NO153260B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av antiviralt virksomme 9-hydroksyetoksyguaninderivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av et 9-hydroksyetoksymetylguaninderivat med formelen:

hvor W og Z er like eller forskjellige, og hver er et hydrogen-atom eller et farmasøytisk akseptabelt kation.

9-(2-hydroksyetoksymetyl)derivater av puriner er kjent for å ha antivirus-aktivitet mot forskjellige klasser av DNA og RNA-virus både in vitro og in vivo forsøk, se norsk patent nr. 144.216. Disse forbindelser er spesielt aktive som anti-virusmidler mot kukopper og herpes virus, inkludert simplex, zoster og varicella i pattedyr, hvilke virus forårsaker sykdommer slik som herpetisk hornhinnebetennelse hos kaniner og herpetisk hjernebetennelse hos mus.

Man har nå funnet at monofosfatesteren av 9-(2-hydroksyetoksymetyl) guanin ikke bare er aktiv som den ikke-fosforylerte forbindelse, men også har den selektive fordel av meget større oppløselighet ved i det minste en pH-verdi på fra 1 til 7,5 sammenlignet med tilsvarende ikke-fosforylerte forbindelse.

Det farmasøytisk akseptable kationet kan velges

fra en gruppe omfattende natrium, kalium, litium, kalsium/2, magnesium/2, aluminium/3 eller ammonium. Forbindelser med formel I hvor Z er natrium, kalium eller ammonium, og hvor

W er hydrogen, foretrekkes, og forbindelser med formel I hvor Z er natrium eller ammonium, og W er hydrogen, er særlig foretrukket.

I den ovenfor angitte definisjon av W og Z ut-trykkes de flerverdige kationer som kalsium/2, magnesium/2 og aluminium/3, hvilket skal bety kationet delt på dets valens, dvs. Ca<++>/2, Mg<++>/2 og Al<+++>/3. Dette skal bety at kalsium- eller magnesiumkationer er i ionisk forbindelse med to fosfat-oksygenatomer og aluminium med tre.

Fremstillingen av en forbindelse med formel I omfatter ifølge foreliggende oppfinnelse at:

(a) en forbindelse med formelen:

omsettes med et fosforyleringsmiddel for dannelse av en forbindelse med formel I hvor både W og Z er hydrogenatomer; eller

underkastes ammonolyse til en forbindelse med formel I og, om ønsket, omdannelse av en forbindelse med formel I, hvor W og Z begge er hydrogen til en forbindelse hvor en av eller begge av W og Z er et farmasøytisk akseptabelt kation, ved omsetning med en base eller et salt inneholdende det ønskede kation.

I metode (a) er derivater av fosforsyre, som har en til

tre hydroksygrupper erstattet med halogenatomer, f.eks. klor,

slik som fosforoksyklorid, foretrukket for fosforylering. Opp til to av hydroksygruppene kan også substitueres for dannelse av alkoksygrupper, eventuelt inneholdende ytterligere substitu-sjoner for dannelse av f.eks. benzyloksygrupper. Slike fosfo-halogenidderivater eller fosfater anvendes under de vanlige nøytrale eller alkaliske betingelser, idet de sistnevnte fortrinnsvis nødvendiggjør aktivering, f.eks. med et karbodiimid, f.eks. dicykloheksylkarbodiimid med unntagelse av når det er tilstede i form av anhydridet.

Når minst to av hydroksygruppene i fosforsyrederivatet

er erstattet med halogen, vil det etter reaksjonen med forbindelsen med formel II, være nødvendig å fjerne de frie halogener ved hjelp av mild vandig hydrolyse, f.eks. ved anvendelse av en molarekvivalent vann i et vannblandbart oppløsningsmiddel, slik som alkohol.

Substituerte eller usubstituerte alkoksygrupper i et fos-fatderivat kan hydrolyseres i et passende vandig medium i nærvær av baser i et etterfølgende trinn. Aromatisk substituerte alkoksygrupper, slik som benzyloksy, kan også utsettes for hydro-genolyse, fortrinnsvis i nærvær av en katalysator ifølge vanlige teknikker for reduktiv spalting.

En foretrukken metode for fosforylering av mellom-produktene innebærer omsetning av en forbindelse med formel II, som definert ovenfor, med fosforoksyklorid i nærvær av et trialkylfosfat og fortrinnsvis ved en temperatur på omkring 0°C eller lavere.

Andre nyttige metoder for fremstilling av monofosfatet er omsetning av en forbindelse med formel II med fosforoksyklorid i tørr pyridin.

Forbindelsen med formel II kan ansees som et mellom-produkt i syntesen av forbindelser med formel I og kan fremstilles ifølge de metoder som er beskrevet i norsk patent nr. 144.216.

