NO345613B1 - Insulinoligomerkonjugater, formuleringer og bruk derav - Google Patents

Insulinoligomerkonjugater, formuleringer og bruk derav Download PDF

Info

Publication number
NO345613B1
NO345613B1 NO20170341A NO20170341A NO345613B1 NO 345613 B1 NO345613 B1 NO 345613B1 NO 20170341 A NO20170341 A NO 20170341A NO 20170341 A NO20170341 A NO 20170341A NO 345613 B1 NO345613 B1 NO 345613B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
insulin
insulin compound
solution
added
him2
Prior art date
Application number
NO20170341A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20170341A1 (no
Inventor
Nnochiri N Ekwuribe
Michelle Ferro
Kenneth James
Navdeep B Malkar
Mark A Miller
Diti Aggarwal
Leo Pavliv
Karen Polowy
Karen Puskas
Original Assignee
Biocon Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocon Ltd filed Critical Biocon Ltd
Publication of NO20170341A1 publication Critical patent/NO20170341A1/no
Publication of NO345613B1 publication Critical patent/NO345613B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/30—Zinc; Compounds thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/28—Mercury; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/2018—Sugars, or sugar alcohols, e.g. lactose, mannitol; Derivatives thereof, e.g. polysorbates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

INSULINOLIGOMERKONJUGATER, FORMULERINGER OG BRUK DERAV
Foreliggende oppfinnelse angår nye insulinforbindelseskonjugater der et insulin eller en insulinanalog kobles til en modifiserende del. Oppfinnelsen angår også kationkomplekser av slike insulinforbindelseskonjugater og farmasøytiske formuleringer som inkluderer slike insulinforbindelseskonjugater og/eller deres modifiserende deler.
Sinkkompleksdannende insulinforbindelser er kommersielt tilgjengelige, for eksempel under varemerkene HUMULIN<® >og HUMALOG<®>. Sinkkompleksinsulin eksisterer typisk i heksamer form.
Forskjellige metoder har vært beskrevet for bruk av sink i krystalliseringen av acetylert insulin. For eksempel beskriver US publ.2001/0041786 av 15.11.01 i navnet Mark L. Brader et al., og med tittelen "Stabilized acylated insulin formulations" en formulering der en vandig oppløsning for parenteral avlevering, særlig som injiserbar formulering, med en pH verdi på 7,1 til 7,6, inneholdende et fettsyreacylert insulin eller en fettsyreacylert insulinanalog og stabilisert ved bruk av sink og særlig en fenolisk forbindelse. US 6451970 av 17.09.02, Schaffer et al., i navnet Novo Nordisk A/S og med tittelen "Peptide derivatives" beskriver derivater av insulinforbindelse og insulinanaloger der N-terminalamino-gruppen av B-kjeden og/eller e-aminogruppen av Lys i posisjon B28, B29 eller B30 er acylert ved bruk av langkjedehydrokarbongrupper med fra 12 til 22 karbonatomer og sinkkomplekser derav.
WO00/50012 med tittelen «Solid oral dosage form for containing an enhancer» beskriver en fast oraldoseformulering med en forsterker. Forsterkeren er en medium lengde fettsyreester, eter eller et salt eller et derivativ av den medium lengde fettsyren hvor karbonkjeden er mellom 6 og 20 karbonatomer lang.
Protaminer og fenoliske forbindelser er beskrevet for anvendelse ved krystallisering av acylert insulin. US 6268335 (31.07.01) og 6465426 (10.10.02) i navnet Brader, begge med tittelen "Insoluble insulin compositions", beskriver uoppløselige preparater bestående av acylert insulin, en protaminkompleksdannende forbindelse, en heksamerstabiliserende fenolisk forbindelse, og et toverdig metallkation.
Eksisterende veier er spesielt skreddersydd for krystallisering av nativ insulinforbindelse eller insulinforbindelsesanaloger eller for acylerte insulinforbindelser med økt lipofilisitet i forhold til ikkeacylerte insulinforbindelser. Det foreligger et behov på området for farmasøytisk akseptable komplekser inkludert derivatiserte insulinforbindelser, andre enn acylerte insulinforbindelser, som hydrofile og/eller amfifile insulinforbindelsesderivater, og for stabilisering av ikke-acylerte lipofile insulinforbindelsesanaloger. Det foreligger også et behov på området for nye proteinkonjugater med økt biotilgjengelighet eller andre forbedrede farmakologiske bidrag i forhold til de eksisterende konjugater. Det foreligger et behov på området for nye formuleringer som letter oral avlevering av proteiner og proteinkonjugater. Til slutt er det et behov for en kombinert tilnærmelse for å forbedre den orale biotilgjengelighet for et protein som insulinforbindelse, som inkorporerer et forbedret oralt proteinkonjugat tilveiebrakt i en fast eller forbedret formulering for å maksimalisere fordelene for oral avlevering av proteiner.
Den foreliggende oppfinnelsen er definert av de vedlagte kravene. Innhold i søknaden som er betegnet som «oppfinnelse», «utførelses», «utførelseseksempel», «aspekt», etc. og som strekker seg ut over oppfinnelsens omfang slik det er definert i kravene, utgjør ikke en del av den krevde oppfinnelsen, men tjener bare som bakgrunnsinformasjon for å forbedre forståelsen av oppfinnelsen.
Generelt tilveiebringer oppfinnelsen et kompleks som inkluderer et insulinforbindelseskonjugat med en insulinforbindelse konjugert til en modifiserende del, og et kation, der insulinforbindelseskonjugatet er kompleksdannet med kationet. Insulinforbindelsen kan for eksempel være et nativt insulin eller en insulinanalog. Eksempler på insulinforbindelser inkluderer humaninsulin, lys-proinsulin, des30 insulin, nativ proinsulin, kunstige proinsuliner, og så videre. Kationkomponenten kan for eksempel være et toverdig metallkation valgt fra gruppen bestående av Zn++, Mn++, Ca++, Fe++, Ni++, Cu++, Co++ og Mg++.
Den modifiserende del kan velges for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet mer, mindre eller like oppløselig sammenliknet med den tilsvarende, ikke-konjugerte insulinforbindelse. Den modifiserende del er fortrinnsvis valgt for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet minst 1,05, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5 eller 15 ganger mer oppløselig enn en tilsvarende, ikke-konjugert insulinforbindelse i en vandig oppløsning ved pH rundt 7,4. Fortrinnsvis blir den modifiserende del valgt for å gi et insulinforbindelseskonjugat en vandig oppløselighet som overskrider rundt 1 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 15 g/l, 20 g/l, 25 g/l, 50 g/l, 75 g/l, 100 g/l, 125 g/l eller 150 g/l ved en pH-verdi lik 7,4. Videre blir den modifiserende del valgt for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet likt eller mer oppløselig enn en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse, og vannoppløseligheten for insulinforbindelseskonjugatet reduseres ved tilsetning av sink. I en annen utførelsesform blir den modifiserende del valgt for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet likt eller mer oppløselig enn tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse; vannoppløseligheten for insulinforbindelseskonjugatet reduseres ved tilsetning av sink; og vannoppløseligheten for komplekset er større enn vannoppløseligheten for insulinforbindelsen. I en ytterligere utførelsesform er lipofilisiteten for insulinforbindelseskonjugatet sammenliknet med den tilsvarende opphavs-insulinforbindelse (Krel)er 1 eller mindre enn 1.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også insulinforbindelseskonjugater med en insulinforbindelse konjugert til en modifiserende del. For eksempel tilveiebringer oppfinnelsen insulinforbindelser koblet til en modifiserende del med formelen:
-X-R<1>-Y-PAG-Z-R<2 >(formel VI)
der,
X, Y og Z uavhengig er valgt blant forbindende grupper og hver eventuelt er til stede, og X, hvis til stede, er koblet til insulinforbindelsen via en kovalent binding,
minst en av R<1 >og R<2 >er til stede og er lavere alkyl og kan eventuelt inkludere en karbonylgruppe,
R<2 >er en dekkende gruppe som –CH3, -H, tosylat eller en aktiverende gruppe, og PAG er en rett eller forgrenet karbonkjede som inkorporerer én eller flere alkalenglykoldeler (det vil si oksyalkylendeler) og eventuelt som innarbeider en eller flere ytterligere deler valgt fra gruppen bestående av –S-, -O-, -N- og –C(O)-, og
der den modifiserende del har et maksimalt antall på 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25 tunge atomer.
I en utførelsesform av oppfinnelsen kan en hvilken som helst eller flere av X, Y og Z være fraværende. Når de videre er til stede kan X, Y og/eller Z uavhengig være valgt blant -C(O)-, -O-, -S-, -C-og –N-. I en utførelsesform er Z -C(O)-. I en annen utførelsesform er Z ikke til stede.
I noen utførelsesformer er R<1 >lavere alkyl og R<2 >er ikke til stede. I andre utførelsesformer er R<2 >lavere alkyl og R<1 >er ikke til stede.
I en annen utførelsesform kan den modifiserende del inkludere en rett eller forgrenet, substituert karbonkjede med et skjelett på 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25 atomer valgt fra gruppen bestående av –C, -C-, -O-, =O, -S-, -N-, -Si-. De tunge atomer vil typisk inkludere ett eller flere karbonatomer og ett eller flere ikke-karbon tungatomer valgt fra gruppen bestående av –O-, -S-, -N- og =O. Karbonatomene og ikke-karbon tungatomene er typisk til stede i et forhold på minst 1 karbonatom per ikke-karbon tungatom og særlig minst 2 karbonatomer per hvert ikke-karbon tungatom, spesielt minst 3 karbonatomer per hvert ikke-karbon tungatom. Karbonatomene og oksygenatomene er typisk til stede i et forhold på minst 1 karbonatom per oksygenatom og særlig minst 2 karbonatomer per hvert oksygenatom, spesielt minst 3 karbonatomer per hvert oksygenatom. Den modifiserende del kan inkludere en eller flere delegrupper som forgrenede eller rette C1-6, rette eller lineære grupper, eller et karbonyl. Den modifiserende del vil typisk inkludere hydrogener, og ett eller flere av hydrogenene kan være substituert med et fluor (som er et tungatom, men som ikke skal telles som et tungatom i den ovenfor angitte formulering). Den modifiserende del kan i visse tilfeller spesifikt ekskludere ikke-substituerte alkyldeler. Den modifiserende del kan for eksempel kobles til en tilgjengelig gruppe på en aminosyre, for eksempel en aminogruppe, en hydroksylgruppe eller en fri karboksylsyregruppe på polypeptidet, for eksempel ved en linkergruppe som karbamat, karbonat, eter, ester, amid eller sekundært amin, eller ved en disulfidbinding. Molekylene i den forbindende gruppe telles som en del av den modifiserende del. I en foretrukket utførelsesform er molekylvekten for den modifiserende del mindre enn molekylvekten for den HIM2 modifiserende del.
Foreliggende oppfinnelse inkluderer insulinforbindelseskonjugater med modifiserende deler med formelen:
(formel VII)
der n er 1, 2, 3 eller 4, og m er 1, 2, 3, 4 eller 5; og/eller
(formel VIII)
der n er 1, 2, 3, 4 eller 5 og m er 1, 2, 3 eller 4.
Det vil erkjennes at de nye modifiserende deler, så vel som bruken av slike deler for å modifisere insulin og andre polypeptider, i seg selv er aspekter ved oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nye formuleringer som inkluderer insulinforbindelseskonjugater og/eller kation-insulinforbindelseskonjugater ifølge oppfinnelsen. Foreliggende oppfinnere har overraskende funnet at visse fettsyrepreparater er spesielt brukbare, særlig for oral avlevering av polypeptidene og polypeptidkonjugatene som insulin og insulinforbindelseskonjugater, og/eller oral avlevering av de kation-insulinforbindelseskonjugatkomplekser ifølge oppfinnelsen. I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsens fettsyrepreparater med en eller flere eventuelt mettede C4-, C5-, C6-, C7-, C8-, C9- eller C10-fettsyrer og/eller salter av slike fettsyrer. Foretrukne fettsyrer er kapryl-, kaprin-, myristin- og laurinsyre. Foretrukne fettsyresalter er natriumsalter av kapryl-, kaprin-, myristin- og laurinsyre. Fettsyreinnholdet av blandingen ligger typisk innen et område som har en nedre grense rundt 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 eller 3,0 vektprosent og har en øvre grense på ca.3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 eller 12 vektprosent. I nok en annen utførelsesform ligger fettsyreinnholdet for preparatet innen et område med en nedre grense rundt 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 eller 3,0 vektprosent og har en øvre grense på ca.3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 eller 12 vektprosent, og fettsyreinnholdet for preparatene er typisk over rundt 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 eller 99,9 vektprosent av en enkelt fettsyre og særlig kapryl-, kaprin-, myristin- eller laurinsyre, eller et salt derav.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for behandling av insulindefiktiviteter eller på annen måte å supplere insulin til et individ ved bruk av insulinforbindelseskonjugater, kation-insulinforbindelseskonjugatkomplekser, og/eller formuleringer ifølge oppfinnelsen. Metodene inkluderer generelt administrering av en terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere av insulinforbindelseskonjugatene, kation-insulinforbindelseskonjugatkompleksene og/eller formuleringer ifølge oppfinnelsen til et individ som trenger dette.
Figurene 1-15B viser mikrofotografier av forskjellige krystallinske faststoffer ifølge oppfinnelsen:
Figurene 1 og 2 er mikrofotografier tatt ved bruk av et Zeiss Axiovert mikroskop som viser T-type Zn komplekset av HIM2
30 g/l konsentrasjon, krystaller dyrket i 24 timer.
Figur 3 er et mikrofotografi tatt ved bruk av et Zeiss Axiovert mikroskop som viser T-type Zn komplekset av HIM230 g/l konsentrasjonen, krystaller dyrket i 5 dager.
Figur 4 er et mikrofotografi tatt ved bruk av et Zeiss Axiovert mikroskop som viser R-type Zn komplekset av HIM2 ved
30 g/l krystaller dyrket i 4 dager.
Figur 5 viser et mikrofotografi av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 inneholdende 30
% organisk materiale.
Figurene 6A-10B viser mikrofotografier av forskjellige R-type Zn komplekser av HIM2 laget ved hjelp av organiske oppløsningsmidler.
Figurene 11A-14B viser mikrofotografier av krystaller av forskjellige R-typer ko-krystalliserte Zn komplekser av HIM2 og IN105.
Figurene 15A og 15B viser mikrofotografier av krystaller av forskjellige R-type ko-krystalliserte Zn komplekser av HIM2 og humaninsulin. Oppfinnelsen inkluderer krystaller med morfologiene som er vist i hvilke som helst av figurene 1-15B.
Figurene 16-20 viser museblodglukoseanalyseresultater for HIM2 og forskjellige Zn-HIM2 komplekser:
Figur 16 viser MBGA biopotensprofilene for HIM2.
Figur 17 viser MBGA biopotensprofilene for Zn HIM2 insulinforbindelsesprodukt R type.
Figur 18 viser MBGA biopotensprofilene for Zn HIM2 insulinforbindelsesprodukt T type.
Figur 19 viser MBGA biopotensprofilene for Zn HIM2 insulinforbindelsesprodukt med protamin.
Figur 20 viser glukosereduserende effekt av R type protaminkompleks ved 30, henholdsvis 90 minutter etter dose.
Figurene 21-24 viser MBGA biopotensprofiler for IN-186, IN-192, IN-190, IN-191, IN-189, IN-178,
IN-193, IN-194, IN-185, IN-196 og IN-197.
Figur 25 og 26 viser hundeklemmestudieresultater for Zn-HIM2 komplekser ifølge oppfinnelsen.
Figur 27 og 28 viser hundeklemmestudieresultatene for Zn-IN105 komplekser ifølge oppfinnelsen.
Figur 29 og 30 viser hundeklemmestudieresultater for hunder dosert med IN105 i 3 % vekt/volum kaprinsyrenatriumsalt i en fosfatbuffer uten ytterligere eksipienter.
Figur 31-33 viser hundeklemmestudieresultater for hunder dosert med tabletter inneholdende 6 mg IN105 og 150 mg mannitol, 30 mg Exlotab med 143 mg Caparte med eller uten 143 mg laurat.
Figurene 34-37 viser hundeklemmestudieresultater fra hunder dosert med prototypetablett 150 mg, henholdsvis 280 mg kaprattabletter og med 150 mg/140 mg kaprat/laurattabletter.
De følgende definisjoner gjelder termer som benyttes i beskrivelse og krav. Definisjonene som gis gjelder under hele beskrivelsen hvis ikke annet er sagt. Termer som ikke definert her har den generelle betydning som fagmannen kjenner.
"Addisjon", benyttet under henvisning til en aminosyresekvens, inkluderer forlengelser av en eller flere aminosyrer ved en av eller begge ender av sekvensen så vel som innskudd i sekvensen.
"Kompleks" henviser til en molekylær assosiasjon der en eller flere insulinforbindelser eller insulinforbindelseskonjugater danner koordinatbindinger med ett eller flere metallatomer eller –ioner. Komplekser kan eksistere i oppløsning som et faststoff, som en krystall, mikrokrystall eller et amorft faststoff.
"Kompleksblanding" betyr en blanding med to eller flere forskjellige komplekser, uansett oppløsning eller fast form. Kompleksblandinger kan for eksempel inkludere komplekser med forskjellige insulinforbindelser, forskjellige insulinforbindelseskonjugater, forskjellige hybridkomplekser, forskjellige kationer, kombinasjoner av de foregående, og liknende.
"Hybrid kompleks" betyr et kation-insulinforbindelseskonjugatkompleks med to eller flere forskjellige insulinforbindelser og/eller insulinforbindelseskonjugater.
"Kompleksdannende middel" betyr et molekyl som har en multiplisitet av ladninger og som binder til eller komplekserer med insulinforbindelseskonjugater. Eksempler på kompleksdannende midler som er egnet for bruk ifølge oppfinnelsen inkluderer protaminer, surfen, globinproteiner, spermin, spermidinalbumin, aminosyrer, karboksylsyrer, polykationiske polymerforbindelser, kationiske polypeptider, anioniske polypeptider, nukleotider, og antisense, se for eksempel Brange, J., Galenics of Insulin compound, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1987), hvis beskrivelse anses som del av foreliggende oppfinnelse.
"Konservativ" benyttet for å henvise til en addisjon, delesjon eller substitusjon av en aminosyre betyr en addisjon, delesjon eller substitusjon i en aminosyrekjede som ikke fullstendig forringer den terapeutiske effekt for insulinforbindelsen, det vil si at effektiviteten kan reduseres, være den samme eller forsterkes i forhold til den terapeutiske effektivitet for en vitenskapelig akseptabel kontroll som en tilsvarende nativ insulinforbindelse.
"Hydrofil" betyr å vise karakteristika for vannoppløselighet og "hydrofil del" henviser til en del som er hydrofil og/el-ler som, når den er festet til en annen kjemisk del, øker hydrofilisiteten for en slik kjemisk del. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til sukre og polyalkylendeler som polyetylenglykol. "Lipofilisk" betyr å vise karakteristika hva angår fettoppløselighet, for eksempel akkumulering i fett og fettvev, evnen til oppløsning i lipider og/eller evnen til å penetrere, interagere med og/eller traversere biologiske membraner, og uttrykket "lipofil del" betyr en del som er lipofil og/eller som, når den er festet til en annen kjemisk del, øker lipofilisiteten for en slik kjemisk del. "Amfifil" betyr å vise karakteristika hva angår hydrofilisitet og lipofilisitet og uttrykket "amfifil del" betyr en del som er amfifil og/eller som, festet til et polypeptid eller et ikke-polypeptidmedikament øker amfifilisiteten (det vil si øker både hydrofilisiteten og amfifilisiteten) for det resulterende konjugat, for eksempel visse PEG-fettsyremodifiserende deler, og sukker-fettsyremodifiserende deler.
"Lavere alkyl" betyr substituerte eller usubstituerte, rette eller forgrenede alkyldeler med fra ett til seks karbonatomer, det vil si C1, C2, C3, C4, C5 eller C6. "Høyere alkyl" betyr substituerte eller usubstituerte, rette eller forgrenede alkyldeler med seks eller flere karbonatomer, for eksempel C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, og så videre.
"Monodispergert" beskriver en blanding av forbindelser der rundt 100 % av forbindelsene i blandingen har den samme molekylvekt. "I det vesentlige monodispergert" beskriver en blanding av forbindelser der minst rundt 95 % av forbindelsene i blandingen har den samme molekylvekt. "Ren monodispergert" beskriver en blanding av forbindelser der rundt 100 % av forbindelsene i blandingen har den samme molekylvekt og har samme molekylstruktur. Således er en ren monodispergert blanding en monodispergert blanding men en monodispergert blanding er ikke nødvendigvis en ren monodispergert blanding. "I det vesentlige ren monodispergert" beskriver en blanding av forbindelser der minst rundt 95 % av forbindelsene i blandingen har samme molekylvekt og samme molekylstruktur. Således er en i det vestlige ren monodispergert blanding en i det vesentlige monodispergert blanding men en i det vesentlige monodispergert blanding er ikke nødvendigvis en i det vesentlige ren monodispergert blanding. Insulinforbindelseskonjugatkomponentene i kationinsulinforbindelseskonjugatpreparatene er fortrinnsvis monodispergerte, i det vesentlige monodispergerte, rene monodispergerte eller i det vesentlige rene monodispergerte men kan også være polydispergerte. "Polydispergert" betyr å ha en dispersitet som ikke er monodispergert, i det vesentlige monodispergert, ren monodispergert eller i det vesentlige ren monodispergert.
"Nativ insulinforbindelse" som spesifikt benyttet her betyr mammalinsulinforbindelse (for eksempel humaninsulin, bovininsulinforbindelse, porcininsulinforbindelse eller hvalinsulinforbindelse), tilveiebrakt fra naturlig, syntetisk eller genetisk konstruerte kilder. Humaninsulin består av en 21 aminosyre A-kjede og en 32 aminosyre B-kjede som er fornettet av disulfidbindinger: et egnet fornettet humaninsulin inkluderer tre disulfidbroer: en mellom A7 og B7, en andre mellom A20 og B19, og en tredje mellom A6 og A11. Humaninsulin har tre frie aminogrupper: B1-fenylalanin, A1-glycin og B29-lycin. De frie aminogrupper i posisjonene A1 og B1 er α-aminogrupper. Den frie aminogruppe i posisjon B29 er en e-aminogruppe. "Insulinanalog" betyr et polypeptid som viser noen av, all eller forsterket aktivitet i forhold til et tilsvarende nativt insulin eller som er konvertert in vivo eller in vitro til et polypeptid som viser en av, all eller forsterket aktivitet i forhold til et tilsvarende nativt insulin, for eksempel et polypeptid med strukturen til et humaninsulin med en eller flere konservative aminosyreaddisjoner, -delesjoner og/eller –substitusjoner. Insulinanaloger kan identifiseres ved bruk av kjente teknikker som de som er beskrevet i US publ.20030049654, "Protein design automation for protein libraries", av 18.03.02 i navnet Dahiyat et al. Proinsuliner, pre-proinsuliner, insulinforløpere, enkeltkjedeinsulinforløpere av human- og ikke-human dyr og analoger av hvilke som helst av disse angis også her som insulinanaloger på samme måte som ikke-mamalinsuliner. Mange insulinanaloger er velkjente i teknikken (se diskusjonen nedenfor). Hvis ikke konteksten spesifikt antyder noe annet (for eksempel der et spesifikt insulin nevnes, som "humaninsulin" eller liknende) benyttes uttrykket "insulinforbindelse" generelt for å inkludere native insuliner og insulinanaloger.
"Polyalkylenglykol" eller PAG henviser til eventuelt substituerte, rette eller forgrenede polyalkylenglykolpolymerer som polyetylenglykol (PEG), polypropylenglykol (PPG) og polybutylenglykol (PBG) og kombinasjoner derav (for eksempel rette eller forgrenede polymerer inkludert kombinasjoner av to eller flere forskjellige PAG subenheter som to eller flere forskjellige PAG enheter valgt blant PEG-, PPG- og PBG subenheter), og inkluderer monoalkyleteren av polyalkylenglykolen. Uttrykket PAG subenhet betyr en enkelt PAG enhet, for eksempel henviser "PEG subenhet" til en enkelt polyetylenglykolenhet, for eksempel –(CH2CH2O)-, "PPG subenhet" henviser til en enkel polypropylenglykolenhet, for eksempel –(CH2CH2CH2O)-, og "PBG subenhet" henviser til en enkel polypropylenglykolenhet, for eksempel –(CH2CH2CH2CH2O)-. PAG'er og/eller PAG subenheter inkluderer også substituerte PAG'er og PAG subenheter, for eksempel inkluderer PAG'er alkylsidekjeder som metyl-, etyl- eller propylsidekjeder, eller karbonylsidekjeder, så vel som PAG'er som inkluderer en eller flere forgrenede PAG subenheter som iso-PPG eller iso-PBG.
"Proinsulinforbindelse" betyr en insulinforbindelse der C-terminus av B-kjeden er koblet til N-terminus av A-kjeden via et naturlig eller konstig C-peptid med 5 eller flere aminosyrer. "Preproinsulinforbindelse" betyr en proinsulinforbindelse som videre inkluderer en ledersekvens koblet til N-terminus av B-kjeden som for eksempel en sekvens valgt for å fremme ekskresjon av et oppløselig protein, eller en sekvens valgt for å forhindre konjugering av N-terminus, eller en sekvens valgt for å forsterke rensing (for eksempel en sekvens med bindende affinitet til en rensekolonne). "Enkeltkjedeinsulinforbindelsesforløper" eller "miniproinsulinforbindelse" betyr en insulinforbindelse der C-terminus av B-kjeden (eller en trunkert B-kjede med 1, 2, 3 eller 4 aminosyrer fjernet fra C-terminus) er koblet til N-terminus av A-kjeden eller en trunkert A-kjede forkortet ved N-terminus ved 1, 2, 3 eller 4 aminosyrer, uten et intervenerende C-peptid, eller via et forkortet C-peptid med 1, 2, 3 eller 4 aminosyrer.
"Protamin" henviser til en blanding av sterkt basiske proteiner oppnådd fra naturlige (for eksempel fiskesperm) eller rekombinante kilder, se Hoffmann, J. A., et al., Protein Expression and Purification, 1:127-133 (1990). Protamin-preparatet kan tilveiebringes i et relativt saltfritt preparat av proteinene, ofte kalt "protaminbase" eller i et preparat som inkluderer salter av proteinene.
"Protein", "peptid" og "polypeptid" anvendes her om hverandre for å henvise til forbindelser med aminosyresekvenser med minst to og opp til en hvilken som helst lengde.
"R-type" betyr en komplekskonformasjon dannet i nærvær av insulinforbindelseskonjugatet, et kation og en stabiliserende forbindelse som fenol. "T-type" betyr en komplekskonformasjon dannet i nærvær av insulinforbindelseskonjugatet og et kation uten stabiliserende forbindelse som fenol. Et T-type- eller R-type kompleks kan inkludere eller ekskludere protamin.
"Vitenskapelig akseptabel kontroll" betyr en eksperiment- eller forsøkskontroll som er akseptabel for en fagmann på området dette forsøk gjelder.
"Faststoff" eller tilsvarende betyr en tilstandsform der det er en tredimensjonal strukturregularitet; uttrykket benyttes generelt her for å henvise til både krystallinske faststoffer, amorfe faststoffer og kombinasjoner av krystallinske og amorfe faststoffer. "Kationinsulinforbindelseskonjugatfast-stoff" henviser til et faststoff som inkluderer et kation-insulinforbindelseskonjugat, fortrinnsvis koordinert med et mono- eller multivalent kation. "Krystall" betyr et faststoff med en regulær polyhedral form. "Krystallinsk" henviser til faststoffer med krystallers karakteristika. "Mikrokrystaller" betyr et faststoff som primært består av et materiale i krystallinsk tilstand som er mikroskopisk av størrelse, typisk med lengste dimensjoner innen området 1 til 100 mikron. I enkelte tilfeller er de individuelle krystaller av et mikrokrystallinsk preparat overveiende av enkelt krystallografisk sammensetning. I noen utførelsesformer er krystallene ifølge oppfinnelsen ikke mikrokrystaller. Uttrykket "mikrokrystallinsk" henviser til tilstanden å være en mikrokrystall. "Amorf" henviser til et fast materiale som ikke er krystallinsk av form. Fagfolk på området kan skille krystaller fra amorfe materialer ved bruk av standardteknikker, for eksempel ved bruk av røntgenkrystallografiske teknikker, scanning elektronmikroskopi eller optisk mikroskopi. "Fast blanding" betyr en blanding av to forskjellige faststoffer. "Krystallblanding" betyr en blanding av to forskjellige krystaller. "Ko-krystall" betyr en krystall med to eller flere forskjellige insulinforbindelser og/eller insulinforbindelseskonjugater. Kationinsulinforbindelseskonjugatkompleksene ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringes i en hvilken som helst av de foregående former eller i blandinger av to eller flere av slike former.
"Substitusjon" betyr erstatning av en eller flere aminosyrerester i insulinforbindelsessekvensen med en annen aminosyre. I noen tilfeller virker den substituerte aminosyre som en funksjonell ekvivalent og resulterer i en taus endring. Substitusjoner kan være konservative; for eksempel kan konservative substitusjoner velges fra andre medlemmer av den klasse hvortil den substituerte aminosyre hører til. Eksempler på ikke-polare (hydrofobe) aminosyrer inkluderer alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. Eksempler på polare, nøytrale aminosyrer inkluderer glycin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. Eksempler på positivt ladede (basiske) aminosyrer inkluderer arginin, lysin og histidin. Eksempler på negativt ladede (sure) aminosyrer inkluderer aspartinsyre og glutaminsyre.
"Vannoppløselighet" eller "vandig oppløselighet" bestemmes hvis ikke annet er sagt i en vandig bufferoppløsning ved pH 7,4.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer kationinsulinforbindelsekonjugatkomplekser og forskjellige preparater som inkluderer slike komplekser, så vel som metoder for å fremstille disse og å benytte slike komplekser og preparater. Kompleksene er brukbare for å administrere insulinforbindelser for behandling av forskjellige medisinske tilstander som tilstander karakterisert ved insulinforbindelsedefektivitet. Kompleksene inkluderer generelt en kationkomponent og en insulinforbindelseskonjugatkomponent. Insulinforbindelseskonjugatkomponenten inkluderer generelt en insulinforbindelse koblet til en modifiserende del. Eksempler på andre egnede komponenter av kompleksene og/eller preparatene inkluderer stabiliseringsmidler, kompleksdannende midler og andre komponenter som er kjente i teknikken for anvendelse ved fremstilling av kation-proteinkomplekser. Oppfinnelsen tilveiebringer også nye insulinforbindelseskonjugater og fettsyreformuleringer som inkluderer slike insulinforbindelseskonjugater og/eller kation-insulinforbindelseskonjugat-komplekser.
Insulinforbindelse
Kation-insulinforbindelseskonjugatet inkluderer en insulinforbindelseskomponent. Insulinforbindelsen kan for eksempel være en mammalinsulinforbindelse som humaninsulin, eller en insulinforbindelsesanalog.
Et vidt spektrum av insulinforbindelsesanaloger er velkjent i teknikken. Foretrukne insulinforbindelsesanaloger er de som inkluderer et lysin og særlig et lysin med 5 aminosyrer ved C-terminus av B-kjeden, for eksempel ved posisjonene B26, B27, B28, B29 og/eller B30. Et sett av egnede analoger er beskrevet i EP-A 1227000107, i sin helhet ansett som del av beskrivelsen, med sekvensen av insulinforbindelse, bortsett fra at aminosyreresten ved posisjon B26 er Asp, Lys, Leu, Val eller Ala; aminosyreresten i posisjon B29 er Lys eller Pro; aminosyreresten i posisjon B10 er His eller Asp; aminosyreresten i posisjon B1 er Phe, Asp eller deletert alene eller i kombinasjon med en delesjon av resten i posisjon B2; aminosyreresten i posisjon B30 er Thr, Ala eller deletert; og aminosyreresten ved posisjon B9 er Ser eller Asp; forutsatt at enten B28 eller B29 er Lys.
Andre eksempler på egnede insulinforbindelsesanaloger inkluderer Asp<B28 >humaninsulin, Lys<B28 >humaninsulin, Leu<B28 >humaninsulin, Val<B28 >humaninsulin, Ala<B28 >humaninsulin, Asp<B28>Pro<B29 >humaninsulin, Lys<B28>Pro<B29 >humaninsulin, Leu<B28>Pro<B29 >humaninsulin, Val<B28>Pro<B29 >humaninsulin, Ala<B28>Pro<B29 >humaninsulin, så vel som analoger tilveiebrakt ved å benytte substitueringsretningslinjene som beskrevet ovenfor. Insulinforbindelsesfragmenter inkluderer, men er ikke begrenset til B22-B30 humaninsulin, B23-30 humaninsulin, B25-B30 humaninsulin, B26-B30 humaninsulin, B27-B30 humaninsulin, B29-B30 humaninsulin, B1-B2 humaninsulin, B1-B3 humaninsulin, B1-B4 humaninsulin, B1-B5 humaninsulin, A kjeden av humaninsulin, og B kjeden av human-insulin.
Ytterligere eksempler på egnede insulinforbindelsesanaloger kan finnes i
USSN 20030144181A1, med tittelen "Insoluble compositions for controlling blood glucose", 31.07.03;
USSN 20030104983A1, med tittelen "Stable insulin formulations", 05.06.03;
USSN 20030040601A1, med tittelen "Method for making insulin precursors and insulin analog precursors", 27.02.03;
USSN 20030004096A1, med tittelen "Zinc-free and low-zinc insulin preparations having improved stability", 02.01.03;
US 6551922B1 med tittelen "Stable insulin formulations", 22.04.03;
US 6534288B1, med tittelen "C peptide for improved preparation of insulin and insulin analogs", 18.03.03;
US 6531448B1 med tittelen "Insoluble compositions for controlling blood glucose", 11.03.03; US RE37,971E med tittelen "Selective acylation of epsilon-amino groups", 28.01.03;
USSN 20020198140A1 med tittelen "Pulmonary insulin crystals", 26.12.02;
US 6465426B2, med tittelen "Insoluble insulin compositions", 15.10.02;
US 6444641B1 med tittelen "Fatty acid-acylated insulin analogs", 03.09.02;
USSN 20020137144A1 med tittelen "Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast", 26.09.02;
USSN 20020132760A1 med tittelen "Stabilized insulin formulations", 19.09.02;
USSN 20020082199A1 med tittelen "Insoluble insulin compositions", 27.06.02;
US 6335316B1 med tittelen "Method for administering acylated insulin", 01.01.02;
US 6268335B1 med tittelen "Insoluble insulin compositions", 31.07.01;
USSN 20010041787A1 med tittelen "Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast", 15.11.01;
USSN 20010041786A1 med tittelen "Stabilized acylated insulin formulations", 15.11.01;
USSN 20010039260A1, med tittelen "Pulmonary insulin crystals", 08.11.01;
USSN 20010036916A1 med tittelen "Insoluble insulin compositions", 01.11.01;
USSN 20010007853A1 med tittelen "Method for administering monomeric insulin analogs", 12.07.01;
US 6051551A, med tittelen "Method for administering acylated insulin", 18.04.00;
US 6034054A, med tittelen "Stable insulin formulations", 07.03.00;
US 5970973A, med tittelen "Method of delivering insulin lispro", 26.10.99;
US 5952297A med tittelen "Monomeric insulin analog formulations", 14.09.99;
US 5922675A med tittelen "Acylated Insulin Analogs", 13.07.99;
US 5888477A med tittelen "Use of monomeric insulin as a means for improving the bioavailability of inhaled insulin", 30.03.99;
US 5873358A med tittelen "Method of maintaining a diabetic patient's blood glucose level in a desired range", 23.02.99;
US 5747642A med tittelen "Monomeric insulin analog formulations", 05.05.98;
US 5693609A med tittelen "Acylated insulin compound analogs", 02.12.97;
US 5650486A, med tittelen "Monomeric insulin analog formulations", 22.07.97;
US 5646242A med tittelen "Selective acylation of epsilon-amino groups", 08.07.97;
US 5597893A med tittelen "Preparation of stable insulin analog crystals", 28.01.97;
US 5547929A med tittelen "Insulin analog formulations", 20.08.96; US 5504188A med tittelen "Preparation of stable zinc insulin compound analog crystals", 02.04.96;
US 5474978A med tittelen "Insulin analog formulations", 12.12.95;
US 5461031A med tittelen "Monomeric insulin analog formulations", 24.10.95;
US 4421685A med tittelen "Process for producing an insulin", 20.12.83;
US 6221837 med tittelen "Insulin derivatives with increased zinc binding" 24.04.01;
US 5177058 med tittelen "Pharmaceutical formulation for the treatment of diabetic mellitus", 05.01.93 (beskriver farmasøytiske formuleringer inkludert et insulinforbindelsesderivat som er modifisert med en base ved B31 og med et isoelektrisk punkt mellom 5,8 og 8,5 og/eller minst en av dens fysiologisk godtakbare salter i en farmasøytisk akseptabel eksipient, og et relativt høyt sinkioneinnhold i området fra over 1 µg til rundt 200 µg sink/IU inkludert insulinforbindelse-B31-Arg-OH og humaninsulin-B31-Arg-B32-Arg-OH). Hele beskrivelsen av hvert av de ovenfor angitte dokumenter anses i sin helhet som del av foreliggende beskrivelse, særlig hva angår læren om fremstilling, bruk og sammensetning av forskjellige insulinforbindelsesanaloger.
Insulinforbindelsen som benyttes for å fremstille kation-insulinforbindelseskonjugatene kan fremstilles ved hvilke som helst av et antall erkjente peptidsynteseteknikker, for eksempel klassiske (oppløsnings) metoder, fastfasemetoder, semisyntetiske metoder og rekombinante DNA metoder. For eksempel beskriver Chance et al i USSN 07/388201, EPO383472, Brange et al., EPO214826 og Belagaje et al. i US 5304473 fremstilling av forskjellige proinsulinforbindelses- og insulinforbindelsesanaloger og disse anses som del av beskrivelsen. A- og B kjedene av insulinforbindelsesanalogene kan også fremstilles via et proinsulinforbindelsesliknende forløpermolekyl eller enkeltkjedeinsulinforbindelsesforløpermolekyl ved bruk av rekombinante DNA teknikker, se Frank et al., i "Peptides: Synthesis-Structure-Function," Proc. Seventh Am. Pept. Symp., utg. D. Rich og E. Gross (1981); Bernd Gutte, Peptides: Synthesis, Structures, and Applications, Academic Press (19.10.95); Chan, Weng and White, Peter (utg.), Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press (mars 2000); der alle henvisninger anses som del av foreliggende beskrivelse hva angår læren når det gjelder peptidsyntese, rekombinant produksjon og fremstilling.
Modifisering av deler
Kation-insulinforbindelseskonjugatkompleksene inkluderer en modifiserende del koblet (for eksempel kovalent eller ionisk) til insulinforbindelsen for å gi insulinforbindelseskonjugatet. Modifiserende deler er deler koblet til insulinforbindelsen som gir insulinforbindelsen med de ønskede egenskaper som beskrevet her. For eksempel kan den modifiserende del redusere nedbrytningshastigheten for insulinforbindelsen i forskjellige omgivelser (som fordøyelseskanalen og/eller i blodstrømmen), slik at mindre insulinforbindelse brytes ned i modifisert form enn det som ville vært brutt ned i fravær av den modifiserende del i slike omgivelser. Foretrukne, modifiserende deler er de som tillater at insulinforbindelseskonjugatet bibeholder en terapeutisk signifikant prosentandel av den biologiske aktivitet for opphavsinsulinforbindelsen. Videre er de foretrukne, modifiserende deler de som er amfifile eller hydrofile, og/eller som gjør insulinforbindelseskonjugatet amfifilt eller hydrofilt eller mindre lipofilt enn en vitenskapelig aksepterbar kontroll, for eksempel som en tilsvarende insulinforbindelse, eller en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse.
Eksempler på egnede, modifiserende deler og insulinforbindelseskonjugater som er nyttige i kationinsulinforbindelseskonjugatpreparatene kan finnes i de følgende patenter, alle ansett som del av beskrivelsen:
US 6303569 med tittelen "Trialkyl-lock-faciliated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents," 16.10.01; US 6214330 "Coumarin and related aromatic-based polymeric prodrugs", 10.04.01;
US 6113906 med tittelen "Water-soluble non-antigenic polymer linkable to biologically active material", 05.09.00; US 5985263 med tittelen "Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates", 16.11.99;
US 5900402 med tittelen "Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins," 04.05.99;
US 5681811, "Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same" 28.10.97;
US 5637749 med tittelen "Aryl imidate activated polyalkylene oxides", 10.06.97;
US 5612460 med tittelen "Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides", 18.03.97;
US 5567422 med tittelen" Azlactone activated polyalkylene oxides conjugated to biologically active nucleophiles", 22.10.96;
US 5405877 med tittelen "Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides", 11.04.95; og US 5359030 med tittelen "Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same", 25.10.94.
Ytterligere eksempler på konjugerte polypeptider nyttige i formuleringene av oppfinnelsen kan finnes i de følgende US patentapplikasjoner, alle spesifikasjonene av hvilke er inkorporert heri ved referanse: USSN 09/134803, dokumentert 14.08.98; 10/018879, dokumentert 19.12.01; 10/235 381, dokumentert 05.09.02; 10/235284, dokumentert 05.09.02; og 09/873797, dokumentert 04.06.01. Hele beskrivelsen av hvert av disse dokumenter anses som del av foreliggende beskrivelse hva angår deres lære angående deler som benyttes for å modifisere polypeptider.
De modifiserende deler kan inkludere svake eller nedbrytbare bindinger i sine skjeletter. For eksempel kan PAG'er inkludere hydrolytisk ustabile bindinger som laktid, glykolid, karbonat, ester, karbamat og liknende, alle tilbøyelige til hydrolyse. Denne vei tillater at polymerene kan spaltes til lavere molekylvektsfragmenter. Eksempler på slike polymerer er for eksempel beskrevet i US 6 153211, i navnet Hubbell et al., ansett som del av beskrivelsen. Det skal også henvises til US 6 309633 i navnet Ekwuribe et al., også ansett som del av beskrivelsen.
Den modifiserende del kan inkludere hvilke som helst hydrofile deler, lipofiliske deler, amfifiliske deler, saltdannende deler og kombinasjoner derav. Representative hydrofile-, amfifile- og lipofile polymerer og modifiserende deler er beskrevet nedenfor i større detalj.
Hydrofile deler
Eksempler på egnede, hydrofile deler inkluderer PAG-deler, andre hydrofile polymerer, sukkerdeler, polysorbatdeler og kombinasjoner derav.
Polyalkylenglykoldeler
PAG'er er forbindelser med repeterende alkylenglykolenheter. I noen utførelsesformer er enhetene alle like (for eksempel PEG eller PPG). I andre utførelsesformer er alkylenenhetene forskjellige (for eksempel polyetylenkopropylenglykol eller PLURONICS<®>). Polymerene kan være vilkårlige kopolymerer (for eksempel der etylenoksid og propylenoksid kopolymeriseres) eller forgrenede polymerer eller podingskopolymerer.
PEG er en foretrukket PAG og er nyttig i biologiske anvendelser fordi den har meget ønskelige egenskaper og er generelt ansett som sikker (GRAS) av Food and Drug Administration. PEG har generelt formelen H-(CH2CH2O)n-H, der n kan ligge fra rundt 2 til rundt 4000 eller mer selv om de dekkende deler kan variere, for eksempel monometoksy eller dihydroksy. PEG er typisk fargeløs, luktfri, vannoppløselig og vannblandbar (avhengig av molekylvekten), varmestabil, kjemisk inert, hydrolytisk stabil og generelt ikke-toksisk. PEG er også biokompatibel og gir typisk ikke noen immunrespons i kroppen. Foretrukne PEG deler inkluderer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 eller flere PEG subenheter.
PEG kan være monodispergert, i det vesentlige monodispergert, ren monodispergert eller i det vesentlige ren monodispergert (for eksempel som beskrevet ovenfor av foreliggende søkere i US 09/873731 og US 09/873797, begge av 04.06.01, alt ansett som del av beskrivelsen) eller polydispergert. En fordel ved å benytte relativt lavmolekylvektsmonodispergerte polymerer er at de danner lett definerte konjugatmolekyler som kan lette både reproduserbar syntese og FDA godkjennelse.
PEG kan være rett med en hydroksylgruppe ved hver terminus (før konjugering til resten av insulinforbindelsen). PEG kan også være en alkoksy PEG som metoksy-PEG (eller mPEG) der en terminus er en relativt inert alkoksygruppe (for eksempel rett eller forgrenet OC1-6), mens den andre terminus er en hydroksylgruppe (som er koblet til insulinforbindelsen).
PEG kan også være forgrenet som i en utførelsesform kan representeres som R(-PEG-nOH)m der R betyr et sentralt (typisk polyhydrisk) kjernemiddel som pentaerytritol, sukker, lysin eller glyserol, n betyr antallet PEG subenheter og kan variere for hver arm og er typisk 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 eller 50 og m betyr antallet armer og ligger fra 2 til det maksimale antallet festeseter på kjernemidlet. Hver gren kan være lik eller forskjellig og kan være avsluttet for eksempel med etere og/eller estere. Antallet armer m kan ligge fra tre til hundre eller flere og en eller flere av de terminale hydroksylgrupper kan være koblet til resten av insulinforbindelsen eller på annen måte gjenstand for kjemisk modifikasjon.
Andre forgrenede PEG'er inkluderer de som er representert ved formel (CH3O-PEG-)pR-Z der p er lik 2 eller 3, R er en sentral kjerne som lysin eller glyserol og Z er en gruppe som karboksyl som er gjenstand for lett kjemisk aktivering. Ytterligere en forgrenet form, den pendante PEG, har reaktive grupper som karboksyler langs PEG skjelettet heller enn, eller i tillegg til, enden av OEG kjedene. Forgaflet PEG kan representeres ved formelen PEG(-LCHX2)n der L er en linkergruppe og X er en aktivert terminal gruppe.
Sukkerdeler
De modifiserende deler som er beskrevet her kan inkludere sukkerdeler. Generelt er sukkerdelen et karbohydratprodukt av minst en sakkarosegruppe. Representative sukkerdeler inkluderer, men er ikke begrenset til glyseroldeler, mono-, di-, tri- og oligosakkarider, og polysakkarider som stivelser, glykogen, cellulose og polysakkaridgummier. Spesifikke monosakkarider inkluderer C6 og over (fortrinnsvis C6 til C8) sukre som glukose, fruktose, mannose, galaktose, ribose og sedoheptulose; di- og trisakkarider inkludert deler med to eller tre monosakkaridenheter (særlig C5 til C8) som sukrose, cellobiose, maltose, laktose og raffinose. Konjugering ved bruk av sukkerdeler er beskrevet i US 5681811, 5438040 og 5359030, hvis beskrivelse anses som del av foreliggende beskrivelse.
Polysorbatdeler
De modifiserende deler kan inkludere en eller flere polysorbatdeler. Eksempler inkluderer sorbitanestere og polysorbatderivatisert med polyoksyetylen. Konjugering ved bruk av polysorbatdeler er beskrevet i US 5681811, 5438040 og 5359030, hvis beskrivelser anses som del av den foreliggende beskrivelse.
Biokompatible, vannoppløselige polykationiske deler
I noen utførelsesformer kan det benyttes biokompatible, vannoppløselige, polykationiske polymerer. Biokompatible, vannoppløselige, polykationiske polymerer inkluderer for eksempel en hvilken som helst modifiserende del med protonerte heterocykler festet som pendante grupper. "Vannoppløselig" i denne kontekst betyr at hele den modifiserende del er oppløselig i vandige oppløsninger som bufret saltoppløsning eller bufret saltoppløsning med små mengder tilsatte organiske oppløsningsmidler som ko-solventer, ved en temperatur mellom 20 og 37 °C. I noen utførelsesformer er det modifiserende middel per se ikke tilstrekkelig oppløselig i vandige oppløsninger per se men bringes i oppløsning ved poding med vannoppløselige polymerer som PEG kjeder. Eksempler inkluderer polyaminer med amingrupper på enten skjelettet i den modifiserende del eller de modifiserende sidekjededeler som poly-L-lys og andre positivt ladede polyaminosyrer av naturlige eller syntetiske aminosyrer eller blandinger av aminosyrer inkludert poly(D-Lys), poly(ornitin), poly(Arg) og poly(histidin) og ikke-peptid polyaminer som poly(aminostyren), poly(aminoakrylat), poly (N-metylaminoakrylat), poly(N-etylaminoakrylat), poly-(N,N-dimetylaminoakrylat), poly(N,N-dietylaminoakrylat), poly(aminometakrylat), poly(N-metylaminometakrylat), poly(N-etylaminometakrylat), poly(N,N-dimetylaminometakrylat), poly(N,N-dietylaminometakrylat), poly(etylenimin), polymerer av kvaternære aminer som poly(N,N,N-trimetylaminoakrylat-klorid), poly(metylakrylamidopropyltrimetylammoniumklorid) og naturlige eller syntetiske polysakkarider som kitosan.
Andre hydrofile deler
De modifiserende deler kan også inkludere andre hydrofile polymerer. Eksempler inkluderer poly(oksyetylerte polyoler) som poly(oksyetylert glyserol), poly(oksyetylert sorbitol) og poly(oksyetylert glukose); poly(vinylalkohol) ("PVA"); dekstran; karbohydratbaserte polymerer og liknende. Polymerene kan være homopolymerer eller tilfeldige eller blokk-kopolymerer og terpolymerer basert på monomerer av de ovenfor angitte polymerer, rettkjedede eller forgrenede.
Spesifikke eksempler på egnede ytterligere polymerer inkluderer, men er ikke begrenset til poly(oksazolin), difunksjonell poly(akryloylmorfolin) ("PAcM") og poly(vinylpyrrolidon) ("PVP"). PVP og poly(oksazolin) er velkjente polymerer på området og deres fremstilling vil lett fremgå for fagmannen. PAcM og dens syntese og bruk er beskrevet i US 5629384 og US 5631322, begge ansett som del av beskrivelsen.
Bioadhesive polyanioniske deler
Visse hydrofile polymerer syntes å ha potensielt brukbare, bioadhesive egenskaper. Eksempler på slike polymerer finnes for eksempel i US 6197346 i navnet Mathiowitz, et al. Disse polymerer inneholder karboksylsyregrupper (for eksempel poly(akrylsyre)) som viser bioadhesive egenskaper, og som også lett konjugeres med inulinforbindelsene som beskrives heri. Hurtig bioeroderbare polymerer som eksponerer karboksylsyregrupper ved nedbrytning som poly(melke-ko-glykolid), polyanhydrider og polyortoestere, er også bioadhesive polymerer. Disse polymerer kan benyttes for å avgi insulinforbindelsene til fordøyelseskanalen. Etter hvert som polymerene brytes ned kan de eksponere karboksylsyregrupper for å muliggjøre adhesjon sterkt til fordøyelseskanalen og kan understøtte avlevering av insulinforbindelseskonjugatene.
