KR20220020810A - Cd22와 cd3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체 - Google Patents

Cd22와 cd3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체 Download PDF

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Abstract

CD22와 CD3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체
요약서
CD22와 CD3에 결합하는 다중특이적, 인간 중쇄 항체 (가령, UniAbsTM), 이러한 항체를 만드는 방법, 이러한 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 비롯하여, CD22의 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 이를 사용하는 용도들이 본원에 기술된다.

Description

CD22와 CD3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 6월 14일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 번호 62/861,708에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원의 내용은 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 CD22와 CD3에 결합하는 다중특이적, 인간 중쇄 항체 (가령, UniAbsTM)에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 항체를 만드는 방법, 이러한 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 비롯한 조성물, 그리고 CD22의 발현을 특징으로 하는 장애 치료에 이를 이용하는 것에 추가 관계한다.
발명의 배경
CD22
CD22 [또한 SIGLEC-2 (UniProt P20273)로도 공지됨]는 성숙 B-세포 상에서 발현되는 세포-표면 수용체다. CD22는 다중 Ig 도메인을 함유하고, 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이다. CD22의 세포외 도메인은 CD45 세포 표면 단백질 상에 존재하는 것들을 비롯한, 시알산 모이어티와 상호작용한다. CD22는 B-세포 수용체 신호전달을 위한 저해성 수용체로 기능하는 것으로 간주된다. CD20 및 CD19와 함께, CD22의 제한적인 B-세포 발현으로 B-세포 악성종양의 치료요법적 처치를 위한 매력적인 표적이 된다. CD22에 특이적인 단일클론성 항체들은 문헌에 기술되어 있고 (가령, Jabbour, Elias, et al. "Monoclonal antibodies in acute lymphoblastic leukemia." Blood 125.26 (2015): 4010-4016), 표준 단일클론성 (가령, 에프라투주맙), 뿐만 아니라 항체-약물 콘쥬게이트 (이노투주맙 오조가미친)로 치료요법적으로 이용되었다. 또한, 항-CD22 키메라 항원 수용체 T-세포는 진료소에서 백혈병 치료에 이용되었다 (Fry, Terry J., et al. "CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy." Nature medicine (2017)).
중쇄 항체
통상적인 IgG 항체에서, 중쇄와 경쇄의 연합은 일부분적으로 경쇄 불변 영역과 중쇄의 CH1 불변 도메인 간의 소수성 상호작용에 의한 것이다. 중쇄 틀구조 2 (FR2)와 틀구조 4 (FR4) 영역에 추가적인 잔기들이 있는데, 이들은 중쇄와 경쇄 간의 이러한 소수성 작용작용에 또한 기여한다.
그러나, 낙타과의 혈청 (낙타, 단봉 낙타 및 라마를 포함하는 아목 Tylopoda)은 한 쌍의 H-사슬로만 구성된 주요 유형의 항체 (오로지 중쇄-항체 또는 UniAbsTM)를 함유한다. 카멜리데(Camelidae) (카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius), 카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus), 라마 글라마(Lama glama), 라마 구아나코(Lama guanaco), 라마 알파카(Lama alpaca) 그리고 라마 비쿠구나(Lama vicugna))의 UniAbsTM은 단일 가변 도메인 (VHH), 힌지 영역 그리고 두 개의 불변 도메인 (CH2와 CH3) - 고전적 항체의 CH2 도메인과 CH3 도메인에 매우 상동성을 갖는다-으로 구성된 독특한 구조를 가진다. 이들 UniAbsTM은 불변 영역 (CH1)의 제 1 도메인이 결여되어 있는데, 이것은 게놈에는 존재하지만, mRNA 프로세싱 동안 잘려나간다. 상기 CH1 도메인의 부재는 이 도메인이 해당 경쇄의 불변 도메인을 위한 엥커링 장소이기 때문에, UniAbsTM에서 경쇄 부재가 설명된다. 이러한 UniAbsTM는 통상적인 항체 또는 이의 단편들의 세 개 CDRs에 의해 항원-결합 특이성과 고-친화성을 부여하도록 자연적으로 진화되었다 (Muyldermans, 2001; J Biotechnol 74:277-302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111-124). 연골어류, 이를 테면, 상어도 IgNAR로 명명된 독특한 유형의 면역글로불린을 진화시켰는데, 이 면역글로불린은 경쇄 폴리펩티드는 결여되어 있고, 전적으로 오로지 중쇄만으로 구성되어 있다. IgNAR 분자는 분자 공학에 의해 조작되어, 단일 중쇄 폴리펩티드 (vNARs)의 가변 도메인을 만들 수 있다 (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).
오로지 중쇄-항체(경쇄 없이)가 항원에 결합하는 능력은 1960년대에 확립되었다 (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). 경쇄로부터 물리적으로 분리된 중쇄 면역글로불린은 사량체 항체와 비교하여 항원-결합 활성의 80%를 유지한다. Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790는 재-배열된 마우스 μ 유전자로부터 CH1 도메인을 제거하면 포유류 세포 배양물에서 오로지 중쇄-항체 (경쇄 없이)가 생산된다는 것을 실증하였다. 생산된 이 항체는 VH 결합 특이성과 작동체 기능을 유지하였다.
면역화를 통하여 다양한 항원에 대항하는 높은 특이성과 친화성을 갖는 중쇄 항체들이 생성될 수 있고 (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), VHH 부분은 효모에서 용이하게 클론되고, 발현될 수 있다 (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). 이들의 발현, 용해성 및 안정성 수준은 고전적 F(ab) 또는 Fv 단편들의 것에 비교하여 상당히 더 높다 (Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)).
마우스에서 λ (람다) 경쇄 (L) 좌 및/또는 λ와 κ (카파) L 쇄 좌들이 기능적으로 침묵화되었고, 이러한 마우스에 의해 생산된 항체는 U.S. 특허 번호 7,541,513 및 8,367,888에 기술되어 있다. 마우스와 렛(rats)에서 오로지 중쇄-항체의 재조합적 생산은 예를 들면, WO2006008548; U.S. 출원 공개 번호 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology; 109(1), 93-101;
Figure pct00001
et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26(5):377-90; 그리고 Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271-3283에서 보고되었다. 아연-핑거 핵산분해효소의 배아 현미주사를 통하여 녹아웃knockout) 렛의 생성에 대해서는 Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433에서 기술된다. 가용성 오로지 중쇄-항체, 그리고 이러한 항체를 생산하는 이종성(heterologous) 중쇄 좌를 포함하는 유전자삽입된 설치류는 U. S. 특허 번호 8,883,150 및 9,365,655에서 기술된다. 결합 (표적화) 도메인으로 단일-도메인 항체를 포함하는 CAR-T 구조는 예를 들면, Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641 및 Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386에서 기술된다.
본 발명의 요약
본 발명의 측면은 CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 UniAbsTM를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 중쇄 항체에 관계한다. 본 발명의 추가 측면은 이러한 항체를 만드는 방법, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 그리고 CD22의 발현을 특징으로 하는 장애 치료에 이들의 용도에 관계한다.
본 발명의 측면에는 CD3에 결합하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포되며, 이 화합물은 다음을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 85에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 식별 번호: 86에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 식별 번호: 87에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 경쇄 가변 영역. 일부 구체예들에서, 중쇄 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열은 인간 VH 틀구조 안에 존재한다. 일부 구체예들에서, 중쇄 가변 영역은 인간 VH 틀구조에서 중쇄 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하며, 이때 각 CDR 서열은 서열 식별 번호: 85-87중 임의의 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고 상기 결합 화합물은 또한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 다음을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 85에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR1 서열; 그리고 (b) 서열 식별 번호: 86에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR2 서열; 그리고 (c) 서열 식별 번호: 87에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 상기 결합 화합물은 또한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 다음을 포함한다: 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 상기 결합 화합물은 또한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 경쇄 가변 영역은 인간 VL 틀구조에서 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하며, 이때 각 CDR 서열은 서열 식별 번호: 92에서 제시된 CDR 서열 또는 CDR 서열 세트와 비교하여 3개 또는 이보다 적은 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함하고; 또는 이때 상기 CDR 서열은 서열 식별 번호: 92에서 제시된 CDR 서열 또는 CDR 서열 세트와 비교하여 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 중쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 91에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 중쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 91에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 92에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 92에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 측면에는 CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포된다: 이때 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 1 ~ 10의 아미노산 서열중 임의의 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR1; 및/또는 (b) 서열 식별 번호: 11 ~ 17의 아미노산 서열중 임의의 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR2; 및/또는 (c) 서열 식별 번호: 18 ~ 23의 아미노산 서열중 임의의 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR3. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 결합 단위의 CDR1 서열, CDR2 서열, 그리고 CDR3 서열은 인간 틀구조 안에 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 결합 단위는 CH1 서열 없이, 중쇄 불변 영역 서열을 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 1 ~ 10로 구성된 군에서 선택된 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열 식별 번호: 11 ~ 17로 구성된 군에서 선택된 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열 식별 번호: 18 ~ 23로 구성된 군에서 선택된 CDR3 서열.
일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 다음을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 1 ~ 10로 구성된 군에서 선택된 CDR1 서열; 그리고 (b) 서열 식별 번호: 11 ~ 17로 구성된 군에서 선택된 CDR2 서열; 그리고 (c) 서열 식별 번호: 18 ~ 23로 구성된 군에서 선택된 CDR3 서열.
일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 다음을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 11의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 18의 CDR3 서열; (b) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 19의 CDR3 서열; 또는 (c) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 20의 CDR3 서열. 일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 서열 식별 번호: 24 ~ 84의 서열중 임의의 하나에 대하여 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 서열 식별 번호: 24 ~ 84로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 서열 식별 번호: 24의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 측면에는 CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포되며, 이때 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: (a) 다음 식의 CDR1 서열: G X1 S I X2 X3 X4 X5 X6 Y (서열 식별 번호: 104), 여기에서 X1 은 D 또는 G이고; X2는 S, T, I 또는 N이고; X3은 S 또는 D이고; X4는 G, S 또는 N이고; X5는 D, G 또는 S이고; 그리고 X6은 Y 또는 H이고; 그리고 (b) 다음 식의 CDR2 서열: X7 X8 Y X9 G X10 X11 (서열 식별 번호: 105) 여기에서 X7은 I 또는 V이고; X8은 Y 또는 H이고; X9는 S 또는 T이고; X10은 A, V 또는 S이고; 그리고 X11은 T 또는 A이고; 그리고 (c) 다음 식의 CDR3 서열: X12 R X13 D S S X14 W R S (서열 식별 번호: 106) 여기에서 X12는 T, A 또는 K이고; X13은 D 또는 E이고; 그리고 X14는 N 또는 S이다.
본 발명의 측면에는 CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포되며, 이때 상기 제 1 결합 단위는 인간 VH 틀구조에서 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 이때 상기 CDR 서열은 서열 식별 번호: 1-23로 구성된 군에서 선택된 CDR 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명의 측면에는 CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포되며, 이때 상기 제 1 결합 단위는 인간 VH 틀구조에서 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 이때 상기 CDR 서열은 서열 식별 번호: 1-23으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 측면에는 CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포되며, 이때 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다: (a) 인간 VH 틀구조에서 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 11의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 18의 CDR3 서열; 또는 (b) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 19의 CDR3 서열; 또는 (c) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 20의 CDR3 서열.
일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 이중특이적이다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-특이적 결합 화합물은 CAR-T 포멧이다.
본 발명의 측면에는 다음을 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포된다:(i) 인간 VH 틀구조에서 CD3에 대한 결합 친화성을 갖고, 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 VL 틀구조에서 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 그리고 (iii) 인간 VH 틀구조에서 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 11의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 18의 CDR3 서열을 포함하는 항-CD22 중쇄 항체의 항원-결합 도메인.
본 발명의 측면에는 다음을 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포된다:(i) 인간 VH 틀구조에서 CD3에 대한 결합 친화성을 갖고, 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 VL 틀구조에서 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 그리고 (iii) 인간 VH 틀구조에서 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 19의 CDR3 서열을 포함하는 항-CD22 중쇄 항체의 항원-결합 도메인.
본 발명의 측면에는 다음을 포함하는 다중-특이적 결합 화합물이 내포된다:(i) 인간 VH 틀구조에서 CD3에 대한 결합 친화성을 갖고, 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 인간 VL 틀구조에서 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 그리고 (iii) 인간 VH 틀구조에서 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 20의 CDR3 서열을 포함하는 항-CD22 중쇄 항체의 항원-결합 도메인.
일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 결합 화합물은 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 인간 IgG1 Fc 영역은 침묵화된 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구체예들에서, 상기 다중특이적 결합 화합물은 인간 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 인간 IgG4 Fc 영역은 침묵화된 인간 IgG4 Fc 영역이다.
본 발명의 측면에는 본원에서 기술된 다중-특이적 결합 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 내포된다.
본 발명의 측면에는 CD22의 발현에 의해 특징화된 B-세포 장애 치료 방법이 내포되는데, 이 방법은 전술한 장애를 갖는 대상체에게 본원에 기술된 다중-특이적 결합 화합물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 측면에는 CD22의 발현에 의해 특징화된 B-세포 장애의 치료를 위한 약제 조제에 있어서 다중-특이적 결합 화합물의 용도가 내포된다.
일부 구체예들에서, 상기 장애는 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL)이다. 일부 구체예들에서, 상기 장애는 비-호지킨 림프종 (NHL)이다. 일부 구체예들에서, 상기 장애는 전신 홍반성 루프스 (SLE)이다. 일부 구체예들에서, 상기 장애는 류마티스성 관절염 (RA)이다. 일부 구체예들에서, 상기 장애는 다발성 경화증 (MS)이다.
본 발명의 측면에는 본원에서 기술된 다중-특이적 결합 화합물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 내포된다. 본 발명의 측면에는 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 내포된다. 본 발명의 측면에는 본원에서 기술된 벡터를 포함하는 세포들이 내포된다.
본 발명의 측면에는 본원에서 기술된 다중-특이적 결합 화합물을 만드는 방법들이 내포되는데, 이 방법은 상기 결합 화합물의 발현을 허용하는 조건 하에서 본원에서 기술된 세포를 성장시키고, 그리고 해당 세포로부터 상기 결합 화합물을 단리시키는 것을 포함한다.
본 발명의 측면에는 본원에서 기술된 다중-특이적 결합 화합물을 만드는 방법들이 내포되며, 이 방법은 UniRat 동물을 CD22로 면역화시키고, 그리고 CD22-결합 중쇄 서열을 식별해내는 것을 포함한다.
본 발명의 측면에는 치료 방법들이 내포되는데, 이 방법은 개체에게 본원에서 기술된 다중-특이적 결합 화합물의 유효 용량, 또는 본원에서 기술된 약제학적 조성물의 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다.
이들 및 추가의 측면은 실시예를 포함하는 본 개시의 나머지 부분에서 추가로 설명될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 휴지기 인간 범(pan) T 세포를 이용하여 CD22 양성 세포 (Daudi)의 T 세포 매개된 세포독성을 도시하는 그래프다.
