NO332559B1

NO332559B1 - Anvendelse av fusjonspolypeptid for fremstilling av medikamenter til behandling av oyesykdommer

Info

Publication number: NO332559B1
Application number: NO20100656A
Authority: NO
Inventors: George D Yancopoulos; Nicholas J Papadopoulos; Samuel Davis
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2010-05-06
Publication date: 2012-10-29
Also published as: CY1108883T1; FR13C0028I1; EP1183353A1; NO20016036D0; MXPA01012630A; CZ302689B6; BRPI0011407B1; CY2013019I2; ATE417928T1; ATE293164T1; NO20100656L; PT1544299E; CN101433715B; YU86901A; ME00024B; CY2013019I1; NO330775B1; NZ515913A; ZA200110068B; HU230159B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av et fusjonspolypeptid som er i stand til å binde vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) for fremstilling av et medikament til behandling av en øyesykdom som erkarakterisert vedvaskulær permeabilitet, hvor fusjonspolypeptidet omfater: (a) en VEGF reseptorkomponent bestående i hovedsak av et immunoglobulinliknende (lg) domene 2 av en første VEGF-reseptor og Ig-domene 3 av en andre VEGF-reseptor samt (b) en multimeriserende komponent; og hvor den første VEGF-reseptor er Fitl, den andre VEGF-reseptor er Fikl eller Flt4, og VEGF-reseptorkomponenten er den eneste VEGF-reseptorkomponenten av fusjonspolypeptidet. De aktuelle fusjonspolypeptider har evnen å nedsette eller inhibere plasmalekkasje og/eller den vaskulære permeabilitet i et pattedyr.

BAKGRUNN

Evnen av polypeptidligander til å bindes til celler og dermed utløse en fenotypisk respons så som cellevekst, overlevelse, celleproduktutsondring eller differensiering, medieres ofte av transmembrane reseptorer på cellene. Det ekstracellulære domene av slike reseptorer (dvs. det parti av reseptoren som vises frem på overflaten av cellen) er generelt det mest karakteristiske parti av molekylet, idet det tilfører proteinet dets ligandbindingskarakteristikk. Bindingen av en ligand til det ekstracellulære domene fører generelt til en signaltransduksjon som overfører et biologisk signal til intracellulære mål. Ofte virker denne signaltransduksjon via et katalytisk intracellulært domene. Den bestemte anordning av sekvensmotiver av dette katalytiske intracellulære domene bestemmer dets tilgang til potensielle kinasesubstrater (Mohammadi et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 11: 5068-5078; Fantl et al., 1992, Cell 69: 413-413). Eksempler på reseptorer som transduserer signaler via katalytiske intracellulære domener, omfatter reseptor-tyrosinkinaser (RTK'er) så som Trk-reseptorfamilien, som generelt er begrenset til celler i nervesystemet, cytokin-reseptorfamilien omfattende tripartat-CNTF-reseptorkompleks (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454-1466), som også er generelt begrenset til cellene i nervesystemet, G-proteinkoblede reseptorer så som p2-adrenergisk reseptor som f.eks. foreligger på hjertemuskelceller, og den flerverdige IgE-høyaffinitetsreseptor FceRI som hovedsakelig finnes på mastceller og basofiler (Sutton &. Gould, 1993, Nature 366: 421-428).

Alle reseptorer som hittil er blitt identifisert, virker å gjennomgå en dimerisering, multimerisering eller en beslektet konformasjonell endring etter ligandbinding (Schlessinger, J., 1998, Trend Biochem. Sei. 13: 443-447; Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212; Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383-391), og molekylære vekselvirkninger mellom dimeriserende intracellulære domener fører til en aktivering av den katalytiske funksjon. I noen tilfeller, så som blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), er liganden en dimer som binder to reseptormolekyler (Hart et a/., 1998, Science, 240: 1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912), mens liganden f.eks. i tilfellet av epidermal vekstfaktor (EGF) er en monomer (Weber eta/., 1984, J. Biol. Chem. 259: 14631-14636). I tilfellet av FCeRI-reseptor, foreligger liganden, IgE, bundet til FcsRI på monomer måte, og aktiveres først når antigen bindes til IgE/FcERI-komplekset og fornetter hosliggende IgE-molekyler (Sutton &Gould, 1993, Nature 366: 421-428).

Ofte gir vevfordelingen av en bestemt reseptor i høyere organismer en forståelse for den biologiske funksjon av reseptoren. RTK'ene for noen vekst- og differensieringsfaktorer, så som fibroblastvekstfaktor (FGF), uttrykkes bredt og virker derfor å spille en generell rolle i vevets vekst og vedlikehold. Medlemmer av Trk-RTK-familien (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3: 262-268) av reseptorer er mer generelt begrenset til celler i nervesystemet, og nervevekstfaktorfamilien bestående av nervevekstfaktor (NGF), hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofin-3 (NT-3) og neurotrofin-4/5 (NT-4/5), som binder reseptorer av Trk-RTK-familie, fremmer differensieringen av forskjellige grupper av neuroner i hjernen og periferien (Lindsay, R.M., 1993, i Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin &J.H. Fallon, utg., s. 257-284, San Diego, CA, Academic Press). FceRI er begrenset til et meget lite antall celletyper, så som mastceller og basofiler. Mastceller stammer fra benmargflerpotent hematopoietisk stam-cellelinjen, men fullfører sin modning i vevet etter en migrasjon fra blodstrømmen (se Janeway & Travers, 1996, i Immunobiology, 2. utg., M. Robertson & E. Lawrence, utg., s. 1:3-1:4, Current Biology Ltd., London, UK, forlag) og er omfattet i allergiske responser.

Mange undersøkelser har vist at den ekstracellulære domene av en reseptor tilveiebringer den spesifikke ligandbindingskarakteristikk. Videre kan det cellulære miljø hvor en reseptor uttrykkes, påvirke den biologiske respons som oppvises etter binding av en ligand til reseptoren. F.eks. når en neuronal celle som uttrykker en Trk-reseptor utsettes for et neurotrofin som bindes til denne reseptor, fører dette til en neuronal overlevelse og differensiering. Når den samme reseptor uttrykkes av en fibroblast, fører en utsettelse for neutrotrofinet til en proliferasjon av fibroblasten (Glass eta/., 1991, Cell 66: 405-413).

En klasse celleeavledede di mere mitogener med selektivitet for vaskulære endotelceller er blitt identifisert og benevnt endotelcellevekstfaktor (VEGF). VEGF er blitt isolert fra kondisjonert vekstmedium av rotte-gliomaceller [Conn et al., (1990), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 87, s. 2628-2632]; og kondisjonert vekstmedium fra bovine hypofysefolikkel-stellatceller [Ferrara og Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, s. 851-858; Gozpadorowicz et al., (1989), Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 86, s. 7311-7315] og kondisjonert vekstmedium fra humane U937-celler [Conolly, D.T. et al. (1989), Science, 246, s. 1309-1312]. VEGF er en dimer med en tilsynelatende molekyl masse på ca. 46 kDa, hvor hver delenhet har en tilsynelatende molekylmasse på ca. 23 kDa. VEGF har noen strukturelle likheter med blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), som er et mitogen for bindevevceller, men som ikke er mitogent for vaskulære endotelceller fra store kar.

Den membranbundne tyrosinkinasereseptor, kjent som Fit, ble demonstrert å være en VEGF-reseptor [DeVries, C. et al., (1992), Science, 255, s. 989-991]. Flt-reseptor binder spesifikt VEGF, hvilket induserer mitogenese. En annen form for VEGF-reseptor, benevnt KDR, er også kjent for å binde VEGF og indusere mitogenese. Den delvise cDNA-sekvens og nærmest hellengdes proteinsekvens av KDR er også kjent [Terman, B.I. et al., (1991), Oncogene 6, s. 1677-1683; Terman, B.I. et al., (1992), Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, s. 1579-1586].

En vedvarende angiogenese kan forårsake eller forverre visse sykdommer så som psoriasis, rheumatoid artritt, hemangiomaer, angiofibromaer, diabetisk retinopati og neovaskulær glaukoma. En inibitor av VEGF-aktiviteten vil være nyttig for behandling av slike sykdommer og annen VEGF-indusert patologisk angiogenese og vaskulære permeabilitetstilstander, så som svulstvaskularisering. Foreliggende oppfinnelse vedrører en VEGF-inhibitor som baserer seg på VEGF-reseptor Fitl.

Plasmalekkasje, en hovedkomponent under betennelse, finner sted i en bestemt undergruppe av mikrokar. Spesielt finner i de fleste organer, plasmalekkasje sted i venulene. Til forskjell fra arterioler og kapillærer, begynner venuler å lekke som respons på forskjellige inflammatoriske mediatorer omfattende histamin, bradykinin og serotonin. Ett kjennetegn av betennelse er plasmalekkasjen som resulterer av intercellulære hulrom som dannes i endotel av venuler. De fleste eksperimentelle modeller for betennelse tyder på at disse intercellulære hulrom forekommer mellom endotelcellene av postkapillære og oppsamlende venuler (Baluk, P. et al., Am. J. Pathol. 1998, 152: 1463-1476). Det er blitt vist at visse lektiner kan brukes for å vise fokale seter for plasmalekkasje, endotele hulrom og fingerlignende utstikkere i endotelcellegrenser i betente venuler (Thurston, G. et al., Am. J. Physiol., 1996, 271: H2547-2562).

Egenskapene av mikrokarene er dynamiske. Kroniske betennelsessykdommer forbindes f.eks. med mikrovaskulær ommodellering, omfattende angiogenese og mikrokarforstørrelse. Mikrokar kan også gjenmodelleres ved å anta abnormale fenotypiske egenskaper. I en murin modell for kronisk luftveisbetennelse antar luftveis-kapillærer egenskapene av venuler, også en forstørret kardiameter, en hevet immunoreaktivitet for von Willebrand-faktor og økt immunoreaktivitet for P-selektin. I tillegg lekker disse ommodellerte kar som respons på inflammatoriske mediatorer, mens kar i den samme posisjon i luftveiene av normale mus ikke gjør dette.

Visse substanser har vist seg å nedsette eller inhibere den vaskulære permeabilitet og/eller plasmalekkasje. F.eks. er mystixiner syntetiske polypeptider som er blitt beskrevet å inhibere plasmalekkasje uten å blokkere dannelsen av endotelhulrom (Baluk, P. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 284: 693-699). Dessuten nedsetter den beta-2-adrenergiske reseptoragonist formoterol den mikrovaskulære lekkasje ved å inhibere dannelsen av endotelhulrom (Baluk, P. og MacDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266: L461-468).

Angiopoietiner og medlemmer av vaskulær endotel-vekstfaktor (VEGF)-familien er de eneste vekstfaktorer som antas å være overveiende spesifikke for vaskulære endotelceller. Målrettede gen-inaktiveringsundersøkelser i mus har vist at VEGF er nødvendig for de tidlige faser av den vaskulære utvikling, og at Ang-1 er nødvendig for senere trinn av den vaskulære ommodellering.

US-patent nr. 6.011.003, utstedet den 4. januar 2000 til Metris Therapeutics Limited, beskriver en endret, løselig form for FLT-polypeptid som har evnen til å bindes til VEGF og som derfor utøver en inhibitorisk virkning på den, hvor polypeptidet omfatter fem eller færre fullstendige immunoglobulindomener.

US-patent nr. 5.712.380, utstedet den 27. januar 1998 og overdratt til Merck & Co., beskriver vaskulære endotelcelle-vekstfaktor (VEGF)-inhibitorer som er naturlig forekommende eller rekombinant konstruerte løselige former med eller uten et C-terminalt transmembrant område av reseptoren for VEGF.

Også overdratt til Merck & Co. er PCT-publikasjon nr. WO 98/13071, publisert den 2. april 1998, som beskriver genterapimetoder for inhibering av primær svulstvekst og metastase ved genoverføring av en nukleotidsekvens som koder for et løselig reseptorprotein som bindes til VEGF.

PCT-publikasjon nr. WO 97/44453, publisert den 27. november 1998 i navnet til Genentech, Inc., beskriver nye chimaere VEGF-reseptorproteiner som omfatter aminosyresekvenser avledet fra vaskulær endotel-vektfaktor (VEGF)-reseptorene Fitl og KDR, medregnet den murine homolog for human KDR-reseptor FLK1, hvor de chimære VEGF-reseptorproteiner bindes til VEGF og antagoniserer den proliferative og angiogene aktivitet derav (se også davis-Smyth et al, EMBO J. 1996, vol 15, s. 4919-4927).

PCT-publikasjon nr. WO 97/13787, publisert den 17. april 1997 i navnet til Toa Gosei Co., Ltd., beskriver en VEGF-inhibitor med lav molekylvekt som kan brukes ved behandling av sykdommer som ledsages av neovaskularisering, så som faste svulster. Et polypeptid som inneholder den første immunoglobulinlignende domene og den andre immunoglobulinlignende domene i den ekstracellulære region av en VEGF-reseptor FLT, men som ikke inneholder den sjette immunoglobulinlignende domene og den syvende immunoglobulinlignende domene derav, viser en VEGF-inhibitorisk aktivitet.

Sharifi, J. eta/., 1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42: 242-249, beskriver at fordi monoklonale antistoffer (mAb'er) er basiske, positivt ladede proteiner, og pattedyrceller er negativt ladet, kan de elektrostatiske vekselvirkninger mellom disse to føre til høyere nivåer av bakgrunnsbinding, som fører til lave forhold mellom svulster og normale organer. For å overvinne denne virkning, forsøkte forskerne å forbedre Mab-utskillingen ved bruk av forskjellige metoder så som sekundære midler, samt kjemiske og ladningsmessige modifikasjoner av selve mAb'et.

Jensen-Pippo eta/., 1996, Pharmaceutical Research 13: 102-107, beskriver at en pegylering av et terapeutisk protein, rekombinant humant granulocytt-kolonistimulernede faktor (PEG-G-CSF), fører til en hevet stabilitet og retensjon av in wVo-bioaktiviteten når det administreres ved intraduodenal rute.

Tsutsumi eta/., 1997, Thromb Haemost. 77: 168-173, beskriver eksperimenter hvor den trombopoietiske aktivitet in vivo av polyetylenglykol-modifisert interleukin-6 (MPEG-IL-6), hvor 54% av de 14 lysin-aminogrupper av IL-6 var koblet til PEG, ble sammenlignet med daktiviteten av nativt IL-6.

Yang et al., 1995, Cancer 76: 687-694, beskriver at konjugering av polyetylenglykol til rekombinant humant interleukin-2 (IL-2) fører til en forbindelse, polyetylenglykol-modifisert IL-2 (PEG-IL-2) som beholder in vitro- og in vivo-aktiviteten av IL-2, men som oppviser en merkbart forlenget sirkulasjonshalveringstid.

R. Duncan og F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) beskriver forsøk på å forlenge plasmahalveringstiden av asparaginase ved å konjugere det med polyetylenglykol.

Den internasjonale PCT-publikasjon WO 99/03996, publisert den 28. januar 1999 i navnet til Regeneron Pharmaceuticals, Inc. og The Regents Of The University of California, beskriver modifiserte humane noggin-polypeptider som har delesjoner av områder med basiske aminosyrer. De modifiserte humane noggin-polypeptider beskrives å beholde sin biologiske aktivitet, mens de har en nedsatt affinitet for heparin og overlegne farmakokinetiske egenskaper i dyreserum sammenlignet med umodifisert humant noggin.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et fusjonspolypeptid som er i stand til å binde vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) for fremstilling av et medikament til behandling av en øyesykdom som erkarakterisert vedvaskulær permeabilitet, hvor fusjonspolypeptidet omfater: (a) en VEGF reseptorkomponent bestående i hovedsak av et immunoglobulinliknende (lg) domene 2 av en første VEGF-reseptor og Ig-domene 3 av en andre VEGF-reseptor samt (b) en multimeriserende komponent; og hvor den første VEGF-reseptor er Fitl, den andre VEGF-reseptor er Fikl eller Flt4, og VEGF-reseptorkomponenten er den eneste VEGF-reseptorkomponenten av fusjonspolypeptidet.

I en foretrukket utførelse er nukleotidsekvensen som koder for Ig-domene 2 av det ekstracellulære domene av den første VEGF-reseptor, oppstrøms for nukleotidsekvensen som koder for Ig-domene 3 av det ekstracellulære domene av den andre VEGF-reseptor.

I en annen utførelse er nukleotidsekvensen som koder for Ig-domene 2 av det ekstracellulære domene av den første VEGF-reseptor, nedstrøms for nukleotidsekvensen som koder for Ig-domene 3 av den ekstracellulære domene av den andre VEGF-reseptor.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen omfatter den multimeriserende komponent en immunoglobulin-domene.

I en annen utførelse er immunoglobulin-domene valgt fra gruppen omfattende Fc-domene av IgG, tung kjede av IgG og den lette kjede av IgG.

Foretrukne utførelsesformer innbefatter anvendelse ifølge oppfinnelsen hvor fusjonspolypeptidet er kodet av en nukleinsyresekvens som angitt i (a) SEQ ID Nr. 11, (b) SEQ ID Nr. 13, (c) SEQ ID Nr. 15 eller en nukleotidsekvens som er resultat av degenerasjonen av den genetiske kode, er forskjellig fra nukleotidsekvensene i (a), (b) eller (c).

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen er et fusjonspolypeptid for anvendelse ifølge oppfinnelsen kodet av det isolerte nukleinsyremolekyl beskrevet ovenfor. Disse kan bli fremskaffet i en vektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som beskrevet ovenfor innbefattende en ekspresjonsvektor omfattende nukliensyremolekylene som beskrevet hvor nukleinsyremolekylet er operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens.

