PL193447B1 - Kompozycja interferonu, kompozycja farmaceutycznainterferonu oraz sposób stabilizowania kompozycjiinterferonu - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja interferonu, zawarta w pojemniku, znamienna tym, ze jest ciek la i (1) za- wiera aminokwasowy czynnik stabilizuj acy, wybrany z grupy obejmuj acej kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, arginin e i glicyn e, przy czym aminokwasowy czynnik stabilizuj acy jest obec- ny w ilo sci 0,3%-5% wag./obj et.; (2) kompozycja nie zosta la ukonstytuowana ponownie z liofili- zowanego interferonu i (3) kompozycja dalej nie jest liofilizowana, przy czym pojemnik charaktery- zuje si e tym, ze co najmniej jedna jego powierzchnia b ed aca w kontakcie z ciek la kompozycj a jest powleczona materia lem oboj etnym wobec interferonu. 30. Kompozycja farmaceutyczna interferonu, zawarta w pojemniku, znamienna tym, ze jest ciek la i (1) zawiera (a) bufor octanowy i (b) arginin e, przy czym kompozycja ma pH 4,0 do 6,0; i (2) kompozycja farmaceutyczna nie obejmuje albuminy surowiczej, przy czym pojemnik charakteryzu- je si e tym, ze ma co najmniej jedn a powierzchni e b ed ac a w kontakcie z ciek la kompozycj a powle- czon a materia lem oboj etnym wobec interferonu, wybranym z grupy obejmuj acej silikon i politetra- fluoroetylen. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja interferonu, kompozycja farmaceutyczna interferonu oraz sposób stabilizowania kompozycji interferonu. W szczególności, wynalazek dotyczy sposobu stabilizowania ludzkiego interferonu-β i trwałych ciekłych formulacji interferonu-β.

Interferony są białkami o różnych aktywnościach biologicznych, między innymi przeciwwirusowych, immunomodulacyjnych i antyproliferacyjnych. Są to stosunkowo małe, swoiste gatunkowo, jednołańcuchowe polipeptydy, wytwarzane przez komórki ssaków w odpowiedzi na ekspozycję na różne induktory, takie jak wirusy, polipeptydy, mitogeny itp. Interferony chronią tkanki i komórki ssaków przed atakiem wirusów i stanowią ważny mechanizm obronny gospodarza. W większości przypadków interferony dają lepszą ochronę tkankom i komórkom tego rodzaju organizmu, z którego zostały wytworzone niż innym typom tkanek i komórek, co wskazuje, że interferon ludzki powinien być bardziej skuteczny w leczeniu chorób ludzi niż interferony z innych gatunków.

Istnieje kilka różnych typów interferonów, generalnie klasyfikowanych jako leukocytowy (interferon-α), fibroblastowy (interferon-β) i odpornościowy (interferon γ) i duża liczba ich wariantów. Ogólne omówienie interferonów można znaleźć w różnych tekstach i monografiach, w tym w „The Interferon System” (W. E. Stewart, II, Springer-Verlag, N. Y. 1979); i „Interferon Therapy” (World Health Organization Technical Reports Seria 676, World Health Organization, Genewa, 1982) powołane tu jako stan techniki.

Sposób podawania interferonu jest ważnym czynnikiem w klinicznym stosowaniu tego ważnego środka terapeutycznego.

Najczęściej z powodzeniem stosowano systemowe podawanie interferonu, przez dożylne, domięśniowe lub podskórne iniekcje w leczeniu takich chorób jak białaczka kosmatokomorkowa, nabyty zespół upośledzenia odporności (AIDS) i związany z nim mięsak Kaposiego. Wiadomo jednak, że białka w oczyszczonej formie są szczególnie podatne na degradację. W przypadku interferonu-β główny mechanizm degradacji interferonu w roztworze obejmuje agregację i deamidację. Brak trwałości interferonu w roztworach i w innych produktach ogranicza zatem jego użyteczność.

Kompozycje farmaceutyczne interferonu do stosowania klinicznego zwykle zawierają interferon w postaci preparatu liofilizowanego (tj. suszonego rozpyłowo) w kombinacji ze złożonymi organicznymi substancjami pomocniczymi i stabilizatorami, takimi jak niejonowe środki powierzchniowo czynne (tj. surfaktanty), różne cukry, organiczne poliole i/lub ludzka albumina surowicza.

Przykładowo, dokument WO 88/09674 ujawnia stabilizowane preparaty interferonu-γ, w postaciach zamrożonej i liofilizowanej, z kwasem laktobionowym w buforze octan/glicyna.

Opis patentowy US 4 496 537 dotyczy liofilizowanych preparatów interferonu-α zawierających glicynę, która jest dodawana przed liofilizacją, jako metoda zwiększania stabilności liofilizowanego interferonu. Preparaty te zawierają ewentualnie także ludzką albuminę surowiczą.

Opis patentowy EP 284 249 ujawnia stabilne, liofilizowane kompozycje limfokiny, zawierające limfokinę, środek wypełniający, stabilizator, np. glicynę i alaninę, środek dyspergujący, środek izotoniczny i bufor.

Opis patentowy EP 163 111 dotyczy sposobu zwiększania rozpuszczalności liofilizowanego interferonu w wodzie (przed liofilizacją lub podczas rekonstrukcji) z zastosowaniem określonych aminokwasów i ich soli.

Liofilizowane preparaty mają tę wadę, że wymagają skomplikowanego pakowania, ponieważ oddzielnie trzeba dostarczyć jałową wodę do iniekcji. Ponadto, liofilizowane preparaty wymagają kilku czynności przed użyciem, co zwiększa możliwość przyklejenia się do igły i stracenia składników podczas przygotowania do iniekcji. Te manipulacje szczególnie stanowią problem dla pacjentów cierpiących na słabość mięśni i słabą koordynację, jak ludzie ze stwardnieniem rozsianym (MS). Pacjenci z MS mogą sami sobie podawać interferony, w związku z czym dostępność takiej postaci użytkowej, która jest znacznie łatwiejsza do podawania niż obecne na rynku produkty liofilizowane jest bardzo cenna dla tej populacji pacjentów.

Bardzo potrzebne są zatem proste, ciekłe formulacje interferonu, aby uniknąć rekonstytucji, która jest konieczna przy stosowaniu preparatów liofilizowanych.

Ciekłe, nieliofilizowane formulacje zawierające interferony, mogą także zawierać złożone nośniki, takie jak ludzka albumina surowicza, poliole, cukry i anionowe powierzchniowo czynne środki stabilizujące, patrz np. WO 89/10756 (Hara i in. - zawierające poliol i p-hydroksybenzoesan).

PL 193 447 B1

Przedmiotowy wynalazek rozwiązuje powyższe problemy przez stwierdzenie, że ludzki interferon-β można stabilizować umieszczając go w buforowanych roztworach o pH w zakresie około 4 i 7,2, które zawierają jako czynnik stabilizujący aminokwas, a w pewnych przypadkach jego sól (jeśli aminokwas nie zawiera bocznego łańcucha z ładunkiem). Interferon-β nie jest liofilizowany, ale po uzyskaniu go ze źródła, znanymi specjaliście metodami jest od razu wprowadzany do formulacji według wynalazku.

Kompozycja interferonu, zawarta w pojemniku, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że jest ciekła i (1) zawiera aminokwasowy czynnik stabilizujący, wybrany z grupy obejmującej kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, argininę i glicynę, przy czym aminokwasowy czynnik stabilizujący jest obecny w ilości 0,3%-5% wag./objęt.; (2) kompozycja nie została ukonstytuowana ponownie z liofilizowanego interferonu i (3) kompozycja dalej nie jest liofilizowana, przy czym pojemnik charakteryzuje się tym, że co najmniej jedna jego powierzchnia będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest powleczona materiałem obojętnym wobec interferonu.

Korzystnie, aminokwasowy czynnik stabilizujący jest wybrany z argininy i glicyny, przy czym ciekła kompozycja nie obejmuje albuminy surowiczej.

Korzystnie, interferonem jest interferon-β lub interferon wytworzony metodą rekombinacji.

Korzystnie, kompozycja ma pH w zakresie od 4,0 do 7,2.

Bardziej korzystnie, kompozycja ma pH w zakresie 4,8 do 5,2.

Najkorzystniej, kompozycja ma pH 5,0.

Najkorzystniej, aminokwasowym czynnikiem stabilizującym jest kwas glutaminowy.

Korzystnie, argininą jest chlorowodorek argininy.

Korzystnie, stężenie interferonu jest w zakresie od 6 MIU do 50 MIU.

Korzystnie, stężenie interferonu jest w zakresie od 6 MIU do 50 MIU na dawkę.

Korzystnie, wymieniona co najmniej jedna powierzchnia pojemnika jest pokryta materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

Korzystniej, pojemnikiem jest strzykawka.

Korzystnie, kompozycja ponadto zawiera bufor o pH 5,0, przy czym interferon stanowi interferon-β, a aminokwasowy czynnik stabilizujący stanowi 170 mM kwas L-glutaminowy.

Korzystnie, kompozycja zawiera dodatkowo sól, a aminokwasowy czynnik stabilizujący stanowi glicynę.

Korzystniej, kompozycja zawiera dodatkowo co najmniej jeden składnik wybrany z grupy składającej się z 15 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej i 0,1% (wag./obj.) surfaktanta, stanowiącego dwufunkcyjny kopolimer blokowy kończący się pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi (Pluronic F 68).

Korzystnie, kompozycja dodatkowo zawiera 20 mM buforu fosforanowego o pH 7,2, przy czym interferon stanowi interferon-β, a czynnik stabilizujący jest wybrany z grupy składającej się z: (a) 140 mM argininy i (b) 100 mM chlorku sodu łącznie z 70 mM glicyny.

Korzystniej, co najmniej jedna powierzchnia pojemnika będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest powleczona materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

Najkorzystniej, pojemnikiem jest strzykawka.

Korzystnie, kompozycja dodatkowo zawiera bufor utrzymujący pH w zakresie 4,0 do 6,0, przy czym ciekła kompozycja jest odpowiednia do pozajelitowego podawania ssakom, a materiał obojętny wobec interferonu jest wybrany z grupy obejmującej silikon i politetrafluoroetylen, zaś interferon stanowi interferon-β.

Korzystniej, w naczyniu do przechowywania nie ma granicy faz między gazem zawierającym tlen i cieczą.

Korzystniej, interferon-β nie był poddany kawitacji wcześniej ani podczas przechowywania w naczyniu.

Korzystniej, buforem jest organiczny bufor kwasowy wybrany z grupy składającej się z buforu cytrynianowego, bursztynianowego, winowego, fumaranowego, glukonianowego, szczawianowego, mleczanowego i octanowego.

Korzystniej, pH kompozycji jest w zakresie 4,5 do 5,5.

Najkorzystniej, pH kompozycji pH wynosi 5,0.

Korzystniej, kompozycja jest jałowa.

Korzystniej, kompozycja jest izotoniczna z krwią.

Korzystniej, interferon-β jest ludzkim rekombinantowym interferonem-β.

Korzystniej, aktywność ludzkiego rekombinantowego interferonu-β jest w zakresie 6 do 50 MIU.

PL 193 447 B1

Korzystnie, kompozycja zawiera aminokwasowy czynnik stabilizujący w ilości 0,3% do 3,13% wag./obj et., przy czym ciekła kompozycja jest zamrożona.

Kompozycja farmaceutyczna interferonu, zawarta w pojemniku, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że jest ciekła i (1) zawiera (a) bufor octanowy i (b) argininę, przy czym kompozycja ma pH 4,0 do 6,0; i (2) kompozycja farmaceutyczna nie obejmuje albuminy surowiczej, przy czym pojemnik charakteryzuje się tym, że ma co najmniej jedną powierzchnię będącą w kontakcie z ciekłą kompozycją powleczoną materiałem obojętnym wobec interferonu, wybranym z grupy obejmującej silikon i politetrafluoroetylen.

Korzystnie, argininę stanowi chlorowodorek argininy.

Korzystnie, interferonem jest interferon-β.

Korzystnie, interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU.

Korzystniej, interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU na dawkę.

Korzystnie, bufor octanowy jest obecny w stężeniu 20 mM.

Korzystnie, arginina lub chlorowodorek argininy jest obecny w stężeniu 0,3% do 5% wag./objęt.

Korzystnie, kompozycja dodatkowo zawiera surfaktant.

Korzystniej, surfaktant stanowi 0,1% wag./objęt. surfaktanta, stanowiącego dwufunkcyjny kopolimer blokowy kończący się pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi (Pluronic F 68).

Korzystnie, ciekła kompozycja ma rozpuszczony tlen, którego poziom jest niższy niż 30% poziomów równowagi atmosferycznej.

Korzystniej, kompozycja ma rozpuszczony tlen, którego poziom jest niższy lub równy 10% poziomów równowagi atmosferycznej.

Sposób stabilizowania kompozycji interferonu, zawartej w pojemniku, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że kompozycja jest ciekła, a sposób obejmuje (1) wytworzenie ciekłej kompozycji przez zmieszanie: a) interferonu, który nie został ukonstytuowany ponownie z liofilizowanego interferonu, b) buforu i c) aminokwasowego czynnika stabilizującego, wybranego z grupy obejmującej kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, argininę i glicynę, przy czym aminokwasowy czynnik stabilizujący jest obecny w stężeniu 0,3%-5% wag./obj et., a ciekła kompozycja dalej nie jest liofilizowana i (2) umieszczenie ciekłej kompozycji w pojemniku, którego co najmniej jedna powierzchnia będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest powleczona materiałem obojętnym wobec interferonu.