도 1B는 CD22 양성 세포 (Daudi)와 함께 항온처리되고, 항-CD22xCD3_F2F 다중특이적 결합 화합물로 처리된 휴지기 인간 범(pan) T 세포, 그리고 양성 대조군에 의한 사이토킨 방출의 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프다.
도 2A는 휴지기 인간 범(pan) T 세포를 이용하여 CD22 양성 세포 (SUDHL10)의 T 세포 매개된 세포독성을 도시하는 그래프다.
도 2B는 CD22 양성 세포 (SUDHL10)와 함께 항온처리되고, 항-CD22xCD3_F2F 다중특이적 결합 화합물로 처리된 휴지기 인간 범(pan) T 세포, 그리고 양성 대조군에 의한 사이토킨 방출의 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프다.
도 3A는 휴지기 인간 범(pan) T 세포를 이용하여 CD22 양성 세포 (RI-1)의 T 세포 매개된 세포독성을 도시하는 일련의 그래프다.
도 3B는 CD22 양성 세포 (RI-1)와 함께 항온처리되고, 항-CD22xCD3_F2F 다중특이적 결합 화합물로 처리된 휴지기 인간 범(pan) T 세포, 그리고 양성 대조군에 의한 사이토킨 방출의 용량 반응 곡선을 도시하는 일련의 그래프다.
도 4는 활성화된 인간 범(pan) T 세포를 이용하여 CD22 양성 세포의 T 세포 매개된 세포독성을 도시하는 일련의 그래프다.
도 5는 CD22와 CD3에 대항하는 이중특이적 항체의 세포 결합을 도시하는 일련의 그래프다.
도 6은 Daudi 이종이식편에서 항-CD22xCD3_F2F 다중특이적 결합 화합물의 생체내 효능을 결정하는 처치 계획을 나타낸다.
도 7은 마우스 Daudi 이종이식편에서 종양 이식-후 일수에 대한 함수로써 평균 종양 용적을 도시하는 그래프다.
도 8은 마우스 Daudi 이종이식편에서 종양 이식-후 일수에 대한 함수로써 체중을 도시하는 그래프다.
도 9는 마우스 Daudi 이종이식편에서 종양 이식-후 일수에 대한 함수로써 체중 변화 퍼센트를 도시하는 그래프다.
도 10은 마우스 Daudi 이종이식편에서 종양 이식-후 일수에 대한 함수로써 평균 종양 용적을 도시하는 그래프다.
도 11은 마우스 Daudi 이종이식편에서 종양 이식-후 일수에 대한 함수로써 개별 종양 측정을 도시하는 일련의 그래프다.
도 12는 마우스 Daudi 이종이식편에서 종양 이식-후 일수에 대한 함수로써 체중을 도시하는 그래프다.
도 13는 마우스 Daudi 이종이식편에서 종양 이식-후 일수에 대한 함수로써 체중 변화 퍼센트를 도시하는 그래프다.
도 14A는 CD3에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 단위와 CD22에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 단위를 갖는 이중특이적 결합을 나타내는 개략도다.
도 14B는 본 발명의 구체예들에 따라 하나 또는 그 이상의 결합 도메인을 통합할 수 있는 다양한 CAR-T 구조체의 예시들이다.
도 15A는 CD3에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 단위와 CD22에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 단위 (단가(monovalent), CD22에 대해 단일특이적)를 갖는 이중특이적 결합 분자의 개략도다.
도 15B는 CD3에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 단위와 CD22에 특이적으로 결합하는 두 개의 결합 단위 (이가(bivalent), CD22에 대해 단일특이적)를 갖는 이중특이적 결합 분자의 개략도다.
도 15C는 CD3에 특이적으로 결합하는 하나의 결합 단위와 CD22에 특이적으로 결합하는 두 개의 결합 단위 (이가, CD22에 대해 이중파라토픽(biparatopic))을 갖는 이중특이적 결합 분자의 개략도다.
도 16은 본 발명의 구체예들에 따른 항-CD22 항체의 다양한 생물학적 활성에 대한 데이터를 나타내는 표다.
도 17은 희석에 대한 함수로써 혈청 역가를 보여주는 일련의 그래프다.
바람직한 구체예들의 상세한 설명
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자에게 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에서 충분히 설명되는데, 이를 테면, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 주기적 업데이트); "PCR: The Polymerase 쇄 Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); 그리고 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988)에서 기술된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 각 중간 값은 해당 범위의 상한 및 하한과 기타 명시된 또는 중간 값 사이에서 하한 단위의 10분의 1까지인 것으로 이해되며, 언급된 범위는 본 발명에 포괄된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 제한에 따라 본 발명에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 본 발명에 또한 내포된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원의 항체 잔기들은 Kabat 번호 매김 시스템에 따라 번호가 매겨진다 (가령, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
다음 설명에서, 본 발명의 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 본 발명이 이러한 특정 세부사항 중 하나 또는 그 이상 없이도 실시될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 경우들에서, 당업자에게 잘 알려진 잘 알려진 특징 및 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 설명되지 않았다.
특허 출원 및 공보를 비롯한, 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
I. 정의
"~를 포함하는"이란, 인용된 요소가 조성물/방법/키트에 필요하지만, 청구범위의 범위 내에서 조성물/방법/키트 등을 형성하기 위해 다른 요소가 포함될 수 있음을 의미한다.
"본질적으로 ~로 구성되는"이란 본 발명의 기본적이고, 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정 재료 또는 단계에 대해 설명된 조성물 또는 방법의 범위로 국한됨을 의미한다.
"~로 구성되는"이란 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분의 조성물, 방법 또는 키트로부터의 배제를 의미한다.
본원에서 항체 잔기는 Kabat 번호매김 시스템과 EU 번호매김 시스템에 따라 번호매김된다. Kabat 번호매김 시스템은 가변 도메인에서 잔기를 언급할 때 일반적으로 이용된다 (대략적으로 중쇄 잔기 1-113) (e.g., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU 번호매김 시스템" 또는 "EU 색인"은 면역글로블린 중쇄 불변 영역에서 잔기를 언급할 때 일반적으로 사용된다 (가령, Kabat et al., 상기에서 보고된 EU 색인). "Kabat에서와 같은 EU 색인"이란 상기 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인에 있는 잔기 번호에 대한 언급은 Kabat 번호 매김 시스템에 의한 잔기 번호 매김을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인에 있는 잔기 번호에 대한 언급은 EU 번호 매김 시스템에 의한 잔기 번호 매김을 의미한다.
면역글로불린이라고도 불리는 항체는 통상적으로 적어도 하나의 중쇄와 하나의 경쇄를 포함하며, 여기에서 중쇄와 경쇄의 아미노 말단은 서열에서 가변이며, 따라서 가변 영역 도메인, 또는 가변 중쇄 (VH) 또는 가변 경쇄 (VH) 도메인으로 흔히 불린다. 두 도메인은 일반적으로 결합하여 특정 결합 영역을 형성하는데, 비록 본원에서 논의될 것이지만, 특이적 결합은 오로지 중쇄-가변 서열로도 얻을 수 있으며, 항체의 다양한 비-천연 구성이 당업계에 공지되어 있고, 당업계에 사용된다.
"기능적" 또는 "생물학적으로 활성" 항체 또는 항원-결합 분자 (본원에서 기술된 오로지 중쇄-항체와 다중-특이적 (가령, 이중특이적) 3-쇄 항체-유사 분자 (TCAs))는 구조적, 조절적, 생화학적 또는 생물물리학적 사건에서 이의 하나 또는 그 이상의 자연 활성을 발휘할 수 있는 것이다. 예를 들면, 기능적 항체 또는 다른 결합 분자, 가령, TCA는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 수 있고, 이 결합은 결국 신호 변환 또는 효소 활성과 같은 세포 또는 분자 사건을 유도하거나, 또는 변경시킬 수 있다. 기능적 항체 또는 다른 결합 분자, 가령, TCA은 수용체의 리간드 작용화를 또한 차단시키거나, 또는 효현제 또는 길항제로 작용할 수 있다. 항체 또는 다른 결합 분자, 가령, TCA가 이의 천연 활성중 하나 또는 그 이상을 발휘하는 능력은 적절한 폴딩 및 폴리펩티드 쇄의 어셈블리를 비롯한, 몇 가지 인자들에 따라 달라진다.
본원에서 용어 "항체"는 광범위한 의미로 이용되는데, 특히 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 단량체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 오로지 중쇄-항체, 3-쇄 항체, 단일 쇄 Fv (scFv), 나노바디 등등을 포괄하며, 또한 항체 단편들이 바람직한 생물학적 활성을 나타낸다면 항체 단편들 또한 포괄된다 (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). 항체는 뮤린, 인간, 인간화된, 키메라 항체일 수 있고, 또는 다른 종으로부터 유래될 수 있다.
용어 항체는 전장 중쇄, 전장 경쇄, 무손상 면역글로불린 분자; 또는 이들 폴리펩티드, 이를 테면, 관심대상 표적의 항원 또는 이의 일부분에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드중 임의의 폴리펩티드의 면역학적 활성 부분을 지칭할 수 있는데, 이때 표적에는 암 세포, 또는 자가면역 질환과 연합된 자가면역 항체를 생산하는 세포가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 기술된 면역글로불린은 임의의 유형 (가령, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 면역글로불린 분자의 클래스 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 감소된 또는 강화된 작동체 세포 활성을 제공하는 변경된 Fc 부분을 갖는 공작된 하위클래스를 비롯한 하위클래스일 수 있다. 면역글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 면역글로불린은 대개 인간 기원의 면역글로불린이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론성 항체"는 실질적으로 동질성 항체의 집단으로부터 수득한 항체, 가령, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 자연 발생적 돌연변이 및/또는 소량으로 존재할 수 있는 경우를 제외하고 동일하다. 단일클론성 항체는 단일 항원 부위로 지향되는 매우 특이적이다. 더욱이, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 종래의 (다중클론성) 항체 조제물과 대조적으로, 각 단일클론성 항체는 항원상의 단일 결정인자를 지향한다. 본 발명에 따른 단일클론성 항체는 Kohler et al. (1975) Nature 256:495에서 처음으로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있으며, 예를 들면, 단백질 생산 방법 (가령, U.S. 특허 번호 4,816,567)을 통하여 또한 만들어질 수 있다.
항체와 관련하여 이용될 때, 용어 "가변"이란 해당 항체 가변 도메인의 특정 일부분이 항체들 간에 서열에서 상당히 상이하며, 이의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성(variability)은 가변 도메인에 고르게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 소위 초가변 영역이라고 알려진 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 더 보존된 부분들은 프레임워크 영역 (FRs)이라고 불린다. 고유의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 β-시트 형태를 채택한 4 개의 FR, 이에 연결된 3 개의 초가변 영역, 이때, 이들은 루프 연결되며, 그리고 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FRs에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄의 초 가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 참고). 상기 불변 도메인은 항체가 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 작동체(effector) 기능, 이를 테면, 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에서 항체에 참여와 같은 기능을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역"이란 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 상기 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (가령, 중쇄 도메인에서 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)로부터 아미노산 잔기를 포함하고; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 중쇄 가변 도메인에서 "초가변 루프" 잔기들 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)로부터 잔기들을 포함한다; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "틀구조 영역" 또는 "FR" 잔기들은 본원에서 특정된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기다.
예시적인 CDR 지명은 본원에서 나타내지만, 그러나, 당업자는 상기 CDRs에 관한 다수의 정의가 흔히 이용되며, Kabat 정의 ("Zhao et al. A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions." Mol Immunol. 2010;47:694-700)-이것은 서열 가변성에 기초되며, 가장 흔히 이용되는 것을 인지할 것이다. Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기반된다 (Chothia et al. "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature. 1989; 342:877-883). 관심대상의 대체 CDR 정의에는 다음의 것이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool." J Mol Biol. 2001;309:657-670; Ofran et al. "Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes." J Immunol. 2008;181:6230-6235; Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires." J Mol Recognit. 2004;17:132-143; 그리고 Padlanet al. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Faseb J. 1995;9:133-139., 이들 각각은 본원의 참고자료에 특별히 편입된다.
용어 "오로지 중쇄-항체" 및 "중쇄 항체"는 본원에서 호환되며, 광역의 의미로써, 통상적인 항체에서 경쇄가 결여된 항체를 지칭한다. 이 용어들에는 VH 항원-결합 도메인, 그리고 CH1 도메인 없이, CH2와 CH3 불변 도메인을 포함하는 동종이량체 항체; 이러한 항체의 기능적 (항원-결합) 변이체들, 가용성 VH 변이체들, 하나의 가변 도메인 (V-NAR)의 동종이량체와 5개의 C-유사 불변 도메인 (C-NAR)을 포함하는 Ig-NAR 그리고 이의 기능적 단편들; 그리고 가용성 단일 도메인 항체 (sUniDabsTM)이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 한 구체예에서, 오로지 중쇄-항체는 틀구조 1, CDR1, 틀구조 2, CDR2, 틀구조 3, CDR3, 그리고 틀구조 4로 구성된 가변 영역 항원-결합 도메인으로 구성된다. 또다른 구체예에서, 상기 오로지 중쇄-항체는 항원-결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부분, 그리고 CH2 도메인과 CH3 도메인으로 구성된다. 또다른 구체예에서, 상기 오로지 중쇄-항체는 항원-결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부분과 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 구체예에서, 상기 오로지 중쇄-항체는 항원-결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부분과 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절두된 오로지 중쇄-항체 또한 본원에 내포된다. 추가 구체예에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 그리고 적어도 하나의 CH (CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 힌지 영역은 없다. 추가 구체예에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 적어도 하나의 CH (CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인, 그리고 힌지 영역의 적어도 일 부분으로 구성된다. 상기 오로지 중쇄-항체는 이량체, 이때 두 중쇄는 이황화 결합되거나, 또는 그렇지 않으면, 공유적으로 또는 비-공유적으로 서로 부착되어 있다. 상기 오로지 중쇄-항체는 IgG 하위클래스에 속할 수 있지만, 그러나 다른 하위클래스, 이를 테면 IgM, IgA, IgD 및 IgE 하위클래스에 속하는 항체 또한 본원에 내포된다. 특정 구체예에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형, 구체적으로 IgG1 하위유형이다. 한 구체예에서, 중쇄 항체는 IgG4 하위유형이며, 이때 CH 도메인들중 하나 또는 그 이상이 변형되어, 해당 항체의 작동체 기능이 변경된다. 한 구체예에서, 중쇄 항체는 IgG1 하위유형이며, 이때 CH 도메인들중 하나 또는 그 이상이 변형되어, 해당 항체의 작동체 기능이 변경된다. 작동체 기능을 변경시키는 CH 도메인의 변형이 본원에 추가 기술된다. 중쇄 항체의 비-제한적인 예는 예를 들면, WO2018/039180에 기술되며, 이의 내용은 전문이 본원 참고자료에 편입된다.
