NO873385L - Oksiran-pseudooligosakkarider, fremgangsmaate til deres fremstilling, deres anvendelse og farmasoeytiske preparater. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører biologisk aktive oxiran-pseudooligosakkarider og deres fysiologisk tålbare salter. De har a-glukosidase, dvs. f.eks a-amylase- og disakkaridasehemmende egenskaper, og kan derfor anvendes i human- og dyremedisin,

i dyreernæring samt i bioteknologien og stivelse.

I den europeiske patentsøknad med publikasjonsnr. 0173948 (EP-A2-0 173 948 tilsvarende US-PS 4 632 917) omtales pseudooligosakkarider med a-glukosidasehemmende virkning og med formel III

hvori

1=1 eller 2

m = 1, 2 eller 3

n = et helt tall på 1-20.

Ved de omtalte forbindelser dreier det seg om potente inhibitorer, i det følgende også betegnet som inhibitorer av typen W-46 som, på grunn av deres virkning og glukosidhydro-laser av fordøyelseskanalen kan anvendes som resepsjons-forsinkere av glukose ved behandlinger av diabetes, adipositas o.l. De fremstilles av kulturvæsken av inhibitor W-46-dannende organismer som f.eks. Streptomyces galbus subsp.

FH 1716 (DSM 3007). Man får bare den omstendelige fremgangs-måteenhetlige stoffer, ofte fremstiller man en blanding av forskjellige inhibitorer som adskiller seg i lengden av de glukoseholdige kjeder. Denne uenlighet hindrende for en sikker dosering og standardisering, den er av ulempe ved anvendelse av preparatet.

Det er nu funnet at ved sur hydrolyse eller enzymatisk glu- koseavspaltning fra den native inhibitorblanding tilsvarende søknad EP-A2 0 173 948 lar seg fremstille høyaktive avbyg-ningsprodukter som med egnede metoder lett spaltes fra hver-andre, kan fremstilles i ren form.

Oppfinnelsen vedrører derfor oxiran-pseudooligosakkarider

med formel I

hvori Z = 0 eller 1,

samt deres fysiologisk tålbare salter med syrer. De to under formel I fallende inhibitorer har følgende formel Ia og Ib

Pseudooligosakkarider med formel Ia og dets salter betegnes i det følgende også som inhibitor W-4 6-H og pseudooligosakkarider med formel Ib samt dets salter som inhibitor W-46 P- Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåte til fremstilling av inhibitorene W-4 6 H og P, farmasøytiske preparater som inneholder disse forbindelser og deres anvendelse som lege-middel, diagnostikum og reagens.

Fremgangsmåten til fremstilling av inhibitorene W-46 H og W-46 P erkarakterisert vedat man

a) fra en a-glukosidaseinhibitor med formel II

hvori

m = 2 eller 3

n = et helt tall på 1-20,

eller det er en blanding av disse inhibitorer med kjemiske eller biokjemiske metoder, under dannelse av en forbindelse med formel I avspaltet sukker, eller b) kultiverer et pesueooligosakkarid med formel I frembringende streptomycetes i et fermenteringsmedium i egnet sub-mersfremgangsmåte, isolerer inhibitorene fra mycelet eller kulturfiltratet på i og for seg kjent måte og renser, øver-fører de dannede forbindelser med formel I eventuelt til fysiologisk tålbart salt.

Av streptomyceter egner det seg spesielt Streptomyces galbus subsp. FH 1716 for gjennomføring av fremgangsmåten. Denne stamme er deponert ved Deutschen Sammlung von Mikroorganis-men (DMS) under registreringsnr. DSM 3007 og omtalt i EP-A2-0 173 948. Det kan også anvendes varianter og mutanter

av denne stamme til fremstilling av inhibitorene W-46 H

og W-46 P .

Inhibitorer med formel II og fremgangsmåte til deres fremstilling er omtalt i EP-A2-0 173 948. Ved avspaltning av sukker som f.eks. glukose, oppstår ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med sakkaridkjeden forkortede enhetlige inhibitor. Inhibitorene W-46 H og W-46 P fremstilles fortrinnsvis ifølge metode a.