Korzystnie, aminokwasowy czynnik stabilizujący jest wybrany z argininy i glicyny, przy czym sposób nie obejmuje domieszania albuminy surowiczej.

Korzystnie, interferon-β nie był poddany kawitacji wcześniej ani podczas przechowywania w pojemniku.

Korzystnie, interferonem jest interferon-β lub interferon wytworzony metodą rekombinacji.

Korzystnie, bufor ma pH w zakresie od 4,0 do 7,2.

Korzystniej, bufor ma pH w zakresie 4,8 do 5,2.

Najkorzystniej, bufor ma pH 5,0.

Korzystnie, argininą jest chlorowodorek argininy.

Korzystnie, stężenie interferonu jest w zakresie od 6 MIU do 50 MIU.

Korzystnie, co najmniej jedna powierzchnia pojemnika jest pokryta materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

Najkorzystniej, pojemnikiem jest strzykawka.

Korzystnie, kompozycja dodatkowo zawiera 20 mM buforu fosforanowego o pH 7,2, a czynnik stabilizujący jest wybrany z grupy składającej się z: (a) 140 mM argininy i (b) 100 mM chlorku sodu łącznie z 70 mM glicyny.

Korzystniej, co najmniej jedna powierzchnia pojemnika, będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją farmaceutyczną, jest powleczona materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

Najkorzystniej, pojemnikiem jest strzykawka.

Sposób stabilizowania kompozycji interferonu-β, zawartej w pojemniku, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się również tym, że kompozycja jest ciekła, a sposób obejmuje (1) wytworzenie ciekłej kompozycji przez zmieszanie: a) interferonu-β, który nie został ukonstytuowany ponownie z liofilizowanego interferonu, b) buforu octanowego i c) argininy, przy czym ciekła kompozycja farmaceutyczna ma pH 4,0 do 7,2, a ciekła kompozycja dalej nie jest liofilizowana i (2) umieszczenie ciekłej kompozycji w pojemniku, którego co najmniej jedna powierzchnia będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest

PL 193 447 B1 powleczona materiałem sprawiającym, że powierzchnia, chemicznie lub fizycznie jest obojętna na adsorpcję interferonu.

Korzystnie, argininę stanowi chlorowodorek argininy.

Korzystnie, interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU.

Korzystniej, interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU na dawkę.

Korzystnie, bufor octanowy jest obecny w stężeniu 20 mM.

Korzystnie, arginina lub chlorowodorek argininy jest obecny w stężeniu 0,3% do 5% wag./objęt. Korzystnie, sposób dodatkowo obejmuje domieszanie surfaktanta.

Korzystniej, surfaktant stanowi 0,1% wag./objęt. surfaktanta, będącego dwufunkcyjnym kopolimerem blokowym kończącym się pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi (Pluronic F 68).

Korzystnie, sposób nie obejmuje domieszania albuminy surowiczej.

Korzystnie, interferon-β nie był poddany kawitacji wcześniej ani podczas przechowywania w pojemniku.

Korzystnie, między ciekłą kompozycją farmaceutyczną i pojemnikiem nie ma zawierającej tlen ciekłej granicy faz.

Korzystnie, interferonem w kompozycji jest interferon-β.

Inne korzystne formulacje według wynalazku obejmują:

(1) 20 mM buforu octanowego o pH 5,0, który nie był wcześniej liofilizowany, w którym znajduje się interferon-β + składniki wybrane spośród (a) 150 mM chlorowodorku argininy; (b) 100 mM chlorku sodu i 70 mM glicyny; (c) 150 mM chlorowodorku argininy i 15 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej; (d) 150 mM chlorowodorku argininy i 0,1% Pluronic F-68; (e) 140 mM chlorku sodu; (f) 140 mM chlorku sodu i 15 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej i (g) 140 mM chlorku sodu i 0,1% Pluronic F-68;

(2) ciecz o pH 5,0, która zawiera interferon-β, 170 mM kwasu L-glutaminowego i 150 mM wodorotlenku sodu, przy czym ciecz nie była wcześniej zliofilizowana;

(3) 20 mM buforu fosforanowego o pH 7,2, który nie był wcześniej zliofilizowany, w którym znajduje się interferon-β + składniki wybrane spośród: (a) 140 mM chlorowodorku argininy i (b) 100 mM chlorku sodu i 70 mM glicyny.

Zestaw do pozajelitowego podawania ciekłej formulacji interferonu obejmuje naczynie zawierające ciekłą formulacje o pH w zakresie 4-6, obejmującą farmaceutycznie skuteczną ilość interferonu-β, który nie był wcześniej zliofilizowany i aminokwasowy czynnik stabilizujący w ilości około 5% wag. lub mniej oraz instrukcję użycia.

Kompozycja jest umieszczona w naczyniu do przechowywania, takim jak strzykawka. Korzystnie, w naczyniu tym ciecz nie kontaktuje się z gazem zawierającym tlen (tzn. podczas przygotowywania i przechowywania roztwór interferonu nie jest wystawiony na działanie gazu zawierającego tlen). Interferon-β zasadniczo utrzymuje aktywność przeciwwirusową podczas przechowywania w temperaturze w zakresie około 2-25°C przez co najmniej 3 miesiące.

Sposób stabilizowania interferonu-β w ciekłych kompozycjach farmaceutycznych, zgodny z wynalazkiem, pozwala na utrzymanie stabilności fizycznej interferonu podczas przechowywania w temperaturze około 2-25°C przez co najmniej 3 miesiące, obejmuje zmieszanie: (a) skutecznej ilości interferonu-β; (b) buforu utrzymującego pH w zakresie 4,0-7,2 przy odpowiedniej sile jonowej i (c) aminokwasowego czynnika stabilizującego, przy czym ciecz nie była wcześniej zliofilizowana i nie jest poddana działaniu gazu zawierającego tlen podczas przygotowywania i przechowywania.

Ciekłe formulacje według wynalazku mają wiele zalet w porównaniu z liofilizowanymi formulacjami. Zalety te obejmują: (i) mają mniejszą objętość iniekcji, która daje mniejszy dyskomfort niż większa objętość; (ii) zastąpienie złożonych substancji pomocniczych prostymi aminokwasami, co umożliwia dokładniejszą kontrolę jakości gotowego produktu; (iii) pakowanie jest znacznie uproszczone, ponieważ nie jest potrzebne oddzielne dostarczanie wody do iniekcji (WFI) i oddzielna strzykawka i fiolka; (iv) można poprawić dokładność dozowania dzięki mniejszej liczbie operacji przenoszenia cieczy i (v) lepsze jest zabezpieczenie produktu, ponieważ prostsze podawanie zmniejsza szansę przebicia igłą i straty składników podczas przygotowywania do iniekcji.

Zatem, celem wynalazku jest dostarczenie biologicznie aktywnej, trwałej ciekłej formulacji interferonu-β do stosowania na drodze iniekcji.

Innym celem wynalazku jest dostarczenie formulacji, która nie wymaga wcześniejszego liofilizowania kompozycji interferonu-β.

Celem wynalazku jest także zabezpieczenie przed utratą stabilności ciekłej formulacji interferonu-β przez: (a) unikanie kawitacji i/lub powstawania pustej przestrzeni nad cieczą podczas przygoto6

PL 193 447 B1 wywania ciekłej kompozycji lub (b) przechowywanie ciekłej formulacji w takich warunkach, aby pusta przestrzeń nad cieczą wypełniana była gazem obojętnym, takim jak argon lub azot.

Jeszcze innym celem wynalazku jest dostarczenie ciekłej formulacji, którą można przechowywać przez dłuższy czas w stanie ciekłem ułatwiającym przechowywanie i przenoszenie jej przed podawaniem. Innym celem jest dostarczenie ciekłej formulacji, którą łatwo wytwarza się i podaje z wyeliminowaniem etapów liofilizacji i rekonstytucji.

Dalszym celem wynalazku jest zastosowanie prostych aminokwasów jako alternatywnych stabilizatorów, oprócz powszechnie stosowanej albuminy surowiczej, co ułatwia ocenę jakości produktu.

Jeszcze innym celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji farmaceutycznej zawierającej nieliofilizowany interferon-β, którą można wytworzyć przy mniejszych kosztach.

Inne zalety wynalazku są częściowo przedstawione dalej w opisie, a częściowo będą wynikać z tego opisu lub z praktycznych jego wykonań. Załączone rysunki ilustrują i wraz z opisem służą do objaśnienia zasady wynalazku.

Krótki opis figur

Na figurze 1 przedstawiony jest wykres procentowej zawartości monomeru interferonu-β pozostałej w cieczy w funkcji procentowej zawartości tlenu rozpuszczonego w cieczy.

Na figurze 2 przedstawiony jest wykres procentowego stężenia białka normalizowanego wobec materiału wyjściowego w funkcji czasu dla ciekłej formulacji BG9589-1. Próbki oznakowane „4°C” (zaciemnione kwadraty) inkubowane są w temperaturze 2-8°C. Inne próbki inkubowano w 25°C (zaciemnione kółka); 33°C (zaciemnione trójkąty) i 40°C (zaciemnione romby).

Na figurze 3 przedstawiony jest wykres procentowego stężenia białka normalizowanego wobec materiału wyjściowego w funkcji czasu dla ciekłej formulacji BG-9589-3. Próbki oznakowane „4°C” (zaciemnione kwadraty) inkubowane są w temperaturze 2-8°C. Inne próbki inkubowano w 25°C (zaciemnione kółka); 33°C (zaciemnione trójkąty) i 40°C (zaciemnione romby).

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek pozwala na uniknięcie problemów i wad związanych ze znanymi strategiami i projektami i dostarcza prostej metody stabilizowania interferonu i prostej formulacji interferonu o podwyższonej stabilności podczas przechowywania. Wynalazek jest oparty częściowo na naszym odkryciu, że:

(a) interferon-β jest szczególnie nietrwały i tworzy agregaty, gdy kontaktuje się z tlenem, tzn. albo gdy tlen jest intensywnie przepuszczany przez ciecz, albo gdy kontaktuje się statycznie w przestrzeni nad cieczą;

(b) ciekłe preparaty interferonu-β, które nie zawierają nośnika, takiego jak ludzka albumina surowicza, szczególnie łatwo adsorbują się na szklanej powierzchni (albo na zasadzie reakcji chemicznej, albo fizycznego wiązania) i (c) interferon-β agreguje przy niskiej sile jonowej, co wymaga jonowego środowiska dla stabilności w stanie wodnym.

Wynalazek zatem dotyczy sposobów stabilizowania ludzkiego interferonu-β, w których unika się tych pułapek i dotyczy wytworzonych ciekłych formulacji stabilizowanego interferonu-β.

A. Definicje

Termin „bufor” odnosi się do roztworów słabego kwasu i soli zawierających anion kwasu lub roztworów słabej zasady i jej soli. Konkretnie, gdy stosowany jest w tym opisie termin „octan” (patrz także tabela 1), odnosi się on do układu buforowego, korzystnie zawierającego octan sodu i kwas octowy, a termin „fosforan” odnosi się do układu buforowego korzystnie zawierającego hepta- i monohydrat dii monozasadowego fosforanu sodu, odpowiednio.

Ponadto, roztwory w tabeli 2 (poniżej) zawierające kwasowy aminokwas w kombinacji z wodorotlenkiem sodu, aczkolwiek nie stanowią buforów w konwencjonalnym znaczeniu tego terminu, wchodzą w zakres stosowanej tu definicji.

Termin „substancja pomocnicza” odnosi się do dowolnego związku dodawanego do ciekłej formulacji podczas jej obróbki i/lub przechowywania w celu zmiany własności, poprawienia trwałości i/lub nastawienia osmolalności.

Termin „czynnik stabilizujący” dotyczy substancji pomocniczej, która poprawia lub zwiększa trwałość.

Termin „trwałość” jest z konieczności definicją funkcjonalną i oznacza stałość w czasie aktywności interferonu, takiej jak aktywność przeciwwirusowa i/lub struktury interferonu.

PL 193 447 B1

Termin „kawitowana” odnosi się do ciekłej formulacji interferonu, która z powodu zmian ciśnienia lub na skutek mieszania fizycznego, miała kontakt z pęcherzykami (np. powietrza) zawierającymi tlen, przynajmniej podczas wytwarzania i przechowywania. Termin „kawitacja” oznacza także, że w jakimś momencie wytwarzania, przechowywania i stosowania ciekłej formulacji interferonu wytworzyła się granica faz gaz zawierający tlen/ciecz. Termin „kawitowane” oznacza także, że poziom rozpuszczonego tlenu w ciekłych formulacjach interferonu przekracza o około 10% wartość równoważną ciśnieniu atmosferycznemu w temperaturach typowo stosowanych, przynajmniej podczas wytwarzania i przechowywania.

Stosowany tu termin „pozajelitowy” obejmuje iniekcję podskórną, dożylną, domięśniową, domostkową, dootrzewnową, dooczną lub dordzeniową, lub techniki infuzyjne.