한 구체예에서, 본원의 오로지 중쇄-항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 결합 (표적화) 도메인으로 이용된다. 이 정의에는 UniAbsTM라고 불리는,인간 면역글로불린 유전자삽입된 렛 (UniRatTM)에 의해 만들어진 인간 오로지 중쇄-항체가 특별히 내포된다. UniAbsTM의 가변 영역 (VH)은 UniDabsTM라고 불리며, 다중-특이성, 역가의 증가 및 반감기의 연장을 갖는 신규 치료제 개발을 위해 Fc 영역 또는 혈청 알부민에 연계될 수 있는 다용도 빌딩 블록이다. 상기 동종이량체 UniAbsTM에는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 VL 도메인가 결여되어 있기 때문에, 해당 항원은 하나의 단일 도메인, 이를 테면, 중쇄 항체 (VH)의 중쇄의 가변 도메인 (항원-결합 도메인)에 의해 인지된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "무손상 항체 쇄"는 전장 가변 영역과 전장 불변 영역 (Fc)을 포함하는 것이다. 무손상 "통상적인" 항체는 무손상 경쇄와 무손상 중쇄를 포함하고, 뿐만 아니라 분비된 IgG에 대한 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, 힌지, CH2와 CH3을 포함한다. 다른 동형(isotypes), 이를 테면 IgM 또는 IgA는 상이한 CH 도메인을 보유할 수 있다. 불변 도메인은 고유의 서열 불변 도메인 (가령, 인간 고유의 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체들일 수 있다. 상기 무손상 항체는 하나 또는 그 이상의 "작동체 기능"을 가질 수 있고, 이는 항체의 Fc 불변 영역 (고유의 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 생물학적 활성을 부여하는 것을 지칭한다. 항체 작동체 기능의 예로는 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 그리고 세포 표면 수용체의 하향 조절이 내포된다. 불변 영역 변이체들에는 작동체 프로파일, Fc 수용체들에 대한 결합, 그리고 이와 유사한 것들을 변경시키는 것들이 내포된다.
이들 중쇄의 Fc (불변 도메인)의 아미노산 서열에 따라, 항체 및 다양한 항원-결합 단백질은 상이한 클래스로 제공될 수 있다. 중쇄 Fc 영역에는 5 가지 주요 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇 가지는 하위클래스(이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 항체의 상이한 클래스에 대응하는 Fc 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ, 그리고 μ로 언급될 수 있다. 상이한 부류의 면역 글로불린의 하위단위 구조 및 3-차원 배열은 잘 알려져 있다. Ig 형태에는 힌지-변형 또는 힌지-없는 형태가 내포된다.(Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, κ 및 λ라고 불리는 2 가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
"기능적 Fc 영역"은 고유의-서열 Fc 영역의 "작동체 기능"을 소유한다. 작동체 기능의 비-제한적인 예시에는 C1q 결합; CDC; Fc-수용체 결합; ADCC; ADCP; 세포-표면 수용체들 (가령, B-세포 수용체)의 하향-조절, 등등이 내포된다. 이러한 작동체 기능은 일반적으로 수용체와 상호작용하는 Fc 영역을 요구하는데, 가령, FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB 수용체들, 그리고 낮은-친화성 FcRn 수용체를 요구하며; 그리고 당분야에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가될 수 있다. "사멸(dead)" 또는 "침묵화된" Fc란 예를 들면, 혈청 반감기 연장과 관련하여 활성이 유지되도록 돌연변이된 것이지만, 그러나 고-친화성 Fc 수용체를 활성화시키지 않으며, 또는 Fc 수용체에 대해 감소된 친화성을 갖는다.
"고유의-서열 Fc 영역"은 자연계에서 볼 수 있는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 고유의-서열 인간 Fc 영역에는 예를 들면, 고유의-서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형(allotypes)); 고유의-서열 인간 IgG2 Fc 영역; 고유의-서열 인간 IgG3 Fc 영역; 그리고 고유의-서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 이의 자연 발생적 변이체들이 내포된다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 고유의-서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 고유의-서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 가령, 고유의-서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 그리고 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 고유의-서열 Fc 영역 및/또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성을 소유할 것이며, 그리고 가장 바람직하게는 이것들과 적어도 약 90% 상동성, 더욱 바람직하게는 이것들과 적어도 약 95% 상동성을 소유할 것이다.
변이체 Fc 서열에는 EU 색인 위치 234, 235, 그리고 237에서 FcγRI 결합을 감소시키기 위해 CH2 영역내 3개의 아미노산 치환이 내포될 수 있다 (Duncan et al., (1988) Nature 332:563 참고). EU 색인 위치 330와 331에서 보체 C1q 결합 부위내 두 개의 아미노산 치환은 보체 고정을 감소시킨다 (Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) 그리고 Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). 위치 233-236에서 인간 IgG1 또는 IgG2 잔기들과 위치 327, 330 및 331에서 IgG4 잔기의 치환은 ADCC와 CDC를 상당히 감소시킨다 (예를 들면, Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; 그리고 Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604). 상기 인간 IgG1 아미노산 서열 (UniProtKB 번호. P01857)은 본원에서 서열 식별 번호: 93으로 제공된다. 상기 인간 IgG4 아미노산 서열 (UniProtKB 번호. P01861)은 서열 식별 번호: 94로 제공된다. 침묵화된 IgG1은 예를 들면, Boesch, A.W., et al., "Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions" MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27에 기술되며, 이의 내용은 전문이 본원 참고자료에 편입된다.
다른 Fc 변이체들이 또한 가능한데, 예를 들면, 이황화 결합을 형성할 수 있는 영역이 결손된 것, 또는 고유의 Fc의 N-말단 단부에 특정 아미노산 잔기들이 제거된 것, 또는 메티오닌 잔기가 이에 추가된 것들이 내포되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 일부 구체예들에서, 결합 화합물의 하나 또는 그 이상의 Fc 부분은 이황화 결합을 제거하기 위하여 힌지 영역에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 여전히 또다른 구체예에서, Fc의 힌지 영역 전체가 제거될 수 있다. 여전히 또다른 구체예에서, 결합 화합물은 Fc 변이체를 포함할 수 있다.
더우기, 보체 결합 또는 Fc 수용체 결합에 영향을 주기 위해 아미노산 잔기를 치환(돌연변이), 결손 또는 추가시킴으로써, 작동체 기능을 제거하거나, 또는 실질적으로 제거하도록 Fc 변이체가 구축될 수 있다. 예를 들면, 보체-결합 부위, 이를 테면, C1q-결합 부위에서 결손이 일어날 수 있다. 면역글로불린 Fc 단편의 이러한 서열 유도체를 만드는 기술은 국제 특허 공개 번호 WO 97/34631 및 WO 96/32478에서 공개된다. 또한, 상기 Fc 도메인은 인산화, 황산화, 아실화, 글리코실화, 메틸화, 파르네실화, 아세틸화, 아미드화, 그리고 이와 유사한 것들에 의해 변경될 수 있다.
용어 "Fc-영역-포함하는 항체"란 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 번호매김 시스템에 따르면 잔기 447)은 항체의 정제 동안 또는 항체를 인코딩하는 핵산의 재조합적 공작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체는 K447을 갖고 있거나, 또는 이것이 없는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 측면에는 이중특이적, 삼중특이적, 등등이 내포된, 그러나 이에 국한되지 않는 다중-특이적 배열형태(configurations)를 갖는 결합 화합물이 내포된다. 다수의 방법 및 단백질 배열형태가 공지되어 있으며, 이중특이적 단일클론성 항체 (BsMAB), 삼중-특이적 항체, 등등에 이용된다.
두 개 또는 그 이상의 항체의 가변 도메인을 재조합적으로 융합시킴으로써 인위적인 다가 항체를 생산하는 다양한 방법들이 개발되었다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드 상에서 제 1 및 제 2 항원-결합 도메인은 폴리펩티드 링커에 의해 연계된다. 이러한 폴리펩티드 링커의 한 가지 비-제한적인 예는 GS 링커로써, 이 링크는 네 개의 글리신 잔기, 이어서 하나의 세린 잔기가 이어진 아미노산 서열을 갖고, 그리고 이때 이 서열은 n 번 반복되며, 여기에서 n은 1 ~ 약 10개 범위내의 정수, 이를 테면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이다. 이러한 링커의 비-제한적인 예로는 GGGGS (서열 식별 번호: 102) (n=1) 및 GGGGSGGGGS (서열 식별 번호: 103) (n=2)이 내포된다. 다른 적합한 링커들이 또한 이용될 수 있고, 예를 들면, Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65(10): 1357-69에 기술되며, 이의 내용은 전문이 본원 참고자료에 편입된다.
용어 "3-쇄 항체 유사 분자" 또는 "TCA"는 세 개 폴리펩티드 하위단위를 포함하는, 이들로 필수적으로 구성된, 또는 이들로 구성된 항체-유사 분자를 지칭하는데 사용되며, 이들 폴리펩티드중 두 개는 단일클론성 항체의 하나의 중쇄와 하나의 경쇄를 포함하는, 이들로 필수적으로 구성된, 또는 이들로 구성되거나, 또는 이러한 항체의 기능적 항원-결합 단편들 (단편은 항원-결합 영역과 적어도 하나의 CH 도메인을 포함)을 포함하는, 이들로 필수적으로 구성된, 또는 이들로 구성된다. 이러한 중쇄/경쇄 쌍은 제 1 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다. 제 3 폴리펩티드 하위단위는 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인 (CH1 도메인 없이)를 포함하는 Fc 부분, 그리고 제 2 항원의 에피토프 또는 제 1 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 또는 그 이상의 항원 결합 도메인 (가령, 두 개의 항원 결합 도메인)를 포함하는 오로지 중쇄-항체를 포함하는, 이들로 필수적으로 구성된, 또는 이들로 구성되며, 여기에서 이러한 결합 도메인은 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역으로부터 유래되거나, 또는 이러한 가변 영역과 서열 동일성을 갖는다. 이러한 가변 영역의 부분들은 VH 및/또는 VL 유전자 세그먼트, D 유전자 세그먼트와 JH 유전자 세그먼트, 또는 JL 유전자 세그먼트에 의해 인코드될 수 있다. 상기 가변 영역은 재-배열된 VHDJH, VLDJH, VHJL, 또는 VLJL 유전자 세그먼트에 의해 인코드될 수 있다. TCA 단백질은 상기 본원에서 정의된 바의 오로지 중쇄-항체를 이용한다.
TCA 결합 화합물은 본원에서 이용된 바와 같이, 중쇄 불변 영역 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4를 포함하지만, 그러나 CH1 도메인은 포함되지 않는 단일 쇄 항체를 의미하는 "오로지 중쇄-항체" 또는 "중쇄 항체" 또는 "중쇄 폴리펩티드"를 이용한다. 한 구체예에서, 중쇄 항체는 항원-결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부분과 CH2 도메인과 CH3 도메인으로 구성된다. 또다른 구체예에서, 중쇄 항체는 항원-결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부분과 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 구체예에서, 중쇄 항체는 항원-결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부분과 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절두된 오로지 중쇄 항체 또한 본원에 내포된다. 추가 구체예에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 그리고 적어도 하나의 CH (CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 그러나 힌지 영역은 없다. 상기 오로지 중쇄-항체는 이량체, 이때 두 중쇄는 이황화 결합되거나, 또는 그렇지 않으면, 공유적으로 또는 비-공유적으로 서로 부착되어 있고, 이들 CH 도메인들중 두 개 또는 그 이상 도메인 간의 비대칭 계면을 임의선택적으로 내포하여, 폴리펩티드 쇄들 간의 적절한 쌍형성을 용이하게 할 수 있다. 상기중쇄 항체는 IgG 하위클래스에 속할 수 있지만, 그러나 다른 하위클래스, 이를 테면 IgM, IgA, IgD 및 IgE 하위클래스에 속하는 항체 또한 본원에 내포된다. 특정 구체예에서, 중쇄 항체는 특정 구체예에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형, 구체적으로 IgG1 하위유형 또는 IgG4 하위유형이다. TCA 결합 화합물의 비-제한적인 예는 예를 들면, WO2017/223111 및 WO2018/052503에 기술되며, 이의 내용은 전문이 본원 참고자료에 편입된다.
중쇄 항체는 낙타과, 가령, 낙타와 야마가 만들어내는 IgG 항체의 약 사분의 일을 구성한다 (Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). 이들 항체는 두 중쇄에 의해 형성되지만, 그러나 경쇄는 없다. 결과적으로, 가변 항원 결합 구분은 VHH 도메인으로 지칭되며, 이는 최소(길이가 겨우 대략 120개인 아미노산임)의 자연 발생적 무손상, 항원-결합 부위를 나타낸다 (Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). 면역화를 통하여 다양한 항원에 대항하는 높은 특이성과 친화성을 갖는 중쇄 항체들이 생성될 수 있고 (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), 그리고 VHH 부분은 효모에서 용이하게 클론되고, 발현될 수 있다 (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). 이들의 발현, 용해성 및 안정성 수준은 고전적 F(ab) 또는 Fv 단편들의 것에 비교하여 상당히 더 높다 (Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). 또한, 상어는 항체에 VNAR라고 하는 단일 VH 유사 도메인을 갖는다 (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).
본원에 사용된 용어 "CD22" 및 "분화 클러스터-22"는 성숙한 B 세포의 표면에서 발견되고, 일부 미성숙 B 세포에서는 더 적은 정도로 발견되는, 렉틴의 SIGLEC 패밀리에 속하는 분자를 지칭한다. 용어 "CD22"에는 임의의 인간 및 비-인간 동물 종의 CD22 단백질이 내포되며, 그리고 인간 CD22 뿐만 아니라 비-인간 포유류의 CD22가 특히 내포된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "인간 CD22"에는 이의 출처 또는 준비 방식에 관계없이, 인간 CD22(UniProt P20273)의 모든 변이체, 동형(isoforms) 및 종 동족체(homologs)들이 내포된다. 따라서, "인간 CD22"에는 세포들에 의해 자연적으로 발현된 인간 CD22, 그리고 상기 인간 CD22 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현된 CD22들이 내포된다.
용어 "항-CD22 오로지 중쇄-항체", "CD22 오로지 중쇄-항체", "항-CD22 중쇄 항체" 및 "CD22 중쇄 항체"는 본원에서 호환적으로 이용되며, 본원에서 정의된 바의 인간 CD22를 비롯한 CD22에 면역특이적으로 결합하는, 본원에서 정의된 오로지 중쇄-항체를 지칭한다. 이 정의에는 인간 항-CD22 UniAbTM 항체를 생산하는 UniRatsTM를 비롯한 인간 면역글로불린를 발현시키는 유전자삽입된 렛 또는 유전자삽입된 마우스에 의해 만들어진 인간 중쇄 항체가 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
참고 폴리펩티드 서열에 대하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"은 참고 서열 및 후보 서열들을 배열하고, 필요에 따라 최대 퍼센트의 서열 동일성을 획득하기 위하여 갭을 도입한 후, 참고 폴리펩티드 서열에 있는 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에 있는 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 임의의 보존 치환은 서열 동일성 부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적으로 배열은 당업자의 기술 분야에 있는 다양한 방법을 통하여 이루어질 수 있는데, 예를 들면, 공개 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 이를 테면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 배열을 획득하기 위한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 배열을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서의 목적을 위하여, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 생성된다.