For fremstillingen av fusjonspolypeptider ifølge oppfinnelsen, kan et vert/vektor-system for produksjon av et fusjonspolypeptid som omfatter ekspresjonsvektoren, i en egnet vertcelle bli brukt for eksempel et vert/vektor-system hvor en egnet vertcelle er en bakteriecelle, gjærcelle, insektcelle eller pattedyrcelle; vert/vektor-systemet hvor den egnede vertscelle er E. coli; vert/vektor-systemet hvor den egnede vertcelle er en COS-celle; vert/vektorsystemet hvor den egnede vertcelle er en CHO-celle.

Fusjonspolypeptider for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ved en fremgangsmåte omfattende å dyrke celler av vert/vektorsystemet under tilstander som tillater en produksjon av fusjonspolypeptidet, og å isolere det således dannede fusjonspolypeptid.

Fusjonspolypeptider for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan ha blitt modifisert ved acetylering eller pegylering, hvor acetyleringen oppnås med minst ca. et 100 gangers molart overskudd av acetyleringsreagensmiddel, eller hvor acetyleringen oppnås med et molart overskudd av acetyleringsreagensmiddel som varierer fra minst ca. et 10 gangers overskudd til ca. et 100 gangers molart overskudd, eller hvor pegyleringen er 10K eller 20K PEG.

Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen angår anvendelse ved fremstilling av medikamenter til behandling av øyesykdommer hos mennesker.

Foretrukne utførelser omfatter anvendelse av et fusjonspolypeptid hvor aminosyresekvensen av Ig-domene 2 av den ekstracellulære domene av den første VEGF-reseptor er oppstrøms for aminosyresekvensen av Ig-domene 3 av det ekstracellulære domene av den andre VEGF-reseptor, og et fusjonspolypeptid hvor aminosyresekvensen av Ig-domene 2 av den ekstracellulære domene av den første VEGF-reseptor er nedstrøms for aminosyresekvensen av Ig-domene 3 av den ekstracellulære domene av den andre VEGF-reseptor.

I enda en annen utførelse omfatter den fusjonspolypeptid-multimeriserende komponent et immunoglobulindomene omfattende en utførelse hvor immunoglobulindomene er valgt fra gruppen omfattende Fc-domene av IgG, tung kjede av IgG og lett kjede av IgG.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1: IEF-gelanalyse av umodifiserte og acetylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner. Umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein har ikke evnen til å trenge inn i gelen grunnet dens pl-verdi >9,3, mens acetylert Fltl(l-3)-Fc har evnen til å trenge inn i gelen og ekvilibrere ved pl-verdien 5,2. Fig. 2: Bindingen av umodifisert Fltl(l-3)-Fc og acetylert Fltl(l-3)-Fc-protein til "Matrigel"-bestrøkne plater. Umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein bindes i stor grad til ekstracellulære matrikskomponenter i "Matrigel", mens acetylert Fltl(l-3)-Fc ikke bindes. Fig. 3: Binding av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, acetylert Fltl(l-3)-Fc og pegylert Fltl(l-3)-Fc i et "Biacore"-basert assay. Acetylert (kolonnene 13-16), pegylert (kolonnene 17-20) og heparinbehandlet KFItl(l-3)-Fc (kolonnene 21-24) har evnen til å fullstendig konkurrere med et "Biacore"-flakbundne Fltl(l-3)-Fc om VEGF-bindingen, sammenlignet med kontrollen (kolonnene 1-4) og irrelevant protein (kolonnene 5-8). Umodifisert Fltl(l-3)-Fc (kolonnene 5-6) virker å kun delvis konkurrere med "Biacore"-flakbundet Fltl(l-3)-Fc om VEGF-bindingen. Imidlertid fører vasking av de bundne prøver med 0,5M NaCI (kolonnene 7-8) til en bin-dingsprofil som ligner profilen for de modifiserte former for Fltl(l-3)-Fc, hvilket tyder på at det umodifiserte protein oppviser en ikke-spesifikk binding til flaket, som kan elimineres ved vaskingen med salt. Fig. 4: Bindingen av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, acetylert Fltl(l-3)-Fc og pegylert Fltl(l-3) til VEGF i et ELISA-basert assay. Både pegylerte og acetylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner bindes til VEGF med en affinitet som er nesten like høy som for umodifisert Fltl(l-3)-Fc. Fig. 5: Farmakokinetisk profil for umodifisert Fltl(l-3)-Fc, acetylert Fltl(l-3)-Fc og pegylert Fltl(l-3)-Fc. Balb/c-mus (23-28g) fikk subkutant injisert 4 mg/kg umodifisert, acetylert eller pegylert Fltl(l-3)-Fc. Man tok blodprøver fra musenes hale 1, 2, 4, 6 og 24 timer, 2 dager og 3 dager etter injeksjon av proteinet, og seraene ble testet i et standard ELISA-basert assay utviklet for å påvise Fltl(l-3)-Fc-protein.

Tmaks-verdien var for alle Fltl(l-3)-Fc-proteiner mellom 6-timers og 24-timers tidspunktet. Cmaks-verdien for de forskjellige proteiner var som følger: umodifisert: 0,06 ug/ml - 0,15 ug/ml; acetylert: 1,5 ug/ml - 4,0 ug/ml; og pegylert: ca. 5 ug/ml. Fig. 6A- 6B: IEF-gelanalyse av umodifiserte og trinnvis acetylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner. Umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein har ikke evnen til å trenge inn i gelen, grunnet sin pl-verdi >9,3, mens hovedparten av de trinnvis acetylerte Fltl(l-3)-Fc-prøver (prøver med 30-100 gangers overskudd) hadde evnen til å migrere inn i gelen og ekvilibrere med en pl-verdi mellom 4,55-8,43, avhengig av acetylerings-raden. Fig. 7: Bindingen av umodifisert Fltl(l-3)-Fc og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc-protein til "Matrigel"-bestrøkne plater. Slik det også var tilfellet for det irrelevante kontrollprotein, nemlig rTie2-Fc, oppviser trinnvis acetylert fFltl(l-3)-Fc (prøver med 20 og 30 gangers overskudd) ingen binding til den "Matrigel"-bestrøkne plate, mens det ikke-acetylerte Fltl(l-3)-Fc-protein oppviser en betydelig binding. Prøven med 10 gangers overskudd oppviser en nedsatt binding, men acetyleringsgraden er ikke tilstrekkelig for å blokkere bindingen til ekstracellulære matrikskomponenter. Fig. 8: Bindingen av umodifisert Fltl(l-3)-Fc og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc i et "Biacore"-basert assay. I et substrøkiometrisk forhold (0,5 ug/ml av enten umodifisert Fltl(l-3)-Fc eller trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc vs. 0,2 ug/ml VEGF), foreligger det ikke tilstrekkelig Fltl(l-3)-Fc (verken umodifisert eller trinnvis acetylert) i oppløsningen for å fullstendig binde VEGF'et. Ved 1,0 ug/ml, som er ca. et 1:1 støkiometrisk forhold, har både umodifisert og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc en bedre evne til å konkurrere om VEGF-bindingen, men det foreligger fortsatt ikke tilstrekkelig Fltl(l-3)-Fc-protein (hverken umodifisert eller trinnvis acetylert) til å fullstendig mette det tilgjengelige VEGF. Ved 5,0 ug/ml, som er mange ganger høyere enn et 1:1 støkiometrisk forhold, har imidlertid både Fltl(l-3)-Fc og det trinnvis acetylerte Fltl(l-3)-Fc-protein evnen til å mette VEGFet, uavhengig av acetyleringsg raden. Fig. 9: Farmakokinetisk profil for umodifisert Fltl(l-3)-Fc og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc. Balb/c-mus (23-28 g) fikk subkutant injisert 4 mg/kg umodifisert eller prøver av 10, 20, 40, 60 eller 100 gangers overskudd av trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc (3 mus for umodifisert prøve og prøver med 10, 20 og 40 gangers overskudd, og 2 mus for prøvene med 60 og 100 gangers overskudd). Man tok blodprøver fra musenes hale etter 1, 2, 4, 6 og 24 timer, 2 dager og 3 dager etter injeksjonen. Seraene ble testet i et ELISA-basert assay utviklet for å påvise Fltl(l-3)-Fc. Tmaks-verdien for alle de testede Fltl(l-3)-Fc-proteiner var på tidspunktet 6 timer, mens Cmaks-verdien var som følger: umodifisert Fltl(l-3)-Fc: 0,06 ug/ml; prøve med 10 gangers overskudd: 0,7 ug/ml, prøve med 20 gangers overskudd: 2 ug/ml, prøve med 40 gangers overskudd: 4 ug/ml, prøve med 60 gangers overskudd: 2 ug/ml, prøve med 100 gangers overskudd: 1 ug/ml. Fig. 10A- 10D: Nukleinsyre-SEQ ID Nr. 1 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr. 2 av Fltl(l-3)-Fc.

Fig. 11: Skjematisk diagram over strukturen av Fitl.

Fig. 12A oa 12B: Hydrofilisitetsanalyse av aminosyresekvensen av Ig-domene 2 og Ig-domene 3 av Fitl. Fig. 13A- 13D: Nukleinsyre-SEQ ID Nr. 3 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr. 4 av Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc. Fig. 14A- 14QC: Nukleinsyre-SEQ ID Nr. 5 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr.

6 av Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc.

Fig. 15A- 15C: Nukleinsyre-SEQ ID Nr. 7 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr. 8 av Mut3: Fltl(2-3)-Fc. Fig. 16A- 16D: Nukleinsyre-SEQ ID Nr. 9 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr.

10 av Mut4: Fltl(l-3R_+N)-Fc.

Fig. 17: Binding av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, basisk region-delesjonsmutant Fltl(l-3)-Fc og Fltl(l-3)R_>N-mutantproteiner i et "Biacore"-basert assay. I et substøkiometrisk forhold (0,25 ug/ml Fltl(l-3)-Fc av den umodifiserte, acetylerte eller genetisk modifiserte prøve vs. 0,1 ug/ml VEGF), foreligger utilstrekkelig Fltl(l-3)-Fc-protein til å blokkere bindingen av VEGF til Fltl(l-3)-Fc som er immobilisert på "Biacore"-flaket. Ved 0,5 ug/ml umodifisert, acetylert eller genetisk modifisert Fltl(l-3)-Fc-protein er det støkiometriske forhold ca. 1:1, og det foreligger en forsterket evne til å blokkere VEGF-bindingen til "Biacore"-flaket. Ved 1,0 ug/ml umodifisert, acetylert eller genetisk modifisert Fltl(l-3)-Fc-protein, som er et ca. 10:1 støkiometrisk forhold, har Fltl(l-3)-Fc-proteinene evnen til å blokkere bindingen av VEGF til "Biacore"-flaket, men de er ikke like gode. Umodifisert, acetylert og Mutl: Fltl(l-3AB)-FC er i det vesentlige like gode til å blokkere VEGF-bindingen, mens Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc er noe mindre virksom på å blokkere bindingen.

Fia. 18: Bindingen av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc og Fltl(2-3)-mutantproteiner til "Matrigel"-bestrøkne plater. Umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein bindes sterkt til disse brønnene, Mut3: Fltl(2-3)-Fc-protein bindes noe svakere, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc-protein bindes enda svakere, og Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc-protein oppviser den beste profil idet det bindes svakere enn noe annet mutant protein. Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc-glykosylasjons-mutantprotein oppviser kun en ubetydelig fordel i "Matrigel"-assayet.

Fia. 19: Binding av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc og Fltl(2-3)-mutantproteiner i et ELISA-basert assay. Ved de testede konsentrasjoner binder umodifisert Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc og Fltl(2-3)-mutantproteiner VEGF i omtrent like sterk grad.

Fig. 20: Farmakokinetisk profil av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc og Fltl(2-3)-mutantproteiner. Cmaks-verdien for disse reagensmidler var som følger: umodifisert Fltl(l-3)-Fc: 0,15 ug/ml; 40 gangers molart overskudd-acetylert Fltl(l-3)-Fc: 1,5 ug/ml; og Mutl: Fltl(l-34B)-Fc: 0,7 ug/ml.

Fig. 21A- 21C: Nukleotid-SEQ ID Nr. 11 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr. 12 av den umodifiserte Fltl-reseptor som benevnes FltlD2.FlklD3.FcACl(a). Fig. 22A- 22C: Nukleotid-SEQ ID Nr. 13 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr. 14 av den modifiserte Fltl-reseptor som benevnes fltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Fig. 23: Ekstracellulær matriks (ECM)-assay. Resultatene av dette assay demonstrerer at FltlD2.FlklD3.FcACl(a)- og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)-protein er betydelig mindre klebrige på ECM sammenlignet med Fltl(l-3)-Fc-protein. Fig. 24A- 24C: Nukleotid-SEQ ID Nr. 15 og avledet aminosyresekvens SEQ ID Nr. 16 av den modifiserte Fltl-reseptor som nevnes VEGFRlR2-FcACl(a). Fig. 25A- 25C: Fosforylasjonsassay. I et 1,5 molart overskudd av enten Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40) eller ubestandig FltlD2FlklD3.FcACl(a) finner det sted en fullstendig blokkering av reseptorstimulering av disse tre modifiserte Fltl-reseptorer, sammenlignet med behandling i kontrollmedium. Derimot oppviser ubestandig FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) ingen vesentlig blokkering ved dette molare overskudd, sammenlignet med behandlingen med VEGF-positiv kontroll. Lignende resultater fremgår fra fig. 25B, hvor de modifiserte Flt-reseptorer foreligger i et 3 gangers molart overskudd i forhold til VEGF165-ligand. På fig. 25C, hvor de modifiserte Fltl-reseptorer foreligger i et 6 gangers molart overskudd i forhold til VEGF165k-ligand, kan nå ubestandig FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) vises å delvis blokkere en VEGF165-indusert stimulering av celleflatereseptorer. Fig. 26A- 26B: Fosforylasjonsassay. Påvisning ved "Western blot" av tyrosin-fosforylert VEGFR2(Flkl) ved VEGF165-ligand-stimulering viser at celleflatereseptorer ikke fosforyleres ved behandlingsprøver som har VEGF165 forhåndsinkubert med 1 og 2 gangers molart overskudd (fig. 26A) eller 3 og 4 gangers molart overskudd (fig. 26B) av enten ubestandig FltlD2FlklD3.FcACl(a), stabilt FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller ubestandig VEGFRlR2-FcACl(a). Ved alle de testede konsentrasjoner av Fltl-reseptor foreligger en fullstendig binding av VEGF165-ligand under forhåndsinkubasjonen, hvilket ikke fører tii noen påvisbar stimulering av celleflatereseptorer med ubundet VEGF165, sammenlignet med kontrollmedium-behandlingen. Fig. 27: MG/R2-celleproliferasjonsassay. De følgende modifiserte Flt-reseptorer: Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) plus en irrelevant reseptor benevnt Tie2-Fc som negativkontroll, ble titrert fra 40 nM til 20 pM og inkubert på callene i 1 time ved 37°C. Humant rekombinant VEGF165 i definert medium ble deretter tilsatt til alle brønnene i konsentrasjonen 1,56 nM. Negativkontrollreseptoren Tie2-Fc blokkerer ikke en VEGF165-indusert celleproliferasjon ved noen konsentrasjon, mens FltlD2.FlklD3.FcACl(a) blokkerer 1,56 nM VEGF165 med en halvmaksimal dose på 0,8 nM. Fltl(l-3)-Fc og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) er mindre effektive ved blokkering av VEGF165 i dette assay, med en halvmaksimal dose på ca. 2 nM. VEGF165 alene gir en avlesning på 1,2 absorbansenheter, og bakgrunnsverdien er 0,38 absorbansenheter. Fig. 28: "Biacore"-analyse av bindingsstøkiometri. Bindingsstøkiometrien ble beregnet som et molart forhold mellom bundet VEGF165 og immobilisert FltlD2FlklD3.FcAC18a) eller VEGFRlR2-FcACl(a), ved bruk av en omregnings-faktor på 1000 RU likeverdig med 1 ng/ml. Resultatene viste til en bindingsstøkiometri på ett VEGF165-dimert molekyl per ett FltlD2FlkilD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a)-molekyl. Fig. 29 og fig. 30: Størrelseseksklusjons-kromatografisk støkiometri. FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a) ved en konsentrasjon på 1 nM (beregnet å være 1000 ganger høyere enn KD-verdien for FltlD2FlklD3.FcACl(a)-eller VEGFRlR2-FcACl(a)/VEGF165-vekselvirkning) ble blandet med forskjellige konsentrasjoner av VEGF165. Ett6er inkubasjonen ble konsentrasjonen av fritt FitlD2FlklD3.FcACl(a) i oppløsningen målt. Dataen viser at tilsetning av 1 nM VEGF165 i FltlD2FlklD3.FcACl(a)-oppløsningen fullstendig blokkerer FltlD2FlklD3.FcACl(a)-bindingen til VEGF165-overflaten. Dette resultat antyder en bindingsstøkiometri på ett VEGF165-molekyl per ett FltlD2FlklD3.FcACl(a)-molekyl. Fig. 31: Størrelseseksklusjons-kromatografi (SEC) under native betingelser. Topp nr. 1 representerer FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165-komplekset, og topp nr. 2 representerer ubundet VEGF165. Fraksjoner som ble eluert mellom 1,1 og 1,2 ml, ble slåttsammen, og guanidiniumhydroklorid (GuHCI) ble tilsatt i den endelige konsentrasjon 4,5M for å dissosiere komplekset. Fig. 32: Størrelsesekskiusjonskromatografi (SEC) under dissosiative betingelser. For å adskille komponentene av reseptor/ligand-komplekset og bestemme deres

molare forhold, ble 50 ul dissosiert kompleks ladet på en "Superose" 12 PC 3,2/30 som var ekvilibrert i 6M GuHCI, og eluert. Topp nr. 1 representerer FltlD2FlklD3.FcACl(a), og topp nr. 2 representerer VEGF165.

