JPS63196268A - 無血清培地で継代増殖可能な形質転換細胞、その育種方法およびその細胞による蛋白質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は有用蛋白質をコードする遺伝子が導入され、有
用蛋白質を生産する無血清培地で継代増殖可能な形質転
換細胞、およびその細胞の育種方法、ならびにその細胞
を用いた有用蛋白質の生産方法に関する。

「従来技術」 動物細胞の大量培養はウィルス、ワクチンの製造のため
、ならびに白血球やハイブリドーマよりインターフェロ
ンやモノクローナル抗体生産等のために実施されてきた
。また、近年遺伝子組み換え技術の進展にともない、大
腸菌や枯草菌等の細菌を宿主として生産される蛋白質と
は異なり、グリコシレーシランや各種の修飾等、生体中
に存在する天然の型として生産される等の多くの利点を
有していることから、動物細胞を宿主とした有用蛋白質
の生産が注目され、大量培養技術の重要性が高まってい
る。

動物細胞大量培養による有用物質生産上の問題点の１つ
に、動物細胞の到達密度が低いことが挙げられる。この
点の解決法の１つとして、培地潅流による高密度培養法
があり、種々の装置が開発されている（Ｗ、Ｒ，Ｔｏｌ
ｂｅｒｔら、インビトロ（ＩｎＶｉｔｒｏ）　、１７巻
、１０号、８８５頁、１９８１年、特開昭６Ｏ−９４８
２）、また、培地中の律速成分を探索し、律速アミノ酸
等を補足することにより、細胞密度の向上をはかる試み
もなされている（特開昭６Ｏ−５４６７７）。

第２の問題点は、動物細胞の生育には糖、アミノ酸、ビ
タミン、核酸等を含む基礎培地に５〜２０％の血清を必
要とすることである。血清は高価であり培地コストの大
半を占めるだけでなく、多種多用の蛋白質が含まれ、目
的蛋白質の精製を複雑にする。更に、血清はロフト毎に
品質が異なり、細胞増殖への影響も大きく、ウィルスや
マイコプラズマの汚染源となる可能性も考えられる。

一方、血清の役割は細胞にホルモンや成長因子を供給す
るという観点から、無血清化の試みも多くなされている
〔Ｇ、５ａｔＯｓアナリテイカル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｅｉｓｔｒｙ
）　　１０２巻、２５５頁、１９８０年〕、無血清培養
に使用されているホルモンや成長因子としては、ハイド
ロコーチシン、′Ｔ３、インスリン、トランスフェリン
、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来
成長因子等が挙げられるが、種類および作用については
細胞成長因子（日本組織培養学会線、朝食書店１９８４
年）に詳しく記載されている。また、新たな成長因子の
探索もなされており、成牛血清より抽出された成長促進
因子（特開昭５８−２０６５２８）、馬血清由来の成長
促進因子（特開昭６ｌ−６３２８１）および植物細胞由
来の成長因子（「発酵と工業」４３巻、１１号、１０７
６頁、１９８５年）等が報告されている。