"단리된" 항체란 한 성분이 이의 자연적 환경에서 식별되고, 이로부터 분리되고 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경에서 오염 성분들은 항체의 연구, 진단 또는 치료요법적 용도를 간섭하는 물질이며, 그리고 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성(proteinaceous) 용질을 함유할 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 해당 항체는 (1) 예를 들면, Lowry 방법에 의해 측정할 때 항체 중량의 95%, 가장 바람직하게는 중량의 99% 이상; (2) 스피닝 컵 서열분석장치(sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻는데 충분한 정도로 정제되거나; 또는 (3) Coomassie 블루 또는, 바람직하게는 실버 착색을 이용하여, 환원 또는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 상동성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에, 재조합 세포 내에서 원위치(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본 발명의 항체에는 다중-특이적 항체가 내포된다. 다중-특이적 항체는 하나 이상의 결합 특이성을 갖는다. 용어 "다중-특이적"에는 특히 "이중특이적" 그리고 "삼중특이적"이 내포되며, 뿐만 아니라 더 높은-차수의 독립적 특이적 결합 친화성, 이를 테면 더 높은-차수의 다중에피토프성 특이성, 뿐만 아니라 사가(tetravalent) 항체 및 항체 단편들이 내포된다. 용어 "다중-특이적 항체", "다중-특이적 오로지 중쇄-항체", "다중-특이적 중쇄 항체", "다중-특이적 UniAbTM", 그리고 "다중-특이적 결합 화합물"은 본원에서 광의의 의미로 이용되며, 하나 이상의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포괄한다. 본 발명의 다중-특이적 중쇄 항-CD22 항체에는 CD22 단백질, 이를 테면 인간 CD22 상에 있는 하나의 단일 에피토프, 그리고 상이한 단백질, 이를 테면, 예를 들면, CD3 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체 (이를 테면, 이가(bivalent)이면서, 그리고 단가파라토픽성)가 특별히 내포된다. 본 발명의 다중-특이적 중쇄 항-CD22 항체에는 CD22 단백질, 이를 테면, 인간 CD22 상의 두 개 또는 그 이상의 비-중첩 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체 (이를 테면, 이가(bivalent)이면서, 그리고 이중파라토픽성)가 특별히 내포된다. 본 발명의 다중-특이적 중쇄 항-CD22 항체에는 CD22 단백질, 이를 테면 인간 CD22 상의 에피토프 및 상이한 단백질, 이를 테면, 예를 들면, CD3 단백질, 이를 테면 인간 CD3 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체 (이를 테면, 이가(bivalent)이면서, 그리고 이중파라토픽성)가 또한 특별히 내포된다. 본 발명의 다중-특이적 중쇄 항-CD22 항체에는 CD22 단백질, 이를 테면 인간 CD22 단백질 상의 두 개 또는 그 이상의 비-중첩 또는 부분적으로 중첩 에피토프, 그리고 상이한 단백질, 이를 테면, 예를 들면, CD3 단백질, 이를 테면 인간 CD3 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체 (이를 테면, 삼가(trivalent)이면서 이중파라토픽성)가 또한 특별히 내포된다.
본 발명의 항체에는 하나의 결합 특이성을 갖는 단일특이적 항체가 내포된다. 단일특이적 항체에는 단일 결합 특이성을 포함하는 항체, 뿐만 아니라, 동일한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 결합 단위를 포함하는 항체가 특별히 내포된다. 용어 "단일특이적 항체", "단일특이적 오로지 중쇄-항체", "단일특이적 중쇄 항체", 그리고 "단일특이적 UniAbTM"란 광의의 의미로 이용되며, 하나의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포괄한다. 본 발명의 단일특이적 중쇄 항-CD22 항체에는 CD22 단백질, 이를 테면 인간 CD22 상의 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체 (이를 테면, 단가(monovalent)이면서, 단일특이적)가 특별히 내포된다. 본 발명의 단일특이적 중쇄 항-CD22 항체에는 CD22 단백질, 이를 테면 인간 CD22 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 단위 (가령, 다가(multivalent) 항체)가 또한 특별히 내포된다. 예를 들면, 본 발명의 구체예들에 따른 단일특이적 항체에는 두 개의 항원-결합 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역이 내포될 수 있는데, 이때 각 항원-결합 도메인은 CD22 단백질 상에 동일한 에피토프에 결합한다 (이를 테면, 이가(bivalent)이면서 단일특이적).
"에피토프"는 항원 분자 표면에 있는, 단일 항체 분자가 결합하는 부위다. 일반적으로 항원은 몇 가지 또는 많은 다른 항원 결정기를 가지고 있으며, 많은 다른 항체와 반응한다. 이 용어에는 특히 선형의 에피토프와 입체형태의 에피토프가 내포된다.
"에피토프 맵핑 (epitope mapping)"은 표적 항원에 대한 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 확인하는 과정이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태의 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 내의 아미노산의 연속적인 배열에 의해 형성된다. 입체형태적 에피토프는 단백질 서열에서 불연속적인 아미노산으로 형성되지만, 단백질을 3-차원으로 폴딩할 때 함께 모이게 된다.
"다중에피토프 특이성"은 동일하거나 또는 상이한 표적(들) 상의 2개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 상기에서 명시된 바와 같이, 본 발명에는 다중에피토프 특이성을 갖는 항-CD22 중쇄 항체, CD22 단백질 이를 테면, 인간 CD22 상의 하나 또는 그 이상의 비-중첩 에피토프에 결합하는 항-CD22 중쇄 항체; 그리고 CD22 단백질 상의 하나 또는 그 이상의 에피토프와 상이한 단백질, 이를 테면, 예를 들면, CD3 단백질 상의 에피토프에 결합하는 항-CD22 중쇄 항체가 특별히 내포된다. 용어 항원의 "비-중첩 에피토프(들)" 또는 "비-경쟁적 에피토프(들)"은 항원-특이적 항체의 쌍에서 하나의 구성원에 의해 인지되지만, 그러나 다른 구성원에 의해서는 인지되지 않는 에피토프(들)을 의미하는 것으로 본원에서 정의된다. 비-중첩 에피토프를 인지하는 항체의 쌍, 또는 다중-특이적 항체 상에서 동일한 항원을 표적으로 하는 항원-결합 영역은 해당 항원에 결합에 대해 경쟁하지 않고, 동시에 해당 항원에 결합할 수 있다.
두 항체가 동일한 또는 입체적으로 중첩 에피토프를 인지할 때, 항체는 참조 항체와 "필수적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 두 에피토프가 동일한 또는 입체적으로 중첩 에피토프에 결합하는 지의 여부를 결정하는 가장 많이 이용되고, 신속한 방법은 경쟁 분석법이며, 예를 들어, 라벨된 항원 또는 라벨된 항체를 사용하여 다수의 상이한 포멧으로 구성될 수 있다. 보통, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정되며, 라벨된 항체의 결합을 차단하는 라벨안된 항체의 능력은 방사성, 또는 효소 라벨을 사용하여 측정된다.
용어 "가(valent)"란 항체 분자에서 명시된 수의 결합 부위가 존재함을 나타낸다.
"단가(monovalent)" 항체는 하나의 결합 부위를 갖는다. 따라서, 단가 항체는 또한 단일특이적이다.
"다가(multi-valent)" 항체는 두 개 또는 그 이상의 결합 부위를 갖는다. 따라서, 용어 "이가(bivalent)", "삼가(trivalent)", 그리고 "사가(tetravalent)"란 차례로 두 개 결합 부위, 세 개 결합 부위, 그리고 네 개 결합 부위가 존재함을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 이가(bivalent)이며, 삼가(trivalent), 사가(tetravalent), 또는 그렇지 않으면 다가다가lent)일 수 있다. 본 발명의 구체예들에 따른 이가 항체는 동일한 에피토프에 두 개의 결합 부위를 가질 수 있고 (이를 테면, 이가(bivalent)서, 단일파라토픽성), 또는 두 개의 한 에피토프에 대해 두 개의 결합 부위를 가진다(이를 테면, 이가(bivalent)이면서 중파라토픽).
다수의 방법 및 단백질 배열형태가 공지되어 있고, 이중특이적 단일클론성 항체 (BsMAB), 삼중-특이적 항체, 등등의 준비에 이용된다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"는 본원에서 광의의 의미로 이용되며, 공작된(engineered) 수용체를 지칭하는데,, 막에 펼쳐있는 그리고 세포내-신호전달 도메인에 대해 원하는 결합 특이성(가령, 단일클론성 항체의 항원-결합 영역 또는 다른 리간드)을 접목시킨다. 전형적으로, 해당 수용체를 이용하여 키메라 항원 수용체 (CAR)를 창출하도록 T 세포 상에 단일클론성 항체의 특이성을 접목시킨다. (J Natl Cancer Inst, 2015; 108(7):dvj439; 그리고 Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383).
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체가 내포하도록 본원에서 사용된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코드되지 않는 아미노산 잔기 (가령, 시험관에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 도입된 돌연변이, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해)를 내포할 수 있다. 용어 "인간 항체"에는 유전자삽입된 동물, 본원에서 상기 특정된 바와 같이, 이를 테면, 유전자삽입된 렛 또는 마우스, 구체적으로 UniRatsTM에 의해 만들어진 인간 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 오로지 중쇄-항체, 구체적으로 UniAbsTM가 내포된다.
"키메라 항체" 또는 "키메라 면역글로불린"이란 적어도 상이한 두 개의 Ig 좌의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 분자, 가령, 인간 Ig 좌에 의해 인코드된 부분과 렛 Ig 좌에 의해 인코드된 부분을 포함하는 유전자삽입된 항체를 의미한다. 키메라 항체에는 비-인간 Fc-영역 또는 인위적인 Fc-영역, 그리고 인간 이디오타입(idiotypes)을 갖는 유전자삽입된 항체가 내포된다. 이러한 면역글로불린은 이러한 키메라 항체를 만들도록 공작된 본 발명의 동물로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동체(effector) 세포"란 면역 반응의 인지 및 활성화 단계와 대조적으로, 면역 반응의 효과기 단계(effector phase)에 관여하는 면역 세포를 지칭한다. 일부 작동체 세포는 특이적 Fc 수용체들을 발현시키고, 특이적 면역 기능을 수행한다. 일부 구체예들에서, 작동체 세포, 이를 테면, 천연 킬러 세포는 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있다. 예를 들면, FcR을 발현하는 단핵구 및 대식세포는 표적 세포를 특이적으로 죽이고, 면역계의 다른 구성요소에 항원을 제시하거나, 또는 항원을 제시하는 세포에 결합하는 데 관여한다. 일부 구체예들에서, 작동체 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식작용화시킬 수 있다.
"인간 작동체 세포"는 수용체들 이를 테면, T 세포 수용체들 또는 FcRs를 발현시키고, 작동체 기능을 수행하는 백혈구다. 바람직하게는, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현시키고, ADCC 작동체 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 자연 킬러(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되며, NK 세포가 바람직하다. 상기 작동체 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
용어 "면역 세포"는 골수성 또는 림프성 기원의 세포, 예를 들어, 림프구(이를 테면, B 세포 및 세포용해성 T 세포(CTL)를 포함하는 T 세포), 킬러 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예를 들어 호중구, 과립구, 비만 세포 및 호염기구가 내포되나, 이에 국한되지 않는, 광의의 의미로 본원에서 이용된다.
"항체 작동체 기능"이란 항체의 Fc 영역 (가령, 고유한 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기여하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 작동체 기능의 예로는 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체들 (가령, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절, 등등이 내포된다.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"란 Fc 수용체 (FcRs)를 발현하는 비-특이적 세포 독성 세포 (예를 들면, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포의 결합 항체를 인식하고, 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기시키는 세포-매개된 반응을 말한다. ADCC를 중개하는 일차 세포, NK 세포는 오직 FcγRIII만을 발현시키고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, U.S. 특허 번호. 5,500,362 또는 5,821,337에서 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 검증을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 작동 세포들은 주변 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들면, 동물 모델에서 생체에서 평가될 수 있는데, 가령, Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)에서 설명된다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"이란 보체 존재 하에서 표적을 용해시키는 분자의 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는 그들의 동족(cognate) 항원과 복합된 분자(가령, 항체)에 대한 보체 시스템의 제 1 성분 (C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석 (가령, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996))이 실행될 수 있다.
"결합 친화성"이란 분자의 단일 결합 부위 (예컨데, 항체)와 이의 결합 짝 (예컨데, 항원) 사이에 비공유 상호작용의 총 강도를 말한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "결합 친화력"이란 결합 쌍의 구성요소들간 (예를 들면, 항체와 항원)에 1:1 상호작용을 반영한 고유한 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화력은 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화력은 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 낮은-친화력 항체는 일반적으로 항원을 천천히 결합 시키며 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은-친화력 항체는 일반적으로 항원을 더 빨리 결합시키고, 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Kd" 또는 "Kd 값"은 동역학 모드에서 Octet QK384 기기(Fortebio Inc., Menlo Park, CA)를 사용하여 생물층 간섭계에 의해 결정된 해리 상수를 나타낸다. 예를 들면, 항-마우스 Fc 센서에 마우스-Fc 융합된 항원을 로딩하고, 그 다음 항체-함유 웰에 침지되어 농도 의존적 결합율(kon)을 측정한다. 항체 해리 속도(koff)는 센서가 완충액만을 포함하는 웰에 담그는 최종 단계에서 측정된다. Kd는 koff/kon의 비율이다. (더 상세한 내용은 Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009을 참고한다).
용어 "치료", "치료하는", 및 이와 유사한 것 등은 본원에서 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 방지하는 점에 있어서 예방적이거나, 및/또는 질환 및/또는 이 질환이 원인이 되는 역 효과의 부분적인 또는 완전한 치료에 있어서 치료요법적일 수 있다. "치료"란 본원에서 이용된 바와 같이, 포유동물의 질환 치료를 포괄하며, 다음이 내포된다: (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만, 아직 해당 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상에서 이런 질환이 발생하는 것을 예방하고; (b) 해당 질환을 억제, 예를 들면, 이의 발생을 억제하고; 또는 (c) 해당 질환을 완화, 예를 들면, 질병의 퇴행을 일으키는 것이 내포된다. 치료제는 질병 또는 손상의 시작 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 또는 감소시키는 진행 중인 질병의 치료가 특히 중요하다. 이러한 치료는 영향을 받은 조직에서 기능이 완전히 상실되기 전 수행되는 것이 바람직하다. 대상 요법은 질병의 증상 단계 동안, 그리고 어떤 경우에는 질병의 증상 단계 후에 투여될 수 있다.
"치료학적 유효량"은 대상체에게 치료적 이점을 부여하는데 필요한 활성제의 양을 의미한다. 예를 들면, "치료학적 유효량"이란 병리학적 증상, 질병 진행 또는 질환과 관련된 생리학적 상태의 개선을 유도, 개선하거나, 또는 그렇지 않으면 장애에 대한 내성을 개선시키는 양이다.
본 발명의 내용에서 용어 "B-세포 신생물" 또는 "성숙 B-세포 신생물"에는 작은 림프구성 림프종, B-세포 전-림프구성 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 버킷 림프종, 소포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 다발성 골수종, 림프구형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈장 세포 신생물, 이를 테면 혈장 세포 골수종, 형질세포종, 단일클론성 면역글로불린 퇴적 질환, 중쇄 질환, MALT 림프종, 결절성 변연 B 세포 림프종, 맥관내 거대 B 세포 림프종, 일차 삼출액 림프종, 림프종 육아종증, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 털 세포 백혈병, 일차 삼출액 림프종 및 AIDS-관련된 비-호지킨 림프종이 내포된다.
용어 "CD22의 발현에 의해 특징화된"이란 CD22 발현이 해당 질환 또는 장애의 특징이 되는 하나 또는 그 이상의 병리학적 과정과 연합되거나, 또는 관련된 임의의 질환 또는 장애를 광범위하게 지칭한다. 이러한 장애에는 B-세포 신생물이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
용어 "대상체", "개체", 그리고 "환자"는 본원에서 호환이용되며, 치료에 대해 평가되는 및/또는 치료중인 포유류를 지칭한다. 한 구체예에서, 해당 포유류는 인간이다. 용어 "대상체", "개체", 그리고 "환자"에는 암을 가지고 있는 개체, 자가면역 질환을 가진 개체, 병원균 감염된 개체, 그리고 이와 유사한 것들이 포괄되나, 이에 국한되지 않는다. 대상체는 인간일 수 있지만, 뿐만 아니라 다른 포유류 특히, 인간 질환을 위한 실험실 모델로 유용한 포유류, 가령, 마우스, 렛, 등등이 또한 내포될 수 있다.
"약제학적 제형(formulation)"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없는 독성을 갖는 추가 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다. 이러한 제형은 무균성이다. "약제학적으로 허용되는" 부형제(비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효량을 제공하기 위해 대상 포유동물에게 합리적으로 투여될 수 있는 부형제이다.
"무균" 제형이란 무균이거나, 또는 모든 살아있는 미생물 및 그들의 포자가 없거나, 또는 실질적으로 없다. "동결" 제형은 0℃ 미만의 온도에 있는 제형이다.
"안정한" 제형이란 저장할 때, 해당 제형 안의 단백질이 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 제형이다. 바람직하게는, 제형은 본질적으로 물리적 및 화학적 안정성 뿐만 아니라 저장 시 생물학적 활성을 유지한다. 저장 기간은 일반적으로 제형의 의도된 저장 수명을 기반으로 선택된다. 단백질 안정성을 측정하는 다양한 분석 기술이 당분야에서 이용가능하고, 예를 들면, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993)에서 검토된다. 선택된 온도에서 선택된 시간 동안 안정성을 측정할 수 있다. 안정성은 다양한 방식으로 정성적 및/또는 정량적으로 평가할 수 있는데, 응집체 형성 평가 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피 사용, 탁도 측정 및/또는 육안 검사); 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전점 집속(icIEF), 또는 모세관 구역 전기영동을 사용하여 전하 불균일성을 평가; 아미노 말단 또는 카르복시 말단 서열 분석; 질량 분석; 환원된 항체와 무손상 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵 (예를 들면, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능을 평가하는 것들이 내포된다. 불안정성에는 다음 중 하나 또는 그 이상이 연루될 수 있다: 응집, 탈아미드화 (가령, Asn 탈아미드화), 산화(가령, Met 산화), 이성질체화(가령, Asp 이성질체화), 클리핑/가수분해/단편화(가령, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 짝을 이루지 않은 시스테인(들), N- 말단 확장, C-말단 프로세싱, 글리코실화 차이 등등.
II. 상세한 설명
항-CD22 항체
본 발명의 측면 항-CD22 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 화합물이 내포된다. 인간 CD22에 결합하는 밀접하게 관련된 오로지 중쇄-항체 결합 도메인의 패밀리가 본원에서 제공된다. 이 패밀리의 항체는 본원에서 특정되고, 표 1에서 나타낸 CDR 서열 세트를 포함하며, 표 2에 제시된 서열 식별 번호: 24 ~ 84의 제공된 중쇄 가변 영역 (VH) 서열에 의해 구체화된다. 본원에서 기술된 항체는 임상 치료요법적 제제(들에로 유용성에 기여하는 다수의 잇점을 제공한다. 이 항체에는 다양한 범위의 결합 친화성을 갖는 구성원이 내포되며, 이로써 원하는 결합 친화성을 갖는 특이적 서열의 선별이 가능하다.
표 1: 항-CD22 중쇄 항체 특유의 CDR 아미노산 서열.
Figure pct00002
표 2. 항-CD22 중쇄 항체 가변 도메인 아미노산 서열.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
개발 및 치료요법제 또는 다른 용도, 이를 테면, 이중특이적 항체 (가령, 도 14A에 나타낸 바와 같은), 또는 삼중-특이적 항체, 또는 CAR-T 구조의 일부분 (가령, 도 14B에 나타낸 바와 같은)로써의 용도를 비롯한 다른 용도를 위하여 본원에서 제공되는 것들로부터 적합한 항체를 선택할 수 있다. 도 14A는 항-CD3 x 항-CD22 다중-특이적 항체의 비-제한적 실시예의 예시이며, 여기에서 항-CD22 도메인은 단가(monovalent)이며, 단일특이적이다. 일부 구체예들에서, 항-CD3 도메인은 CH1 도메인을 함유하며, 경쇄와 쌍을 이루고, 한편 항-CD22 도메인(들)은 오로지 중쇄-항체로부터 유래되며, CH1 도메인을 함유하지 않거나, 또는 경쇄와 상호작용하지 않는다. 일부 구체예들에서, 두 중쇄는 가령, 노브-인투-홀(knobs-into-holes) 기술을 이용하여 쌍을 형성한다.
도 15에서 도시된 항체로 돌아가서, 도 15A는 항-CD3 x 항-CD22 이중특이적 항체를 도시하며, 이때 항-CD22 결합 가지(arm)는 단가이며, 단일특이적이고, 그리고 항-CD22 가지(arm)의 항원-결합 도메인은 단일 배열형태이고, 이것은 오로지 하나의 항원-결합 도메인이 존재한다는 의미다. 도 15B는 항-CD3 x 항-CD22 이중특이적 항체를 도시하고, 이때 항-CD22 결합 가지(arm)는 이가이며, 단일특이적이고, 그리고 항-CD22 가지(arm)의 항원-결합 도메인은 나란한(tandem) 배열형태이며, 이것은 나란하게 위치된 두 개의 동일한 항원 결합 도메인이 있음을 의미한다. 도 15C는 항-CD3 x 항-CD22 이중특이적 항체를 도시하고, 이때 항-CD22 결합 가지(arm)는 이가이며, 이중파라토픽이고, 그리고 항-CD22 가지(arm)의 항원-결합 도메인은 나란한 배열형태다.
후보 단백질에 대한 친화도의 결정은 Biacore 측정과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 항체 패밀리의 구성원은 약 10-6 ~ 약 10-10 부근; 약 10-6 ~ 약 10-9 부근; 약 10-6 ~ 약 10-8 부근; 약 10-8 ~ 약 10-11 부근; 약 10-8 ~ 약 10-10 부근; 약 10-8 ~ 약 10-9 부근; 약 10-9 ~ 약 10-11 부근; 약 10-9 ~ 약 10-10 부근; 또는 이들 범위 안의 임의의 값을 갖는, 약 10-6 ~ 약 10-11 부근의 Kd의 CD22에 대한 친화성을 가질 수 있다. 친화성 선택은 시험관 내 분석, 전-임상 모델 및 임상 시험을 비롯하여, CD22 생물학적 활성의 조절하는, 예를 들어, 차단에 대한 생물학적 평가, 뿐만 아니라 잠재적 독성 평가를 통해 확인할 수 있다.
본원에서 항체 패밀리의 구성원은 시노몰구스(Cynomolgus) 꼬리짧은원숭이의 CD22 단백질과는 교차-반응성이 없지만, 그러나 시노몰구스(Cynomolgus) 꼬리짧은원숭이의 CD22 단백질, 또는 원한다면 임의의 다른 동물 종의 CD22와의 교차-반응성을 제공하도록 공작될 수 있다.
본원의 CD22-특이적 항체 패밀리는 인간 VH 틀구조에서 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 상기 CDR 서열은 예를 들면, CDR1, CDR2와 CDR3에 대해 차례로 서열 식별 번호: 24 ~ 84에서 제시된 예시적인 가변 영역 서열에서 아미노산 잔기 26-35; 53-59; 및 98-117 부근의 영역에 위치할 수 있다. 비록 일반적으로 서열의 순서가 동일하게 유지될지라도, 상이한 틀구조 서열이 선택되는 경우, CDR 서열이 상이한 위치에 있을 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 발명의 항-CD22 항체의 CDR1 서열, CDR2 서열, 및 CDR3 서열은 다음의 구조식에 의해 포괄되며, 여기에서 X는 가변 아미노산을 나타내며, 하기에 표시된 특이적 아미노산일 수 있다.
CDR1
G X1 S I X2 X3 X4 X5 X6 Y (서열 식별 번호: 104)
여기에서
X1은 D 또는 G이며;
X2는 S, T, I 또는 N이며;
X3은 S 또는 D이며;
X4는 G, S 또는 N이며;
X5는 D, G 또는 S이며; 그리고
X6은 Y 또는 H이다.
CDR2
X7 X8 Y X9 G X10 X11 (서열 식별 번호: 105)
여기에서
X7은 I 또는 V이며;
X8은 Y 또는 H이며;
X9는 S 또는 T이며;
X10은 A, V 또는 S이며; 그리고
X11은 T 또는 A이다.
CDR3
X12 R X13 D S S X14 W R S (서열 식별 번호: 106)
여기에서
X12는 T, A 또는 K이며;
X13은 D 또는 E이며; 그리고
X14는 N 또는 S이다.
대표적인 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열은 표 1 및 표 3에 나타낸다.
표 3: 항-CD22 중쇄 항체 CDR1, CDR2와 CDR3 아미노산 서열.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
일부 구체예들에서, 본 발명의 항-CD22 오로지 중쇄-항체는 서열 식별 번호: 1-10중 임의의 하나의 CDR1 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 CDR1 서열은 서열 식별 번호: 1이다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 항-CD22 오로지 중쇄-항체는 서열 식별 번호: 11-17중 임의의 하나의 CDR2 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 CDR2 서열은 서열 식별 번호: 11이다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 항-CD22 오로지 중쇄-항체는 서열 식별 번호: 18-23중 임의의 하나의 CDR3 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 CDR2 서열은 서열 식별 번호: 18이다.
추가 구체예에서, 본 발명의 항-CD22 오로지 중쇄-항체는 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열; 서열 식별 번호: 11의 CDR2 서열; 그리고 서열 식별 번호: 18의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 구체예들에서, 본 발명의 항-CD22 오로지 중쇄-항체는 서열 식별 번호: 24 ~ 84의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열중 임의의 서열을 포함한다 (표 2).
여전히 추가 구체예에서, 본 발명의 항-CD22 오로지 중쇄-항체는 서열 식별 번호: 24의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 항-CD22 오로지 중쇄-항체의 CDR 서열은 서열 식별 번호: 1 ~ 23중 임의의 하나에서 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열 또는 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열의 세트와 비교하여 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 포함한다 (도 1). 일부 구체예들에서, 전술한 아미노산 치환(들)은 상기 제공된 식에 대비하여 CDR1의 아미노산 위치 4-6중 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이며, 및/또는 CDR2의 아미노산 위치 2, 4-7중 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이며, 및/또는 CDR3의 아미노산 위치 5 및 12중 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이다. 일부 구체예들에서, 본원의 오로지 중쇄 항-CD22 항체는 서열 식별 번호: 24 ~ 84의 중쇄 가변 영역 서열중 임의의 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 98% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는, 중쇄 가변 영역 서열을 포함할 수 있다 (표 2에 나타냄).
일부 구체예들에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체가 제공되며, 이들은 이중특이적 3-쇄 항체 유사 분자를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는, 본원에서 논의된 임의의 배열 형태를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 다중-특이적 항체는 CD22에 대한 결합 특이성을 갖는, 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 다중-특이적 항체는 적어도 두 개의 항원-결합 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 이때 각 항원-결합 도메인은 CD22에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 다중-특이적 항체는 제 1 항원 (가령, CD3)에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄/경쇄 쌍을 포함할 수 있고, 그리고 오로지 중쇄-항체의 중쇄를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 오로지 중쇄-항체의 중쇄는 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인 (CH1 도메인 없이)을 포함하는 Fc 부분을 포함한다. 한 가지 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 작동체 세포 상의 항원 (가령, T 세포 상의 CD3 단백질)에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄/경쇄 쌍을 포함하고, 그리고 CD22에 대한 결합 특이성을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 오로지 중쇄-항체에서 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 다중-특이적 항체는 경쇄 가변 도메인과 쌍을 이룬 CD3-결합 VH 도메인을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 경쇄는 고정된(fixed) 경쇄다. 일부 구체예들에서, 상기 CD3-결합 VH 도메인은 인간 VH 틀구조에서 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 고정된 경쇄는 인간 VL 틀구조에서 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함한다. CD3-결합 VH 도메인과 경쇄 가변 도메인은 함께, CD3에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구체예들에서, CD3-결합 VH 도메인은 서열 식별 번호: 91의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, CD3-결합 VH 도메인은 서열 식별 번호: 91의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 고정된 경쇄는 서열 식별 번호: 92의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 고정된 경쇄는 서열 식별 번호: 92의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
상기-기술된 CD3-결합 VH 도메인과 경쇄 가변 도메인을 포함하는 다중-특이적 항체는 예를 들면, 공개된 PCT 출원 공개 번호 WO2018/052503 (이의 명세서는 본원에 이의 전문이 참고자료에 편입된다)에서 기술된 바와 같이, 유리한 속성들을 갖는다. 본원에 기술된, CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 다중-특이적 항체 및 항원-결합 도메인은 하나 또는 그 이상의 CD22 에피토프 뿐만 아니라 CD3에 대한 결합 친화성을 보유하는 다중-특이적 항체를 만들기 위해, 본원에 기술된 CD3-결합 도메인과 고정된 경쇄 도메인과 복합될 수 있다.
표 4. 항-CD3 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 아미노산 서열.
Figure pct00010
표 5. 항-CD3 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열.
Figure pct00011
표 6: 인간 IgG1 및 IgG4 Fc 영역 서열.
Figure pct00012
표 7: 추가적인 서열.
Figure pct00013
일부 구체예들에서, 이중특이적 또는 다중-특이적 항체가 제공되며, 이들은 이중특이적 3-쇄 항체 유사 분자를 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는, 본원에서 논의된 임의의 배열 형태를 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 이중특이적 항체는 CD22에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 그리고 CD22이외의 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다 일부 구체예들에서, 이중특이적 항체는 제 1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄/경쇄 쌍, 그리고 오로지 중쇄-항체로부터의 중쇄 (CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인 (CH1 도메인 없이)을 포함하는 Fc 부분을 포함), 그리고 제 2 항원의 에피토프 또는 제 1 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 한 가지 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 작동체 세포 상의 항원 (가령, T 세포 상의 CD3 단백질)에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄/경쇄 쌍을 포함하고, 그리고 CD22에 대한 결합 특이성을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 오로지 중쇄-항체에서 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 여기에서 본 발명의 결합 화합물은 이중특이적 항체이며, 이 항체의 하나의 가지(arm) (하나의 결합 모이어티, 또는 하나의 결합 단위)는 인간 CD22에 특이적이며, 한편 다른 가지(arm)는 표적 세포, 종양-연합된 항원, 표적화 항원, 가령, 인테그린, 등등, 병원체 항원, 체크포인트 단백질, 그리고 이와 유사한 것들에 대해 특이적일 수 있다. 표적 세포에는 하기에서 논의된 바와 같이, 혈액 종양의 세포, 가령, B-세포 종양이 내포되지만, 이에 국한되지 않은 암 세포가 특별히 내포된다. 일부 구체예들에서, 해당 항체의 하나의 가지(arm) (하나의 결합 모이어티, 또는 하나의 결합 단위)는 인간 CD22에 특이적이며, 한편 다른 가지 (arm)는 CD3에 특이적이다.
일부 구체예들에서, 결합 화합물은 서열 식별 번호: 97의 서열에 연계된 서열 식별 번호: 92의 서열을 포함하는 항-CD3 경쇄 폴리펩티드, 서열 식별 번호: 98, 99, 100 또는 101중 임의의 하나의 서열을 포함하는 항-CD3 중쇄 폴리펩티드, 그리고 서열 식별 번호: 93, 94, 95 또는 96중 임의의 하나의 서열에 연계된 서열 식별 번호: 24-84중 임의의 하나의 서열을 포함하는 항-CD22 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 이들 서열은 다양한 방식으로 조합되어 원하는 IgG 하위클래스, 가령, IgG1, IgG4, 침묵화된 IgG1, 침묵화된 IgG4의 이중특이적 항체를 만들 수 있다.
이중특이적 항체는 단일 쇄 폴리펩티드, 2-쇄 폴리펩티드, 3-쇄 폴리펩티드, 4-쇄 폴리펩티드, 그리고 이의 다중이 내포되나, 이에 국한되지 않는, 다양한 포멧이 본 발명의 범위 안에 있다. 본원의 다중-특이적 항체에는 CD22에 결합하는 T 세포 다중-특이적 (가령, 이중특이적) 항체 (항-CD22 x 항-CD3 항체)가 특별히 내포되며, 이는 성숙 B-세포, 그리고 CD3 상에서 선택적으로 발현된다. 이러한 항체는 CD22를 발현시키는 세포의 강력한 T 세포 매개된 사멸을 유도한다.
항체의 준비
본 발명의 다중특이적 결합 화합물은 당분여에 공지된 방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본원의 중쇄 항체는 유전자삽입된 마우스 및 렛, 바람직하게는 렛을 비롯한 유전자삽입된 동물에 의해 생산되며, 이때 내생성 면역글로불린 유전자는 녹아웃되거나, 또는 불능상태다. 바람직한 구체예에서, 본원의 중쇄 항체는 UniRat™에서 만들어진다. UniRat™ 는 이들의 내생성 면역글로불린 유전자 (침묵화된)를 보유하며, 인간 면역글로불린 중쇄 전좌(translocus)를 사용하여, 완전한(fully) 인간 HCAbs의 다양하고, 자연적으로 최적화된 레퍼토리를 발현시킨다. 렛에서 내생성 면역글로불린 좌는 다양한 기술을 이용하여 UniRat™에서 녹아웃되거나, 또는 침묵화될 수 있고, 아연-핑거 (엔도)뉴클레아제 (ZNF) 기술을 이용하여 내생성 렛(rat) 중쇄 J-좌, 경쇄 Cκ 좌 및 경쇄 Cλ 좌를 비활성화시켰다. 난모세포로의 미세주입을 위한 ZNF 구조체 IgH 및 IgL 녹아웃(KO) 라인을 생성할 수 있다. 상세한 것은 가령, Geurts et al., 2009, Science 325:433을 참고한다. Ig 중쇄 녹-아웃 렛의 특징화는 Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941에서 보고되었다. ZNF 기술의 장점은 최대 몇 kb의 삭제를 통해 유전자 또는 유전자 좌를 침묵시키는 비-상동성 말단 연결(joining)을 통하여 상동성 통합을 위한 표적 부위를 제공할 수도 있다 (Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67). UniRat™ 에서 만들어진 인간 중쇄 항체는 UniAbsTM 이며, 통상적인 항체를 이용하여 공격할 수 없는 에피토프에 결합할 수 있다. 이들의 높은 특이성, 친화성, 그리고 작은 크기는 단일-특이적 적용 및 다중-특이적 적용 모두에 이상적이 되도록 한다.
UniAbsTM에 추가하여, 낙타과 VHH 틀구조 및 돌연변이, 그리고 이들의 기능적 VH 영역이 결여된 오로지 중쇄-항체가 본원에 특별히 내포된다. 이러한 오로지 중쇄-항체는 예를 들면, 가령, WO2006/008548에서 기술된 바와 같이 완전한 인간의 오로지 중쇄 유전자 좌를 포함하는 유전자삽입된 렛에서 만들어질 수 있지만, 그러나 유전자삽입된 다른 포유류, 이를 테면, 토끼, 기니아피그, 렛 또한 이용될 수 있고, 그중 렛과 마우스가 바람직하다. VHH 또는 VH 기능적 단편들이 내포된 오로지 중쇄-항체는 재조합 DNA 기술을 통하여 적합한 진핵 숙주 또는 원핵 숙주, 예를 들면, 포유류 세포 (가령, CHO 세포), 대장균 또는 효모에서 인코딩 핵산을 발현시킴으로써 또한 만들어질 수 있다.
오로지 중쇄-항체의 도메인은 항체와 작은 분자 약물의 장점을 조합하는데: 단가 또는 다가일 수 있고; 독성이 낮고; 그리고 제작에 단가-효과적이다. 작은 크기로 인해 이러한 도메인은 경구 또는 국소 투여를 포함하여 투여하기 쉽고, 위장 안정성을 비롯한 높은 안정성; 그리고 이들의 반감기는 원하는 용도 또는 적응증에 맞게 조정할 수 있다. 또한, HCAbs의 VH 및 VHH 도메인을 비용 효휼적인 방식으로 제작할 수 있다.
특정 구체예에서, UniAbsTM를 비롯한 중쇄 본 발명의 항체는 FR4 영역의 제 1 위치 (Kabat 번호매김 시스템에 따르면 아미노산 위치 101)에서 고유의 아미노산 잔기를 또다른 아미노산 잔기 (해당 위치에 고유의 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 연합된 표면-노출된 소수성 패치를 파괴시킬 수 있는)로 대체시킴으로써, 고유의 아미노산 잔기를 보유한다. 이러한 소수성 패치는 해당 항체 경쇄 불변 영역과의 계면에 보통 매립되지만, 그러나 HCAbs에서 HCAbs의 경쇄 연합 및 원치않는 응집으로 인해 적어도 부분적으로 표면 노출된다. 상기 치환된 아미노산 잔기는 바람직하게는 하전되며, 그리고 더 바람직하게는 양으로 하전되는데, 이를 테면 리신 (Lys, K), 아르기닌 (Arg, R) 또는 히스티딘 (His, H), 바람직하게는 아르기닌 (R)이다. 바람직한 구체예에서, 유전자삽입된 동물로부터 유래된 오로지 중쇄-항체는 위치 101에 Trp가 Arg로 돌연변이된 것을 함유한다. 결과적으로 HCAbs는 응집 없는 생리학적 조건 하에서 바람직하게는 높은 항원-결합 친화성 및 용해성을 갖는다.
본 발명의 일부분으로써, ELISA 단백질 분석 및 세포-결합 분석에서 인간 CD22에 결합하는, UniRatTM 동물 (UniAbTM)의 특유의 서열을 갖는 인간 항-CD22 중쇄 항체가 식별되었다. 식별된 중쇄 가변 영역 (VH) 서열 (가령, 표 2 참조)은 인간 CD22 단백질에 대한 결합 및/또는 CD22+ 세포에 대한 결합에 있어서 양성이지만, 그리고 CD22를 발현시키지 않는 세포에 대한 결합에는 모두 음성이다.
CD22 단백질 상의 비-중첩 에피토프에 결합하는 중쇄 항체, 가령, UniAbsTM은 경쟁 결합 분석, 이를 테면 효소-연계된 면역분석 (ELISA 분석) 또는 유동 세포측정 경쟁적 결합 분석에 의해 식별해낼 수 있다. 예를 들면, 표적 항원에 결합하는 것으로 알려진 항체와 관심대상 항체 사이의 경쟁을 이용할 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 항체 세트를 참조 항체와 경쟁하는 항체와 경쟁하지 않는 항체 세트로 나눌 수 있다. 비-경쟁 항체는 참조 항체에 의해 결합된 에피토프와 중첩되지 않는 별개의 에피토프에 결합하는 것에 의해 식별된다. 종종, 하나의 항체를 고정시키고, 항원이 결합되면, 두 번째 라벨된(가령, 바이오틴화된) 항체가 포획된 항원에 결합하는 능력은 ELISA 분석을 통하여 테스트된다. 이것은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 플렛폼, 가령, ProteOn XPR36 (BioRad, Inc), Biacore 2000 및 Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences), 그리고 MX96 SPR 영상장치 (Ibis technologies B.V.), 뿐만 아니라 생물층 간섭계 플렛폼, 이를 테면 Octet Red384 및 Octet HTX (ForteBio, Pall Inc)을 이용하여 또한 실행될 수 있다. 자세한 내용은 본원의 실시예들을 참조한다.
전형적으로, 표준 기술, 이를 테면, 상기에서 기술된 경쟁 결합 분석으로 결정할 때, 표적 항원에 대한 참조 항체의 결합에 있어서 약 15-100%의 감소를 야기한다면, 이 항체는 참조 항체와 "경쟁한다". 다양한 구체예들에서, 상대적 저해는 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50% 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상이다.
약제학적 조성물, 용도 및 치료 방법들
본 발명의 또다른 측면은 약제학적으로 수용가능한 적합한 담체와 혼합된, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 다중특이적 결합 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약제학적으로 수용가능한 담체는 예를 들어, 어쥬번트, 고체 담체, 물, 완충제, 또는 치료요법적 성분을 담을 수 있는 당업계에서 사용되는 기타 담체, 또는 이들의 조합이 예시되지만 이에 국한되지 않는다.
한 구체예에서, 약제학적 조성물은 CD22에 결합하는 중쇄 항체 (가령, UniAbTM)를 포함한다. 또다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 CD22 단백질 상의 두 개 또는 그 이상의 비-중첩 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는, 다중-특이적 (이중특이적을 비롯하여) 중쇄 항체 (가령, UniAbTM)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 CD22에 대한 결합 특이성과 작동체 세포 상의 결합 표적 (가령, T 세포 상의 결합 표적, 이를 테면, 가령, T 세포 상의 CD3 단백질)에 대한 결합 특이성을 갖는 다중-특이적 (이중특이적을 비롯하여) 중쇄 항체 (가령, UniAbTM)를 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 항체의 약학 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 단백질을 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써, 이를 테면, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태와 같은 보관용으로 만들어진다 (가령, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 수용가능한 운반체, 부형제, 또는 안정화제는 이용되는 투약형 및 농도에서 수령자에게 비독성이며, 그리고 생리학적으로 수용가능한 담체의 예로는 완충액, 이를 테면, 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산; 아스코르브산, 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (이를 테면, 옥타데실디메틸벤질 암모니움 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로로이드, 벤제토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 이를 테면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르씨놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레솔); 저-분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 이를 테면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 폴리머 이를 테면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 이를 테면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린이 포함된 기타 탄수화물; 킬레이트 물질들, 이를 테면 EDTA; 슈가, 이를 테면, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 솔비톨; 염-형성 카운터-이온, 이를 테면, 나트륨, 금속 착물 (가령, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 이를 테면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
비경구 투여용 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균되고 실질적으로 등장성이고, Good Manufacturing Practice (GMP) 조건 하에 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 투약형 (이를 테면, 단일 투여를 위한 용량)으로 제공될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다. 본원의 항체는 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여되거나, 또는 피하로 투여될 수 있다. 주사 투여를 위해, 본원의 항체는 수용액, 바람직하게는 주사 부위의 불편함을 감소시키기 위해 생리학적으로 적합한 완충액으로 제형화될 수 있다. 이 용액은 위에서 논의한 바와 같이 담체, 부형제 또는 안정제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 동결건조된 형태이며, 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원-없는 물과 함께 구성될 수 있다.
항체 제형은 예를 들면, U.S. 특허 번호 9,034,324에서 기술된다. 본 발명의 UniAbsTM을 비롯한 중쇄 항체용으로 유사한 제형이 이용될 수 있다. 피하용 항체 제형은 예를 들면, US20160355591 및 US20160166689에 기술된다.
사용 방법
본원에서 기술된 오로지 중쇄 항-CD22 항체, 다중-특이적 항체, 그리고 약제학적 조성물을 이용하여 CD22의 발현을 특징으로 하는 질환 및 병태, 예를 들면, 본원에 기술된 병태 및 질환이 내포되나, 이에 국한되지 않는 질환 및 병태를 치료할 수 있다.
CD22는 135-kDa 유형 I 막경유 단백질이며, 프레(pre)- 및 미숙 B 세포에서는 낮은 수준으로, 성숙 B 세포에서는 최대로 발현되고, 종국에는 혈장 세포에서 하향조절되는 (가령, Walker et al., Immunology, 2008 Mar; 123(3) 314-25). CD22는 소포성 (일차 및 이차 B 세포 구역), 맨틀 세포, 그리고 변연부 B 세포에서는 강력하게 발현되며, 그리고 B 세포 악성종양 환자의 샘플에 60%~80% 존재한다고 보고된 바 있다 (Alderson et al., Clin. Cancer Res 2009;15(3) February 11, 2009). 많은 혈액 악성종양에서 관찰된 발현으로 인해, CD22는 항체-기반 치료제의 유망한 표적이다.
