DE102009032179A1 - Verfahren zur Reinigung von Interferon beta - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von Interferon beta Download PDFInfo
- Publication number
- DE102009032179A1 DE102009032179A1 DE102009032179A DE102009032179A DE102009032179A1 DE 102009032179 A1 DE102009032179 A1 DE 102009032179A1 DE 102009032179 A DE102009032179 A DE 102009032179A DE 102009032179 A DE102009032179 A DE 102009032179A DE 102009032179 A1 DE102009032179 A1 DE 102009032179A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- ifn
- chromatography
- hydrophobic interaction
- affinity chromatography
- formulation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims abstract description 144
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 20
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title abstract description 9
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 title abstract description 8
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims abstract description 135
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 60
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 48
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 86
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 54
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 43
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 38
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 30
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 30
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 28
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 25
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 23
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 22
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 20
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 claims description 18
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 16
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 16
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 claims description 14
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 13
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 13
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 claims description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 7
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 7
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 7
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 claims description 5
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 241001631457 Cannula Species 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 229920000840 ethylene tetrafluoroethylene copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001307 helium Substances 0.000 claims description 4
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 claims description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 2
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 claims 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 claims 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 23
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 14
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 14
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 11
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 11
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 11
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 9
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 3
- 229920002556 Polyethylene Glycol 300 Polymers 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 238000005325 percolation Methods 0.000 description 3
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 3
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 3
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 3
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 2
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BUHVIAUBTBOHAG-FOYDDCNASA-N (2r,3r,4s,5r)-2-[6-[[2-(3,5-dimethoxyphenyl)-2-(2-methylphenyl)ethyl]amino]purin-9-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(C(CNC=2C=3N=CN(C=3N=CN=2)[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C=2C(=CC=CC=2)C)=C1 BUHVIAUBTBOHAG-FOYDDCNASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100377807 Arabidopsis thaliana ABCI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012617 Butyl Sepharose™ 4 Fast Flow Substances 0.000 description 1
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920012266 Poly(ether sulfone) PES Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020005719 Species specific proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007397 Species specific proteins Human genes 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminetriacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 238000012948 formulation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K lanthanum(iii) chloride Chemical compound Cl[La](Cl)Cl ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000011100 viral filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinantem humanem glykosilierten Interferon beta (IFN-β), umfassend zwei Affinitätschromatographien mit einer nachfolgenden hydrophoben Interaktionschromatographie sowie vorzugsweise daran anschließend eine Anionenaustauschchromatographie. Das durch das beschriebene Verfahren gewonnene IFN-β zeichnet sich durch eine hohe Reinheit und spezifische biologische Aktivität aus, wodurch es sich insbesondere zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen eignet.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinantem humanem Interferon beta (IFN-β), umfassend mindestens eine Affinitätschromatographie (AC) und mindestens eine hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC). Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Reinigung von glykosilierten IFN-β aus Zellkulturüberstand bzw. einem Gemisch von anderen Proteinen, umfassend zwei Affinitätschromatographien mit einer nachfolgenden hydrophoben Interaktionschromatographie sowie vorzugsweise daran anschließend eine Anionenaustauschchromatographie (AEX).
- Natürlich vorkommende Interferone sind speziesspezifische Proteine, teilweise Glykoproteine, die durch unterschiedliche Zellen des Körpers nach Induktion mit Viren, doppelsträngiger RNA, anderen Polynukleotiden sowie Antigenen erzeugt werden. Interferone besitzen zahlreiche biologische Aktivitäten wie antivirale, antiproliferative sowie immunmodulatorische Eigenschaften. Es sind mindestens drei unterschiedliche Typen humaner Interferone identifiziert worden, welche durch Leukozyten, Lymphozyten, Fibroblasten sowie Zellen des Immunsystems produziert werden und als α-, β-, und γ-Interferone bezeichnet werden. Einzelne Interferontypen können weiterhin in zahlreiche Subtypen unterteilt werden. Natives, menschliches Interferon-β kann durch Superinduktion humaner Fibroblastenzellkulturen mit Poly-IC sowie anschließende Isolierung und Reinigung des Interferon-β durch chromatographische und elektrophoretische Techniken industriell hergestellt werden. Proteine oder Polypeptide, welche dem natürlichen Interferon-β vergleichbare Eigenschaften aufweisen, können auch durch rekombinante DNA-Technologien hergestellt werden; siehe beispielweise die europäischen Patentanmeldungen
EP 028 033 EP 0 041 313 ,EP 070 906 EP 287 075 - Der therapeutische Einsatz von Interferon-β setzt voraus, dass es in ausreichender Menge und höchster Reinheit dargestellt und in eine galenische Zubereitung gebracht wird, die das Protein über längere Zeit unter Erhaltung der molekularen Integrität lagerfähig macht. Interferon-β ist instabil und unterliegt unterschiedlichen Abbaureaktionen. Hierzu gehören insbesondere die Spaltung von Peptidbindungen, Deamidierung, Oxidation des Methionins zu Methioninsulfid, Disulfidaustausch sowie Veränderungen der Zuckerseitenkette bis hin zur Deglykosilierung.
- Das Interferon-β (IFN-β) der Maus unterscheidet sich ganz erheblich von humanem IFN-β. Daher sind die in der zahlreich vorhandenen Literatur zur Reinigung von murinem IFN-β beschriebenen Prinzipien nicht übertragbar und es gibt seit Jahrzehnten intensive Bemühungen Reinigungsprotokolle für IFN-β zu finden und zu verbessern, mit denen sich IFN-β in ausreichender Menge und einer Form isolieren lässt, in der es stabil gelagert und therapeutisch genutzt werden kann. Es gibt zahlreiche Publikationen die verschiedene Reinigungsverfahren für IFN-β beschreiben.
- Die europäische Patentanmeldung
EP 011 435 - Die europäische Patentanmeldung
EP 027 262 - Die europäische Patentanmeldung
EP 041 313 - Die europäischen Patentanmeldungen
EP 094 672 EP 118 808 - Die europäische Patentanmeldung
EP 215 658 - In der europäischen Patentanmeldung
EP 274 900 EP 467 992 - Die europäische Patentanmeldung
EP 529 300 - Die internationale Patentanmeldung
WO98/28007 - Die deutsche Patentanmeldung
DE 30 28 919 beschreibt eine Sequenz von Reinigungsschritten umfassend Affinitätschromatographie und RP-HPLC. - In der deutschen Patentanmeldung
DE 30 39 566 wird die Reinigung von IFN-β u. a. mittels Glas-Adsorption und Metall-Chelat-Chromatographie beschrieben. - Die europäische Patentanmeldung
EP 446 850 - Die Reinigung von IFN-β mittels Immunaffinitätschromatographie ist ebenfalls bekannt; siehe beispielsweise Conradt et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 14600–14605, in der vorangehend eine Anionenaustauschchromatographie durchgeführt wird.
- Ferner ist die Reinigung von IFN-β mittels Lektin-Affinitätschromatographie, insbesondere unter Verwendung von Concanavalin A (ConA), und hydrophobe Interaktionschromatographie an Phenyl-Sepharose beschrieben; siehe beispielseise Carter und Horoszewicz, Pharmacol. Ther. 8 (1980), 359–377 sowie Mikulski et al., Prep. Biochem. 10 1980, 103–119.
- Die Einbeziehung einer Größenausschluss-Gelchromatographie (SEC) mit vorangehender Farbliganden und Metall-Chelat-Affinitätschromatographie ist der Dissertation von Meyer 2000, Fachbereich Chemie der Universität Hannover beschrieben.
- In jüngster Zeit wurde ganz allgemein für die Reinigung von Interferonen die Durchführung einer Kationenaustauschchromatographie an einer festen Matrix bei einem basischeren pH als dem pH, der dem isoelektrischen Punkt (pI) der zu reinigenden Interferone entspricht vorgeschlagen, wobei bei diesem pH die Proteine noch absorbiert bleiben sollen, und die Elution der Proteine durch Erhöhen der Ionenstärke und/oder des pH der wässrigen Pufferlösungen erfolgt; siehe die europäische Patentanmeldung
EP 1 273 592 . - Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Reinigung von biologisch aktiven, rekombinanten humanen IFN-β aufzuzeigen, mit dem IFN-β in zufriedenstellender Reinheit und Ausbeute gewonnen werden kann. Dabei soll das Verfahren möglichst einfach und überschaubar in der Durchführung sein. Wünschenswert ist ein Reinigungsverfahren, das im Routinebetrieb unter GMP (Good Manufacturing Practice, ”Gute Herstellungspraktik”) Aspekten einsetzbar ist und vorzugsweise regulatorischer Akzeptanz (Validierbarkeit, Reproduzierbarkeit) und den biochemischen Besonderheiten (z. B. Hydrophobizität) von IFN-β Rechnung trägt.
- Diese und weitere Aufgaben werden durch das in Anspruch 1 angegebene und in der Beschreibung nebst Beispielen erläuterten Verfahren gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Patentansprüchen sowie nachfolgend beschrieben.
- Es wurde gefunden, dass bei chromatographischer Reinigung von rekombinantem humanem IFN-β mittels Affinitätschromatographie und einer hydrophoben Interaktionschromatographie sowie vorzugsweise einer Anionenaustauschchromatographie eine akzeptable Reinheit des rekombinanten, biologisch aktiven IFN-β bei zufriedenstellender Ausbeute erzielt werden kann. Die Reinheit kann durch Verwendung von Filtrationsschritten weiter gesteigert werden.
- Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Reinigung von rekombinant hergestelltem biologisch aktiven humanem Interferon beta (IFN-β), umfassend mindestens eine Affinitätschromatographie (AC) und mindestens eine hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), wobei diese Chromatographieschritte in beliebiger Reihenfolge unmittelbar aufeinander folgen.
- Als Ausgangsmaterial für die chromatographische Reinigung wird vorzugsweise Zellkulturüberstand oder Zellfraktionen enthaltend IFN-β eingesetzt, das in eine Reinheit überführt werden soll, die seine Verwendung in Form einer pharmazeutischen Zubereitung ermöglicht. Das zur Aufreinigung bestimmte IFN-β ist ein Polypeptid, welches biologische oder/und immunologische Eigenschaften von natürlichem humanem Interferon-β aufweist und ein natürlich vorkommendes oder rekombinantes Interferon-β sein kann. Vorzugsweise handelt es sich um ein glykosiliertes IFN-β, besonders bevorzugt um rekombinantes IFN-β aus eukaryotischen Wirtszellen, vorzugsweise CHO-Zellen. Am meisten bevorzugt werden IFN-β Spezies verwendet, wie sie aus der Zelllinie BIC 8622 (ECACC 87 04 03 01) erhältlich sind und beispielsweise in den europäischen Patentanmeldungen
EP 287 075 EP 529 300 - IFN-β (früher: Fibroblasten-Interferon) ist ein Sialo-Glykoprotein mit 166 aa, Mr = 22–22.5 kD (Polypeptid = 18.5 kD), einer N-Glykosilierung an Position 80 (Asn80) mit durchschnittlich zwei Sialinsäuren/Mol (95% biantennär), drei Cysteinen davon eine intramolekulare Disulfidbrücke (Cys31–Cys141) sowie ein freies Cystein (C17). Die Ausbildung der Disulfidbrücke ist essentiell für die biologische Aktivität. Das Protein besitzt 40% hydrophobe Aminosäuren und ist extrem hydrophob (unlöslich). Der pI ist leicht basisch (7.8–8.9). Die Aminosäuresequenz zeigt 4 Histidine in Position 93, 97, 121 und 131. Dies erklärt die gute Bindung an Me++Liganden.
- Die spezifische Aktivität von gereinigtem IFN-β sollte mindestens 2 × 108 IU/mg betragen. Es wurden auch IFN-β Präparationen beschrieben, die hohe triantennäre (> 25%) und zusätzlich tetraantennäre Glykosilierung (> 5%) besitzen und dann eine spezifische Aktivität von bis zu 3 × 108 IU/mg und mehr aufweisen können. Zwei wesentliche biologische Aktivitäten von IFN-β, die gemessen werden können sind dessen antivirale und antiproliferative Wirkung. Die Messung der biologischen Aktivität nach der jeweils gewählten kann durch die Standardmethode der Inhibierung des zytopathischen Effekts eines Virus erfolgen. Eine genaue Beschreibung der verwendeten Testmethode findet sich bei Stewart, W. E. 11 (1981): The Interferon System (Second, enlarged Edition), Springer-Verlag: Wien, New York; Grossberg, S. E. et al. (1984), Assay of Interferons. In: Came, P. E., Carter W. A (eds) Interferons and their Applications, Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 23–43.