Ved fremstillingen går man fortrinnsvis frem som følger:

Som utgangsmateriale tjener inhibitoren med formel II (sammenlign EP-A2-9 173 948) enten i anriket eller i kjemisk renset form. Det kan imidlertid også anvendes de rå uren-sede fermenteringsoppløsninger av W-46 dannende organismer. Avspaltningen av inhibitorenes forskjellige lange glukose-kjeder foregår f.eks. ved sur hydrolyse med svovelsyre, saltsyre, trifluoreddiksyre o.l. i temperaturområder 0°

til 120°C, fortrinnsvis 80-105°C. Hydrolysevarigheten utgjør avhengig av temperaturen noen minutter til flere dager.

Fortrinnsvis arbeider man i området på 20-200 minutter.

En annen mulighet til avspaltning av nøytralsukkere som f.eks. maltose og glukose fra inhibitorene og blandingene ifølge EP-A2 0173 948 består i anvendelse av a-glukosid-spaltende enzymer. Det er funnet at i motsetning til varm-blodsenzymer, er noen mikrobielle a-amylaser meget vel istand til å forkorte inhibitorene av W-46 typen som f.eks. W-46

A, W-46 B eller W-46 C o.l., (sammenlign EP-A2-0' 17.3 948- 1 med nøytralsukkeravspaltning og dermed å enhetliggjøre.

Slike enzymer er f.eks. -amylasen fra Bacillus subtilis eller Bacillus licheniformis (begge spesielt egnet for fremstilling av W-46 H), kan imidlertid også anvendes amylaser fra andre egnede mikroorganismer. Fortrinnsvis anvendes a-amylser fra termofile eller termotolererbare mikroorga- . nismer hvis enzymer også hår et høyere temperaturomtimum. Slike amylaser fører ved de forhøyede temperaturer til høyere reaksjonsgrader, dvs. til fordelaktig kortere reak-sjonstider. Ved hjelp av slike egnede enzymer lar det seg omsette 0,01 til 20, fortrinnsvis 0,5 til 5%-ige inhibitor-opplønsninger i gode utbytter. pH-verdien og temperaturen velges derved i avhengighet av enzyme-egenskapene. Det kan arbeides mellom 0° og 100°C, foretrukket blir området mellom 30° og 80°C.

Ved styring av fermentasjonstiden ved den mikrobielle fremstilling, (ifølge fremgangsmåte b) eller variasjon av glu-koseavspaltningen eller hydrolysetiden), ifølge fremgangsmåte a), kan det enten fortrinnsvis fremstilles inhibitorer W-46 H eller W-46 P. Fra fermenterings- eller reaksjons-oppløsningene kan inhibitorene ved i og for seg kjente fremgangsmåter isoleres og renses.

Hertil egner det seg et stort antall fremgangsmåter som eksempelvis kromatografi på ioneutvekslere, molekylarsjikt eller.adsorbsjonsharpikser, dessuten oppløsningsmiddel-fellinger, ultrafiltrering, Craig-fordeling o.l.

En foretrukket fremgangsmåte til isolering og rensing av inhibitorene W-46 H respektive P, består i at man adsorberer inhibitorene fra det f.eks. som omtalt ovenfor behandlede kulturfiltrat, eller av reaksjonsoppløsningen på en egnet harpiks f.eks. på polystyrenbasis, adskiller denne oppladede harpiks og isolerer de nevnte inhibitorer ved eluering med egnede bufferoppløsninger, som f.eks. fosfat- eller feno-acetatbufferoppløsninger, eller med eventuelt vannholdige organiske oppløsningsmidler som f.eks. metanol, etanol, aceton, fortrinnsvis imidlertid med vandig isopropanol.

