ES2473610T3 - Composiciones y métodos de uso de mutantes de condroitinasa ABCI - Google Patents

Abstract

Una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 6.

Description

Composiciones y métodos de uso de mutantes de condroitinasa ABCI

F. Fundamentos

La médula espinal est� formada por fibras nerviosas. Un daño al sistema nervioso central, incluyendo la médula espinal, tiene como resultado una pérdida de la función. Los tipos más comunes de lesiones de la médula espinal (SCI: Spinal Cord Injuries) incluyen contusiones (hematomas de la médula espinal) y lesiones por compresión (provocadas por una presión prolongada sobre la médula espinal). Después de una lesión de la médula espinal en un mamífero adulto, la incapacidad de los axones para regenerarse puede dar lugar a pérdida de la sensibilidad, pérdida de la función motriz y/o pérdida de la función auton�mica o neurovegetativa, as� como una parálisis permanente. Una de las razones por las que las neuronas no se regeneran es su incapacidad para atravesar la cicatriz glial que se desarrolla después de una lesión de la médula espinal. El daño inducido por la lesión desarrollar� cicatrización glial, que contiene moléculas de la matriz extracelular que incluyen proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs). Los CSPGs inhiben el crecimiento del tejido nervioso in vitro y la regeneración de tejido nervioso en regiones ricas en CSPGs in vivo. Los CSPGs est�n implicados en otras diversas condiciones incluyendo, p. ej., la inflamación.

Los documentos WO 2005/087920 y WO 2004/103299 describen cada uno de ellos la secuencia de amino�cidos de la condroitinasa ABCI de tipo silvestre y su uso para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central.

G. Sumario de la invención

Una realización de la presente invención proporciona una enzima condroitinasa ABCI mutante elegida entre SEC ID N�: 1, SEC ID N�: 2, SEC ID N�: 5, SEC ID N�: 6.

En realizaciones preferidas, tales enzimas mutantes condroitinasa ABCI muestran una actividad potenciada. En otras realizaciones preferidas, tales enzimas mutantes condroitinasa ABCI muestran una resistencia a la inactivaci�n mejorada, incluyendo la inactivaci�n por exposición a UV o al calor. La enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención se selecciona a partir de 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�:2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6).

La secuencia de nucleótidos de condroitinasa ABCI de tipo silvestre de Proteus vulgaris se expone como SEC ID N�: 7 y la secuencia de amino�cidos de condroitinasa ABCI se expone como SEC ID N�: 8.

La invención incluye ácidos nucleicos que codifican las enzimas mutantes condroitinasa ABCI de la invención y métodos para su uso. En una forma de realización, la invención incluye una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 079D2-2 (SEC ID N�: 3), 057G1-1 (SEC ID N�: 4), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Se elige una secuencia de ácidos nucleicos de la invención a partir de ácidos nucleicos de 055D2-3 (SEC ID N�: 9), ácidos nucleicos de 079B6-2 (SEC ID N�: 10), ácidos nucleicos de 023G6-4 (SEC ID N�: 13) y ácidos nucleicos de 005B123 (SEC ID N�: 14).

Otras realizaciones de la presente invención se refieren al uso de una enzima de la invención para el tratamiento de un paciente en necesidad de recuperación neurol�gica funcional, incluyendo la función sensorial, motriz y auton�mica o neurovegetativa, después de, p. ej., una lesión o enfermedad del sistema nervioso central ("SNC"). Las enzimas mutantes ABCI de la invención también pueden ser utilizadas para degradar CSPGs. En consecuencia, una realización de la invención incluye el uso de una enzima de la invención para la degradación de uno o más CSPGs usando una composición que comprende una enzima mutante ABCI de la invención. Una composición de la invención eficaz para promover la recuperación funcional neurol�gica comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre 055D2- 3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6).

Se contempla el uso de una enzima de la invención para modificar el acceso de las células a los espacios y regiones extravasculares, que comprende administrar a un paciente una composición que comprende una enzima de la invención. En consecuencia, la presente invención se refiere al uso de una enzima de la invención para facilitar la difusión de un agente en el sistema nervioso central o para potenciar la absorción de un agente en el sistema nervioso central. Se contempla el uso de una enzima de la invención para reducir la penetraci�n de las células asociadas con la inflamación en el tejido de un paciente. La enzima se elige entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12 - 3 (SEC ID N�: 6).

Otra realización de la presente invención es el uso de una enzima de la invención para inhibir la extravasaci�n de células asociadas con la inflamación de los vasos sanguíneos, en donde es administrada a un paciente una composición que comprende una enzima que segmenta proteoglicanos de sulfato de condroitina. En una realización, una enzima de la invención evita que las células elegidas entre el grupo que consiste en glóbulos blancos, leucocitos, neutr�filos, eosin�filos, bas�filos, linfocitos, células B, células T, monocitos y macr�fagos, salgan de la

corriente sanguínea. La enzima se elige entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023C6-4 (SEC ID N�: 5), y 005B12 - 3 (SEC ID N�: 6).

Otra realización de la invención es el uso de una enzima de la invención para tratar la inflamación en un paciente, en donde una enzima que segmenta proteoglicanos de sulfato de condroitina es administrada al paciente. La enzima se elige entre 055D2-3 (SEC ID ΝΟ: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). En diversas realizaciones de la presente invención, la inflamación est� asociada con una enfermedad o lesión, tales como la enfermedad inflamatoria crónica y la enfermedad del sistema nervioso central.

Otra realización de la invención es el uso de una enzima de la invención para prevenir la inflamación en un paciente, en donde una composición que comprende una enzima que segmenta proteoglicanos de sulfato de condroitina es administrada al paciente. La enzima se elige entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6).

Otra realización de la presente invención es el uso de una enzima de la invención para tratar la inflamación en un paciente, en donde células asociadas con la inflamación extraídas de un paciente son sometidas a una enzima que segmenta proteoglicanos de sulfato de condroitina ex vivo para modificar las células. La enzima se elige entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6).

En una realización, se usa una enzima de la presente invención para tratar a un paciente en necesidad de regeneración de tejido neurol�gico dañado. En otra realización, se usa una enzima de la invención para facilitar la difusión y el transporte de moléculas terapéuticas capaces de bloquear y/o superar la actividad de las moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal en el tejido dañado o enfermo. Las realizaciones de la presente invención incluyen composiciones que comprenden enzimas mutantes condroitinasa ABCI de la invención y métodos para su uso para facilitar el suministro y la difusión de agentes terapéuticos o agentes de diagnóstico, y agentes que favorecen la regeneración de los nervios y los axones, en células o tejidos. Preferiblemente una composición de la invención es eficaz en la regeneración de tejido neurol�gico dañado o para facilitar la difusión o el transporte. Una composición de la invención comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 5B12-3 (SEC ID N�: 6).

Otras realizaciones se refieren a métodos para favorecer la exytensi�n o crecimiento neuronal y uso en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y trastornos relacionados del SNC mediante la administración de tal enzima mutante condroitinasa ABCI. Una composición de la invención comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6).

Descripci�n de los dibujos

En parte, otros aspectos, características, beneficios y ventajas de las realizaciones de la presente invención ser�n evidentes en relación con las siguientes descripción, reivindicaciones anexas y dibujos que se acompañan donde:

La Figura 1 muestra los niveles relativos de proteína condroitinasa mutante en lisados de células enteras, como se describe con más detalle más adelante en el Ejemplo 3.

La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de estabilidad de lisados de células enteras condroitinasa ABCI mutante a 37 �C, como se describe con más detalle en el Ejemplo 3.

La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de estabilidad de enzimas condroitinasa ABCI mutantes semipurificadas, como se describe con detalle en el Ejemplo 4.

