OA13197A - Heparin - derived oligosaccharide mixtures, their preparation and pharmaceutical compositions containing them. - Google Patents
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Abstract
Description
MELANGES D OLIGOSACCHARIDES DERIVES D'HEPARINE, LEUR PREPARATION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANTMIXTURES OF HEPARIN-DERIVED OLIGOSACCHARIDES, THEIR PREPARATION AND THE PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM
La présente invention concerne des mélanges d’oligosaccharides dérivés d'héparine ayant un poids moléculaire moyen de 1800 à 2400 Daltons, caractérisés par une forte activité anti-Xa (aXa) et une absence d’activité anti-IIa (alla), leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques les contenant. L'héparine est un mélange de Mucopolysaccharides sulfatés d'origine animale, utilisée notamment pour ses propriétés anticoagulantes et antithrombotiques. L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante (alla) peut occasionner des hémorragies. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol 5 sup. 3 (1999)).The present invention relates to mixtures of heparin-derived oligosaccharides having an average molecular weight of 1800 to 2400 Daltons, characterized by a high anti-Xa (aXa) activity and a lack of anti-IIa activity (alla), their method of preparation and pharmaceutical compositions containing them. Heparin is a mixture of sulphated Mucopolysaccharides of animal origin, used in particular for its anticoagulant and antithrombotic properties. Heparin, however, has drawbacks that limit the conditions of its use. In particular, its important anticoagulant activity (alla) can cause haemorrhages. (Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol 5 sup 3 (1999)).
Des héparines de bas poids moléculaire, notamment obtenues par dépolymérisation basique d'esters d'héparine et actuellement commercialisées telle que l’Enoxaparine présentent également une activité alla importanteHeparins of low molecular weight, especially obtained by basic depolymerization of heparin esters and currently marketed such as Enoxaparin, also have a significant activity.
Plus récemment, des héparines de très bas poids moléculaires ont été décrites dans l’art antérieur. Par example, dans le brevet US 6,384,021 les produits présentent une activité AntiXa comprise entre 100 et 120 Uï/mg, une activité antilla comprise entre 2 et 8 Ul/mg. Dans les demandes internationales W002/08295 et W02004/033503 les produits présentent des activités AntiXa comprises notamment entre 100 et 190 Ul/mg pour des activités anti Ha inferieures à 5 Ul/mg. Cependant, aucune de ces héparines de très bas poids moléculaire ne présentent effectivement une activité Anti Xa supérieur à 190 Ul/mg tout en présentant une activité Anti-Da nulle ou pratiquement nulle. (Ul = Unité Internationale)More recently, heparins of very low molecular weight have been described in the prior art. For example, in US Pat. No. 6,384,021, the products exhibit an AntiXa activity of between 100 and 120 IU / mg, an antilla activity of between 2 and 8 IU / mg. In international applications W002 / 08295 and W02004 / 033503, the products exhibit AntiXa activities notably comprised between 100 and 190 IU / mg for antiha activities below 5 IU / mg. However, none of these heparins of very low molecular weight actually exhibit an Anti Xa activity greater than 190 IU / mg while having zero or virtually zero anti-Da activity. (Ul = International Unity)
Par activité Antiïïa pratiquement nulle (ou autrement dit, ne présentant pratiquement pas d’activité Anti lia) on entend, une activité inférieure à 0,2 Ul/mg. L'invention a pour objet des mélanges d’oligosaccharides possédant une activité très sélective vis-à-vis du facteur X activé (facteur Xa) tout en ne présentant pas, ou pratiquement pas, d’activité anti Da.By anti-activity practically zero (or in other words, exhibiting practically no anti-IIa activity) is meant an activity of less than 0.2 IU / mg. The subject of the invention is mixtures of oligosaccharides having a very selective activity with respect to the activated factor X (factor Xa) while not exhibiting, or practically none, anti-Da activity.
La présente invention a donc pour objet des mélanges d’oligosaccharides possédant la structure générale des polysaccharides constitutifs de l'héparine et présentant les caractéristiques suivantes : - ils ont un poids moléculaire moyen de 1800 à 2400 Daltons, une activité anti-Xa compris entre 190 Ul/mg et 450 Ul/mg et n’ont pas, ou pratiquement pas, d’activité anti-Ha. - les oligosaccharides constitutifs des mélanges - contiennent de 2 à 16 motifs saccharidiques, - ont un motif acide uronique-4,5 insaturé 2-O-sulfate à l'une de leurs extrémités, et contiennent l’hexasaccharide de formule suivante :The subject of the present invention is therefore mixtures of oligosaccharides having the general structure of the constituent polysaccharides of heparin and having the following characteristics: they have an average molecular weight of 1800 to 2400 Daltons, an anti-Xa activity of between 190 IU / mg and 450 IU / mg and have little or no anti-Ha activity. the constituent oligosaccharides of the mixtures contain from 2 to 16 saccharide units; they have an uronic acid-4,5 unsaturated 2-O-sulfate unit at one of their ends, and contain the hexasaccharide of the following formula:
Alla ||s ls sous forme d'un sel de métal alcalin ou alcalinoterreux. L’hexasaccharide AIIa-IIs-Is contenu dans le mélange d’oligosaccharides décrit dans la présente invention est une séquence fortement affine à ΓΑΤΠΙ et est caractérisé par une activité aXa supérieure à 740 Ul/mg.Alla ls in the form of an alkali metal or alkaline earth metal salt. The hexasaccharide AIIa-IIs-Is contained in the oligosaccharide mixture described in the present invention is a sequence strongly affine to ΓΑΤΠΙ and is characterized by an aa activity greater than 740 IU / mg.
Comme sel de métal alcalin ou alcalinoterreux, sont préférés les sels de sodium, potassium, calcium et magnésium.As the alkali or alkaline earth metal salt, the sodium, potassium, calcium and magnesium salts are preferred.
Le poids moléculaire moyen est déterminé par chromatographie liquide haute pression en utilisant deux colonnes en série par exemple celles commercialiséesThe average molecular weight is determined by high pressure liquid chromatography using two columns in series, for example those marketed
sous le nom de TSK G3000 XL et TSK G2000 XL. La détection est réalisée par réfractométrie. L’éluant utilisé est du nitrate de lithium-et le débit est de 0,6 ml/min. Le système est calibré avec des standards préparés par fractionnement de l’Enoxaparine par chromatographie sur gel d’agarose-polyacrylamide (IBF). Cette préparation est réalisée selon la technique décrite par Barrowcliffe et al, Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) ou D.A. Lane et al, Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Les résultats sont calculés à l’aide du logiciel GPC6 (Perkin Elmer). L'activité anti-Xa est mesurée par la méthode amydolytique sur un substrat chromogénique selon le principe décrit par Teien et al, Thromb. Res., 10, 399-410 (1977). Les dosages sont réalisés selon la méthode décrite dans la monographie des héparines de basse masse moléculaire de la pharmacopée européenne en vigueur, à l'exception du tampon de reconstitution : l'albumine dans le tampon Tris-NaCl pH 7.4 est remplacée par du Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000).under the name of TSK G3000 XL and TSK G2000 XL. The detection is carried out by refractometry. The eluent used is lithium nitrate and the flow rate is 0.6 ml / min. The system is calibrated with standards prepared by fractionation of Enoxaparin by agarose-polyacrylamide gel (IBF) chromatography. This preparation is carried out according to the technique described by Barrowcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) or D.A. Lane et al., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). The results are calculated using the GPC6 software (Perkin Elmer). The anti-Xa activity is measured by the amydolytic method on a chromogenic substrate according to the principle described by Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977). The assays are carried out according to the method described in the monograph of the low molecular weight heparins of the European Pharmacopoeia in force, with the exception of the reconstitution buffer: the albumin in the Tris-NaCl buffer pH 7.4 is replaced by Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000).
La mesure de l'activité anti Xa est réalisée par rapport à une Héparine de Très Bas Poids Moléculaire (HTBPM) standard qui titre de 140 à 180 U/mg (sur sec). L’activité de l’HTBPM standard est mesurée par rapport à l’étalon international standard d’héparine de bas poids moléculaire.The measurement of the anti-Xa activity is carried out with respect to a Heparin of Very Low Molecular Weight (HTBPM) standard which has a titre of 140 to 180 U / mg (on a dry basis). The activity of the standard HTBPM is measured against the standard international standard of low molecular weight heparin.
Cette HTBPM standard a été préparée selon l’enseignement des demandes de brevet WO W002/08295 et notamment de W02004/033503. L’activité de l’HTBPM standard est mesurée par rapport à l’étalon international standard d’héparine de bas poids moléculaire. L’activité anti-Ha est mesurée par la méthode amidolytique sur un substrat chromogénique selon la méthode décrite dans la monographie des héparines de basse masse moléculaire de la pharmacopée européenne en vigueur. La mesure des activités alla est réalisée par rapport à une Héparine de Très Bas Poids Moléculaire (HTBPM) standard d’activité mesurée à 2,1 Ul/mg. L’activité de l’HTBPM standard est mesurée par rapport à l’étalon international standard d’héparine de bas poids moléculaire.This standard HTBPM has been prepared according to the teaching of patent applications WO W002 / 08295 and in particular WO2004 / 033503. The activity of the standard HTBPM is measured against the standard international standard of low molecular weight heparin. The anti-Ha activity is measured by the amidolytic method on a chromogenic substrate according to the method described in the monograph of low molecular weight heparins of the current European Pharmacopoeia. Measurement of the activities was carried out compared to a Heparin of Very Low Molecular Weight (HTBPM) standard of activity measured at 2.1 IU / mg. The activity of the standard HTBPM is measured against the standard international standard of low molecular weight heparin.
Selon un mode préféré, le mélange d’oligosaccharides selon l’invention renferme de 20 à 100 % d’une fraction hexasaccharide. En particulier ce mélange contient de 30 à 60 % de fraction hexasaccharides.According to a preferred embodiment, the oligosaccharide mixture according to the invention contains from 20 to 100% of a hexasaccharide fraction. In particular, this mixture contains from 30 to 60% of hexasaccharide fraction.
Par ailleurs, les mélanges selon l’invention contiennent de 20 à 70 % de l’hexasaccharide Aüa-IIs-Is dans la fraction hexasaccharide du mélange d’oligosaccharides. En particulier, cette fraction Aïïa-Hs-Is est présente dans la fraction hexasaccharide à hauteur de 25 à 50 %.Furthermore, the mixtures according to the invention contain from 20 to 70% of the hexasaccharide Aαa-IIs-Is in the hexasaccharide fraction of the oligosaccharide mixture. In particular, this Al-Hs-Is fraction is present in the hexasaccharide fraction at 25 to 50%.
Le pourcentage de la fraction hexasaccharide peut être déterminée de façon analytique par chromatographie liquide haute pression sur colonnes TSK G3000 XL et TSK G2000 XL ou bien par séparation préparative de la fraction hexasaccharide.The percentage of the hexasaccharide fraction can be determined analytically by high pressure liquid chromatography on TSK G3000 XL and TSK G2000 XL columns or by preparative separation of the hexasaccharide fraction.
Le mélange est dans ce cas chromatogràphié sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose. Le mélange est élué par une solution d’hydrogénocarbonate de sodium. De préférence, la solution d’hydrogénocarbonate de sodium est une solution de 0.1 mol/1 à 1 mol/1. Encore plus préférentiellement, la séparation est réalisée a une concentration de 1 mole/1. La détection est réalisée par spectrométrie UV (254nm). Après fractionnement, la fraction hexasaccharide en solution dans l’hydrogénocarbonate de sodium est neutralisée par de l’acide acétique glacial. La solution est ensuite concentrée sous pression réduite de façon à obtenir une concentration en acétate de sodium supérieure à 30 % en poids. La fraction d’hexasaccharide est précipitée par addition de 3 à 5 volumes de méthanol. La fraction d’hexasaccharides est récupérée par filtration sur verre fritté n°3. Le mélange d’hexasaccharides obtenu peut être analysé par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) pour en déterminer la teneur en hexasaccharide Allans-Is. L’hexasaccharide ADa-ïïs-Is peut être isolé par chromatographie CLHP préparative ou par chromatographie d’affinité sur colonne antithrombine ÏÏI sepharose selon les techniques utilisées par l’homme du métier (M . Hook, I. Bjork, J. Hopwood and U. Lindahl, F.E B.S letters, vol 656(1) (1976)).In this case, the mixture is chromatographed on columns filled with agarose polyacrylamide gel. The mixture is eluted with sodium hydrogencarbonate solution. Preferably, the sodium hydrogen carbonate solution is a solution of 0.1 mol / l to 1 mol / l. Even more preferentially, the separation is carried out at a concentration of 1 mol / l. The detection is carried out by UV spectrometry (254 nm). After fractionation, the hexasaccharide fraction in solution in sodium hydrogencarbonate is neutralized with glacial acetic acid. The solution is then concentrated under reduced pressure so as to obtain a concentration of sodium acetate greater than 30% by weight. The hexasaccharide fraction is precipitated by the addition of 3 to 5 volumes of methanol. The hexasaccharide fraction is recovered by filtration on sintered glass No. 3. The resulting hexasaccharide mixture can be analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) to determine the Allans-Is hexasaccharide content. The hexasaccharide ADa-Isos-Is can be isolated by preparative HPLC chromatography or affinity chromatography on antithrombin column Sepharose according to techniques used by those skilled in the art (Hook M, Bjork I., Hopwood Hop and U. Lindahl, FE BS Letters, Vol 656 (1) (1976)).
De préférence, les mélanges selon l’invention ont un poids moléculaire moyen compris entre 19OOet 2200 Dalton et en particulier de 1950 à 2150 Dalton..Preferably, the mixtures according to the invention have an average molecular weight of between 1900 and 2200 Dalton and in particular from 1950 to 2150 Dalton.
Selon un mode préféré, le mélange d’oligosaccharides selon l’invention est caractérisé en ce qu’il présente une activité anti-Xa comprise entre 190 Ul/mg et 410 Ul/mg et une activité Anti-IIa nulle ou pratiquement nulle. Tout particulièrement l’activité Anti Xa est comprise entre 200 et 300 Ul. L’invention a donc tout particulièrement pour objet les mélanges présentant les caractéristiques suivantes \ - un poids moléculaire moyen compris entre 1950 à 2150 Dalton.. - une activité anti-Xa compris entre 190 Ul/mg et 410 Ul/mg et une activité Anti-IIa nulle ou pratiquement nulle - ils renferment de 30 à 60 % de fraction hexasaccharides, lesquelles contenant de 25 à 55 % de fraction Alla-Üs-Is- L’activité des mélanges d’oligosaccharide selon l’invention est obtenue par le biais d ‘un procédé très particulier qui est exposé ci-dessous. Il est bien connu de l’homme du métier que les caractéristiques physico-chimiques des mélanges de polysaccharides ainsi que l’activité qui en découle sont liées au procédé d’obtention (J. Med Chem 33(6) 1639-2093 (1990)).According to a preferred embodiment, the mixture of oligosaccharides according to the invention is characterized in that it has an anti-Xa activity of between 190 IU / mg and 410 IU / mg and an anti-IIa activity that is zero or virtually zero. In particular, the Anti Xa activity is between 200 and 300 IU. The invention therefore particularly relates to mixtures having the following characteristics: an average molecular weight of between 1950 and 2150 Dalton. An anti-Xa activity between 190 IU / mg and 410 IU / mg and no or virtually no anti-IIa activity - they contain from 30 to 60% of hexasaccharide fraction, which contains from 25 to 55% Alla-Is-Is-L 'fraction. The activity of the oligosaccharide mixtures according to the invention is obtained by means of a very particular process which is set out below. It is well known to those skilled in the art that the physico-chemical characteristics of the polysaccharide mixtures as well as the activity which results therefrom are related to the process of obtaining (J. Med Chem 33 (6) 1639-2093 (1990) ).
