ES2258290T3 - Proceso para la produccion de vainillina. - Google Patents
Proceso para la produccion de vainillina.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO MICROBIOLOGICO PARA LA PRODUCCION DE VAINILLINA, QUE COMPRENDE EL CULTIVO EN UN CALDO NUTRITIVO DE UNA BACTERIA QUE PERTENECE AL ORDEN ACTINOMYCETALES, PREFERENTEMENTE A LA FAMILIA STREPTOMYCETACEAE, LA ADICION DEL SUSTRATO ACIDO FERULICO, EN EL QUE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO EN EL CALDO NUTRITIVO ES ENTRE APROXIMADAMENTE 5 GL -1 Y APROXIMADAMENTE 40 GL -1 EN EL CALDO DE FERMENTACION, PRODUCIENDO VAINILLINA COMO PRODUCTO DE REACCION PRINCIPAL DE LA BIOTRANSFORMACION DEL ACIDO FERULICO Y SEPARANDO LA BIOMASA DEL CALDO DE FERMENTACION Y EXTRAYENDO LA VAINILLINA Y, SI ASI SE DESEA, EL SUBPRODUCTO GUAYACOL DEL CALDO DE FERMENTACION.
Description
Proceso para la producción de vainillina.
La presente invención se refiere a un proceso
microbiológico para la producción de vainillina a partir de ácido
ferúlico. Según este proceso, un cultivo, preferiblemente un cultivo
sumergido, de cualquier bacteria del orden de los
Actinomycetales, preferiblemente de la familia
Streptomycetaceae, se incuba con el ácido ferúlico sustrato
para producir de manera fermentativa vainillina. La vainillina
producto se recupera del caldo de fermentación mediante un método de
extracción diseñado que permite también la separación y recuperación
de subproductos de fermentación de valor, para obtener la vainillina
producto analítica y sensorialmente purificada y, en particular el
subproducto guayacol.
En la utilización de compuestos aromatizantes, es
cada vez más importante que los compuestos aromatizantes se puedan
designar como "naturales". En línea con las regulaciones de
Europa y EE.UU., esto significa que el compuesto se debe obtener
mediante procesos físicos, enzimáticos o microbiológicos y
únicamente a partir de materiales de origen vegetal o animal. De
este modo, durante la última década varias actividades de
investigación se han centrado en la utilización de fuentes de
materias primas renovables, baratas y naturales para la producción
fermentativa de vainillina. Sin embargo, hasta el momento en las
publicaciones y patentes muy raramente se describen rendimientos
volumétricos comercialmente atractivos.
El guayacol es una molécula fenólica de tipo
empireumática que contribuye de forma significativa al aroma
característico de los extractos de vainilla. De este modo,
habitualmente se utiliza en combinación con vainillina para aromas
de tipo vainillina. Sin embargo, hasta el momento no se ha descrito
la producción fermentativa de guayacol natural.
En los últimos diez años se han presentado varias
solicitudes de patente en referencia a la producción microbiana o
enzimática de vainillina. En general, un precursor adecuado se
transforma en vainillina mediante un microorganismo o una enzima.
Algunos precursores sugeridos son eugenol, isoeugenol, ácido
ferúlico, curcumina y resinas de benjuí siam. Habitualmente, los
rendimientos de transformación son extremadamente bajos. Algunos
ejemplos son, por ejemplo, Haarman y Reimer (EP 0 405 197 A1) que
reivindica una producción de 18 mgl^{-1} partiendo de 0,2
gl^{-1} de eugenol utilizando los microorganismos Serratia,
Klebsiella o Enterobacter. Además, esta transformación dura 13 días.
