ES2912138T3 - Composiciones que contienen inhibidores de proteasa, composiciones que comprenden las mismas y métodos para producir y usar las misma - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica oral que comprende una formulación líquida a base de aceite, en donde dicha formulación líquida a base de aceite comprende una proteína terapéutica de hasta 100 kilodalton, un quelante de cationes divalentes y un BBI (inhibidor Bowman-Birk) aislado, y cualquiera de; (i) dicho BBI se ha purificado hasta al menos un 85 % de pureza, medida mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), o (ii) dicho BBI se ha purificado hasta un contenido de proteína mayor al 95 % mediante un ensayo de BCA (ácido bicinconínico), o (iii) dicho BBI contiene menos del 0,1 % de contaminantes de alto MW; en donde dicha formulación líquida tiene una actividad antiquimotripsina de al menos 40 mg de quimotripsina inhibida por ml de la formulación líquida.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que contienen inhibidores de proteasa, composiciones que comprenden las mismas y métodos para producir y usar las mismas

Se reivindica el beneficio a la solicitud provisional de los Estados Unidos 61/632,868, presentada el 1 de febrero de 2012, y a la solicitud provisional de los Estados Unidos 61/634,753, presentada el 6 de marzo de 2012.

Campo

En la presente descripción se proporcionan composiciones para la administración oral de proteínas terapéuticas, preparaciones mejoradas de inhibidores de proteasa, métodos para producir las mismas y composiciones que comprenden las mismas.

Antecedentes

Los fármacos basados en proteínas/péptidos son típicamente susceptibles a la degradación en el tracto gastrointestinal y/o no se absorben eficientemente en el torrente sanguíneo desde el intestino delgado en forma bioactiva. Se están desarrollando formulaciones suministradas por vía oral para fármacos basados en proteínas tal como la insulina (Ziv y otros, 1994; Nissan y otros, 2000, Kidron y otros, 2004, Eldor y otros, 2010A, Eldor y otros, 2010B). Uno de tales productos de insulina oral está programado para ser evaluado en ensayos de Fase II y actualmente se está revisando para el estado de IND.

Los inhibidores de la tripsina derivados de la soja (Glycine max) están fácilmente disponibles y se consideran seguros para el consumo humano. Ellos Incluyen el SBTi (inhibidor de tripsina de soja), que se compone de KTI (inhibidor de tripsina de Kunitz), que inhibe la tripsina y BBI (inhibidor de Bowman-Birk), que inhibe la tripsina y la quimotripsina. Tales inhibidores de tripsina están disponibles, por ejemplo, en Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos. Los métodos para preparar BBI se describen, por ejemplo, en el documento US 7,404,973.

El documento WO 2013/102899 describe una formulación de insulina oral que contiene 8 mg de insulina, 12 % de Gelucire 44/14, 150 mg de EDTA, 75 mg del SBTI y 24 mg de aprotinina en 0,5-0,7 ml de aceite de pescado; el líquido está recubierto por una cápsula de gelatina suave. El documento WO 2009/118722 describe formulaciones que comprenden insulina, EDTA y el SBTI, aprotinina o una combinación de aprotinina y el SBTI en aceite de pescado. Sin embargo, ninguno de estos describe la purificación de materiales inhibidores de proteasa de partida crudo para producir formulaciones optimizadas para composiciones orales. Un método para la purificación del BBI a partir de harina de soja se describe por Yeboah y otros, Protein Expression and Purification 7, 309-314 (1996). Esto incluyó extracción ácida, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de filtración en gel. Sin embargo, estos no eran para aplicación en formulaciones descritas en la presente descripción. Morishita y otros, International Journal of Pharmaceutics, 78, 1-3, 1-7 (1992) y Morishita y otros, International Journal of Pharmceutics, 78, 1-3, 9-16 (1992) describen composiciones de micropartículas que comprenden insulina en combinación con BBI o aprotinina, aunque no en formulaciones líquidas a base de aceite como se describió en la presente descripción. El documento WO 2011/082335 describe métodos para purificar el BBI a partir de varias líneas de procesamiento de soja para producir composiciones de al menos 90 % en peso. Sin embargo, nuevamente esto no fue para usar en las formulaciones descritas en la presente descripción.

Resumen

El presente inventor ha descubierto que las preparaciones del SBTI disponibles comercialmente producen resultados altamente variables cuando se usan en composiciones farmacéuticas. Se postuló que las actividades del KTI y el BBI deberían optimizarse individualmente para mejorar la actividad de las composiciones farmacéuticas. Con este fin, se obtuvo del SBTI de una fuente comercial como preparaciones separadas del KTI y el BBI. Sin embargo, se encontró que cada una de estas preparaciones estaba contaminada con la otra actividad. Para agravar el problema, se encontró una variabilidad significativa en la actividad BBI de las preparaciones, particularmente las preparaciones a gran escala, como lo evidencia la capacidad variable para prevenir la degradación de proteínas (por ejemplo, insulina) por enzimas intestinales.

En consecuencia, de acuerdo con determinadas modalidades descritas en la presente descripción, se desarrolló un método mejorado para la purificación del SBTI, en el que cada producto se preparó bajo sus propias especificaciones a altos niveles de actividad y se minimizaron los niveles de contaminantes de alto peso molecular (MW). De acuerdo con otras modalidades, el proceso evita usar el PEG y una segunda etapa de cromatografía y se caracterizó por un mayor rendimiento. De acuerdo con aún otras modalidades, el producto es particularmente adecuado para usar en composiciones farmacéuticas, por ejemplo, composiciones para administración oral de proteínas terapéuticas. Además, de acuerdo con aún otras modalidades, la separación completa de las actividades del KTI y el BBI permite una modulación más precisa de las actividades antitripsina y antiquimotripsina de las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína terapéutica y el BBI y/o el KTI, lo que permite una actividad in vivo más robusta y/o más reproducible de las composiciones farmacéuticas.

Además, se descubrió que se requerían emulsionantes para preparar convenientemente preparaciones a gran escala de fármacos que contienen péptidos/proteínas. Sin embargo, fue necesario evaluar empíricamente si la adición de emulsificantes particulares podría prevenir efectivamente la precipitación en las preparaciones a base de aceite sin afectar la eficacia oral de las formulaciones. Por lo tanto, otras modalidades descritas se relacionan con la presencia de emulsionantes particulares o combinaciones de emulsionantes, junto con el SBTI mejorado, en composiciones farmacéuticas a base de aceite que contienen proteínas y péptidos terapéuticos.

Los términos “proteína” y “péptido”, se usan indistintamente en la presente descripción. Ninguno de los términos pretende conferir una limitación del número de aminoácidos presentes, excepto cuando se indique explícitamente una limitación.

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras son ejemplos a modo de ilustración y no deben tomarse como limitantes de la invención reivindicada.

Figura 1. Diagrama de flujo de la purificación del SBTI. A. Producción del intermediario del SBTI. B. Purificación aguas abajo para producir el BBI y el KTI.

Figura 2. Cromatograma de separación de columnas mediante DEAE Sepharose™. Se recolectaron fracciones de 0,3 l durante la elución de la columna DEAE.

Figura 3. Análisis SDS-PAGE del BBI y el KTI purificados. Se realizó electroforesis, se escaneó el gel y se cuantificaron las bandas mediante el uso de un ImageScanner™ III junto con ImageQuant™ TL (ambos de General Electric). Se cargaron muestras de 1 miligramo por mililitro (mg/ml) en un Phastgel™ de 20%. Carril 1: Control (antigua preparación del SBTI). Carril 2: KTI purificado, cantidad de banda = 100 %. Carril 3: BBI purificado, cantidad de banda inferior = 89,2 %, cantidad de banda superior = 10,8 %.

Figura 4. Informe de corrida de columna de cromatografía a pequeña escala mediante el uso de un procedimiento mejorado. Los cuadrados, círculos y triángulos indican el gráfico de conductividad, el pH y la OD280, respectivamente. Ejes verticales: diagrama de conductividad (miliSiemens), pH y OD280 (unidades arbitrarias). Eje horizontal: volumen de columna y número de fracción.

Figura 5. 20 % de SDS-PAGE de fracciones de la cromatografía que se muestra en la Figura 4. A. Presentación de las fracciones 4-18 de izquierda a derecha y las fracciones agrupadas 5-11. "C" indica el inhibidor de tripsina de la técnica anterior (Sigma-Aldrich cat. núm. T9003). B. Presentación de las fracciones 6-15 de derecha a izquierda, que incluye el lavado flujo continuo (W+FT) y estándar (inhibidor de tripsina de Glycine max (haba de soja); "ST").

Figura 6. Análisis SDS-PAGE solo de etapas de purificación adicional del BBI. ST = estándar (ver leyenda de la Figura 5), 2 mg/ml. Carriles: 1: El BBI agrupado de la columna. 2: Permeado de filtración de 30 KDa. 3: Retenido de filtración de 30 KDa diluido 1:40. 4: Retenido de concentración de 5 KDa diluido 1:4.

Figura 7. Análisis SDS-PAGE de 1 mg/ml solo del producto final de purificación del BBI. ST = estándar (ver leyenda de la Figura 5), 1 mg/ml.

Figura 8. Diagrama de flujo del protocolo revisado para la purificación aguas abajo del BBI y el KTI.

Figura 9. Informe de ejecución de cromatografía en columna mediante el uso de un procedimiento alternativo.

Figura 10. Análisis por SDS-PAGE de muestras duplicadas del BBI purificadas mediante el uso de un procedimiento alternativo (carriles 1-2) versus procedimientos estándares (carril 3).

Figura 11. Resultados de las pruebas de varias formulaciones de emulsionantes. La puntuación de acumulación de espuma fue de 1-5, donde 1 indica que no hay espuma y 5 indica que no hay líquido visible debido a la espuma. Para la prueba de suspensión, los números 1-5 indican una separación total de fases; separación parcial de fases con algunas burbujas de aceite más grandes; burbuja de aceite pequeña, consistencia lechosa; sin burbujas inicialmente, con separación de fases posterior; y emulsión estable, respectivamente.

Figura 12. Perfiles de glucosa en sangre después de la administración de formulaciones orales de insulina que contienen varios emulsionantes. A. Formulaciones A (superior izquierda), B (inferior izquierda), C (superior derecha) y D (inferior derecha). B. Formulaciones E (izquierda) y F (derecha).

Figura 13. Historias Clínicas de los Pacientes. A. Registro de azúcar en la sangre. B. Cuestionarios.

Figura 14. Hoja de revisión de hipoglucemia. Se otorgan puntos por cada ocurrencia de hipoglucemia documentada, y se otorgan puntos adicionales en dependencia de los síntomas neuroglucopénicos experimentados o la ausencia de estos. Los ejemplos para la definición de síntomas fueron los siguientes: visuales, los ojos no enfocan, problemas de visión, visión doble; conductual, incapacidad de dormir, irritable, estresado, nervioso, "querer sentarse y no hacer nada", otros neurológicos, aturdido, mareado, debilidad, cansancio, somnolencia, dificultad para caminar o hablar, respuestas lentas, habilidades motoras retrasadas, pérdida del equilibrio; confusión, incapacidad para realizar operaciones matemáticas simples, sentirse "fuera de sí". No se otorgan puntos si hubo síntomas autonómicos que dieron una advertencia adecuada de hipoglucemia inminente, incluso si también estaban presentes algunos síntomas neuroglucopénicos. Se otorgan puntos adicionales por la necesidad de ayuda externa para reconocer o tratar el evento.

Figura 15. Respuestas de la glucosa en sujetos tratados con varias dosis de insulina oral.

Descripción detallada de las modalidades

En un aspecto, se proporciona un BBI aislado de un producto de soja, en donde el BBI es al menos 85% puro medido, en diversas modalidades, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), Tinción con Azul Brillante o cuantificación con generador de imágenes. En determinadas modalidades, el producto de soja es harina de soja.

Aún en otro aspecto, se proporciona un BBI aislado de harina de soja, en donde el contenido de proteína del BBI es mayor que 95% mediante ensayo de BCA (ácido bicinconínico).

Aún en otro aspecto, se proporciona un BBI aislado de harina de soja, en donde el BBI contiene menos de 0,1% de contaminantes de alto MW, por ejemplo, según lo evaluado mediante SDS-PAGE y la cuantificación con generador de imágenes.

En otras modalidades, la relación de la actividad antitripsina a la actividad antiquimotripsina presente en el BBI aislado está entre 1,5:1 y 1:1 inclusive. En modalidades más específicas, la relación puede estar entre 1,4:1 -1,1:1, inclusive. En modalidades más específicas, la relación puede estar entre 1,35:1 - 1,2:1, inclusive. En modalidades más específicas, la relación puede ser 1,28:1.

A menos que se indique de cualquier otra manera, la actividad anti quimotripsina a la que se hace referencia en la presente descripción se mide mediante el uso de quimotripsina que tiene una actividad de 40 unidades BTEE por mg de quimotripsina, y se expresa en mg de quimotripsina inhibida por mg de la proteína que se analiza. El BTEE se refiere al Éster Etílico de N-Benzoil-L-Tirosina (consulte las instrucciones para el producto Sigma-Aldrich Núm. B6125).

A menos que se indique de cualquier otra manera, la actividad antitripsina a la que se hace referencia en la presente descripción se mide mediante el uso de tripsina que tiene una actividad de 10000 unidades BAEE por mg de tripsina, y se expresa en mg de tripsina inhibida por mg de la proteína que se analiza. BAEE se refiere a la solución de Éster Etílico de Na-Benzoil-L-Arginina (véase las instrucciones del producto Sigma-Aldrich Núm. B4500). Por ejemplo, en un ensayo típico, una unidad corresponde a la cantidad de inhibidor que reduce la actividad de la tripsina en una unidad de éster etílico de benzoil-L-arginina (BAEE-U). Una BAEE-U es la cantidad de enzima que aumenta la absorbancia a 253 nm en 0,001 por minuto a pH 7,6 y 25 °C. Véase, por ejemplo, K. Ozawa, M. Laskowski, 1966, J. Biol. Chem. 241:3955; y Chen. Birk, 1976, Meth. Enzymol. 45:700.

