NO334975B1 - Materiale omfattende hul glukan- eller celleveggpartikkel, og anvendelse og fremgangsmåte for fremstilling av samme - Google Patents

Abstract

Det beskrives materialer som omfatter en hul glukanpartikkel eller celleveggpartikkel som innkapsler en terpenkomponent, samt fremgangsmåter for deres fremstilling og anvendelser. Materialene er egnet for å hindre og behandle infeksjoner i planter og i dyr, inkluderende mennesker.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører materialer omfattende terpener og hule glukanpartikler eller celleveggpartikler og framgangsmåter for å framstille slike materialer. Materialene øker terpenstabilitet og -aktivitet og tilveiebringer en egnet bærer for terpenene. Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av et slikt materiale for å hindre infeksjon.

Terpenet er kjemiske forbindelser som er utbredt i naturen, hovedsakelig i planter som bestanddeler i essensielle oljer. Deres byggingsblokk er hydrokarbonisoprenen (C5H8)n. Eksempler på terpener inkluderer citral, pinen, nerol, b-ionon, geraniol, carvakrol, eugenol, carvon, terpeniol, anetol, kamfor, mentol, limonen, nerolidol, farnesol, pytol, karoten (vitamin Ai), squalen, tymol, tocotrienol, perillyl alkohol, borneol, myrcen, simen, caren, terpenen og linalool.

Terpener klassifiseres som "Generally Recognized as Safe" (GRAS) og har blitt anvendt i mange år i smakstilsettings- og aromaindustri. LD50i rotter av citral er ca. 5g/kg, som er en ytterligere indikasjon på den relative sikkerhet for disse forbindelser. Videre, terpener har et relativt kort livsforløp på ca. 28 dager straks det eksponeres til oksygen (for eksempel luft). Terpener vil dekomponere til CO2og vann. Denne dekomponering eller nedbryting av terpener viser sikkerhets- og miljømessige vennlighet av materialene og framgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Terpener har blitt funnet å inhibere vekst av cancerceller, redusere tumorstørrelse, redusere kolesterolnivået og har en biocidal effekt på mikroorganismer in vitro. Owawunmi, (Letters in Applied Microbiology, 1993, 9(3): 105-108), viste at vekst-media med mer enn 0,01% citral reduserte konsentrasjonen av E. coli, og at ved 0,08% var der en bakteriecidal effekt. U.S. Patent 5,673,468 beskriver en terpenformulering, basert på furuolje, anvendt som en disinfektant eller et antiseptisk rensemiddel. U.S. Patent 5,849,956 beskriver at en terpen funnet i ris har antifungal aktivitet. U.S. Patent 5,939,050 beskriver et oralt antimikrobielt hygieneprodukt med en kombinasjon av 2 eller 3 terpener som viste en synergistisk effekt. Flere U.S.-patenter (U.S. Patent 5,547,677, 5,549,901, 5,618,840, 5,629,021, 5,662,957, 5,700,679, 5,730,989) beskriver at visse typer olje-i-vann emulsjoner har antimikrobielle, adjuvans- og avgivelsesegenskaper. Terpenene har blitt funnet å være effektive og ikke-toksiske antitumordiettmidler, som virker gjennom en rekke virkningsmekanismer (Crowell et al. Crit. Rev. Oncog., 1994, 5(1): 1-22; Crowell et al. Adv. Exp. Med. Biol., 1996, 401: 131-136). Terpenene geraniol, tocotrienol, perillyl alkohol, b-ionon og d-limonen undertrykker hepatisk HMG-CoA reduktase-aktivitet, et hastighetsbegrensende trinn i syntese av kolesterol, og senker moderat kolesterolnivåene i dyr. (Elson et al, J. Nutr., 1994, 124: 607-614). D-limonen og geraniol reduserer brysttumorer (Elegbede et al. Carcinogenesis, 1984, 5(5): 661-664; Elegbede et al., J. Nati. Cancer Inst., 1986, 76(2): 323-325; Karlson et al. Anticancer Drugs, 1996, 7(4): 422-429) og undertrykker veksten av transplanterte tumorer (Yu et al., J. Agri. Food Chem., 1995, 43: 2144-2147).

Terpener har også blitt funnet å inhibere in wfro-vekst av bakterier og fungi (Chaumont et al.), Ann. Pharm. Fr., 1992, 50(3): 156-166; Moleyar et al., Int. J. Food Microbiol, 1992, 16(4): 337-342; and Pattnaik et al. Microbios, 1997, 89(358): 39-46) og noen indre og ytre parasitter (Hooser et al., J. Am. Vet. Med. Assoc, 1986, 189(8): 905-908). Geraniol ble funnet å inhibere vekst av Candida albicans og Saccharomyces cerevisiae ved å forsterke hastigheten av kaliumlekkasje og ødelegge membranfluiditet (Bard et al., Lipids, 1998, 23(6): 534-538). B-ionon har antifungal aktivitet som ble bestemt ved inhibering av sporegerminering, og vekstinhibering i agar (Mikhlin et al., A. Prikl. Biokhim. Mikrobiol, 1983, 19: 795-803; Salt et al., Adam. Physiol. Molec. Plant Path, 1986, 28: 287-297). Teprenon (geranylgeranylaceton) har en antibakteriell effekt på H. Pylon (Ishii, Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis., 1993, 280(1-2): 239-243). Rosanol, et kommersielt produkt med 1% roseolje har blitt vist å inhibere veksten av flere bakterier ( Pseudomonas, Staphylococus, E. coli, og H. pylori). Geraniol er den aktive komponent (75%) i roseolje. Roseolje og geraniol ved en konsentrasjon på 2 mg/l inhiberte veksten av H. pylori in vitro. Noen ekstrakter av urtemedisiner har blitt vist å ha en inhibitorisk effekt i H. pylori, og det mest effektive er decursinol angelat, decursin, magnolol, berberin, cinnamisk syre, decursinol og gallisk syre (Bae et al., Biol. Pharm. Bull., 1998, 21(9) 990-992). Ekstrakter f ra cashew epler, anacardisk syre og (E)-2-hexenal har vist baktericidale effekter mot H. pylori.

Diterpener, dvs. trikorabdal A (fra R. Trichocarpa), har vist en svært sterk antibakteriell effekt mot H. pylori (Kadota et al., Zentralbl. Bakteriol, 1997, 287(1): 63-67).

Løsninger av 11 forskjellige terpener var effektive i å inhibere veksten av patogene bakterier i in vitro tester; hvor nivåer i området mellom 100 ppm og 1000 ppm var effektive. Terpenene ble fortynnet i vann med 1% polysorbat 20 (Kim et al., J. Agric. Food Chem., 1995, 43: 2839-2845).

Der kan være forskjellige virkningsmodus av terpener mot mikroorganismer; de kan (1) interferere med fosfolipidbisjiktet i cellemembranen, (2) svekke en rekke enzym-systemer (HMG-reduktase), og (3) ødelegge eller inaktivere genetisk materiale. Det antas at på grunn av at virkningsmodi for terpenene er så basiske, for eksempel ved å blokkere kolesterol, at infeksiøse midler ikke vil være i stand til å bygge en resistens mot terpenet.

Der finnes imidlertid et antall ulemper ved anvendelse av terpener. Disse inkluderer: - Terpener er væsker som kan gjøre dem vanskelige å behandle og uegnet for visse formål. - Terpener er ikke svært blandbare med vann, og krever generelt anvendelse av detergenter, surfaktanter eller andre emulsifiserende midler for å framstille vandige emulsjoner. En stabil løsning kan, imidlertid oppnås ved blanding av terpenene under høye skjærkrefter. - Tørrpulver terpenformuleringer inneholder generelt en lav prosentandel vekt/vekt av terpener. - Terpener er utsatt for oksidering i vandige emulsjonssystemer, noe som gjør langtidslagring til et problem.

Der er begrensninger med gjeldende teknikker for spraybelegging, ekstrusjon, koaservasjon, molekylinnkapsling og spraytørking/avkjøling for å tilveiebringe ingredientavgivelsessystemer.

Bakers gjærcellevegger er avledet fra bakers gjærceller og er sammensatt av de uløselige biopolymerer (3-1,3-glukan, (3-1,6-glukan, mannan og kitin. De er typisk 2-4 mikrometer i diameter mikrosfærer med en skallvegg som er 0,2-0,3 mikrometer tykk som omgir et åpent hulrom. Dette materialet har betydelig væske-tilbakeholdelses-kapasitet, absorberer typisk 5-25 ganger dets vekt i væske. Skallene er tilstrekkelig porøse til at lastinger opp til 150.000 Dalton i størrelse kan passere det ytre skall og absorberes inn i det hule hulrom av den sfæriske partikkel. Bakers gjærcellevegger har flere unike egenskaper, inkluderende varmestabilitet, (foreksempel til 121 °C), skjærstabilitet, pH-stabilitet (foreksempel pH 2-12), og med høye konsentrasjoner bygger de ikke signifikant viskositet. I tillegg til dets fysiske egenskaper inneholder dette materiale naturlige og friske diettfibre som bidrar med kardiovaskulære og immunopotensiale helseeffekter.

Gjærcellevegger framstilles fra gjærceller ved ekstrahering og rensing av den uløselige partikkulatfraksjon fra de løselige komponenter i gjærcellen. De fungale cellevegger kan produseres fra uløselige biprodukt av gjærekstraktframstilling. Videre, gjærcellene kan behandles med en vandig hydroksydløsning, uten å ødelegge gjærcelleveggene, som oppkutter proteinet og intracellulær del av cellen, og forlater gjærcelleveggkomponenten fri for signifikant proteinkontaminering, og som har en i hovedsak uforandret celleveggstruktur av (3(1-6) og P(1-3) koblete glukaner. En mer detaljert beskrivelse av hule glukanpartikler og framgangsmåten for framstilling av disse er beskrevet av Jamas et al. in U.S. Pat. No. 4,810,646 og i co-søknader U.S. nr. 166,929, U.S. nr. 297,752 og U.S. nr. 297,982. US Patent 6,242,594, overført til Novogen Research Pty Ltd., beskriver en framgangsmåte for å framstille gjærglukanpartikler med alkalisk ekstrahering, syreekstrahering og deretter ekstrahering med et organisk oppløsningsmiddel og til slutt tørking. U.S. 5,401,727, overført til AS Biotech-Mackzymal, beskriver framgangsmåter for å oppnå gjærglukanpartikler og framgangsmåter for å anvende disse for å fremme resistens i vandige dyr og som en adjuvans for vaksinering. US 5,607,677 overført til Alpha-Beta Technology Inc., beskriver anvendelse av hule, hele glukanpartikler som en avgivelsespakke og adjuvans for avgivelser av en rekke farmasøytiske midler. Europeisk patentsøknad nr. EP 0 242 135A beskriver en fremgangsmåte for å innkapsle materialer, så som essensielle oljer som anvendes i smaksmidler og luktmidler, feromoner etc. hvor en intakt mikrobe inkuberes med et materiale som resulterer i innkapsling. EP 0 242 135A beskriver ikke anvendelse av ikke-intakte mikrober ved innkapslingen.

Internasjonal patentsøknad WO 96/36433 beskriver innkapsling av essensielle oljer i intakte cellevegger av Saccharomyces cerevisiae. Det fremgår av beskrivelsen i WO 96/36433 at mikroben må være intakt.

UK patentsøknad GB 2162147 beskriver et innkapslet produkt inneholdene en mikrobiell kapsel med en betydelig mengde av en organisk syre. Produktet frem-stilles ved å behandle en intakt mikrobe med den organiske væske.

Internasjonal patentsøknad WO 03/020024 beskriver behandling og hindring av infeksjoner i planter med en sammensetning omfattende et terpen eller en terpen-liposomsammesetning. WO 03/020024 beskriver ikke anvendelse av glukanpartikler eller celleveggpartikler.

Internasjonal patentsøknad WO 00/49865 beskriver sammensetninger omfattende minst et ionon og en terpen, en surfaktant, en alkohol og vann. Sammensetningene som er beskrevet er ikke innkapslet.

Internasjonal patentsøknad WO 03/070286 beskriver sammensetninger for å forbedre luftkvalitet, desinfisering av overflater og å hindre respiratorisk infeksjon ved å applisere en trykksatt eller skummende løsning inneholdende et terpen. WO 03/070286 omtaler ikke hule glukanpartikler.

Internasjonal patentsøknad WO 03/069993 beskriver terapeutiske antimikrobielle sammensetninger for behandling av indre infeksjoner for avgivelse ved intramuskulær eller intravenøs injeksjon. WO 03/069993 beskriver også kombinasjons-terapier omfattende et terapeutisk antimikrobielt middel med en analgetisk eller anestetisk forbindelse, så som procain eller lidocain. WO 03/069993 beskriver ikke innkapsling av slike sammensetninger i mikrober.

Andre typer gjær- og fungiceller har cellevegger som ikke inneholder glukan. Celle-veggene av slike gjær og fungi kan isoleres med tilsvarende teknikker til de som er nevnt ovenfor for å oppnå celleveggpartikler.

I tillegg, cellene i mange planter, alger, bakterier og andre mikroorganismer omfatter også en cellevegg. Strukturen og materialet av celleveggen varierer mellom mikroorganismer, men er generelt robust og relativt inert struktur. Det er mulig å oppnå celleveggpartikler avledet fra slike celler gjennom tradisjonelle teknikker, så som de som er nevnt ovenfor i forbindelse med gjær.

Vi har nå funnet at terpener kan opptas og stabilt innkapsles innen hule glukanpartikler eller celleveggpartikler. Innkapsling av terpener i slike partikler kan oppnås ved innkubering med terpen.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et materiale omfattende en hul glukanpartikkel eller en celleveggpartikkel som innkapsler en terpenkomponent.

Termen "hul glukanpartikkel" som anvendt heri inkluderer enhver hul partikkel omfattende glukan som en strukturell komponent. Således, spesielt, termen inkluderer gjærcellevegger (i renset eller av rå former) eller hule, hele glukanpartikler. Termen "celleveggpartikkel" refererer til en partikkel som omfatter veggen av en celle (i en renset eller rå form), hvor glukan ikke er en strukturkomponent. Egnete partikler inkluderer cellevegger av planter, alger, fungi eller bakterielle celler. Celleveggpartikler beholder generelt formen av cellen hvorfra de er avledet, og således, som en hul glukanpartikkel, tilveiebringer et hult sentralt hulrom egnet for innkapsling av terpenforbindelser.

For foreliggende oppfinnelse er det nødvendig at den hule glukanpartikkel eller celleveggpartikkel er i stand til stabilt å innkapsle terpenkomponenten. Generelt betyr dette at den hule glukanpartikkel eller celleveggpartikkel må være i stand til å opprettholde dens struktur under innkubering med terpenkomponenten (generelt er terpenkomponenten i en relativ høy konsentrasjon), og at terpenkomponenten må være i stand til å migrere inn i partikkelen. Hule glukanpartikler og celleveggpartikler dannes generelt fra relativt inerte materialer og er porøse, og det kan antas at generelt, hule glukanpartikler og celleveggpartikler vil være i stand til å innkapsle en terpenkomponent.

Materialer i samsvar med foreliggende oppfinnelse er effektive mot forskjellige infeksiøse midler inkluderende bakterier, virus, mykoplasma, fungi og/eller nematoder.

Materialene i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringe de følgende fordeler: - maksimere terpen nyttelast; - minimere ikke-innkapslet nyttelast; - regulere stabilitet av nyttelast; - regulere frigivelseskinetikk for nyttelast; - etablering av en faststofform av et væskeformet terpen for å øke massen og uniformiteten;

- forenkle behandling og applikasjon av terpener; og

- maskere lukt og smak av terpenet

Spesielt egnete hule glukanpartikler eller celleveggpartikler er fungale cellevegger, fortrinnsvis gjærcellevegger. Gjærcellevegger er preparater av gjærceller som opp-rettholder den tredimensjonale struktur av gjærcellen hvorfra de er avledet. Således har de en hul struktur som muliggjør terpenkomponenten til å kunne innkapsles innen gjærcelleveggene. Gjærcelleveggene kan hensiktsmessig være avledet fra Bakers gjærceller (tilgjengelig fra Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO). Gjærcelleveggpartikler med egnete egenskaper kan også oppnås fra Biorigin (Sao Paolo, Brazil) under varemerkenavnet Nutricell MOS 55. Disse partikler er et spraytørket ekstrakt av S. cerevisiae.

