 60 mm cell culture dish containing 5 ml of standard complete growth medium for CHO cells (high molecular weight glucose; DMEM-F12 (50:50), not containing glycine, with the addition of 1x GHT, 2 mM glutamine and 5% bovine fetal serum), and then cultured overnight in an incubator for culturing cells in the presence of 5% CO 2 .

С. Метод селекции и скринингаC. Selection and Screening Method

На следующий день клетки отделяли от планшетов с помощью трипсина стандартными способами, а затем переносили в 150-мм планшеты с клеточными культурами, содержащие DHFR-селективную среду (среда DMEM-F12 (1:1) Хема, описанную выше и содержащую 2%-ную или 5-ную диализованную фетальную бычью сыворотку, но не содержащую глицина, гипоксантина и тимидина; была использована стандартная DHFR-селективная среда). Затем клетки от каждого 60-мм планшета переносили в 5/150-мм планшеты. Полученные клетки инкубировали в течение 10-15 дней (с одной заменой среды) при температуре 37°С в присутствии 5% СO2 до тех пор, пока не были получены клоны, имеющие размеры, достаточные для их переноса в 96-луночные планшеты с использованием стерильных желтых наконечников на Pipettmann, установленной при 50 мл. Эти клетки оставляли для культивирования до состояния сплошности (обычно 3-5 дней), после чего планшеты трипсинизировали и 2 копии от первоначальных планшетов были снова продуцированы. Две этих копии в течение небольшого промежутка времени хранили в холодильнике, причем клетки в каждой лунке разводили 50 микролитрами 10% фетальной бычьей сыворотки в диметилсульфоксиде. Образцы 5-дневной кондиционированной бессывороточной среды анализировали исходя из конфлуэнтных лунок третьего планшета для экспрессии ТРО посредством анализа на активность клеток Ba/F. Наиболее высокоэкспрессирующие клоны, подтвержденные с помощью данного анализа, доводили еще раз до состояния сплошности в 150-мм Т-колбах, а затем переносили в группу клеточных культур для адаптации суспензии, повторного анализа и создания банка.The next day, the cells were separated from the plates using trypsin by standard methods, and then transferred to 150 mm cell culture plates containing DHFR-selective medium (DMEM-F12 medium (1: 1) Hema, described above and containing 2% or 5th dialyzed fetal bovine serum but not containing glycine, hypoxanthine, and thymidine; standard DHFR selective medium was used). Cells from each 60 mm plate were then transferred to 5/150 mm plates. The resulting cells were incubated for 10-15 days (with one change of medium) at a temperature of 37 ° C in the presence of 5% CO 2 until clones were obtained that were large enough to transfer them to 96-well plates using sterile yellow tips on a pipettmann set at 50 ml. These cells were left for cultivation to a state of continuity (usually 3-5 days), after which the plates were trypsinized and 2 copies from the original plates were again produced. These two copies were stored in a refrigerator for a short period of time, and the cells in each well were diluted with 50 microliters of 10% fetal bovine serum in dimethyl sulfoxide. Samples of a 5-day conditioned serum-free medium were analyzed from the confluent wells of a third TPO expression plate by means of an activity assay for Ba / F cells. The most highly expressing clones confirmed by this assay were again brought to a state of continuity in 150 mm T-flasks, and then transferred to a group of cell cultures to adapt the suspension, re-analyze and create a bank.

d. Амплификацияd. Amplification

Несколько клеточных линий с наиболее высоким титром, отобранных способом, описанным выше, подвергали амплификации с использованием стандартного метотрексата с получением клонов с более высоким титром. Клоны клеток СНО размножали и высевали в 10-см планшеты при 4 концентрациях метотрексата (т.е. 50, 100, 200 и 400 нМ) при двух или трех количествах клеток (105,5×105 и 106 клеток на лунку). Затем культуры инкубировали при температуре 37°С в присутствии 5% CO2 и образованные клоны переносили в 96-луночные планшеты для последующего анализа. Несколько клонов с высокими титрами, отобранных в результате селекции, снова обрабатывали высокими концентрациями метотрексата (т.е. 600, 800, 1000 и 1200 нМ) и в соответствии со способом, описанным ранее, клоны, обладающие резистентностью, оставляли, а затем переносили в 96-луночные планшеты и анализировали.Several cell lines with the highest titer, selected by the method described above, were amplified using standard methotrexate to obtain clones with a higher titer. Clones of CHO cells were propagated and plated in 10 cm plates at 4 concentrations of methotrexate (i.e. 50, 100, 200 and 400 nM) at two or three cell numbers (105.5 × 105 and 106 cells per well). The cultures were then incubated at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 and the formed clones were transferred to 96-well plates for subsequent analysis. Several clones with high titers selected as a result of selection were again treated with high concentrations of methotrexate (i.e. 600, 800, 1000 and 1200 nM) and, in accordance with the method described previously, the clones having resistance were left and then transferred to 96 well plates and analyzed.

4. Культивирование стабильных клеточных линий СНО, экспрессирукщих рекомбинантные ТРО332 и ТРО153 человека4. Cultivation of stable CHO cell lines expressing recombinant human TPO 332 and human TPO 153

Собранные клетки оттаивали и клеточную популяцию размножали с помощью стандартных методов культивирования клеток либо в бессывороточной среде, либо в среде содержащей сыворотку. После размножения до получения достаточной клеточной плотности клетки промывали для удаления культуральной среды. Клетки культивировали с помощью любого стандартного способа, включающего в себя: периодическое культивирование, культивирование с подпиткой или непрерывное культивирование при 25-40°С при нейтральном рН в присутствии растворенного О2, по крайней мере, при 5% до тех пор, пока не накапливался конститутивно секретируемый ТРО. Затем жидкую культуру отделяли от клеток путем механического перемешивания, например центрифугирования.The collected cells were thawed and the cell population was expanded using standard cell culture methods either in serum-free medium or in serum-containing medium. After propagation to obtain sufficient cell density, the cells were washed to remove the culture medium. Cells were cultured using any standard method, including: batch cultivation, fed culture or continuous cultivation at 25-40 ° C at neutral pH in the presence of dissolved O 2 , at least at 5% until it accumulated constitutively secreted SRW. Then the liquid culture was separated from the cells by mechanical stirring, for example centrifugation.

5. Очистка рекомбинантного ТРО человека из клеточной суспензии СНО5. Purification of recombinant human TPO from a cell suspension of CHO

Собранную суспензионную клеточную культуру (HCCF) непосредственно наносили на колонку Fast Flow (Pharmacia) с Blue-Sepharose 6, уравновешенную 0,01 М фосфата натрия (рН 7/4) и 0,15 М хлорида натрия в отношении приблизительно 100 литров HCCF на 1 литр смолы и при линейной скорости потока приблизительно 300 мл/час/см2. Затем колонку промывали 3-5 колоночными объемами уравновешенного буфера, после чего 3-5 колоночными объемами 0,01 М фосфата натрия (рН 7,4) и 2,0 М мочевины. Затем ТРО элюировали 3-5 колоночными объемами 0,01 М фосфата натрия (рН 7,4), 2,0 М мочевины и 1,0 М хлорида натрия.The collected suspension cell culture (HCCF) was directly applied to a Fast Flow column (Pharmacia) with a Blue-Sepharose 6, balanced with 0.01 M sodium phosphate (pH 7/4) and 0.15 M sodium chloride in the ratio of approximately 100 liters of HCCF per 1 liter of resin and at a linear flow rate of approximately 300 ml / hour / cm 2 . Then the column was washed with 3-5 column volumes of equilibrated buffer, followed by 3-5 column volumes of 0.01 M sodium phosphate (pH 7.4) and 2.0 M urea. Then TPO was eluted with 3-5 column volumes of 0.01 M sodium phosphate (pH 7.4), 2.0 M urea and 1.0 M sodium chloride.

Пул Blue-Sepharose, содержащий ТРО, наносили на колонку с Сефарозой 6МВ и лектином из зерен пшеницы (Wheat Germ Lectin Sepharose 6MB, (Pharmacia), уравновешенную 0,01 М фосфата натрия (рН 7,4), 2,0 М мочевине и 1,0 М хлориде натрия в отношении 8-16 мл пула Wheat Germ Lec. На 1 мл смолы при скорости потока равной приблизительно 50 мл/час/см2. После этого колонку промывали 2-3 колоночными объемами уравновешенного буфера. Затем ТРО элюировали 2-5 колоночными объемами 0,01 М фосфата натрия при рН 7,4, 2,0 М мочевины и 0,5 М N-ацетил-D-глюкозамина.A Blue-Sepharose pool containing TPO was applied to a column of Sepharose 6MB and wheat lectin (Wheat Germ Lectin Sepharose 6MB, (Pharmacia), balanced with 0.01 M sodium phosphate (pH 7.4), 2.0 M urea and 1.0 M sodium chloride in a ratio of 8-16 ml of Wheat Germ Lec pool per 1 ml of resin at a flow rate of approximately 50 ml / h / cm 2 After this, the column was washed with 2-3 column volumes of equilibrated buffer, then TPO was eluted 2 -5 column volumes of 0.01 M sodium phosphate at a pH of 7.4, 2.0 M urea and 0.5 M N-acetyl-D-glucosamine.

Пул лектина зерен пшеницы доводили до конечной концентрации 0,04% С12Е8 и 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA). Полученный пул наносили на обращенно-фазовую колонку с С4 (Vydac 214TP1012), уравновешенную в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA) и 0,04% С12Е8 при загрузке, равной приблизительно 0,2-0,5 мг белка на один миллиметр смолы, и при скорости потока, равной 157 мл/час/см2.The wheat grain lectin pool was adjusted to a final concentration of 0.04% C 12 E 8 and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA). The resulting pool was applied onto a C4 reverse phase column (Vydac 214TP1012), equilibrated in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and 0.04% C 12 E 8 with a loading of approximately 0.2-0.5 mg protein per one millimeter of resin, and at a flow rate of 157 ml / hour / cm 2 .

Белок элюировали в двухфазном линейном градиенте ацетонитрила, содержащего 0,1%-ную трифторуксусную кислоту и 0,04% C12E8. Первую фазу обрабатывали линейным градиентом 0-30% ацетонитрила в течение 15 минут, а вторую фазу обрабатывали линейным градиентом 30-60% ацетонитрила в течение 60 минут. ТРО элюировали приблизительно 50%-ным ацетонитрилом. Полученный пул подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН.The protein was eluted in a biphasic linear gradient of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid and 0.04% C 12 E 8 . The first phase was treated with a linear gradient of 0-30% acetonitrile for 15 minutes, and the second phase was treated with a linear gradient of 30-60% acetonitrile for 60 minutes. TPO was eluted with approximately 50% acetonitrile. The resulting pool was subjected to electrophoresis in SDS page.

Пул С4 разводили двумя объемами 0,01 М фосфата натрия при рН 7,4 и 0,15 М хлорида натрия, а затем диафильтровали против приблизительно 6 объемов 0,01 М фосфата натрия (рН 7,4) и 0,15 М хлорида натрия на мембране для ультрафильтрации Amicor УМ или ей подобной мембране, имеющих молекулярные массы в 10000-30000 Да. Полученный диафильтрат может быть сразу обработан путем ультрафильтрации с последующим концентрированием. Смесь диафильтрата и концентрата доводили до конечной концентрации 0,01% Твин-80.Pool C4 was diluted with two volumes of 0.01 M sodium phosphate at pH 7.4 and 0.15 M sodium chloride, and then diafiltered against approximately 6 volumes of 0.01 M sodium phosphate (pH 7.4) and 0.15 M sodium chloride on an Amicor UM ultrafiltration membrane or a similar membrane having a molecular weight of 10,000-30000 Da. The resulting diafiltrate can be immediately processed by ultrafiltration, followed by concentration. The mixture of diafiltrate and concentrate was adjusted to a final concentration of 0.01% Tween-80.

Всю эту смесь или ее часть с 2-5% вычисленным колоночным объемом наносили на колонку HP с Sephacryl S-300 (Pharmacia), уравновешенную в 0,01 М фосфате натрия (рН 7,4), 0,15 М хлориде натрия и 0,01% Твине-80, а затем хроматографировали на скорости потока приблизительно 17 мл/ч/см2. Фракции, содержащие ТРО и не содержащие продуктов агрегации и продуктов протеолитического расщепления, объединяли в пул с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Полученный пул фильтровали через 0,22-мкл фильтр Millex-GY или ему подобный фильтр, а затем хранили при температуре 2-8°С.All or part of this mixture with a 2-5% calculated column volume was applied to an HP column with a Sephacryl S-300 (Pharmacia), equilibrated in 0.01 M sodium phosphate (pH 7.4), 0.15 M sodium chloride and 0 , 01% Tween-80, and then chromatographed at a flow rate of approximately 17 ml / h / cm 2 . Fractions containing TPO and not containing aggregation products and proteolytic cleavage products were pooled by electrophoresis in SDS page with SDS. The resulting pool was filtered through a 0.22 μl Millex-GY filter or a similar filter, and then stored at a temperature of 2-8 ° C.

