PL206727B1 - Syntetyczne polisacharydy o działaniu przeciwzakrzepowym, zawierające je środki farmaceutyczne, zastosowanie tych środków i zastosowanie tych polisacharydów oraz awidyny lub streptoawidyny - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 363368 (22) Data zgłoszenia: 20.09.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

20.09.2001, PCT/FR01/002918 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

28.03.2002,WO02/24754 (11) 206727 (13) B1 (51) Int.Cl.

C08B 37/00 (2006.01) A61K 31/715 (2006.01) A61K 47/42 (2006.01) A61P 7/02 (2006.01)

Syntetyczne polisacharydy o działaniu przeciwzakrzepowym, zawierające je środki (54) farmaceutyczne, zastosowanie tych środków i zastosowanie tych polisacharydów oraz awidyny lub streptoawidyny

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	SANOFI-AVENTIS, Paryż, FR
22.09.2000, FR, 00/12094	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 15.11.2004 BUP 23/04	PHILIPPE DUCHAUSSOY, Toulouse, FR JEAN MARC HERBERT, Tournefeuille, FR MAURICE PETITOU, Paryż, FR PIERRE SAVI, Seysses, FR
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.09.2010 WUP 09/10	(74) Pełnomocnik:
	rzecz. pat. Jacek Wojciech Tykarski

PL 206 727 B1

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy syntetycznych polisacharydów o działaniu przeciwzakrzepowym, zawierających je środków farmaceutycznych, zastosowanie tych środków i zastosowanie tych polisacharydów oraz awidyny lub streptoawidyny. Takie nowe syntetyczne oligo- i polisacharydy mające co najmniej jedno wiązanie kowalencyjne z biotyną lub pochodną biotyny wykazują farmakologiczne działanie hamujące krzepliwość krwi i przeciwzakrzepowe heparyny.

Heparyna katalizuje, w szczególności poprzez antytrombinę III (AT III), hamowanie dwóch enzymów, które biorą udział w kaskadzie krzepnięcia krwi, a mianowicie czynnika Xa i czynnika IIa (czyli trombiny). Preparaty heparyn o niskiej masie cząsteczkowej (LMWH) zawierają łańcuchy utworzone z 4 do 30 monosacharydów i działają bardziej selektywnie wobec czynnika Xa, niż wobec trombiny.

Wiadomo, że hamowanie czynnika Xa wymaga przyłączenia się heparyny do AT III przez domenę wiążącą antytrombinę (domenę A), a hamowanie czynnika IIa (trombiny) przyłączenia do AT III przez domenę A i do trombiny przez pewną gorzej zdefiniowaną domenę (domenę T).

Syntetyczne oligosacharydy odpowiadające domenie A heparyny są znane. Ujawniono je np. w opisach patentowych EP 84999 i EP 529715, w publikacji zgł oszenia patentowego nr WO 99/36428 i w publikacji Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 1509-1516. Te syntetyczne oligosacharydy mają wł a ś ciwość selektywnego hamowania, za pośrednictwem antytrombiny III, czynnika Xa krzepnięcia, bez jakiegokolwiek oddziaływania na trombinę. Wykazują one działanie przeciwzakrzepowe w zakrzepicy żylnej.

Syntetyczne oligosacharydy zdolne do hamowania trombiny i czynnika Xa poprzez aktywację AT III opisano w publikacjach zgłoszeń patentowych nr WO 98/03554 i WO 99/36443.

W tych zgł oszeniach patentowych ujawniono nowe biologicznie czynne siarczanowane i alkilowane pochodne polisacharydowe. Mają one zwłaszcza działanie hamujące krzepliwość krwi i przeciwzakrzepowe. W szczególności wykazano, że te siarczanowane i alkilowane polisacharydy mogą być silnymi środkami hamującymi krzepliwość krwi i przeciwzakrzepowymi w zależności od rozmieszczenia grup alkilowych i siarczanowych na szkielecie glicydowym. Ogólnie stwierdzono, że przez wytworzenie sekwencji polisacharydowych można precyzyjnie regulować działanie typu GAG dla otrzymania bardzo aktywnych produktów wykazujących farmakologiczne działanie hamujące krzepliwość krwi i przeciwzakrzepowe heparyny. W porównaniu z heparyną wykazują one tę zaletę, że mają określoną budowę i nie wchodzą z czynnikiem płytkowym 4 w reakcje, które w przypadku heparyny prowadzą do niedoboru płytek krwi.

Jednak stosowanie w leczeniu ludzi niektórych produktów ujawnionych w publikacjach WO 98/03554 i WO 99/36443 i w opisie patentowym EP 529715 może okazać się problematyczne, zwłaszcza gdy te produkty mają długi półokres trwania. W leczeniu profilaktycznym lub terapeutycznym zakrzepicy z użyciem powyższych produktów trzeba przywracać lub utrzymywać płynność krwi, zapobiegając jednocześnie wystąpieniu krwotoku.

Dzieje się tak, ponieważ, jak wiadomo, krwotok u leczonego pacjenta może wywołać wiele przypadkowych czynników. Może również zaistnieć potrzeba interwencji chirurgicznej u chorego poddawanego leczeniu przeciwzakrzepowemu. Ponadto w przebiegu pewnych interwencji chirurgicznych środki hamujące krzepliwość krwi mogą być stosowane w dużej dawce, aby zapobiec krzepnięciu krwi, i na zakończenie zabiegu należy je zneutralizować. Korzystne byłoby zatem dysponowanie środkami przeciwzakrzepowymi, które można by zneutralizować dla zatrzymania działania hamującego krzepliwość krwi w dowolnej chwili. Powyższych znanych syntetycznych oligosacharydów nie można łatwo zneutralizować z użyciem znanych antidotów dla heparyny lub LMWH, w tym siarczanu protaminy.

Wynalazek dotyczy syntetycznych polisacharydów o działaniu przeciwzakrzepowym, o wzorze:

PL 206 727 B1 w którym:

- linia falista oznacza wią zanie usytuowane pod lub nad pł aszczyzną pierś cienia piranozowego.

Po oznacza polisacharyd zawierający n jednakowych lub różnych jednostek monosacharydowych, związany poprzez swój anomeryczny atom węgla z Pe,

jest schematycznym przedstawieniem jednostki monosacharydowej o strukturze piranozy, wybranej z grupy obejmującej heksozy, pentozy i odpowiednie dezoksycukry, przy czym ta jednostka jest związana poprzez swój anomeryczny atom węgla z inną jednostką monosacharydową, a grupy hydroksylowe tej jednostki są podstawione jednakowymi lub różnymi grupami R1, przy czym R1 ma niżej podane znaczenie,

- Pe oznacza pentasacharyd o budowie:

- h oznacza 1 lub 2,

- n oznacza liczbę cał kowitą i moż e mieć wartość 0 - 25,

- R1 oznacza ugrupowanie -T-Biot, (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

- R2 oznacza ugrupowanie -T-Biot, (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

- R3 oznacza ugrupowanie -T-Biot lub (C1-C6)-alkoksyl,

- R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot, (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, albo R4 oznacza mostek -O-CH2-, przy czym grupa -CH2- jest związana z atomem węgla, do którego jest przyłączona funkcyjna grupa karboksylowa w tym samym pierścieniu;

z tym, ż e co najmniej jeden z podstawników R1, R2, R3 i R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot,

- W oznacza atom tlenu lub metylen,

- T oznacza ugrupowanie wybrane spoś ród:

NH,

PL 206 727 B1 gdzie j i k są jednakowe lub różne i oznaczają liczby całkowite 1 - 10; - Biot oznacza grup ę :

oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Korzystnie polisacharydy te są związkami o wzorze [I.1]

oznacza określoną grupę polisacharydów Po, związanych poprzez ich anomeryczny atom węgla z Pe, jak zdefiniowano dla wzoru (I),

ma takie znaczenie jak we wzorze (I),

- grupy R1 mają takie znaczenie jak we wzorze (I) i w tym samym monosacharydzie mogą być jednakowe lub różne,

- monosacharyd zawarty w [ ]m jest powtórzony m razy, monosacharyd zawarty w [ ]t jest powtórzony t razy, a monosacharyd zawarty w [ ]p jest powtórzony p razy,

- m oznacza liczbę cał kowitą od 1 do 5, t oznacza liczbę cał kowitą od 0 do 24, a p oznacza liczbę całkowitą od 0 do 24, z tym, że 1 < m + t + p < 25, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Korzystniej jeden z podstawników R1, R2, R3 lub R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot, gdzie T i Biot mają takie znaczenia jak we wzorze (I).

PL 206 727 B1

w którym:

- T oznacza ugrupowanie wybrane spoś ród:

gdzie j i k są jednakowe lub różne i oznaczają liczby całkowite od 1 do 10; - Biot oznacza grup ę :

- R1 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

- R2 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

- R3 oznacza (C1-C6)-alkoksyl,

- R4 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, albo R4 oznacza mostek -O-CH2-, przy czym grupa -CH2- jest przyłączona do atomu węgla podstawionego funkcyjną grupą karboksylową w tym samym pierścieniu,

- W oznacza atom tlenu lub metylen, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

PL 206 727 B1

w którym R1, R2, R3, R4 i W mają takie znaczenie jak we wzorze (I), i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Korzystniej w tych pentasacharydach jeden z podstawników R1, R2, R3 lub R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot, gdzie T i Biot mają takie znaczenie jak we wzorze (I).