Alternative partikler er de som er kjent under varemerkenavnet SAF-Mannan (SAF Agri, Minneapolis, MN) og Nutrex (Sensient Technologies, Milwaukee, Wl). Disse er hule glukanpartikler som er den uløselige avfallsstrøm fra gjærekstraktframstillings-prosessen. Under produksjon av gjærekstrakter fjernes de løselige komponenter av delvis autolyserte gjærceller og fjernes, og den uløselige rest er et egnet materiale for terpenlasting. Disse hule glukanpartikler omfatter ca. 25-35% beta 1,3-glukan vekt/vekt. En nøkkelegenskap med disse materialene er at de inneholder mer enn 10% lipid vekt/vekt og er svært effektive i å absorbere terpener. I tillegg, siden de er et avfallsstrømsprodukt er de en relativt billig kilde av hule glukanpartikler.

Alternative hule glukanpartikler som har høyere renhet er de som produseres av Nutricepts (Nutricepts Inc., Burnsville, MN) og ASA Biotech. Disse partikler har blitt alkaliekstrahert, som fjerner ytterligere intracellulære komponenter og likeledes fjerner det ytre mannoproteinsjikt av celleveggen som gir en partikkel med 50-65% glukan vekt/vekt.

Hule glukanpartikler av høyere renhet er WGP-partiklene fra Biopolymer Engineering. Disse partikler er syre-ekstrahert og har fjernet ytterligere gjærkomponenter som gir et produkt 75-85% glukan vekt/vekt.

Hule glukanpartikler med svært høy renhet er Adjuvax™ fra Alpha-beta Technology, Inc. (Worcester, MA) og mikropartikulat glukan fra Novogen (Stamford, CT). Disse partikler er organisk oppløsningsmiddelekstrahert som fjerner restlipider og slik at partiklene omfatter mer enn 90% glukan vekt/vekt.

I noen utførelser kan det være nødvendig med en glukanpartikkel eller celleveggpartikkel av høy renhet, for eksempel hvor streng kontroll over mulig kontaminerende midler er nødvendig. I disse tilfeller vil partiklene med høyere renhet være foretrukket over de med lavere renhet. For andre utførelser kan mindre rene partikler være hensiktsmessig av økonomiske grunner, og disse partikler er også blitt funnet å være mer effektive i å absorbere terpenet.

Fortrinnsvis har de hule glukanpartikler eller celleveggpartikler et lite lipidinnhold, så som 1 eller 2% vekt/vekt lipid. Et lite lipidinnhold kan øke evnen til partikkelen til å innkapsle terpenkomponenten. Fortrinnsvis er lipidinnholdet av den hule glukanpartikkel eller celleveggpartikkel 5% vekt/vekt eller mer, mer fortrinnsvis 10 % vekt/vekt eller mer.

Valgfritt kan terpenkomponenten ifølge foreliggende oppfinnelse være assosiert med en surfaktant. Surfaktanten kan være ikke-ionisk, kationisk eller anionisk. Eksempler på egnete surfaktanter inkluderer natriumlaurylsulfat, polysorbat 20, polysorbat 80, polysorbat 40, polysorbat 60, polyglyceryl ester, polyglyceryl monooleat, decagily-ceryl monocaprylat, propylenglycol dicaprilat, triglycerol monostearat, polyoksyetylensorbitan, monooleat, Tween ®, Span ® 20, Span® 40, Span ® 60, Span ® 80, Brig 30 eller blandinger derav. Surfaktanten bevirker at terpenkomponenten holdes i en emulsjon og assisterer også innkapslingen av terpenkomponenten inn i den hule glukanpartikkel eller celleveggpartikkel.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører i et første aspekt et materiale kjennetegnet ved at det omfatter en hul glukanpartikkel eller hul celleveggpartikkel som innkapsler en terpenkomponent, hvor lipidinnholdet av nevnte hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel er 5 % vekt/vekt eller mer.

Foretrukne utførelser av dette aspekt er angitt i underkravene 2-43.

Terpenkomponenten kan omfatte ett enkelt terpen eller blanding av terpener. Blandinger av terpener kan resultere i synergistiske effekter.

Termen "terpen" som anvendt heri referer ikke kun til terpenet av formel (CsHsK men også omfatter også terpenderivater, så som terpen aldehyder eller terpen poly-merer. Naturlige og syntetiske terpener er inkludert, for eksempel monoterpener, sesquiterpener, diterpener, triterpener og tetraterpener. I tillegg, referanse til et enkelt navn av en forbindelse vil omfatte de forskjellige isomerer av denne forbindelse. For eksempel, termen citral inkluderer cis-isomer citral-a (eller geranial) av trans-isomer citral-b (eller neral).

Det skal bemerkes at terpenet også er kjent som navnet på ekstraktene eller essensielle oljer som inneholder disse, for eksempel sitrongressolje (inneholder citral).

Terpenene som er fritatt fra US-reguleringer og som er listet i EPA-regulering 40 CF.R., del 152 (inkorporert heri med referanse i sin helhet) er egnet for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Spesielt egnede terpener inkluderer de som er valgt blant gruppen omfattende citral, pinen, nerol, b-ionon, geraniol, carvakrol, eugenol, carvon (for eksempel L-carvon), terpeniol, anetol, kamfor, mentol, tymol, limonen, nerolidol, farnesol, pytol, karoten (vitamin Ai), squalen, tymol, tocotrienol, perillyl alkohol, borneol, myrcen, simene, caren, terpenene, linalool og blandinger derav.

Fortrinnsvis har terpenene den generelle struktur C10H16idet denne undergruppe er generelt mer effektiv mot infeksiøse midler.

Mer fortrinnsvis omfatter terpenkomponenten et terpen valgt blant gruppen omfattende geraniol, tymol, citral, carvon (for eksempel L-carvon), eugenol og b-ionon.

Terpenkomponenten kan hensiktsmessig omfatte tymol, idet dette terpen har blitt vist å være spesielt effektiv i å behandle eller hindre fungale planteinfeksjoner.

Et annen spesielt egnet terpen er citral som har vært vist å være spesielt effektiv mot et antall mikroorganismer.

En kombinasjon av geraniol, tymol og eugenol har vist seg å være spesielt effektiv i å bekjempe planteinfeksjoner, og er således en spesielt egnet terpenkomponent. Andre terpenformuleringer som har vist høy effektivitet i å behandle planteinfeksjoner inkluderer (prosentandeler er vekt/vekt): -100% tymol;

- 50% geraniol og 50% tymol

- 50% eugenol og 50% tymol; - 33% geraniol, 33% eugenol og 33% tymol; - 33% eugenol, 33%tymol og 33% citral; - 25% geraniol, 25% eugenol, 25% tymol og 25% citral;

- 20% geraniol, 20% eugenol, 20% citral, 20% tymol og 20% L-carvon.

Således, en terpenkomponent omfattende enhver av de ovennevnte formuleringer er spesielt egnet.

I én utførelse omfatter terpenkomponenten én eller flere terpener som inneholder oksygen. Citral, for eksempel citral 95, er en oksygenert C10H16 terpen, C10H16O CAS nr. 5392-40-5 (3,7-dimetyl-2,6-octadien-1-al). En stabil suspensjon av citral kan formes med opptil ca. 2500 ppm. Citral kan framstilles i en løsning opptil ca. 500 ppm. En stabil suspensjon av hule glukanpartikler som inkorporerer citral på 25 ppt citral kan framstilles.

Materialet ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte 1-99 vol% terpener, 0-99 vol% surfaktant og 1-99 vol% glukanpartikler eller celleveggpartikler. Nærmere bestemt, kan materialene omfatte ca. 10% til ca. 67% vekt/vekt terpener, ca. 0,1-10% surfaktant og ca. 40-90% hule glukanpartikler eller celleveggpartikler.

Hensiktsmessig omfatter et materiale ifølge foreliggende oppfinnelse fra ca. 500 til ca. 10.000 ppm hule glukanpartikler eller celleveggpartikler, hvor partiklene inneholder fra ca. 1 til ca. 67% terpenkomponent. Fortrinnsvis omfatter materialet fra ca. 1000 til ca. 2000 ppm hule glukanpartikler eller celleveggpartikler, og hvor partiklene inneholder fra ca. 10 til ca. 50% terpenkomponenter.

Spesifikke materialer kan inkludere for eksempel for bakterier og fungi, hule glukanpartikler eller celleveggpartikler som omkapsler terpen i vann, eller standard 0,9% saltløsning med opp til 67% L-carvon, opp til 67% eugenol, opp til 67% citral, opp til 67% tymol og L-carvon, opp til 67% geraniol, eller opp til 67% citral og L-carvon og eugenol, og 1% Tween® 80; for mugg, hule glukanpartikler eller celleveggpartikler som omkapsler terpenet i vann eller standard 0,9% saltløsning med opp til 67% citral og 1% Tween® 80; eller for mykoplasma, hule glukanpartikler eller celleveggpartikler som omslutter terpenet i vann eller standard 0,9% saltløsning med opp til 67% citral, opp til 67% L-carvon og eugenol, opp til 67% eugenol, opp til 67% geraniol, eller opp til 67% geraniol, tymol, og 1% Tween® 80.

Konsentrasjoner av hule glukanpartikler eller celleveggpartikler som omslutter terpener på 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 130, 140,150,

160, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1250, 1375, 1425, 1500, 1600, 1750, eller 2000 ppm kan anvendes som effektive konsentrasjoner i materiale og framgangsmåtene ifølge foreliggende

oppfinnelse. Enda høyere konsentrasjoner (opp til 25 ppt, dvs. deler per tusen) kan framstilles og være nyttig i gjeldende oppfinnelse.

Materialene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte mellom ca. 1 ppm og ca. 25 ppt (25.000 ppm) av terpenkomponenten, fortrinnsvis 100 til 2000 ppm av terpenkomponenten, for eksempel 250, 500, 1000, 2000 ppm derav.

Terpenene, surfaktantene og andre komponenter ifølge oppfinnelsen kan hensiktsmessig innkjøpes eller syntetisere ved anvendelse av teknikker generelt kjent for syntesekjemikere.

Det er sterkt foretrukket at terpener anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse, av sikkerhets- og regulatoriske grunner, er minst næringsgraderte terpener (som definert av US FDA eller lignende nasjonal regulatorisk enhet i andre land enn USA). Valgfritt kan materiale omfatte andre næringsgraderte aktive forbindelser i tillegg til terpenkomponenten, for eksempel andre antimikrobielle midler, enzymer eller lignende.

Valgfritt kan materialet omfatte ytterligere aktive midler i tillegg til terpenkomponenten, for eksempel et antimikrobielt middel, et anti-fungalt middel eller insektmiddel, et anti-inflammatorisk middel, et anestetisk middel eller lignende. Egnete midler inkluderer: - Antifungale: Cellevegghydrolyaser (anta at de ikke degraderer den hule glukanpartikkel eller celleveggpartikkel), celleveggsyntese inhibitorer, standard antifungale midler. - Antibakterielle: Antiseptiske, cellevegghydrolaser, syntese inhibitorer, antibiotika.

- Insektmidler: Naturlige insektmidler, kitinase.

Materialet kan omfatte en antioksidant for å redusere oksidering av terpenet. Et eksempel på en slik antioksidant kan være rosmarinolje, vitamin C eller vitamin E.

Materialet ifølge foreliggende oppfinnelse kan være i form av et tørrpulver. Materialet kan tilveiebringes i kombinasjon med en akseptabel bærer for landbruks-applikasjoner, nærings- og farmasøytiske applikasjoner, eller eksipient i en væske, faststoff eller gel-lignende form.

For faststoffmaterialer inkluderer egnete bærere farmasøytiske graderinger av mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talg, cellulose, glukose, sukrose, magnesiumkarbonat og lignende. Hensiktsmessig er formuleringen i tablett- eller pelletform. En egnet bærer kan også være et nærings-materiale for menneske eller dyr. Videre, kommersielle landbruksbærere kan også anvendes.

En pellet, tablett eller annen faststofform av materialet kan fortrinnsvis også inneholde et dispergerende middel som fremmer dispergering av materialet idet det plasseres i en væske, for eksempel vann. Hensiktsmessige dispergerende midler inkluderer xantangummi, maltodekstrin, alginater eller lignende.

Væskeformige materialer kan, for eksempel, framstilles ved å dispergere materialet i vann, saltløsning, vandig dekstrose, glyserol, etanol eller lignende, for å danne en løsning eller suspensjon. Dersom ønskelig kan disse materialer inneholde mindre mengder av ikke-toksiske hjelpesubstanser så som fuktmidler eller emulgerende midler, pH-buffringsmidler (for eksempel natriumacetat, sorbitan monolaurat, tri-etanolaminnatriumacetat eller trietanolaminoleat). Framgangsmåter for framstilling av slike væskematerialer er kjente, eller vil være åpenbare for fagkyndige innen feltet, se for eksempel Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Lippincott, Williams & Wilkins; (December 15, 2000) - som inkorporeres heri med referanse. Et væskemateriale kan framstilles ved å dispergere materialet i et væskeformig nærings- eller drikkemateriale for mennesker eller dyr. Ytterligere, en egnet væskeformig agrikulturell eksipient kan anvendes.

For oral administrering er tabletter og granuler generelt foretrukket. Tabletter kan inneholde bindemiddel og smøremidler. Finfordelte pulver eller granuler kan inneholde fortynnende, dispergerende og/eller overflateaktive midler og kan presenteres i vann eller i en sirup. Kapsler eller poser kan inneholde materialet i en tørr tilstand. Ikke-vandige løsninger eller suspensjoner av materialet er også egnet og kan inneholde suspenderende midler. Dersom ønskelig eller nødvendig kan smaksmidler, konserverende midler, suspenderende midler, tykningsmidler eller emulsifiserende midler inkluderes. Selvsagt, det vil være hensiktsmessig for anvendelse som et nærings- eller drikkemateriale med en oral avgivelsesmetode.

Parenteral administrering er genereltkarakterisert vedinjeksjon. For injiserbare midler vil det være hensiktsmessig at, generelt, alle materialer anvendt i materialet og eksipienter som benyttes må være av farmasøytisk gradering. Injiserbare midler kan framstilles i konvensjonelle former, enten som væskeløsninger, emulsjoner eller suspensjoner, faststofformer egnet for oppløsning, suspensjon i væske før injeksjon, eller som emulsjoner. En alternativ løsning for parenteral administrering involverer anvendelse av en langsom frigivelse av forlenget frigivelsessystem, slik at et konstant nivå av dosering opprettholdes. Se for eksempel US Patent 3,710,795, som inkorporeres heri med henvisning. Preparater for parenteral bruk kan også inneholde buffere, fortynningsmidler andre egnete tilsettingsstoffer. Eksempler på ikke-vandige oppløsningsmidler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer (så som olivenolje), og injiserbare organiske estere (så som etyloleat). Vandige bærere inkluderer vann, alkoholisk/vandige løsninger, emulsjoner eller suspensjoner, inkluderende saltløsning og bufret media. Andre parenterale vehikler inkluderer natrium-kloridløsning, Ringers dekstrose, dekstrose av natriumklorid, laktatisert Ringers, eller faste oljer. Vehikler for intravenøs anvendelse inkluderer fluid og næringserstatnings-midler, elektrolytterstatningsmidler (så som de som er basert på Ringers dekstrose), og lignende. Konserveringsmidler og andre tilsettingsmidler kan også foreligge, så som for eksempel antimikrobielle midler, antioksidanter, kelaterende midler, inerte gasser og lignende.

For topikale administreringsvæsker, suspensjoner, lotion, kremer, geler, salver, dråper, stikkpiller, sprayer og pulvere kan anvendes. Konvensjonelle farmasøytiske bærere så som vandige, pulvere eller oljebaserte, tykningsmidler og lignende kan anvendes som nødvendig eller hensiktsmessig.

I et andre aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å fremstille en hul glukanpartikkel eller hul celleveggpartikkel som innkapsler en terpenkomponent som angitt over, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene: a) tilveiebringe en terpenkomponent; b) tilveiebringe en hul glukanpartikkel eller hul celleveggpartikkel; c) inkubere terpenkomponenten med nevnte glukanpartikkel eller hule

celleveggpartikkel under egnete betingelser for terpeninnkapsling og

d) å gjenvinne glukanpartikkelen eller den hule celleveggpartikkel som innkapsler terpenkomponenten.

Foretrukne utførelser av dette aspekt er angitt i underkravene 45-69.

Valgfritt kan framgangsmåten over ytterligere omfatte trinnet å tørke partiklene med innkapslet terpenkomponent. Tørke kan oppnås på en rekke måter og skal nevnes frysetørking, fluidisert bed tørking, trommeltørking eller spraytørking, og alle disse er kjente prosesser.