I. Descripción detallada

Antes de describir las presentes composiciones y métodos, se ha de entender que esta invención no est� limitada a las moléculas, composiciones, metodolog�as o protocolos descritos en particular, por cuanto estos pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en la descripción tiene la finalidad de describir solamente versiones o realizaciones particulares, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención que se limitar� tan sólo por las reivindicaciones adjuntas.

Tambi�n hay que señalar que, como se usa en el presente texto y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" o “la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique lo contrario con claridad. As�, p. ej., la referencia a “una célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y as� sucesivamente. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente texto tienen los mismos significados como se entienden comúnmente por un profesional con experiencia normal en la técnica. Aunque en la práctica o ensayo de formas de realización de la presente invención se puede utilizar cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente texto, se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Nada en el presente texto se ha de considerar como admisión de que la invención no est� capacitada para anteceder tal descripción en virtud de una invención anterior.

Como se usa en el presente texto, el término "aproximadamente" significa más o menos el 10 % del valor numérico del número con el que se emplea. Por tanto, significa aproximadamente el 50 % en el margen de 45 % a 55 %.

"Administrar", cuando se utiliza junto con una terapia, significa administrar una terapia directamente en o a un tejido diana o administrar una terapia a un paciente mediante la cual la terapia impacta positivamente en el tejido al que se dirige. Por lo tanto, como se usa en el presente texto, el término "administrar" puede incluir, pero sin limitarse a ello, proporcionar una enzima en o a un tejido diana; proporcionar una enzima sist�micamente a un paciente mediante, p. ej., inyección intravenosa por la cual el producto terapéutico alcanza el tejido diana; proporcionar una enzima en forma de la secuencia que la codifica al tejido diana (p. ej. mediante las llamadas técnicas de terapia g�nica).

El término "animal" como se usa en el presente texto incluye, pero sin limitarse a ellos, los seres humanos y los vertebrados no humanos, tales como animales silvestres, domésticos y de granja.

El término "mejora" se utiliza para expresar que la presente invención cambia bien sea la apariencia, o la forma, las características y/o los atributos físicos del objetivo al que ha sido proporcionada, aplicada o administrada. El cambio puede ser demostrado por cualquiera de los siguientes aspectos solos o en combinación, incluyendo la degradación de los CSPGs de la zona lesionada de la médula espinal o en el SNC o la restauración, en su totalidad o en parte, de la función motriz, sensorial o auton�mica del mamífero.

El término "inhibir" incluye administrar un compuesto de la presente invención para prevenir la aparición de los síntomas, aliviar los síntomas, o eliminar la enfermedad, la condición o el trastorno.

Por la expresión "farmac�uticamente aceptable", se entiende que el vehículo, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos.

La expresión "proteína recombinante" se refiere a un polip�ptido de la presente invención que se produce por técnicas de ADN recombinante, en donde generalmente el ADN que codifica un polip�ptido se inserta en un vector de expresión adecuado que es a su vez usado para transformar una célula hospedadora para producir la proteína. Además, se pretende que la frase "derivado de" con respecto a un gen recombinante incluya dentro del significado de "proteína recombinante" las proteínas que tienen una secuencia de amino�cidos de una proteína nativa, o una secuencia de amino�cidos similar a la misma que se genera mediante mutaciones incluyendo sustituciones y deleciones o borrados (incluyendo el truncamiento) de una forma natural de la proteína.

Como se usa en el presente texto, el término "terapéutico" significa un agente utilizado para tratar, combatir, mejorar

o prevenir una condición o la enfermedad no deseada de un paciente. En parte, las realizaciones de la presente invención est�n dirigidas al tratamiento del sistema nervioso central, tal como la degradación de los CSPGs de un área lesionada de la médula espinal o en el SNC, o la restauración, en su totalidad o en parte, de una función motriz, sensorial o auton�mica del mamífero. Otras realizaciones de la invención se dirigen a la inhibición de la extravasaci�n de células. Sin embargo, otras realizaciones de la invención se dirigen a mejorar o facilitar la difusión, como se discute en el presente texto. Otras realizaciones se dirigen a tratar o prevenir la inflamación.

Las expresiones "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva", como se usa en el presente texto, se pueden usar indistintamente y se refieren a una cantidad de un componente de compuesto terapéutico de la presente invención. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico es una cantidad predeterminada calculada para conseguir el efecto deseado, es decir, para tratar con eficacia una lesión en el sistema nervioso central. Por ejemplo, un compuesto terapéutico que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una condroitinasa formulada para proporcionar una enzima activa estable, es suficiente para degradar los CSPGs de un área lesionada de la médula espinal o una cantidad suficiente para restablecer, en su totalidad o en parte, una función motriz, sensorial o auton�mica del mamífero y puede tener como resultado una regeneración de neuronas en el sistema nervioso central, tal como promoviendo la extensión axonal en un área lesionada. Una cantidad terapéuticamente efectiva incluye también una cantidad eficaz para degradar CSPGs y de esa forma promover la recuperación de la función neurol�gica. Una cantidad terapéuticamente efectiva incluye también una cantidad suficiente para modificar la extravasaci�n de las células o para reducir o prevenir la inflamación.

Los términos "tratar", "tratado" o "tratamiento" como se usan en el presente texto, se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o retardar (reducir) una condición fisiológica, trastorno o enfermedad no deseados, u obtener resultados cl�nicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados cl�nicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitarse a ellos, el alivio de los síntomas; la disminución de la extensión de la condición, trastorno o enfermedad; la estabilizaci�n (es decir, ausencia de empeoramiento) del estado de la condición, trastorno o enfermedad; el retraso en el inicio o retardamiento de la progresión de la condición, trastorno o enfermedad; el mejoramiento de la condición, trastorno o estado de la enfermedad; y la remisión (ya sea parcial o total), bien sea detectable o indetectable, o la potenciación

o mejora de la condición, el trastorno o la enfermedad. El tratamiento incluye la obtención de una respuesta cl�nicamente significativa sin excesivos niveles de efectos secundarios. El tratamiento también incluye la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

El proceso de "extravasaci�n" es conocido como la transmigraci�n de células, tales como leucocitos, de un vaso sanguíneo al espacio extravascular, y puede incluir además la migración al tejido circundante. Como se usa en el

presente texto, el término "leucocito" se utiliza para referirse a la clase de células asociadas con la inflamación, que también se puede definir como cualquiera de las diversas células sanguíneas que tienen un núcleo y citoplasma. También conocidos como glóbulos blancos, los leucocitos incluyen los neutr�filos, eosin�filos, bas�filos, linfocitos, tales como células B, células T, monocitos y macr�fagos. Cuatro tipos de leucocitos son particularmente importantes en la defensa inmunitaria, incluyendo los neutr�filos, que liberan varias proteínas antibacterianas; los monocitos, que son los precursores de macr�fagos que engullen y destruyen las partículas extra�as, y los linfocitos T y B, que son las células de reconocimiento de ant�geno de las células inmunitarias.

El término "vector" se refiere a un vehículo que puede transportar las moléculas de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico que codifican el polip�ptido condroitinasa se unen covalentemente al ácido nucleico del vector. Con este aspecto de la invención, el vector puede ser, p. ej., un pl�smido, un fago de cadena simple o doble, un vector viral de ADN o ARN de cadena simple o doble, o un cromosoma artificial, tal como un BAC, PAC, YAC, O MAC.