Wyrażenie „farmaceutycznie dopuszczalne sole” oznacza dowolną organiczną lub nieorganiczną sól addycyjną, która jest stosunkowo nietoksyczna i nieszkodliwa dla pacjenta, w stężeniach, przy których wykazuje skuteczną aktywność tak, że efekty uboczne przypisywane soli nie niszczą korzystnego działania interferonu.

„Skuteczna ilość” związku oznacza taką ilość, która daje wynik lub wywiera wpływ na dany, poddawany leczeniu stan pacjenta. „Skuteczna ilość” oznacza także ilość, która daje dodatni wynik (tj. ma działanie przeciwwirusowe) w teście CFE na aktywność antywirusową.

Stosowany tu termin „farmaceutycznie skuteczna ilość” interferonu oznacza procentowe stężenie tego czynnika znanego w medycynie i farmakologii, które jest bezpieczne i skuteczne w leczeniu danego stanu.

„Izotoniczna w stosunku do krwi” (stosuje się wymiennie z terminem „izotonicznośc”) odnosi się do ciekłej kompozycji interferonu, w której stężenie składników jest takie, że jej własności osmotyczne są zasadniczo takie same jak krwi, tzn. że komórki będące w kontakcie z formulacją zasadniczo utrzymują swój kształt i zasadniczo nie zachodzi przenoszenie wody przez ciśnienie osmotyczne.

„Substancje polijonowe” (termin stosowany wymiennie z terminem „polielektrolity”) odnosi się do substancji o wysokim ciężarze cząsteczkowym, która jest elektrolitem i która, gdy jest stosowana w formulacjach według wynalazku, maksymalizuje siłę jonową dla danej osmolalności. Ta definicja jest oparta na naszym stwierdzeniu, że interferon-β jest stabilizowany przez wysoką siłę jonową, ale całkowita siła jonowa jest ograniczona wymogiem, aby roztwór był izotoniczny wobec krwi (patrz przykład 7). Korzystny sposób zmaksymalizowania siły jonowej dla danej osmolalności polega na użyciu substancji pomocniczej, która jest substancją polijonową.

Materiał, który jest „obojętny wobec interferonu” oznacza materiał, który fizycznie i/lub chemicznie nie reaguje z interferonem.

B. Wytwarzanie interferonów

Wynalazek niniejszy generalnie stosuje się do wszystkich typów interferonu, w tym interferonu naturalnego, interferonu produkowanego techniką rekombinacji DNA i interferonu wytwarzanego przez syntezę lub modyfikację chemiczną.

Wynalazek może być także stosowany z surowym, półoczyszczonym i oczyszczonym interferonem z fibroblastów, leukocytów, limfocytów lub innych zawierających lub produkujących interferon tkanek ludzkich lub innych odpowiednich gatunków. Najkorzystniej wynalazek stosuje się z ludzkim interferonem fibroblastowym (interferonem-β).

Najkorzystniejszym interferonem-β jest interferon rekombinantowy. Znane są metody wytwarzania białek, w tym różnych interferonów, oparte na technice rekombinacji DNA, ale nie ograniczają one wynalazku, patrz., np. patenty USA nr nr 4399 216, 5 149 636, 5 179 017 (Axel i in.); 4 470 461 (Kaufman). Rekombinantowe formy interferonu-β są już wytwarzane, patrz np. europejski opis patentowy nr 041 313 (Fiers - ekspresja interferonu-β); patent USA nr 4 966 842 (McMormick i in. - ekspresja interferonu w komórkach CHO); patent USA nr 5326 859 (Sugano i in. - DAN kodujący interferon-β). Interferon-β może być także modyfikowany albo metodą rekombinacji DNA, albo metodą chemiczną i może być wytwarzany w pożywce zawierającej surowicę lub wolnej od surowicy. Formy interferonu-β mogą obejmować takie odmiany jak mutanty pozbawione cysteiny (patenty USA nr nr 4 588 585 i 4 737 462: Mark i in.) i mutanty pozbawione metioniny (EP 260 350 - Wang i in.). Pierwszorzędowa sekwencja aminokwasowa białka może być zmodyfikowana przez derywatyzację resztami cukrowymi (glikozylacja) lub innymi dodatkowymi cząsteczkami. Mogą zachodzić inne modyfikacje z udziałem systemów obróbki potranslacyjnej w komórce gospodarza. Pojedyncze reszty aminokwasowe w łańcuchu mogą być dalej modyfikowane przez utlenianie, redukcję lub inną derywatyzację, a białko może być rozszczepione w celu uzyskania aktywnych fragmentów. Dokładna struktura chemiczna danego

PL 193 447 B1 rekombinantowego interferonu-β będzie zatem zależeć od kilku czynników i nie ogranicza zakresu wynalazku. Wszystkie interferony-β zawarte w opisanych tu formulacjach będą utrzymywać bioaktywność w odpowiednich warunkach środowiskowych.

Jedna z metod wytwarzania rekombinantowego interferonu-β polega na prowadzeniu hodowli komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) transfekowanych genem ludzkiego interferonu-β.

Rekombinantowy interferon-β jest wydzielany przez komórki CHO rosnące w okresowej hodowli zawiesinowej zawierającej płodową surowicę bydlęcą. Komórki można hodować w kolbach przetrzymywanych w inkubatorze CO2 (5% CO2) przy około 35°C. Jeżeli proces ma być prowadzony w większej skali, zawartość wielu kolb można przenieść do fermentorów. Wzrost w danym fermentorze prowadzi się przez około 6 dni i w tym czasie wyprodukowany interferon-β akumuluje się w pożywce hodowlanej. Następnie hodowlę można zebrać i usunąć komórki z pożywki zawierającej produkt, np. przez filtrację z przepływem stycznym.

C. Oczyszczanie interferonów

Schematy oczyszczania interferonów są dobrze scharakteryzowane i dostępne specjalistom. Takie metody obejmują jedno- lub wieloetapowe procedury z różnymi etapami rozdzielania chromatograficznego, patrz np. patenty USA nr nr 5 015 730 (Friesen i in. - chromatografia powinowactwa i HPLC); 4 541 952 (Hosoi i in. - chromatografia chelatacyjna).

Przykładowa metoda obejmuje wykorzystanie niezwykle hydrofobowego i stosunkowo zasadowego charakteru cząsteczki interferonu-β oraz jej silnego powinowactwa do wiązania jonów metali, patrz np. Knight i Fahey, „Human Fibroblast Interferon, an Improved Purification”, J. Biol. Chem., 256: 3609-3611 (1981) i Edy i in., „Purification of Human Fibroblast Interferon by Zinc Chelate Chromatography”, J. Biol. Chem., 232: 5934-5935 (1981).

Reasumując, etapy wyizolowania i oczyszczania obejmują wiązanie interferonu-β w serii kolumn z Sepharose^® (produkcji Pharmacia Biotech) i elucję solami i poliolem. Gdy ostatni eluant Sepharose zostaje rozcieńczony, a jego pH obniżone, zawarty w nim interferon-β zwiąże się z SP Sepharose^® (produkcji Pharmacia Biotech). Większość pozostałych białek obecnych w ładunku kolumny ma bardziej zasadowy charakter niż monomeryczny interferon-β i wiąże się mocniej z kolumną niż interferon. Na kolumnie oddzielają się z interferonu-β DNA i wirusy. Następnie kolumnę przemywa się serią buforów zawierających chlorek sodu.

Interferon zwiąże się teraz z chelatującą Sepharose^® (Pharmacia Biotech) w kolumnie, do której wcześniej wprowadzono cynk, patrz Edy i in. jak wyżej. Kolumna pracuje w atmosferze wolnej od tlenu, co ma na celu zabezpieczenie wolnych grup sulfhydrolowych, w cząsteczce. Oczyszczony interferon zakwasza się i utrzymuje w niskim pH, aby zdeaktywować pozostałe wirusy. Po zobojętnieniu interferon zatęża się stosując filtrację z przepływem poprzecznym, po czym bufor wymienia się na roztwór buforu obojętnego. Proces wymiany buforu zmniejsza stężenie cynku i związków organicznych. Tak otrzymany interferon można przechowywać w temperaturze -70°C, zanim przeprowadzi się go w formulacje.

D. Wytwarzania formulacji interferonu

W opisanym powyżej sposobie oczyszczania i po pierwszym procesie wymiany buforu, zaczyna się drugi proces wymiany buforu, w którym roztwór buforu obojętnego zastępuje się roztworem buforu o pH w zakresie 4-7,2, który zawiera czynnik stabilizujący, jak opisano szczegółowo poniżej. Wytworzona formulacja zawierająca interferon jest określana jako „przejściowa” i do przechowywania może być zamrożona, patrz także przykład 7.

Jeśli jest przechowywana w stanie zamrożonym (w atmosferze gazu obojętnego, takiego jak argon lub azot), można ją rozmrozić i przepompować przez 0,22 μm filtr do wytarowanego naczynia, korzystnie ze stali nierdzewnej, gdzie ten produkt przejściowy łączy się z rozcieńczalnikiem, który wcześniej został wyjałowiony przez filtrację, aż do uzyskania żądanego ciężaru produktu końcowego. Rozcieńczalnik składa się z tego samego buforu, który był stosowany w drugim procesie wymiany buforu. Ciekły produkt końcowy następnie sterylizuje się przez filtrację w jałowych warunkach stosując np. dwa połączone szeregowo 0,22 μm filtry i umieszcza się w zamkniętym naczyniu, korzystnie ze stali nierdzewnej, które zawiera wlot gazu obojętnego, kombinację filtra i odgazowującego zaworu oraz zanurzoną rurkę dopływową/wypływową. Końcowy produkt pompuje się przez rurkę do zamkniętego naczynia. Stosując gaz obojętny, taki jak azot, produkt końcowy przenosi się pod ciśnieniem do głowicy pompy w urządzeniu do aseptycznego napełniania jałowych strzykawek.

Znanych jest kilka metod aseptycznego napełniania jałowych strzykawek i żadna konkretna stosowana metoda nie ogranicza zakresu niniejszego wynalazku. Przykładowa metoda obejmuje zastoPL 193 447 B1 sowanie autoklawowanego napełniacza strzykawek HYPAK^® (Becton Dickinson Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ). Strzykawki są autoklawowane z nasadkami w aparacie. Na ogół urządzenia tego typu obejmują komorę próżniową, w której znajdują się strzykawki, które mają być napełnione formulacją interferonu. W komorze panują jałowe warunki. Każda strzykawka znajduje się w komorze w pozycji pionowej, a jej otwarty koniec jest skojarzony z koł kiem tł oczka, dopasowanego do otwartego końca cylindra strzykawki. Kołek jest przeznaczony do wprowadzenia zatyczki do cylindra, w celu zatrzymania w niej cieczy. W strzykawce po wstawieniu zatyczki pozostawia się małą przestrzeń nad cieczą.

Komorę odpowietrza się i przedmuchuje obojętnym wolnym od tlenu gazem (np. argonem, azotem) kilkakrotnie, aż do uzyskania końcowej próżni, po czym kołki mechanicznie wsuwa się do otwartego cylindra strzykawki na małą głębokość i automatycznie wprowadza się zatyczki do odpowiednich strzykawek. Następnie do komory wprowadza się przefiltrowane powietrze, aby doprowadzić ciśnienie wewnątrz komory z powrotem do poziomu ciśnienia atmosferycznego. Wielkość próżni określa wielkość przestrzeni nad cieczą, wypełnionej gazem obojętnym.

W konkretnym, stosowanym przez nas ukł adzie strzykawki umieszczone są pionowo i utrzymywane w danym miejscu przez zaczepy na obrotowej tarczy. Strzykawki najpierw umieszcza się pod igłą, którą wkłada się do strzykawki i przez którą do wnętrza wprowadza się gaz obojętny (np. azot, argon). Następnie igłę cofa się, a strzykawkę umieszcza się pod druga igłą, którą wprowadza się do strzykawki. Igła jest połączona z pompą, która dozuje produkt do strzykawki. Drugą igłę wyciąga się ze strzykawki i strzykawkę umieszcza się pod trzecią igłą, którą też wprowadza się do strzykawki. Do strzykawki jest wciskany tłok (uprzednio autoklawowany) za pomocą obojętnego, wolnego od tlenu gazu (np. azotu, argonu) i wycofuje się igłę ze strzykawki. Tłok pozostawia się w takiej pozycji, aby między górną powierzchnią cieczy i dnem tłoka pozostała przestrzeń wypełniona gazem obojętnym.

1. Substancja pomocnicza

Substancją pomocniczą jest korzystnie substancja polijonowa, która doprowadza do maksimum siłę jonową przy danej osmolalności, taka jak np. polielektrolit, który może zawierać heparynę lub inne związki polimeryczne. Jak to omówiono w przykładzie 4, interferon-β jest stabilizowany przez wysoką siłę jonową, ale całkowita siła jonowa jest ograniczona tym, że roztwór musi być izotoniczny z krwią.

Korzystnym sposobem zmaksymalizowania siły jonowej przy danej osmolalności jest zastosowanie substancji polijonowych.

Roztwory interferonu-β według wynalazku są izotoniczne w stosunku do krwi (około 290 miliosmoli/kg).