Ammonolyse av en forbindelse med formel III ved

hjelp av metode b) er beskrevet i "Heterocyclic compounds - Fused Pyrimidines Part II Purines", av D. J. Brown (1971) publisert av Wiley - Interscience.

Forbindelser med formel III kan ansees som mellomprodukter i syntesen av forbindelser med formel I og kan på analog måte fremstilles ifølge metode (a), hvilke forbindelser igjen kan fremstilles analogt ifølge de metoder som er beskrevet i oven-nevnte britiske patent.

Farmasøytisk akseptable salter av 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guaninmonofosfat kan fremstilles ved nøytralisering av monofosfatet i dets sure form med en ekvivalent mengde (dvs. ekvinormal) av en base slik som et hydroksyd, bikarbonat, karbonat som inneholder det ønskede kation, dvs. natrium, kalium, ammonium, kalsium, litium, magnesium eller aluminium. De kan alternativt fremstilles ved utvekslingsreaksjoner hvorved et salt av monofosfatet behandles med en oppløsning, fortrinnsvis vandig, av et salt inneholdende det ønskede kation. Det svakt oppløselige bariumsalt av 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guaninmonofosfat behandles f.eks. i vandig suspensjon med natriumsulfat for å fjerne bariumet i form av det meget uoppløselige bariumsulfat, hvilket etterlater natrium 9-(2-hydroksyetoksymetyl)-guaninmonofosfat i oppløsning.

Et farmasøytisk preparat omfatter en forbindelse med formel I som definert ovenfor, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Farmasøytisk akseptable bærere er materialer som er nyttige for det formål å administrere preparatet, og kan være faste, flytende eller gassformige materialer, som ellers er inerte og medisinsk akseptable og er forenelige med den aktive bestanddel. Disse farmasøytiske preparater kan administreres oralt, parenteralt, benyttet som et suppositorium eller pessar, påført topisk som en salve, krem, aerosol eller pulver, eller gitt som øye- eller nesedråper, avhengig av om preparatet anvendes for behandling av indre eller ytre virusinfeksjoner.

For indre infeksjoner administreres forbindelsene med formel I i dosenivåer på 0,1-250 mg pr. kg, beregnet som det frie fosfat, fortrinnsvis i en mengde på 1,0-50 mg pr. kg legems-vekt, og anvendes hos mennesker i en enhetsdoseringsform, administrert f.eks. noen ganger daglig i form av en eller flere enhetsdoser, i en mengde på 1-800 mg pr. enhetsdose, fortrinnsvis 1-250 mg pr. enhetsdose, og helst i en mengde på 10-200 mg pr. enhetsdose.

For parenteral administrasjon eller topisk administrasjon, som dråper, f.eks. for øyeinfeksjoner, kan forbindelsene med formel I befinne seg i vandige oppløsninger i en konsentrasjon på 0,1-10% vekt/vol., fortrinnsvis 0,1-7%, og helst 0,2-5% vekt/vol.

For infeksjoner i øyet eller annet utvendig vev, f.eks. munn og hud, foretrekkes alternativt topiske oppløsnings-, salve-eller krempreparater. Konsentrasjoner på 0,1-10%

fortrinnsvis 0,3-6%, og helst på 3%, kan anvendes.

Ved behandling av virusinfeksjoner hos pattedyr administreres en effektiv, ikke-toksisk antivirusmengde av en forbindelse med formel I. Angivelsen "effektiv, ikke-toksisk antivirusmengde" betyr en bestemt antivirus-mengde som er til-strekkelig til å være effektiv mot viruset in vivo.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

9-( 2- hydroksyetoksymetyl) guaninmonofosfat

Fosforoksyklorid (0,03 ml) ble tilsatt i en porsjon til

en omrørt suspensjon av 2-klor-9-(2-hydroksyetoksymetyl)hypoxantin (20 mg) i trietylfosfat (0,3 ml) ved -8°C. Temperaturen fikk stige til 0°C iløpet av 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt ved 0°C i 40 minutter og ved +5°C i 50 minutter. Den ble deretter helt på is og pH-verdien ble regulert til 7 med 2N kaliumhydroksyd. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert to ganger med kloroform (2x2 ml) Den vandige fasen ble regulert til pH 8-8,5 med 2N kaliumhydroksyd og bariumacetat (105 mg) ble tilsatt. Det resulterende bariumfosfat-bunnfall ble fjernet ved filtrering. Den ovenstående væske ble behandlet med et stort overskudd etanol, hvilket resulterte i utfelling av urent barium

2-klor-9-(2-hydroksyetoksymetyl)hypoxantinmonofosfat. Det faste stoff ble oppsamlet ved filtrering og suspendert i etanol. Den etanoliske suspensjon ble deretter oppvarmet på et dampbad i flere minutter, avkjølt og filtrert. Det oppsamlede bunnfall ble vasket med vannfri eter og tørket, hvilket ga barium 2-klor-9-(2-hydroksyetoksymetyl)hypoxantinmonofosfat (26 mg).