Пример 21Example 21

Трансформация и индуцирование синтеза белков ТРО в E.coli 1. Конструирование векторов экспрессии ТРО в E.coliTransformation and induction of TPO protein synthesis in E. coli 1. Construction of TPO expression vectors in E. coli

Все плазмиды рМР21, рМР151, рМР41, рМР57 и рМР202 конструировали так, чтобы они экспрессировали первые 155 аминокислот ТРО, расположенных ниже от небольшой лидерной последовательности, которая расположена среди различных конструкций. Главным образом, лидерные последовательности обеспечивают высокий уровень инициации трансляции и быструю очистку. Плазмиды рМР210-1, -Т8, -21, -22, -24, -25 конструировали так, чтобы они экспрессировали первые 153 аминокислоты ТРО, расположенных ниже от инициирующего метионина и отличающиеся друг от друга только лишь использованием кодонов первых 6 аминокислот ТРО, в то время как плазмида рМР251 представляет собой производное рМР210-1, в котором карбокси-конец ТРО удлинен на две аминокислоты. Все вышеуказанные плазмиды продуцируют высокие уровни внутриклеточной экспрессии ТРО E.coli после индуцирования триптофанового промотора (Yansura, D.G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel D.V. Ed) 185: 54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Плазмиды pMPI и pMP172 являются промежуточными в конструкции вышеуказанных плазмид внутриклеточной экспрессии ТРО.All plasmids pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 and pMP202 were designed to express the first 155 amino acids of TPO located downstream from the small leader sequence, which is located among the various constructs. Mostly, leader sequences provide a high level of translation initiation and rapid purification. Plasmids pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 were designed so that they expressed the first 153 TPO amino acids located below the initiating methionine and differing from each other only by using codons of the first 6 TPO amino acids, while the plasmid pMP251 is a derivative of pMP210-1 in which the carboxy terminus of TPO is extended by two amino acids. All of the above plasmids produce high levels of intracellular expression of E. coli TPO after inducing the tryptophan promoter (Yansura, D.G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel D.V. Ed) 185: 54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plasmids pMPI and pMP172 are intermediate in the construction of the above plasmids for intracellular expression of TPO.

(а) Плазмида pMPI(a) Plasmid pMPI

Плазмида pMPI представляла собой секретирующий вектор для первых 155 аминокислот ТРО и была сконструирована путем лигирования всех 5 фрагментов ДНК, как показано на фиг.33. Первые из них являлись вектором pPho21, в котором небольшой Mlul-BamHl-фрагмент был удален. pPho21 представляет собой производное phGHl (Chano, C.N. et al., Gene 55: 189-196 [1987]), в котором ген гормона роста человека заменяли на ген phoA E.coli, а рестрикционный Mlul-сайт конструировали в к-последовательность, кодирующую сигнальную последовательность STll у аминокислот 20-21.Plasmid pMPI was a secretion vector for the first 155 amino acids of TPO and was constructed by ligation of all 5 DNA fragments, as shown in Fig. 33. The first of these was the vector pPho21, in which a small Mlul-BamHl fragment was removed. pPho21 is a phGHl derivative (Chano, CN et al., Gene 55: 189-196 [1987]) in which the human growth hormone gene was replaced with the E. coli phoA gene and the restriction Mlul site was constructed into a k-sequence encoding STll signal sequence for amino acids 20-21.

Следующие два фрагмента, Hinfl-Pstl-фрагмент (258 п.о.) ДНК от pRK5-hmpl 1 (Пример 9), кодирующий аминокислоты ТРО 19-103 и нижеследующую синтетическую ДНК, кодирующую аминокислоты 1-18:The following two fragments, a Hinfl-Pstl fragment (258 bp) of DNA from pRK5-hmpl 1 (Example 9), encoding amino acids TPO 19-103 and the following synthetic DNA encoding amino acids 1-18:

5’CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTG5’CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTG

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGC ACTGA-5’ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGC ACTGA-5 ’

(Посл. NO: 69)(Last NO: 69)

(Посл. NO: 70)(Last NO: 70)

предварительно лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 и второй отрезок гидролизовали ферментом Pstl. Четвертый фрагмент представлял собой Pstl-Haelll-фрагмент (152 п.о.) от плазмиды pRKShmpll, кодирующей аминокислоты 104-155 ТРО. Последний являлся Stul-BamHl-фрагментом (412 п.о.) от плазмиды рро108, содержащей лямбда-терминатор транскрипции, как описано выше (Scholtissek, S. Et al., NAP 15: 3185 [1987]).pre-ligated using T4 DNA ligase and the second segment was hydrolyzed with Pstl enzyme. The fourth fragment was a Pstl-Haelll fragment (152 bp) from plasmid pRKShmpll encoding amino acids 104-155 TPO. The latter was a Stul-BamHl fragment (412 bp) from the plasmid ppo108 containing the lambda transcription terminator, as described above (Scholtissek, S. Et al., NAP 15: 3185 [1987]).

(b) Плазмида рМР21(b) Plasmid pMP21

Плазмиду рМР21 конструировали так, чтобы она экспрессировала первые 155 аминокислот ТРО с помощью лидерной последовательности из 13 аминокислот, содержащей часть сигнальной последовательности STll. Эту плазмиду конструировали путем лигирования всех трех ДНК-фрагментов, как показано на фиг.34, причем первый из них являлся вектором pVEG31, в котором небольшой Xbal-Sphl-фрагмент был удален. Вектор pVEG31 представлял собой производное pHGH207-l (de Boer, H.A. et al., in Promoter Structure and Function (Rodrigues, P.L. и Chamberlain, M.J., Eo), 462, Praege, New York [1982]), в котором ген гормона роста человека заменен геном васкулярного эндотелиального фактора роста (идентичный фрагмент вектора может быть получен от плазмиды pHGH207-1).Plasmid pMP21 was designed to express the first 155 amino acids of TPO using a 13 amino acid leader sequence containing part of the STll signal sequence. This plasmid was constructed by ligation of all three DNA fragments, as shown in FIG. 34, the first of which was the pVEG31 vector in which a small Xbal-Sphl fragment was deleted. Vector pVEG31 was a derivative of pHGH207-l (de Boer, HA et al., In Promoter Structure and Function (Rodrigues, PL and Chamberlain, MJ, Eo), 462, Praege, New York [1982]), in which the growth hormone gene human is replaced by the gene of vascular endothelial growth factor (an identical fragment of the vector can be obtained from plasmid pHGH207-1).

Вторая часть лигирования представляла собой синтетический ДНК-дуплекс, имеющий последовательность, указанную ниже:The second part of the ligation was a synthetic DNA duplex having the sequence shown below:

5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5’TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5 ’

(Посл. NO: 71)(Last NO: 71)

(Посл. NO: 72)(Last NO: 72)

Последняя часть представляла собой Mlul-Sptl-фрагмент (1072 п.о.) от рМР1, кодирующий 155 аминокислот ТРО.The last part was an Mlul-Sptl fragment (1072 bp) from pMP1 encoding 155 amino acids of TPO.

(c) Плазмида рМР151(c) Plasmid pMP151

Плазмиду рМР151 конструировали для экспрессии первых 155 аминокислот ТРО, расположенных ниже лидерной последовательности, содержащей 7 аминокислот сигнальной последовательности STll, 8 гистидиновых остатков и сайт расщепления фактор Ха. Как показано на фиг.35, рМР151 конструировали путем лигирования всех трех ДНК-фрагментов, первый из которых представлял собой вышеописанный вектор pVEG31, из которого был удален небольшой Xbal-Sptl-фрагмент. Вторая плазмида представляла собой синтетический ДНК-дуплекс, имеющий последовательность, указанную ниже:Plasmid pMP151 was designed to express the first 155 amino acids of TPO located below the leader sequence containing 7 amino acids of the STll signal sequence, 8 histidine residues and a factor Xa cleavage site. As shown in FIG. 35, pMP151 was constructed by ligation of all three DNA fragments, the first of which was the pVEG31 vector described above, from which a small Xbal-Sptl fragment was removed. The second plasmid was a synthetic DNA duplex having the sequence shown below:

5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG GTCGTAGCC5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAG GTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC CAGCAT-5’TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTC CAGCAT-5 ’

(Посл. NO: 73)(Last NO: 73)

(Посл. NO: 74)(Last NO: 74)

Последняя плазмида представляла собой Boll-Sptl-фрагмент (1064 п.о.) от pMP11, кодирующий 154 аминокислоты ТРО. Плазмида pMP11 идентична плазмиде рМР1 за исключением того, что в сигнальной последовательности STll были заменены несколько кодонов (этот фрагмент может быть получен из рМР1).The latter plasmid was a Boll-Sptl fragment (1064 bp) from pMP11 encoding 154 TPO amino acids. Plasmid pMP11 is identical to plasmid pMP1 except that several codons have been replaced in the STll signal sequence (this fragment can be obtained from pMP1).

(d) Плазмида рМР202(d) Plasmid pMP202

Плазмида рМР202 являлась аналогичной экспрессирующему вектору рМР151 за исключением того, что сайт расщепления фактором Ха в лидерной последовательности заменен сайтом расщепления тромбином. Как показано на фиг.36, рМР202 конструировали путем лигирования всех трех ДНК-фрагментов. Первый из них представлял собой вышеописанный вектор pVEG31, в котором был удален небольшой Xbal-Sptl-фрагмент. Второй представлял собой синтетический ДНК-дуплекс, имеющий последовательность, указанную ниже:Plasmid pMP202 was similar to the expression vector pMP151 except that the factor Xa cleavage site in the leader sequence was replaced with a thrombin cleavage site. As shown in FIG. 36, pMP202 was constructed by ligation of all three DNA fragments. The first of these was the pVEG31 vector described above, in which a small Xbal-Sptl fragment was removed. The second was a synthetic DNA duplex having the sequence shown below:

5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAA CCAACGTAGCC5’-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAA CCAACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTT GGTGCAT-5’TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTT GGTGCAT-5 ’

(Посл. NO: 75)(Last NO: 75)

(Посл. NO: 76)(Last NO: 76)

Последняя плазмида представляла собой Bgll-Sptl-фрагмент (1064 п.о.) плазмиды рМР11, описанной выше.The latter plasmid was a Bgll-Sptl fragment (1064 bp) of the plasmid pMP11 described above.

(e) Плазмида рМР172(e) Plasmid pMP172

Плазмида рМР172 является секретирующим вектором для первых 153 аминокислот ТРО и промежуточным звеном для конструирования рМР210. Как показано на фиг.37 рМР172 получали путем совместного лигирования трех ДНК-фрагментов, первый из которых являлся вектором pLS321amB, в котором был удален небольшой EcoRl-Hindlll-фрагмент. Второй представлял собой EcoRl-Hbal-фрагмент (946 п.о.) вышеописанной плазмиды рМР11. Последняя часть представляла собой синтетический ДНК-дуплекс, имеющий нижеследующую последовательность:Plasmid pMP172 is a secreting vector for the first 153 amino acids of TPO and an intermediate for the construction of pMP210. As shown in FIG. 37, pMP172 was obtained by co-ligation of three DNA fragments, the first of which was the pLS321amB vector in which a small EcoRl-Hindlll fragment was removed. The second was an EcoRl-Hbal fragment (946 bp) of the above plasmid pMP11. The last part was a synthetic DNA duplex having the following sequence:

5`-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (Посл. NO: 77)5`-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (Last NO: 77)

GGAGACGCAGTCCATCGA-5’ (Посл. NO: 78)GGAGACGCAGTCCATCGA-5 ’(Serial NO: 78)

(f) Плазмида рМР210(f) Plasmid pMP210

Плазмиду рМР210 конструировали для экспрессии первых 153 аминокислот ТРО после метионина, инициирующего трансляцию. Эту плазмиду использовали в виде банка плазмид, в котором первые 6 кодонов ТРО рандомизированы в третьем положении каждого кодона, а затем конструировали, как показано на фиг.38, путем лигирования всех трех ДНК-фрагментов. Первый фрагмент представлял собой ранее описанный вектор pLEG31, в котором был удален небольшой Xbal-Sptl-фрагмент. Второй представлял собой синтетический ДНК-дуплекс, который сначала обрабатывали ДНК-полимеразой 1 (фрагмент Кленова), а затем гидролизовали ферментами Xbal и Hinfl, и наконец, этот дуплекс, кодирующий метионин инициации, рандомизировали в первых шести кодонах ТРО.The plasmid pMP210 was designed to express the first 153 amino acids of TPO after translation initiation methionine. This plasmid was used as a bank of plasmids in which the first 6 TPO codons were randomized at the third position of each codon, and then constructed, as shown in Fig. 38, by ligation of all three DNA fragments. The first fragment was the previously described vector pLEG31, in which a small Xbal-Sptl fragment was removed. The second was a synthetic DNA duplex, which was first treated with DNA polymerase 1 (Klenov fragment), and then hydrolyzed with Xbal and Hinfl enzymes, and finally, this duplex encoding initiation methionine was randomized in the first six TPO codons.

5’-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA5’-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

ACACTGGAGGCTGTTCTCAGTAAA (Посл. NO: 79) CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5’ (Посл. NO: 80)ACACTGGAGGCTGTTCTCAGTAAA (Last NO: 79) CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5 ’(Last NO: 80)

Третий фрагмент представлял собой Hinfl-Sptl-фрагмент (890 п.о.) плазмиды рМР172, кодирующей аминокислоты 19-153 ТРО.The third fragment was a Hinfl-Sptl fragment (890 bp) of plasmid pMP172 encoding amino acids 19-153 TPO.