Les mélanges d'oligosaccharides selon l'invention sont préparés par dépolymérisation d'un sel d'ammonium quaternaire de l'ester benzylique d’une Héparine de Très Bas Pois Moléculaire (HTBPM) en milieu organique, cette (HTBPM) étant elle-même préparée selon l’enseignement des demandes de brevets WO 02/08295 et W02004/033503. Il s’agit de manière générale de re-dépolymériser une héparine de très bas poids moléculaire qui elle même a été obtenue de manière spécifique par dépolymérisation de l’Héparine estérifiée en présence d’une base forte, de préférence dans le dichlorométhane, et en présence d’un pourcentage d’eau inférieur à 3 %.The oligosaccharide mixtures according to the invention are prepared by depolymerization of a quaternary ammonium salt of the benzyl ester of a Heparin of Very Low Molecular Pea (HTBPM) in an organic medium, this (HTBPM) being itself prepared according to the teaching of patent applications WO 02/08295 and WO2004 / 033503. This is generally to re-depolymerize a heparin of very low molecular weight which itself has been obtained specifically by depolymerization of the esterified heparin in the presence of a strong base, preferably in dichloromethane, and presence of a percentage of water less than 3%.
Les HTPBM utilisées comme matière première dans cette invention ont été préparées en particulier selon les procédés décrits dans les demandes de brevets WO 02/08295 et W02004/033503.The HTPBMs used as raw material in this invention were prepared in particular according to the methods described in patent applications WO 02/08295 and WO2004 / 033503.
Les HTBPM utilisées à titre de produit de départ ont notamment une activité aXa supérieures à 140 UI /mg une activité alla inférieure à 5 Ul/mg et des masses moléculaires moyennes comprises entre 2000 et 3000 Daltons. La mesure des activités aXa est réalisée par rapport à une HTBPM standard d’activité mesurée à 158 Ul/mg. L’activité de l’HTBPM standard est mesurée par rapport à l’étalon international standard d’héparine de bas poids moléculaire.The HTBPM used as a starting product have in particular an aa activity greater than 140 IU / mg, an activity less than 5 IU / mg and average molecular masses of between 2000 and 3000 Daltons. The measurement of aXa activities is carried out with respect to a standard HTBPM of activity measured at 158 IU / mg. The activity of the standard HTBPM is measured against the standard international standard of low molecular weight heparin.
Les HTPBM de départ obtenues selon le procédé tel que décrit plus haut sont re-dépolymerisées au moyen d'une base organique forte de pka de préférence supérieur à 20 (propriétés de préférence apparentées à la famille des phosphazènes définies par exemple par R. Schwesinger et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987) ou R. Schwesinger et al, Angew. Chem. 105, 1420 (1993)). Ensuite on transforme le sel d'ammonium quaternaire de l'ester benzylique de 1ΉΤΒΡΜ dépolymérisée en sel de sodium, saponifie les esters résiduels et éventuellement purifie le produit obtenu. Le schéma réactionnel suivant illustre la présente invention : !The starting HTPBMs obtained according to the process as described above are re-depolymerized using a strong organic base of pka preferably greater than 20 (properties preferably related to the family of phosphazenes defined for example by R. Schwesinger and al, Angew Chem Int.Eng., 26, 1167-1169 (1987) or R. Schwesinger et al, Angew Chem 105, 1420 (1993)). The quaternary ammonium salt of the depolymerized 1-benzyl ester is then converted to the sodium salt, the residual esters are saponified, and the resulting product is optionally purified. The following reaction scheme illustrates the present invention:
L’invention a donc également pour objet un procédé de préparation des mélanges d’oligosaccharides tels que définis plus haut caractérisé en ce qu’une Héparine de Très Bas Poids Moléculaire, ayant une activité aXa supérieure à 140 Ul/mg, une activité alla inférieure à 5 Ul/mg et une masse moléculaire moyenne comprise entre 2000 et 3000 Daltons, subit les réactions chimiques suivantes : a) Transalification par action de chlorure de benzéthonium pour obtenir l’héparinate de benzétonium,The subject of the invention is therefore also a process for the preparation of oligosaccharide mixtures as defined above, characterized in that a very low Molecular Weight Heparin, having an aa activity greater than 140 IU / mg, has a lower activity. at 5 IU / mg and a mean molecular mass of between 2000 and 3000 Daltons, undergoes the following chemical reactions: a) Transalification by the action of benzethonium chloride to obtain benzetonium heparinate,
b) Estérification de l’héparinate de benzéthonium obtenu par action de chlorure de benzyle, et traitement par une solution alcoolique d’acétate de sodium pour obtenir le sel de sodium de l’ester benzylique de l’héparine de très bas poids moléculaire, I c) Transalification de l’ester benzylique obtenu et obtention du sel d'ammonium quaternaire, de préférence en sel de benzéthonium, de cétyl pyrinium ou de cétyltriméthyl ammonium, d) Dépolymérisation au moyen d'une base organique forte de pka de préférence supérieur à 20 afin d’obtenir une Héparine de très bas poids Moléculaire | dépolymérisée, e) Transformation du sel d'ammonium quaternaire de 1' Héparine de très bas poids Moléculaire dépolymérisée en sel de sodium f) Saponification des esters résiduels et éventuellement purification.b) Esterification of the benzethonium heparinate obtained by the action of benzyl chloride, and treatment with an alcoholic solution of sodium acetate to obtain the sodium salt of the benzyl ester of the heparin of very low molecular weight, I c) Transalification of the benzyl ester obtained and obtaining the quaternary ammonium salt, preferably benzethonium salt, cetyl pyrinium or cetyltrimethyl ammonium, d) depolymerization using a strong organic base pka preferably greater than 20 to obtain a very low Molecular Weight Heparin | depolymerized, e) Conversion of the quaternary ammonium salt of the very low molecular weight heparin depolymerized to the sodium salt f) Saponification of the residual esters and optionally purification.
Dans la présente invention, on utilise tout particulièrement la forte sélectivité de la base phosphazène lors l’étape de dépolymérisation (étape d) pour enrichir de façon inattendue le mélange d’oligosaccharides en séquences affines à 1ΆΤΠΙ. De préférence, le rapport en mole base forte/ester est compris entre 0,2 et 5 et, tout particulièrement, entre 0,6 et 2.In the present invention, the high selectivity of the phosphazene base during the depolymerization step (step d) is most particularly used to unexpectedly enrich the oligosaccharide mixture in 1-affine sequences. Preferably, the molar base / ester ratio is between 0.2 and 5, and most preferably between 0.6 and 2.
Pour une sélectivité optimale et une préservation maximale des séquences affines à i 1ΆΤΙΠ, il est préférable de travailler à des teneurs en eau inférieures à 0,3 % lorsque l’on travaille avec 1 équivalent molaire de base phosphazène par rapport à l’ester benzylique de l’HTBTM, sel de benzéthonium.For optimum selectivity and maximum preservation of i 1ΆΤΙΠ-affine sequences, it is preferable to work at water contents of less than 0.3% when working with 1 molar equivalent of phosphazene base relative to the benzyl ester. HTBTM, benzethonium salt.
Les bases de la famille des phosphazènes sont, de préférence, celles de formule :The bases of the family of phosphazenes are preferably those of formula:
dans laquelle les radicaux Rj à R7j identiques ou différents, représentent des radicaux alkyles linéaires, ramifiés ou cycliques contenant de 1 à 6 atomes de carbone R3 et R4 pouvant le cas échéant former avec le groupement -N-P-N- qui les porte un hétérocycle à 6 chaînons. En particulier l’invention a pour objet le procédé tel que défini plus haut caractérisé en ce que la base utilisée lors de l’étape d) de dépolymérisation est le 2-tert-butylimino-2-diethylamino-l,3-diméthylperhydro-1,3,2-diaza-phosphorine (nomenclature officielle : l,3,2-diazaphosphorin-2-amine, 2-[( 1, l-dimethylethyl)imino] -N ,N-diéthyl-1,2,2,2,3,5,6-octahydro-l ,3-diméthyl).in which the radicals Rj to R7j, which are identical or different, represent linear, branched or cyclic alkyl radicals containing from 1 to 6 carbon atoms R3 and R4 which may optionally form with the group -NPN- which carries them a 6-membered heterocycle . In particular, the subject of the invention is the process as defined above, characterized in that the base used during the depolymerization step d) is 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1 , 3,2-diaza-phosphorine (official nomenclature: 1,1,2-diazaphosphorin-2-amine, 2 - [(1,1-dimethylethyl) imino] -N, N-1,2,2,2-diethyl 3,5,6-octahydro-1,3-dimethyl).
La réaction de l'étape de transalification a) est réalisée de préférence par action du chlorure de benzéthonium en excès, sur 1ΉΤΒΡΜ sodique, à une température voisine de 15 à 25°C. De manière avantageuse, le rapport molaire sel/héparine sodique est compris entre 2,5 et 3,5. L'estérification de l'étape b) s'effectue de préférence au sein d'un solvant organique chloré (tel que le chloroforme ou le dichlorométhane), à une température comprise entre 25 et 45°C et, de préférence entre 30 et 40°C. L’ester sous forme de sel de sodium est ensuite récupéré par précipitation au moyen d'acétate de sodium à 10 % en poids dans un alcool tel que le méthanol. On emploie généralement 1 à 1,2 volume d'alcool par volume de milieu réactionnel. La quantité de chlorure de benzyle et le temps de réaction sont adaptés pour obtenir un taux d'estérification compris entre 40 et 100 % et, de préférence, entre 70 et 90 %. De façon préférentielle, on utilise 0,5 à 1,5 parties en poids du chlorure de benzyle pour 1 partie en poids du sel de benzéthonium de l'héparine. De même, de façon préférentielle, le temps de réaction sera compris entre 10 et 35 h.The reaction of the transalification step a) is preferably carried out by the action of excess benzethonium chloride on sodium at a temperature in the region of 15 to 25.degree. Advantageously, the salt / heparin sodium molar ratio is between 2.5 and 3.5. The esterification of step b) is preferably carried out in a chlorinated organic solvent (such as chloroform or dichloromethane) at a temperature of between 25 and 45 ° C. and preferably between 30 and 40 ° C. ° C. The ester in the form of sodium salt is then recovered by precipitation with 10% by weight sodium acetate in an alcohol such as methanol. Generally 1 to 1.2 volumes of alcohol per volume of reaction medium are employed. The amount of benzyl chloride and the reaction time are adapted to obtain an esterification rate of between 40 and 100% and preferably between 70 and 90%. Preferably, 0.5 to 1.5 parts by weight of benzyl chloride are used per 1 part by weight of the benzethonium salt of heparin. Likewise, preferably, the reaction time will be between 10 and 35 h.
Par conséquent, le procédé selon l’invention met en œuvre un taux d'estérification du sel d'ammonium quaternaire de l'ester benzylique de l'héparine compris entre 40 et 100 % et, de préférence, entre 70 et 90 %.Consequently, the process according to the invention implements a degree of esterification of the quaternary ammonium salt of the benzyl ester of heparin of between 40 and 100% and, preferably, between 70 and 90%.
La transformation du sel d'ammonium quaternaire de l'ester benzylique de l'héparine dépolymérisée en sel de sodium est effectuée, généralement, par traitement du milieu réactionnel avec une solution alcoolique d'acétate de sodium et, de préférence avec une solution à 10 % d'acétate de sodium dans le méthanol (poids/volume), à une température comprise entre 15 et 25°C. L’équivalent en poids d’acétate ajoutée est préférentiellement 3 fois supérieur à la masse de sel d'ammonium quaternaire de l’ester benzylique de l’héparine engagé par la suite dans la réaction de dépolymérisation. Le sel d'ammonium quaternaire de l'ester benzylique de l’HTBPM obtenue est de préférence le sel de benzéthonium, de cétylpyridinium ou de cétyltriméthyl ammonium.The conversion of the quaternary ammonium salt of the benzyl ester of the depolymerized heparin to the sodium salt is carried out, generally, by treatment of the reaction medium with an alcoholic solution of sodium acetate and, preferably, with a 10% solution. % sodium acetate in methanol (w / v), at a temperature of between 15 and 25 ° C. The weight equivalent of added acetate is preferably 3 times greater than the mass of quaternary ammonium salt of the benzyl ester of heparin subsequently engaged in the depolymerization reaction. The quaternary ammonium salt of the benzyl ester of the HTBPM obtained is preferably the benzethonium, cetylpyridinium or cetyltrimethylammonium salt.
La transalification de l'étape c) s'effectue au moyen d'un chlorure d'ammonium quaternaire et, de préférence, au moyen de chlorure de benzéthonium, de chlorure de cétylpyridinium ou de chlorure de cétyltriméthyl ammonium, en milieu aqueux, à une température comprise entre 10 et 25°C. De manière avantageuse, le rapport en mole chlorure d'ammonium quatemaire/sel de sodium de l'ester benzylique de l'héparine est compris entre 2,5 et 3,5.The transalification of step c) is carried out by means of a quaternary ammonium chloride and, preferably, by means of benzethonium chloride, cetylpyridinium chloride or cetyltrimethylammonium chloride, in an aqueous medium, at a temperature of temperature between 10 and 25 ° C. Advantageously, the ratio by mole of quaternary ammonium chloride / sodium salt of the benzyl ester of heparin is between 2.5 and 3.5.
La saponification s'effectue généralement au moyen d'un hydroxyde de métal alcalin tel que la soude, la potasse, l'hydroxyde de lithium, en milieu aqueux, à une température comprise entre 0 et 20°C et de préférence 0 et 10°C. On utilisera de façon générale de 1 à 5 équivalents molaires d’hydroxyde de métal alcalin. De préférence, la saponification sera réalisée en présence de 1 à 2 équivalents molaires d’hydroxyde de métal alcalin.The saponification is generally carried out using an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or lithium hydroxide, in an aqueous medium, at a temperature of between 0 and 20 ° C. and preferably 0 and 10 ° C. C. Generally, 1 to 5 molar equivalents of alkali metal hydroxide will be used. Preferably, the saponification will be carried out in the presence of 1 to 2 molar equivalents of alkali metal hydroxide.