Najkorzystniejszym czynnikiem stabilizującym w niniejszym wynalazku jest aminokwas, którym może być jeden z następujących: dowolny kwasowy aminokwas (np. kwas glutaminowy, kwas asparaginowy) lub aminokwas wybrany spośród argininy i glicyny. Najkorzystniej stabilizującym aminokwasem jest arginina, którą wprowadza się w kwasowej formie (chlorowodorek argininy) w roztworach o pH 5,0. Korzystnym aminokwasem jest kwas L-glutaminowy. Nie wiążąc się żadną teorią można stwierdzić, że fakt, iż polijonowe substancje są korzystne tłumaczy dlaczego arginina i lizyna (3 grupy z ładunkiem) stabilizują interferon lepiej niż glicyna (2 grupy z ładunkiem), która z kolei stabilizuje lepiej niż badane substancje bez ładunku.

Jeżeli tą substancją jest arginina-HCl, jej stężenie będzie w zakresie 0,5% (wag./obj.) do 5%, a najkorzystniej 3,13% (równoważnik 150 mM argininy-HCl). Jeżeli substancją jest glicyna, jej stężenie będzie w zakresie 0,50% (wag./obj.) do 2,0%, a najkorzystniej 0,52% (równoważnik 66,7 mM do 266,4 mM, a najkorzystniej 70 mM). Jeżeli substancją jest kwas glutaminowy, jego stężenie będzie w zakresie 100 mM do 200 mM, a najkorzystniej 170 mM (co odpowiada stężeniu w % wag./obj. w zakresie 1,47% do 2,94%, a najkorzystniej 2,5%).

Analizowaliśmy różne substancje pomocnicze jako czynniki stabilizujące do ciekłych formulacji interferonu-β stosując układ buforowy składający się z 50 mM octanu sodu i lodowatego kwasu octowego w kombinacji z 100 mM chlorku sodu, pH 5,0. Ciekłe próbki interferonu albo poddaje stresowi termicznemu przez inkubację w 37°C przez około 1-3 tygodni, albo mechanicznemu umieszczając je na 1-3 dni w wirówce. Tak potraktowane próbki ocenia się na stabilność interferonu-β metodami opisanymi w przykładzie 1. Jak to opisano bardziej szczegółowo w przykładzie 7, największą stabilność wykazują formulacje buforowane przy pH 5,0 octanem sodu zawierającym aminokwas (i ewentualnie zawierającym chlorek sodu).

PL 193 447 B1

2. Interferon

Korzystnym interferonem jest interferon-β, a najkorzystniejszym jest rekombinantowy ludzki interferon-β wytworzony przez komórki ssacze. Rekombinantowy ludzki interferon-β może zawierać wolną grupę sulfhydrylową i co najmniej jedno wiązanie disiarczkowe. Szczególnie korzystna cząsteczka zawiera jedną wolną grupę sulfhydrylową w pozycji 17 i jedno wiązanie disiarczkowe między pozycjami 31 i 141. Jak w przypadku naturalnego ludzkiego interferonu-β przy Asn-80 oczekiwać można N-glikozylacji. Stężenie w ciekłej formulacji według wynalazku jest w zakresie od około 30 μg/ml do około 250 μg/ml. Korzystny zakres stężeń stanowi 48-78 μg/ml, a najkorzystniejszym stężeniem jest około 60 μg/ml. Wewnętrzna norma Biogenu została ustanowiona zgodnie z międzynarodową normą WHO dla interferonu, Natural #Gb-23-902-531 tak, że zakres stężeń w jednostkach międzynarodowych IU (dla 0,5 ml objętości iniekcji) wynosi od około 6 MIU do 50 MIU, a najkorzystniej 12 MIU.

3. Bufor

Jako organiczne kwasy i fosforany stanowiące bufory, które stosuje się w niniejszym wynalazku, aby utrzymać pH w zakresie około 4,0 do 7,2, a korzystnie od około 4,5 do około 5,5, a najkorzystniej 5,0, można stosować konwencjonalne bufory typu kwasów organicznych i ich soli, takie jak bufory cytrynianowe (np. mieszanina cytrynianu monosodu i cytrynianu disodu, mieszanina kwasu cytrynowego i cytrynianu trisodu, mieszanina kwasu cytrynowegi i cytrynianu monosodu, itd.), bufory bursztynianowe (np. mieszanina kwasu bursztynowego i bursztynianu monosodu, mieszanina kwasu bursztynowego i wodorotlenku sodu, mieszanina kwasu bursztynowego i bursztynianu disodu, itd.), bufory winianowe (np. mieszanina kwasu winowego i winianu sodu, mieszanina kwasu winowego i winianu potasu, mieszanina kwasu winowego i wodorotlenku sodu, itd.), bufory fumaranowe (np. mieszanina kwasu fumarowego i fumaranu monosodu, mieszanina kwasu fumarowego i fumaranu disodu, mieszanina fumaranu monosodu i fumaranu disodu, itd.), bufory glukonianowe (np. mieszanina kwasu glukonowego i glukonianu sodu, mieszanina kwasu glukonowego i wodorotlenku sodu, mieszanina kwasu glukonowego i glukonianu potasu, itd.), bufory szczawianowe (np. mieszanina kwasu szczawiowego i szczawianu sodu, mieszanina kwasu szczawiowego i wodorotlenku sodu, mieszanina kwasu szczawiowego i szczawianu potasu, itd.), bufory mleczanowe (np. mieszanina kwasu mlekowego i mleczanu sodu, mieszanina kwasu mlekowego i wodorotlenku sodu, mieszanina kwasu mlekowego i mleczanu potasu, itd.), bufory fosforanowe (monozasadowy fosforan sodu/dizasadowy fosforan sodu) i bufory octanowe (np. mieszanina kwasu octowego i octanu sodu, mieszanina kwasu octowego i wodorotlenku sodu, itd.).

W przykładach opisanych poniżej stosowaliśmy różne stężenia buforów i różne pH właściwe dla fosforanu sodu, cytrynianu sodu, bursztynianu sodu, węglanu sodu i octanu sodu, w celu oceny, który bufor jest najbardziej odpowiedni. Próbki interferonu-β umieszcza się albo w 37°C na 6 dni do 2 tygodni, albo w wirówce na 7 do 9 godzin, w celu przyspieszenia procesu degradacji. Następnie oznacza się chemiczne własności próbek. Określa się gęstość optyczną próbek, mapę peptydów, przeprowadza się HPLC wykluczenia zredukowaną i nie zredukowaną SDS-PAGE/Western blot i ogniskowanie izoelektryczne/Western blot (IEF). Wszystkie te badania opisane są w przykładzie 1. Wszystkie doświadczalne próbki interferonu-β są porównywane z wyjściowym materiałem interferonu-β lub z próbkami interferonu-β w temperaturze 2-8°C. Nasze dane wskazują, że pH jest głównym czynnikiem, który określa stabilność naszych próbek interferonu-β i że próbki w zakresie pH 4,0-5,0 są bardziej trwałe niż przy pH 7,0 lub wyższym, patrz przykład 2. Jesteśmy jednak w stanie wytworzyć kilka formulacji interferonu-β przy fizjologicznym pH (7,2), patrz przykład 6.

4. Kawitacja

Większość wolnych grup sulfhydrylowych w interferonie-β ulega utlenieniu przy wysokim pH (pH > 8,0), a więc pH, przy którym wiązanie disulfidowe ulega przegrupowaniu. Wykryliśmy pewien stopień agregacji interferonu-β w produkcie przejściowym metodą chromatografii wykluczenia nie zredukowanej SDS-PAGE i rozproszenia światła laserowego. Następnie odkryliśmy, że powstawanie zagregowanego interferonu-β może zależeć od poziomu rozpuszczonego tlenu. Opracowaliśmy następujące kryteria procesu, które zapewnią, że ciekłe formulacje interferonu-β nie będą kawitowane: (a) w miarę możliwości podczas wytwarzania i przechowywania nie powinno być kontaktu między cieczą i gazem zawierającym tlen, i/lub (b) podczas wytwarzania i przechowywania nie powinny wytwarzać się pęcherzyki, i/lub (c) poziom rozpuszczonego tlenu w formulacji powinien być utrzymany poniżej 10% równoważnika atmosferycznego podczas wytwarzania i przechowywania, patrz przykład 3.

PL 193 447 B1

5. Adsorpcja interferonu na powierzchniach

Stwierdziliśmy także, że interferon adsorbuje się na pewnych powierzchniach i przechowywanie go w naczyniach szklanych wymaga tego, aby przynajmniej jedna powierzchnia naczynia pozostająca w kontakcie z interferonem była powleczona lub inaczej pokryta materiałem, który zapobiegnie lub zasadniczo wyeliminuje adsorpcję. Taka powierzchnia może być chemicznie lub fizycznie obojętna dla adsorpcji. Przykładowe materiały, stosowane w tym celu, są dobrze znane specjalistom i mogą obejmować np. silikon naniesiony przez rozpylanie lub spiekanie, polipropylen lub politetrafluoroetylen (PTFE). Wzięliśmy nasze korzystne ciekłe formulacje o stężeniu 60 μg/ml (BG 9589-1,2,3 i 4; zestawione w tabeli 1 dalej) i napełniliśmy nimi 1 ml szklane strzykawki typu I powleczone napylonym silikonem (Beckon Dickinson) i 0,75 ml szklane fiolki typu I. Następnie próbki analizowano metodą HPLC z odwróconymi fazami (rpHPLC) w celu określenia stężenia białka. Dane wskazują, że w roztworze w tych próbkach, które znajdowały się w szklanych fiolkach, było mniej białka niż w strzykawkach pokrytych silikonem, patrz przykład 5.

6. Korzystne formulacje

Przeprowadziliśmy analizę kinetyczną stabilności białka stosując cztery ciekłe formulacje, których końcowe stężenia są przedstawione poniżej w tabeli 1 i z których każda zawierała 60 μg/ml interferonu-β. Alternatywne formulacje, niektóre zawierające środki powierzchniowo czynne, takie jak Pluronic F68 (produkowane przez BASF) przedstawione są w tabeli 2.

T a b e l a 1 Korzystne formulacje

Układ pH	Substancje pomocnicze	Końcowe pH
20 mM octanu	150 mM argininy-HCl	5,0 („BG9589-1”)
20 mM octanu	70 mM glicyny 100 mM chlorku sodu	5,0 („BG9589-2”)
20 mM fosforanu	140 mM argininy-HCl	7,2 („BG9589-3”)
20 mM fosforanu	70 mM glicyny 100 mM chlorku sodu	7,2 („BG9589-4”)

Wszystkie składniki formulacji są o czystości zgodnej z USP. Poniżej przedstawione są szczegółowe składy:

BG9589-1

Składnik (jako surowce) Ilość

Arginina-HCl, USP 15,8 mg lodowaty kwas octowy, USP 0,167 mg

Trihydrat octanu sodu, USP 0,972 mg

Lnterferon-β 30 μg

Woda do iniekcji 0,5 ml

BG9589-2

Składnik (jako surowce) Ilość

Glicyna, USP 2,628 mg

Lodowaty kwas octowy, USP 0,185 mg

Trihydrat octanu sodu, USP 0,932 mg

Interferon β-1θ 30 μg

Woda do iniekcji 0,5 ml

Chlorek sodu 2,922 mg

BG9589-3

Składnik (jako surowce) Ilość

Arginina-HCl, USP 14,725 mg

Dizasadowy fosforan sodu - 7H2O 2,332 mg

Monozasadowy fosforan sodu - 1H2O 0,359 mg

Interferon β-1θ 30 μg

Woda do iniekcji 0,5 ml

PL 193 447 B1

BG9589-4

Składnik (iako surowce)	Ilość
Dizasadowy fosforan sodu - 7H2O	1,984 mg
Monozasadowy fosforan sodu - 1H2O	0,359 mg
Interferon β-la	30 μg
Glicyna	2,628 mg
Chlorek sodu	2,922 mg
Woda do iniekcji	0,5 ml

T a b e l a 2 Formulacje alternatywne

Układ pH	Substancje pomocnicze	Końcowe pH
20 mM octanu	150 mM argininy-HCl 15 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej	5,0
20 mM octanu	150 mM argininy-HCl i 0,1% Pluronic F-68	5,0
20 mM octanu	140 mM chlorku sodu	5,0
20 mM octanu	15 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej 140 mM chlorku sodu	5,0
20 mM octanu	0,1% Pluronic F-68 140 mM chlorku sodu	5,0
170 mM kwasu L-glutaminowego 150 mM wodorotlenku sodu	15 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej	5,0
170 mM kwasu L-glutaminowego 150 mM wodorotlenku sodu	0,1% Pluronic F-68	5,0

Do formulacji według wynalazku można też wprowadzić inne materiały, które mogą obejmować następujące środki konserwujące (podane % są wag./obj.): fenol (około 0,2%), metyloparaben (0,08%), propyloparaben (0,008%), m-krezol (0,1%), chlorobutanol (0,25%), alkohol benzylowy (0,1%) i timerosal (0,1%). Na podstawie analiz przeprowadzonych w celu określenia agregacji i deamidacji (dane nie są przedstawione) stwierdzono, że najkorzystniejszymi środkami konserwującymi są chlorobutanol i alkohol benzylowy.