Los expertos en la técnica apreciarán que cada uno de los requisitos de pureza anteriores, con respecto a su contenido de proteína, nivel de contaminantes o potencia, típicamente, se evalúa antes de que el BBI se mezcle con uno o más componentes de la composición farmacéutica.

En un aspecto adicional, se proporciona un KTI3 aislado de harina de soja, en donde el KTI3 es al menos 85 % puro medido, en diversas modalidades, mediante SDS-PAGE, Tinción con Azul Brillante o cuantificación con generador de imágenes.

Aún en otro aspecto, se proporciona un KTI3 aislado de harina de soja, en donde el contenido de proteína del KTI3 es mayor al 95 % según lo medido mediante ensayo de BCA.

Aún en otro aspecto, se proporciona un KTI3 aislado de harina de soja, en donde el KTI3 contiene menos de 0,1 % de contaminantes de alto Mw , por ejemplo, según lo evaluado por SDS-PAGE y la cuantificación con generador de imágenes.

Los expertos en la técnica apreciarán que cada uno de los requisitos de pureza anteriores, con respecto a su contenido de proteína, nivel de contaminantes o potencia, típicamente, se evalúa antes de que el KTI3 se mezcle con uno o más componentes de la composición farmacéutica.

En determinadas modalidades, la composición farmacéutica que contiene un KTI3 comprende además un BBI que cumple al menos uno de los requisitos de pureza anteriores antes de que se mezcle con uno o más componentes de la composición farmacéutica.

En determinadas modalidades, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente se formulan para administración oral. En modalidades más específicas, la composición farmacéutica comprende además un recubrimiento que resiste la degradación en el estómago. En modalidades aún más específicas, el recubrimiento es una cápsula sensible al pH o, alternativamente, es una cápsula de gelatina suave.

En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente comprenden además una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons como ingrediente activo. En otras modalidades, el ingrediente activo es una molécula no proteica que es sensible a la degradación o inactivación en el tracto digestivo humano.

En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica oral que comprende una formulación líquida a base de aceite, en donde la formulación líquida a base de aceite comprende una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons (kDa), un quelante de cationes divalentes y un BBI aislado. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en una proteína terapéutica de hasta 100 kDa, un quelante de cationes divalentes, un BBI aislado y un aceite. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en una proteína terapéutica de hasta 100 kDa, un quelante de cationes divalentes, un BBI aislado, un aceite y un emulsionante. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en una proteína terapéutica de hasta 100 kDa, un quelante de cationes divalentes, un BBI aislado, un aceite y dos emulsionantes.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica oral que comprende una formulación líquida a base de aceite, en donde la formulación líquida a base de aceite comprende una proteína terapéutica de hasta 100 kDa, un quelante de cationes divalentes y un BBI derivado de la soja, en donde dicha formulación líquida contiene menos de 0,05 % de sustancias derivadas de la soja con un PM mayor que 30000.

En otro aspecto se proporciona una composición farmacéutica oral que comprende una formulación líquida a base de aceite, en donde la formulación líquida a base de aceite comprende una proteína terapéutica de hasta 100 kDa y un quelante de cationes divalentes, y dicha formulación líquida tiene actividad anti-quimotripsina de al menos 50 mg de quimotripsina inhibida por ml de la formulación líquida. En otras modalidades, la formulación líquida tiene una actividad anti-quimotripsina de al menos 35, 40, 45, 55 o 60 mg de quimotripsina inhibida por ml de la formulación líquida. Aún en otras modalidades, la formulación líquida tiene una actividad anti-quimotripsina en el en el intervalo de 35-70, 40­ 70, 45-70, 50-70 o 40-60 mg de quimotripsina inhibida por ml de la formulación líquida. En otras modalidades, la formulación líquida comprende además una actividad antitripsina de al menos 25 mg de tripsina inhibida por ml de la formulación líquida. En otras modalidades, la formulación líquida comprende además una actividad antitripsina de al menos 30, 35, 40, 45 o 50 mg de tripsina inhibida por ml de la formulación líquida. Alternativamente, la formulación líquida comprende además una actividad antitripsina en el intervalo de 25-50, 30-50, 35-50, 25-40 o 25-45 mg de tripsina inhibida por ml de la formulación líquida.

En otro aspecto se proporciona un método para hacer una composición farmacéutica, que comprende las etapas de (a) proporcionar una preparación del BBI aislada, una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons y un quelante de cationes divalentes; y (b) mezclar dicho BBI aislado, una proteína terapéutica y un quelante en una formulación líquida a base de aceite. Cada una de las modalidades descritas en la presente descripción de identidad, pureza y potencia del BBI aislado puede incorporarse en este método. Además, cada una de las modalidades descritas en la presente descripción de los otros ingredientes y de los ingredientes adicionales que pueden estar presentes, pueden incorporarse a este método. En otras modalidades, se proporciona una composición farmacéutica preparada por este método.

En otro aspecto se proporciona un método para hacer una composición farmacéutica, que comprende la etapa de mezclar un BBI aislado, una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons y un quelante de cationes divalentes en una formulación líquida a base de aceite. Cada una de las modalidades descritas en la presente descripción de identidad, pureza y potencia del BBI aislado puede incorporarse en este método. Además, cada una de las modalidades descritas en la presente descripción de los otros ingredientes y de los ingredientes adicionales que pueden estar presentes, pueden incorporarse a este método. En otras modalidades, se proporciona una composición farmacéutica preparada por este método.

"Líquido", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a una composición que tiene una viscosidad dentro del intervalo de 1-1000 milipascales por segundo, inclusive, a 20 °C. El aceite de pescado, por ejemplo, es un líquido en condiciones ambientales. El término incluye soluciones a base de aceite, suspensiones y sus combinaciones.

El BBI "aislado", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a una preparación enriquecida en BBI con relación a otros componentes. En modalidades más específicas, BBI se refiere al inhibidor de Bowman-Birk; Uniprot número P01055 [base de datos consultada el 28 de enero de 2013]).

Una secuencia precursora representativa del BBI es:

MYVLKYCLVL LFLVGGTTSA NLRLSKLGLL MKSDHQHSND DESSKPCCDQ

CACTKSNPPQ CRCSDMRLNS CHSACKSCIC ALSYPAQCFC VDITDFCYEP

CKPSEDDKEN (SEQ ID NO: 1).

De estos 110 residuos, los residuos 1-19 son el péptido señal, 20-39 son un propéptido y la cadena del BBI de cadena madura está compuesta por los residuos 40-110 (71 AA).

En varias modalidades, la preparación de BBI utilizada en las composiciones descritas es de al menos 85 %, 90 %, 92 %, 94 % o 95 % puro según lo evaluado porSDS-PAGE, Tinción con Azul Brillante o cuantificación con generador de imágenes (por ejemplo, de acuerdo con el protocolo descrito en la presente descripción). En el contexto de una composición farmacéutica, este valor se refiere a las características del BBI antes de que se mezcle con uno o más componentes de la composición farmacéutica. En modalidades alternativas, pueden utilizarse SDS-PAGE y tinción con plata, opcionalmente seguidas de cuantificación con generador de imágenes.

En otras modalidades, el BBI aislado tiene una actividad anti quimotripsina de al menos 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3 o 1,4 mg de quimotripsina inhibida por mg del inhibidor. En otras modalidades, la actividad anti quimotripsina está en el intervalo de 0,8-1,8, 0,9-1,8, 1,0-1,8, 1,1-1,8, 1,2-1,8, 1,3-1,8 o 1,4-1,8 mg de quimotripsina inhibida por mg del inhibidor. En modalidades más específicas, la actividad es de 0,8-1,8 mg de quimotripsina inhibida por mg del inhibidor. En otras modalidades, la actividad está en el intervalo de 0,8-1,5 mg de quimotripsina inhibida pormg del inhibidor. En el contexto de una composición farmacéutica, este valor se refiere a las características del BBI antes de que se mezcle con uno o más componentes de la composición farmacéutica.

En varias modalidades, la preparación de BBI contiene 5 % o menos del KTI según lo evaluado por SDS-PAGE, Tinción con Azul Brillante o cuantificación con generador de imágenes (de acuerdo con el protocolo descrito en la presente descripción). En modalidades alternativas, pueden utilizarse SDS-PAGE y tinción con plata.

En modalidades más específicas, el KTI como se usa en la presente descripción se refiere a el KTI3 (Uniprot número P01070; base de datos consultada el 3 de enero de 2013). Una secuencia precursora representativa del KTI3 es:

MKSTIFFLFL FCAFTTSYLP SAIADFVLDN EGNPLENGGT YYILSDITAF

GGIRAAPTGN ERCPLTVVQS RNELDKGIGT IISSPYRIRF IAEGHPLSLK

FDSFAYIMLC VGIPTEWSVY EDLPEGP A VK IGENKDAMDG WFRLERVSDD

EFNNYKLVFC PQQAEDDKCG DIGISIDHDD GTRRLVYSKN KPLVVQFQKL

DKESLAKKNH GLSRSE SEQ ID NO: 2)

De la secuencia anterior, los residuos 1-24 son el péptido señal, 206-216 son el propéptido y la cadena del KTI madura está compuesta por los residuos 25-205 (181 AA).

En otras modalidades, el contenido de proteínas de la preparación del BBI es mayor al 95 % mediante ensayo de BCA (por ejemplo, mediante el uso del kit de ensayo de proteínas Micro BCA [Núm. Catálogo 23225, Thermo Scientific Rockford, IL]). En el contexto de una composición farmacéutica, este valor se refiere a sus características antes de ser mezclada con uno o más componentes de la composición farmacéutica. En otras modalidades, la preparación del BBI contiene menos de 0,1 % de contaminantes de alto MW (en otras palabras, sustancias con un peso molecular mayor de 30000). En otras modalidades, el BBI se aisló sin usar el polietilenglicol (PEG).

En otras modalidades, el BBI aislado en las composiciones descritas es un BBI recombinante, por ejemplo, BBI producido por un microorganismo tal como una bacteria que ha sido modificada genéticamente para expresarla y subsecuentemente aislada. Aún en otras modalidades, el BBI es un BBI sintético. Un ejemplo de un BBI sintético es el BBI que se ha producido en un aparato sin células, tal como un sintetizador de péptidos. Los sintetizadores de péptidos, por ejemplo, los sintetizadores de péptidos automatizados, se conocen bien en la técnica y están disponibles comercialmente. También se proporcionan en la presente descripción composiciones farmacéuticas que comprenden un BBI recombinante. También se proporcionan en la presente descripción composiciones farmacéuticas que comprenden un BBI sintético.

En determinadas modalidades, el BBI descrito es el único inhibidor de proteasa en las composiciones descritas. Si bien el SBTI de menor potencia requiere un inhibidor de proteasa adicional, por ejemplo, aprotinina, para proteger eficientemente determinadas proteínas terapéuticas en el tracto digestivo humano, se cree que el BBI aislado descrito es capaz de reducir la necesidad de inhibidores de proteasa adicionales con respecto a esto.

Inhibidores de Proteasa Adicionales

En determinadas modalidades, la formulación líquida a base de aceite utilizada en las composiciones descritas comprende además un inhibidor de tripsina distinto del BBI aislado. En otras modalidades, la formulación líquida a base de aceite utilizada en las composiciones descritas comprende además un inhibidor de tripsina distinto del KTI3 aislado. Los expertos en la técnica apreciarán a la luz de la presente descripción que pueden utilizarse una variedad de inhibidores de tripsina. En el caso de los inhibidores de tripsina que son proteínas, el tamaño típicamente será de hasta 100 kDa.

Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de tripsina" se refiere a cualquier agente capaz de inhibir la acción de la tripsina sobre un sustrato. La capacidad de un agente para inhibir la tripsina puede medirse mediante el uso de ensayos bien conocidos en la técnica.

Algunos inhibidores de tripsina conocidos en la técnica son específicos de la tripsina, mientras que otros inhiben la tripsina y otras proteasas tal como la quimotripsina. Los inhibidores de tripsina pueden derivarse de fuentes animales o vegetales: por ejemplo, soja, maíz, lima y otros frijoles, calabaza, girasol, páncreas y pulmón bovino y de otros animales, clara de huevo de pollo y pavo, fórmula infantil a base de soja y sangre de mamífero. Los inhibidores de tripsina también pueden ser de origen microbiano: por ejemplo, antipaína; ver, por ejemplo, H. Umezawa, 1976, Meth. Enzymol. 45, 678. Un inhibidor de tripsina también puede ser un imitador de arginina o lisina u otro compuesto sintético: por ejemplo, arilguanidina, benzamidina, 3,4-dicloroisocumarina, diisopropilfluorofosfato, mesilato de gabexato o fluoruro de fenilmetanosulfonilo. Como se usa en la presente descripción, un imitador de arginina o lisina es un compuesto que es capaz de unirse al bolsillo P1 de la tripsina y/o interferir con la función del sitio activo de tripsina.