- In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Reinigungsverfahren für IFN-β zwei Affinitätschromatographien, die vorzugsweise vor der hydrophoben Interaktionschromatographie durchgeführt werden. In erfindungsgemäß durchgeführten Versuchen wurde überraschenderweise gefunden, dass die Reinigung von IFN-β aus Zellkulturüberstand über eine Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC), Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC), und hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) wie nachfolgend und insbesondere in den Beispielen beschrieben zu einer IFN-β-Präparation führt, die bereits im Wesentlichen rein und sowohl in flüssiger Formulierung als auch im gefrorenen und aufgetauten Zustand stabil ist und eine hohe biologische Aktivität aufweist, die den handelsüblichen Produkten Avonex© (Biogen Idec) und Rebif© (Serono) gleichkommt oder diese sogar übersteigt. Gemäß RP-HPLC-Messungen lag die Schrittausbeute der Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (Zink-Sepharose-Chromatographie) bei 90–100% und der der hydrophoben Interaktionschromatographie (Butyl-Sepharose-Chromatographie) bei > 70%. Eine Analyse des IFN-β-Materials mittels RP-HPLC sowie mittels SDS-PAGE und Silberfärbung zeigte, dass IFN-β bis hin zur apparenten Homogenität aufgereinigt war. Eine Bandenverschiebung in der SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen deutete darauf hin, dass die interne Disulfidbindung vorhanden und das Protein folglich korrekt gefaltet ist. Auf IEF-Western-Blots zeigten sowohl das Präparat als auch das Aufreinigungszwischenprodukt ein ähnliches IFN-β-Isoformenmuster wie Avonex©.
- Das erfindungsgemäß erhaltene IFN-β-Präparat wurde weiterhin mittels analytischer SEC auf Superdex 75 HR 10/30 untersucht. Es zeigten sich die hauptsächlichen Elutionspeaks bei A280 und A214, mit einem Peakmaximum zwischen 13,9 und 14,0 ml Elutionsvolumen. Die apparente Molekularmasse beträgt 14 kDa, was darauf hindeutet, dass die IFN-β-Monomere mit einer leichten Verzögerung eluieren, vermutlich aufgrund einer unspezifischen Interaktion mit der Säulenmatrix.
- Die spezifische Aktivität des erfindungsgemäß gereinigten IFN-β beträgt hier bereits üblicherweise nicht weniger als 1 × 108 IU/mg, typischerweise mindestens 2 × 108 IU/mg, und vorzugsweise mindestens 3 × 108 IU/mg und darüber.
- Zur Entfernung möglicherweise vorhandener restlicher Wirtszellen-DNA und potentieller viraler Kontamination nebst anderer, negativ geladener Kontaminationen umfasst in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung das Reinigungsverfahren für IFN-β eine Anionenaustauschchromatographie (AEX), die vorzugsweise direkt im Anschluss an den HIC-Schritt im Durchflussmodus durchgeführt wird. Dieser anschließende AEX-Schritt ist insbesondere in der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen von IFN-β vorteilhaft, da sich in Vorversuchen zeigte, dass das nach diesem Schritt erhaltene IFN-β-Präparat selbst bei Kontrollversuchen mit zugesetzten Virusmaterial im Wesentlichen nicht mehr infektiös ist und daher therapeutisch verwendet werden kann.
- Nachdem rekombinant hergestelltes humanes IFN-β durch die vorstehend beschriebenen Chromatographien in ausreichender Reinheit dargestellt werden kann, ist grundsätzlich kein weiterer chromatographischer Schritt in den erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren notwendig. Daher wird in einer weiteren Ausführungsform in dem Reinigungsverfahren für IFN-β auf die Durchführung einer Kationenaustauschchromatographie (CEX) verzichtet. Wie in der Beschreibung zum Hintergrund der vorliegenden Erfindung erläutert, wurde insbesondere die Anwendung einer Kationenaustauschchromatographie zur Reinigung von Interferonen beschrieben. Auf den ersten Blick ist dieser Schritt gegenüber einer Anionenaustauschchromatographie (AEX) aufgrund des relativ hohen pI (7.8–8.9) von IFN-β auch vorzuziehen. Da bei neutralem pH (= pH im Kulturüberstand) jedoch keine oder nur schwache Bindung erfolgt und eine Ansäuerung des Kulturüberstand mit Präzipitationen anderer Proteine verbunden sein kann, die eine zusätzliche Klärfiltration notwendig machen, ist der CEX Schritt intermediär, eher sogar als Polishing-Schritt zu platzieren. CEX kann jedoch nicht direkt nach einer Affinitätschromatograhie mit Farbliganden wie Cibacron oder Metall-Chelat wie IMAC erfolgen, da dort auch mittels Salz Konzentrationserhöhung eluiert wird. In einer solchen Reihenfolge würde ein zusätzlicher Umpufferungs- und Entsalzungs-Schritt notwendig werden. In erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten stellte sich ferner heraus, dass die Verwendung der CEX-Technologie nur Schrittausbeuten von ungefähr 25% des in der Probe enthaltenen IFN-β zulässt. Aus diesem Grund wird vorteilhafterweise auf die Durchführung einer CEX verzichtet.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird auf die Durchführung einer präparativen HPLC verzichtet. Gleiches gilt für reverse Phase (RP) Nieder- oder Mitteldruck-Chromatographie, die von der erfindungsgemäßen hydrophoben Interaktionschromatographie zu unterscheiden ist und auf die ebenfalls in der Präparation möglichst verzichtet wird. Dieser Verzicht in der bevorzugten Ausführungsform ist von Vorteil, da ein HPLC Schritt in einem Reinigungsprozess immer mit erheblichem Aufwand verbunden ist. Dies gilt für das Chromatographiesystem (hohe Investitionskosten) wie auch für die räumliche Ausstattung, die meist mit zusätzlichen Auflagen belegt werden (Personalschutz, brennbare Lösungsmittel, Explosionsschutz). Ferner ist eine umweltgerechte Entsorgung der Lösungsmittelabfälle zu gewährleisten. Gegebenenfalls wird RP-HPLC lediglich zu analytischen Zwecken eingesetzt.
- In einer weiteren Ausführungsform findet im Rahmen des Verfahrens keine Immunglobulin-Affinitätschromatographie statt. Derartige Reinigungsschritte von therapeutischen Proteinen sind mit einem sehr aufwändigen Validierungsprogramm belegt um Sicherheitsrisiken, z. B. Kreuzkontamination, auszuschließen. Kann man auf derartige Immunaffinitätsschritte verzichten, gilt dies als großer Vorteil.
- In einer weiteren Ausführungsform wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens auf die Durchführung einer Hydroxyapatitchromatographie verzichtet.
- Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren macht somit in einer bevorzugten Ausführungsform von lediglich zwei bis drei verschiedenen chromatographischen Trennmethoden Gebrauch, nämlich der der Affinitätschromatographie an Farbliganden und/oder Metall-Chelaten und der der hydrophoben Interaktion, die sich dadurch auszeichnet, dass die unpolaren Oberflächenregionen eines Proteins bei hohen Salzkonzentrationen an die schwach hydrophoben Liganden einer stationären Phase adsorbieren (Aussalzeffekt) und bei fallendem Salzgehalt eluiert werden können. Fakultativ, aber bevorzugt, schließt sich direkt die Chromatographie mittels eines Ionenaustausches auf der Grundlage der kompetitiven Wechselwirkung geladener Ionen, d. h. hier Anionen an.
- Hiervon zu unterscheiden ist das chromatographische Trennprinzip der Hydroxyapatit-Chromatographie, die auf dem Einsatz von anorganischen Hydroxyapatitkristallen basiert, die sich von der Ionenaustauschchromatographie in Form der Anionenaustauschchromatographie und der hydrophoben Interaktionschromatographie unterscheidet. Diese genannten Chromatographieprinzipien werden auch in Fachkreisen entsprechend unterschieden; siehe beispielweise Bioanalytik, F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg.), Heidelberg, Berlin, Spektrum Akad. Verlag 1998.
- In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die chromatographische Reinigung von IFN-β folgende Schritte:
- (a) Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC);
- (b) Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC);
- (c) hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC); und/oder
- (d) Anionenaustauschmembranfiltration.
- In diesem Zusammenhang sollte bei der gesamten Reinigung die IFN-β-Probe im Wesentlichen kationisch gehalten werden, d. h. bei pH-Werten unter seinem isoelektrischen Punkt (pI), so dass die verwendeten Puffer und Waschlösungen bis auf einzelne Waschschritte vorzugsweise einen pH-Wert von ≤ 7 aufweisen; siehe auch die Beispiele.
- Für die Farbliganden-Affinitätschromatographie wird beispielweise Blau-Dextran-Sepharose R, oder andere geeignete mit Cibacron R Blau immobilisierte Matrices wie Matrex Gel Blue A von Amicon oder Fraktogel 45 TSK AF-Blue von Merck oder Blue-Sepharose R 6FF von GE Healthcare, verwendet.
- Für die Metall-Chelat-Chromatographie sind verschiedene Matrices mit chemisch identischen oder unterschiedlichen Liganden geeignet. Die zur koordinativen Bindung von rekombinantem IFN-β geeigneten Metallionen können Cu2+, Zn2+, Co2+ oder Ni2+ Ionen sein. Die Desorption kann mittels kompetitiver Substanzen wie Imidazol, Histidin, Glycin oder NH4Cl, Chelatbildner wie EDTA, IDA (Iminodiessigsäure), TED (Tris-Carboxymethylethylendiamin) oder durch Erniedrigung des pH-Wertes auf pH 2 bis pH 4 erfolgen.
- Geeignete Trennmedien sind Immobilized Iminodiacetic Acid gekoppelt an Agarose oder an Fraktogel TSK HW-65F der Firma Pierce oder Chelating Sepharose R FF der Firma GE Healthcare oder Cellufine Chelate der Firma Amicon.
- Wie vorstehend bereits erwähnt, hat sich in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten herausgestellt, dass insbesondere die Farbliganden-Chromatographie an Cibacron Blue und IMAC-Chromatographieverfahren, insbesondere zusammen genommen, besonders vorteilhaft im Reinigungsprozess für IFN-β sind. Dementsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC) Cibacron Blue und für die Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC) Zn-Chelat Sepharose (IMAC) verwendet.
- Die Reinigung von IFN-β mittels Affinitätschromatographie an Cibacron Blue ist an sich bekannt und wurde am häufigsten beschrieben; siehe auch die vorstehenden Literaturquellen, deren Offenbarungsgehalt bezüglich der Durchführung der chromatographischen Verfahren in dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingeschlossen ist. IFN-β bindet sehr stark an Cibacron Blue F3GA (CB-F3GA) und es kann mit diversen Puffer gebundenes Fremdprotein vor der Elution abgewaschen werden. Die starke Bindung ist am ehesten durch die sehr hohe Hydrophobizität erklärt. Da IFN-β unter physiologischen Bedingungen auch in geringen Konzentrationen quantitativ bindet, eignet sich dieser Schritt besonders als Capture-Schritt, d. h. erster chromatographischer Schritt in dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren. Die Elution von IFN-β kann beispielsweise mit Ethylenglykol erfolgen, gegebenenfalls mit einem Gradienten. Bevorzugtes Material ist Blue-Sepharose Streamline bzw. Blue Sepharose Fast Flow (GE Healthcare).
- Anstelle von oder zusätzlich zu einer Farbliganden-Chromatographie kommt grundsätzlich auch eine Lektin-Affinitätschromatographie in Betracht, beispielweise mit Concanavalin A (ConA). In den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten stellte sich allerdings heraus, dass ConA schwierig in der Handhabung ist und auf Grund von qualitativen Unterschieden verschiedener ConA-Chargen keine kontinuierliche, gleichbleibende Qualität des gereinigten IFN-β gewährleistet. Daher wird vorzugsweise auf die Durchführung einer Lektin-Affinitätschromatographie verzichtet.