De inhibitorholdige eluater konsentrerer man ved ultrafiltrering på i og for seg kjent måte, idet det samtidig fore-tas en avsaltning. Den ionefattige vandige oppløsning av de nevnte inhibitorer spaltes deretter på en ioneutveksler-søyle kromatografisk på i og for seg kjent måte. Fortrinnsvis anvender man sterke eller svake sure kationeutvekslere, f.eks. på styren-divinylbenzen-kopolymerisatbaser, som som funksjonelle grupper har SO^H eller -COOH-grupper ("Dowex 50 W", "Amberlite" CG 120) eller på basis av modifisert sulfopropylcellulose (SP-"Sephadex") som ioneutveksler,

som brukbar er imidlertid også et stort antall andre vanlige kationutvekslere. Det siste trinn av isoleringen er anvendelsen av en molekylarsikt, f.eks på polyakrylamid-gel-basis ("Biogel" P-6) eller på basis modifisert cellulose ("Sephadex"). De resulterende vandige oppløsninger av det rene materiale tørkes, deretter f.eks. ved lyofilisering.

De rene inhibitorene W-46 H og W-46 P er fargeløse, amorfe pseudooligosakkarider. De inneholder nitrogen og har svakt basisk karakter Således vandrer inhibitorene W-46 H og P i høyspenningselektroforesen i sure puffere, som f.eks. vandige maursyre/eddiksyre-blandinger som kantioner i ret-ning katoden. Stoffene ifølge oppfinnelsen har reduserende egenskaper, som, som vanlig i sukkerkjemien, kan påvises f.eks. med trifenyltetraazoliumklorid (TCC).

De ved hjelp av FAB-massespektrometere bestemte molekylvek-ter av de rene forbindelser utgjør 981 m/z (M+H<+>) tilsvarende summeformelen COD<H>r.N„0„_ av inhibitoren W-46 H (fri base)

JO D 4 Z /LI

respektive 819 m/z (M+H<+>) tilsvarende summeformelen<C>32<H>54<N>2°22 aV i-nn;i-bi-toren W-46 P (fri base). Ved spektro-skopiske, spesielt kjerneresonansspektroskopisk undersøkelser ble forbindelsene tilordnet

W-46 H formel Ia og

W-46 P formel Ib.

I litteraturen er det allerede omtalt flere a-glukosidase-inhibitorer, imidlertid bare de av H.Takeda et al. (Japan KOKAI 83-172.400 (11. oktober 1983)) omtalte forbindelses-rekke: NS 1 til NS 17 inneholder epoksydringer (oxdraner)

i strukturformlene. Epoksyd-strukturen forekommer respektivt bare en gang.

Med formlene Ia og Ib hvori det virksomme epoksyd-pseudo-amino.sukker-strukturer er tilstede to ganger, adskiller forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen seg fra inhibitorene av rekken NS 1 til NS 17. I forhold til pseudooligosakkarider med a-glukosidasehemmende virkning ifølge EP-

A2- 0 173 948 er W-46 H og W-46 P adskillbar ved de forkortede sakkaridkjeder (mindre molekylvekt). Således foreligger her nye stoffer som har en enhetlig struktur.

Såvel inhibitor W-46 H som også W-46 P hemmer sterkt a-amylasen fra pankreas og disakkaridasene fra tynntarmmucosa, spesielt den rørsukkerspaltende sakkarase. De spesifike aktiviteter utgjør 4 x 10 4 a-amylaseinhibitorenheter (AIE)

pr. mg respektiv 1 x 10 4 sakkaraseinhibitorenhet (SIE) pr.

4 4

mg for W-46 H og 1 x 10 AIE pr. mg respektiv 3 x 10 SIE

pr. mg for inhibitoren W-46 P. Aktivitetene ble bestemt i følgende prøver:

Amylaseprøve.