Le produit final peut éventuellement être purifié par toute méthode connue de purification des héparines dépolymérisées (par exemple EP 0037319B1). De préférence, on purifie au moyen de peroxyde d'hydrogène, en milieu aqueux, à une température de 10 à 50°C. De préférence, cette opération sera réalisée entre 20 et 40°C.The final product may optionally be purified by any known method for purifying the depolymerized heparins (for example EP 0037319B1). Preferably, it is purified by means of hydrogen peroxide in an aqueous medium at a temperature of 10 to 50 ° C. Preferably, this operation will be performed between 20 and 40 ° C.
Les mélanges selon l'invention sous forme de sel de sodium, peuvent être transformés en un autre sel d'un métal alcalin ou alcalinoterreux. On passe éventuellement d’un sel à l’autre en utilisant la méthode décrite dans le brevet FR 73 13 580.The mixtures according to the invention in the form of sodium salt can be converted into another salt of an alkali metal or alkaline earth metal. It is possible to pass from one salt to another using the method described in patent FR 73 13 580.
La présente invention permet notamment un fort enrichissement en hexasaccharide AITa-IIs-Is. Lorsque l’on re-dépolymérise une héparine de bas poids moléculaire par le procédé qui l’a généré, il est bien connu de l’homme du métier que l’activité anti-Xa du produit obtenu décroît fortement jusqu’à être nulle. Dans le cas où l’on utilise les procédés permettant l’obtention de l’Enoxaparine, la Fraxiparine, la Fragmine, î’Innohep (ou Logiparin), le Normiflo, l’Embollex (ou Sandoparin), le Fluxum (ou Minidalton), la Clivarine et l’Hibor, on peut observer ce phénomène si on re-dépolymérise ces HBPM avec leur procédé d’origine. Ceci est la conséquence de la faible sélectivité de ces procédés à vis de la préservation des sites ΑΤΠΙ.The present invention notably allows a high enrichment in hexasaccharide AITa-IIs-Is. When re-depolymerizing a low molecular weight heparin by the method that generated it, it is well known to those skilled in the art that the anti-Xa activity of the product obtained decreases sharply to zero. In the case where the processes making it possible to obtain Enoxaparin, Fraxiparin, Fragmin, Innohep (or Logiparin), Normiflo, Embollex (or Sandoparin), Fluxum (or Minidalton) are used. , Clivarin and Hibor, we can observe this phenomenon if we re-depolymerize these LMWH with their original process. This is the consequence of the low selectivity of these processes for the preservation of sites sites.
Dans la présente invention, si l’on utilise comme matière première, une HTBPM issue du procédé de dépolymérisation phosphazène, c’est exactement le phénomène inverse qui se produit. L’activité aXa du mélange d’oligosaccharide augmente et dépasse même celle de l’héparine qui à send à préparer l’HTBPM. Ceci est la conséquence probable de la sélectivité remarquable des bases phosphazènes sur la préservation des séquences affines à ΓΑΤΙΙΙ.In the present invention, if a HTBPM resulting from the phosphazene depolymerization process is used as a raw material, it is exactly the opposite phenomenon that occurs. The aXa activity of the oligosaccharide mixture increases and even surpasses that of heparin that is required to prepare HTBPM. This is the probable consequence of the remarkable selectivity of the phosphazene bases on the preservation of aff-affine sequences.
Cette caractéristique du procédé s’observe aussi au travers des masses moléculaires moyennes du mélange d’oligosaccharides obtenus. A titre d’exemple, lorsque l’on depolymerise une HTBPM de masse moléculaire moyenne de 2400 Daltons, on obtient un mélange d’oligosaccharides de masse moléculaire moyenne de 2000 Da. On constate que les séquences affines à ΓΑΤΙΑ (hexasaccharides et octasaecharides) sont préservées de l’action de la base phosphazène, ce qui entraîne la destruction et l’élimination des autres séquences, et par voie de conséquence, une masse moléculaire moyenne qui va tendre vers la masse moléculaire moyenne de l’entité non dépolymerisable ; c’est à dire l’hexasaccharide Aüa-IIs-Is (1834 g/mol). Π est à souligner que dans l’étape de dépolymerisation de l’héparine avec une base phosphazène, on passe d’une masse moléculaire moyenne d’environ 15000 Da à environ 2400 Da. A titre de méthode alternative, le procédé .selon l’invention permettant d’augmenter l’activité et la sélectivité envers le facteur Xa est également applicable aux heparines de bas poids moléculaire en général. A titre d’exemple, on citera par exemple l’Enoxaparine, la Fraxiparine, la Fragmine, l’Innohep (ou Logiparin), le Normiflo, l’Embollex (ou Sandoparin), le Fluxum (ou Minidalton), la Clivarine et l’Hibor. Il peut également s’agir de certaines héparines de très bas poids moléculaire telles que décrites dans US 6,384,021 (2000 - 4000 Da) ou WO 02/08295 (1500 à 3000 Da) ayant une activité Anti-Xa présentant une activité anti-Xa inférieure à 140 Ul/mg. (notamment comprise entre 100 et 140 Ul/mg)This characteristic of the process is also observed through the average molecular weights of the mixture of oligosaccharides obtained. By way of example, when depolymerizing an average molecular weight HTBPM of 2400 Daltons, a mixture of oligosaccharides with an average molecular weight of 2000 Da is obtained. It is found that the β-affinity sequences (hexasaccharides and octasaecharides) are preserved from the action of the phosphazene base, which leads to the destruction and elimination of the other sequences, and consequently, an average molecular mass which will tend to to the average molecular weight of the non-depolymerizable entity; that is, hexasaccharide Aαa-IIs-Is (1834 g / mol). It should be emphasized that in the depolymerization step of heparin with a phosphazene base, an average molecular weight of about 15000 Da is passed to about 2400 Da. As an alternative method, the method according to the invention for increasing activity and selectivity for factor Xa is also applicable to low molecular weight heparins in general. By way of example, mention may be made, for example, of Enoxaparin, Fraxiparin, Fragmin, Innohep (or Logiparin), Normiflo, Embollex (or Sandoparin), Fluxum (or Minidalton), Clivarin, and 'HIBOR. It may also be some heparins of very low molecular weight as described in US 6,384,021 (2000-4000 Da) or WO 02/08295 (1500-3000 Da) having Anti-Xa activity with lower anti-Xa activity. at 140 IU / mg. (in particular between 100 and 140 IU / mg)
Cette caractéristique du procédé se traduif par l’obtention d’activités anti-Xa inattendues au regard du poids moléculaire moyen des mélanges d’oligosaccharides (190 Ul/mg < aXa < 450 Ul/mg ; 1800 Da < PM < 2400Da).This characteristic of the process results in the obtaining of unexpected anti-Xa activities with respect to the average molecular weight of the oligosaccharide mixtures (190 IU / mg <aXa <450 IU / mg, 1800 Da <PM <2400Da).
Selon un mode particulier de l’invention, la sélectivité vis à vis du facteur Xa du mélanges d’oligosaccharides peut être encore augmentée en éliminant les fractions disaccharides et tétrasaccharides (fractions ne liant pas spécifiquement à ΓΑΤΙΠ). Le mélange est dans ce cas chromatographié sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose ou un gel de polyacrylamide. Le mélange est élué par une solution d’hydrogénocarbonate de sodium. De préférence, la solution d’hydrogénocarbonate de sodium est une solution de 0.1 mol/1 à 1 mol/1. Encore plus préférentiellement, la séparation est réalisée a une concentration de 1 mole/1. La détection est réalisée par spectrométrie UV (254nm). Après élimination des fractions disaccharides et tetrasaccharides, le mélange d’oligosaccharides en solution dans l’hydrogénocarbonate de sodium est neutralisée par de l’acide acétique glacial. La solution est ensuite concentrée sous pression réduite de façon à obtenir une concentration en acétate de sodium supérieure à 20 % en poids. Le mélange d’oligosaccharides est précipitée par addition de 3 à 5 volumes de méthanol. Le mélange d’oligosaccharide hautement affin est récupéré par filtration. Si cela s’avère nécessaire, il peut être purifié par désalage sur une colonne appropriée. L’exemple 6 illustre cette méthode alternative et permet d’obtenir des héparines de très bas poids moléculaire dont l’activité Anti Xa est supérieure à 400 Ul/mg. L’invention a donc également pour objet un procédé tel que définit plus haut de préparation de mélanges d’oligosaccharides'possédant une sélectivité vis à vis du facteur Xa du mélanges d’oligosaccharides augmentée caractérisé en ce qu’en outre on élimine les fractions disaccharides et tétrasaccharides par chromatographie notamment sur des colonnes remplies de gel de type polyacrylamide agarose.According to a particular embodiment of the invention, the selectivity with respect to the factor Xa of the oligosaccharide mixture can be further increased by eliminating the disaccharide and tetrasaccharide fractions (fractions not binding specifically to ΓΑΤΙΠ). In this case, the mixture is chromatographed on columns filled with agarose polyacrylamide gel or a polyacrylamide gel. The mixture is eluted with sodium hydrogencarbonate solution. Preferably, the sodium hydrogen carbonate solution is a solution of 0.1 mol / l to 1 mol / l. Even more preferentially, the separation is carried out at a concentration of 1 mol / l. The detection is carried out by UV spectrometry (254 nm). After removal of the disaccharide and tetrasaccharide fractions, the mixture of oligosaccharides in solution in sodium hydrogencarbonate is neutralized with glacial acetic acid. The solution is then concentrated under reduced pressure so as to obtain a concentration of sodium acetate greater than 20% by weight. The oligosaccharide mixture is precipitated by the addition of 3 to 5 volumes of methanol. The highly affinity oligosaccharide mixture is recovered by filtration. If necessary, it can be purified by desalting on a suitable column. Example 6 illustrates this alternative method and makes it possible to obtain very low molecular weight heparins whose Anti Xa activity is greater than 400 IU / mg. The invention therefore also relates to a process as defined above for the preparation of oligosaccharide mixtures having a selectivity with respect to the factor Xa of the increased oligosaccharide mixture, characterized in that in addition the disaccharide fractions are eliminated. and tetrasaccharides by chromatography, in particular on columns filled with polyacrylamide agarose type gel.
Les mélanges selon l’invention peuvent être utilisés à titre de médicaments.The mixtures according to the invention can be used as medicaments.
Les mélanges d'oligosaccharides de la présente invention peuvent être utilisés 5 comme agents antithrombotiqués. En particulier, ils sont utiles pour le traitement ou la prévention des thromboses veineuses et artérielles, la thrombose veineuse profonde, l’embolie pulmonaire, l’angor instable, l’infarctus du myocarde, Γ ischémie cardiaque, lès maladies occlusives des artères périphériques et la fibrillation auriculaire. Ils sont également utiles dans la prévention et le traitement 0 de la prolifération des cellules musculaires lisses l’athérosclérose et l’artériosclérose, pour le traitement et la prévention du cancer par la modulation de l’angiogénèse et des facteurs de croissance, et pour le traitement et la prévention des désordres diabétiques tel que les rétinopathies et néphropathies diabétiques.The oligosaccharide mixtures of the present invention can be used as antithrombotickers. In particular, they are useful for the treatment or prevention of venous and arterial thromboses, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, unstable angina, myocardial infarction, cardiac ischemia, occlusive diseases of the peripheral arteries and atrial fibrillation. They are also useful in the prevention and treatment 0 of smooth muscle cell proliferation atherosclerosis and arteriosclerosis, for the treatment and prevention of cancer by modulation of angiogenesis and growth factors, and for the treatment and prevention of diabetic disorders such as diabetic retinopathies and nephropathies.
La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques 5 contenant comme principe actif un mélange de formule (I) éventuellement en association avec un ou plusieurs excipients inertes.The present invention also relates to pharmaceutical compositions containing as active ingredient a mixture of formula (I) optionally in combination with one or more inert excipients.
Les compositions pharmaceutiques sont par exemple des solutions injectables par voie sous-cutanée ou intraveineuse. D’autres compositions pharmaceutiques selon l’invention sont également mises en oeuvre pour une administration par voie 3 pulmonaire (inhalation) ou par voie orale.The pharmaceutical compositions are, for example, solutions that can be injected subcutaneously or intravenously. Other pharmaceutical compositions according to the invention are also used for pulmonary (inhalation) or oral administration.
La posologie peut varier en fonction de l'âge, du poids et de l'état de santé du patient. Pour un adulte, elle est en général comprise entre 20 et 100 mg par jour par voie intramusculaire ou sous-cutanée.The dosage may vary depending on the age, weight and health status of the patient. For an adult, it is usually between 20 and 100 mg per day intramuscularly or subcutaneously.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.The following examples illustrate the invention without limiting it.
Préparation 1 : Obtention d’une héparine de très bas poids moléculaire de départ présentant une activité aXa égale à 158,8 IU/mg L’héparine de très bas poids moléculaire (HTBPM) utilisée à titre de produit de départ pour l’exemple 1 est préparée selon la demande de brevet W02004/033503 à partir d’héparine de sodium en mettant en œuvre les étapes a à f telles que définies plus haut, l’étape de dépolymérisation étant effectuée en présence de 2-tert-butylimino-2-diethylamino-l,3-diméthylperhydro-l,3,2-diaza-phosphorine en présence d’un pourcentage d’eau inférieur à 0,6 %.Preparation 1: Obtaining a starting low molecular weight heparin having aXa activity equal to 158.8 IU / mg The very low molecular weight heparin (HTBPM) used as starting material for Example 1 is prepared according to the patent application WO2004 / 033503 from sodium heparin by implementing steps a to f as defined above, the depolymerization step being carried out in the presence of 2-tert-butylimino-2- diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diaza phosphorine in the presence of a percentage of water less than 0.6%.
Caractéristiques de l’héparine de très bas poids moléculaire obtenueCharacteristics of the very low molecular weight heparin obtained
Les caractéristiques de l'héparine dépolymérisée ainsi obtenue sont les suivantes :The characteristics of the depolymerized heparin thus obtained are as follows:
Poids moléculaire moyen : 2400 DaltonsAverage molecular weight: 2400 Daltons
Activité anti-Xa : 158,8 Ul/mgAnti-Xa activity: 158.8 IU / mg
Activité anti-IIa : 3,1 Ul/mgAnti-IIa activity: 3.1 IU / mg
Rapport activité anti-Xa/activiîé anti-Ha :51Anti-Xa activity report / anti-Ha activity: 51
Préparation 2 : Obtention d’une héparine de très bas poids moléculaire de départ présentant une activité aXa égale à 158 IU/mg L’héparine de très bas poids moléculaire (HTBPM) utilisée à titre de produit de départ pour les exemples 2, 3, 4, 5 est préparée selon la demande de brevet W02004/033503 à partir d’héparine de sodium en mettant en œuvre les étapes a à f telles que définies plus haut, l’étape de dépolymérisation étant effectuée en présence de 2-tert-butylimino-2-diethylamino-l,3-diméthylperhydro-l ,3,2-diaza-phosphorine en présence d’un pourcentage d’eau inférieur à 0,6 %.Preparation 2: Obtaining a starting low-molecular-weight heparin having an aa activity equal to 158 IU / mg The very low molecular weight heparin (HTBPM) used as starting material for Examples 2, 3, 4, 5 is prepared according to the patent application WO2004 / 033503 from sodium heparin by implementing steps a to f as defined above, the depolymerization step being carried out in the presence of 2-tert-butylimino -2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diaza phosphorine in the presence of a percentage of water less than 0.6%.
