PL191552B1

PL191552B1 - Sposób wytwarzania waniliny

Info

Publication number: PL191552B1
Application number: PL326882A
Authority: PL
Inventors: Andreas Muheim; Bruno Müller; Thomas Münch; Markus Wetli
Original assignee: Givaudan Roure Internat Sa
Priority date: 1997-06-19
Filing date: 1998-06-18
Publication date: 2006-06-30
Also published as: EP0885968A1; IL124800A; EP0885968B3; TR199801111A3; CZ188398A3; IL124800A0; JPH1169990A; PL326882A1; TR199801111A2; ZA985146B; CA2238215A1; DE69833516T2; ES2258290T3; BR9802011A; DE69833516D1; EP0885968B1; ES2258290T7; US6235507B1; AU7196498A; DE69833516T3

Abstract

1.Sposób wytwarzania waniliny, znamienny tym, ze a) namnaza sie w odpowiedniej pozywce bakterie nalezaca do rodzaju Streptomyces uzy- skujac bulion fermentacyjny, b) do bulionu fermentacyjnego dodaje sie substrat stanowiacy kwas ferulowy w stezeniu od okolo 5 gL -1 do okolo 40 gL -1 uzyskujac waniline jako glówny produkt reakcji biotransformacji kwasu ferulowego, oddziela sie biomase od bulionu fermentacyjnego i c) ekstrahuje sie z bulionu fermentacyjnego waniline i jezeli to pozadane, pólprodukt sta- nowiacy gwajakol. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest mikrobiologiczny sposób wytwarzania waniliny z kwasu ferulowego. Zgodnie z tym sposobem, kultury, korzystnie zanurzone kultury jakichkolwiek bakterii z rzędu promieniowców (Actinomycetales), korzystnie z rodziny Streptomycetaceae inkubuje się z substratem kwasem ferulowym w celu fermetacyjnego wytworzenia waniliny. Produkt - wanilinę odzyskuje się z bulionu fermentacyjnego przez specjalnie opracowany sposób ekstrakcji, pozwalający również oddzielić i odzyskać wartościowe produkty uboczne fermentacji w celu otrzymania analitycznie i sensorycznie oczyszczonego produktu - waniliny i w szczególności produktu ubocznego - gwajakolu.

W stosowaniu związków smakowych coraz ważniejsze staje się to, że związki smakowe mogą być nazywane „naturalnymi. Zgodnie z regulacjami europejskimi i Stanów Zjednoczonych oznacza to, że związek musi być otrzymany sposobami fizycznymi, enzymatycznymi lub mikrobiologicznymi i tylko z materiałów pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego. Tak więc różne działania badawcze podczas ostatniej dekady były nastawione na stosowanie odnawialnych, tanich i naturalnych, nieprzerobionych źródeł materiałów do fermentacyjnego wytwarzania waniliny. Jednak do tej pory w publikacjach i patentach bardzo rzadko donoszono o handlowo atrakcyjnych objętościowych wydajnościach.

Gwajakol jest cząsteczką typu smolistego, która znacznie przyczynia się do charakterystycznego smaku wyciągów wanilii. Jest on zatem często stosowany w połączeniu z waniliną do środków smakowych typu wanilii. Jednak do tej pory nie opisano jeszcze sposobu fermentacyjnego wytwarzania naturalnego gwajakolu.

