MXPA06013420A - Composiciones que contienen una particula hueca de glucano o una particula de pared celular que encapsula un componente de terpeno, metodos para elaborar y usar las mismas. - Google Patents

Composiciones que contienen una particula hueca de glucano o una particula de pared celular que encapsula un componente de terpeno, metodos para elaborar y usar las mismas.

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Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden una particula hueca de glucano o particula de pared celular que encapsula un componente de terpeno, metodos para su elaboracion y su uso. Las composiciones son adecuadas para prevenir y tratar infecciones en plantas y animales, incluyendo humanos.

Description

COMPOSICIONES QUE CONTIENEN UNA PARTÍCULA HUECA DE GLUCANO O UNA PARTÍCULA DE PARED CELULAR QUE ENCAPSULA UN COMPONENTE DE TERPENO, MÉTODOS PARA ELABORAR Y USAR LAS MISMAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones que comprenden terpenos y partículas huecas de glucano o partículas de pared celular y métodos para preparar estas composiciones. Las composiciones incrementan la estabilidad y actividad de los terpenos y proporcionan un portador adecuado para los terpenos. La invención también se refiere a métodos para usar estas composiciones en los campos médico, veterinario y agrícola.
Antecedentes de la Invención Los terpenos son compuestos químicos que están ampliamente generalizados en la naturaleza, principalmente en plantas como constituyentes de aceites esenciales. Su bloque constituyente es el hidrocarburo isopreno (C5H8)n-Los ejemplos de terpenos incluyen citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, terpeniol, acetol, canfor, mentol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno (vitamina Ai), escualeno, timol, tocotrienol, alcohol perilílico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpeneno y linalool.
REF. : 177762 Los terpenos se clasifican como "reconocidos en general como seguros" (GRAS) y se han usado durante muchos años en las industrias de saborizantes y aromas. La LD50 de citral en ratas es aproximadamente 5 g/kg, que es una indicación adicional de la seguridad relativa de estos compuestos. Adicionalmente, los terpenos tienen un intervalo de vida relativamente corto de aproximadamente 28 días una vez expuestos a oxígeno (por ejemplo, aire) . Los terpenos se descompondrán a C02 y agua. Esta descomposición o fraccionamiento de terpenos demuestra la seguridad y amigabilidad ambiental de las composiciones y métodos de la invención. Se ha encontrado que los terpenos inhiben el crecimiento de células cancerosas, disminuyen el tamaño de tumor, disminuyen los niveles de colesterol, y tienen un efecto biocida en microorganismos in vi tro . Owawunmi, (Letters in Applied Microbiology, 1993, 9(3): 105-108), mostró que los medios de crecimiento con más de 0.01 % de citral redujeron la concentración de E. coli , y a 0.08 % hubo un efecto bactericida. La patente de los Estados Unidos número 5,673,468 describe una formulación de terpeno, basada en aceite de pino, usada como un desinfectante o limpiador antiséptico. La patente de los Estados Unidos número 5,849,956 enseña que un terpeno encontrado en el arroz tiene actividad antifungal. La patente de los Estados Unidos número 5,939,050 describe un producto antimicrobiano de higiene oral con una combinación de 2 ó 3 terpenos que mostró un efecto sinérgico. Varias patentes de los Estados Unidos (patentes de los Estados Unidos números 5,547,677, 5,549,901, 5,618,840, 5,629,021, 5,662,957, 5,700,679, 5,730,989) enseñan que ciertos tipos de emulsiones de aceite en agua tienen propiedades antimicrobianas, adyuvantes y de distribución. Se ha encontrado que los terpenos son agentes antitumor dietéticos no tóxicos y efectivos, que actúan a través de una variedad de mecanismos de acción (Crowell et al., Crit. Rev. Oncog. , 1994, 5(1): 1-22; Crowell et al., Adv. Exp. Med. Biol., 1996, 401: 131-136). Los terpenos geraniol, tocotrienol, alcohol perilílico, b-ionona, y d-limoneno, suprimen la actividad de HMG-CoA-reductasa hepática, un paso limitante de velocidad en la síntesis de colesterol, y disminuyen de forma modesta los niveles de colesterol en animales (Elson et al., J. Nutr., 1994, 124: 607-614) . El d-limoneno y geraniol redujeron tumores mamarios (Elegbede et al., Carcinogenesis, 1984, 5(5): 661-664; Elegbede et al., J. Nati. Cáncer Inst., 1986, 76(2): 323-325; Karlson et al., Anticancer Drugs, 1996, 7(4): 422-429) y suprimieron el crecimiento de tumores trasplantados (Yu et al., J. Agri. Food Chem., 1995, 43:2144-2147). Se ha encontrado que los terpenos inhiben el crecimiento in vi tro de bacterias y hongos (Chaumot et al.), Ann. Pharm. Fr., 1992, 50(3): 156-166; Moleyar et al., Int. J. Food Microbiol, 1992, 16(4): 337-342; y Pattnaik et al., Microbios, 1997, 89(358): 39-46) y que algunos parásitos internos y externos (Hooser et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., 1986, 189(8): 905-908). Se encontró que el geraniol inhibe el crecimiento de cepas de Candida albi cans y Saccharomyces cerevisiae al mejorar la velocidad de fuga de potasio y al interrumpir la fluidez de membrana (Bard et al., Lipids, 1998, 23(6): 534-538). La b-ionona tiene actividad antifungal que se determinó por la inhibición de germinación de esporas, e inhibición de crecimiento en agar (Mikhlin et al., A. Prikl. Biokhim. Miokrobiol, 1983, 19:795-803; Salt et al., Adam. Physiol. Molec. Plant Path, 1986, 28:287-297). La teprenona (geranilgeranilacetona) tiene un efecto antibacteriano en H. pylori (Ishii, Int. J. Med. Microbiol.
Virol. Parasitol. Infect. Dis., 1993, 280(1-2): 239-243).
El rosanol, un producto comercial con 1 % de aceite de rosa, se ha mostrado que inhibe el crecimiento de varias bacterias { Pseudomonas, Staphylococus , E. coli , y H. pylori ) . El geraniol es el componente activo (75 %) de aceite de rosa. El aceite de rosa y el geraniol a una concentración de 2 mg/L inhibieron el crecimiento de H. pylori in vi tro . Se ha mostrado que algunos extractos de medicinas herbarias tienen un efecto inhibidor en H. pylori , el más efectivo que es angelato de ducursinol, ducursina, magnolol, berberina, ácido cinnámico, ducursinol y ácido gálico (Bae et al., Biol. Pharm. Bull., 1998, 21(9) 990-992). Los extractos de manzana de anacardo, ácido anacárdico, y (E) -2-hexenal han mostrado efecto bactericida contra H. pylori . Los diterpenos, es decir, tricorabdal A (de R .
Trichocarpa) , han mostrado un muy fuerte efecto antibacteriano contra H. pylori (Kadota et al., Zentralbl . Bakteriol, 1997, 287(1): 63-67). Las soluciones de 11 diferentes terpenos fueron efectivas en la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas en pruebas in vi tro; fueron efectivos niveles que varían entre 100 ppm y 1000 ppm. Los terpenos se diluyeron en agua con polisorbato 20 al 1 % (Kim et al., J. Agrie. Food Chem., 1995, 43: 2839-2845). Puede haber diferentes modos de acción de los terpenos contra microorganismos; pueden (1) interferir con la bicapa de fosfolípido de la membrana celular, (2) dañan una variedad de sistemas de enzimas (HMG-reductasa) , y (3) destruyen o inactivan el material genético. Se cree que debido a los modos de acción de los terpenos que son básicos, por ejemplo, bloqueo de colesterol, que los agentes infectivos no serán capaces de formular una resistencia a los terpenos . Sin embargo, hay varias desventajas en el uso de los terpenos. Estas incluyen: Los terpenos son líquidos que pueden hacer difícil el manejo y son inadecuados para ciertos propósitos. - Los terpenos no son muy miscibles en agua, y en general requieren el uso de detergentes, agentes tensioactivos u otros emulsionadores para preparar emulsiones acuosas. Sin embargo, se puede obtener una solución estable al mezclar los terpenos bajo alto esfuerzo cortante . Las formulaciones de terpeno en polvo seco contienen en general sólo un bajo porcentaje p/p de terpenos . - Los terpenos están propensos a la oxidación en sistemas acuosos de emulsión, que hacen un problema del almacenamiento a largo plazo. Existen limitaciones en las técnicas actuales de revestimiento por aspersión, extrusión, co-acumulación, encapsulación molecular, secado/enfriamiento por aspersión para proporcionar sistemas de distribución de ingredientes. Las paredes de células de levadura de panadero se derivan de células de levadura de panadero y se componen de los biopolímeros insolubles, ß-1, 3-glucano, ß-1, 6-glucano, mannano y quitina. Típicamente son microesferas de 2-4 micrones de diámetro con una pared de coraza que sólo es de 0.2-0.3 micrones de grueso que circunda una cavidad abierta. Este material tiene una considerable capacidad de retención de líquidos, que absorbe típicamente 5-25 veces su peso en líquido. La coraza es suficientemente porosa tal que pueden pasar a través de la coraza exterior cargas útiles de hasta 150,000 Daltons de tamaño y se absorben en la cavidad hueca de la partícula esférica. Las paredes de células de levadura de panadero tienen varias propiedades únicas, incluyendo estabilidad térmica (por ejemplo a 121 °C) , estabilidad al esfuerzo cortante, estabilidad a pH (por ejemplo, pH 2-12), y a altas concentraciones no acumulan viscosidad significativa. Además de sus propiedades físicas, esta composición contiene fibras dietéticas saludables y naturales que proporcionan beneficios de salud cardiovascular e inmunopotenciación. Se preparan paredes de células de levadura a partir de células de levadura por la extracción y purificación de la fracción insoluble en forma de partículas de los componentes solubles de las células de levadura. Las paredes de células fúngales se pueden producir a partir del subproducto insoluble de elaboración de extracto de levadura. Adicionalmente, las células de levadura se pueden tratar con una solución acuosa de hidróxido, sin romper las paredes de las células de levadura, que digiere la proteína y la porción intracelular de la célula, dejando al componente de la pared de célula de levadura desprovisto de contaminación significativa de proteína y teniendo sustancialmente la estructura de pared celular no alterada de los glucanos ß(l-6) y ß ( 1-3 ) -enlazados . Una descripción más detallada de las partículas enteras de glucano y el proceso para prepararlas se describe por Jamas et al . , en la patente de los Estados Unidos número 4,810,646 y en las solicitudes co-pendientes de patente de los Estados Unidos números de serie 166,929; 297,752; y 297,982. La patente de los Estados Unidos número 6,242,594, asignada a Novogen Research Pty Ltd. , describe un método para preparar partículas de glucano de levadura por extracción alcalina, extracción acida y luego extracción con un solvente orgánico y finalmente secado. La patente de los Estados Unidos número 5,401,727, asignada a AS Biotech-Mackzymal, describe los métodos para obtener proteínas de glucano de levadura y métodos para usarlas para promover la resistencia de materiales acuáticos y como un adyuvante para vacunas. La US 5,607,677, asignada a Alfa-Beta Technology Inc., describe el uso de partículas huecas de glucano entero como un paquete de distribución y adyuvante para la distribución de una variedad de agentes farmacéuticos. Las enseñanzas de las patentes y solicitudes mencionadas anteriormente se incorporan en la presente como referencia. Otros tipos de células de levadura y hongos tienen paredes celulares que no contienen glucano. Las paredes celulares de estas levaduras y hongos se pueden aislar por técnicas similares a aquellas mencionadas anteriormente para obtener partículas de pared celular. Adicionalmente, las células de muchas plantas, algas, bacterias y otros microorganismos también comprenden una pared celular. La estructura y composición de la pared celular varía entre los microorganismos, pero en general es una estructura fuerte y relativamente inerte. Es posible obtener partículas de pared celular derivadas de células a través de técnicas convencionales, tal como aquellas mencionadas anteriormente con relación a levadura. Ahora se ha encontrado que se pueden tomar terpenos y encapsular de forma estable dentro de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular. La encapsulación de terpenos en estas partículas se puede lograr por incubación de las partículas con el terpeno.
Breve Descripción de la Invención De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición que comprende una partícula hueca de glucano o una partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno . El término "partícula hueca de glucano" como se usa en la presente incluye cualquier partícula hueca que comprende glucano como un componente estructural. De esta manera, en particular, el término incluye paredes celulares de levadura (en forma purificada o cruda) o partículas huecas de glucano entero. El término "partícula de pared celular" se refiere a una partícula que comprende la pared de una célula (en una forma purificada o cruda) , en donde el glucano no es un componente estructural. Las partículas adecuadas incluyen las paredes celulares de células de planta, de algas, de hongos y bacterias. En general las partículas de paredes celulares retienen la forma de la célula de la cual se derivan, y de esta manera, al igual que la partícula hueca de glucano, proporcionan una cavidad central hueca adecuada para encapsular el componente de terpeno . Para la presente invención, es necesario que la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular sea capaz de encapsular de manera estable el componente de terpeno. En general, esto significa que la partícula hueca de glucano o la partícula de pared celular deba ser capaz de mantener su estructura durante la incubación con el componente de terpeno (en general, el componente de terpeno está a una concentración relativamente alta) , y que el componente de terpeno deba ser capaz de migrar a la partícula. Las partículas huecas de terpeno y las partículas de pared celular se forman en general de materiales relativamente inertes y son porosas, y de esta manera se puede asumir que, en general, las partículas huecas de glucano y las partículas de pared celular serán capaces de encapsular un componente de terpeno . Las composiciones de acuerdo a la presente invención son efectivas contra varios agentes infectivos que incluyen bacterias, virus, micoplasmas, hongos y/o nemátodos . Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden proporcionar las siguientes ventajas: - aumento al máximo de la carga útil de terpeno; - reducción al mínimo de la carga útil no encapsulada; - control de estabilidad de la carga útil; - control de cinética de liberación de la carga útil; - creación de una forma sólida de un terpeno sólido para incrementar la masa y uniformidad; - simplificación del manejo y aplicación de los terpenos ; y - enmascaramiento del olor y sabor del terpeno. Las partículas huecas de glucano particularmente adecuadas o partículas de pared celular son paredes de células fúngales, de manera preferente paredes de células de levadura. Las paredes de células de levadura son preparaciones de células de levadura que retienen la estructura tridimensional de las células de levadura de la cual se derivan. De esta manera, tienen una estructura hueca que permiten que el componente de terpeno se encapsule dentro de las paredes de células de levadura. Las células de levadura se pueden derivar de manera adecuada de células de levadura de panadero (disponibles de Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) . Las partículas de pared de célula de levadura con propiedades deseables también se pueden obtener de Biorigin (Sao Paolo, Brasil) bajo la marca comercial Nutricell MOS 55. Estas partículas son un extracto secado por aspersión de S. cerevisiae . Las partículas alternativas son aquéllas conocidas por los nombres comerciales SAF-Mannan (SAF Agri, Minneapolis, MN) y Nutrex (Sensient Technologies, Milwaukke, Wl) . Estas son partículas huecas de glucano que son la corriente de desperdicio en soluble del proceso de fabricación de extracto de levadura. Durante la producción de extractos de levadura, los componentes solubles de las células de levadura parcialmente autorizadas, se remueven y el residuo insoluble es un material adecuado para la carga de terpeno. Estas partículas huecas de glucano comprenden aproximadamente 25-35 % de beta-1 , 3-glucano p/p. Un atributo clave de estos materiales es que contienen más de 10 % p/p de lípido y son muy efectivos en absorber terpenos. Además, como un producto de corriente de desperdicio, son una fuente relativamente barata de partículas huecas de glucano.