한 측면에서, 본원에 기술된 CD22 중쇄 항체 (가령, UniAbsTM) 및 약제학적 조성물은 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 비-호지킨 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 그리고 B-세포 급성 림프아구성 백혈병 (ALL)이 내포되나, 이에 국한되지 않는 CD22의 발현을 특징으로 하는 혈액 악성종양을 치료하는데 이용될 수 있다.
미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL 또는 DLBL)는 성인들에서 가장 흔한 형태의 비-호지킨 림프종이며 (Blood 1997 89 (11): 3909-18), US 및 UK에서 매년 100,000명당 7~8의 사례가 발생하는 것으로 예상된다. 그것은 신체의 거의 모든 부분에서 발생할 수 있는 공격적인 암으로 특징지어 진다. DLBCL의 원인은 잘 알려져 있지 않으며, 정상 B 세포 뿐만 아니라 다른 유형의 림프종 또는 백혈병 세포의 악성 변형에서 발생할 수 있다. 치료 방법에는 일반적으로 화학 요법과 방사선이 포함되며,성인의 경우 전반적으로 5-년 평균 생존율은 약 58%이다. 일부 단일클론 항체가 DLBCL 치료에 대한 가능성을 보여 주었지만, 일관된 임상 효능은 아직 결정적으로 입증되지 않았다. 따라서, DLBCL에 대한 면역요법을 포함한 새로운 요법이 크게 필요하다.
또다른 측면에서, 본원의 CD22 중쇄 항체 (가령, UniAbsTM) 및 약제학적 조성물은 CD22를 발현시키는 병원체 B-세포를 특징으로 하는 자가면역 장애, 예를 들면, 전신 홍반성 루프스 (SLE), 류마티스성 관절염 (RA), 그리고 다발성 경화증 (MS)이 내포되나, 이에 국한되지 않는 장애 치료에 이용될 수 있다.
질병의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 그리고 해당 환자가 인간인지 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 및 처치가 예방을 위한 것인지, 또는 치료를 위한 것인지 등을 비롯한 다수의 상이한 요인에 따라 가변적이다. 일반적으로 환자는 인간이지만, 예를 들어, 개, 고양이, 말 등과 같은 반려 동물, 토끼, 생쥐, 쥐 등, 그리고 이와 유사한 것들과 같은 실험용 포유류 등과 같은 인간이 아닌 포유동물도 치료될 수 있다. 치료 용량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 적정될 수 있다.
투여량 수준은 숙련된 임상의에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 필요에 따라, 예를 들어, 치료에 대한 대상체의 반응을 변형시키는 데 요구되는 바와 같이 변형될 수 있다. 단일 투약 형태를 제조하기 위하여 담체 재료와 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 개체 및 특정 투여 방식에 따라 달라진다. 용량 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유한다.
일부 구체예들에서, 치료요법적 용량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg의 범위일 수 있다. 예를 들면, 용량은 1 mg/체중(kg) 또는 10 mg/체중(kg) 또는 1-10 mg/kg 범위 안에 있다. 예시적인 치료요법적 섭생은 2주에 1회, 또는 1개월에 1회 또는 3 내지 6개월에 1회 투여한다. 본 발명의 치료제는 일반적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년이 될 수 있다. 간격은 또한 환자의 혈액내 치료 물질 수준을 측정함으로써 표시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 치료제는 지속 방출 제형으로 투여될 수 있으며, 이 경우 투여 빈도는 덜 빈번하게 된다. 용량 및 빈도는 환자에서 해당 폴리펩티드 반감기에 따라 가변적이다.
전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 중에서 어느 한 가지로서 주사가능물질로서 준비된다; 주사에 앞서 액체 비히클에서 용해, 또는 액체 비히클에서 현탁에 적합한 고체 형태 또한 제조될 수 있다. 본원의 약제학적 조성물은 고체 (예를 들어, 동결건조된) 조성물의 재구성 직후, 정맥내 또는 피하로 직접적으로 투여하는데 적합하다. 조제물은 위에서 논의된 바와 같이, 강화된 보조제 효과를 위해 리포솜 또는 마이크로 입자, 이를 테면, 폴리락티드, 폴리글리콜리드 또는 공중합체에 유화되거나 또는 캡슐화될 수 있다. Langer, Science 249: 1527, 1990 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. 본 발명의 제제는 상기 벡터, 예를 들면, 해당 활성 성분의 지속적 방출 또는 박동 방출이 허용되는 방식으로 제형화될 수 있는 데포(depot) 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 일반적으로 U.S. Food and Drug Administration의 모든 Good Manufacturing Practice(GMP) 규정을 완전히 준수하여 멸균의, 실질적으로 등장성으로 제형화된다.
본원에서 기술된 항체 및 항체 구조의 독성은 LD50을(집단의 50%가 사망하게 되는 용량) 및 LD100 (집단의 100%가 사망하게 되는 용량)을 결정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인체에 사용하기에 독성이 없는 용량 범위를 제형화하는 데 사용할 수 있다. 본원에 기재된 항체의 용량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 투여량을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사가 선택할 수 있다.
투여용 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 항체 또는 다른 작용제(예를 들어, 다른 제거제)를 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 염수 및 이와 유사한 것들이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 무균이며, 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 내포되지 않는다. 이들 조성물들은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은 생리학적 조건에 근사화되는데 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 및 이와 유사한 것들을 함유할 수 있다. 이러한 제형에서 활성제의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 요구에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다 (가령, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980) 그리고 Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)).
또한, 본 발명의 활성제 및 이의 제형 및 사용 설명서를 포함하는 키트 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 하나 또는 그 이상의 추가 시약, 예를 들어, 화학요법 약물 등을 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 당해 키트 내용물의 의도된 용도를 명시한 라벨을 포함한다. 본원에서 이용된 용어 "라벨"은 당해 키트 상에 또는 당해 키트와 함께 공급되는, 또는 그렇지 않으면 키트에 수반된 임의의 기재된 또는 기록된 물질을 포함한다.
이제 본 발명을 더 완전하게 설명하는데, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고, 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
재료와 방법
CD22 단백질 결합
항원-항체 친화성을 결정하기 위한 동역학 결합 실험은 이중층 간섭계를 사용하여 Octet QK-384 시스템(ForteBio)에서 수행되었다. 항-인간 IgG Fc 캡처(AHC) 바이오센서(Forte Bio, 부품 번호: 18-5064)를 분석 완충액(1x PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, pH 7.2)에서 수화시키고, 100mM 글리신 pH 1.5에서 사전-조건화했다. 120초 동안 분석 완충액에서 기선을 설정했다. 그런 다음, AHC 바이오센서를 120초 동안 5μg/mL 농도의 UniAbsTM로 고정화했다. (120초 동안) 분석 완충액에서 또다른 기선을 설정했다. 다음으로, 250nM부터 시작하여 분석 완충액에 있는 인간 CD22 단백질의 7-포인트, 1:2 희석 시리즈에 담그었다. 피분석물 컬럼의 마지막 웰은 완충액과 로딩된 바이오센서 사이의 비-특이적 결합을 시험하기 위해, 오로지 분석 완충액만을 포함하고 있으며, 이를 참조 웰로 사용하였다. 600초 동안 연합을 관찰한 후, 900초 동안 해리를 관찰했다. 데이터 분석은 Octet Data Analysis v9.0(ForteBio)을 사용하여 수행되었다. 모든 동역학을 1:1 표준 결합 모델을 사용하여 분석하였다.
CD22 세포 결합
CD22 양성 세포에 대한 결합은 Daudi 세포주(ATCC)를 사용하여 유동 세포분석(Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore)에 의해 평가되었다. 간단히 말해서, 100,000개의 표적 세포를 4℃에서 30분 동안 정제된 UniAbsTM의 일련의 희석으로 착색했다. 항온처리 후, 세포를 유동 세포분석 완충액(1X PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3)으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE)(Southern Biotech, cat. #2042-09)에 콘쥬게이트된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG로 착색하여, 세포-결합된 항체를 검출하였다. 4℃에서 20-분간 항온처리한 후, 세포를 유동 세포분석 완충액으로 두 번 세척한 다음, 유동 세포분석으로 평균 형광 강도(MFI)를 측정했다. EC50 값은 GraphPad Prism 7을 이용하여 산출되었다. 시노몰구스 CD22 양성 세포에 대한 결합은 동일한 프로토콜을 사용하여 결정하였으며, 이때 다음과 같이 수정을 했다: 표적 세포는 시노몰구스 CD22의 세포외 도메인을 발현하도록 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에서 유래했으며, 각 항체는 단일 농도(~1.7μg/mL)에서 테스트되었고, 따라서 EC50 값은 산출되지 않았다.
실시예 1: 오로지 중쇄-항체를 발현하도록 유전공학적으로 조작된 렛(Rats)
'인간-쥐' IgH 유전자 좌가 구축되었고, 여러 부분으로 어셈블리되었다. 여기에는 인간 JHs의 다운스트림에 있는 쥐 C 영역 유전자의 수정 및 연결이 포함되었고, 이어서 인간 VH6-D-세그먼트 영역의 업스트림 추가가 포함되었다. 인간 VH 유전자의 분리 클러스터 [BAC6 및 BAC3]를 갖는 두 개 BAC는 인간 VH6, 모든 Ds, 모든 JHs, 그리고 변형된 렛(rat) Cγ2a/1/2b (ΔCH1)을 포함하는 어셈블리된, 그리고 변형된 영역을 인코드하는 Georg로 명명된 BAC와 함께 공동-주사되었다.
재배열안된 배열형태의 인위적인 중쇄 면역글로불린 좌를 휴대하는 유전자삽입된 렛이 만들어졌다. IgG2a(ΔCH1)., IgG1(ΔCH1)., IgG2b(ΔCH1) 유전자는 CH1 세그먼트가 결여되어 있었다. Georg BAC에는 불변 영역 유전자 IgE, IgA 및 3' 인헨서가 내포되어 있었다. 유전자삽입된 렛(rats)을 RT-PCR 및 혈청 분석 (ELISA)하면, 유전자삽입된 면역글로불린 좌의 생산적인 재배열, 그리고 혈청에서 다양한 동형의 오로지 중쇄-항체의 발현이 드러났다. 유전자삽입된 렛(rats)은 US 특허 공개 2009/0098134 A1에 이전에 기술된 바와 같이, 돌연변이된 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 갖는 렛(rats)과 교배되었다. 이러한 동물의 분석에서 렛(rat) 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 발현 및 인간 V, D, 및 J 유전자에 의해 인코드된 가변 영역을 갖는 중쇄 항체의 높은 수준의 발현이 비활성화됨이 입증되었다. 유전자삽입된 렛(rats)의 면역화로 항원-특이적 중쇄 항체의 고-역가 혈청 반응이 생성되었다. 인간 VDJ 영역을 갖는 중쇄 항체를 발현시키는 이러한 유전자삽입된 렛(rats)을 UniRatsTM라고 불렀다.
실시예 2: 면역화
재조합 CD22의 세포외 도메인으로 면역화
12마리의 UniRat 동물 (6마리는 HC27, 6마리는 HC28)에게 재조합 인간 CD22 단백질을 면역주사하였다. Titermax/Alhydrogel 어쥬번트를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 동물을 면역화시켰다. CD22의 재조합 세포외 도메인은 R&D Systems에서 구입하였고, 멸균 식염수로 희석하고, 어쥬번트와 복합했다. 면역원을 Titermax 및 Alhydrogel 어쥬번트와 복합했다. Titermax에서 면역원을 사용한 첫 번째 면역(프라이밍)은 왼쪽 다리와 오른쪽 다리에 시행되었다. 후속적인 부스팅 면역화는 Alhydrogel의 존재 하에 수행되었고, 수확 부스트(harvest boosts)가 PBS에서 면역원으로 수행되기 3일 전에 수행되었다. 혈청 역가를 결정하기 위해, 최종 채혈 시에 렛(rats)으로부터 혈청을 수집하였다.
혈청 역가 결과
혈청 역가 요약 정보를 도 17에 나타낸다. 도 17에 도시된 그래프에서, 각 선은 개별 동물을 나타낸다. 그래프의 범례는 각 개별 동물의 ID 번호를 보여준다. 혈청의 8-포인트 희석 시리즈에 대한 결합 활성은 huCD22+Fc 단백질, huCD22+His 태그, 레서스 CD22+His 태그 단백질 단백질 및 His 태그 표적-외 단백질에 대한 ELISA에 의해 테스트되었다. 이 동물 그룹 중에서, 인간과 붉은털원숭이 CD22 단백질 모두에 대한 혈청 반응성 수준의 범위가 관찰되었다. His 단백질 태그에 대한 혈청 반응도 관찰되었다.
실시예 3: CD22-발현시키는 세포주에 결합
도 16에서는 본원에 기재된 항-CD22 중쇄-단독 항체의 표적 결합 활성을 요약한다. 컬럼 1은 항-CD22 오로지 중쇄-항체의 클론 ID 번호를 나타낸다. 컬럼 2는 몰 농도로 측정된 단백질(KD)에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 컬럼 3은 초 단위로 측정된 단백질 결합 해리 상수(K-해리율)를 나타낸다. 컬럼 4는 배경 MFI 신호에 대한 배수로 측정된 Daudi 세포에 대한 결합을 나타낸다. 컬럼 5는 배경 MFI 신호에 대한 배수로 측정된 cyno CD22를 안정적으로 발현시키는 CHO 세포에 대한 결합을 나타낸다. 컬럼 6은 배경 MFI 신호에 대한 배수로 측정된 CD22 단백질을 발현시키지 않는 CHO 세포에 대한 결합을 나타낸다.
실시예 4: 휴지기 인간 범(pan) T 세포를 이용하여 CD22 양성 세포의 T 세포 매개된 세포독성
자극되지 않은 인간 T 세포를 CD22 양성 세포(Daudi) 및 상이한 농도의 이중특이적 항체와 함께 항온처리하였다. 48시간 후, 세포독성을 측정하기 위해 세포에 대해 유동 세포분석을 수행하였다. 세포 배양물의 상청액을 이용하여 사이토킨 IL-2의 방출을 측정하였다. POS CTRL 항체는 동일한 항-CD22 가지(arm)를 포함하지만, 더 강한 친화성 항-CD3 암을 포함하는 항체를 의미한다. 도 1A 및 도 1B에 결과가 제공된다.
자극되지 않은 인간 T 세포를 CD22 양성 세포(SUDHL10) 및 상이한 농도의 이중특이적 항체와 함께 항온처리하였다. 72시간 후, 세포독성을 측정하기 위해 세포에 대해 유동 세포분석을 수행하였다. 세포 배양물의 상청액을 이용하여 사이토킨 IL-2의 방출을 측정하였다. POS CTRL 항체는 동일한 항-CD22 가지(arm)를 포함하지만, 더 강한 친화성 항-CD3 가지(arm)를 포함하는 항체를 의미한다. 도 2A 및 도 2B에 결과가 제공된다.
자극되지 않은 인간 T 세포를 CD22 양성 DL-BCL 세포 (RI-1) 및 상이한 농도의 이중특이적 항체와 함께 항온처리하였다(작동체:표적 (E:T) 세포 비율은 10:1, 5:1 또는 1:1로 변화되면서). 72시간 후, 세포독성을 측정하기 위해 세포에 대해 유동 세포분석을 수행하였다. 세포 배양물의 상청액을 이용하여 사이토킨 IL-2의 방출을 측정하였다. POS CTRL 항체는 동일한 항-CD22 가지(arm)를 포함하지만, 더 강한 친화성 항-CD3 가지(arm)를 포함하는 항체를 의미한다. 데이터에서 세포독성 %는 E:T 비율에 의존적임을 보여준다. 도 3A 및 도 3B에 결과가 제공된다.
실시예 5: 활성화된 인간 범(pan) T 세포를 이용한 CD22 양성 세포의 T 세포 매개된 세포독성
활성화된 인간 T 세포는 CD22 양성 세포 (Daudi 및 RI-1) 또는 CD22 음성 세포주 (K562) 그리고 상이한 농도의 이중특이적 항체와 함께 항온처리하였다. 세포 용해는 칼세인 기반 형광 판독을 사용하여 측정되었다. 이중특이적 CD22xCD3_F2F 결합 화합물은 CD22+ 세포의 용해를 특이적으로 유발시켰지만, 그러나 CD22- K562 세포의 용해는 유발시키지 않았다. POS CTRL 항체는 동일한 항-CD22 가지(arm)를 포함하지만, 더 강한 친화성 항-CD3 가지(arm)를 포함하는 항체를 의미한다. NEG CTRL은 비-특이적 종양 가지(arm), 그리고 항-CD3_F2F로써 동일한 항-CD3 가지(arm)를 갖는 항체를 지칭한다. 도 4에 결과가 제공된다.
실시예 6: CD22와 CD3에 대항하는 이중특이적 항체의 세포 결합
CD22 양성 세포 Daudi, Raji, Ramos 및 CD22 음성 세포 K562는 이중특이적 항체와 함께 항온처리되었다. 세포 결합은 항-인간 IgG 이차 항체 시약을 사용하여 유동 세포분석에 의해 측정하였다. 데이터에서 이중특이적 항체는 CD22+ 세포에 결합하지만, CD22- 세포에는 결합하지 않음을 보여준다. POS CTRL 항체는 동일한 항-CD22 가지(arm)를 포함하지만, 더 강한 친화성 항-CD3 가지(arm)를 포함하는 항체를 의미한다. NEG CTRL은 비-특이적 종양 가지(arm), 그리고 항-CD3_F2F로써 동일한 항-CD3 가지(arm)를 갖는 항체를 지칭한다. 도 5에 결과가 제공된다.
실시예 7: Daudi 이종이식편에서 CD22-1 x CD3_F2F를 이용한 생체내 효능 연구
CD22-1 x CD3_F2F의 생체내 효능을 테스트하기 위해, CD22-1 x CD3_F2F의 용량을 변화시키면서 Daudi 세포 (5e6 세포/마우스)가 이식된 암컷 NSG 마우스에 투여하였다(도 6에 나타냄). 처치 일정은 아래 표 7에 나타낸다. 평균 종양 용적, 체중, 체중 변화 퍼센트, 그리고 개별 종양 용적을 이용하여 처치 효능을 평가하였다.
표 7: 샘플 처치 일정
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음성 대조군 및 리투시맙(Rituximab)과 비교한 CD22-1 x CD3_F2F의 데이터는 도 7-13에 나타내며, 그리고 CD22-1 x CD3_F2F의 효능이 입증된다.
본 발명의 바람직한 구체예들을 본 출원에 나타내고 설명하였으나, 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 이러한 구체예들이 단지 예로서 제공되는 것임은 자명할 것이다. 본 발명에서 벗어나지 않고 수많은 변형들, 변화들, 및 치환들이 해당 분야의 숙련된 기술자들에 의해 이루어질 것이다. 본 발명을 실시함에 있어 본 명세서에 기재된 발명의 구체예들에 대한 다양한 대체예들이 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하며 이러한 청구범위에 속하는 방법들 및 구성들 및 이들의 균등예들은 청구범위에 의해 뒷받침되는 것으로 본다.
SEQUENCE LISTING <110> TENEOBIO, INC. <120> MULTISPECIFIC HEAVY CHAIN ANTIBODIES BINDING TO CD22 AND CD3 <130> TNO-0017-WO <140> PCT/US2020/037566 <141> 2020-06-12 <150> 62/861,708 <151> 2019-06-14 <160> 107 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser 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Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys 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Gly Ser 50

Claims (48)

  1. CD3에 결합하는, 다음을 포함하는 다중-특이적 결합 화합물:
    중쇄 가변 영역, 이 영역은 다음을 포함한다:
    (a) 서열 식별 번호: 85에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
    (b) 서열 식별 번호: 86에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
    (c) 서열 식별 번호: 87에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR3 서열; 그리고
    경쇄 가변 영역.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 전술한 중쇄 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열은 인간 VH 틀구조에 존재하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  3. 청구항 1에 있어서, 인간 VH 틀구조에 중쇄 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이때 상기 각 CDR 서열은 서열 식별 번호: 85-87중 임의의 하나에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  4. 청구항 1에 있어서, 다음을 포함하는 다중-특이적 결합 화합물;
    중쇄 가변 영역, 이 영역은 다음을 포함한다:
    (a) 서열 식별 번호: 85에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR1 서열; 그리고
    (b) 서열 식별 번호: 86에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR2 서열; 그리고
    (c) 서열 식별 번호: 87에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR3 서열; 그리고
    경쇄 가변 영역.
  5. 청구항 4에 있어서, 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고
    경쇄 가변 영역.
  6. 청구항 1-5중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 경쇄 가변 영역은 인간 VL 틀구조에서 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하며, 이때 각 CDR 서열은 서열 식별 번호: 92에서 제시된 CDR 서열 또는 CDR 서열 세트와 비교하여 3개 또는 이보다 적은 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함하고; 또는 이때 상기 CDR 서열은 서열 식별 번호: 92에서 제시된 CDR 서열 또는 CDR 서열 세트와 비교하여 적어도 85% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  7. 청구항 1-6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  8. 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 중쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 91에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  9. 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 중쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 91에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  10. 청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 92에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  11. 청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 경쇄 가변 영역은 서열 식별 번호: 92에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  12. CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물에 있어서, 이때 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    (a) 서열 식별 번호: 1 ~ 10의 아미노산 서열중 임의의 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR1 서열; 및/또는
    (b) 서열 식별 번호: 11 ~ 17의 아미노산 서열중 임의의 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR2 서열; 및/또는
    (c) 서열 식별 번호: 18 ~ 23의 아미노산 서열중 임의의 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 CDR3 서열.
  13. 청구항 12에 있어서, 이때 제 1 결합 단위의 전술한 CDR1 서열, CDR2 서열, 및 CDR3 서열은 인간 틀구조에 존재하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  14. 청구항 12-13중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 결합 단위는 서열 CH1 서열 없이, 중쇄 불변 영역을 더 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  15. 청구항 12 ~ 14중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    (a) 서열 식별 번호: 1 ~ 10로 구성된 군에서 선택된 CDR1 서열; 및/또는
    (b) 서열 식별 번호: 11 ~ 17로 구성된 군에서 선택된 CDR2 서열; 및/또는
    (c) 서열 식별 번호: 18 ~ 23로 구성된 군에서 선택된 CDR3 서열.
  16. 청구항 15중 임의의 한 항에 있어서, 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    (a) 서열 식별 번호: 1 ~ 10로 구성된 군에서 선택된 CDR1 서열; 그리고
    (b) 서열 식별 번호: 11 ~ 17로 구성된 군에서 선택된 CDR2 서열; 그리고
    (c) 서열 식별 번호: 18 ~ 23로 구성된 군에서 선택된 CDR3 서열.
  17. 청구항 12 ~ 16중 임의의 한 항에 있어서, 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    (a) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 11의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 18의 CDR3 서열;
    (b) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 19의 CDR3 서열; 또는
    (c) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 20의 CDR3 서열.
  18. 청구항 12에 있어서, 서열 식별 번호: 24 ~ 84의 서열중 임의의 하나에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  19. 청구항 18에 있어서, 서열 식별 번호: 24 ~ 84로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  20. 청구항 19에 있어서, 서열 식별 번호: 24의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  21. CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물에 있어서, 이때 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    중쇄 가변 영역, 이 영역은 다음을 포함한다:
    (a) 다음 식의 CDR1 서열:
    G X1 S I X2 X3 X4 X5 X6 Y (서열 식별 번호: 104)
    여기에서
    X1은 D 또는 G이며;
    X2는 S, T, I 또는 N이며;
    X3은 S 또는 D이며;
    X4는 G, S 또는 N이며;
    X5는 D, G 또는 S이며; 그리고
    X6은 Y 또는 H이며; 그리고
    (b) 다음 식의 CDR2 서열:
    X7 X8 Y X9 G X10 X11 (서열 식별 번호: 105)
    여기에서
    X7은 I 또는 V이며;
    X8은 Y 또는 H이며;
    X9는 S 또는 T이며;
    X10은 A, V 또는 S이며; 그리고
    X11은 T 또는 A이며; 그리고
    (c) 다음 식의 CDR3 서열:
    X12 R X13 D S S X14 W R S (서열 식별 번호: 106)
    여기에서
    X12는 T, A 또는 K이며;
    X13은 D 또는 E이며; 그리고
    X14는 N 또는 S이다.
  22. CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물에 있어서, 이때 상기 제 1 결합 단위는 인간 VH 틀구조에 존재하는 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 상기 CDR 서열은 서열 식별 번호: 1-23로 구성된 군에서 선택된 CDR 서열에서 두 개 또는 그 미만의 치환을 갖는 서열을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물.
  23. CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물에 있어서, 이때 상기 제 1 결합 단위는 인간 VH 틀구조에서 CDR1 서열, CDR2 서열과 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 이때 상기 CDR 서열은 서열 식별 번호: 1-23으로 구성된 군에서 선택되는, 다중-특이적 결합 화합물.
  24. CD22에 대한 결합 친화성을 갖는 제 1 결합 단위와 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 결합 단위를 포함하는 다중-특이적 결합 화합물, 이때 상기 제 1 결합 단위는 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    상기 중쇄 가변 영역은 인간 VH 틀구조에 다음을 포함한다:
    (a) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 11의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 18의 CDR3 서열; 또는
    (b) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 19의 CDR3 서열; 또는
    (c) 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 20의 CDR3 서열.
  25. 청구항 24에 있어서, 이중특이적인, 다중-특이적 결합 화합물.
  26. 전술한 청구항들중 임의의 하나에 있어서, CAR-T 포멧으로 된, 다중-특이적 결합 화합물.
  27. 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    (i) CD3에 대한 결합 친화성을 갖고, 인간 VH 틀구조에 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 ;
    (ii) 인간 VL 틀구조에 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 그리고
    (iii) 인간 VH 틀구조에 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 11의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 18의 CDR3 서열을 포함하는 항-CD22 중쇄 항체의 항원-결합 도메인.
  28. 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    (i) CD3에 대한 결합 친화성을 갖고, 인간 VH 틀구조에 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (ii) 인간 VL 틀구조에 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 그리고
    (iii) 인간 VH 틀구조에 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 19의 CDR3 서열을 포함하는 항-CD22 중쇄 항체의 항원-결합 도메인.
  29. 다음을 포함하는, 다중-특이적 결합 화합물:
    (i) CD3에 대한 결합 친화성을 갖고, 인간 VH 틀구조에 서열 식별 번호: 85의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 86의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 87의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (ii) 인간 VL 틀구조에 서열 식별 번호: 88의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 89의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 90의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 그리고
    (iii) 인간 VH 틀구조에 서열 식별 번호: 1의 CDR1 서열, 서열 식별 번호: 12의 CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 20의 CDR3 서열을 포함하는 항-CD22 중쇄 항체의 항원-결합 도메인.
  30. 청구항 1-29중 임의의 한 항에 있어서, 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 다중특이적 결합 화합물.
  31. 청구항 30에 있어서, 이때 상기 인간 IgG1 Fc 영역은 침묵화된 인간 IgG1 Fc 영역인, 다중특이적 결합 화합물.
  32. 청구항1-29중 임의의 한 항에 있어서, 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 다중특이적 결합 화합물.
  33. 청구항 32에 있어서, 이때 상기 인간 IgG4 Fc 영역은 침묵화된 인간 IgG4 Fc 영역인, 다중특이적 결합 화합물.
  34. 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항에 따른 다중-특이적 결합 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  35. CD22의 발현에 의해 특징화된 B-세포 장애의 치료 방법에 있어서, 이 방법은 전술한 장애를 갖는 대상체에게 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항에 따른 다중-특이적 결합 화합물, 또는 청구항 34의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  36. 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항에 따른 다중-특이적 결합 화합물의 용도에 있어서, CD22의 발현에 의해 특징화된 B-세포 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는, 다중-특이적 결합 화합물의 용도.
  37. CD22의 발현에 의해 특징화된 B-세포 장애의 치료에 사용을 위한, 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항에 따른 다중-특이적 결합 화합물.
  38. 청구항 35-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 장애는 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL)인, 방법, 용도, 또는 다중-특이적 결합 화합물.
  39. 청구항 35-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 장애는 비-호지킨 림프종 (NHL)인, 방법, 용도, 또는 다중-특이적 결합 화합물.
  40. 청구항 35-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 장애는 전신 홍반성 루프스 (SLE)인, 방법, 용도, 또는 다중-특이적 결합 화합물.
  41. 청구항 35-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 장애는 류마티스성 관절염 (RA)인, 방법, 용도, 또는 다중-특이적 결합 화합물.
  42. 청구항 35-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 장애는 다발성 경화증 (MS)인, 방법, 용도, 또는 다중-특이적 결합 화합물.
  43. 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항에 따른 다중-특이적 결합 화합물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  44. 청구항 43에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  45. 청구항 44의 벡터를 포함하는 세포.
  46. 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항에 따른 다중-특이적 결합 화합물을 만드는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 45에 따른 세포를 이 결합 화합물의 발현을 허용하는 조건 하에서 성장시키고, 그리고 해당 세포로부터 상기 결합 화합물을 단리시키는 것을 포함하는, 방법.
  47. 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항에 따른 다중-특이적 결합 화합물을 만드는 방법에 있어서, 이 방법은 UniRat 동물을 CD22로 면역화시키고, 그리고 CD22-결합 중쇄 서열을 식별해내는 것을 포함하는, 방법.
  48. 개체의 치료 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1 ~ 33중 임의의 한 항 따른 다중-특이적 결합 화합물의 유효 용량, 또는 청구항 34의 약제학적 조성물의 유효 용량을 투하는 것을 포함하는, 방법.
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