NO340807B1 - Isolert monoklonalt antistoff, farmasøytisk preparat,anvendelse av antistoffet, isolert nukleinsyremolekyl, vektor, vertscelle samt fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et isolert fullstendig humant monoklonalt anti-CD3 antistoff eller fragment derav, et farmasøytisk preparat som omfatter nevnte antistoff eller fragment derav, anvendelse av nevnte antistoff eller fragment derav, et isolert nukleinsyremolekyl som koder for nevnte antistoff eller fragment derav, en vektor som omfatter nevnte nukleinsyremolekyl, en vertscelle som omfatter nevnte vektor, så vel som en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte antistoff eller fragment derav.

Kroppens immunsystem tjener som et forsvar mot mange tilstander, f.eks. omfattende skade, infeksjon og neoplasi, og medieres av to separate, men innbyrdes koblede systemer, det cellulære og humorale immunsystemet. Generelt blir det humorale systemet mediert av løselige produkter, betegnet antistoffer eller immunglobuliner, som har evnen til å binde og nøytralisere produkter gjenkjent av systemet som fremmed for kroppen. Derimot involverer det cellulære immunsystemet mobilisering av visse celler betegnet T-celler, som har mange terapeutiske roller.

Immunsystemet hos både mennesker og dyr omfatter to hovedklasser av lymfocytter: thymusavledede celler (T-celler) og beinmargavledede celler (B-celler). Modne T-celler kommer fra thymus og sirkulerer mellom vevene, lymfesystemet og blodet. T-celler oppviser immunologisk spesifisitet og er direkte involvert i cellemedierte immunresponser (slik som transplantatrejeksjon). T-celler virker mot eller i respons til mange fremmede strukturer (antigener). I mange tilfeller er disse fremmede antigenene uttrykt på vertsceller som et resultat av infeksjon. Imidlertid kan fremmede antigener også komme fra verten som er endret ved neoplasi eller infeksjon. Selv om T-celler ikke selv sekrerer antistoffer, er de vanligvis nødvendige for antistoffsekresjon ved den andre klassen med lymfocytter, B-celler.

Det fins ulike undergrupper av T-celler som generelt er definert ved antigene determinanter funnet på deres celleoverflater, så vel som funksjonell aktivitet og gjenkjennelse av fremmed antigen. Noen undergrupper av T-celler, slik som CD8<+>celler, er dreper-/suppressorceller som har en regulerende funksjon i immunsystemet, mens andre, slik som CD4<+>celler, tjener til å fremme inflammatoriske og humorale responser.

Humane perifere T-lymfocytter kan stimuleres til å gjennomgå mitose ved mange midler omfattende fremmede antigener, monoklonale antistoffer og lektiner slik som fytohemaglutinin og konkanavalin A. Selv om aktivering trolig forekommer ved binding av mitogenene til spesifikke seter på cellemembraner, er disse reseptorenes natur og deres aktiveringsmekanisme ikke fullstendig kartlagt. Induksjon av proliferasjon er bare én indikasjon på T-celleaktivering. Andre indikasjoner på aktivering, definert som forandringer i grunn- eller hviletilstanden til cellen, omfatter økt lymfokinproduksjon og cytotoksisk celleaktivitet.

T-celleaktivering er et komplekst fenomen som avhenger av deltakelse av mange celleoverflatemolekyler uttrykt på den responderende T-cellepopulasjonen. For eksempel består antigenspesifikk T-cellereseptor (TcR) av en disulfidbundet heterodimer, inneholdende to klonalt distribuerte, integrerte membranglykoproteinkjeder, alfa og beta (a og p) eller gamma og delta (y og 8), ikke-kovalent assosiert med et kompleks av lavmolekylære konstante proteiner, felles betegnet som CD3 (en gang henvist til som T3).

TcR alfa- og betakjeder bestemmer antigenspesifisiteten CD3-strukturene representerer aksessoriske molekyler som er de transduserende elementer av aktiveringssignaler initiert ved binding av TcR alfa beta (TcR a.p) til dens ligand. Det er både konstante regioner av glykoproteinkjedene av TcR og variable regioner (polymorfismer). Polymorfe TcR-variable regioner definerer undergrupper av T-celler med forskjellige spesifisiteten Til forskjell fra antistoffer som gjenkjenner hele eller mindre fragmenter av fremmede proteiner som antigener, interagerer TcR-komplekset med bare små peptider av antigenet som må presenteres i sammenheng med MHC ("Major Histocompatibility Complex") molekyler. Disse MHC-proteinene representerer et annet svært polymorft sett av molekyler tilfeldig spredd i hele arten. Derfor krever aktivering vanligvis den tredelte interaksjonen av TcR og fremmed peptidisk antigen bundet til de viktige MHC-proteinene.

US 2003/0216551 omhandler ikke-toksisk anti-CD3 antistoff som er anvendbart for behandling, forebygging og reversering av en human autoimmun sykdom. Anti-CD3 antistoff dannes ved immunisering av xenogene mus som er i stand til å utvikle fullstendige humane antistoffer. Da antistoffene ikke er avledet fra andre arter, vil de ikke fremkalle immunresponser som typisk er forbundet med humaniserte eller podede antistoffer. D.XU et al., "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies", Cellular Immunology, 2000, Vol. 200 (1), side 16-26 skal også nevnes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fullstendig humane monoklonale antistoffer rettet spesifikt mot CD3. Antistoffene ifølge oppfinnelsen omfatter CDR sekvensene og tung kjede mutasjonene som definert i krav 1. Eksempler på monoklonale antistoffer omfatter 28F11, 27H5, 23F10 og 15C3 beskrevet her. Antistoffene blir henholdsvis henvist til her som huCD3-antistoffer. huCD3-antistoffet har én eller flere av følgende karakteristika: antistoffet binder til CD3-positive (CD3+) celler, men ikke CD3-negative (CD3-) celler; huCD3-antistoffet induserer antigen modulering som involverer endring (f.eks. reduksjon) av celleoverflateekspresjonsnivået eller aktiviteten av CD3 eller T-cellereseptoren (TcR); huCD3-antistoffet hemmer binding av murint anti-humant OKT3 monoklonalt antistoff til T-lymfocytter; eller huCD3-antistoffet binder en epitop av CD3 som helt eller delvis omfatter aminosyresekvensen EMGGITQTPYKVSISGT (SEKV ID NR:21). huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse konkurrerer med det murine anti-CD3 antistoffet OKT3 for binding til CD3, og eksponering for huCD3-antistoffet fjerner eller maskerer CD3 og/eller TcR uten å affisere celleoverflateekspresjon av CD2, CD4 eller CD8. Maskeringen av CD3 og/eller TcR resulterer i tap eller reduksjon av T-celleaktivering, som er ønskelig i autoimmune sykdommer der ukontrollert T-celleaktivering forekommer. Nedregulering av CD3 resulterer i en forlenget effekt av redusert T-celleaktivering, f.eks. foren periode på minst flere måneder, sammenlignet med transient suppresjon som er observert ved anvendelse av et tradisjonelt immunsuppresivt middel, f.eks. cyklosporin.

Antigen modulering henviser til redistribusjon og eliminering av CD3-T-cellereseptorkomplekset på overflaten av en celle, f.eks. en lymfocytt. Reduksjon i nivået av celleoverflateekspresjon eller aktivitet til TcR på cellen betyr at mengde eller funksjon av TcR er redusert. Modulering av nivået av celleoverflateekspresjon eller aktivitet til CD3 betyr at mengde av CD3 på celleoverflaten eller funksjon av CD3 er endret, f.eks. redusert. Mengden av CD3 eller TcR uttrykt på plasmamembranen til cellen blir redusert for eksempel ved internalisering av CD3 eller TcR ved kontakt av cellen med huCD3-antistoffet. Alternativt, ved kontakt av en celle med huCD3-antistoffet, blir CD3 eller TcR maskert.

Hemming av bindingen av det murine anti-humane 0KT3 monoklonale antistoffet til en T-lymfocytt er definert som en reduksjon i evnen det murine OKT3-antistoffet har til å danne et kompleks med CD3 på celleoverflaten av en T-lymfocytt.

Et huCD3-antistoff inneholder foretrukket en tung kjede variabel som har aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:2, 6, 10 eller 22 og en lett kjede variabel som har aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:4, 8, 16-20 eller 25-26. Et huCD3-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse oppviser minst to eller mer (dvs. to eller mer, tre eller mer, fire eller mer, fem eller mer, seks eller mer, sju eller mer, åtte eller mer, ni eller mer, ti eller mer, elleve eller mer) av følgende karakteristika: antistoffet omfatter aminosyresekvensen VTVSS (SEKV ID NR:64) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-regionen, der posisjonen er i en variabel region C-terminalt i forhold til CDR3-regionen; antistoffet omfatter aminosyresekvensen GTLVTVSS (SEKV ID NR:65) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-region, der posisjonen er i en variabel region C-terminalt i forhold til CDR3-regionen; antistoffet omfatter aminosyresekvensen WGRGTLVTVSS (SEKV ID NR:66) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-region, der posisjonen er i en variabel region C-terminalt i forhold til CDR3-regionen; antistoffet binder en epitop som helt eller delvis omfatter aminosyresekvensen EMGGITQTPYKVSISGT (SEKV ID NR:67) og antistoffet omfatter en ytterligere mutasjon i den tunge kjeden på en aminosyrerest i posisjon, 265 eller 297 eller kombinasjoner derav, og der frigjøring av cytokiner fra en T-celle i nærvær av nevnte antistoff blir redusert sammenlignet med frigjøring av cytokiner fra en T-celle i nærvær av et antistoff som ikke omfatter en mutasjon i den tunge kjeden i posisjon 234, 235, 265 eller 297 eller kombinasjoner derav. Nummereringen av restene til tung kjede beskrevet her er som ifølge EU-indeksen (se Kabat et al., "Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health & Human Services (1983)), som vist f.eks. i US-patent nr. 5.624.821 og 5.648.260.

huCD3-antistoffet inneholderen aminosyremutasjon som definert i krav 1. Mutasjonen er i den konstante regionen. Mutasjonen resulterer i et antistoff som

har en endret effektorfunksjon. En effektorfunksjon til et antistoff blir endret ved å forandre, dvs. å øke eller redusere, affiniteten til antistoffet for et effektormolekyl slik som en Fc-reseptor eller en komplementkomponent. Ved å endre en effektorfunksjon til et antistoff, er det mulig å kontrollere ulike aspekter av immunresponsen, f.eks. å øke eller undertrykke ulike reaksjoner i immunsystemet. Mutasjonen resulterer i et antistoff som kan redusere cytokinfrigjøring fra en T-celle. Mutasjonen er i den tunge kjeden på aminosyrerest 234, 235, idet mutasjoner i posisjoner 265 eller 297 eller kombinasjoner derav også kan være tilstede. Mutasjonen resulterer i en alaninrest i posisjon 234 og en glutamatrest i posisjon 235. Mutasjoner som resulterer i en alaninrest i posisjon 265 eller 297 eller kombinasjoner derav kan også være tilstede. Betegnelsen "cytokin" henviser til alle humane cytokiner kjent på området som binder ekstracellulære reseptorer uttrykt på celleoverflaten og dermed modulerer cellefunksjon, omfattende, men ikke begrenset til, IL-2, IFN-gamma, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 og IL-13.

Frigjøring av cytokiner kan føre til en toksisk tilstand kjent som cytokinfrigjøringssyndrom (CRS), en vanlig klinisk komplikasjon som f.eks. forekommer ved anvendelse av et anti-T-celleantistoff, slik som ATG (anti-thymocyttglobulin) og OKT3 (et murint anti-humant CD3-antistoff). Dette syndromet erkarakterisert vedoverdreven frigjøring av cytokiner slik som TN F, IFN-gamma og IL-2 over i sirkulasjonen. CRS forekommer som et resultat av samtidig binding av antistoffene til CD3 (via den variable regionen til antistoffet) og Fc-reseptorene og/eller komplementreseptorer (via den konstante regionen til antistoffet) på andre celler, hvilket dermed aktiverer T-cellene til å frigjøre cytokiner som produserer en systemisk inflammatorisk responskarakterisert vedhypotensjon, pyreksi og rigor. Symptomer på CRS omfatter feber, kuldegysninger, kvalme, oppkast, hypotensjon og dyspné. Derfor inneholder huCD3-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse én eller flere mutasjoner som hindrer tung kjede konstant region-mediert frigjøring av ett eller flere cytokin(er) in vivo.

Fullstendig humane CD3-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel en L234L235A234E235 mutasjon i Fc-regionen, slik at cytokinfrigjøring ved eksponering for huCD3-antistoffet blir redusert eller eliminert signifikant (se f.eks. Figur 11 A, 11B). Som beskrevet nedenfor i Eksempel 4, reduserer eller eliminerer L234L235A<2>34E235 mutasjonen i Fc-regionen til huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse cytokinfrigjøring når huCD3-antistoffene blir eksponert for humane leukocytter, mens mutasjonene beskrevet nedenfor opprettholder signifikant cytokinfrigjøringskapasitet. For eksempel er en signifikant reduksjon i cytokinfrigjøring definert ved å sammenligne frigjøring av cytokiner ved eksponering for huCD3-antistoffet som har en L234 L235 A234 E235 mutasjon i Fc-regionen til nivå av cytokinfrigjøring ved eksponering for et annet anti-CD3 antistoff som har én eller flere av mutasjonene beskrevet nedenfor. Andre mutasjoner i Fc-regionen omfatter for eksempel L234L235A234A235,L2<35>->E235,N297->A297ogD265->A265.

huCD3-antistoffene omfatter en rammeverk 2-region (FRW2) som inneholder aminosyresekvensen WVRQAPGKGLEWV (SEKV ID NR:73). huCD3-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en rammeverk 3-region (FRW3) som inneholder aminosyresekvensen

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV ID NR:74).

Noen huCD3-antistoffer omfatter den sammenhengende aminosyresekvensen VTVSS (SEKV ID NR:64) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-region. For eksempel inneholder antistoffet den sammenhengende aminosyresekvensen GTLVTVSS (SEKV ID NR:65) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-regionen. Andre huCD3-antistoffer omfatter den sammenhengende aminosyresekvensen WGRGTLVTVSS (SEKV ID NR:66) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-regionen. Argininresten i SEKV ID NR:66 er vist for eksempel i VH-sekvensene for 28F11 huCD3-antistoffet (SEKV ID NR:2) og 23F10 huCD3-antistoffet (SEKV ID NR:6).

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer ifølge krav 1 for anvendelse som et medikament, for eksempel for anvendelse for å behandle, forebygge eller lindre et symptom for en immunrelatert forstyrrelse ved administrering av et huCD3-antistoff til et individ. Eventuelt får individet videre administrert et annet middel slik som, men ikke begrenset til, antiinflammatoriske forbindelser eller immunsuppresive forbindelser. For eksempel får individer med type l-diabetes eller latent autoimmun diabetes hos voksne (LADA) også administrert et andre middel, slik som for eksempel GLP-1 eller en betacellehvilende forbindelse (dvs. en forbindelse som reduserer eller på annen måte hemmer insulinfrigjøring, slik som kaliumkanalåpnere).

Egnede forbindelser omfatter, men er ikke begrenset til, metotreksat, cyklosporin A (omfattende for eksempel cyklosporinmikroemulsjon), takrolimus, kortikosteroider, statiner, interferon beta, Remicade (Infliximab), Enbrel (Etanercept) og Humira (Adalimumab).