Korzystniejsze są pentasacharydy o wzorze (I.4):

w którym

- T oznacza ugrupowanie wybrane spoś ród:

gdzie j i k są jednakowe lub różne i oznaczają liczby całkowite od 1 do 10; - Biot oznacza grup ę :

- R1 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, - R2 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, - R3 oznacza (C1-C6)-alkoksyl,

PL 206 727 B1

- R4 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, albo R4 oznacza mostek -O-CH2-, przy czym grupa -CH2- jest przyłączona do atomu węgla podstawionego funkcyjną grupą karboksylową w tym samym pierścieniu,

- W oznacza atom tlenu lub metylen, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Korzystne polisacharydy są wybrane z grupy obejmującej:

- sól sodową (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo-(1>4)-6-biotynoamido-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-(di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu, sól sodową (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-[6-(biotynoamidoheksamido)heksamido]-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu, sól sodową (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-[6-(6-biotynoamidoheksamido)heksamido]-6-dezoksy-(2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu,

- sól sodową (2-biotynoamido-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu,

- sól sodową (2-[N-(6-biotynoamidoheksanoilo)]-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu,

- sól sodową (2-[6-(6-biotynoamidoheksamido)heksamido]-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu.

Korzystnym polisacharydem jest związek o wzorze

Wynalazek dotyczy także środków farmaceutycznych zawierających jako substancję czynną polisacharyd określony powyżej, ewentualnie w połączeniu z jedną lub większą liczbą odpowiednich obojętnych zaróbek.

PL 206 727 B1

Wynalazek dotyczy również zastosowania środków farmaceutycznych określonych powyżej do wytwarzania leku do stosowania w przypadku patologii spowodowanych zmianami w homeostazie układu krzepnięcia, objawiających się zwłaszcza w czasie zaburzeń układu sercowo-naczyniowego i mózgowonaczyniowego, takich jak zaburzenia zakrzepowo-zatorowe związane z miażdżycą tętnic i cukrzycą, zwłaszcza w dusznicy niestabilnej, w udarze mózgowym, przy nawrocie zwężenia po plastyce naczyń, po endarterektomii lub po założeniu protez wewnątrznaczyniowych; a także zaburzeń zakrzepowozatorowych związanych z nawrotem zakrzepicy po rozpuszczeniu skrzepu, z zawałem, z otępieniem pochodzenia niedokrwiennego, z chorobami tętnic obwodowych, z hemodializą, z migotaniem przedsionków lub przy używaniu protez wewnątrznaczyniowych po wytworzeniu aortowo-wieńcowych przepływów omijających, w leczeniu lub profilaktyce patologii zakrzepowo-zatorowych pochodzenia żylnego, takich jak zatory płucne, w leczeniu lub profilaktyce powikłań zakrzepowych występujących po zabiegach chirurgicznych, przy wzroście nowotworów lub na tle zaburzeń krzepliwości wywołanych aktywującymi je czynnikami bakteryjnymi, wirusowymi lub enzymatycznymi.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polisacharydów określonych powyżej dla pokrywania protez.

Wynalazek dotyczy także zastosowania polisacharydów określonych powyżej jako substancji pomocniczych przy endarterektomii z użyciem baloników porowatych.

Wynalazek dotyczy również zastosowania awidyny lub streptoawidyny do wytwarzania środków farmaceutycznych przeznaczonych do neutralizowania polisacharydów określonych powyżej.

Nowe syntetyczne polisacharydy mają budowę zbliżoną do budowy związków opisanych w publikacjach nr WO 98/03554 i WO 99/36443 i w patencie EP 529715, przy czym modyfikacja budowy syntetycznych oligosacharydów według wynalazku polega na tym, że mają one wiązanie kowalencyjne z biotyną (kwasem heksahydro-2-okso-1H-tieno-[3,4-d]imidazolo-4-pentanowym) lub z pochodną biotyny. Nieoczekiwanie okazało się, że wprowadzenie biotyny lub pochodnej biotyny nie modyfikuje działania farmakologicznego polisacharydów. W rzeczywistości nowe polisacharydy według wynalazku mają działanie przeciwzakrzepowe porównywalne z działaniem oligosacharydów ze stanu techniki. Ich dodatkowa zaleta polega jednak na tym, że można je szybko zneutralizować określonym antidotum w nagłym przypadku. Tym określonym antidotum jest awidyna (The Merck Index, wyd. 12., 1996, M. N. 920, str. 151-152) lub streptoawidyna, dwa tetrameryczne białka o masie wynoszącej odpowiednio około 66000 i 60000 u, wykazujące bardzo silne powinowactwo do biotyny.

Ogólnie wynalazek dotyczy syntetycznych polisacharydów o działaniu przeciwzakrzepowym mających co najmniej jedno wiązanie kowalencyjne z biotyną lub pochodną biotyny.

Jako pochodne biotyny można wymienić pochodne biotyny przedstawione w katalogu Pierce 1999-2000, na str. 62-81, np. 6-biotynoamidoheksanian

lub 6-(6-biotynoamidoheksanoamido)heksanian

PL 206 727 B1 lub 2-biotynoamidoetanotiol

lub związki o następujących wzorach:

PL 206 727 B1

Jak wskazano powyżej, w niniejszym opisie linia falista oznacza wiązanie usytuowane pod lub nad płaszczyzną pierścienia piranozowego.

Monosacharydy zawarte w Po mogą być jednakowe lub różne, a wiązania między glikozydami mogą być typu α lub β.

Te monosacharydy są korzystnie wybrane spośród heksoz D lub L, alozy, altrozy, glukozy, mannozy, galozy, idozy, galaktozy i talozy (w tym przypadku h = 2), lub spośród pentoz D lub L, rybozy, arabinozy, ksylozy i liksozy (w tym przypadku h = 2). Można także stosować inne monosacharydy, takie jak np. dezoksycukry (h = 1 i/lub -CH2R1 = CH3).

Część polisacharydowa Po może się składać z 0 - 25 alkilowanych i di- lub trisiarczanowanych jednostek monosacharydowych.

Część polisacharydowa Po może się także składać z 0 - 25 alkilowanych i mono- lub disiarczanowanych jednostek monosacharydowych.

Część polisacharydowa Po może się składać z 0 - 25 alkilowanych jednostek monosacharydowych bez ładunku i/lub częściowo naładowanych i/lub całkowicie naładowanych.

Jednostki z ładunkiem lub bez ładunku mogą być rozmieszczone wzdłuż łańcucha lub mogą być pogrupowane w domeny sacharydowe z ładunkiem lub bez ładunku.

Wiązania między jednostkami mogą być wiązaniami typu 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 lub 1,6 albo typu α lub β .

W niniejszym opisie zdecydowano się na przypisanie konformacji ¹C4 kwasowi L-iduronowemu, a konformacji ⁴C1 kwasowi D-glukuronowemu, jednak, jak wiadomo, ogólnie konformacja jednostek monosacharydowych w roztworze ulega fluktuacji.

Tak więc kwas L-iduronowy może mieć konformację ¹C4, ²S0 lub ⁴C1.

Zakres wynalazku obejmuje polisacharydy w postaci kwasu lub dowolnych ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. W postaci kwasowej grupy funkcyjne -COO^- i -SO3^- mają postać odpowiednio -COOH i -SO3H.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalna sól polisacharydów według wynalazku oznacza polisacharyd, w którym jedna lub większa liczba grup funkcyjnych -COO^- i/lub -SO3^- jest połączona wiązaniami jonowymi z farmaceutycznie dopuszczalnym kationem. Korzystnymi solami według wynalazku są sole, w których kation jest wybrany z grupy kationów metali alkalicznych, a najkorzystniejsze są te, w których kationem jest Na⁺ lub K⁺.

Do związków o powyższym wzorze (I) należą również takie, w których jeden lub większą liczbę atomów wodoru lub węgla zastąpiono ich izotopami radioaktywnymi, np. trytem lub węglem-14. Takie znaczone związki znajdują zastosowanie w pracach badawczych, w badaniach metabolizmu lub farmakokinetyki i w testach biochemicznych jako ligandy.

Podstawą sposobu wytwarzania związków według wynalazku jest zastosowanie syntonów zasad di- lub oligosacharydowych otrzymanych metodami podanymi w literaturze. Należy tu wymienić zwłaszcza opisy patentowe i zgłoszenia patentowe nr EP 300099, EP 529715, EP 621282 i EP 649854, jak również C. van Boeckel, M Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1671-1690. Te syntony sprzęga się ze sobą z wytworzeniem w pełni zabezpieczonego równoważnika polisacharydu według wynalazku. Ten zabezpieczony równoważnik przeprowadza się następnie w związek według wynalazku.

Jeden z wyżej wspomnianych syntonów zasad zawiera określoną zabezpieczoną grupę funkcyjną pozwalającą na wprowadzenie biotyny lub pochodnej biotyny, np. funkcyjną grupę aminową zabezpieczoną w postaci grupy azydowej lub zabezpieczoną w postaci grupy N-ftaloimidowej.

W reakcjach sprzę gania wspomnianych powyż ej „donorowy di- lub oligosacharyd, zaktywowany przy swym anomerycznym atomie węgla, reaguje z „akceptorowym di- lub oligosacharydem mającym wolną grupę hydroksylową.

Sposób wytwarzania związków o wzorze (I) polega na tym, że w pierwszym etapie syntetyzuje się w pełni zabezpieczony równoważnik żądanego polisacharydu (I), zawierający zabezpieczony prekursor domeny Pe przedłużony na końcu nieredukującym zabezpieczonym prekursorem siarczanowanego polisacharydu Po, przy czym jeden z tych prekursorów zawiera w szczególności odpowiednio zabezpieczoną funkcyjną grupę aminową dla wprowadzenia następnie biotyny lub pochodnej biotyny; w drugim etapie wprowadza się i/lub odbezpiecza grupy z ładunkiem ujemnym; a w trzecim etapie odbezpiecza się funkcyjną grupę aminową i wprowadza się biotynę lub pochodną biotyny.

PL 206 727 B1

Syntezę Pe prowadzi się sposobami opisanymi zwłaszcza w publikacjach zgłoszeń patentowych nr WO98/03554 i WO99/36443 i w literaturze (cytowanej powyżej).