Ammoniumsulfat (3,96 mg) ble tilsatt til en omrørt suspensjon av barium 2-klor-9-(2-hydroksyetoksymetyl)hypoxantinmono-fosfat (7 mg) i vann (0,5 ml). Blandingen ble omrørt ved om-givelsestemperatur i 15 minutter og deretter avkjølt i et isbad.

i

Det utfelte bariumsulfat ble fjernet ved filtrering og vasket

/\

\ med vann (1 ml) og etanol (10 ml). Det kombinerte filtrat og

vakseoppløsningene ble inndampet under redusert trykk og den resulterende rest oppløst i metanol (3 ml). Den metanoliske opp-løsning ble overført til en "Teflon"-foret, rustfri stålbeholder, og metanol (8 ml) mettet med gassformig ammoniakk ved isbad-temperatur ble også tilsatt til beholderen. Den forseglede be-holder ble anbragt i en ovn ved 122°C i 4 timer, avkjølt og åpnet. Oppløsningsmiddel ble inndampet til et minimalt volum. Den resterende reaksjonsblanding ble påført flekkvis på "Eastman i Chromatogram"-cellulose-tynnsjiktskromatografiark som deretter ble fremkalt i n-propanol:vann (70:30 vol/vol). Båndene ved Rf 0,16 og 0,34 ble fjernet, suspendert i Tris-buffer (0,6 ml) ved pH 8

og cellulosen ble filtrering.

Disse bånd viste seg å inneholde 9-(2-hydroksyetoksymetyl)-guaninmonofosfat og 2-klor-9-(2-hydroksyetoksymetyl)hypoxantin-monofosfat ved enzymatisk defosforylering med alkalisk fosfatase til 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guanin og 2-klor-9-(2-hydroksyetoksymetyl) hypoxantin, respektivt. Alkalisk fosfatase (2 yl) fra

\ E. coli, ble tilsatt til filtratet og blandingen ble oppvarmet ved 32°C i 2 timer. Den ble deretter undersøkt ved hjelp av tynnsjiktskromatografi på "Eastman Chromatogram"-celluloseark i tre oppløsningsmiddelsysterner:

(a) n-propanol:vann (70:30 vol/vol)

(b) vann

(c) n-propanol kons. ammoniumhydroksyd:vann (60:30:10 vol/vol) idet to flekker fantes i hvert system, tilsvarende 9-(2-hydroksyetoksymetyl) guanin (A) og 2-klor-9-(2-hydroksyetoksymetyl)hypo-xantin (B) .

Eksempel 2

9-( 2- hydroksyetoksymetyl) guaninmonofosfat

Fosforoksyklorid (0,76 ml) ble tilsatt til en omrørt, avkjølt (-10°C) blanding av 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guanin (0,225 g) og trietylfosfat (5 ml). Reaksjonsblandingens temperatur fikk stige til 0°C iløpet av 30 minutter og ble holdt ved denne temperatur i 2 timer. Den ble deretter helt på en blanding av is og vann og pH-verdien ble innstilt til 7 med 2N kaliumhydroksyd.

Den resulterende oppløsning ble ekstrahert to ganger med kloroform og en gang med eter. pH-verdien til den resterende vandige opp-løsning ble innstilt til 7,1 med 2N kaliumhydroksyd og ble deretter lyofilisert. Det resulterende hvite faste stoff ble oppløst i vann (7 ml) og metanol (7 ml) ble tilsatt for å utfelle de uorganiske salter som deretter ble fjernet ved filtrering. Aceton (70 ml) ble tilsatt til filtratet, hvilket førte til utfelling av et hvitt gummiaktig stoff. Dette stoff ble oppløst i vann (7 ml), etanol (7 ml) ble tilsatt og blandingen filtrert. Et stort overskudd aceton (70 ml) ble tilsatt, og dette førte også til utfelling av et gummiaktig stoff. Dette stoff ble oppløst i etanol (ca. 20 ml) og oppløsningsmidlet ble fjernet ved ekspansjonsfor-dampning, hvilket ga et hvitt pulver (2,6 g) som var en blanding av uorganiske salter og det ønskde fosfat. Det faste stoff ble oppløst i vann (10 ml), påført på en "Bio-Gel P-2"-kolonne (200-400 mesh, 2,7x90 cm) og eluert med vann. Mesteparten av monofosfatet ble eluert i et 50 ml volum etter at 166 ml av eluatet var oppsamlet, som vist ved tynnsjiktskromatografi på "Eastman Chromatogram"-cellulose i n-propanol:vann (70:30 vol/vol); Rf = 0,26 for 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guaninfosfat og Rf = 0,11

for kalium 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guaninfosfat. Eluatet ble lyofilisert og dette ga 0,28 g av et fast stoff som ved ultra-fiolett spektroskopi viste seg å inneholde 0,2 g av monofosfat-produktet.