Lipofile deler
I noen utførelsesformer inkluderer de modifiserende deler en eller flere lipofile deler. Den lipofile del kan være forskjellige lipofile deler som fagmannen vil erkjenne og er, men er ikke begrenset til, alkyl-, alkenyl-, alkynyl-, aryl-, arylalkyl-, alkylaryl- eller fettsyredeler, adamantyl og kolesteryl, så vel som lipofile polymerer og/eller oligomerer.
Alkyldelen kan være mettet eller umettet, rett, forgrenet eller syklisk som hydrokarbonkjede. I noen utførelsesformer har alkyldelen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 eller flere karbonatomer. Eksempler inkluderer mettede, rette alkyldeler som metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, oktadecyl, nonadecyl og eikosyl; mettede, forgrenede alkyldeler som isopropyl, sec-butyl, tert-butyl, 2-metylbutyl, tert-pentyl, 2-metyl-pentyl, 3-metylpentyl, 2-etylheksyl, 2-propylpentyl; og umettede alkyldeler avledet fra de ovenfor mettede alkyldeler inkludert, men ikke begrenset til vinyl, allyl, 1-butenyl, 2-butenyl, etynyl, 1-propynyl og 2-propy-nyl. I andre utførelsesformer er alkyldelen en lavere alkyldel. I ytterligere utførelsesformer er alkyldelen C1 til C3 lavere alkyldel. I noen utførelsesformer består den modifiserende del spesifikt ikke av noen alkyldel eller består spesifikt ikke av noen lavere alkyldel og består spesifikt ikke av en alkandel og spesielt ikke av noen lavere alkandel.
Alkylgruppene kan enten være usubstituert eller substituert med en eller flere substituenter og slike substituenter interfererer enten ikke med syntesemetodene for konjugatene eller eliminerer den biologiske aktivitet for konjugatene. Potensielt interfererende funksjonalitet kan hensiktsmessig blokkeres med en beskyttende gruppe for å gjøre funksjonaliteten ikke-interfererende. Hver substituent kan eventuelt substitueres med ytterligere, ikke-interfererende substituenter. Uttrykket "ikkeinterfererende" karakteriserer substituentene som ikke-eliminerende for brukbarheten av eventuelle reaksjoner som skal gjennomføres i henhold til oppfinnelsens fremgangsmåte.
Den lipofile del kan være en fettsyredel, for eksempel naturlig eller syntetisk, mettet eller umettet, rett eller forgrenet fettsyredel. I noen utførelsesformer har fettsyredelen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller flere karbonatomer. I noen utførelsesformer består den modifiserende del spesifikt ikke av en fettsyredel; eller består spesifikt ikke av en fettsyredel med 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller flere karbonatomer.
Når den modifiserende del inkluderer en arylring kan ringen funksjonaliseres med en nukleofil, funksjonell gruppe (som OH eller SH) som er posisjonert slik at den kan reagere på intramolekylær måte med karbamatdelen og understøtte dens hydrolyse. I enkelte utførelsesformer blir den nukleofile gruppe beskyttet med en beskyttende gruppe i stand til å kunne hydrolyseres eller på annen måte brytes ned in vivo med det resultat at når den beskyttende gruppe debeskyttes lettes hydrolyse av konjugatet og den derav resulterende frigivning av opphavsinsulinforbindelsen.
Andre eksempler på egnede, modifiserende deler inkluderer
–(CH2OH)3; -CH(CH2OH)2; -C(CH3)3; -CH(CH3)2.
Amfifile deler
I noen utførelsesformer inkluderer den modifiserende del en amfifil del. Mange polymerer og oligomerer er amfifile. Disse er ofte blokk-kopolymerer, forgrenede kopolymerer eller podingskopolymerer som inkluderer hydrofile og lipofile deler og som kan foreligge i form av oligomerer og/eller polymerer som rette kjeder, forgrenede eller podingskopolymerer eller kopolymerer.
De amfifile, modifiserende deler kan inkludere kombinasjoner av hvilke som helst av de lipofile og hydrofile deler som er beskrevet her. Slike modifiserende deler inkluderer typisk minst en reaktiv, funksjonell gruppe, for eksempel halo, hydroksyl, amin, tiol, sulfonsyre, karboksylsyre, isocyanat, epoksy, ester og liknende, som ofte er ved en terminal ende av den modifiserende del. Disse reaktive, funksjonelle grupper kan benyttes for å feste en lipofil rett eller forgrenet alkyl-, alkenyl-, alkynyl-, arylalkyl- eller alkylarylgruppe, eller en lipofil polymer eller oligomer for derved å øke lipofilisiteten for den modifiserende del (og derved å gjøre den generelt amfifil).
De lipofile grupper kan for eksempel avledes fra mono- eller dikarboksylsyrer eller der det er hensiktsmessig, reaktive ekvivalenter av karboksylsyrer som anhydrider eller syreklorider. Eksempler på egnede forløpere for de lipofile grupper er eddik-, propion-, smør-, valerin-, isosmør-, trimetyleddik-, kaproin-, kapryl-, heptan-, kaprin-, pelargon-, laurin-, myristin-, palmitin-, stearin-, behen-, lignocer-, ceratin-, montan-, isostearin-, isononan-, 2-etylheksan-,olje-, ricinol-, linol-, linolein-, euroka-, soyabønnefett-, linfrøfett-, dehydratisert kastorfett-, talgoljefett-, tungoljefett-, solsikkefett-, safranfett-, akryl- eller metakrylsyre, malein- eller ortoftalsyreanhydrid, tereftal-, isoftal-, adipin-, azelain- eller sebacin-, tetrahydroftalsyre- eller heksahydroftalsyreanhydrid, rav- og polyolefinkarboksylsyrer.
De terminale, lipofile grupper behøver ikke være ekvivalente, det vil si at de resulterende kopolymerer kan inkludere terminale lipofile grupper som er like eller forskjellige. De lipofile grupper kan avledes fra mer enn en mono- eller di-funksjonell alkyl-, alkenyl-, alkynyl-, cykloalkyl-, arylalkyleller alkylarylgruppe som definert ovenfor.
PAG-alkylmodifiserende deler
Den modifiserende del kan være en rett eller forgrenet polymerdel med en eller flere rette eller forgrenede PAG deler og/eller en eller flere rette eller forgrenede, eventuelt substituerte alkyldeler. I visse tilfeller anses slike deler som amfifiliske, imidlertid kan PAG- og alkyldelene varieres for å gjøre slike deler mer lipofile eller mer hydrofile. I visse utførelsesformer består den modifiserende del spesifikt ikke av en alkyldel og i andre utførelsesformer består den modifiserende del spesifikt ikke av en alkandel.
PAG delene inkluderer i enkelte utførelsesformer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25 PAG subenheter anordnet i rett eller forgrenet form. PAG delene i enkelte utførelsesformer inkluderer PEG-, PPG- og/eller PBG subenheter. Alkyldelene i noen utførelsesformer har fortrinnsvis 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 karbonatomer. Alkyldelene er fortrinnsvis alkandeler. Den modifiserende del kan inkludere en lokk- eller dekkedel som –OCH3. Videre kan den modifiserende del inkludere en hydrofob gruppe som en pivaloylgruppe.
I en utførelsesform har den modifiserende del en formel:
(formel I)
der o, p og q uavhengig er 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 eller 50, og minst en av o, p og q er minst 2. X, Y og Z er uavhengig valgt blant –C-, -O-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NH-, -NHC(O)-, og –C(O)NH- og R er H eller alkyl, særlig lavere alkyl og helst metyl. Variablene o, p og q er fortrinnsvis valgt for å gi en hydrofil eller amfifil modifiserende del og er fortrinnsvis valgt i forhold til insulinforbindelsen for å gi et hydrofilt eller amfifilt insulinforbindelseskonjugat, særlig et mono-, di- eller trikonjugat. I en foretrukket utførelsesform for et insulinforbindelseskonjugat som skal benyttes for basalinsulinforbindelsesopprettholdelse, blir o, p og q valgt for å gi en PAG som er proksimal til insulinforbindelsen og en alkyldel som er distal til insulinforbindelsen. Alternativt kan o, p og q velges for å gi en PAG som er distal til insulinforbindelsen og et alkyl som er proksimalt til insulinet. I en alternativ utførelsesform er R en pivaloylgruppe som en alkylpivaloyl-gruppe.
I en relatert utførelsesform har den modifiserende del formelen:
(formel II)
der m er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25 og n er fra 2 til 100 og særlig 2 til 50, mer spesielt 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25, X er –C-, -O-, -C(O)-, -NH-, -NHC(O)- eller –C(O)NH-, og Y er lavere alkyl eller –H. X er fortrinnsvis O og Y er fortrinnsvis –CH3. I noen tilfeller kan karbonylgruppen (-C(O)-) være fraværende og –(CH2)- delen kan være koblet til en tilgjengelig gruppe på en aminosyre som en hydroksylgruppe eller som en fri karboksylsyregruppe.
I en foretrukket utførelsesform har den modifiserende del en struktur valgt blant den følgende:
(når den umiddelbart foregående, modifiserende del er koblet til humaninsulin B29 er det resulterende monokonjugat angitt som IN105).
(når den umiddelbart foregående modifiserende del er koblet til humaninsulinet på B29 angis det resulterende monokonjugat som HIM2). En hvilken som helst av de foregående deler kan for eksempel kobles til humaninsulin ved en nukleofilrest, for eksempel A1, B1 eller B29. I noen tilfeller kan karbonylgruppen (-C(O)-) være fraværende eller erstattet med en alkyldel, særlig en lavere alkyldel, og –(CH2)- delen kan være koblet til en tilgjengelig gruppe på en aminosyre som en hydroksylgruppe eller en fri karboksylsyregruppe.
I en annen utførelsesform har den modifiserende del formelen:
(formel III),
der hver C uavhengig er valgt og er en alkyldel med m karbonatomer og m er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20; og hver PAG uavhengig er valgt og er en PAG del med n subenheter og n er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25; hver X uavhengig er valgt og er en linkerdel som kobler PAG til C, og fortrinnsvis er –C-, -O-, -C(O)-, -NH-, -NHC(O)- eller –C(O)NH-. I noen utførelsesformer kan Cm-X delen være fraværende og PAGn delen avsluttes med en –OH del eller en –OCH3 del. For eksempel kan PAG være metoksyterminert eller hydroksyterminert PAG med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 PAG enheter inkludert PEG-, PPG- og/eller PBG subenheter. I noen tilfeller kan karbonylgruppen (-C(O)-) være erstattet med en alkyldel og fortrinnsvis en lavere alkyldel som kan være koblet til en tilgjengelig gruppe på en aminosyre som en hydroksylgruppe eller en fri karboksylsyregruppe.
Den modifiserende del kan for eksempel ha formelen:
(formel IV)
der hver C uavhengig er valgt og er en alkyldel med m karbonatomer og m er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20; og hver PAG er uavhengig valgt og er en PAG del med n subenheter der n er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25; X er –O-, eller –NH-; hver o er uavhengig valgt og er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 eller 15. For eksempel kan denne PAG ha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 PAG subenheter inkludert PEG-, PPG-, og/eller PBG subenheter. I noen tilfeller kan karbonylgruppen (-C(O)-) som er proksimal til festepunktet være fraværende eller erstattet med en alkyldel, særlig en lavere alkyldel og –(CH2)- delen kan være koblet til en tilgjengelig gruppe på en aminosyre, for eksempel en hydroksylgruppe eller en fri karboksylsyregruppe.
Den modifiserende del kan for eksempel ha formelen:
(formel V),
der hver C uavhengig er valgt og er en alkyldel med m karbonatomer og m er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20; og hver PAG uavhengig er valgt og er en PAG del med n subenheter og n er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25; hver X er uavhengig valgt og er en linkerdel som kobler PAG til C og fortrinnsvis er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25; hver X er uavhengig valgt og er en linkerdelkobling PAG til C og er fortrinnsvis –C-, -O-, -C(O)-, -NH-, -NHC(O)- eller –C(O)NH.; hver o er uavhengig valgt og er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 eller 15. I noen utførelsesformer er Cm-X delen fraværende og PAGn delen avsluttes med en –OH del eller en –OCH3 del. For eksempel kan PAG være metoksyterminert eller hydroksyterminert PAG med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, eller 20 PAG subenheter inkludert PEG-, PPG- og/eller PBG subenheter. I noen tilfeller kan karboksylgruppen (-C(O)-) proksimalt til festepunktet være fraværende og –(CH2)- delen kan være koblet til en tilgjengelig gruppe på en aminosyre, for eksempel en hydroksylgruppe eller en fri karboksylsyregruppe.
I andre utførelsesformer kan den modifiserende del ha formelen:
(formel VI)
der,
X, Y og Z uavhengig er valgte linkergrupper og hver eventuelt er til stede, og X, hvis til stede, er koblet til insulinforbindelsen via en kovalent binding,
minst en av R<1 >og R<2 >er til stede og er lavere alkyl og eventuelt kan inkludere en karbonylgruppe, R<2 >er en dekkende gruppe som –CH3, -H, tosylat eller en aktiverende gruppe, og
PAG er en rett eller forgrenet karbonkjede som inkorporerer en eller flere alkalenglykoldeler (det vil si oksyalkylendeler) og eventuelt inkorporerer en eller flere ytterligere deler valgt fra gruppen bestående av –S-, -O-, -N- og –C(O)-, og
der den modifiserende del har et maksimalt antall på 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25 tunge atomer.
I utførelsesformer ifølge oppfinnelsen kan en hvilken som helst en eller flere av X, Y og Z være fraværende. Når de videre er til stede kan X, Y og/eller Z uavhengig velges blant –C(O)-, -O-, -S-, -C- og –N-. I en utførelsesform er Z –C(O)-. I en annen utførelsesform er Z ikke til stede.
I visse utførelsesformer er R<1 >lavere alkyl og R<2 >er ikke til stede. I andre utførelsesformer er R<2 >lavere alkyl og R<1 >er ikke til stede.
I nok en utførelsesform kan den modifiserende del inkludere en rett eller forgrenet, substituert karbonkjededel med en ryggrad på 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 eller 25 atomer valgt fra gruppen bestående av –C, -C-, -O-, =O, -S-, -N-, -Si-. De tunge atomer vil typisk inkludere ett eller flere karbonatomer og ett eller flere ikke-karbontunge atomer valgt fra gruppen bestående av –O-, -S-, -N- og =O. Karbonatomene og ikke-karbontungatomene er typisk til stede i et forhold på minst 1 karbonatom per hvert ikke-karbontungatom, særlig minst 2 karbonatomer per hvert ikke-karbontungatom og spesielt minst 3 karbonatomer per hvert ikkekarbontungatom. Karbonatomene og oksygenatomene er typisk til stede i et forhold på minst 1 karbonatom per oksygenatom, særlig minst 2 karbonatomer per oksygenatom og spesielt minst 3 karbonatomer per oksygenatom. Den modifiserende del kan inkludere en eller flere dekkende grupper som forgrenet eller rett C1-6, eller karbonyl. Den modifiserende del vil typisk inkludere hydrogener og ett eller flere av hydrogenene kan være substituert med et fluor (som er et tungatom men som ikke skal telles som tungatom i formlene ovenfor). Det modifiserende middel kan i enkelte tilfeller spesifikt ekskludere ikke-substituerte alkyldeler. Den modifiserende del kan for eksempel kobles til en tilgjengelig gruppe på en aminosyre, for eksempel en aminogruppe, hydroksylgruppe eller en fri karboksylsyregruppe av polypeptidet, for eksempel ved en linkergruppe som karbamat-, karbonat-, eter-, ester-, amid- eller sekundær amingruppe, eller ved en disulfidbinding. Molekylene i linkergruppen telles som del av den modifiserende del. I en foretrukket utførelsesform er molekylvekten for den modifiserende del mindre enn molekylvekten for den HIM2 modifiserende del.
Oppfinnelsen inkluderer modifiserende deler med formelen:
(formel VII)
der n er 1, 2, 3 eller 4, og m er 1, 2, 3, 4 eller 5.
Oppfinnelsen inkluderer modifiserende deler med formelen:
(formel VIII)
der n er 1, 2, 3, 4 eller 5, og m er 1, 2, 3 eller 4.
Oppfinnelsen inkluderer modifiserende deler med formelen:
(formel IX),
der m er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 og n er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20.
Oppfinnelsen inkluderer også modifiserende deler med formelen:
(formel X),
der PAG er en PAG del med m subenheter og m er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 og n er 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20.
Andre foretrukne, modifiserende deler inkluderer:
De følgende, modifiserende deler kan være spesielt foretrukket for anvendelse i basalinsulinforbindelseserstatningsregimer.
Ċ
Ytterligere andre modifiserende deler inkluderer de følgende:
der R er –H, -OH, -CH2OH, -CH(OH)2, -C(O)OH, -CH2C(O)OH, eller en aktiverende del som et karbodiimid, et blandet anhydrid eller et N-hydroksysuksinimid, eller en dekkgruppe. Oppfinnelsen inkluderer også slike deler festet til et protein eller peptid, særlig til en insulinforbindelse. Spesifikke konjugeringsstrategier er diskutert i større detalj nedenfor. Av disse modifiserende deler er foretrukne deler de som gjør insulinforbindelsen mindre lipofil og/eller mer hydrofil enn den tilsvarende ikke-konjugerte insulinforbindelse. Oppfinnelsen inkluderer slike modifiserende deler som videre inkluderer en eller flere karbonylgrupper, særlig 1, 2, 3, 4 eller 5 karbonylgrupper; karbonylgruppene kan innføres i den modifiserende del, eller en –O- eller –CH2- kan erstattes med et karbonyl. Videre kan en hvilken som helst av –CH2- eller –CH3 delene substitueres, for eksempel med en lavere alkyl eller en –OH eller en PAG kjede med 1, 2, 3, 4 eller 5 PAG subenheter, som kan være like eller forskjellige. Fortrinnsvis er R valgt slik at hver –O- er separert fra den nærmeste –O- med minst 2 karbonatomer. Oppfinnelsen inkluderer også forgrenede, modifiserende deler der to eller flere av delene er bundet til en forgrenende del som et lysin.
De farmasøytiske karakteristika som hydrofilicitet/lipofilicitet for konjugatene ifølge utførelsesformer av oppfinnelsen kan varieres for eksempel ved å justere de lipofile og hydrofile egenskaper for de modifiserende deler, for eksempel ved å øke eller redusere antallet PAG monomerer, typen og lengden alkylkjeder, arten av PAG peptidbinding og antallet konjugeringsseter. Den nøyaktige art av den modifiserende del-peptidbinding kan varieres slik at den er stabil og/eller sensitiv for hydrolyse ved fysiologisk pH-verdi eller i plasma. Oppfinnelsen inkluderer også hvilke som helst av de foregående modifiserende deler koblet til et polypeptid og særlig en insulinforbindelse. Fortrinnsvis gjør den modifiserende del polypeptidet mer oppløselig enn et tilsvarende ikke-konjugert polypeptid, for eksempel ved en multiplikator på minst 1,05, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5 eller 15. En modifiserende del av oppfinnelsen kan kobles, for eksempel til en insulinforbindelse som humaninsulin, på et hvilket som helst festepunkt. Et foretrukket festepunkt er en nukleofil rest, for eksempel A1, B1 og/eller B29.
Videre vil det være klart at et aspekt ved oppfinnelsen inkluderer nye modifiserende deler som, men ikke begrenset til delene med formel VII og VIII, i karboksylsyreform. Der videre den modifiserende del inkluderer en karboksylgruppe kan denne konverteres til et blandet anhydrid og omsettes med en aminogruppe av et peptid for å skape et konjugat inneholdende en amidbinding. I en annen prosedyre kan karboksylgruppen behandles med vannoppløselig karbodiimid og omsettes med peptidet for å gi konjugater inneholdende amidbindinger. Som en konsekvens inkluderer oppfinnelsen aktiverte former av de nye deler som er presentert her som aktiverte former av de modifiserende deler med formel VII og VIII og andre nye oligomerer ifølge oppfinnelsen som karbodiimider, blandede anhydrider eller N-hydroksysuksinimider.
I enkelte tilfeller kan den modifiserende del kobles til polypeptidet via en aminosyre eller serier av 2 eller flere aminosyrer koblet til C-terminus, eller en sidekjede av polypeptidet. For eksempel blir i en utførelsesform den modifiserende del koblet til –OH eller –C(O)OH av Thr, og den mm-modifiserte Thr koblet til et polypeptid ved karboksyterminus. I en utførelsesform er for eksempel den modifiserende del koblet til –OH eller –C(O)OH av Thr og den modifiserte Thr er koblet til B29 aminosyren (for eksempel en B29 Lys for humaninsulin) av des-Thr insulinforbindelsen. I et annet eksempel er mm koblet til –OH eller –C(O)OH av Thr av et terminaloktapeptid fra insulinforbindelse B-kjeden og det mm-modifiserte oktapeptid er koblet til B22 aminosyren av des-okta-insulinforbindelsen. Andre varianter vil være åpenbare for fagmannen i lys av foreliggende beskrivelse.
Saltdannende deler
I noen utførelsesformer omfatter den modifiserende del en saltdannende del. Den saltdannende del kan være forskjellige egnede saltdannende deler slik det vil være klart for fagmannen, inkludert, men ikke begrenset til, karboksylat og ammonium. I noen utførelsesformer der den modifiserende del inkluderer en saltdannende del blir insulinforbindelseskonjugatet tilveiebrakt i saltform. I disse utførelsesformer blir insulinforbindelseskonjugatet assosiert med et egnet, farmasøytisk akseptabelt motion slik fagmannen vil forstå, inkludert, men ikke begrenset til negative ioner som klor-, brom-, jod-, fosfat-, acetat-, karbonat-, sulfat-, tosylat- og mesylat- eller positive ioner som natrium-, kalium-, kalsium-, litium- og ammoniumioner.
De foregående eksempler på modifiserende deler skal anses som illustrerende og ikke tas som noen begrensning på noen måte. Fagmannen på området vil erkjenne at egnede deler for konjugering for å oppnå spesiell funksjonalitet vil være mulig innen bindingene for kjemiske konjugeringsmekanismer som beskrevet og krevd her. I henhold til dette kan ytterligere deler velges og benyttes i henhold til de her beskrevne prinsipper.
Konjugeringsstrategier
Faktorer som grad av konjugering med modifiserende deler, seleksjon av konjugeringsseter på molekylet og seleksjon av modifiseringsdeler kan variere for å gi et konjugat som for eksempel er mindre tilbøyelig til in vivo nedbrytning og som derfor har økt plasmahalveringstid. For eksempel kan insulinforbindelsene modifiseres til å inkludere en modifiserende del på 1, 2, 3, 4, 5 eller flere seter av insulinforbindelsesstrukturen ved egnede festepunkter (det vil si modifiserende delkonjugeringsseter) som er tilgjengelige for å lette assosiasjon av en modifiserende del derpå. Som eksempel kan slike egnede konjugeringsseter omfatte en aminosyrerest, som en lysinaminosyrerest.
I noen utførelsesformer er insulinforbindelseskonjugatene monokonjugater. I andre utførelsesformer er insulinforbindelseskonjugatene multikonjugater som di-, tri-, tetra- eller -pentakonjugater og liknende. Antallet modifiserende deler på insulinforbindelsen er begrenset kun av antallet konjugringsseter på insulinforbindelsen. I ytterligere utførelsesformer er insulinforbindelseskonjugatene en blanding av mono-, di-, tri-, tetra- og/eller pentakonjugater.
Foretrukne konjugeringsstrategier er de som gir et konjugat som relaterer noe av eller all bioaktivitet av opphavsinsulinforbindelsen.
Foretrukne festeseter inkluderer A1 N-terminus, B1 N-terminus og B29 lysinsidekjede. B29 monokonjugatet og B1, B29 dikonjugatene er meget foretrukket. Et annet foretrukket festepunkt er en aminofunksjonalitet på en C-peptidkomponent eller en lederpeptidkomponent av insulinforbindelsen.
En eller flere modifiserende deler (det vil si en enkelt eller et antall modifiserende delstrukturer) kan kobles til insulinforbindelsen. De modifiserende deler i antallet er fortrinnsvis de samme. Det skal imidlertid være klart at de modifiserende deler i antallet kan være forskjellig fra hverandre, eller alternativt kan noen av de modifiserende deler i antallet være like og noen være forskjellige. Når et antall modifiserende deler er koblet til insulinforbindelsen kan det være foretrukket å koble en eller flere av de modifiserende deler til insulinforbindelsen med hydrolyserbare bindinger og koble en eller flere av de modifiserende deler til insulinforbindelsen med ikke-hydrolyserbare bindinger. Alternativt kan alle bindingene som koblet antallet av modifiserende deler til insulinforbindelsen være hydrolyserbare men ha forskjellig grad av hydrolyserbarhet slik at for eksempel en eller flere av de modifiserende deler kan fjernes relativt hurtig fra insulinforbindelsen ved hydrolyse i kroppen og en eller flere av de modifiserende deler fjernes langsommere fra insulinet ved hydrolyse i kroppen.
Kobling av modifiserende del til insulinforbindelse
Den modifiserende del er fortrinnsvis kovalent koblet til insulinforbindelsen. Mer enn en del av den modifiserende del kan kovalent være koblet til insulinforbindelsen. Kobling kan benytte hydrolyserbare eller ikke-hydrolyserbare bindinger eller blandinger av disse (det vil si forskjellige bindinger ved forskjellige konjugeringsseter).
I noen utførelsesformer er insulinforbindelsen koblet til den modifiserende del ved bruk av en hydrolyserbar binding (for eksempel en ester-, karbonat- eller hydrolyserbar karbamatbinding). Bruken av en hydrolyserbar kobling vil gi et insulinforbindelseskonjugat som virker som prodrug. En prodrugvei kan være ønskelig der det insulinforbindelses-modifiserende delkonjugat er inaktivt (det vil si at konjugatet mangler evnen til å påvirke kroppen via insulinforbindelsens primære virkningsmekanisme) som når modifiseringsdelkonjugeringssetet er i et bindende område av insulinforbindelsen. Anvendelsen av en hydrolyserbar kobling kan også gi en tidsfrigivnings- eller kontrollert frigivningseffekt, administrering av insulinforbindelsen over et gitt tidsrom etter hvert som en eller flere modifiserende deler spaltes fra sine respektive insulinforbindelse-modifiserende-delkonjugater for å gi det aktive medikament.
I andre utførelsesformer blir insulinforbindelsen koblet til den modifiserende del ved bruk av en ikke-hydrolyserbar binding (for eksempel en ikke-hydrolyserbar karbamat-, amid- eller eterbinding). Bruken av en ikke-hydrolyserbar binding kan være foretrukket når det er ønskelig å tillate terapeutisk signifikante mengder av insulinforbindelseskonjugatet til å sirkulere i blodstrøm i utstrakte tidsrom, for eksempel minst 2 timer etter administrering. Bindinger som benyttes for kovalent å koble insulinforbindelsen til den modifiserende del på ikke-hydrolyserbar måte velges typisk fra gruppen bestående av en eller flere kovalente bindinger, esterdeler, karbonatdeler, karbamatdeler, amiddeler og sekundære amindeler.
Den modifiserende del kan kobles til insulinforbindelsen ved forskjellige nukleofile rester inkludert men ikke begrenset til nukleofile hydroksylfunksjoner og/eller aminofunksjoner. Nukleofile hydroksylfunksjoner kan finnes for eksempel på serin- og/eller tyrosinrester, og nukleofile aminofunksjoner kan finnes for eksempel på histidin- og/eller Lys-rester, og/eller en eller flere av N-terminus av A- eller B kjedene av insulinforbindelsen. Når en modifiserende del er koblet til N-terminus av det natriuretiske peptid danner koblingen fortrinnsvis et sekundært amin.
Den modifiserende del kan kobles til insulinforbindelsen ved en fri –SH gruppe, for eksempel ved å danne en tioester, tioeter eller en sulfonatbinding.
Den modifiserende del kan kobles til insulinforbindelsen via en eller flere aminogrupper. Eksempler ved humaninsulin inkluderer aminogruppene ved A1, B1 og B29. I en utførelsesform blir en enkelt modifiserende del koblet til en enkelt aminogruppe på insulinforbindelsen. I en annen utførelsesform blir to modifiserende deler begge forbundet til en forskjellig aminogruppe på insulinforbindelsen. Der det er to modifiserende deler koblet til to aminogrupper er et foretrukket arrangement kobling på B1 og B29. Der det er flere polymerer vil polymerene alle være like eller en eller flere kan være forskjellig fra de andre. Forskjellige metoder og typer av koblinger av polymerer til insulinforbindelser er beskrevet i USSN 09/873899 med tittelen "Mixture of insulin compound conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same," av 04.06.01 og denne søknad anses som del av foreliggende beskrivelse.
I ytterligere utførelsesformer kan en partialprodrugvei benyttes der en del av den modifiserende del er hydrolysert. Det kan her for eksempel henvises til US 6309633 i navnet Ekwuribe et al. (dokumentet anses som del av foreliggende beskrivelse) som beskriver modifiserende deler med hydrofile og lipofile komponenter der de lipofile komponenter hydrolyserer in vivo for å gi et mikropegylert konjugat.
Seleksjon av modifiserende del og egenskaper for insulin-forbindelseskonjugatet og komplekser derav
Den modifiserende del kan velges for å gi ønskede attributter til insulinforbindelseskonjugatet og kompleksene derav. Foretrukne, modifiserende deler er valgt for å gjøre insulinforbindelsen mer oppløselig i en vandig oppløsning enn den vandige oppløselighet for insulinforbindelsen i fravær av den modifiserende del, særlig minst 1,05, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5 eller 15 ganger mer oppløselig enn opphavsinsulinforbindelsen (det vil si den tilsvarende ikke-konjugerte insulinforbindelse) i en vandig oppløsning. For eksempel har ikke-kompleksdannet nativ humaninsulin en oppløselighet på rundt 18 mg/ml ved en pH-verdi rundt 7,4. Foreliggende oppfinnere har overraskende funnet en metode for kompleksdannelse av humaninsulinkonjugater som er mer oppløselige enn humaninsulin med en faktor minst 1,05, 1,25, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5 eller 15.
I visse utførelsesformer blir den modifiserende del valgt for å gi et insulinforbindelseskonjugat med en vandig oppløselighet som overskrider 1 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l, 5 g/l, 20 g/l, 50 g/l, 100 g/l eller sågar 150 g/l ved en pH verdi i området fra rundt 4 til rundt 8, særlig rundt 5 til rundt 7,5 og spesielt ved en pH-verdi rundt 7,4.
Insulinforbindelseskonjugatet kan være mer oralt biotilgjengelig i et pattedyr enn en vitenskapelig aksepterbar kontroll, for eksempel en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse. I andre utførelsesformer kan insulinforbindelseskonjugatet være mer oralt biotilgjengelig i et menneske enn en vitenskapelig aksepterbar kontroll som en tilsvarende, ikke-konjugert insulinforbindelse. I visse utførelsesformer er absorpsjonen av insulinforbindelseskonjugatet for eksempel som målt ved plasmanivåene for konjugatet, minst 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 eller 4 ganger større enn absorpsjonen av en ikke-konjugert insulinforbindelseskontroll.
Det vil erkjennes at mens, i noen av aspektene ifølge oppfinnelsen, den modifiserende del velges for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet mer oppløselig enn en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse så kan i andre aspekter den modifiserende del også eller alternativt velges for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet like eller mer hydrofilt enn en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse. Videre kan den modifiserende del velges for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet mer amfifilt enn en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse.
I noen utførelsesformer er kation-insulinforbindelseskonjugatkomplekset like vannoppløselig eller mer vannoppløselig enn (a) et tilsvarende, ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat, (b) en tilsvarende ikke-kompleksdannet eller ikke-konjugert insulinforbindelse, og/eller (c) en tilsvarende kompleksdannet men ikke-konjugert insulinforbindelse.
I en foretrukket utførelsesform blir vannoppløseligheten for insulinforbindelseskonjugatet redusert ved tilsetning av Zn<++>. I noen utførelsesformer blir den modifiserende del valgt for å gjøre insulinforbindelseskonjugatet like eller mer oppløselig enn en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse, og vannoppløseligheten for insulinforbindelseskonjugatet reduseres ved tilsetning av sink. I andre utførelsesformer blir den modifiserende del valgt for å gjøre insulin-forbindelseskonjugatet like eller mer oppløselig enn en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse idet vannoppløseligheten for insulinforbindelseskonjugatet reduseres ved tilsetning av sink, og vannoppløseligheten for kationkomplekset er større enn vannoppløseligheten for insulinforbindelsen. I et ytterligere aspekt er insulinforbindelseskonjugatet en fettsyreacylert insulinforbindelse, kationet er sink og vannoppløseligheten for insulinforbindelseskonjugatet reduseres ved tilsetning av sink. I nok en utførelsesform er insulinforbindelseskonjugatet en fettsyreacylert insulinforbindelse som er like eller mer vannoppløselig enn en tilsvarende ikke-konjugert insulinforbindelse, kationet er sink og vannoppløseligheten for insulinforbindelseskonjugatet reduseres ved tilsetning av sink.
I visse foretrukne utførelsesformer er lipofilisiteten for insulinforbindelseskonjugatet i forhold til den tilsvarende opphavsinsulinforbindelse 1 eller mindre enn 1. Den relative lipofilisitet for insulinforbindelseskonjugatet sammenliknet med den tilsvarende opphavsinsulinforbindelse (Krel) kan for eksempel bestemmes som følger:
krel =(tkonjugat – t0)/(thuman – t0),
der relativ lipofilisitet måles på en LiChroSorb RP18 (5 µm, 250 mm X 4 mm) høyytelsesvæskekromatografikolonne ved isokratisk oppløsning ved 40 °C. Den følgende blanding kan benyttes som eluenter:
0,1 M natriumfosfatbuffer ved pH 7,3 inneholdende 10 % acetonitril, og 50 % acetonitril i vann. Dødtid (t0) identifiseres ved å injisere 0,1 mM natriumnitrat. Retensjonstiden for humaninsulin justeres til minst 2 t0 ved å variere forholdet mellom blandinger av (c)(i) og (c)(ii). Fortrinnsvis er i disse utførelsesformer den relative lipofilisitet rundt lik 1 eller er mindre enn 1 eller vesentlig mindre enn 1. I en foretrukket utførelsesform er insulinforbindelsen humaninsulin og den relative lipofilisitet mindre enn 1. Fortrinnsvis er den relative lipofilisitet mindre enn rundt 0,99, 0,98, 0,97, 0,96, 0,95, 0,94, 0,93, 0,92, 0,91 eller 0,90. Diskusjon av teknikker for å bestemme oppløseligheten og/eller lipofilisiteten for insulin og insulinkonjugater er angitt i US 5750499 med tittelen "Acylated insulin" i navnet Harelund et al., inngitt 12.05.98, idet hele beskrivelsen anses som del av foreliggende beskrivelse.
I en utførelsesform er den relative lipofilisitet som beskrevet ovenfor og den modifiserende del en karbonkjede med 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 eller 18 karbonatomer der karbonkjeden omfatter 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 oksygrupper i innskutt form. I en annen utførelsesform er den relative lipofilisitet som beskrevet ovenfor og den modifiserende del er en karbonkjede med 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 karbonatomer der karbonkjeden omfatter 2, 3 eller 4 oksygrupper i innskutt form. I en relatert utførelsesform er den relative lipofilisitet som beskrevet ovenfor og den modifiserende del omfatter 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 polyalkalenglykolenheter. I en annen, relatert utførelsesform er den relative lipofilisitet som beskrevet ovenfor og den modifiserende del omfatter 1, 2 eller 3 polyetylenglykolenheter og 1, 2 eller 3 polypropylenglykolenheter.
Metallkationkomponent og komplekskarakteristika
Kation-insulinforbindelseskonjugatkompleksene inkluderer et metallkation. Egnede metallkationer for bruk som kationkomponent inkluderer et hvilket som helst metallkation som er i stand til å kompleksdanne, aggregere eller krystallisere med insulinforbindelseskonjugatet. Det er foretrukket at metallkationet kompleksdannes til insulinforbindelseskonjugatet. Enkle eller multiple kationer kan benyttes. Kationet er fortrinnsvis ikke signifikant oksiderende for insulinforbindelseskonjugatet, det vil si at det ikke er oksiderende i den grad at kompleksene gjøres ubrukelige for det tilsiktede formål.
I noen utførelsesformer er metallkationet biokompatibelt. Et metallkation er biokompatibelt hvis kationet ikke presenterer noen urimelige signifikante skadelige effekter for mottakeren som signifikante, immunologiske reaksjoner på injeksjonsstedet. Imidlertid skal det erkjennes at under visse omstendigheter kan risiko for toksisitet og andre skadelige effekter oppveies av fordelene ved kation-insulinforbindelseskonjugatpreparatene og derfor allikevel være aksepterbare under slike omstendigheter.
Egnetheten for metallkationer for å stabilisere biologisk aktive midler og forholdet mellom metallkation og biologisk aktivt middel som er nødvendig, kan bestemmes av fagmannen på området ved å gjennomføre et antall tester med henblikk på stabilitet som polyakrylamidgelelektroforese, isoelektrisk fokusering, reversfasekromatografi, og HPLC analyse på partikler av metallkation-stabilisert biologisk aktivt middel før og under partikkelstørrelsesreduksjon og/eller innkapsling.
Metallkationkomponenten egnet inkluderer hensiktsmessig ett eller flere mono-, di- eller trivalente metallkationer eller kombinasjoner derav. I en foretrukket utførelsesform er metallkationet en gruppe II- eller overgangsmetallkation. Eksempler på egnede toverdige kationer er Zn<++>, Mn<++>, Ca<++>, Fe<++>, Ni<++>, Cu<++>, Co<++ >og/eller Mg<++>. Der et monovalent kation er inkludert er dette fortrinnsvis Na<+>, Li<+ >eller K<+>. Kationet tilsettes fortrinnsvis som et salt, som klorid- eller acetatsalt, aller helst benyttes ZnCl2 eller ZnAc.
Molforholdet til insulinforbindelseskonjugatet til kation er typisk mellom 1:1 og rundt 1:100 og særlig mellom 1:2 og rundt 1:12, spesielt mellom rundt 1:2 og 1:7 eller rundt 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 eller 1:7. I spesielle utførelsesformer benyttes Zn<++ >som kationkomponent og tilveiebringes som sinkkationkomponent i forhold til insulinforbindelseskonjugatmolforholdet på rundt 1:1 og rundt 1:100, særlig rundt 1:2 og rundt 1:12 og spesielt rundt 1:2 og rundt 1:7 eller rundt 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 eller 1:7.
Kationkomponenten er fortrinnsvis større enn rundt 90 % enkeltkation som Zn<++>. Fortrinnsvis er kationet større enn rundt 95 %, 99 % eller 99,9 % Zn<++>.
Fortrinnsvis er resistensen for kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat og kymotrypsinnedbrytning større enn kymotrypsinnedbrytningen av det tilsvarende ikke-kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat. Foretrukket resistens for kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat mot kymotrypsinnedbrytning er større enn kymotrypsinnedbrytningen for den kompleksdannende men ikke konjugerte insulinforbindelse.
Det kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat kan være mer oralt biotilgjengelig i et pattedyr enn en vitenskapelig aksepterbar kontroll som et tilsvarende, ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat. I andre utførelsesformer er det kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat lettere biotilgjengelig i et menneske enn i en vitenskapelig aksepterbar kontroll, for eksempel et tilsvarende ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat. I visse utførelsesformer er absorpsjonen av kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat, for eksempel målt ved plasmanivåer for konjugatet, minst 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 eller 4 ganger større enn absorpsjonen av ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat.
Det kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat kan være mer oralt biotilgjengelig i et pattedyr enn en vitenskapelig aksepterbar kontroll, for eksempel som en tilsvarende kompleksdannet men ikke-konjugert insulinforbindelse. I andre utførelsesformer er det kompleksdannende insulinforbindelses-konjugat mer oralt biotilgjengelig i et menneske enn en vitenskapelig aksepterbar kontroll, for eksempel en tilsvarende kompleksdannet men ikke-konjugert insulinforbindelse. I visse utførelsesformer er absorpsjonen av kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat, for eksempel som målt ved plasmanivåer for konjugatet, minst 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 eller 4 ganger større enn absorpsjonen av en kompleksdannet men ikke-konjugert insulinforbindelse.
Kompleksdannende midler
I enkelte utførelsesformer inkluderer de kation-insulinforbindelseskonjugatblandinger en eller flere kompleksdannende midler. Eksempler på kompleksdannende midler som er egnet for bruk ifølge oppfinnelsen er protaminer, surfen, globinproteiner, spermin, spermidinalbumin, aminosyrer, karboksylsyrer, polykationiske polymerforbindelser, kationiske polypeptider, anioniske polypeptider, nukleotider og antisense. Se Brange, J., Galenics of Insulin compound, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1987), der hele beskrivelsen anses som del av foreliggende beskrivelse. Egnetheten for kompleksdannende midler for stabilisering av preparatene kan bestemmes av fagmannen i lys av den foreliggende beskrivelse. I noen utførelsesformer vil kationinsulinforbindelseskonjugatpreparatene spesifikt utelukke eller i det vesentlige være frie for kompleksdannende midler.
Et foretrukket kompleksdannende middel er protamin. I fast form vil protaminet fortrinnsvis være til stede i et forhold insulinforbindelse:protamin på rundt 3:1 til 1:3 og mer spesielt rundt 2:1 til rundt 1:2, ideelt rundt et molforhold på 1:1. I visse utførelsesformer utelukker kation-insulin-forbindelseskonjugatpreparatene spesifikt protamin eller er i det vesentlig frie for protamin.
Aminosyrer kan også benyttes som kompleksdannende midler, for eksempel glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, serintreonin, fenylalanin, prolin, tryptofan, asparagin, glutaminsyre og histidin og oligopeptider som diglycin.
Karboksylsyrer er også egnet for bruk som kompleksdannende midler; eksempler er eddik- og hydrokarboksylsyrer som sitron-, 3-hydroksysmør- og melkesyre.
Stabiliserende midler
I noen utførelsesformer inkluderer kationinsulinforbindelseskonjugatpreparatene ett eller flere stabiliserings-midler. Foretrukne stabiliseringsmidler inkluderer fenoliske forbindelser og aromatiske forbindelser. Foretrukne fenoliske forbindelser er fenol, m-kresol og m-paraben eller blandinger derav. Stabiliseringsmidlet kan tilveiebringes i en hvilken som helst mengde som forbedrer stabiliteten for kation-insulinforbindelseskonjugatpreparatene i forhold til en vitenskapelig aksepterbar kontroll som et tilsvarende kationinsulinforbindelseskonjugatpreparat i fravær av stabiliseringsmiddel.
Presentering av komplekser
Kompleksene kan tilveiebringes som et tørrfaststoff, som i det vesentlige rent pulver av kationinsulinforbindelses-konjugat, eller et pulver som inkluderer et kationinsulin-forbindelseskonjugatfaststoff sammen med andre farmasøytisk akseptable komponenter. Kompleksene kan også tilveiebringes i en oppløst tilstand i vandig eller organisk medium og/eller som ikke-oppløste faststoffer i slike medier.
Faste preparater
Kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekset kan tilveiebringes som et faststoff. Faststoffet kan for eksempel foreligge i tørr tilstand eller i ikke-oppløst tilstand i en vandig oppløsning, et organisk oppløsningsmiddel, en emulsjon, mikroemulsjon eller en annen ikke-tørket form.
I en utførelsesform tilveiebringes kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekset som et rent, prosessert fast preparat. I et rent, prosessert fast preparat er molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation typisk rundt 3:4 til rundt 3:0,5 til rundt 3:3,5 til rundt 3:1 eller ideelt rundt 3:1. I et prosessert rent, fast T-type preparat (med kation, insulinforbindelseskonjugat og uten protamin) er molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation typisk rundt 3:4 til 3:0,5, særlig rundt 3:3,5 til rundt 3:1 og spesielt rundt 3:1. I en prosessert ren, fast T type protaminblanding med kation, insulinforbindelseskonjugat og protamin er molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation typisk rundt 3:6 til rundt 3:0,5, særlig rundt 3:5 til rundt 3:1 eller ideelt rundt 3:2.
I et prosessert rent, fast R-type (lente) preparat (med kation, insulinforbindelse og stabiliseringsforbindelse (for eksempel en fenolisk forbindelse) og uten protamin) kan molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation typisk ligge i området rundt 3:4,5 til 3:0,9, særlig rundt 3:3,9 til rundt 3:2,4. I en prosessert ren, fast R type (ultralente) preparat (med kation, insulinforbindelse og stabiliserende forbindelse (for eksempel en fenolisk forbindelse) og uten protamin), kan molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation typisk ligge rundt 3:12 til større enn rundt 3:4,5, særlig rundt 3:9 til rundt 3:4,8 og helst rundt 3:6 til rundt 3:5,4. I et prosessert rent fast R type protaminpreparat (med kation, insulinforbindelse og stabiliserende forbindelse (for eksempel en fenolisk forbindelse) og protamin) kan molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation typisk ligge fra rundt 3:12 til rundt 3:3, fortrinnsvis rundt 3:9 til rundt 3:4,5 og helst rundt 3:6,9 til rundt 3:5,4.
For et monovalent kation som Na<+ >vil faststoffet forventes å ha et insulinforbindelseskonjugat:kationforhold på rundt 3:6 til rundt 3:3.
Faste preparater ifølge oppfinnelsen kan for eksempel inkluderer preparater som pulvere, inkludert insulinforbindelseskonjugater og/eller kation-insulinforbindelses-konjugat-komplekser ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis tilveiebringes de faste preparater i farmasøytisk akseptable renhetsnivåer, det vil si frie for kontaminanter som på uakseptabel måte kan redusere egnetheten for preparatene for human bruk.
I noen utførelsesformer tilveiebringes preparatene der kation-insulinforbindelseskonjugatkomponentforholdet er større enn rundt 90 % krystallinsk og særlig større enn rundt 95 % krystallinsk, spesielt større enn 99 % krystallinsk. I andre utførelsesformer tilveiebringes det preparater der kationinsulinforbindelseskonjugatkomponenten er mer enn 90 % amorft fast, særlig mer enn 95 % amorft fast og spesielt mer enn rundt 99 % amorft fast.
I ytterligere utførelsesformer tilveiebringes det preparater der kationinsulinforbindelseskonjugatkomponenten er til stede i en blanding av amorfe faststoffer og krystallinske faststoffer. For eksempel kan forholdet amorfe faststoffer: krystallinske faststoffer være fra rundt 1:10 til rundt 10:1, eller rundt 1:9 til rundt 9:1, eller rundt 1:8 til rundt 8:1, eller rundt 1:7 til 7:1, eller rundt 1:6 til 6:1, eller rundt 1:5 til 5:1, eller rundt 1:4 til 4:1, eller rundt 1:3 til 3:1, eller rundt 1:2 til 2:1 eller rundt 1:1.
Videre kan det tilveiebringes preparater ved bruk av blanding av kationinsulinforbindelsesfaststoffer med forskjellige insulinforbindelser, for eksempel som et faststoff som inkluderer nativ insulinforbindelse med et faststoff som inkluderer insulinforbindelseskonjugater eller faststoffer som inkluderer et insulinforbindelseskonjugat med et faststoff som inkluderer et ulikt insulinforbindelseskonjugat.
I tillegg kan fasttypen- og insulinforbindelses/insulin-forbindelseskonjugatforbindelsen alle variere. For eksempel kan preparatene tilveiebringes som inkluderer Zn-insulin-forbindelseskrystaller ved bruk av native insulinforbindelser og amorfe insulinforbindelseskonjugater, eller preparater kan tilveiebringes som inkluderer amorfe Zn-insulinforbindelses-faststoffer ved bruk av nativ insulinforbindelse og krystallinske Zn-insulinforbindelseskonjugater. Slike blandinger kan benyttes for å oppnå forskjellige variasjoner i fysikalske karakteristika som oppløsningsprofil og/eller variasjoner i den farmakokinetiske profil.
Den midlere partikkelstørrelse for faststoffene ligger fortrinnsvis i området rundt 0,1 til rundt 100 mikron, særlig 1-50 mikron, spesielt 1-25 mikron, ideelt 1-15 mikron. Småpartikkelstørrelser kan oppnås ved mikrokrystalliseringsbetingelser, spraytørking, oppmaling, vakuumtørke, frysetørking og liknende.
I en utførelsesform inneholder blandingen, etter tørking, mer enn rundt 96 vektprosent insulinforbindelseskonjugat og fra 0,05, 0,1, 0,15 eller 0,3 til rundt 4 vektprosent sink. I en annen utførelsesform inneholder blandingen etter tørking mer enn rundt 91 vektprosent insulinforbindelseskonjugat, fra rundt 0,05, 0,1 eller 0,2 til 4 vektprosent sink og fra rundt 0,2 til rundt 5 vektprosent fenol. I nok en utførelsesform inneholder blandingen etter tørking rundt 4 vektprosent sink, fra rundt 2 til rundt 14 vektprosent protamin. I nok en utførelsesform inneholder blandingen når den tørkes mer enn rundt 71 vekt-& insulinforbindelseskonjugat, fra rundt 0,05, 0,1 eller 0,2 til rundt 4 vektprosent sink, fra rundt 0,2 til rundt 14 vektprosent protamin, og fra rundt 0,2 til rundt 15 vektprosent fenol.
I en ytterligere utførelsesform inkluderer blandingen når den tørkes fra rundt 0,1 til rundt 2 vektprosent Zn<++ >og fra 0,08 til rundt 1 vektprosent fenol, særlig fra rundt 0,5 til rundt 1,3 vektprosent Zn<++ >og fra rundt 0,1 til rundt 0,7 vektprosent fenol, spesielt lik mer enn 1 til rundt 3,5 vektprosent Zn<++ >og fra rundt 0,1 til rundt 3 vektprosent fenol, og aller helst fra lik mer enn 1,3 til rundt 2,2 vektprosent Zn<++ >og fra rundt 0,4 til rundt 2 vektprosent fenol.