- Die immobilisierte Metall-Chelat-Chromatographie (IMAC) ist ebenfalls häufig für die Reinigung von IFN-β beschrieben. Der Träger sollte mit dem Liganden Iminodiacetat (IDA) gekoppelt sein. Die IMAC wurde bisher stets nach einer Affinitätschromatographie (meist Cibacron Blue oder ConA) positioniert. Die Chromatographie eignet sich aufgrund ihrer hohen Trennleistung bestens als intermediärer Reinigungsschritt. Die starke Bindung lässt sich mit dem Vorhandensein von benachbarten Histidinen gut erklären. Die Elution erfolgt mit steigenden Salz- und fallenden pH-Gradienten. Salz allein eluiert nicht. IFN-β eluiert bei pH < 5. Aus den vorgenannten Gründen ist ein Gradientenbetrieb auf jeden Fall sinnvoll. In den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten stellte sich heraus, dass insbesondere Zn++-Charged Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) für diesen Chromatographieschritt in dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren für IFN-β bestens geeignet ist.
- Wie bereits vorstehend genannt, wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens für IFN-β eine hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) durchgeführt, vorzugsweise an Butylgruppen als Liganden. Die Verwendung der hydrophoben Interaktionschromatographie für die Reinigung von IFN-β wurde bisher noch nicht eingehend untersucht. Aufgrund der extremen Hydrophobizität von IFN-β schien neben der Adsorption die Desorption von der hydrophoben Matrix problematisch. In den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten wurde überraschenderweise festgestellt, dass IFN-β über HIC ohne Weiteres gebunden und eluiert werden kann, insbesondere wenn für den Auftrag und die Elution Acetatpuffer mit pH 5,0 verwendet wird. Als Vorteil für das erfindungsgemäße Verfahren stellte sich ferner heraus, dass die HIC sowohl als Capture Schritt (evtl. mit Zugabe von Salz vor dem Auftrag) als auch intermediärer Chromatographieschritt nach der Metall-Chelat-Chromatographie wie IMAC und gegebenenfalls direkt nach der Farbliganden-Chromatographie wie mit Cibacron durchgeführt werden kann. Ferner kann in der HIC durch die Elution mit organischen Lösungsmitteln eine frühzeitige Inaktivierung von Enzymen und Viren erfolgen. Es gibt viele verschiedene Materialien, die in der HIC Verwendung finden können. Grundsätzlich bevorzugt für stark hydrophobe Proteine sind kurzkettige Alkyle wie Methyl, Butyl oder Propyl, beispielweise Butyl-Sepharose 4 Fast Flow, Macro Prep Methyl, Fractogel EMD Propyl oder Phenyl Sepharose Low Substitution (Merck). Da allerdings auch die Matrix zur Bindung beitragen kann, musste in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten herausgefunden werden, welches Material letztendlich für die Reinigung von IFN-β am besten geeignet ist. Dabei stellte sich heraus, dass Butylgruppen besonders gut für die Adsorption und insbesondere die anschließende Desorption geeignet sind; siehe auch die Beispiele. Dabei können die Produkte von Amersham Biosciences (inzwischen GE Healthcare) verwendet werden. Geeignete Matrices und Protokolle zur Durchführung der hydrophoben Interaktionschromatographie kann der Fachmann den Produktinformationen von Anbietern wie Amersham Biosciences (http://www.amershambiosciences.com, inzwischen GE Healthcare) oder Bio-Rad (http://www.bio-rad.com) entnehmen.
- In einer weiteren Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren für die Anionenaustauschmembranfiltration eine Membran mit quaternären Aminogruppen verwendet. Geeignete Matrices und Protokolle zur Durchführung der Anionenaustauschchromatographie kann der Fachmann den Produktinformationen von Anbietern wie Amersham Biosciences (http://www.amershambiosciences.com, inzwischen GE Healthcare) oder Bio-Rad (http://www.bio-rad.com) entnehmen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird für die Anionenaustauschchromatographie 20 mM Natriumacetat pH 5,0 verwendet, das zum Äquilibrieren und Waschen eingesetzt wird. Weitere geeignete Bedingungen für die Anionenaustauschchromatographie können der einschlägigen Literatur, wie etwa dem Handbuch "Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods" von Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland (inzwischen GE Healthcare), 2002, entnommen werden.
- Zur weiteren Aufreinigung des IFN-β, insbesondere zu dessen Verwendung in einer pharmazeutischen Zubereitung ist es vorteilhaft, wenn weitere Reinigungs- und/oder Konzentrierungsschritte, insbesondere Filtrationen angeschlossen werden, die beispielsweise auch der Entfernung von Rückständen aus der Zellkultur wie Wirtszell DNA, Endotoxin und sonstigen belastenden Stoffen dienen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, umfasst das Reinigungsverfahren für IFN-β daher mindestens einer der folgenden Schritte:
- (e) Ultrafiltration (UF);
- (f) Mikrofiltration (MF);
- (g) Größenausschlusschromatographie (SEC); und/oder
- (i) Nanofiltration (NF); siehe auch die Beispiele
- Dabei dienen die Ultra- und Mikrofiltration grundsätzlich der spezifischen Aufreinigung und Konzentrierung des IFN-β während die Größenausschlusschromatographie und Nanofiltration insbesondere für die Entfernung von Wirtszell-DNA, Endotoxin und in den jeweiligen Eluaten verbliebenen biologischen Stoffen, falls vorhanden, geeignet sind. Wie in den Beispielen erläutert, ist es dabei für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren für IFN-β vorteilhaft, wenn die Ultrafiltration eine Tangentialflussfiltration mit einer Ausschlussgröße von 5 kD–1000 kD umfasst, für die Mikrofiltration eine 0.2 μm Membran, für die Größenausschlusschromatographie Superdex 200 und/oder für die Nanofiltration ein Filter mit 15–75 nm Porengröße verwendet wird. Geeignete Bedingungen für die Durchführung der einzelnen Filtrationsschritte sowie Größenausschlusschromatographie sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur, wie etwa den Produktmonographien von Millipore und Pall Systems entnommen werden.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren für IFN-β folgende, in den Beispielen erläuterten Schritte:
- (a) Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC);
- (b) Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC);
- (c) hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC);
- (d) Anionenaustauschchromatographie (AEX);
- (e) Ultrafiltration (UF);
- (f) Mikrofiltration (MF);
- (g) Größenausschlusschromatographie (SEC);
- (f) Mikrofiltration (MF); und
- (h) Nanofiltration (NF).
- Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, die das erfindungsgemäß gewonnene IFN-β enthalten. Das gewonnene IFN-β kann entweder als Lyophilisat oder vorzugsweise in flüssiger Form aufbewahrt werden. Es wird entweder subkutan oder intravenös verabreicht. Geeignete Hilfsstoffe in den Formulierungen des rekombinant exprimierten IFN-β sind etwa Stabilisatoren wie Zucker und Zuckeralkohole, Aminosäuren sowie Tenside wie Polysorbat 20 und 80 sowie geeignete Puffersubstanzen. Beispiele für Formulierungen sind beschrieben in den internationalen Anmeldungen
WO98/28007 WO99/15193 EP 0 529 300 , siehe auch Handelsprodukte Avonex® und Rebif® in ROTE LISTE 2005. - Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer zur parenteralen Applizierung geeigneten pharmazeutischen Flüssigformulierung von humanem IFN-β umfassend ein Verfahren zur Reinigung von IFN-β wie vorstehend und in Beispielen beschrieben, und
- (i) Formulierung des gereinigten IFN-β in eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung, wobei man die IFN-β-Formulierung und gegebenenfalls weitere galenisch notwendige Hilfsstoffe zubereitet und in eine geeignete Darreichungsform bringt; und
- (ii) Abfüllen der Formulierung in ein geeignetes Gefäß bzw. geeigneten Behälter.
- Die IFN-β-Formulierung kann beispielweise in geeigneten, gewaschenen sowie sterilisierten Glasvials (hydrolytische Klasse 1) mit pharmazeutisch akzeptablen Gummistopfen gelagert werden. Desweiteren können die pharmazeutischen IFN-β-Formulierungen auch aseptisch in Fertigspritzen oder aber in Karpulen zum Einsatz in Selbstinjektionssystemen abgefüllt und eingesetzt werden. Die wässrigen Lösungen können – obwohl dies nicht bevorzugt ist – durch Zusatz weiterer, dem Fachmann bekannter Hilfsstoffe gefriergetrocknet werden und stehen dann nach Rekonstitution in flüssiger Form zur Verfügung. Unter Zusatz von geeigneten Konservierungsmitteln können flüssige Mehrfachdosisarzneiformen sowie Augentropfenlösungen und Tropflösungen zur oralen Applikation hergestellt werden. Die zur Herstellung der entsprechenden Darreichungsformen noch zusätzlich benötigten Hilfsstoffe sind dem Fachmann bekannt; siehe beispielweise das einschlägige Handbuch Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20. Auflage (2000), ISBN 0-683-306472 sowie die vorstehend angeführten Anmeldungen, insbesondere die
WO 98/28007 - In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung von IFN-β Acetat, NaCl oder eine der Aminosäuren Arginin, Lysin und Glutamin sowie ggf. einen oder mehrere weitere Hilfsstoffe, wobei der Hilfsstoff vorzugsweise Methionin, Mannitol, Sorbitol, Glycerol oder ein Tensid ist, wobei vorzugsweise das Tensid Polysorbat 20 oder 80 ist.
- In den erfindungsgemäßen Experimenten betreffend Untersuchungen zur Herstellung einer ausreichend lagerstabilen Flüssigformulierung von IFN-β wurde ferner herausgefunden, dass der pH-Wert der Formulierung vorzugsweise zwischen 4.3 und 4.8 liegt.
- Die spezifische Aktivität des erfindungsgemäß gereinigten IFN-β beträgt üblicherweise nicht weniger als 1 × 108 IU/mg, typischerweise mindestens 2 × 108 IU/mg, vorzugsweise mindestens 3 × 108 IU/mg und darüber.
- Wie in Beispiel 3 erläutert, wurde in einer Vielzahl von möglichen Pufferzusammensetzungen eine Formulierung gefunden, in der durch Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC), Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC) und hydrophobe Interaktionschromatographie erfindungsgemäß gereinigtes, apparent homogenes IFN-β sowohl bei Raumtemperatur als auch Lagerung bei –80°C und nach dem Auftauen im Wesentlichen stabil und biologisch aktiv bleibt. Die Stabilität von IFN-β in einem gegebenen Puffer mit einer Konzentration von 200 μg/ml bei Lagerung für bis zu zwei Wochen +4°C bzw. bei –80°C beträgt mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 97% und ggf. nahezu 100% bezogen auf die Ausgangsaktivität. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die biologisch aktives IFN-β enthalten.
- Vorzugsweise sind die erfindungsgemäß erhaltenen IFN-β-Präparate über eine Lagerungsdauer von 26–27 Tagen –80°C und von 47–48 Tagen (> 6,5 Wochen) bei +4°C stabil wie durch RP-HPLC-Messung, die A280-Messung und/oder Bestimmung der A320-Werte (”Trübheit” unter 0,010) nachgewiesen werden kann. Das Isoformenmuster auf Western-Blots im Anschluss an SDS-PAGE sowie auf IEF-Western-Blots ist vorzugsweise für beide Varianten der Lagerungsbedingungen sowohl dem von Avonex© als auch der IFN-β-Präparation sehr ähnlich oder identisch, das nach dem HIC-Schritt erhalten wird. In einer analytischen SEC auf Superdex 75 HR 10/30 zeigen die erfindungsgemäß erhaltenen IFN-β-Präparate vorzugsweise eine apparente Molekularmasse von 12–16 kDa.