無血清培養のため必要とされる成長因子は、個々の細胞
により異なり、種々成長因子を組み合わせた無血清培地
が数多く報告されている０例えばＣＨＯ細胞はインスリ
ン、トランスフェリン、セレン〔インビトロ、セルラー
・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー（Ｉｎ　
Ｖｉｔｒｏ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　２１巻、１０号、５８
８真、１９８５年）、Ｈｅ１ａ細胞はインスリン、ハイ
ドロコーチシン、トランスフェリン、上皮細胞成長因子
、繊維芽細胞成長因子〔プロシーディンゲス・オブ・ナ
ショナルアカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　　７５巻、
２号、９０１頁、１９７８年）、ＢＨＫ細胞はインスリ
ン、繊維芽細胞成長因子、ファイプロネクチン、トラン
スフェリン、オレイン酸〔ジャーナル・オプ・セルラー
・フィジオロジ−（Ｊｏ−ｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃｅ１ｌ
ｕｌａｒ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）　　１１４巻、２１
５頁、１９８３年〕の組み合わせによる無血清培地が報
告されている。有用蛋白質生産細胞を無血清培地で培養
した例としてモノクローナル抗体生産マウスハイブリド
ーマ（特開昭５８−６３３８５）やインターフェロン−
α産生ヒトバーキット腫瘍由来ナマルバ細胞の馴養によ
る無血清化（「組織培養」９巻、２８６頁、１９８３年
）等が知られている。これらは、いづれも融合細胞やい
わゆる自発生産細胞の例である。一方、遺伝子組み換え
技術により、いかなる細胞でも有用蛋白質の生産が可能
となってきている。例えば、Ｌ細胞を宿主としたインタ
ーフェロン−βの生産（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７９巻
、５１６６頁、１９８２年〕、ＣＨＯ細胞を宿主とした
インターフェロン−γ〔ジャーナル・オブ・インターフ
ェロン６リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｎｔｅｒ
４ｅｒｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃ−ｈ）　　４巻、４６１頁
、１９８４年〕やＴＰＡの生産（特開昭５９−４２３２
１）およびＣ１２７細胞を宿主としたヒト成長ホルモン
の生産（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０巻、３
９７頁、１９８３年〕等動物細胞を用いた有用蛋白質の
多くの生産例がある。しかし、これら遺伝子組み換え技
術により作製した生産株の培養には、すべて血清が使用
されており、前記の如く、コスト、精製面等に問題を有
しており、無血清培地での培養が望まれる。しかし、形
質転換株の取得後、無血清化に際しては更に多くの時間
と労力を必要とするとともに、無血清化も困難である場
合も推定され、形質転換した有用蛋白質生産細胞の無血
清培地での培養は実施されていない。

「本発明が解決しようとする問題点」 遺伝子組み換え技術による動物細胞を宿主とした有用蛋
白質の生産では、生産性の増大をはかるための種々の試
みがなされている０例えば、ＣＨＯ細胞でのメソトレキ
セート（ＭＴＸ）耐性によるジヒドロ葉酸還元酵素（ｄ
　ｈ　ｆ　ｒ”）遺伝子の増幅法により、目的蛋白質が
細胞１０６個当たり５０μｇの生産が報告されている（
特開昭５９−４２３２１）、Ｌかし、動物細胞を用いた
物質生産では、単に生産性の向上をはかる育種ではなく
、無血清培養可能な生産細胞を選択することも同様に重
要である。

血清中には多種多様の成分が含まれており、血清培地で
継代されている細胞は同−株であっても全てのクローン
が同じ要求性を有しているとは限らず、また無血清化し
た細胞を宿主とし有用蛋白質をコードする遺伝子を導入
しても、血清培地で選択ｉれば、選択中に要求性が変化
し、血清要求性を生じることが推定される。特に、現在
高生産株の育種法としてよく用いられているメソトロキ
セート（ＭＴＸ）によるジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆ
ｒ）遺伝子の増幅法ではメソトレキセートの濃度を段階
的に上げて選択するため、血清要求性を有する細胞とな
る確立は高いと思われる。

事実、高生産株取得後宿主細胞を無血清化しうる条件で
は高生産株の無血清化は困難であった。

「問題点を解決するための手段」 本発明者らは上記実情に鑑み、有用蛋白質を生産し、か
つ無血清培養可能な細胞を得るために鋭意検討した結果
、宿主細胞を無血清化しうる成長因子の添加と選択に適
した基礎培地を探索し、無血清培地で細胞の選択を行っ
た結果、無血清培養可能な生産株を取得しうろことが明
らかになった。