7. Zestawy do podawania pozajelitowego

Korzystne wykonania wynalazku obejmują opakowany zestaw do podawania pozajelitowego niniejszej ciekłej formulacji. Opakowanie może obejmować strzykawki napełnione ciekłą formulacją według wynalazku, kilka tamponów z alkoholem, przynajmniej jedną igłę, jeden lub więcej bandaży przylepcowych i instrukcję stosowania. Oczywiście ciekłe formulacje według wynalazku mogą być stosowane z użyciem konwencjonalnych bezigłowych układów do iniekcji.

E. Stosowanie interferonów

Formulacje interferonów według wynalazku mają aktywność przeciwwirusową, patrz przykład 7. W klinicznym stosowaniu ilość interferonu, którą podawano w danym konkretnym przypadku oraz częstość podawania, zależą od takich czynników jak typ stosowanego interferonu, leczona choroba, odpowiedź pacjenta na leczenie interferonem.

Korzystnie ciekłe kompozycje według wynalazku stosuje się do leczenia nawracającego stwardnienia rozsianego. Pacjentom z nawracającym stwardnieniem rozsianym podawano liofilizowane (tzn. po odtworzeniu) ciekłe formulacje naturalnego interferonu-β i rekombinowanego interferonu-β, patrz Jacobs i in., Annals of Neurology, 39, 285-294 (Marzec 1996) i cytowana tam literatura oraz Jacobs i Munschauer „Treatment of multiple sclerosis with interferons” (str. 223-250), w Treatment of multiple sclerosis: trial design, results and future perspectives. (R. A. Rudnick i in., wyd.), Londyn, Springer, 1992. Opisane tu ciekłe formulacje stosowano do leczenia stwardnienia rozsianego według takiego samego protokołu jak opisany w pracy Jacobsa i in., powyżej.

PL 193 447 B1

Jednym ze sposobów oceny użyteczności ciekłej formulacji według wynalazku jest przeprowadzenie badania toksykologicznego i ocena podrażnienia tkanek związanego z podawaniem ciekłej formulacji. Przeprowadziliśmy takie badanie toksykologiczne na królikach, patrz przykład 8.

Następujące przykłady ilustrują wykonania wynalazku, ale nie ograniczają jego zakresu.

P r z y k ł a d 1. Metody badań

Do określenia własności fizyko-chemicznych interferonu-β w naszych ciekłych formulacjach stosowano kilka dobrze znanych matod, które można też stosować do badania własności innych interferonów.

Obecność, bądź nieobecność nierozpuszczalnych agregatów określa się przez pomiar absorbancji przy 320 nm i transmitacji przy 580 nm. Stężenie rozpuszczalnego białka określa się albo przez pomiar absorbancji przy 278-280 nm (ze współczynnikiem ekstynkcji 1,5), albo metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami stosując znane stężenia interferonu-β w buforach do formulacji jako wzorce.

Próbki ciekłej formulacji wiruje się przed badaniem. Procentową zawartość rozpuszczalnego agregatu określa się przez oddzielenie agregatów od monomeru interferonu-β metodą chromatografii wykluczenia na kolumnie G2000 SWXL (Toso Haas, Montgomery Ville, PA) z TSK-Gel^®. Powierzchnie pików odczytanych przy 280 nm wykorzystano do obliczenia procentowej zawartości rozpuszczalnego agregatu.

Trwałość łańcucha peptydowego potwierdzono przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Przed elektroforezą na gradiencie żelu 10-20% (MiniPlus Seprogel®, Integrated Separation Systems, Natick, MA) interferon-β zredukowano merkaptoetanolem w obecności dodecylosiarczanu sodu. Następnie białka przeniesiono elektroforetycznie na błonę nitrocelulozową i wywoływano przez immunodetekcję stosując przeciwciało przeciw interferonowi-β i kozie przeciwmysie przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową, patrz Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach., 2 wyd. B. D. Hames i D. Rickwood, IRL Press.

Zmianę w ładunku powierzchniowym, spowodowaną deamidacją i innymi zmianami powierzchniowymi, oznaczono metodą ogniskowania izoelektrycznego na żelu poliakryloamidowym (IEF 3-10 MiniPlus Seprogel^®, Integrated Separation Systems), patrz Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach., 2 wyd. B. D. Hames i D. Rickwood, IRL Press.

Utlenianie metioniny, deamidację sparaginy i inne zmiany chemiczne wykrywa się przez mapowanie peptydu. Interferon-β trawi się endoproteinazą Lys-C (Woko Pure Chemicals) w obecności ditiotreitolu i rozdziela się wytworzone fragmenty peptydu metodą HPLC z odwróconymi fazami, patrz. K. Kalgahtgi i C. Horveth, „Rapid Peptide Mapping by High Performance Liquid Chromatography”, J. Chromatography, 443, 343-354 (1988). Profil N-związanych oligosacharydów określa się stosując elektroforezę węglowodan wspomagany fluoroforem (FACE^® system firmy Glyko, Lnc. (Novata, CA). Oligosacharydy związane asparaginą (N-związane) uwalnia się z glikoproteiny stosując enzym N-glikozydazę F-peptydową, następnie znakuje się fluoroforem przy końcach redukujących przez reduktywne aminowanie, rozdziela się i oznacza się ilościowo na żelu poliakryloamidowym.

Aktywność przeciwwirusową interferonów oznacza się kilkoma metodami, takim jak te, które są dokładnie opisane w W. E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag (2 wyd., 1981). Do określania aktywności przeciwwirusowej szczególnie odpowiednia jest próba na hamowanie efektu cytopatycznego (CPE). Nasza korzystna metoda jest opisana w WHO Technical Report, nr seryjny 725, aneks 1, (1985). Pokrótce, tą metodą CPE zaczyna się od przygotowania roboczego podstawowego roztworu wzorcowego interferonu-β, który wcześniej był wykalibrowany niezgodnie z normą odniesienia WHO. Roztwór ten przygotowuje się w D-MEM+ pożywce zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą i 4 mM L-glutaminy w stężeniu 10 000 jednostek (U) na ml. W dniu próby wzorzec, kontrole i próbki rozcieńcza się w D-MEMt w trzech kolejnych seriach rozcieńczeń: a) wychodzi się z 32 U/ml i rozcieńcza się dwukrotnie; b) wychodzi się z 12 uU/ml i rozcieńcza się 1,5-krotnie; i c) wychodzi się z 6 U/ml i rozcieńcza się 1,2-krotnie. 50 μl rozcieńczeń dodaje się w kolumnach do studzienek 96studzienkowych płytek do mikromianowania stosując jedną płytkę na serie rozcieńczeń. Następnie do każdej studzienki dodaje się komórki A 549 (nr katalogu ATCC CCL-185, Rockville, MD) w D-MEMt w ilości 5-10⁵ komórek/ml, 50 μl na studzienkę, przeprowadzając dwukrotne rozcieńczenie i komórek i interferonu-β. Komórki i interferon inkubuje się w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO₂ przez 15 do 20 godzin. Zawartość płytek wytrząsa się do wiaderka („a bleach bucket”) i do każdej studzienki dodaje się 100 μl wirusa EMC (encefalomiokarditis) w odpowiednim rozcieńczeniu w pożywce. Wirusy i komórki inkubuje się w 37°C i w 5% CO2 przez 30 godzin. Zawartość płytek wytrząsa się do wiaderka

PL 193 447 B1 i do płytek dodaje się 0,75% fioletu krystalicznego. Po 5-10 minutach płytki przemywa się wodą destylowaną i pozostawia do wyschnięcia. Każda badana płytka obejmuje studzienki kontrolne na wzrost komórek nie zawierające ani interferonu, ani EMC, studzienki kontrolne dla wirusa zawierające EMC i komórki, ale nie zawierające interferonu i serie rozcieńczeń wzorca interferonu. Płytki ocenia się wizualnie określając ostatnią studzienkę w każdej kolumnie z żywymi komórkami (> 25% zlewnego purpurowego zabarwienia). Określa się granicę wykrywalności przy najniższym stężeniu wzorca, które chroni przed cytotoksycznością wirusów. Rozcieńczenie próbki w ostatniej dodatniej studzience mnoży się przez granicę wykrywalności określoną dla wzorca i czynnika rozcieńczenia próbki i otrzymuje się aktywność interferonu (MU/ml) w próbce.

Wyniki z każdej płytki są przekształcone w jednostki log w celu wyznaczenia średniej geometrycznej i obliczenia 95% przedziałów zaufania.

P r z y k ł a d 2. Wybór układu buforowego

Przygotowaliśmy trzy zestawy buforów zawierających w każdym zestawie 9-10 różnych składników. Zestaw I zawiera serie roztworów fosforanu sodu i/lub 100 mM chlorku sodu, zakres pH 4,0-7,2. Zestaw II zawiera dodatkowe serie buforów - cytrynianów sodu z pH w zakresie 4,0-7,0. Zestaw III zawiera serie roztworów bursztynianu sodu, octanu sodu i węglanu sodu, wszystkie ze 100 mM chlorku sodu, z pH w zakresie 4,0-7,2. W dwóch innych roztworach chlorek sodu zastąpiono 50 mM siarczanu sodu, pH 4,0-7,2.

Rozmrożony interferon-β dializowano do różnych buforów przez noc w temperaturze 2-8°C, stosując co najmniej 2 razy wymianę buforów, po czym przed użyciem przesączono go w jałowych warunkach. Stężenie białka określano przez pomiar absorbancji przy 278 nm (współczynnik ekstynkcji 1,5 mg ml cm^-1). Wszystkie próbki zawierały 140 μg/ml lub 150 μg/ml interferonu-β. Próbki przesączono i podzielono na 4 zestawy napełniając nimi częściowo 2,2 ml probówki Eppendorfa. Jeden zestaw umieszczono w temperaturze 2-8°C, drugi w 37°C przez 6 dni do 2 tygodni, trzeci umieszczono w wirówce na 7-9 godzin, a ostatni zestaw wykorzystano jako kontrolę w czasie zero.

Procentową stratę białka spowodowaną nierozpuszczalnymi agregatami oblicza się jako stratę stężenia białka podczas różnych działań podzieloną przez stężenie wyjściowe.

Wyniki

Analiza statystyczna wszystkich danych wskazuje, że próbki interferonu w buforach o pH 4,0 i 5,0 miały mniejsze straty białka spowodowane agregacją niż próbki o wyższym pH. Próbki interferonu inkubowane w 37°C przy pH 4,0 i 5,0 straciły około 10-15% białka z powodu agregacji. Przy wartościach pH > 6,0 straty wzrosły do 40-50%. Stwierdziliśmy także, że próbki interferonu mają więcej rozpuszczalnych agregatów przy wartościach pH wyższych od 6. Ponadto stwierdziliśmy przez mapowanie peptydu, że gdy pH wzrasta od 4,0 do 7,2 zasadniczo liniowo wzrasta ilość interferonu zdeamidowanego; przy pH 7,0 i wyższych ponad 85% interferonu jest zdeamidowane. Mierzyliśmy punkt izoelektryczny (pI) białek w próbce (tzn. pH, przy którym białko nie migruje w polu elektrycznym, a średni ładunek białka wynosi zero) metodą IEF/Western blot. Bloty wykazywały dodatkowe pasma pI dla próbek w cytrynianie sodu i przesunięcie intensywności pasma dla próbek w bursztynianie sodu. Fosforan przy pH 5,0 nie ma żadnej zdolności buforującej. Octan sodu z chlorkiem sodu przy pH 5,0 nie wykazywały zmian we wzorcu pasm lub intensywności.

P r z y k ł a d 3. Wpływ kawitacji

Podczas doświadczeń na sprawdzanie pH opisanych w przykładzie 2, stwierdziliśmy, że pusta przestrzeń w probówce, w której formulację się przechowuje, jest krytyczna dla straty białka w niektórych próbkach. Gdy próbki 1,5-mililitrowe znajdowały się w probówkach 2,2 ml, nie obserwowano żadnych strat białka. Natomiast w próbkach o objętości 1,2 ml znacząco wzrosła ilość agregatów. Jest to zgodne z naszymi obserwacjami, że wytwarzanie agregowanego interferonu-β podczas etapu inaktywacji wirusów w procesie oczyszczania zależy od poziomu rozpuszczonego w tym etapie tlenu.

Krótko mówiąc, etap inaktywacji wirusów obejmuje doprowadzenie pH eluatu z chelatującej Sepharozy (patrz rozdział C) od 7,85 ± 0,25 do 2,5-3,5 za pomocą 15% kwasu fosforowego, utrzymanie zakwaszonego eluatu przez 120-135 minut i ponownie nastawienie pH do wartości 6,7 ± 0,7 za pomocą 0,5 N wodorotlenku sodu. Wszystkie etapy przeprowadza się w 2-8°C. Opracowaliśmy badanie w celu określenia czy występuje zależność między tworzeniem się agregatów interferonu-β w tym etapie i ilością rozpuszczonego tlenu.

Materiały i metody

Eluat z kolumny z chelatującą Sepharosą podzielono na porcje po 50 ml i po 100 ml i umieszczono w 100 ml kolbach. Do każdej kolby dodano 1 ml 15% kwasu fosforowego spryskanego argoPL 193 447 B1 nem. Następnie kolbę delikatnie miesza się przez około 2 minuty, po czym utrzymuje się bez mieszania przez około 2 godziny w 2-8°C. Po tym okresie dodaje się 6,5 ml wodorotlenku sodu spryskanego argonem i próbkę bada się w czasie metodą chromatografii wykluczenia. Tlen rozpuszczony w cieczy mierzy się w sposób ciągły sondą tlenową (Orion Model 860) i zapisuje się w czasie dodawania zasady. Dla próbek, w których poziom rozpuszczonego tlenu jest równy lub mniejszy niż 10%, swobodną przestrzeń nad cieczą w naczyniu reakcyjnym przemiatano argonem.

