NO345476B1

NO345476B1 - Bindingsproteiner for hepatocyttvekstfaktor (HGF)

Info

Publication number: NO345476B1
Application number: NO20085421A
Authority: NO
Inventors: May Han; S Kirk Wright; Lyne Breault; Jie Lin; Bijan Etemad-Gilbertson; Christine Knuehl; Jeno Gyuris; William M Winston; Arnold Horwitz
Original assignee: Xoma Technology Ltd; Aveo Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2021-02-22
Also published as: IL219654A0; NO20085421L; IL195037A0; DE602007011923D1; SG158112A1; US7943344B2; AU2007254942A8; JP5735476B2; ATE495195T1; US20080108565A1; US7649083B2; AU2007254942A1; EP2361934A3; US9096664B2; WO2007143090A3; US20110229462A1; JP2009539347A; CA2654025C; EP2361934A2; WO2007143090A2

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsens område er molekylærbiologi, immunologi og onkologi. Nærmere bestemt er området antistoffbaserte bindingsproteiner som binder human hepatocyttvekstfaktor (HGF).

Oppfinnelsens bakgrunn

Hepatocyttvekstfaktor (HGF), også betegnet Scatter Factor (SF), er et flerfunksjonelt, heterodimert protein som hovedsakelig dannes av mesenchym-celler og som er en effektor for celler som uttrykker Met-tyrosinkinase-reseptoren (Bottaro et al. (1991) S<CIENCE >251: 802-804, Rubin et al. (1993) B<IOCHIM>. B<IOPHYS>. A<CTA >1155: 357-371). Den humane Met-reseptor betegnes også ”c-Met”. Moden HGF inneholder to polypeptidkjeder, α-kjeden og β-kjeden. Publiserte undersøkelser tyder på at det er α-kjeden som inneholder c-Met-reseptorbindings-domenet i HGF.

Når HGF bindes til sin tilhørende reseptor, formidler faktoren en rekke cellulære aktiviteter. HGF-Met-signalveien spiller en rolle i regenerasjon av lever, sårheling, nevral regenerasjon, angiogenese og ondartede tilstander. Se f.eks. Cao et al. (2001) P<ROC>. N<ATL>. A<CAD>. S<CI>. USA 98: 7443-7448, Burgess et al. (2006) C<ANCER >R<ES>. 66: 1721-1729, og US patentskrifter nr. 5 997 868 og 5707 624. Forskere har utviklet en rekke HGF-modulatorer, inkludert antistoffer, for behandling av forskjellige forstyrrelser som omfatter HGF-aktivitet, for eksempel visse HGF-responderende kreftformer. Se f.eks. internasjonal patentsøknad WO 2005/017107.

Den basale strukturen som er felles for alle antistoffer, vises skjematisk i figur 1. Antistoffer er multimere proteiner som inneholder fire polypeptidkjeder. To av polypeptidkjedene betegnes tunge kjeder eller H-kjeder, mens to av polypeptidkjedene betegnes lette kjeder eller L-kjeder. Immunglobulinets tunge og lette kjede er bundet sammen med en disulfidbinding mellom kjedene. Immunglobulinets tunge kjede er bundet sammen med en rekke disulfidbindinger mellom kjedene. En lett kjede består av ett variabelt område (VL i figur 1) og ett konstant område (CL i figur 1), mens den tunge kjeden består av ett variabelt område (VH i figur 1) og minst tre konstante områder (CH1, CH2 og CH3 i figur 1). De variable områdene bestemmer antistoffets spesifisitet, mens de konstante områdene har andre funksjoner.

Aminosyre og strukturell informasjon viser at hvert av de variable områdene omfatter tre hypervariable områder (også betegnet komplementaritetsbestemmende områder eller CDR) som flankeres av fire relativt konserverte rammeverkområder eller FR. De tre CDR som betegnes CDR1, CDR2 og CDR3, er ansvarlige for det enkelte antistoffs bindingsspesifisitet. Når antistoffer skal anvendes som diagnostiske og terapeutiske midler, er det typisk ønskelig å fremstille antistoffer som har den høyeste bindingsspesifisiteten og affiniteten for målmolekylet. Det antas at forskjeller i de variable områdene kan ha omfattende virkninger på antistoffets spesifisitet og affinitet.

I WO 2005/017107 A beskrives antistoffer mot humant HGF protein. US patentskrift nr. 5 707 624 beskriver anvendelse av anti-HGF-antistoffer ved behandling av Kaposis sarkom. På tilsvarende måte beskriver US patentskrift nr. 5997 868 behandling av en tumor ved tilførsel av et anti-HGF-antistoff til pasienten som skal behandles slik at evnen til endogent HGF til å fremme angiogenese i tumoren blokkeres. Mer nylig har forskere foreslått at antistoffer som binder β-kjeden i HGF kan ha potensiale for terapeutiske midler i pasienter med HGF-avhengige tumorer (Burgess (2006) supra).

Ikke desto mindre foreligger det fortsatt et behov for ytterligere HGF-modulatorer som kan anvendes som terapeutiske og diagnostiske midler.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen bygger delvis på oppdagelsen av en familie av bindingsproteiner som spesifikt binder HGF, nærmere bestemt human HGF. Bindingsproteinene er antistoffbaserte, da de inneholder antigen (dvs. HGF) bindende seter basert på CFRer fra en familie av antistoffer som spesifikt binder HGF. CDRene tilfører bindingsspesifisiteten til bindingsproteinene overfor HGF. Bindingsproteinene kan anvendes som diagnostiske og terapeutiske midler. Når de anvendes som terapeutiske midler, er bindingsproteinene modifisert (f.eks. humanisert) for å redusere eller eliminere risikoen for induksjon av en immunrespons mot bindingsproteinet når det tilføres til mottakeren (f.eks. et menneske).

Bindingsproteinene nøytraliserer aktiviteten av HGF og kan følgelig anvendes som terapeutiske midler. I visse utførelser forhindrer bindingsproteinene at HGF bindes til sin tilhørende reseptor, c-Met, slik at HGF-aktiviteten nøytraliseres. Fordi HGF har blitt implisert i vekst og proliferasjon av kreftceller, kan bindingsproteinene anvendes for å inhibere proliferasjonen av kreftceller. Når administrert til et pattedyr kan bindingsproteinene videre inhibere eller redusere tumorvekst i pattedyret.

Oppfinnelsen tilveiebringer et isolert bindingsprotein som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), som omfatter:

(a) et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter strukturen CDRH1-CDRH2-CDRH3, hvor

(i) CDRH1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 15, (ii) CDRH2 omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO.: 204 og SEQ ID NO.: 205 og

(iii) CDRH3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 17 og (b) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, hvor

(i) CDRL1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 18,

(ii) CDRL2 omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO.: 19 og SEQ ID NO.: 206 og

(iii) CDRL3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 20, hvor immunglobulinets tunge kjedes variable område og immunglobulinets lette kjedes variable område sammen definerer et enkelt bindingssete for binding av human HGF.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en isolert nukleinsyre, som omfatter en nukleotid-sekvens som koder for et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, hvor

(i) CDRL1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 18, (ii) CDRL2 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 206 og

(iii) CDRL3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 20, og en ekspresjonsvektor, som omfatter nevnte nukleinsyre.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en isolert nukleinsyre, som omfatter en nukleotid-sekvens som koder for et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter strukturen CDRH1-CDRH2-CDRH3, hvor

(i) CDRH1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 15, (ii) CDRL2 omfatter aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO.: 204 og SEQ ID NO.: 205 og

(iii) CDRH3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 17, og en ekspresjonsvektor, som omfatter nevnte nukleinsyre.

Også tilveiebragt er en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleinsyre, som omfatter en nukleotid-sekvens som koder for et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, hvor

(iii) CDRL3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 20, og en nukleinsyre, som omfatter en nukleotid-sekvens som koder for et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter strukturen CDRH1-CDRH2-CDRH3, hvor (i) CDRH1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 15, (ii) CDRL2 omfatter aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO.: 204 og SEQ ID NO.: 205 og

(iii) CDRH3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 17. Oppfinnelsen tilveiebringer også en vertscelle som omfatter minst én ekspresjonsvektor som koder for et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, hvor

(iii) CDRL3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 20.

Også tilveiebragt er en vertscelle som omfatter minst én ekspresjonsvektor som koder for et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter strukturen CDRH1-CDRH2-CDRH3, hvor

(iii) CDRH3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 17. Oppfinnelsen tilveiebringer videre en vertscelle som omfatter minst én ekspresjonsvektor som koder for et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, hvor

(i) CDRL1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 18, (ii) CDRL2 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 206 og (iii) CDRL3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 20, og et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter strukturen CDRH1-CDRH2-CDRH3, hvor

(iii) CDRH3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 17.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som omfatter et immunglobulins tunge kjedes variable område eller en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som omfatter et immunglobulins lette kjedes variable område hvor fremgangsmåten omfatter:

(i) dyrking av vertscellen ifølge oppfinnelsen under betingelser ved hvilke vertscellen henholdsvis uttrykker polypeptidet som omfatter immunglobulinets tunge kjedes variable område eller polypeptidet som omfatter immunglobulinets lette kjedes variable område og

(ii) høsting av henholdsvis polypeptidet som omfatter immunglobulinets tunge kjedes variable område eller polypeptidet som omfatter immunglobulinets lette kjedes variable område.

I ytterligere utførelsesformer omfatter det isolerte bindingsproteinet som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), et immunglobulins lette kjedes variable område og et immunglobulins tunge kjedes variable område valgt fra gruppen som består av:

(a) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 193 og et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 183,

(b) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 193 og et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 189,

(c) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 199 og et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 183 og

(d) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 199 og et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 189.

I en foretrukket utførelsesform omfatter bindingsproteinet et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 199, og et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 189.

I ytterligere utførelsesformer omfatter det isolerte bindingsproteinet som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), et immunglobulins lette kjedes sekvens og et immun-globulins tunge kjedes sekvens valgt fra gruppen som består av:

(a) et immunglobulins lette kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 197 og et immunglobulins tunge kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 187,

(b) et immunglobulins lette kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 197 og et immunglobulins tunge kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 191,

(c) en immunglobulins lette kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 201 og en immunglobulins tunge kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 187; og

(d) en immunglobulins lette kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 201 og en immunglobulins tunge kjedes sekvens som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 191.

I en foretrukket utførelsesform omfatter bindingsproteinet et immunglobulins lette kjede som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 201 og et immunglobulins tunge kjede som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 191.

Også tilveiebragt er bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen for anvendelse i terapi. I visse utførelsesformer er bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen for anvendelse ved inhibering eller reduksjon av proliferasjon av en tumorcelle eller for anvendelse ved inhibering eller reduksjon av tumor vekst i et pattedyr.

I et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et bindingsprotein som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), som er et intakt antistoff, slik som et monoklonalt antistoff, eller et antigenbindende fragment derav, hvor fremgangsmåten omfatter:

(i) dyrking av vertscellen ifølge oppfinnelsen under betingelser slik at vertscellen uttrykker et polypeptid som omfatter immunglobulinets tunge kjedes variable område og et polypeptid som omfatter immunglobulinets lette kjedes variable område og

(ii) rensing av antistoffet eller det antigenbindende fragmentet av antistoffet. Disse og andre aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil bli åpenbare ved en betraktning av de påfølgende figurerer, den detaljerte beskrivelse og kravene.

Beskrivelse av figurene

Oppfinnelsen kan forstås mer fullstendig ved henvisning til de påfølgende figurer. Figur 1 er en skjematisk fremstilling av et typisk antistoff.

Figur 2 er et skjematisk diagram som viser aminosyresekvensen som definerer det fullstendige variable område i immunglobulinets tunge kjede i antistoffene som betegnes 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 og 3D11. Aminosyresekvensen til antistoffene er sammenstilt med hverandre, og områdene som definerer signalpeptidet, CDR1, CDR2 og CDR3, er omrammet. De ikke omrammede sekvensene representerer FR-sekvenser.

Figur 3 er en skjematisk fremstilling som viser CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensen i hver av sekvensene i immunglobulinets tunge kjedes variable område som er vist i figur 2.

Figur 4 er et skjematisk diagram som viser aminosyresekvensen som definerer det komplette variable område i immunglobulinets lette kjede i antistoffene 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 og 3D11. Aminosyresekvensen til antistoffene er sammenstilt mot hverandre, og områdene som definerer signalpeptidet, CDR1, CDR2 og CDR3, er innrammet. De ikke innrammede sekvensene representerer FR-sekvenser.

Figur 5 er et skjematisk diagram som viser CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensen i hver av sekvensene i immunglobulinets lette kjedes variable område som er vist i figur 4.

Figur 6 er en grafisk fremstilling som oppsummerer resultater fra et eksperiment fra måling av den tumorinhiberende aktivitet av anti-HGF-antistoffene 1D3, 1F3, 1A3 og 2B8 i en U87MG-xenotransplantatmodell. Romber tilsvarer PBS, trekanter tilsvarer anti-HGF-antistoff 1A3, X tilsvarer anti-HGF-antistoff 1D3, firkanter tilsvarer anti-HGF-antistoff 1F3, og sirkler tilsvarer anti-HGF-antistoff 2B8.

Figur 7 er en grafisk fremstilling som oppsummerer resultater fra et eksperiment for måling av den tumorinhiberende aktivitet av anti-HGF-antistoffene 1D3, 1F3, 1A3 og 2B8 i en U118-xenotransplantat modell. Romber tilsvarer IgG, firkanter tilsvarer anti-HGF-antistoff 1F3, trekanter tilsvarer anti-HGF-antistoff 1D3, X tilsvarer anti-HGF-antistoff 1A3, og sirkler tilsvarer anti-HGF-antistoff 2B8.

Figur 8 er en tabell som oppsummerer overflate-plasmon-resonans resultater vedrørende den antigenbindende affinitet og kinetikken for interaksjon mellom human HGF og kimære, kimære/humaniserte eller humaniserte 2B8-antistoffer. Tabellen lister opp de analyserte parene av Kappa-lett kjede og IgG1-tung kjede. Antistoffer med angitt standardavvik (STDEV) ble analysert i tre uavhengige eksperimenter.

Figur 9 er et søylediagram som oppsummerer eksperimentelle resultater som viser at Hu2B8 binder en epitop som tilsvarer epitopen til det monoklonale museantistoff 2B8. Humanisert eller kimært 2B8 ble innfanget på en anti-human Fc-brikke. HGF ble så bundet til det humaniserte eller kimære 2B8. Evnen til muse-2B8 eller kontrollantistoffet (polyklonalt anti-HGF-antistoff fra geit) til å binde innfanget HGF, ble målt. Både humaniserte 2B8-antistoffer og kimært 2B8 forhindret binding av muse-2B8 til HGF. Hvite søyler tilsvarer det kimære 2B8-antistoff, grå søyler tilsvarer det humaniserte antistoff Hu2B8 (kappa variabelt område Kv1-39.1 og tung kjedes variable område Hv5-51.1), mens sorte søyler tilsvarer det humaniserte antistoff Hu2B8 (kappa variabelt område Kv3-15.1 og tung kjedes variable område Hv5-51.1).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen bygger delvis på oppdagelsen av en familie av bindingsproteiner som spesifikt binder HGF og nøytraliserer aktiviteten av HGF, nærmere bestemt human HGF. Bindingsproteinene kan anvendes i en rekke forskjellige diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Bindingsproteinene er basert på de antigenbindende setene i et monoklonalt antistoff som har blitt selektert for dets evne til å binde og nøytralisere aktiviteten av HGF. Nærmere bestemt inneholder bindingsproteinene CDR-sekvenser fra variable immunglobulinområder som sammen definerer et bindingssete for HGF.

I lys av disse antistoffenes nøytraliserende aktivitet er de spesielt nyttige for modulering av vekst og/eller proliferasjon av HGF-responderende celler, for eksempel kreftceller. Når de skal anvendes som terapeutiske midler, kan bindingsproteinene modifiseres for å minimalisere eller fjerne risikoen for induksjon av en immunrespons mot bindingsproteinene ved tilførsel til mottakeren. Videre omfattes det, avhengig av den angjeldende anvendelse, at bindingsproteinene kan være konjugert til andre grupper, for eksempel påvisbare markører, for eksempel radioaktive markører, og effektormolekyler, for eksempel andre protein og små-molekyl baserte terapeutiske midler. Alle disse egenskaper og aspekter av oppfinnelsen diskuteres i mer detalj nedenfor.

I - Bindingsproteiner som binder HGF

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert bindingsprotein som binder human HGF. Bindingsproteinet omfatter (i) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, og (ii) et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter tre komplementaritetsbestemmende områder (CDR), hvor det variable immunglobulinets lette kjede område og det variable immunglobulin-tungkjedeområde sammen definerer et enkelt bindingssete for binding av human HGF. Som beskrevet her omfatter CDRL1 aminosyresekvensen X1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, hvor aminosyre X1 er Arg, Lys eller Ser, X2 er Ala eller Thr, X4 er Glu, Gln eller Ser, X5 er Asn, Asp eller Ser, X6 er Ile eller Val, X7 er Asp, Lys, Ser, Val eller Tyr, X8 er en peptidbinding eller Tyr, X9 er en peptidbinding eller Asp, X10 er en peptidbinding eller Gly, X11 er en peptidbinding eller Asn, X12 er en peptidbinding, Ile eller Ser, X13 er Asn eller Tyr, X14 er Ile, Leu, Met eller Val, og X15 er Ala, Asn, His eller Ser. CDRL2 omfatter aminosyresekvensen X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22, hvor aminosyre X16 er Ala, Asp, Arg, Gly eller Val, X17 er Ala, Thr eller Val, X18 er Asn, Ser eller Thr, X19 er Arg, Asn, Lys eller His, X20 er Leu eller Arg, X21 er Ala, Asn, Glu, Val eller Pro, og X22 er Asp, Ser eller Thr. CDRL3 omfatter aminosyresekvensen X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, hvor aminosyre X23 er Leu, Gly eller Gln, X24 er His eller Gln, X25 er Phe, Ser, Trp eller Tyr, X26 er Asp, Ile, Ser, Trp eller Tyr, X27 er Gly, Glu, Asn eller Ser, X28 er Asp, Asn, Phe, Thr eller Tyr, X30 er Leu, Phe, Pro eller Tyr.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert bindingsprotein som binder human HGF og som omfatter (i) et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter strukturen CDRH1-CDRH2-CDRH3 og (ii) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter tre komplementaritetsbestemmende områder (CDR), hvor det variable immunglobulin-tungkjedeområde og det variable immunglobulinets lette kjede område sammen definerer et enkelt bindingssete for binding av human HGF. Som beskrevet her omfatter CDRH1 aminosyresekvensen X1 Tyr X3 X4 X5, hvor aminosyre X1 er Asp, Asn, Ser eller Thr, X3 er Phe, Ser, Trp eller Tyr, X4 er Ile, Leu eller Met, og X5 er Asn, His eller Ser. CDRH2 omfatter aminosyresekvensen X6 Ile X8 X9 X10 X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 X21 X22, hvor aminosyre X6 er Lys, Gln, Glu, Val eller Tyr, X8 er Asn, Gly, Ser, Trp eller Tyr, X9 er Ala, Pro eller Ser, X10 er Gly eller Thr, X11 er en peptidbinding, Asp, Asn, Gly eller Ser, X13 er Asp, Asn, His eller Ser, X14 er Ser eller Thr, X15 er Asn eller Tyr, X17 er Asn eller Pro, X18 er Ala, Asp, Gly, Gln, Glu, Pro eller Ser, X19 er Asn, Lys, Met eller Ser, X20 er Leu, Phe eller Val, X21 er Lys, Met eller Gln, og X22 er Asp, Gly eller Ser. CDRH3 omfatter aminosyresekvensen X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, hvor aminosyre X23 er Arg, Asn, Gln eller Glu, X24 er Gly, Leu, Arg eller Tyr, X25 er en peptidbinding, Asp eller Gly, X26 er en peptidbinding eller Gly, X27 er en peptidbinding eller Tyr, X28 er en peptidbinding, Leu eller Tyr, X29 er en peptidbinding, Gly, Leu, Arg eller Val, X30 er en peptidbinding, Asp, Gly eller Glu, X31 er en peptidbinding, Asn, Arg, Ser eller Tyr, X32 er en peptidbinding, Ala, Gly, Ile eller Tyr, X33 er Met eller Phe, og X34 er Ala eller Asp.

Det skal forstås at bindingsproteinet kan omfatte både immunglobulinets lette kjede og immunglobulinets tunge kjedes sekvensene eller fragmentene derav som er angitt ovenfor. Videre skal det forstås at bindingsproteinet kan være et intakt antistoff, et antigenbindende fragment derav eller et biosyntetisk antistoffsete.