Una realización de la presente invención proporciona mutantes de condroitinasa ABCI. En una realización preferida, las enzimas mutantes condroitinasa ABCI y los ácidos nucleicos que las codifican son las de los clones aislados seleccionados entre 055D2-3 (depositados en la American Type Culture Collection ( ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 -2209 el 26 de septiembre 2007 y que tiene una designación de depósito ATCC PTA-86661) (SEC ID NO: 1 y SEC ID N � 9), 079B6-2 (depositado en la ATCC el 26 de septiembre de 2007 y que tiene la designación de depósito ATCC PTA-8662) (SEC ID N �: 2 y SEC ID NO: 10), 023G6-4 (depositado en la ATCC el 26 de septiembre de 2007 y que tiene la designación de depósito ATCC PTA-8659) (SEC ID N �: 5 y SEC ID NO: 13) y 005B12-3 (depositado en la ATCC el 26 de septiembre de 2007 y que tiene la designación de depósito ATCC PTA8660) (SEC ID N �: 6 y SEC ID NO: 14). La secuencia de nucleótidos de condroitinasa ABCI se expone como SEC ID N � 7 y la secuencia de amino�cidos de condroitinasa ABCI se expone como SEC ID N � 8.

Los depósitos ATCC mencionados en el presente texto se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de procedimientos de patente. Estos depósitos se proporcionan simplemente como conveniencia para los expertos en la técnica. Puede requerirse una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados, y en el presente no se otorga tal licencia.

Una realización de la presente invención proporciona mutantes de condroitinasa ABCI. En realizaciones preferidas, tales enzimas mutantes de condroitinasa ABCI muestran una mayor actividad. En una realización, una enzima de la invención tiene un nivel de actividad enzim�tica (medido por su capacidad para degradar un sustrato de CSPG) que es de hasta aproximadamente dos veces mayor que el nivel de actividad de la correspondiente enzima de tipo silvestre. En otra realización, una enzima de la invención tiene un nivel de actividad enzim�tica que es de hasta aproximadamente tres veces mayor que la actividad de la correspondiente condroitinasa de tipo silvestre. Las enzimas mutantes de condroitinasa ABCI se eligen entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Más preferiblemente, la enzima se elige entre el grupo que consiste de 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), y 023G6-4 (SEC ID N�: 5).

La invención incluye ácidos nucleicos que codifican las enzimas mutantes de condroitinasa ABCI de la invención que tienen una actividad potenciada, y métodos para su uso. La invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas mutantes de condroitinasa ABCI elegidas entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12- (SEC ID N�: 6). Preferiblemente, se elige una secuencia de ácidos nucleicos de la invención entre ácido nucleico 055D2-3 (SEC ID N�: 9), ácido nucleico 079B6-2 (SEC ID N�: 10), ácido nucleico 023G6-4 (SEC ID N�: 13) y ácido nucleico 005B12-3 (SEC ID N�: 4).

En otras realizaciones preferidas, tales enzimas mutantes de condroitinasa ABCI presentan una mejor resistencia a la inactivaci�n. En una realización, una mejor resistencia a la inactivaci�n permite que una enzima de la invención permanezca activa después de un estr�s (tal como calor o UV) durante un tiempo que es hasta aproximadamente diez veces más prolongado que para la correspondiente condroitinasa de tipo silvestre. Por ejemplo, si una condroitinasa de tipo silvestre mantiene una actividad medible durante hasta aproximadamente 3 días, una enzima condroitinasa de la invención mantiene una actividad medible durante unos 30 días bajo las mismas condiciones. Las enzimas mutantes condroitinasa ABCI que tienen una mayor resistencia a la inactivaci�n se eligen entre 055D23 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5), y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Más preferiblemente, se elige la enzima entre el grupo que consiste en 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2) y 023G6-4 (SEC ID N�: 5).

La invención incluye ácidos nucleicos que codifican las enzimas mutantes condroitinasa ABCI de la invención que tienen una resistencia mayor a la inactivaci�n, y métodos para su uso. La invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas mutantes condroitinasa ABCI seleccionadas entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Preferiblemente, se elige una secuencia de ácidos nucleicos de la invención entre ácido nucleico 055D2 - 3 (SEC ID N�: 9), ácido nucleico 079B6 2 (SEC ID N�: 10), ácido nucleico 023G6-4 (SEC ID N�: 13) y ácido nucleico 005B12-3 (SEC ID N�: 14).

En otra realización más, se proporciona una enzima mutante de la condroitinasa ABCI que tiene una estabilidad incrementada. La enzima muestra mayor resistencia a la inactivaci�n bajo condiciones de estr�s, incluyendo la exposición a la luz UV o al calor, en comparación con la de la enzima ABCI de tipo silvestre. En una realización

preferida, la enzima muestra mayor estabilidad en comparación con la enzima condroitinasa ABCI de tipo silvestre después de un estímulo de estr�s. Las enzimas mutantes ABCI condroitinasa que tienen mayor estabilidad se eligen entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Más preferiblemente, la enzima se elige entre el grupo que consiste en 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), y 023G6-4 (SEC ID N�: 5).

Las enzimas de la invención pueden ser usadas para prevenir, tratar y aliviar los síntomas de inflamación y los estados inflamatorios. En una realización, se usa una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención para prevenir, tratar o aliviar los síntomas de enfermedades inflamatorias crónicas. Una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención puede ser utilizada para tratar la inflamación asociada con dolor, inyección y estados patológicos. Una enzima de la invención puede ser usada para prevenir el daño en tejidos que est� asociado con procesos inflamatorios. Varias condiciones, incluyendo enfermedades inflamatorias crónicas, pueden beneficiarse de la respuesta inmunitaria controlada. Algunos ejemplos de enfermedades inflamatorias crónicas incluyen el asma, la artritis reumatoide (RA), la esclerosis múltiple (MS), lupus eritematoso sist�mico (LES), y la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC). También se puede usar una enzima de la invención para regular el estado inflamatorio asociado con una o más enfermedades seleccionadas entre el grupo que consiste en trastornos del sistema nervioso central, enfermedades del sistema nervioso central, lesión de la médula espinal, y enfermedades cardiovasculares.

Las enfermedades inflamatorias, las enfermedades autoinmunitarias, y las enfermedades con un componente inflamatorio que pueden ser tratadas con una composición que comprende una enzima de la invención, incluyen también la esclerosis múltiple, meningitis, encefalitis, artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, granulomatosis de Wegener, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis de Crohn, colitis ulcerosa, asma, infecciones por clamidia, sífilis, tiroiditis, arteritis temporal, polimialgia reumática, espondilitis anquilosante, psoriasis, vasculitiditis tales como arteritis temporal, arteritis de Takayasu, aortitis sifilítica, aneurismas infecciosos, aneurismas ateroscler�ticos, aneurismas a�rticos abdominales inflamatorios, poliarteritis nodosa, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Churg-Strauss, vasculitis por hipersensibilidad, enfermedad de Buerger, enfermedad veno-oclusiva inflamatoria mesent�rica, flebitis, tromboflebitis, Churg-Strauss, angitis primaria del SNC, vasculitis inducida por fármacos, cualquier arteritis o venulitis secundaria, gota, seudogota, sarcoidosis, síndrome de Sjogren, mielitis, salpingitis de cualquier etiolog�a, uve�tis, enfermedad inflamatoria p�lvica, glomerulonefritis de cualquier etiolog�a, síndrome de Goodpasture, pericarditis, miocarditis, endocarditis, y pancreatitis.

Las enzimas de la presente invención pueden utilizarse para modificar el acceso de las células a los espacios y regiones extravasculares, administrando a un paciente una composición que comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención. Las enzimas de la presente invención pueden usarse también para reducir la penetraci�n de las células asociada con la inflamación en el tejido de un paciente, administrando a un paciente una composición que comprende una enzima de la invención.

Las enzimas de la presente invención pueden usarse para inhibir la extravasaci�n de las células asociada con la inflamación desde los vasos sanguíneos administrando a un paciente una composición que comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención. La enzima de la invención puede prevenir la extravasaci�n de las células seleccionadas entre el grupo elegido entre el grupo que consiste en glóbulos blancos, leucocitos, neutr�filos, eosin�filos, bas�filos, linfocitos, células B, células T, monocitos, macr�fagos y células, evitando que salgan de la corriente sanguínea.