無血清培地に使用する成長因子は特に限定されず、細胞
の種類により、インスリン等単独の場合や、他にトラン
スフェリン、繊維芽細胞成長因子、上皮細胞成長因子、
血小板由来成長因子等を組み合わせても可能である。ま
た、糖、アミノ酸、ビタミン、核酸等を含む基礎培地は
、動物細胞用の一般的な培地であるＭＥＭ培地、ダルベ
ツコ変法ＭＥＭ培地、１９９培地、ＲＰＭ１１６４０培
地、ハムＦ１２培地、ＭＣＤＢ培地等の単独もしくは混
合培地が使用されるが、細胞の選択条件によっては、基
礎培地の検討を必要とする０例えば、メントレキセート
（ＭＥＸ）により、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）
遺伝子増幅をはかる場合、一般的には核酸不含のαＭＥ
Ｍ培地がよく用いられるが、無血清培地による選択の場
合、核酸不含で、かつ細胞の増殖良好な基礎培地の使用
により、好結果を得ることができる。基礎培地の種類、
組成については〔メソフシ・イン・エンザイモロジ−（
Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｓ＾ｃａｄ
ｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ　５８巻、６２頁、１９７９年〕
に詳しく記載されている。

形質転換細胞を選別するに必要な蛋白質をコードする遺
伝子としては、大腸菌由来のＥｃｏｇｐｔをコードする
遺伝子（Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ＋　Ｐ、Ｂｅｒｇ、
＋　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７８巻
、２０７２頁、１９８１年〕、細菌のトランスポゾン（
Ｔｎ）５由来のＮｅｏ遺伝子（Ｐ、Ｊ、５ｏｕｔｈｅｒ
ｒ＋＋　Ｐ、Ｂｅｒｇ、　　（ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・アンド・アプライド・ジエネテイクス（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ　ａ−ｎｄ　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　１巻、３２７頁、
１９８２年〕、チミジンキナーゼ（ｔｋ）欠損宿主に対
するヘルペスウィルス由来のｔｋ遺伝子ＣＭ、Ｗｉｇｌ
ｅｒら、セル（Ｃｅｌｌ）　、１１ｉ８．２２３頁、１
９７７年〕、その他形質転換株を選別可能ならばいかな
る遺伝子でも使用可能である。同様にジヒドロ葉酸還元
酵素（ｄｈｆｒ）をコードする遺伝子はマウスｄｈｆｒ
ｃＤＮＡ以外に他の動物由来の遺伝子でも、染色体由来
の遺伝子であっても何らさしつかえない。

動物細胞へのＤＮＡ導入法としてはリン酸カルシウム法
ＣＭＪｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　、　１１巻、２２３頁
、１９７７年〕、マイクロインジェクション法（Ｗ、Ｆ
、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７７巻、５３９９頁、１９８０年〕、細胞融合法（Ｗ、
５ｃｈｏｆｆｎｅｒ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７７巻、２１６３頁、１９
８０年〕等が用いられる。

「発明の効果」 本発明により得られた無血清培養可能なを用蛋白質生産
細胞は、実施例に示す如く大量培養も可能であり、また
ＣＨＯ細胞等のように通常血清培地では付着して生育す
る細胞が、白血球由来細胞と同様に浮遊状態で生育する
ため、大量培養では浮遊培養可能な細胞が得られること
が判明した。

また、本発明により、無血清培養可能な有用蛋白質生産
細胞が確実に取得でき、実施例に示す如く、培養上清中
の有用蛋白質は高純度で得られ、産業上、コスト、精製
面でより有利な方法を提供するものである。

「実施例」 以下、本発明を実施例を挙げて説明する。

本発明の具体例としてＣＨＯ細胞を記載するが、工業的
に有用な可能性をもつ細胞として、ＢＨＫ。

Ｖｅｒｏ、ＣＥＭ、ナマルバ等その他多数の細胞があり
、本発明は例示細胞に限定されるわけではない。さらに
有用蛋白質の例として、インターフェロン−γ、ティッ
シュプラスミノーゲンアクティベーター、リンフォトキ
シンを実施例として記載するが、勿論代表例であり、例
えばエリスロボエチン、インターロイキン−２、インタ
ーフシロン−β、コロニー刺激因子、その他であっても
何らさしつかえない。