Pernod-Ricard (EP 453 368 A) reivindica 46
mgl^{-1} de vainillina obtenida a partir de ácido ferúlico por
fermentación con Pycnoporus durante 6 días. En esta línea
también, Kraft General Foods (Estados Unidos 5.128.253), que
reivindica 210 mgl^{-1} de vainillina a partir de ácido ferúlico
en 54 días. Para obtener este título se tuvo que añadir un agente
reductor, ya que de otro modo no tendría lugar la formación de
vainillina y únicamente se formaría ácido vainíllico. La solicitud
de patente internacional WO 960 857 A describe un proceso para la
obtención de ácido vainíllico mediante la bioconversión de ácido
ferúlico. Takasago (JP 227980/1993) preparó mutantes de cepas de
Pseudomonas que se bloquean en la ruta de degradación de la
vainillina. De este modo, a partir de 1 gl^{-1} de ácido ferúlico
se pudieron obtener 0,28 gl^{-1} de vainillina. Recientemente,
Haarman y Reimer (EP 0 761 817 A2) han publicado hasta el momento la
única solicitud que describe rendimientos volumétricos de vainillina
económicamente atractivos en un proceso de fermentación. Los autores
identificaron dos cepas del género Amycolatopsis que son
capaces de acumular vainillina hasta una concentración de 11,5
gl^{-1} en el caldo de fermentación tras la adición de ácido
ferúlico.
En conclusión, se puede afirmar que en los
sistemas microbianos no se forman fácilmente cantidades elevadas de
vainillina. Esto se debe principalmente a la toxicidad celular de la
vainillina, que a concentraciones por encima de 1 gl^{-1} evita el
crecimiento de los microorganismos productores de vainillina.
Habitualmente, en los sistemas microbianos, se observa el
correspondiente alcohol o ácido y no la vainillina. Este efecto
tóxico de la vainillina se superó mediante la utilización de enzimas
(Quest, EP 0 542 348 A2). El tratamiento de isoeugenol con
lipoxigenasa dio lugar a 10-15 gl^{-1} de
vainillina con un rendimiento del 10-15%. Se
obtuvieron concentraciones mucho más bajas cuando se utilizó eugenol
(0,3-0,5 gl^{-1} con un rendimiento del
0,3-0,5%) y no se describe ningún cambio para el
ácido ferúlico. Desde el punto de vista económico, el método que
emplea lipoxigenasa es poco atractivo.
Otra medida para evitar la toxicidad de este
compuesto es la producción microbiana de coniferialdehído, que forma
vainillina tras un tratamiento térmico, véase BASF
(Offenlegungsschrift, DE 3604874 A1). Similar es también el sistema
celular inmovilizado tal como se describe en la reciente solicitud
de patente de Orsan (WO 96/34971), en la que la vainillina se
acumula hasta una concentración de 1 gl^{-1}. Un posible beneficio
económico de la utilización de biomasa inmovilizada se proporciona
mediante el reciclado del biocatalizador.
Muchos artículos se refieren a las rutas
metabólicas respectivas a partir de eugenol, isoeugenol o ácido
ferúlico: en general, se cree que la vainillina es un compuesto
intermedio en la ruta de degradación de estos compuestos. Se pueden
citar dos publicaciones que muestran la participación de la
vainillina en la degradación del ácido ferúlico. Toms y Wood,
Biochemistry 9 (1970) 337-43, cultivaron
Pseudomonas sp. sobre ácido ferúlico y elucidaron la ruta de
degradación. A pesar de que no se observó vainillina en el
sobrenadante del cultivo, se evidenció que la vainillina es un
compuesto intermedio, ya que se pudo detectar ácido vainíllico. A
partir del ácido ferúlico, se obtuvo vainillina en cultivos de
Streptomyces setonii (Sutherland y otros, Can. J. Microbiol.
29 (1983) 1253-57). No se indicó la cantidad,
excepto que sólo se observaron trazas cuando se repitió el
experimento.
El ácido ferúlico como sustrato para
biotransformaciones está disponible de forma abundante a partir de
diferentes fuentes naturales. El ácido está presente normalmente en
forma de glucósido en materiales vegetales, tales como madera,
melaza de remolacha azucarera, salvado de maíz, arroz y varios tipos
de gramíneas. Se puede aislar de los correspondientes glicósidos en
estos productos mediante métodos de hidrólisis conocidos, por
ejemplo, utilizando enzimas, y se puede utilizar como material crudo
o material purificado. Una fuente británica (GB 2301103 A1)
describe, por ejemplo, la ruptura enzimática del ácido ferúlico que
contiene un material vegetal mediante una esterasa de ácido
ferúlico, para obtener el ácido libre.