Wyniki

Dane są przedstawione na fig. 1, gdzie wyraźnie widać zależność między ilością rozpuszczonego tlenu podczas dodawania wodorotlenku sodu i wydajnością monomeru interferonu-β w etapie inaktywacji wirusa. Wartości wydajności otrzymane przy stężeniach rozpuszczonego tlenu mniejszych lub równych 10% znacząco różnią się od wszystkich innych wydajności przy innych stężeniach tlenu. Scharakteryzowaliśmy także agregat (danych nie przedstawiamy) i stwierdziliśmy, że jego swoista aktywność jest zmniejszona około 30-40-krotnie w porównaniu z produktem przejściowym. Stwierdziliśmy też, że ponad około 90% agregatów jest odpornych na SDS denaturację w warunkach nie redukujących, co sugeruje kowalencyjne wiązanie sieciujące. W warunkach redukujących (2% β-merkaptoetanol) agregat rozpada się do monomeru, co sugeruje wiązanie sieciujące, które obejmuje wiązanie disulfidowe.

P r z y k ł a d 4. Wybór substancji pomocniczej

Przygotowano serie formulacji interferonu-β (60 μg/ml) zawierających różne substancje pomocnicze w korzystnym buforze pH 5, zawierającym 50 mM octanu sodu i 100 mM chlorku sodu. Substancje pomocnicze obejmują glicynę, chlorowodorek argininy, chlorowodorek lizyny, sacharozę, glicerynę, PEG 3350, glutation i Pluronic F-68. Przejściowy interferon-β poddaje się dializie do 50 mM octanu sodu i 100 mM chlorku sodu, pH 5,0, przez noc w 2-8°C z co najmniej dwukrotną wymianą buforu, po czym filtruje się przed użyciem. Stężenie interferonu-β określa się przez absorbancję przy 278 nm z odjęciem tła. Wszystkie próbki rozcieńcza się do końcowego stężenia interferonu około 60 μg/ml. Wszystkie przygotowane próbki filtruje się, 2 ml przenosi się do 4 ml szklanych fiolek (nie powleczonych silikonem) pustą przestrzeń nad cieczą w fiolkach przedmuchuje się argonem i fiolki zatapia się. Zestaw próbek umieszcza się w temperaturze 2-8°C i 37°C w czasie do 2 tygodni. Inne próbki poddaje się stresowi mechanicznemu przez wirowanie ich w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Próbki analizuje się zgodnie z procedurą według przykładu 1. Ponadto, procent rozpuszczonego tlenu w formulacjach mierzy się za pomocą gazowego analizatora krwi Ciba-Corning Model 248. Wartość „doświadczalną” stanowi cząstkowe ciśnienie tlenu (mm Hg) w próbce minus cząstkowe ciśnienie tlenu w buforze przedmuchanym azotem, a wartość „kontrolna” jest to ciśnienie cząstkowe tlenu w buforze przechowywanym w temperaturze pokojowej minus ciśnienie cząstkowe tlenu w buforze przedmuchanym azotem. Procent rozpuszczonego tlenu („doświadczalne”/”kontrolne”) jest zawsze mniejszy niż 30%.

Wyniki

Bloty lEF/Western i bloty SDS-PAGE/Western próbek inkubowanych w 37°C przez 2 tygodnie wykazują przesunięcie pasma i stratę intensywności oraz obecność multimerów interferonu w próbkach zawracających PEG 3350 i glutation. Po jeszcze 1 tygodniu w 37°C, próbka z gliceryną wykazuje jedno dodatkowe pasmo w naszych blotach. Sacharoza wykazuje stratę intensywności pasma. Ta początkowa procedura przeszukiwania pozwoliła nam dokładniej zająć się chlorowodorkiem argininy, glicyną, chlorkiem sodu i mannitolem w dalszych badaniach.

P r z y k ł a d 5. Adsorpcja interferonu

Rozmrożony interferon-β dializowano do BG9589-1,2,3 i 4 (patrz tabela 1) przez noc w 2-8°C z co najmniej dwukrotną wymianą buforu, po czym przesączono przed użyciem. Stężenie białka określa się przez absorbancję przy 280 nm (ze współczynnikiem ekstynkcji 1,5 mg ml cm^-1). Wszystkie próbki rozcieńcza się do końcowego stężenia około 60 μg/ml. Rozcieńczone próbki sączy się i napełnia się nimi po 3 1-mililitrowe strzykawki z rozpylonym silikonem BD (szkło typu I) w ilości po 0,5 ml i przestrzeń nad cieczą przepłukuje się azotem lub 30,5 ml szklane (typ I) fiolki w ilości po 0,75 ml, w których przestrzeń nad cieczą przepłukuje się argonem. Stężenie białka oznacza się metodą HPLC z odwróconymi fazami (przykład 1).

Wyniki

W tabeli 3 poniżej podane są stężenia białka, które oznaczono metodą HPLC z odwróconymi fazami. Dane wykazują, że w próbkach znajdujących się w szklanych fiolkach jest mniej białka niż w próbkach w strzykawkach powleczonych silikonem. Zatem do ciekłych formulacji interferonu-β stosuje się silikonowane strzykawki.

PL 193 447 B1

T a b e l a 3

	Szklane fiolki ^g/ml) (S. D.)	Silikonowane strzykawki ^g/ml) (S. D.)
BG9589-1	59,3 (2,6)	63,3 (2,5)
BG9589-2	58,3 (0,7)	61,7 (0,1)
BG9589-3	56,4 (0,4)	58,5 (1,1)
BG9589-4	55,5 (0,7)	59,3 (0,5)

P r z y k ł a d 6. Formulacje przy fizjologicznym pH

Siła jonowa/fosforan

Przeprowadziliśmy początkowe badania w układach buforowych fosforan/chlorek sodu pH 7,2, o różnych stężeniach składników, przy czym stężenie fosforanu wynosiło 10,50 i 75 mM z siłą jonową (określoną przez I = Σc_IZ_I ², gdzie ci i z_I oznaczają stężenie molowe i wartościowość ładunku w związku jonowym I, odpowiednio) 0,2, 0,4 i 0,6 nastawioną dodatkiem chlorku sodu.

Stosowaliśmy pełny współczynnikowy projekt, w którym zmienne stanowiło stężenie fosforanu (10,50 i 75 mM) i siła jonowa (I = 0,2, 0,4 i 0,6). Ilości monozasadowego fosforanu sodu, dizasadowego fosforanu sodu i chlorku sodu (którym reguluje się siłę jonową) w buforach oblicza się stosując rozszerzony arkusz z Elkis i Morrison, „Buffers of Constant Ionic Strength for Studying pH-dependent Processes”, Methods Enzymol., 87, 405-426 (1982). Na podstawie równań oznaczono żądane ilości każdego składnika buforu dla danego pH, stężenie fosforanu i siłę jonową. Każdy z dziewięciu roztworów stosowanych w tym eksperymencie otrzymuje się przez wymianę buforu w produkcie przejściowym interferonu-β w kolumnach odsalających Pharmacia PD-10. pH wytworzonych roztworów wynosiło 7,20 = ± 0,15. Stężenia oceniano przez absorbancję przy 280 mm, po czym rozcieńczano odpowiednim buforem do 150 μg/ml interferonu-β. Wytworzone roztwory przesączano w jałowych warunkach pod argonem przez 0,22 μm filtry i rozdozowano po 1,3 ml do 5 ml szklanych fiolek z argonem wypełniającym przestrzeń nad cieczą. Próbki inkubowano w 37°C przez 6 dni, w trzech przebiegach dla każdej. Próbki analizowano określając % transmitancji przy 580 nm, % odzyskania białka i lEF-PAGE/Western blot.

Wyniki

Analiza % transmitancji przy różnych siłach jonowych wykazuje tendencję do wzrostu transmitancji (tzn. malejących ilości nierozpuszczalnych agregatów białka) wraz ze wzrostem siły jonowej. % odzyskania białka wykazuje podobną tendencję, aczkolwiek IED-PAGE/bloty Western nie wykazują żadnej tendencji do deamidacji przy zmiennej sile jonowej, tak że wszystkie próbki są jednakowo zdeamidowane. Zatem, po przechowywaniu przez 6 dni w 37°C próbki wykazują mniejszą agregację wraz ze wzrostem siły jonowej i zmniejszającym się stężeniem fosforanu. Wyniki doświadczeń na % transmitancji i % odzyskania w funkcji zmiennego stężenie fosforanu (nie przedstawione tutaj) wykazują słabą tendencję do zmniejszania się % transmitacji wraz ze wzrostem stężenia fosforanu, ale analiza zmiennych nie wykazuje znaczącej różnicy między próbkami o różnych stężeniach fosforanu. Dane dotyczące % odzyskiwania wykazują lepsze odzyskiwanie białka przy niższych stężeniach fosforanu (znacząca różnica przy 94% poziomie zaufania). IEF-PAGE bloty Western nie wykazują dającej się zauważyć tendencji do deamidowania wraz ze zmieniającym się stężeniem fosforanu.

Stosunek substancja pomocnicza/sól

Wstępne badania (nie przedstawione) wykazały, że niektóre substancje pomocnicze mogą wymagać obecności soli (np. chlorku sodu) do utrzymania wysokiej siły jonowej i w celu wykazania efektu stabilizującego przy pH 7,2. Przeprowadziliśmy badanie stosując substancje pomocnicze (glicynę, lizynę, argininę, sacharozę i mannitol) i frakcję chlorku sodu nadającą izotoniczność (fsól = 0,025, 0,75 ^{i 1,0). Frakcję oblicza się z równania: f}sól ^{= , O}sól ^{/ (O}sól ^{+ O}subst. pomocn^{), którym O}sól ^{i O}subst pomocn ^oznaczają osmolalność w mOsm/kg chlorku sodu i substancji pomocniczej, odpowiednio, w roztworze. Frakcja soli dostarcza środków porównania wpływu soli na różne substancje pomocnicze. Wszystkie próbki zawierały dodatki nadające izotoniczność przy zmieniających się stosunkach substancji pomocniczej: soli (jak określono przez fsól).

Przygotowuje się 10% (wag./obj.) roztwory podstawowe każdej substancji pomocniczej w 20 mM fosforanu, pH 7,2, odgazowuje się i spryskuje argonem. Przygotowuje się roztwór podstawowy 250 mM chlorku sodu i 20 mM fosforanu, pH 7,2, odgazowuje się i spryskuje argonem. Przejściowy interferon-β

PL 193 447 B1 intensywnie dializuje się do spryskanego argonem 20 mM fosforanu, pH 7,2. Wytworzony roztwór oznacza się na stężenie interferonu-β przez absorbancję przy 280 nm i rozcieńcza się buforem fosforanowym i odpowiednimi roztworami podstawowymi substancji pomocniczej i soli aby uzyskać 60 μg/ml interferonu-β i żądane końcowe stężenia soli i substancji pomocniczej. Wytworzone próbki wyjaławia się przez filtr (0,22 μ^ι) i napełnia się nimi 1,0 ml strzykawki szklane (typu I) Becton Dickinson powleczone silikonem (objętość wypełniona 0,5 ml) z przestrzenią nad cieczą wypełnioną azotem. Próbki przechowuje się w 40°C.

Po 6 dniach próbki argininy, glicyny i sacharozy analizuje się przez absorbancję przy 320 i 280 nm, zarówno przed, jak i po filtracji przez filtry 0,22 μm. Po 2 tygodniach argininę, lizynę i mannitol analizuje się podobnie przeprowadzając też IEF-PAGE, redukującą SDS-PAGE i nie redukującą SDS-PAGE. Próbki kontrolne przechowywano w temperaturze 2-8°C i analizowano podobnie.

Wyniki

Odzysk interferonu-β-1a (jako procent w stosunku do kontroli) wzrasta wraz ze wzrostem f_soli dla sacharozy i mannitolu, osiągając maksimum przy fsoli = 1 (130 mM chlorku sodu). Dla argininy i lizyny odzysk spada, gdy wzrasta fsoli. Maksimum odzysku dla forrmulacji glicyny przy pH 7,2 uzyskuje się przy faoii około 0,75.