実施例１：インターフェロンーＴ生産形質転換株の取得 宿主細胞は基礎培地ＭＣＤＢ３０２／ダルベツコＭＥＭ
Ｉ／１の混合培地（ＭＤ培地）にインスリン５μｇ　／
　ｍ　１を加えた無血清培地に馴養したＣＨＯ−Ｋ　Ｉ
細胞を用いた。Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子、ｄｈｆ　ｒ遺伝子
、インターフェロン−Ｔ遺伝子をもつベクターｐｓＶｅ
ｄｈｆｒ−ｒ２　（特願昭６Ｏ−２６０４５０）　、Ｄ
ＮＡ１００μｇを細胞数ｌＸｌ０’個のＣＨＯ細胞にリ
ン酸カルシウム法でトランスフェクションした。インス
リン５μｇ／　ｍ　１を含むＭＤ培地で細胞数１×１０
Ｓ個／ｍｌに調製し、２５μｇ　／　ｍ　ｊ！のミコフ
ェノール酸、２５（Ｊｕｇ／ｍＡ！のキサンチン、０．
１μｇ／ｍｊ２のアミノブチリン、５μｇ　／　ｍ　Ｉ
ｔのチミジンおよび２５μｇ　／　ｍ　Ｊのアデニンを
加え、コーニング社製９６Ｗｅ　１１マルチプレート（
Ｎｏ、２５８６０）に１００．ｃ＋ｊ！／Ｗｅｌ１分注
し、３７℃、５％ＣＯ，インキュベークー中で培養した
。細胞が生育したＷｅｌｌの上演中のインターフェロン
−γ活性を測定し、無血清培養可能なインターフェロン
１５００ｕ／ｍｊ！産生する形質転換株を取得した。

インターフェロン−Ｔ活性の検定はＦＬ細胞に対するシ
ンドビスウィルスの細胞変性効果の阻害によって調べ（
特開昭５９−１１９６４８号参照）、標準インターフェ
ロンサンプル（Ｇｇ２３９０１−５３０）を用いて行っ
た。

実施例２：無血清培養可能なインターフェロン−Ｔ高生
産株の取得 実施例１で得られた無血清培養可能な形質転換株を、メ
ソトレキセート（ＭＴＸ）５００　ｎＭを含むＭＤ培地
（＋インスリン５μｇ　／　ｍ　１　）で、細胞数１０
″〜１０４個／ｍｌに調製し、９６Ｗｅｌ＋マルチプレ
ートに１００μｊ！／Ｗｅ１１分注シ、３７℃、５％Ｃ
Ｏｔインキュベーター中で培養した。３〜４日後にＭＴ
Ｘ５００ｎＭを含む無血清培地を１００μｊ！／Ｗｅｌ
ｌ添加し、以後３日毎ＭＴＸ耐性株が生育するまで１０
０μｍ／Ｗｅｌｌ培地交換を行った。出現したＭＴＸ耐
性株のインターフェロン生産量を測定し、更にＭＴＸ　
ｔａ度１５００ｎＭで上記と同様に耐性株を取得した。

インターフェロン−γアッセイの結果、無血清培養可能
なインターフェロン−γ３０万Ｕ／ｍ！以上の生産株Ｃ
ＨＯ−５９０株を取得した（第１図）。

実施例３：培養上清中のインターフェロン−γの純度 実施例２で得られたインターフェロン−γ生産株ＣＨＯ
−５９０を血清、無血清培地で培養し、培養５日目のイ
ンターフェロン−γ、蛋白質を測定し比活性を求め、ま
た培養上清のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行っ
た。蛋白定量はＢｉｏｒａｄプロテインアフセイキット
を用いた。

実施例４：大量培養 実施例２に示したインターフェロン生産細胞ＣＨＯ−５
９０株のミニジャー培養を行った。種細胞は３７℃、５
％ＣＯ，インキュベーター中で作製した。容ｆｉ３Ｊの
ミニジャーにインスリン５μｇ　／　ｍ　１含有ＲＤＦ
培地（ＲＰＭ１１６４０／ダルベツコ変法ＭＥＭ／ハム
Ｆ＋ｔ＝２／１／１）をｌ１分注し、種細胞を接種した
。