Las enzimas de la presente invención pueden usarse también para el tratamiento de la inflamación en un paciente, sometiendo las células extraídas de un paciente a una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención ex vivo para modificar las células. Las células sanguíneas modificadas pueden ser posteriormente readministradas al paciente. Por consiguiente, el uso de las enzimas descritas en el presente texto también puede ser dirigido a tratamientos ex vivo.

La extracción de células puede realizarse por diversos métodos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, la extracción de sangre intravenosa, transfusión, di�lisis, bypass, trasplante de órgano y otros métodos similares que tienen por resultado la retirada de células del cuerpo. La administración de las células puede llevarse a cabo por los mismos métodos utilizados para extraer las células, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, la administración intravenosa, transfusión, di�lisis, bypass, trasplante de órgano y similares.

Un leucocito circulante con ligandos expresados en su superficie que contienen cadenas de carbohidratos puede ser extraído de un paciente y modificado ex vivo mediante una o más de las enzimas mutantes ABCI de la invención. La extracción puede llevarse a cabo mediante extracción de sangre, transfusión, di�lisis, bypass o trasplante de órgano. Como se ha descrito, una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención modifica las cadenas de carbohidratos. Una vez modificados, los leucocitos pueden ser reintroducidos en el torrente sanguíneo de un paciente. Los leucocitos modificados ser�n incapaces de adherirse a selectinas, mucinas e integrinas expresadas en el endotelio. La programación en el tiempo de una extracción y reintroducci�n en el torrente sanguíneo puede ser optimizada observando la respuesta inflamatoria y la aparición de leucocitos en el torrente sanguíneo, una vez que dichas células son señaladas a sitios específicos de lesión o infección. Como resultado, puede ser regulada, prevenida, reducida o controlada la extravasaci�n de leucocitos a los tejidos. Tal regulaci�n se puede utilizar en los

m�todos y tratamientos dirigidos al control y tratamiento de la respuesta inflamatoria y enfermedades con un componente inflamatorio.

Las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas para el tratamiento de lesiones de la médula espinal y en la promoción de la regeneración de los axones. Las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas también para promover la plasticidad, el recrecimiento, la reparación y/o la regeneración de neuronas disfuncionales en el SNC que han sido dañadas como resultado de una enfermedad, tal como enfermedades degenerativas incluyendo la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Ventajosamente, el uso de polip�ptidos que degradan proteoglicano o polip�ptidos de transducci�n de la membrana en las composiciones de la presente invención también favorecen la difusión y el acceso de tejido dañado o enfermo a otros agentes terapéuticos que promueven la regeneración de las neuronas.

Una realización más de la presente invención es una composición que comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI para tratar lesiones del sistema nervioso central. En realizaciones preferidas, la enzima mutante condroitinasa ABCI se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva. La enzima mutante condroitinasa ABCI utilizada para el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central se elige entre el grupo que consiste en 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Más preferiblemente, la enzima se elige entre el grupo que consiste en 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), y 023G6-4 (SEC ID N�: 5). Tales lesiones del sistema nervioso central pueden incluir, pero sin limitarse a ellas, lesiones de la médula espinal, incluyendo lesiones inducidas por traumatismo, contusiones, o lesiones de compresión.

Otra realización de la presente invención es una composición que comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI para favorecer la extensión neuronal. En realizaciones preferidas, la enzima mutante condroitinasa ABCI se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva. La enzima mutante condroitinasa ABCI que promueve la extensión neuronal se elige entre el grupo que consiste en 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G64 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Más preferiblemente, la enzima se elige entre el grupo que consiste en 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), y 023G6-4 (SEC ID N�: 5).

Otras realizaciones de la presente invención se refieren al uso de una enzima de la invención para promover la recuperación funcional neurol�gica después de una lesión o enfermedad del sistema nervioso central (“SNC”). En realizaciones preferidas, la enzima mutante condroitinasa ABCI se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva. En particular, la presente invención est� dirigida a utilizar la condroitinasa para promover la recuperación funcional neurol�gica sensorial, motriz o auton�mica después de una lesión en la médula espinal. Las composiciones útiles en este método incluyen formulaciones aceptables de una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención, incluyendo, p. ej., formulaciones de la enzima de liberación inmediata y liberación sostenida. La presente invención también est� dirigida al uso para una enzima de la invención para promover la recuperación funcional neurol�gica después de una lesión por contusión de la médula espinal. Los tipos más comunes de lesiones de la médula espinal (SCI) incluyen contusiones (hematomas de la médula espinal) y lesiones por compresión (causadas por presión sobre la médula espinal). En las lesiones por contusión, el tipo más común de lesión, se forma a menudo una cavidad o un orificio en el centro de la médula espinal. Las enzimas mutantes ABCI de la invención pueden también usarse para degradar CSPGs. En consecuencia, una realización de la invención incluye el uso de una enzima de la invención para degradar una o más CSPGs usando una composición que comprende una enzima mutante ABCI de la invención. Una composición de la invención eficaz para promover la recuperación funcional neurol�gica comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6).

Una realización de la presente invención es una composición y su uso que facilita el acceso y la distribución en las células de un agente terapéutico y de diagnóstico en la composición, a través de membranas o en los tejidos mediante el uso de la composición que incluye al menos una enzima capaz de segmentar los proteoglicanos. La composición comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Las moléculas o agentes en la composición pueden incluir uno o más factores de crecimiento, incluyendo, p. ej., factor neurotr�fico derivado del cerebro, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor neurotr�fico ciliar, factor neurotr�fico derivado del glial, factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento glial 2, L1, GM1, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento nervioso, e inmunofilinas. La composición en algunas realizaciones comprende un agente fluorescente o de contraste para formación de imágenes. De acuerdo con una realización, el agente incluye una célula para trasplante, por ejemplo una célula madre o neurona, una célula como agente de suministro, un agente quimioterap�utico, un antibiótico, un anticuerpo, o un antagonista del receptor de Nogo. Las composiciones pueden usarse para el tratamiento de una lesión del SNC. Preferiblemente, la composición se usa en el tratamiento de daño neuronal a partir de una lesión por contusión.

Los tratamientos descritos en el presente texto suministran una cantidad de una enzima mutante condroitinasa ABCI efectiva para degradar CSPGs y de esta manera promover, p. ej., la recuperación de la función neurol�gica, incluyendo opcionalmente un agente terapéutico, para el SNC. Tales métodos pueden incluir opcionalmente administrar, en combinación con una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención, otra condroitinasa, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC y condroitinasa B, o coadministrar una enzima de mamífero con actividad similar a la condroitinasa, tal como hialuronidasas Hyal1,

Hyal2, Hyal3, Hyal4 y PH20 preferiblemente al SNC, y más preferiblemente a las lesiones de la zona del SNC lesionada. Una vez que las proteínas o polip�ptidos en las composiciones han sido purificados hasta el punto deseado, pueden ser suspendidos o diluidos en un vehículo fisiológico o excipiente apropiado para el tratamiento.

La condroitinasa se puede obtener de varias fuentes, incluyendo un microorganismo que exprese de forma natural una condroitinasa; por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, E. coli, Proteus vulgaris, o a partir de la expresión de una proteína recombinante en una célula hospedadora. La célula hospedadora puede ser una célula procari�tica (tal como E. coli) o una célula eucari�tica (tal como una levadura, una célula de mamífero o una célula de insecto).

Los ácidos nucleicos de condroitinasa ABCI mutante de la presente invención se pueden obtener por varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa y/o otras técnicas para generar mutaciones en el P. vulgaris de tipo silvestre u otra secuencia de codificación de condroitinasa. En una realización, puede hacerse una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una enzima mutante condroitinasa ABCI seleccionada entre 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6). Preferiblemente, se elige una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, en donde el ácido nucleico se selecciona entre ácido nucleico 055D2-3 (SEC ID N�: 9), ácido nucleico 079B6-2 (SEC ID N�: 10), ácido nucleico 023G6-4 (SEC ID N�: 13) y ácido nucleico 005B12-3 (SEC ID N�: 14).