Fig. 33. fig. 34 og fig. 35: Størrelseseksklusjons-kromatografi (SEC) med on-line lysspredning. Størrelseseksklusjons-kromatografikolonne med en "MiniDawn" on-line lysspredningsdetektor (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) og refraksjonsindeks (Rl)-detektorer (Shimadzu, Kyoto, Japan) ble brukt for å bestemme molekylvekten (MW) av reseptor/ligand-komplekset. Slik det fremgår fra fig. 33, oppviser elueringsprofilen to topper. Topp nr. 1 representerer reseptor/ligand-komplekset, og topp nr. 2 representerer ubundet VEGF165. MW ble beregnet fra LS- og RI-signalene. Den samme prosedyre ble brukt for å bestemme MW av de enkelte komponenter av reseptor/ligand-komplekset. Resultatene av disse bestemmelser er som følger: MW av FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165-komplekset ved toppens posisjon er 157.300 (fig. 33); MW av VEGF165 ved toppens posisjon er 44.390 (fig. 34), og MW av R1R2 ved toppen er 113.300 (fig. 35).

Fig. 36: Peptid-kartlegging og glykosylasjonsanalyse. Disulfidstrukturene og glykosylasjonssetene i FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ble bestemt ved en peptidkartleggingsmetode. Det finnes tilsammen ti cysteiner i FltlD2.FlklD3.FcAcl(a); seks av den tilhører Fc-region. Cys27 er disulfidbundet til Cys76. Cysl21 er disulfidbundet til Cysl82. De første to cysteiner i Fc-region (Cys211 og Cys214) danner en intermolekylær disulfidbinding med de samme to cysteiner i en annen Fc-kjede. Imidlertid kan det ikke bestemmes om disulfidbinding foreligger mellom de samme cysteiner (f.eks. Cys211 til Cys211) eller mellom Cys211 og Cys214. Cys216 er disulfidbundet til Cys306. Cys352 er disulfidbundet til Cys410.

Det finnes fem mulige N-bundne glykosylasjonsseter i FltlD2.FlklD3.FcACl(a), og disse viser seg å være glykosylert i forskjellig grad. En fullstendig glykosylasjon observeres ved Asn33, Asn 193 og Asn282. En delvis glykosylasjon observeres på Asn65 og Asnl20. Glykolasjonsseter er merket med understreking på figuren.

Fia. 37: Farmakokinetikk av Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og VEGFRlR2-FcACl(a). Balb/c-mus fikk subkutant injisert 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), ubestandig CHO-uttrykt FltlD2.FlklD3.FcACl(a), CHO-stabilt uttrykt FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og ubestandig CHO-uttrykt VEGFRlR2-FcACl(a). Man tok blodprøver fra musenes hale 1, 2, 4, 6 og 24 timer, 2 dager, 3 dager og 6 dager etter injeksjonen. Seraene ble analysert i et ELISA som var utformet til å påvise Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a). Tmaks-verdien for Fltl(l-3)-Fc (A40) var ved 6 timer, mens TmakS-verdien for ubestandig og stabilt FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og ubestandig VEGFRlR2-FcACl(a) var 24 timer. Cmaksfor Fltl(l-3)-Fc (A40) var 8 ug/ml. For begge de ubestandig produkter (FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og VEGFRlR2-FcACl(a)) var Cmaks18 ug/ml, og Cmaksfor stabilt VEGFRlR2-FcACl(a) var 30 ug/ml.

Fia. 38: Farmakokinetikk av Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Balb/c-mus fikk subkutant injisert 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), ubestandig CHO-uttrykt FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og ubestandig CHO-uttrykt FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Man tok blodprøver fra musenes hale 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 og 20 dager etter injeksjonen. Seraene ble analysert i et ELISA som var utformet for å påvise Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Fltl(l-3)-Fc (A40) kunne ikke lenger påvises i serum etter dag 5, mens FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) kunne påvises i 15 dager eller lenger. Fig. 39: Evnen av FltlD2.FlklD3.FcACl(a) til å inhibere HT-1080-fibrosar-komasvulstvekst in vivo. Behandling av SCID-mus med 25 mg/kg FltlD2.FlklD3.FcACl(a) annenhver dag eller 2 ganger i uken nedsetter veksten av subkutane HT-1080-fibrosarkomasvulster vesentlig. Fig. 40: Evnen av FltlD2.FlklD3.FcACl(a) til å inhibere C6-gliomasvulstvekst in vivo. Behandling av SCID-mus med FltlD2.FlklD3.FcACl(a) annenhver dag eller 2 ganger i uken nedsetter veksten av subkutane C6-gliomasvulster betydelig, ved såpass lave doser som 2,5 mg/kg. Fig. 41: VEGF-indusert uterin hyperpermeabilitet. PMSG som injiseres subkutant (5 IU) for å indusere ovulasjon i prepubertale rotter av hunnkjønn, fører til en strøm av østradiol etter 2 dager, hvilket i sin tur forårsaker en induksjon av VEGF i uterus. Denne induksjon fører til en hyperpermeabilitet av uterus og en økning av uterin-våtvekten. En subkutan injeksjon av Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i konsentrasjonen 25 mg/kg 1 time etter PMSG-injeksjonen fører til en ca. 50% inhibering av økningen av uterin-våtvekten.

Fio. 42A- 42B: Bedømmelse av corpus /uteum-angiogenese ved bruk av progesteron som avlesning. PMSG ble injisert subkutant (5 IU) for å indusere ovulasjon i prepubertale rotter av hunnkjønn, hvilket førte til en fullstendig funksjonell corpus luteum som inneholdt et tett nettverk av blodkar som utsondrer progesteron i blodstrømmen for å forberede uterus på implantasjon. Induksjonen av angiogenese i corpus luteum er avhengig av VEGF. Hvilenivået av progesteron er ca. 5 ng/ml, og kan induseres til 25-40 ng/ml etter PMSG. En subkutan injeksjon av Fltl(l-3)-Fc (A40) eller FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i konsentrasjonen 25 mg/kg eller 5 mg/kg 1 time etter PMSG-injeksjonen førte til en fullstendig inhibering av progesteroninduksjonen på dag 4.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Det har lenge vært et problem innen faget å danne en reseptorbasert VEGF-antagonist som har en farmakokinetisk profil som er egnet til at man kan ta antagonisten i betraktning som en terapeutisk kandidat. Søker beskriver heri for første gang et chimært polypeptidmolekyl som har evnen til å antagonisere VEGF-aktivitet, som oppviser forbedrede farmakokinetiske egenskaper sammenlignet med andre kjente reseptorbaserte VEGF-antagonister. De chimære polypeptidmolekyler som beskrives heri, tilveiebringer dermed for første gang egnede molekyler for anvendelse i terapier hvor det er ønskelig med en antagonisme av VEGF, spesielt ved behandling av øyesykdommer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye chimære polypeptidmolekyler som dannes ved å kondensere en modifisert ekstracellulær ligandbindende domene av Fltl-reseptor til Fc-region av IgG.

Det ekstracellulære ligandbindende domene defineres som det parti av en reseptor som i sin native konformasjon i cellemembranen, er orientert ekstracellulært, hvor det kan komme i berøring med sin kognate ligand. Den ekstracellulære ligandbindende domene omfatter ikke de hydrofobe aminosyrer forbundet med reseptorens transmembrane domene eller noen aminosyrer forbundet med reseptorens intracellulære domene. Generelt er den intracellulære eller cytoplasmatiske vanligvis satt sammen av positivt ladede eller polare aminosyrer (dvs. lysin, arginin, histidin, glutaminsyre, aspa rag i nsy re). De forutgående 15-30, overveiende hydrofobe eller apolare aminosyrer (dvs. leucin, valin, isoleucin og fenylalanin) utgjør den transmembrane domene. Den ekstracellulære domene omfatter aminosyrene som ligger foran den hydrofobe transmembrane strekning av aminosyrer. Vanligvis flankeres den transmembrane domene av positivt ladede eller polare aminosyrer så som lysin eller arginin. von Heijne har publisert detaljerte regler som fagmannen vanligvis konsulterer når han bestemmer hvilke aminosyrer av en gitt reseptor som tilhører den ekstracellulære, transmembrane eller intracellulære domene (se von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25-30). Alternativt er det blitt tilgjengelig web-steder på internet, så som http://ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html for å gi proteinkjemikeren informasjon om å forutsi proteindomener.

For å fremstille fusjonspolypeptider til anvendelse ifølge oppfinnelsen, muliggjør oppfinnelsen konstruksjon av nukleinsyremolekyler som koder for chimære polypeptidmolekyler som innføyes i en vektor som har evnen til å uttrykke de chimære polypeptidmolekyler når de innføres i en egnet vertcelle. Egnede vertceller omfatter, men er ikke begrenset til, bakterieceller, gjærceller, insektceller og pattedyrceller. Hvilken som helst metode som er kjent for fagmannen for å innføre DNA-fragmenter i en vektor, kan brukes for å konstruere ekspresjonsvektorer som koder for de chimære polypeptidmolekyler under styring av de transkripsjonelle/trans-lasjonelle styresignaler. Disse metoder kan omfatte in wtro-rekombinant DNA- og syntetiske teknikker og in wVo-rekombinasjoner (genetisk rekombinasjon) (se Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, utg. Ausubel etat., Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY).

Ekspresjon av nukleinsyremolekyler som koder for de chimære polypeptidmolekyler, kan reguleres med en andre nukieinsyresekvens slik at det chimære polypeptidmolekyl uttrykkes i en vert som er blitt transformert med det rekombinante DNA-molekyl. F.eks. kan ekspresjon av de chimære polypeptidmolekyler som beskrives heri, styres ved hjelp av hvilket som helst promoter/- forsterkerelement som er kjent innen faget. Promotere som kan brukes til å styre ekspresjonen av de chimære polypeptidmolekyler, omfatter, men er ikke begrenset til, lang terminal gjentakelse som beskrives av Squinto et al. (1991, Cell 65: 1-20); SV40-tidlig promoterregion (Bernoist og Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), CMV-promoter, M-MuLV-5'-terminal gjentakelse promoteren som foreligger i 3'-lang terminal gjentakelse til Rous sarcomavirus (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), herpes-thymidinkinase-promoter (Wagner et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 78: 144-1445), de regulatoriske sekvenser av metallotionin-gen (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); prokaryotiske ekspresjonsvektorer så som D-lakta-mase-promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 75: 3727-3731) eller tac-promoter (DeBoer et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80: 21-25, se også "Useful proteins from recombinant bacteria" i Scientific American, 1980, 242: 74-94); promoterelementer fra gjær eller annen sopp så som Gal4-promoter, ADH (alkoholdehydrogenase)-promoter, PGK (fosfoglycerolkinase)-promoter, alkalifosfatasepromoter og de følgende animalske transkripsjonene styre-regioner som oppviser vevspesifisitet og er blitt brukt i transgene dyr: elastase I-genkontrollregion, som er aktiv i acinære celler i bukspyttkjertel (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5Q: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); insulin-gen-styreregion som er aktiv i betaceller av bukspyttkjertel (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), immunoglobulin-gen-styreregion, som er aktiv i lymfeceller (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), muse-brystsvulstvirus-styreregion, som er aktiv i testikkel-, bryst-, lymfe- og mastceller (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), albumin-gen-styreregion, som er aktiv i leveren (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), alfa-fetoprotein-gen-styreregion, som er aktiv i leveren (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); alfa 1-antitrypsin-gen-styreregion, som er aktiv i leveren (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), beta-globulin-gen-styreregion, som er aktiv i myeloide celler (Mogram eta/., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); myelin-basisk protein-gen-styreregion, som er aktiv i oligodendrocyttceller i hjernen (Readhead eta/., 1987, Cell 48: 703-712); myosin-lettkjede-2-gen-styreregion, som er aktiv i skjelettmuskler (Shani, 1985, Nature 314: 283-286) og gonadotropisk frigivningshormon-gen-styreregion, som er aktiv i hypothalamus (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

Således brukes ekspresjonsvektorer som har evnen til å replikeres i en bakteriell eller eukaryotisk vert, omfattende en nukleinsyre som koder for et chimært polypeptidmolekyl som beskrevet heri, for å transfisere verten og dermed styre ekspresjonen av slike nukleinsyrer for å danne de chimære polypeptidmolekyler, som deretter kan isoleres i en biologisk aktiv form. Anvendt heri omfatter en biologisk aktiv form en form som har evnen til å bindes til VEGF.

Ekspresjonsvektorer som inneholder de chimære nukleinsyremolekyler som beskrives heri, kan identifiseres ved tre generelle fremgangsmåter: (a) DNA-DNA-hybridisering, (b) nærvær eller fravær av "markør"-genfunksjoner og (c) ekspresjon av innføyde sekvenser. I den første fremgangsmåte kan nærværet av et fremmed gen som er innføyd i en ekspresjonsvektor, påvises ved DNA-DNA-hybridisering ved bruk av prober som omfatter sekvenser som er homologe med de innføyde chimære polypeptid-molekylsekvenser. I den andre fremgangsmåte kan det rekombinante vektor/vertsystem identifiseres og velges ut på grunnlag av nærværet eller fraværet av visse "markør"-genfunksjoner (f.eks. tymidinkinaseakti-vitet, resistens mot antibiotika, transformasjonsfenotype, okklusjonslegeme-dannelse i baculovirus osv.) som forårsakes av innføyelsen av fremmedgener i vektoren. F.eks. hvis den chimære polypeptidmolekyl-DNA-sekvens innføyes i markørgen-sekvensen av vektoren, kan rekombinanter som inneholder innføyelsen, identifiseres ved fraværet av markørgenfunksjonen. I den tredje fremgangsmåte kan rekombinante ekspresjonsvektorer identifiseres ved å teste frem-medgenproduktet som uttrykkes av rekombinanten. Slike assayer kan f.eks. basere seg på de fysiske eller funskjonelle egenskaper av de chimære polypeptidmolekyler.

Celler kan uttrykke de chimære polypeptidmolekyler ubestandig, eller fortrinnsvis, konstitutivt og permanent.

De chimære polypeptidmolekyler kan renses ved hvilken som helst teknikk som muliggjør en påfølgende dannelse av et stabilt, biologisk aktivt kimært polypeptidmolekyl. Som et eksempel, og ikke som en begrensning, kan faktorene isoleres fra celler enten som løselige proteiner eller som innlemmelseslegemer, hvorfra de kan ekstraheres kvantitativt ved 8M-guanidiniumhydroklorid og dialyse (se f.eks. Builder eta/., US-patent nr. 5.663.304). For å rense faktorene ytterligere, kan konvensjonell ionbyttekromatografi, hydrofob vekselvirknings-kromatografi, reversfasekromatografi eller gelfiltrering brukes.

I én utførelse av oppfinnelsen er nukleotidsekvensen som koder for den første komponent, oppstrøms for nukleotidsekvensen som koder for den andre komponent. I en annen utførelse av oppfinnelsen er nukleotidsekvestreringvensen som koder for den første komponent, nedstrøms for nukleotidsekvensen som koder for den andre komponent. Ytterligere utførelser av oppfinnelsen kan fremstilles, hvor rekkefølgen av den første, andre og tredje fusjonspolypeptidkomponent er endret. F.eks. hvis nukleotidsekvensen som koder for den første komponent, benevnes 1, nukleotidsekvensen som koder for den andre komponent, benevnes 2, og nukleotidsekvensen som koder for den tredje komponent, benevnes 3, da kan rekkefølgen av komponentene i den isolerte nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, lest fra 5'- til 3'-ende, være hvilken som helst av de følgende seks kombinasjoner: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; eller 3,2,1.

Foreliggende oppfinnelse har også diagnostisk og terapeutisk nytte. Fremgangsmåter for påvisning av avvik i funksjonen eller ekspresjonen av de chimære polypeptidmolekyler som beskrives heri, kan brukes for diagnostisering av forstyrrelser. Manipulasjon av de chimære polypeptidmolekyler eller agonister eller antagonister som binder de chimære polypeptidmolekyler, kan brukes til behandling av sykdommer. I ytterligere utførelser benyttes det chimære polypeptidmolekyl som middel for å blokkere bindingen av et bindingsmiddel til sitt mål.

Medikamentene som fremstilles ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen, kan brukes ved behandling av øyesykdommer så som aldersrelatert makulær degenerasjon og diabetisk retinopati.

En aminosyresekvensanalyse av Fltl(l-3)-Fc viste et nærvær av et usedvanlig høyt antall (46) av det basiske aminosyreresiduum lysin. En IEF-analyse av Fltl(l-3)-Fc viste at dette protein har en pl-verdi over 9,3, hvilket bekreftet forutsigelsen at proteinet er meget basisk. Man hypotetiserte at den basiske natur av Fltl(l-3)-Fc-protein gjorde at det bandt seg til ekstracellulære matriksbestanddeler, og at denne vekselvirkning kunne være årsaken til den ekstremt korte påvisbare sirkulasjonshalveringstid i serum som oppvises av Fltl(l-3)-Fc når det injiseres i mus. For å teste denne hypotese, ble Fltl(l-3)-Fc-protein acetylert ved lysinresiduene for å nedsette den basiske ladning. Acetylert Fltl(l-3)-Fc ble deretter testet i assayene som skal beskrives i det følgende.

EKSEMPLER

Eksempel 1:

Ekspresjon av Fltl( l- 3)- Fc- protein i CHO- Kl- celler

Ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker (se f.eks. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (utg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY)), ble genet som koder for Fltl(l-3)-Fc, innføyd i ekspresjonsvektoren pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) ved et multippelt kloningssete nedstrøms for CMV-promoter. CHO-Kl-celler ble transfisert med pEE14.1/Fltl(l-3)-Fc-DNA-konstruktet ved bruk av lipofectamin (Gaithersburg, MD). De transfiserte CHO-Kl-celler ble dyrket i glutamin-fritt DMEM (JRH, Kansas City, MO) som inneholdt 25 uM metioninsulfoksimin (MSX) fra Sigma Inc., St. Louis, MO, og høyt rekombinante proteinekspressorer ble erholdt ved å teste å teste CHO-Kl-celle-supernatanten fra over 100 håndplukkede koloniisolater ved bruk av et standard immunoassay som innfanger og påviser humant Fc. Den valgte håndplukkede klon ble amplifisert i nærvær av 100 uM MSX, fulgt av en andre runde med testing av de amplifiserte kloner. Den høyest produserende klon hadde en spesifikk produktivitet av rekombinant Fltl(l-3)-Fc-protein på 55 pg/celle/dag.