Las partículas huecas de glucano, alternativas, que tienen mayor pureza son aquellas producidas por Nutricepts (Nutricepts Inc., Burnsville, MN) y ASA Biotech. Estas partículas se han extraído alcalinamente, lo que remueve los componentes intracelulares adicionales asi como remueve la capa exterior de mannoproteína de la pared celular produciendo una partícula de 50-65 % p/p de glucano. Las partículas huecas de glucano de mayor pureza son las partículas de WGP de Biopolymer Enginnering. Estas partículas son componentes de levadura adicionales de remoción por extracción acida que producen un producto de 75-85 % p/p de glucano. Las partículas huecas de glucano de muy alta pureza son Adjuvax1 de Alfa-beta Technology, Inc. (Worcester, MA) y glucano en micropartículas de Novogen (Stamford, CT) . Estas partículas son extraídas con solvente orgánico lo que remueve los lípidos residuales y de este modo las partículas comprenden más del 90 % p/p de glucano . En algunas modalidades, se puede requerir una partícula de glucano de alta pureza o partícula de pared celular de alta pureza, por ejemplo, donde se requiera un control estricto con respecto a posibles contaminantes. En estos casos, las partículas de mayor pureza se preferirán con respecto a otros productos menos puros. Para otras modalidades, las partículas menos puras se preferirán por razones económicas; aquellas partículas que se han encontrado también que son más efectivas en la absorción de terpeno . De manera preferente, la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular tiene un ligero contenido de lípidos, tal como de 1 ó 2 % p/p de lípidos. Un ligero contenido de lípido puede incrementar la capacidad • de la partícula para encapsular el componente de terpeno. De manera preferente, el contenido de lípido de la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular es de 5 % p/p o mayor, de manera más preferente, 10 % p/p o mayor. Opcionalmente, el componente de terpeno de la presente invención se puede asociar con un agente tensioactivo. El agente tensioactivo puede ser no iónico, catiónico, o aniónico. Los ejemplos de agentes tensioactivos adecuados incluyen lauril sulfato de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80, polisorbato 40, polisorbato 60, éster de poliglicerilo, monooleato de poliglicerilo, monocaprilato de decaglicerilo, dicaprilato de propilenglicol, monoestearato de triglicerol, polioxietilensorbitán, monooleato, Tween11, Span"1* 20, Span" 40, Span*11 60, Span"11 80, Brig 30 o mezclas de los mismos. El agente tensioactivo actúa para retener el componente de terpeno en una emulsión y también ayuda en la encapsulación del componente de terpeno en la partícula hueca de glucano o la partícula de pared celular. El componente de terpeno de la presente invención puede comprender un terpeno individual o una mezcla de terpenos. Las mezclas de terpenos pueden dar por resultado efectos sinérgicos. El término "terpeno" como se usa en la presente se refiere no sólo a terpenos de la fórmula (C5H8)n, sino también abarca derivados de terpeno, tal como aldehidos de terpeno o polímeros de terpeno. Los terpenos naturales y sintéticos incluyen, por ejemplo, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, y tetraterpenos . Además, la referencia a un nombre individual de un compuesto abarcará los varios isómeros de ese compuesto. Por ejemplo, el término citral incluye el cis-isómero citral-a (o geranial) y el trans-isómero citral-b (o neral) . Se debe señalar que los terpenos también se conocen por los nombres del extracto o aceite esencial que contienen, por ejemplo, el aceite de hierba de limón (contiene citral) . Los terpenos que se eximen de las regulaciones norteamericanas y que se listan en la regulación 40 de EPA C.F.R., parte 152 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) son adecuados para el uso en esta invención.
Los terpenos particularmente adecuados para el uso en la presente invención incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona (por ejemplo L-carvona), terpeniol, acetol, canfor, mentol, timol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno (vitamina Ai), escualeno, timol, tocotrienol, alcohol perilílico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpeneno, linalool y mezclas de los mismos. De manera preferente, los terpenos usados en la presente invención tienen la estructura general C?0H?6 puesto que este sub-grupo en general es más efectivo contra agentes infecciosos . De manera más preferente, el componente de terpeno comprende un terpeno seleccionado del grupo que consiste de geraniol, timol, citral, carvona (por ejemplo L-carvona) , eugenol y b-ionona. El componente de terpeno puede comprender de manera adecuada timol, puesto que este terpeno se ha mostrado que es particularmente efectivo en el tratamiento o prevención de infecciones fúngales de plantas . Otro terpeno particularmente adecuado es citral que ha demostrado eficacia particular contra varios microorganismos . Una combinación de geraniol, timol y eugenol ha demostrado eficacia particular al combatir infecciones de plantas, y de esta manera es un componente de terpeno particularmente adecuado. Otras formulaciones de terpeno que han mostrado alta eficacia en el tratamiento de infecciones de plantas incluyen (por ciento están en p/p) : - 100 % de timol; - 50 % de geraniol y 50 % de timol; - 50 % de eugenol y 50 % de timol; - 33 % de geraniol, 33 % de eugenol y 33 % de timol; - 33 % de eugenol, 33% de timol y 33 % de citral; - 25 % de geraniol, 25% de eugenol, 25 % de timol y 25 % de citral; - 20 % de geraniol, 20 % de eugenol, 20 % de citral, 20 % de timol y 20 % de L-carvona. Por consiguiente, un componente de terpeno que comprende cualquiera de las formulaciones anteriores es particularmente adecuado para el uso en la presente invención. En una modalidad, el componente de terpeno incluye uno o más terpenos que contienen oxígeno. El citral, por ejemplo, citral 95, es un terpeno de C10H16 oxigenado, C?oH?60 CAS número 5392-40-5 (3 , 7-dimetil-2 , 6-octadien-l-al) . Una suspensión estable de citral se puede formar hasta de aproximadamente 2500 ppm. Se ha elaborado citral en una solución con hasta aproximadamente 500 ppm. Se puede elaborar una suspensión estable de partículas huecas de glucano que incorporan citral de 25 ppt de citral. La composición de la invención puede comprender de 1 a 99 % en volumen de terpenos, de 0 a 99 % en volumen de agente tensioactivo y de 1 a 99 % de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular. De manera más específica, la composición puede comprender aproximadamente 10 % a aproximadamente 67 % p/p de terpenos, aproximadamente 0.1-10 % de agente tens oactivo y aproximadamente 40-90 % de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular. De manera adecuada, una composición de la presente invención comprende de aproximadamente 500 a aproximadamente 10,000 ppm de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular, donde las partículas contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 67 % del componente de terpeno. De manera preferente, la composición comprende de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2000 ppm de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular, donde las partículas contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 % de componente de terpeno. Las composiciones específicas pueden incluir, por ejemplo, para bacterias y hongos, partículas huecas de glucano o partículas de pared celular que encapsulan terpenos en agua o solución salina normal a 0.9 % con hasta 67 % de L-carvona, hasta 67 % de eugenol, hasta 67 % de citral, hasta 67 % de timol y L-carvona, hasta 67% de geraniol, o hasta 67 % de citral y L-carvona y eugenol, y 1 % de Tween"* 80; para moho, las partículas huecas de glucano o partículas de pared celular que encapsulan terpenos en agua o solución salina normal al 0.9 % con hasta 67 % de citral y 1% de Tween"* 80; o para micoplasma, partículas huecas de glucano o partículas de pared celular que encapsulan terpenos en agua o solución salina normal al 0.9 % con hasta 67 % de citral, hasta 67 % de L-carvona y eugenol, hasta 67 % de eugenol, hasta 67 % de geraniol, o hasta 67 % de geraniol, timol y 1% de Tween"* 80. Las concentraciones de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular que encapsulan terpenos de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 130, 140, 150, 160, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1250, 1375, 1425, 1500, 1600, 1750 ó 2000 ppm se pueden usar como concentraciones efectivas de las composiciones y métodos de la presente invención. Se pueden elaborar concentraciones aún mayores (hasta 25 ppt, es decir partes por mil) y pueden ser útiles en la presente invención. La composición de la presente invención puede comprender entre aproximadamente 1 ppm y aproximadamente 25 ppt (25000 ppm) del componente de terpeno, de manera preferente 100 a 2000 ppm del componente de terpeno, por ejemplo, 250, 500, 1000, 2000 ppm del mismo. Los terpenos, agentes tensioactivos y otros componentes de la invención se pueden comprar fácilmente o sintetizar usando técnicas conocidas en general en la química de síntesis. Es altamente preferido que los terpenos usados en la presente invención, por razones de seguridad y regulatorias, sean al menos, terpenos grado alimenticio (como se define por la FDA de los Estados Unidos o cuerpo regulador nacional equivalente fuera de los Estados Unidos) . Opcionalmente, la composición puede comprender otros compuestos activos grado alimenticio además del componente de terpeno, por ejemplo otros agentes antimicrobianos, enzimas, o similares. Opcionalmente, la composición puede comprender agentes activos adicionales además del componente de terpeno, por ejemplo un agente antimicrobiano, un agente antifungal, un agente insecticida, un agente antiinflamatorio, un anestésico o similar. Los agentes adecuados incluyen: Anti-fungales : Hidrolasas de pared celular (asumiendo que no degradan la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular) , inhibidores de síntesis de pared celular, antifungales normales. - Anti-bacterianos: Antisépticos, hidrolasas de pared celular, inhibidores de síntesis, antibióticos. - Insecticidas: Insecticidas naturales, quitinasa. La composición puede comprender un antioxidante para reducir la oxidación del terpeno. Un ejemplo de este antioxidante puede ser aceite de romero, vitamina C o vitamina E. La composición de la presente invención puede estar en la forma de un polvo seco. La composición se puede proporcionar en combinación con un portador o excipiente aceptable de forma agrícola, farmacéutica o para alimentos en una forma líquida, sólida o tipo gel. Para composiciones sólidas, los portadores adecuados incluyen grados farmacéuticos de mannitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. De manera adecuada, la formulación está en forma de tableta o granulo. Como portador adecuado también puede ser un material de alimento para humanos o animales. Adicionalmente, también se pueden usar portadores agrícolas convencionales.
Un comprimido, tableta u otra forma sólida de la composición, también puede contener de manera preferente un agente de dispersión que promueva la dispersión de la composición cuando se coloca en un líquido, por ejemplo, agua. Los agentes adecuados de dispersión incluyen goma de xantano, maltodextrina, alginatos o similares. Las composiciones líquidas se pueden preparar, por ejemplo al dispersar la composición en agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol o similares, para formar una solución o suspensión. Si se desea, estas composiciones pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tal como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH (por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, acetato de trietanolamina-sodio u oleato de trietanolamina) . Los métodos para preparar estas composiciones líquidas se conocen, o serán evidentes, para aquellos expertos en la técnica; ver, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Lippincott, Williams & Wilkins; (15 de diciembre de 2000), que se incorporan en la presente como referencia. Nuevamente, una composición líquida se puede preparar al dispersar la composición en un material para beber o alimento líquido para humanos o animales. Adicionalmente, se puede usar un excipiente agrícola líquido adecuado.
Para administración oral, se prefieren en general tabletas y granulos. Las tabletas pueden contener aglutinantes y lubricantes . Los polvos o granulos finos pueden contener agentes de dilución, dispersión y/o activos en la superficie y se pueden presentar en agua o en un jarabe. Las cápsulas o bolsas pueden contener de manera conveniente la composición en un estado seco. Las soluciones o suspensiones no acuosas de la composición también son adecuadas y puede contener agentes de suspensión. Donde sea deseable o necesario, se pueden incluir agentes saborizantes, conservadores, de suspensión, espesantes, o emulsionadores. Por supuesto, será adecuado usar un material para beber o de alimento como un método de distribución oral . La administración parenteral se caracteriza en general por inyección. Para productos inyectables, se apreciará que, en general, todos los materiales usados en la composición y el excipiente usado deben ser de grado farmacéutico. Se pueden preparar productos inyectables en formas convencionales, ya sea como soluciones líquidas, emulsiones o suspensiones, formas sólidas adecuadas para dilución, suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Un planteamiento alternativo para la administración parenteral comprende el uso de un sistema de liberación sostenida o liberación lenta, tal que se mantenga un nivel constante de dosis. Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 3,710,795, que se incorpora en la presente como referencia. Las preparaciones para uso parenteral también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (tal como aceite de oliva), y esteres orgánicos inyectables (tal como oleato de etilo) . Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguados. Otros vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, aceites fijos o de Ringer lactados . Los vehículos para uso intravenoso incluyen re-abastecedores de nutrientes y fluidos, reabastecedores de electrolitos (tal como aquellos basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservadores y otros aditivos tal como por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Para administración oral, se pueden usar líquidos, suspensiones, lociones, cremas, gel, ungüentos, gotas, supositorios, aspersiones y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares se pueden usar como sea necesario o deseable. La presente invención proporciona además un método para preparar una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno, el método que comprende los pasos de: a) proporciona un componente de terpeno; b) proporcionar una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular; c) incubar el componente de terpeno con la partícula de glucano o partícula de pared celular bajo condiciones adecuadas para encapsulación de terpeno; y d) recuperar la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula el componente de terpeno . Opcionalmente, el método anterior puede comprender además el paso de secar las partículas que encapsula el componente de terpeno. El secado se puede lograr de varias maneras y se puede hacer mención de liofilización, secado en lecho fluido, secado en tambor o secado por aspersión, todos los cuales son procesos bien conocidos. En el paso a) del método anterior, el componente de terpeno se proporciona de manera adecuada como una suspensión en un solvente acuoso, y opcionalmente en la presencia de un agente tensioactivo. De manera adecuada, el solvente es agua. Un agente tensioactivo adecuado es Tween-80 (monooleato de polioxietilensorbitán) , y de manera preferente el agente tensioactivo está presente a una concentración de aproximadamente 0.1 a 10 % en volumen de la mezcla total de reacción, de manera más preferente, aproximadamente 1 %. De manera alternativa, el componente de terpeno se puede proporcionar como una solución verdadera en un solvente, por ejemplo, agua. Una solución verdadera de terpeno en agua se puede obtener al mezclar el terpeno en agua a alto esfuerzo cortante hasta que se obtenga una solución verdadera. La publicación número WO 03/020024 proporciona detalles adicionales para formar soluciones verdaderas de terpenos en agua. En el paso b) del método anterior, la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular se proporciona de manera adecuada como una suspensión en agua u otro líquido adecuado. De manera adecuada, la suspensión comprende aproximadamente de 1 a 1000 mg de partículas por ml, de manera preferente 200 a 400 mg/ml. De manera alternativa, las partículas se pueden proporcionar como un polvo seco y adicionar a la suspensión de terpeno-agente tensioactivo. De manera alternativa, las partículas se proporcionan en suficiente líquido para hidratar de forma mínima a las partículas, pero no en exceso significativo. El término "volumen hidrodinámico" (HV) se usa para describir el volumen de líquido requerido para hidratar de forma mínima las partículas. De esta manera, de forma adecuada, las partículas se proporcionan con un volumen que varía desde el HV y un volumen de 1.5 veces el HV (1.5 HV) . Esto hace más eficiente el paso subsiguiente de secado. También, donde se usa un bajo volumen de líquido (es decir, aproximadamente HV a 1.5 HV) , también es posible extruir el producto terminado en forma de granulo o fideo, que es conveniente para secado en lecho fluidizado. Se ha encontrado que el componente de terpeno puede llegar a ser encapsulado por la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular a temperatura ambiente. La velocidad de encapsulación se incrementa, sin embargo, a 37°C pero la temperatura se debe mantener por abajo del punto de ebullición o temperatura de desnaturalización de cualquier componente de la composición. Las condiciones adecuadas para el paso c) del método anterior por lo tanto son presión atmosférica a una temperatura de 20 a 37°C. La optimización de las condiciones para una reacción particular de encapsulación será materia de experimentación de rutina. La presente invención proporciona además un método para aniquilar un microorganismo, el método que comprende el paso de: a) poner en contacto el microorganismo con una composición que comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno . Las composiciones adecuadas son aquellas definidas en más detalle anteriormente. La presente invención proporciona además un método para prevenir o tratar una infección en un paciente, el método que comprende el paso de: a) administración al paciente en una dosis terapéuticamente efectiva, una composición que comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno . Las composiciones son aquellas definidas en más detalle anteriormente. La infección del paciente se puede provocar por cualquier agente infeccioso. Los ejemplos de estos agentes infecciosos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, Staphylococcus aureus, Aspergillius fumigatus, Micoplasma iowae, Penicillium sp . , y Micoplasma pneumoniae . Para administración interna, la composición se puede administrar de manera oral, vaginal, rectal, por inhalación, o por rutas parenterales, por ejemplo, por ruta intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intraarterial, intralinfática, intravenosa, intratecal e intratraqueal. Las formulaciones adecuadas de la composición para estas rutas se analizan anteriormente. Para tratamiento externo, la composición se puede aplicar de forma tópica, por ejemplo como una crema o ungüento o como un polvo seco para el tratamiento de una herida. La cantidad de terpeno administrada en el método anterior debe ser claramente suficiente para lograr el resultado deseado, es decir, prevención y/o tratamiento de la infección, pero no debe estar a un nivel que inducirá efectos tóxicos serios en el paciente. La cantidad de composición administrada dependerá, por supuesto, de la manera de administración, del paciente que se trate, es decir, su peso, su edad, condición, sexo y grado de la enfermedad en el sujeto y del juicio del facultativo que prescribe. Se puede variar la dosis, programa de dosis, y ruta de administración. Un experto en la técnica será capaz fácilmente de determinar una cantidad anti-infectiva para una aplicación dada en base al conocimiento general en la técnica y los procedimientos de los ejemplos dados más adelante. Se debe señalar que el término "paciente" como se usa en la presente se refiere a cualquier individuo, ya se humano o animal, al cual se aplique el tratamiento. De esta manera, el paciente puede ser un animal domesticado (por ejemplo, perro, gato, etc.), ganado en existencia (por ejemplo, ganado vacuno, caballo, cerdo, ovejas, cabras, etc.), animal de laboratorio (por ejemplo, ratón, conejo, rata, cobayo, etc.), aves y peces.
De manera adecuada, el sujeto es mamífero y especialmente un primate, por ejemplo, un humano. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir infección de una planta, el método que comprende el paso de: a) administra en una dosis terapéuticamente efectiva una composición que comprende una partícula hueca de glucano o una partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno a la planta o al suelo en proximidad a la planta. Las composiciones adecuadas son aquellas definidas en más detalle anteriormente. Se ha mostrado que los terpenos eliminan varios patógenos (ver WO 03/020024) y, como se describe en la solicitud co-pendiente US 60/538,627 también eliminan de forma efectiva nemátodos que son parásitos vegetales significativos. Sin embargo, los terpenos solos en suspensión o solución son algo inestables y se degradan rápidamente en el ambiente del suelo, perdiendo de este modo eficacia. La incorporación de un componente de terpeno en una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular para reducir la velocidad de liberación del terpeno y la degradación, incrementando de este modo la duración de acción del terpeno en el suelo. De manera adecuada, la infección de una planta que se va a tratar o prevenir en el método anterior es infección por nemátodos . Otras infecciones de plantas que se pueden tratar o prevenir incluyen infecciones fúngales de plantas, especialmente aquellas que afectan la superficie de una planta. Estas infecciones incluyen moho lanuginoso, moho polvoriento o putrefacción de racimo por botrytis; estas infecciones afectan de manera particular las vides. En una modalidad, la infección de planta se puede provocar por uno o más de los siguientes: Aspergillius fumigatus, Sclerotinta homeocarpa, Rhi zoctonia solani , Collectotrichum graminicola o Penicilli um sp . Una ventaja de un tratamiento de plantas basado en terpeno es que se puede aplicar brevemente antes de la recolección. Muchos tratamientos convencionales requieren un periodo prolongado antes de la re-entrada al área tratada (en general 3 semanas) . Esto significa que una epidemia de una enfermedad de planta brevemente antes de la recolección no se puede tratar con tratamientos convencionales puesto que entonces no sería posible recolectar el cultivo o cosecha en el momento deseado. Las composiciones de la presente invención se pueden aplicar de manera adecuada en cualquier momento hasta la recolección, por ejemplo 21 días antes de la recolección, 14 días antes de la recolección, 7 días antes de la recolección, o aún 3 días o menos antes de la recolección. Los terpenos encapsulados han mostrado eficacia particular en el tratamiento de moho lanuginoso, moho polvoriento y putrefacción de racimo por botrytis en uvas, y de esta manera la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir estas enfermedades. La prevención de infecciones de planta se puede lograr al tratar las plantas con los terpenos encapsulados regularmente como una medida profiláctica. De manera adecuada, la composición de la presente invención se aplica por aspersión. Esto es particularmente adecuado para tratar une enfermedad de planta que afecta la superficie de una planta. Por aspersión, se puede usar una preparación que comprende 2 g/l de la composición en agua. Son particularmente efectivas las concentraciones de 2 a 4 g/l, y se pueden usar como se requiera concentraciones de más de 4 g/l. Obviamente, es importante que la concentración de la composición usada sea suficiente para aniquilar o inhibir el agente causante de enfermedad, pero no demasiado alta para dañar la planta que se trata.
Cuando se rocían las plantas, una proporción de 500 L/Ha o mayor es adecuada para cubrir las plantas. De manera preferente, se usa para asegurar una buena cobertura una proporción de 900 L/Ha o mayor, de manera preferente 1200 L/Ha o mayor. Donde se están tratando vides, una proporción de 1200 L/Ha ha probado ser adecuadamente efectiva . La composición de la presente invención se puede aplicar de manera alternativa mediante irrigación. Esto es particularmente adecuado para tratar nemátodos u otros patógenos o parásitos producidos en suelo. En una modalidad adicional, la presente invención también proporciona una composición que comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno para el uso en la prevención o tratamiento de una infección en un paciente o una planta. Las composiciones adecuadas son aquellas definidas en más detalle anteriormente. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona el uso de una composición que comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de infección provocada por un microorganismo. Las composiciones adecuadas son aquellas definidas en más detalle anteriormente.
Breve Descripción de las Figuras La presente invención ahora se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, y figuras en las cuales: La Figura 1 representa una micrografía clara de paredes vacías de célula de levadura; La Figura 2 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan L-carvona; La Figura 3 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan citral; La Figura 4 representa una micrografía clara de emulsión de terpeno; La Figura 5 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura en volumen hidrodinámico (HV) de agua; La Figura 6 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsula terpeno en 5 veces el volumen hidrodinámico (HV) de agua; La Figura 7 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan terpeno en HV de agua; La Figura 8 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan terpeno en HV más 5 % de agua; La Figura 9 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan terpeno en HV más 10 % de agua; La Figura 10 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan terpeno en HV más 20 % de agua; La Figura 11 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan terpeno en HV más 30 % de agua; La Figura 12 representa una micrografía clara de paredes de célula de levadura que encapsulan terpeno en HV más 40 % de agua; La Figura 13 representa una micrografía clara que muestra la dispersión de partículas huecas de glucano, secas que encapsula un componente de terpeno y no goma de xantano . La Figura 14 representa una micrografía clara como en la Figura 13 donde se incluye 0.07 g de goma de xantano al 1 %. La Figura 15 representa una micrografía clara como en la Figura 13 donde se incluye 0.14 g de goma de xantano al 1 %. La Figura 16 representa una micrografía clara como en la Figura 13 donde se incluye 0.28 g de goma de xantano al 1 %. La Figura 17 representa una micrografía clara como en la Figura 13 donde se incluye 0.55 g de goma de xantano al 1 %. La Figura 18 representa una micrografía clara como en la Figura 13 donde se incluye 1.1 g de goma de xantano al 1 %. La Figura 19 representa una micrografía clara como en la Figura 13 donde se incluye 2.2 g de goma de xantano al 1 %. La Figura 20 representa una micrografía clara como en la Figura 13 donde se incluye 4.4 g de goma de xantano al 1 %. La Figura 21 muestra una representación esquemática de áreas de tratamiento en los sitios 18 y 20. La Figura 22 muestra una representación esquemática de áreas de tratamiento en los sitios 18 y 20. La Figura 23 muestra una representación esquemática de áreas de tratamiento en el sitio 7. La Figura 24 muestra una gráfica que muestra la comparación de formulaciones de terpeno encapsuladas versus no encapsuladas . Descripción Detallada de la Invención Los siguientes ejemplos se proporcionan para permitir adicionalmente a aquellos expertos en la técnica que hagan o realicen la presente invención. Son solamente de ejemplo y no se proponen para limitar el alcance de la invención. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en volumen o partes en peso, como se indica, la temperatura está en grados Celsius (°C) o está a temperatura ambiente( y la presión está en o cerca de la atmosférica. Hay numerosas variaciones y combinaciones de las composiciones y condiciones para hacerlas o usarlas, por ejemplo, concentraciones de componentes, solventes deseados, mezclas de solventes, temperaturas, presiones, y otros intervalos y condiciones que se pueden usar para optimizar los resultados obtenidos de las composiciones y métodos descritos. Sólo la experimentación razonable y de rutina se requerirá para optimizar estos.
Ejemplo 1.- Demostración de Carga de terpeno En Partículas de Levadura de Panadero y Partículas de Glucano de Levadura Purificadas El siguiente protocolo se realizó para demostrar que los terpenos se cargarán en paredes de células de levadura y otras partículas huecas de glucano. Se prepararon emulsiones de citral L-carvona al mezclar 150 µl de terpeno con 100 µl de Tween-80 al 10 % en agua y 250 µl de agua. Se mezclaron partículas de levadura de panadero (YP) o partículas de glucano de levadura Levacan"* (YGP) , disponible de Savory Systems Internacional, Inc., Branchburg, NJ, con agua para formar una suspensión de 250 mg/ml . Se mezclaron 500 µl de la suspensión de YP o YGP y 250 µl de la emulsión de terpeno de forma conjunta y se incubaron durante la noche bajo agitación constante. Se usaron 500 µl de suspensión de YP o YGP y 500 µl de agua como un control . Las partículas entonces se lavaron con agua hasta estar libres de emulsión externa. Las preparaciones de partícula entonces se congelaron y liofilizaron hasta que se secaron. Las partículas entonces se rehidrataron y examinaron bajo microscopio de luz. Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 4. La Figura 1 muestra estructuras esféricas con un área oscura en su centro, estas son partículas huecas vacías de glucano. Las Figuras 2 y 3 muestran estructuras esféricas con una apariencia hinchada con un interior coloreado claro, estas son partículas con terpeno encapsulado en la cavidad central, citral en la Figura 2 y L-carvona en la Figura 3. En las Figuras 2 y 3 , también se pueden ver glóbulos pequeños de terpeno libre, por ejemplo, en la parte superior de la Figura 2, justo a la izquierda del centro. La Figura 4 muestra la emulsión de terpeno como pequeñas ampollas de terpeno suspendidas en agua.
Ejemplo 2.- Determinación de niveles máximos de carga de citral y L-carvona en Partículas de Pared de Célula de Levadura' (YP) de Panadero El siguiente protocolo se realizó para determinar las cantidades máximas de terpenos que se cargarán en YP. - Se prepararon emulsiones de L-carvona y citral al tratar por ultrasonido 4.5 g del terpeno con 0.3 ml de agua. - Se preparó solución de Tween-80 al 10 % por tratamiento con ultrasonido de 4.5 g de Tween-80 en 40.5 ml de agua. - Se preparó emulsión de YP al mezclar YP con agua para formar suspensión de 20 mg/ml. Se establecieron reacciones de encapsulación como se describe en la Tabla 1. ' Se mezcla la emulsión de citral o L-carvona-agua con YP y el agente tensioactivo Tween-80 durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos y se clasificó la apariencia del terpeno libre que flota en la capa acuosa. Los resultados se muestran en la columna derecha marcada terpeno libre de la Tabla 1. La expresión "terpeno libre" se refiere a la presencia visible de terpeno en la mezcla de reacción centrifugada. La ausencia de terpeno libre indica absorción completa del terpeno con las partículas. El más alto volumen de terpeno absorbido por las partículas, como se evidencia por la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen máximo de emulsión de terpeno absorbida.
Tabla 1 Como se puede ver entre los resultados, YP es capaz de absorber y encapsular al menos 16.5 µl de la emulsión de terpeno L-carvona o al menos 5 µl de la emulsión de citral por 10 mg de YP.
Ejemplo 3. - Demostración de carga mejorada de terpeno con agente tensioactivo y determinación de relación óptima de Tween-80 : Terpeno El siguiente protocolo se realizó para demostrar que la presencia de agente tensioactivo mejora la carga de terpeno y para determinar el nivel mínimo de agente tensioactivo Tween-80 requerido para la reacción de carga de YP-terpeno. - Se prepararon emulsiones de L-carvona y citral al tratar por ultrasonido 4.5 g del terpeno con 0.3 ml de agua. Se preparó solución de Tween-80 al 10 % al tratar por ultrasonido con 4.5 g de Tween-80 en 40.5 ml de agua. - Se preparó suspensión de YP de panadero al mezclar YP con agua para formar suspensión de 250 mg/ml. Se establecieron las reacciones de carga como se muestra en la Tabla 2 posterior. Se mezcló emulsión de citral o L-carvona-agua con YP con agente tensioactivo Tween-80 al 0-10 % v/v durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos y se clasificó la apariencia del terpeno libre que flota en la capa acuosa. Los resultados se muestran en la columna derecha marcada a terpeno libre de la Tabla 2. La expresión "terpeno libre" se refiere a la presencia visible de terpeno en la mezcla de reacción centrifugada. La ausencia de terpeno libre indica absorción completa y encapsulación de terpeno por la YP. El volumen más alto de terpeno absorbido por La YP, como se evidencia por la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen máximo de emulsión de terpeno absorbida.
Tabla 2 SI = ligero Como se puede ver de los resultados, una concentración de Tween-80 de 1 % (es decir, 100 µl de Tween-80 al 10 % en 1000 µl de mezcla de reacción) es suficiente para permitir captación completa de terpeno en la reacción anterior. Una concentración de Tween-80 al 2 % no provoca mejora en los resultados, en tanto que una concentración a 0.33 % de terpeno libre se observó. Esto indica que: a) Se absorben los terpenos en partículas de YP en la ausencia de un agente tensioactivo, pero la presencia de agente tensioactivo incrementa de forma significativa la absorción de terpeno. b) una concentración de Tween-80 de aproximadamente 1 % es óptima para la carga de YP puesto que asegura carga apropiada en tanto que aumenta al máximo la carga útil de terpeno de las partículas de YP.
Ejemplo 4.- Determinación de carga máxima de terpeno y encapsulación a altos niveles de Partículas de Pared Celular de Levadura de Panadero (YP) El siguiente protocolo se realizó para determinar las cantidades máximas de terpenos que se cargarán en YP a altos niveles de YP.
- Se prepararon emulsiones de L-carvona y citral al tratar por ultrasonido 4.5 g del terpeno con 3 ml de Tween al 1 % . - Se preparó solución de Tween-80 al 5 % al tratar por ultrasonido con 0.5 g de Tween-80 en 9.5 ml de agua. - Se preparó suspensión de YP al mezclar YP con agua para formar suspensión de 250 mg/ml. - Se establecieron las reacciones de encapsulación como se muestra en la Tabla 3. Se mezcló la emulsión de citral o L-carvona-agua con YP y agente tensioactivo Tween-80 durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos y se clasificó la apariencia del terpeno libre que flota en la capa acuosa. Los resultados se muestran en la columna derecha marcada a terpeno libre de la Tabla 3. La expresión "terpeno libre" se refiere a la presencia visible de terpeno en la mezcla de reacción centrifugada. La ausencia de terpeno libre indica absorción completa del terpeno por la YP. El volumen más alto de terpeno absorbido por la YP, como se evidencia por la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen máximo de emulsión de terpeno absorbida.
Tabla 3 Como se puede ver de los resultados en la Tabla 3, YP es capaz de absorber y encapsular terpenos a alta concentración de YP. YP absorbió y encapsuló al menos 112.5 µl de emulsión de terpeno L-carvona o al menos 75 µl de emulsión de citral por 125 mg de YP. Esto demuestra que la reacción de encapsulación de terpeno es independiente de la concentración de YP dentro de los intervalos probados .
Ejemplo 5.- Detección de partículas comercialmente disponibles para absorción de terpeno El siguiente protocolo se realizó para analizar las propiedades de carga de diferentes tipos de partículas. Las partículas estudiadas fueron partículas de pared celular de levadura de panadero (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) , Paredes Nutrex"* (Sensient Technologies, Milwaukee, Wl) , SAF-Mannan"* (SAF Agri , Minneapolis, MN) , Paredes Nutricept"* (Nutricepts Inc., Burnsville, MN) , Levacan"* (Savory Systems Internacional, Inc., Branchburg, NJ) y WGP"* (Alpha-beta Technology, Inc. Worcester, MA) . Se prepararon emulsiones de L-carvona y citral al preparar por ultrasonido 7 g de terpeno + 3 ml de Tween-80 al 3.3 %. La Tabla 4 posterior compara la pureza con el número de partículas de levadura por mg y la relación peso/volumen de sólidos empacados.
Tabla 4 De la Tabla 4 se puede concluir que el número de partículas por mg es inversamente proporcional a la pureza. De esta manera, el número de partículas por mg de WGP es casi 10 veces mayor que la YP de panadero . Las suspensiones se YP se prepararon como sigue: - Se preparó suspensión de partículas de pared celular de levadura de panadero (YP) al mezclar 250 mg de YP/ml de Tween-80 al 1 % . Se preparó suspensión Nutrex al mezclar 163 mg de Nutrex YGP/ml de Tween 80 al 1 %. - Se preparó suspensión de SAF Mannan al mezclar 234 mg de Biospringer YGP/ml de Tween-80 al 1 % . Se preparó suspensión Nutricepts al mezclar 99 mg de Nutricepts YGP/ml de Tween-80 al 1 %. - Se preparó suspensión de Levacan al mezclar 217 mg de Lev YGP/ml de Tween-80 al 1 % . - Se preparó suspensión de WGP al mezclar 121 mg de WGP YGP/ml de Tween-80 al 1 % . El volumen empacado de las partículas anteriores es idéntico, lo que significa que se sellaron números iguales de partículas. Se establecieron reacciones de carga como se muestra en la Tabla 5 y se dejaron incubar durante la noche. Las muestras se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos y se clasificó la apariencia del terpeno libre que flota en la capa acuosa y el color de los terpenos encapsulados en el comprimido. Los resultados se muestran en las dos columnas derechas de la Tabla 5. El volumen más alto de terpeno absorbido por partículas como se evidencia por la ausencia de terpeno libre se registró como el volumen de emulsión de terpeno absorbida.
Tabla 5 W = blanco; Y = amarillo; si = ligero; int = intermedio, De los resultados, se llegan a las siguientes conclusiones : - Las partículas purificadas con un bajo contenido de lípido fueron menos efectivas en la absorción de terpenos . - Las partículas menos puras fueron más efectivas en la absorción de terpenos . - El producto de degradación amarillo de citral no se formó cuando se encapsuló en SAF-Mannan"*. En base a la carga cualitativa al nivel individual de terpeno probado, SAF Mannan"* parece ser mejor, Nutrex"* segundo y de Panadero tercero.
Ejemplo 6.- Cinética de carga de terpeno en varios tipos de partículas y diferentes temperaturas de incubación El siguiente protocolo se adoptó para comparar la cinética de carga de varios tipos de partículas de levadura. Se prepararon emulsiones de L-carvona y citral al tratar por ultrasonido 7 g de terpeno con 3 ml de Tween-80 al 3.3 %. Se preparó solución de Tween-80 al 1 % al tratar con ultrasonido a ml de Tween-80 al 10 % en 10 ml de agua. - Se preparó YP de panadero al mezclar 5 g de YP de panadero en 20 ml de Tween-80 al 1 % . - Se preparó suspensión de Nutrex"* YGP al mezclar 2 g de Nutrex"* YGP en 20 ml de Tween- 80 al 1 % . - Se preparó suspensión de SAF Mannan"* al mezclar 2 g de SAF Mannan"* en 20 ml de Tween-80 al 1 % .
Se establecieron las reacciones de carga como se muestra en la Tabla y. Las reacciones se incubaron durante 1, 3, 6, 9 y 24 horas a temperatura ambiente ó 37°C. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos y se clasificó la apariencia del terpeno libre que flota en la capa acuosa. Los resultados se muestran en las dos columnas derechas de la Tabla 6. El volumen más alto de terpeno absorbido por las partículas como se evidencia por la ausencia de terpeno libre se registró como el volumen de emulsión de terpeno absorbida. El color del comprimido encapsulado se clasificó a las 24 horas .
Tabla 6 (.
Blanco, W; Amarillo, Y; Muy AMARILLO, VY; Temperatura Ambiente, Rt De los resultados mostrados en la Tabla 6 y otras observaciones, se pueden hacer las siguientes conclusiones: - La reacción de carga de terpeno toma entre 1 y 3 horas . - La carga de terpeno se presenta más rápido a 37°C que a temperatura ambiente. SAF Mannan"* parecen ser las partículas preferibles por dos razones : - Actuación más rápida y más completa de ambos terpenos. - Citral permanece estable cuando se carga como se evidencia por la ausencia de color amarillo, característico de la degradación de citral, después de 24 horas a 37°C.
Ejemplo 7. - Detección de un intervalo de terpenos individuales y combinaciones de terpenos para carga de partículas El siguiente protocolo se adoptó para comparar la eficiencia de carga de YP de panadero vs SAF Mannan"*. Se prepararon emulsiones de terpeno como sigue: L-carvona.- 4.5 g de L-carvona en 1.5 ml de Tween-80 al 3.3 %. Citral.- 4.5 g de citral en 1.5 ml de Tween-80 al 3.3%. Mezcla de timol /L-carvona (T/L).- 2.25 g de timol y 2.25 g de L-carvona en 1.5 ml de Tween-80 al 3.3 %. Eugenol.- 4.5 g de eugenol en 1.5 ml de Tween-80 al 3.3 % . Geraniol.- 4.5 g de geraniol en 1.5 ml de Tween-80 al 3.3 %. Mezcla de citral/L-carvona/eugenol (C/L/E).- 1.5 g de citral, 1.5 g de L-carvona, 1.5 g de eugenol en 1.5 ml de Tween-80 al 3.3 %. Se usaron para estos experimentos emulsiones compuestas de terpeno: agua: agente tensioactivo en una relación de 0.75:0.3:0.05. Se mezclaron volúmenes crecientes de emulsión de terpeno con 250 mg/ml de YP de Panadero o 250 mg/ml de SAF Mannan"* durante la noche a temperatura ambiente como se muestra en las Tablas 7 y 8. Las muestras se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos y se clasificó la apariencia del terpeno libre que flota en la capa acuosa. El volumen más alto de emulsión de terpeno absorbida por YP de Panadero o SAF Mannan"* como se evidencia por la ausencia del terpeno libre se registró como el volumen de emulsión de terpeno absorbida. Se registró el color de los terpenos encapsulados en el comprimido. Los resultados en las tablas 7 y 8 muestran que todos los terpenos individuales y combinaciones de terpenos se cargaron eficientemente tanto en las partículas de YP de panadero como de SAF Mannan.
Tabla 7. - Evaluación de Carga de YP de Panadero de Diferentes Terpenos y Mezclas de Terpenos Tabla 8. - Evaluación de Carga de SAF Mannan de Diferentes Terpenos • y Mezclas de Terpenos Invertido = Invertido en Fase - sólidos que flotan en la parte superior - no aceite libre; W = blanco; Y = amarillo.
De los resultados, se hicieron las siguientes observaciones : Todos los terpenos parecieron cargarse en la YP de Levadura y SAF Mannan. - SAF Mannan tiene una mayor capacidad de carga de terpenos que la YP de panadero . - Las mezclas de dos y tres maneras de terpenos también parecieron cargarse eficientemente. - El terpeno Eugenol parece tener una mayor densidad que las partículas y agua puesto que se encontró asociado con el comprimido . - Para el SAF Mannan, los altos niveles de carga y las partículas más ligeras dieron por resultado partículas cargadas que flotan en la superficie de la capa acuosa para citral y geraniol. - Citral se protegió de la oxidación por SAF Mannan pero no por la YP de panadero . La carga máxima aproximada para cada tipo de partículas se determinó y se muestran las Tablas 9 y 10 posteriores. El porcentaje cargado representa una relación de la cantidad de terpeno cargada a la cantidad de partícula presente (peso por peso) .
Tabla 9. - Carga máxima de terpeno en YP de Panadero Tabla 10.- Carga máxima de terpeno en SAF Mannan.
Ejemplo 8.- Evaluación de estabilidad de Terpenos en emulsiones acuosas y formulaciones de terpeno encapsuladas Se valoró la estabilidad de los terpenos por la observación de formulaciones de citral para la formación de un producto de oxidación de color amarillo. Como se señala en la columna derecha en las Tablas 5-8, las emulsiones de citral y el citral encapsulado por YP de Panadero se volvió a un color amarillo progresivamente creciente durante el tiempo. Sin embargo, la encapsulación de citral en SAF Mannan"* incrementó la estabilidad de citral como se evidencia por una reducción o ausencia de color amarillo durante el tiempo.
Ejemplo 9.- Carga de Terpenos en agua mínima El siguiente protocolo se llevó a cabo para evaluar la posibilidad que la carga de terpeno y encapsulación en YP se pudiera llevar a cabo a un nivel muy alto de sólidos de partículas de levadura (YP) para permitir la extrusión directa de la formulación cargada en un secador de lecho fluidizado. La cantidad mínima de agua para hidratar completamente las partículas de SAF Mannan"* se determinó que es 3.53 g de agua por g de sólidos, esto define el volumen hidrodinámico (HV) o capacidad absorbente de agua de las partículas. A este nivel de agua, las partículas hidratadas tienen una consistencia de pasta rígida que es tixotrópica, es decir, de comportamiento pseudoplástico tal como la mayonesa. La adición de agua hasta 40 % por arriba del HV da por resultado una pasta fluida espesa. La reacción normal que se ha usado en los ejemplos anteriores se llevó a cabo a 3 X HV de agua. Una serie de reacciones de carga de terpeno (L-carvona) se llevaron a cabo manteniendo la relación de partícula: terpeno: ween (1:0.44:0.04) constante y variando la cantidad de agua en el sistema desde el HV (3.53 g) al HV + 40 % de agua (4.92 g) . Los controles fueron el sistema de carga normal que usa 3 X HV de agua, partículas únicamente y reacciones con sólo terpeno. Después de la incubación durante la noche, las muestras de las mezclas se evaluaron microscópicamente para terpeno libre y evidencia de captación de terpeno en las partículas y para características de flujo de material al valorar el flujo en tubos invertidos durante 15 minutos. Además, se valoró la presencia de aceite libre al hidratar la mezcla de reacción con 5 X HV, sometiendo a vórtice para obtener una dispersión completa de partículas y centrifugación para sedimentar el terpeno encapsulado en la partícula. Los resultados se muestran en la Tabla 11 y las Figuras 7 a 12. Las figuras 7 a 12 muestran los resultados de carga de los siguientes tubos. Figura 7 - Tubo 3 Figura 8 - Tubo 5 Figura 9 - Tubo 6 Figura 10 - Tubo 8 Figura 11 - Tubo 10 Figura 12 - Tubo 11 Tabla 11 Los resultados mostrados en la Tabla 11 y en las Figuras 7 a 12 demuestran que la carga y encapsulación de terpeno en las partículas se presentó en todas las relaciones evaluadas de agua. De manera sorprendente, la carga equivalente se presentó aun cuando la reacción de carga tomó lugar en una reacción con la consistencia de una pasta rígida usando la cantidad mínima de agua para hidratar las partículas. La ausencia de terpeno libre se observó microscópicamente (Figura 7 a 12) y en el nivel bajo de terpeno en los sobrenadantes, como se pone en evidencia por una reducción marcada en la turbidez del sobrenadante en comparación al control con sólo terpeno. Estos resultados extienden el presente entendimiento de las condiciones para cargar terpenos en partículas huecas de glucano. La flexibilidad para usar un volumen mínimo de agua para hidratar las partículas durante el proceso de carga permitirá la carga de los terpenos bajo condiciones donde la mezcla de reacción está en una consistencia tipo pasta maleable usando mezcladores de pasta de superficie barrida, grado alimenticio, normales. La consistencia de la mezcla final con alta carga de terpenos sólidos es adecuada para la extrusión directa para formar fideos y comprimidos para secado por lecho fluidizado. Las instalaciones adecuadas para aumentar en escala la producción de esta manera requerirán: - Homogeneizador Gaulin, o equivalente, para producir emulsión estable de terpenos. - Tanque de mezclado de pasta de superficie barrida. - Extrusor. - Secador de lecho fluidizado.
Ejemplo 10.- Evaluación de un agente hidrocoloide intersticial para ayudar a la dispersión en partículas huecas secas de glucano que encapsulan una dispersión de componentes de terpeno cuando se re-hidrata El siguiente protocolo se adoptó para evaluar el efecto de un hidrocoloide intersticial para incrementar las formulaciones secas de terpeno encapsulado en partículas huecas de glucano, para dispersarlas cuando se hidraten. - Partículas de SAF Mannan"* - Tween 80 al 0.1 % - L-carvona - Goma de Xantano - 1 % p/v en Tween 80 al 0.1 % Se valoró el efecto de incrementar los niveles de goma de xantano en dispersión de L-carvona, encapsulada en partículas huecas de glucano, secas, en agua al cargar L- carvona en SAF Mannan al incubar 1.1 g de una emulsión de L- carvona (relación de L-carvona: agua: agente tensioactivo de 0.75:0.3:0.05) con 1 g de SAF Mannan y 4.4 g de Tween 80 al 0.1 % que contiene goma de xantano al 0-1 % como se muestra en la Tabla 12.
Tabla 12 Los resultados en la Tabla 12 y en las Figuras 13 a 20 demuestran que la inclusión de un hidrocoloide de alto peso molecular durante el secado del terpeno encapsulado en partículas ayuda en la hidratación y dispersión de las micropartículas en una suspensión uniforme. Otros ejemplos de estos agentes hidrocoloides son maltodextrina, alginatos o similares. También puede ser importante incluir un revestimiento de comprimido para incrementar la estabilidad de los terpenos cargados, y para mejorar la liberación sostenida del terpeno.
Ej emplo 11 . - Evaluación de concentración mínima inhibitoria (MIC ) de emulsiones de terpeno , terpenos encapsulados en SAF Mannan y YP de Panadero , frescos , y terpenos encapsulados en SAF Mannan y YP de Panadero, liofilizados, contra S. aureus Los resultados de un protocolo realizado para comparar la MIC de formulaciones frescas versus liofilizadas de terpeno encapsulado en partículas huecas secas de glucano, se muestran más adelante en la Tabla 13. También se probó una emulsión de terpeno simple y los resultados se muestran para comparación.
Las conclusiones tomadas de los resultados anteriores fueron: La carga de terpeno en partículas huecas de glucano pareció mejorar la MIC del terpeno. En general, las emulsiones frescas de terpeno fueron aproximadamente 4-375 veces menos potentes que las formulaciones encapsuladas, - los terpenos cargados en SAF MAnnan"* se desempeñaron ligeramente mejor que la YP de Panadero. Las composiciones recién cargadas del terpeno se desempeñaron ligeramente mejor que las composiciones liofilizadas (puede haber alguna volatización de terpenos de las composiciones secas durante la liofilización) . - Los terpenos en emulsiones acuosas son estables durante al menos tres semanas .
Ejemplo 12.- Eficacia de terpenos encapsulados a escala de planta piloto contra S. aureus Se llevaron a cabo ensayos antimicrobianos con terpenos encapsulados y mezclas producidas a la escala de planta piloto contra S. aureus . Tanto las muestras frescas como liofilizadas de terpenos encapsulados que contienen materiales demostraron fuertes actividades antimicrobianas. Los resultados se resumen en la Tabla 4 posterior. Los terpenos se encapsularon en SAF-Mannan"* a una escala de 2.5 Kg. Una mezcla de tres terpenos (Geraniol, 275 g; Eugenol, 385 g; y timol, 440 gramos) se disolvió y homogenizó con 100 g de Tween 80 y 8 L de agua. Se adicionó SAF Mannan"* (2.5 Kg) para formar una suspensión homogénea. La suspensión se pasó a través de un homogenizador Gaulin para reducir el tamaño de partícula y el homogenado se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Una muestra del terpeno encapsulado se removió y almacenó a temperatura ambiente. El terpeno encapsulado restante entonces se congeló en bandejas y se liofilizó. El polvo liofilizado de terpeno encapsulado se molió y almacenó a temperatura ambiente.
Tabla 14 A la escala de planta piloto, tanto las muestras secas como liofilizadas fueron igualmente potentes en una base de terpeno p/p. En base a los resultados de preparación a gran escala, la dosis efectiva prevista de la formulación liofilizada contra S. aureus es de 200 ppm (la formulación contiene aproximadamente 50 % p/p de terpeno) o 0.2 g/L de agua.
Ejemplo 13. - Eficacia de terpenos encapsulados contra Microbacterias Se prepararon emulsiones de terpeno como sigue.
- Citral.- 4.5 g de citral en 1.5 ml de Tween 80 al 3.3 %.
L-carvona/eugenol . - 2.5 g de L-carvona y 2.25 g de eugenol en 1.5 ml de Tween 80 al 3.3 %. - Eugenol.- 4.5 g de eugenol en 1.5 ml de Tween 80 al 3.3 %.
- Geraniol.- 4.5 g de geraniol en 1.5 ml de Tween 80 al 3.3 - Mezcla de geraniol/timol . - 2.25 g de geraniol y 2.25 g de timol en 1.5 ml de Tween 80 al 3.3 %. - Emulsión de control.- 6 ml de Tween 80 al 1 %. Se mezcló SAF-Mannan"* (2.5 g) con 3 ml de cada emulsión y 7 ml de Tween 80 al 1 % y se incubó durante la noche para encapsular los terpenos y las mezclas de terpenos . Las formulaciones de terpeno encapsuladas se congelaron y liofilizaron y los polvos se molieron a un polvo fino. Las suspensiones de terpenos encapsulados (25 mg/ml) y las emulsiones de terpeno no encapsuladas se valoraron para actividad antibacteriana contra Micobacterias. Los resultados se exponen en la Tabla 15.
Tabla 15 FD = (Liofilizado) Ejemplo 14.- Actividad Nematocida de Terpenos Encapsulados Se prepararon preparaciones de paredes de células de levadura que encapsulan citral de acuerdo a los procedimientos descritos anteriormente. Las partículas huecas de glucano contuvieron 17.5 % de citral, y las partículas estuvieron presentes en las preparaciones de prueba a una concentración de 1000 ppm. Esto significa que los terpenos estuvieron efectivamente presentes a una concentración de 175 ppm. Se adicionó 1.0 ml de las preparaciones de prueba a 0.1 a 0.15 ml de agua que contiene nematodos de nudo de raíz. Se adicionó 1.0 de agua a los nematodos como el control . Se hicieron observaciones como se describe anteriormente y se valoró la proporción de aniquilación (es decir, porcentaje muerto) después de 24 a 48 horas. Los resultados mostrados más adelante en la Tabla 16 son un promedio de 2 conjuntos de resultados.
Tabla 16.- Actividad nematicida de solución de terpenos encapsulados (17.5 % de citral a 1000 ppm) Los resultados muestran que las partículas huecas de glucano que encapsulan terpenos son efectivas en la aniquilación de nematodos de nudo de raíz a una concentración de partículas de 1000 ppm, que corresponde a una concentración de citral de sólo 175 ppm. De esta manera, las partículas huecas de glucano que encapsulan terpenos parecen ser tan efectivas como los terpenos en solución o con agente tensioactivo como nematicidas. La actividad nematicida se retiene a pesar de que el terpeno está encapsulado dentro de la partícula. Se puede esperar que concentraciones mayores de terpenos dentro de las partículas huecas de glucano, o concentraciones mayores de las partículas darán por resultado aun una mayor proporción de aniquilación, como es el caso para terpenos en solución o con agente tensioactivo.
Ejemplo 15.- Propiedades Fungicidas de Terpenos Encapsulados y No Encapsulados Los siguientes protocolos se llevaron a cabo para valorar las propiedades fungicidas de varias combinaciones de terpenos, y para comparar la eficacia de composiciones encapsuladas y no encapsuladas .
Valoración de propiedades antifungales de diferentes formulaciones de terpeno. Se usó un ensayo de placa de microtítulo para valorar la concentración mínima inhibitoria (MIC) de una variedad de compuestos de terpeno contra diferentes organismos patógenos . El ensayo usado para cada organismo se describe en detalle más adelante pero las características generales importantes son como sigue.
El ensayo usa dos periodos de incubación para distinguir entre actividades estáticas (inhibición de crecimiento) y aniquiladoras (aniquilación) . El primer periodo de incubación permite la valoración de la inhibición del crecimiento, pero no puede distinguir entre la sola prevención del crecimiento y la aniquilación de las células. El propósito del segundo periodo de incubación es permitir un tiempo suficiente, y nutrientes para cualquier célula inactiva o inhibida que sobreviva a la exposición a terpeno para que prolifere. Cualquier célula que se inhibió por efectos fungistáticos debe responder y crecer durante el segundo periodo de incubación, en tanto que las células que se aniquilaron por exposición a terpenos no crecerán en el medio fresco. Se llevaron a cabo experimentos de detección inicial usando un total de 31 formulaciones diferentes de terpenos (Tabla 17). Estos experimentos se repitieron usando un subconjunto de formulaciones de terpeno fuertemente activas (Tabla 18) . Una combinación de los terpenos geraniol, eugenol y timol en una relación de 2:1:2, encapsulados con partículas de glucano también se probó. Esta muestra se refiere como YP-GET. Una combinación no encapsulada de geraniol, eugenol y timol a la misma relación también se probó para comparación con la forma encapsulada.
Ensayo de MIC usando Saccharomyces cerevisiae Se adicionaron S. cerevisiae (5 x 105 células/mL en medio de crecimiento YPD) a cada cavidad de una placa de microtítulo de 96 cavidades en alícuotas de 100 µl . Al menos una columna por placas se diseñó como un control de sólo células y no se adicionó terpeno a estas cavidades. Las alícuotas (100 µL) de diferentes formulaciones de terpeno se adicionaron a la primera fila de columnas restantes, y se realizaron diluciones en serie de dos veces al transferir 100 µL de una fila a la siguiente durante un total de 7 veces. Finalmente, se descartaron 100 µL de la última fila a fin de asegurar que todas las cavidades contuvieran el mismo volumen. Las placas de microtítulo se incubaron de manera estática durante la noche a 30°C. Después de la incubación, las placas se clasificaron para inhibición de crecimiento (evidenciado por una carencia de turbidez) . La inhibición de crecimiento (>75 %) se confirmó visualmente por microscopía. Una vez que se ha determinado la MIC para cada formulación, las placas de microtítulo se centrifugaron y el medio gastado se removió de las cavidades no turbias. Las células de volvieron a suspender en medio fresco (100 µL) y las placas se volvieron a incubar durante la noche a 30°C. Se realizó como antes la valoración de la inhibición de crecimiento.
Ensayo de MIC usando un inoculo mezclado Las diferentes formulaciones de terpeno se diluyeron en serie en la placa de microtítulo de 96 cavidades como se describe para S. cerevisiae. Entonces se adicionó agar YPD fundido a las cavidades, junto con 5 µl de inoculo mezclado (preparado de hojas mohosas de uva a una concentración de 5 x 104 células/mL) . Las placas se incubaron estáticamente durante 24 horas a temperatura ambiente y se valoró visualmente el crecimiento de esporas por microscopía. Debido al uso de medio sólido, no se pudo realizar el segundo periodo de incubación en el medio fresco.
Ensayo de MIC usando Colletotrichum graminicola Las diferentes formulaciones de terpeno se diluyeron en serie en la placa de microtítulo de 96 cavidades como se describe para S. cerevisiae. Se adicionó S. graminicola (300 esporas/cavidad) a los terpenos diluidos y las placas se incubaron de manera estática durante 48 horas a temperatura ambiente. Se valoró visualmente por microscopía la germinación y crecimiento de esporas. Una vez que se ha determinado la MIC para cada formulación, las placas de microtítulo se centrifugaron y el medio gastado se removió de las cavidades que inhibieron el crecimiento. Las esporas se volvieron a suspender en medio fresco (100 µL) y las placas se volvieron a incubar durante la noche a temperatura ambiente. Se realizó como antes la valoración de la inhibición de crecimiento.
Tabla 17.- MIC y valores de MIC fungicidas obtenidos de detección inicial de 31 formulaciones de terpeno NT, no probado; YP-GET, formulación de GET encapsulada en lavadura a Combinaciones de terpeno se mezclaron en una relación 1 : 1 p/p) a menos que se indique de otro modo b MIC calculadas por contenido de terpeno Tabla 18.- Ensayo de repetición para determinar MIC y valores de MIC fungicidas NT, no probado; YP-GET, formulación de GET encapsulada en levadura. NOTA: Las muestras se valoraron en duplicado. Si se obtuvieron diferentes valores entre las muestras duplicadas, el valor más alto se ha presentado. Las muestras no duplicadas difieren por más de una dilución de 2 veces. a Combinaciones de terpeno se mezclaron en una relación de 1:1 (p/p) a menos que se indique de otro modo. b 1 x 104 células/mL de suspensión concentrada. c MIC calculadas por contenido terpeno.
Inoculo mezclado El uso de un inoculo mezclado presenta varios problemas. La variabilidad en el contenido de esporas entre las preparaciones da por resultado una pobre capacidad de reproducción entre los ensayos, y el crecimiento de organismos contaminantes impide la clasificación de la germinación de esporas . Las especies de levaduras unicelulares son particularmente problemáticas al enmascarar el crecimiento de esporas. Aunque no se pueden obtener datos precisos de este ensayo, se observó un efecto inhibidor de los terpenos . La identificación de esporas fue más fácil durante la clasificación del ensayo de repetición que durante el ensayo inicial de detección puesto que se usó un gran número de esporas (aproximadamente 50 /cavidad versus aproximadamente 10 /cavidad) . Por lo tanto, los datos obtenidos durante el ensayo de repetición pueden proporcionar una estimación más confiable de la MIC.
Colletotrichum graminicola Los valores de MIC en general más grandes obtenidos del ensayo de repetición en comparación al ensayo inicial de detección pueden ser debido a: - uso de soluciones de terpeno de 1 semana - uso de esporas recién preparadas, que tienen una mayor viabilidad que aquellas usadas en el ensayo inicial de detección y por lo tanto pueden ser más difíciles de aniquilar .
Comparación de formulaciones de terpeno como emulsiones libres con las mismas formulaciones de terpeno cuando se encapsulan en partículas huecas de glucano: ensayos de MIC de Saccharomyces cerevisiae Se adicionó medio de crecimiento YPD (100 µL) a cada cavidad de una placa de microtítulo de 96 cavidades y se adicionaron alícuotas de diferentes formulaciones de terpeno a la primera fila, dando un volumen total de 200 µL en esta fila. Se diseñó una columna como un control con sólo células y no se adicionó terpeno a estas cavidades. Se realizaron diluciones seriales de 2 veces al transferir 100 µL de una fila a la siguiente un total de 7 veces. Finalmente, se descartaron 100 µL de la última fila a fin de asegurarse que todas las cavidades contuvieron el mismo volumen. Entonces se adicionaron S. cerevisiae (5 x 105 células/ L en medio de crecimiento YPD) a cada cavidad en alícuotas de 100 µL, y se midió la absorbancia a 620 nm (A62o) para cada cavidad usando un vector de placa de microtítulo. Se incubaron placas de microtítulo estáticamente durante la noche a 30°C. Después de la incubación, la A620 se midió nuevamente y las placas se clasificaron para la inhibición de crecimiento (> 75 %) . Se confirmó visualmente por microscopía la inhibición de crecimiento. Para las emulsiones de terpeno libre, una vez que se ha determinado la MIC para cada formulación, las placas de microtítulo se centrifugaron y el medio gastado se removió de las cavidades inhibidas en crecimiento. Las cavidades se volvieron a suspender en medio fresco (100 µL) y las placas se volvieron a incubar durante la noche a 30°C. Se realizó la valoración de la inhibición de crecimiento como antes . Se resumen en la Tabla 19 los resultados de MIC fungicida y MIC.
Resultados Tabla 19. - Valores de MIC y MIC fungicida obtenidos de la detección de 31 formulaciones de terpeno contra Saccharomyces cerevisiae NT, no probado; YP-GET, formulación de GET encapsulada en levadura; YP-ETC, formulación de ETC encapsulada en levadura. Se mezclaron combinaciones de terpeno en una relación 1:1 (p/p) a menos que se indique de otro modo. b Formulaciones encapsuladas en levadura a menos que se indique de otro modo . c MIC calculada por contenido de terpeno. d Formulación de emulsión no encapsulada.
Para tanto las emulsiones de terpeno como los terpeno encapsulados en levadura, las MIC fueron típicamente < 125 ppm, con las formulaciones más activas que inhiben crecimiento a aproximadamente 60 ppm. Los valores de MIC obtenidos para las emulsiones de terpeno fueron similares a aquellos obtenidos para sus respectivas formulaciones encapsuladas en levadura. Cuando se obtuvieron diferentes valores, entonces sólo difirieron por aproximadamente una dilución de 2 veces. Muchas de las emulsiones de terpeno libre fueron fungicidas a la MIC inhibidora de crecimiento, con la mayoría que muestra actividad fungicida a una concentración mayor a 2 veces. Estos resultados demuestran que los terpenos encapsulados en partículas de glucano son al menos tan efectivos en la aniquilación de hongos como las formas no encapsuladas. Adicionalmente, las composiciones encapsuladas usadas pueden tener potencia reducida debido a que se han almacenado durante 45 días a 4°C y que tienen un contenido sub-óptimo de terpeno de aproximadamente 4 % p/p. El ensayo para determinar la actividad fungicida comprende un paso de centrifugación, que intenta separar las cavidades microbianas de cualquier terpeno residual en el medio de crecimiento al producir un sedimento de células en el fondo de la cavidad. Este sedimento entonces se vuelve a suspender en medio fresco y se incuba durante una segunda vez en la ausencia de terpeno. Sin embargo, el paso de centrifugación no puede discriminar entre células microbianas y partículas de levadura, por lo tanto cuando se usan terpenos encapsulados en levadura, el sedimento celular también contendrá partículas de levadura cargadas con terpeno. Como resultado, tanto las partículas de levadura como las células microbianas se vuelven a suspender entonces en el medio fresco. Esta cuestión de metodología no se considera que afecte los resultados obtenidos en los experimentos descritos anteriormente por las siguientes razones. - En los experimentos anteriores, se han usado emulsiones de terpeno en lugar de partículas de levadura cargadas con terpeno y se ha mostrado claramente la actividad fungicida. Los terpenos encapsulados se liberan por difusión, y se alcanza rápidamente un equilibrio entre la concentración de terpenos encapsulados y la concentración de terpenos liberados en el medio circundante. De esta manera, después de la centrifugación y resuspensión en medio fresco, la concentración de terpeno liberado en el medio de crecimiento probablemente va a estar bien por abajo de lo requerido para la actividad inhibidora de crecimiento. - No hubo crecimiento cuando los contenidos de la cavidad de MIC fungicida se colocaron en placas sobre medio sólido de crecimiento de agar. Cuando se colocaron en placa en medio sólido de crecimiento, la difusión de cualquier terpeno residual a todo lo largo del gran volumen de la placa de agar da por resultado una concentración local de terpeno que es demasiado baja para provocar inhibición de crecimiento. La carencia de crecimiento de los contenidos de la cavidad de MIC fungicida por lo tanto puede ser debido a la actividad fungicida inicial. En contraste, cuando se obtuvo una MIC que fue menor que la MIC fungicida y los contenidos de la cavidad de MIC se colocaron en placa sobre el medio de crecimiento de agar sólido, se observó crecimiento, indicando un efecto fungístático .
Ejemplo 16.- Preparación de Composiciones Encapsuladas de Terpeno para Ensayos de Campo El propósito del siguiente protocolo fue encapsular una composición de terpeno en partículas huecas de glucano para los subsiguientes ensayos de campo.
Materiales : Timol (suministrado por Alpha-Gamma Corporation) Eugenol (suministrado por Alpha-Gamma Corporation) Geraniol (suministrado por Alpha-Gamma Corporation) Tween-80 al 1 % (suministrado por Alpha-Gamma Corporation) Partículas de Pared Celular de Levadura Goma de xantano . Las partículas de pared celular de levadura se obtuvieron de Biorigin (Sao Paolo, Brasil) bajo la marca comercial Nutricell MOS 55, y se elaboraron por A?ucareira Quatá S.A., Usina Quatá, Quatá, Sao Paolo, Brasil, código postal 19780 000. Las partículas son un extracto de pared celular liofilizado de S. cerevisiae y son un polvo de fluido libre de color beige claro a café claro. Protocolo: el siguiente protocolo fue adecuado para 1 Kg de partículas, pero simplemente se puede aumentar a escala para una mayor producción. 1. Preparar mezcla de terpeno.- mezclar 375 gramos de Geraniol + 525 gramos de Eugenol + 600 gramos de Timol y agitar en un matraz de vidrio. 2. Preparar 6.2 L de Tween-80 al 1 % al mezclar 62 gramos de Tween-80 en 6.2 L de agua en un cubo blanco de 2 galones. Mezclar para formar solución. 3. Adicionar 6.2 gramos de Goma de Xantano a la solución de Tween y agitar para disolver. 4. Preparar emulsión de terpeno al mezclar 1.5 Kg de mezcla de terpeno + 6.2 L de Tween-80 al 1 %/goma De xantano al 0.1 % en un cubo blanco usando un mezclador polytron. 5. Adicionar 1,000 gramos de partículas de pared celular de levadura; mezclar usando mezclador de pintura para formar suspensión uniforme. 6. Adicionar la emulsión de terpeno del paso 4 a las partículas de pared celular de levadura en tanto que se mezcla para formar una consistencia tipo mayonesa diluida. 7. Verter mezcla de terpeno en botes e incubar durante ia noche . Resultados: el geranoil, eugenol y timol encapsulados en partículas huecas de glucano se obtuvieron como una pasta. La pasta se convirtió fácilmente a un polvo seco por. técnicas convencionales de liofilización. La pasta es la composición "líquida" referida en los siguientes protocolos, y el "polvo" es la forma liofilizada.
Ejemplo 17.- Ensayos de Campo de Composición de Terpeno Encapsulado en Moho Lanuginoso En uvas, el mono lanuginoso se provoca por el hongo Plasmopara vi ticola , que infecta los viñedos a nivel mundial y puede provocar pérdidas devastadoras para cultivadores de uva en términos de rendimiento de cosecha y calidad de vino. El hongo ataca las frutas y todas las partes verdes de la vid, provocando que las hojas se marchiten y que las flores y bayas se pudran. La enfermedad se manifiesta como puntos irregulares de color amarillo pálido o verde amarillo en la superficie superior de las hojas, con crecimiento fungal denso tipo algodón, de color blanco-gris que cubre el lado inferior de las lesiones de las hojas. Las bayas también se pueden cubrir con el crecimiento lanuginoso y dependiendo del tiempo de infección, pueden dorarse y ablandarse o no pueden ablandarse para nada. El moho lanuginoso se extiende a través de la dispersión de esporas por el viento y lluvia, y requiere condiciones húmedas para la infección. Es particularmente problemático en ambientes con alta humedad. Se recomiendan medidas preventivas para el manejo de la enfermedad, con aplicaciones tempranas de fungicidas seguidas por aplicaciones repetidas a intervalos apropiados. La resistencia ha surgido a algunos tratamientos, y aunque se puede reducir al mínimo el desarrollo de la resistencia al rotar el uso de diferentes fungicidas, permanece como un problema. El propósito de este ensayo fue investigar la eficacia de la formulación de terpeno encapsulado del Ejemplo 16 (YGP-GET) suministrado como una formulación líquida o en polvo (liofilizada) , para la prevención de moho lanuginoso en uvas. Cuatro bloques adyacentes, cada uno que cubre 0.1 ha, se identificaron en el sitio 20 en el viñedo Kir-Yianni. Kir-Yianni es un viñedo de 35 ha a una elevación de 300 m. Está circundado por un bosque de robles mezclados en el norte y oeste, y se miran huertos y viñedos al sur y este. Se han tratado todos los cuatro bloques con múltiples productos antes de la aplicación de la formulación de terpeno. El 26 de junio de 2004, dos de los cuatro bloques se rociaron con la formulación en polvo de terpeno a una dosis de ya sea 0.5 g/l o 2 g/l (ver ilustración esquemática en la Figura 21) . Se trató un tercer bloque con mezcla convencional de Bordeaux más azufre humectable, y el bloque restante se dejó sin tratar. Las vides en cada bloque se monitorizaron para signos de moho lanuginoso durante la siguiente semana. Cuatro bloques adyacentes adicionales, cada uno que cubre 0.1 ha, se identificaron en el sitio 18 en el viñedo Kir-Yianni . Se han tratado todos los cuatro bloques con múltiples productos antes de la aplicación de la formulación de terpeno. El 26 de junio de 2004, dos de los cuatro bloques se rociaron con la formulación líquida de terpeno a una dosis de ya sea 1 g/L o 4 g/L (Figura 21) (nota: 1 g de la formulación líquida terpeno tiene un volumen de 1 ml) . De los dos bloques restantes, uno se dejó sin tratar y uno se roció con Mikal"*, un tratamiento convencional para moho lanuginoso, el 28 de junio de 2004. Las vides en cada bloque se monitorizaron para signos de moho lanuginoso durante la siguiente semana. Para ambos lados, el producto de terpeno se aplicó a una proporción de 1200 L/ha. Las siguientes etapas de crecimiento de las uvas se registraron: - corte de brote, 26 de marzo de 2004 - floración, 1 de junio de 2004 - veraison, 6 de agosto de 2004. Las aplicaciones del estudio toman lugar pre-veraison. La estación de crecimiento 2004 fue excepcionalmente tardía y fue húmeda de principio a fin. La presión de la enfermedad del moho lanuginoso fue extremadamente alta, se elevaron los niveles de botrytis y fue moderada la presión del moho polvoriento. Tanto las formulaciones en polvo como líquidas de YGP-GET se almacenaron a temperatura ambiente. No se usaron condiciones especiales de almacenamiento.
Detalles de Productos de Comparador Ensayo de formulación en polvo: mezcla Bordeaux, elaborada por Manica Spa, Italia, envasado en Grecia por Moscholios Chemicals SA; azufre humectable. Ensayo de formulación líquida: Mikal"* (fosetyl-al 50 %, folpet 25 %) , elaborado por Bayer CropScience, distribuida en Grecia por Bayer Helias SA. Los productos de comparador se aplicaron como sigue: una aplicación antes del corte de brotes a una dosis de 15 g/L seguido por dos aplicaciones más por año a una dosis de 6.5 g/L. Se usó una proporción de aspersión de 1000 L/ha para las tres aplicaciones . Ensayo de formulación en polvo: mezcla Bordeaux (2 g/L) y azufre humectable (2.2 g/L) se aplicaron el 26 de junio de 2004. Ensayo de formulación líquida: Mikal (3.2 g/L) se aplicó el 28 de junio de 2004. Las vides se examinaron visualmente para síntomas de moho lanuginoso. El comienzo de la enfermedad se marcó por un promedio de dos puntos aceitosos por hoja. Los tratamientos que previnieron la aparición de puntos adicionales se consideraron que proporcionan protección efectiva contra el moho lanuginoso.
Resultados Formulación en polvo de YGP-GET (liofilizada) El tratamiento convencional de mezcla Bordeaux proporcionó buena protección contra moho lanuginoso. Los síntomas benignos del moho lanuginoso se observaron en las vides de control. La concentración de 0.15 g/L de producto de terpeno no proporcionó protección, y la concentración de 2 g/L de producto de terpeno proporcionó sólo ligera protección mejor que el control. Nota: la presión de la enfermedad en ese sitio fue muy baja debido al tratamiento reciente con pesticida. Se encontraron dificultades en la disolución de la formulación en polvo puesto que fue muy fina, dando por resultado dispersión en el aire. Esto puede haber afectado de manera adversa la eficacia del producto.
Formulación líquida de YGP-GET Cuando se administró a una dosis de 4 g/L, el producto de terpeno proporcionó excelente protección contra moho lanuginoso en el dosel expuesto. No se proporcionó protección por la dosis de 1 g/L. Se observaron síntomas serios del moho lanuginoso en el bloque de control . La formulación líquida fue fácil de usar y tuvo un olor agradable.
Análisis El moho lanuginoso puede provocar pérdidas devastadoras para los cultivadores de uva debido a sus efectos en el rendimiento de la cosecha y calidad del vino. El manejo de la enfermedad se enfoca a la prevención debido a que, una vez establecida, la infección puede extenderse muy rápidamente. En el sitio rociado con la formulación en polvo, YGP-GET no exhibió eficacia a una menor dosis (0.5 g/L) , y la dosis de 2 g/L fue menos efectiva que el tratamiento convencional. En este sitio, las aplicaciones recientes de pesticidas dieron por resultado menor presión de la enfermedad, que puede haber limitado la eficacia aparente del tratamiento con el terpeno. Sin embargo, se consideró que fue inadecuada una dosis de menos de 2 g/L del producto de terpeno. En el sitio rociado con la formulación líquida, se proporcionó excelente protección del dosel expuesto por el nivel mayor de dosis de 4 g/L. El crecimiento vegetativo excesivo en este sitio da por resultado tratamiento más efectivo de ramificaciones jóvenes exteriores en comparación con el crecimiento anterior en el dosel interior. La cobertura foliar completa por el producto de terpeno es útil, puesto que no es sistémico el tratamiento. Se estima que un incremento de aproximadamente 30 % con respecto al volumen usado para los tratamientos sistémicos convencionales logrará buena cobertura usando el tratamiento de terpeno .
Conclusiones La aplicación foliar de la formulación líquida de YGP-GET fue altamente efectiva en el control del moho lanuginoso a una concentración de 4 g/L. Las concentraciones menores de polvo de 0.5 g/L y de líquido 1 g/L no fueron efectivas.
Ejemplo 18.- Ensayo de Campo de Composición de Terpeno Encapsulado en Moho Polvoriento El moho polvoriento de uvas se provoca por el hongo Uncinula necator, y provoca reducciones en el crecimiento de la vid, calidad de la fruta y vigor invernal de las vides. En las uvas para vino, un nivel de infección de sólo 3 % de las bayas puede afectar la calidad del vino. La enfermedad se caracteriza por pequeños parches color blanco grisáceo de crecimiento fangal que se agrandan en revestimiento blanco polvoriento en las hojas. El crecimiento fangal también puede presentarse a las bayas, que puede dividirlas. En contraste el moho lanuginoso, que requiere condiciones cálidas y húmedas, el moho polvoriento puede ser un problema en estaciones de crecimiento más secas, puesto que se favorece de áreas sombreadas con humedad pero no de condiciones con clima lluvioso. Se recomiendan medidas preventivas para el manejo del moho polvoriento, con aplicaciones tempranas de fungicidas seguidas por aplicaciones repetidas a intervalos apropiados. Este estudio tuvo como finalidad investigar la eficacia de la aplicación de la composición de YGP-GET para la prevención de moho polvoriento en uvas . Tres bloques adyacentes, cada uno que cubre 0.1 ha, se identificaron en el sitio 18 en el viñedo Kir-Yianni. El 19 de julio de 2004, uno de los tres bloques se roció con la formulación líquida de YGP-GET a una dosis de 2 ml/L y una se dejó sin tratar. El bloque restante se roció con el tratamiento convencional de Equesion (2.5 g/L), Alliete (0.9 g/L) y Punch (0.075 mL/L) (ver Figura 22). Las vides en cada bloque se monitorizaron para signos de moho polvoriento durante la siguiente semana. Tres bloques adyacentes adicionales, que cubren cada uno 0.1 ha, se identificaron en el sitio 20 en el viñedo Kir-Yianni. El 20 de julio de 2004, uno de los tres bloques se roció con la formulación líquida de YGP-GET a una dosis de 2 mL/L y los dos bloques restantes se dejaron sin tratar (ver Figura 22) . Las vides en cada bloque se monitorizaron para signos de moho polvoriento durante la siguiente semana. En ambos sitios, los bloques se han tratado anteriormente con múltiples productos, incluyendo una aplicación anterior de producto de terpeno. Todos los tratamientos de terpeno se aplicaron a una proporción de 1200 L/ha para asegurar cobertura completa. Las siguientes etapas de crecimiento de las uvas se registraron - corte de brotes, 26 de marzo de 2004 - floración, 1 de junio de 2004 - veraison, 6 de agosto de 2004.
Las aplicaciones del estudio toman lugar pre-veraison. La estación de crecimiento de 2004 fue excepcionalmente tardía y fue húmeda de principio a fin. La presión de la enfermedad del hongo lanuginoso fue extremadamente alta, se elevaron los niveles de botrytis, y fue moderada la presión del moho polvoriento.
Detalles de los Productos de Comparador No se usó producto de comparador en el sitio 20.
El tratamiento de comparador usado en el sitio 18 se detalla más adelante. Punch"* (flusilazol 40 %) , DuPont. El 19 de julio de 2004, se aplicó Punch a una dosis de 0.075 ml/L como un tratamiento preventivo para moho polvoriento de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Detalles de los Productos Adicionales No se usaron productos adicionales en el sitio 20. Los productos adicionales usados en el sitio 18 se detallan más adelante. Sistema Equesion (famoxadona 22.5 % más cimoxanil 30 %) Alliete (fosetil-al 80 %) . El 19 de julio de 2004, se aplicaron Equesion (2.5 g/L) y Alliete (0.9 g/L) como tratamientos preventivos para moho lanuginoso. La dosis se determinó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los productos de comparador y adicionales representan tratamientos convencionales en el programa integrado de manejo de plagas. Las vides se examinaron visualmente para síntomas de moho polvoriento.
Resultados Sitio 18 Aproximadamente 20 % de los pedúnculos y tallos en el bloque de control fueron negros, indicando infección moderada de moho polvoriento. Tanto en el bloque de tratamiento convencional como en el bloque tratado con terpeno, todos los tallos y racimos fueron verdes, indicando que se ha proporcionada la protección adecuada.
Sitio 20 No se observó evidencia de infección de moho polvoriento en ninguno de los bloques.
Observaciones adicionales Al final de la estación de crecimiento, los bloques en los sitios 18 y 20 mostraron en general menos tensión debida a la enfermedad del resto del viñedo.
Las infecciones por moho polvoriento provocan pérdidas considerables a los vinicultores a través de reducciones en el crecimiento de las vides, calidad de fruta y vigor invernal de las vides. Adicionalmente, se puede afectar la calidad del vino por un nivel de infección de tan poco como 3 % de las bayas. El manejo de la enfermedad se enfoca en la prevención debido a que una vez establecida, la infección puede propagarse rápidamente. En este estudio, la aplicación del producto de terpeno YGP-GET en el sitio 18 previno de forma efectiva la infección por moho polvoriento, y el nivel de control exhibido por el producto de terpeno fue comparable a aquél proporcionado por el tratamiento convencional. Los resultados del sitio 20 son inconclusos, sin embargo, debido a la carencia de infección de moho polvoriento. Esta carencia de infección es probablemente debida a la aplicación extensiva de pesticidas antes del estudio, lo que dio por resultado baja presión de la enfermedad. El nivel más bajo de tensión debido a enfermedad en los sitios 18 y 20 sugiere que el tratamiento anterior de terpeno aplicado en estos sitios puede haber sido benéfico en el control de la infección a largo plazo.
Conclusiones YGP-GET previno efectivamente la infección de moho polvoriento, con un nivel comparable de control a aquél proporcionado por el tratamiento convencional .
Ejemplo 18b.- Ensayos de Campo Adicionales de Composición de Terpeno Encapsulado en Moho Polvoriento El estudio tuvo como finalidad investigar adicionalmente la eficacia de YGP-GET para el tratamiento de moho polvoriento en uvas de mesa sin semilla Grimson. Una parcela de 0.1 ha en el viñedo Tsigaras (aproximadamente 80 km al sur del viñedo Kir-Yianni) se dejó inadvertidamente sin tratar durante una aplicación de cisteína el 1 de julio de 2004. Las vides en esta parcela mostraron de manera subsiguiente síntomas severos de moho polvoriento en las hojas, tallos y uvas. El 12 de julio de 2004, la parcela no tratada se roció con 3 ml/L de formulación líquida de YGP-GET a una proporción de 1200 l/ha, y el resto del viñedo se roció con el producto comparador Rogana. Las vides se valoraron para síntomas de moho polvoriento después de 24 horas. Las vides se pusieron en un sistema de enrejado de liras altas.
Detalles del Producto Comparador Rogana ( fenbuconazol 5 %, binocap 16 %), elaborado por BASF (BASF Agro Helias S.A., Athens, Grecia). El 12 de julio de 2004, se aplicó Rogana al viñedo Tsigaras como un tratamiento para moho polvoriento. La dosis se determinó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las vides se examinaron visualmente para los síntomas de moho polvoriento.
Resultados Los síntomas severos de moho polvoriento fueron evidentes antes de la aplicación de YGP-GET. Sólo 24 horas después de la aplicación de YGP-GET, la floración blanca del moho polvoriento se volvió negra, indicando la actividad antifungal efectiva. Puesto que se detuvo eficientemente la enfermedad en este momento, no se aplicaron tratamientos adicionales. YGP-GET mostró eficacia comparable al tratamiento convencional .
Análisis En este estudio, se trató una infección de moho polvoriento bien establecida de forma rápida y efectiva usando YGP-GET. Sólo 24 horas después de la aplicación, la infección de moho polvoriento anteriormente severa se detuvo por aplicación del producto de terpeno, con eficacia comparable al tratamiento convencional . Los datos preliminares obtenidos de este estudio sugieren que YGP-GET puede ser eficaz en el tratamiento de infecciones fúngales establecidas además de mostrar capacidad preventiva.
Ejemplo 19.- Ensayos de Campo Adicionales de Composición de Terpeno Encapsulado en Moho Polvoriento Antecedentes y Fundamento En el ensayo actual, el uso de YGP-GET se investigó como parte del programa experimental del viñedo Tasmanian (Frogmore Creek Vineyard, Hathaway Trading Pty Ltd, Box 187, Richmond TAS 7025, Australia) para controlar el moho polvoriento usando productos orgánicos. La finalidad de este estudio fue investigar la eficacia a corto plazo de la aplicación de YGP-GET en el control orgánico de moho polvoriento en vides Chardonnay. En este ensayo, las vides (variedad Chardonnay) se trataron ya sea con el producto de terpeno YGP-GET o se dejaron sin tratar (control) el 7 de febrero de 2005. Aunque se suprimió por tratamientos orgánicos anteriores, la severidad pre-ensayo de moho polvoriento estaba a un nivel considerado inaceptable de forma comercial y fue equivalente en las 6 parcelas con tratamiento activo y 6 parcelas de control. La etapa de cultivo fue aproximadamente E-L 33-34 (pre-veraison) . Se roció (4 mL/L) (formulación líquida) en 6 parcelas Chardonnay, que se han tratado anteriormente con leche. Seis parcelas Chardonnay se dieron como controles sin tratar, pero se han tratado anteriormente con aceite/suero. El número de vides por parcela fue típicamente 7. Los detalles de la composición del YGP-GET usado en este protocolo se dan en la Tabla 20.
Tabla 20.- Formulación de Lote Usado en el Presente Estudio La severidad del moho polvoriento se valoró 3 días antes del tratamiento con terpeno y nuevamente 3 días después del tratamiento. En cada parcela, se seleccionaron 20 racimos de uva al asar (10 racimos por lado de panel), y se estimó la severidad de la enfermedad como el porcentaje de área de los racimos cubiertos con colonias activas de moho. No fue posible la valoración adicional debido a que el vinicultor roció subsiguientemente el área de ensayo completa con azufre y un adyuvante vegetal de aspersión basado en aceite (Aceite Synertrol Horta) .
Número/área de plantas que se van a tratar Producto de prueba: YGP-GET (4 mL/L) que se va a aplicar a 6 parcelas Chardonnay (total de aproximadamente 42 vides), que se han tratado anteriormente con leche. Control: No se aplicó tratamiento a 6 parcelas Chardonnay (total de aproximadamente 42 vides) que se va a usar como controles, pero se han tratado anteriormente con aceite/suero.
Métodos de cultivo Las vides Vi is vini f era (Chardonnay) en bloque B2 : brote vertical que se coloca con cañas arqueadas .
Arreglo de cultivo Espaciado: Distancia de 2.5 m entre filas y 1.25 m entre vides (dentro de filas), con 3,200 vides por hectárea. La orientación de las filas fue de norte a sur.
Densidad de dosel El método de punto cuadrante se usó para caracterizar la densidad de dosel pre-ensayo de las vides Chardonnay (Tabla 21) . Se tomaron mediciones el 13 de enero de 2005 al seleccionar secciones representativas del dosel dentro de las parcelas Chardonnay que se han tratado anteriormente ya sea con azufre o se dejaron sin tratar. Se tomaron diez mediciones en cada una de las 6 parcelas de cada tratamiento anterior (es decir, un total de 60 mediciones para las parcelas tratadas con azufre y 60 mediciones para las parcelas de control sin tratar) . Además, se midieron la longitud y número de nodos en 3 lotes verticales (por parcela) .
Tabla 21.- Densidad de dosel pre-ensayo de las vides Chardonnay NA, no aplicable.
Condición general El tratamiento anterior de estas parcelas con material experimental suprimió el moho polvoriento en comparación al control no tratado. Sin embargo, el nivel de moho polvoriento se consideró comercialmente inaceptable, aunque equivalente en ambas parcelas tratadas con leche y aceite/suero.
Método de aplicación, dosis y régimen Se aplicó tratamiento de YGP-GET (4 mL/L) el 7 de febrero de 2005 con una pistola manual conectada a un riel de manguera y bomba montada en la bandeja plana de un vehículo utilitario. La aspersión se propulsó con una presión de bomba de 1500-1600 kPa (200-230 lbs/pulg2) , que distribuye aproximadamente 63 mL/segundo. El volumen normal de aspersión para tratamientos convencionales (aproximadamente 900 L/ha) se usó. La severidad del moho polvoriento, estimada como el área (%) de racimos de uva cubiertos con colonias activas de moho, se valoró para 20 racimos seleccionados al asar dentro de cada parcela (10 racimos por lado de panel) . La severidad de la enfermedad se valoró el 4 de febrero de 2005, 3 días antes de la aplicación del tratamiento de YGP-GET, y nuevamente el 10 de febrero de 2005, 3 días después de la aplicación de terpeno.
Los datos se transformaron usando la transformación arco seno para obtener separaciones medias.
Resultados Antes del tratamiento, la severidad media del moho polvoriento en racimos de uva Chardonnay en las 6 parcelas que se van a tratar con terpeno (20.4 %) fue similar a aquella en las 6 parcelas de control (23.2 %; Tabla 22). El análisis estadístico basado en la transformación de arco seno de estos datos se encontró que no hubo diferencia significativa en la severidad de enfermedad antes del tratamiento (Tabla 23) . Tres días después del tratamiento, sin embargo, la severidad media del moho polvoriento fue de 23.8 % en racimos tratados con YGP-GET versus 37.8 % en los controles (Tabla 22) . La transformación de arco seno de estos datos mostró una diferencia estadísticamente significativa a favor de los racimos de uva tratados con terpeno, que tiene un área más pequeña cubierta por colonias activas de moho (p = 0.058; Tabla 23) .
Tabla 22. Severidad media de moho polvoriento (%) en racimos Chardonnay antes y después del tratamiento con YGP-GET Tabla 23. Separación estadística de tratamientos después de transformación de arco seno de datos Análisis : La infección de vides con moho polvoriento puede provocar pérdidas considerables a los vinicultores y al vigor, así como a la calidad de la fruta y vino. En viñedos orgánicamente manejados, los vinicultores están buscando alternativas a los tratamientos tal como azufre elemental. Este estudio investigó la eficacia de formulaciones de terpeno encapsulado (4 mL/L) como una formulación líquida en el control de moho polvoriento en un viñedo orgánico en Tasmania, Australia. En tanto que se han usado otros tratamientos experimentales con tan poco como 3 semanas antes de la aplicación de terpeno, el nivel de infección de moho polvoriento aún se consideró comercialmente inaceptable. 3 días después del tratamiento de las vides Chardonnay con YGP-GET, la severidad del moho polvoriento en las uvas tratadas fue significativamente menor que aquella en los controles no tratados. En tanto que la severidad e infección en los controles no tratados empeoró durante los 6 días entre las valoraciones de pre- y pos-tratamiento, permaneció estable en las vides tratadas. Por lo tanto, YGP-GET pareció haber disminuido la velocidad de incremento de la enfermedad en los racimos de uvas que tienen colonias bien establecidas de moho polvoriento, esporulante antes del tratamiento. Presumiblemente, se inhibió la expansión de las colonias, aunque las colonias existentes continuaron esporulando en algún grado. Una valoración más a largo plazo de la eficacia no fue posible debido a que el vinicultor roció subsiguientemente el área completa de ensayo con azufre. Estos resultados alentadores demuestran la eficacia de YGP-GET en el control del moho polvoriento en vides .
Ejemplo 20.- Ensayos de Campo de Composición de Terpeno Encapsulado en Botrytis La Putrefacción de racimos de uvas por Botrytis se provoca por Botrytis cinérea, un hongo común que puede provocar serias pérdidas en el rendimiento de la fruta. Las bayas son el sitio predominante de infección, aunque la enfermedad puede afectar también las flores y hojas. Inicialménte, las bayas infectadas parecen mullidas y acuosas, y pueden llegar a estar cubiertas con crecimiento fungal gris en condiciones de alta humedad. Durante el tiempo, las bayas infectadas se arrugan y caen. El Botrytis se favorece con condiciones húmedas con pobre circulación de aire, y las bayas divididas o dañadas son particularmente susceptibles a la propagación de la infección. Las estrategias de manejo para botrytis incluyen promoción de una buena circulación de aire, prevención de heridas y aplicación de fungicidas en tiempos apropiados durante la estación de crecimiento. La finalidad de este estudio fue investigar la eficacia de YGP-GET en el tratamiento de infección por botrytis en uvas. La emergencia de botrytis en el viñedo Kir-Yianni a mediados de octubre de 2004 (3 semanas después de una aplicación de Teldor"* no se puede tratar con agroquímicos convencionales debido a las restricciones de tiempo asociadas a las re-entrada que impedirían la recolección planeada. Por lo tanto se identificaron dos parcelas adyacentes de 0.1 ha en el sitio 7 del viñedo, y el 12 de octubre de 2004, una de las parcelas se trató con 4 mL/L de formulación líquida de YGP-GET y la otra se dejó sin tratar (ver Figura 23). El cultivo se recolectó 3 días más tarde, y se determinó la proporción de bayas infectadas para cada parcela (% en peso del rendimiento total) . Las bayas no infectadas tanto de las parcelas tratadas como no trastadas entonces se examinaron en el tanque de fermentación. El sitio 7 se ha tratado con múltiples productos antes de la aplicación de la formulación de terpeno pero aún muestra infección de botrytis. A las vides se les dio una aplicación individual de 4 mL/L de formulación líquida de YGP-GET a una proporción de 1200 l/ha. Las siguientes etapas de crecimiento de las uvas se registraron. - recolección de brotes, 26 de marzo de 2004 - floración, 01 de junio de 2004 - veraison, 06 de agosto de 2004 - recolección, 15 de octubre de 2004 Las aplicaciones de estudio toman lugar 3 días antes de la recolección. La estación de crecimiento de 2004 fue excepcionalmente tardía y fue húmeda de principio a fin. La presión de enfermedad de moho lanuginoso fue extremadamente alta, la presión de moho polvoriento fue moderada y se elevaron los niveles de botrytis. Se aplicó YGP-GET en este momento para valorar su eficacia potencial contra una infección de botrytis que no se puede haber tratado de otro modo debido a las restricciones de tiempo de pesticida antes de la recolección. La valoración visual del sitio antes de la aplicación de producto de terpeno reveló evidencia de infección de botrytis. Después de la recolección, las bayas se exhibieron en una banda transportadora y las bayas infectadas se separaron manualmente de las bayas no infectadas antes del aplastamiento. La proporción de bayas infectadas se calculó como un porcentaje del rendimiento total (en peso) para cada parcela.
Resultados La valoración visual del sitio antes de la aplicación de YGP-GET reveló evidencia de infección por botrytis. Después de la recolección (3 días después de la aplicación de YGP-GET) , las proporciones de las bayas infectadas fueron 13 % y 23 % en las parcelas tratada y no tratada, respectivamente. Las áreas probadas no fueron suficientes para valorar el significado estadístico, sin embargo, el tratamiento con YGP-GET mostró claramente el progreso de la enfermedad. La fermentación no se afectó por el mezclado de bayas no infectadas de las parcelas no tratadas y tratadas con terpeno.
Análisis Los tratamientos convencionales para botrytis se deben detener 3 semanas antes de la recolección, dejando tiempo para daño considerable al rendimiento de cultivo y que se presente pobre calidad. El desarrollo de un tratamiento que se puede usar hasta la recolección, o que se pueda continuar más cerca a la recolección que los productos existentes, puede dar por resultado mejoras significativas en el rendimiento de cultivo y calidad de vino, y sería de beneficio considerable a los vinicultores. En este estudio, el tratamiento con el producto de terpeno YGP-GET retrasó visiblemente el progreso de una infección establecida de botrytis sólo 3 días antes de la recolección, dando por resultado una proporción menor de bayas infectadas en la parcela tratada con terpeno que en la parcela no tratada. Adicionalmente, a pesar del uso de YGP-GET cerca de la recolección, la fermentación no se afectó por la combinación de uvas tratadas y no tratadas . Estos resultados sugieren que YGP-GET es eficaz en reducir el impacto de infecciones establecidas de botrytis y se puede usar cerca de la recolección sin efectos perjudiciales en la fermentación subsiguiente.
Ejemplo 21.- Evaluación de Terpenos Encapsulados para el Tratamiento de Moho Lanuginoso establecido y evaluación subsiguiente de calidad de uva. Se llevó a cabo un ensayo de YGP-GET el 25/08/04 aplicando la composición a una proporción de 1000 g por 250 litros. Un viñedo de Cabernet Sauvignon que estaba 100 % infectado y que sufría pérdida sustancial de hojas debido a moho lanuginoso, se rocío. Cualquier hoja restante estuvo infectada con puntos de moho lanuginosos como se evidencia por el punto amarillo en la parte superior de la hoja y el crecimiento belloso en el fondo de la hoja; la indicación clásica de moho lanuginoso. Muchas de las hojas fueron casi completamente amarillas indicando infección sustancial. Esta pérdida de hojas y la infección retrasa en general la madurez de las uvas y en muchos casos las uvas nunca maduran completamente para los propósitos de elaboración de vino. La observación de racimos totalmente inmaduros (es decir, bayas verde oscuro, duras, de 1 centímetro de diámetro y de forma ovalada) ocasionalmente en los vides indica que los vides estuvieron infectados probablemente antes de veraison, y probablemente en la floración o antes. No se ha usado antes aplicación de cobre (sulfato de Cobre básico o Bordeaux) . Este viñedo estuvo infectado pesadamente en la recolección anterior al punto que no se produjo cosecha del Cabernet Sauvignon. El último año de pérdida de hojas fue de 100 % a pesar del tratamiento con bicarbonato de potasio en un intento para aniquilar por contacto el moho lanuginoso, seguido por aplicación con estilburina para protección sistémica a largo plazo. El 19/09/04, las uvas tratadas en este ensayo se recolectaron y aplastaron y se hicieron las siguientes observaciones en el mosto (Tabla 24): Tabla 24 Estos resultados indican que las uvas de las vides tratadas son más maduras que aquellas de las vides no tratadas. La observación de las uvas por si mismas indicó que las uvas no tratadas fueron, en promedio, más claras en color, algunas con un tinte rosáceo/púrpura/verde transparente, indicativo de uvas justo más allá de veraison, en tanto que las uvas tratadas fueron púrpura oscuro en promedio y opacas, típicas de uvas completa o casi completamente maduras . La degustación de estas uvas reveló que las uvas tratadas tienen un sabor más frutero típico de la sazón Cabernet Sauvignon, en tanto que las uvas no tratadas no tienen el sabor frutal completo. Las uvas no tratadas tienen un sabor acidulado de manzana verde que indica una alta probable relación málica/tartárica inadecuada para una buena elaboración de vinos . Estas uvas se aplastaron y despalillaron en la preparación para producir un vino de estas uvas para demostrar la diferencia en estas uvas y para demostrar la adecuabilidad de las uvas tratadas para elaboración de vino. El vinicultor se preocupó que este tratamiento afectara el sabor del vino, aunque en la sugerencia probó las uvas tratadas el día después de la aplicación de YGP-GET y no encontró sabor o aroma persistente. La diferencia en las uvas tratadas y no tratadas se demuestra adicionalmente en el color del mosto. El jugo de las uvas no tratadas fue verdoso ligero/incoloro (algo similar a un mosto de vino blanco) en tanto que el mosto de las uvas tratadas fue un color rosáceo típico de las uvas de sazón Cabernet Sauvignon inmediatamente después del aplastamiento. Estos resultados indican que YGP-GET es eficaz en el tratamiento tardío de viñedo de verano al aniquilar y detener la re-infección de moho lanuginoso, en al menos del corto plazo. La investigación adicional en la eficacia a largo plazo de YGP-GET en el control de moho lanuginoso sería útil, pero los resultados presentados muestran que YGP-GET es un tratamiento útil . El moho lanuginoso de comienzo tardío puede arruinar completamente una cosecha y actualmente no hay tratamientos efectivos que se puedan aplicar brevemente antes de la recolección y que retengan su capacidad para proporcionar protección. La gran fuerza de YGP-GET es la capacidad para proporcionar una aniquilación rápida y para mantener esta eficacia durante un periodo más prolongado que otros fungicidas de contacto. Hay varios antifungicidas en el mercado que tienen un historial establecido contra moho lanuginoso, pero todos necesitan algún tiempo después de la aplicación para que se pueda recolectar la cosecha. Algunos tratamientos (tal como productos que contienen azufre) no se pueden usar si la temperatura se eleva por arriba de 85°F. La fitotoxicidad de los fungicidas que contienen cobre también es significativa dependiendo de la variedad de la uva. Los fungicidas por contacto no tienen un efecto a largo plazo de modo que frecuentemente se necesita una segunda aplicación de un fungicida activo de más tiempo, pero se puede restringir por la regulación pertinente (por ejemplo PHI o REÍ) . Muchos tratamientos convencionales para moho lanuginoso tienen una reentrada restringida (REÍ y/o PHI) que significa que el vinicultor no puede aplicar el tratamiento por miedo a que aplicará algo similar a Mancozeb, que tiene un PHI de 66 días; el vinicultor entonces sería incapaz de recolectar sus uvas en la madurez máxima . El moho lanuginoso está implicado como la causa principal de vinos muy pobres que se producen al oeste del Mississippi. YGP-GET puede permitir que las uvas afectadas maduren apropiadamente y se recolecten en madurez plena en esta industria rápidamente creciente. De manera ventajosa, debe ser elegible YGP-GET para la aprobación por los varios comités "orgánico" (muchos auto-designados) que este producto es adecuado para el uso de uvas cultivadas bajo guías "orgánicas". Esto abre otro nicho en un segmento de mercado rápidamente creciente en los Estados Unidos y a nivel Mundial.
