CZ302669B6

CZ302669B6 - Efektivní zpusob biotinylace aminosloucenin pomocí syntézy na pevné fázi pro potreby afinitní chromatografie

Info

Publication number: CZ302669B6
Application number: CZ20100229A
Authority: CZ
Inventors: Soural@Miroslav; Hlavác@Jan; Hradil@Pavel
Original assignee: Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date: 2010-03-29
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2011-08-24
Also published as: CZ2010229A3

Abstract

Imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 8, kde n predstavuje pocet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1 až 5, symbol Pol predstavuje polystyrenovou pryskyrici tvorenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu a symbol R predstavuje methyl, 4-methylfenyl, trifluormethyl skupinu, a jejich použití pro efektivní derivatizaci sloucenin obsahujících ve své strukture reaktivní aminoskupinu a následné stadium vzniklého systému pomocí afinitní chromatografie, cehož se využívá zejména ve farmaceutickém výzkumu pri urcování molekulárního cíle biologicky aktivních látek.

Description

Efektivní způsob biotinylace aminosloučenin pomocí syntézy na pevné fázi pro potřeby afínitní ctaromatografíe

Oblast techniky

Vynález se týká přípravy a použití imobilizovaných derivátů bíotinu s navázanými různě dlouhými řetězci polyethylenglykolu s využitím principu syntézy na pevné fázi. Popsaný koncept syntézy na pevné fázi umožňuje efektivní přípravu daných derivátů a jejich následné použití pro io jednoduché navázání sloučenin obsahujících ve své struktuře reaktivní aminoskupinu. Takto derivatizované látky mohou být po odštěpení z pevné fáze použity pro zachycení na stacionární fázi pokryté avidinem. Komplex vzniklý specifickou vazbou avidin-biotin případně streptavidinbiotin je pak metodou afínitní chromatografie využíván především ve farmaceutickém výzkumu při identifikaci molekulárních cílů potenciálních léčiv.

Dosavadní stav techniky

Derivatizace biologicky aktivních sloučenin molekulou biotinu je známý prostředek pro jejich studium za účelem identifikace enzymů, s kterými dané sloučeniny interagují, což výrazně přispívá ke zjištění mechanismus účinku těchto látek v buněčném systému. Biotinylované deriváty lze snadno imobilizovat metodou nekovalentní biospecifícké interakce na chromatografícké koloně vybavené stacionární fází pokrytou avidinem/streptavidinem. Při následném použití mobilní fáze obsahující buněčný lyzát dochází k zachycení cílových enzymů na koloně, jejich následné eluci a identifikaci. Tento druh separační metody se nazývá afínitní chromatografie a patří mezi nej frekventovanější metody studia molekulárních cílů nových typů biologicky aktivních sloučenin (tj. potenciálních léčiv).

Za nejvhodnější typ derivátů biotinu používaných pro modifikaci látek za účelem jejich studia afínitní chromatografií jsou považovány deriváty obecné struktury 1, kde lineární řetězec (tzv. raménko) sestávající se z různého počtu ethylenoxy jednotek je na jednom konci derivatizován biotinem, přičemž druhý konec řetězce je zakončen vhodnou funkční skupinou umožňující derivatizaci příslušné látky. Vhodný počet ethylenoxy jednotek (tj. délka raménka) není přesně definován, neboť se jedná o proměnlivou veličinu závislou na způsobu interakce mezi studovanou látkou a cílovým enzymem.

X-NH,O

Y - COOH, NH_Z OH, OSO₃Me, OSO₃Ph... (1)

Pro derivatizaci látek obsahujících ve své struktuře reaktivní aminoskupinu jsou v literatuře nej40 častěji popisovány deriváty 1 (nebo jejich analoga s alternativní strukturou raménka) obsahující terminální karboxylovou skupinu. Níže jsou uvedeny některé příklady takových derivátů.

V literatuře je hojně popsána příprava a použití derivátů 2 pomocí syntézy v roztoku. Některé z těchto derivátů jsou i komerčně dostupné.

- 1 CZ 302669 B6

Znázorněný typ raménka (tj. pouze na bázi uhlíkatého skeletu) však není považován pro účely afinitní chromatografie za zcela vhodný z důvodů jeho efektivního zkrácení způsobeného hydrofobními interakcemi methylenových skupin a nebude mu proto zde věnována další pozornost. Uvedeny budou pouze některé konkrétní příklady derivátů sraménkem na bázi ethy len oxy jednotek nebo deriváty s raménky podobné struktury, která jsou prostá hydrofobních interakcí ajsou obecně považována z pohledu struktury za optimální.