I visse utførelser ligger CDR-sekvensene fra immunglobulinets lette kjede og immunglobulinets tunge kjede mellom rammeverkområder (FR).

I visse andre utførelser ligger CDR-sekvensene fra immunglobulinets lette kjede og immunglobulinets tunge kjede mellom humane eller humaniserte rammeverkområder.

I én utførelse omfatter bindingsproteinet et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter et CDRL1 som omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO. 18 (2B8), et CDRL2 som omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO. 19 (2B8) eller SEQ ID NO. 206 (LRMR2B8LC) og et CDRL3 som omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO. 20 (2B8).

I alle de ovenfor nevnte utførelser er CDRL1-, CDRL2- og CDRL3-sekvensen fortrinnsvis plassert mellom humane eller humaniserte immunglobulin-FR. Det skal forstås at bindingsproteinet kan være et intakt antistoff, et antigenbindende fragment derav eller et biosyntetisk antistoffsete.

I en annen utførelse omfatter bindingsproteinet et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter: et CDRH1 som omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO. 15 (2B8), et CDRH2 som omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO. 204 (LR2B8HC) eller SEQ ID NO. 205 (LRMR2B8HC), og et CDRH3 som omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO. 17 (2B8).

I alle de ovenfor nevnte utførelser ligger CDRH1-, CDRH2- og CDRH3-sekvensen fortrinnsvis mellom humane eller humaniserte immunglobulin-FR. Det skal forstås at bindingsproteinet kan være et intakt antistoff, et antigenbindende fragment derav eller et biosyntetisk antistoffsete.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert bindingsprotein som binder human HGF som omfatter (i) et immunglobulins lette kjedes variable område valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO. 193 (LR2B8LC-den lette kjedens variable område) og SEQ ID NO. 199 (LRMR2B8LC-den lette kjedens variable område), og (ii) et immunglobulins tunge kjedes variable område valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO. 183 (LR2B8HC-den tunge kjedens variable område) og SEQ ID NO. 189 (LRMR2B8LC-den tunge kjedens variable område). Bindingsproteinet kan være et intakt antistoff, et antigenbindende fragment derav eller et biosyntetisk antistoffsete.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert bindingsprotein som binder human HGF som omfatter (i) et immunglobulins lette kjede valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO. 197 (LR2B8LC Kappa konstant (Km(3)- allotype (allel 1)), og SEQ ID NO. 201 (LRMR2B8LC Kappa konstant (Km(3)- allotype (allel 1)), og (ii) et immunglobulins tunge kjede valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO. 187 (LR2B8HC IgG1-konstant (G1m(3)-allotype) (allel 1)) og SEQ ID NO. 191 (LRMR2B8HC IgG1-konstant (G1m(3)-allotype) (allel 1)). Bindingsproteinet kan være et intakt antistoff, et antigenbindende fragment derav eller et biosyntetisk antistoffsete.

Også beskrevet her er et isolert bindingsprotein som binder redusert, human HGF. Bindingsproteinet omfatter (i) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter tre CDR og (ii) et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter tre CDR. De foreliggende CDR ligger typisk mellom FR-områder. De foreliggende CDR i immunglobulinets lette kjede og immunglobulinets tunge kjede definerer sammen et bindingssete som binder redusert, human HGF, f.eks. α-kjeden i redusert HGF. Redusert HGF viser til HGF behandlet med en mengde av et reduksjonsmiddel, for eksempel ditiotreitol (DTT), 2-merkaptoetanol eller glutation, som er tilstrekkelig til å redusere disulfid-bindingen mellom α-kjeden og β-kjeden. Eksempler på konsentrasjoner omfatter for eksempel 100 mM DTT og 5% 2-merkaptoetanol.

Også beskrevet her er et bindingsprotein som omfatter et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter minst ett CDR valgt fra gruppen som består av CDRL1, CDRL2 og CDRL3. Om ønskelig omfatter bindingsproteinet to CDR, for eksempel CDRL1 og CDRL2, CDRL1 og CDRL3 eller CDRL1 og CDRL3. Om ønskelig omfatter bindingsproteinet alle tre CDR, dvs. CDRL1, CDRL2 og CDRL3. CDRL1 som beskrevet her omfatter aminosyresekvensen X1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, hvor aminosyre X1 er Arg eller Lys, X2 er Ala eller Thr, X4 er Glu eller Gln, X5 er Asn, Ser eller Asp, X6 er Ile eller Val, X7 er Tyr, Asp eller Lys, X8 er en peptidbinding eller Tyr, X9 er en peptidbinding eller Asp, X10 er en peptidbinding eller Gly, X11 er en peptidbinding eller Asn, X12 er en peptidbinding eller Ser, X13 er Asn eller Tyr, X14 er Ile eller Leu, og X15 er Ala, Asn eller Ser. CDRL2 omfatter aminosyresekvensen X16 X17 X18 X19 Leu X21 X22, hvor aminosyre X16 er Ala, Asp, Val eller Arg, X17 er Ala eller Val, X18 er Asn, Ser eller Thr, X19 er Arg, Asn eller His, X21 er Ala, Glu, Val eller Pro, og X22 er Asp eller Ser. CDRL3 omfatter aminosyresekvensen X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, hvor aminosyre X23 er Leu eller Gln, X24 er His eller Gln, X25 er Phe, Ser eller Tyr, X26 er Asp, Ile eller Trp, X27 er Gly eller Glu, X28 er Asp, Phe eller Thr, og X30 er Phe, Pro eller Tyr.

Også beskrevet her er et bindingsprotein som omfatter et immunglobulins tunge kjedes variable område som omfatter minst ett CDR valgt fra gruppen som består av CDRH1, CDRH2 og CDRH3. Om ønskelig omfatter bindingsproteinet to CDR, for eksempel CDRH1 og CDRH2, CDRH1 og CDRH3 eller CDRH1 og CDRH3. Om ønskelig omfatter bindingsproteinet alle tre CDR, dvs. CDRH1, CDRH2 og CDRH3. CDRH1 som beskrevet her omfatter aminosyresekvensen X1 Tyr X3 X4 X5, hvor aminosyre X1 er Asp, Asn, Ser eller Thr, X3 er Phe, Trp eller Tyr, X4 er Ile eller Met, og X5 er Asn, His eller Ser. CDRH2 omfatter aminosyresekvensen X6 Ile X8 X9 Gly X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 Lys X22, hvor aminosyre X6 er Lys, Gln eller Tyr, X8 er Gly, Ser eller Tyr, X9 er Pro eller Ser, X11 er Asp, Gly eller Ser, X13 er Asp eller Ser, X14 er Ser eller Thr, X15 er Asn eller Tyr, X17 er Asn eller Pro, X18 er Ala, Asp, Gly eller Glu, X19 er Asn, Met eller Ser, X20 er Phe eller Val, og X22 er Asp eller Gly. CDRH3 omfatter aminosyresekvensen X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 Asp Tyr, hvor aminosyre X23 er Arg eller Gln, X24 er Gly eller Leu, X25 er Asp, Gly eller en peptidbinding, X26 er Gly eller en peptidbinding, X27 er en peptidbinding eller Tyr, X28 er Leu, en peptidbinding eller Tyr, X29 er Gly, Arg eller Leu, X30 er Asp, Gly eller Glu, X31 er Tyr, Arg eller Asn, X32 er Ala, Gly eller Tyr, og X33 er Met eller Phe.

Det skal forstås at bindingsproteinet kan omfatte både immunglobulin-tungkjedeog immunglobulinets lette kjede sekvensen eller fragmenter av disse som bemerket ovenfor. Videre skal det forstås at bindingsproteinet kan være et intakt antistoff, et antigenbindende fragment derav eller et biosyntetisk antistoffsete.

Det skal forstås at alle bindingsproteinene som er diskutert ovenfor, kan være et intakt antistoff, for eksempel et monoklonalt antistoff. Alternativt kan bindingsproteinet være et antigenbindende fragment av et antihistamin eller være et biosyntetisk antistoffbindingssete. Antistoffragmenter omfatter Fab-fragmenter, Fab’-fragmenter, (Fab’)2-fragmenter og Fv-fragments. Teknikker for fremstilling av slike antistoffragmenter er kjent blant fagfolk. En rekke biosyntetiske antistoffbindingsseter er kjent innen faget og omfatter for eksempel enkeltkjedet Fv- eller sFv-molekyler, som for eksempel beskrives i US patentskrift nr. 5476 786. Andre biosyntetiske antistoffbindingsseter omfatter bispesifikke eller bifunksjonelle bindingsproteiner, for eksempel bispesifikke eller bifunksjonelle antistoffer som er antistoffer eller antistoffragmenter som binder minst to forskjellige antigener. For eksempel kan bispesifikke bindingsproteiner binde HGF, for eksempel human HGF, og et annet antigen av interesse. Fremgangsmåter for fremstilling av bispesifikke antistoffer er kjent innen faget og omfatter for eksempel fusjon av hybridomer eller sammenkobling av Fab’-fragmenter. Se f.eks. Songsivilai et al. (1990) CLIN. EXP. IMMUNOL. 79: 315-325; Kostelny et al. (1992) J. IMMUNOL. 148: 1547-1553.

Bindingsproteinene ifølge oppfinnelsen kan binde hHGF som inneholder en cysteintil arginin-substitusjon i posisjon 561 eller en glysin- til glutamat-substitusjon i posisjon 555.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert bindingsprotein som binder human HGF med en kd på 4,0x10<-5 >s<-1 >eller lavere, 3,0x10<-5 >s<-1 >eller lavere eller 2.0x10<-5 >s<-1 >eller lavere. De isolerte bindingsproteinene kan binde human HGF med en kd på fra 5,0x10<-5 >s<-1 >til 0,5x10<-5 >s<-1>, fra 4,0x10<-5 >s<-1 >til 1,0x10<-5 >s<-1 >eller fra 3,0x10<-5 >s<-1 >til 1,5x10<-5 >s<-1>. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert bindingsprotein som binder human HGF med en KD på 100 pM eller lavere, 20 pM eller lavere, 10 pM eller lavere eller 5 pM eller lavere. De isolerte bindingsproteinene kan binde human HGF med en KD på fra 100 pM til 5 pM, fra 20 pM til 5 pM, fra 15 pM til 10 pM, fra 20 pM til 10 pM eller fra 15 pM til 5 pM. Med mindre annet er angitt, bestemmes KD-verdier ved fremgangsmåtene og under betingelsene som beskrives i eksempel 6.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert bindingsprotein som binder human HGF, hvor antistoffet bindes til human HGF med en lavere KD ved 37 °C enn ved 25 °C. Bindingsproteinet binder om ønskelig human HGF med en KD som er lavere enn 5 pM ved 37 °C.

I andre aspekter og utførelser kan bindingsproteinene inhibere binding av hHGF til c-Met. Bindingsproteinene kan f.eks. ha en IC50 (konsentrasjon som gir 50% av den maksimale inhibering) på minst tilnærmet 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 and 7,0 nM, analysert ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrives i eksempel 7(a). I visse andre utførelser kan bindingsproteinene nøytralisere HGF-indusert BrdU-inkorporering i 4 MBr-5-celler (ATCC, katalog nr. CCL208) ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrives i eksempel 7(b).

Bindingsproteinene har en IC50 på 50 nM eller lavere, fortrinnsvis 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5 nM eller lavere, analysert ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrives i eksempel 7(b). I visse andre utførelser kan bindingsproteinene anvendes for inhibering av HGF-stimulert c-Met-fosforylering i PC-3-celler (ATCC, Manassus, VA, katalog nr. CRL-1435) ved anvendelse av analysen som beskrives i eksempel 9.

Bindingsproteinene inhiberer HGF-stimulert (1,25 nM) c-Met-fosforylering i PC-3-celler med en IC50 på 2 nM eller lavere (tabell 8) ved anvendelse av analysen som beskrives i eksempel 9.

II – Fremstilling av bindingsproteiner

Bindingsproteiner ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på forskjellige måter ved anvendelse av tilnærminger som er kjent innen faget. For eksempel kan DNA-molekyler som koder for variable lettkjedeområder og variable tungkjedeområder, syntetiseres kjemisk ved anvendelse av et kommersielt synteseinstrument og sekvensinformasjonen som tilveiebringes her. Slike syntetiske DNA-molekyler kan ligeres til andre egnede nukleotidsekvenser, innbefattet f.eks. sekvenser som koder for konstant område, og ekspresjonskontroll-sekvenser for fremstilling av konvensjonelle genekspresjonskonstruksjoner som koder for de ønskede bindingsproteinene. Fremstilling av definerte genkonstruksjoner ligger innenfor de rutinemessige kunnskapene innen faget. Alternativt kan sekvensene som tilveiebringes her, klones ut av hybridomer ved konvensjonelle hybridiseringsteknikker eller PCR-teknikker ved anvendelse av syntetiske nukleinsyreprober hvis sekvenser bygger på sekvensinformasjon som tilveiebringes her eller sekvensinformasjon innen teknikkens stand når det gjelder gener som koder for tungkjedene og lettkjedene i museantistoffer i hybridomceller. Fremstilling og anvendelse av slike prober ligger innenfor det normale kunnskapsnivå innen faget.

Nukleinsyrene som koder for de ønskede bindingsproteinene, kan innføres (ligeres inn i) i ekspresjonsvektorer som så kan innføres i en vertscelle ved hjelp av standard transfeksjons- eller transformasjonsteknikker som er kjente innen faget.

Eksempler på vertsceller omfatter f.eks. E. coli-celler, Kinahamster-ovarieceller (CHO-celler), HeLa-celler, hamsterunge-nyreceller (BHK-celler), apenyreceller (COS-celler), humane, hepatocellulære karsinomceller (f.eks. Hep G2) og myelomceller som ikke ellers danner immunglobulinprotein. Transfekterte vertsceller kan dyrkes under betingelser som gjør det mulig for vertscellene å uttrykke genene av interesse, f.eks. genene som koder for de variable immunglobulinets lette kjede eller -tungkjedeområdene. De resulterende ekspresjonsproduktene kan høstes ved anvendelse av teknikker som er kjent innen faget.

De angjeldende ekspresjons- og rensingsbetingelsene vil variere avhengig av hvilket ekspresjonssystem som benyttes. Dersom f.eks. genet skal uttrykkes i E. coli, klones det først inn i en ekspresjonsvektor. Dette oppnås ved å plassere det modifiserte gen nedstrøms for en egnet bakterie-promoter, f.eks. Trp eller Tac, og en signalsekvens, f.eks. en sekvens som koder for fragment B av protein A (FB). Det resulterende, uttrykte fusjonsprotein akkumuleres typisk i refraktile legemer eller inklusjonslegemer i cellenes cytoplasma og kan testes etter oppbryting av cellene ved hjelp av en French-presse eller ultralydbehandling. De refraktile legemene solubiliseres så, og de uttrykte proteinene gjenfoldes og kløyves ved fremgangsmåter som allerede er etablert for mange andre rekombinante proteiner.

Dersom det modifiserte gen skal uttrykkes i eukaryote vertsceller, f.eks. myelomceller eller CHO-celler, innsettes det først i en ekspresjonsvektor som inneholder en egnet eukaryot promoter, et sekresjonssignal, immunglobulin-enhancere og forskjellige introner. Denne ekspresjonsvektoren kan om ønskelig inneholde sekvenser som koder for hele eller en del av et konstant område, noe som gjør det mulig å uttrykke en hel tungkjede eller lettkjede eller en del av en tungkjede eller lettkjede.

Genkonstruksjonen kan transfekteres inn i myelomceller eller CHO-celler ved anvendelse av etablerte transfeksjons-fremgangsmåter. Slike transfekterte celler kan uttrykke VL-eller VH-fragmenter, VL-VH-heterodimerer, VH-VL- eller VL-VH-enkeltkjedede polypeptider, komplette immunglobulinets tunge kjeder eller -lettkjeder eller deler av disse, som alle kan være koblet til et proteindomene med en annen funksjon (f.eks. cytotoksisitet).

III - Modifikasjoner av bindingsproteinene

Det skal forstås at bindingsproteinene kan modifiseres for å optimalisere yteevnen, avhengig av den påtenkte anvendelse av bindingsproteinene. Dersom f.eks. bindingsproteinet skal anvendes som et terapeutisk middel, kan det modifiseres for å redusere immunogenisiteten i den påtenkte mottaker. Alternativt eller i tillegg kan bindingsproteinet fusjoneres eller kobles til et annet protein eller peptid, f.eks. en vekstfaktor, et cytokin eller et cytotoksin. Slike modifikasjoner kan oppnås ved anvendelse av rutinemessige teknikker for genmanipulering som er kjent innen faget.

Forskjellige teknikker for reduksjon av antistoffers og antistoffragmenters antigenisitet er kjent innen faget. Disse teknikkene kan anvendes for å redusere eller fjerne antigenisiteten av bindingsproteinene ifølge oppfinnelsen. Dersom f.eks. bindingsproteinene skal tilføres til et menneske, modifiseres bindingsproteinene fortrinnsvis for å redusere antigenisiteten i mennesker. Denne prosessen betegnes ofte humanisering. De humaniserte bindingsproteinene har fortrinnsvis den samme eller i det vesentlige samme affinitet for antigenet som det opprinnelige, ikke-humaniserte bindingsprotein som det ble avledet fra.

I én velkjent tilnærming for humanisering fremstilles kimære proteiner i hvilke konstante immunglobulinområder fra antistoffer fra én art, f.eks. mus, er erstattet med konstante immunglobulinområder fra en andre, forskjellig art, f.eks. et menneske. I dette eksemplet er det resulterende antistoff en mus-menneskekimær hvor de humane konstant område-sekvensene i prinsippet er mindre immunogene enn de tilsvarende musesekvensene. Denne formen for antistoffmodifisering beskrives f.eks. i Morrison, et al. (1984) PROC. NAT. ACAD. SCI. 81: 6851-6855, Neuberger et al. (1984) NATURE 312: 604-608; US patentskrifter nr. 6893 625 (Robinson); 5 500 362 (Robinson) og 4 816 567 (Cabilly).

I en annen tilnærming, betegnet CDR-transplantasjon, transplanteres CDR fra det variable lettkjedeområdet og det variable tungkjedeområdet i et antistoff av interesse inn i rammeverk (FR) fra en annen art. For eksempel kan muse-CDR transplanteres inn i humane FR-sekvenser. I noen utførelser transplanteres CDR fra det variable lettkjedeområdet og det variable tungkjedeområdet i et anti-HGF-antistoff inn i humane FR eller humane konsensus-FR. For fremstilling av humane konsensus-FR sammenstilles FR fra flere humane tungkjede- eller lettkjede-aminosyresekvenser for identifisering av en konsensus-aminosyresekvens. CDR-transplantasjon beskrives f.eks. i US patentskrifter nr. 7 022 500 (Queen), 6 982 321 (Winter), 6 180 370 (Queen), 6 054 297 (Carter), 5 693 762 (Queen), 5 859 205 (Adair), 5 693 761 (Queen), 5 565 332 (Hoogenboom), 5 585 089 (Queen), 5 530 101 (Queen), Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525, Riechmann et al. (1988) NATURE 332: 323-327, Verhoeyen et al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1536 og Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94.

I en tilnærming som betegnes “superhumanisering”, fremstilles antistoffer i hvilke immunogenisiteten i mennesker er redusert eller fjernet ved en alternativ form for transplantasjon. I superhumanisering utvelges humane FR-sekvenser fra et sett av humane kjønnscellegener basert på den strukturelle likhet mellom de humane CDR og CDR i museantistoffet som skal humaniseres. Denne tilnærmingen beskrives f.eks. i US patentskrift nr. 6 881 557 (Foote) og i Tan et al. (2002) J. IMMUNOL 169:1119-1125.

Andre tilnærminger for reduksjon av immunogenisiteten omfatter teknikker som betegnes ”omforming”, ”hyperkimerisering”, ”fernissering/overflatebehandling” for fremstilling av humaniserte antistoffer. Se f.eks. Vaswami et al. (1998) ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81: 105; Roguska et al. (1996) PROT. ENGINEER 9: 895-904, og US patentskrift nr. 6 072 035 (Hardman). I fernissering/overflatebehandlingstilnærmingen erstattes de overflatetilgjengelige aminosyrerestene i museantistoffet med aminosyrerester som mer hyppig forefinnes i de samme posisjoner i et humant antistoff. Denne formen for overflatemodifisering av antistoffet beskrives f.eks. i US patentskrift nr.

5 639 641 (Pedersen).