En determinadas modalidades, el inhibidor de tripsina adicional utilizado en las composiciones descritas se selecciona del grupo que consiste en inhibidor de tripsina del haba de lima, aprotinina, (también conocido como inhibidor de tripsina pancreática o inhibidor de tripsina pancreática básico [BPTI]; Uniprot Núm. P00974 [base de datos consultada el enero 2, 2013]), inhibidor de Kazal (inhibidor de la tripsina secretora pancreática), inhibidor de Kazal (inhibidor de la tripsina secretora pancreática), ovomucoide, Alfa 1-antitripsina, Globulina fijadora de Cortisol, Centerina ([SERPINA9/GCET1 (transcrito 1 expresado en el centro germinal de los linfocitos b )], PI-6 (Sun y otros, 1995), PI-8 (Sprecher y otros, 1995), Bomapin, una serpina del clado A [por ejemplo, Serpina3 (ID del gen de Nc BI: 12), Serpina6 ( iD del gen de NCBI: 866 ), Serpina12 (ID del gen de NCBI: 145264); Serpina1o (ID del gen de NCBI: 51156); Serpina7 (ID del gen de NCBI: 6906); Serpina9 (ID del gen de NCBI: 327657); Serpina11 (ID del gen de NCBI: 256394); Serpina13 (ID del gen de n Cb I: 388007); Serpina2 (ID del gen de NCBl: 390502); y Serpina4 (ID del gen de NCBI: 5104)] Yukopin b12; ID del gen: 89777), antipaína, benzamidina, 3,4-dicloroisocumarina, diisopropilfluorofosfato y mesilato de gabexato. En otras modalidades, se selecciona uno de los inhibidores anteriores.

Una secuencia precursora representativa de la aprotinina es:

MKMSRLCLSV ALLVLLGTLA ASTPGCDTSN QAKAQRPDFC LEPPYTGPCK

ARIIRYFYNA KAGLCQTFVY GGCRAKRNNF KSAEDCMRTC GGAIGPWENL (SEQ

ID NO: 3).

De estos 100 residuos, los residuos 1-21 son el péptido señal, 22-35 y 94-100 son propéptidos, y la cadena del BBI de cadena madura está compuesta por los residuos 36-93 (58 AA).

En otras modalidades, una formulación líquida a base de aceite utilizada en las composiciones descritas comprende tanto el BBI aislado como el KTI aislado, en modalidades más específicas tanto el BBI aislado como el KTI3 aislado. El KTI "aislado" como se usa en la presente descripción se refiere a una preparación enriquecida en el KTI en relación con otros componentes. En varias modalidades, la preparación del KTI utilizada en las composiciones descritas es de al menos 85 % puro según lo evaluado por SDS-PAGE, Tinción con Azul Brillante o cuantificación con generador de imágenes (por ejemplo, de acuerdo con el protocolo descrito en la presente descripción). En otras modalidades, el contenido de proteínas de la preparación del KTI es superior al 95 % mediante ensayo de BCA. En el contexto de una composición farmacéutica, estos valores se refieren a las características del KTI antes de que se mezcle con uno o más componentes de la composición farmacéutica. En otras modalidades, la preparación del KTI contiene 5 % o menos del BBI según lo evaluado por SDS-PAGE. En otras modalidades, la preparación del KTI contiene menos de 0,1 % de contaminantes de alto MW (es decir, sustancias con un peso molecular mayor a 30000). En otras modalidades, el KTI se aisló sin usar Pe G.

Aún en modalidades más específicas, las composiciones descritas comprenden el BBI y el KTI descritos, en modalidades más específicas el BBI y el KTI3, como los únicos inhibidores de proteasa. En otras modalidades, las composiciones descritas comprenden el KTI y la aprotinina, en modalidades más específicas, el KTI3 y la aprotinina, como los únicos inhibidores de proteasa. En otras modalidades, el BBI aislado, el KTI aislado y la aprotinina están todos presentes en la formulación líquida a base de aceite.

En otras modalidades, el KTI3 aislado tiene una actividad de al menos 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 o 1,3 mg de tripsina inhibida por mg de inhibidor. En otras modalidades, la actividad del KTI3 está en el intervalo de 0,8-1,8, 0,9-1,8, 1,0­ 1,8, 1,1-1,8, 1,2-1,8 o 1,3-1,8 mg de tripsina inhibida por mg de inhibidor. En modalidades más particulares, la actividad del KTI3 es 0,8-1,7 mg de tripsina inhibida por mg de inhibidor. En otras modalidades, la actividad varía entre 0,8­ 1,4 mg de tripsina inhibida por mg de inhibidor.

En otras modalidades preferidas, el KTI aislado es un KTI recombinante, por ejemplo, el KTI producido por un microorganismo tal como una bacteria que ha sido modificada genéticamente para expresarlo. Aún en otras modalidades preferidas, el KTI es un KTI sintético. Un ejemplo de un KTI sintético es el KTI que se ha producido en un aparato sin células, tal como un sintetizador de péptidos.

Otras modalidades se refieren a la relación entre la actividad anti quimotripsina presente en la composición farmacéutica descrita y la actividad antitripsina de la composición. En algunas modalidades, este parámetro está entre 1,5:1 y 1:1 inclusive. En modalidades más específicas, la relación puede estar entre 1,4:1 - 1,1:1, inclusive. En modalidades más específicas, la relación puede estar entre 1,35:1 -1,2:1, inclusive.

En determinadas modalidades, el BBI usado en las composiciones descritas, y/o el KTI, si está presente, se han almacenado con un conservante. En otras modalidades, el BBI y/o el KTI se han preparado y almacenado sin usar conservantes.

En determinadas modalidades, el BBI utilizado en las composiciones descritas, y/o el KTI, si está presente, se obtienen a partir de harina de soja. El término "harina de soja" se refiere a la harina obtenida de las especies Glycine max. En otras modalidades, puede utilizarse cualquier especie del género Glycine. Los métodos para obtener harina de soja se conocen bien en la técnica. Se cree que los métodos descritos son aplicables a cualquier tipo de harina de soja, sin importar cómo se haya producido.

Proteínas terapéuticas

Las proteínas terapéuticas para las composiciones descritas en la presente descripción se aíslan en algunas modalidades antes de su inclusión en las composiciones farmacéuticas descritas. "Aislado" con respecto a esto excluye la provisión de la proteína terapéutica como una preparación de tejido homogeneizado u otra forma que contiene cantidades sustanciales de proteínas contaminantes. Un ejemplo preferido de una proteína o péptido aislado es una proteína o péptido recombinante. Una modalidad aún más preferida es una proteína sintética, en otras palabras, una proteína producida en un aparato sin células. Los expertos en la técnica apreciarán a la luz de la presente descripción que pueden utilizarse proteínas terapéuticas tanto de tipo silvestres como mutadas.

Se conoce que determinadas proteínas y péptidos son inhibidores específicos de tripsina y/o quimotripsina, que incluye, pero no se limitan a aquellos descritos en la presente descripción como inhibidores de tripsina y/o quimotripsina. Tales proteínas no están destinadas para usar como componente terapéutico en las composiciones descritas y están excluidas de la definición de "proteínas terapéuticas" como se usa en la presente descripción.

Los expertos en la técnica apreciarán a la luz de la presente descripción que puede usarse una variedad de proteínas terapéuticas en las composiciones descritas. En determinadas modalidades, la proteína terapéutica tiene un tamaño de hasta 100 kilodaltons (kDa), típicamente, entre 1-100 kDa, inclusive. En modalidades más específicas, el tamaño es de hasta 90 kDa. En otras modalidades, el tamaño es de hasta 80 kDa. En otras modalidades, el tamaño es de hasta 70 kDa. En otras modalidades, el tamaño es de hasta 60 kDa. En otras modalidades, el tamaño es de hasta 50 kDa. Preferentemente, el tamaño está entre 1-90 kDa, inclusive. En otras modalidades, el tamaño está entre 1-80 kDa, inclusive. En otras modalidades, el tamaño está entre 1-70 kDa, inclusive. En otras modalidades, el tamaño está entre 1-60 kDa, inclusive. En otras modalidades, el tamaño está entre 1-50 kDa, inclusive.

Las proteínas terapéuticas adecuadas para usar en la presente descripción incluyen derivados que están modificados (es decir, mediante la unión covalente de una porción no aminoacídica a la proteína). Por ejemplo, pero no por medio de limitación, la proteína incluye proteínas que se han modificados, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación o derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos. El PEG de alto MW puede unirse a las proteínas terapéuticas con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de la conjugación específica al sitio del p Eg al extremo N o C de estos o a través de los grupos amino épsilon presentes en los residuos de lisina. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

En determinadas modalidades más específicas, la proteína terapéutica utilizada en las composiciones descritas se selecciona del grupo que consiste en insulina, hemaglutinina de influenza, neuraminidasa de influenza, glucagón, interferón gamma, interferón beta, interferón alfa, hormona de crecimiento, eritropoyetina, GLP-1, un análogo de GLP-1, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), renina, factor liberador de hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, hormona estimulante de la tiroides, hormona estimulante del folículo, calcitonina, hormona luteinizante, glucagón, un factor de coagulación (por ejemplo, factor VII, factor VIIIC, factor DC, factor tisular (TF) y trombina), un factor anticoagulante (por ejemplo, proteína C), factor natriurético auricular, proteína surfactante A (SP-A), proteína surfactante B (SP-B), proteína surfactante C (SP-C), proteína surfactante D (SP-D), un activador del plasminógeno (por ejemplo activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA)), bombesina, factor de crecimiento hemopoyético (también conocido como factor estimulador de colonias, múltiple), una proteína del factor de necrosis tumoral (TNF) (por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta, TNF beta-2, 4-1BBL), encefalinasa, RANTES (regulada en la activación normalmente expresada y secretada por linfocitos T), proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa), albúmina sérica, sustancia inhibidora de Müller, relaxina, hormona liberadora de gonadotropina de ratón, ADNasa, inhibina, activina, factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), un factor neurotrófico (por ejemplo, factor neurotrófico derivado del cerebro [BDNF]), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas ( PDGF), un factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, alfa-FGF y beta-FGF), un factor de crecimiento transformante (TGF) (por ejemplo, TGF-alfa y TGF-beta, que incluye TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 y TGF-5), factor de crecimiento I y II similar a la insulina (IGF-I e IGF-II), des (1-3)-IG F-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (incluidas IGFBP-1, IGFBP-2, |Gf BP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 e IGFBP-6), factor de crecimiento de queratinocitos, un factor osteoinductivo, proteína morfogenética ósea (BMP)-2, BMP-7, un factor estimulante de colonias (CSF) (por ejemplo, M-CSF y GM-CSF), una interleucina (IL), (por ejemplo, IL-1 a IL-13 e IL-15, IL-18 e IL-23), superóxido dismutasa, factor acelerador de la descomposición, un miembro de la familia de quimiocinas (por ejemplo, las eotaxinas y MCP-1) y un factor del complemento (por ejemplo C3 y C5).

Aún en modalidades más específicas, la proteína terapéutica es insulina. Alternativamente, la proteína terapéutica puede ser un inhibidor de GLP-1. En una modalidad más específica, la proteína terapéutica es exenatida. En otras modalidades, tanto la insulina como la exenatida están presentes en la composición descrita. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en insulina, exenatida, un quelante de cationes divalentes, un BBI aislado y un aceite. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en insulina, exenatida, un quelante de cationes divalentes, un BBI aislado, al menos un emulsionante y un aceite. Aún en otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en insulina, exenatida, un quelante de cationes divalentes, un KTI3 aislado, aprotinina y un aceite. Aún en otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en insulina, exenatida, un quelante de cationes divalentes, un KTI3 aislado, aprotinina, al menos un emulsionante y un aceite.

Una persona experta en la técnica apreciará a la luz de la presente descripción que varios tipos de insulina son adecuados para las composiciones descritas. Las proteínas de insulina ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de insulina de tipo salvaje y mutadas, que incluyen insulina humana sintética, insulina bovina sintética, insulina porcina sintética, insulina de ballena sintética y complejos metálicos de insulina, tal como complejos de zinc de insulina, protamina zinc insulina y globina zinc.

También pueden utilizarse varias clases de insulina, por ejemplo, insulina de acción rápida, insulina lenta, insulina semilenta, insulina ultralenta, insulina NPH, insulina glargina, insulina lispro, insulina aspart o combinaciones de dos o más de los tipos de insulina anteriores.

En una modalidad particularmente preferida, la insulina de las composiciones descritas es insulina humana de tipo salvaje (Uniprot ID P01308; SEQ ID NO: 4). De los 110 aminoácidos, 1-24 es el péptido señal, 25-54 forman la cadena B de la insulina, 57-87 forman el péptido C y 90-110 forman la cadena A de la insulina. En una modalidad preferida, la insulina humana se produce como una proteína recombinante en células bacterianas. En otra modalidad preferida, la insulina humana se produce sintéticamente.

Los análogos de GLP-1 también se denominan en la técnica miméticos de GLP-1. Un experto en la técnica apreciará a la luz de la presente descripción que las composiciones descritas pueden incluir al menos uno de los siguientes análogos de GLP-1: exenatida (Byetta™; CAS núm. 141732-76-5; s Eq ID NO: 5), lixisenatida (CAS núm. 320367­ 13-3), liraglutida (CAS núm. 204656-20-2), exendina-9 (CAS núm. 133514-43-9), AC3174 ([Leu(14)]exendina-4, Amylin Pharmaceuticals, Inc.), taspoglutida (CAS núm. 275371-94-3), albiglutida (CAS núm. 782500-75-8), semaglutida (CAS núm. 910463-68-2), LY2189265 (dulaglutida™; CAS núm. 923950-08-7) y CJC-1134-PC (un análogo modificado de Exendina-4 conjugado con albúmina humana recombinante fabricado por ConjuChem™). Se accedió a todos los registros CAS el 19 de diciembre de 2011. Por lo tanto, en determinadas modalidades, la composición descrita utiliza cualquiera de los análogos de GLP-1 enumerados anteriormente. En otras modalidades, se selecciona uno de los análogos de GLP-1 enumerados anteriormente. Los expertos en la técnica apreciarán, a la luz de los hallazgos presentados en la presente descripción, que también pueden utilizarse otros análogos de GLP-1 en las composiciones descritas.

Emulsionantes

Los porcentajes "peso/peso" de los emulsionantes y detergentes a los que se hace referencia en la presente descripción utilizan la cantidad de base de aceite en la formulación, por ejemplo, aceite de pescado, como denominador; por lo tanto, 60 mg de Gelucire en 500 mg de aceite de pescado se considera como 12 % p/p, independientemente del peso de los demás componentes. De manera similar, 50 mg. Tween-80 mezclado con 500 mg de aceite de pescado se considera como 10 % Tween-80.