Ejemplo 22.- Valoración in vitro de las propiedades fungicidas de terpenos encapsulados y no encapsulados Se llevaron a cabo pruebas adicionales para valorar las 31 preparaciones de terpeno no encapsulado expuestas en el Ejemplo 15 y las preparaciones 16 y 22 encapsuladas en partículas de glucano. Para llevar a cabo estos ensayos, se colocaron 20000 esporas en caldo de dextrosa de patata con concentración de 1/3 (PDB) y se adicionaron cantidades suficientes de formulaciones seleccionadas de terpeno para dar concentraciones que varían de 10 a 1000 ppm. Estos materiales de prueba se colocaron en tubos Ependorf tapados estériles con esporas de Botrytis cinérea (B.c), se incubaron durante 24 horas, luego las esporas se recuperaron por centrifugación, y las soluciones de terpeno se descartaron. Las esporas/biomasa se enjuagaron con agua estéril, se centrifugaron nuevamente y luego se pusieron a 300 µl de PBD de concentración 1/3 y se transfirieron a placas de 96 cavidades. La densidad óptica de las esporas sobrevivientes que crecen en las micelas se midió durante el tiempo. Se definió la actividad fungicida como la aniquilación total de 20000 esporas después de 24 horas de exposición a terpeno, como se evidencia por la ausencia de crecimiento micelial. Los resultados sugieren que ciertas formulaciones no fueron fungicidas a un nivel estadísticamente significativo de acuerdo con las presentes condiciones de prueba (resultados no mostrados) . Estos son: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30. Referirse al Ejemplo 15 (Tabla 17) para detalles de las composiciones. La concentración mínima inhibitoria para la mayoría de los compuestos efectivos se expone en la Tabla 26.
Tabla 25 * En diferentes pruebas, la concentración más baja que no dio crecimiento fue ya sea 500 o 750 ppm.
Prueba comparativa de compuestos en agua y encapsulados en partículas huecas de glucano Se prepararon muestras de las formulaciones 16 (geraniol, eugenol y timol) y 22 (eugenol, timol y citral) encapsuladas en partículas huecas de glucano de acuerdo con las técnicas anteriormente descritas. Entonces se valoraron las propiedades fungicidas para formulaciones encapsuladas y no encapsuladas usando el protocolo descrito anteriormente para las . formulaciones no encapsuladas . Los resultados son bastante diferentes con las formulaciones de terpeno encapsulado en comparación con los terpenos suspendidos en agua, como se muestra en la Figura 24. La concentración mínima efectiva se muestra más adelante en la Tabla 26.
Tabla 26 De esta manera, los resultados con los materiales 16 y 22 son bastante diferentes cuando está en suspensión acuosa y cuando se prueba encapsulado en partículas de glucano. (Nota: como se menciona más adelante, hubo alguna variabilidad en los resultados con terpenos suspendidos en agua, el experimento señalado anteriormente es un ejemplo de esto) . Los valores de MIC son compuestos de varios ensayos.
De manera importante, los resultados con formulaciones de terpeno encapsulado no sufrieron de los problemas de variabilidad asociados con suspensiones acuosas de terpeno. Hay cinco pruebas separadas de terpenos suspendidos en agua y tres con las YP. Las formulaciones de terpeno encapsulado son fácilmente miscibles con agua y proporcionan una formulación de terpeno de liberación lenta en el medio acuoso. Esto da por resultado un tiempo de exposición más prolongado de las esporas a los terpenos. Los problemas que monitorizan las formulaciones de terpeno no encapsulado en suspensión en los medios de prueba se encontraron que pueden haber afectado los resultados a este respecto. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (84)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Composición, caracterizada porque comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno.
  2. 2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular es una pared de célula fungal .
  3. 3. Composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular es una pared de célula de levadura.
  4. 4. Composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la pared de célula de levadura se deriva de una célula de levadura de panadero.
  5. 5. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular es un producto de desperdicio insoluble de un proceso de elaboración de extracto de levadura.
  6. 6. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular se ha extraído por álcalis.
  7. 7. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular se ha extraído por ácidos .
  8. 8. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular se ha extraído con solvente orgánico.
  9. 9. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular tiene un contenido de lípido de 1 % o mayor.
  10. 10. Composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el contenido de lípido de la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular es 5 % p/p o mayor.
  11. 11. Composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el contenido de lípido es 10 % p/p o mayor.
  12. 12. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque el componente de terpeno comprende uno o más de los terpenos seleccionados del grupo que consiste de citral, pineno, nerol, b-yonona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona (por ejemplo L-carvona) , terpeniol, anetol, canfor, mentol, timol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno (vitamina Ai), escualeno, timol, tocotrienol, alcohol perilílico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpeneno, linalol, o mezcla de los mismos.
  13. 13. Composición de conformidad con la reivindicación anterior, caracterizada porque el componente de terpeno comprende un terpeno que tiene la estructura general C?0H?6.
  14. 14. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque el componente de terpeno comprende uno o más terpenos seleccionados del grupo que consiste de geraniol, timol, citral, carvona (por ejemplo, L-carvona), eugenol, b-yonona o una mezcla de los mismos .
  15. 15. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque el componente de terpeno comprende una mezcla de geraniol, timol y eugenol .
  16. 16. Composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente de terpeno comprende 100 % de timol.
  17. 17. Composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente de terpeno comprende 50 % p/p de geraniol y 50 % p/p de timol.
  18. 18. Composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente de terpeno comprende 50 % p/p de eugenol y 50 % p/p de timol.
  19. 19. Composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente de terpeno comprende 33 % p/p de geraniol, 33 % p/p de eugenol y 33 % p/p de timol.
  20. 20. Composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente de terpeno comprende 33 % p/p de eugenol, 33 % p/p de timol y 33 % p/p de citral.
  21. 21. Composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente de terpeno comprende 25 % p/p de geraniol, 25 % p/p de eugenol, 25 % p/p de timol y 25 % p/p de citral.
  22. 22. Composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente de terpeno comprende 20 % p/p de geraniol, 20 % p/p de eugenol, 20 % p/p de citral y 20 % p/p de timol y 20 % p/p de L-carbona .
  23. 23. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque el componente de terpeno está asociado con un agente tensioactivo.
  24. 24. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque el agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste de laurilsulfato de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80, polisorbato, 40, polisorbato 60, éster de poliglicerilo, monooleato de poliglicerilo, monocaprilato de decaglicerilo, dicaprilato de propilenglicol, monoestearato de triglicerol, monooleato de polioxietilensorbitán, Tween"*, Span"* 20, Span"* 40, Span"* 60, Span"* 80, Brig 30 o una mezcla de dos o más de los mismos.
  25. 25. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque comprende de 1 a 99 % en volumen de terpenos, de 0 a 99 % en volumen de agente tensioactivo y de 1 a 99 % de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular.
  26. 26. Composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 67 % p/p de terpenos, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 % p/p de agente tensioactivo y de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 % p/p de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular .
  27. 27. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque es adecuada para aniquilar bacterias u hongos.
  28. 28. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque es adecuada para aniquilar mohos .
  29. 29. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque es adecuada para aniquilar micoplasmas .
  30. 30. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque los terpenos usados son grado alimenticio.
  31. 31. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque comprende un compuesto activo adicional grado alimenticio.
  32. 32. Composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el compuesto activo adicional grado alimenticio es un agente antimicrobiano o enzima.
  33. 33. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque comprende un agente antimicrobiano, un agente antifungal, un agente insecticida, o un agente antiinflamatorio o un anestésico.
  34. 34. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque además comprende un antioxidante.
  35. 35. Composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el antioxidante es aceite de romero, vitamina C o vitamina E.
  36. 36. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque está en la forma de un polvo seco.
  37. 37. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, caracterizada porque está en la forma de comprimido, tableta u otra forma sólida.
  38. 38. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque comprende un agente de dispersión que promueve la dispersión de la composición cuando se coloca en un líquido.
  39. 39. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque está en combinación con un portador o excipiente que es adecuado de forma agrícola, alimenticia o farmacéutica, en una forma líquida, sólida o tipo gel.
  40. 40. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, caracterizada porque está suspendida o disuelta en un líquido.
  41. 41. Composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el líquido es agua.
  42. 42. Composición de conformidad con ya sea la reivindicación 40 o 41, caracterizada porque comprende de aproximadamente 500 a aproximadamente 10000 ppm de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular, en donde las partículas contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 67 % de componente de terpeno.
  43. 43. Composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque comprende de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2000 ppm de partículas huecas de glucano o partículas de pared celular, en donde las partículas contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 % p/p de componente de terpeno.
  44. 44. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, caracterizada porque comprende entre aproximadamente 1 ppm y aproximadamente 25 ppt del componente de terpeno .
  45. 45. Composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque comprende entre aproximadamente 100 a 1000 ppm del componente de terpeno.
  46. 46. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, caracterizada porque se dispersa en agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol o etanol para formar una solución o suspensión.
  47. 47. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque incluye un agente humectante, un agente emulsionador o un agente amortiguador de pH.
  48. 48. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque está dispersada en un material para beber o de alimento, líquido para humanos o animales .
  49. 49. Composición de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizada porque está en una forma adecuada para administración oral.
  50. 50. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, caracterizada porque está en una forma adecuada para administración parenteral .
  51. 51. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, caracterizada porque está en una forma adecuada para administración tópica.
  52. 52. Método para preparar una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar un componente de terpeno; b) proporcionar una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular; c) incubar el componente de terpeno con una partícula de glucano o partícula de pared celular bajo condiciones adecuadas para encapsulación del terpeno; y d) recuperar la partícula del glucano o partícula de pared celular que encapsula el componente de terpeno.
  53. 53. Método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque además comprende el paso de secar la partícula de glucano o partícula de pared celular que encapsula el componente de terpeno .
  54. 54. Método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el secado se logra por liofilización, secado por lecho fluidizado, secado en tambor o secado por aspersión.
  55. 55. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, caracterizado porque en el paso a) el componente de terpeno se proporciona como una suspensión en un solvente acuoso.
  56. 56. Método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el componente de terpeno se proporciona en asociación con un agente tensioactivo.
  57. 57. Composición de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el agente tensioactivo es monooleato de polioxietilensorbitán a una concentración de aproximadamente 0.1 a 10 % en volumen de la mezcla total de reacción.
  58. 58. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, caracterizado porque en el paso a) el componente de terpeno se proporciona como una solución verdadera en el solvente acuoso.
  59. 59. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 58, caracterizado porque en el paso b) la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular se proporciona como una suspensión en agua u otro líquido adecuado .
  60. 60. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la suspensión comprende aproximadamente 1 a 1000 mg de partícula de glucano o partículas de pared celular por ml .
  61. 61. Método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque las partículas se dispersan en un volumen del volumen hidrodinámico (HV) a 1.5 HV de líquido.
  62. 62. Método de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 52 a 58, caracterizado porque en el paso b) la partícula hueca de glucano o partícula de pared celular se proporciona como un polvo seco.
  63. 63. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 62, caracterizado porque en el paso c) la reacción se lleva a cabo a presión atmosférica a una temperatura de aproximadamente 20 a 37°C.
  64. 64. Método para aniquilar un microorganismo, caracterizado porque comprende el paso de: poner en contacto el microorganismo con una composición que comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno .
  65. 65. Método para tratar o prevenir la infección de una planta, caracterizado porque comprende el paso de: administrar, en una dosis terapéuticamente efectiva, una composición que comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno a la planta o al suelo en proximidad a la planta.
  66. 66. Método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la infección de la planta se provoca por un nematodo.
  67. 67. Método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la infección de la planta se provoca por un hongo.
  68. 68. Método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el hongo es moho lanuginoso, moho polvoriento o putrefacción de racimo.
  69. 69. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 68, caracterizado porque la planta es uva de vino .
  70. 70. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 69, caracterizado porque la composición se administra 21 días o menos antes de recolectar el cultivo de la planta.
  71. 71. Método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la composición se administra 14 días o menos antes de la recolección.
  72. 72. Método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la composición se administra 7 días o menos antes de la recolección.
  73. 73. Método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la composición se administra 3 días o menos antes de la recolección.
  74. 74. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 73, caracterizado porque la composición se administra por aspersión.
  75. 75. Método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque la composición se rocía a un proporción de 500 L/Ha o mayor.
  76. 76. Método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la composición se rocía a un proporción de 900 L/Ha o mayor.
  77. 77. Método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la composición se rocía a un proporción de 1200 L/Ha o mayor.
  78. 78. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 a 73, caracterizado porque la composición se administra mediante irrigación.
  79. 79. Método para prevenir o tratar una infección en un paciente, caracterizado porque comprende el paso de administrar al paciente en una dosis terapéuticamente efectiva, una composición que comprende una partícula hueca de glucano o partícula de pared celular que encapsula un componente de terpeno.
  80. 80. Método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque la infección del paciente se provoca por Staphylococcus aureus, Aspergillius fumigatus, Mycoplasma iowae, Penicillium sp. o Mycoplasma pneumoniae.
  81. 81. Método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la composición se administra de manera oral, vaginal, rectal, por inhalación, de forma tópica o por rutas parenterales .
  82. 82. Composición, caracterizada porque comprende una partícula hueca de glucano que encapsula un componente de terpeno para el uso en la prevención o tratamiento de una infección en un paciente o una planta.
  83. 83. Uso de una partícula hueca de glucano que encapsula un componente de terpeno en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una infección en un paciente.
  84. 84. Uso de conformidad con la reivindicación 83, en donde la infección se provoca por Aspergillius fumigatus, Sclerotinta homeocarpa, Rhizoctonia solani , Colletotrichum graminicola o Penicillium sp.
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