Ett eksempel på en tilnærming for overføring av et museantistoff til en form som er egnet for medisinsk anvendelse i mennesker, betegnes ”ACTIVMAB”-teknologien (Vaccinex, Inc., Rochester, NY), som omfatter en vacciniavirus-basert vektor for ekspresjon av antistoffer i pattedyrceller. Et høyt nivå av kombinatorisk diversitet i immunglobulinets tunge kjede og -lettkjeden sies å oppnås. Se f.eks. US patentskrifter nr. 6 706 477 (Zauderer), 6 800 442 (Zauderer) og 6872 518 (Zauderer).

Et annet eksempel på en tilnærming for overføring av et museantistoff til en form som er egnet for anvendelse i mennesker, er teknologi som utføres kommersielt av KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA). Denne teknologien omfatter anvendelse av et rettighetsbeskyttet, humant ”akseptor”-bibliotek for fremstilling av ”epitopfokusert” bibliotek for antistoffseleksjon.

Et annet eksempel på en tilnærming for modifisering av et museantistoff til en form som er egnet for medisinsk anvendelse i mennesker, er ”HUMAN ENGINEERING<” >(”HE”)-teknologien som utføres kommersielt av XOMA (US) LLC. Se f.eks. internasjonal patentsøknad nr. WO 93/11794 og US patentskrifter nr. 5 766 886, 5 770 196, 5 821 123 og 5 869 619.

Hvilken som helst egnet tilnærming, innbefattet hvilken som helst av de ovenfor nevnte tilnærminger, kan anvendes for å redusere eller fjerne immunogenisiteten i mennesker av et bindingsprotein av interesse.

I tillegg er det mulig å fremstille fullt ut humane antistoffer i mus. I denne tilnærmingen fremstilles humane antistoffer ved anvendelse av en transgen mus i hvilken musens antistoffproduserende gener er blitt erstattet med en vesentlig del av de humane antistoffproduserende genene. Slike mus danner humant immunglobulin istedenfor museimmunglobulinmolekyler. Se f.eks. WO 98/24893 (Jacobovitz et al.) og Mendez et al. (1997) NATURE GENETICS 15: 146-156. Fullt ut humane, monoklonale anti-HGF-antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av følgende tilnærming. Transgene mus som inneholder humane immunglobulingener, immuniseres med antigenet av interesse, f.eks.

HGF. Lymfeceller erholdes så fra musene og fusjoneres til en cellelinje av myeloid type for fremstilling av immortaliserte hybridomcellelinjer. Hybridomcellelinjene gjennomsøkes og selekteres for påvisning av hybridomcellelinjer som danner antistoffer som er spesifikke for HGF.

Bindingsproteiner ifølge oppfinnelsen kan konjugeres til andre molekyler, avhengig av den påtenkte anvendelse. Dersom f.eks. bindingsproteinet skal anvendes som et terapeutisk middel, kan det konjugeres til et annet middel, f.eks. et effektormolekyl som modulerer eller på annet vis fremmer behandlingen. I den grad effektoren er et ikke-proteinbasert middel, f.eks. et lavmolekylært medikament, en radioaktiv markør eller et toksin, kan midlet kobles kjemisk til bindingsproteinet ved anvendelse av standard kjemiske fremgangsmåter for sammenkobling in vitro. Dersom effektormolekylet derimot er et protein eller peptid, f.eks. et enzym, en reseptor, et toksin, en vekstfaktor, et cytokin eller en annen immunmodulator, kan bindingsproteinet enten kobles kjemisk til effektoren ved anvendelse av kjemiske fremgangsmåter for in vitro-sammenkobling eller kobles til effektoren som et fusjonsprotein. Fusjonsproteiner kan konstrueres og uttrykkes ved anvendelse av teknikker som tilsvarer dem diskutert i seksjon II.

IV - Anvendelse av bindingsproteiner

Bindingsproteinene som beskrives her, kan anvendes som diagnostiske midler eller terapeutiske midler.

(1) Terapeutiske anvendelser

Da bindingsproteinene ifølge oppfinnelsen nøytraliserer aktiviteten av HGF, kan de anvendes i forskjellige terapeutiske anvendelser. For eksempel er visse bindingsproteiner ifølge oppfinnelsen anvendbare for forebyggelse eller behandling av hyperproliferative sykdommer eller forstyrrelser, f.eks. forskjellige kreftformer.

Bindingsproteinene kan anvendes for å inhibere eller redusere proliferasjonen av tumorceller. I en slik tilnærming utsettes tumorcellene for en terapeutisk effektiv mengde av bindingsproteinet slik at tumorcellens proliferasjon inhiberes eller reduseres. I visse utførelser inhiberer bindingsproteinene proliferasjonen av tumorceller med minst 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 100%.

I visse utførelser anvendes bindingsproteinet for å inhibere eller redusere proliferasjonen av en tumorcelle hvor bindingsproteinet reduserer evnen til hHGF til å bindes til c-Met. Bindingsproteinet kan også anvendes for å inhibere eller redusere proliferasjonen av en tumorcelle selv dersom bindingsproteinet binder hHGF, men ikke i vesentlig grad inhiberer bindingen av hHGF til c-Met som vist ved antistoff 3B6 i tabell 5 og 6.

I tillegg kan bindingsproteinet anvendes for å inhibere eller redusere tumorvekst eller tumorutvikling i et pattedyr. I en slik fremgangsmåte tilføres en effektiv mengde av bindingsproteinet til pattedyret slik at tumorvekst i pattedyret inhiberes eller reduseres. Følgelig kan bindingsproteinene anvendes for behandling av tumorer, f.eks. i et pattedyr. Fremgangsmåten omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av bindingsproteinet. Bindingsproteinet kan tilføres alene eller i kombinasjon med et annet farmasøytisk aktivt molekyl slik at tumoren behandles.

Det omfattes at bindingsproteinene ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved behandling av en rekke forskjellige HGF-responderende forstyrrelser, innbefattet f.eks. HGF-responderende tumorceller i lungekreft, brystkreft, colonkreft, prostatakreft, ovariekreft, kreft i hode og hals, ovariekreft, multippelt myelom, leverkreft, magekreft, spiserørskreft, nyrekreft, nasofaryngeal kreft, bukspyttkjertelkreft, mesoteliom, melanom og glioblastom.

Som anvendt her, viser ”behandle” og ”behandling” til behandling av en sykdomstilstand i et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, og omfatter: (a) å forhindre at sykdomstilstanden opptrer i et pattedyr, særlig dersom pattedyret er predisponert for sykdomstilstanden, men ennå ikke er blitt diagnostisert til å ha den, (b) å inhibere sykdomstilstanden, dvs. å stanse utviklingen av den, og/eller (c) å lindre sykdomstilstanden, dvs. å føre til regresjon av sykdomstilstanden.

Vanligvis vil en terapeutisk effektiv mengde av den aktive bestanddel være i området fra tilnærmet 0,1 mg/kg til tilnærmet 100 mg/kg, om ønskelig fra tilnærmet 1 mg/kg til tilnærmet 100 mg/kg, om ønskelig fra tilnærmet 1 mg/kg til 10 mg/kg.

Mengden som tilføres, vil avhenge av faktorer som hvilken type av sykdom eller indikasjon som skal behandles og omfanget av den, den angjeldende pasients generelle helsetilstand, den relative biologiske virkning av det tilførte bindingsprotein, utformingen av bindingsproteinet, nærvær av eksipienser i utformingen og hvilke typer av eksipienser som foreligger og av tilførselsveien. Den innledende dose som tilføres, kan være økt ut over det øvre nivå for hurtig å oppnå det ønskede nivå i blod eller vev, eller det kan være slik at den innledende dosen er lavere enn den optimale mengden og at den daglige dosen gradvis økes i løpet av behandlingen avhengig av den foreliggende situasjon. Dosen i mennesker kan optimaliseres, f.eks. i en konvensjonell fase I doseeskaleringsstudie utformet til å gå fra 0,5 mg/kg til 20 mg/kg. Doseringshyppigheten kan variere avhengig av faktorer som tilførselsveien, dosemengden og sykdomstilstanden som skal behandles. Eksempler på doseringshyppigheter er én gang pr. dag, én gang i uken eller én gang annenhver uke. En foretrukket tilførselsvei er parenteral, f.eks. intravenøs infusjon. Utforming av medikamenter basert på monoklonale antistoffer, ligger innenfor den alminnelige kunnskap innen faget. I noen utførelser av oppfinnelsen frysetørkes bindingsproteinet, f.eks. det monoklonale antistoff, og rekonstitueres i bufret saltvann på tilførselstidspunktet.

Bindingsproteinene kan tilføres enten alene eller i kombinasjon med andre farmasøytisk aktive bestanddeler. De andre aktive bestanddelene, f.eks. immunmodulatorer, kan tilføres sammen med bindingsproteinet eller tilføres før eller etter bindingsproteinet.

Utforminger som inneholder bindingsproteinene for terapeutisk anvendelse, omfatter typisk bindingsproteinene kombinert med et farmasøytisk akseptabelt bærestoff. Som anvendt her, betyr ”farmasøytisk akseptabelt bærestoff” buffere, bærere og eksipienser som ut fra en sunn medisinsk vurdering er egnet for anvendelse i kontakt med vevene i mennesker og dyr uten overdreven toksisitet, irritasjon, allergisk respons eller andre problemer eller komplikasjoner, i samsvar med et rimelig nytte/risikoforhold. Bærestoffet eller bærestoffene bør være ”akseptable” i den forstand at de er forenlige med de andre bestanddelene i utformingene og ikke er skadelige for mottakeren.

Farmasøytisk akseptable bærestoffer er i denne sammenheng ment å omfatte alle buffere, løsemidler, dispersjonsmedier, belegg, isotonisitets-midler, absorpsjonsforsinkende midler og lignende som er forenlige med farmasøytisk tilførsel. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive forbindelser er kjent innen faget.

Utformingene kan med fordel foreligge i enhetsdoseform og kan fremstilles ved hvilken som helst egnet fremgangsmåte, innbefattet hvilken som helst av fremgangsmåtene som er velkjente innen farmasien. Et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen bør utformes slik at det er tilpasset den påtenkte tilførselsvei. Eksempler på tilførselsveier omfatter parenteral tilførsel eller ikke-parenteral tilførsel, f.eks. intravenøs og intradermal tilførsel, tilførsel ved inhalering, transdermal (topisk), transmukosal og rektal tilførsel. Anvendbare løsninger for oral eller parenteral tilførsel kan fremstilles ved hvilken som helst av fremgangsmåtene som er velkjente innen farmasien og som f.eks. beskrives i Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. utgave (Mack Publishing Company, 1990).

Utforminger som er egnet for oral tilførsel, kan foreligge i form av atskilte enheter, f.eks. injiserbare midler, kapsler, gelatinkapsler, puter, tabletter, flate pastiller eller pastiller, som alle inneholder en på forhånd bestemt mengde av bindingsproteinet, et pulver eller et granulært preparat, en løsning eller en suspensjon i en vandig væske eller ikke-vandig væske, en olje-i-vann-emulsjon eller en vann-i-olje-emulsjon.

Utforminger som er egnet for parenteral tilførsel, omfatter f.eks. følgende bestanddeler: et sterilt fortynningsmiddel, f.eks. vann for injeksjon, en saltløsning, ikkeflyktige oljer, polyetylenglykoler, glyserol, propylenglykol eller andre syntetiske løsemidler, antibakterielle midler, f.eks. benzylalkohol eller metylparabener, antioksidanter, f.eks. askorbinsyre eller natriumbisulfitt, chelateringsmidler, f.eks.

etylendiamintetraeddiksyre, buffere som acetater, sitrater eller fosfater og midler for justering av tonisiteten, f.eks. natriumklorid eller dekstrose. pH kan justeres med syrer eller baser, f.eks. saltsyre eller natriumhydroksid. Det parenterale preparat kan foreligge i ampuller, sprøyter for engangsbruk eller flerdoseflasker fremstilt av glass eller plast.

Generelt omfatter preparater som er egnet for anvendelse ved injeksjon, vandige løsninger (dersom det aktive middel er vannløselig) eller dispersjoner og pulvere for fremstilling etter behov av sterile, injiserbare løsninger eller dispersjoner. For intravenøs tilførsel omfatter egnede bærestoffer fysiologisk saltvann, bakteriostatisk vann, ”Cremophor EL” (BASF, Parsippany, NJ) eller fosfatbufret saltvann (PBS). Bærestoffet bør være stabilt under betingelsene for fremstilling og lagring og bør være konservert mot den kontaminerende virkningen av mikroorganismer, f.eks. bakterier og sopp.

Bærestoffet kan være et løsemiddel eller et dispersjonsmedium som f.eks. inneholder vann, etanol, polyol (f.eks. glyserol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol) og egnede blandinger av disse.

Farmasøytiske utforminger er fortrinnsvis sterile. Sterilisering kan f.eks. oppnås ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner. Dersom preparatet er frysetørket, kan sterilisering ved anvendelse av denne fremgangsmåten utføres før eller etter frysetørking og rekonstitusjon. Etter at det farmasøytiske preparat er blitt utformet, kan det lagres, f.eks. i medisinflasker som en løsning, suspensjon, gel, emulsjon, som fast stoff eller som et dehydrert eller frysetørket pulver.

(2) Diagnostiske anvendelser

Dersom bindingsproteinene anvendes for diagnostiske formål, enten in vitro eller in vivo, er bindingsproteinene typisk merket, enten direkte eller indirekte, med en påvisbar gruppe. Den påvisbare gruppen kan være hvilken som helst gruppe som enten direkte eller indirekte kan gi et påvisbart signal. Den påvisbare gruppen kan f.eks. være en radioaktiv isotop, f.eks. <3>Hydrogen (<3>H), <14>Karbon (<14>C), <32>Fosfor (<32>P), <35>Svovel (<35>S) eller <125>Jod (<125>I), en fluorescerende eller kjemiluminescerende forbindelse, f.eks. fluoresceinisotiocyanat, rhodamin eller luciferin, et enzym, f.eks. alkalisk fosfatase, betagalaktosidase eller pepperrotperoksidase, en spinnmerkingsgruppe, f.eks. en spinnmarkør, eller en farget partikkel, f.eks. en latekspartikkel eller gullpartikkel. Det skal forstås at bindingsproteinet kan være konjugert til den påvisbare gruppen ved anvendelse av en rekke tilnærminger som er kjent innen faget, f.eks. som beskrevet i Hunter et al. (1962) NATUR<E >144: 945; David et al. (1974) BIOCHEMISTRY 13: 1014; Pain et al. (1981) J. IMMUNOL. METH. 40: 219; og Nygren (1982) J. HISTOCHEM. AND CYTOCHEM. 30: 407.

Merkingsgruppene kan påvises, f.eks. visuelt eller ved hjelp av et spektrofotometer eller en annen detektor.

Bindingsproteinene kan benyttes i et bredt utvalg av immunanalyseteknikker som er tilgjengelige innen faget. Eksempler på immunanalyser omfatter f.eks. ”sandwich”-immunanalyser, kompetitive immunanalyser og immunhistokjemiske fremgangsmåter.

I en ”sandwich”-immunanalyse anvendes to antistoffer som binder en analytt eller et antigen av interesse, f.eks. ett antistoff immobilisert til et fast støttemiddel, og ett antistoff som foreligger fritt i løsning og som er merket med en påvisbar gruppe. Dersom en prøve som inneholder antigenet innføres i dette systemet, bindes antigenet til både det immobiliserte antistoff og det merkede antistoff slik at det dannes et ”sandwich”-immunkompleks på støttemidlets overflate. Det kompleksbundne protein påvises ved å vaske bort ubundne prøvebestanddeler og overskudd av merket antistoff og måle mengden merket antistoff som er kompleksbundet til proteinet på støttemidlets overflate. Alternativt kan antistoffet fritt i løsning påvises med et tredje antistoff som er merket med en påvisbar gruppe og som binder det frie antistoffet. En detaljert oversikt over utforming, teori og fremgangsmåter for immunologisk analyse kan finnes i en rekke tekster, innbefattet Butt, red., (1984) PRACTICAL IMMUNOLOGY, Marcel Dekker, New York; Harlow et al. red. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY APPROACH, Cold Spring Harbor Laboratory, og Diamandis et al., red. (1996) IMMUNOASSAY, Academic Press, Boston.

Det omfattes at de merkede bindingsproteinene er anvendbare som in vivobildedanningsmidler, hvorved bindingsproteinene kan styre bildedanningsmidlene til spesielle vev av interesse i mottakeren. En foretrukket gruppe som kan påvises på avstand for in vivo-bildedannelse, omfatter det radioaktive atom Technetium<-99m >(<99m>Tc), et atom som utsender gammastråler med en halveringstid på tilnærmet 6 timer. Ikkeradioaktive grupper som også er anvendbare for in vivo-bildedannelse, omfatter nitroksidholdige spinnmarkører, så vel som lantanid- og transisjonsmetallioner, som alle induserer protonrelaksasjon in situ. I tillegg til immunbildedannelse kan de kompleksbundne radioaktive gruppene anvendes i standardfremgangsmåter for radioimmunterapi for ødeleggelse av målcellen. Foretrukne isotoper for radioimmunterapi i høye doser omfatter de radioaktive atomene <90>Yttrium (<90>Yt), <131>Jod (<131>I) og <111>Indium (<111>In). Bindingsproteinet kan merkes med <131>I, <111>In og <99m>TC ved anvendelse av koblingsteknikker som er kjente innen bildedanningsfaget. På tilsvarende måte er fremgangsmåter for fremstilling og tilførsel av bildedanningsmidlet så vel som innfanging og prosessering av bilder velkjent innen bildedanningsfaget, og diskuteres følgelig ikke i detalj her. På tilsvarende måte er fremgangsmåter for utførelse av antistoffbasert immunbehandling velkjente innen faget. Se f.eks. US patentskrift nr. 5 534 254.

I den foreliggende beskrivelse omfattes det, dersom preparater beskrives til å ha, inkludere eller omfatte visse bestanddeler, at preparatene også i det vesentlige består av eller består av de angitte bestanddeler. På tilsvarende måte omfattes det også at dersom prosesser beskrives til å ha, inkludere eller omfatte spesifikke prosesstrinn, kan prosessene også i det vesentlige bestå av eller bestå av de angitte prosesseringstrinn. Med mindre annet er angitt, er rekkefølgen av trinnene eller rekkefølgen for utførelse av visse aktiviteter uten betydning så lenge som oppfinnelsen forblir anvendelig. Videre kan, med mindre annet er angitt, to eller flere trinn eller aktiviteter utføres samtidig.

Eksempler

De påfølgende eksemplene diskuterer fremstillingen og karakteriseringen av en rekke monoklonale anti-hHGF-antistoffer. Sekvenser som ikke er innen for rammen for kravene er inkludert som referanse.

Eksempel 1 - Fremstilling av monoklonale anti-hHGF-antistoffer

Dette eksempel beskriver fremstillingen av en rekke monoklonale anti-hHGF-antistoffer. Immuniseringer, fusjoner og primærgjennomsøkinger ble utført ved MBS Inc. (Portland, ME) ifølge fremgangsmåten for gjentatt immunisering i flere seter (RIMMS). Fem AJ-mus og fem Balb/c-mus ble immunisert med rekombinant, human HGF (R&D Systems, Minneapolis, MN, katalog nr. 294-HGN-025). De to musene som viste den høyeste anti-HGF-aktivitet i serum målt ved enzymkoblet immunadsorpsjonsanalyse (ELISA), ble valgt for påfølgende fusjon. Milt og lymfeknuter ble fjernet fra musene. B-celler ble så høstet og fusjonert til en myelomcellelinje. Fusjonsproduktene ble seriefortynnet på én eller flere plater til nær klonalitet. Supernatanter fra de resulterende fusjonene ble analysert for binding til hHGF ved ELISA. Supernatanter som ble vist å inneholde antistoffer mot HGF, ble karakterisert videre ved funksjonell analyse in vitro, som diskutert i de påfølgende eksemplene. Et sett av hybridomer ble valgt, og hybridomene ble subklonet og ekspandert. De monoklonale antistoffene ble så renset ved affinitetskromatografi på protein A/G-resin under standardbetingelser.

Eksempel 2 - Sekvensanalyse av monoklonale anti-hHGF-antistoffer

Dette eksemplet beskriver isotype- og sekvensanalyser av de monoklonale antihHGF-antistoffene som ble fremstilt i eksempel 1.

a. Bestemmelse av isotypen av monoklonalt HGF-antistoff fra mus

Den lette kjedens type og den tunge kjedens isotype for hvert av de monoklonale antistoffene ble bestemt ved anvendelse av IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit i samsvar med produsentens instruksjoner (Roche Applied Science).