Kompleksene kan tilveiebringes i en lente-type fremstilling. For eksempel blir i en foretrukket tørket lente-type fremstilling Zn tilveiebrakt i en mengde som ligger fra rundt 0,1 til rundt 2 vektprosent og fenol er til stede i en mengde som ligger fra rundt 0,08 til rundt 1 vektprosent der de gjenværende vektprosent er insulinforbindelseskonjugat. Ideelt og for et tørket lente-type preparat tilveiebringes Zn i en mengde som ligger fra rundt 0,5 til rundt 1,3 vektprosent og fenol er til stede i en mengde som ligger fra rundt 0,1 til rundt 0,7 vektprosent der de resterende vektprosent er insulinforbindelseskonjugat.
Kompleksene kan tilveiebringes i en ultralente-type fremstilling. I en foretrukket tørket ultralentetype fremstilling blir Zn tilveiebrakt i en mengde som ligger fra lik større enn 1 og opp til 3,5 vektprosent og fenol er til stede i en mengde som ligger fra rundt 0,1 til rundt 3 vektprosent der resten av vektprosent er insulinforbindelseskonjugat. For et tørket ultralente-type preparat blir ideelt Zn tilveiebrakt i en mengde som ligger fra lik større enn 1,3 til rundt 2,2 vektprosent og fenol er til stede i en mengde som ligger fra rundt 0,4 til rundt 2 vektprosent der resten av vektprosent er insulinforbindelses-konjugat.
Flytende preparater
Kation-insulinforbindelseskonjugatkompleksene kan tilveiebringes som komponenter som ikke oppløste komponenter i en væske. For eksempel kan væsken være en vandig oppløsning som inkluderer et kation-insulinforbindelseskonjugat som et presipitat, eller kationinsulinforbindelseskonjugatet kan tilveiebringes som en komponent av en suspensjon, emulsjon eller mikroemulsjon. Væsken kan også inkludere oppløste komponenter eller komplekser sammen med ikke-oppløste komponenter.
7.7.3 Blandinger og ko-krystaller
Foreliggende preparater ifølge oppfinnelsen kan for eksempel inkludere komplekse blandinger, faste blandinger, hybridkomplekser og ko-krystaller.
Således tilveiebringer for eksempel oppfinnelsen preparater som inkluderer to eller flere insulinforbindelseskonjugater og/eller ikke-konjugerte insulinforbindelser. Der videre preparatene inkluderer faststoffer kan disse ha forskjellige former. Således kan for eksempel et faststoff være krystallinsk og et annet være et amorft faststoff. Som angitt annensteds kan faststoffene tilveiebringes i en tørket form eller kan tilveiebringes som faste komponenter i en flytende blanding. I en foretrukket utførelsesform inkluderer blandingen ifølge oppfinnelsen to eller flere forskjellige insulinforbindelseskonjugater og de forskjellige insulinforbindelses-konjugater har forskjellige oppløseligheter. I en utførelsesform omfatter et av kompleksene et lipofilt insulinforbindelseskonjugat og det andre omfatter et hydrofilt insulinforbindelseskonjugat. I nok en utførelsesform kan kompleksene inkludere forskjellige insulinforbindelseskonjugater der ett eller flere av konjugatene har en sirkulasjonshalveringstid fra rundt 1 til rundt 4 timer og ett eller flere komplekser har en sirkulasjonshalveringstid som er signifikant større enn sirkulasjonshalveringstiden for det første kompleks. I relaterte utførelsesformer har et av kompleksene en hurtigvirkende profil og det andre av kompleksene har en middels-til-lengevirkende profil. Videre kan et av kompleksene ha profiler som er egnet for basalinsulinforbindelseskontroll mens et annet har en profil som er egnet for post-prandial glukosekontroll. Foretrukne blandinger er blandinger av HIM2 og insulin, blandinger av HIM2 og IN105, blandinger av IN105 og insulinforbindelse, blandinger av IN105 og fettsyreacylert insulin, blandinger av HIM2 og fettsyreacylert insulin. Egnede fettsyreacylerte insuliner er beskrevet i de følgende US patenter som alle anses som del av foreliggende beskrivelse:
US 6531448 med tittelen "Insoluble compositions for controlling blood glucose", av 11.03.03; US RE37971 med tittelen "Selective acylation of epsilon-amino groups", av 28.01.03;
US 6465426 med tittelen "Insoluble insulin compositions", av 15.10.02;
US 6444641 med tittelen "Fatty acid-acylated insulin analogs", av 03.09.02;
US 6335316 med tittelen "Method for administering acylated insulin", av 01.01.02;
US 6268335 med tittelen "Insoluble insulin compositions", av 31.07.01;
US 6051551 med tittelen "Method for administering acylated insulin", av 18.04.00;
US 5922675 med tittelen "Acylated Insulin Analogs", av 13.07.99;
US 5700904 med tittelen "Preparation of an acylated protein powder", av 23.12.97;
US 5693609 med tittelen "Acylated insulin analogs Granted", av 02.12.97;
US5646 242 med tittelen "Selective acylation of epsilon-amino groups", av 08.07.97;
US 5631347 med tittelen "Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein", av 20.05.97;
US 6451974 med tittelen "Method of acylating peptides and novel acylating agents", av 17.09.02; US 6011007 med tittelen "Acylated insulin", av 04.01.00;
US 5750497 med tittelen "Acylated insulin Granted" av 12.05.98;
US 5905140 med tittelen "Selective acylation method", av 18.05.99;
US 6620780 med tittelen "Insulin derivatives", av 16.09.03;
US 6251856 med tittelen "Insulin derivatives", av 26.06.01;
US 6211144 med tittelen "Stable concentrated insulin preparations for pulmonary delivery", av 03.04.01;
US 6310038 med tittelen "Pulmonary insulin crystals", av 30.10.01; og
US 6174856 med tittelen "Stabilized insulin compositions", av 16.01.01.
Spesielt foretrukne mono-fett-syreacylerte insuliner har 12, 13, 14, 15 eller 16-karbonfett-syrer kovalent bundet til Lys(B29) av humaninsulin.
I en utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ko-krystall med to forskjellige insulinforbindelser og/eller insulinforbindelseskonjugater. Fortrinnsvis viser ko-krystallene en eller flere av de følgende karakteristika: i det vesentlige homogen fordeling, en enkelt in vivo oppløsningskurve, og/eller en enkelt toppfarmakodynamisk profil. Foretrukne ko-krystaller er ko-krystaller av HIM2 og insulin, ko-krystaller av HIM2 og IN105, ko-krystaller av IN105 og insulinforbindelse.
I en utførelsesform inkluderer ko-krystallen humaninsulin, og ko-krystallisering med humaninsulin reduserer oppløseligheten for krystallen i forhold til oppløseligheten for en tilsvarende krystall av insulinforbindelseskonjugatet. I en ytterligere utførelsesform inkluderer ko-krystallen humaninsulin, og ko-krystalliseringen med humaninsulin reduserer oppløseligheten av krystallen relativt oppløseligheten for en tilsvarende krystall av insulinforbindelseskonjugatet.
I en ytterligere utførelsesform inkluderer ko-krystallet en hurtigvirkende, hurtigklarende og/eller sterkt potent insulinforbindelseskonjugat, og et lengevirkende, langsomt klarende og/eller dårlig potent insulinforbindelseskonjugat. Fortrinnsvis har ko-krystallen en PK/PD profil som er egnet for post-prandial glukosekontroll eller for overnattbasalinsulinforbindelseskontroll.
I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en blanding eller ko-krystall der et insulinforbindelseskonjugat er inkludert med humaninsulin eller lys-proinsulin. Blandingene ifølge oppfinnelsen kan inkludere to forskjellige insulinforbindelseskonjugater. Blandingene kan inkludere et insulinforbindelseskonjugat og en ikke-konjugert insulinforbindelse. Blandingene kan inkludere forskjellige insulinforbindelseskonjugater med forskjellige insulinforbindelser.
Videre tilveiebringer oppfinnelsen komplekser med to forskjellige insulinforbindelseskonjugater og/eller et insulinforbindelseskonjugat og en ikke-konjugert insulinforbindelse. Oppfinnelsen tilveiebringer hybride ko-krystaller av to, tre eller flere forskjellige insulinforbindelseskonjugater. Oppfinnelsen tilveiebringer et kompleks med et insulinforbindelseskonjugat med en ikke-konjugert insulinforbindelse. Oppfinnelsen tilveiebringer en ko-krystall med to eller flere forskjellige hydrofile insulinforbindelseskonjugater; to eller flere forskjellige hydrofobe insulinforbindelseskonjugater; to eller flere forskjellige amfifile insulinforbindelseskonjugater; et hydrofilt insulinforbindelseskonjugat og en ikke-konjugert insulinforbindelse; HIM2 sammen med en ikke-konjugert insulinforbindelse; IN105 sammen med en ikke-konjugert insulinforbindelse; HIM2 sammen med IN105; HIM2 sammen med insulinforbindelse og IN105; og andre kombinasjoner av de foregående elementer. Som nevnt annensteds kan kompleksene tilveiebringes som tørkede faststoffer, som oppløste komplekser i oppløsning og/eller som ikke-oppløste komplekser i oppløsning. Forskjellige kombinasjoner kan for eksempel benyttes for å tilveiebringe et kompleks eller en ko-krystall med en utstrakt profil.
Oppløselighet av komplekser ifølge oppfinnelsen
Fortrinnsvis er den vandige oppløselighet av kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekset ved en pH rundt 7,4 fra rundt 1/15, 1/14, 1/13, 1/12, 1/11, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5 opp til rundt 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller < 10 ganger den vandige oppløselighet for det ikke-kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat. Enhver kombinasjon av de foregående øvre og nedre grenser ligger innenfor rammen av oppfinnelsen. Imidlertid er et foretrukket område fra rundt 1/15 til < 5, særlig rundt 1/10 til rundt 2, ideelt rundt 1/10 til < 0. I et spesielt overraskende aspekt ved oppfinnelsen er den vandige oppløselighet for kation-insulinforbindelseskonjugatet i oppløsning ved en pH-verdi rundt 7,4 ofte vesentlig mindre enn den vandige oppløselighet for insulinforbindelseskonjugatet i oppløsning ved en pH-verdi rundt 7,4. Imidlertid vil det erkjennes at i visse utførelsesformer kan den vandige oppløselighet for kation-insulinforbindelseskonjugatet i oppløsning ved en pH-verdi rundt 7,4 være lik, større enn eller vesentlig større enn den vandige oppløselighet for insulinforbindelseskonjugatet i oppløsning ved en pH-verdi rundt 7,4.
I en overraskende utførelsesform er den vandige oppløselighet for kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekset ved en pH-verdi rundt 7,4 vesentlig mindre enn oppløseligheten for det tilsvarende ikke-kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat i oppløsning ved pH rundt 7,4 og kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekset forblir oppløselig ved mer enn rundt 1, 23, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 eller 130 g/l i vandig oppløsning over et pH-område som begynner ved rundt 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 eller 6,9 og som slutter ved rundt 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8 eller 8,9. I nok en utførelsesform er den vandige oppløselighet for kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekset ved pH rundt 7,4 vesentlig mindre enn oppløseligheten for det tilsvarende insulinforbindelseskonjugat i oppløsning ved pH rundt 7,4, og kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekset forblir oppløselig i en mengde av mer enn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 eller 130 g/l i vandig oppløsning over et pH-område fra rundt 5,8 til rundt 8,5, fortrinnsvis over et pH-område fra 6,5 til rundt 8 og særlig fra rundt 6,9 til rundt 7,8.
Fortrinnsvis er insulinforbindelseskonjugatene ifølge oppfinnelsen valgt for å gi krystaller i vandig oppløsning ved en pH-verdi som er lik "pI /- anout 2,5", der konsentrasjonen av insulinforbindelseskonjugat er fra 0,5 mg/ml til rundt 50 mg/ml, særlig rundt 5 til rundt 30 mg/ml og spesielt rundt 15 til rundt 30 mg/ml, og krystallformuleringen begynner å inntre ved rundt 3, 4 eller 5 vektprosent kation per insulinforbindelseskonjugat, der kationet fortrinnsvis er Z<++>. Foretrukne krystaller er til stede for et monokonjugat uten protamin i en vandig oppløsning ved en pH-verdi fra rundt 4, 4,1, 4,2, 4,3 eller 4,4 til rundt 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7 eller 5,8, fortrinnsvis en pH-verdi rundt 4 til < 6,5 og særlig rundt 4 til < 5,8, særlig rundt 4,2 til rundt 5,5 og spesielt rundt 4,4 til rundt 5,2. Særlig er krystaller til stede for et dikonjugat uten protamin ved en pH-verdi rundt 3,5 til < 5,8 og særlig rundt 3,8 til rundt 5,5 og spesielt rundt 4,0 til rundt 5,2. Fortrinnsvis er krystaller til stede for et trikonjugat uten protamin ved en pH-verdi rundt 3 til < 5,5, og særlig 3,3 til rundt 5, spesielt rundt 3,8 til rundt 4,8.
R-type komplekser
Fortrinnsvis har den vandige oppløselighet for R-type Zn komplekset av insulinforbindelseskonjugatet ved en pH-verdi rundt 7,4 et område rundt 10 til rundt 150 g/l, særlig rundt 20 til rundt 130 g/l og spesielt rundt 30 til rundt 110 g/l, helt spesielt rundt 35 til rundt 60 g/l.
Fortrinnsvis har den vandige oppløselighet for R type Zn komplekset av insulinforbindelseskonjugatet med protamin ved en pH-verdi rundt 7,4 et område rundt 10 til rundt 110 g/l, særlig rundt 20 til rundt 85 g/l og mer spesielt rundt 30 til rundt 70 g/l.
T-type komplekser
Fortrinnsvis har den vandige oppløselighet av T-type Zn komplekset av insulinforbindelseskonjugatet ved en pH-verdi rundt 7,4 et område rundt 30 til rundt 175 g/l, særlig rundt 50 til rundt 160 g/l og mer spesielt rundt 70 til rundt 150 g/l.
Fortrinnsvis har den vandige oppløselighet av T-type Zn komplekset av insulinforbindelseskonjugatet med protamin ved en pH-verdi rundt 7,4 et område rundt 10 til rundt 150 g/l, mer spesielt rundt 20 til rundt 130 g/l, helst mellom rundt 30 til rundt 110 g/l og aller helst mellom rundt 35 til rundt 60 g/l.
NPH-type komplekser
Fortrinnsvis har den vandige oppløselighet for NPH-type komplekset av insulinforbindelseskonjugatet ved en pH-verdi rundt 7,4 et område rundt 1 til rundt 150 g/l, særlig rundt 5 til rundt 120 g/l og aller helst rundt 10 til rundt 90 g/l.
Farmasøytiske egenskaper
Kompleksering av insulinforbindelseskonjugat med kation resulterer generelt i forbedrede, farmasøytiske egenskaper for insulinforbindelseskonjugatet i forhold til en vitenskapelig aksepterbar kontroll, for eksempel et tilsvarende ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat.
I visse tilfeller vil det kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat vise en utstrakt eller på annen måte endret pK profil i forhold til en vitenskapelig aksepterbar kontroll som et tilsvarende, ikkekompleksdannet insulinforbindelses-konjugat. I visse tilfeller vil pK profilen vise en lispro-liknende profil. pK profilen kan bedømmes ved bruk av standard in vivo forsøk, for eksempel i mus, rotter, hunder eller mennesker. Analyser som beskrevet her for å bedømme attributtene ved kationinsulinforbindelseskonjugat-komplekser er et aspekt ved oppfinnelsen.
Kompleksene kan vise forbedret kjemisk stabilitet. Forskjellige stabilitetsattributter eller –kriterier kan bedømmes ved å eksponere komplekset til forskjellige analysebetingelser som nærvær av plasma, nærvær av proteaser, nærvær av leverhomogenat, nærvær av sure betingelser, og nærvær av basiske betingelser. Stabiliteten er forbedret i forhold til ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat når stabiliteten av det kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat i en hvilken som helst en eller flere av disse analysebetingelser er større enn stabiliteten for ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat under de samme betingelser. En foretrukket analyse for å bestemme stabiliteten i en sur omgivelse involverer eksponering av det kompleksdannende insulinforbindelseskonjugat til en oppløsning med en pH-verdi på 2 i minst 2 timer der redusert nedbrytning av kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat i forhold til en vitenskapelig aksepterbar kontroll, for eksempel et tilsvarende ikke-kompleksdannet insulinforbindelseskonjugat, er indikerende for forbedret stabilitet. In vivo analyser kan også benyttes for å teste stabilitet. For eksempel kan stabiliteten for det kompleks-dannende insulinforbindelseskonjugat testes ved eksponering til fordøyelseskanalen hos et individ og sammenliknes med en egnet kontroll.
Fremstilling
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av kationinsulinforbindelseskonjugat-preparater som beskrevet her. Metoden involverer generelt å bringe ett eller flere insulinforbindelseskonjugater som beskrevet her i kontakt med ett eller flere kationer som beskrevet her, for å danne et faststoff.
For et divalent kation som Zn<++ >kan molforholdet mellom insulinforbindelseskonjugat og kation som benyttes for å fremstille blandingen i vandig oppløsning med en insulinforbindelseskonsentrasjon fra rundt 2 til rundt 50 mg/ml typisk ligge i området rundt insulinforbindelseskonjugat:kation 1:15 til rundt 1:0,4 og særlig rundt 1:9 til rundt 1:2.
For å fremstille T-type faststoff (med kation og insulinforbindelseskonjugat og uten protamin) i de vandige oppløsningsbetingelser som beskrives her, er molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation fortrinnsvis rundt 1:1,5 til 1:3 og særlig 1:2. For å fremstille R-type faststoffer (med kation, insulinforbindelse og stabiliserende forbindelse (for eksempel en fenolforbindelse) og uten protamin) i den vandige oppløsning som beskrevet ovenfor, er molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation fortrinnsvis rundt 1:4 til 1:9 og særlig rundt 1:7 til rundt 1:9, ideelt rundt 1:8.
For å fremstille T-type protaminfaststoff (med kation og insulinforbindelseskonjugat og protamin) i de vandige oppløsninger som er beskrevet ovenfor er molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation særlig rundt 1:1,5 til 1:9 og spesielt 1:2. For å fremstille R-type protaminfaststoff med kation, insulinforbindelse og stabiliserende forbindelse (for eksempel fenolisk forbindelse) og protamin) i de vandige oppløsningsbetingelser som beskrevet ovenfor, er molforholdet insulinforbindelseskonjugat:kation særlig 1:2 til 1:15 og spesielt rundt 1:7 til rundt 1:9, særlig rundt 1:8.
Insulinforbindelseskonjugatet settes fortrinnsvis til bufferen i en mengde som er beregnet for å gi en konsentrasjon i området fra større enn 2 til rundt 100 g/l og særlig fra rundt 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 til rundt 40 g/l, spesielt rundt 10 til rundt 30 g/l.
Der kationet er toverdig (for eksempel Zn<++>, Ca<++>), blir dette fortrinnsvis tilsatt i en mengde som beregnes til å gi en konsentrasjon i området rundt 0,04 til rundt 10 g/l og spesielt fra rundt 0,1 il rundt 5 g/l, helt spesielt fra rundt 0,2 til rundt 4 g/l. for T-type krystaller eller T-type protaminkrystaller er kationkonsentrasjonen fortrinnsvis i området fra rundt 0,04 til rundt 1 g/l og særlig rundt 0,1 til rundt 0,3 g/l. For R-type krystaller eller R-type protaminkrystaller er kationkonsentrasjonen fortrinnsvis i området fra rundt 1 til rundt 5 g/l og særlig rundt 1,5 til rundt 4 g/l.
Der kationet er eneverdig blir det fortrinnsvis tilsatt i en mengde som beregnes for å gi en konsentrasjon i området rundt 0,08 til rundt 40 g/l og særlig fra rundt 0,4 til rundt
20 g/l, spesielt fra rundt 0,8 til rundt 16 g/l.
Metoden kan videre inkludere kombinering av et stabiliseringsmiddel med kation- og insulinforbindelseskonjugatet. Foretrukne stabiliseringsmidler er beskrevet nedenfor. Når de benyttes blir det stabiliserende middel tilsatt i en mengde tilstrekkelig til å gi en større grad av faststoffdannelse som oppnås ved bruk av de samme reagenser og reaksjonsbetingelser i fravær av det stabiliserende middel. Der stabiliseringsmidlet er en fenolisk forbindelse (for eksempel fenol, m-kresol eller mparaben) kan den tilsettes i en mengde som ligger fra rundt 10 til rundt 50 vektprosent og særlig fra rundt 20 til 40 vektprosent, spesielt rundt 25 til rundt 35 vektprosent. I en mer foretrukket utførelsesform er stabiliseringsmidlet en fenolisk forbindelse (for eksempel fenol, m-kresol eller mparaben), og kan tilsettes i en mengde som ligger i området rundt 0,01 til rundt 10 vektprosent, særlig 0,01 til rundt 5 vektprosent og helt spesielt 0,01 til rundt 1 vektprosent. Således involverer metoden i en utførelsesform kombinering av insulinforbindelseskonjugat, et kation og et stabiliseringsmiddel i en vandig oppløsning for å gi kationinsulinforbindelseskonjugatpreparatet, der kombinasjonen kan gi oppløseliggjorte komplekser og/eller krystallinske eller ikke-krystallinske faststoffer.
Fremgangsmåten kan videre inkludere bruken av et kompleksdannende middel som et protamin, som kombineres med kationet og insulinforbindelseskonjugatet, og som eventuelt også inkluderer et stabiliseringsmiddel.
For å fremstille et faststoff i en vandig oppløsning med en pH-verdi i området rundt 5 til rundt 8 blir protamin fortrinnsvis tilveiebrakt i en mengde i forhold til insulinforbindelseskonjugatet på rundt 4 til rundt 45 vektprosent (protamin:insulinforbindelse),særlig rundt 8 til rundt 25 vektprosent og spesielt rundt 9 til rundt 20 vektprosent, ideelt rundt 10 til rundt 12 vektprosent. For T-type faststoffer er et foretrukket pH-område fra rundt 5 til rundt 6 og spesielt rundt 5 til rundt 5,5, aller helst rundt 5,1 til rundt 5,3 og ideelt rundt 5,2. For R-type faststoffer er foretrukne pH-områder fra rundt 6 til rundt 7, særlig rundt 6,2 til rundt 6,8 og helst rundt 6,4 til rundt 6,6, ideelt rundt 6,5.
Oppfinnerne har overraskende funnet at T-type komplekser kan konverteres til protamin T-type komplekser i fravær av stabiliseringsmiddel som fenol. T-type komplekset fremstilles ved kompleksdanning av Zn med insulinforbindelsesmolekylet i vandig oppløsning i fravær av fenol. Protamin settes så til for å konvertere T-type komplekset til et protamin T-type kompleks. Mengder og pH-områder er som beskrevet ovenfor.
I en utførelsesform involverer således metoden å kombinere insulinforbindelseskonjugat, et kation og et kompleksdannende middel, i en vandig oppløsning for å gi kation:insulinforbindelseskonjugatpreparatet der betingelsene kan gi oppløseliggjorte komplekser og/eller krystallinske eller amorfe faststoffer. I en ytterligere utførelsesform involverer metoden å kombinere insulinforbindelseskonjugat, et kation, et kompleksdannende middel og et stabiliserende middel i en vandig oppløsning for å gi kation-insulinforbindelseskonjugat-preparatet der kombinasjonen kan gi oppløseliggjorte komplekser og/eller krystallinske eller amorfe faststoffer.
I en utførelsesform kan preparatene inkludere preserveringsmidler. Eksempler på egnede preserveringsmidler er benzylalkohol, p-hydroksybenzosyreestere eller glycerol. Stabiliseringsmidler som fenol, m-kresol og m-paraben kan også benyttes som preserveringsmidler. Glycerol og fenol tilsettes hensiktsmessig for å forsterke den antimikrobielle effektivitet.
Andre komponenter som er nyttige ved fremstilling av faststoffene inkluderer isotoniske midler som NaCl, glycerol og monosakkarider.
Kationinsulinforbindelseskonjugatfaststoffene kan typisk dannes relativt hurtig. For eksempel er faststoffdannelsen typisk ferdig i løpet av tre dager og ofte innen 24 timer. Det kan være ønskelig i enkelte tilfeller å redusere reaksjonshastigheten for å forbedre krystalldannelsen.
I en utførelsesform av oppfinnelsen blir faststoffene tildannet ved romtemperatur (25 °C) uten at det kreves temperaturreduksjon for å indusere presipitering av faststoffer. For eksempel er romtemperatur effektiv for R- og T-type krystaller. Temperaturen for faststoffdannelsen er fortrinnsvis rundt 0 til rundt 40 °C, særlig rundt 17 til rundt 30 °C og spesielt rundt 22 til rundt 27 °C, ideelt rundt 25 °C.
I en utførelsesform inkluderer metoden kombinering i en vandig oppløsning av et insulinforbindelseskonjugat og et metallkation for å gi et krystallinsk eller amorft faststoff. Den vandige oppløsning inneholdende insulinforbindelseskonjugatet hvortil kationet settes er fortrinnsvis en bufret oppløsning med en pH-verdi i området pI for insulinforbindelses-konjugatet /- rundt 1,5, særlig pI /-rundt 1 og spesielt pI /- rundt 0,75. Disse områder gjelder også for alle T-type-, R-type- og protaminkomplekser. For nøytrale protaminkomplekser (NPH-type) er imidlertid den foretrukne pH-verdi rundt 7 til rundt 8,5, særlig rundt 7,5 til rundt 8. Når først metallkationet er tilsatt, kan pH-verdien forandres lett og pH-verdien kan justeres for innsikting på pH-områder som beskrevet ovenfor. Med fenoliske forbindelser kan det være en mindre pH-verdiforandring og en syre eller en base kan benyttes for å justere til de foretrukne områder.
pI verdier for insulinforbindelseskonjugatene krever typisk en pH-verdi mindre enn rundt 7 og særlig mindre enn rundt 6, spesielt mindre enn rundt 5,5. Humaninsulinmonokonjugater med nøytrale modifiserende deler har typisk et pI område rundt 4,75 /- 0,25. For humaninsulindikonjugater er pI området typisk 4,25 /- 0,25. For humaninsulintrikonjugater er pI området typisk 3,5 /- 0,25.
Eksempler på egnede buffersystemer inkluderer ammoniumacetatbuffer, natriumfosfatbuffer, trisbuffer, blanding av natriumfosfat og ammoniumacetat, natriumacetatbuffer, en blanding av natriumacetat og ammoniumacetat, og sitronsyrebuffer, og et hvilket som helst av de foregående buffersystemer [A] som også inneholder etanol og/eller acetonitril [B] (for eksempel i et prosentforhold A:B rundt 1:1 til 10:1). Det er et overraskende aspekt ved oppfinnelsen at kationinsulinforbindelseskonjugatfaststoffet kan tildannes i en vandig blanding inneholdende et organisk oppløsningsmiddel som etanol eller acetonitril.
Et unikt trekk ved oppfinnelsen er at ved tilsetningen for å tilveiebringe brukbare kationinsulinforbindelseskonjugatkomplekser gir oppfinnelsen også en fremgangsmåte for å separere kationinsulinforbindelseskonjugater fra ikke-konjugert insulinforbindelse ved fremstillingsprosessen. I denne prosess kan kation-insulinforbindelseskonjugatene presipiteres ut av oppløsning og den oppløseliggjorte, ikke-konjugerte insulinforbindelse kan fjernes ved filtrering, som et eksempel. Dette trekk eliminerer to trinn i fremstillingen av insulinforbindelseskonjugater: konsentreringstrinnet og lyofiliseringstrinnet.
Prosessert rent fast preparat kan tildannes ved bruk av standardteknikker som sentrifugering og/eller filtrering, fulgt av vasking (for eksempel med etanol:vann) og lyofilisering eller vakuumtørking. Multippelvasking kan benyttes for å justere fenol- og/eller kationinnholdet.
Formulering
Kompleksene kan formuleres for administrering i en farmasøytisk bærer i henhold til kjente teknikker, se for eksempel Alfonso R. Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (juni 2003) and Howard C. Ansel, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. (oktober 1999), der disse beskrivelser anses som fullstendig del av foreliggende beskrivelse når det gjelder valg, fremstilling og bruk av farmasøytiske doseringsformer.
Kompleksene, typisk i form av et amorft eller krystallinsk faststoff, kan kombineres med en farmasøytisk akseptabel bærer. Bæreren må være akseptabel dit hen at den er kompatibel med en hvilken som helst annen bestanddel i det farmasøytiske preparat og må ikke urimelig være skadelig for individet i forhold til den fordel som gis av den eller de aktive bestanddeler. Bæreren kan være et faststoff eller en væske eller begge deler. Den formuleres fortrinnsvis som en enhetsdoseformulering, for eksempel som en tablett. Enhetsdoseformen kan for eksempel inneholde fra rundt 0,01 eller 0,5 vektprosent til rundt 95 eller 99 vektprosent av kationinsulinforbindelseskomplekset. De farmasøytiske preparater kan fremstilles på en hvilken som helst egnet måte innen farmasien inkludert, men ikke begrenset til blanding av komponentene og eventuelt inkludert en eller flere hjelpebestanddeler.
Eksempler på egnede, farmasøytiske preparater inkluderer de som er tildannet for oral, rektal, inhalering (for eksempel via en aerosol), bukkal (for eksempel sub-lingual), vaginal, parenteral (for eksempel subkutan, intramuskulær, intradermal, intraartikulær, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarteriell eller intravenøs), topisk, mukosal-overflater- (inkludert luftveisoverflater), nasaloverflater- og transdermal administrering. Den mest egnede vei i et gitt tilfelle vil avhenge av arten og alvoret av tilstanden som behandles og av arten av de spesielle kationinsulinforbindelseskomplekser som benyttes. Foretrukne orale preparater er preparater fremstilt for inntak av individet.
Ideelt fremstilles de orale preparater for å overleve eller i det vesentlige å overleve passasje gjennom magen og helt eller delvis fullstendig å gi oppløsning i tarmene for avlevering av den aktive bestanddel. Eksempler på egnede, transdermale systemer inkluderer ultralyd-, iontoforetisk- og puteavleveringssystemer.
I et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fettsyrepreparater omfattende en eller flere mettede eller umettede C4-, C5-, C6-, C7-, C8-, C9- eller C10-fettsyrer og/eller salter av slike fettsyrer. Foretrukne fettsyrer er kapryl-, kaprin-, myristin- og laurinsyre. Foretrukne fettsyresalter er natriumsalter av kapryl-, kaprin-, myristin- og laurinsyre.
Foretrukne fettsyrepreparater inkluderer en enkelt fettsyre eller et enkelt fettsyresalt og inkluderer ikke vesentlige mengder av andre fettsyrer eller fettsyresalter. I et aspekt ved oppfinnelsen er fettsyreinnholdet av preparatet større enn rundt 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 eller 99,9 vektprosent av en enkelt fettsyre. I en annen utførelsesform ligger fettsyreinnholdet i preparatet innen et område med en nedre grense rundt 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 eller 3,0 vektprosent og med en øvre grense rundt 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 eller 12,0 vektprosent. I nok en utførelsesform ligger fettsyreinnholdet av preparatet innen området med en nedre grense rundt 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 eller 3,0 vektprosent og med en øvre grense rundt 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5, 10,6, 10,7, 10,8, 10,9, 11,0, 11,1, 11,2, 11,3, 11,4, 11,5, 11,6, 11,7, 11,8, 11,9 eller 12,0 vektprosent, og der fettsyreinnholdet i preparatet er større enn rundt 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 eller 99,9 vektprosent av en enkelt fettsyre.
Aktive komponenter av disse formuleringer kan inkludere konjugerte eller ikke-konjugerte, kompleksdannende eller ikke-kompleksdannende proteiner og/eller peptider. Foretrukne proteiner og/eller peptider er de som beskrives her. Foretrukne konjugater er de som er beskrevet her. Foretrukne komplekser er de som er beskrevet her. Foretrukne oralpreparater er preparater fremstilt for inntak av individet. Ideelt sett blir oralpreparater fremstilt for å overleve eller i det vesentlig å overleve passasjen gjennom magen og fullstendig eller i det vesentlige fullstendig å oppløses i tarmen for avlevering av den aktive bestanddel. Formuleringen kan i enkelte tilfeller inkludere et enterisk belegg og i enkelte tilfeller vil formuleringen spesifikt ekskludere et enterisk belegg. Preparatet tilveiebringes fortrinnsvis som en tablett, et pulver, en hard gelatinkapsel eller en myk gelatinkapsel selv om andre former som beskrevet her også kan være egnet.
Fettsyrepreparatet ifølge oppfinnelsen kan inkludere fettsyreacylerte insuliner. Eksempler på egnede fettsyreacylerte insuliner er beskrevet i de følgende US patenter hvis beskrivelse anses som del av foreliggende beskrivelse:
US 6531448 med tittelen "Insoluble compositions for controlling blood glucose", av 11.03.03; US RE37971 med tittelen "Selective acylation of epsilon-amino groups", av 28.01.03;
US 6465426 med tittelen "Insoluble insulin compositions", av 15.10.02;
US 6444641 med tittelen "Fatty acid-acylated insulin analogs", av 03.09.02;
US 6335316 med tittelen "Method for administering acylated insulin", av 01.01.02;
US 6268335 med tittelen "Insoluble insulin compositions", av 31.07.01;
US 6051551 med tittelen "Method for administering acylated insulin", av 18.04.00;
US 5922675 med tittelen "Acylated Insulin Analogs", av 13.07.99; US 5700904 med tittelen "Preparation of an acylated protein powder", av 23.12.97;
US 5693609 med tittelen "Acylated insulin analogs Granted", av 02.12.97;
US 5646242 med tittelen "Selective acylation of epsilon-amino groups", av 08.07.97;
US 5631347 med tittelen "Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein", av 20.05.97;
US 6451974 med tittelen "Method of acylating peptides and novel acylating agents", av 17.09.02; US 6011007 med tittelen "Acylated insulin", av 04.01.00;
US 5750497 med tittelen "Acylated insulin Granted" av 12.05.98;
US 5905140 med tittelen "Selective acylation method", av 18.05.99;
US 6620780 med tittelen "Insulin derivatives", av 16.09.03;
US 6251856 med tittelen "Insulin derivatives", av 26.06.01;
US 6211144 med tittelen "Stable concentrated insulin preparations for pulmonary delivery", av 03.04.01;
US 6310038 med tittelen "Pulmonary insulin crystals", av 30.10.01; og
US 6174856 med tittelen "Stabilized insulin compositions", av 16.01.01.
Spesielt foretrukket er monofettsyreacylerte insuliner med 12, 13, 14, 15 eller 16-karbonfettsyrer kovalent bundet til Lys(B29) av humaninsulin.
Farmasøytiske preparater som er egnet for oral administrering kan presenteres som diskrete enheter som kapsler, poser, lozenger eller tabletter, hver inneholdende en på forhånd bestemt mengde av blandingen av insulinforbindelseskonjugater; som et pulver eller granuler; som en oppløsning eller en suspensjon i vandig eller ikke-vandig væske; eller som en olje-i-vann- eller vann-i-oljeemulsjon. Slike formuleringer kan fremstilles ved en hvilken som helst egnet metode i farmasien som inkluderer å bringe sammen blandingen av insulinforbindelseskonjugater og en egnet bærer (som kan inneholde en eller flere hjelpebestanddeler som angitt ovenfor). Formuleringer kan inkludere suspensjoner av faststoffer, kompleks-dannende kation-insulinforbindelseskonjugater, ikkekompleks-dannende aktive bestanddeler (for eksempel nativ insulinforbindelse, insulinforbindelseskonjugater), og blandinger av disse.
Generelt blir de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen fremstilt ved enhetlig og grundig blanding av kompleksene med en flytende eller fast bærer, eller begge deler, og så, hvis nødvendig, formgivning av den resulterende blanding. For eksempel kan en tablett fremstilles ved komprimering eller støping av et pulver eller granuler inneholdende blandingen av insulinforbindelseskonjugater, eventuelt med en eller flere hjelpebestanddeler. Komprimerte tabletter kan fremstilles ved komprimering, i en egnet maskin, av blandingen i fritt rislende form, som et pulver eller som granuler, eventuelt blandet med en binder, en lubrikant, en inert diluent og/eller ett eller flere overflateaktive/dispergerende midler. Støpte tabletter kan fremstilles ved formgivning i en egnet maskin av det pulverformige preparat som er fuktet med et inert bindemiddel.
Farmasøytiske preparater som er egnet for bukkal (sub-lingual) administrering inkluderer lozenger omfattende en blanding av insulinforbindelseskonjugater i en smakssatt base, vanligvis sukrose og akasia eller tragakant; og pastiller omfattende en blanding av insulinforbindelseskonjugater i en inert base som gelatin og glycerin eller sukrose og akasia. Eksempler på egnede formuleringer kan finnes i USSN publ.
20030229022 ("Pharmaceutical formulation");
20030236192 ("Method of modifying the release profile of sustained release compositions");
20030096011 ("Method of producing submicrom particles of a labile agent and use thereof"); 20020037309 ("Process for the preparation of polymer-based sustained release compositions"); 20030118660 ("Residual solvent extraction method and microparticles produced thereby"); så vel som US patenter
6 180141 ("Composite gel microparticles as active principle carriers");
6 737045 ("Methods and compositions for the pulmonary delivery insulin compound");
6 730334 ("Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles");
6 685967 ("Methods and compositions for pulmonary delivery of insulin compound");
6 630169 ("Particulate delivery systems and methods of use");
6 589560 ("Stable glassy state powder formulations; 6592904 ("Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use");
6 582728 ("Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders");
6 565885 ("Methods of spray drying pharmaceutical compositions");
6 546929 ("Dry powder dispersing apparatus and methods for their use");
6 543448 ("Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments");
6 518239 ("Dry powder compositions having improved diversity");
6 514496 ("Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use");
6 509006 ("Devices compositions and methods for the pulmonary delivery of aerosolized medicaments");
6 433040 ("Stabilized bioactive preparations and methods of use");
6 423344 ("Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use"); 6 372258 ("Methods of spray-drying a drug and a hydrophobic amino acid");
6 309671 ("Stable glassy state powder formulations"); 6309623 ("Stabilized preparations for use in metered dose inhalers");
6 294204 ("Method of producing morphologically uniform microcapsules and microcapsules produced by this method");
6 267155 ("Powder filling systems, apparatus and methods");
6 258341 ("Stable glassy state powder formulations");
6 182712 ("Power filling apparatus and methods for their use");
6 165463 ("Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use");
6 138668 ("Method and device for delivering aerosolized medicaments");
6 103270 ("Methods and system for processing dispersible fine powders");
6 089228 ("Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments");
6 080721 ("Pulmonary delivery of active fragments of para-thyroid hormone");
6 051256 ("Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use"); 6 019968 ("Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use");
5 997848 ("Methods and compositions for pulmonary delivery of insulin compound");
5 993783 ("Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder.alpha.1-antitrypsin");
5 922354 ("Methods and system for processing dispersible fine powders");
5 826633 ("Powder filling systems, apparatus and methods");
5 814607 ("Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone");
5 785049 ("Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments");
5 780014 ("Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin");
5 775320 ("Method and device for delivering aerosolized medicaments");
5 740794 ("Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments");
5 654007 ("Methods and system for processing dispersible fine powders");
5 607915 ("Pulmonary delivery of active fragments of parathyroid hormone"); 5
458135 ("Method and device for delivering aerosolized medicaments");
6 602952 ("Hydrogels derived from chitosan and poly(ethyl-eneglycol) or related polymers"); and 5 932462 ("Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces").
Videre er egnede formuleringer for vedvarende frigivning beskrevet i US 5968554 i navnet Cardinal Health's med tittelen "A sustained release pharmaceutical preparation", av 19.10.99, ansett som del av foreliggende beskrivelse i sin helhet.
Egnede mikropartikkelformuleringer er beskrevet i WO/2003-049701 i navnet Spherics, Inc og med tittelen "Methods and products useful in the formation and isolation of micropartic-les", publisert 30.10.03.
Egnede bioadhesive formuleringer er beskrevet i WO/2003-051304 i navnet Spherics Inc. med tittelen "Bioadhesive drug delivery system with enhanced gastric retention", av 06.05.04.
Farmasøytiske preparater ifølge utførelsesformer av oppfinnelsen som er egnet for parenteral administrering omfatter sterile, vandige og ikke-vandige injeksjonsoppløsninger av kompleksene der preparatene fortrinnsvis er isotoniske med den tilsiktede mottakers blod. Disse preparater kan inneholde antioksidanter, bufre, bakteriostater og solutter som gjør preparatet isotonisk med den tilsiktede mottakers blod. Vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner kan inkludere suspenderingsmidler og fortykningsmidler. Preparatene kan presenteres i enhet\dose- eller multidosebeholdere, for eksempel forseglede ampuller og vialer, og kan lagres i frysetørkede (lyofiliserte) betingelser som kun krever tilsetning av sterilt flytende bærer, for eksempel saltoppløsning eller vann-forinjeksjon, umiddelbart før bruk. Ekstemporane injeksjonsoppløsninger og –suspensjoner kan fremstilles fra sterile pulvere, granuler og tabletter av den type som er beskrevet ovenfor. For eksempel kan det tilveiebringes et injiserbart, stabilt, sterilt preparat med en blanding av komplekser i en enhetsdoseform i en forseglet beholder. Blandingen av komplekser kan tilveiebringes i form av et lyofilisat som er i stand til å kunne rekonstitueres med en egnet farmasøytisk akseptabel bærer for å gi et flytende preparat egnet for injeksjon til et individ. Den parenterale enhetsdoseform omfatter typisk fra rundt 1 mikrogram til rundt 10 mg av blandingen av komplekser. Når kompleksene i det vesentlige er vannoppløselige kan en tilstrekkelig mengde emulgeringsmiddel som fysiologisk er akseptabelt benyttes i en tilstrekkelig mengde til å emulgere kompleksene i en vandig bærer. Et slikt brukbart emulgeringsmiddel er fosfatidylkolin.
En fast doseringsform for oral administrering inkluderer typisk fra rundt 2 til rundt 500 mg, særlig rundt 10 til rundt 250 mg og spesielt rundt 20 til rundt 110 mg av kompleksene.
Farmasøytiske preparater som er egnet for rektal administrering presenteres fortrinnsvis som enhetsdosesuppositorier. Disse kan fremstilles ved å blande kompleksene med en eller flere konvensjonelle, faste bærere, for eksempel kakaosmør, og så å formgi den resulterende blanding.
Farmasøytiske preparater egnet for topisk applikering på huden har fortrinnsvis form av en salve, krem, lotion, pasta, gel, spray, aerosol eller olje. Bærere som kan benyttes inkluderer petrolumgele, lanolin, PEG'er, alkoholer, transdermale forsterkere og kombinasjoner av to eller flere av disse.
Farmasøytiske preparater som er egnet for transdermal administrering kan presenteres som diskrete puter tilpasset for å forbli i intim kontakt med epidermis hos mottakeren i lengre tid. Preparater som er egnet for transdermal administrering kan også avgis ved iontoforese (se for eksempel, Pharmaceuticel Research 3 (6):318 (1986)) og typisk ha form av en eventuelt bufret, vandig oppløsning av blandingen av insulinforbindelseskonjugater. Egnede formuleringer omfatter citrat- eller bis/trisbuffer (pH 6) eller etanol/vann og inneholde fra 0,1 til 0,2 M aktiv bestanddel.
I en foretrukket utførelsesform blir kompleksene administrert som komponenter av fettsyreformuleringer som beskrevet i USSN 60/494821, av 13.08.03 av Opawale et al., ansett som del av foreliggende beskrivelse.
I visse utførelsesformer kan insulinforbindelseskonjugatet tilveiebringes separat fra kation- og/eller andre komponenter som trengs for å danne faststoffer. For eksempel kan insulinforbindelseskonjugatet tilveiebringes som et tørket faststoff og bufferoppløsningen som inkluderer kationet, stabiliseringsmidlet, preserveringsmidlet og/eller en annen komponent, kan tilveiebringes separat, slik at brukeren kan kombinere de separate komponenter for å gi kationinsulinforbindelseskonjugatkompleksene.
Behandlingsmetoder
Kationinsulinforbindelseskonjugatpreparatene og -formuleringene av disse er nyttige ved behandling av tilstander der økning av mengde av sirkulerende insulinforbindelse (i forhold til den mengde som tilveiebringes av individet i fravær av administrering av insulinforbindelse fra en eksogen kilde) gir en ønsket terapeutisk eller fysiologisk effekt. For eksempel kan den behandlede tilstand være type I- eller type II diabetes, prediabetes og/eller et metabolsk syndrom. I en utførelsesform blir preparatene administrert for å lindre symptomer på diabetes. I en annen utførelsesform blir preparatene administrert til et prediabetisk individ for å forhindre eller forsinke starten av diabetes.
Den effektive mengde av kation-insulinforbindelseskonjugat-preparatet for administrering ifølge oppfinnelsens metoder vil variere noe fra blanding til blanding og fra individ til individ og vil avhenge av faktorer som alder og tilstand hos individet, avleveringsmodus og tilstanden som behandles. Slike doseringer kan bestemmes i henhold til farmakologiske rutineprosedyrer som velkjente på området.
Som en generell regel vil en oral dose fra rundt 0,025 til rundt 10 mg/kg aktiv bestanddel (det vil si konjugat) ha terapeutisk effektivitet der alle vektandeler er beregnet basert på vekten av blandingen av insulinforbindelseskonjugater. Et mer foretrukket område er rundt 0,06 til rundt 1 mg/kg, og et enda mer foretrukket område er 0,125 til rundt 0,5 mg/kg.
En parenteral dose ligger typisk fra rundt 0,5 µg/kg til rundt 0,5 mg/kg der alle vektandeler beregnes basert på vekten av blandingen av insulinforbindelseskonjugater. Et mer foretrukket område er rundt 1 µg/kg til rundt 100 µg/kg.
Administreringsfrekvensen er vanligvis en, to eller tre ganger per dag eller etter behov for å kontrollere tilstanden. Alternativt kan kation-insulinforbindelseskonjugatpreparatene administreres ved kontinuerlig infusjon. Varigheten for behandlingen avhenger av typen insulinforbindelsesdefiktivitet som behandles og kan vare helt opp til individets levetid. Kompleksene kan for eksempel administreres innen 0 til 30 minutter før et måltid. Kompleksene kan for eksempel administreres innen 0 til 2 timer før sengetid.
Synteseeksempler
De følgende eksempler skal gis for å illustrere og å forklare oppfinnelsen.
Syntese av beskyttet MPEG6C3 oligomer (3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)-etoksy]-etoksy}-propionsyre tert-butylester)
Metylheksaetylenglykol (1,0 g, 3,37 mmol) og tert-butyl-akrylat (0,216 g, 1,69 mmol) oppløses i 10 ml tørr THF. Natriummetall (0,4 mg, 0,016 mmol) ble satt til oppløsningen. Etter omrøring i 4 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen quenchet ved tilsetning av 15 ml 1M HCl. Den quenchede reaksjonsblanding ble så ekstrahert med 1 x 50 ml og
1 x 25 ml CH2Cl2. Det organiske sjikt ble tørket over MgSO4 og konsentrert. Etter rensing ved silikagelkromatografi med etylacetat som elueringsmiddel ble produktet oppnådd som en olje (0,832 g, 58 %).
Syntese av MPEG6C3 oligomersyre (3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)-etoksy]-etoksy}-propionsyre)
Tert-butylesteren (0,165 g, 0,0389 mmol) ble debeskyttet ved omrøring ved romtemperatur i 2,0 ml trifluoreddiksyre. Innholdet ble så konsentrert til en konstant vekt
(0,125 g, 87 %).
Syntese av den aktiverte MPEG6C3 oligomer (3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)-etoksy]-etoksy}-propionsyre 2,5-dioksopyrrolidin-1-yl-ester)
Syren (0,660 g, 1,79 mmol) og N-hydroksysuksinimid (0,2278 g, 1,97 mmol) ble oppløst i 15 ml tørr CH2Cl2. Etyldimetylamino-propylkarbodiimidhydroklorid (EDC, 0,343 g, 1,79 mmol) ble tilsatt. Etter omrøring ved romtemperatur over natten ble reaksjonsblandingen fortynnet med CH2Cl2 og vasket med
2 x 45 ml vann. Det organiske sjikt ble tørket over MgSO4 og konsentrert til konstant vekt. Produktet var en olje
(0,441 g, 53 %).
Syntese av den beskyttede MPEG4C3 oligomer (3-(2-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)-propionsyre-tert-butylester)
Metyltetraetylenglykol (1,0 g, 4,80 mmol) og tert-butyl-akrylat (0,308 g, 2,40 mmol) ble oppløst i 10 ml tørr THF. Natriummetall (0,6 mg, 0,024 mmol) ble satt til oppløsningen. Etter omrøring i 4 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen quenchet ved tilsetning av 15 ml 1M HCl. Den quenchede reaksjonsblanding ble så ekstrahert med 1 x 50 ml og
1 x 25 ml CH2Cl2. Det organiske sjikt ble tørket over MgSO4 og konsentrert. Etter rensing ved silikagelkolonnekromatografi med etylacetat som elueringsmiddel ble produktet oppnådd som en olje (1,28 g, 79 %).
Syntese av MPEG6C3 oligomersyre (3-(2-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)-propionsyre)
Tert-butylesteren (1 g, 3,42 mmol) ble debeskyttet ved omrøring ved romtemperatur i 6,0 ml trifluoreddiksyre. Innholdet ble så konsentrert til konstant vekt (0,87 g, 91 %).
Syntese av den aktiverte MPEG4C3 oligomer (3-(2-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)-propionsyre 2,5-diokso-pyrrolidin-1-yl ester)
Syren (0,6 g, 21,4 mmol) og N-hydroksysuksinimid (0,271 g, 2,35 mmol) ble oppløst i 20 ml tørr CH2Cl2. Etyldimetylamino-propylkarbodiimidhydroklorid (EDC, 0,409 g, 2,14 mmol) ble tilsatt. Etter omrøring ved romtemperatur over natten ble reaksjonsblandingen fortynnet med CH2Cl2 og vasket med 2 x 45 ml vann. Det organiske sjikt ble tørket over MgSO4 og konsentrert til konstant vekt. Produktet var en olje
