NO335446B1 - Kinazolinderivater - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet forbindelsen N-(3-fluorfenyl)-2-{3-[(7-{3-[etyl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy}-kinazolin-4-yl)amino]-1H-pyrazol-5-yl}acetamid; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår visse kinazolinderivater.

Kreft (og andre hyperproliferative sykdommer) erkarakterisert vedukontrollert cellulær proliferasjon. Dette tap av normal regulering av celleproliferasjon synes ofte å forekomme som resultatet av genetisk skade på cellulære baner som kontrollerer progresjonen gjennom cellecyklusen.

I eukaryoter er en bestemt kaskade av protein fosforylering antatt å kontrollere cellecyklusen. Mange familier av proteinkinaser som spiller kritiske roller i denne kaskaden har nå blitt identifisert. Aktiviteten til mange av disse kinaser er øket i humane tumorer når sammenlignet med normalt vev. Dette kan forekomme ved enten økede nivåer av ekspresjon av proteinet (som et resultat av gen amplifisering for eksempel) eller ved endringer i ekspresjon av ko-aktivatorer eller hemmende proteiner.

De første identifiserte og mest bredt studerte av disse cellecyklus regulatorer er cyclin avhengige kinaser (eller CDK). Aktiviteten til spesifikke CDK ved spesifikke tidspunkter er essensiell for både initiering og koordinert progresjon gjennom cellecyklusen. For eksempel synes CDK4 proteinet å kontrollere inngangen i cellecyklusen ( G0-G1-S transisjon) ved fosforylering av retinoblastom genprodukt pRb. Dette stimulerer frigjøringen av transkripsjonensfaktor E2F fra pRb, som deretter virker for å øke transkripsjonen av gener nødvendig for inngang i S fasen. Den katalytiske aktiviteten til CDK4 blir stimulert av binding til et partner protein, Cyclin D. En av de første demonstrasjonene av en direkte binding mellom kreft og cellecyklusen ble utført med observasjonen av at Cyclin Dl genet ble amplifisert og cyclin D protein nivåer øket (og således ble aktiviteten til CDK4 øket) i mange humane tumorer (Reviewed i Sherr, 1996, Science 274: 1672-1677; Pines, 1995, Seminars in Cancer Biology 6: 63-72). Andre undersøkelser (Loda et al, 1997, Nature Medisin 3(2): 231-234; Gemma et al., 1996, International Journal of Cancer 68(5): 605-11; Elledge et al. 1996, Trends in Cell Biology 6; 388-392) har vist at negative regulatorer av CDK funksjon blir ofte nedregulert eller deletert i humane tumorer hvilket igjen fører til upassende aktivering av disse kinaser.

Senere er proteinkinaser som er strukturelt forskjellige fra CDK familien identifisert og som spiller kritiske roller i regulering av cellecyklusen og som også synes å være viktige i oncogenesen. Disse omfatter nylig identifiserte humane homologer av Drosophila aurora og S. cerevisiae Ipll proteiner. Tre humane homologer av disse gener Aurora-A, Aurora-B og Aurora-C (også kjent som henholdsvis aurora 2, aurora 1 og aurora 3) koder for cellecyklus regulerte serin-treonin proteinkinaser (oppsummert i Adams et al, 2001, Trends in Cell Biology. 11(2): 49-54). Disse viser en topp av ekspresjon og kinase aktivitet gjennom G2 og mi tose. Mange observasjoner impliserer involvering av humane aurora proteiner i kreft. Aurora-A genet er kartlagt til kromosom 20ql3, en region som ofte er amplifisert i humane tumorer omfattende både bryst og kolon tumorer. Aurora-A kan være hoved målgenet til dette amplicon, siden Aurora-A DNA er amplifisert og mRNA overuttrykt i mer enn 50% av primær human kolorektal kreft. I disse tumorer fremkommer Aurora-A protein nivåer sterkt forhøyet sammenlignet med vedsidenavliggende normalt vev. I tillegg fører transfeksjon av gnager fibroblaster med human Aurora-A til transformasjon, som gir evnen til å vokse i myk agar og danne tumorer i nakne mus (Bischoff et al., 1998, EMBO Journal. 17(11): 3052-3065). Andre arbeid (Zhou et al., 1998, Nature Genetics. 20(2): 189-93) har vist at kunstig overekspresjon av Aurora-A fører til en økning i centrosom antallet og en økning i aneuploidy, en kjent hendelse ved utviklingen av kreft. Ytterligere arbeid har vist en økning i ekspresjon av Aurora-B (Adams et al, 2001, Chromsoma. 110(2):65-74) og Aurora-C (Kimura et al, 1999, Journal of Biological Chemistry, 274(11): 7334-40) i tumorceller når sammenlignet med normale celler.

Videre har det også vært demonstrert at abrogasjon av Aurora-A ekspresjon og funksjon av antisense oligonukleotid behandling av humane tumorcellelinjer (WO 97/22702 og WO 99/37788) fører til cellecyklus stans og utøver en antiproliferativ effekt i disse tumorcellelinjer. I tillegg er lavmolekylære inhibitorer av Aurora-A og Aurora-B vist å ha en antiproliferativ effekt i humane tumorceller (Keen et al. 2001, Poster #2455, American Association of Cancer research annual meeting), som selektiv abrogasjon av Aurora-B ekspresjon alene ved siRNA behandling (Ditchfield et al. 2003, Journal of Cell Biology, 161(2): 267-280). Dette indikerer at hemning av funksjonen av Aurora-A og/eller Aurora-B vil ha en antiproliferativ effekt som kan være anvendelig ved behandling av humane tumorer og andre hyperproliferative sykdommer. Videre kan hemning av Aurora kinaser som en terapeutisk tilnærming til disse sykdommer ha betydelige fordeler over målretting av signaliseringsbaner oppstrøms for cellecyklusen (f.eks. de aktivert av vekstfaktor reseptor-tyrosinkinaser så som epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) eller andre reseptorer). Siden cellecyklusen er til slutt nedstrøms for alle disse ulike signaliseringshendelser, vil cellecyklus rettete terapier så som hemning av Aurora kinaser være antatt å være aktive over alle prolifererende tumorceller, mens tilnærmingen ved spesifikke signaliseringsmolekyler (f eks. EGFR) ville være forutsagte å være aktive bare i underklassen av tumorceller som uttrykker disse reseptorene. Det er også antatt at betydelig "kryss snakk" eksisterer mellom disse signaliseringsbaner som betyr at hemning av én komponent kan bli kompensert for av en annen.

Flere kinazolinderivater er hittil foreslått for anvendelse ved hemning av forskjellige kinaser. For eksempel beskriver WO 96/09294, WO 96/15118 og WO 99/06378 anvendelse av visse kinazolin-forbindelser som reseptor-tyrosinkinase inhibitorer, som kan være anvendelige ved behandling av proliferativ sykdom og WO 00/21955 beskriver visse kinazolinderivater som inhibitorer av virkningene av VEGF.

Kinazolinderivater er også beskrevet for anvendelse ved hemning av Aurora-A kinase. WO 02/00649 beskriver kinazolinderivat som bærer en 5-leddet heteroaromatisk ring hvor ringen er, spesielt, substituert tiazol eller substituert tiofen og co-ingitt patentsøknad WO 03/055491 beskriver kinazolinderivater som bærer en eventuelt substituert pyrazol-ring. Til tross for forbindelsene i WO 02/00649 og WO 03/055491 er det fortsatt et behov for ytterligere forbindelser som har Aurora kinase hemmende egenskaper.

Søkerne har lykkes i å finne en nye serie av forbindelser som hemmer virkningene av Aurora kinaser og spesielt Aurora-A og/eller Aurora-B kinase og som har visse egenskaper som gjør dem spesielt anvendelige for formulering av medikamenter for behandling av sykdom. Spesielt er forbindelsene anvendelige ved behandling av proliferativ sykdom så som kreft som forekommer som enten fast stoff og haematologiske tumorer hvor Aurora kinaser er kjent for å være aktive og spesielt i sykdommer så som kolorektal, bryst, lunge, prostata, pankreatisk eller blære og nyre- kreft så vel som leukemier og lymfomer.

Innen foreliggende oppfinnelse skal det forstås at en forbindelse eller et salt derav kan vise fenomenet av tautomerisme og at formeltegningene innen denne spesifikasjon kan representere bare én av de mulige tautomere former. Det skal forstås at oppfinnelsen omfatter hvilken som helst tautomer form som har Aurora kinase hemmende aktivitet og spesielt Aurora-A og/eller Aurora-B kinase hemmende aktivitet og skal ikke bare være begrenset til hvilken som helst én tautomer form anvendt innen formeltegningene.

Det skal også forstås at visse forbindelser og salter derav kan eksistere i solvaterte så vel som usolvaterte former så som for eksempel hydratiserte former. Det skal forstås at oppfinnelsen omfatter alle slike solvaterte former som har Aurora kinase hemmende aktivitet og spesielt Aurora-A og/eller Aurora-B kinase hemmende aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelsene som her definert så vel som til saltene derav. Salter for anvendelse i farmasøytiske preparater vil være farmasøytisk akseptable salter, men andre salter kan være anvendelige ved fremstilling av forbindelsene og deres farmasøytisk akseptable salter. Farmasøytisk akseptable salter ifølge oppfinnelsen kan for eksempel omfatte syreaddisjonssalter av forbindelser som her definert som er tilstrekkelig basiske for å danne slike salter. Slike syreaddisjonssalter omfatter, men er ikke begrenset til furmarat, metansulfonat, hydroklorid, hydrobromid, citrat og maleat salter og salter dannet med fosforsyre og svovelsyre. I tillegg hvor forbindelser er tilstrekkelig sure, er saltene basesalter og eksempler omfatter men er ikke begrenset til, et alkalimetall-salt for eksempel natrium eller kalium, et jordalkalimetall-salt for eksempel kalsium eller magnesium eller organisk aminsalt for eksempel trietylamin, etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, morfolin, 7V-metylpiperidin, A^-etylpiperidin, dibenzylamin eller aminosyrer så som lysin.

En utførelsesform ifølge oppfinnelsen er: 7V-(3-fluorfenyl)-2-{3-[(7-{3-[eryl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy}-kinazolin-4-yl)amino]- l//-pyrazol-5-yl} acetamid;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

En syntesemetode til denne forbindelsen er å finne i eksemplene.

Forbindelser som den over eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav kan fremstilles som følger: Reagere en forbindelse med formel (III) hvor L er en utgående gruppe så som halogen (f.eks.klor):

med et amin med formel (IV):

Egnede reaksjonsbetingelser for denne metoden omfatter oppvarmning av en forbindelse med formel (III) med et overskudd av amin med formel (IV) i et inert løsningsmiddel så som dimetylacetamid, med eller uten tilsetning av en egnet katalysator (så som tetra- n-butylammoniuimjodid eller kaliumjodid) ved en temperatur på 50 til 100 °C i 12 til 72 timer. I en alternativ prosedyre, kan den utgående gruppe L i formel (III) være et karboksaldehyd og reaksjonen med amin (IV) kan utføres under reduktive betingelser ved anvendelse av et reduksjonsmiddel så som natriumcyanoborhydrid.

Aminene med formel (IV) er kjente på området eller kan fremstilles av fagfolk ved anvendelse av metoder kjent på området.

Fremgangsmåten kan videre omfatte en metode for fremstilling av en forbindelse med formel (III) hvor X er NR<14>, hvilken metode omfatter reaksjonen av en forbindelse med formel (V) hvor R' og R" er alkylgrupper så som metyl og etyl og L er som definert i relasjon til formel (III): med en forbindelse med formel (VI) hvor R kan være enten hydrogen eller en gruppe så som tert-butoksykarbonyl (Boe) eller trityl:

En slik reaksjon kan oppnås under en rekke betingelser beskrevet i litteraturen, så som oppvarmning av en forbindelse med formel (V) med en forbindelse med formel (VI) i et løsningsmiddel så som eddiksyre ved en temperatur på 100 til 130 °C i 2 til 18 timer.

Alternativt, kan fremgangsmåten videre omfatte en metode for fremstilling av en forbindelse med formel (III) hvor X er NR<14>, O eller S, hvilken metode omfatter reaksjonen av en forbindelse med formel (VII) hvor R<*>er en utgående gruppe så som halogen (f.eks.klor):

med en forbindelse med formel (VI) hvor R er enten hydrogen eller tert-butoksykarbonyl (Boe) eller trityl. En slik reaksjon kan oppnås under en rekke betingelser beskrevet i litteraturen, så som oppvarmning av en forbindelse med formel (VII) med en forbindelse med formel (VI) i et løsningsmiddel så som isopropanol eller dimetylacetamid, i nærvær av en syrekatalysator så som saltsyre, ved en temperatur på 80 til 100 °C i 2 til 6 timer. Alternativt kan reaksjonen utføres ved anvendelse av en base så som natriumhydride' ved å utføre reaksjonen i et inert løsningsmiddel så som dimetylformamid ved en temperatur på 50 til 80 °C i 2 til 6 timer.

Forbindelser med formel (V) kan fremstilles fra en forbindelse med formel (VIII) hvor P er en hydroksy beskyttelsesgruppe så som benzyl: ved omsetning med en forbindelse med formel (IX) hvor L' er en utgående gruppe så som halogen (feks. brom) og L er som definert i relasjon til formel (III):

En slik reaksjon kan oppnås (etter fjerning av beskyttelsesgruppen ved anvendelse av en metode valgt fra de allerede beskrevet i litteraturen) under en rekke betingelser beskrevet i litteraturen så som oppvarmning av en forbindelse med formel (VIII) med en forbindelse med formel (IX) i nærvær av en katalysator så som cesiumkarbonat i et løsningsmiddel så som acetonitril ved en temperatur på 80 til 100 °C i 1 til 4 timer.

En metode for fremstilling av en forbindelse med formel (VIII) omfatter reaksjonen av en forbindelse med formel (X) hvor P er som definert i relasjon for formel (VIII):

med et passende acetal så som A^Af-dimetylformamiddimetylacetal. Reaksjonen blir hensiktsmessig utført i et organisk løsningsmiddel så som toluen eller benzen, ved forhøyet temperatur, hensiktsmessig ved tilbakeløpstemperaturen til løsningsmidlet.

Forbindelser med formel (X) er enten kjente forbindelser eller de kan fremstilles av fagfolk ved anvendelse av konvensjonelle metoder. Spesielt kan forbindelser formel (X) fremstilles ved reduksjon av den tilsvarende nitroforbindelsen med formel (XI) hvor P er som beskrevet i relasjon til formel (VIII):

Egnede reaksjonsbetingelser er illustrert nedenfor.

Forbindelser med formel (XI) kan oppnås ved nitrering av en forbindelse med formelen (XII) hvor P er som definert i relasjon til formel (VIII) for eksempel ved anvendelse av salpetersyre som nitreringsmiddel. Igjen er egnede reaksjonsbetingelser illustrert nedenfor.

Nitrilet med formel (XII) kan avledes ved omsetning av det tilsvarende aldehyd med formel (XIII) med hydroksylamin som illustrert nedenfor: Fremgangsmåten kan videre omfatte en metode for fremstilling av en forbindelse med formel (VII) idet metoden omfatter reaksjonen av en forbindelse med formel (XIV)

hvor L<*>er en hydroksygruppe, med et egnet kloreringsmiddel så som tionylklorid, fosforylklorid eller fosforpentaklorid. Igjen er egnede reaksjonsbetingelser illustrert nedenfor.

Forbindelser med formel (XIV) er enten kjente forbindelser eller de kan fremstilles av fagfolk ved anvendelse av konvensjonelle metoder. Spesielt kan forbindelser med formel (XIV) fremstilles ved reaksjon av en forbindelse med formel (XV) hvor L" er en utgående gruppe så som halogen (fluor) med en forbindelse med formel (XVI) hvor L<*>er en hydroksygruppe:

Egnede reaksjonsbetingelser er illustrert nedenfor.

Forbindelser med formel (XV) er enten kjente forbindelser eller de kan fremstilles av fagfolk ved anvendelse av konvensjonelle metoder. Spesielt kan forbindelser med formel (XV) fremstilles ved reaksjon av en forbindelse med formel (XVII) (hvor L" er en utgående gruppe så som halogen (fluor) og L'" er en alkoksy eller hydroksygruppe) ved omsetning med kun formamid ved en temperatur på 140 til 200 °C i 3 til 6 timer.

Egnede reaksjonsbetingelser er illustrert nedenfor.

Forbindelser med formel (XVII) er enten kjente forbindelser eller de kan fremstilles av fagfolk ved anvendelse av konvensjonelle metoder. Spesielt kan forbindelser med formel (XVII) fremstilles ved reduksjon av en forbindelse med formel (XVIII) (hvor L'' er en utgående gruppe så som halogen (fluor) og L'" er en alkoksy eller hydroksygruppe) ved anvendelse av et reduksjonsmiddel så som natriumditionit i et vann : diklormetan løsningsmiddelsystem ved omgivelsestemperatur i 1 til 3 timer. Forbindelser med iormel (XVIII) kan oppnås ved nitrenng av en forbindelse med formelen (XIX) hvor L" og L'" er som definert i relasjon til formel (XVIII)

for eksempel ved anvendelse av salpetersyre som nitreringsmiddel. Igjen er egnede reaksjonsbetingelser illustrert nedenfor.

Fremgangsmåten kan videre omfatte en metode for fremstilling av en forbindelse med formel (VI) hvor X er NR14 O eller S hvilken metode omfatter reaksjonen av en forbindelse med formel (XX), hvor P er en egnet beskyttelsesgruppe:

med et amin med formel HNR4R5 i nærvær av et koblingsreagens (så som 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-A^A^A^',A^'-tetrametyluroniumheksafluorfosfat) og diisopropyletylamin i et løsningsmiddel (så som dimetylacetamid) under inerte og vannfrie betingelser.

En forbindelse med formel (XX) hvor X er NR<14>og P er COOR kan fremstilles fra en forbindelse med formel (XXI): med en forbindelse med formel (XXII) hvor L er en passende utgående gruppe:

Egnet reagens og reaksjonsbetingelser for denne reaksjonen omfatter anvendelse av di(tert-butyl)dikarbonat og trietylamin i tetrahydrofuran ved 0 °C under en nitrogen-atmosfære.

En forbindelse med formel (III) kan også fremstilles (etter avbeskyttelse) fra en forbindelse med formel (XX) ved omsetning av den med en forbindelse med formel (V) under en rekke betingelser beskrevet i litteraturen, så som oppvarmning av reaksjonsblandingen i et løsningsmiddel så som eddiksyre ved en temperatur på 100 til 130°C i 2 til 18 timer. Produktet, en forbindelse med formel (XXIII):

kan deretter omsettes med et amin med formel HNR R i nærvær av et koblingsmiddel (så som 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-7V;7Vi7V',7V'-tetrametyluronium heksafluorfosfat) og diisopropyletylamin i et løsningsmiddel (så som dimetylacetamid) under inerte og vannfrie betingelser.

Ytterligere en forbindelse med formel (XXIII) kan også fremstilles ved omsetning av en avbeskyttet forbindelse med formel (XX) med en forbindelse med formel (VII) under en rekke betingelser beskrevet i litteraturen, så som oppvarmning av reaksjonsblandingen i et løsningsmiddel så som isopropanol eller dimetylacetamid, i nærvær av en syrekatalysator så som saltsyre, ved en temperatur på 80 til 100 °C i 2 til 6 timer. Alternativt kan reaksjonen utføres ved anvendelse av en base så som natriumhydrid ved å utføre reaksjonen i et inert løsningsmiddel så som dimetylformamid ved en temperatur på 50 til 80 °C i 2 til 6 timer.

Forbindelser med formel (XXI) som omfatter en heteraromatisk ring er fremstilt i henhold til litteraturen. Imidlertid for illustrative formål, når A er en pyrazol-ring, kan en forbindelse med formel (XXI) fremstilles i henhold til det følgende skjema:

Det vil forstås at visse av de forskjellige ring-substituentene i forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan innføres ved standard aromatiske substitusjonsreaksjoner eller dannet ved konvensjonelle modifikasjoner av funksjonelle grupper enten før eller umiddelbart etter prosessene nevnt ovenfor og er som sådanne omfattet ved fremgangsmåte-aspektet ifølge oppfinnelsen. Slike reaksjoner og modifikasjoner omfatter for eksempel innføring av en substituent ved hjelp av en aromatisk substitusjonsreaksjon, reduksjon av substituenter, alkylering av substituenter og oksydasjon av substituenter. Reagensene og reaksjonsbetingelsene for slike prosedyrer er velkjente innen det kjemiske området. Spesielle eksempler på aromatiske substitusjonsreaksjoner omfatter innføring av en nitrogruppe ved anvendelse av konsentrert salpetersyre, innføring av en acylgruppe ved anvendelse av, for eksempel et acylhalogenid og Lewis-syre (så som aluminiumtriklorid) under Friedel Crafts-betingelser; innføring av en alkylgruppe ved anvendelse av et alkylhalogenid og Lewis-syre (så som aluminiumtriklorid) under Friedel Crafts-betingelser; og innføring av en halogen gruppe. Spesielle eksempler på modifikasjoner omfatter reduksjon av en nitrogruppe til en aminogruppe ved for eksempel katalytisk hydrogenering med en nikkelkatalysator eller behandling med jern i nærvær av saltsyre med oppvarmning; oksydasjon av alkyltio til alkylsulfinyl eller alkylsulfonyl.

Det vil også forstås at i noen av reaksjonene nevnt her kan det være nødvendig/ønskelig for å beskytte eventuelle sensitive grupper i forbindelsene. Tilfellene hvor beskyttelse er nødvendig eller ønskelig og egnede metoder for beskyttelse er kjent for fagfolk på området. Konvensjonelle beskyttelsesgrupper kan anvendes i henhold til standard praksis (for illustrasjon se T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991). Således, hvis reaktanter omfatter grupper så som amino, karboksy eller hydroksy kan det være ønskelig for å beskytte gruppen i noen av reaksjonene nevnt her.

En egnet beskyttelsesgruppe for en amino- eller alkylaminogruppe er for eksempel en acylgruppe, for eksempel en alkanoylgruppe så som acetyl, en alkoksykarbonylgruppe, for eksempel en metoksykarbonyl, etoksykarbonyl eller tert-butoksykarbonylgruppe, en arylmetoksykarbonylgruppe, for eksempel benzyloksykarbonyl eller en aroylgruppe, for eksempel benzoyl. Avbeskyttelsesbetingelsene for beskyttelses gruppene ovenfor varierer nødvendigvis med valg av beskyttelsesgruppe. Således kan for eksempel en acylgruppe så som en alkanoyl eller alkoksykarbonylgruppe eller en aroylgruppe fjernes for eksempel ved hydrolyse med en egnet base så som et alkalimetallhydroksyd, for eksempel litium-eller natriumhydroksyd. Alternativt kan en acylgruppe så som en

tert-butoksykarbonylgruppe fjernes, for eksempel ved behandling med en egnet syre som saltsyre, svovelsyre eller fosforsyre eller trifluoreddiksyre og en

arylmetoksykarbonylgruppe så som en benzyloksykarbonylgruppe kan fjernes, for eksempel ved hydrogenering over en katalysator så som palladium-på-karbon eller ved behandling med en Lewis-syre for eksempel bortris(trifluoracetat). En egnet alternativ beskyttelsesgruppe for en primær aminogruppe er for eksempel en ftaloylgruppe som kan fjernes ved behandling med en alkylamin, for eksempel dimetylaminopropylamin eller med hydrazin.

En egnet beskyttelsesgruppe for en hydroksygruppe er for eksempel en acylgruppe, for eksempel en alkanoylgruppe så som acetyl, en aroylgruppe, for eksempel benzoyl eller en arylmetylgruppe, for eksempel benzyl. Avbeskyttelsesbetingelsene for beskyttelsesgruppene ovenfor vil nødvendigvis variere med valg av beskyttelsesgruppe. Således kan for eksempel en acylgruppe så som en alkanoyl eller en aroylgruppe fjernes, for eksempel ved hydrolyse med en egnet base så som et alkalimetallhydroksyd, for eksempel litium- eller natriumhydroksyd. Alternativt kan en arylmetylgruppe så som en benzylgruppe fjernes, for eksempel ved hydrogenering over en katalysator så som palladium-på-karbon.

En egnet beskyttelsesgruppe for en karboksygruppe er for eksempel en esterdannende gruppe, for eksempel en metyl eller en etylgruppe som kan fjernes, for eksempel ved hydrolyse med en base så som natriumhydroksyd eller for eksempel en tert-butylgruppe som kan fjernes, for eksempel ved behandling med en syre, for eksempel en organisk syre så som trifluoreddiksyre eller for eksempel en benzylgruppe som kan fjernes, for eksempel ved hydrogenering over en katalysator så som palladium-på-karbon.

Beskyttelsesgruppene kan fjernes på hvilket som helst hensiktsmessig stadium i syntesen ved anvendelse av konvensjonelle teknikker velkjente innen det kjemiske området.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen hemmer serin-treonin kinase aktiviteten til Aurora kinaser, spesielt Aurora-A og/eller Aurora-B og hemmer således cellecyklusen og celleproliferasjonen. Disse egenskapene kan bedømmes for eksempel ved anvendelse av én eller flere av metodene angitt nedenfor,

(a) In vitro Aurora- A kinase hemningstest

Dette forsøket bestemmer evnen som en testforbindelse har til å hemme serin-treonin kinase aktivitet. DNA som koder for Aurora-A kan oppnås ved total gen syntese eller ved kloning. Dette DNA kan deretter bli uttrykt i et egnet ekspresjonssystem for å oppnå polypeptid med serin-treonin kinase aktivitet. I tilfellet av Aurora-A, ble den kodende sekvensen isolert fra cDNA ved polymerasekjedereaksjon (PCR) og klonet inn i BamHl og Noti restriksjons endonuklease seter av baculovirus ekspresjonsvektor pFastBac HTc (GibcoBRL/Life technologies). 5' PCR primeren inneholdt en gjenkjennelsessekvens for restriksjons endonuklease BamHl 5' til Aurora-A kodende sekvens. Dette tillot insersjonen av Aurora-A genet i ramme med 6 histidinrester, spacer region og rTEV protease spaltningssete kodet for av pFastBac HTc vektor. 3' PCR primer erstattet Aurora-A stoppkodon med ytterligere kodende sekvens fulgt av et stoppkodon og en gjenkjennelsessekvens for restriksjons endonuklease Noti. Denne ytterligere kodende sekvensen (5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TCT TAA 3') kodet for polypeptid sekvens YPYDVPDYAS. Denne sekvensen, avledet fra influensa hemagglutin protein, blir ofte anvendt som en merke epitop sekvens som kan identifiseres ved anvendelse av spesifikke monoklonale antistoffer. Rekombinant pFastBac vektor kodet derfor for et N-terminalt 6 his merket, C terminalt influensa hemagglutin epitop merket Aurora-A protein. Detaljer av metodene for sammensetningen av rekombinante DNA-molekyler kan finnes i standard tekster, for eksempel Sambrook et al. 1989, Molekylær Kloning - A Laboratory Manual, 2. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory press og Ausubel et al. 1999, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc.

Produksjon av rekombinant virus kan utføres ifølge produsentens protokoll fra GibcoBRL. Kort, pFastBac-1 vektor som bærer Aurora-A genet ble transformert t E. coli DHlOBac celler inneholdende baculovirus genom (bacmid DNA) og via en transposisjons hendelse i cellene, ble en region av pFastBac vektor inneholdende gentamycin resistens gen og Aurora-A gen omfattende baculovirus polyhedrin promoter transposert direkte til bacmid DNA. Ved seleksjon på gentamycin, kanamycin, tetracyklin og X-gal, bør resulterende hvite kolonier inneholde rekombinant bacmid DNA som koder for Aurora-A. Bacmid DNA ble ekstrahert fra en liten skala kultur av mange BHlOBac hvite kolonier og transfektert til Spodoptera frugiperda Sf21 celler dyrket i TC 100 medium (GibcoBRL) inneholdende 10% serum ved anvendelse av CellFECTIN reagens (GibcoBRL) ifølge produsentens instruksjoner. Viruspartikler ble høstet ved oppsamling av celle dyrkningsmedium 72 timer etter transfeksjon. 0,5 ml av medium ble anvendt for å infisere 100 ml suspensjonskultur av Sf21s inneholdende 1 x IO<7>celler/ml. Celledyrkningsmediumet ble høstet 48 timer etter infeksjon og virus titre bestemt ved anvendelse av en standard plaque forsøksprosedyre. Virus stokker ble anvendt for å infisere Sf9 og "Høy 5" celler ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 3 for å bestemme ekspresjonen av rekombinant Aurora-A protein.

For stor skala ekspresjon av Aurora-A kinase aktivitet, ble Sf21 insektceller dyrket ved 28°C i TC 100 medium supplert med 10% føtalt kalveserum (Viralex) og 0,2% F68 Pluronic (Sigma) på en Wheaton rulle rigg ved 3 r.p.m. Når celledensiteten nådde 1,2x10<6>celler ml"<1>ble de infisert med plaque-ren Aurora-A rekombinant virus ved en infeksjonsmultiplisitet på 1 og høstet 48 timer senere. Alle påfølgende rensningstrinn ble utført ved 4°C. Frosset insektcellepellet inneholdende totalt 2,0 x IO8 celler ble tint og fortynnet med lyse buffer (25 mM HEPES (N-[2-hydroksyetyl]piperazin-N'-[2-etansulfonsyre]) pH7,4 ved 4°C , 100 mM KC1, 25 mM NaF, 1 mM Na3V04, 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), 2 mM 2-merkaptoetanol, 2 mM imidazol, 1 ug/ml aprotinin, 1fig/ml pepstatin, 1 ug/ml leupeptin), ved anvendelse av 1,0 ml pr. 3 x IO<7>celler. Lyse ble oppnådd ved anvendelse av en dounce homogenisator, hvoretter lysatet ble sentrifugert ved 41,000 g i 35 minutter. Aspirert supernatant ble pumped på en 5 mm diameter kromatografi kolonne inneholdende 500 ul Ni NTA (nitrilo-tri-eddiksyre) agarose (Qiagen, produkt nr. 30250) som hadde vært ekvilibrert i lyserings buffer. Et baselinjenivå av UV absorbans for elueringsmidlet ble nådd etter vasking av kolonnen med 12 ml lyserings buffer fulgt av 7 ml vaskebuffer (25 mM HEPES pH7,4 ved 4°C , 100 mM KC1,20 mM imidazol, 2 mM 2-merkaptoetanol). Bundet Aurora-A protein ble eluert fra kolonnen ved anvendelse av elueringsbuffer (25 mM HEPES pH7,4 ved 4°C , 100 mM KC1, 400 mM imidazol, 2 mM 2-merkaptoetanol). En elueringsfraksjon (2,5 ml) svarende til toppen i UV absorbans ble oppsamlet. Elueringsfraksjonen, inneholdende aktiv Aurora-A kinase, ble dialysert grundig mot dialyse buffer (25 mM HEPES pH7,4 ved 4°C , 45% glycerol (volum/volum), 100 mM KC1, 0,25% Nonidet P40 (volum/volum), 1 mM ditiothreitol).

Hver nye batch av Aurora-A enzym ble titrert i forsøket ved fortynning med enzym fortynningsmiddel (25mM Tris-HCl pH7,5, 12,5mM KC1, 0,6mM DTT). For en typisk batch, blir lager enzymet fortynnet 1 i 666 med enzymfortynningsmiddel og 20jj,1 av fortynnet enzym blir anvendt for hvert forsøk. Testforbindelser (ved lOmM i dimetylsulfoksyd (DMSO) ble fortynnet med vann og 10|ul av fortynnet forbindelse ble overført til brønner i forsøksplater. "Total" og "blank" kontroll brønner inneholdt 2,5% DMSO istedenfor forbindelse. Tyve mikroliter friskt fortynnet enzym ble satt til alle brønner, bortsett fra "blank" brønner. Tyve mikroliter av enzym fortynningsmiddel ble satt til "blank" brønnene. Tyve mikroliter reaksjonsblanding (25 mM Tris-HCl, 78,4 mM KC1, 2,5 mM NaF, 0,6 mM ditiothreitol, 6,25 mM MnCl2, 6,25 mM ATP, 7,5 |jM peptid substrat [biotin-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]) inneholdende 0,2^Ci [y<33>P]ATP (Amersham Pharmacia, spesifikk aktivitet >2500 Ci/mmol) ble deretter satt til alle testbrønner for å starte reaksjonen. Platene ble inkubert ved romtemperatur i 60 minutter. For å stoppe reaksjonen ble 100 \ xl 20% volum/volum ortofosforsyre satt til alle brønner. Peptidsubstratet ble oppfanget på positivt-ladet nitrocellulose P30 filtermat (Whatman) ved anvendelse av en 96-brønn plate høster (TomTek) og deretter undersøkt for innføring av<33>P med en Beta plateteller. "Blank" (uten enzym) og "total" (uten forbindelse) kontrollverdier ble anvendt for å bestemme fortynningsområdet til testforbindelsen som ga 50% hemning av enzymaktiviteten.

I denne testen, gir forbindelsene ifølge oppfinnelsen 50% hemning av enzymaktivitet i konsentrasjoner på 0,3 nM til 1000 nM og spesielt forbindelse 5 i Tabell 1 ga 50% hemning av enzymaktivitet i en konsentrasjon på 5,5 nM.

(b) In vitro Aurora- B kinase hemningstest

Dette forsøket bestemmer evnen som en testforbindelse har til å hemme serin-treonin kinase aktivitet. DNA som koder for Aurora-B kan oppnås ved total gen syntese eller ved kloning. Dette DNA kan deretter bli uttrykt i et egnet ekspresjonssystem for å oppnå polypeptid med serin-treonin kinase aktivitet. I tilfellet av Aurora-B, ble den kodende sekvensen isolert fra cDNA ved polymerasekjedereaksjon (PCR) og klonet inn i pFastBac systemet på en måte som ligner den beskrevet ovenfor for Aurora-A (dvs. for direkte ekspresjon av et 6-histidin merket Aurora-B protein).

For stor skala ekspresjon av Aurora-B kinase aktivitet, ble Sf21 insektceller dyrket ved 28°C i TC 100 medium supplert med 10% føtalt kalveserum (Viralex) og 0,2% F68

Pluronic (Sigma) på en Wheaton rulle rigg ved 3 r.p.m. Når celledensiteten nådde 1,2x10<6>celler ml"<1>ble de infisert med plaque-ren Aurora-B rekombinant virus ved en infeksjonsmultiplisitet på 1 og høstet 48 timer senere. Alle påfølgende rensningstrinn ble utført ved 4°C. Frosset insektcellepellet inneholdende totalt 2,0 x IO8 celler ble tint og fortynnet med lyseringsbuffer (50 mM HEPES (N-[2-hydroksyetyl]piperazin-N'-[2-etansulfonsyre]) pH7,5 ved 4°C , 1 mM Na3V04, 1 mM PMSF

(fenylmetylsulfonylfluorid), 1 mM ditiothreitol, 1 ug/ml aprotinin, 1 ug/ml pepstatin, 1 fig/ml leupeptin), ved anvendelse av 1,0 ml pr. 2 x IO7 celler. Lysering ble oppnådd ved anvendelse av en ultralydbehandlings homogenisator, hvoretter lysatet ble sentrifugert ved 41,000 g i 35 minutter. Aspirert supernatant ble pumpet på en 5 mm diameter kromatografikolonne inneholdende 1,0 ml CM sepharose Fast Strøm (Amersham Pharmacia Biotech) som hadde vært ekvilibrert i lyseringsbuffer. Et baselinjenivå av UV absorbans for elueringsmidlet ble nådd etter vasking av kolonnen med 12 ml lyserings buffer fulgt av 7 ml vaskebuffer (50 mM HEPES pH7,4 ved 4°C, 1 mM ditiothreitol). Bundet Aurora-B B protein ble eluert fra kolonnen ved anvendelse av en gradient av elueringsbuffer (50 mM HEPES pH7,4 ved 4°C , 0,6 M NaCl, 1 mM ditiothreitol, kjørt fra 0% elueringsbuffer til 100% elueringsbuffer over 15 minutter ved en strømhastighet på 0,5 ml/min). Elueringsrfaksjoner (1,0 ml) svarende til toppen i UV absorbans ble oppsamlet. Elueringsrfaksjoner ble dialysert grundig mot dialysebuffer (25 mM HEPES pH7,4 ved 4°C, 45% glycerol (volum/volum), 100 mM KC1, 0,05% (volum/volum) IGEPAL CA630 (Sigma Aldrich), 1 mM ditiothreitol). Dialyserte fraksjoner ble undersøkt for Aurora-B kinase aktivitet.

Hver nye batch av Aurora-B enzym ble titrert i forsøket ved fortynning med enzym fortynningsmiddel (25 mM Tris-HCl pH7,5,12,5 mM KC1, 0,6 mM DTT). For en typisk batch, blir lager enzym fortynnet 1 i 40 med enzym fortynningsmiddel og 20ju.l av fortynnet enzym blir anvendt for hver forsøksbrønn. Testforbindelser (at 10 mM i dimetylsulfoksyd (DMSO) ble fortynnet med vann og lOjul av fortynnet forbindelse ble overført til brønner i forsøksplater. "Total" og "blank" kontroll brønner inneholdt 2,5% DMSO istedenfor forbindelse. Tyve mikroliter friskt fortynnet enzym ble satt til alle brønner, bortsett fra "blank" brønner. Tyve mikroliter av enzym fortynningsmiddel ble satt til "blank" brønner. Tyve mikroliter reaksjonsblanding (25 mM Tris-HCl, 78,4 mM KC1, 2,5 mM NaF, 0,6 mM ditiothreitol, 6,25 mM MnCl2,37,5 mM ATP, 25 |aM peptid substrat [biotin-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]) inneholdende 0,2^Ci [y<33>P]ATP

(Amersham Pharmacia, spesifikk aktivitet >2500Ci/mmol) ble deretter satt til alle testbrønner for å starte reaksjonen. Platene ble inkubert ved romtemperatur i 60 minutter. For å stoppe reaksjonen ble lOOjal 20% volum/volum ortofosforsyre satt til alle brønner. Peptidsubstratet ble oppfanget på positivt-ladet nitrocellulose P30 filtermat (Whatman) ved anvendelse av en 96-brønn plate høster (TomTek) og deretter undersøkt for innføring av<33>P med en Beta plateteller. "Blank" (uten enzym) og "total" (uten forbindelse) kontroll verdier ble anvendt for å bestemme fortynningsområde av testforbindelsen som ga 50% hemning av enzymaktiviteten.

I denne testen gir forbindelsene ifølge oppfinnelsen 50% hemning av enzymaktiviteten i konsentrasjoner på 0,3 nM til 1000 nM og spesielt forbindelse 5 i Tabell 1 ga 50% hemning av enzymaktiviteten i en konsentrasjon på 1,6 nM.

(c) In vitro celleproliferasjonsforsøk

Dette og andre forsøk kan anvendes for å bestemme evnen som en testforbindelse har til å hemme veksten av adherente pattedyrcellelinjer, for eksempel den humane tumorcellelinjen SW620 (ATCC CCL-227). Dette forsøket bestemmer evnen som en testforbindelse har til å hemme innføring av tymidinanalogen , 5'-brom-2'-deoksy-uridin

(BrdU) til cellulært DNA. SW620 eller andre adherente celler ble typisk podet med lxlO<5>celler pr. brønn i L-15 media (GIBCO) pluss 5% føtalt kalveserum, 1% L-glutamin (100 jlaI / well) i 96-brønn vevkultur behandlete 96 brønn plater (Costar) og tillot å adherere natten over. Den følgende dag ble cellene dosert med forbindelse (fortynnet fra 10 mM lager i DMSO ved anvendelse av L-15 (med 5% FCS, 1% L-glutamin). Ubehandlete kontrollbrønner og brønner inneholdende en forbindelse kjent til å gi 100% hemning av BrdU innføring ble tilført på hver plate. Etter 48 timer i nærvær / fravær av testforbindelse ble evnen som cellene har til å innføre BrdU over en 2 timers merke period bestemt ved anvendelse av et Boehringer (Roche) Celleproliferasjon BrdU ELISA sett (kat. nr. 1 647 229) i henhold til produsentens retningslinjer. Kort fortalt, 15 jlxI av BrdU merkings reagens (fortynnet 1:100 i media - L-15, 5% FCS, 1% L-glutamin) ble satt til hver brønn og platen returnert til en fuktet (+5% CO2) 37°C inkubator i 2 timer. Etter 2 timer ble merkings reagenset fjernet ved dekantering og banking av platen på et papirhåndkle. FixDenat løsning (50 |jl pr. brønn) ble tilsatt og platene inkubert ved romtemperatur i 45 minutter med risting. FixDenat løsningen ble fjernet ved dekantering og banking av den omvendte platen på et papirhåndkle. Platen ble deretter vasket én gang med fosfatbufret saltløsning

(PBS) og 100 [ il /brønn av Anti-BrdU-POD antistoffløsning (fortynnet 1:100 i antistoff fortynningsbuffer) ble tilsatt. Platen ble deretter inkubert ved romtemperatur med risting i 90 minutter. Ubundet Anti-BrdU-POD antistoff ble fjernet ved dekantering og vasking av platen 4 ganger med PBS før den blir blottet tørr. TMB substratløsning ble tilsatt (100 |jl/brønn) og inkubert i omtrent 10 minutter ved romtemperatur med risting inntil en fargeforandring ble synlig. Den optiske densiteten av brønnene ble deretter bestemt ved 690 nm bølgelengde ved anvendelse av en Titertek Multiscan plateleser. Verdiene fra forbindelser behandlet, ubehandlet og 100% hemningskontroller ble anvendt for å bestemme fortynningsområde av en testforbindelse som ga 50% hemning av BrdU innføring. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er aktive ved 0,3 nM til 10000 nM i denne testen og spesielt forbindelse 5 i tabell 1 var aktiv ved 0,1 nM.

(d) In vitro cellecyklus analyse forsøk

Dette forsøket bestemmer evnen som en testforbindelse har til å stanse celler i spesifikke faser av cellecyklusen. Mange forskjellige pattedyrcellelinjer kunne anvendes i dette forsøket og SW620 celler er omfattet her som et eksempel. SW620 celler ble podet med 7 x 10<5>celler pr. T25 kolbe (Costar) i 5 ml L-15 (5% FCS, 1% L-glutamin). Kolber ble deretter inkubert natten over i en fuktet 37°C inkubator med 5% CO2. Den følgende dag, ble 5 \ il av L-15 (5% FCS, 1% L-glutamin) som bærer det passende konsentrasjonen av testforbindelse solubilisert i DMSO satt til kolben . En kontroll behandling uten forbindelse ble også omfattet (0,5% DMSO). Cellene ble deretter inkubert i en definert tid (24 timer) med forbindelse. Etter denne tiden ble media aspirert fra cellene og de ble vasket med 5 ml forvarmet (37°C) sterile PB SA, deretter løsnet fra kolben ved kort inkubering med trypsin og fulgt av resuspensjon i 5 ml 1% Bovint serumalbumin (BSA, Sigma-aldrich Co.) i steril PBSA. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 2200 rpm i 10 minutter. Supernatanten ble aspirert hvilket gir 200 jlxI av PB S/B SA løsning. Pelleten ble resuspendert i denne 200 jlaI løsningen ved pipettering 10 ganger for å skape en enkel cellesuspensjon. En ml iskald 80% etanol ble langsomt satt til hver cellesuspensjon og prøvene lagret ved -20°C natten over eller inntil nødvendig for merking. Celler ble pelletert ved sentrifugering, etanol aspirert ut og pelletene resuspendert i 200 [ il PBS inneholdende 100 |J,g/ml RNAse (Sigma Aldrich) og 10 |J,g/ml Propidiumjodid (Sigma Aldrich). Cellesuspensjoner ble inkubert ved 37°C i 30min, ytterligere 200 jLil PBS ble tilsatt og prøver lagret i mørke ved 4°C natten over.

Hver prøve ble deretter sprøytet 10 ganger ved anvendelse av 21-guage nål. Prøvene ble deretter overført til LPS rør og DNA innhold pr. celle analysert ved Fluorescens aktivert celle sortering (FACS) ved anvendelse av et FACScan strøm cytometer (Becton Dickinson). Typisk ble 30,000 hendelser tellet og registrert ved anvendelse av CellQuest vl,l programvare (Verity Programvare). Cellecyklus fordeling av populasjonen ble beregnet ved anvendelse av Modfit programvare (Verity Programvare) og uttrykt som prosentdel av celler med 2N (G0/G1), 2N-4N (S fase) og med 4N (G2/M) DNA innhold.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er aktiv i denne testen ved 0,3nM til lOOOOnM.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert i de følgende eksempler, hvor standard teknikker kjent for fagfolk innen kjemi og teknikker analoge med de beskrevet i disse Eksempler kan anvendes hvor passende og hvor, hvis ikke annet er angitt: (i) inndampninger ble utført ved rotasjonsinndampning i vakuum og opparbeidingsprosedyrer ble utført etter fjerning av gjenværende faste stoffer så som tørkemidler ved filtrering; (ii) operasjoner ble utført ved omgivelsestemperatur, typisk i området 18-25°C og i luft hvis ikke angitt eller hvis ikke fagfolk ville gjøre dette på en annen måte under en atmosfære av en inert gass så som argon; (iii) kolonnekromatografi (ved "flash" prosedyre) og medium trykk væskekromatografi (MPLC) ble utført på Merck Kieselgel silika (Art. 9385); (iv) utbytter er gitt bare for illustrasjon og er ikke nødvendigvis maksimalt oppnåelige; (v) strukturene av sluttproduktene med formel (I) ble generelt bekreftet ved nukleær (generelt proton) magnetisk resonans (NMR) og massespektral teknikker; proton magnetisk resonans kjemisk skift verdier ble målt i deuterert dimetylsulfoksyd (DMSO de)

(hvis ikke annet er angitt) på delta skala (ppm nedfelts fra tetrametylsilan) ved anvendelse av én av de følgende fire instrumenter

Varian Gemini 2000 spektrometer som opererer ved en feltstyrke på 300 MHz Bruker DPX300 spektrometer som opererer ved en feltstyrke på 300MHz

JEOL EX 400 spektrometer som opererer ved en feltstyrke på 400 MHz

- Bruker Avance 500 spektrometer som opererer ved en feltstyrke på 500MHz Topp multiplisiteter er vist som følger: s, singlett; d, dublett; dd, dobbel dublett; t, triplett; q, kvartett; qu, kvintett; m, multippelt; br s, bred singlett. (vi) robott syntese ble utført ved anvendelse av en Zymat XP robot, med tilsetning av løsning via en Zymat Master Laboratory Station og omrørt via en Stem RS5000 Reacto-Station ved 25°C; (vii) opparbeiding og rensning av reaksjonsblandinger fra robott syntese ble utført som følger: inndampninger ble utført/vakuum ved anvendelse av en Genevac HT 4; kolonnekromatografi ble utført ved anvendelse av enten et Anachem Sympur MPLC system på silika ved anvendelse av 27 mm diameter kolonner fylt med Merck silika (60fim, 25 g); strukturene av sluttproduktet ble bekreftet ved LCMS på et Waters 2890 / ZMD mikromasse system ved anvendelse av de følgende og er sitert som retensjonstid (RT) i minutter: (viii) Analytisk LCMS for forbindelser som ikke var blitt fremstilt ved robott syntese ble utført på et Waters Alliance HT system ved anvendelse av de følgende og er sitert som retensjonstid (RT) i minutter:

(ix) Preparativ høy ytelse væskekromatografi (HPLC) ble utført på enten

- Waters preparative LCMS instrument, med retensjonstid (RT) målt i minutter: - Gilson preparative HPLC instrument, med retensjonstid (RT) målt i minutter:

(x) mellomprodukter ble generelt ikke fullstendigkarakterisertog renhet ble bedømt ved tynnskiktskromatografi (TLC), HPLC, infra-rød (IR), MS eller NMR analyse.

Spesielle eksempler på forbindelser er angitt i de følgende tabeller, hvor<*>representerer bindingspunktet av gruppene i hver tabell til forbindelsen med formel (I) over hver tabell:

Referanseeksempel 1 - Fremstilling av Forbindelse 1 i Tabell 1 - { l-[ 3-({ 4-[( 5-{ 2- f( 3-flnorfenyl) aminol- 2- oksoetyli- l^ r- pyrazol- 3- yl) aminol- 6- nietoksykinazolin- 7-yl} oksy) propyll piperidin- 4- yl} metyldihydrogenfosfat

Di(tert-butyl) {1 -[3-({4-[(5- {2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl}oksy)propyl]piperidin-4-yl}metylfosfat (400 mg, 0,53 mmol) ble suspendert i dioksan (20 ml) og behandlet med en løsning av saltsyre (4,0 N) i dioksan (795 jai, 3,18 mmol) ved omgivelsestemperatur i 15 timer. Det faste stoffet ble gjenvunnet ved filtrering, vasket med dioksan, tørket in vakuum ved 50 °C, hvilket gir forbindelse 1 i tabell 1 (360 mg, 94 % utbytte): 'H-NMR (DMSO de, AcOD): 8,88 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,35 (m, 3H), 6,84 (m, 1H), 6,81 (s, 1H), 4,28 (m, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,83 (s, 2H), 3,75 (t, 2H), 3,58 (d, 2H), 3,26 (m, 2H), 3,26 (m, 2H), 2,32 (m, 2H), 1,85 (m, 3H), 1,54 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 644,5 (M+H)<+>.

Di(tert-butyl) {1 -[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl}oksy)propyl]piperidin-4-yl}metylfosfat, anvendt som utgangsmaterialet, ble oppnådd som følger: a) En blanding av 4-benzyloksy-3-metoksybenzaldehyd (157 g, 649 mmol), natriumacetat (106 g, 1,29 mol), hydroksylamin-hydroklorid (90 g, 1,29 mol) og eddiksyre

(500 ml) ble tilbakeløpskokt i 21 timer. Løsningsmidlet ble avdampet og is / vann (1000 ml) ble satt til residuet som dannet et klebrig fast stoff. Blandingen ble nøytralisert med vandig natriumhydroksyd-løsning deretter ekstrahert med diklormetan (2 x 500 ml). Den organiske løsningen ble vasket med 1,0 N natriumhydroksyd (100 ml), saltvann (100 ml) og deretter tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmiddel inndampning, utgnidning av residuet med heksan : etylacetat (3:1) og oppsamling av det faste stoffet ved vakuumfiltrering ga 4-benzyloksy-3-metoksybenzonitril (123 g, 80 % utbytte) som et brunt, fast stoff:

'H-NMR (DMSO d6): 7,38 (m, 7H), 7,19 (m, 1H), 5,18 (s, 2H), 3,80 (s, 3H):

MS (-ve ESI): 238 (M-H)\

b) Eddiksyre (17 ml) ble langsomt satt til salpetersyre (40 ml, 440 mmol) ved 5 °C. Pulverisert 4-benzyloksy-3-metoksybenzonitril (10 g, 42 mmol) ble tilsatt og blandingen oppvarmet til 23 °C over 10 minutter. En eksoterm skjedde og temperaturen ble kontrollert ved < 30 °C ved anvendelse av et isbad. Blandingen ble omrørt ved 23 °C i 20 timer deretter hellet i is / vann (1000 ml). Etter omrøring i to timer ble det gule faste stoffet oppsamlet ved sugefiltrering, vasket med vann og tørket, hvilket gir 4-benzyloksy-3-metoksy-6-nitrobenzonitril (10,1 g, 85 % utbytte) som et gult, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 7,95 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,40 (m, 5H), 5,30 (s, 2H), 3,95 (s, 3H): MS (-ve ESI): 283 (M-H)\ c) En blanding av 4-benzyloksy-3-metoksy-6-nitrobenzonitril (46 g, 162 mmol), natriumbikarbonat (95 g, 1,13 mol), vann (750 ml), diklormetan (550 ml) og

tetrabutylammoniumklorid (30 g, 108 mmol) ble raskt omrørt ved 20 °C og behandlet med natriumditionit (66 g, 379 mmol) porsjons vis over 2 timer. Blandingen ble omrørt i en ytterligere time og deretter ble fasene separert. Den vandige fasen ble ekstrahert med diklormetan (2 x 200 ml) og den samlede organiske løsning vasket med vann (300 ml) og

tørket over magnesiumsulfat. Løsningen ble konsentrert til 250 ml og 4,0 M saltsyre i 1,4-dioksan (150 ml, 0,6 mol) ble tilsatt, deretter fortynnet med dietyleter (1000 ml) og avkjølt på is. Det resulterende faste stoffet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og vasket med dietyleter. Det faste stoffet ble omrørt i metanol (1000 ml) og natriumbikarbonat-løsning (800 ml) satt til pH 8 og omrørt i 1 time. Det faste stoffet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann deretter metanol og tørket i våkum, hvilket gir 2-amino-4-(benzyloksy)-5-metoksybenzonitril (34 g, 82 % utbytte) som et lyse brunt fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 7,40 (m, 5H), 6,90 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 5,60 (br s, 2H), 5,02 (s, 2H), 3,65 (s, 3H):

MS (+ve ESI): 254 (M+H)<+>.

d) 2-amino-4-(benzyloksy)-5-metoksybenzonitril (100 g, 394 mmol) i toluen (1400 ml) ble behandlet med dimetylformamiddimetylacetal (100 ml, 940 mmol) ved tilbakeløp

med langsom destillering av løsningsmidelet for å opprettholde den indre temperaturen ved 105 °C. Etter 3 timer ble løsningen avkjølt og filtrert for å fjerne en liten mengde av fast stoff. Filtratet ble inndampet i våkum og residuet utgnidd med dietyleter og det faste stoffet oppsamlet ved vakuumfiltrering og tørket i våkum, hvilket gir ./V-(5-(benzyloksy)-2-cyano-4-metoksyfenyl)-AyV-dimetylimidoformamid (110 g, 90 % utbytte) som et brunt, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 7,90 (s, 1H), 7,40 (m, 5H), 7,10 (s, 1H), 6,88 (s, 1H), 5,15 (s, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,02 (s, 3H), 2,95 (s, 3H):

MS (+ve ESI): 310 (M+H)<+>

MS (-ve ESI): 308 (M-H)\

e) A''-(5-(benzyloksy)-2-cyano-4-metoksyfenyl)-A^rA^-dimetylimidoformamid (110 g, 356 mmol) og trifluoreddiksyre (600 ml) ble tilbakeløpskokt sammen i 15 min.

Inndampning og ko-inndampning med toluen, utgnidning med dietyleter og oppsamling av det faste stoffet ved vakuumfiltrering og tørking i våkum ga 7V-(2-cyano-5-hydroksy-4-metoksyfenyl)-AyV-dimetylimidoformamid (112 g, 95 % utbytte) som et lyse brunt trifluoracetatsalt:<!>H-NMR (DMSO de): 8,39 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,25 (s, 3H), 3,17 (s, 3H):

MS (+ve ESI): 220 (M+H)<+>

MS (-ve ESI): 218 (M-H)\

f) En blanding av 7V-(2-cyano-5-hydroksy-4-metoksyfenyl)-7V,7V-dimetylimidoformamid (21,9 g, 66 mmol), cesiumkarbonat (998 g, 300 mmol) og 1-brom- 3-klorpropan (11 ml, 110 mmol) i acetonitril (300 ml) ble tilbakeløpskokt i 1 time. Reaksjonsblandingen ble avkjølt og løsningsmidlet inndampet i våkum. Residuet i vann (200 ml) ble ekstrahert med diklormetan (2 x 150 ml). Den organiske løsningen ble vasket med saltvann (50 ml) og tørket over magnesiumsulfat. Løsningsmidlet ble inndampet/våkum og residuet utgnidd med dietyleter. Det faste stoffet ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og tørket i våkum, hvilket gir 7V-(5-(3-klorpropoksy)-2-cyano-4-metoksyfenyl)-AyV-dimetylimidoformamid (17,7 g, 91 % utbytte) som et hvitt, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 8,89 (s, 1H), 7,07 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 4,15 (t, 2H), 3,77 (t, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,05 (s, 3H), 2,95 (s, 3H), 2,18 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 296,4 (M+H)<+>.

g) N'-(5-(3-klorpropoksy)-2-cyano-4-metoksyfenyl)-A^A'-dimetylimidoformamid (230 mg, 0,78 mmol) i eddiksyre (0,7 ml) ble omsatt med metyl (5-amino-lH-pyrazol-3-yl)acetat (CAS 174891-10-2; WO 95/33724) (110 mg, 0,74 mmol) ved tilbakeløp i 1 time. Blandingen ble avkjølt, eddiksyren inndampet og residuet renset ved kromatografi på silikagel, under eluering med diklormetan /1 % metanolisk ammoniakk (90:10), hvilket gir metyl (5-((7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl)amino)-lH-pyrazol-3-yl)acetat (219 mg, 69 % utbytte) som et kremfarget, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de, TF A): 8,93 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,32 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 4,02 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,75-3,85 (m, s, 4H), 3,65 (s, 3H), 2,30 (m, 2H), 1,90 (s, 3H):

MS (+ve ESI): 406,5 (M+H)<+>.

h) Metyl (5-((7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl)amino)-lH-pyrazol-3-yl)acetat (100 mg, 0,247 mmol) i tetrahydrofuran (1,2 ml) / vann (0,6 ml), ble omsatt med

litiumhydroksyd (21 mg, 0,493 mmol) ved omgivelsestemperatur natten over. Blandingen ble surgjort med 6,0 N saltsyre til pH 4 og det faste stoffet ble gjenvunnet ved filtrering, vasket med vann og tørket, hvilket gir (5-((7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl)amino)-lH-pyrazol-3-yl)eddiksyre (72 mg, 75 % utbytte) som et beige, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de, TFA): 8,95 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,32 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 4,33 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,83 (m, 2H), 3,74 (s, 2H), 2,40-2,50 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 392,5, 394,5 (M+H)<+>.

i) (5-((7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl)amino)-lH-pyrazol-3-yl)

eddiksyre (7,83 g, 20 mmol) i dimetylformamid (78 ml) ble omsatt med 3-fluoranilin (2,44 g, 22 mmol) i nærvær av l-(3-dimetylamino-propyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (4,2 g, 22 mmol), 2-hydroksypyridin-l-oksyd (2,22 g, 20 mmol) og diisopropyletylamin (2,8 g, 22 mmol) ved 50 °C i 1,7 timer. Løsningsmidlet ble fjernet ved inndampning under vakuum,

residuet ble utgnidd med vann (to ganger) og renset ved silikagel kromatografi, under eluering med diklormetan : metanol (95:3 til 85:15), hvilket gir 2-(5-((7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl)amino)-lH-pyrazol-3-yl)-N-(3-fluorfenyl) acetamid (4,5 g, 46 % utbytte) som et beige, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 8,47 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,60-7,68 (m, 1H), 7,30-7,41 (m, 2H), 7,20 (s, 1H), 6,88 (m, 1H), 6,84 (s, 1H), 4,27 (m, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,84 (m, 2H), 3,78 (s, 2H), 2,26 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 485,6 (M+H)<+>.

j) Piperidin-4-ylmetanol (115 mg, 1 mmol) ble satt til en løsning av 2-(5-((7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl)amino)-lH-pyrazol-3-yl)-N-(3-fluorfenyl) acetamid (121 mg, 0,25 mmol) i dimetylacetamid (1 ml) og reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved 90 °C i 9 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til omgivelsestemperatur og flyktige substanser fjernet i våkum. Rensning ved revers fase hplc ga JV-(3-fluorfenyl)-2-{3-[(7-{3-[4-(hydroksymetyl)piperidin-l-yl]propoksy}-6-metoksykinazolin-4-yl)amino]-l//-pyrazol-5-yl} acetamid (80 mg, 57 % utbytte) som et gråhvitt, fast stoff:<!>H-NMR (DMSO d6, TFA): 8,96 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 7,63 (m, 1H), 7,36 (m, 3H), 6,90 (m, 1H), 6,84 (s, 1H), 4,30 (t, 2H), 4,01 (s, 3H), 3,85 (s, 2H), 3,62 (d, 2H), 3,32 (d, 2H), 3,27 (m, 2H), 2,98 (t, 2H), 2,29 (m, 2H), 1,90 (d, 2H), 1,67 (m, 1H), 1,42 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 564,6 (M+H)<+>.

k) 7V-(3-fluorfenyl)-2- {3-[(7- {3-[4-(hydroksymetyl)piperidin-1 -yl]propoksy}-6-metoksykinazolin-4-yl)amino]-li/-pyrazol-5-yl} acetamid (450 mg, 1 mmol) ble oppløst i dimetylformamid (2 ml), tetrazol (224 mg, 4 mmol) og di-/ert-butyl-dietyl-fosforamidit (479 jul, 2 mmol) ble satt til blandingen ved omgivelsestemperatur og omrøring ble fortsatt i 3 timer under argon. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til -60 °C og en løsning av monoperoksyftalsyremagnesiumsalt (297 mg, 0,6 mmol) i dimetylformamid (1,5 ml) ble

langsomt satt til reaksjonsblandingen. Denne blandingen ble deretter omrørt i 1,5 timer ved

-60 °C, natriummetabisulfitt (1,5 g, 10 mmol) i løsning i vann (2 ml) ble deretter tilsatt og reaksjonsblandingen ble langsomt oppvarmet til omgivelsestemperatur, inndampet og residuet ble renset ved silikagel kromatografi, under eluering med diklormetan : 3,0 N metanolisk ammoniakk (100:0 til 92:8), hvilket gir di(tert-butyl) {l-[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl}oksy)propyl]piperidin-4-yl}metylfosfat (420 mg, 70 % utbytte) som et kremfarget, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 8,46 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,36 (m, 2H), 7,35 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 6,90 (m, 1H), 6,88 (s, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 3,72 (t, 2H), 2,91 (d, 2H), 2,46 (t, 2H), 1,96 (m, 4H), 1,65 (m, 2H), 1,58 (m, 1H), 1,41 (s, 18H), 1,25 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 756,6 (M+H)<+>.

Referanseeksempel 2 - Fremstilling av forbindelse 2 i tabell 1 - 2- H3-( i4- f( 5- i2- K2, 3-difluorfenvl) aminol- 2- oksoetvli- lJy- pvrazol- 3- vl) aminol- 6- metoksykinazolin- 7-ylioksy) propyll( propyl) aminoletyldihydrogenfosfat

En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 1, men ved å starte med åi- tert-butyl 2-[[3-( {4-[(5- {2-[(2,3-difluorfenyl)amino]-2-oksoetyl} - li/-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl}oksy)propyl](propyl)amino]etylfosfat (316 mg, 0,41 mmol) ga forbindelse 6 i tabell 1 (300 mg, 100 % utbytte): 'H-NMR (DMSO d6,TFA): 8,96 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,20 (m, 2H), 6,84 (s, 1H), 4,31 (t, 2H), 4,24 (m, 2H), 4,01 (s, 3H), 3,94 (s, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,38 (m, 2H), 3,19 (m, 2H), 2,32 (m, 2H), 1,74 (m, 2H), 0,95 (t, 3H): MS (+ve ESI): 650,3 (M+H)<+>. di-tert-butyl 2-[[3-( {4-[(5- {2-[(2,3-difluorfenyl)amino]-2-oksoetyl} - li/-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl}oksy)propyl](propyl)amino]etylfosfat anvendt som utgangsmateriale ble oppnådd som følger : a) 5 - {[7 -(3 -klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl] amino} -1 //-pyrazol- 3 - yl)eddiksyre (3,91 g, 10 mmol) ble suspendert i pyridin (20 ml) i nærvær av 2,3-difluoranilin (1,55 g, 12 mmol) under argon ved 0 °C. Fosforoksyklorid (1,53 g, 10 mmol) i etylacetat (2 ml) ble langsomt tilsatt ved 0 °C og den resulterende blandingen fikk oppvarmes til omgivelsestemperatur over 1,5 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat (150 ml) og dietyleter (50 ml) hvilket resulterer i utfellingen av et rødt, fast stoff. Det faste stoffet ble gjenvunnet ved sugefiltrering, tørket og resuspendert i vann (100 ml). Blandingen ble avkjølt til 0 °C og pH regulert til 7 ved tilsetning av 1,5 N vandig ammoniumhydroksyd-løsning. Etter 15 minutter omrøring, ble det faste stoffet gjenvunnet, tørket og renset ved kromatografi på silikagel, under eluering med diklormetan : metanol (95/5) og øket polaritet til diklormetan : metanolisk ammoniakk (95:2), hvilket gir 2-(3-{[7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl]amino}-l//-pyrazol-5-yl)-7V-(2,3-difluorfenyl)acetamid som et rosa, fast stoff (2,55 g, 50 % utbytte): 'H-NMR (DMSO de, TF A): 8,94 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,15-7,22 (m, 1H), 6,84 (s, 1H), 4,30 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,94 (s, 2H), 3,84 (m, 2H), 2,30 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 503,9 (M+H)<+>.

b) 2-(propylamino)etanol (700 mg, 68 mmol) og kaliumjodid (564 mg, 34 mmol) ble satt til en løsning av 2-(3-{[7-(3-klorpropoksy)-6-metoksykinazolin-4-yl]amino}-li/-

pyrazol-5-yl)-7V-(2,3-difluorfenyl)acetamid (855 mg, 17 mmol) i dimetylacetamid (8 ml) og reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved 85 °C i 5 timer. Løsningsmidlet ble avdampet i våkum, residuet utgnidd med dietyleter og det faste stoffet ble oppsamlet ved sugefiltrering. Rensning ved kromatografi på silikagel, under eluering med, diklormetan / metanol (90:10) til diklormetan / metanol / ammoniakk (7,0 N), hvilket gir N-( 2, 3-difluorfenyl)-2- {3-[(7- {3 -[(2-hydroksyetyl)(propyl)amino]propoksy} -6-metoksykinazolin-4-yl)amino]-li/-pyrazol-5-yl}acetamid (650 mg, 67 % utbytte):

'H-NMR (DMSO de, TFA): 8,96 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 7,75 (m, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,18-7,22 (m, 2H), 6,84 (s, 1H), 4,30 (m, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,94 (s, 2H), 3,78 (m, 2H), 3,30-3,45 (m, 2H), 3,28 (m, 2H), 3,15-3,20 (m, 2H), 2,28 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 0,95 (t, 3H): MS (+ve ESI): 570,3 (M+H)<+>. c) Di-tert-butyl-dietylfosforamidit (417 um, 1,5 mmol) ble langsomt satt til en løsning av 7V-(2,3-difluorfenyl)-2- {3-[(7- {3-[(2-hydroksyetyl)(propyl) amino]propoksy}-6-metoksykinazolin-4-yl)amino]-li/-pyrazol-5-yl} acetamid (569 mg, 1 mmol) i dimetylformamid (2,5 ml) i nærvær av tetrazol (210 mg, 3 mmol) ved omgivelsestemperatur under argon. Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 1,5 timer, avkjølt til -10 °C og hydrogenperoksyd (134 um av en 9,0 N løsning, 1,2 mmol) ble langsomt tilsatt. Den resulterende blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 2 timer. Natriummetabisulfitt (570 mg, 3 mmol) i vann (2 ml) ble deretter tilsatt ved 0 °C og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 0,5 timer. Blandingen ble konsentrert, diklormetan / metanol (8:2) ble tilsatt før det faste stoffet ble filtrert og vasket med diklormetan / metanol. Konsentrasjon av filtratet i våkum fulgt av kromatografi på silikagel, under eluering med diklormetan / metanol (90:10) til diklormetan / metanol / ammoniakk (7,0 N) (90:10:1), ga di-tert-butyl 2-[[3-({4-[(5-{2-[(2,3-difluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl}oksy)propyl](propyl)amino]etylfosfat som et gråhvitt, fast stoff (319 mg, 42 % utbytte) 'H-NMR (DMSO de, TFA): 8,95 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 7,72 (m, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,18 (m, 2H), 6,84 (s, 1H), 4,20-4,35 (m, 4H), 4,00 (s, 3H), 3,94 (s, 2H), 3,53 (m, 2H), 3,39 (m, 2H), 3,20 (m, 2H), 2,30 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 1,44 (s, 18H), 0,95 (t, 3H):

MS (+ve ESI): 762,5 (M+H)<+>.

Forbindelse 6, syntetisert ovenfor som dihydrokloridsalt, kunne også fremstilles som den frie basen i henhold til de følgende metode: d) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(2,3-difluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl} oksy)propyl](propyl)amino]etyldihydrogenfosfatdihydroklorid (10 g, 13 mmol) ble solubilisert i metanol (300 ml) og cykloheksanoksyd (12,7 g, 130 mmol) ble satt til løsningen. Løsningen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 48 timer, under hvilken tid et hvitt, fast stoff ble utfelt. Blandingen ble fortynnet med dietyleter (100 ml) og det faste stoffet ble gjenvunnet ved filtrering, vasket med eter og tørket i våkum, hvilket gir 2-[[3-({4-[(5-{2-[(2,3-difluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li7-pyrazol-3-yl)amino]-6-metoksykinazolin-7-yl}oksy)propyl](propyl)amino]etyldihydrogenfosfat (7,65 g, 88 % utbytte) som et lysegult pulver :<!>H-NMR (DMSO d6, TFA): 8,96 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 7,74 (m, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,19 (m, 2H), 6,84 (s, 1H), 4,31 (m, 2H), 4,24 (m, 2H), 4,01 (s, 3H), 3,94 (s, 2H), 3,51 (m, 2H), 3,38 (m, 2H), 3,18 (m, 2H), 2,29 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 0,96 (t, 3H):

MS (+ve ESI): 650 (M+H)<+>.

C28H34F2N7O7P + 1,04 H20 +0,03 Et20 krever C, 50,37%; H, 5,47%; N, 14,62%; Funnet C, 50,02%; H, 5,54%; N, 14,48%.

Referanseeksempel 3 - Fremstilling av Forbindelse 3 i tabell 2 - 2-[[ 3-({ 4- f( 5-{ 2- r( 2, 3-difluorfenyl) aminol- 2- oksoetylM#- pyrazol- 3- yl) aminol- kinazolin- 7-ylj oksv) propyll ( etyl) aminol etyldihydrogenfosfat

En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 1, men ved å starte med di(/ert-butyl)2-[[3-({4-[(5-{2-[(2,3-dilfuorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl](etyl)amino]etylfosfat (302 mg, 0,422 mmol) ga forbindelse 28 i tabell 3 (300 mg, 100 % utbytte) som et hvitt, fast stoff: 'H-NMR (DMSO d6): 12,00 (s, 1H), 10,30 (s, 1H), 8,90 (d, 1H), 7,65-7,75 (m, 1H), 7,50-7,60 (m, 2H), 7,10-7,25 (m, 2H), 6,70 (s, 1H), 4,35 (t, 2H), 4,20-4,30 (m, 2H), 3,90 (s, 2H), 3,40-3,50 (m, 2H), 3,25-3,35 (m, 2H), 3,10-3,20 (m, 2H), 2,20-2,40 (M, 2H), 1,30 (t, 3H):

MS (+ve ESI): 606 (M+H)<+>,

MS (-ve ESI): 604 (M-H)\

di(ter^butyl)2-[[3-({4-[(5-{2-[(2,3-dilfuorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-l//-pyraz yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl](etyl)amino]etylfosfat anvendt som utgangsmateriale ble oppnådd som følger :

a) 2-amino-4-fluorbenzosyre (15 g, 96 mmol) ble oppløst i 2-metoksyetanol (97 ml). Formamidinacetat (20,13 g, 193,4 mmol) ble tilsatt og blandingen oppvarmet til tilbake løp i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt, konsentrert og residuet omrørt i vandig ammoniumhydroksyd (0,01 N, 250 ml) i 1 time. Suspensjonen ble filtrert, vasket med vann og tørket over fosforpentoksyd, hvilket gir 7-fluorkinazolin-4(3H)-on som et gråhvitt, fast stoff (10,35 g, 65 % utbytte): 'H-NMR (DMSO de): 12,32 (br s, 1H), 8,19 (dd, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,45 (dd, 1H), 7,39 (m, 1H):

MS (-ve ESI): 163 (M-H)\

MS (+ve ESI): 165 (M+H)+.

b) Natriumhydrid (14,6 g, 365 mmol) ble tilsatt ved 0 °C til en løsning av 1,3-propandiol (27,8 g, 365 mmol) i dimetylformamid (70 ml). 7-fluorkinazolin-4(3H)-on (10

g, 60,9 mmol) ble tilsatt porsjonsvis og reaksjonsblandingen oppvarmet ved 60 °C, deretter ved 110 °C i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0 °C, behandlet med vann (280 ml) og regulert til pH 5,9. Den resulterende suspensjonen ble filtrert, vasket med vann deretter eter og tørket over fosforpentoksyd, hvilket gir 7-(3-hydroksypropoksy)kinazolin-4(3H)-on som et hvitt pulver (12,41 g, 92 % utbytte):<!>H-NMR (DMSO d6): 11,90 (br s, 1H), 8,04 (s, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,10 (m, 2H), 4,17 (t, 2H),3,58 (t, 2H), 1,92 (m, 2H):

MS(+ve ESI): 221 (M+H)+.

c) 7-(3-hydroksypropoksy)kinazolin-4(3H)-on (10,5 g, 47,7 mmol) og tionylklorid (100 ml, 137 mmol) ble samlet. Dimetylformamid (1 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen

oppvarmet til 85 °C i 1 time. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur, fortynnet med toluen og inndampet til tørrhet. Dette ble gjentatt inntil alt tionylklorid ble fjernet. Residuet ble oppløst i diklormetan og vasket med en mettet natriumbikarbonat-løsning. Det vandige laget ble ekstrahert med diklormetan. De organiske faser ble samlet, tørket (magnesiumsulfat) og konsentrert hvilket gir et gult, fast stoff. Utgnidning med eter fjernet en mindre oppløselig urenhet og eterfiltratet ble konsentrert hvilket gir 4-klor-7-(3-klorpropoksy)kinazolin som et gråhvitt, fast stoff (8,5 g, 70 % utbytte): 'H-NMR (DMSO de): 13,25 (br s, 1H), 8,34 (s, 1H), 8,06 (d, 1H), 7,17 (m, 2H), 4,21 (t, 2H), 3,83 (t, 2H), 2,23 (m, 2H):

MS (+ve ESI): 257,259 (M+H)<+>.

d) 4-klor-7-(3-klorpropoksy)kinazolin (2,5 g, 9,72 mmol) og (3-amino-l//-pyrazol-5-yl)eddiksyre (1,37 g, 9,72 mmol) ble samlet i dimetylformamid (25 ml). En løsning av 4M

HC1 i dioksan (1,25 ml, 4,8 mmol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen oppvarmet til 90 °C i 40 minutter. Løsningen ble avkjølt til romtemperatur, fortynnet med vann (250 ml) og filtrert gjennom celite. Den sure løsningen ble gjort basisk til pH 4,9 og gult pulver filtrert.

(Ved pH 3, et rødt, fast stoff ble utfelt og ble isolert, suspendert i vann og gjort basisk til pH 12. Forsiktig tilbakejustering til pH 4,8 resulterte i utfellingen av et gult pulver, som ble kombinert med den første avlingen). Det faste stoffet ble vasket med dietyleter og tørket over fosforpentoksyd, hvilket gir (3-{[7-(3-klorpropoksy)kinazolin-4-yl]amino}-l//- pyrazol-5-yl)eddiksyre som et blek oransje fast stoff (2,88 g, 82 % utbytte): 'H-NMR (DMSO de): 12,60 (br s, 2H), 10,78 (br s, 1H), 8,65 (s, 1H), 8,60 (d, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,22 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 3,83 (t, 2H), 3,67 (s, 2H), 2,24 (m, 2H): MS (-ve ESI): 360, 362 (M-H)",

MS (+ve ESI): 362, 364 (M+H)<+>.

e) 2,3-difluoranilin (1,15 g, 8,95 mmol) ble satt til en suspensjon av (3-{[7-(3-klorpropoksy)kinazolin-4-yl]amino}-li/-pyrazol-5-yl)eddiksyre (2,70 g, 7,46 mmol) i

pyridin (30 ml) og reaksjonen avkjølt til 0 °C. Fosforoksyklorid (1,14 g, 7,46 mmol) ble tilsatt dråpevis og reaksjonsblandingen omrørt ved 0 °C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til omgivelsestemperatur og mer fosforoksyklorid (0,5 ml) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 4,5 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat: eter (100 ml: 37 ml) og omrørt i 18 timer. Fellingen ble filtrert, suspendert i vann og nøytralisert med ammoniumhydroksyd (7 %, 15 ml). Den resulterende gule suspensjonen ble filtrert, vasket med vann og tørket (fosfor pentoksyd), hvilket gir 2-(3-{[7-(3-klorpropoksy)kinazolin-4-yl]amino}-li/-pyrazol-5-yl)-7V-(2,3-difluorfenyl)acetamid som et oransje pulver (3,15 g, 89 % utbytte):<!>H-NMR (DMSO de): 10,64 (br s, 1H), 10,27 (s, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,55 (d, 1H), 7,70 (m, 1H), 7,20 (m, 6H), 6,68 (s, 1H), 4,27 (t, 2H), 3,83 (m, 4H), 2,25 (m, 2H):

MS (-ve ESI): 471,473 (M-H)",

MS (+ve ESI): 473,475 (M+H)<+>.

f) 2-(3-{[7-(3-klorpropoksy)kinazolin-4-yl]amino}-li/-pyrazol-5-yl)-7V-(2,3-difluorfenyl)acetamid (300 mg, 0,634 mmol), kaliumjodid (210 mg, 1,27 mmol), dimetylamin (2 ml) og 2-(etylamino)etanol (226 mg, 2,54 mmol) ble samlet og oppvarmet til 50 °C i 72 timer. Reaksjonen ble fortynnet med diklormetan (20 ml) og applisert på en 40S silika biotage kolonne. Eluering med diklormetan fulgt av øket polaritet til diklormetan : metanol (9:1), deretter diklormetan: metanol: ammoniakk (9:1:0,8) ga N-(2,3-difluorfenyl)-2- {3-[(7- {3-[etyl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy} -kinazolin-4-yl)amino]-l//-pyrazol-5-yl}acetamid som et blekrosa, fast stoff (181 mg, 54 % utbytte): 'H-NMR (DMSO de): 12,35 (s, 1H), 10,25 (s, 2H), 8,52 (s, 2H), 7,71 (m, 1H), 7,16 (m, 4H), 6,78 (s, 1H), 4,33 (t, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,84 (s, 2H), 3,43 (m, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,49 (m, 4H), 1,88 (m, 2H), 0,96 (t, 3H):

MS (-ve ESI): 524 (M-H)\

MS (+ve ESI): 526 (M+H)<+>.

g) En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 6c, men ved å starte med N-( 2, 3-difluorfenyl)-2-{3-[(7-{3-[etyl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy} -kinazolin-4-yl)amino]-l//-pyrazol-5-yl}acetamid (372 mg, 0,71 mmol) ga di(tert-butyl) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(2,3-difluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl](etyl)amino]etylfosfat (304 mg, 60 % utbytte) som et blekgult, fast stoff: 'H-NMR (DMSO d6): 12,30 (s, 1H), 10,20 (d, 2H), 8,60-8,70 (m, 2H), 7,70-7,80 (m, 1H), 7,05-7,25 (m, 4H), 6,80 (br s, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,80-3,90 (m, 4H), 2,60-2,70 (m, 4H), 2,40-2,50 (m, 2H), 1,80-1,90 (m, 2H), 1,40 (s, 18H), 0,95 (t, 3H): MS(+ve ESI): 718(M+H)+,

MS (-ve ESI): 716 (M-H)'.

Referanseeksempel 4 - Fremstilling av Forbindelse 4 i tabell 2 - {( 25>- l- f3-({ 4- r( 5-{ 2-[( 3- fluorfenyl) aminol- 2- oksoetyli- l^ r- pyrazol- 3- yl) aminol- kinazolin- 7-vlloksv) propvllpvrrolidin- 2- vllmetvldihydrogenfosfat

En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 1, men ved å starte med å\{ tert-butyl) {(25)-1 -[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl} -l#-pyrazol-3-yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl]pyrrolidin-2-yl}metylfosfat (654 mg, 0,92 mmol) ga forbindelse 37 i tabell 3 (596 mg, 97 % utbytte) som en gråhvitt dihydrokloridsalt: 'H-NMR (DMSO d6): 11,95 (s, 1H), 10,73 (s, 1H), 8,94 (s, 1H), 8,82 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,46 (d, 1H), 7,38 (m, 3H), 6,90 (m, 1H), 6,74 (s, 1H), 4,32 (t, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,85 (s, 2H), 3,78 (m, 1H), 3,64 (m, 2H), 3,29 (m, 1H), 3,19 (q, 1H), 2,31 (m, 3H), 2,20 (m, 1H), 2,00 (m, 3H), 1,81 (m, 1H):

MS (+ve ESI): 599,8 (M+H)<+>.

di(tert-butyl) {(25)-1 -[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-l//-pyrazol-3-yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl]pyrrolidin-2-yl}metylfosfat anvendt som utgangsmateriale ble oppnådd som følger :

a) En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 28f, men ved å starte med L-prolinol (0,89 ml, 8,80 mmol) og 2-(3-{[7-(3-klorpropoksy)kinazolin-4-yl]amino}-l//- pyrazol-5-yl)-7V-(3-fluorfenyl)acetamid (1,00 g, 2,20 mmol) ga 7V-(3-fluorfenyl)-2-{3-[(7-{3- [(25)-2-(hydroksymetyl)pyrrolidin-1 -yl]propoksy} -kinazolin-4-yl)amino] - li/-pyrazol-5-yl} acetamid som et kremfarget, fast stoff (795 mg, 70 % utbytte): 'H-NMR (DMSO de): 12,35 (m, 1H), 10,42 (s, 1H), 10,19 (m, 1H), 8,50 (s, 2H), 7,63 (d, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,16 (m, 2H), 6,90 (t, 1H), 6,73 (m, 1H), 4,28 (t, 1H), 4,18 (t, 2H), 3,73 (s, 2H), 3,40 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 3,07 (m, 1H), 2,97 (m, 1H), 2,43 (m, 2H), 2,15 (q, 1H), 1,94 (m, 2H), 1,81 (m, 1H), 1,64 (m, 2H), 1,55 (m, 1H):

MS (+ve ESI): 520,1 (M+H)<+>.

b) En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 6c, men ved å starte med N-( 3-fluorfenyl)-2- {3- [(7- {3-[(25)-2-(hydroksymetyl)pyrrolidin-1 -yl]propoksy} -kinazolin-4-yl)amino]-l//-pyrazol-5-yl}acetamid (730 mg, 1,41 mmol) ga di(tert-butyl) {(25)-l-[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl]pyrrolidin-2-yl}metylfosfat (654 mg, 65 % utbytte) som et blekgult, fast stoff som ble anvendt i neste trinn uten ytterligere karakterisering. 2-(3 - {[7-(3 -klorpropoksy)kinazolin-4-yl] amino} -1 //-pyrazol-5 - yl)- N-( 3 - fluorfenyl)acetamid anvendt som utgangsmateriale ble oppnådd som følger: c) Pentafluorfenyltrifluoracetat (23,25 g, 83 mmol) ble satt dråpevis til en løsning av (3-{[7-(3-klorpropoksy)kinazolin-4-yl]amino}-li/-pyrazol-5-yl)eddiksyre (15,0 g, 41 mmol) og pyridin (6,7 ml, 83 mmol) i dimetylformamid (150 ml) med avkjøling for å opprettholde løsningstemperatursn ved < 23°C. Løsningen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 30 minutter før tilsetning av 3-fluoranilin (9,22 g, 83 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2,5 timer ved omgivelsestemperatur og deretter ble en ytterligere porsjon av 3-fluoranilin (2 ml) tilsatt og blandingen ble oppvarmet ved 90°C i 3 timer. Reaksjonsblandingen ble hellet i fortynnet saltsyre (0,1 M) og is (ca. 500 ml) og det resulterende faste stoffet ble filtrert, vasket med vann og deretter dietyleter og deretter tørket, hvilket gir 2-(3-{[7-(3-klorpropoksy)kinazolin-4-yl]amino}-l//-pyrazol-5-yl)-A'-(3-fluorfenyl)acetamid (17,7 g, 94% utbytte) som et brunt, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 12,50 (br s, 1H), 10,42 (s, 1H), 8,59 (s, 1H), 8,54 (d, 1H), 7,62 (m, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,24 (m, 1H), 7,19 (m, 1H), 6,90 (m, 1H), 6,67 (br s, 1H), 4,28 (t, 2H), 3,84 (t, 2H), 3,76 (s, 2H), 2,27 (kvintett, 2H).

MS (+ve ESI): 455 (M+H)<+>.

Referanseeksempel 5 - Fremstilling av Forbindelse 5 i tabell 2 - 2-[[ 3-({ 4-[( 5-{ 2-[( 3-flttorfenvl) aminol- 2- oksoetvli- lJg- pyrazol- 3- vl) aminol- kinazolin- 7-vlj oksy) propvll ( etvl) aminol etyldihydrogenfosfat

En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 1, men ved å starte med åi( tert-butyl) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-l//-pyrazol-3-yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl](etyl)amino]etylfosfat (539 mg, 0,77 mmol) ga forbindelse 39 i tabell 3 (504 mg, 99 % utbytte) som et blekgult dihydrokloridsalt: 'H-NMR (DMSO de): 11,98 (s, 1H), 10,79 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,83 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,47 (d, 1H), 7,38 (m, 3H), 6,89 (t, 1H), 6,74 (s, 1H), 4,32 (t, 2H), 4,28 (m, 2H), 3,85 (s, 2H), 3,42 (m, 2H), 3,34 (m, 2H), 3,27 (q, 2H), 2,29 (m, 2H), 1,28 (t, 3H): MS (+ve ESI): 587,8 (M+H)<+>. di(ter^butyl)2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-l//-pyrazol-3-yl)amino kinazolin-7-yl}oksy)propyl](etyl)amino]etylfosfat anvendt som utgangsmateriale ble oppnådd som følger: a) En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 37a, men ved å starte med N-(etylamino)etanol (1,07 ml, 11,0 mmol) ga7V-(3-fluorfenyl)-2-{3-[(7-{3-[etyl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy}-kinazolin-4-yl)amino]-l//-pyrazol-5-yl}acetamid som et gult, fast stoff (660 mg, 59 % utbytte): 'H-NMR (DMSO d6): 12,31 (m, 1H), 10,39 (s, 1H), 10,15 (m, 1H), 8,51 (s, 2H), 7,62 (d, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,16 (m, 2H), 6,90 (t, 1H), 6,78 (m, 1H), 4,29 (m, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,76 (s, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,30 (m, 4H), 2,61 (t, 2H), 1,89 (t, 2H), 0,95 (t, 3H):

MS (+ve ESI): 508,4 (M+H)<+>.

b) En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 6c, men ved å starte med N-( 3-fluorfenyl)-2-{3-[(7-{3-[etyl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy} -kinazolin-4-yl)amino]-li/-

pyrazol-5-yl}acetamid (620 mg, 1,22 mmol) ga di(tert-butyl) 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorfenyl)amino]-2-oksoetyl}-li/-pyrazol-3-yl)amino]-kinazolin-7-yl}oksy)propyl](etyl)amino]etylfosfat (539 mg, 63 % utbytte) som et blekgult, fast stoff som ble anvendt i neste trinn uten ytterligere karakterisering.

Forbindelse 39, syntetisert ovenfor som dihydrokloridsalt, kunne også fremstilles som den frie basen i henhold til følgende metode: c) En analog reaksjon som den beskrevet i eksempel 6d, men ved å starte med Forbindelse 39 ga den frie basen av forbindelse 39 som et blekgult, fast stoff: 'H-NMR (DMSO de): 10,53 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,54 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,37 (m, 2H), 7,27 (s, 1H), 7,21 (d, 1H), 6,88 (m, 1H), 6,65 (s, 1H), 4,27 (t, 2H), 4,05 (m, 2H), 3,75 (s, 2H), 3,24 (m, 2H), 3,21 (t, 2H), 3,13 (q, 2H), 2,18 (m, 2H), 1,24 (t, 3H) :

MS (+ve ESI): 588 (M+H)<+>.

C26H31FN7O6P + 3,0 H20 krever C, 48,7%; H, 5,8%; N, 15,3%; Funnet C, 48,8%; H, 5,35%; N, 15,15%.

Claims (2)

1. 7V-(3-fluorfenyl)-2- {3-[(7- {3-[etyl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy} -kinazolin-4-yl)amino]-l//-pyrazol-5-yl}acetamid; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1 som er 7V-(3-iTuorfenyl)-2-{3-[(7-{3-[etyl(2-hydroksyetyl)amino]propoksy}-kinazolin-4-yl)amino]-l//-pyrazol-5-yl}acetamid.