Caractéristiques de l’héparine de très bas poids moléculaire obtenueCharacteristics of the very low molecular weight heparin obtained
Les caractéristiques de l'héparine dépolymérisée ainsi obtenue sont les suivantes :The characteristics of the depolymerized heparin thus obtained are as follows:
Poids moléculaire moyen : 2450 DaltonsAverage molecular weight: 2450 Daltons
Activité anti-Xa : 158 Ul/mgAnti-Xa activity: 158 IU / mg
Activité anti-Ha : 2,1 Ul/mgAnti-Ha activity: 2.1 IU / mg
Rapport activité anti-Xa/activité anti-IIa :75Anti-Xa activity / anti-IIa activity ratio: 75
Préparation 3 : HTBPM, sel de benzéthoniumPreparation 3: HTBPM, benzethonium salt
Trans-salification de l’HTBPM en sel de benzéthonium (correspondant à l’étape a) du procédé) : 12,53 g (20,7 mmoles) d’HTBPM sel de sodium obtenu selon la préparation 1 sont chargés dans un erlenmeyér A de 500 ml et solubilisés dans 85 ml d’eau (solution jaune). 31,62 g (70,5 mmoles) de chlorure de benzéthonium sont chargés dans un erlenmeyer B de 100 ml avec 250 ml d’eau (solution incolore).Trans-salification of the HTBPM to the benzethonium salt (corresponding to step a) of the process): 12.53 g (20.7 mmol) of HTBPM sodium salt obtained according to Preparation 1 are loaded into an Erlenmeyer flask. 500 ml and solubilized in 85 ml of water (yellow solution). 31.62 g (70.5 mmol) of benzethonium chloride are charged into a 100 ml Erlenmeyer flask B with 250 ml of water (colorless solution).
Le contenu de B est coulé dans A et le mélange est agité environ 1 h à température ambiante. On laisse sédimenter pendant environ 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de d’eau (250 ml). On agite pendant environ 15 minutes et laisse sédimenter approximativement 30 minutes. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume d’eau (250 ml). Le mélange est agité environ 15 minutes puis filtré. Le gâteau est lavé par 3 fois 200 ml d’eau. Le solide beige humide est essoré puis séché à 80 °C pendant environ 18 h en étuve sous pression réduite (6 kPa). On obtient 35,56 g d’HTBPM sel de benzéthonium.The contents of B are poured into A and the mixture is stirred for about 1 hour at room temperature. It is allowed to settle for about 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (250 ml). Stir for about 15 minutes and allow to sediment approximately 30 minutes. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (250 ml). The mixture is stirred for about 15 minutes and then filtered. The cake is washed with 3 times 200 ml of water. The moist beige solid is drained and then dried at 80 ° C. for approximately 18 h in an oven under reduced pressure (6 kPa). 35.56 g of benzethonium salt HTBPM are obtained.
Le rendement obtenu est de 89 %.The yield obtained is 89%.
Préparation 4Preparation 4
Trans-salification de l’HTBPM en sel de benzéthonium ( correspondant à l’étape a) du procédé) : 17.93 g (30,2mmoles) d’HTBPM sel de sodium obtenu selon la préparation 2 sont chargés dans un erlenmeyer A de 1 1 et solubilisés dans 120 ml d’eau (solution jaune). 45 g (0,1 moles) de chlorure de benzéthonium sont chargés dans un erlenmeyer B de 500 ml avec 360 ml d’eau (solution incolore).Trans-salification of the HTBPM to the benzethonium salt (corresponding to step a) of the process): 17.93 g (30.2 mmol) of HTBPM sodium salt obtained according to Preparation 2 are loaded into an Erlenmeyer A of 1 and solubilized in 120 ml of water (yellow solution). 45 g (0.1 mol) of benzethonium chloride are charged into a 500 ml Erlenmeyer flask with 360 ml of water (colorless solution).
Le contenu de B est coulé dans A et le mélange est agité environ 1 h à température ambiante. On laisse sédimenter pendant environ 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de d’eau (500 ml). On agite pendant environ 15 minutes et laisse sédimenter approximativement 30 minutes. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume d’eau (500 ml). Le mélange est agité environ 15 minutes puis filtré. Le gâteau est lavé par 3 fois 200 ml d’eau. Le solide beige humide est essoré puis séché à 80 °C pendant environ 48 h en étuve sous pression réduite (6 kPa). On obtient 49,5g d'HTBPM sel de benzéthonium.The contents of B are poured into A and the mixture is stirred for about 1 hour at room temperature. It is allowed to settle for about 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (500 ml). Stir for about 15 minutes and allow to sediment approximately 30 minutes. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (500 ml). The mixture is stirred for about 15 minutes and then filtered. The cake is washed with 3 times 200 ml of water. The moist beige solid is drained and then dried at 80 ° C. for approximately 48 hours in an oven under reduced pressure (6 kPa). 49.5 g of benzethonium salt are obtained.
Le rendement obtenu est de 87 %.The yield obtained is 87%.
Exemple 1 : Héparine de très bas poids moléculaire (HTBPM) obtenue par le procédé selon l’invention comprenant une étape d’estérification à 77 % et une étape de dépolymerization avec une base dérivé de phosphazene en milieu anhydre . Estérification de l’HTBPM (étape b du procédé) : 35,39 g (18,3 mmoles) d’HTBPM sel de benzéthonium obtenue selon la préparation 3 (avec une teneur en eau de 0.20 %) sont solubilisés dans 183,3 g de dichlorométhane sec et chargés dans un tricol de 500 ml. 29,5 ml (25,7 mmoles) de chlorure de benzyle sont ajoutés à la température de 30°C. Le taux d’estérification est de 77 % après environ 23 h de réaction à 30°C. Après refroidissement à température ambiante (22±3°C), le mélange réactionnel est versé sur 490 ml d’une solution d’acétate de sodium à 10 % dans le méthanol. Le mélange est agité pendant environ 1 h puis on laisse sédimenter approximativement 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (250 ml). On agite approximativement 30 minutes puis on laisse sédimenter environ 45 minutes. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (250 ml). On laisse sédimenter environ 16 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (350 ml). On agite pendant environ 5 minutes et la suspension est filtrée. Le gâteau est lavé par 2 fois 50 ml de méthanol, essoré puis séché à 40°C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 18 h. On obtient 34,48 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium brut avec un taux d’estérification de 77 % . i . Purification de l’HTBPM ester de benzyle sel de sodium (étape b) du procédé).Example 1: Heparin of very low molecular weight (HTBPM) obtained by the process according to the invention comprising a 77% esterification step and a depolymerization step with a base derived from phosphazene in an anhydrous medium. Esterification of the HTBPM (step b of the process): 35.39 g (18.3 mmol) of benzethonium salt HTBPM obtained according to Preparation 3 (with a water content of 0.20%) are solubilized in 183.3 g of dry dichloromethane and charged in a three-necked 500 ml. 29.5 ml (25.7 mmol) of benzyl chloride are added at the temperature of 30 ° C. The degree of esterification is 77% after about 23 hours of reaction at 30 ° C. After cooling to room temperature (22 ± 3 ° C.), the reaction mixture is poured into 490 ml of a 10% sodium acetate solution in methanol. The mixture is stirred for about 1 hour and then allowed to settle for approximately 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (250 ml). Stir approximately 30 minutes and allow to settle for about 45 minutes. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (250 ml). Let settle for about 16 hours. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (350 ml). Stir for about 5 minutes and the suspension is filtered. The cake is washed with twice 50 ml of methanol, drained and then dried at 40 ° C under reduced pressure (6 kPa) for about 18 h. There is obtained 34.48 g of benzyl ester HTBPM crude sodium salt with an esterification rate of 77%. i. Purification of the HTBPM benzyl ester sodium salt (step b) process).
Les 34,48 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium brut sont solubilisés dans 350 ml d’une solution aqueuse de NaCl à 10 %. La solution est coulée sur 1,57 1 de méthanol. La suspensiori est agitée pendant environ 40 minutes puis on laisse i sédimenter pendant environ 16 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume de méthanol (1,5 1). On agite environ 1 h et on laisse sédimenter pendant environ 1,5 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume de méthanol (1,2 1). On agite approximativement 15 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 3 fois 50 ml de méthanol. Le solide humide blanc est essoré puis séché à 40°C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 18 h. On obtient 6,07 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium.The 34.48 g of benzyl ester HTBPM crude sodium salt are solubilized in 350 ml of a 10% aqueous NaCl solution. The solution is cast on 1.57 l of methanol. The suspension is stirred for about 40 minutes and allowed to settle for about 16 hours. The supernatant is discarded and replaced by the same volume of methanol (1.5 l). Stir about 1 hour and allow to settle for about 1.5 hours. The supernatant is discarded and replaced by the same volume of methanol (1.2 l). Stir approximately 15 minutes and filter. The cake is washed with 3 times 50 ml of methanol. The white wet solid is drained and then dried at 40 ° C under reduced pressure (6 kPa) for about 18 h. 6.07 g of HTBPM sodium benzyl ester are obtained.
Le rendement de l’estérification est de 50 %. . Trans-salification de l’HTBPM ester de benzyle, sel de sodium en sel de benzéthonium (étape c) du procédé): 6 g (9,14 mmole) d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium sont solubilisés avec 40 ml d’eau dans un erlenmeyer A de 250 ml.The yield of the esterification is 50%. . Trans-salification of the benzyl ester HTBPM, sodium salt to the benzethonium salt (step c) of the process): 6 g (9.14 mmol) of HTBPM sodium benzyl ester are solubilized with 40 ml of water in a 250 ml Erlenmeyer flask.
Pendant ce temps, 13,93 g (31 mmoles) de chlorure de benzéthonium sont chargés avec 110 ml d’eau dans un erlenmeyer B de 250 ml.During this time, 13.93 g (31 mmol) of benzethonium chloride are charged with 110 ml of water into a 250 ml Erlenmeyer flask B.
Le contenu de B est coulé dans A. La suspension est agitée environ 1 h à température ambiante (22±3°C) puis laissée sédimenter 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (140 ml). On agite pendant environ 15 minutes et on laisse sédimenter 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (140 ml). On agite approximativement 15 minutes et laisse sédimenter de l’ordre de 30 minutes. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (140 ml). On agite environ 5 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 3 fois 50 ml d’eau, essoré puis séché à 80°C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 18 h. On obtient 17,43 g d’HTBPM ester de benzyle, sel de benzéthonium.The contents of B are poured into A. The suspension is stirred for about 1 h at room temperature (22 ± 3 ° C.) and then allowed to settle for 1 h. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (140 ml). Stirred for about 15 minutes and allowed to settle for 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (140 ml). Stir approximately 15 minutes and let settle on the order of 30 minutes. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (140 ml). Stir about 5 minutes and filter. The cake is washed with 3 times 50 ml of water, drained and then dried at 80 ° C under reduced pressure (6 kPa) for about 18 hours. 17.43 g of benzyl benzyl ester, benzethonium salt, are obtained.
Le rendement est de 100 %. . Dépolymérisation de l’HTBPM ester de benzyle, sel de benzéthonium en milieu anhydre : Teneur en eau non détectable < 0.01% (étape d) du procédé) 17,43 g (9,14 mmole) d’HTBPM selon la préparation 2 sont chargés dans un tricol de 250 ml avec 122 ml de dichlorométhane sec. 17,4 g de tamis moléculaire 4 À sont additionnés. L’ensemble est agité pendant environ 18h à température ambiante (22±3°C) sous atmosphère d’argon.The yield is 100%. . Depolymerization of the benzyl ester HTBPM, benzethonium salt in an anhydrous medium: Non-detectable water content <0.01% (step d) of the process) 17.43 g (9.14 mmol) of HTBPM according to the preparation 2 are charged in a tricolor of 250 ml with 122 ml of dry dichloromethane. 17.4 g of 4 A molecular sieve are added. The mixture is stirred for approximately 18 hours at room temperature (22 ± 3 ° C.) under an argon atmosphere.
Le tamis est séparé du mélange par transfert de la solution dans un tricol de 250 ml. On ajoute 2,64 ml (9,14 mmole) de 2-tert-butylimino-2-diethylamino-l ,3-diméthylperhydro-l,3,2-diaza-phosphorine et on agite pendant 24 h à 22±3°C sous atmosphère d’argon. . Transformation du sel d’ammonium quaternaire en sel de sodium (étape e) du procédé)The sieve is separated from the mixture by transfer of the solution in a 250 ml tricolor. 2.64 ml (9.14 mmol) of 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diaza phosphorin are added and the mixture is stirred for 24 hours at 22 ± 3 ° C. under argon atmosphere. . Transformation of quaternary ammonium salt into sodium salt (step e) of the process)
Pendant ce temps, 730 ml d’une solution méthanolique d’acétate de sodium à 10 % est préparée dans un erlenmeyer de 21. 8,71 g de célite Hyflo superçel sont ajoutés à la solution. Le mélange réactionnel est coulé dans la solution méthanolique en maintenant la température à environ 4°C. La suspension est agitée pendant environ 15 minutes à cette température. On laisse sédimenter approximativement 45 minutes à température ambiante puis le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (450 ml). On agite 15 minutes et on laisse sédimenter approximativement 45 minutes. Le surnageant est à nouveau écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (420 ml). On agite pendant environ 15 minutes puis on filtre sur verre fritté n° 3. Le gâteau est lavé par 2 fois 70 ml de méthanol, essoré puis séché pendant environ 18 h à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 4,35 g d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium) dans la célite (8,71g).During this time, 730 ml of a 10% sodium acetate methanol solution is prepared in an Erlenmeyer flask 21. 8.71 g of superficial Hyflo Celite is added to the solution. The reaction mixture is poured into the methanolic solution while maintaining the temperature at about 4 ° C. The suspension is stirred for about 15 minutes at this temperature. The mixture is left to sediment for approximately 45 minutes at room temperature and then the supernatant is removed and replaced by the same quantity of methanol (450 ml). Stir 15 minutes and allow to sediment approximately 45 minutes. The supernatant is again discarded and replaced by the same amount of methanol (420 ml). The mixture is stirred for approximately 15 minutes and then filtered on sintered glass n ° 3. The cake is washed with twice 70 ml of methanol, drained and then dried for approximately 18 h at 50 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 4.35 g of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained in celite (8.71 g).