(0,563 g, 69 %).
Syntese av den beskyttede MPEG4C3 oligomer (3-(2-metoksy-etoksy)-propionsyre tert-butyl ester)
Metyltetraetylenglykol (5,0 g, 41,6 mmol) og tert-butyl-akrylat (2,66 g, 20,8 mmol) ble oppløst i 20 ml tørr THF. Natriummetall (0,47 mg, 20,8 mmol) ble satt til oppløsningen. Etter omrøring i 4 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen quenchet ved tilsetning av 30 ml 1M HCl. Den quenchede reaksjonsblanding ble så ekstrahert med 1 x 100 ml og
1 x 50 ml CH2Cl2. Det organiske sjikt ble tørket over MgSO4 og konsentrert. Etter rensing ved silikagelkromatografi og med etylacetat som elueringsmiddel ble produktet oppnådd som en olje (7,5 g, 89 %).
Syntese av MPEG6C3 oligomersyren (3-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-propionsyre)
Tert-butylesteren (1 g, 4,90 mmol) ble debeskyttet ved omrøring ved romtemperatur i 6,0 ml trifluoreddiksyre. Innholdet ble så konsentrert til en konstant vekt (0,652 g, 89 %).
Syntese av 2-[2-(2-propoksy-etoksy)-etoksy]-etanol (1)
Trietylenglykol (19,5 g, 0,13 mol) ble oppløst i 150 ml tetrahydrofuran og natriumhydrid (2,60 g, 0,065 mmol) ble tilsatt porsjonsvis i løpet av 0,5 timer hvoretter reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 1 time. Deretter ble 1-brompropanol (8,0 g, 0,065 mol) oppløst i 30 ml tetrahydrofuran og dråpevis tilsatt via en dryppetrakt hvoretter reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Den urene reaksjonsblanding ble filtrert gjennom Celite, vasket med cH2Cl2 og fordampet til tørr tilstand. Den resulterende olje ble oppløst i 250 ml CH2Cl2, vasket med 250 ml mettet NaCl, 250 ml H2O og så tørket over MgSO4 og fordampet til tørr tilstand. Kolonnekromatografi over silika med etylacetat ga et gulaktig faststoff (2,24 g, 18 % utbytte).
Syntese av karbonsyre 4-nitro-fenylester 2-[2-(2-propoksy-etoksy)-etoksy]-etylester (1)
4-nitroklorformat (3,45 g, 17,1 mmol) og 1 (2,2 g, 11,4 mmol) ble oppløst i 20 ml CH2Cl2. Etter omrøring i 10 minutter ble TEA (2,1 ml, 15 mmol) tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt over natten ved romtemperatur. Urene reaksjonsprodukter ble fortynnet med 50 ml CH2Cl2, vasket med 50 ml 1M HCl, 50 ml H2O og tørket over MgSO4 og så fordampet til tørr tilstand. Kolonnekromatografi over silika med etylacetat:heksaner 3:2 ga 2 en gulaktig olje (2,57 g, 63 % utbytte).
Syntese av karbonsyre 2,5-diokso-pyrrolidin-1-yl ester 2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etylester
Trietylenglykolmonometyleter (1,0 g, 6,1 mmol) og N,N'-di-suksinimidylkarbonat (1,87 g, 7,3 mmol) ble oppløst i 10 ml acetonitril. Deretter ble trietylamin (1,3 ml, 9,15 mmol) tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt over natten ved romtemperatur. Det urene reaksjonsprodukt ble fordampet til tørr tilstand, oppløst i 50 ml mettet NaHCO3, vasket med 2 x 50 ml etylacetat, tørket over MgSO4 og fordampet til tørr tilstand. Kolonnekromatografi over silika med etylacetat ga 1 en klar olje (0,367 g, 20 % utbytte).
Syntese av karbonsyre 2,5-diokso-pyrrolidin-1-yl ester 2-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etylester (1).
Tetraetylenglykolmonometyleter (1,0 g, 4,8 mmol)og N,N'-di-suksinimidylkarbonat (1,48 g, 5,8 mmol) ble oppløst i 10 ml acetonitril. Deretter ble trietylamin (1,0 ml, 7,2 mmol) tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt over natten ved romtemperatur. Det urene reaksjonsprodukt ble fordampet til tørr tilstand, oppløst i 30 ml mettet NaHCO3, vasket med 2 x 30 ml etylacetat, tørket over MgSO4 og fordampet til tørr tilstand. Kolonnekromatografi over silika med etylacetat:MeOH 20:1 ga 1 en klar olje (0,462 g, 28 % utbytte).
Syntese av but-3-enonsyre etylester
Vinyleddiksyre (10,0 g, 0,12 mol) ble oppløst i 200 ml etanol og konsentrert svovelsyre (0,75 ml, 0,014 mol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble varmet opp til tilbakeløp i 4 timer. De urene reaksjonsprodukter ble fortynnet med 200 ml etylacetat, vasket med 200 ml H2O, 200 ml NaHCO3, tørket over MgSO4 og fordampet til tørr tilstand for å gi 1 en klar olje (3,17 g, 23 %).
Syntese av 4-{2-[-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-smørsyreetylester
Trietylenglykolmonometyleter (4,27 g, 0,026 mmol) og but-3-enonsyreetylester (1,5 g, 0,013 mol) ble oppløst i 10 ml tetrahydrofuran. Deretter ble masse Na<o >(0,030 g, 0,013 mol) tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt i 4 timer. Den urene reaksjonsblanding ble quenchet med 20 ml 1M HCl, og vasket med 3 x 20 ml etylacetat. De organiske sjikt ble kombinert og vasket med 2 x 10 ml H2O, tørket over MgSO4 og fordampet til tørr tilstand for å gi 2a som gul olje (1,07 g, 30 % utbytte).
Syntese av 4-{2-[-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-smørsyre
4-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-smørsyreetylester (1,07 g, 4,0 mmol) ble oppløst i 10 ml 1 NaOH og reaksjonsblandingen omrørt i 2 timer. Den urene reaksjonsblanding ble fortynnet med 40 ml mettet NaCl, surgjort til pH ~ 2 med konsentrert HCl, vasket med 2 x 50 ml CH2Cl2, tørket over MgSO4 og fordampet til tørr tilstand for å gi 3 en klar olje (0,945 g, 94 % utbytte).
Syntese av 4-{2-[-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-smørsyre 2,5-diokso-pyrrolidin-1-yl ester
N-hydroksysuksinimid (0,55 g, 4,8 mmol) og EDCl (1,15 g, 6,0 mmol) ble oppløst i 7 ml CH2Cl2. Deretter ble det tilsatt 4-{2-[2-(2-metoksy-etoksy)-etoksy]-etoksy}-smørsyre (0,940 g, 3,8 mmol), oppløst i 2 ml CH2Cl2. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Det urene reaksjonsprodukt ble fortynnet med 21 ml CH2Cl2, vasket med 30 ml 1M HCl, 30 ml H2O, tørket over MgSO4 og fordampet til tørr tilstand. Kolonnekromatografi over silika med etylacetat ga 4 en klar olje (0,556 g, 43 % utbytte).
Fremstilling av komplekser
Metoder ble undersøkt for fremstilling av sinkkomplekser av insulinforbindelseskonjugater. Nye metoder, eksepsjonelle i forhold til publiserte metoder som benyttes for kompleksering/krystallisering av insulinforbindelse og insulinforbindelsesanaloger, ble utviklet for å gi sinkkomplekser av HIM2. HIM2 er et humaninsulinmonokonjugat med en modifiserende del koblet til B29 der den modifiserende del har følgende struktur:
Ytterligere komplekser ble fremstilt ved bruk av IN105, et humaninsulinmonokonjugat med en modifiserende del koblet til B29 der den modifiserende del har følgende struktur:
Metodene gir tre hovedtyper, "T-type"- og "R-type"- og "protamin" kationkomplekser av insulinforbindelseskonjugatfaststoffer.
Fremstilling og analyse av T-type faststoffer
Forsøkt fremstilling av T-type Zn kompleks av HIM2 (2 g/l)
En HIM2 oppløsning på rundt 2 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl. Iseddik ble satt til en 10 ml alikvot (20 mg protein) av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M.20 (eller 40) µl av en 2 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 5,1 (eller 5,5) med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved romtemperatur
(eller 5 °C) og så satt hen en dag ved romtemperatur (eller 5 °C) for å tillate faststoffdannelse. Ingen krystaller eller presipitat dannet seg etter at reaksjonsblandingen var satt hen 1 dag ved romtemperatur (eller ved 5 °C). Se eksempel 2 i US 5504188 med tittelen "Preparation of stable zinc insulin compound analog crystals".
T-type Zn kompleks av HIM2 (10 g/ l konsentrasjon)
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~3 med 10 % HCl. Iseddik ble satt til en 10 ml (100 mg protein) alikvot av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M.40 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 5,20 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved 5 °C og så satt hen i fem dager ved 5 °C for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2000 omdreininger per minutt i 10 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI vann.
Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2000 omdreininger per minutt i 10 minutter før vannet ble dekantert og faststoffene vasket med ytterligere 5 ml kaldt DI vann. Nok en gang ble prøven sentrifugert ved rundt 2000 omdreininger per minutt i rundt 10 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2000 omdreininger per minutt i 10 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble tørket i en lyofilisør for å gi et hvitt faststoff.
T-type Zn kompleks av HIM2 (20 g/l konsentrasjon)
En HIM2 oppløsning på rundt 20 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~3 med 10 % HCl. Iseddik ble satt til en 10 ml (200 mg protein) alikvot av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M.80 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 5,37 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved 5 °C og så satt hen i fire dager ved 5 °C for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI vann. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før vannet ble dekantert og faststoffene vasket med ytterligere 5 ml kaldt DI vann. Nok en gang ble prøven sentrifugert ved rundt 2600 omdreininger per minutt i rundt 20 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble tørket i en lyofilisør for å gi et hvitt faststoff.
T-type Zn kompleks av HIM2
En HIM2 oppløsning på rundt 30 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~3 med 10 % HCl. Iseddik ble satt til en 50 ml (1,5 g protein) alikvot av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M. 600 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 5,34 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble satt hen ved 5 °C i fem dager for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket tre ganger med 10 ml kaldt DI vann, sentrifugert og H2O ble dekantert etter hver vask. Prøven ble så vasket tre ganger med 10 ml 200 proof kald EtOH. Det ble sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter og dekantert etter hver vask. Prøven ble tørket i en lyofilisør for å gi et hvitt faststoff.
Figurene 1 og 2 er mikrofotografier som er tatt ved bruk av et Zeiss Axiovert mikroskop og viser krystaller som har vokst i 24 timer. I figur 1 er krystallstørrelsen rundt 11,3 µM i lengde og rundt 5,3 µM i diameter. I figur 2 er størrelsen for krystallen til venstre rundt 15,1 µM i lengde og rundt 5,9 µM i diameter og størrelsen av krystallen til høyre er rundt 9,1 µM i lengde og rundt 5,4 µM i diameter. Figur 3 er et mikrofotografi tatt ved bruk av et Zeiss Axiovert mikroskop og viser krystallvekst i 5 dager. I et aspekt inkluderer oppfinnelsen krystaller med en morfologi som vist i figurene 1, 2 eller 3.
T-type Zn kompleks av HIM2 (50 g/l konsentrasjon)
En HIM2 oppløsning på rundt 50 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~3 med 10 % HCl. Iseddik ble satt til en 10 ml alikvot av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M.200 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 5,23 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved 5 °C og så satt hen i fire dager ved 5 °C for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 50 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert og faststoffet vasket med ytterligere 5 ml kaldt DI H2O. Nok en gang ble prøven sentrifugert ved rundt 2600 omdreininger per minutt i rundt 20 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble tørket i en lyofilisør i tre dager.
T-type Zn kompleks av HIM2 (1 g skala)
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl. Iseddik ble satt til en 50 ml (500 mg protein) alikvot av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M.200 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 5,49 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved 5 °C og så satt hen i syv dager ved 5 °C for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 10 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert. Vannvaskingene ble repetert ytterligere to ganger. Prøven ble så vasket med 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Ytterligere to EtOH vaskinger ble gjennomført på samme måte før prøven ble anbrakt på lyofilisøren for tørking i fire dager.
T-type Zn kompleks av HIM2 ved nøytral pH-verdi (5 g skala)
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.2 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 7,05 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur over natten for å tillate faststoffdannelse.
Den melkeaktige Zn-HIM2 reaksjonsblanding (500 ml) ble i porsjoner satt til en 350 ml finfrittet (4,5-5 µm) skivetrakt (ChemGlass CG1402-28, 90 mm diameter). Filtratet ble samlet i en sidearmkolbe under pålegging av vakuum rundt 4-6 timer. Som en mulighet kan kaken vaskes med 100 ml kald 1 % ZnCl2 og filtratet samles separat. Kaken ble vasket med 100 ml iskaldt vann og filtratet samlet igjen. Kaken ble også vasket med ytterligere 100 ml iskald 100 % etanol og filtratet samlet nok en gang. Sluttvaskingen av kaken var 100 ml friskt, iskaldt vann og sluttfiltratet ble samlet. Kaken ble tørket under vakuum og/eller lufttørket i 12-18 timer. Etter tørking ble kaken skrapet av trakten, veid og fuktighet/proteininnholdet ble målt via HPLC. De samlede filtrater fra forskjellige vasketrinn ble også analysert ved bruk av HPLC for å bestemme konsentrasjonen av Zn-HIM2 som gikk tapt under prosessen. Filtreringen ga et 2,5 vektprosent Zn innhold med et totalutbytte på 98 %.
T-type Zn kompleks av HIM2 ved nøytral pH-verdi (500 mg skala)
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble fremstilt med en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.200 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 7,06 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved 5 °C og så satt hen i to dager ved 5 °C for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 10 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før H2O ble dekantert. Vannvaskingene ble gjentatt ytterligere to ganger. Prøven ble så vasket med 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Ytterligere to EtOH vaskinger ble gjennomført på samme måte før prøven ble anbrakt på lyofilisøren for tørking i to dager.
Resultater for T-type faststoffpreparater
INM = ikke nok materiale
ID = ingen data
Fremstilling og analyse av R-type faststoffer
R-type Zn kompleks ved HIM2 med fenol ved 2 g/l
En HIM2 oppløsning på rundt 2 g/l ble fremstilt til en slutt pH-verdi ~ 3 med iseddik.33 µl flytendegjort fenol ble satt til en 10 ml alikvot av oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til 5,89 med konsentrert ammoniumhydroksid.160 µl 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og så satt hen ved romtemperatur i tre dager for å tillate ytterligere presipitatdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 3400 omdreininger per minutt i 15 minutter. Supernatanten ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI vann. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i 15 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble så vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i 25 minutter før EtOH ble dekantert. Nok en gang ble prøven vaket med 5 ml kald EtOH, imidlertid ikke sentrifugert. Faststoffet ble så tillatt avsetning til bunnen av røret og så anbrakt i hurtig vakuum for tørking.
Fremstilling av R-type Zn kompleks av HIM2 ved 20 g/l
En HIM2 oppløsning på rundt 20 g/l ble fremstilt til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.66 µl flytendegjort fenol ble satt til en 10 ml alikvot av oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til 6,43 med konsentrert ammoniumhydroksid.320 µl
10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og så satt hen ved romtemperatur i fire dager for å tillate ytterligere presipitatdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger i 20 minutter før H2O ble dekantert og faststoffet vasket med ytterligere 5 ml kaldt DI H2O. Nok en gang ble prøven sentrifugert med 2600 omdreininger i 20 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble lyofilisert i tre dager.
Fremstilling av R-type Zn kompleks av HIM2 ved 30 g/l
En HIM2 oppløsning på rundt 30 g/l ble fremstilt til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.99 µl flytendegjort fenol ble satt til en 10 ml alikvot av oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til 6,47 med konsentrert ammoniumhydroksid.480 µl 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og så satt hen ved romtemperatur i fire dager for å tillate ytterligere presipitatdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger i 20 minutter før H2O ble dekantert og faststoffet vasket med ytterligere 5 ml kaldt DI H2O. Nok en gang ble prøven sentrifugert med 2600 omdreininger i 20 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble lyofilisert i tre dager.
Figur 4 viser faststoff dyrket i 4 dager. Bildet ble tatt ved bruk av et Zeiss Axiovertmikroskop. Den midlere lengde for krystallene er rundt 9,7 µM.
Fremstilling av R-type Zn kompleks av HIM2 ved 50 g/l
En HIM2 oppløsning på rundt 50 g/l ble fremstilt til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.165 µl flytendegjort fenol ble satt til en 10 ml alikvot av oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til 6,82 med konsentrert ammoniumhydroksid.800 µl 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og så satt hen ved romtemperatur i fire dager for å tillate ytterligere presipitatdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert og faststoffet vasket med ytterligere 5 ml kaldt DI H2O. Nok en gang ble prøven sentrifugert med 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble lyofilisert i tre dager.
Fremstilling av R-type Zn kompleks av HIM2 ved 1 g skala
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble fremstilt til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.165 µl flytendegjort fenol ble satt til en 50 ml alikvot av oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til 6,42 med konsentrert ammoniumhydroksid.800 µl 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og så satt hen ved romtemperatur i syv dager for å tillate ytterligere presipitatdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 10 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert. To ytterligere vannvask skjedde på samme måte. Prøven ble vasket med 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. To ytterligere EtOH vask ble utført på samme måte før prøven ble plassert på lyofilisøren i fire dager.
R-type Zn kompleks av HIM2 ved 5 g skala
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble fremstilt til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.1500 µl flytendegjort fenol ble satt til 450 ml av oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til 7,1 med konsentrert ammoniumhydroksid.1800 µl 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og så satt hen ved romtemperatur over natten for å tillate ytterligere presipitatdannelse.
Reaksjonen som gjennomført ovenfor ble splittet i tre filtreringsprøver. I prøve en ble reaksjonsblandingen filtrert gjennom en finfrittet trakt og så vasket med en 1 % ZnCl2 oppløsning. Materialet ble tørket over natten ved vakuumfiltrering. Den andre prøve ble filtrert over et middelsfrittetfilter som også inneholdt filterpapir. Substansen ble så vasket med etanol og vann og tørket over natten ved vakuum-filtrering. Til slutt ble den tredje prøve filtrert gjennom en finfrittet trakt, vasket med en 1 % ZnCl2 oppløsning og så vasket med etanol og vann. Dette materiale ble også tørket over natten via vakuumfiltrering.
R-type Zn kompleks av HIM2 ved nøytral pH-verdi
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble fremstilt til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.165 µl flytendegjort fenol ble satt til 50 ml av oppløsningen ovenfor. Deretter ble 200 µl 10 % ZnCl2 oppløsning satt til prøven. pH-verdien ble justert til 7,18 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble satt hen ved romtemperatur i 2 dager for å tillate presipitatdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 20 minutter. Imidlertid avsatte materialet seg ikke på bunnen av røret i utgangspunktet og det ble derfor sentrifugert i rundt 2 timer. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 60 minutter før H2O ble dekantert. Vannvaskingen ble gjentatt ytterligere to ganger. Prøven ble så vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 60 minutter før EtOH ble dekantert. Det ble gjennomført ytterligere to EtOH vaskinger på samme måte. Materialet var uklart etter en tredje EtOH vasking og anbrakt i kjøleskap over natten for å tillate ytterligere avsetning. Oppløsningsmidlet ble dekantert og materialet anbrakt i en lyofilisør i 2 dager.
Resultater for R-type faststoffsammensetninger
Fremstilling og analyse av protaminfaststoffer
Fremstilling av T-type Zn kompleks av HIM2 med protamin ved sur pH-verdi
Protamin ble satt til en 10 g/l forrådsoppløsning av HIM2 som hadde en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl. Iseddik ble satt til en 10 ml alikvot (100 mg protein) av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M.200 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert med konsentrert ammoniumhydroksid til pH ~ 5. Oppløsingen ble omrørt ved 5 °C i 15 minutter og så satt hen ved 5 °C i 2 dager for å tillate ytterligere faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 10 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert. Vannvaskingen ble gjentatt ytterligere to ganger. Prøven ble så vasket med 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Det ble gjennomført ytterligere to EtOH vaskinger på samme måte før prøven ble anbrakt på lyofilisøren i 2 dager.
Fremstilling av T-type Zn kompleks av HIM2 med protamin ved nøytral pH-verdi
En HIM2 oppløsning ved rundt 30 g/l ble preparert til en slutt pH verdi ~ 3 med 10 % HCl.1 ml iseddik ble satt til en 50 ml alikvot (1,5 g protein) av oppløsningen ovenfor.600 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til reaksjonsblandingen fulgt av tilsetning av 225 mg protamin. pH-verdien ble justert til 6,95 med konsentrert ammoniumhydroksid og reaksjonsblandingen satt hen i 2 dager ved 5 °C for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 10 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert. Vannvaskingen ble gjentatt ytterligere to ganger. Prøven ble så vasket med 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Det ble gjennomført ytterligere to EtOH vaskinger på samme måte før prøven ble anbrakt på lyofilisøren i 3 dager.
Fremstilling av R-type Zn kompleks av HIM2 med protamin ved sur pH-verdi
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.2,48 ml flytendegjort fenol ble satt til en 150 ml alikvot (1,5 g protein) av oppløsningen ovenfor. pH-verdien for reaksjonen ble justert med konsentrert ammoniumhydroksid til en pH ~ 6,57.12 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til reaksjonsblandingen fulgt av tilsetning av 225 mg protamin. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter før henstand i to dager ved romtemperatur for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 50 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før H2O ble dekantert. Vannvaskingen ble gjentatt ytterligere to ganger. Prøven ble så vasket med 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før EtOH ble dekantert. Det ble gjennomført ytterligere to EtOH vaskinger på samme måte før prøven ble anbrakt på lyofilisøren i 2 dager.
Fremstilling av R-type Zn kompleks av HIM2 med protamin ved nøytral pH-verdi
En HIM2 oppløsning på rundt 10 g/l ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.495 ml flytendegjort fenol ble satt til en 150 ml reaksjonsblanding. Deretter ble 600 ml 10 % ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonen fulgt av tilsetning av 75 mg protamin. pH-verdien ble justert med konsentrert ammoniumhydroksid til en pH-verdi på 7,01. Reaksjonsblandingen ble satt hen i 3 dager ved romtemperatur for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 50 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før H2O ble dekantert. To ytterligere H2O vaskinger skjedde på samme måte. Prøven ble så vasket med 50 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før EtOH ble dekantert. Det ble gjennomført ytterligere to EtOH vaskinger på samme måte før prøven ble anbrakt på lyofilisøren i 2 dager.
Resultater for protaminfaststoffblandinger
INM = ikke nok materiale
ID = ingen data
Fremstilling og analyse av komplekser av insulinforbindelsesdikonjugater
T-type Zn kompleks ved A1 og B29 insulinforbindelsesdikonjugat
Et insulinforbindelsesdikonjugat med en modifiserende del –C(O)(CH2)5(OCH2CH2)7OCH3 koblet på B29 og A1 av humaninsulin (DICON-1) ble satt til en oppløsning ved rundt 10 g/l og preparert til en slutt pH-verdi på 3,15 med 10 % HCl. Iseddik ble tilsatt til en 3,75 ml alikvot av oppløsningen ovenfor til en sluttkonsentrasjon på 0,25 M. Deretter ble 15 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning satt til prøven. pH-verdien ble justert til 4,90 med konsentrert ammoniumhydroksid. Oppløsningen ble omrørt i 15 minutter ved 5 °C og så satt hen i 6 dager ved 5 °C for å tillate faststoffdannelse (det ble oppnådd et hvitt faststoff).
R-type Zn kompleks ved A1 og B29 insulinforbindelsesdikonjugat
DICON-1 ble tilsatt til en oppløsning ved rundt 10 g/l og preparert til en slutt pH-verdi på 3,15 med 10 % HCl. Rundt 12 µl av flytendegjort fenol ble satt til en 3,75 ml alikvot av oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til 5,75 med konsentrert ammoniumhydroksid.60 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter og så satt hen ved romtemperatur i seks dager for å tillate ytterligere presipitatdannelse (ga et hvitt faststoff).
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 30 minutter før H2O ble dekantert og faststoffet vasket med enda 5 ml kaldt DI H2O. Igjen ble prøven sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 5 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 20 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble lyofilisert i seks dager.
Dikonjugat B1, B29 (10 mg/ml)
DICON-1 ble satt til en oppløsning ved rundt 10 g/l og 33 µl flytendegjort fenol ble tilsatt. pH-verdien ble justert til 5,34 med konsentrert ammoniumhydroksid. Deretter ble 160 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning satt til prøven. Oppløsningen ble satt hen ved romtemperatur i to uker for å tillate faststoffdannelse (ga et hvitt faststoff).
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket tre ganger med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter og dekantert etter hver vask. Prøven ble så vasket tre ganger med 5 ml 200 proof kald EtOH. Nok en gang ble prøven sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 15 minutter og dekantert etter hver vasking. Prøven ble lyofilisert i to dager.
Dikonjugat B1, B29 (20 mg/ml)
DICON-1 ble satt til en oppløsning ved rundt 20 g/l og 66 µl flytendegjort fenol ble tilsatt. pH-verdien ble justert til 7,65 med konsentrert ammoniumhydroksid. Deretter ble 320 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning satt til prøven. Oppløsningen ble satt hen ved romtemperatur i to uker for å tillate faststoffdannelse (ga et hvitt faststoff).
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket tre ganger med 5 ml kaldt DI H2O. Oppløsningen ble sentrifugert ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter og dekantert etter hver vask. Prøven ble så vasket tre ganger med 5 ml 200 proof kald EtOH. Nok en gang ble prøven sentrifugert ved 2600 omdreininger per minutt i 15 minutter og dekantert etter hver vasking. Prøven ble lyofilisert i to dager.
Fremstilling av analyse av T-type IN105 faststoffer
T-type Zn kompleks ved IN105 monokonjugat (10 g/l konsentrasjon)
En IN105 oppløsning på rundt 10 g/l (100 mg) ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.
50 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 7,52 med konsentrert ammoniumhydroksid. Den uklare oppløsning ble omrørt og så satt hen i fem dager ved romtemperatur for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen ble overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2900 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen ble dekantert og faststoffet vasket med 3 x 10 ml kaldt DI vann. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 2900 omdreininger per minutt i 10 minutter før vannet ble dekantert og faststoffene vasket med en ytterligere andel kaldt DI vann. Prøven ble så vasket med 3 x 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 2900 omdreininger per minutt i 10 minutter før EtOH ble dekantert. Prøven ble vakuumtørket for å gi 90 mg hvitt faststoff.
T-type Zn kompleks av IN105 monokonjugat (1 g skala)
En IN105 oppløsning på rundt 10 g/l (1 g) ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.500 µl av en 10 vektprosent ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til 7,4 med konsentrert ammoniumhydroksid. Den uklare oppløsning ble omrørt i 15 minutter og så tillatt å stå ved romtemperatur i ~ 2 dager før filtrering.
Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en sintret glass-trakt (fin) under husvakuum. Den sintrede glasstrakt med filtrert materiale ble anbrakt under vakuum i en glassdessikator over natten og man oppnådde 900 mg av et fint, hvitt pulver.
T-type Zn kompleks av IN105 monokonjugat ved nøytral pH (5 g skala)
En IN105 oppløsning på rundt 10 g/l (5 g, lot#Nobex040706L) ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.2 ml av en 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til prøven. pH-verdien ble justert til ~ 7,4 med konsentrert ammoniumhydroksid. Den uklare oppløsning ble så satt hen ved romtemperatur over natten for å tillate faststoffdannelse før filtrering.
Reaksjonen som gjennomført ovenfor ble splittet i 4 x 50 ml sentrifugerør og først sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i til sammen 2 timer. Materialet ble så sentrifugert ved 9000 omdreininger per minutt i 20 minutter og lagret ved 5 °C over natten. Supernatanten ble dekantert og faststoffet vasket med 10 ml kaldt DI H2O fra hvert rør. Rørene ble snudd og sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i ~ 1 time før H2O ble dekantert og faststoffene vasket med ytterligere 10 ml kaldt DI H2O. Nok en gang ble prøven sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i ~ 1 time før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 2 x 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i 1 time før EtOH var dekantert. Prøven ble vakuumtørket i 2 dager for å gi 1,64 g (lot#Nobex040730L-A) av et hvitt pulver.
Resultater for T-type IN105 faststoffblandinger
Fremstilling og analyse av R-type IN105 faststoffer
R-type Zn kompleks ved IN105 konjugat med fenol ved nøytral pH
En IN105 oppløsning på rundt 10 g/l (500 mg) ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.
200 µl 10 % ZnCl2 og 165 µl flytendegjort fenol ble satt til oppløsningen. pH-verdien ble justert til 7,37 med konsentrert ammoniumhydroksid. Den uklare oppløsning ble satt hen ved romtemperatur i 2 dager for å tillate faststoffdannelse før filtrering.
Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en sintret glasstrakt (fin) under husvakuum. Den sintrede glasstrakt med filtermateriale ble anbrakt under vakuum i en glassdessikator over natten og man oppnådde 440 mg av et hvitt, fint pulver.
R-type Zn kompleks av IN105 konjugat ved 5 g skala
En IN105 oppløsning på rundt 10 g/l (4,2 g, lot#Nobex040706L) ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.1,5 (?) flytendegjort fenol og 1,8 ml 10 % ZnCl2 oppløsning ble satt til oppløsningen ovenfor. pH-verdien ble justert til ~ 7,4 med konsentrert ammoniumhydroksid. Den meget uklare oppløsning ble satt hen ved romtemperatur over natten for å tillate ytterligere presipitatdannelse.
Reaksjonen som gjennomført ovenfor ble splittet i 4 x 50 ml sentrifugerør og først sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i 2 timer. Materialet ble så sentrifugert ved 9000 omdreininger per minutt i 20 minutter og satt hen ved 5 °C over natten. Supernatanten ble dekantert og faststoffet vasket med 10 ml kaldt DI H2O fra hvert rør. Rørene ble snudd og sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i 1 time før H2O ble dekantert og faststoffene vasket ned ytterligere 10 ml kaldt DI H2O. Nok en gang ble prøven sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i ~ 1 time før H2O ble dekantert. Prøven ble vasket med 2 x 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugert ved 3200 omdreininger per minutt i 1 time før EtOH ble dekantert. Prøven ble vakuumtørket i 2 dager for å gi 2,34 g hvitt pulver.
Resultater for R-type IN105 faststoffblandinger
ID = ingen data
* i en pH på rundt 7,4 fosfatbuffer
Fremstilling og analyse av protamin IN105 faststoffer
Fremstilling av R-type Zn kompleks av IN105 monokonjugat med protamin ved sur pH
En IN105 oppløsning på rundt 10 g/l ble preparert til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.248 µl flytendegjort fenol settes til en 15 ml alikvot (150 mg protein) av denne oppløsning. pH-verdien for reaksjonen justeres med konsentrert ammoniumhydroksid til pH ~ 6,5.1 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning settes til reaksjonen fulgt av tilsetning av 22,5 mg protamin. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 15 minutter før henstand i to dager ved romtemperatur for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen overføres til et sentrifugerør og sentrifugeres ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen dekanteres og faststoffet vaskes med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning sentrifugeres ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før H2O dekanteres. To ytterligere H2O vaskinger gjennomføres på samme måte. Prøven vaskes så med 10 ml 200 proof kald EtOH og sentrifugeres ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før EtOH dekanteres. Ytterligere to EtOH vaskinger gjennomføres på samme måte før prøven vakuumtørkes i to dager.
Fremstilling av R-type Zn kompleks av IN105 konjugat med protamin ved nøytral pH-verdi
En IN105 oppløsning på rundt 10 g/l prepareres til en slutt pH-verdi ~ 3 med 10 % HCl.49,5 µl flytendegjort fenol settes til 15 ml reaksjonsblanding. Deretter settes 60 µl av en 10 % ZnCl2 oppløsning til reaksjonsblandingen fulgt av tilsetning av 7,5 mg protamin. pH-verdien justeres med konsentrert ammoniumhydroksid til en pH-verdi på 7,00. Reaksjonsblandingen settes hen i tre dager ved romtemperatur for å tillate faststoffdannelse.
Reaksjonsblandingen overføres til et sentrifugerør og sentrifugeres ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter. Oppløsningen dekanteres og faststoffet vaskes med 5 ml kaldt DI H2O. Denne oppløsning sentrifugeres ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før H2O dekanteres. To ytterligere H2O vaskinger gjennomføres på samme måte. Prøven vaskes så med 50 ml 20 % proof kald EtOH og sentrifugeres ved 2800 omdreininger per minutt i 15 minutter før EtOH dekanteres. Ytterligere to EtOH vaskinger gjennomføres på samme måte før prøven vakuumtørkes i to dager.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105
En uren 15 mg/ml IN105 oppløsning inneholdende 25 % organisk materiale ble pH-justert til 3,47 ved bruk av 1M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C vannbad og 0,218 ml ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 0,4 ml 4 % surgjort vandig ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert med 1M NaOH til en sluttverdi pH på 6,6. Mens pH-verdien ble justert ble 10 ml alikvoter trukket av ved de følgende pH-verdier: 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4 og 6,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Det ble observert nåleliknende krystaller under et mikroskop.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 inneholdende 30 % organisk materiale
En frisk 15 mg/ml oppløsning av MPEG3 propionylinsulinforbindelse ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,81 med 1M HCl.0,040 ml flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 0,400 ml av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien i oppløsningen ble justert fra 3,7 til 5,4 ved bruk av 50 % NH4OH og det ble trukket 1 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller (se figur 5), fra pH-området 4,0 til 5,2.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 i 100 mM ammoniumacetatbuffer (30, 20 og 10 % EtOH)
En frisk 15 mg/ml oppløsning av MPEG3, propionylinsulinforbindelse ble preparert i 100 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,8 med 5M HCl.0,040 ml flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonsblandingen. Deretter ble 0,400 ml av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 2,9 til 5,6 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,5 ml alikvoter for hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller fra pH-området 4,4 til 4,8.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av MPEG3, propionylinsulinforbindelse ble preparert i 100 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,8 med 5M HCl.0,040 ml flytendegjort fenol og 2,25 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonsblandingen. Deretter ble 0,400 ml av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 2,9 til 5,6 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,5 ml alikvoter for hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste sirkelliknende krystaller fra pH-området 4,8 til 5,4.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av MPEG3, propionylinsulinforbindelse ble preparert i 100 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,8 med 5M HCl.0,040 ml flytendegjort fenol og 1,15 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonsblandingen. Deretter ble 0,400 ml av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 2,8 til 5,6 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,5 ml alikvoter for hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller fra pH-området 5,0 til 5,6.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 i 20 % organisk med 0,1 og 0,2 % fenol
En frisk 15 mg/ml oppløsning av MPEG3, propionylinsulinforbindelse ble preparert i 100 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 3,0 med 5M HCl.0,010 ml flytendegjort fenol og 2,5 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonsblandingen. Deretter ble 0,400 ml av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,2 til 5,6 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,5 ml alikvoter for hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste sirkelliknende krystaller fra pH-området 4,4 til 5,4.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av MPEG3, propionylinsulinforbindelse ble preparert i 100 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 3,0 med 5M HCl.0,020 ml flytendegjort fenol og 2,5 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonsblandingen. Deretter ble 0,400 ml av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,3 til 5,6 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,5 ml alikvoter for hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste sirkelliknende krystaller fra pH-området 4,4 til 5,2.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 ved 8,0 g skala, pH 4,8 og romtemperatur
En frisk 15 mg/ml oppløsning av MPEG3 propionylinsulinforbindelse ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,0 med 5M HCl.2,13 ml flytendegjort fenol og 225 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonsblandingen. Deretter ble 21,3 ml av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert til 4,8 ved bruk av 5M NH4OH. Oppløsningen ble satt hen uten omrøring i 24 timer før krystallene ble høstet. Nåleliknende krystaller ble observert ved T = 0 mikroskopbildet.
Krystallene ble høstet ved å splitte reaksjonsblandingen i 6 x 250 ml sentrifugerør. Rørene ble behandlet ved 10000 omdreininger per minutt i 8 minutter ved 10 °C før supernatanten ble dekantert. Deretter ble det til hvert rør satt 10 ml kaldt H2O før konsolidering av 6 rør til 2 rør. Sentrifugeprosessen ble gjentatt en gang til med kaldt vann og ytterligere to ganger med kald EtOH. Krystallene ble så tørket med en benkelyofilisør i 2 dager. Prosedyren ga 93 % utbytte på vektbasis beregnet på utgangsmaterialet.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 ved 1,5 g skala, pH 4,8 og romtemperatur
En frisk oppløsning av MPEG3 propionylinsulinforbindelse (IN105) ble preparert ved oppløsning av 1,52 g fast IN105 i 100 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,8 ved bruk av 5M HCl/5M NH4OH. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.400 µl smeltet fenol og 42,5 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 4 ml 4 % surgjort, vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. Den resulterende oppløsning ble så justert til pH 4,8 ved bruk av 5M NH4OH. Reaksjonsblandingen ble så satt hen uten omrøring i 48 timer før krystaller ble høstet. Nåleliknende krystalldannelse ble observert etter 21 timer, ved hjelp av mikroskop.
Krystallene ble høstet ved å splitte reaksjonsoppslemmingen i 4 x 50 ml sentrifugerør. Rørene ble behandlet først ved 1000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble så dekantert. Krystallene i hvert rør ble vasket med 1 x 5 ml alikvot av iskald H2O og så sentrifugert ved 3000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble så dekantert. Vaske/sentrifugeringsprosedyren ble gjentatt med 1 x 5 ml iskald H2O og så med 1 x 5 ml iskald EtOH. Krystallene ble så tørket i en vakuumdessikator over natten. Prosedyren ga et 73 % utbytte på vektbasis beregnet på utgangsmaterialet.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 ved 1,5 g skala, pH 4,4 og romtemperatur
En frisk oppløsning av MPEG3 propionylinsulinforbindelse (IN105) ble preparert ved oppløsning av 1,50 g fast IN105 i 100 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,6 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.400 µl smeltet fenol og 42,5 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 4 ml 4 % surgjort, vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. Den resulterende oppløsning ble så justert til pH 4,4 ved bruk av 5M NH4OH. Reaksjonsblandingen ble så satt hen uten omrøring i 22 timer før krystaller ble høstet. En blanding av nåleliknende krystaller og presipitat ble observert etter 2 timer, ved hjelp av mikroskop. Reaksjonsblandingen syntes å være fullstendig krystallinsk etter 21 timer, sett under mikroskop.
Krystallene ble høstet ved å splitte reaksjonsoppslemmingen til et 1 x 250 ml sentrifugerør. Dette ble først sentrifugert ved 10000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble så dekantert. Krystallene ble vasket med 1 x 20 ml iskald H2O og så sentrifugert ved 10000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble dekantert og vaske/sentrifugeringsprosedyren ble gjentatt med 1 x 20 ml alikvot av iskald H2O, så med 2 x 20 ml alikvoter av iskald EtOH og til slutt 20 ml iskald H2O. Krystallene ble så tørket i en vakuumdessikator over natten. Prosedyren ga et 67 % utbytte på vektbasis beregnet på utgangsmaterialet.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 ved 8,0 g skala, pH 4,8 og romtemperatur
En frisk oppløsning av MPEG3 propionylinsulinforbindelse (IN105) ble preparert ved oppløsning av 7,98 g fast IN105 i 533 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,4 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.2,13 ml smeltet fenol og 225 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 21,3 ml 4 % surgjort, vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. Den resulterende oppløsning ble så justert til pH 4,8 ved bruk av 5M NH4OH. Reaksjonsblandingen ble så satt hen uten omrøring i 21 timer før krystaller ble høstet. Reaksjonsblandingen syntes å være fullstendig krystallinsk etter 2 timer, ved mikroskopundersøkelse.
Krystallene ble høstet ved å splitte reaksjonsoppslemmingen i 6 x 250 ml sentrifugerør. Rørene ble sentrifugert først ved 10000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble så dekantert. Krystallene i hvert rør ble vasket med 1 x 10 ml alikvoter av iskald H2O og så sentrifugert ved 10 000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble så dekantert. Repeterte vaske/sentrifugeringsprosedyren med 1 x 10 ml alikvot av iskald H2O og så med 2 x 10 ml alikvoter av iskald EtOH og til slutt med 1 x 10 ml alikvot av iskald H2O. Krystallene ble så tørket i en vakuumdessikator i 2 dager. Prosedyren ga et 87 % utbytte på vektbasis beregnet på utgangsmaterialet.
Fremstilling av R-type krystallinsk Zn kompleks av IN105 ved 10,0 g skala, pH 4,8 og romtemperatur
En frisk oppløsning av MPEG3 propionylinsulinforbindelse (IN105) ble preparert ved oppløsning av 10,06 g fast IN105 i 670 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,6 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.2,7 ml smeltet fenol og 285 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 27 ml 4 % surgjort, vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. Den resulterende oppløsning ble så justert til pH 4,8 ved bruk av 5M NH4OH. Reaksjonsblandingen ble så satt hen uten omrøring i 21 timer før krystaller ble høstet. Reaksjonsblandingen syntes å være fullstendig krystallinsk etter 2,5 timer via mikroskop.
Krystallene ble høstet ved å splitte reaksjonsoppslemmingen i 6 x 250 ml sentrifugerør. Rørene ble spunnet initielt ved 10 °C, 10000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble så dekantert. Krystallene i hvert rør ble vasket med 1 x 10 ml alikvot av iskald H2O og så konsolidert inn i 2 x 250 ml sentrifugerør og deretter spunnet ved 10 °C, 10000 omdreininger per minutt i 8 minutter. Supernatanten ble så dekantert. Gjentatt vaske/spinningsprosedyre med 1 x 30 ml alikvot iskald H2O og så med 2 x 30 ml alikvoter av iskald EtOH og en siste 1 x 30 ml alikvot av iskald H2O. Krystallene ble så tørket i en benkelyofilisør i 3 dager. Prosedyren ga et 89 vektprosent utbytte, beregnet på utgangsmaterialet.
Fremstilling og analyse av krystallinsk Zn kompleks av HIM2 ved bruk av organisk oppløsningsmiddel
Fremstilling av R-type Zn komplekser av HIM2
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,95 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 3,5 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 600 µl av en 4 %surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,14 til 6,0 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4 (se figur 6A), 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 (se figur 6B), 5,6, 5,8, 6,0. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller ved pH 4,4. pH-området fra 4,6-6,0 viste store, krystallinskliknende faststoffer ved forskjellige former og størrelser.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,95 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 3,5 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 400 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,22 til 6,0 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2 (se figur 7A), 5,4, 5,6, 5,8, 6,0. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller ved pH 4,2-6,0 av forskjellige former og størrelser.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,95 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 3,5 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 200 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,19 til 6,0 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 (se figur 7B), 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystalliknende faststoffer fra pH 4,4-4,6 av forskjellige former og størrelser. pH-området på 4,8-5,2 viste mer uniforme, nåleliknende krystaller.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,95 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 2,6 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 600 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,04 til 6,0 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 (se figur 8A), 5,6, 5,8, 6,0. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste flate, snøflakliknende krystaller fra pH 4,6-5,4.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,95 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 2,6 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 400 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,05 til 6,0 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 (se figur 8B), 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller ved pH 5,0, krystalliknende faststoffer ved pH 5,2 og flate, snøflakliknende krystaller ved pH 5,4.