- Wie in Beispiel 3 gezeigt, ist insbesondere der in Tabelle 10 als Puffer 3a bezeichnete Puffer für die Lagerung von rekombinant hergestellten, glykosilierten IFN-β geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, die IFN-β als Wirkstoff in 25 mM Acetat, 150 mM NaCl und 0,167% (v/v) Polysorbat 20 enthält und vorzugsweise einen pH-Wert von 4,8 aufweist. Die erfindungsgemäßen flüssigen pharmazeutischen Formulierungen sind vorzugsweise frei von Humanserumalbumin und besonders bevorzugt – abgesehen vom Wirkstoff – frei von humanen oder tierischen Polypeptiden, insbesondere von Serumproteinen.
- Die Stabilität der IFN-β-Formulierung kann weiter positiv beeinflusst werden, in dem diese mit einem inerten Gas wie Helium oder Stickstoff begast wird. Dies gilt insbesondere beim Vorliegen der IFN-β-Formulierung in einem geeigneten Behälter, wobei der Kopfraum des Behälters vorzugsweise ebenfalls mit einem inerten Gas wie Helium oder Stickstoff gefüllt ist, und wobei der Kopfraum vorzugsweise höchstens 30% des Volumens des Behälters ausmacht.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel, enthaltend das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte IFN-β und pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe wie Puffer, Salze, Tenside und Stabilisatoren. Wie bereits vorstehend erläutert, ist die erfindungsgemäße Flüssigformulierung von IFN-β über einen langen Zeitraum stabil und kann grundsätzlich in jedem geeigneten Gefäß aufbewahrt werden. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Gefäß enthaltend eine zur parenteralen Applizierung geeignete pharmazeutische Flüssigformulierung von humanem IFN-β und erhältlich nach dem vorstehend erläuterten und insbesondere in den Beispielen erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Flüssigformulierung von IFN-β.
- Das erfindungsgemäße Gemäß ist vorzugsweise derart ausgestaltet, dass dessen innere Oberflächen, die Kontakt zur pharmazeutischen Flüssigformulierung haben, die Adsorption von IFN-β verhindern. Vorzugsweise ist mindestens eine Oberfläche des Gefäßes, die in Kontakt mit der Flüssigformulierung steht, mit einem Material im Wesentlichen bestehend aus Polypropylen (PP), Silikon oder Polytetrafluorethylen oder einem Ethylen-Tetrafluorethylen (ETFE) Copolymer beschichtet oder besteht daraus.
- Typischerweise handelt es sich bei dem Gefäß um Behälter die üblicherweise für die Aufbewahrung und/oder Verabreichung von Flüssigarzneimittel bestimmt sind wie Vial, Spritze, Ampulle, Karpule, Durchstichflasche oder Infusionsbehälter, wobei die erfindungsgemäße Flüssigformulierung von IFN-β insbesondere vorteilhaft für die Verwendung in Fertigspritzen und Ampullen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Flüssigformulierung beispielsweise in der Spritze oder Ampulle bezüglich der Konzentration von IFN-β in einer Konzentration von 10–500 μg/ml, vorzugsweise 50–250 μg/ml und/oder einer Aktivität von 5–50 Millionen I. E./ml vor.
- Die erfindungsgemäß hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen und die sie enthaltenen Gefäße und Behälter können zur Behandlung von Tumoren, Viruserkrankungen, Immunopathien oder Entzündungen einschließlich rheumatischer Erkrankungen, Allergien, Psoriasis, Morbus Crohn und degenerativen Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere Multiple Sklerose, verwendet werden. Die erforderliche Menge des zu verwendenden rekombinanten IFN-β im Arzneimittel für die gewünschte therapeutische Wirkung hängt von der jeweiligen Verabreichungsart und von dem zu behandelnden Subjekt, sowie der jeweiligen Krankheit ab. Eine geeignete Dosis des aktiven Bestandteils zur Verabreichung am Menschen liegt zwischen etwa 0,1 × 106 und 100 × 106 I. E. Die am meisten bevorzugte Dosis beträgt bei lokaler Therapie 6 × 106 I. E., bei systematischer Therapie etwa 1 × 106 bis 30 × 106 I. E. pro Tag, gegebenenfalls mehrmals pro Tag.
- Die erfindungsgemäß hergestellten pharmazeutischen Zubereitungen und die sie enthaltenen Gefäße und Behälter sind vorzugsweise derart hergerichtet, dass sie in einer ophthalmologischen, subkutanen, intrakutanen, intramuskulären, intravenösen, intrathekalen, intraartikulären, intratumoralen/peritumoralen, intralesionalen/perilesionalen oder topischen Verabreichungsform vorliegen.
- Da der erfindungsgemäßen Flüssigformulierung von IFN-β vorteilhafterweise keine weiteren Hilfsstoffe vor deren Verabreichung zugesetzt werden, oder andere vorbereitende Maßnahmen ergriffen werden müssen, wie Filtrieren, Mischen, etc. kann das erfindungsgemäße IFN-β-Flüssigarzneimittel unmittelbar zur dessen Verabreichung vorbereitet werden, beispielsweise in einem Kit.
- In eine für den Arzt, Apotheker und insbesondere Patienten besonders vorteilhaften Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher auch ein Kit zur Verabreichung von IFN-β durch Infusion oder Injektion umfassend ein oder mehrere der vorstehend beschriebenen Gefäße vorzugsweise nebst Anweisungen zur Lagerung und/oder Verabreichung. Üblicherweise wird die Verabreichung von IFN-β mit einer Dosis von 1 × 106 bis 10 × 106 I. E vorgesehen sein, wobei allerdings je nach medizinischer Indikation und Stadium der Krankheit auch niedrigere oder höhere Dosen angezeigt sein können. In dem erfindungsgemäßen Kit sind vorzugsweise mehrere Gefäße vorgesehen, beispielsweise für die wöchentliche Verabreichung intramuskulär für insgesamt einen Monat jeweils 4 vorgefüllte Fertigspritzen nebst Kanülen oder 4 Durchstichflaschen nebst Fertigspritzen und Kanülen sowie ggf. Lösungsmittel im Falle der Verwendung von Lyophilisat was grundsätzlich möglich, aber weniger bevorzugt ist. Demgegenüber steht eine intravenöse Verabreichung dreimal die Woche wie bei Rebif©.
- Zur sicheren Handhabung verfugt das erfindungsgemäße Kit vorteilhafterweise über Sicherheitskompartimente für Spritzen, beziehungsweise für Injektions- und/oder Infusionskanülen. Hierbei kommen auch Abwurfhilfen für die Kanülen und vorbereitete wie vorgesteckte Verschlusskappen in Betracht.
- Wie in den Beispielen beschrieben sind die erfindungsgemäßen IFN-β-Flüssigformulierungen insbesondere bei ca. 2–8°C über einen längeren Zeitraum stabil, vorzugsweise mindestens 4 Wochen. Daher lassen sich die erfindungsgemäßen Flüssigformulierungen, Gefäße und Kits vorteilhafterweise im normalen Kühlschrank lagern.
- Diese und andere Ausführungsformen, die sich aus der vorliegenden Erfindung ergeben sind von den Ansprüchen umfasst.
- Der Offenbarungsgehalt der vor- und nachstehend zitierten Dokumente aus dem Stand der Technik ist hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten, insbesondere betreffend die rekombinante Herstellung von IFN-β Puffer, Spritzen und Kits. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung umfasst. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Hilfsstoffe und elektronischen Hilfsmittel, die im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können dem Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. Zudem bieten sich andere öffentliche Datenbanken an wie die ”PubMed”, die über das Internet zur Verfügung stehen, (http://www.pubmed.gov). Techniken zur Ausführung der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I–IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).
- Im Folgenden wird die Erfindung anhand von einem bevorzugten Ausführungsbeispiel näher beschrieben, ohne jedoch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
- Beispiel 1: Bereitstellung des Ausgangsmaterials für die Reinigung von IFN-β
- Bei dem Ausgangspunkt IFN-β handelt es sich typischerweise um humanes INF-β-1a, das in einer rekombinanten CHO(Chinesische Hamster Ovarien)-Zelllinie exprimiert wird. Das Protein enthält mit Arginin N-verknüpfte Glykane, die ein Isoformenprofil aufweisen, wie es in dem entsprechenden Monographie-Entwurf PHARMEUROPA Bd. 15, Nr. 4, Oktober 2003, beschrieben ist. Die spezifische Aktivität wird mittels des CPE-Assays (Zytopathischer Effekt) unter Verwendung von A549-Zellen sowie des Enzephalomyokarditis-Virus EMC als infektiösem Agens bestimmt (PHARMEUROPA, Bd. 15, Nr. 4, Oktober 2003). Die spezifische Aktivität von aufgereinigtem INF-β liegt in etwa bei 3,2 × 108 IU × mg–1.
- Eine rekombinante CHO-Zelllinie, die humanes INF-β-1a exprimiert, wird erzeugt und an Suspension sowie an serumfreie Kulturbedingungen angepasst. Als Expressionsvektor kann ein Vektor verwendet werden, der die (natürliche) humane INF-β-Gensequenz, eine Translationsstartsequenz gemäß Kozak (Kozak-Sequenz) und als regulatorische Elemente für die Expression SV40-Promotor mit SV40-polyA-Terminatorsequenz enthält. Die Selektion und Amplifikation des Expressionsvektors erfolgt vorzugsweise mittels der murinen dhfr-Gensequenz unter der Kontrolle des Adeno-Major-Late-Promotors und der SV40-polyA-Sequenz. Bei der parentalen Zelllinie handelte es sich vorzugsweise um eine dhfr-defiziente CHO(Chinesische Hamster Ovarien)-Zelllinie, erhältlich beispielsweise von der ATCC oder DSMZ. Die Herstellung der Produktionszelllinie erfolgt nach herkömmlichen Methoden aus dem Stand der Technik. Die dhfr-defizienten CHO-Zellen werden mit dem Expressionsvektor transfiziert. Nach der Selektionierung, der Subklonierung unter Verwendung von Klonierungszylindern und der nachfolgenden Amplifikation unter Verwendung von Methotrexat wird die daraus resultierende Zelllinie an serumfreie Kulturbedingungen angepasst und als Suspensionskultur getestet. Unter Anwendung der Technik der limitierten Verdünnung kann ein zweiter Subklonierungsdurchgang durchgeführt werden.
- Der Prozess der Zellkultivierung besteht vorzugsweise aus einer Folgevermehrung der transfizierten CHO-Zellen in Erlenmeyer-Kolben gefolgt von der Produktion in kommerzieller Größenordnung in einem 10-Liter-Bioreaktor. Dann erfolgen das Wachstum und die Expression von IFN-β, und zwar versuchsweise in einem Perfusions-Bioreaktor mit 1 Liter und in kommerzieller Größenordnung in 10 Litern Arbeitsvolumen über einen Zeitraum von 4 Wochen. Während dieses Zeitraums wird das Zellkulturmedium kontinuierlich vorzugsweise bei einer Zelldichte 1,2 (± 0,2) × 106 Zellen/mL mittels Perfusion durch akustische Zellretention geerntet, in 50 bis 200 Litern fassenden Stedim-Beuteln bei 5 ± 3°C gelagert, mittels einer Affinitätschromatographie an Blue Sepharose einmal pro Woche aus dem Kulturmedium gebunden und die Eluate bei < –70°C eingefroren, bis sie dem nachfolgenden Aufreinigungsvorgang unterzogen werden. Vier oben beschriebene Blue Sepharose Eluate, die einen vollständigen Perfusions-Fermentationsdurchgang repräsentieren, werden aufgetaut, vereinigt und dem nächsten Reinigungsschritt unterzogen.
- Beispiel 2: Erfindungsgemäße Aufreinigung von IFN-β aus Zellkulturmedium
- Der Aufreinigungsvorgang umfasst mehrere Schritte, die so ausgelegt sind, dass sie zum Erhalt eines Produkts führen, das eine hohe biologische Aktivität sowie biochemische Eigenschaften aufweist und hinsichtlich produkt- und vorgangsspezifischer Substanzen und Verunreinigungen den derzeitigen behördlichen, wissenschaftlichen und kompendialen Standard durchaus erfüllt. Der Rahmen für diese Experimente beinhaltete eine ausgedehnte Optimierung eines jeden Aufreinigungsschritts sowie die Erzeugung von repräsentativem Material für eine versuchsweise PK/PD-Studie mit Javaneraffen. Aufgrund limitierter Entwicklungsressourcen wurde die Aufreinigung – ausschließend den Capture-Schritt a) – dieses Materials in einem proportional massstabsreduzierten Laborverfahren durchgeführt.