I trinn a) i framgangsmåten over tilveiebringes terpenkomponenten hensiktsmessig som en suspensjon i et vandig oppløsningsmiddel, og valgfritt i nærvær av en surfaktant. Hensiktsmessig er oppløsningsmidlene vann. En egnet surfaktant er Tween-80 (polyoksyetylensorbitanmonooleat), og fortrinnsvis foreligger surfaktanten i en konsentrasjon på ca. 0,1-10 vol% av den totale reaksjonsblanding, og fortrinnsvis ca. 1%. Alternativt kan terpenkomponenten tilveiebringes som en sann løsning i et opp-løsningsmiddel, for eksempel vann. En sann løsning av terpen i vann kan oppnås ved å blande terpenet i vann med en skjærkraft inntil en sann løsning oppnås. Publikasjon WO 03/020024 tilveiebringer ytterligere detaljer for å framstille sanne løsninger av terpenet i vann.

I trinn b) av framgangsmåten over er den hule glukanpartikkelen eller celleveggpartikkelen hensiktsmessig tilveiebrakt som en suspensjon i vann eller annen egnet væske. Hensiktsmessig omfatter suspensjonen ca. 1-1000 mg partikler per ml, fortrinnsvis 200-400 mg/ml. Alternativt kan partiklene tilveiebringes som et tørrpulver og tilsettes til terpen-surfaktantsuspensjonen.

Alternativt tilveiebringes partiklene i tilstrekkelig væske for minimalt å hydrere partiklene, men ikke i signifikant overskudd. Termen "hydrodynamisk volum" (HV) anvendes for å beskrive volumet av væske som er nødvendig for minimalt å hydrere partiklene. Således, hensiktmessig tilveiebringes partiklene med et volum i området fra HV og et volum av 1,5 ganger HV (1,5HV). Dette gjør påfølgende tørketrinn mer effektivt. Videre, der hvor det anvendes et lite volum av væske (dvs. ca. rundt HV til 1,5HV), er det også mulig å ekstrudere det ferdige produkt til pellet eller nudelform, som er hensiktsmessig for fluidisert bed tørking.

Det er blitt funnet at terpenkomponenten kan innkapsles av den hule glukanpartikkel eller celleveggpartikkel ved romtemperatur. Hastigheten på innkapsling økes imidlertid ved 37°C, men temperaturen bør holdes under kokepunktet eller denaturerings-temperaturen for komponenter i materialet. Egnete betingelser for trinn c) i metoden beskrevet ovenfor er derfor atmosfærisk trykk ved en temperatur på 20-37°C. Optimalisering av betingelsene for en bestemt innkapslingsreaksjon vil være av rutinemessig eksperimentering.

I et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen et materiale som angitt over for anvendelse i å hindre eller behandle en infeksjon i en pasient eller en plante.

I et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen en anvendelse av et materiale som angitt over for fremstilling av et medikament for behandling av en infeksjon i en pasient. I en utførelse er infeksjonen forårsaket av Aspergillius fumigatus, Sclerotinta homeocarpa, Rhizoctonia solani, Colletotricum graminicola eller Penicillium sp.

Egnete materialer er de som er definert i mer detalj over.

For indre administrering kan materialet administreres oralt, vaginalt, rektalt, ved inhalering eller ved parenterale ruter, for eksempel ved intradermal, subkutanøs, intramuskulær, intraperitoneal, intrarektal, intraarteriell, intralymfatisk, intravenøs, intratekal og intratrakeale ruter. Egnete formuleringer av materialene for disse ruter er beskrevet over.

For ytre behandling kan materialet appliseres topikalt, for eksempel som en krem eller salve eller som et tørrpulver for behandling av et sår.

Mengden av terpen administrert i framgangsmåten ovenfor bør klart være tilstrekkelig til å oppnå det ønskede resultat, dvs. hindring og/eller behandling av infeksjonen, men skal ikke være ved et nivå som vil indusere alvorlige toksiske effekter i pasienten.

Mengden av materiale som administreres vil, selvsagt, være avhengig av administra-sjonsmåten, pasienten som skal behandles, dvs. deres vekt, alder, tilstand, kjønn og grad av sykdom i individet og av vurderingen til legen som skriver ut medikamentet. Dosering, doseringstidsforløp, administrasjonsrute kan varieres. En fagkyndig innen fagfeltet vil enkelt være i stand til å bestemme en anti-infektiøs mengde for en gitt applikasjon basert på den generelle kunnskap innen feltet og prosedyrene i eksemplene som gis nedenfor. Det skal bemerkes at termen "pasient" som anvendt heri refererer til ethvert individ, enten menneske eller dyr, hvortil behandling appliseres. Således, pasient kan være et husdyr (for eksempel katt, hund, etc), husdyr (for eksempel kveg, hest, gris, sau, geit, etc), laboratoriedyr (foreksempel mus, kanin, rotte, marsvin, etc), fugler og fisker. Hensiktsmessig er individet et pattedyr og spesielt et primat, for eksempel et menneske.

I utførelsen for å hindre infeksjon av en plante, omfatter framgangsmåten trinnet:

a) å administrere i en terapeutisk effektiv dosering et materiale som omfatter en hul glukanpartikkel eller celleveggpartikkel som innkapsler en terpenkomponent til

planten eller jorden i nærheten av planten.

Egnete materialer er de som er definert i mer detalj over.

Terpener har blitt vist ved å eliminere et antall plantepatogener (se WO 03/020024) og, som beskrevet i samtidig søknad US 60/538,627 også effektiv dreper nematoder som er signifikante planteparasitter. Terpener alene i suspensjon eller løsning, er imidlertid noe ustabile og degraderes hurtig i jordomgivelser, og mister således effektivitet.

Inkorporering av en terpenkomponent i en hul glukanpartikkel eller celleveggpartikkel kan redusere frigivelsesraten for terpen og degradering, og således øke virknings-varigheten av terpen i jorden.

Hensiktsmessig er infeksjonen av en plante som skal behandles eller hindres i framgangsmåten over infeksjon av nematoder.

Andre planteinfeksjoner som kan behandles eller hindres inkluderer fungale planteinfeksjoner, spesielt de som påvirker overflaten av en plante. Slike infeksjoner inkluderer meldugg, pulverformig meldugg eller botrytis sammenbindingsrot; og disse infeksjoner angriper spesielt druevinstokker.

I én utførelse kan planteinfeksjon være forårsaket av én eller flere av følgende: Aspergillius fumigatus, Sclerotinta homeocarpa, Rhizoctonia solani, Colletotrichum graminicola or Penicillium sp.

En fordel med en terpenbasert behandling av planter er at den kan appliseres kort tid før innhøsting.

Mange konvensjonelle behandlinger krever en forlenget tidsperiode før man kan gå inn i det behandlede område (generelt 3 uker). Dette betyr at et utbrudd av en plantesykdom like før innhøsting ikke kan behandles med konvensjonelle behandlingsmetoder idet det da ikke vil være mulig å innhøste avlingen på den hensiktsmessige tid. Materialene ifølge foreliggende oppfinnelse kan hensiktsmessig appliseres ved enhver tid opp til innhøsting, for eksempel 21 dager før innhøsting, 14 dager før innhøsting, 7 dager før innhøsting eller også 3 dager eller mindre før innhøsting.

Innkapslede terpener har vist spesiell effektivitet ved behandling av dunet meldugg, pulverformig meldugg og botrytis sammenbindingsrot i druer, og således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en framgangsmåte for å behandle eller hindre disse sykdommer.

Prevensjon av planteinfeksjoner kan oppnås ved å behandle plantene med de innkapslede terpener regelmessig som et profylaktisk middel.

Hensiktsmessig appliseres materialene ifølge foreliggende oppfinnelse ved spraying. Dette er spesielt hensiktsmessig for å behandle en plantesykdom som angriper overflaten av en plante. For spraying kan et preparat omfattende 2 g/l av materialene i vann anvendes. Konsentrasjoner av fra 2 til 4 g/l er spesielt effektive, og konsentrasjoner på mer enn 4 g/l kan anvendes dersom nødvendig. Det er selvsagt viktig at konsentrasjonen av materialene som anvendes er tilstrekkelig til å drepe eller inhibere det middel som forårsaker sykdommen, men ikke så høy at planten som behandles skades.

Ved spraying av planter i en hastighet på 500 I/Ha eller mer er hensiktsmessig for å dekke plantene. Fortrinnsvis, en hastighet på 900 I/Ha eller mer, mer fortrinnsvis 1200 I/Ha eller mer anvendes for å sikre god dekning. Idet druevinranker behandles har en hastighet på 1200 I/Ha vist seg å være hensiktsmessig effektivt.

Materialet ifølge oppfinnelsen kan alternativt appliseres via irrigasjon. Dette er spesielt hensiktsmessig for behandling av nematoder eller andre jord-bårne patogener eller parasitter.

Den foreliggende oppfinnelse vil bli ytterligere beskrevet med referanser til de påfølgende ikke-begrensende eksempler og figurer, hvori:

Fig. 1 representerer en lysmikrograf av tomme gjærcellevegger.

Fig. 2 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler L-carvon.

Fig. 3 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler citral.

Fig. 4 representerer en lysmikrograf av terpenemulsjon.

Fig. 5 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger i hydrodynamisk volum (HV) vann. Fig. 6 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler terpen i 5 ganger hydrodynamisk volum (HV) av vann. Fig. 7 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler terpen i HV av vann. Fig. 8 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler terpen i HV pluss 5% vann. Fig. 9 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler terpen i HV pluss 10% vann. Fig. 10 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler terpen i HV pluss 20% vann. Fig. 11 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler terpen i HV pluss 30% vann. Fig. 12 representerer en lysmikrograf av gjærcellevegger som innkapsler terpen i HV pluss 40% vann. Fig. 13 representerer en lysmikrograf som viser dispergering av tørkede hule glukanpartikler som innkapsler en terpen komponent og intet xantangummi. Fig. 14 representerer en lysmikrograf som i fig. 13 hvor 0,07 g av 1% xantangummi er inkludert. Fig. 15 representerer en lysmikrograf som i fig. 13 hvor 0,14 g av 1% xantangummi er inkludert. Fig. 16 representerer en lysmikrograf som i fig. 13 hvor 0,28 g av 1% xantangummi er inkludert. Fig. 17 representerer en lysmikrograf som i fig. 13 hvor 0,55 g av 1% xantangummi er inkludert. Fig. 18 representerer en lysmikrograf som i fig. 13 hvor 1,1 g av 1% xantangummi er inkludert. Fig. 19 representerer en lysmikrograf som i fig. 13 hvor 2,2 g av 1% xantangummi er inkludert. Fig. 20 representerer en lysmikrograf som i fig. 13 hvor 4,4 g av 1 % xantangummi er inkludert. Fig. 21 viser en skjematisk representasjon av behandlingsområder på steder 18 og 20. Fig. 22 viser en skjematisk representasjon av behandlingsområder på steder 18 og 20.

Fig. 23 viser en skjematisk representasjon av behandlingsområder på sted 7.

Fig. 24 viser en graf som viser sammenlikning av innkapslete vs. ikke-innkapslete terpenformuleringer.

De påfølgende eksempler er gitt for videre å muliggjøre for de ordinære fagkyndige innen feltet å framstille eller utføre foreliggende oppfinnelse. De er kun representative og er ikke tiltenkt å begrense rammen av oppfinnelsen. Med mindre annet er angitt, er deler oppgitt som deler pr. volum eller deler pr. vekt, som angitt, temperatur er grader Celsius (°C) eller er som ved omgivelsestemperatur, og trykk er ved eller nær atmosfærisk trykk. Der er en rekke variasjoner og kombinasjoner av materialene og tilstandene for å framstille eller anvende disse, for eksempel komponentkonsen-trasjoner, ønskete oppløsningsmidler, oppløsningsmiddelblandinger, temperaturer, trykk og andre områder og tilstander som kan anvendes for å optimalisere resultatene som oppnådd fra de beskrevne materialer og metoder. Kun rimelig og rutinemessig eksperimentering vil være nødvendig for å optimalisere disse.

Eksempel 1 - Demonstrasjon av terpenlasting i Bakers gjærpartikler og rensete gjærglukanpartikler

Den følgende protokoll ble utført for å vise at terpener vil lastes inn i gjærcellevegger og andre hule glukanpartikler.

Emulsjoner av citral og L-carvon ble framstilt ved å blande 150 ul av terpenet med 100 ul av 10% Tween 80 i vann og 250 ul vann.

Bakers gjærpartikler (YP) eller Levacan™ gjærglukanpartikler (YGP), tilgjengelig fra Savory Systems International, Inc., Branchburg, NJ, ble blandet med vann for å danne en 250 mg/ml suspensjon.

500 ul av YP- eller YGP-suspensjonen og 250 ul av terpenemulsjonen ble blandet sammen og inkubert natten over under konstant agitering. 500 ul YP- eller YGP-suspensjon og 500 ul vann ble anvendt som kontroll. Partiklene ble deretter vasket med vann inntil de var frie fra den eksterne emulsjon. Partikkelpreparatene ble deretter frosset og lyofilisert inntil de var tørre.

Partiklene ble deretter rehydrert og eksaminert under lysmikroskop. Resultatene er vist i figurer 1 til 4.

Fig. 1 viser sfæriske strukturer med et mørkt område i deres senter, disse er tomme, hule glukanpartikler. Fig. 2 og 3 viser sfæriske strukturer med et svellet utseende med en lys farget interiør, og disse er partikler med terpen innkapslet i det sentrale hulrom - citral i fig. 2 og L-carvon i fig. 3. I fig. 2 og 3 kan små dråper av fritt terpen også ses, for eksempel ved toppen av fig. 2, liketil til venstre for senter. Fig. 4 viser terpenemulsjonen som små bobler av terpen suspendert i vann.

Eksempel 2 - Bestemmelse av maksimal citral- og L- carvon- lastingsnivåer i Bakers gjærcelleveggpartikler ( YP)

Den følgende protokoll ble utført for å bestemme maksimal mengde terpener som vil lastes inn i YP. L-carvon- og citral-emulsjoner ble framstilt ved å sonikere 4,5 g terpen med 0,3 ml vann. 10% Tween-80-løsning ble framstilt ved sonikering av 4,5 g Tween-80 i 40,5 ml vann. YP-suspensjon ble framstilt ved å blande YP med vann for å danne 20 mg/ml suspensjon. Innkapslingsreaksjoner ble stilt opp som beskrevet i tabell 1.

Citral- eller L-carvon vannemulsjoner ble blandet med YP og Tween-80 surfaktant natten over ved romtemperatur. Prøver ble sentrifugert ved 14.000 x g i 10 minutter og framkomst av fri terpen som flyter på det vandige sjikt ble beregnet. Resultatene er vist på høyre side i kolonnen merket fri terpen i tabell 1.

Uttrykket "fri terpen" refererer til den synlige tilstedeværelse av terpen i den sentrifugerte reaksjonsblanding. Fravær av fri terpen indikerer komplett absorpsjon av terpen av partiklene. Det høyeste volum av terpen absorbert av partiklene, slik det framgår ved fravær av fri terpen, ble registrert som det maksimale volum absorbert terpenemulsjon.

Som det framgår av resultatene er YP i stand til å absorbere og innkapsle minst 16,5 ul L-carvon terpenemulsjon eller minst 5 ul citralemulsjon per 10 mg YP.

Eksempel 3 - Bestemmelse av forbedret terpenlasting med surfaktant og bestemmelse av optimalt forhold Tween- 80; Terpen

Den følgende protokoll ble utført for å demonstrere at nærvær av surfaktant forbedret terpenlasting, og for å bestemme minimumsnivå av Tween-80 surfaktant som var nødvendig for YP terpenlastingsreaksjonen. L-carvon- og citralemulsjoner ble framstilt ved å sonikere 4,5 g av terpenet med 0,3 ml vann. 10% Tween-80 løsning ble framstilt ved sonikering av 4,5 g Tween-80 i 40,5 ml vann. Bakers YP-suspensjon ble framstilt ved å blande YP med vann for å danne 250 mg/ml suspensjon.

Lastingsreaksjoner ble satt opp som vist i tabell 2 nedenfor.

Citral- eller L-carvon-vann-emulsjon ble blandet med YP med 0-10% vol/vol Tween-80 surfaktant natten over ved romtemperatur. Prøvene ble sentrifugert ved 14.000 x g i 10 minutter, og framkomst av fri terpen som flyter på det vandige sjikt ble registrert. Resultatene er vist i den høyre kolonne merket fri terpen i tabell 2.

Uttrykket "fri terpen" refererer til den synlige tilstedeværelse av terpen i den

sentrifugerte reaksjonsblanding. Fravær av fri terpen indikerer komplett absorpsjon og innkapsling av terpen av YP. Det høyeste volum av terpen absorbert av YP, slik det framgår av fravær av fri terpen, ble registrert som maksimalt volum av absorbert terpenemulsjon.

Som det framgår av resultatene er en Tween-80 konsentrasjon på 1% (dvs. 100 ul av 10% Tween-80 i 1000 ul reaksjonsblanding) tilstrekkelig til å muliggjøre fullstendig opptak av terpenet i reaksjonen over. En 2% Tween-80 forårsaker ingen forbedring i resultatet, mens med en 0,33% konsentrasjon ble fri terpen observert. Dette indikerer at: a) Terpen absorberes inn i YP-partikler i fravær av surfaktant, men tilstedeværelse av surfaktant øker signifikant terpenabsorpsjon. b) En Tween-80 konsentrasjon på ca. 1 % er optimal for YP-lasting idet det sikrer hensiktsmessig lasting mens den maksimerer terpennyttelasten i YP-partiklene.

Eksempel 4 - Bestemmelse av maksimal terpenlasting og innkapsling med høyere nivåer av Bakers gjærcelleveggpartikler ( YP)

Den følgende protokoll ble utført for å bestemme maksimale mengder av terpener som kan lastes inn i YP ved høye YP-nivåer. - L-carvon- og citral-emulsjoner ble framstilt ved sonikering av 4,5 g av terpen med 3 ml 1% Tween. - 5% Tween-80 løsning ble framstilt ved sonikering av 0,5 g Tween-80 i 9,5 ml vann. - YP-suspensjon ble framstilt ved å blande YP med vann for å danne 250 mg/ml suspensjon.

- Innkapslingsreaksjoner ble satt opp som vist i tabell 3.

Citral- eller L-carvon-vann-emulsjon ble blandet med YP og Tween-80 surfaktant natten over ved romtemperatur. Prøver ble sentrifugert ved 14.000 x g i 10 minutter og tilsynekomst av fri terpen som flyter på det vandige sjikt ble registrert. Resultatene er vist i den høyere kolonne merket fri terpen i tabell 3.

Uttykket "fri terpen" refererer til den synlige tilstedeværelse av terpen i den sentrifugerte reaksjonsblanding. Fravær av fri terpen indikerer fullstendig absorpsjon av terpen av YP. Det høyeste volum av terpen absorbert av YP, som vist med fravær av fri terpen, ble registrert som maksimalvolumet av absorbert terpenemulsjon.

Som det framgår av resultatene i tabell 3, YP er i stand til å absorbere og innkapsle terpener ved høy YP-konsentrasjon. YP absorberte og innkapslet minst 112,5 ul L-carvon-terpenemulsjon eller minst 75 ul citral-emulsjon per 125 mg YP. Dette viser at terpeninnkapslingsreaksjonen er uavhengig av YP-konsentrasjon i de områder som ble testet.

Eksempel 5 - Screening av kommersielt tilgjengelig partikler for terpenabsorpsion

Den følgende protokoll ble utført for å analysere lastingsegenskaper av forskjellige typer partikler. Partiklene som ble studert var Bakers gjærcelleveggpartikler (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO), Nutrex™ Walls (Sensient Technologies, Milwaukee, Wl), SAF-Mannan™ (SAF Agri, Minneapolis, MN), Nutricept Walls™

(Nutricepts Inc., Burnsville, MN), Levacan™ (Savory Systems International, Inc., Branchburg, NJ) and WGP™ (Alpha-beta Technology, Inc. Worcester, MA). L-carvon- og citral-emulsjoner ble framstilt ved sonikering av 7 g terpen + 3 ml 3,3% Tween-80.

Tabell 4 nedenfor sammenligner renhet med antallet gjærpartikler per milligram og de pakkede faststoff vekt/volum-forhold.

Fra tabell 4 kan det konkluderes at antallet partikler pr. mg er inverst proporsjonalt med renhet. Således, antall partikler pr. mg av WGP er omtrent 10 ganger høyere enn Bakers YP.

YP-suspensjonene ble framstilt som følger:

- Bakers gjærcelleveggpartikkelsuspensjon (YP) ble framstilt ved å blande 250 mg YP/ml 1 % Tween 80. - Nutrex-suspensjon ble framstilt ved å blande 163 mg Nutrex YGP/ml 1 % Tween 80. - SAF Mannan-suspensjon ble framstilt ved å blande 234 mg Biospringer YGP/ml 1 % Tween 80. - Nutricepts-suspensjon ble framstilt ved å blande 99 mg Nutricepts YGP/ml 1% Tween 80. - Lavacan-suspensjon ble framstilt ved å blande 217 mg Lev YGP/ml 1 % Tween 80. - WGP-suspensjon ble framstilt ved å blande 121 mg WGP YGP/ml 1% Tween 80.

Det pakkede volum av partiklene over er identisk, noe som angir at like antall partikler ble analysert.

Lastingsreaksjonene ble stilt opp som vist i tabell 5, og satt til inkubering natten over. Prøvene ble sentrifugert ved 14.000 x g i 10 minutter og tilsynekomst av fri terpen som flyter på det vandige sjikt og fargen av det innkapslede terpen i pelletene ble registrert. Resultatene er vist i to kolonner til høyre i tabell 5. Det høyeste volum av terpen absorbert av partiklene som vist ved fravær av fri terpen ble registrert som volum av absorbert terpenemulsjon.

Fra resultatene ble følgende konklusjoner nådd:

- Rensete partikler med et lavt lipidinnhold var mindre effektive i å absorbere terpener.

- Mindre rene partikler var mer effektive i å absorbere terpener.

- Gult degraderingsprodukt av citral ble ikke dannet ved innkapsling i SAF-Mannan™. - Basert på kvalitativ lasting av de enkelte terpennivåene som ble testet synes SAF-Mannan™ å være best, Nutrex™ nummer to, og Bakers på tredje plass.

Eksempel 6 - Kinetikk av terpenlasting i forskjellige typer partikler og forskjellige inkuberingstemperaturer

Den følgende protokoll ble adaptert for å sammenligne lastingskinetikk av forskjellige typer gjærpartikler. L-carvon- og citral-emulsjoner ble framstilt ved sonikering av 7 g terpen med 3 ml 3,3% Tween-80. 1% Tween-80 løsning ble framstilt ved sonikering av 1 ml 10% Tween-80 i 10 ml vann. - Bakers YP ble framstilt ved å blande 5 g av Bakers YP i 20 ml 1 % Tween-80. - Nutrex™ YGP suspensjon ble framstilt ved å blande 2 g Nutrex™ YGP i 20 ml 1 % Tween-80. - SAF Mannan™ suspensjon ble framstilt ved å blande 2 g SAF Mannan™ i 20 ml 1 % Tween-80.

Lastingsreaksjoner ble satt opp som vist i tabell 6.

Reaksjonene ble inkubert i 1, 3, 6, 9 og 24 timer ved romtemperatur, eller ved 37°C. Etter inkubering ble prøvene sentrifugert ved 14.000 x 6 i 10 minutter, og framkomst av fritt terpen som flyter på det vandige sjikt ble registrert. Resultatene er vist i de to kolonner til høyre i tabell 6. Det høyeste volum at terpen absorbert av partiklene som vist med fravær av fri terpen er registrert som volumet av absorbert terpenemulsjon. Farge av den innkapslede pellets ble skåret ved 24 timer.

Hvit, W; Gul, Y; Svært gul, VY; romtemperatur, Rt

Fra resultatene vist i tabell 6 og andre observasjoner kan følgende konklusjoner trekkes:

• Terpenlastingsreaksjoner tar mellom 1 og 3 timer.

• Terpenlasting foregår hurtigere ved 37°C enn ved romtemperatur.

• SAF Mannan™ synes å være de foretrukne partikler av to grunner:

- hurtigere og mer komplett opptak av begge terpener

- citral forblir stabil ved lasting slik det er vist ved fravær av gul farge,

som er karakteristisk for degradering av citral, etter 24 timer ved 37°C

Eksempel 7 - screening av en rekke enkle terpener og terpenkombinasioner for partikkellasting

Den følgende protokoll ble adaptert for å sammenligne lastingseffektiviteten av Bakers YP versus SAF Mannan™.

Terpenemulsjoner ble framstilt som følger:

L-carvon - 4.5 g L-carvon i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

- Citral - 4.5 g citral i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

Tymol/L-carvon-blanding (T/L)- 2,25 g tymol og 2,25 og L-carvon i 1,5 ml 3,3%

Tween-80.

Eugenol - 4,5 g eugenol i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

Geraniol - 4,5 g geraniol i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

Citral/L-carvon/eugenol-blanding (C/L/E) - 1,5 g citral, 1,5 g L-carvon, 1,5 g

eugenol i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

Emulsjoner sammensatt av terpen : vann : surfaktant-forhold på 0,75 : 0,3 : 0,05 ble anvendt i disse eksperimentene.

Økende volumer av terpenemulsjoner ble blandet med 250 mg/ml Bakers YP eller 250 mg/ml SAF Mannan™ natten over ved romtemperatur som vist i tabell 7 og 8. Prøvene ble sentrifugert ved 14.000 x g i 10 minutter, og framkomst av fri terpen som flyter på det vandige sjikt ble registrert. Det høyeste volum av terpenemulsjon absorbert av Bakers YP eller SAF Mannan™ som vist med fravær av fritt terpen ble registrert som volumet av absorbert terpenemulsjon. Farge på innkapslede terpener i pellet ble registrert. Resultatene i tabellene 7 og 8 viser at alle enkeltstående, og kombinasjoner av terpen effektivt var lastet inn i Bakers YP eller SAF Mannan-partiklene.

Fra resultatene ble følgende observasjoner gjort:

Alle terpener synes å lastes inn i Bakers YP og SAF Mannan.

SAF Mannan har en høyere terpenlastingskapasitet enn Bakers YP. Blandingene av to og tre terpener synes også effektivt å lastes inn. Terpenet eugenol synes å ha høyere tetthet enn partiklene og vann siden

det ble funnet assosiert med paletten.

For SAF Mannan, resulterte de høyere lastingsnivåer og lettere partikler i lastede partikler som flyter på overflaten av det vandige sjikt for citral og geraniol.

Citral ble beskyttet fra oksidering med SAF Mannan men ikke av Bakers

YP.

Den omtrentlige maksimale lasting for hver partikkeltype ble bestemt og er vist i tabeller 9 og 10, nedenfor. Prosentandel lastet representerer et forhold av mengden terpen lastes i forhold til mengden partikkel til stede (vekt for vekt).

Eksempel 8 - Evaluering av terpenstabilitet i vandige emulsjoner og innkapslede terpenformuleringer

Terpenstabilitet ble undersøkt med observasjoner av citralformuleringer for dannelse av et gult farget oksidasjonsprodukt. Som angitt i den høyre kolonne i tabell 5-8 så fikk citralemulsjoner og citral innkapslet i Bakers YP en progressiv økende gul farge overtid. Imidlertid, citral innkapsling i SAF Mannan™ økte citral stabilitet som vist som en reduksjon eller fravær av gul farge over tid.

Eksempel 9 - Lasting av terpener i minimal mengde vann

Den følgende protokoll ble utført for å evaluere muligheten for terpenlasting og

innkapsling i YP kan utføres ved en svært høye gjærpartikler (YP) faststoffnivå for å muliggjøre for direkte ekstrusjon av den lastede formulering i en fluidisert bedtørker. Den minimale mengde vann for å fullstendig hydrere SAF Mannan™ -partiklene ble bestemt til å være 3,53 g vann per g faststoff. Dette definerer det hydrodynamiske

volum (HV) eller vannabsorptiv kapasitet av partiklene. Med dette vannivå har de hydrerte partiklene en konsistens som en stiv deig som er tiksotropisk, dvs. skjær uttynning som majones. Tilsetting av vann opptil 40% over HV resulterer i en tykk flytbar pasta. Standardreaksjonen som har blitt anvendt i eksemplene ovenfor ble utført ved 3 x HV vann.

En serie terpen (L-carvon) lastingsreaksjoner ble utført hvor forholdet mellom partikkel: Tween (1 : 0,44:0,04) ble holdt konstant, og hvor mengden vann ble variert i systemet fra HV (3,53 g) til HV + 40% vann (4,92 g). Kontroller var standard lastingssystem som anvendte 3 x HV vann, kun partikler og reaksjoner med kun terpen. Etter en overnatten inkubering ble prøvene av blandingene evaluert mikroskopisk for fri terpen og bevis på terpenopptak i partiklene og for materialflyt-karakteristika ved å undersøke de inverterte rør i løpet av 15 minutter. I tillegg, nærvær av fri olje ble undersøkt ved å hydrere reaksjonsblandingen med 5 x HV, vortekser for å oppnå en komplett dispersjon av partikler og sentrifugering for å sedimentere partikkel-innkapslet terpen. Resultatene er vist i tabell 11 og fig. 7-12.

Fig. 7-12 viser lastingsresultatene av følgende rør:

- Fig. 7 - Rør 3

- Fig. 8 - Rør 5

- Fig. 9 - Rør 6

Fig. 10-Rør 8

Fig. 11-Rør 10

- Fig. 12-Rør 11

Resultatene vist i tabell 11 og fig. 7-12 viser at terpenlasting og innkapsling i partikler foregår ved alle vann-forhold som ble undersøkt. Overraskende, ekvivalent lasting forekom selv idet lastingsreaksjonen forekom i en reaksjon med konsistens av en stiv deig ved anvendelse av den minimale mengde vann for å hydrere partiklene. Fravær av fri terpen ble observert mikroskopisk (fig. 7-12) og i det lave nivå av terpen i supernatantene, som vist med en markert reduksjon i turbiditet av super-natanten sammenlignet med kontrollen med kun terpen.

Disse resultater utvider vår forståelse av tilstander for å laste terpener i hule glukanpartikler. Fleksibiliteten for anvendelse av et minimalt volum vann for å hydrere partiklene under lastingsprosessen vil muliggjøre lasting av terpenet under betingelser hvor reaksjonsblandingen er en målbar deig-liknende konsistens ved anvendelse av standard næringsgraderte sveipt overflate deigblander. Konsistensen av den finale høyt faststoffinneholdende terpenlastingsblanding er egnet for direkte ekstrudering for å danne nudler og pellet for fluidisert bed tørking.

Egnete fasiliteter for skalere opp produksjonen på denne måte vil kreve: Gaulin-homogeniserer, eller liknende for å produsere stabil

terpenemulsjon.

sveipt deigblandingstank

Ekstruder

Fluidisert bed tørker

Eksempel 10 - Evaluering av hydrokolloid mellomromsagent for å behjelpe dispersion i tørkede hule glukanpartikler som innkapsler en terpenkomponent dispersion idet den re- hvdreres.

Den følgende protokoll ble tilpasset for å evaluere effekten av en interstitial hydrokolloid for å øke tørket hul glukanpartikkel innkapsling av terpenformuleringer for dispergering idet de hydreres.

SAF Mannan™ partikler

- 0,1% Tween 80

L-carvon

Xantangummi - 1 % vekt/vol i 0,1 % Tween 80

Effekten av øke nivåene av xantangummi for tørre hule glukanpartikler som innkapsler L-carvon dispersjon i vann undersøkt ved lasting av L-carvon i SAF Mannan ved inkubering av 1,1 g av en L-carvon emulsjon (L-carvon : vann : surfaktant-forhold fra 0,75 : 0,3 : 0,05) med 1 g SAF Mannan og 4,4 g 0,1% Tween 80 inneholdende 0-1% xantangummi som vist i tabell 12.

Resultatene i tabell 12 og fig. 13-20 viser at inkludering av et høyt molekylt vekthydrokolloid under tørkingen av partikkelen som innkapsler terpen bevirker i hydrering og dispersjon av mikropartiklene til en uniform suspensjon. Andre eksempler på slike hydrokolloide midler er maltodekstrin, alginater eller lignende.

Det er også verdt å inkludere en pellet-coating for å øke stabiliteten av de lastede terpener, og for å tilveiebringe en forlenget frigivelse av terpen.

Eksempel 11 - Evaluering av minimums inhibitorisk konsentrasjon ( MIC) for terpenemulsjoner, ferske Bakers YP og SAF Mannan innkapslede terpener og frvsetørkede Bakers YP og SAF Mannan innkapslede terpener mot S. aureus Resultatene av en protokoll utført for å sammenlikne MIC av fersk versus frysetørkede hule glukanpartikler innkapslede terpenformuleringer er vist nedenfor i tabell 13. En enkel terpenemulsjon ble også testet og resultatene er vist for sammenlikning.

Konklusjonene som tas fra resultatene over var:

Terpenlasting inn i hule glukanpartikler synes å forbedre terpen MIC.

Generelt, de ferske terpenemulsjoner er~4 - 375 ganger mindre potente enn de innkapslede formuleringer.

Terpener lastet i SAF Mannan™ utfører noe bedre enn Bakers YP. Fersklastede terpenmaterialer utfører noe bedre enn frysetørkede materialer (der kan være noe volatilisering av terpener fra tørrmaterialer under frysetørking).

Terpener i vandige emulsjoner er stabil i minst 3 uker.

Eksempel 12 - Effektivitet av innkapslede terpener ved pilot planteskall mot

S. aureus .

Antimikrobielle analyser ble utført med innkapslede terpener og blandinger produsert i pilotfrabrikkskalaer mot S. aureus.

Både ferske og frysetørkede innkapslede terpenprøver inneholdende materialer viste sterk antimikrobielle aktiviteter. Resultatene er summert i tabell 14 nedenfor.

Terpener ble innkapslet i SAF-Mannan™ ved en 2,5 kg skala. En blanding av tre terpener (Geraniol, 275 g; eugenol, 385 g; og tymol, 440 g ble oppløst og homogeni-sert med 100 g Tween-80 og 8 I vann. SAF-Mannan™ (2,5 kg) ble tilsatt for å danne en homogen suspensjon. Suspensjonen ble passert gjennom en Gaulin homogeniserer for å redusere partikkelstørrelse og homogenatet ble inkubert natten over ved romtemperatur. En prøve av det innkapslede terpen ble fjernet og lagret ved romtemperatur. Det resterende innkapslede terpen ble deretter frosset i brett og fryse-tørket. Det frysetørkede, innkapslede terpenpulver ble malt og lagret ved romtemperatur.

Med pilotanleggskala var både ferske og frysetørkete prøver like potente på en vekt/vekt terpenbasis.

Basert på storskalaframstillingsresultatene ble den predikerte effektive dosering av den frysetørkede formulering mot S. aureus er 200 ppm (formuleringen inneholder

-50% terpen vekt/vekt eller 0,2 g/l vann.

Eksempel 13 - Effektivitet av innkapslede terpener mot mykobakterium

Terpenemulsjonene ble framstilt som følger:

- Citral - 4,5 g citral i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

L-carvon/eugenol - 2,25 g L-carvon og 2,25 g eugenol i 1,5 ml 3,3%

Tween-80.

Eugenol - 4,5 g eugenol i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

Geraniol - 4,5 g geraniol i 1,5 ml 3,3% Tween-80.

Geraniol/tymol-blanding - 2,25 g geraniol og 2,25 g tymol i 1,5 ml 3,3%

Tween-80.

Kontrollemulsjon - 6 ml 1% Tween-80.

SAF-Mannan™ (2,5 g) ble blandet med 3 ml av hver emulsjon og 7 ml av 1% Tween-80 og inkubert natten over for å innkapsle terpenene og terpenblandingene. De innkapslede terpenformuleringene ble frosset og frysetørket og pulveret ble malt til et finfordelt pulver. Suspensjoner av innkapslede terpener (25 mg/ml) og ikke-innkapslede terpenemulsjoner ble analysert for antibakteriell aktivitet mot mykobakterium. Resultatene er angitt i tabell 15.

Eksempel 14 - Nematocidal aktivitet av innkapslede terpener

Framstillinger av gjærcellevegger som innkapsler citral ble framstilt i samsvar med prosedyrene beskrevet over. De hule glukanpartikler inneholdende 17,5% citral, og partiklene forelå i testpreparatene i en konsentrasjon av 1000 ppm. Dette betyr at terpenet var effektivt til stede i en konsentrasjon av 175 ppm.

1,0 ml av testpreparatene ble tilsatt til 0,1 til 0,15 ml vann inneholdende rotknollnematoder. 1,0 vann ble tilsatt til nematodene som kontroll.

Observasjoner ble utført som tidligere beskrevet og avlivingshastigheten ble under-søkt (dvs. prosent død) etter 24 og 48 timer. Resultatene vist nedenfor i tabell 16 er gjennomsnitt av 2 sett av resultater.

Resultatene viste at de hule glukanpartikler som innkapsler terpenet er effektive i å drepe rotknollnematoder med en partikkelkonsentrasjon på 1000 ppm, som korresponderer til en citral konsentrasjon på kun 175 ppm.

De hule glukanpartikler som innkapsler terpener synes å være likeså effektive som

terpener i løsning eller med surfaktant som nematicider. Den nematicidale effektivitet opprettholdes til tross for at terpenet er innkapslet inni partikkelen. Det kan forventes at høyere konsentrasjoner av terpener i de hule glukanpartikler, eller høyere konsentrasjoner av partiklene vil resultere i enda høyere avlivingsrate, slik tilfellet er for terpener i løsning eller med surfaktant.

Eksempel 15 - Funqicidale egenskaper av innkapslete og ikke- innkapslete terpener

De følgende protokoller ble utført for å undersøke de fungicidale egenskaper av forskjellige terpenkonsentrasjoner, og å sammenlikne effektiviteten av innkapslete og ikke-innkapslete materialer.

Undersøkelse av antifungale egenskaper av forskjellige terpenformuleringer

En mikrotitreplateanalyse ble anvendt for å undersøke minimums inhibitorisk konsentrasjon (MIC) av en rekke terpenforbindelser mot forskjellige patogene organismer. Analysen som ble anvendt for hver organisme er beskrevet i detalj senere, men viktige generelle trekk er som følger.

Analysene anvender to inkuberingsperioder for å skille mellom statisk (vekt-inhibering) og cidal (avliving) aktiviteter. Den første inkuberingsperiode muliggjør undersøking av vekstinhibering, men kan ikke skille mellom kun hindring av vekt og dreping av cellene. Formålet med den andre inkuberingsperiode er å tillate tilstrekkelig tid og næringsmidler for enhver hvilende eller inhiberte celler som overlever terpeneksponering til å kunne proliferere. Enhver celle som bli inhibert med fungistatisk effekter skal respondere og vokse under den andre inkuberingsperiode, mens celler som blir drept med eksponering til terpenet ikke vil vokse i ferske medium.

Innledende screeningeksperimenter ble utført ved anvendelse av totalt 31 forskjelligle terpenformuleringer (tabell 17). Disse eksperimenter ble repetert ved anvendelse av en undergruppe av sterkt aktive terpenformuleringer (tabell 18).

En kombinasjon av terpenene geraniol, eugenol og tymol i et forhold av 2:1:2 innkapslet med glukanpartikler ble også testet; denne prøve refereres til som YP-GET. En ikke-innkapslet geraniol, eugenol og tymolkombinasjon i det samme forhold ble også testet for sammenlikning med den innkapslede form.

MIC analyse ved anvendelse av Saccharomvces cerevisiae

S. cerevisiae (5 x 10<5>celler/ml i YPD vekstmedium) ble tilsatt til hver brønn av en 96-brønns mikrotitreplate i 100 ul alikvot. Minst én kolonne per plate ble designert som en "kun celle"-kontroll og intet terpen ble tilsatt til disse brønnene. Alikvoter (100 ul) av de forskjellige terpenformuleringer ble tilsatt til den første rad av de resterende kolonner, og serielle 2-gangers fortynninger ble utført ved å overføre 100 ul fra en rad til den neste, totalt 7 ganger. Til slutt ble 100 ul kastet fra den siste rad for å sikre at alle cellene inneholdt det samme volum. Mikrotitreplater ble inkubert statisk natten over ved 30°C.

Etter inkubering ble platene skåret for inhibering av vekst (vist som mangel på turbiditet). Vekstinhibering (>75%) ble visuelt bekreftet med mikroskopi.

Straks MICen hadde blitt bestemt for hver formulering ble mikrotitreplatene sentrifugert og forbrukt medium ble fjernet fra ikke-turbide brønner. Cellene ble resuspendert i ferskt medium (100 ul), og platene ble re-inkubert natten over ved 30°C. Undersøkelse av vekstinhibering ble utført som tidligere.

MIC- analyse ved anvendelse av en blandet inoculum

De forskjellige terpenformuleringer ble serielt fortynnet i 96-brønns mikrotitreplaten som beskrevet for S. cerevisiae. Smeltet YPD-agar ble deretter tilsatt brønnene, sammen med 5 ul blandet inocolum (framstilt fra mugne drueblader til en konsentrasjon av 5 x 10<4>celler/ml). Platene ble inkubert statisk i 24 timer ved romtemperatur og sporvekst ble visuelt undersøkt med mikroskopi.

På grunn av anvendelse av faststoffmedium, kunne den andre inkuberingsperiode i ferskt medium ikke utføres.

MIC- analyse ved anvendelse av colletotrichum graminicola

De forskjellige terpenformuleringer ble serielt fortynnet i 96-brønns mikrotitreplate som beskrevet for S. cerevisiae. C. graminicola (300 sporer/brønn) ble tilsatt til de forskjellige terpener, og platene ble inkubert statisk i 48 timer ved romtemperatur. Sporegerminering og vekst ble visuelt undersøkt med mikroskopi.

Straks MICen hadde blitt bestemt for hver formulering ble mikrotitreplatene sentrifugert og forbrukt medium ble fjernet fra vekstinhiberte brønner. Sporene ble resuspendert i ferskt medium (100 ul) og platene ble reinkubert natten over ved romtemperatur. Undersøkelse av vekstinhibering ble utført som tidligere.

Blandet inoculum

Ved anvendelse av et blandet inoculum presenteres et antall problemer. Variabiliteten i sporinnhold mellom preparatene resulterer i dårlig interanalyse reproduserbarhet, og vekst av kontaminerende organismer hindrer skåring av sporegerminering. Unicellulære gjærformer er spesielt problematiske i å maskere sporevekst. Selv om presise data ikke kunne oppnås fra denne analyse, ble en inhibitorisk effekt av terpenet observert.

Identifisering av sporer var enklere under scoring av repeterende analyse enn under den innledende screeningsanalyse siden et stort antall sporer ble anvendt (ca. 50/brønn versus ca. 10/brønn). Derfor, data oppnådd under repeterende analyse kan tilveiebringe et mer pålitelig estimat for MIC.

Colletotrichum graminicola

De generelt høye MIC-verdier oppnådd fra repeterende analyse sammenliknet med innledende screeninganalyse kan skyldes:

• anvendelse av 1 ukers gamle terpenløsninger

• anvendelse av ferskt framstilte sporer, som har en høyere levedyktighet enn de som anvendes i den innledende screeninganalyse og derfor kan være vanskeligere å drepe.

Sammenlikning av terpenformuleringer som frie emulsjoner med de samme terpenformuleringer innkapslet i hule glukanpartikler: Saccharomyces cerevisiae MIC-analyser

YPD vekstmedium (100 ul) ble tilsatt til hver brønn av en 96-brønns mikrotitreplate

og alikvoter av forskjellige terpenformuleringer ble tilsatt til den første rad, som ga et totalt volum av 200 ul i denne rad. En kolonne ble designert som kun-cellekontroll og ingen terpen ble tilsatt til disse brønner. Serielle 2-gangers fortynninger ble utført ved å overføre 100 ul fra hver rad til den neste, totalt 7 ganger. Til slutt, 100 ul ble kastet

fra den siste rad for å sikre at alle brønnene inneholdt det samme volum. S. cerevisiae (5 x 10<5>celler/ml i YPD vekstmedium) ble deretter til hver brønn i 100 ul alikvoter, og absorbans ved 620 nm (A620) ble målt for hver brønn ved anvendelse av en mikrotitreplateleser. Mikrotitreplatene ble inkubert statisk natten over ved 30°C.

Etter inkubering ble A620målt igjen, og platene ble skåret for inhibering av vekst (>75%). Vekstinhibering ble visuelt bekreftet med mikroskopi.

For de frie terpenemulsjoner, straks MICen hadde blitt bestemt for hver formulering, ble mikrotitreplatene sentrifugert og forbrukt medium ble fjernet fra vekst-inhiberte brønner. Cellene ble re-suspendert i ferskt medium (100 ul) og platene ble reinkubert natten over ved 30°C

Undersøkelse av vekstinhibering ble utført som tidligere.

MIC og fungicidale MIC-resultater er summert i tabell 19.

Resultater

For både terpenemulsjoner og gjær-innkapslede terpener var MICer typisk <125 ppm, hvor de mest aktive formuleringer inhiberer vekst~60 ppm. MIC-verdier oppnådd for terpenemulsjonene var tilsvarende de som var oppnådd for deres respektive gjær-innkapslede formuleringer. Dersom forskjellige verdier ble oppnådd, så avvek de med ca. 2-gangers fortynning.

Mange av de frigitte terpenemulsjoner var fungicidale ved vekstinhibitorisk MIC, men hovedandelen viste fungicidal aktivitet ved en 2-ganger høyere konsentrasjon.

Disse resultater viser at terpen innkapslet i glukanpartikler er minst like effektive i å drepe fungus som ikke-innkapslede former. I tillegg, de innkapslede materialer som ble anvendt kan ha redusert styrke på grunn av at de har blitt lagret i 45 dager ved 4°C og har et sub-optimalt terpeninnhold på -4% vekt/vekt.

Analysen for å bestemme fungicidal aktivitet involverer et sentrifugeringstrinn, som søker å separere de mikrobioale celler fra resterpen i vekstmedium ved å produsere et pellet av celler ved bunnen av brønnen. Denne pellet resuspenderer deretter i ferskt medium, og inkuberes for en andre gang i fravær av terpen. Imidlertid, sentrifugeringstrinnet kan ikke skille mellom mikrobiale celler og gjærpartikler, og derfor, idet gjær-innkapslede terpen anvendes, vil cellepelleten også inneholde terpenlastede gjærpartikler. Som et resultat, både gjærpartiklene og de mikrobiale cellene resuspenderes deretter i det ferske medium.

Dette metodologiske forhold vurderes å ikke påvirke resultatene oppnådd i eksperimentene beskrevet ovenfor av følgende grunner. • I tidligere eksperimenter har terpenemulsjoner blitt anvendt i stedet for terpenlastede gjærpartikler og fungicidal aktivitet har klart blitt vist. Innkapslede terpener frigis med diffusjon, og en likevekt mellom konsentrasjonen av innkapslede terpener og konsentrasjonen av frigitte terpener i det omgivende medium nås hurtig. Således, etter sentrifugering og resuspendering i ferskt medium er konsentrasjonen av frigitt terpen i vekstmedium sannsynligvis godt under det som er nødvendig for vekstinhibitorisk aktivitet. • Der var ingen vekst når innholdene av fungicidal MIC-brønn ble utplatet for faststoff agar vekstmedium. Ved utplating på faststoff vekstmedium resulterte diffusjon av restterpener gjennom det store volum av agarplaten i en lokal terpenkonsentrasjon som er for lav til å forårsake vekstinhibering. Mangel på vekst fra innholdene i de fungicidale MIC-brønn må derfor skyldes innledende fungicidal aktivitet. I motsetning, idet en MIC ble oppnådd som var lavere enn den fungicidale MIC og innholdet av MIC-brønnen ble utsådd for faststoff agar vekstmedium, ble vekst observert, noe som indikerer en fungistatisk effekt.

Eksempel 16 - Framstilling av innkapslete terpenmaterialer for feltforsøk

Formålet med følgende protokoll var å innkapsle et terpenmateriale i hule glukanpartikler for påfølgende feltforsøk.

Materialer:

Tymol (levert av Alpha-Gamma Corporation)

Eugenol (levert av Alpha-Gamma Corporation)

Geraniol (levert av Alpha-Gamma Corporation)

1% Tween-80 (levert av Alpha-Gamma Corporation)

Gjærcelleveggpartikler

Xantangummi

Gjærcelleveggpartiklene ble levert av Biorigin (Sao Paolo, Brazil) under varemerkenavnet Nutricell MOS 55, og ble framstilt av Acucareira Quatå S.A, Usina Quatå, Quatå - Sao Paolo - Brazil - Zip Code 19780 000. Partiklene er spraytørkede celleveggekstrakter av S. Cerevisiae og er friflytende pulver av lys beige til gylden farge.

Protokoll: Den følgende protokoll var hensiktsmessig for 1 kg partikler, men kan enkelt oppskaleres for større produksjon. 1. Framstill terpenblanding - bland 375 gram geraniol + 525 gram eugenol + 600 g tymol, og omrør i en glassflaske. 2. Framstill 6,2 I 1 %Tween-80 ved å blande 62 g Tween-80 i 6,2 I vann i hvit bøtte. Bland slik at det dannes en løsning.

3. Tilsett 6,2 g xantangummi til Tween-løsningen og omrør for oppløsning.

4. Framstill terpenemulsjon ved å blande 1,5 kg terpenblanding + 6,2 I 1%Tween-80/0,1% xantangummi i hvit bøtte ved anvendelse av polytronblander. 5. Tilsett 1000 g gjærcelleveggpartikler - bland ved anvendelse av malingsblander for å danne uniform suspensjon. 6. Tilsett terpenemulsjonen fra trinn 4 til gjærcelleveggpartiklene mens det blandes for å danne en tynn, majoneslignende konsistens.

7. Hell terpenblandingen over i kanner og inkuber natten over.

Resultater: Innkapslet geranoil, eugenol og tymol i hule glukanpartikler ble oppnådd som en pasta. Pastaen ble enkelt omdannet til et tørrpulver ved konvensjonell spraytørkingsteknikker. Pastaen er "væske"-materiale referert til i de følgende protokoller, og "pulveret" er den spraytørkede form.

Eksempel 17 - Feltforsøk for enkapsulerte terpenmaterialer i dunet meldugg

I druer forårsakes dunet meldugg av fungusen Plasmopara viticola, som infiserer vinranker verden over og kan forårsake store tap for druedyrkere med hensyn til avlingsutbytte og kvalitet på vin. Fungusen angriper fruktene og alle grønne deler av vinranken, og forårsaker at bladene visner og at blomstene og bærene råtner. Sykdommen manifesteres som ujevn blek gul eller gul-grønne flekker på den øvre overflate av bladene, med tette, hvit-gråe bomullsliknende soppvekst som dekker undersiden av bladlesjonene. Bær kan også dekkes med den dunete vekst, og avhengig av infeksjonstiden kan bli brun og myk eller de trenger ikke å mykne i det hele. Dunet meldugg spres gjennom dispergering av sporer med vind og regn, og krever våte betingelser for infeksjon. Det er spesielt problematisk i miljø med høy fuktighet. Preventive tiltak er anbefalt for å behandle sykdommen, med tidlig applisering av fungicider etterfølgende av repeterende applisering ved egnete intervaller. Resistens har oppstått til noen behandlinger, og selv om utvikling av resistens kan minimeres ved å rotere anvendelse av forskjellige fungicider, så er det fortsatt et problem.

Formålet med dette forsøk har vært å undersøke effektiviteten av den innkapslede terpenformulering ifølge eksempel 16 (YGP-GET) forsynt som en væske eller pulver (spraytørket) formulering, for å hindre dunet meldugg i druer.

Fire av tilgrensende felt, hver som dekker 0,1 ha, ble identifisert på plass 20 i Kir-Yianni vingården.

Kir-Yianni er en 35 ha vingård ved en høyde på 300 m. Den grenser inn til en blandet eikeskog på nord- og vestsiden, og ser utover frukthager og vingårder sør og øst.

Alle fire felt har blitt behandlet med flere produkter før applisering av terpenformuleringen. Den 26. juni 2004 ble to av de fire felter sprayet med terpenpulverformulering med en dosering av enten 0,5 g/l eller 2 g/l (se skjematisk illustrasjon i figur 21). En tredje blokk ble behandlet med konvensjonell Bordeaux-blanding pluss fuktbar svovel, og den resterende blokk ble ikke behandlet.

Vinrankene i hver blokk ble monitorert for tegn på dunet meldugg i løpet av de påfølgende uker.

Fire ytterligere tilgrensende felter, hver dekkende 0,1 ha, ble identifisert på plass 18 i Kir-Yianni vingården. Alle fire felt hadde blitt behandlet med flere produkter før applisering av terpenformuleringen. På 26. juni 2004 ble to av de fire felter sprayet med terpenvæskeformuleringer ved en dosering av enten 1 g/l eller 4g/l (figur 21)

(bemerk: 1 g terpenvæskeformulering har et volum på 1 ml). Av de resterende to felter, ble ett felt ubehandlet, og ett felt ble sprayet med Mikal®, en konvensjonell behandling for dunet meldugg, den 28. juni 2004. Vinrankene i hvert felt ble monitorert for tegn på dunet meldugg i løpet av de påfølgende uker.

For begge felter ble terpenproduktet applisert med en hastighet på 1200 L/ha.

De følgende veksttrinn for druene ble registrert:

knopputbryting, 26. mars 2004

blomstring, 1. juni 2004

veraison, 6. august 2004

Forsøksappliseringene forekom pre-veraison.

2004 vekstsesongen var eksepsjonelt sen, og våt gjennom hele sesongen. Sykdomstrykket fra dunet meldugg var ekstremt høyt, 6of/yf/s-n ivået var forhøyet, og pulverformig melduggtrykk var moderat.

Både pulver og væskeformige YGP-GET-formuleringer ble lagret ved romtemperatur. Ingen spesielle lagringsbetingelser ble anvendt.

Detaljer for sammenlignende produkter

Pulverformulering på forsøk: Bordeaux -blanding, fremstilt av Manica Spa, Italy, pakket i Hellas av Moscholios Chemicals SA; fuktbar svovel.

Væskeformulering forsøk: Mikal ® (fosetyl-al 50 %, folpet 25 %), fremstilt av Bayer CropScience, distribuert i Hellas av Bayer Hellas SA. De sammenlignende produkter ble applisert som følger: En applisering før knoppskudd ved en dosering av 15 g/l etterfulgt av to ytterligere appliseringer per år med en dosering av 6,5 g/l. En sprayingsrate på 1000 l/ha ble anvendt for alle tre applikasjoner.

Pulverformulering forsøk: Bordeaux-blanding (2 g/l) og fuktbar svovel (2,2 g/l) ble applisert den 26. juni 2004.

Væskeformulering forsøk: Mikal (3,2 g/l) ble applisert den 28. juni 2004.

Vinrankene ble visuelt undersøkt for symptomer på dunet meldugg. Start av sykdommen ble markert med et gjennomsnitt på to oljeflekker per blad. Behandlinger som hindret fremkomst av ytterligere flekker ble vurdert å tilveiebringe effektiv beskyttelse mot dunet meldugg.

Resultater i YGP-GET pulverformulering (spraytørket)

Den konvensjonelle behandling av Bordeaux- blanding ga god beskyttelse mot dunet meldugg. Milde symptomer på dunet meldugg ble observert i kontrollvinrankene. 0,5 g/L terpenprodukt konsentrasjon ga ikke beskyttelse, og 2 g/L terpenprodukt konsentrasjon ga kun noe bedre beskyttelse enn kontroll. Bemerk: Sykdomstrykket på denne plass var svært lav på grunn av nylig pesticid behandling.

Vanskeligheter ble opplevd i å oppløse pulverformuleringene idet de var svært finfordelt, resulterende i dispersjon i luften. Dette kan skadelig ha påvirket effektiviteten av produktet.

YGP- GET væskeformulering.

Ved administrering i dosering av 4 g/L ga terpenproduktet utmerket beskyttelse mot dunet meldugg eksponert løvtak. Ingen beskyttelse ble gitt med 1 g/L dosering. Alvorlige symptomer på dunet meldugg ble observert i kontrollfeltet.

Væskeformuleringen var enkel å håndtere og hadde en gunstig lukt.

Diskusjon.

Dunet meldugg kan forårsake store tap for druedyrkere på grunn av at det påvirker avlingsutbyttet og kvaliteten på vinen. Behandling av sykdommen fokuserer på prevensjon på grunn av, straks den er etablert, kan infeksjonen spres hurtig. På det feltet som ble sprayet med pulverformuleringen oppviste YGP-GET ikke effektivitet ved den lavere dosering (0,5 g/l) og doseringen av 2 g/l var mindre effektiv enn konvensjonell behandling. På denne plass hadde tidligere pesticid applikasjoner resultert i lavt sykdomstrykk, som kan ha begrenset den åpenbare effekt av terpenbehandlingen. Imidlertid, det ble vurdert at en dosering mindre enn 2 g/l av terpenproduktet var inadekvat.

På det felt som ble sprayet med væskeformuleringen ble utmerket beskyttelse av eksponert løvtak tilveiebrakt av det høyere doseringsnivå på 4 g/l. Utstrakt vegetabilsk vekst på dette felt resulterte i mer effektiv behandling av de ytre yngre grenene sammenlignet med den eldre vokst i det indre løvtak. Komplett folier dekning av terpenproduktet er nyttig, siden behandlingen ikke er systemisk. Det er estimert at ca 30 % økning i forhold til volumet anvendt for konvensjonelle systemiske behandlinger vil oppnå god dekning ved anvendelse av terpenbehandling.

Konklusjoner.

Folier applisering av YGP-GET væskeformulering var meget effektiv for å regulere dunet meldugg ved en konsentrasjon av 4 g/L. De lavere konsentrasjoner av 0,5 g/L pulver og 1 g/L væske var ikke effektiv.

Eksempel 18. Feltforsøk av innkapslet terpenmateriale på pulverformig meldugg.

Pulveraktig meldugg på druer forårsakes av fungusen Uncinula necator, og forårsaker reduksjon i vinrankevekst, fruktkvalitet og vinterhardførhet av vinrankene.

I vindruer kan et infeksjonsnivå på kun 3 % av bærene påvirke vinkvaliteten. Sykdommen erkarakterisertav små hvitgråe felt av fungalvækst som forstørres til et pulveraktiv hvitt belegg på bladene. Den fungale vekst skal også foregå på bærene, som kan deles. I motsetning til dunet meldugg, som krever varme, våte forhold, kan pulveraktig meldugg være et problem i tørre vekstsesonger, idet det foretrekker skyggete områder med humid men ikke regnværsbetingelser. Preventive tiltak anbefales for å administrere pulveraktiv meldugg, med tidlig applisering av fungicidet etterfulgt av repeterende applikasjoner ved egnete intervaller.

Dette forsøk forsøker å undersøke effektiviteten av applisering av YGP-GET materiale for prevensjon av pulveraktiv meldugg i druer. Tre tilgrensende felt, hvert som dekker 0,1 ha, ble identifisert på plass 18 i Kir-Yianni vingården. Den 19. juli 2004, ble en av de tre felter sprayet med YGP-GET med 2 ml/L, og et felt ble ikke behandlet. Det resterende felt ble sprayet med konvensjonell behandling av Equesion (2,5 g/l), Alliete ( 0,9 g/l) og Punch (0,075 ml/l) se fig 22. Vinrankene i hvert felt ble monitorert for tegn på pulveraktig meldugg de neste påfølgende uker.

Tre ytterligere tilgrensende felt, som hver dekker 0,1 ha, ble identifisert på plass 20 i Kir- Yianni vingården. Den 20. juli 2004 ble en av de tre felter sprayet med YGP-GET væskeformulering med en dosering av 2 ml/l og de to resterende felter ble ikke behandlet (se fig 22). Vinrankene i hvert felt ble monitorert for tegn på pulveraktiv meldugg i løpet av de neste ukene.

Ved begge plasser hadde feltene tidligere blitt behandlet med flere produkter, inkluderende en tidligere applisering av terpenproduktet. Alle terpenbehandlinger ble applisert med en hastighet på 1200 L/ha for å sikre komplett dekning.

De følgende veksttrinn for druene ble registrert

- knoppskyting, 26. mars 2004

- blomstring, 1. juni 2004

- veraison, 6. august 2004

Forsøksappliseringene foregikk pre-veraison.

Vekstsesongen i 2004 var eksepsjonelt sen og var våt gjennom hele sesongen. Sykdomstrykket fra dunet meldugg var ekstremt høyt, Botrytisnivå var forhøyet, og pulveraktig melduggtrykk var moderat.

Detaljer for sammenlignende produkter.

Ingen sammenlignende produkt ble anvendt ved plass 20. Sammenlignende behandling anvendt ved plass 18 er beskrevet i detalj nedenfor.

Punch ® (flusilasol 40%), DuPont.

Den 19. juli 2004 ble Punch applisert i en dosering av 0,075 ml/L som en preventiv behandling for pulveraktig meldugg i samsvar med leverandørens instruksjoner.

Detaljer for ytterligere produkter.

Ingen ytterligere produkter ble anvendt på plass 20. De ytterligere produkter som ble anvendt på plass 18 er beskrevet i detalj nedenfor.

Equesion- system (famoxadon 22,5 % pluss Cymoxanil 30 %) Alliete (fosetyl-al 80%).

Den 19. juli 2004 ble Equesion (2,5 g/L) og Alliete (0,9 g/L) applisert som preventive behandlinger for dunaktig meldugg. Doseringen ble bestemt i samsvar med leverandørens instruksjoner.

Sammenlignende og ytterligere produkter representerer konvensjonelle behandlinger i integrerte test-administrasjons tidsplan.

Vinranker ble visuelt eksaminert for symptomer på pulveraktig meldugg.

Resultater:

Plass 18.

Ca 20 % av de blomsterbærende stengler og stilker i kontrollfeltet var svarte, noe som indikerer moderat infeksjon av pulveraktig meldugg. I både det konvensjonelle behandlingsfelt og terpen- behandlet felt var alle stegler og buketter grønne, noe som indikerer at adekvat beskyttelse hadde blitt tilveiebrakt.

Plass 20

Ingen bevis på pulveraktiv meldugginfeksjon ble observert i noen av feltene. Ytterligere observasjoner; ved slutten av vekstsesongen viste feltene på plassene 18 og 20 generelt mindre stress på grunn av sykdom enn resten av vingården. Pulveraktige meldugginfeksjoner forårsaker betydelig tap til dyrkere gjennom reduksjon i vinrankevekst, fruktkvalitet og vinterhardførhet for vinrankene. Videre, vinkvaliteten kan påvirkes av et infeksjonsnivå på så lite som 3 % av bærene. Administrering av sykdommen fokuserer på prevensjon på grunn av at straks den er etablert kan infeksjonen spres hurtig. I dette forsøk har applikasjon av terpenproduktet YGP-GET ved plass 18 effektivt hindret pulveraktig meldugginfeksjon, og nivået av kontroll som ble oppvist av terpenproduktet var sammenlignbart med det som ble tilveiebrakt av konvensjonell behandling. Resultatene fra plass 20 kan man ikke konkludere ut fra siden de manglet pulveraktig meldugginfeksjon. Denne mangel på infeksjon er sannsynlig grunnet i den utstrakte applisering av pesticider før forsøket, som har resultert i et lavt sykdomstrykk.

Det lave nivå av stress på grunn av sykdom ved plass 18 og 20 antyder at tidligere terpenbehandling applisert ved disse plassene kan ha vært nyttig i å regulere infeksjon på lang sikt.

Konklusjoner:

YGP-GET hindret effektivt pulveraktig meldugginfeksjon, med et sammenlignbart nivå av regulering til det som tilveiebringes av konvensjonell behandling.

Eksempel 18 - Ytterligere feltforsøk for innkapslet terpenmateriale på pulveraktig meldugg.

Dette forsøk søker å undersøke effektiviteten av YGP-GET for behandling av pulveraktig meldugg i Grimson steinfrie druer.

Et 0,1 ha jordstykke av Tsigaras vingården (ca 80 km sør for Kir- Yianni vingården) ble uoppmerksomt ikke behandlet under en applikasjon av Cistein den 1 juli 2004. Vinrankene i dette feltet viste deretter alvorlige symptomer på pulveraktig meldugg på bladene, stammer og druer. Den 12. juli 2004 ble et ikke-behandlet felt sprayet med 3 ml/L væskeformig YGP-GET formulering med en hastighet av 1200 L/ha, og resten av vingården sprayet med det sammenlignende produkt Rogana. Vinrankene ble undersøkt for symptomer på pulveraktig meldugg etter 24 timer. Vinrankene vokste i et høyt lyre espalier system.

Detaljer av sammenlignende produkt.

Rogana (fenbuconaxol 5%, binocap 16%), fremstilt av BASF (BASF Agro Hellas S.A., Athens, Greece). Den 12. juli 2004 ble Rogana applisert til Tsigaras vingården som en behandling for pulveraktig meldugg. Doseringen ble bestemt i samsvar med leverandørens instruksjoner.

Vinrankene ble visuelt undersøkt for symptomer av pulveraktig meldugg.

Resultater

Alvorlige symptomer på pulveraktig meldugg var åpenbar før applisering av YGP-GET. Kun 24 timer etter YGP-GET applisering ble det hvite belegg av den pulveraktige meldugg svart, noe som indikerer effektiv antifugal effektivitet. Idet sykdommen ble effektivt stoppet på dette tidspunkt, ble ingen ytterligere behandlinger applisert. YGP-GET viste sammenlignbar effektivitet til konvensjonell behandling.

Diskusjon

I dette forsøk ble en etablert pulveraktig meldugg infeksjon behandlet hurtig og effektivt ved anvendelse av YGP-GET. Kun 24 timer etter applisering var den tidligere alvorlige pulveraktige meldugginfeksjon stoppet ved applisering av terpenproduktet, sammenlignbar effektivitet til konvensjonell behandling. De preliminære data som ble oppnådd fra dette forsøk antyder at YGP-GET kan være effektiv i behandling av etablerte fungale infeksjoner i tillegg til å vise en preventiv evne.

Eksempel 19 - Ytterligere feltforsøk for innkapslet terpenmateriale på pulveraktig meldugg.

Bakgrunn og rasjonale.

I gjeldene forsøk ble anvendelse av YGP-GET undersøkt som del av en Tasmaniansk vingårds (Frogmore Creek Vineyard, Hathaway Trading Pty Ltd, Box 187, Richmond TAS 7025, Australia) eksperimentelle program for å kontrollere pulveraktig meldugg ved anvendelse av organiske produkter. Formålet med dette forsøk var å undersøke korttidseffekt av applisering av YGP-GET i den organiske regulering av pulveraktig meldugg i Chardonnay drueviner.

I dette forsøk ble druevinranker (Chardonnay- varietet) enten behandlet med terpenproduktet YGP-GET eller ikke behandlet (kontroll den 7. februar 2005). Selv om det tidligere var undertrykt av tidligere organiske behandlinger var pre-forsøksalvorligheten av pulveraktig meldugg ved dette nivå som ble vurdert som uakseptabelt kommersielt og var ekvivalent i de seks behandlingsaktive felt og de seks kontrollfelt. Avlingstilstanden var ca E-L 33-34 (pre-veraison).

YGP-GET (4 ml/L) væskeformulering ble sprayet på seks Chardonnay felt, som hadde blitt behandlet tidligere med melk. Seks Chardonnay felt fungerte som ubehandlete kontroller, men de hadde tidligere vært behandlet med olje /myse. Antallet vinranker per felt var typisk 7.

Detaljer på materialet av YGP-GET anvendt i denne protokoll er gitt i tabell 20.

Alvorligheten av pulveraktig meldugg ble undersøkt tre dager før terpenbehandling og igjen tre dager etter behandling. I hvert plott ble 20 bunter selektert vilkårlig (10 bunter per panelside), og sykdomsalvorlighet ble estimert som prosentandel areal av buntene som var dekket med aktive melduggkolonier. Ingen ytterligere undersøkelse var mulig på grunn av at dyrkeren deretter sprayet hele forsøksarealet med svovel og vegetabilsk olje- basert spray adjuvans (Synertrol Horti olje).

Antall /areal av planter som ble behandlet.

Testprodukt: YGP-GET (4 ml/L) appliseres på 6 Chardonnay felt (totalt ca 42 vinranker), som har blitt behandlet tidligere med melk.

Kontroll: Ingen behandling ble applisert til 6 Chardonnay felt (totalt ca 42 vinranker) som skal anvendes som kontroll, men de har tidligere vært behandlet med olje/myse.

Dyrkningsmetoder

Vitis vinifera (Chardonnay) vinranker i felt B2:

Vertikale skudd posisjonert med bueformet rotting.

Dyrkningsarrangement

Avstand: Avstand på 2,5 m mellom rader og 1,25 m mellom vinranker (innen rad), med 3200 vinranker per hektar. Rad-orienteringen var nord til sør.

Canopy tetthet.

Punkt- kvadrat metoden ble anvendt for å karakterisere pre-forsøk canopytetthet av Chardonnay vinrankene (tabell 21). Målinger ble tatt den 13. januar 2005 ved å selektere representative seksjoner av canopyen innen Chardonnay- feltene som tidligere har blitt enten behandlet med svovel eller ikke vært behandlet. 10 målinger ble tatt i hver av de 6 felter av hver før behandling. (Det vil si totalt på 60 målinger for svovel-behandlete felter og 60 målinger for ubehandlete kontrollfelter), lengden og antallet ledd på 3 oppovervendte stengler (per felt) ble målt.

Generelle betingelser.

Tidligere behandling av disse felter med eksperimentelle materialer undertrykker pulveraktig meldugg I sammenligning med ubehandlet kontroll. Imidlertid, nivået av pulveraktig meldugg var vurdert som kommersielt uakseptabel, selv om det var likt i både melk og olje/myse behandlete felt.

Applikasjonsmetode, dosering og regime.

YGP-GET behandling (4 ml/L) ble applisert den 7. februar 2005 med et håndvåpen forbundet til en slange og pumpe montert på flatt lasteplan i et kjøretøy. Sprayen ble propellert med et pumpetrykk på 1500 - 1600 kPa (200- 230 psi), som avga ca 63 ml/sekund. Standard sprayvolum for konvensjonelle behandlinger (ca 900 l/ha) ble anvendt.

Alvorligheten av pulveraktig meldugg, estimert som areal (%) av vinrankebuntene som var dekket med aktive melduggkolonier, ble undersøkt for 20 bunter utvalgt vilkårlig innen hvert plott (10 bunter per panelside). Sykdomsalvorlighet ble undersøkt den 4. februar 2005, 3 dager før applisering av YGP-GET behandlingen, og igjen den 10. februar 2005, 3 dager etter terpen appliseringen.

Data ble transformert ved anvendelse av arcsin - transformasjon for å oppnå gjennomsnittlige separeringer.

Resultater

Før behandling var den gjennomsnittlige alvorlighet av pulveraktig meldugg på Chardonnay vinrankebunter i de 6 felt som skulle behandles med terpen 20,4 % tilsvarende til de 6 kontrollfelt (23,2 %; tabell 22). Statistisk analyse basert på arcsin-transformasjon av disse data fant at det var ingen signifikant forskjell i sykdomsalvorlighet før behandling (tabell 23).

Tre dager etter behandling var imidlertid gjennomsnittlig alvorlighet av pulveraktig meldugg 23,8 % på de YGP-GET behandlede bunter versus 37,8 % på kontroller (tabell 22). Arcsin- transformasjon av disse data viste en statistisk signifikant forskjell i favør av terpen- behandlede vinrankebunter, som hadde et mindre areal dekket med aktive melduggkolonier (p = 0,058; tabell 23).

Diskusjon:

Infeksjon av druevinranker med pulveraktig meldugg kan forårsake betydelige tap for dyrkere pga skadelige effekter på vinrankevekst og hardførhet, og likeledes på kvaliteten av frukten og vinen. I organisk behandlete vinranker søker dyrkere etter alternativer for behandlinger med grunnsubstansen svovel.

Dette forsøk har undersøkt effektiviteten av innkapslete terpenformuleringer (4 ml/) som en væskeformulering i å regulere pulveraktig meldugg i en organisk vingård i Tasmania, Australia. Mens andre eksperimentelle behandlinger er blitt anvendt så lite som tre uker før terpen applisering, ble nivået av pulveraktig meldugginfeksjon fremdeles vurdert som konvensjonelt uakseptabelt. 3 dager etter behandling av Chardonnay vinranker med YGP-GET var alvorligheten av den pulveraktige meldugg på de behandlete druer signifikant mindre enn for ubehandlete kontroller. Mens alvorligheten av infeksjonen i ubehandlete kontroller ble forverret under de seks dager mellom pre- og på behandlings undersøkelser, var den stabil i behandlete vinranker, derfor, YGP-GET synes å ha forsinket hastigheten i sykdomsøkningen på drueklaser som hadde vel- etablerte kolonier av sporulerende pulveraktige meldugg før behandling. Formodentlig har koloniekspensjon blitt inhibert, selv om eksisterende kolonier fortsatte og sporolere i noen grad. Mer langtidsvirkende undersøkelse på effektivitet var ikke mulig pga at dyrkeren deretter sprayet hele forsøksarealet med svovel. Disse oppløftende resultater viser effektiviteten av YGP-GET i å regulere pulveraktig meldugg i druevinranker.

Eksempel 20 - Feltforsøk av innkapslet terpenmateriale på Botrytis.

Botrytis klaseråtning av druer forårsakes av Botrytis cinerea, en vanlig fungus som kan forårsake alvorlige tap i fruktfelt. Bærene er den hoveddominerende sted av infeksjon, selv om sykdommen også kan påvirke blomstring og blader. Innledningsvis fremtrer infeksiøse bær som myke og vannaktige, og kan bli dekket med grå fengas vekst i tilstander av høy humiditet og fuktighet. Over tid vil infiserte bær visne og falle av. Botrytis foretrekker humide betingelser med dårlig luftsirkulasjon, og delte og ødelagte bær er spesielt mottagelige for spredning av infeksjon. Behandlings strategier for Botrytis inkluderer og tilveiebringe god luftsirkulasjon, hindre sår og applikasjon av fungicider ved hensiktsmessige tider i vekstsesongen.

Formålet med dette forsøk var og undersøke effektiviteten av YGP-GET i behandling av Botrytis infeksjon i druer.

Fremkomst av Botrytis i Kir-Yianni vingården i midten av oktober 2004 (tre uker etter en applisering av Teldor®) kunne ikke behandles med konvensjonelle agrokjemi-kalier pga at den assosierte re-inngangstids restriksjonen ville hindre den planlagte innhøstingen. To tilgrensende 0,1 ha felt ble derfor identifisert for plass 8 i vingården, og, den 12. oktober 2004 ble et av disse felt behandlet med 4 ml/L YGP-GET væskeformulering og det andre ble ikke behandlet (se fig 23). Avlingen ble høstet tre dager senere, og forholdet mellom infiserte bær ble bestemt for hvert felt

(prosentandel vekt av totalt utbytte). Ikke- infiserte bær fra både behandlet og ubehandlete felt ble deretter blandet i fermenteringstanken.

Plass 7 hadde blitt behandlet med flere produkter før applisering av terpenformuleringen men viste fremdeles Botrytis infeksjon.

Vinrankene ble gitt en enkel applisering av 4 ml/L YGP-GET væskeformulering med en hastighet av 1200 L/ha.

De følgende veksttrinn for vinrankene ble registrert:

Knoppskyting, 26. mars 2004

Blomstring, 1. juni 2004

Veraison 6. august 2004

Høsting, 15. oktober 2004

Appliseringen av forsøksmedikament tok plass 3 dager før innhøsting.

2004 vekstsesongen var eksepsjonelt sen og var våt. Sykdomstrykket fra dunet meldugg var ekstremt høy, pulveraktig melduggstrykk var moderat og Botrytisnivå var forhøyet.

YGP-GET ble applisert på denne tid for å undersøke dets potensielle effektivitet mot en Botrytisinfeksjon som ikke på annen måte kunne blitt behandlet pga pesticid tidsrestriksjoner før innhøsting.

Visuell undersøkelse av stedet før terpenprodukt applisering viste Botrytis infeksjon. Etter innhøsting ble bærene fremvist på et transportbelte og infiserte bær ble manuelt separert fra ikke- infiserte bær før pressing. Andelen infiserte bær ble beregnet som en prosentandel av det totale utbyttet (basert på vekt for hvert felt).

Resultater

Visuell undersøkelse av stedet før YGP-GET applikasjon viste bevis på Botrytis infeksjon. Etter innhøsting (3 dager etter YGP-GET applikasjon), var forhåndstallene for infiserte bær 13 % og 23 % i det behandlete og ikke-behandlete felt respektiv. De testete områder var ikke tilstrekkelig til å undersøke statistisk signifikans, imidlertid, YGP-GET - behandling viste klart redusert utvikling av sykdommen. Fragmenteringen ble ikke påvirket ved å blande ikke- infiserte bær fra de ubehandlete og terpen- behandlete felt.

Diskusjon

Konvensjonelle behandlinger for Botrytis må avsluttes 3 uker før innhøsting, noe som kan gjøre betydelig skade for avlingsutbyttet og kvalitet. Utviklingen av en behandling som kan anvendes helt inn til innhøsting, eller som kan fortsette nærmere innhøsting enn eksisterende produkter, kan resultere i signifikante forbedringer i avlingsutbyttet og vinkvalitet, og er av betydelig nytte for dyrkerne. I dette forsøk viste behandling med terpenproduktet YGP-GET en synlig redusert utvikling av en etablert Botrytis infeksjon kun 3 dager før innhøsting, noe som resulterte i en lavere andel infiserte bær i det terpen- behandlede felt enn i ikke-behandlete felt. Videre, til tross for anvendelse av YGP-GET nær opp til innhøsting, var fermenteringen ikke påvirket av kombinasjonen av behandlete og ubehandlete druer.

Disse resultater antyder at YGP-GET er effektiv i å redusere virkningen av etablerte Botrytis infeksjoner og kan anvendes nær innhøsting uten skadelige effekter på påfølgende fermenterer.

Eksempel 21- Evaluering av innkapslete terpener for behandling av etablert dunet meldugg og påfølgende evaluering av druekvalitet.

Et forsøk med YGP-GET ble utført 25.08.04 ved å applisere materialer i en hastighet av 1000g per250liter.

En vingård med Cabernet Sauvignon som var 100 % infisert og som lider av betydelig bladtap pga dunet meldugg ble sprayet. Gjenværende blad var infisert av flekker av dunet meldugg som vist med gule flekker på toppen av bladene og håret vekst på undersiden av bladene; den klassiske indikasjon på dunet meldugg. Mange av bladene var omtrent helt gule, noe som indikerer en betydelig infeksjon. Dette bladtap og infeksjon vil generelt forsinke modningen av druene og i mange tilfeller blir druene aldri fullt modne for vinfremstillingsformål.

Observasjon av totalt umodne (dvs. harde, mørkegrønne bær,~1cm i diameter og oval i form) klaser innimellom i vinrankene indikerte at vinrankene sannsynligvis var infisert før veraison, og sannsynligvis ved blomstring eller tidligere. Ingen tidligere kopper (Bordeaux eller basis koppersulfat applisering har blitt anvendt). Denne vingård var tungt infisert i den forrige innhøsting til det punkt at ingen avling ble produsert fra Cabernet Sauvignon. Bladtap sist år var 100 % til tross for kaliumbikarbonat behandling i et forsøk på å kontaktdrepe melduggen, etterfulgt av Stilbourin- applisering for langtids systemisk beskyttelse.

Den 19.09.04 ble druene behandlet i dette forsøk plukket og knust, og følgende observasjoner ble gjort (tabell 24):

Disse resultater indikerer at druene fra de behandlete vinranker er mer modne enn de ikke-behandlete vinranker. Observasjoner indikerer at de ubehandlete druer var, i gjennomsnitt, lysere i farge, noen med en transparent rosa /purple /grønn tone, noe som indikerer druer like etter veraison, mens de behandlete druer var mørk lilla i gjennomsnitt og ugjennomskinnelige, typisk for fullt ut eller nærmest fullt ut modnete druer.

Smakstesting av disse druer viste at de behandlete druer har en fyldigere fruktlig smak typisk for modne Cabernet Sauvignon, mens de ubehandlete druer ikke hadde den samme fyldige fruktsmak. De ubehandlete druer har en grønn eplesur smak, noe som indikerer sannsynligvis et høyt malisk/ tartarisk forhold som er uegnet for god vinproduksjon.

Disse druer ble knust og avstilket i fremstillingen for å produsere en vin fra disse druer for å vise forskjellen mellom disse druer, og for å vise hensiktsmessigheten av de behandlete druer for vinproduksjon. Drueprodusenten var bekymret for at denne behandling ville påvirke smaken i vinen, selv om han etter mitt forslag smakte på behandlete druer dagen etter applisering av YGP-GET og fant ingen tvilsom smak eller aroma.

Forskjellen mellom behandlete og ubehandlete druer vises videre i fargen av druesaften. Saften fra de ubehandlete druer var lys grønnaktig /ufarget (noe lignende en hvitvinsaft) mens druesaften fra de behandlete druer var en rosaaktig farge typisk for modne Cabernet Sauvignon druer umiddelbart etter knusing. Disse resultater indikerer at YGP-GET er effektiv i sensommer vingårdbehandling ved å drepe og stoppe dunet meldugg re-infeksjon, i det minste i et kort perspektiv.

Ytterligere forsøk på langtidseffektivitet av YGP-GET for å regulere dunet meldugg vil være nyttig, men resultatene presentert nedenfor viser at YGP-GET er en nyttig behandling.

Sen start av dunet meldugg kan fullstendig ruinere en avling og det er for tiden ingen effektive behandlinger som kan appliseres kort tid før innhøsting, og som beholder evnen til å tilveiebringe beskyttelse. Den store styrke for YGP-GET er evnen til å tilveiebringe en hurtig dreping, og å opprettholde denne effektivitet over lengre tid enn andre kontaktfungicider.

Det er et antall anti- fungale midler på markedet som har etablerte resultater mot dunet meldugg, men alle trenger noe tid etter applisering før avlingen kan høstes. Noen behandlinger (så som svovelinneholdende produkter) kan ikke anvendes dersom temperaturen stiger over 85 ° F. Fytotoksisitet av kopper inneholdende fungicider er også signifikant avhengig av varieteten av druene. Kontaktfungicider har ikke en langtidseffekt slik at en andre applisering av et mer langtidsvirkende fungicid ofte er nødvendig, men dette kan være begrenset pga relevante reguleringer (for eksempel PHI eller REI).

Mange konvensjonelle behandlinger for dunet meldugg haren begrenset gjeninnføring (REI og /eller PHI) som betyr at dyrkeren ikke kan applisere behandlingen i frykt for at han vil applisere noe som Mancozeb, som har en PHI på 66 dager, og dyrkeren vil deretter ikke være i stand til å høste druene når de er helt modne.

Dunet meldugg er implisert som den primære årsak for mange dårlige viner som produseres øst for Mississippi. YGP-GET kan muliggjøre at angrepene druer kan modne hensiktsmessig, og kan plukkes når de er på sitt mest modne i denne hurtigvoksende industri. Fordelaktig YGP-GET bør være spisbar for godkjennelse av de mange forskjellige "organiske" komiteer (mange er selvutnevnte) som dette produkt er egnet for anvendelse for druer som vokser etter "organiske" retningslinjer. Dette åpner en annen nisje i et hurtigvoksende marked segment i USA og resten av verden.

Eksempel 22 - In vitro undersøkelse av de fungicidale egenskaper av innkapslet og ikke-innkapslet terpener.

Ytterligere tester ble utført for å undersøke de 31 ikke- innkapslete terpen preparater angitt i eksempel 15 og preparater 16 og 22 innkapslet i glukanpartikler.

For å utføre denne analyse ble 20 000 sporer plassert i 1/3 styrke potet dekstrose buljong (PDB) og tilstrekkelige mengder av selekterte terpen formuleringer ble tilsatt for å gi konsentrasjoner i området 10 til 1000 ppm. Disse testmaterialer ble plassert i separate sterile lukkete Eppendorf rør med Botrytis cinerea ( B.C sporer), inkubert i 24 t, og deretter ble sporene fjernet med sentrifugering, og terpenløsningene ble kastet. Sporene /biomassen ble skylt med sterilt vann, sentrifugert igjen, og ble deretter ført tilbake i 300 ul av 1/3 styrke PDB og overført til 96 brønns plate. Den optiske tetthet for de overlevende sporer som vokser til mycelia ble målt over tid. Fungicidal aktivitet defineres som total dreping av 20 000 sporer etter 24 timer terpen eksponering, som viste fravær av mycelia vekst.

Resultatene antyder at visse formuleringer ikke var fungicidale med et statistisk signifikant nivå under foreliggende test betingelser (resultater ikke vist).

Disse var:

1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30. Viser til eksempel 15 (tabell 17) for detaljer av materialene.

Minimums inhibitorisk konsentrasjon for de mest effektive forbindelser er gitt i tabell 26.

Sammenlignende testing av forbindelser i vann og innkapslet i hule glukanpartikler.

Prøver av formuleringer 16 (geraniol, eugenol og tymol) og 22 (eugenol, tymol og citral) innkapslet i hule glukanpartikler ble fremstilt i samsvar med teknikkene tidligere beskrevet. De fungicidale egenskaper ble deretter undersøkt for innkapsling og ikke- innkapslete formuleringer ved anvendelse av protokollen tidligere beskrevet for ikke- innkapslete formuleringer.

Resultatene ble ganske forskjellig ved innkapslete terpenformuleringer sammenlignet med terpenene suspendert i vann, som vist i fig 24.

Minimums effektiv konsentrasjon er vist nedenfor i tabell 26.

Således, resultatene med materialene 16 og 22 er ganske forskjellige idet de er i vanlig suspensjon og det de testes innkapslet i glukanpartikler (merk: som nevnt senere, der var noe variabilitet i resultatene med terpener suspendert i vann, og eksperimentet gitt ovenfor er et eksempel på dette). MIC verdiene er sammensatt av flere forsøk. Viktig, resultatene med innkapslete terpenformuleringer lider ikke av problemene av variabilitet som er assosiert med vanlige terpensuspensjoner. Der har blitt utført 5 separate tester av terpener suspendert i vann og 3 med YPer.

Innkapslete terpenformuleringer er enkelt blandbare med vann og tilveiebringer en langsom frigivelse av terpenformulering til det vandige medium. Dette resulterer i en lengre eksponeringstid av sporene for terpener.

Problemer med å monitorere de ikke-innkapslete terpenformuleringer i suspensjon i testmedia som ble opplevd kan ha påvirket resultatene.

Claims (72)

1. Materiale,karakterisert vedat det omfatter en hul glukanpartikkel eller hul celleveggpartikkel som innkapsler en terpenkomponent, hvor lipidinnholdet av nevnte hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel er 5 % vekt/vekt eller mer.

2. Materiale i samsvar med krav 1,karakterisert vedat den hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel er en fungal cellevegg.

3. Materiale i samsvar med krav 2,karakterisert vedat den hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkelen er en gjærcellevegg.

4. Materiale i samsvar med krav 3,karakterisert vedat gjærcelleveggen er avledet av en bakers gjærcelle.

5. Materiale i samsvar med et av kravene 1-4,karakterisert vedat den hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel er et uløselig avfallsprodukt fra en gjærekstrakt fremstillingsprosess.

6. Materiale i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert vedat den hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel har blitt alkalisk ekstrahert.

7. Materiale i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert vedat nevnte hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel har blitt syreekstrahert.

8. Materiale i samsvar med krav 1,karakterisert vedat lipidinnholdet er 10 % vekt/vekt eller mer.

9. Materiale i samsvar med et av de foregående krav, hvor terpenkomponenten omfatter en eller flere terpener valgt blant gruppen omfattende citral, pinen, nerol, b-ionon, geraniol, carvacrol, eugenol, carvon, (for eksempel L-carvon), terpeniol, anetol, camfor, mentol, tymol, limonene, nerolidol, farnesol, fytol, karoten (vitamin Ai), squalen, tymol, tokotrienol, perillyl alkohol, borneol, myrsen, simen, caren, terpenen, linalool eller en blanding derav.

10. Materiale i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter et terpen med den generelle struktur C10H16.

11. Materiale i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter en eller flere terpener valgt blant gruppen omfattende geraniol, tymol, citral, karvon (for eksempel L-carvon), eugenol, b-ionon eller blanding derav.

12. Materiale i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter en blending av geraniol, tymol og eugenol.

13. Materiale i samsvar med krav 11,karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter 100 % tymol.

14. Materiale i samsvar med krav 11,karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter 50 % geraniol og 50 % tymol vekt/vekt.

15. Materiale i samsvar med krav 11,karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter 50 % eugenol og 50 % tymol vekt/vekt.

16. Materiale i samsvar med krav 11,karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter 33 % geraniol, 33 % eugenol og 33 % tymol vekt/vekt.

17. Materiale i samsvar med krav 11,karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter 33 % eugenol, 33 % tymol og 33 % citral vekt/vekt.

18. Materiale i samsvar med krav 11,karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter 25 % geraniol, 25 % eugenol, 25 % tymol og 25 % citral vekt/vekt.

19. Materiale i samsvar med krav 11,karakterisert vedat terpenkomponenten omfatter 20 % geraniol, 20 % eugenol, 20 % citral, 20 % tymol og 20 % L-Carvon vekt / vekt.

20. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat terpenkomponenten er assosiert med en surfaktant.

21. Materiale i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert vedat surfaktanten er valgt blant gruppen omfattende natrium lauryl sulfat, polysorbat 20, polysorbat 80, polysorbat 40, polysorbat 60, polyglyseryl ester, polyglyceryl monooleate, dekaglyceryl monokaprylat, propylen glykol dikaprilat, triglyserol monostearate, polyoksyetylensorbitan monooleat, sorbitan monosterarat, sorbitan monooleate, polyoxyetylen (4) lauryl eter eller en blanding av to eller flere derav.

22. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det omfatter 1 til 99 % basert på volum av terpener, 0,99 % basert på volum, surfaktant, og 1 til 99 % hule glukanpartikler eller celleveggpartikler.

23. Materiale i samsvar med krav 22,karakterisert vedat det omfatter fra 10 til 67 % vekt/vekt terpener, fra 0,1 til 10 % vekt/vekt surfaktant, og fra 40 til 90 % vekt/vekt hule glukanpartikler eller hule celleveggpartikler.

24. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat terpenene som anvendes er næringsklassifisert.

25. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det omfatter ytterligere næringsklassifiserte aktive forbindelser.

26. Materiale i samsvar med krav 25, karakterisert vedat det ytterligere næringsgraderte aktive forbindelse er et antimikrobielt middel eller enzym.

27. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det omfatter et antimikrobielt middel, et antifungalt middel, et insektmiddel, et antiinflammatorisk middel eller et anestetisk middel.

28. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det ytterligere omfatter en antioksidant.

29. Materiale i samsvar med krav 28,karakterisert vedat antioksidanten er rosmarinolje, vitamin C eller vitamin E.

30. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det er i form av et tørt pulver.

31. Materiale i samsvar med krav med ethvert av kravene 1 -29, karakteris ert ved at det er i form av en pellet, tablett eller annen faststoff form.

32. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det omfatter et dispergerende middel som fremmer dispergering av materialet idet det plasseres i en væske.

33. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det er i kombinasjon med et agrikulturelt, nærings eller farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient i en væske, faststoff eller gel-lignende form.

34. Materiale i samsvar med ethvert av kravene 1 -29,karakterisert vedat det er suspendert eller oppløst i en væske.

35. Materiale i samsvar med krav 34,karakterisert vedat væsken er vann.

36. Materiale i samsvar med enten krav 34 eller 35,karakterisert vedat det omfatter 500 til 10 000 ppm hule glukanpartikler eller celleveggpartikler, hvor partiklene inneholder 1 til 67 % terpenkomponent.

37. Materiale i samsvar med ethvert av kravene 34-36,karakterisertve d at det omfatter mellom 1 ppm og 25 ppt av terpenkomponenten.

38. Materiale i samsvar med krav 37,karakterisert vedat det omfatter mellom 100 til 1000 ppm av terpenkomponenten.

39. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det omfatter et fuktmiddel, et emulsifiserende middel eller et pH-bufrende middel.

40. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det er dispergert i en væskeformig mat-eller drikkemateriale for menneske eller dyr.

41. Materiale i samsvar med ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat det er i en form egnet for oral administrering.

42. Materiale i samsvar med ethvert av kravene 1 -38,karakterisert vedat det er i en form egnet for parenteral administrering.

43. Materiale i samsvar med ethvert av kravene 1-38karakterisert vedat det er i en form egnet for topikal administrering.

44. Fremgangsmåte for å fremstille en hul glukanpartikkel eller hul celleveggpartikkel som innkapsler et terpenkomponent i samsvar med ethvert av kravene 1-43,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene: a) tilveiebringe en terpenkomponent; b) tilveiebringe en hul glukanpartikkel eller hul celleveggpartikkel; c) inkubere terpenkomponenten med glukanpartikkelen eller hul celleveggpartikkelen under egnete betingelser for terpeninnkapsling og d) å gjenvinne glukanpartikkelen eller hule celleveggpartikkel som innkapsler terpenkomponenten.

45. Fremgangsmåte i samsvar med krav 44,karakterisert vedat den ytterligere omfatter trinnet å tørke den hule glukanpartikkelen eller den hule celleveggpartikkelen som innkapsler terpenkomponenten.

46. Fremgangsmåte i samsvar med krav 45,karakterisert vedat tørking oppnås med frysetørking, fluidisert bed tørking, trommeltørking eller spraytørking.

47. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 44-46,karakterisert vedat, i trinn a, tilveiebringes terpenkomponenten som en suspensjon i en vandig oppløsningsmiddel.

48. Fremgangsmåte i samsvar med krav 47,karakterisert vedat terpenkomponenten tilveiebringes i forbindelse med en surfaktant.

49. Fremgangsmåte i samsvar med krav 48,karakterisert vedat surfaktanten er polyoksyetylensorbitan monooleat i en konsentrasjon av 0,1 til 10 %, basert på volum av den totale reaksjonsblanding.

50. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 44-49,karakterisert vedat, i trinn b, tilveiebringes den hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel som en suspensjon i vann eller annen egnet væske.

51. Fremgangsmåte i samsvar med krav 50,karakterisert vedat suspensjonen omfatter 1 til 1000 mg hule glukanpartikler eller hule celleveggpartikler per ml.

52. Fremgangsmåte i samsvar med krav 50,karakterisert vedat partiklene dispergeres i et volum av fra det hydrodynamiske volum ((HV) til 1,5 HV væske.

53. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 44-49,karakterisert vedat,i trinn b, tilveiebringes den hule glukanpartikkel eller hule celleveggpartikkel som et tørt pulver.

54. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 44-53,karakterisert vedat, i trinn c, utføres reaksjonen ved atmosfærisk trykk ved en temperatur av 20 til 37 ° C.

55. Fremgangsmåte for å drepe en mikroorganisme,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: Å sette nevnte mikroorganisme i forbindelse med et materiale i samsvar med ethvert av kravene 1-43.

56. Fremgangsmåte for å behandle eller hindre infeksjon i en plante, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: administrering i en terapeutisk effektiv dosering, et materiale i samsvar met ethvert av kravene 1-43 til planten eller til jorden i nærheten av planten.

57. Fremgangsmåte i samsvar med krav 56,karakterisert vedat infeksjonen i planten er forårsaket av en nematode.

58. Fremgangsmåte i samsvar med krav 56,karakterisert vedat infeksjonen i planten er forårsaket av en fungus.

59. Fremgangsmåte i samsvar med krav 58,karakterisert vedat fungusen er dunet meldugg, pulveraktig meldugg eller Botrytis klaseforråtnelse.

60. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 56-60,karakterisert vedat planten er en druevinranke.

61. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 56-60,karakterisert vedat materialet administreres 21 dager eller mindre før innhøsting av avlingen fra planten.

62. Fremgangsmåte i samsvar med krav 61,karakterisert vedat materialet administreres 14 dager eller mindre før innhøsting.

63. Fremgangsmåte i samsvar med krav 62,karakterisert vedat materialet administreres 7 dager eller mindre før innhøsting.

64. Fremgangsmåte i samsvar med krav 63,karakterisert vedat materialet administreres tre dager eller mindre før innhøsting.

65. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 56-64,karakterisert vedat materialet administreres med spraying.

66. Fremgangsmåte i samsvar med krav 65,karakterisert vedat materialet sprayes på med en hastighet av 500 L/ha eller mer.

67. Fremgangsmåte i samsvar med krav 66,karakterisert vedat materialet sprayes på med en hastighet av 900 L/ha eller mer.

68. Fremgangsmåte i samsvar med krav 67,karakterisert vedat materialet sprayes på med en hastighet av 1200 L/ha eller mer.

69. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av kravene 56-64,karakterisert vedat materialene administreres ved irrigasjon.

70. Materialet i samsvar med ethvert av kravene 1-43, for anvendelse i å hindre eller behandle en infeksjon i en pasient eller en plante.

71. Anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 1-43, for fremstilling av et medikament for behandling av en infeksjon i en pasient.

72. Anvendelse i samsvar med krav 71, hvor infeksjonen er forårsaket av Aspergillius fumigatus, Sclerotinta homeocarpa, Rhizoctonia solani, Colletotricum graminicola eller Penicillium sp.