Den valgte klon ble ekspandert i 225 cm<2>T-kolber (Corning, Acton, MA) og deretter i 8,5 I rullekolber (Corning, Acton, MA) ved bruk av det ovenfor beskrevne cellekulturmedium. Celler ble fjernet fra rullekolben ved standard trypsinisering og plassert i 3,5 I suspensjonsmedium. Suspensjonsmediet bestod av glutaminfritt ISCHO-medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) som inneholdt 5% føtalt bovint serum (FBS fra Hyclone Labs, Logan, UT), 100 uM MSX og GS-supplement (JRH Scientific, Kansas City, MO) i en 5 I Celligen-bioreaktor (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) i en tetthet på 0,3 x IO<6>celler/ml. Etter at cellene oppnådde en tetthet på 2,6 x IO6 celler/ml og var tilpasset for suspensjon, ble de overført til en 60 I bioreaktor (ABEC, Allentown, PA) i en tetthet på 0,5 x IO<6>celler/ml i 20 I ISCHO-medium med 5% føtalt bovint serum. Etter 2 dager ble ytterligere 20 I ISCHO + 5% føtalt bovint serum tilsatt til bioreaktoren. Cellene fikk vokse i ytterligere to dager, og oppnådde en endelig tetthet på 3,1 x IO<6>celler/ml, og den endelige Fltl(l-3)-Fc-konsentrasjon ved innsamlingen var 95 mg/l. Ved innsamlingen ble cellene fjernet ved tangensialstrømfiltrering ved bruk av 0,45 pm Prostak-filtre (Millipore, Inc., Bedford, MA).

Eksempel 2:

Rensing av Fltl( l- 3)- Fc- protein som ble erholdt fra CHO- Kl- celler

Fltl(l-3)-Fc-protein ble i utgangspunktet renset ved affinitetskromatografi. En Protein A-kolonne ble brukt til å med høy spesifisitet binde Fc-partiet av molekylet. Dette affinitetsrensede protein ble deretter konsentrert og ført over en SEC-kolonne. Proteinet ble deretter eluert inn i formuleringsbufferen. I det følgende beskrives disse prosedyrer i detalj.

Materialer og metoder

Alle kjemikalier ble ervervet fra J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, unntatt PBS, som ble ervervet som et 10 pm -konsentrat fra Life Technologies, Gaithersburg, MD. Protein A-Fast Flow og Superdex 200-harpiks av prepareringskvalitet ble ervervet fra Pharmacia, Piscataway, NJ. Utstyr og membraner for proteinkonsentrasjon ble erholdt fra Millipore, Bedford, MA.

Ca. 40 I 0,45 um-filtrert CHO-kondisjonert medium som inneholdt Fltl(l-3)-Fc-protein, ble påført på en 290 ml Protein A Fast Flow-kolonne (10 cm diameter) som var blitt ekvilibrert med PBS. Kolonnen ble vasket med PBS som inneholdt 350 mM NaCI og 0,02% CHAPS, og det bundne protein ble eluert med 20 mM sitronsyre som inneholdt 10 mM Na2HP04. Den enkelte topp i elueringen ble samlet, og dens pH ble hevet til nøytral nivå med IM NaOH. Eluatfraksjonene ble konsentrert til ca.

9 mg/ml ved bruk av 10K regenererte cellulosemembraner, både ved

tangensialstrømfiltrering og ved omrørt cellekonsentrasjon. For å fjerne aggregater og andre forurensninger, ble det konsentrerte protein påført på en kolonne som var pakket med Superdex 200-harpiks av prepareringskvalitet (10 cm x 55 cm) og ført 1 PBS som inneholdt 5% glycerol. Hovedtoppfraksjonene ble samlet, sterilfiltrert, alikvotert og lagret ved -80°C.

Eksempel 3:

Acetylering av Fltl( l- 3)- Fc- protein

2 mg Fltl(l-3)-Fc-protein ble acetylert slik det beskrives i veiledningsmanualen som leveres med sulfo-NHS-acetat-modifikasjonssettet (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, kat-nr. 26777).

Eksempel 4:

Karakterisering av acetylert Fltl( l- 3)- Fc- protein

(a) IEF- analyse

Fltl(l-3)-Fc og acetylert Fltl(l-3)-Fc ble analysert ved standard IEF-analyse. Slik det fremgår fra fig. 1, har Fltl(l-3)-Fc-protein ikke evnen til å migrere inn i gelen, og må dermed ha en pl-verdi over 9,3, den høyeste pl-verdi i standarden. Imidlertid har acetylert Fltl(l-3)-Fc evnen til å migrere inn i gelen og ekvilibrere ved en pl-verdi på ca. 5,2. Dette resultat demonstrerer at acetylering nedsetter den positive nettoladning av proteinet, og dermed dets pl-verdi, betraktelig.

(b) Binding til ekstracellulære matriks- komponenter

For å teste bindingen til ekstracellulære matriks-komponenter, ble Fltl(l-3)-Fc og acetylert Fltl(l-3)-Fc testet i et assay som var utformet til å etterligne vekselvirkningen med ekstracellulære matrikskomponenter. I dette assay bestrykes 96-brønners vevkulturplater med Matrigel (Biocoat "MATRIGEL"-matriks-tynnsjikts 96-brønners plate, katalog-nr. 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Platene inkuberes med forskjellige konsentrasjoner av enten Fltl(l-3)-Fc, acetylert Fltl(l-3)-Fc eller rTie2-Fc (et irrelevant kontrollprotein) tilsatt til brønnene. Platene inkuberes i 1-2 timer ved enten romtemperatur eller 37°C, og deretter utføres påvisningen av bundne proteiner ved tilsetning av et sekundært alkalifosfatase-konjugert anti-humant Fc-antistoff til brønnene. Til slutt tilsettes alkalifosfatase-substrat til brønnene, og den optiske tetthet måles. Fig. 2 viser resultatene av dette assay. Slik som også det irrelevante kontrollprotein rTie2-Fc, oppviser heller ikke acetylert Fltl(l-3)-Fc noen binding til den Matrigel-bestrøkne plate, mens det ikke-acetylerte Fltl(l-3)-Fc-protein oppviser en betraktelig binding. Dette resultat tyder på at en acetylering av e basiske aminosyreresiduer er en virksom måte å forstyrre ladningsvekselvirkningene som finnes mellom positivt ladede proteiner og de negativt ladede ekstracellulære matrikskomponenter som de utsettes for in vivo.

Eksempel 5:

Pegylering av Fltl( l- 3)- Fc- protein

Selv om pegylering (polyetylenglykol: PEG) av protein har vist seg å heve deres in v/Vo-potens ved å forsterke stabiliteten og biotilgjengeligheten mens immunogenisiteten minimeres (se publikasjoner som ble nevnt ovenfor), er det kontra-intuitivt at pegylering av molekyler som er for store til å filtreres av nyre-glomeruli, ville forbedre deres farmakokinetiske egenskaper. Uten at man ønsker å binde seg til noen spesiell teori, antok Søker at en pegylering av Fltl(l-3)-Fc-molekylene kunne forbedre de farmakokinetiske egenskaper, eventuelt uten å endre den positive ladning eller ved å nedsette pl-verdien av Fltl(l-3)-Fc, men heller ved å fysisk avskjerne de positive ladninger fra å vekselvirke med den ekstracellulære matriks. Søker bestemte seg for å forsøke å forbedre de farmakokinetiske egenskaper av Fltl(l-3)-Fc-molekyler ved å feste på 20K PEG'er slik det skal beskrives i det følgende.

Materialer oa metoder

Renset Fltl(l-3)-Fc erholdt fra CHO-celler (se ovenfor) ble brukt i de følgende pegyleringseksperimenter. Funksjonaliserte PEG'er ble erholdt fra Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicin fra Sigma, St. Louis, MO; Superose 6-kolonne fra Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS som et 10x-konsentrat fra Life Technologies, Gaithersburg, MD; glycerol fra J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; og Bis-Tris-"precast"-geler fra Novex, CA.

20K PEG-kjeder som var blitt funksjonalisert med aminspesifikke terminale enheter, ble brukt i reaksjonsstudier i liten skala som var satt opp til å bedømme forskjellige reaksjonsbetingelser hvor PEG:proteinstøkiometrien ble variert. På grunnlag av disse reaksjoner og analysene av prøvene på standard SDS-PAGE, ble Fltl(l-3)-Fc i en konsentrasjon på 1,5 mg/ml omsatt ved pH 8,1 med 20K SPA-PEG (PEG-suksinimidylpropionat)-molekyler ved et molart forhold mellom PEG og Fltl(l-3)-Fc-monomer på 1:6. Reaksjonen fikk fremskri ved 8°C over natten. For en første rensing ble reaksjonsproduktene påført på en 10 mm x 30 cm Superose 6-kolonne som var ekvilibrert med PBS som inneholdt 5% glycerol. Kolonnen virket å separere pegylerte Fltl(l-3)-Fc-molekyler på grunnlag av pegyleringsomfanget. Fraksjoner som tilsvarte hva som virker å være primært mono-pegylert og di-pegylert Fltl(l-3)-Fc, bedømt i henhold til båndmønstre på reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE-geler, ble samlet. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å måle absorbansen ved 280 nm. Det pegylerte Fltl(l-3)-Fc-protein ble sterilfiltrert, alikvotert og lagret ved -40°C.

Eksempel 6:

Binding av umodifisert. acetylert og pegylert Fltl,( l- 3)- Fc i et " Biacore"- basert assay

Umodifiserte, acetylerte og pegylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner ble testet i et "Biacore"-basert assay for å bedømme deres evne til å bindes til Fltl-liganden VEGF. I dette assay ble umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein immobilisert på overflaten av et "Biacore"-flak (se Biacore-instruksmanualen, Pharmacia, Ing., Piscataway, NJ, for standardprosedyrer), og en prøve som inneholdt 0,2 ug/ml VEGF og enten umodifisert Fltl(l-3)-Fc, acetylert Fltl(l-3)-Fc eller pegylert Fltl(l-3)-Fc (hver i konsentrasjonen 25 ug/ml), ble ført over det Fltl(l-3)-Fc-bestrøkne flak. For å minimere virkningene av ikke-spesifikk binding, ble de bundne prøver vasket med en 0,5M NaCI-vasking. I én prøve ble umodifisert Fltl(l-3)-Fc blandet med heparin. Heparin er et negativt ladet molekyl, og Fltl(l-3)-Fc-protein er et positivt ladet molekyl, slik at når de to molekyler blandes sammen, bør de vekselvirke gjennom sine ladninger. Dette nøytraliserer i det vesentlige Fltl(l-3)-Fc's iboende positive ladning, og får molekylet til å bete seg som om det var blitt kjemisk eller genetisk modifisert for å nedsette ladningen og dets tendens til å bindes via ladningsveksel-virkninger. Slik det fremgår fra fig. 3, har både acetylert (kolonnene 13-16), pegylert (kolonnene 17-20) og heparinbehandlet Fltl(l-3)-Fc (kolonnene 21-24) evnen til å fullstendig konkurrere med et "Biacore"-flak-bundne Fltl(l-3)-Fc om VEGF-binding, sammenlignet med kontrollen (kolonnene 1-4) og irrelevant protein

(kolonnene 5-8). Umodifisert Fltl(l-3)-Fc (kolonnene 5-6) virket å kun delvis konkurrere med "Biacore"-flak-bundet Fltl(l-3)-Fc om VEGF-bindingen. Imidlertid førte en vasking av de bundne prøver med 0,5M NaCI (kolonnene 7-8) til en bin-dingsprofil som lignet profilen av de modifiserte former for Fltl(l-3)-Fc, hvilket tydet på at det umodifiserte protein oppviste en ikke-spesifikk binding til flaket som kunne elimineres ved saltvasking.

Eksempel 7:

Binding av umodifisertracetylert og pegylert Fltl( l- 3)- Fc i et ELISA- basert assay

Umodifiserte, acetylerte og pegylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner ble testet i et standard ELISA-basert assay for å bedømme deres evne til å binde Fltl-regenerere-septorliganden VEGF. Slik det fremgår fra fig. 4, har både pegylerte og acetylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner evnen til å bindes til VEGF, hvilket demonstrerer at modifikasjon av proteinet enten ved pegylering eller acetylering ikke ødelegger dets evne til å binde dets ligand.

Eksempel 8:

Farmakoklnetlsk analyse av umodifisert Fttl( l- 3)- Fc, acetylert Fltl( l- 3)- Fc og pe<g>ylert Fltlf l- 3)- Fc

In wVo-eksperimenter ble utviklet for å bedømme den farmakokinetiske profil av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, acetylert Fltl(l-3)-Fc og pegylert Fltl(l-3)-Fc-protein. Balb/c-mus (23-28 g; 3 mus/gruppe) fikk subkutant injisert 4 mg/kg umodifisert, acetylert eller pegylert Fltl(l-3)-Fc. Man tok blodprøver fra musenes haler 1, 2, 4, 6 og 24 timer og 2 dager og 3 dager etter injeksjonen av protein. Seraene ble testet i et standard ELISA-basert assay som var utformet for å påvise Fltl(l-3)-Fc-protein. Kort sagt omfatter assayet å bestryke en ELISA-plate med VEGF, binde serumet som inneholder umodifisert, acetylert eller pegylert Fltl(l-3)-Fc, og rapportere med et anti-Fc-antistoff som er bundet til alkalifosfatase. Slik det fremgår fra fig. 5, er Tmaks-verdien for alle Fltl(l-3)-Fc-proteinene mellom 6-timers og 24-timers tidspunktet. CmakS-verdien for de forskjellige proteiner var som følger: umodifisert: 0,05 ug/ml - 0,15 ug/ml; acetylert: 1,5 ug/ml - 4,0 ug/ml; og pegylert: ca. 5 ug/ml.

Eksempel 9:

Trinnvis acetylering av Fltl( l- 3)- Fc

For å bestemme hvilken minimale acetylasjonsgrad som er nødvendig for å eliminere bindingen til ekstracellulære matrikskomponenter, utviklet man et eksperiment som acetylerte Fltl(l-3)-Fc-proteinet trinnvis ved bruk av økende mengder av et molart overskudd av acetyleringsreagensmiddel i acetyleringsreaksjonsblandingen. Området av det molare overskudd var som følger: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 og 100 mol acetyleringsreagensmiddel pr. 1 mol Fltl(l-3)-Fc-monomer. Omsetningene ble utført slik det beskrives i instruksmanualen som leveres sammen med sulfo-NHS-acetat-modifikasjonssettet (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, kat.-nr. 26777).

Eksempel 10:

Karakterisering av trinnvis acetylert Fltl( l- 3)- Fc

(a) IEF- analyse

Umodifisert Fltl(l-3)-Fc og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc-protein ble analysert ved standard IEF-analyse. Slik det fremgår fra fig. 6A-6B, hadde umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein ikke evnen til å migrere inn i gelen på grunn av dets ekstremt høye pl-verdi (over 9,3). Imidlertid hadde de fleste trinnvis acetylerte Fltl(l-3)-Fc-prøver (prøver med 30-100 gangers molart overskudd) evnen til å migrere inn i gelen og ekvilibrere ved en pl-verdi fra 4,55-8,43, avhengig av acetyleringsgraden av proteinet. Dette resultat demonstrerer at en acetylering kan endre den positive ladning av proteinet på doseavhengig måte, og at en reduksjon av pl-verdien kan styres ved å styre acetyleringsgraden.

(b) Binding av trinnvis acetylert Fltl( l- 3)- Fc til ekstracellulære matriks-komponenter

For å teste bindingen til ekstracellulære matrikskomponenter, ble Fltl(l-3)-Fc og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc testet i det ovennevnte assay som var blitt utformet til å etterligne vekselvirkningen med ekstracellulære matriks-komponenter. Forskjellige konsentrasjoner av enten umodifisert Fltl(l-3)-Fc, trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc (prøver med 10, 20 og 30 gangers molart overskudd) eller rTie2-Fc (et irrelevant kontrollprotein) ble tilsatt til prøvene. Platene ble inkubert i 1-2 timer ved romtemperatur eller 37°C, og deretter ble en påvisning av bundne proteiner oppnådd ved å tilsette et sekundært alkalifosfatase-konjugert anti-humant Fc-antistoff til brønnene. Alkalifosfatase-substrat ble deretter tilsatt til brønnene, og den optiske tetthet ble målt. Fig. 7 viser resultatene av dette assay. Slik som også det irrelevante kontrollprotein rTie2-Fc, oppviste heller ikke trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc (prøver med 20 og 30 gangers molart overskudd) noen signifikant binding til den "Matrigel"-bestrøkne plate, mens det ikke-acetylerte Fltl(l-3)-Fc-protein oppviste en betraktelig binding. Bindingen er mettbar, hvilket tyder på at Fltl(l-3)-Fc-proteinet eventuelt bindes til bestemte seter, heller enn til en mer generell ladningsmediert vekselvirkning, som eventuelt ikke ermettbar. Prøven med 10 gangers molart overskudd oppviste en nedsatt binding, men acetyleringsgraden var ikke tilstrekkelig for å fullstendig blokkere bindingen til de ekstracellulære matrikskomponenter. Prøvene med 20 gangers molart overskudd og mer, oppviste ingen påvisbar binding, til tross for at prøvene med de laveste molare overskuddene fortsatt hadde en positiv nettoladning ifølge IEF-analyse (fig. 6A og 6B). Dette resultat demonstrerer at det ikke er nødvendig å fullstendig acetylere alle tilgjengelige basiske aminosyrer for å eliminere bindingen til ekstracellulære matrikskomponenter.