- a) Affinitätschromatographie: Streamline Blue Sepharose
- Zur initialen Bindung aus Kulturüberstand wurden Phenyl und Blue Sepharose Fast Flow getestet. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung von Blue-Sepharose-Chromatographiematerial sowie stufenweisem/-r Waschen und Elution der Säule mit jeweils 10%, 20% bzw. 50% Ethylenglykol erhalten. Die aus jeweils 7-tägigen Sammlungen (d. h. H1 to H4) erhaltene Ernte (H) wird zunächst unter Verwendung von Blue Sepharose FF-Gel (GE Healthcare) durch Affinitätschromatographie gebunden, wie in Tabelle 1 näher erläutert. Für eine direkte Beladung der Rohernte auf eine Chromatographiematrix, ohne eine zusätzliche Trennung residualer Zellen bei der Ernte, wurde unter Verwendung der Streamline® Blue Sepharose untersucht. Die Streamline®-Technologie ist eine Expanded-Bed-Chromatographie. Neben der Reduktion des Probenvolumens entfernt dieser Chromatographieschritt Proteasen und Glykosidasen, reduziert Verunreinigungen aus den Wirtszellen, sogenannte Host Cell Proteine und klärt verfahrensbedingte Verunreinigungen wie z. B. Komponenten aus dem Kulturmedium. Modifikation und Anpassung von chromatographischen Parametern (beispielsweise Flussrate, Expansionsfaktor, Kontaktzeit, Konduktivität der beladenen Probe sowie Menge) führten zum endgültigen beschriebenen Verfahren in der nachfolgenden Tabelle 1. Die Schrittausbeute beträgt in der Regel über 60%. Tabelle 1: Capture-Chromatographie: Streamline Blue Sepharose
Parameter Merkmal Chromatographiematrix Streamline© Blue Sepharose Säulendurchmesser 10 cm Betthöhe 20,4 ± 1,5 cm Trennstufenzahl na. Asymmetriefaktor na. Säulentemperatur 22 ± 3°C Flussrate 120 L/hr – alle Phasen (Säulen-Bypass 120 L/h) Ladepuffer 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,2, 1 M NaCl Waschpuffer a) 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 7,2 b) 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 7,2, 10% Ethylenglykol c) 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 7,2, 20% Ethylenglykol Elutionspuffer 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,2, 1 M NaCl, 50% Ethylenglykol Elutionsvolumen 12,8 L Sammlung Schrittweise Elution, Total-Peak-Sammlung - Zur Äquilibrierung wird Waschpuffer a): 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 7,2 verwendet. Regeneriert wurde die Säule mit Regenerationspuffer 1: 50 mM Tris/HCl, 1 M NaCl, pH 7,6; Regenerationspuffer 2: 10 mM Tris-HCl, 800 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10% Isopropanol, pH 7,6 und Regenerationspuffer 3: 50 mM Tris/HCl, 3 M NaCl, pH 7,6 nebst SIP: 70% Ethanol > 12 h und 2 h/CIP: 0,5 M NaOH. Nachfolgend kann die Säule in Lagerpuffer: 0,01 M NaOH aufbewahrt werden, vorzugsweise bei 2–8°C. Tabelle 2: Allgemeiner Zeitablauf der Aufreinigung nach dem Capture-Schritt
Tag –x bis 0 Lagerung von Blue Sepharose Capture-Eluaten bei < –70°C Tag 0 1) Auftauen von Blue Sepharose Capture-Eluaten 2) Cleaning in place der Chelat-Sepharose 5 ± 3°C Tag 1 1) Chelat-Sepharose-Chromatographie 2) Cleaning in place von Butyl Sepharose 5 ± 3°C Tag 2 1) Aufbereitung von Chelat-Sepharose-Eluaten (Zugabe von EDTA) 2) Butyl Sepharose-Chromatographie 3) Sterilisation und Äquilibrierung von Mustang Q Membranabsorber 4) Mustang Q Membranfiltration (Perkolationsmodus) 5) Cleaing in place der Ultrafiltrationsvorrichtung 6) Cleaning in place von SEC 5 ± 3°C Tag 3 1) Ultrafiltration 2) Mikrofiltration 3) SEC RT Tag 4 1) Nanofiltration 2) Einstellen der Konzentration auf 0,200 μg/ml 3) Sterile Filtration 4) Befüllung 5) Einfrieren RT - b) Affinitätschromatographie: Chelat-Sepharose FF
- Im Anschluss an umfassende Untersuchungen zur Etablierung des Metall-Chelat-Affinitätschromatographie-Verfahrens unter Verwendung von Zink und Kupfer beladener Chelat-Sepharose, einschließlich der Optimierung des Salzgehalts und der Elutionsschritte, zeigte sich besonders die Bindung an Zink-Sepharose als äußerst selektiv und nach der Elution mit einem Puffer mit pH 5,0 war IFN-β zu ca. 96% rein und erbrachte eine Schrittausbeute von ungefähr 75%. Dafür werden die vier Blue Sepharose-Eluate (aus einem vollständigen 10-Liter-Perfusions-Fermentationsdurchgang) vor der nachfolgenden Aufreinigung vereint und dann auf eine mit Zn2+ beladene Chelat-Sepharose FF Säule (GE Healthcare) aufgetragen. Eine weitere Optimierung der Menge an beladener Probe sowie die Ersetzung des Phosphatpuffersystems durch ein auf Acetat basierendes Puffersystem führten zu dem nachfolgend beschriebenen Verfahren mit einer Schrittausbeute von bis zu über 95%. Ferner konnten Wirtzellproteine weitestgehend entfernt werden. Tabelle 3 Affinitätschromatographie: Chelat-Sepharose FF
Parameter Merkmal Chromatographiematrix Chelat-Sepharose FF Säulendurchmesser 14 cm Betthöhe 24 ± 1,5 cm Trennstufenzahl > 3500 N/m Asymmetriefaktor na. Säulentemperatur 22 ± 3°C Flussrate 17,58 L/hr – alle Phasen Ladepuffer 20 mM Na-Acetat, pH 5,0, 1 M NaCl Waschpuffer a) 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 7,2 b) 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1 M NaCl, pH 6,5 Elutionspuffer 20 mM Na-Acetat, pH 5,0, 1 M NaCl Elutionsvolumen 12,8 L Sammlung Schrittweise Elution, Total-Peak-Sammlung - Zur Äquilibrierung wird die Säule mit Wasser, Zn(Cl2), Wasser und Ladepuffer behandelt. Zum Abscheiden von Zn wird die Säule mit 50 mM EDTA, 1 M NaCl behandelt und nachfolgend mit 0,5 M NaOH. Die Säule wird in Lagerpuffer 20 mM NaOH gelagert.
- c) Hydrophobe Interaktionschromatographie: Butyl-Sepharose FF
- Die Realisierbarkeit der Anwendung von hydrophober Interaktionschromatographie mit Butyl-Sepharose FF wurde nach der Optimierung des Puffersystems und der Temperatur initial durch eine Schrittausbeute von ungefähr 60% demonstriert. Demnach wird eine hydrophobe Interaktionschromatographie unter Verwendung von Butyl-Sepharose-Gel (GE Healthcare) durchgeführt.
- Nach dem Einführen eines spezifischen Waschschritts zur Entfernung von Kontaminationen und der Durchführung der Elution im Upflow-Modus, erbrachte das Verfahren später eine Schrittausbeute von bis zu 80%. Ferner konnten noch verbliebene CHO/HCP-Verunreinigungen entfernt werden. Tabelle 4 Hydrophobe Interaktionschromatographie: Butyl-Sepharose FF
Parameter Merkmal Chromatographiematrix Butyl-Sepharose FF Säulendurchmesser 18 cm Betthöhe 10 ± 0,5 cm Trennstufenzahl > 3.500 N/m Asymmetriefaktor na. Säulentemperatur 5 ± 3°C Flussrate a) 22,8 L/h – alle Phasen außer Elutionsflussrate b) 2,28 L/h Elutionsflussrate Ladepuffer 20 mM Na-Acetat, pH 5,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA Waschpuffer a) Waschschritt I nach der Probenbeladung: 20 mM Na-Acetat, pH 5,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA b) Waschschritt II: 20 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA c) Waschschritt III: 20 mM Na-Acetat, pH 5,0, 0,75 M NaCl Elutionspuffer 20 mM Na-Acetat, pH 5,0, Upflow-Modus Elutionsvolumen 7,6 Liter Sammlung Gradient des gesamten Schritts wird gesammelt (3 Säulenvolumina) - Die Konduktivität des Eluats wird bestimmt und unter Verwendung von 20 mM Na-Acetat, pH 5,0 (ungefährer Verdünnungsfaktor 2) auf 2,5 ± 0,5 mS/cm eingestellt. Der pH wird auf pH 5,0 ± 0,1 eingestellt. Die Säule wird mit Waschpuffer a) äquilibriert und nach der Probenelution mit SIP/CIP: 0,1 M NaOH behandelt und in Lagerpuffer: 20 mM NaOH gelagert.
- d) Anionenaustausch-Membranfiltration
- Zur Entfernung der Wirtszellen-DNA und potentieller viraler Kontamination nebst anderer, negativ geladener Kontaminationen wurde direkt im Anschluss an den HIC-Schritt eine AEX-Membranfiltration im Durchflussmodus eingeführt. Im Verlauf einer Prävalidierungsstudie von viraler Infektiosität wurde Mustang Q als ein wirksames Verfahren zur Beseitigung von Viren im Perkolationsmodus identifiziert. Hierbei wird, wie in Tabelle 5 näher erläutert, unter Verwendung einer Mustang Q Filterkartusche (Pall Systems) eine Anionenaustauschchromatographie des Butyl-Sepharose-Eluats durchgeführt. Die Schrittausbeute betrug durchschnittlich über 97%. Tabelle 5: Anionenaustausch-Membranfiltration (Perkolationsmodus)
Parameter Merkmal Filter Mustang Q Filtertyp Dead-End Porengröße 0,8 μm Filterbereich 260 cm3 Flussrate 0,3–0,5 L/min Temperatur 22 ± 3°C Membransterilisation 1 M NaOH, 3 Liter Ladepuffer 20 mM Na-Acetat, pH 5,0 (HP-Flow) Waschpuffer 20 mM Na-Acetat, pH 5,0 Regeneration/Reinigung 20 mM Na-Acetat, pH 5,0, 1 M NaCl Filtratvolumen 15–16 Liter - Die Äquilibrierung erfolgt mit Ladepuffer.
- e) Ultrafiltration
- Zur Aufkonzentrierung von IFN-β im Mustang Q-Filtrats vor der Größenauschluss-Chromatographie (Size Exclusion Chromatographie, SEC), wurde ein Ultrafiltrationsschritt unter Verwendung einer Polyethersulfon(PES)-Membran im Tangentialflussmodus etabliert, wie in Tabelle 6 näher erläutert. Dieses Verfahren hatte eine Schrittausbeute zwischen 80 und 100%. Table 6: Ultrafiltration: Konzentration von Mustang-Eluat Q
Parameter Merkmal Apparat ProFlux M12 Filter Pellicon2 Biomax screen A Millipore Cat: P2B010A05 Cut-off 2 × 0,5 m2 Filterbereich 0,3 ± 0,2 bar Einspeisedruck 0,1 ± 0,2 bar Retentatsdruck 2 × 0,5 m2 Endkonzentration [μg/ml) 3261–4433 - Abschließend wird das System mit 20 mM NaAc, pH 5,0 gespült.
- f) Mikrofiltration
- Zur Entfernung von Präzipitaten sowie zur Eliminierung einer potentiellen biologischen Belastung wurden drei Mikrofiltrationen in das Aufreinigungsverfahren eingeführt. So wird vor der SEC wird das Eluat durch eine 0,22 μm PES-Membran (Pall Systems) gefiltert. Auch hier kann das abschließende Spülen des Systems mit 20 mM NaAc, pH 5,0 erfolgen.