La expresión de una secuencia de ácidos nucleicos ABCI mutante recombinante de la invención puede realizarse ligando un ácido nucleico que codifica la proteína mutante ABCI, o una porción de la misma, en un vector adecuado para la expresión en células procariotas, o bien en células eucariotas, o ambas. Los procedimientos para la ligación son bien conocidos por los profesionales con una experiencia normal en la técnica. Los vectores de expresión para la producción de formas recombinantes de los polip�ptidos condroitinasa sujetos incluyen pl�smidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados para la expresión de un polip�ptido mutante condroitinasa ABCI incluyen pl�smidos de los tipos: pl�smidos derivados de pBR322, pl�smidos derivados de pEMBL, pl�smidos derivados de pEX, pl�smidos derivados de pBTac y pl�smidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coli.

Existen varios vectores para la expresión de proteínas recombinantes en levadura y se podrían utilizar para expresar una proteína mutante ABCI recombinante de la invención. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2, y YRP17 son vehículos de clonaci�n y de expresión útiles en la introducción de construcciones genéticas en S. cerevisiae (véase, p. ej., Broach et al. (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. lnouyc Academic Press, p.83.

En otra realización, se produce un polip�ptido mutante condroitinasa ABCI de la invención de forma recombinante utilizando un vector de expresión generado por subclonaci�n de la secuencia de codificación de una de las proteínas condroitinasa representadas en 055D2-3 (SEC ID N�: 1), 079B6-2 (SEC ID N�: 2), 023G6-4 (SEC ID N�: 5) y 005B12-3 (SEC ID N�: 6).

En algunos casos, puede ser deseable expresar un polip�ptido mutante condroitinasa ABCI recombinante de la invención mediante el uso de un sistema de expresión en insectos tal como el sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de tales sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW ( tales como pAcUW1), y vectores derivados de pBlueBac (tales como la pBlueBac III que contiene β - gal).

Los vectores de expresión y las células hospedadoras enumeradas en el presente texto se proporcionan solamente a título de ejemplo y representan los sistemas bien conocidos disponibles para los expertos en la técnica, que pueden ser útiles para expresar las moléculas de ácido nucleico. El profesional con una experiencia normal en la técnica estar� al tanto de otros sistemas adecuados para la propagación de mantenimiento o la expresión de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente texto.

Las enzimas de la invención pueden ser formuladas en composiciones y formulaciones farmacéuticas. Las formulaciones estables adecuadas y los métodos de purificación se exponen en la solicitud PCT n � US2005/017464 pendiente en común con la presente, presentada el 18 de mayo de 2005 y titulada “Methods of Purifying Chondroitinase and Stable Formulations Thereof” ("Métodos de purificación de condroitinasa y formulaciones estables de la misma”).

Varias realizaciones proporcionan una formulación estable de una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención, tanto para el almacenamiento como para la administración. Generalmente, la enzima de tales formulaciones estables muestra al menos aproximadamente el 50 % de actividad aproximadamente a las 24 horas, preferiblemente al menos aproximadamente el 75 % de actividad, más preferiblemente al menos aproximadamente el 85 % de actividad. En otro aspecto de la invención, las formulaciones proporcionan de forma consistente una actividad estable de condroitinasa.

En una realización, la condroitinasa se formula en un tampón de fosfato, preferiblemente un tampón de fosfato sádico con una concentración en el intervalo de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 1 M. Una realización preferida es de fosfato sádico aproximadamente 750 mM. Otra realización preferida es fosfato sádico aproximadamente 100 mM. En otra realización, la condroitinasa se puede formular en un tampón de fosfato sádico

que comprende además acetato sádico. El acetato sádico puede estar presente en el intervalo de 25 mM a aproximadamente 75 mM. En una realización preferida, la concentración de acetato sádico es de aproximadamente 50 mM. En una realización, una formulación preferida para la administración es una condroitinasa en un tampón con un pH de aproximadamente 7,4. Otras realizaciones de formulaciones para el almacenamiento y la administración se proporcionan en los Ejemplos descritos.

En otras realizaciones, se proporciona una formulación que comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI purificada de la invención y un tampón que comprende un aumento de fuerza iónica. Las realizaciones en las que una formulación comprende una concentración iónica aumentada pueden incrementar la estabilidad de una formulación de enzima. Por ejemplo, una realización preferida proporciona una formulación con NaCl aproximadamente 1 M en fosfato sádico. La concentración de fosfato sádico puede ser aproximadamente 50 mM. En una realización preferida, la concentración de almacenamiento de enzima es inferior a aproximadamente 0,4 mg/ml.

En una realización, una formulación de enzima mutante ABCI condroitinasa comprende aproximadamente 0,4 mg/ml de una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención en fosfato sádico aproximadamente 100 mM, a un pH de aproximadamente 7,4 con una especificidad de sustrato preferida para condroitina A, B y C aproximadamente la misma.

Diversas realizaciones proporcionan una formulación estable de una enzima mutante condroitinasa ABCI de la invención tanto para el almacenamiento como para la administración. Generalmente, la enzima de tales formulaciones estables muestra al menos aproximadamente 50 % de actividad a aproximadamente las 24 horas, preferiblemente al menos aproximadamente 75 % de actividad, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de actividad. En otro aspecto de la invención, las formulaciones proporcionan do forma consistente una actividad de condroitinasa estable.

En otra realización, se proporciona una purificación de la enzima mutante condroitinasa ABCI que comprende las etapas siguientes: 1) extracción de la enzima a partir de una célula, 2) separación del extracto celular crudo usando cromatograf�a de intercambio cati�nico, 3) continuación de la separación del extracto mediante una cromatograf�a de filtración en gel, y 4) eliminación de endotoxina mediante una membrana de intercambio ani�nico para producir una enzima mutante condroitinasa ABCI purificada de la invención. En una realización, se dializa una condroitinasa ABCI purificada de la invención en un tampón volátil, se liofiliza y se almacena a -80 �C.

La actividad de la condroitinasa puede estabilizarse mediante la adición de excipientes o mediante liofilización. Los estabilizantes incluyen carbohidratos, amino�cidos, ácidos grasos y agentes tensoactivos y son conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen carbohidratos tales como sacarosa, lactosa, manitol y dextrano, proteínas tales como albúmina y protamina, amino�cidos tales como arginina, glicina, y treonina, agentes tensoactivos tales como TWEEN� y PLURONIC�, sales tales como cloruro de calcio y fosfato sádico, y lípidos tales como ácidos grasos, fosfol�pidos y sales biliares.

Las enzimas mutantes condroitinasa ABCI de la invención se pueden administrar por vía típica, local o sist�mica. La administración típica o local es preferible para un mayor control de la aplicación. Una enzima de la invención, particularmente o en combinación con otras enzimas de la invención o con otras enzimas degradadoras de CSPG, se puede mezclar con un vehículo farmacéutico apropiado antes de la administración. La administración incluye el suministtro de la enzima al sitio de la lesión o el sitio en el que se encuentran los CSPGs que han de ser degradados. Ejemplos de vehículos y aditivos farmacéuticos utilizados generalmente son diluyentes convencionales, aglutinantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes disgregantes, agentes tampón, ácidos grasos isotonizantes, agentes isotonizantes, agentes conservantes, anestésicos, agentes tensoactivos y similares, y son conocidos por los expertos en la técnica. Los vehículos farmacéuticos que se pueden usar incluyen dextrano, sacarosa, lactosa, maltosa, xilosa, trehalosa, manitol, xilitol, sorbitol, inositol, albúmina de suero, gelatina, creatinina, polietilenglicol, agentes tensoactivos no iónicos (por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbit�n, aceite de ricino endurecido con polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, polioxietilen polioxipropilen glicol) y compuestos similares.