To przesiewowe badanie substancji pomocniczych z użyciem buforu fosforanowego, pH 7,2, z różnymi substancjami, takimi jak glicyna, lizyna, arginina, mannitol i sacharoza dodanymi do izotoniczności, wykazało słaby odzysk dla substancji bez ładunku. Dodatki te nie wpływały na zakres deamidacji. Przykładowo, redukująca i nie redukującą SDS/PAGE wykazuje ubytek nie glikozylowanych postaci interferonu-β we wszystkich formulacjach i pasma cięższego multimeru dla samego izotonicznego chlorku sodu i mannitolu. W sumie jest zatem silna współzależność pomiędzy charakterem jonowym substancji pomocniczej i jej zdolnością do stabilizowania interferonu-β przed agregacją w tych układach buforowych przy fizjologicznym pH. Wydaje się, że niejonowe dodatki, takie jak sacharoza i mannitol nie dają żadnej ochrony lub mogą sprzyjać stratom białka przy fizjologicznym pH. Chlorek sodu, z pojedynczym ładunkiem na rozpuszczalną cząsteczkę, działa lepiej niż mannitol lub sacharoza. Aminokwasy zawierają dwa ładunki na cząsteczkę przy fizjologicznym pH. W przypadku glicyny, wydaje się, że obojnaczy charakter cząsteczki nie jest wystarczający dla stabilizacji interferonu-β. Arginina i lizyna, z których każda zawiera trzy ładunki na cząsteczkę stabilizują interferon-β lepiej niż sam chlorek sodu lub mieszanka glicyna/chlorek sodu.

P r z y k ł a d 7. Badanie stabilności i badanie kinetyczne

Strzykawki napełnia się aseptycznie w obojętnej atmosferze, inkubuje się w zakresie temperatur i różnym czasie, po czym analizuje się ich zawartości. Krótko mówiąc, rozmrożony interferon-β dializuje się do BG-9589-1, -2, -3 i -4 przez noc w 2-8°C z co najmniej dwiema wymianami buforu. Stężenie białka określa się przez absorbancję przy 280 nm ze współczynnikiem ekstynkcji 1,5 ml/mg/cm. Wszystkie próbki rozcieńcza się do końcowego stężenia interferonu-β-1a około 60 μg/ml. Cztery formulacje interferonu-β-1a według tabeli 1 filtruje się i dozuje się po 0,5 ml do 1,0 ml strzykawek Becton Dickinson (BD), których wewnętrzną powierzchnię pokryto spiekanym silikonem lub rozpylonym silikonem.

Próbki analizowano stosując OD, HPLC wykluczenia (SEG), elektroforezę w żelu z ogniskowaniem izoelektrycznym IEF/Western blot, elektroforezę w żelu poliakryloamidowym ze zredukowanym dodecylosiarczanem sodu, mapowanie peptydu, elektroforezę z węglowodanem wspomaganą fluoroforem (FACE) i biopróbę CPE. Przestrzeń nad cieczą w strzykawce zajmował gazowy azot. Strzykawki inkubowano w 2-8°C, 25°C, 33°C i 40°C w czasie do 90 dni. Próbki analizowano metodami według przykładu 1.

Wyniki

Analizowaliśmy stężenie białka w naszych próbkach, znormalizowanych w stosunku do materiału wyjściowego w ciągu 90 dni w różnych temperaturach. Fig. 2 ilustruje, że BG9589-1 wykazuje pełną stabilność białka (nie ma strat białka) po 3 miesiącach inkubacji w zakresie temperatur od 2-8°C (średnio 4°C) do 25°C. W temperaturze przechowywania (33°C) osiągającej temperaturę ciała, około 18% białko uległo degradacji. W temperaturze przechowywania (40°C) przekraczającej temperaturę ciała, około 30% białka uległo degradacji pod koniec 3-go miesiąca. Zasadniczo identyczne wyniki uzyskano dla BG9598-2 (nie przedstawiono). Fig. 3 ilustruje wyniki testu dla BG9589-3 z 2-miesięcznym przechowywaniem. Degradacja białka była minimalna przy 4-25°C, ale zachodziła szybko w wyższych temperaturach. Wyniki dla BG9589-4 są zasadniczo identyczne, jak te przedstawione na fig. 2-3. Te dane zostały potwierdzone metodą SDS-PAGE/Western blot.

PL 193 447 B1

W strzykawkach, w których warstwa silikonu była naniesiona przez „spiekanie”, w okresie badania nie wykryto rozpuszczalnych agregatów. Nie zaobserwowano też znaczących zmian w stężeniu białka, w teście CPE i w % profilach utlenionego AP6 i węglowodanu. Nie obserwowano też zmian w wynikach badania próbek techniką redukującą SDS-PAGE/Western blot i lEF/Western blot. Występuje natomiast pewien wzrost w % deamidacji w porównaniu z wartością wyjściową. Jednakże produkt przejściowy, którym napełniano te strzykawki wykazywał 37% deamidacji, więc więcej niż wartość 33,8% dla materiału, już po umieszczeniu go w strzykawkach. Ta druga, niska wartość może wynikać ze zmienności badania. W strzykawkach, w których silikon naniesiono przez rozpylanie, w okresie badania nie wykryto rozpuszczalnych agregatów. Nie zaobserwowano też znaczących zmian w stężeniu białka, w teście CPE, w % deamidacji i w % profilach utlenionego AP6 i węglowodanu. Nie obserwowano też zmian w wynikach badania próbek technika redukującą SDS-PAGE/Western blot i IEF/Western blot. Krótko mówiąc, dotychczasowe wyniki wykazują, że końcowy produkt BG9589-1 jest trwały do 3 miesięcy w 2-8°C w strzykawkach ze „spiekanym silikonem” i 6 miesięcy w 2-8°C w strzykawkach z „napylonym silikonem”.

Przeprowadziliśmy badanie CPE na aktywność przeciwwirusową formulacji BG9589-1 i BG9589-2 (patrz tabela 1) po napełnieniu nimi strzykawek w jałowych warunkach. Wartości aktywności dla BG9589-1 i BG9589-2 wynoszą 12,0 MU/ml. Przeciwwirusową próbę CPE powtórzono po przechowywaniu próbek w czasie do 3 miesięcy w temperaturze 2-8°C. Wartości aktywności dla BG9589-1 wynoszą 11,6 MU/ml (n = 8) przy 95% przedziale ufności dla zakresu 10,2-13,3 MU/ml.

Zmierzyliśmy także stabilność materiału przejściowego dla BG 9589-1 w 2-8°C przez 5 miesięcy i w -70°C przez 6 miesięcy. Próbki BG9589-1 z pilotowych badań diafiltracji analizowano metodami według przykładu 1. Dotychczasowe wyniki wykazują, że materiał przejściowy dla BG 9589-1 jest trwały w 2-8°C przez 5 miesięcy, a w -70°C przez 6 miesięcy.

W czasie, w którym prowadzono opisane badania nie stwierdzono obecności wykrywalnych rozpuszczalnych agregatów. Nie zaobserwowano też znaczących zmian w % profilach deamidacji i węglowodanów (różnice w % deamidacji mieściły się w zakresie zmienności próby). Nie zaobserwowano też zmian w próbkach badanych technikami redukująca SDS-PAGE/Western blot i IEF/Western blot. Jest natomiast niewielki spadek stężenia białka. Spadek stężenia białka w -70°C może być spowodowany przejściem próbki przez cykl zamrażanie/rozmrażanie. Spadek stężenia białka jest jeszcze w zakresie 15% stężenia początkowego.

P r z y k ł a d 8. Badania przedkliniczne

W celu oceny miejscowej tolerancji interferonu po podaniu go w postaci kilku nowych formulacji przeprowadzono badanie miejscowej tolerancji na pojedynczą dawkę domięśniową (IM) u królików. Reakcje w miejscu iniekcji po podaniu ciekłej formulacji według wynalazku lub liofilizowanych i odtworzonych formulacji interferonu są porównywalne z reakcją widoczną po podaniu zwykłego roztworu soli fizjologicznej.

1. Badanie podrażnienia/biodostępności po podaniu pojedynczej dawki IM czterech formulacji interferonu-β.

Każdemu z grupy 20 samców białych królików nowozelandzkich podano przez iniekcję domięśniową pojedynczą 30 μg dawkę interferonu-β-1a w postaci jednej z następujących pięciu formulacji: BG9589-1 pH 5,0, bufor octanowy, stabilizator argininowy, 0,5 m/dawkę); BG9589-2 (pH 5,0, bufor octanowy, stabilizator glicyna/NaCl, 0,5 ml/dawkę); BG9589-3 (pH 7,2, bufor fosforanowy, stabilizator argininowy, 0,5 ml/dawkę); BG9589-4 (pH 7,2, bufor fosforanowy, stabilizator glicyna/NaCl, 0,5 ml/dawkę) i liofilizowaną formulację interferonu-β o pH 7,2 zawierającą 1,5% HSA, 1,0 ml/dawkę (patrz Jacobs i in., supra).

Każda z grup leczenia obejmowała czworo zwierząt. Zwierzęta, które otrzymywały BG9589-1 albo formulację liofilizowaną otrzymały również jako kontrolę negatywną równoważną objętość normalnego roztworu soli w przeciwległy bok. Próbki krwi pobierano przez 72 godziny po podaniu w celu analizy aktywności interferonu beta w surowicy. Makroskopowe badanie skóry pod względem zaczerwienienia, tworzenia blizny i obrzęku przeprowadzono w 6, 12, 24, 48 i 72 godziny po podaniu. Po pobraniu krwi w 72 godzinie zwierzęta zabito, miejsca wstrzyknięcia zbadano makroskopowo w kierunku objawów uszkodzenia tkanek, a następnie utrwalono w 10% formalinie buforowanej do odczynu obojętnego. Próbki mięśni (trzy/miejsce wstrzyknięcia) badano mikroskopowo w kierunku stanu zapalnego, martwicy, krwotoku i zmian.

PL 193 447 B1

Wyniki

Przy ocenie według skali Primary Irritation Index (EPA Dermal Classification System), żadna z powyższych płynnych formulacji nie została oceniona wyżej niż jako lekko podrażniająca skórę. Badanie mikroskopowe miejsca wstrzyknięcia BG9589-4 u jednego ze zwierząt wykazywało stan lekkiego podrażnienia (krwotok); jednakże badanie mikroskopowe nie wykazało żadnych zmian krwotocznych, zaś obserwacja makroskopowa została określona jako artefakt. Pokrótce, badanie mikroskopowe wykazało, że reakcje w miejscach wstrzyknięcia płynnych formulacji badanej substancji były minimalne do łagodnych oraz, że żadna nie była cięższa od wywołanej przez podanie formulacji liofilizowanej albo normalnego roztworu soli.

Oprócz tego, podrażnienie skóry u królików po wielokrotnym podawaniu IM płynnych formulacji można łatwo badać stosując wiele grup królików, które mogą otrzymywać domięśniowe wstrzyknięcia płynnych formulacji albo normalnego roztworu soli co drugi dzień przez osiem dni (w sumie pięć dawek). Dawki podaje się w określony rejon grzbietu każdego zwierzęcia w celu minimalizacji miejscowej ekspozycji na badaną substancję. Mikroskopowe badanie skóry przeprowadza się w 4-6 godzin po każdorazowym podaniu i w 24 godziny po ostatnim podaniu dla każdej grupy leczenia. Podczas każdego badania skóry przeprowadzano codzienną obserwację powierzchowną. Po badaniu makroskopowym w 24 godziny po podaniu, zwierzęta zabija się, miejsca wstrzyknięcia bada się w kierunku objawów uszkodzenia tkanek, a następnie tkankę utrwala się w 10% formalinie buforowanej do odczynu obojętnego. Utrwalone tkanki bada się mikroskopowo w kierunku stanu zapalnego, martwicy, krwotoku i zmian. Próbki krwi pobiera się również bezpośrednio przed pierwszym podaniem badanej substancji oraz w momencie zabicia w celu badania hematologicznego i badań chemicznych surowicy.

P r z y k ł a d 9. Badania kliniczne

Ciekłe formulacje według wynalazku różnią się istotnie od znanych formulacji interferonu. Dla każdego ze wskazań klinicznych istnieje możliwość zmiany zachowania farmakokinetycznego i farmakodynamicznego interferonu podczas podawania ludziom. Niestety, działanie interferonu beta jest silnie swoiste gatunkowo i większość informacji farmakologicznych pochodzi z badań na komórkach ludzkich w hodowli, badań na ludziach oraz w mniejszym stopniu na rezusach. Korzystnym sposobem badania zmian farmakologicznych, o ile występują, jest przeprowadzenie na ludziach badań równoważności biologicznej.

Przeciwwirusowe poziomy interferonu beta w surowicy można oznaczać ilościowo biologicznym testem efektu cytopatycznemu (CPE), jak to opisano przykładowo w przykładzie 1. Badanie równoważności biologicznej na ludziach można przeprowadzić przy użyciu dowolnej liczby ciekłych i liofilizowanych formulacji interferonu. Przez analizę parametrów aktywności surowicy, pola pod krzywą (AUC) i CMAX, specjalista w dziedzinie może określić czy formulacje liofilizowane i ciekłe są równoważne biologicznie. Jako jeden z przykładów protokołu badania równoważności biologicznej, opisano pokrótce podwójnie ślepe, skrzyżowane badanie jednej dawki w celu wykazania równoważności biologicznej ciekłej formulacji według wynalazku i liofilizowanego produktu interferonu beta na zdrowych osobnikach.

Projekt

Każdy osobnik otrzymuje tę samą dawkę (np. 60 mg/12 MU) formulacji interferonu beta w podwójnie ślepej, skrzyżowanej próbie obejmującej dwa okresy (tabela 4). Osobnicy byli w wieku od 18 do 45 lat, w zakresie 15% włącznie normalnego zakresu ciężaru ciała w oparciu o wysokość i budowę. Próbki krwi do badań hematologicznych, chemicznych, aktywności interferonu beta w surowicy i profili farmakodynamicznych pobiera się bezpośrednio przed i w różnych okresach czasu po każdej dawce, w ciągu 144 godzin po podaniu. Prowadzi się również ocenę bólu w miejscu wstrzyknięcia i reakcji miejscowej w tym miejscu.