Część polisacharydową będącą prekursorem syntetyzuje się drogą reakcji dobrze znanych fachowcom, stosując sposoby syntezy oligosacharydów (G. J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121, WO98/03554 i WO099/36443) względnie oligosacharyd będący donorem wiązania glikozydowego sprzęga się z oligosacharydem będącym akceptorem wiązania glikozydowego, z wytworzeniem nowego oligosacharydu, którego wielkość odpowiada sumie wielkoś ci tych dwóch reagentów. Tę sekwencję powtarza się aż do otrzymania żądanego związku o wzorze (I). Charakter i profil ładunku w pożądanym związku końcowym wyznaczają charakter związków chemicznych stosowanych w różnych etapach syntezy, zgodnie z regułami dobrze znanymi fachowcom. Można tu wymienić np. C. van Boeckel, M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993, 32, 1671-1690 i H. Paulsen, „Advances in selective chemical syntheses of complex oligosaccharides Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21, 155-173 (1982).

Związki według wynalazku otrzymuje się z ich całkowicie zabezpieczonych prekursorów polisacharydowych, z użyciem następującej serii reakcji:

- funkcyjne grupy alkoholowe, które mają zostać przeprowadzone w grupę O-sulfonową i ugrupowania kwasów karboksylowych odbezpiecza się przez usunię cie grup zabezpieczają cych stosowanych podczas wytwarzania szkieletu, a następnie

- wprowadza się grupy sulfonowe,

- odbezpiecza się funkcyjną grupę aminową pozwalają c ą na wprowadzanie biotyny lub pochodnej biotyny,

- biotynę lub pochodną biotyny wprowadza się drogą znanej reakcji sprzę gania grupy aminowej z ugrupowaniem kwasu.

Związki według wynalazku można oczywiście wytwarzać różnymi znanymi fachowcom sposobami syntezy oligosacharydów.

Związki o wzorze (I) można jednak innymi sposobami dobrze znanymi w chemii cukrów, opisanymi np. w „Monosaccharides, their chemistry and their roles in natural products, P. M. Collins i R. J. Ferrier, J. Wiley & Sons, 1995 i w G. J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121.

Pentasacharydy Pe można więc wytwarzać z syntonów disacharydowych sposobem opisanym w publikacji C. van Boeckel, M. Petitou, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993, 32, 1671-1690.

Grupami zabezpieczającymi stosowanymi w sposobie wytwarzania związków (I) są grupy zwykle stosowane w chemii cukrów, np. znane z Protective Groups in Organic Synthesis, TW Greene, John Wiley & Sons, Nowy Jork, 1981.

Grupy zabezpieczające korzystnie wybiera się spośród np. acetylu, chlorowcometylu, benzoilu, lewulinylu, benzylu, podstawionego benzylu, ewentualnie podstawionego tritylu, tetrahydropiranylu, allilu, pentenylu, tert-butylodimetylosililu (tBDMS) i trimetylosililoetylu.

Grupami aktywującymi są grupy zwykle stosowane w chemii cukrów, np. według G. J. Boons, Tetrahedron, 1996, 52, 1095-1121. Te grupy aktywujące są wybrane np. spośród ugrupowań imidanów, tioglikozydów, pentenyloglikozydów, ksantanów, fosforynów i halogenków.

Jeśli chodzi o sposób wiązania się biotyny z oligosacharydem i charakter pochodnej biotyny, literatura chemiczna podaje inne możliwości, wykorzystujące zestawy grup zabezpieczających dobrze znanych fachowcom. Korzystnie stosuje się funkcyjną grupę aminy, funkcyjną grupę tiolu, funkcyjną grupę kwasu karboksylowego lub funkcyjną grupę aldehydu, które poddaje się reakcji z pochodną biotyny zawierają cą reaktywną grupę typu zaktywowanego estru, maleimidu, jodoacetylu lub aminy pierwszorzędowej, przy czym reakcję prowadzi się w warunkach opisanych w literaturze (patrz. Savage i inni, Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, Pierce Chemical Company, 1992).

Wyżej opisany sposób pozwala na otrzymanie związków według wynalazku w postaci soli. Dla otrzymania odpowiednich kwasów, związki według wynalazku w postaci soli kontaktuje się z żywicą kationowymienną w postaci kwasowej.

Związki według wynalazku w postaci kwasów można następnie zobojętniać zasadą dla otrzymania żądanej soli. Do wytworzenia soli związków o wzorze (I) można stosować dowolną zasadę nieorganiczną lub organiczną dającą ze związkami o wzorze (I) farmaceutycznie dopuszczalne sole. Korzystnie jako zasadę stosuje się wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, wodorotlenek wapnia lub wodorotlenek magnezu. Korzystnymi solami są sole sodowe i sole wapniowe związków o wzorze (I).

PL 206 727 B1

Związki według wynalazku poddano badaniom biochemicznym i farmakologicznym.

Ogólne działanie przeciwzakrzepowe tych produktów i ich neutralizację przebadano w modelu zakrzepicy żylnej, zgodnie z którym wstrzykuje się czynnik tkankowy z wytworzeniem zastoju w ż yle gł ównej szczura, jak to opisano w J.-M. Herbert i inni, Blood, 1998, 91, 4197-4205. W tym modelu hamowanie zakrzepicy w 60% uzyskuje się po dożylnym wstrzyknięciu 0,1 - 30 mmol/kg związków. Wstrzyknięcie awidyny w stosunku molowym 1 - 1000 silnie zmniejsza działanie przeciwzakrzepowe tych związków, nawet o ponad 50%. Tak samo neutralizuje się działanie tych związków wywołujące krwotok, to jest przez wstrzyknięcie awidyny w wyżej podanych dawkach. Podobnie działanie oligosacharydów krążących, mierzone jako działanie antyXa i/lub działanie antylla, neutralizuje się przez wstrzyknięcie awidyny.

Jak już wspomniano, niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu stosowania awidyny lub streptoawidyny, charakteryzującego się tym, że pozwala on neutralizować polisacharydy według wynalazku. Awidynę lub streptoawidynę można stosować do wytwarzania leków przeznaczonych do neutralizacji polisacharydów według wynalazku.

Dzięki ich działaniu biochemicznemu i farmaceutycznemu oligosacharydy według wynalazku stanowią wysoce korzystne leki. Ich toksyczność jest całkowicie zgodna z tym zastosowaniem. Są one także bardzo trwałe, a więc są szczególnie odpowiednie jako substancja czynna środków farmaceutycznych.

Można je stosować w różnych patologiach spowodowanych zmianami w homeostazie układu krzepnięcia, objawiających się zwłaszcza w czasie zaburzeń układu sercowo-naczyniowego i mózgowo-naczyniowego, takich jak zaburzenia zakrzepowo-zatorowe zwią zane z miaż d ż ycą tętnic i cukrzycą, np. w dusznicy niestabilnej, w udarze mózgowym, przy nawrocie zwężenia po plastyce naczyń, po endarterektomii lub po założeniu protez wewnątrznaczyniowych; a także zaburzeń zakrzepowo-zatorowych związanych z nawrotem zakrzepicy po rozpuszczeniu skrzepu, z zawał em, z otępieniem pochodzenia niedokrwiennego, z chorobami tę tnic obwodowych, z hemodializą, z migotaniem przedsionków lub przy używaniu protez wewnątrznaczyniowych po wytworzeniu aortowo-wieńcowych przepływów omijających. Ponadto te produkty można stosować w leczeniu lub profilaktyce patologii zakrzepowo-zatorowych pochodzenia ż ylnego, takich jak zatory płucne. Można je stosować w leczeniu lub profilaktyce powikłań zakrzepowych występujących np. po zabiegach chirurgicznych, przy wzroście nowotworów lub na tle zaburzeń krzepliwości wywołanych aktywującymi je czynnikami bakteryjnymi, wirusowymi lub enzymatycznymi. W przypadku ich stosowania przy wszczepianiu protez, związkami według wynalazku można pokrywać protezy dla nadania im hemozgodności. W szczególności można je łączyć z protezami wewnątrznaczyniowymi (stentami). W tym przypadku można je ewentualnie zmodyfikować chemicznie przez wprowadzenie do końca nieredukującego lub redukującego odpowiedniej grupy bocznej, jak ujawniono w EP 649854.

Związki według wynalazku można również stosować jako substancje pomocnicze przy zabiegu endarterektomii z użyciem porowatych baloników.

Związki według wynalazku można stosować do wytwarzania środków farmaceutycznych używanych w leczeniu lub profilaktyce wyżej wymienionych chorób.

Według innego z jego aspektów przedmiotem niniejszego wynalazku jest ś rodek farmaceutyczny zawierający jako substancję czynną syntetyczny polisacharyd według wynalazku lub jedną z jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli, ewentualnie w połączeniu z jedną lub wię kszą liczbą odpowiednich obojętnych zaróbek.

Te zaróbki dobiera się w zależności od postaci farmaceutycznej i żądanego sposobu stosowania: doustnego, podjęzykowego, podskórnego, domięśniowego, dożylnego, przezskórnego, przezśluzówkowego, miejscowego lub doodbytniczego.

Substancja czynna może również występować w postaci kompleksu z cyklodekstryną, np.

α-, β- lub γ-cyklodekstryna, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryną lub metylo-e-cyklodekstryną.

Substancja czynna może być również uwalniana przez zawierający ją balonik lub przez ekspander wewnątrznaczyniowy wprowadzony do naczyń krwionośnych. Dzięki temu nie jest wywierany żaden wpływ na skuteczność farmakologiczną substancji czynnej.

W każdej postaci dawkowanej substancja czynna jest obecna w ilości dostosowanej do dawek dziennych przewidywanych dla osiągnięcia żądanego efektu profilaktycznego lub terapeutycznego. Każda postać dawkowana może zawierać 0,1 - 100 mg substancji czynnej, korzystnie 0,5 - 50 mg. Te dawki związków przeciwzakrzepowych można neutralizować dawkami awidyny

PL 206 727 B1 lub streptoawidyny wynoszącymi 1 - 1000 mg, drogą wstrzyknięcia iv (dożylnego), jako bolus lub jako wlew.

Związki według wynalazku można również stosować w połączeniu z jedną lub większą liczbą innych substancji czynnych odpowiednich w pożądanej terapii, takich jak np. środki przeciwzakrzepowe, środki hamujące krzepliwość krwi lub inhibitory agregacji płytek, takie jak np. dipirydamol, aspiryna, tyklopidyna lub klopidogrel, albo antagoniści kompleksu glikoproteina Ilb/IIIa.

Następujące sposoby, przepisy i schematy ilustrują syntezę różnych związków pośrednich użytecznych w sposobach wytwarzania polisacharydów według wynalazku.

Zastosowano następujące skróty:

Bn: benzyl; Bz: benzoil; TLC: chromatografia cienkowarstwowa; Ts: tosyl; Lew: lewulinyl; Et: etyl; Ph: fenyl; Me: metyl; Ac: acetyl; SE: trimetylosililoetyl; ESI: jonizacja przez elektrorozpylanie; biotyna: kwas heksahydro-2-okso-1H-tieno[3,4-d]imidazolo-4-pentanowy; Z: benzyloksykarbonyl.

Dowex i Sephadex, to nazwy handlowe żywic jonowo-wymiennych (Dowex® produkowany przez Dow Chemical Company) i żeli do czyszczenia/filtracji (Sephadex® produkowany przez Amersham Biosciences),

Następnie opisano szczegółowo, dla ilustracji, przykłady syntezy związków według wynalazku.

Przepis 1

4,6-O-Benzylideno-2,3-di-O-metyl-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (2)

Do roztworu związku 1 (15,8 g, 42,8 mmola) (wytworzony według K. Jansson i inni, J. Org.

Chem., 1988, 53, 5629-5647) i jodku metylu (20 ml, 319 mmoli) w tetrahydrofuranie (350 ml), dodano porcjami w temperaturze 0°C wodorku sodu (18 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Nadmiar wodorku sodu rozłożono z użyciem metanolu i mieszaninę reakcyjną wlano do wody z lodem (1,5 l). Po ekstrakcji octanem etylu fazę orga14

PL 206 727 B1 niczną przemyto nasyconym roztworem chlorku sodu, wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, a nastę pnie zatężono pod próż nią . Po oczyszczeniu pozostał o ś ci drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (cykloheksan/octan etylu 15/1 (obj./obj.)) otrzymano 16,8 g związku 2.

[a]_D= -41° (c = 0,69, dichlorometan).

Przepis 2

6-O-Benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(tri-metylosililo)etylu (3)

Do roztworu związku 2 (16 g, 40,3 mmola) w tetrahydrofuranie (600 ml) dodano kolejno sproszkowanych sit molekularnych 3A (82 g), oranżu metylu (wskaźnik koloru), cyjanoborowodorku sodu (34 g, 526 mmoli), a następnie wkraplano nasycony roztwór kwasu chlorowodorowego w eterze dietylowym aż do zabarwienia różowego. Po przesączeniu i ekstrakcji octanem etylu, fazę organiczną przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu, wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, a następnie zatężono pod próżnią. Po chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/octan etylu 3/1 (obj./obj.)) otrzymano 12,5 g związku 3.

[a]D = -42 (c = 1,2, dichlorometan).

Przepis 3 (2,3-di-O-Benzoilo-4,6-O-benzylideno-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6,-tri-O-benzoilo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo) etylu (5)

Mieszaninę tioglikozydu 4 (16,52 g, 16,60 mmola) (otrzymany według przepisu 1 zgłoszenia patentowego opublikowanego pod numerem WO 99/36443), związku 3 (6,0 g, 15,05 mmola) i sproszkowanych sit molekularnych 4A (16,7 g) w toluenie (300 ml), mieszano w atmosferze argonu przez 1 godzinę. Mieszaninę następnie ochłodzono do temperatury -20°C. Do mieszaniny reakcyjnej wkroplono roztwór N-jodosukcynoimidu (3,9 g, 17,4 mmola) i kwas trifluorometanosulfonowy (0,17 ml, 1,97 mmola) w mieszaninie dichlorometanu/dioksanu 1/1 (obj./obj.) (86 ml). Po 10 minutach mieszaninę reakcyjną przesączono, rozcieńczono dichlorometanem, przemyto kolejno 1M roztworem tiosiarczanu sodu, 10% roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/octan etylu 6/1 (obj./obj.)) i otrzymano 18,8 g trisacharydu 5.

[a]D = +34 (c = 1,26, dichlorometan).

Przepis 4 (4,6-O-Benzylideno-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (6)

Do roztworu związku 5 (18,7 g, 14 mmoli) w mieszaninie metanolu-dioksanu 1/1 (obj./obj.) (140 ml) dodano tert-butanolanu potasu (3,15 g) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zobojętniono żywicą Dowex® 50WX4 H⁺, przesączono i zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (dichlorometan/metanol 20/1 (obj./obj.)) i otrzymano 10,0 g związku 6.

[a]D = +29 (c = 1,11, dichlorometan).

Przepis 5 (4,6-O-Benzylideno-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-Dglukopiranozylo)-(1>4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (7)

Do ochłodzonej mieszaniny (0°C) związku 6 (9,93 g, 12,24 mmola), jodku metylu (9,0 ml, 138 mmoli) w bezwodnym tetrahydrofuranie (100 ml), w atmosferze argonu, dodano porcjami wodorku sodu (5,2 g, 216 mmoli). Mieszaninę mieszano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej. Nadmiar wodorku sodu rozłożono z użyciem metanolu i mieszaninę reakcyjną wlano do wody z lodem (500 ml). Po wyekstrahowaniu octanem etylu, fazę organiczną przemyto nasyconym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad siarczanem sodu, a następnie zatężono pod próżnią i otrzymano 11 g związku 7, który zastosowano w następnym etapie bez oczyszczenia.

TLC: Rf = 0,38, żel krzemionkowy, toluen/octan etylu 3/2 (obj./obj.) CH2CH2

Przepis 6 (2,3-di-O-Metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (8)

Związek 7 (11 g) rozpuszczono w 60% kwasie octowym (180 ml) i mieszano przez 1 godzinę i 30 minut w temperaturze 80°C. Mieszaninę zatężono i współodparowano z toluenem. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/aceton 2/1 (obj./obj.)) i otrzymano 8,46 g związku 8.

TLC: Rf = 0,36, żel krzemionkowy, toluen/aceton 1/1 (obj./obj.)

PL 206 727 B1

Przepis 7 (6-O-Benzoilo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (9).

Do roztworu związku 8 (8,41 g, 10,6 mmola) w dichlorometanie (110 ml) dodano 1-benzoiloksy-1H-benzotriazolu (5,36 g, 22,4 mmola) i trietyloaminy (3,32 ml). Mieszaninę mieszano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńczono dichlorometanem, przemyto nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, a następnie zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (cykloheksan/octan etylu/etanol 5/0,5/0,25 (obj./obj./obj.)) i otrzymano 8,40 g związku 9.

[a]_D = +15° (c = 2, dichlorometan).

Schemat 2 Synteza pentasacharydu 14

Przepis 8 (2,3-di-O-Benzoilo-4,6-O-benzylideno-a-D-glukopiranozylo-(1>4)-(2,3,6,-tri-O-benzoilo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-O-benzoilo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (10)

Związek 9 przeprowadzono w związek 10 według sposobu opisanego w przepisie 3.

[a]_D = +42 (c = 2, dichlorometan).

Przepis 9 (4,6-O-Benzylideno-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo) etylu (11)

PL 206 727 B1

Związek 10 przeprowadzono w związek 11 według sposobu opisanego w przepisie 4.

TLC: Rf = 0,35, żel krzemionkowy, dichlorometan/metanol 10/1 (obj./obj.)

Przepis 10 (4,6-O-Benzylideno-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-3-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (12)

Związek 11 przeprowadzono w związek 12 według sposobu opisanego w przepisie 5.

TLC: Rf = 0,11, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu 1/2 (obj./obj.)

Przepis 11 (2,3-di-O-Metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-2,3,6-tri-O-metylo-3-D-glukopiranozylo)-(1>4)(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-3-D-glukopiranozylo)-(1>4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-3-D-glukopiranozyd-2-(trimetylosililo)etylu (13)

Związek 12 przeprowadzono w związek 13 według sposobu opisanego w przepisie 6.

TLC: Rf = 0,33, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu/etanol 2/0,5/0,5 (obj./obj./obj.).

Przepis 12 (6-O-Benzoilo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-3-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-3-D-glukopiranozylo)-(1>4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-3-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (14)

Związek 13 przeprowadzono w związek 14 według sposobu opisanego w przepisie 7.

TLC: Rf = 0,16, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu/etanol 3/0,5/05 (obj./obj./obj.).

Schemat 3 - Synteza heptasacharydu 19

PL 206 727 B1

Przepis 13 (2,3-di-O-Benzoilo-4,6-O-benzylideno-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-benzoilo-e-D-glukopiranozylo)-(1 ^4)-6-O-benzoilo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 ^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^-4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (15)

Reakcję sprzęgania związku 14 z disacharydem 4 prowadzono sposobem opisanym w przepisie 3 i otrzymano związek 15.

[a]_D = +52 (c = 1,1, dichlorometan).

Przepis 14 (4,6-O-Benzylideno-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,-6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-β-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (16)

Związek 15 przeprowadzono w związek 16 według sposobu opisanego w przepisie 4.

TLC: Rf = 0,31, żel krzemionkowy, dichlorometan/metanol 10/1 (obj./obj.)

Przepis 15 (4,6-O-Benzylideno-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 ^4)]₂-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (17)

Związek 16 przeprowadzono w związek 17 według sposobu opisanego w przepisie 5.

TLC: Rf = 0,46, żel krzemionkowy, dichlorometan/metanol 10/1 (obj./obj.)