V literatuře je např. popsána příprava derivátu 3 v roztoku a jeho následné použití pro studium glykokonjugátů (McReynoIds, Katherine D.; Hadd, Michael J.; Garvay-Hague, Jacquelyn, Bioconjugate Chemistry 1999, 10(6), 1021 až 1031).

Popsána je také syntéza derivátu 4 v roztoku a jeho použití pro studium protein-fosfoinositid vazebných interakcí (Gong, Denghuang; Smith, Matthew D.; Manna, Debasis; Bostic, Heidi E.; Cho, Wonhwa; Best, Michael D, Bioconjugate Chemistry 2009,20(2), 310 až 316).

Derivát 5 s raménkem obsahujícím disulfidickou vazbu byl připraven syntézou v roztoku pomocí biotinu, ethylendíaminu a merkaptoethanolu ve výtěžku 72 % a použit pro studium β-laktamáz. (Marchand-Brynaert, Jacqueline; Bouchet, Michele; Touillaux, Roland; Beauve, Cecile; Fastrez, Jacques, Tetrahedron 1996, 52(15), 5591 až 606).

-2CZ 302669 B6

Popsána je rovněž syntéza derivátu 6 s raménkem obsahujícím dvě ethylenoxy jednotky a další jednotku na bázi amidu. Derivát byl použit pro studium interakcí proteinů (Trester-Zedlitz, Michelle; Kamada, Katsuhiko; Burley, Stephen K.; Fenyoe, David; Chait, Brian T.; Muir, Tom

Kromě derivátů s karboxy lovou skupinou je v literatuře popsána např. i struktura sloučeniny 7 s terminálním reaktivním methansulionovým esterem, který je rovněž vhodný pro derivatizaci io amínosloučenin. Příprava derivátu 7 však není popsána, látka je sice komerčně dostupná, avšak pouze v miligramovém množství.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 8

kde n představuje počet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1 až 5, symbol Pol představuje polystyrénovou pryskyřici tvořenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu a symbol R představuje methyl, 4_methylfenyl, trifluormethyl skupinu.

Podstatou vynálezu je dále příprava daných derivátů pomocí syntézy na pevné fázi, přičemž tato syntéza zahrnuje následující kroky (viz Schéma 1):

• imobilizaci 2-(2-aminoethoxy)ethanolu pomocí reduktivní aminace na polymemí pryskyřici obsahující navázaný 4-oxy-2-methoxybenzaldehyd za vzniku derivátu 9 · Acylací derivátu 2-(2-aminoethoxy)ethanolu 9 biotinem za vzniku sloučeniny 10

-3 CZ 302669 B6 • Esterifikaci hydroxyskupiny ve sloučenině 10 pomocí chloridu kyseliny methansulfonové, /7-toluensulfonové nebo triťluormethansulfonanhydridem za vzniku sloučeniny 8a • Reakci esteru sulfonové kyseliny 8a s alkalickými solemi diethylenglykolu, triethylenglykolu nebo tetraethylenglykolu za vzniku sloučeniny 11 · Esterifikaci hydroxyskupiny ve sloučenině 11 působením methansulfonylchloridu,p-toluensulfonylchloridu nebo trifluormethansulfonanhydridu za vzniku sloučenin 8b až 9.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob použití derivátů 8a až 8d, kdy sloučeniny typu 8 jsou podrobeny reakci se sloučeninou obsahující primární nebo sekundární aminoskupinu za vzniku io látek 12 a následně působením kyseliny trifluoroctové je odštěpen polymer za vzniku sloučenin

13.

Syntéza na pevné fázi ve srovnání se syntézou v roztoku obecně poskytuje řadu výhod. Mezi největší výhody patří především jednoduché instrumentální vybavení a jednoduché experimeni5 tální provedení syntézy, dále snadná příprava malých množství látek (i při mnohastupňových syntézách) a zejména velmi jednoduché izolace produktů syntézy. Zvláště poslední dvě jmenované výhody mají zásadní význam pro použití syntézy na pevné fázi pro účel popsaný ve vynálezu, neboť biotinylované látky pro studium afinitní chromatografií je často potřeba syntetizovat v omezeném množství, přičemž vlivem nepříznivých vlastností produktů může docházet ke znač2o ným ztrátám a obtížím při jejich izolaci.

To, že biotiny lační jednotka je i mobilizovaná na pevné fázi, tedy přináší výhody především v jednoduché a rychlé přípravě, snadné manipulaci s připravenými systémy a jednoduché finální izolaci cílových produktů. Vzhledem k tomu, že pouze některé typy biotinylačních jednotek pro derivatizaci látek v roztoku jsou komerčně dostupné, a to většinou v malém množství za nepříznivou cenu, představuje popsaný vynález efektivní způsob alternativního řešení dané problematiky.