Przeprowadzenie badania

Jako profilaktykę przeciwko zespołowi grypowemu związanemu z podaniem interferonu, wszyscy osobnicy otrzymują acetaminofen bezpośrednio przed i podczas podawania.

Farmakokinetyka

Oznaczanie interferonu-β w surowicy

Poziomy w surowicy mierzono w jednostkach aktywności przeciwwirusowej w próbie CPE. Poziomy tej aktywności w surowicy analizowano na AUC, CMAX i TMAX. Wartości AUC oblicza się z czasu dozowania do ostatniego wykrywalnego poziomu (AUC0-T) i przez 144 godziny po dozowaniu (AUC0-144).

Przeprowadzono standardową analizę opisową danych stosując SAS (wersja 6.08, SAS Institute, Gary, North Carolina).

PL 193 447 B1

T a b e l a 5

Schemat dawkowania w przykładowym badaniu

Grupa	Sposób	Dawka (MU)	Cykl traktowania 1	Cykl traktowania 2
1	IM	12	Liofilizowana (60 mcg)	Ciekła (60 mcg)
2	IM	12	Ciekła (60 mcg)	Liofilizowana (60 mcg)

Farmakodynamika

Scharakteryzowano marker biologiczny, neopterynę, produkt enzymu cyklohydrolazy GTP indukowanej interferonem, która odzwierciedla aktywację makrofagów i limfocytów T (C. Huber i in., J. Exp. Med., 1984; 160, 310-314), 20 września, 1996; D. Fucks i in., Immunol. Today, 9, 150-155, 1988). Zarówno w badaniach nie klinicznych, jak i klinicznych rekombinantowego ludzkiego interferonu-β, indukcja neopteryny koreluje z poziomami aktywności w surowicy po podaniu różnych rekombinantowych interferonów-β.

Poziom neopteryny mierzy się stosując standardowe procedury laboratoryjne. Profil farkodynamiczny interferonu-β jest opisany w sposób ilościowy przez obliczenie trzech parametrów neopteryny w surowicy. Pierwszym parametrem, EAUC, jest pole powierzchni pod krzywą poziomu neopteryny w funkcji czasu, znormalizowaną do poziomu podstawowego. Drugi parametr, Emax, jest to różnica pomiędzy obserwowanym poziomem szczytowym neopteryny i poziomem podstawowym. Trzeci parametr jest to stosunek indukcji, IR; ten parametr oblicza się jako poziom szczytowy neopteryny podzielony przez poziom podstawowy.

Statystyka

Do określenia równoważności stosowano procedurę dwu- i jednostronnych testów Wilcoxon-Manu-Whitney na AUC. W celu ocenienia względnej biodostępności interferonu z ciekłej formulacji w stosunku do liofilizowanej formulacji i jej 90% granic zaufania, AUC poddano analizie wariancji (ANOVA) po transformacji logarytmicznej. Z wariacji „between-subject” wyizolowano sekwencje i rodzaje. Z wariacji „within-subjects” wyizolowano składniki z różnych cykli traktowania.

Ekwiwalenty

Inne wykonania i zastosowania wynalazku będą oczywiste dla specjalisty na podstawie opisu i ujawnionej praktycznej realizacji wynalazku. Ujawnienie w opisie i w przykładach należy traktować jako podane tylko przykładowo, natomiast zakres ochrony i istota wynalazku zostały przedstawione w zastrzeżeniach patentowych.

Claims (66)

1. Kompozycja interferonu, zawarta w pojemniku, znamienna tym, że jest ciekła i (1) zawiera aminokwasowy czynnik stabilizujący, wybrany z grupy obejmującej kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, argininę i glicynę, przy czym aminokwasowy czynnik stabilizujący jest obecny w ilości 0,3%-5% wag./objęt.; (2) kompozycja nie została ukonstytuowana ponownie z liofilizowanego interferonu i (3) kompozycja dalej nie jest liofilizowana, przy czym pojemnik charakteryzuje się tym, że co najmniej jedna jego powierzchnia będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest powleczona materiałem obojętnym wobec interferonu.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że aminokwasowy czynnik stabilizujący jest wybrany z argininy i glicyny, przy czym ciekła kompozycja nie obejmuje albuminy surowiczej.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że interferonem jest interferon-β lub interferon wytworzony metodą rekombinacji.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ma pH w zakresie od 4,0 do 7,2.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że ma pH w zakresie 4,8 do 5,2.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że ma pH 5,0.

7. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że aminokwasowym czynnikiem stabilizującym jest kwas glutaminowy.

8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że argininą jest chlorowodorek argininy.

9. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stężenie interferonu jest w zakresie od 6 MIU do 50 MIU.

PL 193 447 B1

10. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stężenie interferonu jest w zakresie od 6 MIU do 50 MIU na dawkę.

11. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wymieniona co najmniej jedna powierzchnia pojemnika jest pokryta materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że pojemnikiem jest strzykawka.

13. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto zawiera bufor o pH 5,0, przy czym interferon stanowi interferon-β, a aminokwasowy czynnik stabilizujący stanowi 170 mM kwas L-glutaminowy.

14. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera dodatkowo sól, a aminokwasowy czynnik stabilizujący stanowi glicynę.

15. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że zawiera dodatkowo co najmniej jeden składnik wybrany z grupy składającej się z 15 mg/ml ludzkiej albuminy surowiczej i 0,1% (wag./obj.) surfaktanta, stanowiącego dwufunkcyjny kopolimer blokowy kończący się pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi (Pluronic F 68).

16. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo zawiera 20 mM buforu fosforanowego o pH 7,2, przy czym interferon stanowi interferon-β, a czynnik stabilizujący jest wybrany z grupy składającej się z: (a) 140 mM argininy i (b) 100 mM chlorku sodu łącznie z 70 mM glicyny.

17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, co najmniej jedna powierzchnia pojemnika będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest powleczona materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

18. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że pojemnikiem jest strzykawka.

19. Kompozycja według zastrz, 1, znamienna tym, że dodatkowo zawiera bufor utrzymujący pH w zakresie 4,0 do 6,0, przy czym ciekła kompozycja jest odpowiednia do pozajelitowego po dawania ssakom, a materiał obojętny wobec interferonu jest wybrany z grupy obejmującej silikon i politetrafluoroetylen, zaś interferon stanowi interferon-β.

20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że w naczyniu do przechowywania nie ma granicy faz między gazem zawierającym tlen i cieczą.

21. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że interferon-β nie był poddany kawitacji wcześniej ani podczas przechowywania w naczyniu.

22. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że buforem jest organiczny bufor kwasowy wybrany z grupy składającej się z buforu cytrynianowego, bursztynianowego, winowego, fumaranowego, glukonianowego, szczawianowego, mleczanowego i octanowego.

23. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że jej pH jest w zakresie 4,5 do 5,5.

24. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że jej pH wynosi 5,0.

25. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że jest jałowa.

26. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że jest izotoniczna z krwią.

27. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że interferon-β jest ludzkim rekombinantowym interferonem-β.

28. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że aktywność ludzkiego rekombinantowego interferonu-β jest w za kresie 6 do 50 MIU.

29. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera aminokwasowy czynnik stabilizujący w ilości 0,3% do 3,13% wag./obj et., przy czym ciekła kompozycja jest zamrożona.

30. Kompozycja farmaceutyczna interferonu, zawarta w pojemniku, znamienna tym, że jest ciekła i (1) zawiera (a) bufor octanowy i (b) argininę, przy czym kompozycja ma pH 4,0 do 6,0; i (2) kompozycja farmaceutyczna nie obejmuje albuminy surowiczej, przy czym pojemnik charakteryzuje się tym, że ma co najmniej jedną powierzchnię będącą w kontakcie z ciekłą kompozycją powleczoną materiałem obojętnym wobec interferonu, wybranym z grupy obejmującej silikon i politetrafluoroetylen.

31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 30, znamienna tym, że argininę stanowi chlorowodorek argininy.

32. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że interferonem jest interferon-β.

33. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 32, znamienna tym, że interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU.

34. Kompozycja według zastrz. 32, znamienna tym, że interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU na dawkę.

PL 193 447 B1

35. Kompozycja według zastrz. 30, znamienna tym, że bufor octanowy jest obecny w stężeniu 20 mM.

36. Kompozycja według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że arginina lub chlorowodorek argininy jest obecny w stężeniu 0,3% do 5% wag./objęt.

37. Kompozycja według zastrz. 30, znamienna tym, że dodatkowo zawiera surfaktant.

38. Kompozycja według zastrz. 37, znamienna tym, że surfaktant stanowi 0,1% wag./objęt. surfaktanta, stanowiącego dwufunkcyjny kopolimer blokowy kończący się pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi (Pluronic F 68).

39. Kompozycja według zastrz. 30, znamienna tym, że ta ciekła kompozycja ma rozpuszczony tlen, którego poziom jest niższy niż 30% poziomów równowagi atmosferycznej.

40. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że ma rozpuszczony tlen, którego poziom jest niższy lub równy 10% poziomów równowagi atmosferycznej.

41. Sposób stabilizowania kompozycji interferonu, zawartej w pojemniku, znamienny tym, że kompozycja jest ciekła, a sposób obejmuje (1) wytworzenie ciekłej kompozycji przez zmieszanie: a) interferonu, który nie został ukonstytuowany ponownie z liofilizowanego interferonu, b) buforu i c) aminokwasowego czynnika stabilizującego, wybranego z grupy obejmującej kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, argininę i glicynę, przy czym aminokwasowy czynnik stabilizujący jest obecny w stężeniu 0,3%-5% wag./objęt., a ciekła kompozycja dalej nie jest liofilizowana i (2) umieszczenie ciekłej kompozycji w pojemniku, którego co najmniej jedna powierzchnia będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest powleczona materiałem obojętnym wobec interferonu.

42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że aminokwasowy czynnik stabilizujący jest wybrany z argininy i glicyny, przy czym sposób nie obejmuje domieszania albuminy surowiczej.

43. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że interferon-β nie był poddany kawitacji wcześniej, ani podczas przechowywania w pojemniku.

44. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że interferonem jest interferon-β lub interferon wytworzony metodą rekombinacji.

45. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że bufor ma pH w zakresie od 4,0 do 7,2.

46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że bufor ma pH w zakresie 4,8 do 5,2.

47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że bufor ma pH 5,0.

48. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że argininą jest chlorowodorek argininy.

49. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że stężenie interferonu jest w zakresie od 6 MIU do 50 MIU.

50. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że co najmniej jedna powierzchnia pojemnika jest pokryta materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

51. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że pojemnikiem jest strzykawka.

52. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że kompozycja dodatkowo zawiera 20 mM buforu fosforanowego o pH 7,2, a czynnik stabilizujący jest wybrany z grupy składającej się z: (a) 140 mM argininy i (b) 100 mM chlorku sodu łącznie z 70 mM glicyny.

53. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że co najmniej jedna powierzchnia pojemnika, będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją farmaceutyczną, jest powleczona materiałem wybranym z grupy składającej się z silikonu i politetrafluoroetylenu.

54. Sposób według zastrz. 53, znamienny tym, że pojemnikiem jest strzykawka.

55. Sposób stabilizowania kompozycji interferonu-β, zawartej w pojemniku, znamienny tym, że kompozycja jest ciekła, a sposób obejmuje (1) wytworzenie ciekłej kompozycji przez zmieszanie: a) interferonu-β, który nie został ukonstytuowany ponownie z liofilizowanego interferonu, b) buforu octanowego i c) argininy, przy czym ciekła kompozycja farmaceutyczna ma pH 4,0 do 7,2, a ciekła kompozycja dalej nie jest liofilizowana i (2) umieszczenie ciekłej kompozycji w pojemniku, którego co najmniej jedna powierzchnia będąca w kontakcie z ciekłą kompozycją jest powleczona materiałem sprawiającym, że powierzchnia, chemicznie lub fizycznie, jest obojętna na adsorpcję interferonu.

56. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że argininę stanowi chlorowodorek argininy.

57. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU.

58. Sposób według zastrz. 57, znamienny tym, że interferon jest obecny w stężeniu od 6 MIU do 50 MIU na dawkę.

59. Sposób według zastrz. 55 albo 56, znamienny tym, że bufor octanowy jest obecny w stężeniu 20 mM.

PL 193 447 B1

60. Sposób według zastrz. 55 albo 56, znamienny tym, że arginina lub chlorowodorek argininy jest obecny w stężeniu 0,3% do 5% wag./objęt.

61. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje domieszanie surfaktanta.

62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że surfaktant stanowi 0,1% wag./objęt. surfaktanta będącego dwufunkcyjnym kopolimerem blokowym kończącym się pierwszorzędowymi grupami hydroksylowymi (Pluronic F 68).

63. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że nie obejmuje domieszania albuminy surowiczej.

64. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że interferon-β nie był poddany kawitacji wcześniej, ani podczas przechowywania w pojemniku.

65. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że między ciekłą kompozycja farmaceutyczną i pojemnikiem nie ma zawierającej tlen ciekłej granicy faz.

66. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że interferonem jest interferon-β.