Alle antistoffene ble vist å inneholde en Kappa-immunglobulinets lette kjede og en IgG1-immunglobulin-tungkjede.

b. Bestemmelse av nukleotidsekvenser som koder for immunglobulinenes tunge og lette kjedes variable områdene

Total-RNA ble isolert fra hver av de monoklonale hybridom cellelinjene ved anvendelse av RNeasy Miniprep-settet ifølge produsentens instruksjoner (Qiagen Venlo, Nederland). Fullengde førstetråds-cDNA ble fremstilt ved anvendelse av ”BD SMART” RACE cDNA Amplification Kit ifølge produsentens instruksjoner (Clontech) ved anvendelse av oligonukleotidprimerne BD SMART II A (5’ aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3’) (SEQ ID NO. 85) og 5’-RACE CDS Primer (5’ tttttttttttttttttttttttttvn 3’, hvor v = a, g eller c og n = a, g, c eller t) (SEQ ID NO. 86), hvor formålet var å oppnå 5’ RACE (hurtig amplifisering av cDNA-ender).

De variable områdene fra Kappa-immunglobulinkjedene og IgG1-immunglobulintungkjedene ble amplifisert ved PCR (polymerase-kjedereaksjonen) ved anvendelse av Expand High-Fidelity PCR System (Roche Applied Science) ifølge produsentens instruksjoner. Variable tungkjedeområder ble amplifisert med 5’-oligonukleotidprimerblandingen Universal Primer Mix A (blanding av 5’ ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt 3’ (SEQ ID NO. 87) og 5’ ctaatacgactcactatagggc 3’(SEQ ID NO. 88)) og en 3’-primer spesifikk for IgG1-konstant område, enten 5’ tatgcaaggcttacaaccaca 3’ (SEQ ID NO. 89) eller 5’ gccagtggatagacagatgggggtgtcg 3’ (SEQ ID NO. 90). Variable kappa-kjedeområder ble amplifisert med 5’-oligonukleotidprimerblandingen Universal Primer Mix A og en 3’-primer spesifikk for kappa-konstant område, enten 5’ ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3’ (SEQ ID NO.

91) eller 5’ cgactgaggcacctccagatgtt 3’ (SEQ ID NO. 92).

Enkeltvise PCR-produkter ble fraksjonert ved agarosegel elektroforese og renset ved anvendelse av Qiaquick Gel Purification kit ifølge produsentens instruksjoner (Qiagen). PCR-produktene ble så klonet inn i plasmidet pCR2.1 TOPO ved anvendelse av det topoisomerasebaserte kloningssett ”TOPO TA Cloning” Kit (med vektoren ”pCR”2.1-”TOPO”) ifølge produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, CA) og transformert inn i DH5-bakterier ved anvendelse av standardteknikker for transformasjon. Plasmid-DNA isolert fra de transformerte bakterieklonene, ble sekvensert ved anvendelse av T7-primer (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) (SEQ ID NO. 93), M13 Forward-primer (5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’) (SEQ ID NO. 94), og M13 Reverse-primer (5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’) (SEQ ID NO. 95) fra Agencourt Bioscience ved anvendelse av standardfremgangsmåter for dideoksy-DNA-sekvensering for bestemmelse av sekvensen i de variable områdene. Sekvensene ble analysert ved anvendelse av programvaren Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA) og nett-tjeneren IMGT/V-Quest (http://imgt.cines.fr/textes/vquest) for identifisering og bekreftelse av variabelt områdesekvenser.

c. Bestemmelse av nukleotidsekvenser som koder for den tunge og den lette kjedenes konstante område sekvenser i kappa- og IgG1-kjeden i 1A3, 1D3, 1F3

og 2B8

Fullengde-cDNA for IgG1-kjeden i 1A3, 1D3 og 1F3 ble PCR-amplifisert fra cDNA fremstilt ovenfor ved anvendelse av foroverprimeren 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3’ (startkodonet er understreket) (SEQ ID NO. 96) og reversprimeren 5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagagg 3’ (stoppkodonet er understreket) (SEQ ID NO. 97). Fullengde-cDNA for 2B8-IgG1-kjeden ble amplifisert fra cDNA fremstilt ovenfor ved anvendelse av foroverprimeren 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatcatcctcttt 3’ (startkodonet er understreket) (SEQ ID NO. 98) og reversprimeren

5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagag 3’ (stoppkodonet er understreket) (SEQ ID NO. 99).

Fullengde-cDNA for 2B8-kappakjeden ble amplifisert ved anvendelse av foroverprimeren 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcata 3’ (startkodonet er understreket) (SEQ ID NO. 100) og reversprimeren

5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaacactcattcctgttgaagctc 3’ (stoppkodonet er understreket) (SEQ ID NO. 101). PCR-fragmentene ble subklonet i pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved hjelp av en Gateway BP-rekombinasjonsreaksjon (Invitrogen, Carlsbad, CA) og sekvensert av Agencourt Bioscience ved anvendelse av standardfremgangsmåter for dideoksy-DNA-sekvensering for bestemmelse av sekvensen i det konstante område og videre bekreftelse av sekvensene i de variable områdene.

d. Sekvensanalyse

Variable områder (normal tekst) ble identifisert ved anvendelse av programvare tilgjengelig fra nett-tjeneren IMGT/V-QUEST (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/).

Signalpeptidsekvenser ble prediktert basert på en påvisning av start-kodonet (ATG) i samme leseramme som lå oppstrøms for det påviste variable område. Signalpeptidsekvensene ble identifisert og er understreket nedenfor.

Det siste nukleotid i hvert av de variable områdene er den første basen i det neste kodon som dannes i overgangen mellom variabelt område og konstant område. Dette nukleotidet inngår i det variable området da det er en del av dette eksonet.

Aminosyresekvensene til de konstante områdene som er opplistet nedenfor, omfatter en translasjon av dette overgangskodonet.

For fremstilling av de fullstendige tungkjede- eller kappa-kjedeantistoffsekvensene kombineres variabelt område-sekvensene som er angitt nedenfor med de tilsvarende konstant område-sekvensene (signalsekvensene er understreket).

(1) 1A3-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 1)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag

(2) 1A3-den lette kappa kjedens variable område (SEQ ID NO. 3)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa ac

(3) 2B8-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 11)

1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag

(4) 2B8-den lette kappa kjedens variable område (SEQ ID NO. 13) 1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa ac

(5) 2F8-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 21)

1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag

(6) 2F8-den lette kappa kjedens variable område (SEQ ID NO. 23) 1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac

(7) 3B6-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 31)

1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag (8) 3B6-den lette kappa kjedens variable område (2 mulige ATG-startkodoner (med store bokstaver)) (SEQ ID NO. 33)

1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc

61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc

361 ggagggggga ccaagctgga aataaagc

(9) 3D11-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 41)

1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag

61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca

181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag

(10) 3D11-den lette kappa kjedens variable område (SEQ ID NO. 43)

1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc

61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaac

(11) 1D3-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 51)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcag

(12) 1D3-den lette kappa kjedens variable område (SEQ ID NO. 53) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa ac

(13) 1F3-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 61)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag

(14) 1F3-den lette kappa kjedens variable område (SEQ ID NO. 63) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa ac

(15) 3A12-den tunge kjedens variable område (SEQ ID NO. 71)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag

(16) 3A12-den lette kappa kjedens variable område (SEQ ID NO. 73)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa ac

(17) Muse-IgG1-referanse-den tunge kjedens konstante område (J00453) (SEQ ID NO. 81)

1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc

361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg aatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga

(18) Muse-IgG1-den tunge kjedens konstante område bestemt for 1A3, 1D3, 1F3 og 2B8 (avledet fra mus fra AJ-stammen) (SEQ ID NO. 82)

1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc

361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga

(19) Muse-kappa-referanse lett kjedens konstante område (V00807) og musekappa lett kjedens konstante område bestemt for 1D3, 1F3 og 2B8 (avledet fra mus fra AJ-stammen) (SEQ ID NO. 83)

1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg

61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag

(20) Muse-kappa lett kjedens konstante område bestemt for 1A3, inneholdende ett endret nukleotid sammenlignet med 1D3, 1F3 og 2B8 (understreket) (SEQ ID NO. 84) 1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg

61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag

Alle aminosyresekvenser som definerer immunglobulinets tunge kjedes variable områder for antistoffene som ble fremstilt i eksempel 1, er vist i figur 2. Alle sekvensene er sammenstilt med hverandre, og sekvensene som definerer signalpeptidet, CDR1, CDR2 og CDR3, er innrammet. Figur 3 viser en sammenstilling av de separate CDR1-, CDR2- og CDR3-sekvensene fra hvert av antistoffene.

Alle aminosyresekvenser som definerer immunglobulinkjedens variable områder i hvert av antistoffene som ble fremstilt i eksempel 1, er vist i figur 4. Alle sekvensene er sammenstilt med hverandre, og sekvensene som definerer signalpeptidet, CDR1, CDR2 og CDR3, er innrammet. Figur 5 viser en sammenstilling mellom de separate CDR1-, CDR2-og CDR3-sekvensene fra hver av antistoffene.

For enkelhets skyld viser tabell 1 en samsvarstabell som viser sammenhengen mellom antistoffsekvensene som er diskutert i dette eksemplet og sekvensene som foreligger i sekvenslisten.

Tabell 1

Også for enkelhets skyld representerer de påfølgende sekvensene de faktiske fullengde tunge- og lette kjedenes sekvens (dvs. at de inneholder både sekvensen i det variable område og i det konstante område) for hvert av antistoffene som er beskrevet i dette eksempel. Det skal bemerkes at de konstante områdene i museantistoffene 2F8, 3A12, 3B6 og 3D11 ikke ble sekvensert, men antas å ha de samme konstant områdesekvensene som antistoffene 1D3, 1F3 og 2B8, som ble sekvensert, da alle er avledet fra mus fra AJ-stammen. Det innses imidlertid at variabelt område-sekvensene som er beskrevet her, kan ligeres til en rekke andre konstant område-sekvenser som er kjent blant fagfolk slik at det dannes aktive immunglobulinets tunge kjeder og -lettkjeder med full lengde.

(1) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-1A3-tungkjedesekvensen (1A3-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 122)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

6 1 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc

121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca

241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat

361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc

421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact

481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg

541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct

601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc

661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc

721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc

781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt

841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg

901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca

961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg

1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga

1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag

1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact

1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc

1381 cactctcctg gtaaatga

(2) Proteinsekvens som definerer fullengde-1A3-tungkjedesekvensen (1A3-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 123)

1 evqlvesggg lvqpggslkl scaaseftfs nyymswvrqt pekrlqwvay ispgggssyy

61 pasvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycarqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv

121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq

181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf

241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr

301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd

361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(3) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-1A3-lettkjedesekvensen (1A3-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 124)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt

61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc

121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag

181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca

241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct

301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca

421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac

481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg

541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg

601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca

661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(4) Proteinsekvens som definerer fullengde-1A3-lettkjedesekvensen (1A3-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 125)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvya atnladgvps

61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgtyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlm

181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(5) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-2B8-tungkjedesekvensen (2B8-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 126)

1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag

61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc

121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct

181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg

301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg

421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg

481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct

541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact

601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac

661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt

721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag

781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc

841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca

901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt

961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt

1381 aaatga

(6) Proteinsekvens som definerer fullengde-2B8-tungkjedesekvensen (2B8-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 127)

1 qvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny

61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssak

121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly

181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp

241 kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse

301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl

361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc

421 svlheglhnh htekslshsp gk

(7) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-2B8-lettkjedesekvensen (2B8-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 128)

1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg

61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc

121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca

181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat

241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct

301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca

421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac

481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg

541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg

601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca

661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(8) Proteinsekvens som definerer fullengde-2B8-lettkjedesekvensen (2B8-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 129)

1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd

61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt

181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(9) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-2F8-tungkjedesekvensen (2F8-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 130)

1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag

61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc

121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct

181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat

241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg

301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg

361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg

421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg

481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct

541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact

601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac

661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt

721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag

781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc

841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca

901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt

961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca

1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca

1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc

1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag

1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc

1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct

1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt

1381 aaatga

(10) Proteinsekvens som definerer fullengde-2F8-tungkjedesekvensen (2F8-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 131)

1 qvqlkqsgae lvrpgtsvkm sckasgytft tyyihwvnqr pgqglewigk igpgsgstyy

61 nemfkdkatl tvdtssstay mqlssltsdd savyfcarrg lgrgfdywgq gttltvssak

121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly

181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp

241 kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl

361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc

421 svlheglhnh htekslshsp gk

(11) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-2F8-lettkjedesekvensen (2F8-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 132)

1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt

61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc

121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac

181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct

241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat

301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc

361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc

421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg

481 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa

541 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc

601 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc

661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag

(12) Proteinsekvens som definerer fullengde-2F8-lettkjedesekvensen (2F8-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 133)

1 divltqspas lavslgqrat isckasqsvd ydgnsyinwy qqkpgqppkv liyvasnles

61 giparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqqsiedpp tfgagtklel kradaaptvs

121 ifppsseqlt sggasvvcfl nnfypkdinv kwkidgserq ngvlnswtdq dskdstysms

181 stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec

(13) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-3B6-tungkjedesekvensen (3B6-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 134)

1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag

61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc

121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct

181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat

241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg

301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg

361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc

421 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc

481 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg

541 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc

601 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc

661 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat

721 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc

781 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta

841 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg

901 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt

961 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac

1021 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1081 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1141 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat

1201 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1261 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc

1321 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct

1381 cctggtaaat ga

(14) Proteinsekvens som definerer fullengde-3B6-tungkjedesekvensen (3B6-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 135)

1 qvqlqqsgae lvrpgssvki sckasgyvfs sywmnwvkqr pgqglewigq iypgdgdsny

61 ngnfkgkatl tadkssstay mqlssltsed savyfcasql glrenyfdyw gqgttltvss

121 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd

181 lytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif

241 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv

301 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv

361 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf

421 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk

(15) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-3B6-lettkjedesekvensen (3B6-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 136)

1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga

121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag

181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc

241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg

301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc

361 ggagggggga ccaagctgga aataaagcgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc

421 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac

481 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc

541 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc

601 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac

661 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g

(16) Proteinsekvens som definerer fullengde-3B6-lettkjedesekvensen (3B6-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 137)

1 dikmtqspss myaslgervt itckasqdik sylswfqqkp gkspktliyr vnrlvdgvps

61 rfsgsgsgqd ssltitslen edmgiyyclq ydefpftfgg gtkleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt

181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(17) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-3D11-tungkjedesekvensen (3D11-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 138)

1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag

61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact

121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca

181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg

241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa

301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct

361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc

421 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg

481 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc

541 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg

601 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc

661 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata

721 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc

781 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 841 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc

901 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag

961 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc

1021 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt

1081 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac

1141 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac

1201 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat

1261 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc

1321 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc tcccactctc ctggtaaatg a

(18) Proteinsekvens som definerer fullengde-3D11-tungkjedesekvensen (3D11-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 139)

1 qvqlkesgpg lvapsqslsi tctvsgfslt syslhwvrqp pgkglewlgv iwaggntnyn

61 sslmsrltir kdnsksqvfl kmnslqtddt amyycarerf aywgqgtlvt vsaakttpps

121 vyplapgsaa qtnsmvtlgc lvkgyfpepv tvtwnsgsls sgvhtfpavl qsdlytlsss

181 vtvpsstwps etvtcnvahp asstkvdkki vprdcgckpc ictvpevssv fifppkpkdv

241 ltitltpkvt cvvvdiskdd pevqfswfvd dvevhtaqtq preeqfnstf rsvselpimh

301 qdwlngkefk crvnsaafpa piektisktk grpkapqvyt ipppkeqmak dkvsltcmit

361 dffpeditve wqwngqpaen ykntqpimdt dgsyfvyskl nvqksnweag ntftcsvlhe

421 glhnhhteks lshspgk

(19) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-3D11-lettkjedesekvensen (3D11-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 140)

1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc

61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag

121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag

181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct

241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag

301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt

361 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca

421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc

481 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc

541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc

601 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag

661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag

(20) Proteinsekvens som definerer fullengde-3D11-lettkjedesekvensen (3D11-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 141)

1 qivltqspai msaypgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwiydt sklasgvpar

61 fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpltfgag tklelkrada aptvsifpps

121 seqltsggas vvcflnnfyp kdinvkwkid gserqngvln swtdqdskds tysmsstltl

181 tkdeyerhns ytceathkts tspivksfnr nec

(21) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-1D3-tungkjedesekvensen (1D3-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 142)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc

121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca

241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat

361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc

421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact

481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg

541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct

601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc

661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc

721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc

781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt

841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg

901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca

961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg

1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga

1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa

1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag

1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc

1381 cactctcctg gtaaatga

(22) Proteinsekvens som definerer fullengde-1D3-tungkjedesekvensen (1D3-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 143)

1 evqlvesggg lvqpggslkl scaasgftfs dyymswvrqt pekrlewvay issgggstyy

61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed taiyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsviv

121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq

181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf

241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr

301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd

361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn

421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(23) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-1D3-lettkjedesekvensen (1D3-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 144)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt

61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc

121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag

181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca

241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct

301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca

421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac

481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg

541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg

601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca

661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(24) Proteinsekvens som definerer fullengde-1D3-lettkjedesekvensen (1D3-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 145)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcrtseniy snlawyqqkq gkspqlliya atnladgvps

61 rfsgsgsgtq fslrinslqs edfgryycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt

181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(25) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-1F3-tungkjedesekvensen (1F3-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 146)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc

121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca

241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat

361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc

421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact

481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg

541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct

601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc

661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc

721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc

781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt

841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg

901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca

961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg

1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga

1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc

1381 cactctcctg gtaaatga

(26) Proteinsekvens som definerer fullengde-1F3-tungkjedesekvensen (1F3-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 147)

1 evqlvesggg lvqsggslkl scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy

61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq

181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr

301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd

361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn

421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(27) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-1F3-lettkjedesekvensen (1F3-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 148)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt

61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc

121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag

181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca

241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct

301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg

361 gggaccagac tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca

421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac

481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg

541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg

601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca

661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(28) Proteinsekvens som definerer fullengde-1F3-lettkjedesekvensen (1F3-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 149)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvyd athlpdgvps

61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtrleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt

181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(29) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-3A12-tungkjedesekvensen (3A12-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 150)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc

121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca

241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat

361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc

421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact

481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg

541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct

601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc

661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc

721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc

781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt

841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg

901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca

961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg

1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga

1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa

1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag

1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc

1381 cactctcctg gtaaatga

(30) Proteinsekvens som definerer fullengde-3A12-tungkjedesekvensen (3A12-den tunge kjedens variable område og IgG1 konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 151)

1 evqlvesggg lvqpggslki scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy

61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmnslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv

121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq

181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf

241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr

301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd

361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn

421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(31) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde-3A12-lettkjedesekvensen (3A12-kappa variabelt område og konstant område) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 152)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt

61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc

121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag

181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca

241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac

481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(32) Proteinsekvens som definerer fullengde-3A12-lettkjedesekvensen (3A12-kappa variabelt område og konstant område) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 153)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy inlawyqqkq gkspqllvha atkladgvps

61 rfsgsgsgtq yslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

For enkelhets skyld gir tabell 2 en samsvarstabell som viser sammenhengen mellom fullengdesekvensene til antistoffene som diskuteres i dette eksempel og sekvensene som gis i sekvenslisten.

Tabell 2

Eksempel 3 - Fremstilling av forskjellige rekombinante hHGF-proteiner

Dette eksemplet beskriver kloning og ekspresjon av en rekke rekombinante proteiner som ble anvendt for karakterisering av antistoffene fremstilt i eksempel 1 og i eksempel 14. Nærmere bestemt beskriver dette eksemplet kloning og ekspresjon av rekombinant hHGF-protein, et rekombinant hHGF-protein som inneholder en glysin- til glutamat-substitusjon i posisjon 555 (G555E), et rekombinant hHGF-protein som inneholder en cystein- til arginin-substitusjon i posisjon 561 (C561R), et rekombinant mus-menneske-mus (mhm) -kimært HGF-protein som inneholder den humane V495-L585-HGF-sekvens i en muse-HGF-sekvens, et rekombinant mhm-kimært HGF-protein som inneholder den humane I499-R566-HGF-sekvens plassert i en muse-HGF-sekvens og et rekombinant mhm-kimært HGF-protein som inneholder den humane W507-L585-HGF-sekvens plassert i en muse-HGF-sekvens.

Følgende ekspresjonskonstruksjoner ble fremstilt ved anvendelse av standard molekylære teknikker, og de resulterende cDNA-sekvensene ble bekreftet ved DNA-sekvensering:

a. hHGF-Fc

I en første PCR-runde ble det fremstilt to overlappende PCR-fragmenter med et innført Not I-sete og kodende for en 6xHis-merkelapp mellom hHGF og hIgFc. De overlappende PCR-fragmentene fungerte som templat i en andre runde for amplifisering av hHGF-his-IgFc. Det resulterende fragment ble kuttet med NheI og BamHI og klonet inn i pcDNA5/FRT (Invitrogen, katalog nr. 35-3014). Så ble hHGF amplifisert fra Invitrogenklonen ID: IOH29794 (humant HGF-cDNA). Sekvensen ble funnet å tilsvare sekvensen som er deponert hos NCBI under aksesjonsbetegnelsen NM_000601.4.

(1) 5’hHGF NheI-primer

ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT (SEQ ID NO. 102)

(2) 3’ hHGF NotI His-merkelapp-primer

GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATATG

(SEQ ID NO. 103)

(3) 5’ HisIgFc-primer

ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO. 104)

(4) 3’ IgFc BamHI-primer

ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG (SEQ ID NO. 105)

b. hHGF-Fc G555E og hHGF-Fc C561R

hHGF-Fc mutantene G555E og C561R ble fremstilt ved seterettet mutagenese ved anvendelse av settet QuikChange II XL for seterettet mutagenese (Stratagene) ifølge produsentens instruksjoner.

(1) hHGF-Fc (G555E) ”Sense”-primer

CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG (SEQ ID NO. 106)

(2) hHGF-Fc (G555E) ”Antisense”-primer CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG (SEQ ID NO. 107)

(3) hHGF-Fc (C561R) ”Sense”-primer

GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG (SEQ ID NO. 108)

(4) hHGF-Fc (C561R) ”Antisense”-primer

CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC (SEQ ID NO. 109)

c. Mus-menneske-mus-kimært Fc

Den mus-menneske-mus-kimære IgFc-konstruksjon inneholder mHGF alfa-kjedehHGF, β-kjede-aminosyrene Val 495-Leu 585 fra human HGF og den C-terminale del av beta-kjeden fra mHGF, fulgt av en 6xHis-merkelapp og IgG-Fc.

Humant HGF-cDNA som kodet for aminosyrene V495-L585, ble amplifisert fra Invitrogen-klon ID: IOH29794 (humant HGF-cDNA). Sekvensen tilsvarer sekvensen som er deponert hos NCBI under aksesjonsbetegnelsen NM_000601.4. Muse-HGF-sekvenser ble amplifisert ved RT-PCR fra total-RNA fra muselever (Clontech, katalog nr. 636603) ved anvendelse av Super Script One Step RT-PCR kit fra Invitrogen (katalog nr. 10928-034) ifølge produsentens instruksjoner. mHGF-cDNA-sekvensen tilsvarer sekvensen som er deponert hos NCBI under aksesjonsbetegnelsen D10213.1.

Tre fragmenter som ble betegnet fragment 1, 2 og 3, ble fremstilt ved anvendelse av overlappende PCR-primere og hybridisert til hverandre i påfølgende PCR-amplifiseringsrunder. Sluttproduktet ble kuttet med NheI og NotI og klonet inn i pcDNA5/FRT IgGFc.

(1) Fragment 1-primere for mHGF alfa-kjede med 5’NheI 5’ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC (SEQ ID NO. 110)

3’ GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG (SEQ ID NO. 111)

(2) Fragment 2-primere for hHGF beta-kjede aminosyre V495-L585

5’ CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC (SEQ ID NO. 112)

3’ CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT (SEQ ID NO. 113)

(3) Fragment 3-primer for mHGF beta-kjedens C-ende 3’NotI

5’ AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG (SEQ ID NO. 114)

3’ GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCAT CAC (SEQ ID NO.

115)

d. Konstruksjon av hHGF og mhm-kimær

Vektorene som koder for hHGF og mhm-kimær (V495-L585), pcDNA5/FRT hHGF og pcDNA5/FRT-mhm-kimær (V495-L585), uten Fc-merkelapp ble fremstilt ved seterettet mutagenese. Et stoppkodon ble innført 3’ for 6xHis-merkelappen ved anvendelse av settet for seterettet mutagenese QuikChange II XL (Stratagene) ifølge produsentens instruksjoner. Mutageneseprimeren omfattet primer 1:

CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG (SEQ ID NO. 116), og

primer 2: CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG (SEQ ID NO. 117).

I tillegg ble ytterligere to mhm-kimærer fremstilt fra pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585) -konstruksjonen ved seterettet mutagense ved anvendelse av settet for seterettet mutagenese QuikChange II XL (Stratagene) ifølge produsentens instruksjoner. Én mhmkonstruksjon inneholdt området I499-R556 fra hHGF plassert mellom musesekvenser. Den andre mhm-konstruksjonen inneholdt området W507-L585 fra hHGF plassert mellom musesekvenser.

For mhm-kimæren (I499-R556) ble følgende punktmutasjoner innført i denne rekkefølge i pcDNA5/FRT-mhm-kimær (V495-L585) -konstruksjonen som templat:

D558E, C561R, V564I, V567I og M583L, ved anvendelse av egnede oligonukleotidsekvenser. For mhm-kimær (W507-L585) ble følgende punktmutasjoner innført i ett trinn i pcDNA5/FRT-mhm-kimær (V495-L585) -konstruksjonen som templat: Q502R, N504T og I505V, ved anvendelse av egnede oligonukleotidsekvenser.

Den resulterende nukleotidsekvens for hHGF-Fc-proteinet er beskrevet som SEQ ID NO. 118, innbefattet signalsekvens (nukleotid 1-93) og prodomene (nukleotid 94-162). Aminosyresekvensen til hHGF-Fc-proteinet er beskrevet som SEQ ID NO. 119.

Den resulterende nukleotidsekvens som koder for mhm (V495-L585)-Fckimærproteinet, er beskrevet i SEQ ID NO. 120, innbefattet signalsekvens (nukleotid 1-96) og prodomene (nukleotid 97-165). Aminosyresekvensen til mhm (V495-L585)-Fckimærproteinet er beskrevet i SEQ ID NO. 121.

Den resulterende nukleotidsekvens som koder for og proteinsekvensen som definerer mhm (V495-L585) -konstruksjonen, er beskrevet i SEQ ID NO. 211, hhv. 212. Nukleotidsekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO. 211, omfatter signalsekvensen (nukleotid 1-96) og prodomenet (nukleotid 97-165), og proteinsekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO. 212, omfatter den aktive proteinsekvens (uten signalsekvensen og prodomenet). Den resulterende nukleotidsekvens som koder for og proteinsekvensen som definerer mhm (I499-R556) -konstruksjonen, er beskrevet i SEQ ID NO. 231, hhv.

214. Nukleinsyresekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO. 213, omfatter signalsekvensen (nukleotid 1-96) og prodomenet (nukleotid 97-165), mens proteinsekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO. 214, omfatter den aktive proteinsekvens (uten signalsekvensen og prodomenet). Den resulterende nukleotidsekvens som koder for og proteinsekvensen som definerer mhm (W507-L585), er beskrevet i SEQ ID NO. 215, hhv.

216. Nukleinsyresekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO. 215, omfatter signalsekvensen (nukleotid 1-96) og prodomenet (nukleotid 97-165), mens proteinsekvensen som er beskrevet i SEQ ID NO. 216, omfatter den aktive proteinsekvens (uten signalsekvensen og prodomenet).

e. Proteinekspresjon

(1) Celledyrking

CHO FlpIn-celler (Invitrogen, katalog nr. R758-07) ble dyrket i F12K-medium (ATCC, katalog nr. 30-2004), 10% FCS (Invitrogen, katalog nr. 10438026), 1% Penicillin (10 000 enheter)/ml /Streptomycin (10 000 μg/ml) (Invitrogen, katalog nr. 15140-122) ved 37 °C, 5% CO2, 100 μg/ml Zeocin (Invitrogen, katalog nr. R250-01).

(2) Fremstilling av stabile CHO FlpIn-cellelinjer

CHO FlpIn-vertsceller ble transfektert med et 9:1 forhold av pOG44:pcDNA5/FRT-ekspresjonsplasmid-DNA ved anvendelse av lipofectamin 2000 ifølge produsentens instruksjoner (Invitrogen, katalog nr. 11668-027). Som kontroller ble celler transfektert med tom pcDNA5/FRT-vektor/pOG44 og pOG44-plasmid (Invitrogen, katalog nr. 35-3018) alene. 24 timer etter transfeksjonen ble cellene splittet, og etter 48 timer ble 0,5 mg/ml hygromycin B (Sigma, katalog nr. H0654-SPEC) tilsatt til cellene. Polyklonal seleksjon av stabile celler ble utført i F12K, 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,5 mg/ml Hygromycin B.

(3) Proteinekspresjon i stabile CHO FlpIn-cellelinjer

Tilnærmet 2x10<6 >celler ble utsådd i 15 cm skåler og dyrket i F12K (ATCC, katalog nr. 30-2004)/DMEM med høy glukosekonsentrasjon (Invitrogen, katalog nr. 11995065) 1:1, 5% FCS med ultralav IgG-konsentrasjon (Invitrogen, katalog nr. 16250-78) ved 37 ºC, 5% CO2 i 5-6 dager. Supernatanter ble høstet og de resulterende proteinene analysert ved ELISA og overflate-plasmon-resonans.

Eksempel 4 - Bindingsegenskapene til monoklonale anti-hHGF-antistoffer

De monokonale antistoffene som ble fremstilt i eksempel 1, ble karakterisert ut fra evnen til å binde hHGF, og visse av de rekombinante HGF-proteinene som ble fremstilt i eksempel 3.

Antistoffene ble analysert ved overflate-plasmon-resonans ved anvendelse av et BIAcore T100-instrument for måling av evnen til å binde HGF og visse av fusjonsproteinene som ble diskutert i eksempel 3. Hvert antistoff ble immobilisert til en CM5-sensorbrikke med karboksymetylert dekstran (BIAcore, katalog nr. BR-1006-68) ved aminkobling (BIAcore, katalog nr. BR-1000-50) ved anvendelse av en standard koblingsfremgangsmåte ifølge produsentens instruksjoner.

Analysene ble utført ved 25 ºC ved anvendelse av PBS (GIBCO, katalog nr. 14040-133) tilsatt 0,05% surfaktant P20 (BIAcore, katalog nr. R-1000-54), 2 mg/ml BSA (EMD, katalog nr. 2930) og 10 mg/ml CM-dekstran-natriumsalt (Fluka, katalog nr. 86524) som analysebuffer. Supernatant inneholdende forskjellige HGF-fusjonsproteiner eller supernatant fra celler transfektert med tom vektor, ble injisert over hvert antistoff ved en gjennomstrømmingshastighet på 30 μl/minutt i 3 minutter. Den resulterende binding ble målt som resonansenheter (RU) over basalnivået 30 sekunder etter avsluttet injeksjon. Bindingen ble sammenlignet med human HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) fortynnet med analysebuffer. Uspesifikk binding ble målt ved å sammenligne med bindingen til en kontrolloverflate hvor muse-IgG (Rockland, katalog nr. 010-0102) var immobilisert ved anvendelse av den samme aminkoblingsfremgangsmåten.

Resultatene er oppsummert i tabell 3.

Tabell 3

Resultatene i tabell 3 viser at alle antistoffer bandt rHGF og renset human HGF. Videre bandt alle antistoffer hHGF inneholdende punktmutasjonene G555E og C561R.

Generelt bandt ingen av antistoffene bortsett fra 1F3 og 2F8 muse-HGF, noe som viser at antistoffene 1A3, 1D3, 2B8, 3A12, 3B6 og 3D11 spesifikt binder human HGF. Antistoffene 1D3, 1F3 og 2B8 bandt mus-menneske-mus-kimæren, mens resten av antistoffene ikke gjorde dette. Resultatene tyder på at antistoffene 1D3 og 2B8 i det minste delvis bindes til aminosyrerestene 495-585 i human HGF. Antistoffene 1A3, 3A12, 3B6 og 3D11 ser ut til å binde andre deler av human hHGF enn aminosyrerestene 495-585. På det nåværende tidspunkt er det uklart hvorfor 2F8 ikke binder mhm-kimæren da antistoffet ser ut til å binde både hHGF og mHGF.

Eksempel 5 - Monoklonale anti-hHGF-antistoffers evne til å binde redusert og ikkeredusert HGF

I dette eksemplet ble de monoklonale anti-hHGF-antistoffene som ble fremstilt i eksempel 1, analysert for evne til å binde redusert og ikke-redusert HGF.

Reaktiviteten av anti-HGF-sera overfor rekombinant hHGF ble analysert ved immunblotting. 8 μg rekombinant hHGF-protein i NuPAGE MOPS SDS-elektroforesebuffer (Invitrogen) med eller uten NuPAGE-prøvereduksjonsbuffer (Invitrogen) ble fraksjonert i en 4-12% Bis-Tris 1,0 mm gel med 2D-brønn (Invitrogen, Carlsbad, CA). De fraksjonerte proteinene ble så overført til en nitrocellulosemembran ved anvendelse av standardfremgangsmåter. Nitrocellulosemembranene ble blokkert med 5% løsning av fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann med 0,1% ”Tween-20” (TBST) og så montert i et Mini Protean II Multi-Screen-apparat (BioRad) for videre blokkering.

De resulterende membranene ble analysert med de rensede antistoffene i et Multi-Screen-apparat. De rensede antistoffene ble fortynnet til 5 μg/ml i blokkeringsbuffer. Nitrocellulosemembranen ble så fjernet fra apparatet og inkubert med pepperrotperoksidasemerkede anti-muse-IgG-antistoffer. Resultatene er oppsummert i tabell 4, hvor tallene gjenspeiler bindingsgraden og hvor - representerer den laveste bindingsgraden (liten eller ingen binding) og 3+ representerer den høyeste bindingsgraden.

Tabell 4

Resultatene i tabell 4 viser at alle de analyserte antistoffene binder ikke-redusert rhHGF. I motsetning til dette bandt de monoklonale antistoffene 1A3, 1D3, 1F3, 2F8 og 3B6 redusert rhHGF mens antistoffene 2B8, 3A12 og 3D11 ikke bandt seg til redusert rhHGF.

Eksempel 6 - Bindingsaffiniteter

Bindingsaffiniteten og interaksjonskinetikken for hvert av antistoffene som ble fremstilt i eksempel 1 mot hHGF, ble målt ved overflate-plasmon-resonans.

Anti-museimmunglobuliner fra kanin (BIAcore, katalog nr. BR-1005-14) ble immobilisert til CM5-sensorbrikker med karboksymetylert dekstran (BIAcore, katalog nr. BR-1006-68) ved aminkobling (BIAcore, katalog nr. BR-1000-50) ved anvendelse av en standard koblingsfremgangsmåte ifølge produsentens instruksjoner. Analysene ble utført ved 25 ºC ved anvendelse av PBS (GIBCO, katalog nr. 14040-133) tilsatt 0,05% surfaktant P20 (BIAcore, katalog nr. BR-1000-54), 2 mg/ml BSA (EMD, katalog nr. 2930) og 10 mg/ml CM-dekstran-natriumsalt (Fluka, katalog nr. 86524) som analysebuffer.

Hvert antistoff ble innfanget i en separat gjennomstrømmingscelle ved en gjennomstrømmingshastighet på 10 μl/minutt. Injeksjonstiden ble variert for hvert antistoff for erholdelse av tilnærmet 20 RU innfanget antistoff for hver syklus. Buffer eller HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) fortynnet i analysebuffer, ble injisert, først over en referanseoverflate (uten innfanget antistoff) og så over den aktive overflaten (antistoffet som skulle analyseres) i 2 minutter ved 60 μl/minutt. Dissosiasjonsfasen ble fulgt i 15 eller 90 minutter avhengig av konsentrasjonen. Overflaten ble så regenerert med 10 mM glysin-HCl, pH 1,7 (BIAcore, katalog nr. BR-1003-54) injisert i 3 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 60 μl/minutt før en ny syklus ble innledet. De analyserte HGF-konsentrasjonene var fra 0,46 nM til 7,5 nM.

Kinetiske parametere ble bestemt ved anvendelse av kinetikkfunksjonen i programvaren BIAevaluation med subtraksjon av referanse. De kinetiske parameterne ka (assosiasjonshastighetskonstanten), kd (dissosiasjonshastighetskonstanten) og KD (likevekt dissosiasjonskonstanten) for hvert av antistoffene er oppsummert i tabell 5.

Tabell 5

Resultatene i tabell 5 viser at antistoffene binder hHGF med en KD på tilnærmet 100 pM eller lavere, tilnærmet 50 pM eller lavere eller 20 pM eller lavere.

Eksempel 7 - Nøytraliserende aktivitet av anti-hHGF-antistoffer

I dette eksemplet ble antistoffene som ble fremstilt i eksempel 1, karakterisert for deres evne til å (a) inhibere bindingen av hHGF til c-Met, og (b) inhibere HGF-stimulert BrdU-inkorporering i 4MBr-5-celler.

a. Analyse av inhibering av HGF-met-binding (nøytraliseringsanalyse) Antistoffene ble analysert ved ELISA for evne til å inhibere bindingen av hHGF til c-Met.

Nærmere bestemt ble Wallac 96-brønners DELFIA-analyseplater (Wallac Inc., katalog nr. AAAND-0001) belagt med 100 μl 6,25 μg/ml HGF (R&D Systems, katalog nr.

294-HGN-025) i karbonatbasert belegningsbuffer (15 mM Na2CO3 og 34 mM NaHCO3, pH 9,0) i 16 timer ved 4 ºC. Platene ble så blokkert med 200 μl 5% fettfri tørrmelk i PBS i 1 time ved romtemperatur. Antistoffene ble klargjort i en separat plate ved å tilsette økende konsentrasjoner av antistoffene som skulle undersøkes (0,033-667 nM, 3 gangers seriefortynning) til 2 nM c-Met (R&D Systems, katalog nr. 358-MT/CF) i 5% fettfri tørrmelk i PBS. 100 μl prøve pr. brønn ble overført til analyseplaten og inkubert over natten ved 4 ºC. Analyseplatene ble så vasket 3 ganger med PBS-0,1% Tween 20 og inkubert i 2 timer ved romtemperatur med 100 μl/brønn av 2 μg/ml biotinylert antihumant c-Met-antistoff (R&D Systems, katalog nr. BAF358) i 5% fettfri tørrmelk i PBS.

De resulterende platene ble så vasket tre ganger med PBS-0,1% Tween 20 og inkubert i 1 time ved romtemperatur med Eu-merket Streptavidin (Wallac, katalog nr. 1244-360) fortynnet 1:1000 i DELFIA-analysebuffer (Wallac, katalog nr. 4002-0010). De resulterende platene ble vasket 3 ganger med DELFIA-vaskeløsning (Wallac, katalog nr.

4010-0010) og inkubert med 100 μl/brønn DELFIA-forsterkerløsning (Wallac katalog nr.

4001-0010) i 15 minutter ved romtemperatur under omristing.

Platene ble avlest i et Victor<3>V-instrument (Perkin Elmer) ved anvendelse av Europium-fremgangsmåten. IC50-verdier ble beregnet og er oppsummert i tabell 6.

Tabell 6

Resultatene viser at alle antistoffer bortsett fra 3B6 (dvs. 1D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1F3, 3D11 og 2F8) effektivt nøytraliserer bindingen av HGF til c-Met.

b. Nøytralisering av HGF-stimulert BrdU-inkorporering i 4MBr-5-celler

10 μl 12,5 nM hHGF ble overført til enkeltbrønner i en 96-brønners vevsdyrkningsmikrotiterplate (Costar katalog nr. 3903). 10 μl seriefortynnet antistoff i en konsentrasjon på 6667, 2222, 740, 247, 82, 27, 9,1, 3,0, 1,0 eller 0,33 nM ble tilsatt til hver brønn. HGF-antistoffblandingen ble så inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Luftrørets epitelceller fra ape, 4MBr-5 (ATCC, CCL208) dyrket i F-12K (ATCC, 30-2004), 15% FBS (Gibco 10438-026), 30 ng/ml EGF (Sigma E9644), 1% penicillin/streptomycin (PS, Gibco katalog nr. 15140-122) ble dissosiert med trypsin (Gibco katalog nr. 25200-056) og resuspendert i analysemedium (F-12K, 2,5% FBS, 1% PS) ved 75000 celler/ml, og 80 μl av cellesuspensjonen ble tilsatt til HGF-antistoffblandingen.