Individet lider av eller er predisponert for utvikling av en immunrelatert forstyrrelse, slik som for eksempel en autoimmun sykdom eller en inflammatorisk forstyrrelse.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen huCD3-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse for å behandle eller forebygge rejeksjon etter organ- eller vevstransplantasjon.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 er en serie med presentasjoner av nukleotid- og aminosyresekvensene for variabel lett og variabel tung regionene til huCD3-antistoffet 28F11. Figur 1A viser nukleotidsekvensen som koder for den variable regionen til den tunge kjeden og Figur 1B representerer aminosyresekvensen kodet for ved nukleotidsekvensen vist i Figur 1A, der CDR'ene er fremhevet med bokser. Figur 1C viser nukleotidsekvensen som koder for den variable regionen til den lette kjeden og Figur 1D representerer aminosyresekvensen kodet for ved nukleotidsekvensen vist i Figur 1C, der CDR'ene er angitt ved bokser. Figur 2 er serie med presentasjoner av nukleotid- og aminosyresekvensene for variabel lett og variabel tung regionene til huCD3-antistoffet 23F10, med Figur 2A som representerer nukleotidsekvensen som koder for den variable regionen til den tunge kjeden, Figur 2B som representerer aminosyresekvensen kodet for ved nukleotidsekvensen vist i Figur 2A, Figur 2C som representerer nukleotidsekvensen som koder for den variable regionen til den lette kjeden og Figur 2D som representerer aminosyresekvensen kodet for ved nukleotidsekvensen vist i Figur 2C. Figur 3 er serie med presentasjoner av nukleotid- og aminosyresekvensene for variabel lett og variabel tung regionene til huCD3-antistoffet 27H5. Figur 3A representerer nukleotidsekvensen som koder for den variable regionen til den tunge kjeden; Figur 3B representerer aminosyresekvensen kodet for ved nukleotidsekvensen vist i Figur 3A; Figur 3C representerer de fem nukleotidsekvensene som koder for den variable regionen til den lette kjeden for 27H5-klonen; Figur 3D representerer de fem aminosyresekvensene kodet for ved nukleotidsekvensene vist i Figur 3C og Figur 3E er en sammenstilling av de fem lette kjedene fra klon 27H5, der en stjerne (<*>) i den siste raden (merket KEY) representerer en konservert aminosyre i den kolonnen; et kolon (:) i KEY-raden representerer en konservativ mutasjon og et punktum (.) i KEY-raden representerer en semikonservativ mutasjon. Figur 4 er en serie med presentasjoner av nukleotid- og aminosyresekvensene for variabel lett og variabel tung regionene til huCD3-antistoffet 15C3, med Figur 4A som representerer nukleotidsekvensen som koder for den variable regionen til den tunge kjeden, Figur 4B som representerer aminosyresekvensen kodet for ved nukleotidsekvensen vist i Figur 4A, Figur 4C som representerer de to nukleotidsekvensene som koder for den variable regionen til den lette kjeden for 15C3-klonen og Figur 4D som representerer de to aminosyresekvensene kodet for ved nukleotidsekvensene vist i Figur 4C. Figur 5 er en sammenstilling som viser variabel tung kjede-regionene til 15C3, 27H5 og 28F11 huCD3-antistoffer, så vel som DP-50 kimlinje sekvensen, human tung sammenføyning ("joining") 5-02 sekvensen og human tung sammenføyning 2 sekvensen. CDR-regionene er angitt for hver sekvens. Figur 6 er en sammenstilling som viser VkIII variable regioner til 15C3 (variabel lett kjede 1, dvs. "VL1") og 28F11 huCD3-antistoffer, så vel som L6-kimbanesekvensen, human kappa J 4 sekvensen og human kappa J 1 sekvensen. CDR-regionene er angitt for hver sekvens. Figur 7 er en sammenstilling som viser VkI variable regioner til 15C3 (variabel lett kjede 2, dvs. "VL2") og 27H5 VL2 huCD3-antistoffer, så vel som L4/18a kimbanesekvensen, human kappa J 4 sekvensen og human kappa J 5 sekvensen. CDR-regionene er angitt for hver sekvens. Figur 8 er en sammenstilling som viser VkII variable regioner til 27H5 VL1 huCD3-antistoffet og DPK22, så vel som human kappa J 5 sekvens. CDR-regionene er angitt for hver sekvens. Figur 9A er en graf som viser antistoffbinding til CD3-molekyler på overflaten av Jurkat-celler ved anvendelse av en rekke anti-CD3 antistoffer, omfattende 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 og 15C3VL2 huCD3-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 9B er en graf som viser evnen en rekke anti-CD3 antistoffer, omfattende 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 og 15C3VL2 huCD3-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, har til å hemme binding av det murine anti-CD3 antistoffet OKT3 til CD3-positive celler. Figur 9C er en graf som viser antigen modulering av CD3 og TCR fra overflaten av humane T-celler fra perifert blod med en rekke anti-CD3 antistoffer, omfattende 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 og 15C3VL2 huCD3-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 9D er en graf som viser effekten av en rekke anti-CD3 antistoffer, omfattende 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 og 15C3VL2 huCD3-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, på T-celleproliferasjon. Figur 10 er en illustrasjon som viser bindingsmønsteret til det fullstendig humane monoklonale antistoffet 28F11 på en peptidmatrise avledet fra aminosyresekvensen til CD3-epsilonkjeden. Figur 11 er en serie med grafer som viser nivået av cytokinfrigjøring ved eksponering for villtype 28F11 huCD3-antistoff (28F11WT), et mutert 28F11 huCD3-antistoff som har enL234L235->A234A235mutasjon (28F11AA) og et mutert 28F11 huCD3-antistoff som har enL234L235A234E235mutasjon (28F11AE). Figur 11A viser nivået av TNF-alfa frigjøring ved eksponering for disse antistoffene og Figur 11B viser nivået av interferongammafrigjøring.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fullstendig humane monoklonale antistoffer som er spesifikke for CD3-epsilonkjede (CD3e). Antistoffene er henholdsvis henvist til her som huCD3-antistoffer.

CD3 er et kompleks av minst fem membranbundne polypeptider i modne T-lymfocytter som er ikke-kovalent assosiert med hverandre og med T-cellereseptoren. CD3-komplekset omfatter gamma-, delta-, epsilon-, zeta- og etakjedene (også henvist til som subenheter). Ikke-humane monoklonale antistoffer er utviklet mot noen av disse kjedene, som illustrert med de murine antistoffene OKT3, SP34, UCHT1 eller 64.1 (se f.eks. June, et al., J. Immunol. 136:3945-3952 (1986); Yang, et al., J. Immunol. 137:1097-1100 (1986) og Hayward, et al., Immunol. 64:87-92 (1988)).

huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ble produsert ved å immunisere to linjer av transgene mus, HuMab™ mus og KM™ mus (Medarex, Princeton NJ).

huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse har én eller flere av følgende karakteristika: huCD3-antistoffet binder til CD3-positive (CD3+) celler, men ikke CD3-negative (CD3-) celler; huCD3-antistoffet induserer antigen modulering som involverer endringer av celleoverflateekspresjonsnivåene av CD3 og T-cellereseptoren (TcR); eller huCD3-antistoffet hemmer binding av det murine anti-humane OKT3 monoklonale antistoffet til T-lymfocytter. huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse konkurrerer med det murine anti-CD3 antistoffet OKT3 for binding til CD3, og eksponering for huCD3-antistoffet fjerner eller maskerer CD3 og/eller TcR uten å påvirke celleoverflateekspresjon av CD2, CD4 eller CD8. Maskering av CD3 og/eller TcR resulterer i tap eller reduksjon av T-celleaktivering.

huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse binder til en CD3 som helt eller delvis omfatter aminosyrerestene fra posisjon 27 til posisjon 43 av den prosesserte humane CD3-epsilonsubenheten (dvs. uten ledersekvensen). Aminosyresekvensen til den humane CD3-epsilonsubenheten er vist for eksempel i GenBank aksesjonsnr. NP_000724; AAA52295; P07766; A32069; CAA27516 og AAH49847. For eksempel binder huCD3-antistoffet en CD3-epitop som helt eller delvis omfatter aminosyresekvensen til EMGGITQTPYKVSISGT (SEKV ID NR:67). Et eksempel på huCD3 monoklonalt antistoff som binder til denne epitopen er 28F11 -antistoffet beskrevet her. 28F11 -antistoffet omfatter en tung kjede variabel region (SEKV ID NR:2) kodet for ved nukleinsyresekvensen vist nedenfor i SEKV ID NR:1 og en lett kjede variabel region (SEKV ID NR:4) kodet for ved nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR:3 (Figur 1A-1D).

Aminosyrene som omfatter de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR), som definert ved Chothia et al., 1989, E. A. Kabat et al., 1991, er fremhevet med bokser nedenfor (se også Figur 1B og 1D og Figur 5 og 6) (se Chothia, C. et al., Nature 342:877-883 (1989); Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, femte utgave, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)). Tung kjede CDR'ene til 28F11-antistoffet har følgende sekvenser: GYGMH (SEKV ID NR:27)

VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEKV ID NR:28) og QMGYWHFDL (SEKV ID NR:29).

Lett kjede CDR'ene til 28F11-antistoffet har følgende sekvenser: RASQSVSSYLA

(SEKV ID NR:30) DASNRAT (SEKV ID NR:31) og QQRSNWPPLT (SEKV ID

NR:32).

23F10-antistoffet omfatteren tung kjede variabel region (SEKV ID NR:6) kodet for ved nukleinsyresekvensen vist nedenfor i SEKV ID NR:5 og en lett kjede variabel region (SEKV ID NR:8) kodet for ved nukleinsyresekvensen vist i SEKV ID NR:7.

Aminosyrene som omfatter CDR, som definert ved Chothia et al., 1989, E. A. Kabat et al., 1991, er fremhevet med bokser nedenfor (se også Figur 2B, 2D). Tung kjede CDR'ene til 23F10-antistoffet har følgende sekvenser: GYGMH (SEKV

ID NR:27) VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEKV ID NR:28) og QMGYWHFDL (SEKV

ID NR:29). Lett kjede CDR'ene til 23F10-antistoffet har følgende sekvenser: RASQSVSSYLA (SEKV ID NR:30) DASNRAT (SEKV ID NR:31) og

QQRSNWPPLT (SEKV ID NR:32).

27H5-antistoffet omfatter en tung kjede variabel region (SEKV ID NR: 10) kodet for ved nukleinsyresekvensen vist nedenfor i SEKV ID NR:9 og en lett kjede variabel region valgt fra aminosyresekvensene vist nedenfor i SEKV ID NR:16-20 og kodet for ved nukleinsyresekvensene vist i SEKV ID NR: 11-15. Som beskrevet her i Eksempel 2, kan et enkelt klonalt hybridom avledet fra HuMAb® transgene mus produsere multiple lette kjeder for en enkel tung kjede. Hver kombinasjon av tunge og lette kjeder produsert blir testet for optimal funksjon, som beskrevet her i Eksempel 2.

Aminosyrene som omfatter CDR, som definert ved Chothia et al., 1989, E. A. Kabat et al., 1991, er fremhevet med bokser nedenfor (se også Figur 3B, 3D, 5 og 7-8). Tung kjede CDR'ene til 27H5-antistoffet har følgende sekvenser: SYGMH

(SEKV ID NR:33) IIWYDGSKKNYADSVKG (SEKV ID NR:34) og GTGYNWFDP

(SEKV ID NR:35). Lett kjede CDR'ene til 27H5-antistoffet har følgende sekvenser: RASQSVSSSYLA (SEKV ID NR:36); GASSRAT (SEKV ID NR:37); QQYGSSPIT (SEKV ID NR:38); RASQGISSALA (SEKV ID NR:39); YASSLQS (SEKV ID

NR:40); QQYYSTLT (SEKV ID NR:41); DASSLGS (SEKV ID NR:42) og

WASQGISSYLA (SEKV ID NR:43).

15C3-antistoffet omfatter en tung kjede variabel region (SEKV ID NR:22) kodet for ved nukleinsyresekvensen vist nedenfor i SEKV ID NR:21 og en lett kjede variabel

region valgt fra aminosyresekvensene vist nedenfor i SEKV ID NR:25-26 og kodet for ved nukleinsyresekvensene vist i SEKV ID NR:23-24. Som beskrevet her i Eksempel 2, kan et enkelt klonalt hybridom avledet fra HuMAb® transgene mus produsere multiple lette kjeder for en enkel tung kjede. Hver kombinasjon av tunge og lette kjeder produsert blir testet for optimal funksjon, som beskrevet her i Eksempel 2.

Aminosyrene som omfatter CDR, som definert ved Chothia et al., 1989, E. A. Kabat et al., 1991, er fremhevet med bokser nedenfor (se også Figur 4B, 4D og 5-7). Tung kjede CDR'ene til 15C3-antistoffet har følgende sekvenser: SYGMH

(SEKV ID NR:33) AIWYNGRKQDYADSVKG (SEKV ID NR:44) og GTGYNWFDP

(SEKV ID NR:35). Lett kjede CDR'ene til 15C3-antistoffet har følgende sekvenser: RASQSVSSYLA (SEKV ID NR:30); DASNRAT (SEKV ID NR:31); QQRSNWPWT (SEKV ID NR:45); RASQGISSALA (SEKV ID NR:39); DASSLES (SEKV ID

NR:46); QQFNSYPIT (SEKV ID NR:47).

huCD3-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også antistoffer som omfatter en tung kjede variabel aminosyresekvens som er minst 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % eller mer identisk aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:2, 6, 10 eller 22 og/eller en lett kjede variabel aminosyre som er minst 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % eller mer identisk aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR:4, 8, 16-20 eller 25-26.

Alternativt er det monoklonale antistoffet et antistoff som binder til samme epitop som 28F11, 27H5, 23F10 eller 15C3.

Hvis ikke definert på annen måte, skal vitenskapelige og tekniske termer anvendt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse ha betydningen vanligvis forstått av fagfolk på området. Videre, med mindre noe annet er nødvendig ut i fra konteksten, skal entallsbetegnelser omfatte flertall og flertallsbetegnelser skal omfatte entall. Generelt er nomenklatur anvendt sammen med, og teknikker for, celle- og vevskultur, molekylærbiologi og protein og oligo- eller polynukleotidkjemi og hybridisering beskrevet her de som er velkjent og mye anvendt på området. Standard teknikker blir anvendt for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese og vevskultur og transformasjon (f.eks. elektroporering, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker blir utført i henhold til produsentens spesifiseringer eller som vanligvis utført på området eller som beskrevet her. De førnevnte teknikkene og prosedyrene blir generelt utført i henhold til konvensjonelle fremgangsmåter velkjent på området og som beskrevet i ulike generelle og mer spesifikke referanser som er sitert og beskrevet i foreliggende spesifisering. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Nomenklatur anvendt i sammenheng med, og laboratorieprosedyrene og teknikker for, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi og medisin og farmasøytisk kjemi beskrevet her er de som er velkjent og mye anvendt på området. Standard teknikker blir anvendt for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytisk fremstilling, formulering og levering og behandling av pasienter.

Som anvendt i henhold til den foreliggende beskrivelsen, skal følgende betegnelser, med mindre noe annet er angitt, forstås å ha følgende betydninger: Slik den er anvendt her, henviser betegnelsen "antistoff til immunglobulinmolekyler og immunologisk aktive deler av immunglobulin (lg) molekyler, dvs. molekyler som inneholder et antigenbindingssete som binder spesifikt (immunreagerer med) et antigen. Slike antistoffer omfatter, men er ikke begrenset til, polyklonale-, monoklonale-, kimæriske-, enkeltkjedede-, Fab-, Faty- og F(ab)2-fragmenter og et Fab-ekspresjonsbibliotek. Med "binder spesifikt" eller "immunreagerer med" menes det at antistoffet reagerer med én eller flere antigene determinanter av det ønskede antigenet og ikke reagerer (dvs. binder) med andre polypeptider eller binder ved mye lavere affinitet (Kd>10-<6>) med andre polypeptider.

Antistoffets grunnstruktur er kjent å omfatte en tetramer. Hver tetramer er sammensatt av to identiske polypeptidkjedepar, der hvert par har én "lett" (ca. 25 kDa) og én "tung" kjede (ca. 50-70 kDa). Den aminoterminale delen av hver kjede omfatter en variabel region på ca. 100 til 110 eller flere aminosyrer primært ansvarlig for gjenkjennelse av antigen. Den karboksyterminale delen av hver kjede definerer en konstant region primært ansvarlig for effektorfunksjon. Humane lette kjeder blir klassifisert som kappa og lambda lette kjeder. Tunge kjeder blir klassifisert som mu, delta, gamma, alfa eller epsilon og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgM, IgD, IgA og IgE. I lette og tunge kjeder er de variable og konstante regionene koblet med en "J" region på ca. 12 eller flere aminosyrer, der den tunge kjeden også omfatter en "D" region på ca. 10 flere aminosyrer. Se generelt Fundamental Immunology, kap. 7 (Paul, W., ea., 2. utg. Raven Press, NY (1989)). De variable regionene til hvert par av lett og tung kjede danner antistoffbindingssetet.

Betegnelsen "monoklonalt antistoff" (MAb) eller "monoklonal antistoffsammensetning", slik den er anvendt her, henviser til en populasjon av antistoffmolekyler som bare inneholder én molekylær art av antistoffmolekyl bestående av et unikt lett kjede-genprodukt og et unikt tung kjede-genprodukt. Spesielt er de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR'er) i det monoklonale antistoffet identiske i alle molekylene i populasjonen. MAb'er inneholder et antigenbindingssete som kan immunreagere med en spesiell epitop av antigenetkarakterisert veden unik bindingsaffinitet for det.

Generelt tilhører antistoffmolekyler fremskaffet fra mennesker hvilken som helst av klassene IgG, IgM, IgA, IgE og IgD, som er forskjellige fra hverandre ved type tung kjede foreliggende i molekylet. Bestemte klasser har også underklasser, slik som IgGi, lgG2og andre. Videre, hos mennesker, kan den lette kjeden være en kappa- eller en lambdakjede.