V neposlední řadě je výhodou popsané metodiky její variabilita. Volbou reaktantů lze měnit ste30 rické parametry cílových derivátů, tj. délku raménka, která může při provedení afinitní chromatografie značným způsobem ovlivňovat kvalitu interakce mezi studovanou látkou a cílovým enzymem. Jednoduchým způsobem tedy lze připravit a kombinovat jednotlivé typy biotinylačních jednotek.

Popsaný koncept syntézy na pevné fázi, který přináší výše uvedené praktické výhody jak při vlastní přípravě, tak pri použití derivátů 8a až 8d, nebyl dosud v literatuře popsán.

-4CZ 302669 B6

Pol

0)

Pel

Pd o

(10)

OH

V»

V*O (D) »

I

Pd («·)

H* /

Pd <h^-+.

J- (U)

Pd

OH □ ti

Y (U)

Pd

K

Λ p- (8bažd) ⁰ J* Ó

Schéma 1

Příklady provedení vynálezu

Podstata přípravy a použití derivátů podle vynálezu je blíže objasněna v následujících příkladech. Tyto příklady mají pouze ilustrativní charakter a v žádném případě neomezují rozsah vynálezu. Postup přípravy derivátů 8:

Příklad 1

Příprava {mobilizovaného derivátu 8a (n - 1)

UJ vr y_N^_o~^o%

L/

Pol

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém ΧΎ-dimethylformamidu (DMF) (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2-aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1,5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3x DMF a 3x dichlormethanem (DCM). Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsa25 hující 1 mmol 1-hydroxybenzotriazolu (BtOH), 1 mmol ΛζΎ'-diisopropylkarbodiimidu (DíC) a l mmol biotinu přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x DMF a 3x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml)

-5CZ 302669 Β6 dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x suchým DMF, 3x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu:

Vzhledem ktomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení zpěvné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizací modelovým aminem. 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku piperidínu v DMF (1 ml) přes noc za teploty místnosti, pak byla pryskyřice promyta 3x DMF, 3x DCM a třepána v 50% roztoku kyseliny trifluoroctové (TFA) v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UVMS, přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS m/z = 399,6, [M+H]⁺; čistota 97 %.

Příklad 2

Příprava i mobilizovaného derivátu 8b (n = 3)

Pol

300 mg Aminomethylové piyskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém (DMF) (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-{2-aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1,5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidínu v DMF (3 ml), promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC a 1 mmol biotinu přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x DMF a 3x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x suchým DMF. Obdržená pryskyřice byla suspendována v IM roztoku diethylenglykolátu lithného v DMSO (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu BuLi a diethylenglykolu za teploty místnosti), třepána pres noc za teploty místnosti, poté promyta, 3x DMF, třepána 10 minut s 20% roztokem kyseliny octové v DMF, promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x suchým DMF, 3x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu:

Vzhledem ktomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení zpěvné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizací modelovým aminem. 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku piperidínu v DMF (1 ml) 120 min přes noc, pak byla pryskyřice promyta 3x DMF, 3x DCM a třepána v 50% roztoku TFA v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS m/z= 500,7, [M+H]⁺; čistota 95 %.

Příklad 3

Příprava imobilizovaného derivátu 8c (n = 4)

-6CZ 302669 B6

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém DMF (3 ml) obsahujícího l mmol

2-(2-aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1,5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC a ίο 1 mmol biotinu přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x DMF a 3x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x suchým DMF. Obdržená pryskyřice byla suspendována v ÍM roztoku triethylenglykolátu lithného v DMSO (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu BuLi a triethylenglykolu za teploty místnosti), třepána přes noc za teploty místnosti, poté promyta, 3x DMF, třepána 10 minut s 20% roztokem kyseliny octové v DMF, promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x suchým DMF, 3x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu:

Vzhledem k tomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení z pevné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizaci modelovým aminem. 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku piperidinu v DMF (1 ml) 120 min za teploty místnosti, pak byla pryskyřice pro25 myta 3x DMF, 3x DCM a třepána v 50% roztoku TFA v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS m/z = 531,7, [M+H]⁺; čistota 94 %.

Příklad 4

Příprava imobilizovaného derivátu 8d (n = 5)

Pol

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém (DMF) (3 ml) obsahujícího I mmol 2-(2-aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1,5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC a I mmol biotinu přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x DMF a 3x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3x suchým DMF. Obdržená pryskyřice byla sus-7CZ 302669 B6 pendovária v 2M roztoku tetraethylenglykolátu sodného v DMSO (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu NaH a tetraethylenglykolu za teploty místnosti), třepána přes noc za teploty místnosti, poté promyta, 3x DMF, třepána i 0 minut s 20% roztokem kyseliny octové v DMF, promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansu Ifonylch loridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x suchým DMF, 3x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu:

Vzhledem k tomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení z pevné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizaci modelovým aminem. 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku piperidinu v DMF (I ml) 120 min za teploty místnosti, pak byla pryskyřice promyta 3x DMF, 3x DCM a třepána v 50% roztoku TFA v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS m/z = 575,8, [M+H]\ čistota 93 %.

Příklad 5

Postup použití derivátu 8:

Obecný postup derivatizace aminoderivátů použitím i mobilizovaných derivátů 8:

250 mg Výchozí aminomethylové pryskyřice bylo podrobeno syntéze derivátu 8 dle výše uvedených postupů. Výsledná pryskyřice byla třepána s roztokem 1 mmol příslušného aminoderivátů ve DMSO (2,5 ml) přes noc za teploty místnosti. Obdržená pryskyřice byla promyta 3x DMF, 3x DCM a poté třepána v 50% roztoku TFA v DCM (2,5 ml). Poté byla pryskyřice odfiltrována, filtrát odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek sonifikován v diethyletheru. Vysrážená pevná látka byla odsáta a promyta diethyletherem. V případě, že vzhledem k rozpustnosti látky nebylo možné produkt vysrážet diethyletherem, byl odpařen rozpuštěn v chloroformu (5 ml) a protřepán s 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 ml). Organická vrstva byla oddělena, vysušena síranem sodným a zahuštěna dosucha. V obou případech se výtěžky pohybují v rozmezí 60 až 90 % teorie.

-8CZ 302669 B6

Příklady použiti

Studovaný aminoderivát	Biotinylační jedntoka	Sloučenina 13 (HPLC-UV-MS)	Sloučenina 13 Čistota (%) (HPLC-UV-MS)
Propy lamin	8a	417,6	93
Benzy lamin	8a	465,6	92
Aminopropanol	8a	433,6	94
Propylamin	8b	461,7	96
Benzylamin	8b	509,7	95
Aminopropanol	8b	477,6	95
Propylamin	8c	505,6	97
Benzylamin	8c	553,7	95
Aminopropanol	8c	521,6	93
Propylamin	8d	549,7	92
Benzylamin	8d	597,7	91
Aminopropanol	8d	565,7	90

Struktura vybraných derivátů 13 byla potvrzena pomocí ’H a ⁿC NMR spektroskopie.

Průmyslová využitelnost io Imobilizované deriváty obecného vzorce 8 jsou vhodné pro efektivní derivatizaci sloučenin obsahujících ve své struktuře reaktivní aminoskupinu a mohou tak sloužit k rutinní derivatizaci takových sloučenin a následnému studiu vzniklého systému pomocí afinitní chromatografie. To je využitelné zejména ve farmaceutickém výzkumu při určování molekulárního cíle biologicky aktivních látek.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY kde n představuje počet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1 až 5, symbol Pol představuje polystyrénovou pryskyřici tvořenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu a symbol R představuje methyl, 4-methyl fenyl, trifluormethyl skupinu.
2. Způsob přípravy derivátů podle nároku 1, vyznačující se tím, že se sloučeniny vzorce 8a až 8d připravují pomocí syntézy na pevné fázi, která zahrnuje následující kroky:

• I mobil izaci 2-{2-aminoethoxy)ethanolu pomocí reduktivní aminace na polymemí pryskyřici obsahující navázaný 4-oxy-2-methoxybenzaldehyd za vzniku derivátu 9

Pol k Η ζ^χΟΗ (9)

Acylaci derivátu 2-(2-aminoethoxy)ethanolu 9 biotinem za vzniku sloučeniny 10 • Esterifikaci hydroxyskupiny ve sloučenině 10 pomocí chloridu kyseliny methansulfonové, p-toluensulfonové nebo trifluormethansulfonanhydridem za vzniku sloučeniny 8a (8a)

9. R o

L /

Pol • Reakci esteru sulfonové kyseliny 8a s alkalickými solemi diethylenglykolu, triethyienglykolu nebo tetraethy lenglykolu za vzniku sloučeniny 11 • Esterifikaci hydroxyskupiny ve sloučenině 11 působením methansulfonylchloridu,/?-toIuensulfonylchloridu nebo trifluormethansulfonanhydridu za vzniku sloučenin 8b až 8d

- 10CZ 302669 B6

Pd (8b až 9)
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, žese sloučeniny vzorce 8a až 8d 5 podrobí reakci se sloučeninou obsahující primární nebo sekundární aminoskupinu za vzniku sloučeniny 12 a následně působením kyseliny trifluoroctové se odštěpí polymer za vzniku sloučenin 13.