(c) Binding av trinnvis acetylert Fltl( l- 3)- Fc I et " Biacore"- basert assay

Umodifiserte og trinnvis acetylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner ble testet i et "Biacore"-basert assay for å bedømme deres evne til å bindes til Fltl-liganden VEGF. I dette assay ble umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein (0,5, 1,0 eller 5,0 ug/ml) immobilisert på overflaten av et "Biacore"-flak (se Biacore-instruksmanualen, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ for standarprosedyrer) og en oppløsning som inneholdt 0,2 ug/ml VEGF og enten umodifisert Fltl(l-3)-Fc (i enten 0,5, 1,0 eller 5,0 ugt/ml konsentrasjon) eller 10 forskjellige trinnvis acetylerte Fltl(l-3)-Fc-prøver (hver i 0,5, 1,0 eller 5,0 ug/ml konsentrasjon) ble ført over det Fltl(l-3)-Fc-bestrøkne flak. Slik det fremgår fra fig. 8, finnes det ved et substøkiometrisk forhold (0,5 ug/ml umodifisert Fltl(l-3)-Fc eller trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc vs. 0,2 ug/ml VEGF) ikke tilstrekkelig Fltl(l-3)-Fc (enten umodifisert eller trinnvis acetylert) i oppløsningen for å fullstendig binde VEGF'et. I konsentrasjonen 1,0 ug/ml, som omtrent tilsvarer et 1:1 støkiometrisk forhold, har både umodifisert og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc en bedre evne til å konkurrere om VEGF-bindingen, men det foreligger fortsatt ikke tilstrekkelig Fltl(l-3)-Fc-protein (enten umodifisert eller trinnvis acetylert) til å fullstendig binde det tilgjengelige VEGF. Ved 5,0 ug/ml, som er flere ganger høyere enn et 1:1 støkiometrisk forhold, har imidlertid både Fltl(l-3)-Fc og de trinnvis acetylerte Fltl(l-3)-Fc-proteiner evnen til å binde VEGF'et, uavhengig av acetyleringsgraden. Dette demonstrerer klart at acetyleringen ikke endrer Fltl(l-3)-Fc's evne til å binde VEGF.

(d) Farmakokinetisk analyse av trinnvis acetylert Fltl( l- 3)- Fc

In wVo-eksperimenter ble utviklet for å bedømme den farmakokinetiske profil av umodifisert Fltl(l-3)-Fc og trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc-protein. Balb/c-mus (23-28 g) fikk subkutant injisert 4 mg/kg umodifisert Fltl(l-3)-Fc eller prøver av trinnvis acetylert Fltl(l-3)-Fc med 10, 20, 40, 60 eller 100 gangers molart overskudd (3 mus for umodifisert og prøvvene med 10, 20 og 40 gangers molart overskudd, og 2 mus for prøver med 60 og 100 gangers molart overskudd). Man tok blodprøver fra musenes haler 1, 2, 4, 6 og 24 timer og 2 dager og 3 dager etter injeksjonen. Seraene ble analysert i et ELISA-basert assay som var utformet for å påvise Fltl(l-3)-Fc (beskrevet ovenfor). Fig. 9 viser resultatene av denne undersøkelse. Tmaks-verdien for alle de testede Fltl(l-3)-Fc-proteiner var på 6-timers tidspunktet, men Cmaks-verdien var som følger: umodifisert Fltl(l-3)-Fc: 0,06 ug/ml; prøve med 10 gangers molart overskudd: 0,7 ug/ml, prøve med 20 gangers molart overskudd: 2 ug/ml, prøve med 40 gangers molart overskudd: 4 ug/ml, prøve med 60 gangers molart overskudd: 2 ug/ml, prøve med 100 gangers molart overskudd: 1 ug/ml. Disse resultater demonstrerer at en acetylering eller pegylering av Fltl(l-3)-Fc forbedrer dets farmakokinetiske profil vesentlig.

Eksempel 11:

Konstruksjon av F( tlfl- 3)- Fc- basisk regton- detesjonsmutant benevnt Mutl: Fltlfl- S^- Fc

På grunnlag av observasjonen at acetylert Fltl(l-3)-Fc, som har en pl-verdi under 6, har meget bedre farmakokinetiske egenskaper enn det høyt positive, umodifisert Fltl(l-3)-Fc (pl >9,3), spurte man seg om forskjellen i farmakokinetikken ikke kunne tilskrives nettoladningen av proteinet, som gjorde at det klebet til negativt ladede ekstracellulære matrikskomponenter, eller om det eventuelt forelå bestemte plasseringer på overflaten av Fltl(l-3)-Fc-protein som utgjorde spesifikke bindingsseter for ekstracellulære matrikskomponenter. F.eks. er mange proteiner kjent for å ha heparinbindende seter, ofte bestående av en klynge av basiske residuer. Iblant finnes disse residuer i en klynge på den primære sekvens av proteinet; noen publikasjoner har identifisert "konsenssekvenser" for slike heparinbindende seter (se f.eks. Hileman et al., 1998, Bioessays 20 (2): 156-167). I andre tilfeller oppviser den kjente krystallstruktur av et protein en klynge med positivt ladede residuer på overflaten av et protein, men residuene stammer fra forskjellige regioner av den primære sekvens, og bringes kun sammen når proteinet folder seg til sin tertiære struktur. Dermed er det vanskelig å bedømme og et isolert amino syreresiduum utgjør en del av en klynge av basiske residuer på overflaten av proteinet. Hvis det imidlertid foreligger en klynge av positivt ladede aminosyreresiduer i den primære sekvens, er det ikke urimelig å anta at residuene ligger i et romslig nært forhold til hverandre, og at de derfor kan tenkes å utgjøre en del av et bindingssete for ekstracellulære matriks-komponenter. Fltl-reseptor er blitt grundig undersøkt, og forskjellige domener er blitt beskrevet (se f.eks. Tanaka et al., Jpn. J. Cancer Res 88: 867-876). Idet det vises til nukleinsyre- og aminosyresekvensen som vises på fig. 10A-10D i foreliggende søknad, kan man identifisere signalsekvensen for utsondring, som er plassert i starten av sekvensen og strekker seg til glycinet som kodes for av nukleotidene 76-78. Det modne protein starter med Se r- Lys-Leu-Lys, begynnende ved nukleotid 79 av nukleinsyresekvensen. Fltl-Ig-domene 1 strekker seg fra nukleotid 79 til 393 og slutter med aminosyrene Ser-Asp-Thr. Fltl-Ig-domene 2 strekker seg fra nukleotid 394 til 687 (som koder for Gly-Arg-Pro til Asn-Thr-Ile), og Fltl-Ig-domene 3 strekker seg fra nukleotidene 688 til 996 (som koder for Ile-Asp-Val til Asp-Lys-Ala). Det foreligger en brodannende aminosyresekvens, Gly-Pro-Gly, som kodes for av nukleotidene 997-1005, fulgt av nukleotidsekvensen som koder for humant Fc (nukleotidene 1006-1701 eller aminosyrene Glu-Pro-Lys til Pro-Gly-Lys-stop).

En mer detaljert analyse av Fltl-aminosyresekvensen viser at det foreligger en klynge, nemlig aminosyrene 272-281 (KNKRASVRR) på fig. 10A-10D, hvor 6 av 10 aminosyreresiduer er basiske. Denne sekvens er plassert i Fltl-Ig-domene 3 av reseptoren (se fig. 11), som i og for seg ikke er nødvendig for bindingen av VEGF-ligand, men som formidler en høyere affinitet for bindingen til liganden. En linjestilling av sekvensen av Ig-domene 3 med sekvensen av Ig-domene 2 viser at i dette parti, er det en meget dårlig overensstemmelse mellom de to Ig-domener, og at det foreligger ca. 10 tilleggsaminosyrer i Ig-domene 3. En analyse av hydrofilisi-tetsprofilene (MacVector-programvare) av disse to domener viser tydelig et nærvær av et hydrofilt område i proteinet (fig. 12A-12B). Disse observasjoner førte til spørsmålet om det var mulig at den faktiske tredimensjonale konformasjon av Fltl-Ig-domene 3 muliggjorde en type utstikker som ikke foreligger i Fltl-Ig-domene 2. For å teste denne hypotese ble de 10 tilleggsaminosyrene fjernet, og det dannede protein ble testet for å se om delesjonen ville påvirke farmakokinetikken på gunstig måte uten å alvorlig kompromittere affiniteten av reseptoren for VEGF. Dette DNA-konstrukt, som ble konstruert ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker (se f.eks. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (utg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY)) i pattedyr-ekspresjonsvektoren pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) benevnes Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc. Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc-konstruktet ble avledet fra Fltl(l-3)-Fc ved delesjon av nukleotidene 814-843 (vist på fig. 10A-10D), som fjerner den høyt basiske 10-aminosyreresiduers sekvens Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg fra Fltl-Ig-domene 3.

Det endelige DNA-konstrukt ble sekvens-verifisert ved bruk av en ABI 373A-DNA-sekvensierer og Taq-dideoksy-terminatorsyklus-sekvensieringssettet (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvensen av Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc vises på fig. 13A-13D.

Eksempel 12:

Konstruksjon av Fltl( l- 3)- Fc- basisk region- delsjonsmutanten benevnt Mut2: Fltl( 2- 3M)-Fc

Et andre delesjonsmutant-konstrukt, benevnt Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc, ble avledet fra Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc-konstruktet ved delesjon av Fltl-Ig-domene 1 som kodes for av nukleotidene 79-393 (se fig. 10A-10D); for enkelthetens skyld ble nukleotidene 73-78 (TAC GGT) endret til TCC GGA. Dette innførte et restriksjonssete (BspEl) uten å endre den forbundne aminosyresekvens, Ser-Gly. Dette DNA-konstrukt, som ble konstruert ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker (se f.eks. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (utg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY)) i pattedyrekspresjonsvektoren pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) og ble også sekvensverifisert ved bruk av en ABI 373A-DNA-sekvensierer og Taq-dideoksy-terminatorsyklus-sekvensieringssettet (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvensen av Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc vises pp fig. 14A-14C.

Eksempel 13:

Konstruksjon av Fltl( l- 3)- Fc- delesjonsmutanten benevnt Mut3: Fltl( 2- 3)- Fc

Et tredje delesjonsmutantkonstrukt, benevnt Mut3: Fltl(2-3)-Fc, ble konstruert på samme måte som Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc-konstruktet, unntatt at man lot Fltl-Ig-domene 3 være intakt (basisk regionaminosyrene ble ikke fjernet). Konstruktet ble konstruert ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker, og sluttkonstruktet ble sekvensverifisert som beskrevet ovenfor. Sekvensen av Mut3: Fltl(2-3)-Fc vises på fig. 15A-15C.

Eksempel 14:

Konstruksjon av Fitl( 1- 3)- Fe- basisk region- N- glykosyiasjonsmutanten benevnt Mut4: Fltiri- 3g^)- Fc

Et siste konstrukt ble fremstilt, hvor et N-glykosyiasjonssete ble innført i midten av den basiske region av Fltl-Ig-domene 3. Dette konstrukt ble benevnt Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc, og ble fremstilt ved å endre nukleotidene 824-825 fra GA til AC, og dermed å endre det kodede Arg-residuum (AGA) til et Asn-residuum (AAC) (se fig. 10A-10D). Den dannede aminosyresekvens endres dermed fra Arg-Ala-Ser til Asn-Ala-Ser, hvilket passer til det kanoniske signal (Asn-Xxx-Ser/Thr) for tilføyelse av et N-glykosylasjonssete ved Asn-residuet. Sekvensen av Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc vises på fig. 16A-16D.

Eksempel 15:

Karakterisering av acetvlert Fltlfl- 3VFc. Mutl: Fltlf 1- 3^- Fc- oa Mut4: Fltl( l- 3R-_)- Fc- mutanter

(a) Binding til ekstracellulære matrikskomponenter

For å bestemme om de tre modifiserte proteiner var mer eller mindre sannsynlige til å ha forbedrede farmakokinetiske egenskaper, ble "Matrigel"-bestrøkne 96-brønners skåler (som beskrevet ovenfor) inkubert med forskjellige konsentrasjoner av mutant-proteinene og påvist med anti-humant Fc/alkalifosfatase-konjugerte antistoffer. Slik det fremgår fra fig. 18, viste dette eksperiment at selv om det umodifiserte Fltl(l-3)-Fc-protein kunne bindes sterkt til disse brønner, ble Mut3: Fltl(2-3)-Fc-protein bundet noe svakere, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc-protein ble bundet enda svakere, og Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc-protein oppviste den beste profil i det det ble svakere bundet enn noe annet av de mutante proteiner. Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc-glykosylasjonsmutant-protein oppviste kun en marginell forbedring på "Matrigel"-assayet. Disse resultater bekrefter hypotesen om at en lineær sekvens av positive aminosyrer kan fjernes fra den primære sekvens, hvilket vil føre til en nedsatt ladningsvekselvirkning med ekstracellulære matrikskomponenter.

(b) Binding av Mutl: Fltlf 1- 3^- Fc oa Mut4: Fltlfl- 3fi^)- Fc i et " Biacore"-basert assay

Umodifisert og acetylert Fltl(l-3)-Fc og genetisk modifisert Mutl: FltlCl-S^-Fc og Mut4: Fltl(l-3R_,N)-Fc-protein ble testet i et "Biacore"-basert assay for å bedømme deres evne til å bindes til Fltl-liganden VEGF. I dette assay ble umodifisert Fltl(l-3)-Fc-protein (0,25, 0,5 eller 1,0 ug/ml) immobilisert på overflaten av et "Biacore"-flak (se Biacore-instruksmanualen, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, for standardprosedyrer) og en oppøsning som inneholdt 0,1 ug/ml VEGF og enten renset eller COS-celle-supernatant som inneholdt umodifisert Fltl(l-3)-Fc (i ca. 0,25, 0,5 eller 1,0 ug/ml konsentrasjon), renset acetylert Fltl(l-3)-Fc (i konsentrasjonen 0,25, 0,5 eller 1,0 ug/ml), COS-cellesupernatant som inneholdt Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc (i ca. 0,25, 0,5 eller 1,0 ug/ml konsentrasjon) eller COS-cellesupernatant som inneholdt Mut4: FIUCI-Sr^-Fc (i ca. 0,25, 0,5 eller 1,0 ug/ml konsentrasjon), ble ført over det Fltl(l-3)-Fc-bestrøkne flak. Slik det fremgår fra fig. 17, foreligger det ved det substøkiometriske forhold (0,25 ug/ml Fltl(l-3)-Fc fra umodifiserte, acetylerte eller genetisk modifiserte prøver mot 0,1 ug/ml VEGF) ikke tilstrekkelig Fltl(l-3)-Fc-protein til å blokkere bindingen av VEGF til Fltl(l-3)-Fc'et som var immobilisert på "Biacore"-flaket. Ved 0,5 ug/ml umodifisert, acetylert eller genetisk modifisert Fltl(l-3)-Fc-protein, er det støkiometriske forhold ca. 1.1, og det foreligger en forsterket evne til å blokkere VEGF-bindingen til "Biacore"-flaket. Ved 1,0 ug/ml umodifisert, acetylert eller genetisk modifisert Fltl(l-3)-Fc-protein, som er et ca. 10:1 støkiometrisk forhold, har Fltl(l-3)-Fc-proteinene evnen til å blokkere bindingen av VEGF til "Biacore"-flaket, men de er ikke like gode. Umodifisert, acetylert og Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc er i det vesentlige like gode i sin evne til å blokkere VEGF-bindingen, mens Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc er noe mindre virksom på å blokkere bindingen. Disse resultater bekrefter hypotesen om at det er mulig å redusere den ikke-spesifikke binding av et positivt ladet molekyl ved å genetisk fjerne en lineær sekvens av overveiende negativt ladede aminosyrer.

(c) Binding av Mutl: FltlCl- B^- Fc, Mut2: Fttl( 2- 3ag^ Fc oa Mut3: Fltl( 2- 33- Fc i et ELISA- basert assay

For å bestemme om de tre mutante proteiner kunne binde Fltl-liganden VEGF, utførte man bindingseksperimenter hvor 96-brønners plater som var bestrøket med VEGF, ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av det aktuelle mutante protein, og etter vasking, ble mengden av bundet protein påvist ved inkubasjon med et alkalifosfatase-konjugert anti-humant Fc-antistoff og kvantifisert kolorimetrisk ved tilsetning av et egnet alkalifosfatase-substrat. Slik det fremgår fra fig. 19, viste dette eksperiment at alle de mutante proteiner kunne binde VEGF på lignende måte ved de testede konsentrasjoner.

Eksempel 16:

Farmakokinetisk analyse av acetylert Fltl( l- 3)- Fc, Mutl: Fltl( l- 3_ >)- Fc og umodifisert Fltlf l- 3VFc

In wVo-eksperimenter ble utviklet for å bedømme den farmakokinetiske profil av umodifisert Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc og Fltl(l-3)-Fc-protein som var acetylert med et 40 gangers molart overskudd. Balb/c-mus (25-30 g) fikk subkutant injisert 4 mg/kg umodifisert Fltl(l-3)-Fc, 40 gangers molart overskudd-acetylert Fltl(l-3)-Fc eller Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc (4 mus hver). Man tok blodprøver fra disse musene 1, 2, 4, 6 og 24 timer og 2 dager, 3 dager og 5 dager etter injeksjonen. Seraene ble testet i et ELISA-assay som var utformet til å påvise Fltl(l-3)-Fc-protein, hvilket omfattet å bestryke en ELISA-plate med VEGF, binde Fltl(l-3)-Fc og rapportere med et anti-Fc-antistoff bundet til alkalifosfatase. Slik det fremgår fra fig. 20, var Cmaks-verdien for disse reagensmidler som følger: umodifisert Fltl(l-3)-Fc: 0,15 ug/ml; 40 gangers molart overskudd-acetylert Fltl(l-3)-Fc: 1,5 ug/ml og Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc: 0,7 ug/ml.