Betegnelsen "antigenbindingssete" eller "bindende del" henviser til delen av immunglobulinmolekylet som deltar i antigenbinding. Antigenbindingssetet er dannet av aminosyrerester i de N-terminale variable ("V") regionene til de tunge ("H") og lette ("L") kjedene. Tre sterkt divergerende områder i V-regionene til de tunge og lette kjedene, henvist til som "hypervariable regioner", ligger mellom mer konserverte flankerende områder kjent som "strukturregioner", eller "FR'er". Betegnelsen "FR" henviser derfor til aminosyresekvenser som er funnet naturlig mellom og ved siden av hypervariable regioner i immunglobuliner. I et antistoffmolekyl er de tre hypervariable regionene til en lett kjede og de tre hypervariable regionene til en tung kjede plassert i forhold til hverandre tredimensjonalt for å danne en antigenbindende overflate. Den antigenbindende overflaten er komplementær til den tredimensjonale overflaten av et bundet antigen, og de tre hypervariable regionene til hver av de tunge og lette kjedene henvises til som "komplementaritetsbestemmende regioner" eller "CDR'er". Anvisning av aminosyrer til hvert domene er i samsvar med definisjonene ifølge Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 og 1991)) eller Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Slik den er anvendt her, omfatter betegnelsen "epitop" hvilken som helst proteindeterminant som kan binde spesifikt til et immunglobulin, et scFv eller en T-cellereseptor. Betegnelsen "epitop" omfatter hvilken som helst proteindeterminant som kan binde spesifikt til et immunglobulin eller T-cellereseptor. Epitope determinanter består vanligvis av kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler slik som aminosyrer eller sukkersidekjeder og har vanligvis spesifikke tredimensjonale strukturkarakteristika, så vel som spesifikke ladningskarakteristika. Et antistoff sies å binde et antigen spesifikt når dissosiasjonskonstanten er < 1 uM; fortrinnsvis <100 nM og mest foretrukket < 10 nM.

Slik de er anvendt her, henviser betegnelsene "immunologisk binding" og "immunologiske bindingsegenskaper" til de ikke-kovalente interaksjonene av typen som forekommer mellom et immunglobulinmolekyl og et antigen som immunglobulinet er spesifikt for. Styrken eller affiniteten til immunologiske bindingsinteraksjoner kan uttrykkes i form av dissosiasjonskonstanten (Kd) til interaksjonen, der en mindre Kdrepresenterer en større affinitet. Immunologiske bindingsegenskaper til utvalgte polypeptider blir kvantifisert ved anvendelse av fremgangsmåter velkjent på området. Én slik fremgangsmåte medfører måling av hastighetene for antigenbindingssete/antigenkompleks-dannelse og -dissosiering, der hastighetene avhenger av konsentrasjonene av komplekspartnerne, affiniteten til interaksjonen og geometriske parametre som påvirker hastigheten like mye i begge retninger. Derfor kan både "på-hastighetskonstanten" (KPå) og "av-hastighetskonstanten" (Kav) bestemmes ved beregning av konsentrasjonene og de faktiske hastighetene for assosiering og dissosiering (se Nature 361:186-87

(1993)). Forholdstallet Kav/Kpå muliggjør kanselering av alle parametre ikke relatert til affinitet og er lik dissosiasjonskonstanten Kd(se generelt Davies et al. (1990)

Annual Rev Biochem 59:439-473). Et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse sies å binde spesifikt til en CD3-epitop når likevektsbindingskonstanten (Kd) er < 1 uM, fortrinnsvis < 100 nM, mer foretrukket < 10 nM og mest foretrukket < 100 pM til ca. 1 pM, som målt ved analyser slik som radioligandbindingsanalyser eller lignende analyser kjent for fagfolk.

Fagfolk på området vil forstå at det er mulig å bestemme, uten upassende eksperimentering, om et humant monoklonalt antistoff har samme spesifisitet som et humant monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse (f.eks. monoklonalt antistoff 28F11, 27H5, 23F10 eller 15C3) ved å bringe på det rene hvorvidt førstnevnte hindrer sistnevnte fra å binde til et CD3-antigenpolypeptid. Hvis det humane monoklonale antistoffet som testes konkurrerer med et humant monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, som vist ved en reduksjon i binding ved det humane monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen, så binder de to monoklonale antistoffene til samme eller en nært relatert epitop. En annen måte for å bestemme hvorvidt et humant monoklonalt antistoff har spesifisiteten til et humant monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen er å preinkubere det humane monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen med CD3-antigenpolypeptidet som det vanligvis er reaktivt med og deretter tilsette det humane monoklonale antistoffet som testes for å bestemme om det humane monoklonale antistoffet som testes blir hemmet i dets evne til å binde CD3-antigenpolypeptidet. Hvis det humane monoklonale antistoffet som testes blir hemmet deretter, har det sannsynligvis samme eller funksjonelt ekvivalent, epitop spesifisitet som det monoklonale antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ulike prosedyrer kjent på området blir anvendt for produksjon av de monoklonale antistoffene rettet mot et protein slik som et CD3-protein eller mot derivater, fragmenter, analoger, homologer eller ortologer derav (se f.eks. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E og Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Fullstendig humane antistoffer er antistoffmolekyler hvor hele sekvensen til både den lette kjeden og den tunge kjeden, inkludert CDR'ene, kommer fra humane gener. Slike antistoffer blir betegnet "humane antistoffer" eller "fullstendig humane antistoffer" her. Humane monoklonale antistoffer blir for eksempel fremstilt ved anvendelse av prosedyrene beskrevet nedenfor i Eksempel 1. Humane monoklonale antistoffer kan også fremstilles ved anvendelse av triomteknikk; human B-cellehybridomteknikk (se Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72) og EBV-hybridomteknikken for å produsere humane monoklonale antistoffer (se Cole, et al., 1985 i: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96). Humane monoklonale antistoffer kan anvendes og kan produseres ved anvendelse av humane hybridomer (se Cote, et al., 1983. Proe Nati Acad Sei USA 80: 2026-2030) eller ved transformasjon av humane B-celler med Epstein Barr-virus in vitro

(se Cole, et al., 1985 i: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96).

Antistoffer blir renset med velkjente teknikker, slik som affinitetskromatografi ved anvendelse av protein A eller protein G, som primært gir IgG-fraksjonen av immunserum. Deretter, eller alternativt, kan det spesifikke antigenet som er målet for det ønskede immunglobulinet, eller en epitop derav, immobiliseres på en kolonne for å rense det immunspesifikke antistoffet ved immunaffinitets-kromatografi. Rensing av immunglobuliner er beskrevet for eksempel av D. Wilkinson (The Scientist, publisert av The Scientist, Inc., Philadelphia PA, vol. 14, nr. 8(17. april, 2000), s. 25-28).

Det er ønskelig å modifisere antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse med hensyn på effektorfunksjon, for å øke f.eks. effektiviteten til antistoffet i behandling av immunrelaterte sykdommer. For eksempel kan cysteinrest(er) innføres i Fc-regionen og dermed tillate interkjede disulfidbindingsdannelse i denne regionen. Det homodimeriske antistoffet således generert kan ha forbedret internaliseringsevne og/eller økt komplementmediert celledreping og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) (se Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) og Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativt kan et antistoff modifiseres som har doble Fc-regioner og dermed kan ha økt komplementlysering og ADCC-egenskaper (se Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).

Foreliggende oppfinnelse omfatter også Fv, Fab, Fab'og F(ab )2 huCD3-fragmenter, enkeltkjedede huCD3-antistoffer, bispesifikke huCD3-antistoffer og heterokonjugat huCD3-antistoffer.

Bispesifikke antistoffer er antistoffer som har bindingsspesifisiteter for minst to ulike antigener. I dette tilfellet er én av bindingsspesifisitetene for CD3. Det andre bindingsmålet er hvilket som helst annet antigen, og er fordelaktig et celleoverflateprotein eller reseptor eller reseptorsubenhet.

Fremgangsmåter for å lage bispesifikke antistoffer er kjent på området. Tradisjonelt er den rekombinante produksjonen av bispesifikke antistoffer basert på samekspresjon av to immunglobulin tung kjede/lett kjede par, der de to tunge kjedene har ulike spesifisiteter (Milstein og Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). På grunn av det tilfeldige utvalget av immunglobulin tunge og lette kjeder, produserer disse hybridomene (kvadromene) en potensiell blanding av ti ulike antistoffmolekyler, der bare ett har den korrekte bispesifikke strukturen. Rensing av det korrekte molekylet blir vanligvis utført med affinitetskromatografitrinn. Lignende prosedyrer er beskrevet i WO 93/08829, publisert 13. mai 1993, og i Trauneckeretal, EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Variable antistoffdomener med ønskede bindingsspesifisiteter (antistoff-antigen kombinerende seter) kan fusjoneres til immunglobulin konstant domene-sekvenser. Fusjonen er fortrinnsvis med et immunglobulin tung kjede konstant domene, i hvert fall omfattende en del av hengsels-, CH2- og CH3-regionene. Det er foretrukket å ha den første tung kjede konstante regionen (CH1) inneholdende setet nødvendig for lett kjede-binding foreliggende i minst én av fusjonene. DNA'er som koder for immunglobulin tung kjede-fusjonene og, om ønskelig, immunglobulin lett kjede, blir satt inn i separate ekspresjonsvektorer og samtransfektert inn i en egnet vertsorganisme. Forflere detaljer om generering av bispesifikke antistoffer, se for eksempel Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986).

I henhold til en annen tilnærming beskrevet i WO 96/27011, kan grenseflaten mellom et par antistoffmolekyler modifiseres for å maksimalisere prosenten av heterodimerer som blir gjenvunnet fra rekombinant cellekultur. Den foretrukne grenseflaten omfatter minst én del av CH3-regionen til et antistoff konstant domene. I denne fremgangsmåten blir én eller flere små aminosyresidekjederfra grenseflaten til det første antistoffmolekylet byttet ut med større sidekjeder (f.eks. tyrosin eller tryptofan). Kompenserende "hulrom" med identisk eller lignende størrelse som den store sidekjeden(e) blir laget på grenseflaten til det andre antistoffmolekylet ved å bytte ut store aminosyresidekjeder med mindre (f.eks. alanin eller treonin). Dette tilveiebringer en mekanisme for å øke utbyttet av heterodimeren i forhold til andre uønskede sluttprodukter, slik som homodimerer.

Bispesifikke antistoffer kan fremstilles som fullengde antistoffer eller antistoffragmenter (f.eks. F(ab')2-antistoffer). Teknikker for generering av bispesifikke antistoffer fra antistoffragmenter er beskrevet i litteraturen. For eksempel kan bispesifikke antistoffer fremstilles ved anvendelse av kjemisk kobling. Brennan et al., Science 229:81 (1985) beskriver en prosedyre der intakte antistoffer blir kuttet proteolytisk for å generere F(ab')2-fragmenter. Disse fragmentene blir redusert i nærvær av det ditiolkompleksdannende midlet natriumarsenitt for å stabilisere tilstøtende ditioler og forebygge intermolekylær disulfiddannelse. Fab'-fragmentene generert blir deretter konvertert til tionitrobenzoat (TNB)-derivater. Ett av Fab'-TNB derivatene blir deretter rekonvertert til Fab'-tiol ved reduksjon med merkaptoetylamin og blir blandet med en ekvimolar mengde av det andre Fab'-TNB derivatet for å danne det bispesifikke antistoffet. De produserte bispesifikke antistoffene kan anvendes som midler for selektiv immobilisering av enzymer.

I tillegg kan Fab'-fragmenter gjenvinnes direkte fra E. coli og kobles kjemisk for å danne bispesifikke antistoffer. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225

(1992) beskriver produksjonen av et fullstendig humanisert bispesifikt antistoff F(ab')2-molekyl. Hvert Fab'-fragment ble utskilt separat fra E. coli og var gjenstand for rettet kjemisk kobling in vitro for å danne det bispesifikke antistoffet. Det bispesifikke antistoffet således dannet var i stand til å binde til celler som overuttrykte ErbB2-reseptoren og normale humane T-celler, så vel som å trigge den lytiske aktiviteten til humane cytotoksiske lymfocytter mot humane brysttumormål.

Ulike teknikker for å lage og isolere bispesifikke antistoffragmenter direkte fra rekombinant cellekultur er også beskrevet. For eksempel er bispesifikke antistoffer produsert ved anvendelse av leucin-zipper ("leucin-glidelås"). Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Leucin-zipper peptidene fra Fos- og Jun-proteinene ble bundet til Fab'-delene av to ulike antistoffer ved genfusjon. Antistoffhomodimerene ble redusert på hengselsregionen for å danne monomerer og deretter reoksidert for å danne antistoffheterodimerene. Denne fremgangsmåten kan også anvendes for produksjon av antistoffhomodimerer. "Diabody"-teknologien beskrevet av Hollingeret al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) har fremskaffet et alternativ mekanisme for å lage bispesifikke antistoffragmenter. Fragmentene omfatter et tung kjede variabel domene (Vh) koblet til et lett kjede variabel domene (Vl) med en linker som er for kort til å tillate pardannelse mellom de to domenene på samme kjede. Følgelig blir Vh- og VL-domenene til ett fragment tvunget til å danne par med de komplementære Vl- og VH-domenene til et annet fragment og dermed lage to antigenbindende seter. En annen strategi for å lage bispesifikke antistoffragmenter ved anvendelse av enkeltkjede Fv (sFv) dimerer har også blitt rapportert. Se Gruberetal., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Antistoffer med mer enn to valenser er kontemplert. For eksempel kan trispesifikke antistoffer fremstilles. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Eksempler på bispesifikke antistoffer kan binde til to ulike epitoper, der minst én av disse kommer fra proteinantigenet ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt kan en anti-antigen arm av et immunglobulinmolekyl kombineres med en arm som binder til et triggermolekyl på en leukocytt, slik som et T-cellereseptormolekyl (f.eks. CD2, CD3, CD28 eller B7) eller Fc-reseptorer for IgG (FcyR), slik som FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) og FcyRIII (CD16), for å fokusere cellulære forsvarsmekanismer til cellen som uttrykker det spesielle antigenet. Bispesifikke antistoffer kan også anvendes for å styre cytotoksiske midler til celler som uttrykker et spesielt antigen. Disse antistoffene har en antigenbindende arm og en arm som binder et cytotoksisk middel eller en radionuklid chelator, slik som EOTUBE, DPTA, DOTA eller TETA. Et annet bispesifikt antistoff av interesse binder proteinantigenet beskrevet her og videre binder vevsfaktor (TF).

Heterokonjugat antistoffer er også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Heterokonjugat antistoffer er sammensatt av to kovalent koblede antistoffer. Slike antistoffer har for eksempel blitt foreslått å binde immunsystemceller til uønskede celler (US-patent nr. 4.676.980) og for behandling av HIV-infeksjon (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Det er kontemplert at antistoffene kan fremstilles in vitro ved anvendelse av kjente fremgangsmåter i syntetisk proteinkjemi, omfattende de som involverer kryssbindende midler. For eksempel kan immuntoksiner konstrueres ved anvendelse av en disulfidbytter-reaksjon eller ved å danne en tioeterbinding. Eksempler på egnede reagenser for dette formålet omfatter iminotiolat og metyl-4-merkaptobutyrimidat og de beskrevet for eksempel i US-patent nr. 4.676.980.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også immunkonjugater omfattende et antistoff konjugert til et cytotoksisk middel slik som et toksin (f.eks. et enzymatisk aktivt toksin av bakteriell-, fungal-, plante- eller animalsk opprinnelse eller fragmenter derav) eller en radioaktiv isotop (dvs. en radiokonjugat).

Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav som kan anvendes omfatter difteri A-kjede, ikke-bindende aktive fragmenter av difteritoksin, eksotoksin A-kjede (fra Pseudomonas aeruginosa), ricin A-kjede, abrin A-kjede, modeccin A-kjede, alfa-sarcin, Aleurites ford/V-proteiner, diantinproteiner, Phytolaca amer/cana-proteiner (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia-hemmer, curcin, crotin, sapaonaria officinalis- hemmer, gelonin, mitogellin, restriktosin, fenomycin, enomycin og trikotecenene. En rekke radionuklider er tilgjengelig for produksjon av radioaktivt konjugerte antistoffer. Eksempler omfatter 212Bji 131, 131,n 90y og186Re.

Konjugater av antistoff og cytotoksisk middel lages ved anvendelse av en rekke bifunksjonelle proteinbindende midler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat HCL), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutareldehyd), bis-azido forbindelser (slik som bis (p-azidobenzoyl) heksandiamin), bis-diazonium derivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som tolyen 2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (slik som 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). For eksempel kan et ricinimmuntoksin fremstilles som beskrevet i Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Karbon-14-merket 1-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylen triaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på chelaterende middel for konjugering av radionukleotid til antistoffet (se W094/11026).