Eksempel 3

Ammonium 9-( 2- hydroksyetoksymetyl) guaninmonofosfat

9-(2-hydroksyetoksymetyl)guaninfosfat (0,28 g) ble opp-løst i vann (30 ml) og oppløsningens pH-verdi ble innstilt til 6 med 6N saltsyre. Produktet ble adsorbert på 14 ml pakket trekull ("Fischer 5-690B", 50-200 mesh, syrevasket og deaktivert med toluen). Trekullet ble godt vasket med vann og eluert med 70 ml 50% vandig etanol inneholdende 2% konsentrert ammonium-hydroksyd. Oppløsningsmidlet ble inndampet under redusert trykk og dette ga ammonium 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guaninmonofosfat (0,048 g); Rf = 0,30 på "Eastman"-cellulosepapir i n-propanol: vann (70:30 vol/vol).

Eksempel 4

Dinatrium 9-( 2- hydroksyetoksymetyl) guaninfosfat

Fosforoksyklorid (54 ml) ble tilsatt iløpet av 3 timer til en omrørt, avkjølt (-30 til -20°C) blanding av 9-(2-hydroksyetoksymetyl) guanin (25 g) og trietylfosfat (250 ml). Reaksjonsblandingens temperatur fikk stige til 0°C iløpet av 45 minutter og ble holdt ved denne temperatur i ytterligere 4 5 minutter. Den ble deretter helt i en blanding av is og vann og pH-verdien ble innstilt til ca. 1 med 2N natriumhydroksyd. Den resulterende oppløsning ble ekstrahert en gang med kloroform og en gang med eter. pH-verdien til den resterende vandige oppløsning ble innstilt til 6,8 med 2N natriumhydroksyd og deretter til 7,3 med 10N natriumhydroksyd, hvilket ga et sluttvolum på 2,5 liter.

Den nøytraliserte oppløsning ble påført på en kolonne inneholdende 2000 g "Dowex 1 x 8" som var ekvilibrert med 50 mM KHCO^. Eluering var ved 30 l lineær gradient på 50-500 mM

KHC03 fulgt av en 30 i vask på 500 mM KHC03. Fraksjonene inneholdende produktet ble kombinert og mesteparten av KHCO, ble fjernet ved tilsetning "Dowex 50-H " og fjerning av C02 under vakuum. Volumet ble redusert til 2 l i vakuum og produktet ble utfelt ved 4°C ved tilsetning av 10 £ aceton. Det tørkede bunnfall, 55 g, ble påført på en 10x110 cm "Bio-Gel P-2"-kolonne og eluert med H20. 22 g fast stoff ble oppnådd. Materialet ble omkrystallisert ved 4°C som hydrogensaltet fra en pH 3 oppløsning av vann og mer materiale ble oppnådd fra modervæsken ved krystalli-sering fra 20% etanol ved pH 3. Hydrogensaltet ble oppløst i et minimalt volum H20, bragt til pH 8,5 med NaOH og utfelt med 2 volumdeler etanol ved 4°C. Dette bunnfall ble oppløst i 100 ml. H20 og utfelt med 9 volumdeler etanol ved 4°C, hvilket ga 15,1 g 9-(2-hydroksyetoksymetyl)guaninmonofosfatdinatriumsaltdihydrat.

Renheten ble bekreftet ved elementæranalyse, høytrykks-væskekromatografi og UV-spektra.

Empirisk formel: CgH^NgOgP 2Na 2H20

Teori: C 24,94%; H 3,66%; N 18,19%; P 8,04%

Funnet: C 25,20%; H 3,63%; N 18,10%; P 7,89%.

Renhet ved høytrykks-væskekromatografi = 99% Base/fosfat-forhold = 1,00/1,01.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et nytt, antiviralt virksomt 9-hydroksyetoksymetylguaninderivat med formelen:

   hvor W og Z er like eller forskjellige, og hver er et hydrogen-atom eller et farmasøytisk akseptabelt kation, karakterisert ved at (a) en forbindelse med formel:

   omsettes med et fosforyleringsmiddel for dannelse av en forbindelse med formel I hvor både W og Z er hydrogenatomer, eller (b) en forbindelse med formelen:

   underkastes ammonolyse til en forbindelse med formel I, og, om ønsket, omdannelse av en forbindelse med formel I hvor W og Z begge er hydrogen til en forbindelse hvor en av eller begge av W og Z er et farmasøytisk akseptabelt kation, ved omsetning med en base eller et salt inneholdende det ønskede kation.