Eksempel 17:

Modifisert Fltl- reseptorvektor- konstruksjon

Tanken bak å konstruere modifiserte versjoner av Fltl-reseptor (også kjent som VEGFR1) grunnet seg på observasjonen at proteinsekvensen av Fitl var meget basisk, og dermed sannsynligvis ville klebe til den ekstracellulære matriks (ECM). Den sterkt basiske natur av Fitl forklarer sannsynligvis hvorfor umodifisert Fltl(l-3)-Fc (beskrevet ovenfor) har dårlige farmakokinetiske egenskaper som gjør det vanskelig å bruke som terapeutisk middel. Slik det ble beskrevet ovenfor, oppviste den kjemisk modifiserte form for 40 gangers molart overskuddacetylert Fltl(l-3)-Fc, heretter benevnt A40, en sterkt forbedret farmakokinetisk (PK) profil sammenlignet med det ikke-acetylerte Fltl(l-3)-Fc. Derfor gjorde man forsøk på å konstruere DNA-molekyler som kunne brukes til å rekombinant uttrykke modifiserte former for et Fltl-reseptormolekyl som ville ha den forbedrede PK-profil som oppvises av A40, og fortsatt beholde sin evne til å bindes sterkt til VEGF.

Det er kjent i litteraturen at den første Ig-domene av Fitl (som har en nettoladning på +5 ved nøytral pH) ikke er vesentlig for en sterk binding til VEGF, og derfor ble denne domene fjernet. Den tredje Ig-domene (som har en nettoladning på +11) er ikke nødvendig for bindingen, men formidlere en høyere affinitet for VEGF enn den andre Ig-domene, og istedenfor å fjerne denne fullstendig, ble den derfor erstattet med de likeverdige domener av Fltl-reseptor-slektningene Fikl (også kjent som VEGFR2) og Flt4 (også kjent som VEGFR3). Disse chimære molekyler (benevnt henholdsvis R1R2 (Fltl.D2.FlklD3.FcACl(a) og VEGFRlR2-FcACl(a) og R1R3 (FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) og VEGFRlR3-FcACl(a), hvor RI og FltlD2 = Ig-domene 2 av Fitl (VEGFR1); R2 og FlklD3 = Ig-domene 3 av Fikl (VEGFR2) og R3 og VEGFR3D3 = Ig-domene 3 av Flt4 (VEGFR3)) klebet meget mindre til ECM, bedømt ifølge et in wfro-ECM-bindingsassay som skal beskrives i det følgende, og hadde en meget bedre PK, slik det skal beskrives i det følgende. I tillegg hadde disse molekylene evnen til å binde VEGF sterkt slik det skal beskrives i det følgende, og å blokkere fosforylasjonen av nativ Flkl-reseptor som uttrykkes i endotelceller, slik det skal beskrives i det følgende.

(a) Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pFltlD2. FlklD3. FcACl( a)

Ekspresjonsplasmidene pMT21.Fltl(l-3).Fc (6519 bp) og pMT21.Flk-l(l-3).Fc (5230 bp) er plasmider som koder for ampicillinresistens og Fc-taggede versjoner av Ig-domenene 1-3 av henholdsvis humant Fitl og humant Fikl. Disse plasmider ble brukt til å konstruere et DNA-fragment som bestod av en fusjon av Ig-domene 2 av Fitl med Ig-domene 3 av Fikl, ved bruk av PCR-amplifikasjon av den tilsvarende Ig-domene fulgt av ytterligere runder med PCR for å oppnå en fusjon av de to domener i ett enkelt fragment. For Ig-domene 2 av Fitl, var 5'- og 3'-amplifikasjonsprimerne som følger:

5'-amplifikasjonsprimeren koder for et BspEl-restriksjonsenzymsete oppstrøms for Ig-domene 2 av FFItl(l-3)-Fc, definert ved aminosyresekvensen GRPFVEM (tilsvarende aminosyrene 27-33 på fig. 21A-21C). 3'-primeren koder for det reverse komplement av 3'-ende av Fltl-Ig-domene 2 kondensert direkte til 5'-starten av Flkl-Ig-domene 3, med fusjonspunktet definert som TIID av Fitl (tilsvarende aminosyrene 123-126 på fig. 21A-21C) og fortsettende til VVLS (tilsvarende aminosyrene 127-130 på fig. 21A-21C) av Fikl.

For Ig-domene av Fikl, var 5'- og 3'-amplifikasjonsprimerne som følger:

5'-amplifikasjonsprimeren koder for enden av Fltl-Ig-domene 2 kondensert direkte til starten av Flkl-Ig-domene 3, som beskrevet ovenfor. 3'-amplifikasjonsprimeren koder for enden av Flkl-Ig-domene 3, definert ved aminosyrene VRVHEK (tilsvarende aminosyrene 223-228 på fig. 21A-21C), fulgt av en brodannende sekvens som omfatter en gjenkjenningssekvens for restriksjonsenzymet Srfl, og koder for aminosyrene GPG. Den brodannende sekvens tilsvarer aminosyrene 229-231 på fig. 21A-21C.

Etter en runde med PCR-amplifikasjon for å danne de enkelte domener, ble produktene kombinert i et rør og underkastet en ytterligere runde med per med primerne bsp/fltlD2 og flklD3/apa/srf.as (beskrevet ovenfor) for å danne fusjonsproduktet. Dette PCR-produkt ble deretter spaltet med restriksjonsenzymene BspEI og Smal, og det dannede 614 bp lange fragment ble delklonet inn i BspEI- til Srfl-restriksjonssetene av vektoren pMT21/AB2.Fc for å danne plasmidet pMT21/- FltlD2.FlklD3.Fc. Nukleotidsekvensen av FltlD2-FlklD3-genfusjonsinnføyelsen ble verifisert ved standard sekvensanalyse. Dette plasmid ble deretter spaltet med restriksjonsenzymene EcoRI og Srfl, og det dannede 702 bp lange fragment ble overført til EcoRI- til Srfl-restriksjonssetene av plasmidet pFltl(l-3)B2-FcACl(a) for å danne plasmidet pFltlD2.FlklD3.FcACl(a). Den fullstendige DNA- og avledede aminosyresekvens av det chimære FltlD2.FlklD3.FcACl(a)-molekyl vises på fig. 21A-21C.

(b) Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pFltlD2VEGFR3D3FcACl( a)

Ekspresjonsplasmidet pMT21.Fltl(l-3).Fc (6519 bp) koder for ampicillinresistens og en Fc-tagget versjon av Ig-domenene 1-3 av human Fltl-reseptor. Dette plasmid ble brukt til å danne et DNA-fragment som inneholdt Ig-domene 2 av Fitl ved PCR. RNA fra cellelinjen HEL921.7 ble brukt for å danne Ig-domene 3 av Fikl ved bruk av standard RT-PCR-metoder. En ytterligere rundet med PCR-amplifikasjon ble brukt til å oppnå en fusjon av de to Ig-domener til ett enkelt kondensert fragment. For Ig-domene 2 av Fitl var 5'- og 3'-amplifikasjonsprimerne som følger:

5'-amplifikasjonsprimeren koder for et BspEl-restriksjonssete oppstrøms for Ig-domene 2 av Fitl, definert ved aminosyresekvensen GRPFVEM (tilsvarende aminosyrene 27-33 på fig. 22A-22C). 3'-Amplifikasjonsprimeren koder for revers-komplementet av enden av Fltl-Ig-domene 2 kondensert direkte til starten av VEGFR3-Ig-domene 3, hvor fusjonspunktet er definert som TIID av Fitl (tilsvarende aminosyrene 123-126 på fig. 22A-22C) og fortsettende til IQLL av VEGFR3 (tilsvarende aminosyrene 127-130 på fig. 22A-22C).

For Ig-domene 3 av VEGFR3, var 5'- og 3'-primeme som ble brukt for RT-PCR, som følger:

Både 5'- og 3'-amplifikasjonsprimerne tilvarer sekvensen av VEGFR3. Det 296 bp lange amplifikasjonsprodukt av denne RT-PCR-reaksjon ble isolert ved standardteknikker og underkastet en andre runde av PCR for å tilføye egnede sekvenser for å tillate en fusjon av FltlD2- med FlklD3-domene og fusjon av FlklD3- og Fc-domene via en GPG-bro (se nedenfor). Amplifikasjonsprimerne var som følger:

5'-amplifikasjonsprimeren koder for 3'-ende av Fltl-Ig-domene 2 kondensert direkte til starten (5'-ende) av VEGFR3-Ig-domene 3, slik det ble beskrevet ovenfor. 3'-amplifikasjonsprimeren koder for 3'-ende av VEGFR3-Ig-domene 3, definert ved aminosyrene VIVHEN (tilsvarende aminosyrene 221-226 på fig. 22A-22C), fulgt av en brodannende sekvens som omfatter en gjenkjenningssekvens for Srfl og som koder for aminosyrene GPG. Den brodannende sekvens tilsvarer aminosyrene 227-229 på fig. 22A-22C.

Etter én runde (for Fltl-Ig-domene 2) eller to runder (for Flt4-Ig-domene 3) av PCR for å danne de enkelte Ig-domener, ble PCR-produktene kombinert i et rør og underkastet en ytterligere runde med PCR-amplifikasjon med amplifikasjonsprimerne bsp/fltlD2 og VEGFR3D3/srf.as som ble beskrevet ovenfor, for å danne fusjonsproduktet. Dette PCR-produkt ble deretter spaltet med restriksjonsenzymene BspEI og Smal, og det dannede 625 bp lange fragment ble delklonet inn i BspEI- til Srfl-restriksjonssetene av vektoren pMT21/FltlAB2.Fc (beskrevet ovenfor) for å danne plasmidet PMtT21/FltlD2.VEGFR3D3.Fc. Sekvensen av FltlD2-VEGFR3D3-genfusjons-innføyelsen ble verifisert ved standard sekvensanalyse. Dette plasmid ble deretter spaltet med restriksjonsenzymene EcoRI og Srfl, og det dannede 693 bp lange fragment ble delklonet inn i EcoRI- til Srfl-restriksjonssetene av plasmidet pFltl(l-3)AB2-FcACl(a) for å danne plasmidet som benevnes pFltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Den fullstendige DNA og avledede aminosyresekvens av det chimære FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)-molekyl vises på fig. 22A-22C.

Eksempel 18:

Ekstracellulær matriks ( ECM)- bindingsassay

ECM-bestrøkne plater (Becton Dickinson, katalog-nr. 35-4607) ble rehydrert med varmt DME supplementert med glutamin (2 mM), 100 U penicillin, 100 U streptomycin og 10% BCS i minst 1 time før prøvene ble tilsatt. Platene ble deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med forskjellige konsentrasjoner av FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) startende med 10 nM og med påfølgende 2 gangers fortynninger i PBS plus 10% BCS. Platene ble deretter vasket 3 ganger med PBS plus 0,1% Triton-X og inkubert med alkalifosfatase-konjugert anti-humant Fc-antistoff (Promega, 1:4000 i PBS plus 10% BCS) i 1 time ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket 4 ganger med PBS 0,1% Triton-X, og alkalifosfatasebuffer/pNPP-oppløsning (Sigma) ble tilsatt for fargeutvikling. Platene ble avlest ved 1=405-570nm. Resultatene av dette eksperiment vises på fig. 23, og demonstrerer at FltlD2.FlklD3.FcACl(a)- og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)-protein kleber betydelig mindre til ECM sammenlignet med Fltl(l-3)-Fc-protein.

Eksempel 19:

Forbigående eks<p>resjon av pFLTiD2. FlklD3. FcACl( a^ i CHO- K1 fElAVcallér

En kultur i stor skala (2 I) av E. co//-DH10B-celler som bar det ovenfor beskrevne pFltlD2.FlklD3.FcACl(a)-plasmid som ble beskrevet ovenfor i eksempel 17(a), ble dyrket over natten i "Terrific Broth" (TB)-kraft pluss 100 ug/ml ampicillin. Den følgende dag ble plasmid-DNA'et ekstrahert ved bruk av "QIAgen Endofree Megaprep"-settet idet man fulgte produsentens protokoll. Konsentrasjonen av renset plasmid-DNA ble bestemt ved standardteknikker ved bruk av et UV- spektrofotometer og et fluorimeter. Plasmid-DNA'et ble verifisert ved standard restriksjonsenzymspaltning av alikvoter ved bruk av restriksjonsenzymene EcoRI plus Noti og Asel. Alle restriksjonsenzym-spaltningsfragmentene tilsvarte den forutsagte størrelse ifølge analyse på en 1% agarosegel.

15 cm Petri-skåler (40 stykker) ble podet med CHO-Kl/ElA-celler i en tetthet på 4 x 106 celler/plate. Platemediet var Gibco HarrTs F-12 supplementert med 10% "Hyclone" føtalt bovint serum (FBS), 100 U penicillin / 100 U streptomycin og glutamin (2 mM). Den følgende dag ble hver plate med celler transfisert med 6 ug pFltlD2.FlklD3.FcACl(a)-plasmid-DNA ved bruk av "Optimem" fra Gibco og "Lipofcetamine" fra Gibco i 12 ml volum, idet man fulgte produsentens protokoll. Fire timer etter at transfeksjonsblandingen var blitt tilsatt til cellene, ble 12 ml/plate "Optimem" supplementert med 10% FBS tilsatt. Platene ble inkubert ved

37°C i en 5% C02-inkubator over natten. Den følgende dag ble mediene fjernet fra hver plate, og 25 ml ekspresjonsmedium (Gibco CHO-S-SFM II supplementert med glutamin (2 mM) og 1 mM natriumbutyrat) ble tilsatt. Platene ble inkubert ved 37°C i 3 dager. Etter 3 dagers inkubasjon, ble mediet sugd bort fra hver plate og sentrifugert ved 400 rpm i en rotor med dreiende bøtte for å pelletere cellene. Supernatanten ble dekantert inn i sterile 1 l-kolber, og rensing av det uttrykte protein ble utført slik det ble beskrevet ovenfor.

Eksempel 20:

Konstruksjon av pVEGFRlR2- FcACl( a)- ekspresjonsvektor

pVEGFRlR2-FcACl(a)-ekspresjonsplasmidet ble konstruert ved innføyelse av DNA som kodet for aminosyrene SDT (tilsvarende aminosyrene 27-29 på fig. 24A-24C) mellom Fltld2-Flkld3-FcACl(a)-aminosyrene 26 og 27 på fig. 21A-21C (GG) og fjerning av DNA som kodet for aminosyrene GPG tilsvarende aminosyrene 229-231 på figuren. SDT-aminosyresekvensen er nativ for Fltl-reseptor, og ble ført tilbake for å nedsette sannsynligheten for en heterogen N-terminal prosessering. GPG (den brodannende sekvens) ble fjernet, slik at Fitl- og Flkl-Ig-domenene var kondensert direkte til hverandre. Den fullstendige DNA- og avledede aminosyresekvens av det chimære pVEGFRlR2-FcACl(a)-molekyl vises på fig. 24A-24C.

Eksempel 21:

Cellekulturprosess brukt til § danne modifiserte Fltl- reseptorer

(a) Cellekulturprosess bruk til å danne FltlD2. FlklD3. FcAClfa)

Prosessen for å danne FltlD2.FlklD3.FcACl(a)-protein ved bruk av ekspresjonsplasmidet pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) som ble beskrevet ovenfor i eksempel 1, omfatter en suspensjonskultur av rekombinante kinesisk hamster-ovarie (CHO Kl/ElA)-celler som konstitutivt uttrykker protein produktet. Cellene dyrkes i bioreaktorer, og proteinproduktet isoleres og renses ved affinitets- og størrelseseksklusjonskromatografi. Prosessen skal beskrives i større detalj i det føl-gende.

Celleekspansion

To konfluente T-225 cm<2->kolber som inneholdt den FltlD2.FlklD3.FcACl(a)-uttrykkende cellelinje, ble ekspandert ved å føre cellene til åtte T-225 cm<2->kolber i medium (GMEM + 10% serum, GIBCO) og å inkubere dem ved 37°C og 5% C02. Når kolbene nærmet seg konfluens (ca. 3-4 dager), ble cellene løsnet ved bruk av trypsin. Ferskt me4dium ble tilsatt for å beskytte cellene for ytterligere utsettelse for t ry psi net. Cellene ble sentrifugert og resuspendert i ferskt medium og deretter overført til åtte 850 cm<2->rullekolber og inkubert ved 37°C og 5% C02inntil de var konfluente.

Suspensjonskultur i bioreaktorer

Celler dyrket i rullekolber ble trypsin ist for å løsne dem fra overflaten, og vasket med suspensjonskulturmedium. Cellene ble aseptisk overført til en 5 I bioreaktor (New Brunswick Celligen Plus), hvor cellene ble dyrket i 3,5 I suspensjonskultur. Suspensjonskulturmediet var en glutamin-fri lavt glukoseholdig modifikasjon av IS-CHO (Irvine Scientific) til hvilket man hadde tilsatt 5% føtalt bovint serrum (Hyclone), GS-supplement (Life Technologies) og 25 uM metioninsulfoksimin (Sigma). pH ble regulert til 7,2 ved tilsetning av kulldioksid til innstrømmings-gassen, eller ved tilsetning av en flytende oppløsning av natriumkarbonat til bioreaktoren. Nivået av oppløst oksygen ble holdt ved 30% av metningspunktet ved tilsetning av oksygen eller nitrogen til innløpsgassen, og temperaturen ble holdt ved 37°C. Når en tetthet på 4 x IO<6>celler/ml var blitt oppnådd, ble cellene overført til en 40 l-bioreaktor som inneholdt det samme medium, og de samme justeringer for å styre bioreaktoren. Temperaturjusteringen ble senket til 34°C for å sinke celleveksten og heve den relative rate av proteinekspresjon.