Un régimen de tratamiento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo por medio de la administración de una composición que comprende una enzima mutante condroitinasa ABCI de la presente invención. El régimen de tratamiento puede comprender además la administración de condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, condroitinasa AC y condroitinasa B o enzimas de mamífero con actividad similar a la condroitinasa tales como las hialuronidasas Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4 y PH20 a las lesiones de la zona del SNC lesionada. El modo de administración, la programación en el tiempo de la administración y la dosificación se llevan a cabo de manera tal que la recuperación funcional del deterioro del sistema nervioso central se potencia por la promoción del crecimiento de las neuritas.

La cantidad efectiva de condroitinasa puede administrarse en una dosis simple, en dos dosis o en varias dosis. Aunque se ha de entender que la dosis se puede administrar en cualquier momento, en una realización se administra la dosis dentro de las 12 horas posteriores a la lesión, o lo antes posible. En otra realización, la dosis se administra a un mamífero lesionado en una, en dos o en varias dosis; tales dosis dependerían de la gravedad de la lesión y la cantidad de CSPGs presentes en la cicatrización glial. Cuando se administran varias dosis, pueden ser suministradas sobre una base diaria, semanal o quincenal. El suministro de las dosis puede ser mediante un catéter

o una jeringa. Alternativamente, el tratamiento se puede administrar durante la cirugía para permitir la aplicación directa a la cicatriz glial.

Por ejemplo, en algunos aspectos, la invención est� dirigida a una composición farmacéutica que comprende un compuesto, como se define anteriormente, y un vehículo o diluyente farmac�uticamente aceptable, o una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define anteriormente.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar de la manera convencional por cualquier vía en la que sean activos. La administración puede ser sist�mica, típica, u oral. Por ejemplo, la administración puede ser, pero sin limitarse a ellas, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transd�rmica, oral, bucal, u ocular, o por vía intravaginal, por inhalaci�n, por inyecciones de depósito, o por implantes. As� pues, los modos de administración para los compuestos de la presente invención (ya sean solos o en combinación con otros productos farmacéuticos) pueden ser, pero sin limitarse a ellos, sublingual, inyectable (incluyendo formas de acción corta, depósito, implantes y píldoras inyectados por vía subcutánea o intramuscular), o mediante el uso de cremas vaginales, supositorios, óvulos vaginales, anillos vaginales, supositorios rectales, dispositivos intrauterinos y formas transd�rmicas, tales como parches y cremas.

Los modos específicos de administración dependerán de la indicación. La selección de la vía de administración específica y el régimen de dosis ha de ser ajustada o valorada por el m�dico de acuerdo con métodos conocidos por el cl�nico con el fin de obtener la respuesta clónica óptima. La cantidad de compuesto a administrar es aquella cantidad que sea terapéuticamente efectiva. La dosis a administrar depender� de las características del sujeto que se est� tratando, p. ej., el animal tratado en particular, la edad, el peso, la salud, los tipos de tratamiento concurrente, si hay alguno, y la frecuencia de los tratamientos, y puede ser determinada fácilmente por un profesional experto en la técnica (por ejemplo, por el m�dico).

Las formulaciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la presente invención y un vehículo adecuado pueden ser formas de dosificación sólidas que incluyen, pero sin limitarse a ellas, comprimidos, cápsulas, sellos, pastillas, píldoras, polvos y gránulos; formas de dosificación típica, que incluyen, pero sin limitarse a ellas, soluciones, polvos, emulsiones fluidas, suspensiones fluidas, semis�lidos, pomadas, pastas, cremas, geles y jaleas, y espumas; y formas de dosificación parenteral que incluyen, pero sin limitarse a ellas, soluciones, suspensiones, emulsiones, y polvo seco; que comprende una cantidad efectiva de un pol�mero o copol�mero de la presente invención. También es sabido en la técnica que los ingredientes activos pueden estar contenidos en tales formulaciones con diluyentes farmac�uticamente aceptables, cargas, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, agentes tensoactivos, vehículos hidrófobos, vehículos solubles en agua, emulsionantes, tampones, humectantes, hidratantes, solubilizantes, conservantes y similares. Los medios y métodos para la administración son conocidos en la técnica y un experto puede consultar diversas referencias farmacol�gicas para su orientación. Por ejemplo, puede consultarse Modern Pharmaceutics, Banker y Rhodes, 4 � Ed., Informa Healthcare ( 2002); y Goodman and Gilman´s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 10� ed., McGraw -Hill (2001).

Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados para administración parenteral por inyección, p. ej., por inyección en bolo o infusión continua. Los compuestos se pueden administrar por infusión continua por vía subcutánea a lo largo de un período de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo en ampollas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservante incorporado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Para administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente mediante la combinación de dichos compuestos con vehículos farmac�uticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los compuestos de la invención sean formulados en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por el paciente que ha de ser tratado. Los preparados farmacéuticos para uso oral pueden ser obtenidos añadiendo un excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los agentes auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, cargas tales como azúcares, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparados de celulosa tales como, pero sin limitarse a ellos, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sádica, y polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como, pero sin limitarse a ellos, polivinil pirrolidona entrecruzada, agar, o ácido alg�nico o una sal del mismo tal como alginato sádico.

Pueden proporcionarse núcleos de grageas con recubrimientos adecuados. Para este propósito, pueden usarse soluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o di�xido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de las grageas para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Los preparados farmacéuticos que pueden usarse por vía oral incluyen, pero sin limitarse a ellos, cápsulas duras hechas de gelatina, as� como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga tal como, p. ej., lactosa, aglutinantes tales como, p. ej., almidones, y/o lubricantes tales como, p. ej., talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para tal administración.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de, p. ej., comprimidos o pastillas formuladas de una manera convencional.

Para la administración por inhalaci�n, los compuestos para ser usados de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación de aerosol de pulverización de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, di�xido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos, p. ej. de gelatina, para ser usadas en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los compuestos de la presente invención también pueden formularse en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, p. ej., que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glic�ridos.

Adem�s de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos de la presente invención pueden también formularse como preparado de depósito o de liberación lenta. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular.

Las inyecciones de depósito pueden administrarse entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 meses, o en intervalos más largos. As�, p. ej., los compuestos se pueden formular con materiales polim�ricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, p. ej., como una sal escasamente soluble.

En la administración transd�rmica, los compuestos de la presente invención, por ejemplo, se pueden aplicar a un emplasto, o se pueden aplicar por sistemas terapéuticos transd�rmicos, que se suministran al organismo en consecuencia.

Las composiciones farmacéuticas de los compuestos pueden comprender también vehículos o excipientes adecuados en fase sólida o en gel. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero sin limitarse a ellos, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y pol�meros tales como, p. ej., polietilenglicoles.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar también en combinación con otros ingredientes activos, tales como, por ejemplo, coadyuvantes, inhibidores de proteasa, u otros fármacos o compuestos compatibles en donde se ve que tal combinación es deseable o ventajosa para el logro de los efectos deseados de los métodos descritos en el presente texto.

Los métodos que siguen se usan para ilustrar las diversas realizaciones de la presente invención. Los métodos son a título de ejemplo y no se ha de entender que limiten la invención.

EJEMPLO 1

El presente ejemplo ilustra la generación de enzimas mutantes condroitinasa ABCI ejemplares y ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención.

Clonaci�n de cABCI de tipo silvestre: Se gener� condroitinasa ABCI mediante PCR usando el cADN de longitud completa de P. vulgaris y se clon� en el vector de expresión pET15b en los sitios NdeI y BamHI. El vector se expres� en E. coli (Prabhakar V, et al. Biochem J. 2005).