- g) Größenausschlusschromatographie: Superdex 200
- Größenausschlusschromatographien auf Superdex 75, Superdex 200 und Sephacryl S 100 wurden jeweils hinsichtlich ihrer Verwendung als Feinreinigung untersucht. Kontaminierende Proteine wurden quantitativ von IFN-β getrennt mit einer Schrittausbeute von bis zu 85%. Im Hinblick auf ein kleines Elutionsvolumen erwies sich Superdex 200 als die am besten geeignete Chromatographiematrix. Demzufolge wurde der üblicherweise durchgeführte CEX(SP-Sepharose)-Schritt durch eine Größenausschlusschromatographie (Size Exclusion Chromatography – SEC) ersetzt, da unter Verwendung der CEX-Technologie lediglich Schrittausbeuten von ungefähr 25% erhalten wurden.
- Daher wird eine Größenausschlusschromatographie unter Verwendung von Superdex 200-Chromatographiematrix (GE Healthcare) durchgeführt; siehe nachstehend Tabelle 7. Dieser Schritt reduziert CHO/HCP-Verunreinigungen. Da die für präklinische Zwecke erforderliche Gesamtmenge an IFN-β sehr gering ist (ungefähr 200 mg), wurde dieser Verfahrensschritt um den Faktor 4,6 im Massstab reduziert. Diese Vorgehensweise reduzierte ebenfalls die Prozesskosten. Auf der Grundlage der labortechnischen Entwicklung wurde das Probenvolumen auf 2,5% des Säulenvolumens festgesetzt. Es wurden Schrittausbeuten zwischen 86 und 96% erzielt. Tabelle 7: Größenausschlusschromatographie: Superdes 200 (Massstab reduziert um den Faktor 4,6)
Parameter Merkmal Chromatographiematrix Superdex 200 Säulendurchmesser 140 cm Betthöhe 60 ± 3 cm Trennstufenzahl > 10.000 N/m Asymmetriefaktor 0,6 < As < 1,8 Säulentemperatur 22 ± 3°C Flussrate 3.492 L/h – alle Phasen Laufpuffer 25 mM NaAc, pH 4,8, 0,15 M NaCl 0,167% (v/v) Tween 20 Beladungsvolumen maximal 2,5% des Säulenvolumens Elutionsvolumen 1,1–1,4 Liter Sammlung Peak Anfang – Peak Ende - Zur Equilibrierung wurde der Laufpuffer verwendet, der zur Entfernung von Sauerstoff mit Stickstoff begast wurde. Nach der Produktelution wurde die Chromatographiesäule mit 1 M NaOH behandelt und in Lagerpuffer 20 mM NaOH aufbewahrt.
- f) Vorfiltration/Nanofiltration
- Das aufgereinigte Material wird gemäß Tabelle 8 vor der Nanofiltration gefiltert. Diese Filtration wurde mit Mini Kleenpak (Pall Systems) durchgeführt, um die Nanofiltrationsmembran vor Mikropräzipitaten zu schützen. Tabelle 8: Vorfiltration (Mikrofiltration) von aufgereinigtem Material
Parameter Merkmal Filter Mini Kleenpak PALL cat: KA02 EKVP2S Filtertyp PES (Polyethersulfon) Porengröße 0,2 μm Filterbereich 0,022 m2 Flussrate 250–300 ml/min - Nach der Vorfiltration wird das aufgereinigte Material durch ein Planova N20-Filtergerät gefiltert (Tabelle 9). Zur Virusfiltration wurde das Hohlfasersystem Planova 20 N (Asahi Kasei) als geeignet hinsichtlich des Ertrags an IFN-β sowie der Kompatibilität mit dem verwendeten Arzneistoff-Lagerungspuffer identifiziert. Dieses Verfahren erbrachte zwischen 90 und 100% Die Reinheit beträgt > 99% (bestimmt nach RP-HPLC). Table 9: Nanofiltration von aufgereinigtem Material
Parameter Merkmal Filter Planova N20 Filtertyp Hohlfaser, Dead-End Porengröße 20 nm nominal Filterbereich 1200 cm2 Flussrate 0,45 ± 0,05 - Der Nanofilter wird mit bis zu 300 mL 20 mM NaAc, pH 5,0, 150 mM NaCl, 0,167% Tween 20 (v/v) gewaschen. Im Anschluss daran wird der aufgereinigte Arzneistoff zum Einfrieren und zur Lagerung in seine Behälter (TPP Kryogefäße) gefüllt.
- Der Gesamtausbeute von IFN-β bezogen auf die Ausgangsaktivität betrug über 25%.
- Beispiel 3: Identifikation eines geeigneten Lagerungspuffersystems für IFN-β zur Verwendung als gebrauchsfertiges Arzneimittel
- Das Ziel dieses Experiments war es, ein geeignetes Puffersystem sowie geeignete Lagerungsbedingungen für IFN-β zur Verwendung als Arzneistoff zu identifizieren.
- IFN-β wurde mittels Zink-Sepharose-Chromatographie und Butyl-Sepharose-Chromatographie aus Eluaten von Blue Sepharose aufgereinigt und unter Verwendung von Vivacell 70 Zentrifugalfiltervorrichtungen auf etwa 1,9 mg/ml aufkonzentriert. Bei diesem Präparat handelte es sich um das Ausgangsmaterial, das zur Formulierungsanalyse verwendet wurde.
- Der Pufferaustausch wurde unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie durchgeführt (NAP10, GE Healthcare). Es wurden insgesamt 20 unterschiedliche Puffer untersucht (siehe Tabelle 10), teilweise mit Stickstoff als inertem Gas entgast. Des Weiteren wurden die Auswirkungen des Gasraum- und Schließsystems auf die Lagerstabilität und die Präzipitation analysiert. Tabelle 1: Bedingungen für die Identifizierung eines Puffersystems für die stabile Lagerung von aufgereinigtem IFN-β
Nr. Zusammensetzung des Puffers cIFN-β [μg/ml] Oxidierende/nicht oxidierende Bedingungen* 1 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, pH 4,8 200 oxidierend 2 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, pH 4,8 200 nicht oxidierend 3a 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 0,167% Tween 20, pH 4,8 200 nicht oxidierend 3b 25 mM Acetat, 150 mM Arginin, 0,005% Tween 20, pH 4,8 200 nicht oxidierend 3c 25 mM Acetat, 150 mM Lysin, 0,005% Tween 20, pH 4,8 200 nicht oxidierend 4a 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20, 300 mM mannitol, pH 4,3 200 nicht oxidierend 4b 25 mM Acetat, 10% (v/v) Ethanol, pH 4,3 200 nicht oxidierend 5 25 mM Acetat, 100 mM CaCl2, pH 4,3 200 nicht oxidierend 6 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 200 mM CHES, pH 4,3 200 nicht oxidierend 7 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 150 mM Betain, pH 4,3 200 nicht oxidierend 8 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 150 mM GlutaMAX-II, pH 4,3 200 nicht oxidierend 9aI 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 25% (v/v) Glycerin, pH 3,0 200 nicht oxidierend 9aII 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 25% (v/v) Glycerin, pH 4,8 200 nicht oxidierend/semi-steril 9bI 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 25% (v/v) PEG300, pH 3,0 200 nicht oxidierend 9bII 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 25% (v/v) PEG300, pH 4,8 200 nicht oxidierend/semi-steril 10 25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 300 mM Glukose, pH 4,3 200 nicht oxidierend 11aI 70 mM Citrat, 50 mM NaH2PO4, 2 mM methionine, 200 mM Glycerin, pH 5,0 60 nicht oxidierend 11 all 70 mM Citrat, 50 mM NaH2PO4, 2 mM Methionin, 200 mM Glycerin, pH 6,5 60 nicht oxidierend 11b 50 mM Imidazol, 200 mM NaCl, pH 7,5 350 nicht oxidierend 11c 50 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl, pH 7,5 150 nicht oxidierend 12 50 mM Glycin, 2 mM Lanthan (III) chlorid, pH 3,0 200 nicht oxidierend - * Nicht-oxidierende Bedingungen: Die Puffer wurden unter Anwendung von Vakuumfiltration mit 0,2 μm filtriert und vor der Verwendung für 10 min mit N2 begast; nach dem Abfüllen des formulierten IFN-β in PP-Kryogefäße wurde der Kopfraum (maximal 30% des Volumens des Kryogefäßes) mit 0,2 μm-filtriertem N2 beaufschlagt (Inertatmosphäre). Oxidationsbedingungen: Die Puffer wurden nicht unter Anwendung von Vakuumfiltration bei 0,2 μm filtriert, jedoch vor der Verwendung für 10 min mit Luft begast; nach dem Abfüllen des formulierten IFN-β in die PP-Kryogefäße wurde der Kopfraum nicht mit N2 gefüllt. Nicht-oxidierende/semisterile Bedingungen: Die Puffer wurden zunächst für 30 min mit N2 begast, dann unter einem laminaren Strom durch eine 0,2 μm Cellulose-Acetat-Membran (Schleicher & Schuell; FP 30/02 CA-S) filtriert; die nachfolgenden Schritte wurden unter einem laminaren Strom durchgeführt; die finale Proteinlösung wurde nicht steril filtriert, da ein signifikanter Verlust an IFN-β erwartet wurde; nach dem Abfüllen des formulierten IFN-β in PP-Kryogefäße wurde der Gasraum (maximal 30% des Volumens des Kryogefäßes) mit 0,2 μm-filtriertem N2 gefüllt.
- Die Stabilität von IFN-β (Ertrag wie mittels RP-HPLC gemessen) war für alle für 12–14 Tage bei +4°C gelagerten Puffereluate gut (97–103%), mit der Ausnahme des Puffereluats 11aI, das eine niedrige IFN-β-Konzentration (etwa 60 μg/ml) sowie geringe Mengen an Stabilisatoren enthielt. Die Stabilität von IFN-β war ebenfalls für die meisten der für 12–14 Tage bei –80°C gelagerten Puffereluate gut (98–102%), mit der Ausnahme von sechs Puffereluaten, die entweder eine niedrige IFN-beta-Konzentration (etwa 60 μg/ml) und nur geringe Mengen an Stabilisatoren bzw. 10% (v/v) Ethanol, 100 mM CaCl2, 200 mM CHES oder 50 mM Imidazol enthielten.
- Die A320-Werte (”Trübheit”) waren besonders niedrig (0,000–0,006) für die Puffereluate 3a (25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 0,167% Tween 20, pH 4,8), 9aI (25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 25% (v/v) Glyzerin, pH 3,0) und 9bI (25 mM Acetat, 150 mM NaCl, 25% (v/v) PEG300, pH 3,0) vor der Lagerung und nach der Lagerung bei sowohl +4°C als auch –80°C, sowie für zwei weitere Puffereluate mit einer niedrigen IFN-β-Konzentration (etwa 60 μg/ml) vor der Lagerung und nach der Lagerung bei +4°C.
- Weitere Analysen (RP-HPLC, % T580, A280, A320, Western-Blotting im Anschluss an SDS-PAGE, IEF-Western-Blotting, analytische SEC auf Superdex 75 HR 10/30 sowie Peptidkartierung) erfolgten für die Puffereluate 3a, 9aI und 9bI nach einer gesamten Lagerungsdauer von 26–27 Tagen bei den bei –80°C gelagerten Proben und nach 47–48 Tagen (> 6,5 Wochen) bei den bei +4°C gelagerten Proben.
- Die RP-HPLC-Messung (100–102% Ertrag) und die A280-Messung (99–107% Ertrag) zeigten eine äußerst gute Stabilität (IFN-β-Proteinertrag) für alle drei Puffereluate sowie für die beiden Varianten der Lagerungsbedingungen. Die A320-Werte (”Trübheit”) waren für alle drei Puffereluate sowie für die beiden Varianten der Lagerungsbedingungen sehr niedrig (zwischen 0,000 und 0,008).
- Das Isoformenmuster auf den Western-Blots im Anschluss an SDS-PAGE sowie auf IEF-Western-Blots war für alle drei Puffereluate sowie für die beiden Varianten der Lagerungsbedingungen sowohl dem von Avonex als auch dem der HIC-Eluat-Kontrolle (Kontrolle ”vor dem Pufferaustausch”) sehr ähnlich.