W ciągu ostatnich 10 lat kilka zgłoszeń patentowych dotyczyło mikrobiologicznego lub enzymatycznego sposobu wytwarzania waniliny. Ogólnie odpowiedni prekursor jest przekształcany w wanilinę przez mikroorganizmy lub enzymy. Proponowanymi prekursorami są eugenol, izoeugenol, kwas ferulowy, kurkumina lub żywice balsamiczne z drzew Styrax Tonklnensis. Zwykle wydajności przekształcenia są skrajnie niskie. Przykładem jest np. opis EP 0405 197 A1 Haarman'a & Reimer'a, w którym zastrzega się wytwarzanie 18 mgL^-1 wychodząc z 0,2 gL^-1 eugenolu, stosując mikroorganizmy Serratia, Klebsiella lub Enterobacter. Ponadto ta przemiana trwa 13 dni. Pernod - Ricard (EP 453 368 A) zastrzegają wytwarzanie 46 mgL^-1 waniliny otrzymanej w ciągu 6 dni z kwasu ferulowego w fermentacji Pycnoporus. Zgodne z tym również Kraft General Foods (US 5,128,253) zastrzega otrzymane 210 mgL^-1 waniliny z kwasu ferulowego w ciągu 54 dni. W celu otrzymywania tego miana musi być dodawany czynnik redukujący, w przeciwnym razie powstawanie waniliny nie może mieć miejsca imoże być wytworzony tylko kwas wanilinowy. Takasago (JP 227980/1993) wytworzył mutanty szczepów Pseudomonas, które są blokowane w drodze degradacji waniliny. Wychodząc z 1gL^-1 kwasu ferulowego otrzymuje się 0,28 gL^-1 waniliny. Dotychczas jedynym zgłoszeniem donoszącym o ekonomicznie atrakcyjnych wydajnościach objętościowych waniliny w metodzie fermentacyjnej była ostatnio publikacja Haarman'a i Reimer'a (EP 0761 817 A2). Zidentyfikowali oni dwa szczepy rodzaju Amycola-1 topsis, które są zdolne do gromadzenia waniliny do stężenia 11,5 gL^-1 w bulionie fermentacyjnym po dostarczeniu kwasu ferulowego.

Podsumowując można stwierdzić, że nie jest łatwe wytworzenie dużej ilości waniliny w układach mikrobiologicznych. Jest to głównie spowodowane komórkową toksycznością waniliny, która w stężeniu powyżej 1 gL^-1 zapobiega wzrostowi mikroorganizmów produkujących wanilinę. W układach mikrobiologicznych zwykle znajduje się odpowiedni alkohol lub kwas a nie wanilina. To toksyczne działanie waniliny pokonywano przez stosowanie enzymów (Quest, EP 0 542 348 A2). Potraktowanie izoeugenolu lipooksygenazą daje w rezultacie 10-15 gL^-1 waniliny przy wydajności 10-15%. Znacznie -1 niższe stężenia otrzymywano stosując eugenol (0,3-0,5 gL^-1 przy wydajności 0,3-0,5%) i nie donoszono o przemianach kwasu ferulowego. Sposób stosowania lipooksygenazy nie jest bardzo atrakcyjny z ekonomicznego punktu widzenia.

Innym sposobem obejścia toksyczności tego związku jest mikrobiologiczne wytwarzanie aldehydu koniferylowego, który po obróbce cieplnej tworzy wanilinę, patrz BASF (Offenlegungsschrift, DE 3604874 A1). Podobny jest również immobilizowany układ komórkowy, jak opisano w niedawnym zgłoszeniu patentowym Orsan'a (WO 96/34971), w którym wanilinę gromadzono powyżej stężenia 1 gL^-1. Możliwa ekonomiczna korzyść stosowania immobilizowanej biomasy jest realizowana przez zawracanie do obiegu biokatalizatora.

Wiele publikacji zajmuje się poszczególnymi metabolicznymi drogami wychodzącymi z eugenolu, izoeugenolu lub kwasu ferulowego. Ogólnie uważa się, że wanilina jest pośrednim związkiem na drodze degradacji tych związków. Dwie publikacje pokazują rolę waniliny w degradacji kwasu feruloPL 191 552 B1 wego. Toms i Wood, Biochemistry 9 (1970) 337-43, hodowali Pseudomonas sp. na kwasie ferulowym i wyjaśnili drogę degradacji. Chociaż waniliny nie znaleziono w supernatancie kultury, dostarczono dowodów, że wanilina jest związkiem pośrednim, ponieważ można było wykryć kwas wanilinowy. Wychodząc z kwasu ferulowego otrzymano wanilinę w kulturze Streptomyces setonii (Sutherland et al., Can.J. Microbiol. 29 (1983) 1253-57). W publikacji tej nie podano danych dotyczących ilości, ale powtarzając eksperyment znaleziono tylko ilości śladowe.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania waniliny, polegający na tym, że

a) namnaża się w odpowiedniej pożywce bakterię należącą do rodzaju Streptomyces uzyskując bulion fermentacyjny,

b) do bulionu fermentacyjnego dodaje się substrat stanowiący kwas ferulowy w stężeniu od około 5 gL^-1 do około 40 gL^-1 uzyskując wanilinę jako główny produkt reakcji biotransformacji kwasu ferulowego, oddziela się biomasę od bulionu fermentacyjnego i

c) ekstrahuje się z bulionu fermentacyjnego wanilinę i jeżeli to pożądane, półprodukt stanowiący gwajakol.

Namnażanie w etapie a) przeprowadza się w odpowiedniej pożywce przez 5 do 40 godzin uzyskując bulion fermentacyjny i następnie doprowadza się pH bulionu fermentacyjnego do wartości około 8,5 i prowadzi się biotransformację w etapie b) przez 5 do 50 godzin, przy czym w etapie b) tworzy

-1 -1 się bulion fermentacyjny o stężeniu kwasu ferulowego od 15 gL^-1 do około 30 gL^-1, korzystniej o stężeniu kwasu ferulowego od 20 gL^-1 do 25 gL^-1. Kwas ferulowy dodaje się po zakończeniu fazy wzrostu. Środowisko reakcji zawiera glukozę, korzystnie w stężeniu 5-50 gL^-1, bardziej korzystnie 20-35 gL^-1; Środowisko zawiera wyciąg z drożdży korzystnie w stężeniu 2 do 20 gL^-1, bardziej korzystnie 5 do 10 gL^-1;

-1 -1

Środowisko zawiera jony magnezu korzystnie w stężeniu 0,1 do 5 gL^-1, bardziej korzystnie 0,5 do 1 gL^-1. Etap a) sposobu według wynalazku prowadzi się przy pH 7 do 9. Sposób według wynalazku przeprowadza się w temperaturze 30 do 45°C, prowadząc go przy napowietrzaniu i z mieszaniem. Biotransformacja trwa 10 do 30 godzin, bardziej korzystnie 15-25 godzin. W etapie c) gwajakol jest najpierw ekstrahowany przy wzroście pH bulionu fermentacyjnego do >9 i z zastosowaniem organicznego rozpuszczalnika. Po biotransformacji pH bulionu fermentacyjnego następnie doprowadza się do wartości około 7 i przeprowadza się ekstrakcję waniliny przy zastosowaniu organicznego rozpuszczalnika, a jako rozpuszczalnik ekstrakcyjny stosuje się eter metylowo-tert-butylowy. W sposobie według wynalazku jako bakterię stosuje się bakterię należącą do Streptomyces setonii - Streptomyces setonii ATCC 39116.

Kwas ferulowy jako substrat dla biotransformacji jest osiągalny z różnych naturalnych źródeł. Kwas często występuje w formie glukozydu w materiałach roślinnych takich, jak drewno, melasa buraka cukrowego, otręby kukurydziane, ryż i różne rodzaje traw. Może być on izolowany z odpowiednich glikozydów tych produktów dobrze znanymi sposobami hydrolizy, np. stosując enzymy i może być stosowany jako materiał surowy lub materiał oczyszczony. Brytyjskie źródło (GB 2301103 A1) opisuje na przykład enzymatyczny rozkład materiału roślinnego, zawierającego kwas ferulowy przez esterazę kwasu ferulowego, w celu otrzymania wolnego kwasu.

Nowy, wysoko wydajny mikrobiologiczny sposób wytwarzania waniliny obejmuje najpierw namnażanie w pożywce bulionowej mikroorganizmów z rzędu Actinomycetales, korzystnie z rodziny Streptomycetaceae, najkorzystniej bakterii Streptomyces setonii, przy czym korzystny okres namnażania wynosi około 5-40 godzin i trwa dopóki źródło węgla - glukoza jest (prawie) zużyte, a następnie dodanie substratu - kwasu ferulowego w ilości 5-40 gL^-1 bulionu fermentacyjnego, w sposób ciągły lub okresowy. Po przybliżonym okresie inkubacji (biotransformacji) wynoszącym około 5-50 godzin, przekształcenie substratu w wanilinę i kilka produktów ubocznych zostaje zakończone. Kwas ferulowy zostaje zużyty a zawartość waniliny w bulionie fermentacyjnym wynosi około 8-16 gL^-1. Typowymi produktami ubocznymi biotransformacji kwasu ferulowego są alkohol wanilinowy, kwas wanilinowy, guajakol, para-winyloguajakol i 2-metoksy-4-etylofenol.

Następnie proces odzyskiwania produktu obejmuje usunięcie biomasy, po czym korzystnie następuje dwustopniowa ekstrakcja odpowiednim rozpuszczalnikiem organicznym, korzystnie eterem metylo-tert-butylowym. Pierwszą ekstrakcję przeprowadza się przy pH > około 9, korzystnie przy pH 10 do około 11 w fazie wodnej w celu selektywnego odzyskiwania produktów ubocznych takich, jak sensorycznie wysoko aktywny gwajakol. Następnie wodny rafinat jest „zakwaszany do neutralnych wartości pH w celu selektywnej ekstrakcji produktu - waniliny. Oczyszczanie surowego ekstraktu waniliny można ostatecznie przeprowadzić stosując dobrze znane sposoby rekrystalizacji. Gwajakol może być oczyszczany z surowego ekstraktu przez destylację.

PL 191 552 B1

Opisana mikrobiologiczna metoda i sposób ekstrakcji są przydatne dla ekonomicznie atrakcyjnego wytwarzania naturalnej waniliny, jak również produktów ubocznych z kwasu ferulowego według biochemicznej drogi przedstawionej na rysunku.

Powstała wanilina (związek 2), jak również produkt uboczny - gwajakol (związek 3) są znanymi związkami smakowymi i aromatycznymi. Ich użycie i zastosowanie jest znane specjalistom w tej dziedzinie wiedzy. Przez użycie skutecznych i zrównoważonych ilości tych związków można zwiększyć lub wzmóc właściwości organoleptyczne zawierających je produktów spożywczych takich, jak napoje, przetwory mleczne, wypieki, lody i tym podobne, w których zalecane są wyłącznie składniki naturalne. Fermentacyjnie wytwarzana wanilina i guajakol są szczególnie cenne w waniliowych i owocowych kompozycjach smakowych, gdzie zalecane są naturalne składniki.

Jak wskazano wyżej, ustalono dokładne warunki fermentacji połączone ze skutecznym sposobem otrzymywania produktu, które pozwolą na wysoko wydajną produkcję sensorycznie i analitycznie oczyszczonej waniliny, jak również otrzymanie związku o mocnym smaku - gwajakolu jako produktu ubocznego. Metoda ta oparta jest na hodowli bakterii z rodzaju Streptomyces na odpowiednim podłożu hodowlanym i dalszym dodaniu substratu - kwasu ferulowego w podwyższonych stężeniach, np. około 5 do około 40 g/l, żeby otrzymać wanilinę z wysoką objętościowo wydajnością w bulionie fermentacyjnym.

Najodpowiedniejsza jest, jak wskazano wyżej, Streptomyces setonii, korzystnie szczep ATCC 39116 dostępny w handlu.

Substrat - kwas ferulowy jest określony wzorem (1). W nowym sposobie jako substrat stosuje się materiał zawierający kwas ferulowy o zawartości kwasu ferulowego powyżej 10%. Natura pozostałych związków zależy od źródła.

Zgodnie z wynalazkiem hodowla bakterii jest prowadzona w wodnej pożywce w obecności zwykłych substancji odżywczych. Odpowiednie podłoże hodowlane zawiera źródła węgla, organiczne i nieorganiczne źródła azotu, sole nieorganiczne i czynniki wzrostu.

W podłożach hodowlanych jako źródło węgla korzystnie stosowana jest glukoza, np. w stężeniu około 5-50 gL^-1, korzystnie około 20-35 gL^-1. Wyciąg z drożdży jest użytecznym źródłem azotu, fosforanów, czynników wzrostu, przy czym mogą być dodane śladowe pierwiastki np. w korzystnym stęże-1 -1 niu około 2-20 gL^-1, najkorzystniej około 5-10 gL^-1. Ponadto mogą być dodane jony magnezu, np. siarczan magnezu w stężeniu około 0,1-5 gL^-1, korzystnie w stężeniu około 0,5-1 gL^-1.

Bulion hodowlany wytwarza się i sterylizuje w bioreaktorze i wtedy jest inokulowany szczepami Streptomyces w celu rozpoczęcia fazy wzrostu. Odpowiedni czas trwania fazy wzrostu wynosi 5-40 godzin, korzystnie 15-35 godzin, a najkorzystniej 20-30 godzin.

Dalsze warunki procesu to:

zakres pH: około 7 do około 9 zakres temperatury: około 30 do około 45°C napowietrzanie: jest korzystne dla tego procesu tlenowego mieszanie: jest korzystne.

Po zakończeniu fazy wzrostu kultury bakteryjnej dostarczono substrat - kwas ferulowy. Odpowiednia ilość dostarczonego substratu wynosi 5-40 gL^-1 bulionu fermentacyjnego, korzystnie około

15-30 gL^-1, najkorzystniej 20-25 gL^-1. Substrat jest dostarczany albo jako stały materiał albo jako roztwór wodny albo jako zawiesina. Całkowita ilość substratu jest dostarczona albo jednorazowo albo w dwóch lub więcej etapach albo w sposób ciągły.

Faza biotransformacji rozpoczyna się wraz z początkiem dostarczania substratu i trwa około 5-50 godzin, korzystnie 10-30 godzin i najkorzystniej 15-25 godzin, to jest do przekształcenia całego substratu w produkt i produkty uboczne.

Przyjmuje się, że za wysoką objętościowo wydajność wytwarzania waniliny, jaką obserwujemy po zakończeniu przekształcania substratu głównie odpowiedzialny jest nadmiar w stężeniu dostarczonego kwasu ferulowego. Ponadto, za odpowiedzialne za gromadzenie wartościowego materiału - gwajakolu uważa się wyżej przedstawione.

Po zakończeniu fazy biotransformacji biomasę oddziela się od bulionu fermentacyjnego którymkolwiek ze znanych sposobów takim, jak wirowanie lub filtracja przez błonę i tym podobne otrzymując wolny od komórek bulion fermentacyjny.

Ponieważ biotransformacja przekształca hydrofilowy substrat - kwas ferulowy w raczej hydrofobowe substancje takie, jak wanilina i gwajakol, całkowita objętościowa wydajność produkcyjna układu fermentacji może wzrosnąć przez zastosowanie każdego in situ sposobu odzyskiwania produktu. W tym celu np. do bulionu fermentacyjnego można dodać fazę ekstrakcyjną stosując, np. wodę - niemiePL 191 552 B1 szalny - rozpuszczalnik organiczny, olej roślinny lub ekstrahent stały, np. żywicę, korzystnie neutralną żywicę taką, jak Amberlite XAD 4 lub XAD 7 lub tym podobną. Taki sposób odzyskania produktu In situ może pozwolić na ciągłe tworzenie waniliny i gwajakolu również po osiągnięciu stężeń rozpuszczalności w wodzie.

Z tego bulionu fermentacyjnego wanilina i produkty uboczne mogą być teraz ekstrahowane osobno dwoma różnymi sposobami ekstrakcji:

Odpowiednie są: ciągła ekstrakcja ciecz - ciecz a) lub ekstrakcja okresowa b).

a) Na zasadzie ekstrakcji zależnej od wartości pH, może być przeprowadzone wydajne oddzielenie waniliny i gwajakolu. W pierwszym etapie gwajakol może być ekstrahowany z wodnego bulionu fermentacyjnego. Dla tego etapu korzystne jest stosowanie ekstrakcji przeciwprądowej, korzystnie w ekstraktorze, za pomocą nierozpuszczalnego w wodzie organicznego rozpuszczalnika. Przykładami rozpuszczalników są estry kwasów C1-3 alkoholami C1-4, etery, w szczególności eter metylo-tertbutylowy (MTBE). Korzystnie pH zawiera się pomiędzy 10 a 11, w szczególności 10,8-11.

Wanilina jest następnie ekstrahowana z wodnego rafinatu ekstrakcji gwajakolu przy wartości pH wynoszącej od około 5 do około 8, korzystnie od około 6 do około 7,5, najkorzystniej wynoszącej od około 6,9 do 7,1.

Pracując przy stężeniu waniliny wynoszącym od około 8 do około 16 g/l, ekstrakcja przeciwprądowa działa najlepiej przy stosunku substancja dostarczana/rozpuszczalnik wynoszącym około 2,5-3:1, w szczególności około 2,6:1.

b) Przy wyższych stężeniach waniliny w warstwie wodnej, np. po zatężaniu bulionu fermentacyjnego poprzez odparowanie wody, właściwa i korzystna jest odpowiadająca dwu etapowa ekstrakcja okresowa przy różnych wartościach pH i zastosowaniu rozpuszczalników zaproponowanych wyżej.

Zalety tej nowej metody są następujące:

1) Warunki fermentacji są dostępne co umożliwia zebranie waniliny w bulionie fermentacyjnym Streptomyces, np. S. setonii do stężenia atrakcyjnego z ekonomicznego punktu widzenia (około 8-16 gL^-1).

2) Metoda ta umożliwia równoczesną produkcję waniliny i gwajakolu, t.j. dwóch bardzo wartościowych produktów wykorzystywanych do wytwarzania produktów o naturalnych smakach.

3) Metoda fermentacji jest metodą o niedużym stopniu skomplikowania technicznego wykorzystującą nieprzetworzone materiały z łatwo dostępnych źródeł.

Wynalazek obejmuje także nowy sposób wytwarzania waniliny, wykorzystujący zamiast Streptomyces setonii ATCC 39116 jej enzymy lub rekombinowane mikroorganizmy, np. drożdże, które zawierają materiał genetyczny kodujący enzymy, które są niezbędne lub biorą udział w komórkowej biosyntezie waniliny i/lub gwajakolu - a nie same mikroorganizmy

P r zyk ł a d 1

Przygotowano 250 ml kolby wstrząsarkowe zawierające 50 ml następującego pożywki: 103 gL^-1sacharozy, 4 gL^-1 Na2HPO4, 1 gL^-1 KH2PO₄, 1 gL^-1 wyciągu z drożdży, 0,2 gL^-1 NaCl, 0,2 gL^-1 MgSO₄i 0,05 gL^-1 CaCl2. pH doprowadzono do wartości wynoszącej 7,2 stosując NaOH. Kolbę wstrząsarkową inokulowano 2mL prakultury Streptomyces setonii ATCC 39116 i namnażano w temperaturze 37°C, przy 190 rpm (obrotach na minutę) przez 16 godzin. Pod koniec fazy wzrostu do kultury dodano 0,3 g kwasu ferulowego (zakupionego z Aldrich, cat. no. 12.870-8, 99%). W tym celu uprzednio przygotowano i przefiltrowano w sterylnych warunkach 10% wag./wag. roztwór substratu kwasowego w 0,5 M NaOH (końcowe pH roztworu wynosiło w przybliżeniu 7,2). Kolbę inkubowano ponownie w temperaturze 37°C, przy 190 rpm. Po 31,5 godzinach biotransformacji (inkubacji) osiągnięto stężenie waniliny wynoszące 3,10 gL^-1(HPLC). Wyliczono, że wydajność cząsteczkowa wynosi 66% molowych.

P r zyk ł a d 2

Przygotowano i inkubowano 250 ml kolbę wstrząsarkową tak, jak w Przykładzie 1. Po 16 godzinach fazy wzrostu do kultury dodano 0,6 g kwasu ferulowego (jako 10% wag./wag. roztwór w 0,5 M NaOH). Kolbę ponownie inkubowano w temperaturze 37°C i przy 190 rpm. Po 78 godzinach biotransformacji (inkubacji) osiągnięto stężenie waniliny wynoszące 5,94 gL^-1 (HPLC), odpowiadające wydajności 63% molowych.

P r zyk ł a d 3

Przygotowano i inkubowano 250 ml kolbę wstrząsarkową tak, jak w Przykładzie 1. Po 18 godzinach fazy wzrostu do kultury dodano 0,3 g kwasu ferulowego (jako 10% wag./wag. roztwór w 0,5 M NaOH). Kolbę ponownie inkubowano w temperaturze 37°C i przy 190 rpm. Po 28 godzinach dostarczono drugą porcję 0,3 g kwasu. Pod koniec inkubacji (58 godzin) osiągnięto stężenie waniliny wynoszące 6,41 gL^-1odpowiadające wydajności 68% molowych.

PL 191 552 B1

Przykład 4

Prakultura Streptomyces setonii wzrastała przez 24 godziny w kolbie wstrząsarkowej przy pH wynoszącym 7,2, w temperaturze 37°C, przy 190 rpm. Pożywka zawierała 5 gL^-1 glukozy, 4gL^-1 Na2HPO4, 1 gL^-1 KH2PO4, 10 gL^-1 wyciągu z drożdży i 0,2 gL^-1 MgSO4.

-1 -1

Bioreaktor wypełniono 10 mL pożywki zawierającej 32 gL^-1 glukozy, 8 gL^-1 wyciągu z drożdży, 0,8 gL^-1 MgSO4 i 0,2 gL^-1 środka przeciwpieniącego (Dow Corning AF 1520). Po termicznej sterylizacji naczynie reakcyjne inokulowano prakulturą wzrastającą uprzednio w kolbie wstrząsarkowej. Użyto materiał inokulacyjny w ilości 3%. Warunki procesu były następujące: temperatura 37°C, pH równe 7,2, przepływ powietrza 1,0 vvm, 800 rpm. Po 24 godzinach fazy wzrostu zmierzone stężenie glukozy wynosiło 4,6 gL^-1. Następnie dokonano zwiększenia wartości pH do 8,5 przy użyciu NaOH (30%) i 24,5 godziny po inokulacji bulionu fermentacyjnego dodano 2,25 L 10% wag./wag. roztworu kwasu ferulowego w 0,5 M NaOH. W momencie dodawania, stężenie glukozy obniżyło się do 4,0 gL^-1. 3-4 godziny po dodaniu prekursora zaobserwowano początek biotransformacji kwasu ferulowego w wanilinę. 17 godzin po dodaniu prekusora zmierzono przy użyciu GC stężenie waniliny, które wynosiło 13,9 gL^-1 i gwajakolu, które wynosiło 0,4 gL^-1 w bulionie fermentacyjnym. W tym czasie kwas ferulowy był całkowicie przetworzony.

Wyliczono wydajność wytwarzania waniliny wynoszącą 75 % molowych. Bioproces zakończono przez minutową pasteryzację w temperaturze 80°C. Roztwór fermentacyjny poddano mikrofiltracji (2 μm).

Przykład 5

450 L bioreaktor o objętości użytkowej wynoszącej 340 L poddano procedurze opisanej w poprzednim przykładzie.

Po 26,5 godzinnym okresie wzrostu pH zwiększono do wartości 8,5 i dodano pierwszą porcję kwasu ferulowego wynoszącą 4,08 kg zgodnie z Przykładem 4. W tym momencie zmierzono stężenie pozostające glukozy wynoszące 7,5 gL^-1. Godzinę później dodano następne 3,57 kg prekursora. Całkowita ilość dodanego kwasu ferulowego wynosiła 22,5gL^-1. 25,5 godziny po pierwszym dodaniu prekursora zmierzono stężenie waniliny wynoszące 9,0 gL^-1. Stężenie kwasu ferulowego wynosiło w tym momencie 1 ,75 gL^-1. Wydajność otrzymywania waniliny wynosiła 51% molowych.

Przykład 6

Ekstrakcja przeciwprądowa ciecz -ciecz waniliny i gwajakolu na skalę przemysłową.

pH 7930 kg wolnego od komórek, przefiltrowanego przez błonę roztworu fermentacyjnego zawierającego 7,1 gL^-1 waniliny i 0,35 gL^-1 gwajakolu doprowadzono do wartości równej 11 przy użyciu NaOH i roztwór ekstrahowano po raz pierwszy MTBE jako rozpuszczalnikiem w ekstraktorze o mieszanej komorze do ekstrakcji przeciwprądowej w celu oddzielenia gwajakolu. Po odparowaniu MTBE, odzyskano 8 kg surowego ekstraktu zawierającego MTBE i 33% wag./wag. gwajakolu. pH wodnego rafinatu tej alkalicznej ekstrakcji obniżono do 6,9-7,1 przy użyciu kwasu solnego i ekstrahowano ponownie MTBE w tym samym ekstraktorze w celu oddzielenia waniliny. Z drugiego etapu ekstrakcji otrzymano 150 kg surowego ekstraktu zawierającego MTBE i 37% wag./wag. waniliny.

Figura przedstawia:

Typowy wykres produkcji waniliny porcjami na 10L skalę.

-1 -1 -1

Δ stężenie waniliny [gL^- ]; -V- stężenie kwasu ferulowego [gL^- ]; x stężenie gwajakolu [gL^- ]; -o- wartość pH; - -wartość PO₂ [%]; -x- stężenie glukozy [gL^-1]. Po 24 godzinnej fazie wzrostu pH doprowadzono do wartości 8,5 przed dodaniem kwasu ferulowego. 3-4 godziny po dodaniu substratu wykryto niewielką ilość waniliny. Stężenie waniliny wynoszące 13,9 gL^-1 osiągnięto po 41 godzinach całkowitego procesu fermentacji (17 godzin po dodaniu kwasu ferulowego). W tym momencie zmierzone stężenie gwajakolu wynosiło 0,38gL^-1. Wyliczono, że szybkość producji waniliny i gwajakolu wynosiły odpowiednio 1,10 gL¹h^-1 i 0,04 gL^-1h^-1. Po całkowitej przemianie kwasu ferulowego zaobserwowano obniżenie stężeniawaniliny i gwajakolu. Ilościowe pomiary przeprowadzono przy użyciu HPLC i GC.

Claims

1.Sposób wytwarzania waniliny, znamienny tym, że

PL 191 552 B1

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że namnażanie w etapie a) przeprowadza się w odpowiedniej pożywce przez 5 do 40 godzin uzyskując bulion fermentacyjny i następnie doprowadza się pH bulionu fermentacyjnego do wartości około 8,5 i prowadzi się biotransformację w etapie b) przez 5 do 50 godzin.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie b) tworzy się bulion fermentacyjny o stężeniu kwasu ferulowego od 15 gL^-1 do około 30 gL^-1.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w etapie b) tworzy się bulion fermentacyjny o stężeniu kwasu ferulowego od 20 gL^-1 do 25 gL^-1.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kwas ferulowy dodaje się po zakończeniu fazy wzrostu.

6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że środowisko reakcji zawiera glukozę, korzystnie w stężeniu 5-50 gL^-1, bardziej korzystnie 20-35 gL^-1.

7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że środowisko zawiera wyciąg z drożdży

-1 -1 korzystnie w stężeniu 2 do 20 gL^-1, bardziej korzystnie 5 do 10 gL^-1.

8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że środowisko zawiera jony magnezu kobardziej korzystnie 0,5 do 1 gL^-1.

1 albo 2, znamienny tym, że etap a) prowadzi się przy pH 7 do 9.

1 albo 2, znamienny tym, że prowadzi się go w temperaturze 30 do rzystnie w stężeniu 0,1 do 5 gL^-1, 9. Sposób według zastrz. 10. Sposób według zastrz

45°C.

Sposób według zastrz. Sposób według zastrz. Sposób według zastrz.

1 albo 2, 1 albo 2, 1 albo 2, znamienny tym, że prowadzi się go przy napowietrzaniu. znamienny tym, że prowadzi się go z mieszaniem. znamienny tym, że biotransformacja trwa 10 do 30 godzin, bardziej korzystnie 15-25 godzin.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie c) gwajakol jest najpierw ekstrahowany przy wzroście pH bulionufermentacyjnego do >9 i z zastosowaniem organicznego rozpuszczalnika.

15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po biotransformacji pH bulionu fermentacyjnego następnie doprowadza się do wartości około 7 i przeprowadza się ekstrakcję waniliny przy zastosowaniu organicznego rozpuszczalnika.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik ekstrakcyjny stosuje się eter metylowo-tert-butyIowy.

17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako bakterię stosuje się bakterię należącą do Streptomyces setonii.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako bakterię stosuje się Streptomyces setonii ATCC 39116.

PL 191 552 B1

Rysunki

Droga degradacji kwasu ferulowego, np. przez Streptomyces setonii