Rxn 6 En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,95 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 2,6 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 200 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,09 til 6,0 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 (se figur 9A), 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller og krystalliknende faststoffer ved pH 4,8-5,6.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 250 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 2,97 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste krystalliknende presipitering fra pH 4,6-5,8.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 200 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,06 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 (se figur 9B), 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste krystalliknende presipitering fra pH 4,6-5,6.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 150 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,09 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste krystaller av forskjellige former og størrelser fra pH 5,0-5,2.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.40 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 100 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,09 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 (se figur 10A), 5,2, 5,4 (se figur 10B), 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller ved pH 5,0 og forskjellige former og størrelser av krystallinsk materiale fra pH 5,2-5,6.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.20 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 250 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,08 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste krystalliknende presipitering fra pH 4,8-5,8.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.20 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 200 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,05 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste veldig små krystalliknende faststoffer.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.20 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 200 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,05 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste veldig små krystalliknende faststoffer.
En frisk 15 mg/ml oppløsning av HIM2 ble preparert i 250 mM ammoniumacetatbuffer og pH-verdien justert til 2,76 med 5M HCl.20 µl flytendegjort fenol og 4,25 ml 95 % EtOH ble satt til oppløsningen. Deretter ble 100 µl av en 4 % surgjort ZnCl2 oppløsning satt til reaksjonsblandingen. pH-verdien for oppløsningen ble justert fra 3,06 til 5,8 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbildene tatt etter 24 timer viste meget lite krystalliknende faststoffer.
Ko-krystallisering av HIM2 og IN105 med sink
Fremstilling av R-type krystalliserte Zn komplekser av HIM2 og IN105
50:50 (HIM2:IN105)
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 37,3 mg HIM2 og 36,4 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,84 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.166 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 80 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 3,19 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 4 timer. Mikroskopbilder tatt etter 4 timer viste forskjellige størrelser og former fra krystaller fra pH-området 4,4 til 5,6.
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 37,1 mg HIM2 og 35,9 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 3,03 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 3,38 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 (se figur 11A), 5,2 (se figur 11B), 5,4 og 5,6 (se figur 12A). Prøvene ble satt hen uten omrøring i 4 timer. Mikroskopbilder tatt etter 4 timer viste for det meste korte, nåleliknende krystaller fra pH-området 4,6 til 5,6.
70:30 (HIM2:IN105)
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 53,4 mg HIM2 og 23,2 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,62 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 80 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 3,02 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2 (se figur 12B),5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 1 time. Mikroskopbilder tatt etter 1 time viste forskjellige størrelser og former av krystalliknende presipitering fra pH-området 4,4 til 5,6.
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 53,6 mg HIM2 og 24,5 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,89 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 3,28 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 500 µl alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2 (se figur 13A), 5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 1 time. Mikroskopbilder tatt etter 1 time viste for det meste forskjellige størrelser og former av krystalliknende presipitering fra pH-området 4,6 til 4,8 og mange, nåleliknende krystaller fra pH-området 5,0 til 5,4.
30:70 (HIM2:IN105)
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 23,3 mg HIM2 og 54,7 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,84 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 80 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 3,27 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 1 time. Mikroskopbilder tatt etter 1 time viste for det meste forskjellige størrelser og former av krystalliknende presipitering fra pH-området 4,4 til 5,0 og få, nåleliknende krystaller fra pH-området 5,2 til 5,6.
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 24,8 mg HIM2 og 54,9 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 3,09 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 3,47 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 og 5,6 (se figur 13B). Prøvene ble satt hen uten omrøring i 1 time. Mikroskopbilder tatt etter 1 time viste for det meste forskjellige sirkulære størrelser av krystalliknende presipitering fra pH-området 4,4 til 5,0 og krystallvarierende former og størrelser fra pH-området 5,2 til 5,6.
Fremstilling av R-type ko-krystalliserte Zn komplekser av HIM2 og IN105
50:50 (HIM2:IN105)
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 37,4 mg HIM2 og 35,9 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,60 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 2,15 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste krystallfaststoffer av forskjellige former og størrelser fra pH = 4,6-5,6.
70:30 (HIM2:IN105)
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 57,0 mg HIM2 og 24,5 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. oppløsningen ble justert til pH 2,43 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 2,92 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6 (se figur 14A), 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller fra pH 5,0-5,2.
30:70 (HIM2:IN105)
En frisk oppløsning av HIM2 og IN105 ble preparert ved å oppløse 24,1 mg HIM2 og 53,8 mg IN105 i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. oppløsningen ble justert til pH 2,35 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 2,60 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 (se figur 14B), 5,2, 5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste nåleliknende krystaller fra pH 5,0-52.
Fremstilling av R-type ko-krystalliserte Zn komplekser av HIM2 og humaninsulin
50:50 (HIM2:INSULIN)
En frisk oppløsning av HIM2 og insulin ble preparert ved å oppløse 39,2 mg HIM2 og 36,7 mg insulin i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 2,53 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 2,82 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2 (se figur 15A), 5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste forskjellige former og størrelser fra krystalliknende faststoff fra pH 5,2 og 5,4. Mange små, nåleliknende krystaller ble observert ved pH 5,6.
70:30 (HIM2:insulin)
En frisk oppløsning av HIM2 og insulin ble preparert ved å oppløse 56,5 mg HIM2 og 20,2 mg insulin i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 3,23 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 2,82 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste forskjellige former og størrelser av krystalliknende faststoff fra pH 5,2 og 5,6.
30:70 (HIM2:insulin)
En frisk oppløsning av HIM2 og insulin ble preparert ved å oppløse 21,8 mg HIM2 og 49,2 mg insulin i 4 ml 250 mM ammoniumacetat pH 7,5. Oppløsningen ble justert til pH 3,23 ved bruk av 5M HCl. Fast fenol ble smeltet i et 40-60 °C varmt vannbad.16 µl smeltet fenol og 1,75 ml 95 % EtOH ble satt til reaksjonskolben. Deretter ble 40 µl 4 % surgjort vandig ZnCl2 satt til reaksjonskolben. pH-verdien i oppløsningen ble så justert fra 2,93 til 5,60 ved bruk av 5M NH4OH og det ble trukket av 0,500 ml alikvoter ved hver av de følgende ønskede pH-verdier: 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4 (se figur 15B) og 5,6. Prøvene ble satt hen uten omrøring i 24 timer. Mikroskopbilder tatt etter 24 timer viste flate, snøflakliknende krystaller ved pH 4,8. Ved pH 5,0 var det en blanding av nåleliknende og snøflakliknede krystaller. Fra pH 5,2-5,6 var det mange tynne, nåleliknende krystaller observert.
Vandig oppløselighet av Zn komplekser
200 µl 0,1 M fosfatbuffersaltoppløsning (PUBS, filtrert og ved pH = 7,4) ble satt til en 1 ml konisk reaksjonsvial. Til denne vial ble det satt en liten mengde prøve inntil metning ble observert. Periodisk ble oppløsningen vorteksert. Etter metning ble vialen anbrakt i et lite sentrifugerør og prøven ble sentrifugert ved 2000 omdreininger per minutt i 3 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering ble 10 µl av prøven fjernet fra supernatanten og fortynnet i 490 µl buffer (0,1 M PBS). Den fortynnede prøve ble analysert ved HPLC for å bestemme konsentrasjonen.
In vitro enzymresistenseksempler for Zn IN105 komplekser
Insulinforbindelseskonjugater (IN105) ble tilveiebrakt i 10 mM natriumfosfatbuffer (en pH-verdi rundt 7,4) og konsentrasjonen ble bestemt ved HPLC (oppløsningene ble fortynnet med buffer slik at ekvimolare sammenlikninger kan foretas mellom opphav og konjugater ~ 0,6 mg/ml). Lyofilisert kymotrypsin-enzym ble resuspendert i 1 mM HCl til en konsentrasjon ~ 7,53 U/ml. En 1,53 ml alikvot av hver prøve ble satt til prøverør og 0,850 ml i kontrollrør. Prøver ble testet i duplikat sammen med fire kontrollrør per prøve. Alikvoter ble inkubert ved 37 °C i en termoblander i 15 minutter. Deretter ble 17 µl kymotrypsinenzym satt til hvert prøverør.5 µl 1 mM HCl ble satt til hvert kontrollør. Umiddelbart etter tilsetningene ble 200 µl fjernet fra prøven og kontrollrørene og anbrakt i 50 ml 1 % TA som på forhånd var alikvotert inn i sentrifugerør. Denne prøve tjente som T = 0.
Prøveprosedyren for insulinforbindelsen (Zn fri), IN105
(Zn fri) og insulinforbindelse (regulær insulinforbindelse) ble repetert ved de følgende intervaller: 0, 2, 5, 8, 12, 15 og 30 minutter. Kontrollprosedyren ble gjentatt ved de følgende intervaller: 0, 8, 15, 30 minutter. For T-type- og R-type prøver ble prosedyren gjentatt ved de følgende intervaller: 0, 5, 8, 12, 30, 40 og 60 minutter. Kontrollprosedyren for Zn kompleksene ble gjentatt ved de følgende intervaller: 0, 12, 40 og 60 minutter. Prøver ble lagret ved -20 °C inntil analyse kan skje via HPLC. HPLC ble gjennomført for å bestemme prosentnedbrytning i forhold til det respektive T = 0 minutt for hver digest. Den naturlige log for prosentgjenværende materiale ble plottet versus tid og det ble kjørt en lineær regresjon for hver digest. Halveringstiden ble beregnet ved bruk av likningen: t1/2: = -0,693/helling.
Resultater ved 0,6 mg/ml protein:
Formuleringseksempler
Eksempler på flytende formuleringer
Bufferoppløsninger for R6 type Zn-HIM2 bufferstudie
* Justering av mengde sink til 0,037 mg/ml per 3,7 mg/ml insulin ved tilsetning av sinkklorid og for basering av sinkinnholdet i sink HIM2 faststoffet.
** pH-verdien kan justeres med HCl 10 % og/eller natriumhydroksid 10 %.
Fremstilling av kaprinsyre/laurinsyre oral flytende diluentformulering
Det ble overført rundt 60 % av det krevde sterile vannvolum til en egnet beholder. Den egnede mengde (som antydet i tabellen nedenfor) av trometamin, trolamin, vannfri sitronsyre og natriumhydroksidpellets ble satt til beholderen og blandet godt inntil oppløsning. Temperaturen ble justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og pH-verdien målt. pH-verdien ble justert til 7,7-7,9 etter behov ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble temperaturen justert til 45-50 °C ved oppvarming på en varmeplate og denne temperatur ble opprettholdt. Kaprinsyre ble satt til den varme oppløsning og blandet inntil kaprinsyren var oppløst. Temperaturen ble justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og væskens pH-verdi målt. Etter behov ble pH-verdien justert til 7,7-7,9 ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble oppløsningen blandet i 5 minutter. Det ble tilsatt en egnet mengde sterilt vann til 100 % av det ønskede volum og det hele blandet.
IN105, HIM2 eller ZnHIM2 ble veid ut i mengder nødvendig for å oppnå egnede konsentrasjoner for doseringsstudier, for eksempel 1 mg IN105 (av protein) ble veid ut og kombinert med 1ml formulering for å gi en 1 mg/ml IN105 formulering.
Fremstilling av oljesyre/kaprinsyre/laurin-syre/kolatformuleringer for oralt flytende fortynnere
En oral flytende formulering av R-type Zn HIM2 ble preparert med komponentene som vist i den følgende tabell:
Flytende orale prøver ble fremstilt til å inneholde 1 mg/ml proteinekvivalent av R-type Zn HIM2 (ZnHIM2-R). Zn-HIM2-R ble fjernet fra fryseren (-20 °C), anbrakt i en dessikator og tillatt å vende tilbake til romtemperatur. En 1 mg/ml proteinekvivalent av ZnHIM2-R ble preparert i oral flytende diluent-oppløsning som følger.6,4 mg ZnHIM2-R ble veid inn, deretter ble 5,0 ml oral flytende diluent overført til beholderen og forsiktig slynget for blanding. Oppløsningen trengte rundt 45 minutter for oppløsning. Den resulterende oppløsning var en suspensjon (uklart utseende). Før dosering ble oppløsningen forsiktig slynget i ytterligere 60 sekunder for å sikre at oppløsningen var en homogen oppløsning. For ZnHIM2-R var proteininnholdet 78,6 %, 1 mg/ml proteinekvivalent, mengde = 5 ml. Mengden ZnHIM2-R = (1 mg/ml):(0,786)} x (5,0 ml) = 6,4 mg. ZnHIM2-R konsentrasjon = (6,4 mg) / (5,0 ml) = 1,28 mg/ml (ekvivalent til 1 mg/ml justert for proteininnholdet).
Fremstilling av flytende kaprinsyreformuleringer
Det ble overført rundt 60 % av det krevde sterile vannvolum til en egnet beholder. Den egnede mengde (som angitt i tabellen nedenfor) av trometamin, trolamin, vannfri sitronsyre og natriumhydroksidpellets ble satt til beholderen og blandet godt til oppløsning. Deretter ble temperaturen justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og væskens pH-verdi ble målt. pH-verdien ble justert til 7,7-7,9 etter behov ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble temperaturen justert til 45-50 °C ved oppvarming på en varmeplate og denne temperatur ble holdt. Deretter ble kaprinsyre satt til den varme oppløsning og blandet inntil kaprinsyren var oppløst. Temperaturen ble justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og pH-verdien målt. Etter behov ble pH-verdien justert til 7,7-7,9 ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble oppløsningen blandet i 5 minutter. Den egnede mengde sterilt vann ble satt til 100 % av det krevde volum og det hele blandet godt.
IN105 ble veid ut i mengder nødvendige for å oppnå den riktige konsentrasjon for doseringsstudier, for eksempel 1 mg IN105 (av protein) ble veid ut og kombinert med 1 ml formulering og man oppnådde en 1 mg/ml IN105 formulering.
Kaprat og/eller laurat i flytende fosfatbuffer-formuleringer
Fremstilling av 100 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,8 eller 8,2, skjedde ved overføring av 1,17 gram mononatriumsfosfatmonohydrat til en 1 liters kolbe. Rundt 500 ml sterilt vann ble tilsatt og det hele blandet godt til oppløsning. Deretter ble det tilsatt 24,58 gram natriumfosfatdibasisk heptahydrat og det hele blandet til oppløsning. Fortynning til ønsket volum skjedde med sterilt vann og det hele ble blandet godt. Filtrering skjedde gjennom et 0,22 µm filter. pH-verdien ble justert til 7,8 eller 8,2 med 1N HCl eller 1N NaOH.
For IN105 ble det overført 60 % av det ønskede volum av fosfatbuffer pH 7,8 eller 8,2 til en egnet beholder. Deretter ble det tilsatt en mengde kaprat, beregnet for å gi 3 % vekt/volum av sluttoppløsningen og det hele ble blandet inntil oppløsning. Deretter ble pH-verdien justert til 7,8 eller 8,2 med 1N HCl eller 1N NaOH. Fortynningen ble gjennomført til det ønskede volum, for eksempel 100 ml, med fosfatbuffer pH 7,8 eller 8,2.
For BN-054 ble det veid 400 gram 100 mM natriumfosfatbuffer pH 7,8 i en egnet beholder. Det ble tilsatt 9,7 gram natriumkaprat og 11,1 gram natriumlaurat og det hele blandet godt til oppløsning. Det ble tilsatt egnede mengder 100 mM natriumfosfatbuffer pH 7,8 for å utlikne en nettovekt på 500 gram.
Flytende formulering med arginin eller trolamin
Fremstilling av 100 mM natriumfosfatbuffer pH 7,8 skjedde ved overføring av 1,17 gram mononatriumfosfatmonohydrat til en 1 liters kolbe. Rundt 500 ml sterilt vann ble tilsatt og det hele blandet godt til oppløsning. Det ble så tilsatt 24,58 gram natriumfosfatdibasisk heptahydrat og det hele blandet godt til oppløsning. Det hele ble fortynnet til volum med sterilt vann og blandet godt. Filtrering skjedde gjennom et 0,22 µm filter og pH-verdien ble justert til 7,8 med 1N HCl eller 1N NaOH.
60 % av det ønskede volum av fosfatbufferen pH 7,8 ble overført til en egnet beholder. Den ønskede mengde (som angitt i tabellen nedenfor) arginin eller trolamin ble satt til beholderen og det hele blandet godt til oppløsning. Det ble deretter tilsatt en mengde kaprat beregnet for å gi 3 % vekt/volum av den endelige oppløsning og det hele ble blandet godt til oppløsning. pH-verdien ble deretter justert til 7,8 med
1N HCl eller 1N NaOH. Fortynning skjedde til ønsket volum (for eksempel 100 ml) med fosfatbuffer pH 7,8.
IN105 ble veid ut i mengder som var nødvendig for å oppnå egnede konsentrasjoner for doseringsstudier, for eksempel
1 mg IN105 (av protein) ble veid ut og kombinert med 1 ml av formulering for å gi en 1 mg/ml N105 formulering.
Flytende formulering med kaprylsyre
Det ble overført rundt 60 % av det krevde sterile vannvolum til en egnet beholder. Det ble tilsatt egnet mengde (antydet i tabellen nedenfor) trometamin, trolamin, vannfri sitronsyre og natriumhydroksidpellets til beholderen og det hele blandet godt til oppløsning. Temperaturen ble justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og pH-verdien for væsken ble målt. pH-verdien ble justert til 7,7-7,9 etter behov ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble temperaturen justert til 45-50 °C ved oppvarming på en varmeplate og opprettholdelse av denne temperatur. Deretter ble kaprylsyre satt til den varme oppløsning og blandet inntil kaprylsyren var oppløst. Temperaturen ble justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og pH-verdien for væsken ble målt. Etter behov ble pH-verdien justert til 7,7-7,9 ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble oppløsningen blandet i 5 minutter. Egnede mengder sterilt vann ble tilsatt til 100 % av det krevde volum og blandet godt.
IN105 ble veid ut i mengder nødvendig for å oppnå egnede konsentrasjoner for doseringsstudier, for eksempel ble 1 mg IN105 (av protein) veid ut og kombinert med 1 ml formulering for å gi en 1 mg/ml IN105 formulering.
Flytende formulering med linoleinsyre
100 mM natriumfosfatbuffer pH 7,8 ble preparert og 1,17 gram mononatriumfosfatmonohydrat ble overført til en 1 liters kolbe. Rundt 500 ml sterilt vann ble tilsatt og blandet godt til oppløsning. Deretter ble det tilsatt 24,58 gram natriumfosfatdibasisk heptahydrat og det hele blandet godt til oppløsning. Det hele ble fortynnet til ønsket volum med sterilt vann og blandet godt. Det hele ble filtrert gjennom et 0,22 µm filter og pH-verdien ble justert til 7,8 med 1N HCl eller 1N NaOH.
60 % av det egnede volum av fosfatbuffer pH 7,8 ble overført til en egnet beholder. Deretter ble det tilsatt en mengde linoleinsyrenatriumsalt, beregnet for å gi 3 % vekt/volum sluttoppløsning og det hele blandet godt inntil oppløsning. Deretter ble pH-verdien justert til 7,8 med 1N HCl eller 1N NaOH. Det hele ble fortynnet til egnet volum (for eksempel 100 ml) med fosfatbuffer pH 7,8.
Fremstilling av flytende kaprin- og laurinsyre-formuleringer
Ca. 60 % av det krevde sterile vannvolum ble overført til en egnet beholder. Den egnede mengde (som angitt i tabellen nedenfor) av trometamin, trolamin, vannfri sitronsyre og natriumhydroksdpellets ble satt til beholderen og blandet godt til oppløsning. Temperaturen ble justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og pH-verdien i væsken ble målt. pH-verdien ble justert til 7,7-7,9 etter behov ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble temperaturen justert til 45-50 °C ved oppvarming på en varmeplate og denne temperatur ble holdt. Deretter ble det satt kaprinsyre og/eller laurinsyre til den varme oppløsning og det hele blandet inntil kaprin- og/eller laurinsyren var oppløst. Temperaturen ble justert til 21-25 °C (eller romtemperatur) og pH-verdien i væsken ble målt. Etter behov ble pH-verdien justert til 7,7-7,9 ved bruk av 1N natriumhydroksid eller 1N saltsyre. Deretter ble oppløsningen blandet i 5 minutter. Den egnede mengde sterilt vann tilsvarende 100 % av det krevde volum ble tilsatt og det hele blandet godt.
IN105 ble veid ut i mengder nødvendig til å oppnå egnet konsentrasjon for doseringsstudier, for eksempel 1 mg IN105 (av protein) ble veid ut og kombinert med 1 ml formulering for å gi 1 mg/ml IN105 i formulering.
Faste doseringsformuleringseksempler
Fremstilling og oppløsningsprofil av kaprat/laurat faste doseringsformuleringer ved bruk av Nobex-IN105-[854]
Rundt 58 mg natriumkaprat, 57 mg natriumlaurat, 286 mg mannitol, 30 mg natriumstivelsesglykolat og 6 mg (protein) av Nobex-IN105 ble overført på et stykke vektpapir og blandet grundig. Blandingen ble overført til pressen og presset ved rundt 350 psi for å danne en tablett.
Fast doseringsform (tabletter) formulering Nobex-IN105-[854] 58 mg kaprat og 57 mg laurat per tablett
Oppløsningstestingen ble gjennomført ved bruk av en USP apparatur 2 oppløsningsenhet. Mediet var vann, padlehastigheten 50 omdreininger per minutt og medievolumet var 500 ml. Oppløsningsprøvene ble analysert ved HPLC ved bruk av et gradientsystem. De mobile faser var vann med 0,1 % TFA (mobilfase A) og acetonitril med 0,1 % TFA (mobilfase B). Den benyttede gradient var: 0 minutter 100 % mobilfase A, 11 minutter 65 % mobilfase A, 15 minutter 20 % mobilfase A, 16 minutter 20 % mobilfase A, 17 minutter 100 % mobilfase A. Bølgelengden var 214 nm og kolonne var en C18 kolonne på 150 mm x 2 mm. De følgende tabeller og grader oppsummerer oppløsningsdata som ble oppnådd for oppløsningstestingen av Nobex-Zn-IN105 tablettformulering [854] inneholdende 6 mg Zn-IN105 (protein), 286 mg mannitol, 58 mg natriumkaprat, 57 mg natriumlaurat og 30 mg natriumstivelsesglykolat (Explotab):
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [854], % IN105 oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [854], % kaprat oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [854], % laurat oppløst
Fast doseringsform (tablett) formuleringspreparat 143 mg kaprat og 140 mg laurat per tablett
Fremstilling av formulering Nobex-IN105-[856]
Rundt 143 mg natriumkaprat, 140 mg natriumlaurat, 150 mg mannitol, 30 mg natriumstivelsesglykolat og 6 mg (protein) av Nobex-IN105 ble overført til et stykke vektpapir og blandet grundig. Blandingen ble så overført til en presse og presset til en tablett ved rundt 350 psi.
Fast doseringsform (tabletter) formulering Nobex-IN105-[856] 143 mg kaprat og 140 mg laurat per tablett
Oppløsningstestingen ble gjennomført ved bruk av en USP apparatur 2 oppløsningsenhet. Mediet var vann, padlehastigheten 50 omdreininger per minutt og medievolumet var 500 ml. Oppløsningsprøvene ble analysert ved HPLC ved bruk av et gradientsystem. De mobile faser var vann med 0,1 % TFA (mobilfase A) og acetonitril med 0,1 % TFA (mobilfase B). Den benyttede gradient var: 0 minutter 100 % mobilfase A, 11 minutter 65 % mobilfase A, 15 minutter 20 % mobilfase A, 16 minutter 20 % mobilfase A, 17 minutter 100 % mobilfase A. Bølgelengden var 214 nm og kolonnen var en C18 kolonne på 150 mm x 2 mm. De følgende tabeller og grafer oppsummerer oppløsningsdata som ble oppnådd for oppløsningstestingen av Nobex-Zn-IN105 tabletter inneholdende 6 mg Zn-IN105 (protein), 150 mg mannitol, 143 mg natriumkaprat, 140 mg natriumlaurat og 30 mg natriumstivelsesglykolat (Explotab):
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [856], % IN105 oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [856], % kaprat oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [856], % laurat oppløst
Fast doseringsform (tablett) formuleringsfremstilling 143 mg kaprat per tablett
Fremstilling av formulering Nobex-IN105-[859]
Rundt 143 mg natriumkaprat, 150 mg mannitol, 30 mg natrium-stivelsesglykolat og 6 mg (protein) Nobex-IN105 ble overført på et stykke vektpapir og blandet grundig og blandingen ble så overført til en presse og komprimert under rundt 350 psi for å danne en tablett.
Fast doseringsform (tabletter) formulering Nobex-IN105-[859] 143 mg kaprat per tablett
Oppløsningstestingen ble gjennomført ved bruk av en USP apparatur 2 oppløsningsenhet. Mediet var vann, padlehastigheten 50 omdreininger per minutt og medievolumet var 500 ml. Oppløsningsprøvene ble analysert ved HPLC ved bruk av et gradientsystem. De mobile faser var vann med 0,1 % TFA (mobilfase A) og acetonitril med 0,1 % TFA (mobilfase B). Den benyttede gradient var: 0 minutter 100 % mobilfase A, 11 minutter 65 % mobilfase A, 15 minutter 20 % mobilfase A, 16 minutter 20 % mobilfase A, 17 minutter 100 % mobilfase A. Bølgelengden var 214 nm og kolonnen var en C18 kolonne på 150 mm x 2 mm. De følgende tabeller og grafer oppsummerer oppløsningsdata som ble oppnådd for oppløsningstestingen av Nobex-Zn-IN105 tabletter inneholdende 6 mg Zn-IN105 (protein), 150 mg mannitol, 143 mg natriumkaprat og 30 mg natriumstivelsesglykolat (Explotab):
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [859], % IN105 oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [859], % kaprat oppløst
Fast doseringsform (tablett) formuleringsfremstilling 286 mg kaprat per tablett
Fremstilling av formulering Nobex-IN105-[860]
Rundt 286 mg natriumkaprat, 150 mg mannitol, 30 mg natrium-stivelsesglykolat og 6 mg (protein) Nobex-IN105 ble overført på et stykke vektpapir og blandet grundig. Blandingen ble overført til en presse og presset ved rundt 350 psi for å danne en tablett.
Fast doseringsform (tabletter) formulering Nobex-IN105-[860] 286 mg kaprat per tablett
Oppløsningstestingen ble gjennomført ved bruk av en USP apparatur 2 oppløsningsenhet. Mediet var vann, padlehastigheten 50 omdreininger per minutt og medievolumet var 500 ml. Oppløsningsprøvene ble analysert ved HPLC ved bruk av et gradientsystem. De mobile faser var vann med 0,1 % TFA (mobilfase A) og acetonitril med 0,1 % TFA (mobilfase B). Den benyttede gradient var: 0 minutter 100 % mobilfase A, 11 minutter 65 % mobilfase A, 15 minutter 20 % mobilfase A, 16 minutter 20 % mobilfase A, 17 minutter 100 % mobilfase A. Bølgelengden var 214 nm og kolonnen var en C18 kolonne på 150 mm x 2 mm. De følgende tabeller og grafer oppsummerer oppløsningsdata som ble oppnådd for oppløsningstestingen av Nobex-Zn-IN105 tabletter inneholdende 6 mg Zn-IN105 (protein), 150 mg mannitol, 286 mg natriumkaprat og 30 mg natriumstivelsesglykolat (Explotab):
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [860], % IN105 oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [860], % kaprat oppløst
Fast doseringsform (tablett) formuleringsfremstilling 100 mg kaprat per tablett
Fremstilling av formulering Nobex-IN105-[861]
Rundt 100 mg natriumkaprat, 150 mg mannitol, 25 mg natrium-stivelsesglykolat og 6 mg (protein) Nobex-IN105 ble overført på et stykke vektpapir og blandet grundig. Blandingen ble overført til en presse og komprimert ved rundt 350 psi for å danne en tablett.
Fast doseringsform (tabletter) formulering Nobex-IN105-[861] 100 mg kaprat per tablett
Oppløsningstestingen ble gjennomført ved bruk av en USP apparatur 2 oppløsningsenhet. Mediet var vann, padlehastigheten 50 omdreininger per minutt og medievolumet var 500 ml. Oppløsningsprøvene ble analysert ved HPLC ved bruk av et gradientsystem. De mobile faser var vann med 0,1 % TFA (mobilfase A) og acetonitril med 0,1 % TFA (mobilfase B). Den benyttede gradient var: 0 minutter 100 % mobilfase A, 11 minutter 65 % mobilfase A, 15 minutter 20 % mobilfase A, 16 minutter 20 % mobilfase A, 17 minutter 100 % mobilfase A. Bølgelengden var 214 nm og kolonnen var en C18 kolonne på 150 mm x 2 mm. De følgende tabeller og grafer oppsummerer oppløsningsdata som ble oppnådd for oppløsningstestingen av Nobex-Zn-IN105 tabletter inneholdende 6 mg Zn-IN105 (protein), 150 mg mannitol, 100 mg natriumkaprat og 25 mg natriumstivelsesglykolat (Explotab):
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [861], % IN105 oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [861], % kaprat oppløst
Fast doseringsform (tablett) formuleringsfremstilling 150 mg kaprat per tablett
Fremstilling av formulering Nobex-IN105-[862]
Rundt 150 mg natriumkaprat, 150 mg mannitol, 25 mg kroskarmellosenatrium og 6 mg (protein) Nobex-IN105 ble overført på et stykke vektpapir og blandet grundig. Blandingen ble overført til en presse og komprimert under rundt 350 psi for å danne en tablett.
Fast doseringsform (tabletter) formulering Nobex-IN105-[862] 150 mg kaprat per tablett
Oppløsningstestingen ble gjennomført ved bruk av en USP apparatur 2 oppløsningsenhet. Mediet var vann, padlehastigheten 50 omdreininger per minutt og medievolumet var 500 ml. Oppløsningsprøvene ble analysert ved HPLC ved bruk av et gradientsystem. De mobile faser var vann med 0,1 % TFA (mobilfase A) og acetonitril med 0,1 % TFA (mobilfase B). Den benyttede gradient var: 0 minutter 100 % mobilfase A, 11 minutter 65 % mobilfase A, 15 minutter 20 % mobilfase A, 16 minutter 20 % mobilfase A, 17 minutter 100 % mobilfase A. Bølgelengden var 214 nm og kolonnen var en C18 kolonne på 150 mm x 2 mm. De følgende tabeller og grafer oppsummerer oppløsningsdata som ble oppnådd for oppløsningstestingen av Nobex-Zn-IN105 tabletter inneholdende 6 mg Zn-IN105 (protein), 150 mg mannitol, 150 mg natriumkaprat og 25 mg kroskarmellosenatrium (Explotab):
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [862], % IN105 oppløst
Dataoppsummering for oppløsningsprofilen av Nobex-Zn-IN105 tabletter [862], % kaprat oppløst
In vitro enzymresistenseksempler
Insulinforbindelseskonjugater (HIM2) ble tilveiebrakt i en
10 mm natriumfosfatbuffer (en pH-verdi rundt 7,4) og konsentrasjonen bestemt ved HPLC (oppløsningene ble fortynnet med buffer slik at ekvimolare sammenlikninger kan foretas mellom opphav og konjugater ~ 0,6 mg/ml). Lyofilisert kymotrypsinenzym ble resuspendert i 1 mM HCl til en konsentrasjon rundt 7,53 U/ml. En 1,53 ml alikvot av hver prøve ble satt til prøverør og 0,850 ml til kontrollrør. Prøver ble varmet opp i duplikat sammen med fire kontrollrør per prøve. Alikvoter ble inkubert ved 37 °C i en termoblander i 15 minutter. Deretter ble 17 µl kymotrypsinenzym satt til hver prøve.
5 µl 1 mM HCl ble satt til hvert kontrollrør. Umiddelbart etter tilsetning ble 200 µl fjernet fra prøven og kontrollrørene og anbrakt i 50 µl 1 % TFA som i forkant var alikvotert inn i sentrifugerørene. Denne prøve tjente som T = 0.
Prøveprosedyren for insulin (Zn fri), HIM2 (Zn fri) og insulin (regulær insulinforbindelse) ble repetert ved de følgende intervaller: 0, 2, 5, 8, 12, 15 og 30 minutter. Kontrollprosedyren ble repetert ved de følgende intervaller: 0, 8, 15, 30 minutter. For T-type- og R-type prøver ble prosedyren repetert ved de følgende intervaller: 0, 5, 8, 12, 30, 40 og 60 minutter. Kontrollprosedyren for Zn kompleksene ble repetert ved de følgende intervaller: 0, 12, 40 og 60 minutter. Prøver ble lagret ved -20 °C inntil analyse kan skje ved HPLC. HPLC ble gjennomført for å bestemme nedbrytning i forhold til det respektive T = 0 minutt for hver digest. Den naturlige logaritme av gjenværende prosent ble plottet versus tid og en lineær regresjon kjørt for hvert digest. Halveringstiden ble beregnet ved bruk av likningen: t1/2 := -0,693/helling.
Resultater ved 0,6 mg/ml protein
Resultater ved 0,3 mg/ml protein
In vivo eksempler
Utvidet museblodglukoseanalyse (MBGA)
Seks parede-dose grupper av 5 CF-1 hannmus (Charles River Laboratories; 25-30 g) fikk subkutane injeksjoner av enten insulinforbindelseskonjugat (testgjenstand) eller rekombinant humaninsulin. Testgjenstanden ble rekonstituert med fosfatbuffer (0,01 M, en pH-verdi rundt 7,4) inneholdende 0,1 vektprosent bovinserumalbumin og dosert til 100, 66,6, 43,3, 30, 20 og 13,3 µg/kg. Insulin ble rekonstituert med fosfatbuffer (0,01 M, en pH rundt 7,4) inneholdende 0,1 vektprosent bovinserumalbumin og dosert ved 50, 33,3, 21,7, 15, 10 og 6,7 µg/kg. Etter mottaket av en subkutan dose i lommen dannet av hofte og lyske ble dyrene brakt tilbake til burene i 30 minutter ved romtemperatur og deretter hurtig anestetisert og tappet terminalt. Blodprøver ble samlet i heparinrør for glukoseanalyse. Hvis glukoseanalysen ble forsinket ble rørene lagret i isvann og varmet opp igjen til romtemperatur før analyse.
Plasmaglukose ble målt med et glukometer (for eksempel One Touch® Basic; Lifescan) som var kalibrert hver bruksdag i henhold til produsentens instruksjoner. Potensen for insulinforbindelseskonjugatet ble så beregnet i forhold til standardkurven som ble generert for den rekombinante humaninsulinrespons. Beregninger var basert på antakelsen at rekombinant humaninsulin har en potens på 37,5 IU/mg.
Resultatene er vist i figurene 16-20. Figur 16 viser MBGA biopotensprofiler for HIM2. Figur 17 viser MBGA biopotensprofiler for Zn-Him2 insulinforbindelse produkt R-type. Figur 18 viser MBGA biopotensprofiler for Zn-Him2 insulinforbindelse produkt T-type. Figur 19 viser MBGA biopotensprofiler for Zn-Him2 insulinforbindelsesprodukt med protamin. Figur 20 viser en glukosereduserende effekt av R-type protaminkompleks ved 30 og 90 minutter post dose. Disse resultater viser at biopotensen for HIM2 ikke signifikant reduseres ved kompleksering med Zn<++>. R-type protaminkompleks (se figur 17 [7]) viser større glukosereduksjon ved 30 minutter enn 90 minutter.
Videre viser figurene 21-24 MBGA biopotensprofiler for IN-186, IN-192, IN-190, IN-191, IN-189, IN-178, IN-193, IN-194, IN-185, IN-196 og IN-197 med strukturer som følger:
B1 monokonjugat, IN-186:
B29 monokonjugat, IN-194:
B29 monokonjugat, IN-197:
B29 monokonjugat, IN-178:
B29 monokonjugat, IN-190:
B29 monokonjugat, IN-196:
B29 monokonjugat, IN-191:
B29 monokonjugat, IN-189:
Hundeklemmestudier
Initial HIM2 studier
Hunder (n = 3 eller 6) ble preparert kirurgisk (isofluran-anestesi) ved å anbringe et kateter i en femoral arterie. Dyrene ble tillatt å komme seg i 16-17 dager hvoretter de fastet over natten og ble studert i bevisst tilstand. Etter en 60 minutters ekvilibreringsperiode var det en 20 minutters kontrollperiode hvoretter medikamentet ble inngitt via munnen. Zn<++ >HIM2 R-type insulinforbindelse ble testet i en bufferoppløsning, fremstilt som vist i eksempel. I tillegg ble R-type og NPH-type komplekser testet i flytende oralformuleringer inneholdende kapratsyre og lauratsyre, fremstilt som vist i eksempel.
Alle 3 testprøver ble testet ved kun et dosenivå (dosenivået ble identifisert basert på foregående forsøksresultater). Plasmaglukosenivået ble så klemt ved en euglykemisk verdi ved infusjon av D-20 via en leggvene i 4 timer.4 ml blodprøver ble tatt ved -20, 0, 5, 10, 20, 30, 45, 90, 120, 180 og 240 minutter for måling av glukose, insulinforbindelse og C-peptid. Arterieblodprøver ble oppnådd etter behov for å klemme plasmaglukosenivået. Til sammen 72 ml blod ble tatt ved hvert forsøk.
De følgende målinger ble gjennomført: glukoseinfusjonshastighet, insulinforbindelseskonsentrasjon, C-peptidkonsentrasjon og plasma C-peptidnivåer (for å tillate en estimering av endogen insulinforbindelsesfrigivning). Glukoseinfusjonshastigheten som kreves for å opprettholde euglykemi gir en indeks på insulinforbindelsesvirkningen.
Etter forsøket ble den frie ende av kateteret lagt ned subkutant og hundene ble tillatt å komme seg i to uker før en ytterligere studie der forskjellige testgjenstander ble benyttet. Dyrene ble randomisert til dose og benyttet vanligvis 3 timer. Det totale antall hunder var 6.
Figurene 25 og 26 viser resultatene.
Initial IN105 studier
Studien ble gjennomført på (6) overnattfastede, bevisste mongrelhunder som var gitt en diett på 34 % protein, 46 % karbohydrat, 14,5 % fett og 5,5 % fiber basert på tørrvekt. Hvert dyr hadde et silastisk kateter innført i femoralarterien som beskrevet annensteds (1) rundt tre uker før forsøket. På forsøksdagen ble kateteret fjernet fra sin sub-kutane lomme under lokal anestesi. Testgjenstand: Nobex-IN105 (Lot.# KJ-173-095 & KJ-173-116) ble tilveiebrakt i den orale fettsyreformulering (Nobex-IN-[753]-040422) ved en konsentrasjon på 1,0 mg/ml. Hver hund fikk 0,25 mg/kg oraldose Nobex-IN105 (1,0 mg/ml@0,25 ml/kg doseringsvolum). Nobex-IN105 ble gitt ved t = 0 og glukose (D-20)ble infusert via en cefalisk vene for å opprettholde euglykemi. Arterieblodprøver ble trukket for måling av insulin og glukose som beskrevet tidligere (1). Etter at forsøket var ferdig ble arteriekateteret lagt ned subkutant slik det ble gjort under initialkirurgien.
Under forsøket kastet en hund opp umiddelbart etter dosering og kun en del av dosen ble administrert. Derfor ble resultatene fra dette forsøk rapportert med og uten data oppnådd fra denne hunden.
Arterielle plasmainsulinnivåer steg hos alle seks hunder inkludert avvikeren (Oral-2i) etter oral administrering av Nobex-IN105. Midlere arterieinsulin steg fra 6,0 ± 1,4 µU/ml (6,3 ± 1,7 µU/ml, n = 5) til en topp på 109,4 ± 31,4 µU/ml (127,8 ± 30,1 µU/ml, n = 5) ved 10 minutter etter administrering og falt så slik at alle hunder ved 150 minutter var tilbake på basisinsulinnivåer (figurer 27 og 28).
Euglykemi ble opprettholdt ved glukoseinfusjon. Glukoseinfusjonshastighet som var nødvendig for å opprettholde euglykemi var størst i dyr med større økning i arterieinsulin (figurer 27 og 28).
Midlere areal-under-glukoseinfusjonshastighetskurven (AUC0-240) var 578,5 ± 144,5 mg/kg/min. (669,4 ± 137,7 mg/kg/min., n = 5).
Faste formuleringer
Formuleringsscreeningsstudier ved bruk av glukoseklemmemodellen ble gjennomført på overnattfastede, bevisste mongrelhunder som var gitt en diett på 34 % protein, 46 % karbohydrat, 14,5 % fett og 5,5 % fiber, basert på tørrvekt. Hvert dyr hadde et silastisk kateter innført i femoralarterien som beskrevet annensteds (referanse 1) rundt tre uker før forsøket. På forsøksdagen ble kateteret fjernet fra den subkutane lomme under lokal anestesi. Testgjenstanden inneholdt 1,0 mg/ml Zn IN105 i forskjellige flytende formuleringer eller 5-6 mg IN105 per kapsel eller tablett. Hver hund i hvert forsøk fikk en oral flytende dose på rundt 0,25 mg/kg eller en kapsel eller tablett inneholdende 5 eller 6 mg IN105 to ganger etter hverandre, den første ved t = 0 og den andre ved t = 120 minutter. Glukose (D-20) ble infusert gjennom en cefalisk vene for å opprettholde euglykemi. I noen tilfeller ble studietiden forlenget etter dosering der effekten varte utover 120 minutter. Arterieblodprøver ble trukket for måling av insulin, glukose og C-peptid som beskrevet tidligere (referanse 1). Etter at forsøket var ferdig, ble arteriekateteret plassert igjen i den subkutane lomme.
Formuleringer, både oppløsninger og faste doseringsformer, ble preparert med forskjellige nivåer av fettsyrer, bufre, diluenter og disintegranter. For å minimalisere variabler inneholdt væskene og de faste formuleringer konsistente nivåer av IN105 og hver eksipient (kaprin-, laurin-, kapryl-, myristin- eller linoleinsyre) idet man således kun varierte de relative mengder av hvert fettsyreinnhold, buffer, diluenter (mannitol eller mikrokrystallinsk cellulose) og/eller disintegrant (Explotab). Glukoseinfusjonshastigheten og IN105 absorpsjon (plasmainsulinimmunoreaktivitet) data ble evaluert og sammenliknet med hver doserte formulering.
I utgangspunktet ble forsøkene gjennomført for å forenkle og raffinere de optimaliserte flytende formuleringer (referanse 2) til en flytende formulering som lettere kunne konverteres til en fast doseringsform. Dette ble gjennomført ved å erstatte den frie fettsyre med det tilsvarende natriumsalt (for eksempel kaprinsyre erstattet med natriumkaprat) så vel som å fjerne bufferkomponentene (sitronsyre, trolamin, trometamin, natriumhydroksid) som ikke lenger ble ansett som nødvendige. I tillegg ble virkningen av andre fettsyrer som linolein-, kapryl- og myristinsyrer og aminosyre, arginin, undersøkt med henblikk på virkninger av absorpsjonen av IN105.
Etter et initialsett av prototypescreeninger ved bruk av en eller to hunder per forsøk ble noen få prototypeformuleringer valgt og testet i ytterligere hunder for bedre å bestemme variabiliteten og konsistensen mellom formuleringer og individuelle dyr.
En oppløsningsmetode ble utviklet og oppløsningsstudier ble gjennomført på et antall kandidatformuleringer for å evaluere oppløsningsprofilene av IN105 og fettsyreinnholdene.
RESULTATER
I de opprinnelige forsøk viste hunder dosert med IN105 i 3 % vekt/volum kaprinsyrenatriumsalt i en fosfatbuffer uten ytterligere eksipienter (figurene 29-30) en tilsvarende respons sammenliknet med den optimaliserte flytende formulering inneholdende 3 % vekt/volum kaprinsyre i trolamin/sitronsyre/tro-metamin/natriumhydroksidbuffer. Dette viste at natriumsaltet av fettsyreformen oppfører seg sammenliknbart med syreformen og at de ytterligere bufferkomponenter ikke bidrar ril formuleringen.
I separate studier som evaluerer alternative fettsyrer som erstatter 3 % kaprat med enten 3 % kaprylsyre eller 3 % linoleinsyre viste ingen av alternativene signifikante effekter. Bruken av kaprylsyre resulterte i behov for lave til moderate nivåer av glukose mens bruken av linoleinsyre ikke resulterte i noen nødvendig glukoseinfusjon, noe som antyder mangel på effekt. Begge formuleringer viste relativt lave nivåer av arteriell insulin. En flytende formulering inneholdende arginin viste relativt ingen fordel på GIR- eller IN105 nivåer.
I primærstudiene ble faste formuleringer evaluert som både pulverblandinger fylt i harde gelatinkapsler og tabletter komprimert for hånd ved bruk av en Carver presse. Kapslene, pulverblandinger av 6 mg IN105 (insulinekvivalent,
0,25 mg/kg) med 57 mg kaprat/57 mg laurat viste ingen signifikant effekt i den første dosering opp til 120 minutter og i den andre dosering ble en signifikant effekt observert med GIR samtidig med IN105 absorpsjon der nivåene var godt over bunnlinjen fra 0 til 120 minutter. Disse data antyder en variabel men potensiell forsinket respons i IN105 i kapseldoseringsform. Oppløsning ble kun lett forsinket med kapselen i forhold til tabletter selv om det kan være liten eller ingen in vitro/in-vivo korrelasjon.
I initialprototypetablettscreeningsstudier viser tabletter inneholdende 6 mg IN105 og 150 mg mannitol, 30 mg natriumstivelsesglykolat med 143 mg kaprat med eller uten 143 mg laurat signifikant høyere GIR- og IN105 absorpsjon enn de samme tabletter med 54 mg kaprat og/eller 54 mg laurat (figur 31, 32 og 33). Dette antyder en rimelig doserespons av høyere GIR- og IN105 nivåer i forhold il økende nivåer av kaprat og laurat. Tabellene viste en tidlig og konsistent GIR responstid til de IN105 fylte kapsler. I tillegg viste IN105 tablettene en arteriell plasmastigning i insulin for alle doserte hunder.
I en serie sluttstudier ble tre prototypetablettformuleringer (formulering [856] inneholdende 143 mg kaprat og 140 mg laurat, [860] inneholdende 286 mg kaprat og [862] inneholdende 150 mg kaprat) valgt for evaluering i 5 hunder (3 forskjellige hunder for hver formulering) for å bedømme deres ytelseskonsistens (figurer 34-37). Arterieplasmainsulinnivåene steg i alle 3 hunder og ved alle 18 doser (3 hunder x 3 tabletter x 2 doser hver) med tilsvarende GIR respons etter oral administrering av 6 mg (insulinekvivalent) av IN105 formulert i tablettene inneholdende enten 150 eller 280 mg kaprat eller 143 mg/140 mg kaprat/laurat (figurer 31-32 og 38-42). C-peptidnivåene (ng/ml) med 150 mg og 280 mg kaprattabletter viste gjennomsnitt (n = 2), en reduksjon fra et initialnivå på 0,30 ± 0,05 til 0,22 ± 0,02 ved den første dosering og 0,1 ± 0,05 til 0,02 ± 0,0 ved den andre dosering og viste med 140 mg/140 mg kaprat/laurattabletter 0,21 ± 0,05 til ± 0,02 i løpet av den førte dosering og 0,18 ± 0,05 til 0,18 ± 0,01. Dette er indikerende for en undertrykning av C-peptid-sekresjon fra pankreas som et resultat av det eksogene IN105 insulin.
Alle tre prototypetablettformuleringer av IN105 viste konsistente nivåer av IN105 absorpsjon og resulterende glukoseinfusjonshastigheter blant doser og innen og mellom hunder inkludert på forskjellige dager.
Under sluttstudiene der sett på 6 hunder ble benyttet erfarte en hund (hund #3) mindre respons med alle flytende og faste doseringer. For mer nøyaktig å representere resultatene er data vist med og uten resultater fra hund #3. Data fra hunder som ikke fikk en fullstendig dose (dårlig foring, oppkast, og så videre) eller hadde endogent insulin, er utelatt.
Oppløsningsstudie: Representative prøver av tabletter og kapsler ble underkastet oppløsningstesting (beskrevet ovenfor).
Diskusjon
Disse studier viser at prototype IN105 tabletter inneholdende kaprat eller kaprat- og lauratnatriumsalter med mannitol og disintegranten natriumstivelsesglykolat og inneholdende 6 mg IN105 (rundt 0,25 mg/kg) inngitt oralt, resulterte i signifikant og konsistent økning av arterieplasmainsulin som krevde glukoseinfusjon for å bevare euglykemi.
Disse prototypetabletter resulterte i IN105 nivåer og GIR grader på minst like gode og sannsynligvis bedre enn de flytende formuleringer inneholdende sammenliknbare nivåer av kaprat eller laurat. Prototypetablettformene opprettholder absorpsjonsprofilen for orale flytende formuleringer. Den relative orale bioeffektivitet for de valgte prototypetablettformuleringer (for eksempel 280 mg og 150 mg kapratholdige tabletter, n = 6, AUC for GIR = 496 ± 117 og 500 ± 275) syntes å være bedre enn de flytende formuleringer (for eksempel 3 % vekt/volum kaprinsyre flytende formulering, n = 5, AUC for GIR = 182 ± 92 og 198 ± 119).
Disse data antyder at tablettene inneholdende natriumkaprat som den eneste fettsyre sammen med mannitol og disintegrant, natriumstivelsesglykolat, vil være brukbare ved videre utvikling av faste doseringsformer for bruk i kliniske studier. Data antyder også at insulinnivåer etter oral administrering av IN105 i de valgte prototypekaprattablettformer (natriumkaprat ved enten 150 eller 286 mg) viste topper stabilt med typisk Tmax ved rundt 20 minutter etter dose og en Cmax rundt 59,0 ± 20,1 og 62,9 ± 25,4 µ enheter/ml ved begge doser. Plasmainsulinnivåene forble forhøyet nær Cmax nivået for 10-15 minutter og over basalnivåene under 120 minutter etter hver dose. Den GIR krevde opprettholdelse av euglykemi ved bruk av disse tabletter nådde Tmax ved eller rundt 30 til 40 minutter i begge doser og GIR Cmax nådde et middel på 8,4 ± 1,99 og 7,41 ± 2,18 mg/kg/min. Tablettdoseringsformene krevde høyere GIR Cmax (7,4-8,4 vs.4,5-5,4) og krevde glukoseinfusjon i lengre tid (100-120 minutter vs.60-90 minutter) for å opprettholde euglykemi, enn de optimaliserte flytende formuleringer.
Sammenliknet med arterieplasmainsulinnivåer av historisk SQ og inhalert insulin syntes det som om disse prototypetabletter gir maksimum insulinnivåer tilsvarende SQ og inhalert avlevering og minner om en insulinprofil sammenliknet med den til inhalert insulin (figurer 34-37).
Prototypetablettforsøkene antyder at de valgte prototypetabletter er egnet som faste doseringsformuleringer for ytterligere evaluering av IN105 med ytterligere utvikling for fokusering på produksjon av en klinisk formulering som kan produseres ved bruk av en tablettpresse.
Deler av beskrivelsen er oppdelt i avsnitt for enkel forståelse og referanse. Overskrifter for avsnitt og temaer skal ikke anses som begrensende. Utførelsesformene som beskrevet her er for å illustrere de mange aspekter og muligheter ved oppfinnelsen og skal ikke på noen måte være ment å begrense den.

Claims (1)

  1. Patentkrav 1. Fast farmasøytisk preparat formulert for oral administrering ved inntak, k a r a k -t e r i s e r t v e d at det omfatter: fra rundt 40 til rundt 60 vektprosent fettsyrekomponent der fettsyrekomponenten omfatter salt av mettede og umettede C4-12-fettsyrer og et terapeutisk middel, hvor det terapeutiske midlet er humaninsulin som ved LysB29 er koplet til en modifiserende del med formelen
    . 2. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter en diluent valgt fra gruppen bestående av bindere, disintegranter, fyllstoffer, diluenter, lubrikanter, glidere, strømningsforsterkere, kompresjonshjelpestoffer, fargestoffer, søtnere, preserveringsmidler, suspenderingsmidler, dispergeringsmidler, filmdannere, belegg, smaksstoffer, celluloser, sukre, mannitoler, laktoser, oppløsningsforsterkere og krysskarmeloser. 3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 2, k a r a k t e r i s e r t v e d at det er fremstilt i en form valgt fra gruppen bestående av tabletter, minitabs, pulvere, harde gelatinkapsler eller mykgelatinkapsler. 4. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, 2 eller 3, k a r a k t e r i s e r t v e d at fettsyrekomponenten er salter av kaprin- og/eller laurinsyre. 5. Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, k a r a k t e -r i s e r t v e d at det omfatter et buffersalt valgt fra gruppen bestående av fosfatbuffer, natriumfosfat, trisbuffer, sitronsyrebuffer, etanolaminbuffer og trietylaminbuffer. 6. Farmasøytisk preparat ifølge krav 5, k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter et buffersalt valgt for å oppnå en bufferkapasitet på absorpsjonsstedet for å opprettholde en lokal pH-verdi fra rundt 4,8 til rundt 9,5, eller fra rundt 5 til rundt 8. 7. Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, k a -r a k t e r i s e r t v e d at fettsyrekomponenten er natriumkaprat. 8. Farmasøytisk preparat ifølge krav 7, k a r a k t e r i s e r t v e d at det videre omfatter mannitol.
NO20170341A 2004-07-19 2005-07-19 Insulinoligomerkonjugater, formuleringer og bruk derav NO345613B1 (no)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58905804P 2004-07-19 2004-07-19
US61915304P 2004-10-15 2004-10-15
US63257804P 2004-12-02 2004-12-02
US65580305P 2005-02-24 2005-02-24
US65583805P 2005-02-24 2005-02-24
PCT/US2005/025644 WO2006014673A2 (en) 2004-07-19 2005-07-19 Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20170341A1 NO20170341A1 (no) 2007-01-22
NO345613B1 true NO345613B1 (no) 2021-05-10

Family

ID=35787693

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20170341A NO345613B1 (no) 2004-07-19 2005-07-19 Insulinoligomerkonjugater, formuleringer og bruk derav
NO20070859A NO340825B1 (no) 2004-07-19 2007-02-15 Insulinoligomerkonjugater, formuleringer og anvendelser der-av.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20070859A NO340825B1 (no) 2004-07-19 2007-02-15 Insulinoligomerkonjugater, formuleringer og anvendelser der-av.

Country Status (21)

Country Link
US (6) US7872095B2 (no)
EP (2) EP1773878B1 (no)
JP (3) JP5220410B2 (no)
KR (2) KR101309770B1 (no)
CN (3) CN103223160B (no)
AU (1) AU2005269753B2 (no)
BR (1) BRPI0513508B1 (no)
CA (2) CA2580313C (no)
DK (2) DK2626368T3 (no)
ES (2) ES2535823T3 (no)
HK (1) HK1187826A1 (no)
IL (3) IL180762A (no)
MX (1) MX2007000883A (no)
NO (2) NO345613B1 (no)
NZ (1) NZ553263A (no)
PL (2) PL1773878T3 (no)
PT (2) PT2626368T (no)
RU (2) RU2393168C2 (no)
UA (2) UA103758C2 (no)
WO (1) WO2006014673A2 (no)
ZA (1) ZA200701446B (no)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7658938B2 (en) 1999-02-22 2010-02-09 Merrion Reasearch III Limited Solid oral dosage form containing an enhancer
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US20050260259A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-24 Bolotin Elijah M Compositions for treatment with glucagon-like peptide, and methods of making and using the same
US7635463B2 (en) 2002-02-27 2009-12-22 Pharmain Corporation Compositions for delivery of therapeutics and other materials
US7138105B2 (en) * 2002-02-27 2006-11-21 Pharmain Compositions for delivery of therapeutics and other materials, and methods of making and using the same
ES2328579T3 (es) * 2003-07-25 2009-11-16 Conjuchem Biotechnologies Inc. Derivados de insulina de larga duracion y procedimientos asociados.
ES2462117T3 (es) * 2005-09-06 2014-05-22 Oramed Pharmaceuticals Inc. Métodos y composiciones para la administración oral de proteínas
JP5096363B2 (ja) 2005-12-16 2012-12-12 ネクター セラピューティックス Ｇｌｐ−１のポリマ複合体
EP1971372B1 (en) 2005-12-19 2018-11-14 PharmaIN Corporation Hydrophobic core carrier compositions for delivery of therapeutic agents, methods of making and using the same
BRPI0710503A2 (pt) * 2006-04-07 2011-08-16 Merrion Res Iii Ltd uso de uma composição farmacêutica, composição farmacêutica, e, forma de dosagem oral
ES2542146T3 (es) * 2006-07-31 2015-07-31 Novo Nordisk A/S Insulinas extendidas PEGiladas.
KR101699370B1 (ko) * 2006-09-22 2017-02-14 노보 노르디스크 에이/에스 프로테아제 내성 인슐린 유사체
WO2008049711A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
CN101674812B (zh) * 2007-04-30 2013-12-11 诺沃-诺迪斯克有限公司 干燥蛋白组合物的方法、干燥的蛋白组合物和包含干燥的蛋白的药物组合物
WO2008145730A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Novo Nordisk A/S Stable non-aqueous pharmaceutical compositions
CN101743252A (zh) * 2007-07-16 2010-06-16 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶稳定化的、peg化的胰岛素类似物
EP2017288A1 (en) * 2007-07-16 2009-01-21 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues
DK2180787T3 (da) 2007-08-01 2014-02-03 Univ Pittsburgh Nitrooliesyremodulering af type ii-diabetes
US7960336B2 (en) 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
US8563527B2 (en) * 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
BRPI0818004B8 (pt) 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
ES2430042T3 (es) * 2007-11-16 2013-11-18 Novo Nordisk A/S Composiciones farmacéuticas estables que comprenden liraglutida y degludec
NZ584825A (en) * 2007-11-20 2013-03-28 Ambrx Inc Modified insulin polypeptides and their uses
US8598311B2 (en) * 2007-11-21 2013-12-03 The University Of The Sciences In Philadelphia Complexation of fatty acid-conjugated molecules with albumin
FR2925333B1 (fr) * 2007-12-19 2012-04-13 Farid Bennis Compositions pharmaceutiques renfermant au moins un principe actif proteinique protege des enzymes digestives
US20090176892A1 (en) 2008-01-09 2009-07-09 Pharmain Corporation Soluble Hydrophobic Core Carrier Compositions for Delivery of Therapeutic Agents, Methods of Making and Using the Same
EP2254905B1 (en) * 2008-03-14 2016-12-14 Novo Nordisk A/S Protease-stabilized insulin analogues
WO2009115469A1 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
CA3083198A1 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Oramed Ltd. Methods and compositions for oral administration of proteins
DK2280928T3 (en) 2008-05-01 2018-11-05 Complexa Inc Vinyl-substituted fatty acids
WO2009136392A2 (en) 2008-05-05 2009-11-12 Oramed Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for oral administration of exenatide
KR20110007242A (ko) 2008-05-07 2011-01-21 메리온 리서치 Ⅲ 리미티드 펩티드 조성물 및 그의 제조 방법
KR101430627B1 (ko) 2008-05-13 2014-08-14 유니버시티 오브 캔사스 금속 추출 펩타이드(ｍａｐ) 태그 및 관련된 방법
US20140024713A1 (en) 2008-06-19 2014-01-23 University Of Utah Research Foundation Use of nitrated lipids for treatment of side effects of toxic medical therapies
WO2009155439A2 (en) 2008-06-19 2009-12-23 University Of Utah Research Foundation Use of nitrated lipids for treatment of side effects of toxic medical therapies
EP2300514B1 (en) 2008-07-14 2016-03-23 Biocon Limited A method of synthesizing a substantially monodispersed mixture of oligomers
US20110206633A1 (en) * 2008-09-19 2011-08-25 Nektar Therapectics Polymer conjugates of cd-np peptides
AU2010208381A1 (en) 2009-01-28 2011-08-04 Smartcells, Inc. Exogenously triggered controlled release materials and uses thereof
PE20120582A1 (es) * 2009-01-28 2012-05-26 Smartcells Inc Conjugados de insulina cristalina
CA2750252A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Smartcells, Inc. Synthetic conjugates and uses thereof
SG173112A1 (en) 2009-01-28 2011-08-29 Smartcells Inc Conjugate based systems for controlled drug delivery
EP2400851A4 (en) * 2009-02-25 2012-09-05 Merrion Res Iii Ltd COMPOSITION AND ACTIVE COMPOSITION OF BISPHOSPHONATES
AU2010226243A1 (en) * 2009-03-20 2011-09-22 Smartcells, Inc. Terminally-functionalized conjugates and uses thereof
US9095623B2 (en) * 2009-03-20 2015-08-04 Smartcells, Inc. Terminally-functionalized conjugates and uses thereof
US8569231B2 (en) 2009-03-20 2013-10-29 Smartcells, Inc. Soluble non-depot insulin conjugates and uses thereof
US20100330033A1 (en) * 2009-04-16 2010-12-30 Nian Wu Protein-carrier conjugates
TW201105346A (en) * 2009-07-06 2011-02-16 Sanofi Aventis Deutschland Heat-stable and vibration-stable insulin preparations
CA2769624C (en) 2009-07-31 2018-09-11 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Electrophilic fatty acid derivatives as anti-inflammatory agents
EP2483233A4 (en) 2009-10-02 2013-08-14 Complexa Inc HETEROATOMA CONTAINING SUBSTITUTED FATTY ACIDS
EP2488195A2 (en) 2009-10-13 2012-08-22 F. Hoffmann-La Roche AG Neuropeptide-2 receptor (y-2r) agonists
CN102665676B (zh) * 2009-11-02 2015-04-01 诺沃-诺迪斯克有限公司 非共价结合的白蛋白和酰化胰岛素的药物溶液
JP2013514976A (ja) 2009-12-16 2013-05-02 ノッド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 経口薬物送達のための組成物および方法
US20110142889A1 (en) * 2009-12-16 2011-06-16 Nod Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for oral drug delivery
US20110182985A1 (en) * 2010-01-28 2011-07-28 Coughlan David C Solid Pharmaceutical Composition with Enhancers and Methods of Preparing thereof
WO2011120033A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Merrion Research Iii Limited Pharmaceutical compositions of selective factor xa inhibitors for oral administration
CA2804144A1 (en) * 2010-06-28 2012-01-12 Complexa, Inc. Multi-component pharmaceuticals for treating diabetes
EP2598170A4 (en) 2010-07-28 2016-07-06 Smartcells Inc MEDICAMENT-LIGAND CONJUGATES, THEIR SYNTHESIS AND CORRESPONDING INTERMEDIATES
JP2013541500A (ja) 2010-07-28 2013-11-14 スマートセルズ・インコーポレイテツド 組換えレクチン、結合部位修飾レクチンおよびそれらの用途
AU2011282988A1 (en) 2010-07-28 2013-01-31 Smartcells, Inc. Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof
WO2012094598A2 (en) 2011-01-07 2012-07-12 Merrion Research Iii Limited Pharmaceutical compositions of iron for oral administration
CN102614498B (zh) * 2011-01-28 2014-12-17 四川科伦药物研究有限公司 一种胰岛素纳米粒及其制备方法
CN102675452B (zh) * 2011-03-17 2015-09-16 重庆富进生物医药有限公司 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
SG195192A1 (en) * 2011-06-02 2013-12-30 Hanmi Science Co Ltd Non-peptidyl polymer-insulin multimer and method for producing the same
WO2012171994A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Novo Nordisk A/S Multi substituted insulins
WO2013028501A1 (en) 2011-08-19 2013-02-28 The University Of Utah Research Foundation Combination therapy with nitrated lipids and inhibitors of the renin-angiotensin-aldosterone system
ES2644962T3 (es) 2012-01-03 2017-12-01 Oramed Ltd. Cápsulas que contiene composiciones líquidas basadas en aceite de agentes terapéuticos combinados para tratar la diabetes
ES2912138T3 (es) 2012-02-01 2022-05-24 Oramed Ltd Composiciones que contienen inhibidores de proteasa, composiciones que comprenden las mismas y métodos para producir y usar las misma
WO2013153000A2 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Novo Nordisk A/S Insulin formulations
WO2013181461A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 University Of Kansas Metal abstraction peptide with superoxide dismutase activity
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
US9096679B2 (en) 2012-12-03 2015-08-04 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Peptide compounds and methods of production and use thereof
EP2925341B1 (en) 2012-12-03 2018-01-31 The Board of Regents of the University of Oklahoma Peptide compounds and methods of production and use thereof
ES2688367T3 (es) 2012-12-21 2018-11-02 Sanofi Derivados de exendina-4 como agonistas duales de GLP1/GIP o trigonales de GLP1/GIP/glucagón
WO2014106846A2 (en) 2013-01-03 2014-07-10 Oramed Ltd. Methods and compositions for treating nafld, hepatic steatosis, and sequelae thereof
CA2908693C (en) 2013-04-16 2021-04-06 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Peptide compounds and methods of production and use thereof
US20200157159A1 (en) 2013-04-16 2020-05-21 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Peptide compounds and compositions thereof
BR112016007176A2 (pt) 2013-10-04 2018-01-23 Merck Sharp & Dohme conjugado, composição, usos de um conjugado e de uma composição, e, método para tratar um indivíduo que tem diabete
AU2014333979B2 (en) 2013-10-07 2018-02-15 Novo Nordisk A/S Novel derivative of an insulin analogue
WO2015084694A2 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for preparing crystalline insulin
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
WO2015086733A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
EP3080152A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
EP3080154B1 (en) 2013-12-13 2018-02-07 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
AR099569A1 (es) 2014-02-28 2016-08-03 Novo Nordisk As Derivados de insulina y los usos médicos de estos
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
JP6574556B2 (ja) * 2014-08-27 2019-09-11 日東電工株式会社 口腔内フィルム状基剤及び製剤
EP3006045B3 (en) 2014-10-07 2021-03-17 Cyprumed GmbH Pharmaceutical formulations for the oral delivery of peptide or protein drugs
CN104447981B (zh) * 2014-12-25 2015-07-08 重庆浦诺维生物科技有限公司 端羟基聚乙二醇化的人胰岛素及其类似物的偶联物
CN107205948B (zh) 2015-01-29 2021-12-14 诺和诺德股份有限公司 包含glp-1激动剂和肠溶衣的片剂
WO2016119854A1 (en) * 2015-01-29 2016-08-04 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition for oral insulin administration comprising a tablet core and a polyvinyl alcohol coating
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
TN2017000507A1 (en) 2015-07-07 2019-04-12 H Lundbeck As Pde9 inhibitors with imidazo triazinone backbone and imidazo pyrazinone backbone for treatment of peripheral diseases
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物
CA3000842A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Complexa, Inc. Prevention, treatment and reversal of disease using therapeutically effective amounts of activated fatty acids
CA2997343A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Cyprumed Gmbh Pharmaceutical formulations for the oral delivery of peptide drugs
SG11201803606XA (en) 2015-11-13 2018-05-30 Univ Massachusetts Bifunctional molecules containing peg for use in inhibiting cataracts and presbyopia
CN109069569B (zh) * 2015-12-02 2023-02-14 韩美药品株式会社 使用脂肪酸衍生物的蛋白缀合物及其制备方法
JP6835707B2 (ja) * 2016-04-05 2021-02-24 株式会社Moresco オキサ酸化合物
US10458409B2 (en) * 2016-06-06 2019-10-29 Emerson Climate Technologies, Inc. Compressor having a sleeve guide assembly
HUE055231T2 (hu) 2016-12-16 2021-11-29 Novo Nordisk As Inzulint tartalmazó gyógyászati készítmények
CN111194223B (zh) * 2017-09-19 2023-10-24 免疫功坊股份有限公司 与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子
JP2021528424A (ja) * 2018-06-18 2021-10-21 バイオコン・リミテッドＢｉｏｃｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 対象における食後のグルコースレベルをコントロールする方法および使用
WO2020144606A1 (en) * 2019-01-10 2020-07-16 Biocon Limited Preparative crystallization of recombinant human insulin

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506203A (en) * 1993-06-24 1996-04-09 Ab Astra Systemic administration of a therapeutic preparation
WO2000050012A1 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Elan Corporation, Plc Solid oral dosage form containing an enhancer
US20030069170A1 (en) * 2001-09-07 2003-04-10 Richard Soltero Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US20030198619A1 (en) * 2001-12-19 2003-10-23 Dong Liang C. Formulation and dosage form for increasing oral bioavailability of hydrophilic macromolecules
US20030216541A1 (en) * 1993-06-24 2003-11-20 Astrazeneca Ab, A Swedish Corporation Systemic administration of a therapeutic preparation

Family Cites Families (287)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2626228A (en) * 1945-05-17 1953-01-20 Novo Terapeutisk Labor As Method of producing crystalline insulin
US2882203A (en) 1951-06-26 1959-04-14 Novo Terapeutisk Labor As Injectable insulin preparation with protracted effect
DK78069C (da) * 1952-06-23 1954-09-06 Novo Terapeutisk Labor As Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk insulin.
US2789080A (en) 1952-08-14 1957-04-16 Christensen Henry Marinus Insulin-albumin compositions
US2849370A (en) 1953-06-04 1958-08-26 Novo Terapeutisk Labortorium A Injectable insulin preparations with protracted effect and process of producing same
US3102077A (en) * 1953-08-19 1963-08-27 Christensen Henry Marinus Preparation of insulin containing 2.75 to 8 percent zinc content
US2819999A (en) 1953-11-13 1958-01-14 Novo Terapeutisk Labor As Process for crystallization of insulin using freeze dried insulin as seeding material
US2799622A (en) 1953-11-14 1957-07-16 Novo Terapeutisk Labor As Process of producing insulin crystals of substantially uniform size and compositions thereof
US3058885A (en) 1957-06-08 1962-10-16 Novo Terapeutisk Labor As Process for treatment of insulin crystals and for production of insulin preparationstherefrom
US3060093A (en) 1957-07-18 1962-10-23 Nordisk Insulinlab Slowly acting insulin preparation in crystalline form and method of preparation
US3014842A (en) 1957-08-10 1961-12-26 Novo Terapeutish Lab A S Injectable bovine insulin crystal suspensions and process of producing same
US3091573A (en) 1958-05-12 1963-05-28 Novo Terapeutisk Labor As Quick acting insulin preparation
US3256153A (en) * 1963-02-08 1966-06-14 Smith Kline French Lab Method of stabilizing wax-fat coating materials and product thereof
US4003792A (en) * 1967-07-01 1977-01-18 Miles Laboratories, Inc. Conjugates of acid polysaccharides and complex organic substances
US3950517A (en) * 1970-05-08 1976-04-13 National Research Development Corporation Insulin derivatives
GB1381274A (en) 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
US3919411A (en) * 1972-01-31 1975-11-11 Bayvet Corp Injectable adjuvant and compositions including such adjuvant
US4044196A (en) 1972-03-30 1977-08-23 Bayer Aktiengesellschaft Crosslinked copolymers of α,β-olefinically unsaturated dicarboxylic anhydrides
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
FR2408387A2 (fr) 1975-06-30 1979-06-08 Oreal Compositions a base de dispersions aqueuses de spherules lipidiques
US4087390A (en) 1977-02-02 1978-05-02 Eli Lilly And Company Somatostatin analogs and intermediates thereto
US4093574A (en) * 1977-02-02 1978-06-06 Eli Lilly And Company Somatostatin analogs and intermediates thereto
US4087930A (en) * 1976-10-20 1978-05-09 O. F. Mossberg & Sons, Inc. Magazine cap retaining means for tubular magazine firearms
US4223163A (en) * 1976-12-10 1980-09-16 The Procter & Gamble Company Process for making ethoxylated fatty alcohols with narrow polyethoxy chain distribution
JPS53116315A (en) * 1977-03-17 1978-10-11 Ueno Seiyaku Oyo Kenkyujo Kk Powder or granular containing improved sorbinic acid
US4100117A (en) * 1977-04-21 1978-07-11 Eli Lilly And Company Somatostatin analogs and intermediates thereto
US4253998A (en) * 1979-03-09 1981-03-03 American Home Products Corporation Peptides related to somatostatin
JPS54148722A (en) 1978-05-12 1979-11-21 Takeda Chem Ind Ltd Nonapeptide and its preparation
US4277394A (en) 1979-04-23 1981-07-07 Takeda Chemical Industries, Ltd Tetrapeptidehydrazide derivatives
GB2051574B (en) 1979-05-10 1984-01-18 Kyoto Pharma Ind Adjuvant for promoting absorption of pharmacologically active substances through the rectum
US4348387A (en) * 1979-07-31 1982-09-07 The Rockefeller University Method and system for the controlled release of biologically active substances to a body fluid
US4469681A (en) 1979-07-31 1984-09-04 The Rockefeller University Method and system for the controlled release of biologically active substances to a body fluid
FR2465486A1 (fr) 1979-09-21 1981-03-27 Roussel Uclaf Nouvelle application utilisant la lh-rh ou des agonistes
JPS5692846A (en) 1979-12-27 1981-07-27 Takeda Chem Ind Ltd Tetrapeptide derivative and its preparation
US4554101A (en) * 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
IT1144743B (it) 1981-07-09 1986-10-29 Mario Cane Apparecchio infusore di insulina perfezionato
US4654324A (en) 1981-08-27 1987-03-31 Eli Lilly And Company Human proinsulin pharmaceutical formulations
US4476113A (en) * 1981-10-27 1984-10-09 Union Oil Company Of California Stabilized fumigant composition comprising an aqueous solution of ammonia, hydrogen sulfide, carbon disulfide and sulfur
FI78616C (fi) 1982-02-05 1989-09-11 Novo Industri As Foerfarande foer framstaellning av en foer infusionsaendamaol avsedd stabiliserad insulinloesning, som har en foerhoejd zinkhalt.
US4698264A (en) * 1982-08-02 1987-10-06 Durkee Industrial Foods, Corp. Particulate composition and process for making same
IL68769A (en) 1983-05-23 1986-02-28 Hadassah Med Org Pharmaceutical compositions containing insulin for oral administration
US4602043A (en) * 1983-07-18 1986-07-22 Technology Unlimited Inc. Treatment for hypoglycemia
JPS6032714A (ja) * 1983-08-01 1985-02-19 Teijin Ltd 鼻腔粘膜に適用するための安定化された粉末状薬学的組成物
JPS60130003A (ja) 1983-12-16 1985-07-11 日本特殊陶業株式会社 高周波用誘電体磁器組成物
US4717566A (en) 1984-03-19 1988-01-05 Alza Corporation Dosage system and method of using same
US4684524A (en) 1984-03-19 1987-08-04 Alza Corporation Rate controlled dispenser for administering beneficial agent
US4704394A (en) 1984-04-25 1987-11-03 Technology Unlimited, Inc. Treatment for hyperactivity
US4963367A (en) 1984-04-27 1990-10-16 Medaphore, Inc. Drug delivery compositions and methods
US4849405A (en) 1984-05-09 1989-07-18 Synthetic Blood Corporation Oral insulin and a method of making the same
US4761287A (en) 1984-05-03 1988-08-02 Technology Unlimited, Inc. Diabetes control by serotonin
US4863896A (en) 1984-05-03 1989-09-05 Technology Unlimited, Inc. Diabetic control by combined insulin forms
US4963526A (en) 1984-05-09 1990-10-16 Synthetic Blood Corporation Oral insulin and a method of making the same
US4839341A (en) 1984-05-29 1989-06-13 Eli Lilly And Company Stabilized insulin formulations
US4622392A (en) * 1984-06-21 1986-11-11 Health Research Inc. (Roswell Park Division) Thiophospholipid conjugates of antitumor agents
US4629621A (en) * 1984-07-23 1986-12-16 Zetachron, Inc. Erodible matrix for sustained release bioactive composition
US4797288A (en) 1984-10-05 1989-01-10 Warner-Lambert Company Novel drug delivery system
US4946828A (en) 1985-03-12 1990-08-07 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
US5157021A (en) 1985-03-15 1992-10-20 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
SE457326B (sv) 1986-02-14 1988-12-19 Lejus Medical Ab Foerfarande foer framstaellning av en snabbt soenderfallande kaerna innehaallande bl a mikrokristallin cellulosa
CA1257199A (en) * 1986-05-20 1989-07-11 Paul Y. Wang Preparation containing bioactive macromolecular substance for multi-months release in vivo
US4801575A (en) * 1986-07-30 1989-01-31 The Regents Of The University Of California Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
CA1339955C (en) 1986-10-14 1998-07-14 Richard Eugene Heiney Process for transforming a human insulin precursor to human insulin
GB8706313D0 (en) 1987-03-17 1987-04-23 Health Lab Service Board Treatment & prevention of viral infections
US4764592A (en) 1987-04-23 1988-08-16 Eli Lilly And Company Crystalline human proinsulin and process for its production
US5093198A (en) 1987-06-19 1992-03-03 Temple University Adjuvant-enhanced sustained release composition and method for making
US4822337A (en) 1987-06-22 1989-04-18 Stanley Newhouse Insulin delivery method and apparatus
DE3721721C1 (de) * 1987-07-01 1988-06-09 Hoechst Ag Verfahren zur Umhuellung von Granulaten
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5034415A (en) * 1987-08-07 1991-07-23 Century Laboratories, Inc. Treatment of diabetes mellitus
JPH01308231A (ja) * 1988-06-03 1989-12-12 Takeda Chem Ind Ltd 安定化された医薬組成物および製造法
US5055300A (en) 1988-06-17 1991-10-08 Basic Bio Systems, Inc. Time release protein
DK336188D0 (da) 1988-06-20 1988-06-20 Nordisk Gentofte Propeptider
DE3827533A1 (de) 1988-08-13 1990-02-15 Hoechst Ag Pharmazeutische zubereitung zur behandlung des diabetes mellitus
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5306500A (en) 1988-11-21 1994-04-26 Collagen Corporation Method of augmenting tissue with collagen-polymer conjugates
US5162430A (en) 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
KR910700262A (ko) 1988-12-23 1991-03-14 안네 제케르 사람 인슐린 유사체
US4994439A (en) 1989-01-19 1991-02-19 California Biotechnology Inc. Transmembrane formulations for drug administration
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
NZ232375A (en) 1989-02-09 1992-04-28 Lilly Co Eli Insulin analogues modified at b29
US5182258A (en) 1989-03-20 1993-01-26 Orbon Corporation Systemic delivery of polypeptides through the eye
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5650388A (en) 1989-11-22 1997-07-22 Enzon, Inc. Fractionated polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5312808A (en) * 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
CA2030174C (en) 1990-01-10 1996-12-24 Anthony H. Cincotta Process for the long term reduction of body fat stores, insulin resistance, hyperinsulinemia and hypoglycemia in vertebrates
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
US5126324A (en) 1990-06-07 1992-06-30 Genentech, Inc. Method of enhancing growth in patients using combination therapy
IE912365A1 (en) 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
IL99699A (en) 1990-10-10 2002-04-21 Autoimmune Inc Drug with the option of oral, intra-intestinal, or inhaled dosing for suppression of autoimmune response associated with type I diabetes
US5468727A (en) 1990-12-13 1995-11-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of normalizing metabolic parameters in diabetics
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5321009A (en) * 1991-04-03 1994-06-14 American Home Products Corporation Method of treating diabetes
EP0580778B1 (en) 1991-04-19 1999-08-11 LDS Technologies, Inc. Convertible microemulsion formulations
FR2675807B1 (fr) 1991-04-23 1994-07-01 Medgenix Group Sa Conjugue de calcitonine et de polyethylene glycol.
US5304473A (en) * 1991-06-11 1994-04-19 Eli Lilly And Company A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
ES2141108T3 (es) 1991-07-02 2000-03-16 Inhale Inc Metodo y dispositivo para proporcionar medicamentos en aerosol.
CH683149A5 (fr) 1991-07-22 1994-01-31 Debio Rech Pharma Sa Procédé pour la préparation de microsphères en matériau polymère biodégradable.
IL102633A0 (en) 1991-07-26 1993-01-14 Smithkline Beecham Corp Compositions
US5206219A (en) 1991-11-25 1993-04-27 Applied Analytical Industries, Inc. Oral compositions of proteinaceous medicaments
US5693769A (en) 1991-12-13 1997-12-02 Transcell Technologies, Inc. Glycosylated steroid derivatives for transport across biological membranes and process for making and using same
US5320094A (en) 1992-01-10 1994-06-14 The Johns Hopkins University Method of administering insulin
US5876754A (en) * 1992-01-17 1999-03-02 Alfatec-Pharma Gmbh Solid bodies containing active substances and a structure consisting of hydrophilic macromolecules, plus a method of producing such bodies
DE59303759C5 (de) 1992-01-17 2009-04-09 Alfatec-Pharma Gmbh Wirkstoff-enthaltende festkörper mit einem gerüst aus hydrophilen makromolekülen und verfahren zu ihrer herstellung
GB9212511D0 (en) 1992-06-12 1992-07-22 Cortecs Ltd Pharmaceutical compositions
US5262172A (en) 1992-06-19 1993-11-16 Digestive Care Inc. Compositions of gastric acid-resistant microspheres containing buffered bile acids
US5415872A (en) 1992-06-22 1995-05-16 Digestive Care Inc. Compositions of gastric acid-resistant microspheres containing salts of bile acids
US6582728B1 (en) 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
US6509006B1 (en) 1992-07-08 2003-01-21 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Devices compositions and methods for the pulmonary delivery of aerosolized medicaments
US5785049A (en) 1994-09-21 1998-07-28 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for dispersion of dry powder medicaments
US5420108A (en) 1992-09-14 1995-05-30 Shohet; Isaac H. Method of controlling diabetes mellitus
ATE220327T1 (de) 1992-09-29 2002-07-15 Inhale Therapeutic Syst Pulmonale abgabe von aktiven fragmenten des parathormons
US6093391A (en) 1992-10-08 2000-07-25 Supratek Pharma, Inc. Peptide copolymer compositions
GB9316895D0 (en) 1993-08-13 1993-09-29 Guy S And St Thomas Hospitals Hepatoselective insulin analogues
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5364838A (en) 1993-01-29 1994-11-15 Miris Medical Corporation Method of administration of insulin
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US6191105B1 (en) * 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5830853A (en) 1994-06-23 1998-11-03 Astra Aktiebolag Systemic administration of a therapeutic preparation
US5747445A (en) 1993-06-24 1998-05-05 Astra Aktiebolag Therapeutic preparation for inhalation
IS1796B (is) 1993-06-24 2001-12-31 Ab Astra Fjölpeptíð lyfjablanda til innöndunar sem einnig inniheldur eykjaefnasamband
TW402506B (en) 1993-06-24 2000-08-21 Astra Ab Therapeutic preparation for inhalation
US5534488A (en) 1993-08-13 1996-07-09 Eli Lilly And Company Insulin formulation
US6342225B1 (en) 1993-08-13 2002-01-29 Deutshces Wollforschungsinstitut Pharmaceutical active conjugates
ATE204882T1 (de) 1993-09-17 2001-09-15 Novo Nordisk As Acyliertes insulin
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
CA2176927C (en) 1993-11-17 2010-03-23 Seang H. Yiv Transparent liquid for encapsulated drug delivery
US6051256A (en) 1994-03-07 2000-04-18 Inhale Therapeutic Systems Dispersible macromolecule compositions and methods for their preparation and use
ES2218543T3 (es) 1994-03-07 2004-11-16 Nektar Therapeutics Procedimiento y preparacion para la administracion de insulina por via pulmonar.
GB9406094D0 (en) 1994-03-28 1994-05-18 Univ Nottingham And University Polymer microspheres and a method of production thereof
RU2145595C1 (ru) 1994-05-10 2000-02-20 Никокс С.А. Нитроксисоединения и фармацевтическая композиция на их основе, имеющие противовоспалительную, анальгетическую и антитромбоцитарную активности
DE69533987T2 (de) 1994-05-20 2006-03-16 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc., Tosu Protein oder polypeptid, verfahren zur seiner herstellung und entsprechende zwischenprodukte
US5474978A (en) 1994-06-16 1995-12-12 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
US5504188A (en) * 1994-06-16 1996-04-02 Eli Lilly And Company Preparation of stable zinc insulin analog crystals
US5461031A (en) 1994-06-16 1995-10-24 Eli Lilly And Company Monomeric insulin analog formulations
US6165976A (en) 1994-06-23 2000-12-26 Astra Aktiebolag Therapeutic preparation for inhalation
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5856481A (en) * 1994-07-28 1999-01-05 Syntex (U.S.A.) Inc. 2-(2-amino-1,6-dihydro-6-oxo-purin-9-yl)methoxy-1,3-propanediol derivative
US5543414A (en) * 1994-07-28 1996-08-06 Syntex (Usa) Inc. Achiral amino acid acyl esters of ganciclovir and its derivatives
PE32296A1 (es) * 1994-07-28 1996-08-07 Hoffmann La Roche Ester de l-monovalina derivado de 2-(2-amino-1,6-dihidro-6-oxo-purin-9-il) metoxi-1,3-propandiol y sus sales farmaceuticamente aceptables
GB9417524D0 (en) 1994-08-31 1994-10-19 Cortecs Ltd Pharmaceutical compositions
AU697676B2 (en) 1994-09-21 1998-10-15 Nektar Therapeutics Apparatus and methods for dispersing dry powder medicaments
CN1080575C (zh) * 1994-10-14 2002-03-13 蛋白质传送股份有限公司 结合稳定的多肽组合物、其治疗、诊断制剂及其制备和使用方法
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5693609A (en) 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
US5646242A (en) * 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US5856451A (en) 1994-12-07 1999-01-05 Novo Nordisk A/S Method for reducing respiratory allergenicity
GB9424902D0 (en) 1994-12-09 1995-02-08 Cortecs Ltd Solubilisation Aids
SE9404468D0 (sv) 1994-12-22 1994-12-22 Astra Ab Powder formulations
US5843866A (en) 1994-12-30 1998-12-01 Hampshire Chemical Corp. Pesticidal compositions comprising solutions of polyurea and/or polyurethane
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5907030A (en) 1995-01-25 1999-05-25 University Of Southern California Method and compositions for lipidization of hydrophilic molecules
KR0150565B1 (ko) 1995-02-15 1998-08-17 김정재 유전자 조환에 의한 사람 인슐린 전구체의 제조 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법
US6251856B1 (en) 1995-03-17 2001-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
YU18596A (sh) 1995-03-31 1998-07-10 Eli Lilly And Company Analogne formulacije monomernog insulina
US5606038A (en) 1995-04-10 1997-02-25 Competitive Technologies, Inc. Amphiphilic polyene macrolide antibiotic compounds
US6309671B1 (en) 1995-04-14 2001-10-30 Inhale Therapeutic Systems Stable glassy state powder formulations
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6258341B1 (en) 1995-04-14 2001-07-10 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Stable glassy state powder formulations
US5780014A (en) 1995-04-14 1998-07-14 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin
DE741187T1 (de) 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
US5824638A (en) 1995-05-22 1998-10-20 Shire Laboratories, Inc. Oral insulin delivery
US5704910A (en) 1995-06-05 1998-01-06 Nephros Therapeutics, Inc. Implantable device and use therefor
US5714519A (en) 1995-06-07 1998-02-03 Ergo Science Incorporated Method for regulating glucose metabolism
US5700904A (en) 1995-06-07 1997-12-23 Eli Lilly And Company Preparation of an acylated protein powder
US5654007A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Inhale Therapeutic Systems Methods and system for processing dispersible fine powders
US5631347A (en) 1995-06-07 1997-05-20 Eli Lilly And Company Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein
US20010041786A1 (en) * 1995-06-07 2001-11-15 Mark L. Brader Stabilized acylated insulin formulations
US6274549B1 (en) 1995-06-30 2001-08-14 Novo Nordisk A/S Treatment of type 1 diabetes
GB9516268D0 (en) * 1995-08-08 1995-10-11 Danbiosyst Uk Compositiion for enhanced uptake of polar drugs from the colon
PT1568772E (pt) 1995-09-21 2010-04-14 Genentech Inc Variantes da hormona do crescimento humana
WO1997014740A1 (en) 1995-10-19 1997-04-24 Receptagen Corporation Discrete-length polyethylene glycols
US5766620A (en) 1995-10-23 1998-06-16 Theratech, Inc. Buccal delivery of glucagon-like insulinotropic peptides
DE19545257A1 (de) 1995-11-24 1997-06-19 Schering Ag Verfahren zur Herstellung von morphologisch einheitlichen Mikrokapseln sowie nach diesem Verfahren hergestellte Mikrokapseln
US6451970B1 (en) 1996-02-21 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
FR2746035B1 (fr) 1996-03-15 1998-06-12 Microparticules de gel composite susceptibles d'etre utilisees comme vecteur(s) de principe(s) actif(s), l'un de leurs procedes de preparation et leurs applications
US5826633A (en) 1996-04-26 1998-10-27 Inhale Therapeutic Systems Powder filling systems, apparatus and methods
US6103270A (en) 1996-06-07 2000-08-15 Inhale Therapeutic Systems Methods and system for processing dispersible fine powders
US5948751A (en) 1996-06-20 1999-09-07 Novo Nordisk A/S X14-mannitol
US5866538A (en) 1996-06-20 1999-02-02 Novo Nordisk A/S Insulin preparations containing NaCl
GB9613858D0 (en) 1996-07-02 1996-09-04 Cortecs Ltd Hydrophobic preparations
US5905140A (en) 1996-07-11 1999-05-18 Novo Nordisk A/S, Novo Alle Selective acylation method
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
US5856369A (en) 1996-07-30 1999-01-05 Osi Specialties, Inc. Polyethers and polysiloxane copolymers manufactured with double metal cyanide catalysts
DE19632440A1 (de) 1996-08-12 1998-02-19 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von aus Polykationen aufgebauten, geformten Mischhydroxiden
US6180604B1 (en) 1996-08-21 2001-01-30 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
US5874111A (en) 1997-01-07 1999-02-23 Maitra; Amarnath Process for the preparation of highly monodispersed polymeric hydrophilic nanoparticles
US6011008A (en) 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5830918A (en) 1997-01-15 1998-11-03 Terrapin Technologies, Inc. Nonpeptide insulin receptor agonists
KR100479968B1 (ko) 1997-02-05 2005-03-30 에프. 호프만-라 로슈 아게 위장 리파아제 억제제의 용도
US6043214A (en) * 1997-03-20 2000-03-28 Novo Nordisk A/S Method for producing powder formulation comprising an insulin
US5898028A (en) * 1997-03-20 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Method for producing powder formulation comprising an insulin
US6310038B1 (en) 1997-03-20 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Pulmonary insulin crystals
KR19980075132A (ko) * 1997-03-28 1998-11-05 민병무 중간사슬지방산(medium-chain fatty acids)을 유효성분으로 하는 치아우식증 및 치주질환 치료제용 의약조성물
ZA984697B (en) 1997-06-13 1999-12-01 Lilly Co Eli Stable insulin formulations.
JPH1112177A (ja) 1997-06-25 1999-01-19 Teikoku Seiyaku Co Ltd 安定なアスピリン含有外用製剤
US6068993A (en) 1997-07-02 2000-05-30 Biobras Sa Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin
US20020115609A1 (en) 1997-07-14 2002-08-22 Hayat Onyuksel Materials and methods for making improved micelle compositions
EP1019031A4 (en) 1997-07-18 2003-02-05 Infimed Inc BIODEGRADABLE MACROMERS FOR THE REGULATED RELEASE OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
US6182712B1 (en) 1997-07-21 2001-02-06 Inhale Therapeutic Systems Power filling apparatus and methods for their use
GB9715444D0 (en) * 1997-07-22 1997-09-24 Scotia Holdings Plc Therapeutic and dietary compositions
RU2117488C1 (ru) * 1997-07-30 1998-08-20 Институт нефтехимического синтеза им.А.В.Топчиева РАН Твердое инсулинсодержащее лекарственное средство
US6433040B1 (en) 1997-09-29 2002-08-13 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Stabilized bioactive preparations and methods of use
US6309623B1 (en) 1997-09-29 2001-10-30 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Stabilized preparations for use in metered dose inhalers
US6565885B1 (en) 1997-09-29 2003-05-20 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Methods of spray drying pharmaceutical compositions
EP1039920A4 (en) 1997-10-24 2003-05-28 Lilly Co Eli INSULIN ANALOGS ACYLATED BY FATTY ACID
US6444641B1 (en) * 1997-10-24 2002-09-03 Eli Lilly Company Fatty acid-acylated insulin analogs
PL195845B1 (pl) * 1997-10-24 2007-10-31 Novo Nordisk As Rozpuszczalny w wodzie agregat pochodnych insuliny
ZA989744B (en) 1997-10-31 2000-04-26 Lilly Co Eli Method for administering acylated insulin.
US6197764B1 (en) 1997-11-26 2001-03-06 Protarga, Inc. Clozapine compositions and uses thereof
US5955459A (en) 1997-11-26 1999-09-21 Neuromedica, Inc. Fatty acid-antipsychotic compositions and uses thereof
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US6531448B1 (en) * 1997-12-23 2003-03-11 Eli Lilly And Company Insoluble compositions for controlling blood glucose
KR100253916B1 (ko) 1997-12-29 2000-05-01 김충환 사람 인슐린 전구체의 제조방법
DE69924232D1 (de) * 1998-01-09 2005-04-21 Novo Nordisk As Stabilisierte insulin-zubereitungen
US6495514B1 (en) 1998-01-21 2002-12-17 Mercer University Method for reducing inflammation and inducing an analgesic effect and compounds thereof
US6153655A (en) * 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6192887B1 (en) * 1998-05-19 2001-02-27 The Pennsylvania State University Broad spectrum microbicidal and spermicidal compositions and methods having activity against sexually transmitted agents including papillomaviruses
US6257233B1 (en) 1998-06-04 2001-07-10 Inhale Therapeutic Systems Dry powder dispersing apparatus and methods for their use
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
RU2205188C2 (ru) 1998-06-30 2003-05-27 Ново Нордиск А/С Затравочные кристаллы для получения пептидов или протеинов
US5968554A (en) 1998-07-07 1999-10-19 Cascade Development, Inc. A Subsidiary Of Cardinal Health, Inc. Sustained release pharmaceutical preparation
US6211144B1 (en) 1998-10-16 2001-04-03 Novo Nordisk A/S Stable concentrated insulin preparations for pulmonary delivery
US20030049654A1 (en) 1998-10-16 2003-03-13 Xencor Protein design automation for protein libraries
EP1131089B1 (en) 1998-11-18 2004-02-18 Novo Nordisk A/S Stable aqueous insulin preparations without phenol and cresol
ES2180511T3 (es) * 1999-01-26 2003-02-16 Lilly Co Eli Formulaciones monodispersas de analogos de insulina acilados hexamericos.
GB9901809D0 (en) 1999-01-27 1999-03-17 Scarista Limited Highly purified ethgyl epa and other epa derivatives for psychiatric and neurological disorderes
US7658938B2 (en) * 1999-02-22 2010-02-09 Merrion Reasearch III Limited Solid oral dosage form containing an enhancer
DE19908041A1 (de) 1999-02-24 2000-08-31 Hoecker Hartwig Kovalent verbrückte Insulindimere
US6248363B1 (en) 1999-11-23 2001-06-19 Lipocine, Inc. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
US6451974B1 (en) 1999-03-17 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Method of acylating peptides and novel acylating agents
US6630169B1 (en) 1999-03-31 2003-10-07 Nektar Therapeutics Particulate delivery systems and methods of use
US6444223B1 (en) 1999-05-28 2002-09-03 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method of producing submicron particles of a labile agent and use thereof
AU1249001A (en) 1999-06-11 2001-01-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrogels derived from chitosan and poly(ethylene glycol) or related polymers
US6309633B1 (en) * 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
EP1196430B1 (en) 1999-06-29 2012-02-15 MannKind Corporation Purification and stabilization of peptide and protein pharmaceutical agents
KR100345214B1 (ko) * 1999-08-17 2002-07-25 이강춘 생체적합성 고분자가 수식된 펩타이드의 비점막 전달
US6323311B1 (en) * 1999-09-22 2001-11-27 University Of Utah Research Foundation Synthesis of insulin derivatives
AU775565B2 (en) 1999-10-29 2004-08-05 Novartis Ag Dry powder compositions having improved dispersivity
WO2001052937A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Medtronic Minimed, Inc. Mixed buffer system for stabilizing polypeptide formulations
CN1312080A (zh) * 2000-02-18 2001-09-12 日本脏器制药株式会社 含有脂肪酸的组合物
EP1296660A4 (en) * 2000-06-27 2005-04-13 Mi Tech Company Ltd PREPARATION FOR THE CONTROLLED RELEASE OF INSULIN AND ITS MANUFACTURING METHOD
US6479065B2 (en) 2000-08-10 2002-11-12 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Process for the preparation of polymer-based sustained release compositions
US6824822B2 (en) 2001-08-31 2004-11-30 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Residual solvent extraction method and microparticles produced thereby
ES2382636T3 (es) * 2000-10-31 2012-06-12 Surmodics Pharmaceuticals, Inc. Método para producir composiciones para la administración mejorada de moléculas bioactivas
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
HUP0500733A3 (en) 2001-02-09 2010-01-28 Genentech Inc Crystallization of igf-1
US6867183B2 (en) 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
US6558702B2 (en) 2001-04-13 2003-05-06 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method of modifying the release profile of sustained release compositions
BR0209896A (pt) * 2001-05-21 2004-08-17 Nektar Therapeutics Composição de insulina para administração pulmonar, e, métodos para suprir insulina a um indivìduo mamìfero, para prover uma composição de insulina não-imunogênica e uma composição de insulina de efeito prolongado para administração ao pulmão de um indivìduo
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US20030040601A1 (en) 2001-06-08 2003-02-27 Ivan Diers Method for making insulin precursors and insulin analog precursors
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
ATE446971T1 (de) * 2001-09-07 2009-11-15 Biocon Ltd Verfahren zur synthese von insulinpolypeptid- oligomer-konjugaten und proinsulinpolypeptid- oligomer-konjugaten und verfahren zu deren synthese
CN1170851C (zh) * 2001-09-27 2004-10-13 华中科技大学 治疗糖尿病的口服药脂肪二酰氨基酸胰岛素及其合成方法
US20030147965A1 (en) 2001-12-10 2003-08-07 Spherics, Inc. Methods and products useful in the formation and isolation of microparticles
WO2003051304A2 (en) 2001-12-15 2003-06-26 Spherics, Inc. Bioadhesive drug delivery system with enhanced gastric retention
WO2004060347A2 (en) 2002-09-03 2004-07-22 Transform Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical propylene glycol solvate compositions
AU2002255196A1 (en) 2002-04-18 2003-10-27 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Rapidly dispersing solid oral compositions
AR040526A1 (es) 2002-07-09 2005-04-13 Grandis Biotech Gmbh Formulaciuones de hgh en alta concentracion que contienen fenol
DE10250297A1 (de) 2002-10-29 2004-05-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Kristalle von Insulinanaloga und Verfahren zu ihrer Herstellung
US20040235948A1 (en) * 2003-03-05 2004-11-25 Solvay Pharmaceuticals Gmbh Treatment of diabetic patients with omega-3-fatty acids
EP1605781A1 (en) * 2003-03-18 2005-12-21 Novartis AG Compositions comprising fatty acids and amino acids
CN102552917A (zh) * 2003-08-13 2012-07-11 比奥孔有限公司 用于治疗剂的微-粒子脂肪酸盐固体剂量制剂
WO2005034874A2 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 The Mclean Hospital Corporation Enhanced efficacy of omega-3 fatty acid therapy in the treatment of psychiatric disorders and other indications
EP1701714A2 (en) * 2004-01-07 2006-09-20 Nektar Therapeutics Improved sustained release compositions for pulmonary administration of insulin
DE602004014716D1 (de) * 2004-03-06 2008-08-14 Cognis Ip Man Gmbh Use of unsaturated fatty acids for the reduction of appetite or food intake

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506203A (en) * 1993-06-24 1996-04-09 Ab Astra Systemic administration of a therapeutic preparation
US5506203C1 (en) * 1993-06-24 2001-02-06 Astra Ab Systemic administration of a therapeutic preparation
US20030216541A1 (en) * 1993-06-24 2003-11-20 Astrazeneca Ab, A Swedish Corporation Systemic administration of a therapeutic preparation
WO2000050012A1 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Elan Corporation, Plc Solid oral dosage form containing an enhancer
US20030069170A1 (en) * 2001-09-07 2003-04-10 Richard Soltero Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US20030198619A1 (en) * 2001-12-19 2003-10-23 Dong Liang C. Formulation and dosage form for increasing oral bioavailability of hydrophilic macromolecules

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011236233A (ja) 2011-11-24
US20100105605A1 (en) 2010-04-29
CA2910494A1 (en) 2006-02-09
EP2626368B1 (en) 2016-12-21
UA91512C2 (ru) 2010-08-10
RU2007105824A (ru) 2008-08-27
NO340825B1 (no) 2017-06-26
KR101276754B1 (ko) 2013-06-19
KR20070059060A (ko) 2007-06-11
CA2580313C (en) 2016-03-15
US9102758B2 (en) 2015-08-11
RU2527893C2 (ru) 2014-09-10
JP2014043470A (ja) 2014-03-13
CA2580313A1 (en) 2006-02-09
US20060019873A1 (en) 2006-01-26
CN103223160B (zh) 2015-02-18
EP1773878A4 (en) 2012-06-20
CN105801686B (zh) 2020-04-07
US20110124553A1 (en) 2011-05-26
IL180762A (en) 2015-06-30
US20060019874A1 (en) 2006-01-26
US9101596B2 (en) 2015-08-11
MX2007000883A (es) 2007-04-02
JP2008506782A (ja) 2008-03-06
CN103223160A (zh) 2013-07-31
UA103758C2 (ru) 2013-11-25
CN101027318B (zh) 2016-05-25
US7872095B2 (en) 2011-01-18
RU2393168C2 (ru) 2010-06-27
IL227117A (en) 2017-02-28
AU2005269753A1 (en) 2006-02-09
BRPI0513508B1 (pt) 2021-06-01
PL1773878T3 (pl) 2015-07-31
EP1773878B1 (en) 2015-03-04
EP1773878A2 (en) 2007-04-18
US20060018874A1 (en) 2006-01-26
KR20120120985A (ko) 2012-11-02
CN101027318A (zh) 2007-08-29
IL180762A0 (en) 2007-06-03
US20110118179A1 (en) 2011-05-19
RU2010105921A (ru) 2011-08-27
KR101309770B1 (ko) 2013-09-30
BRPI0513508A (pt) 2008-05-06
EP2626368A3 (en) 2013-10-16
JP5750494B2 (ja) 2015-07-22
EP2626368A2 (en) 2013-08-14
IL209494A (en) 2015-07-30
CA2910494C (en) 2018-10-23
NO20170341A1 (no) 2007-01-22
ZA200701446B (en) 2008-09-25
PL2626368T3 (pl) 2017-06-30
DK2626368T3 (en) 2017-02-27
ES2535823T3 (es) 2015-05-18
PT2626368T (pt) 2017-03-10
JP5220410B2 (ja) 2013-06-26
NO20070859L (no) 2007-04-12
US8563685B2 (en) 2013-10-22
US7605123B2 (en) 2009-10-20
WO2006014673A3 (en) 2006-08-17
HK1187826A1 (en) 2014-04-17
AU2005269753B2 (en) 2011-08-18
AU2005269753A2 (en) 2006-02-09
DK1773878T3 (en) 2015-05-11
WO2006014673A2 (en) 2006-02-09
CN105801686A (zh) 2016-07-27
PT1773878E (pt) 2015-06-05
US7875700B2 (en) 2011-01-25
NZ553263A (en) 2010-06-25
IL209494A0 (en) 2011-01-31
ES2618028T3 (es) 2017-06-20
JP5721266B2 (ja) 2015-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO20170341A1 (no) Insulinoligomerkonjugater, formuleringer og bruk derav
JP2003160598A (ja) 接合安定化されたポリペプチド組成物
EP1613343A2 (en) Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
AU2014200247B2 (en) Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees