NO336530B1 - Nogo-reseptorbindingsprotein - Google Patents

Nogo-reseptorbindingsprotein Download PDF

Info

Publication number
NO336530B1
NO336530B1 NO20054836A NO20054836A NO336530B1 NO 336530 B1 NO336530 B1 NO 336530B1 NO 20054836 A NO20054836 A NO 20054836A NO 20054836 A NO20054836 A NO 20054836A NO 336530 B1 NO336530 B1 NO 336530B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
polypeptide
seq
antibody
injury
vector
Prior art date
Application number
NO20054836A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20054836L (no
Inventor
John Mccoy
R Blake Pepinsky
Daniel H Lee
Sha Mi
Alexey A Lugovskoy
Original Assignee
Biogen Ma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Ma Inc filed Critical Biogen Ma Inc
Publication of NO20054836L publication Critical patent/NO20054836L/no
Publication of NO336530B1 publication Critical patent/NO336530B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Det er beskrevet Sp3 5-polypeptider og fusjonsproteiner av disse, Sp35 antistoff og antigenbindende filamenter av disse, og nukleinsyrer som koder for de samme. Det er også beskrevet blandinger som består av slike Sp35 antistoff, antigenbindende fragmenter av disse, Sp35 polypeptider og fusjonsproteiner av disse, og metoder for å lage og bruke disse.

Description

Denne oppfinnelsen relaterer seg til nevrologi, nevrobiologi og molekylær biologi. Nærmere bestemt, relaterer denne oppfinnelsen seg til nukleinsyrer, vektorer og polypeptider samt anvendelse derav til fremstilling av medikamenter til behandling av nevrologiske sykdommer, forstyrrelser og skader som f.eks. ryggmargskade. De aktuelle nukleinsyrene er som angitt i krav 1, de aktuelle vektorene er som angitt i krav 7, de aktuelle polypeptidene er som angitt i krav 11 og de aktuelle anvendel-sene er som angitt i krav 22, 23 og 25-26.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Aksoner og dendritter springer ut fra nevroner. Den distale enden av et utstrålende akson eller nevritt inkluderer et spesielt område kjent som vekststavcelle. Vekststavceller fornemmer den lokale omgivelse og fører aksonal vekst mot et nevrons målcelle. Vekststavceller reagerer på påvirkninger fra omgivelsene, f.eks. overflate-klebrighet, vekstfaktorer, nevrotransmittorer og elektriske områder. Vekststav-cellene forlenger seg vanligvis med en hastighet av 1 - 2 mm pr. dag. Vekststav-cellene undersøker området foran og på hver side av seg ved hjelp av forlengninger klassifisert som lamellipodia og filopodia. Når en forlengelse kontakter en ugunstig overflate, drar den seg tilbake. Når en forlengelse kontakter en gunstig overflate, fortsetter den å utvide seg og fører vekststavcellen i den retningen. Når vekststavcellen når en passende målcelle, dannes en synaptisk forbindelse.
Nervecellefunksjonen influeres av kontakt mellom nevroner og andre celler i deres nærmeste omgivelse (Rutishauser, et al., 1988, Physiol. Rev. 68:819). Disse cellene inkluderer spesialiserte gliaceller, oligodendrocytter i sentralnervesystemet (CNS), og Schwannceller i det perifere nervesystemet (PNS) som pakker inn ner-veaksonet med myelin (Lemke, 1992, in An Introduction to Molecular Neurobiologi, Z. Hall, Ed., p. 281, Sinauer).
CNS-nevroner har en innebygget evne til å regenerere etter skade, men de hindres i dette ved hemmende proteiner som er til stede i myelin (Brittis et al., 2001, Neuron 30:11-14; Jones et al, 2002, J. Neurosci. 22:2792-2803; Grimpe et al, 2002, J. Neurosci.:22:3144-3160).
Flere hemmende myelinproteiner funnet på oligodendrocytter har blittkarakterisert. Kjente eksempler på myelinhemmende proteiner inkluderer NogoA (Chen et al., Nature, 2000, 403,434-439; Grandpre et al., Nature 2000,403, 439-444), myelinassosiert glycoprotein (MAG) (McKerracher et al., 1994, Neuron 13:805-811; Mukhopadhyay et al., 1994, Neuron 13:757-767) og oligodendrocytt glycoprotein (OM-gp) (Mikol et al., 1988, J. Cell. Biol.106:1273-1279). Alle disse proteinene har hver for seg vist seg å være en ligand for nevronal NgRl. (Wang et al., Nature 2002,417, 941-944; Grandpre et al., Nature 2000, 403,439-444; Chen et al., Nature, 2000,403,434-439; Domeniconi et al., Neuron 2002, publis-hed online June 28, 2002.)
Fra artikkelen til Mi. S. et al. «LINGO-1 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex», Nature Neuroscience, 2004, vol. 7, no. 3, side 221-228, er det kjent et nervesystem spesifikt, transmembrant protein som kalles for LINGO-1. LINGO-1 kan modulere nevroners regenerering i nervesystemet etter skade ved å binde til NgRl og p75. LINGO-1 er et uløselig protein i motsetning til foreliggende protein.
Det er videre kjent fra artikkelen til Li W. et al.: «Neutralization of myelin-associated Nogo-A by a Nogo receptor-Fc fusion protein», Society for Neuroscience Abstracts, 2002, side ABS3332, proteinet Nogo-A som spiller en hovedrolle i den inhiberende aktiviteten til myelin i sentralnervesystemet på aksonal regenerering etter skade på sentralnervesystemet.
Fra WO 0112662 A er det kjent membran-assosierte proteiner (MEMAP) samt anvendelse derav for å diagnostisere, behandle eller forebygge sykdommer som er assosiert med ekspresjon av MEMAP.
Nogo reseptor-1 (NgRl) er et GPI-forankret membranprotein som inneholder 8 leucinrike repetisjoner (Fournier et al., 2001, Nature 409:341-346). Gjennom interaksjon med hemmende proteiner (f.eks. NogoA, MAG og OM-gp), overfører NgRl-komplekset signaler som leder til kollaps av vekststavcellen og hemming av nevrittutvekst.
Det er et utilfredsstilt behov for molekyler og metoder til hemming av NgRl-mediert vekststavcellekollaps hvor slik kollaps fører til det resultat at nevrittutveks-ter hemmes.
Oppsummering av oppfinnelsen
Det er gjort forskjellige oppdagelser vedrørende et polypeptidbestemt "Sp35" (foreliggende betegnelse). Alternative betegnelser for Sp35 inkluderer "LINGO" og "LINGO-1". Nærværende oppdagelser inkluderer følgende. Sp35 binder seg til NgRl. Sp35 binder seg til seg selv i en homotypisk interaksjon. Et Sp35-Fc fusjonsprotein induserer eller fremmer sammentrekning av granulære nevroner. Et Sp35-Fc fusjonsprotein fremmer nerveoverlevelse i både rubro-spinalkanalens halvde-lingsskademodell og synsnervens transeksjonsmodell. Sp35 retrovirus-infiserte kortikale primærceller, levert i ryggmargskadede rotter, resulterer i forhøyet nerveoverlevelse, øket pill tubulin-farging av aksoner og økt myelininnhold.
Delvis basert på disse oppdagelser, angir oppfinnelsen bl.a. en isolert nukleinsyre som angitt i krav 1, og som inneholder en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid i hvilket: (a) polypeptidet inkluderer (i) et Sp35 LRR-område, (ii) en Sp35 basalregion C-terminal til LRR-området, og (iii) et Sp35 immunoglobulin (lg) område C-terminal til basalregionen; og (b) polypeptidet mangler et transmembranområde. Sp35 LRR-området kan inneholde en karboksyterminal LRR (LRRCT), en ami-noterminal LRR (LRRNT) eller begge. I noen av oppfinnelsens former mangler det kodede Sp35-polypeptidet det cytoplasmatiske området. I noen former inkluderer det kodede Sp35-polypeptidet aminosyrerester 34-532 av SEQ IN NO: 2 og mangler aminosyrerester 533-614.
Oppfinnelsen inkluderer også en slik nukleinsyre som koder for et polypeptid i hvilket polypeptidet inkluderer et Sp35 Ig-område og mangler et Sp35 LRR-område, en Sp35 basalregion, et transmembranområde og et cytoplasmatisk område.
Oppfinnelsen inkluderer også en slik nukelinsyre som koder for et polypeptid i hvilket polypeptidet inkluderer et Sp35 LRR-område og mangler et Sp35 Ig-område, en Sp35 basalregion, et transmembranområde og et cytoplasmatisk område.
Oppfinnelsen inkluderer også en slik nukleinsyre som koder for et polypeptid som mangler et funksjonelt cytoplasmatisk område men inkluderer også alle andre Sp35-områder, f.eks. det kodede polypeptidet kan inkludere aminosyrer 1-576 av SEQ ID NO: 2 (før behandling av signalsekvensen).
I noen av oppfinnelsens former er det kodede polypeptidet et fusjonspolypeptid som inneholderen ikke-Sp35-enhet/del. Denne ikke-Sp35-enheten/delen kan f.eks. være en Ig-enhet/del, en serumalbuminenhet/del, en målenhet/del, en referent-enhet/del eller en renselettende enhet/del. En foretrukket ikke-Sp35-enhet/del er en lg- enhet/del, dvs. en Fc-enhet/del.
Nukleotidsekvensen kan være operativt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens, f.eks. i en ekspresjonsvektor. Oppfinnelsen inkluderer også en vertscelle som er transformert ved hjelp av en vektor som uttrykker et Sp35 polypeptid ifølge oppfinnelsen som angitt i krav 9.
Oppfinnelsen inkluderer også et Sp35 polypeptid som er kodet ved hjelp av de ovenfor beskrevne nukleinsyrer som angitt i krav 11.
Oppfinnelsen inkluderer også et slikt Sp35-polypeptid som er konjugert til en polymer, f.eks. en polyalkylen glykol, en sukkerpolymer, og et polypeptid. En foretrukket polymer er et polyalkylen glykol, f.eks. polyetylenglykol (PEG). Polypeptidet kan være konjugert til 1, 2, 3 eller 4 polymerer. Fortrinnsvis er den totale molekylvek-ten til de konjugerte polymerene fra 20.000 Da til 40.000 Da pr. Sp35-polypeptid.
Oppfinnelsen inkluderer også en in vitro metode for å hemme signaloverføring av NgRl. Metoden inkluderer kontakt mellom NgRl og en effektiv mengde av Sp35-polypeptid. Foretrukne polypeptider som skal brukes i metoden inkluderer det føl-gende: (a) et Sp35-polypeptid, i hvilket: (a) polypeptidet inkluderer (i) et Sp35 LRR-område, (ii) en Sp35 basalregion C-terminal til LRR-området, og (iii) et Sp35 immunoglobulin (Ig)-område C-terminal til basalregionen; og (b) polypeptidet mangler et transmembranområde; og (b) et Sp35-polypeptid som inkluderer et Sp35 Ig-område og mangler et Sp35 LRR-område, en Sp35 basalregion, et transmembranområde og et cytoplasmatisk område.
Oppfinnelsen inkluderer også en in vitro metode for å redusere hemming av aksonal vekst av et sentralnervesystemnevron (CNS). Metoden inkluderer å skape kontakt mellom nevronet og en effektiv mengde av polypeptid som f.eks. Sp35-polypeptid, et anti-Sp35 antistoff eller et antigenbindende fragment av et anti-Sp35 antistoff.
Oppfinnelsen inkluderer også en metode for å hemme vekststavcellekollaps i et CNS-nevron. Metoden inkluderer å skape kontakt mellom nevronet og en effektiv mengde av polypeptid som f.eks. Sp35-polypeptid, et anti-Sp35 antistoff eller et antigenbindende fragment av et anti-Sp35 antistoff.
De aktuelle polypeptider kan anvendes til å fremstille medikamenter for å behandle en CNS sykdom, forstyrrelse eller skade i et pattedyr. Medikamentene kan benyttes i metoder som inkluderer administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et polypeptid som f.eks. Sp35-polypeptid, et anti-Sp35 antistoff eller et antigenbindende fragment av et anti-Sp35 antistoff, til det aktuelle pattedyret. CNS sykdom, forstyrrelse eller skade er eventuelt en ryggmargskade. Sp35-polypeptidet kan administreres lokalt. I noen av metodens former blir Sp35-polypeptidet i første om-gang administrert innen 48 timer etter en ryggmargskade. Til lokal administrering er den terapeutisk effektive mengden av polypeptidet fortrinnsvis fra 10 ug/kg til 10 mg/kg. Til systemisk administrering er den terapeutisk effektive mengde av polypeptidet fortrinnsvis fra 1 mg/kg til 20 mg/kg.
De aktuelle vektorer og polynukleotider kan også anvendes i en ex v/Vo-genterapi-metode til behandling av en CNS sykdom, forstyrrelse eller skade i et pattedyr. Metoden inkluderer (a) å fremskaffe en dyrket vertscelle som uttrykker et rekombinant Sp35-polypeptid, og (b) innføre vertscellen i pattedyret på stedet for CNS sykdom, forstyrrelse eller skade, f.eks. ryggmargskade. Den dyrkede vertscellen kan høstes fra pattedyret som skal behandles. I denne ex wVo-genterapimetoden kan det rekombinante Sp35 polypeptidet være et Sp35-polypeptid i full lengde.
De aktuelle medikamentene kan også anvendes for å fremme myelinering av stedet for CNS-sykdom, forstyrrelse eller skade hvor det skapes kontakt mellom stedet for CNS-sykdom, forstyrrelse eller skade med en effektiv mengde av et Sp35-polypeptid, f.eks. et polypeptid som inneholder et Sp35 LRR-område og mangler et Sp35 Ig-område, en Sp35 basalregion, et transmembranområde og et cytoplasmatisk område.
De aktuelle vektorer og polynukleotider kan også anvendes i en in wVo-genterapi-metode til behandling av CNS-sykdom, forstyrrelse eller skade ved in vivo-genterapi hvor et pattedyr tilføres en virusvektor, på eller nær skadestedet, som inneholder en nukleotidsekvens som koder for et Sp35-polypeptid slik at Sp35-polypeptidet blir uttrykt ved hjelp av nukleotidsekvensen i pattedyret i en mengde tilstrekkelig til å redusere hemming av aksonal utstråling av nevroner ved eller nær skadestedet. Virusvektoren kan være, f.eks. en adenovirusvektor, en lentivirusvek-tor, en baculovirusvektor, en Epstein Barr virusvektor, en papovavirusvektor, en vaccinavirus-vektor, en herpes simplex-virusvektor. Sykdommen, forstyrrelsen eller skaden kan f.eks. være ryggmargsskade eller synsnerveskade. Virusvektoren kan administreres lokalt, intraokkulært, parenteralt, intratekalt, subduralt og subkutant.
De aktuelle medikamenter kan også anvendes i en metode for å fremme overlevelse av et nevron som risikerer å dø. Metoden inkluderer kontaktskapning mellom nevronet med en effektiv mengde Sp35-polypeptid. Sp35-polypeptidet kan være ien oppløselig form av Sp35, f.eks. et Sp35-Fc fusjonsprotein. Nevronet kan være in vitro eller in vivo, f.eks. i et pattedyr med en nevrodegenerativ sykdom, forstyrrelse eller skade, f.eks. multippel sklerose, ALS, Huntingtons sykdom, Altzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, diabetes nevropati, slag, traumatisk hjerneskade og ryggmargsskade. I noen av behandlingsformene blir Sp35-polypeptidet administrert indirekte ved: (a) å skaffe en dyrket vertscelle som uttrykker et rekombinant Sp35-polypeptid; og (b) å innføre vertscellen i pattedyret på nevronstedet. I noen tilfeller blir polypeptidet administrert indirekte gjennom in wVo-genterapi. I en slik form, inkluderer metoden administrering, på eller nær nevronstedet, av en virusvektor som inneholder en nukleotidsekvens som koder for et Sp35-polypeptid slik at Sp35-polypeptidet uttrykkes fra nukleotidsekvensen i pattedyret i en mengde som er tilstrekkelig til å fremme nevronets overlevelse.
Som brukt her, betyr "humant Sp35 polypeptid i full lengde" det polypeptidet hvor aminosyresekvensen er aminosyrer 34-614 av SEQ ID NO: 2.
Som brukt her, betyr "heterolog halvdel" en aminosyresekvens som ikke er til stede i et Sp35-polypeptid i full lengde.
Som brukt her, betyr "nogo reseptor-1" polypeptidet hvis sekvens er offentlig tilgjengelig under Genbank tilgangsnr. AAG53612.
Som brukt her, betyr "Sp35 antagonistpolypeptid" et Sp35- polypeptid som blokkerer, hemmer eller intefererer med den biologiske aktiviteten til naturlig forekommende Sp35.
Som brukt her, betyr "Sp35 basalregion" det følgende aminosyremotiv:
Den øverste raden av aminosyrer (uthevet; SEQ ID NO: 4) er den foretrukne Sp35 basalregionsekvensen, med varianter som viser valgfrie erstatninger vist under (SEQ ID NOS: 5, 6, 7 og 8).
Som brukt her, betyr "Sp35 fusjonsprotein" et fusjonsprotein som inkluderer en Sp35-halvdel kombinert med en heterolog halvdel.
Som brukt her, betyr "Sp35 Ig-område" aminosyrer 433 - 493 av SEQ ID NO: 2, under forutsetning av at sekvensen kan inneholde opptil 5 individuelle aminosyreinnsettinger, strykninger eller konservative aminosyreerstatninger. De følgende erstatningene (nummerering basert på SEQ ID NO: 2) er uttrykkelig inkludert: V til M i posisjon 6; S til G i posisjon 294; V til A i posisjon 348; og R til H i posisjon 419.
Som brukt her, betyr "Sp35 LRR-området" et område som inkluderer 10 - 14 av de leucinrike repetisjonssekvensene, som inkluderer LRRNT og LRRCT, opplistet i tabell 1, forutsatt at opptil fem aminosyreinnsettinger, strykninger eller konservative aminosyreerstatninger kan opptre innen samlingen av 10 - 14 leucinrike repetisjoner.
Som brukt her, betyr "Sp35-halvdel" et biologisk aktivt fragment av et Sp35 polypeptid i full lengde.
Som brukt her, betyr "Sp35 polypeptid" en Sp35-halvdel eller et fusjonsprotein som inkluderer en Sp35-halvdel.
Med mindre det er definert annerledes, har alle tekniske og vitenskapelige betegnelser som er brukt her, samme betydning som det som vanligvis forstås av en vanlig faglært person innen det området som oppfinnelsen vedrører. I tilfelle en tvist skulle oppstå er denne spesifikasjonen, inkludert alle definisjoner, gjeldende. Selv om metodene og ekvivalent eller lignende materiale til det som blir beskrevet her kan bli brukt i bruken eller testingen av oppfinnelsen, er de foretrukne metoder og materialer beskrevet under.
Kort beskrivelse av tegningene
FIG. 1 viser nukleotidsekvensen av et humant Sp35 cDNA i full lengde (SEQ ID NO:l) FIG. 2 er aminosyresekvensen til humant Sp35-polypeptid i full lengde (SEQ ID NO: 2) FIG. 3 er en skjematisk illustrasjon av Sp35-områdets struktur og strykningsover-sikt for å identifisere Sp35-sekvens(er) som bindes til NgRl. FIG. 4 er et histogram som oppsummerer data for Sp35-bindingen til COS7-celler transfektert ved hjelp av en ekspresjonsvektor som koder for rotte p75 eller en vektorkontroll. Etter 48 timer ble AP-Sp35 eller AP inkubert med cellene. Bundet AP ble påvist ved bruk av kromogent AP og påvisningsreagens. FIG. 5 er et histogram som oppsummerer data for binding av AP-Omgp og AP-Nogo-66 til COS7 celler transfektert med en ekspresjonsvektor som koder for NgRl; NgRl og p75; NgRl, p75 og Sp35 eller en vektorkontroll. Etter 48 timer ble, AP-Omgp, AP-Nogo-66 eller AP inkubert med cellene. Bundet AP ble påvist ved bruk av kromogent AP påvisningsreagens. FIG. 6 er et histogram som oppsummerer data for reduksjon av hemmende aktivitet fra myelinhemmere på nevrittutvekst in vitro. Nevrittlengde ble målt 7 dager etter fødsel av de cerebellare granulære nevroner hos rotter som uttrykker DN-Sp35, Sp35 i full lengde eller kontroller dyrket på immobilisert substrat Omgp, Myelin og Nogo-66. DN-Sp35-transfekterte celler oppviste redusert respons på hemmende substrater. Nevrittlengde ble kvantifisert fra 1000 nevroner pr. behandlingsgruppe fra to uavhengige forsøk (p<0,01) FIG. 7 er et histogram som oppsummerer data for reversert hemmende aktivitet av myelinhemmere av Sp35-Fc. Nevrittlengde 7 dager etter fødsel av de cerebellare granulære nevroner (1000 nevroner) dyrket på immobilisert substrat Omgp, Myelin eller Nogo-66 i nærvær eller fravær av Sp35-Fc. Sp35-Fc reduserte hemming av nevrittutvekst forårsaket av Omgp, Nogo-66 og MAG. Nevrittlengde ble kvantifisert fra 1000 nevroner pr. behandlingsgruppe fra to uavhengige forsøk (p<0,01) FIG. 8 er en graf som oppsummerer data fra et forsøk som viser at intratekal-administrert Sp35-Fc øker funksjonsbedring etter dorsal halvdeling i en rotte. Driv-kraften BBBs score målt som en funksjon av tiden etter dorsal halvdeling i kontroll (IgG) eller Sp35-Fc-behandlede rotter (8 dyr pr. gruppe). Behandling ble initiert ved tidspunkt for ryggmargskade. FIG. 9 er en graf som viser individuelle dyre-BBB score i uke fire i forsøket som er oppsummert i FIG. 8.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Naturlig forekommende humant Sp35 er et glykosylert CNS-spesifikt protein som inneholder 614 aminosyrer (FIG.2; SEQ ID NO: 2). Det humane, villtype Sp35-polypeptid i full lengde inneholder et LRR-område som består av 14 leucinrike repetisjoner (inkludert N- og C-terminal topper), et lg- område, en transmembran region og et cytoplasmatisk område (FIG.3). Det cytoplasmatiske området inneholder et kjent tyrosinfosforylert sted. I tillegg inneholder det naturlig forekommende Sp35-protein en signalsekvens, en kort basalregion mellom LRRCT og Ig-området og en transmembran region mellom Ig-området og det cytoplasmatiske området (FIG. 3). Det humane Sp35-genet inneholder alternative startkodoner for transla-sjon, slik at seks ytterligere aminosyrer, f.eks. MQVSKR (SEQ ID NO: 9) kan eller kan ikke være til stede ved Sp35 signalsekvensens N-terminal. Tabell 1 lister opp Sp35-områder og andre regioner i henhold til aminosyrerestnummer basert på sekvensen i FIG. 2 (SEQ ID NO: 2).
Vevsdistribusjon og Sp35s utviklingsmessige ekspresjon har blitt studert i mennes-ker og rotter. Sp35 biologi har blitt studert i en dyreeksperimentell rottemodell (rotte). Ekspresjonen av Sp35 er lokalisert til CNS-nevroner og oligodendrocytter i hjernen, som bestemt av Northern blot og immunohistokjemisk farging. Rotte-Sp35 mRNAs ekspresjonsnivå reguleres utviklingsmessig og når en topp rett etter fødse-len, dvs. ca. dag 1 etter fødselen. I en rottes ryggmargsskade transfeksjonsmodell blir Sp35 oppregulert på skadestedet, som bestemt av RT-PCR.
Oppfinnerne har oppdaget at villtype Sp35 i full lengde binder seg til NgRl. Løselige derivater av Sp35 fungerer som Sp35 antagonistpolypeptider ved å binde seg til NgRl og blokkerer, hemmer eller interferer med dets funksjon og derigjennom re-duserer NgRl-mediert hemming av aksonale forgreninger som normalt finner sted i CNS-nevroner. Dette er gunstig i situasjoner hvor aksonalforgrening eller nevritt-skudd trengs i hjernen eller i ryggmargen. Ryggmargskade inkludert partiell eller fullstendig knusing eller løsrivelse, er eksempler på en situasjon hvor aksonalforgrening trengs, men er normalt hemmet gjennom innvirkning av Nogo-banen. Eksempler på sykdommer eller forstyrrelser hvor aksonalforgrening og/eller nervittut-skyting i hjernen ville være en fordel, inkluderer slag, multippel sklerose og andre nevrodegenerative sykdommer eller forstyrrelser.
I de aktuelle behandlingsmetodene kan et Sp35-polypeptid eller et Sp35-blokkerende antistoff (eller antigenbindende antistoff-fragment) bli administrert direkte som et forhåndsdannet polypeptid eller indirekte gjennom en nukleinsyre-vektor for å motvirke NgRl-funksjonen og tillate fordelaktig aksonalutvekst.
I enkelte behandlinger blir et løslig Sp35 antagonistpolypeptid administrert i en be-handlingsmetode som inkluderer: (1) å omdanne eller transfektere en implanterbar vertscelle med en nukleinsyre, f.eks. en vektor som uttrykker et Sp35 polypeptid; og (2) å implantere den omdannede vertscellen i et pattedyr, på stedet for sykdom, forstyrrelse eller skade. For eksempel kan den omdannede vertscelle implanteres på skadestedet i ryggmargen. I noen behandlingsformer blir den implanterbare vertscellen tatt bort fra det aktuelle pattedyr, midlertidig dyrket, omformet eller transfektert med en isolert nukleinsyre som koder for et løselig Sp35-polypeptid, og implantert igjen i det samme pattedyret hvorfra det ble fjernet. Cellen kan bli, men må ikke bli, fjernet fra det samme stedet som den ble implantert. Slike former, no-en ganger kjent som ex vivo genterapi, kan skaffe en kontinuerlig tilførsel av Sp35 polypeptid, lokalisert på virkningsstedet, i en begrenset tidsperiode.
Oppfinnelsen skaffer oligopeptider som er nyttige som modulatorer for Sp35s interaksjon med NgRl og Sp35 homotypiske interaksjoner. Oligopeptidene inkluderer det følgende aminosyremotiv:
Den øverste raden av aminosyrer (uthevet; SEQ ID NO: 10) er den foretrukne sekvensen med varianter som inneholder valgfrie erstatninger vist nedenfor (SEQ ID NO: 11, 12 og 13).
Forskjellige mønstergyldige Sp35-polypeptider, anti-Sp35-antistoff og antistoff-fragmenter, og metoder og materiale for å få tilgang til disse molekylene, er beskrevet nedenfor.
Fusjonsproteiner og konjugerte polypeptider
Noen former av foreliggende oppfinnelse medfører bruk av Sp35-polypeptid, f.eks. et Sp35 antagonist-polypeptid i hvilket en Sp35-del er kondensert til en heterolog polypeptiddel for å danne et Sp35 fusjonsprotein. Sp35 fusjonsproteiner kan brukes for å oppnå forskjellige mål, f.eks. økt halveringstid i serum, forbedret biotilgjengelighet, in vivo målretting mot et spesifikt organ eller vevstype, forbedret rekombinant ekspresjonseffektivitet, forbedret vertscelleutskillelse, lette rensing og høyere aviditet. Avhengig av mål(ene) som skal nås, kan den heterologe delen være inert eller biologisk aktiv. Den kan også velges å være stabilt fusjonert til Sp35 halvdelen eller å kunne spaltes in vitro eller in vivo. Heterologe enheter for å få frem forskjellige egenskaper er kjent i faget.
Som et alternativ til å uttrykke et Sp35 fusjonsprotein, kan en valgt heterolog enhet forhåndsdannes og konjugeres kjemisk til Sp35-delen. I de fleste tilfeller vil en valgt heterolog enhet fungere på samme måte, om den er fusjonert eller konjugert til Sp35-halvdelen. I den følgende diskusjonen om heterologe aminosyresekvenser er det derfor underforstått, hvis ikke annet er spesifisert, at heterologe sekvenser kan sammenføyes med Sp35-deler i form av et fusjonsprotein eller som et kjemisk konjugat.
Farmakologisk aktive polypeptider som f.eks. Sp35, har ofte som egenskap rask in vivo utskillelse, noe som nødvendiggjør store doser for å oppnå terapeutisk effektive konsentrasjoner i kroppen. I tillegg kan polypeptider som er mindre enn ca. 60 kDa ha mulighet til glomerulær filtrering, noe som noen ganger fører til nefrotoksisitet. Fusjon eller konjugasjon av relativt små polypeptider, slike som Sp35-fragmenter, kan brukes for å redusere eller forhindre risiko for slik nefrotoksisitet. Forskjellige heterologe aminosyresekvenser, dvs. polypeptidhalvdeler eller "bærere" for å øke in wVo-stabiliteten, dvs. serumhalveringstid av terapeutiske polypeptider, er kjent.
Pga. den lange halveringstiden, bred in wVo-distribusjon og mangel på enzymatisk eller immunologisk funksjon, er essensielt humant serumalbumin (HSA) i full lengde eller et HSA-fragment, en foretrukket heterolog del. Gjennom bruk av metoder og materiale slik som beskrevet i Yeh et al., 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:1904-1908 og Syed et al., 1997, Blood 89:3243-3252, kan HSA bli brukt for å danne et Sp35 fusjonsprotein eller konjugat som viser farmakologisk aktivitet i kraft av Sp35-delen mens den viser signifikant økt, dvs. 10-ganger til 100-ganger høyere, in wVo-stabilitet. Fortrinnsvis er C-terminalen av HSA fusjonert med N-terminalen på Sp35 delen. Siden HSA er et protein som utskilles naturlig, kan HSA-signalsekvensen bli utnyttet for å oppnå utskillelse av Sp35 fusjonsproteiner i celle-kulturmediet, når fusjonsproteinet blir produsert i et eukaryotisk, dvs. pattedyrs, ekspresjonssystem.
Noen av oppfinnelsens former bruker et Sp35 polypeptid i hvilket en Sp35-halvdel er fusjonert til en Fc-region, dvs. C-terminaldelen av en lg tungkjedekonstant region. Mulige fordeler ved en Sp35-Fc-fusjon inkluderer løslighet, in vivo stabilitet, multivalens, dvs. dimerisering. Fc-regionen som er brukt, kan være en IgA, IgD eller IgG Fc-region (hengsel-CH2-CH3). Alternativt kan det være en IgE eller IgM Fc-region (hengsel-CH2-CH3-CH4). En IgG Fc- region er foretrukket, f.eks. en IgGl Fc-region eller en IgG4 Fc-region. Materialer og metoder for å konstruere og uttrykke DNA-kodede Fc-fusjoner er kjent i faget og kan benyttes for å oppnå Sp35-fusjoner uten unødvendig eksperimentering. Noen av oppfinnelsens former bruker et Sp35 fusjonsprotein slik som beskrevet i Capon et al. U.S. Patent Nr. 5.428.130 og 5.565.335.
Signalsekvensen er et polynukleotid som koder for en aminosyresekvens som initie-rer transport av et protein over membranen til det endoplasmatiske reticulum. Signalsekvensen som er nyttig for å konstruere en immunofusjon, inkluderer antistoff, lettkjedesignalsekvens, f.eks. antistoff 14.18 (Gillies et al., 1989, J. Immunol. Meth., 125:191-202), antistoff tungkjedesignalsekvens, f.eks. MOPC141 antistoff tungkjedesignalsekvens (Sakano et al., 1980, Nature 286:5774). Alternativt kan andre signalsekvenser benyttes, (se f.eks. Watson, 1984, Nucleic Acids Research 12:5145). Signalpeptidet blir vanligvis spaltet i hulrommet i det endoplasmatiske reticulum ved hjelp av signalpeptidaser. Dette resulterer i utskillelse av et immuno-fusjonsprotein som inneholder Fc-regionen og Sp35-delen.
I noen former koder DNA-sekvensen for et proteolytisk spaltingssted mellom sekresjonskassetten og Sp35-delen. Et spaltingssted sørger for en proteolytisk spalting av det kodede fusjonsproteinet og derigjennom skiller det Fc-området fra målpro-teinet. Nyttige proteolytiske spaltingssteder inkluderer aminosyresekvenser som gjenkjennes av proteolytiske enzymer som f.eks. trypsin, plasmin, trombin, faktor Xa eller enterokinase K.
Sekresjonskassetten kan inkorporeres i en kopierbar ekspresjonsvektor. Nyttige vektorer inkluderer lineære nukleinsyrer, plasmider, fagemider, kosmider og lignende. pdC er en egnet ekspresjonsvektor hvor overføring av immunofusjons-DNA blir kontrollert av forsterkeren og promoteren det humane cytomegaloviruset. Se f.eks. Lo et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:712; og Lo et al., 1998, Protein Engineering 11:495-500. En passende vertscelle kan transformeres eller trans-fekteres med et DNA som koder for et Sp35-polypeptid og kan bli brukt for å uttrykke og utskille Sp35 polypeptidet. De foretrukne vertscellene inkluderer udødeli- ge hybridomceller, myelomceller, 293-celler, kinesisk hamster eggstokkceller (CHO), Helaceller og COS-celler.
Helt intakt viser villtype Fc-regioner effektorfunksjoner som normalt er unødvendi-ge og uønsket i et Fc fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse. Derfor er visse bindingssteder fortrinnsvis fjernet fra Fc-regionen gjennom oppbygging av sekresjonskassetten. Foreksempel, fordi samuttrykk med lettkjede er unødvendig, blir bindingsstedet til tungkjedebindingsproteinet, Bip (Hendershot et al., 1987, Immunol. Today 8:111-114), fjernet fra CH2-området av IgEs Fc-region, slik at dette stedet ikke inteferer med effektiv utskillelse av immunofusin. Likeledes skal cysteinresiduene som er tilstede i Fc-regioner som er ansvarlig for binding til lettkje-den i immunoglobulinet, bli fjernet eller erstattet med en annen aminosyre slik at disse cysteinresiduene ikke inteferer med passende folding av Fc-regionen når den dannes som et immunofusin. Transmembran områdesekvenser, slik som de presen-tert i IgM, skal fjernes.
IgGl Fc-regionen er foretrukket. Alternativt kan Fc-regionen til andre underklasser av immunoglobulin gamma (gamma-2, gamma-3 og gamma-4) bli brukt i sekresjonskassetten. IgGl Fc-regionen i immunoglobulin gamma-1 er fortrinnsvis brukt i sekresjonskassetten og inkluderer hengselregionen (i hvertfall delvis), CH2-regionen og CH3-regionen. I noen former er Fc-regionen i immunoglobulin gamma-1 et CH2-fjernet Fc, som inkluderer deler av hengselregionen og CH3-regionen, men ikke CH2-regionen. En CH2-fjernet Fc har blitt beskrevet av Gillies et al., 1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47. I noen former blir Fc-regioner fra IgA, IgD, IgE eller IgM brukt.
Sp35-Fc fusjonsproteiner kan konstrueres i flere forskjellige konfigurasjoner. I en konfigurasjon er C-terminalen i Sp35-halvdelen fusjonert direkte med N-terminalen i Fc-halvdelen. I en litt forskjellig konfigurasjon er et kort polypeptid, f.eks. 2-10 aminosyrer inkorporert i fusjonen mellom N-terminalen i Sp35-halvdelen og C-terminalen i Fc-halvdelen. Slike linker fremmer konform fleksibilitet som kan forbedre biologisk aktivitet under noen omstendigheter. Hvis en tilstrekkelig del av hengselregionen blir holdt tilbake i Fc-halvdelen, vil Sp35-Fc fusjonen bli dimerisert og danner dermed et divalent molekyl. En homogen populasjon av monomeriske Fc-fusjoner vil gi monospesifikke, bivalente dimerer. En blanding av to monomeriske Fc-fusjoner som hver har forskjellig spesifisitet, vil gi bi-spesifikke, bi-valente dimerer.
Hvilken som helst av et antall krysslinkere som inneholder en tilsvarende aminore-aktiv gruppe og tiolreaktiv gruppe, kan brukes for å linke Sp35 til serumalbumin. Eksempler på passende linkere inkluderer aminoreaktive krysslinkere som innfører et tiol-reaktivt maleimid, f.eks. SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS og GMBS. Andre passende linkere innfører en tiolreaktiv haloacetatgruppe, f.eks. SBAP, SIA, SIAB. Linkere som skaffer en beskyttet eller ikke-beskyttet tiol for reaksjon med sulfhydryl-grupper for å produsere en reduserbar link, inkluderer SPDP, SMPT, SATA og SATP. Slike reagenser er tilgjengelige på markedet (f.eks. Pierce Chemicals).
Konjugasjon må ikke involvere N-terminalen i et Sp35-polypeptid eller tiol-delen på serumalbumin. For eksempel kan Sp35 albuminfusjoner oppnås ved bruk av gene-tisk manipulering i hvilket Sp35-halvdelen blir fusjonert til serumalbumin-genet ved dets N-terminal, C-terminal eller begge.
Sp35 polypeptider kan fuseres med heterologe peptider for å lette rensing og iden-tifisering av Sp35-delen. Foreksempel kan en histidin-markørfuseres med et Sp35 polypeptid for å lette rensing ved bruk av kromatografimedium tilgjengelig på markedet. I noen av oppfinnelsens former er en Sp35 fusjonskonstruksjon brukt for å øke produksjonen av en Sp35-del i bakterier. I slike konstruksjoner er et bakterie-protein, normalt uttrykt og/eller utskilt på et høyt nivå, brukt som N-terminalens fusjonspartner i et Sp35 polypeptid. Se f.eks., Smith et al., 1988 Gene 67:31; Hopp et al., 1988, Biotechnology 6:1204; La Vallie et al., 1993, Biotechnology 11:187.
I noen av oppfinnelsens former inkluderer en fusjonskonstruksjon en Sp35-halvdel og en annen human NgRl-bindende halvdel, f.eks. en oligodendrocytt myelin glykoprotein (Omgp)-del, en myelin assosiert glykoprotein (MAG)- del eller Nogo66-del. Fordelene ved slike konstruksjoner inkluderer økt NgRl bindingsaffinitet.
Omgp aminosyresekvensen i full lengde er kjent i faget (Genbank aksesjonsnr. P23515). Spesifikke eksempler på Sp35-Omgp-fusjoner inkluderer det følgende:
Sp35 (aa 34-532) + IgGl Fc + Omgp (aminosyrerester 25-400); og
SP35 (aa 34-532) + HSA + Omgp (aminosyrerester 25-400).
MAG aminosyresekvens i full lengde er kjent i faget (Genbank aksesjonsnr. A61084). Spesifikke eksempler på Sp35-MAG fusjoner inkluderer følgende:
Sp35 (aa 34-532) + IgGl Fc + MAG (aminosyrerester 12-500); og
Sp35 (aa 34-532) + HSA + MAG (aminosyrerester 12-500).
Nogo aminosyresekvens i full lengde er kjent i faget (NogoA Genbank aksesjonsnr. AY102279). Spesifikke eksempler på Sp35-Nogofusjoner inkluderer følgende:
Ved å sammenføye en Sp35-del ved amino- og karboksy-terminalen til en passende fusjonspartner, kan bivalente eller tetravalente former av et Sp35 polypeptid oppnås. Foreksempel kan en Sp35-del sammenføyes med amino- og karboksy-terminalen til en Ig-del for å produsere et bivalent monomerisk polypeptid som inneholder 2 Sp35 deler. Ved dimerisering av to av disse monomerene, i kraft av Ig-delen, oppnås en tetravalent form av et Sp35 protein. Slike multivalente former kan brukes for å oppnå økt bindingsaffinitet til målet. Multivalente former av Sp35 kan også oppnås ved å plassere Sp35-deler i tandem for å danne kjeder, som kan bli benyttet alene eller sammenføyet med en fusjonspartner så som lg eller HSA.
Konjugerte polymerer ( andre enn polypeptider)
Noen av oppfinnelsens former involverer et Sp35 polypeptid i hvilket en eller flere polymerer er konjugert (bundet kovalent) til Sp35 polypeptidet. Eksempler på polymerer som passer til slik konjugasjon, inkluderer polypeptider (diskutert ovenfor), sukkerpolymerer og polyalkylen glykolkjeder. Typisk, men ikke nødvendigvis, blir en polymer konjugert til Sp35-polypeptidet i den hensikt å forbedre en eller flere av følgende: løselighet, stabilitet eller biotilgjengelighet.
En foretrukket klasse polymerer til konjugasjon til et Sp35 polypeptid er en polyalkylenglykol. Polyetylenglykol (PEG) er spesielt foretrukket. PEG-enheter, f.eks. 1, 2, 3, 4 eller 5 PEG-polymerer kan konjugeres til hvert Sp35 polypeptid for å øke serumhalveringstid sammenlignet med Sp35 polypeptidet alene. PEG-enheter er ikke-antigene og i hovedsak biologisk inerte. PEG-enheter kan være forgrenet eller ikke-forgrenet. Antall PEG-enheter bundet til Sp35 polypeptidet samt molekylvek-ten av de individuelle PEG-kjedene kan variere. Vanligvis, jo høyere molekylvekt polymeren har, desto færre polymerkjeder er bundet til polypeptidet. Fortrinnsvis er den totale polymermasse forbundet med Sp35 polypeptidet fra 20 kDa til 40 kDa. Hvis en polymerkjede blir bundet, er således kjedens molekylvekt 20-40 kDa. Hvis to kjeder blir bundet er foretrukket molekylvekt av hver kjede 10-20 kDa. Hvis tre kjeder er forbundet er foretrukket molekylvekt 7-14 kDa.
Polymeren, f.eks. PEG, kan bindes til Sp35 polypeptidet gjennom enhver passende, eksponert reaktiv gruppe på polypeptidet. Den eller de eksponerte reaktive gruppene kan f.eks. være en N-terminal aminogruppe eller epsilon aminogruppen til en intern lysinrest, eller begge. En aktivert polymer kan reagere og bindes kovalent til enhver fri aminogruppe på Sp35 polypeptidet. Frie karboksylgrupper, passende aktiverte karbonylgrupper, hydroksyl, guanydyl, imidazol, oksyderte karbohydrat-enheter og merkaptogrupper av Sp35 (hvis tilgjengelig) kan også brukes som reaktive grupper til polymerforbindelsen.
Fortrinnsvis blir ca. 1,0 til ca. 10 mol av aktivert polymer pr. mol polypeptid, avhengig av polypeptid-konsentrasjonen, benyttet i en konjugasjonsreaksjon. Vanligvis representerer det valgte forhold en balanse mellom det å maksimere reaksjonen mens tilleggsreaksjoner (ofte uspesifikke) som kan forringe den ønskede farmako-logiske effekten av Sp35-delen, minimeres. Fortrinnsvis blir minst 50 % av den biologiske aktiviteten til Sp35 polypeptidet(som demonstrert f.eks. i enhver test beskrevet her eller kjent i faget) beholdt og aller helst nærmere 100 % beholdt.
Polymeren kan konjugeres til Sp35-polypeptidet ved å benytte konvensjonell kjemi. For eksempel kan en polyalkylen glykoldel være koblet til en lysin epsilon aminogruppe på Sp35 polypeptidet. Bindingen til lysinsidekjeden kan utføres med en N-hydroksylsuccinimid (NHS) aktiv ester slik som PEG succinimidylsuccinat (SS-PEG) og succinimidylpropionat (SPA-PEG). Passende polyalkylen glykolenheter inkluderer f.eks. karboksymetyl-NHS, norlausin-NHS, SC-PEG, tresylat, aldehyd, epoksid, kar-bonylimidazol og PNP-karbonat. Disse reagensene er tilgjengelig på markedet.
Ekstra aminreaktive PEG-linkere kan byttes ut med succimidyldelen. Disse inkluderer f.eks. isothiocyanat, nitrofenylkarbonat, epoksider og benzotriasolkarbonater. Man velger helst betingelser som maksimerer selektiviteten og reaksjonens om- fang. Slik optimalisering av reaksjonsbetingelsene er innenfor vanlig dyktighet i faget.
PEGylering kan utføres ved hjelp av PEGyleringsreaksjonene som er kjent i faget. Se f.eks. Focus on Growth Factors, 3: 4-10,1992, publiserte europeiske patentsøk-nader EP 0 154 316 og EP 0 401 384. PEGylering kan utføres ved hjelp av en asyle-ringsreaksjon eller en alkyleringsreaksjon med et reaktivt polyetylenglykolmolekyl (eller en analog reaktiv vannløslig polymer).
PEGylering ved asylering involverer vanligvis reaksjon av et aktivt esterderivat av polyetylenglykol. Ethvert reaktivt PEG-molekyl kan benyttes i PEGylering. En foretrukket aktivert PEG-ester er PEG esterifisert til N-hydroksysuccinimid (NHS). Som brukt her, inkluderer asylering uten begrensning de følgende typer av binding mellom det terapeutiske protein og en vannløslig polymer slik som PEG; amid, karba-mat, uretan og lignende. Se Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Reaksjons-parametere bør velges for å unngå temperatur, løsningsmiddel og pH-forhold som kan ødelegge eller inaktivere Sp35 polypeptid.
Fortrinnsvis er forbindelsesbindingen et amid. Fortrinnsvis er minst 95 % av sluttproduktet mono, di- eller tri-PEGylert. Imidlertid kan noen typer med høyere grader av PEGylering dannes i mengder avhengig av den spesifikke reaksjonsbetingelsen som er benyttet. Optimalt blir rensede, PEGylerte typer utskilt fra blandingen, spesielt ikkereagerte typer, ved konvensjonelle rensemetoder, inkludert f.eks. dialyse, utsalting, ultrafiltrering, ionebyttekromatografi, gelfiltrerings-kromatografi og elek-troforese.
PEGylering ved alkylering involverer vanligvis en reaksjon av et terminalt aldehydderivat av PEG med Sp35 i nærvær av et reduserende agens. I tillegg kan man manipulere reaksjonsbetingelsene for å favorisere PEGylering betraktelig bare ved N-terminalens aminogruppe på Sp35 (dvs. et mono-PEGylert protein). I begge tilfeller av mono-PEGylering eller poly-PEGylering er PEG-gruppene fortrinnsvis bundet til proteinet via en -CH2-NH-gruppe. Med spesiell referanse til -CH2-gruppen er denne type binding kjent som en "alkyl"-binding.
Derivatisering via reduserende alkylering for å produsere et mono-PEGylert produkt utnytter differensiert reaktivitet av forskjellige typer primære aminogrupper (lysin versus N-terminalen) tilgjengelig for derivatisering. Reaksjonen utføres ved en pH som tillater en å dra fordel av pKa-forskjellen mellom epsilon-aminogrupper på ly- sinrester og proteinets N-terminale aminogruppe. Ved slik selektiv derivatisering, blir festing av en vannløslig polymer som inneholder en reaktiv gruppe, slik som et aldehyd, til et protein, kontrollert: konjugasjon med polymeren finner hovedsakelig sted på N-terminalen i proteinet, og ingen signifikant modifikasjon av andre reaktive grupper slik som lysin sidekjede aminogrupper, forekommer.
Polymermolekylene som benyttes i både asylerings- og alkyleringsmetoder blir
valgt blant vannløslige polymerer. De valgte polymerene bør modifiseres til å ha en enkel, reaktiv gruppe slik som en aktiv ester for asylering eller et aldehyd for alkylering, fortrinnsvis slik at graden av polymerisering kan kontrolleres, slik som det er vist i de foreliggende metoder. Et egnet reaktivt PEG-aldehyd er polyetylenglykol propionaldehyd som er vannstabil, eller mono-, C1-C10-, alkoksy- eller aryloksyde-rivater av disse (se U.S. Patent 5, 252,714). Polymeren kan være forgrenet eller ikke-forgrenet. Til asyleringsreaksjoner bør valgt(e) polymer(er) ha en enkel reaktiv estergruppe. For reduserende alkylering bør valgt(e) polymer(er) ha en enkel, reaktiv aldehydgruppe. Vanligvis vil den vannløslige polymeren ikke bli valgt fra naturlig forekommende glykocylrester siden disse vanligvis blir laget enklere ved rekombinante ekspresjonssystemer hos pattedyr.
Metoder for å forberede en PEGylert Sp35 inkluderer vanligvis trinn av (a) reaksjon mellom et Sp35 protein eller polypeptid med polyetylenglykol (slik som en reaktiv ester eller aldehydderivat av PEG) under betingelser hvor molekylet blir festet til en eller flere PEG-grupper, og (b) oppnår reaksjonsprodukt(er). Vanligvis vil den opti-male reaksjonsbetingelsen for asyleringsreaksjoner bli bestemt fra tilfelle til tilfelle basert på kjente parametere og ønsket resultat. For eksempel, jo større forhold mellom PEG:protein, dessto større prosent poly-PEGylert produkt.
Redusert alkylering for å danne en vesentlig homogen populasjon av mono-polymer/Sp35 inkluderer vanligvis trinn som: (a) reaksjon mellom et Sp35-protein eller polypeptid med et reaktivt PEG-molekyl under reduserende alkyleringsbeting-elser ved en pH passende til pen-nit selektiv modifikasjon av N-terminalamino-gruppen på Sp35; og (b) oppnå reaksjonsprodukt(er).
For en vesentlig homogen populasjon av mono-polymer/Sp35, er reduserte alkyle-ringsreaksjonsbetingelser de som tillater selektiv festing av den vannløslige poly-merenheten til N-terminalen på Sp35. Slike reaksjonsbetingelser fremskaffer vanligvis pKa-forskjeller mellom lysin sidekjedeaminogruppene og den N-terminale aminogruppen. For den foreliggende oppfinnelsens formål, er foretrukket pH i området fra 3-9, fortrinnsvis 3-6.
Sp35 polypeptider kan inkludere en markør, f.eks. en enhet som deretter kan bli fjernet ved proteolyse. Slik kan lysindelen bli selektivt modifisert ved først å reagere med en His-markør, modifisert med en lav molekylvektbinding slik som Trauts reagens (Pierce) som kan reagere med både lysin og N-terminal, og deretter fjerne His-markøren. Polypeptidet vil så inneholde en fri SH-gruppe som kan bli selektivt modifisert med en PEG som inneholder en tiolreaktiv hovedgruppe så som en maleimidgruppe, en vinylsulfongruppe, en haloacetatgruppe eller en fri eller beskyttet SH.
Trauts reagens kan bli erstattet med en hvilken som helst linker som vil danne et spesifikt sted til PEG-festing. For eksempel kan Trauts reagens bli erstattet med SPDP, SMPT, SATA eller SATP (Pierce). På samme måte kan man få proteinet til å reagere med en aminreaktiv linker som setter inn et maleimid (f.eks. SNCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS eller GMBS), en haloacetatgruppe (SBAP, SIA, SIAB), eller en vinylsulfongruppe, og få endeproduktet til å reagere med et PEG som inneholderen fri SH.
I noen former er polyalkylenglykolhalvdelen koblet til en cysteingruppe på Sp35 polypeptidet. Kobling kan effektueres ved bruk av f.eks. en maleimid-gruppe, en vinylsulfongruppe, en haloacetatgruppe eller en tiolgruppe.
Det er valgfritt om Sp35 polypeptidet er konjugert til polyetylenglykoldelen gjennom en labil binding. Den labile bindingen spaltes f.eks. ved biokjemisk hydrolyse, proteolyse eller sulfhydryldeling. For eksempel kan bindingen bli spaltet under in vivo (fysiologiske) betingelser.
Reaksjonene kan finne sted ved bruk av enhver passende metode som brukes for å få biologisk aktivt materiale til å reagere med inerte polymerer, fortrinnsvis ved pH ca. 5-8, f.eks. pH 5, 6, 7 eller 8 hvis de reaktive gruppene er på alfa-aminogruppen ved N-terminalen. Vanligvis involverer prosessen forberedelse av en aktivert polymer og deretter en reaksjon mellom proteinet med den aktiverte polymeren for å produsere det løselige proteinet som er egnet for en formulering.
Vektorer
Oppfinnelsen fremskaffer vektorer som består av nukleinsyrene som koder for Sp35 polypeptider. Valg av vektor og ekspresjonskontrollsekvenser som nukleinsyrene i denne oppfinnelsen brukes sammen med, avhenger av de ønskede funksjonelle egenskaper, f.eks. proteinekspresjon og vertsceller som kan transformeres.
Ekspresjonskontrollelementer som er nyttige for å regulere ekspresjonen operativt bundet til en kodesekvens, er kjent i faget. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til induserbare forsterkerelementer, konstruktive forsterkerelementer, se-kresjonssignaler og reguleringselementer. Når en induserbar forsterker blir brukt, kan den bli kontrollert av f.eks. en endring i næringsstatus eller en forandring i temperatur i vertscellemediet.
Vektoren kan inkludere et prokaryotisk replikon, dvs. en DNA-sekvens som har ev-nen til direkte autonom replisering og vedlikehold av det rekombinante DNA-molekyl ekstrakromosomt i en bakteriell vertscelle. Slike replikoner er kjente i faget. I tillegg kan vektorer som inkluderer et prokaryotisk replikon også inkludere et gen hvis ekspresjon danner en påviselig markør så som medikamentresistens. Eksempler på bakterielle medikamentresistens gener er de som gir resistens mot ampicillin eller tetracyklin.
Vektorer som inkluderer et prokaryotisk replikon kan også inkludere en prokaryotisk eller bakteriofag forsterker for direkte uttrykk av de kodende gensekvensene i en bakteriell vertscelle. Forsterkersekvenser forenlig med bakterielle verter er typisk fremskaffet i plasmidvektorer som inneholder et egnet restriksjonssted for å sette inn et DNA-segment som skal uttrykkes. Eksempler på slike plasmidvektorer er pUC8, pUC9, pBR322 og pBR329 (Bio-Rad), pPL og pKK223 (Pharmacia). Enhver passende prokaryotisk vert kan bli brukt for å uttrykke et rekombinant DNA-molekyl som koder for et av oppfinnelsens proteiner.
Eukaryotiske celleekspresjonsvektorer er kjent i faget og er kommersielt tilgjengelige. Typisk inneholder slike vektorer egnede restriksjonssteder til innsetting av det ønskede DNA-segmentet. Egnede vektorer inkluderer pSVL og pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pMI2d (International Biotechnologies), pTDTl (ATCC 31255), retroviral ekspresjonsvektor pMIG, adenovirus shuttle vektor pDC315 og AAV-vektorer.
Eukaryotiske celleekspresjonsvektorer kan inkludere en utvalgbar markør, f.eks. et medikamentresistens-gen. Neomycin fosfotransferase (neo) gen (Southern et al., 1982, J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341) er et eksempel på et slikt gen. For å uttrykke antistoff eller antistoff-fragmenter er DNAer som koder for partiell eller full lengde lette eller tunge kjeder satt inn i ekspresjonsvektorer slik som plasmider, retrovirus, kosmider, YACer, EBV-deriverte episomer og lignende. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontrollsekvenser er valgt for å være i samsvar med den benyttede ekspresjonsvertscelle. Antistoff lettkjede-genet og antistoff tungkjede-genet kan settes inn i separate vektorer. I noen former blir begge gener satt inn i samme ekspresjonsvektor.
En egnet vektor er en som koder for en funksjonell, fullstendig human CH eller CLimmunoglobulinsekvens. Foretrukket er restriksjonssteder som er konstruert slik at enhver VH -eller VL-sekvens lett kan settes inn og uttrykkes. I slike vektorer finner vanligvis spleisingsseter mellom spleisedonorstedet i den innsatte J-regionen og spleise-akseptorstedet som kommer foran den humane C-regionen og også ved spleiseregioner som opptrer innenfor det humane CH-område. Polyadenylering og overføringsterminering finner sted ved iboende kromosomale steder nedstrøms for koderegionen. Den rekombinante ekspresjonsvektoren kan også kode for et signal-peptid som letter utskillelse av antistoffkjeden fra en vertscelle.
Foretrukne reguleringssekvenser for vertscelleekspresjon hos pattedyr inkluderer viruselementer som dirigerer høye nivåer av proteinekspresjon i pattedyrceller så som fremmere og forsterkere derivert fra retrovirale LTRer, cytomegalovirus (CMV)
(slike som CMV fremmer/forsterker), Simian Virus 40 (SV40) (slik som SV40 fremmer/forsterker), adenovirus, f.eks. adenovirus sen hovedfremmer (AdMLP)), polyomer og sterke pattedyrfremmere, slik som medfødt immunoglobulin og aktin-fremmere. For ytterligere beskrivelse av virusreguleringselementer og sekvenser av disse, se f.eks. Stinski U.S. Pat. No.5,168,062; Bell U.S. Pat. Nr. 4,510,245; og Schaffner U.S. Pat. Nr. 4,968,615. De rekombinante ekspresjonsvektorene kan være sekvenser som regulerer reprodusering av vektoren i vertsceller (f.eks. re-produseringsorigo) og utvalgbare markørgener. De utvalgbare markørgenene letter utvalg av vertsceller hvor vektorer har blitt introdusert (se f.eks. Axel U.S. Pat. Nr. 4,399,216; 4,634,665 og 5,179,017). For eksempel er det typisk at det utvalgte
markørgenet overfører resistens til medikamenter, slik som G418, hygromycin eller metotrexat på en vertscelle hvor vektoren har blitt introdusert. Foretrukne utvalgte
markørgener inkluderer dihydrofolatreduktase (DHFR) genet (til bruk i dhfr vertsceller med metrotrexat seleksjon/forsterkning og neogenet (til G418 seleksjon).
Nukleinsyremolekyler som koder for Sp35 polypeptider og anti-Sp35 antistoff, og vektorer som inneholder disse nukleinsyremolekylene kan brukes til transformasjon av en passende vertscelle. Transformasjon kan forekomme ved enhver passende metode. Metoder til innføring av eksogent DNA i pattedyrceller er godt kjent i faget og inkluderer dextranmediert transfeksjon, kalsiumfosfatfelling, polybren-mediert transfeksjon, protoplast fusjon, electroporasjon, innkapsling av polynukleotid(er) i liposomer og direkte mikroinjeksjon av DNA i kjerner. I tillegg kan nukleinsyremolekyler bli introdusert i pattedyrceller ved virusvektorer.
Transformasjon av vertsceller kan oppnås ved konvensjonelle metoder som passer til den benyttede vektore og vertscelle. For transformasjon av prokaryotiske vertsceller, kan elektroporasjon og saltbehandlingsmetoder bli brukt (Cohen et al., 1972, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69:2110-2114). For transformasjon av ryggvirvelceller, kan elektroporasjon, kationisk lipid eller saltbehandlingsmetoder brukes. Se f.eks. Graham et al., 1973, Virology 52:456-467; Wigler et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:1373-1376f.
Pattedyrcellelinjer som er tilgjengelige som verter for ekspresjon, er kjent i faget og inkluderer mange udødelige cellelinjer som er tilgjengelig fra American Type Culture Collection (ATTC). Disse inkluderer inter alia kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler, NSO, SP2, He, La celler, babyhamster nyre (BHK), apenyre celler (COS), humane lever karcinom celler (dvs. HeP G2), A549 celler og flere andre cellelinjer.
Ekspresjon av polypeptider fra produksjonscellelinjer kan forsterkes ved å bruke kjente teknikker. For eksempel blir glutaminsyntetase (GS)-systemet vanligvis brukt for å forsterke ekspresjon under visse betingelser, se, f.eks. European Patent Nr. 0216846, 0256055, og 0323997 og European Patentsøknad Nr. 89303964.4.
Vertsceller
Vertsceller kan være prokaryotiske eller eukaryotiske. Foretrukne eukaryotiske vertsceller inkluderer, men er ikke begrenset til, gjær og pattedyrceller, f.eks. kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler (STCC aksesjonsnr. CCL61), NIH sveitsisk mu-seembryoceller NIH-3T3 (ATCC aksesjonsnr. CRL1658), og baby hamster nyreceller (BHK). Andre brukbare eukaryotiske vertsceller inkluderer insektsceller og plante- celler. Egnede prokaryotiske vertsceller er E.coli og streptomyces-arter. Sammen-setninger som inneholder Sp35 polypeptider, anti-Sp35 antistoff eller antigenbindende fragmenter av anti-Sp35 antistoff, kan inneholde egnede farmasøytisk akseptable bærere. For eksempel kan de inneholde tilsetninger og/eller hjelpeutstyr som gjør det enklere å behandle de aktive forbindelser i preparater som er laget for levering til virkningsstedet. Passende formuleringer til parenteral administrering inneholder vannholdige løsninger av den aktive forbindelsen i vannløselig form, f.eks. vannløselige salter. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene av passende oljeinjeksjonssuspensjoner administreres. Passende lipofile løsemidler eller bindemidler inkluderer fete oljer, f.eks. sesamolje eller syntetiske fettsyreestere, f.eks. etyloleat eller triglycerider. Vannholdige injeksjonssuspensjoner som kan inneholde substanser som øker suspensjonens viskositet, inkluderer f.eks. natrium, karboksy metyl, cellulose, sorbitol og dextran. Valgfritt kan suspensjonen også inneholde stabilisatorer. Liposomer kan også brukes for å innkapsle oppfinnelsens molekyler for levering inn i celler eller interstitielle rom. Egnede farmasøytisk akseptable bærere er fysiologisk samsvarende løsemidler, dispersjonsmedia, belegg, antibakterielle og antisoppmidler, isotonisk og absorpsjonsforsinkende midler, vann, saltvann, fosfatbufret saltvann, dekstrose, glyserol, etanol o.l. I noen former inneholder blandingen isotoniske midler, f.eks. sukker, polyalkoholer slike som ma-nitol, sorbitol og natriumklorid. I noen former inneholder blandingene farmasøytisk akseptable substanser som fuktende eller minimale mengder hjelpestoff så som fuktende eller emulgeringsmidler, konserveringsmidler eller buffere, som øker hold-barhetstiden eller de aktive ingrediensenes effektivitet.
Oppfinnelsens blandinger kan være i forskjellige former inkludert f.eks. væske (f.eks. løsninger som kan injiseres og infunderbare løsninger), dispersjon, suspen-sjon, halvfaste og faste doseringsformer. Den foretrukne formen avhenger av ad-ministrasjonsmåten og den terapeutiske anvendelse.
Blandingen kan formuleres som en løsning, en mikroemulsjon, dispersjon, liposom eller andre ordnede strukturer som er egnet til å øke medikamentkonsentrasjonen. Sterile løsninger som kan injiseres, kan lages ved å inkorporere den aktive ingrediensen i den nødvendige mengde i et passende løsningsmiddel med en eller en kombinasjon av ingredienser opplistet ovenfor, etter behov, etterfulgt av filtrert sterilisering. Vanligvis lages dispersjoner ved å inkorporere den aktive ingrediensen i et sterilt bindemiddel som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de nødven-dige andre ingredienser fra de som er opplistet ovenfor. I tilfelle av sterile pulvere for å lage sterile, injiserbare løsninger er den foretrukne tillagningsmetoden va- cumtørring og frysetørring som resulterer i et pulver av den aktive ingrediensen pluss enhver ønsket tilleggsingrediens fra en tidligere sterilfiltrert løsning. En løs-nings egnede fluiditet kan beholdes f.eks. ved å bruke belegg som lecitin, når det gjelder dispersjon ved vedlikehold av den nødvendige partikkelstørrelse og ved bruk av overflateaktive stoffer. Forlenget absorpsjon av injiserbare blandinger kan skje ved å inkludere et middel i blandingen som forlenger absorpsjon, f.eks. mono-stearatsalter og gelatin.
Den aktive ingrediensen kan formuleres med en formulering eller anordning for kontrollert frigjøring. Eksempler på slike formuleringer og anordninger inkluderer implantater, transdermale plastre og mikroinnkapslet leveringssystem. Bionedbrytbare og biokompatible polymerer kan brukes, f.eks. etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglycolisk syre, kollagen, polyortoestere og polyaktisk syre. Metoder for å klargjøre slike formuleringer og anordninger er kjente i faget. Se f.eks. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Injiserbare depotformuleringer kan lages ved å lage mikroinnkapslede matriser av medikamentet i bionedbrytbare polymerer som polyaktid-polyglykolid. Avhengig av forholdet medikament til polymer og den brukte polymerens egenskap kan medi-kamentets frigjøringshastighet kontrolleres. Andre anvendbare bionedbrytbare polymerer er polyortoestere og polyanhydrider. Depotinjiserbare formuleringer kan også lages ved å stenge medikamentet inne i liposomer og mikroemulsjoner.
Supplerende aktive bestanddeler kan inkorporeres i blandingene. I noen former blir et Sp35 polypeptid, anti-Sp35 antistoff eller et fragment av dette, koadministrert med et anti-NgRl antistoff eller et antigenbindende fragment av dette eller løslige NgRl polypeptider eller NgRl fusjonsprotein.
Doseringsregimer kan justeres for å fremskaffe den optimalt ønskede respons. For eksempel kan en enkel bolus administreres, flere separate doser kan administreres overtid eller dosen kan reduseres proporsjonalt eller økt som indisert av den terapeutiske situasjonens krav. Det er en fordel å formulere parenterale blandinger i doseenhetsformer for å lette administrering og doseringens uniformitet. Se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA 1980).
I tillegg til den aktive blandingen kan flytende doseringsformer inneholde inerte ingredienser som vann, etylalkohol, etylkarbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzyl- bensoat, propylenglykol, 1,3 butylenglykol, dimetylformamid, oljer, glycerol, tetra-hydrofurfuryl alkohol, polyetylenglykol og fettsyreestere av sorbitan.
Genterapi
Et Sp35 polypeptid kan produseres in vivo i et pattedyr, f.eks. et menneske, ved å bruke tilnærmingsmåten genterapi ved behandling av en CNS sykdom, forstyrrelse eller skade hvor hemming av aksonal utvekst ville være en terapeutisk fordel. Dette involverer administrering av et passende Sp35 polypeptid som koder for nukleinsyre bundet operativt til passende ekspresjonskontrollsekvenser. Fortrinnsvis er disse sekvensene inkorporert i en virusvektor. Passende virusvektorer til slik genterapi inkluderer adenovirus-vektorer, lentivirus-vektorer, baculovirus-vektorer, Epstein Barr-virusvektorer, papovavirus-vektorer, vaccinavirus-vektorer, herpes sim-plexvirus-vektorer og adenoassosierte virus-(AAV) vektorer. Virusvektoren kan være en replikasjonsdefekt virusvektor. En foretrukket adenovirus-vektor har en utelatelse i sitt El gen eller E3 gen. Når en adenovirus-vektor benyttes, er pattedyret fortrinnsvis ikke utsatt for en nukleinsyre som koder for et valgbart markørgen.
Eksempler
Oppfinnelsen belyses videre gjennom følgende forsøkseksempler. Eksemplene er fremskaffet kun som illustrasjon.
Eksempel 1: Sp35 ekspresjonsmønster
Sp35s ekspresjon i menneskelig vev ble evaluert ved Northern blot-analyse. Multip-le vevsblotter som inneholder 12 humane hovedvev eller 14 humane CNS-vev ble hybridisert over natten ved 68°C med P<32->merket Sp35 probe (nukleotider 150 - 450 av Sp35 cDNA-sekvens). Blottene ble vasket 3 ganger med 2x SSC, 0,5 % SDS, deretter 3 ganger med 0,5x SSC, 0,1 % SDS. Blotten ble deretter utsatt for røntgenfilm og mRNA-nivåene visualisert ved autoradiografi.
Sp35 blir sterkt uttrykt i den menneskelige hjerne men ikke i hjerte, skjelettmusku-latur, tykktarm, tymus, milt, nyre, lever, tynntarm, placenta, lunge og perifere blodleukocytter. Sp35 ble uttrykt i alle hjernevev som ble festet inkludert vev isolert fra frontal cortex og posterior cortex, entorhinal cortex, hippocampus, lukt bulb, striatum, talamus, cerebellum, midthjerne, pons, medulla og ryggmargen. En gradient av gen uttrykk langs den rostrale/cordale akse ble observert for Sp35 med det høyeste nivå i den corticale bark og det laveste nivået i ryggmargen.
Immunohistokjemisk (IHC) farging ble brukt for å bestemme om Sp35 blir uttrykt i spesifikke hjerneceller. 4 % paraformaldehyd-fikserte rottehjerner, ryggmargssnitt eller primære, granulære nevron kulturer ble inkubert med primære antistoff til Sp35, som vist, etterfulgt av sekundære antistoff konjugert til Alexa 480 eller 590 (Molecular Probes Inc). Snittene ble montert i Vectashield og visualisert ved fluo-rescensmikroskopi. Spesifikke anti-Sp35 antistoff brukt til IHC ble generert fra en Fab-fag utstillingsbibliotek som bruker MorPhosys-teknologi.
Sp35 blir uttrykt spesifikt i nevroner og olegodendrocytter, men ikke i astrocytter. Dette ble bestemt i forsøk hvor rottehjernevevs-snitt ble farget med forskjellige stoffer, inkludert antiastrocytt-markør GFAP, et antistoff til en oligodendrocytt-markør (04) og et antistoff til den nevronale pill-tubulin-markør, all motfarging med et anti-Sp35 antistoff. Oligodendrocytter og nevroner ble intenst farget med anti-Sp35 antistoff. Ingen farging av astrocytter ble observert.
Som en uavhengig bekreftelse på ekspresjonsmønsteret til Sp35, utførte vi se-mi kvantitativt RT-PCR ved bruk av mRNA ekstrahert (Ambion kit) fra primære rottecellekulturer av rensede astrocytter, oligodendrocytter og granulære nevroner fra cerebellum. Forover primer AAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGA (SEQ ID NO: 14) og revers primer TACTCGATCTCGATGTTGTGCTTT (SEQ ID NO: 15) ble brukt. Etter 26 sykluser ble et sterkt bånd observert i mRNA fra nevroner, et distinkt men svakere signal ble oppdaget i oligodendrocytt mRNA og ikke noe bånd ble observert i astrocytter.
Eksempel 2: Sp35-Fc fusjonsprotein
For å studere den biologiske funksjonen til Sp35 ble det laget en konstruksjon hvor man blandet en ekstracellulær posjon human Sp35 (rest 1-531) til hengselet og Fc-regionen i humant IgGl. En partiell kodesekvens for humant Sp35 ble oppnådd ved PCR fra klone 227,2 (Incyte) ved bruk av forover-primer
5'CAGCAGGTCGACGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGT3' (SEQ ID NO: 16) og revers primer 5'CAGCAGGTCGACCTCGCCCGGCTGGTTGG3' (SEQ ID NO: 17).
Det butte PCR sluttproduktet ble subklonet inn i Srfl-stedet på PCR SCRIPT AMP vektor (Stratagene) for å danne PCR SCRIPT AMP-sp35. Et Sall-fragment ble isolert fra PCR SCRIPT AMP-sp35 og subklonet inn i PCRCAMP lg vektor (derivat av Stratagene vektor PCR SCRIPT AMP hvori Fc gamma sekvens er subklonet som en SaII(5') til NotI(3') fragment, og sammensmelter Sp35 signalsekvens og ektodo-menesekvens (kodon 1-531) i system med sekvenser som koder for hengselet og Fc-regionen i humant Igl. Korrekte isolater ble identifisert og et Notl-fragment omfattende Sp35 Fc-fragmentet ble subklonet i det enkle Noti kloningsstedet på 293E uttrykksvektor, CH274 og et derivat av kommersiell uttrykksvektor REP4 (Invitrogen). Sp-35 Fc-fusjonen som er kodet av den nye vektoren CH274/Sp35 Fc, ble bekreftet av DNA-sekvensering som plasmid GT123.
Stabile cellelinjer som uttrykker Sp35 Fc-fusjonsproteiner ble generert ved elekro-porasjon av CHO vertsceller DG44 med plasmid GT123. Transfekterte CHO-celler ble dyrket i alfa minus MEM i nærvær av 10 % dialysert serum og 4mM glutamin, for å velge nukleocid uavhengig vekst. Fjorten dager etter transfeksjonen ble cellene tilsatt nytt medium. For å screene for celler som uttrykker Sp35-Fc ble CHO-celler merket med Phycoerythrin (PH)-merket antihumant IgG fra geit (Jackson Labs) og utsatt for høyhastighets flow cytometri sortert i en FACS MoFlo (Cytomation). Cellene som uttrykte det høyeste nivå av Sp35-Ig ble valgt. Disse cellene ble utvidet i en kultur i 7 dager, deretter merket og sortert igjen. Celler som uttrykker det høyeste nivå av Sp35 lg, ble isolert som individuelle kloner i 96-brønnsplater. Disse klonene ble dyrket i to uker og så tilført nytt medium en dag før FACS-analyse for å sjekke for ekspresjonsnivåer. Kloner som uttrykte de høyeste nivåer av Sp35-Fc ble utvidet og frossede cellebanker ble etablert. Cellelinjene ble tilpasset vekst i suspensjonskultur i serumfritt medium BCM16. Titere av Sp35-Fc produsert av disse klonene ble bestemt ved voksende cellelinjer ved 37°C i 4-5 omganger, deretter ble cellene dyrket til 50 % av maksimal celletetthet og dyrket i 10-15 dager ved 28°C inntil levedyktig celletetthet sank til 75%. På dette tidspunktet ble kulturmediet høstet, renset for celler og avfall ved sentrifugering og kultursupernatantene ble titrert for Sp35-Fc-nivåer ved Western blot-analyse ved bruk av anti-humant lg antistoff (Jackson Lab) som proben.
Sp35-Fc fusjonsprotein ble renset fra det klarede kulturmediet som følger: 9 ml av IM HEPES pH 7,5 ble tilsatt 900 ml kondisjonert medium. Mediet ble batch-ladet i 3 timer ved 4 °C i 3 ml Protein A Sepharose (Pharmacia). Resinet ble samlet i en 1,5 cm (LD) søyle og vasket fire ganger med 3 ml PBS, to ganger med 4 ml PBS som inneholder 800 mM NaCI, og deretter igjen med 3 ml PBS. Sp35-Fc ble vasket ut av søylen med 25 mM NaH2P04pH 2,8, 100 mM NaCI i 1,5 ml fraksjoner og nøytrali-sert ved å tilsette 75 ul 0,5 M NaH2P04pH 8,6. Proteininneholdende topp-fraksjoner ble identifisert ved opptak ved 280 nm, slått sammen og utsatt for videre rensing i en 1 ml protein A-søyle. Før lasting ble NaCI tilsatt 600 mM og HEPES pH 7,5 til 50 mM. Søylen ble vasket to ganger med 600 ul lOmM HEPES pH 7,5, 1 M NaCI og deretter med 1 ml PBS. Sp-35-Fc ble vasket ut fra søylen med 25 mM NaH2P04pH
2,8, 100 mM NaCI, innsamling av 0,5 ml fraksjoner og nøytralisert ved å tilsette 25 ul av 0,5 M NaH2P04pH 8,6. Proteininnholdende topp-fraksjoner ble identifisert ved opptak ved 280 nm og samlet. I reduserende SDS-PAGE migrerte Sp-35-Ig som et enkelt bånd (>95 % rent) med en observert masse på 90 kDa. Under ikkereduse-rende betingelser løp proteinet som en dimer med en omtrentlig masse på 180 kDa. Det rensede Sp35-Fc ble delt opp og lagret ved -70 °C. Notl-fragmentet av GT123, som inneholder Sp35 aminosyre 1-531 og humant IgGl Fc, ble subklonet i PV90-vektorens Notl-sete for å danne DB002.
Eksempel 3: His-AP-Sp35 fusjonsprotein
For å studere og isolere reseptoren for Sp35 ble proteinet uttrykt i COS7 og CHO-celler som et His-merket alkalisk fosfatase (His-AP) fusjonsprotein. Plasmidet ble konstruert som følger: Det ekstracellulære området av Sp35 (a.a.34-532) ble PCR amplifisert ved bruk av primere (forover) 5'-AATTAA GAATTCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGT-3' (SEQ ID NO: 18) som inneholder et Eco RI restriksjonssete (understreket), og (revers) 5'-TATATT TCTAGATCACTCGCCCGGCTGGTTGGAGATGAAAGCGA-3' (SEQ ID NO: 19), som inneholder Xba I delingssted (understreket). PCR-produktet ble delt med Xba I, den resulterende klebrige ende ble utfylt med T4 DNA polymerase, deretter spaltet med Eco RI og gelrenset. Det spaltede produktet ble ligert til et Hind III-ifylt/EcoR I His-AP fragment fra His-AP-pcDNA 1,1 vektor (Invitrogen). His-AP-Sp35-fragmentet ble spaltet med Hind III og Eco RI, fylt inn og deretter ligert i et Not I-fylt sted på vektor pV90. DNA-sekvensen på det innsatte ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
COS7-celler ble splittet dagen før transfeksjon. His-AP-Sp35-vektor DNA (8 ug) ble brukt for å transfektere 5xl0<6>celler ved bruk av lipofektamin (Invitrogen). Det betingede mediet ble høstet 48 timer etter transfeksjonen.
Det ble utviklet en CHO cellelinje som uttrykker His-AP-Sp35 fusjonsprotein ved bruk av pV90 plasmidet. CHO vertsceller DG44 (2xl0<6>celler) ble transfektert med 100 ug plasmid ved elektroporasjon. Celler ble dyrket i alfa minus MEM i nærvær av 10 % dialysert serum og 4 mM glutamin for å utvelge nukleosid-uavhengig vekst. 14 dager etter transfeksjon ble cellene tilsatt nytt medium i påvente av screeing ved FACS Mo-Flo (Cytomation) sortering. Transfekterte CHO-celler ble merket med musemonoklonalt antistoff 8B6 rettet mot human placenta alkalisk fosfatase (Sigma). Et sekundært antistoff, PE-merket anti-mus IgG fra geit ble brukt for å produsere et signal spesifikt for transfekterte celler. Etter PE-merking ble cellene utsatt for høyhastighets flow cytometri-sortering og de øverste 5 % valgt ut.
For å produsere kondisjonert medium med His-AP-Sp35, ble cellene som uttrykte det høyeste nivå av His-AP-Sp35, valgt ut. Cellelinjene ble tilpasset vekst i suspensjonskultur i serumfritt medium (BCM16). Titere til His-AP-Sp35 som ble produsert av disse klonene, ble bestemt ved vekst av cellelinjer ved 37 °C i 4-5 omganger, deretter ble cellene dyrket til 50 % av maksimal celletetthet og dyrket i 10-15 dager ved 28 °C inntil den levedyktige celletettheten falt til 75 %. Dyrkningsmediet ble høstet, klarert for celler og avfall ved sentrifugering og kultursupernatantene titrert for His-AP-Sp35-nivåer med Western blot-analyse ved bruk av anti-humant AP-antistoff (Jackon Labs) som proben.
His-AP-Sp35 ble renset fra det betingede mediet som følger: 400 ml betinget medium fra CHO-celler som uttrykker His-AP-Sp35, ble fortynnet med 400 ml vann. Trietanolamin pH 8,5 ble tilsatt til 25 mM fra en 0,5 M beholdning og prøven ble batchpakket i 2 timer ved 4°C i 6 ml Fractogel TMAE (EM Industries) anionbytte resin. Resinet ble samlet i en 1,5 cm (LD.) søyle og vasket to ganger med 6 ml 10 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCI. Ap-Sp35 ble vasket ut av søylen med 10 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCI i 2 ml fraksjoner. Toppfraksjoner ble identifisert ved å overvåke AP-aktivitet og ved SDS-PAGE. Gjennomstrømningsfraksjonen fra TMAE-søylen ble videre fortynnet med 300 ml vann og pakket i batcher natten over ved 4 °C i 6 ml TMAE-resin. Resinet ble samlet og vasket som beskrevet ovenfor og vasket ut med 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCI. Toppfraksjoner ble igjen identifisert ved overvåking av AP-aktivitet og ved SDS-PAGE. His-AP-Sp35 fra den første søylen var 50 % ren og AP-Sp35 fra den andre søylen var 90 % ren. Under reduserende betingelser migrerte His-AP-Sp35 på SDS-PAGE-geler med en tydelig masse på 130 kDa. Mens det 90 % rene materialet var passende til de fleste undersøkel-ser, ble His-AP-Sp35 renset på Ni-NTA agarose resin (Qiagen) for andre studier. NaCI ble tilsatt til de utvaskede fraksjoner fra TMAE-søylen til 800 mM og 0,5 M trietanolamin pH 8,5 og 1 M imidazol pH 7,0 ble tilsatt henholdsvis til 25 mM og 15 mM. 4,5 ml av prøven ble pakket i en 400 ul NiNTA søyle. Søylen ble vasket tre ganger med 25 mM trietanolamin pH 8,5, 800 mM NaCI, 15 mM imidazol og His-AP-Sp35 ble vasket ut av søylen med 200 mM imidazol pH 7,0, 350 mM NaCI, hvoret- ter 200 ul fraksjoner ble samlet opp. AP-inneholdende topp fraksjoner ble samlet og dialysert natten over mot 250 volumer av 10 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCI. MgCI2og ZnCI2ble tilsatt til det som var igjen til henholdsvis 2 og 0,25 mM. Sluttproduktet var renere enn 95 % ved SDS-PAGE og løp som et enkelt bånd med masse på ca. 140 kDa under reduserende betingelser.
Sp35-konstruksjoner ble også laget som Fc-blandinger. En Sp35LRR-Fc konstruksjon ble laget ved PCR ved bruk av primere (forover)
5'CTTGACACGGGATCCGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG3' (SEQ ID NO: 20)
og (tilbake) 5'GCAGCGGGGCGGGCAGCCCGTGGCCGAGCCTGACAGCACTGAGCC3'
(SEQ ID NO: 21). PCR-produktet ble satt inn i Notl-stedet på PV90 vektoren. Sp35 IG-Fc-konstruksjon ble laget ved PCR ved bruk av primere (forover)
5'CTTGACACGGGATCCGCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG3' (SEQ ID NO: 22)
og (tilbake) 5'GTCCCGGATGCGGGCGCGGGCCGAGCCTGACAGCACTGAGCCCAG3'
(SEQ ID NO: 23). PCR-produktet ble satt inn i Notl-stedet på PV90-vektor. Proteiner ble uttrykt i CHO-celler og renset ved bruk av protein A sepharose-søyle.
Eksempel 4: Sp35 binding til NgRl-uttrykkende celler
Fire forskjellige metoder ble brukt for å vise Sp35-binding til NgRl. Først ble det oppdaget interaksjonen i en direkte bindingsanalyse hvor alkalisk fosfatase Sp35-konjugat (AP-Sp35) ble inkubert med NgRl-uttrykkende celler og bindingen ble bedømt ved bruk av en kromogen AP påvisningsreagens. 90 % konfluente COS7-celler ble dyrket på 100 mm vevskulturskåler og transfektert med NgRl-uttrykkende plasmider ved bruk av Fugene 6-reagenser (Roche). Etter 48 timer ble de transfekterte cellene vasket en gang med HBH (Hank's balanced salt buffer), 1 mg/ml BSA, 20 mM HEPES, pH 7,0, og deretter inkubert i 1,5 time ved 23°C med 4 ug/ml AP-Sp35 fusjonsprotein i HBH. Cellene ble vasket med iskald HBH-buffer tre ganger i tre minutter hver, deretter fiksert med 3,7 % formaldehyd i 20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCI i 15 minutter og overført tilbake til HBH-bufferen. Endogen, varmelabil AP ble varmeinaktivert i 2 timer ved 67 °C. Bundet AP-Sp35 ble oppdaget ved inkubering med nitroblå tetrazolium NBT (Roche). Ap-Sp35 bandt seg til COS7-celler som uttrykker human NgRl-reseptor, men ikke til COS7-kontrollcellene som er transfektert med vektorene alene. Et punktfarget mønster for NgRl ble observert, hvilket viser at bare en fraksjon, sannsynligvis 50 % av cellene, var transfektert med NgRl.
For å kunne kvantifisere bindingen bedre ble det samme forsøket utført, men paral-lelle celleprøver ble behandlet med 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,125, 0,06 ug/ml av Ap-Sp35. Bundet AP ble inkubert med 4 nitrofenylfosfat og AP-aktivitet bedømt i en 96-brønnsplateleser (Molecular Devices). Fra disse data estimerte vi at EC50 til binding av AP-Sp35 til humant NgRl var ca. 6 nM.
For det andre oppdaget vi binding av Sp35 med NgRl i en ELISA-metode. ELISA-plater (Costar) ble belagt med 10 ug/ml løslige NgRl-Fc-reseptorer (sNgR310-Fc som inneholder rotte-NgRl peptid 35-310 bundet til hengslet og rotte-IgGl Fc og sNgR344-Fc inneholdende rotte-NgRl peptid 35-344 bundet til rotte-IgGl) i 0,01 M NaHC03, pH 9,0 i en time ved 37 °C. Platene ble blokkert og vasket med 25 mM HEPES, pH 7,0, 0,1 % BSA, 0,1 % ovalbumin, 0,1 % skummet tørrmelk og 0,001 % NaN3. AP-Sp35-protein, 4 ug/ml ble tilsatt til platen og inkubert natten over ved 4 °C. Platene ble deretter vasket med 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCI og bundet AP påvist ved bruk av 10 ug/ml kromogent substrat 4-nitrofenyl fosfat fortynnet i 0,1 M glysin, 1 mM MgCI2, 1 mM ZnCI2pH 10,5. OD410ble bestemt i en ELISA-leser (Molecular Devices) utstyrt med Softmax-program. AP-Sp35 bandt seg til immobilisert sNgR-344-Fc, men ikke til sNgR-310-Fc protein, noe som indikerer at den lange versjonen av NgRl var påkrevet for Sp35-binding. Det var mulig å konkurre-re bindingen av AP-Sp35 til sNgR344-Fc med 80 % ved preinkubering av AP-Sp35 med 100-ganger overskudd av sNgR344-Fc. Ingen konkurrerende binding ble sett ved bruk av pinnsvin-rotte Igl fusjonsprotein som et rotte-Ig fusjonskontrollpro-tein.
For det tredje påviste vi binding av Sp35 til NgRl ved coimmunoutfellings-Sp35 med NgRl. I denne studien ble 80 % konfluente COS7-celler dyrket på 100 mm vevskulturskåler transfektert med plasmider som koder for Sp35 hemaglutinin (Sp35-HA) og NgR-FLAG ved bruk av Fugene 6 reagenser (Roche). 48 timer etter transfeksjon ble celler høstet og løst i en 1 ml lysisbuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCI, 1,5 mM MgCI2, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100 og 10 % glyserol) ved 4 °C i 30 min. Lysatet ble deretter sentrifugert ved 14.000 x g i 15 min. og supernatantene innsamlet og inkubert ved 4 °C natten over med risting ved å bruke anti-HA affinitetsmatrix (Roche). Prøvene ble vasket 3 ganger med 1 ml lysis buffer, deretter kokt i 3 min. i Laemmli prøvebuffer, utsatt for 4-15 % SDS-PAGE og analysert ved immunoblotting med Anti-FLAG M2 antistoff (Sigma). Anti-HA-merket affi-nitetsresin bandt et kompleks som inneholder både Sp35-HA og FLAG-NgR. Dette er åpenbart ved nærvær av FLAG. Dette komplekset ble ikke sett i lysater fra kontrollert transfeksjoner hvor cellene ble behandlet med Sp35-HA-plasmid eller FLAG- NgRl-plasmid alene eller celler som ble cotransfektert med FLAG-NgRl og et HA-merket kontrollprotein som ikke binder NgRl.
Sp35-HA ble laget som følger. Sp35 signalsekvensen og ekstracellulært område (aminosyrer 1-531) ble PCR-utvidet ved bruk av primere
5'ATAT TCTAGAATGCTGGCGGGGGGCGTGAG3' (SEQ ID NO: 24) og
5'ATA TACTAGTGTCGTTGCCGCCCGCGTTGG3' (SEQ ID NO: 25) som inneholder Xbal og Spel-setet (understreket). PCR-produktet ble spaltet med Xbal og Spel og satt inn i vektor pCGCHA mellom Xbal og Spel-setene. Sekvensen av det innsatte ble bekreftet ved DNA-sekvensering. FLAG NgRl-konstruksjonen varen presang fra Dr. Zhigang He (Nature, Vol. 420, Nov. 7, 2002).
For det fjerde viste vi at AP-Sp35 blir bundet til rotte cerebellum granulære nevroner (CGN) som uttrykker NgRl. I dette forsøket ble 90 % konfluente postnatal dag 8 CGN-celler dyrket på 100 mm vevskulturskåler. Etter 48 timer ble cellene vasket en gang med HBH-buffer og deretter inkubert med 4 ug/ml AP-Sp35 i HBH-buffer i 1,5 time ved 23 °C. Cellene ble deretter vasket med iskaldt HBH tre ganger i 3 min. hver, deretter fiksert med 3,7 % formaldehyd i 20 mM HEPES, pH 7,0 og 150 mM NaCI i 15 min. og ført tilbake til HBH. Endogent varmelabilt AP ble varmeinaktivert i 2 timer ved 67 °C. Bundet AP-Sp35 ble påvist ved inkubering med nitroblå tetrazolium NBT (Roche). AP-Sp35 ble bundet til postnatal 8 cerebellum granulære nevroner, som uttrykker NgRl. Bindingen av AP-Sp35 til nevroner ble hemmet ved å behandle CGN med PIPLC (5 enhet/ml) som spalter de fleste GPI-forankrede proteiner fra membranoverflater. Siden NgRl er et GPI-linket protein støtter dette videre forestillingen om at Sp35 binder seg til NgRl på CGN-celler.
Eksempel 5: Co-lokalisering av Sp35 med NgRl
For å bestemme om Sp35 og NgRl blir uttrykt i samme nevroner ble en co-lokaliseringsstudie utført. 4 % paraformaldehydfiksert rotte p8 primære granulære nevron kulturer ble inkubert med antistoff mot Sp35 og NgRl (Santa Cruz) og deretter med passende Alexa-merket sekundære antistoff (Molecular Probes Inc.). Cellene ble visualisert ved konfokal fluorescens mikroskopi. Nevroner ble intenst farget med Sp35 og NgRl antistoff. Begge proteiner ble uttrykt i cellelegemer og aksoner i nevroner. For å hjelpe til med co-lokaliseringsanalysen ble forskjellige fargede pro-ber brukt for de 2 typene antistoff. Når fargene (rød for NgR-positive celler og grønn for Sp35-positive celler) ble slått sammen så vi en gul farge gjennom hele cellen som indikerer at de to proteinene var co-lokalisert inni nevronene.
Eksempel 6: NgRl bindingssteder inni Sp35
Vi brukte utstryknings oversikt for å definere de spesifikke områdene av Sp35 involvert i NgRl-interaksjoner. De følgende utstrykningskonstruksjonene ble laget ved bruk av Stratagene Quikchange Mutagenesis kit. Vi verifiserte alle vektorkon-struksjoner ved DNA-sekvensering av modifiserte innsettinger.
His-AP-Sp35b som inneholder Sp35s leucinrike repetisjonsområder pluss basalregion (a.a. 35-432), ble klonet fra His-AP-Sp35 (a.a. 34-532) vektor ved PCR. Primere brukt var 5'CCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAGTGATCTAGGGCCGCGGATCCCTG-3' (SEQ ID NO: 26) og 5'-CAGGGATCCGCGGCCCTAGATCACTCGTCCACAAACACCTGCTGGG-3' (SEQ ID NO: 27). His-AP-Sp35d som koder Ig-området på Sp35 pluss basalregionen (a.a. 417-531), ble klonet fra His-AP-Sp35a (a.a. 37-531) vektor med PCR. Primere brukt var 5'CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCCGCGCCCGCATCCGGGACCGC-3' (SEQ ID NO: 28) og 5'-GCGGTCCCGGATGCGGGCGCGGAATTCACCCGGGTGCGCGGCG-3' (SEQ ID NO: 29).
His-AP-Sp35e som koder bare for Ig-området (a.a. 425-531), ble klonet fra His-AP-Sp35 (a.a. 34-532) vektor med PCR. Primere brukt var 5'-CGCCGCGCACCCGGGTGAATTCGCCCAGCAGGTGTTTGTGGAC-3' (SEQ ID NO: 30) og 5'-GTCCACAAACACCTGCTGGGCGAATTCACCCGGGTGCGCGGCG-3' (SEQ ID NO: 31).
Et kommersielt mutagenesekit og protokoll (Stratagene Quikchange) ble brukt for å mutere aminosyre 456 (fra arginin til glutaminsyre) og aminosyre 458 (fra histidin til valin) på Sp35 i His-AP-Sp35-vektoren (34-532). Primere brukt var 5'-CATCCTCTGGCTCTCACCCGAAAAGGTACTGGTCTCAGCCAAGAGC-3' (SEQ ID NO: 32) og 5'-GCTCTTGGCTGAGACCAGTACCTTTTCGGGTGAGAGCCAGAGGATG-3' (SEQ ID
NO: 33).
His-AP-Sp35 delesjonskonstruksjoner (fig. 3) ble skapt i PV90 ekspresjonsvektorer og uttrykt i 293 celler. Det betingede medium ble samplet og AP-adduktene renset ved sekvensiell kromatografi trinn på Fractogel TMAE resin og NiNTA-agarose. De rensede proteinene ble testet med hensyn til binding til NgRl uttrykt på COS7-celler. Alle de tre konstruksjonene binder seg svakt til Sp35. Disse resultatene indikerer at både Sp35LRR gjentagelse 1-14 (aminosyre 34-417) og Ig-området på Sp35 (aminosyre 425-531) bidrar til Sp35-binding til NgRl. Ig-området viste høye-re affinitet enn LRR-området.
En strukturmodell for Ig-området på Sp35 ble generert ved å bruke NCAM krystall-struktur som rammeverk (Rasmussen et al., 2000, Nat. Struct. Biol. 7:389-393). Fra denne modellen observerte vi en loop (restnummer 454-458, aminosyrer: SPRKH; SEQ ID NR: 34) som kan involveres i bindingen. For å teste denne hypote-sen skapte vi en Sp35-konstruksjon hvor rest R ved 456 og H ved 458 ble endret til henholdsvis E og V. Når denne konstruksjonen ble testet for NgRl-binding, ble et
>10 ganger fall i signal observert. Som en alternativ tilnærming for å teste bidraget av denne loop-regionen i bindingen ble et peptid som korresponderte til sekvensen LSPRKH (SEQ ID NO: 10) syntetisert og som ble syklisert ved å tilsette cysteiner på N- og C-terminalene på peptidet. Ved binding til NgRl blokkerer, hemmer eller int-erfererer dette peptidet med NgRl-funksjonen.
Eksempel 7: Sp35 induserer p8 CGN muskelsammentrekning
For å bestemme den biologiske funksjonen til Sp35-nevroner inkuberte vi Sp35-Fc med postnatalt dag 8 granulære nevroner for å se om Sp35 kan regulere nevrittutvekst. Laktek kulturslides (8 brønner) ble belagt med 0,1 mg/ml poly-de-glysin (Sigma) før spotting av Sp35-Fc-protein (16 ug/brønnprotein). Slidesene ble tørket over natten, deretter renset og belagt med 10 ug/ml laminin (Gibco). Cerebellum granulære nevroner fra postnatal dag 8 ble adskilt og sådd ut på forhåndsbelagte slides. Slideskulturene ble inkubert ved 37 °C i 5 % C02i 24 timer. Slidesene ble deretter fiksert i 4 % paraformaldehyd inneholdende 20 % sukrose og farget med anti pill tubulin (Covance TUJ1). Etter 24 timer viste CGN klar muskelsammentrek-ningsmorfologi som var åpenbar ved bunting av nevroner. Muskelsammentrekning ble ikke sett i ubehandlede celler eller Fc-proteinbelagte kontroll prøver.
Eksempel 8: Effekten av Sp35 og RhoA-aktivering/inaktivering
Sp35-Fc induserte postnatale cerebellum granulære nevroner i å gjennomgå fasciculasjon. Fordi signalmolekylet RhoA er kjent for å være involvert i fasciculasjon bestemte vi om Sp35-Fc kan regulere RhoA funksjoner i nevroner. RhoA-aktiveringsforsøket ble utført som følger: 293-celler eller COS7-celler ble transfektert med ekspresjonsvektorer som inneholder kombinasjoner av RhoA, Sp35 eller NgRl ved å bruke Fugene 6-reagenser (Roche). 48 timer etter transfeksjon ble cellene sultet over natten, deretter løst i 50 mM Tris, pH 7,5, 1 % Triton X-100, 0,5 % natriumdeoksykolat, 0,1 % SDS, 500 mM NaCI, 10 mM MGCI2, pluss en protease-hemmende blanding. Cellelysater ble klarert ved sentrifugering ved 13.000xg ved 4°C i 5 min. og 95 % av supernatantene ble inkubert med 20 ug av en immobilisert GST-Rho-bindende områdeaffinitetsmatriks (Rhotekin kuler, Upstate Biotechnology) ved 4 °C i 45 min. Kulene ble vasket tre ganger med vaskebuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCI, 10 mM MgCI2med proteasehemmere). GTP-bundet Rho ble vasket ut fra kulene ved oppvarming til 95°C i 5 min. i SDS-PAGE forsøksbuffer. Bundne og totale Rho-proteiner ble påvist ved Western blotting ved bruk av et monoklonalt antistoff mot RhoA (Santa Cruz). COS7 og HEK293-celler transfektert med Sp35, induserte RhoA-aktivering ved en åpenbar økning i mengden av RhoA-GTP påvist i blottet etter transfeksjon med Sp35-genet. En videre for-sterkning i RhoA-GTP ble observert etter behandling med Sp35-Fc. I motsetning til økning i RhoA-GTP etter transfeksjon med Sp35 alene ble Rhoa delvis inaktivert når cellene ble transfektert med Sp35 og NgRl. Behandling av disse cellene med Sp35-Fc resulterte i videre inaktivering av RhoA.
En signalrespons ved Sp35 ble bekreftet ved bruk av FLIPR-analyse (Molecular Devices) for å bestemme påvirkningen av Sp35-behandlingen på Ca<++>fluks. En signifikant Ca<++>fluks ble observert i celler som uttrykker Sp35 med behandling av Sp35-Fc, men ikke i kontrollceller behandlet med Sp35-Fc. Ca<++>fluks ble redusert når cellene som var blitt cotransfektert med NgRl og Sp35, ble behandlet med Sp35-Fc-fusjonsprotein.
Eksempel 9: Sp35 proteininteraksjon med seg selv
Fordi LRR-området ofte er involvert i homotypiske interkasjoner og fordi vi observerte at tillegg av løslig Sp35 til Sp35-transfekterte celler forårsaket en økning i RhoA-GTP over det som ble observert med Sp35-transfeksjoner alene, testet vi Sp35-binding til seg selv. For å utføre dette forsøket brukte vi co-immunoutfelling.
80 % konfluente COS7-celler dyrket på 100 mm vevskulturskåler ble transfektert med plasmidene Sp35 HA eller Sp35-FLAG, eller begge, ved å bruke Fugene 6 reagenser (Roche). 48 timer etter transfeksjon ble cellene høstet og løst i 1 ml lysisbuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCI, 1,5 mM MGCI2, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100 og 10 % glyserol) ved 4 °C i 30 min. Lysatet ble deretter sentrifugert ved 14.000xg i 15 min. og supernatantene samlet inn og inkubert ved 4 °C over natten med risting med en anti-HA affinitetsmatriks (Roche). Prøvene ble deretter vasket 3 ganger i 1 ml lysisbuffer, kokt i Laemmli prøvebuffer, utsatt for 4-15 % SDS-PAGE og analysert ved immunoblotting med anti-FLAG antistoff. Anti-HA antistoffresinet bandt kompleks som inneholdt Sp35-FLAG bestemt ved Western blotting. Dette indikerte en direkte interaksjon av Sp35 med seg selv. Vi behandlet også celler transfektert med HA-Sp35 med Sp35-Fc og brukte en lignende immunoutfellingstil-nærmelse for å vise at HA-Sp35 ble bundet til Sp35-Fc.
Sp35-FLAG ble laget som følger. Sp35 ekstracellulært områdegen (a.a. 1-531) ble PCR-forsterket ved bruk av primere 5'AATTAA GCGGCCGCATGCTGGCGGGGGGCGT3'
(SEQ ID NO: 35) og 5'AATTAA GCGGCCGCTTTGTCATGT'3 (SEQ ID NO: 36) inneholdende Notl-steder (understreket). PCR-produktet ble spaltet med Noti og innsatt i Notl-stedet på vektor PV90. DNA-sekvensen på det innsatte ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Eksempel 10: In vivo transplantasjon av Sp35-transformerte celler
For å bestemme den biologiske funksjonen til Sp35 i ryggmargskadede rotter, ble kortikale primærdyrkede celler (blandede kulturer) infisert med retrovirus som uttrykker Sp35 i full lengde eller en retroviruskontroll for levering til det skadede epi-senteret i rotteryggmarger. 2xl0<6>celler ble innført og rottene ble avlivet dag 10. Ryggmargene ble fiksert i 4 % formaldehyd over natten, deretter dehydrert i 70 % fulgt av 95 % ETOH. Vevsprøver ble støpt inn i parafin. Snitt (10 mikrons tykkelse) ble brukt til immunohistokjemisk farging. Rotter som mottok Sp35-uttrykkende celler viste mindre aksonsammentrekning og mer pill-tubulinfarging nær episente-ret sammenlignet med kontrollen. Økt nevronal overlevelse ble observert i skadede rotter som mottok Sp35.
Sp35 retroviruskonstruksjon ble laget som følger: Sp35-genet ble PCR-forsterket ved bruk av primere 5'-GATTA CTCGAGATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG-3' (SEQ ID NO: 37) som inneholder et Xhol-sete (understreket) og
5'CGCGG GAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3' (SEQ ID NO: 38) som inneholder et EcoRI-sete (understreket). PCR-produktet ble spaltet med Xhol og EcoRl, deretter ligert i Retrovirusvektor pMIG (som inneholder IRES-GFP) som tidligere var spaltet med Xhol og EcoRI. Den nye vektoren ble betegnet pMMC078. Alle isolater av pMMC078 inneholdt ufrivillige punktmutasjoner slik at to isolater av pMMC078 ble ligert sammen. pMMC078.6 ble spaltet med Xhol og AccI og pMMC078.7 ble spaltet med Xhol og AccI. Disse to fragmentene ble ligert sammen for å lage det korrekte sluttplasmidet, pMMC089. DNA-sekvensen av det innsatte ble bekreftet ved DNA-sekvensering. Sp35-retrovirus ble laget som beskrevet. 293G-celler ble delt dagen før transfeksjon. 8 ug Sp35-retrovirus-DNA ble brukt for å transfektere 5xl0<6>celler med lipofektamin (Invitrogen). Det betingede mediet ble høstet 92 timer etter transfeksjon. Det betingede mediet ble sentrifugert ved 5.000g i 10 mi-
nutter og supernatanten brukt som en Sp35 retrovirusbeholdning. Denne behold-ningen ble lagret ved 4 °C i en uke eller -80 °C i 6 måneder.
Eksempel 11: Dyremodell av ryggmargskade
Alle kirurgiske prosedyrer utføres ved bruk av aseptisk teknikk. En uke før enhver kirurgisk manipulasjon blir dyrene behandlet. Ampicillin 100 mg/kg SC blir administrert profylaktisk før og etter operasjon for å redusere insidensen av blæreinfek-sjonsskade.
Dyrene blir bedøvet ved bruk av 2,5 mg/kg IP Midazolam sammen med Isofluran 2-3 % i 02til tung bedøvelse målt ved tåklyp. Dyr blir beholdt på en varmeplate med sirkulerende vann gjennom hele operasjonen og ved rekonvalesens. Okkulært smø-remiddel ble brukt for å forhindre uttørring av kornea og 0,05 mg/kg SC Atropin ble gitt for å redusere overflødig spyttproduksjon. Et lite snitt ble laget i huden og muskelen trakk seg sammen for å blottlegge ryggraden. En dorsal laminektomi ved spinalnivå L6 (og L7 hvis plassering av et intratekalt kateter er nødvendig, se nedenfor) blir utført, L6/L7 og tilstøtende spinale prosesser blir fast fiksert i et spinalt system (David Kopf Instruments). En dorsal halvdeling blir utført ved L6 med skar-pe iridektomi-sakser som fullstendig avbryter hoved dorsomedial og underordnet dorsolateral kortikospinalkanal- (CST) komponenter. Etter operasjon blir laminektomistedet dekket med et beskyttende materiale som durafilm og den overliggende muskel sydd med 4,0 kromokatgut for å beskytte den utsatte spinalsøylen. Huden blir sydd og tørket av med betadinløsning.
Funksjonell helbredelse av dyr ble evaulert ved bruk av Basso Beattie og Bresnehan (BBB) scoremetode vanligvis brukt for å evaluere rotter etter ryggmargskade. Denne metoden kvantifiserer bakre lemfunksjon på rotter ved detaljert analyse av ledd-bevegelse og vektbærende evne. Rotter blir evaluert dagen etter ryggmargskade, deretter hver uke.
Umiddelbart etter CST-gjennomskjæring blir adenovirus som uttrykker Sp35 eller GFP eller kontrollvirus (10<10>partikler) injisert på stedet for gjennomskjæring og områder umiddelbart kaudalt og rostralt til skadestedet. Totalt 10 ul Adv blir injisert på fem forskjellige steder (4ul/sted). For intratekal administrering av Sp35-protein blir det laget et lite hull i dura i ryggmargen 2 mm kaudalt for lesjon L7 og et intratekalt kateter blir satt inn i subaraknoidal mellomrommet ved L7. Kateteret blir trukket langsomt og forsiktig over ryggmargen ca. 1 mm kautalt til skaden. Den delen av kateteret som ligger utenfor intratekal mellomrommet blir fast sydd på plass i det omgivende vev. En preparert miniosmotisk pumpe (Alza corp.) som inneholder testmaterialet (sp35 potein eller kontrollprotein) blir forbundet med den ubeskyttede enden på styrenålen og satt inn i det subkutane området. Etter operasjon blir laminektomistedene dekket av et beskyttende materiale som durafilm og den overliggende muskel sydd med 4,0 kromkatgut for å beskytte den eksponerte ryggsøylen. Huden blir sydd og tørket av med betadinløsning.
Histologisk analyse: Kanalsøkingskirurgi finner sted under operasjonen for å indu-sere ryggmargsskade. Huden på hodet blir barbert og tørket av med betadin og 70 % alkohol. Dyret blir plassert i et stereotaksisk system. Skallen blir skåret på langs og benhinnen skrapt fra kraniet. Et hull drilles i skallen ca. 1-2 mm i diameter og en glass mikroliter nål settes vertikalt inn på 8 steder i motorbarken (koordinater blir bestemt i henhold til Paxinos og Wastons 1977 rottehjernekart) Ca. 5 ul kanalindi-katormateriale (dvs. Biotin dekstranamin, 10.000M.Wt) blir injisert og nålen blir etterlatt i ytterligere fem minutter for å tillate løsningens diffusjon. Etter at nålen er fjernet blir hullet i skallen tettet med et gelskum og skallen stiftet tett over skadestedet. Dyrene tillates å friskne til og får postoperativ omsorg beskrevet nedenfor. 4-10 uker senere blir dyrene dypt bedøvet (Inaktin 100-110 mg/kg ip) og perfundert for histologi som beskrevet nedenfor. Kanalsøkeren bæres av en fremoverret-tet transportmekanisme nedover den kortikale spinalkanalen mot den kaudale enden av ryggmargen og skaffer måter til å kvantifisere anatomisk tilkoblingsmulighet innenfor kortikospinalkanalen.
For immunohistokjemiske forsøk blir dyr dypt bedøvet med Inactin (100-110 mg/kg IP) 2-8 uker etter operasjon for å påføre skade. Brysthulen åpnes og hjertet blir eksponert for å tillate perfusjon. En kanyle settes inn i venstre ventrikkel gjennom hvilken 100 cc iskald PBS trykkes langsomt (et hull blir laget i høyre ventrikkel for å sørge for væskeutslipp). Dette følges av en langsom men et jevnt drypp av 4 % paraformaldehyd (50-100 ml) inntil fiksering av øyne/ører/tær er åpenbar. Ryggmargen fjernes forsiktig for å minimalisere endring av skadestedet, frosset i OCT, delt opp og prosessert for immunohistokjemi. Andre valgfrie vev samles også til senere analyse. Dyrene som mottar adenovirus Sp35 viste økt aksonskyting bestemt ved fJIII tubulinfarging til nevronakson.
Eksempel 12: Sp-35 virusvektorkonstruksjoner
En pMIG-derivert Sp35 virusvektor ble laget som følger. Sp35 kodesekvens i full lengde ble PCR-forsterket ved bruk av primere 5'-GATTA CTCGAGATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG-3' (SEQ ID NO: 37) som inneholder et Xhol-sted og 5'CGCGG GAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3' (SEQ ID NO: 38) som inneholder et EcoRI-sted. PCR-produktet ble spaltet med Xhol og EcoRI, deretter ligert inn i retrovirusvektor pMIG (Cheng et al, 1996, Nat. Biotech-nol.l45:576) som ble spaltet med Xhol og EcoRI. Denne vektoren ble betegnet pMMC078. Alle pMMC078-isolater inneholdt punktmutasjoner slik at to isolater av pMMC078 ble ligert sammen. Vektor pMMC078.6 ble spaltet med Xhol og AccI og pMMC078.7 ble spaltet med Xhol og AccI. Disse to fragmentene ble ligert for å lage plasmidet pMMC089.
En pMIG-derivert Sp35-HA-virusvektor ble laget som følger. Et fragment som koder for Sp35 aminosyrer 326-614 i system med HA-sekvensen ble oppnådd ved bruk av PCR med primere 5'-GCCT TCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTC-3' (SEQ ID NO: 39) som inneholder et SacII-sete, og 5'-CCG G AATTCTC A>4 GCG7A4 TCA G GAA CGTCGTAA GGG7/ATATC ATCTTCATGTTG AACTTG
CGGGGCGCGTCGGC-3' (SEQ ID NO: 40) med pMMC089 som tjener som en mal.
Den lengste primeren inkluderer HA-kodesekvens (kursiv) etter Sp35-kodon 614 og før EcoRI-setet. PCR-produktet ble deretter spaltet med SacII og EcoRI og brukt for å erstatte SacII-EcoRI-fragmentet som inneholder villtype Sp35-kodoner 326-614 i den pMIG-deriverte retrovirusvektoren.
En Sp35 baculovirus HA-vektor ble laget som følger. Sp35-HA-kodesekvens fra Sp35-HA-retrovirusvektor ble spaltet butt, med Xhol og EcoRI, klonet inn i Bgl2-fylling på stedet for baculovirus shuttle vektor pBV-CZPG-setet (U.S. Pat. Nr. 6.190.887; og 6.338.953), for å erstatte LacZ-genet under CMV-promoter.
En Sp35-adenovirusvektor ble laget som følger. Sp35-IRES-GFP kodesekvens fra Sp35-retrovirus ble spaltet ut med Xhol-fylling og Nhe I, deretter klonet til EcoRI-fylling/Nhe I-steder på Adenovirus shuttle vektor pDC315, under en minimal CMV-promoter.
Eksempel 13: Dyremodell for remyelinering
Long Evans hunnrotter er brukt i alle studier. Rotter blir bedøvet ved hjelp av Isofluran og T3/4 eksponert, og en dorsal hemi-laminektomi utført. Den kjemiske demyelineringsagens, lysolecitin (3ul 1 % lysolecitin i 0,9 % saltvann) injiseres derpå på høyre side av den dorsale søyle i ryggmargen 0,5-1 mm under ryggmargens overflate). Passende smertestillende behandling administreres før og etter operasjonen.
Tre dager senere blir injeksjonsstedet reeksponert (under Isofluran-anestesi med passende smertestillende behandling) og følgende behandlinger injisert i den skadede ryggmargen og en adenovirusvektor som koder for protein Sp35/kontrollprotein injiseres i skadestedet. 10<10>partikler av adenovirus som koder for Sp35 eller GFP-kontroll i et volum av 10 ul, vil bli injisert i skadet rotteryggmarg på opptil 5 forskjellige steder i og rundt stedet for lysolecitin-indusert demyelinering. Et volum ikke større enn 2 ul injiseres på hvert av disse 5 injiseringssteder. Dyr blir dypt bedøvet med inactin (100-110 mg/kg IP) og perfundert med et fiksativ via hjertet 2, 3, 4 eller 6 uker etter operasjon for histologisk analyse av ryggmargens demyelinering/remyelinering. Ryggmargen blir deretter fjernet og bearbeidet for analyse. Dyr som mottar Sp35-behandling viste økt aksonmyelinering bestemt ved IHC ved bruk av anti-MBP-proteinantistoff eller luxol fast blue.
Eksempel 14: Sp35 RNAi
For å behandle Sp35s rolle i hjernefunksjonen introduserte vi lentivirus Sp35 RNAi i postnatale 8 CGN-celler. Sp35 RNAi-infiserte celler hadde kortere nevritter og høye-re spredningshastighet enn kontrollceller. Disse resultatene indikerer en rolle for Sp35 i å regulere RhoA-aktivering.
Murine og rotte Sp35 DNA-sekvenser ble sammenlignet for å finne homologe regioner som kan brukes til kandidat shRNAs. CH324 ble konstruert for å avlaste oli-gonucleotider LVI-035 og LVI-036 og ligering til Hpal og Xhol/spaltet pLL3.7. Oli-gonucleotider ble kjøpt fra MWG. Sekvensen er LVI-035 (sense-oligo)
5'TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCTAGCAGGATGACGATC I I I I I IC (SEQ
ID NO: 41).
LVI-036 (antisense-oligo)
Før virusproduksjon ble DNA fra pLL3.7 eller kandidat shRNA i pLL3.7 cotransfektert med murint Sp35-HA-merket plasmid i et forhold på 5 til 1 i CHO-celler av 6 brønnsformat. Deaktiveringen ble analysert med Western blot påvisning av Sp35-HA-markør fra transfektert CHO-cellelysater så vel som ved Northern blot av total RNA preparert fra duplikatbrønner. Blottet ble undersøkt med en 0,7 kb fragment av mSp35. Analyser ble utført 4 timer etter transfeksjon (data ikke vist). Viruset ble produsert fra den beste kandidaten til bruk i rottenevronale kulturer. Vektoren, tilleggsmetodikk og virusproduksjon var som beskrevet hos Rubinsom et. al. "A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference." Nat. Genet. 33,401-6
(2003).
Eksempel 15: RhoA aktivering
COS7-celler som samtidig uttrykker både NgRl og Sp35 viste ingen endring i RhoA/GTP-nivåer i respons til OMgp. Dette antydet at Sp35/NgRI-komplekset ikke er tilstrekkelig til å mediere signaltransduksjon ved hjelp av en myelinhemmer.
Vi undersøkte muligheten for at et ternært kompleks av Sp35/NgRI/p75 medierer signalering. To metoder ble brukt for å evaluere interaksjoner mellom Sp35, NgRl og p75. Først ble bindingen evaluert i en direkte bindingsanalyse ved bruk av et AP-Sp35-konjugat. AP-Sp35-konjugatet bandt svakt til p75-uttrykkende celler. AP-p75 bandt til NgRl-uttrykkende celler. Binding av AP-Sp35 til NgRl og p75 ble målt ved hjelp av ELISA (fig.4). For det andre ble binding av Sp35 til NgRl og p75 evaluert ved co-immunoutfelling fra COS7-celler som samtidig uttrykker Sp35, NgRl og p75. Et anti-NgRI antistoff immunoutfelte et kompleks som inneholdt Sp35 og p75. Et anti-Sp35 antistoff immunoutfelte også et kompleks som inneholdt p75. Interaksjonen og data for co-immunoutfelling fremskaffet bevis for en direkte interaksjon mellom Sp35, NgRl og p75. Vi brukte konfokal mikroskopi og antistoff mot Sp35, p75 og NgRl for å vise at Sp35, NgRl og p75 samlokaliserer til cellelegemer og aksoner av p7 CG-nevroner fra rotte.
Deretter viste vi at kombinasjonen Sp35, NgRl og p75 er tilstrekkelig for myelin-hemmerens aktivitet. Ikke-nevronale COS7-celler ble skapt for å uttrykke alle tre komponenter. Ved bruk av disse cellene viste vi at RhoA/GTP-nivåer ble oppregulert av OMgp. OMgp-Fc-behandling økte RhoA/GTP-nivåer i celler som samtidig uttrykker Sp35/p75/NgRI, sammenlignet med andre kombinasjoner av disse tre kompo-nentene. Vi bekreftet proteinekspresjonen ved hjelp av Western blotting av COS7-cellelysater. Affiniteten til myelinhemmere som binder til NgRl, ble ikke berørt av nærvær av p75 eller p75 og Sp35. De kombinerte resultatene understøtter en mo-dell hvorved det tenære komplekset av NgRl, Sp35 og p75 er nødvendig for RhoA-regulering i nærvær av NgRI-ligander (fig. 5). Sp35 inneholder et cytoplasmatisk område som har et mulig direkte eller indirekte engasjement for signalering. For å bestemme det cytoplasmatiske området produserte vi en cytoplasmatisk område-avkutting av Sp35 (aminosyre 34 til 576 av SEQ ID NO: 2) for å virke på en dominant, negativ måte ved forming av et uproduktivt ternært kompleks som ikke var i stand til å signalere. Vi betegnet dette molekylet med det cytoplasmatiske område-avkutting "DN-Sp35" (for dominant, negativ Sp35). Vi transfekterte postnatale dag 7 (p7) CG-nevroner med Sp35 i full lengde eller DN-Sp35, og analyserte deretter for respons på hemmende myelinkomponenter (OMgp, myelin og Nogo66). Som vist i fig. 6 reagerte ikke DN-Sp35 transfekterte celler på hemmende myelinkomponenter og viste lengre nevritter enn kontroller. I motsetning til dette viste celler transfektert med Sp35-konstruksjon i full lengde forhøyet respons til hemmende substrater og hadde kortere nevritter sammenlignet med kontroller. Dette demonstrerte at DN-Sp35 virker som en konkurrent til svekket nevrittutveksthemming forårsaket av myelinkomponenter. Vi ventet at eksogent løselig Sp35-Fc også ville binde NgRl og blokkere funksjonen av hemmende substrater. Som vist i fig. 7 reduserte Sp35-Fc nevrittutveksthemming ved OMgp, Nogo66 og MAG.
Eksempel 16: Nevrobeskyttende aktivitet
Et likt antall rotte p6 cerebellære granulære nevroner ble lagt i hver brønn av en 12-brønns cellekulturplate i nærvær eller fravær av 50 nM av Sp35-Fc protein. Disse poly-D-lysinplatene har blitt forhåndsbelagt (tørket av) med 10 ug av CNS-myelin eller 200 ng av Nogo66, MAG og OMgp eller kontroll-Fc. De nevronale kulturer ble opprettholdt i 1 til 7 dager ved 37 °C og 5 % C02. Nevronene var friske og vokste bra i PBS kontrollbrønner uavhengig av Sp35-Fc-behandling med full nevritt-forlengelse [bestemt av en nevronal spesifikk markør, (3III tubulin] som ble under-søkt etter 3 dager. I fravær av Sp35-Fc vokste ikke nevronene godt i brønner belagt med myelin, Nogo66, MAG og OMgp. Det var minimal nevrittskytting [kort og fordreid] og nevronene syntes ikke å være friske med avrundede cellelegemer og fortettet nukleært materiale. DAPI-farging demonstrerte at antallet nevroner påvist i disse brønnene var mindre enn i PBS-kontrollbrønner, noe som antyder nevronalt tap. I nærvær av Sp35-Fc var lange nevritter til stede og nevronene syntes friske. DAPI-farging demonstrerte et høyere nevronalt antall i disse brønnene enn i de som ikke hadde mottatt Sp35-Fc. Data er oppsummert i tabell 2 under.
Disse data indikerer at en løselig form av Sp35, dvs. Sp35-Fc har nevrobeskyttende aktivitet.
I rotter som har blitt hemi-transektert (T9, SCT) i ryggmargen, viste pill tubulin-farging av ryggmargssnitt et vesentlig tap av nevroner på skadestedet. Et rekombinant virus som uttrykker Sp35, ble brukt for å infisere SCT-dyr på skadestedet. Histologisk farging av disse ryggmarger viste et økt antall av nevroner rundt skadestedet sammenlignet med kontrollgruppen som ble infisert med vektorvirus. Dette er i samsvar med in wtro-eksperimentelle funn beskrevet over og indikerer videre nevrobeskyttende egenskaper assosiert med Sp35.
Eksempel 17: Sp35 i dyremodell for ryggmargskade
Siden Sp35-Fc reduserte nevrittutveksthemming forårsaket av OMgp, Nogo66 og MAG in vitro, forventet vi at molekylet skulle fremme funksjonell bedring av CNS-skader in vivo. For å bekrefte dette administrerte vi Sp35-Fc til rotter med hemi-seksjonert ryggmarg, dvs. en dyremodell for akutte CNS-traumer. Som vist i fig. 8 og fig. 9 demonstrerte Sp35-Fc behandlede rotter signifikant økt funksjonell bedring sammenlignet med rotter behandlet med IgG.
Ryggmargskade og adferdsanalyse ble utført som følger. Alle operative prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjer fra Biogen Institutional Animal Use and Care Committee. Long Evans hunnrotter (190-210g, Charles River, Wilmington, MA) ble bedøvet ved bruk av 2,5 mg/kg Midazolam, LP. og 2-3 % Fluothan i 02. En dorsal laminektomi ble utført ved spinalnivå T6 og T7. En dorsal hemiseksjon ble utført som fullstendig avbrøt den store dorsomediale og den lille dorsolaterale kortikospi-nale kanals (CST) komponenter. Umiddelbart etter CST-transeksjon ble et intratekalt kateter satt inn i det subaraknoidale mellomrommet ved T7 og forbundet med en primet miniosmotisk pumpe (Alzet model 2004) satt inn subkutant. Mini-osmotiske pumper leverte Hu IgT isotype kontrollprotein (5 mg/ml, n=5, Phar-mingen), PBS (n=3) løselig Hu Sp35-Ig fusjonsprotein (4,3 mg/ml, n=8) i en hastighet på 0,25 ul/t. Etter operasjon ble laminektomistedet sydd og hudsåret stiftet sammen. Postoperativ behandling inkluderte smertebehandling (Buprenorphine 0,05 mg/kg s.c.) i 3 dager og antibiotikabehandling (Ampicillin 100 mg/kg s.c. to ganger daglig) i 7 dager etter operasjonen. Blærene ble manuelt tømt 2 ganger daglig gjennom hele studien (28 dager) eller inntil funksjonen kom tilbake (dette tidspunkt ble notert). Alle dyr ble scoret blindt ved bruk av felles BBB scorings-sytem (Basso et al., 1995, J Neurotrauma 12:1-21; Ono et al., 2003, J. Neurosci. 23:5887-5896). Rotter ble evaluert dagen etter CST-transeksjon (dag 2) og ukent-lig deretter i fire uker ved bruk av Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) bevegelige ra-ting scale. Forskerne var ukjent med hensyn til behandlingsgrupper gjennom hele studien.
Eksempel 18: Nevronal overlevelse og aksonregenerering i rubro-spinalkanalens (RST) hemiseksjonsskademodell
Vi undersøkte også effekten av Sp35-behandling på regenerering av nevroner i rubro-spinal-kanalen som medvirker direkte til bevegelse.
Voksne 9-uker gamle Sprague-Dawley rotter (200-250g) ble bedøvet med en intraperitoneal injeksjon med ketamin (80 mg/kg) og xylazin (8 mg/kg). Underet ope-rasjonsmikroskop ble dorsal laminektomi utført og den syvende thoraxspinalvirvel (C7) identifisert. Etter å ha åpnet dura mater ble en høyre hemiseksjon utført ved ryggmargsnivå C7 ved bruk av et par fjærsakser. Etter ryggmargshemiseksjonen mottok dyrene et stykke gelskum oppbløtt med enten 10 ul av en 2 ug/ml løsning av Sp35-Fc eller 10 pl av en 2 ug/l løsning av humant lg eller 10 pl PBS plassert på toppen av skadestedet. Etter operasjonene ble dyrene i hver gruppe delt opp for aksonal tracing og adferdsanalyse. Dyrene i gruppen for aksjonal tracing (n=5 for hver gruppe) og adferdsanalyse (n=7 for hver gruppe) ble tillatt å overleve i en måned.
Fluoro-Gold (FG, 6 % w/v, Fluorochrome) ble brukt for å merke RST-nevroner som hadde regenerert sine aksoner over skadearret og gått tilbake til den kaudale ryggmargen. To dager før slutten av postskade overlevelsesperioden (1 måned), ble dyrene bedøvet med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (80 mg/kg) og xylazin (8 mg/kg). En dorsal laminektomi ble utført og T2 spinalsegmentet ble identifisert. FG i et volum på 0,5 ml ble injisert manuelt i høyre T2 ryggmarg ved bruk av en Hamilton-sprøyte. To dager senere ble dyrene bedøvet og drept med en dø-delig dose ketamin (150 mg/kg) og xylazin (8 mg/kg) og de ble perfundert intra-kardinelt med vanlig saltvann, etterfulgt av 400 ml fikseringsmiddel som inneholder 5 % paraformaldehyd i 0,1 x PBS. Hjerner og ryggmarger ble fjernet, postfiksert med paraformaldehyd over natten og deretter plassert i 30 % fosfatbufret sukrose. Hjerne og ryggmargsvev ble skåret opp i 30 mm snitt på et kryostat og montert på gelatinbelagte slides. Antallet FG-merkede RST-nevroner på skadesiden ble uttrykt som en prosent av det totale antall FG-merkede nevroner på kontralateral intakt side. Denne prosentdelen i gruppene ble sammenlignet statistisk ved bruk av enveis ANOVA fulgt av en Tukey-Kramer multippel sammenligningstest. Som vist i tabell 3, fremmet 2 ug/ml Sp35-Fc overlevelse av rubro-spinal-kanal (RST) nevroner.
For adferdsanalyse, ble bruken av fremre lemmer gjennom spontan vertikal under-søkelse gransket en måned etter forskjellige behandlinger som beskrevet (Liu et al., 1999) med mindre modifikasjoner. Rotter ble plassert i klare pleksiglass-sylindre (15 cm i diameter og 30 cm høye) som oppmuntrert bruk av fremlemmene til vertikal undersøkelse i 5 minutter. Følgende oppførsel ble scoret: (1) uavhengig bruk av venstre (uskadde) eller høyre (skadde) fremre lemmer med hensyn på kontakt med sylinderveggen; og (2) simultan bruk av begge fremre lemmer for kontakt med sylinderveggen. Den vertikale undersøkelsesadferd ble uttrykt i beteg-nelsene (1) prosentvis bruk av venstre (uskadde) fremre lem relativ til det totale antall av skadde, uskadde og begge lemmers bruk; (2) prosentvis bruk av høyre (skadde) fremre lem relativ til det totale antall av skadde, uskadde og begge lemmers bruk; og (3) prosentvis bruk av begge fremre lemmer relativt til det totale antall av skadde, uskadde og begge lemmers bruk. Forskjellen mellom gruppene ble testet med enveis ANOVA fulgt av Bonferroni post hoc analyse. Sp35-Fc-behandlede dyr viste signifikant forbedret bevegelse av fremre lem; 30 % bruk for begge fremre lemmer hos Sp35-Fc-behandlede dyr mot 10 % bruk for begge fremre lemmer hos kontroll-Fc eller PBS-behandlede dyr; 55 % venstre (uskadd) lembruk mot 80 % bruk hos kontroll-Fc eller PBS-behandlede dyr; og 29 % høyre (skadd) lembruk mot ca. 15 % hos kontroll-Fc eller PBS-behandlede dyr.
Eksempel 19: Sp35-Fc fremmer retinalganglioncelleoverlevelse (RGC) i synsnerve-transeksjonsmodell
Vi bekreftet videre aktiviteten av Sp35 ved bruk av synsnervetranseksjonsmodell, som undersøker faktorer som påvirker nevronal funksjon. Unge voksne Sprague Dawley (SD) hunnrotter ble brukt i denne studien. Høyre synsnerve på hvert dyr ble transektert intraorbitalt 1,5 mm fra den optiske skiven. En stykke gelskum opp-bløtt i 6 % Fluoro-Gold (FG) ble påført det nylig transekterte stedet rett bak den optiske skiven for merking av de overlevende retinale ganglioncellene (RGCs). Dyrene ble delt opp i 6 grupper (n=6 i hver gruppe) som mottok enten Sp35-Fc, humant IgGl eller bare PBS ved intravitreal injeksjon. Volumet på hver intravitreale injeksjon var 4 ml, mens dosen på hver injeksjon var 2 mg. De intravitreale injek-sjonene ble utført umiddelbart etter synsnervetranseksjonen.
Alle dyrene fikk lov til å overleve 1 uke. To dager før avliving av dyrene ble den venstre synsnerven på hvert dyr transfektert og 6 % FG ble brukt for å merke de overlevende RGC-ene som en intern kontroll. Dyrene ble avlivet med en dose nembutal og retinaene ble dissektert i 4 % paraformaldehyd. Fire radiale kutt ble laget for å dele retinaene i fire kvadranter (superior, inferior, nasal og temporal). Retinaene ble deretter postfiksert i samme fikseringsmiddel i en time før de ble flatmontert med monteringsmediet (Dako). Slidesene ble undersøkt under et fluo-rescensmikroskop med ultrafiolett filter (magnetisert bølgelengde = 330-380 nm). Merkede RGCer ble talt langs medianlinjen på hver kvadrant med start fra den optiske skiven til den perifere retinagrensen i 500 mm intervaller, underet kikkhulls-gitter på 200 x 200 mm. Prosentandel overlevende RGCer fra hver behandling ble uttrykt ved å sammenligne antall overlevende RGCer i de skadede øynene med deres kontralaterale øyne. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt + SEM. Statistisk signifikans ble evaluert ved enveis ANOVA, fulgt av en Tukey-Kramer post hoc test. Forskjeller ble ansett for signifikante ved p<0,05. Sp35-Fc-behandlede dyr viste signifikant nevronal overlevelse (83 %) sammenlignet med kontroll-Fc eller PBS-behandlede dyr hvor hver bare viste ca. 50 % nevronal overlevelse.