Przepis 16 (2,3-di-O-Metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-2,3,6-tri-O-metylo-a-D-(glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 ^4)-2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(1,2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (18)

Związek 17 przeprowadzono w związek 18 według sposobu opisanego w przepisie 6.

TLC: Rf = 0,42, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu/etanol 1/0,5/0,5 (obj./obj./obj.)

Przepis 17 (6-O-Benzoilo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1^4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 ^4)-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(tri-metylosililo)etylu (19)

Związek 18 przeprowadzono w związek 19 według sposobu opisanego w przepisie 7.

TLC: Rf = 0,25, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu/etanol 3/0,5/0,5 (obj./obj./obj.).

Schemat 4 - Synteza nonasacharydu 23

PL 206 727 B1

Przepis 18 (2,3-di-O-Benzoilo-4,6-O-benzylideno-a-D-glukopiranozylo)-(1->4)-(2,3,6-tri-O-benzoilo-p-D-glukopiranozylo)-(1-—4)-(6-O-benzoilo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1->4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1 — 4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 — 4)-(2,3,6-triO-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1—4)]₂-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-p-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo) etylu (20)

Mieszaninę tioglikozydu 4 (5,2 g, 5,23 mmola), heptasacharydu 19 (4,72 g, 2,75 mmola) i sproszkowanych sit molekularnych 4A w toluenie mieszano w atmosferze argonu przez 1 godzinę i wkroplono w temperaturze 0°C roztwór N-jodosukcynoimidu (1,36 g, 5,85 mmola) i kwasu trifluorometanosulfonowego (0,140 ml, 1,56 mmola) w dichlorometanie/dioksanie 1/1 (obj./obj.) (32 ml). Mieszaninę reakcyjną po 15 minutach przesączono rozcieńczono dichlorometanem, przemyto kolejno 1M roztworem tiosiarczanu sodu, 10% roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (cykloheksan/octan etylu/etanol 3/0,5/0,5 (obj./obj./obj.)) i otrzymano 7,13 g związku 20.

[a]_D = +65° (c = 1,4, dichlorometan).

Przepis 19 (4,6-O-Benzylideno-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(p-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1—4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1—4)]₂-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-p-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (21)

Związek 20 przeprowadzono w związek 21 według sposobu opisanego w przepisie 4.

TLC: Rf = 0,27, żel krzemionkowy, dichlorometan/metanol 10/1 (obj./obj.)

Przepis 20 (4,6-O-Benzylideno-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1—4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1—4)]₃-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-p-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo) etylu (22)

Związek 21 przeprowadzono w związek 22 według sposobu opisanego w przepisie 5.

TLC: Rf = 0,31, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu/etanol 5/1/1 (obj./obj./obj.).

Przepis 21 (2,3-di-O-Metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1—4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1—4)]₃-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-p-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (23)

Związek 22 przeprowadzono w związek 23 według sposobu opisanego w przepisie 6.

TLC: Rf = 0,35, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu/etanol 2/1/1 (obj./obj./obj.)

PL 206 727 B1

Schemat 5 - Synteza nonasacharydu 29

Przepis 22 (2,3-di-O-Metylo-6-O-tosylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-p-D-glukopiranozylo)-(1 >4)₃-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-p-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (24)

W atmosferze argonu związek 23 (1,09 g) rozpuszczono w pirydynie (10 ml), a następnie dodano chlorku tosylu (1,03 g). Po 2 godzinach mieszania mieszaninę rozcieńczono dichlorometanem (100 ml). Fazę organiczną przemyto kolejno 10% roztworem wodorosiarczanu potasu i wodą, wysuszono i odparowano do sucha. Po chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/aceton 2,3/2 (obj./obj.)), otrzymano 1,77 g związku 24.

TLC: Rf = 0,5, żel krzemionkowy, cykloheksan/octan etylu/etanol 3/1/1 (obj./obj./obj.).

PL 206 727 B1

Przepis 23 (6-Dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (25)

Do roztworu związku 24 (500 mg, 0,23 mmola) w bezwodnym N,N-dimetyloformamidzie (11 ml) zawierającego sproszkowane sita molekularne 4A, dodano ftalimidu potasu (225 mg, 1,38 mmola), a następnie eteru 18-koronowego-6 (121,5 mg, 0,46 mmola). Mieszaninę mieszano przez 4 godziny w temperaturze 80°C. Po ochłodzeniu mieszaninę reakcyjną rozcieńczono dichlorometanem, przesączono przez celit i zatężono. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii na żelu Sephadex® LH20 (3 X 100 cm) (dichlorometan/etanol 1/1 (obj./obj.)), a następnie drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/etanol 11/2 (obj./obj.)) i otrzymano 417,4 mg związku 25.

TLC: Rf = 0,38, żel krzemionkowy, toluen/etanol 11/2 (obj./obj.)

Przepis 24 (2,3,4,6-Tetra-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)]₃-6-O-benzylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd-2-(trimetylosililo)etylu (27)

Mieszaninę tioglikozydu 26 (1,515 g, 1,564 mmola) (wytworzonego jak związek 41 z przepisu 36 zgłoszenia patentowego WO 99/36443), akceptora 25 (840 mg, 0,391 mmola) i sproszkowanych sit molekularnych 4A (2,15 g) w toluenie (33 ml) mieszano w atmosferze argonu przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 0°C i dodano roztworu N-jodosukcynoimidu (387 mg) i kwasu trifluorometanosulfonowego (55,4 μθ w dichlorometanie/dioksanie 1/1 (obj./obj.) (7 ml). Po 10 minutach mieszaninę przesączono, rozcieńczono toluenem, przemyto kolejno 1M roztworem tiosiarczanu sodu, 10% roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, a następnie zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii na żelu Sephadex® LH20 (dichlorometan/etanol 1/1 (obj./obj.)), a następnie drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/aceton 5/4 (obj./obj.)) i otrzymano 887 mg związku 27.

[a]D = +70° (c = 0,35, dichlorometan).

Przepis 25 (2,3,4,6-tetra-O-Acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo) etylu (28)

Roztwór związku 27 (750 mg, 0,245 mmol) w kwasie octowym (37 ml) poddano działaniu wodoru pod ciśnieniem (0,5 MPa) w obecności 10 % palladu na węglu (750 mg) przez 2 godziny i 30 minut. Po przesączeniu roztwór zatężono, pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/etanol 6/1 (obj./obj.)) i otrzymano 728 mg związku 28.

TLC: Rf = 0,32, żel krzemionkowy, toluen/etanol 6/1 (obj./obj.)

Przepis 26 (2,3,4,6-tetra-O-Acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-6-O-acetylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozyd 2-(trimetylosililo)etylu (29)

Do roztworu związku 28 (728 mg, 0,245 mmola) w dichlorometanie (10 ml) dodano trietyloaminy (51,1 μl 0,368 mmol), bezwodnika octowego (32,5 μ!, 0,34 4 mmol) i dimetyloaminopirydyny (6,0 mg, 0,049 mmol). Po 1 godzinie mieszania mieszaninę rozcieńczono dichlorometanem, przemyto kolejno 10 % roztworem wodorosiarczanu potasu i wodą, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, a następnie zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym i otrzymano 0,618 mg związku 29.

TLC: Rf = 0,37, żel krzemionkowy, toluen/etanol 6/1 (obj./obj.)

PL 206 727 B1

Schemat 6 - Synteza oligosacharydu 31

Przepis 27 (2,3,4,6-tetra-O-Acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)]₃-6-O-acetylo-2,3-di-O-metylo-D-glukopiranoza (30)

Roztwór związku 29 (579 mg, 0,192 mmola) w mieszaninie kwasu trifluorooctowego/dichlorometanu 2/1 (obj./obj.) (11,5 ml) mieszano przez 1 godzinę. Mieszaninę rozcieńczono mieszaniną toluenu/octanu n-propylu 2/1 (obj./obj.) (69 ml), zatężono i współodparowano z toluenem. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/etanol 5/1 (obj./obj.)) i otrzymano 523 mg związku 30.

TLC: Rf = 0,31, żel krzemionkowy, toluen/etanol 5/1 (obj./obj.)

Przepis 28

Trichloroacetyloimidan (2,3,4,6-tetra-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-6-O-acetylo-2,3-di-O-metylo-D-glukopiranozy (31)

Do roztworu związku 30 w dichlorometanie (3 ml), dodano trichloroacetonitrylu (65,5 μ!, 0,85 mmola) i węglanu cezu (88,4 mg, 0,27 mmola). Po mieszaniu przez 2 godziny, mieszaninę przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/etanol 6/1 (obj./obj.) + 0,1% trietyloaminy) i otrzymano 477 mg związku 31.

TLC: Rf = 0,35, żel krzemionkowy, toluen/etanol 6/1 (obj./obj.)

PL 206 727 B1

Schemat 7 - Synteza heksadekasacharydu 35

PL 206 727 B1

Przepis 29 (2,3,4,6-tetra-O-Acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-acetylo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronian benzylu)-(1>4)-(3,6-di-O-acetylo-2-O-benzylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronian benzylu) -(1>4)-2,3,6-tri-O-benzylo-a-D-glukopiranozyd metylu (33)

Imidan 31 (370 mg, 0,121 mmola) i związek 32 (336 mg, 0,242 mmola), (otrzymany według P. Westerduin i inni, BioOrg. Med. Chem, 1994, 2, 1267) w mieszaninie dichlorometanu/eteru dietylowego 1/2 (obj./obj.) (5,5 ml). Po dodaniu sproszkowanych sit molekularnych 4A, mieszaninę ochłodzono do temperatury -20°C i dodano 0,1 M roztworu trifluorometanosulfonianu trimetylosililu w dichlorometanie (181,5 l). Po 25 minutach mieszaninę zobojętniono przez dodanie stałego wodorowęglanu sodu. Po przesączeniu i zatężeniu, pozostałość oczyszczono drogą chromatografii na żelu Sephadex® LH20, a następnie drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/aceton 6/5 (obj./obj.)) i otrzymano 302 mg związku 33.

[a]_D = +86° (c = 1, dichlorometan).

Przepis 30 (2,3,4,6-tetra-O-Acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e>D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-acetylo-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(3,6-di-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-a-D-glukopiranozydu metylu (34)

Roztwór związku 33 (104 mg, 0,024 mmola) w kwasie octowym (5 ml) poddano działaniu wodoru pod ciśnieniem (0,4 MPa) w obecności 10% palladu na węglu (104 mg) przez 4 godziny. Po przesączeniu roztwór liofilizowano i otrzymano związek 34 (87 mg), który zastosowano w następnym etapie bez oczyszczania.

Przepis 31 (a-D-Glukopiranozylo)-(1>4)-(a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)]3-(2,3-di-O-metylo -a-D-glukopiranozylo)-(1 >4) (kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-a-D-glukopiranozydu metylu (35)

Do roztworu związku 34 (80 mg, 0,021 mmola) w bezwodnym metanolu (6,9 ml) w obecności sproszkowanych sit molekularnych 3A (875 mg), dodano roztworu molowego metanolanu sodu w metanolu) (140 μ^. Po 20 godzinach przetrzymywania w temperaturze pokojowej, mieszaninę przesączono i zobojętniono kwasem octowym. Roztwór zatężono do połowy objętości i naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (3 x 92 cm). Po elucji wodą i liofilizacji otrzymano związek 35 (66 mg).

PL 206 727 B1

PL 206 727 B1

Przepis 32

Sól sodowa (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>)-(6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-6-ftalimido-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu, (36)

Alkohol wielowodorotlenowy 35 (66,4 mg, 0,021 mmola) rozpuszczono w N,N-dimetyloformamidzie (1,8 ml), dodano kompleksu tritlenku siarki-trietyloaminy (320 mg, 1,77 mmola) i całość mieszano przez 20 godzin w temperaturze 55°C. Roztwór naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (3 x 92 cm) z elucją 0,2M roztworem chlorku sodu. Frakcje zawierające produkt zatężono i odsolono wykorzystując tę samą kolumnę z elucją wodą. Po liofilizacji otrzymano 83 mg związku 36.

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna 4968,92; masa doświadczalna = 4966,52 ±0,16 jednostek mas atomowych.

Przepis 33

Sól sodowa (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-amino-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu (37)

Związek 36 (83 mg, 0,017 mmola) rozpuszczono w mieszaninie etanolu/wody 2/1 (obj./obj.) (1,67 ml) dodano wodorku hydrazyny (81,2 gl, 1,67 mmola) i mieszaninę ogrzewano do temperatury wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 20 godzin. Roztwór naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (3 X 92 cm) z elucją wodą. Frakcje zawierające produkt zatężono, pozostałość rozpuszczono w etanolu/wodzie 2/1 (obj./obj.) (5,00 ml) i ponownie poddano działaniu jak w warunkach poprzednich wodorku hydrazyny (81,2 gl) i otrzymano 71 mg związku 37.

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna = 4838,32; masa doświadczalna = 4814,6 ± 0,70 jednostek mas atomowych.

Schemat 9 - Synteza pentasacharydu 39

Przepis 34 (6-O-Acetylo-2-azydo-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo-β-D-glukopiranozylouronian benzylu)-(1>4)-(3,6-di-O-acetylo-2-O-benzylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3-di-O-metylo -α-L-idopiranozylouronian benzylu)-(1>4)-2,3,6-tri-O-benzylo-a-D-glukopiranozyd metylu (39)

Związek trichloroacetoimidanu 6-O-acetylo-2-azydo-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-a,e-D-glukopiranozy 38 (265 mg, 0,631 mmola) (otrzymany według J. Basten i inni, Bioorg. Med. Chem. Lett. (1992), 2 (9), 901) i związek 32 (584 mg, 0,420 mmola) (otrzymany według P. Westerduin i inni, BioOrg. Med. Chem, 1994, 2, 1267) rozpuszczono w mieszaninie dichlorometanu/eteru dietylowego 1/2 (obj./obj.)

PL 206 727 B1 (28,5 ml). Po dodaniu sproszkowanych sit molekularnych 4A mieszaninę ochłodzono do temperatury -20°C i dodano 0,1M roztworu trifluorometanosulfonianu trimetylosililu w dichlorometanie (94,6 μθ. Po 10 minutach dodano ponownie imidanu (53,8 mg), a następnie 0,1M roztworu trifluorometanosulfonianu trimetylosililu w dichlorometanie (19,2 μβ. Po 10 minutach mieszaninę zobojętniono przez dodanie stałego wodorowęglanu sodu. Po przesączeniu i zatężeniu pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/octan etylu 3/1 (obj./obj.)) i otrzymano 499 mg związku 39.

[a]_D = +66° (c = 1,07, dichlorometan).

Schemat 10 - Synteza pentasacharydu 44 (sposób I)

Przepis 35 (6-O-Acetylo-2-amino-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1 >4)-(3,6-di-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas -2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-a-D-glukopiranozyd metylu (40)

PL 206 727 B1

Roztwór związku 39 (552,6 mg, 0,335 mmola) w mieszaninie tert-butanolu/octanu etylu 5/1 (obj./obj.) (16 ml) poddano działaniu wodoru pod ciśnieniem (1,0 MPa) w obecności 10% palladu na węglu (1,10 g) i 1M roztworu kwasu chlorowodorowego (0,336 ml) przez 4 godziny i 30 minut. Po przesączeniu, roztwór zatężono i otrzymano związek 40, który zastosowano w następnym etapie bez oczyszczania.

Przepis 36 (2-Amino-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(a-D-glukopiranozylo)-(1>4) (kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-a-D-glukopiranozyd metylu (41)

Związek 40 (324 mg, 0,300 mmola) rozpuszczono w metanolu (8,8 ml), dodano 5M roztworu wodorotlenku sodu (2,2 ml) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Mieszaninę zobojętniono żywicą Dowex® 50 H⁺ i przesączono. Roztwór przepuszczono przez żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie z elucją wodą. Frakcje zawierające produkt zatężono i otrzymano 254,2 mg związku 41. W tym etapie sprawdzono metodą NMR, że zabezpieczające grupy (benzylowe i acetylowe) usunięto.

TLC: Rf = 0,26, żel krzemionkowy, octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 5/5/1/3 (obj./obj./obj./obj.)

Przepis 37 (2-(Benzyloksykarbonylo)amino-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas

2,3-di-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-a-D-glukopiranozyd metylu (42).

Związek 41 (241,1 mg, 0,253 mmola) rozpuszczono w wodzie (12,4 ml) i dodano wodorowęglanu sodu (63,7 mg), a następnie wkroplono chloromrówczanu benzylu (41 μ^. Po 12 godzinach mieszania, mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie z elucją wodą. Frakcje zawierające produkt zatężono. Po oczyszczeniu drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 21/17/3,6/10 obj./obj./obj./obj.) otrzymano 221 mg związku 42.

TLC: Rf = 0,63, żel krzemionkowy, octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 5/5/1/3 (obj./obj./obj./obj.)

Przepis 38

Sól sodowa (2-(benzyloksykarbonylo)amino-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu (43)

Alkohol wielowodorotlenowy 42 (19,6 mg, 0,018 mmola) rozpuszczono w N,N-dimetyloformamidzie (1,62 ml), dodano kompleksu tritlenku siarki-trietyloaminy (114 mg) i całość mieszano przez 20 godzin w temperaturze 55°C bez dostępu światła. Roztwór naniesiono na żywicę Sephadex®) G-25 Fine w kolumnie z elucją 0,2M roztworem chlorku sodu. Frakcje zawierające produkt zatężono i odsolono na tej samej kolumnie z elucją wodą. Po liofilizacji otrzymano 28,5 mg związku 43.

[a]D = +48° (c = 2,75, woda).

Przepis 39

Sól sodowa (2-amino-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu (44)

Roztwór związku 43 (27,5 mg, 0,015 mmola) w mieszaninie tert-butanolu (333 μ^/wody (500 μθ poddano działaniu wodoru pod ciśnieniem (0,5 MPa) w obecności 10% palladu na węglu (8,25 mg) przez 16 godzin. Po przesączeniu roztwór zatężono i pozostałość naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (3 x 92 cm). Po elucji wodą i liofilizacji otrzymano 23,7 mg związku 44.

[a]D = +58° (c = 1, woda)

PL 206 727 B1

Przepis 40 (Kwas 4-O-lewulinylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(3,6-di-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-a-D-glukopiranozydu metylu (46)

Roztwór związku 45 (4,50 g, 3,02 mmola) (otrzymany według P. Westerduin i inni, BioOrg. Med. Chem. 1994, 2, 1267) w mieszaninie octanu etylu/tert-butanolu (72 ml, 1/1, obj./obj.) poddano działaniu wodoru pod ciśnieniem (0,4 MPa) w obecności 10% palladu na węglu (9,0 g) przez 6 godzin. Po przesączeniu i zatężeniu otrzymany związek 46 zastosowano bezpośrednio w następnym etapie bez oczyszczania.

TLC: Rf = 0,54, octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 26/22/4,6/17 obj./obj./obj./obj.

Przepis 41 (4-O-Lewulinylo-2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronian metylu)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronian metylu)-(1>4)-2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozyd metylu (47)

Do roztworu związku 46 (2,57 g, 2,71 mmola) w bezwodnym N,N-dimetyloformamidzie (35 ml) dodano w temperaturze 0°C wodorowęglanu potasu (2,71 g), a następnie jodku metylu (3,4 ml). Po 16 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 0°C. Dodano następnie kolejno dimetyloaminopirydyny (132 mg) i bezwodnika octowego (1,5 ml) i całość mieszano przez 16 godzin. Po zobojętnieniu nadmiaru bezwodnika octowego mieszaninę

PL 206 727 B1 rozcieńczono octanem etylu. Fazę organiczną przemyto kolejno 10% roztworem wodorosiarczanu potasu i wodą, a następnie nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano do sucha. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym [cykloheksan/(octan etylu/etanol 1/1) 9/5] i otrzymano 2,51 g związku 47.

TLC: Rf = 0,41, toluen/aceton 2/1 obj./obj.

Przepis 42 (2,3-di-O-Metylo-e-D-glukopiranozylouronian metylu)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo -a-L-idopiranozylouronian metylu)-(1>4)-2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozyd metylu (48)

Związek 47 (2,5 g, 2,56 mmola) rozpuszczono w mieszaninie toluenu/etanolu 1/1 obj./obj. (500 ml) i dodano octanu hydrazyny (1,01 g). Po 2 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną zatężono do sucha. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie. Fazę organiczną przemyto kolejno 2% roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano do sucha. Po chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (toluen/octan etylu 1/4 obj./obj.), otrzymano 2,01 g związku 48.

TLC: Rf = 0,37, toluen/aceton 2/1 obj./obj.

Schemat 12 - Synteza pentasacharydu 49

Przepis 43 (6-O-Acetylo-2-azydo-2-deoksy-3,4-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronian metylu)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronian metylu)-(1>4)-2,3,6-tri-O-acetylo-a-D-glukopiranozyd metylu (49)

W mieszaninie dichlorometanu/eteru dietylowego 1/2 (obj./obj.) (126 ml) rozpuszczono imidan 38 (1,18 g, 2,81 mmola) (otrzymany według J. Basten i inni, Bioorg. Med. Chem. Lett. (1992), 2 (9), 901) i związek 48 (1,83 g, 1,75 mmola). Po dodaniu sproszkowanych sit molekularnych 4A mieszaninę ochłodzono do temperatury -20°C i dodano 1M roztworu trifluorometanosulfonianu tert-butylodimetylosililu w dichlorometanie (421 μβ. Po 30 minutach dodano nową ilość imidanu (266 mg) i 1M roztworu trifluorometanosulfonianu tert-butylodimetylosililu w dichlorometanie (168, μβ. Po 10 minutach, mieszaninę zobojętniono przez dodanie stałego wodorowęglanu sodu i przesączono. Następnie roztwór dopełniono dichlorometanem, przemyto kolejno 2% roztworem wodorowęglanu sodu i wodą, wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Otrzymaną pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (dichlorometan/octan etylu 4/3, a następnie 1/1 obj./obj.) i otrzymano 1,814 g związku 49.

TLC: Rf = 0,57, toluen/octan etylu 3/1 obj./obj.

[a]D = +93° (c = 1,15, dichlorometan).

PL 206 727 B1

Przepis 44 (2-Azydo-2-deoksy-3,4-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-p-D-glukopiranozylouronowy)-(1—4)-(a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)(1—4)-a-D-glukopiranozyd metylu (50)

Do roztworu związku 49 (845,3 mg) w tetrahydrofuranie (104 ml), dodano w temperaturze 5°C 30% wodnego roztworu nadtlenku wodoru (42 ml). Po 5 minutach mieszania wkroplono 0,7M wodny roztwór wodorotlenku litu (19,2 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w temperaturze -5°C, a następnie przez 4 godziny w temperaturze 0°C i w końcu przez 16 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie zobojętniono 1M roztworem kwasu chlorowodorowego. Roztwór naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (5 x 1000 cm) z elucją wodą. Frakcje zawierające oczekiwany związek połączono, zatężono i naniesiono na żywicę Dowex AG 50 WX4 H⁺ (50 ml) w kolumnie. Związek zebrano w temperaturze 0°C, zatężono i otrzymano 618 mg związku 50.

TLC: Rf = 0,56, octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 26/22/4,6/17 obj./obj./obj./obj.

Przepis 45

Sól sodowa (2-azydo-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 —4)-(2,3-di-O-metylo-p-D-glukopiranozylouroniano)-(1—4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1—4)-(2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouroniano)-(1 —4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu (51)

Bezpośrednio przed życiem związek 50 poddano współdestylacji z N,N-dimetyloformamidem (3 x 29 ml). Do roztworu związku 50 (612 mg, 0,624 mmola) w N,N-dimetyloformamidzie (58 ml) dodano kompleksu tritlenku siarki-trietyloaminy (3,84 g). Mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 55°C bez dostępu światła. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i wkroplono roztwór wodorowęglanu sodu (5,33 g) w wodzie (200 ml). Całość mieszano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej i zatężono do sucha. Pozostałość rozpuszczono w wodzie i roztwór naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie z elucją 0,2M roztworem chlorku sodu. Frakcje zawierające produkt zatężono i odsolono na tej samej kolumnie z elucją wodą. Po liofilizacji otrzymano 1,06 g związku 51.

TLC: Rf = 0,5, octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 3/5/1/3 obj./obj./obj./obj.

PL 206 727 B1

Przepis 46

Sól sodowa (2-amino-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas

2.3- di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-triO-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas

2.3- di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu (44)

To uwodornianie przeprowadzono dwukrotnie i za każdym razem z użyciem 534,4 mg związku 51. Roztwór związku 51 (534,4 mg) w mieszaninie tert-butanolu (6,7 ml, 12,6 ml/g)/wody (10 ml, ml/g) poddano działaniu wodoru pod ciśnieniem (0,5 MPa) w obecności 10% palladu na węglu (160 mg) w temperaturze 40°C przez 4 godziny. Po przesączeniu (filtr Millipore®'a LSWP 5 μm) roztwór zatężono do sucha i otrzymano 530 mg związku 44.

TLC: Rf = 0,49, octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 3/5/1/3 obj./obj./obj./obj.

PL 206 727 B1

PL 206 727 B1

ο

LD

Ό rO

Γ-ν)

Λί

Ρ*Ί

Ν

Μ

Cu

Ό (0 rM

Λί (>Ί

Ν

Μ

CU

P r z y k ł a d 1

Sól sodowa (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-biotynoamido-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylo34

PL 206 727 B1 uronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu

Do roztworu związku 37 (18 mg, 3,72 μmola) w 0,5% wodorowęglanie sodu (1,5 ml), dodano sulfosukcynoimidu biotyny (16,5 mg) i całość mieszano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie z elucją chlorkiem sodu. Frakcje zawierające produkt zatężono i odsolono na tej samej kolumnie z elucją wodą. Po liofilizacji otrzymano 15,9 mg związku z przykładu 1.

[a]D = +59° (c = 0,78, woda).

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna = 5065,12; masa doświadczalna = 5064,18 ± 1,04 jednostek masy atomowej.

P r z y k ł a d 2

Sól sodowa (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-[6-(biotynoamido)heksamido]-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu

Do roztworu związku 37 (18 mg, 3,72 μmola) w 0,5% wodorowęglanie sodu (1,5 ml), dodano 6-(biotynoamido)heksanianu (16,5 mg) i mieszano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie z elucją chlorkiem sodu. Frakcje zawierające produkt zatężono i odsolono na tej samej kolumnie z elucją wodą. Po liofilizacji otrzymano 17,9 mg związku z przykładu 2.

[a]D = +60° (c = 1,0, woda).

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna = 5178,28; masa doświadczalna = 5176,3 ± 0,77 jednostek masy atomowej.

P r z y k ł a d 3

Sól sodowa (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo-(1>4)-(6-[(6-(6-biotanoamidoheksamido)heksamido]-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]3-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas -2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3, 6tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu

Do roztworu związku 37 (17 mg, 3,51 μmola) w 0,5% wodorowęglanie sodu (1,4 ml), dodano 6-(biotynoamidoheksamido)heksanianu sulfosukcynoimidu (23,6 mg) i mieszano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie z elucją chlorkiem sodu. Frakcje zawierające produkt zatężono i odsolono na tej samej kolumnie z elucją wodą. Po liofilizacji otrzymano 17,4 mg związku z przykładu 3.

[a]D = +64° (c = 1,0, woda).

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna = 5291,44; masa doświadczalna = 5292,1 ± 0,83 jednostek masy atomowej.

P r z y k ł a d 4

Sól sodowa (2-biotynoamido-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1- >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idiopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu

Do roztworu związku 44 (21,2 mg, 0,012 mmola) w 0,5% wodorowęglanie sodu (750 μθ dodano roztworu N-hydroksysukcynoimidu biotyny (42 mg) w N,N-dimetyloformamidzie (750 μ^. Po 16 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie. Po elucji wodą i liofilizacji otrzymano 22,3 mg związku z przykładu 4.

[a]D = +38° (c = 0,15, woda).

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna = 1938,48; masa doświadczalna = 1937,48 ± 0,11 jednostek masy atomowej.

PL 206 727 B1

P r z y k ł a d 5

Sól sodowa (2-[N-(6-biotynoamidoheksanoilo)]-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu

Tę reakcję przeprowadzono dwukrotnie i za każdym razem z użyciem 494,5 mg związku 44.

Związek 44 (494,5 mg, 0,289 mmola) rozpuszczono w wodnym 0,5% roztworze wodorowęglanu sodu (116 ml). Do mieszaniny wkroplono roztwór 6-(biotynoamido)heksanianu sulfosukcynoimidu (1,46 g, 2,63 mmola) w 0,5% roztworze wodorowęglanu sodu (12 ml). Po 16 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej dodano 1M wodnego roztworu wodorotlenku sodu i całość mieszano przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (5 x 1000 cm) z elucją chlorkiem sodu. Połączono frakcje zawierające produkt pochodzące z dwóch reakcji. Po liofilizacji otrzymano 999,2 mg związku z przykładu 5.

TLC: Rf = 0,42, octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda 3/5/1/3 obj./obj./obj./obj.

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna = 2051,64; masa doświadczalna: 2051,60 ± 0,43 jednostek masy atomowej.

P r z y k ł a d 6

Sól sodowa (2-[6-(6-biotynoamidoheksamido)heksamido]-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu.

Związek 44 (30,1 mg, 17,6 μ^Ό^) rozpuszczono w 0,5% wodnym roztworze wodorowęglanu sodu (7 ml), a następnie wkroplono roztwór 6-(6-biotynoamidohaksamido)sulfosukcynoimidylu (118 mg, 176 μmola) w 0,5% roztworze wodorowęglanu sodu (1 ml). Po 16 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej, dodano 1M wodnego roztworu wodorotlenku sodu i mieszano przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną naniesiono na żywicę Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (2 x 85 cm) z elucją chlorkiem sodu. Frakcje zawierające produkt połączono, zatężono i odsolono na żywicy Sephadex® G-25 Fine w kolumnie (2 x 85 cm) z elucją wodą. Po liofilizacji otrzymano 26,5 mg związku z przykładu 6.

Masa: metoda „ESI, tryb ujemny: masa chemiczna = 2164,48; masa doświadczalna : 2164,29 ± 0,38 jednostek masy atomowej.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Syntetyczne polisacharydy o działaniu przeciwzakrzepowym, znamienne tym, że są związkami o wzorze:

   w którym:

   - linia falista oznacza wiązanie usytuowane pod lub nad płaszczyzną pierścienia piranozowego.

   PL 206 727 B1

   Po oznacza polisacharyd zawierający n jednakowych lub różnych jednostek monosacharydowych, związany poprzez swój anomeryczny atom węgla z Pe, jest schematycznym przedstawieniem jednostki monosacharydowej o strukturze piranozy, wybranej z grupy obejmującej heksozy, pentozy i odpowiednie dezoksycukry, przy czym ta jednostka jest związana poprzez swój anomeryczny atom węgla z inną jednostką monosacharydową, a grupy hydroksylowe tej jednostki są podstawione jednakowymi lub różnymi grupami R1, przy czym R1 ma niżej podane znaczenie,

   - Pe oznacza pentasacharyd o budowie:

   - h oznacza 1 lub 2,

   - n oznacza liczbę całkowitą i może mieć wartość 0 - 25,

   - R1 oznacza ugrupowanie -T-Biot, (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

   - R2 oznacza ugrupowanie -T-Biot, (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

   - R3 oznacza ugrupowanie -T-Biot lub (C1-C6)-alkoksyl,

   - R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot, (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, albo R4 oznacza mostek -O-CH2-, przy czym grupa -CH2- jest związana z atomem węgla, do którego jest przyłączona funkcyjna grupa karboksylowa w tym samym pierścieniu;

   z tym, że co najmniej jeden z podstawników R1, R2, R3 i R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot,

   - W oznacza atom tlenu lub metylen,

   - T oznacza ugrupowanie wybrane spośród:

   gdzie j i k są jednakowe lub różne i oznaczają liczby całkowite 1 - 10; - Biot oznacza grupę:

   oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

   PL 206 727 B1
2. 2. Polisacharydy według zastrz. 1, znamienne tym, że są związkami o wzorze [I.1] oznacza określoną grupę polisacharydów Po, związanych poprzez ich anomeryczny atom węgla z Pe, jak zdefiniowano dla wzoru (I), ma takie znaczenie jak we wzorze (I),

   - grupy R1 mają takie znaczenie jak we wzorze (I) i w tym samym monosacharydzie mogą być jednakowe lub różne,

   - monosacharyd zawarty w [ ]m jest powtórzony m razy, monosacharyd zawarty w [ ]t jest powtórzony t razy, a monosacharyd zawarty w [ ]p jest powtórzony p razy,

   - m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5, t oznacza liczbę całkowitą od 0 do 24, a p oznacza liczbę całkowitą od 0 do 24, z tym, że 1 < m + t + p < 25, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
3. 3. Polisacharydy według zastrz. 2, znamienne tym, że jeden z podstawników R1, R2, R3 lub R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot, gdzie T i Biot mają takie znaczenia jak we wzorze (I).
4. 4. Heksadekasacharydy według zastrz. 1 - 3, znamienne tym, że są związkami o wzorze (I.2):

   PL 206 727 B1 w którym:

   - T oznacza ugrupowanie wybrane spośród:

   gdzie j i k są jednakowe lub różne i oznaczają liczby całkowite od 1 do 10; - Biot oznacza grupę:

   - R1 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

   - R2 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

   - R3 oznacza (C1-C6)-alkoksyl,

   - R4 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, albo R4 oznacza mostek -O-CH2-, przy czym grupa -CH2- jest przyłączona do atomu węgla podstawionego funkcyjną grupą karboksylową w tym samym pierścieniu,

   - W oznacza atom tlenu lub metylen, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
5. 5. Pentasacharydy według zastrz. 1, znamienne tym, że są związkami o wzorze (I.3):

   PL 206 727 B1 w którym R1, R2, R3, R4 i W mają takie znaczenie jak we wzorze (I), i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
6. 6. Pentasacharydy według zastrz. 5, znamienne tym, jeden z podstawników R1, R2, R3 lub R4 oznacza ugrupowanie -T-Biot, gdzie T i Biot mają takie znaczenie jak we wzorze (I).
7. 7. Pentasacharydy według zastrz. 5 albo 6, znamienne tym, że są związkami o wzorze (I.4):

   w którym

   - T oznacza ugrupowanie wybrane spośród:

   gdzie j i k są jednakowe lub różne i oznaczają liczby całkowite od 1 do 10; - Biot oznacza grup ę :

   - R1 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

   - R2 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-,

   - R3 oznacza (C1-C6)-alkoksyl,

   - R4 oznacza (C1-C6)-alkoksyl lub grupę -OSO3^-, albo R4 oznacza mostek -O-CH2-, przy czym grupa -CH2- jest przyłączona do atomu węgla podstawionego funkcyjną grupą karboksylową w tym samym pierścieniu,

   - W oznacza atom tlenu lub metylen, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
8. 8. Polisacharydy według zastrz. 1, znamienne tym, że są wybrane z grupy obejmującej:

   - sól sodową (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo-(1 >4)-6-biotynoamido-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-(di-O-metylo-3-D-glukopiranozylo40

   PL 206 727 B1 uronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu, sól sodową (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-[6-(biotynoamidoheksamido)heksamido]-6-dezoksy-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-3-D-glukopiranozylo)-(1>4)]₃-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-3-D-glukopiranozylouronowy)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu, sól sodową (2,3,4,6-tetra-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(6-[6-(6-biotynoamidoheksamido)heksamido]-6-dezoksy-(2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1>4)-[(2,3,6-tri-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-O-(2,3,6-tri-O-metylo-e-D-glukopiranozylo)-(1 >4)]3-(6-O-sulfoniano-2,3-di-O-metylo-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-3-D-glukopiranozylouronowy)-(1 >4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu,

   - sól sodową (2-biotynoamido-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu,

   - sól sodową (2-[N-(6-biotynoamidoheksanoilo)]-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-(1 >4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu,

   - sól sodową (2-[6-(6-biotynoamidoheksamido)heksamido]-2-dezoksy-3,4-di-O-metylo-6-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1>4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-e-D-glukopiranozylouronowy)-(1>4)-(2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozylo)-(1 >4)-(kwas 2,3-di-O-metylo-a-L-idopiranozylouronowy)-1>4)-2,3,6-tri-O-sulfoniano-a-D-glukopiranozydu metylu.
9. 9. Polisacharyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest nim związek o wzorze
10. 10. Środki farmaceutyczne zawierające substancję czynną, ewentualnie w połączeniu z jedną lub większą liczbą odpowiednich obojętnych zaróbek, znamienne tym, że jako substancję czynną zawierają polisacharyd określony w zastrz. 1 - 9.
11. 11. Zastosowanie środków farmaceutycznych określonych w zastrz. 10 do wytwarzania leku do stosowania w przypadku patologii spowodowanych zmianami w homeostazie układu krzepnięcia, objawiających się zwłaszcza w czasie zaburzeń układu sercowo-naczyniowego i mózgowo-naczyniowego, takich jak zaburzenia zakrzepowo-zatorowe związane z miażdżycą tętnic i cukrzycą, zwłaszcza w dusznicy niestabilnej, w udarze mózgowym, przy nawrocie zwężenia po plastyce naczyń, po endarterektomii lub po założeniu protez wewnątrznaczyniowych; a także zaburzeń zakrzepowo-zatorowych związanych z nawrotem zakrzepicy po rozpuszczeniu skrzepu, z zawałem, z otępieniem pochodzenia niedokrwiennego, z chorobami tętnic obwodowych, z hemodializą, z migotaniem przedsionków lub przy używaniu protez wewnątrznaczyniowych po wytworzeniu aortowo-wieńcowych przepływów omijających, w leczeniu lub profilaktyce patologii zakrzepowo-zatorowych pochodzenia żylnego, takich jak zatory płucne, w leczeniu lub profilaktyce powikłań zakrzepowych występujących po zabiegach chirurgicznych, przy wzroście nowotworów

    PL 206 727 B1 lub na tle zaburzeń krzepliwości wywołanych aktywującymi je czynnikami bakteryjnymi, wirusowymi lub enzymatycznymi.
12. 12. Zastosowanie polisacharydów określonych w jednym z zastrz. 1 - 9 dla pokrywania protez.
13. 13. Zastosowanie polisacharydów określonych w jednym z zastrz. 1 - 9 jako substancji pomocniczych przy endarterektomii z użyciem baloników porowatych.
14. 14. Zastosowanie awidyny lub streptoawidyny do wytwarzania środków farmaceutycznych przeznaczonych do neutralizowania polisacharydów określonych w jednym z zastrz. 1 - 9.