Fagpersoner på området vil forstå at et stort mangfold av mulige grupper kan kobles til de resulterende antistoffene eller til andre molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse (se for eksempel "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse og R. E. Lewis, Jr (red.), Carger Press, New York, (1989)).

Kobling blir oppnådd med hvilken som helst kjemisk reaksjon som vil binde de to molekylene så lenge antistoffet og den andre gruppen beholder deres respektive aktiviteter. Denne bindingen kan omfatte mange kjemiske mekanismer, for eksempel kovalent binding, affinitetsbinding, interkalering, sidestilt binding og kompleksdannelse. Den foretrukne bindingen er imidlertid kovalent binding. Kovalent binding blir oppnådd enten ved direkte kondensasjon av eksisterende sidekjeder eller ved inkorporering av ytre brodannende molekyler. Mange bivalente eller polyvalente bindingsmidler er anvendelige i kobling av proteinmolekyler, slik som antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse, til andre molekyler. For eksempel kan representative bindingsmidler omfatte organiske forbindelser slik som tioestere, karbodiimider, suksinimidestere, diisocyanater, glutaraldehyd, diazobenzener og heksametylendiaminer. Denne listen er ikke ment å være uttømmende for de ulike klassene med bindingsmidler kjent på området, men er snarere eksempler på de mer vanlige bindingsmidlene (se Killen og Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982) og Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Foretrukne linkere er beskrevet i litteraturen (se for eksempel Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984) som beskriver anvendelse av MBS (M-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuksinimidester). Se også US-patent nr. 5.030.719, som beskriver anvendelse av halogener! acetylhydrazidderivat koblet til et antistoff ved hjelp av en oligopeptidlinker. Spesielt foretrukne linkere omfatter: (i) EDC (1 -etyl-3-(3-dimetylamino-propyl) karbodiimidhydroklorid; (ii) SMPT (4-suksinimidyl-oksykarbonyl-alfa-metyl-alfa-(2-pridyl-ditio)-toluen (Pierce Chem. Co., kat.

(21558G); (iii) SPDP (suksinimidyl-6 [3-(2-pyridylditio) propionamidojheksanoat (Pierce Chem. Co., kat. nr. 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuksinimidyl 6 [3-(2-pyridylditio)-propianamid] heksanoat (Pierce Chem. Co., kat. nr. 2165-G) og (v) sulfo-NHS (N-hydroksysulfo-suksinimid: Pierce Chem. Co., kat. nr. 24510) konjugert til EDC.

Linkerne beskrevet ovenfor inneholder komponenter som har ulike egenskaper, hvilket således fører til konjugater med forskjellige fysisk-kjemiske egenskaper. For eksempel er sulfo-NHS estere av alkylkarboksylater mer stabile enn sulfo-NHS estere av aromatiske karboksylater. NHS-ester-inneholdende linkere er mindre løselig enn sulfo-NHS-estere. Videre inneholder linkeren SMPT en sterisk hindret disulfidbinding og kan danne konjugater med økt stabilitet. Disulfidbindinger er generelt mindre stabile enn andre bindinger, fordi disulfidbindingen blir kuttet in vitro, hvilket resulterer i mindre konjugat tilgjengelig. Sulfo-NHS, spesielt, kan øke stabiliteten til karbodimidkoplinger. Karbodimidkoplinger (slik som EDC) når anvendt sammen med sulfo-NHS, danner estere som er mer resistente for hydrolyse enn karbodimidkoblingsreaksjonen alene.

Betegnelsen "isolert polynukleotid", slik den er anvendt her, skal bety et polynukleotid av genomisk, cDNA eller syntetisk opprinnelse eller noen kombinasjon derav, som "det isolerte polynukleotidet" i kraft av dets opprinnelse (1) ikke er assosiert med hele eller en del av et polynukleotid som "det isolerte polynukleotidet" blir funnet i naturen med, (2) er funksjonelt bundet til et polynukleotid som det ikke er bundet til i naturen eller (3) forekommer ikke i naturen som del av en større sekvens.

Betegnelsen "isolert protein" henvist til her betyr et protein av cDNA-, rekombinant RNA- eller syntetisk opprinnelse eller noen kombinasjon derav, der "det isolerte proteinet" i kraft av dets opprinnelse eller kilde for avledning (1) ikke er assosiert med proteiner funnet i naturen, (2) er fri for andre proteiner fra samme kilde, f.eks. fri for marine proteiner, (3) blir uttrykt av en celle fra en annen art eller (4) ikke forekommer i naturen.

Betegnelsen "polypeptid" blir anvendt her som en fellesbetegnelse for å angi nativt protein, fragmenter eller analoger av en polypeptidsekvens. Derfor er native proteinfragmenter og analoger arter av polypeptidslekten. Foretrukne polypeptider ifølge oppfinnelsen omfatter de humane tung kjede-immunglobulinmolekylene vist ved Figur 1B, 2B, 3B og 4B og de humane lett kjede-immunglobulinmolekylene vist ved Figur 1D, 2D, 3D og 4D, så vel som antistoffmolekyler dannet ved kombinasjoner omfattende tung kjede-immunglobulinmolekylene med lett kjede-immunglobulinmolekyler, slik som kappa lett kjede-immunglobulinmolekyler og vice versa, så vel som fragmenter og analoger derav.

Betegnelsen "naturlig forekommende", slik den er anvendt herfor et objekt, henviser til det faktum at et objekt kan finnes i naturen. For eksempel er en polypeptid- eller polynukleotidsekvens naturlig forekommende som foreligger i en organisme (inkludert virus) som kan isoleres fra en kilde i naturen og som ikke har blitt forsettlig modifisert av menneske i laboratoriet eller på annen måte.

Betegnelsen "bundet funksjonelt", slik den er anvendt her, henviser til posisjoner av komponenter slikt beskrevet som er i et forhold som tillater dem å virke på deres tiltenkte måte. En kontrollsekvens "bundet funksjonelt" til en kodende sekvens er ligert på en slik måte at ekspresjon av den kodende sekvensen blir oppnådd under betingelser kompatible med kontrollsekvensene.

Betegnelsen "kontrollsekvens", slik den er anvendt her, henviser til polynukleotidsekvenser som er nødvendige for å få i stand ekspresjon og prosessering av kodende sekvenser som de er ligert til. Egenskapene til slike kontrollsekvenser varierer avhengig av vertsorganismen. I prokaryoter omfatter slike kontrollsekvenser generelt promoter, ribosombindingssete og transkripsjonstermineringssekvens, i eukaryoter omfatter slike kontrollsekvenser generelt promotere og transkripsjonstermineringssekvens. Betegnelsen "kontrollsekvenser" er ment minimum å omfatte alle komponenter hvis tilstedeværelse er essensiell for ekspresjon og prosessering og kan også omfatte ytterligere komponenter hvis tilstedeværelse er fordelaktig, for eksempel ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser. Betegnelsen "polynukleotid", som henvist til her, betyr en polymer av nukleotider med lengde på minst 10 baser, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av begge typer nukleotid. Betegnelsen omfatter enkelt- og dobbelttrådede former av DNA.

Betegnelsen oligonukleotid henvist til her omfatter naturlig forekommende og modifiserte nukleotider bundet sammen med naturlig forekommende og ikke-naturlig forekommende oligonukleotidbindinger. Oligonukleotider er en del av polynukleotid generelt omfattende en lengde på 200 baser eller færre. Foretrukne oligonukleotider er 10 til 60 baser lange og mest foretrukket 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 til 40 baser lange. Oligonukleotider er vanligvis f.eks. enkeltkjedede for prober, selv om oligonukleotider kan være dobbelttrådede, f.eks. for anvendelse i konstruksjon av en genmutant. Oligonukleotider ifølge oppfinnelsen er enten sense eller antisense oligonukleotider.

Betegnelsen "naturlig forekommende nukleotider" henvist til her omfatter deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Betegnelsen "modifiserte nukleotider" henvist til her omfatter nukleotider med modifiserte eller substituerte sukkergrupper og lignende. Betegnelsen "oligonukleotidbindinger" henvist til her omfatter oligonukleotidbindinger slik som fosfortioat, fosforditioat, fosforselerloat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat, fosforonmidat og lignende. Se f.eks. LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al., Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, s. 87-108 (F. Eckstein, red., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stecet al., US-patent nr. 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Et oligonukleotid kan om ønskelig omfatte en markør for deteksjon.

Betegnelsen "hybridisere selektivt" henvist til her betyr å binde detekterbart og spesifikt. Polynukleotider, oligonukleotider og fragmenter derav ifølge oppfinnelsen hybridiserer selektivt til nukleinsyretråder under hybridiserings- og vaskebetingelser som begrenser merkbare mengder av detekterbar binding til uspesifikke nukleinsyrer. Betingelser med høy stringens kan anvendes for å oppnå selektive hybridiseringsbetingelser kjent på området og beskrevet her. Generelt vil nukleinsyresekvenshomologien mellom polynukleotidene, oligonukleotidene og fragmentene ifølge foreliggende oppfinnelse og en nukleinsyresekvens av interesse være minst 80 % og mer typisk med fortrinnsvis økende homologier på minst 85 %, 90 %, 95 %, 99 % og 100 %. To aminosyresekvenser er homologe hvis det er en delvis eller fullstendig identitet mellom deres sekvenser. For eksempel betyr 85 % homologi at 85 % av aminosyrene er identiske når de to sekvensene blir sammenstilt for maksimal matching. Gap (i begge de to sekvensene som blir matchet) er tillatt i maksimalisering av matching. Gap-lengder på 5 eller mindre er foretrukket, der 2 eller mindre er mer foretrukket. Alternativt og fortrinnsvis er to proteinsekvenser (eller polypeptidsekvenser avledet fra dem med lengde på minst 30 aminosyrer) homologe, slik denne betegnelsen blir anvendt her, hvis de har en sammenstillingsscore på mer enn 5 (i standardavvikenheter) ved anvendelse av programmet ALIGN med mutasjonsdatamatrise og en gap-straff på 6 eller mer. Se Dayhoff, M. O., i Atlas of Protein Sequence and Structure, s. 101-110 (volum 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) og Supplement 2 til dette volumet, s. 1-10. De to sekvensene eller deler derav er mer foretrukket homologe hvis deres aminosyrer er mer enn eller lik 50 % identiske når sammenstilt optimalt ved anvendelse av ALIGN-programmet. Betegnelsen "svarer til" blir anvendt her til å bety at en polynukleotidsekvens er homolog (dvs. er identisk, ikke strengt tatt evolusjonsmessig relatert) til hele eller en del av en referansepolynukleotidsekvens eller at en polypeptidsekvens er identisk med en referansepolypeptidsekvens. I motsetning til dette blir betegnelsen "komplementær til" anvendt herfor å bety at den komplementære sekvensen er homolog med hele eller en del av en referansepolynukleotidsekvens. For illustrasjon svarer nukleotidsekvensen "TATAC" til en referansesekvens "TATAC" og er komplementær til en referansesekvens "GTATA".

Følgende betegnelser blir anvendt for å beskrive sekvensforholdet mellom to eller flere polynukleotid- eller aminosyresekvensen "referansesekvens", "sammenligningsvindu", "sekvensidentitet", "prosent sekvensidentitet" og "vesentlig identitet". En "referansesekvens" er en definert sekvens anvendt som et grunnlag for en sekvenssammenligning. En referansesekvens kan være en del av en større sekvens, for eksempel som et segment av et fullengde cDNA eller gensekvens gitt i en sekvensliste eller kan omfatte et fullstendig cDNA eller gensekvens. Generelt er en referansesekvens minst 18 nukleotider eller 6 aminosyrer lang, ofte minst 24 nukleotider eller 8 aminosyrer lang, og ofte minst 48 nukleotider eller 16 aminosyrer lang. Siden to polynukleotider eller aminosyresekvenser hver kan (1) omfatte en sekvens (dvs. en del av den fullstendige polynukleotid- eller aminosyresekvensen) som er lik mellom de to molekylene og (2) videre kan omfatte en sekvens som er divergerende mellom de to polynukleotidene eller aminosyresekvensene, blir sekvenssammenligninger mellom to (eller flere) molekyler typisk utført ved å sammenligne sekvenser til de to molekylene over et "sammenligningsvindu" for å identifisere og sammenligne lokale regioner med sekvenslikhet. Et "sammenligningsvindu", slik det er anvendt her, henviser til et konseptuelt segment på minst 18 sammenhengende nukleotidposisjoner eller 6 aminosyrer der en polynukleotid- eller aminosyresekvens kan sammenlignes med en referansesekvens på minst 18 påfølgende nukleotider eller 6 aminosyresekvenser, og der delen av polynukleotidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner, delesjoner, substitusjoner og lignende (dvs. gaps) på 20 prosent eller mindre sammenlignet med referansesekvensen (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) for optimal sammenstilling av de to sekvensene. Optimal sammenstilling av sekvenser for å sammenstille et sammenligningsvindu kan utføres med den lokale homologialgoritmen ifølge Smith og Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), med homologisammenstillingsalgoritmen ifølge Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), med "søk for likhet" -metoden ifølge Pearson og Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 85:2444 (1988), med datamaskinbaserte implementasjoner av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks eller MacVector-programvarepakker) eller ved undersøkelse, og den beste sammenstillingen (dvs. som resulterer i høyest prosent homologi over sammenligningsvinduet) generert med de ulike fremgangsmåtene blir valgt.

Betegnelsen "sekvensidentitet" betyr at to polynukleotid- eller aminosyresekvenser er identiske (dvs. på en nukleotid-til-nukleotid eller rest-til-rest basis) over sammenligningsvinduet. Betegnelsen "prosent sekvensidentitet" blir beregnet ved å sammenligne to optimalt sammenstilte sekvenser over sammenligningsvinduet, bestemme antall posisjoner hvor det forekommer identisk nukleinsyrebase (f.eks. A, T, C, G, U eller I) eller rest i begge sekvenser for å gi antall matchede posisjoner, dividere antall matchede posisjoner med det totale antallet posisjoner i sammenligningsvinduet (dvs. vindusstørrelsen) og multiplisere resultatet med 100 for å gi prosent sekvensidentitet. Betegnelsen "vesentlig identitet", slik den er anvendt her, betegner en egenskap for en polynukleotid- eller aminosyresekvens, der polynukleotidet eller aminosyren omfatter en sekvens som har minst 85 prosent sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90 til 95 prosent sekvensidentitet, mer vanlig minst 99 prosent sekvensidentitet sammenlignet med en referansesekvens over et sammenligningsvindu på minst 18 nukleotid (6 aminosyre) posisjoner, ofte over et vindu på minst 24-48 nukleotid (8-16 aminosyre) posisjoner, der prosent sekvensidentitet blir beregnet ved å sammenligne referansesekvensen med sekvensen som kan omfatte delesjoner eller addisjoner som totalt 20 prosent eller mindre av referansesekvensen over sammenligningsvinduet. Referansesekvensen kan være en del av en større sekvens.

Slik det er anvendt her, følger de tjue konvensjonelle aminosyrene og deres forkortelser konvensjonell bruk. Se Immunology - A Synthesis (2. utgave, E. S. Golub og D. R. Gren, red., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Stereoisomerer (f.eks. D-aminosyrer) av de tjue konvensjonelle aminosyrene, ikke-naturlige aminosyrer slik som a-, a-disubstituterte aminosyrer, N-alkyl aminosyrer, melkesyre og andre ukonvensjonelle aminosyrer kan også være egnede komponenter for polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ukonvensjonelle aminosyrer omfatter: 4 hydroksyprolin, y-karboksyglutamat, e- N,N,N-trimetyllysin, e-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, a-N-metylarginin og andre lignende aminosyrer og iminosyrer (f.eks. 4-hydroksyprolin). I polypeptidnotasjonen anvendt her er venstre retning aminoterminalretningen og høyre retning er karboksyterminal-retningen, i henhold til standard bruk og konvensjon.

Likeledes, med mindre noe annet er spesifisert, er venstre ende av enkelttrådede polynukleotidsekvenser 5' enden og den venstre retningen til dobbelttrådede polynukleotidsekvenser blir henvist til som 5' retningen. Retningen av 5' til 3' addisjon av voksende RNA-transkripter blir henvist til som transkripsjonsretningen, sekvensregioner på DNA-tråden som har samme sekvens som RNA'et og som er 5' i forhold til 5' enden av RNA-transkriptet henvises til som "oppstrømssekvenser", sekvensregioner på DNA-tråden som har samme sekvens som RNA'et og som er 3' i forhold til 3' enden av RNA-transkriptet henvises til som "nedstrømssekvenser".