De resulterende cellene ble inkubert ved 37 ºC, 5% CO2. 48 timer senere ble 10 μl 100 μM BrdU (Roche katalog nr. 1669915) tilsatt. 72 timer senere ble mediet fjernet, og platene ble tørket med en hårtørrer og analysert ved BrdU-ELISA ifølge produsentens instruksjoner (Roche katalog nr. 1669915).

Luminescenssignalet ble kvantifisert i en Synergy HT-plateleser (Bio-Tek).

Resultatene ble tilpasset en sigmoid dose-responskurve med variabel vinkelkoeffisient med ligningen y = bunn (topp-bunn)/(1+10^(log(EC50-x)*hill-koeffisient)) i GraphPad Prism (GraphPad Software). Hvert eksperiment ble gjentatt minst 3 ganger in duplo, og de gjennomsnittlige EC50-verdiene vises i tabell 7.

Tabell 7

Resultatene i tabell 7 viser at hvert av antistoffene 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 og 3D11 inhiberer HGF-indusert proliferasjon av 4MBr-5-celler.

Eksempel 8 - Anti-spredningsaktivitet av anti-hHGF-antistoffer

Dette eksemplet beskriver en karakterisering av antistoffene fremstilt i eksempel 1 når det gjelder evnen til å inhibere HGF-indusert spredningsaktivitet. HGF induserer ”spredning” (motilitet) av ansamlinger av MDCK-celler (ATCC, Manassas, VA, katalog nr. CCL-34).

MDCK-celler ble utsådd i 96-brønners Costar vevsdyrkningsplater (Corning Incorporated, Corning, NY, katalog nr. 3595) ved en tetthet på 4x10<3 >celler pr. brønn i 80 μl MEM (ATCC, Manassas, VA, katalog nr. 30-2003) tilsatt 10% føtalt, bovint serum (Invitrogen katalog nr. 10438026) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen katalog nr.

15140122). Hvert av antistoffene som skulle undersøkes, ble fortynnet til 6 667 nM i MEM tilsatt 10% føtalt, bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Hver av antistofffortynningene samt MEM tilsatt 10% føtalt, bovint serum og 1% penicillin-streptomycin uten antistoff, ble så separat blandet med et likt volum MEM inneholdende 10% føtalt, bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 100 ng/ml HGF (R&D Systems, katalog nr.

294-HGN-025). Antistoff/HGF-fortynningene ble inkubert i 30 minutter ved 25 ºC. 20 μl av hver antistoff/HGF-fortynning ble så separat overført til enkeltbrønner, noe som ga en endelig antistoffkonsentrasjon på 666,7 nM og en endelig HGF-konsentrasjon på 10 ng/ml. MDCK-cellene ble så inkubert i 24 timer ved 37 ºC med 5% CO2.

Etter 24 timers inkubering ble MDCK-cellene forsiktig vasket én gang med 100 μl pr. brønn av iskald PBS (Invitrogen katalog nr. 14190144) og fiksert med 100 μl pr. brønn av iskald metanol under vipping i 10 minutter ved 25 ºC. Platene ble så forsiktig vasket én gang med destillert vann. 100 μl krystallfiolettløsning inneholdende 0,5% krystallfiolett (Sigma, St. Louis, MO, katalog nr. C3886) og 50% etanol i destillert vann ble tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert i 20 minutter ved 25 ºC under vipping.

Etter fargingen med krystallfiolettløsning ble cellene forsiktig vasket 3 ganger med destillert vann. Så ble PBS tilsatt til hver brønn for å forhindre uttørking av prøvene. Cellene ble undersøkt ved anvendelse av et Leica DMIRB-mikroskop (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Tyskland), et DC500 kamera (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Tyskland) og programvaren MagnaFire 2.1C (Optronics, Goleta, CA), og prøvene ble rangert ut fra spredningsnivået. Resultatene er oppsummert i tabell 8.

Tabell 8

-: Ingen inhibering

++: Svært kraftig og nesten fullstendig inhibering

+: Kraftig inhibering

: Påvisbar inhibering

Resultatene i tabell 8 viser at antistoff 2B8 inhiberte HGF-indusert spredning mer enn de andre antistoffene. Antistoffene 1D3 og 3B6 viste et intermediært inhiberingsnivå, mens antistoff 1A3 viste et lavt til intermediært inhiberingsnivå, antistoffene 1F3 og 2F8 viste et lavt inhiberingsnivå, og antistoffene 3A12 og 3D11 ga liten eller ingen påvisbar inhibering.

Eksempel 9 - Inhibering av HGF-stimulert c-Met-fosforylering

Dette eksemplet beskriver en karakterisering av antistoffene fremstilt i eksempel 1 når det gjelder evnen til å inhibere HGF-stimulert c-Met-fosforylering i PC-3-celler. HGF induserer fosforylering av Met i PC-3-celler (ATCC katalog nr. CRL-1435).

PC-3-celler ble utsådd i enkeltbrønner i 96-brønners Costar vevsdyrkningsplater (Corning katalog nr. 3595) ved en tetthet på 4,5x10<4 >celler pr. brønn i 100 μl F-12K (ATCC, Manassas, VA, katalog nr. 30-2004) tilsatt 10% føtalt, bovint serum (Invitrogen, katalog nr. 10438026) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen katalog nr. 15140122). Etter 24 timer ved 37 ºC og 5% CO2 ble mediet fjernet og cellene vasket én gang med serumfritt F-12K inneholdende 1% penicillin-streptomycin. Cellene ble så inkubert i 24 timer i 100 μl serumfritt F-12K tilsatt 1% penicillin-streptomycin.

Følgende 10 fortynninger av hvert av antistoffene som skulle undersøkes, ble fremstilt i serumfritt F-12K tilsatt 1% penicillin-streptomycin: 6 667 nM, 2222 nM, 741 nM, 247 nM, 82,3 nM, 27,4 nM, 9,1 nM, 3,0 nM, 1,0 nM og 0,3 nM. Hver antistofffortynning og serumfritt F-12K tilsatt 1% penicillin-streptomycin uten antistoff, ble hver for seg blandet med et likt volum serumfritt F-12K tilsatt 1% penicillin-streptomycin og 500 ng/ml HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025). Disse antistoff/HGF-fortynningene ble inkubert i 30 minutter ved 25 ºC. Dette førte til en endelig konsentrasjon på 1,25 nM HGF.

PC-3-cellene ble så vasket én gang med serumfritt F-12K tilsatt 1% penicillinstreptomycin. Så ble 70 μl serumfritt F-12K tilsatt 1% penicillin-streptomycin, tilsatt til cellene, fulgt av 10 μl 10 mM Na3 VO4 (Sigma katalog nr. S6508) i serumfritt F-12K inneholdende 1% penicillin-streptomycin. Cellene ble så inkubert i 60 minutter ved 37 ºC og 5% CO2. Etter denne inkuberingen ble 20 μl av hver antistoff/HGF-fortynning overført til separate brønner, noe som ga en endelig HGF-konsentrasjon på 50 ng/ml og følgende sluttkonsentrasjoner for hvert antistoff: 666,7 nM, 222,2 nM, 74,1 nM, 24,7 nM, 8,23 nM, 2,74 nM, 0,91 nM, 0,30 nM, 0,10 nM, 0,03 nM. Cellene ble så inkubert i 10 minutter ved 37 ºC og 5% CO2, hvoretter medium/antistoff/HGF-blandingen ble fjernet og platene plassert på is. Cellene ble så vasket én gang med 100 μl pr. brønn av iskald PBS (Invitrogen katalog nr. 14190144) tilsatt 1 mM Na3VO4. Cellene ble så inkubert i 30 minutter ved 4 ºC i 100 μl pr. brønn av iskald lyseringsbuffer bestående av 1% OmniPur Triton X-100 (MERCK KGaA, Darmstadt, Tyskland, katalog nr. 9410), 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,3 mM Na3VO4, 1x proteaseinhibitorblanding (Sigma katalog nr. P8340) og 1x fosfataseinhibitorblanding 2 (Sigma katalog nr. 5726).

Biotinylert anti-human HGF-R (c-met) -antistoff (R&D Systems, katalog nr.

BAF358) ble fortynnet til en konsentrasjon på 2 μg/ml i DELFIA-analysebuffer (Perkin Elmer, Turku, Finland, katalog nr. 4002-0010) tilsatt 1% bovint serumalbumin (Sigma katalog nr. A2153), og 50 μl av denne fortynningen ble tilsatt til hver brønn i gule streptavidin-mikrotitreringsplater (Perkin Elmer katalog nr. AAAND-0005). Platene ble så inkubert med antistoff i 30 minutter ved 25 ºC under vipping. Etter inkuberingen ble platene vasket med DELFIA-vaskeløsning (Perkin Elmer katalog nr. 4010-0010), og 80 μl av hvert PC-3-cellelysat ble så separat overført til brønner i de vaskede streptavidinmikrotitreringsplatene.

Streptavidin-mikrotitreringsplatene inneholdende PC-3-cellelysater, ble inkubert i 60 minutter ved 25 ºC under omristing og så vasket med DELFIA-vaskeløsning. 100 μl 600 ng/ml DELFIA Eu-N1 P-Tyr-100-antistoff (Perkin Elmer katalog nr. AD0159) fortynnet med DELFIA-analysebuffer inneholdende 1% bovint serumalbumin, ble tilsatt til hver brønn i de vaskede streptavidin-mikrotitreringsplatene som på forhånd var inkubert med PC-3-cellelysater. Platene ble inkubert i 60 minutter ved 25 ºC under vipping. Platene ble til slutt vasket med DELFIA-vaskeløsning. Så ble 200 μl DELFIA-forsterkerløsning (Perkin Elmer katalog nr. 4001-0010) tilsatt til hver brønn i de vaskede streptavidinmikrotitreringsplatene, og platene ble inkubert i mørke i 5 minutter ved 25 ºC under omristing.

Signalet ble så målt ved anvendelse av Europium-fremgangsmåten i en Victor3V-plateleser (Perkin Elmer). EC50-verdier ble beregnet ved anvendelse av Prism 4 for Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) og den sigmoide doseresponsligningen.

Resultatene angitt som EC50 i nM, er opplistet i tabell 9.

Tabell 9

Resultatene i tabell 9 viser at alle de åtte antistoffene er kraftige inhibitorer av HGF-indusert c-Met-fosforylering i PC-3-celler.

Eksempel 10 - Tumorinhibering i en U87MG-xenotransplantatmodell

Evnen til de monoklonale muse-antistoffene ifølge oppfinnelsen til å inhibere tumorvekst ble analysert i en U87MG-xenotransplantatmodell. U87MG-celler (ATCC) ble ekspandert i kultur ved 37 ºC i en atmosfære inneholdende 5% CO2 og 95% luft ved anvendelse av et medium som omfattet Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt, bovint serum, 100 enheter/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Cellene ble overført i kultur og dyrket videre ved å frigjøre cellene fra veggen av dyrkningsskålen ved anvendelse av trypsin-EDTA.

Nær konfluente celler ble oppsamlet ved trypsinbehandling, hvoretter 5x10<6 >celler i 50% Matrigel (BD Biosciences, katalog nr. 356237) ble injisert subkutant i det øvre ryggområdet mellom skulderbladene i 7 uker gamle ICR SCID-hunnmus (Taconic Labs). Tumorenes lengste (L) og korteste (W) diameter (mm) ble målt med et skyvelær.

Tumorvolumet (vol.) ble beregnet som: volum (mm<3>) = L x W<2>/2. Etter at tumorene hadde vokst til tilnærmet 200 mm<3>, ble de tumorbærende musene tilfeldig fordelt på 5 grupper med 10 mus i hver gruppe. Én gruppe ble tilført PBS. Hver av de andre 4 gruppene ble tilført ett av antistoffene 1A3, 1D3, 1F3 og 2B8. Alle antistoffer ble tilført i en dose på 1 mg/kg kroppsvekt to ganger i uken ved intraperitoneal injeksjon på 5 doser. Tumorvolumet og musenes kroppsvekt ble målt to ganger i uken. Tumorvekstinhiberingen ble analysert ved anvendelse av Students t-test. Resultatene er oppsummert i figur 6 og tabell 10.

Tabell 10

Delvis regresjon ble oppnådd i den 2B8-behandlede gruppe (figur 6). Statistisk signifikant vekstinhibering ble behandlet i den 1A3-behandlede gruppe og den 1F3-behandlede gruppe (tabell 10). Det var 51% tumorvekstinhibering for 1D3 med en pverdi på 0,075. Intet signifikant tap av kroppsvekt ble observert.

Eksempel 11 - Tumorinhibering i en U118-xenotransplantatmodell

Evnen til antistoffene 1A3, 1D3, 1F3 og 2B8 til å inhibere tumorvekst, ble analysert i en U118-xenotransplantatmodell. U118-celler (ATCC) ble ekspandert som beskrevet i eksempel 10 (ovenfor) når det gjelder U87MG-celler.

Subkutane tumorer ble etablert som beskrevet i eksempel 10 ovenfor, bortsett fra at de anvendte musene var 7 uker gamle NCr nakne hunnmus (Taconic), og behandlingen ble innledet da tumorene hadde vokst til tilnærmet 80 mm<3>. Som i U87MG-modellen, ble alle antistoffer tilført i en dose på 1 mg/kg kroppsvekt to ganger i uken ved intraperitoneal injeksjon av 4 doser. Tumorvolumet og musenes kroppsvekt ble målt to ganger i uken. Tumorvekstinhiberingen ble analysert ved anvendelse av Students t-test. Resultatene er oppsummert i figur 7 og tabell 11.

Tabell 11

Statistisk signifikant tumorvekstinhibering ble observert i gruppene behandlet med 2B8 og 1A3 (figur 7). Det var en moderat tumorvekstinhibering i gruppene behandlet med 1F3 og 1D3, med p-verdier som var lavere enn 0,05, som ble definert som statistisk signifikans i denne undersøkelsen (tabell 11). Intet signifikant tap av kroppsvekt ble observert.

Eksempel 12 - Humanisering av monoklonale museantistoffer

Dette eksemplet beskriver humanisering av museantistoff 2B8 sammen med en karakterisering av de resulterende humaniserte antistoffene. Den tunge kjedens og den lette kjedens variable områder i museantistoff 2B8 ble ”humanisert” ved to fremgangsmåter.

A. Humaniseringsfremgangsmåte 1

I den første fremgangsmåten ble tre humaniserte tung kjedes variable områder og to humaniserte lett kappa kjedes variable områder utformet basert på ”superhumaniserings”-fremgangsmåten som er beskrevet i Hwang et al. (2005) METHODS 36:35-42; Tan et al. (2002) J. IMMUNOL. 169:1119-1125; US patentskrift nr. 6881 557.

Den kanoniske Chothia-strukturklassen ble bestemt for hvert CDR i muse-2B8 ut fra CDR-lengden og aminosyre sammensetningen. Humane kjønnscellers variable områder som besto av den lette og tunge kjedens variable områder fra den samme kanoniske Chothia-strukturklasse ble identifisert basert på kjente humane referansealleler av kjønnscellers variable områder, beskrevet på nettsetet International Immunogenetics Information System (IMGT) (tilgjengelig på nettsetene imgt.cines.fr og biochem.unizh.ch/antibody/Sequences/index.html). Disse humane kjønnscellenes variable områder fra samme strukturklasse ble sammenlignet med de variable områdene i muse-2B8 ved å beregne prosent identitet eller likhet mellom CDR-aminosyrerestene. De humane kjønnscellenes variable områder som hadde høyest identitet og/eller likhet med CDR-aminosyrerestene i muse-2B8, ble valgt for CDR-transplantasjon. Rammeverkaminosyrerestene i de humane kjønnscellenes variable områder ble bevart, mens CDR-aminosyrerester fra muse-2B8 ble anvendt for å erstatte de tilsvarende aminosyrerestene i det humane kjønnscellenes variable områder som var forskjellige mellom CDR i muse-2B8 og humane kjønnscelle-CDR. Det humane J-område som lignet mest på J-området i muse-2B8, ble så addert til karboksylenden av det ”superhumaniserte” variable område. En signalsekvens ble så addert til aminoenden av de ”superhumaniserte” variable områdene, og disse aminosyresekvensene ble omdannet til nukleinsyresekvenser.

Nukleinsyresekvensen for det komplette variable område ble konstruert ved anvendelse av PCR-fremgangsmåter for gen syntese (Young et al. (2004) NUCL. ACIDS RES. 32:e59) og klonet inn i en pattedyrekspresjonsvektor (basert på pcDNA3.2 DEST (Invitrogen)) som inneholdt humant konstant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) -området eller Kappa (Km(3)-allotype (allel 2)) -området (nedstrøms for de variable områdene) ved anvendelse av standard molekylærbiologiske teknikker. Alle de fire IgG1-antistofftungkjedene (kimær 2B8-tungkjede og 3 humaniserte tungkjeder (Hu2B8 Hv1-f.1, Hu2B8 Hv5-a.1, Hu2B8 Hv5-51.1) ble uttrykt i de mulige kombinasjonene med alle de 3 kappaantistoffkjedene (kimær 2B8-lettkjede og 2 humaniserte lettkjeder (Hu2B8 Kv1-39.1 og Hu2B8 Kv3-15.1), slik at det ble fremstilt 12 forskjellige antistoffproteiner. Bindingen av de kimære, kimære/humaniserte og humaniserte antistoffene til human HGF ble så målt som beskrevet nedenfor, og resultatene er oppsummert i figur 8. Hver av de mulige kombinasjonene av immunglobulinets tunge kjedes variable områder og immunglobulinets lette kjedes variable områder er gitt nedenfor i tabell 12A.

Tabell 12A

Alle de mulige kombinasjonene av immunglobulinets tunge kjeder og immunglobulinets lette kjeder er gitt nedenfor i tabell 12B.

Tabell 12B

To av de mulige antistoffkonstruksjonene som inneholder fullengdeimmunglobulinets tunge og lette kjeder med humaniserte variable områder, er beskrevet nedenfor:

sh2B8-9 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 konstant område (G1m(17,1)-allotype) (SEQ ID NO. 171) pluss hu2B8 Kv 1-39.1 (+ Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel

2))) (SEQ ID NO. 177)

sh2B8-12 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 konstant område (G1m(17,1)-allotype)) (SEQ ID NO. 171) pluss hu2B8 Kv 3-15.1 (+ Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel

2))) (SEQ ID NO. 181).

Nukleinsyresekvensene som koder for og proteinsekvensene som definerer hvert av de humaniserte antistoffene, er oppsummert nedenfor. I denne seksjonen er det siste nukleotid i hvert av de variable områdene den første basen i det neste kodonet dannet på grensen mellom det variable og det konstante område. Dette nukleotidet inngår i det variable området da det er en del av dette eksonet.

Aminosyresekvensene til konstante områder som er opplistet nedenfor, omfatter translasjonen av dette overgangskodonet.

(1) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde kimær 2B8-tungkjede (variabelt område fra mus og konstant område fra humant IgG1) (allotype G1m(17,1)) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 154)

1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag

61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc

121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct

181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctccacc

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(2) Proteinsekvens som definerer fullengde kimær 2B8-tungkjede (kimært 2B8 IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 155)

1 qvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(3) Nukleinsyresekvens som koder for fullengde kimær 2B8-lettkjede (variabelt område fra mus og humant konstantområde) (kimær 2B8-Kappa (Km(3))) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 156)

1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg

61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc

121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca

181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat

241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct

301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca

421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat

481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga

(4) Proteinsekvens som definerer fullengde-lettkjeden i kimær 2B8 (kimær 2B8-Kappa (Km(3))) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 157)

1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd

61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrtv aapsvfifpp

121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt

181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

(5) Nukleinsyresekvens som koder for humanisert Hu2B8 Hv1-f.1-den tunge kjedens variable område (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 158)

1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag

61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc

121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct

181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg

301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag

(6) Proteinsekvens som definerer humanisert Hu2B8 Hv1-f.1-den tunge kjedens variable område (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 159)

1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvss

(7) Nukleinsyresekvens som koder for den tunge kjedens konstante område i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (SEQ ID NO. 160)

1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg

61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt

121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag

181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct

241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca

301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac

361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg

421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt

481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca

541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg

601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca

661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc

721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg

781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc

841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc

901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc

961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga

(8) Proteinsekvens som definerer den tunge kjedens konstante område i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (SEQ ID NO. 161). Den første aminosyren er erholdt ved translasjon av det siste nukleotid i det variable område og de første to nukleotidene i IgG1-tungkjedesekvensen.

1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss

61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellgg

121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn

181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsrde

241 ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw

301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

(9) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv1f.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 162)

1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag

61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc

121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct

181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(10) Proteinsekvens som definerer det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv1f.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 163)

1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(11) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den tunge kjeden i humanisert Hu2B8 Hv5a.1 (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 164)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg

301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag

(12) Proteinsekvens som definerer det variable område i den tunge kjeden i humanisert Hu2B8 Hv5a.1 (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 165)

1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny

61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss

(13) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv5a.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 166)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg

301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt

721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac

961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag

1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa

1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag

1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag

1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg

1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc

1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(14) Proteinsekvens som definerer det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv5a.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 167)

1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny

61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst

301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(15) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den tunge kjeden i humanisert Hu2B8 Hv5-51.1 (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 168)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg

301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag

(16) Proteinsekvens som definerer det variable område i den tunge kjeden i humanisert Hu2B8 Hv5-51.1 (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 169)

1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny

61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss

(17) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv5-51.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 170)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg

301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt

721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac

961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag

1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa

1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag

1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag

1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc

1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg

1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc

1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(18) Proteinsekvens som definerer det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv5-51.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(17,1)-allotype) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 171)

1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny

61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst

301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(19) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i kappa-kjeden i humanisert Hu2B8 Kv1-39.1 (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 172). To mulige start-ATG er vist med store bokstaver

1 ATGgacATGa gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga

121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag

181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg

301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt

361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac

(20) Proteinsekvens som definerer det variable område i kappa-kjeden i humanisert Hu2B8 Kv1-39.1 (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 173)

1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasenvv syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps

61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleik

(21) Nukleinsyresekvens som koder for det konstante område i human kappakjede (Km(3)-allotype) (allel 2) (SEQ ID NO. 174)

1 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg

61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt

121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tga

(22) Proteinsekvens som definerer det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 2) (SEQ ID NO. 175). Den første aminosyren er erholdt ved translasjon av det siste nukleotid i det variable område og de første to nukleotidene i kappa-lettkjedesekvensen.

1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd

61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec

(23) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-lettkjeden i humanisert Hu2B8 Kv1-39.1 og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 2) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 176)

1 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc

61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga

121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag

181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc

241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg

301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt

361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc

421 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac

481 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac

541 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc

601 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat

661 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a

(24) Proteinsekvens som definerer det variable område i fullengde-lettkjeden i humanisert Hu2B8 Kv1-39.1 og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 1) (SEQ ID NO. 177)

1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasenvv syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps

61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp

121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt

181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

(25) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den lette kjeden i humanisert Hu2B8 Kv3-15.1 (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 178)

1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga

61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc

121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct

181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc

241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct

301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag

361 gggaccaagc tggagatcaa ac

(26) Proteinsekvens som definerer det variable område i den lette kjeden i humanisert Hu2B8 Kv3-15.1 (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 179)

1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa

61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleik

(27) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-lettkjeden i humanisert Hu2B8 Kv3-15.1 og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 2) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 180)

1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga

61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc

121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct

181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc

241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct

301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag

361 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca

421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat

481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag

541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg

601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc

661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga

(28) Proteinsekvens som definerer det variable område i den lette kjeden i humanisert Hu2B8 Kv3-15.1 og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 2) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 181)

1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa

61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp

121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt

181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

For enkelhets skyld gir tabell 13 en samsvarstabell som viser sammenhengen mellom fullengdesekvensene og antistoffene som er diskutert i denne seksjonen og sekvensene som er gitt i sekvenslisten.

Tabell 13

B. Humaniseringsfremgangsmåte 2 Den andre humaniseringsfremgangsmåten som ble benyttet for reduksjon av immunogenisiteten av museantistoff 2B8, bygger på fremgangsmåten som er beskrevet i Studnicka et al. (1994) PROTEIN ENG. 7:805-814. De tunge og kappa humane kjønnscellers variable kjeders områder som var mest identiske (på aminosyrenivå) med områdene i muse-2B8, ble identifisert. Aminosyrerester som var forskjellige mellom mus og menneske, ble omdannet til den humane sekvens avhengig av den sannsynlige risiko for at en slik endring kan påvirke binding eller immunogenisitet. Aminosyrerester med lav risiko (dvs. aminosyrerester som ved endring sannsynligvis ikke vil påvirke antigenbindingen, og som også vil redusere den mulige immunogenisitet) ble endret til den humane aminosyren i den tunge kjedens variable område (for fremstilling av LR2B8HC) og kappas variable område (for fremstilling av LR2B8LC). I tillegg ble aminosyrerester med lav eller middels risiko (dvs. aminosyrerester som ved endring har en viss sannsynlighet for å påvirke antigenbindingen og som også vil redusere den mulige immunogenisitet) endret til den humane aminosyren i den tunge kjedens variable område (for fremstilling av LRMR2B8HC) og kappas variable område (for fremstilling av LRMR2B8LC). Den tunge kjedens konstante område fra humant IgG1 (G1m(3)-allotype (allel 1)) ble addert til karboksylenden av de to modifiserte, humane, tunge kjeders variable område, og det humane, kappa konstante området (Km(3)-allotype (allel 1)) ble addert til karboksylenden av de to humane, modifiserte, lette kjeders variable område slik at det ble fremstilt fire humane, modifiserte antistoffkjeder. Nukleinsyresekvensene for de variable områdene ble først syntetisert ved gen syntese fremgangsmåter og så addert til sekvensene for humane, konstante områder. Disse humane, modifiserte antistoffene ble klonet inn i pattedyr proteinekspresjonsvektorer, og protein ble uttrykt i de fire mulige kombinasjonene av tungkjede pluss lettkjede. Bindingen av de kimære, kimære/humaniserte eller humaniserte antistoffene til human HGF ble målt ved anvendelse av konvensjonelle teknikker som beskrevet nedenfor.

Nukleinsyresekvensene som koder for og proteinsekvensene som definerer hvert av de humaniserte antistoffene, er oppsummert nedenfor. I denne seksjonen er det siste nukleotid i hvert av de variable områdene den første basen i det neste kodonet som dannes i overgangen mellom det variable og det konstante område. Dette nukleotidet inngår i det variable område da det utgjør en del av dette eksonet. Aminosyresekvensene til de konstante områdene som er opplistet nedenfor, omfatter translasjonen av dette overgangskodonet.

(1) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den tunge kjeden i humanisert LR2B8HC (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 182)

1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa

61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc

181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat

241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg

301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta

361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag

(2) Proteinsekvens som definerer det variable område i den tunge kjeden i humanisert LR2B8HC (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 183)

1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny

61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss

(3) Nukleinsyresekvens som koder for det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 1) (SEQ ID NO. 184)

1 ccagcacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg

61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt

121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag

181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct

241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca

301 aatcttgtga caaaactcac acatgtccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac

361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg

421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt

481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca

541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg

601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca

661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga

721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg

781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc

841 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc

901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc

961 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga

(4) Proteinsekvens som definerer det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 1 eller 2) (SEQ ID NO. 185). Den første aminosyren er erholdt ved translasjon av det siste nukleotid i det variable område og de første to nukleotidene i IgG1-tungkjedesekvensen.

1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg

121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn

181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree

241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw

301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

(5) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert LR2B8HC og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 1) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 186)

1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa

61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca

121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc

181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat

241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg

301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta

361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc agccagcaca

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt

721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac

961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag

1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa

1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag

1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag

1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc

1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg

1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc

1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga

(6) Proteinsekvens som definerer det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert LR2B8HC og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 1) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 187)

1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(7) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den tunge kjeden i humanisert LRMR2B8HC (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 188)

1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag

61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca

121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc

181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg

301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta

361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc ag

(8) Proteinsekvens som definerer det variable område i den tunge kjeden i humanisert LRMR2B8HC (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 189)

1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss

(9) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den tunge kjeden i humanisert LRMR2B8HC og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 1) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 190)

1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag

61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca

121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc

301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta

361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc agccagcaca

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt

721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag

1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag

1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc

1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga

(10) Proteinsekvens som definerer det variable området i fullengde-tungkjeden i humanisert LRMR2B8HC og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 1) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 191)

1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny

61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(11) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den lette kjeden i humanisert LR2B8LC (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 192)

1 atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc

61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc

121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc

181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac

241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca

301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa

(12) Proteinsekvens som definerer det variable område i den lette kjeden i humanisert LR2B8LC (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 193)

1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd

61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik

(13) Nukleinsyresekvens som koder for det konstante område i human kappakjede (Km(3)-allotype) (allel 1) (SEQ ID NO. 194)

1 gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg

61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt

121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca

181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga

241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga

301 gcttcaacag gggagagtgt tag

(14) Proteinsekvens som definerer det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 1) (SEQ ID NO. 195). Den første aminosyren er erholdt ved translasjon av det siste nukleotid i det variable område og de første to nukleotidene i kappa-lettkjedesekvensen.

1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd

61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec

(15) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-lettkjeden i humanisert LR2B8LC og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 1) (SEQ ID NO. 196)

1 atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc

61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc

121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc

181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac

241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca

301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa

361 ggaaccaaac tcgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca

421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat

481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag

(16) Proteinsekvens som koder for det variable område i fullengde-lettkjeden i humanisert LR2B8LC og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 1) (SEQ ID NO. 197)

1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp

121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt

181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

(17) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i den lette kjeden i humanisert LRMR2B8LC (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 198)

1 atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga

61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca

121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct

181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac

241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc

301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa

361 ggcactaaac ttgaaattaa ac

(18) Proteinsekvens som definerer det variable område i den lette kjeden i humanisert LRMR2B8LC (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 199)

1 divmtqspds lamslgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd

61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik

(19) Nukleinsyresekvens som koder for det variable område i fullengde-lettkjeden i humanisert LRMR2B8LC og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 1) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 200)

1 atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga

61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca

121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct

181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac

241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc

301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa

361 ggcactaaac ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca

421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat

481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag

541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg

601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc

661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag

(20) Proteinsekvens som definerer det variable område i fullengde-lettkjeden i humanisert LRMR2B8LC og det konstante område i human kappa-kjede (Km(3)-allotype) (allel 1) (SEQ ID NO. 201)

1 divmtqspds lamslgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd

61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp

121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt

181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

For enkelhets skyld gir tabell 14 en samsvarstabell som viser sammenhengen mellom fullengde-sekvensene og antistoffene som er diskutert i denne seksjonen og sekvensene som gis i sekvenslisten.

Tabell 14

Tabell 15 oppsummerer den tunge kjedens CDR-sekvenser (Kaba-definisjon) i de humaniserte 2B8-antistoffene fremstilt ved humaniseringsfremgangsmåte 1 og humaniseringsfremgangsmåte 2, beskrevet ovenfor her i dette eksemplet.

Tabell 15

Tabell 16 oppsummerer den lette kjedens CDR-sekvenser (Kabat-definisjon) i de humaniserte 2B8-antistoffene fremstilt ved humaniseringsfremgangsmåte 1 og ved humaniseringsfremgangsmåte 2, beskrevet her ovenfor i dette eksemplet.

Tabell 16

C. Bindingsaffiniteten av humaniserte 2B8-antistoffer

Antigenbindingsaffiniteten og kinetikken for interaksjon ble analysert ved overflate-plasmon-resonans teknologi ved anvendelse av et BIAcore T100-instrument. Anti-humane immunglobuliner fra mus (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) ble immobilisert til CM4-sensorbrikker med karboksymetylert dekstran (BIAcore, katalog nr. BR-1005-34) ved aminkobling (BIAcore, katalog nr. BR-1000-50) ved anvendelse av en standard koblingsfremgangsmåte ifølge produsentens anbefalinger. Analysene ble utført ved 25 ºC ved anvendelse av PBS (GIBCO, katalog nr. 14040-133) tilsatt 0,05% surfaktant P20 (BIAcore, katalog nr. BR-1000-54), 2 mg/ml BSA (EMD, katalog nr. 2930) og 10 mg/ml CM-dekstran-natriumsalt (Fluka, katalog nr. 86524) som analysebuffer.

Antistoffene ble innfanget på individuelle gjennomstrømmingsceller ved en gjennomstrømmingshastighet på 10 μl/minutt. Injeksjonstiden ble variert for hvert antistoff for erholdelse av tilnærmet 20 RU antistoff innfanget for hver syklus. Buffer eller HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) fortynnet i analysebuffer, ble injisert, først over en referanseoverflate (uten innfanget antistoff) og så over den aktive overflaten (antistoffet som skal analyseres) i 2 minutter ved 60 μl/minutt. Dissosiasjonsfasen ble fulgt i 15 eller 90 minutter avhengig av konsentrasjonen. Overflaten ble så regenerert med 10 mM glysin-HCl, pH 2,0 (BIAcore, katalog nr. BR-1003-55) injisert i 3 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 60 μl/minutt før en ny syklus ble innledet. De analyserte HGF-konsentrasjonene var 1,88, 3,75 og 7,5 nM. Bestemmelsen av kinetiske parametrer ble oppnådd ved anvendelse av kinetikkfunksjonen i programvaren BIAevaluation med subtraksjon av referanser. De kinetiske parameterne ka (assosiasjonshastighetskonstanten), kd (dissosiasjonshastighetskonstanten) og KD (likevekt dissosiasjonskonstanten) for hvert antistoff er oppsummert i figur 8.

Resultatene som er oppsummert i figur 8, viser at visse kombinasjoner av de superhumaniserte tunge kjedene (Hu2B8 Hv5a.1, Hu2B8 Hv5-51.1 og Hu2B8 Hv1-f.1) og lettkjedene (Hu2B8 Kv1-39.1 og Hu2B8 Kv3-15.1) har bevart en bindingsaffinitet (KD) til HGF som tilsvarer bindingsaffiniteten til kimært 2B8 (mus variable områder med humane konstante områder) og 2B8 (tabell 5).

D. Gjensidig utelukkende bindingsanalyse

Gjensidig utelukkende binding til HGF ble analysert ved overflate-plasmonresonans teknologi ved anvendelse av et BIAcore T100-instrument. Anti-humane immunglobuliner fra mus (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) ble immobilisert til CM5-sensorbrikker med karboksymetylert dekstran (BIAcore, katalog nr. BR-1006-68) ved aminkobling (BIAcore, katalog nr. BR-1000-50) ved anvendelse av en standard koblingsfremgangsmåte ifølge produsentens anbefalinger. Analysene ble utført ved 25 ºC ved anvendelse av PBS (GIBCO, katalog nr. 14040-133) tilsatt 0,05% surfaktant P20 (BIAcore, katalog nr. BR-1000-54), 2 mg/ml BSA (EMD, katalog nr. 2930) og 10 mg/ml CM-dekstran-natriumsalt (Fluka, katalog nr. 86524) som analysebuffer.

De humaniserte antistoffene ble innfanget av individuelle gjennomstrømmingsceller ved en gjennomstrømmingshastighet på 30 μl/minutt. Injeksjonstiden ble variert for hvert antistoff for erholdelse av tilnærmet 150 RU innfanget antistoff for hver syklus. HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) fortynnet i analysebuffer til en sluttkonsentrasjon på 7,5 μg/ml, ble injisert i 90 sekunder ved 30 μl/minutt over de innfangede, humaniserte antistoffene. Bindingen av HGF ble fulgt før påfølgende injeksjon av museantistoff 2B8 eller polyklonalt anti-HGF-antistoff fra geit (R&D Systems, AF294) i 3 minutter ved 30 μl/minutt. Overflaten ble så regenerert med 10 mM glysin-HCl, pH 2,0 (BIAcore, katalog nr. BR-1003-55) injisert i 3 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 60 μl/minutt før et nytt antistoff ble analysert. Resultatene er oppsummert i figur 9.

Resultatene som er oppsummert i figur 9, viser at både humaniserte 2B8-antistoffer og kimære 2B8-antistoffer forhindret binding av muse-2B8 til HGF. Disse resultatene viser at de humaniserte antistoffene fortsatt binder den samme HGF-epitop som det opprinnelige 2B8-antistoff.

Eksempel 13 - Fremstilling av humaniserte 2B8-varianter

a. ”HUMAN ENGINEERED”-antistoffer

Kodon- og ekspresjonsoptimalisert lavrisiko og lav pluss moderat risiko ”Human Engineered”-lettkjede (LR2B8LC, hhv. LRMR2B8LC) og -tungkjede (LR2B8HC, hhv.

LRMR2B8HC) ble klonet med opprettholdt leseramme inn i XOMA-vektorer for transient antistoffekspresjon, hvor vektorene inneholder humane Kappa- og Gamma-1-konstant område-moduler. De fire ”Human Engineered”-2B8-variantene ble fremstilt ved transient transfeksjon av HEK293E-celler. Følgende fire antistoffer ble fremstilt:

HE2B8-1 = LR2B8HC (+ IgG1 konstant område (G1m(3)-allotype (allel 1)) (SEQ ID NO. 187) pluss LR2B8LC (+ Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel 1))) (SEQ ID NO. 197)

HE2B8-2 = LR2B8HC (+ IgG1 konstant område (G1m(3)-allotype (allel 1)) (SEQ ID NO. 187) pluss LRMR2B8LC (+ Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel 1))) (SEQ ID NO. 201)

HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ IgG1 konstant område (G1m(3)-allotype (allel 1)) (SEQ ID NO. 191) pluss LR2B8LC (+ Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel 1))) (SEQ ID NO. 197)

HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ IgG1 konstant område (G1m(3)-allotype (allel 1)) (SEQ ID NO. 191) pluss LRMR2B8LC (+ Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel 1))) (SEQ ID NO. 201)

De lette og tunge kjedene ble kotransfektert inn i suspensjonsadapterte HEK293E-celler fra XOMA dyrket i IS293-medium (Irvine Scientific, Irvine, CA) ved anvendelse av 2-liters ristekolber. Etter 24 timer i ristekolbene ble 200 ml transfekterte celler sentrifugert, resuspendert i 40 ml friskt medium og overført til Integra-flasker (Wilson Wolf Manufacturing Inc., MN) for antistoffremstilling. Etter inkubering i 7 dager ble cellesuspensjonene fjernet fra Integra-flaskene og sentrifugert, og dyrkningssupernatantene ble bevart. Antistoffer i dyrknings-supernatantene ble renset på protein A-sentrifugeringskolonner (Pro-Chem), dialysert mot PBS, oppkonsentrert og sterilfiltrert.

b. ”SUPERHUMANIZED”-antistoffer

Fullengde Hu2B8_Hv5-51.1 humant IgG1 konstant domene (G1m(3)-allotype)-cDNA ble klonet inn i pEE6.4 (Lonza Biologics, Berkshire, UK) ved anvendelse av HindIII-og EcoRI-restriksjonssetet. Fullengde Hu2B8_Kv1-39.1 variabelt område humant Kappa konstant domene-cDNA og fullengde Hu2B8_Kv3-15.1 variabelt område humant Kappa konstant domene-cDNA ble begge klonet i pEE14.4 (Lonza Biologics) ved anvendelse av HindIII- og EcoRI-restriksjonssetet. hCMV-MIE-promoter fullengde-Hu2B8_Hv5-51.1 humant IgG1 konstant domene (G1m(3)-allotype)-cDNA SV40 poly A-fragment (i pEE6.4) ble fjernet ved kutting med NotI/SalI og innsatt i enten Kappa-kjede-pEE14.4-vektor via NotI/SalI-setene slik at det ble fremstilt to forskjellige ekspresjonsvektorer som begge samtidig uttrykker tungkjede og lettkjede, for fremstilling av følgende antistoffer:

sh2B8-9 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 konstant område (G1m(3)-allotype) (allel 2)) (SEQ ID NO. 210) pluss hu2B8 Kv 1-39.1 (+

Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel 2))) (SEQ

ID NO: 177)

sh2B8-12 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 konstant område (G1m(3)-allotype) (allel 2)) (SEQ ID NO. 210) pluss hu2B8 Kv 3-15.1

(+ Kappa konstant område (Km(3)-allotype (allel 2)))

(SEQ ID NO. 181)

Nukleinsyresekvensene som koder for og proteinsekvensene som definerer den tunge kjedens konstante område i humant IgG1 av G1m(3)-allotype (allel 2) og hver av fullengde-tung kjedes sekvenser er gitt nedenfor. De lette kjedenes sekvenser var de samme som er beskrevet i eksempel 12.