рМР210-плазмидный банк, приблизительно 3700 клонов, повторно трансформировали в LB-планшеты с высокомолекулярным тетрациклином (50 мкг/мл) для отбора клонов, инициирующих трансляцию (Yansura, D.G. et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:151-158 [1992]). Из 8 колоний, платированных в планшеты с высокомолекулярным тетрациклином, 5 наиболее продуцирующих колоний в промежутке между экспрессией ТРО подвергали ДНК-секвенированию; результаты приведены на фиг.39 (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 и 28)pMP210 plasmid bank, approximately 3,700 clones, was re-transformed into high molecular weight tetracycline LB plates (50 μg / ml) to select translation clones (Yansura, DG et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4: 151- 158 [1992]). Of the 8 colonies plated on tablets with high molecular weight tetracycline, the 5 most producing colonies between the expression of TPO were subjected to DNA sequencing; the results are shown in Fig. 39 (SEQ ID NOS: 23, 24, 25, 26, 27 and 28)

(g) Плазмида рМР41(g) Plasmid pMP 41

Плазмиду рМР41 конструировали для экспрессии первых 155 аминокислот ТРО, слитого с лидерной последовательностью, состоящей из 7 аминокислот сигнальной последовательности STll, за которым расположен сайт расщепления фактором Ха. Эту плазмиду конструировали как показано на фиг.40 путем глигирования всех трех частей ДНК, первая из которых представляла собой ранее описанный вектор pVEG31, в котором был удален небольшой Xbal-Sptl-фрагмент. Второй представлял собой следующий синтетический ДНК-дуплекс:Plasmid pMP41 was designed to express the first 155 amino acids of TPO fused to a leader sequence consisting of 7 amino acids of the STll signal sequence, followed by a factor Xa cleavage site. This plasmid was constructed as shown in FIG. 40 by gligating all three parts of DNA, the first of which was the previously described pVEG31 vector in which a small Xbal-Sptl fragment was removed. The second was the following synthetic DNA duplex:

5` CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (Посл. NO: 81)5` CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (Last NO: 81)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5’ (Посл. NO: 82)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5 ’(Last Post: 82)

Последний фрагмент в лигировании представлял собой Bgll-Sphl-фрагмент (1064 п.о.) ранее описанной плазмиды рМ11.The last fragment in the ligation was a Bgll-Sphl fragment (1064 bp) of the previously described plasmid pM11.

(h) Плазмида рМР57(h) Plasmid pMP57

Плазмида рМР57 экспрессирует первые 155 аминокислот ТРО, расположенные ниже лидерной последовательности, состоящей из 9 аминокислот сигнальной последовательности STll и двухосновного сайта Lys-Arg. Этот двухосновной сайт обеспечивает удаление лидерной последовательности посредством протеазо ArgC, Данную плазмиду конструировали, как показано на фиг.41 путем совместного лигирования трех ДНК-фрагментов. Первый из этих фрагментов представлял собой ранее описанный вектор pLEG31, в котором был удален небольшой Xbal-Sptl-фрагмент. Второй фрагмент представлял собой следующий синтетический ДНК-дуплекс:Plasmid pMP57 expresses the first 155 amino acids of TPO located below the leader sequence consisting of 9 amino acids of the STll signal sequence and the dibasic Lys-Arg site. This dibasic site allows the leader sequence to be deleted by means of ArgC protease. This plasmid was constructed as shown in FIG. 41 by co-ligation of three DNA fragments. The first of these fragments was the previously described vector pLEG31, in which a small Xbal-Sptl fragment was removed. The second fragment was the following synthetic DNA duplex:

5’ CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (Посл. NO: 83)5 ’CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (Last NO: 83)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5’ (Посл. NO: 84)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5 ’(Last Post: 84)

Последний фрагмент после лигирования представлял собой Bgll-Sphl-фрагмент (1064 п.о.) ранее описанной плазмиды рМ11.The last fragment after ligation was a Bgll-Sphl fragment (1064 bp) of the previously described plasmid pM11.

(i) Плазмида рМР251(i) Plasmid pMP251

Плазмида рМР251 представляла собой производное рМР210-1, где на карбокси-концах были расположены две дополнительные аминокислоты ТРО. Как показано на фиг.42, эту плазмиду конструировали путем лигирования двух ДНК, а первый фрагмент представлял собой ранее описанный вектор рМР21, в котором был удален небольшой Xbal-Apal-фрагмент. Второй фрагмент после лигирования представлял собой Xbal-Apal-фрагмент (316 п.о.) плазмиды рМР210-1.Plasmid pMP251 was a derivative of pMP210-1, where two additional TPO amino acids were located at the carboxy-ends. As shown in FIG. 42, this plasmid was constructed by ligation of two DNAs, and the first fragment was the previously described pMP21 vector in which a small Xbal-Apal fragment was removed. The second fragment after ligation was an Xbal-Apal fragment (316 bp) of plasmid pMP210-1.

2. Трансформация и индуцирование векторов экспрессии ТРО в E.coli2. Transformation and induction of TPO expression vectors in E. coli

Вышеуказанные ТРО-экспрессирующие плазмиды использовали для трансформации штамма 44С6 E.coli (w3110 tоnАΔ rpoHts lоnΔ сlрРΔ galE) с помощью метода теплового шока с использованием CaCl2 (Handel, et al., J.Mol.Biol., 53:159-162, [1970]). Трансформироованные клетки сначала культивировали при температуре 37°С в LB-среде, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина, до тех пор пока оптическая плотность (600 нм) культуры не достигла приблизительно 2-3. Затем LB-культуру разводили 20×М9-среде, содержащей 0,49% казаминокислоты (мас./об.) и 50 мкг/мл карбенициллина. После 10-часового культивирования при температуре 30°С с аэрацией к этой культуре добавляли индол-3-акриловую кислоту до конечной концентрации 50 мкг/мл. После этого культуру выращивали еще 15 часов при температуре 30°С с аэрацией и в этот период времени клетки собирали посредством центрифугирования.The above TPO expressing plasmids were used to transform E. coli strain 44C6 (w3110 tonAΔ rpoH ts lonΔ clpPΔ galE) using the heat shock method using CaCl 2 (Handel, et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162 , [1970]). Transformed cells were first cultured at 37 ° C in an LB medium containing 50 μg / ml carbenicillin until the optical density (600 nm) of the culture reached approximately 2-3. Then, the LB culture was diluted with a 20 × M9 medium containing 0.49% casamino acid (w / v) and 50 μg / ml carbenicillin. After a 10-hour cultivation at a temperature of 30 ° C with aeration, indole-3-acrylic acid was added to this culture to a final concentration of 50 μg / ml. After that, the culture was grown for another 15 hours at a temperature of 30 ° C with aeration and during this period of time the cells were collected by centrifugation.

Пример 22Example 22

Продуцирование биологически активного ТРО (Met-1 1-153) в E.coliThe production of biologically active TPO (Met -1 1-153) in E. coli

Нижеприведенные процедуры для продуцирования биологически активного восстановленного ТРО (Met-1 1-153) могут быть осуществлены по аналогии с другими вариантами ТРО, включая N- и С-концевые удлиненные формы (см. Пример 23).The following procedures for the production of biologically active reduced TPO (Met -1 1-153) can be carried out by analogy with other variants of TPO, including N- and C-terminal extended forms (see Example 23).

А. Восстановление нерастворимого ТРО (Met-1 1-153)A. Recovery of insoluble SRW (Met -1 1-153)

ТРО, экспрессирующий клетки E.coli (Met-1 1-153) и кодированный плазмидой рМР210-1, подвергали ферментации, как описано выше. Приблизительно 100 г клеток ресуспендировали в 1 литре (10 объемов) буфера для дезинтеграции клеток (10 мМ, 10 мМ Трис, 5 мМ ЭДТК (рН 8) с использованием гомогенизатора Polytron, а затем клетки центрифугировали при 5000 g в течение 30 минут. Промытый клеточный осадок снова ресуспендировали в 1 л буфера для дезинтеграции клеток с использованием гомогенизатора Polytron, а затем клеточную суспензию пропускали через дезинтегратор клеток LH (LH Inceltech, Inc.) или через псевдоожижитель Microfluidizer (Microfluidics International) в соответствии с инструкциями изготовителя. Полученную суспензию центрифугировали при 5000 g в течение 30 минут, а затем ресуспендировали и центрифугировали еще раз с получением промытого осадка рефрактивных телец. Промытый осадок использовали сразу или предварительно замораживали при -70°С.TPO expressing E. coli cells (Met -1 1-153) and encoded by plasmid pMP210-1 were fermented as described above. About 100 g of cells were resuspended in 1 liter (10 volumes) of cell disintegration buffer (10 mM, 10 mM Tris, 5 mM EDTA (pH 8) using a Polytron homogenizer, and then the cells were centrifuged at 5000 g for 30 minutes. the pellet was again resuspended in 1 L of cell disintegration buffer using a Polytron homogenizer, and then the cell suspension was passed through an LH cell disintegrator (LH Inceltech, Inc.) or through a Microfluidizer (Microfluidics International) fluidiser according to the manufacturer's instructions. They were centrifuged at 5000 g for 30 minutes, then resuspended and centrifuged again to obtain a washed pellet of refractive bodies.The washed pellet was used immediately or pre-frozen at -70 ° C.

В. Солюбилизация и очистка мономерного ТРО (Met-1 1-153)B. Solubilization and purification of monomeric SRW (Met -1 1-153)

Вышеуказанный осадок ресуспендировали в 5 объемах 20 мМ Трис (рН 8), содержащего 6-8 М гуанидин и 25 мМ DTT (дитиотреитол), затем перемешивали в течение 1-3 часов или в течение ночи при температуре 4°С с получением солюбилизированного белка ТРО. Были также использованы высокие концентрации (6-8 М) мочевины, однако в результате получали более низкий выход по сравнению с гуанидином. После солюбилизации раствор центрифугировали при 30000 g в течение 30 минут и получали прозрачный супернатант, содержащий денатурированный мономерный белок ТРО. После этого супернатант хроматографировали посредством гель-фильтрации на колонке Superdex 200 (Pharmacia, 2,6×60 см) при скорости потока 2 мл/минуту, а затем элюировали 20 мМ фосфата натрия (рН 6) и 10 мМ дитиотреитола (DTT). Фракции, содержащие мономерный денатурированный белок ТРО, элюировали (160-200 мл) и объединяли. Кроме того, белок ТРО очищали с помощью полупрепаративной обращенно-фазовой хроматографии на колонках С4 (2×20 см; Vydac). Образец наносили при 5 мл/мин на колонку, уравновешенную в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA), элюируя 30%-ным ацетонитрилом. После этого белок элюировали градиентом ацетонитрила (30-60% в течение 60 минут). Затем очищенный и восстановленный белок элюировали приблизительно 50%-ным ацетонитрилом. Полученный продукт использовали для повторной укладки с получением биологически активного варианта ТРО.The above precipitate was resuspended in 5 volumes of 20 mM Tris (pH 8) containing 6-8 M guanidine and 25 mM DTT (dithiothreitol), then stirred for 1-3 hours or overnight at 4 ° C. to obtain solubilized TPO protein . High concentrations of urea (6-8 M) were also used, but the result was a lower yield compared to guanidine. After solubilization, the solution was centrifuged at 30,000 g for 30 minutes to obtain a clear supernatant containing the denatured TPO monomeric protein. Thereafter, the supernatant was chromatographed by gel filtration on a Superdex 200 column (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) at a flow rate of 2 ml / min, and then eluted with 20 mM sodium phosphate (pH 6) and 10 mM dithiothreitol (DTT). Fractions containing monomeric denatured TPO protein were eluted (160-200 ml) and combined. In addition, TPO protein was purified using semi-preparative reverse phase chromatography on C4 columns (2 × 20 cm; Vydac). A sample was applied at 5 ml / min to a column equilibrated in 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), eluting with 30% acetonitrile. After this, the protein was eluted with a gradient of acetonitrile (30-60% over 60 minutes). The purified and reduced protein was then eluted with approximately 50% acetonitrile. The resulting product was used for re-styling to obtain a biologically active version of the SRW.

С. Продуцирование биологически активного ТРО (Met-1 1-153)C. Production of biologically active TPO (Met -1 1-153)

Приблизительно 20 мг мономерного, восстановленного и денатурированного белка ТРО в 40 мл смеси 0,1%-ной трифторуксусной кислоты и 50%-ного ацетонитрила разводили в 360 мл буфера для укладки, необязательно содержащего реагенты:Approximately 20 mg of the monomeric, reduced and denatured TPO protein in 40 ml of a mixture of 0.1% trifluoroacetic acid and 50% acetonitrile was diluted in 360 ml of styling buffer, optionally containing reagents:

50 мМ Трис;50 mM Tris;

0,3 М хлорид натрия;0.3 M sodium chloride;

5 мМ ЭДТК;5 mM EDTA;

Детергент 2% CHAPS;Detergent 2% CHAPS;

25%-ный глицерин;25% glycerin;

5 Мм окисленный глутатион;5 mm oxidized glutathione;

1 мМ восстановленный глутатион;1 mM reduced glutathione;

рН доведенный 8,3.pH adjusted to 8.3.

После перемешивания буфер для укладки мягко помешивали при температуре 4°С 12-48 часов для получения максимального выхода правильных дисульфид-связанных форм ТРО (см. ниже). Полученный раствор подкисляли трифторуксусной кислотой до конечной концентрации 0,2%, а затем фильтровали через фильтр в 0,45 микрон или 0,22 микрон, и наконец, добавляли 1,10 объема ацетонитрила. Этот раствор непосредственно с помощью насоса вводили в обращенно-фазовую колонку с С4, а затем очищали и уложенный ТРО элюировали с помощью той же самой градиентной программы, описанной выше. Уложенный биологически активный ТРО элюировали в присутствии приблизительно 45% ацетонитрила в тех же самых условиях. Неправильные дисульфид-связанные формы ТРО элюировались раньше. Конечный очищенный ТРО (Met-1 1-153), имеющий чистоту более чем 95%, о чем свидетельствовал анализ, проведенный с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, анализировали посредством обращенно-фазовой хроматографии на колонках С4. Для in vivo-исследований материал, очищенный на колонке С4, диализовали в физиологически совместимые буферы. Были также использованы изотонические буферы (10 мМ ацетат натрия (рН 5,5)), 10 мМ сукцинат натрия (рН 5,5) или фосфат натрия (рН 7,4)) содержащие 150 мМ хлорид натрия и 0,01% Твин 80.After stirring, the styling buffer was gently stirred at 4 ° C for 12-48 hours to obtain the maximum yield of the correct disulfide-bound forms of TPO (see below). The resulting solution was acidified with trifluoroacetic acid to a final concentration of 0.2%, and then filtered through a filter of 0.45 microns or 0.22 microns, and finally, 1.10 volume of acetonitrile was added. This solution was injected directly into the C4 reverse phase column directly by means of a pump, and then it was purified and the stacked TPO was eluted using the same gradient program described above. The stacked biologically active TPO was eluted in the presence of approximately 45% acetonitrile under the same conditions. Irregular disulfide-bound forms of TPO eluted earlier. The final purified TPO (Met -1 1-153), having a purity of more than 95%, as evidenced by analysis performed by SDS page PAGE, was analyzed by reverse phase chromatography on C4 columns. For in vivo studies, the material purified on a C4 column was dialyzed into physiologically compatible buffers. Isotonic buffers (10 mM sodium acetate (pH 5.5)), 10 mM sodium succinate (pH 5.5) or sodium phosphate (pH 7.4)) containing 150 mM sodium chloride and 0.01% Tween 80 were also used. .