En determinadas modalidades, la formulación líquida a base de aceite utilizada en las composiciones farmacéuticas descritas, o en otras modalidades, cada una de la formulación líquida a base de aceite que está presente comprende, además de la proteína terapéutica, el quelante y el BBI, un polietileno éster de glicol (PEG) de un ácido graso, por ejemplo, un éster de PEG de un monoglicérido, un diglicérido, un triglicérido o una mezcla de estos. En modalidades más específicas, el éster de PEG puede proporcionarse como una mezcla de (a) un monoacilglicerol libre, un diacilglicerol libre, un triacilglicerol libre o una mezcla de estos; y (b) un éster de PEG de un ácido graso, por ejemplo, un éster de PEG de un monoglicérido, un diglicérido, un triglicérido o una mezcla de estos. Con respecto a esto, cada uno de los términos "monoacilglicerol", "diacilglicerol" y "triacilglicerol" no necesitan referirse a un solo compuesto, sino que pueden incluir mezclas de compuestos, por ejemplo, mezclas de monoacilgliceroles, diacilgliceroles o triacilgliceroles que tienen ácidos grasos de longitudes variables. En determinadas modalidades preferidas, los monoacilgliceroles, diacilgliceroles o triacilgliceroles utilizados en las composiciones descritas, por ejemplo, los utilizados para los ésteres de PEG generales, proceden de una fuente de aceite que es Generalmente Reconocida Como Segura (GRAS). Ejemplos de aceites GRAS son aceite de coco, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de soja, Myvacet 9-45 (Monoacilgliceroles diacetilados de ácidos grasos C-18). Una modalidad más específica de (a) es una mezcla de monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles Ce-Cí a . Una modalidad más específica del componente (b) es una mezcla de monoésteres y diésteres de PEG de uno o más ácidos grasos Ce-C í e .

En modalidades más específicas, la formulación líquida además comprende, además del éster de PEG de un ácido graso, un PEG libre. Aún en modalidades más específicas, está presente un detergente no iónico adicional, por ejemplo, un detergente basado en polisorbato, además del éster de PEG y el PEG libre.

En una modalidad aún más específica de las composiciones, una formulación líquida comprende: (a) una mezcla de monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles Ce - Cí e ; (b) PEG-32 monoésteres y diésteres de una mezcla de ácidos grasos Ce-C í e ; y (c) PEG-32 libre. En modalidades aún más específicas, la relación peso/peso del componente (a) a la suma de los componentes (b) (c) está entre 10:90-30:70 inclusive; más específicamente entre las í 5:85-25:75 inclusive; más específicamente 20^0. En determinadas modalidades, los componentes (a)-(c) juntos constituyen del 8- í 6% peso/peso inclusive de la formulación líquida a base de aceite. En modalidades más específicas, la cantidad es del 9-15 % inclusive. En modalidades más específicas, la cantidad es del 10-14 % inclusive. En modalidades más específicas, la cantidad es del 11-13 % inclusive. En modalidades más específicas, la cantidad es 12 %.

En otras modalidades, una formulación líquida a base de aceite utilizada en las composiciones farmacéuticas descritas comprende, además de la proteína terapéutica, el quelante y el BBI, un componente autoemulsionante. Si bien algunas modalidades de componentes autoemulsionantes son las mezclas de componentes descritos en los párrafos anteriores, estas mezclas no limitan la definición del término "componentes autoemulsionantes" como se usa en la presente descripción. "Componente autoemulsionante", como se usa en la presente descripción, se refiere a un componente que forma espontáneamente una emulsión. Típicamente, tales componentes formarán una emulsión al entrar en contacto con medios acuosos, formando una dispersión fina, es decir, una microemulsión (SMEDDS). Determinadas modalidades de tales componentes comprenden una mezcla de triacilglicerol de triacilgliceroles y un alto equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB; véase Griffin WC: "Calculation of HLB Values of Non-Ionic Surfactants," J Soc Cosmetic Chemists 5:259 (1954)) surfactante. Otras modalidades del componente autoemulsionante tienen una consistencia cerosa, semisólida.

Preferentemente, el HLB de un componente autoemulsionante utilizado en las composiciones descritas es 10 o mayor. En otras modalidades, está entre 11-19 inclusive. En otras modalidades, está entre 12-1e inclusive. En otras modalidades, está entre 12-17 inclusive. En otras modalidades, está entre 12-16 inclusive, lo que es indicativo de un emulsionante de aceite en agua (O/W). En otras modalidades, está entre 13-15 inclusive. En otras modalidades, es 14. Modalidades aún más específicas de componentes autoemulsionantes tienen un HLB de 12-16 inclusive y comprenden triacilgliceroles de cadena media y larga conjugados con PEG, triacilgliceroles libres y PEG libre. En otras modalidades, el componente autoemulsionante tiene un HLB de 12-16 inclusive y consiste en una mezcla de triacilgliceroles de cadena media y larga conjugados con PEG, triacilgliceroles libres y PEG libre. En otras modalidades, el componente autoemulsionante tiene un HLB de 14 y comprende triacilgliceroles de cadena media y larga conjugados con PEG, triacilgliceroles libres y PEG libre. En otras modalidades, el componente autoemulsionante tiene un HLB de 14 y consta de una mezcla de triacilgliceroles de cadena media y larga conjugados con PEG, triacilgliceroles libres y PEG libre.

Determinadas modalidades más específicas utilizan componentes autoemulsionantes que comprenden (a) un monoacilglicerol, un diacilglicerol, un triacilglicerol o una mezcla de estos; y (b) un éster de polietilenglicol (PEG) de un ácido graso. Con respecto a esto, cada uno de los términos "monoacilglicerol", "diacilglicerol" y "triacilglicerol" no necesitan referirse a un solo compuesto, sino que pueden incluir mezclas de compuestos, por ejemplo, mezclas de monoacilgliceroles, diacilgliceroles o triacilgliceroles que tienen ácidos grasos de longitudes variables. Una modalidad más específica es una mezcla de monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles Ce-C1e. Una modalidad más específica del componente (b) es una mezcla de monoésteres y diésteres de PEG de una mezcla de ácidos grasos Ce-C1e.

En otras modalidades más específicas, el componente autoemulsionante comprende además un PEG libre.

Determinadas porciones de PEG para usar en las composiciones descritas contienen entre 5-100 monómeros. En modalidades más específicas, el PEG puede contener entre 15-50 monómeros. Aún en modalidades más específicas, el PEG puede contener entre 25-40 monómeros. En modalidades más específicas, el PEG puede contener 32 monómeros.

Aún en modalidades más específicas de las composiciones descritas, un componente autoemulsionante usado en estas comprende: (a) una mezcla de monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles C8-C18; (b) PEG-32 monoésteres y diésteres de una mezcla de ácidos grasos C8-C18; y (c) PEG-32 libre; y la relación peso/peso del componente (a) a los componentes (b) (c) es 20:80. En determinadas modalidades, tal componente constituye 8-16% peso/peso inclusive de la formulación líquida a base de aceite. En modalidades más específicas, la cantidad es del 9-15 % inclusive. En modalidades más específicas, la cantidad es del 10-14 % inclusive. En modalidades más específicas, la cantidad es del 11-13 % inclusive. En modalidades más específicas, la cantidad es 12 %.

Ejemplos de componentes autoemulsionantes que cumplen con las especificaciones anteriores son Gelucire™ 44/14, Gelucire™ 53/10 y Gelucire™ 50/13. Una modalidad más específica es Gelucire™ 44/14. Los sufijos 44 y 14 se refieren respectivamente a su punto de fusión y su balance hidrófilo/lipófilo (HLB). Gelucire™ 44/14 (Gattefossé SAS, Saint-Priest, Francia) se obtiene por poliglicólisis de aceite de coco hidrogenado (triacilgliceroles de cadena media y larga con PEG-32). Tiene un balance hidrófilo/lipófilo de 14. Se compone de una mezcla definida de mono-, di- y triacilgliceroles C8-C 18 (20 % p/p), mono- y diésteres de PEG-32 y PEG-32 libre (80 % p/p). El principal ácido graso presente es el ácido láurico, que representa el 45 % en promedio del contenido total de ácidos grasos. Es una dispersión sólida compuesta por una fracción de éster de PEG bajo una fase lamelar de 120 A con conformación helicoidal y una fracción de acilglicerol bajo un empaque hexagonal. Los principales productos de la lipólisis gastrointestinal simulada de Gelucire™ 44/14 son mono y diésteres PEG-32. En modalidades más específicas, las composiciones descritas comprenden alrededor de 12 % de Gelucire 44/14 como único emulsionante o, en otras modalidades, junto con otro emulsionante. En otras modalidades, las composiciones descritas comprenden alrededor de 12 % de Gelucire 44/14 y unos 10 % de Tween-80.

Detergentes no iónicos

En determinadas modalidades, una formulación líquida a base de aceite utilizada en las composiciones farmacéuticas descritas comprende además un detergente no iónico además del componente autoemulsionante. En determinadas modalidades, el detergente no iónico se selecciona del grupo que consiste en polisorbato-20, polisorbato-40, polisorbato-80, lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino polioxietilenado hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso y sacarosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton™-X-100, Tritón™-X-114, Thesit™ , Isotridecipoli (éter de etilenglicol)n, 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-1-propano sulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-2-hidroxi-1-propano sulfonato (Ch A p SO) y N-dodecilo=N,N -d im etil-3 -amonio-1-propano sulfonato. En otras modalidades, se selecciona uno de los detergentes no iónicos enumerados anteriormente.

En determinadas modalidades más específicas, un detergente no iónico usado en las composiciones descritas es un detergente a base de polisorbato. Ejemplos de detergentes a base de polisorbato son los detergentes derivados de la unión covalente de sorbitán polietoxilado a un ácido graso. Modalidades más específicas de detergentes a base de polisorbato son polisorbato-20, polisorbato-40 y polisorbato-80.

Por ejemplo, el polisorbato 80 (Tween-80) es un detergente no iónico derivado de sorbitán polietoxilado y ácido oleico y que tiene la siguiente estructura:

Suma de W X y Z * 20

En el caso del polisorbato 80, la porción que se muestra en el lado derecho es una mezcla de ácidos grasos, que contiene de 60-70 % de ácido oleico (como se representa), con el equilibrio que es principalmente ácidos linoleico, palmítico y esteárico.

En una modalidad más específica, el polisorbato 80 constituye del 3-15 % peso/peso inclusive de una formulación líquida a base de aceite usada en las composiciones descritas. En una modalidad más específica, el porcentaje es de 5-14 % inclusive. En una modalidad más específica, el porcentaje es de 7-12 % inclusive. En modalidades más específicas, el porcentaje es 10 % o, alternativamente, 5 %.

Quelantes de cationes divalentes

El quelante de cationes divalentes utilizado en las composiciones descritas es, en una modalidad, cualquier compuesto fisiológicamente aceptable que tenga una alta afinidad por al menos uno de los iones de calcio, magnesio y manganeso. En otra modalidad, el quelante se selecciona del grupo que consiste en citrato o una sal de este; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o una sal de este (por ejemplo, EDTA disódico y EDTA cálcico disódico); EGTA (ácido tetraacético de etilenglicol) o una sal de este; ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o una sal de este; y BAPTA (1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-ácido tetraacético) o una sal de este. En otras modalidades, se utiliza uno de los quelantes enumerados anteriormente. En modalidades más específicas, el quelante es EDTA.

Aceites

Los expertos en la técnica apreciarán, a la luz de los presentes descubrimientos, que pueden utilizarse varios aceites como la base de su fase líquida de las composiciones descritas. En determinadas modalidades, el aceite puede ser cualquier aceite fisiológicamente aceptable que sea líquido a temperatura ambiente.

En modalidades más específicas, el aceite comprende un ácido graso omega-3. En otras modalidades, el ácido graso omega-3 es un ácido graso poliinsaturado omega-3. En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es DHA, un ácido graso poliinsaturado omega-3, de 22 carbonos, también denominado como ácido 4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoico. En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es el ácido linolénico (ácido 9, 12, 15-octadecatrienoico). En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es ácido estearidónico (ácido 6, 9, 12, 15-octadecatetraenoico). En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es ácido eicosatrienoico (ETA; 11, 14, 17-ácido eicosatrienoico). En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es ácido eicosatetraenoico (ácido 8, 11, 14, 17-eicosatetraenoico). En una modalidad, el ácido graso omega-3 es ácido eicosapentaenoico (EPA; ácido 5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoico). En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es ácido eicosahexaenoico (también denominado como ácido 5, 7, 9, 11, 14, 17-eicosahexaenoico). En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es el ácido docosapentaenoico (DPA; ácido 7, 10, 13, 16, 19-docosapenatenoico). En otra modalidad, el ácido graso omega-3 es ácido tetracosahexaenoico (ácido 6, 9, 12, 15, 18, 21-tetracosahexaenoico).

En otras modalidades, el aceite es un aceite natural que comprende un ácido graso omega-3. En modalidades más específicas, el aceite se selecciona del grupo que consiste en aceite de pescado, aceite de canola, aceite de linaza, aceite de algas y aceite de semilla de cáñamo. En modalidades más específicas, el aceite es un aceite de pescado. Se han evaluado varios tipos de aceite de pescado en las composiciones descritas y se ha encontrado que todos funcionan igualmente bien.

En otras modalidades, una formulación líquida utilizada en la composición descrita no contiene agua. "No contiene agua" se refiere, en determinadas modalidades, a una formulación en la que no se han añadido intencionadamente componentes acuosos. No excluye la presencia de cantidades de trazas de agua que hayan sido absorbidas de la atmósfera en los componentes de esta. En otra modalidad, la formulación líquida está libre de componentes acuosos. Aún en otras modalidades, uno o más aceites son los únicos componentes líquidos de la formulación líquida. En modalidades más específicas, el aceite de pescado es el único componente líquido de la formulación líquida.