(1) Nukleinsyresekvens som koder for det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 2) (SEQ ID NO. 207)

1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg

61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt

121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag

181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct

241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca

301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac

361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg

421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt

481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca

541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg

601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaag accatctcca

661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga

721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg

781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc

841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc

901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc

961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga

(2) Proteinsekvens som definerer det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 (G1m(3)-allotype) (allel 1 eller 2) (SEQ ID NO. 208). Den første aminosyren er erholdt ved translasjon av det siste nukleotid i det variable område og de første to nukleotidene i IgG1-tungkjedesekvensen.

1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss

61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg

121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn

181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree

241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw

301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

(3) Nukleinsyre som koder for det variable område i fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv5-51.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 av G1m(3)-allotype (allel 2) (signalsekvensen er understreket) (SEQ ID NO. 209)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg

301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc

661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt

721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa

1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag

1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc

1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(4) Proteinsekvens som definerer fullengde-tungkjeden i humanisert Hu2B8 Hv5-51.1 og det konstante område i den tunge kjeden i humant IgG1 av G1m(3)-allotype (allel 2) (uten signalsekvens) (SEQ ID NO. 210)

1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst

301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

Hver av de to dobbeltekspresjonsvektorene ble transfektert inn i 293T-celler for transient ekspresjon ved anvendelse av DMEM med 10% føtalt, bovint serum. 48 timer etter transfeksjonen ble cellene vasket med serumfritt medium, ”IS GRO” (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) tilsatt 4 mM L-glutamin og dyrket videre i samme medium. Supernatant ble høstet daglig og erstattet med friskt medium i 10 dager. Dyrkningssupernatantene ble sentrifugert, filtrert (0,45 μm) og oppkonsentrert 10-100 ganger. Antistoffene ble renset på ProSep vA-resin (Millipore), dialysert mot PBS, oppkonsentrert og sterilfiltrert.

Eksempel 14 - Bindingsegenskapene til humaniserte 2B8-varianter

De humaniserte antistoffene som ble fremstilt i eksempel 13, ble karakterisert når det gjaldt evnen til å binde hHGF og de rekombinante HGF-proteinene som ble fremstilt i eksempel 3.

Antistoffene ble analysert ved overflate-plasmon-resonans ved anvendelse av et BIAcore T100-instrument for måling av evnen til å binde hHGF og fusjonsproteinene som er diskutert i eksempel 3. Hvert antistoff ble immobilisert til en CM5-sensorbrikke med karboksymetylert dekstran (BIAcore, katalog nr. BR-1006-68) ved aminkobling (BIAcore, katalog nr. BR-1000-50) ved anvendelse av en standard koblingsfremgangsmåte ifølge produsentens instruksjoner.

Analysene ble utført ved 25 ºC ved anvendelse av PBS (GIBCO, katalog nr. 14040-133) tilsatt 0,05% surfaktant P20 (BIAcore, katalog nr. R-1000-54), 2 mg/ml BSA (EMD, katalog nr. 2930) og 10 mg/ml CM-dekstran-natriumsalt (Fluka, katalog nr. 86524) som analysebuffer. Supernatant inneholdende forskjellige HGF-fusjonsproteiner eller supernatant fra celler transfektert med tom vektor, ble injisert over hvert antistoff ved en gjennomstrømmingshastighet på 30 μl/minutt i 3 minutter. Den resulterende bindingen ble målt som resonansenheter (RU) over basalnivået 30 sekunder etter avsluttet injeksjon. Bindingen ble sammenlignet med human HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) fortynnet i analysebuffer. Uspesifikk binding ble målt ved å sammenligne med bindingen til en kontrolloverflate. Resultatene er oppsummert i tabell 17.

Tabell 17

Resultatene i tabell 17 viser at alle de humaniserte 2B8-baserte antistoffene binder rhHGF og alle de tre mus-menneske-mus-kimærene.

Eksempel 15 - Bindingsaffiniteten av humaniserte 2B8-varianter

Bindingsaffiniteten og interaksjonskinetikken for antistoffene som er opplistet i tabell 15, ble målt ved overflate-plasmon-resonans.

Anti-humane immunglobuliner fra mus (Jackson Labs, katalog nr. 209-005) ble immobilisert til CM4-sensorbrikker med karboksymetylert dekstran (BIAcore, katalog nr. BR-1006-68) ved aminkobling (BIAcore, katalog nr. BR-1000-50) ved anvendelse av en standard koblingsfremgangsmåte ifølge produsentens instruksjoner. Analysene ble utført ved 25 ºC ved anvendelse av PBS (GIBCO, katalog nr. 14040-133) tilsatt 0,05% surfaktant P20 (BIAcore, katalog nr. BR-1000-54) og 2 mg/ml BSA (EMD, katalog nr. 2930).

Antistoffene ble innfanget av individuelle gjennomstrømmingsceller ved en gjennomstrømmingshastighet på 10 μl/minutt. Injeksjonstiden ble variert for hvert antistoff for erholdelse av tilnærmet 20 RU antistoff innfanget for hver syklus. Buffer eller HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) fortynnet i analysebuffer, ble injisert, først over en referanseoverflate (uten innfanget antistoff) og så over den aktive overflate (antistoffet som skulle analyseres) i 2 minutter ved 60 μl/minutt. Dissosiasjonsfasen ble fulgt i 15 eller 90 minutter avhengig av konsentrasjonen. Overflaten ble så regenerert med 10 mM glysin-HCl, pH 2,2 (BIAcore, katalog nr. BR-1003-54) injisert i 3 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 60 μl/minutt før en ny syklus ble innledet. De analyserte HGF-konsentrasjonene var fra 0,46 nM til 7,5 nM.

Kinetiske parametere ble beregnet ved anvendelse av kinetikkfunksjonen i programvaren ”BIAevaluation” med subtraksjon av referanser. De kinetiske parameterne ka (assosiasjonshastighetskonstanten), kd (dissosiasjonshastighetskonstanten) og KD (likevekt-dissosiasjonskonstanten) for hvert antistoff er oppsummert i tabell 18.

Tabell 18

Disse resultatene viser at de humaniserte antistoffene har en hurtig assosiasjonshastighetskonstant (ka), en svært lav dissosiasjonshastighetskonstant (kd) og svært høy affinitet (KD). Nærmere bestemt har antistoffene en affinitet i området fra 2,0-12 pM.

Eksempel 16 - Sammenligning av bindingsaffiniteten ved 25 ºC og 37 ºC Bindingsaffiniteten og interaksjonskinetikken for antistoff HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12 og muse-2B8 ble målt ved overflate-plasmon-resonans under forskjellige betingelser.

Anti-humane immunglobuliner fra mus (Jackson Labs, katalog nr. 209-005) eller anti-museimmunglobuliner fra kanin (BIAcore, katalog nr. BR-1005-14) ble immobilisert til CM4-sensorbrikker med karboksymetylert dekstran (BIAcore, katalog nr. BR-1006-68) ved aminkobling (BIAcore, katalog nr. BR-1000-50) ved anvendelse av en standard koblingsfremgangsmåte ifølge produsentens instruksjoner. For målinger ved 25 ºC for sh2b8-9 og sh2B8-12 ble en CM5-sensorbrikke (BIAcore, katalog nr. BR-1006-68) anvendt. Analysene ble utført ved 25 ºC og 37 ºC ved anvendelse av PBS (GIBCO, katalog nr. 14040-133) tilsatt 0,05% surfaktant P20 (BIAcore, katalog nr. BR-1000-54) og 2 mg/ml BSA (EMD, katalog nr. 2930) som analysebuffer.

Antistoffene ble innfanget av individuelle gjennomstrømmingsceller ved en gjennomstrømmingshastighet på 10 μl/minutt. Injeksjonstiden ble variert for hvert antistoff for erholdelse av tilnærmet 20 RU innfanget antistoff for hver syklus. Buffer eller HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) fortynnet i analysebuffer, ble injisert, først over en referanseoverflate (uten innfanget antistoff) og så over den aktive overflaten (antistoffet som skulle analyseres) i 2 minutter ved 60 μl/minutt. Dissosiasjonsfasen ble fulgt i 15 eller 90 minutter avhengig av konsentrasjonen. Overflaten på sensorbrikker med anti-humane immunglobuliner fra mus ble så regenerert med 10 mM glysin-HCl, pH 2,2 (BIAcore, katalog nr. BR-1003-54) injisert i 3 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 60 μl/minutt før en ny syklus ble innledet. Overflaten til sensorbrikker med anti-museimmunglobuliner fra kanin ble regenerert med 10 mM glysin-HCl, pH 1,7 (BIAcore, katalog nr. BR-1003-54) injisert i 3 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 60 μl/minutt før en ny syklus ble innledet. De analyserte HGF-konsentrasjonene var fra 0,46 nM til 7,5 nM.

Kinetiske parameterer ble bestemt ved anvendelse av kinetikkfunksjonen i programvaren BIAevaluation med subtraksjon av referanser. De kinetiske parameterne ka (assosiasjonshastighetskonstanten), kd (dissosiasjonshastighetskonstanten) og KD (likevekt-dissosiasjonskonstanten) for hvert antistoff er oppsummert nedenfor i tabell 19.

Tabell 19

Som forventet, økte assosiasjonshastighetskonstanten med økende temperatur. Det var overraskende at dissosiasjonskonstantene ikke endret seg signifikant med en tilsvarende økning av temperaturen. Følgelig var de totale likevekt-dissosiasjonskonstantene (KD) tilnærmet 1,4 til 3 ganger mindre (høyere affinitet) ved fysiologisk temperatur (37 ºC).

Eksempel 17 - Nøytraliserende aktivitet av humaniserte 2B8-varianter

Antistoffene som er beskrevet i eksempel 14, ble karakterisert når det gjelder evnen til (a) å inhibere bindingen av hHGF til c-Met og (b) å inhibere HGF-stimulert BrdU-inkorporering i 4MBr-5-celler.

Analysen av inhibering av HGF-Met-binding (nøytraliseringsanalysen) ble utført som beskrevet i det påfølgende. Antistoffene ble analysert ved ELISA for evne til å inhibere hHGF-binding til c-Met. Nærmere bestemt ble Wallac 96-brønners DELFIA-analyseplater (Wallac Inc., katalog nr. AAAND-0001) belagt med 100 μl 6,25 μg/ml HGF (R&D Systems, katalog nr. 294-HGN-025) i karbonatbasert belegningsbuffer (15 mM Na2CO3 og 34 mM NaHCO3, pH 9,0) i 16 timer ved 4 ºC. Platene ble så blokkert med 200 μl 5% fettfri tørrmelk i PBS i 1 time ved romtemperatur. Antistoffene ble klargjort i en separat plate ved å tilsette økende konsentrasjoner av antistoffene som skulle undersøkes (0,033-250 nM, to gangers seriefortynninger) til 2 nM biotinylert c-Met i 5% fettfri tørrmelk i PBS. c-Met (R&D Systems, katalog nr. 358-MT/CF) ble biotinylert ifølge produsentens instruksjoner ved et forhold på 10:1 mellom biotin og c-Met (Pierce, katalog nr. 21335). 100 μl prøve pr. brønn ble overført til analyseplaten og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. De resulterende platene ble vasket tre ganger med PBS-0,1% Tween 20 og inkubert i 1 time ved romtemperatur med Eu-merket Streptavidin (Wallac, katalog nr.

1244-360) fortynnet 1:1000 i DELFIA-analysebuffer (Wallac, katalog nr. 4002-0010). De resulterende platene ble vasket 3 ganger med DELFIA-vaskeløsning (Wallac, katalog nr.

4001-0010) i 15 minutter ved romtemperatur under omristing. Platene ble avlest i et Victor<3>V-instrument (Perkin Elmer) ved anvendelse av Europium-fremgangsmåten. IC50-verdiene ble beregnet ved anvendelse av Prism.

De erholdte IC50-verdiene vises i tabell 20.

Tabell 20

Resultatene i tabell 20 viser at de analyserte, humaniserte antistoffene effektivt nøytraliserer bindingen av HGF til c-Met.

Antistoffene i tabell 17 ble også analysert i celleproliferasjonsanalysen som er beskrevet i eksempel 7(b). Resultatene er oppsummert nedenfor i tabell 21.

Tabell 21

Resultatene i tabell 21 viser at alle de humaniserte antistoffene inhiberer HGF-indusert proliferasjon av 4MBr-5-celler.

Eksempel 18 - Anti-spredningsaktivitet av humaniserte 2B8-varianter

Antistoffene i tabell 17 ble analysert i anti-spredningsanalysen som er beskrevet i eksempel 8. Resultatene er oppsummert nedenfor i tabell 22.

Tabell 22

- : Ingen inhibering

++: Svært kraftig og nesten fullstendig inhibering

+: Kraftig inhibering

: Påvisbar inhibering

Resultatene i tabell 22 viser at alle de analyserte, humaniserte antistoffene inhiberte HGF-indusert spredning i samme grad som det monoklonale museantistoff 2B8.

Eksempel 19 - Inhibering av HGF-stimulert cMet-fosforylering

Antistoffene i tabell 17 ble analysert i c-Met-fosforyleringsanalysen som er beskrevet i eksempel 9. Resultatene er oppsummert nedenfor i tabell 23.

Tabell 23

Resultatene i tabell 23 viser at alle de analyserte, humaniserte antistoffene er kraftige inhibitorer av HGF-indusert c-Met-fosforylering i PC-3-celler.

Eksempel 20 - Tumorinhibering i en U87MG-xenotransplantat modell

Evnen til de humaniserte, monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen til å inhibere tumorvekst ble analysert i en U87MG-xenotransplantatmodell. U87MG-celler (ATCC) ble ekspandert i kultur ved 37 ºC i en atmosfære inneholdende 5% CO2 og 95% luft med anvendelse av et medium som omfattet Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt, bovint serum, 100 enheter/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Cellene ble videreført og holdt i kultur ved å frigjøre cellene fra veggen av dyrkningsskålen ved anvendelse av trypsin-EDTA.

Nær konfluente celler ble oppsamlet ved trypsinbehandling, hvoretter 5 x 10<6 >celler i 50% Matrigel (BD Biosciences, katalog nr. 356237) ble injisert subkutant i det øvre ryggområde mellom skulderbladene hos 7 uker gamle ICR SCID-hunnmus (Taconic Labs). Tumorenes lengste (L) og korteste (W) diameter (mm) ble målt med et skyvelær. Tumorvolumet (vol.) ble beregnet som: volum (mm<3>) = L x W<2>/2. Etter at tumorene hadde nådd en størrelse på tilnærmet 200 mm<3>, ble de tumorbærende musene tilfeldig fordelt på 5 grupper med 10 mus i hver gruppe. Én gruppe ble tilført PBS, mens én gruppe ble tilført humant kontroll-IgG. Hver av de 4 andre gruppene ble tilført ett av de humaniserte antistoffene (HE2B8-1, HE2B8-2, HE2B8-3 og HE2B8-4). Alle antistoffer ble tilført i en dose på 0,25 mg/kg kroppsvekt to ganger i uken ved intraperitoneal injeksjon av 5 doser. Tumorvolumet og musenes kroppsvekt ble målt to ganger i uken.

Tumorvekstinhiberingen ble analysert ved anvendelse av Students t-test.

De analyserte, humaniserte antistoffene var aktive in vivo. Det var 57% tumorvekstinhibering for HE2B8-1 med en p-verdi på 0,02, 61% tumorvekstinhibering for HE2B8-2 med en p-verdi på 0,02, 85% tumorvekstinhibering for HE2B8-3 med en p-verdi på 0,0004, og 74% tumorvekstinhibering for HE2B8-4 med en p-verdi på 0,001. Intet signifikant tap av kroppsvekt ble observert.

En påfølgende undersøkelse ble utført som beskrevet ovenfor i NCR nakne hunnmus (Taconic Labs) som bar subkutane U87MG-tumorer inokulert i siden. Hver gruppe (10 mus i hver) ble tilført én av følgende behandlinger i en dose på 0,5 mg/kg: PBS-bærestoffkontroll, huIgG-kontroll, HE2B8-4 eller sh2B8-9. Behandlingen ble gitt intraperitonealt to ganger i uken i minst 5 uker. Hver behandlingsgruppe viste en tilsvarende tumorregresjon med en tumorvekstinhibering på 113% for sh2B8-9 og 115% for HE2B8-4 og en minimal forsinkelse av tumorveksten på 30 dager. Begge behandlingene ble godt tålt uten signifikant tap av kroppsvekt.

Claims

Patentkrav

1. Et isolert bindingsprotein som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), som omfatter:

(iii) CDRH3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 17 og

(b) et immunglobulins lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, hvor

(i) CDRL1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 18, (ii) CDRL2 omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO.: 19 og SEQ ID NO.: 206 og

2. Bindingsproteinet ifølge krav 1,

hvor immunglobulinets tunge kjedes variable område som omfatter strukturen CDRH1-CDRH2-CDRH3, hvor

(i) CDRH1 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 15, (ii) CDRH2 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 205 og

(iii) CDRH3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 17 og immunglobulinets lette kjedes variable område som omfatter strukturen CDRL1-CDRL2-CDRL3, hvor

(iii) CDRL3 omfatter aminosyresekvensen SEQ ID NO.: 20,

3. Bindingsproteinet ifølge krav 1 eller krav 2, hvor de komplementaritets bestemmende områdene (CDRene) ligger mellom humane eller humaniserte immunglobulin rammeverkområder.

4. Bindingsprotein ifølge et hvilket som helst av de foregående kraven, hvor bindingsproteinet er et antistoff eller et antigenbindende fragment derav.

5. Bindingsproteinet ifølge krav 4, hvor antistoffet er et monoklonalt antistoff.

6. En isolert nukleinsyre,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter en nukleotidsekvens som koder for et immunglobulins lette kjedes variable område ifølge et hvilket som helst av kravene 2-5.

7. Isolert nukleinsyre,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter en nukleotidsekvens som koder for et immunglobulins tunge kjedes variable område ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5.

8. Ekspresjonsvektor,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 6 og/eller krav 7.

9. Vertscelle,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter minst én ekspresjonsvektor som koder for et immunglobulins lette og/eller tunge kjedes variable område ifølge et hvilket som helst av kravene 2-5.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som omfatter et immunglobulins tunge kjedes variable område, hvor fremgangsmåten omfatter:

(i) dyrking av vertscellen ifølge krav 9 under betingelser slik at vertscellen uttrykker polypeptidet som omfatter immunglobulinets tunge kjedes variable område og

(ii) rensing av polypeptidet som omfatter immunglobulinets tunge kjedes variable område.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som omfatter et immunglobulins lette kjedes variable område, hvor fremgangsmåten omfatter:

(i) dyrking av vertscellen ifølge krav 9 under betingelser slik at vertscellen uttrykker polypeptidet som omfatter immunglobulinets lette kjedes variable område og

(ii) rensing av polypeptidet som omfatter immunglobulinets lette kjedes variable område.

12. Det isolerte bindingsproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, hvor bindingsproteinet binder human hepatocytt-vekstfaktor med en Kd 4,0x10<-5 >s<-1 >eller lavere.

13. Det isolerte bindingsproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, hvor bindingsproteinet binder human hepatocytt-vekstfaktor med en KD på 20 pM eller lavere.

14. Bindingsproteinet ifølge krav 1 som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), som omfatter et immunglobulins lette kjedes variable område og et immunglobulins tunge kjedes variable område valgt fra gruppen som består av:

15. Bindingsproteinet ifølge krav 14, hvor immunglobulinets lette kjedes variable område omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 199, og immunglobulinets tunge kjedes variable område omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 189.

16. Bindingsproteinet ifølge krav 1 som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), som omfatter et immunglobulins lette kjedes sekvens og et immunglobulins tunge kjedes sekvens valgt fra gruppen som består av:

17. Bindingsproteinet ifølge krav 16, hvor immunglobulinets lette kjede omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 201 og immunglobulinets tunge kjede omfatter aminosyresekvensen ifølge SEQ. ID. NO.: 191.

18. Bindingsproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 eller 14-17 for anvendelse i terapi.

19. Bindingsproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 eller 14-17 for inhibering eller reduksjon av proliferasjon av en tumorcellen.

20. Bindingsproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5 eller 14-17 for inhibering eller reduksjon av tumorvekst i et pattedyr.

21. En fremgangsmåte for fremstilling av et bindingsprotein som binder human hepatocytt-vekstfaktor (HGF), som er et intakt antistoff, slik som et monoklonalt antistoff, eller et antigenbindende fragment derav, hvor fremgangsmåten omfatter:

(i) dyrking av vertscellen ifølge krav 9 under betingelser slik at vertscellen uttrykker et polypeptid som omfatter immunglobulinets tunge kjedes variable område og et polypeptid som omfatter immunglobulinets lette kjedes variable område og

(ii) rensing av antistoffet eller det antigenbindende fragmentet av antistoffet.