(b) Cellekulturprosess brukt til å produsere FitlD2. VEGFR3D3. FcACl( a^

Den samme metode som ble beskrevet ovenfor for FltlD2.FlklD3.FcACl(a), ble brukt for å produsere FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a).

Eksempel 22:

Samling og rensing av modifiserte Fltl- reseptorer

(a) Samling og rensing av FltlD2. FlklD3. FcACl( a)

Produktproteinet ble aseptisk samlet fra bioreaktoren mens cellene ble igjen, ved bruk av Millipore Prostak tangsialstrømnings-fitrasjonsmoduler og en mekanisk pumpe med lavt skjær (Fristam). Ferskt medium ble tilsatt til bioreaktoren for å erstatte hva som var blitt fjernet under innsamlingsfiltreringen. Ca. 40 I samlingsfiltrat ble deretter fylt på en 400 ml-kolonne som inneholdt Protein A-Sepharose-harpiks (Amersham Pharmacia). Etter påfyllingen ble harpiksen vasket med buffer som inneholdt 10 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, pH 7,2, for å fjerne eventuelt foreliggende, ubundne, forurensende proteiner. FltlD2. FlklD3.FcACl(a)-protein ble eluert med en pH 3,0-citratbuffer. Det eluerte protein ble nøytralisert ved tilsetning av Tris-base og frosset ved -20°C.

Flere frosne batcher av FltlD2.FlklD3.FcACl(a)-protein fra Protein A-trinnet ovenfor ble tint, samlet og konsentrert ved bruk av en 30 kD nominal molekyl vektavskjæring (NMWCO) tangensialstrømnings-filtrasjonsmembran fra Millipore. Proteinet ble overført til en omrørt cellekonsentrator (Millipore) og ytterligere konsentreret til 30 mg/ml ved bruk av en 30 kD NMWCO-membran. Det konsentrerte protein ble fylt på en størrelseseksklusjonskolonne som var pakket med Superdex 200-harpiks (Amersham Pharmacia) som var ekvilibrert med fosfatbufret salin plus 5% glycerol. Den samme buffer ble brukt for å skylle kolonnen. Fraksjonene som tilsvarte FltlD2.FlklD3.FcACl(a)-dimer, ble samlet, sterilfiltrert gjennom et 0,22 mikronfilter, alikvotert og frosset.

(b) Innsamling og rensing av FltlD2. VEGFR3D3. FcACl( a)

De samme metoder som ble beskrevet ovenfor for FltlD2.FlklD3.FcACl(a), ble brukt for å samle og rense FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a).

Eksempel 23:

Fosforylasjonsassay for forbigående uttrykt VEGFR2

Primære humane navlestrengvene-endotelceller (HUVECer), passasje 4-6, ble holdt uten næring i 2 timer i serumfritt DME-høyt glukoseholdig medium. Prøver som inneholdt 40 ng/ml (1 nM) humant VEGF165, som er en ligand for VEGF-reseptorene Fitl, Fikl og Flt4 (VEGFR3), ble preparert og forhåndsinkubert i 1 time ved romtemperatur med forskjellige mengder av de modifiserte Fltl-reseptorer Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) og FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) i serumfritt DME-høyt glukoseholdig medium som inneholdt 0,1% B5A. Cellene ble behandlet i 5 minutter med de ovenfor preparerte prøver med eller uten VEGF165, fulgt av helcellelysis ved bruk av fullstendig lysisbuffer. Cellelysatene ble immunofelt med et antistoff rettet mot C-terminus av VEGFR2-reseptor. De immunofelte lysater ble plassert på 4-12% SDS-Page-"Novex"-gel og deretter overført på PVDF-membran ved bruk av standard over-føringsmetoder. Påvisningen av fosforylert VEGFR2 ble utført ved immunoblotting med anti-fosfo-tyrosin-mAb'et som benevnes 4G10 (UBI), og utviklet ved bruk av ECL-reagens (Amersham).

Fig. 25A-25C og 26A-26B viser resultatene av dette eksperiment. Fig. 25A-25C viser at en påvisning ved "Western blot" av tyrosin-fosforylert VEGFR2(Flkl) ved VEGF165-ligandstimulering, viser at celleflatereseptorene er fosforylert i forskjellig grad avhengig av hvilken modifiserte Fltl-reseptor som brukes under forhåndsinkubasjonen med VEGF. Slik det fremgår fra fig. 25A, foreligger det ved et 1,5 molart overskudd av enten Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40) eller ubestandig FltlD2FlklD3.FcACl(a) en fullstendig blokkering av disse modifiserte Fltl-reseptorers reseptorstimulering, sammenlignet med en behandling i kontrollmedium. Derimot oppviser ubestandig FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) ingen vesentlig blokkering ved dette molare overskudd sammenlignet med den VEGF-positive kontrollbehandling. Lignende resultater fremgår fra fig. 25B, hvor de modifiserte Flt-reseptorer foreligger i et 3 gangers molart overskudd i forhold til VEGF165-ligand. På fig. 25C, hvor de modifiserte Fltl-reseptorer foreligger i et 6 gangers molart overskudd i forhold til VEGF165-ligand, kan ubestandig FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) nå observeres å delvis blokkere den VEGF165-induserte stimulering av celleflatereseptorer.

På fig. 26A-26B viser en påvisning ved "Western blot" av tyrosin-fosforylert VEGFR2(Flkl) ved VEGF165-ligandstimulering at celleflatereseptorer ikke fosforyleres av behandlingsprøver som har VEGF165 forhåndsinkubert med 1 og 2 gangers molart overskudd (fig. 26A) eller 3 eller 4 gangers molart overskudd (fig. 26B) av enten ubestandig FltlD2FlklD3.FcACl(a), stabilt FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller ubestahdnig VEGFRlR2-FcACl(a). Ved alle de testede konsentrasjoner av modifisert Fltl-reseptor foreligger en fullstendig binding av VEGF165-ligand under forhåndsinkubasjonen som ikke fører til noen påvisbar stimulering av celleflatereseptorer med ubundet VEGF165 sammenlignet med behandling med kontrollmedium.

Eksempel 24:

Celleproliferasions- bioassay

Testcellepopulasjonen er MG87-celler som er blitt stabilt transfisert med en ekspresjonsplasmid som inneholder en DNA-innføyelse som koder for VEGFR2(Flkl)-ekstracellulær domene kondensert med TrkB-intracellulær kinasedomene, hvorved det dannes et kimært molekyl. Grunnen til at man brukte TrkB-intracellulær kinasedomene istedenfor den native VEGFR2(Flkl)-intracellulære kinasedomene, er at den intracellulære kinasedomene av VEGFR2(Flkl) ikke forårsaker noen sterk proliferativ respons når den stimuleres med VEGF165 i disse celler. Det er kjent at MG87-celler som inneholder hellengdes TrkB-reseptor, gir en robust proliferativ respons når de stimuleres med BDNF, slik at man erstattet den intracellulære kinasedomene av VEGFR2(Flkl) med TrkB-intracellulær kinasedomene for å dra nytte av denne evne til proliferativ respons. 5 x IO3 celler/brønn ble strøket på en 96-brønners plate og fikk akklimatisere seg i 2 timer ved 37°C. De følgende modifiserte Flt-reseptorer: Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a), plus en irrelevant reseptor benevnt Tie-Fc som negativkontroll, ble titrert fra 40 nM til 20 pM og inkubert på cellene i 1 time ved 37°C. Humant rekombinant VEGF165 i definert medium ble deretter tilsatt til alle brønnene i konsentrasjonen 1,56 nM. Platene ble inkubert i 72 timer ved 37°C, deretter ble MTS (Owen's reagensmiddel, Promega) tilsatt, og platene ble inkubert i ytterligere 4 timer. Til slutt ble platene avlest på et spektrofotometer ved 450/570 nm. Resultatene av dette eksperiment vises på fig. 27. Kontrollreseptoren Tie2-Fc blokkerer ikke den VEGF165-induserte celleproliferasjon ved noen konsentrasjon, mens FltlD2.FlklD3.FcACl(a) blokkerer 1,56 nM VEGF165 med en halvmaksimal dose på 0,8 nM. Fltl(l-3)-Fc og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) er mindre virksomme ved blokkering av VEGF165 i dette assay, med en halvmaksimal dose rundt 2 nM. VEGF165 alene gir en avlesning på 1,2 absorbansenheter, og bakgrunnsverdien er 0,38 absorbansenheter.

Eksempel 25:

Bindingsstøkiometri av modifiserte Flt- reseptorer til VEGF165

(a) BIAcore- analyse

Støkiometrien av FltlD2FlklD3.FcACl(a) og VEGFRlR2-FcACl(a)-vekselvirkningen med humant VEGF165 ble bestemt ved å måle enten nivået av VEGF-metningsbinding til FltlD2FlklD3.FcACl(a)- eller VEGFRlR2-FcACl(a)-flater eller måling av konsentrasjonen av VEGF165 som var nødvendig til å fullstendig forebygge en binding av FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2.RcACl(a) til VEGF-BIAcore-flakflaten.

De modifiserte Fltl-reseptorer FltlD2FlklD3.FcACl(a) og VEGFRlR2-FcACl(a) ble innfanget med et anti-Fc-spesifikt antistoff som først ble immobilisert på et BIAcore-flak (BIACORE) ved bruk av aminkoblingskjemi. En blindprøveantistoff-flate ble brukt som negativkontroll. VEGF165 ble injisert i konsentrasjonen 1 nM, 10 nM og 50 nM over FltlD2FlklD3.FcACl(a)- og VEGFRlR2-FcACl(a)-flaten ved 10 pl/min i 1 time. Et sanntids bindingssignal ble registrert, og metningsbinding ble oppnådd ved slutten av hver injeksjon. Bindingsstøkiometrien ble beregnet som det molare forhold mellom bundet VEGF165 og immobilisert FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a), ved bruk av konversjonsfaktoren 1.000 RU likeverdig med 1 ng/ml. Resultatene antydet en bindingsstøkiometri på ett toverdig VEGF165-molekyl per ett FltlD2FlklD3.FcACl(a)- eller VEGFRlR2-FcACl(a)-molekyl (fig. 28).

I oppløsning ble FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a) i en konsentrasjon på 1 nM (bedømt å være 1000 ganger høyere enn KD-verdien for FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a)/VEGF165-vekselvirkningen) blandet med forskjellige konsentrasjoner av VEGF165. Etter én times inkubasjon ble konsentrasjonene av fritt FltlD2FlklD3.FcACl(a) i oppløsning målt som et bindingssignal til en aminkoblet VEGF165-flate. En kalibreringskurve ble brukt til å omregne FltlD2FlklD3.FcACl(a)-BIAcore-bindingssignalet til sin molare konsentrasjon. Dataen viste at tilsetningen av 1 nM VEGF165 i FltlD2FlklD3.FcACl(a)-oppløsningen fullstendig blokkerte FltlD2FlklD3.FcACl(a)-bindingen til VEGF165-flaten. Dette resultat antydet en bindingsstøkiometri av ett VEGF165-molekyl per ett FltlD2FlklD3.FcACl(a)-molekyl (fig. 29 og fig. 30). Når konsentrasjonen av FltlD2FlklD3.FcACl(a) ble plottet som funksjon av den tilsatte konsentrasjon av VEGF165, var stigningen av det lineære parti -1,06 for FltlD2FlklD3.FcACl(a) og -1,07 for VEGFRlR2-FcACl(a). Størrelsesorden av stigningen, som var meget nær minus ett, tydet på at ett VEGF165-molekyl ble bundet til ett molekyl av enten FltlD2FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a).

(b) Størrelseseksklusjonskromatoqrafi

FltlD2FlklD3.FcACl(a) ble blandet med et 3 gangers overskudd av VEGF165, og reseptor/ligand-komplekset ble renset ved bruk av en Pharmacia Superose 6-størrelseseksklusjonskromatografikolonne. Reseptor/ligand-komplekset ble deretter inkubert i en buffer som inneholdt 6M guanidinhydroklorid, for å adskille det til sine komponentproteiner. FltlD2FlklD3.FcACl(a) ble adskilt fra VEGF165 ved å føre det gjennom gjennom en Superose 6-størrelseseksklusjonskromatografikolonne i 6M guanidiumklorid. For å bestemme kompleksets støkiometri foretok man flere injeksjoner av FltlD2FlklD3.FcACl(a) og VEGF165, og topphøyden eller den integrerte intensitets topp ble plottet som en funksjon av konsentrasjonen av injisert protein. Kalibreringen ble utført under betingelser som var identiske med hva som ble brukt ved separasjon av komponentene av FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF-komplekset. En kvantifisering av FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF-kompleks-sammensetningen var basert på kalibreringskurvene. Resultatene av dette eksperiment vises på fig. 28, som viser at forholdet mellom VEGF165 og FltlD2FlklD3.FcACl(a) i et kompleks er 1:1.

Eksempel 26:

Bestemmelse av bindinqsstøkiometrien av FltlD2FlklD3. FcACl(a)/ VEgF165-kompleks ved størrelseseksklusjonskromatografi

Fremstilling av FltlD2FlklD3. FcACl( aWEGF165- kompleks

VEGF165 (konsentrasjon = 3,61 mg/ml) ble blandet med CHO-celle som ubestandig uttrykte FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (konsentrasjon = 0,9 mg/ml), i det molare forhold 3:1 (VEGF165:FltlD2.FlklD3.FcACl(a)), og det hele ble inkubert over natten ved 4°C.

(a) Størrelseseksklusjonskromatografi ( SEC) under native betingelser

For å adskille komplekset fra overflødig ubundet VEGF165, ble 50 Dl av komplekset fylt på en Pharmacia Superose 12 Pc 3,2/30 som var blitt ekvilibrert i PBS-buffer. Prøven ble eluert med den samme buffer med strømningshastigheten 40 ml/min, ved romtemperatur. Resultatene av denne SEC vises på fig. 31. Topp nr. 1 representerer komplekset, og topp nr. 2 representerer ubundet VEGF165. Fraksjoner som ble eluert mellom 1,1 og 1,2 ml, ble slått sammen, og guanidiniumhydroklorid (GuHCI) ble tilsatt til den endelige konsentrasjon 4,5M, for å adskille komplekset.

(b) Størrelsesekskluslonskromatografi fSECK under dlssoslatlve betingelser

For å adskille komponentene av reseptor/ligand-komplekset og for å bestemme deres molare forhold, ble 50 pl av det ovenfor beskrevne dissosierte kompleks fylt på en Superose 12 PC 3,2/30 som var ekvilibrert i 6M GuHCI, og eluert med den samme oppløsning med strømningshastigheten 40 pl/min, ved romtemperatur. Resultatene av denne SEC vises på fig. 32. Topp nr. 1 representerer FltlD2FlklD3.FcACl(a), og topp nr. 2 representerer VEGF165.

(c) Bere<g>ning av FltlD2FlklD3. FcACl( a)/ VEGF165- kompleksets støkiometri

Støkiometrien av reseptor/ligand-komplekset ble bestemt utfra topparealet eller topphøyden for komponentene. Konsentrasjoner av VEGF165 og FltlD2FlklD3.FcACl(a) som tilsvarte henholdsvis toppens høyde eller toppens areale, ble erholdt fra standardkurvene for VEGF165 og FltlD2FlklD3.FcACl(a). For å oppnå en standardkurve ble fire forskjellige konsentrasjoner (0,04 mg/ml - 0,3 mg/ml) av hver komponent injisert på en Pharmacia Superose 12 PC 3,2/30-kolonne som var blitt ekvilibrert i 6M guanidiniumklorid, og eluert med den samme oppløsning ved strømningshastigheten 40 pl/min, ved romtemperatur. Standardkurven ble erholdt ved å plotte topparealet eller topphøyden mot proteinkonsentrasjonen. Det molare forhold mellom VEGF165 og FltlD2FlklD3.FcACl(a) som ble bestemt utfra topparealet for komponentene, var 1,16. Det molare forhold mellom VEGF165 og FltlD2FlklD3.FcACl(a) som ble bestemt utfra topphøyden for komponentene, var 1,10.

Eksempel 27:

Bestemmelse av støkiometrien av FltlD2FlklP3. FcACl( a)/ VEGF165- kompleks ved størrelseseksklusjonskromatografi med " online"- lysspredning Fremstilling av komplekset

VEGF165 ble blandet med CHO som ubestandig uttrykte FltlD2.FlklD3.FcACl(a)-protein, i det molare forhold 3:1 (VEGF165/FltlD2FlklD3.FcACl(a)), og inkubert over natten vd 4°C.

(a) Størrelseseksklusjonskromatografi ( SEC) med " online"- lysspredning

Størrelseseksklusjonskromatografikolonne med en MiniDawn "online"-lysspredningsdetektor (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) og refraksjonsindeks (Rl)-detektorer (Shimadzu, Kyoto, Japan) ble brukt for å bestemme molekylvekten (MW) av reseptor/ligand-komplekset. Prøver ble injisert på en Superose 12 HR

10/30-kolonne (Pharmacia) som var blitt ekvilibrert i PBS-buffer, og eluert med den samme buffer med strømningshastigheten 0,5 ml/min, ved romtemperatur. Slik det fremgår fra fig. 33, oppviser elueringsprofilen to topper. Topp nr. 1 representerer reseptor/ligand-komplekset, og topp nr. 2 representerer det ubundne VEGF165. MW ble beregnet utfra LS- og RI-signalene. Den samme fremgangsmåte ble brukt for å bestemme MW av de enkelte komponenter av reseptor/ligand-komplekset.

Resultatene av disse bestemmelser er som følger: MW av

FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165-komplekset i topp-posisjonen er 157.300 (fig. 33), MW av VEGF165 i topp-posisjonen er 44.390 (fig. 34), og MW av R1R2 ved toppen er 113.300 (fig. 35).