La presente invención se define en las
reivindicaciones adjuntas.
El presente proceso nuevo y microbiológicamente
de alto rendimiento para la producción de vainillina comprende, en
primer lugar, el cultivo en un caldo de nutrientes de un
microorganismo del género Streptomyces (orden de los
Actinomycetales, familia Streptomycetaceae), preferiblemente
la bacteria Streptomyces setonii, en el que,
preferiblemente, el periodo de cultivo es de, aproximadamente,
5-40 horas y dura, hasta que la fuente de carbono de
glucosa (casi) se consume, añadiendo seguidamente el ácido ferúlico
sustrato en el intervalo de, aproximadamente, 5-40
gl^{-1} de caldo de fermentación, de manera continua o
discontinua. Tras un periodo de incubación (biotransformación)
aproximado de, aproximadamente, 5-50 horas, se
completa la conversión del sustrato en vainillina y varios
subproductos. El ácido ferúlico se consume y la vainillina se
acumula hasta, aproximadamente, 8-16 gl^{-1} en el
caldo de fermentación. Algunos subproductos habituales de la
biotransformación del ácido ferúlico son alcohol vainíllico, ácido
vainíllico, guayacol, para-vinilguayacol y
2-metoxi-4-etil-fenol.
La posterior recuperación del producto consiste
en la eliminación de la biomasa, seguida convenientemente de una
extracción en dos etapas con un disolvente orgánico apropiado,
preferiblemente
metil-tert-butiléter. Se lleva a
cabo una primera extracción a un pH superior a, aproximadamente 9,
preferiblemente a un pH de 10 a, aproximadamente, 11 en la fase
acuosa para extraer de forma selectiva los subproductos, tales como
el guayacol altamente activo sensorialmente. A continuación, el
refinado acuoso se "acidifica" hasta valores de pH neutro para
extraer de forma selectiva la vainillina producto. Finalmente, la
purificación del extracto crudo de vainillina se puede obtener
mediante la aplicación de métodos de recristalización conocidos. El
guayacol se puede purificar a partir del extracto crudo mediante
destilación.
El proceso microbiológico y el procedimiento de
extracción descritos son útiles para la producción económicamente
atractiva de vainillina natural, así como de subproductos, a partir
de ácido ferúlico, según la siguiente ruta bioquímica:
Ruta de degradación del ácido ferúlico, por
ejemplo, mediante Streptomyces setonii.
La vainillina resultante (compuesto 2), así como
el guayacol subproducto (compuesto 3), son ambos compuestos
aromatizantes y de fragancia conocidos. Su utilización y aplicación
son conocidas por los técnicos en la materia. Mediante la
utilización de cantidades eficaces y equilibradas de estos
compuestos es posible aumentar o mejorar las propiedades
organolépticas de consumibles aromatizados, tales como bebidas,
productos lácteos, alimentos cocinados, helados y similares. La
vainillina y el guayacol producidos de forma fermentativa son
especialmente apreciados en composiciones de cualquier tipo de
vainilla y frutas aromatizadas en las que se requieren ingredientes
totalmente naturales.
Tal como se ha indicado anteriormente,
actualmente se ha descubierto que la combinación de unas condiciones
de fermentación exactas con un método de recuperación de producto
eficaz permite una producción de elevado rendimiento de vainillina
sensorial y analíticamente purificada, además de proporcionar como
subproducto el compuesto aromatizante de alto impacto, guayacol.
Estas condiciones se basan en el cultivo de la bacteria del género
Streptomyces en un medio de cultivo apropiado y la adición posterior
del ácido ferúlico sustrato en concentraciones en exceso, es decir,
de, aproximadamente, 5 a, aproximadamente, 40 gl^{-1}, para
obtener vainillina a rendimientos volumétricos elevados en el caldo
de fermentación.
La más adecuada es, tal como se ha indicado
anteriormente, la especie Streptomyces setonii,
preferiblemente la cepa ATCC 39116 disponible comercialmente.