Recubrimientos

Los expertos en la técnica apreciarán, a la luz de los presentes descubrimientos, que pueden utilizarse varios recubrimientos sensibles al pH en las composiciones descritas. En determinadas modalidades, puede utilizarse cualquier recubrimiento que inhiba la digestión de la composición en el estómago de un sujeto.

En otras modalidades, el recubrimiento comprende un polisacárido biodegradable. En otras modalidades, se utiliza un hidrogel. En otras modalidades, el recubrimiento comprende uno de los siguientes excipientes: quitosano, un recubrimiento ECD aquacoat, un polímero reticulado azoico, ftalato de acetato de celulosa, trimelitato de acetato de celulosa (CAT), butirato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa o ftalato de polivinilacetato.

En otras modalidades, se utiliza un sistema de liberación programada tal como Pulsincap™.

En modalidades preferidas, las formas de dosificación recubiertas descritas liberan el núcleo (que contiene la formulación a base de aceite) cuando el pH alcanza el intervalo que se encuentra en los intestinos, que es alcalino con relación al del estómago. En modalidades más específicas, el recubrimiento comprende un polímero sensible al pH. En varias modalidades, pueden utilizarse recubrimientos monocapa o multicapa.

En una modalidad, el recubrimiento es un recubrimiento entérico. Los métodos para el recubrimiento entérico se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Siepmann F y otros, 2005). En modalidades más específicas, se utiliza un recubrimiento Eudragit™ como recubrimiento entérico. Los recubrimientos Eudragit™ son polímeros acrílicos, el uso de los cuales es bien conocido en la técnica.

En otra modalidad, la microencapsulación se usa como recubrimiento resistente al estómago en las composiciones descritas. Los métodos para la microencapsulación se conocen bien en la técnica.

En otras modalidades, el recubrimiento es una cápsula, de las cuales las cápsulas de gelatina son una modalidad más específica. Los métodos para insertar una formulación a base de aceite en una cápsula de gelatina se conocen bien en la técnica. Aún en otras modalidades, el recubrimiento es una cápsula de gel suave con recubrimiento entérico.

En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica oral que comprende una formulación líquida a base de aceite, en donde la formulación líquida a base de aceite comprende una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons, un quelante de cationes divalentes, un inhibidor aislado de quimotripsina/tripsina, un inhibidor aislado de tripsina y un éster PEG de un ácido graso. En otras modalidades, la formulación líquida tiene una actividad anti quimotripsina de al menos 50 mg de quimotripsina inhibida por ml de la formulación líquida. En otras modalidades, la formulación líquida tiene una actividad anti quimotripsina de al menos 50 mg de quimotripsina inhibida por ml de la formulación líquida y una actividad antitripsina de al menos 25 mg de tripsina inhibida por ml de la formulación líquida. En otras modalidades, también está presente un PEG libre. En otras modalidades, también está presente un detergente no iónico. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons, un quelante de cationes divalentes, un inhibidor de quimotripsina/tripsina, un inhibidor de tripsina y un éster PEG de un ácido graso. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons, un quelante de cationes divalentes, un inhibidor de quimotripsina/tripsina, un inhibidor de tripsina, un éster PEG de un ácido graso y un PEG libre. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en una proteína terapéutica de hasta 100 kilodaltons, un quelante de cationes divalentes, un inhibidor de quimotripsina/tripsina, un inhibidor de tripsina, un éster de PEG de un ácido graso, un PEG libre y un detergente no iónico.

Formulaciones representativas

Determinadas formulaciones de insulina representativas comprenden insulina, Gelucire 44/14, EDTA, SBTI y aprotinina en aceite de pescado, recubiertas en una cápsula. Determinadas formulaciones representativas de exenatida contienen exenatida, Gelucire 44/14, EDTA, SBTI y aprotinina en aceite de pescado, recubiertas en una cápsula. Una modalidad más específica es una formulación que tiene los siguientes componentes: 8-20 % de Gelucire 44/14; 50-100 mg por cápsula de BBI aislado, o mezcla del BBI aislado/KTI aislado; 20-30 mg por cápsula de Aprotinina; y 100-200 mg de EDTA; con una proteína terapéutica, que puede ser de 8-32 mg por cápsula de insulina y/o 150-600 mcg por cápsula de Exenatida, todo combinado en 0,5 - 0,7 ml de aceite de pescado. Otra formulación de insulina líquida representativa contiene insulina, Gelucire 44/14, EDTA, BBI, KTI y aprotinina en aceite de pescado. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en insulina, Gelucire 44/14, EDTA, BBI, KTI, aprotinina y aceite de pescado. Formulaciones más específicas contienen 8 mg de insulina, 12 % de Gelucire 44/14, 150 mg de EDTA, 75 mg totales del BBI y el KTI y 24 mg de aprotinina en 0,5-0,7 ml de aceite de pescado; 16 mg de insulina, 12% de Gelucire 44/14, 150 mg de EDTA, 75 mg totales del BBI y el KTI y 24 mg de aprotinina en 0,5-0,7 ml de aceite de pescado; y 16 mg de insulina, 12 % de Gelucire 44/14, 150 mg de EDTA, 150 mg totales del BBI y el KTI y 24 mg de aprotinina en 0,5-0,7 ml de aceite de pescado. En una formulación aún más específica, la relación entre la actividad antitripsina y la actividad anti quimotripsina de la composición es aproximadamente 1,28:1. En otras modalidades, la composición anterior comprende además un detergente no iónico. En modalidades más específicas, el detergente no iónico es un detergente basado en polisorbato. En modalidades aún más específicas, el detergente a base de polisorbato es polisorbato 80. Preferentemente, el polisorbato 80 constituye de 3-10 % peso/peso inclusive de la formulación líquida a base de aceite. La formulación líquida puede recubrirse con una cápsula de gelatina suave con cubierta entérica. Las formulaciones específicas descritas en este párrafo también abarcan, en determinadas modalidades, formulaciones aumentadas y reducidas que contienen los mismos componentes en las mismas relaciones.

Algunas formulaciones orales representativas de exenatida comprenden exenatida, EDTA, BBI, KTI y aprotinina en aceite de pescado. En otras modalidades, la formulación líquida consiste esencialmente en exenatida, Gelucire 44/14, EDTA, BBI, KTI, aprotinina y aceite de pescado. Las formulaciones más específicas contienen 150 microgramos (mcg) de exenatida, 150 mg de EDTA, 75 mg en total del BBI y el KTI y 24 mg de aprotinina en 0,5-0,7 ml de aceite de pescado; 300 mcg de exenatida, 150 mg de EDTA, 75 mg totales del BBI y el KTI y 24 mg de aprotinina en 0,5-0,7 ml de aceite de pescado; y 300 mcg de exenatida, 150 mg de EDTA, 150 mg totales del BBI y el KTI y 24 mg de aprotinina en 0,5-0,7 ml de aceite de pescado. En una formulación aún más específica, la relación de la actividad antitripsina a la actividad antiquimotripsina de la composición está entre 1,5:1 y 1:1, inclusive. En modalidades aún más específicas, la relación es de aproximadamente 1,28:1. La formulación líquida puede recubrirse con una cápsula de gelatina suave con cubierta entérica. En otras modalidades, la composición anterior comprende además un detergente no iónico. En modalidades más específicas, el detergente no iónico es un detergente basado en polisorbato. En modalidades aún más específicas, el detergente a base de polisorbato es polisorbato 80. Preferentemente, el polisorbato 80 constituye de 3-10 % peso/peso inclusive de la formulación líquida a base de aceite. La formulación líquida puede recubrirse con una cápsula de gelatina suave con cubierta entérica.

Indicaciones terapéuticas

Aún en otro aspecto, se proporciona un método para fabricar una composición farmacéutica, que comprende las etapas de: (a) producir una mezcla que comprende un BBI descrito en la presente descripción y un ingrediente activo; y (b) formular la mezcla en una formulación farmacéuticamente aceptable.

Aún en otro aspecto, se proporciona un método para fabricar una composición farmacéutica, que comprende las etapas de: (a) producir una mezcla que comprende un KTI3 descrito en la presente descripción y un ingrediente activo; y (b) formular la mezcla en una formulación farmacéuticamente aceptable.

Como se hace referencia en la presente descripción, la etapa de formulación comprende las etapas de agregar opcionalmente excipientes, moler, recubrir y similares, según sea apropiado para la composición farmacéutica deseada. Estas etapas están dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

En determinadas modalidades, un ingrediente activo al que se hace referencia en la presente descripción es sensible a la degradación o inactivación en el tracto digestivo humano.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica oral descrita en la presente descripción para administrar por vía oral un ingrediente activo a un sujeto. En determinadas modalidades preferidas, el ingrediente activo es sensible a la degradación o inactivación en el tracto digestivo humano. En modalidades más específicas, el ingrediente activo puede ser una proteína terapéutica. En otras modalidades, el ingrediente activo es una molécula no proteica que es sensible a la degradación o inactivación en el tracto digestivo humano.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica descrita en la presente descripción para usar en un método para tratar la diabetes en un humano, donde, en algunas modalidades, la proteína terapéutica es en diversas modalidades insulina, exenatida o una de sus combinaciones.

En un aspecto adicional, se proporciona una composición farmacéutica descrita en la presente descripción para usar en un método para tratar la diabetes inestable en un humano. En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica descrita en la presente descripción para usar en un método para tratar un nivel elevado de glucosa en sangre en ayunas en un humano.

Diabetes inestable

Los médicos expertos en la técnica apreciarán que la diabetes inestable, también conocida como labilidad glucémica, puede diagnosticarse mediante una serie de procedimientos estándar aceptables. Uno de tales procedimientos aparece en Ryan y otros, 2004. En este procedimiento, se pide a los sujetos que monitoreen sus niveles de glucosa con un mínimo de 2 lecturas de glucosa capilar al día. Los pacientes registran en hojas todos los valores de glucosa medidos y los detalles sobre los casos de hipoglucemia durante un período de 4 semanas (Figura 11A-B). En cualquier ocasión en que la glucosa se registre como <3,0 mmol/l, se le pide al sujeto que describa los detalles del evento en el cuestionario (Figura 12), incluidos los síntomas que se presentan y si se obtiene ayuda externa de un tercero para reconocer o tratar la reacción hipoglucémica. Una reacción se considera severa si el individuo perdió el control de la situación y requirió ayuda externa para tratar el evento de hipoglucemia. Otros de tales métodos implican el cálculo del índice MAGE (Service y otros, 1970) o el "valor M" (Schlichtkrull y otros) o utilizan sistemas de monitorización continua de la glucosa (Kesslery otros). La diabetes inestable se asocia típicamente con niveles elevados de glucosa en sangre en ayunas y/o episodios de hipoglucemia.

Métodos de aislamiento de inhibidores de proteasa

Aún en otro aspecto, se proporciona un método para purificar el BBI a partir de un producto de soja, por ejemplo, harina de soja, que comprende las etapas de: a) obtener una mezcla líquida que comprende un extracto del producto de soja, en donde la mezcla líquida es una solución acuosa tamponada con pH que tiene un pH de entre 5,5-7,5 inclusive, con una concentración de sal de menos de 50 mM; y b). someter la solución a cromatografía de exclusión por tamaño, utilizando una fase estacionaria que comprende una resina cargada positivamente y un material de polímero de polisacárido, en donde la cromatografía de exclusión por tamaño comprende un gradiente de sal discontinuo, en donde la concentración de sal de la solución usada en la primera etapa es menor a 40 mM, preferentemente menor a 20 mM, y la concentración de sal de una solución usada en una etapa posterior (típicamente, pero no necesariamente, la segunda etapa) está entre 40-85 mM, con mayor preferencia 50-80 mM, con mayor preferencia 60-80 mM, con mayor preferencia 65-75 mM, lo más preferentemente 70 mM.

Alternativamente o adicionalmente, el método anterior comprende además la etapa previa de extraer harina de soja en un tampón con un pH de 4,5, en presencia de 80-120 mM de NaCl, con mayor preferencia de NaCl 100 mM, y en algunas modalidades ajustar subsecuentemente el pH a 4,5, seguido, alternativamente o adicionalmente, de una clarificación en un filtro prensa. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa previa (antes de la etapa mencionada anteriormente de obtener una mezcla líquida con un pH de entre 5,5-7,5, pero subsecuentemente a la extracción de la harina de soja) de precipitar la preparación líquida inicial de la harina de soja mediante el uso de 30-40 % sulfato de amonio de saturación (AS), con mayor preferencia 35 % de saturación, en algunas modalidades bajo refrigeración, por ejemplo, a una temperatura de 12-17 °C. En modalidades adicionales, el precipitado se recoge luego por centrifugación, por ejemplo, en una centrífuga tubular continua. Aún en otras modalidades, la píldora del AS se extrae, en determinadas modalidades en un tampón de fosfato de pH 7,0-8,0, después, opcionalmente, se aclara mediante centrifugación. En otras diversas modalidades, el sobrenadante resultante se dializa frente a agua, o alternativamente, fosfato de sodio 10 mM, tampón de pH 6,0-7,0, se aclara mediante centrifugación y/o liofilización.

En modalidades más específicas, el método anterior comprende además las etapas de aislar el KTI mediante el lavado de la columna con un tampón de 90-120 mM, con mayor preferencia 100 mM, y eluir el KTI con un tampón de más de 150 mM, preferentemente 180 mM. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de retirar los microorganismos mediante filtración (un ejemplo no limitativo es un filtro de 0,45/0,2 pm). Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de filtración a través de un filtro de 20000 a 40000 MWCO, preferentemente de 30 000 MWCO, y el mantenimiento del permeado. Esta etapa se realiza preferentemente en presencia de una concentración de sal de 0,15-0,5 M, con mayor preferencia 0,18 M. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de concentrar la solución resultante con un filtro de 5000 MWCO y mantener el retenido. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de diafiltrar la solución resultante con un filtro de 10000 MWCO y mantener el retenido, por ejemplo, en tampón de fosfato de sodio con un pH de 7,0-8,0. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de liofilizar el producto líquido final.