- IFN-β eluierte bei allen drei Puffereluate, bei beiden Varianten der Lagerungsbedingungen sowie bei der HIC-Eluat-Kontrolle (Kontrolle ”vor dem Pufferaustausch”) in einer analytischen SEC auf Superdex 75 HR 10/30 mit einer ähnlichen apparenten Molekularmasse von 12–16 kDa.
- Zusammenfassend wurde insbesondere mit der Zusammensetzung 25 mM NaAc, pH 4,8, 150 mM NaCl, 0,167% Tween 20 ein in höchstem Maße geeigneter Puffer für den Arzneistoff im Hinblick auf eine Lagerung von IFN-β bei –80°C (ein Erfordernis bei einer beabsichtigten Monographie für INF-β), auf den Ertrag nach dem Auftauen sowie auf die Abwesenheit einer Präzipitation identifiziert, der sowohl in versuchsweiser als auch in kommerzieller Größenordnung verwendet werden kann.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 028033 [0002]
- - EP 0041313 [0002]
- - EP 070906 [0002]
- - EP 287075 [0002, 0024]
- - EP 011435 [0005]
- - EP 027262 [0006]
- - EP 041313 [0007]
- - EP 094672 [0008]
- - EP 118808 [0008]
- - EP 215658 [0009]
- - EP 274900 [0010]
- - EP 467992 [0010]
- - EP 529300 [0011, 0024]
- - WO 98/28007 [0012, 0051, 0053]
- - DE 3028919 [0013]
- - DE 3039566 [0014]
- - EP 446850 [0015]
- - EP 1273592 [0019]
- - WO 99/15193 [0051]
- - EP 0529300 [0051]
- Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Chernajovsky et al., DNA 3 (1984), 297–308 [0002]
- - McCormick et al., Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 166–172 [0002]
- - Goodkin, Lancet 344 (1994), 1057–1060 [0002]
- - Conradt et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 14600–14605 [0016]
- - Carter und Horoszewicz, Pharmacol. Ther. 8 (1980), 359–377 [0017]
- - Mikulski et al., Prep. Biochem. 10 1980, 103–119 [0017]
- - Meyer 2000, Fachbereich Chemie der Universität Hannover [0018]
- - Stewart, W. E. 11 (1981): The Interferon System (Second, enlarged Edition), Springer-Verlag: Wien, New York [0026]
- - Grossberg, S. E. et al. (1984), Assay of Interferons. In: Came, P. E., Carter W. A (eds) Interferons and their Applications, Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 23–43 [0026]
- - F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg.), Heidelberg, Berlin, Spektrum Akad. Verlag 1998 [0036]
- - http://www.amershambiosciences.com [0046]
- - http://www.bio-rad.com [0046]
- - http://www.amershambiosciences.com [0047]
- - http://www.bio-rad.com [0047]
- - ”Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods” von Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland (inzwischen GE Healthcare), 2002 [0047]
- - Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20. Auflage (2000), ISBN 0-683-306472 [0053]
- - http://www.pubmed.gov [0071]
- - Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) [0071]
- - Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987) [0071]
- - Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I–IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986 [0071]
- - Monographie-Entwurf PHARMEUROPA Bd. 15, Nr. 4, Oktober 2003 [0073]
- - PHARMEUROPA, Bd. 15, Nr. 4, Oktober 2003 [0073]
Claims (33)
- Verfahren zur Reinigung von humanem Interferon beta (IFN-β), umfassend mindestens eine Affinitätschromatographie (AC) und mindestens eine hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), wobei diese Chromatographieschritte in beliebiger Reihenfolge unmittelbar aufeinander folgen.
- Verfahren nach Anspruch 1, umfassend zwei Affinitätschromatographien, die vor der hydrophoben Interaktionschromatographie durchgeführt werden.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend eine Anionenaustauschchromatographie (AEX).
- Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Anionenaustauschchromatographie nach der hydrophoben Interaktionschromatographie durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend mindestens eine (a) Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC); (b) Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC); (c) hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC); und/oder (d) Anionenaustauschmembranfiltration.
- Verfahren nach Anspruch 5, wobei für die Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC) Cibacron Blue, für die Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC) Zn-Chelat Sepharose (IMAC), für die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) Butylgruppen als Liganden, und/oder für die Anionenaustauschmembranfiltration eine Membran mit quaternären Aminogruppen verwendet wird.
- Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei keine HPLC durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei keine Kationenaustauschchromatographie durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei keine Hydroxyapatitchromatographie durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche ferner umfassend mindestens einer der folgenden Schritte: (e) Ultrafiltration (UF); (f) Mikrofiltration (MF); (g) Größenausschlusschromatographie (SEC); und/oder (i) Nanofiltration (NF).
- Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Ultrafiltration eine Tangentialflussfiltration mit einer Ausschlussgröße von 5 kD–1000 kD umfasst, für die Mikrofiltration eine 0.2 μm Membran, für die Größenausschlusschromatographie Superdex 200 und/oder für die Nanofiltration ein Filter mit 15–75 nm Porengröße verwendet wird.
- Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche umfassend die Schritte: (a) Farbliganden-Affinitätschromatographie (AC); (b) Metall-Chelat-Affinitätschromatographie (MAC); (c) hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC); (d) Anionenaustauschchromatographie (AEX); (e) Ultrafiltration (UF); (f) Mikrofiltration (MF); (g) Größenausschlusschromatographie (SEC); (f) Mikrofiltration (MF); und (h) Nanofiltration (NF).
- Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das IFN-β in einer eukaryotischen Wirtszelle hergestellt wird.
- Verfahren nach Anspruch 13, wobei die eukaryotische Wirtszelle eine Chinese Hamster Ovary (CHO) Zelle ist.
- Verfahren zur Herstellung einer zur parenteralen Applizierung geeigneten pharmazeutischen Flüssigformulierung von humanem IFN-β umfassend ein Verfahren zur Reinigung von IFN-β nach einem der vorangehenden Ansprüche, und (i) Formulierung des gereinigten IFN-β in eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung; und (ii) Abfüllen der Formulierung in ein geeignetes Gefäß.
- Verfahren nach Anspruch 15, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung Acetat, NaCl oder eine der Aminosäuren Arginin, Lysin und Glutamin sowie ggf. einen oder mehrere weitere Hilfsstoffe enthält.
- Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Hilfsstoff Methionin, Mannitol, Sorbitol, Glycerol oder ein Tensid ist.
- Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Tensid Polysorbat 20 oder 80 ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der pH-Wert der Formulierung zwischen 4.3 und 4.8 liegt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung 25 mM Acetat, 150 mM NaCl und 0,167% (v/v) Polysorbat 20 enthält.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die Formulierung mit einem inerten Gas wie Helium oder Stickstoff entgast wurde.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei der Kopfraum des Behälters mit einem inerten Gas wie Helium oder Stickstoff gefüllt ist.
- Verfahren nach Anspruche 22, wobei der Kopfraum höchstens 30% des Volumens des Behälters ausmacht.
- Arzneimittel, enthaltend das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 gereinigte IFN-β und pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe wie Puffer, Salze, Tenside und Stabilisatoren.
- Gefäß enthaltend eine zur parenteralen Applizierung geeignete pharmazeutische Flüssigformulierung von humanem IFN-β und erhältlich nach einem Verfahren der Ansprüche 15 bis 23.
- Gefäß nach Anspruch 25 dessen innere Oberflächen, die Kontakt zur pharmazeutischen Flüssigformulierung haben, die Adsorption von IFN-β verhindern.
- Gefäß nach Anspruch 26, wobei mindestens eine Oberfläche des Gefäßes, die in Kontakt mit der Flüssigformulierung ist, mit einem Material im Wesentlichen bestehend aus Polypropylen (PP), Silikon oder Polytetrafluorethylen oder einem Ethylen-Tetrafluorethylen (ETFE) Copolymer beschichtet ist oder daraus besteht.
- Gefäß nach Anspruch 26 oder 27, das eine Spritze, Ampulle, Karpule, Durchstichflasche oder Infusionsbehälter ist.
- Gefäß nach Anspruch 28, wobei die Flüssigformulierung bezüglich der Konzentration von IFN-β in einer Konzentration von 10–250 μg/ml und/oder einer Aktivität von 5–50 Millionen I. E./ml vorliegt.
- Kit zur Verabreichung von IFN-β durch Injektion oder Infusion umfassend ein Gefäß nach einem der Ansprüche 26 bis 29 und Anweisungen zur Lagerung und/oder Verabreichung.
- Kit nach Anspruch 30, wobei in dem Kit mehrere Gefäße vorgesehen sind.
- Kit nach Anspruch 31 oder 32, das über Sicherheitskompartimente für Spritzen, beziehungsweise Injektions- und/oder Infusionskanülen verfügt.