El ácido ferúlico sustrato se define mediante la
fórmula (1). Según el nuevo proceso, como sustrato se utiliza un
material de ácido ferúlico con un contenido de ácido ferúlico de,
preferiblemente, más de un 10%. La naturaleza de los compuestos
restantes depende de la fuente.
Al llevar a cabo la presente invención, el
cultivo de la bacteria se realiza en un medio acuoso en presencia de
sustancias nutrientes habituales. Un medio de cultivo adecuado
contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno orgánica o
inorgánica, sales inorgánicas y factores del crecimiento.
Para el medio de cultivo se utiliza,
preferiblemente, glucosa como fuente de carbono, por ejemplo, a una
concentración de, aproximadamente, 5-50 gl^{-1},
preferiblemente, aproximadamente, 20-35 gl^{-1}.
El extracto de levadura es una fuente adecuada de nitrógeno,
fosfatos, factores del crecimiento y se pueden añadir elementos
traza, por ejemplo, a una concentración preferida de,
aproximadamente, 2-20 gl^{-1}, más
preferiblemente, aproximadamente, 5-10 gl^{-1}.
Además, se pueden añadir iones magnesio, por ejemplo, sulfato
magnésico, a una concentración de, aproximadamente,
0,1-5 gl^{-1}, preferiblemente a, aproximadamente,
0,5-1 gl^{-1}.
El caldo de cultivo se prepara y se esteriliza en
un biorreactor y, a continuación, se inocula con una cepa de
Streptomyces para iniciar la fase de crecimiento. Una duración
adecuada de la fase de crecimiento es de, aproximadamente,
5-40 horas, preferiblemente, aproximadamente,
15-35 horas y más preferiblemente, aproximadamente,
20-30 horas.
Las especificaciones de las condiciones
adicionales del proceso son:
intervalo de pH: de, aproximadamente, 7 a,
aproximadamente, 9
intervalo de temperatura: de, aproximadamente, 30
a, aproximadamente, 45ºC
aireación: se prefiere para este proceso
aeróbico
agitación: se prefiere.
Tras la finalización de la fase de crecimiento,
se introduce el ácido ferúlico sustrato al cultivo. Una cantidad
adecuada de alimentación de sustrato es de 5-40
gl^{-1} de caldo de fermentación, preferiblemente,
aproximadamente, 15-30 gl^{-1}, más
preferiblemente, 20-25 gl^{-1}. El sustrato se
introduce como material sólido o como solución acuosa o suspensión.
La cantidad total de sustrato se introduce en una etapa, en dos o
más etapas de alimentación, o de forma continua.
La fase de biotransformación comienza con el
inicio de la introducción del sustrato y dura, aproximadamente,
5-50 horas, preferiblemente, 10-30
horas y, más preferiblemente, 15-25 horas,
concretamente, hasta que todo el sustrato se transforma en producto
y subproductos.
Se asume que una concentración en exceso del
ácido ferúlico introducido es responsable principalmente del elevado
rendimiento volumétrico de vainillina, tal como se observa tras la
finalización de la conversión del sustrato. Además, también se asume
que las condiciones del proceso descrito anteriormente son las
responsables de la acumulación del material de valor, guayacol.
Tras la finalización de la fase de
biotransformación, se separa la biomasa del caldo de fermentación
mediante cualquier método conocido, tal como centrifugación o
filtración por membrana y similares, para obtener un caldo de
fermentación sin células.
Dado que la biotransformación convierte el ácido
ferúlico sustrato hidrofílico en sustancias bastante hidrofóbicas,
tales como vainillina y guayacol, la productividad volumétrica
global del sistema de fermentación se puede incrementar mediante la
aplicación de cualquier método de recuperación de producto
in-situ. Para este objetivo, por ejemplo, se
puede añadir una fase de extracción al caldo de cultivo utilizando,
por ejemplo, un disolvente orgánico inmiscible en agua, un aceite
vegetal o cualquier extractante sólido, por ejemplo, una resina,
preferiblemente, una resina neutra, tal como la Amberlita XAD 4 o
XAD 7 o similares. Dicho método de recuperación de producto
in-situ puede permitir la formación continua
de vainillina y guayacol también después de alcanzar las
concentraciones de solubilidad en agua.