Aún en otro aspecto, se proporciona un método para purificar el KTI3 (Inhibidor de Tripsina 3 de Kunitz) a partir de un producto de soja, que comprende las etapas de: a). obtener una mezcla líquida que comprende un extracto del producto de soja, en donde la mezcla líquida es una solución acuosa tamponada por pH que tiene un pH entre 6-7 inclusive, con una concentración de sal de menos de 50 mM; y b) someter la solución a cromatografía de exclusión por tamaño, utilizando una fase estacionaria que comprende una resina cargada positivamente y un material de polímero de polisacárido, en donde la cromatografía de exclusión por tamaño comprende un gradiente de sal discontinuo, en donde la concentración de sal de la solución usada en una etapa de lavado (ya sea la primera etapa o una etapa posterior) es superior a 80 mM, y la concentración de sal de una etapa posterior (en donde se eluye el KTI3) está entre 140-250 mM inclusive, preferentemente entre 160-220 mM inclusive, con mayor preferencia entre 170-200 mM inclusive, con mayor preferencia 180 mM.

Alternativamente o adicionalmente, el método anterior comprende además la etapa previa de extraer harina de soja en un tampón con un pH de 4,5, en presencia de NaCl 80-120 mM, con mayor preferencia NaCl 100 mM. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa previa de precipitar la preparación líquida inicial de la harina de soya mediante el uso de sulfato de amonio con una saturación de 30-40%, con mayor preferencia con una saturación de 35%. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de retirar los microorganismos mediante filtración (un ejemplo no limitativo es un filtro de 0,45/0,2 pm). Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de concentrar la solución resultante con un filtro de 5000 MWCO y mantener el retenido. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de diafiltrar la solución resultante con un filtro de 10.000 MWCO y mantener el retenido. Alternativamente o adicionalmente, el método comprende además la etapa de liofilizar el producto líquido final.

La "mezcla líquida" a la que se hace referencia anteriormente puede ser en determinadas modalidades, una solución, una suspensión o una de sus combinaciones. En modalidades preferidas, su concentración de sal es menor que 40 mM, con mayor preferencia menor que 30 mM, con mayor preferencia menor que 20 mM, con mayor preferencia menor que 10 mM. Más preferentemente, no se ha añadido sal. En otras modalidades, el pH de la mezcla líquida está entre 6-7 inclusive.

La resina cargada positivamente usada en los métodos anteriores puede ser en algunas modalidades, un grupo funcional de amina terciaria de dietilaminoetilo (DEAE). Alternativamente o adicionalmente, el material de polímero de polisacárido se reticula a través de cadenas laterales de lisina. Un ejemplo no limitante de tal material es Sepharose™, una forma reticulada de perlas de un material polimérico de polisacárido que se extrae de algas marinas.

En determinadas modalidades, el método descrito para aislar inhibidores de proteasa no utiliza un reactivo que contiene PEG.

Métodos de producción de composiciones farmacéuticas.

En la presente descripción también se proporcionan métodos de producción de composiciones farmacéuticas. En determinadas modalidades, el método comprende las etapas de combinar opcionalmente Gelucire fundido (por ejemplo, Gelucire 44/14) con aceite de pescado, enfriar la mezcla y luego agregar, en forma de polvo, EDTA, SBTI, aprotinina y una proteína o péptido terapéutico. por ejemplo, insulina, o en otras modalidades, exenatida, aunque los expertos en la técnica apreciarán a la luz de los presentes hallazgos que también pueden usarse otras proteínas o péptidos terapéuticos. En otras modalidades, el método comprende las etapas de combinar opcionalmente Gelucire fundido (por ejemplo, Gelucire 44/14) con aceite de pescado, enfriar la mezcla y luego agregar, en forma de polvo, EDTA, BBI y una proteína o péptido terapéutico. En determinadas modalidades, los componentes en polvo se añaden en el orden indicado. En otras modalidades, la mezcla resultante se mezcla y/u homogeneiza opcionalmente.

Cualquiera de las alternativas de las características únicas tales como la pureza del BBI, la pureza del KTI, la naturaleza de la proteína o la naturaleza del componente líquido, etcétera se establecen en la presente descripción como "modalidades", debe entenderse que tales alternativas pueden combinarse libremente para formar modalidades discretas de toda la formulación proporcionada en la presente descripción.

El término “consiste esencialmente de”, como se usa en la presente descripción, limita el alcance de la invención a los materiales o etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la invención reivindicada.

Sección de detalles experimentales

Ejemplo 1: producción a pequeña escala de formulaciones mejoradas del KTI y el BBI

Información general

Los protocolos previos para producir el SBTI a partir de harina de soja generaron inhibidores de proteasa crudos con un rendimiento del 1 %. Los experimentos siguientes se realizaron para desarrollar un método de producción de materiales a granel separados del KTI (Inhibidor de Tripsina de Kunitz) con una actividad de inhibidor de tripsina (TI) y el BBI (Inhibidor Bowman-Birk) con una actividad de inhibidor de tripsina/quimotripsina (CTI), donde cada producto se prepara bajo sus propias especificaciones a altos niveles de actividad enzimática, se mejora el rendimiento y se minimizan los contaminantes de alto peso molecular (MW).

El proceso de producción implica dos grandes fases:

Parte 1: Producción del intermediario del SBTI a partir de harina de soja. El SBTI crudo se precipita del sobrenadante con sulfato de amonio (AS) y se recoge mediante centrifugación. La proteína se extrae y se dializa para eliminar el exceso de AS. El extracto dializado se liofiliza, analiza y denomina "intermediario del SBTI" (Figura 1A).

Parte 2: Purificación aguas abajo del intermediario del SBTI para producir el BBI y el KTI purificado. El intermediario del SBTI se carga en una columna de flujo rápido DEAE-Sepharose™. El KTI y el BBI se eluyen por separado mediante gradientes escalonado de sal. El BBI se purifica aún más para reducir los contaminantes de alto MW mediante filtración a través de un filtro de corte de peso molecular (MWCO) de 30000. La formulación final se prepara en tampón de fosfato antes de la liofilización (Figura 1B).

Varios parámetros de los procesos que se muestran en la Figura 1 se alteraron, incluso: el tipo de harina de soya usada como material de partida, el pH y el nivel de sal del tampón de extracción, los porcentajes de AS usados para la precipitación, el pH y el nivel de sal del tampón usado para la carga de la columna y las condiciones de elución (gradiente continuo de sal versus un gradiente escalonado).

Se usó harina de soya 7B (harina de soya desgrasada y mínimamente procesada con calor, producida por Archer Daniels Midland Company Decatur, IL). El pH preferido para la extracción fue de 4,5, lo que produjo un nivel mucho más bajo de proteínas no relevantes, mientras que mantuvo el nivel del KTI y el BBI relativamente alto. Una precipitación continua del material se observó en ausencia de sal; la adición de sal al tampón de extracción mejoró el proceso considerablemente al evitar la precipitación. Usar AS al 35 % para la precipitación de proteínas dio como resultado un nivel mucho más bajo de proteínas de alto MW, mientras que el nivel del KTI y el b Bi fue mínimamente afectado. Usar el tampón de carga de columna de pH-6,5 redujo la cantidad de proteínas no relevantes unidas a la columna DEAE-Sepharose. La elución por gradiente de sal escalonado resultó en una mejor separación del BBI del KTI y de otras proteínas no relevantes. El BBI se purificó eficazmente mediante filtración a través de un filtro de 30000 MWCO en presencia de NaCl 0,5 M.

Ejemplo 2: Producción mejorada del SBTI a gran escala

Se realizaron tres experimentos a mayor escala mediante el uso de 25 kilogramos (kg) de harina de soya. La recolección de extractos se realizó con el uso de una centrífuga de pila de discos (Westfalia; los dos primeros experimentos) o con un filtro de prensa (tercer experimento). 50% del material se perdió con la centrífuga Westfalia, mientras que no se observó pérdida de extracto con el filtro de prensa. El protocolo y los resultados analíticos del tercer experimento se muestran en las tablas 1-2, respectivamente.

Tabla 1. Preparación del Intermediario del SBTI a gran escala

Tabla 2. Resultados analíticos del intermediario del SBTI.

A continuación, el intermediario del SBTI se sometió al proceso de purificación aguas abajo que se muestra en la Tabla 3. Los resultados analíticos del KIT y el BBI obtenidos se muestran en las Tablas 4-5, respectivamente.

Tabla 3. Preparación aguas abajo a gran escala del BBI y el KTI purificados.

Tabla 4. Resultados analíticos del KTI purificado.

Tabla 5. Resultados analíticos del BBI purificado.

Se logró una clara separación de las fracciones del KTI y el BBI (Figura 2). La elución se realizó con gradiente de NaCl de 0 a 0,14 M, de 0,14 a 0,18 M y de 0,18 a 0,4 M. Conductividad y OD280 se determinaron para cada fracción. El BBI agrupado se recolectó de las fracciones 18-28. El KTI agrupado se recolectó de las fracciones 42-57.

Los productos de cada grupo fueron analizados por SDS-PAGE. En cada caso se obtuvo un producto de alta pureza (Figura 3).

Por lo tanto, se lograron mejoras significativas en el método sintético y el producto resultante.

Tabla 6. Un resumen de las características de diferentes preparaciones.

Ejemplo 3: Protocolo de purificación alternativo del BBI y el KTI aguas abajo

Descripción de los cambios

Se realizaron numerosos cambios en el protocolo de purificación aguas abajo:

1. Adición de timerosal a los agrupados recolectados de las columnas.

Se encontró que los lotes del BBI preparados sin timerosal contenían un alto recuento microbiano aeróbico total (UFC/G) que estaba por encima de la especificación de carga biológica de <100 UFC/G. Los resultados del recuento microbiano aeróbico total (UFC/G) fueron: KTI, Lote 1: 0; BBI, Lote 2: 15,4; BBI, Lote 3: 61,6; BBI, Lote 4: 15,4. Por lo tanto, se añadió timerosal a los grupos que se recolectaron de la columna a una concentración final de 0,01 %. Se encontró que todos los lotes subsecuentes estaban dentro de la especificación de carga biológica. Los recuentos totales de levaduras y mohos fueron cero para todos los lotes.

2. Gradientes de sal mejorados.

Con el fin de separar mejor el BBI del KTI, se realizó un gradiente de sal escalonado, mediante el uso de tampones preparados previamente con conductividad conocida.

3. Proceso de filtración mejorado

El proceso de filtración de 30 000 MWCO se adaptó para usar el soporte KVICK™ fuera del sistema en lugar del sistema Uniflux10™. Usar el soporte KVICK permitió el ciclo del material a través de los filtros y el manejo de grandes volúmenes a la vez. La filtración se realizó de forma contenida, en la medida de lo posible.

Se encontró que este cambio minimizaba la pérdida de proteína y actividad del BBI. Antes del cambio, se obtuvieron 40-70 gramos de producto final con una actividad del BBI de 0,4-0,6/mg por lote de purificación. Después se obtuvieron 85-135 gramos de producto final con una actividad del BBI de 0,8-1,4/mg. Además, la solución usada para la ultrafiltración se cambió de NaCl 0,5 M a NaCl 0,18 M.

Protocolo detallado

La purificación aguas abajo se realizó en una instalación cGMP, empezando con lotes de 800 gr y 350 g del intermediario del SBTI. El intermediario se suspendió con 40 l de tampón A y se cargó en la columna DEAE (37 L = CV). Los resultados del control de calidad (QC) para el material cargado fueron 31,47 mgP/ml; KTI: 0,97; BBI: 0,09. La columna se lavó secuencialmente con:

1) 4 x tampón CV A (fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5, 1,5 mSi (miliSiemens por metro);

2) 2,1 x CV tampón A1 (fosfato de sodio 10 mM pH 6,5 NaCl 75 mM, 9,9 mSi);

3) 3 x tampón CV A2 (fosfato de sodio 10 mM pH 6,5 NaCl 100 mM, 12 mSi); y

4) 4 x tampón CV A3 (fosfato de sodio 10 mM pH 6,5 NaCl 180 mM, 21 mSi).

El BBI agrupado consistía en las fracciones F5-F11 y tenía un volumen de 130 l y 1,46 mgP/ml. El KTI agrupado consistía en las fracciones F15-F18 y tenía un volumen de 85 l. Se añadió Timerosal a ambos grupos hasta una concentración final de 0,01%. Se añadió solución madre de NaCl al BBI agrupado hasta una concentración final de NaCl 0,5 M.

A continuación, el BBI agrupado se sometió a filtración, mediante el uso del soporte Kvick, con cinco casetes de 30000 MWCO. Se retuvo el permeado. El KTI agrupado se concentró 5 veces mediante el sistema Uniflux con 3 casetes de 10 000 MWCO hasta un volumen final de 17,5 l. El grupo concentrado se diafiltró contra agua mediante el sistema Uniflux10 con 3 casetes de 10000 MWCO.

Para evaluar la eficacia del protocolo anterior, se realizó una cromatografía en columna a pequeña escala y se evaluaron las diferentes fracciones, lo que arrojó los resultados mejorados que se muestran en las Figuras 4-5, respectivamente. Se encontró que estos resultados eran reproducibles en varias corridas.

Se repitió un protocolo similar para purificar solo el BBI, excepto que se utilizó 3,5 x tampón A que tenía 12,4 mSi y no se realizó la elución del tampón a 3. Adicionalmente, tras ultrafiltrar el BBI agrupado (135 l) con 2 soportes KVICK, mediante el uso de filtros de 30000 MWCO (2 x 0,55 m2), después se concentró el permeado 4,5 veces, mediante el uso del mismo sistema, pero con filtros de 5000 MWCO. El retenido concentrado se diafiltró contra agua en el sistema Uniflux. Las muestras de cada etapa de purificación y el producto final se analizaron mediante SDS-PAGE, de acuerdo con el protocolo de más abajo; los resultados se muestran en las Figuras 6 y 7, respectivamente.

El SDS-PAGE utilizó geles listos para usar(PhastGels™, 20 %, de la Amersham Pharmacia) se ejecutan en un sistema Phast™ (Pharmacia). La solución de tinción fue 50 % de metanol, 10 % de ácido acético, y 0,05 % de Azul Brillante. La solución de decoloración fue 30 % de metanol, 10 % de ácido acético.

Se analizó una muestra de cada etapa para determinar la concentración de proteína y la actividad del BBI. Los resultados se resumen en la Tabla 7. Para el producto final, la imagen cuantificada mostró 84,4 % - 84,9 % para la banda del BBI.

Tabla 7: Rendimiento de proteína y actividad durante las etapas de purificación de BBI.

* El material contiene 10 % de agua, por tanto, el resultado de la actividad es 0,9 sobre la base del peso seco.

En la Figura 8 se muestra un diagrama de flujo del protocolo mejorado.

Antes de las mejoras descritas en los Ejemplos 1-3, las purificaciones del SBTI a gran escala produjeron 40-70 gramos de producto final por lote de purificación, con una actividad del BBI de 0,4-0,6/mg (mientras que se obtenía una actividad algo mayor en preparaciones a menor escala, esto podría no ser escalado exitosamente). Los cambios permitieron un rendimiento de 85-135 gramos de producto final con una actividad del BBI de 0,8-1,4/mg.

Ejemplo 4: Protocolo de purificación del BBI y el KTI aguas abajo mediante el uso de microfiltración

El protocolo en este Ejemplo se realizó sin timerosal. Comenzando con el intermediario del SBTI, la cromatografía en columna DEAE se realizó de manera similar al último Ejemplo, pero con parámetros ligeramente diferentes, como sigue:

3 x tampón CV A (fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5, 1,5 mSi)

2,1 x tampón CV A1 (fosfato de sodio 10 mM pH 6,5 NaCl 70 mM, 9,9 mSi)

3.5 x tampón CV A2 (fosfato de sodio 10 mM pH 6,5 NaCl 100 mM, 12,4 mSi)

3.5 x tampón CV A3 (fosfato de sodio 10 mM pH 6,5 NaCl 180 mM, 21 mSi)

Los resultados se muestran en la Figura 9.

El BBI agrupado

El BBI agrupado, 130 l, se recolectó y filtró a través de un Filtro Sartobran™ 0,45/0,2 pm (filtro de 0,6 m2).

El KTI agrupado

El KTI, 95 l, se recolectó y se filtró a través de un filtro Sartobran™ de 0,45/0,2 pm (filtro de 0,6 m2) y almacenado a -20 °C. Volumen final = 20 l.

Filtración de 30000 MWCO

El conjunto del BBI se ajustó a una concentración de NaCl de 0,18 M y se sometió a filtración mediante el uso de soportes 2 * Kvick™, cada uno con 5 casetes de 30000 MWCO. Se recolectó el permeado, después de cuatro lavados, 195 l en total

Concentración

El permeado de 30000 MWCO se concentró 5 veces a través de 2 soportes KVICK, cada uno con cinco casetes de 5000 MWCO en cada uno. Volumen final = 34 l.

Diafiltración

El material concentrado se diafiltró contra agua purificada mediante el uso de un sistema Uniflux10 con filtros de 5 * 10 000 MWCO a una conductividad de menos de 1 mSi/cm.

Se añadió tampón de formulación (tampón de fosfato de sodio 0,5 M, pH 7,6) y la muestra se pasó a través de un filtro de 0,45/0,2 |jm directamente a las Bandejas de Secado por Congelación Gore® Lyoguard®.

Liofilización

Después de la liofilización, se obtuvo 95 g de material seco y se recolectó en botellas de vidrio color ámbar.

Todas las botellas fueron muestreadas por QC: Se encontró que el contenido de agua era de 8 % por el método de Karl Fischer.

Se analizaron dos muestras por duplicado mediante SDS-PAGE y se cuantificó el gel mediante el uso de un generador de imágenes. El BBI en ambos carriles estaba en 93,5-93,8 % de pureza (Figura 10).

Las muestras de cada etapa de purificación del BBI se analizaron para determinar la concentración de proteínas, la actividad del BBI y la carga biológica. La Tabla 8 resume la cantidad y calidad de BBI a lo largo del proceso de purificación:

Tabla 8: Etapas de purificación de BBI, cantidad, características y carga biológica.

TNTC = demasiado numeroso para contar

Purificación del KTI:

Concentración del KTI

El KTI agrupado microfiltrado se sacó del almacenamiento en frío y se concentró mediante el uso de soportes 2 * KVICK con 5 filtros MWCO de 5 KDa cada uno. Volumen final = 17 L

Diafiltración del KTI

El material concentrado se diafiltró contra agua mediante Uniflux con filtros de 5 * 10000 MWCO. Volumen final = 20l Se añadió el tampón de formulación y la muestra se pasó a través de un filtro de 0,45/0,2 pm directamente a las bandejas de liofilización de Gore.

Liofilización

El producto liofilizado se eliminó y se transfirió a 4 botellas de vidrio ámbar.

Las muestras de cada etapa de purificación del KTI se analizaron para determinar la concentración de proteínas, la actividad del KTI y la carga biológica. La Tabla 9 resume la cantidad y calidad del KTI a lo largo del proceso de purificación:

Tabla 9: Etapas de purificación de KTI, cantidad, características y carga biológica.

Conclusiones

1. El intermediario del SBTI tiene una carga biológica relativamente alta, que puede eliminarse mediante la segunda microfiltración.

2. Los productos finales después de la microfiltración están dentro de las especificaciones requeridas. 3. El uso de microfiltración no tiene un efecto significativo sobre el rendimiento o la actividad específica del BBI y el KTI.

Ejemplo 5: Identificación de emulsionantes efectivos para preparaciones homogéneas de insulina/aceite de pescado

Se encontró que las formulaciones anteriores de insulina en aceite de pescado precipitaban lentamente; por lo tanto, no eran adecuados para la preparación de formas de dosificación farmacéutica a gran escala. Nuevas formulaciones conteniendo 3,375 g. Se analizaron los SBTI por 22,5 g de aceite de pescado y que contenían los siguientes emulsionantes: lecitina (secuencia de ensayo 1), Polisorbato 80 (Tween-80) (secuencia 2) o Gelucire 44/14 (secuencia 3), solos o en combinación entre sí o monoestearato de glicerol (GMS) (Figura 11). Subsecuentemente, las formulaciones más prometedoras (indicadas con un asterisco) se produjeron de nuevo mediante la fundición del Gelucire (que era un sólido ceroso a temperatura ambiente) y luego añadiéndolo al aceite de pescado. Después de enfriar esta mezcla, los componentes sólidos se agregaron en forma de polvo en el siguiente orden: EDTA, SBTI, aprotinina e insulina; y el líquido resultante se mezcló y homogeneizó en un molino de rodillos.

Ejemplo 6: Pruebas in vivo en animales de diversas Formulaciones de Emulsionantes

Materiales y Métodos Experimentales

Formulaciones

Las formulaciones que se evaluaron se muestran más abajo en la Tabla 10. Los porcentajes de emulsionantes dados son peso/peso con respecto al peso de los líquidos presentes.

Tabla 10. Formulaciones usadas en este Ejemplo.

Mantenimiento

Animales: Para el estudio solo se usaron cerdos sanos, certificados por un veterinario clínico. Alojamiento: Solitario cuando con CVC y agrupado en otras ocasiones. Lecho: Hormigón virutas de madera. Iluminación: Ciclo de luz de 12-12 h. Temperatura: 19-25 °C.

Identificación

Cada animal se identificó de únicamente a través de etiquetas en las orejas.

Diseño experimental

Se privó a los animales de alimentos 24-36 horas antes de la prueba y durante el período de monitoreo subsiguiente. El acceso al agua fue ad libitum.

Los animales fueron anestesiados con 20 mg/kg de ketamina 2 mg/kg de xilazina. Los cerdos en ayunas y anestesiados se colocaron sobre su lado izquierdo antes de administrar las formulaciones líquidas bajo guía endoscópica, directamente al duodeno. Después de la inyección de la formulación, se inyectó 1 ml aceite de pescado, seguido de 10 ml de aire, para enjuagar el aparato, asegurando de esta manera la administración de todos los materiales. Después, los cerdos se devolvieron a sus corrales para permitir su recuperación total del tratamiento anestésico, que requirió 10-15 minutos. Se extrajeron periódicamente muestras de sangre (de las cuales se analizaron 0,5 ml) del catéter de la línea central (CVC) durante el siguiente período de monitoreo de 240 minutos. Se determinaron las concentraciones de glucosa en sangre de cada muestra, en cada punto de tiempo. Los lechones se trataron por vía intravenosa con gentamicina (100 mg/10 kg) después de cada día de experimento para evitar infecciones. En los casos en que las concentraciones de glucosa cayeron por debajo de 30 mg/dl, se sirvió comida comercial para cerdos a los lechones y se monitorearon las concentraciones de glucosa por unos 30 minutos adicionales.

Se impuso un período de lavado de al menos 2 días entre los días de prueba.

Resultados

Se evaluaron 10 formulaciones de insulina y aceite de pescado con diferentes emulsionantes para determinar la actividad in vivo sobre los niveles de glucosa en sangre en 2 experimentos separados. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11. Resultados del Experimento 6A. Los tres números en cada cuadro indican el valor inicial, el valor más bajo y el final (20 mg/dl). "Bajo" indica un valor de menos de 20 mg/dl.

Los resultados del Experimento 6B, representados en la Figura 12, muestran que, aunque todas las formulaciones fueron eficaces, las formulaciones E y F de la Tabla 10 indujeron las caídas más uniformemente agudas en los niveles de glucosa.

Ejemplo 7: Pruebas clínicas de formulaciones de proteínas orales que contienen el SBTI mejorado

Se realizó un estudio para determinar la seguridad, la farmacocinética y la farmacodinámica de las formulaciones de insulina oral descritas en voluntarios sanos. Los sujetos recibieron una dosis única de una de las siguientes formulaciones de tabletas de insulina oral en visitas separadas. Cada dosis fue seguida por un período de lavado de 72 horas. Las dosis se administraron en la mañana después de un ayuno nocturno de 8 horas.

Grupos de tratamiento

1. 1 cápsula de la Formulación de Insulina de 8 mg: 8 mg de Insulina, 150 mg de EDTA, 75 mg en total de una mezcla del BBI purificado y el KTI purificado, 150000 U de Aprotinina y 12 % de Gelucire 44/14.

2. 1 cápsula de la Formulación de Insulina de16 mg: 16 mg de Insulina, 150 mg de EDTA, 75 mg en total de una mezcla del BBI purificado y el KTI purificado, 150000 U de Aprotinina recombinante y 12 % de Gelucire 44/14.

3. 2 cápsulas de la Formulación de Insulina de 8 mg.

Fase de selección:

Las siguientes evaluaciones se realizaron después de que el sujeto firmara el consentimiento informado:

• Historial médico

• Examen físico

• Historial de medicación

• ECG

• Signos vitales (presión arterial, frecuencia cardíaca). Los signos vitales se midieron en posición sentada después de al menos 5 minutos de descanso.

• Evaluaciones de laboratorio clínico (química, hematología)

Fase de tratamiento

Los sujetos ingresaron a la clínica en la mañana de la dosificación después de un ayuno nocturno de 8 horas.

Antes de la administración del fármaco del estudio:

• Se insertó un catéter permanente para la recolección de muestras de sangre.

• Se realizó una prueba de glucosa (una gota) 15 minutos (min) antes de la administración del fármaco del estudio • Los signos vitales se registraron 20 min antes de la administración del fármaco del estudio. Los signos vitales se midieron en posición sentada después de al menos 5 minutos de descanso.

• Se recolectaron muestras de sangre para análisis de insulina, glucosa plasmática y péptido c 15 minutos antes de la administración del fármaco del estudio.

Protocolo para la administración de fármacos: El fármaco experimental se administró por vía oral con al menos 300 ml de agua. Los sujetos permanecieron en posición vertical o sentados durante al menos una hora después de tomar la medicación del estudio.

• Los signos vitales (presión arterial, frecuencia cardíaca) se registraron aproximadamente a las 2 y 5 horas (h) después de la administración del fármaco del estudio. Los signos vitales se midieron en posición sentada después de al menos 5 minutos de descanso.

• Se recolectaron muestras de sangre para análisis de insulina, glucosa plasmática y péptido c cada 20 minutos durante la primera hora y después cada 15 min hasta 5,0 h después de la administración del fármaco del estudio.

Después de completar las evaluaciones para cada período, los sujetos fueron alimentados y dados de alta, luego se les pidió que regresaran para el próximo período después de un período de lavado mínimo de 72 horas.

Fin del estudio/interrupción temprana:

Antes del alta de la unidad de investigación, los sujetos se sometieron a las siguientes evaluaciones de fin del estudio:

• Los signos vitales se midieron en posición sentada después de al menos 5 minutos de descanso.

• Evaluaciones de laboratorio clínico (hematología, química)

Los sujetos que interrumpieron antes de tiempo completaron las evaluaciones de fin de estudio en el momento de la interrupción.

Resultados

Las diversas dosis de insulina fueron bien toleradas y no se informaron ni se observaron eventos adversos después de ninguno de los tratamientos. Las respuestas se demostraron en 7/10 sujetos, observándose respuestas máximas de glucosa en sangre para todos los tratamientos después de un retraso de >60 min desde la administración. Se observó una Cmín de glucosa en sangre media significativamente más baja después de los tratamientos de 8+8 mg (47,9 ±11,3 mg/dl, p=0,006) y 16 mg (57,3 ± 8,4 mg/dl, p=0,001), en comparación con el grupo de 8 mg (64,6 ± 6,2 mg/dl). Se observaron reducciones significativas en los valores del área bajo la curva (AUC) de la glucosa después de tratamientos con 8+8 mg y 16 mg (13,2 % y 8,1 %, respectivamente), en comparación con 8 mg (p=0,003 y 0,008, respectivamente) (Figura 15 y la Tabla más abajo). Tales diferencias no se observaron con formulaciones que contenían preparaciones del SBTI de la técnica anterior.