Når det gjelder polypeptider, betyr betegnelsen "vesentlig identitet" at to peptidsekvenser, når sammenstilt optimalt, slik som ved programmene GAP eller BESTFIT ved anvendelse av standardinnstilte gap-vekter, har minst 80 prosent sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90 prosent sekvensidentitet, mer foretrukket minst 95 prosent sekvensidentitet og mest foretrukket minst 99 prosent sekvensidentitet.

Fortrinnsvis er restposisjoner som ikke er identiske ulike med konservative aminosyresubstitusjoner.

Konservative aminosyresubstitusjoner henviser til utbytting av rester som har lignende sidekjeder. For eksempel er en gruppe med aminosyrer som har alifatiske sidekjeder glysin, alanin, valin, leucin og isoleucin; en gruppe med aminosyrer som har alifatisk-hydroksyl sidekjeder er serin og treonin; en gruppe med aminosyrer som har amidinneholdende sidekjeder er asparagin og glutamin; en gruppe med aminosyrer som har aromatiske sidekjeder er fenylalanin, tyrosin og tryptofan; en gruppe med aminosyrer som har basiske sidekjeder er lysin, arginin og histidin og en gruppe med aminosyrer som har svovelinneholdende sidekjeder er cystein og metionin. Foretrukne konservative aminosyre-substitusjonsgrupper er: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin-tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutaminsyre-asparaginsyre og asparagin-glutamin.

Fragmenter av antistoffer eller immunglobulinmolekyler kan lett fremstilles av fagfolk på området.

Foretrukne amino- og karboksyterminaler til fragmenter eller analoger forekommer nær grenser for funksjonelle domener. Strukturelle og funksjonelle domener kan identifiseres ved sammenligning av nukleotid- og/eller aminosyresekvensdata med offentlige eller proprietære sekvensdatabaser. Fortrinnsvis blir datamaskinbaserte sammenligningsmetoder anvendt for å identifisere sekvensmotiver eller predikerte proteinkonformasjonsdomener som forekommer i andre proteiner med kjent struktur og/eller funksjon. Fremgangsmåter for å identifisere proteinsekvenser som folder seg til en kjent tredimensjonal struktur er kjent. Bowie et al., Science 253:164 (1991). Derfor demonstrerer de førnevnte eksemplene at fagfolk kan gjenkjenne sekvensmotiver og strukturelle konformasjoner som kan anvendes for å definere strukturelle og funksjonelle domener ifølge oppfinnelsen.

Betegnelsen "polypeptidfragment", slik det er anvendt her, henviser til et polypeptid som har en amino- og/eller karboksyterminal delesjon, men der den resterende aminosyresekvensen er identisk med de tilsvarende posisjonene i den naturlig forekommende sekvensen utledet for eksempel fra en fullengde cDNA-sekvens. Fragmenter er typisk minst 5, 6, 8 eller 10 aminosyrer lange, fortrinnsvis minst 14 aminosyrer lange, mer foretrukket minst 20 aminosyrer lange, vanligvis minst 50 aminosyrer lange og enda mer foretrukket minst 70 aminosyrer lange.

Betegnelsen "middel" blir anvendt her til å betegne en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl eller et ekstrakt laget fra biologiske materialer.

Slik de er anvendt her, henviser betegnelsene "markør" eller "merket" til innføring av en detekterbar markør, f.eks. ved innføring av en radioaktivt merket aminosyre eller binding til et polypeptid av biotinylgrupper som kan detekteres ved merket avidin (f.eks. streptavidin inneholdende en fluorescerende markør eller enzymatisk aktivitet som kan detekteres ved optiske eller kalorimetriske metoder).

I visse situasjoner kan merkelappen eller markøren også være terapeutisk. Ulike fremgangsmåter for merking av polypeptider og glykoproteiner er kjent på området og kan anvendes. Eksempler på markører for polypeptider omfatter, men er ikke begrenset til, følgende: radioisotoper eller radionuklider (f.eks.<3>H,<14>C,<15>N, 35S,<9>0Y,9<9>Tc,11<1>ln,125l, 131l), fluorescerende markører (f.eks. FITC, rhodamin, lantanidfosforer), enzymatiske markører (f.eks. pepperrotperoksidase, p-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminescerende, biotinylgrupper, forutbestemte polypeptidepitoper gjenkjent av en sekundær rapportør (f.eks. leucin-zipper parsekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitopmarkører). I noen utførelsesformer blir markører festet med mellomliggende sekvens ("spacer arms") av ulike lengder for å redusere potensiell sterisk hindring. Betegnelsen "farmasøytisk middel eller medikament", slik den er anvendt her, henviser til en kjemisk forbindelse eller sammensetning som kan indusere en ønsket terapeutisk effekt når passende administrert til en pasient.

Andre kjemibetegnelser her blir anvendt i henhold til konvensjonell bruk på området, som illustrert ved "The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms"

(Parker, S., red., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Betegnelsen "antineoplastisk middel" blir anvendt her for å henvise til midler som har den funksjonelle egenskapen av å hemme en utvikling eller progresjon av en neoplasme hos et menneske, spesielt en malign (kreft) lesjon, slik som et karsinom, sarkom, lymfom eller leukemi. Hemming av metastase er ofte en egenskap hos antineoplastiske midler.

Slik det er anvendt her, betyr "hovedsakelig ren" at en objektart er den dominerende arten som foreligger (dvs. på et molart grunnlag er den mer rikelig enn hvilken som helst annen individuell art i sammensetningen), og fortrinnsvis er en hovedsakelig renset fraksjon en sammensetning der objektarten omfatter minst ca. 50 prosent (på molart grunnlag) av alle makromolekylære arter foreliggende.

Generelt vil en hovedsakelig ren sammensetning omfatte mer enn ca. 80 prosent av alle makromolekylære arter foreliggende i sammensetningen, mer foretrukket mer enn ca. 85 %, 90 %, 95 % og 99 %. Mest foretrukket blir objektartene renset til essensiell homogenitet (kontaminerende arter kan ikke detekteres i sammensetningen ved konvensjonelle deteksjonsmetoder) der sammensetningen i alt vesentlig består av en enkel makromolekylær art.

Betegnelsen pasient omfatter mennesker og dyr.

Humane antistoffer og humanisering av antistoffer

Et huCD3-antistoff blir for eksempel generert ved immunisering av xenogene mus som kan utvikle fullstendig humane antistoffer (se Eksempel 1). Et IgG huCD3-antistoff blir for eksempel generert ved å konvertere et IgM anti-CD3 antistoff produsert av en transgen mus (se Eksempel 2). Alternativt blir for eksempel et slikt huCD3-antistoff utviklet ved anvendelse av fase-display metoder ved anvendelse av antistoffer bare inneholdende humane sekvenser. Slike fremgangsmåter er velkjente på området, f.eks. i WO92/01047 og US-patent nr. 6.521.404. I denne tilnærmingen blir et kombinatorisk bibliotek av fag som bærer tilfeldige par av lette og tunge kjeder screenet ved anvendelse av naturlig eller rekombinant kilde for CD3 eller fragmenter derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte for å produsere et huCD3-antistoff ifølge oppfinnelsen som omfatter trinnene med dyrking av en vertscelle ifølge oppfinnelsen under betingelser som er egnet for fremstilling av antistoffet. En prosess der minst ett trinn i prosessen omfatter immunisering av et transgent, ikke-humant dyr med humant CD3-protein er beskrevet. Noen av de endogene tung og/eller kappa lett kjede lokiene til dette xenogene, ikke-humane dyret er invalidisert og er inkapable for rearrangering nødvendig for å generere gener som koder for immunglobuliner i respons til et antigen. I tillegg er minst ett humant tung kjede lokus og minst ett humant lett kjede lokus transfektert stabilt inn i dyret. Derfor, i respons til et administrert antigen, rearrangerer de humane lokiene for å tilveiebringe gener som koder for humane variable regioner immunspesifikke for antigenet. Ved immunisering produserer derfor xenomusen B-cellersom utskiller fullstendig humane immunglobuliner.

En rekke teknikker er velkjent på området for å lage xenogene, ikke-humane dyr. Se for eksempel US-patent nr. 6.075.181 og 6.150.584. Med én strategi blir de xenogene (humane) tung og lett kjede immunglobulingenene innført i vertskimbanen (f.eks. sperm eller oocytter) og, i separate trinn, blir de tilsvarende vertsgenene gjort ikke-funksjonelle ved inaktivering ved anvendelse av homolog rekombinasjon. Humane tung og lett kjede immunglobulingener blir rekonstruert i en passende eukaryot eller prokaryot mikroorganisme, og de resulterende DNA-fragmentene blir innført i den passende verten, for eksempel pronukleusene til befruktede museoocytter eller embryonale stamceller. Inaktivering av endogene vertsimmunglobulinloki blir oppnådd ved målrettet ødeleggelse av de passende lokiene ved homolog rekombinasjon i vertscellene, spesielt embryonale stamceller eller pronukleuser til befruktede museoocytter. Den målrettede ødeleggelsen kan involvere innføring av en lesjon eller delesjon i mål-lokuset eller delesjon i mål-lokuset ledsaget av insersjon i lokuset, f.eks. insersjon av en selekterbar markør. I tilfellet av embryonale stamceller blir kimæriske dyr generert som delvis er avledet fra de modifiserte embryonale stamcellene og som kan overføre de genetiske modifikasjonene gjennom kimbanen. Paring av verter med innførte humane immunglobulinloki til stammer med inaktiverte endogene loki vil gi dyr hvis antistoffproduksjon er kun xenogen, f.eks. human.

I en alternativ strategi blir minst deler av de humane tung og lett kjede immunglobulinlokiene anvendt for å bytte ut de tilsvarende endogene immunglobulinlokiene direkte ved homolog rekombinasjon i embryonale stamceller. Dette resulterer i samtidig inaktivering og utskiftning av det endogene immunglobulinet. Dette blir etterfulgt av generering av kimæriske dyr hvor de embryonale stamcelleavledede cellene kan bidra til kimbanene.

En B-celleklon som uttrykker humant anti-CD3 antistoff blir for eksempel fjernet fra det xenogene, ikke-humane dyret og udødeliggjort i henhold til ulike fremgangsmåter kjent på området. Slike B-celler kan avledes direkte fra blodet til dyret eller fra lymfoide vev omfattende, men ikke begrenset til, milt, mandler, lymfeknuter og beinmarg. De resulterende, udødeliggjorte B-cellene kan ekspanderes og dyrkes in vitro for å produsere store, klinisk egnede mengder av huCD3-antistoff. Alternativt kan gener som koder for immunglobulinene med én eller flere humane variable regioner isoleres og uttrykkes i en annen celletype omfattende, men ikke begrenset til, et mammalsk cellekultursystem, for å oppnå antistoffene direkte eller individuelle kjeder derav, bestående av enkeltkjedede Fv-molekyler.

I tillegg kan hele settet av fullstendig humane anti-CD3 antistoffer generert av det xenogene, ikke-humane dyret screenes for å identifisere én slik klon med

optimale karakteristika. Slike karakteristika omfatter for eksempel bindingsaffinitet for det humane CD3-proteinet, interaksjonens stabilitet så vel som isotypen til det fullstendig humane anti-CD3 antistoffet. Kloner fra hele settet som har de ønskede karakteristikaene blir deretter anvendt som en kilde for nukleotidsekvenser som

koder for de ønskede variable regionene, for videre manipulering for å generere antistoffer med disse karakteristikaene, i alternative cellesystemer, ved anvendelse av konvensjonelle rekombinante eller transgene teknikker.

Denne generelle strategien ble demonstrert i forbindelse med generering av de første XenoMouse™-stammene publisert i 1994. Se Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994). Denne tilnærmingen er videre diskutert og skildret i US-patentsøknad serie nr. 07/466.008, innlevert 12. januar, 1990, 07/610.515, innlevert 8. november, 1990, 07/919.297, innlevert 24. juli, 1992, 07/922.649, innlevert 30. juli, 1992, innlevert 08/031.801, innlevert 15. mars, 1993, 08/112.848, innlevert 27. august, 1993, 08/234.145, innlevert 28. april, 1994, 08/376.279, innlevert 20. januar, 1995, 08/430.938, 27. april, 1995, 08/464.584, innlevert 5. juni, 1995, 08/464.582, innlevert 5. juni, 1995, 08/463.191, innlevert 5. juni, 1995, 08/462.837, innlevert 5. juni, 1995, 08/486.853, innlevert 5. juni, 1995, 08/486.857, innlevert 5. juni, 1995, 08/486.859, innlevert 5. juni, 1995, 08/462.513, innlevert 5. juni, 1995, 08/724.752, innlevert 2. oktober, 1996, og 08/759.620, innlevert 3. desember, 1996, og US-patent nr. 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 og 5.939.598 og japansk patent nr. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 og 3 068 507 B2. Se også Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) og Green og Jakobovits J. Exp. Med.: 188:483-495 (1998). Se også europeisk patent nr., EP 0 463 151 B1, forskningsmidler innvilget 12. juni, 1996, internasjonal patentsøknad nr., WO 94/02602, publisert 3. februar, 1994, internasjonal patentsøknad nr., WO 96/34096, publisert 31. oktober, 1996, WO 98/24893, publisert 11. juni, 1998, WO 00/76310, publisert 21. desember, 2000.

I en alternativ tilnærming har andre anvendt en "minilokus"-metode. I minilokusmetoden blir et eksogent lg-lokus etterlignet ved inklusjon av biter (individuelle gener) fra lg-lokuset. Således blir ett eller flere VH-gener, ett eller flere DH-gener, ett eller flere JH-gener, en mu konstant region og en andre konstant region (fortrinnsvis en gamma konstant region) dannet til en konstruksjon for insersjon i et dyr. Denne tilnærmingen er beskrevet i US-patent nr. 5.545.807 til Surani et al., og US-patent nr. 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 og 6.255.458 hver til Lonberg og Kay, US-patent nr. 5.591.669 og 6.023.010 til Krimpenfort og Berns, US-patent nr. 5.612.205, 5.721.367 og 5.789.215 til Berns et al., og US- patent nr. 5.643.763 til Choi og Dunn og GenPharm International US-patentsøknad serie nr. 07/574.748, innlevert 29. august, 1990, 07/575.962, innlevert 31. august, 1990, 07/810.279, innlevert 17. desember, 1991, 07/853.408, innlevert 18. mars, 1992, 07/904.068, innlevert 23. juni, 1992, 07/990.860, innlevert 16. desember, 1992, 08/053.131, innlevert 26. april, 1993, 08/096.762, innlevert 22. juli, 1993, 08/155.301, innlevert 18. november, 1993, 081161.739, innlevert 3. desember, 1993, 08/165.699, innlevert 10. desember, 1993, 08/209.741, innlevert 9. mars, 1994. Se også europeisk patent nr. 0 546 073 B1, internasjonal patentsøknad nr. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 og WO 98/24884 og US-patent nr. 5.981.175. Se videre Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al.,

(1994), Taylor et al., (1994) og Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).

En fordel med minilokusmetoden er hurtigheten som konstruksjoner omfattende deler av lg-lokuset kan genereres og innføres i dyr med. Imidlertid er en betydelig ulempe med minilokusmetoden teoretisk at utilstrekkelig diversitet blir innført ved inklusjon av lite antall V-, D- og J-gener. Faktisk synes publisert arbeid å støtte denne bekymringen. B-celleutvikling og antistoffproduksjon hos dyr laget ved anvendelse av minilokustilnærmingen synes hemmet. Derfor har forskning som angår foreliggende oppfinnelse vedvarende blitt rettet mot innføring av store deler av lg-lokuset for å oppnå større diversitet og i et forsøk på å rekonstruere immunrepertoaret til dyrene.

Kirin har også demonstrert generering av humane antistoffer fra mus hvor store biter av kromosomer eller hele kromosomer, ved mikrocellefusjon, er innført. Se europeisk patentsøknad nr. 773 288 og 843 961.

Humane anti-mus antistoff (HAMA)-responser har ledet industrien til å fremstille kimæriske eller på annen måte humaniserte antistoffer. Mens kimæriske antistoffer har en human konstant region og en immun variabel region, er det forventet at visse humane anti-kimæriske antistoff (HACA)-responser vil observeres, spesielt i kroniske- eller multidoseanvendelser av antistoffet. Derfor vil det være ønskelig å tilveiebringe fullstendig humane antistoffer mot CD3 for å ugyldiggjøre bekymringer og/eller effekter av HAMA- eller HACA-respons.

Produksjon av antistoffer med redusert immunogenitet blir også oppnådd via humaniserings- og display-teknikker ved anvendelse av passende biblioteker.