Le rendement est de 72,5 %. . Saponification de l’HTBPM dépolymerisée brute, sel de sodium (étape Π) du procédé) : 4,35 g (6,63 mmole) d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium) dans la célite est solubilisée dans 46 ml d’eau puis filtrée sur verre fritté n° 3. La célite est rinçée par 2 portions de 30 ml d’eau. Le filtrat est chargé dans un erlenmmeyer de 500 ml. On introduit 823 μΐ (9,94 mmole) de lessive de soude à 35 % à une température voisine de 4 °C. On agite pendant environ 3 h à cette température. Le milieu est neutralisé par addition d’une solution d’HCl IN puis on ajoute 11,5 g de NaCl et 80 ml de méthanol. Après approximativement 15 minutes d’agitation, 210 ml de méthanol sont ajoutés. La suspension est agitée pendant environ 1 h puis laissée sédimenter 30 minutes. Le surnageant est écarté, remplacé par la même quantité de méthanol (230 ml). On agite pendant environ 15 minutes et on laisse sédimenter 30 minutes. Le surnageant est écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (210 ml). On agite approximativement 15 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 2 fois 9 ml de méthanol, essoré puis séché pendant environ 18 h à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 2,95 g d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium).The yield is 72.5%. . Saponification of crude depolymerized HTBPM, sodium salt (step Π) of the process): 4.35 g (6.63 mmol) of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) in celite is solubilized in 46 ml of water then filtered on sintered glass No. 3. The celite is rinsed with 2 portions of 30 ml of water. The filtrate is loaded into a 500 ml Erlenmeyer flask. 823 μΐ (9.94 mmol) of 35% sodium hydroxide solution are introduced at a temperature in the region of 4 ° C. It is stirred for about 3 hours at this temperature. The medium is neutralized by addition of 1N HCl solution and then 11.5 g of NaCl and 80 ml of methanol are added. After approximately 15 minutes of stirring, 210 ml of methanol are added. The suspension is stirred for approximately 1 h and then allowed to settle for 30 minutes. The supernatant is discarded, replaced by the same amount of methanol (230 ml). Stirred for about 15 minutes and allowed to settle for 30 minutes. The supernatant is discarded and replaced with the same amount of methanol (210 ml). Stir approximately 15 minutes and filter. The cake is washed with 2 times 9 ml of methanol, drained and then dried for approximately 18 h at 50 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 2.95 g of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained.
Le rendement est de 73,7 %. f) Purification de 1’ HTBPM dépolymérisée brute -sel de sodium- (étape £2 du procédé) : 1,5 g d’HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium sont chargés dans un tricol de 50 ml avec 16 ml d’eau. La solution est portée pendant environlO minutes à 40 °C. Le pH est amené à environ 9,7 par addition de soude 0,1 N. La solution est filtrée sur membrane 0,45 μτη puis 84 μί d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène à 30 % sont ajoutés. Le mélange est agité 2 h à température ambiante en maintenant le pH constant à 9,7 ± 0,1 par addition de soude 0,1 N. Le mélange réactionnel est ensuite neutralisé par HCl 0,1 N puis 2 g de NaCl sont additionnés. Après environ 10 minutes d’agitation, la solution est filtrée sur membrane 0,45 μτα. 14 ml de méthanol sont coulés à une température voisine de 4 °C. La solution est agitée approximativement pendant 15 minutes à température ambiante. On ajoute ensuite 36 ml de méthanol et la suspension est agitée pendant environ 1 h. L'agitation est alors arrêtée et on laisse sédimenter pendant environ 30 minutes. Le surnageant est ensuite prélevé puis écarté (40 ml). Sur le précipité sédimenté, on ajoute 40 ml de méthanol et on agite pendant environ 10 minutes. On laisse re-sédimenter le précipité approximativement 30 minutes. Le surnageant est prélevé et écarté (45 ml). 45 ml de méthanol sont ajoutés et le précipité en suspension est ensuite filtré. Le gâteau blanc obtenu est ensuite lavé par 2 portions de 3 ml de méthanol. Le solide humide est essoré puis séché sous pression réduite (6 kPa), à une température voisine de50 °C. Après environ 18 heures de séchage, on obtient 1.303 g d’HTBPM dépolymérisée pure (sel de sodium).The yield is 73.7%. f) Purification of crude depolymerized HTBPM-sodium salt (process step 2): 1.5 g of crude depolymerized HTBPM, sodium salt are charged in a 50 ml three-necked flask with 16 ml of water. The solution is heated for about 10 minutes at 40 ° C. The pH is brought to about 9.7 by addition of 0.1 N sodium hydroxide. The solution is filtered through a 0.45 μηη membrane and then 84 μl of a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide are added. The mixture is stirred for 2 hours at ambient temperature while maintaining the pH constant at 9.7 ± 0.1 by addition of 0.1 N sodium hydroxide. The reaction mixture is then neutralized with 0.1 N HCl and then 2 g of NaCl are added. . After stirring for approximately 10 minutes, the solution is filtered through a 0.45 μτα membrane. 14 ml of methanol are cast at a temperature in the region of 4 ° C. The solution is stirred approximately for 15 minutes at room temperature. 36 ml of methanol are then added and the suspension is stirred for about 1 hour. Stirring is then stopped and allowed to settle for about 30 minutes. The supernatant is then removed and discarded (40 ml). On the sedimented precipitate, 40 ml of methanol are added and stirred for about 10 minutes. The precipitate is left to sediment for approximately 30 minutes. The supernatant is removed and discarded (45 ml). 45 ml of methanol are added and the precipitate in suspension is then filtered. The white cake obtained is then washed with 2 portions of 3 ml of methanol. The moist solid is drained and then dried under reduced pressure (6 kPa) at a temperature of 50 ° C. After about 18 hours of drying, 1.303 g of pure depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained.
Le rendement obtenu est de 86,8 %. g) Caractéristique de l’HTBPM dépolymérisée ainsi obtenueThe yield obtained is 86.8%. g) Characteristic of the depolymerized HTBPM thus obtained
Poids moléculaire moyen : 1950 DaltonAverage Molecular Weight: 1950 Dalton
Indice de polydispersité : 1.1Polydispersity index: 1.1
Activité anti-Xa : 283 U/mgAnti-Xa activity: 283 U / mg
Activité alla : non détectable (< 0.2 U/mg)Alla activity: undetectable (<0.2 U / mg)
Exemple 2 : Héparine de très bas poids moléculaire (HTBPM) obtenue par le procédé selon l’invention comprenant une étape d’estérification à 49 % et une étape de dépolymerization avec une base dérivé de phosphazene en milieu anhydre . Estérification de l’HTBPM (étape b du procédé) : 13,29 g (7,6 mmoles) d’HTBPM sel de benzéthonium obtenue selon la préparation 4 sont solubilisés dans 70,43 g de dichlorométhane anhydre et chargés dans un tricol de 100 ml (La teneur en eau du milieu réactionnel est de 0,073 %). 12,3 ml (107 mmoles) de chlorure de benzyle sont ajoutés à la température de 30°C. Le taux d’estérification est de 49 % après environ 7 h de réaction à 30°C. Après refroidissement, le mélange réactionnel est versé sur 160 ml d’une solution à 12 % d’acétate de sodium dans le méthanol. Le mélange est agité 1 h à l’ambiante puis laissé sédimenter pendant environ 16 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (100 ml). On agite environ 1 h et on laisse sédimenter environ 1 h. Le surnageant est à nouveau écarté et remplacé par le même volume de méthanol (100 ml). On agite environ 5 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 2 x 40 ml de méthanol, essoré puis séché en étuve à 40 °C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 18 h. On obtient 3,90 g d’ HTBPM ester de benzyle sel de sodium brut avec un taux d’estérification de 49 %. . Purification de l’HTBPM ester de benzyle (estérifié à 49 %) sel de sodium (étape b du procédé). 3,90 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium brut sont solubilisés dans 39 ml d’une solution aqueuse de NaCl à 10 %. La solution est coulée sur 176 ml de méthanol. La suspension est agitée pendant environ 15 minutes puis on laisse sédimenter 2 h. Le mélange est filtré. Le gâteau est remis en suspension dans 175 ml de méthanol et agité pendant 10 minutes. On filtre et le gâteau est lavé par 2 portions de 10 ml de méthanol. Le solide humide blanc est essoré, séché en étuve à 40°C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 18 h. On obtient 2,62 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium.EXAMPLE 2 Heparin of Very Low Molecular Weight (HTBPM) obtained by the process according to the invention comprising a 49% esterification step and a depolymerization step with a base derived from phosphazene in an anhydrous medium. Esterification of the HTBPM (step b of the process): 13.29 g (7.6 mmol) of benzethonium salt HTBPM obtained according to Preparation 4 are solubilized in 70.43 g of anhydrous dichloromethane and loaded into a tricolor of 100 ml (The water content of the reaction medium is 0.073%). 12.3 ml (107 mmol) of benzyl chloride are added at the temperature of 30 ° C. The degree of esterification is 49% after about 7 hours of reaction at 30 ° C. After cooling, the reaction mixture is poured into 160 ml of a 12% solution of sodium acetate in methanol. The mixture is stirred for 1 hour at room temperature and then allowed to settle for about 16 hours. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (100 ml). Stir about 1 hour and allow to settle about 1 hour. The supernatant is again discarded and replaced by the same volume of methanol (100 ml). Stir about 5 minutes and filter. The cake is washed with 2 × 40 ml of methanol, drained and then dried in an oven at 40 ° C. under reduced pressure (6 kPa) for about 18 h. 3.90 g of benzyl ester BSBM crude sodium salt are obtained with an esterification rate of 49%. . Purification of the benzyl ester HTBPM (esterified 49%) sodium salt (step b of the process). 3.90 g of benzyl ester HTBPM crude sodium salt are solubilized in 39 ml of a 10% aqueous NaCl solution. The solution is poured on 176 ml of methanol. The suspension is stirred for approximately 15 minutes and then allowed to settle for 2 hours. The mixture is filtered. The cake is resuspended in 175 ml of methanol and stirred for 10 minutes. The mixture is filtered and the cake is washed with 2 portions of 10 ml of methanol. The white wet solid is drained, dried in an oven at 40 ° C under reduced pressure (6 kPa) for about 18 hours. 2.62 g of benzyl ester HTBPM are obtained.
Le rendement global de la phase estérification est de 57,3 %. - Trans-salification de l’HTBPM ester de benzyle en sel de benzéthonium (étape c) du procédé) : 2,62 g (4,37 mmoles) d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium sont solubilisés dans 20 ml d’eau (erlenmeyer « A »). Pendant ce temps, 5,92 g (13,2 mmoles) de chlorure de benzéthonium sont chargés avec 60 ml d’eau dans un erlenmeyer « B ». Le contenu de « B » est coulé dans « A ». La suspension est agitée pendant environl h à température ambiante puis laissée sédimenter 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (70 ml). On agite pendant environ 15 minutes et on laisse sédimenter 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (70 ml). On agite encore environ 5 minutes et on filtre. Le gâteau est lavé par 3 portions de 50 ml d’eau, essoré puis séché en étuve à 80°C sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 18 h. On obtient 6,85 g d’ HTBPM ester de benzyle sel de benzéthonium.The overall yield of the esterification phase is 57.3%. - Trans-salification of the benzyl ester HTBPM to the benzethonium salt (stage c) of the process): 2.62 g (4.37 mmol) of HTBPM sodium benzyl ester are solubilized in 20 ml of water (Erlenmeyer "A"). During this time, 5.92 g (13.2 mmol) of benzethonium chloride are charged with 60 ml of water in a "B" Erlenmeyer flask. The content of "B" is poured into "A". The suspension is stirred for about 1 h at room temperature and then allowed to settle for 1 h. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (70 ml). Stirred for about 15 minutes and allowed to settle for 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (70 ml). Stir another 5 minutes and filter. The cake is washed with 3 portions of 50 ml of water, drained and then dried in an oven at 80 ° C under reduced pressure (6 kPa) for about 18 hours. 6.85 g of benzyl ammonium benzyl ester are obtained.
Le rendement est de 99 %. La teneur en eau du sel de benzéthonium est de 0.6 %. . Dépolymérisation de l’HTBPM ester de benzyle, sel de benzéthonium : 6,80 g (4,3 mmoles) d’HTBPM sont chargés dans un tricol de 100 ml avec 54 ml de dichlorométhane sec. Le mélange est porté à 30°C puis agité jusqu’à dissolution complète. Le teneur en eau estimée du mélange réactionnel est d’environ 0,05 %. On ajoute 1,25 ml (4,3 mmoles) de 2-tert-butylimino-2-diethylamino-l ,3-diméthylperhydro-l,3,2-diaza-phosphorine et on agite 24 h à 30°C sous atmosphère inerte. . Transformation du sel d’ammonium quaternaire en sel de sodium (étape è) du procédé)The yield is 99%. The water content of the benzethonium salt is 0.6%. . Depolymerization of the benzyl ester HTBPM, benzethonium salt: 6.80 g (4.3 mmol) of HTBPM are charged in a three-necked 100 ml with 54 ml of dry dichloromethane. The mixture is brought to 30 ° C and stirred until complete dissolution. The estimated water content of the reaction mixture is about 0.05%. 1.25 ml (4.3 mmol) of 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diaza phosphorine are added and the mixture is stirred for 24 hours at 30 ° C. under an inert atmosphere. . . Transformation of quaternary ammonium salt to sodium salt (step è) of the process)
Pendant ce temps, 270 ml d’une solution méthanolique d’acétate de sodium à 10 % sont préparés dans un erlenmeyer de 1 1. Le mélange réactionnel est coulé dans la solution méthanolique en maintenant la température à environ 4°C. La suspension est agitée environl h à température ambiante. On laisse sédimenter pendant 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (165 ml). On agite environ 1 h et laisse sédimenter 1 h. Le surnageant est à nouveau écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (170 ml). On agite pendant environ 15 minutes et on filtre. Le gâteau est lavé par 3 portions 40 ml de méthanol, essoré puis séché pendant environ 18 h en étuve à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 2,29 g d’HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium.During this time, 270 ml of a 10% sodium acetate methanol solution are prepared in a 1 liter Erlenmeyer flask. The reaction mixture is poured into the methanolic solution while maintaining the temperature at about 4 ° C. The suspension is stirred for about 1 h at room temperature. It is allowed to settle for 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced by the same amount of methanol (165 ml). Stir about 1 hour and let settle 1 hour. The supernatant is again discarded and replaced with the same amount of methanol (170 ml). Stir for about 15 minutes and filter. The cake is washed with 3 portions 40 ml of methanol, filtered and then dried for about 18 h in an oven at 50 ° C under reduced pressure (6 kPa). 2.29 g of crude depolymerized HTBPM, sodium salt, are obtained.
Le rendement obtenu est de 89 %. . Saponification de l’HTBPM brute, sel de sodium (étape fl du procédé) : 2,29 g (3,8 mmoles) d' HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium sont solubilisés dans 23 ml d’eau. La solution est filtrée sur membrane de 0,8 μία. puis chargée dans un tricol de 100 ml. On introduit 575 μΙ (5,73 mmoles) de lessive de soude à 30 % à une température voisine de 3°C. On agite pendant environ 2 h à cette température.The yield obtained is 89%. . Saponification of crude HTBPM, sodium salt (process step): 2.29 g (3.8 mmol) of crude depolymerized HTBPM, sodium salt are solubilized in 23 ml of water. The solution is filtered on a membrane of 0.8 μία. then loaded in a 100 ml tricolor. 575 μΙ (5.73 mmol) of 30% sodium hydroxide solution are introduced at a temperature in the region of 3 ° C. It is stirred for about 2 hours at this temperature.
La moitiée du mélange réactionnel est neutralisé par addition de l’acide acétique glacial et on ajoute ensuite 367 mg d’acétate de sodium solide et 13 ml de méthanol. La solution est agité environ 15 minutes puis 65 ml de méthanol sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée environ 30 minutes puis on laisse sédimenter environ 16 heures. Le surnageant est écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (36 ml). On agite encore approximativement 30 minutes et laisse sédimenter environ 30 minutes. Le surnageant est écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (16 ml). On agite environ 15 minutes et on filtre sur membrane de 0,22 μτη. Le gâteau est lavé par 2 fois 5 ml de méthanol, essoré puis séché sous pression réduite (6 kPa) pendant environ 18 h en étuve à 50°C. On obtient 563 mg d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium).Half of the reaction mixture is neutralized by the addition of glacial acetic acid and then 367 mg of solid sodium acetate and 13 ml of methanol are added. The solution is stirred for about 15 minutes and then 65 ml of methanol are added. The suspension obtained is stirred for about 30 minutes and then allowed to settle for about 16 hours. The supernatant is discarded and replaced with the same amount of methanol (36 ml). Stirring is continued for approximately 30 minutes and allowed to settle for about 30 minutes. The supernatant is discarded and replaced with the same amount of methanol (16 ml). The mixture is stirred for about 15 minutes and filtered through a membrane of 0.22 μτη. The cake is washed with 2 times 5 ml of methanol, drained and then dried under reduced pressure (6 kPa) for about 18 hours in an oven at 50 ° C. 563 mg of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained.
Le rendement est de 52,6 %. . Purification de l’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium) précipitée par AcONa (étape G du procédé) : 560 mg d’HTBMP dépolymérisée brute (sel de sodium) sont chargés dans un tricol de 10 ml avec 5,6 ml d’eau. La solution brune est portée 10 minutes à 40 °C. Le pH est amené à 9,7 par addition de soude 0,1 N. La solution est filtrée sur membrane 0,45 μιη, 28 μΐ d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène à 30 % sont ajoutés. Le mélange est agité 2 h à température ambiante en maintenant le pH constant à 9,5 ± 0,1 par addition de soude 0,1 N. Le mélange réactionnel est neutralisé par HCl 0,lN, 620 mg de NaCl sont additionnés. Après 10 minutes d’agitation, la solution est filtrée sur membrane 0,45 μτη. 4,35 ml de méthanol sont coulés à une température voisine de 4°C. La solution est agitée 15 minutes à température ambiante. 11,2 ml de méthanol sont ajoutés. La suspension est agitée 1 h. L'agitation est alors arrêtée et laisse sédimenter pendant 1 h. Le surnageant est ensuite prélevé puis écarté (13,5 ml). Sur le précipité sédimenté, on ajoute 13,5 ml de méthanol et on agite pendant 15 minutes. On laisse re-sédimenter le précipité 30 minutes environ. Le surnageant est prélevé et écarté (13 ml). 13 ml de méthanol sont ajoutés et le précipité en suspension est ensuite filtré. Le gâteau blanc obtenu est ensuite lavé par 2 portions de 5 ml de méthanol. Le solide humide est essoré puis séché sous pression réduite (6 kPa), à une température voisine de 50°C. Après 18 heures de séchage, on obtient 376 mg d'HTBPM dépolymérisée pure (sel de sodium). Le rendement obtenu est de 67 %.The yield is 52.6%. . Purification of the crude depolymerized HTBPM (sodium salt) precipitated by AcONa (process step G): 560 mg of crude depolymerized HTBMP (sodium salt) are loaded into a 10 ml three-necked flask with 5.6 ml of water . The brown solution is heated for 10 minutes at 40 ° C. The pH is brought to 9.7 by addition of 0.1 N sodium hydroxide. The solution is filtered through a 0.45 μιη membrane, 28 μl of a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide are added. The mixture is stirred for 2 hours at ambient temperature while maintaining the pH constant at 9.5 ± 0.1 by addition of 0.1N sodium hydroxide. The reaction mixture is neutralized with 0.1 N HCl and 620 mg of NaCl are added. After stirring for 10 minutes, the solution is filtered through a 0.45 μm membrane. 4.35 ml of methanol are cast at a temperature of about 4 ° C. The solution is stirred for 15 minutes at room temperature. 11.2 ml of methanol are added. The suspension is stirred for 1 hour. The stirring is then stopped and allowed to settle for 1 hour. The supernatant is then removed and discarded (13.5 ml). On the sedimented precipitate, 13.5 ml of methanol are added and stirred for 15 minutes. The precipitate is left to sediment for approximately 30 minutes. The supernatant is removed and discarded (13 ml). 13 ml of methanol are added and the precipitate in suspension is then filtered. The white cake obtained is then washed with 2 portions of 5 ml of methanol. The wet solid is drained and then dried under reduced pressure (6 kPa) at a temperature of 50 ° C. After 18 hours of drying, 376 mg of pure depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained. The yield obtained is 67%.
Caractéristique de l’HTBPM dépolymérisée ainsi obtenueCharacteristic of the depolymerized HTBPM thus obtained
Activité anti-Xa : 191 Ul/mgAnti-Xa activity: 191 IU / mg
Poids moléculaire moyen: 2100 DaAverage molecular weight: 2100 Da
Exemple 3 : Héparine de très bas poids moléculaire (HTBPM) obtenue par le procédé selon l’invention comprenant une étape d’estérification à 73 % et une étape de dépolymerization avec une base dérivé de phosphazène en milieu anhydre . Estérification de l’HTBPM (étape b du procédé) : 13,7 g (7,3 mmoles) d’HTBPM sel de benzéthonium obtenue selon la préparation 4 sont solubilisés dans 73,67 g de dichlorométhane anhydre et chargés dans un tricol de 100 ml. (La teneur en eau du milieu réactionnel est dosée à 0,23 %). 13 ml (113 mmoles) de chlorure de benzyle sont ajoutés à la température de 30°C. Le taux d’estérification est de 73 % après environ 20 h de réaction à 30 °C. Après refroidissement à température ambiante, le mélange réactionnel est versé sur 210 ml d’une solution à 12 % d’acétate de sodium dans le méthanol. Le mélange est agité 30 minutes à temperature ambiante puis on laisse sédimenter pendant environ 1,5 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (140 ml). On agite 15 minutes et la suspension est filtrée. Le gâteau est lavé par 2 portions de 100 ml de méthanol, essoré puis séché approximativement 18 h en étuve à 40°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 13,3 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium brut avec un taux d’estérification de 73 %. . Purification de l’HTBPM ester de benzyle (estérifié à 73%), sel de sodium (étape b du procédé).EXAMPLE 3 Very Low Molecular Weight Heparin (HTBPM) obtained by the process according to the invention comprising a 73% esterification step and a depolymerization step with a base derived from phosphazene in an anhydrous medium. Esterification of the HTBPM (step b of the process): 13.7 g (7.3 mmol) of benzethonium salt HTBPM obtained according to Preparation 4 are solubilized in 73.67 g of anhydrous dichloromethane and loaded into a tricol of 100 ml. (The water content of the reaction medium is dosed at 0.23%). 13 ml (113 mmol) of benzyl chloride are added at a temperature of 30 ° C. The degree of esterification is 73% after about 20 hours of reaction at 30 ° C. After cooling to room temperature, the reaction mixture is poured into 210 ml of a 12% solution of sodium acetate in methanol. The mixture is stirred for 30 minutes at room temperature and then allowed to settle for about 1.5 hours. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (140 ml). Stir 15 minutes and the suspension is filtered. The cake is washed with 2 portions of 100 ml of methanol, drained and then dried for approximately 18 hours in an oven at 40 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 13.3 g of benzyl ester BSBPM crude sodium salt are obtained with an esterification rate of 73%. . Purification of the benzyl ester HTBPM (esterified to 73%), sodium salt (step b of the process).
Les 13,3 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium brut sont solubilisés dans 133 ml d’une solution aqueuse de NaCl à 10 %. La solution est coulée sur 600 ml de méthanol. La suspension est agitée pendant environ 15 minutes puis laisse sédimenter approximativement 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (400 ml). On agite pendant environ 5 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 3 fois 100 ml de méthanol. Le solide humide blanc est essoré puis séché approximativement 18 h en étuve à 40°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 2,33 g d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium.The 13.3 g of benzyl ester HTBPM crude sodium salt are solubilized in 133 ml of a 10% aqueous NaCl solution. The solution is poured onto 600 ml of methanol. The suspension is stirred for about 15 minutes and then allowed to settle for approximately 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (400 ml). Stir for about 5 minutes and filter. The cake is washed with 3 times 100 ml of methanol. The white wet solid is drained and then dried for approximately 18 hours in an oven at 40 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 2.33 g of HTBPM sodium benzyl ester are obtained.
Le rendement d’estérification est de 49,6 %. . Trans-salification de l’HTBPM ester de benzyle, sel de benzéthonium (étape c du procédé): 2,27 g (3,53 mmoles) d’HTBPM ester de benzyle sel de sodium sont solubilisés avec 15 ml d’eau dans un erlenmeyer « A » de 100 ml. Pendant ce temps 5,22 g (11,6 mmoles) de chlorure de benzéthonium sont chargés avec 55 ml d’eau dans un erlenmeyer « B » de 100 ml.The esterification yield is 49.6%. . Trans-salification of the HTBPM benzyl ester, benzethonium salt (step c of the process): 2.27 g (3.53 mmol) of HTBPM benzyl ester sodium salt are solubilized with 15 ml of water in a 100 ml Erlenmeyer flask "A". During this time 5.22 g (11.6 mmol) of benzethonium chloride are charged with 55 ml of water in a 100 ml "B" Erlenmeyer flask.
Le contenu de « B » est coulé dans « A ». La suspension est agitée environ 1 h à température ambiante puis on laisse sédimenter approximativement 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (50 ml). On agite environ 15 minutes et laisse sédimenter approximativement 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (50 ml). On agite encore 5 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 3 portions de 50 ml d’eau, essoré puis séché pendant environ 18h en étuve à 80°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 5,67 g d’HTBPM ester de benzyle sel de benzéthonium.The content of "B" is poured into "A". The suspension is stirred for about 1 hour at room temperature and then left to settle for approximately 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (50 ml). Stir about 15 minutes and allow to settle approximately 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (50 ml). Stir another 5 minutes and filter. The cake is washed with 3 portions of 50 ml of water, drained and then dried for approximately 18 hours in an oven at 80 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 5.67 g of benzyl ammonium benzyl ester are obtained.
Le rendement obtenu est de 98 %. La teneur en eau du produit obtenu est de 1 % . Dépolymérisation de l’HTBPM ester de benzyie, sel de benzéthonium (étape d du procédé) : 5,45 g (3,3 mmoles) d’HTBPM sont chargés dans un tricol de 100 ml avec 40 ml de dichlorométhane sec. La teneur en eau estimée du mélange est d’environ 0.1%. Le mélange est porté à 30°C. On ajoute 958 μΐ (3,3 mmoles) de 2-tert-butylimino-2-diethylamino-l ,3-diméthylperhydro-l,3,2-diaza-phosphorine et agite 24 h à 30°C sous atmosphère d’argon. . Transformation du sel d’ammonium quaternaire en sel de sodium (étape e) du procédé)The yield obtained is 98%. The water content of the product obtained is 1%. Depolymerization of the benzyl benzyl ester HTBPM (process step d): 5.45 g (3.3 mmol) of HTBPM are charged in a 100 ml three-neck with 40 ml of dry dichloromethane. The estimated water content of the mixture is about 0.1%. The mixture is brought to 30 ° C. 958 μΐ (3.3 mmol) of 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diaza phosphorine are added and the mixture is stirred for 24 hours at 30 ° C. under an argon atmosphere. . Transformation of quaternary ammonium salt into sodium salt (step e) of the process)
Pendant ce temps, 200 ml d’une solution méthanolique d’acétate de sodium à 10 % est préparée dans un erlenmeyer de 500 ml. Le mélange réactionnel est coulé dans la solution méthanolique en maintenant la température à environ 4°C. La suspension est agitée pendant environ 1 h à température ambiante. On laisse sédimenter approximativement 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (150 ml). On agite environ 30 minutes et laisse sédimenter environ 30 minutes. Le surnageant est à nouveau écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (150 ml). On agite pendant approximativement 15 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 3 fois 50 ml de méthanol, essoré 5 puis séché pendant environ 18 h à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 1,40 g d’HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium. Le rendement obtenu est de 65,8 %. . Saponification de l’HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium (étape fl du procédé) : 0 1,40 g (2,18 mmoles) d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium) sont solubilisés dans 14 ml d’eau. La solution est chargée dans un ballon tricol de 100 ml. A une température voisine de 4 °C, on introduit 351 μΐ (3,5 mmoles) de lessive de soude à 30 %. On agite pendant environ 2 h à cette température. La solution est neutralisée par addition d’acide acétique glacial (100 %). On ajoute 5 ensuite 7 g d’acétate de sodium solide et 130 ml de méthanol. La suspension est agitée 30 minutes puis on laisse sédimenter pendant environ 1 heure. Le surnageant est écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (80 ml). On agite encore environ 30 minutes et on laisse sédimenter approximativement 16 heures. Le surnageant est écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (80 ml). On 0 agite de l’ordre de 15 minutes puis on filtre sur membrane de 0,45 μπι. Le gâteau est lavé par 2 fois 10 ml de méthanol, essoré puis séché pendant environ 18 h à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 1,15 g (rendement : 89,4 %) d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium).Meanwhile, 200 ml of a 10% sodium acetate methanol solution is prepared in a 500 ml Erlenmeyer flask. The reaction mixture is poured into the methanolic solution while maintaining the temperature at about 4 ° C. The suspension is stirred for about 1 h at room temperature. It is allowed to sediment approximately 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced by the same amount of methanol (150 ml). Stir about 30 minutes and allow to settle about 30 minutes. The supernatant is again discarded and replaced by the same amount of methanol (150 ml). Stir for approximately 15 minutes and filter. The cake is washed with 3 times 50 ml of methanol, drained and then dried for about 18 h at 50 ° C under reduced pressure (6 kPa). 1.40 g of crude depolymerized HTBPM, sodium salt, are obtained. The yield obtained is 65.8%. . Saponification of crude depolymerized HTBPM, sodium salt (process step): 1.40 g (2.18 mmol) of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are solubilized in 14 ml of water. The solution is loaded into a 100 ml three-neck flask. At a temperature in the region of 4 ° C., 351 μΐ (3.5 mmol) of 30% sodium hydroxide solution are introduced. It is stirred for about 2 hours at this temperature. The solution is neutralized by addition of glacial acetic acid (100%). 7 g of solid sodium acetate and 130 ml of methanol are then added. The suspension is stirred for 30 minutes and then allowed to settle for about 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same amount of methanol (80 ml). Stirring is continued for about 30 minutes and allowed to settle for approximately 16 hours. The supernatant is discarded and replaced with the same amount of methanol (80 ml). The mixture is stirred for about 15 minutes and then filtered through a 0.45 μπι membrane. The cake is washed twice with 10 ml of methanol, drained and then dried for approximately 18 h at 50 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 1.15 g (yield: 89.4%) of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained.
Le rendement obtenu est de 89,4 %. 5 . Purification de l’HTBPM dépolymérisée brute -sel de sodium- (étape G du procédé) : 373 mg d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium) sont chargés dans un tricol de 10 ml avec 3,7 ml d’eau. La solution est portée 10 minutes à 40°C. Le pH est amené à environ 9,5 par addition de soude 1 N. La solution est filtrée sur membrane 0,45 μία puis 18 μΙ d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène à 30 % sont ajoutés. Le mélange est agité environ 2 h à température ambiante en maintenant le pH constant à 9,5 ± 0,1 par addition de soude 0,1 N. Le mélange réactionnel est neutralisé par HCl 0,1 N puis 430 mg de NaCl sont additionnés. Après environ 10 minutes d’agitation, la solution est filtrée sur membrane 0,45 μία. 3 ml de méthanol sont coulés à une température voisine de 4 °C. La solution est agitée 15 minutes à température ambiante. 7,7 ml de méthanol sont ensuite ajoutés. La suspension est agitée pendant environ 1 h. L'agitation est alors arrêtée et on laisse sédimenter pendant approximativement 40 minutes. Le surnageant est ensuite prélevé puis écarté (10 ml). Sur le précipité sédimenté, on ajoute 10 ml de méthanol et on agite pendant 15 minutes. On laisse re-sédimenter le précipité 30 minutes environ. Le surnageant est prélevé et écarté (10 ml). 10 ml de méthanol sont ajoutés et le précipité en suspension est ensuite filtré sur membrane 0,45 μτα. Le gâteau blanc obtenu est lavé par 4 portions de 5 ml de méthanol. Le solide humide est essoré puis séché sous pression réduite (6 kPa), à une température voisine de 50°C. Après environ 18 heures de séchage, on obtient 199 mg d’HTBPM dépolymérisée pure (sel de sodium). Le rendement obtenu est de 54 %. Caractéristique de ΓΗΤΒΡΜ dépolymérisée ainsi obtenueThe yield obtained is 89.4%. 5. Purification of crude depolymerized HTBPM-sodium salt (process step G): 373 mg of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are loaded into a 10 ml three-necked flask with 3.7 ml of water. The solution is heated for 10 minutes at 40 ° C. The pH is brought to about 9.5 by addition of 1N sodium hydroxide. The solution is filtered through a 0.45 μία membrane and then 18 μl of a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide are added. The mixture is stirred for approximately 2 hours at ambient temperature while maintaining the pH constant at 9.5 ± 0.1 by adding 0.1 N sodium hydroxide. The reaction mixture is neutralized with 0.1 N HCl and then 430 mg of NaCl are added. . After stirring for approximately 10 minutes, the solution is filtered through a 0.45 μία membrane. 3 ml of methanol are cast at a temperature in the region of 4 ° C. The solution is stirred for 15 minutes at room temperature. 7.7 ml of methanol are then added. The suspension is stirred for about 1 hour. Stirring is then stopped and allowed to settle for approximately 40 minutes. The supernatant is then removed and discarded (10 ml). On the sedimented precipitate, 10 ml of methanol are added and stirred for 15 minutes. The precipitate is left to sediment for approximately 30 minutes. The supernatant is removed and discarded (10 ml). 10 ml of methanol are added and the precipitate in suspension is then filtered on membrane 0.45 μτα. The white cake obtained is washed with 4 portions of 5 ml of methanol. The wet solid is drained and then dried under reduced pressure (6 kPa) at a temperature of 50 ° C. After about 18 hours of drying, 199 mg of pure depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained. The yield obtained is 54%. Characteristic of depolymerized ainsi thus obtained
Poids moléculaire moyen : 2000 Daltons. Indice de polydispersité : 1.1 Activité anti-Xa : 252 Ul/mgAverage molecular weight: 2000 Daltons. Polydispersity index: 1.1 Anti-Xa activity: 252 IU / mg
Exemple 4 : HTBPM obtenue par le procédé selon l’invention comprenant une étape d’estérification à 96 % et une étape de dépolymerization par le BEMP . Estérification de l’HTBPM (étape b) du procédé) 14,45 g (7,7 mmoles) d’HTBPM sel de benzéthonium obtenue selon la préparation 4 sont solubilisés dans 75,79 g de dichlorométhane anhydre et chargés dans un tricol de 250 ml. (La teneur en eau du milieu réactionnel est de 0,20 %). 12,4 ml (108 mmoles) de chlorure de benzyle sont ajoutés à la température de 30 °C. Le taux d’estérification est de 96 % après environ 26 h de réaction à 30°C. Après refroidissement à température ambiante, le mélange réactionnel est versé sur 180 ml d’une solution à 12 % d’acétate de sodium dans le méthanol. Le mélange est agité environ 30 minutes à température ambiante puis on laisse sédimenter approximativement 30 minutes. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (150 ml). On agite environ 15 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 2 portions de 100 ml de méthanol, essoré puis séché pendant environ 18 h à 40°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 3,67 g d’HTBPM ester de benzyle, sel de sodium brut, avec un taux d’estérification de 96 %. . Purification de l’HTBPM ester de benzyle (estérifié à 96 %) sel de sodium (étape b) du procédé) :Example 4: HTBPM obtained by the process according to the invention comprising a 96% esterification step and a depolymerization step with BEMP. Esterification of the HTBPM (step b) of the process) 14.45 g (7.7 mmol) of HTBPM benzethonium salt obtained according to Preparation 4 are solubilized in 75.79 g of anhydrous dichloromethane and loaded into a tricol of 250 ml. (The water content of the reaction medium is 0.20%). 12.4 ml (108 mmol) of benzyl chloride are added at the temperature of 30 ° C. The esterification rate is 96% after about 26 hours of reaction at 30 ° C. After cooling to room temperature, the reaction mixture is poured into 180 ml of a 12% solution of sodium acetate in methanol. The mixture is stirred for about 30 minutes at room temperature and then allowed to settle for approximately 30 minutes. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (150 ml). Stir about 15 minutes and filter. The cake is washed with 2 portions of 100 ml of methanol, drained and then dried for approximately 18 h at 40 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 3.67 g of benzyl ester HTBPM, crude sodium salt, with a degree of esterification of 96%, are obtained. . Purification of the benzyl ester HTBPM (96% esterified) sodium salt (step b) of the process):
Les 3,67 g d’HTBPM ester de benzyle, sel de sodium brut sont solubilisés dans 37 ml d’une solution aqueuse de NaCl à 10 % (3,7 g de NaCl dans 37 ml d’eau). La solution est coulée sur 167 ml de méthanol. La suspension est agitée environ 15 minutes puis on laisse sédimenter pendant approximativement 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par le même volume de méthanol (38 ml). On agite pendant environ 5 minutes et on filtre. Le gâteau est lavé le gâteau par 2 fois 30 ml de méthanol. Le solide humide blanc est essoré, séché pendant environ 18 h à 40°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 2,76 g d’HTBPM ester de benzyle, sel de sodium.The 3.67 g of benzyl ester HTBPM, crude sodium salt are solubilized in 37 ml of a 10% aqueous solution of NaCl (3.7 g of NaCl in 37 ml of water). The solution is cast on 167 ml of methanol. The suspension is stirred for about 15 minutes and then allowed to settle for approximately 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced by the same volume of methanol (38 ml). Stir for about 5 minutes and filter. The cake is washed cake with 2 times 30 ml of methanol. The white wet solid is drained, dried for about 18 h at 40 ° C under reduced pressure (6 kPa). 2.76 g of benzyl ester HTBPM, sodium salt, are obtained.
Le rendement d’estérification est de 54,4 %. . Trans-salification de l’HTBPM ester de benzyle en sel de benzéthonium (étape c) du procédé) : 2,83 g (4,29 mmoles) d’HTBPM ester de benzyle, sel de sodium sont solubilisés avec 20 ml d’eau dans un erlenmeyer « A » de 100 ml. Pendant ce temps, 6,35 g (14,2 mmoles) de chlorure de benzéthonium sont chargés avec 50 ml d’eau dans un erlenmeyer « B » de 100 ml.The esterification yield is 54.4%. . Trans-salification of the benzyl ester HTBPM to the benzethonium salt (step c) of the process): 2.83 g (4.29 mmol) of benzyl ester HTBPM, sodium salt are solubilized with 20 ml of water in an Erlenmeyer flask "A" of 100 ml. During this time, 6.35 g (14.2 mmol) of benzethonium chloride are charged with 50 ml of water into a 100 ml "B" Erlenmeyer flask.
Le contenu de « B » est coulé dans « A ». La suspension est agitée environ 1 h à température ambiante puis on laisse sédimenter approximativement 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (60 ml). On agite pendant environ 15 minutes et laisse sédimenter approximativement 1 h. Le surnageant est écarté et remplacé par le même volume d’eau (60 ml). On agite encore environ 5 minutes puis on filtre. Le gâteau est lavé par 4 fois 50 ml d’eau, essoré puis séché pendant environ 18 h à 80°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 7,0 g d’HTBPM ester de benzyle, sel de benzéthonium.The content of "B" is poured into "A". The suspension is stirred for about 1 hour at room temperature and then left to settle for approximately 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (60 ml). Stir for about 15 minutes and allow to settle for approximately 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same volume of water (60 ml). Stirring is continued for about 5 minutes and then filtered. The cake is washed with 4 times 50 ml of water, drained and then dried for approximately 18 h at 80 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 7.0 g of benzyl benzyl ester, benzethonium salt, are obtained.
Le rendement observé est d’environ 100 %. La teneur en eau est de 0.23%. . Dépolymérisation de l’HTBPM ester de benzyl, sel de benzéthonium (étape d) du procédé) : 3,67 g (2,3 mmoles) d’HTBPM sont chargés dans un ballon tricol de 50 ml avec 27 ml de dichlorométhane sec. Le mélange est porté à 30°G. On ajoute 676 /il (2,3 mmoles) de 2-tert-butylimino-2-diethylamino-l ,3-diméthylperhydro-l,3,2-diaza-phosphorine et on agite 24 h à 30°C. . Transformation du sel d’ammonium quaternaire en sel de sodium (étape e) du procédé)The observed yield is about 100%. The water content is 0.23%. . Depolymerization of the benzyl ester HTBPM, benzethonium salt (step d) of the process): 3.67 g (2.3 mmol) of HTBPM are charged into a 50 ml three-neck flask with 27 ml of dry dichloromethane. The mixture is brought to 30 ° G. 676 μl (2.3 mmol) of 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diaza phosphorine are added and the mixture is stirred at 30 ° C. for 24 hours. . Transformation of quaternary ammonium salt into sodium salt (step e) of the process)
Pendant ce temps, 150 ml d’une solution méthanolique d’acétate de sodium à 10 % sont préparés dans un erlenmeyer de 250 ml. Le mélange réactionnel est coulé dans la solution méthanolique en maintenant la température à environ 4°C. La suspension est agitée pendant environ 1 h à température ambiante. On. laisse sédimenter pendant approximativement 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (100 ml). On agite 30 minutes et laisse sédimenter 30 minutes. Le surnageant est à nouveau écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (100 ml). On agite 15 minutes et filtre. Le gâteau est lavé par 3 fois 40 ml de méthanol, essoré et séché pendant environ 18 h à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 966 mg d'HTBPM dépolymérisée, sel de sodium.Meanwhile, 150 ml of a 10% sodium acetate methanol solution is prepared in a 250 ml Erlenmeyer flask. The reaction mixture is poured into the methanolic solution while maintaining the temperature at about 4 ° C. The suspension is stirred for about 1 h at room temperature. We. let settle for approximately 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced by the same amount of methanol (100 ml). Stir 30 minutes and allow to sediment 30 minutes. The supernatant is again discarded and replaced by the same amount of methanol (100 ml). Stir 15 minutes and filter. The cake is washed with 3 times 40 ml of methanol, drained and dried for about 18 h at 50 ° C under reduced pressure (6 kPa). 966 mg of depolymerized HTBPM, sodium salt are obtained.
Le rendement obtenu est de 64 %. . Saponification de l’HTBPM ester de benzyle, sel de sodium (étape fl du procédé): 942 mg (1,43 mmoles) d’HTBPM dépolymérisée sel de sodium sont solubilisés dans 9,5 ml d’eau. La solution est chargée dans un ballon tricol de 100 ml. On introduit 236 μϊ (2,35 mmoles) de lessive de soude à 30 % à une température voisine de 4°C. On agite pendant environ 2 h à cette température. La solution est neutralisée par addition d’acide acétique glacial (100 %). On ajoute ensuite 4,5 g d’acétate de sodium solide et 85 ml de méthanol. La suspension est agitée pendant environ 30 minutes puis on laisse sédimenter pendant environ 1 heure. Le surnageant est écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (40 ml). On agite encore pendant environ 30 minutes et on laisse sédimenter pendant environ 16 heures. Le surnageant est écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (40 ml). On agite pendant environ 30 minutes et on filtre sur membrane de 0,45 gm. Le gâteau est lavé par 2 fois 10 ml de méthanol, essoré puis séché pendant environ 18 h à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 776 mg d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium).The yield obtained is 64%. . Saponification of the benzyl ester HTBPM, sodium salt (process step): 942 mg (1.43 mmol) of sodium-depolymerized HTBPM are solubilized in 9.5 ml of water. The solution is loaded into a 100 ml three-neck flask. 236 μϊ (2.35 mmol) of 30% sodium hydroxide solution are introduced at a temperature in the region of 4 ° C. It is stirred for about 2 hours at this temperature. The solution is neutralized by addition of glacial acetic acid (100%). 4.5 g of solid sodium acetate and 85 ml of methanol are then added. The suspension is stirred for about 30 minutes and then allowed to settle for about 1 hour. The supernatant is discarded and replaced with the same amount of methanol (40 ml). Stirring is continued for about 30 minutes and allowed to settle for about 16 hours. The supernatant is discarded and replaced with the same amount of methanol (40 ml). The mixture is stirred for about 30 minutes and filtered through a 0.45 μm membrane. The cake is washed twice with 10 ml of methanol, drained and then dried for approximately 18 h at 50 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 776 mg of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained.