Claims (44)

1. Isolert nukleinsyre som koder for et oppløselig polypeptid, hvori: (A) nevnte oppløselige polypeptid består av et polypeptid valgt fra den følgende gruppe, eventuelt kondensert til et heterologt peptid: (a) et polypeptid omfattende aminosyrer 34-532 av SEQ ID NO: 2; (b) et polypeptid omfattende aminosyrer 34-417 av SEQ ID NO: 2; (c) et polypeptid omfattende aminosyrer 34-432 av SEQ ID NO: 2; (d) et polypeptid omfattende aminosyrer 417-531 av SEQ ID NO: 2; (e) et polypeptid omfattende aminosyrer 425-531 av SEQ ID NO: 2; (f) et polypeptid omfattende aminosyrer 1-531 av SEQ ID NO: 2; (g) et polypeptid omfattende aminosyrer 433-493 av SEQ ID NO: 2; (h) et polypeptid omfattende et LRR-domene av SEQ ID NO: 2, et basisk område av SEQ ID NO: 2 C-terminalt for LRR-domenet, samt et immunoglobulin (lg) - domene av SEQ ID NO: 2 C-terminalt til det basiske område; (i) et polypeptid omfattende et Ig-domene av SEQ ID NO: 2, men som mangler et LRR-domene av SEQ ID NO: 2, et basisk område av SEQ ID NO: 2, samt et cytoplasmisk domene; (j) et polypeptid omfattende et LRR-domene av SEQ ID NO: 2, man som mangler et Ig-domene av SEQ ID NO: 2, et basisk område av SEQ ID NO: 2 samt et cytoplasmisk domene; og (k) et polypeptid som i (h) og som mangler et cytoplasmisk domene, hvor det oppløselige polypeptid kodet at nukleinsyren, er i stand til å binde til NgRl for å lette den NgRl-medierte inhibering av aksonal forlengelse i et sentralnervesystem-nevron; (B) nevnte oppløselige polypeptid består av et polypeptid innbefattende det føl-gende aminosyremotiv, eventuelt kondensert til et heterologt polypeptid:
hvor det oppløselige polypeptid kodet av nukleinsyren er i stand til å blokkere inhibering eller interferering med funksjonen av NgRl; eller (C) nevnte oppløselige polypeptid består av det følgende polypeptid, eventuelt kondensert til et heterologt polypeptid:
hvor det oppløselige polypeptid kodet av nukleinsyren er i stand til å blokkere, inhibere eller interferere med funksjonen av NgRl.
2. Isolert nukleinsyre ifølge krav 1, hvor nevnte oppløselige polypeptid består av et polypeptid innbefattende det følgende aminosyremotiv, eventuelt kondensert til et heterologt polypeptid
hvor det oppløselige polypeptid kodet av nukleinsyren er i stand til å blokkere, inhibere eller interferere med funksjonen av NgRl.
3. Isolert nukleinsyre ifølge krav 1, hvor nevnte oppløselige polypeptid består av det følgende polypeptid:
hvor det oppløselig polypeptid kodet av nukleinsyren er i stand til å blokkere, inhibere eller interferere med funksjonen av NgRl.
4. Isolert nukleinsyre ifølge krav 2, hvor polypeptidet av SEQ ID NO: 10 er cyklisert.
5. Nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor det heterologe polypeptid er valgt fra gruppen bestående av en Ig-enhet, en serum albumin-enhet, en målsø-kende enhet, en rapporterende enhet og en opprenskningslettende enhet.
6. Nukleinsyre ifølge krav 5, hvor Ig-enheten er en Fc-enhet.
7. Vektor omfattende nukleinsyren ifølge ethvert av kravene 1 til 3.
8. Vektor ifølge krav 7, hvor nevnte nukleinsyre er operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens.
9. Vertscelle omfattende vektoren ifølge krav 7 eller krav 8.
10. Vertscelle ifølge krav 9, som uttrykker polypeptidet som er kodet av nevnte nukleinsyre.
11. Isolert polypeptid kodet av nukleinsyren ifølge ethvert av kravene 1 til 6, hvor nevnte polypeptid er i stand til å minske inhibering av aksonal vekst av et sentra I nervesystem nevron.
12. Polypeptid ifølge krav 11, hvor polypeptidet er konjugert til en polymer.
13. Polypeptid ifølge krav 12, hvor polymeren er valgt fra gruppen bestående av en polyalkylenglykol, en sukkerpolymer og et polypeptid.
14. Polypeptid ifølge krav 13, hvor polyalkylenglykolet er polyetylenglykol (PEG).
15. Polypeptid ifølge krav 14, hvor polypeptidet er konjugert til 1, 2, 3 eller 4 polymerer.
16. Polypeptid ifølge krav 15, hvor den totale molekylvekt av polymerene er fra 20.000 til 40.000 Da.
17. Antistoff som binder spesifikt til polypeptidet av SEQ ID NO: 2 eller et antigenbindende fragment av nevnte antistoff, hvor nevnte antistoff eller fragment er i stand til å minske inhibering av aksonal vekst av et sentra I nervesystem nevron.
18. In vitro fremgangsmåte for å inhibere signaltransduksjon av NgRl, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å sette en NgRl-uttrykkende celle i kontakt med en effektiv mengde av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 11 til 16.
19. In vitro fremgangsmåte for å minske inhibering av aksonal vekst av et sentralnervesystemnevron, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å sette nevnte nevron i kontakt med en effektiv mengde av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 11 til 16 eller et antistoff eller segment derav ifølge krav 17.
20. In vitro fremgangsmåte for å inhibere vekstkon-kollaps av et sentralnervesystemnevron, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å sette nevnte nevron i kontakt med en effektiv mengde av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 11 til 16 eller et antistoff eller fragment derav ifølge krav 17.
21. In vitro fremgangsmåte for å fremme overlevelse av et nevron som står i fare for å dø, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å sette nevnte nevron i kontakt med en effektiv mengde av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 11 til 16.
22. Anvendelse av et polypeptid ifølge ethvert av kravene 11 til 16 eller et antistoff eller fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av en sentralnervesystem-sykdom, -forstyrelse eller -skade hos et pattedyr.
23. Anvendelse av en vertscelle ifølge krav 10 for fremstilling av et medikament til behandling av en sentralnervesystem-sykdom, -forstyrrelse eller -skade i et pattedyr, hvor nevnte vertscelle skal introduseres i pattedyret ved eller nærområdet for sykdommen, forstyrrelsen eller skaden.
24. Anvendelse ifølge krav 23, hvor vertscellen er avledet fra pattedyret som skal behandles.
25. Anvendelse av en viral vektor omfattende en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge krav 11, for fremstilling av et medikament til behandling av en sentralnervesystem-sykdom, -forstyrrelse eller -skade i et pattedyr, hvor nevnte virale vektor skal bli administrert til pattedyret ved eller nær området for sykdommen, forstyrrelsen eller skaden slik at nevnte polypeptid blir uttrykt fra nukleotidsekvensen i pattedyret i en mengde som er tilstrekkelig til å redusere inhibering av aksonal forlengelse av nevroner ved eller nær området for skaden.
26. Anvendelse av en viral vektor omfattende en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge krav 11, for fremstilling av et medikament for å fremme overlevelse av et nevron som står i fare for å dø, i et pattedyr med en nevrodegenerativ sykdom, forstyrrelse eller skade, hvor nevnte virale vektor skal bli administrert til pattedyret ved eller nær området for nevronet.
27. Anvendelse ifølge krav 25 eller 26, hvor den virale vektor er valgt fra gruppen bestående av en adenoviral vektor, en lentiviral vektor, en bakuloviral vektor, en Epstein Barr viral vektor, en papovaviral vektor, en vacciiniaviral vektor eller en herpes simplex viral vektor.
28. Anvendelse ifølge krav 25 eller 26, hvor den virale vektor skal administreres ved en rute valgt fra gruppen bestående av topisk administrasjon, intraokular administrasjon, parenteral administrasjon, intratekal administrasjon, subdural administrasjon og subkutan administrasjon.
29. Anvendelse ifølge krav 25, hvor sentralnervesystemsykdommen, -forstyrrelsen eller -skaden er en skade på ryggmargen eller en skade på synsnerven.
30. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 25 til 29, hvor nevnte polypeptid fremmer myelinisering.
31. Anvendelse ifølge krav 26, hvor den nevrodegenerative sykdom, forstyrrelse eller skade er valgt fra gruppen bestående av multippel sklerose, ALS, Huntingtons sykdom, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, diabetisk nevropati, slag, traumatisk hjerneskade og skade på ryggmargen.
32. Interfererende RNA-molekyl som binder spesifikt til nukleinsyren ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvor nevnte interfererende RNA-molekyl er et lite hårnåls-RNA (shRNA) kodet for av et DNA-molekyl omfattende SEQ ID NO: 41 eller SEQ ID NO: 42.
33. Anvendelse ifølge krav 22, hvor sentralnervesystemsykdommen, -forstyrrelsen eller -skaden er multippel sklerose.
34. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av multippel sklerose.
35. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av ryggmargsskade.
36. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av synsnerveskade.
37. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av slag.
38. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av Parkinsons sykdom.
39. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av traumatisk hjerneskade.
40. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av diabetisk nevropati.
41. Farmasøytisk sammensetning omfattende antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.
42. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, til behandling av multippel sklerose.
43. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for fremstilling av et medikament til behandling av synsnerveskade.
44. Anvendelse av antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 17, for anvendelse ved behandling av slag.
NO20054836A 2003-03-19 2005-10-19 Nogo-reseptorbindingsprotein NO336530B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45575603P 2003-03-19 2003-03-19
US48024103P 2003-06-20 2003-06-20
US49205703P 2003-08-01 2003-08-01
PCT/US2004/008323 WO2004085648A2 (en) 2003-03-19 2004-03-17 Nogo receptor binding protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20054836L NO20054836L (no) 2005-10-19
NO336530B1 true NO336530B1 (no) 2015-09-21