Благодаря высокой активности ТРО в анализе Ba/F3 (половина максимальной стимуляции достигалась приблизительно при 3 пг/мл), был получен биологически активный материал с использованием многих других буферов, детергентов и окислительно-восстановительных условий. Однако даже в улучшенных условиях было получено лишь небольшое количество правильно уложенного материала (<10%). Для промышленного изготовления данного продукта желательно, чтобы его выход составлял, по крайней мере, 10%, более предпочтительно 30-50% и наиболее предпочтительно >50%. Многие другие детергенты (Тритон Х-100, додецил-бета-мальтозид, CHAPS, CHAPSO, ДСН, саркозил, Твин 20 и Твин 80, Цвиттергент 3-14 и др.) анализировали на эффективность поддержания высокого уровня самопроизвольного сорачивания белка. Из этих детергентов, как было обнаружено, только семейство CHAPS (CHAPS и CHAPSO) может быть использовано в реакции сворачивания в целях ограничения агрегации белка и образования неправильных дисульфидных связей. Наиболее предпочтительно, чтобы уровни CHAPS составляли более 1%. Для наилучшего выхода оптимальные уровни хлорида натрия должны составлять 0,1 М и 0,5 М. Присутствие EDTA (1-5 мМ) ограничивает количество катализируемого металлом окисления (и агрегации), которое наблюдается при использовании некоторых препаратов. Концентрации глицерина, составляющие более чем 15%, дают оптимальные условия для сворачивания молекулы. Для максимального выхода очень важно, чтобы присутствовали оба как окисленный и восстановленный глутатио, так окисленный и восстановленный цистеин в качестве окислительно-восстановительной пары реагентов. Более высокий выход наблюдается в основном в том случае, когда молярное количество окисленного реагента равно или превышает количество восстановленного реагента в окислительно-восстановительной паре. Оптимальное значение рН для сворачивания указанных ТРО-вариантов составляет в пределах от 7,5 до около 9. Органические растворители (например, этанол, ацетонитрил, метанол) допустимы при концентрациях 10-15% или ниже. Более высокие уровни органических растворителей повышают возможность образования неправильно уложенных форм. Обычно используются Трис и фосфатные буферы. Инкубирование при 4°С также дает более высокие уровни правильно уложенного ТРО.Due to the high TPO activity in the Ba / F3 analysis (half the maximum stimulation was achieved at approximately 3 pg / ml), a biologically active material was obtained using many other buffers, detergents, and redox conditions. However, even under improved conditions, only a small amount of correctly laid material was obtained (<10%). For the industrial production of this product, it is desirable that its yield is at least 10%, more preferably 30-50% and most preferably> 50%. Many other detergents (Triton X-100, dodecyl beta-maltoside, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosyl, Tween 20 and Tween 80, Zwittergent 3-14, etc.) were analyzed for the effectiveness of maintaining a high level of spontaneous protein growth. Of these detergents, it was found that only the CHAPS family (CHAPS and CHAPSO) can be used in the folding reaction in order to limit protein aggregation and the formation of abnormal disulfide bonds. Most preferably, CHAPS levels are greater than 1%. For best yield, optimal sodium chloride levels should be 0.1 M and 0.5 M. The presence of EDTA (1-5 mM) limits the amount of metal-catalyzed oxidation (and aggregation) that is observed with certain drugs. Glycerol concentrations of more than 15% provide optimal conditions for folding the molecule. For maximum yield, it is very important that both oxidized and reduced glutathio and oxidized and reduced cysteine are present as a redox pair of reagents. A higher yield is observed mainly when the molar amount of the oxidized reactant is equal to or greater than the amount of reduced reactant in the redox pair. The optimal pH value for folding these TPO variants is in the range from 7.5 to about 9. Organic solvents (for example, ethanol, acetonitrile, methanol) are acceptable at concentrations of 10-15% or lower. Higher levels of organic solvents increase the possibility of misfolded forms. Commonly used Tris and phosphate buffers. Incubation at 4 ° C also gives higher levels of properly stacked SRW.

Обычно для препаратов ТРО, которые были очищены в процессе первой С4-стадии, уровни восстановления укладки белка составляют 40-60% (исходя из количества восстановленного и денатурированного ТРО, используемого в реакции сворачивания. Активный материал может быть получен при менее чистых препаратах (например, полученных непосредственно после колонки с Сефадексом 200 или после начальной экстракции рефрактивных телец), хотя выходы в этом случае меньше из-за экстенсивной преципитации и воздействия других белков (не ТРО) во время процесса восстановления укладки белка.Typically, for TPO preparations that have been purified during the first C4 stage, recovery levels of protein folding are 40-60% (based on the amount of reduced and denatured TPO used in the folding reaction. The active material can be obtained with less pure preparations (for example, obtained directly after the Sephadex 200 column or after the initial extraction of refractive bodies), although the yields in this case are less due to extensive precipitation and exposure to other proteins (not SRW) during the recovery process Stacking protein.

Поскольку ТРО (Met-1 1-153) содержит 4 цистеиновых остатка, то могут быть продуцированы три различных дисульфидных варианта этого белка:Since TPO (Met -1 1-153) contains 4 cysteine residues, three different disulfide variants of this protein can be produced:

Вариант 1: дисульфиды между цистеиновыми остатками 1-4 и 2-3Option 1: disulfides between cysteine residues 1-4 and 2-3

Вариант 2: дисульфиды между цистеиновыми остатками 1-2 и 3-4Option 2: disulfides between cysteine residues 1-2 and 3-4

Вариант 3: дисульфиды между цистеиновыми отатками 1-3 и 2-4Option 3: disulfides between cysteine residues 1-3 and 2-4

В процессе первоначального исследования по определению условий восстановления укладки белка несколько различных пиков, содержащих белок ТРО, были разделены с помощью С4-обращенно-фазовой хроматографией. Как было определено с помощью анализа на клетках Ba/F3, лишь один из этих пиков обнаруживал значительную биологическую активность. Затем условия для восстановления укладки были оптимизированы для получения предпочтительно этого варианта. В этих условиях варианты неправильного свертывания из всего полученного мономерного ТРО составляли менее 10-20%.During the initial study to determine the conditions for restoration of protein folding, several different peaks containing TPO protein were separated by C4 reverse phase chromatography. As determined by analysis on Ba / F3 cells, only one of these peaks showed significant biological activity. Then, the conditions for restoring the styling were optimized to obtain preferably this option. Under these conditions, improper coagulation options from the total monomeric SRW obtained were less than 10–20%.

С помощью масс-спектроскопии и секвенирования белка было установлено, что для биологического активного ТРО тип дисульфидных связей представляет собой 1-4 и 2-3 (т.е. вариант 1). Аликвоты различных С4-разрешенных пиков (5-10) гидролизовали трипсином (молярное отношение трипсина к белку составляло (1:25). Смесь для гидролиза анализировали с помощью лазерной масс-спектрометрии путем десорбционной ионизации с использованием матрицы как перед, так и после ДТТ-восстановления. После восстановления были детектированы массы, соответствующие наибольшему из триптических пептидов ТРО. В невосстановленных образцах некоторые из этих масс отсутствовали и наблюдались новые массы. Масса новых пиков соответствовала в основном сумме отдельных триптических пептидов, присутствующих в дисульфидной паре. Таким образом, можно со всей определенностью утверждать, что дисульфидный тип рекомбинантного вновь свернутого биологически активного ТРО соответствует варианту 1-4 и 2-3. Это предположение согласуется с известной дисульфидной картиной родственной молекулы эритропоэтина.Using mass spectroscopy and protein sequencing, it was found that for biologically active TPO, the type of disulfide bonds is 1-4 and 2-3 (i.e., option 1). Aliquots of various C4-allowed peaks (5-10) were hydrolyzed with trypsin (the molar ratio of trypsin to protein was (1:25). The mixture for hydrolysis was analyzed by laser mass spectrometry by desorption ionization using a matrix both before and after DTT- After reduction, masses corresponding to the largest of the tryptic peptides of TPO were detected. In unreduced samples, some of these masses were absent and new masses were observed. The mass of new peaks corresponded mainly to the sum Thus, it can be clearly stated that the disulfide type of the recombinant newly folded biologically active TPO corresponds to variants 1–4 and 2–3, which is consistent with the known disulfide picture of the erythropoietin related molecule.

D. Биологическая активность рекомбинантного вновь сложенного ТРО (Met-1 1-153)D. Biological activity of recombinant newly folded TPO (Met -1 1-153)

Вновь сложенный и очищенный ТРО (Met-1 1-153) обладал активностью как в in vivo, так и в in vitro-анализах. В Ba/F3, полумаксимальная стимуляция включения тимидина в клетки Ba/F3 достигалась при 3/3 пг/мл (0,3 пМ). В ELISA на основе рецептора mpl полумаксимальная активность наблюдалась при 1,9 нг/мл (120 пМ). У нормальных и миелосуппрессированных животных, полученных путем рентгеновского облучения дозами, близкими к летальной, ТРО (Met-1 1-153) обладал высокой активностью (эта активность наблюдалась уже при дозах 30 нг/мышь) к стимуляции продуцирования новых тромбоцитов.The newly folded and purified TPO (Met -1 1-153) had activity in both in vivo and in vitro assays. In Ba / F3, half-maximal stimulation of the incorporation of thymidine into Ba / F3 cells was achieved at 3/3 pg / ml (0.3 pM). In the mpl receptor-based ELISA, half-maximal activity was observed at 1.9 ng / ml (120 pM). In normal and myelosuppressed animals obtained by X-ray irradiation with doses close to lethal, TPO (Met -1 1-153) had high activity (this activity was already observed at doses of 30 ng / mouse) to stimulate the production of new platelets.

Пример 23Example 23

Продуцирование других биологически активных вариантов ТРО в E.coliThe production of other biologically active variants of TPO in E. coli

В E.coli было продуцировано три различных варианта ТРО, которые представляли собой очищенные и вновь уложенные биологически активные формы, описанные ниже.Three different types of TPO were produced in E. coli, which were purified and newly laid biologically active forms described below.

(1) MLF - 13 остатков от бактериальной сигнальной последовательности ST11 соединены с N-концевым доменом ТРО (остатки 1-155). Полученная последовательность представляла собой(1) MLF - 13 residues from the bacterial signal sequence ST11 are connected to the N-terminal domain of TPO (residues 1-155). The resulting sequence was

Figure 00000009
Figure 00000009

где лидерная последовательность подчеркнута, а C·······C означает Cys7-Cys151. Этот вариант был сконструирован для получения тиррозина для радиоактивного иодирования ТРО для исследований рецепторов и биологических исследований.where the leader sequence is underlined, and C ······· C means Cys 7 -Cys 151 . This option was designed to produce tyrosine for radioactive iodination of SRW for receptor and biological studies.

(2) H8MLF - 7 остатков от последовательности ST11, 8 остатков гистидина и последовательность фактор Ха-ферментативного расщепления IEGR были присоединены к N-концевому домену (остатки 1-155) ТРО. Эта последовательность представляет собой:(2) H8MLF - 7 residues from the ST11 sequence, 8 histidine residues, and the IEGR XA enzyme cleavage sequence were attached to the N-terminal domain (residues 1-155) of TPO. This sequence is:

Figure 00000010
Figure 00000010

где лидерная последовательность подчеркнута, а C·······C означает Cys7-Cys151. Этот вариант при очистке и укладке может быть обработан фактором Ха, который будет расщеплять последовательность IEGR после аргининового остатка, в результате чего будет получен вариант ТРО в 155 остатков с натуральной сериновой N-концевой аминокислотой.where the leader sequence is underlined, and C ······· C means Cys 7 -Cys 151 . This cleaning and styling option can be treated with factor Xa, which will cleave the IEGR sequence after the arginine residue, resulting in a TPO variant of 155 residues with a natural serine N-terminal amino acid.

(3) T-H8MLF - получали, как описано выше для варианта (2), за исключением того, что тромбин-восприимчивая последовательность IEPR соединена с N-концевым доменом ТРО. В результате была получена последовательность:(3) T-H8MLF - was obtained as described above for option (2), except that the thrombin-susceptible IEPR sequence is connected to the N-terminal domain of TPO. The result was the sequence:

Figure 00000011
Figure 00000011

где лидерная последовательность подчеркнута, а C·······C означает Цис7-Цис151. Этот вариант после очистки и укладки может быть обработан тромбином с получением N-концевого натурального варианта ТРО из 155 остатков.where the leader sequence is underlined, and C ······· C means Cis 7 -Cis 151 . This option, after cleaning and stacking, can be treated with thrombin to obtain an N-terminal natural variant of TPO from 155 residues.