\newpage
A partir de este caldo de fermentación, ahora se
pueden extraer selectivamente la vainillina y los subproductos
mediante dos métodos de extracción diferentes:
Son adecuados a) la extracción
líquido-líquido continua o b) la extracción de
manera discontinua.
- a)
- Basándose en una extracción dependiente del valor de pH, se puede realizar un aislamiento eficaz de vainillina y también de guayacol. En una primera etapa, se puede extraer el guayacol del caldo de fermentación acuoso. Para esta etapa se utiliza, preferiblemente, un método de extracción en contracorriente, preferiblemente en un extractor, mediante un disolvente orgánico insoluble en agua. Algunos ejemplos de disolventes son ésteres de ácidos C_{1-3} con alcoholes C_{1-4}, éteres, en particular metil tert-butiléter (MTBE). El pH se encuentra, preferiblemente, entre 10 y 11, en particular, pH 10,8-11.
- A continuación, se extrae la vainillina del refinado acuoso de la extracción de guayacol a valores de pH de, aproximadamente, 5 a, aproximadamente, 8, preferiblemente de, aproximadamente, 6 a, aproximadamente, 7,5, más preferiblemente, entre, aproximadamente, 6,9 y, aproximadamente, 7,1.
- Si se trabaja con concentraciones de, aproximadamente, 8 a, aproximadamente, 16 gl^{-1}, la extracción en contracorriente es la que funciona más adecuadamente en una proporción de alimentación/disolvente de, aproximadamente, 2,5-3:1, en particular, aproximadamente, 2,6:1.
- b)
- A concentraciones de vainillina más elevadas en la fase acuosa, por ejemplo, tras una concentración del caldo de fermentación mediante la evaporación del agua, una extracción correspondiente a dos etapas de forma discontinua a diferentes valores de pH y con los disolventes propuestos anteriormente es adecuada y preferible.
Las ventajas del nuevo proceso se pueden resumir
tal como se indica a continuación:
- (1)
- Las condiciones de fermentación permiten la acumulación de vainillina en el caldo de fermentación de Streptomyces, por ejemplo, S. setonii, hasta concentraciones económicamente atractivas (aproximadamente, 8-16 gl^{-1}).
- (2)
- El proceso permite la producción simultánea de vainillina y guayacol, es decir, dos productos de elevado valor en la preparación de aromas naturales.
- (3)
- El proceso de fermentación es de baja complejidad técnica y utiliza materias primas de fuentes fácilmente accesibles.
Finalmente, la presente invención se refiere
también al proceso novedoso para la fabricación de vainillina, pero
utilizando en lugar de Streptomyces setonii ATCC 39116, su
enzima o cualquier microorganismo recombinante, por ejemplo,
levadura, que contiene el material genético de codificación para las
enzimas que son relevantes o están implicadas en la biosíntesis
celular de vainillina y/o guayacol y, de este modo, no el
microorganismo como tal.
Se prepararon matraces agitados de 250 ml que
contenían 50 ml del siguiente medio: 103 gl^{-1} de sacarosa, 4
gl^{-1} de Na_{2}HPO_{4}, 1 gl^{-1} de KH_{2}PO_{4}, 1
gl^{-1} de extracto de levadura, 0,2 gl^{-1} de NaCl, 0,2
gl^{-1} de MgSO_{4} y 0,05 gl^{-1} de CaCl_{2}. El pH se
ajustó a 7,2 utilizando NaOH. Se inoculó un matraz agitado con 2 ml
del precultivo de Streptomyces setonii ATCC 39116 y se
cultivó a 37ºC y 190 rpm durante 16 horas. Al final de la fase de
crecimiento se añadieron al cultivo 0,3 g de ácido ferúlico
(adquirido de Aldrich, nº de catálogo 12.870-8,
99%). Para este objetivo, previamente se preparó y se filtró
esterilizada una solución al 10% peso/peso del sustrato ácido en
NaOH 0,5 M (el pH final de la solución fue de, aproximadamente,
7,2). El matraz se incubó de nuevo a 37ºC, 190 rpm. Después de 31,5
horas de biotransformación (incubación) se alcanzó una concentración
de vainillina de 3,10 gl^{-1} (HPLC). Se calculó un rendimiento
molecular del 66% molar.
Se preparó e incubó un matraz agitado de 250 ml
igual que en el Ejemplo 1. Después de 16 horas de fase de
crecimiento se añadieron al cultivo 0,6 g de ácido ferúlico (como
una solución al 10% peso/peso en NaOH 0,5 M). El matraz se incubó de
nuevo a 37ºC y 190 rpm. Después de 78 horas de biotransformación
(incubación) se alcanzó una concentración de vainillina de 5,94
gl^{-1} (HPLC), que correspondía a un rendimiento del 63%
molar.
Se preparó e incubó un matraz agitado de 250 ml
igual que en el Ejemplo 1. Después de 18 horas de fase de
crecimiento se añadieron al cultivo 0,3 g de ácido ferúlico (como
una solución al 10% peso/peso en NaOH 0,5 M). El matraz se incubó de
nuevo a 37ºC y 190 rpm. Después de 28 horas se añadió una segunda
alimentación de 0,3 g de ácido ferúlico. Al final de la incubación
(58 horas) se alcanzó una concentración de vainillina de 6,41
gl^{-1} (HPLC), que correspondía a un rendimiento del 68%
molar.
Se desarrolló un precultivo de Streptomyces
setonii en un matraz agitado a pH 7,2, 37ºC, 190 rpm, durante 24
horas. El medio del matraz agitado contenía 5 gl^{-1} de glucosa,
4 gl^{-1} de Na_{2}HPO_{4}, 1 gl^{-1} de KH_{2}PO_{4},
10 gl^{-1} de extracto de levadura, y 0,2 gl^{-1} de
MgSO_{4}.
Se llenó un biorreactor con 10 l de un medio que
contenía 32 gl^{-1} de glucosa, 8 gl^{-1} de extracto de
levadura, 0,8 gl^{-1} de MgSO_{4} y 0,2 gl^{-1} de agente
antiespumante (Dow Corning AF 1520). Tras la esterilización térmica,
el reactor se inoculó con el precultivo del matraz agitado
previamente desarrollado. La cantidad de inóculo utilizada fue del
3%. Las condiciones del proceso fueron 37ºC, pH 7,2, velocidad del
flujo de aire 1,0 vvm, 800 rpm. Después de 24 horas de fase de
crecimiento se midió una concentración de glucosa remanente de 4,6
gl^{-1}. Posteriormente, el pH se varió hasta 8,5 utilizando NaOH
(30%) y 24,5 horas después de la inoculación se añadieron al caldo
de cultivo 2,25 l de una solución de ácido ferúlico al 10% peso/peso
en 0,5 M de NaOH. En el momento de la alimentación, la
concentración de glucosa descendió hasta 4,0 gl^{-1}. Después de
3-4 horas desde la adición del precursor se observó
el inicio de la biotransformación del ácido ferúlico en vainillina.
Tras 17 horas desde la alimentación de precursor, se midieron
concentraciones de 13,9 gl^{-1} de vainillina y 0,4 gl^{-1} de
guayacol en el caldo de fermentación mediante GC. En ese momento, el
ácido ferúlico se había convertido completamente. Se calculó un
rendimiento de vainillina del 75% molar.
A continuación, se finalizó el bioproceso
mediante la pasteurización a 80ºC durante 15 minutos. El caldo de
fermentación se microfiltró (0,2 \mum).
Un biorreactor de 450 l con un volumen de trabajo
de 340 l se hizo funcionar según el procedimiento descrito en el
ejemplo anterior.
Después de un periodo de crecimiento de 26,5
horas, el pH se varió hasta 8,5 y se llevó a cabo una primera
alimentación de ácido ferúlico que ascendía a 4,08 kg, según el
Ejemplo 4. En ese momento, se midió una concentración remanente de
glucosa de 7,5 gl^{-1}. Una hora más tarde se introdujeron otros
3,57 kg de precursor. La cantidad total de adición de ácido
ferúlico fue de 22,5 gl^{-1}. Después de 25,5 horas desde la
primera alimentación de precursor se midió una concentración de 9,0
gl^{-1} de vainillina. La concentración de ácido ferúlico era
ahora de 1,75 gl^{-1}. Se obtuvo un rendimiento de vainillina del
51% molar.
7930 kg de un caldo de fermentación sin células,
filtrado por membrana, que contenía 7,1 gl^{-1} de vainillina y
0,35 gl^{-1} de guayacol se ajustaron a pH 11 con NaOH y se
extrajeron en primer lugar con MTBE como disolvente en un extractor
de cámara agitada en contracorriente para separar el guayacol.
Después de la evaporación del MTBE, se recuperaron 8 kg de un
extracto crudo que contenía MTBE y un 33% peso/peso de guayacol. A
continuación, el pH del refinado acuoso de esta extracción alcalina
se varió hasta 6,9-7,1 con ácido clorhídrico y de
nuevo se extrajo con MTBE en el mismo extractor para separar la
vainillina. A partir de esta segunda etapa de extracción se
obtuvieron 150 kg de un extracto crudo que contenía MTBE y un 37%
peso/peso de vainillina.
La figura representa:
Un diagrama habitual de una producción en lotes
de vainillina a una escala de 10 l. \Delta concentración de
vainillina [gl^{-1}]; - V - concentración de ácido ferúlico
[gl^{-1}]; x concentración de guayacol [gl^{-1}]; - o - valor de
pH; - \Box - valor de pO_{2} [%]; - x - concentración de glucosa
[gl^{-1}]. Tras una fase de crecimiento de 24 horas el pH se
ajustó a 8,5 antes de la introducción de ácido ferúlico. Después de
3-4 horas desde la adición del sustrato se detectó
una pequeña cantidad de vainillina. Se alcanzó una concentración de
vainillina de 13,9 gl^{-1} después de un total de 41 horas de
fermentación (17 horas después de la introducción de ácido
ferúlico). En ese momento se midió una concentración de guayacol de
0,38 gl^{-1}. Se calculó una velocidad de producción de 1,10
gl^{-1}h^{-1} para la vainillina y de 0,04 gl^{-1}h^{-1}
para guayacol, respectivamente. Tras la conversión completa del
ácido ferúlico se observó una disminución en las concentraciones de
vainillina y guayacol. Las mediciones cuantitativas se realizaron
mediante HPLC y GC.
Claims (18)
1. Proceso para la fabricación de vainillina, que
comprende:
- a)
- cultivar en un medio apropiado una bacteria que pertenece al género Streptomyces para formar un caldo de fermentación;
- b)
- añadir el sustrato de ácido ferúlico al caldo de fermentación para obtener una concentración de ácido ferúlico desde, aproximadamente, 5 gl^{-1} hasta, aproximadamente, 40 gl^{-1}, produciendo vainillina como producto principal de la reacción de la biotransformación de ácido ferúlico, separando la biomasa del caldo de fermentación, y
- c)
- extraer la vainillina, y si se desea, el subproducto guayacol del caldo de fermentación.
2. Proceso, según la reivindicación 1, en el que
el cultivo en la etapa a) se realiza en un medio apropiado durante 5
a 40 horas para formar un caldo de fermentación; y posteriormente,
el pH de dicho caldo de fermentación se varía hasta,
aproximadamente, 8,5; y la biotransformación en b) dura de 5 a 50
horas.
3. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que en la etapa b) se forma un caldo de fermentación que tiene
una concentración de ácido ferúlico de 15 a 30 gl^{-1}.
4. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que en la etapa b) se forma un caldo de fermentación que tiene
una concentración de ácido ferúlico de 20 a 25 gl^{-1}.
5. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que el ácido ferúlico se añade después de la finalización de la
fase de crecimiento.
6. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que el medio de cultivo comprende glucosa, preferiblemente a una
concentración de 5-50 gl^{-1}, más preferiblemente
20-35 gl^{-1}.
7. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que el medio de cultivo comprende extracto de levadura,
preferiblemente a una concentración de hasta 20 gl^{-1}, más
preferiblemente de 5 a 10 gl^{-1}.
8. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que el medio de cultivo comprende iones magnesio, preferiblemente
a una concentración de 0,1 a 5 gl^{-1}, más preferiblemente de 0,5
a 1 gl^{-1}.
9. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que la etapa a) se lleva a cabo a un pH de 7 a 9.
10. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que el proceso se lleva a cabo de 30 a 45ºC.
11. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que el proceso se lleva a cabo con aireación.
12. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que el proceso comprende agitación.
13. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que la biotransformación dura de 10 a 30 horas, más
preferiblemente 15-25 horas.
14. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa c) el guayacol se
extrae en primer lugar mediante el incremento del pH del caldo de
fermentación hasta por encima de 9 y mediante la utilización de un
disolvente orgánico.
15. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que después de la
biotransformación el pH del caldo de fermentación se varía
posteriormente hasta un valor de, aproximadamente, 7, y la
vainillina se extrae mediante un disolvente orgánico.
16. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el
metil-tert-butiléter es el
disolvente de extracción.
17. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que, la bacteria pertenece a
Streptomyces setonii.
18. Proceso, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria es
Streptomyces setonii ATCC 39116.
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WO2004056733A1 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-08 | Council Of Scientific And Industrial Research | A microwave induced process for the preparation of substituted 4-vinylphenols |
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US20050074521A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-04-07 | Sensient Flavors Inc. | Method for the production of natural botanical extracts |
US20050074520A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-04-07 | Sensient Flavors Inc. | Method for the production of natural botanical extracts |
US20050074519A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-04-07 | Sensient Flavors Inc. | Method for the production of natural botanical extracts |
US20060088627A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-04-27 | Sensient Flavors Inc. | Methods for the production of food grade extracts |
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CN101165168B (zh) * | 2006-10-20 | 2010-05-12 | 上海爱普香料有限公司 | 一株链霉菌及利用其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法 |
FR2912758B1 (fr) | 2007-02-21 | 2009-05-15 | Mane Fils Sa V | Systeme de production de molecules aromatiques chez streptomyces. |
MX2008012689A (es) * | 2007-04-19 | 2009-04-17 | Biokab S A De C V | Proceso para producir vainilla a partir de microorganismos inmovilizados por cultivo de superficies. |
ES2854374T3 (es) | 2007-04-19 | 2021-09-21 | Laboratorios Minkab S A De C V | Procedimiento para producir vainillina a partir de microorganismos inmovilizados por cultivo de superficie |
FR2955782B1 (fr) * | 2010-01-29 | 2014-02-14 | Expanscience Lab | Extraction solide / liquide |
WO2012172108A1 (en) * | 2011-06-17 | 2012-12-20 | Symrise Ag | Microorganisms and methods for producing substituted phenols |
CN102321563B (zh) * | 2011-10-24 | 2013-04-03 | 江南大学 | 一株拟无枝酸菌及利用其全细胞转化制备香草醛的方法 |
FR2984314B1 (fr) * | 2011-12-15 | 2014-01-17 | Rhodia Operations | Procede de purification de la vanilline par extraction liquide-liquide |
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EP2964601B1 (en) * | 2013-03-08 | 2020-04-29 | University of Central Florida Research Foundation, Inc. | Methods of making retro-aldol reaction products |
FR3005952B1 (fr) * | 2013-05-21 | 2015-09-04 | Rhodia Operations | Procede optimise d'extraction d'acide ferulique avec pretraitement |
BR112015029141B8 (pt) * | 2013-05-21 | 2020-12-22 | Rhodia Operations | processo para extração de ácido ferúlico, e processo para produzir vanilina natural |
US9932610B2 (en) | 2013-11-04 | 2018-04-03 | Bgn Tech Llc | Methods of making vanillin via the microbial fermentation of ferulic acid from eugenol using a plant dehydrogenase |
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