Family

ID=33102167

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20054836A NO336530B1 (no) 2003-03-19 2005-10-19 Nogo-reseptorbindingsprotein

Country Status (27)

Country Link
US (5) US7785829B2 (no)
EP (3) EP2902491A1 (no)
JP (3) JP5341311B2 (no)
KR (1) KR101106441B1 (no)
AT (1) ATE479754T1 (no)
AU (2) AU2004223464C1 (no)
BR (1) BRPI0408501A (no)
CA (1) CA2519227C (no)
CY (2) CY1111097T1 (no)
DE (1) DE602004028916D1 (no)
DK (2) DK2248899T3 (no)
EA (1) EA010055B1 (no)
ES (1) ES2537015T3 (no)
GE (1) GEP20094629B (no)
HK (3) HK1146297A1 (no)
HU (1) HUE025347T2 (no)
IL (1) IL170721A (no)
IS (1) IS2786B (no)
MX (1) MXPA05009913A (no)
NO (1) NO336530B1 (no)
NZ (1) NZ607886A (no)
PL (3) PL2248899T3 (no)
PT (2) PT1606409E (no)
RS (1) RS54160B1 (no)
SI (2) SI1606409T1 (no)
UA (1) UA87106C2 (no)
WO (1) WO2004085648A2 (no)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA010055B1 (ru) 2003-03-19 2008-06-30 Байоджен Айдек Ма Инк. ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Sp35, ПОЛИПЕПТИД Sp35 И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИПЕПТИДА
KR101239542B1 (ko) * 2004-06-24 2013-03-07 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 탈수초화를 수반하는 병의 치료
WO2006017673A2 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Taj in neuronal function
EP1681565B1 (de) * 2005-01-14 2011-07-06 Abbott GmbH & Co. KG Zellulärer RhoGTPase Aktivierungs-Assay
WO2007008547A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
EP1940460A4 (en) * 2005-10-27 2009-08-12 Biogen Idec Inc OLIGOD DRO CYTEN MYELIN GLYCOPROTEIN COMPOSITIONS AND USES THEREOF
US20090246189A1 (en) * 2005-11-04 2009-10-01 Biogen Idec Ma Inc. And Mclean Hospital Methods for Promoting Neurite Outgrowth and Survival of Dopaminergic Neurons
NZ598421A (en) 2005-12-02 2013-11-29 Biogen Idec Inc Treatment of Conditions Involving Demyelination
JP2009544703A (ja) 2006-07-24 2009-12-17 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの投与により髄鞘形成、ニューロンの生存および希乏突起膠細胞の分化を促進するための方法
AU2007321817A1 (en) * 2006-11-17 2008-05-22 Novartis Ag Lingo binding molecules and pharmaceutical use thereof
GEP20125693B (en) 2007-01-09 2012-11-26 Biogen Idec Inc Sp35 antibodies and usage thereof
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US20100297121A1 (en) * 2007-10-11 2010-11-25 Biogen Idec Ma Inc. Methods for Treating Pressure Induced Optic Neuropathy, Preventing Neuronal Degeneration and Promoting Neuronal Cell Survival Via Administration of LINGO-1 Antagonists and TrkB Agonists
US20110123553A1 (en) * 2007-11-08 2011-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Use of LINGO-4 Antagonists in the Treatment of Conditions Involving Demyelination
NZ590605A (en) 2008-07-09 2012-11-30 Biogen Idec Inc Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof
US20130231464A1 (en) * 2010-04-28 2013-09-05 Oncolmmune, Inc. Methods of use of soluble cd24 for therapy of rheumatoid arthritis
JP2012048656A (ja) * 2010-08-30 2012-03-08 Canon Inc 画像処理装置、画像処理方法
MX2014013950A (es) 2012-05-14 2015-02-17 Biogen Idec Inc Antagonistas de proteina que interactua con el receptor nogo 2 que contiene repeticion rica en leucina y dominio de inmunoglobulina (lingo-2) para el tratamiento de afecciones que involucran neuronas motoras.
JP2015534564A (ja) 2012-10-09 2015-12-03 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 脱髄障害の治療のための併用療法および使用
EP3242893A1 (en) 2015-01-08 2017-11-15 Biogen MA Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
EP3302465A1 (en) 2015-06-05 2018-04-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Triazoles for the treatment of demyelinating diseases
JP7149257B2 (ja) 2016-07-13 2022-10-06 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド Ｌｉｎｇｏ－１アンタゴニストの投与計画及び脱髄障害の処置のための使用
WO2018106646A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aminotriazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106643A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heterocyclic azoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2018106641A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrazoles for the treatment of demyelinating diseases
WO2020185750A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Biogen Ma Inc. Pharmaceutical compositions containing anti-lingo-1 antibodies

Family Cites Families (219)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) * 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) * 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4716111A (en) * 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6054561A (en) * 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4694778A (en) * 1984-05-04 1987-09-22 Anicon, Inc. Chemical vapor deposition wafer boat
US5807715A (en) * 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) * 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5892019A (en) * 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
AU631802B2 (en) 1988-06-14 1992-12-10 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP1892296A1 (en) 1988-09-02 2008-02-27 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
WO1990006952A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
EP0474727B1 (en) * 1989-05-19 1997-07-23 Genentech, Inc. Her2 extracellular domain
US5413923A (en) * 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5180820A (en) 1989-08-30 1993-01-19 Barde Yves Alain Brain-derived neurotrophic factor
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) * 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690935A3 (en) * 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
DE69127749T2 (de) 1990-03-20 1998-04-16 Univ Columbia Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5219837A (en) * 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5532351A (en) 1990-07-12 1996-07-02 Arch Development Corporation Nucleic acid sequences encoding OMGP
US5814318A (en) * 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) * 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) * 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) * 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK0574395T3 (da) 1990-11-09 2002-10-07 Stephen D Gillies Cytokin-immunkonjugater
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
ATE164395T1 (de) * 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
CA2108147C (en) * 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
AU2238292A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
IE922437A1 (en) * 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5756096A (en) * 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
US5565332A (en) * 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
CA2128862C (en) * 1992-02-11 2008-05-20 Jonathan G. Seidman Homogenotization of gene-targeting events
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0627932B1 (en) * 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
DE669986T1 (de) * 1992-11-13 1996-10-10 Idec Pharma Corp Völlig unfunktionelle konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung.
US5468872A (en) 1993-09-16 1995-11-21 Cephalon, Inc. K-252a functional derivatives potentiate neurotrophin-3 for the treatment of neurological disorders
DE69408541T2 (de) * 1993-11-23 1998-08-06 Genentech Inc Kinaserezeptoraktivierungstest
US5753225A (en) 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DK0744958T3 (da) 1994-01-31 2003-10-20 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
GB9402331D0 (en) 1994-02-07 1994-03-30 Univ Mcgill Nerve growth factor structural analogs and their uses
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
DE4415539C2 (de) * 1994-05-03 1996-08-01 Osama Dr Dr Med Omer Pflanzen mit virustatischer und antiviraler Wirkung
US5516637A (en) * 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
WO2001004311A1 (en) 1999-07-07 2001-01-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1020427B1 (en) 1994-10-25 2003-10-01 Toyama Chemical Co., Ltd. Agent for potentiating nerve growth factor activity containing 1,2-ethanediol derivative or salt thereof
US5770577A (en) 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US6130364A (en) * 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6280964B1 (en) * 1995-04-14 2001-08-28 The Regents Of The University Of California Binding sites for phosphotyrosine binding domains
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
EP0873363B1 (en) 1995-06-14 2010-10-06 The Regents of The University of California High affinity human antibodies to tumor antigens
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
IT235676Y1 (it) 1995-07-27 2000-07-12 Felice Gaudioso Allestimenti per lo svolgimento del gioco wormhole action match.
GB9525180D0 (en) 1995-12-08 1996-02-07 Univ Mcgill Design of hormone-like antibodies with agonistic and antagonistic fuctions
JP2978435B2 (ja) * 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US6455277B1 (en) 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
JP2000501416A (ja) 1996-04-26 2000-02-08 ユニバーシティー オブ オタワ ニューロン病を治療し予防するための、治療法および薬物のスクリーニング法
US5611016A (en) * 1996-06-07 1997-03-11 Lucent Technologies Inc. Dispersion-balanced optical cable
JP2000514420A (ja) 1996-06-25 2000-10-31 セファロン・インコーポレイテッド 末梢または中枢神経障害およびサイトカイン過剰産生の治療のためのｋ―２５２ａ誘導体の使用
DE69740038D1 (no) * 1996-07-12 2010-12-16 Genentech Inc
ZA976326B (en) 1996-07-19 1998-02-03 Amgen Inc Analogs of cationic proteins.
CA2264966A1 (en) 1996-09-11 1998-03-19 The General Hospital Corporation Expression of an exogenous gene in a mammalian cell by use of a non-mammalian dna virus having an altered coat protein
CN1233963A (zh) 1996-09-13 1999-11-03 有限会社最先端医学研究所 神经营养因子的眼科用组合物、视神经机能障碍治疗药和视神经机能障碍治疗方法
US6420140B1 (en) * 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US20070213290A1 (en) 1996-10-17 2007-09-13 Kingsman Alan J Neurite regeneration
US6593290B1 (en) 1996-11-01 2003-07-15 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
US6156728A (en) 1996-11-01 2000-12-05 Genentech, Inc. Treatment of inner ear hair cells
ATE387495T1 (de) 1996-12-03 2008-03-15 Amgen Fremont Inc Vollkommen humane antikörper die egfr binden
RO120148B1 (ro) * 1997-03-14 2005-09-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Sistem vector şi procedeu de inserţie a unui fragment adn, în genomul celulelor de mamifere
US20020137890A1 (en) * 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
TR199902553T2 (xx) 1997-04-14 2000-03-21 Micromet Gesellschaft F�R Biomedizinische Forschung Mbh �nsan v�cuduna kar�� antijen resept�rlerinin �retimi i�in yeni metod ve kullan�mlar�.
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2290485C (en) 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US20020112251A1 (en) * 1997-08-04 2002-08-15 Mccarthy Sean A. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic and other uses
AU8768798A (en) 1997-08-04 1999-02-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Tango-78, tango-79, and tango-81 nucleic acid molecules and polypeptides
KR100502596B1 (ko) 1997-09-17 2005-07-22 제넨테크, 인크. 분비 폴리펩티드와 막횡단 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는핵산
US6974689B1 (en) * 1997-09-18 2005-12-13 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding PRO211 polypeptides
DK1205546T3 (da) * 1997-10-24 2006-04-03 Genentech Inc Polypeptider og nucleinsyrer kodende derfor
FR2776661B1 (fr) 1998-03-26 2002-04-05 Centre Nat Rech Scient Polypeptide immunoreactif du recepteur trka du ngf et utilisations
US7282482B2 (en) 1998-04-08 2007-10-16 The Regents Of The University Of California NGF for the prevention of demyelination in the nervous system
IL141535A0 (en) 1998-09-16 2002-03-10 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU774367C (en) 1998-11-06 2005-04-21 University Of Zurich Nucleotide and protein sequences of nogo genes and methods based thereon
ES2278463T3 (es) 1998-12-08 2007-08-01 Biovation Limited Metodo para reducir la inmunogenicidad de proteinas.
CA2383592A1 (en) 1999-03-31 2000-10-05 Curagen Corporation 2384891 acids including open reading frames encoding polypeptides; orfx
US7034132B2 (en) 2001-06-04 2006-04-25 Anderson David W Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20040067490A1 (en) * 2001-09-07 2004-04-08 Mei Zhong Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
CA2373721C (en) * 1999-07-02 2013-10-15 Genentech, Inc. Compounds that bind her2
AU6181300A (en) * 1999-07-29 2001-02-19 Helix Research Institute Liver cancer-associated genes
EP1074617A3 (en) 1999-07-29 2004-04-21 Research Association for Biotechnology Primers for synthesising full-length cDNA and their use
JP2003527089A (ja) * 1999-08-17 2003-09-16 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 膜関連タンパク質
US6461414B1 (en) 1999-10-29 2002-10-08 Baker Hughes Incorporated Foam monitoring and control system
EP1661997A1 (en) 1999-12-01 2006-05-31 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6680209B1 (en) 1999-12-06 2004-01-20 Biosite, Incorporated Human antibodies as diagnostic reagents
US7119165B2 (en) 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
ES2341842T3 (es) 2000-01-12 2010-06-29 Yale University Bloqueo del crecimiento axonal mediado por el receptor de nogo.
AU2001228212A1 (en) 2000-01-18 2001-07-31 Mcgill University Beta-turn peptidomimetic cyclic compounds
CA2398396A1 (en) 2000-01-25 2001-08-02 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to transforming growth factor alpha-like polypeptides and polynucleotides
WO2001055317A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001059063A2 (en) 2000-01-31 2001-08-16 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055447A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1254269A4 (en) 2000-02-03 2004-10-27 Nuvelo Inc METHODS AND MATERIALS IN CONNECTION WITH POLYPEPTIDES AND POLYNUCLEOTIDS, WHICH LIKE NEURONAL GUIDE MOLECULES
US6800607B2 (en) 2000-02-29 2004-10-05 Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. Modified BDNF
CN101289511A (zh) * 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
WO2002000677A1 (en) * 2000-06-07 2002-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US6430914B1 (en) 2000-06-29 2002-08-13 Foster Wheeler Energy Corporation Combined cycle power generation plant and method of operating such a plant
US20040010118A1 (en) 2000-08-16 2004-01-15 Zerhusen Bryan D. Novel proteins and nucleic acids encoding same
IL154725A (en) 2000-09-13 2003-12-23 Smithkline Beecham Corp Polynucleotides encoding secreted polypeptides
EP1349930A2 (en) 2000-10-05 2003-10-08 Curagen Corporation Human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same
AU1153902A (en) * 2000-10-06 2002-04-15 Univ Yale Nogo receptor homologs
EP1340088B1 (en) * 2000-11-17 2007-01-17 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
US20030216558A1 (en) 2000-12-22 2003-11-20 Morris David W. Novel compositions and methods for cancer
WO2002068579A2 (en) 2001-01-10 2002-09-06 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
NZ527283A (en) 2001-01-29 2006-03-31 Biogen Idec Inc Modified antibodies and methods of use
WO2003008583A2 (en) 2001-03-02 2003-01-30 Sagres Discovery Novel compositions and methods for cancer
FI111522B (fi) * 2001-05-07 2003-08-15 Marioff Corp Oy Palontorjuntalaitteisto ja palontorjuntalaitteiston käyttölähde
CA2448073A1 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20030162734A1 (en) 2001-06-28 2003-08-28 Miller Carol A. Modulation of DENN-MADD expression and interactions for treating neurological disorders
US7223558B2 (en) * 2001-07-11 2007-05-29 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding three novel human cell surface proteins with leucine rich repeats and immunologobulin folds, BGS2, 3, and 4 and variants thereof
US20030226155A1 (en) 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20050123990A1 (en) 2001-09-26 2005-06-09 Incyte Corporation Membrane associated proteins
WO2003061559A2 (en) 2001-10-12 2003-07-31 University Of Vermont And State Agricultural College Binding peptides specific for the extracellular domain of erbb2 and uses therefor
WO2003035833A2 (en) 2001-10-22 2003-05-01 Exelixis, Inc. Modifier of the p53 pathway and methods of use
US7309485B2 (en) 2001-12-03 2007-12-18 Children's Medical Center Corporation Reducing myelin-mediated inhibition of axon regeneration
WO2003054152A2 (en) 2001-12-10 2003-07-03 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030215849A1 (en) 2002-03-01 2003-11-20 Marcia Belvin PDPK1s as modifiers of the p53 pathway and methods of use
JP4761710B2 (ja) 2002-04-05 2011-08-31 アムジェン インコーポレイテッド 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
AU2003264033A1 (en) 2002-08-10 2004-02-25 Biogen Idec Ma Inc. Nogo receptor antagonists
ATE549033T1 (de) 2002-09-06 2012-03-15 Amgen Inc Therapeutischer menschlicher monoklonaler anti-il-1r1-antikörper
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
US7816497B2 (en) 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
US20040186044A1 (en) 2002-11-06 2004-09-23 Cosgaya Jose Miguel Modulation of myelination by interaction with P75 and TRK receptors
US7388079B2 (en) 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
EA010055B1 (ru) 2003-03-19 2008-06-30 Байоджен Айдек Ма Инк. ВЫДЕЛЕННАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД Sp35, ПОЛИПЕПТИД Sp35 И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИПЕПТИДА
CA2535007A1 (en) 2003-08-07 2005-02-24 Biogen Idec Ma Inc. Nogo receptor antagonists
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
US7205387B2 (en) 2003-08-28 2007-04-17 Agency For Science, Technology And Research Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist
EP1663278A4 (en) 2003-08-28 2009-07-29 Biorexis Pharmaceutical Corp EPO MIMETIC PEPTIDES AND FUSION PROTEINS
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
ES2378767T3 (es) 2003-12-23 2012-04-17 Crucell Holland B.V. Molécula de unión humana contra CD1a
AU2005213965B2 (en) 2004-02-12 2009-11-19 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US7973139B2 (en) * 2004-03-26 2011-07-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
US20050214288A1 (en) * 2004-03-26 2005-09-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against Nogo receptor
JP4969440B2 (ja) * 2004-04-08 2012-07-04 デビッド， ビー． エイガス， 疼痛治療のためのＥｒｂＢアンタゴニスト
KR101239542B1 (ko) * 2004-06-24 2013-03-07 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 탈수초화를 수반하는 병의 치료
US20060009288A1 (en) 2004-07-07 2006-01-12 Devos John A Conveying information to an interrogator using resonant and parasitic radio frequency circuits
WO2006017673A2 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Taj in neuronal function
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AR054260A1 (es) 2005-04-26 2007-06-13 Rinat Neuroscience Corp Metodos de tratamiento de enfermedades de la neurona motora inferior y composiciones utilizadas en los mismos
EP1879917A2 (en) 2005-04-29 2008-01-23 Wyeth Nogo receptor functional motifs and peptide mimetics related thereto and methods of using the same
CA2609077A1 (en) 2005-05-16 2006-12-28 Mcgill University Lgi, lingo and p75ntr family members: novel modulators of neuronal growth
AR053401A1 (es) 2005-06-06 2007-05-02 Wyeth Corp Anticuerpos monoclonales anti- trkb y usos de los mismos
WO2006133353A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods of facilitating neural cell survival using non-peptide and peptide bdnf neurotrophin mimetics
AU2005332949A1 (en) 2005-06-16 2006-12-21 University Technologies International Inc. A treatment for short bowel syndrome
WO2007008547A2 (en) 2005-07-08 2007-01-18 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1940460A4 (en) 2005-10-27 2009-08-12 Biogen Idec Inc OLIGOD DRO CYTEN MYELIN GLYCOPROTEIN COMPOSITIONS AND USES THEREOF
US20090246189A1 (en) 2005-11-04 2009-10-01 Biogen Idec Ma Inc. And Mclean Hospital Methods for Promoting Neurite Outgrowth and Survival of Dopaminergic Neurons
NZ598421A (en) 2005-12-02 2013-11-29 Biogen Idec Inc Treatment of Conditions Involving Demyelination
WO2007092777A2 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
US7693698B2 (en) * 2006-02-03 2010-04-06 Wyeth Llc Method for identifying or designing a candidate agent that interacts with LINGO-1 polypeptide using a LINGO-1 three-dimensional structure
WO2007098283A2 (en) 2006-02-27 2007-08-30 Biogen Idec Ma Inc. Use of antagonists of maif receptor complex molecules and neurotrophic factors for treatment of neurological diseases and disorders
JP2009544703A (ja) * 2006-07-24 2009-12-17 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｐ３５またはＴｒｋＡアンタゴニストの投与により髄鞘形成、ニューロンの生存および希乏突起膠細胞の分化を促進するための方法
AU2007321817A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Novartis Ag Lingo binding molecules and pharmaceutical use thereof
GEP20125693B (en) 2007-01-09 2012-11-26 Biogen Idec Inc Sp35 antibodies and usage thereof
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
US20100297121A1 (en) * 2007-10-11 2010-11-25 Biogen Idec Ma Inc. Methods for Treating Pressure Induced Optic Neuropathy, Preventing Neuronal Degeneration and Promoting Neuronal Cell Survival Via Administration of LINGO-1 Antagonists and TrkB Agonists
US20110123553A1 (en) 2007-11-08 2011-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Use of LINGO-4 Antagonists in the Treatment of Conditions Involving Demyelination
EP2307042B1 (en) 2008-06-25 2014-03-26 H. Lundbeck A/S Modulation of the trpv : vps10p-domain receptor system for the treatment of pain
KR20110044991A (ko) 2008-07-02 2011-05-03 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 ＴＮＦ-α 길항제 다-표적 결합 단백질
NZ590605A (en) 2008-07-09 2012-11-30 Biogen Idec Inc Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof
GB2477705B (en) 2008-11-17 2014-04-23 Veracyte Inc Methods and compositions of molecular profiling for disease diagnostics
FR2958293B1 (fr) 2010-04-01 2014-09-26 Centre Nat Rech Scient Outils pour l'identification de ligands de lingo-1,lingo-2, lingo-3 et lingo-4, et utilisations
MX2014013950A (es) 2012-05-14 2015-02-17 Biogen Idec Inc Antagonistas de proteina que interactua con el receptor nogo 2 que contiene repeticion rica en leucina y dominio de inmunoglobulina (lingo-2) para el tratamiento de afecciones que involucran neuronas motoras.

Also Published As

Publication number Publication date
EP2248899B1 (en) 2015-05-06
PT1606409E (pt) 2010-12-20
US20150177240A1 (en) 2015-06-25
MXPA05009913A (es) 2005-11-04
AU2004223464A1 (en) 2004-10-07
EP1606409B1 (en) 2010-09-01
CY1111097T1 (el) 2015-06-11
US8932821B2 (en) 2015-01-13
NZ607886A (en) 2014-09-26
IS8016A (is) 2005-09-08
AU2004223464C1 (en) 2010-09-23
HUE025347T2 (en) 2016-02-29
SI2248899T1 (sl) 2015-07-31
AU2004223464A2 (en) 2004-10-07
CY1116863T1 (el) 2017-04-05
ES2537015T3 (es) 2015-06-01
HK1085764A1 (en) 2006-09-01
IL170721A (en) 2011-07-31
PL378582A1 (pl) 2006-05-02
WO2004085648A2 (en) 2004-10-07
RS54160B1 (sr) 2015-12-31
CA2519227C (en) 2013-12-03
SI1606409T1 (sl) 2011-01-31
DK2248899T3 (en) 2015-06-29
JP2013138688A (ja) 2013-07-18
DK1606409T3 (da) 2011-01-03
US20100204304A1 (en) 2010-08-12
JP5341311B2 (ja) 2013-11-13
HK1146297A1 (en) 2011-05-20
US20070059793A1 (en) 2007-03-15
WO2004085648A3 (en) 2004-11-18
JP2010154861A (ja) 2010-07-15
PT2248899E (pt) 2015-09-23
PL1606409T3 (pl) 2011-02-28
ATE479754T1 (de) 2010-09-15
EA200501480A1 (ru) 2006-02-24
EP2248899B8 (en) 2015-07-15
UA87106C2 (uk) 2009-06-25
EP2248899A1 (en) 2010-11-10
EP2902491A1 (en) 2015-08-05
CA2519227A1 (en) 2004-10-07
JP2007524370A (ja) 2007-08-30
US20130287693A1 (en) 2013-10-31
EP1606409A2 (en) 2005-12-21
EA010055B1 (ru) 2008-06-30
KR20050110012A (ko) 2005-11-22
US8153580B2 (en) 2012-04-10
US20120230979A1 (en) 2012-09-13
NO20054836L (no) 2005-10-19
US7785829B2 (en) 2010-08-31
AU2010202636A1 (en) 2010-07-15
PL2248899T3 (pl) 2015-10-30
US8765662B2 (en) 2014-07-01
RS20050709A (en) 2007-11-15
HK1211618A1 (en) 2016-05-27
GEP20094629B (en) 2009-03-10
KR101106441B1 (ko) 2012-01-18
DE602004028916D1 (de) 2010-10-14
BRPI0408501A (pt) 2006-03-14
IS2786B (is) 2012-05-15
AU2004223464B2 (en) 2010-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8932821B2 (en) NOGO receptor binding protein
US8703905B2 (en) Endoplasmic reticulum localization signals
US20060241284A1 (en) Transmembrane protein amigo and uses thereof
ZA200507501B (en) Nogo receptor binding protein
NZ575052A (en) NOGO Receptor Binding Protein
US20100160217A1 (en) Acetylycholine gated ion channel chaperons and methods of using the same
US20080241168A1 (en) Transmembrane protein amigo and uses thereof
EP1904091A2 (en) Compositions and methods for suppressing axonal growth inhibition
YANAN Investigations on the tissue distribution, localization and functions of brain-enriched leucine-rich repeats (LRR) containing proteins AMIGO AND NgR2
US20080206871A1 (en) Large-Scale Production of Recombinant Transmembrane and Cytosolic Proteins
KR20130037269A (ko) 세포 투과성 메탈로티오네인-ⅲ 융합 단백질

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: BIOGEN MA INC, US

MM1K Lapsed by not paying the annual fees