Det vil forstås at murine antistoffer eller antistoffer fra andre arter kan humaniseres eller gjøres primatlike ved anvendelse av velkjente teknikker på området. Se f.eks. Winterog Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) og Wright et al., Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). Antistoffet av interesse kan modifiseres ved rekombinante DNA-teknikkerforå substituere CH1-, CH2-, CH3-, hengselsdomener og/eller strukturdomenet med den tilsvarende humane sekvensen (se WO 92102190 og US-patent nr. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350 og 5.777.085). Dessuten er anvendelse av lg cDNAfor konstruksjon av kimæriske immunglobulingener kjent på området (Liu et al., PNAS 84:3439 (1987) og J. Immunol. 139:3521 (1987)). mRNA blir isolert fra et hybridom eller annen celle som produserer antistoffet og anvendt for å produsere cDNA. cDNA av interesse kan amplifiseres ved polymerasekjedereaksjonen ved anvendelse av spesifikke primere (US pat. nr. 4.683.195 og 4.683.202). Alternativt blir et bibliotek laget og screenet for å isolere sekvensen av interesse. DNA-sekvensen som koder for den variable regionen til antistoffet blir deretter fusjonert til humane konstant region-sekvenser. Sekvensene til humane konstant regiongener kan finnes i Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. I. H. publikasjon nr. 91-3242. Humane C-regiongener er lett tilgjengelig fra kjente kloner. Valg av isotype vil bli ledet av de ønskede effektorfunksjonene, slik som komplementfiksering eller aktivitet i antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet. Foretrukne isotyper er lgG1, lgG3 og lgG4. En av de humane lett kjede konstante regionene, kappa eller lambda, kan anvendes. Det kimæriske, humaniserte antistoffet blir deretter uttrykt ved konvensjonelle fremgangsmåter.

Antistoffragmenter, slik som Fv, F(ab')2og Fab kan fremstilles ved kutting av det intakte proteinet, f.eks. ved protease eller kjemisk kutting. Alternativt blir et trunkert gen utformet. For eksempel vil et kimærisk gen som koder for en del av F(ab')2-fragmentet omfatte DNA-sekvenser som koder for CH1-domenet og hengselsregionen til H-kjeden, etterfulgt av et translasjonsstoppkodon for å gi det trunkerte molekylet.

Konsensussekvenser av H- og L J-regioner kan anvendes til å utforme oligonukleotider for anvendelse som primere til å innføre anvendelige restriksjonsseter i J-regionen for påfølgende kobling av V-regionsegmenter til humane C-regionsegmenter. C-region cDNA kan modifiseres ved målrettet mutagenese for å plassere et restriksjonssete på den analoge posisjonen i den humane sekvensen.

Ekspresjonsvektorer omfatter plasmider, retrovirus, YACer, EBV-avledede episomer og lignende. En hensiktsmessig vektor er en som koder for en funksjonell fullstendig human CH- eller CL-immunglobulinsekvens, med passende restriksjonsseter modifisert slik at hvilken som helst Vh eller VL-31 sekvens lett kan settes inn og uttrykkes. I slike vektorer forekommer spleising vanligvis mellom spleisdonorsetet i den innsatte J-regionen og spleisakseptorsetet som kommer foran den humane C-regionen og også på spleisregionene som forekommer i de humane CH-eksonene. Polyadenylering og transkripsjonsterminering forekommer på native kromosomale seter nedstrøms for de kodende regionene. Det resulterende kimæriske antistoffet kan kobles til hvilken som helst sterk promoter, omfattende retrovirale LTR'er, f.eks. SV-40 tidlig promoter (Okayama et al., Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), Rous sarkomvirus LTR (Gorman et al., PNAS 79:6777

(1982)) og moloney murint leukemivirus LTR (Grosschedl et al., Cell 41:885

(1985)). Hvilket vil forstås, kan dessuten native Ig-promotere og lignende anvendes.

Videre kan humane antistoffer eller antistoffer fra andre arter genereres ved display-teknologier omfattende, uten begrensning, fagdisplay, retroviral display, ribosomal display og andre teknikker, ved anvendelse av velkjente teknikker på området og de resulterende molekylene kan være gjenstand for videre modning, slik som affinitetsmodning, ettersom slike teknikker er velkjente på området. Wright og Harris, supra, Hanes og Plucthau PEAS USA 94:4937-4942 (1997)

(ribosomal display), Parmley og Smith Gene 73:305-318 (1988) (fagdisplay), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell og McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992) og US-patent nr. 5.733.743. Hvis display-teknologier anvendes for å fremstille antistoffer som ikke er humane, kan slike antistoffer humaniseres som beskrevet ovenfor.

Ved å anvende disse teknikkene kan antistoffer genereres til CD3-uttrykkende celler, selve CD3, former av CD3, epitoper eller peptider derav og ekspresjonsbiblioteker dertil (se f.eks. US-patent nr. 5.703.057) som deretter kan screenes som beskrevet ovenfor for aktivitetene beskrevet ovenfor.

Design og generering av andre terapeutika

Basert på aktiviteten til antistoffene som blir produsert ogkarakteriserther med hensyn til CD3, blir utforming av andre terapeutiske modaliteter utover antistoffgrupper forenklet. Slike modaliteter omfatter, uten begrensning, avanserte antistoffterapeutika, slik som bispesifikke antistoffer, immuntoksiner og radioaktivt merkede terapeutika, generering av peptidterapeutika, genterapier, spesielt "intrabodies", antisense terapeutika og små molekyler.

I forbindelse med bispesifikke antistoffer kan for eksempel bispesifikke antistoffer genereres som omfatter (i) to antistoffer, ett med en spesifisitet for CD3 og et annet for et annet molekyl, som er konjugert sammen, (ii) et enkelt antistoff som har én kjede spesifikk for CD3 og en annen kjede spesifikk for et annet molekyl eller (iii) et enkeltkjedet antistoff som har spesifisitet for CD3 og det andre molekylet. Slike bispesifikke antistoffer kan genereres ved anvendelse av teknikker som er velkjente for eksempel i forbindelse med (i) og (ii), se f.eks. Fanger et al., Immunol Methods 4:72-81 (1994) og Wright og Harris, supra, og i forbindelse med (iii), se f.eks. Trauneckeretal., Int. J. Cancer (Supplement) 7:51-52 (1992). I hvert tilfelle kan den andre spesifisiteten være rettet mot tung kjede-aktiveringsreseptorene omfattende, uten begrensning, CD16 eller CD64 (se f.eks. Deo et al, 18:127 (1997)) eller CD89 (se f.eks. Valerius et al, Blood 90:4485-4492 (1997)). Bispesifikke antistoffer fremstilt i henhold til det førnevnte vil trolig drepe celler som uttrykker CD3, og spesielt de cellene hvor CD3-antistoffene ifølge oppfinnelsen er effektive.

I sammenheng med immuntoksiner kan antistoffer modifiseres til å fungere som immuntoksiner ved anvendelse av teknikker som er velkjente på området. Se f.eks. Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Se også US-patent nr. 5.194.594. I sammenheng med fremstilling av radioaktivt merkede antistoffer kan slike modifiserte antistoffer også lett fremstilles ved å anvende teknikker som er velkjente på området. Se f.eks. Junghans et al, i Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2. utgave, Chafnerog Longo, red, Lippincott Raven (1996)). Se også US-patent nr. 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827, 5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471 og 5.697.902. Hver av immuntoksiner og radioaktivt merkede molekyler vil trolig drepe celler som uttrykker CD3, og spesielt de cellene hvor antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er effektive.

I sammenheng med generering av terapeutiske peptider, ved utnyttelse av strukturell informasjon relatert til CD3 og antistoffer dertil, slik som antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse eller screening av peptidbiblioteker, kan terapeutiske peptider genereres som er rettet mot CD3. Design og screening av peptidterapeutika er beskrevet i forbindelse med Houghten et al, Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al, Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake og Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Immuntoksiner og radioaktivt merkede molekyler kan også fremstilles, og på en lignende måte, i forbindelse med peptidiske grupper som beskrevet ovenfor i forbindelse med antistoffer. Ved å anta at CD3-molekylet (eller en form, slik som en spleisvariant eller alternativ form) er funksjonelt aktiv i en sykdomsprosess, vil det også være mulig å utforme gen og antisense terapeutika dertil ved konvensjonelle teknikker. Slike modaliteter kan anvendes for modulering av funksjonen til CD3. I sammenheng med dette letter antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse utforming og anvendelse av funksjonelle analyser relatert dertil. En design og strategi for antisense terapeutika er beskrevet i detalj i internasjonal patentsøknad nr. WO 94/29444. Design og strategier for genterapi er velkjent. Imidlertid kan spesielt anvendelse av genterapeutiske teknikker som involverer "intrabodies" vise seg å være spesielt fordelaktig. Se f.eks. Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) og Marasco Gene Therapy 4:11-15

(1997). Generell design og betraktninger relatert til genterapeutika er også beskrevet i internasjonal patentsøknad nr. WO 97/38137.

Kunnskap samlet inn fra strukturen til CD3-molekylet og dets interaksjoner med andre molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som antistoffene ifølge oppfinnelsen og andre, kan anvendes rasjonelt for å utforme ytterligere terapeutiske modaliteter. I dette henseende kan rasjonelle medikament-designteknikker slik som røntgenkrystallografi, data-assistert molekylær modellering (CAMM), kvantitativ eller kvalitativ struktur-aktivitetsforhold (QSAR) og lignende teknologier anvendes for å fokusere medikamentoppdagelsesforsøk. Rasjonell design tillater prediksjon av protein eller syntetiske strukturer som kan interagere med molekylet eller spesifikke former derav som kan anvendes for å modifisere eller modulere aktiviteten til CD3. Slike strukturer kan syntetiseres kjemisk eller uttrykkes i biologiske systemer. Denne tilnærmingen er beskrevet i Capsey et al, Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Videre kan kombinatoriske biblioteker utformes og syntetiseres og anvendes i screeningsprogrammer, slik som høykapasitetsscreeningsforsøk.

Terapeutisk administrering og formuleringer

Det vil forstås at terapeutiske entiteter i henhold til oppfinnelsen vil administreres med egnede bærere, hjelpestoffer og andre midler som er inntatt i formuleringer for å gi bedret overføring, levering, toleranse og lignende. En rekke passende formuleringer kan finnes i formularet kjent for alle farmasøytiske kjemikere: Remington's Pharmaceutical Sciences (15. utg, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), spesielt kapittel 87 ved Blaug, Seymour, deri. Disse formuleringene omfatter for eksempel pulvere, pastaer, salver, geleer, voks, oljer, lipider, lipid (kationisk eller anionisk)-inneholdende vesikler (slik som Lipofectin™), DNA-konjugater, vannfrie absorpsjonspastaer, olje-i-vann og vann-i-olje emulsjoner, emulsjoner karbovoks (polyetylenglykoler av ulike molekylvekter), semisolide geler og semisolide blandinger inneholdende karbovoks. Hvilken som helst av de førnevnte blandingene kan være passende i behandlinger og terapier ifølge foreliggende oppfinnelse, gitt at den aktive bestanddelen i formuleringen ikke blir inaktivert ved formuleringen og formuleringen er fysiologisk kompatibel og tolerabel med administreringsveien. Se også Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1 -2):1 -60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sei. 89(8):967-78 Powell et al, "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sei Technol. 52:238-311 (1998) og henvisningene deri for videre informasjon relatert til formuleringer, hjelpestoffer og bærere velkjent for farmasøytiske kjemikere.

Terapeutiske formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse, som omfatter et huCD3-antistoff ifølge oppfinnelsen, blir anvendt for å behandle eller lindre et symptom assosiert med en immunrelatertforstyrrelse, slik som foreksempel en autoimmun sykdom eller en inflammatorisk forstyrrelse.

Autoimmune sykdommer omfatter for eksempel ervervet immunsviktsyndrom (AIDS, som er en viral sykdom med en autoimmun komponent), alopecia areata, ankyloserende spondylitt, antifosfolipidsyndrom, autoimmun Addisons sykdom, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun hepatitt, autoimmun sykdom i det indre øret (AlED), autoimmunt lymfoproliferativt syndrom (ALPS), autoimmun trombocytopenisk purpura (ATP), Behcets sykdom, kardiomyopati, cøliaki-cetrmaf/f/s herpetiformis; kronisk utmattelse- og immundysfunksjonssyndrom (CFIDS), kronisk inflammatorisk demyelinerende polynevropati (CIPD), cikatrisiell pemfigoid, kuldeagglutininsykdom, CREST-syndrom, Crohns sykdom, Degos sykdom, juvenil dermatomyositt, diskoid lupus, essensiell blandet kryoglobulinemi, fibromyalgi-fibromyositt, Graves sykdom, Guillain-Barré syndrom, Hashimotos tyroiditt, idiopatisk pulmonal fibrose, idiopatisk trombocytopenisk purpura (ITP), IgA nefropati, insulinavhengig diabetes mellitus, juvenil kronisk artritt (Stills sykdom), juvenil revmatoid artritt, Méniéres sykdom, blandet bindevevsykdom, multippel sklerose, myasthenia gravis, pernisiøs anemi, polyarteritis nodosa, polykondritt, polyglandulære syndromer, polymyalgia rheumatica, polymyositt og dermatomyositt, primær agammaglobulinemi, primær biliær cirrhose, psoriasis, psoriasisartritt, Raynauds fenomener, Reiters syndrom, revmatisk feber, revmatoid artritt, sarkoidose, skleroderm (progressiv systemisk sklerose (PSS), også kjent som systemisk sklerose (SS)), Sjogrens syndrom, "stiff-man" syndrom, systemisk lupus erythematosus, Takayasu arteritt, temporal arteritt/kjempecellearteritt, ulcerøs kolitt, uveitt, vitiligo og Wegeners granulomatose.

Inflammatoriske forstyrrelser omfatter for eksempel kroniske og akutte inflammatoriske forstyrrelser. Eksempler på inflammatoriske forstyrrelser omfatter Alzheimers sykdom, astma, atopisk allergi, allergi, aterosklerose, bronkial astma, eksem, glomerulonefritt, transplantat-mot-vert-reaksjon, hemolytiske anemier, osteoartritt, sepsis, slag, transplantasjon av vev og organer, vaskulitt, diabetisk retinopati og ventilatorindusert lungeskade.

Eventuelt blir huCD3-antistoffsammensetningene ifølge oppfinnelsen administrert sammen med et annet middel, slik som for eksempel GLP-1 eller en betacellehvilende forbindelse (dvs. en forbindelse som reduserer eller på annen måte hemmer insulinfrigjøring, slik som kaliumkanalåpnere). Eksempler på egnede GLP-1 forbindelser er beskrevet i f.eks. den publiserte søknaden US 20040037826 og egnede betacellehvilende forbindelser er beskrevet i publisert søknad US 20030235583.

Evenetuelt blir huCD3-antistoffsammensetningene anvendt for å behandle en immunrelatert forstyrrelse administrert i kombinasjon med hvilken som helst av mange kjente antiinflammatoriske og/eller immunsuppresive forbindelser. Egnede kjente forbindelser omfatter, men er ikke begrenset til, metotreksat, cyklosporin A (omfattende for eksempel cyklosporinmikroemulsjon), takrolimus, kortikosteroider, statiner, interferon beta, Remicade (Infliximab), Enbrel (Etanercept) og Humira (Adalimumab).

I behandlingen av revmatoid artritt kan for eksempel huCD3-antistoff-sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres sammen med kortikosteroider, metotreksat, cyklosporin A, statiner, Remicade (Infliximab), Enbrel (Etanercept) og/eller Humira (Adalimumab).

I behandlingen av uveitt kan huCD3-antistoffsammensetningene administreres sammen med f.eks. kortikosteroider, metotreksat, cyklosporin A, cyklofosfamid og/eller statiner. Likeledes kan pasienter som lider av en sykdom slik som Crohns sykdom eller psoriasis behandles med en kombinasjon av en huCD3-antistoffsammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse og Remicaid (Infliximab) og/eller Humira (Adalimumab).

Pasienter med multippel sklerose kan motta en kombinasjon av en huCD3-antistoffsammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med f.eks. glatirameracetat (Copaxone), interferonbeta-1a (Avonex), interferonbeta-1a (Rebif), interferonbeta-1 b (Betaseron eller Betaferon), mitoksantron (Novantrone), deksametason (Decadron), metylprednisolon (Depo-Medrol) og/eller prednison (Deltasone) og/eller statiner.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffer for anvendelse for å behandle eller lindre et symptom assosiert med en immunrelatert forstyrrelse eller et symptom assosiert med rejeksjon etter organtransplantasjon. For eksempel blir sammensetningene ifølge oppfinnelsen anvendt for å behandle eller lindre et symptom for hvilken som helst av de autoimmune sykdommene og inflammatoriske forstyrrelsene beskrevet her.

De terapeutiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse blir også anvendt som immunsuppressive midler i organ- eller vevstransplantasjon. Slik det er anvendt her, henviser "immunsuppressivt middel" til et middel hvis effekt på immunsystemet fører til umiddelbar eller forsinket reduksjon av aktiviteten til minst én signalvei involvert i en immunrespons, enten denne responsen er naturlig forekommende eller kunstig trigget, enten denne responsen finner sted som del av det medfødte immunsystemet, det adaptive immunsystemet eller begge deler. Disse immunsuppresive huCD3-antistoffsammensetningene blir administrert til et individ før, under og/eller etter organ- eller vevstransplantasjon. For eksempel blir et huCD3-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse anvendt for å behandle eller forebygge rejeksjon etter organ- eller vevstransplantasjon.

Eventuelt kan de immunsuppresive huCD3-antistoffsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres sammen med et annet middel, slik som for eksempel GLP-1 eller en betacellehvilende forbindelse, som beskrevet ovenfor.

Alternativt kan disse immunsuppresive huCD3-antistoffsammensetningene administreres i kombinasjon med hvilken som helst av mange kjente antiinflammatoriske og/eller immunsuppresive forbindelser. Egnede antiinflammatoriske og/eller immunsuppresive forbindelser for anvendelse med huCD3-antistoffene ifølge oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, metotreksat, cyklosporin A (omfattende for eksempel cyklosporinmikroemulsjon), takrolimus, kortikosteroider og statiner.

Et huCD3-antistoff kan også administreres til et menneske ved deteksjon av nærvær av autoreaktive antistoffer hos mennesket. Slike autoreaktive antistoffer er kjent på området som antistoffer med bindingsaffinitet for ett eller flere proteiner uttrykt endogent hos mennesket. I ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse blir mennesket testet for tilstedeværelse av autoreaktive antistoffer involvert spesifikt i én eller flere autoimmune sykdommer som er velkjente på området. I én spesifikk utførelsesform blir en menneskepasient testet for nærvær av antistoffer mot insulin, glutaminsyredekarboksylase og/eller IA-2 proteinet og deretter administrert med et huCD3-antistoff ved positiv deteksjon av ett eller flere slike autoreaktive antistoffer.

Det er også beskrevet administrering av et huCD3-antistoff til mennesker for å forebygge, redusere eller svekke rekrutteringen av immunceller inn i humane vev. Et huCD3-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse blir administrert til et individ som har behov derav for å forebygge og behandle tilstander assosiert med unormal eller deregulert immuncellerekruttering til vevsområder med human sykdom.

Det er også beskrevet administrering av et huCD3-antistoff til mennesker for å forebygge, redusere eller svekke ekstravasasjon og diapedese av immunceller inn i humane vev. Således blir huCD3-antistoffene ifølge oppfinnelsen administrert for å forebygge og/eller behandle tilstander assosiert med unormal eller deregulert immuncelleinfiltrering i vevsområder med human sykdom.

Det er også beskrevet administrering av et huCD3-antistoff til mennesker for å forebygge, redusere eller svekke effektene mediert ved frigjøring av cytokiner i menneskekroppen. Betegnelsen "cytokin" henviser til alle humane cytokiner kjent på området som binder ekstracellulære reseptorer på celleoverflaten og dermed modulerer cellefunksjon, omfattende, men ikke begrenset til, IL-2, IFN-g, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10og IL-13.

Frigjøring av cytokiner kan føre til en toksisk tilstand kjent som cytokinfrigjøringssyndromet (CRS), en vanlig klinisk komplikasjon som forekommer f.eks. ved anvendelse av et anti-T-celleantistoff slik som ATG (anti-thymocyttglobulin) og OKT3 (et murint anti-humant CD3-antistoff). Dette syndromet erkarakterisert vedoverdreven frigjøring av cytokiner slik som TN F, IFN-gamma og IL-2 over i sirkulasjonen. CRS forekommer som et resultat av den samtidige bindingen av antistoffene til CD3 (via den variable regionen til antistoffet) og Fc-reseptorene og/eller komplementreseptorer (via den konstante regionen til antistoffet) på andre celler, hvilket dermed aktiverer T-cellene til å frigjøre cytokiner som produserer en systemisk inflammatorisk responskarakterisert vedhypotensjon, pyreksi og rigor. Symptomer på CRS omfatter feber, kuldegysninger, kvalme, oppkast, hypotensjon og dyspné. Derfor inneholder et huCD3-antistoff ifølge oppfinnelsen én eller flere mutasjoner utformet til å forebygge unormal frigjøring og produksjon av ett eller flere cytokin(er) in vivo.

Det er også beskrevet administrering av et huCD3-antistoff til mennesker for å forebygge, redusere eller svekke effektene mediert ved frigjøring av cytokinreseptorer i menneskekroppen. Betegnelsen "cytokinreseptor" henviser til alle humane cytokinreseptorer på fagområdet som binder ett eller flere cytokin(er), som definert her, omfattende, men ikke begrenset til, reseptorer til de førnevnte cytokinene. Derfor blir et huCD3-antistoff ifølge oppfinnelsen administrert for å behandle og/eller forebygge tilstander mediert gjennom unormal aktivering, binding eller ligering av én eller flere cytokinreseptor(er) i menneskekroppen. Det er videre omfattet at administrering av huCD3-antistoffet in vivo vil fjerne den intracellulære signaleringen mediert av cytokinreseptor(er) i slikt menneske.

Det er også beskrevet administrering av et huCD3-antistoff til et menneske ved reduksjon av pankreatisk betacellefunksjon deri. Individet kan bli testet for betacellefunksjon, insulinsekresjon eller nivåer av c-peptid som er kjent på området. Deretter, ved varsel om tilstrekkelig reduksjon av en av indikatorene, får mennesket administrert et tilstrekkelig doseringsregime av et huCD3-antistoff for å hindre videre progresjon av autoimmun ødeleggelse av betacellefunksjon deri.

Diagnostiske og profylaktiske formuleringer

Fullstendige humane anti-CD3 MAb'er ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i diagnostiske og profylaktiske formuleringer. Et huCD3 MAb ifølge foreliggende oppfinnelse kan for eksempel administreres til pasienter som har risiko for å utvikle én av de førnevnte autoimmune sykdommene. En pasients predisposisjon for én eller flere av de førnevnte autoimmune sykdommene kan bestemmes ved anvendelse av genotypiske, serologiske eller biokjemiske markører. For eksempel er nærvær av spesielle HLA-undertyper og serologiske autoantistoffer (mot insulin, GAD65 og IA-2) indikativt for type l-diabetes.

Alternativt kan et huCD3-antistoff administreres til mennesker diagnostisert med én eller flere av de førnevnte autoimmune sykdommene. Ved diagnose blir et huCD3-antistoff administrert for å dempe eller reversere effektene av autoimmunitet. I ett slikt eksempel får et menneske diagnostisert med type I-diabetes administrert tilstrekkelig dose av et huCD3-antistoff for å gjenopprette pankreatisk funksjon og begrense skade av autoimmun infiltrering i pankreas. Alternativt får et menneske diagnostisert med revmatoid artritt administrert et huCD3-antistoff for å redusere immuncelleinfiltrering i og ødeleggelse av beinledd.

Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendelige i deteksjon av CD3 i pasientprøver og er følgelig anvendelige som diagnostika. For eksempel blir huCD3-antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendt i in wfro-analyser, f.eks. ELISA, for å detektere CD3-nivåer i en pasientprøve.

Et huCD3-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan immobiliseres på en fast fase (f.eks. brønnen(e) i en mikrotiterplate). Det immobiliserte antistoffet tjener som et oppfangingsantistoff for hvilket som helst CD3 som kan foreligge i en testprøve. Før det immobiliserte antistoffet kommer i kontakt med en pasientprøve, blir den faste fasen skylt og behandlet med et blokkerende middel slik som melkeprotein eller albumin for å hindre uspesifikk adsorpsjon av analytten.

Deretter ble brønnene behandlet med en testprøve mistenkt for å inneholde antigenet eller med en løsning inneholdende en standard mengde av antigenet. En slik prøve kan f.eks. være en serumprøve fra et individ mistenkt for å ha nivåer av sirkulerende antigen betraktet å være diagnostisk for en patologi. Etter å ha vasket bort testprøven eller standarden, blir den faste fasen behandlet med et sekundært antistoff som er merket detekterbart. Det merkede sekundære antistoffet tjener som et detekterende antistoff. Nivået av detekterbar markør blir målt, og konsentrasjonen av CD3-antigen i testprøven blir bestemt ved sammenligning med en standardkurve utviklet fra standardprøvene.

Basert på resultatene fremskaffet ved anvendelse av huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse i en diagnostisk in wfro-analyse, vil det forstås at det er mulig å bestemme stadiet til en sykdom (f.eks. en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse) i et individ basert på ekspresjonsnivåer av CD3-antigenet. For en gitt sykdom blir blodprøver tatt fra individer diagnostisert til å være på ulike stadier i progresjon av sykdommen og/eller på ulike punkter i den terapeutiske behandlingen av sykdommen. Ved å anvende en populasjon av prøver som gir statistisk signifikante resultater for hvert stadium av progresjon eller terapi, blir et konsentrasjonsområde av antigenet som kan betraktes karakteristisk for hvert stadium bestemt.

EKSEMPLER

Følgende eksempler, omfattende eksperimentene utført og resultatene oppnådd blir bare fremskaffet for illustrative formål og skal ikke tolkes som begrensende for foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1: Generering av huCD3-antistoffer

Immuniseringsstrategier: For å generere et fullstendig humant huCD3-antistoff, ble to transgene muselinjer anvendt, HuMab® mus og KM™ mus (Medarex, Princeton NJ). Innledende immuniseringsstrategier fulgte veldokumenterte protokoller fra litteraturen for generering av museantistoffer (se f.eks. Kung P. et al. Science; 206(4416): 347-9 (1979); Kung PC, et al, Transplant Proe. (3 Suppl 1):141-6

(1980); Kung PC, et al, Int J Immunopharmacol. 3(3): 175-81 Standardprotokollene kjent på området klarte ikke å produsere fullstendig humane anti-CD3 antistoffer i HuMAb® eller KM™ mus. For eksempel var følgende immuniseringsstrategier feilslått og produserte ikke funksjonelle antistoffer i verken HuMAb® eller KM™ mus:

- immunisering med bare thymocytter eller bare T-celler

- immunisering med bare rekombinant humant CD3-materiale

- immunisering med rekombinant CD3-materiale i Freunds adjuvans

- immunisering med celle i Freunds adjuvans

- immunisering med thymocytter eller T-celler administrert sammen med løselig CD3 - immunisering med thymocytter eller T-celler administrert sammen med rekombinant CD3-uttrykkende celler

Når disse tidligere kjente immuniseringsstrategiene på området blir anvendt i en BALB/c mus i stedet for en HuMAb® eller KM™ mus, produserer disse strategiene et murint anti-CD3 antistoff i stedet for et humant anti-CD3 antistoff.

Følgelig ble nye immuniseringsstrategier utviklet ved å variere følgende parametre:

- typer immunogener anvendt

- injeksjonsfrekvens

- typer adjuvantia anvendt

- typer av samstimuleringsteknikker anvendt

- immuniseringsveier anvendt

- typer av sekundært lymfoid vev anvendt for fusjon

En serie med nye immuniseringsstrategier ble utviklet, omfattende for eksempel (i) immunisering med en viral partikkel som uttrykker bare CD3 og (ii) immunisering med samstimulatoriske signaler (f.eks. CD40, CD27 eller kombinasjoner derav) administrert sammen med T-celler, thymocytter eller med celler som er transfektert til å uttrykke rekombinant CD3.

I en første ny immuniseringsstrategi, henvist til her som "hyper-boost" protokollen, ble en HuMAb® mus (Medarex, Inc, Princeton, NJ) eller en KM™ mus (Medarex, Inc, Kirin) immunisert ved å først injisere humane celler, f.eks. thymocytter eller T-celler. På tidspunkter fra 1 til 8 uker etter injeksjon av thymocyttene og/eller T-cellene mottok musene en eller flere påfølgende hyper-boost injeksjoner. Hyper-boost injeksjonen omfattet for eksempel løselig CD3-protein (f.eks. rekombinant løselig CD3-protein), ytterligere injeksjoner av thymocytter eller T-celler, CD3-transfekterte celler, virale partikler som uttrykker høye nivåer av CD3 og kombinasjoner derav. For eksempel inneholdt hyper-boost injeksjonen en kombinasjon av løselig CD3-protein og CD3-transfekterte celler.

I hyper-boost immuniseringsprotokollene mottok de immuniserte musene fortrinnsvis to siste hyper-boost injeksjoner på -6 og -3 dager før fusjon av lymfeknutene og/eller milten. I KM™ musen blir for eksempel det fusjonerte vevet avledet fra milten, og i HuMAb® musen blir det fusjonerte vevet avledet fra lymfeknuter og/eller miltvev.

I ett eksempel på hyper-boost immuniseringsprotokollen ble én HuMAb™ mus immunisert tre ganger med humane thymocytter (~10<6>celler) på dag 0, 7 og 28. Den kinesiske eggstokkcellelinjen (CHO) transfektert med cDNA som koder for humane CD3 5- og e-kjeder (CHO/CD3,~10<6>celler) ble deretter injisert på dag 47 og 65. En annen boost med en viral partikkel som uttrykker høye nivåer av CD38e på overflaten ble gitt på dag 79. Til slutt ble musen injisert med løselig rekombinant human CD35e på dag 121 og 124 førfusjon av lymfeknutene på dag 127.

Alle immuniseringer ble gitt subkutant med Ribi (Corixa Corp, Seattle WA) som et adjuvans. Totalt 8,5 x 10<6>celler ble fusjonert. Kun sju av 470 screenede hybridomer produserte et fullstendig humant anti-CD3 antistoff, og alle de fullstendig humane anti-CD3 antistoffene var IgM-molekyler. To av disse anti-CD3 antistoffene ble selektert som en terapeutisk klinisk kandidat (Figur 1-3).

I et annet eksempel på hyper-boost immuniseringsprotokoll ble én KM™ mus immunisert to ganger med løselig rekombinant human CD35e på dag 0 og 25. Humane thymocytter (~10<6>celler) ble deretter anvendt for boosting på dag 40, 49 og 56. Løselig rekombinant CD35e ble injisert to ganger på dag 70, 77, 84 og 91. Den murine T-cellelinjen transfektert med cDNA som koder for humane CD3 8- og8-kjeder (EL4/CD3,~10<6>celler) ble deretter injisert på dag 98. Til slutt ble musen injisert med løselig rekombinant human CD38e på dag 101 førfusjon av milten på dag 104. Immuniseringer ble administrert intraperitonealt med Alun som et adjuvans, unntatt på dag 70 der Ribi-adjuvans ble anvendt. CpG ble anvendt som et samstimulatorisk middel på dag 0, 25, 84 og 91. Totalt ble 1,27 x 10<8>celler fusjonert. Kun fem av 743 screenede hybridomer produserte et fullstendig humant anti-CD3 antistoff, og alle antistoffer produsert var IgG-molekyler. Ett av de fullstendig humane anti-CD3 antistoffene ble selektert som en terapeutisk klinisk kandidat (Figur 4).

Seleksjonskriterier: Terapeutisk kliniske kandidater ble selektert ved anvendelse av følgende kriterier. Først ble antistoff binding til CD3-positive celler versus CD3-negative celler analysert. For dette ble Jurkat CD3-positive celler (J+) og Jurkat negative celler (J-) inkubert med de ulike antistoffene og binding ble vurdert ved væskestrømcytometri (Figur 9A). Videre ble en konkurranseanalyse hvor evnen kandidatantistoffet har til å hemme binding av murint anti-humant OKT3 monoklonalt antistoff til CD3-positive celler vurdert ved anvendelse av J+ celler, og konkurranse ble vurdert ved væskestrømcytometri (Figur 9B). Deretter ble antigen modulering av CD3 og TCR fra overflaten av humane T-celler fra perifert blod vurdert ved væskestrømcytometri (Figur 9C). Til slutt ble en T-celleproliferasjonsanalyse utført ved anvendelse av humane T-celler fra perifert blod farget med CFSE og celledeling ble vurdert ved væskestrømcytometri (Figur 9D).

Eksempel 2: Isotypeswitching av humane anti-CD3 antistoffer

Noen huCD3-antistoffer produsert ved anvendelse av de nye protokollene beskrevet i Eksempel 1 var IgM-antistoffer. Disse IgM-antistoffene ble "konvertert" til et IgG-antistoff, fortrinnsvis til et lgG1-antistoff. Foreksempel ble IgM-antistoffene konvertert ved en kloningsprosedyre hvor VDJ-regionen til genet som koder for IgM-antistoffet ble klonet inn i et IgG tung kjede-gen fremskaffet fra en vektor som inneholder et gen som koder for allotype F gammal For konvertering av den lette kjeden ble IgM-sekvensen klonet inn i en vektor inneholdende kapparegionen. I Medarex-mus, f.eks. HuMAb® mus, blir multiple lette kjeder produsert pga. en mangel på allelisk eksklusjon.