Sumario de los datos del Área Bajo la Curva (AUC) después de la administración de insulina

Ejemplo 8: Pruebas en animales de formulaciones de proteínas orales que contienen el SBTI mejorado

Se realizan análisis adicionales en animales con formulaciones que comprenden el SBTI altamente purificado y un fármaco proteico (por ejemplo, insulina o exenatida), de manera similar a uno o más de los protocolos descritos en la presente descripción. En algunos experimentos, las formulaciones líquidas se recubren con una gelatina y/o una cápsula con cubierta entérica, que puede administrarse por vía oral. En otros experimentos, las formulaciones líquidas se administran directamente al duodeno a través de una cánula o similar. En ciertos experimentos, se permite que los animales coman antes o después de la administración de la formulación, para simular las condiciones preprandiales o posprandiales.

Aún en otros experimentos, se usa el SBTI recombinante como se describió anteriormente. En otros experimentos, se usa el SBTI sintético como se describió anteriormente.

Ejemplo 9: Prueba de formulaciones orales de exenatida que contienen el SBTI mejorado en sujetos humanos

El siguiente estudio se está realizando para evaluar la seguridad, la farmacocinética y la farmacodinámica de las formulaciones orales de exenatida que comprenden el BBI y el KTI purificados y, opcionalmente, 12 % de Gelucire 44/14 en voluntarios sanos y en sujetos con T2D, con detección y tratamiento realizados de manera similar al Ejemplo 7:

Etapa I: La etapa I consta de dos segmentos: El segmento 1 evaluará la seguridad, la tolerabilidad y la PK/PD de dosis crecientes de exenatida oral en voluntarios sanos. En el primer segmento, las dos dosis más bajas de exenatida (150 y 300 |jg) se administrarán aleatoriamente a todos los sujetos sanos en ayunas. Si se considera seguro, se autorizará un mayor aumento de la dosis (450 y 600 jg de exenatida) en el Segmento 2. La dosis tolerable más alta se administrará después a todos los pacientes sanos 60 minutos antes de una comida estándar (Visita 5).

Etapa II: Esta etapa evaluará la respuesta del paciente con T2DM a dosis crecientes de exenatida cuando se suministran 60 minutos antes de una comida estándar. Los controles de placebo pueden incluirse en el estudio, al igual que el tratamiento con un control activo de Byetta (5 jg ) suministrado por vía subcutánea 30 minutos antes de una comida estándar. Además, todos los sujetos con T2DM serán tratados con una cápsula de insulina oral que contiene 16 mg de insulina y con una combinación de insulina oral/exenatida oral, en dos visitas de estudio independientes, 60 minutos antes de servírseles una comida estándar.

Interpretación:

Se calculará y comparará la AUC de las reducciones de glucosa y la fluctuación de la insulina entre los diferentes tratamientos. La eficacia de la formulación se demostrará mediante fluctuaciones de insulina en el grupo tratado con GLP-1 oral que son mayores que las del grupo no tratado con GLP-1 y/o fluctuaciones más pequeñas de glucosa en el grupo tratado con GLP-1 oral.

Aún en otros experimentos, se usa el BBI recombinante (opcionalmente con el KTI y/o aprotinina) como se describió anteriormente en lugar del BBI y el KTI purificados. En otros experimentos, se usa el BBI sintético (opcionalmente con el KTI y/o aprotinina) como se describió anteriormente en lugar del BBI y el KTI purificados.

Ejemplo 10: Prueba de formulaciones de insulina oral que contienen el SBTI mejorado en sujetos humanos

El siguiente estudio se está realizando para evaluar la seguridad y la farmacodinámica de dosis múltiples al acostarse de formulaciones de insulina oral que comprenden el BBI purificado y el KTI y, opcionalmente, 12 % de Gelucire 44/14, en pacientes adultos con T2DM que están inadecuadamente controlados con dieta y metformina, con detección y tratamiento realizados de manera similar al Ejemplo 7:

Objetivos principales: Evaluar los efectos farmacodinámicos de la formulación sobre los niveles medios de glucosa durante la noche y los parámetros de seguridad (por ejemplo, hipoglucemia) y evaluar la seguridad, que incluye la incidencia de hipoglucemia y eventos cardiovasculares. Los puntos finales primarios de eficacia estarán determinados por:

• El efecto de 24 mg de insulina en los niveles de glucosa nocturnos medios ponderados basados en dos noches de datos* (monitorización continua de glucosa (CGM)), determinado por comparación de:

a) El cambio del por ciento medio entre la línea base (período inicial) y el tratamiento con insulina de 24 mg para

b) El cambio del por ciento medio entre la línea base y el tratamiento con placebo para el grupo receptor del placebo.

• Los "datos de la CGM", como se usa en la presente descripción, siempre se basan por completo en la recogida de datos dentro de las primeras seis horas después del tratamiento con medicamentos orales.

• El efecto de 16 mg de insulina en los niveles de glucosa nocturnos medios ponderados en dos noches de datos de la CGM determinados por comparación de:

a) El cambio del por ciento medio entre la línea base (período inicial) y el tratamiento con insulina de 16 mg para

b) El cambio del por ciento medio entre la línea base y la Semana 4 del tratamiento con placebo para el grupo receptor del placebo.

Objetivos secundarios: Para evaluar los cambios en la línea de base en la glucosa en sangre en ayunas (FBG), la insulina sérica matutina en ayunas, el péptido c, los triglicéridos y la HbA1c. Los criterios de valoración secundarios estarán determinados por:

• El efecto de 24 mg de insulina y/o 16 mg de insulina en los niveles de glucosa nocturnos promedio ponderados se determinará mediante la comparación de los niveles de glucosa nocturnos promedio ponderados para los grupos tratados con insulina versus al grupo receptor del placebo.

• El efecto de 24 mg de insulina y/o 16 mg de insulina en los cambios desde la línea base hasta la fase de tratamiento en la glucosa en sangre matutina en ayunas, la insulina sérica matutina en ayunas, el péptido C matutino en ayunas, la HbA1c y los triglicéridos.

• El efecto de 24 mg de insulina y/o 16 mg de insulina en los cambios desde la línea base hasta la fase de tratamiento en la glucosa media evaluada mediante la CGM.

Aún en otros experimentos, se usa el BBI recombinante (opcionalmente con el KTI y/o aprotinina) como se describió anteriormente en lugar del BBI y el KTI purificados. En otros experimentos, se usa el BBI sintético (opcionalmente con el KTI y/o aprotinina) como se describió anteriormente en lugar del BBI y el KTI purificados.

Ejemplo 11: Prueba de formulaciones de insulina oral que contienen el SBTI mejorado en el tratamiento de la diabetes inestable

Sujetos con diabetes inestable (por ejemplo, sujetos que tienen un nivel de hemoglobina glicosilada [HgA1c] de 8­ 10 %) se monitorean durante varios días mediante el uso de un monitor continuo de glucosa a ciegas (CGM) para establecer una línea base. Durante varios días subsecuentes, se les administra una formulación que contiene insulina descrita en la presente descripción, opcionalmente mediante el uso de formulaciones de la técnica anterior como grupo de control, antes de las comidas. Se realiza un CGM a ciegas para determinar la eficacia de las formulaciones.

Aún en otros experimentos, se usa el BBI recombinante (opcionalmente con el KTI y/o aprotinina) como se describió anteriormente en lugar del BBI y el KTI purificados. En otros experimentos, se usa el BBI sintético (opcionalmente con el KTI y/o aprotinina) como se describió anteriormente en lugar del BBI y el KTI purificados.

Ejemplo 12: Prueba de formulaciones de insulina oral que contienen el BBI mejorado en ausencia de otros inhibidores de la proteasa

Se realizan estudios adicionales, similares a los descritos anteriormente, pero mediante el uso del BBI preparado como se describió en la presente descripción, en ausencia del KTI (por ejemplo, el BBI y la aprotinina como los únicos inhibidores de proteasa), y en otros experimentos, en ausencia de cualquier otro inhibidor de proteasa. La capacidad

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i . Una composición farmacéutica oral que comprende una formulación líquida a base de aceite, en donde dicha formulación líquida a base de aceite comprende una proteína terapéutica de hasta 100 kilodalton, un quelante de cationes divalentes y un BBI (inhibidor Bowman-Birk) aislado, y cualquiera de;

   (i) dicho BBI se ha purificado hasta al menos un 85 % de pureza, medida mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), o

   (ii) dicho BBI se ha purificado hasta un contenido de proteína mayor al 95 % mediante un ensayo de BCA (ácido bicinconínico), o

   (iii) dicho BBI contiene menos del 0,1 % de contaminantes de alto MW;

   en donde dicha formulación líquida tiene una actividad antiquimotripsina de al menos 40 mg de quimotripsina inhibida por ml de la formulación líquida.
2. 2. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 1, en donde dicha formulación líquida a base de aceite comprende además un inhibidor de tripsina distinto de dicho BBI.
3. 3. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 2, en donde dicho inhibidor de tripsina es el KTI (inhibidor de tripsina de Kunitz), y opcionalmente:

   (i) dicho KTI se ha purificado hasta al menos un 85 % de pureza según lo medido por SDS-PAGE, o (ii) dicho KTI se ha purificado hasta un contenido de proteína mayor al 95 % según lo medido mediante un ensayo BCA, o

   (iii) dicho KTI contiene menos del 0,1 % de contaminantes de alto MW.
4. 4. Una composición farmacéutica oral de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha formulación líquida comprende además una actividad antitripsina de al menos 20 mg de tripsina inhibida por ml de la formulación líquida.
5. 5. La composición farmacéutica oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en insulina, hemaglutinina de influenza, neuraminidasa de influenza, un glucagón, interferón gamma, interferón beta, interferón alfa, hormona del crecimiento, eritropoyetina, GLP -1, un análogo de GLP-1, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), renina, factor liberador de hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, hormona estimulante de la tiroides, hormona estimulante del folículo, calcitonina, hormona luteinizante, glucagón, un factor de coagulación, un factor anticoagulante, factor natriurético auricular, proteína surfactante A (SP-A), proteína surfactante B (SP-B), proteína surfactante C (SP-C), proteína surfactante D (SP-D), un activador del plasminógeno, bombesina, factor de crecimiento hemopoyético (factor estimulante de colonias, múltiple), una proteína del factor de necrosis tumoral (TNF), encefalinasa, RANTES (regulado por activación normalmente expresado y secretado por linfocitos T), proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa), albúmina sérica, sustancia inhibidora de Müller, relaxina, hormona liberadora de gonadotropina de ratón, ADNasa, inhibina, activina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un factor neurotrófico, neurotrofina-3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento similar a la insulina-I y II (IGF-1 e IGF-11), des (1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral), proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFBP-1), IGFBP-2, IGFb P-3, IGFBP-4, Ig Fb P-5, IGFBP-6, un factor de crecimiento de queratinocitos, un factor osteoinductor, proteína morfogenética ósea (BMP)-2, BMP-7, un factor estimulante de colonias (CSF), una interleucina (IL), superóxido dismutasa, factor acelerador de la descomposición, un miembro de la familia de las quimiocinas y un factor del complemento.
6. 6. La composición farmacéutica oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha formulación líquida a base de aceite comprende además un éster de polietilenglicol (PEG) de un monoglicérido, un diglicérido, un triglicérido o una mezcla de estos.
7. 7. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 6, en donde dicha formulación líquida a base de aceite comprende además un PEG libre.
8. 8. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 6, en donde dicho éster de PEG se proporciona como una mezcla de (a) un monoacilglicerol, un diacilglicerol, un triacilglicerol o una mezcla de estos; y (b) un éster de polietilenglicol (PEG) de un ácido graso.
9. 9. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 8, en donde:

   (i) la parte (a) de dicha mezcla comprende monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles Ca-C-ia, o (ii) la parte (b) de dicha mezcla comprende monoésteres y diésteres de PEG de una mezcla de ácidos grasos C8-C18, o

   (iii) la parte (a) de dicha mezcla comprende monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles C8-C18; la parte (b) de dicha mezcla comprende monoésteres y diésteres de PEG-32 de una mezcla de ácidos grasos C8-C18; dicha formulación líquida a base de aceite comprende además (c) PEG-32 libre; y la relación peso/peso de la parte (a) de dicha mezcla a la suma de la parte (b) de dicha mezcla y (c) está entre 10:90 y 30:70 inclusive y opcionalmente (a), (b) y (c) juntos constituyen 8-16 % peso/peso inclusive de dicha formulación líquida a base de aceite.
10. 10. La composición farmacéutica oral de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, que comprende además un detergente no iónico y, opcionalmente, dicho detergente no iónico es un detergente a base de polisorbato.
11. 11. La composición farmacéutica oral de la reivindicación 10, en donde dicho detergente a base de polisorbato es polisorbato 80, y opcionalmente dicho polisorbato 80 constituye 3-10 % peso/peso inclusive de dicha formulación líquida a base de aceite.
12. 12. La composición farmacéutica oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicha formulación líquida a base de aceite no contiene agua.
13. 13. La composición farmacéutica oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además un recubrimiento que resiste la degradación en el estómago y, opcionalmente, dicho recubrimiento es una cápsula sensible al pH o dicho recubrimiento es una cápsula de gelatina suave.
14. 14. La composición farmacéutica oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para usar en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno, el método comprende la etapa de administrar por vía oral la composición de aceite líquido que comprende la proteína terapéutica a un sujeto.