Denne data antydet at støkiometrien av FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF-komplekset er 1:1, idet dette tilsvarer summen av molekylvekten av FltlD2FlklD3.FcACl(a) og VEGF165. Viktig er at denne metode på endelig beviste at FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165-komplekset faktisk kun bestod av ett molekyl av VEGF165-ligand og kun ett molekyl av FltlD2FlklD3.FcACl(a).

Eksempel 28:

Peptid kartlegg i na av FltlD2. FlklD3. FcAClfa^

Disulfidstrukturene og glykosylasjonssetene i FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ble bestemt ved en peptidkartleggingsmetode. I denne metode ble proteinet først spaltet med trypsin. Trypsinfragmenter ble analysert og identifisert ved kHPLC koblet med massespektrometri, i tillegg til en N-terminal-sekvensieringsteknikk. Reduksjon av trypsinspaltningsproduktet ble brukt for å hjelpe med å identifisere de disulfidbindings-holdige fragmenter. En behandling av trypsinspaltningsproduktet med PNGase F (Glyko, Novato, CA) ble brukt for å hjelpe med å identifisere fragmenter som inneholdt N-bundne glykosylasjonsseter. Resultatene sammenfat-tes på den vedlagte fig. 36.

Det finnes tilsammen ti cysteiner i FltlD2.FlklD3.FcACl(a); seks av dem tilhører Fc-parti. Det er blitt bekreftet at Cys27 er disulfidbundet til Cys76. Det er blitt bekreftet at Cysl21 er disulfidbundet til Cysl82. De første to cysteiner i Fc-parti (Cys211 og Cys214) danner en intermolekylær disulfidbinding med de samme to cysteiner i en anne Fc-kjede. På grunn av at disse to cysteiner ikke kan separeres enzymatisk fra hverandre, kan man imidlertid ikke bekrefte om det finner sted en disulfidbinding mellom de samme cysteiner (f.eks. Cys 211 til Cys 211) eller mellom Cys211 og Cys214. Det er blitt bekreftet at Cys216 er disulfidbundet til Cys306. Det er blitt bekreftet at Cys352 er disulfidbundet til Cys410.

Det finnes fem mulig N-bundne glykosylasjonsseter i FltlD2.FlklD3.FcACl(a). Alle fem viser seg å være glykosylert i forskjellig grad. En fullstendig glykosylasjon ble observert ved Asn33 (aminosyresekvens NIT), ASN193 (aminosyresekvens NST) og Asn282 (aminosyresekvens NST). I tillegg observeres en delvis glykosylasjon på Asn65 og Asnl20. Glykosylasjonsseter er merket ved understreking på fig. 36.

Eksempel 29:

Farmakokinetisk analyse av modifiserte Fltl( l- 3)- Fc- reseptorer

(a) Farmakokinetisk analyse av Fltl( l- 3VFc ( A4C». FltlD2. FlklD3. FcACl( a) og VEGFRlR2- FcACl( a^

Balb/c-mus (25-30 g) fikk subkutant injisert 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), ubestandig CHO-uttrykt FltlD2.FlklD3.FcACl(a), stabilt CHO-uttrykt FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og ubestandig CHO-uttrykt VEGFRlR2-FcACl(a). Man tok blodprøver fra musene 1, 2, 4, 6 og 24 timer, 2 dager, 3 dager og 6 dager etter injeksjonen. Seraene ble testet i et ELISA-assay som var utformet for å påvise Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a). ELISA-assayet omfatter å bestryke en ELISA-plate med VEGF165, binde det påviste Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) eller VEGFRlR2-FcACl(a) og rapportering med et anti-Fc-antistoff som var bundet til pepperrot-peroksidase. Resultatene av disse eksperimenter vises på fig. 37. Tmaks-verdien for Fltl(l-3)-Fc (A40) var 6 timer, mens Tmaks-verdien for ubestandig og stabilt FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og ubestandig VEGFRlR2-FcACl(a) var 24 timer. Cmaks-verdien for Fltl(l-3)-Fc (A40) var 8 pg/ml. For begge de ubestandige molekyler

(FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og VEGFRlR2-FcACl(a)) var Cmaks-verdien 18 ug/ml, og Cmaks-verdien for stabilt VEGFRlR2-FcACl(a) var 30 ug/ml.

(b) Farmakokinetisk analyse av Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)

Balb/c-mus (25-30 g) fikk subkutant injisert 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), ubestandig CHO-uttrykt FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og ubestandig CHO-uttrykt FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Man tok blodprøver fra musenes hale 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 og 20 dager etter injeksjonen. Seraene ble testet i et ELISA-assay for å påvise Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). ELISA-assayet omfatter å bestryke en ELISA-plate med 165, binde Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) eller FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) og rapportere med et anti-Fc-antistoff bundet til pepperrot-peroksidase. Fltl(l-3)-Fc (A40) kunne ikke lenger påvises i serum etter 5 dager, mens FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) var påvisbart i 15 dager eller lenger. Resultatene av dette eksperiment vises på fig. 38.

Eksempel 30:

Bedømmelse av evnen av FltlD2. FlklD3. FcACl( a) til å inhibere svulstvekst in vivo

For å bedømme evnen av FltlD2.FlklD3.FcACl(a) til å inhibere svulstvekst in vivo, brukte man en modell hvor svulstcellesuspensjoner implanteres subkutant i høyre flanke av hannlige mus med alvorlig kombinert immunsvikt (SCID-mus). To cellelinjer, nemlig human HT-1080-fibrosarkomacellelinje (ATCC-tilgangsnummer CCL-121) oog rotte-C6-gliomacellelinje (ATCC-tilgangsnummer CCL-107), som hver oppviser meget forskjellige morfologier og vekstkarakteristikk, ble brukt i assayet. Den første dose av FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (i konsentrasjonen 25 mg/kg eller slik det vises på fig. 39 og 40) ble gitt på dagen for svulstimplantasjonen. Dyrene fikk deretter subkutane injeksjoner av Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) eller vehikkel enten annenhver dag (EOD) eller to ganger per uke (2D/uke) over et tidsrom på 2 uker. Etter 2 uker ble dyrene perfusert med fiksasjonsmiddel, svulstene ble fjernet, og prøvene ble blindgjort. Svulstvolumet ble bestemt ved å måle lengden og bredden av synlige subkutane svulster. Både Fltl(l-3)-Fc (A40) og FltlD2.FlklD3.FcACl(a) nedsatte veksten av svulster som ble dannet av HT-1080- og C6-celler, betydelig. Resultatene av disse eksperimenter vises på fig. 39 og 40.

Eksempel 31:

Virkningen av VEGF165 og modi fiserte Fltl- reseptorer I det kvinnelige reproduksjonssystem

Det stereotype mønster av den vaskulære ommodellering som finner sted i uterus og ovarier i løpet av reproduksjonssyklusen, er velkarakterisert, hvilket gjør disse vev spesielt godt egnet for å undersøke mekanismene som regulerer angiogenese, den vaskulære ommodellering og den vaskulære regresjon. Faktisk var det in situ-hybridiseringsundersøkelser i reproduksjonsvevene som gav de første klare tegn på at VEGF virker som mediator av den fysiologiske angiogenese i modne gnagere samt i mennekser og ikke-humane primater (Phillips era/., 1990; Ravindranath et al., 1992; Shweiki eta/., 1993; Kamat eta/., 1995). Fordi en cyklisk angiogenese og vaskulær ommodellering er utpregede trekk av normal ovarie og uterus, er det ikke overraskende at en abnormal blodkarvekst og/eller vaskulær dysfunksjon har vist seg å kjennetegne mange patologiske tilstander som rammer disse organer. Videre tror man at disse patogene vaskulære abnormaliteter forårsakes eller forverres av den dysregulerte ekspresjon av én eller flere angiogene eller anti-angiogene faktorer, mest utpreget VEGF.

For eksempel er en abnormal angiogenese et kjennetegn for polycystisk ovariesykdom og endometrisk karsinom, og i begge tilfellene overuttrykkes VEGF i det rammede vev (Kamat eta/., 1995; Shifren eta/., 1996; Guidi eta/., 1996; Donnez eta/., 1998). En overekspresjon av VEGF antas også å spille en patogen rolle ved etableringen av systemisk vaskulær hyperpermeabilitet i ovarisk hyperstimulasjonssyndrom (McClure eta/., 1994; Levin eta/., 1998) og preeklampsi (Baker et al., 1995; Sharkey et al., 1996). I tillegg er VEGF blitt implisert som den permeabilitetsfaktor som er ansvarlig for produksjon av askitter forbundet med ovariekarsinomer og andre svulster (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Midler som virksomt nøytraliserer de biologiske virkninger av VEGF, kan rimelig tenkes å være av terapeutisk nytte i de ovennevnte og beslektede tilstander.

Angiogenese og vaskulær ommodellering er også kjennetegn for blastocyst-implantasjon- og placental utvikling (Findlay, 1986). VEGF uttrykkes sterkt både i maternal decidua og i embryoniske trofoblaster, hvor man tror at det først stimulerer en ekspansjon og hperpermeabilitet av uterusvaskulaturen under periimplantasjonsperioden og deretter medierer dannelsen av både de maternale og embryoniske bestanddeler av placentavaskulaturen (Shweiki eta/., 1993; Cullinan-Bove og Koos, 1993; Chakraborty era/., 1995; Das eta/., 1997). VEGF er også nødvendig for en luteal angiogenese og den forbundne progesteronutsondring som er nødvendig for å forberede uterus på implantasjonen (Ferrara eta/., 1998).

Dermed kan midler som inhiberer de biologiske virkninger av VEGF vise seg å være nyttige som prevensjonsmidler (ved å forebygge implantasjon) eller som aborti-faciens under de tidlige gestasjonsstadier. Den senere anvendelse kan finne spesiell bruk som ikke-kirurgisk inngrep for terminering av ektopiske svangerskap.

Selv om ekspresjonen av VEGF-reseptorer til stor del er begrenset til vaskulær endotelium i normale reproduksjonsvev, uttrykkes Fitl også av trofoblaster i placenta av både mennesker og dyr (Clark eta/., 1996; He eta/., 199), hvor det er blitt foreslått at det spiller en rolle ved trofoblastinvasjon. Det er interessat å bemerke at både Fitl og KDR (Fikl) uttrykkes av koriokarsinomacellelinjen BeWo (Charnock-Jones et al., 1994), og VEGF har vist seg å fremme en DNA-syntese og tyrosinfosforylasjon av MPA-kinase i disse celler. Videre uttrykker primære og metastatiske ovariekarsinomer ikke bare høye nivåer av VEGF, men, i tillegg til vaskulær endotelium, uttrykker også selve svulstcellene KDR og/eller Fitl (Boocock et al., 1995). Disse funn tyder på at VEGF ikke bare er kritisk omfattet i gene-reringen og vedlikeholdet av svulstvaskulaturen, men at i det minste i noen svulster av reproduktivt opphav, kan VEGF undertjene en autokrin rolle og dermed direkte støtte overlevelsen og proliferasjonen av svulstcellene. Dermed kan midler som blokkerer virkningen av VEGF, ha spesielt fordelaktige anvendelser ved behandling av svulster av reproduktivt opphav.

Metoder oa resultater

(a) Bedømmelse av VEGF- indusert uterushyperpermeabilitet

Gravid hesteserum-gonadotrofin (PMSG) ble injisert subkutant (5 IU) for å indusere ovulasjon i prepubertale rotter av hunnkjønn. Dette fører til en strøm av østradiol etter 2 dager, som i sin tur forårsaker en induksjon av VEGF i uterus. Det beskrives at denne induksjon fører til en hyperpermeabilitet av uterus og en økning av uterus' våtvekt 6 timer senere, og dermed potensielt kunne blokkeres ved hjelp av de modifisert Flt-reseptorer Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). I denne in wVo-modell er normalvekten av rotteuterus ca. 50 mg, og denne kan induseres til 300-350 mg med PMSG. En uttørking av vevet viser at alt dette er vannvekt. En subkutan injeksjon av Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) i konsentrasjonen 25 mg/kg 1 time etter PMSG-injeksjonen fører til en ca. 50% inhibering av økningen av uterus-våtvekten. En heving av dosen av modifisert Flt-reseptor nedsetter ikke økningen av våtvekten ytterligere, hvilket tyder på at det finnes en VEGF-uavhengig komponent i denne modell. Resultatene av dette eksperiment vises på fig. 41.

(a) Bedømmelse av corpus / uteum- anqiogenese ved bruk av progesteron som avlesning

Gravid hesteserum-gonadotrofin (PMSG) injiseres subkutant (5 IU) for å indusere en ovulasjon i prepubertale rotter av hunnkjønn. Dette fører til en komplett fungerende corpus luteum som inneholder et tett nettverk av blodkar etter 4 dager, hvilket muliggjør en utsondring av progesteron i blodstrømmen for å forberede uterus på implantasjonen. Induksjonen av angiogenese i corpus luteum krever VEGF; derfor ville en blokkering av VEGF føre til en mangel på nye blodkar og dermed en mangel på progesteron som utsondres i blodstrømmen. I denne in vivo-modell er hvilenivået av progesteron ca. 5 ng/ml, og dette kan induseres til et nivå på 25-40 ng/ml etter PMSG. En subkutan injeksjon av Fltl(l-3)-Fc (A40) eller FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i konsentrasjonen 25 mg/kg eller 5 mg/kg 1 time etter PMSG-injeksjonen fører til en fullstendig inhibering av progesteroninduksjonen på dag 4. Resultatene av dette eksperiment vises på fig. 42A-42B.

Eksempel 33:

Farmakokinetisk analyse av Fltlf l- 3)- Fc fA40) oa PEGylert Fltl( l- 3)- Fc

Fltl(l-3)-Fc ble PEGylert med enten 10 kD PEG eller 20 kD PEG og testet i balb/c-mus for sin farmakokinetiske profil. Begge de PEGylerte former for Fltl(l-3)-Fc viste seg å ha en meget bedre PK-profil enn Fltl(l-3)-Fc (A40), idet Tmaks-verdien fant sted etter 24 timer for de PEGylerte molekyler, sammenlignet med 6 timer for Fltl(l-3)-Fc (A40).

Eksempel 34:

VEGF165- ELISA for å test<g>e affiniteten av modifiserte Fltl- reseptorvarianter

10 pM VEGF165 ble inkubert over natten ved romtemperatur med modifiserte Fltl-reseptorvarianter i området 160 pM til 0,1 pM. De modifiserte Fltl-reseptorvarianter som ble brukt i dette eksperiment, var Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40), ubestandig uttrykt FltlD2FlklD3.FcACl(a), ubestandig uttrykt FltlD2VEGFR3D3-FcACl(a), Fltl(l-3NAS)-Fc, Fltl(l-3R^C)-Fc og Tie2-Fc.

Fltl(l-3NAs)-Fc er en modifisert versjon av Fltl(l-3)-Fc, hvor den høyt basiske aminosyresekvens KNKRASVRRR er erstattet med NASVNGSR, hvilket fører til innlemmelse av to nye glykosylasjonsseter og en nettoreduksjon av fem positive ladninger, begge med hensikt å nedsette de ugunstige virkninger av denne sekvens på PK-verdien. Fltl(l-3R_»C)-Fc er en modifikasjon hvor et enkelt arginin (R)-residuum i den samme basiske aminosyresekvens er endret til cystein (C)

(KNKRASVRRR -> KNKCASVRRR) for å muliggjøre en PEGylering ved dette residuum, som da kunne beskytte det basiske parti fra å utøve sine ugunstige virkninger på PK-verdien. Etter inkubasjon, ble oppløsningen overført til en plate som inneholdt et innfangingsantistoff for VEGF165 (R&D). Mengden av fritt VEGF165 ble deretter bestemt ved bruk av et antistoff for å rapportere fritt VEGF165. Dette viste at den modifiserte Fltl-reseptorvariant med høyest affinitet for VEGF165 (bestemt som den minste mengde fritt VEGF165) var FltlD2FlklD3.FcACl(a), fulgt av Fltl(l-3)-Fc og Fltl(l-3)-Fc (A40), og deretter av Fltl(l-3R^c)-Fc, Fltl(l-3NAS)-Fc og FltlD2VEGFR3D3-FcACl(a). Tie2-Fc har ingen affinitet for VEGF165.

Claims

1. Anvendelse av et fusjonspolypeptid som er i stand til å binde vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) for fremstilling av et medikament til behandling av en øyesykdom som erkarakterisert vedvaskulær permeabilitet, hvor fusjonspolypeptidet omfater: (a) en VEGF reseptorkomponent bestående i hovedsak av et immunoglobulinliknende (lg) domene 2 av en første VEGF-reseptor og Ig-domene 3 av en andre VEGF-reseptor samt (b) en multimeriserende komponent; og hvor den første VEGF-reseptor er Fitl, den andre VEGF-reseptor er Fikl eller Flt4, og VEGF-reseptorkomponenten er den eneste VEGF-reseptorkomponenten av fusjonspolypeptidet.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor fusjonspolypeptidet er arrangert som 1,2,3;

1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 eller 3,2,1 hvor 1 er første VEGF-reseptorkomponent, 2 er andre VEGF-reseptorkomponent og 3 er den multimeriserende komponent.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor den multimeriserende komponent omfatter et immunoglobulindomene.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor immunoglobulindomenet er Fc-domenet av IgG eller den tunge kjede av IgG.

5. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, hvor fusjonspolypeptidet er kodet av en nukleinsyre som angitt i (a) SEQ ID NO: 11, (b) SEQ ID NO: 13, (c) SEQ ID NO: 15 eller en nukleotidsekvens som, som et resultat av degenerasjonen av den genetiske kode, er forskjellig fra nukleotidsekvensen av (a), (b) eller (c).

6. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, hvor fusjonspolypeptidet omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 eller SEQ ID NO: 15.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor fusjonspolypeptidet omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 15.

8. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, hvor øyesykdommen er aldersrelatert makular degenerering eller diabetisk retinopati.