Hver kombinasjon av tunge og lette kjeder ble transfektert inn i 293T-celler ved anvendelse av FuGENE 6 (Roche Diagnostics) transfeksjonsmiddel i henhold til produsentens retningslinjer. De utskilte monoklonale antistoffene ble testet for optimalisert funksjonalitet, f.eks. målantigenbinding, ved anvendelse av seleksjonskriteriene beskrevet i Eksempel 1.

EKSEMPEL 3: Antigen modulering ved anvendelse av huCD3-antistoffene

huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er kapable for antigen modulering, som er definert som redistribusjon og eliminering av CD3-TCR komplekset indusert ved antistoffbinding. Celleoverflateekspresjon av andre molekyler på T-celler, omfattende for eksempel CD4, blir ikke endret ved eksponering for et anti-CD3 antistoff ifølge oppfinnelsen (Figur 9C).

EKSEMPEL 4: Redusering av det toksiske cytokinfrigjøringssyndromet generert ved huCD3-antistoffer

Fortrinnsvis omfatter huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse en mutasjon i Fc-regionen, slik at mutasjonen forandrer cytokinfrigjøringssyndrom. Som beskrevet ovenfor er cytokinfrigjøringssyndromet (CRS) en vanlig umiddelbar komplikasjon som forekommer ved anvendelse av et anti-T-celleantistoff slik som ATG (anti-thymocyttglobulin) og OKT3 (et murint anti-CD3 antistoff). Dette syndromet erkarakterisert vedoverdreven frigjøring av cytokiner slik som TN F, IFN-gamma og IL-2 over i sirkulasjonen. Cytokinene frigjort av de aktiverte T-cellene produserer en type systemisk inflammatorisk respons lignende den funnet i alvorlig infeksjonkarakterisert vedhypotensjon, pyreksi og rigor. Symptomer på CRS omfatter for eksempel feber, kuldegysninger, kvalme, oppkast, hypotensjon og dyspné.

huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder én eller flere mutasjoner som hindrer tung kjede konstant region-mediert frigjøring av ett eller flere cytokin(er) in vivo. I én utførelsesform er huCD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse IgG-molekyler som har én eller flere av følgende mutasjoner i en modifisert IgG y1 ryggrad: "y1 N297A", hvor asparaginresten i posisjon 297 er byttet ut med en alaninrest; "y1 L234/A, L235/A", hvor leucinrestene i posisjoner 234 og 235 er byttet ut med alaninrester; "y1 L234/A; L235/E", hvor leucinresten i posisjon 234 er byttet ut med en alaninrest, mens leucinresten i posisjon 235 er byttet ut med en glutaminsyrerest; "y1 L235/E" hvor leucinresten i posisjon 235 er byttet ut med en glutaminsyrerest og "y1 D265/A" hvor asparaginsyreresten i posisjon 265 er byttet ut med en alaninrest. Nummerering av restene til tung kjede beskrevet her er som ifølge EU-indeksen (se Kabat et al, "Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health & Human Services (1983)), som vist f.eks. i US-patent nr. 5.624.821 og 5.648.260.

Andre IgG y1-ryggradmodifikasjonersom kan anvendes i huCD3-antistoffene ifølge oppfinnelsen omfatter for eksempel "A330/S" hvor alaninresten i posisjon 330 er byttet ut med en serinrest og/eller "P331/S" hvor prolinresten i posisjon 331 er byttet ut med en serinrest.

De fullstendig humane CD3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse som har en L<2>34L2<35>^-A23<4>E235 mutasjon i Fc-regionen har en unik funksjon - eliminering av cytokinfrigjøring i nærvær av huCD3-antistoffet. Tidligere studier har faktisk demotivert anvendelse av en L E mutasjon (se f.eks. Xu et al. Cellular Immunology, 200, s. 16-26 (2000), på s. 23). Imidlertid eliminerte disse to spesielle mutasjonene i posisjon 234 og 235 (dvs. L234L235->A234E235) cytokinfrigjøringssyndromet, som vurdert i in wfro-analysesystem med humane mononukleære celler fra perifert blod (Figur 11 A, 11B). I denne analysen ble humane mononukleære celler fra perifert blod isolert ved anvendelse av en ficoll-gradient, merket med CFSE og de CFSE-merkede cellene ble deretter overført til 96-brønners plater. De ulike monoklonale antistoffene ble tilsatt ved ulike fortynninger og inkubert i 72 timer ved 37 °C. Etter 6 timer ble 50 ul supernatant fjernet for å evaluere TNF-frigjøring med ELISA. Etter 48 timer ble 50 ul supernatant fjernet for å evaluere IFN-y frigjøring med ELISA. Etter 72 timer ble cellene høstet og proliferasjon ble vurdert med FACS ved anvendelse av CFSE-merkingsintensitet.

Derfor, i motsetning til villtype tunge kjeder og i motsetning til en serie med andre mutasjoner som er beskrevet av andre (f.eks. TolerX

(aglykosyleringsmutasjon), Bluestone (L234L235-»a234A235 mutasjon) (se f.eks. US pat. nr. 5.885.573)), som alle beholder et signifikant nivå av cytokinfrigjøringseffekt, oppviser ikkeL234L235-^A234E235 mutasjonene av huCD3-antistoffene ifølge oppfinnelsen cytokinfrigjøringsfenomen. Nivået av gjenværende cytokinfrigjøringseffekt var 100 % for villtype Fc, ca. 50 til 60 % for Bluestone (L<2>34L235->A234A23<5>) mutasjon og ikke-detekterbarfor Ala/Glu Fc-mutasjoner beskrevet her (Figur 11 A, 11B).

EKSEMPEL 5: Peptidmatriseidentifisering av den huCD3-antistoffbindende epitopen

Syntese og ELISA-screening av stort antall peptider er anvendt for å bestemme aminosyrerestene involvert i epitopen for ulike monoklonale antistoffer (se f.eks. Geysen et al, J Immunol Methods, vol. 102(2):259-74 (1987)). I eksperimentene beskrevet her ble matriser med overlappende peptider avledet fra aminosyresekvensen til CD3-epsilonkjeden kjøpt fra Jerini (Berlin, Tyskland) og deretter testet for et bindingsmønster med de fullstendig humane anti-CD3 mAb'ene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Peptidene i matrisene ble dannet ved anvendelse av SPOT-synteseteknikken for direkte kjemisk syntese på membranunderlag (se Frank og Overwin, Meth Mol Biol, vol. 66:149-169 (1996); Kramer og Schneider-Mergener, Meth Mol Biol, vol. 87:25-39 (1998)). De lineære 14-mer peptidene ble bundet kovalent til et Whatman 50-celluloseunderlag med C-terminalen, hvilket lar N-terminalen være fri (dvs. ubundet). Ved anvendelse av standard western blott-teknikker avslørte disse fast fase-bundne peptidene at 28F11 monoklonalt antistoff gjenkjente et overlappende sett av aminosyrer i nærheten av N-terminalen (Fig. 10).

ANDRE UTFØRELSESFORMER

Selv om oppfinnelsen er beskrevet i forbindelse med den detaljerte beskrivelsen derav, er foregående beskrivelse ment å illustrere og ikke begrense omfanget av oppfinnelsen, som er definert ved omfanget av de vedlagte kravene. Andre aspekter, fordeler og modifikasjoner er innenfor omfanget av følgende krav.

Claims (21)

1. Isolert fullstendig humant monoklonalt CD3-antistoff eller fragment derav,karakterisert vedat det omfatter en tung kjede aminosyresekvens som omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) hvor de tre tung kjede CDR'ene og lett kjede CDR'ene er valgt fra: a. en variabel tung kjede CDR1 (VH CDR1) som omfatter aminosyresekvensen GYGMH (SEKV ID NR:27), en variabel tung kjede CDR2 (VH CDR2) som omfatter aminosyresekvensen VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEKV ID NR:28), en variabel tung kjede CDR3 (VH CDR3) som omfatter aminosyresekvensen QMGYWHFDL (SEKV ID NR:29), en variabel lett kjede CDR1 (VL CDR1) som omfatter aminosyresekvensen RASQSVSSYLA (SEKV ID NR:30), en variabel lett kjede CDR2 (VL CDR2) som omfatter aminosyresekvensen DASNRAT (SEKV ID NR:31), og en variabel lett kjede CDR3 (VL CDR3) som omfatter aminosyresekvensen QQRSNWPPLT (SEKV ID NR:32); b. en VH CDR1 som omfatter aminosyresekvensen SYGMH (SEKV ID NR:33), en VH CDR2 som omfatter aminosyresekvensen IIWYDGSKKNYADSVKG (SEKV ID NR:34), en VH CDR3 som omfatter aminosyresekvensen GTGYNWFDP (SEKV ID NR:35), en VL CDR1 som omfatter aminosyresekvensen RASQSVSSSYLA (SEKV ID NR:36), RASQGISSALA (SEKV ID NR:39) eller WASQGISSYLA (SEKV ID NR:43), en VL CDR2 som omfatter aminosyresekvensen GASSRAT (SEKV ID NR:37), YASSLQS (SEKV ID NR:40) eller DASSLGS (SEKV ID NR:42), og en VL CDR3 som omfatter aminosyresekvensen QQYGSSPIT (SEKV ID NR:38) eller QQYYSTLT (SEKV ID NR:41); og c. en VH CDR1 som omfatter aminosyresekvensen SYGMH (SEKV ID NR:33), en VH CDR2 som omfatter aminosyresekvensen AIWYNGRKQDYADSVKG (SEKV ID NR:44) og en VH CDR3 som omfatter aminosyresekvensen GTGYNWFDP (SEKV ID NR:35); en VL CDR1 som omfatter aminosyresekvensen RASQSVSSYLA (SEKV ID NR:30) eller RASQGISSALA (SEKV ID NR:39), en VL CDR2 som omfatter aminosyresekvensen DASNRAT (SEKV ID NR:31) eller DASSLES (SEKV ID NR:46), og en VL CDR3 som omfatter aminosyresekvensen QQRSNWPWT (SEKV ID NR:45) eller QQFNSYPIT (SEKV ID NR:47); hvor nevnte antistoff inneholder minst en første mutasjon i den tunge kjeden i posisjon 234 og en andre mutasjon i posisjon 235, og hvor nevnte første mutasjon resulterer i en alaninrest i posisjon 234 og nevnte andre mutasjon resulterer i en glutaminsyrerest i posisjon 235.

2. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som hemmer binding av det murine anti-humane OKT3 monoklonale antistoffet til en T-lymfocytt.

3. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som binder en epitop som helt eller delvis omfatter aminosyresekvensen EMGGITQTPYKVSISGT (SEKV ID NR:67).

4. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som omfatter en VH CDR1 omfattende aminosyresekvensen GYGMH (SEKV ID NR:27); en VH CDR2 omfattende aminosyresekvensen VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEKV ID NR:28); en VH CDR3 omfattende aminosyresekvensen QMGYWHFDL (SEKV ID NR:29); en VL CDR1 omfattende aminosyresekvensen RASQSVSSYLA (SEKV ID NR:30); en VL CDR2 omfattende aminosyresekvensen DASNRAT (SEKV ID NR:31); og en VL CDR3 omfattende aminosyresekvensen QQRSNWPPLT (SEKV ID NR:32); og hvor antistoffet videre omfatter en variabel tung kjede omfattende aminosyresekvensen (SEKV ID NR:2) og en variable lett kjede omfattende aminosyresekvensen (SEKV ID NR:4).

5. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som omfatter en tung kjede med tre CDR'er som omfatter en VH CDR1 omfattende aminosyresekvensen GYGMH (SEKV ID NR:27); en VH CDR2 omfattende aminosyresekvensen VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEKV ID NR:28); en VH CDR3 omfattende aminosyresekvensen QMGYWHFDL (SEKV ID NR:29); og en lett kjede med tre CDR'er som omfatter en VL CDR1 omfattende aminosyresekvensen RASQSVSSYLA (SEKV ID NR:30), og en VL CDR2 omfattende aminosyresekvensen DASNRAT (SEKV ID NR:31), og en VL CDR3 omfattende aminosyresekvensen QQRSNWPPLT (SEKV ID NR:32), og hvor antistoffet videre omfatteren variabel tung kjede omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:6 og en variable lett kjede omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:8.

6. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som har en tung kjede med tre CDR'ersom omfatteren VH CDR1 omfattende aminosyresekvensen SYGMH (SEKV ID NR:33), en VH CDR2 som omfatter aminosyresekvensen IIWYDGSKKNYADSVKG (SEKV ID NR:34), en VH CDR3 som omfatter aminosyresekvensen GTGYNWFDP (SEKV ID NR:35), og en lett kjede med tre CDR'er som omfatter en VL CDR1 omfattende aminosyresekvensen RASQSVSSSYLA (SEKV ID NR:36), RASQGISSALA (SEKV ID NR:39) eller WASQGISSYLA (SEKV ID NR:43), en VL CDR2 som omfatter aminosyresekvensen GASSRAT (SEKV ID NR:37), YASSLQS (SEKV ID NR:40) eller DASSLGS (SEKV ID NR:42), og en VL CDR3 som omfatter aminosyresekvensen QQYGSSPIT (SEKV ID NR:38) eller QQYYSTLT (SEKV ID NR:41); og hvor antistoffet videre omfatter en variabel tung kjede omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:10 og en variable lett kjede omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:16, 17, 18, 19 eller 20.

7. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som har en tung kjede med tre CDR'ersom omfatteren VH CDR1 omfattende aminosyresekvensen SYGMH (SEKV ID NR:33), en VH CDR2 som omfatter aminosyresekvensen AIWYNGRKQDYADSVKG (SEKV ID NR:44), en VH CDR3 som omfatter aminosyresekvensen GTGYNWFDP (SEKV ID NR:35), og en lett kjede med tre CDR'er som omfatter en VL CDR1 omfattende aminosyresekvensen RASQSVSSYLA (SEKV ID NR:30) eller RASQGISSALA (SEKV ID NR:39), en VL CDR2 som omfatter aminosyresekvensen DASNRAT (SEKV ID NR:31) eller DASSLES (SEKV ID NR:46), og en VL CDR3 som omfatter aminosyresekvensen QQRSNWPWT (SEKV ID NR:45) eller QQFNSYPIT (SEKV ID NR:47); og hvor antistoffet videre omfatter en tung kjede variabel region omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:22 og en lett kjede variable region omfattende aminosyresekvensen SEKV ID NR:25 eller 26.

8. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som omfatter en rammeverk 2-region (FWR2) omfattende aminosyresekvensen WVRQAPGKGLEWV (SEKV ID NR:73).

9. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som omfatter en rammeverk 3-region (FRW3) omfattende aminosyresekvensen RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV ID NR:74).

10. Antistoff ifølge krav 1 eller fragment derav, som omfatter en variabel region lokalisert C-terminalt i forhold til CDR3-regionen, der nevnte variabel region omfatter aminosyresekvensen VTVSS (SEKV ID NR:64) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-regionen.

11. Antistoff ifølge krav 10 eller et fragment derav, som omfatter en variabel region lokalisert C-terminalt i forhold til CDR3-regionen, der nevnte variabel region omfatter aminosyresekvensen GTLVTVSS (SEKV ID NR:65) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-regionen.

12. Antistoff ifølge krav 10 eller et fragment derav, som omfatter en variabel region lokalisert C-terminalt i forhold til CDR3-regionen, der nevnte variabel region omfatter aminosyresekvensen WGRGTLVTVSS (SEKV ID NR:66) i en posisjon som ligger C-terminalt i forhold til CDR3-regionen.

13. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat det omfatter et antistoff eller fragment derav ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 12.

14. Antistoff eller fragment derav ifølge hvilket som helst av de foregående krav for anvendelse som et medikament.

15. Anvendelse av et antistoff eller fragment derav ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12 for fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av et symptom assosiert med en immunrelatert lidelse, eller et symptom relatert til rejeksjon assosiert med organtransplantasjon.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor individet videre får administrert et andre middel.

17. Anvendelse ifølge krav 15, hvor den immunrelaterte lidelsen er valgt fra en autoimmun sykdom, en inflammatorisk lidelse.

18. Isolert nukleinsyremolekyl,karakterisert vedat det koder for et antistoff eller fragment derav ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12.

19. Vektor,karakterisert veda t den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 18.

20. Vertscelle,karakterisert vedat den omfatter vektoren ifølge krav 19.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffet eller fragmentet derav ifølge hvilke som helst av kravene 1 til 12,karakterisert vedat den omfatter trinnene med dyrking av vertscellen ifølge krav 20 under betingelser som er egnet for fremstilling av antistoffet.