Le rendement obtenu est de 91,4 %. . Purification de l’HTBPM dépolymérisée brute -sel de sodium- étape f2 du procédé : 758 mg d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium) sont chargés dans un tricol de 25 ml avec 7,6 ml d’eau. La solution est portée 10 minutes à 40°C. Le pH est amené à environ 9,5 par addition de soude 0,1 N. La solution est filtrée sur membrane 0,45 gm puis 38 gl d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène à 30 % sont ajoutés. Le mélange est agité pendant environ 2 h à température ambiante en maintenant le pH constant à 9,5 ± 0,1 par addition de soude 0,1 N. Le mélange réactionnel est neutralisé par HCl IN et 880 mg de NaCl sont additionnés. Après environ 10 minutes d’agitation, la solution est filtrée sur membrane 0,45 gm. 6,2 ml de méthanol sont coulés à une température voisine de 4 °C. La solution est agitée approximativement 15 minutes à température ambiante. On ajoute 16 ml de méthanol et la suspension est agitée pendant environ 1 h. L'agitation est alors arrêtée et la suspension est filtrée. Le gâtêau est lavé par 2 portions de 15 ml de méthanol. Le solide humide est essoré puis séché sous pression réduite (6 kPa), à une température voisine de 50°C. Après approximativement 18 heures de séchage, on obtient 490 mg d’HTBPM dépolymérisée pure (sel de sodium). Le rendement obtenu est de 65 %. 'The yield obtained is 91.4%. . Purification of crude depolymerized HTBPM-sodium salt-step f2 of the process: 758 mg of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are loaded into a 25 ml three-necked flask with 7.6 ml of water. The solution is heated for 10 minutes at 40 ° C. The pH is brought to about 9.5 by addition of 0.1 N sodium hydroxide. The solution is filtered through a 0.45 μm membrane and then 38 μl of a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide are added. The mixture is stirred for about 2 hours at room temperature while maintaining the pH constant at 9.5 ± 0.1 by addition of 0.1 N sodium hydroxide. The reaction mixture is neutralized with 1N HCl and 880 mg of NaCl are added. After stirring for approximately 10 minutes, the solution is filtered through a 0.45 μm membrane. 6.2 ml of methanol are cast at a temperature in the region of 4 ° C. The solution is stirred approximately 15 minutes at room temperature. 16 ml of methanol are added and the suspension is stirred for about 1 hour. The stirring is then stopped and the suspension is filtered. The cake is washed with 2 portions of 15 ml of methanol. The wet solid is drained and then dried under reduced pressure (6 kPa) at a temperature of 50 ° C. After approximately 18 hours of drying, 490 mg of pure depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained. The yield obtained is 65%. '
Caractéristique de l’HTBPM dépolymérisée ainsi obtenueCharacteristic of the depolymerized HTBPM thus obtained
Poids moléculaire moyen : 2000 DaltonsAverage molecular weight: 2000 Daltons
Indice de polydispersité : 1.1Polydispersity index: 1.1
Activité anti-Xa : 205 Ul/mgAnti-Xa activity: 205 IU / mg
Exemple 5 : HTBPM obtenue par le procédé selon l’invention comprenant une étape d’estérification à Estérification à 96 % et une étape de dépolymerization par le tert-Butylimino-tris(dimethyamino) phosphorane . Dépolymérisation de l’HTBPM ester de benzyle, sel de benzéthonium (étape d) du procédé): 3,67 g (2,3 mmoles) d’HTBPM ester de benzyle, sel de benzéthonium obtenue selon l’exemple 4 (estérifié à 96 %) avec une teneur en eau de 0,23 %, sont chargés dans un tricol de 50 ml avec 30 ml de dichlorométhane sec. Le mélange est porté à 30°C. On ajoute 595 μΐ (2,3 mmoles) de tert-Butylimino-tris(dimethylamino) phosphorane et on agite 24 h à 30°C. . Transformation du sel d’ammonium quaternaire en sel de sodium (étape e) du procédé)Example 5: HTBPM obtained by the process according to the invention comprising an esterification step at 96% esterification and a depolymerization step with tert-butylimino-tris (dimethylamino) phosphorane. Depolymerization of the benzyl ester HTBPM, benzethonium salt (step d) of the process): 3.67 g (2.3 mmol) of benzyl benzyl ester HTBPM, benzethonium salt obtained according to Example 4 (esterified at 96.degree. %) with a water content of 0.23%, are loaded in a three-necked 50 ml with 30 ml of dry dichloromethane. The mixture is brought to 30 ° C. Tert-Butylimino-tris (dimethylamino) phosphorane (595 μΐ, 2.3 mmol) is added and the mixture is stirred at 30 ° C. for 24 hours. . Transformation of quaternary ammonium salt into sodium salt (step e) of the process)
Pendant ce temps, 160 ml d’une solution méthanolique d’acétate de sodium à 10 % sont préparés dans un erlenmeyer de 250 ml. Le mélange réactionnel est coulé dans la solution méthanolique en maintenant la température à environ 4°C. La suspension est agitée approximativement 1 h à température ambiante. On laisse sédimenter pendant environ 1 h. Le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (120 ml). On agite environ 30 minutes et laisse sédimenter 30 minutes. Le surnageant est à nouveau écarté et remplacé par la même quantité de méthanol (125 ml). On agite pendant environ 15 minutes et on filtre. Le gâteau est lavé par 3 fois 40 ml de méthanol, essoré et séché environ 18 h à une température voisine de 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 982 mg d'HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium. Le rendement obtenu est de 65 %. '*·· . Saponification de l’HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium (étape fl du procédé) : 980 mg (1,49 mmoles) d'HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium, sont solubilisés dans 10 ml d’eau. La solution est chargée dans un ballon tricol de 100 ml. On introduit 246 μί (2,45 mmoles) de lessive de soude à 30 % à une température voisine de 4°C. On agite pendant environ 2 h à cette température. La solution est neutralisée par addition d’acide acétique glacial (100 %). On ajoute ensuite 4,9 g d’acétate de sodium solide et 95 ml de méthanol. La suspension est agitée 30 minutes puis on laisse sédimenter pendant environ 1 heure. Le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (60 ml). On agite encore environ 30 minutes puis on laisse sédimenter environ 16 heures. Le surnageant est écarté puis remplacé par la même quantité de méthanol (60 ml). On agite pendant environ 30 minutes et on filtre sur membrane de 0,45 gm. Le gâteau est lavé par 2 fois 10 ml de méthanol, essoré puis séché approximativement 18 h à 50°C sous pression réduite (6 kPa). On obtient 809 mg d’HTBPM dépolymérisée brute, sel de sodium.During this time, 160 ml of a 10% sodium acetate methanol solution are prepared in a 250 ml Erlenmeyer flask. The reaction mixture is poured into the methanolic solution while maintaining the temperature at about 4 ° C. The suspension is stirred for approximately 1 h at room temperature. It is allowed to settle for about 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced with the same amount of methanol (120 ml). Stir about 30 minutes and allow to sediment 30 minutes. The supernatant is again discarded and replaced with the same amount of methanol (125 ml). Stir for about 15 minutes and filter. The cake is washed with 3 times 40 ml of methanol, drained and dried for about 18 h at a temperature of 50 ° C under reduced pressure (6 kPa). 982 mg of crude depolymerized HTBPM, sodium salt are obtained. The yield obtained is 65%. '* ··. Saponification of crude depolymerized HTBPM, sodium salt (process step): 980 mg (1.49 mmol) of crude depolymerized HTBPM, sodium salt, are solubilized in 10 ml of water. The solution is loaded into a 100 ml three-neck flask. 246 μί (2.45 mmol) of 30% sodium hydroxide solution are introduced at a temperature in the region of 4 ° C. It is stirred for about 2 hours at this temperature. The solution is neutralized by addition of glacial acetic acid (100%). 4.9 g of solid sodium acetate and 95 ml of methanol are then added. The suspension is stirred for 30 minutes and then allowed to settle for about 1 hour. The supernatant is discarded and then replaced by the same amount of methanol (60 ml). Stirring is continued for about 30 minutes and then allowed to settle for about 16 hours. The supernatant is discarded and then replaced by the same amount of methanol (60 ml). The mixture is stirred for about 30 minutes and filtered through a 0.45 μm membrane. The cake is washed twice with 10 ml of methanol, drained and then dried for approximately 18 h at 50 ° C. under reduced pressure (6 kPa). 809 mg of crude depolymerized HTBPM, sodium salt are obtained.
Le rendement de la réaction est de 91,6 %. . Purification de l’HTBPM dépolymérisée brute -sel de sodium- étape f2 du procédé : 792 mg d’HTBPM dépolymérisée brute (sel de sodium) sont chargés dans un tricol de 25 ml avec 8 ml d’eau. La solution est portée 10 minutes à 40 °C. Le pH est amené à environ 9,5 par addition de soude 0,1 N. La solution est filtrée sur membrane 0,45 gm, puis 39,6 gl d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène à 30 % sont ajoutés. Le mélange est agité 2 h à température ambiante en maintenant le pH constant à 9,5 ±0,1 par addition de soude 0,1 N. Le mélange réactionnel est neutralisé par HCl IN et 1,04 g de NaCl sont additionnés. Après environ 10 minutes d’agitation, la solution est filtrée sur membrane 0,45 μτη. 7,3 ml de méthanol sont coulés à une température voisine de 4°C. La solution est agitée pendant 15 minutes à température ambiante. On ajoute 18,8 ml de méthanol et la suspension est agitée pendant environ 1 h. L'agitation est alors arrêtée puis on filtre. Le gâteau est lavé par 3 portions de 15 ml de méthanol. Le solide humide est essoré puis séché sous pression réduite (6 kPa), à une température voisine de 50°C. Après 18 heures de séchage, on obtient 538 mg d’HTBPM dépolymérisée pure (sel de sodium). Le rendement obtenu est de 67,9 %.The yield of the reaction is 91.6%. . Purification of crude depolymerized HTBPM-sodium salt-step f2 of the process: 792 mg of crude depolymerized HTBPM (sodium salt) are loaded into a 25 ml three-necked flask with 8 ml of water. The solution is heated for 10 minutes at 40 ° C. The pH is brought to about 9.5 by addition of 0.1N sodium hydroxide. The solution is filtered through a 0.45 μm membrane and then 39.6 g of a 30% aqueous solution of hydrogen peroxide are added. The mixture is stirred for 2 hours at ambient temperature while maintaining the pH constant at 9.5 ± 0.1 by addition of 0.1 N sodium hydroxide. The reaction mixture is neutralized with 1N HCl and 1.04 g of NaCl are added. After stirring for approximately 10 minutes, the solution is filtered through a 0.45 μτη membrane. 7.3 ml of methanol are cast at a temperature in the region of 4 ° C. The solution is stirred for 15 minutes at room temperature. 18.8 ml of methanol are added and the suspension is stirred for about 1 hour. The agitation is then stopped and then filtered. The cake is washed with 3 portions of 15 ml of methanol. The wet solid is drained and then dried under reduced pressure (6 kPa) at a temperature of 50 ° C. After 18 hours of drying, 538 mg of pure depolymerized HTBPM (sodium salt) are obtained. The yield obtained is 67.9%.
Caractéristique de l’HTBPM dépolymérisée ainsi obtenueCharacteristic of the depolymerized HTBPM thus obtained
Poids moléculaire moyen : 2100 DaltonsAverage molecular weight: 2100 Daltons
Indice de polydispersité : 1.1Polydispersity index: 1.1
Activité anti-Xa : 209 Ul/mgAnti-Xa activity: 209 IU / mg
Exemple 6 : HTBPM obtenue par le procédé selon l’invention comprenant une étape supplémentaire de séparation par chromatographie en éliminant les fractions disaccharides et tetrasaccharidesExample 6: HTBPM Obtained by the Process According to the Invention Comprising an Additional Chromatography Separation Step by Eliminating Disaccharide and Tetrasaccharide Fractions
Le mélange d’oligosaccharides décrit à l’exemple 1 (286 mg) est solubilisé dans 20 ml de phase mobile (solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 0.2 moles /1). Les conditions chromatographiques sont les suivantes : - Phase mobile : solution de bicarbonate de sodium à 0.2 moles/1 - Phase stationnaire : Gel biogel P6 - Colonne : Longueur 1 m, Diamètre 5 cm. - Longueur d’onde de détection : 240 nm.The oligosaccharide mixture described in Example 1 (286 mg) is solubilized in 20 ml of mobile phase (aqueous solution of sodium bicarbonate at 0.2 mol / l). The chromatographic conditions are as follows: - Mobile phase: 0.2 mol / l sodium bicarbonate solution - Stationary phase: Biogel gel P6 - Column: Length 1 m, Diameter 5 cm. - Detection wavelength: 240 nm.
Les fractions supérieures ou égales à un hexasaccharide sont collectées et rassemblées. Elles sont neutralisées par de l’acide acétique puis concentrées jusqu’à l’obtention d’une solution à 200 g/1 d’acétate de sodium. A la solution obtenue et sous agitation, on ajoute 5 volumes de méthanol. La suspension est agitée pendant environ 18h, puis fitrée sur membrane 0,45 pm. Le gâteau est séché pendant environ 6 h à une température voisine de 40°C sous pression réduite (6kPa). Le produit obtenu est re-précipité puis dissdus dans un minimum d’eau et désalé sur colonne Sephadex G10. Après concentration des fractions désalées puis lyophilisation, on obtient 109 mg de produit. Le rendement est de 38 %.Fractions greater than or equal to one hexasaccharide are collected and pooled. They are neutralized with acetic acid and then concentrated until a solution of 200 g / l of sodium acetate is obtained. To the resulting solution with stirring, 5 volumes of methanol are added. The suspension is stirred for about 18h and then applied to a 0.45 μm membrane. The cake is dried for about 6 h at a temperature of 40 ° C under reduced pressure (6 kPa). The product obtained is re-precipitated and then dissolved in a minimum of water and desalted on Sephadex G10 column. After concentration of the desalted fractions and freeze-drying, 109 mg of product are obtained. The yield is 38%.
Les caractéristiques du mélange d’oligosaccharides ainsi obtenue sont les suivantes :The characteristics of the oligosaccharide mixture thus obtained are as follows:
Activité anti-Xa : 403 Ul/mg .Le pourcentage des oligosaccharides est le suivant :Anti-Xa activity: 403 IU / mg. The percentage of oligosaccharides is as follows:
Activité pharmacologique des composés selon l’invention :Pharmacological activity of the compounds according to the invention
Pourcentage en hexasaccharide Δ Ha-ïïs-Is des composés selon l’invention :Percentage of hexasaccharide ΔHa-Isos-Is compounds according to the invention:
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