- Kit nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei die Lagerung bei etwa 2°C bis 8°C vorgesehen ist.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102009032179A DE102009032179A1 (de) | 2009-07-07 | 2009-07-07 | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
| JP2012518819A JP2012532167A (ja) | 2009-07-07 | 2010-07-07 | インターフェロンβの精製方法 |
| EP10737494A EP2451470A1 (de) | 2009-07-07 | 2010-07-07 | VERFAHREN ZUR AUFREINIGUNG VON INTERFERON-ß |
| PCT/EP2010/004130 WO2011003600A1 (en) | 2009-07-07 | 2010-07-07 | METHOD FOR THE PURIFICATION OF INTERFERON-β |
| EA201290040A EA201290040A1 (ru) | 2009-07-07 | 2010-07-07 | СПОСОБ ОЧИСТКИ ИНТЕРФЕРОНА-β |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102009032179A DE102009032179A1 (de) | 2009-07-07 | 2009-07-07 | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE102009032179A1 true DE102009032179A1 (de) | 2011-01-13 |
Family
ID=42562473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE102009032179A Withdrawn DE102009032179A1 (de) | 2009-07-07 | 2009-07-07 | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2451470A1 (de) |
| JP (1) | JP2012532167A (de) |
| DE (1) | DE102009032179A1 (de) |
| EA (1) | EA201290040A1 (de) |
| WO (1) | WO2011003600A1 (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210009982A (ko) * | 2019-07-18 | 2021-01-27 | 에이비온 주식회사 | 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 |
Citations (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0011435A1 (de) | 1978-11-07 | 1980-05-28 | Toray Industries, Inc. | Verfahren zur Reinigung von Human-Fibroblast-Interferon |
| DE3028919A1 (de) | 1979-07-31 | 1981-02-19 | Hoffmann La Roche | Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung |
| EP0027262A2 (de) | 1979-10-12 | 1981-04-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Reinigung von Interferon |
| EP0028033A2 (de) | 1979-10-30 | 1981-05-06 | Juridical Foundation Japanese Foundation for Cancer Research | Doppelsträngige DNS, welche für ein Polypeptid mit der Aktivität von menschlichem Fibroblasten-Interferon codiert, clonierte DNS, rekombinantes Plasmid, welches die DNS enthält, und Mikroorganismus, welcher das rekombinante Plasmid enthält |
| DE3039566A1 (de) | 1979-10-23 | 1981-05-21 | Stichting Rega V.Z.W., Leuven | Verfahren zur reinigung von interferon |
| EP0041313A2 (de) | 1980-04-03 | 1981-12-09 | Biogen, Inc. | DNS-Sequenzen, rekombinante DNS-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von dem menschlichen Fibroblast-Interferon |
| EP0070906A1 (de) | 1981-02-04 | 1983-02-09 | Juridical Foundation Japanese Foundation For Cancer Research | Menschliches gen für interferon-beta |
| EP0094672A1 (de) | 1982-05-17 | 1983-11-23 | Toray Industries, Inc. | Verfahren zur Reinigung von Human-Interferon |
| EP0118808A2 (de) | 1983-03-03 | 1984-09-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Reinigung von Interferon |
| EP0215658A2 (de) | 1985-09-13 | 1987-03-25 | Cetus Oncology Corporation | Formulierung für rekombinantes beta-Interferon, Verfahren zur Gewinnung und Stabilisierung des beta-Interferons und dessen Verwendung |
| EP0274900A2 (de) | 1986-12-23 | 1988-07-20 | Cetus Oncology Corporation | Reinigung von rekombiniertem beta-Interferon durch RP-HPLC und Formulierungen, die diese Produkte enthalten |
| EP0287075A2 (de) | 1987-04-14 | 1988-10-19 | Dr. Rentschler Biotechnologie GmbH | Verfahren zur Konstruktion einer animalen Zellinie für die Herstellung von humanem Interferon-beta |
| EP0446850A2 (de) | 1990-03-16 | 1991-09-18 | SCLAVO S.p.A. | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Humaninterferon-beta in reiner Form |
| EP0467992A1 (de) | 1989-04-14 | 1992-01-29 | Biogen, Inc. | Verfahren zur reinigung eines proteins |
| EP0529300A1 (de) | 1991-08-27 | 1993-03-03 | Dr. Rentschler Biotechnologie GmbH | Neues rekombinantes Human-IFN-beta, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltende pharmazeutische Zubereitungen |
| WO1998028007A1 (en) | 1996-12-24 | 1998-07-02 | Biogen, Inc. | Stable liquid interferon formulations |
| WO1999015193A1 (de) | 1997-09-23 | 1999-04-01 | Rentschler Biotechnologie Gmbh & Co. Kg | FLÜSSIGE INTERFERON-β-FORMULIERUNGEN |
| WO1999055377A2 (en) * | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Polyol-ifn-beta conjugates |
| EP1273592A2 (de) | 2001-07-06 | 2003-01-08 | ALFA WASSERMANN S.p.A. | Verfahren für die Reinigung von pharmakologisch aktiven Proteinen mittels Kationen-Austauschchromatographie |
| US20040126361A1 (en) * | 2002-12-26 | 2004-07-01 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1917276B1 (de) * | 2005-08-26 | 2018-03-21 | Ares Trading S.A. | Verfahren zur herstellung von glykosyliertem interferon-beta |
| AU2006323925B2 (en) * | 2005-12-09 | 2012-08-02 | Ares Trading S.A. | Method for purifying FSH or a FSH mutant |
| DE102007050165B4 (de) * | 2007-10-19 | 2010-06-17 | Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover | Stabilisierte Lösung, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung und Arzneimittel in Form einer stabilisierten Lösung |
| CA2711375C (en) * | 2008-01-18 | 2019-04-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Purification of not-glycosylated polypeptides |
| DE102008051574A1 (de) * | 2008-10-14 | 2010-04-15 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verfahren zur Herstellung von Interferon-beta und deren Varianten |
-
2009
- 2009-07-07 DE DE102009032179A patent/DE102009032179A1/de not_active Withdrawn
-
2010
- 2010-07-07 EP EP10737494A patent/EP2451470A1/de not_active Withdrawn
- 2010-07-07 JP JP2012518819A patent/JP2012532167A/ja active Pending
- 2010-07-07 WO PCT/EP2010/004130 patent/WO2011003600A1/en active Application Filing
- 2010-07-07 EA EA201290040A patent/EA201290040A1/ru unknown
Patent Citations (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0011435A1 (de) | 1978-11-07 | 1980-05-28 | Toray Industries, Inc. | Verfahren zur Reinigung von Human-Fibroblast-Interferon |
| DE3028919A1 (de) | 1979-07-31 | 1981-02-19 | Hoffmann La Roche | Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung |
| EP0027262A2 (de) | 1979-10-12 | 1981-04-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Reinigung von Interferon |
| DE3039566A1 (de) | 1979-10-23 | 1981-05-21 | Stichting Rega V.Z.W., Leuven | Verfahren zur reinigung von interferon |
| EP0028033A2 (de) | 1979-10-30 | 1981-05-06 | Juridical Foundation Japanese Foundation for Cancer Research | Doppelsträngige DNS, welche für ein Polypeptid mit der Aktivität von menschlichem Fibroblasten-Interferon codiert, clonierte DNS, rekombinantes Plasmid, welches die DNS enthält, und Mikroorganismus, welcher das rekombinante Plasmid enthält |
| EP0041313A2 (de) | 1980-04-03 | 1981-12-09 | Biogen, Inc. | DNS-Sequenzen, rekombinante DNS-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von dem menschlichen Fibroblast-Interferon |
| EP0070906A1 (de) | 1981-02-04 | 1983-02-09 | Juridical Foundation Japanese Foundation For Cancer Research | Menschliches gen für interferon-beta |
| EP0094672A1 (de) | 1982-05-17 | 1983-11-23 | Toray Industries, Inc. | Verfahren zur Reinigung von Human-Interferon |
| EP0118808A2 (de) | 1983-03-03 | 1984-09-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Reinigung von Interferon |
| EP0215658A2 (de) | 1985-09-13 | 1987-03-25 | Cetus Oncology Corporation | Formulierung für rekombinantes beta-Interferon, Verfahren zur Gewinnung und Stabilisierung des beta-Interferons und dessen Verwendung |
| EP0274900A2 (de) | 1986-12-23 | 1988-07-20 | Cetus Oncology Corporation | Reinigung von rekombiniertem beta-Interferon durch RP-HPLC und Formulierungen, die diese Produkte enthalten |
| EP0287075A2 (de) | 1987-04-14 | 1988-10-19 | Dr. Rentschler Biotechnologie GmbH | Verfahren zur Konstruktion einer animalen Zellinie für die Herstellung von humanem Interferon-beta |
| EP0467992A1 (de) | 1989-04-14 | 1992-01-29 | Biogen, Inc. | Verfahren zur reinigung eines proteins |
| US5169936A (en) * | 1989-04-14 | 1992-12-08 | Biogen, Inc. | Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand |
| EP0446850A2 (de) | 1990-03-16 | 1991-09-18 | SCLAVO S.p.A. | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Humaninterferon-beta in reiner Form |
| EP0529300A1 (de) | 1991-08-27 | 1993-03-03 | Dr. Rentschler Biotechnologie GmbH | Neues rekombinantes Human-IFN-beta, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltende pharmazeutische Zubereitungen |
| WO1998028007A1 (en) | 1996-12-24 | 1998-07-02 | Biogen, Inc. | Stable liquid interferon formulations |
| WO1999015193A1 (de) | 1997-09-23 | 1999-04-01 | Rentschler Biotechnologie Gmbh & Co. Kg | FLÜSSIGE INTERFERON-β-FORMULIERUNGEN |
| WO1999055377A2 (en) * | 1998-04-28 | 1999-11-04 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Polyol-ifn-beta conjugates |
| EP1273592A2 (de) | 2001-07-06 | 2003-01-08 | ALFA WASSERMANN S.p.A. | Verfahren für die Reinigung von pharmakologisch aktiven Proteinen mittels Kationen-Austauschchromatographie |
| US20040126361A1 (en) * | 2002-12-26 | 2004-07-01 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency |
Non-Patent Citations (20)
| Title |
|---|
| "Ion Exchange Chromatography - Principles and Methods" von Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland (inzwischen GE Healthcare), 2002 |
| Carter und Horoszewicz, Pharmacol. Ther. 8 (1980), 359-377 |
| Chernajovsky et al., DNA 3 (1984), 297-308 |
| Conradt et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 14600-14605 |
| F. Lottspeich, H. Zorbas (Hrsg.), Heidelberg, Berlin, Spektrum Akad. Verlag 1998 |
| Goodkin, Lancet 344 (1994), 1057-1060 |
| Grossberg, S. E. et al. (1984), Assay of Interferons. In: Came, P. E., Carter W. A (eds) Interferons and their Applications, Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 23-43 |
| Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986 |
| http://www.amershambiosciences.com |
| http://www.bio-rad.com |
| http://www.pubmed.gov |
| Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987) |
| McCormick et al., Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 166-172 |
| Meyer 2000, Fachbereich Chemie der Universität Hannover |
| Mikulski et al., Prep. Biochem. 10 1980, 103-119 |
| Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) |
| Monographie-Entwurf PHARMEUROPA Bd. 15, Nr. 4, Oktober 2003 |
| PHARMEUROPA, Bd. 15, Nr. 4, Oktober 2003 |
| Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20. Auflage (2000), ISBN 0-683-306472 |
| Stewart, W. E. 11 (1981): The Interferon System (Second, enlarged Edition), Springer-Verlag: Wien, New York |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011003600A8 (en) | 2011-09-01 |
| JP2012532167A (ja) | 2012-12-13 |
| EP2451470A1 (de) | 2012-05-16 |
| WO2011003600A1 (en) | 2011-01-13 |
| EA201290040A1 (ru) | 2012-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1988913B1 (de) | G-csf-flüssigformulierung | |
| DE602004013372T2 (de) | Il-7-fusionsproteine mit antikörperportionen, deren herstellung und deren verwendung | |
| DE60224415T2 (de) | Pegyliertes und diglykosyliertes erythropoietin | |
| EP0538300B1 (de) | O-glycosyliertes ifn-alpha | |
| DE69729786T2 (de) | Hochkonzentrierte, lyophilisierte und flüssige faktor-ix formulierungen | |
| DE60036053T2 (de) | Erythropoietinkonjugate | |
| DE60011087T2 (de) | Konjugate zwischen erythropoietin und polyethylenglycol | |
| AT514675B1 (de) | Herstellung von faktor h (fh) und fh-derivaten aus plasma | |
| DE60109625T2 (de) | Flüssige arzneizubereitung enthaltend ein erythropoietin derivat | |
| DE69432179T3 (de) | Eine formulierung des gerinnungsfaktors viii | |
| US20190290767A1 (en) | Method of Reducing Formation of Etanercept Aggregates or Fragments | |
| EP0529300B1 (de) | Neues rekombinantes Human-IFN-beta, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltende pharmazeutische Zubereitungen | |
| EP1904522B1 (de) | Verfahren zur reinigung von g-csf | |
| DE4111393A1 (de) | Stabilisierte faktor viii-praeparationen | |
| EA035448B1 (ru) | СПОСОБ ОЧИСТКИ рчГ-КСФ | |
| DE102004027816A1 (de) | Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin | |
| KR101443257B1 (ko) | 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법 | |
| CN116023466B (zh) | 纯化PEG修饰重组人干扰素β1b蛋白的方法 | |
| CA2544432C (en) | Stable pharmaceutical composition comprising granulocyte-colony stimulating factor | |
| EP0420049B1 (de) | Stabilisierte Leukocyten-Interferone | |
| EP0203382B1 (de) | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von alpha-Interferon | |
| DE69836315T2 (de) | Verwendung von TCF-II zur Behandlung von durch Krebs verursachtem Gewichtsverlust, Anaemie und TNF-Erhöhung | |
| DE102009032179A1 (de) | Verfahren zur Reinigung von Interferon beta | |
| DE60226327T2 (de) | Reinigungsverfahren zur grossmassstabigen produktion von gc-globulin, damit erhaltenes produkt und dessen verwendung in medizin | |
| US20120177603A1 (en) | Method for the purification of interferon-b |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| R081 | Change of applicant/patentee |
Owner name: RATIOPHARM GMBH, DE Free format text: FORMER OWNER: BIOGENERIX AG, 68199 MANNHEIM, DE Effective date: 20120712 |
|
| R082 | Change of representative |
Representative=s name: MUELLER FOTTNER STEINECKE RECHTSANWALTS- UND P, DE Effective date: 20120712 Representative=s name: MUELLER FOTTNER STEINECKE RECHTSANWAELTE PATEN, DE Effective date: 20120712 |
|
| R082 | Change of representative |
Representative=s name: MUELLER FOTTNER STEINECKE RECHTSANWAELTE PATEN, DE |
|
| R081 | Change of applicant/patentee |
Owner name: RATIOPHARM GMBH, DE Free format text: FORMER OWNER: BIOGENERIX AG, 89079 ULM, DE Effective date: 20140131 |
|
| R082 | Change of representative |
Representative=s name: MUELLER FOTTNER STEINECKE RECHTSANWALTS- UND P, DE Effective date: 20140131 Representative=s name: MUELLER FOTTNER STEINECKE RECHTSANWAELTE PATEN, DE Effective date: 20140131 |
|
| R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |