PL114474B1 - Process for preparing novel derivatives of 9-/2-hydroxyethoxymethylo/guanine - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych 9-/2-hydroksyetoksyme- tylo/guaniny.Znane jest dzialanie przeciwwirusowe pochod¬ nych 9-/2-hydroksyetoksymetylowych/puryn, wy¬ kazywane w próbach in vitro i in vivo przeciw wirusom z klasy DNA i RNA. Zwiazki te dzialaja przeciwwirusowo zwlaszcza wobec wirusa Vacci- nia i wirusów z grupy Herpesvirus, takich jak Herpes simplex, Herpes Zoster i Herpes varicella, wystepujacych u ssaków. Wymienione wirusy po¬ woduja takie choroby, jak opryszczkowe zapale¬ nie rogówki u królików i opryszczkowe zapalenie mózgu u myszy.Obecnie stwierdzono, ze monofosforan 9-/2-hydro- ksyetoksymetylo/guaniny wykazuje dzialanie prze¬ ciwwirusowe równe dzialaniu zwiazku nie zawie¬ rajacego grupy fosforylowej, a przy tym jego roz¬ puszczalnosc, przynajmniej przy wartosciach pH 1—7,5 jest o wiele wyzsza.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie no¬ we pochodne 9-/2-hydroksyetoksymetylo/guaniny o ogólnym wzorze 1, w którym W i Z sa takie same lub rózne i oznaczaja atomy wodoru lub farmako¬ logicznie dopuszczalne kationy.Farmakologicznie dopuszczalnym kationem moze byc kation sodowy, potasowy, litowy, wapniowy*1/*, magnezowy'V2, glinowy*V3 lub amonowy. Okresle¬ nie kation wapniowy*1/* lub magnezowy*1/* ozna¬ cza, ze kation wapniowy lub magnezowy zwia- 10 15 20 25 30 zany jest wiazaniami jonowymi z dwoma atomami tlenu grupy fosforylowej, a okreslenie kation gli- nowyVa oznacza, ze kation glinowy zwiazany jest wiazaniami jonowymi z trzema atomami tlenu grupy fosforylowej. W korzystnych zwiazkach o wzorze 1 Z oznacza kation sodowy, potasowy lub amonowy, a W oznacza atom wodoru, natomiast w szczególnie korzystnych zwiazkach o wzorze 1 Z oznacza kation sodowy lub amonowy, a W ozna¬ cza atom wodoru.Zgodnie z wynalazkiem, zwiazki o wzorze 1, w którym W i Z oznaczaja atomy wodoru, wytwarza sie w ten sposób, ze zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji ze srodkiem fosforylujacym, po czym na otrzymany zwiazek dziala sie zasada lub sola, wymieniajac jeden lub oba podstawniki W i Z na farmakologicznie dopuszczalne kationy.Jako srodki fosforylujace korzystnie stosuje sie pochodne kwasu fosforowego wytworzone przez podstawienie jednej, dwóch albo trzech grup hy¬ droksylowych atomami chlorowców, np. atomem chloru, takie jak tlenochlorek fosforu. Jedna lub dwie grupy hydroksylowe w kwasie mozna rów¬ niez zastapic grupami alkoksylowymi, ewentual¬ nie podstawionymi innymi podstawnikami, uzysku¬ jac np. grupy benzyloksylowe. Takie pochodne fosfochlorowcowe lub fosforany stosuje sie w sro¬ dowisku obojetnym lub zasadowym, przy czym w srodowisku zasadowym korzystnie prowadzi sie aktywacje np. za pomoca karboimidu, takiego jak 114 4743 114 474 4 dwucykloheksylokarbodwuimid, z wyjatkiem przy¬ padku, gdy pochodne lub fosforany maja postac bezwodników.Gdy zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji z pochodna kwasu fosforowego, w której co naj¬ mniej dwie grupy hydroksylowe zostaly.zastapio¬ ne atomami chlorowca, wówczas po zakonczeniu tej reakcji konieczne jest usuwanie wolnych chlo¬ rowców droga dosc lagodnej hydrolizy za pomoca wody, np. przez uzycie wody w ilosci odpowia¬ dajacej równowaznikowi molowemu, w mieszaja¬ cym sie z woda rozpuszczalniku, takim jak al¬ kohol.Podstawione lub niepodstawione grupy alkoksy- lowe wprowadzone z fosforanem mozna nastepnie zhydrolizowac w odpowiednim srodowisku wod¬ nym w obecnosci zasad. Grupy alkoksylowe pod¬ stawione rodnikami aromatycznymi, np. grupy ben- zyldks^lowe, mozna : poddawac równiez hydroge- nolizie, korzystnie w obecnosci katalizatora, sto¬ sujac zn^ne, metody odszczepiania redukujacego.Zwiazek** wzorze • 2 korzystnie fosforyluje sie poddajacego reakcji z tlenochlorkiem fosforu w obecnosci fosforanu trójalkilowego, zwlaszcza w temperaturze okolo 0°C lub nizszej. Zwiazek o wzorze 2 mozna równiez fosforylowac tlenochlor¬ kiem fosforu w bezwodnej pirydynie.Zwiazek o wzorze 2, który mozna uwazac za zwiazek przejsciowy w procesie wytwarzania zwiazków o wzorze 1, mozna wytwarzac sposoba¬ mi podanymi w brytyjskim opisie patentowym nr 1523865.Farmakologicznie dopuszczalne sole monofosfo¬ ranu 9-/2-hydroksyetoksymetyloi/guankiy mozna wy¬ twarzac zobojetniajac monofosforan równomolowa iloscia zasady, takiej jak wodorotlenek, wodoro¬ weglan lub weglan, zawierajacej wlasciwy kation, to jest kation sodowy, potasowy, amonowy, wap¬ niowy, litowy, magnezowy lub glinowy. Sole te mozna równiez wytwarzac stosujac reakcje wy¬ miany, w których na jedna sól monofosforanu dziala sie w wodnej zawiesinie siarczanem sodo- nym, soli zawierajacej wlasciwy kation. Przykla¬ dowo, gdy na slabo" rozpuszczalna sól barowa mo¬ nofosforanu 9-/2-hydroksyetoksymetylo/guaniny dziala sie roztworem^ korzystnie rozltworeiri wod¬ nym otrzymuje sie po usunieciu baru w postaci tnudinorozpuszczaineigo siarczanu barowego roztwór soli sodowej monofosforanu 9-/2-hydroksyetoksy- metylo/guaniny.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku stanowia substancje czynne srodków farmako¬ logicznych, zawierajacych ponadto farmakologicz¬ nie dopuszczalny nosnik. Nosnikami sa obojetne, nie dzialajace na substancje czynne i dopuszczalne farmakologicznie substancje, majace postac ciala stalego, cieczy lub gazu, stosowane w celu ulat¬ wienia podawania srodków farmakologicznych.Srodki te mozna podawac doustnie, pozajelitowo, w postaci czopków lub pessardów, zewnetrznie w postaci masci, kremów, aerozolu lub zasypki lub jako krople do oczu lub nosa, co zalezne jest od tego, czy preparat stosuje sie w leczeniu zakaze¬ nia wewnetrznego, czy zewnetrznego.Wielkosc dawki zwiazku o wzorze 1 przy za¬ kazeniach wewnetrznych wynosi w przeliczeniu na wolny fosforan 0,1—250 mg/tog, korzystnie 1,0*- 50 mg/kg wagi ciala ssaka. W leczeniu ludzi sto¬ suje sie postac dawek jednostkowych podajac np. 5 jedna lub kilka dawek jednostkowych kilka razy dziennie, przy czym jedna dawka zawiera 1— 800 mg, korzystnie 1—250 mg, a zwlaszcza 10— 200 mg czynnej substancji. Przy podawaniu po¬ zajelitowym lub zewnetrznym w postaci kropli, 10 np. w zakazeniach oczu, wodne roztwflfcy moga zawierac okolo 0,1—10%, korzystnie 0,1—7%, a zwlaszcza 0,2—5% wagowo-objetosciowych zwiazku o wzorze 1. W zakazeniach oczu lub innych tka¬ nek zewnetrznych, np. ust i skóry, korzystne jest jj stosowanie preparatów do uzytku zewnetrznego w postaci roztworów, masci lub kremów o ste¬ zeniu substancji czynnej wynoszacymi okolo 0,1— 10%, korzystnie 0,3—6%, a zwlaszcza 3%. Zakaze¬ nia wirusowe u ssaków leczy sie podajac nietok- M syczna, skuteczna przeciwwirusowo ilosc zwiazku o wzorze 1. Okreslenie „nietoksyczna, przeciwwi¬ rusowo skuteczna ilosc" oznacza okreslona uprzed¬ nio ilosc wykazujaca wystarczajaco skuteczne dzia¬ lanie przeciwwirusowe in vivo. w Przyklad I. Monofosforan 9-/2-hydroksyeto- ksymetylo/guaniny. Do ochlodzonej do tempera¬ tury —10°C mieszaniny 0,225 g 9^2-hydroksyeto- ksylometylo/guaninyi 5ml fosforanu trójetylowego dodaje sie mieszajac 0,76 ml tlenochlorku fosforu, 30 po czym temperatura mieszaniny reakcyjnej wzra¬ sta w ciagu 30 minut do 0°C. Mieszanine utrzy¬ muje sie w tej temperaturze w ciagu 2 godzin, a nastepnie wlewa do mieszaniny wody i lodu i doprowadza odczyn do wartosci pH 7 za pomoca 35 2n wodorotlenku potasowego. Otrzymany roztwór ekstrahuje sie dwukrotnie chloroformem i jeden raz eterem. Odczyn pozostalego roztworu wodne¬ go doprowadza sie do wartosci pH 7,1 za pomoca 2n wodorotlenku potasowego, a nastepnie roztwór 40 poddaje sie liofilizacji. Otrzymane cialo stale bia¬ lej barwy rozpuszcza sie w 7 ml wody i dodaje 7 ml metanolu w celu stracenia nieorganicznych soli, które sie odsacza. Do przesaczu dodaje sie 70 ml acetonu i wytracona zywice bialej barwy 45 rozpuszcza sie w 7 ml wody, dodaje 7 ml etanolu i przesacza mieszanine. Po dodaniu duzego nad¬ miaru (70 ml) acetonu ponownie wytraca sie zy¬ wica, która rozpuszcza sie w okolo 20 ml etanolu.Po usunieciu rozpuszczalnika droga odparowa- 50 nia rzutowego otrzymuje sie 2,6 g proszku bialej _. barwy, stanowiacego mieszanine nieorganicznych soli i zadanego fosforanu Produkt ten rozpuszcza sie w 10 ml wody, umieszcza w kolumnie Bio^Gel P-2 (200^-400 mesz, 2,7X90 cm) i eluuje woda. 55 Glówna czesc monofosforanu zostaje wyeluowana w objetosci 50 ml po odebraniu 166 ml eluatu, co stwierdza sie za pomoca chromatografii cienko¬ warstwowej przy uzyciu celulozowych arkuszy Eastman Chromatogram i ukladu rozpuszczalniko- oo 'wego nnpropanol: woda (70 :30 objetosciowo).Wspólczynnik R* dla fosforanu 9*/2^hydroksyeto- ksymetylo/guaniny wynosi 0,26, a dla soli pota¬ sowej fosforanu 9-/2-hydroksyetoiksymetylo/guani- ny wynosi 0,11. Elualt, liofilizuje sie, otrzymuja? tt 0,28 g ciala stalego, zawierajacego 0,2 g monosfo^I 114 474 Tanu, co stwierdza sie droga spektroskopii UV.Przyklad II. Sól anionowa monofosforanu 9-/2-hydroksyetoksymetylo/guaniny. 0,28 g fosforanu 9-/2-*hydroiksyetoksymetylo/gua- niny rozpuszcza sie w 30 ml wody i odczyn roztwo¬ ru doprowadza do wartosci pH 6za pomoca 6n kwa¬ su solnego. Produktem tym nasyca sie 14 ml we¬ gla drzewnego (FAscfoer 5-690B, 50—200 mesz, prze¬ myty kwasem i zdezaktywowany toluenem) sta¬ nowiacego wypemienie kolumny. Wegiel przemy¬ wa sie dokladnie woda i eluuje 70 ml 50% Wod¬ nego roztworu etanolu zawierajacego 2% stezone¬ go roztworu wodorotlenku amonowego. Rozpusz¬ czalnik odparowuje sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem, otrzymujac 0,048 g soli amonowej monofo¬ sforanu 9-/2-hydro|k«yetofcsymetylo/guandny. Wspól¬ czynnik Rf wynosi 0,30 (celuloza Eastman, uklad rozpuszczalnikowy n-pfropanol: woda w stosunku objetosciowym 70:30).Przyklad IIL Sól dwusodowa fosforanu 9-/2- -hydiroksyetoksymetylo/guanidyny.Do mieszaniny 2& g &-/2-hydrolesyetókBymetyk/ guaniny i 250 ml fosforanu trójetylowegoy chlodzo¬ nej do temperatury od —30° do —20°C, dodaje sie mieszajac w ciagu 3 godzin 54 ml tlenochlorku fosforu. Temperatura mieszaniny reakcyjnej wzra¬ sta do 0°C w ciagu 4S minut, po czym mieszanine utrzymuje sie w tej temperaturze w ciagu dodat¬ kowych 45 minult, a nastepnie wlewa do mie¬ szaniny wody i lodu i odczyn doprowadza do wartosci pH okolo 1 za pomoca 2n wodorotlenku sodowego, Otrzymany roztwór ekstrahuje sie raz chloroformem i raz eterem, po czym odczyn po¬ zostalego roztworu wodnego doprowadza sie do wartosci pH 6,8 za pomoca wodorotlenku sodowe¬ go, a nastepnie do wartosci pH 7,3 za pomoca lOn wodorotlenku sodowego, otrzymujac ostatecz¬ nie objetosc 2,5 litra.Zobojetniony roztwór wprowadza sie do kolum¬ ny zawierajacej 2000 g Dowexu 1X8, zrównowa¬ zonego uprzednio 50 milimolami KHCO3. Do eluo- wania stosuje sie 30 litrów KHC03, którego ste¬ zenie zmienia sie liniowo od 50 do 500 milimo¬ lowego, a nastepnie prowadzi sie przemywanie za pomoca 30 litrów 500 milimolowego roztworu KHCO3. Frakcje zawierajace produkt laczy sie i wiekszosc KHCO3 usuwa dodajac Dowex 50 —H+, a C02 odpedza sie pod zmniejszonym cisnieniem.Roztwór odparowuje sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem do objetosci 2 litrów i wytraca produkt dodajac w temperaturze 4°C 10 litrów acetonu. 55 g wysuszonego osadu umieszcza sie w kolum¬ nie 10X110 cm Bio-Gel P-2 i eluuje woda, otrzy¬ mujac 22 g stalej substancji. Substancje te prze- krystalizowuje sie w temperaturze 4°C z roztwo¬ ru wodnego o wartosci pH 3, otrzymujac sól jed- nowodorowa. Dalsza ilosc tej sok' otrzymuje sie z roztworu macierzystego droga rekrystalizacji z 2\)% etanolu o wartosci pH 3. Sól jednowodorowa rozpuszcza sie w minimalnej objetosci wody, od¬ czyn doprowadza sie do wartosci pH 8,5 za po¬ moca NaOH i straca taka sama objetoscia eta¬ nolu w temperaturze 4°C. Wytracony osad roz¬ puszcza sie w 100 ml wody i wytraca 9 objetos- 'Ciami etanolu w temperaturze 4°C, otrzymujac 10 15,1 g dwuwodziatfiu soli dwusodowej monofosfo- ranu 9-/2-hydiroksyetoksymetylo/guaniny.Czystosc zwiazku potwierdzala wyniki analizy elementarnej i analizy metody wysokocisnieniowej chromatograftt cieczowej oraz widmo UV.Wzór empiryczny: CgHuNsOffP 2Na 2H^O Obliczono: C 24,94%; H 3,66%; N 18,19%; P 8,04%.Stwierdzano: C Z5,Z0%; H 3,63%; N 18,10%; P 7,89%.Widmo UV: 40 45 50 55 60 Rozpusz¬ czalnik 0,1 m HC1 PH 7 0,1 m NaÓH Amax 254 25I5--264 e 12970 14060 11760 Amin 225 219 228 Ostre 1 pasma 272 266 Czystosc oznaczona metoda wysokocisnieniowej chromatografii, cieczowej = 99%. Stosunek zasa¬ da/fosforan = 1,00/1,01.Przyklad IV. W celu wykazania przeciwwi- rusowego dzialania soli sodowej fosforanu 9-/2- -hydroksyetoksymetylo/guaniny przeprowadzono próbe zmniejszania liczby lysinek.Komórki Vero hodowano do uzyskania hodowli zlanej w naczyniach do hodowli tkankowej o sred¬ nicy 60 mm, stosujac jako pozywke plyn odzyw¬ czy Eagla zawierajacy zdezaktywowana termicz¬ nie 10% surowice plodu cielecia. Jednowarstwowe hodowle zakazono wirusem, stosujac 100—200 jed¬ nostek lyisinkotwórczych, po czym pozostawiono je w ciagu 1 godziny dla zajscia adsorbcji. Po godzinie inkubacji w temperaturze 37°C nadmiar pozywki usunieto i naniesiono wierzchnia war¬ stwe agaru skladajacego sie z 0,6% agaru, plynu odzywczego Eagla, 2% surowicy plodu cielecia i poddawanego próbie zwiazku o dzialaniu prze- ciwwirusowym. Po skrzepnieciu agaru hodowle inkubowano w ciagu 4 dni do powstania lysinek.Nastepnie hodowle utrwalano w ciagu 1,5 godziny za pomoca 10% formaliny, po czym wierzchnia warstwe zdjeto i komórki zabarwiano w ciagu 10 minut 0,8% roztworem fioletu krystalicznego w 50% stanolu. Hodowle przemyto woda, wysuszono i policzono lysinki. Obliczono wartosci ED» dl?, badanych zwiazków, to jest stezenie badanego zwiazku, przy którym liczba lysinek zmniejsza sie o 50%.Dla soli sodowej fosforanu 9-/2-hydroksyetoksy- metylo/guaniny wartosc ED50 wynosi 0,15 mikro- mola, podczas gdy dla 9-/2-hydroksyetoksymetylo/ guaniny (zwiazek kontrolny) wartosc ta wynosi 0,1 mikromola. Rozpuszczalnosc badanej soli jest jednakze zhacznie wyzsza od rozpuszczalnosci zwiazku kontrolnego. Przykladowo, przy warto¬ sci pH 1 rozpuszczalnosc soli w 0,ln kwasie sol¬ nym wynosi ponad 63 mg/ml^ a przy wartosci pH 7)5 rozpuszczalnosc w roztworze wynosi po¬ nad 73 mg/ml, podczas gdy rozpuszczalnosc zwiaz¬ ku kontrolnego wynosi w tych warunkach odpo¬ wiednio 12 mg/ml i 1,41 mg/ml.114 474 8 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 9- -/2-hydroksyetoksymetylo/guaniny o wzorze 1, w którym W i Z sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atomy wodoru lub farmakologicznie dopuszczalne kationy, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji ze srodkiem fosforylujacym, otrzymujac zwiazek o wzorze 1, w którym W i Z oznaczaja atomy wodoru, po czym zwiazek ten ewentualnie przeprowadza sie droga reakcji z za¬ wierajaca farmakologicznie dopuszczalny kation zasada lub sola w zwiazek o wzorze 1, w którym jeden z podstawników W i Z oznacza farmako¬ logicznie dopuszczalny kation lub oba te podstaw¬ niki oznaczaja farmakologicznie dopuszczalne ka¬ tiony. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako srodek fosforylujacy stosuje sie pochodna kwasu fosforowego. 3. • Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie pochodna kwasu fosforowego, w której 1—3 grupy hydroksylowe zostaly zastapione atomami chlorowców. 16 15 25 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym,. ze stosuje sie tlenochlorek fosforu. 5. Spoisób wedlug zastrz. 2, znamienny tym,. ze stosuje sie pochodna kwasu fosforowego, w któ¬ rej 1—2 grupy hydroksylowe zostaly przeksztal¬ cone w grupy alkoksylowe, ewentualnie podsta¬ wione dalszymi podstawnikami. 6. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji tleno¬ chlorkiem fosforu, w obecnosci fosforanu trójal- kilowego i w temperaturze 0°C lub nizszej. 7. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym,. ze reakcje zwiazjku o wzorze 2 z tlenochlorkiem, fosforu prowadzi sie w srodowisku bezwodnej pirydyny. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 1, w którym W i Z ozna¬ czaja atomy wodoru, poddaje sie reakcji z za¬ sada bedaca wodorotlenkiem, wodoroweglanem^ lub weglanem zawierajacym farmakologicznie dopusz¬ czalny kation. 9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze jako farmakologicznie dopuszczalny kation sto¬ suje sie kation sodowy, potasowy, amonowy, wap¬ niowy, litowy, magnezowy lub glinowy. 9 oko-CHa PL PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych 9- -/2-hydroksyetoksymetylo/guaniny o wzorze 1, w którym W i Z sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atomy wodoru lub farmakologicznie dopuszczalne kationy, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji ze srodkiem fosforylujacym, otrzymujac zwiazek o wzorze 1, w którym W i Z oznaczaja atomy wodoru, po czym zwiazek ten ewentualnie przeprowadza sie droga reakcji z za¬ wierajaca farmakologicznie dopuszczalny kation zasada lub sola w zwiazek o wzorze 1, w którym jeden z podstawników W i Z oznacza farmako¬ logicznie dopuszczalny kation lub oba te podstaw¬ niki oznaczaja farmakologicznie dopuszczalne ka¬ tiony.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako srodek fosforylujacy stosuje sie pochodna kwasu fosforowego.3. • Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie pochodna kwasu fosforowego, w której 1—3 grupy hydroksylowe zostaly zastapione atomami chlorowców. 16 15 254. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym,. ze stosuje sie tlenochlorek fosforu.5. Spoisób wedlug zastrz. 2, znamienny tym,. ze stosuje sie pochodna kwasu fosforowego, w któ¬ rej 1—2 grupy hydroksylowe zostaly przeksztal¬ cone w grupy alkoksylowe, ewentualnie podsta¬ wione dalszymi podstawnikami.6. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2 poddaje sie reakcji tleno¬ chlorkiem fosforu, w obecnosci fosforanu trójal- kilowego i w temperaturze 0°C lub nizszej.7. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym,. ze reakcje zwiazjku o wzorze 2 z tlenochlorkiem, fosforu prowadzi sie w srodowisku bezwodnej pirydyny.8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 1, w którym W i Z ozna¬ czaja atomy wodoru, poddaje sie reakcji z za¬ sada bedaca wodorotlenkiem, wodoroweglanem^ lub weglanem zawierajacym farmakologicznie dopusz¬ czalny kation.9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze jako farmakologicznie dopuszczalny kation sto¬ suje sie kation sodowy, potasowy, amonowy, wap¬ niowy, litowy, magnezowy lub glinowy. 9 oko-CHa PL PL PL PL