Mutag�nesis aleatoria de cABCI: El gen de condroitinasa ABCI se dividió en cuatro módulos. Se realizó la mutag�nesis aleatoria en cada uno de los módulos, usando el kit GeneMorph II (Stratagene) para crear un producto que contiene 1-2 cambios de amino�cidos por mutante. Los productos fueron clonados y transformados en DH10B de E. coli de forma que el número de colonias obtenidas que contienen la estructura correcta del clon era de al menos 5 veces el número de genes mutantes individuales que se predice que existen en la población de ADN. Las colonias se agruparon y el ADN de pl�smido se purificó y se utilizó para transformar la cepa de expresión, BL21.

Ensayo de estr�s térmico: Cepas de E. coli que expresan las enzimas cABCI mutadas se sembraron en placa clonalmente para crecimiento e inducción (Overnight Express, Novagen) en placas de 96 pocillos. También se

incluyeron E. coli que expresan la enzima de tipo silvestre. La proteína total se extrajo de los sedimentos de bacterias resultantes usando BPER (PIERCE) seguido por una dilución 1:50 con PBS. Las muestras fueron sometidas a un estr�s térmico de 42 �C en un incubador humidificado durante 2 horas. Las muestras se mezclaron después con un volumen igual de sulfato de condroitina C de 0,25 mg/ml (Sigma), un sustrato de cABCI que tiene por resultado la escisión de las cadenas GAG . Después de una incubaci�n a temperatura ambiente de 10 minutos, se a�adi� reactivo DMB, y se midió la absorbancia a 660 nm. Las identificaciones positivas con medidas de absorbancia mayores que la enzima de tipo silvestre en la misma placa se contaron como éxitos positivos, indicando mayor actividad después del estr�s térmico.

Creaci�n de la biblioteca recombinada: Los diez clones más resistentes térmicamente de los módulos A, B y C fueron recombinados de manera aleatoria para producir una biblioteca de productos combinatoria. Los productos de la PCR de cada módulo se combinaron en una relación equimolar, con un equivalente molar del correspondiente tipo silvestre también presente. Esto cre� un grupo de 9 secuencias variantes para el Módulo C, y un agrupamiento de 11 variantes para los dos módulos A y B. Se realizó una ligación de 3 vías en la que cada módulo sólo podía ser ligado en la orientación correcta con el módulo o módulos flanqueante apropiados y se ligó en el ADN del vector pET15b para producir clones de expresión que contienen cABCI de longitud completa. El tamaño total de esta biblioteca es 1089 secuencias cABCI variantes. El número de colonias obtenidas que contienen la estructura clónica correcta era de al menos 5 veces el número de genes mutantes individuales previsto. La ligación se ponder� para producir en su mayor parte clones que contienen dos o tres módulos mutantes, creando de esta manera nuevas combinaciones de las mutaciones identificadas en los "hits" (identicaciones) del cribado inicial.

EJEMPLO 2

El presente ejemplo ilustra a título de ejemplo enzimas mutantes condroitinasa de la presente invención.

Se confirm� que se generan mutantes térmicamente estables por medio del proceso de evolución molecular. El ensayo de DMB modificado identificó los clones con mayor estabilidad térmica a 42 �C durante 2 horas, en comparación con cABCI de tipo silvestre. Es probable que la estabilidad a esta temperatura confiera mayor estabilidad a 37 �C, permitiendo la facilidad de manipulación y el suministro para los estudios in vivo, ya que pudieron ser utilizadas minibombas permanentes para la dosificación. Los módulos individuales tuvieron como resultado un margen esperado de identificaciones positivas globalmente, como se define por los parámetros de estudio.

Los clones que tienen una mayor estabilidad térmica fueron caracterizados por secuenciaci�n. Todas las secuencias de nucleótidos y amino�cidos son indicadas como el tipo silvestre y después la versión mutante (tipo silvestre a mutante).

Enzima mutante condroitinasa

Secuencia de Condroitinasa ABCI mutante Secuencia de

ABCI (proteína)

amino�cidos (ácido nucleico) nucleótidos

Prote�na 055D2-3 (SEC ID N� 1)

E256 a K256 ácido nucleico 055D2-3 (SEC ID N� 9) T450 a C450 G766 a A766 C2295 a T2295

Prote�na 079B6-2 (SEC ID N� 2)

D683 a N683 ácido nucleico 079B6-2 (SEC ID N� 10) G2047 a A2047

Prote�na 079D2-2 (SEC ID N� 3)

ácido nucleico 079D2-2 (SEC ID N� 11) A1773 a G1773 G1980 a A1980 T2068 a C2068 A2076 a G2076

Prote�na 057G1-1 (SEC ID N� 4)

ácido nucleico 057G1-1 (SEC ID N� 12) G483 a A483 T1110 a C1110 T1821 a C1821

Prote�na 023G6-4 (SEC ID N� 5)

I919 a F919 A736 a P736 ácido nucleico 023G6-4 (SEC ID N� 13) A2755 a T2755 G2206 a C2206

Enzima mutante condroitinasa

Secuencia de Condroitinasa ABCI mutante Secuencia de

ABCI (proteína)

amino�cidos (ácido nucleico) nucleótidos

Prote�na 005B12-3 (SEC ID N� 6)

E296 a K296 ácido nucleico 005B12-3 (SEC ID N� 14) G985 a A985

EJEMPLO 3

Evaluaci�n de la Estabilidad - Estabilidad a 37 �C del Lisado Bacteriano. Condroitinasa ABCI de tipo silvestre y variante que expresan E. coli fueron expandidas y expresadas en placas de 96 pocillos. Se prepararon extractos de5 proteína a partir de los sedimentos bacterianos resultantes. Los sedimentos se lisaron con BPER (Pierce) durante diez minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron a 1000 g para sedimentar cualquier material insolubilizado. Los sobrenadantes se transfirieron a recipientes nuevos. El contenido de proteína se normalizó usando un ensayo de proteína BCA. Los lisados también se analizaron en geles de SDS-PAGE y se tiñeron con Coomassie. La cantidad de enzima producida se determin� utilizando el software GeneTools (Syngene) comparando el tamaño de

10 la banda de enzima con todas las demás bandas de proteína extraída (histograma copiado al final del documento). El porcentaje de enzima sobre la base de la proteína total del lisado de células se muestra en la Figura 1.

Las muestras fueron sometidas a un estr�s térmico de 37 �C en un incubador humidificado. Se midió la actividad en incrementos a lo largo del tiempo usando un ensayo DMB colorim�trico (dimetil, azul de metileno). Las muestras se mezclaron con un volumen igual de 0,25 mg/ml de sulfato de condroitina C, un sustrato de la condroitinasa ABCI que

15 resulta en la segmentación de las cadenas GAG. Después de una incubaci�n de diez minutos a temperatura ambiente se a�adi� reactivo DMB y se midió la absorbancia a 660 nm. Los resultados se representan en la Figura 2 y en las Tablas IA y IB que siguen.