А. Восстановление, солюбилизация и очистка мономерных биологически активных вариантов ТРО: (1), (2) и (3)A. Recovery, solubilization and purification of monomeric biologically active variants of SRW: (1), (2) and (3)

Все варианты были экспрессированы в E.coli. Большинство вариантов было однаружено в рефрактивных тельцах, как описано в Примере 22 для ТРО (Met-1 1-153). Идентичные процедуры для восстановления, солюбилизации и очистки мономерных ТРО-вариантов проводили, как описано в Примере 22. При этом условия восстановления укладки белка были идентичны условиям, использованным для ТРО (Met-1 1-153), где полный выход составлял 30-50%. После восстановления укладки ТРО-варианты очищали с помощью С4-обращенно-фазовой хроматографии в 0,1% ТГФ с использованием градиента ацетонитрила, как описано ранее. Все ТРО-варианты (в их непротеолизированной форме) имели биологическую активность в Ва/F3-анализах с полумаксимальной активностью 2-5 пМ.All variants were expressed in E. coli. Most variants were found in refractory bodies, as described in Example 22 for SRW (Met -1 1-153). Identical procedures for the recovery, solubilization and purification of monomeric TPO variants were performed as described in Example 22. The conditions for restoration of protein folding were identical to the conditions used for TPO (Met -1 1-153), where the total yield was 30-50% . After stacking was restored, the TPO variants were purified by C4 reverse phase chromatography in 0.1% THF using an acetonitrile gradient as previously described. All TPO variants (in their non-proteolyzed form) had biological activity in Ba / F3 analyzes with a half-maximum activity of 2-5 pM.

В. Протеолитический процессинг вариантов (2) и (3) с образованием активных N-концевых ТРО (1-155)B. Proteolytic processing of options (2) and (3) with the formation of active N-terminal SRW (1-155)

Были сконструированы вышеуказанные ТРО-варианты (2) и (3), содержащие ферментативно отщепляемый лидерный пептид, расположенный перед нормальным N-концевым аминокислотным остатком ТРО. После укладки и очистки вариантов (2) и (3), как описано выше, каждый вариант подвергали гидролизу соответствующим ферментом. На стадии С4-обращенно-фазовой хроматографии ацетонитрил удаляли путем продувания раствора легким потоком азота. После этого два варианта обрабатывали либо фактором Ха, либо тромбином, как описано ниже.The above TPO variants (2) and (3) were constructed containing an enzymatically cleavable leader peptide located in front of the normal N-terminal amino acid residue of the TPO. After laying and cleaning options (2) and (3), as described above, each option was subjected to hydrolysis of the corresponding enzyme. In the C4 reverse phase chromatography step, acetonitrile was removed by flushing the solution with a gentle stream of nitrogen. After that, two options were treated with either factor Xa or thrombin, as described below.

В случае варианта (2) к не содержащему ацетонитрила раствору добавляли 1М Трис-буфер (рН 8) до конечной концентрации 50 мМ и, если необходимо, рН доводили до 8. Затем добавляли NaCl и CaCl2 до 0,1 М и 2 М соответственно. Фактор Ха (New England Biolabs) добавляли в таком количестве, что молярное отношение фермента к варианту составляло 1:25-1:100. Образец инкубировали в течение 1-2 часов при комнатной температуре для достижения максимального расщепления, которое оценивали по изменению миграции на ДСН-геле, отображающей потерю лидерной последовательности. Затем реакционную смесь очищали посредством С4-обращенно-фазовой хроматографии с использованием того же самого градиента и тех же самых условий, которые были описаны выше для очистки правильно уложенных вариантов. При этих условиях нерасщепленный вариант В отделялся от расщепленного варианта (2). Было показано что N-концевыми аминокислотами являются SPAPP, что свидетельствует о том, что отщепление N-концевой лидерной последовательности прошло успешно. Фактор Ха также генерировал вариабельные количества внутреннего расщепления в ТРО-доменен; причем расщепление наблюдалось после агрининового остатка в положении 118, в результате чего образовывалась дополнительная N-концевая последовательность TTAHKDP (SEQ ID NO 88). На нередуцирующих ДСН-гелях наблюдалась одна полоса приблизительно 17000 Да для варианта, расщепленного фактором Ха; а на редуцирующих гелях наблюдались две полосы с молекулярной массой приблизительно 12000 и 5000 Да, что соответствует расщеплению у аргинина 118. Эти наблюдения также подтверждают тот факт, что две части молекулы связаны вместе дисульфидной связью между 1 и 4 цистеиновыми остатками, как было выявлено в результате экспериментов по триптическому расщеплению, описанных выше. В Ва/F3-анализе очищенный ТРО-вариант (1-155) после удаления N-концевой лидерной последовательности и внутреннего расщепления имел полумаксимальную активность 0,2-0,3 пМ. Интактный вариант с лидерной последовательностью имел полумаксимальную активность 2-4 пМ.In the case of option (2), 1M Tris buffer (pH 8) was added to an acetonitrile-free solution to a final concentration of 50 mM and, if necessary, the pH was adjusted to 8. Then, NaCl and CaCl 2 were added to 0.1 M and 2 M, respectively . Factor Xa (New England Biolabs) was added in such an amount that the molar ratio of the enzyme to the variant was 1: 25-1: 100. The sample was incubated for 1-2 hours at room temperature to achieve maximum cleavage, which was evaluated by the change in migration on the SDS gel, reflecting the loss of leader sequence. Then, the reaction mixture was purified by C4 reverse phase chromatography using the same gradient and the same conditions as described above for the purification of correctly placed variants. Under these conditions, unsplit variant B was separated from the split variant (2). It has been shown that the N-terminal amino acids are SPAPP, which indicates that cleavage of the N-terminal leader sequence was successful. Factor Xa also generated variable amounts of internal cleavage in the TPO domain; moreover, cleavage was observed after the agrinine residue at position 118, resulting in the formation of an additional N-terminal sequence TTAHKDP (SEQ ID NO 88). On non-reducing SDS gels, one band of approximately 17,000 Da was observed for the variant cleaved by factor Xa; and on reducing gels, two bands with a molecular weight of approximately 12,000 and 5,000 Da were observed, which corresponds to cleavage of arginine 118. These observations also confirm the fact that the two parts of the molecule are linked together by a disulfide bond between 1 and 4 cysteine residues, as was revealed as a result tryptic cleavage experiments described above. In the Ba / F3 analysis, the purified TPO variant (1-155) after removal of the N-terminal leader sequence and internal cleavage had a half-maximum activity of 0.2-0.3 pM. The intact variant with leader sequence had a half-maximal activity of 2-4 pM.

Для варианта (3) использовали буфер для гидролиза, состоящий из 50 мМ Трис, рН 8; 2% CHAPS; 0,3 М NaCl; 5 мМ EDTA и человеческого или коровьего тромбина (Calbiochem) при соотношении (по массе) фермента и ТРО-варианта 1:25-1:50 соответственно. Гидролиз проводили при комнатной температуре в течение 2-6 часов. Процесс расщепления оценивали по ДСН-гелям, как было описано выше для реакции расщепления фактором Ха. За это время в основном достигалось более чем 90%отщепления лидерной последовательности. Полученный ТРО очищали на С4-обращенно-фазовых колонках, как описано выше и при аминокислотном секвенировании было выявлено, что этот ТРО имеет нужный N-аминоконец. При этом, как и в случае фактора Ха, описанного выше, наблюдались очень небольшие (<5%) количества внутреннего расщепления в той же самой аргинин-треониновой связи. Полученный ТРО-белок обладал высокой биологической активностью в Ва/F3-анализе, при этом полумаксимальные ответы наблюдались при 0,2-0,4 пМ белка. В ELISA-анализе на основе рецептора mpl этот белок имел полумаксимальный ответ при 2-4 нг/мл очищенного белка (120-240 пМ), тогда как интактный вариант, содержащий лидерную последовательность, имел в 5-10 раз меньшую активность в обоих анализах. Для in vivo-исследования ВЭЖХ-очищенный расщепленный белок диализовали в физиологически приемлемых буферах (150 мМ NaCl, 0/01% Твин 80 и 10 мМ сукцината натрия, рН 5,5 или 10 мМ ацетат натрия, рН 5,5 или 10 мМ фосфат натрия, рН 7,4). В случае ВЭЖХ-и ДСН-гелей очищенный белок сохранял стабильность в течение нескольких недель при 4°С. У нормальных и миелосуппрессированных мышей, этот очищенный ТРО с аутентичной N-концевой последовательностью обладал высокой активностью и стимулировал продуцирование тромбоцитов при дозах уже в 30 нг на мышь.For option (3), a hydrolysis buffer was used consisting of 50 mM Tris, pH 8; 2% CHAPS; 0.3 M NaCl; 5 mM EDTA and human or bovine thrombin (Calbiochem) with a ratio (by weight) of the enzyme and TPO variant 1: 25-1: 50, respectively. Hydrolysis was carried out at room temperature for 2-6 hours. The cleavage process was evaluated by SDS gels as described above for the factor Xa cleavage reaction. During this time, more than 90% cleavage of the leader sequence was generally achieved. The resulting TPO was purified on C4 reversed-phase columns as described above, and amino acid sequencing revealed that this TPO had the desired N-amino terminus. Moreover, as in the case of factor XA described above, very small (<5%) amounts of internal cleavage in the same arginine-threonine bond were observed. The obtained TPO protein had high biological activity in the Ba / F3 analysis, with half-maximal responses observed at 0.2-0.4 pM protein. In the mpl receptor-based ELISA, this protein had a half-maximal response at 2-4 ng / ml of purified protein (120-240 pM), while the intact variant containing the leader sequence was 5-10 times less active in both assays. For in vivo studies, HPLC-purified digested protein was dialyzed in physiologically acceptable buffers (150 mM NaCl, 0/01% Tween 80 and 10 mM sodium succinate, pH 5.5 or 10 mM sodium acetate, pH 5.5 or 10 mM phosphate sodium, pH 7.4). In the case of HPLC and SDS gels, the purified protein remained stable for several weeks at 4 ° C. In normal and myelosuppressed mice, this purified TPO with an authentic N-terminal sequence was highly active and stimulated platelet production at doses as low as 30 ng per mouse.

Пример 24Example 24

Синтетический лиганд mplSynthetic ligand mpl

Хотя человеческий лиганд mpl (hML) обычно получали с использованием рекомбинантных методов, однако он может быть также синтезирован путем ферментативного лигирования синтетических пептидных фрагментов в соответствии с методикой, описанной ниже. Синтетическое продуцирование hML позволяет вводить ненатуральным аминокислоты или синтетические функциональные группы, такие как полиэтиленгликоль. Ранее для эффективного лигирования сложных эфиров пептидов в водном растворе был сконструирован мутант субтилизина (сериновой протеазы) BPN, субтилигаза (S221C/P225A) (Abrahmsen et al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). В настоящей работе было показно, что синтетические пептиды могут быть ферментативно лигированы последовательным методом в целях продуцирования ферментативно активных длинных пептидов, таких как рибонуклеаза A (Jackson et al., Science [1994]). Эта техника, которая более подробно описана ниже, позволяет осуществлять химических синтез белков, который ранее мог проводиться лишь с помощью технологии рекомбинантных ДНК.Although the human ligand mpl (hML) was usually obtained using recombinant methods, it can also be synthesized by enzymatic ligation of synthetic peptide fragments in accordance with the procedure described below. Synthetic production of hML allows the introduction of unnatural amino acids or synthetic functional groups, such as polyethylene glycol. Previously, a subtilisin (serine protease) mutant BPN, subtiligase (S221C / P225A) (Abrahmsen et al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]) was constructed to effectively ligate peptide esters in an aqueous solution. In the present work, it was shown that synthetic peptides can be enzymatically ligated by a sequential method in order to produce enzymatically active long peptides such as ribonuclease A (Jackson et al., Science [1994]). This technique, which is described in more detail below, allows the chemical synthesis of proteins, which previously could only be carried out using recombinant DNA technology.

Общая стратегия минтеза hМL153 с использованием субтилигазы представлена на Схеме 1. Начиная с полностью деблокированного пептида, соответствующего защищенному у N-конца С-концевому фрагменту белка, добавляли под действием субтилигазы активированный у С-конца сложным эфиром пептид. После завершения реакции продукт выделяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ и защитную группу у N-конца удаляли. Затем лигировали следующий пептидный фрагмент, после чего его деблокировали и процесс повторяли снова до тех пор, пока не был получен полноразмерный белок. Этот процесс аналогичен твердофазному пептидному синтезу, в котором защищенный у N-конца и активированный у С-конца пептид присоединяют к N-концу предыдущего пептида, в результате чего синтезируют пептид в направлении C→N. Однако вследствие того, что каждое присоединение добавляет до 50 остатков, а продукты выделяют после каждого лигирования, этот метод позволяет синтезировать белки с гораздо более высокой степенью чистоты и с приемлемыми выходами.The general strategy for the synthesis of hML 153 using subtiligase is presented in Scheme 1. Starting from a fully unblocked peptide corresponding to the C-terminal fragment of the protein protected at the N-terminus, a peptide activated at the C-terminus was added under the action of subtiligase. After completion of the reaction, the product was isolated by reverse phase HPLC and the protective group at the N-terminus was removed. Then the following peptide fragment was ligated, after which it was released and the process was repeated again until a full-sized protein was obtained. This process is similar to solid-phase peptide synthesis, in which the peptide protected at the N-terminus and activated at the C-terminus is attached to the N-terminus of the previous peptide, as a result of which the peptide is synthesized in the C → N direction. However, due to the fact that each addition adds up to 50 residues, and the products are isolated after each ligation, this method allows the synthesis of proteins with a much higher degree of purity and with acceptable yields.

Схема I: Стратегия синтеза hML с использованием субтилигазыScheme I: Subtiligase hML Synthesis Strategy

Figure 00000012
Figure 00000012

Figure 00000013
Figure 00000013

На основании наших знаний относительно специфичности последовательности субтилигазы, а также аминокислотной последовательности биологически активного "эпо-домена" hML мы разделили hML153 на семь фрагментов длиной в 18-25 остатков. Для определения подходящих областей соединения для лигирования 18-25-метров были синтезированы тетрапептиды для теста на лигирование. Результаты таких тестов на лигирование представлены в Таблице 13.Based on our knowledge regarding the specificity of the subtiligase sequence, as well as the amino acid sequence of the biologically active “hML“ e-domain ”, we divided hML 153 into seven fragments of 18-25 residues in length. To determine the appropriate regions of the compound for ligation of 18-25 meters, tetrapeptides were synthesized for the ligation test. The results of such ligation tests are presented in Table 13.

Таблица 13Table 13

Тест на лигирование hML. Донорные и нуклеофильные пептиды при 10 мМ в 100 мМ трицина (рН 7,8) при 22°С. Затем добавляли лигазу до конечной концентрации 10 мкМ из 1,6 мг/мл маточного раствора (~70 мкМ) и смесь для лигирования оставляли на ночь для реакции. Выходы выражали как % лигирования по отношению к гидролизу донорных пептидов.HML ligation test. Donor and nucleophilic peptides at 10 mM in 100 mM tricin (pH 7.8) at 22 ° C. Ligase was then added to a final concentration of 10 μM from 1.6 mg / ml stock solution (~ 70 μM) and the ligation mixture was allowed to react overnight. Yields were expressed as% ligation with respect to hydrolysis of donor peptides.

СайтWebsite Донор(gIк-K-NH2)Donor (gIk-K-NH 2 ) Нуклеофил-NН2,Nucleophil-NH 2 , % гидролиза% hydrolysis % лигирования% ligation SiteSite Donor (glc-K-NH2)Donor (glc-K-NH 2 ) Nucleophile-NH2 Nucleophile-NH 2 % Hydrolysis% Hydrolysis % Ligation% Ligation 1(23/24)1 (23/24) HVLH (SEQ ID NO: 89)HVLH (SEQ ID NO: 89) SRLS (SEQ ID NO: 90)SRLS (SEQ ID NO: 90) 9292 0808 (22/23)(22/23) SHVL (SEQ ID NO: 91)SHVL (SEQ ID NO: 91) HSRL (SEQ ID NO: 92)HSRL (SEQ ID NO: 92) 4848 5252 2(46/47)2 (46/47) AVDF (SEQ ID NO: 93)AVDF (SEQ ID NO: 93) SLGE (SEQ ID NO: 94)SLGE (SEQ ID NO: 94) 2222 7878 3(69/70)3 (69/70) AVTL (SEQ ID NO: 95)AVTL (SEQ ID NO: 95) LLEG (SEQ ID NO: 96)LLEG (SEQ ID NO: 96) 5353 4747 4(89/90)4 (89/90) LSSL (SEQ ID NO: 97)LSSL (SEQ ID NO: 97) LGQL (SEQ ID NO: 98)LGQL (SEQ ID NO: 98) 9595 0505 (88/89)(88/89) C(acm)LSS (SEQ ID NO: 99)C (acm) LSS (SEQ ID NO: 99) LLGQ (SEQ ID NO: 100)LLGQ (SEQ ID NO: 100) 0000 0000 (90/91)(90/91) SSLL (SEQ ID NO: 101)SSLL (SEQ ID NO: 101) GQLS (SEQ ID NO: 102)GQLS (SEQ ID NO: 102) 4545 5555 (88/89)(88/89) CLSS (SEQ ID NO: 103)CLSS (SEQ ID NO: 103) LLGQ (SEQ ID NO: 100)LLGQ (SEQ ID NO: 100) 9090 1010 5(107/108)5 (107/108) LQSL (SEQ ID NO: 104)LQSL (SEQ ID NO: 104) LGTQ (SEQ ID NO: 105)LGTQ (SEQ ID NO: 105) 9999 0101 (106/107)(106/107) ALQS (SEQ ID NO: 106)ALQS (SEQ ID NO: 106) LLGT (SEQ ID NO: 107)LLGT (SEQ ID NO: 107) 7070 30thirty 6(128/129)6 (128/129) NAIF (SEQ ID NO: 108)NAIF (SEQ ID NO: 108) LSFQ (SEQ ID NO: 109)LSFQ (SEQ ID NO: 109) 6060 4040

На основании этих экспериментов с помощью субтилигазы может быть проведено успешное лигирование пептидов, проиллюстрированных в Таблице 14. Для предупреждения самолигирования необходимо использовать подходящую защиту для N-конца каждого донорного сложноэфирного пептида. В качестве защитной группы мы выбрали изоникотинил (iNOC) (Veber et al., J.Org.Chem., 42: 3286-3289 [1977]), поскольку она является водорастворимой, может быть введена в последней стадии твердофазного синтеза и является стабильной в отношении безводного HF, который используется для деблокирования и отщепления пептидов от твердофазного полимера. Кроме того, эта группа может быть удалена из пептида после каждого лигирования в мягких восстановительных условиях (Zn/CH3CO2H) с получением свободного N-конца для последующего лигирования. Сложный эфир гликолат-лизил-амида (glc-K-NH2) был использован для активации С-конца на основании предыдущих экспериментов, которые показали, что он может быть эффективно ацилирован с помощью субтилигазы (Abrahmsen et al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). INOC-защищенные и активированные glc-K-амидом пептиды могут быть синтезированы с использованием стандартных твердофазных методов, как показно на Схеме 2. Эти пептиды последовательно лигируют до тех пор пока не будет продуцирован полный белок, после чего конечный продукт подвергают реакции укладки in vitro. Исходя из гомологии с ЕРО дисульфидные пары, очевидно, образуются между цистеиновыми остатками 7 и 157 и между 28 и 85. Окисление дисульфидов может быть осуществлено путем простого размешивания восстановленного материала в течение нескольких часов в атмосфере кислорода. Свернутый материал затем очищают с помощью ВЭЖХ и фракции, содержащие активный белок, собирают и лиофилизуют. Альтернативно, дисульфиды могут быть различным образом защищены для контроля за последующим окислением между специфическими дисульфидными парами. Защита цистеинов 7 и 151 ацетомидометильными (acm) группами должна обеспечивать окисление 28 и 85. acm-Группы могут быть затем удалены, а остатки 7 и 151 окислены. И наоборот, остатки 28 и 85 могут быть асm-защищены и окислены, в случае если для правильной укладки необходимо последующее окисление. Цистеины 28 и 85 могут быть замещены, но не обязательно, другим натуральным или ненатуральным остатком, не являющимся Цис, для обеспечения правильного окисления цистеинов 7 и 151.Based on these experiments, the ligation of the peptides illustrated in Table 14 can be successfully performed using subtiligase. To prevent self-ligation, it is necessary to use appropriate protection for the N-terminus of each donor ester peptide. As a protective group, we chose isonicotinyl (iNOC) (Veber et al., J. Org. Chem., 42: 3286-3289 [1977]), since it is water-soluble, it can be introduced in the last stage of solid-phase synthesis and is stable in with respect to anhydrous HF, which is used for the release and cleavage of peptides from the solid phase polymer. In addition, this group can be removed from the peptide after each ligation under mild reducing conditions (Zn / CH 3 CO 2 H) to give a free N-terminus for subsequent ligation. Glycolate-lysyl amide ester (glc-K-NH 2 ) was used to activate the C-terminus based on previous experiments, which showed that it can be efficiently acylated with subtiligase (Abrahmsen et al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). INOC-protected and glc-K-amide activated peptides can be synthesized using standard solid phase methods, as shown in Scheme 2. These peptides are ligated sequentially until a complete protein is produced, after which the final product is subjected to an in vitro folding reaction. Based on homology with EPO, disulfide pairs are obviously formed between cysteine residues 7 and 157 and between 28 and 85. Oxidation of disulfides can be accomplished by simply mixing the reduced material for several hours in an oxygen atmosphere. The rolled material is then purified by HPLC and the fractions containing the active protein are collected and lyophilized. Alternatively, disulfides can be protected in various ways to control subsequent oxidation between specific disulfide vapors. The protection of cysteines 7 and 151 by the acetomidomethyl (acm) groups should provide oxidation of 28 and 85. The acm groups can then be removed and residues 7 and 151 oxidized. Conversely, residues 28 and 85 can be acm-protected and oxidized if subsequent oxidation is necessary for proper installation. Cysteines 28 and 85 may be substituted, but not necessarily, with another natural or non-natural residue other than Cis, to ensure proper oxidation of cysteines 7 and 151.

Таблица 14Table 14

Пептидные фрагменты, используемые для полного синтеза с использованием субтилигазыPeptide fragments used for complete synthesis using subtiligase

ФрагментFragment

ПоследовательностьSequence

1 (Посл.NO: 110)1 (Last Post: 110)

iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2 (1-22)iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH 2 (1-22)

2 (Посл.NO: 111)2 (Last Post: 111)

iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2 (23-46)iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH 2 (23-46)

3 (Посл.NO: 112)3 (Last Post: 112)

iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH2 (47-69)iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH 2 (47-69)

4 (Посл. NO: 113)4 (Last NO: 113)

iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2 (70-90)iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH 2 (70-90)

5 (Посл. NO: 114)5 (Last NO: 114)

iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2 (90-106)iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH 2 (90-106)

6 (Посл. NO: 115)6 (Last NO: 115)

iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2 (107-128)iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH 2 (107-128)

7 (Посл. NO: 116)7 (Last NO: 116)

iNOC-HN-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2 (129-153)iNOC-HN-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO 2 (129-153)

Лигирование пептидов осуществляли при 25°С в 100 мМ трицина, рН 8 (свежеприготовленом и дегазированном путем вакуумной фильтрации через 5 мкм-фильтр). Обычно С-концевой фрагмент растворяли в буфере (2-5 мМ пептид) и добавляли 10х маточный раствор субтилигазы (1 мг/мл в 100 мМ трицина, рН 8) для доведения конечной концентрации фермента до ~5 мкМ. Затем добавляли 3-5 молярный избыток glc-K-активированного донорного пептида (в твердом виде), растворяли и полученную смесь оставляли при 25°С. За ходом лигирования следили с помощью аналитической обращенно-фазовой С18-ВЭЖХ (СН3СN/Н2O-градиент с 0/1% TFA). Продукты лигирования очищали с помощью препаративной ВЭЖХ и лиофилизовали. Снятие защитной изоникотинильной (iNOC) группы осуществляли путем размешивания HCl-активированной цинковой пыли с защищенным пептидом в уксусной кислоте. Цинковую пыль удаляли путем фильтрации, а уксусную кислоту выпаривали под вакуумом. Полученный пептид может быть затем непосредственно использован для последующей стадии лигирования и процесс повторяют. Синтетический hML153 может быть лигирован в соответствии с процедурами, аналогичными процедурам, описанным выше для синтетического или рекомбинантного hML154-332, в результате чего может быть продуцирован синтетический или полусинтетический полноразмерный hML.Peptide ligation was carried out at 25 ° C in 100 mM tricin, pH 8 (freshly prepared and degassed by vacuum filtration through a 5 μm filter). Typically, the C-terminal fragment was dissolved in buffer (2-5 mM peptide) and a 10x mother liquor of subtiligase (1 mg / ml in 100 mM tricin, pH 8) was added to bring the final enzyme concentration to ~ 5 μM. Then, a 3-5 molar excess of the glc-K-activated donor peptide (solid) was added, dissolved, and the resulting mixture was left at 25 ° C. The ligation progress was monitored by analytical reverse phase C18-HPLC (CH 3 CN / H 2 O gradient with 0/1% TFA). Ligation products were purified by preparative HPLC and lyophilized. The removal of the isonicotinyl (iNOC) group was carried out by mixing the HCl-activated zinc dust with the protected peptide in acetic acid. Zinc dust was removed by filtration, and acetic acid was evaporated in vacuo. The resulting peptide can then be directly used for the subsequent ligation step and the process is repeated. Synthetic hML 153 may be ligated in accordance with procedures similar to those described above for synthetic or recombinant hML 154-332 , whereby synthetic or semi-synthetic full-length hML can be produced.

Синтетический hML имеет много преимуществ по сравнению с рекомбинантным. Натуральные боковые цепи могут быть введены для повышения активности или специфичности. Полимерные функциональные группы, такие как полиэтиленгликоль, могут быть введены для повышения продолжительности действия. Например, полиэтиленгликоль может быть присоединен к лизиновым остаткам отдельных фрагментов (Таблица 14) до или после осуществления одной или нескольких стадий лигирования. Чувствительные к действию протеазы пептидные связи могут быть удалены или модифицированы для улучшения стабильности in vivo. Кроме того, для облегчения определения структуры могут быть синтезированы производные с тяжелыми атомами.Synthetic hML has many advantages over recombinant. Natural side chains may be introduced to increase activity or specificity. Polymer functional groups, such as polyethylene glycol, can be introduced to increase the duration of action. For example, polyethylene glycol can be attached to the lysine residues of individual fragments (Table 14) before or after one or more ligation steps. Protease sensitive peptide bonds can be removed or modified to improve in vivo stability. In addition, derivatives with heavy atoms can be synthesized to facilitate structural determination.

Схема 2: Твердофазный синтез пептидных фрагментов для сегментного лигированияScheme 2: Solid-phase synthesis of peptide fragments for segment ligation

Figure 00000014
Figure 00000014

(а) Лизил-параметилбензгидриламиновую (МВНА) смолу 1 (0,063 мэк/г, Advanced Chem.Tech.) размешивали с бромуксусной кислотой (5 экв.) и диизопропилкарбодиимидом (5 экв.) в течение 1 часа при 25°С в диметилацетамиде (DMA), в результате чего получали бромоацетиловое производное 2. (b) Смолу интенсивно промывали DMA, а отдельные Вос-защищенные аминокислоты (3 экв., Bachem) этерифицировали путем размешивания с бикарбонатом натрия (6 экв.) в диметилформамиде (ДМФ) в течение 24 часов при 50°С, в s результате чего получали соответствующую гликолат-фенилаланиламидную смолу 3. Амино-ацетилированную смолу 3 промывали диметилформамидом (3х) и дихлорметаном (CH2Cl2) (3х) и после этой промывки смолу можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Затем смолу (3) загружали в автоматический пептидный синтезатор (Applied Biosystems 430 А) и пептиды наращивали в соответствии со стандартыми процедурами твердофазного синтеза (5). (с) N-α-Boc-группу удаляли с помощью раствора 45%-ной трифторуксусной кислоты в СН2Сl2. (d) Последующие Вос-защищенные аминокислоты (5 экв.) предварительно активировали с использованием гексафторофосфата бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)-фосфония (ВОР, 4 экв.) и N-метилфорфолина (NMM, 10 экв.) в DMA и проводили реакцию в течение 1-2 часа. (е) Конечную N-α-Boc-группу удаляли (TFA/CH2Cl2), в результате чего получали 4 и вводили изоникотинильную (iNOC) защитную группу, как описано выше (4) посредством размешивания 4-изоникотинил-2-4-динитрофенил-карбоната (3 экв.) и NMM (6 экв.) в DMA в течение 24 часов при 25°С. (f) После расщепления и деблокирования пептида посредством обработки безводным HF (5% анизол/5% этилметилсульфид) в течение часа при 0°С получали iNOC-защищенный гликолат-Цис-амид-активированный пептид 5, который очищали с помощью обращенно-фазовой С18-ВЭЖХ (СН3СN/Н2О-градиент, 0,1% TFA). Идентичность всех субстратов подтверждалась масс-спектрометрией.(a) Lysylparamethylbenzhydrylamine (MVNA) resin 1 (0.063 meq / g, Advanced Chem.Tech.) was stirred with bromoacetic acid (5 equivalents) and diisopropylcarbodiimide (5 equivalents) for 1 hour at 25 ° C in dimethylacetamide ( DMA), resulting in the production of bromoacetyl derivative 2. (b) The resin was washed extensively with DMA, and individual Boc-protected amino acids (3 eq., Bachem) were esterified by stirring with sodium bicarbonate (6 eq.) In dimethylformamide (DMF) for 24 hours at 50 ° C, as a result of which the corresponding glycolate-phenylalanilamide resin 3 was obtained. Amino the acetylated resin 3 was washed with dimethylformamide (3x) and dichloromethane (CH 2 Cl 2 ) (3x) and after this washing the resin can be stored at room temperature for several months. Then, the resin (3) was loaded into an automatic peptide synthesizer (Applied Biosystems 430 A) and the peptides were expanded in accordance with standard solid phase synthesis procedures (5). (c) the N-α-Boc group was removed using a solution of 45% trifluoroacetic acid in CH 2 Cl 2 . (d) Subsequent Boc-protected amino acids (5 eq.) were preactivated using benzotriazol-1-yl-hydroxy-tris- (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP, 4 eq.) and N-methylphospholine (NMM, 10 eq. ) in DMA and the reaction was carried out for 1-2 hours. (e) The final N-α-Boc group was removed (TFA / CH 2 Cl 2 ), whereby 4 was obtained and the isonicotinyl (iNOC) protecting group was introduced as described above (4) by stirring 4-isonicotinyl-2-4 -dinitrophenyl carbonate (3 equiv.) and NMM (6 equiv.) in DMA for 24 hours at 25 ° C. (f) After cleavage and release of the peptide by treatment with anhydrous HF (5% anisole / 5% ethyl methyl sulfide) for 1 hour at 0 ° C, an iNOC-protected glycolate-Cis-amide-activated peptide 5 was obtained, which was purified using reverse phase C18 HPLC (CH 3 CN / H 2 O gradient, 0.1% TFA). The identity of all substrates was confirmed by mass spectrometry.

Дополнение к юридическому статусуAddition to legal status

Настоящее изобретение имеет юридический статус в соответствии с вышеприведенным описанием и легкодоступными ссылками и исходными материалами. Тем не менее, заявители депонировали в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Роквил, США, следующую клеточную линию:The present invention has legal status in accordance with the above description and readily available links and source materials. However, the applicants deposited the following cell line at the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA:

Escherichia coli, DH10B-pBSK-hmpl 1 1,8, АТСС, рег. №CRL 69575, депонирована 24 февраля 1994.Escherichia coli, DH10B-pBSK-hmpl 1 1.8, ATCC, reg. No. CRL 69575, deposited on February 24, 1994.

Плазмида pSV15.ID.LL.MLORRF, АТСС рег. №CRL 75958, депонирована 2 декабря 1994.Plasmid pSV15.ID.LL.MLORRF, ATCC reg. No. CRL 75958, deposited December 2, 1994.

Клетки CHO DP-12, ML 1/50 МСВ (мечен. №1594), АТСС рег. №CRL 11770, депонированы 6 декабря 1994.Cells CHO DP-12, ML 1/50 MCB (labeled No. 1594), ATCC reg. No. CRL 11770, deposited on December 6, 1994.

Депонирование проводили в соответствии с Будапештским договором по Международному соглашению о депонировании микроорганизмов в целях проведения патентной экспертизы (Будапештский договор). Сохранение жизнеспособных культур гарантируется в течение 30 лет от даты депонирования. Эти микроорганизмы, в соответствии с Будапештским договором будут доступны широкой публике без всякого ограничения после выдачи патента на заявку. Доступность депонированного штамма не должна быть истолкована как лицензия на осуществление изобретения, поскольку это противоречит правам, предоставляемым любым правительством в соответствии с патентными законами данного государства.Deposits were carried out in accordance with the Budapest Treaty under the International Agreement on the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Examination (Budapest Treaty). Preservation of viable crops is guaranteed for 30 years from the date of deposit. These microorganisms, in accordance with the Budapest Treaty, will be available to the general public without any restriction after the grant of a patent for an application. The availability of the deposited strain should not be construed as a license to carry out the invention, since this contradicts the rights granted by any government in accordance with the patent laws of that state.

Необходимо иметь в виду, что проиллюстрированные и описанные выше варианты осуществления изобретения следует рассматривать как предпочтительные, и в него могут быть внесены различные изменения, замещения и модификации, не выходящие, однако, за рамки существа и объема ниже следующей формулы изобретения. Поэтому следует отметить, что защита, предоставляемая патентной грамотой, ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.It should be borne in mind that the illustrated and described embodiments of the invention should be considered preferred, and various changes, substitutions, and modifications may be made thereto, however, without departing from the spirit and scope of the following claims. Therefore, it should be noted that the protection afforded by a patent letter is limited only by the attached claims and their equivalents.

Все цитируемые работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.All cited works are introduced into the present description by reference.

Figure 00000015
Figure 00000015

Figure 00000016
Figure 00000016

Figure 00000017
Figure 00000017

Figure 00000018
Figure 00000018

Figure 00000019
Figure 00000019

Figure 00000020
Figure 00000020

Figure 00000021
Figure 00000021

Figure 00000022
Figure 00000022

Figure 00000023
Figure 00000023

Figure 00000024
Figure 00000024

Figure 00000025
Figure 00000025

Figure 00000026
Figure 00000026

Figure 00000027
Figure 00000027

Figure 00000028
Figure 00000028

Figure 00000029
Figure 00000029

Figure 00000030
Figure 00000030

Figure 00000031
Figure 00000031

Figure 00000032
Figure 00000032

Figure 00000033
Figure 00000033

Figure 00000034
Figure 00000034

Figure 00000035
Figure 00000035

Figure 00000036
Figure 00000036

Figure 00000037
Figure 00000037

Figure 00000038
Figure 00000038

Figure 00000039
Figure 00000039

Figure 00000040
Figure 00000040

Figure 00000041
Figure 00000041

Figure 00000042
Figure 00000042

Figure 00000043
Figure 00000043

Figure 00000044
Figure 00000044

Figure 00000045
Figure 00000045

Figure 00000046
Figure 00000046

Figure 00000047
Figure 00000047

Figure 00000048
Figure 00000048

Figure 00000049
Figure 00000049

Figure 00000050
Figure 00000050

Figure 00000051
Figure 00000051

Figure 00000052
Figure 00000052

Figure 00000053
Figure 00000053

Figure 00000054
Figure 00000054

Figure 00000055
Figure 00000055

Figure 00000056
Figure 00000056

Figure 00000057
Figure 00000057

Figure 00000058
Figure 00000058

Figure 00000059
Figure 00000059

Figure 00000060
Figure 00000060

Figure 00000061
Figure 00000061

Figure 00000062
Figure 00000062

Figure 00000063
Figure 00000063

Figure 00000064
Figure 00000064

Figure 00000065
Figure 00000065

Figure 00000066
Figure 00000066

Figure 00000067
Figure 00000067

Figure 00000068
Figure 00000068

Figure 00000069
Figure 00000069

Figure 00000070
Figure 00000070

Figure 00000071
Figure 00000071

Figure 00000072
Figure 00000072

Figure 00000073
Figure 00000073

Figure 00000074
Figure 00000074

Figure 00000075
Figure 00000075

Figure 00000076
Figure 00000076

Figure 00000077
Figure 00000077

Figure 00000078
Figure 00000078

Figure 00000079
Figure 00000079

Figure 00000080
Figure 00000080

Figure 00000081
Figure 00000081

Claims (21)

1. Существенно гомогенный полипептид лиганд mpl, выбранный из группы, состоящей из1. A substantially homogeneous mpl ligand polypeptide selected from the group consisting of (а) полипептидного фрагмента, представленного формулой(a) a polypeptide fragment represented by the formula X-hTPO-YX-hTPO-Y где hTPO выбран из группы, состоящей из аминокислотной последовательности человеческого ТРО (hML) от Ser1 до Arg245, от Ser1 до Arg153 и от Cys7 до Cys151 включительно;where hTPO is selected from the group consisting of the amino acid sequence of human TPO (hML) from Ser 1 to Arg 245 , from Ser 1 to Arg 153, and from Cys 7 to Cys 151 inclusive; Х представляет собой аминоконцевую аминогруппу или аминокислотный(ые) остаток(ки), выбранные из группыX represents an amino-terminal amino group or amino acid (s) residue (s) selected from the group М,M МА,MA МРА,MRA MPPA(SEQ ID NO: 117),MPPA (SEQ ID NO: 117), МАРРА (SEQ ID NO: 118),MARRA (SEQ ID NO: 118), MPAPPA (SEQ ID NO: 119),MPAPPA (SEQ ID NO: 119), MSPAPPA (SEQ ID NO: 120),MSPAPPA (SEQ ID NO: 120), A,A PA,PA, PPA,PPA APPA (SEQ ID NO: 121),APPA (SEQ ID NO: 121), PAPPA (SEQ ID NO: 122),PAPPA (SEQ ID NO: 122), SPAPPA (SEQ ID NO: 123),SPAPPA (SEQ ID NO: 123), Y представляет собой карбоксиконцевую карбоксигруппу или аминокислотный(ые) остаток(ки), выбранные из группыY represents a carboxy-terminal carboxy group or amino acid residue (s) selected from the group V,V VR,VR VRR,VRR VRRA (SEQ ID NO: 124),VRRA (SEQ ID NO: 124), VRRAP (SEQ ID NO: 125),VRRAP (SEQ ID NO: 125), VRRAPP (SEQ ID NO: 126),VRRAPP (SEQ ID NO: 126), VRRAPPT (SEQ I D NO: 127),VRRAPPT (SEQ I D NO: 127), VRRAPPTT (SEQ ID NO: 128),VRRAPPTT (SEQ ID NO: 128), VRRAPPTTA (SEQ ID NO: 129),VRRAPPTTA (SEQ ID NO: 129), VRRAPPTTAV (SEQ ID NO: 130),VRRAPPTTAV (SEQ ID NO: 130), VRRAPPTTAVP (SEQ ID NO: 131),VRRAPPTTAVP (SEQ ID NO: 131), VRRAPPTTAVPS (SEQ ID NO: 132),VRRAPPTTAVPS (SEQ ID NO: 132), VRRAPPTTAVPSR (SEQ ID NO: 133),VRRAPPTTAVPSR (SEQ ID NO: 133), VRRAPPTTAVPSRT (SEQ ID NO: 134),VRRAPPTTAVPSRT (SEQ ID NO: 134), VRRAPPTTAVRSRTS (SEQ ID NO: 135),VRRAPPTTAVRSRTS (SEQ ID NO: 135), VRRAPPTTAVRSRTSL (SEQ ID NO: 136),VRRAPPTTAVRSRTSL (SEQ ID NO: 136), VRRAPPTTAVRSRTSLV (SEQ ID NO: 137),VRRAPPTTAVRSRTSLV (SEQ ID NO: 137), VRRAPPTTAVRSRTSLVL (SEQ ID NO: 138),VRRAPPTTAVRSRTSLVL (SEQ ID NO: 138), VRRAPPTTAVRSRTSLVLT (SEQ ID NO: 139),VRRAPPTTAVRSRTSLVLT (SEQ ID NO: 139), VRRAPPTTAVRSRTSLVLTL (SEQ ID NO: 140),VRRAPPTTAVRSRTSLVLTL (SEQ ID NO: 140), VRRAPPTTAVRSRTSLVLTLN (SEQ ID NO: 141),VRRAPPTTAVRSRTSLVLTLN (SEQ ID NO: 141), VRRAPPTTA VRSRTSLVLTLNE (SEQ ID NO: 142),VRRAPPTTA VRSRTSLVLTLNE (SEQ ID NO: 142), VRRAPPTTAVRSRTSLVLTLNEL (SEQ ID NO: 143),VRRAPPTTAVRSRTSLVLTLNEL (SEQ ID NO: 143), VRRAPPTTAVRSRTSLVLTLNELP (SEQ ID NO: 144),VRRAPPTTAVRSRTSLVLTLNELP (SEQ ID NO: 144), аминоконцевую аминокислотную последовательность, содержащую один или несколько остальных остатков человеческого ML, представленных на фиг.1 (SEQ ID NO: 1), и его конъюгированной с ПЭГ формы;an amino-terminal amino acid sequence containing one or more of the remaining human ML residues shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and its PEG conjugated form; (б) химерного полипептида, содержащего лиганд mpl, аминокислотная последовательность которого содержит аминокислотные остатки от 1 до Х на фиг.1 (SEQ ID NO: 1), где X представляет собой аминокислотный остаток в положении 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 или 332, слитый с гетерологичным полипептидом; и(b) a chimeric polypeptide containing the mpl ligand, the amino acid sequence of which contains amino acid residues from 1 to X in figure 1 (SEQ ID NO: 1), where X is the amino acid residue at position 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 or 332 fused to a heterologous polypeptide; and (в) полипептида, содержащего N-концевые остатки с 1 приблизительно по 153-157 hML, замещенного остатком человеческого ЕРО, добавленным или заменяющим N-концевые остатки hML в положениях, выбранных из группы, включающей 1, 3-6, 9, 13-15, 17-28, 30, 32-34, 36-41, 43-50, 53-59, 61-68, 71, 73, 75-80, 82-88, 90-96, 98-99, 102-103, 105-107, 110, 112-113, 115-119, 121-130, 132-133, 135, 137-140, 143-150 и 152-156 в соответствии с выравниванием, приведенным на фиг.10;(c) a polypeptide containing N-terminal residues from 1 to about 153-157 hML, substituted by a human EPO residue added or replacing N-terminal hML residues at positions selected from the group consisting of 1, 3-6, 9, 13- 15, 17-28, 30, 32-34, 36-41, 43-50, 53-59, 61-68, 71, 73, 75-80, 82-88, 90-96, 98-99, 102- 103, 105-107, 110, 112-113, 115-119, 121-130, 132-133, 135, 137-140, 143-150 and 152-156 in accordance with the alignment shown in Fig.10; причем указанный полипептид стимулирует включение меченых нуклеотидов (3H-тимидина) в ДНК IL-3-зависимых клеток Ba/F3, трансфицированных человеческим mpl P; или стимулирует включение в циркулирующие тромбоциты 35S.wherein said polypeptide stimulates the incorporation of labeled nucleotides ( 3 H-thymidine) into the DNA of IL-3-dependent Ba / F3 cells transfected with human mpl P; or stimulates incorporation into circulating platelets of 35 S. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанного полипептидного фрагмента содержит2. The polypeptide according to claim 1, characterized in that the amino acid sequence of the specified polypeptide fragment contains SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL (SEQ ID NO: 110),SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL (SEQ ID NO: 110), HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF (SEQ ID NO: 111),HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF (SEQ ID NO: 111), SLGEWKTOMEETKAODILGAVTL (SEQ ID NO: 112),SLGEWKTOMEETKAODILGAVTL (SEQ ID NO: 112), LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL (SEQ ID NO: 113),LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL (SEQ ID NO: 113), GQLSGQVRLLLGALQS (SEQ ID NO: 114),GQLSGQVRLLLGALQS (SEQ ID NO: 114), LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF (SEQ ID NO: 115) илиLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF (SEQ ID NO: 115) or LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR (SEQ ID NO: 116)LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR (SEQ ID NO: 116) или их комбинации.or combinations thereof. 3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он не содержит олигосахаридных групп.3. The polypeptide according to claim 1, characterized in that it does not contain oligosaccharide groups. 4. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что hTPO выбран из группы, состоящей из hML (SEQ ID NO: 6), hML153 (SEQ ID NO: 1, группы 1-153), hML (R153A, R154A) (SEQ ID NO: 1, R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) и pML2 (SEQ ID NO: 21).4. The polypeptide according to claim 1, characterized in that hTPO is selected from the group consisting of hML (SEQ ID NO: 6), hML153 (SEQ ID NO: 1, groups 1-153), hML (R153A, R154A) (SEQ ID NO: 1, R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) and pML2 (SEQ ID NO: 21). 5. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он обладает, по крайней мере, 80%-ной идентичностью последовательности с таковой полипептида, аминокислотная последовательность которого содержит аминокислотные остатки от 1 до Х на фиг.1 (SEQ ID NO: 1), где X выбирают из группы 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 и 332.5. The polypeptide according to claim 1, characterized in that it has at least 80% sequence identity with that of the polypeptide, the amino acid sequence of which contains amino acid residues from 1 to X in figure 1 (SEQ ID NO: 1) where X is selected from the group 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 and 332. 6. Полипептид по п.5, отличающийся тем, что Х представляет собой 153.6. The polypeptide according to claim 5, characterized in that X represents 153. 7. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид в составе химерного полипептида представляет собой полипептид иммуноглобулина.7. The polypeptide according to claim 1, characterized in that the heterologous polypeptide in the composition of the chimeric polypeptide is an immunoglobulin polypeptide. 8. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид в составе химерного полипептида представляет собой полипептид интерлейкина.8. The polypeptide according to claim 1, characterized in that the heterologous polypeptide in the composition of the chimeric polypeptide is an interleukin polypeptide. 9. Полипептид по п.1, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, обладающую, по крайней мере, 70%-ной идентичностью последовательности с таковой нуклеиновой кислоты, представленной на фиг.1 (SEQ ID NO: 2), или комплементарной ей последовательностью.9. The polypeptide according to claim 1, encoded by a nucleic acid containing a sequence having at least 70% sequence identity with that of the nucleic acid shown in figure 1 (SEQ ID NO: 2), or its complementary sequence. 10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид лиганд mpl, охарактеризованный в п.1.10. A nucleic acid molecule encoding a mpl ligand polypeptide described in claim 1. 11. Молекула нуклеиновой кислоты по п.10, отличающаяся тем, что кодирует полипептид, охарактеризованный в п.5.11. The nucleic acid molecule of claim 10, characterized in that it encodes the polypeptide described in claim 5. 12. Молекула нуклеиновой кислоты по п.10, отличающаяся тем, что содержит нуклеотидную последовательность открытой рамки считывания, представленную на фиг.1 (SEQ ID NO: 2).12. The nucleic acid molecule of claim 10, characterized in that it contains the nucleotide sequence of the open reading frame shown in figure 1 (SEQ ID NO: 2). 13. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид лиганд mpl, охарактеризованный в п.4, необязательно функционально связанную с контрольными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной указанным вектором.13. An expression vector containing a nucleic acid molecule encoding the mpl ligand polypeptide described in claim 4, optionally operably linked to control sequences recognized by a host cell transformed with the specified vector. 14. Способ получения антитела против полипептида лиганда mpl, предусматривающий иммунизацию млекопитающего и выделение антитела, отличающийся тем, что для иммунизации используют полипептид, охарактеризованный в п.5.14. A method of producing an antibody against an mpl ligand polypeptide, comprising immunizing a mammal and isolating an antibody, characterized in that the polypeptide described in claim 5 is used for immunization. 15. Способ получения полипептида лиганда mpl, охарактеризованного в п.5, предусматривающий культивирование клеток-хозяев и выделение указанного полипептида, отличающийся тем, что для культивирования используют клетку-хозяина, трансформированную вектором, охарактеризованным в п.13, и где выделенный полипептид необязательно содержит олигосахаридные группы.15. A method of producing a mpl ligand polypeptide described in claim 5, comprising culturing the host cells and isolating said polypeptide, characterized in that a host cell transformed with the vector described in Claim 13 is used for culturing, and wherein the isolated polypeptide optionally contains oligosaccharide groups. 16. Способ по п.15, где полипептид лиганд mpl выделен из клетки-хозяина.16. The method according to clause 15, where the mpl ligand polypeptide is isolated from the host cell. 17. Способ по п.15, где полипептид лиганд mpl выделен из культуральной среды клетки-хозяина.17. The method of claim 15, wherein the mpl ligand polypeptide is isolated from the culture medium of the host cell. 18. Способ определения наличия гена, кодирующего полипептид лиганд mpl, охарактеризованного в п.1, в тестируемом образце, содержащем нуклеиновую кислоту, предусматривающий гибридизацию ДНК-зонда с нуклеиновой кислотой тестируемого образца, отличающийся тем, что в качестве ДНК-зонда используют молекулу ДНК, обладающую, по меньшей мере, 80%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID NO: 2 или ее фрагментом.18. A method for determining the presence of a gene encoding the mpl ligand polypeptide described in claim 1 in a test sample containing a nucleic acid, comprising hybridizing a DNA probe with a nucleic acid of a test sample, characterized in that a DNA molecule is used as a DNA probe, having at least 80% homology with the sequence of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof. 19. Композиция для стимуляции пролиферации, созревания и/или дифференцировки мегакариоцитов, содержащая активный агент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного агента используется полипептид лиганд mpl, охарактеризованный в п.1.19. A composition for stimulating the proliferation, maturation and / or differentiation of megakaryocytes containing an active agent and a pharmaceutically acceptable carrier, characterized in that the mpl ligand polypeptide described in claim 1 is used as the active agent. 20. Композиция по п.19, отличающаяся тем, что дополнительно содержит терапевтически эффективное количество агента, выбранного из группы, состоящей из цитокина, колониестимулирующего фактора и интерлейкина.20. The composition according to claim 19, characterized in that it further comprises a therapeutically effective amount of an agent selected from the group consisting of cytokine, colony stimulating factor and interleukin. 21. Композиция по п.20, отличающаяся тем, что указанный агент выбран из KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 и IL-11.21. The composition according to claim 20, characterized in that said agent is selected from KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, and IL-11.
RU96115932/13A 1994-01-03 1994-12-28 Thrombopoietin RU2245365C2 (en)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17655394A 1994-01-03 1994-01-03
US08/176553 1994-01-03
US08/185607 1994-01-21
US08/196689 1994-02-15
US08/223263 1994-04-04
US08/249,376 US8192955B1 (en) 1994-01-03 1994-05-25 Nucleic acids encoding MPL ligand (thrombopoietin), variants, and fragments thereof
US08/249376 1994-05-25
US08/348658 1994-12-02
US08/348657 1994-12-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005104301/13A Division RU2005104301A (en) 1994-01-03 2005-01-26 Thrombopoietin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU96115932A RU96115932A (en) 1998-11-20
RU2245365C2 true RU2245365C2 (en) 2005-01-27

Family

ID=35139229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU96115932/13A RU2245365C2 (en) 1994-01-03 1994-12-28 Thrombopoietin

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2245365C2 (en)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2491347C2 (en) * 2005-10-24 2013-08-27 Вайет Method of production proteins using compounds that prevent aging
RU2519745C2 (en) * 2012-06-13 2014-06-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии" Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ "РосНИИГТ" ФМБА России) Method for correction of amegakaryocytic thrombocytopenia
RU2570550C2 (en) * 2008-11-21 2015-12-10 Антродженезис Корпорейшн Treatment of disease, disorders or pathological conditions of lungs with application of placental cells
RU2573389C2 (en) * 2009-09-15 2016-01-20 Сайентист оф Форчи С.А. Method of producing 3-hydroxy-3-methyl-butyric acid from acetone and acetyl-coa

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mc DONALD "Trombopoetin: ITS biology, purification and characterization", J.Exper. hematology, 1988, v.6, №3, p.201-205. Mc DONALD et al. "Studies on the purification of trombopoetin from kidney cell culture medium", J. of Laboratory and clinical medicine, 1985, v.106, №2, p.162-174. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2491347C2 (en) * 2005-10-24 2013-08-27 Вайет Method of production proteins using compounds that prevent aging
RU2570550C2 (en) * 2008-11-21 2015-12-10 Антродженезис Корпорейшн Treatment of disease, disorders or pathological conditions of lungs with application of placental cells
RU2732240C2 (en) * 2008-11-21 2020-09-14 Антродженезис Корпорейшн Treating diseases, disorders or pathological conditions of the lungs using placental cells
RU2573389C2 (en) * 2009-09-15 2016-01-20 Сайентист оф Форчи С.А. Method of producing 3-hydroxy-3-methyl-butyric acid from acetone and acetyl-coa
RU2519745C2 (en) * 2012-06-13 2014-06-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии" Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ "РосНИИГТ" ФМБА России) Method for correction of amegakaryocytic thrombocytopenia

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121573B (en) A method for preparing an isolated mpl ligand polypeptide
EP1009831A2 (en) Agonist antibodies to the thrombopoietin receptor, and their therapeutic uses
RU2245365C2 (en) Thrombopoietin
US5830647A (en) Hybridization and amplification of nucleic acids encoding mpl ligand
KR100607613B1 (en) Thrombopoietin
US8278099B1 (en) Monoclonal antibody to human thrombopoietin
US8147844B1 (en) Mpl ligand (thrombopoietin), nucleic acids encoding such, and methods of treatment using mpl ligand
DE19500030A1 (en) New mpl ligand polypeptide, thrombopoietin
US8192955B1 (en) Nucleic acids encoding MPL ligand (thrombopoietin), variants, and fragments thereof
US8241900B1 (en) mpl ligand
US6660256B1 (en) Porcine mpl ligand
AU749175B2 (en) Thrombopoietin
KR20040065249A (en) Thrombopoeitin
AU782245B2 (en) Thrombopoietin
US8357513B1 (en) Nucleic acids encoding mpl ligand (thrombopoietin) and fragments thereof
IL161813A (en) CHIMERIC POLYPEPTIDES COMPRISING A HETEROLOGOUS POLYPEPTIDE AND A FRAGMENT OF A mpl LIGAND
SA95150635B1 (en) thrombopoietin (a platelet-forming factor)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20041229

NF4A Reinstatement of patent