En amylaseinhibitorenhet (AIE) e-r definert som den inhibitor-mengde som under prøvebetingelsene formår å hemme to amylaseenheter (AE) til 50%. En amylaseenhet er ifølge internasjonal overenskomst den enzymmengde som i løpet av 1 minutt spalter 1 u ekvivalent glukosidiske bindinger i stivelsen. De |aVal spaltede glukosidiske bindinger bestemmes... som^Val-reduserende sukker fotometrisk med dinitroalicyl-syre. Omgivelsene beregnes som umol maltose som fastslås ved hjelp av en maltose-vurderingsgrad.

Prøvene gjennomføres på følgende måte:

a-amylase fra svinepankreas og de oppløsninger som skal undersøkes forinkuberes sammen i 1,0 ml 20 mM fosfatpuffer,

pH 6,9 - 10 mM NaCl i 10-20 min. ved 37°C. Den enzymatiske reaksjonen startes ved tilsetning av 1,0 ml oppløselig stivelse (0,25% i den angitte puffer) iflge Zulkowski. Etter nøyaktig 10 min. stoppes reaksjonen med 2,0 ml dinitrosali-zylsyre-fargereagens (ifølge Boehringer Mannheim: Bio-chemica-Informasjon II) oppvarmes til fargefremkalling i

iiL.i n. i kokende vannbad. Etter avkjøling måles ekstinksjo-nen ved 546 nm mot reagens blindverdien. Den 50%-ige hemming bestemmes sammenlignet til uhemmet enzymreaksjon ved anvendelse av forskjellig inhibitormengder grafisk ved hjelp av sannsynlighetsoppføring.

Sakkaraseprøve.

En sakkaraseinhibitorenhet (SIE) er definert som den inhibi-tormengde, som under prøvebetingelsene formår å hemme to sakkaraseenheter (SE) til 50%. En SE er ifølge internasjo-nale overenskoms den enzymmengde som i løpet av et minutt spalter 1 u ekvivalent glukosidiske bindinger av sakkarosen. De [ iVal spaltede glukosidiske bindinger bestemmes som 2

uVal fotometrisk med heksokinase/glukose-6-fosfatdehydro-genasemetoden. Angivelsene er beregnet som umol heksoser som ble fastslått ved hjelp av en glukosevurderingsmidtlinje.

Prøvene ble gjennomført ifølge H.U.Bergmeyer, omtalt i "Methods of Enzymatic Analysis", 3. utg., Verlag Chemie, Weinheim, 1984, side 96-103.

Egenskapene av inhibitorene ifølge oppfinnelsen er interes-sante med hensyn til den anvendelsen som terapeutikum mot diabetes og prediabetes samt adipositas og understøttelse av diett. På grunn av deres egenskaper er de også verdifulle som reagens for diagnostiske formål. Oppfinnelsen omfatter derfor også legemidler, spesielt slike til behandling av de nevnte sykdommer, samt anvendelsen som legemidler spesielt som anti-diabetikum samt som reagens.

Stivelses- og rørsukkerholdige nærings- og nytelsesmidler fører hos dyr og mennesker til en økning av blodsukkeret og derved også til en øket insulinsekresjon av pankreas. Hyperglukemi kommer istand ved oppspaltning av stivelsen

og rørsukker i fordøyelseskanalen under innvirkning av amylase og sakkarase til glukose.

Hos diabetikere er hyperglukemi spesielt utpreget og lang-

varig.

Den alimentære hyperglukemi samt hyperinsuliemi etter stivelses- og rørsukkeropptak lar seg nedsette ved inhibitorene W-46 H og W-46 P ifølge oppfinnelsen. Denne virkning er dosisavhengig. a-glukosidaseinhibitorene ifølge oppfinnelsen lar seg derfor anvende som terapeutikum ved diabetes, prediabetes og adipositas samt til understøttelse av diett. For dette formål lønner det seg med en administrering, spesielt til måltidene. Doseringen som skal rette seg etter pasientens vekt samt det individuelle behov, utgjør 5-500 mg pr. dose som hensiktsmessig tas til hvert måltid. Doseringen kan imidlertid i begrunnede enkelttilfeller også ligge høyere eller lavere.

a-glukosidaseinhibitorene ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt til oral administrering. De kan anvendes som stoff i og for seg som deres fysiologisk tålbare salter med syrer, men også i form av en farmasøytisk tilberedning under anvendelse av de vanlige hjelpe- og bæ-restof f er. Også en kombinert anvendelse med andre legemidler som blodsukkersenkende eller lipidsenkende stoffer kan være av fordel. Da høyere moleky-lære sakkarider som sådan ikke, eller ikke nevneverdig, resporberes av fordøyelseskanalen, er det ikke av stoffene ifølge oppfinnelsen å vente noen toksikologisk uheldig bi-virkning .

Følgelig kunne det etter oral inngivning også av høyere doser av inhibitorene W-46 H og P på forsøksdyr ikke ses påfallende symptomer.

For undersøkelse av den farmakologiske virkning av a-glukosidaseinhibitoren fikk nøkterne hann-Wistar-rotter med en vekt mellom 200 og 250 g et hem-stoff W-46 H eller W-46

P ifølge oppfinnelsen sammen med 2 g stivelse, respektive rørsukker pr. kg legemsvekt som suspensjon "Tylose" (metyl-hydroksyetylcellulose) administrert oralt. Ved bestemmelse av blodsukkerkonsentrasjonen i blodprøver som var tatt før, under og etter p.o. applikasjon av a-glukosidaseinhibitoren, ble preparatenes virkning bevist.

I disse undersøkelser ble det fastslått ved forinhibitor W-46 H de i tabell 1 (virkning på blodglukosekonsentrasjonen hos stivelsesbelastet rotte) og 2 (virkning på glodglukose-konsentrasjonen av rørsukkerbelastede rotter) oppstilte verdier.

Fra de i tabell I angitte verdier beregner det seg en grenseverdi på 0,27 mg/kg rotte og fra de i tabell II angitte verdier en grenseverdi på 1,29 mg/kg rotte (med grenseverdi av det virksomme stoff forstås det en mengde pr. kg forsøks-dyr ved hvis administrering det etter 1 time ennu er å fast-slå en tydéligvvirkning).

Ved siden av blodglukoseregulering kan man anvende oligo-sakkaridene ifølge oppfinnelsen også til hemming av spytt-a-amylase. Dette enzym bevirker fordøyning av stivelse i munnen og det således dannede sukker befordrer tennenes caries-angrep. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes til å hindre eller nedsette dannelsen av caries.

Videre kan de anvendes som biokjemiske reagenser så som diagnostiske midler.

Eksempel 1.

5,0 g inhibitorblanding med komponent W-46 A, W-46 B og W-46 C, fremstiller tilsvarende -angivelsene i EP-A2-0 173

948 (eksempel 1 og 2), oppløses i 80 ml 2 N trifluoreddiksyre og oppvarmes i 10 minutter eller under oksygenuteluk-kelse ved 100°C. Etter utløp av denne tid avkjøles hurtig reaksjonskaret under omrøring og den vandige trifluoreddiksyre avdestilleres i vakuum til tørrhet.

Til fremstilling av de forkortede inhibitorer oppløses det faste destillasjonsresiduet i destillert vann og påføres på en med ioneutveksler

"SP Sephadex" C-25 fylt og til pH 3 ekvilibrert søyle av 3 liters innhold. Elueringen av det virksomme stoff foregår ved anlegg av en økende 50.mM NaCl-gradient. Mens kokesalt-konsentrasjonen med en ledningsevne på 3,0 mS, oppløser inhibitoren W-46 H fra søylen, foregår elueringen av forbindelsen W-46 P ved en ledningsevne på 4 mS. Adskillelsen.

av de samlede eluater konsentreres for avsaltning ved ultrafiltrering veds 35 bar og frysetørkes deretter. Det frem-

kommer 0,7 g av en inhibitor W-46 H og 1,6 g inhibitor W-

46 P (respektiv som hydroklorider).

Eksempel 2

65 g inhibitorblanding, fremstilt ifølge EP-A2-0 173 948 (eksempel 1,2) oppløses i 6,5 1 vann og pH-verdien innstilles på 7,5. Deretter tilsettes 1 g a-amylase fra Bacillus subtilis 130 U/mg og omrøres 18 timer ved 60°C. I løpet av denne tid påser man at pH-verdien forblir konstant.

Etter forløp på denne reaksjonstid filtreres den resulterende oppløsning ved værelsestemperatur over 4 liter 20 poly-styren-adsorbsjonsharpiks ("Diaion" HP-20). Under det så-kalte gjennomløp som inneholder uønskede forurensninger, nøytralsukker og salter, fremstiller man inhibitoren W-46

H ved vasking av søylen med 20 1 10%-ig isopropanol-oppløs-ning. Tørking fører til den ønskede inhibitor. Skulle her forbindelsen W-4 6 H ikke fremkomme rent nok, så kan det foregå en videre rensning på ioneutveksleren som omtalt i eksempel 1.

Eksempel 3.

10 av inhibitoren W-46 H fremstilt ifølge eksempel 1 oppløses i 200 ml vann og filtreres over 200 ml ioneutveksler IRA-

68, OH-form, som fylles i en glass-søyle. Deretter etter-vaskes med 200 ml vann. Eluatene forenes. De inneholder inhibitoren i form av den frie base. Oppløsningen deles nu i 4 like deler. Hver gang 1/4 innstilles med glukoron-syre respektiv med svovelsyre respektiv med saltsyre på

pH 6 og frysetørkes likelede som den 4. 1/4 som ikke nøytra-liseres. Sistnevnte oppløsning gir etter tørkning 2,3 g W-46 H (fri base) med 4 x IO<4>AIE/mg og 1 x IO<4>SIE/mg,

de andre oppløsninger gir 2,5 g glukoronsurt W-46 H, spesi-

4 3

fik aktivitet 3,6 x 10 AIE/mg og 9 x 10 SIE/mg respektivt 2,4 g svovelsurt W-46 H, spesifik aktivitet 3,8 x 10<4>AIE og 9,6 x 10<3>SIE/mg respektivt 2,34 g saltsurt W-46

4 4

H, spesifik aktivitet 3,9 x 10 AIE/mg og 1 x 10 SIE/mg.

Eksempel 4.

10 g ct-glukosidaseinhibitor W-46 P ifølge eksempel 1 behand-les som omtalt i eksempel 3 med W-46 H. Det fremkommer 2,4 g W-46 P fri base med 1 x 10 4 AIE/mg og

4

1 x 10 AIE/mg og

3 x IO<4>SIE/mg,

2,6 g W-46 P-glukoronat,

2,3 g W-46 P-sulfat,

2,3 g W-46 P-klorid.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av oksiran-pseudooligosakkarider med formel I

hvori

52 = 0 eller 1, samt deres fysiologisk tålbare salter med syrer, karakterisert ved ata) fra en a-glukosidaseinhibitor med formel II

hvori m = 2 eller 3 n = et helt tall på 1-20, eller fra en blanding av disse inhibitorer avspaltes med kjemisk eller biokjemiske metoder under dannelse av en for-bindeles med formel I sukker, eller b) et pseudooligosakkarid med formel I frembringende streptomycet kultiveres i et fermenteringsmedium i egnet submers-fremgangsmåte, pseudooligosakkaridet isoleres fra mycelet eller kulturfiltratet på i og for seg kjent måte og renses, og de dannede forbindelser med formel I overføres eventuelt i et fysiologisk tålbart salt.

2. Fremgangsmåte til fremstilling av et farmasøytisk preparat karakterisert ved at et oksiran-pseudooligosakkarid med den i krav 1 angitte formel I eller et fysiologisk tålbart salt herav, overføres i en egnet administreringsform.

3. Anvendelse av oksiran-pseudooligosakkarider ifølge krav 1 som diagnostikum, reagens eller profylaktikum mot caries.