Tabla 1A: Tiempo (días) a 37 �C

0,00

0,71 1,00 1,65 2,81 3,69 4,69 9,69 11,69

057G1-1

0,94 1,04 0,88 1,05 0,90 1,18 1,04 0,90 0,69

023G6-4

0,94 1,06 1,03 1,05 0,92 1,22 1,04 1,04 1,08

005B12-3

0,97 1,08 0,91 1,10 0,93 1,24 1,11 1,09 0,97

079D2-2

0,93 1,06 0,92 1,05 0,90 1,18 1,02 0,85 0,72

079B6-2

0,93 1,08 0,89 1,05 1,05 1,18 1,07 1,12 1,12

021B8-3

0,97 1,07 0,91 1,08 0,95 1,22 1,08 1,07 0,92

055D2-3

0,92 1,03 0,86 1,06 0,92 1,15 1,04 1,03 0,92

+cABC1

0,95 1,07 1,02 1,09 0,18 0,09 0,03 0,08 -0,03

20 Tabla 1B: Tiempo (días) a 37 �C (continuación)

13,69

16,69 18,69 20,69 23,69 25,69 27,69 31,69

057G1-1

0,30 0,20 0,19 -0,01 0,06 0,09 0,11 0,08

023G6-4

1,00 0,95 0,60 0,01 0,09 0,16 0,18 0,05

005B12-3

0,63 0,49 0,46 0,02 0,02 0,03 0,09 0,15

079D2-2

0,32 0,28 0,32 0,06 0,18 0,23 0,09 0,08

079B6-2

1,07 1,07 0,94 0,73 0,38 0,42 0,27 0,14

021B8-3

0,42 1,19 0,15 0,08 0,22 0,10 0,10 0,03

055D2-3

0,57 0,21 0,29 0,30 0,21 0,14 0,14 0,11

+cABC1

0,02 -0,13 0,06 -0,01 0,05 0,06 0,09 0,05

EJEMPLO 4

Estabilidad a 37 � C semipurificado. Todas las enzimas procedentes de E. coli que expresa condroitinasa ABCI de tipo silvestre y variante se purificaron usando una columna SP de alta velocidad. Las muestras de proteína se 5 normalizaron mediante la A280 para coincidir con la lectura de la absorbancia de la enzima nativa (0,35) por dilución en tampón para eluci�n (acetato de Na 20 mM + NaCl 250 mM). También se reconstituyó una enzima cABCI totalmente purificada y se diluyó hasta una A280 de 0,35 la misma que la muestra nativa semipurificada. Se tomaron lecturas de actividad inicial para todas las muestras usando un ensayo espectrofotom�trico de sustrato de condroitina C. El ensayo mide el producto producido por la digestión de sulfato de condroitina C a lo largo del tiempo

10 a A232. Las muestras fueron sometidas a un estr�s térmico de 37 �C en un incubador humidificado. Se tomaron lecturas de la actividad todos los días hasta que la muestra nativa perdió toda la actividad. El ensayo de las muestras restantes continu� 3 veces por semana. Las lecturas de actividad mostradas como porcentaje de la actividad total retenida para unas pocas variantes se presentan en la Figura 3 y en las Tablas 2A y 2B que siguen.

Tabla 2A: Tiempo (días) a 37 �C

Tabla 2B:

0,50

1,50 2,50 3,79 4,79 5,79

cABCI

56,43 34,45 25,48 14,42 8,63 5,77

023G6-1

58,32 42,28 41,70 31,96 24,61 19,82

0,79B6-2

65,23 54,21 44,96 35,14 19,09 17,93

cABCI purificada

33,78 18,64 11,21 4,51 1,59 0,66

6,79

8.79 11,79 13,79 15,79 18,79

cABCI

3,55 2,23 0,74 0,00 0,00 0,00

023G6-1

15,23 12,41 9,00 6,74 3,76 1,86

0,79B6-2

13,89 10,76 5,02 2,89 1,51 1,10

cABCI purificada

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

EJEMPLO 5

Estabilidad de condroitinasa mutante después del tratamiento con UV. Después del crecimiento y la expresión, se 20 extrae un mutante de condroitinasa usando BPER (Pierce) como anteriormente y se expone a la luz UV. La actividad de liasa de la condroitina se mide mediante un ensayo de DMB.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Acorda Therapeutics, Inc. Caggiano, Anthony O. Iaci, Jennifer Vecchione, Andrea

<120> Composiciones y métodos de uso de mutantes de condroitinasa ABCI

<130> 127304.03202 10 <140> todavía sin asignar

<141>

<150> 60/828,800

<151>

<160> 14

<170> PatentIn versión 3.4 20 <210> 1

<211> 997

<212> PRT

<213> Artificial 25 <220>

<223> Proteus vulgaris

<400> 1

<210> 2

<211>

997 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus vulgaris

<400> 2

<210> 3

<211>

997 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400> 3

<210> 4

<211>

997 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400>

4

<400>

5

<210> 6

<211> 997

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400> 6

<210> 7

<211> 997

<212> PRT

<213> Proteus vulgaris

<400> 7

<210> 8

<211> 2994

<212> ADN

<213> Proteus vulgaris

<400> 8

<210> 9

<211> 2994

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400> 9

<210> 10

<211>

2994 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400> 10

<210> 11

<211> 2994

<212> ADN

<213> Proteus vulgaris

<400> 11

<210> 12

<211> 2994

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400> 12

<210> 13

<211> 2992

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400> 13

<210> 14

<211>

2993 5 <212> ADN

5

<210> 5 <211> 997 <212> PRT <213> Artificial

10

<220> <223> Proteus vulgaris

31

<213> Artificial

<220>

<223> Proteus Vulgaris

<400> 14

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una enzima mutante condroitinasa ABCI elegida entre SEC ID N�: 1, SEC ID N�: 2, SEC ID N�: 5 y SEC ID N�: 6.

2. 2.

   La enzima condroitinasa ABCI mutante según la reivindicación 1�, en donde dicha enzima es la SEC ID No. 1.

3. 3.

   La enzima condroitinasa ABCI mutante según la reivindicación 1�, en donde dicha enzima es la SEC ID N�: 2.

4. 4.

   La enzima condroitinasa ABCI mutante según la reivindicación 1�, en donde dicha enzima es la SEC ID N�: 5.

5. 5.

   La enzima condroitinasa ABCI mutante según la reivindicación 1�, en donde dicha enzima es la SEC ID N�: 6.

6. 6.

   La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1� a 5� para tratar una lesión del sistema nervioso central

   o para promover la extensión neuronal.

7. 7.

   La enzima según la reivindicación 6�, en donde la enzima condroitinasa ABCI mutante es para la administración después de una lesión del sistema nervioso central por contusión.

8. 8.

   La enzima según la reivindicación 6�, en donde la enzima condroitinasa ABCI mutante es para la administración después de una lesión del sistema nervioso central no causada por contusión.

9. 9.

   La enzima según la reivindicación 6�, en donde la enzima condroitinasa ABCI mutante es para la administración después de una lesión de la médula espinal.

10. 10.

    La enzima según la reivindicación 6�, en donde la enzima condroitinasa ABCI mutante es para la administración local, preferiblemente en donde la administración local se elige entre la administración intratecal y la administración típica.

11. 11.

    La enzima según una cualquiera de las reivindicaciones 1� a 5�, para facilitar la difusión de un agente en el sistema nervioso central o para potenciar la absorción de un agente en el sistema nervioso central.

12. 12.

    La enzima según la reivindicación 11�, en donde el agente se elige entre el grupo que consiste en materiales biológicos complejos, moléculas pequeñas y células trasplantadas.

13. 13.

    Una composición farmacéutica que comprende la enzima según la reivindicación 11�, en combinación con uno o más vehículos aceptables farmac�uticamente, preferiblemente en donde el vehículo farmacéutico se elige entre el grupo que consiste en diluyentes, aglutinantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes disgregantes, agentes tampón, agentes isotonizantes, polioles, agentes conservantes y anestésicos.

14. 14.

    La enzima según la reivindicación 1� para inhibir la extravasaci�n de células desde los vasos sanguíneos o para tratar la inflamación en un paciente.

15. 15.

    La enzima según la reivindicación 14� para inhibir la extravasaci�n de células desde los vasos sanguíneos, en donde las células se eligen entre el grupo que consiste en glóbulos blancos, leucocitos, neutr�filos, eosin�filos, bas�filos, linfocitos, células B, células T, monocitos y macr�fagos.

16. 16.

    Un método para modificar las células sanguíneas ex vivo que comprende someter las células extraídas de la corriente sanguínea de un paciente a una enzima según la reivindicación 1�.