ＣＨＯ−５９０株は浮遊培養可能であり、温度３７℃、
ｐ　Ｈ７，０で培地潅流培養を行った。培地潅流速度は
細胞密度向上にともない増加させた（第２図）。

実施例５：無血清培養可能なリンフォトキシン高生産株
の取得 Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子ｄｈｆｒ遺伝子リンフォトキシン遺
伝子をもつベクターｐｓＶｅＬＴｄｈｆｒ（特願昭６１
−２３６３７）ＤＮＡＧＣＨＯ細胞にリン酸カルシウム
法でトランスフェクションした。無血清培地を用い実施
例１と同様に形質転換株を選択した。細胞が生育したＷ
ｅｌｌの培養上清中のリンフォトキシン活性を測定し、
リンフォトキシン産生形質転換株を取得した。

形質転換株を実施例２と同様に無血清培地中でメソトレ
キセート（ＭＴＸ）選択を行った。ＭＴＸ２５０ｎＭで
得られた増幅株を更にＭＴＸＩＯｏｏｎＭで選択するこ
とにより、リンフォトキシン１８万ｕ　／　ｍ　ｊ！の
無血清培養可能な細胞株が得られた。

実施例６：無血清培養可能なティッシュプラスミノーゲ
ンアクティベーター（Ｔ　Ｐ　Ａ）高生産株の取得 Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子、ＴＰＡ遺伝子を
もつベクターｐＳＶｅＰＡ−３（特願昭６ｌ−９７４８
１）ＤＮＡを、ＣＨＯ細胞ニリン酸カルシウム法でトラ
ンスフエフシランした。実施例１と同様に無血清培地で
選択し、ＴＰＡ活性の測定によりＴＰＡ産生形質転換株
を得た。

形質転換株を実施例２と同様に、無血清培地中でＭＴＸ
選択を行った。ＭＴＸ？ｎ度２５０ｎＭ。

７５０ｎＭ、２０００ｎＭでの３回の増幅により、ＴＰ
Ａ１４００ｕ／ｍ１を産生ずる無血清培養株が得られた
。

【図面の簡単な説明】

第１図はＣＨＯ−５９０株の無血清培地の生育およびＩ
ＦＮ−ｒ産生曲線、第２図はＣＨＯ−５９０株を用いた
ミニジャー培養でのＩＦＮ−γの生産曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有用蛋白質をコードする遺伝子が導入された、無血
   清培地で継代増殖可能な形質転換細胞。 ２、宿主細胞が無血清培地で継代増殖可能な細胞である
   特許請求の範囲第１項記載の細胞。 ３、宿主細胞がＣＨＯ、Ｈｅｌａ細胞、もしくはこれら
   の細胞から派生した細胞である特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載の細胞。 ４、有用蛋白質がインターフェロン−γ、ティッシュプ
   ラスミノゲンアクティベーターもしくはリンフォトキシ
   ンである特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載
   の細胞。 ５、有用蛋白質をコードする遺伝子が導入された細胞を
   、無血清培地で選択することにより無血清培地で継代増
   殖可能な形質転換細胞を育種する方法。 ６、宿主細胞が無血清培地で継代増殖可能な細胞である
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、宿主細胞がＣＨＯ、Ｈｅｌａ細胞、もしくはこれら
   の細胞から派生した細胞である特許請求の範囲第５項又
   は第６項記載の方法。 ８、有用蛋白質がインターフェロン−γ、ティッシュプ
   ラスミノゲンアクティベーターもしくはリンフォトキシ
   ンである特許請求の範囲第５項、第６項又は第７項記載
   の方法。 ９、有用蛋白質をコードする遺伝子が導入された、無血
   清培地で継代増殖可能な形質転換細胞を無血清培地で培
   養し有用蛋白質を生産する方法。 １０、宿主細胞が無血清培地で継代増殖可能な細胞であ
   る特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、宿主細胞がＣＨＯ、Ｈｅｌａ細胞、もしくはこれ
   らの細胞から派生した細胞である特許請求の範囲第９項
   又は第１０項記載の方法。 １２、有用蛋白質がインターフェロン−γ、ティッシュ
   プラスミノゲンアクティベーターもしくはリンフォトキ
   シンである特許請求の範囲第９項、第１０項又は第１１
   項記載の方法。